NO329235B1 - IL-2- mutein, farmasoytisk preparat, polynukleotid, vektor, vertcelle, anvendelse samt fremgangsmate for utvelgelse av visse IL-2 muteiner. - Google Patents

IL-2- mutein, farmasoytisk preparat, polynukleotid, vektor, vertcelle, anvendelse samt fremgangsmate for utvelgelse av visse IL-2 muteiner. Download PDF

Info

Publication number
NO329235B1
NO329235B1 NO20005762A NO20005762A NO329235B1 NO 329235 B1 NO329235 B1 NO 329235B1 NO 20005762 A NO20005762 A NO 20005762A NO 20005762 A NO20005762 A NO 20005762A NO 329235 B1 NO329235 B1 NO 329235B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cells
cell
mutein
muteins
human
Prior art date
Application number
NO20005762A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20005762L (no
NO20005762D0 (no
Inventor
Armen Shanafelt
Jeffrey M Greve
Gary Jesmok
Kenneth J Lembach
Gayle D Wetzel
Original Assignee
Aicuris Gmbh & Co Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aicuris Gmbh & Co Kg filed Critical Aicuris Gmbh & Co Kg
Publication of NO20005762D0 publication Critical patent/NO20005762D0/no
Publication of NO20005762L publication Critical patent/NO20005762L/no
Publication of NO329235B1 publication Critical patent/NO329235B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

Oppfinnelsens bakgrunn
1. Oppfinnelsens område
Oppfinnelsen er generelt rettet mot feltene farmakologi og immunologi. Nærmere bestemt er oppfinnelsen rettet mot nye sammensetninger av materie for selektiv aktivering av T-celler (PHA-blaster) med redusert aktivering av naturlige dreperceller ("NK-celler"). De nye sammensetningene omfatter varianter av cytokinfamilien, nærmere bestemt humant Interleukin-2 ("IL-2").
2. Beskrivelse av teknikkens stand
Interleukin 2 (EL-2) er en kraftig immunstimulator som aktiverer forskjellige celler i immunsystemet, innbefattet T-celler, B-celler og monocytter. IL-2 er også en kraftig og avgjørende vekstfaktor for T-celler. Det var grunnet disse aktiviteter at EL-2 ble analysert for evne til behandling av cancer. Humant IL-2 er et medikament godkjent av FDA for behandling av metastatisk nyrekarsinom og metastatisk melanom. Anvendelse av IL-2 i kvalifiserte pasienter er begrenset grunnet den alvorlige toksisitet som er forbundet med EL-2-behandling, det anslås at i beste fall blir kun 20% av kvalifiserte pasienter faktisk behandlet. Toksisiteten forbundet med IL-2-behandling omfatter alvorlig feber, kvalme, oppkast, vaskulær lekkasje og alvorlig hypotensjon. Trass i denne toksisitet er imidlertid EL-2 effektiv for de indikasjoner medikamentet er godkjent for (~17% objektiv responsrfekvens).
Selv om struktur/funksjonsanalyse av EL-2 fra mus er omfattende (Zurawski, S.M. og Zurawski, G. (1989) Embo 78:2583-90; Zurawski, S. M., et al, (1990) Embo J 9. 3S99-905; Zurawski, G. (1991). Trends Biotechnol 9:250-7; Zurawski, S.M. og Zurawski, G.
(1992) Embo 711:3905-10. Zurawski, et al., EMBOJ, 12 5113-5119 (1993)), er kun begrenset analyse av humant EL-2 blitt utført. De fleste undersøkelser med humane EL-2-muteiner har blitt utført på museceller, imidlertid har et begrenset antall undersøkelser foregått ved anvendelse av human PHA-blaster som uttrykker høyaffinitets-EL-2-reseptoren EL-2RapY Undersøkelsene som benyttet PHA-blaster bekreftet viktigheten av aminosyrerestene Asp-20 og D-heliksen i humant EL-2. Det har blitt vist at posisjonene Asp-20 og Gin-126 i humant EL-2 er de aminosyrerester som hovedsakelig er ansvarlige for interaksjonen med p- henholdsvis y-subenheten i EL-2-reseptoren (se oversikt i Théze, et al, Immunol. Today, 17, 481-486 (1995)). Selv om aminosyrereseter i C-heliksen i muse-IL-2 har blitt vist å delta i interaksjonen med muse-EL-2R.p (Zurawski, et al, EMBOJ, 12 5113-5119 (1993)), har de ekvivalente aminosyrerester i humant EL-2 ikke blitt vist å ha de samme egenskaper (disse aminosyrerester vil i humant EL-2 være Asp-84 og Asn-88). Siden signifikant artsspesifisitet er vist mellom EL-2 fra menneske og mus (humant EL-2 viser ~100 ganger lavere aktivitet i musesystemer) er det vanskelig å forutsi hvorvidt de samme typer interaksjoner forekommer innenfor artsgrensene. Ingen undersøkelser som benytter celler som kun uttrykker den humane intermediærafifnitetsreseptor EL2-RPy er kjent.
Noen humane EL-2-muteiner har blitt undersøkt for aktivitet på humane PHA-blaster (Xu, et al., Eur, Cytokine Netw. 6,237-244 (1995)). Muteiner som inneholder substitusjoner av Asp-20 med leucin (D20L), såvel som arginin, asparagin og lysin, ble vist å ha alvorlige defekter når det gjelder evne til å indusere proliferasjon av PHA-blaster. Denne del av teknikkens stand lærer således at substitusjon av Asp-20 vil være til muteiner med nedsatt aktivitet. I tillegg hevder Xu, et al. at til nå (1995) har ingen anvendbare EL-2-muteiner blitt identifisert, verken for kliniske formål eller forskningsformål.
EL-2 muteiner, hvor aminosyren i posisjon 20 er substituert med Asn, Leu, Lys eller Arg er kjent fra e.g. Eckenberg R. et al. (Cytokine, 1997, vol. 9, side 488-498). Kompetitive bindingsforsøk, der muteinenes bindingskapasitet til celler som utrykker enten EL-2RaPy eller EL-2RPy, er omtalt og resultatene sammenliknes med binding av villtype IL-2.
Ernst J. F. et al., Bio/Technology, 1989, vol. 7, side 716-720 omtaler et mutein av EL-2 hvor Asn i posisjon 88 er byttet ut med Asp.
Det human EL-2 Q126D-mutein fremstilt av Buchli og Ciardelli, Arch, Biochem. Biophys, 307(2):411-415, (1993) viste signifikant nedsatt aktivitet både når det gjelder . potens og agonisme, i humane T-celleanalyser viste det ~1000 ganger lavere aktivitet enn EL-2 og oppførte seg som en delvis agonist. I muse-T-celleanalyser var muteinet nærmest inaktivt. Begge de analyserte cellelinjer uttrykte høyaffinitetsformen av EL-2-reseptoren. For begge celletyper viste Q126D evnen til å antagonisere EL-2-formidlet aktivitet, om enn kun delvis i den humane T-celleanalyse.
Zhi-yong, W., et al., Acta Biochimica etBiophysica Sinica 25(5):559-560 (sept. 1993)) utførte substitusjonseksperimenter på EL-2 i posisjonene 62, 69, 99 og 126, og viste 20 gangers og 30 gangers aktivitetsreduksjon med 62-Leu-EL-2 henholdsvis 126-Asp-EL-2 sammenlignet med villtype-IL-2- i en muse-T-celleanalyse (CTLL-2). Imidlertid læres eller antydes det ikke at substitusjoner i posisjon 126 kan gi T-celle selektiv aktivitet fremfor NK-celler, og det foreslås heller ikke at slike endringer kunne ha tilsvarende virkning på humane T-celler.
Collins, L., et al., PNAS USA 85:7709.7713 (1988) rapporterte at substitusjon av Asp i posisjon 20 med enten Asn (D20N) eller Lys (D20K) førte til -100 til 1.000 gangers redusert binding, relativt til humant EL-2, for både høyeaffinitetsreseptoren (EL-2Rapy betegnet p55/p70 i Collins, et al) og intermediæraffinitetsreseptoren (EL2-RPy, betegnet "p70" i Collins, et al). Binding til EL-2Ra var tilsynelatende ikke påvirket for noen av de to mutante proteiner. Dette arbeid viser at forstyrrelse av bindingen til intermediæraffinitets-EL-2-reseptoren (IL-2Rpy) også vil føre til forstyrrelse av bindingen til høyaffinitets-EL-2-reseptoren (EL-2-RaPy), noe som tyder på at differensiell binding eller aktivering mellom EL-2RPy eller EL-2RaPy ikke kan oppnås ved substitusjon av Asp i posisjon 20.
Berndt, W.G., et al., Biochemistry 33(21):6571-6577 (1994) benyttet kombinatorisk kassettmutagenese for samtidig mutasjon av posisjonene 17-21 i nativt EL-2, som antas å interagere med intermediæraffinitets-EL-2-reseptoren. Av 2610 analyserte kloner var kun 42 aktive. De fant at posisjonene 20 og 21 var av spesiell betydning for den biologiske aktivitet. Det er ingen antydninger eller lære vedrørende individuelle substitusjoner bortsett fra L2IV.
U.S. patentskrift nr. 5.229.109 (Grimm, et al.) beskriver angivelig EL-2-analoger med lav toksisitet for anvendelse i immunterapi og cancerbehandling. Egenskapene til to EL-2-analoger med substitusjoner i posisjonene Arg38 (til alanin) og Phe42 (til lysin) ble analysert og sammenlignet med egenskapene til nativt EL-2. Analogene ble funent å kunne bibeholde evnen til å binde til intermediær-EL-2-reseptoren med kun minimal binding til den såkalte "høyaffinitets"-reseptor. På dette tidspunkt ble intermedæraffini-tetsreseptoren antatt å kun bestå av p75 (IL-2RP), og høyaffinitetsreseptoren ble antatt å kun bestå av p55+p75-reseptorkomplekset (EL-2RaP). Analogene opprettholdt også evnen til å stimulere mononukleære celler til lymfokinaktivert dreping (LAK). Det bør bemerkes at sekresjonen av EL-ip og TNFa var signifikant redusert som respons på analogene, sammenlignet med det native EL-2-molekyl. Aminosyrerestene beskrevet i dette patent er aminosyrerester som vil interagere spesifikt med EL-2Ra (p55); eliminering av interaksjoner med EL-2Ra ville føre til redusert aktivitet på høyaffinitets-EL-2-reseptorbærende celler og ville ikke påvirke aktiviteten overfor intermediær affinitets-EL-2-reseptorbærende celler. Således burde frembringelsen av LAK-celler
(som antas å være avledet fra NK-celler) opprettholdes. Muteinene som beskrives heri er rettet mot aminosyrerestposisjonene 20, 88 og 126, disse posisjoner antas å interagere spesifikt med EL-2R(3 (p75: posisjonene 20 og 88) og EL-2Ry (ikke kjent på det tidspunkt patentsøknaden til Grimm, et al ble innlevert; posisjonene 126). Følgelig forblir interaksjonene med IL-2Rcc uendret. Mekanistisk vil muteinene beskrevet av Grimm, et al, ha redusert interaksjon med høyaffinitets-IL-2-reseptoren, mens mutasjonene ikke burde ha noen virkning på intermediæraffinitets-IL-2-reseptoren, muteinene beskrevet heri har de motsatte egenskaper idet de besitter en uttalt defekt når det gjelder evne til å interagere med intermediæraffinitets-IL-2-reseptoren EL-2RPy og viser liten eller ingen defekt når det gjelder funksjonelle interaksjoner med høyaffinitets-EL-2-reseptoren, EL-2RaPy.
U.S. patentskrift nr. 5.206.344 (Goodson et al.) beskriver muteiner av EL-2 i hvilke en av aminosyrene i den modne native EL-2-sekvens er erstattet med en cysteinrest, hvor muteinet fremstilles og konjugeres via den innsatte cysteinrest til en polymer utvalgt blant polyetylenglykol-homopolymerer eller polyoksyetylerte polyoler, hvori homopolymerene er ikke-substituerte eller substituerte i en ende med en alkylgruppe. Disse muteiner fremstilles via ekspresjon i vertsceller i mutante gener som koder for muteinene som er endret relativt til genene for utgangsproteinene ved setestyrt mutagenese. I tillegg kan andre typer IL-2 konjugeres via cysteinresten i posisjon 125 i det modne IL-2-protein, som ikke er nødvendig for den biologiske aktivitet av IL-2. Det gis ingen beskrivelse av mutasjoner som medfører redusert toksisitet.
U.S. patentskrift nr. 4.959.314 (Lin et al.) beskriver muteiner av biologisk aktive proteiner, for eksempel EFN-P og EL-2, i hvilke cysteinrester som ikke er essensielle for den biologiske aktivitet har blitt delert eller erstattet med andre aminosyrer for å fjerne seter for intermolekylær kryssbinding eller dannelse av ikke-korrekte intramolekylære disulfidbroer. Disse muteiner fremstilles ved bakteriell ekspresjon av mutante gener som koder for muteinene, syntetisert fra genene for utgangsproteinene ved oligonukleotid-styrt mutagenese. Det gis ingen beskrivelse av mutasjoner som medfører redusert toksisitet.
U.S. patentskrift nr. 5.116.943 (Halenbeck et al.) beskriver at et biologisk aktivt terapeutisk referanseprotein er beskyttet mot oksidasjon ved en fremgangsmåte som omfatter innføring av en konservativ aminosyre i stedet for hver metionylrest som er utsatt for kloramin T- eller peroksidoksidasjon, hvori ytterligere, ikke følsomme metionylrester ikke er substituert. Det oksidasjonsresistente mutein som fremstilles slik er fortrinnsvis et humant mutein av interleukin-2 eller interferon-P og den konservative aminosyre er fortrinnsvis alanin. Det gis ingen beskrivelse av mutasjoner som medfører redusert toksisitet.
U.S. patentskrift nr. 4.853.332 (Mark et al.) er rettet mot EFN-y- og LL-2-muteiner i hvilke cysteinrester som ikke er essensielle for den biologiske aktivitet har blitt delert eller erstattet med andre aminosyrer for å fjerne seter for intermolekylær kryssbinding eller dannelse av ukorrekte intramolekylære disulfidbroer. Patentet viser at en substitusjon i EL-2 i cystein 125 til serin fører til et mutein med en aktivitet som tilsvarer nativt EL-2.
U.S. patentskrift nr. 5.696.234 (Zurawski et al.) er rettet mot muteiner av pattedyrscytokiner og fremgangsmåter for søk etter agonister og antagonister av pattedyrscytokiner. Nærmere bestemt vises et dobbeltmutein av humant EL-2 P82A/Q126D å ha antagonistaktivitet overfor muse-Baf3-celler kotransfektert med humane a- og P-EL-2R-subenheter. Liten agonistaktivitet vises. Videre vises muse-EL-2-muteiner å ha delvis agonist- og antagonistaktivitet på HT2-celler, særlig Q141D, Q141K, Q141VogQ141L. Ingen muteinaktiviteter beskrives som viser eller antyder en selektiv agonistvirkning av mutasjoner i posisjonene 20, 88 og 126.
Zurawski, et al, beskriver muse-IL-2-muteiner som har den egenskap at de er aktive overfor celler som uttrykker EL-2RaPy, men inaktive overfor celler som uttrykker EL-2Rpy (Zurawski, G., Trends Biotechnol.): 250-257 (1991); Zurawski, S. M. og Zurawski, G. EmboJ. 11:3905-3910 (1992)). Muse-EL-2-muteinene som fremviste disse egenskaper hadde substitusjonene Asp-34 til Ser eller Thr og Gin-141 til Lys. Asp-34 og Gln-141 i muse-EL-2 ser ut til å tilsvare Asp-20 henholdsvis Gln-141 i humant EL-2. Selv om disse referanser viser til "selektiv agonist"-EL-2-muteiner beskriver de ikke muteinene som mindre toksiske, men snarere som mulige antagonister av endogent EL-2.
EP 0267 795 A2 (Zurawski et al.) beskriver en rekke muse-EL-2-muteiner gjennom hele sekvensen, innbefattet muteiner som inneholder delesjoner og/eller substitusjoner innenfor de første tretti N-terminale aminosyrerester, som er biologisk kompetente, men patentskriftet hverken omfatter, diskuterer eller antyder aminosyresubstitusjonene som beskrives heri i de ekvivalente muse-EL-2-aminosyrerester. Det foreligger et behov for et forbedret EL-2-molekyl med redusert toksisitet og som tolereres mer generelt. Taniguchi et al., U.S. 4.738.927 er rettet mot et rekombinant DNA som omfatter et rekombinant DNA som koder for et polypeptid som besitter en biologisk EL-2-aktivitet, hvori aktiviteten er fremming av vekst av en cytotoksisk T-lymfocyttcellelinje og et vektor-DNA som kan oppformeres i en prokaryot eller eukaryot celle, hvor den kodende sekvens for genet er plassert i en posisjon nedstrøms for en promotersekvens, hvori polypeptidet har 132 til 134 aminosyrer totalt i polypeptidsekvensen. Patentskriftet beskriver også et gen, rekombinante DNA-vektorer, vertsceller og fremgangsmåter for rekombinant fremstilling av nativt EL-2. Taniguchi et al. beskriver ingen varianter eller muteiner og beskriver ikke hvilke posisjoner i proteinet som er ansvarlige for signalaktivitet eller bindingsaktivitet.
Det er klart at EL-2-muteiner som ikke besitter den dosebegrensende toksisitet til rekombinante EL-2-muteiner ifølge teknikkens stand er nødvendige for å dra terapeutiske fordeler av dette cytokinets potensiale.
Oppsummering av oppfinnelsen
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et polypeptid som er kjennetegnet ved at det omfatter et humant interleukin-2 (EL-2) mutein nummerert i samsvar med villtype IL-2, hvori nevnte humane EL-2 mutein er substituert, i forhold til villtype, i minst en av posisjonene 20, 88 eller 126, hvor substitusjonen i posisjon 20 er valgt fra isoleucin eller histidin, og hvori substitusjonen i posisjon 88 er valgt fra arginin, isoleucin eller glysin, og hvori substitusjonen i posisjon 126 er leucin, hvorved nevnte humane EL-2 mutein selektivt aktiverer T-celler fremfor naturlige dreperceller. Foreliggende oppfinnelse realiserer et mindre toksisk IL-2-mutein som tillater mer omfattende terapeutisk anvendelse av dette cytokinet.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter et polypeptid ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Et tredje aspekt ved oppfinnelsen vedrører et polynukleotid som er kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for polypeptidet ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen; og degenererte varianter av dette.
Et fjerde aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en vektor, kjennetegnet ved at den omfatter polynukleotidet ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen.
Et femte aspekt ved oppfinnelsen vedrører en prokaryot vertcelle, kjennetegnet ved at den er transformert med polynukleotidet ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen.
Et sjette aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelse av polypeptidet ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen, for fremstilling av et medikament - for behandling av et pattedyr som lider av en tilstand som kan behandles med EL-2;
og/eller
- for å selektivt aktivere T-celler fremfor naturlige dreperceller.
Et syvende aspekt ved oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte for utvelgelse av EL-2 muteiner som selektivt aktiverer T-celler fremfor naturlige dreperceller, hvor nevnte IL-2 muteiner utvelges gjennom evaluering av analyser som anvender IL-2Rapy sammenlignet med EL-2RPy, hvori aktiviteten av et IL-2-mutein er forhøyet relativt til villtype-EL-2 i en analyse fremfor de andre.
Kort beskrivelse av figurene
Figurene 1 til 7 viser dose-responskurvene for villtype humant EL-2- (EL-2) og D20H
(Fig. 1), EL-2 og D20I (Fig. 2), EL-2 ogN88G (Fig. 3), EL-2 og N88I (Fig. 4), IL-2 og N88R (Fig. 5), EL-2 og Q126E, (Fig. 6), og IL-2 og Q126L (Fig. 7).
A: Dose-responskurve for EL-2 (fylte sirkler) og mutein (åpne sirkler) i analyse av proliferasjon av den primære human T-celler (PHA-blast).
B: Dose-responskurve for EL-2 (fylte triangler) og mutein (åpne triangler) i analysen av proliferasjon av den primære human NK-celle. Figurene 8A-8D Toksisitet av "PROLEUKIN™" i sjimpanse ble evaluert i to dyr (X-159, triangler og X-124, firkanter), sammenlignet med bærestoffkontroll (X-126, romber). Toksisiteten ble evaluert ved renale parametere (Ureanitrogen i blodet (BUN): A, kreatinin: B) og leverfunksjon (totalbilrubin, C: ALT, D). Figur 9 Kurve over prosent endring i kroppsvekt over 30 dager. Kroppsvekten for dyr behandlet med I1-2/N88R (triangler), "PROLEUKIN" (firkanter) eller bærestoff (romber) ble målt på de angitte dager. Figurene 1 OA-1 OD Lymfocytter (A), totale hvite celler (B), neutrofile celler (C) og blodplater (D) for dyr behandlet med LL-2/N88R (triangler), "PROLEUKIN" (firkanter) eller bærestoff (romber) ble evaluert på de angitte dater. Figurene 11 A-I IDUreanitrogen i blodet (A, BUN), kreatinin (B), fosfor (C) og aniongap (D) for dyr behandlet med EL-2/N88R (triangler), "PROLEUKIN" (firkanter) eller bærestoff (romber) ble evaluert på den angitt dager. Figurene 12A-12D Totalbilirubin(A9, aLT (B), fibrinogen (C) og aktivert protrombintid (D) for dyr behandlet med EL-2/N88R (triangler), "PROLEUKIN" (firkanter) eller bærestoff (romber) ble evaluert på de angitte dager. Figurene 13A-13DNivå i blodet av natrium (A), kloridjon (B), kalsium (C) og kalium (D) for dyr behandlet med EL-2/N88R (triangler), "PROLEUKIN" (firkanter) eller bærestoff (romber) ble evaluert på de angitte dager. Figurene 14A-14C Albuminnivå i blodet (A), hematokritt (B) og hemoglobin (C) for dyr behandlet med EL-2/N88R (triangler), "PROLEUKTN" (firkanter) eller bærestoff (romber) ble evaluert på de angitt dager. Figurene 15A-15C Virkning av EL-2/N88R (firkanter), "PROLEUKIN" (romber) og bærestoff (triangler) er angitt for den totale T-cellepopulasjon (A, CD3+-celler), CD4+-T-cellepopulasjonen (B) og CD8+-T-cellepopulasjonen (C). Figurene 16A-16C Virkning av LL-2/N88R (firkanter), "PROLEUKIN" (romber) og bærestoff (trekanter) er angitt for den totale T-cellepopulasjon (A, CD3+-celler), CD4+-T-cellepopulasjonen (B) og CD8+-T-cellepopulasjonen (C). Figur 17 Virkning av EL-2/N88R og "PROLEUKIN" på T-celleaktivering målt som gjennomsnittlig fluorescens fra CD25-positive celler. Virkningen av LL-2/N88R (firkanter), "PROLEUKIN" (romber) og bærestoff (trekanter) er angitt for CD3+CD4+-T-cellepopulasjonen. Antall erholdte CD3+/CD8+-celler var ikke tilstrekkelig til å evaluere gjennomsnittslfuorescensen av denne populasjon. Figurene 18A-18D Virkningen av EL-2/N88R (firkanter) "PROLEUKIN" (romber) og bærestoff (trekanter) er angitt for CD4+-T-cellepopulasjonen (A, CD3+/CD4+-celler), CD8+-T-cellepopulasjonen (B, CD3+/CD8+-celler), den totale T-cellepopulasjon (C, CD3+-celler) og NK-cellepopulasjonen (D, CD3+/CD16+-celler). Figur 19 Kurve over lungemetastaser mot dose hos mus behandlet med "PROLEUKIN" (åpne sirkler) eller IL-2/N88R (fylte sirkler). Antall lungemetastaser ble talt ved avslutning av undersøkelsen.
Figur 20 Plasmidkart over EL2N88R-vektoren pBCUL2SA.
Beskrivelse av de foretrukne utførelser
A. Bakgrunn
Virkningen av IL-2 på T-celler formidles ved binding til IL-2-reseptorproteiner. Forskjellige celleoverflateproteiner på T-celler binder EL-2. Det som først ble identifisert er et enkelt polypeptid, betegnet EL-2Ra, som er et polypeptid på 55 kD (p55) som opptrer ved T-celleaktivering og som opprinnelig ble kalt Tac (for T-aktiverings) antigen. EL-2Ra binder EL-2 med en K<j på tilnærmet 10"<8>M og er også kjent som "lavaffinitets"-EL-2-reseptoren. Binding av EL-2 til celler som kun uttrykker IL-2Ra fører ikke til noen påvisbar biologisk respons.
Den andre EL-2-reseptor er et bindingskompleks som består av IL-2Rb og EL-2Rg; EL-2Rg, et polypeptid på 64 kD, også kjent som den felles y (yc)-kjede siden det er felles for en rekke cytokinreseptorer. EL-2Rb er på tilnærmet 70 til 75 kD (betegnes enten p70 eller p75) og er et medlem av cytokinreseptorfamilie type I, som særpreges ved de to cystein/WSXWS-motiv. EL-2RP uttrykkes parallelt med yc. Affiniteten for binding av EL-2 til EL-2RPyc er høyere enn bindingsaffiniteten til EL-2Ra, med en Ka på tilnærmet 10'<9>M, reseptoren er også kjent som "intermediæraffinitets"-EL2-reseptoren. EL-2 forårsaker vekst av celler som uttrykker EL-2RPyc, med halv maksimal vekststimulering ved samme EL-2-konsentrasjon som gir halv maksimal binding (d.v.s. 1 x 10"<9>M).
EL-2RPyc er det samme signalreseptorkompleks som kan binde EL-15.
Det tredje kjente EL-2-reseptorkompleks er EL-2Rapyc-komplekset. Celler som uttrykker både EL-2Roc og EL-2RccPyc kan binde EL-2 mye kraftigere, med en Kd på tilnærmet og er således også kjent som "høyaffinitets"-kornplekset. Vekststimulering av slike celler skjer ved en tilsvarende lav EL-2-konsentrasjon. Både EL-2-binding og vekststimulering kan blokkeres med antistoffer rettet mot EL-2Roc, EL-2Rp eller yc, og mest effektivt med en kombinasjon av antistoffer rettet mot flere reseptorsubenheter. Disse observasjoner tyder på at EL-2Roc danner et kompleks med EL-2RPyc, noe som øker affiniteten av signalreseptoren for EL-2 og derved tillater levering av et vekstsignal ved signifikant lavere EL-2-konsentrasjoner. Det antas at EL-2 først bindes hurtig til EL-2Ra og at dette letter assosiasjonen med EL-2RPyc. Hvilende T-celler uttrykker EL-2RPyc, men kun lave mengder av EL-2Ra, økt overflateekspresjon av IL-2Ra kan stimuleres med EL-2. Etter antigenreseptorformidlet T-celleaktivering uttrykkes EL-2Ra hurtig, noe som reduserer konsentrasjonen av EL-2 som er nødvendig for vekststimulering. Binding av IL-2 til EL-2RctPyc-komplekset fører til signaloverføring via en Jak/STAT-signalreaksjonsvei.
Vi har oppdaget muteiner av humant EL-2 som preferensielt aktiverer T-celler (PHA-blaster, celler som uttrykker høyaffinitets-EL-2-reseptoren EL-2RaPy) fremfor naturlige dreperceller (NK)-celler (celler som uttrykker intermediæraffinitets-EL-2-reseptoren EL-2RPy). Muteiner som omfatter substitusjon av Asp-20 med Histidin (D20H) eller Isoleucin (D20I), Asn-88 med Arginin (N88R), Glycin (N88G) eller Isoleusin (N88I) eller Gin-126 med Leucin (Q126L) eller Glutamat (Q126E) viser uventet full EL-2-aktivitet på PHA-blaster og liten (om noen) aktivitet på NK-celler. Tidligere undersøkelser av humane EL-2-muteiner har bygget på cellesystemer fra mus for analyse, og dersom humane celler har blitt benyttet har disse ikke vært celler som kun uttrykker EL-2Ry (f.eks. NK-celler). I tillegg har undersøkelsene som har benyttet humane PHA-blaster vist at substitusjon av Asp-20 (med Leu, Arg, asp eller Lys; Xu, et. al, Eur. Cytokine Netw, 6,237-244 (1995)) eller Gln-126 (med Asp; Buchli og Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys, 307(2): 411-415, (1993)) fører til humane EL-2-muteiner med alvorlig nedsatt aktivitet. Tidligere undersøkelser som benyttet muse-EL-2 identifiserte muse EL-2-muteiner med forskjellige aktiviteter (Zurawski, et al., EMBO J, 125113-5119 (1993), men ingen av mutasjonene som ga disse resultater pekte i retning av mutasjonene som er identifisert i det heri beskrevne arbeid. Human EL-2-muteiner som inneholder de samme mutasjoner som muse-EL-2-muteiner i synonyme posisjoner viser ikke tilsvarende aktiviteter, noe som tyder på at eksemplene fra mus ikke kan forutsi funksjoner i mennesket. Oppfinnerene kjenner ikke til noen undersøkelser av humane EL-2-muteiner hvor den relative aktivitet på humane celler som uttrykker IL-2-reseptoren EL-2-Rocpy (f.eks. PHA-blaster) og celler som uttrykker IL-2-reseptoren EL-2Ry (f.eks. NK-celler). Det forventes at analyse in vivo vil bekrefte at de beskrevne muteiner vil ha en forbedret terapeutisk indeks fremfor villtypehumant EL-2 grunnet reduksjonen i toksisitet, noe som tilveiebringer terapeutisk anvendbare forbidnelser fsom kan anvendes ved behandling av forstyrrelser som krever
immunsystemstimulering.
Interleukin 2 (EL-2) benyttes i dag i klinikken for behandling av metastatisk nyrecancer. Stoffets alvorlige toksisitet har imidlertid begrenset anvendelsen til kun en undergruppe bestående av de friskeste pasientene, og den dosebegrensende toksisitet antas å svekke totaleffektiviteten. Den akutte toksisitet av EL-2 har blitt foreslått å skyldes aktivering av NK-celler, mens effektiviteten formidles ved direkte aktivering av T-celler ( Jacobson, et al, Proe Nati Acad Sei USA (De Forente Stater), sept. 17,1996,93(19) s. 10405-10; Smith KA, Blood 1993, 81(6) s. 1414-23; Kaplan, et al, Biotechnology, 10(2) s. 157-62). T-celler uttrykker en annen EL-2-reseptor enn NK-celler (T-celler: EL-2RocPy, høyaffinitets-EL-2-reseptoren, NK-celler: EL-2Ry, intermediæraffinitets-EL-2-reseptor). De humane EL-2-muteiner som beskrives heri aktiverer selektivt T-celle-EL-2-reseptoren og ikke NK-celle-EL-2-reseptoren.
Lavdosebehandling med EL-2 har blitt benyttet med en viss suksess for å unngå direkte aktivering av NK-celler (Jacobson, et al (1996). Proe Nati Acad Sei USA 93: 10405-10). Denne strategi bygget på at ved lave EL-2-doser vil kun høyaffinitets-EL-2-reseptoren aktiveres, og ikke intermediæraffinitets-EL-2-reseptoren. Intermediær-affinitetsformen av EL-2-reseptoren, EL-2Rpy uttrykkes på NK-celler, mens T-celler uttrykker høyaffinitetsformen EL-2Ray.
Oppfinnerene angrep imidlertid toksisitetsproblement fra en annen vinkel. Forstyrrelse av interaksjonen av EL-2 med EL-2RP og/eller EL-2Ry via egnet modifisering av spesifikt bindende aminosyrerester på bindingsoverflaten til EL-2 ble antatt å forhindre effektiv binding til, og således aktivering av, celler som kun uttrykker EL-2RPy. På celler som uttrykker EL-2RaPy, vil imidlertid innledende binding til EL-2Ra, og således binding til cellen, fortsatt skje, og følgelig vil lavdosebehandlingen som foreslås av Jacobs et al. fortsatt kunne vise toksiske bivirkninger. Ved binding til EL-2Ra kan effektiv rekruttering av IL-2RP og EL-2Ry skje på celleoverflaten trass i den svekkede interaksjon av modifisert EL-2 med EL-2RP og/eller EL-2Ry. Et signaliseringskompetent EL-2/EL-2RaPy-kompleks kan således dannes. Vi tror at en EL-2-variant som selektivt kan aktivere høyaffinitets-EL-2-reseptorene på T-celler fremfor intermediæraffinitets-EL-2-reseptorene på NK-celler kan ha en forhøyet terapeutisk indeks framfor villtype-IL-2 grunnet en redusert toksisitetsprofil. En EL-2-variant med forhøyet terapeutisk indeks vil ha et signifikant utvidet bruksområde, både ved behandling av cancer (som direkte behandling og/eller tilleggsbehandling) og immundefisiens (f.eks. HIV og tuberkulose). Andre mulige anvendelser av EL-2 bygger på den immunstimulerende aktivitet og omfatter i tillegg til direkte cancer behandling også immundefisiens, for eksempel HEV-pasienter eller humane SCEO-pasienter, infeksiøse sykdommer som tuberkulose, som adjuvans i "cancervaksine"-strategier og når immunsystemstimulering er ønskelig, for eksempel for å forsterke standard vaksinasjonsrfemgangsmåter eller for behandling av eldre mennesker.
Egnet substituasjon av Asp-20, Asn-88 eller Gln-126 reduserte bindingsinteraksjonene for enten IL-2Rp (Asp-20 og Asn-88) eller IL-2Ry (Gln-126). Nettovirkningen av slike substitusjoner førte til IL-2-muteiner som opprettholdt aktiviteten på human T-celler og som har redusert aktivitet på humane NK-celler.
Siden det ikke var mulig å forutsi resultatet av en gitt substitusjon før evaluering i T- og NK-celleanalysene ble alle mulige naturlige aminosyresubstitusjoner (bortsett fra Cys) utført i posisjonene Asp-20, Asn-88 og Gln-126 og et begrenset, men varierende sett mutasjoner i posisjon Asp-84 for å analysere hvorvidt disse aminosyrerestene faktisk interagerte med EL-2RP. Ytterligere mutasjoner ville blitt analysert i posisjon Asp-84 dersom virkninger på tilsynelatende IL-2Rp-interaksjoner ble observert. Resultater fra førtiseks uavhengige substitusjoner i disse posisjoner presenteres i Tabell 1, nedenfor.
Mutasjoner ble innført ved anvendelse av setestyrt mutagenese på villtype humant EL-2-cDNA. Korrekte kloner ble subklonet til en ekspresjonsvektor egnet for ekspresjon i et heterologt system (f.eks. E. Coli, baculovirus, gjær eller pattedyrsceller, for eksempel Kina-hamster ovarie-celler (CHO-celler). Rensede proteiner ble analysert i analyser for T-celle (PHA-blast)- og NK-celleproliferasjon. Forskjellige responser frembrakt av enkeltmuteiner i disse analyser, d.v.s. EC50, tyder på mutasjoner som påvirker disse aktiviteter. Nærmere bestemt vil mutasjoner som stimulerer en relativt kraftigere respons i PHA-blast (T-celle)-analysen (sammenlignet med villtype-IL-2) enn i NK-celleanalysen (sammenlignet med villtype-IL-2) tyde på substitusjoner som gir cellulær spesifisitet basert på spesifike muteiners evne til å bindes til og aktivere EL-2RaPy som uttrykkes på disse celler, men som ikke kan bindes til og således ikke aktivere celler som kun uttrykker EL-2RPy. EL-2-muteiner som besitter denne egenskap vil således besitte in vivo de immunstimulerende egenskaper til EL-2 med redusert IL-2-behandlingsforbundet toksisitet omfattende vaskulær lekkasje og hypotensjon.
B. Definisjoner
Som benyttet heri betyr "villtype-EL-2" EL-2, enten nativt eller rekombinant, med den normalt forekommende aminosyresekvens på 133 aminosyrerester for nativt humant EL-2 (minus signalpeptidet som består av ytterligere 20 N-terminale aminosyrer), hvis aminosyresekvens er beskrevet i Fujita, et al., PNAS USA, 80, 7437-7441 (1983), med eller uten en ekstra N-terminal metionin, som nødvendigvis inngår dersom proteinet er uttrykt som en intracellulær fraksjon i E. coli.
Som benyttet heri betyr "EL-2-mutein" et polypeptid hvori spesifikke substitusjoner er innført i det human, modne interleukin-2-protein. Tabell 1 nedenfor beskriver førtiseks fremstilte EL-2-muteiner med enkeltsubstitusjoner og deres tilsvarende verdier for relativ aktivitet. Muteinine ifølge foreliggende oppfinnelse besitter mer enn 1.000 ganger relativ aktivitet.
EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse har foretrukket en aminosyresekvens som er identisk med sekvensen til villtype-EL-2 i de andre ikke-substituerte aminosyrerester. Imidlertid kan EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse også kjennetegnes ved aminosyre-insersjoner, -delesjoner, -substitusjoner og -modifikasjoner i ett eller flere seter i eller ved de andre aminosyrerestene i den native EL-2-polypeptidkjede. I samsvar med foreliggende oppfinnelse kan enhver slik insersjon, delesjon, substitusjon og modifikasjon føre til et EL-2-mutein som bibeholder en PHA-blastselektiv aktivitet, samtidig som det har redusert evne til å aktivere NK-celler, og som ligger innenfor foreliggende patents område.
En kombinasjon av de foretrukne eller delvis foretrukne substitusjoner beskrevet ovenfor i et enkelt rekombinant EL-2-molekyl kan føre til kombinasjonsmutanter med en aktivitet som ligner den beskrevet heri for enkeltmutantene. For eksempel kan det forventes at et EL-2-molekyl som har en kombinasjon av to eller flere mutasjoner utvalgt fra Tabell 1 kan føre til en T-celleselektiv EL-2-agonist med en relativ aktivitet som tilsvarer den relative aktivitet av enkeltsubstitusjonene beskrevet heri.
Vi foretrekker konservative modifikasjoner og substitusjoner i andre posisjoner i EL-2 (d.v.s. modifikasjoner og substitusjoner som har minimal virkning på muteinets sekundærstruktur eller tertiærstruktur). Slike konservative substitusjoner omfatter substitusjonene beskrevet av Dayhoff i The Atlas of Protein Sequence and Structure 5
(1978) og av Argos i EMBO J., 8:779-785 (1989). For eksempel representerer aminosyrer som tilhører en av de følgende grupper konservative endringer:
Vi foretrekker også modifikasjoner eller substitusjoner som ikke innfører seter for ytterligere intermolekylær kryssbinding eller ukorrekt dannelse av desulfidbindinger. For eksempel vites det at EL-2 har tre cysteinrester i villtypeposisjonene 58,105 og 125 i den modne sekvens.
Med "nummerert i samsvar med villtype-EL-2" mener vi identifisering av en utvalgt aminosyre ved henvisning til posisjonen som aminosyren normalt forekommer i i den modne sekvens til villtype-EL-2. Dersom insersjoner eller delesjoner er utført i EL-2-muteinet vil en fagmann forstå at Asp som normalt foreligger i posisjon 20 kan ha en forskjøvet posisjon i muteinet. Plasseringen av det forskjøvede Asp kan imidlertid lett fastslås ved undersøkelse og korrelasjon av de frankerende aminosyrer med de aminosyrer som flankerer Asp i villtype-EL-2-
Begrepet "celletyper med EL-2RaPy-reseptoren" betyr de celler som vites å ha denne reseptortype, d.v.s. T-celler, aktiverte T-celler, B-celler, aktiverte monocytter og aktiverte NK-celler. Begrepet "celletyper med EL-2RPy-reseptoren" betyr de celler som vites å ha denne reseptortype, d.v.s. B-celler, hvilende monocytter og hvilende NK-celler.
EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved enhver egnet fremgangsmåte som er kjent innen faget. Slike fremgangsmåter omfatter konstruksjon av en DNA-sekvens som koder for EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse og ekspresjon av sekvensene i en egnet transformert vert. Denne fremgangsmåte vil produsere de rekombinante muteiner ifølge foreliggende oppfinnelse. Muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan imidlertid også fremstilles, om enn mindre foretrukket, ved kjemisk syntese eller en kombinasjon av kjemisk syntese og rekombinant DNA-teknologi. Fremgangsmåter for porsjonsvis fremstilling eller perfusjonsfremstilling ligger generelt innenfor teknikkens stand. Se Freshey, R.I. (red), "Animal Cell Culture: A Practical Approach," 2. utgave, 1992, URL Press, Oxford, England; Mather, J.P. "Laboratory Scaleup of Cell Cultures (0.5 - 50 liter)" Methods Cell Biology 51:219- 527
(1998); Hu, W.S., and Aunins, J.G., "Large-scale Mammalian Cell Culture", Curr Opin Biotechnol 8: 148-153 (1997); Konstantinov, K.B., Tsai, Y., Moles, D., Matanguihan, R., "Control of long-term perfusion Chinese hamster ovary cell culture by glucose auxostat.," Biotechnol Prog 12:100-109 (1996).
I en utførelse av en rekombinant fremgangsmåte for fremstilling av et mutein ifølge foreliggende oppfinnelse konstrueres en DNA-sekvens ved å isolere eller syntetisere en DNA-sekvens som koder for villtype-IL-2 og så endre kodonet for asp20 til et kodon for Isoleucin (I) ved setestyrt mutagenese. Denne teknikk er velkjent. Se f.eks. Mark et al., "Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, s. 5662-66 (1984); og U.S. patentskrift nr. 4.588.585.
En annen fremgangsmåte for konstruksjon av en DNA-sekvens som koder for EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse vil være kjemisk syntese. Dette omfatter for eksempel direkte syntese ved kjemiske midler av et peptid med proteinsekvensen som koder for et EL-2-mutein som besitter egenskapene som beskrives i oppfinnelsen. Denne fremgangsmåte kan innføre både naturlige og unaturlige aminosyrer i posisjoner som påvirker interaksjonen mellom IL-2 og EL-2RP eller IL-2Ry. Alternativt kan et gen som koder for det ønskede IL-2-mutein syntetiseres ved kjemiske midler med en oligonukleotidsyntesemaskin. Slike oligonukleotider utformes basert på aminosyre-sekvensen til det ønskede IL-2-mutein, hvor det fortrinnsvis utvelges kodoner som favoriseres i vertscellen i hvilken det rekombinante mutein skal fremstilles. I dette henseende er det velkjent at den genetiske kode er degenerert - at en aminosyre kan kodes av mer enn ett kodon. For eksempel kodes Phe (F) av to kodoner, TTC og TTT, Tyr (Y) kodes av TAC og TAT og his (H) kodes av CAC og CAT. Trp (W) kodes av et enkeltkodon, TGG. Følgelig vil det forstås at for en gitt DNA-sekvens som koder for et gitt IL-2-mutein vil det være mange degenererte DNA-sekvenser som koder for dette IL-2-mutein. Det vil for eksempel forstås at i tillegg til den foretrukne DNA-sekvens for mutein D20I vist i SEQ EO NO:l vil det være mange degenererte DNA-sekvenser som koder for det viste EL-2-mutein. Disse degenererte DNA-sekvenser anses å ligge innenfor foreliggende oppfinnelses område. Følgelig betyr "degenererte varianter derav" i forbindelse med foreliggende oppfinnelse alle DNA-sekvenser som koder for og derved muliggjør ekspresjon av et gitt mutein.
DNA-sekvensen som koder for EL-2-muteinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan, enten det er fremstilt ved setestyrt mutagenese, kjemisk syntese eller andre fremgangsmåter,
enten også omfatte DNA-sekvenser som koder for en signalsekvens eller ikke gjøre det. Dersom en slik signalsekvens foreligger bør det være en som gjenkjennes av cellen som er valgt for ekspresjon av EL-2-muteinet. Signalsekvensen kan være prokaryot, eukaryot eller en kombinasjon av disse. Den kan også være signalsekvensen for nativt EL-2. Hvorvidt en signalsekvens innføres vil avhenge av hvorvidt det er ønskelig å utskille EL-2-muteinet fra de rekombinante celler som det femstilles i. Dersom de valgte celler er prokaryote foretrekkes det generelt at DNA-sekvensen ikke koder for en signalsekvens. Dersom de valgte celler er eukaryote foretrekkes det generelt at en signalsekvens kodes, og mest foretrukket at villtype-EL-2-signalsekvensen benyttes.
Standard fremgangsmåter kan anvendes for syntese av et gen som koder for et EL-2-mutein ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan den fullstendige aminosyresekvens anvendes for konstruksjon av et reverstranslatert gen. En DNA-oligomer som omfatter en nukleotidsekvens som koder for EL-2-mutein kan syntetiseres. For eksempel kan flere små oligonukleotider som koder for deler av det ønskede polypeptid syntetiseres og så ligeres sammen. De enkelte oligonukleotider inneholder typisk 5' giler 3' overheng for komplementær sammensetning.
Når DNA-sekvensene som koder for et EL-2-mutein ifølge foreliggende oppfinnelse først er sammensatt (ved syntese, setestyrt mutagenese eller en annen fremgangsmåte) vil de innføres i en ekspresjonsvektor og kobles operativt til en ekspresjonskontrollsekvens som er egnet for ekspresjon av EL-2-muteinet i den ønskede transformerte vert. Korrekt oppbygging kan bekreftes ved nukleotidsekvensering, restriksjonskartlegging og ekspresjon av et biologisk aktivt polypeptid i en egnet vert. For å oppnå høyt ekspresjonsnivå av et transfektert gen i en vert må genet, som velkjent innen faget, være operativt koblet til transkripsjons- og translasjonsekspresjonskontrollsekvenser som fungerer i den valgte ekspresjonsvert.
Valg av ekspresjonskontrollsekvens og ekspresjonsvektor vil avhenge av vertsvalget. Et stort utvalg av ekspresjonsvert/vektorkombinasjoner kan benyttes. Egnede ekspresjonsvektorer for eukaryote verter omfatter for eksempel vektorer som inneholder ekspresjonskontrollsekvenser fra SV40, storfépapillomvirus, adenovirus og cytomegalovirus. Egnede ekspresjonsvektorer for bakterieverter omfatter kjente bakterieplasmider som plasmider fra E. coli, innbefattet col El, pCRl, pER32z, pMB9 og disses derivater, plasmider med bredere vertsutvalg som RP4, bakteriofag-DNA, f.eks. de mange derivater av bakteriofag lambda, f.eks. NM989 og andre DNA-bakteriofager som Ml3 og filamentøse bakteriofager med enkelttrådet DNA. Egnede ekspresjonsvektorer for gjærceller omfatter 2u.-plasmidet og derivater av dette. Egnede vektorer for innsektceller omfatter pVL 941. Vi foretrekker pFastBac™ 1 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Cate et al, "Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, s. 685-98 (1986).
I tillegg kan enhver av et bredt utvalg av ekspresjonskontrollsekvenser benyttes i disse vektorer. Slike anvendbare ekspresjonskontrollsekvenser omfatter ekspresjonskontroll-sekvensene forbundet med strukturelle gener i de ovenfor nevnte ekspresjonsvektorer. Eksempler på anvendbare ekspresjonskontrollsekvenser omfatter for eksempel den tidligere og sene promoter fra SV40 eller adenovirus, lac-systemet, trp-systemet, TAC-eller TRC-systemet, hovedoperator- og promoterområdene fra bakteriofag lambda, for eksempel PL, kontrollområdene fra fd-kappeprotein, promoteren for 3-fosfoglyseratkinase eller andre glykolyttiske enzymer, promoterene fra sur fosfatase, f.eks. PhoA, promoterene fra a-parringssystemet i gjær, polyhedronpromoteren fra Baculovirus og andre sekvenser som vites å kontrollere ekspresjonen av gener i prokaryote eller eukaryote celler og disses virus, og forskjellige kombinasjoner av disse.
Enhver egnet vert kan benyttes for fremstilling av IL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse, inbefattet bakterier, sopp (innbefattet gjær), planteceller, insektceller, pattedyrsceller eller andre egnede dyreceller eller cellelinjer, såvel som transgene dyr eller planter. Nærmere bestemt kan disse verter omfatter velkjente eukaryote og prokaryote verter, for eksempel stammer av E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, sopp, gjær, insektceller som Spodoptera frugiperda ( S/ 9), dyreceller som Kina-hamsterovarieceller (CHO-celler) og museceller som NS/O, "African green monkey"-celler som COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 og BNT 10 og humane celler, såvel som planteceller i vevskultur. For ekspresjon i dyreceller foretrekker vi CHO-celler og COS 7-celler i kultur, og særlig CHO-cellelinjen CHO (DHFR-) eller HKB-linjen.
Det må naturligvis forstås at ikke alle vektorer og ekspresjonskontrollsekvenser vil fungere like godt for ekspresjon av DNA-sekvensene som beskrives heri. Heller ikke vil alle verter fungere like godt med det samme ekspresjonssystem. En fagmann kan imidlertid foreta en utvelgelse blant disse vektorer, ekspresjonskontrollsekvenser og verter uten omfattende eksperimentring. Ved for eksempel utvalg av en vektor må verten tas med i betraktning, siden vektoren må kunne replikere i denne. Vektorens kopitall, evnen til å kontrollere kopitallet og ekspresjonen av eventuelt andre proteiner som kodes av vektoren, for eksempel antibiotiske markører, må også tas i betraktning. Foretrukne vektorer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel vektorer som tillater amplifisering av kopitallet av DNA som koder for EL-2-muteinene. Slike amplifiserbare vektorer er velkjente innen faget. De omfatter for eksempel vektorer som kan amplifiseres ved DHFR-amplifisering (se f.eks. Kaufman, U.S. patentskrift 4.470.461, Kaufman og Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2 s. 1304-19 (1982)) eller glutaminsyntetase ("GS")-amplifisering (se f.eks. U.S. patentskrift nr. 5.122.464 og Europeisk patentskrift nr. 338.841.
Ved valg av ekspresjonskontrollsekvens bør også en rekke faktorer tas i betraktning. Disse omfatter for eksempel sekvensens relative styrke, dens kontrollerbarhet og dens kompatibilitet med den aktuelle DNA-sekvens som koder for IL-2-muteinet ifølge foreliggende oppfinnelse, særlig når det gjelder mulige sekundærstrukturer. Vertene bør utvelges ved å ta hensyn til deres kompatibilitet med den valgte vektor, toksisiteten av produktet som kodes av DNA-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse, deres sekresjonsegenskaper, deres evne til å folde polypeptidene korrekt, deres fermenterings-eller dyrkningskrav og hvor enkel rensing av produktene som kodes av DNA-sekvensene vil være.
Innenfor disse parametere vil en fagmann kunne utvelge forskjellige vektor/ekspresjonskontrollsekvens/vertskombinasjoner som vil uttrykke de ønskede DNA-sekvenser ved fermentering eller i nyrecellekultur i stor skala, for eksempel ved anvendelse av CHO-celler eller COS 7-celler.
EL-2-muteinene som erholdes ifølge foreliggende oppfinnelse kan være glykosylerte eller ikke-glykosylerte, avhengig av vertsorganismen som benyttes for fremstilling av muteinet. Dersom bakterier velges som vert vil EL-2-muteinet som dannes være ikke-glykosylert. Eukaryote celler vil på den annen side glykosylere EL-2-muteinene, om enn kanskje ikke på samme måte som nativt EL-2 glykosyleres. EL-2-muteinet som fremstilles av den transformerte vert kan renses ifølge enhver egnet fremgangsmåte. Forskjellige fremgangsmåter er kjent for rensing av IL-2. Se f.eks. Current Protocols inProtein Science, bind 2. Red. John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, del 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc. Vi foretrekker gjenfolding fra inklusjonslegemer dannet i E. coli eller fra kondisjonert medium fra enten pattedyrscellekulturer eller gjærkulturer som danner et gitt mutein ved anvendelse av kationbytting, gelfiltrering og/eller reversfase-væskekromatografi. Se eksemplene 1 ( E. coli) og 10 (CHO-celleperfusjon) nedenfor.
Den biologiske aktivitet av IL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan analyseres ved enhver egnet fremgangsmåte kjent innen faget. Slike analyser omfatter PHA-blastproliferasjon og NK-celleproliferasjon. Muteiner med egnet aktivitet, d.v.s. fullt aktive på EL-2RocPy og med redusert aktivitet på celler som bærer EL-2RPy, vil bekreftes ved anvendelse av disse to analyser. Den "relative aktivitet" av et mutein måles relativt til villtype-IL-2 og er, som beskrevet videre i eksemplene, forholdet mellom aktiviteten på PHA-blastproliferasjon og NK-celleproliferasjon.
EL-2-muteinet ifølge foreliggende oppfinnelse vil tilføres i en dose som tilnærmet tilsvarer eller er høyere enn dosen som benyttes i behandling med villtypenativt eller rekombinant EL-2. Fortrinnsvis tilføres en effektiv mengde av EL-2-muteinet. En "effektiv mengde" betyr en mengde som kan forhindre eller redusere omfanget eller spredningen av tilstanden eller indikasjonen som behandles. Det vil være åpenbart for fagfolk at den effektive mengde av EL-2-muteinet blant annet vil avhenge av sykdommen, dosen, tilførselsskjemaet for EL-2-muteinet, hvorvidt IL-2-muteinet tilføres alene eller sammen med andre terapeutiske midler, preparatets halveringstid i serum og pasientens generelle helsetilstand. IL-2-muteinet tilføres fortrinnsvis i et preparat som omfatter et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. "Farmasøytisk aksepterbart bærestoff betyr et bærestoff som ikke forårsaker uønskede virkninger i pasienter som det tilføres til. Slike farmasøytisk aksepterbare bærestoffer er velkjente innen faget. Vi foretrekker 2% HSA/PBS ved pH 7.0.
EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan utformes til farmasøytiske
preparater ved velkjente fremgangsmåter. Se f.eks. Remington's Pharmacautical Science av E. W. Martin som beskriver egnede utforminger. Det farmasøytiske preparat av EL-2-muteinet kan utformes på en rekke måter, innbefattet som en væske eller gel, frysetørket eller i enhver annen egnet form. Den foretrukne form vil avhenge av den tilstand som
behandles og vil være åpenbar for en fagmann.
Det farmasøytiske preparat med EL-2-muteinet kan tilføres oralt, som en aerosol, intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, intradermalt eller subkutant, eller på enhver annen aksepterbar måte. Den foretrukne tilførselsvei vil avhenge av tilstanden som behandles og vil være åpenbar for en fagmann. Det farmasøytiske preparat av EL-2-muteinet kan tilføres sammen med andre terapeutiske midler. Disse midler kan inngå som del av det samme farmasøytiske preparat, eller de kan tilføres adskilt fra EL-2-muteinet, enten samtidig eller i samsvar med ethvert annet aksepterbart behandlings-skjema. I tillegg kan det farmasøytiske preparat av IL-2-muteinet anvendes som tillegg til andre behandlingsformer.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse preparater som kan anvendes ved behandling av HIV, cancer, autoimmune sykdommer, infeksiøse sykdommer, vaksineadjuvanser i cancervaksiner og konvensjonell vaksinebehandling, for immunstimulering hos eldre mennesker eller individer som på annet vis er immunkompromiterte, såvel som i humane SCED-pasienter, eller annen terapeutisk anvendelse som krever generell stimulering av immunsystemet i ethvert egnet dyr, fortrinnsvis et pattedyr, mest foretrukket et menneske. Som tidligere angitt i bakgrunnsseksjonen har EL-2 mange virkninger. Noen av disse er stimlering av PHA-blaster, hvilende T-celler, B-celler, monocytter og NK-celler o.s.v., muteiner som beskrives heri vil ha aktivitet på celletyper som kun uttrykker høyaffinitets-EL-2-reseptoren, for eksempel hvilende T-celler, men ikke intermediærafifnitets-EL-2-reseptoren, for eksempel NK-celler eller monocytter.
Videre omfattes kan DNA-sekvensene som koder for EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes i genterapi. Genterapianvendelser som omfattes omfatter behandling av sykdommer i hvilke EL-2 forventes å gi effektiv behandling grunnet forbindelses T-celleaktivitet, for eksempel HEV, cancer, autoimmune sykdommer, infeksiøse sykdommer, som vaksineadjuvans i cancervaksiner og konvensjonell vaksinebehandling, for immunstimulering hos eldre eller på annet vis immun-kompromiterte individer, såvel som i human SCED-pasienter, og sykdommer som ellers responderer på IL-2 eller infeksiøse midler som er følsomme for en EL-2-formidlet immunrespons.
Lokal tilførsel av EL-2-muteiner ved anvendelse av genterapi kan tilføre det terapeutiske middel til målområdet. Metodologier for både in vitro- og in v*'vo-genterapi omfattes. Flere fremgangsmåter for overføring av mulige terapeutiske gener til definerte cellepopulasjoner er kjente. Se f.eks. Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science, 260:926-31 (1993). Disse fremgangsmåter omfatter: 1) Direkte genoverføring. Se f.eks. Wolff et al, "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In Vivo", Science. 247:1465-68 (1990); 2) Liposomformidlet DNA-overføring. Se, f.eks. Caplen et al, "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis", Nature Med. 3:39-46 (1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med. 1:15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient
Transfection Of Mammalian Cells", Biochem. Biophvs. Res. Comm.. 179:280-85
(1991). 3) Retrovirusformidlet DNA-overføring. Se, f.eks. Kay et al, "In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs", Science. 262:117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science. 256:808-13 (1992). 4) DNA-virusformidlet DNA-overføring. Slike DNA-virus omfatter adenovirus (fortrinnsvis Ad-2 eller Ad-5-baserte vektorer), herpesvirus (fortrinnsvis herpes simplex-virusbaserte vektorer) og parvovirus (fortrinnsvis "defekte" eller ikke-autonome parvovirusbaserte vektorer, mer foretrukket adenoassosiert virusbaserte vektorer, mest foretrukket AAV-2-baserte vektorer). Se f.eks. Ali et al, "The Use Of DNA Viruses As Vector for Gene Therapy", Gene Therapy. 1:367-84 (1994);
U.S. patentskrift nr. 4.797.368 og U.S. patentskrift nr. 5.139.941.
Valg av et gitt vektorsystem for overføring av genet av interesse vil avhenge av en rekke faktorer. En viktig faktor er målcellepopulasjonens natur. Selv om retrovirale vektorer har blitt grundig undersøkt og anvendt i en rekke genterapianvendelser er disse vektorer generelt ikke egnet for infeksjon av celler som ikke deler seg. I tillegg har retrovirus mulig onkogen virkning.
Adenovirus har den fordel at de har et bredt utvalg av verter, kan infisere hvilende eller terminalt differensierte celler som neuroner eller hepatocytter, og at de synes å være i det vesentlige ikke-onkogene. Se f.eks. Ali et al, supra, s. 367. Adenovirus ser ikke ut til å integreres i vertsgenomet. Siden de foreligger ekstrakromosomalt er faren for insersjonsmutagenese i stor grad redusert. Ali et al, supra s. 373.
Adenoassosiert virus viser lignende fordeler som adenovirusbaserte vektorer. Imidlertid viser AAV setespesifikk integrasjon i humant kromosom 19. Ali et al, supra s. 377.
Det EL-2-muteinkodende DNA ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i genterapi for immundefisienssykdommer som HIV, infeksiøse sykdommer som tuberkulose og cancere, for eksempel nyrekarsinom.
Ifølge denne utførelse gis en pasient med behov for denne genterapi med DNA som koder for EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse, samtidig med eller umiddelbart etter diagnosen.
Denne tilnærming drar fordel av den selektive aktivitet til EL-2-muteinene ifølge foreliggende oppfinnelse for å forhindre uønskede toksiske og skadelige virkninger. Den erfarne fagmann vil forstå at enhver egnet genterapivektor som inneholder IL-2-mutein-DNA kan benyttes i samsvar med denne utførelse. Teknikkene for konstruksjon av en slik vektor er kjente. Se f.eks. Anderson, W.F., Human Gene Therapy, Nature, 392 25-30 (1998); Verma, LM. og Somia, N., Gene Therapy - Promises Problems, and Prospects, Nature, 389 239-242 (1998). Innføring av den IL-2-mutein-DNA-holdige vektor til målsetet kan oppnås ved anvendelse av kjente teknikker.
For at foreliggende oppfinnelse skal forstås bedre gis de påfølgende eksempler. Disse eksempler er kun ment å illustrere oppfinnelsen.
C. Eksempler
Eksempel 1. Fremstilling av muteiner i E. coli
Muteiner ble fremstilt ved setestyrt mutagenese ved anvendelse av primere som inneholdt kodoner som tilsvarte den ønskede mutasjon, i det vesentlige som beskrevet av Kunkel TA, Roberts JD, og Zakour RA, "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" (1987), Methods Enzymol 154:367-382. Kort beskrevet ble human EL-2-cDNA som inneholdt restriksjonsenzymsetene Barn HI og Xba I subklonet i M13-bakteriofagvektoren Ml3 mp 19 (New England Biolabs, Beverly, MA) ved anvendelse av de samme seter. Villtype-IL-2-cDNA ble erholdt ved anvendelse av polymerase-kjedereaksjonen ("PCR") fra cDNA dannet fra mRNA isolert fra lymfocytter fra humant perifert blod, indusert i 24 timer med forbol 12-myristat 13-acetat (10 ng/ml). De benyttede PCR-primere var for den 5' ende av den åpne leseramme for EL-2: og for den 3' ende av den åpne leseramme for IL-2:
Restriksjonsenzymsetene Eco RI (5' ende) og Barn HI (3' ende) ble innført i oligonukleotidene og er vist i kursiv. De benyttede PCR-betingelser var 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 58.7°C og 1 minutt ved 72°C i 25 sykluser. Den således erholdte, korrekte EL-2cDNA-sekvens ble bekreftet ved sekvensering med sekvenseringssettet "Sequenase (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, EL) som beskrevet av produsenten. Uracil-holdig enkelttrådet DNA (U-DNA) ble erholdt ved transformasjon av E. co/j-stammen (CJ236 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) med EL-2cDNA-holdig Ml3 mp 19. For setestyrt mutagenese ble det generelt benyttet primere som inneholdt 15 nukleotider som var homologe til templat-U-DNA 5' for kodonet eller kodonene som skulle mutageniseres, nukleotider som innførte den ønskede endring, og ytterligere 10 nukleotider som var homologe til templat-U-DNA 3' for det siste endrede nukleotid. I utgangspunktet ble setestyrt mutagenese anvendt for innføring av et Nco I-restriksjonssete i begynnelsen av den modne sekvens for humant IL-2. Anvendelse av dette restriksjonssetet innfører en N-terminal metioninrest som vil styre ekspresjonen til det cytoplasmatiske rom i E. coli ved for eksempel anvendelse av ekspresjonsvektoren pET3d. Primeren som ble benyttet for dette formål var: 5'-GCA CTT GTC ACA AAC ACCATG GCA CCT ACT TCA AGT-3' (SEQ ID NO: 5)
Spesifikke primere som ble benyttet for innføring av mutasjoner i posisjonene D20, N88 og Q126 var:
hvor NNN ble erstattet med et passende kodon for Histidin (CAC) eller Isoleucin (ATC)
(i posisjon D20), arginin (CGT), glycin (GGT) eller isoleucin (ATC) (i posisjon N88)
eller leucin (CTG) (i posisjon Q126). For andre mutasjoner ble det anvendt en tilvarende strategi og et egnet kodon for en gitt mutasjon. Primerene ble fosforylert ved anvendelse av T4 polynukleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA) ifølge produsentens fremgangsmåter. Etter hybridisering av primeren til U-DNA-templatet og forlengelse med T7 DNA-polymerase (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ble celler fra E. Coli-stammen DH5a™ (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) transformert med 5 \ x\ reaksjonsblanding og utstrøket på LB-medium tilsatt 0.7% agar. Etter ikubering ved 37°C ble plakk ekspandert ved å plukke enkeltplakk og overføre dem til 2 ml LB-medium og dyrke dem over natten ved 37°C. Enkelttrådet DNA ble isolert ved anvendelse av et M13-rensesett (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) ifølge produsentens fremgangsmåter, og kloner som inneholdt den ønskede mutasjon ble identifisert ved sekvensering av enkelttrådet DNA med sekvenseirngssettet "Sequenase<®>" (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, EL) ifølge produsentens fremgangsmåter. IL-2-mutein-cDNA fra replikativ form-DNA som tilsvarte plakk som inneholdt det korrekt muterte sekvens ble isolert ved anvendelse av Ncol og Xba I og subklonet i plasmidvektoren pET3a (Stratagene, San Diego, CA) (Strat). E. co/i-stammen BL21 ble transformert med muteinholdig pET3a-vektor og dyrket til en absorbans ved 280 nanometer på tilnærmet 0.6 og 1.0, hvoretter 0.4 mM ff TG ble tilsatt for induksjon av EL-2-muteinproduksjon.
Eksempel 2. Ekstraksjon og rensing av IL-2-muteiner fra E. coli
Tre timer etter induksjonen ble cellene festet ved sentrifugering ved 10.000 X g. De rekombinante EL-2-muteinene ble renaturert og renset ved først å dispergere cellene i 10 volumer (vol/våtvekt) sukrose/Tris/EDTA-buffer (0.375M sukrose, 10 mM Tris/HCL pH 8.0 ImM ETA). De dispergerte cellene ble ultralydbehandlet 3 ganger ved 300 W med 30 sekunders mellomrom i et isbad ved anvendelse av en Missonix modell XL2020 sonikator utstyrt med en 2.5 cm standard probe. Det ultralydbehandlede materiale bel så sentrifugert ved 17.000 x g i 20 minutter ved 4°C. Nedsentrifugert materiale, som på dette stadium bør være hvitt, ble vasket ved resuspensjon og sentrifugering en gang i sukrose/Tris/EDTA-buffer, og to ganger i Tris/EDTA-buffer (50mM Tris/HCL pH 8.0, ImM EDTA), og endelig resuspendert i 10 volumer 0.1M Tris/HCL, pH 8.0-buffer (uttak tas på dette tidspunkt for gelanalyser) og sentrifugert i 20 minutter ved 17.000 x g-
Nedsentrifugert materiale ble løst ved tilsetning av 3 volumer 8 M guanidiniumklorid i 0.1 M Tris/HCL (pH 8.0) og 0.1% (vol/vol) 2-merkaptoetanol. Etter inkubering i 2 timer ved romtemperatur ble prøven sentrifugert i 20 minutter ved 17.000 x g. Den resulterende løsning ble dialysert i tilnærmet 20 timer mot 20 volumer lOmM Tris/HCL, pH 8.0 ImM EDTA ved 4°C. Løsningen ble sentrifugert ved 17.000 x g i 20 minutter, justert til 0.1% trifluoreddiksyre og filtrert i en 0.22 mikrometer filterenhet. Løsningen ble umiddelbart overført til en silikonisert kolbe og påsatt en C8-kolonne (Vydac 208TP54). EL-2-muteiner ble renset ved anvendelse av en linenær gradient over 20 minutter med 45-84% acetonitril i 0.1% TFA. Konsentrasjonen av det eluerte protein ble bestemt ved måling av absorbansen ved 280 nm og aminosyreanalyse. Proteinet ble så fordelt på porsjoner (100 ml) i silikoniserte rør og lagret ved -20°C. Således renset mutein ga typisk et enkelt bånd ved SDS-PAGE (sølvfarging) og ble kvantitert ved aminosyreanalyse (typisk nøyaktighet >90%).
Eksempel 3. T-celleproliferasjonsanalyse
Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble isolert fra tilnærmet 100 ml normal menneskeblod (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA) fortynnet 1:2 med kaldt Dulbecco's fosfatbufrede saltvann (Ca<2+-> og Mg^-fritt DPBS). Ficoll - Paque (Pharmacia) legges under prøven som sentrifugeres for isolering av PMBC, fulgt av omfattende vask med kaldt DPBS. PHA-blaster (aktiverte T-celler) ble fremstilt ved resuspensjon av celler i RPMI1640 tilsatt 10% fetalt bovint serum (Hyclone), til hvilket 1% (vekt/vol) av hver av følgende stoffer tilsettes: L-glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, natriumpyruvat og antibiotikum/antimykotikum (RPMI-medium) til en tetthet på 1X10<6> celler/ml. Fytohemmaglutanin (PHA.P, Sigma) ble tilsattt til en sluttkonsentrasjon på 10ug/ml, og cellene ble inkubert ved 37°C, 5% CO2 i 3 dager. Cellene ble høstet og vasket to ganger med DPBS, resuspendert i RPMI-medium og utsådd i 96-brønners flatbunnede plater ved en tetthet på 1 X IO<5> celler/brønn i 200 \ i\ med varierende konsentrasjoner av EL-2 eller mutein i RPMI-medium. Platene bel inkubert i 48 timer ved 37°C, pulsmerket med luCi <3>H-tymidin (DuPont NEN<®>, Boston, MA)/brønn i 6 timer og høstet, og radioaktiviteten ble målt etter oppsamling av cellene på glassfiberfilter.
Eksempel 4. NK-celleproliferasjonsanalyse
Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble isolert fra tilnærmet 100 ml normalt menneskeblod (Irwin Memorial Blood Bank, San Francisco, CA) fortynnet 1:2 med kaldt Dulbecco's fosfatbufrede saltvann (Ca<2+-> og Mg<2+->fritt, DPBS). Ficoll - Paque (Pharmacia) legges under prøven som sentrifugeres for isolering av PBMC, fulgt av omfattende vask med kaldt DPBS. NK-cellene ble skilt fra andre celler. Miltenyi Biotec NK-celleisoleringssettet fra (Bergisch Gladbach, Germany, kat.nr. 465-01) foretrekkes for dette formål. Settet består av to reagenser, separasjonskolonner og et meget kraftig magnetisk kolonnestativ. Det første reagens er en blanding av haptenkonjugerte monoklonale CD3, CD4, CD19, CD33-antistoffer av IgGl-isotype fra mus. Dette er for å fjerne T-celler, B-celler og myeloide celler fra PBMC. Det antas at ethvert egnet sett med antistoffer som gjenkjenner disse celletyper kan benyttes. Det andre reagens består av koloidale superparamagnetiske MACs-mikrokuler konjugert til et anti-hapten antistoff. Cellene resuspenderes i PBS med 0.5% bovint serumalbumin og 2mM EDTA (PBS/EDTA). Suspensjonens volum avhenger av antall celler som benyttes og oppgis i en tabell av Miltenyi Biotec. Med et celletall på 2 til x 10<8> PBMC resuspenderes cellene typisk i 800 jliI av bufferen, hvoretter 200 ul av hvert reagens benyttes. Etter inkubering med reagensene tilsettes cellene til kolonnen (resuspendert i 2 ml buffer). Ikke-NK-celler bindes til magneten (fjernes), og NK-cellene isoleres og oppsamles i det ubundne materialet. Cellene vaskes, resuspenderes i RPMI-medium (inneholder: RPMI1640 til hvilket 1% av følgende stoffer er tilsatt: L-glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, natriumpyruvat, antibiotikum/antimykotikum (alle fra Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), 10% fetalt bovint serum Yhyclone)) og plasseres i 96-brønners flatbunnede plater ved en tetthet på 1 X 10<5> celler/brønn i 200 (il. Cellene ble høstet og vasket to ganger i DPBS, resuspendert i RPMI-medium og utsådd i 96-brønners flatbunnede plater ved en tetthet på 1 X 10<5> celler/brønn i 200 ul, med varierende konsentrasjoner av EL-1 eller mutein i RPMI-medium. Platene ble inkubert i 48 timer ved 37°C, pulsmerket med 1 (iCi <3>H-tymidin (DuPont NEN<®>, Boston, MA)/brønn i 6 timer og høstet, og radioaktiviteten ble målt etter oppsamling av cellene på glassfiberfilter.
Eksempel 5. Muteiner som selektivt aktiverer T-celler fremfor NK-celler
Muteiner ble fremstilt ved anvendelse av setestyrt mutagenese (Kunkel et al (1987), Methods Enzymol 154: 367-382) i posisjonene Asp-20, Asp-84, Asn-88 og Gln-126 og ble uttrykt i E. coli ved anvendelse av pET-3a-ekspresjonssystemet som beskrevet av produsenten (Stratagene). Muteinene ble renset ved gjenvinning av inklusjonslegemer i guanidin-HCL, gjenfolding og kromatografier ved anvendelse av HPLC som tidligere beskrevet. Det resulterende protein så ut til å være >95% rent ved sølvfarget SDS-PAGE og ble analysert for konsentrasjon og renhet ved aminosyreanalyse (AAA, nøyaktighet typisk >90%). Muteiner med egnet aktivitet ble sekvensbekreftet ved anvendelse av massespektrometrisk analyse. Således rensede muteiner ble analysert i T- og NK-celleanalysene som er beskrevet tidligere. Relative aktiviteter for JJL-2-muteiner i T- og NK-celleanalysen er gitt i Tabell 1.
Muteinenes aktivitet er gitt som den relative myteinkonsentrasjon som er nødvendig for å gi 50% av den maksimale respons (EC50) sammenlignet med EC50 for villtype-IL-2 i samme analyse, dersom samme mutein ble analysert flere ganger er den geometriske middelverdi av verdiene angitt. EC50-verdiene for villtype-IL-2 varierte mellom ~10 pM og 150 pM i T-celleanalysen og ~50 pM og ~200 pM i NK-celleanalysen. Forholdet mellom T-celle- og NK-celleaktivitet av muteinene er angitt som den relative aktivitet av muteinet på T-celler dividert med muteinets relative aktivitet på NK-celler. Dette forhold bestemmes for hvert mutein ved kun å benytte aktivitet bestemt fra gitte T- og NK-celleanalyser med celler fra en enkelt donor.
Muteinaktivitene kan klassifiseres i 6 brede grupper:
1) 1000 gangers T-celleselektivitet,
2) 100, men <1000 gangers T-celleselektivitet,
3) 10, men <100 gangers T-celleselektivitet
4) forbedret aktivitet relativt til EL-2 på T-celler,
5) NK-celleselektivitet,
6) 10 gangers selektivitet for enten T-celler eller NK-celler.
Klasse 1: D20H, I og Y; N88G, I og R
Klasse 2: D20K, L, M, N, Q og S; N88M og T; Q126D, E, G, L og V.
Klasse 3: D20R; N88A, E, F, S og V; Q126F, I, N, R og S.
Klasse 4: D20I; N88G; Q126E, L, M, N og R.
Klasse 5: Q126A.H.
Klasse 6: D20A, T og V; N88H, K, L, W og Y; Q126K, P, T, W og Y.
I klassene 1-3 er de foretrukne muteiner muteiner som har en aktivitet på T-celler som tilsvarer eller er høyere enn aktiviteten av villtype-EL-2.
I klasse 1 vil dette omfatte D20H og I; N88G, I og R;
i klasse 2 omfatter dette N88M og T, Q126D, E, G, L og V;
i klasse 3 omfatter dette N88A, Q126F og G.
Muteiner i klasse 4 antas å ha høyere aktivitet enn villtype-EL-2 in vivo.
Det kan sees fra Tabell 1 at ingen enkeltmutasjon førte til et EL-2-mutein som var inaktivt i begge analyser. Det kan imidlertid utledes at en kombinasjon av mutasjoner i to forskjellige posisjoner som førte til alvorlig nedsatt aktivitet muligens kunne gi en antagonist-EL-2-aktivitet på T-celler eller andre celletyper med høyaffinitets-EL-2-reseptor. En slik antagonist kan forutsies fra disse resultater, siden mutasjonene var utformet slik at de kun endret interaksjonene med EL.2RP og EL-2Ry. Et slik eksempel vil være dobbeltmuteinet D20R/Q126T. Kombinasjonen i et molekyl av mutasjoner som gir nedsatt aktivitet forventes å være kombinatorisk av natur, d.v.s. at D20R har 0.00018 aktivitet på t-celler, Q126T 0.0001 aktivitet på T-celler, hvorved dobbeltmuteinet D20R/Q126T ville forventes å ha 0.000000018 av aktiviteten til villtype-EL-2 på T-celler. Andre kombinasjoner kan utledes fra de tilveiebrakte resultater.
Eksempel 6. Biologisk aktivitet av viltype-IL-2 og IL-2-muteiner
Figurene 1 til 7 viser dose-responskurver for villtype humant IL-2- (L-2) og D20H (Fig. 1), EL-2 og D20I (Fig. 2), EL-2 og N88G (Fig. 3), EL-2 og N88I (Fig. 4), EL2 og N88R (Fig. 5), EL-2 og Q126E, (Fig. 6) og EL-2 og Q126 (Fig. 7).
A: Dose-responskurve for EL-2 (fylte sirkler) og mutein (åpne sirkler) i
proliferasjonsanalysen av primære humane T-celler (PHA-blaster).
B: Dose-responskurve for EL-2 (fylte triangler) og mutein (åpne triangler) i
proliferasjonsanalysen for primære humane NK-celler.
Når det gjelder Fig. 1 var for det viste eksperiment dosen av villtype-EL-2 som gir 50% maksimal proliferasjon (EC50) -1.5 X 10'<10>M for T-celleanalysen (A) og -1 X 10'I0M for NK-celleanalysen (B). EC50 for D20H var ~2 X 10'<10>M i denne T-celleanalyse, men ble anslått til >1 X 10'<5>M i denne NK-celleanalyse. Netto forbedring av T-celleaktivitet av D20H fremfor NK-celleaktivitet er således >50.000 ganger, bestemt ved denne analyse. Tilsvarende resultater ble erholdt med blod fra andre donorer (resultater ikke vist). Når det gjelder Fig. 2 var for det viste eksperiment dosen av villtype-EL-2 som gir 50% maksimalt proliferasjon (EC50) -1.5 X 10"<!0>M for T-celleanalysen (A) og ~3 X 10"<10>M for NK-celleanalysen (B). EC50 for D20I var også -1.5 X 10"<10>M i denne T-celleanalyse, men ble anslått til kun å være -5 X 10"<6>M i denne NK-celleanalyse. Netto forbedring av T-celleaktivitet av D20I fremfor NK-celleaktivitet er således -16.000 ganger, bestemt ved denne analyse. Tilsvarende resultater ble erholdt med blod fra andre donorer (resultater ikke vist).
Når det gjelder Fig. 3 var for de viste eksperimenter dosen av villtype-EL-2 som gir 50% maksimal proliferasjon (EC50) -4 X 10"nM for T-celleanalysen (A) og -2 X 1010M for NK-celleanalysen (B). EC50 for N88G var -5 X 10"<12>M i denne T-celleanalyse, men ble anslått til kun -3 X 10'<8>M i denne NK-celleanalyse. Nettoforbedring av T-celleaktiviten av N88G fremfor NK-celleaktiviteten er således -1.200 ganger, bestemt ved denne analyse. Tilsvarende resultater ble erholdt med blod fra andre donorer (resultater ikke vist).
Når det gjelder Fig. 4 var for det viste eksperiment dosen av villtype-EL-2 som gir 50% maksimalt proliferasjon (EC50) -1.5 X 10"<10>M for T-celleanaylsen (A) og ~1 X 10<-10>M for NK-celleanalysen (B). EC50 for N88I var ~4 X 10-,<0>M i denne T-celleanalyse, men anslått til kun ~5 X 10"<6>M i denne NK-celleanalyse. Nettoforbedringen av T-celleaktivitet for N88I fremfor NK-celleaktivitet er således ~18.000 ganger bestemt ved denne analyse. Tilsvarende resultater ble erholdt med blod fra andre donorer (resultater ikke vist).
Når det gjelder Fig. 5 var for det viste eksperiment dosen av villtype-EL-2 som gir 50% maksimal proliferasjon (EC50) ~1.5 X 10"10M for T-celleanalysen (A) og ~1 X 10'10M for NK-celleanalysen (B). EC50 for N88R var ~9 X 10"HM i denne T-celleanalyse, men anslått til kun ~3 X 10"7M i denne NK-celleanalyse. Nettoforbedringen av T-celleaktiviten av N88R fremfor NK-celleaktivitet er således ~5.000 ganger bestemt ved denne analyse. Tilsvarende resultater ble erholdt med blod fra andre donorer (resultater ikke vist).
Når det gjelder Fig. 6 var for det viste eksperiment dosen av villtype-EL-2 som gir 50% maksimal proliferasjon (EC50) ~8 X 10'<12>M for T-celleanalysen (A) og ~5 X 10'nM for NK-celleanalysen (B). EC50 for Q126E var ~8 X 10"<13>M i denne T-celleanalyse, men anslått til kun ~2 X 10'<9>M i denne NK-celleanalyse. Nettoforbedringen av T-celleaktiviteten til Q126E fremfor NK-celleaktivitet er således ~400 ganger bestemt ved denne analyse. Tilsvarende resultater ble erholdt med blod fra andre donorer (resultater ikke vist).
Når det gjelder Fig. 7 var for det viste eksperiment dosen av villtype-EL-2 som gir 50% maksimal proliferasjon (EC50) ~5 X 10"nM for T-celleanalysen (A) og ~8 X 10"UM for NK-celleanalysen (B). EC50 for Q126 var ~2 X 10"nM i denne T-celleanalyse, men anslått til kun ~2 X 10"<8>M i denne NK-celleanalyse. Nettoforbedringen av T-celleaktiviteten til Q126L framfor NK-celleaktiviteten er således ~625 ganger bestemt ved denne analyse. Tilsvarende resultater ble erholdt med blod fra andre donorer (resultater ikke vist).
Eksempel 7. Toksisitetsundersøkelser i sjimpanse
EL-2/N88R ble utvalgt blant de mutante EL-2-proteiner i Tabell 1 grunnet proteinets deomentrerte T-celleselektive agonistaktivitet i analyser med primære humane T- og NK-celler. Relativt til villtype-EL-2 er proteinet ~6.000 ganger mer aktivt på T-celler enn på NK-celler og viser en aktivitet som i det vesentlige tilsvarer villtype-EL-2 på T-celler. EL-2/N88R ble fremstilt i CHO-celler, renset og evaluert i en sjimpanse-modell for EL-2-aktivitetet og -toksisitet. I denne in vivo-modellen viste forbindelsen en T-celleaktivitet som tilsvarte en kommersielt tilgjengelig rekombinant variant av EL-2 ("PROLEUKIN™"), Chiron Corporation, Emeryville, CA), men induserte likevel kun milde bivirkninger i sammenligning (både når det gjelder objektive og kliniske parametere).
A. Eksperimentell utforming
1. Materialer og fremgangsmåter
In v/vo-delen av undersøkelsen fant sted ved New Iberia Research Center (New Iberia, LA, Sponsor Bayer Corporation, Berkeley, CA) og omfattet to undersøkelsesfaser og 11 unge voksne til voksne hann-sjimpanser med kroppsvekt i området fra tilnærmet 45 til 70 kg.
Fase I av undersøkelsen var en dosebestemmelsesfase og omfattet tilførsel av en subkutan dose av bærestoff eller en subkutan dose av "PROLEUKIN" på 1.2 mg/m<2>, to ganger daglig (BED) i 5 dager. Fase U av undersøkelsen er en sammenligning mellom bærestoff, "PROLEUKIN" og EL-2/N88R gitt subkutant hver 12 time (ql2h) i 5 dager. Dosen av IL-2/N88R var valgt for å gi tilsvarende eksponering som for "PROLEUKIN", basert på farmakokinetisk analyse. Blodprøver ble uttatt for analyse av blodkjemi, CBC, hematologi/koagulasjon og FACS-analyse av T- og NK-cellepopulasjoner, som beskrevet i detalj i seksjoneen 5 og 6.
2. Doseringsfremgangsmåte
På forsøksdager hvor blod skulle erholdes ble dyrene fullstendig bedøvet ved anvendelse av intramuskulært ketamin i en dose på tilnærmet 10 mg/kg før tilførsel av analyseforbindelsen eller bærestoffet. På forsøksdager hvor blodprøver ikke var nødvendige ble dyrene fysisk begrenset ved anvendelse av et klemmebur før tilførsel av analyseforbindelsen eller bærestoffet. Dosen ble tilført ved subkutan injeksjon hver 12. time i 5 dager, og injeksjonssetet ble barbert for hår på undersøkelsens dag 1. Doseringsetet og tidspunkt for doseringen ble notert for hver dose.
3. Kliniske observasjoner
(a) Daglige observasjoner og forinntak.
Hvert dyr ble observert to ganger om dagen, og enhver unormal observasjon rapportert til forsøkslederen. Forsøkslederen, prosjektveterinæren og sponsorrepresentanten ble gjort oppmerksom på dyr som virket syke. Forinntaket ble bekreftet og notert to ganger daglig ved visuell observasjon.
(b) Kroppsvekt.
Kroppsvekten ble målt før undersøkelsen, før doseringen på dag 1 og hver hver gang dyrene ble bedøvet for uttak av blodprøver.
(c) Observasjon av inieksjonsseter.
Injeksjonssetene ble undersøkt daglig. Ethvert unormalt utseende, for eksempel rødhet og opphovning, ble notert.
4. Prøvehåndtering
(a) Serumkiemi.
Blodprøver på tilnærmet 2 ml ble oppsamlet fra hvert dyr i rør uten antikoagulasjonsmiddel på de ovenfor angitte tidspunkt. Blodoppsamlings-tidspunktet ble dokumentert og blodet tillatt å koagulere ved romtemperatur. Prøvene ble så sentrifugert og serum fraskilt og videresendt til NER.C Clinical Pathology Laboratory. Standardserumkjemipanelet til NIRC er gitt i Tabell 4:
(b) Hematologi.
Blodprøver på tilnærmet 2 ml ble oppsamlet fra hvert dyr i EDTA-rør ved de ovenfor angitte tidspunkt og videresendt til NIRC Clinial Pathology Laboratory. Standard hematologipanelet til NIRC, innbefattet fullstendig telling av blodceller, differensialtelling og blodplatetelling, ble utført på alle prøver.
(c) Sponsoranalvser.
Blodprøver på tilnærmet 6 ml ble oppsamlet i rør med EDT som antikoagulasjonsmiddel på de angitte tidspunkt. Tidspunktene for bloduttak ble notert. Prøvene ble sentrifugert og plasma fraskilt og fordelt på tre adskilte rør. Plasmaet ble lagret nedfrosset (-60°C eller lavere) og sendt til Bayer Corporation, Berkeley, CA så snart forsøket var avsluttet.
5. FACS
(a) Fremgangsmåte.
En blodprøve på tilnærmet 5 ml ble oppsamlet med natriumheparin som antikoagulasjonsmiddel på tidspunktene angitt for FACS-analyse.
Helblodsprøver ble erholdt i enten EDT A, ACD eller heparin. Celletallet ble justert til området 2 til 20 tusen pr. Mm<3>.
12 X 75 glassrør eller plastrør ble merket på egnet vis for det benyttede
antistoffpanel. Antistoff eller antistoffblandinger ble tilsatt til rørene ifølge produsentens anbefalte volumer.
100 ul av en godt sammenblandet blodprøve ble tilsatt til hvert rør, og blandingen ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur beskyttet fra lys.
Etter inkuberingen ble 2 ml lyseringsløsning (Becton Dickinson FACS-type lyseringsløsning BD # 92-0002) tilsatt, og blandingen ble forsiktig sammenblandet og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Rørene ble så sentrifugert ved romtemperatur i 5 minutter ved 300 X g. Supernanten ble avhelt, overskudd av væske fjernet med papir og 2 ml PBS-buffer (GEBCO 14190-144) tilsatt til de nedsentrifugerte celler. Etter forsiktig opprysting ble rørene
sentrifugert ved romtemperatur i 5 minutter ved 300 X g. Supernatanten ble avhelt og overskudd av væske fjernet med papir før tilsetning av 1 ml
fikseringsløsing (0.5% formaldehydløsning fremstilt ved å fortynne 10% formaldehyd (Polyscience, Inc. #0418) 1:20 med PBS-buffer) til de nedsentrifugerte celler og forsiktig sammenblanding for resuspensjon. Prøvene ble så analysert i et Coulter EPICS SL Flow Cytometer.
Antistoffer benyttet for undersøkelsen: MlgGI/MIgGlisotypekontroll (Becton Dickinson, kat. nr. 349526), CD45-PerCP (Becton Dickinson, kat. nr. 347464), CD8-FITC (Becton Dickinson, kat. nr. 347313), CD25-PE (Becton Dickinson, kat. nr. 30795X), CD4-FITC (Becton Dickinson, kat.nr. 340133), CD16-PE (Pharmingen, kat.nr. 347617), CD3-PerCP (Becton Dickinson, kat.nr. 347344).
6. Koagulasjonsprofil
Blodprøver på tilnærmet 2 ml ble oppsamlet i rør med natriumsitrat tilsatt som antikoagulasjonsmiddel på de ovenfor angitte tidspunkt. Koagulasjonsprofilen besto av protrombintid (PT), aktivert partiell tromboplastintid (APTT) og fibrinogen.
B. Resultater og diskusjon
1. " PROLEUKIN"- dosebestemmelse
Hovedformålet med denne fase var å fastsette en optimal "PROLEUKIN"-dose for sammenligning med EL-2/N88R. Denne optimale "PROLEUKIN"-dose skulle være en tolererbar dose (lavere enn den maksimale tolererte dose) som ideelt sett vil gi klinisk signifikant, men moderat og reversibel toksisitet. En "PROLEUKLN<H->dose på 1.2 mg/m<2 >BED, ble bestemt som utgangsdose, basert på ekstra polering på tvers av artene ut fra kliniske doseringsskjemaer for "PROLEUKIN", deres tilsvarende toksisitet og dose-responsresultater fra cynomolgus-aper i laboratoriet.
To sjimpanser ble behandlet på denne måte med "PROLEUKTN". Disse dyr ble stadig mindre aktive, forstyrrede og dehydrerte gjennom doseringsforløpet. Begge dyr utviklet alvorlige mage-tarmsymptomer ved start på dag 3 eller 4, innbefattet redusert appetitt, diare og oppkast. Doseringen av ett dyr (nummer X-159) ble avsluttet etter 3 dagers dosering grunnet alvorlig nyresvikt (Figur 8A og B) og moderat leversvikt (Figur 8C og D), vist ved kjemisk analyse av blodet. Analysene omfattet forhøyet ureanitrogen i blodet (BUN), kreatin og totalbilirubin, ALT (SGPT). Ringers løsning tilsatt laktat ble gitt intravenøst til begge de "PROLEUKIN"-behandlede dyr på dag 3 og 4 (dyr X-159) og kun dag 4 (dyr X-124), for gjenopplivelse eller for å forhindre ytterligere dehydrering. Dyr nummer X-159 ble fjernet fra undersøkelsen på dag 8 grunnet dyresvikt og mulig trombe i høyre bein, vist ved en svært minimal puls (femoral), og hele leggen var kald og oppsvulmet. Selv om signifikant toksisitet ble observert i ett dyr gjennomgikk det andre dyr mindre alvorlige hendelser, og profilen for uønskede hendelser for begge dyr var reversibel. Basert på dette ble 1.2 mg/m<2> "PROLEUKIN" og den ekvivalente dose (basert på eksponering) av EL-2(N88R, ql2hr fastsatt som et egnet doseringsskjema for sammenligning av disse to forbindelser.
2. Sammenligning av LL- 2/ N88R med " PROLEUKIN"
Kliniske observasjoner
Tabell 5 angir de kliniske observasjoner som ble gjort under undersøkelsen. Verdiene er gitt på en skala fra 0 til 5 hvor 5 er alvorlig. Alle "PROLEUKIN"-behandlede dyr var alvorlig syke, det var ett dødsfall forbundet med "PROLEUKIN"-behandling. Verdiene angitt etter dag 6 for "PROLEUKIN"-gruppen gjengir resultater fra de gjenværende to dyr. Den mest åpenbare bivirkning av IL-2/N88R-behandlingen virket å være mild mage-tarmkanalforstyrrelse (emesis), selv om behandlingen omfattet nominal toksisitet når det gjelder parameterene angitt i Tabell 4. Kroppsvekten for "PROLEUKIN"-gruppen falt med 6% på dag 6 og gikk ned til 10% vekttap på dag 10, og økte langsomt etter dette (se Figur 9). I motsetning til dette hadde EL-2/N88R-gruppen og bærestoffgruppen kun 1-3% vekttap på det meste.
(a) Hematologi.
EL-2/N88R induserte cellulære virkninger som var i samsvar med "PROLEUKIN"-aktivering, nærmere bestemt lymfocytose (Figur 10A), økt antall hvite blodceller (Figur 10B) og neutrofile celler (Figur 10C) ble ogå observert. IL-2/N88R induserte kun en marginal tromocytopeni (med topp på -15%) sammenlignet med "PROLEUKIN" (topp -50%) under behandlingsdelen av undersøkelsen (Figur 10D).
(b) Nyrefunksjon.
BUN-nivået var markant høyere hos alle "PROLEUKEN<T->behandlede dyr på dagene 6 og 8 (Figur 1 IA). BUN-nivået var over 130 mg/dL hos to av dyrene. Kreatininnivået økte også dramatisk i disse to dyr, både på dag 6 og dag 8 (Figur 1 IB), noe som tyder på en fullstendig stans i nyrefunksjonen. I tillegg økte både fosfor i serum og aniongap i den "PROLEUKJJST-behandlede gruppe på dagene 6 og 8.1 motsetning til dette forble disse nyreparametere stort sett normale hos alle EL-2/N88R dyr under hele undersøkelsen (Figur 11C og D).
(c) Leverfunksjon.
Total bilirubin var mer enn tre ganger høyere i "PROLEUKIN"-gruppen på dag 6 og forble høy til og med dag 10 (Figur 12 A). I motsetning til dette hadde kun ett dyr i iL-2/N88R-gruppen en forbigående, mindre økning på dagene 3 og 6. Serum-SGPT-nivået økte dramatisk og nådde over 100 U/L hos alle
"PROLEUKTN"-dyr på dag 6 (Figur 12B). SGPT-nivået hos dyr nr. Al 99 nådde 651 U/L, og SGOT-nivået 2789 U/L (Laboratoriejournal: NIRC#8754-9852-fase II, Tabell 1, gjennomsnittlige kjemiverdier for enkeltdyr og grupper, side 17 av 21 av tabellen), noe som tyder på alvorlig leversvikt.
(d) Koagulasjon.
Fibrinogennivået ble mer enn fordoblet både hos "PROLEUKIN"-gruppen og IL-2/N88R-gruppen, og nådde en topp på dag 6 (Figur 12C). Økningen skjedde tilsynelatende tidligere i "PROLEUKTN"-gruppen enn hos EL-2/N88R-dyrene. Dette gjenspeiles av en økning på 51% på dag 3, sammenlignet med 5%. Endringen i fibrinogen kan være et resultat av en akutt proteinrespons snarere enn koagulasjonsdefekter, siden det ikke var noen meningsfulle endringer i APTT eller PT under det samme tidsrom (Figur 12D). Fra og med dag 10 viste imidlertid APTT-nivået hos "PROLEUKIN"-dyrene en åpenbar oppadgående trend, selv om den absolutte verdi forble innenfor normalområdet. Den samme trend ble også observert i EL-2/N88R-gruppen, om enn med mindre omfang. Det er imidlertid av interesse at fibrinogennivået tilsynelatende ble lavere under det samme tidsrom i begge grupper.
(e) Homeostase.
Natriumnivået i serum ble redusert til under 135 MEQ/L hos to av de tre "PROLEUKEN<T->dyr på dag 8, men forble normalt hos resten av dyrene (Figur 13 A). Kloridnivået hos "PROLEUKIN"-gruppen ble også redusert til under 95
MEQ/L fra og med dag 3, og forble lavt inntil dag 15 (Figur 13B).
Kalsiumnivået var lavere hos to av tre "PROLEUKIN"-dyr på dagene 6 og 8 og gikk helt ned til 4.9 og 3.1 mg/dL i dyr Al99 (Figur 13C). Kaliumnivået ble redusert til under 3 MEQ/L fra dag 3 til 12 hos alle "PROLEUKIN"-behandlede dyr bortsett fra dyr Al99, hvis kaliumnivå faktisk økte til et toksisk nivå på 7.2 MEQ/L før dyret ble fjernet fra undersøkelsen (Figur 13D).
(f) Tegn på vaskulær lekkasj e.
Serumalbuminnivået ble redusert både i "PROLEUKJJST-gruppen (37%) og EL-2/N88R-gruppen (19%) (Figur 14A). Et økt hematokrittnivå ble observert i "PROLEUKEN<T->gruppen på dagene 3 og 6 (Figur 14B). I motsetning til dette gikk hematokrittnivået i både bærestoffkontrollgruppen og EL-2/N88R-gruppen ned under det samme tidsrom og forble lavt, noe som tyder på en mild anemi, som forventet grunnet flere uttak av blodprøver (Figur 14B og C). Den økte hematokritt i "PROLEUKEN"-gruppen, koblet til redusert albumin, er i samsvar med utvikling av kapillært lekkasj esyndrom.
3. Cellulær aktivering.
Virkningen av "PROLEUKIN" og LL-2/N88R ble fulgt via variasjonen i prosent CD25-positive lymfocytter (trafikkering + proliferasjon) og middelverdien for fluorescens for CD25 eller antall CD25-antigener uttrykt på overflaten av en gitt T-celle (CD25=lavaffinitets-EL-2R). CD25-ekspresjonen ble fulgt i den totale T-cellepopulasjon (CD3+celler) såvel som CD3+CD4+- og CD3+CD8+-populasjonen. IL-2-aktiviteten på naturlige dreperceller (NK-celler) ble fulgt ved å analysere trafikkering av CD3-CD16+- og CD-CD25+-NK-celler. Det absolutte antall CD3+, CD4+, CD8+, NK-celler ble bestemt ved å multiplisere prosent celler med antall lymfocytter pr. mm<3>, resultater som ble erholdt i den hematologiske analyse.
(a) Regulering av CD25-ekspresjonen på T-celleoverflaten.
Prosent aktiverte T-celler, målt som CD2 5-positive celler var oppregulert på dag 6 av undersøkelsen, hovedsakelig i CD3+CD4+-T-cellesubpopulasonen.
"PROLEUKIN" ser ut til å indusere ekspresjon av CD25 på en høyere prosentandel av den totale CD3+-, CD3+CD4+- og CD3+CD8+-subpopulasjon av T-celler på dag 6. På dag 8 var imidlertid prosent celler som uttrykte CD25-antigenet identisk på lymfocyttene fra sjimpanser behandlet med "PROLEUKIN" og sjimpanser behandlet med EL-2/N88R (Figur 15A, B og C). Ingen farging for CD25 på overflaten av populasjonen av naturlige dreperceller (NK-celler) ble observert, hverken hos de "PROLEUKIN"-behandlede eller LL-2/N88R-behandlede sjimpanser. Manglende ekspresjon av EL-2Roc (antigenet som er målet for celleoverflatefarging for CD25) på overflaten av den utvalgte NK-cellepopulasjon (CD3-/CD16+) antas å være ansvarlig for disse resultater.
Det absolutte antall CD3+CD25+-T-celler fulgte et tilsvarende mønster som prosentandelen CD3+CD25+-T-celler, med "PROLEUKIN" tilsynelatende mer aktivt enn BL-2/N88R (figur 16A). EL-2/N88R viste en tilsvarende evne til T-celleaktivering som "PROLEUKIN" på CD3+CD4+-T-cellepopulasjonen, siden oppregulering av det totale antall CD3+CD4+CD25+-lymfocytter indusert ved EL-2/N88R var identisk med oppreguleringen observert med "PROLEUKIN"
(Figur 16B). "PROLEUKIN" så ut til å øke antall CD3+CD8+CD25+-T-celler i større grad enn IL-2(N88R (Figur 16C).
Antall CD25-molekyler (gjennomsnittsfluorescens)uttrykt på CD3+CD4+-T-cellesubpopulasjonen fulgte samme kinetikk, både med "PROLEUKIN" eller EL-2/N88R (Figur 17). (b) Lymfocyttrafikkering: virkning av "PROLEUKIN"- og LL-2/N88R-behandling.
"PROLEUKIN" og EL-2/N88R-aktiviteten på T- og NK-cellepopulasjonen ble bestemt ved analyse av variasjonen i det absolutte antall sirkulerende lymfocytter før, under og etter behandlingen (Figur 18). EL-2/N88R så ut til å ha større aktivitet enn "PROLEUKIN" når det gjaldt økning av det absolutte antall CD3+CD4+-sirkulerende lymfocytter (Figur 18A), og en noe redusert aktivitet sammenlignet med "PROLEUKIN" når det gjaldt økning av det absolutte antall CD3+CD8+-sirkulerende lymfocytter (Figur 18B). Begge forbindelser hadde tilsvarende, om enn moderat virkning når det gjaldt å øke det totale antall CD3+-lymfocytter (Figur 18C). Hverken "PROLEUKIN" eller EL-2/N88R påvirket trafikkering av NK-celler (Figur 18D).
C. Konklusjon
EL-2/N88R ble utvalgt ved analyse av mutante EL-2-proteiner i analyser på primære humane T- og NK-celler. Forbindelsen viser en in vtfro-selektivitet for T-celler fremfor NK-celler på tilnærmet 6.000 ganger. Basert på denne cellulære profil ble det postulert at forbindelsen kun ville indusere milde bivirkninger ved tilførsel i en dose som ville utløse signifikant T-celleaktivering. Eksperimenter i sjimpanser hvor "PROLEUKIN" ble sammenlignet med EL-2/N88R bekreftet at EL-2/N88R har en signifikant bedre sikkerhetsprofil enn "PROLEUKIN", samtidig som forbindelsen har tilsvarende evne til å indusre T-celleaktivering.
Eksempel 8: Virkning av den IL-2-selektive agonist N88R i muse-CT-26-lungemetastasetumormodellen.
Fremgangsmåte:
Mus (Balb/c, hunnmus, 6-8 uker gamle) ble injisert intravenøst med 1 x IO<5> CT-26-celler (musekolonkarsinom) i 0.2 ml PBS i den laterale halevene på dag 0. Dyrene ble behandlet med "PROLEUKIN" eller EL-2/N88R i forskjellige doser (fortynningsmiddel: 5% dekstrose i vann (D5W)), eller D5W tilført intravenøst en gang daglig i 8 dager (QD x 8) med start på dag 1 etter implanteringen. EL-2/N88R ble klargjort ved romtemperatur ved fortynning i D5W ved anvendelse av silikoniserte rør med en tuberkulinsprøyte, og tilført dyrene i løpet av 2 timer etter fremstillingen. "PROLEUKIN" ble forberedt ved å tilsette 0.7 ml sterilt injeksjonsvann (SWF1) til hver ampulle (sluttkonsentrasjon 1.86 mg/ml). Fortynningene ble gjort som beskrevet for IL-2/N88R i D5W (Tabell 6). Dyrene ble avlivet på dag 11. Lungene ble fjernet, veid og vasket med PBS, og vevet overført til Bouin's løsning. 24 timer senere ble vevet overført til 10% formalin. Antall metastatiske kolonier i lungene ble talt under et disseksjonsmikroskop.
Tabell 7 viser antall metastaser som ble talt i enkeltmusene. En sammenlignbar effektivitet ble observert både for EL-2/N88R og "PROLEUKIN". I høydose-EL-2/N88R (gruppe 8,60 mg/kg) hadde alle unntatt en mus 12 metastaser eller færre, 3 av musene hadde ingen metastaser. Dette står i motsetning til den høyeste "PROLEUKIN"-dose som ble analysert, hvor alle overlevende mus hadde 12 metastaser eller flere. Signifikant (P<0.05) reduksjon av antall metastaser ble observert hos mus behandlet med EL-2/N88R i doser på 10, 30 og 60 mg/kg (gruppene 6,7 henholdsvis 8), og i gruppen behandlet med 10 mg/kg "PROLEUKIN" (gruppe 3). Disse resultater er vist grafisk i Figur 19. Verdiene er plottet ved å benytte logarytmen til dosen: for "PROLEUKIN" var dosene 3 og 10 mg/kg, for LL-2/N88R var dosene 1, 3,10, 30 og 60 mg/kg. Kurvetilpassing ved anvendelse av en ikke-lineær likning (4-parameters tilpasning) ga IC50-verdier på 5.2 mg/kg for "PROLEUKIN" og 10.9 mg/kg for EL-2/N88R.
Fra resultatene i dette eksperiment ble IC50 for reduksjon av metastasetallet for IL-2/N88R beregnet til 10.9 mg/kg (8.6-13.9 mg/kg ved 95% pålitelighet), og for "PROLEUKIN" 5.2 mg/kg (3.5-7.7 mg/kg ved 95% pålitelighet).
Overlevelse av musene er vist i Tabell 8.1 gruppen som fikk 10 mg/kg "PROLEUKIN" døde en (1) mus på dag 7 og ytterligere fem (5) på dag 8. En (1) mus døde på dag 8 i hver av gruppene som ble behandlet med 3 eller 10 mg/kg EL-2/N88R, og ingen dødsfall ble observert med hverken 1,30 eller 60 mg/kg EL-2/N88R. I tillegg var de fleste mus behandlet med 3 mg/kg "PROLEUKIN" og alle mus behandlet med 10 mg/kg "PROLEUKIN" døende, ingen sykelighet ble observert hos de EL-2/N88R-behandlede mus.
"PROLEUKJJST-behandlede dyr i begge grupper var døende. Ingen sykelighet ble observert hos noe EL-2/N88R-behandlet dyr.
I oppsummering tyder disse undersøkelser på at EL-2/N88R er like effektivt som "PROLEUKIN" når det gjelder å redusere tumorbyrden (mål som antall lungemetastaser i CT26-modellen). I tillegg ble EL-2/N88R vist å være vesentlig mindre toksisk enn
"PROLEUKIN".
Eksempel 9. Utvikling av stabile, høyt produserende CHO-cellelinjer som
uttrykker IL-2/N88R.
Stabile produksjonscellelinjer som utskiller store mengder av EL-2/N88R-muteinet ble viklet ved transfeksjon av CHO(dhfr)-celler med ekspresjonsvektoren vist i Figur 20 (ATCC deponeringsnummer ikke angitt). Enkeltelementene i IL-2/N88R-ekspresjonsvektoren er vist i plasmidkartet (Fig. 20). Dette viser CMVe/p = Cytomegalovirus tidlig promoter, PA = SV40 polyadenyleringssignalsekvens og DHFR = dihydrofolat reduktase ekspresjonskassett.
Vektoren ble konstruert ved anvendelse av standard rekombinant-DNA-teknikker. Se generelt Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. utgave 1989, Cold Spring Harbor Press; Short Protocols in Molecular Biologv. 2. utgave 1992, John Wiley & Sons; Methods in Enzymology bind 185, Ed. Goeddel et al., Academic Press, Inc., London, 1991. Ekspresjonsvektoren inneholder adskilte ekspresjonskassetter for EL2N88R-genet og det amplifiserbare og selekterbare gen DHFR (dihydrofolat reduktase). Tilnærmet 1 x IO<6 >CHO-celler (Kina-hamster ovarieceller) ble transfektert med 10 (xg pBCHL2SA ved anvendelse av Lipofektin-reagenser (Life Technology Inc., Bethesda, Maryland) ifølge produsentens instruksjoner. Cellene ble så selektert i nærvær av 50 nM metotreksat og dyrket i DME/F12 medium (Life Tehnologies, Inc.) uten tymidin og hypoksantin, tilsatt 5% dialysert fetalt bovint serum. Cellepopulasjonene ble analysert for EL2N88R-produksjon med et kommersielt ELISA-sett (R & D Systems). Populasjoner med høy produksjon ble videre selektert i medium som inneholdt økende konsentrasjoner av metotreksat (100 til 400 nM metotreksat) og analysert for EL2N88R-produksjon. Kloning ved grensefortynning ble så benyttet for avledning av kloner med høy og stabil produktivitet. Kloningen ble utført i fravær av metotreksat ved anvendelse av standard vevskulturteknikker.
Eksempel 10. Serumfri produksjon av IL-2/N88R i en perfusjonsbioreaktor.
Kontinuerlig produksjon av IL-2/N88R ble utført ved kontinuerlig perfusjons-fermentering. En Wheaton-fermentor på 19 liter ble inokulert med den stabile CHO-cellelinjen fra Eksempel 9 ved 2 x IO6 celler/ml og perfundert ved en mediumutbytningshastighet på 5 liter/dag. Produksjonsmediet var et DME/F12-bsert medium (Life Technologies, Inc. Rockville, MD) tilsatt rekombinant humant insulin (10 ug/ml) ("HUMULEN", Eli Lilly, Inc. Indianapolis, EN) og FeS04.EDTA (50 |xM). Celletettheten ble opprettholdt ved 4 x IO6 celler/ml. Det gjennomsnittlige daglige utbytte fra fermentoren var ~220 mg/dag. Produksjonen av EL-2/N88R ble stabilt opprettholdt i 30 dager.
Eksempel 11. Rensing av IL-2/N88R fremstilt i CHO-celler.
Følgende fremgangsmåte ble benyttt på perfusjonseluatet beskrevet ovenfor. Perfusjonsmediet ble høstet og påsatt en S-sefarose-kolonne. Kolonnen var ekvilibrert med 20 millimolar fosfatbuffer tilsatt 5 millimolar NaCl ved pH 7.0. Materialet som skulle påsettes kolonnen ("TCF") justeres til en ledningsevne på 4 millisiemens ved tilsetning av vann, og justeres til samme pH med fosforsyre.
Etter påsetting av TCF vaskes kolonnen med samme ekvilibreringsbuffer. Eluering oppnås ved en pH-endring. Muteinene ble eluert med 20 mM etanoloamin, pH 10.5 for awasking av muteinene fra kolonnen for fremstilling av S-eluatet.
Anionbytting ble utført ved å la S-eluatet passere gjennom enkolonne med QAE "Fast Flow"™ (Pharmacia) ekvilibrert med 10 mM bikarbonatbuffer ved pH 10.5. Gjennomstrømningshastigheten ble holdt ved 250 cm/time. Ettervask til grunnlinjenivå ble EL-2SA eluertmed 20 mM fosfat pH 4.0.
Hydroksyapatitt (HAP)-kromatografi ble utført ved å la det fortynnede QAE-eluat (1:1 med WFI) passere gjennom en kolonne pakket med keramisk hydroksyapatitt (Type TJ, Bio-Rad, Hercules, CA) ekvilibrert med 0.10 mM fosfat ved pH 7.0. Gjennomstrøm-ningshastigheten ble holdt ved 250 cm/timer. Etter vask til grunnlinjenivå ble IL-2SA eluert med 100 mM fosfat ved pH 7.0.
Hydroksyapatitteluatet ble ultrafiltrert til et volum på 300 ml med en Millipore Pelicon-2-enhet utstyrt med tre PES 5K-patroner (Millipore Corporation, Bedford, MA).
Det ultrafiltrerte HAP-eluat ble renset videre ved å la det passere gjennom en S100HR (Pharmacia) størrelseseksklusjonskolonne ved 35 cm/time. Kolonnen var ekvilibrert med 10 mM fosfat og 150 mM NaCl pH 7.0.
Den gelfiltrerte porsjon ble fortynnet med WFI til en ledningsevne på 4.0 mMhos/cm og ble igjen påsatt S-sefarose under de tidligere beskrevne betingelser. IL-2SA ble eluert med 10 mM fosfatbuffer tilsatt 1 molar NaCl ved pH 7.0.
Den endelige kationbytterporsjon ble dialysert mot fosfatbufret saltvann (PBS) over natten og fortynnet med sterilt PBS til en konsentrasjon på 6 mg/ml. Den endelige, fortynnede porsjon ble så sterilfiltrert, utporsjonert og nedfrosset ved -70°C. Totalutbyttet var 65%.
Andre utførelser av oppfinnelsen vil være åpenbare for en fagmann. Oppfinnelsen lærer hvordan man kan erholde muteiner som ikke spesifikt er beskrevet heri, men som gir T-celleaktivering som vist ved PHA-blastproliferasjon, og redusert NK-celleproliferasjon. Konseptet og den eksperimentelle tilnærming som er beskrevet heri bør være anvendbar for andre cytokiner som benytter heterologe, multimere reseptorsystemer, særlig de
beslektede cytokiner EL-7, EL-9 og IL-15, EL-10, interferon a, og interferon y.

Claims (13)

1. Polypeptid, karakterisert ved at det omfatter et humant interleukin-2 (EL-2) mutein nummerert i samsvar med villtype EL-2, hvori nevnte humane EL-2 mutein er substituert, i forhold til villtype, i minst en av posisjonene 20, 88 eller 126, hvor substitusjonen i posisjon 20 er valgt fra isoleucin eller histidin, og hvori substitusjonen i posisjon 88 er valgt fra arginin, isoleucin eller glysin, og hvori substitusjonen i posisjon 126 er leucin, hvorved nevnte humane EL-2 mutein selektivt aktiverer T-celler fremfor naturlige dreperceller.
2. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid ifølge krav 1 i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
3. Polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for polypeptidet ifølge krav 1, og degenererte varianter av dette.
4. Prokaryot vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med polynukleotidet ifølge krav 3.
5. Vektor, karakterisert ved at den omfatter polynukleotidet ifølge krav 3.
6. Anvendelse av et polypeptid ifølge krav 1, for fremstilling av et medikament for behandling av et pattedyr som lider av en tilstand som kan behandles med IL-2.
7. Anvendelse ifølge krav 6, hvori nevnte tilstand som kan behandles med IL-2 er valgt fra gruppen som består av HEV, cancer innbefattet nyrekarsinom og malignmelanom, autoimmune sykdommer, infeksiøse sykdommer, immundefisiens, innbefattet SCI, eller andre terapeutiske anvendelser som krever generell stimulering av immunsystemet.
8. Fremgangsmåte for utvelgelse av EL-2 muteiner som selektivt aktiverer T-celler fremfor naturlige dreperceller, karakterisert ved at nevnte EL-2 muteiner utvelges gjennom evaluering av analyser som anvender EL-2RaPy sammenlignet med EL-2RPy, hvori aktiviteten av et EL-2-mutein er forhøyet relativt til villtype-EL-2 i en analyse fremfor de andre.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved atEL-2RaPy og IL-2RPy er de individuelle reseptorsubenhetektodomener i egnede kombinasjoner, og benytts for direkte måling av binding av EL-2-muteiner til hvert av reseptorkompleksene.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert vedatEL-2RaPy-analysen benytter en respons fra en EL-2RaPy-bærende celletype og EL-2Py-analysen benytter en respons fra en EL-2Py-bærende celletype.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den EL-2RaPy-bærende celle er en PHA-blast og den EL-2Py-bærende celle er en NK-celle.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at analysen omfatter proliferasjon av både den IL-2apy-bærende celletype og den IL-2py-bærende celletype.
13. Anvendelse av et polypeptid som omfatter et humant interleukin-2 (IL-2) mutein nummerert i samsvar med villtype EL-2, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for å selektivt aktiverer T-celler fremfor naturlige dreperceller, hvori nevnte humane EL-2 mutein er substituert, i forhold til villtype, i minst en av posisjonene 20, 88 eller 126, hvor substitusjonen i posisjon 20 er valgt fra isoleucin eller histidin, og hvori substitusjonen i posisjon 88 er valgt fra arginin, isoleucin eller glysin, og hvori substitusjonen i posisjon 126 er leucin.
NO20005762A 1998-05-15 2000-11-14 IL-2- mutein, farmasoytisk preparat, polynukleotid, vektor, vertcelle, anvendelse samt fremgangsmate for utvelgelse av visse IL-2 muteiner. NO329235B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8008098A 1998-05-15 1998-05-15
PCT/US1999/010643 WO1999060128A1 (en) 1998-05-15 1999-05-13 Il-2 selective agonists and antagonists

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20005762D0 NO20005762D0 (no) 2000-11-14
NO20005762L NO20005762L (no) 2001-01-11
NO329235B1 true NO329235B1 (no) 2010-09-20

Family

ID=22155135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20005762A NO329235B1 (no) 1998-05-15 2000-11-14 IL-2- mutein, farmasoytisk preparat, polynukleotid, vektor, vertcelle, anvendelse samt fremgangsmate for utvelgelse av visse IL-2 muteiner.

Country Status (39)

Country Link
EP (1) EP1076704B1 (no)
JP (1) JP4276783B2 (no)
KR (1) KR100607609B1 (no)
CN (2) CN101319247B (no)
AR (1) AR020322A1 (no)
AT (1) ATE351907T1 (no)
AU (1) AU759697B2 (no)
BG (1) BG65139B1 (no)
BR (1) BRPI9910504B1 (no)
CA (1) CA2327349C (no)
CO (1) CO5070701A1 (no)
CU (2) CU23273B7 (no)
CY (1) CY1107533T1 (no)
CZ (1) CZ302071B6 (no)
DE (1) DE69934881T2 (no)
DK (1) DK1076704T3 (no)
DZ (1) DZ2788A1 (no)
ES (1) ES2281175T3 (no)
HK (1) HK1039963B (no)
HN (1) HN1999000075A (no)
HU (1) HU226142B1 (no)
IL (2) IL139136A0 (no)
MY (1) MY130274A (no)
NO (1) NO329235B1 (no)
NZ (1) NZ508098A (no)
PA (1) PA8472601A1 (no)
PE (1) PE20000475A1 (no)
PL (1) PL201675B1 (no)
PT (1) PT1076704E (no)
RO (1) RO122150B1 (no)
RU (1) RU2235729C2 (no)
SI (1) SI20643B (no)
SK (1) SK288100B6 (no)
SV (1) SV1999000061A (no)
TN (1) TNSN99090A1 (no)
TR (1) TR200003354T2 (no)
TW (1) TWI223663B (no)
UA (1) UA73719C2 (no)
WO (1) WO1999060128A1 (no)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6566500B1 (en) 1999-03-30 2003-05-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for modifying toxic effects of proteinaceous compounds
EP1935431A3 (en) 2000-05-15 2008-08-13 Health Research, Inc. Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2
US6689353B1 (en) * 2000-06-28 2004-02-10 Bayer Pharmaceuticals Corporation Stabilized interleukin 2
US7723102B2 (en) * 2000-09-28 2010-05-25 Bayer Corporation Enhanced transfection system
MY139948A (en) * 2000-09-28 2009-11-30 Bayer Corp Enhanced transfection system
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
PT1454138E (pt) * 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
DE602004031341D1 (de) 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
ES2359473T3 (es) * 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
EP1694360B1 (en) 2003-11-04 2010-08-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection
JP5744369B2 (ja) * 2004-02-27 2015-07-08 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ＩＬ１５−Ｒα用ＩＬ−１５結合部位およびアゴニスト／アンタゴニスト活性を有する特異的ＩＬ−１５突然変異体
RU2006135112A (ru) * 2004-03-05 2008-04-10 Чирон Корпорейшн (Us) Тест-система in vitro для прогнозирования устойчивости пациента к терапевтическим средствам
WO2009061853A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
CN101244261B (zh) * 2008-03-10 2010-09-15 山东大学 一种含未复性重组蛋白的生物制剂及其制备方法与应用
DE102008023820A1 (de) * 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
CN102101885B (zh) * 2010-09-01 2013-06-05 南京发士达生物科技有限公司 低诱导抑制性t细胞的人白细胞介素ⅱ突变体及其用途
PT2637694T (pt) 2010-11-12 2021-05-05 Nektar Therapeutics Conjugados de uma fração de il-2 e um polímero
CU23923B1 (es) * 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
US9428567B2 (en) 2010-12-22 2016-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antagonists of interleukin-2 receptor
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
WO2012119093A1 (en) * 2011-03-03 2012-09-07 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
EP3049445A4 (en) 2013-09-24 2017-10-25 Medicenna Therapeutics, Inc. Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
MA39250B1 (fr) 2014-02-06 2018-09-28 Hoffmann La Roche Protéines hybrides de l'interleukine-2 et leurs utilisations
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CA2946398A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
SG11201700629TA (en) * 2014-08-11 2017-02-27 Delinia Inc Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
WO2017201432A2 (en) * 2016-05-19 2017-11-23 Jounaidi Youssef Tethered interleukin-2 to its receptor il-2rbeta, a platform to enhance natural killer and regulatory t cell activity
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
EP3475413B1 (en) 2016-06-22 2024-02-14 David Klatzmann Genetically modified t lymphocytes
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US11077172B2 (en) 2016-11-08 2021-08-03 Delinia, Inc. IL-2 variants for the treatment of psoriasis
BR112019011799B1 (pt) * 2016-12-13 2021-12-21 Delinia, Inc Proteína de fusão, proteína dimérica e composição farmacêutica
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
CA3064435A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
JOP20190271A1 (ar) * 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
US11542312B2 (en) 2017-06-19 2023-01-03 Medicenna Therapeutics, Inc. IL-2 superagonists in combination with anti-PD-1 antibodies
US20200181220A1 (en) * 2017-08-03 2020-06-11 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
US20200299349A1 (en) * 2017-11-21 2020-09-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partial agonists of interleukin-2
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
EP3752178A1 (en) 2018-02-16 2020-12-23 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating sjögren's syndrome
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
AU2019246389A1 (en) 2018-03-28 2020-08-27 Ascendis Pharma Oncology Division A/S IL-2 conjugates
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
CA3106858A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Il2 agonists
WO2020035482A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
MX2020007072A (es) * 2018-09-17 2020-11-11 Gi Innovation Inc Proteina de fusion que comprende proteina il-2 y proteina cd80 y uso de la misma.
TW202034945A (zh) 2018-12-21 2020-10-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種人白細胞介素２變體或其衍生物
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
TW202115105A (zh) * 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
MX2022001866A (es) * 2019-08-13 2022-03-11 Amgen Inc Muteinas de interleucina-2 para la expansion de celulas t reguladoras.
JP2023505590A (ja) 2019-12-12 2023-02-09 イルトゥー・ファルマ インターロイキン２キメラ構築物
CA3162705A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Amgen Inc. Dual interleukin-2 /tnf receptor agonist for use in therapy
US11633488B2 (en) 2020-01-10 2023-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
KR102653906B1 (ko) 2020-01-14 2024-04-03 신테카인, 인크. 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물
KR20220155316A (ko) 2020-03-19 2022-11-22 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 인터루킨-2 돌연변이 및 이의 용도
AR121713A1 (es) 2020-03-31 2022-06-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Nuevos análogos de il-2 inmunoestimulantes
EP4161956A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 sequences and uses thereof
CN114507643A (zh) * 2020-10-29 2022-05-17 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-2的多能干细胞衍生物及应用
KR20230097094A (ko) 2020-10-29 2023-06-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 질환의 치료를 위한 융합 단백질
CN113308477A (zh) * 2021-04-08 2021-08-27 华南农业大学 一种鸭il-2基因真核表达重组质粒及其制备方法
TW202320862A (zh) 2021-09-22 2023-06-01 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 介白素２突變體以及其融合蛋白
WO2023057588A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Iltoo Pharma Interleukin 2 chimeric constructs with targeting specificy to inflamed tissues
CN114875069B (zh) * 2022-04-22 2023-09-15 四川大学 基因工程修饰的il2细胞因子的重组载体、宿主细胞及其用途
WO2023245097A2 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Cephalon Llc Anti-pd-1 antibody-attenuated il-2 immunoconjugates and uses thereof
WO2024056154A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
FR3140287A1 (fr) 2022-10-03 2024-04-05 Arkema France Procede de granulation de composes azoiques et granules obtenus

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5696234A (en) * 1994-08-01 1997-12-09 Schering Corporation Muteins of mammalian cytokine interleukin-13

Also Published As

Publication number Publication date
RU2235729C2 (ru) 2004-09-10
DZ2788A1 (fr) 2003-12-01
BRPI9910504B1 (pt) 2016-08-09
KR100607609B1 (ko) 2006-08-02
BG104929A (en) 2001-09-28
PE20000475A1 (es) 2000-07-07
CO5070701A1 (es) 2001-08-28
NO20005762L (no) 2001-01-11
DK1076704T3 (da) 2007-03-12
TR200003354T2 (tr) 2001-03-21
CA2327349A1 (en) 1999-11-25
WO1999060128A1 (en) 1999-11-25
EP1076704A1 (en) 2001-02-21
PT1076704E (pt) 2007-02-28
RO122150B1 (ro) 2009-01-30
CN101319247B (zh) 2012-12-12
UA73719C2 (en) 2005-09-15
SK17242000A3 (sk) 2001-07-10
CA2327349C (en) 2010-10-26
SV1999000061A (es) 2000-03-14
HU226142B1 (en) 2008-05-28
TWI223663B (en) 2004-11-11
SI20643B (sl) 2008-02-29
KR20010043602A (ko) 2001-05-25
CZ20004213A3 (en) 2001-05-16
MY130274A (en) 2007-06-29
HUP0101948A2 (hu) 2001-09-28
TNSN99090A1 (fr) 2005-11-10
PA8472601A1 (es) 2000-09-29
ES2281175T3 (es) 2007-09-16
PL201675B1 (pl) 2009-04-30
IL139136A0 (en) 2001-11-25
DE69934881D1 (de) 2007-03-08
CN100366742C (zh) 2008-02-06
CN1309705A (zh) 2001-08-22
HN1999000075A (es) 1999-09-29
CY1107533T1 (el) 2013-03-13
AU759697B2 (en) 2003-04-17
PL344407A1 (en) 2001-11-05
EP1076704B1 (en) 2007-01-17
CZ302071B6 (cs) 2010-09-29
JP4276783B2 (ja) 2009-06-10
BR9910504A (pt) 2001-01-09
CN101319247A (zh) 2008-12-10
SI20643A (sl) 2002-02-28
CU23273B7 (es) 2008-04-09
AR020322A1 (es) 2002-05-08
NO20005762D0 (no) 2000-11-14
CU23272A1 (es) 2008-04-09
ATE351907T1 (de) 2007-02-15
HUP0101948A3 (en) 2003-08-28
IL139136A (en) 2009-05-04
DE69934881T2 (de) 2007-11-08
HK1039963A1 (en) 2002-05-17
HK1039963B (zh) 2008-09-05
AU4078499A (en) 1999-12-06
JP2002515247A (ja) 2002-05-28
NZ508098A (en) 2003-09-26
SK288100B6 (sk) 2013-07-02
BG65139B1 (bg) 2007-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO329235B1 (no) IL-2- mutein, farmasoytisk preparat, polynukleotid, vektor, vertcelle, anvendelse samt fremgangsmate for utvelgelse av visse IL-2 muteiner.
US6955807B1 (en) IL-2 selective agonists and antagonists
EP2382228B1 (en) Compositions and methods of treating inflammatory and autoimmune diseases
US7960514B2 (en) IL-7 fusion proteins
US7875709B2 (en) Nucleic acids encoding interleukin-18 mutants
US6319691B1 (en) Fusion proteins comprising IFN-alpha2b and TM-alpha1
US20020150555A1 (en) Osteoclastgenic inhibitory agent
MXPA00010943A (en) Il-2 selective agonists and antagonists
JP3689111B2 (ja) インターロイキン１５

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired