DE69934881T2

DE69934881T2 - Selective il-2 agonisten und antagonisten

Info

Publication number: DE69934881T2
Application number: DE69934881T
Authority: DE
Inventors: B. Armen Moraga SHANAFELT; M. Jeffrey Berkeley GREVE; Gary Richmond JESMOK; J. Kenneth Danville LEMBACH; D. Gayle Martinez WETZEL
Original assignee: Aicuris GmbH and Co KG
Current assignee: Aicuris GmbH and Co KG
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-13
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2019-05-14
Also published as: RU2235729C2; NZ508098A; SI20643B; HUP0101948A2; MY130274A; CN101319247B; NO20005762L; IL139136A; EP1076704B1; SK17242000A3; CN100366742C; TWI223663B; IL139136A0; HU226142B1; BG104929A; NO20005762D0; HK1039963A1; UA73719C2; DE69934881D1; AR020322A1

Description

Hintergrund
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Pharmakologie und Immunologie. Im Speziellen ist die Erfindung auf neue Zusammensetzungen aus Substanzen zur selektiven Aktivierung von T-Zellen (PHA-Blasts) gerichtet, die eine reduzierte Aktivierung von natürlichen Killerzellen ("NK") bewirken. Die neuen Zusammensetzungen umfassen Varianten der Cytokinfamilie und insbesondere humanes Interleukin 2 ("IL-2").
2. Beschreibung des im Zusammenhang stehenden Standes der Technik
Interleukin 2 (IL-2) ist ein potenter Immunstimulator, der verschiedene Zellen des Immunsystems aktiviert, einschließlich T-Zellen, B-Zellen und Monocyten. IL-2 ist außerdem ein potenter und kritischer Wachstumsfaktor von T-Zellen. Aufgrund dieser Aktivitäten wurde IL-2 auf dessen Fähigkeit getestet, um Krebs zu behandeln. Humanes IL-2 ist ein von der FDA genehmigtes Arzneimittel zur Behandlung von Metastasen bildendem Nierenkarzinom und Metastasen bildendem Melanom. Die Verwendung von IL-2 an in Frage kommenden Patienten ist aufgrund der hohen Toxizität eingeschränkt, die mit der IL-2-Therapie verbunden ist; es wird angenommen, dass höchstens lediglich 20 % der in Frage kommenden Patienten tatsächlich die Therapie erhalten. Die Toxizitäten, die mit der IL-2-Therapie verbunden sind, beinhalten schweres Fieber, Übelkeit, Erbrechen, vaskuläre Leckage und schwere Hypotension. Trotz dieser Toxizitäten ist IL-2 jedoch hinsichtlich seiner genehmigten Indikationen wirksam (~17 % objektive Ansprechrate).
Obwohl die Analyse der Struktur/Funktion von IL-2 aus der Maus umfassend erfolgt ist, (Zurawski, S. M. und Zurawski, G. (1989) Embo J 8: 2583-90; Zurawski, S. M. et al. (1990) Embo J 9: 3899-905; Zurawski, G. (1991). Trends Biotechnol 9: 250-7; Zurawski, S. M. und Zurawski, G. (1992) Embo J 11: 3905-10; Zurawski, et al. Embo J 12: 5113-5119 (1993)), hat lediglich eine eingeschränkte Analyse von humanem IL-2 stattgefunden. Die meisten Studien mit humanen IL-2-Muteinen wurden an Mauszellen durchgeführt; allerdings fanden eingeschränkte Studien unter Verwendung von humanen PHA-Blasts statt, die den hoch affinen IL-2-Rezeptor IL-2Rαβγ exprimieren. Diese Studien, in denen PHA-Blasts verwendet wurden, bestätigen die Wichtigkeit der Reste Asp-20 und der D-Helix von humanem IL-2. Es ist gezeigt worden, dass die Positionen Asp-20 und Gln-126 von humanem IL-2 die Reste darstellen, die primär für die Interaktion mit den β- bzw. γ-Untereinheiten des IL-2-Rezeptors verantwortlich sind (zusammenfassend dargestellt in Thèze et al., Immunol. Today, 17, 481-486 (1996)). Obwohl gezeigt wurde, dass die Reste in der C-Helix von IL-2 aus der Maus in die Interaktion mit IL-2Rβ aus der Maus involviert sind (Zurawski et al., EMBO J, 12: 5113-5119 (1993)), konnte nicht gezeigt werden, dass die äquivalenten Reste in humanem IL-2 die gleichen Eigenschaften aufweisen (diese Reste in humanem IL-2 wären Asp-84 und Asn-88). Da eine signifikante Speziesspezifität von humanem IL-2 und solchem aus der Maus gezeigt werden konnte (humanes IL-2 weist eine ~100fach reduzierte Aktivität in Maussystemen auf), ist es schwierig vorherzusagen, ob der gleiche Typ von Interaktionen innerhalb der Speziesgrenzen erfolgt. Es sind keine Studien bekannt, in denen Zellen verwendet wurden, die nur den humanen intermediär affinen Rezeptor IL-2Rβy exprimieren.
Einige humane IL-2-Muteine wurden hinsichtlich ihrer Aktivität an humanen PHA-Blasts untersucht (Xu et al., Eur. Cytokine Netw, 6, 237-244 (1995)). Für Muteine, die Substitutionen von Asp-20 durch Leucin (D20L) sowie durch Arginin, Asparagin und Lysin enthalten, konnte gezeigt werden, dass diese schwere Defekte in ihrer Fähigkeit aufweisen, die Proliferation von PHA-Blasts zu induzieren. Deshalb lehrt dieser Stand der Technik, dass die Substitution von Asp-20 zu Muteinen führt, die eine beeinträchtigte Aktivität zeigen. Ferner behaupten Xu et al., dass bis heute (1995) keine nützlichen IL-2-Muteine identifiziert wurden, weder für klinische, noch für forschungsbezogene Verwendungen.
Das humane IL-2-Q126D-Mutein, das von Buchli und Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys., 307(2): 411-415, (1993) generiert wurde, zeigte eine signifikant beeinträchtigte Aktivität sowohl in seiner Potenz als auch in seinem Agonismus; in Assays mit humanen T-Zellen übte es eine ~1000fach niedrigere Aktivität aus und verhielt sich wie ein partieller Agonist. In Assays mit T-Zellen der Maus war das Mutein nahezu inaktiv. Beide getesteten Zelllinien exprimierten die hoch affine Form des IL-2-Rezeptors. An beiden Zelltypen zeigte Q126D die Fähigkeit, die IL-2-vermittelte Aktivität zu antagonisieren, obwohl dies in dem Assay mit humanen T-Zellen nur teilweise der Fall war.
Zhi-yong, W. et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica 25(5):558-560 (Sept. 1993) führten Substitutionsexperimente an IL-2 an den Positionen 62, 69, 99 und 126 durch, und demonstrierten eine 20fache und 30fache Reduzierung der Aktivität im Vergleich zu wt-IL-2 bei 62-Leu-IL-2 bzw. 126-Asp-IL-2 in einem Assay mit T-Zellen der Maus (CTLL-2). Es lässt sich jedoch keine Lehre oder kein Vorschlag dazu finden, dass Substitutionen an Position 126 eine Aktivität verleihen, die selektiv für T-Zellen gegenüber NK-Zellen ist, oder Hinweise, ob solche Veränderungen einen ähnlichen Effekt auf humane T-Zellen haben.
Collins, L. et al., PNAS USA 85: 7709-7713 (1988) berichten, dass die Substitution von Asp an Position 20 entweder durch Asn (D20N) oder Lys (D20K) zu einem ~100 bis 1000fachen Verlust der Bindung im Vergleich zu humanem IL-2 führt, und zwar sowohl für den hoch affinen (IL-2Rαβγ, in Collins et al. als p55/p70 bezeichnet) als auch den intermediär affinen Rezeptor (IL-2Rβy, in Collins et al. als "p70" bezeichnet). Die Bindung an IL-2Rα scheint bei beiden mutierten Proteinen unbeeinflusst zu sein. Diese Arbeit lehrt, dass die Störung der Bindung an den intermediär affinen IL-2-Rezeptor (IL-2Rβγ) auch zu einer Störung der Bindung an den hoch affinen IL-2-Rezeptor (IL-2Rαβγ) führt, was darauf hindeutet, dass die unterschiedliche Bindung oder Aktivierung von IL-2Rβγ oder IL-2Rαβγ nicht durch die Substitution von Asp an Position 20 erreichbar ist.
Berndt, W. G. et al., Biochemistry 33(21): 6571-6577 (1994) verwendeten eine kombinatorische Kassettenmutagenese, um in nativem IL-2 simultan die Positionen 17-21 zu mutieren, für die angenommen wird, dass diese mit dem intermediär affinen IL-2-Rezeptor interagieren. Von 2610 gescreenten Klonen waren lediglich 42 aktiv. Sie fanden heraus, dass die Positionen 20 und 21 für die biologische Aktivität von primärer Wichtigkeit waren. Es findet sich kein Vorschlag oder keine Lehre zu individuellen Substitutionen, außer für L21V.
US-Patent Nr. 5,229,109 (Grimm et al.) offenbart angeblich Analoge von IL-2 mit niedriger Toxizität zur Verwendung in der Immuntherapie und der Behandlung von Krebs. Die Eigenschaften von zwei IL-2-Analoga mit Substitutionen an den Positionen Arg38 (durch Alanin) und Phe42 (durch Lysin) wurden analysiert und mit jenen von nativem IL-2 verglichen. Es wurde festgestellt, dass die Analoga in der Lage sind, ihre Fähigkeit an den intermediären IL-2-Rezeptor zu binden, beizubehalten, während sie lediglich minimal an den so genannten "hoch affinen" Rezeptor binden. Zu diesem Zeitpunkt wurde angenommen, dass der intermediär affine Rezeptor nur aus p75 (IL-2Rβ) besteht, und es wurde angenommen, dass der hoch affine Rezeptor nur aus dem Rezeptorkomplex p55 + p75 (IL-2Rαβ) besteht. Die Analoga behielten ebenfalls ihre Fähigkeit, die mononucleären Zellen des peripheren Blutes zu stimulieren, um das Lymphokin-aktivierte Killing (LAK) zu generieren. Bemerkenswerterweise war die IL-1β- und TNFα-Sekretion als Antwort auf die Analoga im Vergleich zu nati vem IL-2-Molekül signifikant reduziert. Die Aminosäurereste, die in diesem Patent beschrieben werden, seien jene, die spezifisch mit IL-2Rα (p55) interagieren würden; die Eliminierung der Interaktionen mit IL-2Rα würde in einer reduzierten Aktivität an solchen Zellen führen, die den hoch affinen IL-2-Rezeptor tragen, und würde nicht die Aktivität an solchen Zellen beeinflussen, die intermediär affine IL-2-Rezeptoren tragen. Deshalb soll die Generierung von LAK-Zellen (von denen angenommen wird, dass sich diese von NK-Zellen ableiten) erhalten bleiben. Die hier beschriebenen Muteine sind auf Aminosäurereste an den Positionen 20, 88 und 126 gerichtet; für diese Positionen wird angenommen, dass diese spezifisch mit IL-2Rβ (p75; Positionen 20 und 88) und IL-2Rγ (nicht bekannt zum Zeitpunkt des Patentes von Grimm et al.; Positionen 126) interagieren. Als Konsequenz bleiben die Interaktionen mit IL-2Rα unverändert. Mechanistisch gesehen zeigen die von Grimm et al. beschriebenen Muteine abgeschwächte Interaktionen mit dem hoch affinen IL-2-Rezeptor, sollen jedoch keinen Effekt auf den intermediär affinen IL-2-Rezeptor haben; die hier beschriebenen Muteine weisen die entgegengesetzte Eigenschaft auf, sie haben einen ausgeprägten Defekt in ihrer Fähigkeit, mit dem intermediär affinen IL-2-Rezeptor IL-2Rβγ zu interagieren, und zeigen einen geringen oder keinen Defekt in den funktionellen Interaktionen mit dem hoch affinen IL-2-Rezeptor IL-2Rαβγ.
In dem US-Patent Nr. 5,206,344 (Goodson et al.) werden Muteine von IL-2 offenbart, in denen eine der Aminosäuren der reifen nativen Sequenz von IL-2 durch einen Cysteinrest ersetzt wird, die anschließend präpariert und durch den ausgetauschten Cysteinrest an ein Polymer konjugiert werden, das ausgewählt ist aus den Polyethylenglykol-Homopolymeren oder polyoxidierten Polyolen, wobei die Homopolymere unsubstituiert oder an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sind. Diese Muteine werden über eine Wirtsexpression von mutierten Genen hergestellt, die für die Muteine codieren, welche durch ortsgerichtete Mutagenese gegenüber den Genen für die parentalen Proteine verändert wurden. Außerdem können andere Spezies von IL-2 über den Cysteinrest an Position 125 des reifen IL-2-Proteins konjugiert werden, der für die biologische Aktivität von IL-2 nicht notwendig ist. Es gibt keine Offenbarung von Mutationen, die eine reduzierte Toxizität verleihen.
Das US-Patent Nr. 4,959,314 (Lin et al.) offenbart Muteine von biologisch aktiven Proteinen, wie bspw. IFN-β und IL-2, in denen Cysteinreste, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind, deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, um Stellen für eine intermolekulare Quervernetzung oder inkorrekte intramolekulare Disulfidbrückenbildung zu eliminieren. Diese Muteine werden über eine bakterielle Expression von mutierten Genen hergestellt, die für die Muteine codieren, welche ausgehend von den Genen für die parentalen Proteine durch Oligonucleotidgerichtete Mutagenese synthetisiert wurden. Es werden keine Mutationen offenbart, die eine reduzierte Toxizität verleihen.
In dem US-Patent Nr. 5,116,943 (Halenbeck et al.) wird offenbart, dass ein biologisch aktives, therapeutisches Referenzprotein gegenüber Oxidation geschützt wird, und zwar durch ein Verfahren, das die Substitution einer konservierten Aminosäure für jeden Methionylrest beinhaltet, der einer Oxidation durch Chloramin T oder Peroxid zugänglich ist, wohingegen weitere, nicht zugängliche Methionylreste nicht substituiert werden. Das so produzierte oxidationsresistente Mutein ist vorzugsweise ein humanes Mutein von Interleukin-2 oder Interferon-β, und die konservierte Aminosäure ist höchst vorzugsweise Alanin. Es werden keine Mutationen offenbart, die eine reduzierte Toxizität verleihen.
Das US-Patent Nr. 4,853,332 (Mark et al.) betrifft IFN-γ und IL-2-Muteine, in denen die Cysteinreste, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind, deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, um Stellen für eine intermolekulare Quervernetzung oder inkorrekte intramolekulare Disulfidbrückenbildung zu eliminieren. In dem Patent wird offenbart, dass eine Substitution in IL-2 an dem Cystein 125 durch Serin in einem Mutein mit einer Aktivität resultiert, die vergleichbar ist mit jener von nativem IL-2.
Das US-Patent Nr. 5,696,234 (Zurawski et al.) betrifft Muteine von Säugetier-Cytokinen und Verfahren zum Screenen von Agonisten und Antagonisten von Säugetier-Cytokinen. Im Speziellen wurde demonstriert, dass das Doppelmutein von IL-2 P82A/Q126D eine Aktivität eines Antagonisten an Baf3-Zellen der Maus hat, die mit den humanen α- und β-IL-ZR-Untereinheiten cotransfiziert wurden. Eine geringe Agonistenaktivität wird gezeigt. Ferner wird gezeigt, dass IL-2-Muteine der Maus teilweise eine Agonisten- und Antagonistenaktivität an HT2-Zellen ausüben, insbesondere Q141D, Q141K, Q141V und Q141L. Es werden weder solche Aktivitäten beschrieben noch vorgeschlagen, die einen selektiven Agonisteneffekt bei Mutationen an den Positionen 20, 88 und 126 zeigen.
Zurawski et al. beschreiben IL-2-Muteine der Maus, die Eigenschaften haben, gemäß denen sie an Zellen aktiv sind, die IL-2Rαβγ exprimieren, jedoch inaktiv an Zellen sind, die IL-2Rβγ exprimieren (Zurawski, G. Trends Biotechnol 9: 250-257 (1991); Zurawski, S. M. und Zurawski, G. Embo J 11: 3905-10 (1992)). Die IL-2-Muteine der Maus, die diese Eigenschaften ausüben, weisen die Substitutionen Asp-34 durch Ser oder Thr und Gln-141 durch Lys auf. Asp-34 und Gln-141 in IL-2 der Maus scheinen äquivalent zu Asp-20 bzw. Gln-141 des humanen IL-2 zu sein. Obwohl in diesen Referenzen von "selektiven agonistischen" IL-2-Muteinen die Rede ist, wird nicht deren Potenzial beschrieben, niedrige Toxizität aufzuweisen, sondern eher ihre Eigenschaft als potenzielle Antagonisten von endogenem IL-2 zu fungieren.
In der EP 0 267 795 A2 (Zurawski et al.) wird eine Vielzahl von IL-2-Muteinen über die Sequenz hinweg offenbart, einschließlich solche, die Deletionen oder Substitutionen innerhalb der ersten dreißig N-terminalen Aminosäurereste enthalten, die biologisch kompetent sind, wohingegen die Aminosäuresubstitutionen, die hier bezüglich der äquivalenten IL-2-Reste in der Maus offenbart werden, weder genannt, diskutiert noch vorgeschlagen werden. Es gibt einen Bedarf an einem verbesserten IL-2-Molekül, das reduzierte Toxizität aufweist und im Allgemeinen besser vertragen wird.
Taniguchi et al., US 4,738,927 , betrifft eine rekombinante DNA, die eine solche rekombinante DNA aufweist, die für ein Polypeptid codiert, das eine biologische Aktivität von IL-2 besitzt, wobei diese Aktivität die Förderung des Wachstums einer Zelllinie von cytotoxischen T-Lymphocyten betrifft, sowie einen DNA-Vektor, der in der Lage ist, sich in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle zu vermehren, wobei die Codierungssequenz dieses Genes an einer Position lokalisiert ist, die stromabwärts von einer Promotorsequenz liegt, wobei das Polypeptid insbesondere 132 bis 134 Aminosäuren in der gesamten Aminosäuresequenz des Polypeptides aufweist. Es wird ferner ein Gen beschrieben, rekombinante DNA-Vektoren, Wirtszellen und Methoden, um natives IL-2 rekombinant zu produzieren. Taniguchi et al. beschreiben keinerlei Varianten oder Muteine und lehren nicht, welche Positionen in dem Protein für die Signalgebungs- oder Bindungsaktivität verantwortlich sind.
Eckenberg, R. et al. beschreiben: Analysis of human IL-2)IL-2- receptor beta chain interactions: monoclonal antibody H2-8 and new IL-2 mutants define the critical role of alpha helix-A of IL-2, Cytokine, Vol. 9, Nr. 7, Juli 1997 (1997-07), Seiten 488-498;
die WO 96 04306A (Schering Corporation (US); Zurawski S. M: Zurawski G.) betrifft Muteine von Säugetier-Cytokinen;
Ju, G. et al. beschreiben: Structure-function analysis of human Interleukin-2, Journal of Biological Chemistry, Vol. 262, Nr. 12, 25. April 1987 (1987-04-25), Seiten 5723-5 731; und
Ernst, J. F. et al. betrifft: Screening of muteins secreted by yeast: random mutagenesis of human Interleukin-2, Bio/Technology, Vol. 7, Nr. 7, 1. Juli 1989 (1989-07-01), Seiten 716-720.
Es versteht sich, dass IL-2-Muteine benötigt werden, die keine dosisbeschränkende Toxizität der rekombinanten IL-2-Muteine aus dem Stand der Technik aufweisen, um das Potenzial dieses Cytokins therapeutisch nutzen zu können.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das ein humanes IL-2-Mutein aufweist, welches entsprechend dem Wildtyp-IL-2 nummeriert ist, wobei das humane IL-2 zumindest an einer der Positionen 20, 88 oder 126 substituiert ist, wobei das Mutein bevorzugt T-Zellen gegenüber NK-Zellen aktiviert. Diese Erfindung verwirklicht ein weniger toxisches IL-2-Mutein, das eine größere therapeutische Verwendung dieses Interleukins ermöglicht.
Ferner betrifft die Erfindung IL-2-Muteine, die einzelne Mutationen an den Positionen Aspartat 20, Asparagin 88 und Glutamin 126 aufweisen. Spezifische Muteine werden durch die Bezeichnungen D20X, N88X und Q126X repräsentiert, wobei "X" eine spezifische Aminosäure darstellt, die, wenn sie in humanem IL-2 substituiert wird, eine selektive Aktivität für Zellen verleiht, die den IL-2Rαβγ-Rezeptor (z.B. T-Zellen) exprimieren, und dies bevorzugt gegenüber Zellen, die den IL-2Rβγ-Rezeptor (z.B. NK-Zellen) exprimieren. Muteine, die eine mehr als 1000fache Selektivität ausüben, umfassen D20H, D20I, N88G, N88I, N88R und Q126L. Im Speziellen weisen diese Muteine an T-Zellen im Wesentlichen die Aktivität von Wildtyp-IL-2 auf. Es werden ferner weitere Mutationen angegeben, die eine Selektivität von weniger als 1000fach, jedoch größer als 10fach liefern. Die Erfindung umfasst ferner Polynucleotide, die für das erfindungsgemäße Mutein codieren, Vektoren, die die Polynucleotide enthalten, transformierte Wirtszellen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Muteine aufweisen sowie therapeutische Behandlungsmethoden, in denen die Muteine verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ferner eine Methode, um IL-2-Muteine mittels einer Evaluierung in Assays zu selektieren, in denen IL-2Rαβγ im Vergleich zu IL-2Rβγ verwendet wird, wobei vorzugsweise die Aktivität eines IL-2-Muteins relativ zu wt-IL-2 in einem Assay gegenüber dem anderen erhöht ist. IL-2Rαβy und IL-2Rβγ sind individuelle Rezeptoruntereinheit-Ektodomänen in geeigneter Kombination und werden dazu verwendet, um direkt die Bindung von IL-2-Muteinen an jeden Rezeptorkomplex zu messen. In dem IL-2αβγ-Assay wird die Antwort eines Zelltyps verwendet, der IL-2αβγ trägt, und in dem IL-2βγ-Assay wird die Antwort eines Zelltyps verwendet, der IL-2βγ trägt. Bei der IL-2αβγ-tragenden Zelle handelt es sich um einen PHA-Blast, und bei der IL-2βγ-tragenden Zelle handelt es sich um eine NK-Zelle. Der Assay betrifft die Proliferation sowohl des IL-2αβγ-tragenden Zelltyps als auch des IL-2βγ-tragenden Zelltyps.
Die Erfindung betrifft ferner einen Vektor, der das Polynucleotid aufweist, das für ein erfindungsgemäßes Mutein codiert, wobei der Vektor die Expression eines humanen IL-2-Muteins steuert, das eine aktivierende Aktivität auf PHA-Blast-Zellen aufweist, jedoch eine reduzierte aktivierende Aktivität gegenüber NK-Zellen, wobei der Vektor in der Lage ist, eine Transfektion eines Zielorganismus und eine anschließende Expression des humanen IL-2-Muteins, für welches das Polynucleotid codiert, in vivo zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner eine Methode zur Behandlung eines Patienten, der von einem IL-2-behandelbaren Zustand betroffen ist, und zwar durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines humanen IL-2-Muteins, das gemäß der Nummerierung des Wildtyp-IL-2 eine gegenüber PHA-Blasts aktivierende Aktivität, jedoch eine gegenüber NK-Zellen reduzierte Aktivität aufweist. Diese Methode ist geeignet, wenn der IL-2-behandelbare Zustand HIV, Krebs, eine Immunkrankheit, eine infektiöse Krankheit ist, als Impfstoffadjuvans in einer Therapie der Krebsvakzinierung und konventionellen Vakzinierung, zur Immunstimulierung in älteren oder auf andere Art und Weise immunkompromittierten sowie in humanen SCID-Patienten oder für andere therapeutische Anwendungen, die die Stimulierung des Immunsystems erfordern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 bis 7 zeigen Dosis-Wirkungs-Kurven von humanem wt-IL-2 (IL-2) und D20H (1), IL-2 und D20I (2), IL-2 und N88G (3), IL-2 und N88I (4), IL-2 und N88R (5), IL-2 und Q126E (6) und IL-2 und Q126L (7).

A: Individuelle Dosiswirkung von IL-2 (ausgefüllte Kreise) und Mutein (unausgefüllte Kreise) in dem Proliferationsassay mit primären humanen T-Zellen (PHA-Blasts).
B: Individuelle Dosiswirkung von IL-2 (ausgefüllte Dreiecke) und Mutein (unausgefüllte Dreiecke) in dem Proliferationsassay mit primären humanen NK-Zellen.

8A-8D. Die Toxizität von PROLEUKIN^TM im Schimpansen wurde in zwei Tieren (X-159, Dreiecke, und X-124, Quadrate) im Vergleich zu der Vehikelkontrolle (X-126, Rauten) evaluiert. Die Toxizität wurde durch Nierenparameter (Blood Urea Nitrogen (BUN), A; Kreatinin, B) und der Leberfunktion (Gesamtbilirubin, C; ALT, D) evaluiert.
9. Grafik über die prozentuale Veränderung des Körpergewichts innerhalb von 30 Tagen. Das Körpergewicht der mit IL-2/N88R (Dreiecke), PROLEUKIN (Quadrate) oder Vehikel (Rauten) behandelten Tiere wurde an den angegebenen Tagen gemessen.
10A-10D. An den angegebenen Tagen wurden die Lymphocyten (A), die gesamten weißen Zellen (B), Neutrophile (C) und Plättchen (D) der mit IL-2/N88R (Dreiecke), PROLEUKIN (Quadrate) oder Vehikel (Rauten) behandelten Tiere evaluiert.
11A-11D. An den angegebenen Tagen wurden der Harnstoff-Stickstoff im Blut (A, BUN), Kreatinin (B), Phosphor (C) und die Anionenlücke (D) der mit IL-2/N88R (Dreiecke), PROLEUKIN (Quadrate) oder Vehikel (Rauten) behandelten Tiere evaluiert.
12A-12D. An den angegebenen Tagen wurden das Gesamtbilirubin (A), ALT (B), Fibrinogen (C) und die aktivierte Prothrombinzeit (D) der mit IL-2/N88R (Dreiecke), PROLEUKIN (Quadrate) oder Vehikel (Rauten) behandelten Tiere evaluiert.
13A-13D. An den angegebenen Tagen wurden die Blutspiegel von Natrium (A), des Chloridions (B), von Calcium (C) und Kalium (D) der mit IL-2/N88R (Dreiecke), PROLEUKIN (Quadrate) oder Vehikel (Rauten) behandelten Tiere evaluiert.
14A-14C. An den angegebenen Tagen wurden die Albuminspiegel in dem Blut (A), der Hämatokritwert (B) und das Hämoglobin (C) der mit IL-2/N88R (Dreiecke), PROLEUKIN (Quadrate) oder Vehikel (Rauten) behandelten Tiere evaluiert.
15A-15C. Die Wirkungen von IL-2/N88R (Quadrate), PROLEUKIN (Rauten) und Vehikel (Dreiecke) werden für die gesamte T-Zell-Population (A, CD3⁺-Zellen), die CD4⁺-T-Zell-Population (B) und die CD8-T-Zell-Population (C) angegeben.
16A-16C. Die Wirkungen von IL-2/N88R (Quadrate), PROLEUKIN (Rauten) und Vehikel (Dreiecke) werden für die gesamte T-Zell-Population (A, CD3⁺-Zellen), die CD4⁺-T-Zell-Population (B) und die CD⁸-T-Zell-Population (C) angegeben.
17. Effekt von IL-2/N88R und PROLEUKIN auf die T-Zell-Aktivierung in Bezug auf die mittlere Fluoreszenz von CD25-positiven Zellen. Der Effekt von IL-2/N88R (Quadrate), PROLEUKIN (Rauten) und Vehikel (Dreiecke) ist für die CD3⁺CD4⁺-T-Zell-Population angegeben. Die Anzahl der erhaltenen CD3⁺/CD8⁺-Zellen war nicht ausreichend, um die mittlere Fluoreszenz dieser Population zu evaluieren.
18A-18D. Angegeben wird der Effekt von IL-2/N88R (Quadrate), PROLEUKIN (Rauten) und Vehikel (Dreiecke) für die CD4⁺-T-Zell-Population (A, CD3⁺/CD4⁺-Zellen) und die CD8⁺-T-Zell-Population (B, CD3⁺/CD8⁺-Zellen), die gesamte T-Zell-Population (C, CD3⁺-Zellen) und die NK-Zell-Population (D, CD3^–/CD-16⁺-Zellen).
19. Grafik der Lungenmetastasen in Abhängigkeit der Dosis in Mäusen, die mit PROLEUKIN (unausgefüllte Kreise) oder IL-2/N88R (ausgefüllte Kreise) behandelt wurden. Die Lungenmetastasen wurden am Ende der Studie gezählt.
20. Plasmidkarte des IL-2/N88R-Vektors pBClIL2SA.
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen
A. Hintergrund
Die Wirkung von IL-2 auf T-Zellen wird durch die Bindung an IL-2-Rezeptorproteine vermittelt. Verschiedene Zelloberflächenproteine auf T-Zellen binden IL-2. Das erste, das identifiziert wurde, ist ein einzelnes Polypeptid, das als IL-2Rα bezeichnet wird, bei dem es sich um ein 55kD großes Polypeptid (p55) handelt, das nach der T-Zell-Aktivierung erscheint und ursprünglich als Tac-(für T-Zell-Aktivierung) Antigen bezeichnet wurde. IL-2Rα bindet IL-2 mit einer K_d von ungefähr 10^–8 M und ist auch als "nieder affiner" IL-2-Rezeptor bekannt. Die Bindung von IL-2 an Zellen, die nur IL-2R exprimieren, führt zu keiner detektierbaren biologischen Antwort.
Bei dem zweiten IL-2-Rezeptor handelt es sich um einen Bindungskomplex, der aus IL-2Rβ und IL-2Rγ besteht; IL-2Rγ, bei dem es sich um ein Polypeptid mit 64 kD handelt, ist auch bekannt als gemeinsame γ-(γ_c) Kette, denn eine Anzahl von Cytokinrezeptoren haben diese gemein. IL-2Rβ hat eine Größe von ungefähr 70 bis 75 kD (und wird unterschiedlich als p70 oder p75 bezeichnet) und ist ein Mitglied der Cytokinrezeptorfamilie vom Typ I, die durch das Motiv mit zwei Cysteinen/WSXWS charakterisiert ist. IL-2Rβ wird koordinativ mit γ_c exprimiert. Die Affinität der Bindung von IL-2 an IL-2Rβγ_c ist größer als an IL-2Rα, mit einer K_d von ungefähr 10^–9 M; dieser ist auch als "intermediär affiner" IL-2-Rezeptor bekannt. IL-2 bewirkt das Wachstum von Zellen, die IL-2Rβγ_c exprimieren, wobei eine halbmaximale Wachstumsstimulation bei der gleichen Konzentration von IL-2 stattfindet, die zu einer halbmaximalen Bindung führt (d.h. 1 × 10^–9 M). Bei IL-2Rβγ_c handelt es sich um den gleichen Signalrezeptorkomplex, der an IL-15 binden kann.
Bei dem dritten bekannten IL-2-Rezeptorkomplex handelt es sich um den IL-2Rαβγ_c-Komplex. Die Zellen, die sowohl IL-2Rα als auch IL-2Rβγ_c exprimieren, können IL-2 wesentlich stärker binden, nämlich mit einer K_d von ungefähr 10^–11 M und dieser ist deshalb auch als "hoch affiner" Komplex bekannt. Die Wachstumsstimulation solcher Zellen findet bei gleichermaßen niedriger IL-2-Konzentration statt. Sowohl die IL-2-Bindung als auch die Wachstumsstimulation kann durch Antikörper blockiert werden, die gegen IL-2Rα, IL-2Rβ oder γ_c gerichtet sind, und am effektivsten durch eine Kombination von Antikörpern, die gegen mehrere Rezeptoruntereinheiten gerichtet sind. Diese Beobachtungen legen nahe, dass IL-2Rα einen Komplex mit IL-2Rβγ_c bildet, wodurch die Affinität des Signalrezeptors für IL-2 erhöht wird, wodurch es möglich wird, ein Wachstumssignal bei signifikant niedrigeren IL-2-Konzentrationen weiterzuleiten. Es wird angenommen, dass IL-2 als Erstes rasch an IL-2Rα bindet und dieses die Assoziierung mit IL-2Rβγ_c ermöglicht. Ruhende T-Zellen exprimieren IL-2Rβγ_c, jedoch nur niedrige Mengen von IL-2Rα; eine zunehmende Expression von IL-ZRα an der Oberfläche kann durch IL-2 stimuliert werden. Durch die Antigenrezeptor-vermittelte 7-Zell-Aktivierung wird rasch IL-2Rα exprimiert, wodurch die Konzentration von IL-2 reduziert wird, die für die Wachstumsstimulation erforderlich ist. Die Bindung von IL-2 an den IL-2Rαβγ_c-Komplex führt zu einer Signaltransduktion durch den Jak/STAT-Signalweg.
Wir haben Muteine von humanem IL-2 aufgefunden, die im Verhältnis zu natürlichen Killer-(NK) Zellen (Zellen, die den intermediär affinen IL-2-Rezeptor IL-2Rβγ exprimieren) bevorzugt T-Zellen (PHA-Blasts; Zellen, die den hoch affinen IL-2-Rezeptor IL-2Rαβγ exprimieren) aktivieren. Muteine, in denen Asp-20 durch Histidin (D20H) oder Isoleucin (D20I), Asn-88 durch Arginin (N88R), Glycin (N88G) oder Isoleucin (N88I), oder Gln-126 durch Leucin (Q126L), oder Glutamat (Q126E) substituiert werden, üben unerwarteterweise die volle IL-2-Aktivität auf PHA-Blasts und wenig Aktivität (wenn überhaupt eine) auf NK-Zellen aus. Frühere Studien mit humanen IL-2-Muteinen beruhten auf zellulären Analysesystemen der Maus, und sofern humane Zellen verwendet wurden, sind nicht solche eingesetzt worden, die nur IL-2Rβγ exprimieren (wie bspw. NK-Zellen). Außerdem zeigten diese Studien, in denen humane PHA-Blasts verwendet wurden, dass die Substitution von Asp-20 (gegen Leu, Arg, Asp oder Lys; Xu et al., Eur. Cytokine Netw, 6, 237-244 (1995)) oder Gln-126 (durch Asp; Buchli und Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys, 307(2): 411-415, (1993)) zu humanen IL-2-Muteinen führt, die eine stark beeinträchtigte Aktivität aufweisen. In früheren Studien, in denen IL-2 aus der Maus verwendet wurde, wurden IL-2-Muteine der Maus mit unterschiedlichen Aktivitäten identifiziert (Zurawski, et al., EMBO J, 12: 5113-5119 (1993)), wobei jedoch keine dieser Mutationen, die zu diesen Ergebnissen führten, auf jene hinweist, die in der Arbeit identifiziert werden, die hier beschrieben wird. Humane IL-2-Muteine, die identische Mutationen an synonymen Positionen der IL-2-Muteine aus der Maus tragen, weisen nicht die gleichen Aktivitäten auf, was deshalb darauf hindeutet, dass die Beispiele aus der Maus nicht prädikativ für die humane Funktionalität sind. Den Erfindern sind keine Studien mit humanen IL-2-Muteinen bekannt, bei denen die relativen Aktivitäten an humanen Zellen, die den IL-2-Rezeptor IL-2Rαβγ (z.B. PHA-Blasts) exprimieren, in Bezug auf jene miteinander verglichen werden, die den IL-2-Rezeptor IL-2Rβγ (z.B. NK-Zellen) exprimieren. Es ist zu erwarten, dass die Analyse in vivo bestätigt, dass die beschriebenen Muteine einen verbesserten therapeutischen Index gegenüber dem Wildtyp des humanen IL-2 aufgrund einer reduzierten Toxizität aufweisen, wodurch therapeutisch nützliche Verbindungen zur Behandlung von solchen Störungen bereitgestellt werden, die eine Stimulierung des Immunsystems erfordern.
Interleukin 2 (IL-2) wird gegenwärtig in der Klinik zur Behandlung von Metastasen bildendem Nierenkrebs verwendet. Allerdings hat die hohe Toxizität dessen Verwendung auf lediglich eine Teilgruppe der gesündesten Patienten beschränkt, und es wird angenommen, dass die dosisbegrenzende Toxizität dessen Gesamteffizienz beeinträchtigt. Es wurde vorgeschlagen, dass die akute Toxizität von IL-2 über die Aktivierung von NK-Zellen vermittelt wird, während die Effizienz durch die direkte Aktivierung von T-Zellen vermittelt wird (Jacobson, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (Vereinigte Staaten), 17. September 1996, 93(19) Seiten 10405-10; Smith KA, Blood 1993, 81(6) Seiten 1414-23; Kaplan, et al., Biotechnology, 10(2) Seiten 157-62). T-Zellen exprimieren einen anderen Rezeptor für IL-2 als dies bei NK-Zellen der Fall ist (T-Zellen: IL-2Rαβγ, der hoch affine IL-2-Rezeptor; NK-Zellen: IL-2Rβγ, der intermediär affine IL-2-Rezeptor). Die hier beschriebenen humanen IL-2-Muteine aktivieren selektiv den IL-2-Rezeptor von T-Zellen und nicht den IL-2-Rezeptor von NK-Zellen.
Eine Niederdosistherapie mit IL-2 wurde mit einigem Erfolg dazu verwendet, um die direkte Aktivierung von NK-Zellen zu umgehen (Jacobson, et al., (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 93: 10405-10). Diese Strategie umfasste das Konzept, dass bei niedrigen Dosen von IL-2 nur der hoch affine IL-2-Rezeptor aktiviert wird, unter Ausschluss des intermediär affinen IL-2-Rezeptors. Die intermediär affine Form des IL-2-Rezeptors, IL-2Rβγ, wird auf NK-Zellen exprimiert, während T-Zellen die hoch affine Form, IL-2Rαβγ, exprimieren.
Die Erfinder sind das Toxizitätsproblem jedoch von einem anderen Standpunkt aus angegangen. Es wurde angenommen, dass durch die Unterbrechung der Interaktionen von IL-2 mit IL-2Rβ und/oder IL-2Rγ durch geeignete Modifikation der spezifischen Bindungsreste auf der Bindungsoberfläche von IL-2 eine effektive Bindung (und dadurch Aktivierung) von Zellen verhindert werden kann, die nur IL-2Rβγ exprimieren. Allerdings erfolgt an Zellen, die IL-2Rαβγ exprimieren, eine anfängliche Bindung an IL-2Rα und damit nach wie vor eine Bindung an die Zelle, so dass sich bei der von Jacobs et al. vorgeschlagenen Niederdosistherapie nach wie vor toxische Nebenwirkungen manifestieren. Aufgrund der Bindung an IL-2Rα kann eine effektive Rekrutierung von IL-2Rβ und IL-2Rγ auf der Zelloberfläche erfolgen, trotz der beeinträchtigten Interaktionen des modifizierten IL-2 mit IL-2Rβ und/oder IL-2Rγ. Dadurch kann ein signalgebungskompetenter Komplex aus IL-2 und IL-2Rαβγ gebildet werden. Eine IL-2-Variante, die in der Lage ist, selektiv die hoch affinen IL-2-Rezeptoren auf T-Zellen bevorzugt gegenüber den intermediär affinen IL-2-Rezeptoren auf NK-Zellen zu aktivieren, kann nach unserer Auffassung aufgrund eines reduzierten Toxizitätsprofils einen erhöhten therapeutischen Index gegenüber Wildtyp-IL-2 aufweisen. Eine IL-2-Variante mit einem erhöhten therapeutischen Index würde einen signifi kant erweiterten Anwendungsbereich sowohl in der Behandlung von Krebs (als direkte und/oder zusätzliche Therapie) als auch von Immundefizienz (z.B. HIV und Tuberkulose) aufweisen. Weitere potenzielle Verwendungen von IL-2 leiten sich von dessen immunstimulierender Aktivität ab und umfassen neben einer direkten Behandlung von Krebs die Behandlung einer Immundefizienz, wie bspw. HIV, oder von humanen SCID-Patienten; einer infektiösen Krankheit, wie bspw. Tuberkulose; die Verwendung als ein Adjuvans in Strategien zur "Krebsvakzination"; und bei Indikationen zur Immunsystemstimulierung, wie bspw. verstärkte Standardvakzinationsprotokolle, oder für die Behandlung älterer Menschen.
Eine geeignete Substitution von Asp-20, Asn-88 oder Gln-126 reduzierte die Bindungsinteraktionen entweder mit IL-2Rβ (Asp-20 und Asn-88) oder mit IL-2Rγ (Gln-126). Die Nettowirkung solcher Substitutionen resultiert in IL-2-Muteinen, die ihre Aktivität gegenüber humanen T-Zellen beibehalten und gegenüber NK-Zellen eine reduzierte Aktivität aufweisen.
Da es nicht möglich war, das Ergebnis einer bestimmten Substitution vor der Evaluierung in den Assays mit T- und NK-Zellen vorherzusagen, wurden alle möglichen Substitutionen von natürlichen Aminosäuren (außer Cys) an den Positionen Asp-20, Asn-88 und Gln-126 durchgeführt und ein begrenzter, jedoch ein diverser Satz von Mutationen wurden an der Position Asp-84 durchgeführt, um zu testen, ob diese in der Tat mit IL-2Rβ interagieren. Zusätzliche Mutationen an Position Asp-84 wären getestet worden, wenn Auswirkungen auf ersichtliche IL-2Rβ-Interaktionen beobachtet worden wären. Daten für sechsundvierzig separate Substitutionen an diesen Positionen werden in der unten stehenden Tabelle 1 präsentiert.
Unter Verwendung der ortsgerichteten Mutagenese wurden Mutationen in die cDNA von humanem Wildtyp-IL-2 eingeführt. Korrekte Klone wurden in einen Expressionsvektor subkloniert, der für eine Expression in einem heterologen System (z.B. E. coli, Baculovirus, Hefe oder Säugetierzellen, wie bspw. chinesische Hamsterovarzellen (CHO)) geeignet war. Die gereinigten Proteine wurden in Assays auf T-Zell- (PHA-Blast) Proliferation und NK-Proliferation getestet. Unterschiedliche Antworten in diesen Assays, die durch die einzelnen Muteine hervorgerufen wurden, d.h. EC₅₀, weisen auf Mutationen hin, die diese Aktivitäten ausüben. Im Speziellen deuten Muteine, die eine relativ stärkere Antwort in dem Assay mit PHA-Blasts (T-Zellen) (vs. Wildtyp-IL-2) im Vergleich zu der Antwort in dem Assay mit NK-Zellen (vs. Wildtyp-IL-2) zeigen, auf Substitutionen hin, die eine zelluläre Spezifität haben, und zwar basierend auf der Fähigkeit von spezifischen Muteinen an IL-2Rαβγ, der auf diesen Zellen exprimiert wird, zu binden und diesen zu aktivieren, deuten jedoch auf eine Unfähigkeit hin, an Zellen zu binden und diese zu aktivieren, die nur IL-2Rβγ exprimieren. IL-2-Muteine, die diese Eigenschaft aufweisen, werden in vivo die immunstimulierenden Eigenschaften von IL-2 aufweisen, dies jedoch mit reduzierten Toxizitäten, die mit einer IL-2-Therapie assoziiert sind, betreffend vaskuläre Leckage und Hypotension.
B. Definitionen
Wie hier verwendet, bedeutet "Wildtyp-IL-2" IL-2, sowohl nativ als auch rekombinant, das eine Sequenz von 133 Aminosäuren aufweist, die normalerweise in nativem humanem IL-2 vorliegt (ohne das Signalpeptid, das aus weiteren 20 N-terminalen Aminosäuren besteht), und dessen Aminosäuresequenz in Fujita, et al., PNAS USA, 80, 7437-7441 (1983) beschrieben ist, und zwar mit oder ohne einem zusätzlichen N-terminalen Methionin, das notwendigerweise umfasst ist, wenn das Protein als intrazelluläre Fraktion in E. coli exprimiert wird.
Wie hier verwendet, bezeichnet "IL-2-Mutein" ein Polypeptid, in dem gegenüber dem humanen reifen Interleukin-2-Protein spezifische Substitutionen vorgenommen wurden. Die unten stehende Tabelle 1 offenbart sechsundvierzig individuell hergestellte Substitutions-IL-2-Muteine und deren Daten betreffend die relative Aktivität. Bevorzugte Ausführungsbeispiele umfassen jene Muteine, die zumindest die 100fache relative Aktivität aufweisen. Besonders bevorzugte Ausführungsbeispiele beinhalten folgende Muteine, welche eine mehr als 1000fache relative Aktivität aufweisen: Der Aspartat-(Asp) Rest (D) an Position 20 ("D20"), sofern eine Nummerierung entsprechend dem Wildtyp-IL-2 erfolgt, wurde durch Isoleucin ("D20I") oder Histidin ("D20H") substituiert; der Asparaginrest (Asn) an Position 88 (N88) wurde durch Isoleucin (N88I), Glycin (N88G) oder Arginin (N88R) substituiert; und der Glutaminrest (Gln) an Position 126 (Q126) wurde durch Leucin (Q126L) oder Glutamat (Q126E) oder Aspartat (Q126D) substituiert. Die bevorzugten IL-2-Muteine weisen eine Aminosäuresequenz auf, die in den anderen nicht-substituierten Resten mit Wildtyp-IL-2 identisch sind. Die IL-2-Muteine dieser Erfindung können jedoch außerdem durch Aminosäureinsertionen, Deletionen, Substitutionen und Modifikationen an einer oder mehreren Stellen in oder an den anderen Resten der nativen IL-2-Polypeptidkette charakterisiert sein. Gemäß dieser Erfindung kann jede dieser Insertionen, Deletionen, Substitutionen und Modifikationen zu einem IL-2-Mutein führen, das eine Aktivität beibehält, die selektiv ist für PHA-Blasts, während es eine reduzierte Fähigkeit aufweist, NK-Zellen zu aktivieren, und welches deshalb von der Reichweite dieses Patentes erfasst ist.
Die Kombination der bevorzugten oder besonders bevorzugten Substitutionen, die oben für ein einziges rekombinantes IL-2-Molekül beschrieben werden, können zu Kombinationsmutanten führen, die eine Aktivität aufweisen, die jener entspricht, die hier für die einzelnen Mutanten beschrieben wird. Es ist bspw. zu erwarten, dass ein IL-2-Molekül, das eine Kombination von zwei oder mehreren Mutationen aufweist, die aus der Tabelle 1 ausgewählt werden, zu einem IL-2-Agonisten führen kann, der selektiv für eine T-Zelle ist, und zwar mit einer relativen Aktivität, die der relativen Aktivität der hier offenbarten einzelnen Substitutionen entspricht. Kombinationsmutanten liegen im Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung.
Wir bevorzugen konservative Modifikationen und Substitutionen an anderen Positionen von IL-2 (d.h. solche, die einen minimalen Effekt auf die Sekundär- oder Tertiärstruktur des Muteins haben). Solche konservativen Substitutionen umfassen jene, die von Dayhoff in The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), und von Argos in EMBO J., 8: 779-785 (1989) beschrieben wurden. Bspw. stellen Aminosäuren, die zu einer der folgenden Gruppen gehören, konservative Austausche dar:

– ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr;
– cys, ser, typ, thr;
– val, ile, leu, met, ala, phe;
– lys, arg, his;
– phe, tyr, trp, his; und
– asp, glu.

Wir bevorzugen ferner Modifikationen oder Substitutionen, die keine Stellen für weitere intermolekulare Quervernetzung oder inkorrekte Disulfidbrückenbildungen einbringen. So ist bspw. bekannt, dass IL-2 in der reifen Sequenz des Wildtyps drei cys-Reste an den Positionen 58, 105 und 125 aufweist.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein humanes IL-2-Mutein, das entsprechend dem Wildtyp-IL-2 nummeriert ist, eine Aminosäuresubstitution an einer der Positionen 20, 88 und 126 aufweist, wobei die Substitution an Position 20 nicht Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Threonin oder Tryptophan umfasst; die Substitution an Position 88 nicht Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Tryptophan oder Prolin umfasst; die Substitution an Position 126 nicht Asparaginsäure, Alanin, Histidin, Tryptophan, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure oder Lysin umfasst; und wobei das IL-2-Mutein bevorzugt T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Bevorzugt ist ein IL-2-Mutein, bei dem die Position 20 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Histidin, Isoleucin, Methionin, Glutamin, Serin, Valin und Tyrosin, wobei das Mutein bevorzugt T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Ebenfalls bevorzugt ist ein IL-2-Mutein, bei dem die Position 88 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Arginin, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Leucin, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Methionin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin, wobei das Mutein bevorzugt T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Weiter bevorzugt ist ein IL-2-Mutein, bei dem die Position 88 durch Arginin substituiert ist.
Ebenfalls bevorzugt ist ein IL-2-Mutein, bei dem die Position 126 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Asparagin, Leucin, Prolin, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Methionin, Arginin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin, wobei das Mutein bevorzugt T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutischen Träger und das wie oben definierte humane IL-2-Mutein aufweist, wobei die Zusammensetzung vorzugsweise T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Die Erfindung betrifft ferner ein humanes IL-2-Mutein, das entsprechend dem Wildtyp-IL-2 nummeriert ist, Substitutionen an zwei der Positionen 20, 88 und 126 aufweist, wobei die Substitution an Position 20 nicht Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Threonin oder Tryptophan umfasst; wobei die Substitution an Position 88 nicht Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Tryptophan, oder Prolin umfasst; und wobei die Substitution an Position 126 nicht Asparaginsäure, Alanin, Histidin, Tryptophan, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure oder Lysin umfasst; und wobei das IL-2-Mutein vorzugsweise T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Die Erfindung umfasst ferner ein Polynucleotid, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für das wie oben definierte IL-2-Mutein codiert, einen Vektor, der das Polynucleotid aufweist, und eine isolierte eukaryotische Zelle, die mit dem Polynuc leotid transformiert ist, und ferner eine prokaryotische Zelle, die mit dem Polynucleotid transformiert ist.
Mit "entsprechend dem Wildtyp-IL-2 nummeriert" ist gemeint, dass eine gewählte Aminosäure in Bezug auf die Position identifiziert wird, an der die Aminosäure normalerweise in der reifen Sequenz von Wildtyp-IL-2 vorkommt. Wenn Insertionen oder Deletionen in dem IL-2-Mutein vorgenommen werden, versteht es sich für einen Fachmann, dass Asp, das normalerweise an Position 20 vorkommt, hinsichtlich seiner Position in dem Mutein verändert werden kann. Allerdings kann die Anordnung des veränderten Asp rasch durch Untersuchung und Korrelation der flankierenden Aminosäuren mit jenen bestimmt werden, die das Asp in Wildtyp-IL-2 flankieren.
Mit dem Begriff "Zelltypen, die den IL-2Rαβγ-Rezeptor aufweisen" sind Zellen gemeint, für die bekannt ist, dass sie diesen Rezeptortyp aufweisen, d.h. T-Zellen, aktivierte T-Zellen, B-Zellen, aktivierte Monocyten und aktivierte NK-Zellen. Mit dem Begriff "Zelltypen, die den IL-2Rβγ-Rezeptor aufweisen" sind Zellen gemeint, für die bekannt ist, dass sie diesen Rezeptortyp aufweisen, d.h. B-Zellen, ruhende Monocyten und ruhende NK-Zellen.
Die IL-2-Muteine der vorliegenden Erfindung können durch jede geeignete, im Stand der Technik bekannte Methode hergestellt werden. Solche Methoden beinhalten das Konstruieren einer DNA-Sequenz, die für die IL-2-Muteine der Erfindung codiert, und das Exprimieren dieser Sequenzen in einem geeigneten transformierten Wirt. Diese Methode führt zu den rekombinanten Muteinen dieser Erfindung. Allerdings können die Muteine dieser Erfindung auch durch chemische Synthese oder eine Kombination von chemischer Synthese und rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden, auch wenn dies weniger bevorzugt ist. Die Batch-weisen Herstellungs- oder Perfusionsherstellungsmethoden gehören im Allgemeinen zum Wissen des Fachmannes. Siehe Freshey, R.i. (Hrsg.), "Animal Cell Culture: A Practical Approach", 2. Ausgabe, 1992, IRL Press, Oxford, England; Mather, J. P. "Laboratory Scaleup of Cell Cultures (0.5-50 Liters)", Methods Cell Biology 57: 219-527 (1998); Hu, W. S. und Aunins, J. G., "Large-scale Mammalian Cell Culture", Curr Opin Biotechnol 8: 148-153 (1997); Konstantinov, K. B., Tsai, Y., Moles, D., Matanguihan, R., "Control of long-term perfusion Chinese hamster ovary cell culture by glucose auxostat.", Biotechnol Prog 12: 100-109 (1996).
In einem Ausführungsbeispiel der rekombinanten Methode zur Herstellung eines Muteins dieser Erfindung wird eine DNA-Sequenz konstruiert, indem eine DNA-Sequenz isoliert oder synthetisiert wird, die für das Wildtyp-IL-2 codiert, und anschließend wird durch ortsspezifische Mutagenese das Codon für Asp-20 gegen das Codon für Isoleucin (I) ausgetauscht. Diese Technik ist gut bekannt. Siehe z.B. Mark et al., "Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, Seiten 5662-66 (1984); und US-Patent Nr. 4,588,585, durch Inbezugnahme der vorliegenden Anmeldung.
Eine weitere Methode, um eine DNA-Sequenz zu konstruieren, die für die IL-2-Muteine dieser Erfindung codiert, wäre die chemische Synthese. Diese beinhaltet bspw. die direkte Synthese eines Peptides mit einer Proteinsequenz, die für ein IL-2-Mutein codiert, das die in der Erfindung beschriebenen Eigenschaften aufweist, und zwar durch chemische Mittel. Mit dieser Methode können sowohl natürliche als auch unnatürliche Aminosäuren an den Positionen eingebaut werden, die die Interaktionen von IL-2 mit IL-2Rβ oder IL-2Rγ beeinflussen. Alternativ kann ein Gen, das für das gewünschte IL-2-Mutein codiert, unter Verwendung einer Oligonucleotidsynthesevorrichtung durch chemische Mittel synthetisiert werden. Solche Oligonucleotide werden auf der Basis der Aminosäuresequenz des gewünschten IL-2-Muteins konstruiert und vorzugsweise werden solche Codons selektiert, die von der Wirtszelle bevorzugt werden, in der das rekombinante Mutein hergestellt wird. In diesem Zusammenhang versteht es sich, dass der genetische Code degeneriert ist – so dass eine Aminosäure von mehr als einem Codon codiert werden kann. Bspw. wird Phe (F) von zwei Codons TTC oder TTT codiert, Tyr (Y) wird von TAC oder TAT codiert und His (H) wird von CAC oder CAT codiert. Trp (W) wird von einem einzigen Codon TGG codiert. Dementsprechend versteht es sich, dass es für eine bestimm te DNA-Sequenz, die für ein bestimmtes IL-2-Mutein codiert, viele degenerierte DNA-Sequenzen gibt, die für das IL-2-Mutein codieren. Es versteht sich bspw., dass es zusätzlich zu der bevorzugten DNA-Sequenz für das Mutein D20I, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, viele degenerierte DNA-Sequenzen gibt, die für das dargestellte IL-2-Mutein codieren. Diese degenerierten DNA-Sequenzen werden als im Rahmen dieser Erfindung liegend angesehen. Deshalb betreffen im Zusammenhang mit dieser Erfindung "degenerierte Varianten hiervon" sämtliche DNA-Sequenzen, die für ein bestimmtes Mutein codieren und deshalb dessen Expression ermöglichen.
Die DNA-Sequenz, die für das IL-2-Mutein dieser Erfindung codiert, gleich ob diese durch ortsgerichtete Mutagenese, chemische Synthese oder durch andere Methoden hergestellt wurde, kann, muss jedoch nicht, DNA-Sequenzen umfassen, die für eine Signalsequenz codieren. Solch eine Signalsequenz, sofern vorhanden, sollte von der Zelle erkannt werden, die für die Expression des IL-2-Muteins ausgewählt wird. Diese kann prokaryotisch, eukaryotisch oder eine Kombination aus beidem sein. Es kann sich auch um die Signalsequenz des nativen IL-2 handeln. Das Einschließen einer Signalsequenz hängt davon ab, ob es gewünscht ist, dass das IL-2-Mutein aus den rekombinanten Zellen, in denen es hergestellt wird, sekretiert wird. Wenn die ausgewählten Zellen prokaryotisch sind, ist es im Allgemeinen bevorzugt, wenn die DNA-Sequenz nicht für eine Signalsequenz codiert. Wenn die ausgewählten Zellen eukaryotisch sind, ist es allgemein bevorzugt, wenn eine Signalsequenz codiert ist, und höchst bevorzugt, wenn die Signalsequenz von Wildtyp-IL-2 verwendet wird.
Es können Standardmethoden angewendet werden, um ein Gen zu synthetisieren, das für ein erfindungsgemäßes IL-2-Mutein codiert. Bspw. kann die vollständige Aminosäuresequenz dazu verwendet werden, um ein zurücktranslatiertes Gen zu konstruieren. Es kann ein DNA-Oligomer synthetisiert werden, das eine Nucleotidsequenz enthält, die für ein IL-2-Mutein codiert. Bspw. können mehrere kleine Oligonucleotide synthetisiert werden, die für Teile des gewünschten Polypeptides codieren, und anschließend ligiert werden. Die einzelnen Oligonucleotide enthalten typischerweise 5'- oder 3'-Überhänge zur komplementären Assemblierung.
Nachdem die DNA-Sequenzen assembliert wurden (durch Synthese, ortsgerichtete Mutagenese oder eine andere Methode), codieren diese für ein IL-2-Mutein dieser Erfindung und werden in einen Expressionsvektor eingebracht und operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden, die für die Expression des IL-2-Muteins in dem gewünschten transformierten Wirt geeignet ist. Eine korrekte Assemblierung kann durch Nucleotidsequenzierung, Restriktionskartierung und die Expression eines biologisch aktiven Polypeptids in einem geeigneten Wirt bestätigt werden. Wie dies im Stand der Technik gut bekannt ist, muss das Gen zum Erhalt von hohen Expressionsspiegeln eines transfizierten Genes in einem Wirt operativ mit Transkriptions- und Translations-Expressionskontrollsequenzen verbunden sein, die in dem ausgewählten Expressionswirt funktionell sind.
Die Wahl der Expressionskontrollsequenz und des Expressionsvektors hängt von der Wahl des Wirtes ab. Es kann eine große Vielzahl von Kombinationen aus Expressionswirt und Vektor verwendet werden. Nützliche Expressionsvektoren für eukaryotische Wirte beinhalten bspw. Vektoren, die Expressionskontrollsequenzen aus SV40, Rinderpapillomvirus, Adenovirus und Cytomegalovirus aufweisen. Nützliche Expressionsvektoren für bakterielle Wirte beinhalten bekannte bakterielle Plasmide, wie bspw. Plasmide von E. coli, einschließlich col E1, pCR1, pER32z, pMB9 und deren Abkömmlinge, Plasmide für ein weiteres Spektrum von Wirten, wie bspw. RP4, Phagen-DNAs, z.B. die vielen Abkömmlinge des Phagen Lambda, z.B. NM989 und andere DNA-Phagen, wie bspw. M13 und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen. Nützliche Expressionsvektoren für Zellen umfassen das 2µ-Plasmid und Abkömmlinge hiervon. Nützliche Vektoren für Insektenzellen umfassen pVL 941. Wir bevorzugen pFastBac^TM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Cate et al., "Isolations Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, Seiten 685-98 (1986).
Zusätzlich kann in diesen Vektoren jede beliebige aus einer großen Vielfalt von Expressionskontrollsequenzen verwendet werden. Solche nützlichen Expressionskontrollsequenzen beinhalten die Expressionskontrollsequenzen, die mit strukturellen Genen der zuvor genannten Expressionsvektoren assoziiert sind. Beispiele von nützlichen Expressionskontrollsequenzen umfassen bspw. die frühen und späten Promotoren von SV40 oder Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, den Hauptoperator und Promotorregionen des Phagen Lambda, bspw. PL, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren für die saure Phosphatase, z.B. Pho A, die Promotoren für das α-Mating-System aus der Hefe, den Polyhedronpromotor aus Baculovirus und andere Sequenzen, für die bekannt ist, dass sie die Expression von Genen prokaryotischer und eukaryotischer Zellen und deren Viren kontrollieren, sowie zahlreiche Kombinationen hiervon.
Jeder geeignete Wirt kann dazu verwendet werden, um die IL-2-Muteine dieser Erfindung herzustellen, einschließlich Bakterien, Pilze (einschließlich Hefen), Pflanzen, Insekten, Säugetiere oder andere geeignete tierische Zellen oder Zelllinien, sowie transgene nicht-humane Tiere oder Pflanzen. Im Speziellen können diese Wirte gut bekannte eukaryotische und prokaryotische Wirte umfassen, wie bspw. Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Pilze, Hefe, Insektenzellen, wie bspw. Spodoptera frugiperda (Sf9), tierische Zellen, wie bspw. chinesische Hamsterovarzellen (CHO), und Mauszellen, wie bspw. NS/O, Zellen des afrikanischen grünen Affen, wie bspw. COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 und BNT 10, und humane Zellen, sowie Pflanzenzellen in Gewebekultur. Für die Expression in tierischen Zellen bevorzugen wir CHO-Zellen und COS-7-Zellen in Kultur und insbesondere die CHO-Zelllinie CHO(DHFR^–) oder die HKB-Linie.
Es versteht sich von selbst, dass nicht alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen gleichermaßen gut funktionieren, um die hier beschriebenen DNA-Sequenzen zu exprimieren. Ferner funktionieren nicht sämtliche Wirte gleich gut mit dem gleichen Expressionssystem. Ein Fachmann kann jedoch unter diesen Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirten eine Auswahl treffen, ohne übermäßiges Experimentieren. Bspw. muss bei der Auswahl eines Vektors der Wirt berücksichtigt werden, da der Vektor in ihm replizieren muss. Die Kopienzahl des Vektors, die Fähigkeit, diese Kopienzahl zu kontrollieren, und die Expression jedes anderen Proteins, das von dem Vektor codiert wird, wie bspw. Antibiotika-Marker, sollten ebenfalls berücksichtigt werden. Bspw. umfassen bevorzugte Vektoren zur Verwendung in dieser Erfindung jene, die es ermöglichen, dass die DNA, die für die IL-2-Muteine codiert, in ihrer Kopienzahl amplifiziert wird. Solche amplifizierbaren Vektoren sind im Stand der Technik gut bekannt. Sie beinhalten z.B. Vektoren, die in der Lage sind, durch DHFR-Amplifizierung (siehe z.B. Kaufmann, US-Patent 4,470,461, Kaufman und Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, Seiten 1304-19 (1982)) oder durch Glutaminsynthetase-("GS") Amplifizierung (siehe z.B. US-Patent 5,122,464 und veröffentlichte europäische Anmeldung 338,841) amplifiziert zu werden.
Bei der Selektion einer Expressionskontrollsequenz sollte ebenfalls eine Vielzahl von Faktoren berücksichtigt werden. Diese umfassen z.B. die relative Stärke der Sequenz, ihre Kontrollierbarkeit und ihre Kompatibilität mit der eigentlichen DNA-Sequenz, die für das IL-2-Mutein dieser Erfindung codiert, insbesondere in Bezug auf potenzielle Sekundärstrukturen. Die Wirte sollten unter Berücksichtigung ihrer Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, der Toxizität des Produktes, für das die DNA-Sequenzen dieser Erfindung codieren, ihrer Sekretionseigenschaften, ihrer Fähigkeit, das Polypeptid korrekt zu falten, ihren Fermentations- oder Kultivierungserfordernissen und der Leichtigkeit der Reinigung der Produkte ausgewählt werden, die von den DNA-Sequenzen codiert werden.
Innerhalb dieser Parameter kann ein Fachmann verschiedene Kombinationen von Vektoren/Expressionskontrollsequenzen und Wirten auswählen, die die gewünschten DNA-Sequenzen nach Fermentation oder in Tierkulturen im Großmaßstab, bspw. unter Verwendung von CHO-Zellen oder COS-7-Zellen, exprimieren.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen IL-2-Muteine können in Abhängigkeit von dem Wirtsorganismus, der zur Herstellung des Muteins verwendet wird, glycosyliert oder unglycosyliert sein. Wenn Bakterien als Wirt gewählt werden, dann wird das hergestellte IL-2-Mutein unglycosyliert sein. Auf der anderen Seite werden eukaryotische Zellen die IL-2-Muteine glycosylieren, obgleich möglicherweise nicht auf die gleiche Art und Weise, wie das native IL-2 glycosyliert vorliegt. Das durch den transformierten Wirt hergestellte IL-2-Mutein kann gemäß jeder beliebigen geeigneten Methode gereinigt werden. Es sind viele Methoden zur Reinigung von IL-2 bekannt. Siehe z.B. Current Protocols in Protein Science, Vol. 2. Hrsg: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unit 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc. Wir bevorzugen die Rückfaltung aus Einschlusskörpern, die in E. coli gebildet werden, oder aus konditioniertem Medium, und zwar entweder aus Säugetier- oder Hefekulturen, die ein bestimmtes Mutein herstellen unter Verwendung eines Kationenaustausches, der Gelfiltration oder Umkehrphasen-Flüssigchromatographie. Siehe die unten genannten Beispiele 1 (E. coli) und 10 (CHO-Zellperfusion).
Die biologische Aktivität der IL-2-Muteine dieser Erfindung kann durch jede im Stand der Technik bekannte Methode untersucht werden. Solche Methoden beinhalten die Proliferation von PHA-Blasts und die Proliferation von NK-Zellen. Muteine mit geeigneter Aktivität, d.h. solche, die an IL-2Rαβγ voll aktiv sind und eine reduzierte Aktivität an Zellen zeigen, die IL-2Rβγ tragen, werden durch die Verwendung der beiden Methoden bestätigt. Die "relative Aktivität" eines Muteins wird in Bezug auf Wildtyp-IL-2 gemessen, und, wie dies in den Beispielen weiter beschrieben wird, bezieht sich auf das Verhältnis der Aktivität der Proliferation von PHA-Blasts zu der Proliferation von NK-Zellen.
Das IL-2-Mutein dieser Erfindung wird mit einer Dosis verabreicht, die ungefähr jener entspricht oder größer ist als die, welche in der Therapie mit nativem oder rekombinantem Wildtyp-IL-2 verwendet wird. Vorzugsweise wird eine wirksame Menge des IL-2-Muteins verabreicht. Unter einer "wirksamen Menge" wird eine Menge verstanden, die in der Lage ist, der Schwere oder Ausbreitung der zu behandelnden Bedingung oder Indikation vorzubeugen oder diese zu verringern. Für einen Fachmann versteht es sich, dass die effektive Menge des IL-2-Muteins u.a. von der Krankheit, der Dosis, dem Verabreichungsprogramm des IL-2-Muteins abhängt, ob das IL-2-Mutein allein oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Agenzien verabreicht wird, der Halbwertszeit der Zusammensetzung im Serum und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten.
Das IL-2-Mutein wird vorzugsweise in einer Zusammensetzung verabreicht, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhaltet. Unter einem "pharmazeutisch akzeptablen Träger" wird ein Träger verstanden, der in Patienten, denen dieser verabreicht wird, keinerlei unerwünschten Effekt verursacht. Solche pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik gut bekannt. Wir bevorzugen 2 % HSA/PBS bei pH 7,0.
Die IL-2-Muteine der vorliegenden Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Science von E. W. Martin, durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung, der geeignete Formulierungen beschreibt. Die pharmazeutische Zusammensetzung des IL-2-Muteins kann in eine Vielzahl von Formen formuliert werden, einschließlich in flüssige, gelartige, lyophilisierte oder jede andere beliebige geeignete Form. Die bevorzugte Form hängt von der besonderen Indikation ab, die behandelt wird, und ergibt sich für den Fachmann.
Die pharmazeutische Zusammensetzung betreffend das IL-2-Mutein kann oral, durch ein Aerosol, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intradermal oder subkutan sowie auf jede andere akzeptable Art und Weise verabreicht werden. Der bevorzugte Verabreichungsmodus hängt von der besonderen Indikation ab, die behandelt wird, und ergibt sich für den Fachmann. Die pharmazeutische Zusammensetzung des IL-2-Muteins kann in Verbindung mit anderen therapeutischen Agenzien verabreicht werden. Diese Agenzien können als Teil der gleichen pharmazeutischen Zusammensetzung oder separat zu dem IL-2-Mutein verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder gemäß eines beliebigen anderen akzeptablen Behandlungsprogramms. Zusätzlich kann die pharmazeutische Zusammensetzung betreffend das IL-2-Mutein als ein Zusatzstoff für andere Therapien verwendet werden.
Dementsprechend stellt diese Erfindung Zusammensetzungen und Methoden zur Behandlung von HIV, Krebs, einer Autoimmunkrankheit, einer infektiösen Krankheit, ein Vakzinadjuvans für die Krebsvakzinierung und die konventionelle Vakzinierungstherapie, für die Immunstimulation von älteren Menschen oder auf andere Art und Weise immunkomprimittierten Individuen sowie für humane SCID-Patienten oder für eine andere therapeutische Anwendung bereit, in der es einer allgemeinen Stimulierung des Immunsystems in einem beliebigen geeigneten Tier, vorzugsweise einem Säugetier, höchst vorzugsweise einem Menschen, bedarf. Wie zuvor in dem Abschnitt zum Hintergrund erwähnt, hat IL-2 viele Wirkungen. Einige dieser Wirkungen betreffen die Stimulierung von PHA-Blasts, ruhenden T-Zellen, B-Zellen, Monocyten und NK-Zellen, etc.; die hier beschriebenen Muteine weisen Aktivitäten gegenüber solchen Zelltypen auf, die lediglich den hoch affinen IL-2-Rezeptor exprimieren, wie bspw. ruhende T-Zellen, nicht jedoch den intermediär affinen IL-2-Rezeptor, wie bspw. NK-Zellen oder Monocyten.
In Betracht gezogen wird ferner die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für die IL-2-Muteine dieser Erfindung codieren, und zwar in gentherapeutischen Anwendungen. Die in Betracht gezogenen gentherapeutischen Anwendungen beinhalten die Behandlung von jenen Krankheiten, von denen angenommen wird, dass IL-2 eine effektive Therapie aufgrund seiner T-Zell-Aktivität bewirkt, z.B. von HIV, Krebs, einer Autoimmunkrankheit, einer infektiösen Krankheit, als Vakzinadjuvans in der Krebsvakzinierung und konventionellen Vakzinierungstherapie, zur Immunstimulierung bei älteren oder auf andere Art und Weise immunkomprimittierten Menschen sowie in humanen SCID-Patienten und von Krankheiten, die auf andere Art und Weise auf IL-2 ansprechen, oder infektiösen Agenzien, die gegenüber einer IL-2-vermittelten Immunantwort sensitiv sind.
Durch die lokale Zufuhr von IL-2-Muteinen unter Verwendung der Gentherapie kann das therapeutische Agens in dem Zielgebiet bereitgestellt werden. Es werden sowohl Gentherapiemethoden in vitro als auch in vivo in Betracht gezogen. Es sind verschiedene Methoden, um potenzielle therapeutische Gene definierten Zellpopula tionen zuzuführen, bekannt. Siehe z.B. Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science, 260:926-31 (1993). Diese Methoden beinhalten:

1) Direkter Gentransfer. Siehe z.B. Wob et al., "Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In Vivo", Science, 247: 1465-68 (1990);
2) Liposom-vermittelter DNA-Transfer. Siehe z.B. Caplen et al., "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis", Nature Med. 3: 39-46 (1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med. 1: 15-17 (1995); Gao und Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 179: 280-85 (1991);
3) Retrovirus-vermittelter DNA-Transfer. Siehe z.B. Kay et al., "In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs", Science, 262: 117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256: 808-13 (1992).
4) DNA-Virus-vermittelter DNA-Transfer. Solche DNA-Viren umfassen Adenoviren (vorzugsweise Ad-2- oder Ad-5-basierende Vektoren), Herpesviren (vorzugsweise Vektoren, die auf dem Herpes simplex-Virus basieren) und Parvoviren (vorzugsweise solche Vektoren, die auf einem "defekten" oder nicht-autonomen Parvovirus basieren, weiter bevorzugt solche Vektoren, die auf einem Adenoassoziierten Virus basieren, höchst bevorzugt AAV-2-basierende Vektoren). Siehe z.B. Ali et al., "The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy", Gene Therapy, 1: 367-84 (1994); US-Patent 4,797,368, durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung und US-Patent 5,139,941, durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Die Wahl eines bestimmten Vektorsystems, um das interessierende Gen zu transferieren, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Ein wichtiger Faktor ist die Natur der Zielzellpopulation. Obwohl retrovirale Vektoren umfangreich untersucht und in einer Vielzahl von gentherapeutischen Anwendungen verwendet wurden, sind diese Vektoren im Allgemeinen für die Infektion von sich nicht-teilenden Zellen ungeeignet. Außerdem haben Retroviren das Potenzial zur Onkogenität.
Adenoviren haben den Vorteil, dass sie ein breites Wirtsspektrum aufweisen, ruhende oder terminal differenzierte Zellen, wie bspw. Neuronen oder Hepatocyten, infizieren können und im Wesentlichen nicht-onkogen zu sein scheinen. Siehe z.B. Ali et al., oben, Seite 367. Adenoviren scheinen sich nicht in das Wirtsgenom zu integrieren. Da diese extrachromosomal vorliegen, ist das Risiko einer Insertionsmutagenese stark reduziert. Ali et al., oben, Seite 373.
Die Adeno-assoziierten Viren weisen ähnliche Vorteile auf wie die adenoviral basierenden Vektoren. Allerdings zeigen die AAVs eine ortsspezifische Integration in das humane Chromosom 19. Ali et al., oben, Seite 377.
Die DNA, die für das IL-2-Mutein dieser Erfindung codiert, kann in der Gentherapie von Immundefizienzkrankheiten verwendet werden, wie bspw. HIV; infektiösen Krankheiten, wie bspw. Tuberkulose; und Krebs, wie bspw. dem renalen Karzinom.
Dementsprechend wird eine Gentherapie mit DNA, die für die IL-2-Muteine dieser Erfindung codiert, für einen hierfür bedürftigen Patienten bereitgestellt, und zwar zusammen mit oder unmittelbar nach der Diagnose.
In diesem Ansatz wird die selektive Aktivität der IL-2-Muteine dieser Erfindung ausgenutzt, um unerwünschte Toxizität und Nebenwirkungen zu vermeiden. Für einen Fachmann versteht es sich, dass jeder geeignete Gentherapievektor, der die DNA für das IL-2-Mutein aufweist, gemäß diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung verwendet werden kann. Die Techniken zur Konstruktion eines solchen Vektors sind bekannt. Siehe z.B. Anderson, W. F., Human Gene Therapy, Nature, 392: 25-30 (1998); Verma, I. M. und Somia, N., Gene Therapy-Promises, Problems, and Prospects, Nature, 389: 239-242 (1998). Die Einbringung des Vektors in die Zielstelle, der die DNA für das IL-2-Mutein enthält, kann durch bekannte Techniken erfolgen.
C. Beispiele
Beispiel 1. Herstellung von Muteinen in E. coli. Die Muteine wurden durch ortsgerichtete Mutagenese generiert, bei der Primer verwendet wurden, die Codons enthielten, welche der gewünschten Mutation entsprachen, wie dies im Wesentlichen von Kunkel T. A., Roberts J. D. und Zakour R. A., "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" (1987), Methods Enzymol 154: 367-382, beschrieben wird. Kurz gesagt, die cDNA für humanes IL-2, die die Restriktionsstellen BamHI und XbaI enthielt, wurde unter Verwendung der gleichen Stellen in den Vektor M13 mp19 des M13-Phagen (New England Biolabs, Beverly, MA) subkloniert. Die cDNA von Wildtyp-IL-2 wurde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") aus einem cDNA-Pool erhalten, der aus mRNA generiert wurde, die aus humanen peripheren Blutlymphocyten isoliert wurde, welche für 24 Stunden mit Phorbol-l2-Myristat-l3-Acetat (10 ng/ml) induziert wurden. Die verwendeten PCR-Primer waren für das 5'-Ende des offenen Leserasters von IL-2 Folgende:
5'-CCT CAA CTC CTG AAT TCA TGT ACA GGA TGC-3' (SEQ ID Nr: 3);
und für das 3'-Ende des offenen Leserasters von IL-2:
5'-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3' (SEQ ID Nr: 4).
Die Stellen für die Restriktionsenzyme EcoRI (5'-Ende) und BamHI (3'-Ende) wurden in jedes Oligonucleotid eingebracht und sind durch Kursivschrift kenntlich gemacht. Die verwendeten PCT-Bedingungen waren 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 58,7°C und 1 Minute bei 72°C für 25 Zyklen. Die so erhaltene Sequenz der IL-2-cDNA wurde durch Sequenzierung unter Verwendung des Sequenase^®-Sequenzierkits (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) bestätigt, wie vom Hersteller beschrieben. Die einzelsträngige, Uracil-enthaltende DNA (U-DNA) wurde durch Transformation des E. coli-Stammes CJ236 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mit M13 mp19, der die IL-2-cDNA enthielt, erhalten. In der ortsgerichteten Mutagenese wurden allgemeine Primer verwendet, die 15 Nucleotide enthielten, welche homolog zu der Template U-DNA waren, und zwar 5'-wärts zu dem/den Codon(s), in dem/denen die Mutagenese erfolgen sollte, und zwar solche Nucleotide, welche die gewünschte Veränderung einbringen, und weitere 10 Nucleotide, die homolog zu dem U-DNA-Template 3'-wärts zu dem letzten veränderten Nucleotid waren. Ursprünglich wurde die ortsgerichtete Mutagenese dazu verwendet, um eine NcoI-Restriktionsstelle am Beginn der reifen Sequenz von humanem IL-2 einzubringen. Durch die Verwendung dieser Restriktionsstelle wird ein N-terminaler Methioninrest eingebracht, der die Expression in dem Cytoplasmaraum von E. coli steuert, bspw. durch Verwendung des Expressionsvektors pET3d. Der Primer, der für diese Zwecke verwendet wurde, war Folgender:
5'-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3' (SEQ ID Nr: 5)
Die spezifischen Primer, die dazu verwendet wurden, um Mutationen an den Positionen D20, N88 und Q126 einzubringen, waren: D20X: 5
'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3' (SEQ ID Nr: 6)
N88X: 5'-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3' (SEQ ID Nr: 7)
Q126X: 5'-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3' (SEQ ID Nr: 8)
wobei NNN durch ein geeignetes Codon für Histidin (CAC) oder Isoleucin (ATC) (an Position D20), Arginin (CGT), Glycin (GGT) oder Isoleucin (ATC) (an Position N88), oder Leucin (CTG) (an Position Q126) ersetzt wurde. Für andere Mutationen wurde eine entsprechende Strategie sowie ein geeignetes Codon für eine bestimmte Mutation verwendet. Die Primer wurden unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA) gemäß dem Protokoll des Hersteller phosphoryliert. Nach der Anlagerung der Primer an das U-DNA-Template und der Extension mit der T7-DNA-Polymerase (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) wurden die Zellen des E. coli-Stammes DHSα^TM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) mit 5 µl einer Reaktionsmischung transformiert und in LB-Medium enthaltend 0,7 % Agar ausplattiert. Nach der Inkubation bei 37°C wurden die Plaques durch die Auswahl eines einzelnen Plaques und Transferieren in 2 ml LB-Medium und Wachsenlassen bei 37°C über die Nacht expandiert. Einzelsträngige DNA wurde unter Verwendung eines M13-Reinigungskits (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert, und die Klone, die die gewünschte Mutation enthielten, wurden durch Sequenzierung der einzelsträngigen DNA unter Verwendung des Sequenase^®-Sequenzierkits (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) gemäß dem Protokoll des Herstellers identifiziert. Die IL-2-Mutein-cDNA von der DNA in replikativer Form, die den Plaques zuzuordnen war, welche die korrekte mutierte Sequenz enthielten, wurde unter Verwendung von NioI und XbaI isoliert und in den Plasmidvektor pET3a (Stratagene, San Diego, CA) (Strat) subkloniert. Der E. coli-Stamm BL21 wurde mit einem pET3a-Vektor transformiert, der das Mutein enthielt, und bis zu einer ABS₂₈₀ von 0,60 bis 1,0 wachsen gelassen, zu welcher Zeit 0,4 mM IPTG hinzugegeben wurde, um die Produktion von IL-2-Mutein zu induzieren.
Beispiel 2. Extraktion und Reinigung von IL-2-Muteinen aus E. coli
Drei Stunden nach der Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 × g geerntet. Die rekombinanten IL-2-Muteine wurden renaturiert und gereinigt, indem die Zellen zuerst in 10 Volumina (vol/Nassgewicht) Saccharose/Tris/EDTA-Puffer (0,375 M Saccharose, 10 mM Tris/HCL pH 8,0, 1 mM EDTA) dispergiert wurden. Die dispergierten Zellen wurden dreimal mit 300 W und 30 Sekunden Ruheintervallen in einem Eisbad sonifiziert, wozu ein Missonix Model XL2020-Sonicator verwendet wurde, der mit einer 1 Inch-Standardprobe ausgestattet war. Das sonifizierte Material wurde dann bei 17.000 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet, das zu diesem Zeitpunkt eine weiße Farbe haben sollte, wurde gewaschen, indem es einmal in einem Saccharose/Tris/EDTA-Puffer, zweimal mit Tris/EDTA-Puffer (50 mM Tris/HCL pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und zentrifugiert wurde und schlussendlich in 10 Volumina eines 0,1 M Tris/HCL-Puffer, pH 8,0 resuspendiert (zu diesem Zeitpunkt wird eine Probe für die Gelanalyse entnommen) und für 20 Minuten bei 17.000 × g zentrifugiert.
Das Pellet wurde durch Zugabe von 3 Volumina 8 M Guanidiniumchlorid in 0,1 M Tris/HCL (pH 8,0) und 0,1 % (vol/vol) 2-Mercaptoethanol gelöst. Nach einer Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Probe für 20 Minuten bei 17.000 × g zentrifugiert. Die sich ergebende Lösung wurde für ungefähr 20 Stunden gegen 20 Volumina 10 mM Tris/HCL, pH 8,0, 0,1 mM EDTA bei 4°C dialysiert. Die Lösung wurde bei 17.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert, mit 0,1 % Trifluoressigsäure eingestellt und in einer 0,22 Mikron-Filtereinheit filtriert. Die Lösung wurde unmittelbar in eine silikonisierte Flasche überführt und auf eine C8-Säule geladen (Vydac 208TP54). Die IL-2-Muteine wurden unter Verwendung eines 20 Minuten linearen Gradienten gereinigt, indem 45-85 % Acetonitril in 0,1 % TFA verwendet wurden. Die Konzentration des eluierten Proteins wurde durch A280 und durch Aminosäureanalyse bestimmt. Das Protein wurde dann in silikonisierte Röhrchen aliquotiert (100 ml) und bei –20 Grad Celsius gelagert. Das so gereinigte Protein stellte sich typischerweise in der SDS-PAGE (Silberfärbung) als einzelne Bande dar und wurde durch Aminosäureanalyse quantifiziert (Genauigkeit typischerweise >90 %).
Beispiel 3. T-Zell-Proliferationsassay.
Periphere mononucleäre Blutzellen (PBMC) wurden aus ungefähr 100 ml normalem humanem Blut isoliert (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA), 1:2 in kalter Dulbecco's phosphatgepufferter Saline (Ca²⁺- und Mg²⁺-frei, DPBS) verdünnt. Ficoll-Paque (Pharmacia) wird unterlegt und die Probe wird zentrifugiert, um die PBMC zu isolieren, gefolgt von extensiven Waschvorgängen in kaltem DPBS. PHA-Blasts (aktivierte T-Zellen) wurden generiert, indem die Zellen in RPMI 1640 resuspendiert wurden, das 10%/oiges fötales Rinderserum enthielt (Hyclone), in welches jeweils 1 % (w/v) von Folgendem hinzugegeben wurde: L-Glutamin, nicht-essen zielle Aminosäuren; Natriumpyruvat; und Antibiotika/Antimykotika (RPMI-Medium) bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml. Phytohemmaglutanin (PHA-P; Sigma) wurde mit einer Endkonzentration von 10 µg/ml hinzugegeben und die Zellen wurden bei 37°C, 5 % CO₂, für 3 Tage inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und zweimal in DPBS gewaschen, in RPMI-Medium resuspendiert und auf Platten ausplattiert, die 96 Vertiefungen mit einem flachen Boden aufwiesen, und zwar mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in 200 µl mit variierenden Konzentrationen von IL-2 oder Mutein in RPMI-Medium. Die Platten wurden für 48 Stunden bei 37°C inkubiert, mit 1 µCi ³H-Thymidin (DuPont NEN^®, Boston, MA)/Vertiefung für 6 Stunden gepulst, geerntet und nach dem Ernten der Zellen wurde die Radioaktivität auf Glasfaserfiltern gemessen.
Beispiel 4.
Periphere mononucleäre Blutzellen (PBMC) wurden aus ungefähr 100 ml normalem humanem Blut isoliert (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA), 1:2 in kalter Dulbecco's phosphatgepufferter Saline (Ca²⁺- und Mg²⁺-frei, DPBS) verdünnt. Ficoll-Paque (Pharmacia) wurde unterlegt und die Probe wurde zentrifugiert, um die PBMC zu isolieren, gefolgt von extensiven Waschvorgängen in kaltem DPBS. Die NK-Zellen wurden von den anderen Zellen abgetrennt. Für diese Zwecke ist das Miltenyi Biotec's NK-Zellen-Isolierungskit (Bergisch Gladbach, Deutschland; Cat# 465-01) bevorzugt. Das Kit besteht aus zwei Reagenzien, Abtrennungssäulen und einem äußerst leistungsstarken magnetischen Säulenträger. Das erste Reagens betrifft einen Cocktail aus Hapten-konjugierten monoklonalen CD3-, CD4-. CD19-, CD33-Antikörpern des IgG1-Isotyps der Maus. Dies dient dazu, um die PMBC von T-Zellen, B-Zellen und myeloiden Zellen zu depletieren. Es ist vorgesehen, dass jeder beliebige Satz von Antikörpern, die diese Zelltypen erkennen, verwendet werden kann. Das zweite Reagens besteht aus kolloidalen super-paramagnetischen MACs Mikrokugeln, die mit einem anti-Hapten-Antikörper konjugiert sind. Die Zellen wurden in PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin und 2 mM EDTA (PBS/EDTA) resuspendiert. Das Volumen der Suspension hängt von der Anzahl der verwendeten Zellen ab und wird von Miltenyi Biotec in einer Tabelle angegeben. Typischerweise werden die Zellen mit einer Zellzahl von 2 bis 5 × 10⁸ PBMC in 800 µL des Puffers resuspendiert und anschließend werden 200 µL von jedem Reagens verwendet. Nach der Inkubation mit den Reagenzien werden die Zellen zu den Säulen hinzugegeben (resuspendiert in 2 mL Puffer). Die nicht-NK-Zellen adhärieren an den Magneten (depletiert) und die NK-Zellen werden isoliert und in dem Durchfluss gesammelt. Die Zellen werden gewaschen, in RPMI-Medium (enthält: RPMI 1640, zu dem 1 % des jeweils folgenden hinzugegeben wird: L-Glutamin; nicht essentielle Aminosäuren; Natriumpyruvat; Antibiotika/Antimykotika (alle von Gibco/BRL, Gaithersburg, MD); 10 % fötales Rinderserum (Hyclone)), und auf Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden bei einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in 200 µl ausplattiert. Die Zellen wurden geerntet und zweimal in DPBS gewaschen, in RPMI-Medium resuspendiert und auf Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden bei einer Dichte von 1 × 10¹⁵ pro Vertiefung in 200 µl mit variierenden Konzentrationen von IL-2 oder Mutein in RPMI-Medium ausplattiert. Die Platten wurden für 48 h bei 37°C inkubiert, mit einem µCi ³H-Thymidin (DuPont NEN^®, Boston, MA)/Vertiefung für 6 h gepulst, geerntet und nach dem Ernten der Zellen wurde die Radioaktivität auf Glasfaserfiltern gemessen.
Beispiel 5. Muteine, die selektiv T-Zellen gegenüber NK-Zellen aktivieren.
Unter Verwendung der ortsgerichteten Mutagenese (Kunkel et al. (1987), Methods Enzymol 154: 367-382) an den Positionen Asp-20, Asp-84, Asn-88 und Gln-126 wurden Muteine generiert und in E. coli exprimiert, indem das pET-3a-Expressionssystem verwendet wurde, wie vom Hersteller (Stratagene) beschrieben. Die Muteine wurden gereinigt, indem die Einschlusskörper in Guanidin-HCL rückgewonnen, rückgefaltet und unter Verwendung einer HPLC chromatographiert wurden, wie zuvor beschrieben. Das resultierende Protein erschien in der silbergefärbten SDS-PAGE zu >95 % sauber und wurde hinsichtlich der Konzentration und Reinheit durch Aminosäureanalyse (AAA-Genauigkeiten typischerweise >90 %) analysiert. Muteine, die eine geeignete Aktivität aufwiesen, wurden unter Verwendung einer Massenspektrometrieanalyse in ihrer Sequenz bestätigt. Die so gereinigten Muteine wurden in den zuvor beschriebenen T- und NK-Zellassays untersucht. Die relativen Aktivitäten für die IL-2-Muteine in den T- und NK-Zellassays werden in der Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1 – Muteine, die in Bezug auf ihre T-Zell-Selektivität evaluiert wurden
Die Aktivitäten der Muteine werden hinsichtlich der relativen Konzentration des Muteins beschrieben, die erforderlich ist, um eine 50 % maximale Antwort (EC₅₀) im Vergleich zu der EC₅₀ von wt-IL-2 im gleichen Assay zu erzielen; im Fall von multiplen Assays mit dem gleichen Mutein wird das geometrische Mittel der Werte gelistet. Die EC₅₀-Werte für wt-IL-2 bewegen sich bei ~10 pM bis 150 pM in dem T- Zell-Assay und bei ~50 pM bis 200 pM in dem NK-Zell-Assay. Das Verhältnis von T-Zell- vs. NK-Zell-Aktivität der Muteine wird ausgedrückt als die relative Aktivität des Muteins an T-Zellen, geteilt durch die relative Aktivität des Muteins an NK-Zellen.
Dieses Verhältnis wird für jedes Mutein bestimmt, indem nur Aktivität verwendet wird, die aus den vorgegebenen T- und NK-Zell-Assays bestimmt wurde, wobei Zellen aus einem einzigen Spender verwendet wurden.

Die Aktivitäten der Muteine können in 6 umfassende Kategorien einklassifiziert werden: 1) 1000fache T-Zell-Selektivität; 2) 100- bis <1000fache T-Zell-Selektivität; 3) 10- bis <100fache T-Zell-Selektivität; 4) relativ zu IL-2 verbesserte Aktivität an T-Zellen; 5) NK-Zell-Selektivität; 6) 10fache Selektivität entweder für T- oder NK-Zellen.

Klasse 1:	D20H, I und Y; N88G, I und R.
Klasse 2:	D20K, L, M, N, Q und S; N88M und T; Q126D, E, G, L und V.
Klasse 3:	D20R; N88A, E, F, S und V; Q126F, I, N, R und S.
Klasse 4:	D20I; N88G; Q126E, L, M, N und R.
Klasse 5:	Q126A, H.
Klasse 6:	D20A, T und V; N88H, K, L, W und Y; Q126K, P, T, W und Y.

Innerhalb der Klassen 1 bis 3 sind die bevorzugten Muteine jene, die an T-Zellen nahezu wt-IL-2- oder bessere Aktivität ausüben. In der Klasse 1 umfassen diese D20H und I; N88G, I und R; in Klasse 2 umfassen diese N88M und T, Q126D, E, G, L und V; in Klasse 3 umfassen diese N88A, Q126F und G. Für die Muteine in Klasse 4 wird vorhergesagt, dass diese eine größere Potenz als wt-IL-2 in vivo aufweisen.
Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, dass keine einzelne Mutation zu einem IL-2-Mutein führte, das in beiden Assays inaktiv war. Es kann jedoch geschlussfolgert werden, dass eine Kombination von Mutationen aus zwei verschiedenen Positionen, die in einer deutlich beeinträchtigten Aktivität resultiert, potenziell zu einer antagonistischen IL-2-Aktivität an T-Zellen oder an anderen Zelltypen führt, die den hoch affinen IL-2-Rezeptor tragen. Aufgrund dieser Daten wird solch ein Antagonismus vorausgesagt, da die Mutationen konstruiert wurden, um nur die Interaktionen mit IL2Rβ und IL-2Rγ zu verändern. Ein solches Beispiel wäre das Doppelmutein D20R/Q126T. Für die Kombination von schwach aktiven Mutationen in einem einzigen Molekül wird vorausgesagt, dass diese kombinatorischer Art ist, das bedeutet, D20R weist 0,00018 Aktivität an T-Zellen auf, Q126T weist 0,0001 Aktivität an T-Zellen auf und für das Doppelmutein D20R/Q126T wird erwartet, dass dieses 0,000000018 der Aktivität von wt-IL-2 an T-Zellen aufweist. Andere Kombinationen können aus den bereitgestellten Daten abgeleitet werden.
Beispiel 6. Biologische Aktivität von wt-IL-2 und IL-2-Muteinen.
Die 1 bis 7 zeigen die Dosis-Wirkungs-Kurven von humanem wt-IL-2 (IL-2) und D20H (1), IL-2 und D20I (2), IL-2 und N88G (3), IL-2 und N88I (4), IL-2 und N88R (5), IL-2 und Q126E (6) und IL-2 und Q126L (7). A: Individuelle Dosiswirkung von IL-2 (ausgefüllte Kreise) und Mutein (unausgefüllte Kreise) in dem Proliferationsassay mit primären humanen T-Zellen (PHA-Blasts). B: Individuelle Dosiswirkung von IL-2 (ausgefüllte Dreiecke) und Mutein (unausgefüllte Dreiecke) in dem Proliferationsassay mit primären humanen NK-Zellen.
Insbesondere bei Bezugnahme auf 1 beträgt für das gezeigte Experiment die Dosis von wt-IL-2, die zu einer 50 % maximalen Proliferation (EC₅₀) führt, ~1,5 × 10^–10 M für den T-Zell- (A) und ~1 × 10^–10 M für den NK-Zell-Assay (B). Der EC₅₀ für D20H betrug in diesem NK-Zell-Assay ~2 × 10^–10 M, wird in diesem T-Zell-Assay jedoch auf nur >1 × 10^–5 M geschätzt. Die Nettoverbesserung in der T-Zell-Aktivität von D20H gegenüber der NK-Zell-Aktivität ist deshalb >50.000fach, wie diese für diesen Assay bestimmt wurde. Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Insbesondere bei Bezugnahme auf 2 beträgt für das gezeigte Experiment die Dosis von wt-IL-2, die zu einer 50 % maximalen Proliferation (EC₅₀) führt, ~1,5 × 10^–10 M für den T-Zell- (A) und ~3 × 10^–10 M für den NK-Zell-Assay (B). Der EC₅₀ für D20I betrug demnach in diesem T-Zell-Assay ~1,5 × 10^–10 M, wird in diesem NK-Zell-Assay jedoch auf nur ~5 × 10^–6 M geschätzt. Die Nettoverbesserung in der T-Zell-Aktivität von D20I gegenüber der NK-Zell-Aktivität ist deshalb ~16.000fach, wie dies für diesen Assay bestimmt wurde. Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Insbesondere bei Bezugnahme auf 3 beträgt für das gezeigte Experiment die Dosis von wt-IL-2, die zu einer 50 % maximalen Proliferation (EC₅₀) führt, ~4 × 10^–11 M für den T-Zell- (A) und ~2 × 10^–10 M für den NK-Zell-Assay (B). Der EC₅₀ für N88G betrug in diesem T-Zell-Assay ~5 × 10^–12 M, wird in diesem NK-Zell-Assay jedoch auf nur ~3 × 10^–8 M geschätzt. Die Nettoverbesserung in der T-Zell-Aktivität von N88G gegenüber der NK-Zell-Aktivität ist deshalb -1.200fach, wie dies für diesen Assay bestimmt wurde. Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Insbesondere bei Bezugnahme auf 4 beträgt für das gezeigte Experiment die Dosis von wt-IL-2, die zu 50 % maximaler Proliferation (EC₅₀) führt, ~1,5 × 10^–10 M für den T-Zell- (A) und ~1 × 10^–10 M für den NK-Zell-Assay (B). Der EC₅₀ für N88I betrug in diesem T-Zell-Assay ~4 × 10^–10 M, wird in diesem NK-Zell-Assay jedoch auf nur ~5 × 10^–6 M geschätzt. Die Nettoverbesserung in der T-Zell-Aktivität von N88I gegenüber der NK-Zell-Aktivität ist deshalb ~18.000fach, wie dies für diesen Assay bestimmt wurde. Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt). Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Insbesondere bei Bezugnahme auf 5 beträgt für das gezeigte Experiment die Dosis von wt-IL-2, die zu 50 % maximaler Proliferation (EC₅₀) führt, ~1,5 × 10^–10 M für den T-Zell- (A) und ~1 × 10^–10 M für den NK-Zell-Assay (B). Der EC₅₀ für N88R betrug in diesem T-Zell-Assay ~9 × 10^–11 M, wird in diesem NK-Zell-Assay jedoch auf nur ~3 × 10^–7 M geschätzt. Die Nettoverbesserung in der T-Zell-Aktivität von N88R gegenüber der NK-Zell-Aktivität ist deshalb ~5.000fach, wie dies für diesen Assay bestimmt wurde. Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Insbesondere bei Bezugnahme auf 6 beträgt für das gezeigte Experiment die Dosis von wt-IL-2, die zu 50 % maximaler Proliferation (EC₅₀) führt, ~8 × 10^–12 M für den T-Zell- (A) und ~5 × 10^–11 M für den NK-Zell-Assay (B). Der EC₅₀ für Q126E betrug in diesem T-Zell-Assay ~8 × 10^–13 M, wird in diesem NK-Zell-Assay jedoch auf nur ~2 × 10^–9 M geschätzt. Die Nettoverbesserung in der T-Zell-Aktivität von Q126E gegenüber der NK-Zell-Aktivität ist deshalb ~400fach, wie dies für diesen Assay bestimmt wurde. Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Insbesondere bei Bezugnahme auf 7 beträgt für das gezeigte Experiment die Dosis von wt-IL-2, die zu 50 % maximaler Proliferation (EC₅₀) führt, ~5 × 10^–11 M für den T-Zell- (A) und ~8 × 10^–11 M für den NK-Zell-Assay (B). Der EC₅₀ für Q126L betrug in diesem T-Zell-Assay ~2 × 10^–11 M, wird in diesem NK-Zell-Assay jedoch auf nur ~2 × 10^–8 M geschätzt. Die Nettoverbesserung in der T-Zell-Aktivität von Q126L gegenüber der NK-Zell-Aktivität ist deshalb ~625fach, wie dies für diesen Assay bestimmt wurde. Mit Blut aus weiteren Spendern wurden entsprechende Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 7. Toxizitätsstudien im Schimpansen.
Aus den mutierten IL-2-Proteinen in Tabelle 1 wurde IL-2/N88R ausgewählt, und zwar wegen dessen nachgewiesener selektiver agonistischer Aktivität in Assays mit humanen primären T- und NK-Zellen. Relativ zu Wildtyp-IL-2 ist es ~6.000fach aktiver an T-Zellen als an NK-Zellen und weist an T-Zellen eine Aktivität auf, die im Wesentlichen äquivalent zu jener von wt-IL-2 ist. IL-2/N88R wurde in CHO-Zellen hergestellt, gereinigt und in einem Schimpansenmodell auf IL-2-Aktivität und Toxizi tät evaluiert. In diesem in vivo-Modell zeigte es eine solche T-Zell-Aktivität, die vergleichbar mit jener einer kommerziell verfügbaren rekombinanten Variante von IL-2 (PROLEUKIN^TM, Chiron Corporation, Emeryville, CA) ist, induzierte im Vergleich jedoch nur geringe Nebenwirkungen (sowohl in Bezug auf objektive als auch klinische Parameter).
A. Experimentelles Design
1. Material und Methoden
Der am lebenden Tier durchgeführte Teil der Studie erfolgte im New Iberia Research Center (New Iberia, LA, Sponsor Bayer Corporation, Berkeley, CA) und umfasste zwei Studienphasen und 11 jung-erwachsene bis erwachsene männliche Schimpansen mit Körpergewichten, die bei 45 bis 70 kg lagen.
Die Phase I der Studie war eine Phase zur Bestimmung der Dosis und umfasste die Zufuhr einer subkutanen Dosis eines Vehikels oder einer subkutanen Dosis von PROLEUKIN mit 1,2 mg/m², und zwar zweimal täglich (BID) für 5 Tage. Die Phase II der Studie betrifft einen Vergleich des Vehikels PROLEUKIN und IL-2/N88R, welche subkutan verabreicht wurden, und zwar alle 12 Stunden (q 12 h) für 5 Tage. Die Dosis von IL-2/N88R wurde so ausgewählt, dass auf der Basis einer pharmakokinetischen Analyse eine mit PROLEUKIN vergleichbare Dosis bereitgestellt wurde. Blutproben wurden für die Analysen der Blutchemie, CBC, Hämatologie/Coagulation und FACS-Analyse von T- und NK-Zell-Populationen entnommen, wie im Detail in den Abschnitten 5 und 6 beschrieben.
Tabelle 2A. Protokoll Phase I
Tabelle 2B: Protokoll Phase II
2. Dosierungsvorgang
An Studientagen, an denen Blut zu entnehmen war, wurden die Tiere vollständig anästhetisiert, indem vor der Verabreichung des Testartikels oder Vehikels IM-Ketamin mit einer Dosis von ungefähr 10 mg/kg verwendet wurde. An Studientagen, an denen keine Blutprobe erforderlich war, wurden die Tiere physikalisch unter Verwendung eines Klemmkäfigs eingegrenzt, bevor der Testartikel oder das Vehikel verabreicht wurde. Die Dosis wurde für 5 Tage alle 12 Stunden durch subkutane Injektion verabreicht und die Injektionsstelle wurde am Tag 1 der Studie von Haaren befreit. Die Stelle und Verabreichungszeit wurde für jede Dosis aufgezeichnet.
3. Klinische Beobachtungen

(a) Tägliche Beobachtungen und Nahrungsmittelverbrauch. Jedes Tier wurde zweimal täglich beobachtet und jede abnormale Beobachtung wurde dem Studienleiter berichtet. Tiere, die krank erschienen, wurden dem Studienleiter, dem Veterinärmediziner des Projektes und einem Vertreter des Sponsors gemeldet. Der Nahrungsmittelverbrauch wurde zweimal täglich durch visuelle Beobachtung bestätigt und aufgezeichnet.
(b) Körpergewichte. Die Körpergewichte wurden vor der Studie, vor der Verabreichung am Tag 1 und zu jeder Zeit aufgezeichnet, zu der die Tiere für die Blutentnahme sediert wurden.
(c) Beobachtung der Injektionsstellen. Die Injektionsstellen wurden täglich beobachtet. Jede abnormale Erscheinung, wie bspw. Rötung oder Schwellung, wurde aufgezeichnet.

Tabelle 3A: Zeitplan für Probenentnahme in der Phase II
4. Probenhandhabung

(a) Serumchemie. Zu den oben spezifizierten Zeitpunkten wurden von jedem Tier ungefähr 2 ml Blutproben in Röhrchen ohne Antikoagulans entnommen. Die Zeiten der Blutentnahme wurden dokumentiert und das Blut konnte bei Raumtemperatur koagulieren. Die Proben wurden dann zentrifugiert, das Serum wurde abgetrennt und an das NIRC Clinical Pathology Laboratory weitergeleitet. Das Standardpanel der NIRC für die Serumchemie ist in Tabelle 4 enthalten: Tabelle 4: Blutchemiepanel
(b) Hämatologie. Zu den oben spezifizierten Zeitpunkten wurden von jedem Tier ungefähr 2 ml Blutproben in EDTA-Röhrchen entnommen und an das NIRC Clinical Pathology Laboratory weitergeleitet. Das Standardpanel der NIRC für Hämatologie, einschließlich der vollständigen Blutzählung, Differenzial und Plättchenzählung, wurde für sämtliche Proben geführt.
(c) Sponsor-Assays. Zu den oben spezifizierten Zeitpunkten wurde von jedem Tier ungefähr eine 6 ml-Blutprobe in Röhrchen mit EDTA als Antikoagulans entnommen. Die Blutentnahmezeiten wurden dokumentiert. Die Proben wurden zentrifugiert, das Plasma abgetrennt und in drei separate Röhrchen aliquotiert. Das Plasma wurde gefroren gelagert (–60°C oder darunter) und zu der Bayer Corporation, Berkeley, CA, verschickt, sobald die Studie beendet war.

5. FACS

(a) Vorgehensweise. Zu den für die FACS-Analyse angegebenen Zeiten wurde eine Probe mit ungefähr 5 ml Blut in Natrium/Heparin-Antikoagulans entnommen.

Vollblutproben wurden entweder in EDTA, ACD oder Heparin erhalten. Die Zellzahlen wurden angepasst, damit diese im Bereich von 2 bis 20 Tausend pro mm³ lagen.
12 × 75 Glas- oder Kunststoffröhrchen wurden für die einzusetzenden verschiedenen Antikörper auf geeignete Art und Weise gekennzeichnet. Der Antikörper oder ein Antikörpercocktail wurde entsprechend der vom Hersteller vorgeschlagenen Volumina zu den Röhrchen hinzugegeben.
Pro Röhrchen wurden 100 µl der gründlich gemischten Blutprobe hinzugegeben und die Mischung wurde für 30 min bei Raumtemperatur unter lichtgeschützten Bedingungen inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 2 ml einer lysierenden Lösung (Becton Dickinson FACS brand lysierende Lösung, BD# 92-0002) hinzugegeben, die Mischung wurde sanft gevortext und für 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Röhrchen wurden anschließend bei Raumtemperatur für 5 Minuten bei 300 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert, die überschüssige Flüssigkeit getrocknet und zu jedem Zellpellet wurde 1 ml PBS-Puffer (GIBCO 14190-144) hinzugegeben. Nach einem sanften vortexen wurden die Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 min bei 300 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die überschüssige Flüssigkeit getrocknet, bevor 1 ml Fixierungslösung (0,5 % Formaldehydlösung, hergestellt durch Verdünnung von 10 % Formaldehyd (Polyscience, Inc. #0418) 1:20 mit PBS-Puffer) zu dem Zellpellet hinzugegeben wurde und ein sanftes vortexen zur Resuspendierung erfolgte. Die Proben wurden anschließend auf einem Coulter EPICS SL Durchflusszytometer analysiert.
Antikörper, die für die Studie verwendet wurden: MIgG1/MIgG1 Isotypenkontrolle (Becton Dickinson, Cat. # 349526), CD45-PerCP (Becton Dickinson, Cat. # 347464), CD8-FITC (Becton Dickinson, Cat. # 347313), CD25-PE (Becton Dickinson, Cat. # 30795X), CD4-FITC (Becton Dickinson, Cat. # 340133), CD16-PE (Pharmingen, Cat. # 347617), CD3PerCP (Becton Dickinson, Cat. # 347344).
6. Koagulationsprofil
Zu den oben spezifizierten Zeitpunkten wurde eine Probe von ungefähr 2 ml Vollblut in Röhrchen mit Natriumcitrat gesammelt, das als Antikoagulans hinzugegeben wurde. Das Koagulationsprofil bestand aus der Prothrombinzeit (PT), der aktivierten partialen Thromboplastinzeit (APTT) und Fibrinogen.
B. Ergebnisse und Diskussion
1. Bestimmung der Dosis von PROLEUKIN
Das primäre Ziel dieser Phase war es, eine optimale Dosis von PROLEUKIN für den Vergleich mit IL-2/N88R zu identifizieren. Diese optimale Dosis von PROLEUKIN zielt darauf ab, eine tolerierbare Dosis zu sein (niedriger als die maximal tolerierte Dosis), die idealerweise eine klinisch signifikante, jedoch moderate und reversible Toxizität verursacht. Eine PROLEUKIN-Dosis von 1,2 mg/M², BID, wurde als die Anfangsdosis bestimmt, und zwar basierend auf einer Interspezies-Extrapolation bei gegebenen klinischen Dosierungsschemata von PROLEUKIN, ihren entsprechenden Toxizitäten und Ergebnissen zur Dosiswirkung für PROLEUKIN aus einer internen Studie am Cynomolgus-Affen.
Auf diese Art und Weise wurden zwei Schimpansen mit PROLEUKIN behandelt. Diese Tiere wurden während des Zeitraumes, in dem eine Verabreichung erfolgte, zunehmend weniger aktiv, betrübt und dehydriert. Beide Tiere entwickelten schwere gastrointestinale Symptome, die an den Tagen 3 oder 4 begannen, einschließlich einem reduzierten Appetit, Diarrhöe, Erbrechen. Die Verabreichung für 1 Tier (Nummer X-159) wurde nach 3 Tagen der Dosierung wegen einer schweren Nieren-(8A & B) und moderaten Leberstörung (8C & D), welche sich in den Blutchemieanalysen reflektierten, eingestellt. Diese beinhalteten Erhöhungen des Blut-Harnstoff-Stickstoffs (BUN), Kreatinin und Gesamtbilirubin, ALT (SGPT). Beiden PROLEUKIN-behandelten Tieren wurden an den Tagen 3 und 4 (Tier X-159) und allein am Tag 4 (Tier X-124) zur Wiederbelebung oder um einer weiteren Dehydrierung vorzubeugen, Lactat-Ringer-Lösung i.v. verabreicht. Das Tier X-159 wurde am Tag 8 auf Grund einer renalen Störung und einem möglichen Thrombus im rechten Bein, was sich durch sehr niedrigen Puls (femoral) und dadurch zeigte, dass die gesamte Wade kalt und vergrößert war, aus der Studie genommen. Obwohl in einem Tier eine signifikante Toxizität beobachtet wurde, erfuhr das andere Tier weniger schwere Vorfälle und das Profil der ungewünschten Vorfälle war für beide Tiere reversibel. Darauf basierend wurden 1,2 mg/M² PROLEUKIN und die äquivalente Dosis (basierend auf der Exposition) von IL-2/N88R, g12hr als geeignetes Dosierungsschema bestimmt, um diese zwei Komponenten miteinander zu vergleichen.
2. Vergleich von IL-2/N88R mit PROLEUKIN
Klinische Beobachtungen. Die Tabelle 5 listet die klinischen Beobachtungen, die während der Studie gemacht wurden. Die Werte werden auf einer Skala von 0 bis 5 angezeigt, wobei 5 schwer bedeutet. Sämtliche PROLEUKIN-behandelten Tiere waren schwer krank; es gab einen Todesfall, der mit der Behandlung von PROLEUKIN assoziiert war. Die Werte, die nach dem 6. Tag für die PROLEUKIN-Gruppe angezeigt wurden, reflektieren Daten aus den verbleibenden zwei Tieren. Die am deutlichsten erscheinende Nebenwirkung der IL-2/N88R-Behandlung scheint die leichte GI-Unruhe (Erbrechen) zu sein, obwohl die Behandlung hinsichtlich der in Tabelle 4 angegebenen Parameter nominale Toxizität induzierte. Das Körpergewicht der PROLEUKIN-Gruppe fiel am Tag 6 um 6 % und stürzte am Tag 10 um bis 10 % und erholte sich danach langsam (siehe 9). Im Gegensatz hierzu zeigten die IL-2/N88R- und Vehikelgruppen lediglich höchstens 1 bis 3 % Gewichtsverlust. Tabelle 5. Klinische Beobachtungen*

*ala von 0 bis 5, wobei 5 am stärksten ist

(a) Hämatologie. IL-2/N88R induzierte zelluläre Effekte, die mit der PROLEUKIN-Aktivierung in Einklang stehen, insbesondere eine Lymphocytose (10A), wobei ebenfalls ein Anstieg von weißen Blutzellen (10B) und Neutrophilen (10C) beobachtet wurde. IL-2/N88R induzierte lediglich eine marginale Thrombozytopenie (Tiefpunkt von ~15 %) im Vergleich zu PROLEUKIN (Tiefpunkt ~50 %) während des Behandlungsteils der Studie (10D).
(b) Renale Funktion. Die BUN-Spiegel lagen in diesen beiden Tieren deutlich über 130 mg/dL; die Kreatininspiegel erhöhten sich in den beiden Tieren ebenfalls dramatisch, sowohl am Tag 6 als auch am Tag 8 (11B), wodurch eine vollständige Aufhebung der renalen Funktion angezeigt wird. Außerdem nahmen in der PROLEUKIN-behandelten Gruppe an den Tagen 6 und 8 sowohl das Serumphosphor als auch die Anionenlücke zu. In sämtlichen IL-2/N88R-Tieren verblieben diese renalen Parameter während der Studie im Wesentlichen normal (11C & D).
(c) Hepatische Funktion. Das Gesamtbilirubin hatte sich am Tag 6 in der PROLEUKIN-Gruppe mehr als verdreifacht und verblieb bis zum Tag 10 hoch (12A). Im Gegensatz dazu zeigte lediglich ein Tier in der IL-2/N88R-Gruppe an den Tagen 3 und 6 einen transienten geringen Anstieg. Die SGPT-Spiegel im Serum erhöhten sich dramatisch und erreichten am Tag 6 in sämtlichen PROLEUKIN-Tieren mehr als 100 U/L. Der SGPT-Spiegel in Tier Nr. A-199 erreichte 651 U/L, und der SGOT-Spiegel 2789 U/L (Laborjournal: NIRC#8754-9852-Phase II, Tabelle 1 mittlere Chemiewerte individuell und Gruppe, Seite 17 von 21 der Tabelle), wodurch ein schweres Leberversagen angezeigt wird.
(d) Koagulation. Der Fibrinogenspiegel wurde sowohl in der PROLEUKIN- als auch in der IL-2/N88R-Gruppe mehr als verdoppelt und erreichte am Tag 6 seinen Höhepunkt (12C). Dieser Anstieg scheint in der PROLEUKIN-Gruppe früher als in den IL-2/N88R-Tieren zu erfolgen. Dies wird durch einen Anstieg am Tag 3 von 51 % vs. 5 % reflektiert. Die Veränderungen des Fibrinogens können eher ein Ergebnis der aktiven Proteinantwort sein als Koagulationsdefekte, da es während des gleichen Zeitraumes zu keinen dementsprechenden Veränderungen von APTT oder PT kam (12D). Allerdings zeigte der APTT-Spiegel beginnend am Tag 10 in den PROLEUKIN-Tieren einen offensichtlichen Aufwärtstrend, obwohl der absolute Wert im Normalbereich blieb. Der gleiche Trend, wenn auch in einem geringeren Ausmaß, wurde ebenfalls in der IL-2/N88R-Gruppe beobachtet. Interessanterweise scheint jedoch der Fibrinogenspiegel während des gleichen Zeitraumes in beiden Gruppen entsprechend langsamer zu driften.
(e) Homöostase. Die Natriumspiegel im Serum nahmen am Tag 8 in zwei der drei PROLEUKIN-Tiere unter 135 MEQ/L ab, blieben jedoch in den restlichen Tieren normal (13A). In der PROLEUKIN-Gruppe nahmen die Chloridspiegel beginnend am Tag 3 ebenfalls auf unter 95 MEQ/L ab und blieben bis zum Tag 15 niedrig (13B). Der Calciumspiegel war in zwei von drei PROLEUKIN-Tieren an den Tagen 6 und 8 niedriger und erreichte im Tier A199 einen niedrigen Wert von 4,9 und 3,1 mg/dL (13C). Der Kaliumspiegel nahm in den Tagen 3 bis 12 in sämtlichen PROLEUKIN-behandelten Tieren außer Tier A199 auf unter 3 MEQ/L ab, dessen Kaliumspiegel sogar auf einen toxischen Spiegel von 7,2 MEQ/L anstieg, bevor es aus der Studie herausgenommen wurde (13D).
(f) Anzeichen einer vaskulären Leckage. Der Serumalbuminspiegel nahm sowohl in der PROLEUKIN- (37 %) als auch IL-2/N88R-Gruppe (19 %) ab (14A). In der PROLEUKIN-Gruppe wurde an den Tagen 3 und 6 ein Anstieg des Hämatokritspiegels beobachtet (14B). Im Gegensatz dazu nahmen die Hämatokritspiegel in der Vehikelkontroll- als auch in der IL-2/N88R-Gruppe während des gleichen Zeitraumes ab und verblieben niedrig, wodurch eine leichte Anämie angezeigt wird, wie aufgrund von multiplen Blutprobenentnahmen erwartet (14B & C). Die Erhöhung des Hämatokritwertes in der PROLEUKIN-Gruppe steht bei einer Kopplung mit einer Abnahme des Albumins in Übereinstimmung mit der Entwicklung des Kapillarleckage-Syndroms.

3. Zelluläre Aktivierung
Die Effizienz von PROLEUKIN und IL-2/N88R wurde über die Veränderung des prozentualen Anteils von CD25-positiven Lymphocyten (Trafficking + Proliferation) und der mittleren Fluoreszenz für CD25 bzw. der Anzahl von CD25-Antigenen, die auf der Oberfläche einer bestimmten T-Zelle exprimiert werden (CD25 = nieder affiner IL-2R), verfolgt. Die CD25-Expression wurde auf der gesamten T-Zell-Population (CD3⁺-Zellen) sowie auf den CD3⁺CD4⁺- und CD3⁺CD8⁺-Populationen verfolgt.
Die IL-2-Aktivität an natürlichen Killerzellen (NK) wurde durch eine Analyse des Traffickings von CD3^–CD16⁺- und CD3^–CD25⁺CD16⁺-NK-Zellen verfolgt. Die absolute Anzahl von CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-, NK-Zellen wurde bestimmt, indem der prozentuale Anteil der Zellen mit der Anzahl von Lymphocyten pro mm³ multipliziert wurde, wobei die Daten während der Hämatologieanalyse erhalten wurden.

(a) CD25-Regulation der Expression auf der T-Zell-Oberfläche. Der prozentuale Anteil von aktivierten T-Zellen, der durch CD25-positive Zellen angezeigt wurde, wurde am Tag 6 der Studie hochreguliert, hauptsächlich auf der CD3⁺CD4⁺-T-Zell-Population. PROLEUKIN scheint am Tag 6 die Expression von CD25 auf einen höheren prozentualen Anteil der gesamten CD3⁺-, CD3⁺CD4⁺- und CD3⁺CD8⁺-Subpopulationen von T-Zellen zu induzieren. Allerdings war am Tag 8 der prozentuale Anteil von Zellen, die das CD25-Antigen exprimieren, auf den Lymphocyten der Schimpansen, die mit PROLEUKIN behandelt wurden, und denen der Schimpansen, die mit IL-2/N88R behandelt wurden, identisch (15A, B und C). Weder bei PROLEUKIN- noch bei IL-2/N88R-behandelten Schimpansen wurde eine Färbung für CD25 an der Oberfläche der natürlichen Killerzellen-(NK) Population beobachtet. Es wird angenommen, dass das Fehlen der Expression von IL-2Rα (das Zielantigen für die Zelloberflächenfärbung von CD25) auf der Oberfläche der selektierten NK-Zell-Population (CD3^–/CD16⁺) für diese Ergebnisse verantwortlich ist.

Die absolute Anzahl von CD3⁺CD25⁺-T-Zellen folgte einem entsprechenden Muster wie der prozentuale Anteil von CD3⁺CD25⁺-T-Zellen, wobei PROLEUKIN aktiver zu sein scheint als IL-2/N88R (16A). IL-2/N88R zeigte ein ähnliches Potenzial zur T-Zell-Aktivierung auf die CD3⁺CD4⁺-T-Zell-Population wie PROLEU-KIN, da die Hochregulation der absoluten Anzahl von CD⁺CD4⁺CD25⁺-Lymphocyten, die durch IL-2/N88R induziert wurden, identisch zu der Hochregulation war, die mit PROLEUKIN beobachtet wurde (16B). PROLEUKIN scheint die Anzahl der CD3⁺CD8⁺CD25⁺-T-Zellen in stärkerem Maße zu erhöhen als IL-2/N88R (16C).
Die Zahl der CD25-Moleküle (mittlere Fluoreszenz), die auf der CD3⁺CD4⁺-T-Zell-Subpopulation exprimiert wurden, folgte identischen Kinetiken sowohl bei der PROLEUKIN- als auch der IL-2/N88R-Behandlung (17).

(b) Lymphocyten-Trafficking: Effekt der PROLEUKIN- und IL-2/N88R-Behandlung.

Die Aktivitäten von PROLEUKIN und IL-2/N88R an den T- und NK-Zell-Populationen wurden über die Analyse der Veränderung der absoluten Zahl von zirkulierenden Lymphocyten vor, während und nach der Behandlung bestimmt (18). Es scheint, dass IL-2/N88R hinsichtlich der Erhöhung der absoluten Zahl von zirkulierenden CD3⁺CD4⁺-Lymphocyten eine größere Aktivität als PROLEUKIN (18A), und hinsichtlich der Erhöhung der absoluten Zahl von zirkulierenden CD3⁺CD8⁺-Lymphocyten eine leicht reduzierte Aktivität im Vergleich zu PROLEUKIN (18B) zeigt. Beide Verbindungen hatten einen vergleichbaren, wenn auch moderaten, Effekt auf die Erhöhung der Gesamtzahl von CD3⁺-Lymphocyten (18C). Weder PROLEUKIN noch IL-2/N88R beeinflusste das Trafficking von NK-Zellen (18D).
C. Schlussfolgerung
IL-2/N88R wurde über ein Screening von mutanten IL-2-Proteinen in Assays mit humanen primären T- und NK-Zellen generiert. Es übt in vitro eine ~6000fache Selektivität für T-Zellen gegenüber NK-Zellen aus. Basierend auf diesem zellulären Profil wurde postuliert, dass es lediglich schwache Nebenwirkungen induziert, wenn es bei einer Dosis verabreicht wird, die eine signifikante T-Zell-Aktivierung hervorruft. Experimente in Schimpansen, in denen PROLEUKIN mit IL-2/N88R verglichen wurde, bestätigten, dass IL-2/N88R ein signifikant besseres Sicherheitsprofil aufweist als PROLEUKIN, während es eine vergleichbare Fähigkeit zur Induktion der T-Zell-Aktivierung beibehält.
Beispiel 8: Effizienz des IL-2-selektiven Agonisten N88R im Mausmodell CD26 für Lungenmetastasen.
Protokoll: Mäusen (Balb/c, weiblich, 6 bis 8 Wochen alt) wurden am Tag 0 intravenös (IV) einmal 10⁵ CD26-Zellen (murines Colonkarzinom) in 0,2 ml PBS in die laterale Schwanzvene injiziert. Die Behandlung erfolgte mit PROLEUKIN oder IL-2/N88R mit verschiedenen Dosierungen (Verdünnungsmittel: 5 % Glucose in Wasser (DSW)), oder DSW, zugeführt IV, einmal täglich für 8 Tage (QD × 8) mit Beginn am Tag 1 nach der Implantation. IL-2/N88R wurde bei Raumtemperatur hergestellt, und zwar durch Verdünnung in DSW unter Verwendung von silikonisierten Röhrchen mittels einer Tuberkulinspritze und innerhalb von zwei Stunden der Präparation an die Tiere verabreicht. PROLEUKIN wurde präpariert, indem 0,7 ml steriles Wasser zur Injektion (SWFI) zu jedem Röhrchen (Endkonzentration 1,86 mg/ml) hinzugegeben wurde. Die Verdünnungen wurden hergestellt, wie für IL-2/N88R in DSW beschrieben (Tabelle 6). Die Tiere wurden am Tag 11 getötet. Die Lungen wurden entfernt und gewogen, mit PBS gespült und das Gewebe wurde in Bouin's-Lösung transferiert. 24 Stunden später wurde das Gewebe in 10 % Formalin transferiert. Unter einem Seziermikroskop wurde die Anzahl von Metastasenkolonien in den Lungen gezählt.
Tabelle 6. Dosierung und Gruppen in der Studie des Tumor-Maus-Modells CD26
Die Tabelle 7 zeigt die Anzahl von in individuellen Mäusen gezählten Metastasen. Für IL-2/N88R als auch PROLEUKIN wurde eine vergleichbare Effizienz beobachtet. Bei der hohen Dosis von IL-2/N88R (Gruppe 8, 60 mg/kg) hatten alle bis auf eine Maus 12 Metastasen oder weniger; drei der Mäuse wiesen keine Metastasen auf. Dies steht im Gegensatz zu der höchsten getesteten Dosis von PROLEUKIN, wo alle überlebenden Mäuse 12 Metastasen oder mehr hatten.
Tabelle 7. Listung der Anzahl von individuellen Metastasen und Mittelwerten
Eine signifikante (P<0,05) Reduktion der Metastasen wurde in Mäusen, die mit IL-2/N88R bei Dosen von 10, 30 und 60 mg/kg (Gruppen 6, 7 bzw. 8), und in Gruppen, die mit 10 mg/kg PROLEUKIN (Gruppe 3) behandelt wurden, beobachtet. Diese Ergebnisse sind grafisch in 19 dargestellt. Die Daten sind unter Verwendung des log der Dosis aufgetragen: für PROLEUKIN lagen die Dosen bei 3 und 10 mg/kg; für IL-2/N88R lagen die Dosen bei 1, 3, 10, 30 und 60 mg/kg. Die Kurvenanpassung unter Verwendung einer nicht-linearen Gleichung (4-Parameter-Anpassung) führte zu IC₅₀-Werten von 5,2 mg/kg für PROLEUKIN und von 10,9 mg/kg für IL-2/N88R.
Aus den Daten dieses Experimentes wurde die IC₅₀ in Bezug auf die Reduzierung der Anzahl von Metastasen für IL-2/N88R mit 10,9 mg/kg (8,6-13,9 mg/kg bei 95 % Sicherheit) und für PROLEUKIN mit 5,2 mg/kg (3,5-7,7 mg/kg bei 95 % Sicherheit) berechnet.
Das Überleben der Mäuse ist in Tabelle 8 gezeigt. In der Gruppe mit 10 mg/kg PROLEUKIN starb eine (1) Maus am Tag 7 und weitere fünf (5) starben am Tag 8. Eine (1) Maus starb am Tag 8 in jeder der Gruppen, die mit 3 oder 10 mg/kg IL-2/N88R behandelt wurden, wobei keinerlei Todesfälle weder bei 1, 30 noch 60 mg/kg IL-2/N88R heobachtet wurden. Außerdem waren die meisten Mäuse, die mit 3 mg/kg PROLEUKIN, und sämtliche Mäuse, die mit 10 mg/kg PROLEUKIN behandelt wurden, dem Sterben nahe; keine Morbidität wurde in Mäusen beobachtet, die mit IL-2/N88R behandelt wurden. Tabelle 8. Überleben von mit IL-2/N88R oder PROLEUKIN behandelten Mäusen

¹n = 14 Mause/Gruppe
²n = 11 Mäuse/Gruppe
³n = 11 Mäuse/Gruppe
⁴Vor dem Tag 7 wurden keine Todesfälle beobachtet.

Die PROLEUKIN-behandelten Tiere in beiden Gruppen waren am Sterben. In keinem der IL-2/N883R-behandelten Tiere wurde Morbidität beobachtet.
Zusammenfassend zeigen diese Studien, dass IL-2/N88R hinsichtlich der Reduzierung der Tumorbelastung (was durch die Zählung der Lungenmetastasen in dem CD26-Modell gemessen wurde) gleich effizient ist wie PROLEUKIN. Außerdem wurde gezeigt, dass IL-2/N88R wesentlich weniger toxisch ist als PROLEUKIN.
Beispiel 9. Entwicklung von stabilen, Hochleistungs-CHO-Zelllinien, die IL-2/N88R exprimieren.
Stabile Produktionszelllinien, die große Mengen des IL-2/N88R-Muteins sekretieren, wurden entwickelt, indem CHO(dhfr)-Zellen mit dem Expressionsvektor transfiziert wurden, der in 20 gezeigt ist. Die individuellen Elemente des IL-2/N88R-Expressionsvektors sind in der Plasmidkarte (20) gezeigt. Sie zeigt CMVe/p = früher Promotor des Cytomegalovirus; PA = SV40-Polyadenylierungssignalsequenz; und DHFR = Dihydrofolatreduktaseexpressionskassette.
Der Vektor wurde unter Verwendung von Standardtechniken zur DNA-Rekombination konstruiert. Siehe allgemein Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Ausgabe, 1989, Cold Spring Harbor Press; Short Protocols in Molecular Biology, 2. Ausgabe, 1992, John Wiley & Son; Methods in Enzymology Vol. 185, Ed. Goeddel et al., Academic Press Inc., London, 1991. Der Expressionsvektor enthält diskrete Expressionskassetten für das IL-2/N88R-Gen und für das amplifizierbare und selektierbare Gen DHFR (Dihydrofolatreduktase). Etwa 1 × 10⁶ CHO-(chinesischer Hamsterovar) Zellen wurden mit 10 µg von pBC1IL2SA unter Verwendung von Lipofectin-Reagenzien (Life Technology Inc., Bethesda, Maryland) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Die Zellen wurden dann in Gegenwart von 50 nM Methotrexat selektiert und in DME/F12-Medium (Life Technologies Inc.) ohne Thymidin und Hypoxanthin plus 5 % dialysiertes fötales Rinderserum wachsen gelassen. Die Zellpopulationen wurden mit einem kommerziellen ELISA-Kit (R & D Systems) auf die Produktion von IL-2/N88R gescreent. Die Hochleistungs-Populationen wurden weiter in Medium selektiert, das zunehmende Konzentrationen von Methotrexat (100 bis 400 Methotrexat) enthielt, und auf die Produktion von IL-2/N88R gescreent. Es wurde dann eine Grenzverdünnungsklonierung angewendet, um Klone mit hoher und stabiler Produktivität zu gewinnen. Die Klonierung erfolgte in Abwesenheit von Methotrexat unter Verwendung von Standardtechniken der Gewebekultivierung.
Beispiel 10. Serumfreie Produktion von IL-2/N88R in einem Perfusionsbioreaktor.
Die kontinuierliche Produktion von IL-2/N88R erfolgte durch kontinuierliche Perfusionsfermentation. Ein 19-Liter-Wheaton-Fermenter wurde mit einer stabilen CHO-Zelllinie aus Beispiel 9 mit 2 × 10⁶ Zellen/ml inokuliert und bei einer Mediumsaustauschrate von 5 Litern/Tag perfundiert. Das Produktionsmedium war ein DME/F12-basiertes Medium (Life Technologies, Inc., Rockville, MD), versetzt mit rekombinantem humanem Insulin (10 µg/ml) (HUMULINT^TM, Eli Lilly, Inc., Indianapolis, IN) und FeSO⁴·EDTA (50 µM). Die Zelldichte wurde bei 4 × 10⁶ Zellen/ml gehalten. Die durchschnittliche tägliche Ausbeute des Fermenters war ~200 mg/Tag. Die Produktion von IL-2/N88R war für 30 Tage anhaltend stabil.
Beispiel 11. Reinigung von in CHO-Zellen produziertem IL-2/N88R.
Auf das oben beschriebene Perfusionseluat wurde folgende Vorgehensweise angewendet. Das Perfusionsmedium wurde gesammelt und auf eine S-Sepharose-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 20 Millimolar Phosphatpuffer mit 5 Millimolar NaCl bei pH 7,0 äquilibriert. Die Feed-Lösung ("TCF") wurde durch Zugabe von Wasser auf eine Leitfähigkeit von 4 Millisiemens eingestellt und mit Phosphorsäure auf den gleichen pH eingestellt.
Nach dem Beladen des TCF wurde die Säule mit dem gleichen Äquilibrierungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgte durch einen pH-Shift. Die Muteine wurden mit 20 mM Ethanolamin, pH 10,5, eluiert, um die Muteine von der Säule zu waschen, um das S-Eluat herzustellen.
Der Anionenaustausch erfolgte, indem das S-Eluat durch eine Säule QAE Fast Flow^TM (Pharmacia) hindurchgeleitet wurde, die mit 10 mM Bicarbonatpuffer bei pH 10,5 äquilibriert wurde. Die Durchflussrate wurde bei 250 cm/h gehalten. Nach dem Waschen bis zur Grundlinie wurde IL-2SA mit 20 mM Phosphat pH 4,0 eluiert.
Es wurde eine Hydroxyapatit-(HAP) Chromatographie durchgeführt, indem das verdünnte QAE-Eluat (1:1 mit WFI) durch eine Säule hindurchgeleitet wurde, die mit Keramikhydroxyapatit (Typ II, Bio-Rad, Hercules, CA), das mit 0,10 mM Phosphat auf pH 7,0 äquilibriert war, gepackt war. Die Durchflussrate wurde bei 250 cm/h gehalten. Nach dem Waschen bis zur Grundlinie wurde IL-2SA mit 100 mM Phosphat bei pH 7,0 eluiert.
Das Hydroxyapatiteluat wurde mit einer Millipore Pelicon-2-Einheit, die mit drei PES-5K-Einsätzen (Millipore Corporation, Bedford, MA) versehen war, auf ein Volumen von 300 ml ultrafiltriert. Das ultrafiltrierte HAP-Eluat wurde weiter gereinigt, indem es durch eine S100HR (Pharmacia) Größenausschlusssäule bei 35 cm/h hindurchgeleitet wurde. Die Säule wurde mit 10 mM Phosphat und 150 mM NaCl pH 7,0 äquilibriert.
Der Gelfiltrationspool wurde mit WFI verdünnt, um eine Leitfähigkeit von 4,0 mMhos/cm zu erreichen, und erneut auf die S-Sepharose unter den zuvor beschriebenen Bedingungen geladen. IL-2SA wurde mit 10 mM Phosphatpuffer mit 1 M NaCl bei pH 7,0 eluiert.
Der finale Kationenaustauschpool wurde über Nacht gegen phosphatgepufferte Saline (PBS) dialysiert und mit steriler PBS auf eine Konzentration von 6 mgs/ml verdünnt. Der finale verdünnte Pool wurde dann sterilfiltriert, aliquotiert und bei –70°C eingefroren. Die Gesamtausbeute betrug 65 %.
Weitere Ausführungsbeispiele der Erfindung sind für einen Fachmann naheliegend. Diese Erfindung lehrt, wie Muteine erhalten werden können, die vorliegend nicht im Speziellen beschrieben sind, welche jedoch eine T-Zell-Aktivierung bewirken, die durch PHA-Blast-Proliferation ersichtlich wird, und welche die NK-Zell-Proliferation reduzieren, so dass diese Muteine im Geist und Umfang der Erfindung liegen. Das hier beschriebene Konzept und der experimentelle Ansatz ist auf weitere Cytokine anwendbar, die heterologe, multimere Rezeptorsysteme verwenden, insbesondere die verwandten Cytokine IL-7, IL-9 und IL-15, IL-10, Interferon-α und Interferon-γ.
SEQUENZEN
Die folgenden Sequenzen sind in dieser Anmeldung enthalten:

SEQ ID Nr: 1 hIL-2 (Aminosäure)
SEQ ID Nr: 2 hIL-2 (cDNA)
SEQ ID Nr: 3 5'-PCR-Primer, IL-2
SEQ ID Nr: 4 3'-PCR-Primer, IL-2
SEQ ID Nr: 5 Mutagenese-Primer für den IL-2-Expressionsvektor
SEQ ID Nr: 6 Mutagenese-Primer für D20X-Mutationen
SEQ ID Nr: 7 Mutagenese-Primer für N88X-Mutationen
SEQ ID Nr: 8 Mutagenese-Primer für Q126X-Mutationen

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Humanes IL-2-Mutein, das entsprechend dem Wildtyp-IL-2 nummeriert ist, eine Aminosäuresubstitution an einer der Positionen 20, 88 und 126 aufweist, wobei Position 20 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Histidin, Isoleucin, Methionin, Glutamin, Serin, Valin oder Tyrosin; Position 88 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Arginin, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Leucin, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Methionin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Valin; Position 126 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Asparagin, Leucin, Prolin, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Methionin, Arginin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Valin, und wobei das IL-2-Mutein bevorzugt T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
IL-2-Mutein gemäß Anspruch 1, wobei die Position 88 durch Arginin substituiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutischen Träger und das humane IL-2-Mutein gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 aufweist, wobei die Zusammensetzung bevorzugt T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Humanes IL-2-Mutein, das entsprechend dem Wildtyp-IL-2 nummeriert ist, eine Aminosäuresubstitution an zwei der Positionen 20, 88 und 126 aufweist, wobei Position 20 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Histidin, Isoleucin, Methionin, Glutamin, Serin, Valin oder Tyrosin; Position 88 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Arginin, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Leucin, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Methionin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Valin; Postion 126 durch eine Aminosäure substituiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Asparagin, Leucin, Prolin, Phenylalanin, Glycin, Isoleucin, Methionin, Arginin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Valin, und wobei das IL-2-Mutein bevorzugt T-Zellen gegenüber natürlichen Killerzellen aktiviert.
Polynucleotid, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für das IL-2-Mutein gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 codiert.
Vektor, der das Polynucleotid gemäß Anspruch 5 aufweist.
Isolierte eukaryotische Zelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 6 transformiert ist.
Prokaryotische Zelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 6 transformiert ist.