PT1963369E

PT1963369E - Antagonistas de il-21

Info

Publication number: PT1963369E
Application number: PT68501980T
Authority: PT
Inventors: Pallavur V Sivakumar; Stephen R Jaspers
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2006-11-28
Publication date: 2013-05-28
Also published as: US7923539B2; JP2013081461A; WO2007111714B1; JP6163520B2; US20070122413A1; WO2007111714A3; PL1963369T3; EP2567973B1; ES2409835T3; JP6027849B2; DK1963369T3; JP5322653B2; US20090075341A1; EP1963369A2; US20110172399A1; US20170037123A1; AU2006340750B2; EP2567973A2; JP2016011301A; AU2006340750A1

Description

DESCRIÇÃO "ANTAGONISTAS DE IL-21" 0 sistema imunitário é a defesa primária do corpo contra doenças causadas por patogénios, nomeadamente bactérias, vírus, fungos etc., assim como contra doenças causadas por crescimento anómalo das células e tecidos do próprio corpo (i. e., tumores cancerosos). Normalmente, o sistema imunitário é capaz de distinguir entre as células normais do corpo ou "próprias" e patogénios estranhos ou células anómalas ou "não próprias". Os processos pelos quais o sistema imunitário se abstém de reagir ao seu próprio corpo são denominados tolerância. Por vezes, o sistema imunitário perde a capacidade de reconhecer "próprio" como normal e a subsequente resposta dirigida contra o tecido ou células resulta na perda de tolerância, um estado de auto-imunidade. As patologias resultantes de auto-imunidade têm, frequentemente, sérias consequências clinicas e são um dos principais problemas de saúde no mundo, especialmente em nações desenvolvidas.

As citocinas, em geral, estimulam a proliferação ou diferenciação de células da linhagem hematopoiética ou participam nos mecanismos de resposta imune e inflamatória do corpo. As interleucinas são uma família de citocinas que medeiam respostas imunológicas. Os receptores que se ligam a citocinas são, tipicamente, compostos por uma ou mais proteínas membranares integrais que se ligam à citocina com elevada afinidade e transduzem este evento de ligação à célula, através das porções citoplasmáticas de determinadas subunidades de 1 receptor. Os receptores de citocina foram agrupados em várias classes, com base em semelhanças nos seus domínios extracelulares de ligação de ligando. Por exemplo, as cadeias de receptor responsáveis pela ligação e/ou transdução do efeito de interferões são membros da família de receptores de citocina de classe II, com base num característico domínio extracelular de 200 resíduos. A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais anti-IL-21 e as suas utilizações no tratamento de doença auto-imune, como definido nas reivindicações. O documento WO 99/61617 descreve IL-21 e IL-22. 0 documento WO 03/040313 descreve antagonistas de IL-21. O documento WO/2004/083249 descreve anticorpos contra o receptor IL-21 humano e as suas utilizações.

Ueda Maki et ai., British Journal of Haematology, Janeiro de 2005, Vol. 128(2), páginas 169-176, descrevem a expressão de receptor de IL-21 funcional em células de leucemia de células T adultas. A presente descrição descreve um anticorpo monoclonal anti-IL-21 que se liga a uma região de antigénio de IL-21 humana. Um anticorpo monoclonal pode ligar—se a uma região antigénica de IL-21 que é mostrada na SEQ ID N° : 6, desde os resíduos de aminoácido 97-122. Um anticorpo monoclonal pode ligar-se a uma região antigénica, como mostrada na SEQ ID N°: 6, desde os resíduos de aminoácido 145 a 148. Um anticorpo monoclonal pode ligar-se a uma região antigénica, como mostrada 2 na SEQ ID N°: 6, desde os resíduos de aminoácido 154 a 162. Um anticorpo monoclonal pode ligar-se a uma região de antigénio, como mostrada na SEQ ID N° : 6, desde os resíduos de aminoácido 30 a 50. A descrição descreve um anticorpo monoclonal que se liga a uma região de antigénio, como mostrada na SEQ ID N° : 6, desde os resíduos de aminoácido 40 a 50. Pode mostrar-se que os anticorpos monoclonais da invenção, como aqui descrito, neutralizam uma actividade de proteína de IL-21 humana. Pode mostrar-se que os anticorpos monoclonais aqui descritos se ligam a uma proteína de IL-21-Fc humana, ligam-se a uma proteína de Fc de muteína humana, onde as mutações são em Gin 145 e/ou Ile 148 da SEQ ID N° : 6, ou ligam-se a uma proteína de fusão IL-21 de murganho-Fc de murganho. Em geral, os anticorpos monoclonais aqui descritos ligam-se a duas ou mais proteínas de IL-21.

Em outros aspectos da invenção, o anticorpo monoclonal (como definido nas reivindicações) liga-se, especificamente, ao epitopo a que o anticorpo monoclonal 272.21.1.13.4.2 (Acesso ATCC N° PTA-10395) se liga. A descrição também descreve um anticorpo monoclonal que se liga, especificamente, ao epitopo a que o anticorpo monoclonal 268.5.1.11.42.1.4.3.9 (Acesso ATCC N° pta-10394) se liga. Os anticorpos monoclonais da presente invenção também podem ser marcados com um marcador detectável e o marcador detectável pode ser seleccionado, mas não está limitado a isótopos radioactivos, enzimas, corantes e biotinas. A presente invenção descreve um bin (ou grupo de anticorpos) que é capaz de competição com o anticorpo monoclonal 272.21.1.13.4.2 (Acesso ATCC N° PTA-10395) para ligação a um antigénio de IL-21 humana. 3 A descrição descreve um bin que é capaz de competição com o anticorpo monoclonal 268.5.1.11.42.1.4.3.9 (Acesso ATCC N° PTA-10394) para ligação a um antigénio de IL-21 humana.

Também estão incluídos na presente invenção hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais reivindicados, como definido nas reivindicações. A presente invenção proporciona um método de produção dos anticorpos monoclonais reivindicados, compreendendo: (a) proporcionar um hibridoma capaz de produzir o anticorpo monoclonal; e (b) cultivar o hibridoma sob condições que proporcionam a produção do anticorpo monoclonal pelo hibridoma, como definido nas reivindicações.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo, como definido nas reivindicações, para utilização no tratamento de uma doença auto-imune. Em determinadas formas de realização, a doença auto-imune é seleccionada do grupo consistindo em pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), Doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn, colite ulcerosa, síndrome do intestino irritável, esclerose múltipla, artrite reumatóide, diverticulose, lúpus eritematoso sistémico, psoríase, espondilite anquilosante, esclerodermia, esclerose sistémica, artrite psoriática, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença de enxerto vs. hospedeiro (GVHD), linfoma cutâneo de células T (CTCL), síndrome de Sjogren, glomerulonefrite, nefropatia de IgA, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, dermatite atópica, síndrome anti-fosfolípido, asma e outras doenças auto-imunes. 4 A presente descrição descreve um método de inibição ou redução de um distúrbio mediado por IL-21, compreendendo a administração de um anticorpo monoclonal anti-IL-21, numa quantidade suficiente para inibir ou reduzir actividade biológica mediada por IL-21 no indivíduo.

As seguintes definições são proporcionadas para facilitar a compreensão das invenções aqui descritas. A expressão "anticorpo" ou "péptido(s) de anticorpo" refere-se a um anticorpo intacto, ou um seu fragmento de ligação, que compete com o anticorpo intacto para ligação específica e inclui anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos e bi-específicos. Os fragmentos de ligação podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinante. Os fragmentos de ligação podem ser produzidos por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem mas não estão limitados a Fab, Fab', F(ab')2, Fv e anticorpos de cadeia simples. A expressão "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que iriam interferir com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteicos ou não proteicos. 0 anticorpo pode ser purificado (1) para mais de 95%, em peso, de anticorpo, como determinado pelo método de Lowry e, de um modo muito preferido, mais de 99%, em peso, (2) até um grau suficiente para se obter, pelo menos, 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminais ou internos, por utilização de um sequenciador com frasco de rotação ou (3) até 5 homogeneidade por SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando coloração de azul de Coomassie ou, de um modo preferido, prata. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes dado que, pelo menos, um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Habitualmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado por, pelo menos, uma etapa de purificação.

Um anticorpo anti-IL-21 "variante", refere-se aqui a uma molécula que difere em sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos de anticorpo anti-IL-21 "parental", em virtude de adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduo (s) de aminoácido na sequência de anticorpo parental. 0 variante pode compreender uma substituição ou mais substituições de aminoácido em uma região hipervariável ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo parental. Por exemplo, o variante pode compreender, pelo menos, uma, e. g., desde cerca de uma a cerca de dez e, de um modo preferido, desde cerca de duas a cerca de cinco substituições em uma ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo parental. Habitualmente, o variante terá uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 75% de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências de domínio variável de cadeia pesada ou leve de anticorpo parental ou, de um modo mais preferido, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 85%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% e, de um modo muito preferido, pelo menos, 95%. A identidade ou homologia, com respeito a esta sequência, é aqui definida como a percentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que é idêntica aos resíduos de anticorpo parental, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a máxima percentagem de identidade de sequência. Nenhuma das extensões, deleções ou inserções N-terminais, 6 C-terminais ou internas na sequência de anticorpo deverá ser interpretada como afectando a identidade ou homologia de sequência. 0 variante retém a capacidade de se ligar a IL-21 humana e, de um modo preferido, tem propriedades que são superiores às do anticorpo parental. Por exemplo, o variante pode ter uma afinidade de ligação mais forte, capacidade melhorada para inibir a estimulação induzida por IL-21 de células imunes. Para analisar essas propriedades, deve-se comparar uma forma de Fab do variante com uma forma de Fab do anticorpo parental ou uma forma de tamanho total do variante com uma forma de tamanho total do anticorpo parental, por exemplo, dado que se verificou que o formato do anticorpo anti-IL-21 influencia a sua actividade nos ensaios de actividade biológica aqui divulgados. 0 presente anticorpo variante de interesse particular é aquele que exibe um melhoramento de, pelo menos, cerca de 10 vezes, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 20 vezes e, de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 50 vezes na actividade biológica, quando comparado com o anticorpo parental. A expressão "anticorpo parental", como aqui utilizada, refere-se a um anticorpo que é codificado por uma sequência de aminoácidos utilizada para a preparação do variante. De um modo preferido, o anticorpo parental tem uma região de estrutura humana e, se presente(s), tem região ou regiões constantes de anticorpo humano. Por exemplo, o anticorpo parental pode ser um anticorpo humanizado ou humano. 0 termo "agonista" refere-se a qualquer composto, incluindo uma proteína, polipéptido, péptido, anticorpo, fragmento de anticorpo, molécula grande ou molécula pequena (inferior a 10 kD) que aumenta a actividade, activação ou função de outra 7 molécula. Os agonistas de IL-21 causam, por exemplo: estimulação de células NK, subconjuntos de células T e subconjuntos de células B e células dendríticas. 0 termo "antagonista" refere-se a qualquer composto, incluindo uma proteína, polipéptido, péptido, anticorpo, fragmento de anticorpo, molécula grande ou molécula pequena (inferior a 10 kD) que diminui a actividade, activação ou função de outra molécula. Os antagonistas de IL-21 causam: função imune diminuída de células NK, subconjuntos de células T e subconjuntos de células B e células dendríticas; ligam-se a IL-21 de modo que a interacção da proteína de IL-21 seja bloqueada, inibida, reduzida, antagonizada ou neutralizada.

Compreende-se que um "anticorpo bivalente" que não um anticorpo "multiespecífico" ou "multifuncional", em determinadas formas de realização, compreende sítios de ligação tendo especificidade antigénica idêntica.

Um anticorpo "bi-específico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido tendo dois pares de cadeias pesadas/leves diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos bi-específicos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo mas não limitados a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos de Fab'. Ver, e. g., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 1^_:315-321 (1990): Kostelny et al., J. Immunol. 148 : 1547-1553 (1992) . A expressão "anticorpo quimérico" ou "anticorpos quiméricos" refere-se a anticorpos cujos genes de cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente por engenharia genética, a partir de genes de região variável e constante de imunoglobulina pertencendo a diferentes espécies. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal de murganho podem ser ligados a segmentos constantes humanos, tais como gama 1 e gama 3. Um anticorpo quimérico terapêutico típico é, deste modo, uma proteína híbrida, composta pelo domínio variável ou de ligação de antigénio de um anticorpo de murganho e o domínio constante de um anticorpo humano, embora outras espécies mamíferas possam ser utilizadas. A expressão "título neutralizante eficaz", como aqui utilizada, refere-se à quantidade de anticorpo que corresponde à quantidade presente no soro de animais (humano ou rato do algodão) que se demonstrou ser clinicamente eficaz (em humanos) ou que reduz o vírus em 99% em, por exemplo, ratos do algodão. A redução de 99% é definida por uma provocação específica de, e. g., 103 pfu, 104 pfu, 105 pfu, 106 pfu, 107 pfu, 108 pfu ou 109 pfu) de RSV. 0 termo "epitopo" inclui qualquer determinante de proteína, capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Os determinantes epitópicos consistem, habitualmente, em agrupamentos de superfície quimicamente activa de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm, habitualmente, características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Mais especificamente, a expressão "epitopo de IL-21", como aqui utilizada, refere-se a uma porção de um polipéptido de IL-21 tendo actividade antigénica ou imunogénica num animal, de um modo preferido num mamífero e, de um modo muito preferido, num murganho ou um humano. Um epitopo tendo actividade imunogénica é uma porção de um polipéptido de IL-21 que deduz uma resposta de anticorpo num animal. Um epitopo tendo actividade antigénica é 9 uma porção de um polipéptido de IL-21 a que um anticorpo se liga de modo imunoespecífico, como determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, por imunoensaios. Os epitopos antigénicos não necessitam de ser necessariamente imunogénicos . 0 termo "epitopo marcado", quando aqui utilizado, refere-se ao anticorpo anti-IL-21 fundido a um "marcador epitopo". 0 polipéptido do marcador epitopo tem resíduos suficientes para proporcionar um epitopo contra o qual um anticorpo pode ser preparado, contudo é curto o suficiente de modo a que não interfira com actividade do anticorpo IL-21. 0 marcador epitopo é, de um modo preferido, suficientemente único, de modo a que o anticorpo não reaja de modo cruzado substancialmente com outros epitopos. Os polipéptidos marcadores adequados têm, em geral, pelo menos, 6 resíduos de aminoácido e, habitualmente, entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácido (de um modo preferido entre cerca de 9-30 resíduos). Os exemplos incluem o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 (Field et ai., Mol. Cell. Biol. 8_:2159-2165 (1988)); o marcador de c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 desta (Evan et ai.,

Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); e o marcador de glicoproteína D do vírus Herpes Simplex (gD) e o seu anticorpo (Paborsky et ai., Protein Engineerinq 3(6):547-553 (1990)). Em determinadas formas de realização, o marcador epitopo é um "epitopo de ligação de receptor de resgate". Como aqui utilizada, a expressão "epitopo de ligação de receptor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (e. g., IgGl, IgG2, lgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semi-vida sérica in vivo da molécula de IgG. 10 0 termo "fragmento", como aqui utilizado, refere-se a um péptido ou polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, 5 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 10 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 15 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 20 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 25 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 40 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 50 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 60 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 70 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 80 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 90 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 100 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 125 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos, 150 resíduos de aminoácido contíguos da sequência de aminoácidos de um polipéptido de IL-21 ou um anticorpo que se liga de modo imunoespecifico a um polipéptido de IL-21.

Como aqui utilizado, o termo "imunoglobulina" refere-se a uma proteína consistindo em um ou mais polipéptidos, substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são responsáveis, em conjunto, pela ligação a um antigénio e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efectoras de anticorpo.

As "cadeias leves" de imunoglobulina de tamanho total (cerca de 25 Kd ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável no terminal NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e um gene de região constante capa ou lambda no terminal COOH. As 11 "cadeias pesadas" de imunoglobulina de tamanho total (cerca de 50 Kd ou 446 aminoácidos) são codificadas, de modo semelhante, por um gene de região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes de região constante mencionados acima (cerca de 330 aminoácidos). As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Nas cadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes estão ligadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a região pesada incluindo também uma região "D" de cerca de mais 10 aminoácidos. (Ver, de uma maneira geral, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.I., 1989), Cap. 7.

Uma região variável de cadeia leve ou pesada de

imunoglobulina consiste numa região de "estrutura", interrompida por três regiões hipervariáveis. Deste modoa expressão "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "Região Determinante de Complementaridade" ou "CDR" (i. e., resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-56 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou os resíduos de um "gancho hipervariável" (i. e., resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987) . Os resíduos de "Região de Estrutura" ou "FR" são os resíduos de domínio variável que não os resíduos de região 12 hipervariável, como aqui definido. As sequências das regiões de estrutura de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. Deste modo, uma "região de estrutura humana" é uma região de estrutura que é substancialmente idêntica (cerca de 85% ou mais, habitualmente 90-95% ou mais) à região de estrutura de uma imunoglobulina humana de ocorrência natural. A região de estrutura de um anticorpo, ou seja as regiões de estrutura combinadas das cadeias leve e pesada constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDR. As CDR são, principalmente, responsáveis pela ligação a um epitopo de um antigénio.

Consequentemente, o termo imunoglobulina "humanizada" refere-se a uma imunoglobulina compreendendo uma região de estrutura humana e uma ou mais CDR de uma imunoglobulina não humana (habitualmente um murganho ou rato). A imunoglobulina não humana proporcionando a CDR é denominada a "dadora" e a imunoglobulina humana proporcionando a estrutura é denominada a "aceitadora". As regiões constantes não necessitam de estar presentes mas, se estiverem, devem ser substancialmente idênticas a regiões constantes de imunoglobulina humana, i. e., pelo menos, cerca de 85-90%, de um modo preferido cerca de 95% ou mais idênticas. Por este motivo, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, excepto possivelmente as CDR, são substancialmente idênticas a partes correspondentes de sequências de imunoglobulina humana natural. Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo compreendendo uma cadeia leve humanizada e uma cadeia pesada humanizada de imunoglobulina. Por exemplo, um anticorpo humanizado não abrangeria um anticorpo quimérico típico, como definido acima, e. g., porque a região variável integral de um anticorpo quimérico é não humana. 13

Como aqui utilizada, a expressão "anticorpo humano" inclui um anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e inclui anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgénicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressa imunoglobulinas endógenas, como descrito, por exemplo, por Kucherlapati et al., na Pat. U.S. N° 5939598. A expressão "anticorpos geneticamente alterados" significa anticorpos em que a sequência de aminoácidos foi variada a partir da de um anticorpo nativo. Devido à relevância das técnicas de ADN recombinante na produção de anticorpos, não é necessário estar-se confinado às sequências de aminoácidos verificadas em anticorpos naturais; os anticorpos podem ser redesenhados para se obter as caracteristicas desejadas. As possíveis variações são muitas e vão desde a alteração de apenas um ou alguns aminoácidos até ao redesenho completo, por exemplo, da região variável ou constante. As alterações na região constante serão, em geral, realizadas de modo a melhorar ou alterar caracteristicas, tais como fixação de complemento, interacção com membranas e outras funções efectoras. As alterações na região variável serão realizadas de modo a melhorar as caracteristicas de ligação de antigénio.

Além de anticorpos, as imunoglobulinas podem existir numa variedade de outras formas incluindo, por exemplo, cadeia simples ou Fv, Fab e (Fab')2f assim como diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos multivalentes ou multiespecificos híbridos (como descrito acima e em detalhe em: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 1_7, 105 (1987)) e em cadeias simples (e. g. , Huston et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85 5879-5883 (1988) e

Bird et al., Science, 242:423-426 (1988)). (Ver, de um modo 14 geral, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.I., 2a ed. (1984) e Hunkapiller e Hood, Nature, 323:15-16 (1986).

Como aqui utilizados, as expressões "Fv de cadeia simples", "anticorpos de cadeia simples", "Fv" ou "scFv" referem-se a fragmentos de anticorpo que compreendem as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, mas são desprovidos das regiões constantes, mas numa cadeia polipeptídica simples. Em geral, um anticorpo de cadeia simples compreende, ainda, um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL, o que lhe possibilita formar a estrutura desejada que permitiria para ligação de antigénio. Os anticorpos de cadeia simples são discutidos em detalhe por Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore ed. Springer-Verlag, Nova Iorque, p. 269-315 (1994); ver, também, a Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 88/01649 e Pat. U.S. N° 4946778 e 5260203. Os anticorpos de cadeia simples também podem ser bi-específicos e/ou humanizados.

Um "fragmento de Fab" é constituído por uma cadeia leve e as regiões CHi e variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula de Fab não pode formar uma ligação dissulfureto com outra molécula de cadeia pesada.

Um "fragmento de Fab'" contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constante, entre os domínios CHi e CH2, de modo a que uma ligação dissulfureto intercadeia possa ser formada entre duas cadeias pesadas, para formar uma molécula de F(ab')2·

Um "fragmento de F(ab')2" contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, contendo uma porção da região constante entre 15 os domínios CHi e CH2/ de modo a que uma ligação dissulfureto intercadeia seja formada entre duas cadeias pesadas. 0 termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antigénio, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL) . Pela utilização de um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antigénio. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, nos documentos EP 404097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA jh) :6444-6448 (1993) . A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos de Fd em tandem (Vh-Chi-Vh-Chi) que formam um par de regiões de ligação de antigénio. Os anticorpos lineares podem ser bi-específicos ou mono-específicos. A expressão "fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional", como aqui utilizada, refere-se a um fragmento polipeptídico que contém, pelo menos, os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulina. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional é capaz de ligação a um ligando, impedindo a ligação do ligando ao seu receptor, interrompendo a resposta biológica resultante da ligação de ligando ao receptor, ou qualquer sua combinação. De um modo 16 preferido, um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional liga-se especificamente a IL-21. A expressão "anticorpo monoclonal", como aqui utilizada, não está limitada a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. A expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago e não ao método pelo qual é produzido. A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais e fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente com proteínas e polipéptidos de IL-21. Os polipéptidos, proteínas e polinucleótidos de IL-21 humanos e de murganho codificando os polipéptidos são divulgados em Parrish-Novak et al., Nature 4_0_8:57-63, 2003, Pat. U.S. N° 6307024 e 6686178 e documento WO 04/055168. Os anticorpos exemplificativos incluem anticorpos neutralizantes e podem ser anticorpos monoclonais murinos, anticorpos humanizados derivados de anticorpos monoclonais murinos e anticorpos monoclonais humanos. Os fragmentos de anticorpo ilustrativos incluem F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv e unidades de reconhecimento mínimas. Os anticorpos neutralizantes ligam-se, de um modo preferido, a IL-21, de modo a que a interacção da proteína de IL-21 seja bloqueada, inibida, reduzida, antagonizada ou neutralizada. São aqui descritos epitopos e regiões definidoras de caracteristicas estruturais e funcionais da proteína de IL-21 humana que foram identificados como alvos para um anticorpo monoclonal terapêutico. São apresentados anticorpos monoclonais de IL-21 anti-humano de murganho exemplificativos e anticorpos monoclonais anti-humano de rato e agregados destes anticorpos monoclonais, com a capacidade de se ligarem a IL-21 humana de tipo selvagem, uma 17 proteína de IL-21 mutante e/ou regiões peptídicas de IL-21 humana. A presente descrição descreve composições compreendendo um veículo e um péptido, polipéptido ou anticorpo aqui descritos.

Deste modo, a presente descrição descreve antagonistas para actividade de IL-21, tal como anticorpos anti-IL-21, os quais são úteis no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias. Os anticorpos anti-IL-21 presentemente reivindicados são úteis no tratamento de pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), Doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn, colite ulcerosa, síndrome do intestino irritável, esclerose múltipla, artrite reumatóide, diverticulose, lúpus eritematoso sistémico, psoríase, espondilite anquilosante, esclerodermia, esclerose sistémica, artrite psoriática, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença de enxerto vs. hospedeiro (GVHD), linfoma cutâneo de células T (CTCL) , síndrome de Sjogren, glomerulonefrite, nefropatia de IgA, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, dermatite atópica, síndrome anti-fosfolípido e asma e outras doenças auto-imunes. A presente descrição descreve anticorpos geneticamente alterados que são funcionalmente equivalentes aos anticorpos descritos acima. Os anticorpos modificados proporcionando estabilidade e/ou eficácia terapêutica melhoradas são preferidos. Os exemplos de anticorpos modificados incluem aqueles com substituições conservativas de resíduos de aminoácido e uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram de modo significativamente deletério a utilidade de ligação de antigénio. As substituições podem variar desde alteração ou modificação de um ou mais resíduos de aminoácido até ao redesenho completo de uma região, desde que a utilidade 18 terapêutica seja mantida. Os anticorpos podem ser modificados pós-traducionalmente (e. g., acetilação e fosforilação) ou podem ser modificados sinteticamente (e. g., a conjugação de um grupo de marcação).

Os anticorpos geneticamente alterados também incluem anticorpos quiméricos que derivaram dos anticorpos anti-IL-21. De um modo preferido, os anticorpos quiméricos compreendem uma região variável derivada de um murganho ou rato e uma região constante derivada de um humano, de modo que o anticorpo quimérico tenha uma semi -vida mais longa e seja menos imunogénico quando administrado a um indivíduo humano. 0 método de preparação de anticorpos quiméricos é conhecido na técnica. As regiões variáveis destes anticorpos podem estar ligadas com uma região constante de uma IgG humana para formar o anticorpo quimérico desejado.

De um modo preferido, os anticorpos anti-IL-21 geneticamente alterados aqui descritos incluem a versão humanizada dos anticorpos aqui descritos. 0 anticorpo humanizado compreendendo CDR de uma imunoglobulina dadora de murganho e estruturas de cadeia pesada e cadeia leve de uma imunoglobulina aceitadora humana. 0 método de preparação de anticorpo humanizado é divulgado nas Pat. U.S. N° 5301101; 5585089; 5693762; e 6180370. As CDR destes anticorpos podem ser, depois, enxertadas a quaisquer estruturas humanas seleccionadas, as quais são conhecidas na técnica, para produzir o anticorpo humanizado desejado.

Os anticorpos da presente invenção podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epitopo(s) ou porção ou porções de um polipéptido da presente invenção que reconhecem ou se ligam 19 especificamente. A porção ou porções do(s) epitopo(s) ou polipéptido(s) podem ser especificadas como aqui descrito, e. g. , por posições N-terminais e C-terminais ou por tamanho em resíduos de aminoácido contíguos. Os anticorpos da presente invenção também podem ser descritos ou especificados em termos da sua reactividade cruzada. A descrição também descreve anticorpos que não se ligam a qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogo de um polipéptido aqui descrito. 0 binning de epitopo refere-se à utilização de ensaios de ligação competitiva para identificar pares de anticorpos que são, ou não são, capazes de ligaçao a proteína de IL -21 identificando simultaneamente, desse modo, anticorpos que se ligam à mesma, ou epitopos de sobreposição em proteína. As famílias de anticorpos (ou bins) tendo a mesma especificidade de ligação podem ser, depois, utilizadas para definir epitopos específicos em IL-21. As experiências de binning de epitopo proporcionam evidência de que epitopos antigenicamente distintos estão presentes. Contudo, por si só, não identificam, ou "mapeiam" o epitopo para uma sequência de aminoácidos ou localização específica na molécula de proteína de IL-21. A competição para ligação pode ser avaliada para qualquer par de anticorpos ou fragmentos. Por exemplo, utilizando os reagentes de detecção apropriados, a especificidade de ligação de anticorpos ou fragmentos de ligação de qualquer espécie/fonte pode ser comparada com a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais aqui divulgados. 0 binning de epitopo pode ser realizado com "anticorpos isolados" ou com sobrenadantes de cultura celular. Frequentemente, o binning é realizado com sobrenadantes clonais de primeiro ciclo, para guiar a escolha de clones a serem desenvolvidos posteriormente. 20

Os anticorpos a serem comparados devem ter domínios de ligação de antigénio substancialmente homogéneos. No caso de anticorpos "bi-específicos" ou "bifuncionais", a especificidade de ligação dos dois sítios de ligação diferentes não necessita de ser avaliada ou tornada bin independentemente. A presente descrição descreve anticorpos específicos de receptor e anticorpos específicos de ligando. Além da ligação competitiva de anticorpos, o binning de epitopo também pode ser utilizado para identificar anticorpos para um receptor ou um ligando que interfere competitivamente com o binning de um ligando e seu receptor. Frequentemente, as propriedades favoráveis de uma família (ou bin) de anticorpos podem correlacionar-se com uma ligação a um epitopo específico definido pelo binning de epitopo.

As experiências de ligação competitiva não medem directamente a afinidade de ligação, contudo os anticorpos a serem testados devem ligar-se de modo suficientemente forte para actuarem como competidores. Em geral, as condições experimentais são concebidas para minimizar os efeitos de diferenças na afinidade de ligação.

Os anticorpos anti-antigénio de IL-21 também podem ser úteis em ensaios de diagnóstico para proteína de IL-21, e. g., detectando a sua expressão em células, tecidos ou soro específicos. Os anticorpos atribuídos a diferentes bins e capazes de ligação a diferentes porções imunogénicas, ou epitopos, de IL-21 podem ser utilizados como os reagentes para ensaios de sanduíche. Num ensaio de sanduíche, o analito de amostra de teste é capturado por um primeiro anticorpo que está imobilizado num suporte sólido e, a seguir, detectado por um 21 segundo anticorpo que também se liga ao analito formando, deste modo, um complexo tripartido insolúvel. Ver, e. g., a Pat. U.S. N° 4376110. O segundo anticorpo pode, ele próprio, ser marcado com uma fracção detectável (ensaios de sanduíche directos) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma fracção detectável (ensaio de sanduíche indirecto) . Por exemplo, um tipo de ensaio de sanduíche é um ensaio de ELISA, caso em que a fracção detectável é uma enzima.

Os anticorpos da presente invenção podem ser ensaiados para ligação específica por qualquer método conhecido na técnica. Muitos formatos diferentes de ensaio de ligação competitiva podem ser utilizados para binning de epitopo. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem mas não estão limitados a sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas, tais como transferências de Western, radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), imunoensaios de "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reacções de precipitina, reacções de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para nomear apenas alguns. Esses ensaios são rotina e bem conhecidos na técnica (ver, e. g., Ausubel et al. , ed., 1994, Current Protocols in Molecular Bioloqy, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque). Os imunoensaios exemplificativos são descritos resumidamente abaixo (mas não se destinam a limitar) . Além disso, pode ser realizado um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988). 22 0 Biacore é apenas um de uma variedade de formatos de ensaio que são rotineiramente utilizados para painéis de binning de epitopo de anticorpos monoclonais. Muitas referências (e. g., The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 6.6, Glenn E. Morris ed.) descrevem métodos alternativos que poderiam ser utilizados para o binning de anticorpos e poderia esperar-se que proporcionassem informação idêntica com respeito à especificidade de ligação dos anticorpos para proteína de IL-21. Quando se utiliza o sistema Biacore, as experiências de binning de epitopo são realizadas com antigénio solúvel nativo. Os estudos de binning de epitopo podem ser realizados num sistema BiacorelOOO® (Biacore, Uppsalla Suécia). 0 software BIAlogue® v. 1.2 pode ser utilizado para programação de métodos de corrida. Para o exemplo de utilização do Biacore para o binning de anticorpos monoclonais de murganho, deduzidos contra IL-21, o anticorpo policlonal de Fc de IgG de cabra anti-Murganho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) pode ser covalentemente imobilizado num chip sensor Biacorei CM5 e utilizado para ligar (capturar) o anticorpo monoclonal primário da série de teste ao chip. Os sítios de ligação de Fc não ocupados no chip são, depois, bloqueados utilizando um fragmento de Fc de IgG policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) . Subsequentemente, a proteína de IL-21 é injectada e deixada ligar-se especificamente ao anticorpo monoclonal primário capturado. 0 instrumento Biacore mede a massa de proteína ligada ao chip sensor e a ligação do anticorpo primário e antigénio de IL-21 pode ser verificada para cada ciclo. Após a ligação do anticorpo primário e antigénio ao chip, o anticorpo secundário solúvel é injectado e deixado ligar-se ao antigénio pré-ligado. Se o anticorpo monoclonal secundário for capaz de se ligar ao antigénio de IL-21 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, a sua 23 ligação é detectada pelo Biacore. Contudo, se o anticorpo monoclonal secundário não for capaz de se ligar ao antigénio de IL-21 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, não é detectada ligação adicional. Cada anticorpo monoclonal é testado contra ele próprio como um controlo negativo, para estabelecer o nivel de sinal do fundo (sem ligação).

Um formato de ELISA competitivo, isento de marcador (LFC-ELISA) também pode ser utilizado para o binning de anticorpos. Este método é descrito por Nagata et al., J. Immuno Methods 292:141-155, 2004. Este método para binning de epitopo utilizava IL-21 biotinilada. Para o exemplo de binning de anticorpos monoclonais de murganho deduzidos contra IL-21, placas de microtitulação são revestidas a 100 pL/poço com 1 pg/mL de um anticorpo especifico de Fc-γ de IgG de cabra anti-murganho (Jackson ImmunoResearch) diluído em ELISA B (PBS, Tween 20 a 0,1%, BSA a 1%) . Após ligação deste anticorpo de revestimento, durante 3 horas, à temperatura ambiente, cada dos meios condicionados contendo mAb é diluído em ELISA B para produzir uma concentração de mAb aproximada de 0,5 pg/mL e deixado ligar-se às placas revestidas com IgG de cabra anti-murganho, de um dia para o outro, a 4 °C (mAb N° 1) . Em paralelo, um segundo conjunto de meios condicionados (mAb N° 2) é diluído em tubos de ensaio de poliestireno para, aproximadamente, 0,5 pg/mL de mAb em ELISA B, misturados com antigénio de IL-21 biotinilado a 50 ng/mL e incubados, de um dia para o outro, a 4 °C. Após incubação do mAb N° 1 com o anticorpo de revestimento, as placas são bloqueadas com um anticorpo não relacionado, para saturar sítios de ligação não ocupados na placa. As misturas de mAb N° 2-biotina-IL-21 são adicionadas à placa e deixadas ligar-se. Como um controlo para (não competição) no ensaio, IL-21 biotinilado a 50 ng/mL é adicionado directamente (sem pré-incubação com mAb N° 2) a poços contendo mAb N° 1 imobilizado. Após incubação com o complexo IL-21-mAb N° 2 biotinilado, estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, IL) é adicionada à placa, a 0,5 pg/mL. As placas são reveladas com o substrato TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e a absorvência dos poços individuais a 450 nm é medida com um leitor de placas (Molecular Devices SpectraMax® 340, Sunnyvale, CA) . Se o mAb N° 1 se ligar a um epitopo diferente do mAb N° 2, o complexo biotina-IL-21-mAb N° 2 irá ligar-se à placa, resultando numa leitura de elevada absorvência. Se o mAb N° 1 se ligar ao mesmo epitopo gue o mAb N° 2, o complexo biotina-IL-21-mAb N° 2 não se irá ligar à placa, resultando numa leitura de baixa absorvência.

Os anticorpos da presente invenção actuam como antagonistas de IL-21. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos gue dissociam as interacções receptor/ligando de IL-21, parcialmente ou totalmente. A invenção apresenta anticorpos específicos de ligando que previnem a activação de receptor. A invenção inclui anticorpos neutralizantes que se ligam ao ligando e previnem a ligação do ligando ao receptor, assim como anticorpos que se ligam ao ligando prevenindo, desse modo, a activação de receptor, mas não previnem o ligando de se ligar ao receptor. A activação de receptor (i. e., sinalização) pode ser determinada por técnicas aqui descritas ou, de outro modo, conhecidas na matéria. Por exemplo, a activação de receptor pode ser determinada pela detecção da fosforilação (e. g., tirosina ou serina/treonina) do receptor ou seu substrato por imunoprecipitação, seguida de transferência de Western ou análise baseada em luminex (por exemplo, como descrito supra). A descrição descreve anticorpos que inibem a actividade de ligando ou receptor em, pelo menos, 90%, pelo menos, 80%, pelo menos, 25 da actividade na 70%, pelo menos, 60% ou, pelo menos, 50%, ausência do anticorpo.

Produção de Anticorpos Anti-IL-21

Os anticorpos para IL-21 podem ser obtidos, por exemplo, utilizando o produto de um vector de expressão de IL-21 ou IL-21 isolado de uma fonte natural como um antigénio. Os anticorpos anti-IL-21 particularmente úteis "ligam-se especificamente" com IL-21. Os anticorpos são considerados como ligando-se especificamente se os anticorpos exibirem, pelo menos, uma das seguintes duas propriedades: (1) os anticorpos ligam-se a IL-21 com um nivel de limiar de actividade de ligação e (2) os anticorpos não reagem significativamente de modo cruzado com polipéptidos relacionados com IL-21.

Em relação à primeira caracteristica, os anticorpos ligam-se especificamente se se ligarem a um polipéptido, péptido ou epitopo de IL-21 com uma afinidade de ligação (Ka) de ΙΟ6 M_1 ou maior, de um modo preferido 107 M_1 ou maior, de um modo mais preferido ΙΟ8 M_1 ou maior e, de um modo muito preferido, 109 M”1 ou maior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser facilmente determinada por alguém com conhecimentos gerais na técnica, por exemplo, pela análise de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 5JL:660 1949) ou utilizando um instrumento biossensor comercialmente disponível (BIAcore, Pharmacia biossensor, Piscataway, NJ) . Em relação à segunda caracteristica, os anticorpos não reagem significativamente de modo cruzado com moléculas polipeptídicas relacionadas, por exemplo, se detectarem IL-21, mas não outros polipéptidos conhecidos, utilizando uma análise de transferência de Western 26 padrão ou ELISA de captura. Os exemplos de polipéptidos relacionados conhecidos incluem membros conhecidos da família de IL-2 .

Os anticorpos anti-IL-21 podem ser produzidos utilizando péptidos e polipéptidos contendo epitopo de IL-21 antigénico. Os péptidos e polipéptidos contendo epitopo antigénico contêm uma sequência de, pelo menos, nove, ou entre 15 a cerca de 30 aminoácidos, contidos na SEQ ID N° : 2 ou outra sequência de aminoácidos aqui divulgada. Contudo, os péptidos ou polipéptidos compreendendo uma porção maior de uma sequência de aminoácidos, contendo desde 30 a 50 aminoácidos, ou qualquer comprimento até e incluindo a sequência de aminoácidos integral de um polipéptido, também são úteis para a indução de anticorpos que se ligam com IL-21. É desejável que a sequência de aminoácidos do péptido contendo epitopo seja seleccionada para proporcionar solubilidade substancial em solventes aquosos (i. e., a sequência inclui resíduos relativamente hidrófilos, enquanto os resíduos hidrófobos são tipicamente evitados). Além disso, as sequências de aminoácidos contendo resíduos de prolina também podem ser desejáveis para a produção de anticorpos.

Os anticorpos anti-IL-21 monoclonais podem ser processados por métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Os anticorpos monoclonais de roedor para antigénios específicos podem ser obtidos por métodos conhecidos (ver, por exemplo, Kohler et ai., Nature 256:495 (1975), Coligan et ai., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", em DNA Cloninq 2: Expression Systems, 2a Edição, Glover et al., (ed.), página 93 (Oxford University Press 1995)). 27 A selecção de ligantes a partir da apresentação de uma biblioteca de fragmentos de anticorpo é uma alternativa in vitro ao desenvolvimento de anticorpos monoclonais. 0 principio da tecnologia de apresentação é o estabelecimento de uma ligação física entre uma fracção de ligação e o material genético de codificação. Este conceito tem sido utilizado em vários modos, desde a apresentação de bibliotecas de proteína e péptido em superfícies de bacteriófagos, bactérias e levedura, até à apresentação de proteínas conjugadas a ribossomas in vitro (ver,

por exemplo, Rothe et al., FASEB J. 2_0:1599 (2006)). A apresentação de anticorpos na superfície em bacteriófago de cadeia simples é a mais altamente desenvolvida destas tecnologias. 0 método típico utilizado para apresentação de anticorpo é a fusão do fragmento de Fv de cadeia simples ou a Fd de cadeia pesada (porção de cadeia pesada de um Fab) com a proteína de gene III do fago. As bibliotecas de anticorpo podem ser inactivas, representando o repertório imune natural, ou semi-sintéticas, consistindo em estruturas retiradas de moldes

humanos nativos, combinadas com bibliotecas de sequência de CDR sintéticas, para aumentar a diversidade. O fago com actividade de ligação específica pode ser isolado de bibliotecas aleatórias de fragmentos de anticorpo (particular Fab e scFv) ou péptidos após ciclos repetidos de crescimento e selecção (ver, por exemplo, Hoogenboom, Nature Biotech. 2_3 :1105 (2005) .

Numa forma de realização adicional, os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados utilizando diversos métodos de apresentação fágica conhecidos na técnica. Nos métodos de apresentação fágica, os domínios de anticorpo funcionais são apresentados na superfície de partículas de fago que transportam as sequências polinucleotídicas codificando-os. 28

Num particular, esse fago pode ser utilizado para apresentar domínios de ligação de antigénio, expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpo combinatória (e. g., humana ou murina) . 0 fago expressando um domínio de ligação de antigénio que se liga ao antigénio de interesse pode ser seleccionado ou identificado com antigénio, e. g., utilizando antigénio marcado ou antigénio ligado ou capturado a uma superfície sólida ou esfera. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos, incluindo os domínios de ligação de fd e M13, expressos a partir de fagos com Fab, Fv ou domínios de anticorpo de Fv estabilizados com dissulfureto, fundidos recombinantemente ao gene III do fago ou proteína de gene VIII. Os exemplos dos métodos de apresentação fágica que podem ser utilizados para preparar os anticorpos da presente invenção incluem os divulgados em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182;41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al. , Eur. J. Immunol. 2_4:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997); Burton

et al., Advances in Immunology 5_7 :191-280 (1994); pedido PCT N° PCT/GB91/01134; publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Pat. U.S. N° 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 e 5969108. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo produzidas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. As publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (gama de nM) por rearranjo de cadeia (Marks 29 et al., Bio/Technology, 10; 779-783 (1992)), assim como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para a construção de bibliotecas de fago de grandes dimensões (Waterhouse et al.r Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Deste modo, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para o isolamento de anticorpos monoclonais.

Como descrito nas referências acima, após selecção de fago, as regiões de codificação de anticorpo do fago podem ser isoladas e utilizadas para produzir anticorpos intactos, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação de antigénio desejado e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de insecto, células vegetais, leveduras e bactérias, e. g., como descrito em detalhe abaixo. Por exemplo, também podem ser empregues técnicas para produzir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab' e F(ab')2, utilizando métodos conhecidos na técnica, tal como os divulgados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechnigues 12 (6) :864-869, 1992; e Sawai et al. , AJRI 34:26-34, 1995; e Better et al., Science 240:1041-1043, 1988.

Os anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando murganhos transgénicos que são incapazes de expressarem imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos génicos de imunoglobulina de cadeia pesada e leve humana podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias de murganho. Alternativamente, a região variável, região constante e região de diversidade humanas podem ser introduzidas em células estaminais embrionárias de murganho, além dos genes de cadeia 30 pesada e leve humanos. Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de murganho podem ser tornados não funcionais, separadamente ou simultaneamente, com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em particular, a deleção homozigótica da região de JH previne a produção de anticorpo endógeno. As células estaminais embrionárias modificadas são expandidas e microinjectadas em blastocistos para produzir murganhos quiméricos. Os murganhos quiméricos são, depois, reproduzidos para produzir descendência homozigótica que expressa anticorpos humanos. Os murganhos transgénicos são imunizados do modo normal com um antigénio seleccionado, e. g., a totalidade ou uma porção de um polipéptido da invenção. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio podem ser obtidos dos murganhos imunizados transgénicos, utilizando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana alojados pelos murganhos transgénicos rearranjam-se durante a diferenciação de células B e, subsequentemente, sofrem uma mutação somática de troca de classe. Deste modo, utilizando essa técnica, é possível produzir de modo terapêutico anticorpos de IgG, IgA, IgM e IgE úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar (Int. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995) .

Para uma discussão detalhada desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção desses anticorpos, ver, e. g., J akobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., J_:33 (1993); publicações PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; Pat. U.S. N° 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; e 5939598. 31

Além disso, empresas, tais como Medarex, Inc. (Princeton, Nova Jérsia) e Genpharm (San Jose, Calif.), podem ser contratadas para proporcionar anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio seleccionado, utilizando tecnologia semelhante à descrita acima. Ver, e. g., Pat. U.S. 7135287.

Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química ou, de um modo preferido, por técnicas de expressão recombinante. A expressão recombinante de um anticorpo da invenção, ou seu fragmento, derivado ou análogo, e. g., uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção, requer a construção de um vector de expressão contendo um polinucleótido que codifica o anticorpo. Uma vez obtido um polinucleótido codificando uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou a sua porção (de um modo preferido, contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve) da invenção, o vector para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de ADN recombinante, utilizando técnicas bem conhecidas na matéria. Deste modo, são aqui descritos os métodos para a preparação de uma proteína pela expressão de um polinucleótido contendo uma sequência nucleotídica codificando anticorpo. Os métodos que são bem conhecidos dos especialistas na técnica podem ser utilizados para a construção de vectores de expressão contendo sequências codificando anticorpo e sinais de controlo transcricional e traducional apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A descrição descreve vectores replicáveis compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma sua cadeia pesada ou leve, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, ligada 32 de um modo operativo a um promotor. Esses vectores podem incluir a sequência nucleotídica codificando a região constante da molécula de anticorpo (ver, e. g. , Publicação PCT WO 86/05807; Publicação PCT WO 89/01036; e Pat. U.S. N° 5122464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado nesse vector para expressão da cadeia pesada ou leve integral. O vector de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são, depois, cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo da invenção. Deste modo, a descrição descreve células hospedeiras contendo um polinucleótido codificando um anticorpo da invenção, ou uma sua cadeia pesada ou leve, ligada de um modo operativo a um promotor heterólogo. Em formas de realização preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vectores codificando as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina integral, como detalhado abaixo.

Uma variedade de sistemas de vector de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar as moléculas de anticorpo da invenção. Esses sistemas de expressão de hospedeiro representam transportadores pelos quais as sequências codificantes de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências codificantes nucleotídicas apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Estes incluem mas não estão limitados a microrganismos, tais como bactérias (e. g., E. coli, B. subtilis) transformadas com vectores de expressão de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico ou ADN de cosmídeo, contendo sequências codificantes de anticorpo; levedura (e. g., 33

Saccharomyces, Pichia) transformada com vectores de expressão de levedura recombinante, contendo sequências codificantes de anticorpo; sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão de vírus recombinante (e. g., baculovírus), contendo sequências codificantes de anticorpo; sistemas de células vegetais infectadas com vectores de expressão de vírus recombinante (e. g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão de plasmídeo recombinante (e. g., plasmídeo Ti) contendo sequências codificantes de anticorpo; ou sistemas de células de mamífero (e. g., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) albergando construções de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (e. g., promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamífero (e. g., MPSV, CMV, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7.5K do vírus vaccinia) . De um modo preferido, as células bacterianas, tal como Escherichia coli e, de um modo mais preferido, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula de anticorpo recombinante intacto, são utilizadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, as células de mamífero, tal como células de ovário de hámster Chinês (CHO) , em conjunto com um vector, tal como o elemento promotor do gene precoce intermediário principal de citomegalovírus humano, estimulador de CMV ou promotor de MPSV, é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al. , 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2) .

Em sistemas bacterianos, dependendo da utilização pretendida para a molécula de anticorpo a ser expressa, pode ser seleccionado de um modo vantajoso um número de vectores de 34 expressão. Por exemplo, quando uma grande quantidade dessa proteína se destina a ser produzida, para a produção de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, podem ser desejáveis vectores que dirigem a expressão de elevados níveis de produtos de proteína de fusão que sejam facilmente

purificados. Esses vectores incluem mas não estão limitados ao vector de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), no qual a sequência codificante de anticorpo pode estar ligada individualmente ao vector, em fase, com a região codificante de lac Z, de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109, 1985; Van Heeke & Schuster J. Biol. Chem. 2_4:5503-5509, 1989); e semelhantes. Os vectores pGEX também podem ser utilizados para expressar polipéptidos estranhos como proteínas de fusão com glutationo S-transferase (GST). Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas, por adsorção e ligação a uma matriz de esferas de glutationo-agarose, seguida de eluição na presença de glutationo livre. Os vectores pGEX são concebidos para incluírem sítios de clivagem de trombina ou protease de factor Xa, de modo a que o produto génico alvo clonado possa ser libertado da fracção de GST.

Num sistema de insecto, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa califomica (AcNPV) é utilizado como um vector para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência codificante de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina). 35

Em células hospedeiras de mamífero, pode ser utilizado um número de sistemas de expressão de base virai. Nos casos onde um adenovírus é utilizado como um vector de expressão, a sequência codificante de anticorpo de interesse pode estar ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovírus, e. g. , o promotor tardio e sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode ser, depois, inserido no genoma de adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (e. g., região EI ou E3) irá resultar num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados. (e. g., ver Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_l:355-359, 1984).

Sinais de iniciação específicos também podem ser requeridos para a tradução eficiente de sequências codificantes de anticorpo inseridas. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com a fase de leitura da sequência codificante desejada, para garantir a tradução de todo o inserto. Estes sinais de controlo traducional exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens, naturais e sintéticas. A eficiência de expressão pode ser melhorada pela inclusão de elementos estimuladores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544, 1987).

Além disso, pode ser escolhida uma estirpe celular hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto génico no modo específico desejado. Essas modificações (e. g., glicosilação) e processamento (e. g., clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o 36 processamento e modificação pós-traducional de proteínas e produtos génicos. As linhas celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para garantir a modificação e processamento correctos da proteína estranha expressa. Para o efeito, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o correcto processamento do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto génico. Essas células hospedeiras de mamífero incluem mas não estão limitadas a CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 e, em particular, linhas celulares de cancro da mama, tais como, por exemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D e linha celular de glândula mamária normal, tais como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.

Para produção de longo prazo, de alto rendimento, de proteínas recombinantes, é preferida a expressão estável. Por exemplo, podem ser manipuladas linhas celulares que expressem de um modo estável a molécula de anticorpo. Em vez de se utilizarem vectores de expressão que contêm origens de replicação virai, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (e. g., sequências promotoras, estimuladoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. A seguir à introdução do ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas crescer, durante 1-2 dias, em meios enriquecidos e ser, depois, trocadas para meios selectivos. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite que as células integrem, de um modo estável, o plasmídeo nos seus cromossomas e cresçam para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser, de um modo vantajoso, utilizado para manipular linhas celulares que 37 expressem a molécula de anticorpo. Essas linhas celulares manipuladas podem ser particularmente úteis em rastreio e avaliação de compostos que interagem, directamente ou indirectamente, com a molécula de anticorpo.

Pode ser utilizado um número de sistemas de selecção, incluindo mas não limitados aos genes de timidina cinase do vírus herpes simplex (Wigler et al., Cell 12^:223, 1977), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska &

Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA _4_8_: 2 0 2, 1992) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell _^2:817, 1980) podem ser empregues em células tk-, hgprt- ou aprt, respectivamente. De modo semelhante, a resistência de antimetabolito pode ser utilizada como a base de selecção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA JJ_:351, 1980; 0'Hare et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 7_8:1527, 1981); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_8 :2072, 1981); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Wu e Wu, Biotherapy 3:87-95, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 3_2:573-596, 1993; Mulligan, Science 260:926-932, 1993; e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217, 1993; TIB TECH 11 (5):155-215), Maio de 1993; e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 3_0 : 147, 1984). Os métodos geralmente conhecidos na matéria da tecnologia de ADN recombinante que podem ser utilizados são descritos em Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in

Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.I.; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, N.I; e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al., (ed.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, N.I.; Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1, 1981. 38

Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vector (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nova Iorque, 1987)). Quando um marcador no sistema vector expressando anticorpo é amplificável, o aumento do nível de inibidor presente em cultura de célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Dado que a região amplificada está associada ao gene de anticorpo, a produção do anticorpo também irá aumentar (Crouse et ai., Mol. Cell. Biol. _3:257, 1983). A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vectores de expressão, o primeiro vector codificando um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo codificando um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores seleccionáveis idênticos que possibilitem expressão igual de polipéptidos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode ser utilizado um único vector que codifique polipéptidos de cadeia pesada e leve. Nessas situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada, para evitar um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52, 1986; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2197, 1980). As sequências codificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.

Assim que uma molécula de anticorpo da invenção tenha sido expressa recombinantemente, pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (e. g., troca iónica, afinidade, particularmente por afinidade para o 39 antigénio específico após Proteína A e cromatografia de coluna de exclusão por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas.

Para utilizações particulares, pode ser desejável preparar fragmentos de anticorpos anti-IL-21. Esses fragmentos de anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo. Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por digestão de pepsina ou papaína de anticorpos intactos por métodos convencionais. Como uma ilustração, os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina, para proporcionar um fragmento de 5S, denotado F(ab')2. Este fragmento pode ser ainda clivado, utilizando um agente de redução tiol, para produzir fragmentos monovalentes de Fab' de 3.5S. Opcionalmente, a reacção de clivagem pode ser realizada utilizando um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrilo que resulta da clivagem de ligações dissulfureto. Como uma alternativa, uma clivagem enzimática utilizando pepsina produz dois fragmentos de Fab monovalentes e um fragmento de Fc directamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, Pat. U.S. N° 4331647, Nisonoff et ai., Arch Biochem. Biophys. 8 9:230, 1960; Porter, Biochem. J. T3_:119, 1959; Edelman et al. , em Methods in Enzymology, Vol. 1, página 422 (Academic Press 1967) e por Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4.

Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalentes, clivagem adicional de fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas, também podem 40 ser utilizados, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Por exemplo, os fragmentos de Fv compreendem uma associação de cadeias de VH e VL. Esta associação pode ser não covalente, como descrito por Inbar et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 6_9 :2659, 1972. Alternativamente, as cadeias variáveis podem estar ligadas por uma ligação dissulfureto intermolecular ou reticuladas por químicos, tal como glutaraldeído (ver, por exemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. _12_:437, 1992) .

Os fragmentos de Fv podem compreender cadeias de VH e VL que estão ligadas por um ligante peptídico. Estas proteínas de ligação de antigénio de cadeia simples (scFv) são preparadas pela construção de um gene estrutural, compreendendo sequências de ADN codificando os domínios de VH e VL que estão ligados por um oligonucleótido. 0 gene estrutural é inserido num vector de expressão que é subsequentemente introduzido numa célula hospedeira, tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia polipeptídica com um péptido ligante ligando os dois domínios V. Os métodos para a produção de scFv são descritos, por exemplo, por Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (ver, também, Bird et al., Science 2 42:423, 1988, Ladner et al., Pat. U.S. N° 4946778, Pack et al., Bi o/Technology 1_1:1271, 1993 e

Sandhu, supra).

Como uma ilustração, um scFV pode ser obtido pela exposição de linfócitos a polipéptido de IL-21 in vitro e selecção de bibliotecas de apresentação de anticorpos no fago ou vectores semelhantes (por exemplo, através de utilização de proteína ou péptido de IL-21 imobilizado ou marcado). Os genes codificando 41 polipéptidos tendo potenciais domínios de ligação de polipéptido de IL-21 podem ser obtidos pelo rastreio de bibliotecas peptídicas aleatórias apresentadas no fago (apresentação fágica) ou em bactérias, tal como E. coli. As sequências nucleotídicas codificando os polipéptidos podem ser obtidas num número de modos, tais como através de mutagénese aleatória e síntese polinucleotídica aleatória. Estas bibliotecas de apresentação peptídica aleatória podem ser utilizadas para rastrear para péptidos que interagem com um alvo conhecido que pode ser uma proteína ou polipéptido, tais como um ligando ou receptor, uma macromolécula biológica ou sintética ou substâncias orgânicas ou inorgânicas. As técnicas para a criação e rastreio dessas bibliotecas de apresentação peptídica aleatória são conhecidas na técnica (Ladner et al. , Pat. U.S. N° 5223409, Ladner et al. , Pat. U.S. N° 4946778, Ladner et al., Pat. U.S. N° 5403484, Ladner et al., Pat. U.S. N° 5571698 e Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) e as bibliotecas de apresentação peptídica aleatória e kits para o rastreio dessas bibliotecas estão disponíveis comercialmente, por exemplo a partir de CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) e Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). As bibliotecas de apresentação peptídica aleatória podem ser rastreadas utilizando as sequências de IL-21 aqui divulgadas para identificar proteínas que se ligam a IL-21.

Outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido codificando para uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os péptidos de CDR ("unidades mínimas de reconhecimento") podem ser obtidos pela construção de genes codificando a CDR de um anticorpo de interesse. Esses genes são preparados, por exemplo, pela utilização da reacção em cadeia da 42 polimerase, para sintetizar a região variável de ARN de células de produção de anticorpos (ver, por exemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinicai Application, Ritter et ai., (ed.), página 166 (Cambridge University Press 1995) e Ward et al. , "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (ed.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Alternativamente, um anticorpo anti-IL-21 pode ser derivado de um anticorpo monoclonal "humanizado". Os anticorpos monoclonais humanizados são produzidos pela transferência de regiões determinantes de complementaridade de murganho ou rato de cadeias variáveis pesadas e leves da imunoglobulina de murganho para um domínio variável humano. Os resíduos típicos de anticorpos humanos são, depois, substituídos nas regiões de estrutura dos equivalentes murinos. A utilização de componentes de anticorpo derivados de anticorpos monoclonais humanizados obvia potenciais problemas associados à imunogenicidade de regiões constantes murinas. As técnicas genéricas para clonagem de domínios variáveis de imunoglobulina murina são descritas, por exemplo, por Orlandi et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 8_6:3833, 1989. As técnicas para a produção de anticorpos monoclonais humanizados são descritas, por exemplo, por Jones et al. , Nature 321:522, 1986; Cárter et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 8_9 :42 85, 19 92; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. , (ed.), 43 páginas 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) e por Queen et ai., Pat. U.S. N° 5693762.

Também é possível construir estruturas alternativas, pela utilização de uma colecção de proteínas monoméricas, para formar um domínio de monómero. Estes domínios de monómero podem ser suficientemente pequenos para penetrarem em tecidos. Os domínios de monómero podem ser de ocorrência natural ou variantes não naturais ou as suas combinações. Os domínios de monómero podem formar multímeros de mais dois domínios. 0 domínio de monómero liga-se a uma posição, análoga a epitopos aqui descritos, numa molécula alvo. Em alguns casos, o multímero pode ser formado a partir de uma variedade de domínios de monómero. (Ver, e. g., o Pedido de Patente U.S. 2004-0132028 e Pedido de Patente U.S. 2006-0177831.)

Os anticorpos aqui descritos incluem derivados que são modificados, i. e., pela conjugação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, de modo a que a conjugação covalente não previna o anticorpo de se ligar a IL-21 ou previna a activação de receptor. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, e. g., por glicosilação, acetilação, peguilação, fosfilação, amidação, derivatização, por grupos de protecção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer de numerosas modificações químicas pode ser efectuada por técnicas conhecidas, incluindo mas não limitadas a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. 44

Um anticorpo anti-IL-21 pode estar conjugado com um marcador detectável para formar um imunoconjugado anti-IL-21. Os marcadores detectáveis adequados incluem, por exemplo, um radioisótopo, um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um marcador enzimático, um marcador bioluminescente ou ouro coloidal. Os métodos de preparação e detecção desses imunoconjugados marcados de um modo detectável são bem conhecidos de alguém com conhecimentos gerais na técnica e são descritos em maior detalhe abaixo. 0 marcador detectável pode ser um radioisótopo que é detectado por auto-radiografia. Os isótopos que sao aqui partícularmente uteis sao Η, I, I, 35S e 14C.

Os imunoconjugados anti-IL-21 também podem ser marcados com um composto fluorescente. A presença de um anticorpo marcado fluorescentemente é determinada pela exposição do imunoconjugado à luz do comprimento de onda correcto e detecção da fluorescência resultante. Os compostos de marcação fluorescente incluem isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeido e fluorescamina.

Também é possível que os imunoconjugados anti-IL-21 possam ser marcados de um modo detectável pela ligação de um componente de anticorpo a um composto quimioluminescente. A presença do imunoconjugado com cauda quimioluminescente é determinada pela detecção da presença de luminescência que surge durante o curso de uma reacção química. Os exemplos de compostos de marcação quimioluminescente incluem luminol, isoluminol, um éster de acridínio aromático, um imidazole, um sal de acridínio e um éster de oxalato. 45

De modo semelhante, um composto bioluminescente pode ser utilizado para marcar imunoconjugados anti-IL-21. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência verificado em sistemas biológicos, no qual uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reacção quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada pela detecção da presença de luminescência. Os compostos bioluminescentes que são úteis para marcação incluem luciferina, luciferase e aequorina.

Alternativamente, os imunoconjugados anti-IL-21 podem ser marcados de um modo detectável pela ligação de um componente de anticorpo anti-IL-21 a uma enzima. Quando o conjugado anti-IL-21-enzima é incubado na presença do substrato apropriado, a fracção enzimática reage com o substrato para produzir uma fracção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorométricos ou visuais. Os exemplos de enzimas que podem ser utilizadas para marcar de um modo detectável imunoconjugados poliespecíficos incluem β-galactosidase, glucose oxidase, peroxidase e fosfatase alcalina.

Alguém com conhecimentos gerais na técnica conhecerá outros marcadores adequados que podem ser empregues de acordo com a presente invenção. A ligação de fracções marcadoras a anticorpos anti-IL-21 pode ser alcançada utilizando técnicas padrão conhecidas na matéria. A metodologia típica a este respeito é descrita por Kennedy et al. , Clin. Chim. Acta 7_0:1, 1976;, Schurs et al., Clin. Chim. Acta 8_1:1, 1977;, Shih et al. , Int' 1 J. Câncer 4_6:1101, 1990;, Stein et al., Câncer Res. 50:1330, 1990; e Coligan, supra. 46

Além disso, a conveniência e versatilidade da detecção imunoquímica podem ser melhoradas pela utilização de anticorpos anti-IL-21 que tenham sido conjugados com avidina, estreptavidina e biotina (ver, por exemplo, Wilchek et ai., (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990) e Bayer et ai., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", em Methods In Molecular Blology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992).

Os métodos para a realização de imunoensaios estão bem estabelecidos. Ver, por exemplo, Cook e Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", em Monoclonal Antibodies: Production Engineering and Clinicai Application, Ritter e Ladyman (ed.), páginas 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch e Lennox (ed.), páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995) e Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).

Os anticorpos ou os seus fragmentos, tendo semi-vidas in vivo aumentadas, podem ser gerados por técnicas conhecidas dos especialistas na matéria. Por exemplo, os anticorpos ou seus fragmentos com semi-vidas in vivo aumentadas podem ser produzidos pela modificação (e. g., substituição, deleção ou adição) de resíduos de aminoácido, identificados como envolvidos na interacção entre o domínio de Fc e o receptor de FcRn (ver, e. g., Publicações Internacionais N° WO 97/34631 e WO 02/060919, as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade). Os anticorpos ou seus fragmentos com semi-vidas in vivo aumentadas podem ser gerados pela conjugação aos referidos anticorpos ou moléculas poliméricas de fragmentos de anticorpo, tal como polietilenoglicol (PEG) de elevado peso molecular. 0 PEG pode ser conjugado aos referidos anticorpos ou fragmentos de anticorpo, com ou sem um ligante multifuncional, através de conjugação especifica de sitio do PEG ao terminal N ou C dos referidos anticorpos ou fragmentos de anticorpo, ou via grupos amino épsilon presentes em resíduos de lisina. Será utilizada a derivatização polimérica, linear ou ramificada, que resulte em perda mínima de actividade biológica. 0 grau de conjugação será cautelosamente monitorizado por SDS-PAGE e espectrometria de massa, para garantir a correcta conjugação de moléculas de PEG aos anticorpos. 0 PEG que não reagiu pode ser separado de conjugados de anticorpo-PEG por, e. g., cromatografia de exclusão de tamanho ou permuta iónica.

Composições Farmacêuticas A presente invenção inclui, ainda, composições farmacêuticas, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um anticorpo, como definido nas reivindicações. A composição farmacêutica pode incluir agentes terapêuticos adicionais, incluindo mas não limitados a agentes citotóxicos, uma citotoxina, e. g. , um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um ião metálico radioactivo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo para as células. Os exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, antracina diona di-hidróxido, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, 48 lidocaína, propranolol e puromicina e os seus análogos ou homólogos. Os agentes terapêuticos incluem mas não estão limitados a antimetabolitos (e. g., metotrexato, β-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (e. g., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (e. g. , daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina) , antibióticos (e. g. , dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes anti-mitóticos (e. g. , vincristina e vinblastina) . Por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender uma proteína ou polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína, tais como factor de necrose tumoral, a-IFN, β-IFN, factor de crescimento nervoso, factor de crescimento derivado de plaquetas, activador do plasminogénio tecidular, um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico, e. g., angiostatina ou endostatina; ou modificadores de resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulação de colónias de macrófagos granulocíticos ("GM-CSF"), factor de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF") ou outros factores de crescimento.

Para objectivos de terapia, as moléculas de anticorpo anti-IL-21 e um veículo farmaceuticamente aceitável são administrados a um doente, numa quantidade terapeuticamente eficaz. Diz-se que uma combinação de uma molécula terapêutica e 49 um veículo farmaceuticamente aceitável é administrada numa "quantidade terapeuticamente eficaz", se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo se a sua presença resulta numa alteração detectável na fisiologia de um doente receptor. Por exemplo, um agente utilizado para tratar a inflamação é fisiologicamente significativo se a sua presença alivia a resposta inflamatória.

Uma composição farmacêutica compreendendo anticorpo anti-IL-21 pode ser proporcionada na forma líquida, num aerossol ou na forma sólida. As formas liquidas são ilustradas por soluções injectáveis e suspensões orais. As formas sólidas exemplificativas incluem cápsulas, comprimidos e formas de libertação controlada. A última forma é ilustrada por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 1_0:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (ed.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (ed.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).

Os lipossomas proporcionam um meio para distribuir polipéptidos terapêuticos a um indivíduo intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutaneamente ou via administração oral, inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas que consistem em uma ou mais bicamadas lipidicas rodeando compartimentos aquosos (ver, de um modo geral, 50

Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1) :S61 (1993), Kim, Drugs £6:618 (1993) e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (ed.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)) . Os lipossomas são semelhantes em composição a membranas celulares e, como resultado, os lipossomas podem ser administrados de modo seguro e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares e os lipossomas podem variar em tamanho, com diâmetros variando entre 0,02 μπι a mais de 10 μιη. Uma variedade de agentes pode ser encapsulada em lipossomas: partição de agentes hidrófobos nas bicamadas e partição de agentes hidrófilos no(s) espaço(s) aquoso(s) interno(s) (ver, por exemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) e Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. £6:1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado pela variação do tamanho de lipossoma, do número de bicamadas, composição lipídica, assim como das características de carga e superfície dos lipossomas.

Alternativamente, diversos ligandos alvo podem ser ligados à superfície do lipossoma, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpo, hidratos de carbono, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo, os lipossomas podem ser modificados com derivados de galactosilípido de tipo ramificado a receptores de asialoglicoproteína alvo (galactose), que são exclusivamente expressos na superfície de células hepáticas (Kato e Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. ££:287, 1997; Murahashi et al., Biol. Pharm. Buli. £0:259, 1997). De modo semelhante, Wu et al., Hepatoloqy £7:772, 1998, mostraram que a marcação de lipossomas com asialofetuína conduzia a semi-vida plasmática de 51 lipossoma encurtada e melhorava grandemente a absorção de lipossomas marcados com asialofetuína pelos hepatócitos. Por outro lado, a acumulação hepática de lipossomas compreendendo derivados de galactosilípido de tipo ramificado pode ser inibida pela pré-injecção de asialofetuína (Murahashi et ai., Biol. Pharm. Buli. 2_0:259, 1997). Os lipossomas de albumina sérica humana poliaconitilados proporcionam outra abordagem para o direccionamento de lipossomas para células hepáticas (Kamps et ai., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 9_4 :11681, 1997). Além disso, Geho, et ai., Pat. U.S. N° 4603044, descrevem um sistema de distribuição de vesículas de lipossomas direccionado para hepatócitos, que tem especificidade para receptores hepatobiliares associados às células metabólicas especializadas do fígado.

Numa abordagem mais genérica ao direccionamento de tecidos, as células alvo são pré-marcadas com anticorpos biotinilados específicos para um ligando expresso pela célula alvo (Harasym et ai., Adv. Drug Deliv. Rev. 3_2 : 99, 1998). Após eliminação plasmática de anticorpo livre, os lipossomas conjugados a estreptavidina são administrados. Noutra abordagem, os anticorpos de direccionamento são directamente conjugados a lipossomas (Harasym et al., ibid. (1998)).

Os polipéptidos e anticorpos podem ser encapsulados em lipossomas utilizando técnicas padrão de microencapsulação de proteína (ver, por exemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099, 1981, Anderson et ai., Câncer Res. 50:1853, 1990 e Cohen et ai., Biochim. Biophys. Acta 1063:95, 1991, Alving et ai., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", em Liposome Technology, 2a Edição, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et ai., 52

Meth. Enzymol. 149;124, 1987). Como notado acima, os lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivados lipidicos de poli(etilenoglicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993).

As microsferas poliméricas degradáveis foram concebidas para manter níveis sistémicos elevados de proteínas terapêuticas. As microsferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis, tais como poli(láctido-co-glicolida) (PLG), polianidridos, poli(orto ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo não biodegradáveis, nos quais as proteínas são aprisionadas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6_:332, 1995; Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (ed.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (ed.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161, 1998; Putney e Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998; Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2_:548, 1998). As nanosferas revestidas com polietilenoglicol (PEG) também podem proporcionar veículos para administração intravenosa de proteínas terapêuticas (ver, por exemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 1_0:167, 1997) .

Outras formas de dosagem podem ser elaboradas pelos especialistas na técnica, como mostrado, por exemplo, por Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5a Edição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995) e por Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) . 53

As composições farmacêuticas podem ser proporcionadas como um kit, compreendendo um recipiente que compreende um anticorpo anti-IL-21 neutralizante. Os polipéptidos terapêuticos podem ser proporcionados na forma de uma solução injectável para doses únicas ou múltiplas ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injecção. Alternativamente, esse kit pode incluir um dispersor de pó seco, gerador de aerossol líquido ou nebulizador para administração de um polipéptido terapêutico. Esse kit pode, ainda, compreender informação escrita sobre indicações e utilização da composição farmacêutica.

Uma composição farmacêutica compreendendo anticorpos anti-IL-21 pode ser proporcionada na forma líquida, num aerossol ou na forma sólida. As formas líquidas são ilustradas por soluções injectáveis, aerossóis, gotículas, soluções topológicas e suspensões orais. As formas sólidas exemplificativas incluem cápsulas, comprimidos e formas de libertação controlada. A última forma é ilustrada por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al. , Pharm. Biotechnol. 1_0 :239, 1997; Ranade, "Implants in Drug Delivery", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (ed.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (ed.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (ed.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Outras formas sólidas incluem cremes, pastas, outras aplicações topológicas e semelhantes. 54

Utilizações Terapêuticas para Anticorpos Anti-IL-21 A IL-21 é uma citocina de célula T CD4+ que é importante para imunidade mediada por células T CD8+ óptima, activação de células NK e respostas humorais óptimas, tais como produção de anticorpos e maturação de células B. Demonstrou-se que a IL-21

induz um número de quimiocinas e citocinas proinflamatórias, tais como IL-18, IL-15, IL-5, IL-6, TNFRII, SCD25 e RANTES. A IL-21 também induz uma resposta de fase aguda em primatas não humanos e humanos. A expressão aumentada do receptor de IL-21 foi demonstrada na epiderme em doentes com esclerose sistémica (Distler et al. , Arthritis & Rheumatism 5_2:865-864, 2004) e fibroblastos sinoviais de artrite reumatóide (Jungel et al., Arthritis & Rheumatism _50_: 1468-1476, 2004). Além disso, os murganhos NOD auto-imunes, diabéticos, têm expressão aumentada de receptor de IL-21 (King et al., Cell 117:265-277, 2004).

Demonstrou-se que a expressão de IgG e IL-21 está aumentada no modelo de murganho de BXSB-Eaa que desenvolve uma doença semelhante a lúpus eritematoso auto-imune (Ozaki et al., J. Immunol. 173:5361-5371, 2004); a expressão de IL-21 é superior em murganhos Sanroque propensos a lúpus (Vinuesa et al., Nature 435:452, 2005); A expressão de IL-21 é superior em doentes com a doença de Crohn (Monteleone, et ai., Gastroenteroloqy 128:687-694, 2005) .

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IL-21 refere-se a uma quantidade de anticorpo que, quando administrada a um indivíduo, é eficaz para prevenir, retardar, reduzir ou inibir um sintoma ou actividade biológica associado a uma doença ou distúrbio. A administração pode consistir numa única dose ou doses múltiplas e pode ser dada em combinação com outras composições farmacêuticas. 55 A presente invenção proporciona anticorpos IL-21 e composições farmacêuticas, com definido nas reivindicações, para utilização no tratamento de doenças ou estados auto-imunes, tais como pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), Doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn, colite ulcerosa, sindrome do intestino irritável, esclerose múltipla, artrite reumatóide, diverticulose, lúpus eritematoso sistémico, psoriase, espondilite anquilosante, esclerodermia, esclerose sistémica, artrite psoriática, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença de enxerto vs. hospedeiro (GVHD), linfoma cutâneo de células T (CTCL), sindrome de Sjogren, glomerulonefrite, nefropatia de IgA, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, dermatite atópica, sindrome anti-fosfolipido e asma e outras doenças auto-imunes.

Dermatite de Contacto A dermatite de contacto alérgica é definida como uma reacção imunitária mediada por células T contra um antigénio gue entra em contacto com a pele. Considera-se gue a população de células T CLA+ está envolvida na iniciação da dermatite, dado gue as respostas de células T dependentes de alergénio estão largamente confinadas à população de células CLA+ (Ver Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med 181:1935, (1995)).

Verificou-se, com dados recentes, gue apenas as células T CD4+ CLA+ e não CD8+ de memória (CD45RO+) proliferam e produzem citocinas de tipo (IFN-γ) e tipo (IL-5) em resposta a níquel, um alergénio de hipersensibilidade de contacto comum. Além disso, as células expressando CLA em combinação com CD4, CD45RO (memória) ou CD69 estão aumentadas após estimulação específica 56 de níquel e expressam os receptores de quimiocina CXCR3, CCR4, CCR10 mas não CCR6. Ver Moed H., et al. , Br J Dermatol 51:32, (2004) . Ver Moed H., et al., Br J Dermatol 5_1:32, (2004) .

Em modelos animais, demonstrou-se que a dermatite de contacto alérgica é dependente de células T e que as células T responsivas alérgicas migram para o local de aplicação de alergénio. Ver, de um modo geral: Engeman T. M., et al., J Immunol 164:5207, (2000); Ferguson T. A. & Kupper T. S. J Immunol 150 :1172, (1993); e Gorbachev A. V. & Fairchild R. L.

Crit Rev Immunol. 21:451 (2001).

Dermatite Atópica A dermatite atópica (AD) é uma doença de pele inflamatória recorrente crónica, com uma incidência dramaticamente crescente ao longo das últimas décadas. Clinicamente, a AD é caracterizada por placas e pápulas altamente pruriticas, frequentemente escoriadas, que mostram um curso recorrente crónico. O diagnóstico da AD é maioritariamente baseado em verificações clínicas maiores e menores. Ver Hanifin J. M., Arch Dermatol 135:1551 (1999). A histopatologia revela espongiose, hiperparaqueratose e paraqueratose focal em lesões agudas, ao passo que a hiperplasia epidérmica marcada com hiperparaqueratose e paraqueratose, acantose/hipergranulose e infiltração perivascular da derme com linfócitos e mastócitos abundantes são os traços distintivos das lesões crónicas.

As células T desempenham um papel central na iniciação de respostas imunitárias locais em tecidos e a evidência sugere que, em particular, as células T que se infiltram na pele podem 57 desempenhar um papel na iniciação e manutenção de respostas imunitárias desreguladas na pele. Aproximadamente 90% das células T de infiltração em locais inflamatórios cutâneos expressam o Ag (CLA+) associado a linfócito cutâneo que se liga a selectina E, uma molécula de adesão indutivel no endotélio (revisto em Santamaria-Babi L. F., et al. , Eur J Dermatol 14:13, (2004)). Foi documentado um aumento significativo em células T CLA+ em circulação entre os doentes de AD, em comparação com indivíduos de controlo (Ver Teraki Y., et al. , Br J Dermatol 143:373 (2000), enquanto outros demonstraram que células T CLA+ de memória de doentes de AD respondem de um modo preferido a extracto de alergénio, em comparação com a população de CLA-(Ver Santamaria-Babi, L. F., et al., J Exp Med. 181:1935, (1995)). Em humanos, a patogénese de distúrbios atópicos da pele foi associada a aumentos nas células T CLA+ que expressam níveis aumentados de citocinas de tipo Th-2, como IL-5 e IL-13. Ver Akdis M., et al. , Eur J Immunol 3_0:3533 (2000); e Hamid Q., et al., J Allergy Clin Immunol 98: 225 (1996) .

Os murganhos NC/Nga desenvolvem espontaneamente lesões semelhantes a AD que, em muitos aspectos, são análogas a AD humana, incluindo curso e sinais clínicos, histopatologia e imunopatologia, quando alojados em estados isentos de patogénios não especificadas (não SPF), a cerca de 6-8 semanas de idade. Em contraste, murganhos NC/Nga, mantidos sob condições de SPF, não desenvolvem lesões de pele. Contudo, o começo das lesões de pele espontâneas e comportamento de comichão pode ser sincronizado em murganhos NC/Nga alojados em instalações de SPF, por injecção intradérmica semanal de antigénio de ácaro em bruto. Ver Matsuoka H., et al., Allergy 5_8:139 (2003). Por conseguinte, o desenvolvimento da AD em NC/Nga é um modelo útil para a avaliação de novas terapêuticas para o tratamento da AD. 58

Além do modelo de NC/Nga de AD espontânea, a sensibilização epicutânea de murganhos utilizando OVA também pode ser utilizada como um modelo para induzir espessamento epidérmico e dérmico, dependente de antigénio, com um infiltrado mononuclear na pele de murganhos sensibilizados. Este coincide habitualmente com níveis séricos elevados de IgE total e específica, contudo, neste modelo, normalmente não ocorre disfunção de barreira de pele ou prurido. Ver Spergel J. M., et ai., J Clin Invest, 101:1614, (1998). Este protocolo pode ser modificado, de modo a induzir desregulação de barreira de pele e prurido pela sensibilização de murganhos transgénicos DO11.10 OVA TCR com OVA. O aumento do número de células T específicas de antigénio que poderiam reconhecer o antigénio sensibilizante pode aumentar o nível de inflamação na pele, para induzir comportamento visível de comichão e liquenificação/escamação da pele.

Artrite A artrite, incluindo osteoartrite, artrite reumatóide, articulações artríticas, como resultado de lesão e semelhantes, são estados inflamatórios comuns que poderiam beneficiar da utilização terapêutica de anticorpos anti-inflamatórios e polipéptidos de ligação. Por exemplo, a artrite reumatóide (RA) é uma doença sistémica que afecta todo o corpo e é uma das formas mais comuns de artrite. É caracterizada pela inflamação do revestimento membranar da articulação que causa dor, rigidez, calor, vermelhidão e inchaço. As células inflamatórias libertam enzimas que podem digerir osso e cartilagem. Como resultado da artrite reumatóide, o revestimento de articulação inflamado, o sinóvio, pode invadir e lesionar osso e cartilagem, conduzindo a 59 deterioração de articulação e dor grave, entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder a sua forma e alinhamento, resultando em dor e perda de movimento. A artrite reumatóide (RA) é uma doença de mediação imunitária, particularmente caracterizada por inflamação e subsequente lesão de tecido, conduzindo a incapacidade grave e mortalidade aumentada. Uma variedade de citocinas é produzida localmente nas articulações reumatóides. Numerosos estudos demonstraram que IL-1 e TNF alfa, duas citocinas pró-inflamatórias prototípicas, desempenham um papel importante nos mecanismos envolvidos na inflamação sinovial e na destruição progressiva da articulação. De facto, a administração de inibidores de TNF alfa e IL-1 em doentes com RA conduziu a um dramático melhoramento dos sinais clínicos e biológicos da inflamação e uma redução de sinais radiológicos da erosão óssea e destruição de cartilagem. Contudo, não obstante estes resultados encorajadores, uma percentagem significativa de doentes não responde a estes agentes, sugerindo que também estão envolvidos outros mediadores na patofisiologia da artrite (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2 (2) :135-149, 2002) . Há vários modelos animais para a artrite reumatóide conhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colagénio (CIA), os murganhos desenvolvem artrite inflamatória crónica que se assemelha estreitamente à artrite reumatóide humana. Dado que a CIA partilha características imunológicas e patológicas semelhantes com a RA, isto faz dela um modelo ideal para o rastreio de potenciais compostos anti-inflamatórios humanos. O modelo de CIA é um modelo bem conhecido em murganhos que, de modo a ocorrer, depende de uma resposta imunitária e uma resposta inflamatória. A resposta 60 imunitária compreende a interacção de células B e células T CD4+ em resposta a colagénio, o qual é administrado como antigénio, e conduz à produção de anticorpos anti-colagénio. A fase inflamatória é o resultado de respostas tecidulares de mediadores de inflamação, como uma consequência de alguns destes anticorpos reagindo de modo cruzado com o colagénio nativo do murganho e activando a cascata do complemento. Uma vantagem na utilização do modelo de CIA é que o mecanismo básico da patogénese é conhecido. Os epitopos relevantes de células T e células B no colagénio de tipo II foram identificados e diversos parâmetros imunológicos (e. g., hipersensibilidade de tipo retardado e anticorpo anti-colagénio) e inflamatórios (e. g., citocinas, quimiocinas e enzimas de degradação de matriz) referentes a artrite de mediação imunitária foram determinados e podem, deste modo, ser utilizados para avaliar a eficácia de composto de teste no modelo de CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3_:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 8_9 : 9784-788, 1992; Myers et al., Life Sei. 6_l:1861-78, 1997; e Wang et al., Immunol. 9_2: 8955-959, 1995) . A administração de anticorpos anti-IL-21 a estes murganhos de modelo de CIA é utilizada para avaliar a utilização de anticorpos anti-IL-21, para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença.

Doença Inflamatória Intestinal (IBP)

Nos Estados Unidos, aproximadamente 500000 pessoas sofrem de doença inflamatória intestinal (IBD) que pode afectar cólon e recto (colite ulcerosa) ou ambos, intestino grosso e delgado (Doença de Crohn) . A patogénese destas doenças não é clara, mas 61 envolve inflamação crónica dos tecidos afectados. A colite ulcerosa (UC) é uma doença inflamatória do intestino grosso, geralmente denominado cólon, caracterizada por inflamação e ulceração da mucosa ou revestimento mais interior do cólon. A inflamação faz com que o cólon se esvazie frequentemente, resultando diarreia. Os sintomas incluem desarranjo das fezes e cãibra abdominal associada, febre e perda de peso. Embora a causa exacta da UC seja desconhecida, a investigação recente sugere que as defesas naturais do corpo estão operando contra proteínas no corpo que o corpo pensa serem estranhas (uma "reacção auto-imune"). Talvez por se assemelharem a proteínas bacterianas no intestino, estas proteínas podem instigar ou estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. À medida que o revestimento do cólon é destruído, formam-se úlceras, libertando muco, pus e sangue. A doença começa habitualmente na área rectal e pode, eventualmente, estender-se por todo o intestino grosso. Episódios repetidos de inflamação conduzem ao espessamento da parede do intestino e recto, com tecido de cicatriz. A morte do tecido de cólon ou sépsis pode ocorrer com doença grave. Os sintomas da colite ulcerosa variam em gravidade e o seu começo pode ser gradual ou repentino. Os ataques podem ser provocados por muitos factores, incluindo infecções respiratórias ou stress.

Embora não haja actualmente cura disponível para a UC, os tratamentos focam-se na supressão do processo inflamatório anormal no revestimento do cólon. Os tratamentos, incluindo corticosteróides imunossupressores (e. g., azatioprina, mercaptopurina e metotrexato) e aminosalicitatos estão disponíveis para tratar a doença. Contudo, a utilização de longo prazo de imunossupressores, tais como corticosteróides e 62 azatioprina, pode resultar em sérios efeitos secundários, incluindo estreitamento de ossos, cataratas, infecção e efeitos hepáticos e de medula óssea. Nos doentes nos quais as actuais terapias não são bem-sucedidas, a cirurgia é uma opção. A cirurgia envolve a remoção de todo o cólon e do recto. Há vários modelos animais que podem imitar parcialmente a colite ulcerosa crónica. 0 modelo mais largamente utilizado é o modelo de colite induzida por ácido 2,4,6-trinitrobezenossulfónico/etanol (TNBS), que induz inflamação crónica e ulceração no cólon. Quando o TNBS é introduzido no cólon de murganhos susceptíveis, por meio de instilação intra-rectal, induz resposta imunitária mediada por células T na mucosa colónica conduzindo, neste caso, a inflamação mucosal maciça, caracterizada pela densa infiltração de células T e macrófagos por toda a parede do intestino grosso. Além disso, este quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clínico de perda de peso progressiva (deperdição) , diarreia com sangue, prolapso rectal e espessamento da parede do intestino grosso (Neurath et al., Intem. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000) .

Outro modelo de colite utiliza dextranossulfato de sódio (DSS), que induz uma colite aguda, manifestada por diarreia com sangue, perda de peso, estreitamento do cólon e ulceração mucosal, com infiltração de neutrófilos. A colite induzida por DSS é histologicamente caracterizada por infiltração de células inflamatórias na lamina própria, com hiperplasia linfóide, lesão de cripta focal e ulceração epitelial. Considera-se que estas alterações se desenvolvem devido a um efeito tóxico do DSS no epitélio e por fagocitose de células da lamina própria e produção de TNF alfa e IFN gama. Não obstante a sua utilização 63 comum, várias questões com respeito ao mecanismo do DSS sobre a relevância para a doença humana permanecem por resolver. 0 DSS é considerado como um modelo independente de células T, devido a ser observado em animais deficientes em células T, tal como murganhos SCID. A administração de anticorpos anti-IL-21 a estes modelos de transferência de TNBS, DSS ou CD4 pode ser utilizada para avaliar a utilização de antagonistas de IL-21, para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença gastrointestinal. A IL-21 pode desempenhar um papel na resposta inflamatória na colite e a neutralização da actividade de IL-21, pela administração de antagonistas de IL-21, é uma potencial abordagem terapêutica para a IBD.

Psoriase A psoriase é um estado cutâneo crónico que afecta mais de sete milhões de Americanos. A psoriase ocorre quando novas células de pele crescem anormalmente, resultando em zonas inflamadas, inchadas e escamosas de pele, onde a pele antiga não foi libertada suficientemente rápido. A psoriase de placa, a forma mais comum, é caracterizada por porções inflamadas de pele ("lesões"), encimadas com escamas brancas prateadas. A psoriase pode estar limitada a apenas algumas placas ou envolver áreas moderadas a extensas de pele, surgindo mais geralmente no couro cabeludo, joelhos, cotovelos e tronco. Embora seja altamente visível, a psoriase não é uma doença contagiosa. A patogénese das doenças envolve inflamação crónica dos tecidos afectados. Os anticorpos anti-IL-21 da presente invenção poderiam servir como uma terapêutica valiosa para reduzir a inflamação e efeitos patológicos na psoríase, outras doenças inflamatórias da pele, alergias de pele e mucosais e doenças relacionadas. A psoriase é um distúrbio inflamatório mediado por células T da pele que pode causar desconforto considerável. É uma doença para a qual não há cura e afecta pessoas de todas as idades. A psoriase afecta, aproximadamente, dois porcento das populações da Europa e América do Norte. Embora os indivíduos com psoríase moderada possam frequentemente controlar a sua doença com agentes tópicos, mais de um milhão de doentes em todo o mundo requer terapia ultravioleta ou imunossupressora sistémica. Infelizmente, a inconveniência e riscos da radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapias limitam a sua utilização de longo prazo. Além disso, os doentes têm habitualmente recorrência de psoríase e, em alguns casos, recidiva, pouco depois da interrupção da terapia imunossupressora. Os anticorpos anti-IL-21 podem ser testados utilizando um modelo de psoríase recentemente desenvolvido, baseado no modelo de transferência de CD4+CD45RB (Davenport et ai., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672, 2002) .

Além de outros modelos de doença aqui descritos, a actividade dos anticorpos anti-IL-21 em tecido inflamatório derivado de lesões psoriáticas humanas pode ser medida in vivo utilizando um modelo de murganho de imunodeficiência combinada grave (SCID). Foram desenvolvidos vários modelos de murganho, nos quais as células humanas são implantadas em murganhos imunodeficientes (colectivamente referidos como modelos de xenoenxerto); Ver, por exemplo, Cattan A R, Douglas E, Leuk. Res. 1_8:513-2 2, 1994 e Flavell, D J, Hematoloqical Oncoloqy h4:67-82, 1996. Como um modelo de xenoenxerto in vivo para psoríase, tecido de pele psoriático humano é implantado no 65 modelo de murganho de SCID e provocado com um antagonista apropriado. Além disso, podem ser utilizados outros modelos animais de psoríase na técnica para avaliar antagonistas de IL-21, tal como enxertos de pele psoriáticos humanos implantados no modelo de murganho de AGR129 e provocados com um antagonista apropriado (e. g., ver, Boyman, 0. et al., J. Exp. Med. Publicação online N° 20031482, 2004) . De modo semelhante, os tecidos ou células derivados de colite humana, IBD, artrite ou outras lesões inflamatórias podem ser utilizados no modelo de SCID para avaliar as propriedades anti-inflamatórias dos anticorpos anti-IL-21 agui descritos. A eficácia do tratamento é medida e estatisticamente avaliada como efeito anti-inflamatório aumentado na população tratada ao longo do tempo, utilizando métodos bem conhecido na técnica. Alguns métodos exemplificativos incluem mas não estão limitados a medição, por exemplo, num modelo de psoríase, de espessura epidérmica, o número de células inflamatórias na derme superior e os graus de paraqueratose. Esses métodos são conhecidos na técnica e aqui descritos. Por exemplo, ver Zeigler, M. et al. , Lab Invest 8_1:1253, 2001; Zollner, T. M. et al., J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. et al.,

Microbio.l Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. et al.,

Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H et al., Arch.

Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H et al., J. Invest.

Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H et al., J. Cutan. Pathol .. 24:1, 1997; Sugai, J. , M. et al., J. Dermatol. Sei. 17:85, 1998; e Villadsen L. S. et al., J. Clin. Invest . 112:1571, 2003. A inflamação também pode ser monitorizada ao longo do tempo, utilizando métodos bem conhecidos, tal como citometria de fluxo (ou PCR), para quantificar o número de células inflamatórias ou 66 lesionais presentes numa amostra, pontuação (perda de peso, diarreia, sangramento rectal, comprimento de cólon) para IBD, pontuação de doença de pata e pontuação de inflamação para o modelo de CIA RA. Lúpus Eritematoso Sistémico 0 lúpus eritematoso sistémico (SLE) é um distúrbio relacionado com o complexo imunitário, caracterizado por produção crónica de anticorpo de IgG dirigido a auto-antigénios ubíquos (e. g., anti-ADNcd) . Os efeitos do SLE são sistémicos, em vez de localizados num órgão específico. Múltiplos loci cromossómicos foram associados à doença e podem contribuir para os diferentes aspectos da doença, tais como anticorpos anti-ADNcd e glomerulonefrite. Mostrou-se que as células T CD4+ desempenham um papel activo em modelos de murganho do SLE (Horwitz, Lupus l_0:319-320, 2001; Yellin e Thienel, Curr. Rheumatol. Rep. , ,2:24-37, 2000). O papel para as células T CD8 + não está claramente definido, mas há evidência que sugere que a função de células T CD8+ "supressora" está comprometida em doentes de lúpus (Filaci et al., J. Immunol., 166:6452-6457, 2001; Sakane et al., J. Immunol., 137:3809-3813, 1986).

Demonstrou-se que a IL-21 modula as respostas de anticorpo pela actuação directa em células B. (Mehta et al., J. Immunol., 170:4111-4118, 2003; Ozaki et al., Science, 298:1630-1634, 2002; Suto et al. , Blood, 100:4565-4573, 2002). Por exemplo, Ozaki et al., (J. Immunol. 173:5361, 2004) demonstraram que em murganhos BXSB-Yaa, um modelo para o SLE, há um nível sérico de IL-21 elevado. Além disso, porque a IL-21 estimula a actividade de células T CD8+, a administração de anticorpos anti-IL-21 67 proporcionaria uma função supressora de células T mais robusta em doentes de lúpus, onde essa função está comprometida.

Os anticorpos anti-IL-21 podem ser administrados em combinação com outros agentes já em utilização em auto-imunidade, incluindo imunomoduladores, tais como IFNy, NOVANTRONE®, ENBREL®, REMICADE®, LEUKINE® e IL-2. 0 estabelecimento do nível de dose e programação óptimos para anticorpos anti-IL-21 é feito por uma variedade de meios, incluindo o estudo da farmacocinética e farmacodinâmica dos anticorpos anti-IL-21; determinação de doses eficazes em modelos animais e avaliação da toxicidade dos anticorpos anti-IL-21. As medições farmacocinéticas directas feitas em primatas e ensaios clínicos podem ser, depois, utilizadas para prever doses teóricas em doentes que alcancem níveis plasmáticos de anticorpo anti-IL-21 que sejam de magnitude e duração suficientes para alcançar uma resposta biológica em doentes. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Preparação de Proteínas de IL-21 A proteína de IL-21 foi produzida como descrito na Publicação de Patente U.S. N° US 2006-0134754 e WO 04/055168. Resumidamente, uma sequência nucleotídica de IL-21 foi optimizada e inserida num vector de expressão de E. coli que foi depositado como Acesso ATCC N° PTA-4853. O vector de expressão 68 foi introduzido na estirpe W3110 de E. coli (Acesso ATCC N° 27325).

As células hospedeiras foram fermentadas por cultivo de estirpes de E. coli expressando IL-21 num meio adequado, em cultura de balão de agitação, num meio adequado e pode ser suplementado com hidratos de carbono, tais como frutose, glucose, galactose, lactose e glicerol. 0 isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) pode ser adicionado à cultura até uma concentração de 0,1 até 2,0 mM.

Após a fermentação, as células foram recolhidas por centrifugação, ressuspensas em tampão de homogeneização e homogeneizadas. Depois de o homogeneizado ser recolhido, foi ressuspenso numa solução contendo guanidina e o sobrenadante contendo IL-21 solubilizado foi decantado e retido. A concentração da IL-21 na fracção solubilizada foi determinada por HPLC de fase reversa. Assim que os corpos de inclusão foram solubilizados e desnaturados em solução de guanidina contendo um agente de redução, a IL-21 reduzida foi, depois, oxidada numa etapa de renaturação controlada. Esta etapa envolveu a diluição num tampão de reenvolvimento, contendo cloridrato de arginina, sais e um sistema de rearranjo de óxido. A purificação da proteína de IL-21 pode incluir purificação da IL-21, utilizando cromatografia de interacção hidrófoba. A IL-21 pode ser, ainda, purificada por cromatografia de permuta catiónica de alta resolução. Os métodos para purificação de IL-21 podem compreender a concentração e efectuar troca de tampão da proteína. Esta etapa é concebida para concentrar o eluato da coluna de permuta catiónica de alta resolução e trocá-lo para o tampão de formulação. O agregado de eluato de 69 coluna final é concentrado para aumentar a concentração de IL-21. Pode ser desejável a purificação adicional de IL-21 para remover as restantes impurezas e contaminantes. Por exemplo, uma coluna de permuta aniónica pode ser utilizada para reduzir o nível de endotoxina.

Exemplo 2 - Preparaçao de Proteínas de Receptor de IL-21 A proteína heterodimérica de receptor de IL-21 (também designado como zalphall ou IL-21r) pode ser produzida como descrito na Publicação de Patente U.S. N° US 2002-0137677. Resumidamente, é construído um vector expressando um heterodímero de hzalphal1/hIL2Rgamma humano segregado. Nesta construção, o domínio extracelular de hzalphall está fundido ao domínio CHI de γΐ de IgG. O domínio CHI é clonado num vector de expressão mamífero. O domínio CL1 da cadeia leve κ humana é clonado num vector de expressão mamífero.

Uma construção tendo zalphall humano fundido a CHI é preparada e o vector é sequenciado para confirmar que a fusão está correcta. Uma construção separada tendo hIL2Rgamma fundido a CL1 também pode ser construída. O vector resultante é sequenciado para confirmar que a fusão IL-2Rgamma/CLl humana está correcta.

As fusões de receptor de zalphall humano (IL-21r) e IL-2Rgamma humano são co-expressas. Cada vector de expressão é co-transfectado para células hospedeiras de mamífero por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. As células transfectadas são seleccionadas, durante 10 dias, em metotrexato (MTX) e G418 (Gibco/BRL), durante 10 dias. O agregado resultante 70 de transfectantes é seleccionado novamente em MTX e G418, durante 10 dias. O agregado resultante de células duplamente seleccionadas é utilizado para gerar proteína. Fábricas (Nunc, Dinamarca) deste agregado são utilizadas para produzir meio condicionado. Estes meios condicionados, isentos de soro, são passados sobre uma coluna de Proteína A e eluídos em fracções. As fracções que se verificou terem a concentração mais elevada são agregadas e dialisadas (exclusão de PM de 10 kD) contra PBS. Finalmente, o material dialisado é submetido para análise de aminoácido (AAA). O receptor de zalphal1/receptor de IL-2Rgamma humano solúvel purificado pode ser utilizado para avaliar a sua capacidade para competir por ligação do ensaio de proliferação de Ligando a BaF3 de zalphall humano. B. O domínio extracelular de zalphall humano fundido a Fc9 (região Fc de gamai humano (numeração de Kabat 221-447; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health e Human Serv., Bethesa, MD, 1991)) com uma cauda de GluGlu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952-4, 198)) no terminal carboxilo foi produzido por PCR de sobreposição. O ADNc foi inserido em pZMP31 (descrito no pedido de Patente US US2003/023414; um vector híbrido tendo um estimulador de citomegalovírus e promotor do vírus do sarcoma mieloproliferativo) por recombinação em levedura. O domínio extracelular da cadeia gama comum do receptor de IL2 humano foi fundido a Fc9 com uma cauda de 6Xhis, no terminal carboxilo de Fc9. Esta construção foi inserida em pZMP21z por recombinação de levedura, utilizando o mesmo método como descrito para zalphall F c9CEE. As construções resultantes foram sequenciadas para verificar que os insertos foram correctos. Ambos os plasmídeos 71 foram transfectados em células CHO em suspensão, adaptadas a isenção de soro, por electroporação e seleccionados em meios de PFCHO isentos de proteína (BioWhittaker), sem hipoxantina e timidina, com zeomicina a 200 ng/mL adicionada. Estas células foram, depois, seleccionadas no mesmo meio, mais concentrações crescentes de metotrexato, até que as células estivessem resistentes a metotrexato a 1 μΜ e zeomicina a 200 ng/mL. As células foram testadas para produção do receptor de IL21 heterodimérico por análise de transferência de Western para a presença de caudas de EE e his. A concepção de zcytor26f2 (o domínio extracelular da cadeia gama comum do receptor de IL2 humana foi fundido a Fc9 com uma cauda de 6XHis) é de modo que três caudas estejam disponíveis para purificação (GluGlu, His e FC) , das quais duas são utilizadas para melhor discriminar O heterodímero dos dois contaminantes homodiméricos. Todas as moléculas contendo um domínio de Fc (contaminantes homodiméricos e heterodímero alvo) foram capturadas e purificadas de componentes de célula hospedeira e produtos de meios relacionados. O agregado contendo todas as espécies foi concentrado e injectado sobre uma coluna exclusão de tamanho apropriada (Superdex 200), de modo a remover agregados. O agregado de SEC contendo todas as três espécies (dois homodímeros e um heterodímero) foi submetido a Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC) utilizando o contra-ião Ni, sob condições de carga e eluição altamente discriminantes. O agregado de eluição de IMAC continha heterodímero altamente puro, com contaminação de homodímero apenas residual. O tampão de agregado de IMAC foi trocado por tampão de formulação, utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 200) que também remove quaisquer produtos de agregação residuais. Esta proteína de IL-21 heterodimérica foi 72 utilizada como um comparador quando se testa a actividade de um anticorpo neutralizante.

Exemplo 3 - Preparaçao Anticorpo Monoclonais de IL-21

Os anticorpos monoclonais de rato são preparados pela imunização de 4 Ratos Sprague-Dawley fêmea (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) com a proteína de IL-21 recombinante purificada. É administrada a cada rato uma injecção intraperitoneal (IP) inicial de 25 pg da proteína recombinante purificada em Adjuvante Completo de FREUND (Pierce, Rockford, IL) , seguida de injecções de IP reforço de 10 pg da proteína recombinante purificada em Adjuvante Incompleto de Freund, de duas em duas semanas. Sete dias após a administração da segunda injecção de reforço, os animais são sangrados e o soro é recolhido.

As amostras de soros de rato específicos de IL-21 são caracterizadas por ELISA, utilizando 1 pg/mL da proteína do receptor de IL-21 recombinante purificado como o alvo de anticorpo específico. Os ELISA compreendem a preparação de antigénio de IL-21, o revestimento dos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços com o antigénio, a adição dos soros de rato de interesse aos poços e a incubação durante um período de tempo para permitir que os anticorpos nos soros de rato se liguem ao antigénio. Um segundo anticorpo de detecção (que reconhece os anticorpos de interesse contidos nos soros de rato) conjugado a um composto detectável conjugado a um composto detectável, tal como um substrato enzimático (e. g., peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) é adicionado aos poços. Um especialista na técnica estaria informado quanto aos parâmetros 73 que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado, assim como outras variações dos ELISA conhecidas na técnica. Para discussão adicional em relação aos ELISA, ver, e. g., Ausubel et al. ed., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, em 11.2.1.

Os esplenócitos são recolhidos de um único rato de elevado titulo e fundidos a células de mieloma SP2/0 (murganho) utilizando PEG 1500, num único processo de fusão (razão de fusão de 4:1, esplenócitos para células de mieloma, "Antibodies: A Laboratory Manual", E. Harlow e D. Lane, Cold Spring Harbor Press) . Após 9 dias de crescimento pós-fusão, os agregados de hibridoma produzindo anticorpo especifico são identificados por ELISA, utilizando 500 ng/mL da proteína de IL-21 recombinante, como alvo de anticorpo específico. Os agregados de hibridoma positivos são analisados posteriormente para a sua capacidade de bloquearem a actividade proliferativa celular ("ensaio de neutralização") de proteína de IL-21 recombinante purificada, em células BaF3 expressando a sequência de receptor de IL-21.

Os agregados de hibridoma produzindo resultados positivos pelo "ensaio de neutralização" são clonados, pelo menos, duas vezes por diluição limitante.

Os anticorpos monoclonais produzidos por clones são caracterizados num número de modos, incluindo binning (i. e., determinar se cada anticorpo poderia inibir a ligação de qualquer outra ligação), afinidade relativa e neutralização. Os anticorpos monoclonais purificados de meios de cultura de tecidos são caracterizados para a sua capacidade de bloquearem a actividade proliferativa celular ("ensaio de neutralização") de IL-21 recombinante purificada em células Baf3 expressando as 74 sequências de receptor. Os anticorpos monoclonais "neutralizantes" são identificados deste modo.

As amostras foram retiradas dos agregados de hibridoma e ensaiadas utilizando o ensaio de neutralização e um ELISA de titulação directa. Neste ensaio, uma amostra foi titulada utilizando diluições em série de quatro vezes, para ver que clone poderia manter a leitura de D.O. mais elevada. Utilizando os resultados dos ensaios de neutralização e titulação, os clones específicos de cada poço principal inicial foram escolhidos para se avançar. Foi realizado outro rastreio de neutralização que correu todas estas amostras no mesmo ensaio e, nesta altura, o número de linhas celulares foi estreitado para quatro escolhas de topo. Estas foram submetidas a um ciclo adicional de clonagem, para garantir homogeneidade de cultura e rastreadas utilizando o ELISA directo. Após mais um ensaio de titulação, dois clones de IL-21 finais foram escolhidos e designados 268.5.1.11.42.1.4.3.9 (IL-21 de rato anti-murganho,

Acesso ATCC N° PTA-10394) e 2 72.21.1.3.4.2 (IL-21 de rato anti-humano, Acesso ATCC N° PTA-10395) . Os anticorpos monoclonais produzidos por estes clones de hibridoma podem ser cultivados num meio de crescimento de meio de Dulbecco Modificado por Iscove a 90%, com L-glutamina a 2 mM, penicilina a 100 pg/mL e sulfato de estreptomicina a 100 pg/mL e Soro de Clone I Fetal a 10% (Hyclone Laboratories) . Os clones podem ser propagados pelo lançamento de culturas a 2 x 105 células/mL e manutenção entre 1 x 105 e 5 x 105 células/mL, a 37 °C e CO a 5-6%. As células podem estar adaptadas a condições isentas de soro após transferências subsequentes. As células que são congeladas são armazenadas em soro a 90%, DMSO a 10% e armazenadas em fase de vapor da arca congeladora de azoto líquido. 75

Exemplo 4 - Rastreio Sérico de Anticorpos Monoclonais A actividade dos anticorpos anti-IL-21 é medida utilizando um bioensaio de potência de base celular. 0 bioensaio utiliza uma linha celular repórter de BaF3 que foi manipulada para expressar o receptor de IL-21 (IL-21R), através de transfecção estável com ADNc de IL-21R. As células transfectadas com IL-2lR/BaF3 são altamente dependentes de rIL-21 ou IL-3 para crescimento e, na sua ausência, são incapazes de proliferar e sofrem apoptose no espaço de 24 horas. No bioensaio de base celular, as células transfectadas com IL-21R/BaF3 são incubadas com concentrações variáveis de soro contendo anticorpos anti-IL-21 e a proliferação celular subsequente é medida.

Exemplo 5 - Caracterização de Anticorpos Binning de Epitopo

Os estudos de binning de epitopo são realizados num sistema BiacorelOOO™ (Biacore, Uppsalla Suécia). Os métodos são programados utilizando a Linguagem de Definição de Método (MDL) e corridos utilizando o Software Biacore Control, v 1.2. Anticorpo de Fc de IgG de cabra anti-Murganho policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) é covalentemente imobilizado num chip sensor Biacore CM5 e é utilizado para ligar (capturar) o anticorpo monoclonal primário da série de teste ao chip. Os sítios de ligação de Fc não ocupados no chip são, depois, bloqueados utilizando um fragmento de Fc de IgG policlonal (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Subsequentemente, a IL-21 é injectada e deixada 76 ligar-se especificamente ao anticorpo monoclonal primário capturado. O instrumento Biacore mede a massa de proteína ligada à superfície do chip sensor e, deste modo, a ligação do anticorpo primário e antigénio de IL-21 é verificada para cada ciclo. Após a ligação do anticorpo primário e antigénio ao chip, um anticorpo monoclonal da série de teste é injectado como o anticorpo secundário e deixado ligar-se ao antigénio pré-ligado. Se o anticorpo monoclonal secundário for capaz de se ligar ao antigénio de IL-21 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, um aumento em massa na superfície do chip, ou ligação, é detectado. Contudo, se o anticorpo monoclonal secundário não for capaz de se ligar ao antigénio de IL-21 simultaneamente com o anticorpo monoclonal primário, não é detectada massa, ou ligação, adicional. Cada anticorpo monoclonal testado contra ele próprio é utilizado como o controlo negativo, para estabelecer o nível de sinal do fundo (sem ligação). Os dados são compilados utilizando o software BioEvaluation 3.2 RCI, depois, carregados em Excel™ para processamento de dados.

Transferência de Western A capacidade de os anticorpos monoclonais neutralizantes de clones detectarem IL-21 desnaturada e reduzida/desnaturada de duas fontes é avaliada utilizando um formato de transferência de Western. Um anticorpo policlonal de coelho conhecido por detectar IL-21 num formato de transferência de Western é utilizado como um controlo positivo. A proteína de IL-21 é carregada sobre géis de Bis-Tris NuPAGE a 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) em tampão de amostra, não redutor ou redutor (Invitrogen), juntamente com padrões de 77 peso molecular (SeeBlue; Invitrogen) e a electroforese é realizada. Após electroforese, a proteína é transferida do gel, as transferências de nitrocelulose são bloqueadas, de um dia para o outro, e expostas a cada anticorpo. As transferências são, depois, sondadas com um anticorpo secundário conjugado a peroxidase de rábano; IgG-HRP de ovelha anti-murganho (Amersham: Piscataway, NJ), para os anticorpos monoclonais e Ig-HRP de burro anti-coelho (Amersham), para os anticorpos policlonais. 0 anticorpo ligado é detectado utilizando um reagente quimioluminescente (Reagente Lumi-Light Plus: Roche, Mannheim, Alemanha) e as imagens das transferências foram registadas num Imageador Lumi (Mannheim-Boehringer).

Exemplo 6 - Modelo de Murganho de DTH

As respostas de DTH são respostas imunitárias clássicas que são iniciadas por células T CD4+ e mediadas por células T, neutrófilos e macrófagos. Uma resposta de DTH é um bom indicador de uma resposta mediada por células T CD4+. Os murganhos são imunizados subcutaneamente com proteína de ovalbumina de galinha (OVA) num de 2 adjuvantes, RIBI ou CFA. Esta fase é denominada a fase de sensibilização (dias 0-6) . As medições de orelha são tomadas sete dias mais tarde. Os murganhos são, depois, injectados na orelha com PBS de controlo (orelha esquerda) ou OVA (orelha direita) . Esta fase é denominada a fase de provocação (dias 7-8). As respostas imunitárias geradas contra OVA induzem inflamação na orelha, resultando num aumento na espessura da orelha em 24 horas, na orelha tratada com OVA, mas não na orelha tratada com PBS. Isto é medido utilizando compassos de espessura. 78

Os murganhos C57BL/6 (n=8/grupo) são imunizados no dorso com 100 pg de ovalbumina de galinha (OVA) emulsionada em adjuvante de RIBI (Corixa, Seattle, WA) , num volume total de 200 pL. Ovalbumina a 0,5 mg/mL é adicionada a um único frasquinho de RIBI e agitada vigorosamente em vórtice, durante 2 minutos, para formar uma emulsão que é utilizada para injectar os murganhos. Sete dias após a imunização, os murganhos são injectados com 10 pL de PBS na orelha esquerda (controlo) e com 10 pg de OVA em PBS na orelha direita, num volume de 10 pL. A espessura da orelha de todos os murganhos é medida antes de injectar os murganhos na orelha (medição 0). A espessura da orelha é medida 24 horas após provocação. A diferença em espessura da orelha entre a medição 0 e a medição de 24 horas é calculada e é reflectiva da inflamação na orelha. Os grupos de murganhos são injectados com PBS ou diferentes concentrações de anticorpo anti-IL-21 intraperitonealmente de um dos dias 0-6 (fase de sensibilização) ou dos dias 7-8 (fase de provocação). A injecção no dia 7 e 8 é administrada 2 horas antes da medição da espessura da orelha nos intervalos de tempo de 0 e 24 horas. No fim do período de 24 horas, assim que a espessura da orelha foi medida, as orelhas foram cortadas e colocadas em formalina, para análise histológica.

Exemplo 7 - Modelo de Murganho para Esclerose Múltipla

Para testar se o anti-IL-21 tem quaisquer efeitos na esclerose múltipla, a capacidade de os anticorpos anti-IL-21 inibirem a encefalomielite auto-imune experimental (EAE), é testado um modelo de murganho para MS. É utilizado o modelo de imunização do péptido 35-55 da glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG) bem caracterizado em murganhos C57BL/6. A 79 experiência é realizada para determinar que o anticorpo anti-IL-21 poderia retardar e/ou inibir pontuações de doença em EAE, pela inibição da apresentação de antigénio mediada por DC ou pela estimulação de respostas de células T CD8. A ausência de respostas de células T CD8 eficientes neste modelo exacerba a EAE (Malipiero et al., Eur. J. Immunol., 2_7 :3151-3160, 1997). O começo retardado da doença no modelo de EAE, num modo dependente de dose, sugere que a utilização do anticorpo anti-IL-21 pode ser benéfica na MS. A encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é um modelo de murganho para a MS. Nesse modelo, os murganhos C57BL/6 são imunizados com 100 pg de péptido de MOG (MOG35-55) ou 100 pg de proteína de MOG recombinante emulsionada em adjuvante de RIBI. Dois mililitros de uma preparação a 0,5 mg/mL do MOG35-55 em PBS são adicionados a um frasquinho de RIBI e agitados vigorosamente em vórtice até a emulsionação da solução ou é preparada uma razão 1:1 de MOG recombinante em DFA. Os dorsos dos murganhos são rapados e MOG/RIBI a 100 pg é injectado, s.c., nos dorsos dos murganhos. Os pesos dos murganhos são tomados 2 dias antes e todos os dias após a imunização. Os murganhos são, depois, injectados no dia 2, i.v., com 200 pL de toxina pertussis (PT), uma concentração final de 200 ng/murganho. Os murganhos são monitorizados diariamente para pontuações clínicas. Os grupos de murganhos são injectados, i.p., com 200 pL de PBS, 100 pg de BSA, 10 pg-200 pg de anticorpo anti-IL-21, num volume de 200 pL, dos dias 0-20, ou 3x por semana, durante 3 semanas. Os pesos dos murganhos, pontuações clínicas e incidência são avaliados e representados graficamente para análise. 80

Exemplo 8 - Modelo de Murganho de Colite e Psoríase de CD4+CD45RBhi (CD25-) A transferência de células T de CD4+CD45RBhi ou CD4+CD25 para murganhos SCID isogénicos resulta em colite nos murganhos. A co-transfência de células T regulatórias (CD4+CD25+ ou CD4+CD45RBlo) inibe esta colite. Após transferência das células T de CD4+CD25- em murganhos, se os murganhos forem posteriormente injectados com enterotoxina B estafilocócica (SEB), os murganhos desenvolvem, não apenas colite, mas também psoríase. 0 anticorpo anti-IL-21 é administrado desde os dias 0-21 após a transferência celular e os sintomas para colite e psoríase são monitorizados. A inibição da pontuação psoriática ou colite (histologia) indica que o anticorpo anti-IL-21 pode inibir estas doenças auto-imunes.

Os baços e nódulos linfáticos inguinais são isolados de murganhos B10.D2. As suspensões de células únicas são formadas e contadas. Utilizando o Sistema de Esferas Miltenyi, as células CD25+ são tríadas por selecção positiva. As células são coradas com CD25-PE (BD Pharmingen) à diluição de 1:100 e incubadas, durante 15 minutos. O anticorpo em excesso é lavado e as células são incubadas com 10 pL de esferas de anti-PE/106 células, durante 20 minutos. As células são lavadas com PBS e passadas sobre uma coluna de LS (Miltenyi Biotech). As células que passam através da coluna (CD25-) são retidas para análise posterior. Um cocktail de enriquecimento de CD4 (Stem Cell technologies) é adicionado (1:100) a estas células CD25- e incubado durante 15 minutos. As células são lavadas com PBS. Uma diluição 1:10 de tetrâmero anti-biotina é adicionada às células, durante 15 minutos, seguida de um colóide magnético (60 pL/106 células), durante 15 minutos (todos de Stem Cell technologies). As células 81 são passadas através de uma coluna de selecção negativa (0,5'', Stem Cell Technologies) . As células que passam são as células CD4+CD25-. A pureza é analisada utilizando citometria de fluxo. 0,4 x 106 células são injectadas, i.v., em murganhos CB-17 SCID inactivos, num volume total de 200 pL. Os murganhos são injectados, i.p., com 10 pg de SEB no dia seguinte (dl). Os sintomas para psoríase e colite são seguidos desde 2-5 semanas. Os grupos de murganhos são injectados, i.p., com PBS, 100 pg de BSA ou 10-200 pg de IL-21 desde os dias 1-20, ou 3x por semana, durante 3 semanas. A inibição de sintomas psoriáticos e colite em murganhos tratados com anticorpo anti-IL-21 indica que os anticorpos anti-IL-21 podem inibir os sintomas auto-imunes neste modelo para psoriase e colite.

Exemplo 9 - Modelo de Murganho de Hipersensibilidade de

Contacto A hipersensibilidade de contacto pode ser induzida em murganhos utilizando uma variedade de alergénios de contacto, incluindo dinitrofluorobenzeno (DNFB) e oxazolona. Os murganhos são sensibilizados topicamente com o alergénio num veículo de acetona e azeite e, depois, provocados na orelha com o alergénio apenas em azeite. A alteração na espessura da orelha é uma medida da resposta imunitária contra o alergénio. Os anticorpos anti-IL-21 são administrados na fase de sensibilização (d0-5) ou durante a fase de provocação (d5-6). A inibição da espessura da orelha por IL-21 indica um papel para IL-21 na inibição da hipersensibilidade de contacto. 82

Os murganhos C57B1/6 são pintados no dorso com DNFB a 0,5% em acetona:azeite (4:1) ou apenas acetona:azeite em dO. Em d5, a espessura da orelha dos murganhos é medida utilizando compassos de espessura e os murganhos são provocados nas orelhas apenas com azeite (controlo) ou DNFB a 0,25% em azeite, pela introdução de 25 pL de uma solução na orelha. A alteração na espessura da orelha é medida em d6 e a inflamação calculada como uma diferença na espessura da orelha entre d5 e d6. Os grupos de murganhos sao injectados, i.p., com PBS ou 10- 10 0 pg de anticorpos anti-IL-21 num dos dias 0-5 ou dias 5-6. A inibição da espessura da orelha por anticorpos anti-IL-21 demonstra gue os anticorpos anti-IL-21 podem ser úteis na inibição da hipersensibilidade de contacto.

Os esplenócitos são recolhidos e agregados a partir de dois murganhos Balb/c de elevado titulo e fundidos a células de mieloma de murganho P3-X63-Ag8.653 utilizando PEG 1450, num único processo de fusão (razão de fusão de 2:1, esplenócitos para células de mieloma, "Antibodies: A Laboratory Manual", E. Harlow e D. Lane, Cold Spring Harbor Press) . Após 9 dias de crescimento pós-fusão, os agregados de hibridoma produzindo anticorpo especifico são identificados por ELISA Directo e de

Captura, utilizando proteína de IL-21 recombinante, sem cauda e com cauda de Fc de IgG humana, como alvo de anticorpo específico. Os agregados de hibridoma positivos são analisados posteriormente para a sua capacidade de bloquearem a actividade proliferativa celular ("ensaio de neutralização") de proteína de IL-21 recombinante purificada, em células BaF3 expressando a sequência de receptor de IL-21. Os anticorpos monoclonais purificados de meios de cultura de tecidos são caracterizados para a sua capacidade de bloquearem a actividade proliferativa 83 celular ("ensaio de neutralização") de IL-21 recombinante purificada em células Baf3 expressando as sequências de receptor. Os anticorpos monoclonais "neutralizantes" são identificados deste modo.

Os agregados de hibridoma produzindo resultados positivos pelo "ensaio de neutralização" e formatos de ELISA são clonados, pelo menos, duas vezes por diluição limitante. Nestes ensaios, as amostras são tituladas utilizando diluições em série de quatro vezes, para ver que clone irá manter a leitura de D.O. mais elevada. Utilizando os resultados dos ensaios de neutralização e titulação, dois clones específicos de cada poço principal inicial são seleccionados para análise posterior. Estes são submetidos a um ciclo adicional de clonagem, para garantir homogeneidade de cultura e rastreados utilizando o ELISA Directo. Após um ensaio de titulação adicional, são seleccionados dois clones de IL-21 finais. Os clones de hibridoma são cultivados num meio de crescimento de meio de Dulbecco Modificado por Iscove a 90%, com L-glutamina a 2 mM, penicilina a 100 pg/mL e sulfato de estreptomicina a 100 pg/mL e Soro de Clone I Fetal a 10% (Hyclone Laboratories). Os clones são propagados pela sementeira de culturas a 2 x 105 células/mL e mantidos entre 1 x 105 e 5 x 105 células/mL, a 37 °C e CO a 5-6%. Após transferências subsequentes, as células estão adaptadas a condições isentas de soro. As células são congeladas em soro a 90%, DMSO a 10% e armazenadas em fase de vapor de uma arca congeladora de azoto líquido.

Os anticorpos monoclonais purificados produzidos por clones de hibridoma são caracterizados num número de modos, incluindo binning (i. e., determinar se cada anticorpo poderia inibir a 84 ligaçao de qualquer outra ligaçao), mapeamento de epitopo utilizando péptidos, afinidade relativa e neutralização.

Exemplo 11 - Selecção de Sequências Peptídicas Para

Utilização na Avaliação de Anticorpos Monoclonais Dirigidos contra IL-21 Humana

Uma avaliação da ligação de anticorpos de IL21 anti-humanos murinos aos diversos domínios de IL-21 foi conduzida, em parte através da capacidade de os anticorpos monoclonais se ligarem a péptidos sintéticos derivados da sequência de IL-21 humana nativa. Péptidos de 18-29 aminoácidos foram seleccionados para proporcionar cobertura significativa do polipéptido de citocina, mantendo-se a incidência em domínios previstos de estudos de muteína de citocina e a estrutura de citocinas relacionadas com IL-21 como sendo importantes na ligação ou activação de receptor. Os péptidos nesta gama de tamanhos também são eficientes para preparação e são de um tamanho que pode proporcionar estrutura secundária limitada para reconhecimento de anticorpo. Os péptidos 1, 3 e 4 foram sintetizados com uma terminação carboxilo amidada, para melhor imitar a carga electrostática verificada nas ligações peptídicas nativas. Péptido N° 1 A terminação N de IL-21 humana após o processamento de mamífero da sequência de péptido sinal, juntamente com a sequência de aminoácidos adjacente de IL-21 (SEQ ID N°: 6), foi escolhida para um péptido. A expressão de mamífero de IL-21 humana e sequenciação N-terminal da citocina demonstrou 85 anteriormente que, após clivagem do péptido sinal, o aminoácido N-terminal resultante era o derivado de piroglutamato de glutamina-30. Este derivado foi escolhido para o aminoácido N-terminal para o péptido e juntamente com os 20 aminoácidos subsequentes verificados no terminal amino de IL-21 humana. Para permitir ligação eficiente e especifica do péptido a proteínas veículo ou matriz de fase sólida, necessária para a análise com este péptido, um resíduo de cisteína adicional foi adicionado ao terminal carboxilo do péptido. A sequência peptídica completa é piroGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKCamida (SEQ ID N°: 1). Péptido N° 2 0 segundo péptido foi escolhido devido ao seu carácter hidrófilo, à presença de resíduos de prolina (segmento não helicoidal previsto) e sua localização na sequência de IL-21 entre as regiões helicoidais A e B previstas. A extremidade carboxiterminal do péptido foi seleccionada, devido à presença de um resíduo de cisteína na sequência polipeptídica de IL-21 humana. A sequência peptídica é NDLVPEFLPAPEDVETNC (SEQ ID N°: 2). Péptido N° 3

Esta sequência peptídica foi seleccionada pela sua localização prevista, compreendendo uma porção significativa da hélice C hidrófila da estrutura de IL-21. Prevê-se que esta região hidrófila seja importante na interacção ligando-receptor e a abrangência do péptido também foi seleccionada, para permitir a inclusão de um resíduo de cisteína nativo (Cys-122), 86 para possibilitar conjugações eficientes, quando apropriado, como notado acima. A sequência peptídica é NVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCamida (SEQ ID N°: 3). Péptido N° 4

Este péptido foi seleccionado devido à sua localização próxima da terminação carboxilo da citocina e porque estudos utilizando muteinas de IL-21 demonstraram que esta região peptidica é importante para activação de ligando-receptor mas não ligação de ligando. Mostrou-se que a mutação de Gln-145 e/ou Ile-148 contida na sequência deste péptido afecta a activação de receptor de IL-21 humana. 0 péptido de 29 aminoácidos foi iniciado na Cys-125 nativa, para possibilitar a sua utilização na ligação química do péptido, como notado acima, e terminar em Ser-153. Esta serina é o aminoácido final em IL-21 murina, assim prevê-se que a sequência peptídica aminoterminal deste resíduo contenha os elementos da sequência de IL-21 humana que são importantes para actividade de ligando. A sequência peptídica é CDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSamida (SEQ ID N°: 4).

Exemplo 12 - Ensaio de STAT3 Fosforilado para Detecção de Neutralização de IL-21

Foram utilizados transfectantes de receptor (hIL-21R) de Baf3/IL21 humana anteriormente derivados (ver, as Pat. U.S. N° 6307024 e 6686178). As células foram lavadas três vezes em meios de bioensaio Baf3 que consistem em: RPMI, IX Glutamax,

Soro Bovino Fetal a 10%, Beta-mercaptoetanol a 50 μΜ, Zeocina a 200 pg/mL, G418 a 1 mg/mL (todos de Invitrogen Corporation, 87

Carlsbad, CA). Após a terceira lavagem, as células foram contadas utilizando métodos padrão (hemacitómetro) e ressuspensas para 6xl05 células por mL em meios de bioensaio. As células foram, depois, plaqueadas numa placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços, a 30000 células por poço. A placa foi, depois, transferida para uma incubadora de cultura de tecidos, a 37 °C, enquanto as outras placas de ensaio foram preparadas. A placa de amostras foi, depois, preparada com 30 pL de IL-21 humana a 2,0 ng/mL, mais 30 pL de um dos seguintes: soro de murganho diluído (concentrações finais de 1:10, 1:50 ou 1:100), meios, anticorpo neutralizante anti-IL-21 (diversos lotes e concentrações), hIL-21R solúvel (exemplo 2) ou controlos irrelevantes. A placa foi, depois, transferida para uma incubadora a 37 °C. Após 30-40 minutos, a placa de células e as placas de amostras foram removidas da incubadora e 50 pL de cada poço na placa de amostras foram transferidos para a placa de células e misturados. As placas foram, depois, colocadas de volta na incubadora a 37 °C durante, exactamente, 8 minutos. Nesta altura, a reacção foi interrompida pela colocação da placa sobre gelo e adição de 150 pL de Tampão de Lavagem Celular BioPlex gelado (BioRad Laboratories, Hercules, CA) . A placa foi centrifugada, durante 5 minutos, a 1500 RPM e 4 °C. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado na fossa e as células foram lisadas em 60 pL de Tampão de Lise Celular BioPlex, contendo Factor 1, Factor 2 e PMSF (todos de BioRad). As células lisadas foram pipetadas para desfazer grumos e, depois, agitadas a 600 RPM, a 4 °C, durante 20 minutos. A placa foi, depois, centrifugada de novo, durante 20 minutos, a 3000 RPM, a 4 °C. Após centrifugação, 55 pL de lisado foram 88 removidos e misturados com 55 pL de Tampão de Ensaio de Teste de Fosfoproteina (BioRad).

Nesta altura, uma placa de filtro foi pré-molhada com 50 pL de Tampão de Lavagem de Fosfoproteina (PWB), aspirada e 50 pL de Esferas Ligadas a PhosphoSTAT3 (BioRad) plagueados. Estas esferas foram, depois, aspiradas e a placa foi lavada três vezes com 75 pL de PWB. Após a aspiração final, 50 pL do lisado diluído foram transferidos para a placa gue foi, depois, coberta e agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, a placa foi lavada três vezes com PWB e Anticorpos de Detecção de PhosphoSTAT3 Biotinilados (BioRad) foram, depois, adicionados, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. A placa foi lavada mais três vezes em PWB e, depois, Estreptavidina-PE foi adicionada, durante 10 minutos. Finalmente, a placa foi lavada três vezes com Tampão de Ressuspensão de Fosfoproteina (PRB) e as esferas foram ressuspensas em 125 pL de PRB. STAT3 fosforilado total foi medido em cada poço, seguindo o protocolo de recolha de dados padrão Luminex 100, como recomendado pelo fabricante (Luminex Inc., Austin, TX) . Os dados foram, depois, analisados e expressos como factor de indução de STAT3 fosforilado, em comparação com apenas meios.

O soro de murganhos imunizados com diversos péptidos de IL-21 (ver a tabela 1) foi testado para neutralização da fosforilação de STAT3 induzida por IL21. A IL-21 foi pré-misturada com uma diluição de soro, durante 30 minutos, a 37 °C. Esta solução foi, depois, adicionada a transfectantes de Baf3/hIL21R, durante 8 minutos. A reacção foi, depois, interrompida, as células lisadas e STAT3 fosforilado medido. O 89 factor de aumento em STAT3 fosforilado é calculado utilizando o controlo de "apenas meios", como a linha de base. Os números mais baixos correlacionam-se com neutralização de IL-21 mais forte. Os dados são resumidos na Tabela 2 abaixo.

Resumidamente: um de três murganhos (N° 1976) imunizado com péptido N° 1 e dois de três murganhos (N° 1979, 1980) imunizados com péptido N° 2, geraram anticorpos neutralizantes de IL-21. Nenhuns murganhos imunizados com os péptidos N° 3 e N° 4 produziram anticorpos neutralizantes. A neutralização verificada na coluna de diluição 1:10 pode ser devida a um efeito sérico, actividade anti-IL-21 não especifica (fazer referência a dados de "soro irrelevante").

Tabela 1 Péptidos de IL21 o correspondentes números de amostras séricas Amostra N2 Péptido N2 1976-1978 Péptido N° 1 (ver o exemplo 11) 1979-1981 Péptido N° 2 (ver o exemplo 11) 1982-1984 Péptido N° 4 (ver o exemplo 11) 1985-1987 Péptido N° 3 (ver o exemplo 11) 1988-1990 Péptido N° 3 (ver o exemplo 11) 90

Tabela 2

Factor de aumento médio nos níveis de STAT3 fosforilado, em comparação com meios

Diluição Sérica Amostra N2 1:10 1:50 1:100 1976 1,89 5,07 5, 15 1977 4, 98 10, 14 8,63 1978 6, 72 8,33 12, 99 1979 1, 04 1, 81 2,17 1980 0,65 1,4 1, 81 1981 6, 91 9,8 17, 06 1982 4, 04 10,8 12, 73 1983 9,68 12, 05 12, 42 1984 5, 84 10,84 11, 78 1985 6, 94 12,64 11,5 1986 9,01 13,41 16, 61 1987 8,48 14, 11 17,36 1988 4,56 8,66 9,38 1989 4, 88 11,63 12,66 1990 9,56 10,29 14, 58 Controlos Apenas Meios 1 IL-21 12, 4 NMS 11,28 11, 72 10,31 Soro Irrelevante 3,52 11,09 9,49 91

Exemplo 13

Descrição de Ensaio de EIA Directo A capacidade de os péptidos de IL-21 humanos (exemplo 11) se ligarem a anticorpos de IL-21 anti-humanos foi avaliada utilizando um ensaio de ELISA de estilo "directo". Neste ensaio, poços de placas de ELISA de poliestireno de 96 poços foram, em primeiro lugar, revestidos com 100 pL/poço de proteína de IL-21 humana, a uma concentração de 1 pg/mL em Tampão de Revestimento (Na2CC>3 a 0,1 M, pH 9,6) . As placas foram incubadas, de um dia para o outro, a 4 °C, após o que os péptidos não ligados foram aspirados e as placas lavadas duas vezes com Tampão de Lavagem a 300 pL/poço (PBS-Tween, definido como NaCl a 0,137 M, KC1 a 0,0022 M, Na2HP04 a 0, 0067 M, KH2P04 a 0,0020 M, polissorbato 20 a 0,05%, v/p, pH 7,2) . Os poços foram bloqueados com 200 pL/poço de Tampão de Bloqueio (PBS-Tween, mais albumina de soro bovino (BSA) a 1%, v/p) , durante 1 hora, após que as placas foram lavadas duas vezes com Tampão de Lavagem. As diluições de anticorpo foram preparadas em meio de FBS/IMDM a 5% e ajustadas para 1 pg/mL. As amostras em duplicado de cada diluição de anticorpo foram, depois, transferidas para as placas de ensaio, 100 pL/poço, de modo a ligar os péptidos de IL-21 anti-humano. Após incubação de 1 hora, à t.a., os poços foram aspirados e as placas lavadas duas vezes, como descrito acima. IgG de Cabra anti-Murganho marcado com peroxidase de rábano, específico de Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) , a uma diluição de 1:5000 com meio de IMDM a 5% foi, depois, adicionado a cada poço, 100 pL/poço e as placas incubadas, à t.a., durante 1 hora. Após remoção do anticorpo conjugado a HRP não ligado, as placas foram lavadas cinco vezes, 100 pL/poço de 92 tetrametilbenzidina (TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) adicionada a cada poço e as placas incubadas, durante 3 minutos, à t.a. 0 desenvolvimento da cor foi interrompido pela adição de 100 pL/poço de Reagente de Interrupção de TMB a 450 nM (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e os valores de absorvência dos poços lidos num instrumento Spectra MAX 340 da Molecular Devices, a 450 nm.

Exemplo 14

Caracterizaçao de Anticorpos Neutralizantes A caracterização de amostras derivadas de sobrenadante de cultura de hibridoma incluiu ensaios de ligação, utilizando uma proteína de fusão de Fc de IL-21 humana, proteína de fusão de Fc de IL-21 de murganho, uma proteína de IL-21 humana mutada em Gin 145 e Ilel48 (SEQ ID N°: 6) e péptidos descritos acima. As fusões de Fc de IL-21 são divulgadas nas Pat. U.S. N° 6307024 e 6686178 e métodos para produção de fusões de Fc são divulgados nas Pat. U.S. N° 5155027 e 5567584. A proteína mutante de IL-21 é descrita na Pat. U.S. 6929932 e Pedido de Patente U.S. N° 2005-0244930. 93

Tabela 3

Designação Isótipo Neutralização Liga-se a proteína de hIL-21-Fc Liga-se a muteína de hIL-21 Liga-se a proteína de mIL-21-mFc Liga-se a péptido número Ab de murganho 338.17 IgGl Sim Sim Sim Sim N° 3 Ab de murganho 338.24 IgGl Sim Sim Sim Sim N° 3 Ab de murganho 338.25 IgGl Sim Sim Sim Sim Nenhum Ab de murganho 338.29 IgGl Sim Sim Sim Sim N° 1 Ab de rato 297.21.1.3.4.2 IgG2a Sim Não Sim Sim N° 1

Ab de murganho 338.17 Esta amostra ligou-se à estrutura de proteína de IL-21 humana na área prevista como sendo a região da Hélice c, com base na sua capacidade para se ligar a Péptido N° 3 . Ab de murganho 338.24 Esta amostra ligou-se à estrutura de proteína de IL-21 humana na área prevista como sendo a região da C-Hélice-C, com base na sua capacidade para se ligar a Péptido N° 3. Ab de murganho 338.25 Esta amostra ligou-se ao lado da hélice D da molécula próxima de Q145 e/ou 1148 (SEQ ID N°: 6), com base na sua capacidade de se ligar a hIL-21 nativa, mas não a muteína de hIL-21. É provável que a ligação seja a um epitopo descontínuo, com base na sua incapacidade de se ligar ao péptido N° 4, que contém a sequência peptídica nativa mutada na muteína 94 de IL-21, ou o epitopo pode requerer a presença de Serl54-Serl62 da sequência de IL-21 humana (SEQ ID N°: 6) .

Ab de murganho 338.29 Esta amostra ligou-se à estrutura de proteína de IL-21 humana na área prevista, como sendo a região da Hélice A, com base na sua capacidade para se ligar a Péptido N° 1. Com base na sua capacidade de reagir moderadamente com um Péptido N° 1 conjugado C-terminalmente mas reage muito fortemente com o péptido não conjugado, poderia prever-se que o epitopo para este anticorpo incluísse o domínio médio ou C-terminal da Hélice A, como representado no Péptido N° 1.

Ab de rato 272.21.1.3.4.2 Com base na sua capacidade de reagir fracamente com o Péptido N° 1 conjugado e não conjugado no terminal C, a sua capacidade para neutralizar hIL-21 mas a sua incapacidade de capturar hIL-21-Fc da solução, este anticorpo liga-se a um epitopo largamente descontínuo na estrutura de proteína de IL-21 humana, compreendendo uma área prevista como sendo na região do terminal N de IL-21 e a Hélice A e requer espaço próximo do terminal C adjacente de hIL-21, onde está ligado à proteína de fusão de Fc.

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Jaspers, Stephen R. <120> ANTAGONISTAS DE IL-21 95

<130> 05-24PC <150> US 60/740154 <151> 2005-11-28 <160> 8 <170> FastSEQ para Windows

<210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> péptido sintetizado <22 0> <221> VARIANTE <222> (1) ... (1) <223> Xaa = piroGlu <22 0> <221> ΑΜΙDAÇÃO <222> (21) ... (21) <40 0> 1 >iaa Gin Asp -Arg Hís Met Ile Arg Mel: Arg Gin Leu Ile Asp Ile Vai

Asp Gin Leu Lys Cys 20 96

<210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> péptido sintetizado <400> 2

Asn ,ftsp Leu vai Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Vai Glu Asn i 5 10 15

Thr Asn Cya

<210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> péptido sintetizado <220> <221> AMIDAÇÃO <222> (26) ... (26) <400> 3 n Vai Ser lie Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro • Ser Thr Asn Ala 5 10 15 >' Arg Arg Gin Lys HiS Arg Leu Thr Cys 20 2 5 97

<210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> péptido sintetizado <22 0> <22L> ΑΜΙDAÇÃO <222> (29) ... (29) <400> 4

Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu 1 Giu Arg 1 5 10 .15 hys Ser Leu Leu Glu Lys Met lie Bis Gin His Leu Ser 20 25

<210> 5 <211> 642 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (47) ... (532) 98 < 4 Ο Ο > 5 gctgaagtça aaacgagacc asggtctagc Lccactgttg gtactt atg aga tcc 55

He;:, Arcj Ser agt cct ggc aac atg gag agg att gtc ate tgt ctg atg 1 gtc ate ttc 103 Ser Pr o Giy As π Met Giu Arg Ile Vai Ile Cys Leu Met Va 1 Ile Phe 5 10 15 ttç ggç aca c-tg gtc cac aaa tea age tcc caa ggt caa gat ege cac 151 .Leu G.lv Thr Leu. vai His Lys Ser Ser Ser G .1 n Giy Gin Asp Arg His 20 25 30 35 atg att aga atg egt caa ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat 199 Met Ile Arg Met Arg Gin Leu ile Asp Ile vai Aso Gin Leu Lys Asn 40 45 50 tat gtg aafc «ae ttg gtc cct Gj G· CS o fcfcfc ctg CCS gct cca gaa cat gtõ 2 47 Tyr vai Asr; hS-p Leu Vai Pro Giu Phe Lee Pro Ala Pro Giu Asp Vai 55 SO 65 gsg SCÔ aac ;:q;: gsg fcgg fcca gct ttt: tcc tgt ttt cag aag gee caa 295 Gla Thr Asa cy s Giu Trp Ser .Ala Phe Ser Cys Phe Gin Lys Ala Gl n 70 75 80 cta aag toa gca aat aca 93 u aac aat oas agg ata ate a a t çta tea 34.3 Leu Lys Sar Ala Asn Thr Gly Asn As n Giu Arg ile Ile Asn Vai Ser 85 90 95 att asa aag ctg aag agg aaa cca cct t.cc aca aat gca ggg aga aga 391 lie Lya Lys Leu Lys Arg Lys Pro P ro Ser Thr Asn Ala G i y Arg Arg 100 105 i 10 1 i 5 cag a a.a cac aga cta &CÃ tgc cct tes tgt gat; tct tat gag asa aaa 4 39 Gin Lys HÍS A rg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys 120 125 130 cca ccc aaa Çclci ttc c >; a gaa aga ttc aaa tea ctt. ete ca a aag atg 4 8? Pro Pr o Lys Giu Phe Leu Giu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gin Lys Met i 35 140 145 att cat eag cat ctg tcc tct aga aca cac gaa agt gaa gat tcc lie Kis Gin His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Giu Asp Ser .150 155 160 tgaggatcsa acttgcagtt ggacactatg ; ttacatactc ta a t a t agt a gtçaaagfcca 592 tttctttgta ttccaagtçg aggagcccta ttaaattata taaagaaata 642 <210> 6 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens 99 < 4 Ο Ο > 6

Arg Ser Ser V' Ζ\ I He Pha Leia 20 Arg urja 35 Met Len Lys 50 Asn Ty r 65 Asp Vai Gl« Lys Ala Gin Leu Asn Vai. Ser Ile 100 Gly Arg Arg 115 Gin Glu Lys "5 -5Π Λ V.· V Lys Pro Gin J. v4 Α3ΐ> Lys <J .¾ f Met rre

Pro Gly A^a n Met 5 Gly Thr Lei- V <5. .1. Ile Arg Met Arg 40 Vai Asn Asp 55 Leu Thr Asn 70 Cys G x u Lys S £9 V Ala Asn 83 Lys Lys Leu Lys Lys His Arg Leu 120 Pro Lys Giu 135 Phe His Gin 150 nas? Lea

Glu j*.rg 1 0 Ile Vai H i s 2 5 Lys Ser Ser Gin Leu XI e Asp Vai Pro Glu Phe L0 Trp Ser A a a 7 5 Phe Thr Gly 90 Asn Asn Arg 105 Lys Pro F r o Thr Cys Pro Ser Leu Glu Ar g Phe 14 0 Ser Ser Arg Thr 15 5

Ile Cys Leu 15 MôC Ser Gin 30 Gly Gin Ile 45 Vai ASp Gin Leu Pro Àla Pro Ser Cys Phe Gin 80 Glu Arg I le 95 lie Ser Th r 110 Asn Ala Cys 1 9 Asp Ser Ty r Lys Sw2T Leu Leu His Gly Ser Glu 160

<210> 7 <211> 3072 <212> ADN <213> Mus musculus < 2 2 0 >

<221> CDS <222> (54) ... (491) 100 <4Ο0> 7 gagaaccaga ccaaggccct gtcatcagct eotgç-iaqact cagttctqgt ggc atg .56

Met 1 gag agg a cc Ctt- gtc tgt ctg gta gtc ate ttc ttg ggg a ca gtg gee 104 Gin Arg Thr Leu Val Cys Leu Val val 11 e Phe Lei; Gly Thr Val Ala 5 10 15 cat aaa tca age ccc ca a ggg CCS gat cçc ctc ctg att aga ctt cgt 152 His Lys Ser Ser Pro Gin Gly Pro Asp Arg Leu Leu 1 ie Arg Leu Arg 20 25 30 cac ct;: a í:t gac att qtt gaa càg ctg aaa a t Ο ta;: gaa a st: gac ttg 200 His Leu lie Asp Ile Val Glu Glu Leu Lys ι le Ty r Glu Asn A.sp Leu 35 40 45 gafc cct gaa ctt cta cea gct cca ca a gat gta aag ggg CSC tgt gag 248 Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gin Asp Val Lys GJ y His Cys Glu 50 55 60 65 cat- gca gct: ttt gee tgt ttt cag aag gee aaa ctc aag cca tca aac. 2 56 κ.is Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gin Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn 70 75 80 cct: ggs aac aat aag a ca ttc ate att cac ctc gtg gee cag ctc agg 344 Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe lie lie Asp Leu Val Ala Gin Leu Arg 85 9G S5 agg ctg cct gee agg 99« 99 a aag aaa cag aag cac ata gct 3 52 Arg Arg Leu Pro .Ala Arg Arg GJ.y Gly Lys Lys Gin Lys His lie Ala 100 105 110 aaa r.gc cct tcc tgt gat teg tat gag aaa agg acs ccc aaa gaa ttc 440 Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Gin Phe 115 120 125 cta gaa aga cta aaa tgg ctc ctt caa •S aq atg att cat cag cs t ctc 488 Lee Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gin. Lys Met lie His Gin Ki s Leu 130 135 140 145 tcc tagaacacat aggacccgaa gattcctgag gatccgagaa gattcccgag 541

Ser gactgaggag acgccggaca ctatagacgc ccacgaatgc aggagtacat cttgcctctt 601 gggattgcaa gtggagaagt acgatacgti: atgataagââ caactcagaa aagctatagg 661 ttaagaccct ttegeecatt aactaagcag acactgtggt íccctgcaca gactcoatgc 721 101 tgtcaac&tg tgcttcccas gassact aaa cctcttatga aaactqasgt âctcattacc gctttccaga gagggtcacc cttaagt.tçc agatggcsat tr. tcaagttt iccagectca aaaagcaatc aaatccaacc. ttccagtttt gagcaaatag aagtctacas aaatçgatct ctgtacctca açaccagtgt actttaaaaa attatacaca tgctcga&ag gtctccatgt tgafttttat stcactgaca igt.ategtct gaqtaaacta gtcctttgac tgtccatgaa acaagaatgt agttttaatg afccccaagtg catacataca tatatataga aggagttçag gaataaattc gagaatttag ttggttttqa cccagtc‘cgg çaaaaccfcca gctgtggctt gctitcagca tcctaacgga ctttattctt dciiíí a c atoe taggtacagt cctggcttcc cttcctcccs gaaagcctgt gtagcfccfcca gtctcctctc caascaagt t atctatttaa aaac.agaett ttCtgcoatt agctattttc gagafcccasg cagtgcettt t&aetgattc tat.gtat.tgc catagcccac ctgaagcaga tttattcttt atttaagaca atetetastc ggsaaagcca çacaaaâttg attattgttc ggttgccact ggggctttcc ttttgagtac tgatatttag tstatatata gagagagaga aggaaatcag atagcattat fcfctaatatg atgtttgtgt a actcaacaag catcttattg aaââtacagc atgatgtaag taagaaaaac agcatsttga ttttcttctc acfcgí: t : ttc atçtcaagtt ggaagcgcaa cctcsagtgg ccacatcctt oagcacttaa aatcâaaatc ttactgaaca. tgatataatt cctggagt-gg catggcctçg aaaacaagca ç c a gs a a a q t aaagaacttg gtaagtgtcc gafcgcagtcc tgttgtttct acgtatttat aagaagtaca gtgaaggctt cacagcagtc actgtgggtg ggtgtaagct taagtctatt tcttacagga ttgttcaaaa tatatatac.a gagagagaga ttatggccgt tgatctatgt aatgatgtac tcatggcttc agcccagctt cccaactgtg tagggssttt ct-ggaaataa tttgtacttg r.aacta&cat tattaggtct taaagaggca cctttátaag acctcactat ttatgggtgt tcctttctti: gacacattgc aggagatqag acccaatctt tccaacagta ta tcatcgct gggatggttt cagatcecgt gtcacaatc» tgtasctgta aatggtgcta ttcacsaagc ggctgtgtaa tttggtgtgt aataattcaa C !.CCciC i. ttgaacctct ggaacacatt ttttttggtt ctgtat.tt.ta aeacctgacc agggaaggga tatatatata gagaaagaga tastactgta tattgctctg tttataactt fcfcatttaaga cccgtgtcag acattctttg gtcgatctgc caagcataag asagcatgtc ctttatactc atcaaaafctt. agggtgtagt ctaatagttt cttct.ggagc cctgtgatga cctctttgaâ atgcacactc ccaagagacc itaaccacag tgtttcaatg ttgagaattt tgãtctaagçj gtaccgccct gaaccaacgc aatgtgtgac gcattggttg aatgatggac ctgttgactt ttattgttct tgcagcacag catgggaaag ctgt.çetcaa ggacctgaca ttcatlccct ttctgaactt acacttttga fcar.acataca tatatatatg gagaggttgt gctgaaagtg ttttatttac aatgattatt cctçatcsta ggatt.tct.gg 781 sttggaaçgg 8-11 gagagtaega SOI atgaaattga 961 tgaagagttt 1021 tacaagsqaç 1081 aacctattat 1141 aagaagcsgg 1201 aatcttgtga 126.1 caagtagaafc 1321 atctgctagc 1381 acttctaaga 1441 ttgataagtt 1501 âgaggttctg .1561 agçctaaatt 1621 tcsagttaa a 1681 cttar.ggt ta 17 41 aaaaaggtgt 1801 aagatagcac 1861 attctcttaa 1921 tgttgatgac 1981 ctgagtttgc 2041 agagaggggs 2.101 ctfcgacattg 2161 agccttttaa 2221 gctaagagct 2281 ctacgcttta 2341 gacfccagcca 2401 cactgttgtg 2 461 tatctgtaga 2521 cgtstgtctg 2581 gttaaattfct 2S41 taca ta cata 2 7 01 tstatatata 2762 tgtaggfccat 2821 ttttctttgt 2881 agccacacct 2841 t.attatgtat 3001 ttaaafcqcta 3061 3072 <210> 8 <211> 146 <212> PRT <213> Mus musculus 102 <4Ο0> 8

Met Glu Thr X Ala His Lya Ser 20 Arg H i s Leu 35 1 le Leu Asp 50 Pro Glu Gru 65 Bis Ala As ri Pr o Gly Asn Ar q Arg Arg 7, eu Ala Lys Cy:^ i I D Pro Fhe Lsu 145 Leu 130 Ser Glu Arg ueu Vai Cys Ser Pro Gin Gly Asp Ile Vai Glu 4 0 Leu Leu Ser 55 Ala Fbe Ala 70 Cys Phe Asa S5 Lys Thr Phe Pro Ala Arg Arç Se r Cys Asp 120 Leu Lys Trp 1 3 5' Leu Vâ 1 Vai 10 Ile Phe Fr o 25 Asp Arg Leu 1 π Leu Lys 11 w Pro Gin Asp Vai 60 Gin Lys Ala y ib Lys Ile Ile 90 t -3 3a. .¾ Leu Gly Gly Lys Lys 10 3 Tyr Glu Lys Arg Leu Gin Lys Met 140

Leu G1 y Thr vai Leu lie 1 5 .Arg i*êu Tyr 30 Glu As n Asp 45 Lys Gly His Cvs Leu Lys Pro Se r. o 0 vai Ala Gin CS u Leu Gin Lys 95 His Ile Thr 110 P ro Lys Glu 12 iT' 3 Â. H i s Gin His

Lisboa, 21 de Maio de 2013 103

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo que é capaz de competição com o anticorpo monoclonal 272.21.1.13.4.2 (Acesso ATCC N° PTA-10395) para ligação a um antigénio de IL-21 humana, em que o anticorpo se liga especificamente a hIL-21, com uma afinidade de ligação de ΙΟ1 2 ΝΓ1 ou maior e em que o anticorpo neutraliza a IL-21 humana.
2. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao epitopo a que o anticorpo monoclonal 272.21.1.13.4.2 (Acesso ATCC N° PTA-10395) se liga, com a afinidade de ligação de 102 M1 ou maior.
3. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que o anticorpo está marcado com um marcador detectável, de um modo preferido, em que o marcador detectável é seleccionado do grupo consistindo num isótopo radioactivo, enzima, corante e biotina.
4. Anticorpo de acordo com qualquer das Reivindicações 1-3, em que a afinidade de ligação é 109 M-1 ou maior.
5. Célula de hibridoma que produz um anticorpo de acordo com a Reivindicação 2 . 1 1 Método de produção do anticorpo de acordo com a 2 Reivindicação 2, compreendendo: (a) proporcionar um hibridoma capaz de produzir o anticorpo; e (b) cultivar o hibridoma sob condições que proporcionam a produção do anticorpo pelo hibridoma.
7. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer das Reivindicações 1-4 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
8. Anticorpo anti-IL-21 de acordo com qualquer das Reivindicações 1-4, ou uma composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 7, para utilização no tratamento de uma doença auto-imune.
9. Anticorpo anti-IL-21 ou uma composição farmacêutica para utilização de acordo com a Reivindicação 8, em que a doença auto-imune é seleccionada do grupo consistindo em pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), Doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn, colite ulcerosa, síndrome do intestino irritável, esclerose múltipla, artrite reumatóide, diverticulose, lúpus eritematoso sistémico, psoríase, espondilite anquilosante, esclerodermia, esclerose sistémica, artrite psoriática, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença de enxerto vs. hospedeiro (GVHD), linfoma cutâneo de células T (CTCL), síndrome de Sjogren, glomerulonefrite, nefropatia de IgA, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, dermatite atópica, síndrome anti-fosfolípido e asma e outras doenças auto-imunes. 2
10. Utilização de um anticorpo anti-IL-21 de acordo com uma composição icação 7, para a tratamento de uma qualquer das Reivindicações 1-4, ou farmacêutica de acordo com a Reivind preparação de um medicamento para o doença auto-imune. Lisboa, 21 de Maio de 2013 3