HU226142B1 - Il-2 selective agonists and antagonists - Google Patents

Il-2 selective agonists and antagonists Download PDF

Info

Publication number
HU226142B1
HU226142B1 HU0101948A HUP0101948A HU226142B1 HU 226142 B1 HU226142 B1 HU 226142B1 HU 0101948 A HU0101948 A HU 0101948A HU P0101948 A HUP0101948 A HU P0101948A HU 226142 B1 HU226142 B1 HU 226142B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
cell
mutein
muteins
activity
Prior art date
Application number
HU0101948A
Other languages
English (en)
Inventor
Armen B Shanafelt
Jeffrey M Greve
Gary Jesmok
Kenneth J Lembach
Gayle D Wetzel
Original Assignee
Aicuris Gmbh & Co Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aicuris Gmbh & Co Kg filed Critical Aicuris Gmbh & Co Kg
Publication of HUP0101948A2 publication Critical patent/HUP0101948A2/hu
Publication of HUP0101948A3 publication Critical patent/HUP0101948A3/hu
Publication of HU226142B1 publication Critical patent/HU226142B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

A találmány tárgya általánosságban farmakológia és immunológia területére esik. Közelebbről, a találmány tárgyát T-sejtek (PHA-blasztok) szelektív aktiválására szolgáló készítmények képezik, amelyek a természetes killer- (NK) sejtek vonatkozásában csökkentett aktiválást mutatnak. A találmány szerinti készítmények a citokinek családjának variánsait tartalmazzák, közelebbről humán interleukin-2 (IL—2) variánsokat. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti proteineket kódoló nukleinsavmolekulák, az azokat tartalmazó vektorok és gazdasejtek, valamint eljárások a találmány szerinti variáns proteinek előállítására.
A találmány szerinti megoldás alkalmas IL—2-vel összefüggő rendellenességek - például rákos elváltozások és immunrendszert érintő megbetegedések kezelésére és megelőzésére.
Az interleukin-2 (IL—2) erős immunstimulátor, amely az immunrendszer különböző sejtjeit aktiválja, beleértve T-sejteket, B-sejteket és monocitákat. Az IL-2 ugyanakkor a T-sejtek erős és kritikus növekedési faktora. Ezen aktivitásoknak köszönhető, hogy az IL-2-t megvizsgálták, képes-e a rákot gyógyítani. A humán IL-2 egy FDA által elfogadott gyógyszer metasztázisos renal karcinóma és metasztázisos melanoma kezelésére. Megfelelő páciensekben is az IL-2 alkalmazása korlátozott azonban az IL-2 terápiával kapcsolatos súlyos toxicitás miatt; becslések szerint legjobb esetben is a megfelelő pácienseknek csak 20 százaléka kap ténylegesen kezelést. Az IL-2-terápiával kapcsolatos toxikus hatások magukban foglalják a következőket: magas láz, hányinger, hányás, vaszkuláris áteresztés és súlyos hipotenzió. Ezen toxikus hatások ellenére azonban az IL-2 hatékony az elfogadott indikációk kezelésére (körülbelül 17% objektív válaszarány).
Bár az egéreredetű IL-2 szerkezet/funkció analízise széles körű volt [Zurawski és Zurawski: EMBO J. 8 2583 (1989); Zurawski és munkatársai: EMBO J. 9 3899 (1990); Zurawski: Trends Biotechnol. 9 250 (1991); Zurawski és Zurawski: EMBO J. 11 3905 (1992); Zurawski és munkatársai: EMBO J. 12 5113 (1993)], mindmostanáig a humán IL-2 esetében csak korlátozott analízisre került sor. A legtöbb, humán IL-2 muteinnel végzett vizsgálatot egéreredetű sejteken végezték, azonban kevés vizsgálatot végeztek humán PHA-blasztok alkalmazásával, amelyek a nagy affinitású IL-2Rapy IL-2-receptort expresszálják. A PHAblasztokkal végzett vizsgálatok igazolták a humán IL-2 Asp-20 aminosav és a D-hélix fontosságát. Kimutatták, hogy a humán IL-2 Asp-20 és Gln-126 pozíciói az elsődleges aminosavak, amelyek - sorrendben megfeleltetve - az IL-2-receptor β- és γ-alegységeivel létrejövő kölcsönhatásért felelősek [összefoglaló ismertetését lásd: Théze és munkatársai: Immunoi. Today 17 481 (1996)]. Bár kimutatták hogy az egér IL-2 C-hélixében lévő aminosavak részt vesznek az egér IL-2Rp-val létrejövő kölcsönhatásban [Zurawski és munkatársai: EMBO J. 12 5113 (1993)], nem mutatták ki azt, hogy a humán IL-2-ben a megfelelő aminosavak ugyanilyen tulajdonsággal rendelkeznének (ezek az aminosavak a humán IL-2-ben az Asp-84 és
Asn-88 aminosavak lennének). Mivel jelentős mértékű fajspecifitás mutatható ki a humán és az egér IL-2 között (a humán IL-2 körülbelül 100-szoros mértékben csökkentett aktivitást mutat egéreredetű rendszerekben), nehéz megjósolni, hogy ugyanolyan típusú kölcsönhatások fordulnak-e elő a fajhatárokon belül. Nem ismertek olyan vizsgálatok, amelyek csak a humán IL-2Rpy közepes affinitású receptort expresszáló sejteket alkalmaztak.
Megvizsgáltak néhány humán IL-2 muteint a humán PHA-blasztokra gyakorolt aktivitásukra [Xu és munkatársai: Eur. Cytokine Netw. 6 237 (1995)]. Olyan muteinek esetében, amelyek Asp-20-leucin (D20L) cserét és hasonlóképpen arginin-, aszparagin- és üzincserét tartalmaztak, kimutatták, hogy súlyos hiányosságok vannak a PHA-blasztok proliferációját indukáló képességükben. így a technika állása szerint az Asp-20 szubsztitúciója komprimált aktivitású muteineket fog eredményezni. Továbbá Xu és munkatársai kijelentették, hogy mostanáig (1995-ig) nem azonosítottak sem klinikai sem kutatási alkalmazásokra jól használható IL-2 muteineket.
A Buchli és Ciardelli által létrehozott humán IL-2 Q126D mutein [Buchli és Ciardelli: Arch. Biochem. Biophys. 370(2) 411 (1993)] jelentős mértékben komprimált aktivitást mutatott mind potenciában és agonizmusban; humán T-sejt-vizsgálati eljárásokban az IL-2 aktivitásával összehasonlítva körülbelül 1000-szer kisebb aktivitást mutatott és részleges agonistaként viselkedett. Egéreredetű T-sejt-vizsgálati eljárásokban a mutein csaknem inaktív volt. Mindkét vizsgált sejtvonal az IL-2-receptor nagy affinitású formáját expresszálta. Mindkét sejttípuson a Q126D mutatta az IL-2-közvetített aktivitás antagonizálására szolgáló képességet, bár csak részlegesen mutatta a humán T-sejt-vizsgálati eljárásban.
Zhi-yong és munkatársai szubsztitúciós kísérleteket végeztek az IL-2-vel a 62., 69., 99. és 126. pozíciókban [Zhi-yong és munkatársai: Acta Biochimica et Biophysica Sinica 25(5) 558 (1993)], amelyek a vad típusú IL-2-vel összehasonlítva a 62-Leu-IL-2 és a 126Asp-IL-2 esetében - sorrendben megfeleltetve 20-szoros és 30-szoros mértékben csökkent aktivitást mutattak egy egér T-sejt-vizsgálati eljárás során (CTLL-2). Azonban nem található kitanítás vagy javaslat arra, hogy a 126. pozícióban létrehozott helyettesítések T-sejt-szelektív aktivitást vihetnek át az NK-sejtekre, illetve nem található utalás arra, hogy ilyen változtatásoknak hasonló hatása lehet humán T-sejtekre.
Collins és munkatársai ismertették, hogy a 20. pozícióban az aszparaginsav helyettesítése aszparaginnal (D20N) vagy lizinnel (D20K) a humán IL-2-hez viszonyítva mind a nagy affinitású receptorhoz (IL-2RaPy, Collins és munkatársai szerint p55/p70), mind a közepes affinitású receptorhoz (IL—2Rpy, Collins és munkatársai szerint p70) történő kötődésben körülbelül 100szoros-1000-szeres mértékű csökkenést eredményezett [Collins és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 7709 (1988)]. Az IL-2Ra-receptorhoz való kötődés láthatóan egyik mutáns fehérje esetében sem
HU 226 142 Β1 mutatott változást. Az itt ismertetettek szerint a közepes affinitású IL-2-receptorhoz (IL-2Rpy) való kötődés akadályozása a nagy affinitású IL—2-receptorhoz (IL—2Rapy) való kötődés akadályozásához is vezet, ezzel azt sugallva, hogy az IL-2Rpy vagy az IL-2Rapy közötti differenciális kötődés vagy aktiválás nem valósítható meg az aszparaginsav szubsztitúciójával a 20. pozícióban.
Berndt és munkatársai kombinatoriális kazetta mutagenezist alkalmaztak a természetes eredetű IL—2 17-21. pozícióinak egyidejű mutáltatására, amelyekről feltételezik, hogy kölcsönhatásba lépnek a közepes affinitású IL-2-receptorral [Berndt és munkatársai: Biochemistry 33(21) 6571 (1994)]. 2610 szkrínelt klón közül csak 42 volt aktív. Azt találták, hogy a biológiai aktivitás számára elsődleges fontosságúak a 20. és 21. pozíciók. Az L21V kivételével nem található javaslat vagy kitanítás egyedi szubsztitúciókra.
Az 5,229,109 lajstromszámú US szabadalom (Grimm és munkatársai) ismereteink szerint alacsony toxicitású IL-2-analógokat ismertet immunterápiás alkalmazásra és rák kezelésére. Két, az Arg-38 pozícióban (alaninra) és a Phe-42 pozícióban (lizinre) szubsztitúciót tartalmazó IL-2-analóg tulajdonságait analizálták és összehasonlították a természetes eredetű IL—2 tulajdonságaival. Az analógok esetében azt találták, hogy megtartották képességüket a közepes affinitású IL-2-receptor kötésére, míg az úgynevezett „nagy affinitású” receptort csak minimális mértékben kötötték. Ebben az időben feltételezték, hogy a közepes affinitású receptor csak p75-ből (IL-2R6) áll és a nagy affinitású receptor csak a p55+p75 receptor komplexből (IL-2RaP) áll. Az analógok szintén megőrizték azon képességüket, hogy perifériás vér mononukleáris sejteket aktiváljanak limfokinaktivált pusztításra („lymphokine activated killing”, LAK). Megjegyzendő, hogy az analógokra adott válaszként az IL—1 β és a TNFa-kiválasztás jelentősen mértékben csökkent a természetes eredetű IL—2 molekulához viszonyítva. A leírás során ismertetett aminosavak azok, amelyek specifikusan kölcsönhatásba léphetnek az IL-2Ra-val (p55); IL-2Ra-val való kölcsönhatás megszüntetése csökkentett aktivitást eredményezne a nagy affinitású IL—2receptort hordozó sejteken és nem befolyásolná az aktivitást a közepes affinitású IL-2-receptort hordozó sejteken. (gy a LAK sejtek létrehozása (amelyekről feltételezzük, hogy NK-sejtekből származnak) megmaradna. Az ismertetett muteinek a 20., 88. és 126. aminosavpozíciókra irányulnak; ezekről a pozíciókról feltételezzük, hogy specifikusan kölcsönhatásba lépnek az IL—2R6val (p75; 20. és 88. pozíciók) és az IL-2Ra-val (Grimm és munkatársai szabadalmának benyújtásakor még nem ismert; 126. pozíció). Ennek következtében az IL-2Ra-val való kölcsönhatások változatlanok maradnak. Mechanikusan a Grimm és munkatársai által ismertetett muteinek csökkentett mértékű kölcsönhatásokat mutatnak az IL—2 nagy affinitású receptorral, de szükségszerűen nincs hatásuk az IL—2 közepes affinitású receptorra; a leírás során ismertetett muteinek ezzel ellenkező tulajdonságokkal rendelkeznek, jelentős hiányosságot mutatva az IL-2R6y közepes affinitású IL-2-receptorral való kölcsönhatási képességükben, míg kismértékű hiányosságot mutatnak vagy egyáltalán nem vagy mutatnak hiányosságot az IL-2Ra8y nagy affinitású IL-2-receptorral való funkcionális kölcsönhatásokban.
Az 5,206,344 lajstromszámú US szabadalom (Goodson és munkatársai) az IL—2 olyan muteinjeit ismerteti, amelyekben az IL—2 érett, természetes eredetű szekvenciájában egy aminosavat ciszteinnel helyettesítünk, majd a muteineket előállítjuk és a helyettesített ciszteinen keresztül polimerhez konjugáljuk, amely polimer az alábbiak bármelyike lehet: polietilénglikol homopolimerek vagy polioxietilált poliolok, amelyeknél a homopolimerek szubsztituálatlanok vagy egyik végükön alkilcsoporttal szubsztituáltak. Ezeket a muteineket az őket kódoló mutáns gének gazdaszervezetben történő expressziójával állították elő, amely géneket a szülöfehérjék génjeiből módosítottak helyspecifikus mutagenezis segítségével. Továbbá az IL—2 más fajtái is konjugálhatóak az érett IL—2 fehérje 125. pozíciójában található cisztein aminosavon keresztül, amely cisztein az IL—2 biológiai aktivitásához nem szükséges. Nem ismertettek olyan mutációkat, amelyek csökkentett toxicitást biztosítanának.
A 4,959,314 lajstromszámú US szabadalom (Lin és munkatársai) olyan biológiailag aktív fehérjék muteinjeit ismerteti, mint az IFN-β és az IL—2, amely muteinekben a biológiai aktivitáshoz nem lényeges ciszteineket eltávolították, vagy más aminosavakkal helyettesítették, hogy a molekulák közötti keresztkapcsolást létrehozó helyeket, vagy a nem megfelelő, molekulák közötti diszulfidhíd kialakulásának helyeit eltávolítsák. Ezeket a muteineket az azokat kódoló mutáns gének bakteriális expressziójával állították elő, amely géneket a szülöfehérjék génjeiből kiindulva szintetizálták oligonukleotidirányított mutagenezis segítségével. Nem ismertettek olyan mutációkat, amelyek csökkentett toxicitást biztosítanának.
Az 5,116,943 lajstromszámú US szabadalom (Halenbeck és munkatársai) ismerteti, hogy egy biológiailag aktív referenciaterápiás fehérje oxidáció elleni védelme megvalósítható olyan eljárással, amely során mindegyik, klóramin-T vagy peroxid oxidációra hajlamos metionin-aminosavat konzervatív aminosawal helyettesítünk, míg további, oxidációra nem hajlamos metionin-aminosavakat nem helyettesítünk. Az így előállított oxidációrezisztens mutein előnyösen interleukin-2 vagy interferon-β humán muteinje és a konzervatív aminosav legelőnyösebben alanin. Nem ismertettek olyan mutációkat, amelyek csökkentett toxicitást biztosítanának.
A 4,853,332 lajstromszámú US szabadalom (Mark és munkatársai) tárgyát olyan IFN-γ és IL—2 muteinek képezik, amelyekben a biológiai aktivitáshoz nem lényeges ciszteineket eltávolították vagy más aminosavakkal helyettesítették, hogy a molekulák közötti keresztkapcsolást létrehozó vagy a nem megfelelő molekulák közötti diszulfidhíd kialakulásának helyeit eltávolítsák. A szabadalmi bejelentés ismerteti, hogy az
HU 226 142 Β1
IL—2 cisztein-125 szerinnel történő szubsztitúciója olyan muteint eredményez, amely a természetes eredetű IL-2-vel összehasonlítható aktivitást mutat.
Az 5,696,234 lajstromszámú US szabadalom (Zurawski és munkatársai) tárgyát emlős citokinek muteinjei, továbbá emlős citokinek agonistáinak és antagonistáinak szkrínelésére szolgáló eljárások képezik. Közelebbről bemutatják, hogy a P82A/Q126D humán IL—2 dupla muteinantagonista aktivitással rendelkezik egéreredetű Baf3 sejtekkel szemben, amelyeket humán a- és β-IL—2R alegységekkel kotranszfektáltak. Kismértékű agonista aktivitást mutattak ki. Ugyanakkor az egéreredetű IL—2 muteinek esetében kimutatták, hogy részleges agonista és antagonista aktivitást mutatnak HT2 sejteken, közelebbről a Q141D, Q141K, Q141V és Q141L muteinek esetében. Nem ismertetnek olyan mutein aktivitásokat amelyek szelektív agonista hatást mutatnak vagy sugallnak a 20., 88. és 126. pozíciókban előforduló mutációk esetében.
Zurawksi és munkatársai olyan egéreredetű IL—2 muteineket ismertettek, amelyek rendelkeznek a következő tulajdonságokkal: IL-2RaPy-t expresszáló sejteken aktívak, míg IL-2Rpy-t expresszáló sejteken inaktívak [Zurawski: Trends Biotechnoi. 9 250 (1991); Zurawski és Zurawski: EMBO J. 11 3905 (1992)]. Az ilyen tulajdonságokat mutató egéreredetű IL—2 muteinekben a következő szubsztitúciók találhatók: Asp-34 szerinre vagy threoninra és Gln-141 lizinre. Az egér IL—2 esetében az Asp-34 és Gln-141 aminosavak látszólag egyenértékűeknek mutatkoznak - sorrendben megfeleltetve - a humán IL—2 Asp-20 és Gln141 aminosavakkal. Bár ezek a referenciák IL—2 muteinek „szelektív agonistáira hivatkoznak, nem ismertetik, hogy ezek kevésbé lennének toxikusak, hanem inkább azt emelik ki, hogy ezek lehetséges antagonistái az endogén IL-2-nek.
Zurawski és munkatársai az EP 0267 795 A2 lajstromszámú szabadalomban különböző egéreredetű IL—2 muteineket ismertetnek a szekvencián végig, belefoglalva olyanokat, amelyek az első harminc, biológiailag kompetens N-terminális aminosavszekvencián belül tartalmaz deléciókat és/vagy szubsztitúciókat, de nem foglalják bele, ismertetik vagy javasolják az itt közölt aminosavszubsztitúciókat az egyenértékű egér IL—2 aminosavaknál. Szükség van tehát olyan javított IL—2 molekulára, amely csökkentett toxicitással rendelkezik és szélesebb körben tolerált.
A 4,738,927 lajstromszámú US szabadalom (Taniguchi és munkatársai) tárgyát olyan rekombináns DNS képezi, amely tartalmaz egy IL—2 biológiai aktivitását hordozó polipeptidet kódoló rekombináns DNS-t, amelyben az aktivitás citotoxikus T-limfocita-sejtvonal növekedésének elősegítése és tartalmaz egy vektor DNS-t, amely képes prokarióta vagy eukarióta sejtben szaporodni, a fentebb említett gén kódolószekvenciája egy promoterszekvenciától 3'-irányban található pozícióban helyezkedik el, ahol a polipeptid összesen 132-134 aminosavat tartalmaz a polipeptid teljes aminosavszekvenciájában. A találmány tárgyát képezi továbbá egy gén, rekombináns DNS-vektorok, gazdasejtek és a természetes eredetű IL-2-rekombináns előállítására szolgáló eljárások. Taniguchi és munkatársai nem ismertetnek semmilyen változatot vagy muteint és a kitanításban nem térnek ki arra, hogy a fehérjében mely pozíciók felelősek a jelzési (signalling) vagy a kötődési aktivitásért.
A szakember számára egyértelmű, hogy olyan IL—2 muteinekre van szükségünk, amelyek nem mutatják a technika állása szerint ismert rekombináns IL—2 muteinek dóziskorlátozó toxicitását ahhoz, hogy ki tudjuk használni ezen citokin potenciáljának terápiás előnyeit.
A találmány tárgyát olyan humán IL—2 muteint tartalmazó polipeptid képezi, amelynek számozása a vad típusú IL-2 szerint történik és amelyben a humán IL—2 a 20., 88. vagy 126. pozíciók közül legalább az egyikben szubsztituált és ahol ennek következtében a mutein a T-sejtek aktiválását előnyben részesíti az NK-sejtek aktiválásával szemben. A találmány tárgyát képezi egy kevésbé toxikus IL—2 mutein, amely lehetővé teszi ezen interleukin nagyobb mértékű terápiás alkalmazását.
A találmány tárgyát képezik továbbá egyszeres mutációkat tartalmazó IL—2 muteinek, amelyeknél a mutáció helye aszparaginsav-20, aszparagin-88 és glutamin-126. A specifikus muteineket a D20X, N88X és Q126X jelölések képviselik, ahol „X” olyan specifikus aminosav, amelyet ha humán IL-2-be helyettesítünk, szelektív aktivitást biztosít az IL-2RaPy-receptort expresszáló sejteknek (mint például T-sejtek) előnyben részesítve ezeket az IL-2Rpy-receptort expresszáló sejtekkel szemben (mint például NK-sejtek). Az ezerszeresnél nagyobb szelektivitást mutató muteinek magukban foglalják a következőket: D20H, D20I, N88G, N88I, N88R és Q126L. Közelebbről meghatározva ezek a muteinek T-sejteken ugyanakkor lényegében vad típusú IL—2-aktivitást mutatnak. Azonosítottunk más olyan mutációkat is, amelyek ezerszeresnél kisebb de tízszeresnél nagyobb szelektivitást biztosítanak. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti muteineket kódoló polinukleotidok, a polinukleotidokat tartalmazó vektorok, transzformált gazdasejtek, a muteineket tartalmazó gyógyhatású készítmények és terápiás eljárások a muteinek alkalmazásával történő kezelésre.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás IL—2 muteinek kiválasztására vizsgálati eljárások során történő értékelésén keresztül, amelyekben IL-2RaPy-t hasonlítunk össze IL-2Rpy-vel, ahol egy IL—2 mutein aktivitását a vad típusú IL-2 aktivitásához viszonyítva az egyik vizsgálati eljárásban előnyösen megnöveljük a másik vizsgálati eljárással szemben. AZ IL-2Rapy és az IL—2Rpy az egyedi receptor alegység ektodomének megfelelő kombinációban és ezeket alkalmazzuk az IL-2 muteinek egyes receptorkomplexekhez történő kötődésének a közvetlen mérésére. Az IL-2apy vizsgálati eljárás egy IL-2apy-hordozó sejttípusból származó választ alkalmaz és az IL-2βγ vizsgálati eljárás egy IL-2Py-hordozó sejttípusból származó választ alkalmaz. Az IL-2aPy-hordozó sejt egy PHA-blaszt és az IL-2Py-hordozó sejt egy NK-sejt. A vizsgálati eljárás
HU 226 142 Β1 alapja proliferáció mind az IL-2a3y-hordozó sejttípusra és az IL-2Py-hordozó sejttípusra.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan vektor, amely a találmány szerinti muteint kódoló polinukleotidot tartalmaz és a vektor olyan humán IL—2 mutein expresszióját irányítja amely rendelkezik PHA-blasztsejt-aktiváló aktivitással, de csökkentett NK-sejt-aktiváló aktivitással rendelkezik és a vektor képes lehetővé tenni kívánt megcélzott élő szervezet transzfektálást és ennek következtében képes a polinukleotid által kódolt humán IL—2 mutein in vívó expressziójára.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás IL—2-vel kezelhető állapotban szenvedő páciens kezelésére olyan humán IL—2 mutein terápiásán hatékony mennyiségének bejuttatásával, amely rendelkezik PHA-blaszt-aktiváló aktivitással, de csökkentett NK-sejt-aktiváló aktivitást mutat és számozása a vad típusú IL—2 szerint történik. Ez az eljárás alkalmazható mindenütt, ahol az IL-2-vel kezelhető állapot a következők egyike: HÍV, rák, autoimmun betegség, fertőző betegség; IL—2 alkalmazható még rákvakcinában és hagyományos vakcinaterápiában vakcinaadjuvánsként, az idősekben vagy másképp legyengült immunrendszerű egyénekben immunstimulációra éppúgy, mint humán SCID páciensekben, vagy más terápiás alkalmazásokban, amelyek az immunrendszer stimulálását igénylik.
Az 1-7. ábrák mutatják be a dózis-hatás görbéket a következők esetében; vad típusú humán IL-2 (IL-2) és D20H (1. ábra), IL-2 és D20I (2. ábra), IL-2 és N88G (3. ábra), IL-2 és N88I (4. ábra), IL-2 és N88R (5. ábra), IL-2 és Q126E (6. ábra), valamint IL-2 és Q126L (7. ábra). A: IL-2 (teli körök) és mutein (üres körök) egyedi dózis-hatás görbéi a primer humán T-sejt-proliferációs vizsgálati eljárásban (PHA-blasztok). B: IL-2 (teli háromszögek) és mutein (üres háromszögek) egyedi dózis-hatás görbéi a primer humán NK-sejt proliferációs vizsgálati eljárásban.
8A-8D. ábrák: A PROLEUKIN™ csimpánzban mérhető toxieitását két állaton értékeltük ki (X-159: háromszögek és X-124: négyzetek) kontroll hordozóanyaggal összehasonlítva (X-126: rombuszok). A toxicitás értékelését veseparaméterek alapján [vér karbamid-nitrogén („Blood Urea Nitrogén, BÚN), A; kreatinin, B] és májfunkció alapján (összes bilirubin, C; ALT, D) végeztük.
A 9. ábra mutatja be a testsúly százalékos változását grafikon segítségével, 30 napon keresztül. Az IL-2/N88R (háromszögek), PROLEUKIN (négyzetek) vagy hordozóanyag (rombuszok) kezelt állatok testsúlyát a megjelölt napokon értékeltük.
10A-10D. ábrák: Az IL-2/N88R (háromszögek), PROLEUKIN (négyzetek) vagy hordozóanyag (rombuszok) kezelt állatok esetében a limfocitákat (A), összes fehérvérsejtet (B), neutrofileket (C) és vérlemezkéket (D) a megjelölt napokon értékeltük.
A-11D. ábrák: Az IL-2/N88R (háromszögek), PROLEUKIN (négyzetek) vagy hordozóanyag (rombuszok) kezelt állatok esetében a vér karbamid-nitrogént (A, BÚN), kreatinint (B), foszfort (C) és az anion hiányt („anion gap”) (D) a megjelölt napokon értékeltük.
12A-12D. ábrák: Az IL-2/N88R (háromszögek), PROLEUKIN (négyzetek) vagy hordozóanyag (rombuszok) kezelt állatok esetében az összes bilirubint (A), ALT-szintet (B), fibrinogént (C) és az aktivált protrombin időt (0) a megjelölt napokon értékeltük.
13A-13D. ábrák: Az IL-2/N88R (háromszögek), PROLEUKIN (négyzetek) vagy hordozóanyag (rombuszok) kezelt állatok esetében a vér nátriumszintjét (A), kloridionszintjét (B), kalciumszintjét (C) és káliumszintjét (D) a megjelölt napokon értékeltük.
14A-14C. ábrák: Az IL-2/N88R (háromszögek), PROLEUKIN (négyzetek) vagy hordozóanyag (rombuszok) kezelt állatok esetében az albuminszinteket a vérben (A), a hematokrit értékeket (B) és a hemoglobint (C) a megjelölt napokon értékeltük.
A 15A-15C. ábrák mutatják be az IL-2/N88R (négyzetek), PROLEUKIN (rombuszok) és hordozóanyag (háromszögek) hatását a teljes T-sejt-populációra (A, CD3+ sejtek), CD4+ T-sejt-populációra (B) és a CD8+ T-sejt-populációra (C).
A 16A-16C. ábrák mutatják be az IL-2/N88R (négyzetek), PROLEUKIN (rombuszok) és hordozóanyag (háromszögek) hatását a teljes T-sejt-populációra (A, CD3+ sejtek), CD4+ T-sejt-populációra (B) és a CD8+ T-sejt-populációra (C).
A 17. ábra mutatja be az IL-2/N88R és a PROLEUKIN hatását T-sejt-aktiválásra CD25 pozitív sejtek átlagfluoreszcenciája alapján. Az IL-2/N88R (négyzetek), PROLEUKIN (rombuszok) és hordozóanyag (háromszögek) hatását a CD3+CD4+ T-sejt-populációra jelezzük. CD3+/CD8+ sejtekből nem tudtunk előállítani megfelelő mennyiséget, hogy a populáció átlagfluoreszcenciáját kiértékelhessük.
A 18A-18D. ábrákon mutatjuk be az IL-2/N88R (négyzetek), PROLEUKIN (rombuszok) és hordozóanyag (háromszögek) hatását a CD4+ T-sejt-populációra (A, CD3+/CD4+ sejtek), a CD8+ T-sejt-populációra (B, CD3+/CD8+ sejtek), teljes T-sejt-populációra (C, CD3+ sejtek) és az NK-sejt-populációra (D, CD3-/CD16+ sejtek).
A 19. ábra tüdőmetasztázisok grafikonját mutatja be az alkalmazott dózis függvényében PROLEUKIN (üres körök) vagy IL-2/N88R
HU 226 142 Β1 (teli körök) kezelt egerekben. A tüdőmetasztázisokat a vizsgálat végén számoltuk össze.
A 20. ábra mutatja be a pBC1 IL2SA IL2N88R vektor plazmidtérképét.
A) Háttértanulmány
Az IL—2 hatását T-sejteken az IL-2-receptor fehérjékhez történő kötődés közvetíti. A T-sejteken különböző sejtfelszíni fehérjék kötik az IL-2-t. Az elsőnek azonosított fehérje egy önmagában álló 55 kDa nagyságú polipeptid (p55) - elnevezése IL-2Ra - amely T-sejtaktiválás esetén jelenik meg és eredetileg Tac („T-activation”, T-aktiválás) antigénnek nevezték. Az IL-2Ra az IL-2-t körülbelül 10-8 M Kd-érték mellett köti és úgy is ismert, mint a „kis affinitású” IL-2-receptor. IL—2 kötődése a csak IL-2Ra-t expresszáló sejtekhez nem vezet semmilyen kimutatható biológiai válaszhoz.
A második IL-2-receptor egy kötőkomplex, amely IL—2Rp-ből és IL—2Ry-ből áll; az IL—2Ry egy 64 kDa nagyságú polipeptid, amely úgy is ismert, mint a közös γ-lánc (yc), mivel számos citokinreceptorban megtalálható. Az IL-2RP körülbelül 70-75 kDa nagyságú polipeptid (különböző helyeken mint p70 vagy p75 néven ismert) és az I. típusú citokinreceptor-család tagja, amelyet a két cisztein/WSXWS részlet jellemez. Az IL-2Rp a yc-vel koordinált módon expresszálódik. Az IL—2 kötődési affinitása az IL-2Rpyc-hez nagyobb, mint az IL-2Ra-hoz, a Kd körülbelül 10-9 M; és úgy is ismert, mint a „közepes affinitású” IL-2-receptor. Az IL—2 az IL—2Rpyc-t expresszáló sejtek növekedését okozza, a félmaximális növekedés stimuláció az IL—2 ugyanazon koncentrációjánál fordul elő, mint amely a félmaximális kötődést eredményezi (azaz 1*10“9 M). Az IL-2RPyc megegyezik azzal a szignálreceptor komplexszel, amely képes az IL—15-höz kötődni.
A harmadik ismert IL-2-receptor komplex az IL-2RaPyc komplex. Olyan sejtek, amelyek mind az IL-2Ra-t, mind az IL—2Rpyc-t expresszálják, sokkal erősebben képesek az IL-2-t kötni, körülbelül 10-11 M Kd-értékkel, így ezt mint „nagy affinitású” komplexet is ismerik. Az ilyen sejtek növekedésének stimulációja ennek megfelelően alacsony IL-2-koncentrációnál már bekövetkezik. Mind az IL—2 kötődése, mind a növekedés stimulálása blokkolható IL—2Rot, IL—2Rp vagy yc ellenes antitestekkel, leghatékonyabban több receptor alegység elleni antitestek kombinációjával. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az IL-2Ra komplexet képez az IL-2RPyc-vel, megnövelve a szignálreceptor IL-2-affinitását, és ezáltal jelentősen alacsonyabb IL-2-koncentrációknál lehetővé teszi a növekedési szignál átvitelét. Feltételezzük, hogy az IL—2 először gyorsan kötődik az IL-2Ra-hoz, és ez megkönnyíti az asszociációt az IL-2Rpyc-vel. Nyugalomban lévő T-sejtek expresszálják az IL—2Rpyc-t, de csak kis mennyiségű IL-2Ra-t; a felületen expresszált IL-2Ra mennyiségének megnövekedését IL—2-vel stimulálhatjuk. Antigénreceptor-közvetített T-sejt-aktiválást követően az IL-2Ra gyorsan expresszálódik, ezáltal csökkentve a növekedés stimulációhoz szükséges IL—2koncentrációt. Az IL—2 kötődése az IL-2RaPyc komplexhez szignálátvitelt eredményez Jak/STAT szignálátviteli reakcióúton keresztül.
Felfedeztünk olyan humán IL—2 muteineket, amelyek a természetes killer- („natural killer”, NK) sejtekkel (az IL—2RPy közepes affinitású IL-2-receptort expresszáló sejtek) szemben preferáltan T-sejteket aktiválnak (PHA-blasztok; az IL-2RaPy nagy affinitású IL—2receptort expresszáló sejtek). Olyan muteinek, amelyekben az Asp-20 aminosavat hisztidinnel (D20H) vagy izoleucinnal (D20I); az Asn-88 aminosavat argininnel (N88R), glicinnel (N88G) vagy izoleucinnal (N88I) vagy a Gln-126 aminosavat leucinnal (Q126L) vagy glutaminsawal (Q126E) helyettesítik, nem vártan teljes IL—2-aktivitást mutatnak PHA-blasztokon és kismértékű aktivitást (ha van egyáltalán) mutatnak NK-sejteken. A humán IL—2 muteinek korábbi vizsgálatai az analízisnél egéreredetű sejtrendszerre támaszkodtak és amikor humán sejteket használtak fel, nem alkalmaztak csak IL—2Rpy-t expresszáló sejteket (mint például NK-sejtek). Továbbá, a humán PHA-blasztokat alkalmazó vizsgálatok kimutatták, hogy az Asp-20 aminosav leucinnal, argininnal, aszparaginsawal vagy lizinnel való szubsztitúciója [Xu és munkatársai: Eur. Cytokine Netw. 6 237 (1995)]; vagy a Gln-126 aminosav aszparaginsawal történő szubsztitúciója [Buchli és Ciardelli: Arch. Biochem. Biophys. 307(2) 411 (1993)] súlyosan csökkent aktivitású humán IL—2 muteineket eredményez. Egér IL-2-t alkalmazó korábbi vizsgálatok különböző aktivitású egér IL—2 muteineket azonosítottak [Zurawski és munkatársai: EMBO J. 12 5113 (1993)], de az ezen eredményeket adó mutációk egyike sem sugallta az itt leírt munka során azonosítottakat. Az egéreredetű IL—2 muteinekkei szinonim pozícióban azonos mutációkat tartalmazó humán IL—2 muteinek nem mutatnak hasonló aktivitásokat, és ezáltal azt sugallják, hogy az egéreredetű példák nem tudják előre jelezni a humán esetek funkcionalitását. A feltalálók nem találkoztak olyan, humán IL—2 muteinekkei végzett vizsgálatokkal, amelyek során az IL-2Rapy IL-2-receptort expresszáló humán sejteken (mint például PHA-blasztok) mutatott aktivitást és az IL-2Rpy IL-2-receptort expresszáló sejteken (mint például NK-sejtek) mutatott aktivitást hasonlították össze. Feltételezésünk szerint az in vivő analízis igazolni fogja, hogy az ismertetett muteinek a vad típusú humán IL—2vel összevetve nagyobb terápiás indexet mutatnak a toxicitás csökkenése következtében, így terápiásán jól alkalmazható vegyületeket biztosítanak az immunrendszer stimulálását igénylő rendellenességek kezelésére.
Az interleukin-2 (IL—2) jelenleg alkalmazásra kerül a klinikai gyakorlatban metasztázisos veserák kezelésére. Azonban súlyos toxicitása alkalmazását a legegészségesebb páciensek alcsoportjára korlátozza és a dózist korlátozó toxicitásról feltételezhető, hogy csökkenti az összességében vett hatékonyságát. Az IL—2 akut toxicitása feltételezhetően az NK-sejtek aktiválásán keresztül jön létre, míg a hatékonyságot a T-sejtek közvetlen aktiválása biztosítja [Jacobson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 10405 (1996); Smith: Blood 81 1414 (1993); Káplán és mun6
HU 226 142 Β1 katársai: Biotechnology 10 157], A T-sejtek az IL-2-höz más receptort expresszálnak mint az NK-sejtek (T-sejtek: IL-2RaPy, a nagy affinitású IL-2-receptor; NK-sejtek: IL-2Rpy, a közepes affinitású IL-2-receptor). Az itt ismertetett humán IL—2 muteinek szelektíven a T-sejt IL-2-receptort aktiválják, és nem aktiválják az NK-sejt IL-2-receptort.
Az IL-2-vel végzett alacsony dózisú terápiát némi sikerrel alkalmazták az NK-sejtek közvetlen aktiválásának kikerülésére [Jacobson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 10405 (1996)]. Ez a stratégia azon az elven alapszik, hogy alacsony IL-2-dózisoknál csak a nagy affinitású IL-2-receptor aktiválódik a közepes affinitású IL-2-receptor kizárásával. Az IL—2Ρβγ-ί, az IL-2-receptor közepes affinitású formája az NK-sejteken kerül expresszióra, míg a T-sejtek a nagy affinitású formát, az IL-2RaPy-receptort expresszálják.
Azonban a feltalálók a toxicitás problémáját más oldalról közelítették meg. Feltételeztük, hogy az IL—2, valamint az IL—2Rp és/vagy az IL-2Ry között létrejövő kölcsönhatás a specifikus kötő aminosavak megfelelő megváltoztatásával az IL—2-kötödési felszínén megszüntethető, hogy ezzel megakadályozzuk a hatékony kötődést (és így az aktiválást) olyan sejtek esetében, amelyek csak IL—2Rpy-t expresszálnak. Azonban az IL-2RaPy-t expresszáló sejtek esetében az IL-2Rahoz történő kezdeti kötődés, így a sejthez való kötődés még mindig létrejön és ezzel a Jacobs és munkatársai által javasolt alacsony dózisú terápia még mindig mutathat toxikus mellékhatásokat. Az IL-2Ra-hoz való kötődés segítségével az IL-2Rp és az IL-2Ry hatékony begyűjtése megtörténhet a sejt felszínén a módosított IL—2 IL-2Rp-val és/vagy IL-2Ry-val létrejövő, csökkentett mértékű kölcsönhatása ellenére. így kialakulhat egy szignálkompetens IL-2/IL-2RaPy komplex. Feltételezzük, hogy egy, a nagy affinitású IL-2-receptorokat T-sejteken az NK-sejteken található közepes affinitású IL-2-receptorokkal szemben szelektíven aktiválni képes IL—2 változat a vad típusú IL-2-hez képest megnövekedett terápiás indexszel rendelkezhet a csökkentett toxicitási profil következtében. Egy megnövekedett terápiás indexszel rendelkező IL—2 változatnak jelentősen megnövekedhetne az alkalmazási területe mind a rák kezelésében (mint közvetlen és/vagy kiegészítő terápia), mind immunhiány kezelésében (mint például HÍV és tuberkulózis). Az IL—2 más lehetséges alkalmazásai az immunstimuláló aktivitásából következnek és a rák közvetlen kezelésén kívül magukban foglalják a következőket: immunhiány, mint például HÍV vagy humán SCID páciensek kezelését: fertőző betegség, mint például tuberkulózis kezelését; adjuvánsként történő alkalmazást „rákvakcina” stratégiákban; valamint immunrendszeri stimulánsként történő alkalmazásokat, mint például hagyományos vakcinálási protokollok javítását vagy az idősek kezelésében történő alkalmazásokat.
Az Asp-20, Asn-88 vagy Gln-126 pozíciókban a megfelelő szubsztitúció csökkentette az IL—2Rp (Asp-20 és Asn-88) vagy az IL-2Ry (Gln-126) kötődési kölcsönhatásokat. Az ilyen szubsztitúciók végső eredménye olyan IL—2 muteinek létrehozása volt, amelyek megőrizték az aktivitást humán T-sejtekkel szemben és csökkentett aktivitást mutattak humán NK-sejtekkel szemben.
Nem volt lehetőség arra, hogy megjósoljuk egy adott szubsztitúció hatását a T- és NK-sejt vizsgálati eljárásokban történő kiértékelés előtt, tehát az Asp-20, Asn-88 és Gln-126 pozíciókban elvégeztük az összes lehetséges természetes aminosavhelyettesítést (a cisztein kivételével) és létrehoztunk egy korlátozott de változatos mutációkészletet az Asp-84 pozícióban annak megvizsgálására, hogy ezek valóban kölcsönhatásba lépnek-e az IL-2Rp-vel. További mutációkat vizsgálunk meg az Asp-84 pozícióban, ha az IL-2RP kölcsönhatások észlelhető jelenségeit figyeljük meg. Ezen pozíciók esetében negyvenhat különböző szubsztitúció adatait adjuk meg az 1. táblázatban, lásd alább.
A mutációkat vad típusú humán IL—2 cDNS-en végzett helyspecifikus mutagenezis segítségével juttattuk be. A megfelelő kiónokat heterológ rendszerben történő [mint például E. coli, baculovírus, élesztő- vagy emlőssejtek, mint például kínai hörcsög petefészek („Chinese Hamster Ovary”, CHO) sejtek] expresszióra alkalmas expressziós vektorba szubklónoztuk. A tisztított fehérjéket T-sejt- (PHA-blaszt) proliferációs és NK-sejt proliferációs vizsgálati eljárásokban vizsgáltuk. Az ezen vizsgálati eljárások összevetésével az egyedi muteinek által létrehozott különböző válaszok - mint például EC50-érték - olyan mutációkat jelöltek ki, amelyek ezeket az aktivitásokat befolyásolni képesek. Közelebbről meghatározva azok a muteinek amelyek viszonylag erősebb választ stimulálnak a PHA-blaszt (T-sejt) vizsgálati eljárásban (vad típusú IL-2-vel szemben) az NK-sejt vizsgálati eljárásban kapott válaszhoz viszonyítva (vad típusú IL-2-vel szemben) olyan szubsztitúciókat sugallnak, amelyek sejtspecifitást biztosítanak a specifikus muteinek azon képessége alapján, hogy képesek ezen sejteken expresszált IL-2Rapy-hez kötődni és azt aktiválni, de nem képesek kötődni és így nem képesek aktiválni a csak IL-2Rpy-t expresszáló sejteket. Az ilyen jellegzetességet mutató IL—2 muteinek így in vivő rendelkezni fognak IL—2 immunstimuláló tulajdonságokkal, az IL-2-terápiához társuló toxikus hatások - vaszkuláris áteresztés és hipotenzió - csökkentése mellett.
B) Definíciók
Az ismertetett rekombináns fehérje előállítására alkalmazott CHO-sejtvonalat 1999. május 5-én letétbe helyeztük az ATCC-nél (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, Egyesült Államok) katalógusszám alatt. Mivel a hivatkozott törzs a Budapesti Egyezmény előírásai szerint kerül fenntartásra, ez a törzs elérhető bármely, a Budapesti Egyezményt aláíró szabadalmi hivatal számára.
A leírás szerint „vad típusú IL-2” kifejezés alatt olyan IL-2-t értünk - akár természetes, akár rekombináns eredetű -, amely a természetes eredetű humán IL—2 133 természetben előforduló aminosavból álló szekvenciájával rendelkezik (leszámítva a szignálpep7
HU 226 142 Β1 tidet, amely további 20 N-terminális aminosavat tartalmaz) és amelynek aminosavszekvenciáját Fujita és munkatársai ismertették [Fujita és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 7437 (1983)], egy további N-terminális metioninnal vagy anélkül, amelyet szükségszerűen tartalmaz amennyiben a fehérjét E. coliban intracelluláris frakcióként expresszáljuk.
A leírás szerint az „IL-2 mutein” kifejezés alatt olyan polipeptidet értünk, amely esetében az érett, humán interleukin-2 fehérjén specifikus szubsztitúciókat végeztünk. Az 1. táblázat - lásd alább - negyvenhat egyedi, általunk előállított szubsztitúciós IL—2 muteint és ezek megfelelő relatív aktivitási adatait mutatja be. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint eljárva olyan muteineket alkalmazunk, amelyek legalább százszoros relatív aktivitással rendelkeznek. A találmány különösen előnyös megvalósítási módjai szerint eljárva a következő muteineket alkalmazzuk: ezerszeresnél nagyobb relatív aktivitást mutató muteinek: aszparaginsav (Asp) aminosav (D) a 20. pozícióban (D20) - a vad típusú IL—2-vel megegyező számozás szerint jelölve - izoleucinnal (D20I) vagy hisztidinnel (D20H) szubsztituálva; az aszparagin (Asn) aminosav a 88. pozícióban (N88) izoleucinnal (N88I), glicinnel (N88G) vagy argininnel (N88R) helyettesítve; és a glutamin (Gin) aminosav a 126. pozícióban (Q126) leucinnal (Q126L) vagy glutaminsawal (Q126E) vagy aszparaginsawal (Q126D) szubsztituálva. Az előnyösen alkalmazható IL—2 muteinek az aminosavszekvenciája a többi, nem szubsztituált aminosavnál megegyezik a vad típusú IL—2 szekvenciájával. Azonban a találmány szerinti IL—2 muteinek jellemezhetőek még aminosav inszerciókkal, deléciókkal, szubsztitúciókkal és módosításokkal egy vagy több helyen a természetes eredetű IL—2 polipeptidláncban vagy a polipeptidlánc egyéb helyein is. A találmány szerint bármely ilyen inszerció, deléció, szubsztitúció és módosítás olyan IL—2 muteint eredményezhet, amely PHA-blaszt-szelektív aktivitást biztosít, míg NK-sejtek aktiváló képessége csökkentett; ezen muteinek mindegyike az igényelt oltalmi körön belüli.
A fentebb leírt előnyösen alkalmazható vagy különösen előnyösen alkalmazható szubsztitúciókat egyetlen rekombináns IL-2-molekulába kombinálva olyan kombinációs mutánsokhoz juthatunk, amelyek aktivitása hasonló lehet az itt ismertetett egyszeres mutánsok aktivitásához, fgy például feltételezhető, hogy az 1. táblázatból kiválasztott két vagy több mutáció kombinációját tartalmazó IL-2-molekula olyan T-sejt-szelektív IL-2-agonista lehet, amely hasonló relatív aktivitással rendelkezik mint az ismertetett egyszeres szubsztitúciók relatív aktivitása. A kombinációs mutánsok mindegyike az igényelt oltalmi körön belüli.
Előnyösen az IL—2 más pozícióiban konzervatív módosításokat és szubsztitúciókat alkalmazunk (azaz olyan módosításokat és szubsztitúciókat, amelyeknek minimális hatása van a mutein másodlagos vagy harmadlagos szerkezetére). Az ilyen konzervatív szubsztitúciók magukban foglalják a Dayhoff és Argos által ismertetett eseteket [Dayhoff: The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978); Argos: EMBO J. 8 779 (1989)]. így például az alábbi csoportokon belüli aminosavak cseréje konzervatív változtatásokat jelent:
- Alá, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Thr;
- Cys, Ser, Tyr, Thr;
- Val, Ile, Leu, Met, Alá, Phe;
- Lys, Arg, His;
- Phe, Tyr, Trp, His; és
- Asp, Glu.
Hasonlóképpen előnyösen olyan módosítások vagy szubsztitúciókat alkalmazunk, amelyek nem juttatnak be további intermolekuláris keresztkötéseket vagy nem megfelelő diszulfidhíd kialakulását biztosító helyeket. Például az IL-2 esetében ismert, hogy három ciszteint tartalmaz a vad típus 58., 105. és 125. pozícióiban az érett szekvenciában.
A leírás során a „vad típusú IL-2 szerint számozott” kifejezés alatt oly módon azonosított aminosavat értünk, amelyet a vad típusú IL-2 érett szekvenciájában természetes körülmények között elfoglalt pozíciójával azonosítunk. Ahol inszerciókat vagy deléciókat hajtunk végre az IL-2 muteinen, a szakember számára egyértelmű, hogy a természetes körülmények között a 20. pozícióban előforduló aszparaginsav pozíciója változhat a muteinben. Azonban az elmozdult aszparaginsav helye egyértelműen meghatározható a határoló aminosavak vizsgálatával és összehasonlítás útján a vad típusú IL-2 esetében az aszparaginsavat határoló aminosavakkal.
A leírás során az „IL-2Rapy-receptorral rendelkező sejttípusok kifejezés alatt olyan sejteket értünk, amelyekről ismert, hogy rendelkeznek ezzel a receptortípussal, azaz T-sejtek, aktivált T-sejtek, B-sejtek, aktivált monociták és aktivált NK-sejtek lehetnek. Az „IL-2Rpy-receptorral rendelkező sejttípusok kifejezés alatt olyan sejteket értünk, amelyekről ismert, hogy rendelkeznek ezzel a receptortípussal, azaz B-sejtek, nyugalomban lévő monociták és nyugalomban lévő NK-sejtek lehetnek.
A találmány szerinti IL-2 muteinek bármely megfelelő, a technika állása szerint ismert eljárással előáll íthatóak. Ilyen eljárások közé tartozik a találmány szerinti IL-2 muteineket kódoló DNS-szekvenciák létrehozása és ezen szekvenciák expresszálása egy megfelelően transzformált gazdaszervezetben. Ez az eljárás létrehozza a találmány szerinti rekombináns muteineket. Azonban a találmány szerinti muteinek előállíthatók - bár kevésbé előnyös módon eljárva - kémiai szintézissel vagy kémiai szintézis és rekombináns DNStechnológla kombinációjával. Szakaszos termelési vagy perfúziós termelési eljárások általában a technika állása szerint ismertnek tételezhetők fel. [lásd például: Freshey (szerk.): Animál Cell Culture: A Practical Approach, 2. kiadás, IRL Press, Oxford, Anglia (1992); Mather: Methods Cell Biology 57 219 (1998); Hu és Aunins: Curr. Opin. Biotechnoi. 8 148 (1997); Konstantinov és munkatársai: Biotechnoi. Prog. 12 100 (1996)].
A találmány egy megvalósítási módja szerint eljárva rekombináns eljárást alkalmazunk a találmány szerinti mutein előállítására, amelynek során egy DNS8
HU 226 142 Β1 szekvenciát szerkesztünk meg vad típusú IL-2-t kódoló DNS-szekvencia izolálásával vagy szintetizálásával, majd az Asp-20 kodonját izoleucin (I) kodonjára cseréljük helyspecifikus mutagenezis segítségével. Ez a módszer a technika állása szerint jól ismertnek tételezhető fel [lásd például: Mark és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 5662 (1984), valamint a 4,588,585 lajstromszámú US szabadalom, amely teljes egészében a kitanítás részének tekintendő].
A találmány szerinti IL—2 muteineket kódoló DNSszekvenciák előállítására egy másik eljárás lehet a kémiai szintézis. Ez például magában foglalja egy peptid közvetlen szintézisét kémiai módszerekkel, amelyek a találmány szerinti tulajdonságokat mutató IL—2 muteint kódoló fehérjeszekvencián alapszanak. Ez az eljárás beépíthet mind természetben előforduló, mind nem természetes aminosavakat az IL-2Rp és az IL—2Ry IL—2vel való kölcsönhatását befolyásoló pozíciókban. Egy más módon eljárva, a kívánt IL—2 muteint kódoló gént megszintetizálhatjuk kémiai eljárásokkal, oligonukleotidszintetlzátor alkalmazásával. Az ilyen oligonukleotidokat a kívánt IL—2 mutein aminosavszekvenciája alapján tervezzük meg és előnyösen azokat a kodonokat választjuk, amelyek a gazdasejtben - ahol a rekombináns muteint fogjuk termelni - előnyben részesülnek. E szempontból jól ismert, hogy a genetikai kód degenerált - azaz egy aminosavat több mint egy kodon kódolhat. Például a fenil-alanint (F) két kodon kódolja, a TTC vagy TTT, a tirozint (Y) a TAC vagy TAT kodonok kódolják és a hisztidint (H) a CAC vagy CAT kodonok kódolják. A triptofánt (W) egyetlen kodon kódolja, a TGG. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy egy bizonyos IL—2 muteint kódoló adott DNS-szekvencia esetében számos degenerált DNS-szekvencia található, amely ugyanazt az IL—2 muteint kódolja. Például nyilvánvaló, hogy az 1. azonosító szám szerinti szekvenciában bemutatott előnyös D20I mutein DNS-szekvencia mellett létezik számos olyan degenerált DNS-szekvencia, amely a bemutatott IL—2 muteint kódolja. Ezek a degenerált DNS-szekvenciák az igényelt oltalmi körön belülik. Ebből következik, hogy a „degenerált változatai” kifejezés a találmány keretei között az összes olyan DNS-szekvenciát jelenti, amely egy adott muteint kódol és ezáltal lehetővé teszi annak expresszióját.
A találmány szerinti IL—2 muteint kódoló DNS-szekvencia - függetlenül attól, hogy helyspecifikus mutagenezissel, kémiai szintézissel, vagy más eljárással készült - tartalmazhat vagy nem tartalmaz olyan DNSszekvenciákat is, amelyek szignálszekvenciát kódolnak. Az ilyen szignálszekvencia - amennyiben jelen van - olyan legyen, amit az IL—2 mutein expressziójára kiválasztott sejt felismerni képes. Az ilyen szignálszekvencia lehet prokarióta, eukarióta, vagy a kettő kombinációja. A szignálszekvencia a természetes körülmények között előforduló IL—2 szignálszekvenciája is lehet. A szignálszekvencia alkalmazása attól függ, kívánjuk-e az IL-2 mutein kiválasztását az előállítására alkalmazott rekombináns sejtekből. Ha a kiválasztott sejtek prokarióták, általánosságban előnyös, ha a DNSszekvencia nem kódol szignálszekvenciát. Amennyiben a kiválasztott sejtek eukarióták, általánosságban előnyös egy szignálszekvencia kódolása és legelőnyösebben a vad típusú IL-2 szignálszekvenciát alkalmazzuk.
Standard eljárások alkalmazhatóak a találmány szerinti IL-2 muteint kódoló gén szintetizálására. Például a teljes aminosavszekvencia alkalmazható egy visszafordított („back-translated) gén megszerkesztésére. Szintetizálhatunk IL-2 muteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS oligomert is. Például számos, a kívánt polipeptid részeit kódoló kis oligonukleotidot szintetizálhatunk, majd azokat ligálhatjuk. Az egyes oligonukleotidok általánosságban 5’- vagy 3’- átfedéseket tartalmaznak komplementer összeillesztéshez.
Miután szintézissel, helyspecifikus mutagenezissel vagy más eljárással összeillesztettük a találmány szerinti IL-2 muteint kódoló DNS-szekvenciákat, ezt expressziós vektorba illesztjük és funkcionálisan egy expressziót szabályozó szekvenciához kapcsoljuk, amely alkalmas az IL-2 mutein expressziójára a kívánt transzformáit gazdaszervezetben. A megfelelő összeillesztést alátámasztható nukleotid szekvenálással, restrikciós térképezéssel és egy biológiailag aktív polipeptid expressziójával a megfelelő gazdaszervezetben. A technika állása szerint jól ismert, hogy egy transzfektált gén magas expressziós szintjeinek eléréséhez a gazdaszervezetben a gént funkcionálisan transzkripciós és transzlációs expressziós szabályozószekvenciákhoz kell kapcsolnunk, amelyek a kívánt expressziós gazdaszervezetben működőképesek.
Az expressziót szabályozó szekvencia és expressziós vektor kiválasztása függ a kiválasztott gazdaszervezettől. Az expressziós gazdaszervezet/vektor kombinációk széles skáláját alkalmazhatjuk. Eukarióta gazdaszervezetek esetében a jól alkalmazható expressziós vektorok például magukban foglalnak olyan vektorokat, amelyek SV40-ből, marha-papillomavírusból, adenovírusból és citomegalovírusból származó expressziós szabályozószekvenciákat tartalmaznak. Bakteriális gazdaszervezetek esetében a jól alkalmazható expressziós vektorok magukban foglalják a következőket: ismert bakteriális plazmidok, mint például E. coliból származó plazmidok, beleértve a col E1-, pCR1-, pER32z-, pMB9-plazmidokat és származékaikat: szélesebb körben alkalmazható gazdaszervezetspecifitású plazmidok, mint például RP4, fág DNS-ek, mint például a lambda fág számos származéka, mint például NM989 és más DNS-fágokat, mint például az M13 és filamentózus egyláncú DNS-fágokat. Élesztősejtek esetében a jól alkalmazható expressziós vektorok magukban foglalják a 2p-plazmidot és annak származékait. Rovarsejtek esetében a jól alkalmazható vektorok magukban foglalják a pVL 941-plazmidot. Előnyösen alkalmazható a pFastBac™ 1 plazmid (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), [Cate és munkatársai: Cell 45 685(1986)].
Továbbá az expressziós szabályozószekvenciák széles skáláját alkalmazhatjuk ezekben a vektorokban. Az ilyen jól alkalmazható expressziós szabályozószekvenciák magukban foglalják az előbbiekben ismertetett
HU 226 142 Β1 expressziós vektorok struktúrgénjeihez társuló expressziós szabályozószekvenciákat. A jól alkalmazható expressziós szabályozószekvenciákra például szolgálhatnak a következők: az SV40 vagy az adenovírus korai és késői promoterei, a lac rendszer, a trp rendszer, a TAC vagy TRC rendszer, a lambda fág fő operátorés promoterrégiói, mint például PL, az fd burokfehérje szabályozórégiói, a 3-foszfoglicerát-kináz vagy más glikolitikus enzimek promoterei, a savas foszfatáz promoterei, mint például PhoA, élesztő α-párosodási rendszerének promoterei, a Baculovirus poliéder promotere és további olyan szekvenciák, amelyekről ismert, hogy prokarióta vagy eukarióta sejtek génjeiben vagy vírusaikban gének expresszióját szabályozzák, illetve az előbb felsoroltak különböző kombinációi.
Bármely megfelelő gazdaszervezet alkalmazható a találmány szerinti IL—2 muteinek előállítására, beleértve baktériumokat, gombákat (beleértve az élesztőket), növényi, rovar, emlős vagy más megfelelő állati sejteket vagy sejtvonalakat szintúgy, mint transzgénikus állatokat vagy növényeket. Közelebbről meghatározva, ezek a gazdaszervezetek magukban foglalhatnak jól ismert eukarióta és prokarióta gazdaszervezeteket, mint például E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces törzseket; gomba-, élesztő-, rovarsejteket mint például Spodoptera frugiperda (Sf9), állati sejteket, mint például kínai hörcsög petefészek sejtek (CHO) és egérsejtek, mint például NS/O, afrikai zöld majom sejtek, mint például COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 és BNT 10 valamint humán sejteket szintúgy, mint növényi sejteket szövettenyészetben. Állati sejtben expresszióra előnyösen alkalmazhatók a CHO-sejtek és a COS 7 sejtek tenyészetekben és különösen előnyösen alkalmazható a CHO (DHFR-) CHO-sejt-sejtvonal vagy a HKB-sejtvonal.
Természetesen feltételezhető, hogy az összes vektor és expressziós szabályozószekvencia nem képes egyformán jól működni a leírás szerinti DNS-szekvenciák expresszálása során. Szintén feltételezhető, hogy az összes gazdaszervezet nem képes egyformán jól működni ugyanazon expressziós rendszerrel. Azonban a szakember felesleges kísérletezés nélkül képes kiválasztani a megfelelőket ezen vektorok, expressziós szabályozószekvenciák és gazdaszervezetek közül, így például egy vektor kiválasztása során figyelembe kell venni a gazdaszervezetet, mivel a vektor szükségszerűen képes replikációra ezekben a gazdaszervezetekben. Szintén figyelembe kell venni a vektor kópiaszámát, a kópia szám szabályozhatóságát és a vektor által kódolt más fehérjék - mint például antibiotikum markerek - expresszióját. így például a találmány szerint előnyösen alkalmazható vektorok közé tartoznak azon vektorok, amelyek lehetővé teszik az IL—2 muteineket kódoló DNS kópiaszámának amplifikációját. A technika állása szerint az ilyen amplifikálható vektorok jól ismertnek tételezhetők fel. Az ilyen vektorok például magukban foglalják a DHFR amplifikációval [lásd például: Kaufman: 4,470,461 lajstromszámú US szabadalom; Kaufman és Sharp: Mól. Cell. Bioi. 2 1304 (1982)] vagy glutaminszintetáz-amplifikációval („GS”) [lásd például: 5,122,464 lajstromszámú US szabadalom és 338,841 azonosító számú közzétett európai szabadalmi bejelentés] amplifikálható vektorokat.
Expressziószabályozó szekvencia kiválasztása során szintén számos tényezőt kell figyelembe venni. Ezek például magukban foglalják a szekvencia viszonylagos erősségét, annak szabályozhatóságát és kompatibilitását a találmány szerinti IL—2 muteint kódoló tényleges DNS-szekvenciával, különösen a potenciális szekunder struktúrák vonatkozásában. A gazdaszervezetek kiválasztásánál a kiválasztott vektorral való kompatibilitásukat, a találmány szerinti DNS-szekvenciák által kódolt termék toxicitását, azok kiválasztási jellemzőit, képességüket a polipeptidek helyes feltekeredésének biztosítására, fermentációs vagy tenyésztési szükségleteiket és a DNS-szekvenciák által kódolt termékek tisztításának egyszerűségét is figyelembe kell venni.
Ezen paramétereken belül a szakember számos vektor/expressziőszabályozó szekvencia/gazdaszervezet kombinációt választhat ki, amelyek a kívánt DNSszekvenciákat expresszálni képesek fermentáció során vagy nagyléptékű állati sejttenyészetekben, például CHO-sejteket vagy COS 7 sejteket alkalmazva.
A találmány szerint előállított IL—2 muteinek lehetnek glikoziláltak vagy nem glikoziláltak a mutein előállítására szolgáló gazdaszervezettől függően. Ha baktériumokat alkalmazunk gazdaszervezetként, az előállított IL—2 mutein nem lesz glikozilált. Eukarióta sejtek azonban glikozilálják az IL—2 muteineket, bár lehet, hogy nem ugyanolyan módon mint ahogy a természetes IL—2 glikozilált. A transzformált gazdaszervezet által termelt IL—2 mutein bármely megfelelő eljárás szerint tisztítható. A technika állása szerint különböző eljárások ismertek IL—2 tisztítására. Lásd például: Current Protocols in Protein Science, 2. kötet, Coligan, Dunn, Ploehg, Speicher, Wingfield (szerk.) Unit 6.5, Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc. Előnyösen az újrafeltekeredést E. coliban termeltetett inklúziós testekből hajtjuk végre, vagy egy kívánt muteint termelő, akár emlős vagy élesztőtenyészetekből származó kondicionált táptalajból állítjuk elő kationcserélő, gélszűréses és/vagy fordított fázisú folyadékkromatográfia alkalmazásával. Lásd az 1. példát (E. coli) és a 10. példát (CHO-sejt-perfúzió) esetében, az alábbiakban.
A találmány szerinti IL—2 muteinek biológiai aktivitását a technika állása szerint ismert bármely megfelelő eljárás segítségével vizsgálhatjuk. Ilyen vizsgálati eljárások magukban foglalják a PHA-blaszt proliferációt és az NK-sejt proliferációt. A megfelelő aktivitású muteineket - azaz az IL-2Rapy-receptoron teljesen aktív és az IL-2RPy-receptort hordozó sejteken csökkent aktivitással rendelkező muteineket - a két vizsgálati eljárás alkalmazásával bizonyítjuk. Egy mutein „relatív aktivitását” a vad típusú IL-2-hez viszonyítva mérjük és amint a példákban részletesebben ismertetjük, a relatív aktivitás értékét a PHA-blaszt-proliferáció aktivitásának és az NK-sejt proliferáció aktivitásának az aránya adja.
A találmány szerinti IL—2 muteint a vad típusú természetes eredetű vagy rekombináns IL-2-terápiában
HU 226 142 Β1 alkalmazott dózisával körülbelül megegyező vagy annál nagyobb dózisban adhatjuk be. Előnyösen az IL-2 mutein hatékony mennyiségét adjuk be. A „hatékony mennyiség” kifejezés alatt olyan mennyiséget értünk, amely képes megakadályozni vagy csökkenteni a kezelt állapot vagy alkalmazás súlyosságát vagy terjedését. A szakember számára egyértelmű, hogy az IL-2 mutein hatékony mennyisége - többek között függ a betegségtől, a dózistól, az IL-2 mutein beadási rendjétől, attól, hogy az IL-2 muteint egyedül vagy más terápiás ágensekkel kombinálva adjuk be, a készítmény szérumfelezési idejétől és a páciens általános egészségi állapotától.
Az IL-2 muteint előnyösen farmakológiailag elfogadható hordozót is tartalmazó készítményben adjuk be. A „farmakológiailag elfogadható hordozó” kifejezés alatt olyan hordozót értünk, amely a páciensekben akiknek beadják - nem vált ki semmilyen káros hatást. A technika állása szerint ilyen farmakológiailag elfogadható hordozók jól ismertnek tekinthetők. Előnyösen 2% HSA/PBS oldatot alkalmazunk pH=7,0 értéknél.
A találmány szerinti IL-2 muteinek a technika állása szerint jól ismert eljárások alkalmazásával gyógyhatású készítményekké formulázhatók. (gy például Martin: Remington’s Pharmaceutical Science című kézikönyve ismertet megfelelő készítményeket és a publikáció teljes egészében a kitan ítás részének tekintendő. Az IL-2 mutein gyógyhatású készítményei számos formában elkészíthetőek, beleértve folyadék, gél, liofilizált vagy bármely más megfelelő formát. Az előnyösen alkalmazható forma függ a kezelt specifikus alkalmazástól és a szakember számára egyértelműnek tételezhető fel.
Az IL-2 mutein gyógyhatású készítmény bejuttatható szájon át, aeroszolként, intravénásán, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, intradermálisan vagy szubkután vagy bármely más elfogadható módon. A bejuttatás előnyös módja függ a kezelt specifikus alkalmazástól és a szakember számára egyértelműnek tételezhető fel. Az IL-2 mutein gyógyhatású készítmény beadható más terápiás ágensekkel kombinálva. Ezek az ágensek képezhetik ugyanazon gyógyhatású készítmény részét, vagy beadhatóak az IL-2 muteintől külön is, akár egy időben vagy bármely más elfogadható kezelési rendnek megfelelően. Továbbá az IL-2 mutein gyógyhatású készítmény kiegészítőként is alkalmazható más terápiákban.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik készítmények és eljárások HÍV, rák, autoimmun betegség, fertőző betegség kezelésére, rákvakcinában és hagyományos vakcinaterápiában vakcinaadjuvánsként történő alkalmazásra, idősekben vagy másképp legyengült immunrendszerű egyedekben immunstimulálásra, szintúgy, mint humán SCID páciensekben vagy bármely más terápiás alkalmazásban, amely az immunrendszer általános stimulálását igényli, bármely megfelelő állatban, előnyösen emlősben, legelőnyösebben emberben. Amint a háttér fejezetben korábban ismertettük, az IL-2 sok hatással rendelkezik. Néhány ezek közül a PHA-blasztok, nyugalomban lévő T-sejtek, B-sejtek, monociták és NK-sejtek stb. stimulálása; az itt ismertetett muteinek csak a nagy affinitású IL—2receptort expresszáló sejteken lesznek aktívak, mint például nyugalomban lévő T-sejteken, de nem mutatnak aktivitást a közepes affinitású IL-2-receptort expresszáló sejteken, mint például NK-sejteken vagy monocitákon.
Az igényelt oltalmi körön belüli a találmány szerinti IL-2 muteineket kódoló DNS-szekvenciák alkalmazása génterápiás esetekben. A figyelembe veendő génterápiás alkalmazások azon betegségek kezelését foglalják magukban, amelyekben az IL-2 hatékony terápiát biztosíthat a T-sejt aktivitása következtében, így például HÍV, rák, autoimmun betegség, fertőző betegség kezelése, alkalmazható még rákvakcinában és hagyományos vakcinaterápiában vakcinaadjuvánsként, idősekben vagy másképpen legyengült immunrendszerü egyénekben immunstimulációra, szintúgy mint humán SCID páciensekben és olyan betegségek kezelésére, amelyek más módon érzékenyek IL-2-re vagy IL—2közvetített immunválaszra érzékeny fertőző ágensek esetében.
Az IL-2 muteinek génterápiával történő lokális bejuttatása a célterület számára biztosíthatja a terápiás ágenst. Ez magában foglal mind in vitro és in vivő génterápiás eljárásokat. Számos eljárás ismert potenciálisan terápiás gének átvitelére meghatározott sejtpopulációkba. Lásd például: Mulligan: Science 260 926 (1993). Ezek az eljárások a következőket foglalják magukban:
(1) Közvetlen gén transzfer. Lásd például: Wolff és munkatársai: Science 247 1465 (1990);
(2) Liposzómaközvetített DNS-transzfer. Lásd például: Caplen és munkatársai: Natúré Med. 3 39 (1995); Crystal: Natúré Med. 1 15 (1995); Gao és Huang: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 179 280 (1991);
(3) Retrovírusközvetített DNS-transzfer. Lásd például: Kay és munkatársai: Science 262 117 (1993); Anderson: Science 256 808 (1992)];
(4) DNS-vírus-közvetített DNS-transzfer. Ilyen DNSvírusok magukban foglalják a következőket: adenovírusok (előnyösen Ad-2 vagy Ad-5 alapú vektorok), herpeszvírusok (előnyösen herpes simplex vírus alapú vektorok) és parvovírusok (előnyösen „hiányos” vagy nem-autonom parvovírus alapú vektorok, előnyösebben adenoasszociált vírus alapú vektorok, legelőnyösebben AAV-2 alapú vektorok). Lásd például: Ali és munkatársai: Gene Therapy 1 367 (1994); 4,797,368 lajstromszámú US szabadalom, amely teljes egészében a kitanítás részének tekintendő és az 5,139,941 lajstromszámú US szabadalom, amely teljes egészében a kitanítás részének tekintendő.
A kívánt gén átvitelére szolgáló specifikus vektorrendszer kiválasztása számos tényezőtől függ. Egy fontos tényező a célpontsejt-populáció természete. Bár a retrovírusvektorokat kimerítően tanulmányozták és számos génterápiás alkalmazásban felhasználták ezeket, a vektorok általában nem megfelelőek nem osztódó sejtek fertőzésére. Továbbá a retrovírusok rendelkeznek onkogén potenciállal is.
HU 226 142 Β1
Az adenovírusok előnye, hogy széles gazdaszervezet-skálájuk van, képesek megfertőzni nyugvó vagy véglegesen differenciált sejteket, mint például neuronokat vagy hepatocitákat és lényegében feltételezhetően nem mutatnak onkogén sajátosságot. Lásd: Ali és munkatársai: fentebb, 367. oldal. Úgy tűnik, hogy az adenovírusok nem integrálódnak a gazdaszervezet genomjába. Mivel ezek a kromoszómán kívül léteznek, a beillesztési mutagenezis kockázata jelentősen csökken (Ali és munkatársai: fentebb, 373. oldal).
Az adenoasszociált vírusoknak hasonló előnyöket mutatnak, mint az adenovírusalapú vektoroknak. Azonban az AAV-k helyspecifikus integrációt mutatnak a 19. humán kromoszómán (Ali és munkatársai: fentebb, 377. oldal).
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a találmány szerinti IL—2 muteint kódoló DNS-t génterápiában alkalmazzuk immunhiányos betegségek, mint például HÍV, fertőző betegségek, mint például tuberkulózis és rákok, mint például vesekarcinóma kezelésére.
A találmány ezen megvalósítási módja szerint eljárva a találmány szerinti IL-2 muteineket kódoló DNS-sel végzett génterápiát az erre rászoruló páciensnek a diagnózissal egy időben vagy rögtön utána biztosítjuk.
Ez a megközelítés kihasználja a találmány szerinti IL—2 muteinek szelektív aktivitását, hogy ezzel a nem kívánt toxikus és hátrányos hatásokat megakadályozza. A szakember számára egyértelmű, hogy a találmány ezen megvalósítási módja szerint bármely, IL—2 mutein DNS-t tartalmazó, megfelelő génterápiás vektor alkalmazható. Egy ilyen vektor megszerkesztéséhez szükséges eljárások a technika állása szerint ismertnek tételezhetők fel. Lásd például: Anderson: Natúré 392 25 (1998); Verma és Somia: Natúré 389 239 (1998)]. Az IL—2 mutein DNS-t tartalmazó vektor bejuttatását a kívánt helyre ismert eljárások szerint végezhetjük.
A találmány jobb megérthetősége érdekében az alább következő példákat adjuk közre. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy ezek a példák csupán a találmány jobb megérthetőségét szolgálják és nem korlátozó értelemben kerülnek bemutatásra. Számos más, a fentiekkel egyenértékű módosítás, illetve változtatás hajtható végre és az ilyen módosítások nem térnek el a találmányi gondolattól és a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott igényelt oltalmi körön belülinek tekintendők. Az itt említett összes publikáció teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő.
C) példák
1. példa
Muteinek előállítása E. coliban
A muteineket helyspecifikus mutagenezissel állítottuk elő a kívánt mutációnak megfelelő kodonokat tartalmazó primerek alkalmazásával, lényegében Kunkel és munkatársai leírása alapján [Kunkel és munkatársai: Methods Enzymol 154: 367 (1987)]. Röviden, a BamHI és Xbal restrikciós enzim hasító helyeket tartalmazó humán IL—2 cDNS-t szubklónoztuk az M13 mp19 M13fágvektorba (New England Biolabs, Beverly, MA) ugyanezen hasítóhelyeket alkalmazva. A vad típusú IL—2 cDNS-t polimeráz-láncreakció alkalmazásával („PCR) nyertük forbol-12-mirisztát-13-acetáttal (10 ng/ml) 24 órán keresztül indukált humán perifériás vér limfocitákból izolált mRNS-ből előállított cDNS elegyből. Az alkalmazott PCR-primerek a következők voltak: az IL—2 nyílt leolvasási fázis 5’-végéhez:
5'-CCT CAA CTC CTG AAT TCA TGT ACA GGA TGC-3’ (3. azonosítási szám szerinti szekvencia);
és az IL—2 nyílt leolvasási fázis 3’-végéhez a következő volt:
5’-GGA AGC GGA TCC TTA TCA AGT CAG TGT TGA G-3’ (4, azonosítási szám szerinti szekvencia).
Az EcoRI (5’-vég) és BamHI (3’-vég) restrikciós enzim hasító helyeket mindegyik oligonukleotidba beépítettük és dőlt betűvel jelöljük. Az alkalmazott PCR-beállítások a következők voltak: 1 perc 94 °C-on, 1 perc 58,7 °C-on és 1 perc 72 °C-on 25 cikluson keresztül. Az így kapott korrekt IL—2 cDNS-szekvenciát szekvenálással igazoltuk a Sequenase® szekvenáló reagenskészlet (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Uracilt tartalmazó egyszálú DNS-t (U-DNS) kaptunk az E. coli CJ236-törzs (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) transzformálásával IL—2 cDNS-t tartalmazó M13 mp19vektorral. A helyspecifikus mutagenezis általánosságban olyan primereket alkalmazott, amelyek 15, a mutagenezissel megcélzott kodontól 5’-irányban elhelyezkedő, a templát U-DNS-sel homológ nukleotidot, a kívánt változást megtestesítő nukleotidokat és az utolsó megváltoztatott nukleotidtól 3’-irányban további 10, a templát U-DNS-sel homológ nukleotidot tartalmaztak. Először helyspecifikus mutagenezis segítségével egy Ncol restrikciós helyet vittünk be a humán IL—2 érett szekvenciája kezdeténél. Ennek a restrikciós helynek az alkalmazása beépít egy N-terminális metionin aminosavat, amely irányítja az expressziót az E. coli citoplazma térben, például a pET3d expressziós vektor alkalmazásával. Az erre a célra alkalmazott primer a következő volt:
5’-GCA CTT GTC ACA AAC ACC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3' (5. azonosítási szám szerinti szekvencia).
A D20, N88 és Q126 pozíciókban mutációk beépítésére alkalmazott specifikus primerek a következők voltak:
D20X: 5'-GGA GCA TTT ACT GCT GNN NTT ACA GAT G-3’ (6. azonosítási szám szerinti szekvencia);
N88X: 5’-GGG ACT TAA TCA GCN NNA TCA ACG TAA TAG-3’ (7. azonosítási szám szerinti szekvencia);
Q126X: 5’-GGA TTA CCT TTT GTN NNA GCA TCA TCT C-3’ (8. azonosítási szám szerinti szekvencia);
ahol az NNN részletet egy hisztidinnek (CAC) vagy izoleucinnak (ATC) (a D20 pozíciónál), argininnek (CGT), glicinnek (GGT) vagy izoleucinnak (ATC) (az N88 pozíciónál) vagy leucinnak (CTG) (a Q126 pozíciónál) megfelelő kodonnal helyettesítettük. A további
HU 226 142 Β1 mutációk hasonló stratégiát és a kívánt mutációra megfelelő kodont alkalmaztak. A primereket T4 polinukleotidkináz (New England Biolabs, Beverly, MA) alkalmazásával foszforiláltuk a gyártó utasításai szerint. A primer U-DNS templáthoz történő illesztése és T7 DNSpolimerázzal (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) történő meghosszabbítása után az E. coli DH5a™ (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) törzs sejtjeit 5 μΙ reakcióeleggyel transzformáltuk és 0,7% agart tartalmazó LB táptalajra szélesztettük. A telepek felszaporításához 37 ’C-on történő inkubálás után egyetlen telepet választottunk ki és 2 ml LB táptalajba oltottuk, majd 37 °C-on éjszakán át tenyésztettük. Egyszálú DNS-t izoláltunk M13 tisztítási reagenskészlet segítségével (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) a gyártó utasításai szerint és a kívánt mutációt tartalmazó kiónokat az egyszálú DNS szekvenálásával azonosítottuk a Sequenase® szekvenáló reagenskészlet alkalmazásával (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) a gyártó utasításai szerint. A korrekt mutáltatott szekvenciát tartalmazó telepeknek megfelelő replikatív formájú DNS-ből IL—2 mutein cDNS-t izoláltunk Ncol és Xbal alkalmazásával, majd a pET3a (Stratagene, San Diego, CA) plazmidvektorba szubklónoztuk. Az E. coli BL21-törzset a muteint tartalmazó pET3a vektorral transzformáltuk és 0,60 és 1,0 közötti ABS280-értékig növesztettük, amikor az IL—2 muteintermelés indukálásához 0,4 mM IPTG-t adtunk hozzá.
2. példa
IL-2 muteinek extrakciója és tisztítása E. coliőó/
Az indukálás után három órával a sejteket centrifugálással begyűjtöttük (10 000 g). A rekombináns IL—2 muteinek renaturálásához és tisztításához első lépésben a sejteket 10 térfogatnyi (térfogat/nedves tömeg) répacukor/Trisz/EDTA pufferben (0,375 M répacukor, 10 mM Trisz/HCI, pH=8,0; 1 mM EDTA) diszpergáltuk. A diszpergált sejteket háromszor szonikáltuk 300 W teljesítménnyel 30 másodperces pihentetési periódusokkal jégfürdőben, egyhüvelykes (2,54 cm) standard fejjel felszerelt Missonix (Model XL2020) szonikátor alkalmazásával. A szonikált anyagot ezután centrifugáltuk (17 000 g, 20 percig 4 °C-on). A csapadékot amely ebben a pontban szükségszerűen fehér színű újraszuszpendálással és centrifugálással egyszer mostuk répacukor/Trisz/EDTA pufferben, kétszer Trisz/EDTA pufferben (50 mM Trisz/HCI, pH=8,0; 1 mM EDTA) és végül 10 térfogatnyi 0,1 M Trisz/HCI, pH=8,0 pufferben újraszuszpendáltuk (ekkor veszünk mintát a gélanalízishez, majd centrifugáltuk (17 000 g, 20 perc).
A csapadékot 3 térfogat 8 M guanidínium-klorid-oldat (0,1 M Trisz/HCI, pH=8,0 pufferben) hozzáadásával feloldottuk és 0,1% (térf/térf) 2-merkapto-etanolt adtunk hozzá. 2 órás inkubáció után szobahőmérsékleten a mintát centrifugáltuk (17 000 g, 20 perc). Az így kapott oldatot körülbelül 20 óráig dializáltuk 20 térfogat 10 mM Trisz/HCI, pH=8,0; 1 mM EDTA pufferrel szemben 4 °C-on. Az oldatot centrifugáltuk (17 000 g, 20 perc), trifluor-ecetsavat adtunk hozzá 0,1% koncentrációig és 0,22 mikron pórusméretű szűrőegységen átszűrtük. Az oldatot azonnal átvittük egy szilikonizált palackba és C8 oszlopra (Vydac 208TP54) töltöttük fel. Az IL—2 muteineket 20 perces lineáris gradiens alkalmazásával tisztítottuk, 45-85% acetonitrilt használva 0,1% TFA-ban. Az eluált fehérje koncentrációját A280-értéke alapján és aminosavanalízissel határoztuk meg. A fehérjét ezután kisebb részegységekre osztottuk (100 ml) szilikonizált csövekben és -20 ’C-on tároltuk. Az így tisztított mutein tipikusan egyetlen sávot adott SDS-PAGE (ezüst festés) alkalmazásával vizsgálva és mennyiségi meghatározást végeztünk aminosavanalizis segítségével (a pontosság tipikusan >90%).
3. példa
T-sejt-proliferációs vizsgálati eljárás
Perifériális vér mononukleáris sejteket (PBMC) izoláltunk körülbelül 100 ml normál humán vérből (Irwin Memóriái Blood Bank, San Francisco, CA) amelyet 1:2 arányban hígítottunk hideg Dulbecco-féle foszfátpufferolt fiziológiás sóoldatban (Ca2+ és Mg2+ mentes; DPBS). Ficoll-Paque-t (Pharmacia) rétegeztünk alája, és a mintát centrifugáltuk a PBMC izolálása céljából, amit többszöri mosás követett hideg DPBS-ben. PHAblasztokat (aktivált T-sejtek) hoztunk létre a sejtek újraszuszpendálásával 10% fötális marhaszérumot (Hyclone) tartalmazó RPMI-1640 táptalajban, amihez a következők mindegyikéből 1 % mennyiséget (tömeg/térfogat) adtunk: L-glutamin, nem esszenciális aminosavak, nátrium-piruvát és antibiotikum-antimikotikum (RPMI táptalaj), 1*106 sejt/ml koncentrációban. Fitohemagglutinint (PHA-P; Sigma) adtunk hozzá 10 pg/ml végső koncentrációban és a sejteket 37 ’C-on inkubáltuk 5% CO2 mellett három napig. A sejteket begyűjtöttük és kétszer DPBS-ben mostuk, újraszuszpendáltuk RPMI táptalajban és 1*105 sejt/lyuk mennyiségben 200 μΙ térfogatban 96 lyukas lapos fenekű lemezekbe osztottuk változó IL-2- vagy muteinkoncentrációk mellett RPMI táptalajban. A lemezeket 48 óráig inkubáltuk 37 °C-on, 1 pCi 3H-timidinnel/lyuk pulzáltuk (DuPont NEN®, Boston, MA) 6 órán keresztül, a sejteket begyűjtöttük, és miután a sejteket üvegszálas szűrőkre gyűjtöttük, lemértük a radioaktivitást.
4. példa
NK-sejt proliferációs vizsgálati eljárás Perifériális vér mononukleáris sejteket (PBMC) izoláltunk körülbelül 100 ml normál humán vérből (Irwin Memóriái Blood Bank, San Francisco, CA) amelyet 1:2 arányban hígítottunk hideg Dulbecco-féle foszfátpufferolt fiziológiás sóoldatban (Ca2+ és Mg2+ mentes; DPBS). Ficoll-Paque-t (Pharmacia) rétegeztünk alája, és a mintát centrifugáltuk a PBMC izolálása céljából, amit többszöri mosás követett hideg DPBS-ben. Az NK-sejteket a többi sejttől elválasztottuk. Előnyösen a Miltenyi Biotec NK-sejt izoláló reagenskészletét (Bergisch Gladbach, Németország; katalógusszám: 465-01) alkalmaztuk erre a célra. A reagenskészlet két reagensből, elválasztóoszlopokból és egy nagyon erős
HU 226 142 Β1
1. táblázat
T-sejt-szelektív aktivitásra értékelt muteinek mágneses oszloptartóból áll. Az első reagens egy hapténkonjugált monoklonális CD3, CD4, CD19, CD33 egér lgG1 izotípusú antitestkeverék. Ennek célja, hogy a PMBC-t kimerítsük T-sejtekre, B-sejtekre és mieloidsejtekre nézve. Feltételezhetően bármely megfelelő, ezen sejttípusokat felismerni képes antitestcsoport alkalmazható. A második reagens antihaptén ellenanyaggal konjugált kolloidális szuperparamágneses MACs mikrogyöngyöket tartalmaz. A sejteket 0,5% marha-szérumalbumint és 2 mM EDTA-t tartalmazó PBS-ben (PBS/EDTA) újraszuszpendáltuk. A szuszpenzió térfogata függ az alkalmazott sejtek számától és egy, a Miltenyi Biotec által biztosított táblázat tartalmazza. Tipikusan 2-5*10® PBMC sejtszámtartományban a sejteket 800 μΙ pufferben szuszpendáljuk fel és utána mindegyik reagensből 200 μΙ-t alkalmazunk. A reagensekkel történő inkubálás után a sejteket az oszlopra visszük (2 ml pufferben újraszuszpendálva). A nem NK-sejtek a mágneshez tapadnak (kimerítés) és az NK-sejteket az átfolyó anyagból izoláljuk és összegyűjtjük. A sejteket mossuk, RPMI táptalajban újraszuszpendáljuk (ennek összetétele: RPMI-1640, amihez mindegyik következőből 1% mennyiséget adtunk: L-glutamin, nem esszenciális aminosavak, nátrium-piruvát, antibiotikum-antimikotikum (mindegyik a Gibco/BRL terméke, Gaithersburg, MD), 10% fötális marhaszérum (Hyclone); és 96 lyukas lapos fenekű lemezekbe osztjuk szét 1*105 sejt/lyuk mennyiségben, 200 μΙ térfogatban. A sejteket begyűjtöttük és kétszer DPBS-ben mostuk, RPMI táptalajban újraszuszpendáltuk és ismét 96 lyukas lapos fenekű lemezekbe osztjuk szét 1*105 sejt/lyuk mennyiségben, 200 μΙ térfogatban, változó koncentrációjú IL—2 vagy mutein jelenlétében, RPMI táptalajban. A lemezeket 37 °C-on 48 órán keresztül inkubáltuk, 1 pCi 3H-timidin/lyuk mennyiséggel pulzáltuk 6 órán keresztül (DuPont NEN®, Boston, MA), a sejteket begyűjtöttük, és miután a sejteket üvegszálas szűrőkre gyűjtöttük, lemértük a radioaktivitást.
5. példa
T-sejteket az NK-sejtekkel szemben szelektíven aktiváló muteinek
Helyspecifikus mutagenezis segítségével muteineket állítottunk elő [Kunkel és munkatársai: Methods Enzymol 154 367 (1987)] az Asp-20, Asp-84, Asn-88 és Gln-126 pozíciókban, majd E. coliban expresszáltuk a pET-3a expressziós rendszer alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint (Stratagene). A muteineket inklúziós testek kinyerésével tisztítottuk guanidínium-HCI-oldatban, renaturáltuk és HPLC alkalmazásával kromatografáltuk, ahogyan ezt már korábban leírtuk. Az így kapott fehérje >95% tisztaságot mutatott ezüstfestett SDS-PAGE-gélen; koncentrációját és tisztaságát aminosavanalízis segítségével vizsgáltuk (az AAA pontosság tipikusan >90%). A megfelelő aktivitással rendelkező muteinek szekvenciáját tömegspektrometriás analízis segítségével igazoltuk. Az így tisztított muteineket a korábban leírt T- és NK-sejt vizsgálati eljárással analizáltuk. Az IL—2 muteinek relatív aktivitását mutatja be az 1. táblázat a T- és NK-sejt vizsgálati eljárásokban.
Mutein Relatív aktivitás Relatív aktivitás
TK-sejt vs. NK-sejt T-sejt NK-sejt
wtlL-2 1 1,00000 1,00000
D20 muteins
D20A 5 0,00024 0,00005
D20H 3900 0,37081 0,00009
D20I 7600 4,59635 0,00061
D20K 330 0,06301 0,00019
D20L 100 0,00063 0,00001
D20M 490 0,05372 0,00011
D20N 160 0,03000 0,00019
D20Q 100 0,03180 0,00032
D20R 33 0,00018 0,00001
D20S 170 0,06640 0,00038
D20T 1 1,00000 1,00000
D20V 10 0,00093 0,00009
D20Y 1000 0,06587 0,00007
N88 muteins
N88A 50 0,50000 0,01
N88E 10 0,01172 0,00115
N88F 22 0,02222 0,001
N88G 980 8,33333 0,00853
N88H 3 0,00100 0,001
N88I 9600 0,98074 0,00010
N88K 3 0,00010 0,00032
N88L 4 0,00400 0,001
N88M 250 0,25000 0,001
N88R 6200 0,89730 0,00015
N88S 80 0,00200 0,16000
N88T 395 0,50000 0,001266
N88V 67 0,06670 0,001
N88W 1 0,00100 0,001
N88Y 8 0,00800 0,001
Q126 muteins
Q126A 0,30 0,01743 0,05809
Q126D 240 0,14630 0,00061
Q126E 400 10,0000 0,02500
Q126F 32 0,87358 0,02749
Q126G 100 0,55556 0,00556
HU 226 142 Β1
1. táblázat (folytatás)
Mutein Relatív aktivitás Relatív aktivitás
TK-sejt vs. NK-sejt T-sejt NK-sejt
Q126H 0,03 0,02216 0,73875
Q126I t 33 0,00100 0,00003
O126K 1,0 1,00000 1,00000
Q126L 680 3,06186 0,00447
Q126M 9,1 19,94092 2,19298
Q126N 10 6,57895 0,64993
Q126P 3,0 0,00032 0,00011
Q126R 11 4,02695 0,36392
Q126S 33 0,03417 0,00103
Q126T 3,3 0,00010 0,00003
Q126V 330 1,00556 0,00302
Q126W 1,0 0,20000 0,20000
Q126Y 10 0,88500 0,08850
A muteinek aktivitását az 50%-os maximális válasz kiváltásához szükséges, az ugyanazon vizsgálati eljárásban a vad típusú IL—2 EC50-értékéhez viszonyított muteinkoncentrációval fejezzük ki (EC50); ugyanannak a muteinen végzett többszöri vizsgálat esetén az eredmények mértani átlagát adjuk meg. A vad típusú IL—2 EC5o-értékei a körülbelül 10 pM és körülbelül 150 pM közötti tartományba estek a T-sejt-vizsgálati eljárásban és körülbelül 50 pM és körülbelül 200 pM közötti tartományba az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A T-sejt versus NK-sejt muteinaktivitás arányát úgy kaptuk meg, hogy a mutein T-sejteken mutatott relatív aktivitását elosztottuk a mutein NK-sejteken mutatott relatív aktivitásával. Ezt az arányt minden egyes muteinre csak olyan adott T- és NK-sejt vizsgálati eljárásból meghatározott aktivitás alkalmazásával állapítottuk meg, ahol az alkalmazott sejtek egyetlen donortól származtak.
A muteinaktivitásokat 6 nagy kategóriába sorolhatjuk: (1) ezerszeres T-sejt-szelektivitás; (2) száznál nagyobb, de ezerszeresnél kisebb T-sejt-szelektivitás; (3) tíznél nagyobb, de százszorosnál kisebb T-sejt-szelektivitás; (4) IL-2-höz viszonyítva megnövekedett aktivitás T-sejtekre; (5) NK-sejt-szelektivitás; (6) tízszeres szelektivitás akár T- akár NK-sejtekre.
1. osztály: D20H, I és Y; N88G, I és R;
2. osztály: D20K, L, Μ, N, Q és S; N88M és T; Q126D, E, G, Lés V;
3. osztály: D20R; N88A, E, F, S és V; Q126F, I, N, R és S;
4. osztály: D20I; N88G; Q126E, L, Μ, N és R;
5. osztály: Q126A, H;
6. osztály: D20A, T és V; N88H, K, L, W és Y; Q126K, P, T, W és Y.
Az 1-3. osztályokon belül előnyösen alkalmazhatók azok a muteinek, amelyek a T-sejteken a vad típusú IL-2-t megközelítő, vagy annál nagyobb aktivitást mutatnak. Az 1. osztályban ez magában foglalja a D20H és I; az N88G, I és R muteineket; a 2. osztályban ez magában foglalja az N88M és T, a Q126D, E, G, L és V muteineket; a 3. osztályban ez magában foglalja az N88A, a Q126F és G muteineket. A 4. osztályba tartozó muteinekről azt feltételezzük, hogy in vivő nagyobb hatékonysággal rendelkeznek, mint a vad típusú IL—2.
Látható az 1. táblázatból, hogy egyetlen egyszeri mutáció sem eredményezett olyan IL—2 muteint, amely mindkét vizsgálati eljárásban hatástalannak bizonyult. Azonban kikövetkeztethető, hogy két olyan mutáció kombinációja, amelyek erősen csökkentett aktivitást eredményeztek két különböző pozícióból, potenciálisan IL-2-antagonista hatást eredményezne T-sejteken, vagy más nagy affinitású IL-2-receptort hordozó sejttípusokon. Egy ilyen antagonistára következtethetünk ezekből az adatokból, mivel a mutációkat úgy terveztük meg, hogy csak az IL-2Rp-val és az IL-2Ry-val létrejövő kölcsönhatásokat változtassák meg. Erre például szolgálhatna a D20R/Q126T dupla mutein. A gyenge aktivitású mutációk kombinációja egy molekulában előreláthatólag kombinatorikus jellegű, vagyis mivel a D20R aktivitása T-sejteken 0,00018, a Q126T aktivitása T-sejteken 0,0001, a D20R/Q126T dupla mutein aktivitása várhatóan a vad típusú IL—2 aktivitásának csupán 0,000000018-ad részét mutatná T-sejteken. Egyéb kombinációk a megadott adatokból levezethetőek.
6. példa
Vad típusú IL-2 és IL-2 muteinek biológiai aktivitása
Az 1-7. ábrák mutatják be a dózis-hatás görbéket a vad típusú humán IL-2 (IL-2) és D20H esetében (1. ábra); az IL-2 és a D20I esetében (2. ábra); az IL-2 és az N88G esetében (3. ábra); az IL-2 és az N88I esetében (4. ábra); az IL-2 és az N88R esetében (5. ábra); az IL-2 és a Q126E esetében (6. ábra), valamint az IL-2 és a Q126L esetében (7. ábra). A: Egyedi dózis-hatás válasz az IL-2 (teli körök) és a mutein esetében (üres körök) a primer humán T-sejt-proliferációs vizsgálati eljárásban (PHA-blasztok). B: Egyedi dózishatás válasz az IL-2 (teli háromszögek) és a mutein esetében (üres háromszögek) a primer humán NK-sejt proliferációs vizsgálati eljárásban.
Közelebbről az 1. ábrára vonatkozóan, a bemutatott kísérletnél az 50% maximum proliferációt kiváltó (EC50) vad típusú IL-2 dózis körülbelül 1,5*10-10 M a T-sejt (A) és körülbelül 1*10_1° M az NK-sejt (B) vizsgálati eljárásban. A D20H EC50-értéke körülbelül 2*10_1θ M volt ebben a T-sejt-vizsgálati eljárásban, de becsülhetően >1*10-5 M ebben az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A nettó emelkedés a D20H T-sejt-aktivitásban az NK-sejt aktivitáshoz képest így tehát több mint 50 000-szeres erre a vizsgálati eljárásra meghatározva. Hasonló eredményeket értünk el további do15
HU 226 142 Β1 norokból származó vérrel (az adatok nem kerültek közlésre).
Közelebbről a 2. ábrára vonatkozóan, a bemutatott kísérletnél az 50% maximum proliferációt kiváltó (EC50) vad típusú IL-2 dózis körülbelül 1,5*10_1° M a T-sejt (A) és körülbelül 3*10'1° M az NK-sejt (B) vizsgálati eljárásban. A D20I EC50-értéke is körülbelül 1,5*10_1° M volt ebben a T-sejt-vizsgálati eljárásban, de becsülhetően csak körülbelül 5*10“® M ebben az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A nettó emelkedés a D20I T-sejt-aktivitásban az NK-sejt aktivitáshoz képest így tehát körülbelül 16 000-szeres erre a vizsgálati eljárásra meghatározva. Hasonló eredményeket értünk el további donorokból származó vérrel (az adatok nem kerültek közlésre).
Közelebbről a 3. ábrára vonatkozóan, a bemutatott kísérletnél az 50% maximum proliferációt kiváltó (EC50) vad típusú IL-2 dózis körülbelül 4*10~11 M a T-sejt (A) és körülbelül 2*10-10 M az NK-sejt (B) vizsgálati eljárásban. Az N88G EC50-értéke körülbelül 5* 1012 M volt ebben a T-sejt-vizsgálati eljárásban, de becsülhetően csak körülbelül 3*10-8 M ebben az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A nettó emelkedés az N88G T-sejt-aktivitásban az NK-sejt aktivitáshoz képest így tehát körülbelül 1200-szoros erre a vizsgálati eljárásra meghatározva. Hasonló eredményeket értünk el további donorokból származó vérrel (az adatok nem kerültek közlésre).
Közelebbről a 4. ábrára vonatkozóan, a bemutatott kísérletnél az 50% maximum proliferációt kiváltó (EC50) vad típusú IL-2 dózis körülbelül 1,5*10_1° M a T-sejt (A) és körülbelül 1χ10-1θ M az NK-sejt (B) vizsgálati eljárásban. Az N88I EC50-értéke körülbelül 4χ10_1θ M volt ebben a T-sejt-vizsgálati eljárásban, de becsülhetően csak körülbelül 5χ10_θ M ebben az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A nettó emelkedés az N88I T-sejt-aktivitásban az NK-sejt aktivitáshoz képest így tehát körülbelül 18 000-szeres erre a vizsgálati eljárásra meghatározva. Hasonló eredményeket értünk el további donorokból származó vérrel (az adatok nem kerültek közlésre).
Közelebbről az 5. ábrára vonatkozóan, a bemutatott kísérletnél az 50% maximum proliferációt kiváltó (EC50) vad típusú IL-2 dózis körülbelül 1,5χ10_1θ M a T-sejt- (A) és körülbelül 1χ10_1θ M az NK-sejt (B) vizsgálati eljárásban. Az N88R EC5o-értéke 9χ10-11 M volt ebben a T-sejt-vizsgálati eljárásban, de becsülhetően csak körülbelül 3χ10-7 M ebben az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A nettó emelkedés az N88R T-sejt-aktivitásban az NK-sejt aktivitáshoz képest így tehát körülbelül 5000-szeres erre a vizsgálati eljárásra meghatározva. Hasonló eredményeket értünk el további donorokból származó vérrel (az adatok nem kerültek közlésre).
Közelebbről a 6. ábrára vonatkozóan, a bemutatott kísérletnél az 50% maximum proliferációt kiváltó (EC50) vad típusú IL-2 dózis körülbelül 8χ10-12 M a T-sejt- (A) és körülbelül 5χ10-11 M az NK-sejt (B) vizsgálati eljárásban. A Q12 6E EC50-értéke körülbelül 8*10~13 M volt ebben a T-sejt-vizsgálati eljárásban, de becsülhetően csak körülbelül 2*10-9 M ebben az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A nettó emelkedés a Q126E T-sejt-aktivitásban az NK-sejt aktivitáshoz képest így tehát körülbelül 400-szoros erre a vizsgálati eljárásra meghatározva. Hasonló eredményeket értünk el további donorokból származó vérrel (az adatok nem kerültek közlésre).
Közelebbről a 7. ábrára vonatkozóan, a bemutatott kísérletnél az 50% maximum proliferációt kiváltó (EC50) vad típusú IL-2 dózis körülbelül 5χ10~11 M a T-sejt- (A) és körülbelül 8*10-11 M az NK-sejt (B) vizsgálati eljárásban. A Q126L EC50-értéke 2χ10-11 M volt ebben a T-sejt-vizsgálati eljárásban, de becsülhetően csak körülbelül 2x10“® M ebben az NK-sejt vizsgálati eljárásban. A nettó emelkedés a Q126L T-sejt-aktivitásban az NK-sejt aktivitáshoz képest így tehát körülbelül 625-szörös erre a vizsgálati eljárásra meghatározva. Hasonló eredményeket értünk el további donorokból származó vérrel (az adatok nem kerültek közlésre).
7. példa
Csimpánz toxikológiai tanulmányok
Az lL-2/N88R-t választottuk ki az 1. táblázatban található IL-2 mutáns fehérjék közül bizonyítottan T-sejtszelektív agonista hatása miatt primer humán T- és NK-sejt vizsgálati eljárásokban. A vad típusú IL-2-höz viszonyítva körülbelül 6000-szer aktívabb T-sejteken, mint NK-sejteken és lényegében a vad típusú IL-2-vel azonos aktivitást mutat T-sejteken. Az IL-2/N88R-t CHO-sejtekben termeltettük, majd megtisztítottuk és IL—2-aktivitásra, valamint toxicitásra vizsgáltuk csimpánzmodellen. Ebben az in vivő modellben, egy kereskedelmi forgalomban hozzáférhető rekombináns IL—2variánssal (PROLEUKIN™, Chiron Corporation, Emeryville, CA) összehasonlítható aktivitást mutatott T-sejteken, viszont ezzel összevetve csupán enyhe mellékhatásokat okozott (mind az objektív és klinikai paraméterek tekintetében).
A) Kísérleti elrendezés
1. Anyagok és módszerek
A vizsgálat életben végzett részét a New Ibéria Research Centerben hajtottuk végre (New Ibéria, LA, Sponsor Bayer Corporation, Berkeley, CA) és két vizsgálati fázisban 11 fiatal felnőtt - felnőtt hím csimpánzt foglalt magában, amelyek testsúlya körülbelül 45-70 kg tartományban változott.
A vizsgálat I. fázisa egy dózis meghatározó fázis volt, amely egy hordozó szubkután dózisának vagy 1,2 mg/m2 PROLEUKIN szubkután dózisának beadását foglalta magában naponta kétszer (BID) 5 napon keresztül. A vizsgálat II. fázisa a minden 12 órában (q12h) 5 napig szubkután adagolt hordozó, a PROLEUKIN és az IL-2/N88R összehasonlítása. Az IL-2/N88R dózisát úgy választottuk meg, hogy a PROLEUKIN-nal összehasonlítható terhelést adjon farmakokinetikai vizsgálatok alapján. Vérmintákat vettünk a vérkémia, CBC, hematológia/koaguláció vizsgálatára, valamint a T- és NK-sejt populációk FACS-analízisének elvégzésére, ahogyan ezt az 5. és 6. fejezetekben részletesen ismertetjük.
HU 226 142 Β1
2A. táblázat Fázis-I protokoll
Csoport száma Állatok száma Vizsgálat tárgya Dózis Gyakoriság
1 1 hordozó NA BID 5 napig
2 2 PROLEUKIN 1,2 mg/m2 BID 5 napig
2B. táblázat Fázis-ll protokoll
Csoport száma Állatok száma Vizsgálat tárgya Dózis Gyakoriság
1 2 hordozó 2,4 ml/m2 q12h 5 napig
2 3 PROLEUKIN 1,2 mg/m2 q12h 5 napig
3 3 IL-2/N88R 1,2 mg/m2 q12h 5 napig
2. Dozírozási eljárás
A vizsgálati napokon - amikor vért vettünk - az álla- 20 tokát teljes mértékben érzéstelenítettük IM ketamin alkalmazásával körülbelül 10 mg/kg dózissal a vizsgált anyag vagy hordozó beadása előtt. Azokon a vizsgálati napokon, amikor nem kellett vérmintát venni, az állatokat fizikailag lefogtuk szorítóketrec alkalmazásával a vizsgált 25 anyag vagy hordozó beadása előtt. A dózist szubkután injekcióval juttattuk be minden 12 órában 5 napig és az injekció helyét a vizsgálat 1. napján szőrtelenítettük.
3. Klinikai megfigyelések (a) Napi megfigyelések és táplálékfogyasztás 30
Minden állatot naponta kétszer figyeltünk meg és bármely rendellenes tapasztalatot a vizsgálatvezetőnek jelentettünk. A betegnek látszó állatokra felhívtuk a figyelmét a vizsgálatvezetőnek, a vizsgálat állatorvosának és a szponzor képviselőjének. A táplálék fogyasztást vizuális megfigyeléssel igazoltuk és naponta kétszer feljegyeztük.
(b) Testsúlyok
A testsúlyokat megmértük a vizsgálat előtt, az adagolás első napja előtt és minden alkalommal, amikor az állatokat vérvétel céljából elaltattuk.
(c) Injekció helyeinek megfigyelése
Az injekciók helyeit naponta megfigyeltük. Bármely rendellenes tünetet, mint például kivörösödést vagy duzzanatot feljegyeztük.
3A. táblázat
Fázis-ll mintavételek rendje
Ideje CBC CHEM COAG FACS Szponzorvizsgá- lat
Vizsgálat előtt X X X X X
1. nap, dózis előtt X X X X X
1. nap, 15 perc X
3. nap, dózis előtt X X X X X
3. nap, 15 perc X
6. nap X X X X X
8. nap X X X X X
10. nap X X X X X
12. nap X X X X X
15. nap X X X X X
30. nap X X X X X
4. Mintakezelés (a) Szérumkémia
Mindegyik állattól körülbelül 2 ml vérmintát gyűjtöttünk kémcsövekbe véralvadásgátló nélkül a fentebb megállapított időpontokban. A vérvételi időket felje- 60 gyeztük és hagytuk a vért szobahőmérsékleten megalvadni. A mintákat ezután centrifugáltuk, elválasztottuk a szérumot és az NIRC Klinikai Patológia Laboratóriumba továbbítottuk. Az NIRC standard szérum kémiai paneljét mutatja be a 4. táblázat.
HU 226 142 Β1
4. táblázat Vérkémiapanel
Nátrium Foszfát
Kálium Karbamid-nitrogén
Klorid Kreatinin
összes bilirubin összes fehérje
Lúgos foszfatáz Albumin
Laktát-dehidrogenáz (LDH) Albumin/globulin arány
Aszpartát-amino-transzferáz (AST) Glükóz
Alanin-amino-transzferáz (ALT) Kalcium
Szén-dioxid (CO2) Gamma-glutamil-transzferáz (GGT)
(b) Hematológia
Körülbelül 2 ml vérmintát gyűjtöttünk mindegyik állattól a fentebb meghatározott időpontokban EDTAcsövekbe és az NIRC Klinikai Patológiai Laboratóriumba továbbítottuk. A standard NIRC hematológiai panelt - beleértve a teljes vér számlálást, differenciál- és vérlemezke-számlálást - hajtottuk végre mindegyik minta esetében.
(c) Szponzorvizsgálatok
Körülbelül 6 ml vérmintát gyűjtöttünk a fentebb meghatározott időpontokban véralvadásgátlóként EDTA-t tartalmazó csövekbe. Feljegyeztük a vérvételi időket. A mintákat lecentrifugáltuk, elválasztottuk a plazmát és három külön csőbe szétosztottuk. A plazmát lefagyasztva tároltuk (-60 °C vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten) és a Bayer Corporation (Berkely, CA) részére kiszállítottuk, amint a vizsgálatot befejeztük.
5. FACS (a) Munkamenet
Körülbelül 5 ml vérmintát gyűjtöttünk nátrium-heparinát véralvadásgátlón a meghatározott időpontokban FACS vizsgálatokra.
Teljes vérmintát gyűjtöttünk EDTA-ban, ACD-ben vagy heparinban. A sejtszámokat úgy állítottuk be, hogy a 2-20 ezer per mm3 tartományba essenek.
12*75 mm méretű üveg- vagy műanyag csöveket jelöltünk meg megfelelő módon a végrehajtott antitest panelhez. Az antitestet vagy az antitestkeveréket a gyártó által ajánlott térfogatokat követve adtunk a csövekhez.
100 μΙ jól összekevert vérmintát adtunk minden egyes csőhöz, és a keveréket szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk fénytől védve.
Inkubálás után 2 ml lizálóoldatot (Becton Dickinson FACS típusú lizálóoldat, katalógusszám: BD 92-0002) adtunk hozzá, a keveréket óvatosan vortexeltük és 10 percig hagytuk állni szobahőmérsékleten. Ezután a csöveket szobahőmérsékleten centrifugáltuk (5 percig 300 g). A felülúszót leöntöttük, a felesleges folyadékot felitattuk és 1 ml PBS-puffert (GIBCO 14190-144) adtunk mindegyik sejtcsapadékhoz. Óvatos vortexelés után a csöveket szobahőmérsékleten centrifugáltuk (5 percig 300 g). A felülúszót leöntöttük, a felesleges folyadékot felitattuk majd 1 ml fixálóoldatot [0,5% formaldehidoldat, amelyet 10%-os formaldehidoldat (Polyscience, Inc. katalógusszám: 0418) 1:20 arányú hígításával, PBS-pufferben állítottunk elő] adtunk a sejtcsapadékhoz és a felszuszpendáláshoz óvatosan vortexeltük. A mintákat ezután Coulter EPICS SL átáramlásos citométerrel analizáltuk.
A vizsgálathoz a következő antitesteket használtuk: MlgG1/MlgG1 izotípus kontroll (Becton Dickinson, katalógusszám: 349526), CD45-PerCP (Becton Dickinson, katalógusszám: 347464), CD8-FITC (Becton Dickinson, katalógusszám: 347313), CD25-PE (Becton Dickinson, katalógusszám: 30795X), CD4-FITC (Becton Dickinson, katalógusszám: 340133), CD16-PE (Pharmingen, katalógusszám: 347617), CD3-PerCP (Becton Dickinson, katalógusszám: 347344).
6. Koagulációs profil
Körülbelül 2 ml teljes vérmintát gyűjtöttünk véralvadásgátlóként nátrium-citrátot tartalmazó csövekbe a fentebb megadott időpontokban. A koagulációs profil a következőket foglalta magába: protrombin idő (PT), aktivált részleges tromboplasztin idő (APTT) és fibrinogén.
B) Eredmények és megbeszélés
1. PROLEUKIN-dózis meghatározás
Ennek a fázisnak az elsődleges célja egy optimális PROLEUKIN-dózis meghatározása volt az IL-2/N88Rrel történő összehasonlításhoz. A PROLEUKIN ezen optimális dózisát egy elviselhető dózisnak választottuk (kisebb, mint a maximális tolerált dózis), amely ideális esetben klinikailag jelentős, de mérsékelt és visszafordítható toxicitást okoz. 1,2 mg/m2 PROLEUKIN-dózist (BID) határoztunk meg, mint kezdődózis a fajok közötti extrapolációra támaszkodva adott klinikai PROLEUKIN-dózis kezelések, a hozzájuk tartozó toxicitások és a házon belüli cynomolgus majom PROLEUKIN-dózishatás eredmények figyelembevételével.
Két csimpánzt kezeltünk ezen a módon PROLEUKIN-nal. Ezeknek az állatoknak egyre csökkent az aktivitása, egyre zaklatottabbak és dehidratáltak lettek a dózisadagolás során. Mindkét állatnál a 3. vagy 4. naptól kezdve súlyos gyomor-bél rendszeri tünetek léptek fel, beleértve a csökkent étvágyat, hasmenést és hányást. Az egyik állat kezelését (X-159 szám) 3 napos adagolás után leállítottuk súlyos vese- (8A. és B. ábra) és közepes máj- (8C. és D. ábra) rendellenességek miatt, amelyeket a vérkémiai értékek mutattak ki. Ezek magukban foglalták az emelkedett vér karbamid-, nitrogén- (BÚN), kreatinin- és összes bilirubin-, ALT(SGPT)- szinteket. Laktáttartalmú Ringer-féle oldatot adtunk iv. mindkét PROLEUKIN-kezelt állatnak a 3. és 4. napon (X-159 állat) és a 4. napon egyedül (X-124 állat) újraélesztésként, illetve a további dehidratáció megelőzésére. Az X-159 állatot a 8. napon kivettük a vizsgálatból veseelégtelenség és a jobb lábon feltételezhető trombózis miatt, amit a nagyon lecsökkent pulzus (femorális) jelzett, valamint a teljes lábszár hideg volt, és duzzadt. Bár jelentős mértékű toxicitást
HU 226 142 Β1 figyeltünk meg az egyik állaton, a másik állat esetében kevésbé súlyos elváltozások léptek fel, és a káros esetek köre mindkét állat esetében megfordítható volt.
Erre alapozva az 1,2 mg/m2 PROLEUKIN-dózist és az ezzel ekvivalens (a terhelésre alapozott) IL-2/N88R- 5 dózist, q12hr határoztuk meg, mint a megfelelő dózis kezelést ezen két vegyület összehasonlítására.
2. IL-2/N88R és PROLEUKIN összehasonlítása
Klinikai megfigyelések
Az 5. táblázat tartalmazza a vizsgálat során tett kli- 10 nikai megfigyeléseket. Az értékeket O-tól 5-ig terjedő skálán tüntettük fel, ahol az 5 jelzi a súlyos állapotot. Mindegyik PROLEUKIN-kezelt állat súlyosan beteg volt; egy PROLEUKIN-kezeléshez kapcsolódó halálesetet tapasztaltunk. A 6. nap után feljegyzett értékek a PROLEUKIN-kezelt csoport esetében a megmaradt két állat adatait tükrözi. Az IL-2/N88R kezelés legszembetűnőbb mellékhatásának egy mérsékelt Gl-zavar (emezis) tűnt, bár a kezelés valóban indukált névleges toxicitást a 4. táblázatban feltüntetett paraméterek tükrében. A PROLEUKIN-kezelt csoport testsúlya a 6. napra 6%-os mértékben lecsökkent és a 10. napra elérte a 10%-os mértéket is, majd ezt követően lassan rendbejött (lásd a 9. ábrát). Ezzel ellentétben az IL-2/N88R és a hordozóanyag-csoportok legfeljebb 1-3% testsúlycsökkenést mutattak.
5. táblázat
Klinikai megfigyelések*
Kezelés Általános állapot Étvágytalanság Letargia Gl Rossz közérzet
IL-2/N88R jó 1 1 2 1
PROLEUKIN súlyosan beteg 5 4/5 5 4/5
Hordozó normál 0 0 0 0
* A skála 0-5 között értelmezett, ahol az 5 érték jelenti a legsúlyosabb esetet.
(a) Hematológia
Az IL-2/N88R a PROLEUKIN-aktivációval összhangban lévő sejtes hatásokat indukált, közelebbről limfocitózist (10A. ábra), növekedést a fehérvérsejtszámban (10B. ábra) és a neutrofilek számában (10C. ábra) is megfigyeltünk. Az IL-2/N88R csak enyhe trombocitopéniát (nadir körülbelül 15%) indukált a PROLEUKIN-hoz képest (nadir körülbelül 50%) a vizsgálat kezelési szakasza során (10D. ábra).
(b) Vesefunkció
Minden PROLEUKIN-kezelt állatban jelentősen magasabb volt a BUN-szint a 6. és 8. napon (11A. ábra). Ezen állatok közül kettőben a BUN-szint 130 mg/dl felett volt; a kreatininszint is drámaian megemelkedett a két állatban mind a 6. és 8. napon (11B. ábra), ami a veseműködés teljes leállását jelzi. Továbbá mind a szérumfoszfor- és -anion-hiány úgyszintén megemelkedett a PROLEUKIN-kezelt csoportban a 6. és 8. napon. Ezzel ellentétben az összes IL-2/N88R állatban ezek a veseparaméterek lényegében normálisak maradtak a vizsgálat folyamán (11C. és D. ábra).
(c) Májfunkció
A teljes bilirubinszint több mint háromszorosára nőtt a PROLEUKIN csoportban a 6. napon és magasan maradt a 10. napig (12A. ábra). Ezzel ellentétben az IL-2/N88R csoportban csak egy állat esetében tapasztaltunk egy tranziens, enyhe emelkedést a 3. és 6. napon. A szérum SGPT-szint drámaian megemelkedett és több mint 100 U/l értéket ért el minden PROLEUKIN-kezelt állatban a 6. napon (12B. ábra). Az A199 állat SGPT szintje 651 U/l értéket ért el és az SGOT 2789 U/l értéket ért el (Laboratóriumi Jegyzőkönyv: NIRC #8754-9852 fázis-ll, 1. táblázat: egyedi és csoport átlag kémiaértékek, a táblázat 17-21. oldalakon), amely súlyos májleállást jelez.
(d) Koaguláció
A fibrinogénszint több mint kétszeresére nőtt mind a PROLEUKIN és az IL-2/N88R csoportban és a 6. napon érte el legmagasabb értékét (12C. ábra). Az emel30 kedés úgy tűnik hamarabb következett be a PROLEUKIN csoportban, mint az IL-2/N88R állatokban. Ez meglátszik az 51% vs. 5% emelkedésben a 3. napon. A fibrinogénben tapasztalt változások inkább egy akut fehérje válasz eredményei lehetnek mint koagulációs 35 zavarok hatásai, mivel nem tapasztaltunk ennek megfelelő jellemző változásokat az APTT-ben vagy PT-ben ugyanabban az időtartományban (12D. ábra). Ugyanakkor a 10. naptól kezdődően a PROLEUKIN állatokban az APTT-szint egy egyértelmű emelkedési tenden40 ciát mutatott, bár az abszolút érték a normális határokon belül maradt. Ugyanez a tendencia - bár kisebb mértékben - megfigyelhető volt az IL-2/N88R csoportban is. Érdekes viszont, hogy a fibrinogénszintek mindkét csoportban lefelé mozdultak el ugyanebben az idő45 tartományban.
(e) Homeosztázis
A szérumnátriumszintek 135 mEQ/1 alá csökkentek a három PROLEUKIN állat közül kettőben a 8. napon, de a többi állat esetében normális maradt (13A. ábra). 50 A PROLEUKIN csoportban a kloridszintek úgyszintén lecsökkentek 95 mEQ/1 szint alá a 3. nappal kezdődően és a 15. napig alacsony maradtak (13B. ábra). A kalciumszint három PROLEUKIN állat esetében kettőben alacsonyabb volt a 6. és 8. napon és az A199 ál55 latban elérte a 4,9 mg/dl, illetve 3,1 mg/dl szintet (13C. ábra). A káliumszint 3 mEQ/1 alá csökkent a 3. naptól a 12. napig az összes PROLEUKIN-kezelt állatban, kivéve az A199 állatot, amely esetében a káliumszint ténylegesen a 7,2 mEQ/1 toxikus szintre emelke60 dett, mielőtt a vizsgálatból kivettük (13D. ábra).
HU 226 142 Β1 (f) Vaszkuláris áteresztés jelei
A szérumalbuminszint mind a PROLEUKIN (37%) és az IL-2/N88R (19%) csoportban (14A. ábra) csökkent. A PROLEUKIN csoportban a 3. és 6. napon emelkedett hematokrit értéket figyeltünk meg (14B. ábra). Ezzel ellentétben a hematokritérték mint a hordozóanyag kontroll és az IL-2/N88R csoportban lecsökkent ugyanebben az időtartományban és alacsony maradt, ami mérsékelt anémiát jelzett, ami várható is volt a többszöri vérmintavétel miatt (14B. és C. ábra). A PROLEUKIN csoportban a hematokritérték megemelkedése az albumin esetében tapasztalt csökkenéssel összekapcsolva alátámasztja egy vaszkuláris áteresztés szindróma kialakulást.
3. Sejtes aktiválás
A PROLEUKIN és az IL-2/N88R hatékonyságot a CD25 pozitív limfociták százalékos arányának változásán (szállítás+proliferáció) és a CD25 fluoreszcencia átlagának vagy egy adott T-sejt felületén (CD25=alacsony affinitású IL-2R) az expresszált CD25 antigének számán keresztül követtük. A CD25 expressziót a teljes T-sejt-populáción (CD3+ sejtek) és hasonlóképpen a CD3+CD4+, valamint a CD3+CD8+ populációkon követtük.
Az IL-2-aktivitást a természetes killersejteken (NK) a CD3-CD16+ és CD3-CD25+CD16+ NK-sejtek forgalmának az analízisével követtük. A CD3+, CD4+, CD8+, NK-sejtek abszolút számát úgy határoztuk meg, hogy a sejtek százalékos arányát a limfociták mm3-re vonatkoztatott számával megszoroztuk, amely adatot a hematológiai analízis során kaptunk.
(a) Expresszié CD25 szabályozása a T-sejt felületén
Az aktivált T-sejtek százalékos aránya - ahogyan ezt a CD25 pozitív sejtek jelzik - a tanulmány 6. napjára felfelé szabályozódon, főleg a CD3+CD4+ T-sejtszubpopuláció esetében. Úgy tűnik, hogy a PROLEUKIN a CD25 expressziót az összes CD3+, CD3+CD4+ és CD3+CD8+ T-sejt-szubpopulációk magasabb százalékán indukálja a 6. napon. Azonban a 8. napra a CD25 antigént expresszáló sejtek százalékos aránya azonos volt olyan csimpánzok limfocitái esetében, amelyek PROLEUKIN-kezelést kaptak, és amely csimpánzok IL-2/N88R kezelést kaptak, (15A., B. és C. ábra). Nem figyeltünk meg CD25 festődést a természetes killer- (NK) sejt populáció felületén sem a PROLEUKIN-, sem az IL-2/N88R-kezelt csimpánzok esetében. Ezen eredményekért feltételezésünk szerint az IL-2Ra (a CD25 részéről a sejtfelszíni festésre célba vett antigén) expressziójának hiánya felelős a kiválasztott NK-sejt populáció (CD3-/CD16+) felületén.
A CD3+CD25+ T-sejtek abszolút száma hasonló elrendeződést követett mint a CD3+CD25+ T-sejtek százalékos aránya, ahol a PROLEUKIN aktívabbnak tűnt mint az IL-2/N88R (16A. ábra). Az IL-2/N88R hasonló T-sejt-aktivációs potenciált mutatott, mint a PROLEUKIN a CD3+CD4+ T-sejt-populáción, ahogy az IL-2/N88R-indukált CD3+CD4+CD25+ limfociták abszolút számának felfelé szabályozása azonos volt a PROLEUKIN esetében tapasztalt felfelé szabályozással (16B. ábra). Úgy tűnt, hogy a PROLEUKIN a CD3+CD8+CD25+ T-sejtek számát nagyobb mértékben növeli, mint az IL-2/N88R (16C. ábra).
A CD3+CD4+ T-sejt-szubpopuláción expresszált CD25 molekulák száma (fluoreszcencia átlaga) azonos kinetikát követett akár a PROLEUKIN-, akár az IL-2/N88R-kezelés során (17. ábra).
(b) Limfocitavándorlás: PROLEUKIN- és
IL-2/N88R-kezelés hatása
A PROLEUKIN- és az IL-2/N88R-aktivitásokat a Tés NK-sejt populációkon a keringő limfociták abszolút száma változásának analízisével végeztük a kezelés előtt, alatt és utána (18. ábra). Úgy tűnt, hogy az IL-2/N88R nagyobb aktivitással rendelkezik, mint a PROLEUKIN a CD3+CD4+ keringő limfociták abszolút számának növelésében (18A. ábra) és a PROLEUKINnal összehasonlítva enyhén csökkent aktivitást mutat a CD3+CD8+ keringő limfociták abszolút számának növelésében (18B. ábra). Mindkét vegyület összevethető, bár mérsékelt hatást mutat a CD3+ limfociták teljes számának növelésében (18C. ábra). Sem a PROLEUKIN, sem az IL-2/N88R nem befolyásolta az NK-sejtek forgalmát (18D. ábra).
C) Következtetések
Az IL-2/N88R-t mutáns IL—2-fehérjék szkrínelése útján állítottuk elő humán primer T- és NK-sejt vizsgálati eljárásokban. In vitro 6000-szeres szelektivitást mutat a T-sejtekre az NK-sejtekkel összehasonlítva. Ezen sejtes profil alapján azt tételeztük fel, hogy csupán enyhe mellékhatásokat indukálna olyan dózisban beadva, amely jelentős mértékű T-sejt-aktivációt vált ki. Csimpánzokon végzett kísérletek - amikor a PROLEUKIN és az IL-2/N88R összehasonlítására került sor - megerősítették, hogy az IL-2/N88R jelentős mértékben jobb biztonsági profillal rendelkezik, mint a PROLEUKIN, míg ezzel összevethető képességet mutat T-sejt-aktiválásra.
8. példa
Az N88R IL-2-szelektlv agonista hatékonysága az egér CT-26 tüdőmetasztázis tumor modellben Protokoll: Egereket (Balb/c, nőstény, 6-8 hetes) injektáltunk intravénásán (iv.) 1x105 CT-26-sejttel (egér végbélrák) 0,2 ml PBS-pufferben a laterális farokvénába a 0. napon. A kezeléseket PROLEUKIN vagy IL-2/N88R adásával végeztük különböző dózisok mellett [hígítószer: 5% dextróz vízben (D5W)], vagy D5W adásával: naponta egyszer intravénásán beadva 8 napon keresztül (QD*8) az implantációt követően az 1. napon kezdve. Az IL-2/N88R előkészítését szobahőmérsékleten végeztük D5W oldatban szilikonizált ampullákba kihígítva tuberkulin fecskendő segítségével, és az állatoknak az elkészítést követően 2 órán belül beadtuk. A PROLEUKIN előkészítéséhez 0,7 ml injekcióhoz alkalmas steril vizet adtunk (SWFI) mindegyik ampullához (végső koncentrációja: 1,86 mg/ml). A hígításokat az IL-2/N88R esetében leírtaknak megfelelően végeztük D5W-ben (6. táblázat). Az állatokat a 11. napon áldoztuk fel. A tüdőket eltávolítottuk és lemértük, PBS-ben leöblítettük és a szövetet Bouin-féle oldatba átvittük. 24 órával később a szövetet 10% formalinol20
HU 226 142 Β1 datba tettük. A tüdőkben a metasztázisos telepek számát boncoló mikroszkóp alatt megszámoltuk.
6. táblázat
Dózis- és csoportbeosztás az egér CT-26 tumormodell-tanulmány során
Csoport n Kezelés Dózis, mg/kg
1. 14 D5W NA
2. 11 PROLEUKIN 3 mg/kg
3. 11 PROLEUKIN 10 mg/kg
4. 11 IL-2/N88R 1 mg/kg
5. 12 IL-2/N88R 3 mg/kg
6. 12 IL-2/N88R 10 mg/kg
Csoport Π Kezelés Dózis, mg/kg
7. 12 IL-2/N88R 30 mg/kg
8. 11 IL-2/N88R 60 mg/kg
A 7. táblázatban mutatjuk be az egyes egerekben leszámolt metasztázisok számát. Összehasonlítható hatékonyságot figyeltünk meg mind az IL-2/N88R és a PROLEUKIN esetében. Az IL-2/N88R magas dózisa esetén (8. csoport, 60 mg/kg) egy kivételével az összes egér esetében 12, vagy annál kevesebb metasztázist találtunk; az egerek közül 3 esetében nem találtunk metasztázist. Ez szembeállítható a legmagasabb vizsgált PROLEUKIN-dózis esetével, ahol az összes túlélő egér esetében 12, vagy annál több metasztázist találtunk.
7. táblázat
Felsoroljuk az egyéni metasztázisszámlálásokat és a középértékeket
Cso- port Tüdőmetasztázisok (felsoroljuk az egyes egerek esetén kapott értékeket) Át- lag SEM P-érték (2 mintás)
1. 0 129 183 179 155 165 200 152 148 158 200 194 165 125 154 13,42
2. 118 126 107 111 118 110 137 114 135 158 132 124 4,61 0,07278
3. 12 38 18 19 30 23 4,66 0,00003
4. 169 173 189 200 120 117 136 122 200 163 110 154 10,41 0,97029
5. 171 176 186 159 192 139 117 200 195 116 192 168 9,31 0,43401
6. 92 111 112 114 109 84 68 47 58 49 112 87 8,16 0,00060
7. 15 13 59 62 23 55 46 16 9 4 8 2 26 6,57 0,00000
8. 7 0 3 2 4 9 7 0 12 55 0 9 4,75 0,00000
Szignifikáns (P<0,05) csökkenést figyeltünk meg az egerek esetében a metasztázisokban a 10, 30 és 60 mg/kg IL-2/N88R dóziscsoportokban (sorrendben megfeleltetve a 6. 7. és 8. csoportok), valamint a 10 mg/kg PROLEUKIN-mennyiséggel kezelt csoport 40 esetében (3. csoport). Ezeket az eredményeket grafikusan mutatjuk be a 19. ábrán. Az adatokat a dózis logaritmusát alkalmazva tüntetjük fel: PROLEUKIN esetében 3 és 10 mg/kg dózisok voltak; IL-2/N88R esetében 1, 3,
10,30 és 60 mg/kg dózisok voltak. Nemlineáris egyenle- 45 tét alkalmazva a görbeillesztés (4 paraméteres illesztés)
5,2 mg/kg IC5Q-értéket adott PROLEUKIN esetében és 10,9 mg/kg IC50-értéket adott IL-2/N88R esetében.
Az ezen kísérletben kapott adatok alapján az IC50 értéke az IL-2/N88R esetében tapasztalt metasztá- 50 zisszám-csökkentésre vonatkozólag számításaink szerint 10,9 mg/kg volt (8,6-13,9 mg/kg 95% konfidencia mellett) míg PROLEUKIN esetében 5,2 mg/kg érték adódott (3,5-7,7 mg/kg 95% konfidencia mellett).
Az egerek túlélését a 8. táblázatban mutatjuk be. A 10 mg/kg PROLEUKIN csoportban egy (1) egér pusztult el a 7. napon és további öt (5) pusztult el a 8. napon. Egy (1) egér pusztult el a 8. napon mind a 3 vagy 10 mg/kg IL-2/N88R kezelt csoportban, és nem tapasztaltuk elhullást az 1, 30, vagy 60 mg/kg IL-2/N88R-kezelt csoportok egyikében sem. Továbbá a legtöbb 3 mg/kg PROLEUKIN-dózissal kezelt egér és az összes 10 mg/kg PROLEUKIN-dózissal kezelt egér a végét járta; nem tapasztaltunk elhullást az IL-2/N88R-kezelt egerekben.
8. táblázat
IL-2/N88R- vagy PROLEUKIN-kezelt egerek túlélése
Csoport Nap
0 74 8 11
D5W1 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Pro: 3 mg/kg 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
HU 226 142 Β1
8. táblázat (folytatás)
Csoport Nap
0 74 8 11
Pro: 10 mg/kg 100,0% 90,9% 45,5% 45,5%
IL-2/N88R: 1 mg/kg 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
IL-2/N88R: 3 mg/kg 100,0% 100,0% 91,7% 91,7%
IL-2/N88R: 10 mg/kg 100,0% 100,0% 91,7% 91,7%
IL-2/N88R: 30 mg/kg 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
IL-2/N88R: 60 mg/kg 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
1n=14 egér/csoport 2n=11 egér/csoport 3n=12 egér/csoport 4 nem figyeltünk meg elhullást a 7. napot megelőzően
Mindkét PROLEUKIN-kezelt csoportban az állatok a végüket járták. Nem figyeltünk meg elhullást egyetlen IL-2/N88R-kezelt állat esetében sem.
összefoglalva ezek a tanulmányok azt jelzik, hogy az IL-2/N88R éppen olyan hatékony mint a PROLEUKIN a tumorterhelés csökkentésében (ahogyan ez a tüdőmetasztázis-számlálás segítségével mérhető a CT26 modellben). Továbbá az IL-2/N88R esetében kimutattuk, hogy jelentős mértékben kisebb toxicitással rendelkezik, mint a PROLEUKIN.
9. példa
Stabil, nagy mennyiséget termelni képes CHOsejtvonalak kifejlesztése, amelyek IL-2N88R-t expresszálnak
Stabil, az IL-2/N88R mutein nagy mennyiségeit kiválasztó termelő sejtvonalakat fejlesztettünk ki CHO(dhfr-) sejtek transzfektálásával a 20. ábrán bemutatott expresszíós vektort alkalmazva (ATCC letéti szám:). Az IL-2/N88R expresszíós vektor egyedi elemeit a 20. ábrán látható plazmidtérképen mutatjuk be. Itt látható a CMVe/p=citomegalovírus korai promoter; PA=SV40 poliadenilációs szignálszekvencia; valamint DHFR=dihidrofolát-reduktáz expresszíós kazetta.
A vektort standard rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával szerkesztettük meg. Általánosságban lásd: Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, (1989); Short Protocols in Molecular Biology, 2. kiadás, John Wiley&Son, (1992); Methods in Enzimology 185. köt., szerk.: Goeddel és munkatársai, Academic Press, Inc., London, (1991). Az expresszíós vektor külön expresszíós kazettákat tartalmaz az IL-2/N88R gén, valamint az amplifikálható és szelektálható DHFR (dihidrofolát-reduktáz) gén számára. Körülbelül 1*106 CHO- (kínai hörcsög petefészek) sejtet transzfektáltunk 10 pg pBC1IL2SA alkalmazásával Lipofectin reagens segítségével (Life Technology Inc., Bethesda, Maryland) a gyártó utasításai szerint. A sejteket ezt követően 50 nM methotrexát jelenlétében szelektáltuk és 5% dializált fötális marhaszérummal kiegészített DME/F12 táptalajban tenyésztettük (Life Technologies Inc.) amelyből hiányzott a timidin és a hipoxantin. A sejtpopulációkat IL-2/N88R termelésre szkríneltük kereskedelemben hozzáférhető ELISA reagenskészlet segítségével (R&D Systems). A nagy termelést mutató populációkat tovább szelektáltuk növekvő methotrexát koncentrációkat tartalmazó táptalajban (100-400 nM methotrexát) és IL-2/N88R termelésre szkríneltük. Ezt követően korlátozó hígítások módszerével végzett klónozást alkalmaztunk, hogy magas és stabil termelékenységgel rendelkező kiónokat nyerjünk ki. A klónozást methotrexát távollétében végeztük standard szövettenyésztési eljárások alkalmazásával.
10. példa
IL-2/N88R szérummentes termelése perfúziós bioreaktorban
Az IL-2/N88R folyamatos termelését folyamatos perfúziós fermentációval valósítottuk meg. Egy 19 literes Wheaton fermentort oltottunk be a 9. példában leírt stabil CHO-sejtvonallal 2*106 sejt/ml koncentrációnál és 5 liter/nap közepes kicserélődési sebességgel perfundáltuk. A termelő-táptalaj egy DME/F12 alapú táptalaj volt (Life Technologies, Inc., Rockville, MD), amelyet rekombináns humán inzulinnal (10 pg/ml) (HUMULIN™, Eli Lilly, Inc., Indianapolis, IN) és FeSO4-EDTAval (50 μΜ) egészítettünk ki. A sejtsűrűséget 4*106 sejt/ml értéken tartottuk. A fermentor átlagos napi kitermelése körülbelül 200 mg/nap volt. Az IL-2/N88R termelését 30 napig stabilan fenntartottuk.
11. példa
CHO-sejtekben termelt IL-2/N88R tisztítása
A fentebb leírt perfúziós eluátumra a következő eljárást alkalmaztuk.
A perfúziós táptalajt begyűjtöttük és egy S-Sepharose oszlopra vittük fel. Az oszlopot 5 millimólos NaCI-dal kiegészített 20 millimólos foszfátpufferrel (pH=7,0) hoztuk egyensúlyba. A felvitelt (TCF) 4 millisiemens vezetőképességre állítottuk be víz hozzáadásával és foszforsavval a fentivel megegyező pH-értékre állítottuk.
HU 226 142 Β1
Miután a TCF-t az oszlopra felvittük, az oszlopot ugyanezen ekvilibrációs pufferrel mostuk. Az elúciót a pH-érték eltolásával hajtottuk végre. A muteineket 20 mM etanol-aminnal (pH=10,5) eluáltuk, hogy a muteineket az oszlopról lemossuk és így létrehozzuk az 5 S-eluátumot.
Anioncserélő kromatográfiai hajtottunk végre oly módon, hogy az S-eluátumot 10 mM bikarbonátpufferrel (pH=10,5) egyensúlyba hozott QAE Fást Flow™ oszlopon (Pharmacia) engedtük keresztül. Az áramlási sebességet 250 cm/óra értéken tartottuk. Miután az alapvonal eléréséig mostuk, az IL-2SA-t 20 mM foszfáttal (pH=4,0) eluáltuk,
Hidroxi-apatit (HAP) kromatográfiát hajtottunk végre oly módon, hogy a hígított QAE eluátumot (1:1 WFI- 15 vei) 10 mM foszfáttal (pH=7,0) egyensúlyba hozott kerámia hidroxi-apatittal (Type-ll, Bio-Rad, Hercules, CA) töltött oszlopon vittük keresztül. Az áramlási sebességet 250 cm/óra értéken tartottuk. Miután az alapvonal eléréséig mostuk, az IL-2SA-Í 100 mM foszfáttal (pH=7,0) eluáltuk.
A hidroxi-apatit eluátumot 300 ml térfogatra ultraszűrtük három PES 5K patronnal felszerelt Millipore Pellicon-2 egység segítségével (Millipore Corporation, Bedford, MA). 25
Az ultraszűrt HAP eluátumot egy S100HR (Pharmacia) gélszűrő oszlopon áteresztve tisztítottuk tovább 35 cm/óra sebességgel. Az oszlopot 150 mM NaCI-ot tartalmazó 10 mM foszfátpufferrel (pH=7,0) hoztuk egyensúlyba.
A gélszűrésből nyert egyesített anyagot vízzel (WFI) hígítottuk, hogy 4,0 mMhos/cm vezetőképességet érjünk el és újra S-Sepharose oszlopra vittük a fentebb leírt körülmények között. Az IL-2SA-t 1 M NaCI-ot tartalmazó 10 mM foszfátpufferrel (pH=7,0) eluáltuk. 35
A végső kationcserélő kromatográfiából nyert összeöntött anyagot foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS) szemben dializáltuk éjszakán keresztül és steril PBS alkalmazásával 6 mg/ml koncentrációra hígítottuk. A végső hígított egyesített anyagot ezután 40 sterilre szűrtük, kisebb egyenlő részletekbe szétosztottuk és -70 °C-on lefagyasztottuk. A teljes kinyerés
65% volt.
A szakember számára egyértelmű, hogy a fentiekben leírt megvalósítási módokon túl számos, ezekkel egyenértékű megvalósítási mód képzelhető el. Ezek mind az igényelt oltalmi körön belülik. A találmány leírása során kitanítást adunk arról, hogyan állíthatunk elő a leírásban specifikusan nem említett olyan mutei10 neket, amelyek T-sejt-aktiválást okoznak, amire bizonyítékul szolgál a PHA-blaszt-proliferáció és a csökkentett NK-sejt proliferáció és ennek következtében ezek a muteinek a találmányi gondolatot testesítik meg és az igényelt oltalmi körön belülik. Az itt leírásra került koncepció és kísérletes megközelítés más citokinekre is alkalmazható lehet, amelyek heterológ multimer receptorrendszereken keresztül fejtik ki hatásukat, közelebbről meghatározva ilyen citokinek lehetnek a következők: az IL—7, IL—9 és IL—15 rokon citokinek, az 20 IL—10, interferon-α és interferon-γ.
Szekvenciák
A találmányi bejelentés érvényességi körén belülinek tekintendők az alábbi szekvenciák:
1. azonosítási szám szerinti szekvencia: hlL-2 (aminosav);
2. azonosítási szám szerinti szekvencia: hlL-2 (cDNS);
3. azonosítási szám szerinti szekvencia: 5’-PCR30 primer, IL-2;
4. azonosítási szám szerinti szekvencia: 3'-PCRprimer, IL-2;
5. azonosítási szám szerinti szekvencia: IL-2 expressziós vektorhoz mutagenezisprimer;
6. azonosítási szám szerinti szekvencia: D20X mutációkhoz mutagenezisprimer;
7. azonosítási szám szerinti szekvencia: N88X mutációkhoz mutagenezisprimer;
8. azonosítási szám szerinti szekvencia: Q126X mutációkhoz mutagenezisprimer.
SZEKVENCIALISTA <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Alá 1 Pro Thr Ser Ser 5 Ser Thr Lys Lys Thr 10 Glu Leu Gin Leu Glu 15 His
Leu Leu Leu Asp 20 Leu Gin Met Ile Leu 25 Asn Gly Ile Asn Asn 30 Tyr Lys
Asn Pro Lys 35 Leu Thr Arg Met Leu 40 Thr Phe Lys Phe Tyr 45 Met Pro Lys
Lys Alá 50 Thr Glu Leu Lys His 55 Leu Gin Cys Leu Glu 60 Glu Glu Leu Lys
HU 226 142 Β1
Pro 65 Leu Glu Glu Val Leu 70 Asn Leu Alá Gin Ser 75 Lys Asn Phe His Leu 80
Arg Pro Arg Asp Leu 85 Ile Ser Asn Ile Asn 90 Val Ile Val Leu Glu 95 Leu
Lys Gly Ser Glu 100 Thr Thr Phe Met Cys 105 Glu Tyr Alá Asp Glu 110 Thr Alá
Thr Ile Val 115 Glu Phe Leu Asn Arg 120 Trp Ile Thr Phe Cys 125 Gin Ser Ile
Ile Ser Thr Leu Thr
130 <210>2 <211 >465 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 2 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt gataa 465 <210>3 <211 >30 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 3 cctcaactcc tgaattcatg tacaggatgc 30 <210>4 <211 >31 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 4 ggaagcggat ccttatcaag tcagtgttga g 31 <210>5 <211 >36 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 5 gcacttgtca caaacaccat ggcacctact tcaagt 36 <210>6 <211 >28
HU 226 142 Β1 <212> DNS <213> Homo sapiens <400>6 ggagcattta ctgctgnnnt tacagatg <210>7 <211> 30 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 7 gggacttaat cagcnnnatc aacgtaatag <210>8 <211> 28 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 8 ggattacctt ttgtnnnagc atcatctc

Claims (8)

1. A vad típusú IL-2-nek megfelelően számozott humán IL—2 mutein, amely a 20., 88. és 126. pozíciók közül legalább egyben szubsztituált, ahol a 20. pozícióban végrehajtott szubsztitúció alanint, hisztidint, izoleucint, metionint, glutamint, szerint, valint vagy tirozint eredményez;
a 88. pozícióban végrehajtott szubsztitúció alanint, arginint, glutaminsavat, hisztidint, lizint, leucint, fenilalanint, glicint, izoleucint, metionint, szerint, treonint, tirozint vagy valint eredményez;
a 126. pozícióban végrehajtott szubsztitúció pedig aszparagint, leucint, prolint, fenil-alanint, glicint, izoleucint, metionint, arginint, szerint, treonint, tirozint vagy valint eredményez, miáltal az IL—2 mutein a T-sejteket a természetes killersejtekhez viszonyítva preferenciálisan aktiválja.
2. Az 1. igénypont szerinti IL-2 mutein, amelyben a 88. pozícióban végrehajtott szubsztitúció arginint eredményezett.
3. Gyógyászati készítmény, amely gyógyászatilag elfogadható hordozót és 1. vagy 2. igénypont szerinti humán IL—2 muteint tartalmaz, miáltal a gyógyászati készítmény a T-sejteket a természetes killersejtekhez viszonyítva preferenciálisan aktiválja.
4. A vad típusú IL-2-nek megfelelően számozott humán IL—2 mutein, amely a 20., 88. és 126. pozíciók közül kettőben szubsztituált, ahol a 20. pozícióban végrehajtott szubsztitúció alanint, hisztidint, izoleucint, metionint, glutamint, szerint, valint vagy tirozint eredményez;
a 88. pozícióban végrehajtott szubsztitúció alanint, arginint, glutaminsavat, hisztidint, lizint, leucint, fenilalanint, glicint, izoleucint, metionint, szerint, treonint, tirozint vagy valint eredményez;
a 126. pozícióban végrehajtott szubsztitúció pedig aszparagint, leucint, prolint, fenil-alanint, glicint, izoleucint, metionint, arginint, szerint, treonint, tirozint vagy valint eredményez, miáltal az IL—2 mutein a T-sejteket a természetes killersejtekhez viszonyítva preferenciálisan aktiválja.
5. Polinukleotid, amely az 1., 2. és 4. igénypont bármelyike szerinti IL—2 muteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
6. Vektor, amely 5. igénypont szerinti polinukleotidot tartalmaz.
7. Izolált eukarióta sejt, amely 6. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.
8. Prokarióta sejt, amely 6. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.
HU0101948A 1998-05-15 1999-05-13 Il-2 selective agonists and antagonists HU226142B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8008098A 1998-05-15 1998-05-15
PCT/US1999/010643 WO1999060128A1 (en) 1998-05-15 1999-05-13 Il-2 selective agonists and antagonists

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0101948A2 HUP0101948A2 (hu) 2001-09-28
HUP0101948A3 HUP0101948A3 (en) 2003-08-28
HU226142B1 true HU226142B1 (en) 2008-05-28

Family

ID=22155135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0101948A HU226142B1 (en) 1998-05-15 1999-05-13 Il-2 selective agonists and antagonists

Country Status (39)

Country Link
EP (1) EP1076704B1 (hu)
JP (1) JP4276783B2 (hu)
KR (1) KR100607609B1 (hu)
CN (2) CN101319247B (hu)
AR (1) AR020322A1 (hu)
AT (1) ATE351907T1 (hu)
AU (1) AU759697B2 (hu)
BG (1) BG65139B1 (hu)
BR (1) BRPI9910504B1 (hu)
CA (1) CA2327349C (hu)
CO (1) CO5070701A1 (hu)
CU (2) CU23273B7 (hu)
CY (1) CY1107533T1 (hu)
CZ (1) CZ302071B6 (hu)
DE (1) DE69934881T2 (hu)
DK (1) DK1076704T3 (hu)
DZ (1) DZ2788A1 (hu)
ES (1) ES2281175T3 (hu)
HK (1) HK1039963B (hu)
HN (1) HN1999000075A (hu)
HU (1) HU226142B1 (hu)
IL (2) IL139136A0 (hu)
MY (1) MY130274A (hu)
NO (1) NO329235B1 (hu)
NZ (1) NZ508098A (hu)
PA (1) PA8472601A1 (hu)
PE (1) PE20000475A1 (hu)
PL (1) PL201675B1 (hu)
PT (1) PT1076704E (hu)
RO (1) RO122150B1 (hu)
RU (1) RU2235729C2 (hu)
SI (1) SI20643B (hu)
SK (1) SK288100B6 (hu)
SV (1) SV1999000061A (hu)
TN (1) TNSN99090A1 (hu)
TR (1) TR200003354T2 (hu)
TW (1) TWI223663B (hu)
UA (1) UA73719C2 (hu)
WO (1) WO1999060128A1 (hu)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6566500B1 (en) 1999-03-30 2003-05-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for modifying toxic effects of proteinaceous compounds
EP1935431A3 (en) 2000-05-15 2008-08-13 Health Research, Inc. Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2
US6689353B1 (en) * 2000-06-28 2004-02-10 Bayer Pharmaceuticals Corporation Stabilized interleukin 2
US7723102B2 (en) * 2000-09-28 2010-05-25 Bayer Corporation Enhanced transfection system
MY139948A (en) * 2000-09-28 2009-11-30 Bayer Corp Enhanced transfection system
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
PT1454138E (pt) * 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
DE602004031341D1 (de) 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
ES2359473T3 (es) * 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
EP1694360B1 (en) 2003-11-04 2010-08-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection
JP5744369B2 (ja) * 2004-02-27 2015-07-08 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ＩＬ１５−Ｒα用ＩＬ−１５結合部位およびアゴニスト／アンタゴニスト活性を有する特異的ＩＬ−１５突然変異体
RU2006135112A (ru) * 2004-03-05 2008-04-10 Чирон Корпорейшн (Us) Тест-система in vitro для прогнозирования устойчивости пациента к терапевтическим средствам
WO2009061853A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
CN101244261B (zh) * 2008-03-10 2010-09-15 山东大学 一种含未复性重组蛋白的生物制剂及其制备方法与应用
DE102008023820A1 (de) * 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
CN102101885B (zh) * 2010-09-01 2013-06-05 南京发士达生物科技有限公司 低诱导抑制性t细胞的人白细胞介素ⅱ突变体及其用途
PT2637694T (pt) 2010-11-12 2021-05-05 Nektar Therapeutics Conjugados de uma fração de il-2 e um polímero
CU23923B1 (es) * 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
US9428567B2 (en) 2010-12-22 2016-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antagonists of interleukin-2 receptor
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
WO2012119093A1 (en) * 2011-03-03 2012-09-07 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
EP3049445A4 (en) 2013-09-24 2017-10-25 Medicenna Therapeutics, Inc. Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
MA39250B1 (fr) 2014-02-06 2018-09-28 Hoffmann La Roche Protéines hybrides de l'interleukine-2 et leurs utilisations
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CA2946398A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
SG11201700629TA (en) * 2014-08-11 2017-02-27 Delinia Inc Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
WO2017201432A2 (en) * 2016-05-19 2017-11-23 Jounaidi Youssef Tethered interleukin-2 to its receptor il-2rbeta, a platform to enhance natural killer and regulatory t cell activity
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
EP3475413B1 (en) 2016-06-22 2024-02-14 David Klatzmann Genetically modified t lymphocytes
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US11077172B2 (en) 2016-11-08 2021-08-03 Delinia, Inc. IL-2 variants for the treatment of psoriasis
BR112019011799B1 (pt) * 2016-12-13 2021-12-21 Delinia, Inc Proteína de fusão, proteína dimérica e composição farmacêutica
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
CA3064435A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
JOP20190271A1 (ar) * 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
US11542312B2 (en) 2017-06-19 2023-01-03 Medicenna Therapeutics, Inc. IL-2 superagonists in combination with anti-PD-1 antibodies
US20200181220A1 (en) * 2017-08-03 2020-06-11 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
US20200299349A1 (en) * 2017-11-21 2020-09-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partial agonists of interleukin-2
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
EP3752178A1 (en) 2018-02-16 2020-12-23 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating sjögren's syndrome
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
AU2019246389A1 (en) 2018-03-28 2020-08-27 Ascendis Pharma Oncology Division A/S IL-2 conjugates
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
CA3106858A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Il2 agonists
WO2020035482A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
MX2020007072A (es) * 2018-09-17 2020-11-11 Gi Innovation Inc Proteina de fusion que comprende proteina il-2 y proteina cd80 y uso de la misma.
TW202034945A (zh) 2018-12-21 2020-10-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種人白細胞介素２變體或其衍生物
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
TW202115105A (zh) * 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
MX2022001866A (es) * 2019-08-13 2022-03-11 Amgen Inc Muteinas de interleucina-2 para la expansion de celulas t reguladoras.
JP2023505590A (ja) 2019-12-12 2023-02-09 イルトゥー・ファルマ インターロイキン２キメラ構築物
CA3162705A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Amgen Inc. Dual interleukin-2 /tnf receptor agonist for use in therapy
US11633488B2 (en) 2020-01-10 2023-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
KR102653906B1 (ko) 2020-01-14 2024-04-03 신테카인, 인크. 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물
KR20220155316A (ko) 2020-03-19 2022-11-22 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 인터루킨-2 돌연변이 및 이의 용도
AR121713A1 (es) 2020-03-31 2022-06-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Nuevos análogos de il-2 inmunoestimulantes
EP4161956A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 sequences and uses thereof
CN114507643A (zh) * 2020-10-29 2022-05-17 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-2的多能干细胞衍生物及应用
KR20230097094A (ko) 2020-10-29 2023-06-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 질환의 치료를 위한 융합 단백질
CN113308477A (zh) * 2021-04-08 2021-08-27 华南农业大学 一种鸭il-2基因真核表达重组质粒及其制备方法
TW202320862A (zh) 2021-09-22 2023-06-01 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 介白素２突變體以及其融合蛋白
WO2023057588A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Iltoo Pharma Interleukin 2 chimeric constructs with targeting specificy to inflamed tissues
CN114875069B (zh) * 2022-04-22 2023-09-15 四川大学 基因工程修饰的il2细胞因子的重组载体、宿主细胞及其用途
WO2023245097A2 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Cephalon Llc Anti-pd-1 antibody-attenuated il-2 immunoconjugates and uses thereof
WO2024056154A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
FR3140287A1 (fr) 2022-10-03 2024-04-05 Arkema France Procede de granulation de composes azoiques et granules obtenus

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5696234A (en) * 1994-08-01 1997-12-09 Schering Corporation Muteins of mammalian cytokine interleukin-13

Also Published As

Publication number Publication date
RU2235729C2 (ru) 2004-09-10
DZ2788A1 (fr) 2003-12-01
BRPI9910504B1 (pt) 2016-08-09
KR100607609B1 (ko) 2006-08-02
BG104929A (en) 2001-09-28
PE20000475A1 (es) 2000-07-07
CO5070701A1 (es) 2001-08-28
NO20005762L (no) 2001-01-11
DK1076704T3 (da) 2007-03-12
TR200003354T2 (tr) 2001-03-21
CA2327349A1 (en) 1999-11-25
WO1999060128A1 (en) 1999-11-25
EP1076704A1 (en) 2001-02-21
PT1076704E (pt) 2007-02-28
RO122150B1 (ro) 2009-01-30
CN101319247B (zh) 2012-12-12
UA73719C2 (en) 2005-09-15
SK17242000A3 (sk) 2001-07-10
CA2327349C (en) 2010-10-26
SV1999000061A (es) 2000-03-14
TWI223663B (en) 2004-11-11
SI20643B (sl) 2008-02-29
KR20010043602A (ko) 2001-05-25
CZ20004213A3 (en) 2001-05-16
MY130274A (en) 2007-06-29
HUP0101948A2 (hu) 2001-09-28
TNSN99090A1 (fr) 2005-11-10
PA8472601A1 (es) 2000-09-29
ES2281175T3 (es) 2007-09-16
PL201675B1 (pl) 2009-04-30
IL139136A0 (en) 2001-11-25
DE69934881D1 (de) 2007-03-08
CN100366742C (zh) 2008-02-06
CN1309705A (zh) 2001-08-22
HN1999000075A (es) 1999-09-29
CY1107533T1 (el) 2013-03-13
AU759697B2 (en) 2003-04-17
PL344407A1 (en) 2001-11-05
EP1076704B1 (en) 2007-01-17
CZ302071B6 (cs) 2010-09-29
JP4276783B2 (ja) 2009-06-10
BR9910504A (pt) 2001-01-09
CN101319247A (zh) 2008-12-10
SI20643A (sl) 2002-02-28
CU23273B7 (es) 2008-04-09
AR020322A1 (es) 2002-05-08
NO20005762D0 (no) 2000-11-14
CU23272A1 (es) 2008-04-09
ATE351907T1 (de) 2007-02-15
HUP0101948A3 (en) 2003-08-28
IL139136A (en) 2009-05-04
NO329235B1 (no) 2010-09-20
DE69934881T2 (de) 2007-11-08
HK1039963A1 (en) 2002-05-17
HK1039963B (zh) 2008-09-05
AU4078499A (en) 1999-12-06
JP2002515247A (ja) 2002-05-28
NZ508098A (en) 2003-09-26
SK288100B6 (sk) 2013-07-02
BG65139B1 (bg) 2007-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU226142B1 (en) Il-2 selective agonists and antagonists
US7105653B2 (en) IL-2 selective agonists and antagonists
RU2369616C2 (ru) Слитые белки il-7
JP2006094862A (ja) Ｔ細胞調節のための製品と方法
WO2003040313A2 (en) Il-21 antagonists
MX2007014474A (es) Composiciones y metodos para inmunomodulacion en un organismo.
JP2010279365A (ja) 修飾したヒト胸腺ストローマ細胞リンホポエチン
JP2023505590A (ja) インターロイキン２キメラ構築物
JPH09512165A (ja) インターロイキン１５
MXPA00010943A (en) Il-2 selective agonists and antagonists
JP3689111B2 (ja) インターロイキン１５
MXPA06007377A (en) Il-7 fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: AICURIS GMBH & CO. KG, DE

Free format text: FORMER OWNER(S): BAYER CORP., US; AICURIS, DE; BAYER CORP., US