ES2334338T3

ES2334338T3 - Antagonistas de il-21.

Info

Publication number: ES2334338T3
Application number: ES02773925T
Authority: ES
Inventors: Scott R. Presnell; James W. West; Julia E. Novak
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2001-11-05
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2010-03-09
Anticipated expiration: 2022-10-28
Also published as: EP1451322A2; US20050244930A1; WO2003040313A3; JP2010207238A; JP2005508179A; US20070166796A1; MXPA04004167A; AU2002336676A1; ATE444363T1; CA2465156A1; EP1451322A4; US20030134390A1; US6929932B2; EP1451322B1; CA2465156C; WO2003040313A2; US7186805B2; US7410780B2; EP2130919A1; DK1451322T3

Abstract

Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:5.

Description

Antagonistas de IL-21.

Las interleuquinas son una familia de citoquinas que median en respuestas inmunológicas, incluyendo la inflamación. Las interleuquinas median en una diversidad de patologías inflamatorias. Para las respuestas inmunológicas son fundamentales las células T, que producen muchas citoquinas e inmunidad adaptativa frente a antígenos. Las citoquinas producidas por las células T se han clasificado como de tipo 1 y de tipo 2 (Kelso, A., Immun. Cell Biol., 76:300-317, 1998). Las citoquinas de tipo 1 incluyen IL-2, IFN-\gamma y LT-\alpha, y están implicadas en respuestas inflamatorias, inmunidad vírica, inmunidad parasitaria intracelular y rechazo de aloinjertos. Las citoquinas de tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están implicadas en respuestas humorales, inmunidad frente a helmintos y respuestas alérgicas. Las citoquinas que son compartidas por el tipo 1 y el tipo 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-\alpha. Existen algunas pruebas que sugieren que las poblaciones de células T productoras de citoquinas de tipo 1 y de tipo 2 migran preferentemente hacia diferentes tipos de tejido inflamado.

Las células T maduras pueden ser activadas, es decir, por un antígeno u otros estímulos, para que produzcan, por ejemplo, citoquinas, moléculas de señalización bioquímica o receptores que influyen posteriormente en el destino de la población de células T. Las células B pueden ser activadas a través de receptores sobre su superficie celular, incluyendo el receptor de células B y otras moléculas accesorias, para que realicen funciones celulares accesorias, como la producción de citoquinas.

Las actividades in vivo demostradas de la familia de las citoquinas en la inflamación y las enfermedades autoinmunológicas ilustran el enorme potencial clínico de los antagonistas de citoquinas y su necesidad. La presente invención trata de estas necesidades, proporcionando antagonistas de la citoquina IL-21, así como composiciones y métodos relacionados.

La presente invención proporciona estos polipéptidos para estos y otros usos que serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las indicaciones que aparecen en la presente.

El documento WO 00/53761 describe moléculas polinucleotídicas y polipeptídicas de zalfa11 y sus correspondientes métodos y usos.

La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:5. En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que codifica un polipéptido antagonista de IL-21 que comprende la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6. Estas secuencias incluyen mutaciones en la hélice D de IL-21.

En una realización, la presente invención proporciona una molécula antagonista con un truncamiento del polipéptido de IL-21 después del resto 147 (Met), y en la que el resto Gln_{145} (SEQ ID NO:2) se muta hacia Asp_{145} (como se muestra en SEQ ID NO:4). Estas mutaciones producen una proteína con una IC_{50} de 10, y una EC_{50} que es indetectable. El polipéptido resultante, que se denominó ligando zalfa11 I156ST/Q153D (ST indica truncamiento, en este caso en el resto aminoácido 156), demostró que se unía al receptor cognado con especificidad y sin señalización
detectable.

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula antagonista en la que el resto Gln_{145} (mostrado en SEQ ID NO:2) se muta hacia Asp_{145} (mostrado en SEQ ID NO:6), e Ile_{148} (mostrado en SEQ ID NO:2) se muta hacia Asp_{148} (mostrado en SEQ ID NO:6). Estas mutaciones producen una proteína con una IC_{50} de 10, y una EC_{50} que es indetectable. El polipéptido resultante, denominado ligando zalfa11 I156D/Q153D, demostró que se unía al receptor cognado con especificidad y sin señalización detectable.

Un aspecto de la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende al menos dos polipéptidos, en los que al menos uno de los polipéptidos comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6, y una segunda secuencia polipeptídi-
ca.

Otro aspecto de la invención proporciona un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está unido operablemente a la molécula de ácido nucleico, y en el que la molécula de ácido nucleico está operablemente unida al terminador de la transcripción.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una célula hospedante recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5, en la que la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero y células vegetales.

\newpage

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido según la reivindicación 3, comprendiendo dicho método la etapa de cultivar células hospedantes recombinantes que comprenden el vector de expresión de la reivindicación 5, y que producen el polipéptido.

Descripción detallada de la invención

Antes de exponer en detalle la invención puede resultar útil para su comprensión definir los siguientes términos y expresiones:

La expresión "marcador de afinidad" se emplea en la presente para indicar un segmento polipeptídico que puede unirse a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido, o para proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para la cual se encuentra disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica puede utilizarse como marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen la proteína A con un tramo de polihistidina (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3, 1991), la glutatión S-transferasa (Smith y Johnson, Gene, 67:31, 1988), el marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7952-7954, 1985), la sustancia P, el péptido Flag^{TM} (Hopp et al., Biotechnology, 6:1204-1210, 1988), el péptido de unión a estreptavidina, u otro epitopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95-107, 1991. Los ADN que codifican marcadores de afinidad están disponibles en fuentes comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

La expresión "variante alélico" se emplea en la presente para indicar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de la mutación, y puede producir polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (no se producen cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión "variante alélico" también se emplea en la presente para indicar una proteína codificada por un variante alélico de un gen.

Las expresiones "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" se emplean en la presente para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando lo permita el contexto, estas expresiones se emplean haciendo referencia a una secuencia o una porción particulares de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una secuencia concreta colocada en posición carboxilo-terminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está colocada próxima al carboxilo terminal de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el carboxilo terminal del polipéptido completo.

La expresión "pareja de complemento/anticomplemento" indica restos no idénticos que forman una pareja estable, unida de forma no covalente, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o la estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja de complemento/anticomplemento. Otros ejemplos de parejas de complemento/anticomplemento incluyen parejas de receptor/ligando, parejas de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epitopo), parejas de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. Cuando se desee la posterior disociación de la pareja de complemento/anticomplemento, la pareja de complemento/anticomplemento preferiblemente tiene una afinidad de unión de <10^{9} M^{-1}.

La expresión "complementos de una molécula polinucleotídica" indica una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de bases complementaria y una orientación inversa comparada con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.

La expresión "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (comparada con una molécula polinucleotídica de referencia que codifique un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

La expresión "vector de expresión" se emplea para indicar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés unido operablemente a otros segmentos que posibilitan su transcripción. Estos segmentos adicionales incluyen secuencias de promotores y de terminadores, y también pueden incluir uno o más orígenes de la replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión proceden, en general, de ADN plasmídico o vírico, o pueden contener elementos de ambos.

El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, indica que el polinucleótido se ha retirado de su entorno genético natural y, por tanto, está exento de otras secuencias codificadoras extrañas o indeseadas, y está en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas mediante modificación genética. Estas moléculas aisladas se separan de sus entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están exentas de otros genes con los que normalmente están asociados, pero pueden incluir regiones 5' y 3' sin traducir naturales, como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature, 316:774-778, 1985).

\newpage

Un polipéptido o una proteína "aislados" son un polipéptido o una proteína que se encuentran en una condición distinta a su entorno nativo, tal como apartados de la sangre y los tejidos animales. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente exento de otros polipéptidos, en particular de otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma muy purificada, es decir, más del 95% puros, más preferiblemente más del 99% puros. Cuando se emplea en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, como dímeros o formas glicosiladas o derivatizadas de manera alternativa.

El término "neoplásico", cuando se refiere a células, indica células que sufren una proliferación nueva y anómala, en particular en un tejido en que la proliferación está descontrolada y es progresiva, dando como resultado un neoplasma. Las células neoplásicas pueden ser malignas, es decir, invasivas y metastásicas, o benignas.

La expresión "unido operablemente", cuando se refiere a segmentos de ADN, indica que los segmentos están dispuestos de tal manera que funcionan en concierto para sus objetivos previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y avanza a través del segmento codificador hasta el terminador.

El término "ortólogo" indica un polipéptido o una proteína obtenidos a partir de una especie que son los homólogos funcionales de un polipéptido o una proteína procedente de una especia diferente. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la especiación.

Los "parálogos" son proteínas diferenciadas pero relacionadas desde el punto de vista estructural fabricadas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen de la duplicación de genes. Por ejemplo, la \alpha-globina, la \beta-globina y la mioglobina son parálogos entre sí.

Un "polinucleótido" es un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas que se leen desde el extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse a partir de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan como pares de bases (de manera abreviada "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Cuando lo permita el contexto, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias, se emplea para indicar la longitud global y se entenderá que es equivalente a la expresión "pares de bases". Los expertos en la técnica reconocerán que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden tener una longitud ligeramente diferente y que sus extremos pueden estar cortados de forma escalonada como resultado de la ruptura enzimática; por tanto, todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica bicatenaria pueden no estar apareados.

Un "polipéptido" es un polímero de restos aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, producido tanto de forma natural como sintética. Los polipéptidos con menos de aproximadamente 10 restos aminoácidos se denominan habitualmente "péptidos".

El término "promotor" se emplea en la presente con su significado conocido en la técnica, para indicar una porción de una secuencia de ADN que contiene un gen, que proporciona la unión de ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias de promotores se encuentran habitualmente, pero no siempre, en las regiones no codificadoras 5' de los genes.

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser añadidos a una proteína por la célula en que se produce la proteína, y variarán según el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente en términos de sus estructuras de esqueleto de aminoácidos; los sustituyentes, tales como grupos carbohidrato, en general no se especifican pero no obstante pueden estar presentes.

El término "receptor" indica una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a membranas se caracterizan por una estructura multipeptídica que comprende un dominio extracelular de unión al ligando y un dominio intracelular efector que está implicado, de forma típica, en la transducción de señales. La unión del ligando al receptor produce un cambio conformacional en el receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y otra molécula o moléculas en la célula. Esta interación, a su vez, conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que están conectados a interacciones de receptor-ligando incluyen la transcripción de genes, la fosforilación, la desfosforilación, los aumentos en la producción de AMP cíclico, la movilización del calcio celular, la movilización de lípidos de membrana, la adhesión celular, la hidrólisis de lípidos de inositol y la hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden estar unidos a membranas, pueden ser citosólicos o nucleares; pueden ser monoméricos (por ejemplo, el receptor de la hormona estimulante del tiroide, el receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, el receptor de PDGF, el receptor de la hormona del crecimiento, el receptor de IL-3, el receptor de GM-CSF, el receptor de G-CSF, el receptor de eritropoyetina y el receptor de IL-6).

La expresión "secuencia señal secretora" indica una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a través de la vía secretora de la célula en que se sintetiza. El polipéptido mayor normalmente se rompe para retirar el péptido secretor durante el tránsito a través de la vía secretora.

La expresión "variante de corte y empalme" se emplea en la presente para indicar formas alternativas de ARN transcritas a partir de un gen. La variación de corte y empalme surge de modo natural mediante el uso de sitios de corte y empalme alternativos dentro de la molécula de ARN transcrita o, de manera menos habitual, entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede producir varios ARNm transcritos a partir del mismo gen. Los variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tengan una secuencia de aminoácidos alterada. La expresión "variante de corte y empalme" también se emplea en la presente para indicar una proteína codificada por un variante de corte y empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.

Se entenderá que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados mediante métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel) son valores aproximados. Cuando estos valores se expresan como "aproximadamente" X o "alrededor de" X, se entenderá que el valor indicado de X será preciso en \pm10%.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que ciertas mutaciones en el ADN que codifica la interleuquina-21 (IL-21) producen moléculas polipeptídicas que pueden unirse al receptor de IL-21. En particular, las mutaciones en la hélice D de IL-21 pueden modificarse y se puede mantener la especificidad de unión por el receptor de IL-21. La IL-21 se denominó, en un principio, ligando zalfa11, y el receptor se denominó, en un principio, zalfa11. La IL-21 se describe en la patente de EEUU nº 6.307.042, de propiedad de los solicitantes.

En general, se predice que las citoquinas tengan cuatro estructuras en alfa-hélice, siendo las hélice A, C y D las más importantes en las interacciones de ligando-receptor. En la secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana, que se muestra en SEQ ID NO:2, la hélice A se define por los restos aminoácidos 41-56; la hélice B por los restos aminoácidos 69-84; la hélice C por los restos aminoácidos 92-105; y la hélice D por los restos aminoácidos 135-148. El análisis estructural sugiere que el bucle A/B es largo, el bucle B/C es corto y el bucle C/D es largo paralelo. Esta estructura de bucles produce una organización helicoidal de arriba-arriba-abajo-abajo. Los restos cisteína están absolutamente conservados entre IL-21 e IL-15. Los restos cisteína que están conservados entre IL-15 e IL-21 se corresponden con los restos aminoácidos 71, 78, 122 y 125 de SEQ ID NO:2. La conservación de algunos de los restos cisteína también se encuentra en IL-2, IL-4, GM-CSF e IL-21, que se corresponden con los restos aminoácidos 78 y 125 de SEQ ID NO:2. La colocación consecuente de las cisteínas constituye otra confirmación más de la estructura en haz de las cuatro hélices. En la familia que comprende IL-15, IL-2, IL-4, GM-CSF e IL-21 también se conserva en gran medida la secuencia Glu-Phe-Leu como se muestra en SEQ ID NO:2 en los restos 136-138.

El ánalisis de IL-21 predice que los restos aminoácidos 44, 47 y 135 (como se muestra en SEQ ID NO:2) desempeñan un papel importante en la unión de IL-21 a su receptor cognado. Además, la secuencia de aminoácidos predicha de la IL-2 murina muestra una coincidencia del 57% con la proteína humana predicha. Basándose en la comparación entre las secuencias de IL-21 humana y murina, se encontraron restos bien conservados en las regiones que se predice que codifican las alfa-hélices A y D. Los correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones polipeptídicas, los dominios, los motivos, los restos y las secuencias de IL-21 descritos en la presente son como se muestra en SEQ ID NO:1.

Se ha realizado un análisis mutacional detallado para IL-4 e IL-21, estando ambas muy relacionadas con IL-21. El análisis de la IL-2 murina (Zurawski et al., EMBO J., 12:5113-5119, 1993) muestra que los restos en las hélices A y C son importantes para la unión a IL-2R\beta; los restos críticos son Asp_{34}, Asn_{99} y Asn_{103}. Múltiples restos dentro de la hélice B y del bucle A/B de la IL-2 murina son importantes para la unón de IL-2R\alpha, mientras que sólo un único resto, Gln_{141} en la hélice D, es vital para la unión con IL-2R\alpha. De forma similar, las hélices A y C son sitios de interacción entre IL-4 e IL-4R\alpha (estructuralmente similar a IL-2R\alpha), y los restos dentro de la hélice D son vitales para la interacción de IL-2R\alpha (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J., 11:3237-3244, 1992). En particular, la mutación de Tyr_{124} a Asp en la IL-4 humana crea un antagonista, que se une con IL-4R\alpha pero no con IL-2R\alpha y, por tanto, no puede señalizar (Kruse et al., ibid., 1992).

Mientras que la hélice A está relativamente bien conservada entre la IL-21 humana y murina, la hélice C es más divergente. Aunque ambas especies tienen predominantemente aminoácidos ácidos en esta región, las diferencias pueden ser las responsables de la especificidad de especie en la interacción entre IL-21 y su receptor de tipo "beta", zalfa11. El bucle A/B y la hélice B de IL-21 están bien conservados entre especies; aunque aún no se ha identificado ninguna subunidad de receptor que corresponda a IL-2R\alpha, la conservación a través de esta región sugiere que es funcionalmente significativa. Las hélices D de la IL-21 humana y murina también están altamente conservadas. Pueden diseñarse antagonistas del receptor de IL-21 mediante mutaciones dentro de la hélice D de IL-21. Cualquier mutación que rompa la estructura helicoidal de IL-21 puede evitar la unión con su receptor y, por tanto, inhibir la señali-
zación.

En una realización de la presente invención se proporciona una molécula antagonista con un truncamiento del polipéptido IL-21 después del resto 147 (Met), y en la que el resto Gln_{145} (SEQ ID NO:2) se muta a Asp_{145} (como se muestra en SEQ ID NO:4). Estas mutaciones producen una proteína con una IC_{50} de 10 y una EC_{50} que es indetectable. El polipéptido resultante, denominado ligando zalfa11 I156ST/Q153D (ST indica truncamiento, en este caso en el resto aminoácido 156), demostró que se unía al receptor cognado con especificidad y sin señalización detectable.

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula antagonista en la que el resto Gln_{145} (mostrado en SEQ ID NO:2) se muta a Asp_{145} (mostrado en SEQ ID NO:6), e Ile_{148} (mostrado en SEQ ID NO:2) se muta a Asp_{148} (mostrado en SEQ ID NO:6).. Estas mutaciones producen una proteína con una IC_{50} de 10 y una EC_{50} que es indetectable. El polipéptido resultante, denominado ligando zalfa11 I156D/Q153D demostró que se unía al receptor cognado con especificidad y sin señalización detectable.

Los dominios funcionales de las citoquinas con cuatro hélices se determinan basándose en la homología estructural, independientemente de la coincidencia de la secuencia, y pueden mantener la integridad funcional en una quimera (Kallen et al., J. Biol. Chem., 274:11859-11867, 1999). Por tanto, los dominios helicoidales de los antagonistas de IL-21 serán útiles para preparar moléculas de fusión quiméricas, en particular con otras formas de citoquinas con hélices cortas, para determinar y modular la especificidad de unión al receptor. De particular interés son las proteínas de fusión modificadas con la hélice A, y las proteínas de fusión que combinan los dominios helicoidales y de bucles procedentes de otras formas de citoquinas con hélices cortas, como IL-2, IL-4, IL-15 y GM-CSF. Los restos aminoácidos que comprenden las hélices A, B, C y D, y los bucles A/B, B/C y C/D para IL-21, IL-2, IL-4, IL-15 y GM-CSF se muestran en la tabla 1.

TABLA 1

1

El receptor de IL-21 es un miembro de la subfamilia de receptores de citoquinas de clase I que incluye los receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF y G-CSF (para un informe, véase Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily", en Cytokine, 5(2):95-106, 1993). El receptor de IL-21 se describe completamente en la solicitud de patente PCT nº US99/22149, de propiedad de los solicitantes. El receptor de IL-21 se expresa en nódulos linfáticos, leucocitos de sangre periférica (PBL), bazo, médula ósea y timo. La distribución tisular del receptor sugiere que una diana para la IL-21 predicha son las células de linaje hematopoyético, en particular las células progenitoras linfoides y las células linfoides. Otras citoquinas de haz de cuatro hélices conocidas que actúan sobre células linfoides incluyen IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15. Para un informe de citoquinas de haz de cuatro hélices véase Nicola et al., Advances in Protein Chemistry, 52:1-65, 1999, y Kelso, A., Immunol. Cell Biol., 76:300-317, 1998.

La presente invención proporciona moléculas polinucleotídicas, incluyendo moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos antagonistas de IL-21, según se describe en la presente. Los expertos en la técnica reconocerán con facilidad que, a la vista de la degeneración del código genético, es posible una considerable variación en la secuencia entre estas moléculas polinucleotídicas. La SEQ ID NO:1 es una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de IL-21 de SEQ ID NO:2.

Mediante la utilización de los polinucleótidos aislados de la presente invención, que incluyen ADN y ARN, se aisla la secuencia nativa de la IL-21 como molde para identificar mutantes. Los métodos para preparar ADN y ARN son muy conocidos en la técnica.

La presente memoria describe polipéptidos antagonistas de IL-21 que tienen una coincidencia de secuencia sustancialmente similar a los polipéptidos de las SEQ ID NO:4 ó 6. La expresión "coincidencia de secuencia sustancialmente similar" se emplea en la presente para indicar polipéptidos que comprenden al menos más del 95% de coincidencia de secuencia con las secuencias que aparecen en SEQ ID NO:4 ó 6. La presente memoria describe también moléculas de ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos. Los métodos para determinar el porcentaje de coincidencia se describen a continuación.

La presente memoria describe moléculas de ácidos nucleicos de IL-21 variantes que pueden identificarse utilizando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ó 6, y/o un ensayo de hibridación. Estos variantes de IL-21 incluyen moléculas de ácidos nucleicos: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 ó 5 (o sus complementos) bajo condiciones de lavado rigurosas, en que el lavado riguroso es equivalente a 0,5x-2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC; o (2) que codifican un polipéptido que tiene al menos más del 95% de coincidencia de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ó 6. Como alternativa, los antagonistas de IL-21 pueden caracterizarse como moléculas de ácidos nucleicos: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 ó 5 (o sus complementos) bajo condiciones de lavado muy rigurosas, en que el lavado riguroso es equivalente a 0,1x-0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC; y (2) que codifican un polipéptido que tiene al menos más del 95% de coincidencia de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ó 6.

El porcentaje de coincidencia de secuencia se determina mediante métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio., 48:603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1992). Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineamiento utilizando una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 1, y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la tabla 2 (los aminoácidos se indican mediante los códigos de una letra convencionales).

1000

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

2

Los expertos en la técnica apreciarán que puede haber muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de proteínas adecuado para estudiar el nivel de coincidencia compartida por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente y la secuencia de aminoácidos de un variante putativo de IL-21. El algoritmo FASTA se describe en Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), y en Pearson, Meth. Enzymol., 183:63 (1990).

Brevemente, el FASTA en primer lugar caracteriza la similitud de secuencia identificando regiones compartidas por la secuencia cuestionada (por ejemplo, SEQ ID NO:4 ó 6) y una secuencia de ensayo que tiene la mayor densidad de coincidencias (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin tener en cuenta sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos conservadoras. Luego, se vuelven a puntuar las diez regiones con la mayor densidad de coincidencias comparando la similitud de todos los aminoácidos apareados mediante una matriz de sustitución de aminoácidos, y se "recortan" los extremos de las regiones para incluir únicamente aquellos restos que contribuyan a la mayor puntuación. Si hay varias regiones con puntuaciones mayores que el valor de "corte" (calculado mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor de ktup), entonces las regiones iniciales recortadas se estudian para determinar si las regiones pueden unirse para formar un alineamiento aproximado con huecos. Por último, las regiones con la mayor puntuación de las dos secuencias de aminoácidos se alinean utilizando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math., 26:787 (1974)), que permite las inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup = 1, penalización por apertura de hueco = 10, penalización por extensión de hueco = 1, y matriz de sustitución = BLOSUM62. Estos parámetros pueden introducirse en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el anexo 2 de Pearson, Meth. Enzymol., 183:63 (1990).

El FASTA también puede utilizarse para determinar la coincidencia de secuencia de moléculas de ácidos nucleicos utilizando una proporción, tal como se describió anteriormente. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor de ktup puede variar entre uno y seis; preferiblemente entre tres y seis; lo más preferiblemente tres, con los demás parámetros fijados por defecto.

Los polipéptidos de IL-21 variantes o los polipéptidos con una coincidencia de secuencia sustancialmente similar se caracterizan porque tienen una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de poca importancia, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras (véase la tabla 3) y otras sustituciones que no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad del polipéptido; deleciones pequeñas, de forma típica de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino- o carboxilo-terminales, como un resto metionina amino-terminal, un péptido conector pequeño de hasta aproximadamente 20-25 restos, o un marcador de afinidad. La presente memoria describe polipéptidos de aproximadamente 108 a 216 restos aminoácidos que comprenden una secuencia que es al menos 95% o más idéntica a la correspondiente región de SEQ ID NO:4 ó 6. Los polipéptidos que comprenden marcadores de afinidad pueden comprender también un sitio de ruptura proteolítica entre el polipéptido de IL-21 y el marcador de afinidad. Los sitios de este tipo preferidos incluyen los sitios de ruptura de trombina y los sitios de ruptura del factor Xa.

TABLA 3 Sustituciones de aminoácidos conservadoras

3

Pueden determinarse los restos aminoácidos que comprenden regiones o dominios que son críticos para mantener la integridad estructural. Dentro de estas regiones se pueden determinar los restos específicos que serán más o menos tolerantes a los cambios y que mantengan la estructura terciaria global de la molécula. Los métodos para analizar la estructura de la secuencia incluyen, pero no se limitan al alineamiento de múltiples secuencias con una alta coincidencia de aminoácidos o nucleótidos, propensiones de la estructura secundaria, patrones binarios, empaquetado complementario e interacciones polares enterradas (Barton, Current Opin. Struct. Biol., 5:372-376, 1995, y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol., 6:3-10, 1996). En general, cuando se diseñan modificaciones en las moléculas o se identifican fragmentos específicos, la determinación de la estructura vendrá acompañada de la evaluación de la actividad de las moléculas modificadas. Los efectos de los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden predecirse, por ejemplo, mediante la formación de modelos informáticos como se indicó anteriormente, o pueden determinarse mediante un análisis de la estructura cristalina (véase, por ejemplo, Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol., 2:266-268, 1995). Otras técnicas que son muy conocidas en la técnica comparan el plegamiento de una proteína variante con una molécula patrón (por ejemplo, la proteína nativa). Por ejemplo, puede efectuarse la comparación del patrón de cisteínas en moléculas variantes y patrones. La espectrometría de masas y la modificación química que emplea la reducción y la alquilación proporcionan métodos para determinar los restos cisteína que están asociados con enlaces disulfuro o están exentos de dichas asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci., 2:1732-1748, 1993; y Patterson et al., Anal. Chem., 66:3727-3732, 1994). En general se cree que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón de cisteínas que la molécula patrón, el plegamiento se verá afectado. Otro método muy conocido y aceptado para medir el plegamiento es el dicroismo circular (CD). La medición y la comparación de los espectros de CD generados por una molécula modificada y por una molécula patrón es algo habitual (Johnson, Proteins, 7:205-214, 1990). La cristalografía es otro método muy conocido para analizar el plegamiento y la estructura. La resonancia magnética nuclear (RMN), el cartografiado de péptidos digestivo y el cartografiado de epitopos también son métodos conocidos para analizar el plegamiento y las similitudes estructurales entre proteínas y polipéptidos (Schaanan et al., Science, 257:961-964, 1992).

Pueden realizarse análisis de deleción rutinarios de moléculas de ácidos nucleicos para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de IL-21. Como ilustración, las moléculas de ADN que tengan la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 ó 5, o sus fragmentos, pueden digerirse con la nucleasa Bal31 para obtener una serie de deleciones anidadas. Estos fragmentos de ADN entonces se insertan en vectores de expresión en el marco de lectura apropiado, y los polipéptidos expresados se aislan y se ensayan para la actividad IL-21, o para la capacidad para unirse a anticuerpos anti-IL-21 o al receptor de IL-21. Una alternativa a la digestión con exonucleasas es utilizar la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para introducir deleciones o codones de terminación para especificar la producción de un fragmento de IL-21 deseado. Como alternativa, pueden sintetizarse fragmentos concretos de un gen de IL-21 utilizando la reacción en cadena de polimerasa.

Los métodos convencionales para identificar dominios funcionales son muy conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los estudios sobre el truncamiento en alguno o ambos terminales de interferones han sido resumidos por Horisberg y Di Marco, Pharmac. Ther., 66:507 (1995). Además, las técnicas convencionales para el análisis funcional de proteínas son descritas, por ejemplo, en Treuter et al., Molec. Gen. Genet., 240:113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pp. 65-72 (Nijhoff, 1987); Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al. (eds.), pp. 169-199 (Academic Press, 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem., 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem., 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol., 50:1295 (1995); y Meisel et al., Plant Molec. Biol., 30:1 (1996).

Pueden realizarse múltiples sustituciones de aminoácidos y ensayarse utilizando métodos conocidos de mutagénesis y selección, como los descritos en Reidhaar-Olson y Sauer (Science, 241:53 (1988)) o Bowie y Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:2152 (1989)). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar un polipéptido funcional, y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de las sustituciones que son posibles en cada posición. Otros métodos que pueden utilizarse incluyen la presentación de fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem., 30:10832 (1991); Ladner et al., patente de EEUU nº 5.223.409; Huse, publicación internacional nº WO 92/06204), y la mutagénesis dirigida a regiones (Derbyshire et al., Gene, 46:145 (1986); y Ner et al., DNA, 7:127 (1988)).

Los variantes de las secuencias polipeptídicas y de nucleótidos de la IL-21 descritas también pueden generarse a través de selección aleatoria de ADN, como se describe en Stemmer, Nature, 370:389 (1994); Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 91:10747 (1994); y la publicación internacional nº WO 97/20078. Brevemente, las moléculas de ADN variantes se generan mediante recombinación homóloga in vitro por fragmentación aleatoria de un ADN de origen, seguido de una reasociación utilizando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales introducidas aleatoriamente. Este técnica puede modificarse utilizando una familia de moléculas de ADN de origen, como variantes alélicos o moléculas de ADN de diferentes especies, para introducir más variabilidad en el proceso. La selección de la actividad deseada, seguida de más repeticiones de mutagénesis y ensayo, proporciona una "evolución" rápida de las secuencias mediante la selección de las mutaciones deseables mientras se selecciona simultáneamente contra cambios perjudiciales.

Los métodos de mutagénesis, tal como se describen en la presente, pueden combinarse con métodos de selección automática de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutagenizados en células hospedantes. Las moléculas de ADN mutagenizado que codifican polipéptidos biológicamente activos, o polipéptidos que se unen con anticuerpos anti-IL-21 o con el receptor soluble de IL-21, pueden recuperarse de las células hospedantes y secuenciarse con rapidez utilizando un equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los restos aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.

Además, las proteínas descritas en la presente (o sus fragmentos polipeptídicos) pueden unirse a otras moléculas bioactivas, en particular otras citoquinas, para proporcionar moléculas multifuncionales. Por ejemplo, una o más hélices de IL-21 pueden unirse a otras citoquinas para potenciar sus propiedades biológicas o su eficacia de producción.

La presente memoria describe una serie de nuevas moléculas híbridas, en las que un segmento que comprende una o más de las hélices de IL-21 está fusionado con otro polipéptido. La fusión se realiza preferiblemente mediante corte y empalme al nivel del ADN para permitir la expresión de moléculas quiméricas en sistemas de producción recombinantes. Las moléculas resultantes entonces se ensayan para propiedades como una mejor solubilidad, una mejor estabilidad, una semivida de eliminación prolongada, una mejor expresión y niveles de secreción, y su farmacodinámica. Estas moléculas híbridas pueden comprender también restos aminoácidos adicionales (por ejemplo, un conector polipeptídico) entre las proteínas o polipéptidos componentes.

Los aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, tiazolidina, ácido carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. En la técnica se conocen varios métodos para incorporar restos aminoácidos no naturales a las proteínas. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema in vitro en que se supriman las mutaciones terminadoras utilizando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y para aminoacilar ARNt son conocidos en la técnica. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones terminadoras se realiza, de forma típica, en un sistema exento de células que comprende un extracto de E. coli S30, y enzimas y otros reactivos disponibles en el mercado. Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc., 113:2722 (1991); Ellman et al., Methods Enzymol., 202:301 (1991); Chung et al., Science, 259:806 (1993); y Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:10145 (1993).

En un segundo método, la traducción se realiza en oocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem., 271:19991 (1996)). Dentro de un tercer método, se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural, que debe ser reemplazado (por ejemplo, fenilalanina), y en presencia del aminoácido o aminoácidos no naturales deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural se incorpora a la proteína en lugar de su homólogo natural. Véase, Koide et al., Biochem., 33:7470 (1994). Los restos aminoácidos naturales pueden convertirse en especies no naturales mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con la mutagénesis dirigida específica de sitio para ampliar aún más la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci., 2:395 (1993). Para estabilizar la IL-21 puede resultar ventajoso extender la semivida de la molécula, en particular para extender la persistencia metabólica en un estado activo. Para lograr una semivida extendida, las moléculas de IL-21 pueden modificarse químicamente utilizando métodos descritos en la presente. La PEGilación es un método que se emplea habitualmente que ha demostrado aumentar la semivida plasmática, aumentar la solubilidad y disminuir la antigenicidad y la inmunogenicidad (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 6:133-155, 1991; y Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138, 1994).

Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético, aminoácidos no naturales, y aminoácidos poco normales pueden sustituir a los restos aminoácidos de IL-21.

La presente memoria describe fragmentos polipeptídicos o péptidos que comprenden una porción que porta un epitopo de un polipéptido de IL-21 descrito en la presente. Estos fragmentos o péptidos pueden comprender un "epitopo inmunogénico", que es una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos cuando se emplea la proteína completa como inmunógeno. Los péptidos que portan epitopos inmunogénicos pueden identificarse utilizando métodos convencionales (véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:3998 (1983)).

Independientemente de la secuencia de nucleótidos concreta de un polinucleótido antagonista de IL-21, el polinucleótido codifica un polipéptido que se caracteriza por su capacidad para inducir o inhibir funciones celulares especializadas, o por su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo anti-IL-21 o a un receptor de IL-21. Más específicamente, un antagonista de IL-21 se unirá a su receptor cognado con al menos una IC_{50} de 100 nM y mostrará una EC_{50} de 100 nM o mayor.

Para cualquier polipéptido de IL-21, incluyendo los variantes y las proteínas de fusión, los expertos en la técnica pueden generar con facilidad una secuencia polinucleotídica totalmente degenerada que codifique este variante utilizando la información indicada en las anteriores tablas 1 y 2.

La presente memoria describe una diversidad de otras fusiones de polipéptidos (y las proteínas multiméricas relacionadas, que comprenden una o más fusiones de polipéptidos). Por ejemplo, un polipéptido de IL-21 puede prepararse como una fusión con una proteína dimerizantes, como se describe en las patentes de EEUU nº 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas dimerizantes preferidas a este respecto incluyen los dominios de las regiones constantes de inmunoglobulinas. Las fusiones de inmunoglobulina-polipéptido de IL-21 pueden expresarse en células genéticamente modificadas (para producir una diversidad de análogos de IL-21 multiméricos). Los dominios auxiliares pueden fusionarse a polipéptidos de IL-21 para dirigirlos a células, tejidos o macromoléculas específicos. Por ejemplo, un polipéptido o una proteína de IL-21 puede dirigirse a un tipo celular predeterminado fusionando un polipéptido de IL-21 a un ligando que se una específicamente a un receptor sobre la superficie de esta célula diana. De esta forma, los polipéptidos y las proteínas pueden ser dirigidos con objetivos terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido de IL-21 puede fusionarse con dos o más restos, como un marcador de afinidad para la purificación, y un dominio de transporte dirigido. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de ruptura, en particular entre dominios. Véase, Tuan et al., Connective Tissue Research, 34:1-9, 1996.

Utilizando los métodos descritos en la presente, los expertos en la técnica pueden identificar y/o preparar una diversidad de polipéptidos que tengan una coincidencia de secuencia sustancialmente similar a los restos 1-162 ó 33-162 de SEQ ID NO:4 ó 6, en los que dichos polipéptidos o fusiones se unen al receptor zalfa11 o a anticuerpos de IL-21 con una IC_{50} de 100 nm o menor, y muestran una EC_{50} de 100 mM o mayor.

Los polipéptidos de IL-21, incluyendo los polipéptidos de longitud completa, los fragmentos funcionales y los polipéptidos de fusión, pueden producirse en células hospedantes genéticamente modificadas según técnicas convencionales. Las células hospedantes adecuadas son aquellos tipos de células que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y cultivarse en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas, y células de eucariotas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucariotas, en particular las células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una diversidad de células hospedantes se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de IL-21 está unida operablemente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluyen en general un terminador y un promotor de la transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá habitualmente uno o más marcadores seleccionables, y uno o más orígenes de la replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que, dentro de ciertos sistemas, los marcadores seleccionables pueden proporcionarse en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede proporcionarse mediante la integración en el genoma de la célula hospedante. La selección de los promotores, los terminadores, los marcadores seleccionables, los vectores y otros elementos es cuestión de diseño rutinario dentro del nivel de los expertos en la técnica. Muchos de estos elementos se describen en la bibliografía y están disponibles en suministradores comerciales.

Para dirigir un polipéptido de IL-21 hacia la vía secretora de una célula hospedante, en el vector de expresión se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia conductora, secuencia prepro o secuencia pre). La secuencia señal secretora puede ser la del ligado zalfa11 o puede derivarse de otra proteína segregada (por ejemplo, t-PA) o sintetizarse de novo. La secuencia señal secretora está unida operablemente a la secuencia de ADN de IL-21, es decir, las dos secuencias están unidas en el marco de lectura correcto y están colocadas para dirigir el polipéptido recién sintetizado hacia la vía secretora de la célula hospedante. Las secuencias señal secretoras normalmente están colocadas 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden estar colocadas en otro punto de la secuencia de ADN de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente de EEUU nº 5.037.743; Holland et al., patente de EEUU nº 5.143.830).

Como alternativa, la secuencia señal secretora contenida en los polipéptidos de la presente invención puede utilizarse para dirigir a otros polipéptidos hacia la vía secretora. La presente memoria describe estos polipéptidos de fusión. Puede fabricarse un polipéptido de fusión señal, en el que una secuencia señal secretora derivada de los restos aminoácidos 1-31 de SEQ ID NO:2 está unida operablemente a una secuencia de ADN que codifica otro polipéptido, utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La secuencia señal secretora contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención está fusionada preferiblemente de manera amino-terminal a otro péptido para dirigir el otro péptido hacia la vía secretora. Estas construcciones tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estas nuevas construcciones de fusión de secuencia señal secretora pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína que normalmente no se segrega. Estas fusiones pueden utilizarse in vivo o in vitro para dirigir a los péptidos a través de la vía secretora.

Las células de mamífero cultivadas son hospedantes adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno en células hospedantes de mamifero incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell, 14:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics, 7:603, 1981; Graham y Van der Eb, Virology, 52:456, 1973), electroporación (Neumann et al., EMBO J., 1:841-845, 1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.), transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus, 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus, 15:80, 1993), y vectores víricos (Miller y Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1989; Wang y Finer, Nature Med., 2:714-716, 1996). La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas se describe, por ejemplo, en Levinson et al., patente de EEUU nº 4.713.339; Hagen et al., patente de EEUU nº 4.784.950; Palmiter et al., patente de EEUU nº 4.579.821; y Ringold, patente de EEUU nº 4.656.134. Las células de mamífero cultivadas adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC nº CRL 1650), COS-7 (ATCC nº CRL 1651), BHK (ATCC nº CRL 1632), BHK 570 (ATCC nº CRL 10314), 293 (ATCC nº CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977), y de ovario de hámster chino (por ejemplo, CHO-K1; ATCC nº CCL 61). Otras líneas celulares adecuadas son conocidas en la técnica y están disponibles en depósitos públicos, como American Type Culture Collection, Manassas, VA. En general, se prefieren los promotores de la transcripción fuertes, como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen los de los genes de metalotioneína (patentes de EEUU nº 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor tardío prinpcipal de adenovirus.

En general se emplea la selección con fármacos para seleccionar las células de mamífero cultivadas en las que se ha insertado ADN extraño. Estas células se denominan habitualmente "transfectantes". Las células que se han cultivado en presencia del agente selectivo y que son capaces de pasar el gen de interés a su progenie se denominan "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se realiza en presencia de un fármaco de tipo neomicina, como G-418 o similares. Los sistemas de selección también pueden utilizarse para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado "amplificación". La amplificación se realiza cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y después aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También pueden utilizarse otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, de resistencia a la higromicina, de resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). Pueden emplearse marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, como la proteína fluorescente verde, o proteínas de la superficie celular, como CD4, CD8, MHC de clase I, fosfatasa alcalina placentaria, para separar las células transfectadas de las células no transfectadas por medios como las tecnologías de selección FACS o de separación con esferas magnéticas.

También pueden utilizarse otras células de eucariotas superiores como hospedantes, incluyendo células vegetales, células de insecto y células de ave. El uso de Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar genes en células vegetales se ha analizado en Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore), 11:47-58, 1987. La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos extraños en su interior se describe en Guarino et al., patente de EEUU nº 5.162.222 y la publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insecto pueden infectarse con baculovirus recombinante, de forma habitual derivado del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV). Véase, King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londres, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York, Oxford University Press, 1994; y Richardson, C.D., ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. El segundo método para fabricar baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow, V.A., et al., J. Virol., 67:4566-4579, 1993). Este sistema se comercializa en el kit Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBac1^{TM} (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido de IL-21 hacia un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande denominado "bácmido". El vector de transferencia pFastBac1^{TM} utiliza el promotor de polihedrina AcNPV para dirigir la expresión del gen de interés, en este caso el ligando zalfa11. Sin embargo, el pFastBac1^{TM} puede modificarse hasta un grado considerable. El promotor de polihedrina puede retirarse y sustituirse con el promotor de la proteína básica de baculovirus (también conocido como promotor Pcor, p6.9 o MP) que se expresa de forma temprana en la infección por baculovirus, y ha demostrado ser ventajoso para expresar proteínas segregadas. Véase, Hill-Perkins, M.S. y Possee, R.D., J. Gen. Virol., 71:971-976, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol., 75:1551-1556, 1994; y Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J. Biol. Chem., 270:1543-1549, 1995. En estas construcciones de vector de transferencia puede utilizarse una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además pueden construirse vectores de transferencia que reemplacen las secuencias señal secretoras de IL-21 nativas por secuencias señal secretoras derivadas de proteínas de insecto. Por ejemplo, puede utilizarse una secuencia señal secretora de ecdiesteroide glucosiltransferasa (EGT), melitina de abeja (Invitrogen, Carlsbad, CA) o gp67 de baculovirus (PharMingen, San Diego, CA) en construcciones para reemplazar la secuencia señal secretora de la IL-21 nativa. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión dentro del marco con ADN que codifique un marcador de epitopo en el extremo C- o N-terminal del polipéptido de IL-21 expresado, por ejemplo, un marcador de epitopo Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:7952-7954, 1985). Utilizando técnicas conocidas en la técnica, un vector de transferencia que contiene IL-21 se transforma en E. coli y se selecciona para bácmidos que contengan un gen lacZ interrumpido, indicativo del baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aisla, utilizando técnicas habituales, y se emplea para transfectar células de Spodoptera frugiperda, por ejemplo células Sf9. Posteriormente se producen los virus recombinantes que expresan la IL-21. Se preparan cepas de virus recombinantes mediante métodos que se emplean habitualmente en la técnica.

El virus recombinante se emplea para infectar células hospedantes, de forma típica una línea celular derivada de la procesionaria del otoño, Spodoptera frugiperda. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveO^{TM} (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de EEUU nº 5.300.435).

También pueden utilizarse células fúngicas, incluyendo células de levadura, dentro de la presente invención. Las especies de levadura de particular interés a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica. Los métodos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y para producir polipéptidos recombinantes a partir de éstas se describen, por ejemplo, en Kawasaki, patente de EEUU nº 4.599.311; Kawasaki et al., patente de EEUU nº 4.931.373; Brake, patente de EEUU nº 4.870.008; Welch et al., patente de EEUU nº 5.037.743; y Murray et al., patente de EEUU nº 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan mediante el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, de manera habitual la resistencia a fármacos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente concreto (por ejemplo, leucina). Un sistema de vector preferido para su uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vector POT1, descrito por Kawasaki et al. (patente de EEUU nº 4.931.373), que permite que las células transformadas puedan seleccionarse mediante el crecimiento en un medio que contenga glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para su uso con levaduras incluyen los de los genes de enzimas glicolíticas (véase, por ejemplo, Kawasaki, patente de EEUU nº 4.599.311; Kingsman et al., patente de EEUU nº 4.615.974; y Bitter, patente de EEUU nº 4.977.092) y genes de alcohol deshidrogenasa. Véanse también las patentes de EEUU nº 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936; y 4.661.454. En la técnica son conocidos los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véase, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132:3459-3465, 1986; y Cregg, patente de EEUU nº 4.882.279. Pueden utilizarse células de Aspergillus según los métodos de McKnight et al., patente de EEUU nº 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum han sido descritos por Sumino et al., patente de EEUU nº 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora han sido descritos por Lambowitz, patente de EEUU nº 4.486.533.

El uso de Pichia methanolica como hospedante para la producción de proteínas recombinantes se describe en las publicaciones WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para su uso en la transformación de P. methanolica se preparan, de manera habitual, como plásmidos circulares bicatenarios que preferiblemente se linealizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sean de un gen de P. methanolica, como el gen de utilización del alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los de los genes de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), la formiato deshidrogenasa (FMD) y la catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del hospedante se prefiere que el segmento de expresión completo del plásmido esté flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN del hospedante. Un marcador seleccionable preferido para su uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que las células hospedantes ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala, en los que resulta deseable minimizar el uso de metanol, se prefieren utilizar células hospedantes en las que se hayan deleccionado ambos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas segregadas, se prefieren células hospedantes sin los genes de proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). Se utiliza la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene el ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Se prefiere transformar las células de P. methanolica mediante electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado con atenuación exponencial con una potencia de campo de entre 2,5 y 4,5 kV/cm, preferiblemente de aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (\Omega) de 1 a 40 milisegundos, lo más preferiblemente de aproximadamente 20 milisegundos.

Las células hospedantes procariotas, incluyendo las cepas de la bacteria Escherichia coli, Bacillus y otros géneros, también son células hospedantes útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos hospedantes y para expresar secuencias de ADN extraño clonadas en su interior son muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., ibid.). Cuando se expresa un polipéptido de IL-2 en bacterias como E. coli, el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, de forma típica como gránulos insolubles, o puede ser dirigido hacia el espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y los gránulos se recuperan y se desnaturalizan utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado entonces puede volver a plegarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, como mediante diálisis contra una disolución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de una diálisis contra una disolución salina tamponada. En el último caso, el polipéptido puede recuperarse del especio periplásmico en forma soluble y funcional rompiendo las células (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando con ello la necesidad de una desnaturalización y un nuevo plegamiento.

Las células hospedantes transformadas o transfectadas se cultivan según procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contenga nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células hospedantes elegidas. En la técnica se conoce una diversidad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos e incluyen, en general, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes como factores del crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento seleccionará, en general, las células que contengan el ADN exógeno añadido, por ejemplo mediante selección de fármacos o deficiencia en un nutriente esencial que es complementado por el marcador seleccionable que porta el vector de expresión o que se cotransfecta en la célula hospedante. Las células de P. methanolica se cultivan en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y oligoelementos a una temperatura de aproximadamente 25ºC a 35ºC. Se proporcionan cultivos líquidos con una aireación suficiente por medios convencionales, como agitando matraces pequeños o burbujeando fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P. methanolica es YEPD (D-glucosa al 2%, peptona Bacto^{TM} al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levadura Bacto^{TM} al 1% (Difco Laboratories), adenina al 0,004% y L-leucina al 0,006%).

Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención hasta \geq80% de pureza, más preferiblemente hasta \geq90% de pureza, aún más preferiblemente \geq95% de pureza, y particularmente preferido es un estado farmacéuticamente puro, que es más del 99,9% puro con respecto a macromoléculas contaminantes, en particular otras proteínas y ácidos nucleicos, y exento de agentes infecciosos y pirógenos. Preferiblemente, un polipéptido purificado está sustancialmente exento de otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de origen animal.

Los polipéptidos de IL-21 recombinantes expresados (o polipéptidos de IL-21 quiméricos) pueden purificarse utilizando métodos y medios de fraccionamiento y/o purificación convencional. Puede utilizarse la precipitación con sulfato de amonio y la extracción con ácidos o caotropos para el fraccionamiento de muestras. Los ejemplos de etapas de purificación pueden incluir hidroxiapatito, exclusión molecular, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especializadas y similares. Se prefieren los derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Los ejemplos de medios cromatográficos incluyen los medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen esferas de vidrio, resinas con una base de sílice, resinas celulósicas, esferas de agarosa, esferas de agarosa reticuladas, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares que sean insolubles bajo las condiciones en que se van a utilizar. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permitan la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos carbohidrato. Los ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida, y derivados de carboxilo y amino para químicas de acoplamiento con carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son muy conocidos y se emplean ampliamente en la técnica, y están disponibles en suministradores comerciales. Los métodos para unir polipéptidos receptores a medios de soporte son muy conocidos en la técnica. La selección de un medio particular es cuestión de diseño rutinario y está determinada, en parte, por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia,
1988.

Los polipéptidos de la presente invención pueden aislarse aprovechando sus propiedades físicas o bioquímicas. Por ejemplo, puede utilizarse una cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo las que comprenden marcadores de polihistidina. Brevemente, primero se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelado (Sulkowski, Trends in Biochem., 3:1-7, 1985). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán sobre esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico utilizado, y serán eluidas mediante elución competitiva, disminución del pH o uso de agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol., vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-539) y el uso del receptor soluble zalfa11. Puede construirse una fusión del polipéptido de interés y un marcador de afinidad (por ejemplo, la proteína de unión a la maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación.

Los polipéptidos de IL-21 o sus fragmentos también pueden prepararse mediante síntesis química. Los polipéptidos de IL-21 pueden ser monómeros o multímeros; pueden estar glicosilados o no glicosilados; pueden estar pegilados o no pegilados; y pueden incluir o no un resto aminoácido metionina inicial. Por ejemplo, los polipéptidos pueden prepararse mediante síntesis de péptidos en fase sólida, por ejemplo como se describe en Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1963.

La actividad de las moléculas de la presente invención puede medirse utilizando una diversidad de ensayos que miden la proliferación y/o la unión a células que expresan el receptor de IL-21. De particular interés son los cambios en las células dependientes de IL-21. Las líneas celulares adecuadas que se van a modificar para que sean dependientes de IL-21 incluyen la línea celular BaF3 dependiente de IL-3 (Palacios y Steinmetz, Cell, 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood, 64:786-790, 1984), y MO7e (Kiss et al., Leukemia, 7:235-240, 1993). Pueden establecerse líneas celulares dependientes del factor del crecimiento según métodos publicados (por ejemplo, Greenberger et al., Leukemia Res., 8:363-375, 1984; Dexter et al., en Baum et al., eds., Experimental Hematology Today, 8ª Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol., 1979, 145-156, 1980).

Las proteínas descritas en la presente son útiles para la inducción o la inhibición de funciones celulares especializadas de células de linajes hematopoyéticos que incluyen, pero no se limitan a células T, células B, células NK, células dendríticas, monocitos y macrófagos, así como células epiteliales. Se emplean antagonistas de IL-21 para bloquear la unión a IL-21 y la transducción de señales in vitro e in vivo. Estos polipéptidos anti-unión de IL-21 serían útiles para inhibir la actividad IL-2 o la unión a proteínas. Los ensayos para medir la proliferación o la diferenciación celular son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos para medir la proliferación incluyen ensayos como la quimiosensibilidad al tinte rojo neutro (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs, 8:347-354, 1990), la incorporación de nucleótidos radiomarcados (Cook et al., Analytical Biochem., 179:1-7, 1989), la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células en proliferación (Porstmann et al., J. Immunol. Methods, 82:169-179, 1985), y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods, 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res., 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg., 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cancer Res., 48:4827-4833, 1988). Los ensayos que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, medir los marcadores de la superficie celular asociados con la expresión específica de etapa de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989).

Las moléculas de la presente invención pueden ensayarse in vivo utilizando sistemas de transporte víricos. Los ejemplos de virus para este fin incluyen adenovirus, herpesvirus, retrovirus, virus de vaccinia, y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, en la actualidad es el vector de transferencia de genes mejor estudiado para el transporte de ácidos nucleicos heterólogos (para un informe, véase T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol., 43:161-189, 1994; y J.T. Douglas y D.T. Curiel, Science & Medicine, 4:44-53, 1997).

A la vista de la distribución tisular observada para los agonistas (incluyendo la IL-21 natural/sustrato/cofactor/etc.) y/o antagonistas del receptor de la IL-21, éstos tienen un enorme potencial en aplicaciones in vitro e in vivo. Los antagonistas son útiles como reactivos de investigación para caracterizar sitios de interacción de ligando-receptor. Los antagonistas son útiles para inhibir la expansión, la proliferación, la activación y/o la diferenciación de células implicadas en la regulación de la hematopoyesis.

Un sistema de ensayo que emplea un receptor de unión al ligando (o un anticuerpo, un miembro de una pareja de complemento/anticomplemento), o su fragmento de unión, y un instrumento biosensor disponible en el mercado (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) pueden emplearse ventajosamente. Este receptor, anticuerpo, miembro de una pareja de complemento/anticomplemento o fragmento se inmoviliza sobre la superficie de un chip receptor. El uso de este instrumento se describe en Karlsson, J. Immunol. Methods, 145:229-240, 1991; y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol., 234:554-563, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se une covalentemente, utilizando la química de aminas o sulfhidrilos, a fibras de dextrano que están unidas a una película de oro dentro de una célula de flujo. Una muestra de ensayo se hace pasar a través de la célula. Si el ligando, epitopo o miembro opuesto de la pareja de complemento/anticomplemento está presente en la muestra se unirá con el receptor, anticuerpo o miembro inmovilizados, respectivamente, provocando un cambio en el índice refractario del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia de plasmón de superficie de la película de oro. Este sistema permite la determinación de la constante de afinidad y la constante de disociación, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de unión y se puede evaluar la estequiometría de la unión. Como alternativa, la unión del ligando/receptor puede analizarse utilizando la tecnología SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).

Los polipéptidos del receptor de unión al ligando también pueden utilizarse dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Estos sistemas incluyen el análisis de Scatchard para la determinación de la afinidad de unión (véase, Scatchard, Ann. NY Acad. Sci., 51:660-672, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham et al., Science, 253:545-548, 1991; Cunningham et al., Science, 245:821-825, 1991).

Los polipéptidos antagonistas de IL-21 también pueden utilizarse para preparar anticuerpos que se unen a epitopos, péptidos o polipéptidos de IL-21. El polipéptido de IL-21, o su fragmento, sirve como antígeno (inmunógeno) para inocular un animal y provocar una respuesta inmunológica. Los expertos en la técnica reconocerán que los polipéptidos antigénicos que portan epitopos contienen una secuencia de al menos 6, preferiblemente al menos 9, y más preferiblemente al menos 15 a aproximadamente 30 restos aminoácidos contiguos de un polipéptido de IL-21 (por ejemplo, SEQ ID NO:4 ó 6). Los polipéptidos que comprenden una porción mayor del polipéptido antagonista de IL-21, es decir, de 30 a 100 restos hasta la longitud completa de la secuencia de aminoácidos, se incluyen. Los antígenos o epitopos inmunogénicos también pueden incluir marcadores unidos, adyuvantes y vehículos, como se describe en la presente. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido antagonista de IL-21 de longitud completa y maduro, la hélice D mutante, como se describe en la presente.

Las proteínas de fusión de antagonistas de IL-21 pueden utilizarse para potenciar la muerte in vivo de tejidos diana (por ejemplo, cánceres de sangre y de médula ósea) si el polipéptido de IL-21 o el anticuerpo anti-IL-21 se dirigen a sangre o células de médula ósea hiperproliferativas (véase, en general, Hornick et al., Blood, 89:4437-4447, 1997). Las proteínas de fusión descritas permiten dirigir una citoquina hacia un sitio de acción deseado, proporcionando con ello una concentración local elevada de citoquina. Los polipéptidos de IL-21 o anticuerpos anti-IL-21 adecuados se dirigen a un tejido o célula indeseable (es decir, un tumor o una leucemia), y la citoquina unida media en una mayor lisis de las células diana realizada por células efectoras. Las citoquinas adecuadas para este fin incluyen la interleuquina-2 y el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), por ejemplo.

La IL-21 se aisla a partir de un tejido conocido por tener una importante función inmunológica y que contiene células que desempeñan un papel en el sistema inmunológico. La IL-21 se expresa en células de sangre periférica activadas, CD3+ seleccionadas, y se ha demostrado que la expresión de IL-21 aumenta después de la activación de las células T. Además, los resultados de experimentos han demostrado previamente que los polipéptidos de IL-21 tienen un efecto sobre el crecimiento/expansión y/o el estado de diferenciación de células NK o progenitores de NK. Otras pruebas demuestran que la IL-21 afecta a la proliferación y/o diferenciación de células T y células B in vivo. En general se conocen los factores que estimulan la proliferación de progenitores hematopoyéticos y activan células maduras. Por tanto, los polipéptidos antagonistas de IL-21 serán útiles para inhibir el crecimiento y la diferenciación de estos tipos celulares que responden a IL-21. Esto es particularmente útil cuando la proliferación de un tipo celular específico que responde está asociado con una enfermedad hiperproliferativa, como cáncer o una enfermedad autoinmunológica.

Los ensayos para medir la diferenciación incluyen, por ejemplo, medir los marcadores celulares asociados con la expresión específica de etapa de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989). Como alternativa, el polipéptido de IL-21 en sí mismo puede actuar como un marcador de la superficie celular o marcador segregado adicional asociado con la expresión específica de etapa de un tejido. Como tal, la medición directa del polipéptido de IL-21 o la pérdida de su expresión en un tejido a medida que se diferencia puede actuar como marcador para la diferenciación de tejidos.

La actividad y el efecto de los antagonistas de IL-21 sobre el avance y la metástasis de tumores puede medirse in vivo. Se han desarrollado varios modelos de ratones singeneicos para estudiar la influencia de polipéptidos, compuestos u otros tratamientos sobre el avance de los tumores. En estos modelos, las células tumorales transferidas en cultivo se implantan en ratones de la misma raza como tumor donante. Las células se desarrollarán en tumores que tienen características similares en los ratones receptores, y la metástasis también se producirá en algunos de los modelos. Los modelos de tumores apropiados para los estudios de la presente incluyen el carcinoma de pulmón de Lewis (ATCC nº CRL-1642) y el melanoma B16 (ATCC nº CRL-6323), entre otros. Estas son dos líneas tumorales que se emplean habitualmente, singeneicas para el ratón C57BL6/J, que pueden cultivarse con facilidad y manipularse in vitro. Los tumores que resultan de la implantación de cualquiera de estas líneas celulares son capaces de producir metástasis en el pulmón de ratones C57BL6/J. El modelo de carcinoma de pulmón de Lewis se ha utilizado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de la angiogénesis (O'Reilly M.S., et al., Cell, 79:315-328, 1994). Los ratones C57BL6/J se tratan con un agente experimental a través de una inyección diaria de proteína recombinante, agonista o antagonista, o con una sola inyección de adenovirus recombinante. Tres días después de este tratamiento, se implantan de 10^{5} a 10^{6} células bajo la piel dorsal. Como alternativa, las mismas células pueden infectarse con un adenovirus recombinante, como uno que exprese IL-21, antes de la implantación, de forma que la proteína se sintetiza en el sitio tumoral o de forma intracelular, en lugar de una forma sistémica. Los ratones normalmente desarrollarán tumores visibles en 5 días. Se deja que los tumores crezcan durante un periodo de hasta 3 semanas, durante las cuales pueden alcanzar un tamaño de 1500-1800 mm^{3} en el grupo control tratado. El tamaño del tumor y el peso corporal se controlan cuidadosamente a lo largo del experimento. En el momento del sacrificio se retira el tumor y se pesa junto con los pulmones y el hígado. Se ha demostrado que el peso del pulmón se correlaciona bien con la carga tumoral metastásica. Como medición adicional, se cuentan las metástasis de la superficie pulmonar. El tumor, los pulmones y el hígado reseccionados se preparan para el estudio histopatológico, la inmunohistoquímica, y la hibridación in situ, utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. Por tanto, puede evaluarse la influencia del polipéptido expresado en cuestión, por ejemplo IL-21, sobre la capacidad del tumor para reclutar vasculatura y sufrir metástasis. Además, aparte de la utilización de adenovirus, las células implantadas pueden transfectarse provisionalmente con IL-21. El uso de transfectantes de IL-21 estables, así como el uso de promotores inducibles para activar la expresión de IL-21 in vivo son conocidos en la técnica y pueden emplearse en este sistema para evaluar la inducción de metástasis de IL-21. Además, en este modelo de ratón puede inyectarse directamente IL-21 purificada o medio condicionado con IL-21 y, por tanto, pueden utilizarse en este sistema. Para una referencia general, véase O'Reilly M.S., et al., Cell, 79:315-328, 1994; y Rusciano, D., et al., Murine Models of Liver Metastasis, Invasion Metastasis, 14:349-361, 1995.

Los antagonistas de IL-21 pueden administrarse en combinación con otros agentes que ya se usan, incluyendo agentes quimioterapéuticos convencionales y también moduladores inmunológicos, como alfa-interferón. Los interferones-alfa/beta han demostrado ser eficaces para tratar algunas leucemias y modelos de enfermedad animales, y los efectos inhibidores del crecimiento del alfa-interferón y la IL-21 son aditivos para al menos una línea celular derivada de tumor de células B.

En otro aspecto, la presente memoria describe un método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas, que comprende administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T una cantidad de una composición de un antagonista de IL-21, suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas. La composición puede comprender al menos otra citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando Flt3 o factor de células pluripotenciales. Además, el antagonista de IL-21 puede ser una proteína de fusión de ligando/toxina.

La distribución tisular de un receptor para una citoquina concreta ofrece una fuerte indicación de los sitios potenciales de acción de esta citoquina. Un análisis de la transferencia Northern del receptor de IL-21 revela transcritos en el bazo, timo, nódulos linfáticos, médula ósea y leucocitos de sangre periférica humanos. Se identificaron tipos celulares específicos que expresan receptores zalfa11 y se observaron fuertes señales en una reacción de linfocitos mixtos (MRL) y en la línea celular Raji de linfoma de Burkitt. Las dos líneas celulares monocíticas, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cancer, 26:171-176, 1980) y U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cancer, 17:565-577, 1976) fueron negativas.

El receptor de IL-21 se expresa a niveles relativamente altos en una MLR, en la que se mezclan células mononucleares de sangre periférica (PMBNC) de dos individuos, dando como resultado una activación mutua. La detección de altos niveles de transcritos en la MLR pero no en poblaciones de células T o B en reposo sugiere que la expresión del receptor de IL-21 puede estar inducida en uno o más tipos celulares durante la activación. La activación de poblaciones aisladas de células T y B puede lograrse artificialmente mediante la estimulación de las células con PMA e ionomicina. Cuando las células seleccionadas se someten a estas condiciones de activación, los niveles del transcrito del receptor de IL-21 aumentan en ambos tipos celulares, apoyando el papel de este receptor y de IL-21 en las respuestas inmunológicas, en especial en expansiones de células T y B autocrinas y paracrinas durante la activación. La IL-21 también puede desempeñar un papel en la expansión de progenitores más primitivos implicados en la linfopoyesis.

Se descubrió que el receptor de IL-21 estaba presente a bajos niveles en células T y B en reposo, y que es sobrerregulado durante la activación en ambos tipos celulares. De manera interesante, las células B también infrarregulan el mensaje con más rapidez que las células T, sugiriendo que la amplitud de la señal y el momento de extinción de la señal son importantes para la regulación apropiada de las respuestas de células B.

Además, una gran proporción de células de la lámina propia intestinal muestran señales de hibridación positiva con el receptor IL-2. Este tejido consiste en una población mixta de células linfoides, incluyendo células T CD4+ activadas y células B activadas. La disfunción inmunológica, en particular la activación crónica de la respuesta inmunológica mucósica, desempeña un papel importante en la etiología de la enfermedad de Crohn; una respuesta anómala a citoquinas proinflamatorias y/o su producción también se consideran un factor sospechoso (Braegger et al., Annals Allergy, 72:135-141, 1994; Sartor, R.B., Am. J. Gastroenterol., 92:5S-11S, 1997). La IL-21, junto con la IL-15, expanden las células NK desde los progenitores de la médula ósea y aumentan la función efectora de las células NK. La IL-21 también coestimula las células B maduras estimuladas con anticuerpos anti-CD40, pero inhibe la proliferación de células B a las señales a través de IgM. La IL-21 potencia la proliferación de células T junto con una señal a través del receptor de células T, y la sobreexpresión en ratones transgénicos conduce a linfopenia y a una expansión de los monocitos y granulocitos. Estos efectos fenotípicos de la IL-21 sugieren que puede proporcionar utilidad terapéutica para una amplia gama de enfermedades que surgen de defectos en el sistema inmunológico incluyendo, pero sin limitarse a lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MD), miastenia grave y diabetes. Es importante advertir que estas enfermedades son el resultado de una red compleja de disfunciones inmunológicas (el SLE, por ejemplo, es la manifestación de defectos en células T y B), y que las células inmunológicas dependen de su interacción para provocar una respuesta inmunológica potente. Por tanto, el antagonista de IL-21 que puede utilizarse para manipular más de un tipo de célula inmunológica es un candidato terapéutico atractivo para la intervención en múltiples etapas de la enfermedad.

Para un uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención se formulan para la administración parenteral, en particular intravenosa o subcutánea, según métodos convencionales. El polipéptido bioactivo o los conjugados de anticuerpos descritos en la presente pueden administrarse por vía intravenosa, intraarterial o intraductal, o pueden introducirse de forma local en el sitio de acción previsto. La administración intravenosa será mediante una inyección en embolada o una infusión a lo largo de un periodo de tiempo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína de IL-21 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones también pueden incluir uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para evitar la pérdida de proteínas sobre las superficies de los viales, etc. Los métodos de formulación son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19ª ed., 1995. Las dosis terapéuticas estarán, en general, en el intervalo de 0,1 a 100 \mug/kg de peso del paciente diarios, preferiblemente de 0,5-20 \mug/kg diarios, determinando el médico la dosis exacta según estándares aceptados, tomando en consideración la naturaleza y la gravedad del trastorno que se va a tratar, los rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de los expertos en la técnica. Las proteínas pueden administrarse para un tratamiento agudo, a lo largo de una semana o menos, a menudo a lo largo de un periodo de uno a tres días, o pueden utilizarse en un tratamiento crónico, a lo largo de varios meses o años. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de IL-21 es una cantidad suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en la función hematopoyética o inmunológica.

La invención se ilustra más a fondo mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de una quimera de polipéptido receptor de MPL-IL-21: dominios MPL extracelular y TM fusionados con el dominio de señalización intracelular del receptor de IL-21

Los dominios extracelular y transmembrana del receptor de MPL murino se aislaron a partir de un plásmido que contenía el receptor de MPL murino (plásmido PHZ1/MPL) utilizando PCR con los cebadores ZC17.212 (SEQ ID NO:11) y ZC19.914 (SEQ ID NO:12). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 45ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min; seguidos de 72ºC durante 10 min; después una inmersión a 10ºC. El producto de PCR se ensayó sobre agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), y el fragmento del receptor de MPL de aproximadamente 1,5 kb se aisló utilizando el kit de extracción de gel Qiaquick^{TM} (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

Los dominios intracelulares del receptor de IL-21 humano se aislaron a partir de un plásmido que contenía ADNc del receptor de IL-21 utilizando PCR con los cebadores ZC19.913 (SEQ ID NO:13) y ZC20.097 (SEQ ID NO:14). La secuencia polinucleotídica correspondiente a la secuencia codificadora del receptor de IL-21 se muestra en SEQ ID NO:15, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO:16. Las condiciones de reacción fueron las mismas que anteriormente. El producto de PCR se ensayó sobre agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Boehringer Mannheim) y el fragmento del receptor de IL-21 de aproximadamente 900 pb se aisló utilizando el kit de extracción de gel Qiaquick según las instrucciones del fabricante.

Cada uno de los fragmentos aislados descritos anteriormente se mezclaron con una proporción volumétrica 1:1 y se emplearon en una reacción de PCR que utiliza ZC17.212 (SEQ ID NO:11) y ZC20.097 (SEQ ID NO:14) para crear una quimera de receptor de MPL-IL-21. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min; seguidos de 72ºC durante 10 min; después una inmersión a 10ºC. El producto de PCR completo se ensayó sobre agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Boehringer Mannheim) y el fragmento de la quimera de receptor de MPL-IL-21 de aproximadamente 2,4 kb se aisló utilizando el kit de extracción de gel Qiaquick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de la quimera de receptor de MPL-IL-21 se digirió con EcoRI (BRL) y XbaI (Boerhinger Mannheim) según las instrucciones del fabricante. El digerido completo se ensayó sobre agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Boehringer Mannheim) y la quimera de receptor de MPL-IL-21 rota se aisló utilizando el kit de extracción de gel Qiaquick^{TM} (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La quimera de receptor de MPL-IL-21 rota resultante se insertó en un vector de expresión como se describe a continuación.

El vector de expresión pZP-5N receptor se digirió con EcoRI (BRL) e HindIII (BRL) según las instrucciones del fabricante y se purificó en gel como se describió anteriormente. Este fragmento de vector se combinó con la quimera de receptor de MPL-IL-21 rota por EcoRI y XbaI aislada anteriormente y un fragmento conector XbaI/HindIII en una reacción de acoplamiento. El acoplamiento se realizó utilizando ligasa T4 (BRL) a 15ºC durante la noche. Una muestra del acoplamiento se electroporó en células E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX^{TM} (25 \muF, 200 \Omega, 2,3 V). Los transformantes se colocaron en placas de LB+ampicilina y se seleccionaron colonias individuales mediante PCR para comprobar si tenían la quimera de receptor de MPL-IL-21 utilizando ZC17.212 (SEQ ID NO:11) y ZC20.097 (SEQ ID NO:14) con la condiciones de PCR descritas anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Proliferación basada en la quimera de receptor de MPL-IL-21 en un ensayo de BaF3 utilizando azul Alamar A. Construcción de células BaF3 que expresan la quimera de receptor de MPL-IL-21

La BaF3, una línea celular prelinfoide dependiente de interleuquina-3 (IL-3) derivada de médula ósea murina (Palacios y Steinmetz, Cell, 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135, 1986) se mantuvo en medio completo (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado con suero de ternera fetal inactivado con calor al 10%, IL-3 murina (mIL-3) 2 ng/ml (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1^{TM} 2 mM (Gibco BRL), piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) y antibióticos PSN (GIBCO BRL). Antes de la electroporación se preparó el ADN del plásmido receptor pZP-5N/MPL-IL-21 (ejemplo 1) y se purificó utilizando un kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las células BaF3 para la electroporación se lavaron una vez en medio RPMI y después se resuspendieron en medio RPMI con una densidad celular de 10^{7} células/ml. Se mezcló 1 ml de células BaF3 resuspendidas con 30 \mug del ADN del plásmido receptor pZP-5N/MPL-IL-21 y se trasladaron a cámaras de electroporación desechables separadas (GIBCO BRL). Tras 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células se sometieron a dos choques en serie (800 IFad/300 V; 1189 IFad/300 V) administrados por un aparato de electroporación (CELL-PORATOR^{TM}; GIBCO BRL). Después de un tiempo de recuperación de 5 minutos, las células electroporadas se trasladaron a 50 ml de medio completo y se colocaron en un incubador durante 15-24 horas (37ºC, CO_{2} al 5%). Las células entonces se centrifugaron y se resuspendieron en 50 ml de medio completo que contenía la selección Geneticin^{TM} (Gibco) (G418 500 \mug/ml) en un matraz T-162 para aislar el grupo de resistentes a G418. Los grupos de células BaF3 transfectadas, en lo sucesivo denominadas células BaF3/receptor de MPL-IL-21, se ensayaron para su capacidad de señalización como se describe a continuación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Construcción de un vector de expresión que expresa el receptor de IL-21 de longitud completa

El receptor de IL-21 entero se aisló a partir del plásmido que contenía el ADNc del receptor zalfa11 (SEQ ID NO:15) utilizando PCR con los cebadores ZC19.905 (SEQ ID NO:19) y ZC19.906 (SEQ ID NO:20). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min; seguidos de 72ºC durante 10 min; después una inmersión a 10ºC. El producto de PCR se ensayó sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Boehringer Mannheim) y el ADNc de zalfa11 de aproximadamente 1,5 kb se aisló utilizando el kit de extracción de gel Qiaquick^{TM} (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

El ADNc del receptor de IL-21 purificado se digirió con BamHI (Boerhinger Mannheim) y EcoRI (BRL) según las instrucciones del fabricante. El digerido completo se ensayó sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Boerhinger Mannheim) y el fragmento del receptor de IL-21 roto se purificó utilizando el kit de extracción en gel Qiaquick^{TM} según las instrucciones del fabricante. El fragmento del receptor de IL-21 roto resultante se insertó en un vector de expresión como se describe a continuación.

El vector de expresión pZP-5N receptor se digirió con BamHI (Boerhinger Mannheim) y EcoRI (BRL) según las instrucciones del fabricante y se purificó en gel como se describió anteriormente. Este fragmento de vector se combinó con el fragmento del receptor de IL-21 roto por BamHI y EcoRI aislado anteriormente en una reacción de acoplamiento que emplea ligasa T4 (BRL). El acoplamiento se incubó a 15ºC durante la noche. Una muestra del acoplamiento se electroporó en células E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX^{TM} (25 \muF, 200 \Omega, 2,3 V). Los transformantes se colocaron en placas de LB+ampicilina y se seleccionaron colonias individuales mediante PCR para comprobar si tenían la secuencia del receptor de IL-21 utilizando ZC19.905 (SEQ ID NO:19) y ZC19.906 (SEQ ID NO:20) con la condiciones de PCR descritas anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 La IL-21 activa el receptor de IL-21 humano en un ensayo de luciferasa A. Construcción de la línea celular BaF3/KZ134/receptor de IL-21

El plásmido KZ134 se construyo con los oligonucleótidos complementarios ZC12.749 (SEQ ID NO:17) y ZC12.
748 (SEQ ID NO:18) que contienen elementos de unión del factor de transcripción STAT procedentes de 4 genes. Un elemento inducible c-fos Sis modificado (m67SIE o hSIE) (Sadowski, H. et al., Science, 261:1739-1744, 1993), el p21 SIE1 del gen p21 WAF1 (Chin, Y. et al., Science, 272:719-722, 1996), el elemento de respuesta de glándulas mamarias del gen de \beta-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol., 11:3745-3755, 1991) y un elemento inducible STAT del gen Fcg R1 (Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:3041-3045, 1995). Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles Asp718-XhoI y se acoplaron utilizando métodos convencionales en un vector receptor indicador de luciferasa de luciérnaga con un promotor c-fos (Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem., 273:6229-6232, 1998) digerido con las mismas enzimas y que contenía un marcador seleccionable de neomicina. El plásmido KZ134 se utilizó para transfectar de forma estable células BaF3 utilizando métodos de trasnfección y de selección convencionales, para fabricar la línea celular BaF3/KZ134.

Se construyó una línea celular indicadora BaF3/KZ134 estable, que expresa el receptor de IL-21 de longitud completa, como en el ejemplo 2 utilizando aproximadamente 30 \mug del vector de expresión del receptor de IL-21 descrito en el ejemplo 3. Los clones se diluyeron, se colocaron en placas y se seleccionaron utilizando técnicas convencionales. Los clones se seleccionaron mediante un ensayo de luciferasa utilizando el medio condicionado con IL-21 humana como inductor. Se seleccionaron los clones con la mayor respuesta a luciferasa (mediante luciferasa STAT) y el efecto de fondo menor. Se seleccionó una línea celular transfectante estable. La línea celular se denominó BaF3/KZ134/receptor de IL-21.

B. La IL-21 humana y de ratón activa el receptor de IL-21 humano en el ensayo de luciferasa con BaF3/KZ134/re- ceptor de IL-21

Las células BaF3/KZ134/receptor de IL-21 se centrifugaron y se lavaron en medio exento de IL-3 de ratón. Las células se centrifugaron y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de IL-3 de ratón. Las células entonces se contaron en un hemacitómetro. Las células se colocaron en un formato de 96 pocillos a aproximadamente 30.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo utilizando medio exento de IL-3 de ratón. El mismo procedimiento se empleó para células BaF3/KZ134 no transfectadas para utilizarlas como control en el posterior ensayo.

La activación STAT de las células BaF3/KZ134/receptor de IL-21 se evaluó empleando medio condicionado procedente de (1) células BHK570 transfectadas con el receptor de IL-21 humano, o (2) células BHK570 transfectadas con el receptor de IL-21 de ratón, o (4) medio exento de mIL-3 para medir la respuesta del control sólo con medio. El medio condicionado se diluyó con medio RPMI exento de mIL-3 hasta concentraciones del 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% y 0,375%. Se añadieron 100 \mul de medio condicionado diluido a las células BaF3/KZ134/receptor de IL-21. El ensayo que emplea el medio condicionado se realizó en paralelo sobre células BaF3/KZ134 sin transfectar como control. El volumen de ensayo total fue de 200 \mul. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 24 horas, en cuyo momento las células se sedimentaron mediante centrifugación a 2000 rpm durante 10 min, y el medio se aspiró y se añadieron 25 \mul de tampón de lisis (Promega). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, las placas se midieron para la activación de la construcción del indicador STAT mediante su lectura en un luminómetro (Labsystems Luminoskan, modelo RS) que añade 40 \mul de sustranto de ensayo de luciferasa (Promega) a una integración de cinco segundos.

Los resultados también confirmaron la respuesta del indicador STAT de las células BaF3/KZ134/receptor de IL-21 a la IL-21 de ratón. La respuesta, tal como se midió, era aproximadamente 50 veces mayor que la del control sólo con medio a una concentración del 50%. No se produjo la activación STAT en respuesta a la IL-21 humana en células control BaF3/KZ134 sin transfectar, demostrando que la respuesta está mediada a través del receptor de IL-21.

Los resultados también confirman la respuesta del indicador STAT de las células BaF3/KZ134/receptor de IL-21 a la IL-21 de ratón. La respuesta, tal como se midió, era aproximadamente 40 veces mayor que la del control sólo con medio a una concentración del 50%. Además, la activación STAT en respuesta a la IL-21 de ratón fue evidente (aproximadamente 5 veces más) en las células control BaF/KZ134 sin transfectar, lo cual sugiere que las células BaF3 murinas pueden tener un receptor de ratón endógeno.

\newpage

Ejemplo 5 Construcción de un vector de expresión, expresión y purificación de IL-21 humana y murina sin marcar procedente de baculovirus A. Construcción para expresar la IL-21 humana en baculovirus

Se preparó un vector de expresión, pzalfa11L, para que expresase polipéptidos de IL-21 humana en células de insecto. Un fragmento de 517 bp que contenía la secuencia de la IL-1 humana y sitios de restricción BamHI y XhoI codificados en los extremos 5' y 3', respectivamente, se generó mediante amplificación con PCR a partir de un plásmido que contenía ADNc de IL-21 humana utilizando los cebadores ZC23.444 (SEQ ID NO:21) y ZC23.445 (SEQ ID NO:22). La condiciones de reacción de la PCR fueron las siguientes: un ciclo de 94ºC durante 4 min, seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 min; seguido de una inmersión a 4ºC. El fragmento se visualizó mediante una electroforesis en gel (SeaPlaque al 1%/NuSieve al 1%). La banda se retiró, se diluyó hasta agarosa al 0,5% con MgCl_{2} 2 mM, se fundió a 65ºC, se digirió con BamHI y XhoI (Boerhinger Mannheim) y se acopló en un vector de expresión de baculovirus digerido con BamHI/XhoI, pZBV3L. El vector pZBV3L es una modificación del vector de expresión pFastBac1^{TM} (Life Technologies), en el que se ha retirado el promotor de polihedron y se ha sustituido por el promotor de la proteína básica de activación tardía. Se acoplaron durante la noche a 16ºC aproximadamente 14 nanogramos del inserto de IL-21 digerido por restricción y aproximadamente 40 ng del correspondiente vector.

La mezcla de acoplamiento se diluyó en 3 veces en TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y EDTA 1 mM), y aproximadamente 4 fmol de la mezcla de acoplamiento diluida se transformaron en células competentes DH5\alpha Library Efficiency (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante mediante choque térmico durante 45 segundos en un baño de agua a 42ºC. El ADN transformado y las células se diluyeron con 450 \mul de medio SOC (triptona Bacto^{TM} al 2%, extracto de levadura Bacto^{TM} al 0,5%, 10 ml de NaCl 1 M, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, y glucosa 20 mM) y se colocaron en placas LB que contenían ampicilina 100 \mug/ml. Los clones se analizaron mediante digestiones de restricción y 1 \mul del clon positivo se transformó en 20 \mul células competentes DH10Bac Max Efficiency (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante mediante choque térmico como se describió anteriormente. Las células transformadas entonces se diluyeron en 980 \mul de medio SOC (triptona Bacto^{TM} al 2%, extracto de levadura Bacto^{TM} al 0,5%, 10 ml de NaCl 1 M, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, y glucosa 20 mM) cultivadas en un incubador en agitación a 37ºC durante cuatro horas y colocadas en placas de agar Luria que contenían kanamicina 50 \mug/ml, gentamicina 7 \mug/ml (Life Technologies), tetraciclina 10 \mug/ml, IPTG (Pharmacia Biotech) y Bluo-Gal (Life Technologies). Las células cultivadas se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Se empleó una selección por color para identificar las células que tenían el inserto donante que codifica la IL-21 humana incorporado en el plásmido (denominado "bácmido"). Estas colonias, de color blanco, se recogieron para su análisis. Se aisló el ADN del bácmido de IL-21 humana a partir de las colonias positivas utilizando el sistema QiaVac Miniprep8 (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Los clones se seleccionaron para el inserto correcto mediante la amplificación del ADN empleando cebadores para el elemento transponible en el bácmido mediante PCR, empleando los cebadores ZC447 (SEQ ID NO:23) y ZC976 (SEQ ID NO:24). Las condiciones de reacción de PCR fueron las siguientes: 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 5 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 min; seguido de una inmersión a 4ºC. El producto de PCR se ensayó en un gel de agarosa al 1% para comprobar el tamaño del inserto. Los clones que tenían el inserto correcto se utilizaron para transfectar células de Spodoptera frugiperda (Sf9).

B. Expresión y generación de material para la purificación de la IL-21 humana a partir de baculovirus

Se sembraron células Sf9 a 5 x 10^{6} células por placa de 35 mm y se dejó que prendiesen durante 1 hora a 27ºC. Se diluyeron 5 microlitros de ADN del bácmido de IL-21 humana (anterior) con 100 \mul de Sf-900 II SFM (Life Technologies). Se diluyeron 6 \mul del reactivo CellFECTIN (Life Technologies) con 100 \mul de Sf-900 II SFM. El ADN del bácmido y las disoluciones de lípidos se mezclaron con suavidad y se incubaron durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. El medio de una placa de células se aspiró, las células se lavaron 1x con 2 ml de medio fresco Sf-900 II SFM. Se añadieron 800 microlitros de Sf-900 II SFM a la mezcla de lípidos-ADN. El medio de lavado se aspró y la mezcla de ADN-lípidos se añadió a las células. Las células se incubaron a 27ºC durante 4-5 horas. La mezcla de ADN-lípidos se aspiró y se añadieron 2 ml de medio Sf-900 II a cada placa. Las placas se incubaron a 27ºC con humedad al 90% durante 96 horas, tras lo cual se recolectaron los virus.

Para la amplificación primaria se cultivaron células Sf9 en 50 ml de Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 125 ml hasta una densidad aproximada de 0,41-0,52 x 10^{5} células/ml. Entonces se infectaron con 150 \mul de la cepa del virus anterior y se incubaron a 27ºC durante 3 días, tras lo cual el virus se recolectó según métodos convencionales conocidos en la técnica. Una muestra de 500 \mul que se sometió a un ensayo BaF3 de actividad mostró que era biológicamente activa.

Para la amplificación secundaria se cultivaron células Sf9 en 1 l de Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 2800 ml hasta una densidad aproximada de 0,5 x 10^{5} células/ml. Se infectaron con 500 ul de la cepa del virus primario anterior y se incubaron a 27ºC durante 4 días, tras lo cual el virus se recolectó según métodos convencionales conocidos en la técnica. El virus se valoró y se cultivó a gran escala para la purificación de la IL-21 humana producida en baculovirus (huzalfa11L-Bv).

C. Purificación a gran escala de IL-21 humana/murina expresada en baculovirus

A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se realizaron a 4ºC. Se empleó el siguiente procedimiento para purificar la IL-21 humana (huzalfa11L-Bv) a partir de medio condicionado con BV. El medio condicionado (CM) se esterilizó mediante filtración a través de filtros de 0,45 y 0,22 micrones, después se tamponó con MES 0,01 M (Fluka BioChemika, Suiza) y se ajustó el pH a 6,0. El CM entonces se cargó sobre una columna POROS 50 HS y se ensayó, las fracciones se recogieron y se analizaron.

Se reunieron las fracciones de los picos anteriores, se ensayaron concentradas en una columna de exclusión molecular de alta resolución y se analizaron.

Las fracciones de interés procedentes de la columna de exclusión molecular se reunieron y se concentraron con concentradores de rotación centrífuga Millipore de valor de corte de peso molecular de 5 kD hasta un volumen mínimo. El producto final entonces se analizó mediante SDS-PAGE con Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), análisis de la transferencia inmunológica Western, secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, y CB (Pierce, Rockford, Illinois) para determinar la pureza y la concentración de proteínas como se describe en el ejemplo 29A. La masa de proteínas se conservó a -80ºC.

D. Purificación a pequeña escala (<2 mg) de IL-21 humana/murina expresada en baculovirus

A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se realizaron a 4ºC. Se empleó el siguiente procedimiento para purificar <2 mg de IL-21 humana o murina a partir de medio condicionado con BV. El CM se filtró, se tamponó y el pH se ajustó como en el ejemplo 30C. El CM entonces se cargó, se eluyó y la cromatografía POROS 50 HS se analizó como en el ejemplo 30C.

Las fracciones se reunieron y después se concentraron mediante una diafiltración en un concentrador de células agitado sobre una membrana YM10 (valor de corte de peso molecular 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) hasta un volumen nominal (20-30 ml). El pH se ajustó a 7,0, después la muestra se cargó sobre una columna Poros AL de 0,8 ml que tiene aproximadamente 3 mg de receptor soluble zalfa11CFLAG, o sobre una columna con aproximadamente 10 mg de receptor soluble de fusión IL-21-Fc4 inmovilizado sobre la resina a 1 ml/min sobre un BioCad SPRINT. La columna entonces se lavó con al menos 20 CV de NaCl 0,3 M/PBS (Gibco BRL)/MES 0,01 M a 10 ml/min. La columna entonces se eluyó rápidamente con una inyección de 600 \mul de glicina 0,1 M (ácido aminoacético; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA), pH 2,5, con un caudal de 10 ml/min con PBS en un BioCAD SPRINT. Se recogieron fracciones de 1 ml durante 6 segundos cada una e inmediatemente se neutralizó el pH con 55 \mul de TRIS 2 M (Tris(hidroximetil)aminometano, EM Science, Gibbstown, NJ), pH 8,8. Se controló la absorbancia a 280 y 215 nM a lo largo de toda la cromatografía. Las fracciones se analizaron como anteriormente.

Los fracciones de los picos se reunieron y después se concentraron mediante una diafiltración en un concentrador de células agitado sobre una membrana YM10 (valor de corte de peso molecular 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) hasta 1-2 ml. Después la muestra se cargó sobre una columna de exclusión molecular de alta resolución Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) apropiada, equilibrada en PBS (Gibco BRL) a un caudal óptimo; las fracciones se recogieron a lo largo de toda la cromatografía y se controló la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones se analizaron como se indicó anteriormente.

Las fracciones de interés se reunieron y se concentraron con concentradores de rotación centrífuga Millipore de valor de corte de peso molecular de 5 kD hasta un volumen nomimal. El producto final entonces se analizó mediante SDS-PAGE con Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), análisis de la transferencia inmunológica Western, secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, y BCA (Pierce, Rockford, Illinois) para determinar la pureza y la concentración de proteínas. La masa de proteínas se conservó como se describió anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Proliferación dependiente de IL-21 de células B estimuladas con anti-CD40 0 anti-IgM A. Purificación de células B humanas

Un vial que contenía 1 x 10^{8} células mononuclares de sangre periférica (PBMC) humanas sometidas a aféresis se descongeló con rapidez en un baño de agua a 37ºC y se resuspendieron en 25 ml de medio de células B (medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), suero bovino fetal inactivado con calor al 10%, L-glutamina al 5%, penicilina/estreptomicina al 5%) (Gibco BRL)) en un tubo de 50 ml (Falcon VWR, Seattle, WA). Las células se ensayaron para su viabilidad utilizando azul de tripano (Gibco BRL). Se colocaron 10 mililitros de Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) bajo la suspensión celular y se centrifugó durante 30 minutos a 1800 rpm y se dejó que se detuviese con el freno sin accionar. La interfase entonces se retiró y se trasladó a un tubo Falcon de 50 ml nuevo, se llevó hasta un volumen final de 40 ml con PBS y se centrifugó durante 10 minutos a 1200 rpm con el freno accionado. De nuevo se ensayó la viabilidad de las células aisladas utilizando azul de tripano. Como alternativa, sangre human recién extraída se diluyó 1:1 con PBS (Gibco BRL) y se colocó sobre Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia), se centrifugó y se lavó con se indicó anteriormente. Las células aisladas de la fuente fresca o congelada produjeron resultados equivalentes.

Se purificaron células B a partir de células de sangre periférica suspendidas en Ficoll de donantes humanos normales (anteriormente) con esferas magnéticas anti-CD19 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes se controló mediante análisis citométricos de flujo con Ab anti-CD22 FITC (Pharmingen, San Diego, CA). Las preparaciones de células B fueron, de forma típica, >90% puras.

B. Purificación de células B murinas

Se preparó una suspensión de esplenocitos murinos separando los bazos de ratones adultos C57B1/6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con agujas dobladas en medio de células B. Las RBC se retiraron mediante lisis hipotónica. Se retiraron las células CD43-positivas con esferas magnéticas CD43 (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes se controló mediante análisis citométricos de flujo con Ab anti-CD45R FITC (Pharmingen). Las preparaciones de células B fueron, de forma típica, >90% puras.

C. Proliferación de células B estimuladas con anti-CD40 en presencia de IL-21 humana o murina

Células B de origen humano o murino se resuspendieron a una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml en medio de células B y se colocaron en placas a 100 \mul/pocillo en una placa con fondo en forma de U de 96 pocillos (Falcon, VWR) que contenía diversas condiciones de estimulación para conseguir que el volumen final fuese de 200 \mul/pocillo. Para la estimulación anti-CD40 se suplementaron cultivos humanos con anti-CD40 humano 1 \mug/ml (Genzyme, Cambridge, MA) y los cultivos de ratón se suplementaron con anti-CD40 murino 1 \mug/ml (Serotec, Reino Unido). Se añadió IL-21 humana o murina a diluciones que varían de 1 pg/ml-100 ng/ml. La especificidad del efecto de la IL-21 se confirmó mediante la inhibición de IL-21 con IL-21 CEE humana soluble 25 mg/ml. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Las células entonces se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado durante 120 horas (humanas) o 72 horas (de ratón). Dieciséis hores antes de la recolección se añadió ^{3}H-timidina 1 \muCi (Amersham, Piscataway, NJ) a todos los pocillos para evaluar si las células B habían proliferado. Las células se recolectaron hacia una placa de filtro de 96 pocillos (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) utilizando un recolector de células (Packard) y se recolectaron según las instrucciones del fabricante. Las placas se secaron a 55ºC durante 20-30 minutos y el fondo de los pocillos se selló con un sellador de placas opaco. A cada pocillo se le añadieron 0,25 ml de fluido de centelleo (Microscint-O, Packard) y la placa se leyó utilizando un contador de centelleo de microplacas TopCount (Packard).

La incubación con IL-21 a unas concentraciones de 3 ng/ml o más potenció la proliferación inducida por anti-CD40 soluble de una manera dependiente de la dosis en células B murinas y humanas en tanto como 30 veces más. Las células B murinas y humanas respondían igual de bien a su respectiva especie de IL-21. En ambas especies, la estimulación era específica de IL-21, puesto que fue revertida por la presencia del receptor soluble de IL-21 en el cultivo.

D. Proliferación de células B estimuladas con anti-IgM en presencia de IL-21 humana o murina

Células B de origen humano o de ratón, como se describieron anteriormente, se colocaron en placas como se describió anteriormente. Para la estimulación con anti-IgM de células humanas, las placas se prerrevistieron durante la noche con F(ab')_{2} de Ab anti-IgM humana 10 mg/ml (Southern Biotech Associates, Birmingham, Alabama) y se lavaron con medio estéril justo antes de su uso. Los cultivos se suplementaron con hu rIL-4 0-10 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN). Para la estimulación con anti-IgM de células murinas se añadió anti-IgM soluble (Biosource, Camarillo, CA) a los cultivos a 10 mg/ml. A cada una de las anteriores condiciones de anti-IgM/IL-4 se le añadió IL-21 humana o murina a diluciones que varían de 1 pg/ml-100 ng/ml, como se describió anteriormente. La especificidad del efecto de la IL-21 se confirmó mediante la inhibición con el receptor soluble de IL-21 humano. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Las células se incubaron, se marcaron con ^{3}H-timidina, se recolectaron y se analizaron.

La incubación con IL-21 a unas concentraciones de 0,3 ng/ml o más inhibió la proliferación inducida por anti-IgM insoluble (de ratón) o anti-IgM e IL-14 (humana) de una manera dependiente de la dosis. Esta inhibición era específica de IL-21, puesto que fue revertida por la presencia del receptor soluble de IL-21 en el cultivo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Estudio de la unión de IL-21 humana marcada con ^{125}I en líneas celulares

Se marcaron 25 microgramos de IL-21 humana purificada con ^{125}I 2 mCi utilizando IODO-BEADS® (Pierce, Rockford, Illinois) según las instrucciones del fabricante. Esta proteína marcada se empleó para evaluar la unión de IL-21 humana a células Raji humanas (ATCC nº CCL-86) utilizando la unión a células BaF3 murinas de tipo salvaje y células BaF3 transfectadas con el receptor de IL-21 (células BaF3/hIL-21) como controles. Se espera una unión de IL-21 a las células BaF3/hIL-21 (control positivo), mientras que no se espera unión a las células BaF3 de tipo salvaje (control negativo), basándose en un ensayo de proliferación. Aproximadamente 5 x 10^{5} células Raji/pocillo, 1 x 10^{6} células BaF3/hIL-21 y 1 x 10^{6} células BaF3/pocillo se colocaron en placas de 96 pocillos. Se añadieron 10 ng/ml de IL-21 humana marcada por duplicado a los pocillos, con una dilución en serie de competidor de IL-21 humana sin marcar añadido desde un exceso en 250 veces molar en diluciones 1:4 hasta un exceso en 0,061 veces molar. Cada punto se ensayó por duplicado. Después de haber añadido la IL-21 humana marcada a los pocillos se dejó en incubación a 4ºC durante 2 h para permitir la unión de IL-21 a las células. Las células entonces se lavaron 3x en tampón de unión (RPMI-1710 (JRH Bioscience) con BSA al 1% (Sigma)), y se contaron en un contador gamma COBRA II AUTO-GAMMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT).

La unión de la IL-21 marcada a las células resultó evidente en las células Raji y en las células BaF3/receptor de hIL-21. Además, para las células Raji, una media de un exceso en 250 molar de IL-21 sin marcar disminuyó la unión en 3 veces en presencia de un competidor no específico no marcado (gamma-interferón de R&D Systems, Minneapolis, MN) y en 3,7 veces con relación a un no competidor. Se observó competencia de una manera dependiente de la dosis para el competidor no marcado específico, la IL-21 humana. Por tanto, la unión de IL-21 a células Raji fue específica. De forma similar, para células BaF3/receptor de IL-21 de control positivo, el exceso en 250 veces molar de IL-21 sin marcar disminuyó la unión en 2 veces con relación al competidor no específico y en 3,06 veces con relación al no competidor. Por tanto, la unión de IL-21 a células BaF3/receptor de IL-12 también fue específica. No se observó competencia de unión con las células BaF3 de tipo salvaje. Por tanto, se demostró que la IL-21 se unía específicamente a células Raji y a células BaF3/hIL-21, pero no a células BaF3 de control negativo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Expresión del receptor de IL-21 sobre células sanguíneas humanas A. Preparación y cultivo de células de sangre periférica humanas

Sangre human recién extraída se diluyó 1:1 con PBS (GIBCO BRL) y se colocó sobre Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ), se centrifugó durante 30 minutos a 1800 rpm y se dejó que se detuviese con el freno sin accionar. La capa de la interfase se retiró y se trasladó a un tubo Falcon de 50 ml nuevo (Falcon, VWR, Seattle, WA), se llevó hasta un volumen final de 40 ml con PBS y se centrifugó durante 10 minutos a 1200 rpm con el freno accionado. Se ensayó la viabilidad de las células aisladas utilizando azul de tripano (GIBCO BRL) y las células se resuspendieron a una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml de medio celular (medio RPMI 1640, suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, L-glutamina al 5%, penicilina/estreptomicina al 5%) (GIBCO BRL).

Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos (Falcon, VWR) durante 0, 4 ó 24 horas con una diversidad de estímulos diferentes descritos a continuación. La estimulación con anti-IgM, anti-CD40 y anti-CD3 se realizó como en el ejemplo 44 y el ejemplo 42. Se añadió acetato miristato de forbol (PMA) e ionomicina (Sigma, St. Louis, MO) (ejemplo 5C) a los pocillos apropiados a 10 ng/ml y 0,5 mg/ml, respectivamente. Las células se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado durante diversos intervalos de tiempo.

B. Tinción y análisis de anticuerpos

Las células se recolectaron de las placas, se lavaron y se resuspendieron en medio de tinción enfriado en hielo (HBSS, suero bovino fetal al 1%, azida de sodio al 0,1%) a una concentración de aproximadamente 10 millones de células por mililitro. Se logró el bloqueo de receptor Fc y la unión no específica de los anticuerpos a las células añadiendo suero de cabra normal al 10% (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) y suero humano normal al 10% (Ultraserum, Gemini) a la suspensión celular. Se mezclaron partes alícuotas de las suspensiones celulares con un anticuerpo monoclonal marcado con FITC contra uno de los marcadores de linaje CD3, CD19 o CD14 (PharMingen, La Jolla, CA) y un anticuerpo monoclonal biotinilado contra el receptor de IL-21 humano. Se determinó la especificidad de la tinción mediante competencia utilizando el receptor soluble de IL-21 CEE en un exceso en 10 veces en masa. Después de una incubación sobre hielo durante 60 minutos, las células se lavaron dos veces con medio de tinción enfriado en hielo y se resuspendieron en 50 ml de medio de tinción que contenía estreptavidina-PE (Caltag, Burlingame, CA). Después de una incubación durante 30 minutos sobre hielo, las células se lavaron dos veces con tampón de lavado enfriado en hielo (PBS, suero bovino fetal al 1%, azida de sodio al 0,1%) y se resuspendieron en tampón de lavado que contenía 7-AAD 1 mg/ml (Molecular Probes, Eugene, OR) como marcador de viabilidad. Los datos de flujo se adquirieron de células vivas utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (BD Immunocytometry Systems, San José, CA). La adquisición y el análisis se realizarn utilizando el programa informático CellQuest (BD Immunocytometry Systems).

Los resultados de la tinción con el anticuerpo anti-IL-21 demostraron que el receptor de IL-21 humano se expresa sobre células de sangre periférica humana que expresan CD3, CD19 o CD14. La tinción de las células CD3 y CD19 fue específica, según se evidencia por la competencia absoluta con el receptor soluble de IL-21. La tinción de las células CD14 demostró alguna especificidad por el ligando, según se evidencia por la competencia parcial con el receptor soluble. La activación de células T con anti-CD3 o de células B con anti-CD40 produjo un aumento del nivel del receptor de IL-21 en la superficie celular a las 24 horas. No se observó aumento en el nivel de expresión del receptor de IL-21 a las 4 horas con ningún estímulo en cualquiera de las poblaciones celulares. El tratamiento de las células con la IL-21 produjo la disminución de la tinción del receptor de IL-21 en células CD3-positivas y CD19-positivas pero no en células CD14-positivas a las 4 y 24 horas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Preparación de antagonistas de IL-21 Construcción de mutantes de IL-21

Se fabricó un total de 7 construcciones (de las cuales se muestran 3 en la presente) utilizando un kit de mutagénesis Stratagene QuikChange (nº de catálogo 200518). Se emplearon 100 ng de molde con 125 ng de cada uno de los oligonucleótidos sentido y antisentido. Se realizaron 25 ciclos de cada uno de 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, y 68ºC durante 25 min para cada reacción individual. Se emplearon las siguientes parejas de oligonucleótido y molde.

Se incorporaron mutaciones en la secuencia codificadora de IL-21 incluida en el vector de expresión de baculovirus BVpIL-21 utilizando mutagénesis dirigida específica de sitio. Se reunieron 100 ng de molde con 125 ng de cada uno de los oligonucleótidos sentido y antisentido como se muestra en la tabla a continuación. Se añadió ADN polimerasa térmicamente estable y se sintetizó el ADN que contenía las mutaciones deseadas durante 25 ciclos térmicos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto, y 68ºC durante 25 minutos.

5

Tras la síntesis se retiró el ADN no mutado de origen mediante digestión con la enzima de restricción DPNI, y el ADN mutado se transformó en DH10B electrocompetentes (Life Technologies). Las células transformadas se colocaron en placas de LB para la selección que contenían ampicilina 100 \mug/ml. Los clones se analizaron mediante secuenciación de ADN, y se transformó 1 \mul del clon positivo en 20 \mul de células competentes DH10Bac Max Efficiency (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante.

Los mutantes resultantes se denominaron Q153D;I156D como se muestra en SEQ ID NO:5 (secuencia de nucleótidos) y SEQ ID NO:6 (secuencia de aminoácidos), e I156ST;Q153D como se muestra en SEQ ID NO:3 (secuencia de nucleótidos) y SEQ ID NO:4 (secuencia de aminoácidos).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 A. Identificación de la actividad antagonista en mutantes de IL-21

Los clones mutantes de IL-21 se expresaron en baculovirus como se describió en el ejemplo 5. Se cultivaron células de insecto que expresaban la IL-21 humana de tipo salvaje y cada uno de los mutantes de hélice D en condiciones exentas de suero. El medio de cultivo se recolectó y se determinó la concentración de la IL-21 o de la IL-21 mutante mediante análisis de la transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal anti-IL-21 de conejo, D1048, para la detección.

B. Estudios de unión de la IL-21 humana en líneas celulares

Cada proteína mutante se evaluó para su capacidad para inhibir la unión de ^{125}I-IL-21 a receptores expresados sobre la superficie de células BHK transfectadas con el receptor de IL-21 e IL-2R\gamma. Se determinó una IC_{50} para la inhibición de la unión de ^{125}I-IL-21 para cada proteína. La activación del receptor por cada proteína se expresa como una EC_{50} determinada por la capacidad para sostener el crecimiento de una línea celular BaF3 dependiente de IL-21 que expresa IL-21R\alpha e IL2R\gamma.

La IL-21 se yodó utilizando IODO-BEADS® (Pierce) según las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de unión de competencia se empleó ^{125}I-IL-21 250 pM aumentando las concentraciones de proteínas competidoras. Se incubaron células en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en 250 \mul de tampón de unión (RPMI 1640 (GIBCO-BRL), HEPES 20 mM, pH 7,4, BSA 1 mg/ml (Sigma)) que contenía ^{125}I-IL-21, con o sin inhibidores, durante 2 horas a 4ºC. El ligando sin unir se retiró mediante tres lavados con tampón de unión enfriado en hielo. Las células entonces se extrajeron con PBS, Triton-X100 al 1% (Sigma) y los extractos se contaron en un contador gamma (Packard). El análisis se realizó utilizando GraphPad PRISM® (programa informático GraphPad, Inc., San Diego, CA).

Células BaF3 transfectadas que expresan el receptor de IL-21 humano se lavaron 3x con RPMI/FBS al 10% para eliminar las cantidades traza de IL-3. Entonces las células BaF3 se colocan en placas de 96 pocillos a 7500 células/pocillo y se cultivan durante tres días en ausencia o en presencia de IL-21 o de mutantes de IL-21 a concentraciones que varían de 1 ng/ml a 1 \mug/ml. Después de tres días, los cultivos se ensayaron para detectar células viables utilizando azul Alamar (Alamar, Inc.) según las instrucciones del fabricante. Se calculan las EC50 para la IL-21 y para los mutantes de IL-21 utilizando GraphPad PRISM® (programa informático GraphPad, Inc.).

TABLA 6

6

A partir de lo anterior se apreciará que, aunque en la presente se han descrito realizaciones específicas de la invención con fines ilustrativos, pueden realizarse diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y del alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

<110> ZymoGenetics, Inc.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> ANTAGONISTAS DEL LIGANDO ZALFA11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 01-37PC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> documento 60/337.586

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 5 de noviembre de 2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 642

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47)...(532)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 444

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ligando zalfa11 Q153ST/I156D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(444)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ligando zalfa11 Q153ST/I156D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 489

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ligando zalfa11 Q153D/I156D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(489)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

12

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ligando zalfa11 Q153D/I156D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC17.212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaattcg aagccatgcc ctcttgggcc ctc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC19.914

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caatggatgg gtctttagca gcagtaggcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC19.913

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcctactgc tgctaaagac ccatccattg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC20.097

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatctagat tagctggcct ggggtccagg cgt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1614

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1614)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

19

\hskip1cm

20

\hskip1cm

21

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 538

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

23

\hskip1cm

24

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC12.749

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC12.748

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC19.905

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaggatccg tcagcatgcc gcgtggctgg gccgcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC19.906

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagaattct tagctggcct ggggtccagg cgt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC23.444

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccgggcgg atccatggat tccagtcct

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC23.445

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgccctcg agtcaggaat cttcacttcc gt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC447

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taacaatttc acacagg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC976

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgttgtaaaa cgacggcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC27.885

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacagatgc tgatgttaca tcttttggag aag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC27.884

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctccaaa agatgtaaca tcagcatctg tcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC37.198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctcgata agatggatca tcagcatctg tcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC37.199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacagatgc tgatgatcca tcttatcgag aag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC37.200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctcgata agatgtaaca tcagcatctg tcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico ZC37.203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacagatgc tgatgttaca tcttatcgag aag

\hfill

33

Claims

1. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:5.

2. Una molécula polinucleotídica aislada que codifica un polipéptido antagonista de IL-21 que comprende la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6.

3. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6.

4. Una proteína de fusión que comprende al menos dos polipéptidos, en la que al menos uno de los polipéptidos comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6, y una segunda secuencia polipeptídica.

5. Un vector de expresión que comprende la molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 1, un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está unido operablemente a la molécula polinucleotídica, y en el que la molécula polinucleotídica está unida operablemente al terminador de la transcripción.

6. Una célula hospedante recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5, en la que la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero y células vegetales.

7. Un método para producir un polipéptido según la reivindicación 3, comprendiendo dicho método la etapa de cultivar células hospedantes recombinantes que comprenden el vector de expresión de la reivindicación 5, y que producen el polipéptido.