ES2910969T3

ES2910969T3 - Muteínas de interleucina-21 y métodos de tratamiento

Info

Publication number: ES2910969T3
Application number: ES18759207T
Authority: ES
Inventors: Khaled Ali; Neeraj Agrawal; Gunasekaran Kannan; Ian Foltz; Zhulun Wang; Daren Bates; Marissa Mock; Shunseke Takenaka
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: LT3661954T; US20230381276A1; JOP20200020B1; ES2975221T3; BR122021015266B1; HRP20220404T1; TW202342501A; JP7531545B2; SI3661954T1; KR20220092652A; TW201920239A; KR20200035291A; JP2022116099A; MX2020001328A; PH12020500231A1; SG11202000821SA; CN118126157A; AU2018311079B2; IL272137B1; JOP20200020A1

Abstract

Un conjugado que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (AEQ ID NO.2), en la que "X" representa cualquier aminoácido, y en la que dicha secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-21 difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en al menos 1 aminoácido.

Description

DESCRIPCIÓN

Muteínas de interleucina-21 y métodos de tratamiento

ANTECEDENTES

El eje PD-1/PD-L1 está implicado en la supresión de las respuestas inmunitarias de las células T en el cáncer. Los antagonistas de esta ruta se han validado clínicamente a lo largo de un número de indicaciones de tumores sólidos. Nivolumab y pembrolizumab son dos inhibidores de este tipo que se dirigen a la ruta de PD-1, y cada uno ha sido aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos de América para el tratamiento del melanoma metastásico. Recientemente, los investigadores han estudiado el paradigma de la inhibición del punto de control en el contexto de otros tipos de tumores. Si bien se han logrado algunos avances, la terapia de inhibición del punto de control aún permanece a la sombra de otras opciones de tratamiento del cáncer.

Se están realizando estudios de inhibidores del punto de control en combinación con otros agentes, o se han completado recientemente. La combinación de nivolumab e ipilimumab, un anticuerpo bloqueador del receptor de CTLA-4, por ejemplo, se evaluó en un ensayo clínico de fase III en pacientes con melanoma irresecable en estadio III o IV. En este estudio, el porcentaje de pacientes que lograron una respuesta completa fue el más alto entre los que recibieron la combinación de nivolumab e ipilimumab, superando el resultado exhibido por los del grupo que recibió cualquiera de los dos fármacos solos. Actualmente también se están explorando otras combinaciones.

La interleucina-21 (IL-21) es una citocina pleiotrópica derivada de células T que regula la actividad de las células inmunitarias tanto innatas como adaptativas. IL-21 puede aumentar la supervivencia de las células T y la función efectora. Debido a que desempeña un papel clave en las respuestas antitumorales y antivirales, además de ejercer efectos importantes en las respuestas inflamatorias que conducen al desarrollo de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, la IL-21 ha sido una diana atractiva para varias terapias.

Sin embargo, el desarrollo de terapias basadas en IL-21 ha sido complejo. La investigación se ha visto complicada por estudios que muestran que potenciar, o de forma confusa, inhibir la acción de IL-21 conduce a un efecto terapéutico. Existen desafíos adicionales debido a la amplia expresión del receptor para IL-21 (IL-21 R). IL-21 R se expresa no solo en las células T, sino también en las células B, las células NK, y las células mieloides. En consecuencia, se debe tener cuidado para limitar la activación amplia de IL-21 en los leucocitos, y evitar el potencial de toxicidad. La restricción de la señalización de IL-21 debe ser equilibrada y selectiva. La activación de los efectos de IL-21 debe diseñarse para que se produzca en el momento y lugar correctos.

De hecho, se ha silenciado cualquier éxito, especialmente el éxito clínico con restos de IL-21 como monoterapia o en combinación con inhibidores del punto de control. De este modo, sigue existiendo la necesidad de modalidades de tratamiento que utilicen IL-21, incluyendo modalidades que combinen restos de IL-21 con inhibidores del punto de control. También sigue existiendo la necesidad de terapias con IL-21 combinadas con la inhibición del punto de control inmunitario.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un conjugado que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2),

en la que "X" representa cualquier aminoácido, y en el que dicha secuencia de aminoácidos de muteína de IL-21 difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en al menos 1 aminoácido. La presente invención proporciona además un kit que comprende dicho conjugado y un recipiente; una composición farmacéutica que comprende dicho conjugado y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable; y dicha composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesite. La invención se define adicionalmente en las reivindicaciones adjuntas.

SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN ADICIONAL

Se describen aquí muteínas de IL-21 que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que SEQ ID NO: 2 es

QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2), y X es cualquier aminoácido, y en la que la secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-21 difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en al menos 1 aminoácido.

De este modo, también se describen muteínas de IL-21 que comprenden solo una sustitución de aminoácido, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, que se proporciona aquí como SEQ ID NO: 1. La sustitución de aminoácido puede ubicarse en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

También se describen muteínas de IL-21 que comprenden solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en dos posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5, 9, 15, 70, 71,72, 73, y 76, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Las muteínas de IL-21 pueden unirse al receptor de IL-21 (IL-21 R) con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 de tipo salvaje por el receptor de IL-21. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21 R humano con una Kd que es mayor que o es alrededor de 0,04 nM. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21 R de mono cinomolgo con una Kd que es mayor que o es alrededor de 0,055 nM.

También se describen conjugados que comprenden una muteína de IL-21 como se describe aquí unida a un resto heterólogo. El resto heterólogo puede ser un polipéptido, de modo que el conjugado es una proteína de fusión. Por lo tanto, también se describen proteínas de fusión que comprenden una muteína de IL-21 como se describe aquí. La proteína de fusión puede comprender una muteína de IL-21 de la presente descripción unida a una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo.

La proteína de fusión comprende una muteína de IL-21 unida a un anticuerpo de unión al antígeno PD-1 como se describe aquí.

También se describen proteínas de unión a antígeno PD-1, y conjugados y proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1.

También se describen ácidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica una muteína de IL-21 , una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), o una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1) como se describe aquí. La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica un conjugado o proteína de fusión como se describe aquí. Además, se describen aquí vectores que comprenden los ácidos nucleicos como se describen aquí, y células hospedantes que comprenden los ácidos nucleicos como se describen aquí.

También se describen kits que comprenden una muteína de IL-21, una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), un conjugado, una proteína de fusión (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1)), ácido nucleico, vector, o célula hospedante como se describe aquí, o una combinación de los mismos.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una muteína de IL-21, una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), un conjugado, una proteína de fusión (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1)), ácido nucleico, vector, o célula hospedante como se describe aquí, o una combinación de los mismos.

Se describen aquí métodos para obtener una muteína de IL-21, una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), y una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1). El método puede comprender cultivar una célula hospedante como se describe aquí para expresar la muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), o una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y una proteína de unión al antígeno PD-1

(por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), y recolectar la muteína de IL-21 expresada, la proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1), o la proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo de unión al antígeno PD-1).

Los métodos de tratamiento se describen adicionalmente aquí. El método puede ser un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto que lo necesite una composición farmacéutica como se describe aquí en una cantidad eficaz para tratar al sujeto. El sujeto puede tener un tumor (por ejemplo, un tumor sólido, una neoplasia hematológica, o una neoplasia linfoide), y la composición farmacéutica puede administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor en el sujeto. El tumor puede ser cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (por ejemplo, NSCLC en estadio III o IV), cáncer de pulmón microcítico (SCLC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, carcinoma hepatocelular, cánceres con alta inestabilidad de microsatélites (es decir, cánceres con alta MSI), linfoma, o leucemia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1A representa un gráfico del volumen del tumor (mm3) de ratones BALB/c a los que se les implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores, y los ratones recibieron una inyección intraperitoneal (IP) de 300 gg de anticuerpo de control de isotipo (mIgG1) los días 12, 15 y 18.

La Figura 1B representa un gráfico del volumen del tumor (mm3) de ratones BALB/c a los que se les implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores, y los ratones recibieron una inyección IP de 300 gg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18.

La Figura 1C representa un gráfico del volumen del tumor (mm3) de ratones BALB/c a los que se les implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores, y a los ratones se les administraron 50 gg de IL-21 murina recombinante (rmIL-21) tres veces por semana durante 3 semanas. La dosificación finalizó el día 33

La Figura 1D representa un gráfico del volumen del tumor (mm3) de ratones BALB/c a los que se les implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5 en función del tiempo (días). El día 12, se midieron los tumores, y los ratones recibieron 300 gg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18, y 50 gg de rmIL-21 tres veces por semana durante 3 semanas. La dosificación finalizó el día 33

La Figura 2 representa un gráfico del porcentaje de supervivencia de los cuatro grupos de ratones BALB/c a los que se les implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5. Los ratones del grupo 1 recibieron una inyección intraperitoneal (IP) de 300 gg de anticuerpo de control de isotipo (mIgG1) los días 12, 15 y 18. Los ratones del grupo 2 recibieron una inyección IP de 300 gg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18. Los ratones del grupo 3 recibieron 50 gg de rmIL-21 tres veces por semana durante 3 semanas. Los ratones del grupo 4 recibieron 300 gg de un anticuerpo anti-PD-1 los días 12, 15 y 18, y 50 gg de rmIL-21 tres veces por semana durante 3 semanas. La administración de una combinación de anti-PD-1 y rmIL-21 prolonga significativamente la supervivencia en comparación con la monoterapia con rmIL-21 o anti-PD-1.

La Figura 3 es una ilustración de una hipótesis del mecanismo de acción de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo bloqueador de PD-1 fusionado con una muteína de IL-21 (aPD-1 :muteína de IL-21). Sin estar ligados a una teoría particular, se cree que la fusión se une a IL-21R en las células T CD8+ mientras bloquea simultáneamente la transducción de señales entre PD-1 y PD-L1.

La Figura 4A es una ilustración de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21. La proteína de fusión no tiene un enlazador. El anticuerpo puede comprender regiones constantes que reducen o eliminan la unión y funciones efectoras asociadas a Fc (por ejemplo, carecen de la capacidad de interactuar con los receptores Fcy (por ejemplo, SEFL2-2)).

La Figura 4B es una ilustración de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21. La proteína de fusión puede comprender un enlazador GGGGS (G4S) entre la región constante de cadena pesada del anticuerpo y la muteína de IL-21. El anticuerpo también puede comprender modificaciones SEFL2-2.

La Figura 4C es una ilustración de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con un monómero de muteína de IL-21. La proteína de fusión puede comprender un enlazador G4S entre la región constante de cadena pesada del anticuerpo y la muteína de IL-21. Las cadenas pesadas del anticuerpo comprenden mutaciones de pares de carga (cpm; por ejemplo, V1, V4, V103, o V131) para ayudar en la asociación preferencial de las regiones Fc del heterodímero. El anticuerpo también puede comprender modificaciones SEFL2-2.

La Figura 5A representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T PD-1-ve Hut78 expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 solo (línea continua con rombos negros), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 sin enlazador (línea continua con triángulos negros), (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 con enlazador (línea discontinua con triángulos blancos), (v) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 sin enlazador (línea continua con cuadrados negros), o (vi) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 con un enlazador (línea discontinua con cuadrados blancos) .

La Figura 5B representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T PD-1+ve Hut78 expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 solo (línea continua con rombos negros), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 sin enlazador (línea continua con triángulos negros), (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 con enlazador (línea discontinua con triángulos blancos), (v) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 sin enlazador (línea continua con cuadrados negros), o (vi) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 con un enlazador (línea discontinua con cuadrados blancos) .

La Figura 6 representa un gráfico de las concentraciones séricas de una proteína de fusión de homodímero que comprende IL-21 WT fusionada con un mAb anti-PD-1 que se administró por vía intravenosa a 6 animales a una dosis baja (250 pg/kg) o una dosis alta (1000 pg/kg). Como control, se usó un dominio de anticuerpo IgG (150 pg/kg).

La Figura 7 representa un gráfico de la reducción en veces de la actividad de IL-21 (con respecto a la actividad de rhIL-21) por células PD-1-ve Hut78 (barras en blanco) o células PD-1+ve Hut78 (barras en negro) expuestas a muteínas de IL-21 con afinidad reducida por IL-21 Ra.

La Figura 8 representa un gráfico de la reducción en veces de la actividad de IL-21 (con respecto a la actividad de rhIL-21) por células PD-1-ve Hut78 (barras en blanco) o células PD-1+ve Hut78 (barras en negro) expuestas a muteínas de IL-21 con afinidad reducida por IL-21 Ry.

La Figura 9A representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T PD-1-ve Hut78 expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 WT (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 WT (línea discontinua con círculos negros), y (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína 51 de IL-21 (R65P) (línea punteada con triángulos negros).

La Figura 9B representa un gráfico de la señalización de STAT3 en células T PD-1-ve Hut78 expuestas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola (línea continua con círculos negros), (ii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 WT (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 WT (línea discontinua con círculos negros), y (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína 51 de IL-21 (R65P) (línea punteada con triángulos negros).

La Figura 10 representa un gráfico de las concentraciones séricas de una proteína de fusión que comprende (i) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 R76E (línea de puntos con círculos negros), (ii) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 R76A (línea discontinua con triángulos negros), (iii) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 D15N (línea discontinua con X), (iv) un anticuerpo anti-PD-1 (8,25 mg/kg; línea discontinua con rombos blancos), y (v) un mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de muteína de IL-21 WT (línea continua con cuadrados negros).

La Figura 11 representa un gráfico de la IL-2 (pg/ml) segregada por las células de una reacción de linfocitos mixtos en función de la concentración de anticuerpos de (i) un anticuerpo anti-PD-1 (línea continua con círculos negros), (ii) una proteína de fusión que comprende un homodímero de muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (línea discontinua con círculos blancos), (iii) una combinación de mAb anti-PD-1 y rhIL-21 (línea punteada con cuadrados blancos), (iv) una proteína de fusión que comprende un homodímero de muteína simple de IL-21 R76E (cuadrados negros), (v) control de IgG (línea de puntos con rombos blancos), y (vi) una rhIL-21 (línea discontinua con triángulos blancos).

La Figura 12A representa un gráfico del cambio en veces de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la actividad STAT3 de las células expuestas a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5E/R76A (línea con triángulos blancos), (ii) un control de IgG 1 (línea punteada con rombos negros), (iii) rhIL-21 (línea discontinua con cuadrados blancos), (iv) un mAb anti-PD-1 (línea continua con óvalos blancos), (v) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea discontinua con óvalos negros), o (vi) una proteína de fusión que comprende una muteína simple de IL-21 R76E (línea con rombos blancos).

La Figura 12B representa un gráfico del cambio en veces de la MFI de la actividad STAT3 de las células expuestas a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (línea con triángulos blancos), (ii) un control de IgG1 (línea punteada con rombos negros), (iii) rhIL-21 (línea discontinua con cuadrados blancos), (iv) un mAb anti-PD-1 (línea continua con óvalos blancos), (v) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea discontinua con óvalos negros), o (vi) una proteína de fusión que comprende una muteína simple de IL-21 R76E (línea con rombos blancos).

La Figura 12C representa un gráfico del cambio en veces de la MFI de la actividad STAT3 de las células expuestas a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R9E/R76A (línea con triángulos blancos), (ii) un control de IgG1 (línea punteada con rombos negros), (iii) rhIL-21 (línea discontinua con cuadrados blancos), (iv) un mAb anti-PD-1 (línea continua con óvalos blancos), (v) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea discontinua con óvalos negros), o (vi) una proteína de fusión que comprende una muteína simple de IL-21 R76E (línea con rombos blancos).

La Figura 13A representa un gráfico del % de lisis específica por los CTL (eje y) frente a relaciones de células efectoras a células diana (eje x) expuestos a (i) rhIL-21 (línea continua con círculos negros), (ii) anticuerpo de control hIgG4 (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 (línea discontinua con triángulos negros), (iv) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea punteada con triángulos blancos), o (v) una proteína de fusión que comprende IL-21 R5E/R76A (línea discontinua con X).

La Figura 13B representa un gráfico del % de lisis específica por los CTL expuestos a representa un gráfico del % de lisis específica por parte de los CTLs expuestos a (i) rhIL-21 (línea continua con círculos negros), (ii) anticuerpo de control hIgG4 (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 (línea discontinua con triángulos negros), (iv) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea punteada con triángulos blancos), o (v) una proteína de fusión que comprende IL-21 R5Q/R76E (línea discontinua con X).

La Figura 13C representa un gráfico del % de lisis específica por los CTL expuestos a (i) rhIL-21 (línea continua con círculos negros), (ii) anticuerpo de control hIgG4 (línea discontinua con círculos blancos), (iii) mAb anti-PD-1 (línea discontinua con triángulos negros), (iv) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea punteada con triángulos blancos), o (v) una proteína de fusión que comprende IL-21 R9E/R76A (línea discontinua con X).

La Figura 14 representa las concentraciones séricas de (i) mAb anti-PD-1 (línea continua con cuadrados negros), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R5Q/R76E (línea continua con círculos negros), (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R76E (línea continua), (iv) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R5E/R76A (línea discontinua con X), (v) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de IL-21 R76A (línea discontinua con rombos negros), o (vi) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de IL-21 R76E (línea continua con triángulos negros).

La Figura 15A representa una línea de tiempo del muestreo de células (flechas blancas) y de las administraciones (flechas negras).

La Figura 15B representa un gráfico del cambio en veces en células PD-1+/CD4+ (con respecto al Día -5) según se mide el Día 7 en animales que recibieron una dosis de (i) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y una muteína de IL-21 R76E (barra con líneas horizontales), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de muteína simple de IL-21 R76E (barra con líneas verticales), o (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (barra blanca) (cada una administrada el Día 0).

La Figura 15C representa un gráfico del cambio en veces en células PD-1+/CD8+ (con respecto al Día -5) según se mide el Día 7 en animales que recibieron una dosis de (i) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y una muteína de IL-21 R76E (barra con líneas horizontales), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de muteína simple de IL-21 R76E (barra con líneas verticales), o (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (barra blanca) (cada una administrada el Día 0).

La Figura 15D representa un gráfico del cambio en veces en células PD-1+/CD8+ (con respecto al Día -5) según se mide el Día 21 en animales que recibieron una primera dosis de (i) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y una muteína de IL-21 R76E (barra con líneas horizontales), (ii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un monómero de muteína simple de IL-21 R76E (barra con líneas verticales), o (iii) una proteína de fusión que comprende mAb anti-PD-1 y un homodímero de muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (barra blanca) (la primera dosis administrada el Día 0, y la segunda dosis administrada el Día 8).

La Figura 16 representa un gráfico de la expansión de células PD-1+/CD8+ (con respecto al Día -5) en función de la ocupación del receptor de PD-1 (RO) en células PD-1+/CD8+. Los mutantes simples de IL-21 (801,802, 807, y 808) se muestran dentro del círculo azul, y los mutantes dobles de IL-21 (803, 804, 805, y 806) se muestran en el círculo rosa. Estos datos demuestran que las propiedades farmacocinéticas superiores de los mutantes dobles permiten una mejor cobertura de la diana, y se correlacionan con mejores respuestas farmacodinámicas, según se miden por la expansión de la población diana PD-1+. La línea azul indica la delimitación general entre mutantes simples y dobles.

La Figura 17 representa diagramas de flujo de animales individuales tratados con construcciones de homodímero de mutante simple (animales 801 y 802), construcciones de homodímero de mutante doble (animales 803 - 806), o construcciones monoméricas de mutante simple (animales 807 y 808). Las células T PD-1+ se detectaron mediante anticuerpos de detección competitivos o no competitivos. El porcentaje de cobertura de la diana se calcula como un porcentaje de la relación entre el anticuerpo anti-PD-1 competitivo y no competitivo. Los datos muestran que todas las construcciones demuestran una cobertura robusta de la diana después de repetir la dosificación el Día 21.

La Figura 18A representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad de STAT3 de células T PD-1-ve Hut78 expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de diez mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R5Q/R76E. Los diez mAb anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con rombos), 20C1.006 (cuadrado rojo), 20C1.009 (línea con triángulos), y 22D4.006 (línea con círculos blancos).

La Figura 18B representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad de STAT3 de células T PD-1+ve Hut78 expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de diez mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R5Q/R76E. Los diez mAb anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con rombos), 20C1.006 (cuadrado rojo), 20C1.009 (línea con triángulos), y 22D4.006 (línea con círculos blancos). La comparación de la Figura 18A con la Figura 18B indica que la selección de PD-1 como diana necesita la señalización de pSTAT3, y que la actividad de las muteínas es similar cuando se fusionan con diferentes mAb anti-PD-1.

La Figura 19A representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad de STAT3 de células T PD-1-ve Hut78 expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de siete mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R9E/R76A. Los siete mAbs anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con triángulos blancos), 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con rombos blancos), y 22D4.006 (línea con círculos blancos).

La Figura 19B representa un gráfico del cambio en veces (con respecto a rhIL-21 (línea continua con X en un círculo)) de la actividad de STAT3 de células T PD-1+ve Hut78 expuestas a una proteína de fusión que comprende uno de siete mAb anti-PD-1 diferentes y un homodímero de muteína de IL-21 R9E/R76A. La comparación de la Figura 19A con la Figura 19B indica que la selección de PD-1 como diana necesita la señalización de pSTAT3, y que la actividad de las muteínas es similar cuando se fusionan con diferentes mAb anti-PD-1. Los siete mAbs anti-PD-1 incluyeron 20A2.003 (línea con triángulos blancos), 20C1.006 (línea con cuadrados blancos), 20C1.009 (línea con rombos blancos), y 22D4.006 (línea con círculos blancos).

Las Figuras 20A-20D representan la cantidad de señalización de pSTAT3 observada con varias fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21. La línea continua con círculos negros (parte superior de los gráficos) es rhIL-21; la línea discontinua con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea de puntos con cuadrados negros (parte inferior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 22D4.006 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) usado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea punteada con rombos blancos (parte inferior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las líneas restantes son fusiones de mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21 (con diversas mutaciones de pares de carga), en las que los mutantes dobles son R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E; o R5Q/R76E. rhIL-21 demuestra actividad tanto en células PD-1-ve como PD-1+ve, las fusiones de muteínas dobles monoméricas y homodiméricas son incapaces de demostrar actividad de pSTAT3 (basada en IL-21) en células PD-1-ve, y las fusiones de muteínas dobles monoméricas y homodiméricas son capaces de demostrar actividad de pSTAT3 (basada en IL-21) en células PD-1+ve. De este modo, las fusiones monoméricas con mutantes dobles de IL-21 exhiben niveles similares de atenuación de la actividad de IL-21 en células PD-1-ve y de rescate de la actividad de IL-21 en células PD-1+ve como sus fusiones diméricas equivalentes. Las Figuras 20A y 20B son experimentos duplicados del ensayo de pSTAT3 en células PD-1-ve. Las Figuras 20C y 20D son experimentos duplicados del ensayo de pSTAT3 en células PD-1+ve.

Las Figuras 21A-21D representan los resultados de un ensayo del gen informador de PD-1 (RGA; Figuras 21A y 21B) y un ensayo de MLR (Figuras 21C y 21D) con las mismas fusiones de mAb anti-PD-1 (22D4.006) - fusiones de muteínas dobles monoméricas o diméricas de IL-21 evaluadas en las Figuras 20A-20D. Las Figuras 21A-21D demuestran que las fusiones de mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteínas dobles monoméricas y diméricas de IL-21 son capaces de inducir la actividad de PD-1. La línea continua con círculos negros (parte inferior de los gráficos) es rhIL-21; la línea con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea de discontinua con cuadrados negros (parte superior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 22D4.006 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) usado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea punteada con rombos blancos (parte superior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las líneas restantes son fusiones de mAb anti-PD-1 - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21. Las Figuras 21A y 21B son experimentos duplicados del ensayo de RGA de PD-1. Las Figuras 20C y 20D son experimentos duplicados del ensayo de MLR.

Las Figuras 22A-22D representan los resultados de los ensayos de pSTAT3 que evalúan las mismas construcciones que las de las Figuras 20A-20D, excepto que se usa un mAb anti-PD-1 diferente (20A2.003) en las fusiones de mAb anti-PD-1 - muteínas dobles monoméricas y diméricas de IL-21. Los resultados de las Figuras 22A-22D son similares a los que se observan en las Figuras 20A-20D. La línea continua con círculos negros (parte superior de los gráficos) es rhIL-21; la línea discontinua con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea de puntos con cuadrados negros (parte inferior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 20A2.003 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) usado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea punteada con rombos blancos (parte inferior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las líneas restantes son fusiones de mAb anti-PD-1 (20A2.003) - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21 (con diversas mutaciones de pares de carga), en las que los mutantes dobles son R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E; o R5Q/R76E. Las Figuras 22A y 22B son experimentos duplicados del ensayo de pSTAT3 en células PD-1-ve. Las Figuras 22C y 22D son experimentos duplicados del ensayo de pSTAT3 en células PD-1+ve.

Las Figuras 23A-23D representan los resultados de los ensayos del gen informador de PD-1 (Figuras 23A y 23B) y los ensayos de MLR (Figuras 23C y 23D) que evalúan las mismas construcciones que las de las Figuras 21A-21D, excepto que se usa un mAb anti-PD-1 diferente (20A2.003) en las fusiones de mAb anti-PD-1 - muteínas dobles monoméricas y diméricas de IL-21. Los resultados de las Figuras 23A-23D son similares a los que se observan en las Figuras 21A-21D. La línea continua con círculos negros (parte inferior de los gráficos) es rhIL-21; la línea discontinua con círculos blancos (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG1; la línea con X (parte inferior de los gráficos) es el control de IgG2; la línea de puntos (parte superior de los gráficos) es el mAb anti-PD-1 20A2.003 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) usado en las fusiones de muteína de IL-21; la línea discontinua con cuadrados blancos y la línea punteada con rombos blancos (parte superior de los gráficos) son mAb anti-PD-1 de control; las líneas restantes son fusiones de mAb anti-PD-1 (20A2.003) - muteína doble monomérica o dimérica de IL-21. Las Figuras 23A y 23B son experimentos duplicados del ensayo de RGA de PD-1. Las Figuras 23C y 23D son experimentos duplicados del ensayo de MLR.

La Figura 24 representa un gráfico de la actividad de NFAT/luciferasa de anticuerpos anti-PD-1 purificados en función de la concentración de mAb.

La Figura 25A es un gráfico del cambio en veces en el número de células Ki67+/CD3+/CD4+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25B es un gráfico del cambio en veces en el número de células Ki67+/CD3+/CD8+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25C es un gráfico del cambio en veces en el número de células pSTAT3+/CD3+/CD4+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25D es un gráfico del cambio en veces en el número de células pSTAT3+/CD3+/CD8+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25E es un gráfico del cambio en veces en el número de células CD3+/CD4+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25F es un gráfico del cambio en veces en el número de células CD3+/CD8+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25G es un gráfico del cambio en veces en el número de células PD-1+/CD3+/CD4+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25H es un gráfico del cambio en veces en el número de células PD-1+/CD3+/C84+ con respecto a la línea base tras la exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25I es un gráfico del cambio en veces en la cantidad de perfina sérica con respecto a la línea base tras 72 horas de exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) o al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 25J es un gráfico del % de células Ki67+ con respecto a la línea base como una función del aumento en veces en perforina tras 72 horas de exposición a la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) 0 al anticuerpo anti-PD-1 [22D4.017].

La Figura 26A es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada del anticuerpo 22D4.017 para el antígeno PD-1 humano.

La Figura 26B es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada del anticuerpo 20C1.009 para el antígeno PD-1 humano.

La Figura 26C es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada del anticuerpo 20A2.003 para el antígeno PD-1 humano.

La Figura 26D es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada de un mAb IgG1 anti-PD-1, para el antígeno PD-1 humano.

La Figura 26E es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada de un mAb IgG4 anti-PD-1 para el antígeno PD-1 humano.

La Figura 26F es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada de 22D4.017 para el antígeno PD-1 de cyno.

La Figura 26G es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada del anticuerpo 20C1.009 para el antígeno PD-1 de cyno.

La Figura 26H es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada de anticuerpo 20A2.003 para el antígeno PD-1 de cyno.

La Figura 26I es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada de un mAb IgG1 anti-PD-1, para el antígeno PD-1 de cyno.

La Figura 26J es un gráfico de la absorbancia (nm) en función del tiempo (s) usado para determinar la Kd indicada de un mAb IgG4 anti-PD-1, para el antígeno PD-1 de cyno.

La Figura 27 es un gráfico de la Cp (kcal/mol/°C) en función de la temperatura para los anticuerpos anti-PD-1 22D4.017 y 20C1.009.

La Figura 28 es un gráfico de la viscosidad frente a la velocidad de cizallamiento para los anticuerpos anti-PD-1 22D4.017 y 20C1.009.

Las Figuras 29A-29D son una serie de gráficos que trazan la señal en función de la concentración de anticuerpo en (Fig. 29A) una línea de células T Hut78 variante que es PD-1 positiva, (Fig. 29B) una línea de células T Hut78 variante que es TIGIT positiva, (Fig. 29C) una línea de células T Hut78 variante que es LAG3 positiva, y (Fig. 29D) la línea de células T Hut78 parental que no expresa endógenamente PD-1, TIGIT o LAG3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Sigue existiendo la necesidad de nuevos enfoques de potenciación inmunitaria que puedan desplegar el sistema inmunitario contra las células cancerosas de una manera segura y eficaz, especialmente a la luz del hecho de que los enfoques de inmunoterapia actuales son eficaces solo en una minoría de pacientes, y pueden tener toxicidades significativas y a menudo impredecibles. Se describe aquí una nueva clase de moléculas de fusión bifuncionales que comprenden un anticuerpo dirigido a PD-1 que puede bloquear la interacción PD-1/PD-L1, fusionado con una muteína de interleucina-21 manipulada mediante ingeniería y con afinidad atenuada, que aborda esta necesidad. Las fusiones de anticuerpos/citocinas descritas aquí superan las barreras significativas asociadas con la terapéutica de citocinas, lo que permite, entre otros, dosificación similar a la de un anticuerpo y suministro selectivo de la citocina IL-21 de manera dirigida contra PD-1. Cuando se fusionan con un anticuerpo anti-PD-1, las muteínas de IL-21 pueden activar y expandir selectivamente in vivo las células T que expresan PD-1. En consecuencia, las fusiones de anticuerpos/citocinas descritas aquí pueden mejorar y ampliar la utilidad de los tratamientos anti-PD-1 que se están evaluando actualmente en la clínica.

La combinación de citocinas y agonistas o antagonistas de receptores co-inhibidores sigue siendo un desafío debido a los riesgos de toxicidad incremental y la necesidad de un diseño de ensayo clínico complejo (véanse, por ejemplo, Ott et al., J Immunother Cancer 5, 16 (2017); and Hermel et al., Cancer Metastasis Rev 36, 43-50 (2017)). Con respecto a las citocinas, también existe el potencial para la activación de rutas de retroalimentación inhibidoras que pueden conducir a la supresión inmune (véanse, por ejemplo, Portielje et al, Clin Cancer Res 9, 76-83 (2003); Wan et al., Immunity 38, 514-527 (2013); and Mooradian et al., Oncoimmunology 7, e1423172 (2018)). La interleucina-21 (IL-21) es una citocina de tipo I y un miembro de la familia de citocinas de la cadena gamma (cadena cg) del receptor de citocinas común que se ha convertido en un tratamiento inmunitario prometedor para el tratamiento del cáncer. La IL-21 es producida por células T CD4 activadas y células T asesinas naturales (NKT), y emite señales a través de un complejo de receptor heterodimérico compuesto por una subunidad discreta del receptor de IL-21 (IL-21R) que se asocia con la cadena gamma común (véase, por ejemplo, Spolski et al., Nat Rev Drug Discov 13, 379-395 (2014)). La activación del complejo de IL-21 R conduce a la activación de la ruta de señalización JAK/STAT. IL-21 R se expresa ampliamente en células hematopoyéticas, incluyendo los linfocitos T y B, las células asesinas naturales (NK), y las células mieloides. Aunque no es un factor esencial de crecimiento o diferenciación, la IL-21 es un potente mitógeno y factor de supervivencia para las células NK y las células T activadas. IL-21 puede apoyar la diferenciación de CD4 (+) T auxiliar 17 (Th17) así como células T auxiliares foliculares (Tfh), y puede antagonizar la diferenciación de células T reguladoras (Treg). Además, la IL-21 puede aumentar la supervivencia de las células T CD8, y conserva un fenotipo de células T menos activado pero más persistente, lo que permite un mejor control de tumores y virus.

Un aspecto desafiante de la inmunoterapia con citocinas es que, además de activar las células inmunitarias para potenciar las respuestas inmunitarias, la misma citocina también puede activar rutas contrarreguladoras. Por ejemplo, IL-2 e IFNy pueden activar respuestas inmunitarias protectoras así como respuestas de células T reguladoras y rutas inhibidoras (tal como PD-L1), respectivamente. En las células dendríticas (DC), la IL-21 puede inhibir tanto la maduración como la activación de las DC, puede inducir la apoptosis de las DC convencionales, puede inhibir potentemente el cebado de células T en cultivos mixtos, y puede desempeñar un papel en la inducción de la tolerancia. En seres humanos, la IL-21 se ha estudiado como una citocina libre no dianizada en varias indicaciones de cáncer, pero a pesar de los datos preclínicos prometedores y los datos clínicos de fase I iniciales, el desarrollo de este enfoque no ha progresado más allá del ensayo de fase II (véanse, por ejemplo, Thompson et al., J Clin Oncol 26, 2034-2039 (2008); and Davis et al., Clin Cancer Res 15, 2123-2129 (2009)). En modelos preclínicos más recientes, la combinación de la citocina IL-21 recombinante con antagonistas de receptores co-inhibidores (por ejemplo, anti-CTLA-4 y anti-PD-1) ha demostrado que la IL-21 puede extender la eficacia de estos tratamientos. Estas combinaciones ahora están bajo ensayo en la clínica, aunque aún no se ha demostrado la eficacia clínica (Lewis et al., Oncoimmunology 7, e1377873 (2017)).

Sin estar ligado a ninguna teoría, las fusiones de anticuerpos/citocinas descritas aquí están diseñadas para usar la actividad inmunopotenciadora de IL-21 (que puede ser un requisito previo para abordar la toxicidad y la supresión inmune distinta de la deseada), para maximizar la eficacia, y mejorar la viabilidad de dosificación en la clínica. IL-21 y muteínas de IL-21

La interleucina-21 (IL-21) es una citocina expresada por las células T, las células B, las células NK, y las células mieloides, y regula la actividad de las células inmunes tanto innatas como adaptativas, y mejora la supervivencia de las células T y la función efectora. Varios ensayos clínicos de Fase I y II incluyen IL-21 como producto de investigación para el tratamiento de cánceres, enfermedades inflamatorias, y enfermedades autoinmunes, incluyendo melanoma, carcinoma de células renales, leucemia mieloide aguda, linfoma no de Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, y artritis reumatoide.

IL-21 tiene una estructura de haz de cuatro hélices, y existe como monómero. En seres humanos, se conocen dos isoformas de IL-21, cada una de las cuales deriva de una molécula precursora. La primera isoforma de IL-21 comprende 162 aminoácidos (aa), los primeros 29 de los cuales forman el péptido señal; y la segunda isoforma de IL-21 comprende 153 aa, cuyos primeros 29 forman el péptido señal como en la primera isoforma. Las secuencias de aminoácidos de la primera y segunda isoformas de IL-21 (incluyendo el péptido señal) se proporcionan aquí como SEQ ID NO: 258 y SEQ ID NO: 259, respectivamente.

La IL-21 se une al receptor heterodimérico de IL-21 (IL-21 R) expresado en la superficie de las células T, B, y NK. El IL-21 R tiene una estructura similar al receptor de IL-2 y al receptor de IL-15, en el sentido de que cada uno de estos receptores de citocina comprende una cadena gamma común (yc). Además de la yc, el IL-21 R comprende una cadena alfa que es importante para la unión a IL-21. Hay dos isoformas de la cadena alfa del receptor de IL-21 humano: isoforma 1 e isoforma 2. Las secuencias de aminoácidos de la isoforma 1 y la isoforma 2 se proporcionan aquí como SEQ ID NOs: 256 y 261, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la cadena gamma común humana se proporciona aquí como SEQ ID NO: 257.

Cuando la IL-21 se une a IL-21 R, la ruta de señalización Jak/STAT se activa para activar los genes diana. Si bien la señalización inducida por IL-21 puede ser terapéuticamente deseable, se necesita una cuidadosa consideración del momento y la ubicación de la señalización, dado el amplio perfil de expresión de IL-21 y debido al hecho de que IL-21 tiene la capacidad de potenciar las respuestas de células T CD8 así como suprimir la presentación de antígenos y el cebado de células T. Los datos presentados aquí por primera vez respaldan el uso de muteínas de IL-21 cuidadosamente diseñadas para lograr la señalización de IL-21 en el momento y lugar apropiados.

Se describen aquí muteínas de IL-21 que comprenden al menos una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, que se proporciona aquí como SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la muteína de IL-21 comprende al menos una y no más de 34 sustituciones de aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender al menos una y no más de X sustituciones de aminoácidos, en las que X es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, o 34. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en no más de 10 aminoácidos, 15 aminoácidos, 20 aminoácidos, o 25 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en no más de 7 aminoácidos, o no más de 5 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en 3, 4, 5, o 6 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en 3 a 6 aminoácidos, o 1 a 5 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en uno o dos aminoácidos.

La muteína de IL-21 puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que SEQ ID NO: 2 es

QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2) , en la que X representa cualquier aminoácido, y en la que la secuencia de ácidos de la muteína de IL-21 difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en al menos 1 aminoácido.

Así, la muteína de IL-21 puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que SEQ ID NO: 2 difiere de SEQ ID NO: 1 en al menos un aminoácido en una posición designada por X en SEQ ID NO: 2. La muteína de IL-21 que comprende SEQ ID NO: 2 puede tener al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, y la sustitución o sustituciones de aminoácidos se pueden producir en la mitad N-terminal de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la o las sustituciones de aminoácidos se producen en una posición dentro de las posiciones 5-25 o 8-23 (ambas inclusive), según la numeración de las posiciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, y la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden ocurrir en la mitad C-terminal de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la o las sustituciones de aminoácidos se producen en una posición dentro de las posiciones 100-133 o 109-123 (ambas inclusive), según la numeración de las posiciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, y la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden ocurrir en el tercio medio de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la o las sustituciones de aminoácidos se producen en una posición dentro de las posiciones 55-85 o 65-80 (ambas inclusive), según la numeración de las posiciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

También se describen muteínas de IL-21 que comprenden solo una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, que se proporciona aquí como SEQ ID NO: 1. La sustitución de aminoácido puede ubicarse en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71,72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La sustitución de aminoácido puede ubicarse en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3-21 y 23-37.

También se describen muteínas de IL-21 que comprenden solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en dos posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71,72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123 según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ iD n O: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en dos posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5, 9, 15, 70, 71, 72, 73, y 76, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en dos posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5, 9, 73, y 76, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Al menos una de las dos sustituciones de aminoácidos puede estar ubicada en la posición 76, según la numeración de posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 199-208 y 210-212.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, y la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden ser sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas. Como se usa aquí, la expresión "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, por ejemplo tamaño, carga, hidrofobia, hidrofilia, y/o aromaticidad, e incluye intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes:

1. I. Pequeños restos alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

2. II. Restos polares, cargados negativamente, y sus amidas y ésteres: Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico y ácido homocisteico;

3. III. Restos polares, cargados positivamente: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn)

4. IV. Restos grandes, alifáticos, no polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína

5. V. Restos grandes, aromáticos: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, y la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden ser una sustitución o sustituciones de aminoácidos no conservativas. Como se usa aquí, la expresión "sustitución de aminoácidos no conservativa" se define aquí como la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene diferentes propiedades, por ejemplo tamaño, carga, hidrofobia, hidrofilia, y/o aromaticidad, e incluye intercambios fuera de los cinco grupos anteriores.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido natural. Por "aminoácido natural" o "aminoácido estándar" o "aminoácido canónico" se entiende uno de los 20 alfa aminoácidos que se encuentran en eucariotas codificados directamente por los codones del código genético universal (Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Arg, His, Lys, Asp, Glu). La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 de tipo salvaje, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido no estándar, o un aminoácido que no se incorpora a las proteínas durante la traducción. Los aminoácidos no estándar incluyen, pero no se limitan a: selenocisteína, pirrolisina, ornitina, norleucina, p-aminoácidos (por ejemplo, p-alanina, ácido p-aminoisobutírico, p-fenilalanina, p-homofenilalanina, ácido p-glutámico, p-glutamina, p-homotriptófano, p-leucina, p-lisina), homoaminoácidos (por ejemplo, homofenilalanina, homoserina, homoarginina, monocisteína, homocistina), W-metilaminoácidos (por ejemplo, L-abrina, W-metil-alanina, W-metil-isoleucina, W-metilleucina), ácido 2-aminocaprílico, ácido 7-aminocefalosporánico, ácido 4-aminocinámico, ácido alfaaminociclohexanopropiónico, ácido amino-(4-hidroxifenil)acético, ácido 4-amino-nicotínico, ácido 3-aminofenilacético, y similares.

La muteína de IL-21 de la presente descripción puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116, y 119 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser aminoácidos alifáticos. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, la sustitución de aminoácidos puede ser en la posición 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido alifático.

La muteína de IL-21 de la presente descripción puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser aminoácidos ácidos. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido ácido.

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 5, 9, 73, 76, 109, 113, o 116 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser aminoácidos básicos. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, y el aminoácido en la posición 5, 9, 73, 76, 109, 113 o 116 de SEQ ID NO: 1 puede ser un aminoácido básico.

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 70, o 76 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser aminoácidos aromáticos. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, la sustitución de aminoácidos puede ser en la posición 5, 8, 9, 70, o 76 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido aromático.

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser aminoácidos que comprenden una amida de cadena lateral. La muteína de IL-21 como se describe aquí comprende una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, la sustitución de aminoácidos puede ser en la posición 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido que comprende una amida de cadena lateral.

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser aminoácidos que comprenden un hidroxilo de cadena lateral. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, la sustitución de aminoácidos puede ser en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido que comprende un hidroxilo de cadena lateral.

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, o 80 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser iminoácidos. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, la sustitución de aminoácidos puede ser en la posición 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, o 80 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido que comprende un iminoácido.

La muteína de IL-21 como se describe aquí comprende una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), la sustitución de aminoácidos puede ser en una o más de las posiciones 5, 9, 15, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, y el o los aminoácidos sustitutos pueden ser aminoácidos que comprenden una cadena lateral que contiene azufre. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, la sustitución de aminoácidos puede ser en la posición 5, 9, 15, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido que comprende un aminoácido que comprende una cadena lateral que contiene azufre.

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), en la que la al menos una sustitución de aminoácidos se muestra en la Tabla A.

TABLA A

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con solo una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1, y la sustitución de aminoácidos puede ser la que se muestra en la Tabla A. La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos con dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a SEQ ID NO: 1, y las sustituciones de aminoácidos pueden ser dos de las que se muestran en la Tabla A.

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla B.

TABLA B

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 47, 48, 51,61,62, 64-67, 69, 71-112, 114-198, 249-254, o 283. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con una de SEQ ID NOs: 47, 48, 51,61, 62, 64-67, 69, 71-112, 114-198, 249-254, o 283.

También se describen muteínas de IL-21 que comprenden solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a SEQ ID NO: 1, y las dos sustituciones de aminoácidos se producen en dos de las posiciones 5, 9, 15, 70, 71,72, 73 y 76 de SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender solamente dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a SEQ ID NO: 1, y las dos sustituciones se pueden producir en un par de posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 5 y 76; 9 y 76; 15 y 70; 15 y 71; 15 y 72; 15 y 73; 70 y 73; 70 y 76; 71 y 73; 71 y 76; 72 y 73; 72 y 76; y 73 y 76. La muteína de IL-21 puede comprender una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 199-208 y 210-212. También se describen muteínas de IL-21 que comprenden solo dos sustituciones de aminoácidos, con respecto a SEQ ID NO: 1, y las dos sustituciones de aminoácidos se producen en dos de las posiciones 5, 9, 73, y 76 de SEQ ID NO: 1. Una de las sustituciones pueden ocurrir en la posición 76 de SEQ ID NO: 1. El aminoácido sustituto en la posición 76 de SEQ ID NO: 1 puede ser un aminoácido alifático o un aminoácido ácido. El aminoácido alifático puede ser alanina. El aminoácido ácido puede ser ácido aspártico o ácido glutámico. El aminoácido ácido puede ser ácido glutámico. La muteína de IL-21 puede comprender un aminoácido sustituto en la posición 76 y un aminoácido alifático o un aminoácido ácido en la posición 5, 9 o 73 de SEQ ID NO: 1. El aminoácido sustituto en la posición 5, 9 o 73 puede ser un aminoácido alifático, un aminoácido ácido, o un aminoácido con una amida de cadena lateral. El aminoácido alifático puede ser alanina, el aminoácido ácido puede ser ácido glutámico, y el aminoácido con una amida de cadena lateral puede ser glutamina. La muteína de IL-21 puede comprender un aminoácido sustituto en la posición 76 de SEQ ID NO: 1 (opcionalmente, un aminoácido alifático o un aminoácido ácido) y un aminoácido sustituto en la posición 5 o 9 (según la numeración de SEQ ID NO: 1).

La muteína de IL-21 como se describe aquí puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: mostradas en la Tabla C.

TABLA C

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 213-219 y 227-248. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con una de SEQ ID NOs: 213-219 y 227-248.

Longitud peptídica

Las muteínas de IL-21 descritas aquí pueden comprender un esqueleto peptídico de cualquier número de aminoácidos, es decir, pueden tener cualquier longitud peptídica. Los péptidos descritos aquí pueden tener aproximadamente la misma longitud que SEQ ID NO: 1, es decir, tienen una longitud de 133 (± alrededor de 1 a alrededor de 20, ± alrededor de 1 a alrededor de 15, ± alrededor de 1 a alrededor de 10, o ± alrededor de 1 a alrededor de 5) aminoácidos. El péptido descrito aquí puede tener una longitud de más de 133 aminoácidos en virtud de estar fusionado con otra cadena polipeptídica, por ejemplo una cadena pesada de anticuerpo que comprende alrededor de 400 a alrededor de 600 aminoácidos, una cadena ligera de anticuerpo que comprende alrededor de 150 a alrededor de 300 aminoácidos, como se describe más adelante aquí.

Modificaciones peptídicas adicionales

Como alternativa o adicionalmente, la muteína de IL-21 puede estar lipidada (por ejemplo, miritoilada, palmitoilada), glicosilada, amidada, carboxilada, fosforilada, esterificada, acilada, acetilada, ciclada, o convertida en una sal de adición de ácido, y/u opcionalmente dimerizada o polimerizada, o conjugada, como se describe más adelante aquí.

Sales farmacéuticamente aceptables

La muteína de IL-21 puede estar en forma de una sal, por ejemplo una sal farmacéuticamente aceptable. Tales sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y la purificación finales de la muteína de IL-21, o se pueden preparar por separado haciendo reaccionar una función de base libre con un ácido adecuado. Ejemplos de ácidos que se pueden emplear para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, un ácido inorgánico, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, y ácido fosfórico, y un ácido orgánico, por ejemplo ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico, y ácido cítrico.

Las sales de adición de ácido representativas incluyen, pero no se limitan a, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canfosulfonato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato (isotionato), lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, palmitoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluenosulfonato, y undecanoato.

Las sales de adición básicas también se pueden preparar in situ durante el aislamiento y purificación finales de la muteína de IL-21, o haciendo reaccionar un resto que contiene ácido carboxílico con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato, o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable o con amoníaco o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, cationes basados en metales alcalinos o metales alcalino-térreos tales como sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, y aluminio, y similares, y cationes de amina y amoníaco cuaternario no tóxicos que incluyen amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, trietilamonio, dietilamonio, y etilamonio, entre otros. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina, y similares.

Además, los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con agentes activos tales como haluros de alquilo inferior tales como cloruros, bromuros, y yoduros de metilo, etilo, propilo, y butilo; haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros, y yoduros de decilo, laurilo, miristilo, y estearilo; haluros de arilalquilo como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. De este modo se obtienen productos solubles o dispersables en agua o en aceite.

Purificación

Las muteínas de IL-21 como se describe aquí se pueden purificar. El término "purificado", tal como se usa aquí, significa que se ha aumentado la pureza, en el que "pureza" es un término relativo, y no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. La pureza del compuesto (por ejemplo, en la composición) puede ser al menos o alrededor de 50%, al menos o alrededor de 60%, al menos o alrededor de 70%, al menos o alrededor de 80%, al menos o alrededor de 90%, al menos o alrededor de 95%, o al menos o alrededor de 98%, o puede ser alrededor de 100%.

Peptidomiméticos

La muteína de IL-21 puede ser un peptidomimético, o al menos una parte de la muteína puede ser un peptidomimético. Los peptidomiméticos, así como los métodos para prepararlos, son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, Volumes 1 and 2, ed., Abell, A., JAI Press Inc., Greenwich, CT, 2006. El peptidomimético puede ser un peptidomimético de péptido D que comprende aminoácidos de isómero D. El peptidomimético puede ser un peptoide en el que la cadena lateral de un aminoácido está conectada al átomo de nitrógeno alfa del esqueleto del péptido. Los métodos para preparar peptoides son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Zuckermann et al., JACS 114(26): 10646-10647 (1992) and Design, Synthesis, and Evaluation of Novel Peptoids, Fowler, Sarah, University of Wisconsin-Madison, 2008. El peptidomimético puede ser un péptido p que comprende aminoácidos p que tienen su grupo amino enlazado al carbono p en lugar de al carbono alfa. Los métodos para obtener péptidos p son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Seebach et al., Helvetica Chimica Acta 79(4): 913-941 (1996).

Características de unión

Las muteínas de IL-21 pueden unirse al receptor de IL-21 (IL-21 R) con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de la IL-21 de tipo salvaje por el IL-21R. Las muteínas de IL-21 pueden unirse al IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 humana de tipo salvaje por el IL-21 R humano. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena alfa del IL-21R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 humana de tipo salvaje por la cadena alfa del IL-21 R humano. Las muteínas de IL-21 que se unen a la cadena alfa del IL-21 R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 humana de tipo salvaje por la cadena alfa del IL-21R humano, pueden contener una, dos, o más sustituciones ubicadas en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, y 80, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos específicas que se pueden realizar en tales posiciones se analizan aquí (véanse, por ejemplo, las Tablas A, B y C).

Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma del IL-21 R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 humana de tipo salvaje por la cadena gamma del IL-21 R humano. Las muteínas de IL-21 que se unen a la cadena gamma de IL-21 R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 humana de tipo salvaje por la cadena gamma del IL-21 R humano, pueden contener una, dos, o más sustituciones ubicadas en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: 11, 14, 15, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 y 123, según la numeración de la posición de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos específicas que se pueden realizar en tales posiciones se analizan aquí (véanse, por ejemplo, las Tablas A, B y C).

Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma de IL-21 R humano con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 humana de tipo salvaje por la cadena alfa del IL-21 R humano. Las muteínas de IL-21 pueden unirse al IL-21R de mono cinomolgo con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 de cinomolgo de tipo salvaje por el IL-21 R de cinomolgo. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena alfa del IL-21 R de mono cinomolgo con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 de cinomolgo de tipo salvaje por la cadena alfa del IL-21 R de cinomolgo. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma de IL-21 R de mono cinomolgo con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 de cinomolgo de tipo salvaje por la cadena gamma del IL-21 R de cinomolgo. Las muteínas de IL-21 pueden unirse a la cadena gamma de IL-21 R de mono cinomolgo con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 de cinomolgo de tipo salvaje por la cadena alfa del IL-21 R de cinomolgo.

Las muteínas de IL-21 descritas aquí se unen a IL-21 R de manera no covalente y reversible. La fuerza de unión de las muteínas a IL-21 R puede describirse en términos de su afinidad, una medida de la fuerza de interacción entre el sitio de unión de la muteína y el IL-21 R. Las muteínas de IL-21 descritas aquí pueden tener una alta afinidad por IL21R, y de este modo se unirán a una mayor cantidad de IL-21R en un período de tiempo más corto que las muteínas de IL-21 de baja afinidad. Las muteínas de IL-21 descritas aquí pueden tener baja afinidad por IL-21 R, y de este modo se unirán a una menor cantidad de IL-21 R en un período de tiempo más prolongado que las muteínas de IL-21 de alta afinidad. La muteína de IL-21 puede tener una constante de asociación de equilibrio, KA, que es al menos 105 M-1, al menos 106 M-1, al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, o al menos 1010 M-1. Como entenderá el experto de pericia normal, KA puede verse influida por factores que incluyen el pH, la temperatura y la composición del amortiguador.

La fuerza de unión de la muteína de IL-21 a IL-21 R puede describirse en términos de su sensibilidad. Kd es la constante de disociación de equilibrio, una relación de koff/kon, entre la muteína de IL-21 y el IL-21 R. Kd y KA están inversamente relacionados. El valor de Kd se refiere a la concentración de la muteína (la cantidad de muteína necesaria para un experimento particular), y por lo tanto, cuanto menor sea el valor de Kd (menor concentración necesaria) mayor será la afinidad de la muteína. La fuerza de unión de la muteína de IL-21 a IL-21 R puede describirse en términos de Kd. La Kd de las muteínas de IL-21 descritas aquí puede ser alrededor de 10-1 M, alrededor de 10-2 M, alrededor de 10-3 M, alrededor de 10-4 M, alrededor de 10-5 M, alrededor de 10-6 M, o menos. La Kd de las muteínas de IL-21 descritas aquí pueden ser micromolar, nanomolar, picomolar o femtomolar. La Kd de las muteínas de IL-21 descritas aquí pueden estar dentro de un intervalo de alrededor de 10-4 a 10-6 M, a 10-7 a 10-9 M, o 10-10 a 10-12 M, o 10-13 a 10-15 M. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21 R humano con una Kd que es mayor que o es alrededor de 0,04 nM. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21 R humano con una Kd de alrededor de 0,01 nM a alrededor de 20 nM, 0,02 nM a 20 nM, 0,05 nM a 20 nM, 0,05 nM a 15 nM, 0,1 nM a 15 nM, 0,1 nM a 10 nM, 1 nM a 10 nM, o 5 nM a 10 nM. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21R de mono cynomolgus con una Kd que es mayor que o es alrededor de 0,055 nM. La muteína de IL-21 puede unirse al IL-21 R de mono cinomolgo con una Kd de alrededor de 0,01 nM a alrededor de 20 nM, 0,02 nM a 20 nM, 0,05 nM a 20 nM, 0,05 nM a 15 nM, 0,1 nM a 15 nM, 0,1 nM a 10 nM, 1 nM a 10 nM, o 5 nM a 10 nM.

La muteína de IL-21 puede exhibir una reducción en la afinidad de unión por la cadena a de IL-21 R. La muteína de IL-21 puede ser una muteína (por ejemplo, simple o doble) que exhibe una reducción de alrededor de 2-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 55-, 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, 100-, 105-, 110-, 115-, 120-, 125-, 130-, 135-, 140-, 145-, 150-, 175-, 200-, 225-, 250-, 275-, 300-, 325-, 350-, 375-, 400-, 425-, 450-, 475-, 500-, 525-, 550-, 575-, 600-, 625-, 650-, 675-, 700-, 725-, 750-, 775-, 800-, 825-, 850-, 875-, 900-, 925-, 950-, 975-veces, 1000 veces, o más en la afinidad de unión por la cadena a de IL-21 R. La muteína de IL-21 puede ser una muteína doble que exhibe la reducción en la afinidad de unión por la cadena a de IL-21 R.

La reducción anterior en la afinidad de unión de la muteína de IL-21 (por ejemplo, muteína simple o doble) puede dar como resultado una afinidad reducida por la cadena a de IL-21R en comparación con la afinidad de alrededor de 0,025 nM de IL-21 humana de tipo salvaje por la cadena a de IL-21R. En consecuencia, una reducción de 2 veces en la afinidad como se discutió anteriormente daría como resultado una muteína de IL-21 con una afinidad de alrededor de 0,05 nM por la cadena a de IL-21 R. De este modo, la muteína de IL-21 (por ejemplo, simple o doble) puede tener una afinidad de alrededor de 0,05, 0,125, 0,25, 0,375, 0,5, 0,625, 0,75, 0,875, 1,0, 1,125, 1,25, 1,375, 1,5, 1,625, 1,75, 1.875, 2,0, 2,125, 2,25, 2,375, 2,5, 2,625, 2,75, 2,875, 3,0, 3,125, 3,25, 3,375, 3,5, 3,625, 3,75, 4,375, 5, 5,625, 6,25, 6.875, 7,5, 8,125, 8,75, 9,375, 10,0, 10,625, 11,25, 11,875, 12,5, 13,125, 13,75, 14,375, 15,0, 15,625, 16,25, 16,875, 17,5, 18,125, 18,75, 19,375, 20,0, 20,625, 21,25, 21,875, 22,5, 23,125, 23,75, 24,375, 25 nM, o más por la cadena a de IL-21 R. La muteína de IL-21 puede ser una muteína doble que exhibe una afinidad de unión reducida por la cadena a de IL-21 R.

La muteína de IL-21 puede exhibir una reducción en la actividad según se mide por un ensayo de fosforilación de STAT3 in vitro. La muteína de IL-21 puede ser una muteína (por ejemplo, simple o doble) que exhibe una reducción de alrededor de 2-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 55-, 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, 100-, 105-, 110-, 115-, 120-, 125-, 130-, 135-, 140-, 145-, 150-, 175-, 200-, 225-, 250-, 275-, 300-, 325-, 350-, 375-, 400-, 425-, 450-, 475-, 500-, 525-, 550-, 575-, 600-, 625-, 650-, 675-, 700-, 725-, 750-, 775-, 800-, 825-, 850-, 875-, 900-, 925-, 950-, 975-veces, 1000 veces, o más en la afinidad según se mide por un ensayo de fosforilación de STAT3. La muteína de IL-21 puede ser una muteína doble que exhibe la reducción en la afinidad según se mide por un ensayo de fosforilación de STAT3.

Conjugados de muteína de IL-21

También se describen conjugados que comprenden una o más de las muteínas de IL-21 como se describe aquí, unidas a un resto heterólogo. Como se usa aquí, la expresión "resto heterólogo" es sinónimo de la expresión "resto conjugado", y se refiere a cualquier molécula (química o bioquímica, natural o no codificada) que es diferente de las muteínas de IL-21 descritas aquí. Los restos de conjugados ejemplares que se pueden unir a cualquiera de las muteínas de IL-21 descritas aquí incluyen, pero no se limitan a, un péptido o polipéptido heterólogo (que incluye, por ejemplo, una inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, región variable, CDR, o región Fc)), un agente de direccionamiento, un marcador de diagnóstico tal como un radioisótopo, un fluoróforo, o un marcador enzimático, un polímero que incluye polímeros solubles en agua, u otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Se describe un conjugado que comprende una muteína de IL-21 como se describe aquí y una inmunoglobulina. El conjugado puede comprender una o más de las muteínas de IL-21 descritas aquí y uno o más de: un péptido (que es distinto de las muteínas de IL-21 descritas aquí), un polipéptido, una molécula de ácido nucleico, un anticuerpo o fragmento del mismo, un polímero, un punto cuántico, una molécula pequeña, una toxina, un agente de diagnóstico, un hidrato de carbono, un aminoácido.

El conjugado como se describe aquí puede comprender una muteína de IL-21 como se describe aquí y un resto heterólogo que es un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido distinto de cualquiera de las muteínas de IL-21 descritas aquí), y el conjugado puede ser un polipéptido de fusión o proteína de fusión, o una proteína quimérica o un polipéptido quimérico. Se proporcionan aquí descripciones adicionales de tales conjugados bajo "Proteínas de fusión".

El resto heterólogo se puede unir a través de un enlace no covalente o covalente a la muteína de IL-21 como se describe aquí. El enlace entre la muteína de IL-21 y el resto heterólogo puede lograrse mediante enlaces químicos covalentes, por ejemplo enlaces peptídicos, enlaces de disulfuro, y similares, o mediante fuerzas físicas, tales como interacciones electrostáticas, de hidrógeno, iónicas, de van der Waals, o hidrófobas o hidrófilas.

Se puede usar una variedad de sistemas de acoplamiento no covalentes, que incluyen, por ejemplo, biotina-avidina, ligando/receptor, enzima/sustrato, ácido nucleico/proteína de unión a ácido nucleico, lípido/proteína de unión a lípido, parejas de moléculas de adhesión celular; o cualquiera de las parejas de unión o fragmentos de las mismas que tienen afinidad entre sí.

La muteína de IL-21 se puede enlazar a un resto de conjugado a través de un enlace covalente directo haciendo reaccionar restos de aminoácidos específicos de la muteína de IL-21 con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los restos N- o C-terminales de estos aminoácidos específicos. Los grupos reactivos en la muteína de IL-21 o resto de conjugado incluyen, por ejemplo, un grupo aldehído, amino, éster, tiol, a-haloacetilo, maleimido, o hidrazino. Los agentes derivatizantes incluyen, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, u otros agentes conocidos en la técnica. Alternativamente, los restos de conjugados se pueden unir a la muteína de IL-21 indirectamente a través de portadores intermedios, tales como portadores polisacáridos o polipeptídicos. Los ejemplos de portadores polisacáridos incluyen aminodextrano. Los ejemplos de portadores polipeptídicos adecuados incluyen polilisina, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, copolímeros de los mismos, y polímeros mixtos de estos aminoácidos y otros, por ejemplo serinas, para conferir propiedades de solubilidad deseables al portador cargado resultante.

Los restos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético, cloroacetamida para dar derivados de carboximetilo o carboxamidometilo. Los restos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metilo y 2-piridilo, pcloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Residuos de histidilo se derivatizan por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0, ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil bromuro de parabromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los restos de lisinilo y amino-terminales se hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otro ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de residuos de tirosilo se puede realizar, con particular interés, en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (RN=C=N-R'), en las que R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), desamidación de asparagina o glutamina, acetilación de la amina N-terminal, y/o amidación o esterificación del grupo ácido carboxílico C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a la muteína de IL-21. El o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos método se describen en WO87/05330 publicado el 11 Sep. 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

El resto heterólogo se puede unir a la muteína de IL-21 como se describe aquí a través de un enlazador. El enlazador puede comprender una cadena de átomos de 1 a alrededor de 60, o 1 a 30 átomos o más, 2 a 5 átomos, 2 a 10 átomos, 5 a 10 átomos, o 10 a 20 átomos de longitud. Los átomos de la cadena pueden ser todos átomos de carbono. Los átomos de la cadena en el esqueleto del enlazador se pueden seleccionar del grupo que consiste en C, O, N, y S. Los átomos de la cadena y los enlazadores se pueden seleccionar según su solubilidad esperada (hidrofilia) para proporcionar un conjugado más soluble. El enlazador puede proporcionar un grupo funcional que está sujeto a escisión por una enzima u otro catalizador, o a condiciones hidrolíticas que se encuentran en el tejido u órgano o célula diana. La longitud del enlazador puede ser lo suficientemente larga para reducir el potencial de impedimento estérico. Si el enlazador es un enlace covalente o un enlace peptídico, y el conjugado es un polipéptido, todo el conjugado puede ser una proteína de fusión. Tales enlazadores de peptidilo pueden tener cualquier longitud. Los enlazadores de peptidilo ejemplares tienen una longitud de alrededor de 1 a 50 aminoácidos, 5 a 50, 3 a 5, 5 a 10, 5 a 15, o 10 a 30 aminoácidos de longitud, y son flexibles o rígidos. El enlazador puede ser un péptido que comprende alrededor de 2 a alrededor de 20 aminoácidos. El enlazador puede ser un péptido que comprende alrededor de 2 a alrededor de 15 aminoácidos, alrededor de 2 a alrededor de 10 aminoácidos, o alrededor de 2 a alrededor de 5 aminoácidos. Los enlazadores peptídicos adecuados son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Chen et al., Adv Drug Delivery Reviews 65(10): 1357-1369 (2013); Arai et al., Protein Eng Des Sel 14(8): 529-532 (2001); y Wriggers et al., Curr Trends in Peptide Science 80(6): 736-746 (2005). El enlazador puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS (SEQ iD NO: 262).

Proteínas de fusión

La muteína de IL-21 se puede enlazar a un polipéptido que es distinto de cualquiera de las muteínas de IL-21 descritas aquí, y el conjugado puede ser un polipéptido de fusión o una proteína de fusión, o una proteína quimérica o un polipéptido quimérico. Por consiguiente, se describen aquí polipéptidos de fusión o proteínas de fusión que comprenden una muteína de IL-21 como se describe aquí y un polipéptido o péptido heterólogo. La proteína de fusión como se describe aquí puede comprender una muteína de IL-21 como se describe aquí enlazada a una proteína de unión a antígeno. La proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o inmunoglobulina, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o un producto de proteína de anticuerpo.

Colectivamente, los anticuerpos forman una familia de proteínas plasmáticas conocidas como inmunoglobulinas, y comprenden dominios de inmunoglobulina (Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed., Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, 1999. Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que tiene un formato de inmunoglobulina convencional, que comprende cadenas pesadas y ligeras, y que comprende regiones variables y constantes. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser una IgG que es una estructura "en forma de Y" de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (que normalmente tiene un peso molecular de alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (que normalmente tiene un peso molecular de alrededor de 50-70 kDa). Un anticuerpo tiene una región variable y una región constante. En los formatos de IgG, la región variable generalmente tiene alrededor de 100-110 o más aminoácidos, comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), es principalmente responsable del reconocimiento de antígenos, y varía sustancialmente entre otros anticuerpos que se unen a diferentes antígenos. La región constante permite que el anticuerpo reclute células y moléculas del sistema inmunitario. La región variable está formada por las regiones N-terminales de cada cadena ligera y cadena pesada, mientras que la región constante está formada por las porciones C-terminales de cada una de las cadenas pesada y ligera. (Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).

La estructura general y las propiedades de las CDR de anticuerpos se han descrito en la técnica. Brevemente, en un armazón de anticuerpo, las CDR están incrustadas dentro de un marco en la región variable de la cadena pesada y ligera en la que constituyen las regiones en gran parte responsables de la unión y reconocimiento del antígeno. Una región variable normalmente comprende al menos tres CDR de cadena pesada o ligera (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; see also Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de una región marco (regiones marco designadas 1 -4, FR1, FR2, FR3, y FR4, por Kabat et al., 1991; véase también Chothia y Lesk, 1987, más arriba).

Los anticuerpos pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero sin limitarse a, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. IgM tiene subclases, que incluyen, pero no se limitan a, IgM1 e IgM2. La presente descripción incluye todas esas clases o isotipos de anticuerpos. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma, o mu, por ejemplo una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma, o mu humana. Por consiguiente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo de isotipo IgA, IgD, IgE, IgG, o IgM, incluyendo uno cualquiera de IgG 1, IgG2, IgG3, o IgG4.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. El anticuerpo puede comprender una secuencia que es sustancialmente similar a un anticuerpo natural producido por un mamífero, por ejemplo ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, y similares. A este respecto, el anticuerpo se puede considerar como un anticuerpo de mamífero, por ejemplo un anticuerpo de ratón, un anticuerpo de conejo, un anticuerpo de cabra, un anticuerpo de caballo, un anticuerpo de pollo, un anticuerpo de hámster, un anticuerpo humano, y similares. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene dominios de dos o más anticuerpos diferentes. Un anticuerpo quimérico puede contener, por ejemplo, los dominios constantes de una especie y los dominios variables de una segunda, o más generalmente, puede contener tramos de secuencia de aminoácidos de al menos dos especies. Un anticuerpo quimérico también puede contener dominios de dos o más anticuerpos diferentes dentro de la misma especie. El término "humanizado", cuando se usa con respecto a anticuerpos, se refiere a anticuerpos que tienen al menos regiones CDR de una fuente no humana que se manipulan para tener una estructura y una función inmunológica más similares a los anticuerpos humanos verdaderos que los anticuerpos de la fuente original. Por ejemplo, la humanización puede implicar injertar una CDR de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón, en un anticuerpo humano. La humanización también puede implicar seleccionar sustituciones de aminoácidos para hacer que una secuencia no humana sea más similar a una secuencia humana.

Un anticuerpo puede escindirse en fragmentos mediante enzimas, tales como, por ejemplo, papaína y pepsina. La papaína escinde un anticuerpo para producir dos fragmentos Fab y un solo fragmento Fc. La pepsina escinde un anticuerpo para producir un fragmento F(ab')2 y un fragmento pFc'. La proteína de fusión de la presente descripción puede comprender un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. Como se usa aquí, la expresión "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" se refiere a una porción de una molécula de anticuerpo que es capaz de unirse al antígeno del anticuerpo, y también se conoce como "fragmento de unión a antígeno" o "porción de unión a antígeno". El fragmento de anticuerpo de unión a antígeno puede ser un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2.

La arquitectura de los anticuerpos se ha explotado para crear una gama cada vez mayor de formatos alternativos que abarcan un intervalo de pesos moleculares de al menos alrededor de 12-150 kDa, y tiene un intervalo de valencia (n) desde monomérico (n = 1) hasta dimérico (n = 2), trimérico (n = 3), tetramérico (n = 4), y potencialmente mayor; dichos formatos alternativos se denominan aquí "productos de proteína de anticuerpo". Los productos de proteína de anticuerpo incluyen aquellos basados en la estructura completa del anticuerpo, y aquellos que imitan fragmentos de anticuerpos que retienen la capacidad total de unión a antígeno, por ejemplo scFvs, Fabs, y VHH/VH (explicados más abajo). El fragmento de anticuerpo de unión a antígeno más pequeño que retiene su sitio de unión a antígeno completo es el fragmento Fv, que consiste completamente en regiones variables (V). Se usa un enlazador peptídico de aminoácido flexible y soluble para conectar las regiones V a un fragmento scFv (fragmento variable monocatenario) para la estabilización de la molécula, o los dominios constantes (C) se añaden a las regiones V para generar un fragmento Fab [fragmento, unión a antígeno]. Tanto los fragmentos scFv como Fab se pueden producir fácilmente en células hospedantes, por ejemplo células hospedantes procariotas. Otros productos de proteína de anticuerpo incluyen scFv estabilizado con enlaces de disulfuro (ds-scFv), Fab monocatenario (scFab), así como formatos de anticuerpos di- y multiméricos tales como dia-, tria- y tetra-cuerpos, o minicuerpos (miniAbs) que comprenden diferentes formatos que consisten en los scFv enlazados a dominios de oligomerización. Los fragmentos más pequeños son VHH/VH de los Ab de cadena pesada de camélidos, así como los Ab de un solo dominio (sdAb). El bloque de construcción que se usa con más frecuencia para crear nuevos formatos de anticuerpos es el fragmento de anticuerpo de dominio variable (V) monocatenario (scFv), que comprende dominios V de la cadena pesada y ligera (dominio VH y VL) enlazados por un enlazador peptídico de ~ 15 restos de aminoácidos. Una pepticuerpo o fusión péptido-Fc es aún otro producto de proteína de anticuerpo. La estructura de un pepticuerpo consiste en un péptido biológicamente activo injertado en un dominio Fc. Los pepticuerpos están bien descritos en la técnica. Véase, por ejemplo, Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).

Otros productos de proteína de anticuerpo incluyen un anticuerpo monocatenario (SCA); un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; anticuerpos biespecíficos o triespecíficos, y similares. Los anticuerpos biespecíficos se pueden dividir en cinco clases principales: BsIgG, IgG con apéndice, fragmentos de BsAb, proteínas de fusión biespecíficas, y conjugados de BsAb. Véase, por ejemplo, Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Part A: 97-106 (2015).

La proteína de fusión como se describe aquí puede comprender uno cualquiera de estos productos de proteína de anticuerpo. La proteína de fusión como se describe aquí puede comprender uno cualquiera de un scFv, Fab VHH/VH, fragmento Fv, ds-scFv, scFab, anticuerpo dimérico, anticuerpo multimérico (por ejemplo, un diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo), miniAb, pepticuerpo VHH/VH de anticuerpo de cadena pesada de camélido, sdAb, diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un anticuerpo biespecífico o triespecífico, BsIgG, IgG con apéndice, fragmento de BsAb, proteína de fusión biespecífica, y conjugado de BsAb.

La proteína de fusión como se describe aquí puede comprender un producto de proteína de anticuerpo en forma monomérica, o en forma polimérica, oligomérica, o multimérica. Cuando el anticuerpo comprende dos o más fragmentos de regiones de unión a antígeno distintas, el anticuerpo puede considerarse biespecífico, triespecífico, o multiespecífico, o bivalente, trivalente, o multivalente, según el número de epítopos distintos que reconozcan y a los que se unan.

El anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, o producto de proteína de anticuerpo puede unirse a un antígeno tumoral. El antígeno tumoral puede ser un antígeno derivado de una proteína viral, un antígeno derivado de mutaciones de punto, o un antígeno codificado por un gen de la línea germinal del cáncer. El antígeno tumoral puede ser p53, KRAS, NRAS, MAGEA, MAGEB, MAGEC, BAGE, GAGE, LAGE/NY-ESO1, SSX, tirosinasa, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, Tr P2, CEA, RAGE-1, HER2/NEU, WT1. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, o producto de proteína de anticuerpo de la proteína de fusión como se describe aquí puede unirse a un agente de inmunoterapia, o es un agente de inmunoterapia, como se describe aquí. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, o producto de proteína de anticuerpo de la proteína de fusión como se describe aquí puede unirse a una citocina, linfocina, factor de crecimiento, o factor hematopoyético, como se describe aquí.

La proteína de fusión como se describe aquí puede comprender una citocina (por ejemplo, una muteína de IL-21 descrita aquí) y un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo, que se une a una proteína de la ruta de punto de control inmunitario, un antígeno tumoral, una citocina, linfocina, factor de crecimiento, u otro factor hematopoyético, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los descritos aquí. La proteína de fusión de la presente descripción puede comprender una citocina (por ejemplo, una muteína de IL-21 descrita aquí) y un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo, que se une a una proteína de la ruta de punto de control inmunitario seleccionada del grupo que consiste en: CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CEACAM-1, TIGIT, LAG3, CD112, CD112R, CD96, T iM3, BTLA, o receptor co-estimulador: ICOS, OX40, 41BB, CD27, GITR.

La proteína de fusión de la presente descripción puede comprender una citocina y un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) que se une a una proteína de la ruta de punto de control inmunitario. Las citocinas adecuadas incluyen, por ejemplo, citocinas que potencian las respuestas de tipo TH-1; y citocinas que activan STAT 1, 3, 4, o 5. La citocina puede ser una interleucina. La citocina puede ser una interleucina que potencia la actividad de las células T, tal como, por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, o IL-21. Tales citocinas pueden modificarse (por ejemplo, mediante mutaciones) para atenuar su afinidad por su receptor respectivo. Tales muteínas pueden exhibir perfiles de seguridad mejorados al reducir las interacciones no deseadas y distintas de las pretendidas. De este modo, las citocinas pueden modificarse para generar muteínas de IL-2, IL-7, lL-10, IL-12, IL-15, o IL-21. La citoquina puede ser una muteína de IL-21 descrita aquí. Los anticuerpos adecuados (o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos) que se unen a una proteína de la ruta de punto de control inmunitario incluyen, por ejemplo, aquellos que se unen a Ct LA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, TIGIT, LAG3, CD112 TIM3, BTLA, o receptor coestimulador: ICOS, OX40, 41BB, o GITR. El anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede unirse a PD-1 (por ejemplo, PD-1 humano).

La proteína de fusión como se describe aquí puede ser una proteína de fusión multiespecífica que comprende una citocina, un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo), y al menos un resto dianizador adicional. Por ejemplo, la proteína de fusión como se describe aquí puede ser una proteína de fusión triespecífica que comprende una citocina, un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo), y un resto dianizador adicional.

La proteína de fusión como se describe aquí puede comprender una muteína de IL-21 descrita aquí y un antagonista de unión a PD-1. La expresión "antagonista de unión a PD-1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula, o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con una o más de sus parejas de unión, tales como PD-L1, PD-L2. El antagonista de unión a PD-1 puede ser una molécula que inhiba la unión de PD-1 a una o más de sus parejas de unión. El antagonista de unión a PD-1 puede inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos, y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan, o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. Un antagonista de unión a PD-1 puede reducir la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T mediada por señalización a través de PD-1 para hacer que una célula T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, mejorando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). El antagonista de unión a PD-1 puede ser un anticuerpo anti-PD-1. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 incluyen nivolumab (BMS-936558), pembrolizumab (MK-3475), BMS 936558, BMS- 936559, TSR-042 (Tesaro), ePDR001 (Novartis), y pidilizumab (CT-011). Más abajo se proporcionan ejemplos específicos adicionales de antagonistas de unión a PD-1.

El antagonista de unión a PD-1 puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una proteína de unión a antígeno que se une a PD-1. La proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o un producto de proteína de anticuerpo, que se une a PD-1.

La proteína de fusión como se describe aquí puede comprender una muteína de IL-21, como se describe aquí, y un anticuerpo anti-PD-1 (como se describe aquí), un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o un producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser una IgG monoclonal. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede ser monovalente o bivalente. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede unirse a PD-1 humano, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 263. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede unirse a PD-1 de cinomolgo, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 264. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 se puede unir tanto a PD-1 humano como a PD-1 de cinomolgo. La proteína de fusión comprende una muteína de IL-21 (como se describe aquí) y un anticuerpo anti-PD-1 (como se describe aquí).

La fuerza de unión del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 a PD-1 se puede describir en términos de Kd. La Kd del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 proporcionado aquí puede ser alrededor de 10-1 M, alrededor de 10-2 M, alrededor de 10-3 M, alrededor de 10-4 M, alrededor de 10-5 M, alrededor de 10-6 M, alrededor de 10-7 M, alrededor de 10-8 M, alrededor de 10-9 M, o menos. La Kd del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 como se describe aquí puede ser micromolar, nanomolar, picomolar, o femtomolar. La Kd del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 como se describe aquí puede estar dentro de un intervalo de alrededor de 10-4 a 10-6 M, o 10-7 a 10-9 M, o 10-10 a 10-12 M, o 10 13 a 10-15 M. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una alta afinidad por PD-1 humano, PD-1 de cinomolgo, o ambos. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una Kd para PD-1 humano de menos de 100 pM, opcionalmente alrededor de 1 pM a alrededor de 50 pM. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una Kd para PD-1 humano dentro de alrededor de 1 pM hasta alrededor de 20 pM, o menor que alrededor de 10 pM. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una Kd para PD-1 de cinomolgo de menos de 100 pM, opcionalmente alrededor de 1 pM a alrededor de 75 pM. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede tener una Kd para PD-1 de cinomolgo dentro de alrededor de 1 pM hasta alrededor de 20 pM, o menor que 10 pM.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede ser un antagonista de la unión de PD-1 que disminuye, bloquea, inhibe, anula, o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con una o más de sus parejas de unión, tales como PD-L1, PD-L2. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede bloquear la unión de PD-1 a su ligando PD-L1 o PD-L2. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede inhibir al menos el 50% de las interacciones de unión entre PD-1 y PD-L1 o PD-L2. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede exhibir al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, o al menos alrededor de 70% de inhibición de la interacción de unión entre PD -1 y PD-L1 o PD-L2.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede inhibir la producción de IL-2 mediada por PD-1 por células T en una reacción de linfocitos mixtos (MLR). La IC50 del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 en la MLR puede estar dentro de alrededor de 0,1 nM a alrededor de 5 nM. La IC50 del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 en la MLR puede ser menor que 2 nM o menor que 1 nM. La IC50 del anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 en la MLR puede ser alrededor de 0,5 nM a alrededor de 2 nM.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de región 1 determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HC) seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, (véase la Tabla D), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de HC CDR2 seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, (véase la Tabla D), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de HC CDR3 seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374 y 384, (véase la Tabla D), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375 y 385, (véase la Tabla D), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de LC CDR2 seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 y 386, (véase la Tabla D), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de LC CDR3 seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377 y 387, (véase la Tabla D), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, o seis cualquiera de (a)-(f). El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales CDR.

TABLA D

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender una secuencia de aminoácidos de LC CDR1, una secuencia de aminoácidos de LC CDR2, y una secuencia de aminoácidos de LC CDR3 expuestas en la Tabla D, y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de HC CDR expuestas en la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender una secuencia de aminoácidos de HC CDR1, una secuencia de aminoácidos de HC CDR2, y una secuencia de aminoácidos de HC CDR3 expuestas en la Tabla D, y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de LC CDR expuestas en la Tabla D. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales CDR.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender 3, 4, 5, o las 6 secuencias de aminoácidos designadas por las SEQ ID NOs: en una sola columna de la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender cada una de las secuencias de aminoácidos de LC CDR designadas por las SEQ ID NOs: de una sola columna de la Tabla D, y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de HC CDR designadas por las SEQ ID NOs: en la misma columna única o en otra columna única de la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender cada una de las secuencias de aminoácidos de HC CDR designadas por las SEQ ID NOs: de una sola columna de la Tabla D, y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de LC CDR designadas por las SEQ ID NOs: en la misma columna única o en otra columna única de la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1 (o antígeno fragmento de anticuerpo de unión del mismo) puede comprender seis secuencias de aminoácidos CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332 337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; y (h) SEQ ID NOs: 382-387. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender las 6 secuencias de aminoácidos de CDR en la Tabla D para uno cualquiera de los anticuerpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006, o 22D4.017. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales CDR.

Las secuencias de aminoácidos de la Tabla D pueden estar separadas por al menos uno o más (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) aminoácidos intermedios. Puede haber alrededor de 10 a alrededor de 20 aminoácidos entre las secuencias de la LC CDR1 y la LC CDR2, y alrededor de 25 a alrededor de 40 aminoácidos entre las secuencias de la LC CDR2 y la LC CDR3. Puede haber alrededor de 14 a alrededor de 16 aminoácidos entre las secuencias de la LC CDR1 y la LC CDR2, y alrededor de 30 a alrededor de 35 aminoácidos entre las secuencias de la LC CDR2 y la LC CDR3. Puede haber alrededor de 10 a alrededor de 20 aminoácidos entre las secuencias de la HC CDR1 y la HC CDR2, y alrededor de 25 a alrededor de 40 aminoácidos entre las secuencias de la HC CDR2 y la HC CDR3. Puede haber alrededor de 14 a alrededor de 16 aminoácidos entre las secuencias de la HC CDR1 y la HC CDR2, y alrededor de 30 a alrededor de 35 aminoácidos entre las secuencias de la HC CDR2 y la HC CDR3.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378 y 388, (véase la Tabla E), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379 y 389, (véase la Tabla E), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales regiones variables.

TABLA E

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 y 390, (véase la Tabla E), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: 321,331,341,351,361,371,381 y 391, (véase la Tabla E), o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales regiones variables.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEQ ID NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEQ ID NOs: 380 y 381; y (h) SEQ ID NOs: 390 y 391. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales regiones.

Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) pueden comprender un conjunto de mutaciones de pares de carga, como se describe aquí. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) pueden comprender mutaciones de pares de carga seleccionadas de mutaciones de pares de carga V1, V103 y V131.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es similar a una secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente, aunque la proteína de unión a antígeno conserva sustancialmente su función biológica, por ejemplo su capacidad para unirse a PD-1, por ejemplo PD-1 humano, PD-1 de cinomolgo, o para disminuir, bloquear, inhibir, anular, o interferir con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con una o más de sus parejas de unión, tales como PD-L1 o PD-L2.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto proteico del anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere en solo 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más aminoácidos, con respecto a la o las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto proteico del anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante difiere en solo uno o dos aminoácidos, con respecto a la secuencia mencionada. La proteína de unión a antígeno puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos que se producen fuera de las CDR, por ejemplo la una o más sustituciones de aminoácidos se producen dentro de la o las regiones marco de la cadena pesada o ligera. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos, aunque la proteína de unión a antígeno conserva las secuencias de aminoácidos de las seis CDR. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto proteico del anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más sustituciones conservativas de aminoácidos, con respecto a la o las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene más de o alrededor de 30%, más de o alrededor de 50%, o más de o alrededor de 70% de identidad de secuencia con la o las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. La proteína de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o tiene más de 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. La proteína de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o tiene más de 90% de identidad de secuencia a lo largo de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. La proteína de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a lo largo de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto proteico del anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto proteico del anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos 0 alrededor de 80% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto proteico del anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos o alrededor de 90% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto proteico del anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos o alrededor de 95% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender una, dos, tres, cuatro, o cinco secuencias de las SEQ ID NOs. en una sola columna de la Tabla D, y al menos una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 312-387. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender una, dos, tres, cuatro, o cinco secuencias de un conjunto de secuencias seleccionadas de: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; y (h) SEQ ID NOs: 382-387, en las que el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además al menos una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias del conjunto. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender cuatro secuencias de SEQ ID NOs: 312-317, a saber, SEQ ID NOs: 312-315, en las que el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además al menos dos secuencias variante: una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 316, y otra secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 317. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales regiones.

El producto de anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias variantes que tienen al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 318, 319, 328, 329, 338, 339, 348, 349, 358, 359, 368, 369, 378, 379, 388, y 389. El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender un par de secuencias variantes que tienen al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con (a) SEQ ID Nos: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias: una secuencia de la Tabla E, y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 318, 319, 328, 329, 338, 339, 348, 349, 358, 359, 368, 369, 378, 379, 388, y 389. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias: una secuencia seleccionada de (a) SeQ ID NOs: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389, y otra secuencia que puede ser una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia a una secuencia de (a) -(u). Por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 318, y puede comprender además una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO 319. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales regiones.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias variantes que tienen al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 320, 321, 330, 331, 340, 341, 350, 351, 360, 361, 370, 371, 380, 381, 390, y 391. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias variantes que tienen al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEQ ID NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEQ ID NOs: 380 y 381; y (h) SEQ ID NOs: 390 y 391. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprenden un par de secuencias: una secuencia de la Tabla E, y otra secuencia que puede ser una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 320, 321,330, 331,340, 341,350, 351,360, 361,370, 371,380, 381,390, y 391. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias: una secuencia seleccionada de (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEQ ID NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEQ ID NOs: 380 y 381; y (h) SEQ ID NOs: 390 y 391, y otra secuencia que puede ser una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia a una secuencia de (a) - (u). Por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 320, y puede comprender además una secuencia variante que tiene al menos o alrededor de 70% (por ejemplo, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO 321. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales regiones.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos, con respecto a la contraparte natural, a fin de mejorar la vida media/estabilidad o hacer al anticuerpo más estable para la expresión/fabricabilidad (por ejemplo, como una proteína de fusión con la muteína de IL-21). El anticuerpo anti-PD-1 puede diseñarse para prevenir o reducir la interacción entre el anticuerpo anti-PD-1 y los receptores Fc. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser un anticuerpo Sin Función Efectora Estable (SEFL), que comprende una región constante que carece de la capacidad para interactuar con receptores Fcy. Los anticuerpos SEFL son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Liu et al., J Biol Chem 292: 1876-1883 (2016); y Jacobsen et al., J. Biol. Chem. 292: 1865-1875 (2017). El anticuerpo SEFL puede comprender una o más de las siguientes mutaciones, numeradas según el sistema UE: L242C, A287C, R292C, N297G, V302C, L306C, y/o K334C. El anticuerpo SEFL puede comprender N297G. El anticuerpo SEFL puede comprender A287C, N297G, y L306C. El anticuerpo SEFL puede comprender R292C, N297G, y V302C (es decir, SEFL2-2).

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender otras modificaciones de extensión de la vida media (HLE). La modificación HLE puede ocurrir en la región constante de cadena pesada, y puede comprender una o más de las siguientes mutaciones, numeradas según el sistema UE: M252Y, S254T, y T256E. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una o dos de M252Y, S254T, y T256E. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender las tres M252Y, S254T y T256E. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 545 o SEQ ID NO: 547 o SEQ ID NO: 549 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 545 o SEQ ID NO: 547 o SEQ ID NO: 549. La modificación HLE puede ocurrir en la región constante de cadena pesada, y comprende una o más de las siguientes mutaciones, numeradas según el sistema UE: L309D, Q311H, y N434S. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una, dos, o las tres L309D, Q311H y N434S. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender las tres L309D, Q311H y N434S. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 544 o SEQ ID NO: 546 o SEQ ID NO: 548 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ iD NO: 544 o SEQ ID NO: 546 o SEQ ID NO: 548.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender modificaciones SEFL2-2 y modificaciones HLE. Las modificaciones de HLE pueden comprender una, dos, o las tres M252Y, S254T y T256E. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 551 o SEQ ID NO: 553 o SEQ ID NO: 555 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 551 o SEQ ID NO: 553 o SEQ ID NO: 555. Las modificaciones de h Le pueden comprender una, dos, o las tres L309D, Q311H y N434S. La región constante de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 550 o SEQ ID NO: 552 o SEQ ID NO: 554 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 550 o SEQ ID NO: 552 o SEQ ID NO: 554. La cadena pesada puede comprender adicionalmente mutaciones de pares de carga como se describe más abajo.

En células eucariotas, ocurren dos tipos de reacciones de glicosilación: (1) glicosilación ligada a N, en la que los glicanos se unen a la asparagina de la secuencia de reconocimiento Asn-X-Thr/Ser, en la que "X" es cualquier aminoácido excepto prolina, y (2) glicosilación ligada a O, en la que los glicanos se unen a serina o treonina. La glicosilación ligada a N comienza en el retículo endoplasmático (RE), en el que un conjunto complejo de reacciones da como resultado la unión de una estructura central de glicano compuesta esencialmente por dos restos de GlcNAc y tres restos de Man. El complejo de glicano formado en el RE se modifica por la acción de enzimas en el aparato de Golgi. Si el sacárido es relativamente inaccesible para las enzimas, generalmente permanece en la forma HM original. Si las enzimas pueden acceder al sacárido, entonces muchos de los restos de Man se escinden y el sacárido se modifica aún más, lo que da como resultado la estructura de N-glicanos de tipo complejo. Por ejemplo, la manosidasa-1 ubicada en el cis-Golgi, puede escindir o hidrolizar un glicano HM, mientras que la fucosiltransferasa FUT-8, ubicada en el Golgi medio, fucosila el glicano (Hanrue Imai- Nishiya (2007), BMC Biotechnology, 7 :84). En aspectos ejemplares, el anticuerpo anti-PD-1 está N-glicosilado, por ejemplo comprende uno o más restos de azúcar (por ejemplo, glicanos, sacáridos) unidos covalentemente a un aminoácido específico de la cadena pesada. En aspectos alternativos, el anticuerpo anti-PD-1 no está glicosilado o no comprende restos de azúcar (por ejemplo, glicanos, sacáridos) unidos covalentemente a un aminoácido específico de la cadena pesada.

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, y además comprende un enlazador. El conector puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 262. De este modo, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 287, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 287. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, con el Lys C-terminal recortado o eliminado. A este respecto, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que carece de Lys C-terminal y puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 285, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 285. En general, la lisina C-terminal de un anticuerpo sufre escisión por la carboxipeptidasa durante la expresión. Una región constante de cadena pesada que carece de la Lys C-terminal evita ventajosamente que la carboxipeptidasa actúe sobre la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que carece de la Lys C-terminal, y además puede comprender un enlazador. El conector puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 262. De este modo, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 286, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 286. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, y con una o más mutaciones SEFL que previenen o reducen la interacción entre el anticuerpo anti-PD-1 y los receptores Fc, incluyendo, entre otras, L242C, A287C, R292C, N297G, V302C, L306C, y/o K334C. Las mutaciones SEFL pueden ser mutaciones SEFL2-2: R292C, N297G, y V302C, de modo que el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 265, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 265. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada con mutaciones SEFL2-2 y con la Lys C-terminal recortada o eliminada. Tal región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 266. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada con mutaciones SEFL2-2, la Lys C-terminal recortada o eliminada, y un enlazador. Tal región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 267. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada con mutaciones SEFL2-2 y un enlazador sin la Lys C-terminal recortada. Tal región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 282.

La muteína de IL-21 puede unirse al Fc del anticuerpo anti-PD-1. La muteína de IL-21 puede unirse a una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. La muteína de IL-21 puede unirse al extremo C de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo.

La proteína de fusión puede comprender solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21). La muteína de IL-21 puede unirse al extremo C de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21, el Fc del anticuerpo puede comprender modificaciones diseñadas para impulsar la heterodimerización de las dos cadenas pesadas (una cadena pesada fusionada con la muteína de IL-21, y una cadena pesada que carece de la muteína de IL-21). Dichas modificaciones incluyen mutaciones de Fc tales como botones en agujeros (knobs-into-holes), DuoBodies, Azymetric, par de carga, HA-TF, SEEDbody, y modificaciones con afinidad diferencial por la proteína A. Véase, por ejemplo, Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2, Part A), 2015, pp. 95-106. Las mutaciones de botones en agujeros incluyen T366W en la primera cadena pesada, y T366S, L368A, y/o Y407V en la segunda cadena pesada. Véase, por ejemplo, Ridgway et al., Protein Eng., 9 (1996), pp. 617-621; and Atwell et al., J. Mol. Biol., 270 (1997), pp. 26-35. Las mutaciones DuoBody incluyen F405L en la primera cadena pesada, y K409R en la segunda cadena pesada. Véase, por ejemplo, Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110 (2013), pp. 5145-5150. Las mutaciones Azymetric incluyen T350V, L351Y, f405A, y/o Y407V en la primera cadena pesada, y T350V, T366L, K392L, y/o T394W en la segunda cadena pesada. Véase, por ejemplo, Von Kreudenstein et al., mAbs, 5 (2013), pp. 646-654. Las mutaciones HA-TF incluyen S364H y/o F405A en la primera cadena pesada, y Y349T y/o T394F en la segunda cadena pesada. Véase, por ejemplo, Moore et al., mAbs, 3 (2011), pp. 546-557. Las mutaciones SEEDbody incluyen mutaciones de quimera IgG/A en la primera cadena pesada, y mutaciones de quimera IgG/A en la segunda cadena pesada. Véase, por ejemplo, Davis et al., Protein Eng. Des. Sel., 23 (2010), pp. 195-202. Las mutaciones de afinidad diferencial por la proteína A incluyen H435R en una cadena pesada, y ninguna mutación en la otra cadena pesada. Véase, por ejemplo, Patente US No. 8.586.713.

En un ejemplo particular, las mutaciones son mutaciones de pares de carga. Los siguientes son ejemplos de tales mutaciones de pares de carga, numeradas según el sistema UE. Las mutaciones de pares de carga incluyen K409D en la primera cadena pesada y D399K en la segunda cadena pesada; K392D en la primera cadena pesada y E356K en la segunda cadena pesada; o tanto K409D como K392D en la primera cadena pesada y tanto D399K como E356K en la segunda cadena pesada (la última indicada aquí como "V1"). Véase, por ejemplo, Gunasekaran et al., J Biol Chem 285: 19637-19646 (2010). En otro ejemplo particular, las mutaciones de pares de cargas incluyen K439D, K392D y K409D en la primera cadena pesada; y E356K y D399K en la segunda cadena pesada (indicada aquí como "VI03"). En aún otro ejemplo particular, las mutaciones de pares de cargas incluyen K360E, K370E, K392E, y K409D en la primera cadena pesada; y E357K y D399K en la segunda cadena pesada (indicada aquí como "V131"). Las mutaciones de pares de carga también pueden incluir K370D en la primera cadena pesada y E357K en la segunda cadena pesada; o las tres K409D, K392D y K370D en la primera cadena pesada y las tres D399K, E357K y E356K en la segunda cadena pesada (la última indicada aquí como "V4"). Las mutaciones de pares de carga adicionales también incluyen D221E, P228E, y/o L368E en la primera cadena pesada, y D221R, P228R, y/o K409R en la segunda cadena pesada. Véase, por ejemplo, Strop et al., J. Mol. Biol., 420 (2012), pp. 204-219.

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V1, la muteína de IL21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K409D y K392D (es decir, la muteína de IL-21 se puede unir a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 294, 296, o 298), o a la cadena pesada que contiene las mutaciones D399K y E356K (por ejemplo, la muteína de IL-21 se puede unir a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 295, 297, o 299. La muteína de IL-21 puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones D399K y E356K.

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V4, la muteína de IL-21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K409D, K392D, y K370D (es decir, la muteína de IL-21 se se une a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 288, 290, o 292), o a la cadena pesada que contiene las mutaciones D399K, E357K, y E356K (por ejemplo, la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 289, 291, o 293). La muteína de IL-21 puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones D399K, E357K, y E356K.

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V103, la muteína de IL-21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K439D, K392D, y K409D (es decir, la muteína de IL-21 se se une a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 472, 474, o 476), o a la cadena pesada que contiene las mutaciones E356K y D399K (por ejemplo, la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 473, 475, o 477). La muteína de IL-21 puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones E356K y D399K.

Cuando la proteína de fusión comprende solo una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un monómero de muteína de IL-21) y la cadena pesada contiene las mutaciones de pares de carga V131, la muteína de IL-21 se puede unir a la cadena pesada que contiene las mutaciones K360E, K370E, K392E, y K409D (es decir, la muteína de IL-21 se se une a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 478, 480, o 482), o a la cadena pesada que contiene las mutaciones E357K y D399K (por ejemplo, la muteína de IL-21 se une a una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 479, 481, o 483). La muteína de IL-21 puede unirse a la cadena pesada que contiene las mutaciones E357K y D399K.

De este modo, el anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un conjunto de mutaciones de pares de carga, como se describe aquí. El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) pueden comprender mutaciones de pares de carga seleccionadas de mutaciones de pares de carga V1, V103 y V131.

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, con una o más mutaciones de pares de carga, por ejemplo las mutaciones de pares de carga V1, V4, V103 o V131. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V1, en el que una primera región constante de cadena pesada comprende las mutaciones K409 y K392D y una segunda región constante de cadena pesada comprende las mutaciones D399K y E356K. Tal primera región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 294, y tal segunda región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 295. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 296 y 297, respectivamente. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal recortada o eliminada y un enlazador, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 298 y 299, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V1 y mutaciones SEFL2-2. Tal primera región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V1 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 306, y tal segunda región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V1 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 307. Se contemplan variaciones adicionales de tales cadenas pesadas primera y segunda, incluyendo, por ejemplo, cadenas pesadas con la Lys C-terminal recortada o eliminada (SEQ ID NOs: 308 y 309) y con la Lys C-terminal recortada o eliminada con un enlazador (SEQ ID NO: 310 y 311).

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V4, en el que una primera región constante de cadena pesada comprende las mutaciones K409, K392D, y K370D y una segunda región constante de cadena pesada comprende las mutaciones D399K, E356K, y E357K. Tal primera región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 288, y tal segunda región constante de cadena pesada puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 289. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 290 y 291, respectivamente. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal recortada o eliminada y un enlazador, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 292 y 293, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V4 y mutaciones SEFL2-2. Tal primera región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V4 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 300, y tal segunda región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V4 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 301. Se contemplan variaciones adicionales de tales cadenas pesadas primera y segunda, incluyendo, por ejemplo, cadenas pesadas con la Lys C-terminal recortada (SEQ ID NOs: 302 y 303) y con la Lys C-terminal recortada o eliminada con un enlazador (SEq ID NO: 304 y 305).

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V103, en el que una primera región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 484, y una segunda región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 485. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 486 y 487, respectivamente. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal recortada o eliminada y un enlazador, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 488 y 489, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V103 y mutaciones SEFL2-2. Tal primera región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V103 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 484, y tal segunda región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V103 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 485. Se contemplan variaciones adicionales de tales cadenas pesadas primera y segunda, incluyendo, por ejemplo, cadenas pesadas con la Lys C-terminal recortada (SEQ ID NOs: 486 y 487) y con la Lys C-terminal recortada o eliminada con un enlazador (SEQ ID NO: 488 y 489).

El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 284, con mutaciones de pares de carga V131, en el que una primera región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 478, y una segunda región constante de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 479. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal cortada o eliminada, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 480 y 481, respectivamente. Tales primera y segunda regiones constantes de cadena pesada pueden tener la Lys C-terminal recortada o eliminada y un enlazador, de manera que la primera y la segunda regiones constantes de cadena pesada pueden comprender SEQ ID NO: 482 y 483, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región constante de cadena pesada que comprende mutaciones de pares de carga V131 y mutaciones SEFL2-2. Tal primera región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V131 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 490, y tal segunda región constante de cadena pesada, que comprende las mutaciones de pares de carga V131 y las mutaciones SEFL2-2, puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 491. Se contemplan variaciones adicionales de tales cadenas pesadas primera y segunda, incluyendo, por ejemplo, cadenas pesadas con la Lys C-terminal recortada (SEQ ID NOs: 492 y 493) y con la Lys C-terminal recortada o eliminada con un enlazador (SEQ ID NO: 494 y 495).

La proteína de fusión puede comprender más de una muteína de IL-21 (es decir, la proteína de fusión comprende un dímero de muteína de IL-21 o multímero de muteína de IL-21). La proteína de fusión puede comprender 2, 3, o 4 (o más) muteínas de IL-21. Cuando la proteína de fusión comprende más de una muteína de IL-21, cada muteína de IL21 puede comprender la misma estructura, por ejemplo la misma secuencia de aminoácidos. La proteína de fusión puede comprender un homodímero de IL-21 o un homomultímero de IL-21. Cada muteína de IL-21 de la proteína de fusión puede comprender una estructura diferente, por ejemplo una secuencia de aminoácidos diferente. La proteína de fusión puede comprender un heterodímero de IL-21 o un heteromultímero de IL-21. La proteína de fusión puede comprender dos muteínas de IL-21, en el que la primera muteína de IL-21 está unida al extremo C de la cadena pesada del primer anticuerpo, y la segunda muteína de IL-21 está unida al extremo C de la cadena pesada del segundo anticuerpo. Cada muteína de IL-21 puede tener la misma secuencia de aminoácidos (por ejemplo, es un homodímero de muteína de IL-21). La primera muteína de IL-21 puede tener una secuencia de aminoácidos diferente con respecto a la segunda muteína de IL-21 (por ejemplo, es un heterodímero de muteína de IL-21).

Con respecto a las proteínas de fusión que comprenden una o más muteínas de IL-21, cada muteína de IL-21 puede unirse a una de las cadenas pesadas del anticuerpo con o sin un enlazador. La muteína de IL-21 se puede unir al extremo C de una de las cadenas pesadas del anticuerpo a través de un enlazador, y el enlazador es un péptido. El péptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 262). La muteína de IL-21 puede unirse directamente al extremo C de una de las cadenas pesadas del anticuerpo sin un enlazador.

La proteína de fusión puede comprender solo una muteína de IL-21 que está unida directamente al extremo C de una de las cadenas pesadas del anticuerpo anti-PD-1. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos enumerada en la Tabla 4, o una secuencia de una SEQ ID NO: enumerada en la Tabla 4. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos enumerada en la Tabla 5, o una secuencia de una SEQ ID NO: enumerada en la Tabla 5. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 7, o una secuencia de una SEQ ID NO: enumerada en la Tabla 7. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos enumeradas en una cualquiera de las Tablas 6 y 8-14, o una secuencia de SEQ ID NO: enumerada en estas Tablas. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 159, 161, 238, 241, 242, o 244. La muteína de IL-21 puede unirse directamente al anticuerpo anti-PD-1 , y no no comprende un enlazador peptídico.

La proteína de fusión puede comprender dos muteínas de IL-21, cada una de las cuales está unida directamente al extremo C de una cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1, y cada una de las cuales tiene la misma secuencia de aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos enumerada en la Tabla 4, o una secuencia de una SEQ ID NO: enumerada en la Tabla 4. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos enumerada en la Tabla 5, o una secuencia de una SEQ ID NO: enumerada en la Tabla 5. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 7, o una secuencia de una SEQ ID NO: enumerada en la Tabla 7. La muteína de IL-21 puede comprender las sustituciones de aminoácidos enumeradas en una cualquiera de las Tablas 6 y 8-14, o una secuencia de SEQ ID NO: enumerada en estas Tablas. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 159, 161,237, 238, 241, y 244. La muteína de IL-21 puede unirse directamente al anticuerpo anti-PD-1, y no no comprende un enlazador peptídico.

La proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región constante de anticuerpo descrita aquí fusionada con una secuencia de aminoácidos de cualquier muteína de IL-21 descrita aquí. La proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región constante de anticuerpo descrita aquí, que no está glicosilada, fusionada con una secuencia de aminoácidos de cualquier muteína de IL-21 descrita aquí. La proteína de fusión puede comprender una región constante que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311,472-495, y 544-555, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311, 472-495, y 544-555, fusionada con una muteína de IL-21 que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SeQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283. La proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 268-281, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 268-281.

La proteína de fusión puede comprender una construcción como se describe en la Figura 4A, 4B, o 4C. La proteína de fusión puede comprender (i) un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) descrito aquí; y (ii) una muteína de IL-21 descrita aquí. La proteína de fusión puede comprender (i) un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) descrito aquí; (ii) una mutación de pares de carga descrita aquí; y (iii) una muteína de IL-21 descrita aquí (véase, por ejemplo, la Figura 4C). La proteína de fusión puede comprender (i) un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) descrito aquí, en el que las secuencias de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) no comprenden una lisina C-terminal; (ii) una mutación de pares de carga descrita aquí; y (iii) una muteína de IL-21 descrita aquí.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HC), expuesta en la Tabla D, seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de HC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de HC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374 y 384, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, y 385, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de LC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, y 386, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de LC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, y 387, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos cualquiera o más de (a)-(f). El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender una secuencia de aminoácidos de LC CDR1, una secuencia de aminoácidos de LC CDR2, y una secuencia de aminoácidos de LC CDR3, expuestas en la Tabla D, y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de HC CDR expuestas en la Tabla D. La proteína de unión a antígeno puede comprender 3, 4, 5, o 6 de las secuencias de aminoácidos designadas por las SEQ ID NOs: en una sola columna de la Tabla D. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322 327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; y (h) SEQ iD NOs: 382-387. El producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender tales regiones.

El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla E, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378, y 388, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera expuesta en la Tabla E, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, y 389, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). El anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo) puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389. La región constante del anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, y 284-311, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, y 284-311, fusionada con una muteína de IL-21 que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs: 3-21,23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283. El anticuerpo de unión a antígeno puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEQ ID NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEQ ID NOs: 380 y 381; y (h) SEQ ID NOs: 390 y 391. La proteína de fusión puede comprender (I) un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEq iD NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEq ID NOs: 380 y 381; y (h) SeQ ID NOs: 390 y 391, y (Il) una muteína de IL-21 que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114 208, 210-222, 224-255, y 283.

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4A, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 265 o 266), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 562, o SEQ ID NOs: 361 y 563. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 562). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 563).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4A, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 265 o 266), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 564, o SEQ ID NOs: 361 y 565. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 564). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 565).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4B, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (por ejemplo, SEQ ID NO: 267), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 566. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 566).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4B, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (por ejemplo, SEQ ID NO: 267), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 567. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 567).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355 357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 306 y 307, o SEQ ID NOs: 308 y 309), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs: 309), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 568. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 568), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 574).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355 357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 484 y 485, o SEQ iD NOs: 486 y 487), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V103 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 487), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 569. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 569), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 575).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355 357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 490 y 491, o SEQ iD NOs: 492 y 493), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E357K y D399K V131 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 493), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 570. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 570), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 576).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355 357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 306 y 307, o SEQ ID NOs: 308 y 309), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 309), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 571. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 571), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 574).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355 357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 484 y 485, o SEQ iD NOs: 486 y 487), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V103 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 487), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 572. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 572), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 575).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355 357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 490 y 491, o SEQ iD NOs: 492 y 493), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E357K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ iD NOs: 493), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 358, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 359. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 360, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 361. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 y 573. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 573), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 576).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4A, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 265 o 266), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 496, o SEQ ID NOs: 389 y 519. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 496). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 519).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4A, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 265 o 266), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 497, o SEQ ID NOs: 389 y 498. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y la fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 497). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 498).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4B, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (por ejemplo, SEQ ID NO: 267), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 499. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 499).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4B, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (por ejemplo, SEQ ID NO: 267), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 500. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 500).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385 387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 306 y 307, o SEQ ID NOs: 308 y 309), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 309), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 501. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 501, y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385 387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 484 y 485, o SEQ iD NOs: 486 y 487), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V103 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 487), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 502. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 502), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385 387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 490 y 491, o SEQ iD NOs: 492 y 493), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E357K y D399K V131 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 493), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 503. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 503), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385 387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 306 y 307, o SEQ ID NOs: 308 y 309), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 309), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 504. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 504), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385 387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 484 y 485, o SEQ iD NOs: 486 y 487), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V103 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 487), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 505. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 505), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385 387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 490 y 491, o SEQ iD NOs: 492 y 493), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E357K y D399K V131 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende una cualquiera de SEQ iD NOs: 493), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 390, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 391. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 y 506. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 506), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4A, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 265 o 266), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 507, o SEQ ID NOs: 369 y 508. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 507). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 508).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4A, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 265 o 266), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 509 o SEQ ID NOs: 369 y 510. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 509). La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 510).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4B, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (por ejemplo, SEQ ID NO: 267), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 511. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 511).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero como se muestra en la Figura 4B, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), las tres c Dr de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y cada cadena pesada comprende una secuencia de región constante que comprende mutaciones SEFL2-2 y un enlazador (por ejemplo, SEQ ID NO: 267), en la que cada una de las dos muteínas de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, cada una comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 512. La proteína de fusión puede comprender un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 306 y 307, o SEQ ID NOs: 308 y 309), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs: 309), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 513. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 513), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 484 y 485, o SEQ iD NOs: 486 y 487), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V103 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 487), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 514. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 514), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 490 y 491, o SEQ iD NOs: 492 y 493), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E357K y D399K V131 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 493), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76A (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 244). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 515. En pasectos ejemplares, la proteína de fusión comprende un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 515), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 561).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 306 y 307, o SEQ ID NOs: 308 y 309), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 309), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 516. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 516), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V103 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 484 y 485, o SEQ iD NOs: 486 y 487), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E356K y D399K V103 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ ID NOs: 487), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 517. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 517), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

La proteína de fusión puede comprender un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y un par de cadenas pesadas que comprenden secuencias de regiones constantes que comprenden mutaciones SEFL2-2 y mutaciones de pares de carga V131 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 490 y 491, o SEQ iD NOs: 492 y 493), en la que el monómero de muteína de IL-21 está unido a la cadena pesada que contiene las mutaciones de pares de carga E357K y D399K V1 (por ejemplo, el monómero de muteína de IL-21 está unido a una cadena pesada que comprende SEQ iD NOs: 493), y en la que la muteína de IL-21 comprende las sustituciones de aminoácidos R9E y R76E (es decir, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 245). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368, y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 370, o la cadena ligera de SEQ ID NO: 371. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 y 518. La proteína de fusión puede comprender un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 518), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 561).

La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, y un anticuerpo anti-PD-1 que comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y una secuencia de región constante de cadena pesada que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs 544-555. La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365 367), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), y una secuencia de región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 525 o 527.

La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y una secuencia de región constante de cadena pesada que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs 544-555. La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385 387), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), y una secuencia de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO 529 o 531.

La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y una secuencia de región constante de cadena pesada que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs 544-555. La proteína de fusión puede comprender un homodímero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4A o 4B, o un monómero de muteína de IL-21 como se muestra en la Figura 4C, en la que el anticuerpo anti-PD-1 comprende las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355 357), las tres CDR de cadena pesada del anticuerpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), y una secuencia de región constante de cadena pesada de SEQ ID NO 521 o 523.

Proteínas de unión a antígeno

Se describen aquí proteínas de unión al antígeno PD-1. La proteína de unión al antígeno PD-1 puede ser un anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1, descrito aquí. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HC), expuesta en la Tabla D, seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de HC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de HC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374 y 384, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, y 385, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de LC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, y 386, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de LC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, y 387, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos cualquiera o más de (a)-(f). El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos de LC CDR1, una secuencia de aminoácidos de LC CDR2, y una secuencia de aminoácidos de LC CDR3, expuestas en la Tabla D, y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de HC CDR expuestas en la Tabla D. La proteína de unión a antígeno puede comprender al menos 3, 4, o 5 de las secuencias de aminoácidos designadas por las SEQ ID NOs: en una sola columna de la Tabla D.

El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; y (h) SEQ ID NOs: 382-387. Las secuencias de aminoácidos de la Tabla D pueden estar separadas por al menos uno o más (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) aminoácidos intermedios. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla E, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en de: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378, y 388, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera expuesta en la Tabla E, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, y 389, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389. El anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1 puede comprender (I) un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389, y (II) una región constante que comprende una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311,472-495, y 544-555. El anticuerpo de unión a antígeno puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEQ ID NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEQ ID NOs: 380 y 381; y (h) SEQ ID NOs: 390 y 391. La proteína de unión a antígeno puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con una o más de las SEQ ID Nos: anteriores.

La proteína de unión a antígeno descrita anteriormente puede ser un anticuerpo anti-PD-1, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo.

Adicionalmente se describen conjugados que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1 descrita aquí y un resto heterólogo. El resto heterólogo puede ser cualquier molécula que sea diferente de la proteína de unión al antígeno PD-1 descrita aquí. El resto heterólogo puede ser un péptido o polipéptido heterólogo, un agente de direccionamiento, una marca de diagnóstico, un polímero, un ácido nucleico, un punto cuántico, una molécula pequeña, una toxina, un hidrato de carbono, un aminoácido, u otro agente terapéutico o de diagnóstico. El resto heterólogo puede ser una muteína de IL-21 como se describe aquí.

Adicionalmente se describen proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión al antígeno PD-1 descrita aquí y un péptido o polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo puede ser una muteína de IL-21 como se describe aquí.

Métodos para obtener anticuerpos

En la técnica se conocen métodos adecuados para obtener anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígenos, y productos de proteína de anticuerpos. Por ejemplo, los métodos de hibridoma estándar para producir anticuerpos se describen, por ejemplo, en Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y CA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Aquí en los EJEMPLOS se proporciona un método ejemplar para preparar anticuerpos monoclonales anti-PD-1 de la presente descripción.

Dependiendo de la especie hospedante, se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica que conduce a una mayor producción de anticuerpos por parte del hospedante. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, y dinitrofenol. BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente útiles.

Otros métodos de producción de anticuerpos se resumen en la Tabla F.

TABLA F

Los métodos para evaluar la capacidad de los anticuerpos para unirse a PD-1, independientemente de cómo se produzcan los anticuerpos, son conocidos en la técnica, e incluyen cualquier ensayo de unión antígeno-anticuerpo, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, SPR, y ensayos de inhibición competitiva (véanse, por ejemplo, Janeway et al., más abajo, y la Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2002/0197266, y el apartado anterior relativo a los ensayos de competición). Otros ensayos de unión, por ejemplo ensayos de unión competitiva o ensayos de competición, que evalúan la capacidad de un anticuerpo para competir con un segundo anticuerpo para unirse a un antígeno, o a un epítopo del mismo, son conocidos en la técnica, y pueden usarse para evaluar la capacidad de un anticuerpo para unirse a PD-1. Véanse, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. US20140178905, Chand et al., Biologicals 46: 168-171 (2017); Liu et al., Anal Biochem 525: 89 91 (2017); y Goolia et al., J Vet Diagn Invest 29(2): 250-253 (2017). También, en la técnica se conocen otros métodos para comparar dos anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales (SPR). La SPR se puede usar para determinar las constantes de unión del anticuerpo y el segundo anticuerpo, y se pueden comparar las dos constantes de unión.

Restos heterólogos: polímeros, hidratos de carbono, ¡(pidos y agentes terapéuticos

El conjugado como se describe aquí puede comprender una muteína de IL-21 unida a un polímero. El polímero se puede seleccionar del grupo que consiste en: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos y derivados de los mismos, incluyendo polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, incluyendo poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), y poli(acrilato de octadecilo), polímeros de polivinilo que incluyen alcoholes de polivinilo, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, poli(acetato de vinilo), y polivinilpirrolidona, poliglicolidas, polisiloxanos, poliuretanos y sus copolímeros, celulosas que incluyen alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato-ftalato de celulosa, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, y sal sódica de sulfato de celulosa, polipropileno, polietilenos que incluyen poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), y poli(tereftalato de etileno), y poliestireno. En realizaciones específicas, el polímero es un polialquilenglicol, que incluye, por ejemplo, polietilenglicol (PEG).

El conjugado como se describe aquí puede comprender una muteína de IL-21 unida a un hidrato de carbono. El hidrato de carbono puede ser un monosacárido (por ejemplo, glucosa, galactosa, fructosa), un disacárido (por ejemplo, sacarosa, lactosa, maltosa), un oligosacárido (por ejemplo, rafinosa, estaquiosa), o un polisacárido (por ejemplo, almidón, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, calosa, laminarina, xilano, manano, fucoidano, o galactomanano).

El resto heterólogo puede ser un lípido. El lípido puede ser un ácido graso, eicosanoide, prostaglandina, leucotrieno, tromboxano, N-acil etanolamina), glicerolípido (por ejemplo, gliceroles mono-, di-, trisustituidos), glicerofosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina), esfingolípido (por ejemplo, esfingosina, ceramida), lípido de esterol (por ejemplo, esteroide, colesterol), lípido de prenol, sacarolípido, o un policétido, aceite, cera, colesterol, esterol, vitamina liposoluble, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, un fosfolípido.

El conjugado como se describe aquí puede comprender una muteína de IL-21 unida a un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser cualquiera de los conocidos en la técnica. El agente terapéutico puede ser un agente de inmunoterapia en la medida en que el agente estimule una respuesta inmunitaria. El agente de inmunoterapia puede ser una vacuna contra el cáncer. El agente de inmunoterapia puede ser un anticuerpo monoclonal. El agente de inmunoterapia puede ser un inhibidor del punto de control inmunitario, por ejemplo un inhibidor de CTLA4, PD-1, PD-L1. El anticuerpo monoclonal puede ser específico para una proteína en una ruta del punto de control inmunitario. La proteína de la ruta del punto de control inmunitario puede ser, por ejemplo, CTLA4, PD-1, PD-L1, B7-H3, B7H4, o TIM3. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno de la presente descripción se pueden conjugar con atezolizumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, BMS-936558, MK3475, CT-011, AM-224, MDX-1105, IMP321, MGA271.

El agente terapéutico puede ser una citocina, linfocina, factor de crecimiento, o factor hematopoyético eficaz para inhibir la metástasis tumoral y/o tener un efecto antiproliferativo en al menos una población celular. Tales citocinas, linfocinas, factores de crecimiento, u otros factores hematopoyéticos incluyen, pero no se limitan a: M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFa, TNF1, Tn F2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoyetina, factor de células madre, y eritropoyetina. Los factores de crecimiento adicionales para uso aquí incluyen angiogenina, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteína morfogénica ósea, receptor IB de proteína morfogénica ósea, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor neutrófico ciliar, receptor a del factor neutrófico ciliar, factor 1 quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas, factor 2a quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas, factor 2p quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas, factor p de crecimiento de células endoteliales, endotelina 1, atrayente de neutrófilos derivado del epitelio, receptor a1 del factor neutrófico derivado de la línea de células gliales, receptor a2 del factor neutrófico derivado de la línea de células gliales, proteína relacionada con el crecimiento, proteína a relacionada con el crecimiento, proteína p relacionada con el crecimiento, proteína y relacionada con el crecimiento, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor I de crecimiento similar a insulina, receptor del factor de crecimiento similar a insulina, factor II de crecimiento similar a insulina, proteína de unión al factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor a del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre, receptor del factor de células madre, factor a de crecimiento transformante, factor p de crecimiento transformante, factor p1 de crecimiento transformante, factor p1.2 de crecimiento transformante, factor p2 de crecimiento transformante, factor p3 de crecimiento transformante, factor p5 de crecimiento transformante, factor p1 de crecimiento transformante latente, proteína I de unión al factor p de crecimiento transformante, proteína II de unión al factor p de crecimiento transformante, proteína III de unión al factor p de crecimiento transformante, receptor del factor de necrosis tumoral tipo I, receptor del factor de necrosis tumoral tipo II, receptor del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunológicamente activos de las mismas. En realizaciones ejemplares, el agente terapéutico comprende un anticuerpo específico para uno cualquiera de citocinas, linfocinas, factores de crecimiento, u otros factores hematopoyéticos mencionados anteriormente.

Ácidos nucleicos

Se describen además ácidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica una muteína de IL-21 como se describe aquí, un conjugado que comprende una muteína de IL-21, o una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1, seguida de una secuencia nucleotídica que codifica una muteína de IL-21 de la presente descripción. La secuencia nucleotídica que codifica una cadena pesada y la secuencia nucleotídica que codifica la muteína de IL-21 pueden flanquear una secuencia nucleotídica que codifica un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 262). Alternativamente, el ácido nucleico puede no comprender una secuencia nucleotídica que codifica un enlazador peptídico, y la secuencia nucleotídica que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-1 está en tándem con la secuencia nucleotídica que codifica una muteína de IL-21 como se describe aquí.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una muteína de IL-21 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3-21,23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica un enlazador peptídico de SEQ ID NO: 262 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 262.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de una región constante de anticuerpo descrita aquí fusionada con una secuencia de aminoácidos de cualquier muteína de IL-21 descrita aquí. El ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, y 282, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, y 282, fusionada con una cualquiera de SEQ ID NOs: 3-21,23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114 208, 210-222, 224-255, y 283. El ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 268-281, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 268-281.

El ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica un anticuerpo anti-PD-1 que comprende una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada de una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311,472-495, y 544-555, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, o tiene más de alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 91 %, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%) de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO: 265-267, 282, 284-311,472-495 y 544-555.

Además se describen ácidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de unión al antígeno PD-1 de la presente descripción. La secuencia nucleotídica puede comprender una secuencia que codifica una CDR de cadena pesada o una CDR de cadena ligera, una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera, o una secuencia de cadena pesada o una secuencia de cadena ligera. Véase la Tabla G a continuación. La secuencia nucleotídica puede comprender una cualquiera de SEQ ID NOs: 392-471. Se describen además pares de secuencias nucleotídicas que comprenden (a) SEQ ID NOs: 398 y 399; (b) SEQ ID NOs: 408 y 409; (c) SEQ ID NOs: 418 y 419; (d) SEQ ID NOs: 428 y 429; (e) SEQ ID NOs: 438 y 439; (f) SEQ ID NOs: 448 y 449; (g) SEq ID NOs: 458 y 459; o (h) SEQ ID NOs: 468 y 469. Se describen adicionalmente pares de secuencias nucleotídicas que comprenden (a) SEQ iD NOs: 400 y 401; (b) SEQ ID NOs: 410 y 411; (c) SEQ ID NOs: 420 y 421; (d) SEQ ID NOs: 430 y 431; (e) SEQ ID NOs: 440 y 441; (f) SEQ ID NOs: 450 y 451; (g) SEQ ID NOs: 460 y 461; o (h) SEQ ID NOs: 470 y 471.

TABLA G

La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica un conjugado o proteína de fusión de la presente descripción. Por "ácido nucleico", como se usa aquí, se incluyen "polinucleótido", "oligonucleótido", y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, o formas modificadas del mismo, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales, o alterados, y que puede contener un enlace entre nucleótidos natural, no natural, o alterado, tal como un enlace de fosforoamidato o un enlace de fosforotioato, en lugar del fosfodiéster que se encuentra entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia nucleotídica que codifique cualquiera de las proteínas o polipéptidos de unión a antígeno de la presente descripción. El ácido nucleico puede no comprender inserciones, supresiones, inversiones, y/o sustituciones. El ácido nucleico puede comprender una o más inserciones, supresiones, inversiones, y/o sustituciones.

Los ácidos nucleicos como se describen aquí pueden ser recombinantes. Como se usa aquí, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos a moléculas de ácidos nucleicos que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de los descritos en (i) anterior. Para los fines aquí, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en reacciones de síntesis química y/o de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., más arriba; y Ausubel et al., más arriba. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de diversas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodoruracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N-sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, uno o más de los ácidos nucleicos de la presente descripción se pueden adquirir de compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

Vectores

Los ácidos nucleicos como se describen aquí pueden incorporarse en un vector. A este respecto, se describen aquí vectores que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente. El vector puede ser un vector de expresión recombinante. Para los fines aquí, la expresión "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótidos o polinucleótidos modificada genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido, o péptido por parte de una célula hospedante, cuando la construcción comprende una secuencia nucleotídica que codifica el ARNm, proteína, polipéptido, o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que el ARNm, la proteína, el polipéptido, o el péptido se expresen dentro de la célula. Los vectores que se describen aquí no se producen de forma natural en su totalidad. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores descritos en el presente pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales, o alterados. Los vectores pueden comprender enlaces internucleotídicos naturales o no naturales, o ambos tipos de enlaces. Los nucleótidos alterados o los enlaces internucleotídicos no naturales pueden no obstaculizar la transcripción o replicación del vector.

El vector como se describe aquí puede ser cualquier vector adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier hospedante adecuado. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para propagación y expansión o para expresión, o para ambas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJoIIa, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden usar vectores de bacteriófagos, tales como AGTIO, AGTl 1, AZapII (Stratagene), AEMBL4, y ANMl 149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBIOl, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). El vector puede ser un vector viral, por ejemplo un vector retroviral.

Los vectores como se describen aquí se pueden preparar usando técnicas estándar de ADN recombinante descritas, por ejemplo, en Sambrook et al., más arriba, y Ausubel et al., más arriba. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, pueden prepararse para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedante procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden derivar, por ejemplo, de ColEl, plásmido 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino, y similares.

El vector puede comprender secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de hospedante (por ejemplo, bacteria, hongo, planta, o animal) en el que se va a introducir el vector, según corresponda, y tomando en consideración si el vector está basado en ADN o ARN.

El vector puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de hospedantes transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedante auxotrófico para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión descritos en el presente incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina, y genes de resistencia a ampicilina.

El vector puede comprender un promotor nativo o normativo ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido (incluyendo las porciones funcionales y variantes funcionales del mismo), o a la secuencia nucleotídica que es complementaria o que se hibrida con la secuencia nucleotídica que codifica la IL-21, conjugado, o proteína de fusión. La selección de promotores, por ejemplo fuerte, débil, inducible, específico de tejido, y específico del desarrollo, está dentro de la experiencia normal del experto. De manera similar, la combinación de una secuencia nucleotídica con un promotor también está dentro de la experiencia del experto. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, por ejemplo un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV, y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Células hospedantes

Se describen aquí células hospedantes que comprenden un ácido nucleico o vector como se describe aquí. Como se usa aquí, la expresión "célula hospedante" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector descrito en el presente y sea capaz de producir un producto de expresión codificado por el ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, proteína). La célula hospedante puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. La célula hospedante puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo un ser humano. La célula hospedante puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido, y puede estar en cualquier etapa de desarrollo.

La célula puede ser una célula eucariota, incluyendo, pero sin limitarse a, una célula de levadura, una célula de hongo filamentoso, una célula de protozoo, una célula de alga, una célula de insecto, o una célula de mamífero. Tales células hospedantes se describen en la técnica. Véase, por ejemplo, Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013). Las células eucariotas pueden ser células de mamífero. Las células de mamífero pueden ser células de mamífero no humano. Las células pueden ser células de ovario de hámster chino (CHO) y derivados de las mismas (por ejemplo, CHO-K1, CHO pro-3, CS9), células de mieloma de ratón (por ejemplo, NS0, GS-NS0, Sp2/0), células manipuladas por ingeniería para ser deficientes en actividad de dihidrofolato reductasa (DHFR) (por ejemplo, DUKX-X11, DG44), células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) o derivados de las mismas (por ejemplo, HEK293T, HEK293-EBNA), células de riñón de mono africano verde (por ejemplo, células COS, células VERO), células de cáncer de cuello uterino humano (por ejemplo, HeLa), células epiteliales de osteosarcoma óseo humano U2-OS, células epiteliales basales alveolares humanas adenocarcinómicas A549, células de fibrosarcoma humano HT1080, células de tumor cerebral de ratón CAD, células de carcinoma embrionario P19, células de fibroblastos de embrión de ratón NIH 3T3, células de fibroblastos de ratón L929, células de neuroblastoma de ratón N2a, células de cáncer de mama humano MCF-7, células de retinoblastoma Y79, células de retinoblastoma humano SO-Rb50, células de cáncer de hígado humano Hep G2, células de mieloma B de ratón J558L, o células de riñón de hámster bebé (BHK) (Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-263 (2013)). En una realización particular, la célula hospedante es CS9 (una línea celular CHO).

Con el fin de amplificar o replicar el vector, la célula hospedante puede ser una célula procariota, por ejemplo una célula bacteriana.

También se describe aquí una población de células que comprende al menos una célula hospedante descrita aquí. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedante que comprende los vectores descritos, además de al menos otra célula, que no comprende ninguno de los vectores.

Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células hospedantes (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector. La población puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula hospedante que comprende un vector, de manera que todas las células de la población comprenden el vector. La población de células puede ser una población clonal que comprende células hospedantes que comprenden un vector como se describe aquí.

Composiciones farmacéuticas

Se describen aquí composiciones que comprenden una muteína de IL-21, un conjugado que comprende la muteína de IL-21, una proteína de fusión que comprende la muteína de IL-21 y un polipéptido, una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado que comprende la proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), una proteína de fusión que comprende la proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un ácido nucleico, vector o célula hospedante, como se describe aquí, o una combinación de los mismos. Las composiciones pueden comprender la muteína de IL-21, la proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, una proteína de fusión, un ácido nucleico, un vector, o una célula hospedante de la presente descripción, o una combinación de los mismos, en forma aislada y/o purificada. La composición puede comprender un solo tipo (por ejemplo, estructura) de una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, o célula hospedante como se describe aquí, o comprende una combinación de dos o más tipos diferentes (por ejemplo, estructuras diferentes) de muteínas de IL-21, proteínas de unión al antígeno PD-1, conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, o células hospedantes como se describe aquí.

La composición puede comprender agentes que potencian las características fisicoquímicas de la muteína IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, o célula hospedante, por ejemplo estabilizando, por ejemplo, la muteína IL-21 o la proteína de fusión a ciertas temperaturas (por ejemplo, temperatura ambiente), aumentando la vida útil, reduciendo la degradación, por ejemplo la degradación mediada por proteasa de oxidación, aumentando la vida media de, por ejemplo, la muteína o proteína de fusión de IL-21, etc. La composición puede comprender cualquiera de los agentes descritos aquí como un resto heterólogo o un resto conjugado, opcionalmente, en mezcla con las muteínas de IL-21, conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, o células hospedantes como se describe aquí.

La composición puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las muteínas de IL-21, proteínas de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, o células hospedantes como se describen en el presente (en lo sucesivo denominados "agentes activos") pueden formularse en una composición farmacéutica que comprende el agente activo, junto con un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable. En este sentido, se describen además composiciones farmacéuticas que comprenden un agente activo (es decir, cualquiera de las muteínas de IL-21, proteínas de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-1), conjugados, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, vectores, o células hospedantes de la presente descripción), composición farmacéutica la cual puede estar destinada a la administración a un sujeto, por ejemplo un mamífero.

El agente activo puede estar presente en la composición farmacéutica a un nivel de pureza adecuado para la administración a un paciente. El agente activo puede tener un nivel de pureza de al menos alrededor de 90%, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99%, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener un agente activo a una concentración de alrededor de 0,001 a alrededor de 30,0 mg/ml.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como una disolución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. La expresión también abarca cualquiera de los agentes aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal de los Estados Unidos de América, o enumerados en la Farmacopea US para uso en animales, incluyendo seres humanos.

La composición farmacéutica puede comprender cualquier ingrediente farmacéuticamente aceptable, incluyendo, por ejemplo, agentes acidulantes, aditivos, adsorbentes, propulsores de aerosoles, agentes de desplazamiento de aire, agentes alcalinizantes, agentes antiaglomerantes, anticoagulantes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, antisépticos, bases, aglutinantes, agentes amortiguadores, agentes quelantes, agentes de recubrimiento, agentes colorantes, desecantes, detergentes, diluyentes, desinfectantes, disgregantes, agentes dispersantes, agentes potenciadores de disolución, tintes, emolientes, agentes emulsionantes, estabilizadores de emulsión, cargas, agentes formadores de película, potenciadores del sabor, agentes aromatizantes, potenciadores de la fluidez, gelificantes, granuladores, humectantes, lubricantes, mucoadhesivos, bases de ungüentos, ungüentos, vehículos oleaginosos, bases orgánicas, bases para píldoras, pigmentos, plastificantes, abrillantadores, conservantes, secuestrantes, penetrantes cutáneos, solubilizantes, disolventes, estabilizadores, bases para supositorios, agentes tensioactivos, tensioactivos, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes terapéuticos, agentes espesantes, agentes de tonicidad, agentes de toxicidad, agentes que aumentan la viscosidad, agentes absorbentes de agua, codisolventes miscibles en agua, ablandadores de agua, o agentes humectantes. Véase, por ejemplo, e1Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000). Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980).

La composición farmacéutica puede comprender materiales de formulación que no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un agente activo y una o más sales farmacéuticamente aceptables; polioles; tensioactivos; agentes de equilibrio osmótico; agentes de tonicidad; antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes de carga; lioprotectores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; analgésicos; o agentes farmacéuticos adicionales. La composición farmacéutica puede comprender uno o más polioles y/o uno o más tensioactivos, opcionalmente, además de uno o más excipientes, incluyendo, pero sin limitarse a, sales farmacéuticamente aceptables; agentes de equilibrio osmótico (agentes de tonicidad); antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes de carga; lioprotectores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; y analgésicos.

La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, transarencia, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción, o penetración de la composición. En tales realizaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o hidrogenosulfito de sodio); amortiguadores (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tal como manitol o glicina); agentes quelantes (tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina, o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa, o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tal como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol, o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tal como polisorbato 20, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehículos para administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para lograr un pH fisiológicamente compatible. El pH de la composición farmacéutica puede estar, por ejemplo, entre alrededor de 4 o alrededor de 5 y alrededor de 8,0, o alrededor de 4,5 y alrededor de 7,5, o alrededor de 5,0 a alrededor de 7,5. El pH de la composición farmacéutica puede estar entre 5,5 y 7,5.

Vías de administración

Con respecto a la presente descripción, el agente activo, o la composición farmacéutica que lo comprende, puede administrarse al sujeto a través de cualquier vía de administración adecuada. Por ejemplo, el agente activo se puede administrar a un sujeto mediante administración parenteral, nasal, oral, pulmonar, tópica, vaginal, o rectal. La siguiente discusión sobre vías de administración se proporciona simplemente para ilustrar realizaciones ejemplares, y no debe interpretarse como una limitación del alcance de ninguna manera.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos, y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores, y conservantes. El término "parenteral" significa no a través del canal alimentario, sino por alguna otra vía tal como subcutánea, intramuscular, intraespinal, o intravenosa. El agente activo de la presente descripción se puede administrar con un diluyente fisiológicamente aceptable en un vehículo farmacéutico, tal como un líquido estéril o una mezcla de líquidos, inclyendo agua, disolución salina, disoluciones acuosas de dextrosa y de azúcares relacionados, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tal como 2,2-dimetil-153-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres o glicéridos de ácidos grasos, o glicéridos de ácidos grasos acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes, y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites que se pueden usar en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales, o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina, y minerales. Los ácidos grasos adecuados para uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico, y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para uso en formulaciones parenterales incluyen sales grasas de metales alcalinos, amonio y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, alquil-, aril- y olefinasulfonatos, alquil-, olefina-, éter- y monogliceridosulfatos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos, y copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-p-aminopropionatos, y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales pueden contener de alrededor de 0,5% a alrededor de 25% en peso del agente activo de la presente descripción en disolución. Se pueden usar conservantes y amortiguadores. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de la inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un balance hidrófilo-lipófilo (HLB) de alrededor de 12 a alrededor de 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones oscilará normalmente de alrededor de 5% a alrededor de 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol sorbitán, tales como monooleato de sorbitán, y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales pueden presentarse en recipientes monodosis o multidosis sellados, tales como ampollas y viales, y pueden conservarse en estado secado por congelación (liofilizado), requiriendo únicamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las disoluciones y suspensiones para inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos ésteriles, gránulos y comprimidos, del tipo descrito anteriormente.

Las formulaciones inyectables están según la presente descripción. Los requisitos para vehículos farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos normales en la técnica (véanse, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., páginas 622-630 (1986)).

Dosificaciones

Se cree que los agentes activos que se describen aquí son útiles en los métodos para inhibir la señalización de PD-1, al mismo tiempo que proporcionan la señalización de IL-21, como se describe aquí, y de este modo se cree que son útiles en métodos para tratar o prevenir una o más enfermedades por ejemplo cáncer. La cantidad o dosis del agente activo administrado debe ser suficiente para efectuar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal durante un marco de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del agente activo de la presente descripción debe ser suficiente para tratar el cáncer como se describe aquí en un período de alrededor de 1 a 4 minutos, 1 a 4 horas, o 1 a 4 semanas o más, por ejemplo 5 a 20 o más semanas, desde el momento de la administración. El período de tiempo podría ser aún más largo. La dosis estará determinada por la eficacia del agente activo particular y la condición del animal (por ejemplo, humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, humano) a tratar.

En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines del presente documento, un ensayo, que comprende comparar el grado en que se trata el cáncer tras la administración de una dosis dada del agente activo de la presente descripción a un mamífero entre un conjunto de mamíferos, cada uno de los cuales recibe una dosis diferente del agente activo, podría usarse para determinar una dosis inicial a administrar a un mamífero. El grado en que se trata el cáncer tras la administración de una cierta dosis puede representarse, por ejemplo, mediante la citotoxicidad del agente activo o el grado de regresión tumoral logrado con el agente activo en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los métodos para medir la citotoxicidad de las proteínas de fusión y los métodos para evaluar la regresión tumoral son conocidos en la técnica.

La dosis del agente activo de la presente descripción también estará determinada por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un agente activo particular de la presente descripción. Por lo general, el médico tratante decidirá la dosis del agente activo de la presente descripción con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el sexo, el agente activo de la presente descripción que se va a administrar, la vía de administración, y la gravedad de la afección que se está tratando. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la presente descripción, la dosis del agente activo de la presente descripción puede ser alrededor de 0,0001 a alrededor de 1 g/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando/día, de alrededor de 0,0001 a alrededor de 0,001 g/kg de peso corporal/día, o alrededor de 0,01 mg a alrededor de 1 g/kg de peso corporal/día.

Formulaciones de liberación controlada

Los agentes activos descritos aquí se pueden modificar en una forma de depósito, de modo que la manera en que el agente activo como se describe aquí se libera en el cuerpo al que se administra se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del cuerpo (véase, por ejemplo, patente U.S. No. 4.450.150). Las formas de depósito de agentes activos como se describe aquí pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los agentes activos y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en la que el agente activo está encapsulado o se dinfunde por todo el material y/o degradación del material no poroso. A continuación, el depósito se implanta en la ubicación deseada dentro del cuerpo del sujeto, y el agente activo se libera del implante a una velocidad predeterminada.

La composición farmacéutica que comprende el agente activo puede modificarse para tener cualquier tipo de perfil de liberación in vivo. La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación inmediata, liberación controlada, liberación sostenida, liberación prolongada, liberación retardada, o liberación bifásica. Los métodos para formular péptidos para liberación controlada son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009) y las Publicaciones de Solicitudes de Patentes Internacionales Nos. WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; y WO 1999/040942.

Las presentes composiciones pueden comprender además, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma encapsulada, o pueden administrarse en una forma de liberación prolongada para proporcionar un efecto prolongado de almacenamiento y/o administración.

Combinaciones

Las proteínas de fusión o proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1) descritas aquí pueden administrarse solas, y alternativamente, pueden administrarse en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo otro agente activo de diferente tipo (por ejemplo, estructura). El otro agente terapéutico puede tener como objetivo tratar o prevenir el cáncer. El otro agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico. El otro agente terapéutico puede ser un agente usado en radioterapia para el tratamiento del cáncer. En consecuencia, las proteínas de fusión o las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1) descritas aquí pueden administrarse en combinación con uno o más compuestos de coordinación de platino, inhibidores de la topoisomerasa, antibióticos, alcaloides antimitóticos, y difluoronucleósidos. Una proteína de fusión de IL-21 descrita aquí (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con una muteína de IL-21) puede combinarse con una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o producto de proteína de anticuerpo anti-PD-1).

Cualquiera de los anticuerpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006, 22D4.017, puede administrarse en combinación con una proteína de fusión de IL-21 descrita aquí, incluyendo, por ejemplo: una proteína de fusión que comprende un homodímero o monómero seleccionado de:

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 496);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y la fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 497);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 498);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 499);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 500);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 501), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 555);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 502), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 503), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 504), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 555);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 505), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 556);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 391), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 506), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 557);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 507);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 508);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 509);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 510);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 511);

un homodímero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y cada fusión de cadena pesada con muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 513), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 514), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 515), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 516), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 558);

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 517), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 559); o

un monómero que comprende dos cadenas ligeras de anticuerpos (comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371), y dos cadenas pesadas de anticuerpo (cada una de las cuales está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 518), y una de las cuales no está fusionada con una muteína de IL-21, y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

Kits

Adicionalmente se describen kits que comprenden una muteína de IL-21, una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, una proteína de fusión, un ácido nucleico, un vector, o una célula hospedante como se describe aquí, o una combinación de los mismos. El kit puede comprender al menos una muteína de IL-21, una proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, una proteína de fusión, un ácido nucleico, un vector, o una célula hospedante como se describe aquí, o una combinación de los mismos, en un recipiente. La al menos una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, o célula hospedante como se describe aquí, puede proporcionarse en el kit como dosis unitaria. Para los fines aquí, "dosis unitaria" se refiere a una cantidad discreta dispersa en un vehículo adecuado. La dosis unitaria puede ser la cantidad suficiente para proporcionar a un sujeto el efecto deseado, por ejemplo el tratamiento del cáncer. El kit puede comprender varias dosis unitarias, por ejemplo un suministro de dosis unitarias para una semana o un mes, opcionalmente, cada una de las cuales está envasa individualmente o separada de otro modo de otras dosis unitarias. Los componentes del kit/dosis unitaria pueden envasarse con instrucciones para la administración a un paciente. El kit puede comprender uno o más dispositivos para la administración a un paciente, por ejemplo una aguja y una jeringa, y similares. La al menos una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, o célula hospedante como se describe aquí, o una combinación de los mismos, puede estar preenvasado en una forma lista para usar, por ejemplo una jeringa, una bolsa intravenosa, etc. La forma lista para uso puede ser para un solo uso. El kit puede comprender múltiples formas listas para uso de un solo uso de al menos una muteína de IL-21, proteína de unión al antígeno PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1), un conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, o célula hospedante como se describe aquí. El kit puede comprender además otros agentes terapéuticos o de diagnóstico, o vehículos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, disolventes, amortiguadores, diluyentes, etc.), incluyendo cualquiera de los descritos aquí.

Métodos de fabricación

Las muteínas de IL-21 como se describen aquí pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados para sintetizar polipéptidos de novo se describen, por ejemplo, en Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; and Patente U.S. No. 5.449.752. Aquí se exponen métodos ejemplares adicionales para obtener los péptidos descritos aquí.

Las muteínas de IL-21 descritas aquí pueden ser sintetizadas comercialmente por compañías tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), Multiple Peptide Systems (San Diego, CA), Peptide 2.0 Inc. (Chantilly, VA), y American Peptide Co. (Sunnyvale, CA). A este respecto, las muteínas de IL-21 pueden ser sintéticas, recombinantes, aisladas, y/o purificadas.

También, las muteínas de IL-21 se pueden producir de forma recombinante usando un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido usando métodos recombinantes estándar. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994.

Se describen aquí métodos para obtener una muteína de IL-21. El método puede comprender cultivar una célula hospedante como se describe aquí para expresar la muteína de IL-21, y recolectar la muteína de IL-21 expresada.

Aquí también se describen métodos para obtener proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21. El método puede comprender cultivar una célula hospedante como se describe aquí para expresar la proteína de fusión, y recolectar la proteína de fusión expresada.

El método puede comprender cultivar una célula hospedante que comprende un ácido nucleico que codifica la muteína de IL-21 o proteína de fusión como se describe aquí, para expresar la muteína de IL-21 o proteína de fusión. La célula hospedante puede ser cualquiera de las células hospedantes descritas aquí. La célula hospedante puede seleccionarse del grupo que consiste en: células CHO, células NS0, células COS, células VERO, y células BHK. La etapa de cultivar una célula hospedante puede comprender cultivar la célula hospedante en un medio de crecimiento, para apoyar el crecimiento y la expansión de la célula hospedante. El medio de crecimiento puede aumentar la densidad celular, la viabilidad del cultivo, y la productividad, de manera oportuna. El medio de crecimiento puede comprender aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, glucosa, y suero como fuente de factores de crecimiento, hormonas, y factores de unión. El medio de crecimiento puede ser un medio completamente definido químicamente que consiste en aminoácidos, vitaminas, oligoelementos, sales inorgánicas, lípidos, e insulina o factores de crecimiento similares a la insulina. Además de los nutrientes, el medio de crecimiento también ayuda a mantener el pH y la osmolalidad. Varios medios de cultivo están disponibles comercialmente, y se describen en la técnica. Véase, por ejemplo, Arora, "Cell Culture Media: A Review" MATER METHODS 3:175 (2013).

El método para obtener una muteína de IL-21 o proteína de fusión como se describe aquí puede comprender cultivar la célula hospedante en un medio de alimentación. El método puede comprender cultivar en un medio de alimentación en un modo alimentado por lotes. Los métodos de producción de proteínas recombinantes son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Li et al., "Cell culture processes for monoclonal antibody production" MAbs 2(5): 466-477 (2010).

El método para obtener una muteína de IL-21 o proteína de fusión puede comprender una o más etapas para purificar la muteína o proteína de un cultivo celular o el sobrenadante del mismo, y preferiblemente recuperar la proteína purificada. El método puede comprender una o más etapas de cromatografía, por ejemplo cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad con proteína A), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hodrófoba. El método puede comprender purificar la proteína usando una resina de cromatografía de afinidad de Proteína A.

El método puede comprender además etapas para formular la proteína purificada, etc., obteniendo así una formulación que comprende la proteína purificada. Tales etapas se describen en Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing, eds. Jameel and Hershenson, John Wiley & Sons, Inc. (Hoboken, NJ), 2010.

Métodos de uso

Los métodos de tratamiento se describen adicionalmente aquí. El método puede ser un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto que lo necesite una composición farmacéutica de la presente descripción en una cantidad eficaz para tratar al sujeto.

Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción son útiles para inhibir la señalización de PD-1 y/o activar la señalización de IL-21. Sin estar ligado a una teoría particular, [1] la actividad inhibidora de PD-1 de las composiciones proporcionadas aquí permite que tales entidades sean útiles en métodos para potenciar la actividad de las células T y potenciar una respuesta inmune, y, en particular, una respuesta inmune contra un tumor o cáncer; y/o [2] la actividad activante de IL-21 de las composiciones proporcionadas aquí permite que tales entidades potencien la supervivencia de las células T y la función efectora, restrinjan la diferenciación terminal y la pérdida de potencial replicativo, promuevan la longevidad de las células T al cambiar las células efectoras activadas hacia un fenotipo de células T vírgenes (por ejemplo, al potenciar la expresión de CCR7), y potencien la citotoxicidad contra células diana (por ejemplo, cancerosas) (por ejemplo, al aumentar la producción de IFNy y granzima B).

En consecuencia, se describen aquí métodos para potenciar la actividad de las células T en un sujeto, potenciar la supervivencia de las células T y la función efectora, restringir la diferenciación terminal y la pérdida de potencial replicativo, promover la longevidad de las células T, y potenciar la citotoxicidad contra las células diana (por ejemplo, cancerosas). Los métodos pueden comprender administrar al sujeto la composición farmacéutica de la presente descripción en una cantidad eficaz. La actividad de las células T o la respuesta inmunitaria pueden estar dirigidas contra una célula cancerosa o un tejido canceroso o una célula tumoral o un tumor. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria innata. La respuesta inmunitaria que se potencia puede ser una respuesta inmunitaria mediada por células T.

Como se usa aquí, el término "potenciar", y las palabras derivadas del mismo, puede no ser una potenciación o aumento del 100% o total. Más bien, existen diversos grados de potenciación que un experto normal en la técnica reconoce que tienen un beneficio potencial o un efecto terapéutico. A este respecto, las composiciones farmacéuticas como se describen aquí pueden potenciar, por ejemplo, la actividad de las células T, o potenciar una respuesta inmunitaria, en cualquier cantidad o nivel. La mejora proporcionada por los métodos como se describe aquí puede ser una potenciación de al menos o alrededor de 10% (por ejemplo, una potenciación de al menos o alrededor de 20%, una potenciación de al menos o alrededor de 30%, una potenciación de al menos o alrededor de 40%, una potenciación de al menos o alrededor de 50%, una potenciación de al menos o alrededor de 60%, una potenciación de al menos o alrededor de 70%, una potenciación de al menos o alrededor de 80%, una potenciación de al menos o alrededor de 90%, una potenciación de al menos o alrededor de 95%, una potenciación de al menos o alrededor de 98%).

Los métodos para medir la actividad de las células T y las respuestas inmunitarias son conocidos en la técnica. La actividad de las células T se puede medir, por ejemplo, mediante un ensayo de citotoxicidad, tal como los descritos en Fu et al., PLoS ONE 5(7): e11867 (2010). Otros ensayos de actividad de células T se describen en Bercovici et al., Clin Diagn Lab Immunol. 7(6): 859-864 (2000). Los métodos para medir respuestas inmunitarias se describen, por ejemplo, en Macatangay et al., Clin Vaccine Immunol 17(9): 1452-1459 (2010), y Clay et al., Clin Cáncer Res.7(5): 1127-35 (2001).

Adicionalmente, se describen aquí métodos para tratar a un sujeto con cáncer, y métodos para tratar a un sujeto con un tumor sólido. El método puede comprender administrar al sujeto la composición farmacéutica como se describe aquí en una cantidad eficaz para tratar el cáncer o el tumor sólido en el sujeto. El cáncer que se puede tratar mediante los métodos descritos aquí puede ser cualquier tipo de cáncer, por ejemplo, cualquier crecimiento o tumor maligno causado por una división celular anormal e incontrolada que puede extenderse a otras partes del cuerpo a través del sistema linfático o del torrente sanguíneo. El cáncer puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal, o anorreco, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal, u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no de Hodgkin, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células renales [RCC]), cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uréter, y cáncer de vejiga urinaria. En aspectos particulares, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de cabeza y cuello, de ovario, de cuello uterino, de vejiga y de esófago, cáncer de páncreas, gastrointestinal, cáncer gástrico, de mama, de endometrio y colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, cáncer de vejiga, de pulmón, por ejemplo cáncer de pulmón de células no microcítico (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar. El tumor puede ser cáncer de pulmón de células no microcítico (NSCLC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de mama triple negativo, y cáncer gástrico. En aspectos ejemplares, el sujeto tiene un tumor (por ejemplo, un tumor sólido, una neoplasia hematológica, o una neoplasia linfoide), y la composición farmacéutica se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor en el sujeto. En otros aspectos ejemplares, el tumor es cáncer de pulmón de células no microcítico (NSCLC), cáncer de pulmón de células microcítico (SCLC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer gástrico, linfoma o leucemia, y la composición farmacéutica se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor en el sujeto.

Como se usa aquí, el término "tratar", así como las palabras relacionadas con el mismo, no implican necesariamente el 100% del tratamiento o el tratamiento completo. Más bien, existen diversos grados de tratamiento que un experto normal en la técnica reconoce que tienen un beneficio potencial o un efecto terapéutico. A este respecto, los métodos para tratar el cáncer descritos aquí pueden proporcionar cualquier cantidad o nivel de tratamiento. Además, el tratamiento proporcionado por el método descrito aquí puede incluir el tratamiento de una o más afecciones o síntomas o signos del cáncer que se está tratando. Además, el tratamiento proporcionado por los métodos descritos aquí puede abarcar la ralentización de la progresión del cáncer. Por ejemplo, los métodos pueden tratar el cáncer en virtud de la potenciación de la actividad de las células T o una respuesta inmunitaria contra el cáncer, de la reducción del crecimiento tumoral o canceroso, de la reducción de metástasis de células tumorales, del incremento de la muerte celular de células tumorales o cancerosas, y similares. Los métodos pueden tratar a través del retraso de la aparición o recurrencia del cáncer en 1 día, 2 días, 4 días, 6 días, 8 días, 10 días, 15 días, 30 días, dos meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 4 años, o más. Los métodos pueden tratar a través medio del incremento de la supervivencia del sujeto.

Sujetos

El sujeto puede ser un mamífero, incluyendo, entre otros, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos, mamíferos del orden Carnivora, incluyendo félidos (gatos) y cánidos (perros), mamíferos del orden Artiodactyla, incluyendo bóvidos (vacas) y cerdos (cerdos), o del orden Perssodactyla, incluyendo équidos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos), o del orden Antropoides (seres humanos y simios). El mamífero puede ser un ser humano.

Descripción ejemplar

Se describe aquí una muteína de IL-21 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2),, en la que X representa cualquier aminoácido, y en la que la secuencia de ácidos de la muteína de IL-21 difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en al menos 1 aminoácido.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en no más de 7 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en 3, 4, 5, o 6 aminoácidos. La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en 1 o 2 aminoácidos. La o las diferencias entre la secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-21 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 puede estar dentro de los aminoácidos 10-15, inclusive, o los aminoácidos 105-123, inclusive, de SEQ ID NO: 2, opcionalmente, en el que las diferencias ocurren en los aminoácidos 11, 14, 15, 109, 110, 112, 113, 116 , 119, 120, y/o 123 de SEQ ID NO: 2. La o las diferencias entre la secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-21 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 puede estar dentro de los aminoácidos 5-25, inclusive, o los aminoácidos 65-80, inclusive, de SEQ ID NO: 2, opcionalmente, en el que la o las diferencias ocurren en los aminoácidos 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, y/o 80 de SEQ ID NO: 2.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1). La sustitución de aminoácidos puede ocurrir en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1. La sustitución de aminoácidos puede ocurrir en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos:

1. a. en la posición 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido alifático

2. b. en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido ácido; 3. c. en la posición 5, 9, 73, 76, 109, 113, o 116 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido básico;

4. d. en la posición 5, 8, 9, 70 o 76 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido aromático;

5. e. en la posición 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido que comprende una amida de cadena lateral;

6. f. en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido no aromático que comprende un hidroxilo de cadena lateral;

7. g. en la posición 65, 66, 69, 70, 72, 73, 76, 77, o 80 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un iminoácido;

8. h. en la posición 5, 9, 15, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido que comprende una cadena lateral que contiene azufre; o

9. i. o una combinación de las mismas.

El aminoácido sustituto puede ser un aminoácido natural. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos con un aminoácido en la posición según la TABLA A. La Tabla A se muestra a continuación.

TABLA A

Se describe aquí una muteína de IL-21 que comprende una secuencia de una cualquiera de SEQ ID NOs: 3-21, 23 56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, y 283.

La muteína de IL-21 puede comprender una secuencia de aminoácidos con dos sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1). La sustitución de aminoácidos puede ocurrir en dos de las posiciones 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos pueden ocurrir en dos de las posiciones 5, 9, 15, 70, 71,72, 73, y 76 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, las sustituciones de aminoácidos ocurren en dos de las posiciones 5, 9, 73, y 76 de SEQ ID NO: 1. Una de las sustituciones puede ocurrir en la posición 76 de SEQ ID NO: 1. El aminoácido sustituto en la posición 76 de SEQ ID NO: 1 puede ser un aminoácido alifático o un aminoácido ácido. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos en la posición 5, 9, o 73 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido alifático o un aminoácido ácido. La muteína de IL-21 puede comprender una sustitución de aminoácidos en la posición 5 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto puede ser un aminoácido con una amida de cadena lateral. El aminoácido alifático puede ser alanina, el aminoácido ácido es ácido glutámico, o el aminoácido con una amida de cadena lateral puede ser glutamina. Se describe aquí una muteína de IL-21 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 208, 210 a 222, 224 a 248, y 255.

Las muteínas de IL-21 pueden unirse al receptor de IL-21 con una afinidad reducida, con respecto a la afinidad de IL-21 de tipo salvaje por el receptor de IL-21. El receptor de IL-21 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 256 o 261. La muteína de IL-21 puede unirse a una cadena gamma del receptor de IL-21 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 257. La muteína 21 puede unirse al receptor de IL-21 humano con una Kd que es mayor que o es alrededor de 0,04 nM.

Se describen adicionalmente los conjugados. El conjugado puede comprender una muteína de IL-21 de uno cualquiera de los párrafos anteriores, y un resto heterólogo. La IL-21 puede unirse directamente al resto heterólogo. La IL-21 puede unirse al resto heterólogo a través de un enlazador. El enlazador puede comprender un péptido, por ejemplo que comprende una secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 262). El resto heterólogo puede ser un polipéptido, opcionalmente, en el que el polipéptido es una proteína de unión a antígeno. El polipéptido heterólogo puede ser un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-PD-1. La muteína de IL-21 puede unirse directamente al Fc del anticuerpo. La muteína de IL-21 puede unirse al Fc del anticuerpo a través de un enlazador. El conjugado puede comprender una única muteína de IL-21, en el que dicha única muteína de IL-21 está unida al extremo C de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. El conjugado puede comprender dos muteínas de IL-21, en el que la primera muteína de IL-21 está unida al extremo C de la cadena pesada del primer anticuerpo, y la segunda muteína de IL-21 está unida al extremo C de la cadena pesada del segundo anticuerpo. Opcionalmente, la primera IL-21 tiene la misma secuencia de aminoácidos que la segunda muteína de IL-21. Alternativamente, la primera IL-21 tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la de la segunda muteína de IL-21. Las cadenas pesadas del anticuerpo pueden comprender mutaciones de pares de carga (por ejemplo, las mutaciones V1, V4, V103, o V131). En el conjugado de uno cualquiera de los párrafos anteriores, la muteína de IL-21 puede comprender sustituciones de aminoácidos en dos de las posiciones 5, 9, 73, y 76 de SEQ ID NO: 1. El conjugado puede comprender una muteína de IL-21 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, excepto que dicha muteína de IL-21 comprende sustituciones de aminoácidos en dos posiciones cualesquiera de 5, 9, 73, y 76 de SEQ ID NO: 1, y un anticuerpo anti-PD-1 , en el que la muteína de IL-21 está unida al extremo C del anticuerpo anti-PD-1. El conjugado puede comprender un anticuerpo anti-PD-1 que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HC) expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de HC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de HC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374 y 384, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, y 385, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de LC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, y 386, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de LC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, y 387, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos cualquiera o más de (a)-(f). El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; y (h) SEQ ID NOs: 382-387. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389. En aspectos ejemplares, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una región constante que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311. El anticuerpo anti-PD-1 puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEQ ID NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEQ ID NOs: 380 y 381; y (h) SEQ ID NOs: 390 y 391.

También se describe aquí un polipéptido de fusión o proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 como se describe aquí y un polipéptido o péptido heterólogo. El polipéptido de fusión o la proteína de fusión puede comprender una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la misma. También se describe aquí un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una muteína de IL-21 descrita aquí. También se describe un vector que comprende el ácido nucleico descrito aquí. También se describe una célula hospedante que comprende el ácido nucleico o el vector descrito aquí. También se describe un kit que comprende una muteína de IL-21, un ácido nucleico, un vector, una célula hospedante, un conjugado, una proteína de fusión, o una combinación de los mismos, como se describe aquí, y un recipiente.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una muteína de IL-21, un ácido nucleico, un vector, una célula hospedante, un conjugado, una proteína de fusión, o una combinación de los mismos, como se describe aquí, y un vehículo, excipiente, o diluyente farmacéuticamente aceptable.

También se describen métodos para obtener una muteína de IL-21, que comprenden cultivar la célula hospedante como se describe aquí para expresar la muteína de IL-21, y recolectar la muteína de IL-21 expresada. Se describe adicionalmente un método para tratar a un sujeto que lo necesite. El método comprende administrar al sujeto que lo necesite una composición farmacéutica de la presente descripción en una cantidad eficaz para tratar al sujeto. El sujeto puede tener un tumor sólido, y la composición farmacéutica puede administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor sólido en el sujeto. Opcionalmente, el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de cabeza y cuello, de ovario, de cuello uterino, de vejiga y de esófago, cáncer de páncreas, gastrointestinal, cáncer gástrico, de mama, de endometrio y colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, cáncer de vejiga, de pulmón, por ejemplo cáncer de pulmón de células no microcítico (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar.

También se describe una proteína de unión al antígeno PD-1, que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HC) expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 y 382, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de HC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 y 383, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de HC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374 y 384, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, y 385, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de LC CDR2 expuesta en la Tabla D, o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, y 386, o una secuencia variante de la misma que difiere solo en uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de LC CDR3 expuesta en la Tabla D o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, y 387, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o alrededor de 70% de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos cualquiera o más de (a)-(f). La proteína de unión al antígeno PD-1 puede comprender seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332 337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; y (h) SEQ ID NOs: 382-387. La proteína de unión al antígeno PD-1 puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 318 y 319; (b) SEQ ID NOs: 328 y 329; (c) SEQ ID NOs: 338 y 339; (d) SEQ ID NOs: 348 y 349; (e) SEQ ID NOs: 358 y 359; (f) SEQ ID NOs: 368 y 369; (g) SEQ ID NOs: 378 y 379; y (h) SEQ ID NOs: 388 y 389. La proteína de unión al antígeno PD-1 puede comprender una región constante que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311. La proteína de unión al antígeno PD-1 puede comprender un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 320 y 321; (b) SEQ ID NOs: 330 y 331; (c) SEQ ID NOs: 340 y 341; (d) SEQ ID NOs: 350 y 351; (e) SEQ ID NOs: 360 y 361; (f) SEQ ID NOs: 370 y 371; (g) SEQ ID NOs: 380 y 381; y (h) SEQ ID NOs: 390 y 391.

También se describe un conjugado que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores, y un resto heterólogo. También se describe un polipéptido de fusión o una proteína de fusión que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores, y un polipéptido o péptido heterólogo. También se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína de unión al antígeno PD-1, el conjugado, o el polipéptido de fusión o proteína de fusión, como se describe en los párrafos anteriores. El ácido nucleico puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NOs: 392 471. También describe un vector que comprende el ácido nucleico, como se describe anteriormente, así como una célula hospedante que comprende el ácido nucleico o el vector, como se describe anteriormente. También se describe un kit que comprende una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores, o un conjugado, polipéptido de fusión, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, o célula hospedante, o una combinación de los mismos, y un recipiente. También se describe una composición farmacéutica que puede comprender una proteína de unión al antígeno PD-1 como se describe en los párrafos anteriores, o un conjugado, polipéptido de fusión, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, o célula hospedante, o una combinación de los mismos, y un vehículo, excipiente, o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se describe además un método para obtener una proteína de unión al antígeno PD-1, en el que el método puede comprender cultivar la célula hospedante como se describe en este párrafo, para expresar la proteína de unión al antígeno PD-1, y recolectar la proteína de unión al antígeno PD-1 expresada. Se describe adicionalmente un método para tratar a un sujeto que lo necesite, en el que el método puede comprender administrar al sujeto que lo necesite una composición farmacéutica como se describe en este párrafo, en una cantidad eficaz para tratar al sujeto. El sujeto puede tener un tumor sólido, y la composición farmacéutica puede administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el tumor sólido en el sujeto. Opcionalmente, el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de cabeza y cuello, de ovario, de cuello uterino, de vejiga y de esófago, cáncer de páncreas, gastrointestinal, cáncer gástrico, de mama, de endometrio y colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, cáncer de vejiga, de pulmón, por ejemplo cáncer de pulmón de células no microcítico (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar.

Los siguientes ejemplos se dan simplemente para ilustrar la presente descripción, y de ningún modo para limitar su alcance.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra que la terapia de combinación que comprende un anticuerpo bloqueador de PD-1 y una IL-21 recombinante es superior a una monoterapia correspondiente.

En un estudio preclínico, los efectos de un tratamiento de combinación de un anticuerpo bloqueador de PD-1 monoclonal y una IL-21 murina recombinante (rmIL-21) se compararon con los efectos del tratamiento de monoterapia con el anticuerpo bloqueador de PD-1 o la rmIL-21.

El Día 1, se implantaron células de carcinoma de colon CT26/3E5 en ratones BALB/c para iniciar el crecimiento tumoral. El Día 12, se midieron los tumores, y los ratones se aleatorizaron en 4 grupos (10 ratones por grupo): el Grupo 1 recibió una inyección intraperitoneal (IP) de 300 gg de anticuerpo de control de isotipo (mIgG1), el Grupo 2 recibió una inyección IP de 300 gg de un anticuerpo bloqueador de PD-1, el Grupo 3 recibió 50 gg de rmIL-21, y el Grupo 4 recibió tanto el anticuerpo bloqueador de PD-1 (300 gg) como rmIL-21 (50 gg). Los Grupos 1, 2 y 4 recibieron anticuerpos una vez cada 3 días, y los Grupos 3 y 4 recibieron rmIL-21 3 veces por semana durante 3 semanas. La dosificación finalizó el día 33

El volumen tumoral se monitorizó durante todo el estudio. Como se muestra en las Figuras 1A-1D, el tamaño del tumor aumentó en mayor medida para el Grupo 1 y en menor medida para el Grupo 4.

La supervivencia, medida por el análisis de mantel cox de rango logarítmico de Kaplan Meier, fue el criterio principal de valoración de este estudio. Como se muestra en la Figura 2 y la Tabla 1, el porcentaje de supervivencia y la mediana de supervivencia fueron mayores para el Grupo 4. En particular, dos sujetos estaban libres de tumores en el Grupo 4 (Tabla 1).

TABLA 1

Estos resultados demuestran que una combinación de un anticuerpo bloqueante de PD-1 monoclonal y una mIL-21 recombinante proporciona una ventaja de supervivencia superior frente a cualquiera de los componentes administrados solos como monoterapia.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra el diseño y la construcción de múltiples plataformas destinadas a proporcionar una combinación de inhibición de PD-1 y señalización de IL-21.

Los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 demuestran las ventajas de un enfoque combinatorio de señalización de IL-21 e inhibición de PD-1 para el tratamiento de sujetos con tumores. Sin embargo, se requería una consideración cuidadosa de cómo se debería administrar la IL-21, debido a la capacidad de la IL-21 tanto para potenciar las respuestas de las células T CD8 como para suprimir la presentación de antígenos y el cebado de células T. Además, IL-21 R se expresa ampliamente en tejidos humanos (por ejemplo, por células presentadoras de antígenos (APC), células NK, B, y T), lo que requiere una cuidadosa consideración para evitar efectos no deseados (por ejemplo, actividad de IL-21 fuera de un entorno del tumor) y la eliminación de IL-21 cuando se une a su receptor en diferentes tejidos.

Se ideó un enfoque doble para abordar las consideraciones anteriores. En primer lugar, se generaron muteínas de IL-21 con actividad atenuada - a través de la unión reducida de las muteínas de IL-21 a IL-21 R. Se imaginó que dichas muteínas de IL-21 tendrían una actividad reducida cuando se difundieran por todo el cuerpo, pero que dicha actividad se "rescataría" si las muteínas de IL-21 pudieran concentrarse en células T diana (por ejemplo, cancerosas). Es decir, las muteínas de IL-21, una vez presentes y concentradas en células diana, podrían exhibir, en el agregado, actividad terapéutica de IL-21. En segundo lugar, las muteínas de IL-21 se fusionaron con un brazo de direccionamiento, tal como un anticuerpo monoclonal, para dirigir las muteínas de IL-21 a células relevantes (por ejemplo, células cancerosas). Para administrar las muteínas de IL-21 a una célula cancerosa diana, se fusionaron con un mAb anti-PD-1. El uso de un mAb anti-PD-1 tuvo el beneficio adicional de prevenir la señalización a través de PD-1/PD-L1 (actuando así como un inhibidor del punto de control).

Sin estar ligado a ninguna teoría en particular, se planteó la hipótesis de que una proteína de fusión que comprendiera un anticuerpo anti-PD-1 fusionado con una muteína de IL-21 proporcionaría una respuesta más duradera contra las células destinadas a la destrucción. Por ejemplo, [1] las células T CD8+ que expresan PD-1 se unirían al mAb anti-PD-1 de la proteína de fusión, y [2] la unión simultánea de la muteína IL-21 de la proteína de fusión al receptor de IL-21 expresado por las células T CD8+ conduciría a una mayor proliferación de las células T, así como a una mayor producción y secreción de IFNy por parte de las células T, lo que mejoraría la citotoxicidad general contra las células diana. Además, se planteó la hipótesis de que las rutas de señalización intracelular activadas por IL-21 evitarían la diferenciación terminal y la pérdida asociada de la función efectora y la apoptosis. Véase la Figura 3.

Las consideraciones de diseño adicionales incluyeron la valencia del mAb (por ejemplo, mAb monovalente o bivalente), el requisito de función efectora de Fc, el sitio para la fusión de citocinas (extremo C o N de mAb), la inclusión de un enlazador, y el remedio de la modificación secundaria predicha o sitios de recorte.

Se consideraron varios formatos de proteínas de fusión, y se clonaron y expresaron cuatro construcciones de fusión para experimentos de validación del concepto. La IL-21 de tipo salvaje (WT) se fusionó con el extremo C de una IgG de un mAb bivalente anti-PD-1 como (1) un homodímero de IL-21 sin ningún enlazador; (2) un homodímero de IL-21 con un enlazador GGGGS (SEQ ID NO: 262); (3) un monómero de IL-21 sin ningún enlazador, pero con mutaciones de pares de carga en el Fc de IgG para impulsar la heterodimerización; y (4) un monómero de IL-21 tanto con un enlazador GGGGS (SEQ ID NO: 262) como con mutaciones de pares de carga. Las cuatro construcciones de proteínas de fusión incluían las siguientes modificaciones en la región Fc de mAb, numeradas según el sistema EU: N297G, R292C, V302C (mutaciones SEFL2-2). Las mutaciones de pares de carga usadas fueron las mutaciones V1 (es decir, K409D y K392D en una cadena pesada, y D399K y E356K en la otra cadena pesada). Las cuatro construcciones de proteínas de fusión se diseñaron para eliminar una lisina C-terminal, para evitar el recorte.

Las construcciones de fusión se cribaron en busca de la actividad de IL-21 en ensayos celulares usando dos variantes (PD-1+ve y PD-1-ve) de una línea de células T Hut78 IL-21R-positiva (IL-21R+). En cada línea celular, se midió la fosforilación de STAT3 como una medida sustituta de la actividad de IL-21. Ambas variantes de células Hut78 se expusieron a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sola, (ii) mAb anti-PD-1 solo, (iii) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 con un enlazador, (iv) mAb anti-PD-1 fusionado con un homodímero de IL-21 sin un enlazador, (v) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 con un enlazador, o (vi) mAb anti-PD-1 fusionado con un monómero de IL-21 sin un enlazador. Los resultados del ensayo de fosforilación de STAT3 y las EC50 de cada molécula para la señalización de STAT se muestran en las Figuras 5A y 5B y la Tabla 2, respectivamente.

TABLA 2

Como se muestra en la Figura 5A y la Tabla 2 (columna central), la proteína de fusión que comprende un mAb anti-PD-1 con un homodímero de IL-21 mostró una potencia 10 veces menor con respecto a la rhIL-21 en células PD-1-ve. La rhIL-21 también fue más potente en comparación con la proteína de fusión que comprende el monómero de IL-21. A pesar de tener solo un resto de IL-21, la proteína de fusión monomérica mostró una mayor potencia con respecto al homodímero que tenía dos restos de IL-21. Estos resultados sugieren que el monómero exhibe una mayor actividad de IL-21 en células PD-1-ve, y/o sugieren que el formato de proteína de fusión de homodímero puede conferir una atenuación parcial de la actividad de IL-21 (por ejemplo, posiblemente a través de interacciones estéricas entre restos de IL-21).

Este estudio también permitió la evaluación del enlazador entre la porción de IL-21 y el extremo C de IgG. Como se muestra en la Tabla 2 (columna central) y las Figuras 5A y 5B (línea continua = sin enlazador; línea punteada = enlazador), la presencia de un enlazador no parece afectar la actividad de IL-21. En consecuencia, todas las construcciones futuras se realizaron sin el enlazador, para reducir la cantidad de secuencias no nativas en las proteínas de fusión.

El efecto de la expresión de PD-1 sobre la actividad de IL-21 se evaluó comparando los resultados del ensayo de fosforilación de STAT3 entre las células PD-1-ve y las células PD-1+ve. Como se muestra en la Figura 5B, la actividad de IL-21 de cada una de las proteínas de fusión de homodímero y monómero de IL-21 en células PD-1+ve fue esencialmente la misma.

Juntos, estos resultados demuestran que la señalización de IL-21, en ausencia de expresión de PD-1 en una célula diana, puede atenuarse fusionando IL-21 con un mAb anti-PD-1. Además, la señalización de IL-21 de una IL-21 fusionada con un mAb anti-PD-1 se rescata en células que expresan PD-1.

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra el diseño, la construcción, y la caracterización de múltiples muteínas de IL-21.

Para comprender mejor el perfil farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) de la proteína de fusión, se evaluó in vivo en monos cinomologos una proteína de fusión que comprende una IgG fusionada con un homodímero de IL-21 WT.

La proteína de fusión de homodímero que comprende IL-21 WT fusionada con un mAb anti-PD-1 se administró por vía intravenosa a 6 animales en una dosis baja (250 pg/kg) o una dosis alta (1000 pg/kg). Como control, se usó un dominio de anticuerpo IgG (150 pg/kg). Las concentraciones séricas se midieron a lo largo del tiempo, y se determinaron la Cmax, AUClast, vida media (t1/2), Vss, y CI. Los resultados se muestran en la Figura 6 y la Tabla 3.

TABLA 3

Con respecto al control de IgG (datos no mostrados), la proteína de fusión de homodímero que comprende un mAb anti-PD-1 e IL-21 WT exhibió una mayor eliminación y menores exposiciones. De este modo, se determinó que, para mejorar la exposición de la proteína de fusión y minimizar los efectos de la IL-21 fuera de la diana (es decir, minimizar la señalización de IL-21 en las células inmunitarias que no expresan el receptor de PD-1), sería necesaria la mutagénesis de IL-21 para atenuar la señalización a través del IL-21 R. En consecuencia, se diseñó una proteína de fusión que comprende una IL-21 mutada para unirse con menos fuerza a IL-21 R en células que no expresan PD-1. Se planteó la hipótesis de que la proteína de fusión se uniría primero a la diana de PD-1 (al unirse al anticuerpo anti-PD-1) con alta afinidad, lo que impulsaría entonces la segunda interacción de menor afinidad entre la muteína de IL-21 y el IL-21 R (cadena alfa). En ausencia del receptor de PD-1, se planteó la hipótesis de que las proteínas de fusión no se unirían a las células que no expresan el receptor de PD-1, independientemente de la expresión de IL-21 R.

Se usó ingeniería guiada por estructura para crear un panel de 141 muteínas de IL-21, teniendo cada una una única sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de IL-21 WT. Cada muteína se diseñó para tener una afinidad reducida por la subunidad alfa del IL-21R (101 muteínas) o la subunidad gamma de IL-21R (40 muteínas). Cada muteína del panel se expresó como una proteína de fusión con un mAb anti-PD-1 (PD-1 x muteína de IL-21), y posteriormente se evaluó en busca de su capacidad para unirse a IL-21R usando el sistema FortéBio Octet® (Pall FortéBio; Fremont, CA), y se examinó para determinar la actividad usando la línea de células T IL-21 R+ (Hut78) usando la fosforilación de STAT3 como sustituto de la actividad de IL-21. Para seleccionar muteínas que tienen el menor potencial de actividad fuera de la diana, los criterios de selección se establecieron en una atenuación de más de 20 veces en la señalización de IL-21 frente a rhIL-21 a 3,7 nM en células PD-1-ve.

En la Tabla 4 se muestra una lista completa de las 141 muteínas.

TABLA 4

Los resultados ejemplares de los ensayos de fosforilación de STAT3 usando muteínas de IL-21 se muestran en la Figura 7 (muteínas con afinidad reducida por IL-21 Ra) y Figura 8 (muteínas con afinidad reducida por IL-21 Ry). Como se muestra en estas figuras, varias muteínas demostraron una atenuación de más de 20 veces en la actividad de IL21 en células PD-1-ve, pero conservaron la actividad en células PD-1+ve. Como se muestra en las Figuras 9A-9B, el mutante 51 (R65P) (círculos azules) fue uno de esos mutantes que demostró una reducción de más de 20 veces en la actividad de IL-21 en células PD-ve, pero exhibió un nivel de actividad de IL-21 similar a la lograda por rhIL-21 en células que expresan PD-1. En la Tabla 5 se proporciona una lista de muteínas ejemplares seleccionadas para una atenuación superior de más de 20x de la señal STAT3 en células PD-1 bajas/negativas.

TABLA 5

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra la selección de muteínas de IL-21 candidatas para uso en la construcción de proteínas de fusión, y el ensayo in vivo de las mismas.

Las 22 muteínas de IL-21 con mejor rendimiento se ampliaron para realizar más ensayos. Sobre la base de estos ensayos adicionales (en ensayos de pSTAT3 de Hut78 como se describe aquí), se seleccionaron cuatro proteínas de fusión candidatas para que la colección de cuatro mostrara un intervalo de atenuación (cambio de potencia, con respecto a rhIL-21, en el ensayo de pSTAT3 de Hut78). El Mutante C10 (D15N) representó la muteína de baja atenuación, el Mutante 77 (R76A) representó la muteína de atenuación intermedia, y los Mutantes 79 y 78 (R76E y R76D, respectivamente) representaron la muteína de alta atenuación. De los cuatro, tres fueron ampliados para un estudio in vivo en monos cinomolgos para evaluar las propiedades farmacocinéticas de las construcciones de proteína de fusión de muteína. Se administraron dosis únicas (10 mg/kg) de Mutante 79 (R76E), Mutante 77 (R76A), o Mutante C10 (D15N) por vía intravenosa (bolo) a monos cinomolgos sin tratamiento previo, y se recogieron las concentraciones séricas durante un período de diez días. A modo de comparación, se dosificaron (individualmente) un mAb anti-PD-1 y una proteína de fusión que comprendía el mAb anti-PD-1 e IL-21 WT, a monos cinomolgos mediante administración de bolo intravenoso. El estudio se realizó con dos controles: el mAb anti-PD-1 solo, y la construcción de proteína de fusión que comprende el mAb anti-PD-1 e IL-21 WT. Como se muestra en la Figura 10, cada una de las proteínas de fusión de mAb anti-PD-1 -muteína de IL-21 exhibió un perfil farmacocinético alterado, en comparación con el mAb anti-PD-1 original (triángulos negros). La Tabla 6 proporciona las propiedades farmacocinéticas ajustadas por análisis no compartimental.

TABLA 6

EJEMPLO 5

Este ejemplo demuestra la generación de un panel de doble mutante de IL-21, y la expresión y caracterización de proteínas de fusión que comprenden homodímeros de doble mutante de IL-21 (a menos que se especifique lo contrario).

Se seleccionaron tres muteínas que tenían una sola sustitución de aminoácidos, incluyendo el Mutante No. 77 (R76A) y el Mutante No. 79 (R76E), para una manipulación adicional en función de los datos de actividad celular (por ejemplo, la atenuación más alta de la actividad en células T Hut78 PD-1-ve) y su fabricabilidad. Se utilizó manipulación de ingeniería guiada por estructuras para generar una mutación adicional dentro de la secuencia del mutante simple de IL-21 (es decir, para generar un mutante doble) para atenuar aún más la unión de citocinas a la cadena alfa de IL-21 R (IL-21 Ra). La secuencia del mutante doble se fusionó con la secuencia de un mAb anti-PD-1, y las proteínas de fusión se expresaron y analizaron en ensayos celulares. En la Tabla 7 se proporciona una lista de las proteínas de fusión de mutantes dobles obtenidas y analizadas.

TABLA 7

Como se deseaban proteínas de fusión de mutantes dobles con propiedades de alta atenuación, el criterio de selección se fijó en una potencia (EC50) mayor que 1000 nM en células T Hut78 IL-21R positivas, PD-1 negativas (PD-1-ve), con respecto a la potencia de rhIL-21. Además, al igual que con las muteínas que contenían una única sustitución de aminoácidos, las proteínas de fusión de mutantes dobles se caracterizaron para determinar la unión a IL-21 R (ForteBio Octet). Finalmente, las proteínas de fusión de mutantes dobles se caracterizaron para determinar la actividad de PD-1 usando un ensayo del gen informador de PD-1 Jurkat. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8

Proteína de fusión hPD1 informador N1 hPD1 informador N2 (nM)

ensayada (nM)

R5Q:R76E 0,954 0,942

mAb anti-PD-1 1.39 1,77

Hu = Humano; Cyno = mono cinomolgo

pSTAT3 EC50 (cambio de 2,5 veces)

Octet: Unión a IL-21 R-his monovalente inmovilizado humano o de Cyno

Como se muestra en la Tabla 8, las proteínas de fusión de mutantes dobles exhibieron una actividad de IL-21 muy baja en las células T que expresan niveles bajos de PD-1 (por ejemplo, por debajo de los niveles detectables de PD-1), pero retuvieron una actividad significativa de IL-21 en células que expresan PD-1. Las proteínas de fusión de mutantes dobles exhibieron una unión débil a IL-21 R (Kd > 300 nM), pero conservaron la capacidad de unirse a PD-1 y bloquear la señalización de PD-1.

EJEMPLO 6

Este ejemplo demuestra un ensayo in vitro de células primarias que compara una proteína de fusión que comprende un mAb anti-PD-1 y un homodímero de mutante doble de IL-21 o un homodímero de mutante simple de IL-21.

Una proteína de fusión que comprende un mAb anti-PD-1 e IL-21 con sustituciones de aminoácidos R5Q y R76E se evaluó en un ensayo in vitro de células primarias (una reacción de linfocitos mixtos (MLR)). La MLR comprendía una población mixta de células IL-21 R+, incluyendo células dendríticas (DC) que expresan IL-21 R pero no expresan PD-1, células T que expresan PD-1, y células T que no expresan PD-1. La MLR se expuso a (i) la proteína de fusión que comprende las sustituciones de aminoácidos R5Q y R76E, (ii) la proteína de fusión que comprende solo la sustitución de aminoácidos R76E, (iii) IL-21 humana recombinante (rHu IL-21), (iv) mAb anti-PD-1, (v) una combinación de rHu IL-21 y mAb anti-PD-1, o (vi) una IgG de control.

Como se muestra en la Figura 11, la rhIL-21 suprimió la función de las DC, y es dominante sobre la respuesta de PD-1 cuando se codosifica. La proteína de fusión que comprende la muteína doble de IL-21 con actividad atenuada exhibió una actividad reducida fuera de la diana. Además, cada una de rhIL-21 y la proteína de fusión que comprende solo la sustitución de aminoácidos R76E mostró una actividad fuera de la diana significativa en las DC, y suprimió la producción de citocinas. Por el contrario, el mAb anti-PD-1 y la proteína de fusión que comprende las sustituciones de aminoácidos R5Q y R76E solo suministraron señales de IL-21 a células T PD-1+ve diana (y no a células dendríticas PD-1-ve), y retuvieron la capacidad (a través del brazo de PD-1) de aumentar la producción de citocinas. En consecuencia, estos resultados sugieren que las proteínas de fusión que comprenden el mutante doble de IL-21 tienen una inmunosupresión reducida y efectos perjudiciales en el cebado de DC, y pueden permitir el reclutamiento de nuevos clones de células T y respuestas inmunitarias antitumorales más duraderas.

EJEMPLO 7

Este ejemplo demuestra la actividad de diferentes proteínas de fusión que comprenden muteínas dobles de IL-21 (homodímeros) y un mAb anti-PD-1 en linfocitos T citotóxicos primarios (CTL). La fosforilación endógena de STAT3 en CTL primarios (líneas de CTL reactivas con CMV de un donante humano) se midió mediante FAC, y se usó como una medida de la señalización de IL-21. Después de dejar en reposo los CTL durante 48 horas (para reducir la expresión de PD-1), las células se expusieron (durante 10 min) a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5E/R76A (línea roja en el gráfico de la izquierda), (ii) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E (línea roja en el gráfico central), (iii) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R9E/R76A (línea roja en el gráfico de la derecha), (iv) un control de IgG1 (línea gris en cada gráfico), (v) rhIL-21 (línea azul en cada gráfico), (vi) un mAb anti-PD-1 (línea verde continua en cada gráfico), (vii) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 (línea verde punteada en cada gráfico), o (viii) una proteína de fusión que comprende una muteína simple de IL-21 R76E (línea púrpura en cada gráfico). Los resultados de las FAC se muestran en las Figuras 12A-12C. La actividad de IL-21 de cada proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 se representa frente a la actividad lograda con (iv) un control de IgG1, (v) rhIL-21, (vi) mAb anti-PD-1, (vii) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1, y (viii) una proteína de fusión que comprende una muteína simple de IL-21 R76E. Este ensayo de células primarias demuestra que las fusiones de mutantes dobles estimulan débilmente la señalización de STAT3 inducida por IL-21 en CTL en reposo (que expresan niveles bajos de PD-1). La actividad de IL-21 se atenúa más con las fusiones de muteínas dobles (y es similar a lo que se observa con el mAb anti-PD-1 y el control de IgG1), exhibiendo la fusión de mutante simple una atenuación moderada de la actividad de IL-21, y teniendo la combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1 una actividad similar a rhIL-21.

También se exploró el efecto de las proteínas de fusión que comprenden un mAb anti-PD-1 y homodímeros de muteínas dobles de IL-21 sobre la función de citotoxicidad celular mediada por CTL tras la estimulación crónica. Los CTL se activaron con CD3/CD28, y se expusieron a (i) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5E/R76A, (ii) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E, (iii) una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 R9E/R76A, (iv) un control de IgG4, (v) rhIL-21, (vi) mAb anti-PD-1, o (vii) una combinación de rhIL-21 y mAb anti-PD-1. Después de siete días de estimulación, las células se cocultivaron con una línea celular de cáncer de melanoma pulsada con péptido de CMV, y se midió la citotoxicidad. Los resultados de este ensayo se muestran en las Figuras 13A-13C.

Como se muestra en las Figuras 13A-13C, las proteínas de fusión pueden mantener la función de los CTL de una manera superior en comparación con la monoterapia con mAb anti-PD-1. Las proteínas de fusión de muteínas de IL-21 pueden mantener la función de citotoxicidad celular mediada por CTL tras la estimulación crónica. Estos resultados apoyan la idea de que IL-21 puede mantener la función de CTL en condiciones de activación crónica como se observa en el cáncer. La administración de IL-21 a las células T específicas del antígeno PD-1+ puede mantener selectivamente la función de una población de células T que impulsa la eficacia terapéutica.

EJEMPLO 8

Este ejemplo demuestra la farmacocinética in vivo con las construcciones de muteínas dobles.

Las proteínas de fusión que comprenden un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21 o una muteína simple de IL-21 se administraron a monos cinomolgos sin tratamiento previo mediante administración de bolo intravenoso, para caracterizar la exposición al fármaco. La Tabla 9 muestra la dosis de cada construcción administrada a los animales. La variante de muteína simple (IL-21 R76E) se ensayó in vivo como homodímero y monómero para comprender mejor cómo se puede mejorar aún más la exposición.

Perfiles de concentración sérica-tiempo para mAb anti-PD-1 y PD-1: las fusiones de IL-21 después de la administración de un bolo intravenoso a monos cinomolgos sin tratamiento previo se muestran en la Figura 14, con las exposiciones al fármaco observadas la primera semana después de la administración enumeradas en la Tabla 9.

TABLA 9

Como se muestra en la Tabla 9, la proteína de fusión R76E monomérica exhibió una exposición superior tras la dosificación intravenosa en comparación con la proteína de fusión R76E homodimérica. Las proteínas de fusión que comprenden las muteínas dobles de IL-21 (R5Q/R76E y R5E/R76A) observaron mayores exposiciones que las construcciones de proteínas de fusión de homodímero de muteína simple parentales (R76E y R76A, respectivamente) (Figura 14; Tabla 9).

También se evaluaron in vivo los parámetros farmacodinámicos (PD) en monos cinomolgos. La expresión de PD-1 se determinó usando anticuerpo no competitivo para PD-1, y este muestreo de PD-1 se produjo el Día -5, el Día 7 y el Día 21. A los animales se les administró una primera dosis de (i) una proteína de fusión que comprende un mAb anti -PD-1 y un homodímero de una muteína simple de IL-21 R76E, (ii) una proteína de fusión que comprende un mAb anti-PD-1 y un monómero de una muteína simple de IL-21 R76E, o (iii) una proteína de fusión que comprende un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21 R5Q/R76E, el Día 1, y una segunda dosis el Día 8. Véase la Figura 15A.

Las Figuras 15B-15D muestran el cambio en veces en las células positivas para PD-1/positivas para CD4 (con respecto al Día - 5) según se mide el Día 7 (Figura 15B), el cambio en veces en las células positivas para PD-1/positivas para CD8 (con respecto al Día -5) según se mide el Día 7 (Figura 15C), y el cambio en veces en células positivas para PD-1/positivas para CD8 (con respecto al Día -5) según se mide el Día 21 (Figura 15D).

Como se muestra en las Figuras 15B-15D, incluso una sola dosis de la proteína de fusión, que comprende un mAb anti-PD-1 y un mutante doble de IL-21, expande las células T PD-1+/CD8+ periféricas. Este estudio demostró que las proteínas de fusión de mutantes dobles son capaces de expandir significativamente las células T CD8 PD-1+ de manera superior a las variantes parentales de muteína simple.

Los biomarcadores de PD también se examinaron en busca de diferencias, y los datos sugieren que la construcción monomérica tiene una cobertura de la diana y respuestas de PD más bajas con la administración de una sola dosis, pero tiene cambios equivalentes en la cobertura de la diana y PD con la administración de múltiples dosis. Estos datos sugieren que las propiedades PK de las proteínas de fusión pueden mejorarse aún más con un formato monomérico.

Como se muestra en la Figura 16, la ocupación del receptor (RO) en las células CD8+ generalmente se correlacionó con la expansión de las células T CD8 PD-1+ para los mutantes dobles (Animales 803, 805, 806). Las construcciones de homodímero de mutante simple (Animales 801,802) no lograron expandir las células T CD8 PD-1+, probablemente debido a sus propiedades farmacocinéticas relativamente pobres. En particular, las construcciones de muteínas dobles, que tienen propiedades farmacocinéticas más deseables, expandieron las células T CD8 PD-1+, y las respuestas de PD se correlacionaron con la cobertura de la diana. Los datos sugieren que las proteínas de fusión de mutantes dobles pueden expandir una población de células T relevante, que se sabe que está involucrada en la inmunidad antitumoral protectora.

La Figura 17 muestra que la cobertura de la diana de PD-1 en células T CD8+ tras la dosificación repetida es similar a lo que se observa para un mAb anti-PD-1 (no se muestran los datos de mAb anti-PD-1). Colectivamente, con respecto a los mutantes dobles, las Figuras 16 y 17 respaldan la idea de que la modulación de la población diana (células T CD8 PD-1+) requiere una cobertura de la diana suficiente, y que la cobertura de la diana mejorada se correlaciona con respuestas farmacodinámicas mejoradas.

EJEMPLO 9

Este ejemplo demuestra la generación de un panel de proteínas de fusión que comprenden diferentes mAbs anti-PD-1 fusionados con diferentes muteínas dobles homodiméricas de IL-21.

Se generó un panel de mAb anti-PD-1 y se analizó como se describe en el Ejemplo 12, y los mAb principales se fusionaron con ciertas muteínas dobles de IL-21. Doce proteínas de fusión, que comprenden muteínas dobles homodiméricas de IL-21 y mAbs anti-PD-1, se analizaron para determinar la actividad de IL-21, tanto en células T Hut78 PD-1-ve como PD-1 ve, usando el ensayo de fosforilación de STAT3; para determinar la unión a IL-21R y la unión a PD-1, usando el ensayo ForteBio Octet; para determinar la actividad de PD-1, usando el ensayo de gen informador de PD-1 Jurkat; y para determinar la actividad in vitro, usando el ensayo de MLR (reacción de linfocitos mixtos). Estos experimentos se llevaron a cabo tal como se describe esencialmente en los ejemplos anteriores.

En las Tablas 10-12 se proporciona una lista de las doce proteínas de fusión que comprenden un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21, y sus actividades medidas en estos ensayos.

TABLA 10

TABLA 11

TABLA 12

La mayoría de los candidatos, si no todos, se comportaron tan bien como, si no mejor que, dos mAb anti-PD-1. Varios demostraron potencias para la actividad de PD-1 y en el ensayo de MLR que eran mayores o iguales a la potencia del mAb anti-PD-1.

De los 12 candidatos, dos se seleccionaron para estudios posteriores. Uno de los dos tenía la muteína doble de IL-21 que comprende las mutaciones R5Q/R76E, y el segundo tenía la muteína doble de IL-21 que comprende las mutaciones R9E/R76A. Se usaron diferentes mAb anti-PD-1 del panel de mAb PD-1 para obtener una proteína de fusión con una de las dos muteínas de IL-21. Se usaron diez mAb anti-PD-1 en las proteínas de fusión R5Q/R76E, incluyendo los mAb anti-PD-1 20A2.003 (rombos naranja), 20C1.006 (cuadrado rojo), 20C1.009 (triángulo verde), y 22D4.006 (círculo púrpura oscuro). Se usaron siete mAb anti-PD-1 en las proteínas de fusión R9E/R76A, incluyendo los mAb anti-PD-1 20A2.003 (triángulo púrpura), 20C1.006 (cuadrado rojo), 20C1.009 (triángulo verde), y 22D4.006 (círculo negro). Las proteínas de fusión se analizaron para determinar la actividad de IL-21 usando el ensayo de fosforilación de STAT3, como se describe esencialmente aquí. Las Figuras 18A-18B y 19A-19B muestran las actividades en células T HUT78 PD-1-ve y PD-1+ve, con respecto a las señales de rhIL-21 (línea rosa fuerte). Como se muestra en estas figuras, las proteínas de fusión exhibieron una atenuación >1000x en células T HUT78 PD-1-ve , pero retuvieron la potencia en células T HUT78 PD-1+ve.

EJEMPLO 10

Este ejemplo demuestra la generación de un panel de proteínas de fusión que comprenden diferentes mAbs anti-PD-1 fusionados con diferentes muteínas dobles monoméricas y homodiméricas de IL-21.

Se generó un panel de proteínas de fusión que comprendía un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21 monomérica u homodimérica. En la Tabla 13 se proporciona una lista de las proteínas de fusión que comprenden un mAb anti-PD-1 y una muteína doble de IL-21.

TABLA 13

Las proteínas de fusión se analizaron para determinar la actividad de IL-21 tanto en células T Hut78 PD-1-ve como PD-1+ ve, usando el ensayo de fosforilación de STAT3; para determinar la unión a IL-21R y la unión a PD-1, usando el ensayo ForteBio Octet; para determinar la actividad de PD-1, usando el ensayo de gen informador de PD-1 Jurkat; y para determinar la actividad in vitro, usando el ensayo de MLR. Estos experimentos se llevaron a cabo tal como se describe esencialmente en los ejemplos anteriores. Las actividades según se miden en estos ensayos in vitro se muestran en las Figuras 20-23.

Las Figuras 20A-20D representan la cantidad de señalización de pSTAT3 observada con varias fusiones de mAb anti-PD-1 - muteínas dobles monoméricas u homodiméricas de IL-21. La señalización de pSTAT3 estimulada con rhIL-21 se muestra en rojo en la parte superior de los gráficos, mientras que la señalización de pSTAT3 estimulada con un control de IgG1 se muestra en gris (parte inferior de los gráficos), y con un control de IgG2 se muestra en naranja (parte inferior de los gráficos). La señalización de pSTAT3 estimulada por mAb anti-PD-1 (presente como mAb; es decir, no como una fusión) se muestra en verde (parte inferior de los gráficos). La señalización de pSTAT3 estimulada con los mAb de control anti-PD-1 se muestra en naranja y amarillo (parte inferior de los gráficos), mientras que las líneas restantes representan la señalización de pSTAT3 lograda tras la estimulación con fusiones de mAb anti-PD-1 -muteínas dobles monoméricas o diméricas de IL-21 (con diversas mutaciones de pares de carga), en las que los mutantes dobles son R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E o R5Q/R76E. Como se muestra en este conjunto de figuras, rhIL-21 demuestra actividad tanto en células PD-1-ve como PD-1+ve. Por el contrario, las fusiones de muteínas dobles monoméricas y homodiméricas pueden demostrar actividad de pSTAT3 (basada en IL-21) solamente en células PD-1+ve y no en células PD-1-ve. De este modo, las fusiones monoméricas con mutantes dobles de IL-21 exhiben niveles similares de atenuación de la actividad de IL-21 en células PD-1-ve y de rescate de la actividad de IL-21 en células PD-1+ve como sus fusiones diméricas equivalentes.

Las proteínas de fusión evaluadas en las Figuras 20A-20D se analizaron en un ensayo de gen informador de PD-1 (RGA; Figuras 21A y 21B), y un ensayo de MLR (Figuras 21C y 21D). Los resultados mostrados en las Figuras 21A-21D demuestran que las fusiones de mAb anti-PD-1 - muteínas dobles monoméricas y diméricas de IL-21 son capaces de inducir la actividad de PD-1.

Los resultados de los ensayos de pSTAT3 que evalúan las mismas construcciones de fusiones de mAb anti-PD-1 -muteínas dobles monoméricas y diméricas de IL-21 como las de las Figuras 20A-20D, excepto con un mAb anti-PD-1 diferente, se muestran en las Figuras 22A-22D. Los resultados de las Figuras 22A-22D son similares a los que se observan en las Figuras 20A-20D.

Los resultados de los ensayos del gen informador de PD-1 y los ensayos de MLR que evalúan las mismas construcciones de fusiones de mAb anti-PD-1 - muteínas dobles monoméricas y diméricas de IL-21 cmo las de las Figuras 21A-21D, excepto con un mAb anti-PD-1 diferente, se muestran en las Figuras 23A-23D.

Estos datos demuestran que una proteína de fusión que comprende una muteína doble de IL-21 puede no requerir una configuración de homodímero para la atenuación parcial. Se seleccionaron las siguientes muteínas dobles (fusionadas como monómeros u homodímeros) a un mAb anti-PD-1 (Tabla 14) para la evaluación adicional.

TABLA 14

Los datos basados en células sugieren que estas muteínas, cuando se fusionan con un anticuerpo PD-1, pueden dirigirse selectivamente a las células T (demostrado usando líneas de células T) que expresan el receptor de PD-1. Estas moléculas bifuncionales de PD-1 x IL-21 tienen propiedades únicas adquiridas de cada brazo de la molécula de fusión (mAb anti PD-1 y muteína de IL-21).

EJEMPLO 11

En los ejemplos se usaron los siguientes materiales y métodos.

Generación de fusiones de Ab anti-PD-1 - muteína de IL-21

Se clonaron secuencias de Ab anti-PD-1 - muteína de IL-21 recombinante en pTT5 para expresión transitoria en HEK293-6E, o un vector que contenía un casete de selección de antibiótico para expresión estable en células CHO-K1. Las producciones de expresión se realizaron durante 5-7 días a 36°C, y el sobrenadante se recogió para su purificación. Todos los lotes de proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A (Mab Select SuRe), seguido de intercambio catiónico (SP Sepharose HP) e intercambio de amortiguador (UF/DF) en amortiguador A5.2Su. Todos los lotes tenían un pico principal de >95% por cromatografía de exclusión por tamaños con endotoxina < 0,2 UE/mg (Endosafe LAL, Charles River).

Ensayos de gen informador de PD-1 Jurkat

Células efectoras GloResponse Jurkat NFAT-/uc2/PD-1 estables (Promega, #CS 187102) y la línea celular CHO PD-L1 estable (Promega, #CS178103) se cocultivaron a una relación de 1,25:1 en presencia de anticuerpos diluidos en serie por triplicado durante 6 horas a 37°C, 5% de CO2. La luminiscencia se midió usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Bio-Glo (Promega, #G7940).

Ensayos de fosforilación de STAT3

pSTAT3 AlphaScreen. Las líneas celulares de HuT 78 parental y HuT 78 PD-1 estable se sembraron entonces en placas separadas, a 40.000 células por pocillo, en presencia de anticuerpos diluidos en serie por triplicado durante 40 minutos a 37°C, 5% de CO2. Los niveles de Tyr705 de Pstat3 se midieron usando el kit de ensayo AlphaLisa Surefire Ultra Pstat3 (Tyr705) (Perkin Elmer, #ALSU-PST3-A10K).

Ensayo HTRFphospho-STAT3. Las células se privaron de suero durante la noche en medio RPMI 1860 suplementado con L-glutamina al 1 % (HyClone Cat# SH30034.01). A continuación, las células se resuspendieron en disolución salina equilibrada de Hanks sin rojo fenol, sin calcio ni magnesio (HBSS; ThermoFisher Cat# 14175095), a 2,5 x 106 células/ml, y se sembraron 8 ul/pocillo en una placa blanca de pequeño volumen de 384 pocillos (Perkin Elmer Cat# 6008289). A continuación, las células se estimularon con 4 ul/pocillo de moléculas de muteína de IL-21 diluidas en HBSS a 37°C durante 40 minutos. La fosforilación de STAT3 se detectó usando el kit de ensayo HTRF® phosphor-STAT3 (Tyr705) según la recomendación del fabricante (Cisbio Cat# 64NT3PEH). La señal de FRET del ensayo se detectó usando EnVision Multilable Plate Reader (Perkin Elmer). Los datos se analizaron determinando primero la relación HTRF según lo recomendado por Cisbio, y después calculando los valores en veces con respecto al fondo usando datos de células no estimuladas. Para cada experimento, se trazaron las curvas de dosificación, y la potencia de una molécula determinada se representa como la concentración a la que se observó un valor en veces definido con respecto al fondo.

Reacción de linfocitos mixtos (MLR)

Los leucopacos de pares de donantes no coincidentes se obtuvieron de AllCells Inc. Las células T del donante se aislaron usando el Pan T-cell Isolation Kit (Milteny Biotec, # 130-096-535), y los monocitos de donante no coincidentes se aislaron usando el Pan Monocyte Isolation Kit (Miltenyi Biotec, # 130-096-537). Los monocitos se maduraron durante 10 días usando el CellXVivo Human Monocyte-Derived Dendritic Cell Differentiation Kit (R&D Systems, #CDK004). Las células pan-T se cocultivaron con monocitos maduros en una relación de 10:1 en presencia de anticuerpos diluidos en serie por triplicado durante 72 horas a 37°C, 5% CO2. Los niveles de IL-2 del sobrenadante se midieron mediante ELISA (Mesoscale Discoveries, #K151QQD-4).

Ensayos de unión a IL-21R y PD-1

Afinidad de unión a IL-21R humana y de mono cinomolgo: Se evaluaron los reactivos recombinantes tanto IL-21R-FLAG-His monovalente como IL-21 R-Fc bivalente, pero produjeron resultados muy similares (dentro de ~2-3 veces). Los reactivos de IL-21 R soluble recombinante se biotinilaron mínimamente, y se capturaron en puntas Streptavidin SAX a un nivel de carga de 2,0 nm. A continuación, las puntas se incubaron en pocillos en los que se diluyeron en serie 3 veces las muestras de anticuerpo anti-PD-1 -IL-21. Para las fusiones de IL-21 de tipo salvaje, la concentración de muestra máxima fue 10 nM, mientras que para las fusiones de muteína de IL-21, la concentración de muestra máxima fue 300 nM. Se usó un tiempo de asociación de 20 minutos y un tiempo de disociación de 1,5 horas para maximizar la curvatura en los gráficos de unión con el fin de obtener ajustes cinéticos precisos.

Afinidad de unión a PD-1 humana y de mono cinomolgo: La afinidad de unión a PD-1 humana y de mono cinomolgo se analizó capturando primero las muestras de anticuerpo anti-PD-1 -IL-21 a través del acoplamiento de amina EDC-NHS a puntas AR2G; la carga de la muestra fue típicamente a pH 6 durante 2000 segundos, seguida de una inactivación rápida con entanolamina 1 M para inmovilizar al menos un nivel de 2 nm. Una vez inmovilizadas las muestras, las puntas se incubaron entonces en pocillos que contenían una dilución en serie de 3 veces de receptores recombinantes solubles PD-1(1-170)-FLAG-His humanos o PD-1(1-167)-FLAG-His de mono cinomolgo. En ambos casos, la concentración máxima de PD-1 fue de 30 nM. Se usaron la asociación durante 300 segundos y la disociación durante 500 segundos, ya que produjeron suficiente curvatura para ajustes cinéticos precisos.

Las afinidades de unión a IL-21R humano/mono cinomolgo y PD-1 humano/mono cinomolgo anteriores se cuantificaron con instrumentos ForteBio Octet HTX y RED384. En todos los casos, se usó amortiguador de muestra Octet estándar para la dilución de la muestra y para todos las etapas de la línea base de unión, asociación y disociación (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,10 mg.ml, 0,13% (v/v) de Tritón X-100).

Todos los datos brutos de ForteBio se procesaron de la siguiente manera usando el software estándar de análisis de datos del instrumento (v9 y v10): (a) se promediaron dos curvas de la punta de referencia, que tenían la diana inmovilizada pero sin interacción (es decir, solo el amortiguador), y se restaron de las curvas de las puntas de muestras restantes en la misma columna; (b) las curvas de asociación y disociación se aislaron y se alinearon con el eje Y; (c) se alinearon la etapa intermedia de asociación y disociación; (d) se implementó el filtrado Savitzky-Golay para reducir el ruido de la señal, y (e) el conjunto resultante de curvas de asociación y disociación para cada interacción muestradiana se ajustó globalmente con un solo modelo de unión 1:1 para determinar los valores medidos de la constante de velocidad de asociación ka y las constantes de velocidad de disociación kd; la constante de disociación del equilibrio Kd se calculó como una relación de las constantes de las velocidades de disociación y asociación (= kd/ka).

EJEMPLO 12

Este ejemplo describe la generación de los mAb anti-PD-1 para uso en las proteínas de fusión que comprenden muteínas de IL-21.

Generación de respuestas inmunitarias anti-PD-1

Razas de ratones

Se generaron anticuerpos completamente humanos contra PD-1 humano mediante la inmunización de ratones transgénicos XENOMOUSE® (patentes U.S. Nos. 6.114.598; 6.162.963;6.833.268; 7.049.426; 7.064.244; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green y Jakobovits, 1998, J. Ex. Med, 188:483-495; Kellerman y Green, Current Opinion in Biotechnology 13, 593-597, 2002). Para estas inmunizaciones, se usaron animales de las razas XENOMOUSE® XMG4-K y XMG4-KL.

Inmunizaciones

Se usó una ruta de inmunización basada en células para generar respuestas inmunitarias anti-PD-1 humano. Las células CHO-S se transfectaron transitoriamente con PD-1 humano fusionado a través de un enlazador Gly-Ser-Ser a una etiqueta de epítopo de células T E3K, o con PD-1 de cinomolgo como fuente de inmunógeno. Los animales se inmunizaron con cualquiera de estas células CHO transfectadas transitoriamente mezcladas con Alum con CpG-ODN, 13 veces durante 8 semanas usando inyecciones TIP (base de la cola e intraperitoneal). El refuerzo inicial estaba compuesto por 4 millones de células que expresaban PD-1 humano, mientras que los refuerzos posteriores contenían 2 millones de células que expresaban PD-1 humano o de cinomolgo. Se realizaron un total de 9 inmunizaciones con PD-1 humano (1-6, 8, 10 y 13), y las 4 inmunizaciones restantes se realizaron con PD-1 de cinomolgo. Los animales se desangraron después del 10° refuerzo, para evaluar los títulos específicos de PD-1.

Los títulos séricos específicos de PD-1 se monitorizaron mediante análisis FACS de células vivas en un citómetro de flujo Accuri. Brevemente, las células HEK293 se transfectaron de forma simulada o se transfectaron transitoriamente con PD-1 humano o de cinomolgo. El suero de animales inmunizados se diluyó 100 veces, y se incubó durante 1 hora en hielo en las células transfectadas. A continuación, las células se lavaron para eliminar los anticuerpos no unidos, y se incubó en las células un anticuerpo secundario específico anti-Fc humano marcado con Cy5 durante 15 minutos adicionales a 4 grados. Las células se lavaron una vez para eliminar el anticuerpo secundario no unido, y la señal fluorescente en las células se cuantificó mediante FACS. Para la generación de hibridomas, se usaron animales con los títulos nativos de suero específicos del antígeno más altos dirigidos contra PD-1 humano y de cinomolgo (Kohler y Milstein, 1975).

Preparación de anticuerpos monoclonales

Generación de hibridomas

Se identificaron los animales que exhibían títulos séricos adecuados, y se obtuvieron linfocitos del bazo y/o de los ganglios linfáticos de drenaje. Los linfocitos reunidos (de cada cosecha) se disociaron del tejido linfoide moliéndolos en un medio adecuado (por ejemplo, Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM); Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células B se seleccionaron y/o se expandieron usando métodos estándar, y se fusionaron con una pareja de fusión adecuada usando técnicas que eran conocidas en la técnica.

Generación de preparaciones de membrana:

Se transfectaron 20 millones de células 293T con pTT5-mini4:huPD-1::GSS:E3K usando Reactivo de Transfección 293fectin™ (Thermo Fisher, Cat: 12347019). 24 horas después de la transfección, las células 293T se biotinilaron incubándolas en PBS a pH 8,6 que contenía EZ-Link™ NHS-LC-LC-Biotin (Thermo Fisher Cat: 21343) a 400 pg/ml durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron en PBS a pH neutro, y después se resuspendieron en amortiguador hipotónico que contenía inhibidor de proteasas libre de EDTA y 10% de Triton X100. Las células se rompieron bombeándolas repetidamente a través de una jeringa con una aguja de calibre 26. Los fragmentos de células se peletizaron mediante centrifugación a 12000G durante 20 minutos. A continuación, se recogió el sobrenadante que contenía partículas de membrana, y se lavó 3 veces con PBS en una columna centrífuga Amicon Ultracel 100k (Millipore, Cat# UFC810024), para eliminar el detergente. A continuación, las preparaciones de membrana se analizaron en hits de seguimiento (células de hibridoma de control positivo con especificidad para PD-1) para comprobar la unión de la preparación de membrana correlacionada con IgG. A continuación, la preparación de membrana se dividió en alícuotas y se congeló a -20 grados Celsius hasta su uso.

Tinción específica del antígeno de células de hibridoma:

Las células de hibridoma se retiraron del matraz y se lavaron en amortiguador de FACS estéril (2% FBS PBS). A continuación, las células se mezclaron con preparación de membrana de PD-1 (diluida 1:10 en amortiguador de FACS, 1 ml de volumen de reacción, por ejemplo 100 pl de preparación de membrana en 900 pl de amortiguador de FACS), y se incubaron a 4 grados Celsius durante 1 hora. Las células se lavaron de nuevo en amortiguador de FACS, y se tiñeron con 1 ml de cóctel de detección que contenía 5 pg/ml de fragmento F(ab')2 de cabra anti-Fc de IgG humana conjugado con Alexa Fluor 488 (Jackson, Cat: 109-546-098) y estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 647 (Jackson, Cat: 016-600-084), y después se incubaron a 4 grados Celsius durante 30 minutos en la oscuridad. Las células se lavaron de nuevo en amortiguador de FACS, se resuspendieron en medio, y después se pasaron a través de un filtro de células de 40 micrómetros para eliminar las células agregadas. Las células específicas del antígeno se clasificaron usando BD FACSAria 3 seleccionando en la población que presentaba fluorescencia tanto de Alexa Fluor 488 como de Alexa Fluor 647 (IgG+ y células de unión a antígeno).

Las células clasificadas se dejaron cultivar durante unos días en medios de hibridoma. Se extrajo una pequeña muestra de las células enriquecidas, y se analizó la unión a la preparación de membrana de PD-1 usando las mismas condiciones de tinción que se mencionaron anteriormente. Después de confirmar el enriquecimiento exitoso de las células específicas de PD-1, los hibridomas se clasificaron entonces en células individuales en placas de microtitulación de 384 pocillos usando BD FACSAria 3. Después de 2 semanas de cultivo, los sobrenadantes de las placas de microtitulación se recolectaron y se examinaron para determinar la unión de PD-1.

Selección inicial de anticuerpos de unión específica a PD-1

Cell Insight analizó los sobrenadantes de hibridomas agotados para determinar la unión a PD-1 humano expresado transitoriamente en células HEK293. Brevemente, las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con una construcción de expresión de mamífero que codifica PD-1, usando 293Fectin. Al día siguiente, a cada pocillo de una placa FMAT de 384 pocillos se añadieron 15 pl de medio de hibridoma agotado. Después, las células HEK293 transfectadas (0,27 millones/ml), la tinción nuclear Hoechst 33342 (7,5 pg/ml), y un anticuerpo de detección secundario (0,75 pg/ml - Goat anti Human IgG (H+L) Alexa 488 (Jackson ImmunoResearch)) se mezclaron, y se añadieron 30 pl de esta mezcla a cada pocillo de una placa FMAT de 384 pocillos. Después de ~3 horas, el sobrenadante se aspiró usando un lector de placas AquaMax, y se añadieron 30 pl de amortiguador de FACS a cada pocillo con un instrumento Multidrop. Las placas se colocaron en un agitador Big Bear Plate para distribuir uniformemente las células en el pocillo, y después se leyeron en la plataforma de Cell Insight usando Cell Health Bio-App. Este análisis condujo a la identificación de 383 anticuerpos específicos del antígeno de esta cosecha.

Ensayo de informador Jurkat PD-lhumano/NFAT-luciíerasa

Células Jurkat que expresaban de manera estable PD-1 humano y el informador NFAT-luciferasa (Promega) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma), L-glutamina 2 mM (Sigma), HEPES 10 mM (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), 500 pg/ml de geneticina (Gibco Life Technologies), 100 pg/ml de higromicina B (Invitrogen) a 37°C/5% de CO2. Células Jurkat que expresaban de manera estable PD-1 de cinomolgo y el informador NFAT-luciferasa (Promega) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Sigma), L-glutamina 2 mM (Sigma), HEPES 10 mM (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), 200 pg/ml de higromicina B (Invitrogen), 300 pg/ml de zeocina (Invitrogen) a 37°C/5% de CO2. La línea celular clonal 99 de ovario de hámster chino (CHO) que expresa de forma estable PD-L1 humano (Promega) se cultivó en Nutrient Mixture F12 HAM (Sigma), suero bovino fetal al 10%, HEPES 10 mM, 250 pg/ml de geneticina, 200 pg/ml de higromicina B a 37°C/5% de CO2. El día del experimento, las células Jurkat NFAT-luciferasa/PD-1 y las células CHO Clon 99 PD-L1 (separadas con tripsina) se centrifugaron a 200 x g durante 5 minutos, y se resuspendieron en medio de ensayo (medio RPMI 1640, suero bovino fetal al 2%, HEPES 15 mM). Las moléculas de ensayo se diluyeron y titularon usando el amortiguador de ensayo en placas de ensayo de fondo negro/transparente de 384 pocillos (Corning). Las células preparadas se sembraron a razón de 40.000 células/pocillo en total mezclando primero las células preparadas en una relación 1:1, y añadiendo entonces la mezcla de células a las placas de ensayo. Las placas se incubaron durante 18 a 24 horas a 37°C/5% de CO2. La cantidad de luciferasa producida se midió con el reactivo Bio-Glo Luciferase Assay System (Promega), después de lo cual las placas se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente, y se detectó la luminiscencia con el lector de placas EnVision (PerkinElmer). Para el ensayo de punto único, las muestras de ESN primero se cuantificaron, normalizaron, y analizaron a 0,5 pg/ml. Para la determinación de la potencia, las muestras de ESN o los anticuerpos purificados se titularon tres veces en serie en medios de ensayo, y se usaron para tratar células informadoras de PD-1 humano o de cinomolgo. El número de anticuerpos que muestran la actividad deseada durante la selección de concentración única y la clasificación de potencia se muestran en la Tabla 15.

TABLA 15

La actividad de los anticuerpos anti-PD-1 purificados (n=1 para el ensayo de PD-1 humano que se muestra) se muestra en la Figura 24, y la potencia de los anticuerpos anti-PD-1 purificados en los ensayos informadores de PD-1 humano y de cinomolgo se enumeran en la Tabla 16.

TABLA 16

Rescate molecular y secuenciación de anticuerpos antagonistas de PD-1

El ARN (total o ARNm) se purificó a partir de pocilios que contenían células de hibridoma productoras de anticuerpos antagonistas de PD-1 usando un Qiagen RNeasy mini o el kit Invitrogen ARNm catcher plus. El ARN purificado se usó para amplificar los genes de la región variable (V) de la cadena ligera y pesada del anticuerpo usando síntesis de ADNc a través de la transcripción inversa, seguido de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). La cadena pesada gamma del anticuerpo completamente humano se obtuvo usando el Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR kit (Qiagen). Este método se usó para generar el ADNc de primera cadena a partir de la plantilla de ARN, y después para amplificar la región variable de la cadena pesada gamma usando PCR multiplex. El cebador 5' específico de la cadena gamma se hibrida con la secuencia señal de la cadena pesada del anticuerpo, mientras que el cebador 3' se hibrida con una región del dominio constante gamma. La cadena ligera kappa completamente humana se obtuvo usando el Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR kit (Qiagen). Este método se usó para generar el ADNc de primera cadena a partir de la plantilla de ARN, y después para amplificar la región variable de la cadena ligera kappa usando PCR multiplex. El cebador 5' específico de la cadena ligera kappa se hibrida con la secuencia señal de la cadena ligera del anticuerpo, mientras que el cebador 3' se hibrida con una región del dominio constante kappa. La cadena ligera lambda completamente humana se obtuvo usando el Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR kit (Qiagen). Este método se usó para generar el ADNc de primera cadena a partir de la plantilla de ARN, y después para amplificar la región variable de la cadena ligera lambda usando PCR multiplex. El cebador 5' específico de la cadena ligera lambda se hibrida con la secuencia señal de la cadena ligera, mientras que el cebador 3' se hibrida con una región del dominio constante lambda.

El ADNc amplificado se purificó enzimáticamente usando exonucleasa I y fosfatasa alcalina, y el producto de PCR purificado se secuenció directamente. Las secuencias de aminoácidos se dedujeron bioinformáticamente a partir de las correspondientes secuencias de ácidos nucleicos. Se completaron dos ciclos independientes adicionales de amplificación y secuenciación de RT-PCR para cada muestra de hibridoma con el fin de confirmar que cualquier mutación observada no era consecuencia de la PCR. Las secuencias de aminoácidos derivadas se analizaron entonces para determinar el origen de la secuencia de la línea germinal de los anticuerpos y para identificar las desviaciones de la secuencia de la línea germinal. Se indica una comparación de cada una de las secuencias de cadena ligera y pesada con sus secuencias de la línea germinal originales. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos secuenciados se alinearon, y estas alineaciones se usaron para agrupar los clones por similitud.

Ensayos de unión de células primarias

La unión de los sobrenadantes de hibridoma a PD-1 expresado por células primarias humanas y de mono cinomolgo se analizó mediante citometría de flujo. Para el ensayo de unión de células primarias humanas, se descongelaron y suspendieron células T humanas purificadas (Biological Specialty Corp.) a una concentración de 2,5 x 106 células/ml. Las células T se estimularon con 5 ug/ml de anti-CD3 humano clon OKT3 (eBioscience) y 1 pg/ml de anti-CD28 humano (BD Pharmingen) durante 72 horas a 37°C/5% de CO2 en una placa que había sido recubierta previamente con 5 pg/ml anti IgG Fc de ratón (Pierce). Después de 72 horas, las células se retiraron, se lavaron, y se suspendieron a una concentración de 0,5 x 106 células/ml con 10 ng/ml de IL-2 (Pepro Tech). A continuación, las células se incubaron durante otras 48 horas a 37°C/5% de CO2. Para el ensayo de unión de células primarias de cinomolgo, se descongelaron y suspendieron PBMC de cinomolgo (SNBL) en una concentración entre 4x106 y 5x106 células/ml. Las PBMC se estimularon con 1 pg/ml de anti-CD3 humano clon SP34 (BD Pharmingen) y 1 pg/ml de anti-CD28 humano (BD Pharmingen) durante 72 horas a 37°C/5 % de CO2 en una placa que había sido recubierta previamente con 5 pg/ml anti IgG Fc de ratón (Pierce). Después de 72 horas, las células se retiraron, se lavaron, y se suspendieron a una concentración de 0,5 x 106 células/ml con 20 ng/ml de IL-2 (Pepro Tech). A continuación, las células se incubaron durante otras 48 horas a 37°C/5% de CO2. Después de la incubación final, las células se prepararon para citometría de flujo mediante incubación con sobrenadantes de hibridoma normalizados, anticuerpos de control positivo, y anticuerpos de control de isotipo, a una concentración final de 1 pg/ml. Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L) (Jackson ImmunoReserach) a 5 pg/ml se usó para la detección secundaria, y se usó YoPro1 8,25 nM (Invitrogen) para una tinción de células vivas/muertas. A continuación, las células llevaron a un citómetro de flujo BD FACSCanto II para detectar la unión del anticuerpo anti-PD-1. Los resultados se expresan como geomedia de FACS de células que expresan PD-1, y los datos se muestran en la Tabla 17.

TABLA 17

Ensayo de competición receptor - ligando

Los sobrenadantes de hibridoma de unión a PD-1 se analizaron para determinar su capacidad para bloquear PD-1 del ligando de unión. Se realizaron ensayos de unión competitiva en las muestras de sobrenadante de hibridoma específico de antígeno usando FACS en células HEK293 que expresan transitoriamente PD-1 humano de la siguiente manera. Las células HEK293 que expresan PD-1 humano se mezclaron con la muestra de anticuerpos (sobrenadantes de hibridoma específicos para PD-1), y se incubaron durante 1 hora a 4°C, y después se lavaron dos veces. A continuación, las células con la muestra unida se incubaron con huPD-L1 -Fc-Alexa647 o huPD-L2-Fc-Alexa 647 (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante 45 minutos a 4°C. Después se añadió la tinción de viabilidad celular 7-AAD, y las células se incubaron durante otros 15 minutos a 4°C, se lavaron dos veces, y se resuspendieron en amortiguador de FACS. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo BD Accuri™ y un automuestreador Intellicyt HyperCyt. Los datos en la Tabla 18 reflejan el porcentaje de inhibición de la unión de PD-L1 o PD-L2 humano a PD-1 humano a 1 ug/ml.

TABLA 18

Análisis de brechas de afinidad

Las medidas cinéticas de varios de los anticuerpos se evaluaron usando el método KinExA®. Este método implica la determinación basada en disoluciones de medidas de afinidad formal en equilibrio.

Se recubrieron perlas de poli(metacrilato de metilo) o PMMA con PD-1 humano biotinilado recubribriendo en primer lugar por adsorción las perlas de PMMA con BSA biotinilada, Neutravidin, y después con PD-1 biotinilado.

Los experimentos de KinExA se realizaron usando un sistema de inmunoensayo de flujo automatizado, KinExA 3200, en el que las perlas acopladas con PD-1 sirvieron como fase sólida. Brevemente, se incubó una cantidad constante de mAbs anti-hPD-1 (3 nM o 1 nM o 100 pM) con concentraciones de titulación de h-PD-1 o cy-PD-1 a partir de 100 nM en amortiguador de muestra (PBS con 0,1% de BSA para reducir la unión no específica). Los complejos antígeno/anticuerpo se incubaron a RT durante 48 h a 72 h para permitir que se alcanzara el equilibrio. La mezcla se extrajo a través de las perlas acopladas a PD-1, para acumular el anticuerpo no unido. Los volúmenes y caudales de la mezcla se variaron dependiendo de la señal específica obtenida en cada experimento.

El mAb capturado se detectó usando disoluciones que contenían un anticuerpo secundario Ab Goat anti-Hu IgG (H+L)-Alexa647 en el amortiguador de muestra. Las señales unidas se convirtieron en valores relativos como una proporción de control en ausencia de hu- o cy-PD-1. Se midieron dos réplicas de cada muestra para todos los experimentos en el equilibrio. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se obtuvo a partir del análisis de regresión no lineal de los datos usando un modelo de unión homogénea de un sitio contenido en el software de análisis de curva n KinExA. El software calcula la Kd, y determina el intervalo de confianza del 95% ajustando los puntos de datos a una curva de Kd teórica. El intervalo de confianza del 95% se da como Kd baja y Kd alta.

TABLA 19

Confirmación de actividad de anticuerpos purificados en el ensayo de MLR

Se descongelaron células dendríticas derivadas de monocitos humanos inmaduros (Astarte), y se diferenciaron en células dendríticas maduras mediante cultivo en IL-4, GM-CSF y TNF-a durante 72 horas usando el CellXVivo Human Monocyte-Derived Dendritic Cell Differentiation Kit (R&D Systems #CDK004). Las células no adherentes y débilmente adherentes se retiraron, se combinaron y se centrifugaron para peletizar las células. Después de eliminar el medio, las células se resuspendieron en medio X-Vivo-15 a 400x10A3 células/ml, y se añadieron células dendríticas a cada celda de una placa de 96 pocillos (20k células en 50 |ul). Las células T humanas (Astarte) se descongelaron rápidamente y se lavaron en medio X-Vivo-15. Las células se resuspendieron a 2x10A6 células/ml, y se añadieron 100 |ul a cada pocillo (200k células/100 |ul). Los anticuerpos se diluyeron y se añadieron a cada pocillo en un volumen total de 50 |ul. La mezcla se incubó durante tres días a 37 grados. En ese momento, las células se centrifugaron, y se usaron 175 |ul para medir la producción de IL2 como una medida de la proliferación de células T usando el IL-2 V-Plex Kit (MSD) según las recomendaciones del fabricante.

TABLA 20

EJEMPLO 13

Cuando fue posible, las secuencias de dominio variable anti-PD-1 A-1 (20A2), A-3 (20C1) y A-2 (22D4) se manipularon mediante ingeniería para eliminar los motivos que tenían riesgo de degradación de la cadena lateral. Tales motivos de aminoácidos incluyen: (1) secuencias de CDR 'NG' y 'NT' propensas a la desamidación de la asparagina, (2) secuencias de CDR 'DG', 'DH', 'DS' y 'DT' propensas a la isomerización del ácido aspártico, (3) y triptófanos de CDR3 propensos a la oxidación. Por lo general, las identidades de sustitución derivaron de secuencias de la línea germinal o de mAbs de unión a PD-1 relacionados con la secuencia. Para los casos en los que los análisis bioinformáticos o estructurales no proporcionaron una identidad de sustitución clara, se seleccionaron tipos de restos químicamente similares al resto original.

También se eliminaron los motivos de secuencia de dominio variable que violaban las tendencias de covarianza de restos por pares basadas en alineación de secuencias múltiples. La corrección de los infractores de la covarianza por pares mediante la sustitución con tipos de restos de la línea germinal o relacionados con la línea germinal puede conducir a una mejor capacidad de fabricación debido al aumento de los niveles de expresión de mAb y las estabilidades biofísicas. Véase, Kannan, G. Method of Correlated Mutational Analysis to Improve Therapeutic Antibodies. Solicitud de Patente US PCT/US2012/028596, presentada el 9 de marzo de 2012. Las identidades de sustitución para los infractores de la covarianza se seleccionaron usando un enfoque similar al usado para remediar los sitios de degradación, como se discutió anteriormente.

La manipulación de 20A2 condujo a 20A2.003. La manipulación de 20C1 condujo a 20C1.006 y 20C1.009. La manipulación de 22D4 condujo a 22D4.006 y 22D4.017.

EJEMPLO 14

La actividad in vivo de la proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-PD-1 22D4.017 fusionado con una muteína doble de IL-21 monomérica que comprende las mutaciones R9E y R76A ("[22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero)") se evaluó en monos cinomolgos no humanos sin tratamiento previo. Un primer grupo de monos recibió el anticuerpo anti-PD-1 22D4.017 solo (no fusionado con una muteína de IL-21), y un segundo grupo de monos recibió la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero). Los parámetros farmacodinámicos (PD) se monitorizaron mediante FACS en sangre periférica, e incluyeron la dinámica de las células inmunitarias y la fosforilación del factor de transcripción STAT3 (pSTAT3) en linfocitos. Las citocinas séricas y la perforina también se examinaron mediante ensayo multiplex de perfil de multianalito (MAP) Millipore Milliplex®. Se realizó un análisis previo a la dosis de los parámetros de sangre periférica para permitir la normalización de los conjuntos de datos a la línea de base. La dosificación comenzó el Día 1 Se extrajeron sangre y suero en puntos de tiempo fijos predeterminados.

A pesar de la activación de Ki67 [Figuras 25A y 25B] y STAT3 [Figuras 25C y 25D] en las células T, no se observó un aumento significativo en la población total de células T en los grupos a los que se les administró el anticuerpo 22D4.017 o la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) [Figuras 25A y 25B], lo que sugiere que ambos tratamientos fueron insuficientes por sí mismos para inducir la expansión de la población de células T general [Figuras 25E y 25F]. Estos datos respaldan la noción de que el bloqueo sistémico de la señalización de PD-1 puede tener un impacto más global en la población de células T general, incluyendo la activación de la señalización de STAT3 y Ki67, pero que estos cambios pueden ser insuficientes por sí mismos para manifestar un resultado funcional significativo (como también se evidencia por el fracaso de la monoterapia anti-PD-1 o los tratamientos con proteínas de fusión para inducir una expansión de células T más generalizada).

Para comprender mejor cómo los cambios en la señalización proximal podrían afectar específicamente a las células T que expresan PD-1, y debido a que las células T PD-1 (+) reflejan solo una pequeña fracción de la población general de células T en la sangre periférica, estas células se examinaron más directamente agrupando las células T PD-1(+) CD4 y CD8 usando un mAb de detección de PD-1 no competitivo [Figuras 16 y 17]. Después de una leve reducción inicial en el número absoluto de células PD-1(+) circulantes, esta población se mantuvo estable en el grupo del anticuerpo [22D4.017]. Por el contrario, después de una reducción inicial en el número de células T PD-1(+) CD4 y CD8 en sangre periférica, hubo un rebote significativo (por encima de la línea de base) en el número de células PD-1(+) observado a las 336 h tras la dosificación en la población del grupo de tratamiento con proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) [Figura 25G]. De este modo, a pesar de la falta de una expansión significativa de la población general, estos datos sugieren que el número de células T PD-1(+) aumenta selectivamente tras la administración de la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) [Figura].

Para determinar un posible impacto funcional de la expansión de las células T PD-1(+), se examinó la relación entre la expansión de las células T CD4/8 PD-1 (+) y la perforina sérica. De hecho, los datos sugieren que existe una relación positiva entre estos dos parámetros: la perforina sérica es más alta en animales a los que se les administró la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero), que experimentaron un aumento significativo en células T PD-1 (+) de sangre periférica [Figura 25I].

En conjunto, estos datos sugieren que, aunque la exposición sistémica de la proteína de fusión [22D4.017]-[R9E:R76A] (monómero) no logró manifestar un aumento en la población total de células T, el bloqueo de PD-1 y la administración simultánea de la señal de IL-21 en la misma célula (que expresa PD-1) es suficiente para inducir la expansión de la población. Esto también se correlaciona con un aumento de la perforina sérica [Figura 25I].

EJEMPLO 15

El siguiente ejemplo demuestra las afinidades de unión de diversos anticuerpos anti-PD-1.

Las afinidades de unión del anticuerpo anti-PD-1 ::PD-1 Octet se caracterizaron como sigue. Para cuantificar la Kd de la afinidad de unión (constante de disociación del equilibrio) entre los anticuerpos anti-PD-1 y el PD-1 humano y de macaco cinomolgo recombinante, soluble, las constantes de velocidad de asociación y disociación se midieron usando un instrumento Pall® ForteBio® Octet® RED384 en modo de 16 puntas o un instrumento Pall® Octet® HTX en modo de 96 puntas. En todos los casos, se usaron puntas de biosensores de fibra óptica reactivas con amina de segunda generación (AR2G) para capturar covalentemente los anticuerpos a niveles de carga finales entre 2,5 y 4 nm. El método de ensayo de unión usó las siguientes etapas de inmovilización: (1) equilibrio en agua, 60 segundos; (2) activación con hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) 20 mM reciente, mezclado con N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) 10 mM, 600 segundos; (3) inmovilización de anticuerpos 20 nM diluidos en amortiguador acetato 10 mM pH 6,0, 2000 segundos; (4) inactivación con etanolamina 1M, 300 segundos; y finalmente (5) una incubación de línea de base en amortiguador de ejecución Octet (TRIS 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl21 mM, 0,13% (v/v) de Triton X-100 y 0,10 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA), 60 segundos. Todos los experimentos se realizaron con las placas de muestra negras de 384 pocillos sugeridas por el fabricante (100 pl de volumen por pocillo) a 27°C y 1000 RPM.

Para cada interacción Ab::PD-1, se inmovilizó igualmente con el mismo anticuerpo una columna de ocho puntas como se describe anteriormente. Se usaron tres puntas para unir una serie de dilución de tres puntos de PD-1 (1 -170)-FLAG-His humano soluble, se usaron tres puntas más para unir una serie de dilución de tres puntos de cyno PD-1 (1 - 167)-BANDERA-His, y después, las dos puntas restantes (con Ab inmovilizado como el resto de las puntas en la columna) se expusieron a amortiguador Octet® para que puedan ser puntas de referencia. Todas las puntas de fibra óptica se usaron una vez y después se desecharon; es decir, sin regeneración. Se generaron curvas de unión de PD-1 humano y cyno creando una serie de diluciones en serie de 1:3 veces del receptor de PD-1 soluble en amortiguador de ejecución Octet; las concentraciones finales de PD-1 fueron 30, 10 y 3,3 nM (excepto para el mAb IgG4 anti-PD-1, que tenía una concentración de PD-1 de 33, 11,3,7 nM). Los biosensores de fibra óptica con los anticuerpos inmovilizados se incubaron en los pocillos que contenían la serie de diluciones en serie de PD-1 durante 300 segundos (etapa de asociación) y después se trasladaron a pocillos con solo el amortiguador de ejecución durante 500 segundos (etapa de disociación).

Los datos en bruto se procesaron con el software de análisis de datos del instrumento (v10). Para cada columna de sensores, la señal de unión de los dos sensores de referencia se promedió y restó de los seis sensores de muestra restantes. Después, los datos sustraídos de referencia se procesaron con las opciones de software por defecto: eje Y alineado con la línea base, corrección entre etapas para la disociación, y finalmente procesados con un filtro Savitzky-Golay. Los datos finales procesados para cada anticuerpo que se une a tres concentraciones de PD-1 humano o tres de cyno se ajustaron globalmente a un modelo de unión 1:1 y se representaron gráficamente. Todos los gráficos muestran tanto los datos procesados como el ajuste al modelo de unión 1:1. Se usó el ajuste del modelo de unión 1:1 para determinar la constante de velocidad de asociación (fe; unidades M-1s-1) y la constante de velocidad de disociación (fe; unidades s-1). La constante de disociación del equilibrio (Kd; unidades nanomolar (nM) = 1 x 10-9 mol/l) se calculó entonces como una relación de kd / fe.

La Figura 26 muestra los perfiles de unión para los anticuerpos anti-PD-1 22D4.017, 20C1.009 y 20A2.003, ensayados junto con dos mAb anti-PD-1 (un mAb IgG1 anti-PD-1 y un mAb IgG4 anti-PD-1). Los perfiles de unión se determinaron usando el sistema FortéBio Octet®. La unión se muestra frente a receptores de PD-1 humanos y de cyno.

Como se muestra en las Figuras 26A-26E, los anticuerpos 22D4.017, 20C1.009 y 20A2.003 PD-1 exhibieron valores de Kd que fueron 2 a 14 veces mayores que los anticuerpos disponibles comercialmente cuando se ensayaron contra la proteína PD-1 humana. Además, el análisis de la reactividad cruzada de la proteína PD-1 de cyno con los anticuerpos 22D4.017, 20C1.009 y 20A2.003 mostró una afinidad similar en general, mientras que los anticuerpos disponibles comercialmente mostraron una diferencia de afinidad de alrededor de doble (Figura 26F- 26J).

EJEMPLO 16

El siguiente ejemplo demuestra la estabilidad de diversos anticuerpos anti-PD-1.

La estabilidad conformacional térmica de los anticuerpos anti-PD-1 se caracterizó como sigue. Se evaluó la estabilidad térmica de los anticuerpos 20C1.009 y 22D4.017 mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). DSC es una técnica que mide las capacidades caloríficas en función de la temperatura. La señal de la celda de muestra se compara con una celda de referencia que carece de la proteína. A medida que aumenta la temperatura de las celdas, se mide la entalpía y la temperatura de fusión, la anchura del pico para cada transición de desnaturalización. Esto proporciona información sobre la estabilidad térmica y la estructura de orden superior de la proteína, incluida la estabilidad térmica de los dominios de la proteína. La Figura 27 representa un termograma de DSC de cada anticuerpo anti-PD-1 a 1 mg/ml en A52SuT, y la Tabla 21 proporciona la Tm para cada anticuerpo analizado.

TABLA 21

La viscosidad se determinó adicionalmente usando un cono y una placa (TA Instruments, New Castle, DE) midiendo la resistencia al flujo debido a las fuerzas de fricción entre las moléculas. Se aplicó un procedimiento de barrido de flujo de 100 a 1000 s-1 usando una placa cónica de 1,988° de 20 mm y una placa Peltier de acero - 990918. La viscosidad se midió en Pas, en la que 1 mPas = 1 cP a 1000 s-1. La viscosidad se midió para cada anticuerpo a 70 y 150 mg/ml con tensioactivo al 0,01% añadido al amortiguador de formulación (A52Su). Todas las muestras se midieron a temperatura ambiente. Los datos de viscosidad (velocidad de cizallamiento 1000) se muestran en la Figura 28 y se proporcionan en la Tabla 22.

TABLA 22

Las propiedades de estabilidad de un anticuerpo son factores importantes que se tienen en cuenta durante el desarrollo de candidatos terapéuticos. Por ejemplo, la propensión de un anticuerpo a agregarse (formación de grandes complejos en disolución que pueden conducir a la precipitación) puede afectar la vida útil, el modo de administración (por ejemplo, i.v. frente a subcutánea), y la actividad de la molécula. Normalmente, las propiedades de termoestabilidad y viscosidad de un anticuerpo son buenos indicadores de la capacidad de un anticuerpo para mantener la integridad estructural a altas temperaturas y altas concentraciones. Como demuestran los datos anteriores, 20C1.009 exhibe propiedades de estabilidad que lo hacen particularmente adecuado como agente terapéutico que se puede administrar tanto por administración i.v. como subcutánea (y a alta concentración).

EJEMPLO 17

Este ejemplo demuestra la actividad de IL-21 provocada por diversas proteínas de fusión.

Se prepararon diversas proteínas de fusión que comprenden una muteína de IL-21, y se analizaron para determinar la actividad de IL-21 usando el ensayo de pSTAT3 AlphaLISA®. Una comprendía un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-TIGIT, mientras que la segunda comprendía un mAb anti-LAG3. Se generaron cuatro líneas celulares para uso en estos experimentos: (A) una línea de células T Hut78 variante que es PD-1 positiva, (B) una línea de células T Hut78 variante que es TIGIT positiva, (C) una línea de células T Hut78 variante que es LAG3 positiva, y (D) la línea de células T Hut78 parental que no expresa endógenamente PD-1, TIGIT o LAG3. Las cuatro líneas celulares se expusieron a (i) rhIL-21 sola, (ii) mAb anti-PD-1 solo, (iii) mAb anti-TIGIT solo, (iv) mAb anti-LAG3 solo, (v) mAb anti-PD -1 mAb fusionado con una muteína de IL-21 (R5Q:R76E) (monómero), (vi) mAb anti-TIGIT fusionado con una muteína de IL-21 (R5Q:R76E) (dímero) y (vii) mAb anti-LAG3 fusionado con una muteína de IL-21 (R5Q:R76E) (dímero).

Los resultados del ensayo de fosforilación de STAT3 y las EC50 de cada molécula para la señalización de STAT se muestran en las Figuras 29A-29D y en la Tabla 23, respectivamente.

TABLA 23

Como se muestra en las Figuras 29A-29D y en la Tabla 23, las proteínas de fusión anti-TIGIT y anti-LAG3 exhibieron una potencia significativamente reducida (anti-TIGIT) o ninguna potencia medible (anti-LAG3) en comparación con rhIL-21.

El uso de los términos "un" y "una" y "el/la", y referencias similares, en el contexto de describir la descripción (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique aquí de otro modo o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero no se limita a"), a menos que se indique lo contrario.

La enumeración de intervalos de valores aquí tiene la intención meramente de servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo y cada punto final, a menos que se indique lo contrario aquí, y cada valor y punto final por separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se citase individualmente aquí.

Todos los métodos descritos aquí se pueden realizar en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario aquí o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") que se proporciona aquí, tiene como intención ilustrar mejor la descripción, y no representa una limitación en el alcance de la descripción, a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como una indicación de cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la descripción.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la muteína de IL-21 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID

NO: 2),

en laque "X" representa cualquier aminoácido, y

en la que dicha secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-21 difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en al menos 1 aminoácido.

2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en no más de 7 aminoácidos.

3. El conjugado de la reivindicación 1, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en 3, 4, 5, o 6 aminoácidos.

4. El conjugado de la reivindicación 1, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) en 1 o 2 aminoácidos.

5. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la o las diferencias entre la secuencia de aminoácidos de la muteína de IL-21 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se producen en (A) los aminoácidos 10-15, inclusive, o los aminoácidos 105-123, inclusive, de SEQ ID NO: 2, opcionalmente, en el que las diferencias ocurren en los aminoácidos 11, 14, 15, 109, 110, 112, 113, 116 , 119, 120, y/o 123 de SEQ ID NO: 2, o (B) los aminoácidos 5-25, inclusive, o los aminoácidos 65-80, inclusive, de SEQ ID NO: 2, opcionalmente, en el que la o las diferencias ocurren en los aminoácidos 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, y/o 80 de SEQ ID NO: 2.

6. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos con una sustitución de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1).

7. El conjugado de la reivindicación 6, en el que la sustitución de aminoácidos se produce en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71,72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1.

8. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende una sustitución de aminoácidos:

a. en la posición 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116 o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido alifático;

b. en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120 o 123 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido ácido;

c. en la posición 5, 9, 73, 76, 109, 113 o 116 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido básico;

d. en la posición 5, 8, 9, 70 o 76 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido aromático; e. en la posición 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido que comprende una amida de cadena lateral;

f. en la posición 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido no aromático que comprende un hidroxilo de cadena lateral;

g. en la posición 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, o 80 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un iminoácido;

h. en la posición 5, 9, 15, 76, 116, o 119 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto es un aminoácido que comprende una cadena lateral que contiene azufre; o

i. o una combinación de las mismas.

9. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende una sustitución de aminoácidos con un aminoácido en la posición según la TABLA A:

TABLA A

10. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 3-21,23-56, 58-112, 114-198, 249-254, y 283; o

(b) una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 199 a 208, 210 a 222, 224 a 248, y 255.

11. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos con dos sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), opcionalmente, en el que la sustitución de aminoácidos ocurre en dos de las posiciones 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, o 123 de SEQ ID NO: 1.

12. El conjugado de la reivindicación 11, en el que la sustitución de aminoácidos se produce en dos de las posiciones 5, 9, 73, y 76 de SEQ ID NO: 1.

13. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende dos cualquiera de los siguientes:

(i) un aminoácido en la posición 5 de SEQ ID NO: 1, en la que dicho aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, o Y;

(ii) un aminoácido en la posición 9 de SEQ ID NO: 1, en la que dicho aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, o Y;

(iii) un aminoácido en la posición 73 de SEQ ID NO: 1, en la que dicho aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: A, D, E, G, H, I, N, P, Q, S, o V; y

(iv) un aminoácido en la posición 76 de SEQ ID NO: 1, en la que dicho aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, o Y.

14. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 5, 9, o 73 de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido sustituto se selecciona de:

15. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 76 de SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituto en la posición 76 es un aminoácido alifático o un aminoácido ácido, opcionalmente, en el que el aminoácido alifático es alanina, o en el que el aminoácido ácido es ácido glutámico.

16. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 se une directamente a la Fc del anticuerpo.

17. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 se une a la Fc del anticuerpo a través de un enlazador.

18. El conjugado de la reivindicación 16 o 17, en el que dicho conjugado comprende una única muteína de IL-21, en el que dicha única muteína de IL-21 está unida al extremo C de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo.

19. El conjugado de la reivindicación 16 o 17, en el que dicho conjugado comprende dos muteínas de IL-21, en el que la primera muteína de IL-21 está enlazada al extremo C de la cadena pesada del primer anticuerpo, y la segunda muteína de IL-21 está enlazada al extremo C de la cadena pesada del segundo anticuerpo, opcionalmente, en el que dicha primera muteína de IL-21 tiene la misma secuencia de aminoácidos que la segunda muteína de IL-21.

20. El conjugado de la reivindicación 19, en el que dicha primera muteína de IL-21 y dicha segunda muteína de IL-21 tienen las mismas secuencias de aminoácidos.

21. El conjugado de la reivindicación 19, en el que dicha primera muteína de IL-21 y dicha segunda muteína de IL-21 tienen secuencias de aminoácidos diferentes.

22. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 233-245.

23. El conjugado de la reivindicación 22, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 244.

24. El conjugado de la reivindicación 22, en el que la muteína de IL-21 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 245.

25. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1.

26. El conjugado de la reivindicación 25, en el que la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 391, y

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NOs: 498-500 o 519; o

(ii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 391,

una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de una cualquiera de SEQ ID NOs: 501 -506, y

una cadena pesada que comprende la cadena pesada de una cualquiera de SEQ ID NOs: 556-558; o

(iii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 371, y

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NOs: 508-512; o

(iv) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 371,

una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 513-518, y

una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 559-561; (v) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389, y dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NOs: 498-500 o 519; o

(vi) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389, una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de una cualquiera de SEQ ID NOs: 501-506, y

(vii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369, y dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NOs: 508-512; o

(viii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369, una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de una cualquiera de SEQ ID NOs: 513-518, y

una cadena pesada que comprende la cadena pesada de una cualquiera de SEQ ID NOs: 559-561; o

(ix) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389 y una región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 391, y

(x) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389 y una región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 391,

una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de una cualquiera de SEQ ID NOs: 501-506, y

(xi) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369 y una región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 371, y

(xii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369 y una región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 371,

una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de una cualquiera de SEQ ID NOs: 513-518, y

una cadena pesada que comprende la cadena pesada de una cualquiera de SEQ ID NOs: 559-561.

27. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una una LC CDR1, LC CDR2, y LC CDR3, que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 385, 386, y 387, respectivamente;

(ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una una HC CDR1, HC CDR2, y HC CDR3, que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 382, 383 y 384, respectivamente; y

(iii) una muteína de IL-21 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 244, en la que la IL-21 está fusionada con una de las cadenas pesadas del anticuerpo.

28. El conjugado de la reivindicación 27, en el que cada cadena ligera comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389, y cada cadena pesada comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 388.

29. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 391;

(ii) una cadena pesada que comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 556; y

(iii) una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 501.

30. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que:

(a) la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389;

(ii) una cadena pesada que comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 556; y

(iii) una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 501; o

(b) la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389 y la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 391;

(ii) una cadena pesada que comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 556; y

31. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la proteína de fusión comprende:

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 499, o

(ii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389, y dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 499, o

(iii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389 y la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 391, y

(iv) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 391, y

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 519; o

(v) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389, y dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 519; o

(vi) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 389 y la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 391, y

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 519.

32. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una una LC CDR1, LC CDR2, y LC CDR3, que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 365, 366, y 367, respectivamente;

(ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una una HC CDR1, HC CDR2, y HC CDR3, que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 362, 363 y 364, respectivamente; y

33. El conjugado de la reivindicación 32, en el que cada cadena ligera comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369, y cada cadena pesada comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 368.

34. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que:

(a) la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 371;

(ii) una cadena pesada que comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 559; y

(iii) una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 513; o

(b) la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369;

(ii) una cadena pesada que comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 559; y

(c) la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369 y la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 371;

(ii) una cadena pesada que comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 559; y

(iii) una cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 que comprende la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 513.

35. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado es una proteína de fusión que comprende una muteína de IL-21 y un anticuerpo anti-PD-1, en el que la proteína de fusión comprende:

(i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 371, y

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 508, o

(ii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369, y dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 508, o

(iii) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369 y la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 371, y

(iv) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la cadena ligera de SEQ ID NO: 371, y

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 511; o

(v) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369, y dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 511; o

(vi) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 369 y la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 371, y

dos fusiones de muteína de IL-21 de cadena pesada, comprendiendo cada una la cadena pesada fusionada con una muteína de IL-21 de SEQ ID NO: 511.

36. Un kit que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un recipiente.

37. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

38. La composición farmacéutica de la reivindicación 37, para uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesite.

39. La composición farmacéutica de la reivindicación 38, para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor sólido.