BR112020022511A2 - proteínas de fusão compostas por uma muteína de interleucina-2 (il-2) e interferon do tipo i - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS DE FUSÃO COMPOSTAS POR UMA MUTEÍNA DE INTERLEUCINA-2 (IL-2) E INTERFERON DO TIPO I. A presente invenção descreve proteínas de fusão baseadas em citocinas, denominadas bi-citocinas (BC), especificamente formadas pela ligação de uma muteína agonista da IL2 com um interferon (IFN) do tipo I, ligadas por uma região Fc de uma IgG1 humana mutante e um peptídeo conector. A combinação de uma muteína agonista da IL2 e um IFN do tipo I na estrutura das bi-citocinas fornece propriedades imunoregulatórias surpreendentes àquelas moléculas e um efeito terapêutico superior àquele das citocinas parentais, ou sua combinação, a qual as torna moléculas atrativas e novas para o tratamento do câncer. As composições farmacêuticas compreendendo como um ingrediente ativo as proteínas de fusão objeto desta patente são também descritas.

Description

PROTEÍNAS DE FUSÃO COMPOSTAS POR UMA MUTEÍNA DE INTERLEUCINA-2 (IL-2) E INTERFERON DO TIPO I

ESCOPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção se refere ao campo da Biotecnologia e Imuno-oncologia, especialmente ao desenvolvimento das proteínas de fusão baseadas em citocinas. Particularmente, ela descreve proteínas de fusão compostas pela ligação de um interferon do tipo I (IFN) à muteínas agonistas de interleucina 2 (IL2).

ANTECEDENTES

[002] Apesar de décadas de trabalho árduo no campo da imunoterapia do câncer, relacionado ao uso de citocinas, os resultados obtidos até o momento foram modestos. A alta toxicidade e meia-vida reduzida destas moléculas, bem como a baixa percentagem de pacientes beneficiados, tornam necessário criar estratégias inovadoras as quais melhoram suas propriedades antitumorais, que se traduzirá em melhor qualidade de vida e vida mais longa para os pacientes com câncer. Dentre os mecanismos os quais prejudicam a eficácia terapêutica das citocinas está a indução de células T regulatórias, as quais suprimem a resposta das células T CD8+ citotóxicas no microambiente tumoral (Ovens e Naugler (2012) Theoretical Biology and Medical Modeling, 9: 44).

[003] Tradicionalmente, as combinações têm sido uma das estratégias que visam otimizar o uso terapêutico de citocinas no tratamento de câncer, tanto através da coadministração de moléculas solúveis ou da geração de proteínas de fusão, frequentemente denominadas fusocinas. Dentre as vantagens associadas com o uso das últimas, não é apenas a viabilidade de sua produção, porém também a possibilidade de estabelecer relações estequiométricas entre as moléculas com diferentes propriedades farmacológicas. Em adição, foi demonstrado que algumas fusocinas apresentam um efeito terapêutico superior em comparação com a administração de citocinas parentais separadamente, e até mesmo quando comparadas à sua combinação (Stagg J. et al (2004) Cancer Research, 64: 8795 - 8799; Acres B. (2005) Cancer Research, 65: 9536 - 9546); US 2011/0150828. Uma das estratégias terapêuticas recentemente descritas no estudo das fusocinas é a administração intratumoral de mRNA que codifica uma proteína de fusão baseada em IFN do tipo 1 e o ectodomínio do receptor TGFβ, o qual mostrou efeito antitumoral. A tecnologia de transferência intratumoral de mRNA é uma ferramenta terapêutica altamente versátil, reprodutível, fácil e adaptável bem adequada para o cenário clínico (Van der Jeught et al (2015), OncoImmunology, 4: 5).

[004] Duas citocinas relevantes para a terapia antitumoral são um interferon do tipo 1: IFNα, e IL2, as quais são potentes indutoras dos padrões de resposta da T auxiliar 1 desejados no tratamento do câncer. A ação antitumoral direta do IFNα nas células malignas foi previamente descrita. Foi associada ao efeito citostático, antiproliferativo e a uma diminuição nos níveis de protease da matriz extracelular, os quais estão envolvidos nos processos de invasão e metástase e relacionados a um pior prognóstico da doença. Por outro lado, essa citocina promove a maturação e migração das células apresentadoras de antígeno, a indução da apresentação cruzada em células dendríticas αCD8 e ativação de linfócitos (Chikkala et al (1990) Cancer Research, 50: 1176 - 1182). Foi descrito que o IFNα protege as células T da apoptose dependente de mitocôndrias, como uma consequência da ativação mediada pelo antígeno e, então, favorece o processo de expansão clonal, de maneira regulada (Dondi et al (2004) The Journal of Immunology, 173 (6): 3740 - 3747).

[005] Por outro lado, a citocina IL2 é um fator autócrino o qual promove a proliferação de antígenos ativados por linfócitos T. No entanto, ela se liga com maior afinidade aos linfócitos T regulatórios do que às células efetoras, então, induzindo sua proliferação com o consequente impacto negativo no efeito antitumoral (Chaput et al (2007) J Immunol, 179: 4969 - 4978). Uma das estratégias para melhorar a eficácia terapêutica desta molécula é o desenvolvimento de muteínas baseadas em um desenho racional. Este é o caso da muteína agonista da IL2 gerada no Centro de Imunologia Molecular, a qual é incapaz de se ligar ao receptor de alta afinidade expresso nas células T regulatórias. A muteína agonista da IL2 será daqui em diante referida como IL2 não alfa (SEQ ID NO 6 do US 9,206,243). Como um resultado das suas modificações em relação à IL2 do tipo selvagem, a IL2 não alfa preferencialmente expande populações efetoras de NK e células T CD8 de memória, em relação aos linfócitos T regulatórios. A menor toxicidade desta molécula em tecidos saudáveis em comparação com a Il2 do tipo selvagem também foi descrita (Carmenate et al (2013) Immunology, 190: 6230 - 6238).

[006] Outra variante agonista de IL2 foi gerada a partir da evolução in vitro (engenharia genética). Esta variante denominada supercina de IL2 (H9) exibe afinidade de ligação aumentada para a cadeia beta do receptor de IL2 e estimula uma poderosa proliferação de linfócitos T, independentemente da expressão da cadeia alfa CD25 do receptor de IL2. De fato, foi demonstrado que é capaz de induzir um aumento da expansão de linfócitos T citotóxicos, uma resposta antitumoral melhorada in vivo, uma expansão limitada de células T regulatórias, e toxicidade reduzida, em relação à IL2 (Levin et al. (2012) Nature, 48: 529 - 535). Esta variante será aqui em seguida referida como H9.

[007] Diversos estudos sugerem um efeito sinérgico da administração combinada de IL2 e IFNα no tratamento de câncer. A capacidade de estimular a citotoxicidade celular dependente de anticorpos induzida pelo MAb BR55-2 contra a linhagem de carcinoma colorretal HT29 foi significativamente aumentada usando a combinação de IFNα e IL2, quando comparada àquela das citocinas usadas separadamente (Flieger et al. (2000) Cytokine, 12: 756 - 761). Em 2010, Konjevic et al., demonstrou que ambas a IL2 e IFNα aumentam a atividade in vitro das células NK, a partir de amostras de sangue periférico retiradas de pacientes com melanoma metastático em estágio clínico IV. Ambas as citocinas, IL2 e IFNα, foram capazes de estimular a expressão do receptor de ativação NKG2D nas células NK, até mesmo na subpopulação das células NK com a alta expressão de CD16; indução do NKG2D por ambas as citocinas correlacionadas com a indução da atividade celular da célula NK (Konjevic et al (2010) Melanoma Research, 20: 459 - 67).

[008] Na literatura, existe um relatório que descreve a geração de uma proteína de fusão que combina duas citocinas, IL2 do tipo selvagem e IFNα2b humana. Nesta molécula, a IL2 está diretamente ligada ao IFNα2b, e seu efeito antitumoral não foi comparado com o das citocinas parentais e sua combinação (He et al (1999) J Leukoc Biol, 125: 77 - 82), então não há evidência de sua superioridade sobre eles.

[009] Tendo em conta os antecedentes descritos acima, os inventores do presente pedido geraram diversas proteínas de fusão bifuncionais denominadas bi-citocinas (BC), para a terapia do câncer. Duas moléculas bifuncionais as quais combinam um IFN do tipo I com agonistas IL2 foram obtidas para o tratamento de câncer. Para obter as mesmas, o ponto de início foi a fusão de duas muteínas: IL-2 não alfa ou H9, e IFNα. O desenho proposto para estas BC, daqui em diante referidas como BC2 e BC3, respectivamente, consiste na conexão de ambas as citocinas através de uma região Fc de uma imunoglobulina com ligação limitada aos receptores Fcγ. A presença desta região Fc, capaz de se ligar aos receptores Fc neonatais, permite aumentar o tempo da meia-vida. Essas combinações e desenhos constituem novos elementos no desenvolvimento desse tipo de proteínas. As moléculas resultantes apresentam efeito imunomodulador, bem como propriedades antitumorais surpreendentes in vivo, as quais são superiores àquelas observadas após a administração de cada citocina parental (fundidas à mesma região Fc), e até mesmo, à combinação das mesmas, em quantidades equimolares.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0010] Em uma modalidade, a matéria da presente invenção é proteínas de fusão compreendendo uma muteína de IL2 conectada através de um ligante a um IFN do tipo I. Particularmente, as sequências das muteínas de IL2 as quais são parte das proteínas de fusão da presente invenção são descritas na SEQ ID NO 1 e 2. O IFN o qual é parte da estrutura das referidas proteínas de fusão é IFNα (SEQ ID NO 3).

[0011] Em uma modalidade particular, as proteínas de fusão da presente invenção são caracterizadas pelo fato de o ligante consistir de uma região Fc de uma IgG1 humana mutada, e um peptídeo conector, e sua sequência é mostrada na SEQ ID NO 5.

[0012] Adicionalmente, as sequências das proteínas de fusão descritas na presente invenção são mostradas na SEQ ID NO 6 e 7, e as sequências de ácido nucleico que as codificam são mostradas nas SEQ ID NOs 10 e 11, respectivamente.

[0013] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo como ingrediente ativo as proteínas de fusão descritas nas SEQ ID NO 6 e 7, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0014] Em outra modalidade, a matéria da presente invenção é o uso das proteínas de fusão aqui descritas no tratamento de câncer; incluindo a abordagem da injeção intratumoral das moléculas de ácido nucleico que codificam as referidas proteínas de fusão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Desenho das BCs

[0015] As proteínas de fusão da presente invenção foram desenhadas tendo em conta o cenário patológico para o qual elas são pretendidas. BC2 é formada pela fusão de muteína IL-2 não alfa, cuja sequência é mostrada na SEQ ID NO. 1 (previamente divulgada na SEQ ID No. 6 da US 9,206,243 B2) com o IFNα humano cuja sequência é mostrada na Figura 1A e na SEQ ID. NO 3 da presente invenção. A região Fc de uma

IgG1 humana mutada apresentando as mutações L234A L235A, associadas com uma capacidade limitada de ativação dos receptores envolvidos na resposta imune (Hezareh et al (2001) J Virol., 75 (24): 12161 - 12168), e o peptídeo conector (Gly4Ser)3 formam o elemento ligante. A molécula IFNα está ligada na extremidade N-terminal (Nt) do fragmento ligante, e a molécula IL2 não alfa na extremidade C-terminal (Ct). A sequência do referido ligante está descrita na Figura 1B e na SEQ ID. NO 5.

[0016] BC3 é formada pela fusão de IFNα humana, cuja sequência é mostrada na Figura 1A e na SEQ ID. NO 3, para a muteína H9 acima mencionada, cuja sequência é mostrada na SEQ ID NO. 2 e Figura 2. O elemento ligante é composto pela região Fc de uma IgG1 humana com mutações L234A L235A, e uma capacidade de ativação limitada dos receptores envolvidos na resposta imune, e o peptídeo ligante (Gly4Ser)3. A molécula de IFNα está ligada no Nt do fragmento ligante e no Ct é encontrada a molécula H9. A sequência do referido ligante está descrita na Figura 1B e na SEQ ID. NO 5. Composições farmacêuticas

[0017] As BC objeto da presente invenção podem ser encontradas como ingrediente ativo, fazendo parte de diferentes composições farmacêuticas adequadas da mesma, e um carreador farmaceuticamente aceitável. As concentrações do ingrediente ativo nas referidas composições farmacêuticas estão dentro da faixa de 1 μg / ml a 20 μg / ml, preferencialmente de 5 μg / ml a 10 μg / ml.

[0018] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não estão limitados a: solução salina, salina tamponada com fosfato em pH neutro e formulações similares.

Outros agentes tamponantes, agentes dispersantes e substâncias inertes não tóxicas adequadas para a administração a um paciente podem estar incluídos nas composições da presente invenção. As composições podem ser soluções adequadas para a administração e são normalmente estéreis e livres de partículas indesejáveis. Uso terapêutico e tratamento

[0019] O novo formato das BC é parcialmente devido à presença de uma região Fc no elemento ligante das citocinas que compõem os mesmos. Esta região Fc torna possível sua purificação por cromatografia de afinidade com a proteína A, a qual permite a administração como uma proteína solúvel por diferentes vias (subcutânea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal) e, também, aumenta os tempos de meia-vida desses agentes em circulação e, assim, melhora sua eficácia terapêutica. Isso permite o uso de doses menores com a consequente redução da toxicidade. Uma via alternativa de administração é a intratumoral, a qual teria menor toxicidade quando comparada às demais vias. Da mesma forma, a presença de IL2 não alfa ou H9 está associada a toxicidade reduzida em comparação com a molécula de IL2 do tipo selvagem, atualmente utilizada no cenário clínico.

[0020] Em adição, as estratégias de administração usadas na presente invenção para essas BC podem incluir injeção intratumoral do produto, por abordagens terapêuticas baseadas em genes, por exemplo, a injeção intratumoral do mRNA e partículas transdutoras que as codificam. A modificação genética do tumor ou a infiltração de células tumorais, pela expressão de BC2 ou BC3, garante a presença das mesmas no microambiente tumoral, o que possibilita sua ação imunomoduladora, bem como o efeito direto sobre o próprio tumor. A versatilidade e alta reprodutibilidade da injeção intratumoral de ácidos nucleicos os quais codificam agentes terapêuticos é uma plataforma adequada para o tratamento de diferentes tipos de tumores.

[0021] Dadas as propriedades imunomoduladoras dessas moléculas, em adição à potencialização da resposta antitumoral in situ de maneira não específica, a estimulação da resposta imune do antígeno específico, suportada pela possível combinação com terapias direcionadas em pacientes com diversos tipos de câncer pode ser considerado para tratamentos futuros.

[0022] Neste sentido, a BC acima mencionada visa constituir uma nova frente terapêutica que melhora a ação farmacológica das citocinas individuais IFN do tipo I e das IL2, atualmente utilizadas no tratamento do câncer. Esse efeito estaria associado à expansão preferencial das células T citotóxicas sobre as células T regulatórias, o que leva a uma resposta imune antitumoral mais eficiente e, portanto, a um atraso no crescimento do tumor e uma maior sobrevida dos indivíduos tratados. Além disso, os níveis mais baixos de toxicidade das muteínas de IL2 utilizadas aumentam a probabilidade de sucesso em comparação com as terapias com citocinas do tipo selvagem. Todas essas respostas podem ser traduzidas em maior expectativa de vida e qualidade de vida nos pacientes tratados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] Figura 1. Sequência de: (A) IFNα2b humano, (B) fragmento de ligante.

[0024] Figura 2. Sequência de H9.

[0025] Figura 3. Avaliação da expressão transitória da BC2m e dos controles individuais em células HEK293T por ELISA.

[0026] Figura 4. Imuno identificação por Western blot da BC2m e dos controles individuais, com: (A) um anticorpo específico para IFNα, (B) um anticorpo específico para IL2.

[0027] Figura 5. (A) atividade tipo IFNα da BC2m e controle de IFNα-Fc, conforme medido pelo teste de indução de expressão de MHCI em células tumorais MB16F10 tratadas com sobrenadantes de células HEK293T transfectadas, (B) atividade tipo IL2 da BC2m e o controle individual Fc-IL2 não alfa, medido pelo teste de expansão de linfócitos T CD8+, de culturas de esplenócitos de camundongos naive, tratados com sobrenadantes de células HEK293T transfectadas.

[0028] Figura 6. Detecção da BC2m e dos controles individuais no sobrenadante de células tumorais 4T1 transduzidas por ELISA (A) específico para a região Fc, (B) específico para as regiões Fc e IL2, (C) específico para as regiões Fc e IFNα.

[0029] Figura 7. Avaliação do efeito antitumoral da BC2m usando células tumorais 4T1 transduzidas, nos dias 25 e 27 do experimento.

[0030] Figura 8. Avaliação do efeito terapêutico no modelo 4T1 da injeção intratumoral da BC2m, no dia 17 do experimento.

[0031] A presente invenção é ainda elaborada com os exemplos e figuras a seguir. No entanto, esses exemplos não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1. Desenho e obtenção das BCs e controles individuais de citocinas.

[0032] Para a modelagem em camundongos o efeito imunomodulador e antitumoral das BCs com base nos agonistas de IFN do tipo I e IL2, a BC2m descrita na SEQ ID NO 8 foi gerada. Esta consiste em um IFN do tipo I, o IFNα4 murino (SEQ. ID NO 4), fundida à muteína de IL2 não alfa, exemplo do agonista de IL2, descrito na SEQ ID NO 1, através de um fragmento de ligante mostrado na SEQ ID NO 12, o qual consiste de uma região Fc de uma IgG1 murina mutada ligada ao conector do peptídeo (Gly4Ser)3. A mutação D265A na região Fc reduz a capacidade de ativação dos receptores envolvidos na resposta imune (Becker J. C. et al (1996) PNAS, 93: 2702 - 2707). A muteína de IL2 não alfa está localizada no Ct terminal do fragmento do ligante, enquanto o IFNα4 está localizado no Nt terminal deste mesmo fragmento. Portanto, a BC2m é uma molécula dimérica e tetravalente.

[0033] Os controles individuais foram desenhados como moléculas contendo cada citocina parental fundida à região Fc da IgG1 murina mutada (D265A) e mantendo as posições relativas de cada citocina na estrutura da BC2m. Então, no controle individual de IFNα, esta citocina estava ligada ao Nt da região Fc acima mencionada, enquanto no controle individual da IL2 não alfa, esta citocina está localizada em direção ao Ct da região Fc acima mencionada. Então, os controles individuais de IFNα e IL2 não alfa são moléculas diméricas e bivalentes.

[0034] A BC2m e os controles individuais dos genes de IFNα-Fc e Fc-IL2 não alfa foram clonados no vetor pLV-

CMV-IRES-Neo para ensaios de expressão transitória em células superiores. As construções genéticas resultantes também serviram como vetores de transferência para obter as partículas de transdução utilizadas na modificação genética das linhagens de células tumorais. A expressão dos referidos genes em células HEK293T foi verificada por transfecção transitória usando lipofectamina. A quantificação das diferentes moléculas recombinantes nos sobrenadantes foi realizada por meio de um ELISA específico para a região Fc murina. Geração de BC2 e BC3

[0035] Para a construção das BCs humanas BC2 e BC3, o IFNα humano (SEQ ID NO 3 e Figura 1A) e as muteínas agonistas IL2 não alfa e H9, descritas na SEQ ID NO. 1 e 2, respectivamente, foram utilizadas. A região Fc de uma IgG1 humana mutada com mutações L234A L235A e capacidade de ativação limitada de receptores envolvidos na resposta imune e o peptídeo ligante (Gly4Ser)3 foram utilizados como um ligante; o referido ligante é mostrado na SEQ ID NO. 5 e na Figura 1B. A molécula IFNα está ligada no Nt do fragmento do ligante, e a IL2 não alfa ou a H9, no Ct do ligante.

[0036] Os desenhos finais das proteínas bifuncionais BC2 e BC3 são mostrados na SEQ ID NO. 6 e 7, respectivamente. Os genes da BC2 e BC3 foram clonados no vetor de transferência pLV-CMV-IRES-Neo, para a expressão estável em células superiores. A funcionalidade destes genes foi verificada por ensaios de expressão transiente com lipofectamina em células HEK293T, para os quais as moléculas recombinantes foram quantificadas por um ELISA específico para a região Fc humana.

Exemplo 2. BC2m é expresso como uma proteína integral e funcional.

[0037] Uma vez que o constructo da BC2m e os controles individuais IFNα-Fc e Fc-IL2 não alfa foram obtidos, um ensaio de expressão transiente foi realizado em células HEK293T para avaliar a viabilidade do desenho dessas moléculas. Após 72 horas de cultivo, os sobrenadantes foram removidos e um ELISA específico para a região Fc murina foi realizado. Para isso, placas de poliestireno foram revestidas com um anticorpo específico para a molécula de IgG murina e incubadas com os sobrenadantes de células transfectadas com cada um dos constructos contendo os genes da BC2m e controles individuais. Por fim, a detecção foi realizada utilizando um anticorpo específico para a região Fc de uma IgG murina, conjugado com a enzima peroxidase. A partir da interpolação dos valores de absorbância a 492 nm em uma curva padrão com IgG murina, foram calculadas as concentrações das proteínas recombinantes. Por meio desse teste foi possível detectar a expressão das três proteínas de interesse, e a funcionalidade do formato desenhado foi verificada (Figura 3).

[0038] De forma similar, pela realização de um ensaio de Western blot específico para as citocinas IFNα e IL2, a presença das mesmas na estrutura da BC2m foi verificada (Figura 4A e B). Da mesma forma, foi verificado que a BC2m foi expressa como uma proteína cuja migração eletroforética corresponde ao tamanho teórico de 120 kDa, para o dímero, e 60 kDa para o monômero, sob condições não redutoras e redutoras, respectivamente. A identificação destas citocinas foi também verificada nos controles individuais correspondentes IFNα-Fc e Fc-IL2 não alfa, e as migrações eletroforéticas detectadas correspondem aos tamanhos esperados de acordo com o desenho (Figura 4A e 4B). Exemplo 3. BC2m preserva as atividades biológicas que correspondem às citocinas IFNα e IL2.

[0039] Para determinar se as porções de IFNα4 e a muteína de IL2 não alfa estavam ativas na estrutura da BC2m e dos controles individuais, experimentos in vitro foram realizados com os sobrenadantes das células HEK293T transfectadas com os constructos genéticos correspondentes e utilizando quantidades equimolares das moléculas. O sobrenadante de células HEK293T não transfectadas foi utilizado como um controle negativo. No caso da atividade tipo IFNα, o aumento na expressão de MHCI na superfície de células de melanoma MB16F10 tratadas durante 24 horas com os referidos sobrenadantes foi avaliado por citometria de fluxo. Os sobrenadantes contendo a BC2m ou o controle de IFNα-Fc foram capazes de estimular a expressão de MHCI nas células tumorais tratadas, em contraste com os resultados obtidos utilizando o controle negativo, o que indica que a funcionalidade da atividade do IFNα está preservada na estrutura da BC2 (Figura 5A).

[0040] Para determinar se a IL2 não alfa presente na BC2m e no controle de Fc-IL2 não alfa exibiu atividade biológica, um ensaio de estimulação da proliferação de linfócitos CD8+ foi realizado com culturas de esplenócitos de camundongos naive. Esplenócitos de camundongos C57BL / 6 foram marcados com o reagente CFSE e cultivados por 72 horas, na presença dos sobrenadantes de células HEK293T transfectadas contendo a BC2m ou o controle de Fc-IL2 não alfa. No final do experimento, a porcentagem de linfócitos T CD8+ em proliferação foi analisada. Como controle negativo, esplenócitos incubados com um sobrenadante de células HEK293T não transfectadas foram usados, e a Proporção de Proliferação dos Linfócitos T CD8+ (Pr) foi calculada pela divisão da porcentagem das células T CD8+ em proliferação pelos esplenócitos tratados com a BC2m ou a Fc-IL2 não alfa, e o valor correspondente ao controle negativo, respectivamente.

[0041] Na Figura 5B, os sobrenadantes contendo a BC2 e a Fc-IL2 não alfa, foram capazes de induzir a proliferação dos esplenócitos, 4 e 5 vezes mais do que o controle negativo, respectivamente. Estes resultados demonstram que a porção de IL2 não alfa contida na estrutura das referidas proteínas de fusão mantém as suas propriedades biológicas. Exemplo 4. BC2m é secretada por células tumorais 4T1 geneticamente modificadas por transdução lentiviral.

[0042] Para avaliar a atividade antitumoral da BC2m in vivo, a abordagem de células tumorais transduzidas foi selecionada, usando como modelo um carcinoma mamário 4T1. As células foram transduzidas com partículas lentivirais que codificam a BC2m e os controles individuais. Como controle negativo, as células tumorais transduzidas com o vetor pLV- CMV-IRES-Neo (controle simulado) foram utilizadas. As células transduzidas foram mantidas em meio seletivo (com antibiótico G-418) por 10 dias, e a concentração das moléculas recombinantes nos sobrenadantes foi medida por ELISA para detectar a porção Fc de imunoglobulinas murinas. A BC2m e os controles individuais foram detectados por esta técnica nos sobrenadantes das células tumorais transduzidas

(Figura 6A).

[0043] Em adição, a presença da porção IL2 não alfa e IFNα nas BC2m e nos controles individuais foi confirmada por ELISAs sanduíche. Em um deles, os sobrenadantes das células transduzidas foram incubados em placas revestidas com um anticorpo anti-Fc, e a porção IL2 foi detectada com a adição sequencial de um anticorpo específico de coelho para a IL2 e um anticorpo de imunoglobulina anti-coelho conjugado à enzima peroxidase. Assim, a porção Fc-IL2 foi detectada na estrutura da BC2m e o único controle Fc-IL2 não alfa (Figura 6B). Em outro ensaio, os sobrenadantes das células transduzidas foram incubados em placas revestidas com um anticorpo anti-IFNα, e a porção Fc foi detectada com um anticorpo específico para a região Fc de um IgG de camundongo, conjugado à enzima peroxidase. A porção IFNα-Fc foi detectada na BC2m e no controle individual de IFNα-Fc (Figura 6C). Exemplo 5. A BC2m mostra um efeito antitumoral superior àquele dos controles de citocinas individuais IFNα-Fc e Fc- IL2 não alfa ou sua combinação

[0044] Para comparar o efeito antitumoral da BC2m em relação aos controles, foi avaliado o crescimento dos tumores implantados a partir das células 4T1 secretoras de diferentes moléculas. Cinco grupos de animais a serem tratados foram concebidos: três deles receberam células 4T1-Mock, 4T1-IFNα- Fc ou 4T1-Fc-IL2 não alfa, e os dois grupos restantes foram inoculados com uma combinação de células 4T1-IFNα-Fc + 4T1- FcIL2 não alfa ou 4T1-BC2m. Um número de 100.000 células totais foram administradas subcutaneamente. Considerando que as linhagens transduzidas expressaram diferentes níveis de proteínas recombinantes, elas foram misturadas em alguns casos com células simuladas para garantir que a proporção entre proteína secretada / célula total fosse equivalente entre todos os grupos.

[0045] Para a análise dos resultados, comparações pareadas das frequências de animais com tumores de volume menor ou igual aos menores encontrados no grupo 4T1-Mock foram realizadas entre os diferentes grupos, por meio do teste exato de Fisher, nos dias 25 e 27 do experimento.

[0046] Tal como observado na Figura 7, a frequência dos animais com tumores de tamanho menor ou igual ao menor valor observado no grupo controle Mock foi significativamente mais alto no grupo que recebeu as células 4T1-BC2m, quando comparado com os controles individuais e sua combinação, nos dias 25 e 27 (teste exato de Fisher, p < 0,05). Este fenômeno não foi observado no grupo que recebeu a combinação de células 4T1 – IFNα - Fc+4T1 - Fc IL2 não alfa, no qual a frequência avaliada não é diferente em comparação com os grupos tratados com cada uma das monoterapias (resultados não mostrados, teste exato de Fisher, p > 0,05).

[0047] Esses resultados apontam para a superioridade terapêutica da BC2m, uma vez que indicam que a ligação do IFNα à IL2 não alfa, leva à ativação de mecanismos moleculares e celulares qualitativa ou quantitativamente diferentes, os quais exercem uma resposta antitumoral melhorada, superior àquela obtida com a coadministração dos controles individuais de citocinas IFNα-Fc e Fc-IL2 não alfa, ou a administração destas citocinas individualmente. Exemplo 6. A injeção intratumoral de BC2m apresenta um maior efeito antitumoral do que aquela dos controles individuais de IFNα-Fc e Fc-IL2 não alfa no modelo 4T1

[0048] As células 4T1 foram inoculadas em camundongos BALB/c imunocompetentes. Após 10 dias, quantidades equimolares de IFNα-Fc, Fc-IL2 não alfa e BC2m, contidas em sobrenadantes de células HEK293T previamente transfectadas, foram injetados intratumoralmente. Um grupo adicional recebeu a injeção da mistura de sobrenadantes contendo IFNα-Fc e Fc-IL2 não alfa, então, garantindo a equimolaridade de cada uma das citocinas, no que diz respeito aos controles individuais e à BC2m. Como um controle negativo, o sobrenadante das células HEK293T não transfectadas foi usado. Os sobrenadantes foram injetados com uma frequência diária, por quatro dias. Como observado na Figura 8, no dia 17 do experimento, 100 % dos camundongos tratados com a BC2m apresentaram volumes tumorais inferiores à média do grupo controle negativo, um resultado que não foi observado em qualquer outro grupo de tratamento. A frequência de animais que carregam tumores com tamanho inferior à média do grupo controle negativo foi maior no grupo tratado com BC2m do que em qualquer um dos grupos que receberam as terapias individuais de IFNα-Fc ou Fc-IL2 não alfa (teste exato de Fisher; p < 0,05). No entanto, a frequência de animais com volumes tumorais menores do que o volume tumoral médio do grupo controle negativo, foi maior no grupo tratado com a combinação dos controles de IFNα-Fc e Fc-IL2 não alfa, do que aquele do controle individual de IFNα-Fc. Por outro lado, essa frequência não foi maior em relação ao controle de Fc-IL2 não alfa, o qual aponta a necessidade de ligação de citocinas IFNα e IL2 não alfa na mesma molécula para alcançar um efeito protetor mais eficiente.

Isso pode ser devido à possível ativação de mecanismos moleculares e celulares associados à estimulação simultânea dos receptores de ambas as moléculas.

Em geral, essas evidências suportam o valor terapêutico superior da administração local da BC2m no tumor, em relação às citocinas parentais.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma muteína agonista da IL2 ligada a um interferon (IFN) do tipo I.

2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de a muteína agonista da IL2 estar ligada ao IFN do tipo I por um ligante.

3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de a muteína de IL2 apresentar a sequência mostrada na SEQ ID NO 1.

4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de a muteína de IL2 apresentar a sequência mostrada na SEQ ID NO 2.

5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de o IFN do tipo I ser o IFNα humano cuja sequência é mostrada na SEQ ID NO 3.

6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de apresentar o ligante que consiste de uma região Fc de uma IgG1 humana mutada, ligada a um peptídeo conector.

7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de apresentar o ligante com a sequência mostrada na SEQ ID NO 5.

8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de apresentar a sequência mostrada na SEQ ID NO 6.

9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de apresentar a sequência mostrada na SEQ ID NO 7.

10. Molécula de ácido nucleico CARACTERIZADA pelo fato de compreender a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína de fusão conforme definida na reivindicação 8 ou 9.

11. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de apresentar a sequência mostrada na SEQ. ID NO 10.

12. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de apresentar a sequência mostrada na SEQ. ID NO 11.

13. Molécula de mRNA CARACTERIZADA pelo fato de codificar qualquer uma das proteínas de fusão conforme definidas na reivindicação 8 ou 9.

14. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de compreender como ingrediente ativo a proteína de fusão conforme definida na reivindicação 8 ou 9, em uma faixa de concentração de 1 μg / ml a 20 μg / ml, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

15. Uso da proteína de fusão, conforme definida na reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de ser no tratamento de câncer.

16. Uso da molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de ser para injeção intratumoral.