BR112020002013B1

BR112020002013B1 - Muteínas de il-21, método de preparação das mesmas, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, kit, uso dos mesmos e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112020002013B1
Application number: BR112020002013-3A
Authority: BR
Inventors: Khaled M.K.Z. Ali; Neeraj Jagdish Agrawal; Gunasekaran Kannan; Ian Foltz; Zhulun Wang; Daren Bates; Marissa Mock; Shunseke Takenaka
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2023-01-24
Also published as: PL3661954T3; JP2022116099A; KR20220092652A; EP3661954A1; DK3661954T3; JOP20200020A1; CO2020001113A2; TW201920239A; JP7079171B2; EP4029877A1; US20230381276A1; UY37829A; TWI798245B; IL272137A; SA520411230B1; CR20200099A; KR102414120B1; MA56289A; ES2910969T3; HRP20220404T1

Abstract

São proporcionadas aqui muteínas de IL-21 e proteínas de fusão compreendendo as mesmas para uso em métodos de tratamento de uma doença. Conjugados, ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras, composições farmacêuticas e estojos relacionados são também proporcionados aqui. Métodos de preparação das muteínas de IL-21 e proteínas de fusão compreendendo as mesmas, bem como métodos de tratamento de um sujeito com sua necessidade, são proporcionados pela presente divulgação. São adicionalmente proporcionadas proteínas de ligação ao antígeno PD-1.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O benefício sob 35 U.S.C. §119(e) do Pedido de Patente Provisória dos E.U.A. No. 62/540,692, depositado a 3 de agosto, 2017, e Pedido de Patente Provisória dos E.U.A. No. 62/616,733, depositado a 12 de janeiro, 2018, é deste modo reivindicado, e a sua divulgação é deste modo incorporada por referência aqui.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO ELETRONICAMENTE

[0002] É incorporada por referência na sua totalidade uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos legível por computador submetida simultaneamente aqui e identificada como se segue: Ficheiro ASCII (Texto) de 975.000 bytes chamado “51633_Seqlisting.txt”; criado em 25 de julho, 2018.

ANTECEDENTES

[0003] O eixo de PD-1/PD-L1 está envolvido na supressão de respostas imunitárias de células T no câncer. Antagonistas desta via foram clinicamente validados ao longo de um número de indicações tumorais sólidas. Nivolumab e pembrolizumab são dois tais inibidores que visam a via de PD-1, e cada um foi aprovado pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de melanoma metastático. Recentemente, os investigadores testaram o paradigma da inibição de pontos de controle no cenário de outros tipos tumorais. Embora alguns avanços tenham sido feitos, a terapia de inibição de pontos de controle permanece ainda nas sombras de outras opções de tratamento do câncer.

[0004] Estudos de inibidores de pontos de controle em combinação com outros agentes estão a decorrer ou foram recentemente completados. A combinação de nivolumab e ipilimumab, um anticorpo bloqueador do receptor de CTLA-4, por exemplo, foi testada em um ensaio clínico de Fase III em pacientes com melanoma de estágio III ou IV irressecável. Em este estudo, a percentagem de pacientes alcançando uma resposta completa foi a mais elevada entre aqueles que receberam a combinação de nivolumab e ipilimumab, batendo o resultado exibido por aqueles no grupo recebendo qualquer um dos fármacos sozinho. Outras combinações estão também sendo correntemente exploradas.

[0005] A interleucina-21 (IL-21) é uma citocina pleiotrópica derivada de células T que regula a atividade de células imunitárias tanto inatas como adaptativas. A IL-21 consegue aumentar a sobrevivência e função efetora de células T. Como desempenha um papel-chave em respostas antitumorais e antivirais, adicionalmente a exercer grandes efeitos em respostas inflamatórias que levam ao desenvolvimento de doenças autoimunes e doenças inflamatórias, a IL-21 tem sido um alvo atrativo para várias terapias.

[0006] No entanto, o desenvolvimento de terapias à base de IL-21 tem sido complexo. A investigação tem sido complicada por estudos mostrando que a intensificação ou, confusamente, a inibição da ação de IL-21 leva a um efeito terapêutico. Existem desafios adicionais devido à ampla expressão do receptor para IL-21 (IL-21R). O IL-21R é expresso não só em células T, mas também em células B, células NK e células mieloides. Conformemente tem de ser tido cuidado para limitar a ampla ativação de IL-21 em leucócitos e evitar o potencial para toxicidade. A restrição da sinalização de IL-21 tem de ser equilibrada e seletiva. O desencadeamento de efeitos de IL-21 tem de ser concebido para ocorrer no momento e local certos.

[0007] De fato, qualquer sucesso, especialmente sucesso clínico com frações de IL-21 como uma monoterapia ou em combinação com inibidores de pontos de controle, tem sido mudo. Assim permanece uma necessidade de modalidades de tratamento utilizando IL-21, incluindo modalidades combinando frações de IL-21 com inibidores de pontos de controle. Permanece também uma necessidade de terapias de IL-21 combinadas com inibição de pontos de controle imunitários.

SUMÁRIO

[0008] A presente divulgação proporciona muteínas de IL- 21 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que SEQ ID NO: 2 é QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2), e X é qualquer aminoácido, e em que a sequência de aminoácidos de muteína de IL-21 difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em pelo menos 1 aminoácido.

[0009] Assim, em um aspecto, a presente divulgação proporciona também muteínas de IL-21 compreendendo somente uma substituição de aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, que é proporcionada aqui como SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, a substituição de aminoácidos está localizada em uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 ou 123, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0010] A presente divulgação proporciona adicionalmente muteínas de IL-21 compreendendo somente duas substituições de aminoácidos, em relação a SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, as substituições de aminoácidos estão localizadas em dois posições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: 5, 9, 15, 70, 71, 72, 73 e 76, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0011] Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam ao receptor de IL-21 (IL-21R) com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 de tipo selvagem pelo receptor de IL-21. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 se liga ao IL-21R humano com uma KD que é maior do que ou é cerca de 0,04 nM. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 se liga ao IL- 21R de macaco-cinomólogo com uma KD que é maior do que ou é cerca de 0,055 nM.

[0012] A presente divulgação proporciona também conjugados compreendendo uma muteína de IL-21 da presente divulgação ligada a uma fração heteróloga. Em aspectos exemplificativos, a fração heteróloga é um polipeptídeo, tal que o conjugado seja uma proteína de fusão. Portanto, a presente divulgação proporciona proteínas de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 da presente divulgação. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende uma muteína de IL-21 da presente divulgação ligada a uma proteína de ligação ao antígeno, tal como um anticorpo, ou um seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno.

[0013] Em modalidades particulares, a proteína de fusão compreende uma muteína de IL-21 ligada a uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) da presente divulgação.

[0014] A presente divulgação proporciona também proteínas de ligação ao antígeno PD-1 e conjugados e proteínas de fusão compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno PD-1.

[0015] A presente divulgação proporciona adicionalmente ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma muteína de IL-21, uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) ou uma proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 e uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) da presente divulgação. Em aspectos exemplificativos, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um conjugado ou proteína de fusão da presente divulgação. Vetores compreendendo os ácidos nucleicos da presente divulgação e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos da presente divulgação são além do mais proporcionados aqui.

[0016] A presente divulgação proporciona adicionalmente estojos compreendendo uma muteína de IL-21, uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1), um conjugado, proteína de fusão (p.ex., uma proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 e uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1)), ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação ou uma sua combinação.

[0017] Composições farmacêuticas compreendendo uma muteína de IL-21, uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1), um conjugado, proteína de fusão (p.ex., uma proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 e uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1)), ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação, ou uma sua combinação, são proporcionadas aqui.

[0018] Métodos de preparação de uma muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) e uma proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 e uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) são proporcionados aqui. O método, em modalidades exemplificativas, compreende cultura de uma célula hospedeira da presente divulgação para expressar a muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) ou uma proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 e uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) e coleta da muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) ou proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 e uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo de ligação ao antígeno PD-1) expressa.

[0019] Métodos de tratamento são adicionalmente proporcionados pela presente divulgação. O método, em modalidades exemplificativas, é um método de tratamento de um indivíduo com sua necessidade, compreendendo administração ao indivíduo com sua necessidade de uma composição farmacêutica da presente divulgação em uma quantidade eficaz para tratar o indivíduo. Em aspectos exemplificativos, o indivíduo tem um tumor (p.ex., um tumor sólido, uma malignidade hematológica ou uma malignidade linfoide) e a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar o tumor no indivíduo. Em outros aspectos exemplificativos, o tumor é câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC) (p.ex., NSCLC de Estágio III ou IV), câncer do pulmão de células pequenas (SCLC), câncer da cabeça e pescoço, câncer renal, câncer da mama, melanoma, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer da próstata, câncer gástrico, câncer da bexiga, carcinoma hepatocelular, cânceres com elevada instabilidade de microssatélites (i.e., cânceres ricos em MSI), linfoma ou leucemia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A Figura 1A representa um gráfico do volume tumoral (mm3) de camundongos BALB/c implantados com células de carcinoma do cólon CT26/3E5 em função do tempo (dias). No Dia 12, os tumores foram medidos e foi dada aos camundongos uma injeção intraperitoneal (IP) de 300 μg de anticorpo de controle do isótipo (mIgG1) nos dias 12, 15 e 18.

[0021] A Figura 1B representa um gráfico do volume tumoral (mm3) de camundongos BALB/c implantados com células de carcinoma do cólon CT26/3E5 em função do tempo (dias). No Dia 12, os tumores foram medidos e foi dada aos camundongos uma injeção IP de 300 μg de um anticorpo anti-PD-1 nos dias 12, 15 e 18.

[0022] A Figura 1C representa um gráfico do volume tumoral (mm3) de camundongos BALB/c implantados com células de carcinoma do cólon CT26/3E5 em função do tempo (dias). No Dia 12, os tumores foram medidos e foram dados aos camundongos 50 μg de IL-21 murina recombinante (rmIL-21) três vezes por semana durante 3 semanas. A dosagem terminou no Dia 33.

[0023] A Figura 1D representa um gráfico do volume tumoral (mm3) de camundongos BALB/c implantados com células de carcinoma do cólon CT26/3E5 em função do tempo (dias). No Dia 12, os tumores foram medidos e foram dados aos camundongos 300 μg de anticorpo anti-PD-1 nos dias 12, 15 e 18 e 50 μg de rmIL-21 três vezes por semana durante 3 semanas. A dosagem terminou no Dia 33.

[0024] A Figura 2 representa um gráfico da percentagem de sobrevivência dos quatro grupos de camundongos BALB/c implantados com células de carcinoma do cólon CT26/3E5. Foi dada aos camundongos do grupo 1 uma injeção intraperitoneal (IP) de 300 μg de anticorpo de controle do isótipo (mIgG1) nos dias 12, 15 e 18. Foi dada aos camundongos do grupo 2 uma injeção IP de 300 μg de um anticorpo anti-PD-1 nos dias 12, 15 e 18. Foram dados aos camundongos do grupo 3 50 μg de rmIL-21 três vezes por semana durante 3 semanas. Foram dados aos camundongos do grupo 4 300 μg de anticorpo anti-PD-1 nos dias 12, 15 e 18 e 50 μg de rmIL-21 três vezes por semana durante 3 semanas. A administração de uma combinação de anti- PD-1 e rmIL-21 prolonga significativamente a sobrevivência em comparação com a monoterapia rmIL-21 ou anti-PD-1.

[0025] A Figura 3 é uma ilustração de uma hipótese do mecanismo de ação de uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo contra PD-1 bloqueador fundido a uma muteína de IL-21 (muteína de αPD-1:IL-21). Sem estar limitado por uma teoria particular se acredita que a fusão se liga a IL-21R em células T CD8+ enquanto bloqueia simultaneamente a transdução de sinal entre PD-1 e PD-L1.

[0026] A Figura 4A é uma ilustração de uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo anti-PD-1 fundido a um homodímero de muteína de IL-21. A proteína de fusão não tem um ligante. O anticorpo pode compreender regiões constantes que reduzem ou eliminam a ligação e funções efetoras associadas a Fc (p.ex., não têm a capacidade de interagir com receptores FCY (p.ex., SEFL2-2)).

[0027] A Figura 4B é uma ilustração de uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo anti-PD-1 fundido a um homodímero de muteína de IL-21. A proteína de fusão pode compreender um ligante de GGGGS (G4S) entre a região constante de cadeia pesada do anticorpo e a muteína de IL- 21. O anticorpo pode também compreender modificações de SEFL2-2.

[0028] A Figura 4C é uma ilustração de uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo anti-PD-1 fundido a um monômero de muteína de IL-21. A proteína de fusão pode compreender um ligante de G4S entre a região constante de cadeia pesada do anticorpo e a muteína de IL-21. As cadeias pesadas do anticorpo compreendem mutações de pares de carga (cpm; p.ex., V1, V4, V103 ou V131) para auxiliar na associação preferencial de regiões Fc de heterodímero. O anticorpo pode também compreender modificações de SEFL2-2.

[0029] A Figura 5A representa um gráfico da sinalização de STAT3 em células T Hut78 PD-1-vas expostas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sozinha (linha sólida com círculos fechados), (ii) mAb anti-PD-1 sozinho (linha sólida com diamantes fechados), (iii) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL-21 sem ligante (linha sólida com triângulos fechados), (iv) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL- 21 com ligante (linha tracejada com triângulos abertos), (v) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL-21 sem ligante (linha sólida com quadrados fechados) ou (vi) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL-21 com um ligante (linha tracejada com quadrados abertos).

[0030] A Figura 5B representa um gráfico da sinalização de STAT3 em células T Hut78 PD-1+vas expostas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sozinha (linha sólida com círculos fechados), (ii) mAb anti-PD-1 sozinho (linha sólida com diamantes fechados), (iii) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL-21 sem ligante (linha sólida com triângulos fechados), (iv) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL- 21 com um ligante (linha tracejada com triângulos abertos), (v) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL-21 sem um ligante (linha sólida com quadrados fechados) ou (vi) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL-21 com um ligante (linha tracejada com quadrados abertos).

[0031] A Figura 6 representa um gráfico das concentrações no soro de uma proteína de fusão de homodímero compreendendo IL-21 WT fundida a um mAb anti-PD-1 que foi intravenosamente administrada a 6 animais a uma baixa dose (250 μg/kg) ou uma elevada dose (1000 μg/kg). Um domínio de anticorpo de IgG (150 μg/kg) foi operado como um controle.

[0032] A Figura 7 representa um gráfico da redução de vezes na atividade de IL-21 (em relação à atividade de rhIL- 21) por células Hut78 PD-1-vas (barras abertas) ou células Hut78 PD-1+vas (barras fechadas) expostas a muteínas de IL-21 com afinidade reduzida por IL-21Rα.

[0033] A Figura 8 representa um gráfico da redução de vezes na atividade de IL-21 (em relação à atividade de rhIL- 21) por células Hut78 PD-1-vas (barras abertas) ou células Hut78 PD-1+vas (barras fechadas) expostas a muteínas de IL-21 com afinidade reduzida por IL-21RY.

[0034] A Figura 9A representa um gráfico da sinalização de STAT3 em células T Hut78 PD-1-vas expostas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sozinha (linha sólida com círculos fechados), (ii) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL-21 WT (linha tracejada com círculos abertos), (iii) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL- 21 WT (linha tracejada com círculos fechados) e (iv) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero 51 de muteína de IL-21 (R65P) (linha pontilhada com triângulos fechados).

[0035] A Figura 9B representa um gráfico da sinalização de STAT3 em células T Hut78 PD-1+vas expostas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sozinha (linha sólida com círculos fechados), (ii) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL-21 WT (linha tracejada com círculos abertos), (iii) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL- 21 WT (linha tracejada com círculos fechados) e (iv) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero 51 de muteína de IL-21 (R65P) (linha pontilhada com triângulos fechados).

[0036] A Figura 10 representa um gráfico das concentrações no soro de uma proteína de fusão compreendendo (i) um mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de muteína R76E de IL-21 (linha pontilhada com círculos fechados), (ii) um mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de muteína R76A de IL- 21 (linha tracejada com triângulos fechados), (iii) um mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de muteína D15N de IL-21 (linha tracejada com Xs), (iv) um anticorpo anti-PD-1 (8,25 mg/kg; linha tracejada com diamantes abertos) e (v) um mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de muteína de IL-21 WT (linha sólida com quadrados fechados).

[0037] A Figura 11 representa um gráfico da IL-2 (pg/mL) secretada pelas células de uma reação mista de linfócitos em função da concentração de anticorpo de (i) um anticorpo anti- PD-1 (linha sólida com círculos fechados), (ii ) uma proteína de fusão compreendendo homodímero de muteína dupla R5Q/R76E de IL-21 (linha tracejada com círculos abertos), (iii) uma combinação de mAb anti-PD-1 e rhIL-21 (linha pontilhada com quadrados abertos), (iv) uma proteína de fusão compreendendo homodímero de muteína simples R76E de IL-21 (quadrados fechados), (v) controle de IgG (linha pontilhada com diamantes abertos) e (vi) uma rhIL-21 (linha quebrada com triângulos abertos).

[0038] A Figura 12A representa um gráfico da mudança de vezes de sobre a intensidade de fluorescência média (MFI) da atividade de STAT3 de células expostas a (i) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R5E/R76A de IL-21 (linha com triângulos abertos), (ii) um controle de IgG1 (linha pontilhada com diamantes fechados), (iii) rhIL-21 (linha tracejada com quadrados abertos), (iv) um mAb anti- PD-1 (linha sólida com ovais abertos), (v) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD-1 (linha tracejada com ovais fechados) ou (vi) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína simples R76E de IL-21 (linha com diamantes abertos).

[0039] A Figura 12B representa um gráfico da mudança de vezes de sobre a MFI da atividade de STAT3 de células expostas a (i) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R5Q/R76E de IL-21 (linha com triângulos abertos), (ii) um controle de IgG1 (linha pontilhada com diamantes fechados), (iii) rhIL-21 (linha tracejada com quadrados abertos), (iv) um mAb anti-PD-1 (linha sólida com ovais abertos), (v) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD- 1 (linha tracejada com ovais fechados) ou (vi) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína simples R76E de IL-21 (linha com diamantes abertos).

[0040] A Figura 12C representa um gráfico da mudança de vezes de sobre a MFI da atividade de STAT3 de células expostas a (i) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R9E/R76A de IL-21 (linha com triângulos abertos), (ii) um controle de IgG1 (linha pontilhada com diamantes fechados), (iii) rhIL-21 (linha tracejada com quadrados abertos), (iv) um mAb anti-PD-1 (linha sólida com ovais abertos), (v) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD- 1 (linha tracejada com ovais fechados) ou (vi) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína simples R76E de IL-21 (linha com diamantes abertos).

[0041] A Figura 13A representa um gráfico da % de lise específica por CTLs (eixo dos y) vs. razões entre células efetoras e alvo (eixo dos x) expostas a (i) rhIL-21 (linha sólida com círculos fechados), (ii) anticorpo de controle hIgG4 (linha tracejada com círculos abertos), (iii) mAb anti- PD-1 (linha tracejada com triângulos fechados), (iv) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD-1 (linha pontilhada com triângulos abertos) ou (v) uma proteína de fusão compreendendo R5E/R76A de IL-21 (linha quebrada com Xs).

[0042] A Figura 13B representa um gráfico da % de lise específica por CTLs expostos a (i) rhIL-21 (linha sólida com círculos fechados), (ii) anticorpo de controle hIgG4 (linha tracejada com círculos abertos), (iii) mAb anti-PD-1 (linha tracejada com triângulos fechados), (iv) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD-1 (linha pontilhada com triângulos abertos) ou (v) uma proteína de fusão compreendendo R5Q/R76E de IL-21 (linha quebrada com Xs).

[0043] A Figura 13C representa um gráfico da % de lise específica por CTLs expostos a (i) rhIL-21 (linha sólida com círculos fechados), (ii) anticorpo de controle hIgG4 (linha tracejada com círculos abertos), (iii) mAb anti-PD-1 (linha tracejada com triângulos fechados), (iv) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD-1 (linha pontilhada com triângulos abertos) ou (v) uma proteína de fusão compreendendo R9E/R76A de IL-21 (linha quebrada com Xs).

[0044] A Figura 14 representa concentrações no soro de (i) mAb anti-PD-1 (linha sólida com quadrados fechados), (ii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um homodímero R5Q/R76E de IL-21 (linha sólida com círculos), (iii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um homodímero R76E de IL-21 (linha sólida), (iv) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um homodímero R5E/R76A de IL-21 (linha tracejada com Xs), (v) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um homodímero R76A de IL-21 (linha tracejada com diamantes fechados) ou (vi) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um monômero R76E de IL-21 (linha sólida com triângulos fechados).

[0045] A Figura 15A representa uma linha temporal da amostragem de células (setas abertas) e das administrações (setas fechadas).

[0046] A Figura 15B representa um gráfico da mudança de vezes em células PD-1+/CD4+ (em relação ao Dia -5) como medido no Dia 7 em animais aos quais foi dada uma dose de (i) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e uma muteína R76E de IL-21 (barra com linhas horizontais), (ii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um monômero de muteína simples R76E de IL-21 (barra com linhas verticais) ou (iii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um homodímero de muteína dupla R5Q/R76E de IL-21 (barra aberta) (cada uma administrada no Dia 0).

[0047] A Figura 15C representa um gráfico da mudança de vezes em células PD-1+/CD8+ (em relação ao Dia -5) como medido no Dia 7 em animais aos quais foi dada uma dose de (i) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e uma muteína R76E de IL-21 (barra com linhas horizontais), (ii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um monômero de muteína simples R76E de IL-21 (barra com linhas verticais) ou (iii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um homodímero de muteína dupla R5Q/R76E de IL-21 (barra aberta) (cada uma administrada no Dia 0).

[0048] A Figura 15D representa um gráfico da mudança de vezes em células PD-1+/CD8+ (em relação ao Dia -5) como medido no Dia 21 em animais aos quais foi dada uma primeira dose de (i) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e uma muteína R76E de IL-21 (barra com linhas horizontais), (ii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um monômero de muteína simples R76E de IL-21 (barra com linhas verticais) ou (iii) uma proteína de fusão compreendendo mAb anti-PD-1 e um homodímero de muteína dupla R5Q/R76E de IL- 21 (barra aberta) (primeira dose administrada no Dia 0 e segunda dose administrada no Dia 8).

[0049] A Figura 16 representa um gráfico da expansão de células PD-1+/CD8+ (em relação ao Dia -5) em função da ocupância do receptor (RO) de PD-1 em células PD-1+/CD8+. Os mutantes simples de IL-21 (801, 802, 807 e 808) são mostrados dentro do círculo azul e os mutantes duplos de IL-21 (803, 804, 805 e 806) são mostrados no círculo rosa. Estes dados demonstram que propriedades farmacocinéticas superiores dos mutantes duplos permitem melhor abrangência alvo e se correlacionam com melhores respostas farmacodinâmicas, como medido por expansão da população alvo PD-1+. A linha azul indica a delineação geral entre mutantes simples e duplos.

[0050] A Figura 17 representa representações gráficas de fluxo de animais individuais tratados com construtos de homodímero mutante simples (animais 801 e 802), construtos de homodímero mutante duplo (animais 803 - 806) ou construtos monoméricas de mutante simples (animais 807 e 808). Células T PD-1+ foram detectadas por anticorpo de detecção não competidor ou competidor. A percentagem de abrangência alvo é calculada como uma percentagem da razão entre anticorpo contra PD-1 competidor e não competidor. Os dados mostram que todos os construtos demonstram abrangência alvo robusta após dosagem repetida no Dia 21.

[0051] A Figura 18A representa um gráfico da mudança de vezes (em relação a rhIL-21 (linha sólida com Xs circulados)) da atividade de STAT3 de células T Hut78 PD-1-vas expostas a uma proteína de fusão compreendendo um de dez mAbs anti-PD- 1 diferentes e um homodímero de muteína R5Q/R76E de IL-21. Os dez mAbs anti-PD-1 de teste incluíram 20A2.003 (linha com diamantes), 20C1.006 (quadrado vermelho), 20C1.009 (linha com triângulos) e 22D4.006 (linha com círculos abertos).

[0052] A Figura 18B representa um gráfico da mudança de vezes (em relação a rhIL-21 (linha sólida com Xs circulados)) da atividade de STAT3 de células T Hut78 PD-1+vas expostas a uma proteína de fusão compreendendo um de dez mAbs anti-PD- 1 diferentes e um homodímero de muteína R5Q/R76E de IL-21. Os dez mAbs anti-PD-1 de teste incluíram 20A2.003 (linha com diamantes), 20C1.006 (quadrado vermelho), 20C1.009 (linha com triângulos) e 22D4.006 (linha com círculos abertos). A comparação da Figura 18A com a Figura 18B indica que o direcionamento de PD-1 necessário para a sinalização de pSTAT3 e que a atividade das muteínas é similar quando fundida a diferentes mAbs anti-PD-1.

[0053] A Figura 19A representa um gráfico da mudança de vezes (em relação a rhIL-21 (linha sólida com Xs circulados)) da atividade de STAT3 de células T Hut78 PD-1-vas expostas a uma proteína de fusão compreendendo um de sete mAbs anti-PD- 1 diferentes e um homodímero de muteína R9E/R76A de IL-21. Os sete mAbs anti-PD-1 de teste incluíram 20A2.003 (linha com triângulos abertos), 20C1.006 (linha com quadrados abertos), 20C1.009 (linha com diamantes abertos) e 22D4.006 (linha com círculos abertos).

[0054] A Figura 19B representa um gráfico da mudança de vezes (em relação a rhIL-21 (linha sólida com Xs circulados)) da atividade de STAT3 de células T Hut78 PD-1+vas expostas a uma proteína de fusão compreendendo um de sete mAbs anti-PD- 1 diferentes e um homodímero de muteína R9E/R76A de IL-21. A comparação da Figura 19A com a Figura 19B indica que o direcionamento de PD-1 necessário para a sinalização de pSTAT3 e que a atividade das muteínas é similar quando fundida a diferentes mAbs anti-PD-1. Os sete mAbs anti-PD-1 de teste incluíram 20A2.003 (linha com triângulos abertos), 20C1.006 (linha com quadrados abertos), 20C1.009 (linha com diamantes abertos) e 22D4.006 (linha com círculos abertos).

[0055] As Figuras 20A-20D representam a quantidade de sinalização de pSTAT3 observada com várias fusões mAb anti- PD-1 - muteína dupla monomérica ou dimérica de IL-21. A linha sólida com círculos fechados (topo dos gráficos) é rhIL-21; a linha tracejada com círculos abertos (fundo dos gráficos) é controle de IgG1; a linha com Xs (fundo dos gráficos) é controle de IgG2; a linha pontilhada com quadrados fechados (fundo dos gráficos) é o mAb anti-PD-1 22D4.006 (presente como mAb; i.e., não como uma fusão) usado nas fusões de muteína de IL-21; a linha tracejada com quadrados abertos e a linha pontilhada com diamantes abertos (fundo dos gráficos) são mAbs anti-PD-1 de controle; as linhas restantes são fusões mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteína dupla monomérica ou dimérica de IL-21 (com várias mutações de pares de carga) em que os mutantes duplos são R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E ou R5Q/R76E. rhIL-21 demonstra atividade em células tanto PD-1-vas como PD-1+vas, as fusões de muteína dupla monoméricas e homodiméricas são incapazes de demonstrar atividade de pSTAT3 (à base de IL-21) em células PD-1-vas, e as fusões de muteína dupla monoméricas e homodiméricas são capazes de demonstrar atividade de pSTAT3 (à base de IL-21) em células PD-1+vas. Assim, as fusões monoméricas com mutantes duplos de IL-21 exibem níveis similares de atenuação da atividade de IL-21 em células PD-1-vas e resgate da atividade de IL-21 em células PD-1+vas que as suas fusões diméricas em contrapartida. As Figuras 20A e 20B são operações em duplicado do ensaio de pSTAT3 em células PD-1-vas. As Figuras 20C e 20D são operações em duplicado do ensaio de pSTAT3 em células PD-1+vas.

[0056] As Figuras 21A-21D representam os resultados de um ensaio de gene repórter de PD-1 (RGA; Figuras 21A e 21B) e ensaio de MLR (Figuras 21C e 21D) com as mesmas fusões mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteína dupla monomérica ou dimérica de IL-21 avaliadas nas Figuras 20A-20D. As Figuras 21A-21D demonstram que as fusões mAb anti-PD-1 (22D4.006) - muteína dupla monomérica e dimérica de IL-21 são capazes de induzir a atividade de PD-1. A linha sólida com círculos fechados (fundo dos gráficos) é rhIL-21; a linha com círculos abertos (fundo dos gráficos) é controle de IgG1; a linha com Xs (fundo dos gráficos) é controle de IgG2; a linha tracejada com quadrados fechados (topo dos gráficos) é o mAb anti-PD- 1 22D4.006 (presente como mAb; i.e., não como uma fusão) usado nas fusões de muteína de IL-21; a linha tracejada com quadrados abertos e a linha pontilhada com diamantes abertos (topo dos gráficos) são mAbs anti-PD-1 de controle; as linhas restantes são fusões mAb anti-PD-1 - muteína dupla monomérica ou dimérica de IL-21. As Figuras 21A e 21B são operações em duplicado do ensaio de RGA de PD-1. As Figuras 20C e 20D são operações em duplicado do ensaio de MLR.

[0057] As Figuras 22A-22D representam os resultados de ensaios de pSTAT3 testando os mesmos construtos que aqueles nas Figuras 20A-20D, exceto que um mAb anti-PD-1 diferente (20A2.003) é usado nas fusões mAb anti-PD-1 — muteína dupla monomérica e dimérica de IL-21. Os resultados nas Figuras 22A-22D são similares àqueles vistos nas Figuras 20A-20D. A linha sólida com círculos fechados (topo dos gráficos) é rhIL-21; a linha tracejada com círculos abertos (fundo dos gráficos) é controle de IgG1; a linha com Xs (fundo dos gráficos) é controle de IgG2; a linha pontilhada com quadrados fechados (fundo dos gráficos) é o mAb anti-PD-1 20A2.003 (presente como mAb; i.e., não como uma fusão) usado nas fusões de muteína de IL-21; a linha tracejada com quadrados abertos e a linha pontilhada com diamantes abertos (fundo dos gráficos) são mAbs anti-PD-1 de controle; as linhas restantes são fusões mAb anti-PD-1 (20A2.003) - muteína dupla monomérica ou dimérica de IL-21 (com várias mutações de pares de carga) em que os mutantes duplos são R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E ou R5Q/R76E. As Figuras 22A e 22B são operações em duplicado do ensaio de pSTAT3 em células PD-1-vas. As Figuras 22C e 22D são operações em duplicado do ensaio de pSTAT3 em células PD-1+vas.

[0058] As Figuras 23A-23D representam os resultados de ensaios de gene repórter de PD-1 (Figuras 23A e 23B) e ensaios de MLR (Figuras 23C e 23D) testando os mesmos construtos que aqueles nas Figuras 21A-21D, exceto que um mAb anti-PD-1 diferente (20A2.003) é usado nas fusões mAb anti-PD-1 — muteína dupla monomérica e dimérica de IL-21. Os resultados nas Figuras 23A-23D são similares àqueles vistos nas Figuras 21A-21D. A linha sólida com círculos fechados (fundo dos gráficos) é rhIL-21; a linha tracejada com círculos abertos (fundo dos gráficos) é controle de IgG1; a linha com Xs (fundo dos gráficos) é controle de IgG2; a linha pontilhada (topo dos gráficos) é o mAb anti-PD-1 20A2.003 (presente como mAb; i.e., não como uma fusão) usado nas fusões de muteína de IL-21; a linha tracejada com quadrados abertos e a linha pontilhada com diamantes abertos (topo dos gráficos) são mAbs anti-PD-1 de controle; as linhas restantes são fusões mAb anti-PD-1 (20A2.003) - muteína dupla monomérica ou dimérica de IL-21. As Figuras 23A e 23B são operações em duplicado do ensaio de RGA de PD-1. As Figuras 23C e 23D são operações em duplicado do ensaio de MLR.

[0059] A Figura 24 representa um gráfico da atividade de NFAT/luciferase de anticorpos anti-PD-1 purificados em função da concentração de mAb.

[0060] A Figura 25A é um gráfico da mudança de vezes no número de células Ki67+/CD3+/CD4+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0061] A Figura 25B é um gráfico da mudança de vezes no número de células Ki67+/CD3+/CD8+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0062] A Figura 25C é um gráfico da mudança de vezes no número de células pSTAT3+/CD3+/CD4+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]- [R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0063] A Figura 25D é um gráfico da mudança de vezes no número de células pSTAT3+/CD3+/CD8+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]- [R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0064] A Figura 25E é um gráfico da mudança de vezes no número de células CD3+/CD4+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0065] A Figura 25F é um gráfico da mudança de vezes no número de células CD3+/CD8+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0066] A Figura 25G é um gráfico da mudança de vezes no número de células PD-1+/CD3+/CD4+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0067] A Figura 25H é um gráfico da mudança de vezes no número de células PD-1+/CD3+/C84+ em relação à linha de base após exposição à proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0068] A Figura 25I é um gráfico da mudança de vezes na quantidade de perforina no soro em relação à linha de base após 72 horas de exposição à proteína de fusão [22D4.017]- [R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0069] A Figura 25J é um gráfico da % de células Ki67+ em relação à linha de base em função do aumento de vezes na perforina após 72 horas de exposição à proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) ou ao anticorpo anti-PD-1 [22D4.017].

[0070] A Figura 26A é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada do anticorpo 22D4.017 pelo antígeno PD-1 humano.

[0071] A Figura 26B é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada do anticorpo 20C1.009 pelo antígeno PD-1 humano.

[0072] A Figura 26C é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada do anticorpo 20A2.003 pelo antígeno PD-1 humano.

[0073] A Figura 26D é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada de um mAb anti-PD-1 IgG1, pelo antígeno PD-1 humano.

[0074] A Figura 26E é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada de um mAb contra PD-1 IgG4 pelo antígeno PD-1 humano.

[0075] A Figura 26F é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada de 22D4.017 pelo antígeno PD-1 de cino.

[0076] A Figura 26G é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada do anticorpo 20C1.009 pelo antígeno PD-1 de cino.

[0077] A Figura 26H é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada de antibody 20A2.003 pelo antígeno PD-1 de cino.

[0078] A Figura 26I é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada de um mAb anti-PD-1 IgG1 pelo antígeno PD-1 de cino.

[0079] A Figura 26J é um gráfico da absorvância (nm) em função do tempo (seg) usado para se determinar a KD indicada de um mAb anti-PD-1 IgG4 pelo antígeno PD-1 de cino.

[0080] A Figura 27 é um gráfico da Cp (kcal/mol/°C) em função da temperatura para os anticorpos anti-PD-1 22D4.017 e 20C1.009.

[0081] A Figura 28 é um gráfico da viscosidade representada graficamente contra a taxa de cisalhamento para os anticorpos anti-PD-1 22D4.017 e 20C1.009.

[0082] As Figuras 29A-29D são uma série de gráficos representando graficamente o sinal em função da concentração de anticorpo em (Fig. 29A) uma linha de células T Hut78 variante que é positiva quanto a PD-1, (Fig. 29B) uma linha de células T Hut78 variante que é positiva quanto a TIGIT (Fig. 29C) uma linha de células T Hut78 variante que é positiva quanto a LAG3 e (Fig. 29D) a linha de células T Hut78 variante que não expressa endogenamente PD-1, TIGIT ou LAG3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0083] Pe rmanece uma necessidade de novas abordagens potencializadoras imunitárias que possam empregar o sistema imunitário contra células cancerosa de uma maneira segura e eficaz, especialmente à luz do fato de que as correntes abordagens de imunoterapia são eficazes somente em uma minoria de pacientes e podem ter toxicidades significativas e frequentemente imprevisíveis. Em um aspecto, a nova classe de moléculas de fusão bifuncionais compreendendo um anticorpo visando PD-1 que consegue bloquear a interação PD- 1/PD-L1, fundido a uma muteína de interleucina-21 com afinidade atenuada manipulada, divulgada aqui aborda esta necessidade. As fusões anticorpo/citocina descritas aqui ultrapassam barreiras significativas associadas aos terapêuticos com citocina, permitindo, inter alia, dosagem tipo anticorpo e distribuição seletiva da citocina IL-21 de uma maneira visada por PD-1. Quando fundidas a um anticorpo anti-PD-1, as muteínas de IL-21 conseguem ativar e expandir seletivamente células T expressando PD-1 in vivo. Conformemente, as fusões anticorpo/citocina descritas aqui podem melhorar e prolongar a utilidade de terapêuticos anti- PD-1 correntemente sob teste na clínica.

[0084] A combinação de citocina e agonistas ou antagonistas de receptores coinibidores permanece desafiante devido aos riscos de toxicidade incremental e à necessidade de desenho complexo de ensaios (ver, p.ex., Ott et al., J Immunother Cancer 5, 16 (2017); e Hermel et al., Cancer Metastasis Rev 36, 43-50 (2017)). No que diz respeito às citocinas existe também o potencial para a ativação de vias de feedback inibidoras que podem levar à supressão imunitária (ver, p.ex., Portielje et al., Clin Cancer Res 9, 76-83 (2003); Wan et al., Immunity 38, 514-527 (2013); e Mooradian et al., Oncoimmunology 7, e1423172 (2018)). A interleucina- 21 (IL-21) é uma citocina tipo I e um membro da família de citocinas de cadeia gama (cadeia cg) receptoras de citocinas comuns que tem emergido como um terapêutico imunitário promissor para o tratamento do câncer. A IL-21 é produzida por células T CD4 e células T matadoras naturais (NKT) e sinais através de um complexo receptor heterodimérico compreendido de uma subunidade do receptor de IL-21 (IL-21R) discreta que se associa à cadeia gama comum (ver, p.ex., Spolski et al., Nat Rev Drug Discov 13, 379-395 (2014)). A ativação do complexo IL-21R leva à ativação da via de sinalização de JAK/STAT. O IL-21R é amplamente expresso em células hematopoiéticas incluindo linfócitos T e B, células matadoras naturais (NK) e células mieloides. Embora não um fator de crescimento ou diferenciação essencial, a IL-21 é um mitógeno e fator de sobrevivência potente para células NK e células T ativadas. A IL-21 pode apoiar a diferenciação de T CD4(+) ajudante 17 (Th17) bem como células T ajudantes (Tfh) foliculares e pode antagonizar a diferenciação de células T reguladoras (Treg). Além do mais, a IL-21 pode aumentar a sobrevivência de células T CD8 e preserva um fenótipo de células T menos ativado mas mais persistente, o que permite controle tumoral e viral intensificado.

[0085] Um aspecto desafiante da imunoterapia com citocinas é que, adicionalmente à ativação de células imunitárias para potenciar respostas imunitárias, a mesma citocina pode também ativar vias contrarreguladoras. Por exemplo, IL-2 e IFNY que podem ativar respostas imunitárias protetoras bem como respostas de células T reguladoras e vias inibidoras (tais como PD-L1), respectivamente. Em células dendríticas (DCs), a IL-21 pode inibir tanto a maturação como a ativação de DC, pode induzir a apoptose de DCs convencionais, pode inibir potentemente a iniciação de células T em culturas mistas e pode desempenhar um papel na indução de tolerância. Em humanos, a IL-21 foi testada como uma citocina livre não visada em várias indicações de câncer mas, apesar dos dados pré-clínicos promissores e dados clínicos de fase I inicial, o desenvolvimento desta abordagem não tem progredido além de teste de fase II (ver, p.ex., Thompson et al., J Clin Oncol 26, 2034-2039 (2008); e Davis et al., Clin Cancer Res 15, 2123-2129 (2009)). Em modelos pré-clínicos mais recentes, a combinação de citocina IL-21 recombinante com antagonistas de receptores coinibidores (p.ex., anti-CTLA-4 e anti-PD-1) demonstrou que a IL-21 consegue prolongar a eficácia destes tratamentos. Tais combinações estão agora sob teste na clínica, embora a eficácia clínica ainda não tenha sido demonstrada (Lewis et al., Oncoimmunology 7, e1377873 (2017)).

[0086] Sem estar limitado por uma teoria, as fusões anticorpo/citocina descritas aqui são concebidas para utilizarem a atividade potencializadora imunitária da IL-21 (que pode ser pré-requisito para lidar com a toxicidade e a supressão imunitária fora do alvo), para maximizarem a eficácia e melhorarem a viabilidade de dosagem na clínica. IL-21 e muteínas de IL-21

[0087] A interleucina-21 (IL-21) é uma citocina expressa por células T, células B, células NK e células mieloides e regula a atividade de células imunitárias tanto inatas como adaptativas e melhora a sobrevivência e função efetora de células T. Vários ensaios clínicos de Fase I e II incluem IL-21 como o produto experimental para o tratamento de cânceres, doenças inflamatórias e doenças autoimunes, incluindo melanoma, carcinoma das células renais, leucemia mieloide aguda, linfoma de não Hodgkin, câncer do ovário, câncer colorretal, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn e artrite reumatoide.

[0088] A IL-21 tem uma estrutura de pacote de quatro hélices e existe como um monômero. Em humanos são conhecidas duas isoformas de IL-21, cada uma das quais é derivada de uma molécula precursora. A primeira isoforma de IL-21 compreende 162 aminoácidos (aa), os primeiros 29 dos quais constituem o peptídeo-sinal; e a segunda isoforma de IL-21 compreende 153 aa, os primeiros 29 dos quais constituem o peptídeo-sinal como na primeira isoforma. As sequências de aminoácidos das primeira e segunda isoformas de IL-21 (incluindo o peptídeo-sinal) são proporcionadas aqui como SEQ ID NO: 258 e SEQ ID NO: 259, respectivamente.

[0089] A IL-21 se liga ao receptor de IL-21 (IL-21R) heterodimérico expresso na superfície de células T, B e NK. O IL-21R é similar em estrutura ao receptor de IL-2 e ao receptor de IL-15, na medida em que cada um destes receptores de citocina compreende uma cadeia gama (yc) comum. Adicionalmente à YC, o IL-21R compreende uma cadeia alfa que é importante para a ligação a IL-21. Existem duas isoformas da cadeia alfa do receptor de IL-21 humano: isoforma 1 e isoforma 2. As sequências de aminoácidos da isoforma 1 e isoforma 2 são proporcionadas aqui como SEQ ID NOs: 256 e 261, respectivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia gama comum humana é proporcionada aqui como SEQ ID NO: 257.

[0090] Quando IL-21 se liga a IL-21R, a via de sinalização de Jak/STAT é ativada para ativar genes alvo. Embora a sinalização induzida por IL-21 pode ser terapeuticamente desejável é necessária consideração cuidadosa do momento e da localização da sinalização, dado o amplo perfil de expressão de IL-21 e devido ao fato de que a IL-21 tem a capacidade de potenciar as respostas de células T CD8 bem como de suprimir a apresentação de antígenos e iniciação de células T. Os dados apresentados aqui apoiam pela primeira vez o uso de muteínas de IL-21 cuidadosamente concebidas para se alcançar sinalização de IL-21 no momento e local apropriados.

[0091] A presente divulgação proporciona muteínas de IL- 21 compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, que é proporcionada aqui como SEQ ID NO: 1. Por exemplo, a muteína de IL-21 compreende pelo menos uma e não mais do que 34 substituições de aminoácidos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende pelo menos uma e não mais do que X substituições de aminoácidos, em que X é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34. Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em não mais do que 10 aminoácidos, 15 aminoácidos, 20 aminoácidos ou 25 aminoácidos. Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em não mais do que 7 aminoácidos ou não mais do que 5 aminoácidos. Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos. Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em 3 a 6 aminoácidos ou 1 a 5 aminoácidos. Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em um ou dois aminoácidos.

[0092] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que SEQ ID NO: 2 é QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2), em que X representa qualquer aminoácido, e em que a sequência de aminoácidos de muteína de IL-21 difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em pelo menos 1 aminoácido.

[0093] Assim, em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende a sequência de SEQ ID NO: 2, em que SEQ ID NO: 2 difere de SEQ ID NO: 1 em pelo menos um aminoácido em uma posição designada por X em SEQ ID NO: 2. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreendendo SEQ ID NO: 2 tem pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que é menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1.

[0094] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, e a(s) substituição(ões) de aminoácidos ocorre(m) dentro da metade N-terminal da sequência de aminoácidos. Por exemplo, a(s) substituição(ões) ocorre(m) em uma posição dentro das posições 5-25 ou 8-23 (ambas inclusive), de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0095] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, e a(s) substituição(ões) de aminoácidos ocorre(m) dentro da metade C-terminal da sequência de aminoácidos. Por exemplo, a(s) substituição(ões) ocorre(m) em uma posição dentro das posições 100-133 ou 109-123 (ambas inclusive), de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0096] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, e a(s) substituição(ões) de aminoácidos ocorre(m) no terço do meio da sequência de aminoácidos. Por exemplo, a(s) substituição(ões) ocorre(m) em uma posição dentro das posições 55-85 ou 65-80 (ambas inclusive), de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0097] A presente divulgação proporciona também muteínas de IL-21 compreendendo somente uma substituição de aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, que é proporcionada aqui como SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, a substituição de aminoácidos está localizada em uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, ou 123, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em outros aspectos exemplificativos, a substituição de aminoácidos está localizada em uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, ou 123, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Ainda em outros aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3-21 e 23-37.

[0098] A presente divulgação proporciona adicionalmente muteínas de IL-21 compreendendo somente duas substituições de aminoácidos, em relação a SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, as substituições de aminoácidos estão localizadas em dois posições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, ou 123, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em outros aspectos exemplificativos, as substituições de aminoácidos estão localizadas em dois posições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: 5, 9, 15, 70, 71, 72, 73, e 76, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Ainda em outros aspectos exemplificativos, as substituições de aminoácidos estão localizadas em dois posições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: 5, 9, 73 e 76, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, pelo menos uma das duas substituições de aminoácidos está localizada na posição 76, de acordo com a numeração das posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 199-208 e 210-212.

[0099] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, e a(s) substituição(ões) de aminoácidos é/são substituição(ões) de aminoácidos conservativa(s). Como usado aqui, o termo “substituição de aminoácidos conservativa” se refere à substituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo propriedades similares, p.ex., tamanho, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou aromaticidade, e inclui permutas dentro de um dos seguintes cinco grupos: I. Pequenos resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Resíduos negativamente carregados, polares e suas amidas e ésteres: Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico e ácido homocisteico; III. Resíduos positivamente carregados, polares: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn) IV. Grandes resíduos não polares, alifáticos: Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína V. Grandes resíduos aromáticos: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina.

[00100] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, e a(s) substituição(ões) de aminoácidos é/são substituição(ões) de aminoácidos não conservativa(s). Como usado aqui, o termo “substituição de aminoácidos não conservativa” é definido aqui como a substituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo propriedades diferentes, p.ex., tamanho, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou aromaticidade, e inclui permutas fora dos cinco grupos acima:

[00101] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, e o aminoácido substituto é um aminoácido ocorrendo naturalmente. Por “aminoácido ocorrendo naturalmente” ou “aminoácido padrão” ou “aminoácido canônico” se entende um dos 20 aminoácidos alfa encontrados em eucariotas codificados diretamente pelos códons do código genético universal (Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Arg, His, Lys, Asp, Glu). Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 de tipo selvagem, e o aminoácido substituto é um aminoácido não padrão ou um aminoácido que não está incorporado em proteínas durante a tradução. Os aminoácidos não padrão incluem, mas não estão limitados a: selenocisteína, pirrolisina, ornitina, norleucina, e-aminoácidos (p.ex., β-alanina, ácido β- aminoisobutírico, β-fenilalanina, β-homofenilalanina, ácido e—glutâmico, β-glutamina, β-homotriptofano, β-leucina, β- lisina), homo-aminoácidos (p.ex., homofenilalanina, homosserina, homoarginina, monocisteína, homocistina), N- metil aminoácidos (p.ex., L-abrina, N-metil-alanina, N- metil-isoleucina, N-metil-leucina), ácido 2-aminocaprílico, ácido 7-aminocefalosporânico, ácido 4-aminocinâmico, ácido alfa-aminociclo-hexanopropiônico, ácido amino-(4- hidroxifenil)acético, ácido 4-amino-nicotínico, ácido 3- aminofenilacético e similares.

[00102] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos é em uma ou mais das posições 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116, e 119 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são aminoácidos alifáticos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, a substituição de aminoácidos é na posição 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116, ou 119 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido alifático.

[00103] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos é em uma ou mais das posições 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120, ou 123 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são aminoácidos ácidos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, a substituição de aminoácidos é na posição 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120, ou 123 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido ácido.

[00104] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos é em uma ou mais das posições 5, 9, 73, 76, 109, 113, ou 116 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são aminoácidos básicos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, e o aminoácido na posição 5, 9, 73, 76, 109, 113 ou 116 de SEQ ID NO: 1 é um aminoácido básico.

[00105] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos é em uma ou mais das posições 5, 8, 9, 70 ou 76 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são aminoácidos aromáticos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, a substituição de aminoácidos é na posição 5, 8, 9, 70 ou 76 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido aromático.

[00106] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos é em uma ou mais das posições 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116, ou 119 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são aminoácidos compreendendo uma amida de cadeia lateral. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, a substituição de aminoácidos é na posição 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116, ou 119 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido compreendendo uma amida de cadeia lateral.

[00107] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos é em uma ou mais das posições 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116, ou 119 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são aminoácidos compreendendo uma hidroxila de cadeia lateral. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, a substituição de aminoácidos é na posição 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116, ou 119 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido compreendendo uma hidroxila de cadeia lateral.

[00108] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos é em uma ou mais das posições 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, ou 80 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são iminoácidos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL- 21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, a substituição de aminoácidos é na posição 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, ou 80 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido compreendendo um iminoácido.

[00109] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), a substituição de aminoácidos em uma ou mais das posições 5, 9, 15, 76, 116 ou 119 de SEQ ID NO: 1, e o(s) aminoácido(s) substituto(s) é/são aminoácidos compreendendo uma cadeia lateral contendo enxofre. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, a substituição de aminoácidos é na posição 5, 9, 15, 76, 116 ou 119 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral contendo enxofre.

[00110] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1), em que a pelo menos uma substituição de aminoácidos é mostrada na Tabela A. TABELA A

[00111] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com somente uma substituição de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, e a substituição de aminoácidos é uma mostrada na Tabela A. Em outras modalidades, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos com duas substituições de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1, e as substituições de aminoácidos são duas daquelas mostradas na Tabela A.

[00112] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na Tabela B. TABELA B

[00113] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 47, 48, 51, 61, 62, 64-67, 69, 71-112, 114-198, 249-254, ou 283. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que é menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 47, 48, 51, 61, 62, 64-67, 69, 71-112, 114-198, 249-254, ou 283.

[00114] A presente divulgação proporciona adicionalmente muteínas de IL-21 compreendendo somente duas substituições de aminoácidos, em relação a SEQ ID NO: 1, e as duas substituições de aminoácidos ocorrem em duas das posições 5, 9, 15, 70, 71, 72, 73, e 76 de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende somente duas substituições de aminoácidos, em relação a SEQ ID NO: 1, e as duas substituições ocorrem em um par de posições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: 5 e 76; 9 e 76; 15 e 70; 15 e 71; 15 e 72; 15 e 73; 70 e 73; 70 e 76; 71 e 73; 71 e 76; 72 e 73; 72 e 76; e 73 e 76. Em aspectos exemplificativos, a IL-21 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 199-208 e 210-212. Em outros aspectos, a presente divulgação proporciona adicionalmente muteínas de IL-21 compreendendo somente duas substituições de aminoácidos, em relação a SEQ ID NO: 1, e as duas substituições de aminoácidos ocorrem em duas das posições 5, 9, 73 e 76 de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, uma das substituições ocorre na posição 76 de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, o aminoácido substituído na posição 76 de SEQ ID NO: 1 é um aminoácido alifático ou um aminoácido ácido. Em aspectos exemplificativos, o aminoácido alifático é alanina. Em aspectos exemplificativos, o aminoácido ácido é ácido aspártico ou ácido glutâmico. Em aspectos exemplificativos, o aminoácido ácido é ácido glutâmico. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende um aminoácido substituto na posição 76 e um aminoácido alifático ou aminoácido ácido na posição 5, 9 ou 73 de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, o aminoácido substituto na posição 5, 9 ou 73 é um aminoácido alifático, um aminoácido ácido ou um aminoácido com uma amida de cadeia lateral. Em aspectos exemplificativos, o aminoácido alifático é alanina, o aminoácido ácido é ácido glutâmico e o aminoácido com uma amida de cadeia lateral é glutamina. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende um aminoácido substituído na posição 76 de SEQ ID NO: 1 (opcionalmente, um aminoácido alifático ou um aminoácido ácido) e um aminoácido substituto na posição 5 ou 9 (de acordo com a numeração de SEQ ID NO: 1).

[00115] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: mostradas na Tabela C. TABELA C

[00116] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 213-219 e 227-248. Em aspectos exemplificativos, a IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que é menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 213-219 e 227-248.

Comprimento de Peptídeos

[00117] As muteínas de IL-21 descritas aqui podem compreender um esqueleto de peptídeo de qualquer número de aminoácidos, i.e., pode ter qualquer comprimento de peptídeos. Em algumas modalidades, os peptídeos descritos aqui têm cerca do mesmo comprimento que SEQ ID NO: 1, i.e., têm 133 (± cerca de 1 a cerca de 20, ± cerca de 1 a cerca de 15, ± cerca de 1 a cerca de 10 ou ± cerca de 1 a cerca de 5) de aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades, o peptídeo presentemente divulgado tem mais do que 133 aminoácidos em comprimento em virtude de estar fundido a outra cadeia de polipeptídeo, p.ex., uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo cerca de 400 a cerca de 600 aminoácidos, uma cadeia leve de anticorpo compreendendo cerca de 150 a cerca de 300 aminoácidos, como adicionalmente descrito aqui.

Modificações de peptídeos adicionais

[00118] Em modalidades alternativas ou adicionais da presente divulgação, a muteína de IL-21 está lipidada (p.ex., miritoilada, palmitoilada), glicosilada, amidada, carboxilada, fosforilada, esterificada, acilada, acetilada, ciclizada ou convertida em um sal de adição de ácidos e/ou opcionalmente dimerizada ou polimerizada ou conjugada, como adicionalmente descrito aqui.

Sais farmaceuticamente aceitáveis

[00119] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está na forma de um sal, p.ex., um sal farmaceuticamente aceitável. Tais sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais da muteína de IL-21 ou separadamente preparados por reação de uma função de base livre com um ácido adequado. Exemplos de ácidos que podem ser empregues para formar sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, um ácido inorgânico, p.ex., ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, e um ácido orgânico, p.ex., ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico e ácido cítrico.

[00120] Sais de adição de ácidos representativos incluem, mas não estão limitados a, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, canforato, canforassulfonato, digluconato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hidrocloreto, hidrobrometo, hidroiodeto, 2- hidroxietanossulfonato (isotionato), lactato, maleato, metanossulfonato, nicotinato, 2-naftalenossulfonato, oxalato, palmitoato, pectinato, persulfato, 3- fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p- toluenossulfonato e undecanoato.

[00121] Os sais de adição básica podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais da muteína de IL-21 ou por reação de uma fração contendo ácido carboxílico com uma base adequada tal como o hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um cátion de metal farmaceuticamente aceitável ou com amônia ou uma amina primária, secundária ou terciária orgânica. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, cátions baseados em metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos tais como sais de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio e similares e amônia quaternária não tóxica e cátions de amina incluindo amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamônio, dimetilamônio, trimetilamônio, trietilamônio, dietilamônio e etilamônio, entre outros. Outras aminas orgânicas representativas úteis para a formação de sais de adição de bases incluem, por exemplo, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina e similares.

[00122] Adi cionalmente, grupos contendo nitrogênio básico podem ser quaternizados com tais agentes ativos como haletos de alquila inferior tais como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e butila; haletos de cadeia longa tais como cloretos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila; haletos de arilalquila como brometos de benzila e fenetila e outros. Produtos solúveis ou dispersíveis em água ou óleo são deste modo obtidos.

Purificação

[00123] As muteínas de IL-21 da presente divulgação podem ser purificadas. O termo “purificado” como usado aqui significa ter sido aumentado em pureza, em que “pureza” é um termo relativo e não é para ser necessariamente interpretado como pureza absoluta. Em aspectos exemplificativos, a pureza do composto (p.ex., na composição) é pelo menos ou cerca de 50%, pelo menos ou cerca de 60%, pelo menos ou cerca de 70%, pelo menos ou cerca de 80%, pelo menos ou cerca de 90%, pelo menos ou cerca de 95% ou pelo menos ou cerca de 98% ou é cerca de 100%.

Peptidomiméticos

[00124] Em alguns aspectos, a muteína de IL-21 é um peptidomimético, ou pelo menos uma porção da muteína é peptidomimética. Os peptidomiméticos bem como métodos de fabricação dos mesmos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, Volumes 1 e 2, ed., Abell, A., JAI Press Inc., Greenwich, CT, 2006. Em alguns aspectos, o peptidomimético é um peptidomimético de D-peptídeo compreendendo aminoácidos de D-isômero. Em alguns aspectos, o peptidomimético é um peptoide no qual a cadeia lateral de um aminoácido está conetada ao átomo de nitrogênio alfa do esqueleto de peptídeo. Métodos de fabricação de peptoides são conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Zuckermann et al., JACS 114 (26): 10646-10647 (1992) e Design, Synthesis, and Evaluation of Novel Peptoids, Fowler, Sarah, University of Wisconsin-Madison, 2008. Em alguns aspectos, o peptidomimético é um β-peptideo compreendendo e-aminoácidos que têm seu grupo amino ligado ao β-cargon em vez do carbono alfa. Métodos de fabricação de e-peptídeos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Seebach et al., Helvetica Chimica Acta 79(4): 913-941 (1996).

Características de Ligação

[00125] Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam ao receptor de IL-21 (IL-21R) com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 de tipo selvagem pelo IL-21R. Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam ao IL-21R humano com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 humana de tipo selvagem pelo IL-21R humano. Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam à cadeia alfa do IL-21R humano com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 humana de tipo selvagem pela cadeia alfa do IL-21R humano. Em modalidades específicas, as muteínas de IL-21 que se ligam à cadeia alfa do IL-21R humano com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade da IL-21 humana de tipo selvagem pela cadeia alfa do IL-21R humano, contêm uma, duas ou mais substituições localizadas em uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, e 80, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Substituições de aminoácidos específicas que podem ser feitas em tais posições são discutidas aqui (ver, p.ex., Tabelas A, B e C).

[00126] Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam à cadeia gama do IL-21R humano com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 humana de tipo selvagem pela cadeia gama do IL-21R humano. Em modalidades específicas, as muteínas de IL-21 que se ligam à cadeia gama do IL-21R humano com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade da IL-21 humana de tipo selvagem pela cadeia gama do IL-21R humano, contêm uma, duas ou mais substituições localizadas em uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: 11, 14, 15, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 e 123, de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Substituições de aminoácidos específicas que podem ser feitas em tais posições são discutidas aqui (ver, p.ex., Tabelas A, B e C).

[00127] Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam à cadeia gama do IL-21R humano com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 humana de tipo selvagem pela cadeia alfa do IL-21R humano. Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam ao IL-21R de macaco-cinomólogo com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 de cinomólogo de tipo selvagem pelo IL-21R de cinomólogo. Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam à cadeia alfa do IL-21R de macaco-cinomólogo com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 de cinomólogo de tipo selvagem pela cadeia alfa do IL-21R de cinomólogo. Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam à cadeia gama do IL-21R de macaco-cinomólogo com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 de cinomólogo de tipo selvagem pela cadeia gama do IL-21R de cinomólogo. Em modalidades exemplificativas, as muteínas de IL-21 se ligam à cadeia gama do IL-21R de macaco-cinomólogo com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 de cinomólogo de tipo selvagem pela cadeia alfa do IL-21R de cinomólogo.

[00128] As muteínas de IL-21 proporcionadas aqui se ligam a IL-21R de uma maneira não covalente e reversível. Em modalidades exemplificativas, a força de ligação das muteínas ao IL-21R pode ser descrita em termos da sua afinidade, uma medida da força de interação entre o local de ligação da muteína e o IL-21R. Em aspectos exemplificativos, as muteínas de IL-21 proporcionadas aqui têm elevada afinidade por IL-21R e assim se ligarão a uma quantidade maior de IL-21R em um período de tempo mais curto do que as muteínas de IL-21 de baixa afinidade. Em aspectos exemplificativos, as muteínas de IL-21 proporcionadas aqui têm baixa afinidade por IL-21R e assim se ligarão a uma quantidade menor de IL-21R em um período de tempo mais longo do que as muteínas de IL-21 de elevada afinidade. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 tem uma constante de associação em equilíbrio, KA, que é pelo menos 105 M-1, pelo menos 106 M-1, pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 109 M-1 ou pelo menos 1010 M-1. Como entendido pelo especialista perito, a KA pode ser influenciada por fatores incluindo pH, temperatura e composição de tampão.

[00129] Em modalidades exemplificativas, a força de ligação da muteína de IL-21 a IL-21R pode ser descrita em termos da sua sensibilidade. KD é a constante de dissociação em equilíbrio, uma razão de koff/kon, entre a muteína de IL- 21 e IL-21R. KD e KA estão inversamente relacionadas. O valor de KD se relaciona com a concentração da muteína (a quantidade de muteína necessária para uma experiência particular) e logo quanto menor o valor de KD (menos concentração necessária), mais elevada a afinidade da muteína. Em aspectos exemplificativos, a força de ligação da muteína de IL-21 a IL-21R pode ser descrita em termos de KD. Em aspectos exemplificativos, a KD das muteínas de IL-21 proporcionadas aqui é cerca de 10-1 M, cerca de 10-2 M, cerca de 10-3 M, cerca de 10-4 M, cerca de 10-5 M, cerca de 10-6 M ou menor. Em aspectos exemplificativos, a KD das muteínas de IL-21 proporcionadas aqui é micromolar, nanomolar, picomolar ou femtomolar. Em aspectos exemplificativos, a KD das muteínas de IL-21 proporcionadas aqui está dentro de uma gama de cerca de 10-4 a 10-6 M ou 10-7 a 10-9 M ou 10-10 a 10-12 M ou 10-13 a 10-15 M. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 se liga ao IL-21R humano com uma KD que é maior do que ou é cerca de 0,04 nM. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 se liga ao IL-21R humano com uma KD de cerca de 0,01 nM a cerca de 20 nM, 0,02 nM a 20 nM, 0,05 nM a 20 nM, 0,05 nM a 15 nM, 0,1 nM a 15 nM, 0,1 nM a 10 nM, 1 nM a 10 nM ou 5 nM a 10 nM. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 se liga ao IL-21R de macaco-cinomólogo com uma KD que é maior do que ou é cerca de 0,055 nM. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 se liga ao IL-21R de macaco-cinomólogo com uma KD de cerca de 0,01 nM a cerca de 20 nM, 0,02 nM a 20 nM, 0,05 nM a 20 nM, 0,05 nM a 15 nM, 0,1 nM a 15 nM, 0,1 nM a 10 nM, 1 nM a 10 nM ou 5 nM a 10 nM.

[00130] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 exibe uma redução na afinidade de ligação pela cadeia α de IL-21R. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 é uma muteína (p.ex., simples ou dupla) que exibe uma redução de cerca de 2-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 55-, 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, 100-, 105, 110-, 115-, 120-, 125-, 130-, 135-, 140-, 145-, 150-, 175, 200-, 225-, 250-, 275-, 300-, 325-, 350-, 375-, 400-, 425, 450-, 475-, 500-, 525-, 550-, 575-, 600-, 625-, 650-, 675, 700-, 725-, 750-, 775-, 800-, 825-, 850-, 875-, 900-, 925, 950-, 975 vezes, 1000 vezes ou mais na afinidade de ligação pela cadeia α de IL-21R. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 é uma muteína dupla exibindo a redução na afinidade de ligação pela cadeia α de IL-21R.

[00131] Em aspectos exemplificativos, a redução na afinidade de ligação acima da muteína de IL-21 (p.ex., muteína simples ou dupla) resulta em uma afinidade reduzida pela cadeia α de IL-21R em comparação com a afinidade de cerca de 0,025 nM de IL-21 humana de tipo selvagem pela cadeia α de IL-21R. Conformemente, uma redução de 2 vezes na afinidade como discutido acima resultaria em uma muteína de IL-21 com uma afinidade de cerca de 0,05 nM pela cadeia α de IL-21R. Assim, em modalidades exemplificativas, a muteína de IL-21 (p.ex., simples ou dupla) tem uma afinidade de cerca de 0,05, 0,125, 0,25, 0,375, 0,5, 0,625, 0,75, 0,875, 1,0, 1,125, 1,25, 1,375, 1,5, 1,625, 1,75, 1,875, 2,0, 2,125, 2,25, 2,375, 2,5, 2,625, 2,75, 2,875, 3,0, 3,125, 3,25, 3,375, 3,5, 3,625, 3,75, 4,375, 5, 5,625, 6,25, 6,875, 7,5, 8,125, 8,75, 9,375, 10,0, 10,625, 11,25, 11,875, 12,5, 13,125, 13,75, 14,375, 15,0, 15,625, 16,25, 16,875, 17,5, 18,125, 18,75, 19,375, 20,0, 20,625, 21,25, 21,875, 22,5, 23,125, 23,75, 24,375, 25 nM ou mais pela cadeia α de IL- 21R. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 é uma muteína dupla exibindo uma afinidade de ligação reduzida pela cadeia α de IL-21R.

[00132] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 exibe uma redução na atividade como medida por um ensaio de fosforilação de STAT3 in vitro. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 é uma muteína (p.ex., simples ou dupla) que exibe uma redução de cerca de 2-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 55-, 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, 100-, 105-, 110-, 115-, 120-, 125-, 130-, 135-, 140-, 145-, 150-, 175-, 200-, 225-, 250-, 275-, 300-, 325-, 350-, 375-, 400-, 425-, 450-, 475-, 500-, 525-, 550-, 575-, 600-, 625-, 650-, 675-, 700-, 725-, 750-, 775-, 800-, 825-, 850-, 875-, 900-, 925-, 950-, 975 vezes, 1000 vezes ou mais na atividade como medida por um ensaio de fosforilação de STAT3. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 é uma muteína dupla exibindo a redução na atividade como medida por um ensaio de fosforilação de STAT3.

Conjugados de muteína de IL-21

[00133] A presente divulgação proporciona também conjugados compreendendo uma ou mais das muteínas de IL-21 da presente divulgação ligada a uma fração heteróloga. Como usado aqui, o termo “fração heteróloga” é sinônimo do termo “fração conjugada” e se refere a qualquer molécula (química ou bioquímica, ocorrendo naturalmente ou não codificada) que é diferente das muteínas de IL-21 descritas aqui. Frações conjugadas exemplificativas que podem ser ligadas a qualquer uma das muteínas de IL-21 descritas aqui incluem, mas não estão limitadas a, um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo (incluindo, por exemplo, uma imunoglobulina ou sua porção (p.ex., região variável, CDR ou região Fc)), um agente de direcionamento, uma etiqueta de diagnóstico tal como um radioisótopo, fluoróforo ou etiqueta enzimática, um polímero incluindo polímeros solúveis em água ou outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico. Em algumas modalidades é proporcionado um conjugado compreendendo uma muteína de IL- 21 da presente divulgação e uma imunoglobulina. O conjugado em algumas modalidades compreende uma ou mais das muteínas de IL-21 descritas aqui e um ou mais de: um peptídeo (que é distinto das muteínas de IL-21 descritas aqui), um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucleico, um anticorpo ou seu fragmento, um polímero, um ponto quântico, uma molécula pequena, uma toxina, um agente de diagnóstico, um carboidrato, um aminoácido.

[00134] Em modalidades exemplificativas, o conjugado da presente divulgação compreende uma muteína de IL-21 como descrito aqui e uma fração heteróloga que é um polipeptídeo (p.ex., um polipeptídeo distinto de qualquer uma das muteínas de IL-21 descritas aqui), e o conjugado é um polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão ou uma proteína quimérica ou polipeptídeo quimérico. Descrições adicionais de tais conjugados são proporcionadas aqui sob “Proteínas de fusão”.

[00135] Em algumas modalidades, a fração heteróloga está anexada através de ligação não covalente ou covalente à muteína de IL-21 da presente divulgação. Em aspectos exemplificativos, a ligação entre a muteína de IL-21 e a fração heteróloga é alcançada através de ligações químicas covalentes, p.ex., ligações de peptídeo, ligações de dissulfeto e similares, ou através de forças físicas, tais como eletrostática, hidrogênio, iônica, van der Waals ou interações hidrofóbicas ou hidrofílicas. Uma variedade de sistemas de acoplamento não covalentes pode ser usada, incluindo, p.ex., biotina-avidina, ligando/receptor, enzima/substrato, proteína de ligação ácido nucleico/ácido nucleico, proteína de ligação lipídeo/lipídeo, parceiros de molécula de adesão celular; ou quaisquer parceiros de ligação ou seus fragmentos que têm afinidade uns pelos outros.

[00136] A muteína de IL-21 em modalidades exemplificativas está ligada a uma fração conjugada através de ligação covalente direta por reação de resíduos de aminoácidos visados da muteína de IL-21 com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N- ou C-terminais destes aminoácidos visados. Os grupos reativos na muteína de IL-21 ou fração conjugada incluem, p.ex., um grupo aldeído, amino, éster, tiol, α-haloacetila, maleimido ou hidrazino. Os agentes de derivatização incluem, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico ou outros agentes conhecidos na técnica. Alternativamente, as frações conjugadas podem ser ligadas à muteína de IL-21 através de transportadores intermediários, tais como transportadores de polissacarídeo ou polipeptídeo. Exemplos de transportadores de polissacarídeo incluem aminodextrana. Exemplos de transportadores de polipeptídeo adequados incluem polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, seus copolímeros e polímeros mistos destes aminoácidos e outros, p.ex., serinas, para conferir propriedades de solubilidade desejáveis ao transportador carregado resultante.

[00137] Os resíduos de cisteinila são o mais comumente reagidos com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético, cloroacetamida para dar derivados de carboximetila ou carboxiamidometila. Os resíduos de cisteinila são também derivatizados por reação com bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-β-(5- imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N- alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila, dissulfeto de metil 2-piridila, p-cloromercuribenzoato, 2- cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol.

[00138] Os resíduos de histidila são derivatizados por reação com dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específico para cadeia lateral de histidila. O brometo de para-bromofenacila é também útil; a reação é preferencialmente realizada em cacodilato de sódio a 0,1 M a pH 6,0.

[00139] Os resíduos de lisinila e amino-terminais são reagidos com anidridos de ácido succínico ou outro carboxílico. A derivatização com estes agentes temo efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinila. Outros reagentes adequados para derivatização de resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroboro-hidreto, ácido trinitrobenzenossulfônico, O-metilisoureia, 2,4- pentanodiona e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

[00140] Os resíduos de arginila são modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao elevado pKa do grupo funcional guanidina. Além do mais, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina bem como o grupo épsilon-amino de arginina.

[00141] A modificação específica de resíduos de tirosila pode ser feita, com particular interesse na introdução de etiquetas espectrais em resíduos de tirosila por reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. O mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosila e derivados de 3- nitro, respectivamente.

[00142] Os grupos laterais carboxila (aspartila ou glutamila) são seletivamente modificados por reação com carbodi-imidas (R-N=C=N-R’), onde R e R’ são grupos alquila diferentes, tais como 1-ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-4- etil)carbodi-imida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4- dimetilpentil)carbodi-imida. Além do mais, os resíduos de aspartila e glutamila são convertidos em resíduos de asparaginila e glutaminila por reação com íons de amônio.

[00143] Out ras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos alfa- amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, pp. 79-86 (1983)), desamidação de asparagina ou glutamina, acetilação da amina N-terminal e/ou amidação ou esterificação do grupo ácido carboxílico C-terminal.

[00144] Outro tipo de modificação covalente envolve acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos à muteína de IL-21. O(s) açúcar(es) pode(m) estar anexado(s) a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidrila livres tais como aqueles de cisteína, (d) grupo hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tais como aqueles de tirosina ou triptofano ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em WO87/05330 publicada a 11 set. 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

[00145] Em aspectos exemplificativos, a fração heteróloga está anexada à muteína de IL-21 da presente divulgação através de um ligante. Em alguns aspectos, o ligante compreende uma cadeia de átomos de 1 a cerca de 60 ou a 1 a 30 átomos ou mais, 2 a 5 átomos, 2 a 10 átomos, 5 a 10 átomos ou 10 a 20 átomos em comprimento. Em algumas modalidades, os átomos de carbono são todos átomos de carbono. Em algumas modalidades, os átomos da cadeia no esqueleto do ligante são selecionados do grupo consistindo em C, O, N e S. Os átomos e ligantes da cadeia podem ser selecionados de acordo com a sua solubilidade esperada (hidrofilicidade) de modo a proporcionarem um conjugado mais solúvel. Em algumas modalidades, o ligante proporciona um grupo funcional que está indivíduo à clivagem por uma enzima ou outras condições catalisadoras ou hidrolíticas encontradas no tecido ou órgão ou célula alvo. Em algumas modalidades, o comprimento do ligante é longo o suficiente para reduzir o potencial de impedimento estérico. Se o ligante for uma ligação covalente ou uma ligação de peptidila e o conjugado for um polipeptídeo, o conjugado inteiro pode ser uma proteína de fusão. Tais ligantes de peptidila podem ter qualquer comprimento. Ligantes de peptidila exemplificativos têm de cerca de 1 a 50 aminoácidos em comprimento, 5 a 50, 3 a 5, 5 a 10, 5 a 15 ou 10 a 30 aminoácidos em comprimento e são flexíveis ou rígidos. Em aspectos exemplificativos, o ligante é um peptídeo compreendendo cerca de 2 a cerca de 20 aminoácidos. Em aspectos exemplificativos, o ligante é um peptídeo compreendendo cerca de 2 a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 2 a cerca de 10 aminoácidos ou cerca de 2 a cerca de 5 aminoácidos. Ligantes de peptídeo adequados são conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Chen et al., Adv Drug Delivery Reviews 65 (10): 1357-1369 (2013); Arai et al., Protein Eng Des Sel 14 (8): 529-532 (2001); e Wriggers et al., Curr Trends in Peptide Science 80 (6): 736-746 (2005). Em aspectos exemplificativos, o ligante é um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 262).

Proteínas de fusão

[00146] Em modalidades exemplificativas, a muteína de IL- 21 está ligada a um polipeptídeo que é distinto de qualquer uma das muteínas de IL-21 descritas aqui, e o conjugado é um polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão ou uma proteína quimérica ou polipeptídeo quimérico. Conformemente, a presente divulgação proporciona polipeptídeos de fusão ou proteínas de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 da presente divulgação e um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão da presente divulgação compreende uma muteína de IL- 21 da presente divulgação ligada a uma proteína de ligação ao antígeno. Em aspectos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou imunoglobulina, ou um seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, ou um produto de proteína de anticorpo

[00147] Coletivamente, os anticorpos formam uma família de proteínas plasmáticas conhecidas como imunoglobulinas e compreendem de domínios da imunoglobulina. (Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a ed., Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, 1999). Como usado aqui, o termo “anticorpo” se refere a uma proteína tendo um formato de imunoglobulina convencional, compreendendo cadeias pesadas e leves e compreendendo regiões variáveis e constantes. Por exemplo, um anticorpo pode ser uma IgG que é uma estrutura “em forma de Y” de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, tendo cada par uma cadeia “leve” (tendo tipicamente um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma “pesada” (tendo tipicamente um peso molecular de cerca de 50-70 kDa). Um anticorpo tem uma região variável e uma região constante. Nos formatos de IgG, a região variável tem geralmente cerca de 100-110 ou mais aminoácidos, compreende três regiões determinantes da complementaridade (CDRs), é principalmente responsável pelo reconhecimento do antígeno e varia substancialmente entre outros anticorpos que se ligam a diferentes antígenos. A região constante permite que o anticorpo recrute células e moléculas do sistema imunitário. A região variável é constituída pelas regiões N-terminais de cada cadeia leve e cadeia pesada, enquanto a região constante é constituída pelas porções C-terminais de cada uma das cadeias pesadas e leves. (Janeway et al., “Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).

[00148] A estrutura e propriedades gerais de CDRs de anticorpos foram descritas na técnica. Brevemente, em um molde de anticorpo, as CDRs estão embebidas dentro de um arcabouço na região variável de cadeia pesada e leve onde constituem as regiões largamente responsáveispela ligação e reconhecimento do antígeno. Uma região variável compreende tipicamente pelo menos três CDRs de cadeia pesada ou leve (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; ver também Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de uma região de arcabouço (designadas regiões de arcabouço 1-4, FR1, FR2, FR3 e FR4, por Kabat et al., 1991; ver também Chothia e Lesk, 1987, supra).

[00149] Os anticorpos podem compreender qualquer região constante conhecida na técnica. As cadeias leves humanas são tipicamente classificadas como cadeias leves kappa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. A IgG tem várias subclasses, incluindo, mas não se limitando a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A IgM tem subclasses, incluindo, mas não se limitando a, IgM1 e IgM2. As modalidades da presente divulgação incluem todas tais classes ou isótipos de anticorpos. A região constante de cadeia leve pode ser, por exemplo, uma região constante de cadeia leve tipo kappa ou lambda, p.ex., uma região constante de cadeia leve tipo kappa ou lambda humana. A região constante de cadeia pesada pode ser, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada tipo alfa, delta, épsilon, gama ou mu, p.ex., uma região constante de cadeia pesada tipo alfa, delta, épsilon, gama ou mu humana. Conformemente, em modalidades exemplificativas, o anticorpo é um anticorpo do isótipo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, incluindo qualquer um de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[00150] O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência que é substancialmente similar a um anticorpo ocorrendo naturalmente produzido por um mamífero, p.ex., camundongo, coelho, cabra, cavalo, galinha, hamster, humano e similares. A este respeito, o anticorpo pode ser considerado como um anticorpo de mamífero, p.ex., um anticorpo de camundongo, anticorpo de coelho, anticorpo de cabra, anticorpo de cavalo, anticorpo de galinha, anticorpo de hamster, anticorpo humano e similares. Em certos aspectos, o anticorpo é um anticorpo humano. Em certos aspectos, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. O termo “anticorpo quimérico” se refere a um anticorpo contendo domínios de dois ou mais anticorpos diferentes. Um anticorpo quimérico pode, por exemplo, conter os domínios constantes de uma espécie e os domínios variáveis de uma segunda ou, mais geralmente, pode conter trechos da sequência de aminoácidos de pelo menos duas espécies. Um anticorpo quimérico pode também conter domínios de dois ou mais anticorpos diferentes dentro da mesma espécie. O termo “humanizado” quando usado em relação a anticorpos se refere a anticorpos tendo pelo menos regiões CDR de uma fonte não humana que são manipulados para terem uma estrutura e função imunológicas mais similares aos anticorpos humanos verdadeiros do que os anticorpos originais da fonte. Por exemplo, a humanização pode envolver enxertia de uma CDR de um anticorpo não humano, tal como um anticorpo de camundongo, em um anticorpo humano. A humanização pode também envolver selecionar substituições de aminoácidos para fazer uma sequência não humana mais similar uma sequência humana.

[00151] Um anticorpo pode ser clivado em fragmentos por enzimas, tais como, p.ex., papaína e pepsina. A papaína cliva um anticorpo para produzir dois fragmentos Fab e um único fragmento Fc. A pepsina cliva um anticorpo para produzir um fragmento F(ab')2 e um fragmento pFc'. Em aspectos exemplificativos da presente divulgação, a proteína de fusão da presente divulgação compreende um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno. Como usado aqui, o termo “fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno” se refere a uma porção de uma molécula de anticorpo que é capaz de se ligar ao antígeno do anticorpo e é também conhecido como “fragmento de ligação ao antígeno” ou “porção de ligação ao antígeno”. Em casos exemplificativos, o fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno é um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2.

[00152] A arquitetura de anticorpos tem sido explorada para criar uma gama crescente de formatos alternativos que abrangem uma gama de pesos moleculares de pelo menos 12-150 kDa e tem uma gama de valências (n) de monomérica (n = 1), a dimérica (n = 2), a trimérica (n = 3), a tetramérica (n = 4) e, potencialmente, mais elevada; tais formatos alternativos são referidos aqui como “produtos de proteína de anticorpo”. Os produtos de proteína de anticorpo incluem aqueles baseados na estrutura de anticorpo inteiro e aqueles que mimetizam fragmentos de anticorpo que retêm capacidade de ligação ao antígeno inteira, p.ex., scFvs, Fabs e VHH/VH (discutido em baixo). O fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno mais pequeno que retém seu local de ligação ao antígeno completo é o fragmento Fv, que consiste inteiramente em regiões variáveis (V). Um ligante de peptídeo de aminoácidos flexível, solúvel é usado para conetar as regiões V a um fragmento scFv (variável de fragmento de cadeia única) para estabilização da molécula, ou os domínios constantes (C) são adicionados às regiões V para gerar um fragmento Fab [fragmento, ligação ao antígeno]. Os fragmentos tanto scFv como Fab podem ser facilmente produzidos em células hospedeiras, p.ex., células hospedeiras procarióticas. Outros produtos de proteínas de anticorpos incluem scFv estabilizado por ligação de dissulfeto (ds-scFv), Fab de cadeia única (scFab), bem como formatos de anticorpos di- e multiméricos como dia-, tria- e tetra-corpos, ou minicorpos (miniAbs) que compreendem diferentes formatos consistindo em scFvs ligados a domínios de oligomerização. Os fragmentos mais pequenos são VHH/VH de Abs de cadeia pesada de camelídeo, bem como Abs de domínio único (sdAb). O bloco de construção que é o mais frequentemente usado para criar novos formatos de anticorpos é o fragmento de anticorpo de domínio variável (V) de cadeia única (scFv), que compreende domínios V da cadeia pesada e leve (domínio VH e VL) ligados por um ligante de peptídeo de ~15 resíduos de aminoácidos. Um pepticorpo ou fusão peptídeo-Fc é ainda outro produto de proteína de anticorpo. A estrutura de um pepticorpo consiste em um peptídeo biologicamente ativo enxertado em um domínio Fc. Os pepticorpos são bem descritos na técnica. Ver, p.ex., Shimamoto et al., mAbs 4 (5): 586-591 (2012).

[00153] Out ros produtos de proteínas de anticorpos incluem um anticorpo de cadeia única (SCA); um diacorpo; um triacorpo; um tetracorpo; anticorpos biespecíficos ou triespecíficos e similares. Os anticorpos biespecíficos podem ser divididos em cinco classes principais: BsIgG, IgG pendente, fragmentos de BsAb, proteínas de fusão biespecíficas e conjugados de BsAb. Ver, p.ex., Spiess et al., Molecular Immunology 67 (2) Parte A: 97-106 (2015).

[00154] Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão da presente divulgação compreende qualquer um destes produtos de proteína de anticorpo. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão da presente divulgação compreende qualquer um de um scFv, Fab VHH/VH, fragmento Fv, ds-scFv, scFab, anticorpo dimérico, anticorpo multimérico (p.ex., um diacorpo, triacorpo, tetracorpo), miniAb, pepticorpo VHH/VH de anticorpo de cadeia pesada de camelídeo, sdAb, diacorpo; um triacorpo; um tetracorpo; um anticorpo biespecífico ou triespecífico, BsIgG, IgG pendente, fragmento BsAb, proteína de fusão biespecífica e conjugado de BsAb.

[00155] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão da presente divulgação compreende um produto de proteína de anticorpo na forma monomérica ou polimérica, oligomérica ou multimérica. Em certas modalidades nas quais o anticorpo compreende dois ou mais fragmentos de regiões de ligação ao antígeno distintos, o anticorpo é considerado biespecífico, triespecífico ou multiespecífico, ou bivalente, trivalente ou multivalente, dependendo do número de epítopos distintos que são reconhecidos e ligados pelo anticorpo.

[00156] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo, fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo se liga a um antígeno tumoral. Em aspectos exemplificativos, o antígeno tumoral é um antígeno derivado de uma proteína viral, um antígeno derivado de mutações pontuais ou um antígeno codificado por um gene da linha germinativa do câncer. Em aspectos exemplificativos, o antígeno tumoral é p53, KRAS, NRAS, MAGEA, MAGEB, MAGEC, BAGE, GAGE, LAGE/NY-ESO1, SSX, tirosinase, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, TRP2, CEA, RAGE-1, HER2/NEU, WT1. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo, fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo da proteína de fusão da presente divulgação se liga a um agente de imunoterapia ou é um agente de imunoterapia, como descrito aqui. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo, fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo da proteína de fusão da presente divulgação se liga a uma citocina, linfocina, fator de crescimento ou fator hematopoiético, como descrito aqui.

[00157] Em modalidades exemplificativas, a proteína de fusão da presente divulgação compreende uma citocina (p.ex., uma muteína de IL-21 descrita aqui) e um anticorpo, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo, que se liga a uma proteína da via de pontos de controle imunitários, um antígeno tumoral, uma citocina, linfocina, fator de crescimento ou outro fator hematopoiético, incluindo mas não se limitando a qualquer um daqueles descritos aqui. Em modalidades exemplificativos, a proteína de fusão da presente divulgação compreende uma citocina (p.ex., uma muteína de IL-21 descrita aqui) e um anticorpo, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo, que se liga a uma proteína da via de pontos de controle imunitários selecionada do grupo consistindo em: CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CEACAM-1, TIGIT, LAG3, CD112, CD112R, CD96, TIM3, BTLA ou receptor coestimulante: ICOS, OX40, 41BB, CD27, GITR.

[00158] Em outras modalidades, a proteína de fusão da presente divulgação compreende uma citocina e um anticorpo (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) que se liga a uma proteína da via de pontos de controle imunitários. Citocinas adequadas incluem, por exemplo, citocinas que intensificam as respostas tipo TH-1; e citocinas que ativam STAT 1, 3, 4 ou 5. Em algumas modalidades, a citocina é uma interleucina. Em outras modalidades, a citocina é uma interleucina que intensifica a atividade de células T tais como, por exemplo, IL-2, IL- 7, IL-10, IL-12, IL-15 ou IL-21. Tais citocinas podem ser modificadas (p.ex., através de mutações) para atenuar a sua afinidade pelo seu respectivo receptor. Tais muteínas podem exibir perfis de segurança melhorados por redução de interações fora do alvo e indesejadas. Assim, as citocinas podem ser modificadas para gerar muteínas de IL-2, IL-7, IL- 10, IL-12, IL-15 ou IL-21. Em uma modalidade particular, a citocina é uma muteína de IL-21 descrita aqui. Anticorpos (ou seus fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno) adequados que se ligam a uma proteína da via de pontos de controle imunitários incluem, por exemplo, aqueles que se ligam a CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, TIGIT, LAG3, CD112 TIM3, BTLA ou receptor coestimulante: ICOS, OX40, 41BB ou GITR. Em uma modalidade particular, o anticorpo (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) se liga a PD-1 (p.ex., PD-1 humana).

[00159] Em outras modalidades, a proteína de fusão da presente divulgação é uma proteína de fusão multiespecífica que compreende uma citocina, um anticorpo (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) e pelo menos uma fração de direcionamento adicional. Por exemplo, a proteína de fusão da presente divulgação pode ser uma proteína de fusão triespecífica que compreende uma citocina, um anticorpo (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) e uma fração de direcionamento adicional.

[00160] Em modalidades exemplificativas, a proteína de fusão da presente divulgação compreende uma muteína de IL- 21 descrita aqui e um antagonista de ligação a PD-1. O termo “antagonista de ligação a PD-1” se refere a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere com a transdução de sinal resultando da interação de PD-1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tais como PD-L1, PD- L2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a PD-1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-1 a um ou mais de seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação a PD-1 inibe a ligação de PD-1 a PD- L1 e/ou PD-L2. Por exemplo, os antagonistas de ligação a PD- 1 incluem anticorpos anti-PD-1, seus fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, revogam ou interferem com a transdução de sinal resultando da interação de PD-1 com PD-L1 e/ou PD-L2 Em uma modalidade, um antagonista de ligação a PD-1 reduz o sinal coestimulante negativo mediado por ou através das proteínas da superfície celular expressas na sinalização mediada por linfócitos T através de PD-1 de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional (p.ex., intensificando respostas efetoras ao reconhecimento do antígeno). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a PD-1 é um anticorpo anti-PD-1. Exemplos de anticorpos anti-PD-1 incluem nivolumab (BMS-936558), pembrolizumab (MK-3475), BMS 936558, BMS-936559, TSR-042 (Tesaro), ePDR001 (Novartis) e pidilizumab (CT-011). Exemplos específicos adicionais de antagonistas de ligação a PD-1 são proporcionados infra.

[00161] Em modalidades exemplificativos, o antagonista de ligação a PD-1 compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma proteína de ligação ao antígeno que se liga a PD-1. Em aspectos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou um produto de proteína de anticorpo que se liga a PD-1.

[00162] Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão da presente divulgação compreende uma muteína de IL-21, como descrito aqui, e um anticorpo anti-PD-1 (como descrito aqui), um seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou um produto de proteína de anticorpo anti-PD-1. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 é uma IgG monoclonal. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD- 1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 é um monovalente ou bivalente. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 se liga a PD- 1 humano, que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 263. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 se liga a PD-1 de cinomólogo, que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 264. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 se liga tanto a PD-1 humano como a PD-1 de cinomólogo. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão da presente divulgação compreende uma muteína de IL-21 (como descrito aqui) e um anticorpo anti- PD-1 (como descrito aqui).

[00163] Em modalidades exemplificativos, a força de ligação do anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 a PD-1 pode ser descrita em termos de KD. Em aspectos exemplificativos, a KD do anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 proporcionado aqui é cerca de 10-1 M, cerca de 10-2 M, cerca de 10-3 M, cerca de 10-4 M, cerca de 10-5 M, cerca de 10-6 M, cerca de 10-7 M, cerca de 10-8 M, cerca de 10-9 M ou menor. Em aspectos exemplificativos, a KD do anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 proporcionado aqui é micromolar, nanomolar, picomolar ou femtomolar. Em aspectos exemplificativos, a KD do anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 proporcionado aqui está dentro de uma gama de cerca de 10-4 a 10-6 M ou 10-7 a 10-9 M ou 10-10 a 10-12 M ou 10-13 a 10-15 M. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 tem elevada afinidade para PD-1 humano, PD-1 de cinomólogo ou ambos. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 tem um KD para PD-1 humano de menos do que 100 pM, opcionalmente, cerca de 1 pM a cerca de 50 pM. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD- 1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 tem um KD para PD-1 humano dentro de cerca de 1 pM a cerca de 20 pM ou menor do que cerca de 10 pM. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, um seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 tem um KD para PD-1 de cinomólogo de menos do que 100 pM, opcionalmente, cerca de 1 pM a cerca de 75 pM. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 tem um KD para PD-1 de cinomólogo dentro de cerca de 1 pM a cerca de 20 pM ou menor do que 10 pM.

[00164] Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD- 1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 é um antagonista de ligação a PD-1 que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere com a transdução de sinal resultando da interação de PD-1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tais como PD-L1, PD-L2. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 bloqueia PD-1 de se ligar ao seu ligando PD-L1 ou PD-L2. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 inibe pelo menos 50% das interações de ligação entre PD-1 e PD-L1 ou PD-L2. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 exibe pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% de inibição da interação de ligação entre PD-1 e PD-L1 ou PD-L2.

[00165] Em exemplos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 inibe a produção de IL-2 mediada por PD-1 por células T em uma reação mista de linfócitos (MLR). Em aspectos exemplificativos, a IC50 do anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 na MLR está dentro de cerca de 0,1 nM a cerca de 5 nM. Em aspectos exemplificativos, a IC50 do anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 na MLR é menor do que 2 nM ou menor do que 1 nM. Em aspectos exemplificativos, a IC50 do anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 na MLR é cerca de 0,5 nM a cerca de 2 nM.

[00166] Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD- 1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende (a) uma sequência de aminoácidos da região determinante da complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada (HC) selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, e 382, (ver Tabela D) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373, e 383, (ver Tabela D) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374, e 384, (ver Tabela D) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve (LC) selecionada do grupo consistindo em: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, e 385 (ver Tabela D) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC selecionada do grupo consistindo em: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, e 386, (ver Tabela D) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC selecionada do grupo consistindo em: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, e 387, (ver Tabela D) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (g) uma combinação de quaisquer duas, três, quatro, cinco ou seis de (a)-(f). Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende tais CDRs. TABELA D

O número representa a SEQ ID NO relevante.

[00167] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentadas na Tabela D e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC apresentadas na Tabela D. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de HC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela D e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de LC apresentadas na Tabela D. Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende tais CDRs.

[00168] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende 3, 4, 5 ou todas as 6 das sequências de aminoácidos designadas pelas SEQ ID NOs: em uma única coluna da Tabela D. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ ID NOs: de uma única coluna da Tabela D e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID NOs: na mesma coluna única ou em outra coluna única da Tabela D. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende cada uma das sequências de aminoácidos de CDR de HC designadas pelas SEQ ID NOs: de uma única coluna da Tabela D e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de LC designadas pelas SEQ ID NOs: na mesma coluna única ou em outra coluna única da Tabela D. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 312317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; e (h) SEQ ID NOs: 382-387. Em modalidades específicas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende todas as 6 das sequências de aminoácidos de CDR na Tabela D para qualquer um dos anticorpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006 ou 22D4.017. Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti- PD-1 compreende tais CDRs.

[00169] Em casos exemplificativos, as sequências de aminoácidos da Tabela D estão separadas por pelo menos um ou mais (p.ex., pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) aminoácido(s) interveniente(s). Em casos exemplificativos existem cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de LC e a CDR2 de LC e cerca de 25 a cerca de 40 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de LC e a CDR3 de LC. Em casos exemplificativos existem cerca de 14 a cerca de 16 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de LC e a CDR2 de LC e cerca de 30 a cerca de 35 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de LC e a CDR3 de LC. Em casos exemplificativos existem cerca de 10 a cerca de 20 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de HC e a CDR2 de HC e cerca de 25 a cerca de 40 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de HC e a CDR3 de HC. Em casos exemplificativos existem cerca de 14 a cerca de 16 aminoácidos entre as sequências da CDR1 de HC e a CDR2 de HC e cerca de 30 a cerca de 35 aminoácidos entre as sequências da CDR2 de HC e a CDR3 de HC.

[00170] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende (a) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378, e 388, (ver Tabela E) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (b) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379 e 389, (ver Tabela E) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (c) tanto (a) como (b). Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende tais regiões variáveis. TABELA E

O número representa a SEQ ID NO relevante.

[00171] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389.

[00172] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende (a) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 e 390, (ver Tabela E) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (b) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: 321, 331, 341, 351, 361, 371, 381, e 391, (ver Tabela E) ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (c) tanto (a) como (b). Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti- PD-1 compreende tais regiões variáveis.

[00173] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391. Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende tais regiões.

[00174] Em aspectos exemplificativos, as sequências de aminoácidos de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreendem um conjunto de mutações de pares de carga, como descrito aqui. Em aspectos particulares, as sequências de aminoácidos de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreendem mutações de pares de carga selecionadas das mutações de pares de carga V1, V103 e V131.

[00175] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de aminoácidos que é similar a uma sequência de aminoácidos acima referenciada, todavia a proteína de ligação ao antígeno retém substancialmente sua função biológica, p.ex., sua capacidade de se ligar a PD-1, p.ex., PD-1 humano, PD-1 de cinomólogo, ou de diminuir, bloquear, inibir, revogar ou interferir com a transdução de sinal resultando da interação de PD-1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tais como PD-L1 ou PD-L2.

[00176] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de aminoácidos que difere somente em 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos, em relação à(s) sequência(s) de aminoácidos acima referenciada(s). Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência variante da sequência referenciada, sequência variante essa que difere somente em um ou dois aminoácidos, em relação à sequência referenciada. Em aspectos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que ocorrem fora das CDRs, p.ex., a uma ou mais substituições de aminoácidos ocorrem dentro da(s) região(ões) de arcabouço da cadeia pesada ou leve. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais substituições de aminoácidos, todavia a proteína de ligação ao antígeno retêm as sequências de aminoácidos das seis CDRs. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo somente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais substituições de aminoácidos conservativas, em relação à(s) sequência(s) de aminoácidos acima referenciada(s).

[00177] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de aminoácidos que tem mais do que ou cerca de 30%, mais do que ou cerca de 50% ou mais do que ou cerca de 70% de identidade de sequências com a(s) sequência(s) de aminoácidos acima referenciada(s). Em aspectos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou tem mais do que 90% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos acima referenciada. Em aspectos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou tem mais do que 90% de identidade de sequências ao longo do comprimento inteiro da sequência de aminoácidos acima referenciada. Em aspectos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências ao longo do comprimento inteiro da sequência de aminoácidos acima referenciada.

[00178] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência variante da sequência referenciada, sequência variante essa que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências, em relação à sequência acima referenciada. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência variante da sequência referenciada, sequência variante essa que tem pelo menos ou cerca de 80% de identidade de sequências, em relação à sequência acima referenciada. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência variante da sequência referenciada, sequência variante essa que tem pelo menos ou cerca de 90% de identidade de sequências, em relação à sequência acima referenciada. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência variante da sequência referenciada, sequência variante essa que tem pelo menos ou cerca de 95% de identidade de sequências, em relação à sequência acima referenciada.

[00179] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende uma, duas, três, quatro ou cinco sequências das SEQ ID NOs. em uma única coluna da Tabela D e pelo menos uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOs: 312-387. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende uma, duas, três, quatro ou cinco sequências de um conjunto de sequências selecionadas de: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; e (h) SEQ ID NOs: 382-387, em que o anticorpo ou seu fragmento compreende adicionalmente pelo menos uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com pelo menos uma das sequências do conjunto. Por exemplo, em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende quatro sequências de SEQ ID NOs: 312-317, nomeadamente, SEQ ID NOs: 312-315, em que o anticorpo ou seu fragmento compreende duas sequências variantes: uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 316 e outra sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 317. Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende tais regiões.

[00180] Em modalidades exemplificativas, o produto de anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências variantes tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOs: 318, 319, 328, 329, 338, 339, 348, 349, 358, 359, 368, 369, 378, 379, 388, e 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo ou seu fragmento compreende um par de sequências variantes que têm pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389. Em modalidades exemplificativas, o produto de anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências: uma sequência da Tabela E e outra sequência que é uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOs: 318, 319, 328, 329, 338, 339, 348, 349, 358, 359, 368, 369, 378, 379, 388, e 389. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências: uma sequência selecionada de (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389 e outra sequência que é uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequências com uma sequência de (a) - (u). Por exemplo, em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende a sequência de SEQ ID NO: 318 e compreende adicionalmente uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequências com SEQ ID NO 319. Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende tais regiões.

[00181] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências variantes tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOs: 320, 321, 330, 331, 340, 341, 350, 351, 360, 361, 370, 371, 380, 381, 390, e 391. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências variantes que têm pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391. Em modalidades exemplificativas, o produto de anticorpo anti- PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências: uma sequência da Tabela E e outra sequência que é uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOs: 320, 321, 330, 331, 340, 341, 350, 351, 360, 361, 370, 371, 380, 381, 390 e 391. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD- 1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências: uma sequência selecionada de (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391 e outra sequência que é uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequências com uma sequência de (a) - (u). Por exemplo, em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende a sequência de SEQ ID NO: 320 e compreende adicionalmente uma sequência variante tendo pelo menos ou cerca de 70% (p.ex., pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%) de identidade de sequências com SEQ ID NO 321. Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti- PD-1 compreende tais regiões.

[00182] Em aspectos exemplificativos adicionais, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou mais modificações de aminoácidos, em relação à contraparte ocorrendo naturalmente, de modo de melhorar a meia-vida/estabilidade ou a tornar o anticorpo mais adequado para expressão/manufatura (p.ex., como uma proteína de fusão com a muteína de IL-21). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 é concebido para prevenir ou reduzir a interação entre o anticorpo anti-PD-1 e receptores Fc. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 é um anticorpo Sem função Efetor Estável (SEFL) compreendendo uma região constante que não tem a capacidade de interagir com receptores FCY. Os anticorpos SEFL são bem conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Liu et al., J Biol Chem 292: 1876-1883 (2016); e Jacobsen et al., J. Biol. Chem. 292: 1865-1875 (2017). Em aspectos exemplificativos, o anticorpo SEFL compreende uma ou mais das seguintes mutações, numeradas de acordo com o sistema EU: L242C, A287C, R292C, N297G, V302C, L306C e/ou K334C. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo SEFL compreende N297G. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo SEFL compreende A287C, N297G e L306C. Em outros aspectos exemplificativos, o anticorpo SEFL compreende R292C, N297G e V302C (i.e., SEFL2-2).

[00183] O anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 pode compreender outras modificações de extensão da meia-vida (HLE). Em casos exemplificativos, a modificação HLE ocorre na região constante de cadeia pesada e compreende uma ou mais das seguintes mutações, numeradas de acordo com o sistema EU: M252Y, S254T e T256E. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma ou duas de M252Y, S254T e T256E. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende todas as três de M252Y, S254T e T256E. Em aspectos exemplificativos, a região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 545 ou SEQ ID NO: 547 ou SEQ ID NO: 549 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 545 ou SEQ ID NO: 547 ou SEQ ID NO: 549. Em casos exemplificativos, a modificação HLE ocorre na região constante de cadeia pesada e compreende uma ou mais das seguintes mutações, numeradas de acordo com o sistema EU: L309D, Q311H e N434S. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma, duas ou todas as três de L309D, Q311H e N434S. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende todas as três de L309D, Q311H e N434S. Em aspectos exemplificativos, a região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 544 ou SEQ ID NO: 546 ou SEQ ID NO: 548 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 544 ou SEQ ID NO: 546 ou SEQ ID NO: 548.

[00184] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende modificações SEFL2-2 e modificações HLE. Em alguns casos, as modificações HLE compreendem uma ou duas ou todas as três de M252Y, S254T e T256E. Em aspectos exemplificativos, a região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 551 ou SEQ ID NO: 553 ou SEQ ID NO: 555 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 551 ou SEQ ID NO: 553 ou SEQ ID NO: 555. Em alguns casos, as modificações HLE compreendem uma ou duas ou todas as três de L309D, Q311H e N434S. Em aspectos exemplificativos, a região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 550 ou SEQ ID NO: 552 ou SEQ ID NO: 554 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 550 ou SEQ ID NO: 552 ou SEQ ID NO: 554. Em aspectos exemplificativos, a cadeia pesada compreende adicionalmente mutações de pares de carga como descrito em baixo.

[00185] Em células eucarióticas ocorrem dois tipos de reações de glicosilação: (1) glicosilação ligada em N, na qual glicanas são anexadas à asparagina da sequência de reconhecimento Asn-X-Thr/Ser, onde “X” é qualquer aminoácido exceto prolina e (2) glicosilação ligada em O, na qual glicanas são anexadas à serina ou treonina. A glicosilação ligada em N começa no Retículo Endoplasmático (ER), onde um conjunto complexo de reações resulta na anexação de uma estrutura de glicana nuclear constituída essencialmente por dois resíduos de GlcNAc e três resíduos de Man. O complexo de glicana formado no ER é modificado por ação de enzimas no aparelho de Golgi. Se o sacarídeo for relativamente inacessível às enzimas permanece tipicamente na forma HM original. Se as enzimas conseguirem aceder ao sacarídeo, então muitos dos resíduos de Man são separados por clivagem e o sacarídeo é adicionalmente modificada, resultando na estrutura de N-glicanas tipo complexo. Por exemplo, a manosidase-1 localizada no cis-Golgi pode clivar ou hidrolisar uma glicana HM, enquanto a fucosiltransferase FUT-8, localizada no Golgi medial, fucosila a glicana (Hanrue Imai-Nishiya (2007), BMC Biotechnology, 7: 84). Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 é N-glicosilado, p.ex., compreende uma ou mais frações de açúcar (p.ex., glicanas, sacarídeos) covalentemente anexadas a um aminoácido específico da cadeia pesada. Em aspectos alternativos, o anticorpo anti-PD-1 não é glicosilado ou não compreende quaisquer frações de açúcar (p.ex., glicanas, sacarídeos) covalentemente anexadas a um aminoácido específico da cadeia pesada.

[00186] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284 e compreende adicionalmente um ligante. Em casos exemplificativos, o ligante compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262. Assim, em alguns aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 287 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 287. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD- 1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284, com a Lys C- terminal cortada ou removida. A este respeito, em alguns aspectos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada não tendo a Lys C-terminal e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 285 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 285. Em geral, a lisina C-terminal de um anticorpo sofre clivagem por carboxipeptidase durante a expressão. Uma região constante de cadeia pesada não tendo a Lys C-terminal previne vantajosamente que a carboxipeptidase atue na cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada não tendo a Lys C-terminal e compreende adicionalmente um ligante. Em casos exemplificativos, o ligante compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 262. Assim, em alguns aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 286 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 286. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284, e com uma ou mais mutações SEFL que previnem ou reduzem a interação entre o anticorpo anti-PD-1 e receptores Fc, incluindo mas não se limitando a L242C, A287C, R292C, N297G, V302C, L306C e/ou K334C. Em aspectos exemplificativos, as mutações SEFL compreendem mutações SEFL2-2: R292C, N297G e V302C, tal que o anticorpo anti-PD-1 compreenda uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 265 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 265. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada com mutações SEFL2-2 e com a Lys C-terminal cortada ou removida. Uma tal região constante de cadeia pesada pode compreender a sequência de SEQ ID NO: 266. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada com mutações SEFL2-2, a Lys C-terminal cortada ou removida e um ligante. Uma tal região constante de cadeia pesada pode compreender a sequência de SEQ ID NO: 267. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada com mutações SEFL2-2 e um ligante sem a Lys C-terminal cortada. Uma tal região constante de cadeia pesada pode compreender a sequência de SEQ ID NO: 282.

[00187] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está anexada ao Fc do anticorpo anti-PD-1. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está anexada a uma das duas cadeias pesadas do anticorpo. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está anexada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do anticorpo.

[00188] Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende somente uma muteína de IL-21 (i.e., a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21). Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está anexada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas do anticorpo. Em aspectos exemplificativos, quando a proteína de fusão compreende somente uma muteína de IL-21, o Fc do anticorpo compreende modificações concebidas para dirigir a heterodimerização das duas cadeias pesadas (uma cadeia pesada fundida à muteína de IL-21 e uma cadeia pesada não tendo a muteína de IL-21). Tais modificações incluem mutações de Fc tais como knobs-into-holes, DuoBodies, Azimétrica, par de carga, HA-TF, SEEDbody e modificações com afinidade diferencial de proteína A. Ver, p.ex., Spiess et al., Molecular Immunology, 67 (2, Parte A), 2015, pp. 95-106. As mutações knobs-into-holes incluem T366W na primeira cadeia pesada e T366S, L368A e/ou Y407V na segunda cadeia pesada. Ver, p.ex., Ridgway et al., Protein Eng., 9 (1996), pp. 617621; e Atwell et al., J. Mol. Biol., 270 (1997), pp. 26-35. As mutações DuoBody incluem F405L na primeira cadeia pesada e K409R na segunda cadeia pesada. Ver, p.ex., Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110 (2013), pp. 51455150. As mutações azimétricas incluem T350V, L351Y, F405A e/ou Y407V na primeira cadeia pesada e T350V, T366L, K392L e/ou T394W na segunda cadeia pesada. Ver, p.ex., Von Kreudenstein et al., mAbs, 5 (2013), pp. 646-654. As mutações HA-TF incluem S364H e/ou F405A na primeira cadeia pesada e Y349T e/ou T394F na segunda cadeia pesada. Ver, p.ex., Moore et al., mAbs, 3 (2011), pp. 546-557. As mutações SEEDbody incluem mutações de quimera IgG/A na primeira cadeia pesada e mutações de quimera de IgG/A na segunda cadeia pesada. Ver, p.ex., Davis et al., Protein Eng. Des. Sel., 23 (2010), pp. 195-202. As mutações com afinidade diferencial de proteína A incluem H435R em uma cadeia pesada e nenhumas mutações na outra cadeia pesada. Ver, p.ex., Patente dos EUA No. 8,586,713.

[00189] Em um exemplo particular, as mutações são mutações de pares de carga. O que se segue são exemplos de tais mutações de pares de carga, numeradas de acordo com o sistema EU. As mutações de pares de carga incluem K409D na primeira cadeia pesada e D399K na segunda cadeia pesada; K392D na primeira cadeia pesada e E356K na segunda cadeia pesada; ou K409D e K392D na primeira cadeia pesada e D399K e E356K na segunda cadeia pesada (esta última denotada como “V1” aqui). Ver, p.ex., Gunasekaran et al., J Biol Chem 285: 19637-19646 (2010). Em outro exemplo particular, as mutações de pares de carga incluem K439D, K392D e K409D na primeira cadeia pesada; e E356K e D399K na segunda cadeia pesada (denotada “V103” aqui). Ainda em outro exemplo particular, as mutações de pares de carga incluem K360E, K370E, K392E e K409D na primeira cadeia pesada; e E357K e D399K na segunda cadeia pesada (denotada “V131” aqui). As mutações de pares de carga podem também incluir K370D na primeira cadeia pesada e E357K na segunda cadeia pesada; ou todas as três K409D, K392D e K370D na primeira cadeia pesada e todas as três D399K, E357K e E356K na segunda cadeia pesada (esta última denotada como “V4” aqui). Mutações de pares de carga adicionais incluem também D221E, P228E e/ou L368E na primeira cadeia pesada e D221R, P228R e/ou K409R na segunda cadeia pesada. Ver, p.ex., Strop et al., J. Mol. Biol., 420 (2012), pp. 204-219.

[00190] Em modalidades onde a proteína de fusão compreende somente uma muteína de IL-21 (i.e., a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21) e a cadeia pesada contém as mutações de pares de carga V1, a muteína de IL-21 pode estar anexada à cadeia pesada contendo as mutações K409D e K392D (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 294, 296 ou 298) ou à cadeia pesada contendo as mutações D399K e E356K (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 295, 297 ou 299. Em uma modalidade específica, a muteína de IL-21 está anexada à cadeia pesada contendo as mutações D399K e E356K.

[00191] Em modalidades onde a proteína de fusão compreende somente uma muteína de IL-21 (i.e., a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21) e a cadeia pesada contém as mutações de pares de carga V4, a muteína de IL-21 pode estar anexada à cadeia pesada contendo as mutações K409D, K392D e K370D (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 288, 290 ou 292) ou à cadeia pesada contendo as mutações D399K, E357K e E356K (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 289, 291 ou 293). Em uma modalidade específica, a muteína de IL-21 está anexada à cadeia pesada contendo as mutações D399K, E357K e E356K.

[00192] Em modalidades onde a proteína de fusão compreende somente uma muteína de IL-21 (i.e., a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21) e a cadeia pesada contém as mutações de pares de carga V103, a muteína de IL-21 pode estar anexada à cadeia pesada contendo as mutações K439D, K392D e K409D (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 472, 474 ou 476) ou à cadeia pesada contendo as mutações E356K e D399K (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 473, 475 ou 477). Em uma modalidade específica, a muteína de IL-21 está anexada à cadeia pesada contendo as mutações E356K e D399K.

[00193] Em modalidades onde a proteína de fusão compreende somente uma muteína de IL-21 (i.e., a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21) e a cadeia pesada contém as mutações de pares de carga V131, a muteína de IL-21 pode estar anexada à cadeia pesada contendo as mutações K360E, K370E, K392E e K409D (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 478, 480 ou 482) ou à cadeia pesada contendo as mutações E357K e D399K (p.ex., a muteína de IL-21 está anexada a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 479, 481 ou 483). Em uma modalidade específica, a muteína de IL-21 está anexada à cadeia pesada contendo as mutações E357K e D399K.

[00194] Assim, em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um conjunto de mutações de pares de carga, como descrito aqui. Em aspectos particulares, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende mutações de pares de carga selecionadas das mutações de pares de carga V1, V103 e V131.

[00195] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284, com uma ou mais mutações de pares de carga, p.ex., as mutações de pares de carga V1, V4, V103 ou V131. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284, com mutações de pares de carga V1, em que uma primeira região constante de cadeia pesada compreende as mutações K409 e K392D e uma segunda região constante de cadeia pesada compreende as mutações D399K e E356K. Uma tal primeira região constante de cadeia pesada pode compreender a sequência de SEQ ID NO: 294 e uma tal segunda região constante de cadeia pesada pode compreender a sequência de SEQ ID NO: 295. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 296 e 297, respectivamente. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida e um ligante tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 298 e 299, respectivamente. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo mutações de pares de carga V1 e mutações SEFL2-2. Uma tal primeira região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V1 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 306 e uma tal segunda região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V1 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 307. Variações adicionais de tais primeira e segunda cadeias pesadas, incluindo, p.ex., cadeias pesadas com a Lys C-terminal cortada ou removida (SEQ ID NOs: 308 e 309) e com a Lys C-terminal cortada ou removida com um ligante (SEQ ID NOs: 310 e 311) estão contempladas.

[00196] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284, com mutações de pares de carga V4, em que uma primeira região constante de cadeia pesada compreende as mutações K409, K392D e K370D e uma segunda região constante de cadeia pesada compreende as mutações D399K, E356K e E357K. Uma tal primeira região constante de cadeia pesada pode compreender a sequência de SEQ ID NO: 288 e uma tal segunda região constante de cadeia pesada pode compreender a sequência de SEQ ID NO: 289. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 290 e 291, respectivamente. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida e um ligante tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 292 e 293, respectivamente. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo mutações de pares de carga V4 e mutações SEFL2-2. Uma tal primeira região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V4 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 300 e uma tal segunda região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V4 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 301. Variações adicionais de tais primeira e segunda cadeias pesadas, incluindo, p.ex., cadeias pesadas com a Lys C-terminal cortada (SEQ ID NOs: 302 e 303) e com a Lys C-terminal cortada ou removida com um ligante (SEQ ID NOs: 304 e 305) estão contempladas.

[00197] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284, com mutações de pares de carga V103, em que uma primeira região constante de cadeia pesada compreende a sequência de SEQ ID NO: 484 e uma segunda região constante de cadeia pesada compreende a sequência de SEQ ID NO: 485. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 486 e 487, respectivamente. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida e um ligante tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 488 e 489, respectivamente. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo mutações de pares de carga V103 e mutações SEFL2-2. Uma tal primeira região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V103 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 484 e uma tal segunda região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V103 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 485. Variações adicionais de tais primeira e segunda cadeias pesadas, incluindo, p.ex., cadeias pesadas com a Lys C-terminal cortada (SEQ ID NOs: 486 e 487) e com a Lys C-terminal cortada ou removida com um ligante (SEQ ID NOs: 488 e 489) estão contempladas.

[00198] Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 284 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 284, com mutações de pares de carga V131, em que uma primeira região constante de cadeia pesada compreende a sequência de SEQ ID NO: 478 e uma segunda região constante de cadeia pesada compreende a sequência de SEQ ID NO: 479. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 480 e 481, respectivamente. Tais primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada podem ter a Lys C-terminal cortada ou removida e um ligante tal que as primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada possam compreender SEQ ID NO: 482 e 483, respectivamente. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo mutações de pares de carga V131 e mutações SEFL2-2. Uma tal primeira região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V131 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 490 e uma tal segunda região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações de pares de carga V131 e as mutações SEFL2-2 podem compreender uma sequência de SEQ ID NO: 491. Variações adicionais de tais primeira e segunda cadeias pesadas, incluindo, p.ex., cadeias pesadas com a Lys C-terminal cortada (SEQ ID NOs: 492 e 493) e com a Lys C-terminal cortada ou removida com um ligante (SEQ ID NOs: 494 e 495) estão contempladas.

[00199] Em aspectos alternativos, a proteína de fusão compreende mais do que uma muteína de IL-21 (i.e., a proteína de fusão compreende um dímero de muteína de IL-21 ou multímero de muteína de IL-21). Em aspectos alternativos exemplificativos, a proteína de fusão compreende 2, 3 ou 4 (ou mais) muteínas de IL-21. Em aspectos exemplificativos, quando a proteína de fusão compreende mais do que uma muteína de IL-21, cada muteína de IL-21 compreende a mesma estrutura, p.ex., a mesma sequência de aminoácidos. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero de IL-21 ou homomultímero de IL-21. Em aspectos alternativos, cada muteína de IL-21 da proteína de fusão compreende uma estrutura diferente, p.ex., uma sequência de aminoácidos diferente. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um heterodímero de IL-21 ou heteromultímero de IL-21. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende duas muteínas de IL-21, em que a primeira muteína de IL-21 está ligada ao terminal C da primeira cadeia pesada de anticorpo e a segunda muteína de IL-21 está ligada ao terminal C da segunda cadeia pesada de anticorpo. Em aspectos exemplificativos, cada muteína de IL- 21 tem a mesma sequência de aminoácidos (p.ex., é um homodímero de muteína de IL-21). Em aspectos exemplificativos, a primeira muteína de IL-21 tem uma sequência de aminoácidos diferente em relação à segunda muteína de IL-21 (p.ex., é um heterodímero de muteína de IL- 21).

[00200] No que diz respeito às proteínas de fusão compreendendo uma ou mais muteínas de IL-21, cada muteína de IL-21 pode estar anexada a uma das cadeias pesadas do anticorpo com ou sem um ligante. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está anexada ao terminal C de uma das cadeias pesadas do anticorpo através de um ligante e o ligante é um peptídeo. Em casos exemplificativos, o peptídeo compreende a sequência de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 262). Em aspectos alternativos, a muteína de IL- 21 está diretamente anexada ao terminal C de uma das cadeias pesadas do anticorpo sem um ligante.

[00201] Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende somente uma muteína de IL-21 que está diretamente anexada ao terminal C de uma das cadeias pesadas do anticorpo anti-PD-1. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos listada na Tabela 4 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada na Tabela 4. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos listada na Tabela 5 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada na Tabela 5. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos listadas na Tabela 7 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada na Tabela 7. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos listadas em qualquer uma das Tabelas 6 e 8-14 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada em estas Tabelas. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 159, 161, 238, 241, 242 ou 244. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está diretamente anexada ao anticorpo anti-PD-1 e não compreende um ligante de peptídeo.

[00202] Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende duas muteínas de IL-21, cada uma das quais está diretamente anexada ao terminal C de uma cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 e cada uma das quais tem a mesma sequência de aminoácidos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos listada na Tabela 4 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada na Tabela 4. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos listada na Tabela 5 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada na Tabela 5. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos listadas na Tabela 7 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada na Tabela 7. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos listadas em qualquer uma das Tabelas 6 e 8-14 ou uma sequência de uma SEQ ID NO: listada em estas Tabelas. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 159, 161, 237, 238, 241 e 244. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está diretamente anexada ao anticorpo anti- PD-1 e não compreende um ligante de peptídeo.

[00203] Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos de uma região constante de anticorpo descrito aqui fundida a uma sequência de aminoácidos de qualquer muteína de IL-21 descrita aqui. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos de uma região constante de anticorpo descrito aqui, que não está glicosilado, fundida a uma sequência de aminoácidos de qualquer muteína de IL-21 descrita aqui. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende uma região constante compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311, 472-495, e 544-555 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311, 472495, e 544-555, fundida a uma muteína de IL-21 compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, e 283 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, e 283. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 268-281 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 268-281.

[00204] Em modalidades exemplificativas, a proteína de fusão compreende um construto como descrito na Figura 4A, 4B ou 4C. Em modalidades exemplificativas, a proteína de fusão compreende (i) um anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) descrito aqui; e (ii) uma muteína de IL-21 descrita aqui. Em modalidades exemplificativas adicionais, a proteína de fusão compreende (i) um anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) descrito aqui; (ii) uma mutação de pares de carga descrita aqui; e (iii) uma muteína de IL-21 descrita aqui (ver, p.ex., Figura 4C). Em outras modalidades exemplificativas, a proteína de fusão compreende (i) um anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) descrito aqui, em que as sequências de cadeia pesada do referido anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) ) não compreendem uma lisina C-terminal; (ii) uma mutação de pares de carga descrita aqui; e (iii) uma muteína de IL-21 descrita aqui.

[00205] Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD- 1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende (a) uma sequência de aminoácidos da região determinante da complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada (HC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 e 382 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 e 383 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374, e 384 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada (LC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, e 385, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, e 386, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, e 387, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (g) uma combinação de quaisquer duas ou mais de (a)-(f). Em aspectos exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentadas na Tabela D e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC apresentadas na Tabela D. Em modalidades exemplificativas, a proteína de ligação ao antígeno compreende 3, 4, 5 ou 6 das sequências de aminoácidos designadas pelas SEQ ID NOs: em uma única coluna de Tabela D. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; e (h) SEQ ID NOs: 382-387. Em algumas modalidades, o produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende tais regiões.

[00206] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende (a) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela E ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378, e 388, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (b) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve apresentada na Tabela E ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, e 389, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (c) tanto (a) como (b). Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1 (ou seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389. Em casos exemplificativos, a região constante de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267, 282 e 284-311 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267, 282, e 284-311, fundida a uma muteína de IL-21 compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, e 283 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, e 283. Em modalidades exemplificativas, a proteína de ligação ao antígeno compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391. Em modalidades exemplificativas, a proteína de fusão compreende (I) um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391 e (II) uma muteína de IL- 21 compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 e 283 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210222, 224-255, e 283.

[00207] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4A, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 (p.ex., SEQ ID NO: 265 ou 266), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 562 ou SEQ ID NOs: 361 e 563. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 562). Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL- 21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 563).

[00208] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4A, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 (p.ex., SEQ ID NO: 265 ou 266), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 564 ou SEQ ID NOs: 361 e 565. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 564). Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL- 21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 565).

[00209] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4B, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e um ligante (p.ex., SEQ ID NO: 267), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 566. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 566).

[00210] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4B, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e um ligante (p.ex., SEQ ID NO: 267), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 567. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 567).

[00211] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V1 (p.ex., SEQ ID NOs: 306 e 307 ou SEQ ID NOs: 308 e 309), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 309), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 568. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 568 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 574).

[00212] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V103 (p.ex., SEQ ID NOs: 484 e 485 ou SEQ ID NOs: 486 e 487), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V103 E356K e D399K (p.ex., i.e., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 487), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 569. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 569 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 575).

[00213] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V131 (p.ex., SEQ ID NOs: 490 e 491 ou SEQ ID NOs: 492 e 493), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V131 E357K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 493), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 570. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 570 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 576).

[00214] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V1 (p.ex., SEQ ID NOs: 306 e 307 ou SEQ ID NOs: 308 e 309), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 309), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 571. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 571 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 574).

[00215] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V103 (p.ex., SEQ ID NOs: 484 e 485 ou SEQ ID NOs: 486 e 487), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V103 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 487), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 572. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 361) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 572 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 575).

[00216] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V131 (p.ex., SEQ ID NOs: 490 e 491 ou SEQ ID NOs: 492 e 493), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E357K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 493), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 358 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 359. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 360 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 361. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 361 e 573. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 573 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 576).

[00217] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4A, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 (p.ex., SEQ ID NO: 265 ou 266), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 496 ou SEQ ID NOs: 389 e 519. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 496). Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL- 21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 519).

[00218] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4A, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 (p.ex., SEQ ID NO: 265 ou 266), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 497 ou SEQ ID NOs: 389 e 498. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e a cadeia pesada- muteína de IL-21 fundida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 497). Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL- 21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 498).

[00219] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4B, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e um ligante (p.ex., SEQ ID NO: 267), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 499. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 499).

[00220] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4B, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e um ligante (p.ex., SEQ ID NO: 267), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 500. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 500).

[00221] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V1 (p.ex., SEQ ID NOs: 306 e 307 ou SEQ ID NOs: 308 e 309), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 309), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 501. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 501, e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 556).

[00222] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V103 (p.ex., SEQ ID NOs: 484 e 485 ou SEQ ID NOs: 486 e 487), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V103 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 487), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 502. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 502 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 557).

[00223] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V131 (p.ex., SEQ ID NOs: 490 e 491 ou SEQ ID NOs: 492 e 493), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V131 E357K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 493), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 503. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 503 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 558).

[00224] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V1 (p.ex., SEQ ID NOs: 306 e 307 ou SEQ ID NOs: 308 e 309), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 309), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 504. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 504 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 556).

[00225] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V103 (p.ex., SEQ ID NOs: 484 e 485 ou SEQ ID NOs: 486 e 487), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V103 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 487), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 505. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 505 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 557).

[00226] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V131 (p.ex., SEQ ID NOs: 490 e 491 ou SEQ ID NOs: 492 e 493), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V131 E357K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 493), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 388 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 389. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 390 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 391. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 389 e 506. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 506 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 558).

[00227] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4A, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 (p.ex., SEQ ID NO: 265 ou 266), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 507 ou SEQ ID NOs: 369 e 508. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 507). Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL- 21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 508).

[00228] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4A, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 (p.ex., SEQ ID NO: 265 ou 266), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 509 ou SEQ ID NOs: 369 e 510. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 509). Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL- 21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 510).

[00229] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4B, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e um ligante (p.ex., SEQ ID NO: 267), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 511. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 511).

[00230] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero como mostrado na Figura 4B, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e cada cadeia pesada compreende uma sequência de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e um ligante (p.ex., SEQ ID NO: 267), em que cada uma das duas muteínas de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., cada uma compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 512. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 512).

[00231] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V1 (p.ex., SEQ ID NOs: 306 e 307 ou SEQ ID NOs: 308 e 309), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 309), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 513. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 513 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 559).

[00232] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V103 (p.ex., SEQ ID NOs: 484 e 485 ou SEQ ID NOs: 486 e 487), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V103 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 487), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 514. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 514 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

[00233] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V131 (p.ex., SEQ ID NOs: 490 e 491 ou SEQ ID NOs: 492 e 493), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V131 E357K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 493), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76A (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 244). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 515. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 515 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 561).

[00234] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V1 (p.ex., SEQ ID NOs: 306 e 307 ou SEQ ID NOs: 308 e 309), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 309), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 516. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 516 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 559).

[00235] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V103 (p.ex., SEQ ID NOs: 484 e 485 ou SEQ ID NOs: 486 e 487), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V103 E356K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 487), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 517. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 517 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

[00236] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e um par de cadeias pesadas compreendendo sequências de região constante compreendendo mutações SEFL2-2 e mutações de pares de cargas V131 (p.ex., SEQ ID NOs: 490 e 491 ou SEQ ID NOs: 492 e 493), em que o monômero de muteína de IL-21 está anexado à cadeia pesada que contém as mutações de pares de carga V1 E357K e D399K (p.ex., o monômero de muteína de IL-21 está anexado a uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 493), e em que a muteína de IL-21 compreende as substituições de aminoácidos R9E e R76E (i.e., compreende a sequência de SEQ ID NO: 245). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 368 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 369. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende a cadeia pesada de SEQ ID NO: 370 ou a cadeia leve de SEQ ID NO: 371. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 369 e 518. Em aspectos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 518 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 561).

[00237] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4A ou 4B, monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C e um anticorpo anti-PD-1 compreendendo as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364), e uma sequência da região constante de cadeia pesada compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs 544-555. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4A ou 4B, monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 365-367), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20A2.003 (SEQ ID NOs: 362-364) e uma sequência da região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 525 ou 527.

[00238] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4A ou 4B, monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384), e uma sequência da região constante de cadeia pesada compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs 544-555. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4A ou 4B, monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 385-387), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 22D4.017 (SEQ ID NOs: 382-384) e uma sequência da região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO 529 ou 531.

[00239] Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4A ou 4B, monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354), e uma sequência da região constante de cadeia pesada compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs 544-555. Em casos exemplificativos, a proteína de fusão compreende um homodímero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4A ou 4B, monômero de muteína de IL-21 como mostrado na Figura 4C, em que o anticorpo anti-PD-1 compreende as três CDRs de cadeia leve do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 355-357), as três CDRs de cadeia pesada do anticorpo 20C1.009 (SEQ ID NOs: 352-354) e uma sequência da região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO 521 ou 523.

Proteínas de Ligação ao Antígeno

[00240] A presente divulgação proporciona proteínas de ligação ao antígeno PD-1. Em aspectos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno PD-1 é um anticorpo anti-PD- 1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 descrito aqui. Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende (a) uma sequência de aminoácidos da região determinante da complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada (HC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, e 382, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373, e 383 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374, e 384 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada (LC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, e 385 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 e 386 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, e 387, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (g) uma combinação de quaisquer duas ou mais de (a)-(f). Em aspectos exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 de LC, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentadas na Tabela D e pelo menos 1 ou 2 das sequências de aminoácidos de CDR de HC apresentadas na Tabela D. Em modalidades exemplificativas, a proteína de ligação ao antígeno compreende pelo menos 3, 4 ou 5 das sequências de aminoácidos designadas pelas SEQ ID NOs: em uma única coluna de Tabela D.

[00241] Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; e (h) SEQ ID NOs: 382-387. Em casos exemplificativos, as sequências de aminoácidos da Tabela D estão separadas por pelo menos um ou mais (p.ex., pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) aminoácido(s) interveniente(s). Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende (a) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela E ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378, e 388, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (b) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve apresentada na Tabela E ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, e 389, ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (c) tanto (a) como (b). Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1 compreende (I) um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389 e (II) uma região constante compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284311, 472-495, e 544-555. Em modalidades exemplificativas, a proteína de ligação ao antígeno compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391. Em modalidades exemplificativas, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com uma ou mais das SEQ ID NOs: acima.

[00242] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno descrita acima é um anticorpo anti-PD-1 ou um seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno.

[00243] A presente divulgação proporciona adicionalmente conjugados compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 descrita aqui e uma fração heteróloga. A fração heteróloga pode ser qualquer molécula que seja diferente da proteína de ligação ao antígeno PD-1 descrita aqui. A fração heteróloga, em aspectos exemplificativos, é um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo, um agente de direcionamento, uma etiqueta de diagnóstico, um polímero, um ácido nucleico, um ponto quântico, uma molécula pequena, uma toxina, um carboidrato, um aminoácido ou outro agente terapêutico ou de diagnóstico. Em aspectos exemplificativos, a fração heteróloga é uma muteína de IL-21 como descrito aqui.

[00244] A presente divulgação proporciona adicionalmente proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 descrita aqui e um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Em aspectos exemplificativos, o polipeptídeo heterólogo é uma muteína de IL-21 como descrito aqui.

Métodos de Preparação de Anticorpos

[00245] Métodos adequados de preparação de anticorpos, fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno e produtos de proteína de anticorpo são conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos de hibridoma padrão para produção de anticorpos são descritos em, p.ex., Harlow e Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988) e CA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nova Iorque, NY (2001)). Um método exemplificativo de preparação de anticorpos monoclonais anti-PD-1 ou da presente divulgação é proporcionado aqui nos EXEMPLOS.

[00246] Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica levando a maior produção de anticorpos pelo hospedeiro. Tais adjuvantes incluem mas não estão limitados a adjuvante de Freund, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, e substâncias de superfície ativa tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina da lapa-californiana e dinitrofenol. BCG (bacilos Calmette-Guérin) e Corynebacterium parvum são adjuvantes humanos potencialmente úteis.

[00247] Out ros métodos de produção de anticorpos são resumidos na Tabela F. TABELA F

[00248] Os métodos de teste de anticorpos quanto à capacidade de se ligarem a PD-1 independentemente de como os anticorpos são produzidos são conhecidos na técnica e incluem qualquer ensaio de ligação anticorpo-antígeno, tal como, por exemplo, radioimunoensaio (RIA), ELISA, transferência de Western, imunoprecipitação, SPR e ensaios de inibição competitiva (ver, p.ex., Janeway et al., infra e Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. No. 2002/0197266 e a seção acima se relacionando com ensaios de competição). Outros ensaios de ligação, p.ex., ensaios de ligação competitiva ou ensaios de competição, que testam a capacidade de um anticorpo de competir com um segundo anticorpo quanto à ligação a um antígeno, ou a um seu epítopo, são conhecidos na técnica e podem ser usados para testar o capacidade de um anticorpo de se ligar a PD-1. Ver, p.ex., Publicação de Pedido de Patente de E.U.A. No. US20140178905, Chand et al., Biologicals 46: 168-171 (2017); Liu et al., Anal Biochem 525: 89-91 (2017); ed Goolia et al., J Vet Diagn Invest 29 (2): 250-253 (2017). Igualmente, outros métodos de comparação de dois anticorpos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ressonância de plasmon de superfície (SPR). A SPR pode ser usada para se determinar as constantes de ligação do anticorpo e segundo anticorpo e as duas constantes de ligação podem ser comparadas.

Frações heterólogas: polímeros, carboidratos, lipídeos e agentes terapêuticos

[00249] Em modalidades exemplificativas, o conjugado da presente divulgação compreende uma muteína de IL-21 ligada a um polímero. Em algumas modalidades, o polímero é selecionado do grupo consistindo em: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos e seus derivados incluindo polialquilenoglicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, incluindo poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato de etila), poli(butilmetacrilato), poli(metacrilato de isobutila), poli(hexilmetacrilato), poli(metacrilato de isodecila), poli(metacrilato de laurila), poli(metacrilato de fenila), poli(acrilato de metila), poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila) e poli(acrilato de octadecila), polímeros de polivinila incluindo álcoois de polivinila, éteres de polivinila, ésteres de polivinila, haletos de polivinila, poli(acetato de vinila) e polivinilpirrolidona, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliuretanos e seus copolímeros, celuloses incluindo celulose de alquila, celuloses de hidroxialquila, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitroceluloses, celulose de metila, celulose de etila, celulose de hidroxipropila, celulose de hidróxi- propilmetila, celulose de hidroxibutilmetila, acetato de celulose, propionato de celulose, acetato butirato de celulose, acetato ftalato de celulose, celulose de carboxietila, triacetato de celulose e sal de sódio de sulfato de celulose, polipropileno, polietilenos incluindo poli(etilenoglicol), poli(óxido de etileno) e poli(tereftalato de etileno) e poliestireno. Em modalidades específicas, o polímero é um polialquilenoglicol, incluindo, por exemplo, polietilenoglicol (PEG).

[00250] Em modalidades exemplificativas, o conjugado da presente divulgação compreende uma muteína de IL-21 ligada a um carboidrato. Em algumas modalidades, o carboidrato é um monossacarídeo (p.ex., glucose, galactose, frutose), um dissacarídeo (p.ex., sacarose, lactose, maltose), um oligossacarídeo (p.ex., rafinose, estaquiose) ou um polissacarídeo (p.ex., amido, amilase, amilopectina, celulose, quitina, calose, laminarina, xilana, manana, fucoidana ou galactomanana).

[00251] Em algumas modalidades, a fração heteróloga é um lipídeo. O lipídeo, em algumas modalidades, é um ácido graxo, eicosanoide, prostaglandina, leucotrieno, tromboxano, N-acil etanolamina), glicerolipídeo (p.ex., gliceróis mono-, di-, tri-substituídos), glicerofosfolipídeo (p.ex., fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina), esfingolipídeo (p.ex., esfingosina, ceramida), lipídeo de esterol (p.ex., esteroide, colesterol), lipídeo de prenol, sacarolipídeo ou um policetídeo, óleo, cera, colesterol, esterol, vitamina solúvel em gordura, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, um fosfolipídeo.

[00252] Em modalidades exemplificativas, o conjugado da presente divulgação compreende uma muteína de IL-21 ligada a um agente terapêutico. O agente terapêutico pode ser qualquer um daqueles conhecidos na técnica. Em aspectos exemplificativos, o agente terapêutico é um agente de imunoterapia desde que o agente estimule uma resposta imunitária. Em aspectos exemplificativos, o agente de imunoterapia é vacina contra o câncer. Em aspectos exemplificativos, o agente de imunoterapia é um anticorpo monoclonal. Em aspectos exemplificativos, o agente de imunoterapia é um inibidor de pontos de controle imunitários, p.ex., um inibidor de CTLA4, PD-1, PD-L1. Em casos exemplificativos, o anticorpo monoclonal é específico de uma proteína em uma via de pontos de controle imunitários. A proteína da via de pontos de controle imunitários pode ser, por exemplo, CTLA4, PD-1, PD-L1, B7-H3, B7H4 ou TIM3. Por exemplo, as proteínas de ligação ao antígeno da presente divulgação podem ser conjugadas a atezolizumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, BMS-936558, MK3475, CT-011, AM- 224, MDX-1105, IMP321, MGA271.

[00253] Em aspectos exemplificativos, o agente terapêutico é uma citocina, linfocina, fator de crescimento ou fator hematopoiético eficaz na inibição de metástases tumorais e/ou tendo um efeito antiproliferativo em pelo menos uma população de células. Tais citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou outros fatores hematopoiéticos incluem, mas não estão limitados a: M-CSF, GM-CSF, TNF, IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFα, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, fator de células-tronco e eritropoietina. Fatores de crescimento adicionais para uso aqui incluem angiogenina, proteína morfogênica óssea-1, proteína morfogênica óssea-2, proteína morfogênica óssea-3, proteína morfogênica óssea-4, proteína morfogênica óssea-5, proteína morfogênica óssea-6, proteína morfogênica óssea-7, proteína morfogênica óssea-8, proteína morfogênica óssea-9, proteína morfogênica óssea-10, proteína morfogênica óssea-11, proteína morfogênica óssea- 12, proteína morfogênica óssea-13, proteína morfogênica óssea-14, proteína morfogênica óssea-15, receptor de proteína morfogênica óssea IA, receptor de proteína morfogênica óssea IB, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotrófico ciliar, receptor de fator neurotrófico ciliar α, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 1, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 2 α, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 2 β, fator de crescimento de células endoteliais β, endotelina 1, atrator de neutrófilos derivado do epitélio, receptor de fator neurotrófico derivado da linha de células gliais α 1, receptor de fator neurotrófico derivado da linha de células gliais α 2, proteína relacionada com o crescimento, proteína relacionada com o crescimento α, proteína relacionada com o crescimento β, proteína relacionada com o crescimento y, fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina, fator de crescimento de hepatócitos, receptor de fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento tipo insulina I, receptor de fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento tipo insulina II, proteína de ligação ao fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento de queratinócitos, fator inibidor da leucemia, receptor de fator inibidor da leucemia α, fator de crescimento nervoso, receptor de fator de crescimento nervoso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, fator estimulante do crescimento de células pré-B, fator de células-tronco, receptor de fator de células-tronco, fator de crescimento transformante α, fator de crescimento transformante β, fator de crescimento transformante β1, fator de crescimento transformante β1.2, fator de crescimento transformante β2, fator de crescimento transformante β3, fator de crescimento transformante β5, fator de crescimento transformante latente β1, proteína de ligação I ao fator de crescimento transformante β, proteína de ligação II ao fator de crescimento transformante β, proteína III de ligação ao fator de crescimento transformante β, receptor de fator de necrose tumoral tipo I, receptor de fator de necrose tumoral tipo II, receptor ativador do plasminogênio tipo urocinase e proteínas quiméricas e seus fragmentos biologicamente ou imunologicamente ativos. Em modalidades exemplificativos, o agente terapêutico compreende um anticorpo específico de qualquer uma das citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou outros fatores hematopoiéticos acima mencionados.

Ácidos nucleicos

[00254] A presente divulgação proporciona adicionalmente ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma muteína de IL-21 da presente divulgação, um conjugado compreendendo uma muteína de IL-21 ou uma proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21. Por exemplo, o ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos codificando uma cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-1 seguida por uma sequência de nucleotídeos codificando uma muteína de IL-21 da presente divulgação. A sequência de nucleotídeos codificando uma cadeia pesada e a sequência de nucleotídeos codificando a muteína de IL-21 podem flanquear uma sequência de nucleotídeos codificando um ligante de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 262). Em aspectos alternativos, o ácido nucleico não compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um ligante de peptídeo e a sequência de nucleotídeos codificando uma cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-1 está em tandem em relação à sequência de nucleotídeos codificando uma muteína de IL-21 da presente divulgação.

[00255] Em aspectos exemplificativos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma muteína de IL-21 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224255 e 283 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, e 283.

[00256] Em aspectos exemplificativos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um ligante de peptídeo de SEQ ID NO: 262 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 262.

[00257] Em aspectos exemplificativos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma região constante de anticorpo descrito aqui fundida a uma sequência de aminoácidos de qualquer muteína de IL-21 descrita aqui. Em casos exemplificativos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267 e 282 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267 e 282, fundida a qualquer uma de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255, e 283 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210222, 224-255, e 283. Em aspectos exemplificativos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 268281 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com SEQ ID NO: 268-281.

[00258] Em aspectos exemplificativos, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um anticorpo anti-PD-1 compreendendo uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311, 472-495 e 544-555 ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou tem mais do que cerca de 90% (p.ex., cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NO: 265267, 282, 284-311, 472-495 e 544-555.

[00259] A presente divulgação proporciona adicionalmente ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 da presente divulgação. Em aspectos exemplificativos, a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência codificando uma CDR de cadeia pesada ou CDR de cadeia leve, uma região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve ou sequência de cadeia pesada ou sequência de cadeia leve. Ver Tabela G em baixo. Em casos exemplificativos, a sequência de nucleotídeos compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 392-471. A presente divulgação proporciona adicionalmente pares de sequências de nucleotídeos compreendendo (a) SEQ ID NOs: 398 e 399, (b) SEQ ID NOs: 408 e 409, (c) SEQ ID NOs: 418 e 419, (d) SEQ ID NOs: 428 e 429, (e) SEQ ID NOs: 438 e 439, (f) SEQ ID NOs: 448 e 449, (g) SEQ ID NOs: 458 e 459 ou (h) SEQ ID NOs: 468 e 469. A presente divulgação proporciona adicionalmente pares de sequências de nucleotídeos compreendendo (a) SEQ ID NOs: 400 e 401, (b) SEQ ID NOs: 410 e 411, (c) SEQ ID NOs: 420 e 421, (d) SEQ ID NOs: 430 e 431, (e) SEQ ID NOs: 440 e 441, (f) SEQ ID NOs: 450 e 451, (g) SEQ ID NOs: 460 e 461 ou (h) SEQ ID NOs: 470 e 471. TABELA G

[00260] Em aspectos exemplificativos, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um conjugado ou proteína de fusão da presente divulgação. Por “ácido nucleico” como usado aqui inclui “polinucleotídeo”, “oligonucleotídeo” e “molécula de ácido nucleico” e significa geralmente um polímero de DNA ou RNA, ou suas formas modificadas, que podem ter fita simples ou fita dupla, sintetizado ou obtido (p.ex., isolado e/ou purificado) a partir de fontes naturais, que podem conter nucleotídeos naturais, não naturais ou alterados e que podem conter uma ligação internucleotídeos natural, não natural ou alterada, tal como uma ligação de fosforoamidato ou uma ligação de fosforotioato, em vez do fosfodiéster encontrado entre os nucleotídeos de um oligonucleotídeo não modificado. O ácido nucleico pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas ou polipeptídeos de ligação ao antígeno da presente divulgação. Em algumas modalidades, o ácido nucleico não compreende quaisquer inserções, deleções, inversões e/ou substituições. Em outras modalidades, o ácido nucleico compreende uma ou mais inserções, deleções, inversões e/ou substituições.

[00261] Em alguns aspectos, os ácidos nucleicos da presente divulgação são recombinantes. Como usado aqui, o termo “recombinante” se refere a (i) moléculas que são construídas fora de células vivas por união de segmentos de ácido nucleico naturais ou sintéticos a moléculas de ácido nucleico que podem se replicar em uma célula viva ou (ii) moléculas que resultam da replicação daquelas descritas em (i) acima. Para propósitos aqui, a replicação pode ser replicação in vitro ou replicação in vivo.

[00262] Os ácidos nucleicos em alguns aspectos são construídos com base em síntese química e/ou reações de ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra; e Ausubel et al., supra. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser quimicamente sintetizado usando nucleotídeos ocorrendo naturalmente ou nucleotídeos variadamente modificados concebidos para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física do dúplex formado após hibridação (p.ex., derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituídos por acridina). Exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usados para gerar os ácidos nucleicos incluem, mas não estão limitados a, 5- fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5- iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxi-hidroximetil)uracila, 5-carboximetilaminometil-2- tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracila, di- hidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina substituída em N, 7- metilguanina, 5-metilamometiluracila, 5- metoxiaminometil- 2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), vibutoxosina, pseudouratila, queosina, 2-tiocitosina, 5- metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5- metiluracila, metiléster do ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3- amino-3-N-2-carboxipropil)uracila e 2,6-diaminopurina. Alternativamente, um ou mais dos ácidos nucleicos da presente divulgação podem ser adquiridos a partir de empresas, tais como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) e Synthegen (Houston, TX).

Vetores

[00263] Os ácidos nucleicos da presente divulgação em alguns aspectos são incorporados em um vetor. A este respeito, a presente divulgação proporciona vetores compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos presentemente divulgados. Em aspectos exemplificativos, o vetor é um vetor de expressão recombinante. Para propósitos aqui, o termo “vetor de expressão recombinante” significa um construto de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo geneticamente modificado que permite a expressão de um mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo por uma célula hospedeira, quando o construto compreende uma sequência de nucleotídeos codificando o mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo, e o vetor é contatado com a célula sob condições suficientes para que o mRNA, proteína, polipeptídeo ou peptídeo seja expresso dentro da célula. Os vetores da presente divulgação não são naturalmente ocorrentes como um todo. No entanto, partes dos vetores podem ser naturalmente ocorrentes. Os vetores presentemente divulgados podem compreender qualquer tipo de nucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, DNA e RNA, que podem ter fita simples ou dupla, sintetizados ou obtidos em parte a partir de fontes naturais e que podem conter nucleotídeos naturais, não naturais ou alterados. Os vetores podem compreender ligações internucleotídeos ocorrendo naturalmente ou não ocorrendo naturalmente ou ambos os tipos de ligações. Em alguns aspectos, os nucleotídeos alterados ou ligações internucleotídeos não ocorrendo naturalmente não restringem a transcrição ou replicação do vetor.

[00264] O vetor da presente divulgação pode ser qualquer vetor adequado e pode ser usado para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. Vetores adequados incluem aqueles concebidos para propagação e expansão ou para expressão ou ambas, tais como plasmídeos e vírus. O vetor pode ser selecionado do grupo consistindo na série pUC (Fermentas Life Sciences), na série pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), na série pET (Novagen, Madison, WI), na série pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) e na série pEX (Clontech, Palo Alto, CA). Vetores de bacteriófagos, tais como ÀGTIO, ÀGTl 1, ÀZapII (Stratagene), ÀEMBL4 e ÀNMl 149, podem ser também usados. Exemplos de vetores de expressão de plantas incluem pBIOl, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Exemplos de vetores de expressão animal incluem pEUK-Cl, pMAM e pMAMneo (Clontech). Em alguns aspectos, o vetor é um vetor viral, p.ex., um vetor retroviral.

[00265] Os vetores da presente divulgação podem ser preparados usando técnicas de DNA recombinante padrão descritas em, por exemplo, Sambrook et al., supra e Ausubel et al., supra. Construtos de vetores de expressão, que são circulares ou lineares, podem ser preparados para conterem um sistema de replicação funcional em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Os sistemas de replicação podem ser derivados, p.ex., de CoIEl, plasmídeo 2 μ, À, SV40, vírus do papiloma bovino e similares.

[00266] Em alguns aspectos, o vetor compreende sequências reguladoras, tais como códons de iniciação e terminação da transcrição e tradução, que são específicas do tipo de hospedeiro (p.ex., bactéria, fungo, planta ou animal) no qual o vetor é para ser introduzido, como apropriado e tendo em consideração se o vetor é à base de DNA ou RNA.

[00267] O vetor pode incluir um ou mais genes marcadores, que permitem seleção de hospedeiros transformados ou transfectados. Os genes marcadores incluem resistência a biocidas, p.ex., resistência a antibióticos, metais pesados, etc., complementação em um hospedeiro auxotrófico para proporcionar prototrofia e similares. Os genes marcadores adequados para os vetores de expressão presentemente divulgados incluem, por exemplo, genes de resistência à neomicina/G418, genes de resistência à higromicina, genes de resistência ao histidinol, genes de resistência à tetraciclina e genes de resistência à ampicilina.

[00268] O vetor pode compreender um promotor nativo ou normativo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo (incluindo suas porções funcionais e variantes funcionais) ou à sequência de nucleotídeos que é complementar à ou que hibrida com a sequência de nucleotídeos codificando a IL-21, conjugado ou proteína de fusão. A seleção de promotores, p.ex., fortes, fracos, indutíveis, específicos de tecidos e específicos do desenvolvimento, está dentro da perícia do especialista. Similarmente, a combinação de uma sequência de nucleotídeos com um promotor está também dentro da perícia do especialista. O promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, p.ex., um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de RSV e um promotor encontrado na repetição de terminal longo do vírus das célula-troncos de murino.

Células hospedeiras

[00269] São proporcionadas aqui células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico ou vetor da presente divulgação. Como usado aqui, o termo “célula hospedeira” se refere a qualquer tipo de célula que pode conter o vetor presentemente divulgado e é capaz de produzir um produto de expressão codificado pelo ácido nucleico (p.ex., mRNA, proteína). A célula hospedeira em alguns aspectos é uma célula aderente ou uma célula suspensa, i.e., uma célula que cresce em suspensão. A célula hospedeira em aspectos exemplificativos é uma célula cultivada ou uma célula primária, i.e., isolada diretamente a partir de um organismo, p.ex., um humano. A célula hospedeira pode ser qualquer tipo de célula, pode ter origem de qualquer tipo de tecido e pode ser de qualquer etapa do desenvolvimento.

[00270] Em aspectos exemplificativos, a célula é uma célula eucariótica, incluindo, mas não se limitando a, uma célula de levedura, célula fúngica filamentosa, célula de protozoário, célula de alga, célula de inseto ou célula de mamífero. Tais células hospedeiras são descritas na técnica. Ver, p.ex., Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013). Em aspectos exemplificativos, as células eucarióticas são células de mamífero. Em aspectos exemplificativos, as células de mamífero são células de mamífero não humano. Em alguns aspectos, as células são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) e seus derivados (p.ex., CHO-K1, CHO pro-3, CS9), células de mieloma de camundongo (p.ex., NS0, GS-NS0, Sp2/0), células manipuladas para serem deficientes na atividade de di-hidrofolatorredutase (DHFR) (p.ex., DUKX- X11, DG44), células 293 renais embriônicas humanas (HEK293) ou seus derivados (p.ex., HEK293T, HEK293-EBNA), células renais de macaco-africano verde (p.ex., células COS, células VERO), células cancerosas cervicais humanas (p.ex., HeLa), células epiteliais de osteossarcoma ósseo humano U2-OS, células epiteliais basais alveolares humanas adenocarcinômicas A549, células de fibrossarcoma humano HT1080, células tumorais do cérebro humanas CAD, células de carcinoma embriônicas P19, células de fibroblastos de embrião de camundongo NIH 3T3, células de fibroblastos de camundongo L929, células de neuroblastoma de camundongo N2a, células de câncer da mama humano MCF-7, células de retinoblastoma Y79, células de retinoblastoma humano SO- Rb50, células cancerosas de fígado humanas Hep G2, células de mieloma B de camundongo J558L ou células renais de hamster bebê (BHK) (Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3 (2): 257-263 (2013)). Em uma modalidade particular, a célula hospedeira é CS9 (uma linha de células CHO).

[00271] Para propósitos de amplificação ou replicação do vetor, a célula hospedeira é em alguns aspectos uma célula procariótica, p.ex., uma célula bacteriana.

[00272] É também proporcionada pela presente divulgação uma população de células compreendendo pelo menos uma célula hospedeira descrita aqui. A população de células em alguns aspectos é uma população heterogênea compreendendo a célula hospedeira compreendendo vetores descritos, adicionalmente a pelo menos uma outra célula, que não compreende qualquer um dos vetores. Alternativamente, em alguns aspectos, a população de células é uma população substancialmente homogênea, na qual a população compreende maioritariamente células hospedeiras (p.ex., consistindo essencialmente em) compreendendo o vetor. A população em alguns aspectos é uma população clonal de células, na qual todas as células da população são clones de uma única célula hospedeira compreendendo um vetor, tal que todas as células da população compreendam o vetor. Em modalidades exemplificativas da presente divulgação, a população de células é uma população clonal compreendendo células hospedeiras compreendendo um vetor como descrito aqui.

Composições Farmacêuticas

[00273] Composições compreendendo uma muteína de IL-21, um conjugado compreendendo a muteína de IL-21, uma proteína de fusão compreendendo a muteína de IL-21 e um polipeptídeo, uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado compreendendo a proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), uma proteína de fusão compreendendo a proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira, da presente divulgação, ou uma sua combinação, são proporcionadas aqui. As composições em alguns aspectos compreendem a muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação, ou uma sua combinação, na forma isolada e/ou purificada. Em alguns aspectos, a composição compreende um único tipo (p.ex., estrutura) de uma muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação ou compreende uma combinação de dois ou mais tipos diferentes (p.ex., estruturas diferentes) de muteínas de IL-21, proteínas de ligação ao antígeno PD-1, conjugados, proteínas de fusão, ácidos nucleicos, vetores ou células hospedeiras da presente divulgação.

[00274] Em aspectos exemplificativos, a composição compreende agentes que intensificam as características físico-químicas da muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira, p.ex., através da estabilização, por exemplo, da muteína de IL-21 ou proteína de fusão a certas temperaturas (p.ex., temperatura ambiente), aumento da vida de prateleira, redução da degradação, p.ex., degradação mediada por protease de oxidação, aumento da meia-vida, por exemplo, da muteína de IL-21 ou proteína de fusão, etc. Em alguns aspectos, a composição compreende qualquer um dos agentes divulgados aqui como uma fração heteróloga ou fração conjugada, opcionalmente, em mistura com adição com as muteínas de IL-21, conjugados, proteínas de fusão, ácidos nucleicos, vetores ou células hospedeiras da presente divulgação.

[00275] Em aspectos exemplificativos da presente divulgação, a composição compreende adicionalmente um transportador, diluentes ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, as muteínas de IL-21, proteínas de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., anticorpos anti-PD-1), conjugados, proteínas de fusão, ácidos nucleicos, vetores ou células hospedeiras como presentemente divulgados (doravante referidos como “agentes ativos”) são formulados em uma composição farmacêutica compreendendo o agente ativo, em conjunto com um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A este respeito, a presente divulgação proporciona adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo um agente ativo (i.e., qualquer uma das muteínas de IL-21, proteínas de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., anticorpos anti-PD-1), conjugados, proteínas de fusão, ácidos nucleicos, vetores ou células hospedeiras da presente divulgação), composição farmacêutica essa que se destina à administração a um indivíduo, p.ex., um mamífero.

[00276] Em algumas modalidades, o agente ativo está presente na composição farmacêutica a um nível de pureza adequado para administração a um paciente. Em algumas modalidades, o agente ativo tem um nível de pureza de pelo menos cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% e um diluente, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composições contêm um agente ativo a uma concentração de cerca de 0,001 a cerca de 30,0 mg/mL.

[00277] Em aspectos exemplificativos, as composições farmacêuticas compreendem um transportador farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, o termo “transportador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um dos transportadores farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões tais como uma emulsão óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes molhantes. O termo engloba também qualquer um dos agentes aprovados por uma agência reguladora do governo federal dos EUA ou listados na Farmacopeia dos EUA para uso em animais, incluindo humanos.

[00278] A composição farmacêutica pode compreender qualquer ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, agentes acidificantes, aditivos, adsorventes, propulsores de aerossóis, agentes de deslocamento de ar, agentes alcalinizantes, agentes antiaglomerantes, anticoagulantes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, antissépticos, bases, aglutinantes, agentes tamponantes, agentes quelantes, agentes de revestimento, agentes corantes, dessecantes, detergentes, diluentes, desinfetantes, desintegrantes, agentes dispersantes, agentes intensificadores de dissolução, corantes, emolientes, agentes emulsificantes, estabilizantes da emulsão, enchimentos, agentes formadores de filme, intensificadores do sabor, agentes aromatizantes, intensificadores do fluxo, agentes gelificantes, agentes granulantes, umectantes, lubrificantes, mucoadesivos, bases de pomada, pomadas, veículos oleaginosos, bases orgânicas, bases de pastilhas, pigmentos, plastificantes, agentes de polimento, conservantes, agentes sequestrantes, penetrantes na pele, agentes solubilizantes, solventes, agentes estabilizantes, bases de supositórios, agentes com superfície ativa, surfatantes, agentes de suspensão, agentes adoçantes, agentes terapêuticos, agentes espessantes, agentes de tonicidade, agentes de toxicidade, agentes aumentadores da viscosidade, agentes absorvedores de água, cossolventes miscíveis em água, amaciadores de água ou agentes molhantes. Ver,p.ex., o Handbook of Pharmaceutical Excipients, Terceira Edição, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, Londres, RU, 2000), que é incorporado por referência na sua totalidade. Remington's Pharmaceutical Sciences, Décima Sexta Edição, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), que é incorporado por referência na sua totalidade.

[00279] Em aspectos exemplificativos, a composição farmacêutica compreende materiais de formulação que são não tóxicos para os receptores às dosagens e concentrações empregues. Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas compreendem um agente ativo e um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis; polióis; surfatantes; agentes de equilíbrio osmótico; agentes de tonicidade; antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes de volume; lioprotetores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; corantes; analgésicos; ou agentes farmacêuticos adicionais. Em aspectos exemplificativos, a composição farmacêutica compreende um ou mais polióis e/ou um ou mais surfatantes, opcionalmente, adicionalmente a um ou mais excipientes, incluindo, mas não se limitando a, sais farmaceuticamente aceitáveis; agentes de equilíbrio osmótico (agentes de tonicidade); antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes de volume; lioprotetores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; corantes; e analgésicos.

[00280] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Em tais modalidades, materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antibióticos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA)); agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil- beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais como glucose, manose ou dextrina); proteínas (tais como albumina, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, aromatizantes e diluentes; emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sais (tais como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool de fenetila, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcares (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; surfatantes ou agentes molhantes (tais como pluronics, PEG, ésteres de sorbitana, polissorbatos tais como polissorbato 20, polissorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes intensificadores da estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes intensificadores da tonicidade (tais como haletos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou de potássio, manitol, sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18'' Edição, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

[00281] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para alcançar um pH fisiologicamente compatível. Em algumas modalidades, o pH da composição farmacêutica pode ser por exemplo entre cerca de 4 ou cerca de 5 e cerca de 8,0 ou cerca de 4,5 e cerca de 7,5 ou cerca de 5,0 a cerca de 7,5. Em modalidades exemplificativas, o pH da composição farmacêutica é entre 5,5 e 7,5.

Vias de Administração

[00282] No que diz respeito à presente divulgação, o agente ativo, ou composição farmacêutica compreendendo o mesmo, pode ser administrado ao indivíduo através de qualquer via de administração adequada. Por exemplo, o agente ativo pode ser administrado a um indivíduo através de administração parenteral, nasal, oral, pulmonar, tópica, vaginal ou retal. A seguinte discussão sobre vias de administração é meramente proporcionada para ilustrar modalidades exemplificativas e não deve ser interpretada como limitando do escopo de modo algum.

[00283] As formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis isotônicas, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. O termo “parenteral” significa não através do canal alimentar mas por alguma outra via tal como subcutânea, intramuscular, intraespinhal ou intravenosa. O agente ativo da presente divulgação pode ser administrado com um diluente fisiologicamente aceitável em um transportador farmacêutico, tal como um líquido ou mistura de líquidos estéreis, incluindo água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, um álcool, tal como etanol ou álcool de hexa-decila, um glicol, tal como propilenoglicol ou polietilenoglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetais tais como 2,2-dimetil-l53-dioxolano-4- metanol, éteres, poli(etilenoglicol) 400, óleos, ácidos graxos, ésteres ou glicerídeos de ácidos graxos ou glicerídeos de ácidos graxos acetilados com ou sem a adição de um surfatante farmaceuticamente aceitável, tal como um sabão ou um detergente, agente de suspensão, tal como pectina, carbômeros, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelulose ou agentes emulsificantes e outros adjuvantes farmacêuticos.

[00284] Os óleos que podem ser usados em formulações parenterais incluem óleos de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos. Exemplos específicos de óleos incluem óleo de amendoim, soja, gergelim, semente de algodão, milho, azeite, petrolato e mineral. Ácidos graxos adequados para uso em formulações parenterais incluem ácido oleico, ácido esteárico e ácido isoesteárico. Oleato de etila e miristato de isopropila são exemplos de ácidos graxos adequados.

[00285] Sabões adequados para uso em formulações parenterais incluem sais de metais alcalinos graxos, amônio e trietanolamina, e detergentes adequados incluem (a) detergentes catiônicos tais como, por exemplo, haletos de dimetil dialquil amônio e haletos de alquil piridínio, (b) detergentes aniônicos tais como, por exemplo, sulfonatos de alquila, arila e olefina, sulfatos de alquila, olefina, éter e monoglicerídeo e sulfossuccinatos, (c) detergentes não iônicos tais como, por exemplo, óxidos de aminas graxas, alcanolamidas de ácidos graxos e copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfotéricos tais como, por exemplo, alquil-β-aminopropionatos e sais de amônio quaternário de 2-alquil-imidazolina e (e) suas misturas.

[00286] As formulações parenterais em algumas modalidades contêm de cerca de 0,5% a cerca de 25% em peso do agente ativo da presente divulgação em solução. Conservantes e tampões podem ser usados. De modo a minimizar ou eliminar a irritação no local da injeção, tais composições podem conter um ou mais surfatantes não iônicos tendo um equilíbrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de cerca de 12 a cerca de 17. A quantidade de surfatante em tais formulações variará normalmente de cerca de 5% a cerca de 15% em peso. Surfatantes adequados incluem ésteres de ácidos graxos de sorbitana de polietilenoglicol, tais como mono-oleato de sorbitana e os adutos de elevado peso molecular de óxido de etileno com uma base hidrofóbica, formados pela condensação de óxido de propileno com propilenoglicol. As formulações parenterais em alguns aspectos são apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou multidose, tais como ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição criodessecada (liofilizada) requerendo somente a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas em alguns aspectos são preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo previamente descrito.

[00287] As formulações injetáveis estão de acordo com a presente divulgação. Os requisitos para transportadores farmacêuticos eficazes para composições injetáveis são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, p.ex., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, JB Lippincott Company, Filadélfia, PA, Banker e Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982) e ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622630 (1986)).

Dosagens

[00288] Se acredita que os agentes ativos da divulgação são úteis em métodos de inibição de uma sinalização de PD- 1, enquanto proporcionam sinalização de IL-21, como descrito aqui, e se acredita assim que são úteis em métodos de tratamento ou prevenção de uma ou mais doenças, p.ex., câncer. Para propósitos da divulgação, a quantidade ou dose do agente ativo administrado deve ser suficiente para efetuar, p.ex., uma resposta terapêutica ou profilática, no indivíduo ou animal, ao longo de um período de tempo razoável. Por exemplo, a dose do agente ativo da presente divulgação deve ser suficiente para tratar o câncer como descrito aqui em um período de cerca de 1 a 4 minutos, 1 a 4 horas ou 1 a 4 semanas ou mais, p.ex., 5 a 20 ou mais semanas, a partir do momento de administração. Em certas modalidades, o período de tempo poderia ser ainda maior. A dose será determinada pela eficácia do agente ativo particular e pela condição do animal (p.ex., humano), bem como pelo peso corporal do animal (p.ex., humano) a ser tratado.

[00289] Muitos ensaios para determinação de uma dose administrada são conhecidos na técnica. Para propósitos aqui, um ensaio, que compreende comparação da extensão de tratamento do câncer após administração de uma dada dose do agente ativo da presente divulgação a um mamífero entre um conjunto de mamíferos, a cada conjunto dos quais é dada uma dose diferente do agente ativo, poderia ser usado para se determinar uma dose de partida a ser administrada a um mamífero. A extensão de tratamento do câncer após administração de uma certa dose pode ser representada, por exemplo, pela citotoxicidade do agente ativo ou pela extensão da regressão tumoral alcançada com o agente ativo em um modelo de xenoenxerto de camundongo. Métodos de medição da citotoxicidade das proteínas de fusão e métodos de avaliação da regressão tumoral são conhecidos na técnica.

[00290] A dose do agente ativo da presente divulgação será também determinada pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos secundários adversos que poderiam acompanhar a administração de um agente ativo particular da presente divulgação. Tipicamente, o médico assistente decidirá a dosagem do agente ativo da presente divulgação com a qual cada paciente deve ser tratado, tendo em consideração uma variedade de fatores, tais como idade, peso corporal, saúde geral, dieta, sexo, agente ativo da presente divulgação a ser administrado, via de administração e a gravidade da condição sendo tratada. A título de exemplo e não pretendendo limitar a presente divulgação, a dose do agente ativo da presente divulgação pode ser cerca de 0,0001 a cerca de 1 g/kg de peso corporal do indivíduo sendo tratado/dia, de cerca de 0,0001 a cerca de 0,001 g/kg de peso corporal/dia ou cerca de 0,01 mg a cerca de 1 g/kg de peso corporal/dia.

Formulações de Liberação Controlada

[00291] Em algumas modalidades, os agentes ativos descritos aqui podem ser modificados em uma forma de depósito, tal que a maneira pela qual o agente ativo da presente divulgação é liberado no corpo ao qual é administrado seja controlada no que diz respeito ao tempo e localização dentro do corpo (ver, por exemplo, Patente dos E.U.A. No. 4,450,150). As formas de depósito de agentes ativos da presente divulgação podem ser, por exemplo, uma composição implantável compreendendo os agentes ativos e um material poroso ou não poroso, tal como um polímero, em que o agente ativo é encapsulado pelo ou difundido ao longo do material e/ou degradação do material não poroso. O depósito é depois implantado na localização desejada dentro do corpo do indivíduo e o agente ativo é liberado a partir do implante a uma taxa predeterminada.

[00292] A composição farmacêutica compreendendo o agente ativo em certos aspectos é modificada para ter qualquer tipo de perfil de liberação in vivo. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é uma formulação de liberação imediata, liberação controlada, liberação sustentada, liberação prolongada, liberação retardada ou liberação bifásica. Métodos de formulação de peptídeos para liberação controlada são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009) e Publicações de Pedidos de Patentes Internacionais Nos. WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; e WO 1999/040942.

[00293] As presentes composições podem adicionalmente compreender, por exemplo, micélios ou lipossomos, ou alguma outra forma encapsulada, ou podem ser administradas em uma forma de liberação prolongada para proporcionar um efeito de armazenamento e/ou distribuição prolongado.

Combinações

[00294] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão ou proteínas de ligação ao antígeno (p.ex., anticorpo anti-PD- 1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1) descritas aqui são administradas sozinhas e, em modalidades alternativas, são administrado em combinação com outro agente terapêutico, p.ex., outro agente ativo da invenção de tipo diferente (p.ex., estrutura). Em alguns aspectos, o outro terapêutico pretende tratar ou prevenir o câncer. Em algumas modalidades, o outro terapêutico é um agente quimioterapêutico. Em algumas modalidades, o outro terapêutico é um agente usado em radioterapia para o tratamento do câncer. Conformemente, em alguns aspectos, as proteínas de fusão ou proteínas de ligação ao antígeno (p.ex., anticorpo anti-PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1) descritas aqui são administradas em combinação com um ou mais de compostos de coordenação da platina, inibidores da topoisomerase, antibióticos, alcaloides antimitóticos e difluoronucleosídeos. Em aspectos exemplificativos, uma proteína de fusão IL-21 descrita aqui (p.ex., um anticorpo anti-PD-1 fundido a uma muteína de IL-21) é combinada com uma proteína de ligação ao antígeno (p.ex., anticorpo anti- PD-1, seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno ou produto de proteína de anticorpo anti-PD-1).

[00295] Em modalidades específicas, qualquer um dos anticorpos 20A2, 20C1, 22D4, 20C1.006, 20C1.009, 20A2.003, 22D4.006, 22D4.017 é administrado em combinação com uma proteína de fusão de IL-21 descrita aqui incluindo, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo um homodímero ou monômero selecionado de: um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 496); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e a cadeia pesada-muteína de IL-21 fundida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 497); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 498); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 499); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 500); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 501 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 555); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 502 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 556); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 503 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 557); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 504 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 555); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 505 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 556); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 391) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 506 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 557); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 507); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 508); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 509); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 510); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 511); um homodímero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo (cada uma das quais está fundida a uma muteína de IL-21, e cada fusão cadeia pesada-muteína de IL-21 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 512); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 513 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 558); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 514 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 559); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 515 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 560); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 516 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 558); um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 517 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 559); ou um monômero compreendendo duas cadeias leves de anticorpo (cada uma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371) e duas cadeias pesadas de anticorpo diferentes (uma das quais está fundida a uma muteína de IL- 21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 518 e uma das quais não está fundida a uma muteína de IL-21 e compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 560).

Estojos

[00296] A presente divulgação proporciona adicionalmente estojos compreendendo uma muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação ou uma sua combinação. O estojo em aspectos exemplificativos compreende pelo menos uma muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação, ou uma sua combinação, em um recipiente. Em aspectos exemplificativos, a pelo menos uma muteína de IL- 21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação é proporcionado no estojo como uma dose unitária. Para propósitos aqui, “dose unitária” se refere a uma quantidade discreta dispersa em um transportador adequado. Em aspectos exemplificativos, a dose unitária é a quantidade suficiente para proporcionar a um indivíduo um efeito desejado, p.ex., tratamento do câncer. Em aspectos exemplificativos, o estojo compreende várias doses unitárias, p.ex., um fornecimento semanal ou mensal de doses unitárias, opcionalmente, cada uma das quais é individualmente empacotada ou de outro modo separada de outras doses unitárias. Em algumas modalidades, os componentes do estojo/dose unitária são empacotados com instruções para administração a um paciente. Em algumas modalidades, o estojo compreende um ou mais dispositivos para administração a um paciente, p.ex., uma agulha e seringa, e similares. Em alguns aspectos, a pelo menos uma muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação, ou uma sua combinação, é/são pré-empacotados em uma forma pronta para usar, p.ex., uma seringa, um saco intravenoso, etc. Em aspectos exemplificativos, a forma pronta para usar é para um único uso. Em aspectos exemplificativos, o estojo compreende múltiplas formas prontas a usar, de único uso da pelo menos uma muteína de IL-21, proteína de ligação ao antígeno PD-1 (p.ex., um anticorpo anti-PD-1), um conjugado, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira da presente divulgação. Em alguns aspectos, o estojo compreende adicionalmente outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis (p.ex., solventes, tampões, diluentes, etc.), incluindo qualquer um daqueles descritos aqui.

Métodos de Manufatura

[00297] As muteínas de IL-21 da presente divulgação podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica. Métodos adequados de síntese de novo de polipeptídeos são descritos em, por exemplo, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; e Patente dos E.U.A. No. 5,449,752. Métodos exemplificativos adicionais de preparação dos peptídeos da invenção são apresentados aqui.

[00298] Em algumas modalidades, as muteínas de IL-21 descritas aqui são comercialmente sintetizadas por empresas, tais como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), Multiple Peptide Systems (San Diego, CA), Peptide 2.0 Inc. (Chantilly, VA) e American Peptide Co. (Sunnyvale, CA). A este respeito, as muteínas de IL-21 podem ser sintéticas, recombinantes, isoladas e/ou purificadas.

[00299] Igualmente, em alguns aspectos, as muteínas de IL-21 são recombinantemente produzidas usando um ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos do peptídeo usando métodos recombinantes padrão. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994.

[00300] Métodos de preparação de uma muteína de IL-21 são proporcionados aqui. O método, em modalidades exemplificativas, compreende cultura de uma célula hospedeira da presente divulgação para expressar a muteína de IL-21 e coleta da muteína de IL-21 expressa.

[00301] Métodos de preparação de proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 são também proporcionados aqui. O método, em modalidades exemplificativas, compreende cultura de uma célula hospedeira da presente divulgação para expressar a proteína de fusão e coleta da proteína de fusão expressa.

[00302] Em modalidades exemplificativos, o método compreende cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando a muteína de IL-21 ou proteína de fusão como descrito aqui de modo a expressar a muteína de IL-21 ou proteína de fusão. A célula hospedeira pode ser qualquer uma das células hospedeiras descritas aqui. Em aspectos exemplificativos, a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em: células CHO, células NS0, células COS, células VERO e células BHK. Em aspectos exemplificativos, o passo de cultura de uma célula hospedeira compreende cultura da célula hospedeira em um meio de crescimento para apoiar o crescimento e expansão da célula hospedeira. Em aspectos exemplificativos, o meio de crescimento aumenta a densidade celular, a viabilidade da cultura e a produtividade de uma maneira oportuna. Em aspectos exemplificativos, o meio de crescimento compreende aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos, glucose e soro como uma fonte de fatores de crescimento, hormônios e fatores de anexação. Em aspectos exemplificativos, o meio de crescimento é um meio totalmente quimicamente definido consistindo em aminoácidos, vitaminas, elementos vestigiais, sais inorgânicos, lipídeos e insulina ou fatores de crescimento tipo insulina. Adicionalmente aos nutrientes, o meio de crescimento ajuda também a manter o pH e a osmolalidade. Vários meios de crescimento estão comercialmente disponíveis e são descritos na técnica. Ver, p.ex., Arora, “Cell Culture Media: A Review” MATER METHODS 3: 175 (2013).

[00303] Em aspectos exemplificativos, o método de preparação de uma muteína de IL-21 ou proteína de fusão da presente divulgação compreende cultura da célula hospedeira em um meio de alimentação. Em aspectos exemplificativos, o método compreende cultura em um meio de alimentação em um modo descontínuo com alimentação. Métodos de produção de proteínas recombinantes são conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Li et al., “Cell culture processes for monoclonal antibody production” MAbs 2 (5): 466-477 (2010).

[00304] O método preparação de uma muteína de IL-21 ou proteína de fusão pode compreender um ou mais passos para purificação da muteína ou proteína a partir de uma cultura celular ou do seu sobrenadante e preferencialmente recuperação da proteína purificada. Em aspectos exemplificativos, o método compreende um ou mais passos de cromatografia, p.ex., cromatografia de afinidade (p.ex., cromatografia de afinidade por proteína A), cromatografia de permuta iônica, cromatografia de interação hidrofóbica. Em aspectos exemplificativos, o método compreende purificação da proteína usando uma resina de cromatografia de afinidade por Proteína A.

[00305] Em modalidades exemplificativas, o método compreende adicionalmente passos para formulação da proteína purificada, etc., obtendo deste modo uma formulação compreendendo a proteína purificada. Tais passos são descritos em Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing, eds. Jameel and Hershenson, John Wiley & Sons, Inc. (Hoboken, NJ), 2010.

Métodos de Uso

[00306] Métodos de tratamento são adicionalmente proporcionados pela presente divulgação. O método, em modalidades exemplificativas, é um método de tratamento de um indivíduo com sua necessidade, compreendendo administração ao indivíduo com sua necessidade de uma composição farmacêutica da presente divulgação em uma quantidade eficaz para tratar o indivíduo.

[00307] As composições farmacêuticas da presente divulgação são úteis para inibição da sinalização de PD-1 e/ou ativação da sinalização de IL-21. Sem estar limitado a uma teoria particular, [1] a atividade inibidora de PD-1 das composições proporcionadas aqui permite que tais entidades sejam úteis em métodos de intensificação da atividade de células T e intensificação de uma resposta imunitária e, em particular, uma resposta imunitária contra um tumor ou câncer; e/ou [2] a atividade ativante de IL-21 das composições proporcionadas aqui permite que tais entidades intensifiquem a sobrevivência e função efetora de células T, restrinjam a diferenciação terminal e perda de potencial replicativo, promovam a longevidade de células T por desvio das células efetoras ativadas na direção de um fenótipo de célula T mais ingênuo (p.ex., por intensificação da expressão de CCR7) e intensifiquem a citotoxicidade contra a célula alvo (p.ex., cancerosa) (p.ex., por aumento da produção de IFNY e granzima B).

[00308] Conformemente são proporcionados aqui métodos de intensificação da atividade de células T em um indivíduo, intensificação da sobrevivência e função efetora de células T, restrição da diferenciação terminal e perda de potencial replicativo, promoção da longevidade de células T e intensificação da citotoxicidade contra células alvo (p.ex., cancerosas). Em modalidades exemplificativas, os métodos compreendem administração ao indivíduo da composição farmacêutica da presente divulgação em uma quantidade eficaz. Em aspectos exemplificativos, a atividade de células T ou resposta imunitária é dirigida contra uma célula cancerosa ou tecido canceroso ou uma célula tumoral ou tumor. Em aspectos exemplificativos, a resposta imunitária é uma resposta imunitária humoral. Em aspectos exemplificativos, a resposta imunitária é uma resposta imunitária inata. Em aspectos exemplificativos, a resposta imunitária que é intensificada é uma resposta imunitária mediada por células T.

[00309] Como usado aqui, o termo “intensificar” e palavras decorrendo dele pode não ser uma intensificação ou aumento de 100% ou completo. Ao invés existem graus variáveis de intensificação dos quais um perito na técnica reconhece como tendo um benefício potencial ou efeito terapêutico. A este respeito, as composições farmacêuticas da presente divulgação podem intensificar, p.ex., a atividade de células T ou intensificar uma resposta imunitária, até qualquer quantidade ou nível. Em modalidades exemplificativas, a intensificação proporcionada pelos métodos da presente divulgação é pelo menos ou cerca de uma intensificação de 10% (p.ex., pelo menos ou cerca de uma intensificação de 20%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 30%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 40%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 50%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 60%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 70%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 80%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 90%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 95%, pelo menos ou cerca de uma intensificação de 98%).

[00310] Métodos de medição da atividade de células T e respostas imunitárias são conhecidos na técnica. A atividade de células T pode ser medida por, por exemplo, um ensaio de citotoxicidade, tal como aqueles descritos em Fu et al., PLoS ONE 5 (7): e11867 (2010). Outros ensaios de atividade de células T são descritos em Bercovici et al., Clin Diagn Lab Immunol. 7 (6): 859-864 (2000). Métodos de medição de respostas imunitárias são descritos, p.ex., Macatangay et al., Clin Vaccine Immunol 17 (9): 1452-1459 (2010) e Clay et al., Clin Cancer Res. 7 (5): 1127-35 (2001).

[00311] São adicionalmente proporcionados aqui métodos de tratamento de um indivíduo com câncer e métodos de tratamento de um indivíduo com um tumor sólido. Em modalidades exemplificativas, o método compreende administração ao indivíduo da composição farmacêutica da presente divulgação em uma quantidade eficaz para tratamento do câncer ou do tumor sólido no indivíduo. O câncer tratável pelos métodos divulgados aqui pode ser qualquer câncer, p.ex., qualquer crescimento ou tumor maligno causado por divisão celular anormal e descontrolada que pode se espalhar para outras partes do corpo através do sistema linfático ou da corrente sanguínea. O câncer em alguns aspectos é um selecionado do grupo consistindo em câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossarcoma alveolar, câncer do osso, câncer do cérebro, câncer da mama, câncer do ânus, canal anal ou anorreto, câncer do olho, câncer do ducto biliar intra-hepático, câncer das articulações, câncer do pescoço, vesícula biliar ou pleura, câncer do nariz, cavidade nasal ou ouvido médio, câncer da cavidade oral, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer do cólon, câncer esofágico, câncer cervical, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma de Hodgkin, câncer da hipofaringe, câncer do rim, câncer da laringe, câncer do fígado, câncer do pulmão, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer da nasofaringe, linfoma de não Hodgkin, câncer do ovário, câncer do pâncreas, peritônio, omento e mesentério, câncer da faringe, câncer da próstata, câncer retal, câncer renal (p.ex., carcinoma das células renais (RCC)), câncer do intestino delgado, câncer do tecido mol, câncer do estômago, câncer testicular, câncer da tireoide, câncer do ureter e câncer da bexiga urinária. Em aspectos particulares, o câncer é selecionado do grupo consistindo em: cânceres da cabeça e pescoço, ovário, cervical, bexiga e esofágico, cânceres pancreático, gastrointestinal, cânceres gástricos, mama, endometrial e colorretal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, câncer da bexiga, pulmão, p.ex., câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar. Em modalidades particulares, o tumor é câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer da cabeça e pescoço, câncer renal, câncer da mama triplo negativo e câncer gástrico. Em aspectos exemplificativos, o indivíduo tem um tumor (p.ex., um tumor sólido, uma malignidade hematológica ou uma malignidade linfoide) e a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar o tumor no indivíduo. Em outros aspectos exemplificativos, o tumor é câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer do pulmão de células pequenas (SCLC), câncer da cabeça e pescoço, câncer renal, câncer da mama, melanoma, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer da próstata, câncer gástrico, linfoma ou leucemia, e a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar o tumor no indivíduo.

[00312] Como usado aqui, o termo “tratar”, bem como as palavras relacionadas com ele, não implicam necessariamente tratamento a 100% ou completo. Ao invés existem graus variáveis de tratamento dos quais um perito na técnica reconhece como tendo um benefício potencial ou efeito terapêutico. A este respeito, os métodos de tratamento de câncer da presente divulgação podem proporcionar qualquer quantidade ou qualquer nível de tratamento. Além do mais, o tratamento proporcionado pelo método da presente divulgação pode incluir tratamento de uma ou mais condições ou sintomas ou sinais do câncer sendo tratado. Igualmente, o tratamento proporcionado pelos métodos da presente divulgação pode englobar desaceleração da progressão do câncer. Por exemplo, os métodos podem tratar o câncer em virtude de intensificarem a atividade de células T ou uma resposta imunitária contra o câncer, reduzirem o crescimento tumoral ou canceroso, reduzirem as metástases de células tumorais, aumentarem a morte celular de células tumorais ou cancerosas e similares. Em aspectos exemplificativos, o método trata por meio de retardar o início ou ocorrência do câncer em 1 dia, 2 dias, 4 dias, 6 dias, 8 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, dois meses, 4 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 4 anos ou mais. Em aspectos exemplificativos, os métodos tratam por meio aumentarem a sobrevivência do indivíduo.

Indivíduos

[00313] Em algumas modalidades da presente divulgação, o indivíduo é um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, mamíferos da ordem Rodentia, tais como ratos e hamsters, e mamíferos da ordem Logomorpha, tais como coelhos, mamíferos da ordem Carnivora, incluindo Felinos (gatos) e Caninos (cães), mamíferos da ordem Artiodactyla, incluindo Bovinos (vacas) e Suínos (porcos) ou da ordem Perssodactyla, incluindo Equídeos (cavalos). Em alguns aspectos, os mamíferos são da ordem Primatas, Ceboides ou Simoides (macacos) ou da ordem Antropoides (humanos e símios). Em alguns aspectos, o mamífero é um humano.

Modalidades Exemplificativas

[00314] Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona uma muteína de IL-21 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2), em que “X” representa qualquer aminoácido, e em que a sequência de aminoácidos de muteína de IL-21 difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em pelo menos 1 aminoácido.

[00315] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em não mais do que 7 aminoácidos. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos. Em casos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em 1 ou 2 aminoácidos. Em aspectos exemplificativos, a(s) diferença(s) entre a sequência de aminoácidos da muteína de IL-21 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 está/estão dentro dos aminoácidos 10-15, inclusive, ou aminoácidos 105-123, inclusive, de SEQ ID NO: 2, opcionalmente, em que a(s) diferença(s) ocorre(m) nos aminoácidos 11, 14, 15, 109, 110, 112, 113, 116, 119, 120 e/ou 123 de SEQ ID NO: 2. Em aspectos exemplificativos, a(s) diferença(s) entre a sequência de aminoácidos da muteína de IL-21 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 está/estão dentro dos aminoácidos 5-25, inclusive, ou aminoácidos 65-80, inclusive, de SEQ ID NO: 2, opcionalmente, em que a(s) diferença(s) ocorre(m) nos aminoácidos 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, e/ou 80 de SEQ ID NO: 2.

[00316] Em alguns aspectos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos com uma substituição de aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1). Em alguns casos, a substituição de aminoácidos ocorre na posição 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 ou 123 de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, a substituição de aminoácidos ocorre na posição 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120 ou 123 de SEQ ID NO: 1. Em casos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos: a. na posição 5, 8, 9, 12, 14, 15, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 116, ou 119 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido alifático. b. na posição 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 110, 112, 116, 117, 119, 120, ou 123 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido ácido; c. na posição 5, 9, 73, 76, 109, 113 ou 116 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido básico; d. na posição 5, 8, 9, 70 ou 76 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido aromático; e. na posição 5, 8, 9, 12, 15, 73, 76, 116 ou 119 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido compreendendo uma amida de cadeia lateral; f. na posição 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 73, 76, 116 ou 119 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido não aromático compreendendo uma hidroxila de cadeia lateral; g. na posição 65, 66, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77 ou 80 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um iminoácido; h. na posição 5, 9, 15, 76, 116 ou 119 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral contendo enxofre; ou i. ou uma sua combinação.

[00317] Em aspectos exemplificativos, o aminoácido substituto é um aminoácido ocorrendo naturalmente. Em alguns casos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos por um aminoácido na posição de acordo com a TABELA A. A Tabela A é mostrada em baixo. TABELA A

[00318] Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona uma muteína de IL-21 compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 3-21, 23-56, 58-112, 114-208, 210-222, 224-255 e 283.

[00319] Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma sequência de aminoácidos com duas substituições de aminoácidos, em relação à sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1). Em aspectos exemplificativos, a substituição de aminoácidos ocorre em duas das posições 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 109, 110, 112, 113, 116, 117, 119, 120, ou 123 de SEQ ID NO: 1. Em casos exemplificativos, as substituições de aminoácidos ocorrem em duas das posições 5, 9, 15, 70, 71, 72, 73, e 76 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, as substituições de aminoácidos ocorrem em duas das posições 5, 9, 73 e 76 de SEQ ID NO: 1. Em alguns aspectos, uma das substituições ocorre na posição 76 de SEQ ID NO: 1. Em casos exemplificativos, o aminoácido substituído na posição 76 de SEQ ID NO: 1 é um aminoácido alifático ou um aminoácido ácido. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos na posição 5, 9 ou 73 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido alifático ou aminoácido ácido. Em alguns aspectos, a muteína de IL-21 compreende uma substituição de aminoácidos na posição 5 de SEQ ID NO: 1, e o aminoácido substituto é um aminoácido com uma amida de cadeia lateral. Em alguns casos, o aminoácido alifático é alanina, o aminoácido ácido é ácido glutâmico ou o aminoácido com uma amida de cadeia lateral é glutamina. A presente divulgação, em modalidades exemplificativas, proporciona uma muteína de IL-21 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 208, 210 a 222, 224 a 248 e 255.

[00320] No que diz respeito a qualquer um dos aspectos acima, a muteína de IL-21 pode se ligar ao receptor de IL- 21 com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL- 21 de tipo selvagem pelo receptor de IL-21. Em alguns aspectos, o receptor de IL-21 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 256 ou 261. Em alguns casos, a muteína de IL-21 se liga à cadeia gama de um receptor de IL- 21 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 257. Em casos exemplificativos, a muteína de IL-21 da presente divulgação se liga ao receptor de IL-21 humano de com uma Kd que é maior do que ou é cerca de 0,04 nM.

[00321] São adicionalmente proporcionados conjugados. Em aspectos exemplificativos, o conjugado compreende uma muteína de IL-21 de qualquer um dos parágrafos precedentes e uma fração heteróloga. Em casos exemplificativos, a IL-21 está diretamente anexada à fração heteróloga. Em casos alternativos, a IL-21 está anexada à fração heteróloga através de um ligante. Em alguns aspectos, o ligante compreende um peptídeo, p.ex., compreendendo uma sequência de aminoácidos de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 262). Em aspectos exemplificativos, a fração heteróloga é um polipeptídeo, opcionalmente, em que o polipeptídeo é uma proteína de ligação ao antígeno. Em alguns casos, o polipeptídeo heterólogo é um anticorpo ou um seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo é um anticorpo anti-PD-1. Em alguns aspectos, a muteína de IL-21 está diretamente anexada ao Fc do anticorpo. Em aspectos exemplificativos, a muteína de IL-21 está anexada ao Fc do anticorpo através de um ligante. O conjugado em alguns aspectos compreende uma muteína de IL-21 única, em que a referida muteína de IL-21 única está ligada ao terminal C de uma das duas cadeias pesadas de anticorpo. Em casos exemplificativos, o conjugado compreende duas muteínas de IL-21, em que a primeira muteína de IL-21 está ligada ao terminal C da primeira cadeia pesada de anticorpo e a segunda muteína de IL-21 está ligada ao terminal C da segunda cadeia pesada de anticorpo. Opcionalmente, a primeira IL-21 tem a mesma sequência de aminoácidos que a segunda muteína de IL-21. Alternativamente, a primeira IL-21 tem uma sequência de aminoácidos diferente da segunda muteína de IL-21. Em aspectos exemplificativos, as cadeias pesadas de anticorpo compreendem mutações de pares de carga (p.ex., as mutações V1, V4, V103 ou V131). Em aspectos exemplificativos do conjugado de qualquer um dos parágrafos precedentes, a muteína de IL-21 compreende substituições de aminoácidos em duas das posições 5, 9, 73 e 76 de SEQ ID NO: 1. Em aspectos exemplificativos, o conjugado compreende uma muteína de IL- 21 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, exceto que a referida muteína de IL-21 compreende duas substituições de aminoácidos em quaisquer duas das posições 5, 9, 73 e 76 de SEQ ID NO: 1 e um anticorpo anti-PD-1, em que a muteína de IL-21 está ligada ao terminal C do anticorpo anti-PD-1. Em aspectos exemplificativos, o conjugado compreende um anticorpo anti-PD-1 compreendendo (a) uma sequência de aminoácidos da região determinante da complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada (HC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 e 382 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 e 383 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374 e 384 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve (LC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375 e 385 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 e 386 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377 e 387 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (g) uma combinação de quaisquer duas ou mais de (a)-(f). Em casos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; e (h) SEQ ID NOs: 382-387. Em alguns aspectos, o anticorpo anti- PD-1 compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389. Em aspectos exemplificativos, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma região constante compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 265267, 282, 284-311. Em certos casos, o anticorpo anti-PD-1 compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391.

[00322] Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona um polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 descrita aqui e um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Em alguns aspectos, o polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão compreende uma imunoglobulina ou um seu fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno. Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma muteína de IL-21 descrita aqui. Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona um vetor compreendendo o ácido nucleico descrito aqui. Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico ou o vetor descrito aqui. Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona um estojo compreendendo uma muteína de IL-21, um ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, conjugado, proteína de fusão, ou uma sua combinação, como descrito aqui, e um recipiente.

[00323] São adicionalmente proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo uma muteína de IL-21, um ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, conjugado, proteína de fusão, ou uma sua combinação, da presente divulgação, e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[00324] São também proporcionados métodos de preparação de uma muteína de IL-21 compreendendo cultura da célula hospedeira da presente divulgação de modo a expressar a muteína de IL-21 e coleta da muteína de IL-21 expressa. Um método de tratamento de um indivíduo com sua necessidade é adicionalmente proporcionado. O método compreende administração ao indivíduo com sua necessidade de uma composição farmacêutica da presente divulgação em uma quantidade eficaz para tratar o indivíduo. Em aspectos exemplificativos, o indivíduo tem um tumor sólido e a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar o tumor sólido no indivíduo. Opcionalmente, o tumor sólido é selecionado do grupo consistindo em: cânceres da cabeça e pescoço, ovário, cervical, bexiga e esofágico, cânceres pancreático, gastrointestinal, cânceres gástricos, mama, endometrial e colorretal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, câncer da bexiga, pulmão, p.ex., câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar.

[00325] Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 compreendendo (a) uma sequência de aminoácidos da região determinante da complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada (HC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372 e 382 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373 e 383 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de HC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 314, 324, 334, 344, 3545, 364, 374 e 384 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve (LC) apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375 e 385 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376 e 386 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; (f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de LC apresentada na Tabela D ou uma sequência selecionada do grupo consistindo em: 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377 e 387 ou uma sua sequência variante que difere somente em um ou dois aminoácidos ou que tem pelo menos ou cerca de 70% de identidade de sequências; ou (g) uma combinação de quaisquer duas ou mais de (a)-(f). Em casos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno PD-1 compreende seis sequências de aminoácidos de CDR selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 312-317; (b) SEQ ID NOs: 322-327; (c) SEQ ID NOs: 332-337; (d) SEQ ID NOs: 342-347; (e) SEQ ID NOs: 352-357; (f) SEQ ID NOs: 362-367; (g) SEQ ID NOs: 372-377; e (h) SEQ ID NOs: 382-387. Em certos aspectos, a proteína de ligação ao antígeno PD-1 compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 318 e 319; (b) SEQ ID NOs: 328 e 329; (c) SEQ ID NOs: 338 e 339; (d) SEQ ID NOs: 348 e 349; (e) SEQ ID NOs: 358 e 359; (f) SEQ ID NOs: 368 e 369; (g) SEQ ID NOs: 378 e 379; e (h) SEQ ID NOs: 388 e 389. Em casos exemplificativos, a proteína de ligação ao antígeno PD-1 compreende uma região constante compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 265-267, 282, 284-311. Em alguns aspectos, a proteína de ligação ao antígeno PD-1 compreende um par de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NOs: 320 e 321; (b) SEQ ID NOs: 330 e 331; (c) SEQ ID NOs: 340 e 341; (d) SEQ ID NOs: 350 e 351; (e) SEQ ID NOs: 360 e 361; (f) SEQ ID NOs: 370 e 371; (g) SEQ ID NOs: 380 e 381; e (h) SEQ ID NOs: 390 e 391.

[00326] Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona um conjugado compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 como descrito nos parágrafos anteriores e uma fração heteróloga. Em modalidades exemplificativas, a presente divulgação proporciona um polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 como descrito nos parágrafos anteriores e um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Em modalidades exemplificativos, a presente divulgação proporciona um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando a proteína de ligação ao antígeno PD-1, o conjugado ou o polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão, como descrito nos parágrafos anteriores. Em casos exemplificativos, o ácido nucleico compreende a sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 392-471. A presente divulgação em modalidades exemplificativas proporciona um vetor compreendendo o ácido nucleico, como descrito acima, bem como uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico ou o vetor, como descrito acima. É também proporcionado um estojo compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 como descrito nos parágrafos anteriores ou um conjugado, polipeptídeo de fusão, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira, ou uma sua combinação, e um recipiente. A presente divulgação proporciona uma composição farmacêutica que em modalidades exemplificativas compreende uma proteína de ligação ao antígeno PD-1 como descrito nos parágrafos anteriores ou um conjugado, polipeptídeo de fusão, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira, ou uma sua combinação, e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. A presente divulgação proporciona adicionalmente um método de preparação de uma proteína de ligação ao antígeno PD-1, em que, em modalidades exemplificativas, o método compreende cultura da célula hospedeira como descrito em este parágrafo, de modo a expressar a proteína de ligação ao antígeno PD-1 e coleta da proteína de ligação ao antígeno PD-1 expressa. A presente divulgação proporciona adicionalmente um método de tratamento de um indivíduo com sua necessidade, em que, em modalidades exemplificativas, o método compreende administração ao indivíduo com sua necessidade de uma composição farmacêutica como descrito em este parágrafo em uma quantidade eficaz para tratar o indivíduo. Em aspectos exemplificativos, o indivíduo tem um tumor sólido e a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar o tumor sólido no indivíduo. Opcionalmente, o tumor sólido é selecionado do grupo consistindo em: cânceres da cabeça e pescoço, ovário, cervical, bexiga e esofágico, cânceres pancreático, gastrointestinal, cânceres gástricos, mama, endometrial e colorretal, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, câncer da bexiga, pulmão, p.ex., câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar.

[00327] Os seguintes exemplos são dados meramente para ilustrar a presente divulgação e não de modo algum para limitar seu escopo.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[00328] Este exemplo demonstra que a terapia de combinação compreendendo um anticorpo bloqueador de PD-1 e IL-21 recombinante é superior a uma monoterapia correspondente.

[00329] Em um estudo pré-clínico, os efeitos de um tratamento de combinação de um anticorpo bloqueador de PD-1 monoclonal e IL-21 murina recombinante (rmIL-21) foram comparados com os efeitos de tratamento de monoterapia do anticorpo bloqueador de PD-1 ou da rmIL-21.

[00330] No Dia 1, células de carcinoma do cólon CT26/3E5 foram implantadas em camundongos BALB/c para iniciar crescimento tumoral. No Dia 12, os tumores foram medidos e os camundongos foram randomizados em 4 grupos (10 camundongos por grupo): O Grupo 1 recebeu uma injeção intraperitoneal (IP) de 300 μg de anticorpo de controle do isótipo (mIgGI), o Grupo 2 recebeu uma injeção IP de 300 μg de um anticorpo contra PD-1 bloqueador, o Grupo 3 recebeu 50 μg de rmIL-21 e o Grupo 4 recebeu tanto um anticorpo contra PD-1 bloqueador (300 μg) como rmIL-21 (50 μg). Os Grupos 1, 2 e 4 receberam anticorpo uma vez a cada 3 dias, e os Grupos 3 e 4 receberam rmIL-21 3x por semana durante 3 semanas. A dosagem terminou no Dia 33.

[00331] O volume tumoral foi monitorizado ao longo do estudo. Como mostrado nas Figuras 1A-1D, o tamanho tumoral aumentou na maior medida para o Grupo 1 e na menor medida para o Grupo 4.

[00332] A sobrevivência, como medida pela análise de Mantel-Cox de log-rank de Kaplan-Meier, foi o ponto final principal deste estudo. Como mostrado na Figura 2 e Tabela 1, a percentagem de sobrevivência e a sobrevivência mediana foram as maiores para o Grupo 4. Notavelmente, dois indivíduos estavam isentos de tumor no Grupo 4 (Tabela 1). TABELA 1

[00333] Estes resultados demonstram que uma combinação de um anticorpo bloqueador de PD-1 monoclonal e mIL-21 recombinante proporciona vantagem de sobrevivência superior versus qualquer um dos componentes sozinhos como monoterapia.

EXEMPLO 2

[00334] Este exemplo demonstra o desenho e construção de múltiplas plataformas dirigidas ao proporcionar de uma combinação de inibição de PD-1 e sinalização de IL-21.

[00335] Os resultados obtidos no Exemplo 1 demonstram que as vantagens de uma abordagem combinatorial da sinalização de IL-21 e inibição de PD-1 para o tratamento de indivíduos com tumores. Foi requerida consideração cuidadosa de como a IL-21 deve ser administrada, no entanto, devido à capacidade de IL-21 de tanto potenciar as respostas de células T CD8 como suprimir a apresentação do antígeno e iniciação de células T. Adicionalmente, o IL-21R é amplamente expresso em tecidos humanos (p.ex., por células apresentadoras de antígenos (APCs), células NK, B e T), requerendo assim consideração cuidadosa para se evitarem efeitos fora do alvo (p.ex., atividade de IL-21 fora de um ambiente tumoral) e eliminação de IL-21 à medida que se liga ao seu receptor em diferentes tecidos.

[00336] Foi idealizada uma abordagem em duas frentes para lidar com as considerações acima. Em primeiro lugar foram geradas muteínas de IL-21 com atividade atenuada - através de ligação reduzida das muteínas de IL-21 a IL-21R -. Foi idealizado que tais muteínas de IL-21 teriam atividade reduzida quando difundidas ao longo do corpo, mas que tal atividade seria “resgatada” se as muteínas de IL-21 pudessem ser concentradas em células T alvo (p.ex., cancerosas). Isto é, as muteínas de IL-21, uma vez presentes e concentradas em células alvo, exibiriam, no agregado, atividade terapêutica de IL-21. Em segundo lugar, as muteínas de IL-21 foram fundidas a um braço de direcionamento, tal como um anticorpo monoclonal, de modo a visar as muteínas de IL-21 a células relevantes (p.ex., células cancerosas). De modo a administrar as muteínas de IL-21 a uma célula cancerosa alvo, elas foram fundidas a um mAb anti-PD-1. O uso de um mAb anti- PD-1 tinha o benefício adicional de prevenir a sinalização através de PD-1/PD-L1 (atuando assim como um inibidor de pontos de controle).

[00337] Sem estar limitado por qualquer teoria particular foi colocada a hipótese de que uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo anti-PD-1 fundido a uma muteína de IL-21 proporcionaria uma resposta mais durável contra células visadas para destruição. Por exemplo, [1] células T CD8+ expressando PD-1 seriam ligadas pelo mAb anti-PD-1 da proteína de fusão e [2] a ligação simultânea da muteína de IL-21 da proteína de fusão ao receptor de IL-21 expresso pelas células T CD8+ levaria a proliferação aumentada das células T bem como maior produção e secreção de IFNY pelas células T, o que melhoraria a citotoxicidade global contra as células alvo. Foi adicionalmente colocada a hipótese de que as vias de sinalização intracelular ativadas por IL-21 preveniria a diferenciação terminal e perda de função efetora associada e apoptose. Ver Figura 3.

[00338] Considerações de desenho adicionados incluíram a valência do mAb (p.ex., mAb monovalente ou bivalente), requisito para função efetora de Fc, local para fusão de citocina (terminal C ou N de mAb), inclusão de um ligante e remediação de modificação secundária prevista ou locais de corte.

[00339] Vários formatos de proteínas de fusão foram considerados e quatro construtos de fusão foram clonados e expressos para experiências de prova de conceito. IL-21 de tipo selvagem (WT) foi fundida ao terminal C de uma IgG de um mAb contra PD-1 bivalente como (1) um homodímero de IL- 21 sem qualquer ligante; (2) um homodímero de IL-21 com um ligante de GGGGS (SEQ ID NO: 262); (3) um monômero de IL-21 sem qualquer ligante, mas com mutações de pares de carga no Fc de IgG para dirigir a heterodimerização; e (4) um monômero de IL-21 com tanto um ligante de GGGGS (SEQ ID NO: 262) como mutações de pares de carga. Todos os quatro construtos de proteínas de fusão incluíram as seguintes modificações na região Fc de mAb, numeradas de acordo com o sistema EU: N297G, R292C, V302C (mutações SEFL2-2). As mutações de pares de carga usadas foram as mutações V1 (i.e., K409D & K392D em uma cadeia pesada e D399K & E356K na outra cadeia pesada). Todos os quatro construtos de proteínas de fusão foram concebidos para terem uma lisina C-terminal removida para prevenir o corte.

[00340] Os construtos de fusão foram rastreados quanto à atividade de IL-21 em ensaios de células usando duas variantes (PD-1+vas e PD-1-vas) de uma linha de células T Hut78 positivas quanto a IL-21R (IL-21R+). Em cada linha de células, a fosforilação de STAT3 foi medida como uma medida substituta da atividade de IL-21. Ambas as variantes de células Hut78 foram expostas a (i) IL-21 humana recombinante (rhIL-21) sozinha, (ii) mAb anti-PD-1 sozinho, (iii) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL-21 com um ligante, (iv) mAb anti-PD-1 fundido a um homodímero de IL-21 sem um ligante, (v) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL-21 com um ligante ou (vi) mAb anti-PD-1 fundido a um monômero de IL-21 sem um ligante. Os resultados do ensaio de fosforilação de STAT3 e as EC50s de cada molécula para sinalização de STAT são mostrados nas Figuras 5A e 5B e Tabela 2, respectivamente. TABELA 2

[00341] Como mostrado na Figura 5A e Tabela 2 (coluna do meio), a proteína de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 com um homodímero de IL-21 exibiu 10 vezes menos potência em relação a rhIL-21 em células PD-1-vas. A rhIL-21 foi também mais potente em comparação com a proteína de fusão compreendendo o monômero de IL-21. Apesar de ter somente uma fração de IL-21, a proteína de fusão monomérica mostrou maior potência em relação ao homodímero tendo duas frações de IL- 21. Estes resultados sugerem que o monômero exibe atividade de IL-21 mais elevada em células PD-1-vas e/ou sugerem que o formato de proteína de fusão de homodímero pode conferir atenuação parcial da atividade de IL-21 (p.ex., possivelmente através de interações estéricas entre frações de IL-21).

[00342] Este estudo permitiu também avaliação do ligante entre a porção de IL-21 e o terminal C de IgG. Como mostrado na Tabela 2 (coluna do meio) e Figuras 5A e 5B (linha sólida = sem ligante; linha pontilhada = ligante), a presença de um ligante não parece afetar a atividade de IL-21. Consequentemente, todos os construtos futuros foram feitos sem o ligante para reduzir a quantidade de sequências não nativas nas proteínas de fusão.

[00343] O efeito da expressão de PD-1 na atividade de IL- 21 foi avaliada por comparação dos resultados do ensaio de fosforilação de STAT3 entre as células PD-1-vas e as células PD-1+vas. Como mostrado na Figura 5B, a atividade de IL-21 de cada uma das proteínas de fusão de homodímero e monômero de IL-21 em células PD-1+vas foi essencialmente a mesma.

[00344] Em conjunto, estes resultados demonstram que a sinalização de IL-21, na ausência de expressão de PD-1 em uma célula alvo, pode ser atenuada por fusão de IL-21 a um mAb anti-PD-1. Adicionalmente, a sinalização de IL-21 de uma IL-21 fundida a um mAb anti-PD-1 é resgatada em células expressando PD-1.

EXEMPLO 3

[00345] Este exemplo demonstra o desenho, construção e caracterização de múltiplas muteínas de IL-21.

[00346] Para ganhar um entendimento do perfil farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) da proteína de fusão, uma proteína de fusão compreendendo uma IgG fundida a um homodímero de IL-21 WT foi testada in vivo em um macaco- cinomólogo.

[00347] A proteína de fusão de homodímero compreendendo IL-21 WT fundida a um mAb anti-PD-1 foi intravenosamente administrada a 6 animais a uma baixa dose (250 μg/kg) ou uma elevada dose (1000 μg/kg). Um domínio de anticorpo de IgG (150 μg/kg) foi operado como um controle. As concentrações no soro foram medidas ao longo do tempo, e Cmáx, AUCúltima, meia-vida (t1/2), Vss e Cl foram determinados. Os resultados são mostrados na Figura 6 e Tabela 3. TABELA 3

[00348] Em relação ao controle de IgG (dados não mostrados), a proteína de fusão de homodímero compreendendo um mAb anti-PD-1 e IL-21 WT exibiu eliminação aumentada e exposições mais baixas. Foi assim determinado que, de modo a intensificar a exposição da proteína de fusão e a minimizar os efeitos de IL-21 fora de alvo (i.e., minimizar a sinalização de IL-21 em células imunitárias que não expressam o receptor de PD-1), seria necessária mutagênese de IL-21 para atenuar a sinalização através do IL-21R. Conformemente, uma proteína de fusão compreendendo uma IL-21 mutada foi concebida para se ligar menos fortemente a IL-21R em células que não expressavam PD-1. Foi colocada a hipótese de que a proteína de fusão se ligaria em primeiro lugar ao alvo de PD-1 (por ligação ao anticorpo anti-PD-1) com elevada afinidade o que dirigiria depois a segunda interação de afinidade mais baixa entre a muteína de IL-21 e IL-21R (cadeia alfa). Na ausência de receptor de PD-1 foi colocada a hipótese de que as proteínas de fusão não se ligariam a células não expressando o receptor de PD-1, independentemente da expressão de IL-21R.

[00349] Foi usada manipulação guiada pela estrutura para criar um painel de 141 muteínas de IL-21, tendo cada uma uma substituição de aminoácidos única em comparação com a sequência de aminoácidos de IL-21 WT. Cada muteína foi concebida para ter afinidade reduzida pela subunidade alfa do IL-21R (101 muteínas) ou pela subunidade gama de IL-21R (40 muteínas). Cada muteína do painel foi expressa como uma proteína de fusão com um mAb PD-1 (PD-1 x muteína de IL-21) e, subsequentemente, avaliada quanto à sua capacidade de se ligar a IL-21R usando o sistema FortéBio Octet® (Pall FortéBio; Fremont, CA) e rastreada quanto à atividade usando a linha de células T IL-21R+ (Hut78) usando fosforilação de STAT3 como um substituto para a atividade de IL-21. Para selecionar muteínas que têm o menor potencial para atividade fora do alvo, o critério de seleção foi definido a uma atenuação maior do que 20 vezes na sinalização de IL-21 vs. rhIL-21 a 3,7 nM em células PD-1-vas.

[00350] Uma lista completa das 141 muteínas foi mostrada na Tabela 4. Tabela 4

NB = sem ligação detectável WB = ligação fraca (abaixo do limite de quantificação confiável) As substituições de AA de IL-21 são de acordo com a numeração de posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. * mAb anti-PD-1 fundido a IL-21 humana (sem mutações) ** Não em uma fusão; presente somente como IL-21 humana *** Não em uma fusão; presente somente como Ab contra PD-1

[00351] Resultados exemplificativos dos ensaios de fosforilação de STAT3 usando muteínas de IL-21 são mostrados na Figura 7 (muteínas com afinidade reduzida por IL-21Rα) e Figura 8 (muteínas com afinidade reduzida por IL-21RY). Como mostrado em estas figuras, várias muteínas demonstraram uma atenuação de mais do que 20 vezes na atividade de IL-21 em células PD-1-vas mas retiveram a atividade em células PD-1+vas. Como mostrado nas Figuras 9A-9B, o mutante 51 (R65P) (círculos azuis) foi um tal mutante que demonstrou uma redução maior do que 20x na atividade de IL-21 em células PD-vas mas exibiu um nível de atividade de IL-21 que era similar àquele alcançado por rhIL-21 em células expressando PD-1. Uma listagem de muteínas exemplificativas para atenuação maior do que 20x do sinal de STAT3 em células pobres/negativas quanto a PD-1 é proporcionada na Tabela 5. TABELA 5

1 vs. rhIL-21

EXEMPLO 4

[00352] Este exemplo demonstra a seleção de muteínas de IL-21 candidatas para uso na construção de proteínas de fusão e o seu teste in vivo.

[00353] As 22 muteínas de IL-21 com desempenho de topo foram escalonadas para teste adicional. Com base em este teste adicional (em ensaios de Hut78 pSTAT3 como discutido aqui), quatro proteínas de fusão candidatas foram selecionadas tal que a coleção de quatro exibiria uma gama de atenuação (desvio de potência, em relação a rhIL-21, no ensaio de Hut78 pSTAT3). O Mutante C10 (D15N) representou a muteína de atenuação baixa, o Mutante 77 (R76A) representou a muteína de atenuação intermédia e os Mutantes 79 e 78 (R76E e R76D, respectivamente) representaram a muteína de atenuação elevada. Dos quatro, três foram escalonados para um estudo in vivo em macacos-cinomólogos para se avaliarem as propriedades farmacocinéticas dos construtos de proteínas de fusão de muteína. Doses únicas (10 mg/kg) de Mutante 79 (R76E), Mutante 77 (R76A) ou Mutante C10 (D15N) foram administradas intravenosamente (bólus) a macacos-cinomólogos sem tratamento e as concentrações no soro foram coletadas ao longo de um período de dez dias. Para comparação, um mAb anti-PD-1 e uma proteína de fusão compreendendo o mAb anti- PD-1 e IL-21 WT foram doseados (individualmente) a macacos- cinomólogos por administração por bólus intravenoso. O estudo foi operado com dois controles: o mAb anti-PD-1 sozinho e o construto de proteína de fusão compreendendo o mAb anti-PD-1 e IL-21 WT. Como mostrado na Figura 10, cada uma das proteínas de fusão mAb anti-PD-1-muteína de IL-21 exibiram um perfil farmacocinético alterado, em comparação com o mAb anti-PD-1 genitor (triângulos pretos). A Tabela 6 proporciona as propriedades farmacocinéticas ajustadas por análise não comportamental. TABELA 6

a Estudo com primatas não humanos b Captura de IL21 humana com detecção de Fc humano c Captura de Fc humano com detecção de Fc humano d Estudo com primatas não humanos

EXEMPLO 5

[00354] Este exemplo demonstra a geração de um painel de mutantes duplos de IL-21 e a expressão e caracterização de proteínas de fusão compreendendo homodímeros mutantes duplos de IL-21 (a não ser que de outro modo especificado).

[00355] Três muteínas tendo uma substituição de aminoácidos única, incluindo (No. Mutante 77 (R76A) e No. Mutante 79 (R76E), foram selecionadas para manipulação adicional com base nos dados da atividade de células (p.ex., atenuação mais elevada da atividade em células T Hut78 PD- 1-vas) e manufaturabilidade. Foi utilizada manipulação guiada pela estrutura para gerar uma mutação adicional dentro da sequência de mutante simples de IL-21 (i.e., para gera um mutante duplo) para atenuar adicionalmente a ligação de citocina à cadeia alfa de IL-21R (IL-21Rα). A sequência de mutante duplo foi fundida à sequência de um mAb anti-PD-1, e as proteínas de fusão foram expressas e testadas em ensaios de células. Uma listagem das proteínas de fusão mutante duplas preparadas e testadas é proporcionada na Tabela 7. TABELA 7

[00356] Como eram desejadas proteínas de fusão mutantes duplas com elevadas propriedades de atenuação, o critério de seleção foi definido a uma potência (EC50) maior do que 1000 nM em células T Hut78 positivas quanto a IL-21R, negativas quanto a PD-1 (PD-1-vas), em relação à potência de rhIL-21. Adicionalmente, como com as muteínas contendo uma substituição de aminoácidos única, as proteínas de fusão mutantes duplas foram caracterizadas quanto à ligação a IL- 21R (ForteBio Octet). Finalmente, as proteínas de fusão mutantes duplas foram caracterizadas quanto à atividade de PD-1 usando um ensaio de gene repórter de PD-1 Jurkat. Os resultados destes ensaios são mostrados na Tabela 8. TABELA 8

Hu = Humano; Cino = Macaco-cinomólogo EC50 de pSTAT3 (mudança de 2,5 vezes) Octet: Ligação a IL-21R-his Humano e de Cino monovalente imobilizado

[00357] Como mostrado na Tabela 8, as proteínas de fusão mutantes duplas exibiram atividade de IL-21 muito baixa em células T expressando baixos níveis de PD-1 (p.ex., abaixo dos níveis detectáveis de PD-1) mas retiveram atividade de IL-21 significativa em células expressando PD-1. As proteínas de fusão mutantes duplas exibiram ligação fraca a IL-21R (Kd > 300 nM), mas retiveram a capacidade de se ligarem a PD-1 e bloquearem a sinalização de PD-1.

EXEMPLO 6

[00358] Este exemplo demonstra um ensaio de células primárias in vitro comparando uma proteína de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e um homodímero mutante duplo de IL-21 ou um homodímero mutante simples de IL-21.

[00359] Uma proteína de fusão compreendendo um mAb anti- PD-1 e IL-21 com as substituições de aminoácidos R5Q e R76E foi testada em um ensaio de células primárias in vitro (uma reação mista de linfócitos (MLR)). A MLR compreendeu uma população mista de células IL-21R+, incluindo células dendríticas (DCs) expressando IL-21R mas não expressando PD- 1, células T expressando PD-1 e células T não expressando PD-1. A MLR foi exposta (i) à proteína de fusão compreendendo as substituições de aminoácidos R5Q e R76E, (ii) à proteína de fusão compreendendo somente a substituição de aminoácidos R76E, (iii) à IL-21 humana recombinante (rHu IL-21), (iv) mAb anti-PD-1, (v) uma combinação de rHu IL-21 e mAb anti- PD-1 ou (vi) uma IgG de controle.

[00360] Como mostrado na Figura 11, a rhIL-21 suprimiu a função de DC e é dominante sobre a resposta de PD-1 quando codoseada. A proteína de fusão compreendendo a muteína dupla de IL-21 com atividade atenuada exibiu atividade fora do alvo reduzida. Igualmente, cada uma da rhIL-21 e da proteína de fusão compreendendo somente a substituição de aminoácidos R76E exibir atividade fora do alvo significativa em DCs e suprimiu a produção de citocinas. Em contraste, o mAb PD-1 e proteína de fusão compreendendo as substituições de aminoácidos R5Q e R76E administraram somente sinais de IL- 21 a células T PD-1+vas alvo (e não células dendríticas PD-1- vas) e retiveram a capacidade (através do braço de PD-1) de aumentar a produção de citocinas. Conformemente, estes resultados sugerem que as proteínas de fusão compreendendo o mutante duplo de IL-21 têm imunossupressão e impactos prejudiciais reduzidos na iniciação de DC e podem permitir o recrutamento de novos clones de células T e respostas imunitárias antitumorais mais duráveis.

EXEMPLO 7

[00361] Este exemplo demonstra a atividade de diferentes proteínas de fusão compreendendo muteínas duplas de IL-21 (homodímeros) e um mAb anti-PD-1 em linfócitos T citotóxicos (CTLs) primários. A fosforilação de STAT3 endógena em CTLs primários (linhas de CTL reativas com CMV de um dador humano) foi medida por FACs e foi usada como uma medida da sinalização de IL-21. Após repouso dos CTLs durante 48 horas (de modo a reduzir a expressão de PD-1), as células foram expostas (durante 10 min) a (i) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R5E/R76A de IL-21 (linha vermelha no gráfico esquerdo), (ii) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R5Q/R76E de IL-21 (linha vermelha no gráfico do meio), (iii) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R9E/R76E de IL-21 (linha vermelha no gráfico direito), (iv) um controle de IgG1 (linha cinza em cada gráfico), (v) rhIL-21 (linha azul em cada gráfico), (vi) um mAb anti-PD-1 (linha verde sólida em cada gráfico), (vii) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD-1 (linha verde pontilhada em cada gráfico) ou (viii) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína simples R76E de IL-21 (linha roxa em cada gráfico). Os resultados de FACs são mostrados nas Figuras 12A-12C. A atividade de IL-21 de cada proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla de IL-21 é representada graficamente contra a atividade alcançada com (iv) um controle de IgG1, (v) rhIL-21, (vi) mAb anti-PD-1, (vii) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti- PD-1 e (viii) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína simples R76E de IL-21. Este ensaio de células primárias demonstra que as fusões mutantes duplas estimulam fracamente a sinalização de STAT3 induzida por IL-21 em CTLs em repouso (que expressam baixos níveis de PD-1). A atividade de IL-21 é o mais atenuada com as fusões de muteína dupla (e é similar àquela vista com o mAb anti-PD-1 e controle de IgG1), com a fusão mutante simples exibindo atenuação da atividade de IL- 21 moderada, e a combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD-1 tendo atividade similar à rhIL-21

[00362] O efeito de proteínas de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e homodímeros de muteína dupla de IL-21 na função de citotoxicidade celular mediada por CTL após estimulação crônica foi também explorado. Os CTLs foram ativados com CD3/CD28 e foram expostos a (i) uma proteína de fusão compreendendo muteína dupla R5E/R76A de IL-21, (ii) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R5Q/R76E de IL-21, (iii) uma proteína de fusão compreendendo uma muteína dupla R9E/R76A de IL-21, (iv) um controle de IgG4, (v) rhIL-21, (vi) mAb anti-PD-1 ou (vii) uma combinação de rhIL-21 e mAb anti-PD-1. Após sete dias de estimulação, as células foram cocultivadas com uma linha de células cancerosas de melanoma pulsada com peptídeo de CMV e a citotoxicidade foi medida. Os resultados deste ensaio são mostrados nas Figuras 13A-13C.

[00363] Como mostrado nas Figuras 13A-13C, as proteínas de fusão são capazes de sustentar função de CTL de uma maneira superior em comparação com a monoterapia de mAb anti- PD-1. As proteínas de fusão de muteínas de IL-21 pode sustentar função de citotoxicidade celular mediada por CTL após estimulação crônica. Estes resultados apoiam a ideia de que IL-21 consegue sustentar função de CTL sob condições de ativação crônica como é observado no câncer. A administração de IL-21 a células T específicas do antígeno PD-1+ consegue sustentar seletivamente a função de uma população de células T que dirige a eficácia terapêutica.

EXEMPLO 8

[00364] Este exemplo demonstra a farmacocinética in vivo com os construtos de muteína dupla.

[00365] Proteínas de fusão compreendendo um mAb anti-PD- 1 e uma muteína dupla de IL-21 ou uma muteína simples de IL- 21 foram administradas a macacos-cinomólogos por administração por bólus intravenoso para caracterizar a exposição ao fármaco. A Tabela 9 mostra a dose de cada construto administrada aos animais. A variante de muteína simples (IL-21 R76E) foi testada in vivo como um homodímero e monômero para melhor entender como a exposição pode ser adicionalmente melhorada.

[00366] Os perfis de concentração no soro-tempo para mAb PD-1 e fusões PD-1:IL-21 após administração por bólus intravenoso a macacos-cinomólogos são mostrados na Figura 14 com as exposições ao fármaco observadas na primeira semana após administração listadas na Tabela 9. TABELA 9

a Estudo com primatas não humanos b Captura de Fc humano com detecção de Fc humano c Captura de IL-21 humana com detecção de Fc humano d Estudo com primatas não humanos e Captura de PD-1 com detecção de IL-21 humana

[00367] Como mostrado na Tabela 9, a proteína de fusão R76E monomérica exibiu exposição superior após dosagem intravenosa em comparação com a proteína de fusão de R76E de homodímero. As proteínas de fusão compreendendo as muteínas duplas de IL-21 (R5Q/R76E e R5E/R76A) observaram maiores exposições do que construtos de proteínas de fusão de homodímero de muteína simples genitores (R76E e R76A, respectivamente) (Figura 14; Tabela 9).

[00368] Os parâmetros farmacodinâmicos (PD) foram também testados in vivo em macacos-cinomólogos. A expressão de PD- 1 foi determinada usando anticorpo não competidor para PD-1 e esta amostragem de PD-1 ocorreu no Dia -5, Dia 7 e Dia 21. Foi dada aos animais uma primeira dose de (i) uma proteína de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e um homodímero de uma muteína única R76E de IL-21, (ii) uma proteína de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e um monômero de uma muteína simples R76E de IL-21 ou (iii) uma proteína de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e uma muteína dupla R5Q/R76E de IL-21 no Dia 1 e uma segunda dose no Dia 8 Ver Figura 15A.

[00369] As Figuras 15B-15D mostram as vezes de mudança de células positivas quanto a PD-1/positivas quanto a CD4 (em relação ao Dia -5) como medido no Dia 7 (Figura 15B), as vezes de mudança de células positivas quanto a PD-1/positivas quanto a CD8 (em relação ao Dia -5) como medido no Dia 7 (Figura 15C) e as vezes de mudança de células positivas quanto a PD-1/positivas quanto a CD8 (em relação ao Dia -5) como medido no Dia 21 (Figura 15D).

[00370] Como mostrado nas Figuras 15B-15D, mesmo uma dose única da proteína de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e um mutante duplo de IL-21 expandiu as células T PD-1+/CD8+ periféricas. Este estudo demonstrou que as proteínas de fusão mutantes duplos são capazes de expandir significativamente as células T CD8 PD-1+ de maneira superior a variantes genitoras de muteína simples.

[00371] Biomarcadores PD foram também examinados quanto a diferenças e os dados sugerem que o construto monomérico tem abrangência de alvo e respostas PD mais baixas após administração de dose única, mas mudanças equivalentes na PD e abrangência de alvo após administração de doses múltiplas. Estes dados sugerem que as propriedades PK de proteínas de fusão podem ser adicionalmente melhoradas com um formato monomérico.

[00372] Como mostrado na Figura 16, a ocupância de receptor (RO) em células CD8+ se correlacionou com a expansão de células T CD8 PD-1+ para os mutantes duplos (Animais 803, 805, 806). Os construtos de homodímero mutantes simples (Animais 801, 802) falharam em expandir células T CD8 PD-1+, provavelmente devido às suas propriedades farmacocinéticas relativamente fracas. Notavelmente, os construtos de muteína dupla, que têm propriedades farmacocinéticas mais desejáveis, expandiram células T CD8 PD-1+ e as respostas PD se correlacionaram com a abrangência de alvo. Os dados sugerem que as proteínas de fusão mutantes duplos conseguem expandir uma população de células T conhecida como estando envolvida na imunidade antitumoral protetora.

[00373] A Figura 17 mostra que a abrangência de alvo de PD-1 em células T CD8+ após dosagem repetida é similar ao que é observado para um mAb anti-PD-1 (dados de mAb anti-PD- 1 não mostrados). Coletivamente, no que diz respeito aos mutantes duplos, as Figuras 16 e 17 apoiam a ideia de que a modulação da população alvo (células T CD8 PD-1+) requer abrangência de alvo suficiente e que a abrangência de alvo melhorada está correlacionada com respostas farmacodinâmicas melhoradas.

EXEMPLO 9

[00374] Este exemplo demonstra a geração de um painel de proteínas de fusão compreendendo diferentes mAbs anti-PD-1 fundidas a muteínas duplas de IL-21 homodiméricas variáveis.

[00375] Um painel de mAbs anti-PD-1 foi gerado e testado como descrito no Exemplo 12 e os mAbs líderes foram fundidos a certas muteínas duplas de IL-21. Doze proteínas de fusão compreendendo muteínas duplas de IL-21 homodiméricas e mAbs anti-PD-1 foram testadas quanto à atividade de IL-21 em células T HuT78 tanto PD-1-vas como PD-1+vas usando o ensaio de fosforilação de STAT3, ligação a IL-21R e ligação a PD-1 usando o ensaio de ForteBio Octet, atividade de PD-1 usando o ensaio de repórter PD-1 Jurkat e atividade in vitro usando o ensaio de MLR (reação mista de linfócitos). Estas experiências foram levadas a cabo como essencialmente descrito nos exemplos prévios.

[00376] Uma list a das doze proteínas de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e uma muteína dupla de IL-21 e suas atividades como medido em estes ensaios é proporcionada nas Tabelas 10-12. TABELA 10 Atividade de IL-21 como medido por ensaio de fosforilação de STAT3 mAb contra

TABELA 11 Ligação a IL-21R e ligação a PD-1

TABELA 12 Atividade de PD-1 e MLR

[00377] A maioria dos se não todos os candidatos se desempenharam igualmente se não melhor do que dois mAbs anti- PD-1. Vários demonstraram potências para a atividade de PD- 1 e no ensaio de MLR que eram maiores do que a ou iguais à potência do mAb anti-PD-1.

[00378] Dos 12 candidatos, dois foram selecionados quanto a estudos adicionais. Um dos dois tinha a muteína dupla de IL-21 compreendendo as mutações R5Q/R76E e o segundo tinha a muteína dupla de IL-21 compreendendo as mutações R9E/R76A. Diferentes mAbs anti-PD-1 do painel de mAb PD-1 foram usados para preparar uma proteína de fusão com uma das duas muteínas de IL-21. Dez mAbs anti-PD-1 foram usados nas proteínas de fusão R5Q/R76E, incluindo os mAbs anti-PD-1 20A2.003 (diamante laranja), 20C1.006 (quadrado vermelho), 20C1.009 (triângulo verde) e 22D4.006 (círculo roxo escuro). Sete mAbs anti-PD-1 foram usados nas proteínas de fusão R9E/R76A, incluindo os mAbs anti-PD-1 20A2.003 (triângulo roxo), 20C1.006 (quadrado vermelho), 20C1.009 (triângulo verde) e 22D4.006 (círculo preto). As proteínas de fusão foram testadas quanto à atividade de IL-21 usando o ensaio de fosforilação de STAT3, como essencialmente descrito aqui. As Figuras 18A-18B e 19A-19B mostram as atividades em células T HUT78 PD-1-vas e PD-1+vas, em relação aos sinais de rhIL-21 (linha rosa escura). Como mostrado em estas figuras, as proteínas de fusão exibiram >1000x de atenuação em células T HUT78 PD-1-vas mas retiveram a potência em células T HUT78 PD-1+vas.

EXEMPLO 10

[00379] Este exemplo demonstra a geração de um painel de proteínas de fusão compreendendo diferentes mAbs anti-PD-1 fundidas a muteínas duplas de IL-21 monoméricas e homodiméricas variáveis.

[00380] Um painel de proteínas de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e uma muteína de IL-21 monomérica ou homodimérica foi gerado. Uma lista das proteínas de fusão compreendendo um mAb anti-PD-1 e uma muteína dupla de IL-21 é proporcionada na Tabela 13. TABELA 13

[00381] As proteínas de fusão foram testadas quanto à atividade de IL-21 em células T HuT78 tanto PD-1-vas como PD- 1+vas usando o ensaio de fosforilação de STAT3, ligação a IL- 21R e ligação a PD-1 usando o ensaio de ForteBio Octet, atividade de PD-1 usando o ensaio de repórter PD-1 Jurkat e atividade in vitro usando o ensaio de MLR. Estas experiências foram levadas a cabo como essencialmente descrito nos exemplos prévios. As atividades como medido em estes ensaios in vitro são mostradas Figuras 20-23.

[00382] As Figuras 20A-20D representam a quantidade de sinalização de pSTAT3 observada com várias fusões mAb anti- PD-1 - muteína dupla monomérica ou homodimérica de IL-21. A sinalização de pSTAT3 estimulada com rhIL-21 é mostrada em vermelho no topo dos gráficos, enquanto a sinalização de pSTAT3 estimulada com um controle de IgG1 é mostrada em cinza (fundo dos gráficos) e com um controle de IgG2 é mostrada em laranja (fundo dos gráficos). A sinalização de pSTAT3 estimulada por mAb anti-PD-1 (presente como mAb; i.e., não como uma fusão) é mostrada em verde (fundo dos gráficos). A sinalização de pSTAT3 estimulada com mAbs anti-PD-1 de controle é mostrada em laranja e amarelo (fundo dos gráficos), enquanto as linhas restantes representam a sinalização de pSTAT3 alcançada após estimulação com fusões mAb anti-PD-1 - muteína dupla monomérica ou dimérica de IL- 21 (com várias mutações de pares de carga) em que os mutantes duplos são R5E/R76A; R9E/R76A; R5A/R76E ou R5Q/R76E. Como mostrado em este conjunto de figuras, a rhIL-21 demonstra atividade em células tanto PD-1-vas como PD-1+vas. Em contraste, as fusões de muteína dupla monoméricas e homodiméricas são capazes de demonstrar atividade de pSTAT3 (à base de IL-21) somente em células PD-1+vas e não em células PD-1-vas. Assim, as fusões monoméricas com mutantes duplos de IL-21 exibem níveis similares de atenuação da atividade de IL-21 em células PD-1-vas e resgate da atividade de IL-21 em células PD-1+vas que as suas fusões diméricas em contrapartida.

[00383] As proteínas de fusão avaliadas nas Figuras 20A- 20D foram testadas em um ensaio de gene repórter de PD-1 (RGA; Figuras 21A e 21B) e um ensaio de MLR (Figuras 21C e 21D). Os resultados mostrados nas Figuras 21A-21D demonstram que as fusões mAb anti-PD-1 - muteína dupla monomérica e dimérica de IL-21 são capazes de induzir a atividade de PD- 1.

[00384] Os resultados de ensaios de pSTAT3 testando os mesmos construtos de fusão mAb anti-PD-1 - muteína dupla monomérica e dimérica de IL-21 que aqueles nas Figuras 20A- 20D, exceto com um mAb anti-PD-1 diferente, são mostrados nas Figuras 22A-22D. Os resultados nas Figuras 22A-22D são similares àqueles vistos nas Figuras 20A-20D.

[00385] Os resultados de ensaios de gene repórter de PD- 1 e ensaios de MLR testando os mesmos construtos de fusão mAb anti-PD-1 - muteína dupla monomérica e dimérica de IL- 21 que aqueles nas Figuras 21A-21D, exceto com um mAb anti- PD-1 diferente, são mostrados nas Figuras 23A-23D.

[00386] Estes dados demonstram que uma proteína de fusão compreendendo uma muteína duplo de IL-21 pode não requerer uma configuração de homodímero para atenuação parcial. As seguintes muteínas duplas (fundidas como monômeros ou homodímeros) para um mAb anti-PD-1 (Tabela 14) foram selecionadas para avaliação adicional. TABELA 14

[00387] Os dados à base de células sugerem que estas muteínas quando fundidas a um anticorpo contra PD-1 conseguem visar seletivamente células T (demonstrado usando linhas de células T) expressando o receptor de PD-1. Estas moléculas PD-1 x IL-21 bifuncionais têm propriedades únicas adquiridas a partir de cada braço da molécula de fusão (mAb anti-PD-1 e muteína de IL-21).

EXEMPLO 11

[00388] Os seguintes materiais e métodos foram usados nos exemplos.

Geração de Fusões Ab anti-PD-1 - muteína de IL-21

[00389] Sequências de Ab anti-PD-1 - muteína de IL-21 recombinantes foram clonadas em pTT5 para expressão transiente em HEK293-6E ou um vetor contendo um cassete de seleção de antibióticos para expressão estável em células CHO-K1. As produções de expressão foram realizadas durante 5-7 dias a 36 °C e o sobrenadante foi coletado para purificação. Todos os lotes de proteína foram purificados por cromatografia de afinidade por Proteína A (Mab Select SuRe) seguida por permuta catiônica (SP Sepharose HP) e troca de tampões (UF/DF) em tampão A5.2Su. Todos os lotes tinham >95% de pico principal por cromatografia por exclusão de tamanhos com endotoxina < 0,2 EU/mg (Endosafe LAL, Charles River).

Ensaios de Gene Repórter de PD-1 Jurkat

[00390] Células efetoras estáveis GloResponse Jurkat NFAT-luc2/PD-1 (Promega, #CS187102) e a linha de células estável CHO PD-L1 (Promega, #CS178103) foram cocultivadas a uma razão de 1,25:1 na presença de anticorpos diluídos em série em triplicado durante 6 horas a 37 0C., CO2 a 5%. A luminescência foi medida usando Sistema Bio-Glo Luciferase Assay (Promega, #G7940).

Ensaios de Fosforilação de STAT3

[00391] pSTAT3 AlphaScreen. Linhas de células estáveis genitora de HuT 78 e e HuT 78 PD-1 foram depois inoculadas em placas separadas a 40.000 células por poço na presença de anticorpos diluídos em série em triplicado durante 40 minutos a 37 0C., CO2 a 5%. Os níveis de Pstat3 Tyr705 foram medidos usando Estojo AlphaLisa Surefire Ultra Pstat3 (Tyr705) Assay (Perkin Elmer, #ALSU-PST3-A10K).

[00392] Ensaio de HTRF fosfo-STAT3. As células foram esgotadas quanto ao soro durante a noite em meio RPMI 1860 suplementado com L-glutamina a 1% (HyClone # de Cat SH30034.01). As células foram depois ressuspensas em Solução de Sais Equilibrada de Hanks isenta de vermelho de fenol sem cálcio e magnésio (HBSS; ThermoFisher # de Cat 14175095) a 2,5 x 106 células/mL e 8 uL/poço foram plaqueados em placa branca de pequeno volume com 384 poços (Perkin Elmer # de Cat 6008289). As células foram depois estimuladas com 4 uL/poço de moléculas de muteína de IL-21 diluídas em HBSS a 37 °C durante 40 minutos. A fosforilação de STAT3 foi detectada usando estojo HTRF® phosphor-STAT3 (Tyr705) assay de acordo com a recomendação do fabricante (Cisbio # de Cat 64NT3PEH). O sinal de FRET a partir do ensaio foi detectado usando Leitor de Placas EnVision Multilable (Perkin Elmer). Os dados foram analisados por determinação em primeiro lugar da razão de HTRG como recomendado pela Cisbio e depois cálculo de valor de vezes em relação ao fundo usando dados de células não estimuladas. Para cada experiência, curvas de dosagem foram representadas graficamente e a potência de uma dada molécula é representada como a concentração à qual um valor de vezes em relação ao fundo definido foi observado.

Reação Mista de Linfócitos (MLR)

[00393] Leukopaks de pares de dadores não correspondidos foram obtidos a partir da AllCells Inc. As células T do dador foram isoladas usando Estojo Pan T-cell Isolation (Milteny Biotec, # 130-096-535) e os monócitos de um dador não correspondidos foram isolados usando Estojo Pan Monocyte Isolation (Miltenyi Biotec, #130-096-537). Os monócitos foram adicionalmente maturados durante 10 dias usando Estojo CellXVivo Human Monocyte-Derived Dendritic Cell Differentiation (R&D Systems, #CDK004). As células pan-T foram cocultivadas com monócitos maturados a uma razão de 10:1 na presença de anticorpos diluídos em série em triplicado durante 72 horas a 37 °C., CO2 a 5%. Os níveis de IL-2 no sobrenadante foram medidos por ELISA (Mesoscale Discoveries, #K151QQD-4).

Ensaios de ligação a IL-21R e PD-1

[00394] Afinidade de ligação a IL-21R humano e de macaco- cinomólogo: Ambos os reagentes recombinantes IL-21R-FLAG- His monovalente et IL-21R-Fc bivalente foram testados mas produziram resultados muito similares (dentro de ~2-3 vezes). Os reagentes de IL-21R solúveis recombinantes foram minimamente biotinilados e capturados em pontas Estreptavidina SAX até um nível de carga de 2,0 nm. As pontas foram depois incubadas em poços onde as amostras de anticorpo contra PD-1-IL-21 foram diluídas em série 3 vezes. Para as fusões de IL-21 de tipo selvagem, a concentração de amostra de topo foi 10 nM, enquanto para as fusões de muteína de IL- 21 a concentração de amostra de topo foi 300 nM. Um tempo de associação de 20 minutos e um tempo de dissociação de 1,5 horas foram usados para maximizar a curvatura nos gráficos de ligação de modo a se obterem ajustes cinéticos precisos.

[00395] Afinidade de ligação a PD-1 humano e de macaco- cinomólogo: A afinidade de ligação a PD-1 humano e de macaco-cinomólogo foi testada por captura em primeiro lugar das amostras de anticorpo contra PD-1-IL-21 através de acoplamento de amina EDC-NHS a pontas AR2G; a carga de amostras foi tipicamente a pH 6 durante 2000 segundos seguido por extinção com Etanolamina a 1 M de modo a imobilizar pelo menos um nível de 2 nm. Logo que as amostras estivessem imobilizadas, as pontas foram depois incubadas em poços contendo uma diluição em série de 3 vezes de receptores recombinantes, solúveis PD-1(1-170)-FLAG-His humano ou PD- 1(1-167)-FLAG-His de macaco-cinomólogo. Em ambos os casos, a concentração de PD-1 de topo foi 30 nM. Associação durante 300 segundos e dissociação durante 500 segundos foram usadas uma vez que produziram curvatura suficiente para ajustes cinéticos precisos.

[00396] As afinidades de ligação a IL-21R humano/macaco- cinomólogo e PD-1 humano/macaco-cinomólogo foram quantificadas com instrumentos ForteBio Octet HTX e RED384. Em todos os casos, tampão de amostras Octet padrão foi usado para diluição de amostras e para todos os passos de linha de base de ligação, associação e dissociação (Tris a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 1 mM, BSA a 0,10 mg.mL, Triton X-100 a 0,13% (v/v)).

[00397] Todos os dados em bruto de ForteBio foram processados da seguinte maneira usando o software de análise de dados do instrumento padrão (v9 e v10): (a) a média de duas curvas de ponta de referência que tinham alvo imobilizado mas nenhuma interação (i.e., somente tampão) foi calculada e estas foram subtraídas a partir das curvas de ponta de amostra restantes na mesma coluna; (b) as curvas de associação e dissociação foram isoladas e alinhadas com o eixo dos Y; (c) o interpasso de associação e dissociação foi alinhado; (d) a filtração de Savitzky-Golay foi implementada para reduzir o ruído do sinal e (e) o conjunto resultante de curvas de associação e dissociação para cada interação amostra-alvo foi globalmente ajustado com um único modelo de ligação 1:1 para se determinarem os valores medidos da constante da taxa de associação ka e constantes de taxas de dissociação kd; a constante de dissociação em equilíbrio KD foi calculada como uma razão das constantes de taxas de dissociação e associação (= kd/ka).

EXEMPLO 12

[00398] Este exemplo descreve a geração de mAbs anti-PD- 1 para uso nas proteínas de fusão compreendendo muteínas de IL-21.

Geração de Respostas Imunitárias anti-PD-1 Estirpes de Camundongo

[00399] Anticorpos totalmente humanos para PD-1 humano foram gerados por imunização de camundongos transgênicos XENOMOUSE® (Pat. dos E.U.A. 6,114,598; 6,162,963, 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244, que são incorporadas aqui por referências na sua totalidade; Green et al., 1994, Nature Genetics 7: 13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156; Green e Jakobovits, 1998, J. Ex. Med, 188: 483-495; Kellerman e Green, Current Opinion in Biotechnology 13, 593597, 2002). Animais das estirpes de XENOMOUSE® XMG4-K e XMG4- KL foram usados para estas imunizações.

Imunizações

[00400] Uma via de imunização à base de células foi usada para gerar respostas imunitárias anti-PD-1 humano. Células CHO-S foram transientemente transfectadas com PD-1 humano fundido através de um ligante de Gly-Ser-Ser a um marcador de epítopo de células T E3K ou PD-1 de cinomólogo como uma fonte de imunógeno. Os animais foram imunizados com qualquer uma destas células CHO transientemente transfectadas misturadas Alúmen com CpG-ODN, 13 vezes ao longo de 8 semanas usando injeções TIP (base da cauda e intraperitoneal). O reforço inicial era compreendido por 4 milhões de células expressando PD-1 humano enquanto os reforços subsequentes continham 2 milhões de células expressando PD-1 humano ou de cinomólogo. Um total de 9 imunizações foi realizado com PD- 1 humano (1-6, 8, 10 e 13) e as restantes 4 imunizações foram realizadas com PD-1 de cinomólogo. Os animais foram sangrados após o 10° reforço para se avaliarem os títulos específicos de PD-1.

[00401] Os títulos no soro específicos de PD-1 foram monitorizados por análise FACS de células vivas em um citômetro de fluxo Accuri. Brevemente, células HEK293 foram pseudotransfectadas ou transientemente transfectadas com PD- 1 humano ou de cinomólogo. Os soros de animais imunizados foram diluídos 100 vezes e incubados nas células transfectadas durante 1 hora em gelo. As células foram depois lavadas para se removerem anticorpos não ligados e um anticorpo específico anti-Fc humano secundário etiquetado com Cy5 foi incubado nas células durante 15 minutos adicionais a 4 graus. As células foram lavadas uma vez para se remover anticorpo secundário não ligado e o sinal fluorescente nas células foi quantificado por FACS. Os animais com os títulos nativos no soro específicos do antígeno o mais elevados dirigidos contra PD-1 humano e de cinomólogo foram usados para geração de hibridoma (Kohler e Milstein, 1975).

Preparação de Anticorpos Monoclonais Geração de Hibridoma

[00402] Os animais exibindo títulos no soro adequados foram identificados e os linfócitos foram obtidos a partir do baço e/ou linfonodos drenantes. Os linfócitos agrupados (de cada coleta) foram dissociados de tecido linfoide por trituração em um meio adequado (por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM); Invitrogen, Carlsbad, CA). As células B foram selecionadas e/ou expandidas usando métodos padrão e fundidas com um parceiro de fusão adequado usando técnicas que eram conhecidas na técnica.

Geração de Prep de Membrana:

[00403] 20 milhões de células 293T foram transfectadas com pTT5-mini4:huPD-1::GSS:E3K usando Reagente de Transfecção 293fectin™ (Thermo Fisher, Cat: 12347019). 24 horas após transfecção, as células 293T foram biotiniladas por incubação das mesmas em PBS pH 8,6 PBS contendo EZ-Link™ NHS-LC-LC-Biotina (Thermo Fisher Cat: 21343) a 400 μg/mL durante 30 minutos. As células foram depois lavadas em PBS pH neutro e depois ressuspensas em tampão hipotônico contendo inibidor de protease isento de EDTA e triton X100 a 10%. As células foram desagregadas por bombagem repetida das mesmas através de uma seringa com agulha de calibre 26. Os fragmentos celulares foram peletizados por centrifugação a 12000G durante 20 minutos. O sobrenadante contendo partículas de membrana foi depois coletado e lavado 3 vezes com PBS em colina centrífuga Amicon Ultracel 100k (Millipore, # de Cat UFC810024) para se remover o detergente. As preps de membrana foram depois testadas em sucessos de rastreamento (células de hibridoma de controle positivo com especificidade por PD-1) para checar quanto à ligação a prep de membrana correlacionada com IgG. A prep de membrana foi depois aliquotada e congelada a -20 graus Celisus até ao uso.

Coloração Específica do Antígeno de Células de Hibridoma:

[00404] As células de hibridoma foram removidas do frasco e lavadas com tampão de FACS estéril (FBS PBS a 2%). As células foram depois misturadas com prep de membrana de PD- 1 (diluída 1:10 em tampão de FACS, volume de reação de 1 mL, p.ex. 100 μL de prep de membrana em 900 μL de tampão de FACS) e incubadas a 4 graus Celsius durante 1 hora. As células foram lavadas novamente em tampão de FACS e coloridas com 1 mL de cocktail de detecção contendo 5 μg/mL de Fc anti-IgG humana de cabra de fragmento F(ab')2 conjugado com Alexa Fluor 488 (Jackson, Cat: 109-546-098) e estreptavidina conjugada com Alexa Fluor 647 (Jackson, Cat: 016-600-084), depois incubadas a 4 graus Celsius durante 30 minutos na escuridão. As células foram lavadas novamente em tampão FACS, ressuspensas em meio e depois colocadas através de um separador de células de 40 mícrons para se removerem as células agregadas. As células específicas do antígeno foram separadas usando BD FACSAria 3 por atuação em população exibindo fluorescência tanto Alexa Fluor 488 como Alexa Fluor 647 (células IgG+ e de ligação ao antígeno).

[00405] Foi permitido que as células separadas crescessem durante alguns dias em meio de hibridoma. Uma pequena amostra das células enriquecias foi retirada e testada quanto à ligação à prep de membrana de PD-1 usando as mesmas condições de coloração como mencionado acima. Após confirmação do enriquecimento bem-sucedido de células específicas de PD-1, os hibridomas foram depois separados em termos de célula única em placas de microtitulação de 384 poços usando BD FACSAria 3. Após 2 semanas de cultura, os sobrenadantes das placas de microtitulação foram coletados e rastreados quanto à ligação a PD-1.

Seleção Inicial de Anticorpos de Ligação Específicos de PD- 1

[00406] Os sobrenadantes de hibridomas esgotados foram testados quanto à ligação a PD-1 humano transientemente expresso em células HEK293 pela Cell Insight. Brevemente, células HEK293 foram transientemente transfectadas com um construto de expressão de mamífero codificando PD-1 usando 293Fectin. No dia seguinte, 15 μL de meio de hibridoma esgotado foram adicionados a cada poço de uma placa FMAT com 384 poços. Depois, as células HEK293 transfectadas (0,27 milhões/mL), a coloração nuclear Hoechst 33342 (7,5 μg/mL) e um anticorpo de detecção secundário (0,75 μg/mL - Anti-IgG humano de cabra (H+L) Alexa 488 (Jackson ImmunoResearch)) foram misturados e 30 μL desta mistura foram adicionados a cada poço de uma placa FMAT com 384 poços. Após ~3 horas, o sobrenadante foi aspirado usando um leitor de placas AquaMax e 30 μL de tampão de FACS foram adicionados a cada poço usando um instrumento multigotas. As placas foram colocadas em um agitador Big Bear Plate para distribuir uniformemente as células no poço e depois lidas na plataforma da Cell Insight usando a Cell Health Bio-App. Esta análise levou à identificação de 383 anticorpos específicos do antígeno a partir desta coleta.

Ensaio de repórter Jurkat PD-1 humano/NFAT-luciferase

[00407] Células Jurkat expressando estavelmente PD-1 humano e repórter NFAT-luciferase (Promega) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Sigma), L-glutamina a 2 mM (Sigma), HEPES a 10 mM (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), geneticina a 500 μg/mL (Gibco Life Technologies), higromicina B a 100 μg/mL (Invitrogen) a 37 oC/CO2 a 5%. Células Jurkat expressando estavelmente PD-1 de cinomólogo e repórter NFAT-luciferase (Promega) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Sigma), L-glutamina a 2 mM (Sigma), HEPES a 10 mM (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), higromicina B a 200 μg/mL (Invitrogen), zeocina a 300 μg/mL (Invitrogen) a 37 oC/CO2 a 5%. A linha de células clonais do Ovário de Hamster Chinês (CHO) 99 expressando estavelmente PD-L1 humano (Promega) foi cultivada em Nutrient Mixture F12 HAM (Sigma), soro bovino fetal a 10%, HEPES a 10 mM, geneticina a 250 μg/mL, higromicina B a 200 μg/mL a 37 oC/CO2 a 5%. No dia da experiência, as células Jurkat NFAT-luciferase/ PD-1 e as células CHO Clone 99 PD- L1 (desanexadas com tripsina) foram centrifugadas a 200 x g durante 5 minutos e ressuspensas em meio de ensaio (meio RPMI 1640, soro bovino fetal a 2%, HEPES a 15 mM). As moléculas de teste foram diluídas e tituladas usando o tampão de ensaio em placas de ensaio pretas/de fundo límpido com 384 poços (Corning). As células preparadas foram inoculadas a 40.000 células/poço no total por mistura em primeiro lugar das células preparadas a uma razão 1:1 e, depois, adição da mistura de células às placas de ensaio. As placas foram incubadas durante 18 a 24 horas a 37 oC/CO2 a 5%. A quantidade de luciferase produzida foi medida pelo reagente Bio-Glo Luciferase Assay System (Promega), após o que as placas foram incubadas durante 20 minutos à temperatura, e a luminescência detectada com leitor de placas EnVision (PerkinElmer). Para ensaio de ponto único, as amostras de ESN foram em primeiro lugar quantificadas, normalizadas e testadas a 0,5 μg/mL. Para determinação da potência, as amostras de ESN ou anticorpos purificados foram titulados em série 3 vezes em meio de ensaio e usados para tratar células repórter de PD- 1 humano ou de cinomólogo. O número de anticorpos mostrando atividade desejada durante rastreamento de concentração única e classificação da potência é mostrado na Tabela 15. TABELA 15

[00408] A atividade de anticorpos anti-PD-1 purificados (n = 1 para ensaio de PD-1 humano mostrado) é mostrada na Figura 24 e a potência de anticorpos anti-PD-1 purificados em ensaios de repórter de PD-1 humano e de cinomólogo é listada na Tabela 16. TABELA 16

Resgate Molecular e Sequenciamento de Anticorpos Antagonistas de PD-1

[00409] RNA (total ou mRNA) foi purificado a partir de poços contendo as células de hibridoma produtoras de anticorpos antagonistas de PD-1 usando um Qiagen RNeasy mini ou o estojo Invitrogen mRNA catcher plus. RNA purificado foi usado para amplificar os genes da região variável (V) de cadeia pesada e leve de anticorpos usando síntese de cDNA através de transcrição reversa, seguido por uma reação em cadeia de polimerase (RT-PCR). A cadeia pesada gama do anticorpo totalmente humano foi obtida usando o estojo Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR (Qiagen). Este método foi usado para gerar o cDNA da primeira fita a partir do molde de RNA e depois para amplificar a região variável da cadeia pesada gama usando PCR em multiplex. O iniciador específico da cadeia gama 5' emparelhou com a sequência-sinal da cadeia pesada do anticorpo, ao passo que o iniciador 3' emparelhou com uma região do domínio constante gama. A cadeia leve kappa totalmente humana foi obtida usando o estojo Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR (Qiagen). Este método foi usado para gerar o cDNA da primeira feita a partir do molde de RNA e depois para amplificar a região variável da cadeia leve kappa usando PCR em multiplex. O iniciador específico da cadeia leve kappa 5' emparelhou com a sequência-sinal da cadeia leve do anticorpo ao passo que o iniciador 3' emparelhou com uma região do domínio constante kappa. A cadeia leve lambda totalmente humana foi obtida usando o estojo Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR (Qiagen). Este método foi usado para gerar o cDNA da primeira feita a partir do molde de RNA e depois para amplificar a região variável da cadeia leve lambda usando PCR em multiplex. O iniciador específico da cadeia leve lambda 5' emparelhou com a sequência-sinal da cadeia leve ao passo que o iniciador 3' emparelhou com uma região do domínio constante lambda.

[00410] O cDNA amplificado foi purificado enzimaticamente usando exonuclease I e fosfatase alcalina e o produto de PCR purificado foi sequenciado diretamente. As sequências de aminoácidos foram deduzidas a partir das sequências de ácido nucleico correspondentes bioinformaticamente. Dois ciclos de amplificação e sequenciamento por RT-PCR independentes, adicionais foram completados para cada amostra de hibridoma de modo a se confirmar que quaisquer mutações observadas não eram uma consequência da PCR. As sequências de aminoácidos derivadas foram depois analisadas para se determinar a origem da sequência da linha germinal dos anticorpos e para se identificarem desvios a partir da sequência da linha germinal. Uma comparação de cada uma das sequências de cadeia pesada e leve com suas sequências da linha germinal originais é indicada. As sequências de aminoácidos correspondendo a regiões determinantes da complementaridade (CDRs) dos anticorpos sequenciados foram alinhadas e estes alinhamentos foram utilizados para agrupar os clones por similaridade.

Ensaios de Ligação a Células Primárias

[00411] A ligação de sobrenadantes de hibridoma a PD-1 expresso por células humanas e de macaco-cinomólogo primárias foi testada por citometria de fluxo. Para ensaio de ligação a células primárias humanas, células T humanas purificadas (Biological Specialty Corp.) foram descongeladas e suspensas a uma concentração de 2,5 x 106 células/mL. As células T foram estimuladas com 5 ug/mL de clones anti-CD3 humana OKT3 (eBioscience) e 1 μg/mL de anti-CD28 humana (BD Pharmingen) durante 72 horas a 37 °C/CO2 a 5% em uma placa que havia sido pré-tratada com Fc de IgG anticamundongo a 5 μg/mL (Pierce). Após 72 horas, as células foram removidas, lavadas e suspensas a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL com 10 ng/mL de IL-2 (Pepro Tech). As células foram depois incubadas durante outras 48 horas a 37 °C/CO2 a 5%. Para ensaio de ligação a células primárias de cinomólogo, PBMCs de cinomólogo (SNBL) foram descongeladas e suspensas em uma concentração entre 4 x 106 e 5 x 106 células/mL. As PBMCs foram estimuladas com 1 μg/mL de clones anti-CD3 humana SP34 (BD Pharmingen) e 1 μg/mL de anti-CD28 humana (BD Pharmingen) durante 72 horas a 37 °C/CO2 a 5% em uma placa que havia sido pré-tratada com Fc de IgG anticamundongo a 5 μg/mL (Pierce). Após 72 horas, as células foram removidas, lavadas e suspensas a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL com 20 ng/mL de IL-2 (Pepro Tech). As células foram depois incubadas durante outras 48 horas a 37 °C/CO2 a 5%. Após a incubação final, as células foram preparadas para citometria de fluxo por incubação com sobrenadantes de hibridoma normalizados, anticorpos de controle positivo e anticorpos de controle do isótipo à concentração final de 1 μg/mL. Anti-IgG Humana de Cabra de Fragmento F(ab')2 Alexa Fluor 647 AffiniPure (H+L) (Jackson ImmunoReserach) a 5 μg/mL foi usado para detecção secundária e YoPro1 a 8,25 nM (Invitrogen) foi usado para uma coloração de células vivas/mortas. As células foram depois introduzidas em citômetro de fluxo BD FACSCanto II para detectar ligação ao anticorpo anti-PD-1. Os resultados são expressos como geomédia de FACS de células expressando PD-1 e os dados são mostrados na Tabela 17. TABELA 17

Ensaio de Competição Receptor - Ligando

[00412] Os sobrenadantes de hibridoma de ligação a PD-1 foram depois testados quanto à sua capacidade de bloquearem a ligação de PD-1 ao ligando. Ensaios de ligação competitiva foram realizados na amostras de sobrenadante de hibridoma específico do antígeno usando FACS em células HEK293 expressando transientemente PD-1 humano como se segue. Células HEK293 expressando PD-1 humano foram misturadas com a amostra de anticorpo (sobrenadantes de hibridoma específicos de PD-1) e incubadas durante 1 hora a 4 °C e, depois, lavadas duas vezes. As células com amostra ligada foram depois incubadas com huPD-L1-Fc-Alexa647 ou huPD-L2- Fc-Alexa 647 (R&D systems, Minneapolis, MN) durante 45 minutos a 4 °C. A coloração de viabilidade de células 7-AAD foi depois adicionada e as células incubadas durante 15 minutos adicionais a 4 °C, lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de FACS. As amostras foram analisadas usando um Citômetro de Fluxo BD Accuri™ e um autoAmostrador Intellicyt HyperCyt. Os dados na Tabela 18 refletem que essa percentagem de inibição de PD-L1 humano da ligação de PD-L2 a PD-1 humano a 1 ug/mL. TABELA 18 Análise de competição de anticorpos anti-PD-1 com ligação de PD-L1 ou PD-L2 a PD-1

Análise de Lacuna de Afinidade

[00413] As medições cinéticas de vários dos anticorpos foram avaliadas usando o método KinExA®. Este método envolve determinação à base de solução de medições de afinidade formais no equilíbrio.

[00414] Esférulas de poli(metacrilato de metila) ou PMMA foram revestidas com PD-1 humano biotinilado por adsorção em primeiro lugar das esférulas de PMMA com BSA biotinilada, Neutravidina e depois com PD-1 biotinilado.

[00415] Experiências KinExA foram realizadas usando um sistema de imunoensaio de fluxo automatizado, KinExA 3200, no qual esférulas acopladas com PD-1 serviram como a fase sólida. Brevemente, uma quantidade constante de mAbs anti- hPD-1 (3 nM ou 1 nM ou 100 pM) foi incubada com concentrações titulantes de h-PD-1 ou ci-PD-1 começando a 100 nM em tampão de amostra (PBS com BSA a 0,1% para reduzir a ligação não específica). Os complexos antígeno/anticorpo foram incubados à TA durante 48 hrs a 72 hrs para permitir que seja alcançado equilíbrio. A mistura foi conduzida através de esférulas acopladas a PD-1 para acumular anticorpo não ligado. Os volumes e caudais da mistura foram variados dependendo do sinal específico obtido em cada experiência.

[00416] O mAb secundário foi detectado usando soluções contendo um Ab secundário anticorpo anti-IgG Hu de Cabra (H+L)-Alexa647 em tampão de amostra. Os sinais ligados foram convertidos em valores relativos como uma proporção de controle na ausência de hu- ou ci-PD-1. Duas réplicas de cada amostra foram medidas para todas as experiências em equilíbrio. A constante de dissociação em equilíbrio (Kd) foi obtida a partir de análise de regressão não linear dos dados usando um modelo de ligação homogêneo em um local contido dentro do software de análise de n-curva KinExA. O software calcula a Kd e determina o intervalo de confiança de 95% por ajuste dos pontos de dados a uma curva de Kd teórica. O intervalo de confiança de 95% é dado como Kd baixa e Kd elevada. TABELA 19 Afinidade de anticorpos anti-PD-1 purificados para PD-1 humano e de cinomólogo recombinante

Kd calculada tomando em consideração de PD-1 como concentração conhecida e deixando o software a calcular a Kd e a concentração de mAb.

Confirmação de Atividade de Anticorpos Purificados em ensaio de MLR

[00417] Célul as dendríticas derivadas de monócitos imaturos humanos (Astarte) foram descongeladas em células dendríticas maduras através de cultura em IL-4, GM-CSF e TNF-a durante 72 horas usando Estojo CellXVivo Human Monocyte-Derived Dendritic Cell Differentiation (R&D Systems #CDK004). As células não aderentes e vagamente aderentes foram removidas, combinadas e centrifugadas para peletizar as células. Após o meio ter sido removido, as células foram ressuspensas em meio X-Vivo-15 a 400 x 10A3 células/mL e células dendríticas foram adicionadas a cada célula de uma placa com 96 poços (20k células em 50 μL). Células T humanas (Astarte) foram rapidamente descongeladas e lavadas em meio X-Vivo-15. As células foram ressuspensas a 2 x 10A6 células/mL e 100 μL foram adicionados a cada poço (200k células/100 μL). Os anticorpos foram diluídos e adicionados a cada poço em um volume total de 50 μL. A mistura foi incubada durante três dias a 37 graus. Em este momento, as células foram giradas e 175 μL foram usadas para se medir a produção de IL2 como uma medida da proliferação de células T usando o Estojo IL-2 V-Plex (MSD) conforme as recomendações do fabricante. TABELA 20

EXEMPLO 13

[00418] Quando possível, as sequências de domínio variável anti-PD-1 A-1 (20A2), A-3 (20C1) e A-2 (22D4) foram manipuladas para se removerem motivos tendo um risco de degradação de cadeia lateral. Tais motivos de aminoácidos incluem; (1) sequências “NG” e “NT” de CDR propensas à desamidação de asparagina, (2) sequências “DG”, “DH”, “DS” e “DT” de CDR propensas à isomerização de ácido aspártico, (3) e triptofanos de CDR3 propensos à oxidação. Tipicamente, as identidades de substituição foram derivadas das sequências da linha germinal ou de mAbs de ligação a PD-1 relacionados com sequências. Para casos nos quais a bioinformática ou análises estruturais não proporcionaram uma identidade de substituição clara, tipos de resíduos quimicamente similares ao resíduo genitor foram selecionados.

[00419] Os motivos de sequência de domínio variável violando múltiplas tendências de covariância de resíduos par a par à base de alinhamento de sequências múltiplas foram também removidos. A remediação de violadores da covariância par a par através de substituição por tipos de resíduos da linha germinal ou relacionados com a linha germinal pode levar a melhor manufaturabilidade devido a níveis de expressão de mAb aumentados e estabilidades biofísicas. Ver, Kannan, G. Method of Correlated Mutational Analysis to Improve Therapeutic Antibodies. Pedido de Patente dos EUA PCT/US2012/028596 depositado a 9 de março, 2012. Identidades de substituição para violadores da covariância foram selecionadas usando abordagem similar àquela usada para remedir locais de degradação, como discutido acima.

[00420] A manipulação de 20A2 levou a 20A2.003. A manipulação de 20C1 levou a 20C1.006 e 20C1.009. A manipulação de 22D4 levou a 22D4.006 e 22D4.017.

EXEMPLO 14

[00421] A atividade in vivo da proteína de fusão compreendendo o anticorpo anti-PD-1 22D4.017 fundido a uma muteína dupla de IL-21 de monômero compreendendo as mutações R9E e R76A (“[22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero)”) foi avaliada em macacos-cinomólogos não humanos sem tratamento. Um primeiro grupo de macacos recebeu o anticorpo anti-PD-1 22D4.017 sozinho (não fundido a uma muteína de IL-21), e um segundo grupo de macacos recebeu a proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero). Os parâmetros farmacodinâmicos (PD) foram monitorizados usando FACS em sangue periférico e incluíram dinâmica de células imunitárias e fosforilação de fator de transcrição STAT3 (pSTAT3) em linfócitos. As citocinas e perforina no soro foram também examinadas por ensaio em multiplex de perfil de múltiplos analitos (MPA) Millipore Milliplex®. A análise pré- dose de parâmetros de sangue periférico foi conduzida para permitir normalização de conjuntos de dados em relação à linha de base. A dosagem começou no Dia 1. Sangue e soro foram retirados em pontos temporais fixos predeterminados.

[00422] Apesar da ativação de Ki67 [Figuras 25A e 25B] e STAT3 [Figuras 25C e 25D] em células T, não foi observado nenhum aumento significativo na população de células T em massa nos grupos aos quais foi administrado o anticorpo 22D4.017 ou a proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) [Figuras 25A e 25B], sugerindo que ambos estes tratamentos foram insuficientes por si próprios para induzir a expansão da população de células T em massa [Figuras 25E e 25F]. Estes dados apoiam a noção de que o bloqueio sistêmico da sinalização de PD-1 pode ter um impacto mais global na população de células T em massa incluindo a ativação da sinalização de STAT3 e Ki67, mas que estas mudanças podem ser insuficientes por si só para manifestar resultado funcional significativo (como também evidenciado pela falha de tratamentos de monoterapia ou proteína de fusão anti-PD-1 em induzir uma expansão de células T mais generalizada).

[00423] Para melhor entender como mudanças na sinalização proximal poderia impactar especificamente células T expressando PD-1, e como as células T PD-1(+) refletem somente uma pequena fração da população de células T em massa no sangue periférico, estas células foram examinadas mais diretamente por ativação de células T CD4 e CD8 PD-1(+) usando um mAb de detecção de PD-1 não competidor [Figuras 16 e 17]. Após uma redução ligeira inicial em números absolutos de células PD-1(+) em circulação, esta população permaneceu estável no grupo de anticorpo [22D4.017]. Em contraste, após uma redução inicial nos números de células T CD4 e CD8 PD- 1(+) em circulação, existiu um ressalto significativo (acima da linha de base) no número de células PD-1(+) observado às 336 h pós-dosagem na população de grupo com tratamento de proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) [Figura 25G]. Assim, apesar da ausência de expansão significativa da população em massa, estes dados sugerem que os números de células T PD-1(+) são aumentados seletivamente após administração da proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero) [Figura ].

[00424] Para se determinar um possível impacto funcional da expansão de células T PD-1(+), uma relação entre a expansão de células T CD4/8 PD-1(+) e a perforina no soro foi examinada. De fato, os dados sugerem que existe uma relação positiva entre estes dois parâmetros: a perforina no soro é a mais elevada em animais aos quais foi administrada proteína de fusão [22D4.017]-[R9E:R76A] (monômero), que experienciaram aumento significativo nas células T PD-1(+) no sangue periférico [Figura 25I].

[00425] Tomados em conjunto, estes dados sugerem que, embora a exposição sistêmica da proteína de fusão [22D4.017]- [R9E:R76A] (monômero) tenha falhado em manifestar um aumento na população de células T em massa total, o bloqueio de PD- 1 e administração simultânea do sinal de IL-21 na mesma célula (expressando PD-1) é suficiente para induzir a expansão da população. Isto se relaciona também com um aumento na perforina no soro [Figura 25I].

EXEMPLO 15

[00426] O seguinte exemplo demonstra as afinidades de ligação de vários anticorpos anti-PD-1.

[00427] As afinidades de ligação Octet de anticorpo anti- PD-1::PD-1 foram caracterizadas como se segue. Para quantificar a afinidade de ligação KD (constante de dissociação em equilíbrio) entre os anticorpos anti-PD-1 e PD-1 humano e de macaco-cinomólogo recombinante, solúvel, as constantes de taxa de associação e dissociação foram medidas usando um instrumento Pall® ForteBio® Octet® RED384 em modo de 16 pontas ou um instrumento Pall® Octet® HTX em modo de 96 pontas. Em todos os casos, pontas de biossensor óptico de fibra reativas com amina de segunda geração (AR2G) foram usadas para capturar covalentemente os anticorpos até níveis de carga finais entre 2,5 e 4 nm. O método de ensaio de ligação usou os seguintes passos de imobilização: (1) equilíbrio em água, 60 segundos; (2) ativação com Hidrocloreto de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodi- imida (EDC) a 20 mM fresco misturado com N- hidroxissulfossuccinimida (sulfo-NHS) a 10 mM, 600 segundos; (3) imobilização de anticorpos a 20 nM diluídos em tampão de acetato pH 6,0 a 10 mM, 2000 segundos; (4) extinção com etanolamina a 1 M, 300 segundos; e finalmente (5) uma incubação de linha de base em tampão de operação Octet (TRIS pH 7,5 a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 1 mM, Triton X-100 a 0,13% (v/v) e Albumina de Soro Bovino (BSA) a 0,10 mg/mL, 60 segundos. Todas as experiências foram operadas com as placas de amostras pretas com 384 poços sugeridas pelo fabricante (volume de 100 μL por poço) a 27 °C e 1000 RPM.

[00428] Para cada interação Ab::PD-1, uma coluna de oito pontas foi igualmente imobilizada como descrito acima com o mesmo anticorpo. Três pontas foram usadas para ligar uma série de diluição de três pontos de PD-1(1-170)-FLAG-His humana solúvel, três pontas mais foram usadas para ligar uma série de diluição de três pontos de PD-1(1-167)-FLAG-His humana solúvel e depois as duas pontas restantes (com Ab imobilizado como o resto das pontas na coluna) foram expostas a tampão de Octet® tal que pudessem ser pontas de referência. Todas as pontas de fibra óptica foram usadas uma vez e depois descartadas; i.e., sem regeneração. Curvas de ligação a PD- 1 humano e de cino foram geradas por criação de uma série de diluição em série 1:3 vezes do receptor de PD-1 solúvel em tampão de operação Octet; as concentrações finais de PD-1 foram 30, 10 e 3,3 nM (exceto para o mAb anti-PD-1 IgG4 que tinha concentração de PD-1 33, 11, 3,7 nM). Os biossensores ópticos de fibra com o anticorpos imobilizados foram incubados nos poços contendo a série de diluição em série de PD-1 durante 300 segundos (passo de associação) e depois movidos para poços com apenas o tampão de operação durante 500 segundos (passo de dissociação).

[00429] Os dados em bruto foram processados com o software de análise de dados do instrumento (v10). Para cada coluna de sensores, a média do sinal de ligação dos dois sensores de referência foi calculada e este foi subtraído a partir dos seis sensores de amostra restantes. Os dados subtraídos da referência foram depois processados com as opções de software padrão: Eixo dos Y alinhado com a linha de base, correção interpassos com a dissociação e finalmente processados com um filtro de Savitzky-Golay. Os dados processados finais para cada ligação de anticorpo a três concentrações de PD-1 humano ou três de cino foram depois globalmente ajustados a um modelo de ligação 1:1 e representados graficamente. Todos os gráficos mostram tanto os dados processados como o ajuste ao modelo de ligação 1:1. O ajuste de modelo de ligação 1:1 foi usado para se determinar a constante de taxa de associação (ka; unidades M-1seg-1) e a constante de taxa de dissociação (kd; unidades seg-1). A constante de dissociação em equilíbrio (KD; unidades nanomolar (nM) = 1 x 10-9 Mol/L) foi depois calculada a como uma razão kd/ka.

[00430] A Figura 26 mostra os perfis de ligação para anticorpos anti-PD-1 22D4.017, 20C1.009 e 20A2.003, testados lado a lado com dois mAbs anti-PD-1 (um mAb anti-PD-1 IgG1 e um mAb anti-PD-1 IgG4). Os perfis de ligação foram determinados usando o sistema FortéBio Octet®. A ligação é mostrada contra receptores de PD-1 humanos e de cino.

[00431] Como mostrado nas Figuras 26A-26E, os anticorpos 22D4.017, 20C1.009 e 20A2.003 PD-1 exibiram valores de KD que foram 2 a 14 vezes maiores do que anticorpos comercialmente disponíveis quando testados contra a proteína PD-1 humana. Adicionalmente, a análise da reatividade cruzada de proteína PD-1 de cino com os anticorpos 22D4.017, 20C1.009 e 20A2.003 mostrou uma afinidade similar global, ao passo que os anticorpos comercialmente disponíveis mostraram diferença de em torno de 2 vezes na afinidade (Figuras 26F- 26J).

EXEMPLO 16

[00432] Os seguintes exemplos demonstra a estabilidade de vários anticorpos anti-PD-1.

[00433] A estabilidade conformacional térmica dos anticorpos anti-PD-1 foi caracterizada como se segue. Os anticorpos 20C1.009 e 22D4.017 foram avaliados quanto à estabilidade térmica por calorimetria diferencial de varrimento (DSC). A DSC é uma técnica que mede as capacidades de calor em função da temperatura. O sinal da célula de amostra é comparada com uma célula de referência não tendo a proteína. À medida que a temperatura das células são aumentadas a entalpia e temperatura de fusão, a largura do pico é medida para cada transição de desdobragem. Isto proporciona informação sobre a estabilidade térmica e estrutura de ordem superior da proteína, incluindo estabilidade térmica dos domínios da proteína. A Figura 27 representa um Termograma de DSC de cada anticorpo anti-PD-1 a 1 mg/mL em A52SuT e a Tabela 21 proporciona a Tm para cada anticorpo testado. TABELA 21

[00434] A viscosidade foi adicionalmente determinada usando um cone e placa (TA Instruments, New Castle, DE) por medição da resistência ao fluxo devido às forças friccionais entre moléculas. Um procedimento de varrimento de fluxo foi aplicado de 100 a 1000 s-1 usando uma placa de cone de 20 mm e 1,988° e placa de Peltier Aço - 990918. A viscosidade foi medida em Pa*s, onde 1 m Pa*s = 1 cP a 1000 s-1. A viscosidade foi medida para cada anticorpo a 70 e 150 mg/mL com surfatante a 0,01% adicionado ao tampão de formulação (A52Su). Todas as amostras foram medidas à temperatura ambiente. Os dados de viscosidade (Taxa de Cisalhamento 1000) são mostrados na Figure 28 e proporcionados na Tabela 22. TABELA 22

[00435] As propriedades de estabilidade do anticorpo são fatores importantes considerados durante o desenvolvimento de candidatos terapêuticos. Por exemplo, a propensão de um anticorpo a se agregar (formação de grandes complexos em solução que podem levar à precipitação) pode impactar a vida de prateleira, modo de administração (p.ex., i.v. vs. subcutâneo) e atividade da molécula. Tipicamente, as propriedades de termoestabilidade e viscosidade de um anticorpo são bons indicadores da capacidade de um anticorpo de manter integridade estrutural a elevadas temperaturas e elevadas concentrações. Como os dados acima demonstram, 20C1.009 exibe propriedades de estabilidade que o tornam particularmente adequado como um terapêutico que é passível de administração tanto i.v. como subcutânea (e elevada concentração).

EXEMPLO 17

[00436] Este exemplo demonstra a atividade de IL-21 provocada por várias proteínas de fusão.

[00437] Várias proteínas de fusão compreendendo uma muteína de IL-21 foram preparadas e testadas quanto à atividade de IL-21 usando o ensaio pSTAT3 AlphaLISA®. Uma compreendeu um anticorpo monoclonal (mAb) anti-TIGIT, enquanto um segundo compreendeu um mAb anti-LAG3. Quatro linhas de células foram geradas para uso em estas experiências: (A) uma linha de células T Hut78 variante que é positiva quanto a PD-1, (B) uma linha de células T Hut78 variante que é positiva quanto a TIGIT (C) uma linha de células T Hut78 variante que é positiva quanto a LAG3 e (D) a linha de células T Hut78 variante que não expressa endogenamente PD-1, TIGIT ou LAG3. Todas as quatro linhas de células foram expostas a (i) rhIL-21 sozinha, (ii) mAb anti- PD-1 sozinho, (iii) mAb anti-TIGIT sozinho, (iv) mAb anti- LAG3 sozinho, (v) mAb anti-PD-1 fundido a uma muteína de IL- 21 (R5Q:R76E) (monômero), (vi) mAb anti-TIGIT fundido a uma muteína de IL-21 (R5Q:R76E) (dímero) e (vii) mAb anti-LAG3 fundido a uma muteína de IL-21 (R5Q:76E) (dímero).

[00438] Os resultados do ensaio de fosforilação de STAT3 e as EC50s de cada molécula para sinalização de STAT são mostrados nas Figuras 29A-29D e Tabela 23, respectivamente. TABELA 23

Como mostrado nas Figuras 29A-29D e Tabela 23, as proteínas de fusão anti-TIGIT e anti-LAG3 exibiram potência significativamente reduzida (anti-TIGIT) ou nenhuma potência mensurável (anti-LAG3) em comparação com a rhIL-21.

[00439] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patentes e patentes, citadas aqui são deste modo incorporadas por referência na mesma medida como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada como estando incorporada por referência e fosse apresentada na sua totalidade aqui.

[00440] O uso dos termos “um” e “uma” e “o/a” e referentes similares no contexto da descrição da divulgação (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) é para ser interpretado como abrangendo tanto o singular como o plural, a não ser que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” e “contendo” são para ser interpretados como termos abertos (i.e., significando “incluindo, mas não se limitando a”), a não ser que de outro modo notado.

[00441] A recitação de gamas de valores aqui se destina meramente a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado residindo dentro da gama e a cada ponto final, a não ser que de outro modo indicado aqui, e cada valor e ponto final separados são incorporados no relatório descritivo como se fossem individualmente recitados aqui.

[00442] Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a não ser que de outro modo indicado aqui ou de outro modo contradito pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplificativa (p.ex., “tal como”) proporcionados aqui se destina meramente a esclarecer melhor a divulgação e não coloca uma limitação no escopo da divulgação a não ser que de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da divulgação.

[00443] Modalidades preferenciais desta divulgação são descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para levar a cabo a divulgação. Variações dessas modalidades preferenciais podem se tornar aparentes aos peritos na técnica após leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que os especialistas peritos empreguem tais variações como apropriado, e os inventores pretendem que a divulgação seja praticada de outro modo que não especificamente descrito aqui. Conformemente, esta divulgação inclui todas as modificações e equivalentes do assunto recitado nas reivindicações anexas aqui como permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas suas variações possíveis é englobada pela divulgação a não ser que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto.

Claims

1. Muteína de IL-21 caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWS AFSCF QKAQL KSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHR LTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXX QHXSS RTHGS EDS (SEQ ID NO: 2), em que “X” representa qualquer aminoácido, e em que a referida sequência de aminoácidos da muteína de IL-21 difere da sequência de aminoácidos de IL-21 humana (SEQ ID NO: 1) em pelo menos dois aminoácidos, adicionalmente em que as substituições de aminoácidos ocorrem em duas das posições 5, 9, 73 e 76 da SEQ ID NO: 1.

2. Muteína de IL-21, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma das substituições ocorre na posição 76 de SEQ ID NO: 1.

3. Muteína de IL-21, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o aminoácido substituto na posição 76 de SEQ ID NO: 1 é um aminoácido alifático ou um aminoácido ácido.

4. Muteína de IL-21, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácidos na posição 5, 9 ou 73 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido alifático ou aminoácido ácido.

5. Muteína de IL-21, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácidos na posição 5 de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido substituto é um aminoácido com uma amida de cadeia lateral.

6. Muteína de IL-21, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o aminoácido alifático é alanina.

7. Muteína de IL-21, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o aminoácido ácido é ácido glutâmico.

8. Muteína de IL-21, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o aminoácido com uma amida de cadeia lateral é glutamina.

9. Muteína de IL-21 caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 199 a 208, 210 a 222, 224 a 248 e 255.

10. Muteína de IL-21, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a muteína de IL-21 se liga ao receptor de IL-21 com uma afinidade reduzida, em relação à afinidade de IL-21 de tipo selvagem pelo receptor de IL-21.

11. Muteína de IL-21, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que se liga a um receptor de IL-21 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 256.

12. Muteína de IL-21, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que se liga à cadeia gama de um receptor de IL-21 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 257.

13. Muteína de IL-21, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que se liga ao receptor de IL-21 humano com uma Kd que é maior do que ou é 0,04 nM.

14. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma da SEQ ID Nos: 392-471.

15. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 14.

16. Célula hospedeira de microorganismo caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 14, ou o vetor, conforme definido na reivindicação 15.

17. Kit caracterizado pelo fato de que compreende uma muteína de IL-21, um ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, conjugado, polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão, ou uma sua combinação, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, e um recipiente.

18. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma muteína de IL-21, um ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, conjugado, polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão, ou uma sua combinação, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

19. Método de preparação de uma muteína de IL-21, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira de microorganismo, conforme definida na reivindicação 16, de modo a expressar a muteína de IL-21 e a coletar a muteína de IL-21 expressa.

20. Uso de uma muteína de IL-21, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 15, do vetor, conforme definido na reivindicação 16, ou da célula hospedeira de microorganismo, conforme definida na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição farmacêutica para tratar um tumor sólido em um indivíduo.