JP2014511147A - 改善された免疫療法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、疾患の治療にそれを必要とする個体において使用される（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを提供する。さらに、前記組合せを含む薬学的組成物とそれらを使用する方法も提供される。

Description

本発明は一般に免疫療法に関する。より特定的には、本発明は、免疫療法剤として併用使用するための、抗原-標的化イムノコンジュゲート及びＦｃ-操作抗体に関する。さらに、本発明は、前記イムノコンジュゲート及び抗体の組合せを含有する薬学的組成物と、疾患の治療において該組成物を使用する方法に関する。
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床的設定で、しばしば所望される。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊する一方、残った健康な細胞及び組織は無傷であり、ダメージを受けないようにするための、癌治療の主要目的である。
これを達成するための魅力的な方法は、腫瘍細胞に免疫応答を誘発させ、免疫エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、腫瘍細胞を攻撃し、破壊するようにさせることによりなされる。エフェクター細胞は、免疫細胞の表面へのそれらのレセプターの結合を介してシグナル伝達事象を誘発させる多くのサイトカイン類を含む様々な刺激により活性化されうる。例えば、とりわけ、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び活性化を刺激するインターロイキン-２(ＩＬ-２)は、転移性の腎細胞癌及び悪性メラノーマの治療用として承認されている。しかしながら、急速な血液クリアランス及び腫瘍特性の欠乏には、免疫応答を活性化させ、抗-腫瘍効果を有するよう、腫瘍部位で高濃度のサイトカインを獲得するため、高用量のサイトカインを全身的に投与する必要がある。このように、サイトカインが全身的に高レベルであると、重度の毒性及び拒否反応に至るおそれがあり、ＩＬ-２についての場合もしかりである。よって、癌治療に使用するためには、腫瘍又は腫瘍微小環境に、特異的にサイトカインを送達させることが望まれる。これは、腫瘍抗原に特異的な抗体又は抗体断片等、標的部分にサイトカインをコンジュゲートさせることにより達成可能である。このようなイムノコンジュゲートのさらなる利点は、非コンジュゲートサイトカインと比較して、血清半減期が長いことである。免疫賦活性を最大にするそれらの能力は腫瘍部位で活性化され、低用量で全身性の副作用を最小に維持することは、サイトカインイムノコンジュゲートを最適な免疫療法剤にする。
エフェクター細胞を活性化させる他の方法は、免疫グロブリンのＦｃ部分又はＦｃ領域を含む組換え融合タンパク質による、それらの表面上の活性化Ｆｃレセプターの関与を介している。そのＦｃ領域により媒介されるいわゆる抗体のエフェクター機能は、抗体ベースの癌免疫療法における重要な作用機序である。抗体依存性細胞-媒介性細胞傷害性、つまり抗体被覆標的細胞（例えば腫瘍細胞）のＮＫ細胞による破壊は、細胞表面に結合した抗体がＮＫ細胞上のＦｃレセプターと相互作用する場合に誘発される。ＮＫ細胞は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの免疫グロブリンを認識するＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）を発現する。さらに、エフェクター機能は、抗体依存性細胞−媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を含み、種々の免疫細胞型が、種々のタイプ及びサブタイプの免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（例えば、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭクラスの抗体に対応するα、δ、γ、ε、又はμ重鎖定常ドメイン）を認識する種々のＦｃレセプターセットを有するため、抗体のクラス及びサブクラスで変化する。抗体のエフェクター機能を増加させるための様々な方策が使用されている。例えば、Shieldsら(J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001))は、Ｆｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位のアミノ酸置換により、ＦｃγＩＩＩａレセプター及びＡＤＣＣへの、抗体の結合性が改善されることを示している。さらに、Ｆｃ領域にアミノ酸修飾を有し、改善されたＦｃレセプター結合性及びエフェクター機能を示す抗体変異体が、米国特許第６７３７０５６号、国際公開第２００４／０６３３５１号、及び国際公開第２００４／０９９２４９号に記載されている。また、レセプター結合性及びエフェクター機能の増加は、抗体のグリコシル化を変えることにより、得ることができる。癌の免疫療法において最も一般に使用されているＩｇＧ１型の抗体は、Ｆｃ領域の各ＣＨ２ドメインにおいて、Ａｓｎ２９７に保存されたＮ結合グリコシル化部位を有する。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメインの間に埋在しており、ポリペプチド骨格と広大な接触部を形成し、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞-媒介性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を含むエフェクター機能を媒介するのに必須である(Lifelyら, Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferisら, Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright 及び Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997)). Protein engineering studies have shown that FcγRs interact with the lower hinge region of the IgG CH2 domain (Lundら, J Immunol 157, 4963-69 (1996))。しかしながら、ＦｃγＲ結合には、ＣＨ２領域にオリゴ糖の存在が必要であり(Lundら, J Immunol 157, 4963-69 (1996); Wright 及び Morrison, Trends Biotech 15, 26-31 (1997))、オリゴ糖及びポリペプチドが双方とも相互作用部位に直接寄与するか、又はオリゴ糖が活性化ＣＨ２ポリペプチドの立体構造を維持するために必要であることが示唆される。よって、オリゴ糖構造の修飾は、ＩｇＧ１とＦｃγＲとの相互作用の親和性を増加させるため、またＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を増加させるための手段として研究されている。Umanaら (その内容の全体が出典明示によりここに援用されるNat Biotechnol 17, 176-180 (1999)及び米国特許第６６０２６８４号（国際公開第９９／５４３４２号）)には、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞における、二分岐オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(ＧｎＴＩＩＩ)の過剰発現がその細胞において産生される抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加させることが示されている。産生細胞株におけるＧｎＴＩＩＩの過剰発現により、一般に非フコシル化及びハイブリッド型のものである、二分岐オリゴ糖に豊富な抗体に至る。ＧｎＴＩＩＩに加えて、マンノシダーゼＩＩ(ＭａｎＩＩ)が産生細胞株で過剰発現している場合、複合型の二分岐、非フコシル化オリゴ糖に富む抗体が得られる(Ferraraら, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006))。双方のタイプの抗体は、未修飾のグリカンを有する抗体と比較して、強く増加したＡＤＣＣを示すが、Ｎ-グリカンの大部分が複合型のものである抗体のみが、有意な補体-依存性細胞傷害性を誘導することができる(Ferraraら, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006))。ＡＤＣＣ活性を増加させるための重要な要因は、ＦｃγＲＩＩＩａへのＩｇＧ Ｆｃドメインの結合性を改善する、オリゴ糖コア部の最遠のＮ-アセチルグルコサミン残基からフコースを除去することであると思われる(Shinkawaら, J Biol Chem 278, 3466-3473 (2003))。フコシル化が低減した抗体を生成するためのさらなる方法は、例えば、α(１,６)-フコシルトランスフェラーゼを欠く宿主細胞における発現を含む(Yamane-Ohnukiら, Biotech Bioeng 87, 614-622 (2004); Niwaら, J Immunol Methods 306, 151-160 (2006))。
遊離のサイトカイン、イムノコンジュゲート、又は操作抗体の使用による抗癌免疫療法において達成された成功にもかかわらず、癌治療において新規の効果的で安全な治療選択肢が絶えず必要とされている。
本発明者は、局所的な免疫細胞活性のためのこれら２つの方策の組合せ、すなわち、サイトカインイムノコンジュゲートとエフェクター機能が増加するように操作された抗体とによるエフェクター細胞の同時刺激が抗癌免疫療法の効能を大きく改善することを見出した。
従って、本発明は、疾患の治療にそれを必要とする個体において使用される（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを提供する。一実施態様において、エフェクター部分はサイトカインである。一実施態様において、サイトカインは、ＩＬ-２、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮ-α、及びＩＬ-１２からなる群から選択される。特定の実施態様において、エフェクター部分はＩＬ-２である。他の実施態様において、エフェクター部分はＩＬ-１２である。他の特定の実施態様において、ＩＬ-２エフェクター部分は、未変異ＩＬ-２エフェクター部分と比較すると、ＩＬ-２レセプターのα-サブミットに対する変異ＩＬ-２エフェクター部分の親和性を減少させ又は無効にするが、中程度の親和性のＩＬ-２レセプターに対する変異ＩＬ-２エフェクター部分の親和性を保存している少なくとも一つのアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む変異ＩＬ-２エフェクター部分である。特定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３の位置で、１、２又は３のアミノ酸置換を有する。さらに特定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５及び７２に対応する位置で、３のアミノ酸置換を有する。またさらに特定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを有するヒトＩＬ-２である。所定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、ＩＬ-２のＯ-グリコシル化部位が除去された、ヒトＩＬ-２の３位に対応する位置で、アミノ酸変異を付加的に有する。特定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、配列番号：２のアミノ酸配列を有する。一実施態様において、エフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。
一実施態様において、抗原-結合部分は、抗体又は抗体断片である。一実施態様において、エフェクター部分は、抗原-結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。一実施態様において、抗原-結合部分はＦａｂ分子である。他の実施態様において、抗原-結合部分はｓｃＦｖ分子である。一実施態様において、イムノコンジュゲートは第１及び第2の抗原-結合部分を有する。一実施態様において、第１及び第２の抗原-結合部分は、Ｆａｂ分子及びｓｃＦｖ分子から独立して選択される。一実施態様において、第１及び第２の抗原-結合部分は、それぞれＦａｂ分子である。他の実施態様において、第１及び第２の抗原-結合部分は、それぞれｓｃＦｖ分子である。一実施態様において、エフェクター部分は、第１の抗原-結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第２の抗原-結合部分は、エフェクター分子又は第１の抗原-結合部分のいずれかとアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。一実施態様において、エフェクター部分は、第１の抗原-結合部分とアミノ-末端ペプチド結合を共有し、また第２の抗原-結合部分とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、一又は複数のリンカー配列と結合した、第１及び第２の抗原-結合部分及びエフェクター部分から本質的になる。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートはエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分、特に第１及び第２のＦａｂ分子を含み、ここでエフェクター部分は第１のＦａｂ分子の重鎖又は軽鎖のカルボキシ-末端に、そのアミノ-末端アミノ酸で結合しており、ここでエフェクター部分は第２のＦａｂ分子の重鎖又は軽鎖のアミノ-末端に、そのカルボキシ-末端アミノ酸で結合している。
ある実施態様において、抗原-結合部分は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に対するものである。特定の実施態様において、抗原-結合部分は、線維芽細胞活性タンパク質(ＦＡＰ）、テネイシン-ＣのＡ１ドメイン(ＴＮＣ Ａ１）、テネイシン-ＣのＡ２ドメイン(ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ(ＥＤＢ）、カルシノ胚性抗原(ＣＥＡ)、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)からなる群から選択される抗原に対するものである。
一実施態様において、増加したエフェクター機能は、活性化Ｆｃレセプターへの結合、増加したＡＤＣＣ、増加したＡＤＣＰ、増加したＣＤＣ、増加したサイトカイン分泌性からなる群から選択される。一実施態様において、増加したエフェクター機能は、増加した活性Ｆｃレセプターへの結合性である。特定の実施態様において、活性Ｆｃレセプターは、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及びＦｃＲγＩＩａの群から選択される。一実施態様において、活性化ＦｃレセプターはＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、増加したエフェクター機能は増加したＡＤＣＣである。一実施態様において、増加したエフェクター機能は、活性化Ｆｃレセプターへの結合性、及び増加したＡＤＣＣである。
一実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域に一又は複数のアミノ酸変異を導入することにより操作される。特定の実施態様において、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により操作される。特定の実施態様において、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。さらなる特定の実施態様において、Ｆｃ領域において増加した割合の非フコシル化オリゴ糖は、Ｆｃ領域の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％の非フコシル化オリゴ糖である。特定の実施態様において、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐オリゴ糖の割合が増加している。さらなる特定の実施態様において、Ｆｃ領域において増加した割合の二分岐オリゴ糖は、Ｆｃ領域の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％の二分岐オリゴ糖である。さらなる他の特定の実施態様において、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。好ましくは抗体は、Ｆｃ領域に、少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、又は少なくとも約５０％の二分岐の非フコシル化オリゴ糖を有する。特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。抗体のＦｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加することで、抗体のエフェクター機能、特にＡＤＣＣが増加する。特定の実施態様において、非フコシル化オリゴ糖は二分岐の非フコシル化オリゴ糖である。
一実施態様において、抗体は全長ＩｇＧクラスの抗体、特にＩｇＧ１サブクラスの抗体である。ある実施態様において、抗体は、腫瘍細胞に存在する抗原に対するものである。特定の実施態様において、抗体は、ＣＤ２０、上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリン様成長因子レセプター(ＩＧＦ-１Ｒ）、ｃ-Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質-１(ＣＤＣＰ１）、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びメラノーマ関連コンドロイチンスルファートプロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される抗原に対するものである。
特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗-ＣＤ２０抗体である。適切な抗-ＣＤ２０抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される国際公開第２００５／０４４８５９号に記載されている。他の特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗-ＥＧＦＲ抗体である。適切な抗-ＥＧＦＲ抗体は、それぞれその全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００６／０８２５１５号及び国際公開第２００８／０１７９６３号に記載されている。さらに特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体である。適切な抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されている。さらなる他の特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗-ＣＥＡ抗体である。適切な抗-ＣＥＡ抗体は、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２３７８７に記載されている。さらなる他の特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗-ＨＥＲ３抗体である。適切な抗-ＨＥＲ３抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０７６６８３に記載されている。さらなる他の特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗-ＣＤＣＰ１抗体である。適切な抗-ＣＤＣＰ１抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２３３８９に記載されている。一実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域にてグリコシル化が修飾され、一又は複数のグリコシルトランスフェラーゼに活性が変化した宿主細胞で抗体が生成されるように操作されている。
一実施態様において、抗体は、増加したβ(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴＩＩＩ)活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。特定の実施態様において、宿主細胞は、付加的に、増加したα-マンノシダーゼＩＩ(ＭａｎＩＩ)活性を有する。他の実施態様において、抗体は、低減したα(１,６)-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。
一実施態様において、疾患はエフェクター細胞の機能を刺激することにより治療可能な疾患である。一実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。特定の実施態様において、癌は、肺癌、結腸直腸癌、腎癌、前立腺癌、乳癌、頭部及び頸部の癌、卵巣癌、脳癌、リンパ腫、白血病、及び皮膚癌の群から選択される。一実施態様において、個体は動物である。特定の実施態様において、個体はヒトである。
他の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体を、薬学的に許容可能な担体に含有せしめてなる薬学的組成物を提供する。
また本発明は、（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の、個体における疾患を治療する医薬を製造するための使用を含む。
さらに本発明は、（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを、治療的有効量、個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法を提供する。
（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを、エフェクター細胞機能を刺激するのに有効な量、個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法が、本発明において提供される。
さらなる態様において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体、及び（ｃ）場合によっては、疾患を治療する方法として、併用治療の使用を指示する印刷された使用説明書を含むパッケージ挿入物を、同じ又は別々の容器に収容してなる、疾患を治療することを意図したキットを提供する。
本発明の薬学的組成物、使用、方法及びキットに使用されるイムノコンジュゲート及び抗体は、本発明に有用な抗体イムノコンジュゲートに関連した上述の段落に記載さた特徴の任意のものを、単独で又は組合せて含みうることが理解される。
図１は、ＴＮＣＡ２-標的２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに静脈内注射し、ヒト非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株Ａ５４９において試験したものを示す。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、テネイシンＣのＡ２ドメインに対してポジティブであることが示された。データには、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、高められた生存期間中央値において、優れた有効性を媒介することが示されている(実施例１を参照)。 図２は、ＴＮＣＡ２-標的２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤマウスに脾臓内注射し、ヒト結腸直腸ＬＳ１７４Ｔ細胞株において試験したものを示す。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、テネイシンＣのＡ２ドメインに対してポジティブであることが示された。データには、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、高められた生存期間中央値及び全生存において、優れた有効性を媒介することが示されている(実施例２を参照)。 図３は、ＦＡＰ-標的３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤマウスに腎臓内注射し、ヒト腎臓細胞株ＡＣＨＮにおいて試験したものを示す。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＦＡＰに対してポジティブであることが示された。データには、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、相乗的に高められた生存期間中央値及び全生存が得られることが示されている(実施例３を参照)。 図４は、ＦＡＰ-標的３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに腎臓内注射し、ヒト腎臓細胞株ＡＣＨＮにおいて試験したものを示す。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＦＡＰに対してポジティブであることが示された。データには、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、全生存において、優れた有効性を媒介することが示されている(実施例４を参照)。 図５は、ＴＮＣ Ａ２-標的２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに静脈内注射し、ヒトマントル細胞リンパ腫細胞株Ｚ１３８において試験したものを示す。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＴＮＣ Ａ２に対してポジティブであることが示された。データには、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、生存期間中央値及び全生存を相乗的に高めることが示されている(実施例５を参照)。 図６は、ＣＤ２５への結合性を欠くＩＬ-２四重変異(ｑｍ)を含むＦＡＰ-標的２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに腎臓内注射し、ヒト腎臓細胞株ＡＣＨＮにおいて試験したものを示す。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＦＡＰに対してポジティブであることが示された。データには、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、高められた生存期間中央値において、優れた有効性を媒介することが示されている(実施例６を参照)。 図７は、溶液中に存在する(Ａ)、ＩＬ-２(プロリュウキン)、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂを用いて４８時間前処理されたＰＢＭＣ(Ｅ：Ｔ＝１０：１、４時間)により、Ｋ５６２腫瘍細胞の死滅性が増加していることを示す。値は、未処理のＰＢＭＣと比較した、死滅性パーセントの増加度合いを表す(実施例８を参照)。 図７は、細胞皿にコーティングされた(Ｂ)、ＩＬ-２(プロリュウキン)、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂを用いて４８時間前処理されたＰＢＭＣ(Ｅ：Ｔ＝１０：１、４時間)により、Ｋ５６２腫瘍細胞の死滅性が増加していることを示す。値は、未処理のＰＢＭＣと比較した、死滅性パーセントの増加度合いを表す(実施例８を参照)。 図８は、種々の濃度の抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの存在下にて、５７ｎＭのＦａｐ-標的２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂを用いて、４５時間前処理した又はしていないＰＢＭＣ(Ｅ：Ｔ＝１０：１、４時間)による、全体的なＡ５４９腫瘍細胞の死滅を示す(実施例８を参照)。 図９は、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ(Ａ)単独(５又は５００ｎｇ／ｍｌ)、又は種々の濃度のＩＬ-２(プロリュウキン)、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂの組合せと共にインキュベートした後、ＡＤＣＣ中における、ＰＢＭＣによるＩＦＮ-γの放出性を示す。Ａ５４９細胞を標的細胞として使用した(Ｅ：Ｔ＝５：１、２１時間；実施例８を参照)。 図９は、アービタックス(Ｂ)単独(５又は５００ｎｇ／ｍｌ)、又は種々の濃度のＩＬ-２(プロリュウキン)、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂの組合せと共にインキュベートした後、ＡＤＣＣ中における、ＰＢＭＣによるＩＦＮ-γの放出性を示す。Ａ５４９細胞を標的細胞として使用した(Ｅ：Ｔ＝５：１、２１時間；実施例８を参照)。 図１０は、種々の濃度のＩＬ-２(プロリュウキン)、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂの組合せと共にインキュベートした後の、Ａ５４９腫瘍細胞の抗体非依存性死滅性における、ＰＢＭＣによるＩＦＮ-γの放出を示す(Ｅ：Ｔ＝５：１、２１時間；実施例８を参照)。
第１の態様において、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用するための、（ａ）少なくとも抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを提供する。
本発明はさらに、（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを、治療的有効量、個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法を提供する。
（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを、エフェクター細胞機能を刺激するのに有効な量、個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法が、本発明において提供される。
(定義)
以下において、特に定める以外は、用語は、当該技術で一般に使用されているように使用される。
ここで使用される場合、「イムノコンジュゲート」なる用語は、少なくとも一つのエフェクター部分と少なくとも一つの抗原結合部分を有する、ポリペプチド分子を意味する。ある実施態様において、イムノコンジュゲートは、少なくとも一つのエフェクター部分と少なくとも２の抗原結合部分を有する。本発明の特定のイムノコンジュゲートは、１のエフェクター部分と２の抗原結合部分が、一又は複数のリンカー配列により結合したものから本質的になる。抗原結合部分は、個々に記載するような様々な相互作用、及び様々な立体配置により、エフェクター部分に結合可能である。
ここで使用される場合、「抗原結合部分」なる用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を意味する。一実施態様において、抗原結合部分は、それが抗原決定基を担持する、特定のタイプの腫瘍細胞又は腫瘍ストローマ等の標的部位に結合する実体に対するものであることができる(例えば、エフェクター部分又は第２の抗原結合部分)。抗原結合部分は、ここでさらに定める抗体又はその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を有する、抗体の抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、抗原結合部分は、ここでさらに定められ、当該技術で公知の抗体定常領域をさらに含む。有用な重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμの任意のものを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλの任意のものを含む。
ここで使用される場合、「コントロール抗原結合部分」なる用語は、他の抗原結合部分及びエフェクター部分がない場合に、抗原結合部分を意味する。例えば、コントロール抗原結合部分と、ここで記載のＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを比較した場合、コントロール抗原結合部分は遊離のＦａｂであり、ここでコントロール抗原結合部分及び遊離のＦａｂ分子は、同じ抗原決定基に、双方とも特異的に結合可能である。
ここで使用される場合、「抗原決定基」なる用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義語であり、抗原-結合部分が結合し、抗原-結合部分-抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子の部位(例えば、非近接アミノ酸の種々の領域を形成する、アミノ酸又は立体構造的配置の近接伸長)を意味する。有用な抗原決定基は、例えば腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の罹患した細胞の表面、血流中及び／又は細胞外マトリックス(ＥＣＭ)に遊離で見出すことができる。
「特異的に結合」とは、結合が抗原に対して特異的であり、所望しない又は非特異的相互作用と区別可能なことを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原-結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)又は当業者に精通している他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術(ビアコア装置において分析)(Liljebladら, Glyco J 17, 323-329 (2000))、及び伝統的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))を介して測定可能である。
「抗-[抗原]抗体」及び「[抗原]に結合する抗体」なる用語は、抗体が、抗原を標的とする診断及び／又は治療剤として有用な、十分な親和性でそれぞれの抗原に結合可能な抗体を意味する。一実施態様において、関係のないタンパク質への抗-[抗原]抗体の結合度合いは、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)により測定された場合、抗原に対する抗体の結合性で約１０％未満である。ある実施態様において、[抗原]に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ又はそれ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ)の解離定数(ＫＤ)を有する。上述した定義は、抗原に結合する抗原-結合部分に対して適用されると理解される。
ここで使用される場合、抗原-結合部分等に関して「第１」及び「第２」なる用語は、１以上の各タイプの部分が存在する場合に、簡便に区別するために使用される。これらの用語の使用は、明確に述べられていないならば、イムノコンジュゲートの特定の順番又は方向を付与することを意図したものではない。
ここで使用される場合、「エフェクター部分」なる用語は、例えば、シグナル伝達又は他の細胞経路を介して、細胞活性に影響を与えるポリペプチド、例えばタンパク質又は糖タンパク質を意味する。従って、本発明のエフェクター部分は、エフェクター部分に対する一又は複数のレセプターを担持する細胞にて、反応を調節するため、細胞膜の外側からシグナルを伝達する、レセプター媒介性シグナル伝達に関連している。一実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する一又は複数のレセプターを担持する細胞に、細胞傷害性反応を引き起こすことができる。他の実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する一又は複数のレセプターを担持する細胞に、増殖反応を引き起こすことができる。他の実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対するレセプターを担持する細胞に、分化を引き起こすことができる。他の実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対するレセプターを担持する細胞において、内在性細胞タンパク質の発現を変更する(例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレート)ことができる。非限定的エフェクター部分には、サイトカイン類、成長因子、ホルモン、酵素、基質、及び補助因子が含まれる。エフェクター部分は種々の立体配置で抗原-結合部分と結合し、イムノコンジュゲートを形成する。
ここで使用される場合、「サイトカイン」なる用語は、生物学的又は細胞機能又はプロセス(例えば、免疫、炎症、及び造血)を媒介又は調節する分子を意味する。ここで使用される場合、「サイトカイン」なる用語は、「リンホカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」、及び「インターロイキン」を含む。有用なサイトカインの例には、限定されるものではないが、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１β、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ-α、及びＴＮＦ-βが含まれる。特定のサイトカイン類はＩＬ-２及びＩＬ-１２である。ここで使用される場合、「サイトカイン」なる用語は、対応する野生型サイトカインのアミノ酸配列に、一又は複数のアミノ酸変異を有するサイトカイン類似体、例えばSauveら, Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991)；Huら, Blood 101, 4853-4861 (2003) 及び米国特許第２００３／０１２４６７８号；Shanafelt ら, Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)；Heatonら, Cancer Res 53, 2597-602 (1993) 及び米国特許第５２２９１０９号；米国特許第２００７／００３６７５２号；国際公開第２００８／００３４４７３号；国際公開第２００９／０６１８５３号；又は上述及び以下に記載するものを含むことを意味する。
ここで使用される場合、「単鎖」なる用語は、ペプチド結合により直線的に結合したアミノ酸モノマーを含有する分子を意味する。一実施態様において、エフェクター分子は単鎖エフェクター分子である。単鎖エフェクター分子の非限定的例には、サイトカイン類、成長因子、ホルモン、酵素、基質、及び補助因子が含まれる。エフェクター分子がサイトカインであり、関心あるサイトカインが、通常、マルチマーとして見出される場合、マルチマーサイトカインのエフェクター部分は、エフェクター部分の単鎖により連続してコードされている。従って、有用な単鎖エフェクター部分の非限定的例には、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１β、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ-α、及びＴＮＦ-βが含まれる。
ここで使用される場合、「コントロールエフェクター部分」なる用語は、コンジュゲートしていないエフェクター部分を意味する。例えば、コントロールエフェクター部分とここに記載のＩＬ-２イムノコンジュゲートとを比較した場合、コントロールエフェクター部分は、遊離のコンジュゲートしていないＩＬ-２である。同様に、例えばコントロールエフェクター部分とＩＬ-１２イムノコンジュゲートとを比較した場合、コントロールエフェクター部分は遊離のコンジュゲートしていないＩＬ-１２である(例えば、ｐ４０及びｐ３５サブミットがジスルフィド結合のみを共有しているヘテロダイマータンパク質として存在)。
ここで使用される場合、「エフェクター部分レセプター」なる用語は、エフェクター部分に対して特異的に結合可能なポリペプチド分子を意味する。例えば、ＩＬ-２がエフェクター部分である場合、ＩＬ-２分子に結合するエフェクター部分レセプター(例えば、ＩＬ-２を含有するイムノコンジュゲート)はＩＬ-２レセプターである。同様に、例えばＩＬ-１２がイムノコンジュゲートのエフェクター部分である場合、エフェクター部分レセプターはＩＬ-１２レセプターである。エフェクター部分が１以上のレセプターに特異的に結合する場合、エフェクター部分に特異的に結合する全てのレセプターが、エフェクター部分に対する「エフェクター部分レセプター」である。
ここで「抗体」なる用語は広義の意味で使用され、種々の抗体構造を含み、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及びそれらが所望の抗原-結合活性を示し、免疫グロブリンのＦｃ領域又はＦｃ領域に等価な領域を含む限り、それらの抗体断片を含む。
「全長抗体」、「無傷抗体」及び「全抗体」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する、又はここに記載のＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。
「天然抗体」なる用語は、種々の構造を有する天然に生じた免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合した、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。ＮからＣ末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインと称される可変ドメイン(ＶＨ)を有し、重鎖定常領域とも称される３の定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３)が続く。同様に、ＮからＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインと称される、可変ドメイン(ＶＬ)を有し、軽鎖定常ドメインとも称される定常軽(ＣＬ)ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と称される、２つのタイプの一方に整列している。
「抗体断片」は、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体の一部を含む無傷抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子(例えば、ｓｃＦｖ)、単-ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。所定の抗体断片に関し、Hudsonら, Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片については、例えばPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照；また国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び同５５８７４５８号を参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片の開示については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってよい、２の抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudsonら, Nat Med 9, 129-134 (2003);及び Hollingerら, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudsonら, Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単-ドメイン抗体は、抗体の軽鎖可変ドメインの全て又は一部、重鎖可変ドメインの全て又は一部を有する抗体断片である。ある実施態様において、単-ドメイン抗体はヒト単-ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。抗体断片は、限定されるものではないが、ここに記載したような、組換え宿主細胞(例えば大腸菌又はファージ)による生成、及び無傷抗体のタンパク質分解的消化を含む、種々の技術により作製することができる。
「抗原結合ドメイン」なる用語は、抗原の一部又は全てに対して相補的であり、特異的に結合する領域を含む、抗体の一部を意味する。抗原結合ドメインは、例えば一又は複数の抗体可変ドメイン(いわゆる抗体可変領域)により提供されうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(ＶＬ)と抗体重鎖可変領域(ＶＨ)を有する。
「可変領域」又は「可変ドメイン」なる用語は、抗原への抗体の結合性に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれＶＨ及びＶＬ)は、一般に類似した構造を有し、各ドメインは４の保存されたフレームワーク領域(ＦＲ)と３の高頻度可変領域(ＨＶＲ)を含む。例えば、Kindtら, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照。単ＶＨ又はＶＬドメインは、抗原-結合特異性を付与するのに十分である。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループ(「高頻度可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、天然の四鎖抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。ＨＶＲは、一般に高頻度可変ループ及び／又は相補性決定領域(ＣＤＲ)からのアミノ酸残基を有し、後者は、抗原認識に関与し、及び／又は最も高い配列可変性をしている。ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般に高頻度可変ループからのアミノ酸残基を有する。固頻度可変領域(ＨＶＲ)は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の一部に関連して、交換可能に使用される。この特定の領域は、Kabatら, U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) 及び Chothiaら, J Mol Biol 196:901-917 (1987)により記載され、定義には、互いに比較した場合に、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを意味するいずれかの定義の適用は、ここで定められ、使用される場合の用語の範囲内にあることを意図している。上述にて引用した各参照に定められる場合、ＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基を、比較として、以下の表１に説明する。特定のＣＤＲを含む正確な残基の数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わるであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を付与する特定のＣＤＲを含む残基を、常套的に決定できる。
Figure 2014511147
Kabatらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列に対する番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えて、任意の実験データに依存することなく、任意の可変領域配列に「Kabat番号付け」のこのシステムに、一義的に当てはめることができる。ここで使用される場合、「Kabat番号付け」とは、Kabatら, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)により説明されている番号付けシステムを意味する。特定されない限りは、抗体可変領域の特定のアミノ酸残基位置の番号付けに対する参照は、Kabat番号付けシステムに従う。
配列リスト(すなわち、配列番号：３、４、５、６、７、８、９等)のポリペプチド配列は、Kabat番号付けシステムに従い番号付けされていない。しかしながら、Kabat番号付けに対する配列リストの配列の番号付けに転換することは、当該技術の通常の裁量の想定内である。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、高頻度可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般に４のＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲとＦＲ配列は、一般にＶＨ(又はＶＬ)：ＦＲ１-Ｈ１(Ｌ１)-ＦＲ２-Ｈ２(Ｌ２)-ＦＲ３-Ｈ３(Ｌ３)-ＦＲ４の配列のようになるであろう。
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する、定常ドメイン又は定常領域のタイプを意味する。抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかはサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。
ここで「Ｆｃ領域」なる用語は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端町域を定めるために使用される。本用語は、天然配列Ｆｃ領域及び可変Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長すると定められている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン(Ｌｙｓ４４７)は、存在してもしていなくてもよい。ここで特定されない限りは、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD,1991に記載したような、ＥＵ指標と称される、ＥＵ番号付けシステムに従う。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の自然に生じた対立遺伝子変異体、並びに、エフェクター機能(例えば、抗体-依存性細胞-媒介性細胞傷害性)を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させることのない、置換、付加又は欠失を生じる変更を有する変異体を含むことを意図している。例えば、一又は複数のアミノ酸が、実質的に生物学的機能を失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失する可能性がある。このような変異体は、活性における影響が最小になるように、当該技術で公知の一般的規則に従い、選択することができる(例えば、Bowieら, Science 247, 1306-10 (1990)を参照)。
抗体に関して使用される場合、「エフェクター機能」なる用語は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合性、抗体-依存性細胞-媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)、抗体-依存性細胞ファゴサイトーシス(ＡＤＣＰ)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原の取込、細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化が含まれる。
ここで使用される場合、「エフェクター細胞」なる用語は、エフェクター部分のレセプター、例えばサイトカインレセプター、及び／又はそれらがエフェクター部分に結合するのを介してそれらの表面上にあるＦｃレセプター、例えばサイトカイン、及び／又は腫瘍細胞等、標的細胞の破壊に寄与する抗体のＦｃ領域を示す、リンパ球の集団を意味する。エフェクター細胞は、例えば細胞傷害性又は食作用効果を媒介可能である。エフェクター細胞に、限定されるものではないが、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ８＋細胞傷害Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞、及びマクロファージ／単球が含まれる。それらのレセプター発現パターンに依存して、種々のサブセットのエフェクター細胞、すなわち（ａ）Ｆｃレセプターではなく、特定のエフェクター部分に対するレセプターを発現し、本発明の抗体ではない、イムノコンジュゲートにより刺激される細胞(例えば、ＩＬ-２レセプターを発現するＴ細胞)；（ｂ）特定のエフェクター部分に対するレセプターではない、Ｆｃレセプターを発現し、本発明のイムノコンジュゲートではない抗体により刺激される細胞；及び（ｃ）Ｆｃレセプターと特定のエフェクター部分に対するレセプターの双方を発現し、抗体と本発明のイムノコンジュゲートにより同時に刺激される細胞(例えば、ＦｃγＩＩＩレセプター及びＩＬ-２レセプターを発現するＮＫ細胞)が存在する。
ここで使用される場合、「操作、操作された、操作する」といった用語は、自然に生じた又は組換えポリペプチド又はその断片の、ペプチド骨格のマニピュレーション又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基のアミノ酸配列の修飾、並びにこれらのアプローチの組合せが含まれる。特に、接頭語「グリコ-」を有する「操作する」、並びに「グリコシル化操作」なる用語には、細胞で発現する糖タンパク質のグリコシル化の改変を達成するための、オリゴ糖合成経路の遺伝的マニピュレーションを含む細胞のグリコシル化の仕組みの代謝的操作が含まれる。さらにグリコシル化操作には、グリコシル化における変異及び細胞環境の影響が含まれる。一実施態様において、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性における変更である。特定の実施態様において、操作により、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の変更に至る。グリコシル化操作は、「ＧｎＴＩＩＩ活性が増加した宿主細胞」(例えば、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴＩＩＩ)活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにマニピュレートされている宿主細胞)、「ＭａｎＩＩ活性が増加した宿主細胞」(例えば、α-マンノシダーゼＩＩ(ＭａｎＩＩ)活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにマニピュレートされている宿主細胞)、又は「α(１,６)フコシルトランスフェラーゼ活性が低減した宿主細胞」(例えば、α(１,６)フコシルトランスフェラーゼを、低減したレベルで発現するようにマニピュレートされている宿主細胞)を得るために使用することができる。
ここで使用される場合、「アミノ酸変異」なる用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び変異を含むことを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組合せにより、最終的なコンストラクトに達することができ、但し、最終コンストラクトは、所望の特徴、例えばＦｃレセプターへの結合性の低下を有する。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ-及び／又はカルボキシ末端の欠失及びアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。変更目的、例えばＦｃ領域の結合特徴のために、非保存的アミノ酸置換、すなわち、一つのアミノ酸を異なる構造及び／又は化学的特性を有する他のアミノ酸と置き換えることが、特に好ましい。アミノ酸置換には、自然に生じたアミノ酸又は２０の標準的アミノ酸の自然に生じたアミノ酸誘導体(例えば、４-ヒドロキシプロリン、３-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５-ヒドロキシリジン)が含まれる。アミノ酸変異は、当該技術でよく知られている遺伝的又は化学的方法を使用して、生じさせることができる。遺伝的方法には、部位指向性変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれる。遺伝的操作、例えば化学修飾以外の方法により、アミノ酸の側鎖基を変更する方法も有用であると考えられる。
ポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、特にデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用されるの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」なる用語は交換可能に使用され、このような細胞の子孫を含む、外来性の拡散が導入される細胞を意味する。宿主細胞は、継代の数にかかわらず、一次形成転換細胞及びそこから誘導された子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、親細胞と、核酸含有物において完全に同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞において、スクリーニング又は選択された場合に、同様の機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。宿主細胞は、本発明で使用されるイムノコンジュゲート及び抗体を生成するために使用可能な、任意のタイプの細胞システムである。一実施態様において、宿主細胞は、修飾されたオリゴ糖を用いて抗体の生成が可能なように操作される。ある実施態様において、宿主細胞は、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＩＩＩ)活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにマニピュレートされている。ある実施態様において、宿主細胞は、α-マンノシターゼＩＩ(ＭａｎＩＩ)活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにさらにマニピュレートされている。宿主細胞は、培養細胞、例えば哺乳動物の培養細胞、特にＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞ばかりでなく、さらにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物又は動物組織に包含される細胞も含む。
ここで使用される場合、「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」なる用語は、Ｎ結合オリゴ糖のトリマンノシルコア部のβ結合したマンノシドへの、β-１,４結合における、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)残基の付加を触媒可能なポリペプチドを意味する。これは、依存性であってもそうでなくても、特定の生物学的アッセイで測定された場合、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)に従い、β-１,４-マンノシル-糖タンパク質 ４-ベータ-Ｎ-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼ(ＥＣ ２.４.１４４)としても公知の、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性に類似、必須ではないが同一の酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。用量依存性が存在するケースにおいて、ＧｎＴＩＩＩのものに同一である必要はないが、ＧｎＴＩＩＩと比較して、付与された活性において、むしろ用量依存性にかなり類似している(すなわち、候補ポリペプチドは、ＧｎＩＩＩと比較して、より大きな活性、又は約２５倍未満、好ましくは約１０倍未満の活性、最も好ましくは約３倍未満の活性を示すであろう)。ある実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメイン、及びＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む、融合ポリペプチドである。特に、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩの局在化ドメイン、特にマンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。また、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、及びα１,６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。このような融合ポリペプチドを生成する方法、及び増加したエフェクター機能を有する抗体を生成するためのそれらの使用は、その全内容が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００４／０６５５４０号、米国仮特許第６０／４９５１４２号、及び米国特許第２００４／０２４１８１７号に開示されている。
ここで使用される場合、「ゴルジ局在化ドメイン」なる用語は、ゴルジ複合体内の位置に、ポリペプチドを固定する原因となる、ゴルジ常在ポリペプチドのアミノ酸配列を意味する。一般に、局在化ドメインは酵素のアミノ末端「尾部」を含む。
ここで使用される場合、「ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチド」なる用語は、Ｎ結合のオリゴ糖の分枝状ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２マンノース中間体における、１,３-及び１,６-結合したα-Ｄ-マンノース残基の加水分解を触媒可能なポリペプチドを意味する。これは、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)に従い、マンノシルオリゴ糖１,３-１,６-α-マンノシダーゼＩＩ(ＥＣ３.２.１.１１４)としても公知の、ゴルジα-マンノシダーゼＩＩの活性に類似、必須ではないが同一の酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。
「活性化Ｆｃレセプター」は、抗体のＦｃ領域による次の約束が、エフェクター機能を機能させるためにレセプター担持細胞を刺激するシグナル伝達事象を引き起こすＦｃレセプターである。活性化Ｆｃレセプターには、ＦｃγＲＩＩＩａ(ＣＤ１６ａ)、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩａ(ＣＤ３２)、及びＦｃαＲＩ(ＣＤ８９)が含まれる。
抗体-依存性細胞-媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)は、免疫エフェクター細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解に至らしめる免疫メカニズムである。標的細胞は、Ｆｃ領域を有する抗体又はその断片が、Ｆｃ領域に、一般にＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合している細胞である。ここで使用される場合、「増加したＡＤＣＣ」なる用語は、ＡＤＣＣのメカニズムにより、付与された時間において付与された数の標的細胞の溶解を達成するのに必要な、標的細胞を包囲する媒体における、抗体濃度の低減度合い、及び／又は上述したＡＤＣＣのメカニズムにより、標的細胞を包囲する媒体における、付与された抗体濃度で、付与された時間に溶解した標的細胞の数の増加度合いと定められる。ＡＤＣＣの増加度合いは、同様の標準的な生成、精製、調製及び保管方法(当業者に公知のもの)を使用し、同じタイプの宿主細胞により生成される、操作はされていない同様の抗体により媒介されるＡＤＣＣに相対するものである。例えば、ここで記載された方法により、変更されたパターンのグリコシル化を有する(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、又は他のグリコシルトランスフェラーゼを発現する)ように操作された宿主細胞から生成される抗体によって媒介されるＡＤＣＣにおける増加度合いは、同様のタイプの操作されていない宿主細胞により生成される同様の抗体により媒介されるＡＤＣＣに相対するものである。
「増加した抗体依存性細胞-媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)を有する抗体」は、当業者に公知の任意の適した方法により測定される、増加したＡＤＣＣを有する抗体を意味する。承認されているインビトロＡＤＣＣアッセイは以下の通りである：
１）アッセイは、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することが公知の標的細胞を使用；
２）アッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健康なドナーの血液から単離された、ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を使用；
３）アッセイは、以下のプロトコルに従い実施：
ｉ）ＰＢＭＣを標準的な密度の標準的手順を使用して単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地に５×１０６細胞／ｍｌで懸濁させ；
ｉｉ）標準細胞を標準的な組織培養法で増殖させ、９０％以上の生存率を有する指数関数的増殖相から収集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地において洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、１０５細胞／ｍｌ密度で細胞培養培地に再懸濁させ；
ｉｉｉ）上述した、１００マイクロリットルの最終的な標的細胞懸濁液を、９６-ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移し；
ｉｖ）抗体を、細胞培養培地に、４０００ｎｇ／ｍｌ〜０．０４ｎｇ／ｍｌで連続希釈し、５０マイクロリットルの得られた抗体溶液を、９６-ウェルマイクロタイタープレートの標的細胞に添加し、上述した全濃度範囲で、種々の抗体濃度にて３回試験し；
ｖ）最大放出(ＭＲ)コントロールについて、標識された標的細胞を含有するプレートの３つの付加的なウェルに、５０マイクロリットルの２％(ＶＮ)非イオン性洗浄剤の水溶液(Nonidet, Sigma, St. Louis)を、抗体溶液(上述したポイントｉｖ)の代わりに受容させ；
ｖｉ）自発放出(ＳＲ)コントロールについて、標識された標的細胞を含有するプレートの３つの付加的なウェルに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を、抗体溶液(上述したポイントｉｖ)の代わりに受容させ；
ｖｉｉ）ついで、９６-ウェルマイクロタイタープレートを５０ｘｇで１分遠心分離し、４℃で１時間インキュベートし；
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液(上述したポイントｖ)を各ウェルに添加し、２５：１の比率のエフェクター：標的細胞を生じさせ、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で４時間、インキュベーターにプレートを配し；
ｉｘ）各ウェルの無細胞懸濁液を収集し、実験的に放出させた放射活性(ＥＲ)をガンマカウンターを使用して定量し；
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、式(ＥＲ−ＭＲ)／(ＭＲ−ＳＲ)×１００に従い、各抗体濃度について算出し、ここでＥＲは、抗体濃度に対して定量された平均放射化活性(上述したポイントｉｘを参照)であり、ＭＲはＭＲコントロール(上述したポイントｖを参照)について定量された平均放射活性(上述したポイントｉｘを参照)であり、ＳＲはＳＲコントロール(上述したポイントｖｉ)について定量された平均放射活性(上述したポイントｉｘを参照)である；
４）「増加したＡＤＣＣ」は、上述にて試験した抗体濃度範囲内で観察される、特異的溶解の最大パーセンテージにおける増加度合い、及び／又は上述にて試験した抗体濃度範囲内で観察される、特異的溶解の最大パーセンテージの２分の１を達成するのに必要な抗体濃度における低減度合いとして定義される。ＡＤＣＣの増加度合いは、同様の標準的な生成、精製、調製及び保管方法(当業者に公知のもの)を使用し、同じタイプの宿主細胞により生成される、操作はされていない同様の抗体により媒介されるＡＤＣＣに相対するものである。
ここで使用される場合、「組合せ」(及び「組合せる又は「組合せた」等のその文法的変形」)は、本発明の抗体とイムノコンジュゲートの組合せを含み、ここで抗体とイムノコンジュゲートは、同一又は異なった容器、同一又は異なった薬学的製剤にあり、一緒又は別々に投与され、任意の順序で連続して又は同時に投与され、同一又は異なった経路で投与されるが、但し、抗体とイムノコンジュゲートは、体内の生物学的効果を同時に働きかける、すなわちエフェクター細胞を同時に刺激することができるようにされる。例えば、本発明の抗体とイムノコンジュゲートを「組合せる」とは、特定の薬学的製剤において、まずイムノコンジュゲートを投与し、続いて、他の薬学的組成物において抗体を投与する、又はその逆を意味する。
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織に生理学的変化をもたらすのに必要な量を意味する。
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望する治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。治療的有効量の薬剤で、疾患の悪影響が除去、低減、遅延化、最小化又は予防される。いくつかの活性成分の組合せの治療的有効量は、各活性成分の治療的有効量であってよい。また、治療に起因する副作用を低減するために、いくつかの活性成分の組合せの治療的有効量は、付加的又は超付加的な、もしくは相乗効果を生じるのに有効であり、組合せて治療的に有効であるが、それらが単独で使用された場合、活性成分の一つ又はいくつかの治療量以下であってもよい、個々の活性成分の量である。
「個体」又は「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物には、限定されるものではないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、及び齧歯動物(例えば、マウス及びラット)が含まれる。特に、個体又は被験者はヒトである。
「薬学的組成物」なる用語は、薬剤の生物活性が効果的であるような形態であり、製剤が投与される被験者に対して、許容できない毒性のある付加的な成分を含まない調製物を意味する。
「薬学的に許容可能な担体」は、被験者に無毒な、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を意味する。薬学的に許容可能な担体には、限定されるものではないが、バッファー、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれる。
ここで使用される場合、「治療」(及び「治療する」又は「治療した」等の文法的変形)は、治療される個体の疾患の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を称し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療に所望する効果には、限定されるものではないが、発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び緩解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の組合せは、疾患の発症を遅延化、又は疾患の進行の遅延化のために使用される。
「パッケージ挿入物」なる用語は、このような治療用製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与法、併用治療、禁忌、及び／又は警告についての情報を含む、治療用製品の市販パッケージに常套的に含まれる指示書を意味するために使用される。
イムノコンジュゲート
本発明で有用なイムノコンジュゲートは、少なくとも一つのエフェクター部分と少なくとも一つの抗原-結合部分を有するポリペプチド分子である。
イムノコンジュゲートは、抗原-結合部分にエフェクター部分を化学的にコンジュゲートすることにより、又は融合タンパク質として、抗原-結合部分とエフェクター部分を発現させることにより調製することができる(例えば、Nakamura and Kubo, Cancer 80, 2650-2655 (1997); 及び Beckerら, Proc Natl Acad Sci USA 93, 7826-7831 (1996)を参照)。本発明で使用するために、融合タンパク質として発現したイムノコンジュゲートが、一般に好ましい。従って、ある実施態様において、エフェクター部分は、抗原-結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している(すなわち、イムノコンジュゲートは融合タンパク質である)。このようなイムノコンジュゲートにおいて、エフェクター部分は免疫グロブリン重鎖又は軽鎖に融合していてもよい。本発明において特に有用なものは、抗原-結合部分として、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ分子として、抗体断片を含有するイムノコンジュゲートである。例示的な抗体断片／サイトカインイムノコンジュゲートは、Savageら, Br J Cancer 67, 304-310 (1993); Yangら, Mol. Immunol. 32, 873-881 (1995)；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１／０６２２９８Ａ２；米国特許第５６５０１５０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／１１９８９７Ａ２；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２９７３２Ａ２に記載されている。
一実施態様において、エフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。一実施態様において、エフェクター部分はサイトカインである。一実施態様において、イムノコンジュゲートは少なくとも２の抗原-結合部分を有する。イムノコンジュゲートの抗原-結合部分及びエフェクター部分は、上述及び以下に詳細に述べるものを含む。イムノコンジュゲートの抗原-結合部分は、様々な標的分子に対するものであることができる(例えば、腫瘍細胞又は腫瘍ストローマにおいて発現したタンパク質分子常の抗原決定基)。ここに開示の特に有用なイムノコンジュゲートは、一又は複数の次の特徴を示す：特に、同様のエフェクター部分を担持し、同様の抗原決定基に対するものである、種々の立体配置のイムノコンジュゲートと比較して、高度な作用特異性、低減した毒性及び／又は改善された安定性。本発明で使用される特定のイムノコンジュゲートは、その全内容が出典明示によりここに援用される、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３にさらに記載されている。
イムノコンジュゲートフォーマット
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に記載されているイムノコンジュゲートは、少なくとも２の抗原結合ドメインを有する。よって、一実施態様において、イムノコンジュゲートは、少なくとも一つの第１のエフェクター部分と少なくとも一つの第１及び第２の抗原結合部分を有する。一実施態様において、第１のエフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分は、ｓｃＦｖ分子及びＦａｂ分子からなる群から独立して選択される。特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ分子である。他の実施態様において、第１及び第２の抗原-結合部分はｓｃＦｖ分子である。特定の実施態様において、第１のエフェクター部分は、第１の抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第２の抗原結合部分は、ｉ）第１のエフェクター部分又はｉｉ）第１の抗原結合部分のいずれかのアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、第１の単鎖エフェクター部分と、第１及び第２の抗原結合部分から本質的になる。さらなる特定の実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ分子である。
一実施態様において、第１のエフェクター部分は、第１の抗原結合部分とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、さらに第２の抗原結合部分とアミノ-末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様において、第１の抗原結合部分は、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、さらに第２抗原結合部分とアミノ-末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様において、第１の抗原結合部分は、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分とアミノ-末端ペプチド結合を共有し、さらに第２抗原結合部分とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。
一実施態様において、エフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分は、第１の重鎖可変領域とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の重鎖可変領域とアミノ-末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様において、エフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分は、第１の軽鎖可変領域とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２の軽鎖可変領域とアミノ-末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様において、第１の重鎖及び軽鎖可変領域は、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分に、カルボキシ-末端ペプチド結合により結合しており、さらに、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に、アミノ-末端ペプチド結合により結合している。他の実施態様において、重鎖又は軽鎖可変領域は、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分に、アミノ-末端ペプチド結合により結合しており、さらに、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に、カルボキシ-末端ペプチド結合により結合している。
特定の実施態様において、エフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分は、Ｆａｂ重鎖又は軽鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖とアミノ-末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様において、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、第１の単鎖エフェクター部分とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖とアミノ-末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様において、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、第１の単鎖エフェクター部分とアミノ-末端ペプチド結合を共有し、さらに、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、一又は複数のｓｃＦｖ分子とアミノ-末端ペプチド結合を共有する、少なくとも一つの第１のエフェクター部分を有し、ここで第１のエフェクター部分は、一又は複数のｓｃＦｖ分子とカルボキシ-末端ペプチド結合をさらに共有している。特定の実施態様において、エフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。
他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、少なくとも一つの第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分と、第１及び第２の抗原結合部分を有し、ここで各抗原結合部分は、イムノコンジュゲート定常ドメインを含む定常ドメインに、カルボキシ-末端アミノ酸で結合したｓｃＦｖ分子を有し、第１の抗原結合部分は、第１のエフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に、その定常領域のカルボキシ-末端アミノ酸で結合しており、第１及び第２の抗原結合部分は、少なくとも一つのジスルフィド結合を介して共有結合している。特定の実施態様において、定常領域は、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＨ２、ＩｇＧ ＣＨ３、ＩｇＧ Ｃκ、ＩｇＧ Ｃλ及びＩｇＥ ＣＨ４ドメインからなる群から独立して選択される。一実施態様において、第１の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して、第２の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインに共有結合している。一実施態様において、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１及び第２の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのカルボキシ-末端に位置している。他の実施態様において、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１及び第２の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのアミノ-末端に位置している。他の実施態様において、少なくとも２のジスルフィド結合は、第１及び第２の抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのアミノ-末端に位置している。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、第１及び第２の抗原結合部分を有し、それぞれは、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインを有する定常領域に結合し、ここで第１の抗原結合部分は、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に結合しており、第１及び第２の抗原結合部分は少なくとも一つのジスルフィド結合を介して共有結合している。イムノコンジュゲートの第２の抗原結合部分は、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、第２のエフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に、さらに結合可能である。一実施態様において、第２のエフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、第１及び第２の抗原結合部分を有し、それぞれは、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、ＩｇＧ Ｃκドメインを有する定常領域に結合したｓｃＦｖ分子を有し、ここで第１の抗原結合部分は、その定常領域のカルボキシ-末端アミノ酸で、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に結合しており、第１及び第２の抗原結合部分は、少なくとも一つのジスルフィド結合を介して共有結合している。イムノコンジュゲートの第２の抗原結合部分は、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、第２のエフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に、さらに結合可能である。一実施態様において、第２のエフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。
他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、第１及び第２の抗原結合部分を有し、それぞれは、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、ＩｇＥ ＣＨ４ドメインを有する定常領域に結合したｓｃＦｖ分子を有し、ここで第１の抗原結合部分は、その定常領域のカルボキシ-末端アミノ酸で、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に結合しており、第１及び第２の抗原結合部分は、少なくとも一つのジスルフィド結合を介して共有結合している。イムノコンジュゲートの第２の抗原結合部分は、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、第２のエフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に、さらに結合可能である。一実施態様において、第２のエフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。
他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、第１及び第２の抗原結合部分を有し、それぞれは、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、ＩｇＥ ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖ分子を有し、ここで第１の抗原結合部分は、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、第１のエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に結合しており、第１及び第２の抗原結合部分は、少なくとも一つのジスルフィド結合を介して共有結合している。イムノコンジュゲートの第２の抗原結合部分は、そのカルボキシ-末端アミノ酸で、第２のエフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に、さらに結合可能である。一実施態様において、第２のエフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。
他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、第１及び第２のエフェクター部分と、第１及び第２の抗原結合部分を有し、それぞれの抗原結合部分は、その重鎖又は軽鎖カルボキシ-末端アミノ酸で、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに結合したＦａｂ分子を有し、ここでそれぞれのＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、そのそれぞれのカルボキシ-末端アミノ酸で、１のエフェクター部分のアミノ-末端アミノ酸に結合しており、第１及び第２の抗原結合部分は、少なくとも一つのジスルフィド結合を介して共有結合している。特定の実施態様において、第１及び／又は第２のエフェクター部分は単鎖エフェクター部分である。さらなる実施態様において、抗原結合部分のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、ジスルフィド結合により結合していてもよい。他の実施態様において、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１及び第２の抗原結合部分のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのカルボキシ-末端に位置している。他の実施態様において、少なくとも一つのジスルフィド結合は、第１及び第２の抗原結合部分のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのアミノ-末端に位置している。他の実施態様において、少なくとも２のジスルフィド結合は、第１及び第２の抗原結合部分のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのアミノ-末端に位置している。
いくつかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、エフェクター部分と抗原結合部分との間に位置する、一又は複数のタンパク質分解性切断部位を有する。イムノコンジュゲートの成分(例えば、抗原結合部分及び／又はエフェクター部分)は、直接又は種々のリンカー、特に一又は複数のアミノ酸、典型的には約２-２０のアミノ酸で、当該技術で公知であり、ここで開示されているものを介して結合していてよい。適切な非免疫原性のリンカーペプチドには、例えば(Ｇ４Ｓ)ｎ、(ＳＧ４)ｎ又はＧ４(ＳＧ４)ｎリンカーペプチドが含まれ、ここでｎは一般に、１〜１０、典型的には２〜４の数である。
本発明のイムノコンジュゲートの抗原-結合部分は、一般に、それが標的部位、例えば抗原決定基を担持する特定のタイプの腫瘍細胞又は腫瘍ストローマに結合する実体(例えば、エフェクター部分又は第２の抗原結合部分)に指向可能であり、特定の抗原決定基に結合するポリペプチド分子である。イムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、血清及び／又は細胞外マトリックス(ＥＣＭ)中に遊離で見出される抗原決定基に結合可能である。腫瘍抗原の非限定的例には、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ-１／メラン-Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチターゼＩＶ(ＤＰＰＩＶ)、アデノシンデアミナーゼ-結合タンパク質(ＡＤＡｂｐ)、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原(ＣＲＣ)-Ｃ０１７-１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びその免疫原性エピトープＣＡＰ-１及びＣＡＰ-２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異性抗原(ＰＳＡ)及びその免疫原性エピトープＰＳＡ-１、ＰＳＡ-２、及びＰＳＡ-３、前立腺特異性膜抗原(ＰＳＭＡ)、Ｔ-細胞レセプター／ＣＤ３-ゼータ鎖、ＭＡＧＥ-腫瘍抗原ファミリー(例えば、ＭＡＧＥ-Ａ１、ＭＡＧＥ-Ａ２、ＭＡＧＥ-Ａ３、ＭＡＧＥ-Ａ４、ＭＡＧＥ-Ａ５、ＭＡＧＥ-Ａ６、ＭＡＧＥ-Ａ７、ＭＡＧＥ-Ａ８、ＭＡＧＥ-Ａ９、ＭＡＧＥ-Ａ１０、ＭＡＧＥ-Ａ１１、ＭＡＧＥ-Ａ１２、ＭＡＧＥ-Ｘｐ２(ＭＡＧＥ-Ｂ２)、ＭＡＧＥ-Ｘｐ３(ＭＡＧＥ-Ｂ３)、ＭＡＧＥ-Ｘｐ４(ＭＡＧＥ-Ｂ４)、ＭＡＧＥ-Ｃ１、ＭＡＧＥ-Ｃ２、ＭＡＧＥ-Ｃ３、ＭＡＧＥ-Ｃ４、ＭＡＧＥ-Ｃ５)、ＧＡＧＥ-腫瘍抗原ファミリー(例えば、ＧＡＧＥ-１、ＧＡＧＥ-２、ＧＡＧＥ-３、ＧＡＧＥ-４、ＧＡＧＥ-５、ＧＡＧＥ-６、ＧＡＧＥ-７、ＧＡＧＥ-８、ＧＡＧＥ-９)、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ-１、ＮＡＧ、ＧｎＴ-Ｖ、ＭＵＭ-１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α-フェトプロテイン、Ｅ-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、及びγ-カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００ Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質(ＡＰＣ)、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ-イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス生成物、例えばヒト乳頭腫ウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ-１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ-コード化核内抗原(ＥＢＮＡ)-１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-２(ＨＯＭ-ＭＥＬ-４０)、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-４、ＳＳＸ-５、ＳＣＰ-１及びＣＴ-７、及びｃ-ｅｒｂＢ-２が含まれる。ウイルス抗原の非限定適例には、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、エプスタインバーウイルスＬＭＰ-１、肝炎ＣウイルスＥ２糖タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１６０、及びＨＩＶ ｇｐ１２０が含まれる。ＥＣＭ抗原の非限定的例には、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、リンク、カドヘリン、ラミニン、ラミニン型ＥＧＦ、レクチン、フィブロネクチン、ノッチ、テネイシン、及びマトリキシンが含まれる。本発明のイムノコンジュゲートは、次の特異的な非限定的例の細胞表面抗原：ＦＡＰ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２(Ｔ-細胞表面抗原)、ＣＤ３(ＴＣＲと結合したヘテロマルチマー)、ＣＤ２２(Ｂ-細胞レセプター)、ＣＤ２３(低親和性のＩｇＥレセプター)、ＣＤ２５(ＩＬ-２レセプターα鎖)、ＣＤ３０(サイトカインレセプター)、ＣＤ３３(骨髄細胞表面抗原)、ＣＤ４０(腫瘍壊死因子レセプター)、ＩＬ-６Ｒ(ＩＬ６レセプター)、ＣＤ２０、ＭＣＳＰ、ｃ-Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質-１(ＣＤＣＰ１)、及びＰＤＧＦβＲ(β血小板由来成長因子レセプター)に結合可能である。
ある実施態様において、抗原-結合部分は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に対するものである。特定の実施態様において、抗原-結合部分は、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)、テネイシン-ＣのＡ１ドメイン(ＴＮＣ Ａ１)、テネイシン-ＣのＡ２ドメイン(ＴＮＣ Ａ２)、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ(ＥＤＢ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される抗原に対するものである。
一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、２又はそれ以上の抗原結合部分を有し、これら抗原結合部分のそれぞれは、同じ抗原決定基に特異的に結合する。他の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、２又はそれ以上の抗原結合部分を有し、これら抗原結合部分のそれぞれは、異なる抗原決定基に特異的に結合する。
抗原結合部分は、任意のタイプの抗体、又は抗原決定基に対する特異的結合性を保持しているその断片とすることができる。一実施態様において、抗原-結合部分は抗体又は抗体断片である。抗体断片には、限定されるものではないが、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ(例えば、Hudson 及び Souriau, Nature Med 9, 129-134 (2003)を参照)が含まれる。特に有用な抗体断片は、Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖ断片である。従って、一実施態様において、抗原-結合部分は、Ｆａｂ分子及びｓｃＦｖ分子から選択される。一実施態様において、抗原-結合部分はＦａｂ分子である。他の実施態様にいて、抗原-結合部分はｓｃＦｖ分子である。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢに対して特異的な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＥＤＢのエピトープへの結合について、モノクローナル抗体Ｌ１９と競合可能な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／１２８５６３Ａ１(その全体が参照としてここに導入を参照)。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでＬ１９モノクローナル抗体由来の第１のＦａｂ重鎖は、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでＬ１９モノクローナル抗体由来の第１のＦａｂ重鎖は、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-１２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでＬ１９モノクローナル抗体由来の第１のＦａｂ重鎖は、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＦＮ α分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでＬ１９モノクローナル抗体由来の第１のＦａｂ重鎖は、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＧＭ-ＣＳＦ分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでＬ１９モノクローナル抗体由来の第１のｓｃＦｖは、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第２のｓｃＦｖとカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号：９１のポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の実施態様において、イムノコンジュゲートはＬ１９モノクローナル抗体由来のＦａｂ軽鎖を有する。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９１及び配列番号：９２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９８及び配列番号：９２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９９と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９９及び配列番号：９２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００及び配列番号：９２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０１及び配列番号：９２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により共有結合している。
一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１)に対して特異的な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＴＮＣ-Ａ１のエピトープへの結合について、モノクローナル抗体Ｆ１６と競合可能な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／１２８５６３Ａ１（その全体が出典明示によりここに援用）を参照のこと。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１及び／又はＡ４ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１又はＴＮＣ-Ａ４又はＴＮＣ-Ａ１／Ａ４)に対して特異的な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第１のＦａｂ重鎖は、テネイシンのＡ１ドメインに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＦＮα分子又はＧＭ-ＣＳＦ分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第１のＦａｂ重鎖は、テネイシンのＡ１ドメインに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここでテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第１のｓｃＦｖは、テネイシンのＡ１ドメインに対して特異的な第２のｓｃＦｖとカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：８又は配列番号：９のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：６又は配列番号：７のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：８又は配列番号：９のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号：６又は配列番号：７のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９６又は配列番号：１０５と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：９７又は配列番号：１１５のいずれかと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：９６及び配列番号：９７と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０５及び配列番号：１１５と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ２ドメイン(ＴＮＣ-Ａ２)に対して特異的な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、テネイシンのＡ２ドメインに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、テネイシンのＡ２ドメインに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖と、カルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子、ＩＬ-１２分子、ＩＦＮ α分子又はＧＭ-ＣＳＦ分子と、カルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、テネイシンのＡ２ドメインに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、テネイシンのＡ２ドメインに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：５、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、及び配列番号：８５の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、及び配列番号：８４の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：５、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、及び配列番号：８５の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体と、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、及び配列番号：８４の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１７、配列番号：１１８及び配列番号：１１９の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１２０、配列番号：１２１及び配列番号：１２２の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１７、配列番号：１１８及び配列番号：１１９の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体と、配列番号：１２０、配列番号：１２１及び配列番号：１２２の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１７、及び配列番号：１２１又は配列番号：１２２のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１８、及び配列番号：１２０又は配列番号：１２１のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１９及び配列番号：１２０又は配列番号：１２２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、線維芽細胞活性タンパク質(ＦＡＰ)に対して特異的な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、ＦＡＰに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、ＦＡＰに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子、ＩＬ-１２分子、ＩＦＮ α分子又はＧＭ-ＣＳＦ分子と、カルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、ＦＡＰに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、ＦＡＰに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、ＦＡＰに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、ＦＡＰに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-１２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、及び配列番号：６９からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、及び配列番号：６８からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、及び配列番号：６９からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体と、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、及び配列番号：６８からなる群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、及び配列番号：１１１の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１２、配列番号：１１３、配列番号：１１４、及び配列番号：１１６の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０３、配列番号：１０７、及び配列番号：１０８の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体と、配列番号：１１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０２、配列番号：１０９、配列番号：１１０、及び配列番号：１１１の群から選択される配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体と、配列番号：１１２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０４及び配列番号：１１４と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０６及び配列番号：１１６と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０８及び配列番号：１１３と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０９及び配列番号：１１２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１０及び配列番号：１１２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらなる他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１１１及び配列番号：１１２と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)に対して特異的な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、ＭＣＳＰに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、ＭＣＳＰに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子、ＩＬ-１２分子、ＩＦＮ α分子又はＧＭ-ＣＳＦ分子と、カルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、ＭＣＳＰに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、ＭＣＳＰに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：８６又は配列番号：８８のいずれかの配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：８７又は配列番号：９０のいずれかの配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：８６又は配列番号：８８のいずれかの配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体と、配列番号：８７又は配列番号：９０のいずれかの配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：８６の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：８７の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：８８の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：８７の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１２３又は配列番号：１２５のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１２４又は配列番号：１２７のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１２３又は配列番号：１２５のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号：１２４又は配列番号：１２７のいずれかと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１２３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号：１２４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１２５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号：１２４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、癌胎児抗原(ＣＥＡ)に対して特異的な、少なくとも１、典型的には２又はそれ以上の抗原結合部分を有する。他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、ＣＥＡに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、ＣＥＡに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子、ＩＬ-１２分子、ＩＦＮ α分子又はＧＭ-ＣＳＦ分子と、カルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。さらなる他の実施態様において、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を有し、ここで、ＣＥＡに対して特異的な第１のＦａｂ重鎖は、ＣＥＡに対して特異的な第２のＦａｂ重鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を順に共有し、ＩＬ-２分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１５４の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。他の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１５５の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。さらに特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１５４の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号：１５５の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。本発明の抗原-結合部分は、その機能的断片又は変異体を含む、配列番号：３-１２７で説明された配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を有するものが含まれる。また本発明は、保存的アミノ酸置換を有する配列番号：３-１２７の配列を含む抗原-結合部分も含有する。配列番号：９１，９３、９４、９５、９６、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２３及び１２５の配列において、ヒトＩＬ-２の配列(配列番号：１を参照)は、ＩＬ-２類似体の配列、特にここに記載の変異ＩＬ-２の配列(配列番号：２を参照)により置き換えられてもよい。
イムノコンジュゲートのエフェクター部分
本発明で称されるエフェクター部分は、一般に、例えばシグナル伝達径路を介して細胞活性に影響を与えるポリペプチドである。従って、本発明で有用なエフェクター部分は、細胞膜の外側からシグナルを伝達し、細胞内における反応性を調節する、レセプター-媒介性シグナル伝達に関連している可能性がある。例えば、イムノコンジュゲートのエフェクター部分はサイトカインであってよい。特定の実施態様において、エフェクター部分は、ここで記載されたような、単鎖エフェクター部分である。一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートの一又は複数のエフェクター部分、典型的には単鎖エフェクター部分は：ＩＬ-２、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮ-α、及びＩＬ-１２からなる群から選択されるサイトカインである。一実施態様において、エフェクター部分はＩＬ-２である。他の実施態様において、イムノコンジュゲートの一又は複数の単鎖エフェクター部分は：ＩＬ-８、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１β、及びＴＧＭ-βからなる群から選択されるサイトカインである。
一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分はＩＬ-２である。特定の実施態様において、ＩＬ-２エフェクター部分は：活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞(ＣＴＣ)活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、及びＮＫ／リンパ球活性化キラー(ＬＡＫ)抗腫瘍細胞傷害性からなる群から選択される、一又は複数の細胞反応を誘発させることができる。ある実施態様において、ＩＬ-２エフェクター部分は、変異していないＩＬ-２エフェクター部分と比較して、ＩＬ-２レセプターのα-サブミットに対する変異ＩＬ-２エフェクター部分の親和性は減少させ又は無効になっているが、中程度の親和性のあるＩＬ-２レセプター(ＩＬ-２レセプターのβ-及びγ-サブミットからなる)に対する、変異ＩＬ-２エフェクター部分の親和性は保存されている、少なくとも一つのアミノ酸変異を有するＩＬ-２エフェクター部分である。一実施態様において、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。特定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３の位置(類)に、１、２又は３のアミノ酸置換を有する。さらに特定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５及び７２に対応する位置に、３のアミノ酸置換を有する。さらに特定の実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを有するヒトＩＬ-２である。一実施態様において、変異ＩＬ-２エフェクター部分は、ヒトＩＬ-２の３位に対応する位置に、アミノ酸変異を付加的に有し、ＩＬ-２のＯ-グリコシル化部位が除去されている。特に、前記付加的なアミノ酸変異は、スレオニン配列がアラニン残基で置き換えられたアミノ酸置換である。アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを有する四重変異(ＱＭ)ＩＬ-２の配列を、配列番号：２に示す。適切な変異ＩＬ-２分子は、欧州特許出願第11153964.9に詳細に記載されている。
イムノコンジュゲートのエフェクター部分として有用なへにＩＬ-２分子は、当該技術でよく知られている遺伝的又は化学的方法を使用し、欠失、置換、挿入又は修飾することにより調製することができる。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異性変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合資等が含まれる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定により確認することができる。これに関し、天然ＩＬ-２のヌクレオチド配列は、Taniguchiら (Nature 302, 305-10 (1983))に記載されており、ヒトＩＬ-２をコードする核酸は、例えばAmerican Type Culture Collection (Rockville MD)等、公の保管所から入手することができる。ヒトＩＬ-２の例示的な配列は、配列番号：１に示されている。置換又は挿入は、天然並びに非天然のアミノ酸残基を含みうる。アミノ酸修飾は、グリコシル化部位の付加又は除去、又は炭水化物の結合等、よく知られている化学的な修飾方法を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分はＧＭ-ＣＳＦである。特定の実施態様において、ＧＭ-ＣＳＦエフェクター部分は、顆粒球、単球又は樹状細胞に、増殖及び／又は分化を誘発させることができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分は
ＩＦＮ-αである。特定の実施態様において、ＩＦＮ-αエフェクター部分は、ウイルス感性細胞におけるウイルス複製の阻害、及び多くの組織適合性複合体Ｉ(ＭＨＣ Ｉ)の発現のアップレギュレートからなる群から選択される、一又は複数の細胞反応を誘発させることができる。他の特定の実施態様において、ＩＦＮ-αエフェクター部分は素様細胞における増殖を阻害することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分はＩＬ-１２である。特定の実施態様において、ＩＬ-１２エフェクター部分は、ＮＫ細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、Ｔ細胞における増殖、及びＴ細胞における分化からなる群から選択される、一又は複数の細胞反応を誘発させることができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分はＩＬ-８である。特定の実施態様において、ＩＬ-８エフェクター部分は、好中球に走化性を誘発させることができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分はＭＩＰ-１αである。特定の実施態様において、ＭＩＰ-１αエフェクター部分は、単球及びＴリンパ球細胞に走化性を誘発させることができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分はＭＩＰ-１βである。特定の実施態様において、ＭＩＰ-１βエフェクター部分は、単球及びＴリンパ球細胞に走化性を誘発させることができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分はＴＧＦ-βである。特定の実施態様において、ＴＧＦ-βエフェクター部分は、単球における走化性、マクロファージにおける走化性、活性化マクロファージにおけるＩＬ-１発現のアップレギュレート、及び活性化Ｂ細胞におけるＩｇＡ発現のアップレギュレートからなる群から選択される、一又は複数の細胞反応を誘発させることができる。
抗体
本発明で有用な抗体は、特定の抗原決定基、例えば、特定の腫瘍細胞抗原に対して結合し、Ｆｃ領域を有する抗体又は抗体断片を含む。ある実施態様において、抗体は腫瘍細胞上に存在する抗原に対するものである。本発明で有用な抗体の特定の標的抗原は、限定されるものではないが、細胞表面レセプター、例えば上皮細胞増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、インスリン様成長因子レセプター(ＩＧＦＲ)、及び血小板由来増殖因子レセプター(ＰＤＧＦＲ)、前立腺特異性膜抗原(ＰＳＭＡ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)、ジペプチジルペプチターゼＩＶ(ＣＤ２６、ＤＰＰＩＶ)、ＦＡＰ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ-３、Ｅ-カドヘリン、ＣＤ２０、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)、ｃ-Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質-１(ＣＤＣＰ１)、及び扁平上皮癌抗原(ＳＣＣＡ)等を含む、腫瘍細胞の表面で発現する抗原を含む。
特定の実施態様において、抗体は、ＣＤ２０、上皮細胞増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリン様成長因子１レセプター(ＩＧＦ-１Ｒ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)、ｃ-Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質-１(ＣＤＣＰ１)、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される抗原に対するものである。一実施態様において、抗体、多重特異性抗体は、ＣＤ２０、上皮細胞増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリン様成長因子１レセプター(ＩＧＦ-１Ｒ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)、ｃ-Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質-１(ＣＤＣＰ１)、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される、２又はそれ以上の抗原に対するものである。
本発明で有用な特定の抗-ＣＤ２０抗体は、マウスＢ-Ｌｙ１抗体の結合特異性を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスＩＩ型の抗-ＣＤ２０抗体である(Poppema and Visser, Biotest Bulletin 3, 131-139 (1987))。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号：１２８のＣＤＲ１、配列番号：１２９のＣＤＲ２、及び配列番号：１３０のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号：１３１のＣＤＲ１、配列番号：１３２のＣＤＲ２、及び配列番号：１３３のＣＤＲ３；
を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスＩＩ型の抗-ＣＤ２０抗体である。
特に、前記抗体の重鎖可変領域フレームワーク領域(ＦＲ)ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＶＨ１ １０ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列であり、前記抗体の重鎖可変領域ＦＲ４は、ＪＨ４ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域ＦＲ、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＶＫ ２ ４０ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域ＦＲ４は、ＪＫ４ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列である。
特に本発明で有用な特定の抗-ＣＤ２０抗体は、配列番号：１３４の重鎖可変ドメイン、及び配列番号：１３５の軽鎖可変ドメインを含む。
このような抗-ＣＤ２０抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００５／０４４８５９号に記載されている。
本発明で有用な特定の抗-ＥＧＦＲ抗体は、ラットＩＣＲ６２抗体の結合特異性を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗体である(Modjtahediら, Br J Cancer 67, 247-253 (1993))。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号：１３６のＣＤＲ１、配列番号：１３７のＣＤＲ２、及び配列番号：１２８のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号：１３９のＣＤＲ１、配列番号：１４０のＣＤＲ２、及び配列番号：１４１のＣＤＲ３；
を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗-ＥＧＦＲ抗体である。
特に本発明で有用な特定の抗-ＥＧＦＲ抗体は、配列番号：１４２の重鎖可変ドメイン、及び配列番号：１４３の軽鎖可変ドメインを含む。
このような抗-ＥＧＦＲ抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００６／０８２５１５号及び国際公開第２００８／０１７９６３号に記載されている。
本発明で有用な他の適切なヒト化されたＩｇＧクラスの抗-ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ／ＩＭＣ-Ｃ２２５(アービタックス(登録商標)、Goldsteinら, Clin Cancer Res 1, 1311-1318 (1995)に記載)、パニツムナブ／ＡＢＸ−ＥＧＦ(Vectibix(登録商標)、Yangら, Cancer Res 59, 1236-1243 (1999), Yangら, Critical Reviews in Oncology/Hematology 38, 17-23 (2001)に記載)、ニモツズマブ／ｈ-Ｒ３(TheraCim(登録商標)、Mateoら, Immunotechnology 3, 71-81 (1997); Crombet-Ramosら, Int J Cancer 101, 567-575 (2002), Boland & Bebb, Expert Opin Biol Ther 9, 1199-1206 (2009)に記載)、マツズマブ／ＥＭＤ７２０００(Bierら, Cancer Immunol Immunother 46, 167-173 (1998), Kim, Curr Opin Mol Ther 6, 96-103 (2004)に記載)、及びザルツムマブ／２Ｆ８(Bleekerら, J Immunol 173, 4699-4707 (2004), Lammerts van Bueren, PNAS 105, 6109-6114 (2008)に記載)を含む。
本発明で有用な特定の抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、その全内容が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００５／００５６３５号及び国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されており、インスリン様成長因子-１レセプター(ＩＧＦ-１Ｒ)への、インスリン様成長因子-１(ＩＧＦ-１)及びインスリン様成長因子-２(ＩＧＦ-２)の結合を阻害する。
本発明で有用な抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、好ましくはモノクローナル抗体、さらにキメラ抗体(ヒト定常ドメイン)、ヒト化抗体、特に好ましくは全長ヒト抗体である。本発明で有用な特定の抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、抗体１８に競合して、ヒトＩＧＦ-１Ｒに結合する、すなわち、それらは、国際公開第２００５／００５６３５号に記載されているように、抗体１８の場合、ＩＧＦ-１Ｒの同じエピトープに結合する。特定の抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、ＩＧＦ-１Ｒへの親和性が１０−８Ｍ(ＫＤ)未満、特に約１０−９〜１０−１３Ｍであることによりさらに特徴付けられ、好ましくはインスリンレセプターへのインスリン結合性の濃度依存性阻害を検出できない。
本発明で有用な特定の抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、次の配列：
ａ）配列番号：１４４又は１４６のＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体重鎖；
ｂ）配列番号：１４５又は１４７のＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；
を有する、補体決定領域(ＣＤＲ)を含む。
特に、本発明で有用な抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、配列番号：４１の抗体重鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号：４２の抗体軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、又は配列番号：４３の抗体重鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号：４４の抗体軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有する。
本発明で有用な特定の抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、それぞれ、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７及びＤＳＭ ＡＣＣ ２５９４にて、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託されている、ハイブリドーマ細胞株＜ＩＧＦ-１Ｒ＞ ＨＵＭＡＢ-クローン１８及び＜ＩＧＦ-１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ-クローン２２から得ることができる。
本発明で有用な他の適切な抗-ＩＧＦ-１Ｒ抗体は、例えば、全長ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂシクツムマブ(cixutumumab)／ＩＭＣ-Ａ１２(Burtrumら, Cancer Res 63, 8912-21 (2003); Rowinskyら, Clin Cancer Res 13, 5549s-5555s (2007)に記載)、全長ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ ＡＭＧ-４７９(Beltranら, Mol Cancer Ther 8, 1095-1105 (2009); Tolcherら, J Clin Oncol 27, 5800-7 (2009)に記載)、ヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ ＭＫ-０６４６／ｈ７Ｃ１０(Goetschら, Int J Cancer 113, 316-28 (2005); Broussasら, Int J Cancer 124,2281-93 (2009); Hidalgoら, J Clin Oncol 26, abstract 3520 (2008); Atzoriら, J Clin Oncol 26, abstract 3519 (2008)に記載)、ヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ ＡＶＥ１６４２(Descampsら, Br J Cancer 100, 366-9 (2009); Tolcherら, J Clin Oncol 26, abstract 3582 (2008); Moreauら, Blood 110, abstract 1166 (2007); Maloneyら, Cancer Res 63, 5073-83 (2003)に記載)、全長ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂフィギツムマブ／ＣＰ-７５１、８７１(Cohenら, Clin Cancer Res 11, 2063-73 (2005); Haluskaら, Clin Cancer Res 13, 5834-40 (2007); Lacyら, J Clin Oncol 26, 3196-203 (2008); Gualberto & Karp, Clin Lung Cancer 10, 273-80 (2009)、全長ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ ＳＣＨ-７１７４５４(国際公開第２００８／０７６２５７号又は Kolbら, Pediatr Blood Cancer 50, 1190-7 (2008)に記載)、２.１３.２.ｍＡｂ(米国特許第７０３７４９８号(国際公開第２００２／０５３５９６号)に記載)、又は全長ヒトＩｇＧ４ ｍＡｂ ＢＩＩＢ０２２である。
本発明で有用な特定の抗-ＣＥＡ抗体は、マウスＰＲ１Ａ３抗体の結合特異性を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗体である(Richman 及び Bodmer, Int J Cancer 39, 317-328 (1987))。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号：１４８のＣＤＲ１、配列番号：１４９のＣＤＲ２、及び配列番号：１５０のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号：１５１のＣＤＲ１、配列番号：１５２のＣＤＲ２、及び配列番号：１５３のＣＤＲ３；
を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗-ＣＥＡ抗体である。
本発明で有用な特定の抗-ＣＥＡ抗体は、配列番号：１５４の重鎖可変ドメイン、及び配列番号：１５５の軽鎖可変ドメインを含む。
このような抗-ＣＥＡ抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される、ＰＣＴ公開番号WO2011/023787に記載されている。
本発明で有用な特定の抗-ＨＥＲ３抗体は、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗体、例えば、Ｍａｂ ２０５.１０.１、Ｍａｂ ２０５.１０.２、及びＭａｂ ２０５.１０.３、特にＭａｂ ２０５.１０.２で、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０７６６８３に記載されているものである。
本発明で有用な特定の抗-ＣＤＣＰ１-抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２３３８９に記載されているような、ＣＵＢ４抗体(寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２５５１(ＤＳＭＺ)から誘導される、ヒト化されたＩｇＧクラスの抗体である。
本発明で使用可能な例示的な抗-ＭＣＳＰ抗体は、例えば国際公開第２００６／１００５８２号に記載されている。
一実施態様において、抗体はＩｇＧクラスの全長抗体である。特定の実施態様において、抗体はＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体はヒトＦｃ領域、特にヒトＩｇＧＦｃ領域、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。本発明で有用な抗体、例えば上述した抗-ＩＧＦ-１Ｒ、抗-ＥＧＦＲ及び抗-ＣＤ２０抗体は、配列番号：１５６に説明したような、ヒトＩｇガンマ-１重鎖定常領域を含んでよい(すなわち、抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのものである)。
本発明で有用な抗体は、未操作抗体と比較して、増加したエフェクター機能を有するように操作されている。一実施態様において、増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体は、対応する未操作抗体と比較して、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも１００倍増加したエフェクター機能を有する。増加したエフェクター機能には、限定されるものではないが、一又は複数の次の特徴：増加したＦｃレセプター結合性、増加したＣ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)、増加した抗体-依存性細胞-媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)、増加した抗体-依存性細胞ファゴサイトーシス(ＡＤＣＰ)、増加したサイトカイン分泌性、抗原提示細胞による増加した免疫複合体-媒介性抗原の取込、増加したＮＫ細胞への結合性、増加したマクロファージへの結合性、増加した単球への結合性、増加した多形核細胞への結合性、増加した直接的シグナル伝達誘発性アポトーシス、増加した標的結合抗体の架橋性、増加した樹状細胞の成熟、又は増加したＴ細胞プライミングが含まれる。
一実施態様において、増加したエフェクター機能は、増加したＦｃレセプター結合性、増加したＣＤＣ、増加したＡＤＣＣ、増加したＡＤＣＰ、及び増加したサイトカイン分泌性の群から選択される、一又は複数のものである。一実施態様において、増加したエフェクター機能は、増加した活性化Ｆｃレセプターへの結合性である。このような実施態様において、活性化Ｆｃレセプターへの結合親和性は、対応する未操作抗体の結合親和性と比較して、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍に増加している。特定の実施態様において、活性化Ｆｃレセプターは、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及びＦｃＲγＩＩａの群から選択される。一実施態様において、活性化ＦｃレセプターはＦｃγＲＩＩＩａである。他の実施態様において、増加したエフェクター機能は増加したＡＤＣＣである。
このような実施態様において、ＡＤＣＣは、対応する未操作抗体により媒介されるＡＤＣＣと比較して、少なくとも１０倍、特に少なくとも１００倍に増加している。他の実施態様において、増加したエフェクター機能は、活性化Ｆｃレセプターへの結合性、及び増加したＡＤＣＣである。
増加したエフェクター機能は、当該技術で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイをここに記載する。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの他の例は、米国特許第5,500,362号; Hellstromら ProcNatl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及び Hellstromら, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); 米国特許第5,821,337号; Bruggemannら, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。また、非放射活性アッセイ法を使用してもよい(例えば、フローサイトメトリーによるＡＣＴＩＴＭ非放射活性細胞傷害アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及びCytoTox 96(登録商標)非放射活性細胞傷害アッセイ(登録商標)(Promega, Madison, WI))。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞細胞を含む。あるいは、又は付加的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynesら 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:652-656に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。Ｆｃレセプターに対する結合性は、例えばＥＬＩＳＡ、又はビアコア装置(GE Healthcare)等の標準的な装置を使用する表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)により、容易に測定することができ、Ｆｃレセプターは組換え発現により得られたものであってよい。特定の実施態様に従い、活性化Ｆｃレセプターへの結合親和性は、２５℃でビアコア(登録商標)Ｔ１００機器(GE Healthcare)を使用する、表面プラズモン共鳴により測定される。また、Ｆｃレセプターに対する抗体の結合親和性は、特定のＦｃレセプターを発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａレセプターを発現ＳるＮＫ細胞を使用し、評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを、抗体がＣ１ｑに結合可能であり、よってＣＤＣ活性を有しているかどうかを決定するために実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい(例えば、Gazzano-Santoroら, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Craggら, Blood 101, 1045-1052 (2003); 及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照)。
増加したエフェクター機能は、Ｆｃ領域の糖鎖工学、又は抗体のＦｃ領域へのアミノ酸変異の導入に起因している可能性がある。一実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域に一又は複数のアミノ酸変異を導入することにより操作される。特定の実施態様において、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。さらなる特定の実施態様において、アミノ酸置換は、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位に存在する(残基のＥＵ番号付け)。さらに適切なアミノ酸変異は、例えばShieldsら, J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)；米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０６３３５１号及び国際公開第２００４／０９９２４９号に記載されている。変異Ｆｃ領域は、当該技術でよく知られている遺伝的又は化学的方法を使用し、アミノ酸を欠失、置換、挿入又は修飾することにより調製することができる。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異性免疫原性、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定により確認することができる。
他の実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により操作される。特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加するように操作されている。抗体のＦｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加することで、抗体のエフェクター機能、特にＡＤＣＣが増加する。特定の実施態様において、非フコシル化オリゴ糖は二分岐の非フコシル化オリゴ糖である。
さらに特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは約７０％が、非フコシル化である。非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド又は複合型であってよい。
他の特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐オリゴ糖の割合が増加するように操作されている。さらに特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％が二分岐である。二分岐オリゴ糖はハイブリッド又は複合型であってよい。
さらなる他の特定の実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加するように操作されている。さらに特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、又は少なくとも約５０％が、二分岐の非フコシル化である。二分岐の非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド又は複合型であってよい。
抗体Ｆｃ領域におけるオリゴ糖構造は、例えば、Umanaら, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)又は Ferraraら, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)に記載されているような、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法により、当該技術でよく知られている方法により分析することができる。非非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖に対する、フコース酸基を欠くオリゴ糖の量であり(例えば、複合した、ハイブリッドの高マンノース構造)、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより、Ｎ-グルコシダーゼＦ処理されたサンプルにおいて同定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域においてほぼ２９７位に位置するアスパラギン残基を意味する(Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け)が；抗体中の小さな配列変化のために、Ａｓｎ２９７は、２９７位のほぼ±３アミノ酸の上流又は顆粒、すなわち２９４〜３００位に位置していてもよい。二分岐、又は二分岐の非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、同様に決定される。
一実施態様において、抗体は、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域にてグリコシル化が修飾され、一又は複数のグリコシルトランスフェラーゼに活性が変化した宿主細胞で抗体が生成されるように操作されている。グリコシルトランスフェラーゼには、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴＩＩＩ)、β(１,４)-ガラクトシルトランスフェラーゼ(ＧａｌＴ)、β(１,２)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ(ＧｎＴＩ)、β(１,２)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ(ＧｎＴＩＩ)、及びα(１,６)-フコシルトランスフェラーゼが含まれる。特定の実施態様において、抗体は、増加したβ(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＴＩＩＩ)活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。特定の実施態様において、宿主細胞は、付加的に、増加したα-マンノシダーゼＩＩ(ＭａｎＩＩ)活性を有する。本発明に有用な抗体を操作するために使用可能な糖鎖工学法は、その全内容が出典明示によりここに援用される、Umanaら, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferraraら, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); 国際公開第９９／５４３４２号（米国特許第６６０２６８４号；欧州特許出願公開第１０７１７００号）；国際公開第２００４／０６５５４０号（米国特許第２００４／０２４１８１７号；欧州特許出願公開第１５８７９２１号）、国際公開第０３／０１１８７８号（米国特許第２００３／０１７５８８４号）にさらに詳細に記載されている。この方法を使用して糖鎖操作された抗体は、ここではＧｌｙｃｏＭａｂと称する。
一般に、ここで論議される細胞株を含む、任意の種類の培養された細胞株は、変化したグリコシル化パターンを有する抗-ＴＮＣ Ａ２抗体を生成するための細胞株の作製に使用することができる。特定の細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞、及び他の哺乳動物細胞が含まれる。ある実施態様において、宿主細胞は、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ(ＧｎＩＩＩ)活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにマニピュレートされている。ある実施態様において、宿主細胞は、α-マンノシターゼＩＩ(ＭａｎＩＩ)活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにさらにマニピュレートされている。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメイン、及びＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む、融合ポリペプチドである。特に、前記ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩのゴルジ局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを生成する方法、及び増加したエフェクター機能を有する抗体を生成するためのそれらの使用は、その全内容が出典明示によりここに援用される、Ferraraら, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)、及び国際公開第２００４／０６５５４０号に開示されている。
本発明で有用な抗体のコード化配列、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのコード化配列を有し、生物学的に活性な遺伝子生成物を発現する宿主細胞は、例えばＤＮＡ-ＤＮＡ又はＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーション；「マーカー」遺伝子機能の存在又は不在；宿主細胞における、それぞれのｍＲＮＡ転写の発現により測定される場合の転写レベルの評価；又はイムノアッセイ又はその生物活性により測定される場合の、遺伝子生成物の検出で、当該技術でよく知られている方法により同定可能である。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性は、それぞれＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩの生合成生成物に結合するレクチンを使用することにより、検出することができる。このようなレクチンの具体例は、二分岐ＧｌｃＮＡｃを含有するオリゴ糖に優先的に結合するＥ４-ＰＨＡレクチンである。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドの生合成生成物(すなわち、特定のオリゴ糖構造)は、前記ポリペプチドを発現する細胞により生成される糖タンパク質から放出されるオリゴ糖を質量分析することで、検出することができる。また、ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドを用いて操作された細胞により生成された抗体で媒介される、増加したエフェクター機能、例えば増加したＦｃレセプター結合性を測定する機能アッセイを使用してもよい。
他の実施態様において、抗体は、低減したα(１,６)-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合で非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。低減したα(１,６)-フコシルトランスフェラーゼを有する宿主細胞は、α(１,６)-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊又は不活性化された、例えばノックアウトされた細胞であってよい(Yamane-Ohnukiら, Biotech Bioeng 87, 614 (2004); Kandaら, Biotechnol Bioeng, 94(4), 680-688 (2006); Niwaら, J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)を参照)。
脱フコシル化(defucosylated)抗体を生成可能な細胞株の他の例には、タンパク質フコシル化におけるＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞欠失(Ripkaら, Arch. Biochem.Biophys., 249:533-545(1986); 米国特許第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１)が含まれる。本発明で有用な抗体は、例えば、抗体生成に使用される宿主細胞における、ＧＤＰ-フコーストランスポータータンパク質の活性を減少させ又は無効にすることにより、欧州特許出願公開第１１７６１９５Ａ１号、国際公開第０３／０８４５７０号、国際公開第０３／０８５１１９号、及び米国特許第２００３／０１１５６１４号、同２００４／０９３６２１号、同２００４／１１０２８２号、同２００４／１１０７０４号、同２００４／１３２１４０号、米国特許第６９４６２９２号(Kyowa)に開示されている技術に従い、Ｆｃ領域におけるフコース残基を低減させるように糖鎖操作することができる。
本発明で有用な糖鎖操作された抗体は、修飾された糖タンパク質を生成する発現システムにても生成可能であり、例えば国際公開第０３／０５６９１４号(GlycoFi, Inc.)又は国際公開第２００４／０５７００２号及び国際公開第２００４／０２４９２７号(Greenovation)に教示されている。
組換え方法
本発明で有用な抗体及びイムノコンジュゲートを生成する方法は、当該技術でよく知られており、例えば国際公開第２０１１／０２０７８３号、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００６／０８２５１５号、国際公開第２００８／０１７９６３号、国際公開第２００５／００５６３５号、国際公開第２００８／０７７５４６号、国際公開第２０１１／０２３７８７号、国際公開第２０１１／０７６６８３号、国際公開第２０１１／０２３３８９号、及び国際公開第２００６／１００５８２号に開示されている。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を生成するための確立された方法も、例えば.Harlow 及び Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載されている。
自然に生じない抗体又はその断片は、固相ペプチド合成を使用して構成することができ、組換え的に生成することもでき(例えば、米国特許第4,816,567号に記載)、又は可変重鎖及び可変軽鎖を有するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることにより(例えば、米国特許第５９６９１０８号、McCafferty)得ることができる。本発明で有用なイムノコンジュゲート及び抗体を組換え生成するために、該イムノコンジュゲート又は抗体をコードする一又は複数のポリヌクレオチド(類)を単離し、宿主細胞においてさらにクリーニングし及び／又は発現させるために、一又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来からの手順を使用し、容易に単離及び配列決定することができる。当業者によく知られてる方法を使用し、適切な転写／翻訳コントロールシグナルと共に、抗体又はイムノコンジュゲートのコード化配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝的組換えを含む。例えば、Maniatisら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubelら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載されている技術を参照。
本発明で有用なイムノコンジュゲートは、当時発現する複数(例えば、２又はそれ以上)のポリヌクレオチドから、又は全イムノコンジュゲートをコードする単一のポリヌクレオチドから発現したものであっってよい。同時発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能的イムノコンジュゲートを形成している。例えば、抗原結合部分の重鎖部分は、エフェクター部分と抗原結合部分の軽鎖部分を有するイムノコンジュゲートの一部から、ポリヌクレオチドを単離することによりコードされてよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと結合し、抗原結合部分を形成する。また、他の実施例において、抗原結合部分の軽鎖部分は、エフェクター部分と抗原結合部分の重鎖部分を有するイムノコンジュゲートの一部から、ポリヌクレオチドを単離することによりコードすることができる。
組換えタンパク質の複製及び発現を支持するのに適した宿主細胞は、当該技術でよく知られている。このような細胞は、適切である場合、特定の発現ベクターを用いて形質移入又は形質導入されてよく、多量のベクター含有細胞は、例えば臨床用途に、十分な量のタンパク質を得るために、大規模な発酵槽に播種して増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)、昆虫細胞等が含まれる。例えば、組換えタンパク質は、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌中に生成させてもよい。発現後、タンパク質は可溶化フラクションにおいて、細菌細胞ペーストから単離され、さらに精製することもできる。原核生物に加え、真核微生物、例えば糸状菌又は酵母は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌及び酵母株を含む、タンパク質-コード化ベクターに対する適切なクローニング又は発現宿主であり、部分的又は全長ヒトグリコシル化パターンを有する、タンパク質の生成に帰する。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), 及び Liら, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。また、(グリコシル化)タンパク質の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と共に、特にヨトウガ細胞の形質移入に使用される、多くのバキュロウイルス株が同定されている。また、植物細胞培養体も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号; 同6,040,498号; 同6,420,548号; 同7,125,978号、及び同6,417,429号(トランスジェニック植物において抗体を生成させるためのPLANTIBODIESＴＭ技術を記載)を参照。また、脊椎動物細胞も宿主として使用されてよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株も有用である。有用な哺乳動物宿主細胞の他の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７)；ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ)系(例えば、Grahamら, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されているような２９３又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているようなＴＭ４細胞)、サル腎臓細胞(ＣＶ１)、アフリカミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ-７６)、ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)、イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ)、バッファローラット肝臓細胞(ＢＲＬ ３Ａ)、ヒト肺細胞(Ｗ１３８)、ヒト肝臓細胞(Ｈｅｐ Ｇ２)、マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２)、ＴＲＩ細胞(例えば、Matherら, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68(1982)に記載)、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980))；及び骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が含まれる。タンパク質生成に適したある種の哺乳動物宿主細胞の概説について、例えばYazaki 及び Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えば哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、及び植物細胞ばかりでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物もしくは動物組織内に含まれる細胞が包含される。一実施態様において、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ)２９３細胞、又はリンパ球系細胞(例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞)である。
抗体及びイムノコンジュゲートがヒト使用を意図している場合、抗体又は抗原結合部分のキメラ形態が使用されてよく、ここで抗体定常領域はヒトからのものである。また、抗体又は抗原結合部分のヒト化又は完全ヒト形態も、当該技術でよく知られている方法に従い、調製することができる(例えば、米国特許第5,565,332号、Winter)。ヒト化は、限定されるものではないが、（ａ）重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するのに重要なもの)の保持を伴う又は伴わない、ヒト(例えば、レシピエント抗体)フレームワーク及び定常領域への、非ヒト(例えば、ドナー抗体)ＣＤＲのグラフト、（ｂ）ヒトフレームワーク及び定常領域への、非ヒト特異性-決定領域(ＳＤＳ又はａ-ＣＤＲ；抗体-抗原相互作用に重要な残基)のみのグラフト、又は（ｃ）表面残基の置換による、ヒト様切片を用いた、それらの「クローキング」を除く、全非ヒト可変ドメインの移植を含む、当該技術で公知の種々の方法により達成可能である。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、Almagro 及び Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)に概説されており、さらに、例えばRiechmannら, Nature 332, 323-329 (1988); Queenら, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); 米国特許第5,821,337号, 同7,527,791号,同6,982,321号、及び同7,087,409号; Jonesら, Nature 321, 522-525 (1986); Morrison ら, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison 及び Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyenら, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiriら, Methods 36, 25-34 (2005)(SDR (a-CDR)グラフトを記載); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)(「リサーフェイシング」を記載); Dall'Acquaら, Methods 36, 43-60 (2005)(「FRシャフリング」を記載); 及びOsbournら, Methods 36, 61-68 (2005)及び Klimkaら, Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FRシャフリングに対する「指針となる選択」アプローチを記載)にも記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術で公知の種々の技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk 及び van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)及び Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)に一般に記載されている。ヒト可変領域はハイブリドーマ法により作製されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成し、そこから誘導されることができる(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照)。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原投与に応じて、ヒト可変領域を有する無傷ヒト抗体又は無傷抗体を生成するように修飾されているトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる(例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによっても作製することができる(例えば、Hoogenboomら Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brienら編, Human Press, Totowa, NJ, 2001); 及び McCaffertyら, Nature 348, 552-554; Clacksonら, Nature 352, 624-628 (1991))。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片又はＦａｂ断片として、抗体断片を示す。
ある実施態様において、本発明で有用な抗体又は抗原結合部分は、例えば、その全内容が出典明示によりここに援用される、米国特許第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従い、高められた結合親和性を有するように操作されている。本発明で有用な抗体又は抗原結合部分の、特定の抗原決定基に対する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、又は当業者になじみの他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術(ビアコアＴ１００システムで分析)により測定可能である(Liljebladら, Glyco J 17, 323-329 (2000))、及び伝統的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))。
ここで記載したようにして調製された抗体及びイムノコンジュゲートは、当該分野で公知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を使用して精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するのに使用される実際の条件は、一部には、正味荷電、疎水性度合い、親水性度合いなどの要因に依存し、当業者には明らかであろう。
薬学的組成物
他の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体を、薬学的に許容可能な担体に含有せしめた薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、例えば以下に記載する任意の治療方法に使用することができる。
ここで記載されたように、増加したエフェクター機能を有する抗体とイムノコンジュゲートの薬学的組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に、一又は複数の任意の薬学的に許容可能な担体と、所望の純度を有する抗体とこのようなイムノコンジュゲートを混合することによって調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Printing Company (1990))。薬学的に許容可能な担体は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えばＺｎ-タンパク質錯体)；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ここで、例示的な薬学的に許容可能な担体には、さらに、間質薬剤分散剤、例えば可溶性の中性-活性化ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(ｓＨＡＳＥＧＰ)、例えばヒト可溶性ＰＨ-２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEX(登録商標）、Baxter International, Inc.)が含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、一又は複数の付加的なグルコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組合せられる。
例示的な凍結乾燥製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン-アセタートバッファーを含む。
ここで、薬学的組成物は、治療される特定の兆候に必要な付加的な活性成分、特に互いに悪影響を与えない相補活性を有するものを、さらに含有してよい。例えば、治療される疾患が癌である場合、一又は複数の抗癌剤、例えば化学療法剤、腫瘍細胞の増殖のインヒビター、又は腫瘍細胞のアポトーシスのアクチベーターをさらに提供することが望ましい。このような活性成分は、意図する目的にとって効果的な量で組合せて、適切に存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 第18版, Mack Printing Company (1990)に開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用される組成物は、一般に滅菌されてる。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を介して濾過することにより、容易に達成される。
治療方法
ここで提供される、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せが、治療方法に使用されてよい。
一態様においては、医薬として使用される、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せが提供される。さらなる態様においては、疾患の治療に使用するための、（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せが提供される。ある実施態様においては、治療方法に使用するための、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せが提供される。ある実施態様において、本発明は、組合せの治療的有効量を、個体に投与する含む、疾患に罹患している個体を治療する方法に使用するための、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを提供する。このような一実施態様において、本方法は、以下に記載するような、少なくとも一つの付加的な治療的有効量、個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様において、本発明は、エフェクター細胞機能の刺激に使用するための、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを提供する。ある実施態様において、本発明は、エフェクター細胞機能を刺激するために、有効量の組合せを個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法に使用するための、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを提供する。上述した任意の実施態様の「個体」は、哺乳動物、特にヒトである。上述した任意の実施態様の「疾患」は、エフェクター細胞機能の刺激により治療される疾患である。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患、特に癌である。
さらなる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せの使用を提供する。一実施態様において、医薬は疾患を治療するためのものである。さらなる実施態様において、医薬は、治療的有効量の医薬を、疾患に罹患している個体に投与することを含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。このような一実施態様において、本方法は、例えば以下に記載するような、少なくとも１つの付加的な治療剤を治療的有効量、個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様において、医薬は、エフェクター細胞機能を刺激するためのものである。さらなる実施態様において、医薬は、エフェクター細胞機能を刺激するために、医薬的有効量、個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法に使用されるものである。上述した任意の実施態様の「個体」は、哺乳動物、特にヒトである。上述した任意の実施態様の「疾患」は、エフェクター細胞機能の刺激により治療される疾患である。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患、特に癌である。
さらなる態様において、本発明は疾患を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを治療的有効量、このような疾患に罹患している個体に投与することを含む。このような一実施態様において、本方法は、以下に記載するような、少なくとも１つの付加的な治療剤を治療的有効量、個体に投与することをさらに含む。上述した任意の実施態様の「個体」は、哺乳動物、特にヒトである。上述した任意の実施態様の「疾患」は、エフェクター細胞機能の刺激により治療される疾患である。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患、特に癌である。
さらなる態様において、本発明は、個体におけるエフェクター細胞機能を刺激する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを、エフェクター細胞機能を刺激するのに有効な量、個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」は哺乳動物、特にヒトである。
さらなる態様において、本発明は、上述した治療方法のいずれかに使用するために提供される、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の任意の組合せを含有する薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は、（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の、ここで提供された組合せと、薬学的に許容可能な担体を含有する。他の実施態様において、薬学的組成物は、例えば以下に記載するような、少なくとも１つの付加的な治療と、ここで提供される任意の組合せを含有する。
上述した任意の実施態様において、疾患は、エフェクター細胞機能を刺激することにより治療される疾患である。本発明の組合せは、疾患の治療に有用であり、宿主の免疫系の刺激により、特に細胞免疫反応を高めることが所望される病状において有効である。これらには、宿主免疫反応は不十分又は欠失している病状も含まれる。本発明の組合せを投与可能な病状は、細胞免疫反応が特定の免疫に対して重要なメカニズムである、腫瘍又は肝炎を含む。本発明の組合せを使用可能な特定の病状には、癌、特に腎細胞癌又はメラノーマ；特にＨＩＶ-ポジティブの患者における免疫不全、免疫抑制された患者、慢性感染症が含まれる。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌、特に肺癌、結腸直腸癌、腎癌、前立腺癌、乳癌、頭部及び頸部の癌、卵巣癌、脳癌、リンパ腫、白血病、皮膚癌からなる群から選択される癌である。
本発明の組合せは、治療において、単独で、又は他の薬剤と共に使用することができる。例えば、本発明の組合せは、少なくとも一つの付加的な治療剤と同時投与されてよい。ある実施態様において、付加的な治療剤は抗癌剤、例えば化学療法剤、腫瘍細胞増殖のインヒビター、又は腫瘍細胞アポトーシスのアクチベーターである。
ここで提供される併用療法は、抗体とイムノコンジュゲートを一緒に投与(２又はそれ以上の治療剤が、同じ又は別々の処方剤に含有されている場合)、又は抗体の投与が、イムノコンジュゲート、付加的な治療剤、及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に生じるケースでは別々に投与することを含む。また、本発明の組合せは、放射線療法と併用することもできる。
本発明の組合せ(及び任意の付加的な治療剤)は、非経口、肺内、及び経鼻による投与、、局所的治療が所望されている場合は、病巣内投与が可能である。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。抗体及びイムノコンジュゲートは、同じ又は違う経路で投与されてよい。投与は、短期間又は慢性的であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば注射、特に静脈又は皮下注射とすることができる。限定されるものではないが、種々の時点での単一又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む、種々の投与スケジュールが、ここで考慮される。
本発明の組合せは、良好な医療行為に矛盾しない方式で、処方、服用、及び投与されるであろう。ここで考慮される要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、患者個体の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医者に公知の他の要因が含まれる。組合せが、必要ではないが、場合によっては当該問題の疾患を予防又は治療するのに現在使用されている一又は複数の薬剤と共に処方されてもよい。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在する抗体及びイムノコンジュゲートの量、疾患又は治療の種類、及び上述にて論議した他の要因に依存する。これらは、ここに記載した同様の服用及び投与経路、又はここに記載の１〜９９％の用量、又は経験的／臨床的に適切に決定された任意の用量及び任意の経路により、一般に使用される。
疾患の予防又は治療のために、（場合によっては、一又は複数の他の付加的な治療剤との併用で使用される場合）抗体及びイムノコンジュゲートの適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、抗体及びイムノコンジュゲートのタイプ、疾患の重篤度及び経過、組合せが予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、事前治療、患者の臨床病歴及び抗体及び／又はイムノコンジュゲートに対する応答性、及び担当医師の裁量に依存する。抗体及びイムノコンジュゲートは一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、例えば一又は複数の分割投与でも又は連続注入でも、患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるかもしれない。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。抗体の例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のその組合せ）の一又は複数回の用量で患者に投与することができる。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週ごとに投与されうる（例えば患者に約２から約２０、例えば約６用量の抗体が投与されるように)。初期のより高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量が投与されうる。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。投与に関して、同じ考慮が、本発明の組合せに使用されるイムノコンジュゲートにも適用される。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この治療法の進行は、従来からの技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
製造品
本発明の他の態様では、上述の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、一又は複数の容器、及び容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、組成物自体、又は病状の治療、予防及び／又は診断に有効な他の組成物と組合せて収容され、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は、本発明の組合せに使用される抗体である。他の活性剤は、本発明の組合せに使用されるイムノコンジュゲートであり、抗体と同じ組成物及び容器に存在していてよく、又は異なる組成物及び容器において提供されてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。
一態様において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの抗原-結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体、及び（ｃ）場合によっては、疾患を治療する方法として、併用治療の使用を指示する印刷された使用説明書を含むパッケージ挿入物を、同じ又は別々の容器に収容してなる、疾患を治療することを意図したキットを提供する。さらにキットは、（ａ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体を含有する組成物を収容する第１の容器；（ｂ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートを含有する組成物を収容する第２の容器；及び場合によっては（ｃ）さらに細胞傷害剤又は他の治療剤を含有する組成物を収容する第３の容器を具備していてよい。本発明のこの実施態様のキットは、組成物が、特定の病状を治療するのに使用可能であることを示したパッケージ挿入物をさらに含んでいてよい。代替的に、又は付加的に、キットは、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第３(又は第４)の容器をさらに具備していてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。種々の他の実施態様で、上述に提供された一般的記述を実施してもよいと理解される。
一般的方法
抗体のＦｃ領域の糖鎖操作により、高められたＡＤＣＣ誘発及び抗-腫瘍効果に順に翻訳される、ヒトＦｃγＲＩＩＩレセプターに対する、結合親和性の増加に至る。ヒトＦｃγＲＩＩＩレセプターは、マクロファージ、好中球、及びナチュラルキラー(ＮＫ)、樹状細胞及びγδＴ細胞において発現する。マウスにおいて、前臨床効能を試験するために最も広く利用されている種、マウスＦｃγＲＩＩＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのマウス類似体は、マクロファージ及び好中球に存在するが、ＮＫ細胞には存在しない。よって、糖鎖操作された抗体を用いた任意の予期される改善された効能は、全ての程度ではないが、これらのモデルに反映されている。我々は、血液、リンパ様組織及び腫瘍中のマウスＮＫ細胞において、安定したヒトＣＤ１６ａ発現を示す、ヒトＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６ａ)に対してトランスジェニックなマウスを作製した。さらに、これらのトランスジェニックマウスの血液中の、刺激していないＮＫ細胞における、ヒトＣＤ１６ａの発現レベルは、ヒトにおいて見出されたものに類似している。また、我々は、抗体治療を抗腫瘍活性と相互に関連させた後、腫瘍結合ＮＫ細胞のヒトＦｃγＲＩＩＩのダウンレギュレーションを示した。最後に、我々は、それらのヒトＣＤ１６-ネガティブ同腹仔と比較して、この新規のマウス株を使用した腫瘍モデルにおいて、糖鎖操作された抗体治療によりかなり改善された効能が示されることを表した。
実施例１
Ａ５４９肺異種移植モデル
ＴＮＣ Ａ２-標的２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート(配列番号：１１７及び１２０)及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ(配列番号：１４２及び１４３)を、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩ(ｈＣＤ１６)トランスジェニックマウスに静脈内注射し、ヒト非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株Ａ５４９において試験した。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、テネイシンＣのＡ２ドメインに対してポジティブであることが示された。Ａ５４９ ＮＳＣＬＣ細胞は、最初はＡＴＣＣ(ＣＣＬ-１８５)から得、Ｇｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託された増殖後のものである。腫瘍細胞株を、５％のＣＯ２で水飽和した雰囲気において、３７℃で１０％のＦＣＳ(Gibco)を含有するＤＭＥＭにおいて培養させた。９８％生存率の継代８を移植用に使用した。動物あたり５×１０６細胞を、２００μlのＡｉｍ Ｖ細胞培養培地(Gibco)の尾部静脈に静脈注射した。実験の開始時に８-９週齢である、メスのＳＣＩＤ-ＦｃγＲＩＩＩマウス(ＧＬＹＣＡＲＴ-ＲＣＣ)(ＲＣＣで飼育、Switzerland)を、認定されたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を新しい環境に馴れさせ、観察のために、１週間維持した。連続的な健康モニタリングを規則正しく実施した。マウスに、５×１０６のＡ５４９細胞を、調査０日目に静脈注射し、無作為化して計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間、又は２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間と抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間の組合せで、静脈注射した。全てのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。用量を表２に特定する。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート、又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又は２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを注射した。２００μｌ当たりのイムノコンジュゲートの正確な量を得るために、必要ならば、保管溶液をＰＢＳで希釈した。図１には、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、ｈＣＤ１６トランスジェニックＳＣＩＤマウスにおいて、相乗的に高められた生存期間中央値及び全生存とする、優れた有効性を媒介することが示されている(実施例１を参照)
Figure 2014511147
実施例２
ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸異種移植モデル
ＴＮＣ Ａ２-標的２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤマウスに脾臓内注射し、ヒト結腸直腸ＬＳ１７４Ｔ細胞株において試験した。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、テネイシンＣのＡ２ドメインに対してポジティブであることが示された。ＬＳ１７４Ｔ細胞(ヒト結腸癌細胞)は、最初はＥＣＡＣＣ(細胞培養の欧州コレクション)から得、Ｇｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託された増殖後のものである。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、１０％のＦＣＳ、１％のグルタマックス、及び１％の非必須アミノ酸(Sigma)を含有するＭＥＭイーグルで培養した。細胞を、５％のＣＯ２で水飽和した雰囲気において、３７℃で培養させた。９７％生存率のインビトロ継代１８を脾臓内注射用に使用した。麻酔されたＳＣＩＤマウスの左腹部に、小さな切込を入れた。５０マイクロリットルの細胞懸濁液(ＡｉｍＶ培地に３×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞)を、脾臓の嚢の真下に腹壁を通って注射した。クランプを使用し、皮膚損傷を閉じた。実験の開始時に８-９週齢である、メスのＳＣＩＤマウス(Taconics, Denmarkから購入)を、認定されたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を新しい環境に馴れさせ、観察のために、１週間維持した。連続的な健康モニタリングを規則正しく実施した。マウスに、３×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞を、調査０日目に脾臓内注射し、無作為化して計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間、又は２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間と抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間の組合せで、静脈注射した。全てのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。用量を表３に特定する。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート、又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又は２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを注射した。２００μｌ当たりのイムノコンジュゲートの適切な量を得るために、必要ならば、保管溶液をＰＢＳで希釈した。図２には、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、高められた生存期間中央値及び全生存に関し、優れた有効性を媒介することが示されている。
Figure 2014511147
実施例３
ＡＣＨＮ腎癌異種移植モデル
ＦＡＰ-標的３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート(配列番号：１０２及び１１２)及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤマウスに腎臓内注射し、ヒト腎細胞株ＡＣＨＮにおいて試験した。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＦＡＰに対してポジティブであることが示された。ＡＣＨＮ細胞(ヒト腎臓腺癌細胞)は、最初はＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から得、Ｇｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託された増殖後のものである。ＡＣＨＮ細胞を、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭにて、５％のＣＯ２で水飽和した雰囲気において、３７℃で培養させた。９７．７％生存率のインビトロ継代９を腎臓内注射用に使用した。麻酔されたＳＣＩＤマウスの右側腹部及び腹壁に、小さな切込を入れた。５０マイクロリットルの細胞懸濁液(ＡｉｍＶ培地に１×１０６のＡＣＨＮ細胞)を、腎臓内の嚢下２ｍｍに注射した。クランプを使用し、皮膚損傷と腹壁を閉じた。実験の開始時に８-９週齢である、メスのＳＣＩＤマウス(TCharles River, Sulzfeld, Germanyから購入)を、認定されたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を新しい環境に馴れさせ、観察のために、１週間維持した。連続的な健康モニタリングを規則正しく実施した。マウスに、１×１０６のＡＣＨＮ細胞を、調査０日目に腎臓内注射し、無作為化して計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間、又は３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間と抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間の組合せで、静脈注射した。全てのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。用量を表４に特定する。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート、又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又は３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを注射した。２００μｌ当たりのイムノコンジュゲートの適切な量を得るために、必要ならば、保管溶液をＰＢＳで希釈した。図３には、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、ＳＣＩＤマウスにおいて、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、相乗的に高められた生存期間中央値及び全生存となることが示されている。
Figure 2014511147
実施例４
ＡＣＨＮ腎癌異種移植モデル
ＦＡＰ-標的３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに腎臓内注射し、ヒト腎細胞株ＡＣＨＮにおいて試験した。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＦＡＰに対してポジティブであることが示された。ＡＣＨＮ細胞(ヒト腎臓腺癌細胞)は、最初はＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から得、Ｇｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託された増殖後のものである。ＡＣＨＮ細胞を、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭにて、５％のＣＯ２で水飽和した雰囲気において、３７℃で培養させた。９６．７％生存率のインビトロ継代１１を腎臓内注射用に使用した。麻酔されたＳＣＩＤマウスの右側腹部及び腹壁に、小さな切込(２ｃｍ)を入れた。５０マイクロリットルの細胞懸濁液(ＡｉｍＶ培地に１×１０６のＡＣＨＮ細胞)を、腎臓内の嚢下２ｍｍに注射した。クランプを使用し、皮膚損傷と腹壁を閉じた。実験の開始時に８-９週齢である、メスのＳＣＩＤ-ＦｃγＲＩＩＩマウス(ＧＬＹＣＡＲＴ-ＲＣＣ)(ＲＣＣで飼育、Switzerland)を、認定されたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を新しい環境に馴れさせ、観察のために、１週間維持した。連続的な健康モニタリングを規則正しく実施した。マウスに、１×１０６のＡＣＨＮ細胞を、調査０日目に腎臓内注射し、無作為化して計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間、又は３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間と抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間の組合せで、静脈注射した。全てのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。用量を表５に特定する。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又は３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを注射した。２００μｌ当たりのイムノコンジュゲートの適切な量を得るために、必要ならば、保管溶液をＰＢＳで希釈した。図４には、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、全生存に関して、優れた有効性を媒介することが示されている。
Figure 2014511147
実施例５
Ｚ１３８マントル細胞リンパ腫異種移植モデル
ＴＮＣ Ａ２-標的２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに静脈注射し、ヒトマントル細胞リンパ腫細胞株Ｚ１３８において試験した。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＴＮＣの ２に対してポジティブであることが示された。Ｚ１３８ヒトマントル細胞リンパ腫細胞は、最初はProfessor Martin Dyer (MRC Toxicology Unit, Leicester, UK)から得、Ｇｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託された増殖後のものである。腫瘍細胞株を、１０％のＦＣＳを含有するＤＥＭＥにおいて、５％のＣＯ２で水飽和した雰囲気において、３７℃で常套的に培養させた。９８％生存率の継代１８を移植に使用した。動物あたり１０×１０６細胞を、２００μlのＡｉｍ Ｖ細胞培養培地(Gibco)の尾部静脈に静脈注射した。実験の開始時に８-９週齢である、メスのＳＣＩＤ-ＦｃγＲＩＩＩマウス(ＧＬＹＣＡＲＴ-ＲＣＣ)(ＲＣＣで飼育、Switzerland)を、認定されたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を新しい環境に馴れさせ、観察のために、１週間維持した。連続的な健康モニタリングを規則正しく実施した。マウスに、１０×１０６のＺ１３８細胞を、調査０日目に静脈注射し、無作為化して計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間、抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間、又は２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に２回で３週間と抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間の組合せで、静脈注射した。全てのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。用量を表６に特定する。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート、抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又は２Ｂ１０Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを注射した。２００μｌ当たりのイムノコンジュゲートの適切な量を得るために、必要ならば、保管溶液をＰＢＳで希釈した。図５には、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２Ｂ１０ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＣＤ２０ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、生存期間中央値及び全生存に関して、相乗的に高められた優れた有効性に至らしめることが示されている。
Figure 2014511147
実施例６
ＡＣＨＮ腎癌異種移植モデル
ＣＤ２５(配列番号：１０８、ここでＩＬ-２配列(配列番号：１)は配列番号：２及び配列番号：１１３で置き換えられている)への結合性を欠く、ＩＬ-２四重変異(ｑｍ)を有するＦＡＰ-標的２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート、及び抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに腎臓内注射し、ヒト腎細胞株ＡＣＨＮにおいて試験した。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織において、ＩＨＣにより、ＦＡＰに対してポジティブであることが示された。ＡＣＨＮ細胞(ヒト腎臓腺癌細胞)は、最初はＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から得、Ｇｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託された増殖後のものである。ＡＣＨＮ細胞を、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭにて、５％のＣＯ２で水飽和した雰囲気において、３７℃で培養させた。９７％生存率のインビトロ継代１８を腎臓内注射用に使用した。麻酔されたＳＣＩＤマウスの右側腹部及び腹壁に、小さな切込(２ｃｍ)を入れた。５０μｌの細胞懸濁液(ＡｉｍＶ培地に１×１０６のＡＣＨＮ細胞)を、腎臓内の嚢下２ｍｍに注射した。クランプを使用し、皮膚損傷と腹壁を閉じた。実験の開始時に８-９週齢である、メスのＳＣＩＤ-ＦｃγＲＩＩＩマウス(ＧＬＹＣＡＲＴ-ＲＣＣ)(ＲＣＣで飼育、Switzerland)を、認定されたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を新しい環境に馴れさせ、観察のために、１週間維持した。連続的な健康モニタリングを規則正しく実施した。マウスに、１×１０６のＡＣＨＮ細胞を、調査０日目に腎臓内注射し、無作為化して計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを週に３回で３週間、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間、又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ ｑｍ-Ｆａｂを週に３回で３週間と抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを週に１回で３週間の組合せで、静脈注射した。全てのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。用量を表７に特定する。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲート、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを注射した。２００μｌ当たりのイムノコンジュゲートの適切な量を得るために、必要ならば、保管溶液をＰＢＳで希釈した。図６には、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲート又は抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、高められた生存期間中央値及び全生存に関し、優れた有効性を媒介することが示されている。
Figure 2014511147
実施例７
ＩＬ-２イムノコンジュゲートによるＮＫ細胞 ＩＮＦ-γの放出性及びＮＫ細胞死滅性のインビトロ追加免疫
ＮＫ細胞におけるイムノコンジュゲートの効果を測定するために、我々は、イムノコンジュゲート、特にエフェクター分子としてＩＬ-２を有するイムノコンジュゲートを用いた処理時における、ＮＫ細胞による、ＩＮＦ-γ放出性及び腫瘍細胞の死滅性を評価する。この目的のために、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, USA)を使用す、標準的な手順に従い単離した。簡単には、静脈血を、ヘパリン処理されたシリンジを用いて、健康な志願者から取り出した。カルシウム又はマグネシウムを含有しないＰＢＳを用いて、血液を２：１に希釈し、Histopaque-1077において層化させた。中断することなく、室温(ＲＴ)で３０分、４５０ｘｇで、勾配を遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する中間相を収集し、全体で３回、ＰＢＳで洗浄した(３５０ｘｇ、続いて３００ｘｇを、ＲＴで１０分)。
第１の実験において、単離されたＰＢＭＣを種々の濃度のＩＬ-２(プロリュウキン)又はＩＬ-２イムノコンジュゲート(ＦＡＰ-標的２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂを含有する野生型又は四重変異体(ｑｍ)ＩＬ-２)と共にインキュベートした。２つの実験用セッティング、ＩＬ-２含有コンストラクトが細胞懸濁液に添加された「溶液」、及びＩＬ-２含有コンストラクトが、９６-Ｆ-ウェルプレート(４℃で２０時間、ＰＢＳに５００ｎｇ／ウェル)に予めコーティングされた、ＦＡＰに結合した「コート」において試験した。未結合のイムノコンジュゲートを洗い流し、ＰＢＭＣを添加した。双方のケースにおいて、ＰＢＭＣをＩＬ-２含有コンストラクトを用いて、４８時間事前処理し、ついで回収し、標的細胞に対するエフェクターの比率(Ｅ：Ｔ)が１０：１にて４時間、Ｋ５６２標的細胞を死滅させるために使用した。標的細胞死滅性を細胞上清におけるＬＤＨの放出性を測定することにより検出した(Roche Cytotoxicity Detection Kit LDH)。図７には、未処理のＰＢＭＣと比較して、溶液(Ａ)又は細胞皿のコーティング(Ｂ)における、ＩＬ-２コンストラクトを用いたエフェクター細胞(ＰＢＭＣ)の事前処理時における、Ｋ５６２腫瘍細胞死滅性における増加度合いを示す。ＩＬ-２並びにＦａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂイムノコンジュゲートは、標的細胞を死滅させるＰＢＭＣの能力を追加免疫した。
第２の実験において、単離されたＰＢＭＣを、細胞懸濁液に添加されたＩＬ-２(プロリュウキン)又はＩＬ-２イムノコンジュゲートと共に、４５時間インキュベートした。続いて、ＰＢＭＣを回収し、１０：１のＥ：Ｔにて４時間、Ａ５４９細胞の抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ-媒介性ＡＤＣＣに使用した。標的細胞死滅性を細胞上清におけるＬＤＨの放出性を測定することにより検出した(Roche Cytotoxicity Detection Kit LDH)。図８は、種々の濃度の抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの存在下にて、５７ｎＭのＦａｐ-標的２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ含有の野生型(ｗｔ)又は四重変異体(ｑｍ)ＩＬ-２を用いて、前処理した又はしていないＰＢＭＣによる、全体的なＡ５４９腫瘍細胞の死滅性を示す。結果には、本実験条件下で、単独の薬剤では達成されない、ほぼ１００％の標的細胞死滅が、イムノコンジュゲートとＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを使用することで得ることができることが示されている。野生型又は四重変異ＩＬ-２のいずれかを含有する２つのイムノコンジュゲートは、等しく有効である。
他の実験において、単離されたＰＢＭＣを、２つの異なる濃度(５及び５００ｎｇ／ｍｌ)の抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ及び糖鎖操作されていない抗-ＥＧＦＲ抗体(アービタックス)を用い、５：１のＥ：Ｔにて２１時間、Ａ５４９細胞において、ＡＤＣＣアッセイに使用した。インキュベート時間の終わりに、細胞上清へのＰＢＭＣからのＩＦＮ-γの放出性を、ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＡキット(ＢＤ＃５５０６１２)を使用して検出した。抗体単独とインキュベートした後、有意のＩＦＮ-γ放出性は検出されず、インキュベート中、ＩＬ-２(プロリュウキン)の存在下、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂは、(Ａ)抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ−、並びに(Ｂ)アービタックス-媒介性での、ＩＦＮ-γ放出を強く高めた。全体的に、特に低い抗体濃度(５ｎｇ／ｍｌ)及び最も高いＩＬ２(イムノコンジュゲート)濃度(１１４０ｎＭ)で、ＩＦＮ-γ放出性は、アービタックスよりも抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂで高い。
最後に、任意の抗体を使用することなく、ＩＬ-２(プロリュウキン)、２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は２８Ｈ１ Ｆａｂ-ＩＬ２ ｑｍ-Ｆａｂと共にインキュベートした後の、ＰＢＭＣからのＩＦＮ-γ放出性を測定した。実験条件は上述した通りである。図１０に示すように、ＩＬ-２(イムノコンジュゲート)は、ＡＤＣＣ誘発性抗体の不在下でも、ＰＢＭＣからのＩＦＮ-γ放出性を高めた。ＩＦＮ-γレベルは、５ｎｇ／ｍｌのアービタックスの存在下で測定されたレベルに匹敵するが(図９Ｂを参照)、抗-ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの存在下でよりは低い(図９Ａを参照)。
上記の発明は、例証によりある程度詳細に、また理解を容易にする目的で実施例により、説明したが、明細書と実施例は発明の範囲を限定すると解されてはならない。ここに引用された全ての特許及び科学文献の開示はその全体が出典明示により明示的に援用される。

Claims (26)

  1. 疾患の治療にそれを必要とする個体において使用される（ａ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せ。
  2. エフェクター部分がサイトカインである請求項１に記載の組合せ。
  3. エフェクター部分が、ＩＬ-２、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮ-α、及びＩＬ-１２からなる群から選択されるサイトカインである請求項１又は２に記載の組合せ。
  4. エフェクター部分がＩＬ-２である請求項１から３のいずれか一項に記載の組合せ。
  5. ＩＬ-２エフェクター部分が、未変異ＩＬ-２エフェクター部分と比較して、ＩＬ-２レセプターのα-サブミットに対する変異ＩＬ-２エフェクター部分の親和性を減少させ又は無効にするが、中程度の親和性のＩＬ-２レセプターに対する変異ＩＬ-２エフェクター部分の親和性を保存している少なくとも一つのアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む変異ＩＬ-２エフェクター部分である請求項４に記載の組合せ。
  6. 抗原-結合部分が、抗体又は抗体断片である請求項１から５のいずれか一項に記載の組合せ。
  7. 抗原-結合部分がＦａｂ分子及びｓｃＦｖ分子から選択される請求項１から６のいずれか一項に記載の組合せ。
  8. イムノコンジュゲートが第１及び第２の抗原-結合部分を含む請求項１から７のいずれか一項に記載の組合せ。
  9. 前記第１及び第２の抗原-結合部分がＦａｂ分子である請求項８に記載の組合せ。
  10. エフェクター部分が、第１の抗原-結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第２の抗原-結合部分が、エフェクター分子又は第１の抗原-結合部分のいずれかとアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有している請求項８又は９に記載の組合せ。
  11. イムノコンジュゲートが、エフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分、及び第１及び第２のＦａｂ分子を含み、ここでエフェクター部分が第１のＦａｂ分子の重鎖又は軽鎖のカルボキシ-末端にそのアミノ-末端アミノ酸で結合しており、ここでエフェクター部分が第２のＦａｂ分子の重鎖又は軽鎖のアミノ-末端にそのカルボキシ-末端アミノ酸で結合している請求項１から１０のいずれか一項に記載の組合せ。
  12. 抗原-結合部分が、腫瘍細胞上に又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に対するものである請求項１から１１のいずれか一項に記載の組合せ。
  13. 増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体が、全長ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１サブクラス抗体である請求項１から１２のいずれか一項に記載の組合せ。
  14. 増加したエフェクター機能が、増加した活性化Ｆｃレセプターへの結合性、増加したＡＤＣＣ、増加したＡＤＣＰ、増加したＣＤＣ、及び増加したサイトカイン分泌性からなる群から選択される請求項１から１３のいずれか一項に記載の組合せ。
  15. 増加したエフェクター機能が、増加した活性Ｆｃレセプターへの結合性、及び／又は増加したＡＤＣＣである請求項１から１４のいずれか一項に記載の組合せ。
  16. 増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体が、Ｆｃ領域に一又は複数のアミノ酸変異を導入することにより、又はＦｃ領域におけるグリコシル化の修飾により操作されている請求項１から１５のいずれか一項に記載の組合せ。
  17. 増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体が、未操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加するように操作されている請求項１から１６のいずれか一項に記載の組合せ。
  18. 増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体が、腫瘍細胞上に存在する抗原に対するものである請求項１から１７のいずれか一項に記載の組合せ。
  19. 疾患が、エフェクター細胞の機能の刺激により治療可能な疾患、特に癌である請求項１から１８のいずれか一項に記載の組合せ。
  20. 個体が哺乳動物、特にヒトである請求項１から１９のいずれか一項に記載の組合せ。
  21. （ａ）少なくとも一つの抗原−結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体とを、薬学的に許容可能な担体中に含有せしめてなる薬学的組成物。
  22. （ａ）少なくとも一つの抗原−結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の、個体における疾患を治療するための医薬の製造のための使用。
  23. （ａ）少なくとも一つの抗原−結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを、治療的有効量、個体に投与することを含む、個体の疾患の治療方法。
  24. （ａ）少なくとも一つの抗原−結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートと（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体の組合せを、エフェクター細胞機能を刺激するのに有効な量、個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法。
  25. （ａ）少なくとも一つの抗原−結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体、及び（Ｃ）任意で、疾患の治療方法として併用治療の使用を指示する印刷された使用説明書を含むパッケージ挿入物を、同じ又は別々の容器に収容してなる、疾患の治療を意図したキット。
  26. 明細書に記載された発明。
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