TWI825020B - 抗體-細胞激素植入之蛋白質及使用於免疫相關病症之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗體-細胞激素植入之蛋白質，其結合至高親和力介白素受體並經由該受體刺激細胞內信號傳導。該等抗體-細胞激素植入之蛋白質可用於增強抗發炎細胞反應並減小促發炎效應以治療、改善及預防免疫相關病症，例如1型糖尿病。

Description

抗體-細胞激素植入之蛋白質及使用於免疫相關病症之方法
本發明係關於結合至介白素-2 (IL2)高親和力受體之抗體-細胞激素植入之蛋白質及治療自體免疫及免疫相關病症之方法。
IL2係於1983年首次選殖(Taniguchi等人，Nature 1983, 302:305-310；Devos等人，Nucleic Acid Res.1983, 11(13):4307-4323；Maeda等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1983, 115:1040-1047)。IL2蛋白具有153個胺基酸之長度且信號肽為胺基酸1-20，並摺疊成4個逆平行、兩親性α-螺旋之結構(Smith K.A., Science 1988, 240:1169-1176)。
IL2藉由經由高親和力或低親和力受體之信號傳導來調介其生物效應(Kreig等人，PNAS 2010, 107(26)11906-11911)。高親和力受體係三聚體，其由IL2-Rα (CD25)、IL2-Rβ (CD122)及IL2-Rγ (CD132)組成。低親和力受體係二聚體，其僅由IL2-Rβ(CD122)及IL2-Rγ(CD132)鏈組成。低親和力受體結合IL2，但親和力小於三聚體、高親和力受體10-100倍，從而指示IL2-Rα (CD25)對於增加親和力較為重要，但其並非信號傳導組分(Kreig等人，見上文)。IL2受體之表現亦有所不同。高親和力IL2受體表現於經活化T細胞及CD4+/Foxp3+ T調控細胞(Treg)上。與之相比，低親和力IL2受體發現於CD8+ T記憶細胞、T常規細胞(Tcon)及天然殺手細胞(NK)。
重組IL2 (rhIL2)最早在1992年批准用於臨床使用(Coventry等人，Cancer Mgt Res. 2012 4:215-221)。Proleukin® (阿地介白素(Aldesleukin))係改質IL2，其無醣基化，缺乏N-末端丙胺酸且在胺基酸125處具有絲胺酸以代替半胱胺酸(C125S)。Proleukin®最初指定作為用於惡性黑色素瘤及腎細胞癌之療法，但已用於其他癌症類型(例如結腸直腸癌、乳癌、肺癌及間皮瘤) (Coventry等人，見上文)。涵蓋259名自1986年至2006年之腎細胞癌患者之研究發現，23名患者具有完整反應且30名具有部分反應(Klapper等人，Cancer 2008 113(2):293-301)。此結果得到20%之整體目標反應率，其中7%之腎細胞癌症患者具有完整腫瘤消退(Klapper等人，見上文)。
然而，癌症之IL2治療並非沒有不良效應。259名患者研究注意到毛細管/血管滲漏、血管舒張及少尿。亦存在3級及4級感染，其皆係導管及全身感染且歸因於嗜中性球功能障礙(Klapper等人，見上文)。Proleukin®文獻指出，Proleukin®與自體免疫疾病及免疫相關病症(例如克羅恩氏病(Crohn's Disease)、硬皮症、甲狀腺炎、發炎性關節炎、糖尿病、眼球型重症肌無力、新月體性IgA腎小球性腎炎、膽囊炎、腦血管炎、史蒂芬-強森症候群(Stevens-Johnson syndrome)及大皰性類天皰瘡)之加重有關。
已發現，Treg細胞組成型表現高親和力IL2受體且其存活及功能依賴於IL2，此使得著眼於IL2以作為刺激Treg細胞之方式(D’Cruz等人，Nat. Immuno. 2005, 6:1152-1159)。已展示，低劑量IL2可安全且有效地治療I型糖尿病患者(Hartemann等人，Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1:295-305)。C型肝炎病毒誘導血管炎(Saadoun等人，N. Eng. J. Med. 2011, 365:2067-2077)及慢性移植物抗宿主病(Koreth等人，N. Eng. J. Med. 2011 365:2055-2066)。然而，IL2在身體中具有極短半衰期，從而需要多個投與。此可闡釋，需要經由高親和力受體選擇性刺激Treg且對IL2低受體具有減小之活性並具有改良之藥物動力學之IL2治療劑。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年5月24日提出申請之美國臨時申請案第62/510,514號之權益，該臨時申請案之全部內容以引用方式併入本文中。序列表
本申請案含有以ASCII格式以電子方式提交之序列表且其全部內容以引用方式併入本文中。該ASCII拷貝在2018年3月30日創建，命名為PAT056491-WO-PCT_SL.txt且大小為115,255個字節。
本發明提供在抗體CDR序列中植入IL2分子之抗體-細胞激素植入之蛋白質，該等蛋白質較臨床中已知及使用之分子具有較佳治療特徵。特定而言，所提供抗體-細胞激素植入之蛋白質增加或維持Treg活性且並不增加CD8+ T細胞、Tcon或NK細胞之活性。另外，較重組人類IL2調配物(例如Proleukin®)，所提供組合物可改良半衰期、穩定性及可產生性。該等組合物之較佳性質使得產生優於先前用於臨床中或闡述於文獻中者之治療組合物。舉例而言，本文所揭示之一些實施例提供與IL2低親和力受體相比較佳地結合至IL2高親和力受體並經由該IL2高親和力受體來促進信號傳導之抗體-細胞激素植入之蛋白質。本文所揭示之一些實施例提供與CD8+ T細胞、Tcon或NK細胞相比較佳地活化Treg之抗體-細胞激素植入之蛋白質。
本發明實施例提供包括以下之抗體-細胞激素植入之蛋白質：(a)重鏈可變區(VH)，其包括互補決定區(CDR) HCDR1、HCDR2、HCDR3；及 (b)輕鏈可變區(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及 (c)介白素2 (IL2)分子，其植入VH或VL之CDR中。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括植入重鏈CDR中之IL2分子。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中將IL2分子植入選自互補決定區1 (HCDR1)、互補決定區2 (HCDR2)或互補決定區3 (HCDR3)之區域中。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括植入HCDR1中之IL2分子。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括植入輕鏈CDR中之IL2分子。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中將IL2分子植入選自互補決定區1 (LCDR1)、互補決定區2 (LCDR2)及互補決定區3 (LCDR3)之區域中。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括含有減小IL2分子與低親和力IL2受體之親和力之突變之IL2分子。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質刺激大於天然IL2或Proleukin®之Treg細胞增殖。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質刺激小於天然IL2或Proleukin®之CD8 T效應物增殖。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質具有長於天然IL2或Proleukin®之半衰期。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中IL2分子由SEQ ID NO:4組成。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中IL2分子由SEQ ID NO:6組成。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括IgG種類抗體重鏈。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中IgG種類抗體重鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體CDR之結合特異性由所植入IL2分子減小。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體CDR之結合特異性在所植入IL2分子存在下得以保留。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體CDR之結合特異性不同於IL2分子之結合特異性。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體可變結構域之結合特異性係針對非人類抗原。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中非人類抗原係病毒。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中病毒係呼吸道融合病毒(RSV)。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中RSV係選自RSV亞群A及RSV亞群B。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質之抗體支架部分係人類化或人類部分。
本發明實施例提供包括以下之抗體-細胞激素植入之蛋白質：(i)重鏈可變區，其包括：(a) SEQ ID NO: 17之HCDR1，(b) SEQ ID NO:18之HCDR2，(c) SEQ ID NO:19之HCDR3；及輕鏈可變區，其包括：(d) SEQ ID NO:30之LCDR1，(e) SEQ ID NO:31之LCDR2，及(f) SEQ ID NO:32之LCDR3； (ii)重鏈可變區，其包括：(a) SEQ ID NO:43之HCDR1，(b) SEQ ID NO:44之HCDR2，(c) SEQ ID NO:45之HCDR3；及輕鏈可變區，其包括：(d) SEQ ID NO:56之LCDR1，(e) SEQ ID NO:57之LCDR2，及(f) SEQ ID NO:58之LCDR3； (iii)重鏈可變區，其包括：(a) SEQ ID NO:69之HCDR1，(b) SEQ ID NO:70之HCDR2，(c) SEQ ID NO:71之HCDR3；及輕鏈可變區，其包括：(d) SEQ ID NO:82之LCDR1，(e) SEQ ID NO:83之LCDR2，及(f) SEQ ID NO:84之LCDR3；或 (iv)重鏈可變區，其包括：(a) SEQ ID NO:95之HCDR1，(b) SEQ ID NO:96之HCDR2，(c) SEQ ID NO:97之HCDR3；及輕鏈可變區，其包括：(d) SEQ ID NO:108之LCDR1，(e) SEQ ID NO:109之LCDR2，及(f) SEQ ID NO:110之LCDR3。
本發明實施例提供包括以下之抗體-細胞激素植入之蛋白質：(i)包括SEQ ID NO:20之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO: 33之輕鏈可變區(VL)； (ii)包括SEQ ID NO:46之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO: 59之輕鏈可變區(VL)； (iii)包括SEQ ID NO:72之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO: 85之輕鏈可變區(VL)；或 (iv)包括SEQ ID NO:98之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO: 111之輕鏈可變區(VL)。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中該抗體包括對應於減小之效應功能之經修飾Fc區。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中經修飾Fc區包括選自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A及L235A中之一或多者之突變。
抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中經修飾Fc區包括選自D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之一或多者之突變組合。
本發明實施例提供抗體-細胞激素植入之蛋白質，該等蛋白質包括SEQ ID NO: 17之HCDR1、SEQ ID NO:18之HCDR2、SEQ ID NO:19之HCDR3、SEQ ID NO:30之LCDR1、SEQ ID NO:31之LCDR2、SEQ ID NO:32之LCDR3、含有突變D265A/P329A之經修飾Fc區，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質之Treg細胞活化性大於Proleukin®。
本發明實施例提供抗體-細胞激素植入之蛋白質，該等蛋白質包括SEQ ID NO: 43之HCDR1、SEQ ID NO:44之HCDR2、SEQ ID NO:45之HCDR3、SEQ ID NO:56之LCDR1、SEQ ID NO:57之LCDR2、SEQ ID NO:58之LCDR3、含有突變D265A/P329A之經修飾Fc區，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質之Treg細胞活化性大於Proleukin®。
本發明實施例提供抗體-細胞激素植入之蛋白質，該等蛋白質包括SEQ ID NO: 69之HCDR1、SEQ ID NO:70之HCDR2、SEQ ID NO:71之HCDR3、SEQ ID NO:82之LCDR1、SEQ ID NO:83之LCDR2、SEQ ID NO:84之LCDR3、含有突變D265A/P329A之經修飾Fc區，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質之Treg細胞活化性大於Proleukin®。
本發明實施例提供抗體-細胞激素植入之蛋白質，該等蛋白質包括SEQ ID NO: 95之HCDR1、SEQ ID NO:96之HCDR2、SEQ ID NO:97之HCDR3、SEQ ID NO:108之LCDR1、SEQ ID NO:109之LCDR2、SEQ ID NO:110之LCDR3、含有突變D265A/P329A之經修飾Fc區，其中抗體-細胞激素植入之蛋白質之Treg細胞活化性大於Proleukin®。
本發明實施例提供經分離核酸，其編碼包括以下之抗體-細胞激素植入之蛋白質：(i) SEQ ID NO:23之重鏈及SEQ ID NO:36之輕鏈； (ii) SEQ ID NO:49之重鏈及SEQ ID NO:62之輕鏈； (iii) SEQ ID NO:75之重鏈及SEQ ID NO:88之輕鏈；或 (iv) SEQ ID NO:101之重鏈及SEQ ID NO:114之輕鏈。
本發明實施例提供適於產生抗體-細胞激素植入之蛋白質之重組宿主細胞，該等重組宿主細胞包括本文所揭示編碼蛋白質之重鏈及輕鏈多肽之核酸及視情況分泌信號。
重組宿主細胞，其係哺乳動物細胞系。
本發明實施例提供包括抗體-細胞激素植入之蛋白質及一或多種醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。
本發明實施例提供治療有需要之個體之免疫相關病症之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質或醫藥組合物。
在該方法中，免疫相關病症係選自由以下組成之群：1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、白斑病、慢性移植物抗宿主病(cGvHD)、預防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV誘導之血管炎、斑禿、全身性硬化症、侷限性硬皮病及原發性抗磷脂症候群。
在該方法中，組合投與抗體-細胞激素植入之蛋白質或醫藥組合物與另一治療劑。
在該方法中，治療劑係另一抗體-細胞激素植入之蛋白質。
本發明實施例提供擴增有需要之患者中之Treg細胞之方法，其包括向患者投與抗體-細胞激素植入之蛋白質或醫藥組合物。
在該方法中，Treg細胞發生擴增且CD8 T效應細胞未發生擴增。
在該方法中，Treg細胞發生擴增且NK細胞未發生擴增。
在該方法中，組合投與抗體-細胞激素植入之蛋白質或醫藥組合物與另一治療劑。
在該方法中，治療劑係另一抗體-細胞激素植入之蛋白質。
本發明實施例提供用作治療劑之抗體-細胞激素植入之蛋白質。
在該用途中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括： (i)重鏈可變區，其包括(a) SEQ ID NO: 17之HCDR1，(b) SEQ ID NO:18之HCDR2，(c) SEQ ID NO:19之HCDR3；及輕鏈可變區，其包括(d) SEQ ID NO:30之LCDR1，(e) SEQ ID NO:31之LCDR，及(f) SEQ ID NO:32之LCDR3；及(ii)重鏈可變區，其包括(a) SEQ ID NO:43之HCDR1，(b) SEQ ID NO:44之HCDR2，(c) SEQ ID NO:45之HCDR3；及輕鏈可變區，其包括：(d) SEQ ID NO:56之LCDR1，(e) SEQ ID NO:57之LCDR2，及(f) SEQ ID NO:58之LCDR3，且用於治療免疫相關病症。
在該用途中，該免疫相關病症係選自由以下組成之群：1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、白斑病、慢性移植物抗宿主病(cGvHD)、預防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV誘導之血管炎、斑禿、全身性硬化症、侷限性硬皮病及原發性抗磷脂症候群。
在該用途中，組合投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與另一治療劑。
本發明實施例提供本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質之用途，其用以製造用於治療有需要之個體之免疫相關病症之藥劑。
在該用途中，該免疫相關病症係選自由以下組成之群：1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、白斑病、慢性移植物抗宿主病(cGvHD)、預防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV誘導之血管炎、斑禿、全身性硬化症、侷限性硬皮病及原發性抗磷脂症候群。
在某些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IgG種類抗體Fc區。在特定實施例中，免疫球蛋白係選自IgG1、IgG2或IgG4子類Fc區。抗體、抗體片段或抗原結合分子視情況含有至少一種調節(亦即增加或降低)抗體或抗體片段與Fc受體之結合之修飾。免疫球蛋白重鏈可視情況包括賦予經修飾效應功能之修飾。在特定實施例中，免疫球蛋白重鏈可包括減小效應功能之選自以下中之任一者之突變：D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A。
抗體-細胞激素植入之蛋白質亦在分子之IL2部分中包括變化。該等變化可為單一胺基酸變化、單一胺基酸缺失、多個胺基酸變化及多個胺基酸缺失。分子之IL2細胞激素部分中之該等變化可降低細胞激素植入之蛋白質對低親和力IL2受體的親和力。
另外，本發明提供至少編碼如本文所闡述抗體-細胞激素植入之蛋白質之重鏈及/或輕鏈蛋白質之多核苷酸。在另一相關態樣中，本發明另外提供適於產生如本文所闡述之抗體-細胞激素植入之蛋白質之宿主細胞。在特定實施例中，宿主細胞包括編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之輕鏈及/或重鏈多肽之核酸。在再一態樣中，提供產生抗體-細胞激素植入之蛋白質之方法，該等方法包括在適於表現、形成及分泌抗體-細胞激素植入之蛋白質之條件下培養如本文所闡述之所提供宿主細胞，及自培養物回收抗體-細胞激素植入之蛋白質。在另一態樣中，本發明另外提供包括如本文所闡述之抗體-細胞激素植入之蛋白質之套組。
在另一相關態樣中，本發明另外提供組合物，該等組合物包括如本文所闡述之抗體-細胞激素植入之蛋白質及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，本發明提供投與個體之包括抗體-細胞激素植入之蛋白質之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供治療有需要之個體之免疫相關病症之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如本文所闡述之抗體-細胞激素植入之蛋白質。在另一態樣中，本發明提供一種抗體-細胞激素植入之蛋白質，其用於治療或預防個體之免疫相關病症。
在一些實施例中，患者患有免疫相關病症，例如1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、白斑病、慢性移植物抗宿主病(cGvHD)、預防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV誘導之血管炎、斑禿、全身性硬化症、侷限性硬皮病及原發性抗磷脂症候群。對於一些適應症而言，共投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與類固醇(例如甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)、氫化可體松(hydrocortisone)、普賴松(prednisone)、普賴蘇濃(prednisolone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone))。定義
「抗體」係指包括四聚體結構單元之免疫球蛋白家族分子。每一四聚體由兩個相同多肽鏈對構成，每一對具有一條「輕鏈」 (約25 kDa)及一條「重鏈」 (約50 kDa-70 kDa)，此二者經由二硫鍵連結。所識別免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因以及眾多免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其繼而分別定義免疫球蛋白種類IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。抗體可具有任何同型/種類(例如IgG、IgM、IgA、IgD及IgE)或任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。
將輕鏈及重鏈分成具有結構及功能同源性之區域。術語「恆定」及「可變」係以結構及功能形式使用。每一鏈之N-末端定義主要負責抗原識別之具有約100至110或更多個胺基酸之可變(V)區或結構域。術語可變輕鏈(VL )及可變重鏈(VH )分別係指輕鏈及重鏈之該等區域。VH 及VL 之配對一起形成單一抗原結合位點。除V區外，重鏈及輕鏈亦含有恆定(C)區或結構域。分泌形式之免疫球蛋白C區係由三個C結構域CH1、CH2、CH3及視情況CH4 (Cμ)以及鉸鏈區構成。膜結合形式之免疫球蛋白C區亦具有膜及細胞內結構域。每一輕鏈在N-末端具有VL ，隨後在其另一端具有恆定結構域(C)。輕鏈(CL)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定結構域賦予重要生物性質，例如分泌、經胎盤運動性、Fc受體結合、補體結合及諸如此類。按照慣例，恆定區結構域之編號隨著其變得更加遠離抗體之抗原結合位點或胺基-末端而增加。N-末端係可變區且C-末端係恆定區；CH3及CL結構域實際上分別包括重鏈及輕鏈之羧基-末端結構域。VL與VH對準且CL與重鏈之第一恆定結構域對準。如本文中所使用，「抗體」涵蓋習用抗體結構及抗體變化形式。因此，此概念包括抗體-細胞激素植入之蛋白質、全長抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及其抗體片段。
抗體以完整免疫球蛋白鏈形式存在，或或以諸多藉由使用各種肽酶消解所產生之充分表徵之抗體片段形式存在。本文所用之術語「抗體片段」係指抗體中保留6個CDR之一或多個部分。因此，舉例而言，胃蛋白酶消解抗體鉸鏈區中二硫化物鍵聯以下之部分以產生F(ab)’2 (Fab’二聚體，Fab’本身係藉由二硫鍵接合至VH -CH 1之輕鏈)。F(ab)’2 可在溫和條件下發生還原以斷裂鉸鏈區中之二硫化物鍵聯，由此將F(ab)’2 二聚體轉化成Fab’單體。Fab’單體基本上係具有一部分鉸鏈區之Fab (Paul等人，Fundamental Immunology ，第3版(1993))。儘管各種抗體片段係針對完整抗體之消解來定義，但熟習此項技術者應瞭解，該等片段可以化學方式或藉由使用重組DNA方法重新合成。如本文中所使用，「抗體片段」係指一或多個保留結合特異性及功能活性之抗體部分，其係藉由修飾全抗體產生，或使用重組DNA方法重新合成。抗體片段之實例包含Fv片段、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab'、Fd (Vh及CH1結構域)、dAb (Vh及經分離CDR)及具有相同結合特異性之該等片段(例如F(ab')2, )之多聚體形式。抗體-細胞激素植入之蛋白質亦可包括達成期望結合特異性及活性所需之抗體片段。
上下文中所用之「Fab」結構域包括重鏈可變結構域、恆定區CH1結構域、輕鏈可變結構域及輕鏈恆定區CL結構域。結構域之相互作用係藉由CH1結構域與CL結構域之間之二硫鍵來穩定。在一些實施例中，Fab之重鏈結構域自N-末端至C-末端依次為VH-CH且Fab之輕鏈結構域自N-末端至C-末端依次為VL-CL。在一些實施例中，Fab之重鏈結構域自N-末端至C-末端依次為CH-VH且Fab之輕鏈結構域依次為CL-VL。儘管過去藉由完整免疫球蛋白之木瓜酶消解來鑑別Fab片段，但「Fab」通常係以重組方式藉由任一方法來產生。每一Fab片段關於抗原結合為單價，亦即，其具有單一抗原結合位點。
「互補決定結構域」或「互補決定區」 (「CDR」)可互換地係指VL 及VH 之超變區。CDR係抗體鏈中具有用於該靶蛋白之特異性之靶蛋白結合位點。在每一人類VL 或VH 中存在三個CDR (CDR1-3，自N-末端依次編號)，其構成約15-20%之可變結構域。CDR在結構上與靶蛋白之表位互補且由此直接負責結合特異性。VL 或VH 之剩餘片段(所謂的框架區(FR))展現較小之胺基酸序列變化(Kuby, Immunology，第4版，第4章. W.H. Freeman & Co., New York, 2000)。
可使用業內之各種熟知定義(例如Kabat、Chothia及AbM)來確定CDR及框架區之位置(例如參見Kabat等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號；Johnson等人，Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)；Chothia及Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)；Chothia等人，Nature, 342:877-883 (1989)；Chothia等人，J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997))。抗原組合位點之定義亦闡述於下列文獻中：Ruiz等人，Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)；及Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)；(ImMunoGenTics (IMGT) numbering) Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P.等人，Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)；MacCallum等人，J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)；及Martin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)；Martin等人，Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)；及Rees等人，In Sternberg M.J.E. (編輯), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
在Kabat下，VH 中之CDR胺基酸殘基編號為31-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且VL 中之CDR胺基酸殘基編號為24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)。在Chothia下，VH 中之CDR胺基酸編號為26-32 (HCDR1)、52-56 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且VL 中之胺基酸殘基編號為26-32 (LCDR1)、50-52 (LCDR2)及91-96 (LCDR3)。藉由組合Kabat及Chothia二者之CDR定義，CDR係由人類VH中之胺基酸殘基26-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)以及人類VL中之胺基酸殘基24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)組成。
本文所用之「抗體可變輕鏈」或「抗體可變重鏈」係指分別包括VL 或VH 之多肽。內源性VL 係由基因區段V (可變)及J (接合)編碼，且內源性VH 係由V、D (多樣性)及J編碼。VL 或VH 中之每一者包含CDR以及框架區(FR)。術語「可變區」或「V-區」可互換地係指包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之重鏈或輕鏈。V-區可為天然、重組或合成之區域。在本申請案中，抗體輕鏈及/或抗體重鏈可通稱為「抗體鏈」。如本文所提供及另外所闡，「抗體可變輕鏈」或「抗體可變重鏈」及/或「可變區」及/或「抗體鏈」視情況包括納入CDR中之細胞激素多肽序列。
本文之免疫球蛋白重鏈之C-末端部分(包括(例如) CH2及CH3結構域)係「Fc」結構域。本文所用之「Fc區」係指排除第一恆定區(CH1)免疫球蛋白結構域之抗體恆定區。Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白結構域及IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白結構域以及該等結構域之撓性鉸鏈N-末端。對於IgA及IgM，Fc可包含J鏈。對於IgG，Fc包括免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3及Cγ1與Cγ之間之鉸鏈。業內應理解，Fc區之邊界可有所變化，然而，使用根據EU索引之編號(Kabat等人，1991, NIH公開案91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)，人類IgG重鏈Fc區通常經定義以包括殘基C226或P230至其羧基末端。「Fc區」可係指孤立之此區域或抗體或抗體片段背景中之此區域。「Fc區」在(例如) CH2及CH3區中包含Fc區之天然等位基因變體，該等變體包含(例如)調節效應功能之修飾。Fc區亦包含並不改變生物功能之變體。舉例而言，一或多個胺基酸自免疫球蛋白之Fc區之N-末端或C-末端缺失且並不實質上損失生物功能。舉例而言，在某些實施例中，C-末端離胺酸經修飾、代替或去除。在特定實施例中，改變或去除Fc區中之一或多個C-末端殘基。在某些實施例中，Fc中之一或多個C-末端殘基(例如末端離胺酸)缺失。在某些其他實施例中，Fc中之一或多個C-末端殘基經替代胺基酸取代(舉例而言，末端離胺酸經代替)。該等變體根據業內已知之一般規則來選擇以對活性具有最小效應(例如參見Bowie等人，Science 247:306-1310, 1990)。Fc結構域係免疫球蛋白(Ig)中由細胞受體(例如FcR)識別且與補體活化蛋白C1 q結合之部分。下鉸鏈區(其編碼於CH2外顯子之5'部分中)提供抗體內結合至FcR受體之撓性。
「嵌合抗體」係如下抗體分子：其中(a)恆定區或其部分發生改變、代替或交換，從而抗原結合位點(可變區)連接至不同或改變之種類、效應功能及/或物種之恆定區或賦予嵌合抗體新性質之完全不同分子(例如酶、毒素、激素、生長因子及藥物)；或(b)可變區或其部分經具有不同或改變之抗原特異性之可變區改變、代替或交換。
「人類化」抗體係保留非人類抗體之反應性(例如結合特異性、活性)同時在人類中具有較小免疫原性之抗體。舉例而言，此可藉由保留非人類CDR區並使用人類對應體代替剩餘抗體部分來達成。例如參見 Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984)；Morrison及Oi,Adv. Immuno l. , 44:65-92 (1988)；Verhoeyen等人，Science , 239:1534-1536 (1988)；Padlan,Molec. Immun. , 28:489-498 (1991)；Padlan,Molec. Immun. , 31(3):169-217 (1994)。
「人類抗體」包含具有可變區之抗體，在該等可變區中框架區及CDR區二者皆衍生自人類起源之序列。另外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦衍生自該等人類序列，例如人類種系序列或人類種系序列之突變形式或含有衍生自人類框架序列分析之共有框架序列的抗體(例如如Knappik等人，J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000中所闡述)。人類抗體可包含並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機誘變或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變或用於促進穩定性或製造之保守取代)。
術語「相應人類種系序列」係指與所有其他由人類種系免疫球蛋白可變區序列編碼之已知可變區胺基酸序列相比，核酸序列編碼與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高測定胺基酸序列一致性之人類可變區胺基酸序列或子序列。相應人類種系序列亦可係指與所有其他所評估可變區胺基酸序列相比與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列一致性之人類可變區胺基酸序列或子序列。相應人類種系序列可為僅框架區、僅互補決定區、框架及互補決定區、可變區段(如上文所定義)或包括可變區之序列或子序列之其他組合。可使用本文所闡述之方法(例如使用BLAST、ALIGN比對兩個序列或業內已知之另一比對算法)來測定序列一致性。相應人類種系核酸或胺基酸序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。
本文所用之術語「價」係指多肽中之潛在靶結合位點之數量。每一靶結合位點特異性結合一種靶分子或靶分子上之一個特定位點。在多肽包括一個以上靶結合位點時，每一靶結合位點可特異性結合相同或不同分子(例如可結合至不同分子(例如不同抗原)或相同分子上之不同表位)。習用抗體(例如)具有兩個結合位點且為二價；「三價」及「四價」係指在抗體分子中分別存在三個結合位點及四個結合位點。抗體-細胞激素植入之蛋白質可為單價(亦即結合一種靶分子)、二價或多價(亦即結合一種以上靶分子)。
在用於闡述靶(例如蛋白質)與抗體-細胞激素植入之蛋白質之間之相互作用之背景中時，片語「特異性結合」或「結合特異性」係指決定靶在蛋白質異質群體及其他生物產品中(例如在生物試樣(例如血液、血清、血漿或組織試樣)中)之存在之結合反應。因此，在某些指定條件下，具有特定結合特異性之抗體-細胞激素植入之蛋白質至少兩倍於背景結合至特定靶且並不實質上以顯著量結合存在於試樣中之其他靶。在一實施例中，在指定條件下，具有特定結合特異性之抗體-細胞激素植入之蛋白質至少十(10)倍於背景結合至特定抗原且並不實質上以顯著量結合存在於試樣中之其他靶。在該等條件下特異性結合至抗體-細胞激素植入之蛋白質可需要針對關於特定靶蛋白之特異性來選擇抗體-細胞激素植入之蛋白質。如本文中所使用，特異性結合包含抗體-細胞激素植入之蛋白質選擇性結合至人類IL2高親和力受體，且並不包含抗體-細胞激素植入之蛋白質與(例如)其他細胞激素受體超家族成員交叉反應。在一些實施例中，選擇選擇性結合至人類IL2高親和力受體且與非人類靈長類動物IL2R (例如食蟹猴IL2R)交叉反應之抗體-細胞激素植入之蛋白質。在一些實施例中，選擇選擇性結合至人類IL2高親和力受體且與其他靶抗原反應之抗體植入蛋白。可使用各種格式來選擇與特定靶抗原蛋白特異性反應之抗體-細胞激素植入之蛋白質。舉例而言，固相ELISA免疫分析通常用於選擇與蛋白質特異性免疫反應之抗體(例如參見Harlow及Lane，Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)，其闡述可用於測定特異性免疫反應之免疫分析格式及條件)。通常，特異性或選擇性結合反應將產生至少兩倍於背景信號及更通常至少10至100倍於背景之信號。
術語「平衡解離常數(KD , M)」係指解離速率常數(kd ，時間-1 )除以締合速率常數(ka ，時間-1 ，M-1 )。可使用業內已知之任一方法量測平衡解離常數。抗體-細胞激素植入之蛋白質通常具有小於約10-7 或10-8 M、例如小於約10-9 M或10-10 M、在一些實施例中小於約10-11 M、10-12 M或10-13 M之平衡解離常數。
如本文中所使用，術語「表位」或「結合區」係指抗原蛋白中負責抗體CDR與抗原蛋白之間之特異性結合之結構域。
如本文中所使用，術語「受體-細胞激素結合區」係指抗體-細胞激素植入之蛋白質之植入細胞激素部分中負責植入細胞激素與其受體(例如IL2高親和力受體)之間之特異性結合的結構域。在每一抗體-細胞激素植入之蛋白質中存在至少一個該受體-細胞激素結合區，且每一結合區可彼此相同或不同。
術語「激動劑」可互換地係指能夠活化受體以誘導完全或部分受體調介反應之抗體。舉例而言，IL2高親和力受體之激動劑結合至IL2高親和力受體並誘導IL2-調介之細胞內信號傳導、細胞活化及/或Treg細胞增殖。在一些態樣中，類似於天然IL2配體，抗體-細胞激素植入之蛋白質激動劑經由IL2高親和力受體來刺激信號傳導。IL2結合至IL2高親和力受體可誘導Jak1及Jak2活化，從而產生STAT5磷酸化。在一些實施例中，可藉由結合IL2高親和力受體並誘導STAT5磷酸化及/或Treg細胞增殖之能力來鑑別抗體-細胞激素植入之蛋白質激動劑。
術語「IL2」或「IL-2」或「介白素2」或「介白素-2」可互換地係指α螺旋細胞激素家族成員，其中天然蛋白質用於調控及維持發炎性過程。IL2之性質在於，N-末端及C-末端在空間中彼此靠近，此使得IL2細胞激素蛋白適於抗體植入。將包括全長天然人類結構之殘基21-153之IL2用於激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質之背景中。如本文所揭示之人類IL2在其全長中與胺基酸SEQ ID NO:2具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性，並保留如本文所闡述之抗體-細胞激素植入之蛋白質之優先激動劑活性且已公開為基因庫登錄號：NP_000577。SEQ ID NO:1係人類IL2 cDNA序列。編碼如本文所揭示IL2蛋白之人類IL2核酸在其全長中與SEQ ID NO:1之核酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性，且公開為基因庫登錄號：NM_000586。
術語「抗體-細胞激素植入之蛋白質」或「抗體-細胞激素植入」或「植入」意指，將至少一種細胞激素直接納入抗體之CDR內，從而中斷CDR序列。可將細胞激素納入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3內。可將細胞激素納入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3內且朝向CDR之N-末端序列或朝向CDR之C-末端序列納入。納入CDR內之細胞激素可減小抗體部分與原始靶蛋白之特異性結合或抗體-細胞激素植入之蛋白質可保留其與其靶蛋白之特異性結合。實例性細胞激素包含(但不限於)：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α及TNF-β。亦可將細胞激素植入一個抗體「臂」之特定CDR中且將另一不同細胞激素植入另一抗體「臂」之CDR中。舉例而言，將IL2植入一個抗體「臂」之HCDR1中且將IL-7植入抗體-細胞激素植入之蛋白質之另一「臂」之LCDR1中可產生雙重功能之抗體-細胞激素植入之蛋白質。
在應用於核酸或蛋白質時，術語「經分離」表示，核酸或蛋白質基本上不含以天然狀態締合之其他細胞組分。其較佳呈均質狀態。其可呈乾燥或水溶液形式。通常使用分析化學技術(例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析)來測定純度及均質性。作為存在於製劑中之主要物質之蛋白質係實質上純化的。特定而言，經分離基因係自側接基因且編碼除所關注基因外之蛋白質之開放閱讀框所分離。術語「純化」表示，核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上產生一個帶。特定而言，其意指，核酸或蛋白質至少85%純、更佳地至少95%純及最佳地至少99%純。
術語「核酸」或「多核苷酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有與參考核酸具有類似結合性質且以類似於天然核苷酸之方式代謝之天然核苷酸已知類似物的核酸。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如簡並密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。具體而言，藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃嘌呤核苷殘基取代之序列可達成簡並密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，其皆指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基係對應天然胺基酸之人造化學模擬物之胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。
術語「胺基酸」係指天然及合成胺基酸以及以類似於天然胺基酸之方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係藉由基因代碼編碼者以及彼等經稍後經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然胺基酸具有相同基本化學結構(亦即與氫、羧基、胺基及R基團結合之α-碳)之化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸通常化學結構之結構但以類似於天然胺基酸之方式起作用的化學化合物。
「保守修飾變體」適用於胺基酸序列及核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修飾變體係指彼等編碼一致或基本上一致之胺基酸序列之核酸，或在該核酸不編碼胺基酸序列之情況下係指基本上一致之序列。由於基因代碼之簡並性，大量功能相同之核酸編碼任一給定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定之每一情形下，可在不改變所編碼多肽下將該密碼子改變成所闡述之任一相應密碼子。該核酸變化為「沉默變化」，其係保守修飾變化之一種。本文中編碼多肽之每一個核酸序列亦闡述該核酸之每一可能之沉默變化。熟習此項技術者將認識到，核酸中之每一密碼子(AUG (其通常為甲硫胺酸之唯一密碼子)及TGG (其通常為色胺酸之唯一密碼子)除外)可經修飾以產生功能相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之每一沉默變化暗含於每一所闡述序列中。
對於胺基酸序列而言，熟習此項技術者將認識到，核酸、肽、多肽或蛋白質序列之改變、添加或缺失所編碼序列中單一胺基酸或小部分胺基酸之個別取代、缺失或添加為「保守修飾變體」，其中該改變導致胺基酸經化學上類似之胺基酸所取代。提供功能類似胺基酸之保守取代已為熟習此項技術者所熟知。該等保守修飾變體亦包括且不排除多態變體、種間同系物及等位基因。下列8個群各自含有之胺基酸互為保守取代：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M) (例如參見Creighton,Proteins (1984))。
「序列一致性百分比」係藉由在對比窗中比較兩個最佳比對序列來測定，其中多核苷酸序列在對比窗中之部分可相對於參考序列(例如多肽，其不包括添加或缺失)包括添加或缺失(例如空位)以達成兩個序列之最佳比對。該百分比係藉由以下方式來計算：測定兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基之位置數以得到匹配位置數，使用匹配位置數除以對比窗中之中之位置總數，且將結果乘以100以得到序列一致性百分比。
術語「一致」或「一致性百分比」在兩個或更多個核酸或多肽序列背景中係指兩個或更多個係相同序列之序列或子序列。若在針對最大對應性在對比窗或指定區中進行比較及比對(如使用下列序列對比算法中之一者或藉由人工比對及目測檢查所量測)時兩個序列具有胺基酸殘基或核苷酸之指定相同百分比(亦即在指定區中或在未指定時在參考序列之整個序列中具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性)，則兩個序列「實質上相同」。本發明提供分別與本文所例示之多肽或多核苷酸(例如例示於SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:111中之任一者中之可變區)實質上一致之多肽或多核苷酸。一致性存在於長度為至少約15、25或50個核苷酸之區域或更佳地長度為100至500或1000或更多個核苷酸之區域或參考序列之全長中。對於胺基酸序列而言，一致性或實質性一致性可存在於長度為至少5、10、15或20個胺基酸、視情況長度為至少約25、30、35、40、50、75或100個胺基酸、視情況長度為至少約150、200或250個胺基酸之區域或參考序列之全長中。對於較短胺基酸序列(例如20個或更少胺基酸之胺基酸序列)而言，實質性一致性存在於根據本文所定義之保守取代一或兩個胺基酸殘基經保守取代時。
就序列對比而言，一個序列通常將作為參考序列與測試序列進行比較。在採用序列對比算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指示子序列坐標，並指定序列算法程式參數。可使用缺省程式參數，或可指定替代參數。然後，序列對比算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
本文所用之「對比窗」包含對選自由20至600、通常約50至約200、更通常為約100至約150個位置組成之群之多個鄰接位置中任一者的一個區段之參考，在該對比窗中，序列與具有相同數量鄰接位置之參考序列在兩個序列經過最佳比對後可進行比較。比對對比序列之方法已眾所周知。可(例如)藉由以下方式實施對比序列之最佳比對：Smith及Waterman (1970)Adv. Appl. Math. 2:482c之局部同源性算法；Needleman及Wunsch (1970)J. Mol. Biol. 48:443之同源性比對算法；Pearson及Lipman (1988)Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444之類似性方法探索；電腦化實施該等算法(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)；或人工比對及目測檢查(例如參見Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995增刊))。
適於測定序列一致性及序列類似性百分比之算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0算法，其分別闡述於Altschul等人(1977)Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及Altschul等人(1990)J. Mol. Biol . 215:403-410中。用於實施BLAST分析之軟體可經由National Center for Biotechnology資訊公開獲得。該算法首先涉及藉由鑑別詢問序列中之代碼長度縮寫W來鑑別高評分序列對(HSP)，在代碼與一個資料庫序列中具有相同長度之代碼進行比對時，其將與某一正臨限評分T相匹配或滿足其條件。T稱為相鄰代碼評分臨限值(Altschul等人，見上文)。該等初始相鄰重複代碼將作為引子以啟動發現含有其之更長HSP的搜索。將重複代碼沿每一序列之兩個方向延伸，儘量能夠使累積比對評分增加。對於核苷酸序列而言，累積評分係使用參數M (匹配殘基對之獎勵評分；始終＞0)及N(不匹配殘基之懲罰評分；始終＜ 0)來計算。對於胺基酸序列而言，使用評分矩陣來計算累積評分。重複代碼在每一方向上之延伸在以下時候將停止：累積比對評分自其所達成之最大值降低了X數量；由於一或多個負評分殘基比對累加而使累積評分變為零或負值；或達到任一序列之端點。BLAST算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列而言)使用之缺省值有代碼長度(W) 11、預期值(E) 10、M=5、N=-4及兩條鏈之對比值。對於胺基酸序列而言，該BLASTN程式使用之缺省值有代碼長度3及預期值(E) 10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff，(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對(B) 50、預期值(E) 10、M=5、N=-4及兩條鏈之對比值。
BLAST算法亦對兩個序列之間之類似性實施統計學分析(例如參見Karlin及Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供之一種類似性量度係最小和概率(P(N))，其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶爾匹配之概率。舉例而言，若在對比測試核酸與參考核酸時最小和概率小於約0.2、更佳地小於約0.01及最佳地小於約0.001，則該核酸可視為類似於參考序列。
兩個核酸序列或多肽實質上相同之指示為由第一核酸編碼之多肽與針對由第二核酸編碼之多肽產生之抗體在免疫學上交叉反應，如下文所闡述。因此，該多肽通常與第二多肽實質上相同，舉例而言，其中兩種肽之區別僅在於保守取代。兩個核酸序列實質上相同之另一指示為兩個分子或其補體在嚴格條件下相互雜交，如下文所闡述。兩個核酸序列實質上相同之又一指示為可使用相同引子擴增序列。
在用於闡述結合區在抗體-細胞激素植入之蛋白質內如何連結之背景中時，術語「連接」涵蓋以物理方式接合區域之所有可能方式。多個結合區通常由諸如以下等化學鍵接合：共價鍵(例如肽鍵或二硫鍵)或非共價鍵(其可為直接鍵(亦即在兩個結合區之間並無連接體)或間接鍵(亦即藉助兩個或更多個結合區之間之至少一種連接體分子))。
「免疫相關病症」或「免疫疾病」係指免疫系統之功能障礙，其中身體之自有免疫系統攻擊健康組織。功能障礙可位於免疫細胞之組分中，且包含過度活性及活性不足之免疫系統。
術語「個體(subject)」、「患者」及「個體(individual)」可互換地係指哺乳動物，例如人類或非人類靈長類哺乳動物。哺乳動物亦可為實驗室哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠。在一些實施例中，哺乳動物可為農業哺乳動物(例如馬、羊、牛、豬、駱駝)或家養哺乳動物(例如犬、貓)。
在一實施例中，如本文中所使用，術語「治療(treat、treating或treatment)」任一疾病或病症係指改善該疾病或病症(亦即減緩或阻止或降低該疾病或其至少一種臨床症狀的發展)。在另一實施例中，「治療(treat、treating或treatment)」係指減輕或改善至少一個物理參數(包含患者不可識別者)。在又一實施例中，「治療(treat、treating或treatment)」係指在身體上(例如穩定可識別症狀)、生理上(例如穩定身體參數)或二者上調節疾病或病症。在另一實施例中，「治療(treat、treating或treatment)」係指預防或延遲疾病或病症之發作或發展或進程。
術語「治療可接受量」或「治療有效劑量」可互換地係指足以實現期望結果(亦即減少發炎，抑制疼痛，預防發炎，抑制或預防發炎性反應)之量。在一些實施例中，治療可接受量並不誘導或引起不期望副效應。可藉由以下方式來測定治療可接受量：首先投與低劑量，且然後以遞增方式增加該劑量直至達成期望效應為止。IL2抗體-細胞激素植入之蛋白質之「預防有效劑量」及「治療有效劑量」可分別預防疾病症狀(包含與免疫相關病症有關症狀)之發作或降低其嚴重程度。
術語「共投與」係指在個體中同時存在兩種(或更多種)活性劑。可同時或依序遞送共投與之活性劑。
如本文中所使用，片語「基本上由……組成」係指方法或組合物中所包含活性醫藥藥劑之類或種以及任一對於方法或組合物之預期目的為惰性之載劑或賦形劑。在一些實施例中，片語「基本上由……組成」明確排除包含一或多種除IL2抗體-細胞激素植入之蛋白質外之其他活性劑。在一些實施例中，片語「基本上由……組成」明確排除包含多種除IL2抗體-細胞激素植入之蛋白質外之其他活性劑及第二共投與藥劑。
除非上下文另外明確指示，否則術語「一(a、an)」及「該」包含複數個指示物。
靶向 IL2 高親和力受體之抗體 - 細胞激素植入之蛋白質
本文提供包括植入抗體之互補決定區(CDR)中之IL2之蛋白質構築體。抗體-細胞激素植入之蛋白質展示用於人類患者中之適宜性質，例如其保留類似於天然或重組人類IL2之免疫刺激活性。然而，負效應有所減弱，例如NK細胞之刺激。其他活性及特性亦顯示於整個說明書中。因此，提供較先前已知IL2治療劑及改良IL2治療劑(例如Proleukin®)具有改良治療特徵之抗體-細胞激素植入之蛋白質及所提供抗體-細胞激素植入之蛋白質在療法中的使用方法。
因此，本發明提供係IL2高親和力受體激動劑且具有選擇性活性特徵之抗體-細胞激素植入之蛋白質。提供包括免疫球蛋白重鏈序列及免疫球蛋白輕鏈序列之抗體-細胞激素植入之蛋白質。每一免疫球蛋白重鏈序列包括重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)，其中重鏈恆定區由CH1、CH2及CH3恆定區組成。每一免疫球蛋白輕鏈序列包括輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。在每一抗體-細胞激素植入之蛋白質中，將IL2分子納入抗體之VH或VL之互補決定區(CDR)中。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括納入重鏈CDR中之IL2分子。在某些實施例中，將IL2分子納入重鏈互補決定區1 (HCDR1)中。在某些實施例中，將IL2分子納入重鏈互補決定區2 (HCDR2)中。在某些實施例中，將IL2分子納入重鏈互補決定區3 (HCDR3)中。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括納入輕鏈CDR中之IL2分子。在某些實施例中，將IL2分子納入輕鏈互補決定區1 (LCDR1)中。在某些實施例中，將IL2分子納入輕鏈互補決定區2 (LCDR2)中。在某些實施例中，將IL2分子納入輕鏈互補決定區3 (LCDR3)中。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括納入CDR中之IL2序列，藉此將IL2序列插入CDR序列中。插入可位於CDR之N-末端區域或靠近該區域、位於CDR之中央區域或位於CDR之C-末端區域或靠近該區域。在其他實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括納入CDR中之IL2分子，藉此IL2序列代替所有或一部分CDR序列。代替可位於CDR之N-末端區域、位於CDR之中央區域或位於CDR之C-末端區域或靠近該區域。代替可少至CDR序列之一或兩個胺基酸或整個CDR序列。
在一些實施例中，在不使用肽連接體下將IL2分子直接植入CDR中，且在CDR序列與IL2序列之間並無其他胺基酸。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IgG種類抗體重鏈之免疫球蛋白重鏈。在某些實施例中，IgG重鏈係IgG1、IgG2或IgG4子類中之任一者。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括選自已知臨床利用之免疫球蛋白序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。在某些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括係人類化序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。在其他某些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括係人類序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括選自種系免疫球蛋白序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括免疫球蛋白可變結構域對靶之結合特異性不同於IL2分子之結合特異性之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。在一些實施例中，在所植入細胞激素存在下，免疫球蛋白可變結構域對其靶之結合特異性保留10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。在某些實施例中，所保留結合特異性係針對非人類靶。在某些實施例中，所保留結合特異性係針對病毒(例如RSV)。在其他實施例中，結合特異性係針對在IL2療法中具有治療用途之人類靶。在某些實施例中，靶向免疫球蛋白之結合特異性可向IL2組分傳遞額外治療益處。在某些實施例中，免疫球蛋白對其靶之結合特異性向IL2傳遞協同活性。
在其他實施例中，藉由植入IL2分子，免疫球蛋白對其靶之結合特異性減小10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
所提供抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IL2分子納入抗體-細胞激素植入之蛋白質之VH或VL之互補決定區(CDR)中。在一些實施例中，IL2序列與SEQ ID NO:4之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。在一些實施例中，IL2分子包括SEQ ID NO:4之序列。在一些實施例中，IL2分子由SEQ ID NO:4之序列組成。所提供抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IL2分子納入抗體-細胞激素植入之蛋白質之VH或VL之互補決定區(CDR)中。在一些實施例中，IL2序列與SEQ ID NO:4之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。在一些實施例中，IL2分子包括SEQ ID NO:4之序列。在一些實施例中，IL2分子由SEQ ID NO:4之序列組成。
所提供抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IL2分子納入抗體-細胞激素植入之蛋白質之VH或VL之互補決定區(CDR)中。在一些實施例中，IL2序列與SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。在一些實施例中，IL2分子包括SEQ ID NO:6之序列。在一些實施例中，IL2分子由SEQ ID NO:6之序列組成。所提供抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IL2分子納入抗體-細胞激素植入之蛋白質之VH或VL之互補決定區(CDR)中。在一些實施例中，IL2序列與SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。在一些實施例中，IL2分子包括SEQ ID NO:6之序列。在一些實施例中，IL2分子由SEQ ID NO:6之序列組成。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入賦予優於人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®之抗發炎性性質。在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質賦予Treg細胞增加之活性，同時減小相應促發炎性活性。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質優先刺激高親和力IL2受體®。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質較Teff細胞、Tcon細胞及/或NK細胞優先活化Treg細胞。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質較Teff細胞、Tcon細胞及/或NK細胞優先擴增Treg細胞。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質增加Treg細胞之擴增且並不擴增CD8 T效應細胞或NK細胞。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質所提供Treg細胞:NK細胞之擴增比為、約為、大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質所提供Treg細胞:CD8 T效應細胞之擴增比為、約為、大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質所提供Treg細胞:CD4 Tcon細胞之擴增比為、約為、大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質提供在CD4 Tcon細胞中減小之IL-2R信號傳導功效。在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質提供在CD8 Teff細胞中減小之IL-2R信號傳導功效。在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質提供在NK細胞中減小之IL-2R信號傳導功效。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質較CD4 T效應細胞對Treg細胞之特異性活化高於人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®約1,000倍、約2,000倍、約3,000倍、約4,000倍、約5,000倍、約6,000倍、約7,000倍、約8,000倍、約9,000倍、約10,000倍或更多倍。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質較CD8 T效應細胞對Treg細胞之特異性活化高於人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍、約1,000倍或更多倍。在一些實施例中，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質較CD8 T效應/記憶細胞對Treg細胞之特異性活化高於人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍、約1,000倍或更多倍。
在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質提供減小之毒性(例如嗜酸性球增多症之擴展)。在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質提供增加之半衰期，例如大於4小時、大於6小時、大於8小時、大於12小時、大於24小時、大於48小時。在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質提供減小之體重損失(例如在移植物抗宿主病(GvHD)患者中)。在一些實施例中，與人類IL2、重組人類IL2或Proleukin®相比，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質提供針對1型糖尿病發生之較佳保護。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括具有賦予經修飾效應功能之經修飾Fc之經修飾免疫球蛋白IgG。在某些實施例中，經修飾Fc區包括選自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A及L235A中之一或多者之突變。在特定實施例中，免疫球蛋白重鏈可包括賦予減小之效應功能之選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/ N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者的突變或突變組合。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括：(i)重鏈可變區，其與SEQ ID NO:20之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性；及(ii)輕鏈可變區，其與SEQ ID NO:33之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG種類。在某些實施例中，免疫球蛋白視情況包括賦予減小之效應功能之選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者的突變或突變組合。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括：(i)重鏈可變區，其與SEQ ID NO:46之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性；及(ii)輕鏈可變區，其與SEQ ID NO:58之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG種類。在某些實施例中，免疫球蛋白視情況包括賦予減小之效應功能之選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者的突變或突變組合。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括：(i)重鏈可變區，其與SEQ ID NO:71之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性；及(ii)輕鏈可變區，其與SEQ ID NO:84之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG種類。在某些實施例中，免疫球蛋白視情況包括賦予減小之效應功能之選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者的突變或突變組合。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括：(i)重鏈可變區，其與SEQ ID NO:97之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性；及(ii)輕鏈可變區，其與SEQ ID NO:110之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG種類。在某些實施例中，免疫球蛋白視情況包括賦予減小之效應功能之選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者的突變或突變組合。經改造及經修飾之抗體 - 細胞激素植入之蛋白質
在某些態樣中，藉由將IL2序列植入免疫球蛋白支架之CDR區中來生成抗體-細胞激素植入之蛋白質。產生重鏈及輕鏈免疫球蛋白鏈以生成最終抗體植入蛋白。抗體-細胞激素植入之蛋白質賦予Treg細胞較佳治療活性，然而，抗體-細胞激素植入之蛋白質與天然或重組人類IL2 (rhIL2或Proleukin®)相比具有減小之促發炎性活性。
為改造抗體-細胞激素植入之蛋白質，將含有特定突變蛋白之IL2序列(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6)插入免疫球蛋白鏈支架蛋白之CDR環中。可使用以下序列中之任一者來製備植入構築體：各種已用於臨床環境中之已知免疫球蛋白序列、處於當前研究及/或臨床研發中之已知免疫球蛋白序列、人類種系抗體序列以及新穎抗體免疫球蛋白鏈之序列。使用標準分子生物學方法利用重組DNA編碼相關序列來產生構築體。稱為GFTX3b之實例性支架之IL2序列繪示於表2中。插入點基於可用結構或同源性模型數據選擇位於環中點處，然而，可朝向CDR環之N-末端或C-末端調節插入點。
因此，本發明提供特異性結合至高親和力IL2受體之抗體-細胞激素植入之蛋白質，該等蛋白質包括以重組方式插入異源抗體蛋白或多肽中以生成抗體-細胞激素植入之蛋白質之IL2蛋白。特定而言，本發明提供抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括本文所闡述之抗體或抗體之抗原結合片段或任何其他相關支架抗體多肽(例如全抗體免疫球蛋白、Fab片段、Fc片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH結構域、VH CDR、VL結構域、VL CDR等)及異源細胞激素蛋白、多肽或肽(例如IL2)。業內已知使蛋白質、多肽或肽融合或偶聯至抗體或抗體片段之方法。例如參見美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號；國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zheng等人，1995, J. Immunol. 154:5590-5600；及Vil等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341。另外，可經由基因改組、基序改組、外顯子改組及/或密碼子改組(通稱為「DNA改組」)之技術來生成抗體-細胞激素植入之蛋白質。可採用DNA改組來製備抗體-細胞激素植入之蛋白質及/或改變抗體或其片段之活性(例如具有較高親和力及較低解離速率之抗體或其片段)。通常參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson等人，1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；及Lorenzo及Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313 (該等專利及公開案中之每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中)。可藉由在重組之前經受隨機誘變(藉由易錯PCR)、隨機核苷酸插入或其他方法來改變抗體或其片段或編碼抗體或其片段。可重組編碼特異性結合至所關注抗原蛋白之抗體或其片段之多核苷酸與一或多個異源細胞激素分子(例如IL2)之一或多種組分、基序、區段、部分、結構域、片段等以用於製備如本文所提供的抗體-細胞激素植入之蛋白質。
抗體Fab含有6個CDR環，3個位於輕鏈(CDRL1、CDRL2、CDRL3)中且3個位於重鏈(CDRH1、CDRH2、CDRH3)中，該等環可用作細胞激素蛋白之潛在插入位點。應考慮結構及功能因素以測定插入細胞激素之CDR環。因CDR環之大小及構形在不同抗體中變化較大，故可根據經驗來測定每一特定抗體/蛋白質組合中用於插入之最佳CDR。另外，由於細胞激素蛋白將插入CDR環中，故此可對細胞激素蛋白之結構產生額外約束。舉例而言，細胞激素蛋白之胺基及羧基末端應容許在空間中相對靠近地(約25 Å)約束之可能性。另外，抗體-細胞激素植入之蛋白質之生物活性不應依賴於寡聚。可用蛋白質資料庫結構之分析指示，許多細胞激素蛋白(包含IL2)在此分類內。
藉由業內已知之熟知編號系統(包含本文所闡述者)來測定免疫球蛋白鏈之CDR。舉例而言，藉由以下方式來鑑別及定義CDR：(1)使用闡述於Kabat等人(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版。Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)，NIH公開案第91-3242號中之編號系統；及(2) Chothia，參見Al-Lazikani等人(1997) 「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins,」 J.Mol.Biol. 273:927-948。對於長度小於20個胺基酸之所鑑別CDR胺基酸序列，可耐受一或兩個保守胺基酸殘基取代，同時仍保留期望特異性結合及/或激動劑活性。
另外，可使用具有本文(例如表2)所展示之一或多個CDR及/或VH及/或VL序列之抗體作為起始材料以改造經修飾抗體-細胞激素植入之蛋白質來製備抗體-細胞激素植入之蛋白質，該蛋白質可相對於起始抗體植入蛋白具有改變之性質。或者，可利用任何已知抗體序列作為支架來改造經修飾抗體-細胞激素植入之蛋白質。舉例而言，可利用任一臨床利用之已知抗體作為起始材料支架來製備抗體植入蛋白。已知抗體及相應免疫球蛋白序列包含(例如)帕利珠單抗(palivizumab)、阿裡羅單抗(alirocumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、地妥昔單抗(dinutuximab)、蘇金單抗(secukinumab)、依伏庫單抗(evolocumab)、比林莫單抗(blinatumomab)、派姆單抗(pembrolizumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、瑞西巴庫單抗(raxibacumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、貝利木單抗(belimumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、地諾單抗(denosumab)、托珠單抗(tocilizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、卡那單抗(canakinumab)、戈利木單抗(golimumab)、優特克單抗(ustekinumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、依庫珠單抗(eculizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、那他珠單抗(natalizumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、依法利珠單抗(efalizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、阿達木單抗(adalimumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、達克珠單抗(daclizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、阿昔單抗(abciximab)、莫羅單抗(muromonab)或其修飾。已知抗體及免疫球蛋白序列亦包含種系抗體序列。框架序列可自包含種系抗體基因序列之公開DNA資料庫或公開參考文獻來獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參見「VBase」人類種系序列資料庫以及Kabat, E. A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號；Tomlinson, I. M.等人，1992 J. fol. Biol. 227:776-798；及Cox, J. P. L.等人，1994 Eur.J免疫l. 24:827-836。在其他實例中，來自其他已知實體之可進行早期研究及/或藥物研發之抗體及相應免疫球蛋白序列可類似地適於作為起始材料來改造經修飾抗體-細胞激素植入之蛋白質。
可採用眾多種抗體/免疫球蛋白框架或支架，只要所得多肽包含至少一個適於納入細胞激素(例如IL2)之結合區。該等框架或支架包含5個主要獨特型之人類免疫球蛋白或其片段，且包含其他動物物種之較佳地具有人類化及/或人類態樣之免疫球蛋白。熟習此項技術者繼續研究及研發新穎抗體、框架、支架及片段。
可使用業內已知方法來生成抗體。為製備單株抗體，可使用業內已知之任一技術(例如參見Kohler & Milstein,Nature 256:495-497 (1975)；Kozbor等人，Immunology Today 4:72 (1983)；Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985)。用於產生單鏈抗體之技術(美國專利第4,946,778號)可適於產生用於抗體-細胞激素植入之蛋白質中之抗體。同樣，可使用轉基因小鼠或其他生物體(例如其他哺乳動物)來表現及鑑別靈長類化或人類化或人類抗體。或者，可使用噬菌體顯示技術來鑑別特異性結合至用於抗體-細胞激素植入之蛋白質中之所選抗原之抗體及異源Fab片段(例如參見McCafferty等人(見上文)；Marks等人，Biotechnology , 10:779-783, (1992))。
用於靈長類化或人類化非人類抗體之方法為業內所熟知。通常，靈長類化或人類化抗體具有自非靈長類動物或非人類來源引入至其中之一或多個胺基酸殘基。該等非靈長類動物或非人類胺基酸殘基經常稱為引入殘基，其通常取自引入可變結構域。人類化可基本上遵循Winter及同事之方法(例如參見Jones等人，Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536 (1988)及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992))藉由使用齧齒類動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來實施。因此，該等人類化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於一個完好人類可變結構域已由來自非人類物種之相應序列所取代。在實踐中，靈長類化或人類化抗體通常係靈長類動物或人類抗體，其中一些互補決定區(「CDR」)殘基及可能一些框架(「FR」)殘基由來自起源物種(例如齧齒類動物抗體)中之類似位點之殘基取代以賦予結合特異性。
或者或另外，可利用使用抗體中之人類可變區代替非人類抗體可變區同時相對於非人類抗體維持相同結合特性或提供較佳結合特性之活體內方法來將非人類抗體轉化成經改造人類抗體。例如參見美國專利公開案第20050008625號、美國專利公開案第2005/0255552號。或者，可藉由依序盒代替來生成人類V區段庫，其中首先藉由人類序列庫代替僅一部分參考抗體V區段；且然後在第二庫篩選中重組所鑑別支持殘餘參考抗體胺基酸序列背景中之結合之人類「盒」以生成完整人類V區段(參見美國專利公開案第2006/0134098號)。
用於製備抗體-細胞激素植入之蛋白質之各種抗體或抗原結合片段可藉由完整抗體之酶促或化學修飾來產生，或使用重組DNA方法(例如單鏈Fv)重新合成，或使用噬菌體顯示庫來鑑別(例如參見McCafferty等人，Nature 348:552-554, 1990)。舉例而言，可使用業內(例如Vaughan及Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001)所闡述方法來生成微小抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法(包含雜交瘤植入或連接Fab'片段)產生。例如參見Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)；Kostelny等人，J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)。可使用噬菌體顯示庫或核糖體顯示庫、基因改組庫來鑑別單鏈抗體。可自合成、半合成或天然及免疫活性來源來構築該等庫。所選免疫球蛋白序列可由此用於製備如本文所提供之抗體-細胞激素植入之蛋白質構築體。
本發明之抗體、抗原結合分子或抗體-細胞激素植入之分子進一步包含雙特異性抗體。雙特異性或雙功能性抗體係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜合抗體。其他抗原結合片段或抗體部分包含二價scFv (二價抗體)、抗體分子識別兩個不同表位之雙特異性scFv抗體、單一結合結構域(dAb)及微小抗體。所選免疫球蛋白序列可由此用於製備如本文所提供之抗體-細胞激素植入之蛋白質構築體。
可使用抗體之抗原結合片段(例如Fab片段、scFv)作為結構單元來構築抗體-細胞激素植入之蛋白質，且可視情況包含多價形式。在一些實施例中，該等多價分子包括抗體之恆定區(例如Fc)。
可藉由修飾抗體之一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內)之一或多個殘基來改造抗體-細胞激素植入之蛋白質，且該等改變之VH及/或VL區序列可用於植入細胞激素或準備細胞激素植入。抗體與靶抗原主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基相互作用。出於此原因，在個別抗體之間CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列更不同。CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，可藉由構築表現載體來表現模擬特異性抗體之特性之重組抗體，該等表現載體包含來自特異性抗體移植至具有不同特性之不同抗體之框架序列上的CDR序列(例如參見Riechmann, L.等人，1998 Nature 332:323-327；Jones, P.等人，1986 Nature 321:522-525；Queen, C.等人，1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033；頒予Winter之美國專利第5,225,539號；及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。在某些情況下，可有益地突變框架區內之殘基以維持或增強抗體之抗原結合能力(例如參見頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
在一些態樣中，使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基發生突變以由此改良所關注抗體之一或多種結合性質(例如親和力，稱為「親和力成熟」)可有益於(例如)在細胞激素植入之蛋白質背景中最佳化抗體之抗原結合。可實施定點誘變或PCR調介之誘變以引入突變，且可在如本文所闡述且於實例中提供之活體外或活體內分析及/或業內已知之替代或其他分析中評估對抗體結合之效應或所關注之其他功能性質。可引入保守修飾。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。此外，通常改變CDR區內之不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。
經改造抗體或抗體片段包含已對VH及/或VL內之框架殘基進行修飾以(例如)改良抗體特性之彼等。在一些實施例中，進行該等架構修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方式係將一或多個框架殘基變成相應之種系序列。更具體而言，已經受體細胞突變之抗體可含有與衍生出該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生出該抗體之種系序列來鑒定。為使框架區序列返回至其種系構形，可藉由(例如)定點誘變將體細胞突變「回復突變」成種系序列。其他框架修飾涉及突變框架區或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基以去除T細胞表位，由此降低抗體之潛在免疫原性。此方式亦稱為「去免疫化」且另外詳細闡述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
用於製備抗體-細胞激素植入之蛋白質之抗體或抗體片段之恆定區可為任一類型或亞型(若適當)，且可選自擬藉由本發明方法治療之個體物種(例如人類、非人類靈長類動物或其他哺乳動物，例如農業哺乳動物(例如馬、羊、牛、豬、駱駝)、家養哺乳動物(例如犬、貓)或齧齒類動物(例如大鼠、小鼠、倉鼠、兔))。在一些實施例中，改造用於抗體-細胞激素植入之蛋白質中之抗體以生成人類化或Humaneered®抗體。在一些實施例中，用於抗體-細胞激素植入之蛋白質中之抗體係人類抗體。在一些實施例中，抗體恆定區同型係IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在某些實施例中，恆定區同型係IgG1 。在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IgG。在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IgG1 Fc。在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質包括IgG2 Fc。
除在框架或CDR區內進行之修飾外或替代地，用於製備抗體-細胞激素植入之蛋白質之抗體或抗體片段可經改造以包含Fc區內之修飾，從而通常改變抗體之一或多種功能性質，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。另外，抗體、抗體片段或抗體-細胞激素植入之蛋白質可經化學修飾(舉例而言，可將一或多個化學部分附接至該抗體)或經修飾以改變其醣基化，從而同樣以改變抗體-細胞激素植入之蛋白質之一或多種功能性質。
在一實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以改變(例如增加或減少)鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數。舉例而言，藉由另外闡述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中之方式，其中改變CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數以(例如)促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低抗體-細胞激素植入之蛋白質之穩定性。在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以改變抗體-細胞激素植入之蛋白質之生物半衰期。更具體而言，將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區域中，從而該抗體-細胞激素植入之蛋白質具有相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合受損之葡萄球菌蛋白A (SpA)結合。此方式另外詳細闡述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
本發明提供特異性結合至IL2高親和力受體且具有延長活體內半衰期之抗體-細胞激素植入之蛋白質。在另一實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質經修飾以增加其生物半衰期。多種方式係可能的。亦可藉由將一或多個胺基酸修飾(亦即取代、插入或缺失)引入IgG恆定結構域或其FcRn結合片段(較佳地Fc或鉸鏈Fc結構域片段)中來生成具有增加之活體內半衰期之抗體-細胞激素植入之蛋白質。舉例而言，可引入下列突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如Ward等人之美國專利第6,277,375號中所闡述。例如參見國際公開案第WO 98/23289號；國際公開案第WO 97/34631號；及美國專利第6,277,375號。或者，為增加生物半衰期，在CH1或CL區內改變抗體-細胞激素植入之蛋白質以含有自IgG之Fc區中CH2結構域之兩個環獲得之補救受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所闡述。 在其他實施例中，藉由使用不同胺基酸殘基代替至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體-細胞激素植入之蛋白質之效應功能。舉例而言，可使用不同胺基酸殘基來代替一或多個胺基酸，從而抗體-細胞激素植入之蛋白質具有對效應物配體經改變之親和力但保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和力改變之效應物配體可為(例如) Fc受體(FcR)或補體之C1組分。此方法進一步詳細闡述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基代替，從而抗體-細胞激素植入之蛋白質具有經改變之C1q結合及/或降低或消除補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方式進一步詳細闡述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
含有該等突變之抗體-細胞激素植入之蛋白質可調介減小或消失之抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，將IgG1恆定區之胺基酸殘基L234及L235取代為Ala234及Ala235。在一些實施例中，將IgG1恆定區之胺基酸殘基N267取代為Ala267。
在另一實施例中，改變一或多個胺基酸殘基以由此改變抗體-細胞激素植入之蛋白質固定補體之能力。此方式進一步闡述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又一實施例中，藉由修飾一或多個胺基酸來對Fc區進行修飾以增加抗體調介抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加抗體-細胞激素植入之蛋白質對Fcγ受體之親和力。此方式進一步闡述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgG1上針對FcγRl、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點，且已闡述具有經改良結合之變體(參見Shields, R.L.等人，2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604)。
在再一實施例中，對抗體-細胞激素植入之蛋白質之醣基化進行修飾。舉例而言，可製備無醣基化抗體-細胞激素植入之蛋白質(亦即未醣基化抗體-細胞激素植入之蛋白質)。可改變醣基化以(例如)增加抗體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來達成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代以消除一或多個可變區框架醣基化位點，由此消除該位點處之醣基化。該無醣基化可增加抗體對抗原之親和力。此方法進一步詳細闡述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外或或者，可製備具有經改變醣基化類型之抗體-細胞激素植入之蛋白質，例如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻醣基化抗體-細胞激素植入之蛋白質或具有增加之二等分GlcNac結構的抗體。已證實，該等經改變醣基化模式增加抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)在具有經改變醣基化機構之宿主細胞中表現抗體-細胞激素植入之蛋白質來完成。具有經改變醣基化機構之細胞已於業內有所闡述且可用作其中表現重組抗體-細胞激素植入之蛋白質之宿主細胞，以藉此產生具有經改變醣基化之抗體-細胞激素植入之蛋白質。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195闡述具有編碼岩藻糖基轉移酶之功能被破壞之FUT8基因之細胞系，從而在此一細胞系中表現之抗體-細胞激素植入之蛋白質展現低岩藻醣基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述將岩藻糖附接至Asn(297)連接碳水化合物之能力有所降低的變體CHO細胞系Lecl3細胞，亦導致在該宿主細胞中表現之抗體-細胞激素植入之蛋白質的低岩藻醣基化(亦參見Shields, R.L.等人，2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現修飾醣蛋白之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII))之細胞系，從而在經改造細胞系中表現之抗體-細胞激素植入之蛋白質展現增加的二等分型GlcNac結構，從而增加抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，1999 Nat. Biotech. 17:176-180)。
在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質之一或多個結構域或區域經由連接體(例如肽連接體，例如業內眾所周知者)進行連結(例如參見Holliger, P.等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, RJ.等人(1994) Structure 2:1121-1123)。肽連接體之長度可有所變化，舉例而言，連接體之長度可為1-100個胺基酸，通常，連接體之長度為5至50個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸。
在一些實施例中，視情況使用一或多個肽連接體序列將IL2植入CDR序列中。在某些實施例中，一或多個肽連接體獨立地係選自(Glyn -Ser)m 序列(SEQ ID NO: 115)、(Glyn -Ala)m 序列(SEQ ID NO: 116)或(Glyn -Ser)m /(Glyn -Ala)m 序列(分別為SEQ ID NOS 115及116)之任一組合，其中每一n獨立地係整數1至5且每一m獨立地係整數0至10。連接體之實例包含(但不限於)基於甘胺酸之連接體或gly/ser連接體G/S(例如(Gm S)n ，其中n為等於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之正整數且m係等於0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之整數(SEQ ID NO: 117))。在某些實施例中，一或多個連接體包含G4 S重複(SEQ ID NO: 118)，例如Gly-Ser連接體(G4 S)n ，其中n係等於或大於1之正整數(SEQ ID NO: 118)。舉例而言，n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一些實施例中，Ser可經Ala代替，例如連接體G/A，例如(Gm A)n ，其中n係等於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之正整數且m係等於0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之整數(SEQ ID NO: 119)。在某些實施例中，一或多個連接體包含G4 A重複(SEQ ID NO: 120)，(G4 A)n ，其中n係等於或大於1之正整數(SEQ ID NO: 120)。舉例而言，n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一些實施例中，連接體包含多個連接體重複。在其他實施例中，連接體包含G4 S (SEQ ID NO: 118)及G4 A (SEQ ID NO: 120)之組合及複合體。
連接體之其他實例包含基於抗體中之撓性連接體序列者以最小化源連接體及接點之免疫原性。舉例而言，在抗體分子結構中之可變結構域與CH1恆定結構域之間存在天然撓性鍵聯。此天然鍵聯包括大約10-12個胺基酸殘基，其中自V結構域之C-末端具有4-6個殘基且自CH1結構域之N-末端具有4-6個殘基。抗體-細胞激素植入之蛋白質可(例如)採用納入CH1之末端5-6個胺基酸殘基或11-12個胺基酸殘基之連接體作為連接體。CH1結構域之N-末端殘基、尤其前5-6個胺基酸殘基採用無強二級結構之環構形，且由此可用作撓性連接體。CH1結構域之N-末端殘基係可變結構域之天然延伸體，此乃因其係Ig序列之一部分，且由此在較大程度上最小化可能源自連接體及接點之任一免疫原性。在一些實施例中，連接體序列包含基於鉸鏈序列之經修飾肽序列。
此外，可使抗體-細胞激素植入之蛋白質融合至標記物序列(例如肽)以促進抗體-細胞激素植入之蛋白質之純化。在較佳實施例中，標記物胺基酸序列係六組胺酸肽(SEQ ID NO: 121)，例如尤其係提供於pQE載體中之標籤(QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)，許多係市面有售。如Gentz等人，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824中所闡述，舉例而言，六組胺酸(SEQ ID NO: 121)提供植入蛋白之便利純化。可用於純化之其他肽標籤包含(但不限於)血球凝集素(「HA」)標籤(其對應於衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白之表位(Wilson等人，1984, Cell 37:767))及「flag」標籤。
抗體亦可附接至固體載體，此尤其可用於免疫分析或純化靶抗原。該等固體載體包含(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。用於抗體 - 細胞激素植入之蛋白質活性之分析
業內已知用於鑑別抗體-細胞激素植入之蛋白質之分析且闡述於本文中。激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質結合至IL2高親和力受體且促進、誘導、刺激細胞內信號傳導以產生Treg效應以及免疫刺激效應。
可使用業內已知之任一方法來測定抗體-細胞激素植入之蛋白質與IL2高親和力受體之結合。舉例而言，可使用已知技術(包含(但不限於) ELISA、西方印漬(Western blot)、表面電漿共振(例如BIAcore)及流式細胞術)來測定IL2高親和力受體結合。
可使用業內已知之任一方法來量測經由IL2高親和力受體之細胞內信號傳導。舉例而言，經由IL2進行活化可促進STAT5活化及信號傳導。量測STAT5活化之方法係業內標準方法(例如STAT5蛋白之磷酸化狀態、報告基因分析下游信號傳導分析等)。經由IL2高親和力受體進行活化可具有增加之Treg效應。另外，減小IL2低親和力受體結合可減小天然殺手(NK)細胞及CD 8 T效應細胞之增殖。量測細胞增殖之方法係業內標準方法(例如3 H-胸苷納入分析、CFSE標記)。量測細胞激素產生之方法在業內已眾所周知(例如ELISA分析、ELISpot分析)。在實施活體外分析時，可對與激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質接觸之測試細胞或測試細胞培養上清液與未與激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質接觸之對照細胞或對照細胞培養上清液及/或與重組人類IL2 (例如Proleukin®)接觸者進行比較。
亦可離體及/或在活體內量測抗體-細胞激素植入之蛋白質之活性。在一些態樣中，可使用量測來自使用抗體-細胞激素植入之蛋白質治療之動物(與未治療對照動物及/或類似地使用Proleukin®治療之動物相比)之各種離體細胞類型中STAT5活化之方法來展示激動劑抗體植入蛋白在各種細胞類型中的差異性活性。較佳激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質能夠活化並擴增Treg細胞。舉例而言，可使用業內已知之任一方法(例如藉由流式細胞術)來量測Treg細胞之活體內活化及擴增。較佳激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質可在治療上用於預防、減少、抑制或消除諸如以下等免疫相關病症：1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、白斑病、慢性移植物抗宿主病(cGvHD)、預防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV誘導之血管炎、斑禿、全身性硬化症、侷限性硬皮病及原發性抗磷脂症候群。可藉由以下方式來測定激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質在1型糖尿病及SLE中之效能：向個體投與治療有效量之抗體-細胞激素植入之蛋白質且比較在投與抗體-細胞激素植入之蛋白質之前及之後之個體。亦可藉由以下方式來測定激動劑抗體-細胞激素植入之蛋白質在治療1型糖尿病及SLE中之效能：向測試個體投與治療有效量之抗體-細胞激素植入之蛋白質且比較測試個體與未投與抗體之對照個體及/或與類似地使用Proleukin®進行治療之個體進行比較。編碼激動劑抗體 - 細胞激素植入之蛋白質之多核苷酸
在另一態樣中，提供編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之重鏈及輕鏈蛋白質之經分離核酸。可藉由業內已知之任一方式(包含(但不限於)重組表現、化學合成及抗體四聚體之酶促消解)來產生抗體-細胞激素植入之蛋白質。重組表現可來自業內已知之任一適當宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本文提供編碼SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:112中之任一者中所例示之可變區之多核苷酸。
本發明由此提供編碼本文所闡述e抗體-細胞激素植入之蛋白質之輕鏈及/或重鏈多肽之多核苷酸，例如編碼包括如本文所闡述互補決定區之輕鏈或重鏈可變區或區段之多核苷酸。在一些實施例中，編碼重鏈可變區之多核苷酸包括與選自由SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO:73及SEQ ID NO:99組成之群之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性的序列。在一些實施例中，輕鏈可變區之多核苷酸編碼包括與選自由SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO:86及SEQ ID NO: 112組成之群之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性的序列。
在一些實施例中，編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:23之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:36之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:49之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:62之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:75之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:88之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:101之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:114之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。
多核苷酸可僅編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之可變區序列。其亦可編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之可變區及恆定區。一些多核苷酸序列編碼包括一種抗體-細胞激素植入之蛋白質之重鏈及輕鏈之可變區之多肽。一些其他多核苷酸編碼兩個分別實質上與一種抗體蛋白植入體之重鏈及輕鏈之可變區相同之多肽區段。
在某些實施例中，多核苷酸或核酸包括DNA。在其他實施例中，多核苷酸或核酸包括可為單鏈或雙鏈之RNA。
在一些實施例中，提供重組宿主細胞，該細胞包括編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之一或多條免疫球蛋白鏈之核酸及視情況分泌信號。在某些實施例中，重組宿主細胞包括編碼一條免疫球蛋白鏈之載體及分泌信號。在其他某些實施例中，重組宿主細胞包括一或多個編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之兩條免疫球蛋白鏈之載體及分泌信號。在一些實施例中，重組宿主細胞包括編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之兩條免疫球蛋白鏈之單一載體及分泌信號。在一些實施例中，重組宿主細胞包括兩個載體，一個載體編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之重鏈免疫球蛋白鏈且另一載體編碼輕鏈免疫球蛋白鏈，每一載體包含分泌信號。重組宿主細胞可為原核或真核細胞。在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞系。在一些實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞系。在一些實施例中，宿主細胞係CHO細胞。在一些實施例中，宿主細胞系係用於產生抗體之CHO細胞系。
另外，提供產生抗體-細胞激素植入之蛋白質之方法。在一些實施例中，該方法包括以下步驟：(i)在適於表現、形成及分泌抗體-細胞激素植入之蛋白質之條件下培養包括一或多個編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之免疫球蛋白鏈之載體的宿主細胞；及(ii)回收抗體-細胞激素植入之蛋白質。
可藉由重新固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之多肽鏈之現有序列(例如如本文所闡述之序列)來產生多核苷酸序列。可藉由業內已知方法來達成核酸之直接化學合成，例如Narang等人，Meth. Enzymol. 68:90, 1979之磷酸三酯方法；Brown等人，Meth. Enzymol. 68:109, 1979之磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra. Lett., 22:1859, 1981之二乙基亞磷醯胺方法；及美國專利第4,458,066號之固體載體方法。可如(例如)以下文獻中所闡述藉由PCR向多核苷酸序列引入突變：PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (編輯), Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等人(編輯), Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1:17, 1991。
亦提供表現用於產生上述抗體-細胞激素植入之蛋白質之載體及宿主細胞。可採用各種表現載體來表現編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之免疫球蛋白多肽鏈或片段之多核苷酸。可使用基於病毒及非病毒之表現載體在哺乳動物宿主細胞中產生免疫球蛋白。非病毒載體及系統包含質體、附加型載體(通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現序列盒)及人類人工染色體(例如參見Harrington等人，Nat Genet 15:345, 1997)。舉例而言，可用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現抗體-細胞激素植入之蛋白質多核苷酸及多肽之非病毒載體包含pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C (Invitrogen, San Diego, CA)、MPSV載體及業內已知用於表現其他蛋白質之諸多其他載體。有用病毒載體包含基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒之載體、基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein Barr virus)之載體、牛痘病毒載體及西門利克森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)載體。參見Brent等人(見上文)；Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；及Rosenfeld等人，Cell 68:143, 1992。
表現載體之選擇取決於擬表現載體之預期宿主細胞。通常，表現載體含有啟動子及其他可操作地連接至編碼抗體-細胞激素植入之蛋白質之免疫球蛋白之多核苷酸之調控序列(例如增強子)。在一些實施例中，採用可誘導啟動子來預防除在誘導條件下插入序列之表現。可誘導啟動子包含(例如)阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可在非誘導條件下擴增經轉變有機體之培養物，此並不偏離表現產物由宿主細胞較佳耐受之編碼序列群體。除啟動子外，亦可需要或期望其他調控元件來有效表現抗體-細胞激素植入之蛋白質之免疫球蛋白鏈或片段。該等元件通常包含ATG起始密碼子及毗鄰核糖體結合位點或其他序列。另外，可藉由納入適用於細胞系統中之增強子來增強表現效率(例如參見Scharf等人，Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；及Bittner等人，Meth. Enzymol., 153:516, 1987)。舉例而言，可使用SV40增強子或CMV增強子來增加哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以形成輸出細胞並進入培養基中之抗體-細胞激素植入之蛋白質。在某些態樣中，在納入載體中之前，使抗體-細胞激素植入之蛋白質之所插入免疫球蛋白序列連接至信號序列。擬用於接收編碼免疫球蛋白輕鏈及重鏈可變結構域之序列之載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體容許以具有恆定區之植入蛋白形式表現可變區，由此使得產生完整抗體-細胞激素植入之蛋白質或其片段。通常，該等恆定區係人類區域。
用於具有及表現抗體-細胞激素植入之蛋白質鏈之宿主細胞可為原核或真核。大腸桿菌(E. coli )係一種可用於選殖及表現本發明多核苷酸之原核宿主。其他適用微生物宿主包含桿菌(bacilli) (例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))及其他腸桿菌科(enterobacteriaceae) (例如沙門氏菌(Salmonella)、黏質沙雷氏菌(Serratia)及各種假單胞菌(Pseudomonas)屬)。在該等原核宿主中，亦可製備通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製源)之表現載體。另外，存在任一數量之各種熟知啟動子，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常視情況使用操縱因子序列控制表現，且具有用於引發及完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及諸如此類。亦可採用其他微生物(例如酵母)來表現抗體-細胞激素植入之蛋白質多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一些較佳實施例中，使用哺乳動物宿主細胞來表現及產生抗體-細胞激素植入之蛋白質多肽。舉例而言，其可為含有外源性表現載體之哺乳動物細胞系。該等細胞包含任一正常短命或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已研發許多能夠分泌完整免疫球蛋白之適宜宿主細胞系，包含CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、經轉變B細胞及雜交瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽通常論述於(例如) Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987中。用於哺乳動物宿主細胞之表現載體可包含表現對照序列(例如複製源)、啟動子及增強子(例如參見Queen等人，Immunol. Rev. 89:49-68, 1986)及必需處理資訊位點(例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點)及轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒之啟動子。適宜啟動子可為組成型、細胞類型特異性、時期特異性及/或可調變或可調控。有用啟動子包含(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松可誘導MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素(tetracycline)可誘導CMV啟動子(例如人類即刻早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子及業內已知之啟動子-增強子組合。
引入含有所關注多核苷酸序列之表現載體之方法端視細胞宿主之類型而有所變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主(通常參見Sambrook等人，見上文)。其他方法包含(例如)電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體調介之轉變、注射及微注射、彈道方法、病毒體、免疫脂質體、多價陽離子:核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、植入至皰疹病毒結構蛋白VP22 (Elliot及O'Hare, Cell 88:223, 1997)、DNA之藥劑增強之吸收及離體轉導。對於重組蛋白之長期、高產率生產而言，通常期望穩定表現。舉例而言，可使用含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記物基因之表現載體來製備穩定表現抗體-細胞激素植入之蛋白質免疫球蛋白鏈之細胞系。在引入載體後，可在切換至選擇性培養基中之前使細胞在富集培養基中生長1-2天。可選擇標記物之目的在於賦予選擇抗性，且其存在容許生長在選擇性培養基中成功表現引入序列之細胞。可使用適用於細胞類型之組織培養技術增殖抗性穩定轉染細胞。包括抗體 - 細胞激素植入之蛋白質之組合物
提供包括調配至一起之抗體-細胞激素植入之蛋白質以及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。視情況，醫藥組合物另外含有適於治療或預防給定病症之其他治療劑。醫藥上可接受之載劑可增強或穩定組合物，或促進組合物之製備。醫藥上可接受之載劑包含生理上相容之溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及諸如此類。
醫藥組合物可藉由多種業內已知之方法來投與。投與途徑及/或模式端視期望結果而變化。較佳地，藉由非經腸投與(例如選自靜脈內、肌內、腹膜腔內、鞘內、動脈內或皮下中之任一者)來進行投與，或鄰近靶位點來進行投與。醫藥上可接受之載劑適於藉由以下方式中之任一者或多者進行投與：靜脈內、肌內、腹膜腔內、鞘內、動脈內、皮下、鼻內、吸入、脊柱或表皮投與(例如藉由注射或植入(inengrafted))。端視投與途徑，可於材料中對活性化合物(例如抗體-細胞激素植入之蛋白質)進行包衣以保護化合物免受酸及可使化合物失活之其他天然條件的作用。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。在一些實施例中，醫藥組合物係用於皮下投與之調配物。
抗體-細胞激素植入之蛋白質(單獨或與其他適宜組分組合)可製成擬經由吸入來投與之氣溶膠調配物形式(亦即，其可「霧化」)。可將氣溶膠調配物置於加壓可接受推進劑(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮及諸如此類)。
在一些實施例中，醫藥組合物無菌且係流體。可藉由(例如)以下方式來維持適當流動性：使用諸如卵磷酯等包衣，在分散液情形中維持所需粒徑，及使用表面活性劑。在多種情形下，較佳地在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)及氯化鈉。可藉由向組合物中納入延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來實現可注射組合物之長期吸收。在某些實施例中，可使用適當賦形劑(例如蔗糖)製備用於以凍乾形式進行儲存之組合物。
可根據業內熟知且通常實踐之方法來製備醫藥組合物。醫藥上可接受之載劑可部分地根據所投與特定組合物以及根據用於投與組合物之特定方法來確定。因此，存在醫藥組合物之眾多種適宜調配物。用於調配抗體-細胞激素植入之蛋白質及測定適當投藥及時間安排之可適用方法可參見(例如)Remington: The Science and Practice of Pharmacy ，第21版，University of the Sciences in Philadelphia編輯，Lippincott Williams & Wilkins (2005)；及Martindale: The Complete Drug Reference , Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.；及Martindale,Martindale: The Extra Pharmacopoeia ，第31版，1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編輯，Marcel Dekker, Inc., New York, 1978，該等文獻中之每一者以引用方式併入本文中。較佳地在GMP條件下製造醫藥組合物。通常，將治療有效劑量或有效劑量之抗體-細胞激素植入之蛋白質用於醫藥組合物中。藉由熟習此項技術者已知之習用方法將抗體-細胞激素植入之蛋白質調配至醫藥上可接受之劑型中。調節劑量方案以提供期望反應(例如治療反應)。在測定治療或預防有效劑量時，可投與低劑量且然後逐漸增加直至達成期望反應且具有最小或並無不期望副效應為止。舉例而言，可投與單次濃注劑，可隨時間投與若干個分次劑量或可根據治療狀況之緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。尤其有利的是，將非經腸組合物調配成劑量單位形式以便於投與及劑量均勻性。如本文所用之劑量單位形式係指適於作為單位劑量供擬治療個體使用之物理離散單元；各單元含有預定量之活性化合物，此預定量經計算與所需醫藥載劑一起產生期望治療效應。
本發明醫藥組合物中之活性成分之實際劑量值可變以便獲得有效達成對特定患者有期望治療反應之量的活性成分、組合物及投與模式，且對患者無毒。所選劑量量端視多種藥物代謝動力學因素而定，該等因素包含所用特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康情況及先前病史以及類似因素。使用第二藥劑之共調配
在一些實施例中，藥理學組合物包括抗體-細胞激素植入之蛋白質及一或多種其他藥理學藥劑之混合物。與本發明之抗體-細胞激素植入之蛋白質一起納入混合物中之實例性第二藥劑包含(但不限於)抗發炎劑、免疫調節劑、胺基水楊酸鹽及抗生素。適當選擇可取決於較佳配方、劑量及/或遞送方法。
在一些實施例中，將抗體-細胞激素植入之蛋白質與抗發炎劑共調配(亦即提供為混合物或製成混合物)。在特定實施例中，可聯合使用皮質類固醇抗發炎劑與抗體-細胞激素植入之蛋白質。所用皮質類固醇可選自甲基普賴蘇濃、氫化可體松、普賴松、布地奈德、美沙拉明及地塞米松中之任一者。適當選擇將取決於配方及遞送偏好。
在一些實施例中，將抗體-細胞激素植入之蛋白質與免疫調節劑共調配。在特定實施例中，免疫調節劑係選自6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、環孢素A、他克莫司(tacrolimus)及胺甲喋呤(methotrexate)中之任一者。在特定實施例中，免疫調節劑係選自抗TNF藥劑(例如英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、戈利木單抗)、那他珠單抗及維多珠單抗。
在一些實施例中，將抗體-細胞激素植入之蛋白質與胺基水楊酸鹽藥劑共調配。在特定實施例中，胺基水楊酸鹽係選自柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、美沙拉明、巴柳氮(balsalazide)、奧沙拉秦(olsalazine)或5-胺基水楊酸之其他衍生物。
在一些實施例中，將抗體-細胞激素植入之蛋白質與抗細菌劑共調配。實例性抗細菌劑包含(但不限於)磺醯胺類(例如對苯胺磺醯胺(sulfanilamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、磺胺醋醯(sulfacetamide))、甲氧苄啶(trimethoprim)、喹啉酮類(例如萘啶酮酸(nalidixic acid)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、培氟沙星(perloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)及吉米沙星(gemifloxacin))、烏洛托品(methenamine)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、青黴素(penicillin) (例如青黴素G、青黴素V、甲氧西林-扼煞西林(methicilin oxacillin)、氯噻青黴素(cloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcilin)、胺苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、卡本西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)及必倍西林(piperacillin))、頭孢菌素(cephalosporin) (例如頭孢若林(cefazolin)、頭孢力新(cephalexin)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢可若(cefaclor)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢呋辛酯(cefuroxime acetil)、氯碳頭孢(loracarbef)、西弗特坦(cefotetan)、頭孢雷特(ceforanide)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢噻肟酯(cefpodoxime proxetil)、頭孢布烯(cefibuten)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢妥侖匹酯(cefditoren pivorxil)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢他啶(ceftazidime)及頭孢吡肟(cefepine))、碳青黴烯(carbapenem) (例如亞胺培南(imipenem)、胺曲南(aztreonam))及胺基醣苷(例如新黴素(neomycin)、卡那黴素(kanamycin)、鏈黴素(streptomycin)、慶大黴素(gentamicin)、妥拉米星(toramycin)、奈替米星(netilmicin)及阿米卡星(amikacin))。製品 / 套組
在一些態樣中，將抗體-細胞激素植入之蛋白質提供於製品(亦即套組)中。所提供抗體-細胞激素植入之蛋白質通常存於小瓶或容器中。因此，該製品包括容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包含(例如)瓶、小瓶、注射器、溶液袋等。在適當時，抗體-細胞激素植入之蛋白質可呈液體或乾燥(例如凍乾)形式。容器容納組合物，該組合物本身或與另一組合物組合可有效地製備用於治療、預防及/或改善免疫相關病症之組合物。標記或包裝插頁指示，該組合物可用於治療、預防及/或改善免疫相關病症。包括如本文所闡述之抗體-細胞激素植入之蛋白質之製品(套組)視情況含有一或多種其他藥劑。在一些實施例中，製品(套組)含有抗體-細胞激素植入之蛋白質及醫藥上可接受之稀釋劑。在一些實施例中，將抗體-細胞激素植入之蛋白質與一或多種其他活性劑一起以同一調配物形式(例如呈混合物形式)提供於製品(套組)中。在一些實施例中，將抗體-細胞激素植入之蛋白質與第二或第三藥劑一起以分開調配物(例如分開容器)提供於製品(套組)中。在某些實施例中，製品(套組)含有抗體-細胞激素植入之蛋白質之等分試樣，其中等分試樣提供一或多個劑量。在一些實施例中，提供用於多次投與之等分試樣，其中劑量係均勻的或有所變化。在特定實施例中，在適當時，變化之投藥方案係遞增式或遞減式。在一些實施例中，抗體-細胞激素植入之蛋白質及第二藥劑之劑量獨立地均勻或獨立地有所變化。在某些實施例中，製品(套組)包括選自抗發炎劑、免疫調節劑、胺基水楊酸鹽及抗生素中之任一者之其他藥劑。一或多種其他藥劑之選擇將取決於劑量、遞送及擬治療疾病病狀。治療方法及組合物用於治療免疫相關病症之用途 經受治療或預防之病狀
抗體-細胞激素植入之蛋白質可用於治療、改善或預防免疫相關病症。在一態樣中，本發明提供治療有需要之個體之免疫相關病症之方法，其包括向個體投與治療有效量之如本文所闡述之抗體-細胞激素植入之蛋白質。在一態樣中，本發明亦提供用作治療劑之抗體-細胞激素植入之蛋白質。在一些實施例中，提供抗體-細胞激素植入之蛋白質以用作治療或預防個體之免疫相關病症之治療劑。在一些實施例中，提供抗體-細胞激素植入之蛋白質之用途，其用以製造用於治療有需要之個體之免疫相關病症之藥劑。在另一態樣中，本發明提供包括此一抗體-細胞激素植入之蛋白質之組合物，該組合物用於治療或改善有需要之個體之免疫相關病症。
經受治療之病狀包含免疫相關病症。出於治療目的，個體可患有免疫相關病症。出於預防性(preventative或prophylactic)目的，個體可自活性狀態之免疫相關病症有所緩解或可預測將來之發作。在一些實施例中，患者患有免疫相關病症，懷疑患有免疫相關病症，或自免疫相關病症有所緩解。使用抗體-細胞激素植入之蛋白質進行治療之免疫相關病症受益於IL2受體信號傳導對Treg細胞之活化。經受治療之免疫相關病症包含(但不限於)：1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、白斑病、慢性移植物抗宿主病(cGvHD)、預防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV誘導之血管炎、斑禿、全身性硬化症、侷限性硬皮病及原發性抗磷脂症候群。抗體 - 細胞激素植入之蛋白質之投與
醫師或獸醫可以低於達成期望治療效應所需之劑量來開始醫藥組合物中所採用抗體-細胞激素植入之蛋白質之劑量並逐漸增加劑量直至達成期望效應為止。一般而言，組合物之有效劑量端視許多不同因素有所變化，該等因素包含擬治療之具體疾病或病狀、投與方式、靶位點、患者生理學狀態、患者係人類抑或動物、其他藥劑投與及治療係預防性抑或治療性。通常需要逐步增加治療劑量以最佳化安全性及效能。對於抗體-細胞激素植入之蛋白質之投與而言，劑量介於約0.0001 mg/kg至100 mg/kg且更通常0.01 mg/kg至5 mg/kg宿主體重之間。舉例而言，劑量可為1 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg範圍內。若需要或期望，則投藥可為每天、每週、每兩週、每月或以更大或更小頻率進行。實例性治療方案需要每週一次、每兩週一次或每月一次或每3至6個月一次進行投與。
抗體-細胞激素植入之蛋白質可以單一或分開劑量來投與。通常投與抗體-細胞激素植入之蛋白質多次。若需要或期望，則單一劑量之間之間隔可為每週、每兩週、每月或每年。間隔亦可如藉由量測患者之抗體-細胞激素植入之蛋白質之血液含量所指示而不規則。在一些方法中，對劑量進行調整以達成1-1,000 µg/ml且在一些方法中為25-300 µg/ml之血漿抗體-細胞激素植入之蛋白質濃度。或者，抗體-細胞激素植入之蛋白質可以持續釋放調配物來投與，在該情形下需要較不頻繁之投與。劑量及頻率端視抗體-細胞激素植入之蛋白質在患者中之半衰期而變化。一般而言，抗體植入蛋白展示長於天然IL2或重組細胞激素(例如Proleukin®)之半衰期。投與劑量及頻率可端視治療為預防性抑或治療性而變化。一般而言，對於預防性應用，以相對較不頻繁之間隔經較長時間段投與相對較低之劑量。一般而言，對於治療性應用，有時需要相對較短間隔之相對較高之劑量直至減輕或終止疾病進展為止，且較佳地直至患者展示疾病症狀之部分或完全改善為止。此後，可向患者投與預防性方案。與第二藥劑共投與
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本發明中所闡述之治療病狀或病症。該投與涵蓋該等治療劑以實質上同時之方式、例如在具有固定比率活性成分之單一膠囊中共投與。或者，該投與涵蓋每一活性成分在多個容器中或在各別容器(例如膠囊、粉末及液體)中共投與。可在投與前將粉末及/或液體復原或稀釋至期望劑量。另外，該投與亦涵蓋各類治療劑以依序方式在大約相同的時間或在不同時間使用。在任一情形下，治療方案將在治療本文所闡述之病狀或病症中提供藥物組合之有益效應。
在一些實施例中，共投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與一或多種其他藥理學藥劑。在一些實施例中，投與抗體-細胞激素植入之蛋白質及其他一或多種藥劑之混合物。在一些實施例中，以分開調配物投與抗體-細胞激素植入之蛋白質及其他一或多種藥劑。在某些實施例中，在利用分開調配物之情形下，同時投與。在某些實施例中，在利用分開調配物之情形下，依序投與。在某些實施例中，在利用分開調配物之情形下，經由相同途徑投與。在某些實施例中，在利用分開調配物之情形下，經由不同途徑投與。與抗體-細胞激素植入之蛋白質共投與之實例性其他藥劑包含(但不限於)抗發炎劑、免疫調節劑、胺基水楊酸鹽及抗生素。適當選擇可取決於較佳配方、劑量及/或遞送方法。抗體-細胞激素植入之蛋白質亦可與用於治療免疫相關病症病狀之其他確立程序(例如手術)一起用於組合療法中。
在一些實施例中，共投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與抗發炎劑。在特定實施例中，可聯合使用皮質類固醇抗發炎劑與抗體-細胞激素植入之蛋白質。所用皮質類固醇可選自甲基普賴蘇濃、氫化可體松、普賴松、布地奈德、美沙拉明及地塞米松中之任一者。適當選擇將取決於配方及遞送偏好。
在一些實施例中，共投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與免疫調節劑。在特定實施例中，免疫調節劑係選自6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、環孢素A、他克莫司及胺甲喋呤中之任一者。在另一實施例中，免疫調節劑係選自抗TNF藥劑(例如英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、戈利木單抗)、那他珠單抗及維多珠單抗。
在一些實施例中，共投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與胺基水楊酸鹽藥劑。在特定實施例中，胺基水楊酸鹽係選自柳氮磺胺吡啶、美沙拉明、巴柳氮、奧沙拉秦或5-胺基水楊酸之其他衍生物。
在一些實施例中，共投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與抗細菌劑。實例性抗細菌劑包含(但不限於)磺醯胺類(例如對苯胺磺醯胺、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺醋醯)、甲氧苄啶、喹啉酮類(例如萘啶酮酸、西諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星、氟羅沙星、培氟沙星、左氧氟沙星、加雷沙星及吉米沙星)、烏洛托品、呋喃妥因、青黴素(例如青黴素G、青黴素V、甲氧西林-扼煞西林、氯噻青黴素、雙氯西林、萘夫西林、胺苄西林、阿莫西林、卡本西林、替卡西林、美洛西林及必倍西林)、頭孢菌素(例如頭孢若林、頭孢力新、頭孢羥胺苄、頭孢西丁、頭孢可若、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢呋辛酯、氯碳頭孢、西弗特坦、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢噻肟酯、頭孢布烯、頭孢地尼、頭孢妥侖匹酯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶及頭孢吡肟)、碳青黴烯(例如亞胺培南、胺曲南)及胺基醣苷(例如新黴素、卡那黴素、鏈黴素、慶大黴素、妥拉米星、奈替米星及阿米卡星)。
在一些實施例中，共投與抗體-細胞激素植入之蛋白質與標準護理。舉例而言，在治療1型糖尿病時，標準護理係投與胰島素或胰島素療法。隨著胰島素基本上恢復正常糖含量，本文所揭示之抗體-細胞激素植入之蛋白質仍良好地促進免疫耐受性。實例 實例 1 ： IL2 抗體 - 細胞激素植入之蛋白質之產生
藉由將IL2序列改造至各種免疫球蛋白支架之CDR區中來生成抗體-細胞激素植入之蛋白質，然後使用重鏈及輕鏈免疫球蛋白鏈來生成最終抗體-細胞激素蛋白。抗體-細胞激素植入之蛋白質賦予IL2之較佳治療性質；然而，與rhIL2相比，抗體-細胞激素植入之蛋白質具有減少之不期望效應，例如增加之NK細胞活性。
為產生抗體-細胞激素植入之蛋白質，將含有突變蛋白之IL2序列(SEQ ID NO:4或6)插入免疫球蛋白鏈支架之CDR環中。使用已用於臨床環境中之各種已知免疫球蛋白序列以及種系抗體序列來製備抗體-細胞激素植入之蛋白質。稱為GFTX3b之實例性支架中之IL2序列繪示於表2中。基於可用結構或同源性模型數據，插入點選擇位於環之中點處。使用標準分子生物學方法利用編碼相關序列之重組DNA來產生抗體-細胞激素植入之蛋白質。
基於以下參數來選擇經選擇用於細胞激素植入之CDR：所需生物學、生物物理學性質及有益研發特徵。建模軟體僅部分地可用於預測提供期望參數之CDR及CDR內位置，由此製備所有6種可能之抗體-細胞激素移植物且然後在生物分析中評估。若達成所需生物活性，則解析生物物理學性質，例如關於抗體-細胞激素植入分子如何與各別細胞激素受體相互作用之結構解析。
對於抗體IL2植入分子而言，首先解析視為用於細胞激素植入之候選抗體之結構。自此結構注意到，互補位(抗體中與表位相互作用之部分)位於抗體「臂」之極端N-末端且植入此位置中之細胞激素將細胞激素呈遞至其各別受體。因移植技術，每一抗體-IL2植入之蛋白質受限於不同長度、序列及結構環境之CDR環。因此，將IL2植入所有6個CDR (對應於LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3及HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3)中。圖1展示所製備IL2抗體-細胞激素移植物之不同實例性形式，該等形式包含各種點突變且將IL2插入點移位至CDR環之N或C部分中(nH1、cH1、nH2、cH2)。自圖1中之表格顯而易見，抗體-細胞激素植入之蛋白質的活性皆不同，包含植入CDR2之輕鏈中之IL2 (IgG.IL2.L2)不表現之情形。亦觀察到，具有改變之Fc功能(例如Fc沉默)之IL2抗體-細胞激素移植物具有較佳特徵。
HCDR-1選擇，此乃因其具有最佳組合之性質(生物物理學及生物)且經包含以增強期望生物性質之IL2點突變。對於插入點之選擇而言，選擇CDR環之結構中心，此乃因此中心在任一側提供最大空間(線性大小3.8Å ×殘基數)，且不受限於任一理論，此方式藉由容許IL2更易於獨立摺疊來提供穩定分子。因移植支架GFTX3b之結構係已知的，故每一CDR結構之中心亦已知。此中心與如使用Chothia編號格式所定義之CDR環序列之中心一致。如先前所提及，IL-2移植物之插入點移位至遠離中心並朝向CDR環之N或C末端部分移位。然而，CDR環內之IL2移位並不顯著改變生物活性。
總而言之，基於結構來選擇每一CDR中之插入點，且假設移植至CDR中將向IL2受體之個別亞單元提供一定程度之立體阻礙。特定細胞激素之最佳CDR移植之最終選擇係基於期望生物學及生物物理學性質。細胞激素受體之性質、細胞激素/受體相互作用及信號傳導機制亦發揮作用且此係藉由比較每一個別抗體-細胞激素分子之各別性質所得出。表 1 表 2 實例 2 ： 抗體 - 細胞激素植入之蛋白質展示對 Treg 細胞之較大活性及增加之半衰期
選擇IgG.IL2D49A.H1及IgG.IL2.L3，此乃因其達成優於Proleukin®之期望生物效應(圖1匯總相對變化)。該等效應包含：Treg相對於Tcon及NK細胞之IL-2R選擇性、小鼠中Treg相對於Tcon及NK細胞之較大半衰期擴增。
在評價高親和力IL-2受體刺激時，Proleukin®及IgG.IL2D49A.H1移植物皆針對Treg細胞展示相當之信號功效，但不同於Proleukin®，IgG.IL2D49A.H1展示針對CD8 T效應細胞及NK細胞之活性降低至消失。植入CDRL3中之IL2 (IgG.IL2.L3)對Treg展示小於Proleukin®之信號功效，但對NK細胞並無活性。自HemaCare Corp.購買人類末梢血單核細胞(hPBMC)且在活體外使用Proleukin®、IgG.IL2D49A.H1或IgG.IL2.L3測試以評價對IL-2高親和力受體之選擇性活性。使細胞在無血清測試培養基中靜置，並添加至每一孔中。向孔中添加抗體-細胞激素植入之蛋白質或天然人類IL-2，並在37℃下培育20 min。在20 min之後，將細胞固定，使用表面標記物染色，滲透並使用STAT5抗體(BD Biosciences)遵循製造商說明書進行染色。
IgG.IL2D49A.H1或IgG.IL2.L3在血漿中之藥物動力學展示在僅1個劑量之後其半衰期長於Proleukin®。在使用Proleukin®或移植物進行一個治療之後8天，在糖尿病前NOD小鼠之脾中評價細胞擴增。IgG.IL2D49A.H1達成優於T效應細胞及NK細胞之Treg擴增且其在糖尿病前小鼠中之耐受性優於Proleukin®。STAT5刺激、IgG.IL2D49A.H1及IgG.IL2.L3之PK/PD之匯總展示於圖2中。此圖展示，抗體-細胞激素植入之蛋白質可不僅具有大於Proleukin®之半衰期，且亦刺激靶向Treg細胞，而不會不期望地刺激T效應細胞及NK細胞。 實例 3 ： 抗體 - 細胞激素植入之蛋白質對 Treg 細胞展示較大活性
非肥胖糖尿病性(NOD)小鼠自發性發生1型糖尿病且通常用作人類1型糖尿病之動物模型。向糖尿病前NOD小鼠投與等莫耳之Proleukin® (每週3次)及不同抗體-細胞激素植入之蛋白質(每週1次)。在第一治療之後8天，處理脾以獲得單一細胞懸浮液並在RPMI (10% FBS)中洗滌。使用紅血球裂解緩衝液(Sigma R7757號)裂解紅血球並對細胞之細胞數及存活率進行計數。在標準方案下使用FACS緩衝液(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05%疊氮化鈉)實施FACS染色。使用表面抗體：大鼠抗小鼠CD3-BV605 (BD Pharmingen 563004號)、大鼠抗小鼠CD4-Pacific Blue (BD Pharmingen 558107號)、大鼠抗小鼠CD8-PerCp (BD Pharmingen 553036號)、CD44 FITC (Pharmingen 553133號)、大鼠抗小鼠CD25-APC (Ebioscience 17-0251號)將細胞染色，且隨後固定/滲透並根據抗小鼠/大鼠FoxP3 Staining Set PE (Ebioscience 72-5775號)針對FoxP3進行染色。在BD LSR Fortessa®或BD FACS LSR II®上分析細胞，且使用FlowJo®軟體來分析數據。圖3展示自每一脾計算之倍數值及比率(以絕對數形式)且比較IgG.IL2D49A.H1及IgG.IL2D113A.H1與Proleukin®。在頂行中展示，使用IgG.IL2D49A.H1可增加Treg細胞之擴增且並不擴增CD8 T效應細胞或NK細胞。與之相比，低劑量及較高劑量之Proleukin®則擴增所有細胞類型。 實例 4 ： CD4 Tcon 及 CD8 Teff 中之活體外 IL-2R 信號傳導功效有所減小 ， 但在 Treg 中並不減小
在活體外測試Proleukin®及IgG.IL2D49A.H1對IL-2R、人類及食蟹猴PBMC之信號功效。IgG.IL2D49A.H1及Proleukin®在等莫耳IL2濃度下對表現高親和力IL-2R之Treg細胞展示類似信號功效，但僅IgG.IL2D49A.H1對表現低親和力IL-2受體之習用CD4及CD8 T效應細胞展示減小之功效。在人類及食蟹猴PBMC中觀察到該等結果。對於分析而言，在無血清測試培養基中靜置PBMC細胞，並添加至每一孔中。向孔中添加IgG.IL2D49A.H1或Proleukin®，並在37℃下培育20分鐘。在20分鐘之後，將細胞固定，使用表面標記物染色，滲透並使用STAT5抗體(BD Biosciences)遵循製造商說明書進行染色。在BD LSR Fortessa®上分析細胞且使用FlowJo®軟體分析數據。
如圖4中所展示之結果尤其明顯。在人類及食蟹猴PBMC中，在Treg中發現pSTAT5由IgG.IL2D49A.H1活化，在CD8 T效應物中之活化極少。 實例 5 ： IgG.IL2D49A.H1 在活體外擴增功能性及穩定之 Treg
Treg之改良選擇性伴有功能效應。使用IgG.IL2D49A.H1擴增之Treg係等效於或優於Proleukin®擴增之Treg之T效應細胞阻抑因子。在此分析中，藉由離心在Ficoll-Hypaque梯度(GE HealthCare目錄號17-1440-03)下自全血純化人類PBMC。對PBMC實施RBC裂解(Amimed目錄號3-13F00-H)。使用EasySep CD4+ T細胞富集套組(StemCell Technologies目錄號19052)富集CD4+ T細胞。使用V500抗CD4 (純系RPAT4)、PerCP-Cy5.5抗CD127及APC抗CD25將富集CD4+染色並分選以分離CD4+CD127-CD25+天然調控性T細胞(nTreg)及CD4+CD127+CD25- T反應者(Tresp)。將分選Treg重複平鋪(1×105 /100μl/孔)於填充有培養基之96孔圓底微量板中並使用微珠以3:1珠粒-對-細胞比率在1nM或0.3nM Proleukin®或等莫耳濃度IgG.IL2D49A.H1存在下進行刺激。在37℃下培育24小時之後，向孔中再填充100μl含有相同IL2濃度之培養基。在第3天，懸浮培養物，一分為二並再填充100μl含有相同IL2濃度之培養基。在第6天，如同第3天來處理培養物。在第8天，收穫細胞，彙集於管中並藉由將管置於multistand magnet上1-2分鐘來去除珠粒。收集含有細胞之上清液並在室溫下以200g離心5分鐘。然後將細胞計數，並再次以約5×105 /ml平鋪於填充由含有1/5之原始IL2濃度之培養基之48孔平底微量板中。在靜置2天之後，收穫細胞，計數並分析或用於阻抑分析中。如製造商說明書中所闡述分別使用0.8µM CTViolet (Life Technologies目錄號C34557)及1µM CFSE (Life Technologies目錄號C34554)來標記經擴增Treg及新解凍CD4+CD127+CD25- T反應(Tresp)細胞。為評價經擴增Treg之阻抑性質，將3×104 個CFSE標記Tresp一式三份單獨或與CTViolet標記Treg (不同Tresp:Treg比率)一起平鋪並使用Dynabeads以1:8珠粒-對-細胞比率(最終體積為200μl/孔)進行刺激。在4-5天之後，收集細胞並藉由流式細胞術評估反應細胞之增殖。
在新鮮及擴增Treg以及Tresp細胞中評估甲基化狀態。使用來自Qiagen之Allprep® DNA/RNA Mini (目錄號80204)自＞5.0 × 105 個細胞分離基因體DNA (gDNA)。然後，使用來自Sigma之Imprint® DNA修飾套組(目錄號MOD50)處理200ng gDNA以將未甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶(同時甲基化胞嘧啶保持不變)。然後在8ng亞硫酸氫鹽轉化之gDNA上使用基於序列特異性探針之實時PCR利用EpiTect MethyLight® PCR+ROX (Qiagen目錄號59496)、Epitect對照DNA (Qiagen目錄號59695)、標準甲基化(Life Technologies，目錄號12AAZ7FP)及未甲基化(Life Technologies，目錄號12AAZ7FP)質體、Treg特異性去甲基化區域(TSDR)、甲基化及未甲基化正向及反向引子及探針(MicroSynth)來評估定量甲基化。如EpiTect MethyLight® PCR手冊中所闡述來計算甲基化百分比。
圖5以圖形形式展示Proleukin®及IgG.IL2D49A.H1擴增Treg對Foxp3基因座之穩定去甲基化。經IgG.IL2D49A.H1在活體外擴增之人類Treg藉由Foxp3表現及去甲基化而穩定，從而產生穩定Treg細胞。 實例 6 ： 使用 IgG.IL2D49.H1 之活體外人類 NK 中之對 IL-2R 信號傳導之功效有所減小
與Proleukin®相比，等莫耳濃度之IgG.IL2D49A.H1在NK細胞中展示減小之信號傳導功效。使PBMC細胞在無血清測試培養基中靜置，並添加至每一孔中。向孔中添加IgG.IL2D49A.H1或Proleukin®，並在37℃下培育20分鐘。在20分鐘之後，使用1.6%甲醛固定細胞，洗滌並使用表面標記物染色。在室溫下30分鐘之後，洗滌試樣且使用-20℃甲醇滲透再懸浮細胞糰粒，洗滌並使用STAT5及DNA嵌入劑染色。在Cytof上運行細胞並使用FlowJo®軟體分析數據。結果展示於圖6中，其中IgG.IL2D49A.H1對NK細胞具有極少效應。與之相比，Proleukin®處理會增加NK細胞上之pSTAT5活性，此係Proleukin®處理之不期望副效應。 實例 7 ： 評估在經皮下投與雌性食蟹猴時 IgG.IL2D49A.H1 之藥物動力學 (PK) 、藥效動力學 (PD) 及毒理學效應。
與低劑量Proleukin®相比，食蟹猴中之IgG.IL2D49A.H1展示延長藥物動力學、優於T效應細胞之Treg擴增及較小毒性。根據Novartis動物護理與使用委員會(Novartis Animal Care and Use Committee)批准之一般方案第TX 4039號、使用此方案並使用設施標準操作程序(SOP)來實施此非臨床實驗室研究。
在研究之第一天，經皮下向動物投用IgG.IL2D49A.H1或Proleukin®。在研究之每一劑量值下自所有動物收集血液。在投藥前第1天、在投藥後1小時、6小時及12小時，且然後在第2、3、4、5、6、7、8、10及12天。將用於藥物動力學及藥效動力學之所有血樣離心，並獲得血漿試樣。將所得血漿試樣轉移至單一聚丙烯管中並在大約-70℃或更低溫度下冷凍。分析所有試樣，且使用免疫分析量測血漿中之IgG.IL2D49A.H1及Proleukin®之濃度。計算藥物動力學參數(例如半衰期)，且藉由FACS針對藥效動力學對細胞進行免疫表現型分型。IL-2/IL-2 Gyros分析方案如下。一式兩份運行每一試樣，其中每一重複分析需要5µL以1:20稀釋之試樣。捕獲抗體係山羊抗人類IL-2生物素化抗體(R&D Systems BAF202)並使用Alexa 647抗人類IL-2純系MQ1-17H12 (Biolegend 500315)進行檢測(LOQ: 0.08 ng/ml)，使用Gyrolab Bioaffy200®利用Gyros CD-200s®來實施所有免疫分析。
圖7展示IgG.IL2D49A.H1與Proleukin®之間之對比。IgG.IL2D49A.H1具有12小時之半衰期，而Proleukin®具有3小時之半衰期。伴隨IgG.IL2D49A.H1之延長半衰期，Treg活性有所增加且嗜酸性球增多症毒性大大減少。 實例 8 ： IgG.IL2D49A.H1 展示相對於 Proleukin® 之延長半衰期
在單一投與之後，IgG.IL2D49A.H1展示大約12小時之半衰期，與之相比，Proleukin®之半衰期為4小時。經靜脈內或經皮下向幼稚CD-1動物進行投藥並在投藥前、在投藥後1小時、3、7、24、31、48、55及72小時自所有動物收集血液。離心血樣，並獲得血漿試樣。將所得血漿試樣轉移至單一聚丙烯管中並在-80℃下冷凍。分析所有試樣，且使用免疫分析量測血漿中之IgG.IL2D49A.H1之濃度。IL-2/IL-2 Gyros分析方案如下。一式兩份運行每一試樣，其中每一重複分析需要5µL以1:20稀釋之試樣。捕獲抗體係山羊抗人類IL-2生物素化抗體(R&D Systems BAF202)並使用Alexa 647抗人類IL-2純系MQ1-17H12 (Biolegend 500315)進行檢測(LOQ: 0.08 ng/ml)，使用Gyrolab Bioaffy200®利用Gyros CD-200s®來實施所有免疫分析。此分析擴展實例7之半衰期測定。此分析之結果展示於圖8中，其中測得IgG.IL2D49A.H1之半衰期為12-14小時，與之相比，Proleukin®之半衰期為4小時。 實例 9 ： xeno-GvHD 小鼠中之人類 Treg 發生擴增 ， 但 T 效應細胞或 NK 細胞並不擴增
IgG.IL2D49A.H1在xeno-GvHD模型中較T效應細胞或NK細胞選擇性擴增Treg，而Proleukin®則無此功能。經由腹膜腔內注射向NOD-scid IL2Rγ缺失小鼠(NSG)注射來自健康供體之hPBMC (HemaCare Corp)。在注射之後24小時，向動物投用IgG.IL2D49A.H1 (每週1次)或Proleukin® (每週5次)並持續整個研究。在研究期間，每週兩次監測體重。在第一劑量之後28天每組收穫4隻小鼠，且處理脾以獲得單一細胞懸浮液並在RPMI (10% FBS)中洗滌。使用紅血球裂解緩衝液裂解紅血球並對細胞之細胞數及存活率進行計數。在標準方案下使用FACS緩衝液(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05%疊氮化鈉)實施FACS染色。使用表面抗體將細胞染色且隨後固定/滲透並根據抗小鼠/大鼠FoxP3 Staining Set PE (Ebioscience 72-5775號)針對FoxP3進行染色。在BD LSR Fortessa®上分析細胞且使用FlowJo®軟體分析數據。倍數值及比率係基於自每一脾絕對數量計算之相對數量。圖9展示，IgG.IL2D49A.H1在此小鼠模型中擴增Treg細胞且遠優於Proleukin®，且亦減小Tcon及NK細胞之不期望擴增。
在使用IgG.IL2D49.H1治療xeno-GvHD小鼠並注射人類PBMC (外來細胞)時，其在治療過程中維持正常體重。與之相比，使用Proleukin®治療之小鼠具有嚴重體重損失。在研究期間每週兩次監測體重，且在考慮動物在招募時之初始重量下來計算體重百分比。此改良與IgG.IL2D49A.H1在此模型中對Treg增強之效應有關，且數據以圖形形式展示於圖10中。此數據指示，IgG.IL2D49A.H1及其他抗體-細胞激素植入之蛋白質具有較大治療指數及安全邊際。 實例 10 ： IgG.IL2D49A.H1 在 NOD 小鼠糖尿病模型中預防 1 型糖尿病發生
藉由腹膜腔內注射向糖尿病前NOD雌性小鼠投與等莫耳之Proleukin® (每週3次)及IgG.IL2D49A.H1 (每週1次)。在研究期間(在第一劑量之後4個月)，每週兩次監測小鼠之血糖及體重。圖11展示，經IgG.IL2D49A.H1治療之小鼠維持低血糖值。因此，使用IgG.IL2D49A.H1治療之小鼠不會進展至明顯1型糖尿病(T1D)。與之相比，經Proleukin®治療之小鼠在開始時具有低血糖值，但此值隨時間增加且產生1型糖尿病症狀。 實例 11 ： 糖尿病前 NOD 小鼠中之 IgG.IL2D49A.H1 與低劑量 Proleukin®
在NOD小鼠模型中，與3個劑量之Proleukin®相比，一個劑量之IgG.IL2D49A.H1展示優良Treg擴增、較佳耐受性且並無不良事件。藉由腹膜腔內注射向糖尿病前NOD雌性小鼠投與等莫耳之低劑量Proleukin® (每週3次)及IgG.IL2D49A.H1 (每週1次)。在第一劑量之後4天每組獲取4隻小鼠，且處理脾以獲得單一細胞懸浮液並在RPMI (10% FBS)中洗滌。使用紅血球裂解緩衝液裂解紅血球並對細胞之細胞數及存活率進行計數。在標準方案下使用FACS緩衝液(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05%疊氮化鈉)實施FACS染色。使用表面抗體：大鼠抗小鼠CD3-BV605 (BD Pharmingen 563004號)、大鼠抗小鼠CD4-Pacific Blue (BD Pharmingen 558107號)、大鼠抗小鼠CD8-PerCp (BD Pharmingen 553036號)、CD44 FITC (Pharmingen 553133號)、大鼠抗小鼠CD25-APC (Ebioscience 17-0251號)將細胞染色，且隨後固定/滲透並根據抗小鼠/大鼠FoxP3 Staining Set PE (Ebioscience 72-5775號)針對FoxP3進行染色。在BD LSR Fortessa®或BD FACS LSR II®上分析細胞，且使用FlowJo®軟體來分析數據。倍數值及比率係基於自每一脾絕對數量計算之相對數量。在NOD小鼠模型中，投與單一劑量之IgG.IL2D49A.H1可展示大於重複投與之Proleukin®之Treg擴增，如圖12中所展示。 實例 12 ： 有效劑量之 IgG.IL2D49A.H1 在 NOD 小鼠模型中之藥物動力學
在1個劑量之後最長48小時於血漿中分析1.3 mg/kg及0.43mg/kg IgG.IL2D49A.H1之藥物動力學。經腹膜腔內向糖尿病前10週齡NOD小鼠投用兩種不同濃度之IgG.IL2D49A.H1且在投藥後1小時、3小時、7小時、24小時及48小時自所有動物收集血液。離心血樣，並獲得血漿試樣。將所得血漿試樣轉移至單一聚丙烯管中並在-80℃下冷凍。使用以下三種適用於Gyros平臺之不同方法分析每一試樣以檢測IgG.IL2D49A.H1血漿濃度：1)基於IL2之捕獲及檢測，2)基於IL2之捕獲及基於hFc之檢測，及3)基於hFc之捕獲及檢測。一式兩份運行每一試樣，其中每一重複分析需要5µL以1:20稀釋之試樣。Gyros IL-2/IL-2分析使用捕獲山羊抗人類IL-2生物素化抗體(R&D Systems BAF202)並使用Alexa 647抗人類IL-2純系MQ1-17H12 (Biolegend 500315)進行檢測。對於IL-2/Fc檢測而言，使用捕獲山羊抗人類IL-2生物素化抗體(R&D Systems BAF202)，且為進行檢測，使用Alexa 647山羊抗人類Fc特異性IgG (Jackson ImmunoResearch 109-605-098)抗體。對於人類Fc/Fc分析而言，使用捕獲生物素化山羊抗人類Fc特異性IgG (Jackson ImmunoResearch 109-065-098號)。檢測步驟使用Alexa 647山羊抗人類Fcγ特異性IgG (Jackson ImmunoResearch 109-605-098號)。使用Gyrolab Bioaffy200®利用Gyros CD-200s實施所有免疫分析。此小鼠模型中之量化限值(LOQ)為48小時，如圖13A中所展示。在圖13B中對此物質與Proleukin®及IL2-Fc融合蛋白進行比較。此圖形展示，抗體-細胞激素植入之蛋白質(例如IgG.IL2D49.H1)之LOQ較高。 實例 13 ： 糖尿病前 NOD 小鼠中之劑量範圍發現
與相同等莫耳濃度之Proleukin®相比，IgG.IL2D49A.H1展示相對於CD4 Tcon及CD8 T效應細胞之優良Treg擴增。在最高Proleukin®組中發現不良事件(例如死亡率)，且在使用任一劑量之IgG.IL2D49.H1治療之小鼠中未發現死亡率。
藉由腹膜腔內注射向糖尿病前NOD雌性小鼠投與等莫耳之低劑量IL-2 (每週3次)及IgG.IL2D49A.H1 (每週1次)。在第一劑量之後8天對每組之三隻小鼠實施安樂死並收穫脾。處理脾以獲得單一細胞懸浮液並在RPMI (10% FBS)中洗滌。收集血液，使用紅血球裂解緩衝液裂解紅血球並對細胞之細胞數及存活率進行計數。在標準方案下使用FACS緩衝液(1xPBS + 0.5% BSA + 0.05%疊氮化鈉)實施FACS染色。使用表面抗體將細胞染色且隨後固定/滲透並根據抗小鼠/大鼠FoxP3 Staining Set PE (Ebioscience 72-5775號)針對FoxP3進行染色。在BD LSR Fortessa®上分析細胞且使用FlowJo®軟體分析數據。比率係基於自每一脾計算之相對細胞數量。此數據提供於圖14中。該表提供抗體-細胞激素植入之蛋白質之劑量範圍格式。亦證實，IgG.IL2D49A.H1之治療指數大於Proleukin®，此乃因投藥在較大範圍內充分耐受。與之相比，投與較高劑量之Proleukin®會在小鼠中產生發病及死亡。最高劑量之Proleukin®產生足以導致必須停止此劑量之治療之發病及死亡。 實例 14 ： 人類 PBMC 中之 STAT5 信號傳導
在健康供體人類PBMC中以及在來自自體免疫供體之PBMC中，IgG.IL2D49A.H1相對於Tcon及NK可選擇性活化Treg。在活體外使用IgG.IL2D49.H1治療之後，STAT5信號傳導在Tcon中之功效有所減小，但在Treg中並不減小。使來自健康個體及自體免疫患者之人類PBMC (Hemacare Corp)細胞在無血清測試培養基中靜置，並添加至每一孔中。向孔中添加IgG.IL2D49A.H1，並在37℃下培育20 min。在20分鐘之後，將細胞固定，使用表面標記物染色，滲透並使用STAT5抗體(BD Biosciences)遵循製造商說明書進行染色。在BD LSR Fortessa®上分析細胞且使用FlowJo®軟體分析數據。圖15A中之數據指示，在使用IgG.IL2D49A.H1處理自人類白斑病患者獲取之PBMC時，NK、CD4 T con或CD8 T效應細胞存在極小活化，同時維持Treg活性。在自SLE及橋本氏病(Hashimoto’s disease)患者獲取之PBMC中亦觀察到此結果(數據未展示)。圖15B展示，自人類1型糖尿病(T1D)患者獲取並使用IgG.IL2D49A.H1及Proleukin®處理之PBMC對NK細胞、CD8 T效應細胞或CD4 Tcon細胞具有極小pSTAT5活性。因IgG.IL2D49A.H1處理可有效用於正常PBMC中並在自T1D患者獲取之PBMC中充分耐受,故此可指示，抗體-細胞激素蛋白可用於治療T1D，即使患者正接收胰島素療法。此指示，IgG.IL2D49A.H1在患有該等免疫相關病症之患者中充分耐受，且有效解決該等免疫相關病症。 實例 15 ： 抗體 - 細胞激素植入之蛋白質之結合
將含有突變蛋白之IL2序列(SEQ ID NO:4或6)插入免疫球蛋白鏈支架之CDR環中。使用已用於臨床環境中之各種已知免疫球蛋白序列以及種系抗體序列來製備抗體-細胞激素植入之蛋白質。一種所用抗體具有RSV作為其抗原。為測定將IL2植入此抗體之CDR中是否會減小或廢止RSV結合，在PBS或碳酸鹽緩衝液中對RSV蛋白運行ELISA分析。如圖16中所展示，此似乎受選擇用於IL2植入之CDR影響。舉例而言，IgG.IL2D49A.H1之RSV結合類似於未移植(未修飾)原始抗體。與之相比，將IL2植入CDR3之輕鏈(CDR-L3)或CDR-H3中可減小結合。如所預計，植入不相關抗體(Xolair)中之IL2並不產生結合。此證實，抗體-細胞激素植入之蛋白質可保持結合至抗體支架之原始靶，或此結合可有所減小。 實例 16 ： 非人類靈長類動物中之 Treg 擴增
以兩個單一遞增皮下劑量向食蟹猴投與IgG.IL2D49A.H1，該等劑量係以4週無間隔投藥形式在2個劑量組(3M/組)之間交替給予。隨後係兩個組(3M/組)中之2週多劑量期且接收6個皮下劑量(在兩週內每個一天)之緩衝液或5mg/kg IgG.IL2D49A.H1。藉由流式細胞術(免疫表現型分型)自「單一劑量期」 (相隔29天給予兩個劑量)評價之淋巴球群體變化展示於圖17中。在125 µg/kg及375 µg/kg劑量下，觀察到Treg之絕對數量增加3-4倍及最多5.5倍且對Tcon或NK細胞並無任何表觀效應。最大Treg擴增可見於第4天且Treg數量在第10天時返回基線附近。IgG.IL2D49A.H1較為安全並充分耐受，且並無死亡、臨床體徵或體重、食物消耗、細胞激素含量或臨床病理學之變化。另外，在研究中，在最高2.4 mg/kg之單一劑量或每隔一天之多個劑量(兩週，5 mg/kg)之後，未觀察到心血管效應(ECG或血壓)。並無血管滲漏適應症或其他CV相關發現。 實例 17 ：抗藥物抗體效應之風險
為測定抗藥物抗體效應對GFTX3b_IL-2-H1-D49A之選擇性特徵之風險，在Fc交聯抗體存在下於劑量反應中實施信號傳導分析。
將人類PBMC以3×106 個細胞/ml再懸浮於RPMI完整培養基中，以3×105 個細胞/孔(100ul)平鋪並靜置2 hr。在單獨96孔板上，在2×最終濃度下於培養基中製備最高濃度之Proleukin、GFTX3b_IL-2-H1-D49A及GFTX3b_IL-2-H1-D49A +莫耳過量山羊F(ab’)2抗人類IgG、僅山羊F(ab’)2抗人類IgG (Southern Biotech目錄號2042-01，批號J1715-PI77)及滴定曲線。對於所有條件而言，IL2等效物之最高濃度為200nM。製備最高濃度且在最高濃度以下(使用插入1:2稀釋)來製備Proleukin及GFTX3b_IL-2-H1-D49A之10點稀釋曲線。另外，使用GFTX3b_IL-2-H1-D49A在最高濃度200nM下(等效IL-2)且使用抗人類IgG在0.5×、1×、2.5×、5×及10× GFTX3b_IL-2-H1-D49A下(基於莫耳濃度)來製備滴定曲線。在每一條件之最高濃度以下製備10點1:10稀釋曲線。製備抗人類IgG + GFTX3b_IL-2-H1-D49A滴定液並在室溫下培育20分鐘，然後添加至PBMC中。
將製備條件(或僅培養基)添加至PBMC中直至最終體積為100ul/孔。在37℃、5% CO2 下將PBMC刺激25 min。在培育之後，迅速固定細胞，處理至條碼化，將表面染色，滲透並針對pSTAT5及Foxp3染色。在Cytof上讀取細胞並使用FlowJo軟體分析數據。增加交聯劑抗人類IgG抗體之濃度並不干擾GFTX3b_IL-2-H1-D49A之選擇性活性(圖18)。 實例 18 ： 於不同自體免疫患者中保留之選擇性信號傳導
使來自自體免疫患者之人類PBMC (Hemacare Corp)細胞在無血清測試培養基中靜置，並添加至每一孔中。在單獨板上，製備最高濃度之Proleukin或GFTX3b_IL-2-H1-D49A且在4×最終濃度下於培養基中製備滴定曲線。製備最高濃度(200nM IL-2等效物)且在GFTX3b_IL-2-H1-D49A或天然人類IL-2 (Proleukin)之最高濃度下方製備4點稀釋曲線(或對於AD而言10點)。將製備條件添加至孔中，並在37℃下培育25 min。在25 min之後，將細胞固定，使用表面標記物染色，滲透並使用細胞內抗體染色(pSTAT5、Foxp3)以用於遵循製造商說明書在Cytof上獲取(所有抗體皆來自Fluidigm)。使用FlowJo軟體分析數據
在若干測試之自體免疫適應症(包含1型糖尿病、SLE、白斑病及異位性皮膚炎)中，GFTX3b_IL-2-H1-D49A相對於CD4 Tcon 及CD8 Teff 對Treg 具有選擇性(圖19)。IL-2R信號傳導在Tcon 及Teff 中之活體外功效有所減小，但在Treg 中未減小。 實例 19 ： 在人類 PBMC 中 Treg 相對於 T 效應細胞之信號傳導選擇性
使PBMC細胞在RPMI培養基中靜置，並添加至每一孔中。向孔中添加IL-2移植物D49A或天然人類IL-2，並在37℃下培育25 min。在25 min之後，使用1.6%甲醛固定細胞，洗滌並使用表面標記物染色。在室溫下30 min之後，洗滌試樣且使用-20℃甲醇滲透再懸浮細胞糰粒，洗滌並使用STAT5及DNA嵌入劑染色。在Cytof上運行細胞並使用FlowJo軟體分析數據。
在等莫耳濃度之IL-2下，關於Treg相對於T效應物之信號傳導，GFTX3b_IL-2D49A展示高於Proleukin之特異性(圖20)。
應理解，本文所闡述實例及實施例係用於舉例說明之目的，且基於其之各種修改或變化應為熟習此項技術者所瞭解且意欲包含在本申請案之精神與範圍內及隨附申請專利範圍之範圍內。出於所有目的，本文所引用之所有公開案、序列登錄號、專利及專利申請案之全部內容皆以引用方式併入本文中。
圖1係抗體-細胞激素植入構築體之表格，其展示，與重組IL2 (Proleukin®)相比，IgG.IL2D49A.H1優先擴增Treg。
圖2係比較抗體-細胞激素植入之蛋白質與重組IL2 (Proleukin®)之表格。應注意，IgG.IL2D49A.H1分子刺激Treg細胞上之IL2受體，而不刺激T效應細胞(Teff)或NK細胞上之受體，如藉由STAT5磷酸化所量測。此分子亦之半衰期長於Proleukin®且在活體內引起Treg細胞之較大擴增。
圖3係在比較等莫耳劑量之抗體-細胞激素植入之蛋白質與Proleukin®時一組不同免疫調節細胞類型之倍數變化。
圖4展示抗體-細胞激素植入之蛋白質與Proleukin®相比對IL2低親和力或高親和力受體之差異性活化之實驗數據，如藉由STAT5磷酸化所量測。應注意，IgG.IL2D49A.H1刺激Treg細胞上之高親和力IL2受體表現，但不刺激CD4+或CD8+ Tcon細胞上者。
圖5展示以下結論之實驗數據：經抗體-細胞激素植入之蛋白質(例如IgG.IL2D49A.H1)擴增之Treg係T效應細胞(Teff)之較佳阻抑因子(參見上部圖)。下部圖展示經抗體-細胞激素植入之蛋白質擴增之Treg細胞藉由Foxp3蛋白質表現及Foxp3甲基化而穩定之實驗數據。
圖6展示以下結論之實驗數據：抗體-細胞激素植入之蛋白質對表現IL2低親和力受體之NK細胞具有極少效應。與之相比，Proleukin®則刺激NK細胞，如藉由pSTAT5活化所量測。
圖7展示關於抗體-細胞激素植入之蛋白質與Proleukin®相比在食蟹猴中之藥物動力學(PK)、藥效動力學(PD)及毒性特徵之實驗數據。舉例而言，IgG.IL2D49A.H1之嗜酸性球增多症毒性特徵遠小於Proleukin®。
圖8係繪示IgG.IL2D49.H1之延長半衰期之圖形。
圖9展示抗體-細胞激素植入之蛋白質分子在小鼠GvHD模型中之實驗數據。此圖展示，使用抗體-細胞激素植入之蛋白質在此模型中進行治療會優於Proleukin®地擴增Treg，而對CD4+/CD8+ Teff細胞或NK細胞具有極少效應。
圖10展示與GvHD小鼠模型中之Proleukin®治療有關之體重損失之實驗數據，而與投與IgG.IL2D49.H1有關之體重損失較小。
圖11展示在糖尿病前(NOD)小鼠模型中比較抗體-細胞激素植入之蛋白質與Proleukin®之實驗數據，且證實IgG.IL2D49A.H1在此模型中預防1型糖尿病。
圖12展示在糖尿病前NOD小鼠模型中比較Treg對CD8 T效應細胞之比率之實驗數據。
圖13A展示1.3 mg/kg劑量之IgG.IL2D49A.H1在NOD小鼠模型中之藥物動力學之實驗數據。圖13B展示0.43 mg/kg劑量之IgG.IL2D49A.H1在NOD小鼠模型中之藥物動力學之實驗數據。
圖14係用於糖尿病前NOD小鼠模型中之劑量範圍之表格，且比較等莫耳量之Proleukin®。
圖15A展示一系列繪示自白斑病患者獲取且在活體外使用IgG.IL2D49.H1及Proleukin®進行處理之人類PBMC上之pSTAT5活化量之圖形。圖15B展示一系列繪示自1型糖尿病患者獲取且在活體外使用IgG.IL2D49.H1及Proleukin®進行處理之人類PBMC上之pSTAT5活化量之圖形。
圖16展示ELISA數據之圖形，該數據展示，在將IL2植入抗RSV抗體之CDRH1中時，RSV結合得以維持。然而，在將IL2植入CDRL3中時，RSV結合有所減小。在將IL2植入不同抗體主鏈(Xolair)中時，並無RSV結合。
圖17展示在單一劑量之IgG.IL2D49A.H1之後食蟹猴中之Treg擴增的實驗數據。
圖18展示增加濃度之交聯劑抗人類IgG抗體對GFTX3b_IL-2-H1-D49A之選擇性活性之效應之實驗數據。
圖19展示使用GFTX3b_IL-2-H1-D49A之不同自體免疫患者PBMC中之選擇性信號傳導之實驗數據。
圖20展示在人類PBMC中較T效應細胞對Treg中之信號傳導之選擇性高於Proleukin之GFTX3b_IL-2-H1-D49A的實驗數據。
<110> 瑞士商諾華公司(NOVARTIS AG)
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<130> PAT056491
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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Figure 107117357-A0305-02-0156-74
Figure 107117357-A0305-02-0157-75
Figure 107117357-A0305-02-0158-76
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 50
Figure 107117357-A0305-02-0158-77
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 51
Figure 107117357-A0305-02-0158-78
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 52
Figure 107117357-A0305-02-0158-79
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 53
Figure 107117357-A0305-02-0159-80
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 54
Figure 107117357-A0305-02-0159-81
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 55
Figure 107117357-A0305-02-0159-82
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 56
Figure 107117357-A0305-02-0159-83
<210> 57
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 57
Figure 107117357-A0305-02-0160-85
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 58
Figure 107117357-A0305-02-0160-86
<210> 59
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 59
Figure 107117357-A0305-02-0160-87
Figure 107117357-A0305-02-0161-88
<210> 60
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 60
Figure 107117357-A0305-02-0161-89
<210> 61
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 61
Figure 107117357-A0305-02-0161-90
Figure 107117357-A0305-02-0162-91
<210> 62
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 62
Figure 107117357-A0305-02-0163-92
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 63
Figure 107117357-A0305-02-0163-93
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 64
Figure 107117357-A0305-02-0164-94
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 65
Figure 107117357-A0305-02-0164-95
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 66
Figure 107117357-A0305-02-0164-96
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 67
Figure 107117357-A0305-02-0164-98
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 68
Figure 107117357-A0305-02-0165-99
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 69
Figure 107117357-A0305-02-0165-100
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 70
Figure 107117357-A0305-02-0165-101
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 71
Figure 107117357-A0305-02-0165-102
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 72
Figure 107117357-A0305-02-0166-103
<210> 73
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 73
Figure 107117357-A0305-02-0166-104
Figure 107117357-A0305-02-0167-105
<210> 74
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 74
Figure 107117357-A0305-02-0167-106
Figure 107117357-A0305-02-0168-107
Figure 107117357-A0305-02-0169-108
<210> 75
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 75
Figure 107117357-A0305-02-0169-109
Figure 107117357-A0305-02-0170-110
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 76
Figure 107117357-A0305-02-0170-111
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 77
Figure 107117357-A0305-02-0171-112
<210> 78
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 78
Figure 107117357-A0305-02-0171-113
Figure 107117357-A0305-02-0172-114
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 79
Figure 107117357-A0305-02-0172-115
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 80
Figure 107117357-A0305-02-0172-116
<210> 81
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 81
Figure 107117357-A0305-02-0172-117
Figure 107117357-A0305-02-0173-118
<210> 82
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 82
Figure 107117357-A0305-02-0173-120
<210> 83
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 83
Figure 107117357-A0305-02-0174-121
<210> 84
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 84
Figure 107117357-A0305-02-0174-122
<210> 85
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 85
Figure 107117357-A0305-02-0175-123
Figure 107117357-A0305-02-0176-124
<210> 86
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 86
Figure 107117357-A0305-02-0176-125
Figure 107117357-A0305-02-0177-126
<210> 87
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 87
Figure 107117357-A0305-02-0177-127
Figure 107117357-A0305-02-0178-128
<210> 88
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 88
Figure 107117357-A0305-02-0179-129
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 89
Figure 107117357-A0305-02-0180-130
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 90
Figure 107117357-A0305-02-0180-131
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 91
Figure 107117357-A0305-02-0180-132
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 92
Figure 107117357-A0305-02-0180-133
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 93
Figure 107117357-A0305-02-0181-134
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 94
Figure 107117357-A0305-02-0181-135
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 95
Figure 107117357-A0305-02-0181-136
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 96
Figure 107117357-A0305-02-0181-137
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 97
Figure 107117357-A0305-02-0182-138
<210> 98
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 98
Figure 107117357-A0305-02-0182-139
Figure 107117357-A0305-02-0183-140
<210> 99
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 99
Figure 107117357-A0305-02-0183-141
<210> 100
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 100
Figure 107117357-A0305-02-0183-142
Figure 107117357-A0305-02-0184-143
Figure 107117357-A0305-02-0185-144
Figure 107117357-A0305-02-0186-1
<210> 101
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 101
Figure 107117357-A0305-02-0186-146
Figure 107117357-A0305-02-0187-147
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 102
Figure 107117357-A0305-02-0187-148
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 103
Figure 107117357-A0305-02-0187-149
<210> 104
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 104
Figure 107117357-A0305-02-0187-150
Figure 107117357-A0305-02-0188-151
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 105
Figure 107117357-A0305-02-0188-152
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 106
Figure 107117357-A0305-02-0189-153
<210> 107
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 107
Figure 107117357-A0305-02-0189-154
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 108
Figure 107117357-A0305-02-0190-155
<210> 109
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 109
Figure 107117357-A0305-02-0190-156
<210> 110
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 110
Figure 107117357-A0305-02-0190-157
Figure 107117357-A0305-02-0191-158
<210> 111
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 111
Figure 107117357-A0305-02-0191-159
Figure 107117357-A0305-02-0192-160
<210> 112
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 112
Figure 107117357-A0305-02-0193-161
<210> 113
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 113
Figure 107117357-A0305-02-0193-162
Figure 107117357-A0305-02-0194-163
Figure 107117357-A0305-02-0195-164
<210> 114
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 114
Figure 107117357-A0305-02-0195-165
Figure 107117357-A0305-02-0196-166
<210> 115
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(11)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(17)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(23)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(29)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(41)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(47)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(53)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(59)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(60)
<223> 此序列可涵蓋0-10個「(Gly)n-Ser」重複單元，其中n=1-5
<400> 115
Figure 107117357-A0305-02-0197-167
<210> 116
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(11)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(17)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(23)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(29)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(41)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(47)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(53)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(59)
<223> 此區域可涵蓋1-5個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(60)
<223> 此序列可涵蓋0-10個「(Gly)n-Ala」重複單元，其中n=1-5
<400> 116
Figure 107117357-A0305-02-0199-168
<210> 117
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(21)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(32)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<222> (34)..(43)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(54)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(65)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<221> MISC_FEATURE
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<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (78)..(87)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(98)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(109)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 此序列可涵蓋1-10個「(Gly)n-Ser」重複單元，其中n=0-10
<400> 117
Figure 107117357-A0305-02-0200-169
Figure 107117357-A0305-02-0201-170
<210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<220>
<223> 參見針對取代及較佳實施例之詳細說明所提出之說明
<400> 118
Figure 107117357-A0305-02-0201-171
<210> 119
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(21)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(32)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(43)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(54)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(65)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(76)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (78)..(87)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
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<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(98)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(109)
<223> 此區域可涵蓋0-10個殘基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 此序列可涵蓋1-10個「(Gly)n-Ala」重複單元，其中n=0-10
<400> 119
Figure 107117357-A0305-02-0203-172
<210> 120
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<220>
<223> 參見針對取代及較佳實施例之詳細說明所提出之說明
<400> 120
Figure 107117357-A0305-02-0203-173
<210> 121
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成6xHis標籤
<400> 121
Figure 107117357-A0305-02-0204-3

Claims (15)

  1. 一種抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括：重鏈可變區(VH)，其包括(a)SEQ ID NO：17之互補決定區(CDR)HCDR1、(b)SEQ ID NO：18之HCDR2、及(c)SEQ ID NO：19之HCDR3；以及輕鏈可變區(VL)，其包括(d)SEQ ID NO：30之LCDR1、(e)SEQ ID NO：31之LCDR2、及(f)SEQ ID NO：32之LCDR3；其中介白素2(IL2)分子植入該HCDR1中。
  2. 如請求項1之抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中該IL2分子含有減小該IL2分子與低親和力IL2受體之親和力之突變。
  3. 如請求項1或2之抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中該抗體-細胞激素植入之蛋白質刺激Treg細胞增殖大於天然IL2或Proleukin®，或刺激CD8T效應細胞增殖小於天然IL2或Proleukin®。
  4. 如請求項1或2之抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中該IL2分子由SEQ ID NO：4組成。
  5. 如請求項1或2之抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中該抗體-細胞激素植入之蛋白質之抗體支架部分係帕利珠單抗(palivizumab)。
  6. 如請求項1或2之抗體-細胞激素植入之蛋白質，其包括：包括SEQ ID NO：20之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：33之輕鏈可變區(VL)。
  7. 如請求項1或2之抗體-細胞激素植入之蛋白質，其進一步包括對應於減小之效應功能之經修飾Fc區。
  8. 如請求項7之抗體-細胞激素植入之蛋白質，其中該經修飾Fc區包括選自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A及L235A中之一或多者之突變。
  9. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至8中任一項之抗體-細胞激素植入之蛋白質。
  10. 一種適於產生抗體-細胞激素植入之蛋白質之重組宿主細胞，其包括如請求項9之編碼該蛋白質之重鏈及輕鏈多肽之核酸。
  11. 如請求項10之適於產生抗體-細胞激素植入之蛋白質之重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞進一步包括分泌信號。
  12. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至8中任一項之抗體-細胞激素植入之蛋白質及醫藥上可接受之載劑。
  13. 一種如請求項1至8中任一項之抗體-細胞激素植入之蛋白質之用途，其係用於製備治療免疫相關病症之醫藥品。
  14. 如請求項13之用途，其中該免疫相關病症係選自由以下組成之群：1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、白斑病、慢性移植物抗宿主病(cGvHD)、預防性急性移植物抗宿主病(pGvHD)、HIV誘導之血管炎、斑禿、全身性硬化症、侷限性硬皮病及原發性抗磷脂症候群。
  15. 如請求項13或14之用途，其中該醫藥品進一步包括另一治療劑或與其組合投與。
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