JPH07508714A - 免疫療法に使用する低毒性のインターロイキン２類似体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 効匿繕 免疫療法に使用する低毒性のインターロイキン２類似体光朋Ω茸景 両立衛生研究所助成金番号ＣＡ　４５２２５に従って、政府は、本発明に関する 権利を所有するものである。

１、立型ぬ虱皿 本発明は、一般に免疫療法と癌治療に係わるものである。本発明は、毒性の低い サイトカインの同定と選択、および、臨床的治療法と抗癌治療においてこのよう なサイトカインを高投与量使用することに関する。特に、殺腫瘍作用を維持する 低毒性インターロイキン２類似体の有用な利用法が明らかにされる。本発明は更 に、養子免疫療法におけるこのような低毒性インターロイキン２類似体の利用に も係わるものである。

２、　閃Ａ田Ｇ痕グ閃吸 ヒトインターロイキン２（ｒＬ−２）は、強力な免疫調節サイトカインで、ｉｎ 　ｖｉｔｒｏにおける活性化されたＴ細胞の長期増殖を促進できるリンホカイン として初めて報告された（Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７６；　Ｒｕ５ ｃｅｔｔｉ　ｅｔ　ａＬ、　１９７７）。その後、ＩＬ−２は、細胞障害性Ｔ細 胞（Ｇｉｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０）、他の様々な免疫機能を調節す ることも明らかにされた。それには、例えば、ナチュラルキラー細胞（Ｏｒｔａ ｌｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）、活性化されたＢ細胞（Ｍｉｎｇａｒｉ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）、リンホカインにより活性化されるキラー細胞（ｌ ｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ：　Ｌ ＡＫ　ｃｅｌｌｓ）（Ｇｒｉｍｍ　ｅｔ　ａｌA　、　１９ ８２；　Ｍａｚｕｍｄｅｒ　＆　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　１９８４）に対する効 果等が挙げられる。

ヒトＩＬ−２をコード化しているｃＤＮＡがクローン化され（Ｔａｎｉｇｕｃｈ ｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３）、−次配列が推定されている。真核細胞におい て、ＩＬ−２は１５３個のアミノ酸から成る前駆体ポリペプチドとして合成され 、これから２０個のアミノ酸が除去され、完全なＩＬ−２が分泌される。分子生 物学の技術を用いて、活性を有する組み換えヒトＩＬ−２が、Ｅ、　ｃｏｌｉ（ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａＬ、　１９８４）、昆虫の細胞（Ｓｍｉｔｈ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９８５）、哺乳動物のコス細胞（ＣＯ３ｃｅｌｌ）（Ｔａｎｉ ｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３）において生産されている。

ＩＬ−２の生物学的作用は、標的細胞表面の特異的レセプタに結合することによ って仲介される。少な（とも３種類のＩＬ−２レセプタ（ＩＬ−２Ｒ）が知られ ている。親和性が低いレセプタ（Ｋ＝　＝　１０〜３０ｎＭ）、中等度のレセプ タ（Ｋｄ＝０．８〜２ｎＭ）、高いレセプタ（Ｋ、　＝　１０〜５０ｐＭ）の３ 種類である（Ｗａｌｄｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）。親和性が低いＩ Ｌ−２Ｒは、Ｍ、が約５５ｋＤのポリペプチド鎖でｐ５５またはルー２Ｒαと呼 ばれ（Ｌｅｏｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　。

１９８４；　Ｎ１ｋａｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８４；　Ｃｏｓｍａｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）、親和性が中等度のルー２Ｒは、Ｖ、が約７０〜７ ５ｋＤで、ｐ７５またはＩＬ−２Ｒβと呼ばれている（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ　 ｅｔ　ａｌ、　。

１９８９）。ｐ７５とｐ５５のとの間で形成される複合体に更に別の成分が加わ ったものが、親和性の高いＩＬ−２Ｈに相当する（Ｉ（ａｔａｋｅｙａｍａ　ｅ ｔ　ａｌ、　、　１９８９；　Ｈｅｒｒｍａｎｎ　＆　Ｄｉａｍａｎｔｓｔｅｉ ｎ、　１９８８）。

これらのレセプタそれぞれの生物学的機能は、天然または組み換えレセプタを発 現する細胞に結合するＩＬ−２の作用を研究することによって、検討されてきた 。

ＩＬ−２は、リンホカインによって活性化されるキラー作用（ＬＡＫ）を、親和 性が高いｐ５５　＋　ｐ７５複合体を介してではなく、親和性が中等度のルー２ レセプタ分子ｐ７５を介して活性化することが明らかにされている。

近年、ＩＬ−２の投与が、癌治療、特にある種の腎細胞癌患者の治療にある程度 有用であることが証明されている。現在、耐えられる至適量のＩＬ−２を投与さ れた腎臓癌患者の約２０％が腫瘍消退の徴候を示している。しかし、ＩＬ−２免 疫療法の臨床的有用性は、顕著な毒性作用のため今の所限定されている。ヒトに おけるＩＬ−２投与による毒性は、動物試験から得られた結果わかった適量の１ ０％以下の投与量にしか耐えることができない程のものである。従って、残念な がら、動物モデルにおいて達成された「治療有効量」に近づけることは、ヒト患 者においては不可能である。

更に、現在使用されている投与量においてさえ、倦怠感、悪心、嘔吐、下痢、体 液貯留、低血圧、更に臓器機能不全をも含む毒性症状が、ＩＬ−２療法を受けて いる患者にしばしば観察されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ８９）。更に、特に懸念されるのは、ＩＬ−２療法が、ときに患者の死亡を引き 起こすことがあり、ＩＬ−２毒性による死亡率は、ある投与試験においては１． ５％である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）。

癌患者においてルー２により誘発される腫瘍拒絶反応の重要なメカニズムの１つ は、リンホカインにより活性化されるキラー作用（ＬＡＮ）の誘導と考えられて いる。

ＬＡＮ細胞は、非常に強力な殺腫瘍性リンパ球であることが明らかにされている 。これに対し、有害な毒性副作用は、インターロイキン１類や腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）類等の二次的サイトカインが原因と考えられている。

ヒト細胞に対する毒性を低（したサイトカインを生産することにより、より有効 な臨床的免疫療法が開発されるであろう。特に、低毒性でありながら、ＬＡＫを 誘導できるサイトカインの同定が、適用範囲の広い新しい抗癌療法の開発におい て重要であろう。そのような特性を備えたルー２変種を同定することは、ＩＬ− ２療法の治療範囲を拡大し、動物において有効性が明らかにされている治療有効 量まで臨床的ルー２投与量を増大させることができる点で、特に有利と思われる 。

光皿凶要稔 本発明は、毒性副作用の少ない免疫療法のための方法を提供することによって、 従来の技術に固有の種々の欠点の１つ以上を解決することを目的としている。本 発明は、毒性の低いサイトカインの同定と選択に関するもので、特に臨床的免疫 療法と癌治療においてこのようなサイトカインの投与量を増大させて使用するこ とに関するものである。特に、本発明は、その殺腫瘍作用を維持する低毒性イン ターロイキン２（ＩＬ−２）類似体の使用に関する。更に、本発明は、養子免疫 療法に使用する活性化された細胞の生産に、低毒性インターロイキン２類似体を 使用することにも関する。

本発明の重要な点は、特定のヒトＩＬ−２類似体、特に、親和性が中等度のルー ２レセプタに特異的なヒトＴＬ−２類似体が、殺腫瘍作用を維持しながら、低い 毒性を示すことを発見した点である。従って、このようなＩＬ−２類似体は「低 毒性ＩＬ−２類似体」であり、この言葉は、ここでは天然のＩＬ−２とはアミノ 酸配列が異なるＩＬ−２類似体または突然変異体を示すために使用されている。

ＩＬ−２類似体は、天然のＩＬ−２よりも二次的サイトカインの誘導が少ない。

二次的サイトカインは、インターロイキン１（ＩＬ−１）類および腫瘍壊死因子 （ＴＮＦ）類等の分子であり、例えばＩＬ−１β、耐Ｆα、ＴＮＦβ、ＩＦＮ− γ等が含まれる。

本発明に従って使用するのに望ましい低毒性ＩＬ−２類似体は、親和性が中等度 のＩＬ−２レセプタに対し、実質的な結合を示すが、親和性が高いルー２レセプ タに対しては実質的な結合を示さないヒトＩＬ−２類似体と考えられる。ここで 言及される！Ｌ−２レセプタは、本技術分野において確立されているルー２レセ プタである。例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ　（１９８９）を参照のこと。このよう に、親和性が中等度のＩＬ−２レセプタは、置、〜７Ｏ−７５ｋＤのポリペプチ ドで、ここではｐ７５と呼ばれる。親和性が高いルー２レセプタは、他の成分の ほかに、ｐ７５とＭ、〜５Ｏ−５５ｋＤのポリペプチド（ｐ５５と呼ばれる）を 含む複合体で、ｐ５５　＋　ｐ７５複合体と呼ばれる。

従って、低毒性ＩＬ−２類似体は、ｐ５５結合部位に突然変異が引き起こされた 、あるいはｐ５５結合部位が変更された類似体と定義することもできる。重要な ｐ５５結合に関する領域は、一般にＩＬ−２分子の残基３０〜６０の内、より特 定すれば残基３３〜４６によって形成されるＢα−へリックス内に存在すると考 えられている（Ｓａｕｖｅ　ｅｔ　ａｌ、　。

１９９１）。更に特定すれば、リジン３５、アルギニン３８、フェニルアラニン ４２、リジン４３が、この相互作用に重要な役割を果たしていると考えられてい る（Ｓａｕｖｅ　ｅｔａｌ、、　１９９１）。従って、これらの領域に突然変異 または修飾を受けたＩＬ−２類似体が、本発明に従って使用するのに適した低毒 性ＩＬ−２類似体であることが証明されるものと予想される。

「実質的な結合」という言葉は、ｒＬ−２またはＩＬ−２類似体が特定のレセプ タ・ポリペプチドと結合する、あるいは機能的に相互作用を示すことを意味して いる。

本発明において使用するためのＩＬ−２類似体は、親和性が中等度のＩＬ−２レ セプタと実質的に結合するが、親和性が高いＩＬ−２レセプタとは結合しないも のと考えられる。ＩＬ−２類似体そのものは、天然のルー２と本質的に同じよう にして親和性が中等度のＩＬ−２レセプタと結合する。これに対し、有用な類似 体は、天然のＩＬ−２と比較して、親和性が高いレセプタに対して、約１％から 約２５％、望ましくは約２％から約１０％のオーダーの結合を示すと考えられて いる。

ＩＬ−２またはＩＬ−２類似体の毒性は、ＩＬ−２分子による刺激に反応して、 リンパ球から放出される二次的サイトカインを測定することによって決定される のが望ましい。これは、ＥＬＩＳ＾またはラジオイムノアッセイ等の適切な方法 により、ルー１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮ−γ等の生産される種々のサイ トカインを測定することによって達成できる。本発明の重要な点は、新鮮なヒト 血液から得られたリンパ球を含む標本の使用が、このような分析の実施に特に有 利であることを発明者等が発見した点である。ヒト由来であることと、新たに分 離されたこのようなリンパ球の性質とは共に、臨床状況を非常によく反映してい るため、重要であると考えられる。従って、ヒトの新鮮末梢血液の単核細胞また はリンパ球（それぞれＰＢＭＣまたはＰＢＬ）を使用して、ＩＬ−２類似体のサ イトカイン誘導活性を分析することが望ましいと考えられる。

本発明において使用するＩＬ−２類似体は、天然のＩＬ−２よりも低いサイトカ イン誘導活性を示す。望ましい実施例においては、天然のものと比較して、約２ ５％から７００６の低下を示し、約４０９６から約７５％の低下を示すのが望ま しいと考えられる。

更に、本発明において使用するＩＬ−２類似体は、リンホカインによって活性化 されるキラー作用（ＬＡＫ）の刺激能を維持しているものと思われる。なぜなら ば、これは、ＩＬ−２療法の基礎となる有効な臨床的メカニズムの１つと考えら れているからである。リンホカインによって活性化されるキラー作用を刺激する 能力は、ここでは、ＩＬ−２類似体等のリンホカインが、リンパ球を活性化状態 に誘導する能力として定義されている。活性化されたリンパ球は、リンホカイン によって活性化される「キラー細胞」となり、腫瘍細胞を溶解することができる ようになる。ＬＡＫ誘導能は、親和性が中等度のＩＬ−２レセプタに結合した結 果化じる特性と考えられている。

ＰＢＭＣまたはＰＢＬを使用する分析法により、発明者等は、２つのヒトＩＬ− ２類似体、Ｒ３８ＡとＦ４２Ｋ（Ｈｏｆｆｍａｎ　Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ）が本発明 に使用するのに適切であることを発見した。Ｒ３８Ａは、ＩＬ−２配列の３８位 のアミノ酸がアルギニンからアラニンに突然変異した物質であり、Ｆ４２には４ ２位のフェニルアラニンからリジンに突然変異した物質である。Ｒ３８Ａまたは Ｆ４２Ｋを生産するには、例えば、引用することにより本明細書の一部をなすも のとする米国特許第４．９９２．３６７号に明らかにされているヒトＩＬ−２配 列のように、天然のＩＬ−２配列に特定部位の突然変異を実施する。Ｒ３８Ａま たはＦ４２Ｋを調製する望ましい方法は、ここに述べられているように、５ａｕ ｖｅおよび共同研究者等（Ｓａｕｖｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１；　Ｃｏ１１ ｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８；　Ｊｕ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７；引用 に謔■ それぞれ本明細書の一部とする。）によって開発された方法である。

このようなＩＬ−２類似体を生産するには、ＩＬ−２、望ましくはヒト比−２を コード化しているｃＤＮＡを入手し、ＩＬ−２をコード化しているＤＮＡ配列に 特異的に突然変異を引き起こすことによって、タンパク質中のアミノ酸を変更す る。これは、タンパク質とＤＮＡの配列を分析し、特異的に変更されたコドンを 含むオリゴヌクレオチドをデザインし、次にどのヌクレオチドをＤＮＡ配列の対 応する天然の部分と交換するかをデザインすることによって達成される。例えば 、配列決定によってヌクレオチドの変更を確認後、変更されたＤＮＡを使用して 、組み換え原核または真核宿主細胞においでＩＬ−２類似体の発現させ、次にＩ Ｌ−２類似体を精製することができる。

体も生産できると考えられる。これを達成するには、例えば特定部位の突然変異 により、新しいＩＬ−２類似体を作成し、その類似体がここに明らかにされてい る低毒性類似体の基準を満たすかどうかを決定するだけでよい。すなわち、親和 性が高いＩＬ−２レセプタには結合できないが、親和性が中等度のＩＬ−２レセ プタに実質的に結合でき、ＬＡＫを誘導し、二次的サイトカイン誘導活性が低い ことを検査する。

コード化しているＤＮＡ配列の特定部位の突然変異によって、タンパク質の変種 または突然変異体を生産するこのような技術は、本技術分野に精通する者にとっ ては公知である。

あるいは、化学的に修飾されたＩＬ−２変種が望ましい低毒性の特性を示すこと も可能である。アミノ酸の側鎖置換基の形状と特性により、部分的にポリペプチ ドの相互作用能が決定されるため、遺伝子工学により交換するほかに、側鎖基に 変更を加える方法も有用であるかも知れない。従って、本技術分野に精通する者 にとって公知の多くの化学的修飾法のいずれでも、ＩＬ−２類似体の生産に使用 でき、このようにして得られたＩＬ−２類似体が、ここに明らかにされている有 利な特性を有するかどうかを、日常検査により検討することができる。

上述のように、ｐ５５結合部位に突然変異を誘発させられた、またはその他の変 更を加えられた類似体は、有用な低毒性ＩＬ−２類似体でありうることが証明で きる。

従って、遺伝子工学的または化学的修飾によって、特定の！Ｌ−２類似体を特別 に作成することができる。これは、残基３０−６０内に、望ましくはβヘリック スを構成する残基３３−４６内に、より望ましくは残基３５．３８．４２または ４３のいずれかに突然変異を有するものである。

多くの米国特許において明らかにされているように、ＩＬ−２は、様々な供給源 から、また種々の方法によって作成できる。これらには、例えば、ハイブリッド ネズミＴ細胞系または悪性ヒトＴ細胞系等がある。これらはそれぞれ米国特許第 ４，４０７、９４５号および第４．４７３．６４２号および第４．４０１．７５ ６号に明らかにされており、これらは全て引用により本明細書の一部とする。あ るいは、哺乳動物細胞におけるＩＬ−２の発現とその調製は、引用することによ り本明細書の一部をなす米国特許第４．９９２、３６７号に明らかにされている 方法に従って達成することもできる。

ある実施例において、本発明は、動物の免疫システムを刺激する方法を提供して おり、この方法は、治療効果を発揮する量の低毒性インターロイキン２類似体を 、薬理学的に許容できる形態で投与することから成る。このような方法において 使用するのに望ましいＩＬ−２類似体は、調製方法が明らかに確立されているこ とから、ＩＬ−２類似体Ｒ３８＾およびＦ４２にである。しかし、上述の如く、 低毒性基準を満たすＩＬ−２類似体ならばどれでも使用できるものと考えられる 。

低毒性ＩＬ−２類似体によるこのような免疫システムの刺激は、ヒトの癌、特に ヒトの腎細胞癌またはメラノーマの治療に有用である。従って、低毒性ＩＬ−２ 類似体は、天然のＩＬ−２投与と殆ど同じように有用であるが、高投与量を投与 することができる点で明らかな利点を有する。

ヒト対象に対するＩＬ−２類似体の投与に適した方法は様々である。勿論、適切 な薬剤組成であればどのような組成でも、天然のＩＬ−２療法に使用されている ような、治療効果を発揮する量を投与することができる。しかし、類似体は、天 然の化合物よりも、治療のための最大投与量を高くすることができる。特に適切 で安定した薬品組成は、引用により本明細書の一部をなす米国特許第５．０３７ ．６４４号に報告されているもので、ＩＬ−２を非経口投与するために開発され たものであろう。あるいは、ＩＬ−２類似体は、例えば、リポゾーム形成物とし て、あるいは生分解性ポリマー基質内に被包された徐放剤として投与することが できる。これらは、引用により本明細書の一部をなすものとする米国特許第４． ８６３．７４０号および第４．８３２．６８６号にそれぞれ明らかにされている 。

必要であれば、ＩＬ−２類似体組成は、他の有効量の治療薬と併用投与すること も可能である。例えば、引用により本明細書の一部をなすものとする米国特許第 ４゜９９９、３３９号および第５．０６６、４８９号に明らかにされているよう に、悪性メラノーマ患者の治療にＤＴＩＣと併用できる。あるいは引用により本 明細書の一部をなすものとする米国特許第５．０６１．４８８号に明らかにされ ているように、腎臓癌の患者に治療にフラボン−８−酢酸と併用できる。また、 引用により本明細書の一部をなすものとする米国特許第４．８９４．２２７号に 報告されているように、ヒト腫瘍細胞と選択的に結合する免疫毒素と併用するこ ともできる。

ＩＬ−２類似体は、持続注入により毎日、あるいは、恐らく他の免疫療法剤と交 互に、ＩＬｌおきに投与することもできる。ＩＬ−２類似体の投与量は、天然の ＩＬ−２の投与量よりも大きくされる。投与量を増加する場合には、当然注意深 く監視し、特定の増大した投与量において毒性副作用が出現するかどうかを決定 すべきである。

このような臨床的および実験的分析は、本技術分野に精通する者にとって公知で あり、例えば治療に使用されている天然のＩＬ−２の現行の投与量を確立するの に使用されている。

直接注入療法において使用する以外に、ＩＬ−２類似体は、養子免疫療法におい ても有用であると考えられる。養子免疫療法は、癌を治療するための１つの方法 で、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞を他の化合物と共に、あるいは単独で腫瘍患 者に移入するものである。ＩＬ−２とリンホカインによって活性化されるキラー （ＬＡＮ）細胞を使用する養子免疫療法に関する特定の方法は、引用により本明 細書の一部をなすものとする米国特許第４．６９０．９１５号に報告されている 。この技術は、ここに明らかにされている低毒性ＩＬ−２類似体を使用しても、 同様に適切であることが提案される。

本発明のさらに別の実施例は、リンホカインによって活性化されるキラー（ＬＡ Ｋ）細胞を生体外（ｅｘ〜□１ｖｏ）で調製するための改善法と養子免疫療法に おけるそれらの利用に関するものである。この方法でＬＡＮ細胞を調製するには 、治療される動物のリンパ球と組織適合性リンパ球から構成される組成を、低毒 性ＩＬ−２類似体の存在下に生体外でインキュベーションする。次に、このよう なＬＡＮ細胞を使用して、例えば、動物に治療効果を発揮する量のＬＡＮ細胞を 投与することによる癌治療法として、動物の免疫システムを刺激することができ る。

養子免疫療法を実施する望ましい実施例において、組織適合性リンパ球から成る 組成は、治療される動物から得られる末梢血液単核細胞を含む組成と考えられる 。これらの細胞をＩＬ−２類似体、望ましくはＲ３８ＡまたはＦ４２にと共に、 刺激を可能となるのに十分な一定期間、例えば３〜４日間インキュベーションす る。次に、正常細胞ではなく、新鮮な腫瘍細胞を溶解する細胞の能力を検査し、 すなわちＬＡＫ活性の存在を確認することができる。次に、血液標本を入手した 動物または患者に、言い換えれば自己輸血動物または患者にＬＡＮ細胞を注入す る。必要ならば、この期間にＩＬ−２類似体そのものを動物または患者に追加投 与することも可能と考えられる。

区面少皿里望説盟 図１は、天然の比−２およびＩＬ−２類似体Ｒ３８＾およびＦ４２Ｋに応答した 、ＰＢＭＣによるＴＮＦ−αの産生を示す。実験１゜ 図２は、天然のＩＬ−２およびＩＬ−２類似体Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋに応答し た、ＰＢＭＣによるＴＮＦ−αの産生を示す。実験２゜ 図３は、天然のＩＬ−２およびＩＬ−２類似体Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋに応答し た、ＰＢＭＣによるＴＮＦ−βの産生を示す。実験１゜ 図４は、天然のＩＬ−２およびＩＬ−２類似体Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋに応答し た、ＰＢＭＣによるＴＮＦ−βの産生を示す。実験２゜ 図５は、天然のＩＬ−２およびＩＬ−２類似体Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋに応答し た、ＰＢＭＣによるＩＬ−１βの産生を示す。実験１゜３５分。

図６は、天然のルー２およびＩＬ−２類似体Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋに応答した 、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの産生を示す。実験１゜ 図７は、天然のルー２およびＩＬ−２類似体Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋに応答した 、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの産生を示す。実験２゜ 図８は、ＬＡＫ生成の動態を示す。

、い５．　の雷、ｔ＋４０ インターロイキン２（ＩＬ−２）は、免疫システムを刺激し、標的細胞表面の特 異的レセプタに結合後、生物学的作用を発揮するサイトヵインである。ルー２は 、多（の生物学的作用を有し、活性化されたＢ細胞とＴ細胞（細胞毒性Ｔ細胞を 含む）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞、リンホカインによって活性化され るキラー（ＬＡＮ）細胞への刺激を誘発することが知られている。引用により本 明細書の一部をなすものとする米国特許第４．９９２．３６７号、第４．４０７ ．９４５号、第４．４７３．６４２号おヨヒ第４．４０１．７５６弓に報告され ているように、組み換えヒト比−２を生産することができる。

ＩＬ−２は、腎細胞癌とメラノーマの治療に使用され、臨床的にある程度成功し ており、免疫機能の全身的正常化等、臨床的利用法が現在更に検討されている。

しかし、ヒトに対するＩＬ−２療法には大きな問題、すなわち毒性の問題がある 。ＩＬ−２療法による毒性副作用は、インターロイキン１（ＩＬ−１）類や腫瘍 壊死因子（ＴＮＦ）類等の二次的サイトカインの生成によるもので、例えばルー １β、ＴＮＦ−α等がある。ルー１類およびＴＮＦ類は、血流力学的変化を引き 起こし、体液の移動と低血圧の原因となることが知られており、これらはヒトに おいてＩＬ−２利用が限定される主要要因である。この毒性は、動物モデルにお いて達成できる「治療有効量」を、ヒトでは達成できないことを意味する。ヒト が耐えられる量は、動物試験において報告されている適量の１０９６以下に過ぎ ない。

リンホカインによって活性化されるキラー作用（ＬＡＫ）の誘発は、ＩＬ−２療 法を受けている癌患者に認められる腫瘍拒絶反応のメカニズムの１つと提唱され ている。

事実、ＬＡＮは非常に強力な殺腫瘍性リンパ球である。ヒトと動物の全器官にお いて、親和性が高いｐ５５　＋　ｐ７５複合体を介してではなく、親和性が中等 度のルー２レセプタ分子ｐ７５を介して、ＩＬ−２がＬＡＫを活性化することは 公知である。

ＬＡＮ誘導能は維持するが、毒性は低いルー２変種または突然変異体の同定は、 臨床状況では特に有用と思われる。上記に論じられている情報がら見て、発明者 等は、親和性が高度のＩＬ−２レセプタではなく、親和性が中等度のＩＬ−２レ セプタに結合するＩＬ−２類似体を同定することにより、このような低毒性分子 を提供することができると推論した。

ＩＬ−２とＩＬ−２レセプタの相互作用は、遺伝子工学を利用して異なるレセプ タポリペプチドと相互作用するＩＬ−２の部位をマツピングすることによって検 討されている。例えば、ＩＬ−２のＮＨｉ末端のＡｓｐ−２０は、中等度の親和 性を有するＩＬ−２レセプタであるｐ７５の結合を調節することが明らかにされ ている（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）。親和性の低いＩＬ−２ レセプタであるｐ５５に対するＩＬ−２の中の結合部位を形成する特異的なアミ ノ酸群も同定されている（Ｓａｕｖｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１）。このよう な研究において、アルギニン３８（−アラニン）またはフェニルアラニン４２（ −リジン）に突然変異を引き起こされたＩＬ−２分子は、親和性の低いレセプタ ｐ５５とはもはや結合しないが、中等度のレセプタｐ７５に対する親和性は維持 していることが証明された（Ｓａｕｖｅ　ｅｔａｌ、、、　１９９１）。

本発明者等は、５ａｕｖｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９９１）によって報告され ているＡｒｇ−＋ＡｌａおよびＰｈｅ−ＬｙｓのＩＬ−２突然変異体が増殖が無 い状態でＬＡＫを誘導し、二次的サイトカイン、ＩＬ−１、ＴＮＦ、　ＩＦＮ− γの生産を刺激する能力を検討した。これらの研究は、以前は不明であったＩＬ −２類似体の長所の解明につながる。下記に明らかにされているように、新鮮な ヒト末梢血液単核細胞またはリンパ球（それぞれＰＢｉ［ＣまたはＰＢＬという ）を使用する研究において、発明者等はこれらのルー２類似体が、二次的サイト カインの放出を有意に減少させ、ヒトＬＡＫを活性化することを見いだした。二 次的サイトカインは、臨床治療において大きな毒性の問題を引き起こすため、こ れは特に重要な所見である。

このような所見は今まで報告されていない。事実、これらの！Ｌ−２類似体によ って引き起こされる二次的サイトカインの生産量すなわち放出量を、天然のＩＬ −２における観察結果と比較し、違いを明らかにした研究は全（報告されていな い。この観点から、発明者等が新鮮ヒトＰＢＭＣまたはＰＢＬを選択したことは 特に重要なことであると忠われる。なぜならば、これらのヒト細胞は、臨床的応 答に関与する細胞の種類を正確に代表しているからである。

ＩＬ−２類似体は、天然のルー２療法に現在使用されている適切な薬剤組成によ って、治療効果を発揮する量を投与することができる。また、引用により本明細 書の一部をなすものとする米国特許第４．８６３．７４０号および第４．８３２ ．６８６号にそれぞれ明らかにされているように、リボゾーム構造として、ある いは生分解性ポリマー基質内に被包された徐放剤の形態で投与することもできる 。

必要ならば、ＩＬ−２類似体療法を、放射線療法、化学療法、外科的手術、また は免疫毒素等の他の治療薬の投与等の他の治療と併用することもできる。直接注 入ＩＬ−２類似体をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて患者の細胞を刺激し活性化状態に するために使用し、活性化された細胞を同じ患者に再投与し、身体の疾病と戦う 能力を更に強化する。

以下の例は、本発明の望ましい実施例を提示するために記載されている。本技術 に精通する者は、以下の例において明らかにされる技術が、本発明の実行におい て良好に機能することを目的として、発明者等によって発見された技術を代表す るものであり、従って本発明を実行するための望ましい方法を構成するものと見 なすことができるということを理解すべきである。しかし、本技術に精通する者 は、本発見の見地から、明らかにされている具体的な実施例において多（の変更 力呵能であり、本発明の本質と範囲を逸脱せずに、なお同様の結果を得ることが できることを認識すべきである。

遡上 ７　こ゛　がｔ−ヒ　■Ｌ−２′　の ｌ１分子生り学的技術 ＩＬ−２類似体タンパク質は、下記に記載されているように、または引用により 本明細書の一部をなすものとする５ａｕｖｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、Ｃｏ １１ｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、およびＪｕ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８７）においても報告されているように、特定部位の突然変異を使用してＥ、　 ｃｏｌｉにおいて調製した。以下の方法は、特定部位の突然変異を使用し、どの ようなＩＬ−２類似体を調製するのにも適した方法と考えられている。当然、調 製される特定のルー２類似体は、修飾される残基の選択と、適切なオリゴヌクレ オチドのデザインによって異なる。

Ｊｕ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）において報告されているように、ＩＬ−２お よびＩＬ−２類似体を発現する発現プラスミドの作成に利点が認められるものと 考えられる。ＩＬ−２発現プラスミドは、例えば、温度に感受性を示すリプレッ サーの遺伝子を有する低コピー数適合性プラスミド、ｐＲＫ２４８ｃｌ　ｔｓか ら作成することができる（Ｃａｓａｄａｂａｎ　＆　Ｃｏｈｅｎ、１９８０）。

ヒトＩＬ−２をコード化するｃＤＮＡの挿入断片を、Ｂ８ｄｌおよびＡｈａｍ等 の適切な制限酵素を用いる消化により、ｐＩＬ２−２Ｂから放出させた後（Ｓｍ ｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　。

１９８５）、プラスミドの中に挿入する。成熟ＩＬ−２ｃＤＮＡをコード化して いるｃＤＮＡにとって、ｐＬプロモータの下流に入るように、また例えばテトラ サイクリン耐性遺伝子のようなマーカー遺伝子を崩壊するように、プラスミドの 中に挿入されるのが有利である。これは、ＤＮＡ操作技術を使用して、例えば制 限酵素技術と平滑末端連結を使用することによって達成できる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏｌ：おける突然変異誘発のために、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　＆　 Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）において報告されているように、合成オリゴ ヌクレオチドを調製する。オリゴヌクレオチドは、約２０個から約３０個のオー ダーのヌクレオチド長で、特定のアミノ酸置換をコード化するようにデザインす る。すなわち、変更されるアミノ酸のコドンを除いて、天然のＤＮＡ配列と一致 しなくてはならない。例えば、３８位のアルギニンをアラニンに変更するには、 ３８位に対応するコドンをアラニンを特定するように、すなわち、ＧＣＡＳＧＣ Ｃ％ＧＣＧに変更する。４２位のフェニルアラニンをリジンに変更するには、４ ２位に対応するコドンをリジンを特定するように、すなわち、ＡＡＡまたは＾Ａ Ｇに変更する。新しい制限エンドヌクレアーゼ切断部位も含むオリゴヌクレオチ ドの作成も有利と考えられる。これは、ＩＬ−２遺伝子の正しい位置に突然変異 を生じた配列が取り込まれていることを監視するために使用できる。

適切な特定部位の突然変異法は、Ｍｏｒｉｎａｇａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４ ）によって報告されている方法の変法と見なされる。ＩＬ−２を含むプラスミド は、制限エンドヌクレアーゼにより消化して線状分子を生産し、間隙のある分子 は、別の制限エンドヌクレアーゼで消化することによって生産される。これらは 、新しいオリゴヌクレオチドの挿入を促進するために選択される。このような消 化によって得られる大きなフラグメントを、アガロースミニゲル上で精製する。

また、突然変異誘発の度に、少量の（約１２．５　ｕ　ｌ）の適切な緩衝液（０ ，ＩＭ　ＮａＣ１，６，５ｍＭ　Ｔｒｉｓ４Ｃ１，ｐ［１７，５，４，５ｍＭＭ ｇＣｈ、１００ｍＭ　２−メルカプトエタノール）中で、線状および間隙のある プラスミドＤＮＡを、５゛−燐酸化合成オリゴヌクレオチドと混合する。試料を 、例えば１００℃で５分間加熱し、プラスミド分子を変性する。次に、反応混合 物をゆっくりと冷却する。例えば、室温で３０分間、４℃で３０分間、０℃で１ ０分間、インキュベーションすることによって、プラスミドＤＮＡの復元、ヘテ ロ二本鎖の形成、オリゴヌクレオチドのアニーリングが可能となる。

復元後、ヌクレオチドに例えば、１ｍＭ　ＡＴＰおよび５００　ＩＭのｄＡＴＰ ＳｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ。

ＴＴＰをそれぞれ加え、同時にＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ） ・フラグメント（約３単位）およびＬＤＮＡリガーゼ（約１単位）を添加し、例 えば１５℃で２〜３時間反応物をインキュベートする。次に連結反応の試料を、 ＭＣ１０６１（ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ）細胞のような有能なＥ、　ｃｏｌｉ細胞 の形質変換に使用する０［ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２、引用に より本明細書の一部をなすものとする）。突然変異を引き起こされたプラスミド を含むコロニーは、５−ｓ２Ｐ−標識オリゴヌクレオチドを用いるハイブリッド 形成により同定することができる。次に、陽性コロニーのプラスミドＤＮＡをミ ニブレツブ法により調製しくＢｉｒｎｂｏｉｍ　＆　Ｄｏｌｙ、　１９７９）、 ２回目の形質変換とスクリーニングに使用することができる。陽性の２回目の形 質変換から得られるプラスミドＤＮＡについて、オリゴヌクレオチドによってコ ード化された予想される新しい制限部位の存在を分析し、突然変異が正しい位置 に発生したことを確認することができる。

二本鎖プラスミドに関して改変されたジデオキシ鎖終結法等の配列分析を行い、 新しいヌクレオチド配列を確認する必要が通常は生じるものと予想される。この ような分析を行うには、プラスミドＤＮＡを線状化し、これを合成オリゴヌクレ オチドプライマとポリメラーゼ反応緩衝液（６，６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ ｕ’７．５．６．６ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ、１３ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭヂチオトレ イトール）中で混合する。次に試料を、１００℃で加熱して変性させてから、０ ℃で５分間冷却する。この反応物に、約４００Ｃｉ／ｍｍｏｌの［α−３２Ｐ］ ｄＡＴＰを１０μＣｉと０．０１Ｍジチオトレイトールを加える。この混合物を ４つのアリコートに分け、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７７）に報告 されているように、アリコートを４回のジデオキシ鎖終結反応に使用する。

２、ＬＩＩＭ　の生　と ＩＬ−２類似体発現プラスミドを含む細菌細胞を、問培地等の適切な培地内で３ ０℃で初期対数期（ＯＤ、、、＝０．５）まで増殖させる（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８２）。次に、培養物を０Ｄｓｏｏ＝１．０±０．１にな るまで、４２℃に約２時間移すことにより誘導する。次に、培養物の試料を、例 えば１２．０００　ｘ　ｇ、　１分間、４℃で遠心分離し、ペレットを得る。

Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０）中で激しく渦を作っ て混合し、１００℃で加熱することによって、この細胞ペレットから抽出物を調 製することができる。

ＩＬ−２類似体は、未修飾ＩＬ−２の調製法に関する本技術において公知の数多 くの方法のいずれによっても調製することができる。例えば、引用により本明細 書の一部をなすものとする米国特許第４．９９２．３６７号に明らかにされてい るヒト比−２生産に関する方法等がある。あるいは、Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、 　（１９８５）によって報告されている方法を利用することもできる。類似体は 、Ｂａ１ｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）において報告されているように、 組み換えヒトＩＬ−２に結合するモノクローナル抗体を使用するイムノアフィニ ティークロマトグラフィにより精製することもできる。組み換えヒトＩＬ−２に 特異的なモノクローナル抗体の例としては、５Ｂ１（Ｂａｉｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８７）および米国特許第４．７７２．５７２号に明らかにされている 抗体、およびＲ，Ｅ、　３３２５２　（米国特許第４．４７３．４９３号の再発 行特許）等があり、それぞれ引用により本明細書の一部をなすものとする。必要 な場合には、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下に、望ましくはＬａｅｍｍｌｉ　 （１９７０）によって報告されているように、１５９６ポリアクリルアミドゲル を使用してポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）を行い、！ Ｌ−２類似体を分析することができる。

例■ ７５（こ　−白・なヒトＩＬ−２゛　は　１ンホカイン（こ　って　゛　−一２ 　起こし　二　がサイトカイント゛、　させる以下の組み換えヒトＩＬ−２類似 体は、上記に記載されている方法により生産されたもので、Ｈｏｆｆｍａｎｎ− Ｌａ　Ｒｏｃｈｅ社より入手した。

Ｒ３８、〜−３８位のアルギニン（Ｒ）−アラニン（Ａ）Ｒ４２Ｋ　−４２位の フェニルアラニン（Ｆ）−リジン（Ｋ）１、　ν欠プえ結合 ＩＬ−２に対する特異的結合分析は、本質的にはＲｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ、　、　 （１９８１）により報告された方法を用い、それを以下のように改変して実施し た。細胞培養中に存在するＩＬ−２を除去するために、細胞を遠心分離（５００ Ｘｇ、　５分間）により１回洗浄し、結合緩衝液（ＲＰＭＩ　１６４０．１％牛 血清アルブミン（ＢＳＡ）、２５ｍＭヘペス、ｐＨ７，２）中に再懸濁した。次 に細胞を３７℃で１時間インキュベーションし、洗浄手順を３回繰り返した。各 分析物は、０．１５ｍ１の結合緩衝液中に約６Ｘ１０’個の細胞と０４０９Ｍの １１８１−ｒＬ−２（５０μＣｉ／μｇ）を含んでいた。非特異的結合は、５０ ％Ｍ未標識七トｒＩＬ−２を分析に含めて測定した。インキュベーションは、２ または３標本ずつ３７℃で２０分間実施した。報告されているように（Ｋｉｌｉ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）、細胞に結合した放射能を、結合していない 放射能から分離し、特異的結合量を計算した。

特定部位の突然変異により作成されたこれらの類似体、Ｒ３８ＡとＲ４２には、 ＩＬ−２レセプタｐ７５に対する結合能を維持しているが、親和性が高いｐ５５ 　＋　ｐ７５レセプタ複合体に対しては結合が最小限であることが見いだされた （それぞれ１０％と２％）。

２、　二　がサイ　力インｌ− 組み換えヒトＩＬ−２および２つのヒトＩＬ−２類似体、Ｒ３８＾とＲ４２にの 更なる特性を、次に分析する。同じ濃度のＩＬ−２とＩＬ−２類似体が、ｉｎ　 ｖｉｔｒｏで末梢血液単核細胞を刺激して、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αの分泌を刺 激する能力を最初に比較した。２４時間おきに７日間まで、上述の実験から得ら れるＬＡＮ培養物上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩＬ−１βとＴＮＦ− αの含有量を検査した。市販のＥＬＩＳ＾キットを、Ｒ＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ 社（ＴＮＦ−ａおよびＴＮＦ−β）、Ｉｗｕｎｏｔｅｃｈ社（ＩＬ−１ｆｆおよ びルー１β）、Ｅｎｄｏｇｅｎ社（ＩＮＦ−７）より購入した。ＥＬＩＳ＾は、 製造者によって提供されたプロトコルに従って実施した。

ＩＬ−１βとＴＮＦ−αは共に、天然のＩＬ−２に応答して生産された場合より も、類似体Ｆ４２Ｋを使用した場合に、全時点で有意に低下した（ｐ＜０．０５ 、三元分散分析）。ＩＬ−１β分泌は、４３％（Ｒ４２Ｋ）と２８％（Ｒ３８Ａ ）まで低下し、ＴＮＦ−αは、７７％（Ｒ４２Ｋ）と６６％（Ｒ３８Ａ）まで低 下した。

３　いＬＬ産 次に、至適濃度のＩＬ−２とその類似体が、末梢血液単核細胞を刺激し、リンホ カインによって活性化されるキラー作用（ＬＡＫ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏで引き起 こす能力を比較し健常人供血者の白血球泳動から得られた新鮮な末梢血液単核細 胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏ　ｌ　１ｆｌｙｐａｑｕｅ勾配上で分離した。これ らの細胞を、０．５ｎＭの天然組み換えＩＬ−２または１ｎＭのルー２突然変異 体、Ｒ３８ＡとＦ４２にのいずれかを補給した血清を含まない培地、ＡＩＭ　Ｖ 　（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた培地内に入れた。４時間の６１Ｃｒ放出分析により Ｄａｕｄｉ標的に対する細胞毒性を、非付着性細胞に関して検査した。特異的溶 解は、３回の値の平均値として表した。３日間のＰＢＩＪＣ培養物から得られた 細胞を含まない上清に関して、サイトカイン含有量をＥＬＩＳ八によって分析し た。このデータは、２回の値の平均として表し、実施された２回の実験を代表す るものである。

Ｄａｕｄ　ｉ標的に対する５ＩＣｒＩＣ上性分析により決定されたＬＡＮの生産 は有意であったが、下記に示すように、天然ＩＬ−２と比較すると、両類似体に おいては軽度の減少が認められた。

最大特異的溶解％ １００　：　１エフエクタ・標的化 天然ＩＬ−２６２ Ｒ３８Ａ　５５ Ｆ４２Ｋ　５４ ＬＡＫ活性化の動態も同じで、最初に腫瘍崩壊活性が認められたのは３日目で、 ３〜７日目白目ピークに達した（図８）。

４、ＦＡＣ３主化　・　ｙ１１ 培養されたＰＢＭＣをＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ア ジドナトリウムで洗浄した。約１００万個の細胞に、ＩＬ−２レセプタｐ５５に 対するＦＩＴＣ（フロレッセインーイソチオサネイト）−標識モツクローナル抗 体または非特異的対照マウスＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を加 えた。３０分間のインキュベーション後、５ｏｒｖａｌｌ細胞洗浄液２して２回 洗浄し、次にＰＢＳと１％パラホルムアルデヒド中に固定した。次に、細胞をＢ ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣ３ｃａｎで分析し、非特異的バックグ ランド蛍光をサブトラクション後、ｐ５５に陽性と決定された細胞のパーセント として結果を表した。

ＦＡＣ３分析によって、Ｆ４２Ｋによって７２時間刺激された培地内のｐ５５を 発現する細胞は２倍であることが認められたが（３０％対１５％）、Ｒ３８Ａと 天然ＩＬ−２では認められなかったことから、ｐ５５レセプタの選別除去および ／または内面化が示唆される。

上述のデータは、免疫療法において、ｒＬ−２類似体であるＲ３８＾とＦ４２Ｋ が天然ＩＬ−２に代わる有用な物質である可能性を示している。ＬＡＫ活性誘導 を維持すると同時に、二次的サイトカインを減少させることから、これらの類似 体が有効かつ毒性の少ない癌免疫療法の手段を提供することが初めて明らかにさ れた。

例■ 九史就紅な吐コ匹 ここに明らかにされているＩＬ−２類似体は、現在ルー２が利用されているヒト を対象とする全ての治療法において有用と考えられる。更に、Ｒ３８ＡおよびＦ ４２に等の類似体の使用は、現在ＩＬ−２療法に観察される毒性副作用を引き起 こさずに、投与量を増加させることができるため、このような治療プロトコルを 大きく進歩させるものである。ＩＬ−２類似体は、様々な腫瘍の治療、特に、腎 細胞癌またはメラノーマの患者の治療に有用と考えられており、またここで引用 することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第４．９０８．４３３ 号に報告されているように、患者の免疫応答の正常化にも有用と思われる。

ヒトを対象とした治療に使用する場合、ＩＬ−２類似体は、天然ＩＬ−２と全（ 同じ薬剤組成で、投与量を増加して投与することができる。必要ならば、ルー２ 類似体組成を、有効量の他の治療薬と併用投与することができる。例えば、引用 することにより本明細書の一部をなす米国特許第４．９９９．３３９号および第 ５．０６６、４８９号に明らかにされているように、悪性メラノーマの治療に、 ＤＴＩＣと併用できる。あるいは、引用することにより本明細書の一部をなす米 国特許第５．０６１．４８８号に明らかにされているように、腎臓癌の治療にフ ラボン−８−酢酸と併用できる。

引用することにより本明細書の一部をなす米国特許第４．８９４．２２７号に報 告されているように、ヒトにおける抗腫瘍活性を、薬理学的有効量のＩＬ−２類 似体とヒト腫瘍細胞に選択的に結合するイムノトキシンを投与することによって 増大することもできる。これは、選択的腫瘍マーカーと特異的イムノトキシンの 数が比較的多い卵巣癌と乳癌、およびメラノーマの治療に特に有用と考えられて いる。

ＩＬ−２類似体は、連続注入によって毎日、あるいは恐らく他の免疫療法剤と交 互に隔日投与できる。ＩＬ−２類似体の投与量は、天然ＩＬ−２よりも多いであ ろう。投与量を増大する場合には、当然、特定の増大した投与量において、毒性 副作用が出現するかどうかを明らかにするために、注意深く監視しなくてはなら ない。このような臨床的および実験的分析は、ルー２療法において現在使用され ている投与量が確立されていることか明らかなように、本技術分野に精通する者 にとって公知である。

ＩＬ−２類似体は、本技術において現在公知のヒト投与用薬剤組成のいずれとも 併用できるものと思われる。引用により本明細書の一部をなすものとする米国特 許第５．０３７．６４４号に明らかにされているように、特にＩＬ−２を非経口 投与するために開発された安定した薬剤組成を使用するのが有利と考えられる。

このような組成において、治療効果を発揮する量のＩＬ−２は、ＩＬ−２の可溶 化剤および／または安定剤として作用する１種類以上の生体適合性非イオン性ポ リマー界面活性剤から成る水性の不活性な担体媒質に溶解されている。適切な生 体適合性非イオン性ポリマー界面活性剤には、例えば、オクチルフェノキシポリ エトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアリン酸化合物お よびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等がある。

あるいは、ＩＬ−２は、徐放剤の形態で投与することができる。引用することに より本明細書の一部をなす米国特許第４．８６３．７４０号に明らかにされてい るように、例えば、燐脂質および／またはステロイド脂質によるリボゾーム形成 物質として投与できる。あるいは、生体適合性生物分解性ポリマー基質内に処方 して投与することができる。生体適合性生物分解性ポリマー基質には、例えば、 引用することにより本明細書の一部をなす米国特許第４．８３２．６８６号に報 告されているように、コラーゲンまたはアルブミン基質、あるいは乳酸のポリマ ーまたはコポリマー、ラクチド、グリコリドまたはグルタミン酸等がある。後者 の場合、ＩＬ−２徐放カプセルは、悪性組織が除去された部位に合うように成形 し、移植することもできる。

直接注入療法に加えて、ＩＬ−２類似体は養子免疫療法にも有用と思われる。養 子免疫療法は、癌を治療するための１つの方法で、抗腫瘍反応性を有する免疫細 胞を腫瘍患者に移す。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）および Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　（１９８４）を参照すること。天然ＩＬ−２は、養子免疫 療法の有用なアジュバントであることが明らかにされている。この場合、天然Ｉ Ｌ−２は、キラーＴ細胞の発育を刺激するために使用される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒ ｇ、　１９８５）。更に、ＩＬ−２を利用する養子免疫療法は、ヒトにおける種 々の進行した癌の転移の治療に応用できることが証明されている（Ｒｏｓｅｎｂ ｅｒｇ　ｅｔａｌ、、１９８５）。

次のような簡単化した方法が可能である。ＩＢＭ細胞分離器と認められている方 法を用いて、新鮮なヒト末梢血液単核細胞またはリンパ球（それぞれＰＢＭＣま たはＰＢＬ）を採取する。次に、これらの細胞をＩＬ−２類似体と一部インキユ ベーションし、次に誘導された細胞をゆっくり持続的に患者に注入する。このよ うな治療法は、最初は週に２〜３回行うことができるであろう。しかし、腫瘍内 への浸潤が確実となるまでの、より長い期間にわたり、投与間隔を更に延長して 、投与することになるであろう。

肉腫以外の癌患者に対する養子免疫療法のための同様の方法が、引用することに より本明細書の一部をなす米国特許第４．６９０．９１５号に、更に詳細に報告 されている。この技術は、ヒトＩＬ−２とリンホカインによって活性化されるキ ラー（ＬＡＫ）細胞とを使用しており、この方法が、低毒性ＩＬ−２類似体と共 に使用するのに特に適していることが提唱されている。このような方法を実施す るには、末梢血液単核細胞をＩＬ−２類似体と、例えば３〜４０間インキュベー ションする。次に得られたＬＡＮ細胞の、新鮮な腫瘍細胞は溶解するが、正常な 細胞を溶解しない能力を検討する。

次に、望ましくは類似体そのものを約８時間おきに静注しながら、ＬＡＮ細胞を 自己採血した患者に注入する。患者は、９０回までＩＬ−２類似体を投与し、２ ．８から１２．６Ｘ１０１０個の活性化細胞を投与することができるものと考え られる。

本発明の組成と方法を、望ましい実施例の見地から報告してきたが、本技術分野 に精通する者にとって、本発明の概念、本質、範囲を逸脱すること無く、ここに 報告された方法の組成、方法、およびステップに、あるいはステップの順番に、 変更を加えることができることは明らかである。より具体的には、化学的にも生 理学的にも関連性を有するある薬剤を、ここに記載されている薬剤と置き換える ことができ、同様の結果が達成されることは明らかである。このような同様の置 き換えまたは改変は、添付の請求の範囲によって規定されている本発明の本質、 範囲、概念の範囲内にあるものと考えられることは、本技術分野に精通する者に とって明らかである。

参考文献 以下の参考文献は、ここに報告されている内容に、模範的手順の詳細またはその 他の詳細を補う範囲において、引用することにより本明細書の一部をなすものと する。

Ｂａ１ｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　５：１１９５ ．　１９８７゜Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆　Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、　７：１５１３．　１９７９゜Ｃａ５ａｄａｂａｎ　＆　Ｃｏｈ ｅｎ、Ｊ、　にｏｆ、　Ｂｉｏｌ、、１３８：１７９．　１９８０゜Ｃｏ１１ｉ ｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、Ａ、、　８５ニア７０９−７７１３．　１９８W゜ Ｃｏｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１２ニア６８−７７１．　１９ ８４゜Ｇ１１ｌｊｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２４：１９５ ４．　１９８０゜Ｇｒｉｍｍ　ｅｔ　ａｌｌ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１ ５５：１８２３．　１９８２゜Ｈａｔａｋｅｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉ ｅｎｃｅ、　２４４：５５１−５５６．　１９８９゜Ｈｅｒｒｍａｎｎ　＆　Ｄ ｉａｍａｎｔｓｔｅｉｎ、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１８：１０５１− １０５７．　１９８８゜Ｊｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 、　２６２：５７２３−５７３１．　１９８７゜Ｋ１１ｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３７：１５３８．　１９８６゜Ｌａｅｍｍｌｉ、　 Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８０．　１９７０゜Ｌｅｏｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｎａｔｕｒｅ、　３］１；６２６−６３１．　２９８４゜Ｍａｎｉａｔｉｓ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ垂窒奄獅■ Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｕｒ、　Ｎ、　Ｙ、　１９８２゜Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒ ｓ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１０３：３１８５．　１９８１ ゜Ｍａｚｕｍｄｅｒ　＆　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、 １５９：４９５．　１９８４゜Ｍｉｎｇａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 、　３１２：６４１．　１９８４゜Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、１９３：１００７．　１９７６゜Ｍｏｒｉｎａｇａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６３６．　１９８４゜Ｎ１ｋａｉｄｏ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１１：６３１−６３５．　１９８４゜０ｒｔａｌ ｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３３ニア７９．　１９８４゜Ｒ ｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１５４：１４５５．　１ ９８１゜Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｄｖ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、、　２５＋３２３．１９７７゜Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒ ｅａｔ、　Ｒｅｐ、、　６８：２３３．１９８４゜Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　 ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２３：１４１２．１９８４゜Ｒｏｓｅｎｂｅｒ ｇ、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　７５：５９５．１９８ ５゜Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、 　３１３：１４８５．１９８５゜Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　、＾ｎｎ 、　Ｓｕｒｇ、、　２１０（４）：４７４．１９８９゜Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１１９：１３１．１９７７゜Ｓａｎｇ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、 Ｓ、Ａ、、　７４：５４６３．１９７７゜５ａｕｖｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、、　８８：４６３６． 　１９９１゜Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、ん、　８２：８４０４．１９８５゜Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０２：３０５．１９８３゜Ｗａｌｄｍａ ｎｎ、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｌ、　５８：８７５−９１１． １９８９゜フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ ７７２９−４Ｂ Ｉ Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｂ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．親和性の高いインターロイキン２レセプタに対する結合性が天然のインター ロイキン２に比べて低い低毒性インターロイキン２類似体の、動物の免疫システ ムを刺激するための医薬の調製における使用。
2. ２．上記低毒性インターロイキン２類似体が、親和性が中等度のインターロイキ ン２には実質的な結合を示すが、親和性の高いインターロイキン２レセプタには 実質的な結合を示さない請求項１に記載の使用。
3. ３．上記低毒性インターロイキン２類似体が、残基３３−４６によって形成され るＢαヘリックス内でアミノ酸の置換または修飾を受けている請求項１に記載の 使用。
4. ４．上記低毒性インターロイキン２類似体が、Ｒ３８Ａである請求項３に記載の 使用。
5. ５．上記低毒性インターロイキン２類似体が、Ｆ４２Ｘである請求項３に記載の 使用。
6. ６．上記医薬が、非経口投与用に処方されている請求項１に記載の使用。
7. ７．上記医薬が、生物分解性ポリマーまたは徐放カプセル内に被包されている請 求項１に記載の使用。
8. ８．上記医薬が、リポゾーム内に被包されている請求項１に記載の使用。
9. ９．上記医薬が、約１０００Ｕ／ｋｇ／日から約１００．０００，０００Ｕ／ｋ ｇ／日までの量を投与できるように処方されている請求項１に記載の使用。
10. １０．上記医薬が、癌を治療するためのものである請求項１に記載の使用。
11. １１．上記医薬が、腎細胞癌またはメラノーマを治療するためのものである請求 項１に記載の使用。
12. １２．上記医薬が、ヒトの患者に投与するために調整されている請求項１または １０のいずれかに記載の使用。
13. １３．低毒性インターロイキン２類似体の存在下において生体外で処理される動 物のリンパ球に対し、組織適合性を示すリンパ球から構成される組成物をインキ ュベートすることを含むことを特徴とする、動物の養子免疫療法に使用するため のリンホカインによって活性化されるキラー細胞の改善された調製方法。
14. １４．上記低毒性インターロイキン２類似体が、残基３３−４６によって形成さ れるＢα−ヘリックス内でアミノ酸の置換または修飾を受けている請求項１３に 記載の方法。
15. １５．上記低磁性インターロイキン２数似体が、Ｒ３８ＡまたはＦ４２Ｋである 請求項１４に記載の方法。
16. １６．請求項１３に記載の方法による、リンホカインによって活性化されるキラ ー細胞を含む組成物。