WO2019214757A1 - Proteínas de fusión compuestas por una muteina de interleucina-2 e interferon tipo 1 - Google Patents

Abstract

La presente invención describe proteínas de fusión basadas en citocinas, denominadas bicitocinas (BCs), particularmente formadas por la unión de una muteína agonista de IL2 con un interferón (IFN) tipo 1, enlazados mediante la región Fc de una IgG1 humana mutada y un péptido conector. La combinación de una muteína agonista de IL2 y el IFN tipo 1 en la estructura de las moléculas aquí obtenidas, le confiere propiedades inmunorreguladoras sorprendentes y un efecto terapéutico superior a las citocinas parentales, o a su combinación, lo cual las convierte en moléculas novedosas y atractivas para el tratamiento del cáncer. Se describen además, las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo las proteínas de fusión aquí descritas.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN COMPUESTAS POR UNA MUTEINA DE INTERLEUCINA 2 E INTERFERON TIPO 1

CAMPO DE LA TÉCNICA

La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología y la Inmuno- oncología, especialmente con el desarrollo de proteínas de fusión basadas en citocinas. Particularmente describe proteínas de fusión compuestas por la unión de un interferón (IFN) tipo 1 a muteínas agonistas de la interleucina 2 (IL2).

ANTECEDENTES

A pesar de los múltiples esfuerzos realizados durante décadas en el campo de la inmunoterapia del cáncer, basados en el empleo de citocinas, los resultados obtenidos hasta el momento han sido modestos. La elevada toxicidad y reducido tiempo de vida media de estas moléculas, así como el bajo porciento de pacientes beneficiados, imponen la necesidad de crear estrategias innovadoras que potencien sus propiedades antitumorales, traducidas en una mejor calidad y tiempo de vida de los pacientes con cáncer. Entre los mecanismos que atentan contra la eficacia terapéutica de las citocinas se encuentra la inducción de células T reguladoras, las cuales suprimen la respuesta de linfocitos T CD8 citotóxicos en el microambiente tumoral (Ovens y Naugler (2012) Theoretical Biology and Medical Modelling, 9:44).

Tradicionalmente, entre las estrategias encaminadas a la optimización del uso terapéutico de las citocinas en el tratamiento del cáncer, se encuentran las combinaciones, bien sea a través de la coadministración de moléculas solubles, o de la generación de proteínas de fusión, frecuentemente llamadas fusocinas. Entre las ventajas asociadas a estas últimas, se encuentran no solo la factibilidad de las mismas desde el punto de vista productivo, sino también la posibilidad de establecer relaciones estequiométricas entre moléculas con propiedades farmacológicas diferentes. Además, se ha demostrado que determinadas fusocinas presentan un efecto terapéutico superior en comparación con la administración de las citocinas parentales por separado, e incluso a su combinación (Stagg J. y cois. (2004) Cáncer Research, 64: 8795-8799; Acres B. (2005) Cáncer Research, 65: 9536-9546); US 201 1/0150828. Recientemente, una de las estrategias terapéuticas empleadas en el estudio de las fusocinas, lo constituye la administración intratumoral de ARNm codificante de una proteína de fusión basada en un IFN tipo 1 y el ectodominio del receptor del TQRb, la cual presentó un efecto antitumoral. La tecnología de transferencia intratumoral de ARNm constituye una herramienta terapéutica altamente versátil, reproducible, fácil y adaptable al escenario clínico (Van der Jeught y cois. (2015). Oncolmmunology, 4:5). Dos atocinas relevantes para la terapia antitumoral lo constituyen un interferón tipo 1 : el IFNa, y la IL2, las cuales son potentes inductoras de patrones de respuesta T auxiliadora de tipo 1 , deseada en el tratamiento del cáncer. Se ha descrito la acción antitumoral directa del IFNa sobre células malignas, debido a su efecto citostático, antiproliferativo, y a la disminución en los niveles de proteasas de la matriz extracelular, asociadas a los procesos de invasión y metástasis, relacionadas con un peor pronóstico de la enfermedad. Por otra parte, esta citocina presenta múltiples propiedades asociadas a la maduración y migración de células presentadoras, inducción de presentación cruzada en células dendríticas CD8a y activación linfocitaria (Chikkala y cois. (1990) Cáncer Research, 50:1 176-1 182). Se ha descrito que esta citocina protege a las células T de la apoptosis dependiente de la mitocondria, luego de la activación mediada por el antígeno, y favorece así el proceso de expansión clonal, fenómeno que ocurre de manera regulada (Dondi y cois. (2004) The Journal of Immunology, 173 (6): 3740-3747).

La IL2, por su parte, actúa como un factor autocrino que promueve la proliferación de linfocitos T activados por el antígeno. Sin embargo, puede unirse con mayor afinidad a células T reguladoras, que a las efectoras, e inducir la proliferación de estas con la consecuente afectación de su efecto antitumoral (Chaput y cois. (2007). J Immunol, 179:4969-4978). Entre las estrategias para mejorar la eficacia terapéutica de esta molécula se encuentra el desarrollo de muteínas basadas en un diseño racional. Tal es el caso de la muteína agonista de IL2 generada en el Centro de Inmunología Molecular, la cual presenta afectada la capacidad de unión al receptor de alta afinidad expresado en células T reguladoras y a partir de ahora se identificará como IL2 no alfa (SEQ ID NO. 6 de US 9,206,243). Como resultado de sus modificaciones respecto a la IL2 salvaje, la IL2 no alfa es capaz de expandir preferencialmente poblaciones efectoras de células T CD8 de memoria y NK, e incluso presenta menor toxicidad en tejidos sanos (Carménate y cois. (2013). The Journal of Immunology, 190: 6230-6238).

Otra variante agonista de la IL2 se generó a partir de evolución in vitro (ingeniería genética), y exhibe una afinidad de unión incrementada por la cadena beta del receptor de IL2. Esta muteína, denominada Superkina de IL2 (H9) estimula una potente proliferación de los linfocitos T, independientemente de la expresión de CD25. De hecho, se ha demostrado que es capaz de inducir una expansión superior de linfocitos T citotóxicos, una respuesta antitumoral potenciada in vivo, una menor expansión de células T reguladoras, y toxicidad reducida, respecto a la IL2 (Levin y cois. (2012). Nature, 48: 529-535). Esta variante, se denominará a partir de ahora H9.

Varios estudios sugieren un efecto sinérgico de la administración combinada de la IL2 e IFNa en el tratamiento del cáncer. La capacidad de estimular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, inducida por el AcM BR55-2 contra la línea de carcinoma colorrectal HT29, se incrementó significativamente al emplear la combinación de IFNa e IL2, en comparación con estas citocinas por separado (Flieger y cois. (2000) Cytokine, 12: 756-761 ). Konjevic y colaboradores, en el 2010, demostraron que tanto la IL2 como el IFNa potenciaban la actividad in vitro de las células NK, a partir de muestras de sangre periférica de pacientes de melanoma metastásico en estadio clínico IV. Ambas citocinas, la IL2 y el IFNa fueron capaces de estimular la expresión del receptor activador NKG2D en células NK, incluso en la subpoblación de células NK con alta expresión de CD16, la inducción de NKG2D por ambas citocinas se correlacionó con la actividad de estas células (Konjevic y cois. (2010) Melanoma Research, 20: 459-67).

En la literatura existe un reporte que describe la obtención de una proteína de fusión que combina dos citocinas, la IL2 salvaje y el IFNa2b humano. En esta molécula, la IL2 se encuentra directamente unida al IFNa2b, y no se contrastó su efecto antitumoral con el de las citocinas parentales y su combinación (Fie y cois. (1999) J Leukoc Biol, 125:77- 82), por lo que no hay evidencias que demuestren su superioridad respecto a estas. Teniendo en cuenta el conjunto de antecedentes anteriormente descritos, los inventores de la presente solicitud generaron varias proteínas de fusión bifuncionales denominadas bicitocinas (BC), para la terapia del cáncer. Se obtuvieron dos moléculas bifuncionales que combinan un IFN tipo I con agonistas de IL2, para el tratamiento del cáncer. Para ello se partió de la unión de dos muteínas: la IL2 no alfa o la H9, y el IFNa. El diseño planteado para estas BCs, a partir de ahora BC2 y BC3, respectivamente, implica que ambas citocinas se conecten por medio de la región Fe de una inmunoglobulina de unión limitada a receptores Fcy. La presencia de esta región Fe, capaz de unirse a receptores Fe neonatales, permite aumentar el tiempo de vida media. Estas combinaciones y formato constituyen elementos novedosos en el desarrollo de este tipo de proteínas. Las moléculas resultantes tienen efecto inmunomodulador, así como propiedades antitumorales in vivo sorprendentes, las cuales son superiores a las observadas tras la administración de cada citocina parental (fusionada a la misma región Fe), e incluso, a la combinación de estas, en cantidades equimolares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En una realización son objeto de la presente invención proteínas de fusión que comprenden una muteína de IL2 unida a un IFN tipo 1 , a través de un enlazador. Particularmente, las secuencias de las muteínas de IL2 que forman parte de las proteínas de fusión de la presente invención se describen en las SEQ ID NO 1 y 2. El IFN que forma parte de dichas proteínas de fusión es IFNa (SEQ ID NO 3). En una realización particular las proteínas de fusión de la presente invención se caracterizan porque el enlazador es la región Fe de una lgG1 humana mutada, unida a un péptido conector, y su secuencia se muestra en la SEQ ID NO 5.

Adicionalmente, las secuencias de las proteínas de fusión descritas en la presente invención se muestran en las SEQ ID NO 6 y 7, y las secuencias de ácido nucleico que codifican las mismas se muestran en las SEQ ID NO 10 y 1 1 , respectivamente.

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo las proteínas de fusión descritas en las SEQ ID NO 6 y 7, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, es objeto de la presente invención el uso de las proteínas de fusión aquí descritas en el tratamiento del cáncer; incluyendo el enfoque de inyección intratumoral de las moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas de fusión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Diseño de las BCs

Las proteínas de fusión de la presente invención se diseñaron teniendo en cuenta el escenario patológico para el cual estaban destinadas. La BC2 se forma por la fusión de la muteína IL2 no alfa, cuya secuencia se muestra en la SEQ ID NO. 1 (previamente divulgada en la SEQ ID NO. 6 de US 9,206,243 B2) con el IFNa humano cuya secuencia se muestra en la Figura 1 A y en la SEQ ID. NO 3 de la presente invención. Como elemento enlazador se emplea la región Fe de una lgG1 humana mutada que presenta las mutaciones L234A L235A, asociadas a una capacidad limitada de activación de receptores involucrados en la respuesta inmune (Flezareh y cois. (2001 ) J Virol., 75(24): 12161-12168), y el péptido conector (Gly₄Ser)₃. En el extremo N-terminal (Nt) del fragmento enlazador, se encuentra unida la molécula IFNa y en el C-terminal (Ct), la molécula IL2 no alfa. La secuencia de dicho enlazador se describe en la Figura 1 B y en la SEQ ID. NO 5.

La BC3 se forma por la fusión del IFNa humano, cuya secuencia se muestra en la Figura 1 A y en la SEQ ID. NO 3, a la muteína H9 antes mencionadas, cuya secuencia se muestra en las SEQ ID NO. 2 y la Figura 2. Como enlazador se emplea la región Fe de una lgG1 humana mutada que presenta las mutaciones L234A L235A y capacidad limitada de activación de receptores involucrados en la respuesta inmune, y el péptido conector (Gly₄Ser)₃. En el extremo Nt del fragmento enlazador se encuentra unida la molécula IFNa y en el Ct, la molécula H9. La secuencia de dicho enlazador se describe en la Figura 1 B y en la SEQ ID. NO 5. Composiciones farmacéuticas

Las BCs objeto de la presente invención se pueden encontrar como ingrediente activo, formando parte de diferentes composiciones farmacéuticas apropiadas para las mismas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las concentraciones del ingrediente activo en dichas composiciones farmacéuticas se encuentran en el rango de 1 pg/ml a 20 pg/ml, preferiblemente de 5 pg/ml a 10 pg/ml.

Entre los vehículos farmacéuticamente aceptables se incluyen, pero no se limitan a: solución salina, salina amortiguada con fosfato pH neutro, y otros parecidos. Otros agentes de amortiguación, agentes dispersos, y sustancias inertes no tóxicas apropiadas para entregar a un paciente podrán ser incluidas en las composiciones de la presente invención. Las composiciones podrán ser soluciones apropiadas para la administración, y son normalmente estériles y libres de partículas indeseables.

Aplicación terapéutica y métodos de tratamiento

El formato novedoso de las BCs se debe, en parte, a la presencia de la región Fe en el elemento enlazador de las citocinas que las componen. Esta región Fe no solo brinda la posibilidad de purificarla por cromatografía de afinidad por proteína A, y administrarla como proteína soluble por diferentes vías (subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal), sino también, aumenta los tiempos de vida media de este agente en circulación y con ello, la efectividad terapéutica. Esto permite el empleo de menores dosis con la consecuente reducción de la toxicidad. Una vía alternativa de administración es la intratumoral, que implicaría una menor toxicidad comparada con las otras vías. Igualmente, la presencia de la IL2 no alfa o la H9 confieren una toxicidad reducida en comparación con la molécula IL2 salvaje, actualmente empleada en el escenario clínico.

En adición, las estrategias de administración empleadas en la presente invención para estas BCs pueden incluir la inyección intratumoral del producto, mediante enfoques de terapia génica. Por ejemplo, la inyección intratumoral de ARNm y partículas transductoras codificantes de las mismas. La modificación genética de las células tumorales o infiltrantes del tumor, para la expresión de BC2 o BC3, garantiza la presencia de estas en el microambiente tumoral, lo que posibilita su acción inmunomoduladora sobre este, y sobre el propio tumor. La versatilidad y alta reproducibilidad de la inyección intratumoral de ácidos nucleicos codificantes de agentes terapéuticos, permitiría la extensión a diferentes tipos de tumores.

Dadas las propiedades inmunomoduladoras de estas moléculas, además de la potenciación de la respuesta antitumoral in situ de manera inespecífica, no sería descartable la estimulación de la respuesta inmune antígeno específica, sustentado por la posible combinación con terapias blanco en pacientes con diversos tipos de cáncer. De este modo, las BCs mencionadas pretenden constituir un nuevo frente terapéutico que potencia la acción terapéutica de las citocinas individuales IFN tipo 1 y la IL2, actualmente empleadas en el tratamiento del cáncer. Este efecto estaría asociado a la expansión preferencial de células T citotóxicas en detrimento de las células T reguladoras, lo cual conlleva a una respuesta inmune antitumoral más eficiente, y por tanto, a un retardo en el crecimiento tumoral y una mayor supervivencia de los individuos tratados. A esto se suman los menores niveles de toxicidad que garantizan las muteínas de IL2 empleadas, lo cual aumenta la probabilidad de éxito respecto a las terapias con las citocinas salvajes. Todo esto se traduce en una mayor esperanza y calidad de vida en los pacientes tratados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Secuencia de: (A) IFNa2b humano, (B) fragmento enlazador.

Figura 2. Secuencia de H9.

Figura 3. Evaluación de la expresión transitoria de la BC2m y los simples controles en células HEK293T por ELISA.

Figura 4. Inmunoidentificación mediante Western blot, de la BC2m y los simples controles, con: (A) un anticuerpo específico por IFNa, (B) un anticuerpo específico por IL2.

Figura 5. (A) Actividad tipo IFNa de la BC2m y el control IFNa-Fc, mediante el ensayo de inducción de la expresión de MFICI en células tumorales MB16F10 tratadas con sobrenadantes de células FIEK293T transfectadas, (B) Actividad tipo IL2 de la BC2m y el simple control Fc-IL2 no alfa, mediante el ensayo de expansión de linfocitos T CD8+, a partir de cultivos de esplenocitos de ratones vírgenes, tratados con sobrenadantes de células FIEK293T transfectadas.

Figura 6 Detección de la BC2m y los simples controles en el sobrenadante de células tumorales 4T1 transducidas, mediante ELISA (A) específico por la región Fe. (B) específico por las regiones Fe e IL2, (C) específico por las regiones Fe e IFNa.

Figura 7. Evaluación del efecto antitumoral de la BC2m mediante el uso de células tumorales 4T 1 transducidas, en los días 25 y 27 del experimento.

Figura 8. Evaluación del efecto terapéutico en el modelo 4T1 de la inyección intratumoral de la BC2m, al cabo del día 17 del experimento.

La presente invención queda aún más elaborada con los siguientes ejemplos y dibujos. Sin embargo, estos ejemplos no deberían ser interpretados como una limitación del ámbito de la invención. EJEMPLOS

Ejemplo 1. Diseño y obtención de las BCs y los simples controles de citocinas.

Para la modelación en ratones del efecto inmunomodulador y antitumoral de las BCs basadas en IFN tipo I y agonistas de IL2, se generó la BC2m, descrita en la SEQ ID NO 8. Esta consiste en un IFN tipo 1 , el IFNa4 murino (SEQ. ID NO 4), fusionado a la muteína IL2 no alfa, ejemplo de agonista de IL2, descrita en la SEQ ID NO 1 , mediante un fragmento enlazador mostrado en la SEQ ID NO 12, el cual consiste en la región Fe de una lgG1 murina mutada unida al péptido conector (Gly₄Ser)3. La mutación D265A en la región Fe afecta la capacidad de activación de receptores involucrados en la respuesta inmune (Becker J.C. y cois. (1996) PNAS, 93: 2702-2707). La muteína IL2 no alfa se ubica hacia el extremo Ct del fragmento enlazador, mientras que el IFNa4 se localiza en el extremo Nt de este fragmento. De esta manera, la BC2m es una molécula dimérica y tetravalente.

Los simples controles se concibieron como moléculas que contenían cada citocina parental fusionada a la región Fe de la lgG1 murina mutada (D265A), y respetando las posiciones relativas de cada citocina en la BC2m. De este modo, en el simple control IFNa, esta citocina se unió al extremo Nt de la mencionada región Fe, mientras que en el simple control de IL2 no alfa, esta citocina se localiza hacia el extremo Ct de la región Fe referida. Así, los simples controles de IFNa e IL2 no alfa son moléculas diméricas, y bivalentes.

Los genes de la BC2m y los simples controles IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa, se clonaron en el vector pLV-CMV-IRES-Neo, para los ensayos de expresión transitoria en células superiores. Las construcciones genéticas resultantes sirvieron también de vector de transferencia para la obtención de las partículas transductoras utilizadas en la modificación genética de las líneas tumorales. La expresión de dichos genes en las células HEK293T se comprobó mediante transfección transitoria usando lipofectamina. La cuantificación de las diferentes moléculas recombinantes en los sobrenadantes se realizó mediante un ELISA específico por la región Fe murina.

Obtención de la BC2 y BC3

Para la construcción de las BCs humanas BC2 y BC3 se empleó el IFNa humano (SEQ ID NO 3 y Figura 1 A) y las muteínas agonistas IL2 no alfa y H9, descritas en las SEQ ID NO. 1 y 2, respectivamente. Como enlazador se utilizó la región Fe de una lgG1 humana mutada que presenta las mutaciones L234A L235A y capacidad limitada de activación de receptores involucrados en la respuesta inmune, y el péptido conector (Gly₄Ser)₃; dicho enlazador se muestra en la SEQ ID NO. 5 y la Figura 1 B. En el extremo Nt del fragmento enlazador, se encuentra unida la molécula IFNa y en el Ct, las moléculas IL2 no alfa o H9.

El diseño final de las proteínas bifuncionales BC2 y BC3 quedan contempladas en las SEQ ID NO. 6 y 7, respectivamente. Los genes de la BC2 y BC3 se clonaron en el vector de transferencia pLV-CMV-IRES-Neo, para la expresión estable en células superiores. La funcionalidad de dichos genes se comprobó mediante ensayos de expresión transitoria con lipofectamina en células HEK293T, para lo cual las moléculas recombinantes se cuantificaron mediante un ELISA específico por la región Fe humana.

Ejemplo 2. La BC2m se expresa como una proteína íntegra y funcional.

Una vez obtenidos los constructos de la BC2m y los simples controles IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa, se realizó un ensayo de transfección transitoria en células HEK293T, para evaluar la factibilidad del diseño de estas moléculas. A las 72 horas de cultivo se extrajeron los sobrenadantes y se realizó un ELISA específico por la región Fe murina. Para ello se recubrieron placas de poliestireno con un anticuerpo específico por la molécula IgG murina y se incubaron los sobrenadantes de células transfectadas con cada una de las construcciones que contenían los genes de la BC2m y los simples controles. Finalmente, la detección se realizó mediante el empleo de un anticuerpo específico por la región Fe de una IgG de ratón, conjugado a la enzima peroxidasa. A partir de la interpolación de los valores de absorbancia a 492nm en una curva patrón con una IgG murina, se calcularon las concentraciones de las proteínas recombinantes. A través de este ensayo fue posible detectar la expresión de las tres proteínas de interés, y se comprobó la funcionalidad del formato diseñado (Figura 3). De igual modo, al realizar un ensayo de Western blot específico por las citocinas IFNa e IL2, se comprobó la presencia de las mismas en la estructura de la BC2m (Figura 4A y B). Igualmente, se verificó que la BC2m se expresó como una proteína cuya migración electroforética se corresponde con la talla teórica de 120 kDa, para el dímero, y de 60 kDa para el monómero, en condiciones no reductoras y reductoras, respectivamente. La identificación de estas citocinas también se comprobó en los correspondientes simples controles IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa, y la migración electroforética de estas se corresponde con las tallas esperadas de acuerdo al diseño (Figura 4A y 4B).

Ejemplo 3. La BC2m conserva las actividades biológicas correspondientes a las porciones de citocinas IFNa e IL2.

Para determinar si las porciones de IFNa4 y la muteína IL2 no alfa eran activas en la estructura de la BC2m y los simples controles, se realizaron experimentos in vitro a partir de los sobrenadantes de células HEK293T transfectadas con las construcciones genéticas correspondientes, y usando cantidades equimolares de las mismas. Se utilizó como control negativo el sobrenadante de células HEK293T no transfectadas. En el caso de la actividad tipo IFNa, se evaluó por citometría de flujo el aumento de la expresión de MHCI en la superficie de células de melanoma MB16F10 tratadas con dichos sobrenadantes por 24 horas. Los sobrenadantes que contenían la BC2m o el control IFNa-Fc fueron capaces de estimular la expresión de MFICI en las células tumorales tratadas, a diferencia del control negativo, lo que indica que la actividad de tipo IFNa se encuentra conservada en la estructura de la BC2 (Figura 5A).

Para determinar si la IL2 no alfa contenida en la estructura de la BC2m y el control Fc- IL2 no alfa presentaba actividad biológica, se realizó un ensayo de estimulación de la proliferación de linfocitos T CD8+ a partir de cultivos de esplenocitos de ratones vírgenes. Los esplenocitos de ratones C57BL/6 se marcaron con el reactivo CFSE y se cultivaron durante 72 horas, en presencia de los sobrenadantes de células HEK293T transfectadas, que contenían la BC2m o el control Fc-IL2 no alfa. Al cabo de ese tiempo, se analizó el porciento de linfocitos T CD8+ que se encontraban en proliferación. Como control negativo se emplearon esplenocitos que se incubaron con un sobrenadante de células HEK293T no transfectadas, y se halló la Razón de Proliferación de Linfocitos T CD8+ (Rp) mediante la determinación del cociente del porciento de células T CD8+ en proliferación para los esplenocitos tratados con la BC2m o el Fc-IL2 no alfa, y el valor correspondiente al control negativo, respectivamente.

En la figura 5B se puede observar que los sobrenadantes que contienen la BC2 y el Fc- IL2 no alfa, fueron capaces de inducir la proliferación de los esplenocitos, 4 y 5 veces más que el control negativo, respectivamente. Estos resultados demuestran que porción IL2 no alfa contenida en la estructura de dichas proteínas de fusión, conserva sus propiedades biológicas.

Ejemplo 4. La BC2m es secretada por células tumorales 4T1 modificadas genéticamente por transducción lentiviral.

Para evaluar la actividad antitumoral de la BC2m in vivo se seleccionó el enfoque de células tumorales transducidas, empleando como modelo el carcinoma mamario 4T1 . Las células se transdujeron con partículas lentivirales codificantes de la BC2m y los simples controles. Como control negativo se usaron células tumorales transducidas con el vector pLV-CMV-IRES-Neo vacío (control mock). Las células transducidas se mantuvieron en medio selectivo (con antibiótico G-418) durante 10 días, y se midió la concentración de las moléculas recombinantes en los sobrenadantes, mediante un ELISA para la detección de la porción Fe de inmunoglobulinas murinas, como se describió anteriormente. La BC2m y los simples controles se detectaron por esta técnica en los sobrenadantes de las células tumorales transducidas (Figura 6A). Además, se comprobó la presencia de la porción IL2 no alfa e IFNa en la BC2m y los simples controles, mediante dos ELISA sándwich. En uno de ellos, los sobrenadantes de las células transducidas se incubaron en placas recubiertas con un anticuerpo anti-Fc, y la porción IL2 se detectó con la adición secuencial de un anticuerpo de conejo específico por la IL2 y un anticuerpo anti-inmunoglobulinas de conejo conjugado a la enzima peroxidasa. Se detectó así la porción Fc-IL2 en la estructura de la BC2m y el simple control Fc-IL2 no alfa (Figura 6B). En otro ensayo, los sobrenadantes de las células transducidas se incubaron en placas recubiertas con un anticuerpo anti-IFNa, y la porción Fe se detectó con un anticuerpo específico por la región Fe de una IgG de ratón, conjugado a la enzima peroxidasa. Se detectó así la porción IFNa-Fc en la BC2m y el simple control IFNa-Fc (Figura 6C).

Ejemplo 5. La BC2m presenta un efecto antitumoral superior a los controles de citocinas individuales IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa, o su combinación

Para la comparación del efecto antitumoral de la BC2m respecto a los controles se evaluó el crecimiento de los tumores implantados a partir de las células 4T1 que secretan las diferentes moléculas. Se concibieron 5 grupos de animales a tratar: Tres de ellos recibieron las células 4T1 -Mock, 4T1 -IFNa-Fc o las 4T1 -Fc-IL2 no alfa, y los dos restantes se inocularon con una combinación de células 4T1 -IFNa-Fc+4T1 -FclL2 no alfa, o las 4T1 -BC2m. Se administraron 100 000 células totales por vía subcutánea. Teniendo en cuenta que las líneas transducidas expresaban diferentes niveles de proteínas recombinantes, se mezclaron en algunos casos con células mock para garantizar que la relación cantidad de proteína secretada/total de células fuera equivalente entre todos los grupos.

Para el análisis de los resultados se realizaron comparaciones pareadas entre los distintos grupos, de las frecuencias de animales con tumores de menor o igual volumen que el mínimo encontrado en el grupo 4T1 -Mock, mediante la prueba exacta de Fisher, los días 25 y 27 del experimento.

Como se observa en la Figura 7, la frecuencia de animales que presentaban tumores de menor o igual tamaño que el menor valor observado en el grupo control Mock, fue significativamente mayor en el grupo que recibió las células 4T1 -BC2m, en comparación con los simples controles individuales y su combinación, en los días 25 y 27 (Prueba exacta de Fisher, p<0.05). Este fenómeno no se observó en el grupo que recibió la combinación de células 4T1 -IFNa-Fc+4T1 -FclL2 no alfa, para el cual la frecuencia evaluada no difiere respecto a la de los grupos tratados con cada una de las monoterapias (resultados no mostrados, Prueba exacta de Fisher, p>0.05). Estos resultados apuntan a la superioridad terapéutica de la BC2m pues indican que la unión del IFNa a la IL2 no alfa, conlleva a la activación de mecanismos moleculares y celulares cualitativa o cuantitativamente diferentes, que provocan una respuesta antitumoral potenciada, de mayor magnitud que la obtenida con la coadministración de los simples controles de citocinas IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa, o estos individualmente.

Ejemplo 6. La inyección intratumoral de la BC2m tiene un mayor efecto antitumoral que los simples controles IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa en el modelo 4T1

Las células 4T1 se inocularon en ratones inmunocompetentes BALB/c. Al cabo de los 10 días, se inyectaron intratumoralmente cantidades equimolares de IFNa-Fc, Fc-IL2 no alfa y BC2m, contenidas en sobrenadantes de células FIEK293T previamente transfectadas. Un grupo adicional recibió la inyección de la mezcla de sobrenadantes que contenían IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa, garantizando la equimolaridad de cada una de las citocinas, respecto a los simples controles y a la BC2m. Como control negativo se utilizó sobrenadante de células FIEK293T no transfectadas. Los sobrenadantes se inyectaron con una frecuencia diaria, durante cuatro días. Como se observa en la Figura 8, al cabo del día 17 del experimento el 100% de los ratones tratados con la BC2m presentaron volúmenes tumorales por debajo de la media del grupo control negativo, fenómeno que no se observó en ningún otro grupo de tratamiento. La frecuencia de animales que cumplen este criterio (tumores inferiores a la media del grupo control) fue superior a la de cada una de las terapias con los controles individuales IFNa-Fc y Fc-IL2 no alfa (prueba exacta de Fisher; p<0.05). Sin embargo, la frecuencia de animales con tumores con volúmenes menores que la media del control negativo, en el grupo tratado con la coadministración de los controles IFNa-Fc y Fc-IL2, aunque fue superior al del simple control IFNa-Fc no lo fue con respecto al Fc-IL2 no alfa, lo cual apunta a la necesidad de la unión de las citocinas IFNa e IL2 no alfa en la misma molécula para lograr un efecto protector más eficiente. Esto podría deberse a la posible activación de mecanismos moleculares y celulares asociados a la estimulación conjunta de los receptores de ambas moléculas. De conjunto, estas evidencias soportan el valor terapéutico superior de la administración local en el tumor de la BC2m, respecto a las citocinas parentales.

Claims

PROTEÍNAS DE FUSIÓN COMPUESTAS POR UNA MUTEINA DE INTERLEUCINA 2 E INTERFERON TIPO 1 REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende una muteína agonista de IL2 unida a un interferón (IFN) de tipo 1.

2. La proteína de fusión según la reivindicación 1 donde la muteína agonista de IL2 está unida al IFN tipo 1 por un enlazador.

3. La proteína de fusión según la reivindicación 2 caracterizada porque la muteína de IL2 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO 1 .

4. La proteína de fusión según la reivindicación 2 caracterizada porque la muteína de IL2 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO 2.

5. La proteína de fusión según la reivindicación 2 caracterizada porque el IFN tipo 1 es el IFNa humano cuya secuencia se muestra en la SEQ ID NO 3.

6. La proteína de fusión según la reivindicación 2 caracterizada porque el enlazador es una región Fe de una lgG1 humana mutada, unida a un péptido conector.

7. La proteína de fusión según la reivindicación 6 caracterizada porque el enlazador tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO 5.

8. La proteína de fusión según la reivindicación 2 caracterizada porque tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO 6.

9. La proteína de fusión según la reivindicación 2 caracterizada porque tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO 7.

10. Una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica codificante de la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9.

1 1 . La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10 caracterizada porque tiene la secuencia que se muestra en la SEQ. ID NO 10.

12. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10 caracterizada porque tiene la secuencia que se muestra en la SEQ. ID NO 1 1 .

13. Una molécula de ARNm codificante de cualquiera de las proteínas de fusión de las reivindicaciones 8 y 9.

14. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, en un rango de concentración de 1 pg/ml a 20 pg/ml, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Uso de la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9 en el tratamiento del cáncer.

16. Uso de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 1 1 para la inyección intratumoral.