JP2010500020A - Ｅｇｆｒと結合する抗原結合分子、それをコードするベクター、並びにその使用 - Google Patents

Ｅｇｆｒと結合する抗原結合分子、それをコードするベクター、並びにその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は抗原結合分子（ＡＢＭ）に関する。特定の実施形態によれば、本発明は組換モノクローナル抗体、例えばヒトＥＧＦＲに特異的なキメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体に関する。また、本発明は、かかるＡＢＭをコードする核酸分子と、かかる核酸分子を含んでなるベクター及び宿主細胞に関する。さらに、本発明は、本発明のＡＢＭを作製する方法と、かかるＡＢＭを用いて疾患を治療する方法に関する。加えて、本発明は、グリコシル化が修飾され、治療特性が改善されたＡＢＭ、例えばＦｃ受容体への結合が増大し、エフェクター機能が向上した抗体に関する。

Description

本発明は抗原結合分子（ＡＢＭ）に関する。特定の実施形態によれば、本発明は組換モノクローナル抗体、例えばヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的なキメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体に関する。また、本発明は、かかるＡＢＭをコードする核酸分子と、その核酸分子を含んでなるベクター及び宿主細胞に関する。さらに、本発明は、本発明のＡＢＭを作製する方法と、そのＡＢＭを用いて疾患を治療する方法に関する。加えて、本発明は、グリコシル化が修飾され、治療特性が改善されたＡＢＭ、例えばＦｃ受容体への結合が増大し、エフェクター機能が向上した抗体に関する。
ＥＧＦＲ及び抗ＥＧＦＲ抗体
ヒト上皮増殖因子受容体（別名ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１。本明細書では“ＥＧＦＲ”と呼ぶ）は、ｃ−ｅｒｂＢ癌原遺伝子によりコードされる１７０ｋＤａの膜貫通受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を有する（Modjtahedi他、Br. J. Cancer、第73巻、228〜235ページ、1996年；HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。SwissProtデータベースの登録番号Ｐ００５３にＥＧＦＲの配列が提示されている。ＥＧＦＲにはアイソフォーム及び変異体（例えば選択的ＲＮＡ転写産物、切断型、多型等）も存在する。例えば、これに限定されるものではないが、SwissProtデータベースの登録番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、Ｐ００５３３−４によって特定されるものが挙げられる。ＥＧＦＲは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、βセルリン、エピレギュリン等のリガンドと結合することが知られている（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年；MendessohnとBaselga、Oncogene、第19巻、6550〜6565ページ、2000年）。ＥＧＦＲは、チロシンキナーゼ媒介型シグナル伝達経路を通じて、多数の細胞プロセスを調節している。例えば、これに限定されるものではないが、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂、転移等を制御するシグナル伝達経路の活性化等が挙げられる。（Atalay他、Ann. Oncology、第14巻、1346〜1363ページ、2003年；TsaoとHerbst、Signal、第4巻、4〜9ページ、2003年；HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年；Modjtahedi他、Br. J. Cancer、第73巻、228〜235ページ、1996年）。
これまで多数のヒト悪性疾患（例えば膀胱がん、脳腫瘍、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、腎臓がん）においてＥＧＦＲの過剰発現が報告されている（Atalay他、Ann. Oncology、第14巻、1346〜1363ページ、2003年；HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年；Modjtahedi他、Br. J. Cancer、第73巻、228〜235ページ、1996年）。これらの疾患の多くでは、ＥＧＦＲの過剰発現は、患者の予後不良と相関又は関連を有する（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年；Modjtahedi他、Br. J. Cancer、第73巻、228〜235ページ、1996年）。ＥＧＦＲは正常組織の細胞（特に皮膚、肝臓、胃腸管の上皮組織細胞）でも発現しているが、悪性細胞と比べるとそのレベルは通常は低い（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。
非結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は有用ながん治療となり得る。それを実証するのが、米国食品医薬品局による以下の薬の承認である。即ち、進行乳がん治療におけるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）；ジェネンテック社）（Grillo-Lopez, A.-J.他、Semin. Oncol.、第26巻、66〜73ページ、1999年；Goldenberg, M.M.、Clin. Ther.、第21巻、309〜318ページ、1999年）、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、軽度非ホジキンリンパ腫、濾胞性非ホジキンリンパ腫の治療におけるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）；IDECファーマシューティカルズ社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州と、ジェネンテック社、サン・フランシスコ、カリフォルニア州）、再発性急性骨髄性白血病におけるゲムツズマブ（ミロタルグ（登録商標）；セルテック／ワイエス−エイヤースト社）、及び、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病におけるアレムツズマブ（キャンパス（登録商標）；ミレニアム・ファーマシューティカルズ／シェリング社）である。これらの製品が成功した原因は、その薬効のみならず、顕著な安全性プロファイルにもある（Grillo-Lopez, A.-J.他、Semin. Oncol.、第26巻、66〜73ページ、1999年；Goldenberg, M.M.、Clin. Ther.、第21巻、309〜318ページ、1999年）。これらの薬は成果を挙げているものの、非結合ｍＡｂ療法によって通常得られる特異的抗体活性よりも高い活性を得ることに、現在大きな関心が持たれている。
多数の研究結果によれば、細胞傷害性抗体の腫瘍に対する作用には、Ｆｃ受容体依存型の機構が実質的に寄与していることが示唆されており、また、腫瘍に対する最適抗体は活性化Ｆｃ受容体に優先的に結合し、抑制パートナーＦｃγＲIIＢへの結合は最小限となるとの予測が示されている（Clynes, R.A.他、Nature Medicine、第6巻(4)、443〜446ページ、2000年；Kalergis, A.M.とRavetch, J.V.、J. Exp. Med.、第195巻(12)、1653〜1659ページ、2002年6月）。例えば、特にＦｃγＲIIIａ受容体の多型が、抗体療法の効果と強い関連を有することを示唆する研究結果が少なくとも１つ存在する（Cartron, G.他、Blood、第99巻(3)、754〜757ページ、2002年2月）。本研究は、ＦｃγＲIIIａに関してホモの患者は、ヘテロの患者よりもリツキシマブに対する応答性に優れていることを示している。著者等の結論によれば、前記の優れた応答性は、抗体がインビボでＦｃγＲIIIａに対してより優れた結合を示す結果、リンパ腫細胞に対するＡＤＣＣ活性がより大きくなるためである（Cartron, G.他、Blood、第99巻(3)、754〜757ページ、2002年2月）。
ＥＧＦＲを標的としてＥＧＦＲのシグナル伝達経路を阻止する戦略が種々報告されている。小分子チロシンキナーゼ阻害剤（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ−１０３３）は、細胞内チロシンキナーゼ領域においてＥＧＦＲの自己リン酸化を阻止することにより、下流のシグナル伝達事象を抑制する（TsaoとHerbst、Signal、第4巻、4〜9ページ、2003年）。これに対して、モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲの細胞外部分を標的とし、リガンドの結合を阻止することにより、下流の事象（例えば細胞増殖）を抑制する（TsaoとHerbst、Signal、第4巻、4〜9ページ、2003年）。
かかる阻止をインビトロで実現するマウス・モノクローナル抗体が幾つか作製され、マウス異種移植片モデルで腫瘍の増殖に及ぼす影響が評価された（Masui他、Cancer Res.、第46巻、5592〜5598ページ、1986年；Masui他、Cancer Res.、第44巻、1002〜1007ページ、1984年；Goldstein他、Clon. Cancer Res.、第1巻、1311〜1318ページ、1995年）。例えば、ヒト類表皮癌細胞系Ａ４３１に対して産生されたマウスＥＧＦＲモノクローナル抗体であるEMD55900（EMDファーマシューティカルズ社）は、咽頭又は下咽頭の進行扁平上皮細胞癌を有する患者の臨床研究で試験された（Bier他、Eur. Arch. Otohinolaryngol.、第252巻、433〜439ページ、1995年）。また、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合するラットのモノクローナル抗体ＩＣＲ１６、ＩＣＲ６２、ＩＣＲ８０は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αの受容体に対する結合の抑制に有効であることが示されている（Modjtahedi他、Int. J. Cancer、第75巻、310〜316ページ、1998年）。ヒトＡ４３１癌細胞系に対して産生された別のＭＡｂであるマウス・モノクローナル抗体４２５は、ヒト上皮増殖因子受容体の外部ドメイン上のポリペプチド・エピトープに結合することが見出だされた（Murthy他、Arch. Biochem. Biophys.、第252巻(2)、549〜560ページ、1987年）。治療にマウス抗体を用いることにより生じ得る課題の一つは、ヒト宿主が非ヒト・モノクローナル抗体を外来性タンパク質と認識する可能性があるという点である。従って、かかる外来性抗体を繰り返し注入すると、免疫応答が誘導されて有害な過敏反応が生じる可能性がある。これはマウス系モノクローナル抗体の場合、ヒト抗マウス抗体応答若しくは“ＨＡＭＡ”応答、又は、ヒト抗ラット抗体若しくは“ＨＡＲＡ”応答と呼ばれることが多い。加えて、これら“外来”抗体は、宿主の免疫系によって攻撃され、実際には標的部位に到達する前に無力化されてしまう可能性がある。さらに、非ヒト・モノクローナル抗体（例えばマウス・モノクローナル抗体）は通常、ヒト・エフェクター機能を欠いている。すなわち、これらは特に補体依存性溶解を媒介し、或いは、抗体依存性細胞毒性又はＦｃ受容体媒介性貪食作用を通じてヒト標的細胞を溶解することができない。
“結合”抗体の代わりとして、異なる２以上の種（例えばマウスとヒト）由来の抗体の部分を含むキメラ抗体が開発された。例えば米国特許第５，８９１，９９６号（Mateo de Acosta del Rio他）には、ＥＧＦＲを対象とするマウス／ヒト・キメラ抗体Ｒ３が記載されており、米国特許第５，５５８，９６４号では、マウス抗ＥＧＦＲ ＭＡｂ ４２５のキメラ形態及びヒト化形態の生成が論じられている。また、キメラ・マウス／ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるIMC-C225（エルビタックス（登録商標）；イムクローン社）（マウスM225モノクローナル抗体をベースとし、ヒトの臨床試験でＨＡＭＡ応答を引き起こした）は、種々のヒト異種移植片モデルで抗腫瘍効果を示すことが報告されている（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。IMC-C225がその効力を発揮する機構としては、幾つかの機構が考えられてきた。例として、ＥＧＦＲシグナル伝達経路と、そしておそらくは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性の増大とによって調節される細胞事象の抑制が挙げられる（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。IMC-C225は臨床試験でも使用されており、放射線療法及び化学療法との組み合わせも試みられている（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。最近、アブジェニクス社（フレモント、カリフォルニア州）が、がん治療用のＡＢＸ−ＥＧＦを開発した。ＡＢＸ−ＥＧＦは完全ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である（Yang他、Crit. Rev. Oncol./Hematol.、第38巻、17〜23ページ、2001年）。
抗体のグリコシル化
オリゴ糖成分は、治療用糖タンパク質の効力に関係する性質（例えば物理的安定性、プロテアーゼの攻撃に対する抵抗力、免疫系との相互作用、薬物動態、特異的生物活性等）に大きな影響を与え得る。かかる性質はオリゴ糖の有無のみならず、オリゴ糖の具体的な構造にも依存すると思われる。オリゴ糖の構造と糖タンパク質の機能との間の関係はある程度一般化することができる。例えば、あるオリゴ糖構造は、特定の炭水化物結合タンパク質との相互作用を通じて、血流からの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介するのに対し、別のオリゴ糖構造は、抗体と結合して不所望の免疫反応を引き起こす（Jenkins他、Nature Biotechnol.、第14巻、975〜981ページ、1996年）。
哺乳動物の細胞は、タンパク質をヒトでの利用に最も適した形態にグリコシル化できるため、治療用糖タンパク質の産生に最も好ましい宿主である（Cumming他、Glycobiology、第1巻、115〜130ページ、1991年；Jenkins他、Nature Biotechnol.、第14巻、975〜981ページ、1996年）。細菌は、タンパク質をグリコシル化することは非常に稀であり、また、他の一般的な宿主（例えば酵母細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞、植物細胞）と同様、血流からの迅速なクリアランスに関連するグリコシル化パターン、望ましくない免疫相互作用、そして特定の場合には、生物活性の低下を生じさせる。哺乳動物細胞の中でも、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、過去２０年間で最も頻繁に使用されてきた。この細胞は、適切なグリコシル化パターンを示すのに加えて、遺伝的に安定で生産性に優れたクローン細胞系列を持続的に生成することが可能である。この細胞は、簡単なバイオリアクター中で無血清培地を用いて高密度で培養できるため、安全かつ再現性のある生体プロセスの開発が可能である。一般に用いられる他の動物の細胞として、ベビー・ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０−マウス骨髄腫細胞、ＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞等がある。より最近では、トランスジェニック動物を用いて作製する試みもなされている（Jenkins他、Nature Biotechnol.、第14巻、975〜981ページ、1996年）。
全ての抗体は重鎖定常領域の保存位置に炭水化物構造を有するが、各アイソタイプは、Ｎ結合糖質構造からなる独自のアレイを有し、これがタンパク質の集合、分泌、官能性に種々の影響を及ぼす（Wright, A.とMorrison, S.L.、Trends Biotech.、第15巻、26〜32ページ、1997年）。結合するＮ結合糖質の構造はプロセシングの程度等によって大きく異なるが、高マンノース多分岐オリゴ糖や二分岐複合オリゴ糖が含まれる可能性がある（Wright, A.とMorrison, S.L.、Trends Biotech.、第15巻、26〜32ページ、1997年）。通常は、特定のグリコシル化部位に結合したコア・オリゴ糖構造に対してヘテロ・プロセシングが生じるので、モノクローナル抗体であっても複数の糖形態で存在する。同様に、細胞系列が異なると抗体のグリコシル化に大きな差異が見られること、また、１つの細胞系列を異なる培養条件下で培養しても小さな差異が生じることが示されている（Lifely, M.R.他、Glycobiology、第5巻(8)、813〜822ページ、1995年）。
製法を簡便に保ちつつ、不所望の副作用の顕著な発生を回避し、且つ力価を大幅に増大させる方法の一つは、オリゴ糖成分を操作してモノクローナル抗体のエフェクター機能を増大させることである。かかる方法は、Umana, P.他、Nature Biotechnol.、第17巻、176〜180ページ、1999年、及び、米国特許第６，６０２，６８４号に記載されている（これらの内容はその全体が援用により本明細書に組み込まれる）。がんの免疫療法で最も一般的に用いられている抗体であるＩｇＧ１タイプの抗体は、それぞれのＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合二アンテナ性オリゴ糖はＣＨ２ドメインの間に埋まり、ポリペプチド骨格との間に広範囲の接触を形成するが、かかる接触の存在は、抗体が抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介する上で不可欠である（Lifely, M.R.他、Glycobiology、第5巻(8)、813〜822ページ、1995年；Jefferis, R.他、Immunol. Rev、第163巻、59〜76ページ、1998年；Wright, A.とMorrison, S.L.、Trends Biotech.、第15巻、26〜32ページ、1997年）。
Umanaらは以前、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でβ（１,４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（“ＧｎＴIII”）（bisectedオリゴ糖の形成の触媒となるグリコシルトランスフェラーゼ）を過剰発現させると、遺伝子組換ＣＨＯ細胞により産生される抗神経芽細胞腫キメラ・モノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のＡＤＣＣ活性が、インビトロで著しく増大することを示した（Umana, P.他、Nature Biotechnol.、第17巻、176〜180ページ、1999年と国際公開ＷＯ９９／５４３４２を参照。これらの全内容は援用により本明細書に組み込まれる。）。ｃｈＣＥ７抗体は大きなクラスに属する。このクラスは、高い腫瘍親和性及び特異性を有するものの、ＧｎＴIII酵素を欠く標準的な工業的細胞系で産生させると力価が小さ過ぎるため、臨床には使用できない非結合ｍＡｂからなる（Umana, P.他、Nature Biotechnol.、第17巻、176〜180ページ、1999年）。この研究は、抗体産生細胞を操作してＧｎＴIIIを発現させるとＡＤＣＣ活性が大幅に増大することを初めて示した。この操作によって、定常領域（Ｆｃ）に関連する分断（bisected）オリゴ糖（例えば分断（bisected）非フコシル化オリゴ糖）の割合も、天然の抗体で見られるレベルより高くなった。
霊長類（例えば、限定されるものではないが、ヒト等）の細胞増殖疾患を治療するための、ＥＧＦＲを標的とする改良された治療法が依然として求められている。かかる疾患は、ＥＧＦＲの発現、特に異常な発現（例えば過剰発現）を特徴とするものであり、例えば膀胱がん、脳腫瘍、頭部及び頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、腎臓がん等が挙げられる。特に、ヒト患者に投与される抗原結合分子中の非ヒト残基数を可能な限り低減することが依然として求められている。
本発明者等は、ラットＩＣＲ６２抗体の結合特異性を有する（例えば同じエピトープに結合する）とともに、Ｆｃ受容体結合親和性及びエフェクター機能を増大させるための糖改変を加えた抗原結合分子（ＡＢＭ）が、治療用途で大きな可能性を有することを認識し、かかるＡＢＭを製造する方法を開発した。特に、この方法は、組換抗体、キメラ抗体、又はそのキメラ断片を作製する操作を有する。これらのＡＢＭの効力は、抗体のＦｃ領域のグリコシル化プロファイルを操作することによって、さらに増大する。
即ち、一態様によれば、本発明は、ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体の１又は２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１又は２以上の特異性決定残基（ＳＤＲ）と、異種ポリペプチドに由来する配列とを含んでなる抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、ＥＧＦＲに特異的に結合するＡＢＭに関する。特定の実施形態によれば、ＡＢＭは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号１２１からなる群から選択される配列を有さない。
更なる態様によれば、前記１又は２以上のＳＤＲは、１又は２以上の重鎖ＣＤＲ内に存在する。特定の実施形態によれば、前記１又は２以上の重鎖ＳＤＲは、Kabat２９位のフェニルアラニン、Kabat５２位のアスパラギン、Kabat５６位のチロシン、及びKabat１００ｂ位のバリンからなる群より選択される。別の特定の実施形態によれば、前記１又は２以上の重鎖ＳＤＲは、Kabat５６位のチロシン及びKabat１００ｂ位のバリンを含んでなる。別の特定の実施形態によれば、前記１又は２以上の重鎖ＳＤＲは、Kabat２９位のフェニルアラニン、Kabat５２位のアスパラギン、Kabat５６位のチロシン、Kabat１００ｂ位のバリンである。
一実施形態によれば、前記１又は２以上のＳＤＲは、１又は２以上の軽鎖ＣＤＲ内に存在する。特定の実施形態によれば、前記１又は２以上の軽鎖ＳＤＲは、Kabat５０位のアスパラギンを含んでなる。別の特定の実施形態によれば、前記１又は２以上の軽鎖ＳＤＲは、Kabat３４位のアスパラギン及びKabat５０位のアスパラギンを含んでなる。
別の態様によれば、本発明は、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも２つ含んでなるＡＢＭに関する。一実施形態によれば、ＡＢＭは、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも３つ含んでなる。別の実施形態によれば、ＡＢＭは、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも４つ含んでなる。別の実施形態によれば、ＡＢＭは、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも５つ含んでなる。別の実施形態によれば、ＡＢＭは、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも６つ含んでなる。さらに別の実施形態によれば、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲは、１又は２以上のアミノ酸位置に置換を有し、前記ＡＢＭは、未置換のＡＢＭと比べて結合活性を保持している。さらに別の実施形態によれば、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲは、特異性決定残基以外の任意の位置に置換を有する。さらに別の実施形態によれば、ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲは、特異性決定残基以外の全ての位置に置換を有する。特定の実施形態によれば、ＣＤＲは、Chothia重鎖ＣＤＲ１のKabat２７位、２８位、２９位、Kabat重鎖ＣＤＲ１の３１位、Kabat重鎖ＣＤＲ２のKabat５２位、５２ａ位、５３位、５７位、Kabat重鎖ＣＤＲ３のKabat１０２位のうちの１又は２以上に置換を有する。別の特定の実施形態によれば、ＣＤＲは、Kabat軽鎖ＣＤＲ１のKabat３０位、３２位、Kabat軽鎖ＣＤＲ２のKabat５１位、５２位、５３位、５６位、Kabat軽鎖ＣＤＲ３のKabat９４位のうちの１又は２以上に置換を有する。
さらに別の態様によれば、本発明は、結合に関するＥＣ50濃度の変化が、未置換のＡＢＭと比べて約１０〜約０．００１倍未満であるＡＢＭに関する。特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約１０〜約１倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約１０〜約５倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約５〜約０．１倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約５〜約２倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約３〜約１倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約２倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約１倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約０．１倍未満である。別の特定の実施形態によれば、結合に関するＥＣ50濃度の変化は、未置換のＡＢＭと比べて約０．００１倍未満である。ある実施形態によれば、上述の変化とは、ＥＣ50の増加である。別の実施形態によれば、上述の変化とは、ＥＣ50の低下である。
別の態様によれば、本発明は、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを含んでなるＡＢＭに関する。
別の態様によれば、本発明は、ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体の変化した重鎖ＣＤＲと、１又は２以上のヒト生殖系列可変領域遺伝子配列に由来する重鎖フレームワーク領域とを含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする単離ポリペプチドであって、前記変化した重鎖ＣＤＲが、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５２、５２ａ、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００ａ、１０１、１０２からなる群から選択されるKabat位、又はこれらの任意の組み合わせの位置に１又は２以上のアミノ酸置換を有するとともに、前記ポリペプチドが抗原結合分子の一部として、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチドに関する。特定の実施形態によれば、変化した重鎖ＣＤＲは、Kabat２７位、２８位、２９位、３１位、５２位、５３位、５４位、５８位、１０２位に１又は２以上のアミノ酸置換を有する。別の特定の実施形態によれば、変化した重鎖ＣＤＲは、Kabat２７位、２８位、３１位、５３位、５４位、５８位に１又は２以上のアミノ酸置換を有する。別の特定の実施形態によれば、変化した重鎖ＣＤＲは、Kabat及びChothia重鎖ＣＤＲ内のＳＤＲを除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する。別の特定の実施形態によれば、変化した重鎖ＣＤＲは、Kabat及びChothia重鎖ＣＤＲ内のKabat位置２９位、５２位、５６位、１００ｂ位を除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する。本発明は、前記単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。
別の態様によれば、本発明は、ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体の変化した軽鎖ＣＤＲと、１又は２以上のヒト生殖系列可変領域遺伝子配列に由来する軽鎖フレームワーク領域とを含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする単離ポリペプチドであって、変化した軽鎖ＣＤＲが、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、５１、５２、５３、５４、５５、５６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７からなる群から選択されたKabat位、又はこれらの任意の組み合わせの位置に１又は２以上のアミノ酸置換を有するとともに、前記ポリペプチドが抗原結合分子の一部として、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチドに関する。特定の実施形態によれば、変化した軽鎖ＣＤＲは、Kabat及びChothia軽鎖ＣＤＲ内のＳＤＲを除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する。別の特定の実施形態によれば、変化した軽鎖ＣＤＲは、Kabat及びChothia軽鎖ＣＤＲ内のKabat位置３４位及び５０位を除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する。本発明は、単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。本発明は、単離ポリペプチドを含んでなるＡＢＭにも関する。
別の態様によれば、本発明は、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、抗原結合分子の一部としてヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、ポリヌクレオチドに関する。別の態様によれば、本発明は、前記ポリヌクレオチドをトランスフェクトされた宿主細胞、又は前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。一実施形態によれば、前記ベクターは複製クローニングベクターである。別の実施形態によれば、前記ベクターは発現ベクターである。
別の態様によれば、本発明は、ヒトＥＧＦＲに結合するラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体と競合し得る抗原結合分子を作製する方法であって、本発明の宿主細胞を培地中、抗原結合分子をコードする１又は２以上のポリヌクレオチドを発現させる条件下で培養する工程；及び、前記抗原結合分子を回収する工程を含んでなる方法に関する。
別の態様によれば、本発明のＡＢＭは、糖改変により変化したオリゴ糖構造をＦｃ領域内に有する。特定の実施形態によれば、前記Ｆｃ領域におけるフコース残基数は、対応する非糖改変ＡＢＭと比べて少ない。
別の態様によれば、本発明は、本発明のＡＢＭと、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、対象においてＥＧＦＲを発現する細胞を標的とする方法であって、その対象に本発明の組成物を投与する工程を含んでなる方法に関する。特定の実施形態によれば、前記細胞はＥＧＦＲを過剰に発現している。別の特定の実施形態によれば、本方法は、前記対象におけるＥＧＦＲ媒介性細胞シグナル伝達の遮断により治療し得る病気を治療するために実施される。本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲ媒介性細胞シグナル伝達の遮断により治療し得る病気を治療するための医薬の製造に使用される本発明のＡＢＭに関する。一実施形態によれば、前記病気は細胞増殖疾患である。特定の実施形態によれば、前記細胞増殖疾患はがんである。より具体的な実施形態によれば、がんは、乳がん、膀胱がん、頭部及び頸部のがん、皮膚がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、直腸がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍からなる群から選択される。
さらに別の態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号１２２及び配列番号１２４からなる群から選択される配列と；（ｂ）配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１２６からなる群から選択される配列と；（ｃ）配列番号１０８とを含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。別の態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号１１２及び配列番号１１４からなる群から選択される配列と；（ｂ）配列番号１１６及び配列番号１１８からなる群から選択される配列と；（ｃ）配列番号１１９とを含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。別の実施形態によれば、これらポリヌクレオチドはいずれも、融合ポリペプチドをコードする。別の態様によれば、これらの単離ポリヌクレオチドのいずれか、或いは全てが本発明から除外される。
さらに別の態様によれば、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０及び配列番号１２０からなる群から選択される配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。別の態様によれば、本発明は、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０及び配列番号５２からなる群から選択される配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。一実施形態によれば、かかるポリヌクレオチドは融合ポリペプチドをコードする。別の態様によれば、これらの単離ポリヌクレオチドのいずれか、或いは全てが本発明から除外される。
さらに、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０及び配列番号１２０からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％が一致する配列を含んでなり、融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。更なる態様によれば、本発明は、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５２からなる群から選択される配列と少なくとも８０％が一致する配列を含んでなり、融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。別の態様によれば、これらの単離ポリヌクレオチドのいずれか、或いは全てが本発明から除外される。別の態様によれば、これらの単離ポリヌクレオチドのいずれか、或いは全てが本発明から除外される。
本発明は、配列番号１の配列を有するキメラポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するポリペプチドをコードする配列と、ラット以外の種に由来する抗体のＦｃ領域又はその断片の配列を有するポリペプチドをコードする配列とを含んでなる。本発明は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号１２１からなる群から選択される配列を有するキメラポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号１２１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードする配列と、ラット以外の種に由来する抗体のＦｃ領域又はその断片の配列を有するポリペプチドをコードする配列とを含んでなる。別の態様によれば、ポリペプチドをコードするこれらの単離ポリヌクレオチドのいずれか、又は全てが本発明から除外される。
さらに別の態様によれば、本発明は、配列番号４３の配列を有するキメラポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号４３の配列を有するポリペプチドをコードする配列と、ラット以外の種に由来する抗体のＦｃ領域又はその断片の配列を有するポリペプチドをコードする配列とを含んでなる。さらに別の態様によれば、本発明は、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１からなる群から選択される配列を有するキメラポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。一実施形態によれば、本ポリヌクレオチドは、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードする配列と、ラット以外の種に由来する抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）又はその断片の配列を有するポリペプチドをコードする配列とを含んでなる。別の態様によれば、ポリペプチドをコードするこれらの単離ポリヌクレオチドのいずれか、又は全てが本発明から除外される。
本発明は、ＩＣＲ６２抗体のＶＨ領域を有するポリペプチド又はその機能的変異体をコードする配列と、ラット以外の種に由来する抗体のＦｃ領域又はその断片の配列を有するポリペプチドをコードする配列とを含んでなる単離ポリヌクレオチドにも関する。別の態様によれば、本発明は、ＩＣＲ６２抗体のＶＬ領域を有するポリペプチド又はその機能的変異体をコードする配列と、ラット以外の種に由来する抗体のＣＬ領域又はその断片の配列を有するポリペプチドをコードする配列とを含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、上記の単離された任意のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターと、かかる発現ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。さらに別の態様によれば、本発明は、上記の単離された任意のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞に関する。
一の態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号１２３及び配列番号１２５からなる群から選択される配列と；（ｂ）配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５及び配列番号１２７からなる群から選択される配列と；（ｃ）配列番号１０７とを含んでなり、融合ポリペプチドである単離ポリペプチドに関する。別の態様によれば、これらの単離ポリペプチドのいずれか、又は全てが本発明から除外される。別の態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群から選択される配列と；（ｂ）配列番号１１５と；（ｃ）配列番号１１７とを含んでなる融合ポリペプチドである単離ポリペプチドに関する。別の態様によれば、これらの単離ポリペプチドのいずれか、又は全てが本発明から除外される。
本発明は、配列番号１の配列を含んでなるキメラポリペプチド又はその変異体にも関する。さらに、本発明は、配列番号４３の配列を含んでなるキメラポリペプチド又はその変異体にも関する。一実施形態によれば、これらポリペプチドのいずれかは、ヒトＦｃ領域及び／又はヒトＣＬ領域をさらに含んでなる。本発明は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９及び配列番号１２１からなる群から選択される配列を含んでなるキメラポリペプチド、又はその変異体にも関する。さらに、本発明は、配列番号４５、配列番号４９及び配列番号５１からなる群から選択される配列を含んでなるキメラポリペプチド、又はその変異体に関する。一実施形態によれば、これらのポリペプチドのいずれかは、さらにヒトＦｃ領域及び／又はヒトＣＬ領域を含んでなる。一実施形態によれば、前記ヒトＦｃ領域はＩｇＧ１を含んでなる。
別の態様によれば、本発明は、ＩＣＲ６２抗体に由来する配列と、異種ポリペプチドに由来する配列とを含んでなるポリペプチド、並びに、かかるポリペプチドを含んでなる抗原結合分子に関する。一実施形態によれば、その抗原結合分子は抗体である。好適な実施形態によれば、その抗体はキメラ抗体である。別の好適な実施形態によれば、その抗体は、ヒト化抗体又は霊長類化抗体である。
別の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲへの結合に関してＩＣＲ６２と競合することができてキメラであるＡＢＭに関する。一実施形態によれば、前記ＡＢＭは、抗体又はその断片である。さらに別の実施形態によれば、前記ＡＢＭは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９及び配列番号１２１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含んでなる組換抗体である。別の実施形態によれば、前記ＡＢＭは、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９及び配列番号５１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含んでなる組換抗体である。さらに別の実施形態によれば、前記ＡＢＭは、霊長類化された組換抗体である。さらに別の実施形態によれば、前記ＡＢＭは、ヒト化された組換抗体である。別の実施形態によれば、前記ＡＢＭは、ヒトＦｃ領域を含んでなる組換抗体である。さらに別の実施形態によれば、上記のＡＢＭのいずれかを、毒素や放射性標識といった部分と結合させてもよい。
さらに、本発明は、変化したオリゴ糖を有する本発明のＡＢＭに関する。一実施形態によれば、その変化したオリゴ糖は、変化していないオリゴ糖と比べてフコシル化が減少している。別の実施形態によれば、その変化したオリゴ糖は、混成体又は複合体である。さらに別の実施形態によれば、ＡＢＭは、その分子のＦｃ領域において、非フコシル化オリゴ糖又は切断（bisected）非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。一実施形態によれば、切断非フコシル化オリゴ糖は混成体である。さらに別の実施形態によれば、切断非フコシル化オリゴ糖は複合体である。一実施形態によれば、ポリペプチドのＦｃ領域の少なくとも２０％のオリゴ糖が、非フコシル化オリゴ糖であるか、切断非フコシル化オリゴ糖である。より好ましい実施形態によれば、オリゴ糖の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又はそれ以上が、非フコシル化オリゴ糖であるか、切断非フコシル化オリゴ糖である。
さらに、本発明は、上記の任意のＡＢＭをコードするポリヌクレオチドと、かかるポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター及び細胞とに関する。
さらに、本発明は、ＥＧＦＲへの結合に関してＩＣＲ６２と競合することができてキメラであるＡＢＭの製造方法であって、（ａ）本発明のＡＢＭをコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞を培地中、前記ポリヌクレオチドを発現させ得る条件下で培養する工程；及び、（ｂ）得られた培地からそのＡＢＭを回収する工程を含んでなる方法に関する。
別の態様によれば、本発明は、本発明のＡＢＭを含んでなる医薬組成物に関する。その医薬組成物はさらに、医薬的に許容し得る担体又はアジュバント、又はこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
さらに別の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲの発現（例えばＥＧＦＲの異常又は過剰発現）を特徴とする疾患を治療する方法に関する。この方法は、治療に有効な量の本発明のＡＢＭを、それを必要とする対象（哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい）に投与する工程を含んでなる。好適な実施形態によれば、疾患の治療は、キメラ（例えばヒト化）抗体、又は抗体のキメラ断片であるＡＢＭの投与によって行われる。一実施形態によれば、ＡＢＭは、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５．０ｍｇ／ｋｇの量が投与される。別の実施形態によれば、ＡＢＭは、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２．０ｍｇ／ｋｇの量が投与される。さらに別の実施形態によれば、ＡＢＭは、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約４．５ｍｇ／ｋｇの量が投与される。さらに別の実施形態によれば、ＡＢＭは、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２．０ｍｇ／ｋｇの量が投与される。さらに別の実施形態によれば、ＡＢＭは、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約１２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量が投与される。
さらに別の態様によれば、本発明は、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞であって、その核酸の発現が、その宿主細胞によって産生されるＡＢＭのＦｃ領域のオリゴ糖を変化させるのに十分な量であり、前記ＡＢＭが、ＥＧＦＲへの結合に関してＩＣＲ６２と競合し得るとともに、前記ＡＢＭがキメラである、宿主細胞に関する。一実施形態によれば、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドである。別の実施形態によれば、宿主細胞によって産生されるＡＢＭは、抗体又は抗体断片である。一実施形態によれば、その抗体又は抗体断片は、ヒト化されている。さらに別の実施形態によれば、ＡＢＭは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と同等な領域を含んでなる。
本発明は、ラットＩＣＲ６２抗体の相補性決定領域、又は、その相補性決定領域の特異性決定残基を少なくとも含有する変異体又はその切断形態を、少なくとも１つ（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）含んでなるとともに、融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。かかる単離ポリヌクレオチドは、抗原結合分子である融合ポリペプチドをコードすることが好ましい。一実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、ラットＩＣＲ６２抗体の３つの相補性決定領域、又は、それら３つの相補性決定領域それぞれの特異性決定残基を少なくとも含有するその変異体又は切断形態を含んでなる。別の実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、キメラ（例えばヒト化）抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域全体をコードする。さらに、本発明は、かかるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。
本発明の別の実施形態は、ラットＩＣＲ６２抗体の相補性決定領域、又は、その相補性決定領域の少なくとも特異性決定残基を有する変異体又はその切断形態を、少なくとも１つ（例えば１個、２個、３個、４個、５個又は６個）含んでなるとともに、異種ポリペプチドに由来する配列を含んでなる抗原結合分子に関する。一実施形態によれば、その抗原結合分子は、ラットＩＣＲ６２抗体の３つの相補性決定領域、又は、それら３つの相補性決定領域それぞれの少なくとも特異性決定残基を含有する変異体又はその切断形態を含んでなる。別の態様によれば、その抗原結合分子は、抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を含んでなる。特に有用な一実施形態によれば、前記抗原結合分子は、キメラ（例えばヒト化）抗体である。本発明は、前記抗原結合分子の製造方法と、それを利用した疾患（例えば膀胱がん、脳腫瘍、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、皮膚がん、腎臓がん）の治療にも関する。
本発明の宿主細胞は、限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞からなる群から選択することができる。一実施形態によれば、本発明の宿主細胞はさらに、ラットＩＣＲ６２抗体のＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド又はその変異体と、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域と同等な領域をコードする配列とを含んでなるトランスフェクトされたポリヌクレオチドを含んでなる。別の実施形態によれば、本発明の宿主細胞はさらに、ラットＩＣＲ６２抗体のＶＨ領域をコードするポリヌクレオチド又はその変異体と、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域と同等な領域をコードする配列とを含んでなるトランスフェクトされたポリヌクレオチドを含んでなる。
さらに別の態様によれば、本発明は、オリゴ糖が変化した結果として増加したＦｃ受容体結合親和性及び／又は増加したエフェクター機能を有するＡＢＭを産生する宿主細胞に関する。一実施形態によれば、増大した結合親和性は、Ｆｃ受容体、その中でも特にＦｃγＲIIIＡ受容体に対するものである。本明細書で想定されるエフェクター機能は、限定されるものではないが、Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞への結合の増加、単球への結合の増加、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達の増加、樹状細胞の成熟の増加、Ｔ細胞のプライミングの増加からなる群から選択することができる。
さらに別の態様によれば、本発明の宿主細胞は、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードし、構成的プロモータ要素に作動式に連結した少なくとも１つの核酸を含んでなる。
別の態様によれば、本発明は、宿主細胞にＡＢＭを産生させる方法であって、（ａ）ＡＢＭの産生を可能にするとともに、前記ＡＢＭのＦｃ領域に存在するオリゴ糖を変化させ得る条件下、ＧｎＴIII活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するように操作された宿主細胞を培養する工程；及び（ｂ）そのＡＢＭを単離する工程を含んでなるとともに、ＥＧＦＲへの結合に関してＩＣＲ６２と競合し得るキメラ（例えばヒト化）ＡＢＭを産生させる方法に関する。一実施形態によれば、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドであり、ＧｎＴIIIの触媒ドメインを有するとともに、マンノシダーゼIIの局在ドメイン、β（１,２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（“ＧｎＴＩ”）の局在ドメイン、マンノシダーゼＩの局在ドメイン、β（１,２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII（“ＧｎＴII”）の局在ドメイン、α１−６コア・フコシルトランスフェラーゼの局在ドメインからなる群から選択された異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなることが好ましい。ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼII又はＧｎＴＩに由来することが好ましい。
さらに別の態様によれば、本発明は、宿主細胞によって産生される抗ＥＧＦＲ ＡＢＭのグリコシル化プロファイルを変化させる方法であって、その宿主細胞に本発明の少なくとも１つの核酸又は発現ベクターを導入する工程を含んでなる方法に関する。一実施形態によれば、ＡＢＭは抗体又はその断片であり、Ｆｃ領域とＩｇＧを含んでなることが好ましい。或いはポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と同等な領域を含有する融合タンパク質である。
一の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲへの結合に関してＩＣＲ６２と競合することができてフコシル化が減少している組換キメラ抗体又はその断片に関する。
別の態様によれば、本発明は、ＧｎＴIII活性を持っていて異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなる融合ポリペプチドを用い、本発明の組換抗体又はその断片のグリコシル化を変化させる方法に関する。一実施形態によれば、本発明の融合ポリペプチドは、ＧｎＴIIIの触媒ドメインを含んでなる。別の実施形態によれば、ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼIIの局在ドメイン、ＧｎＴＩの局在ドメイン、マンノシダーゼIの局在ドメイン、ＧｎＴIIの局在ドメイン、α１−６コア・フコシルトランスフェラーゼの局在ドメインからなる群から選択される。ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼII又はＧｎＴＩに由来することが好ましい。
一実施形態によれば、本発明の方法は、変化していないオリゴ糖と比べてフコシル化が減少している変化したオリゴ糖を有する組換キメラ抗体又はその断片の産生に関する。本発明によれば、変化したオリゴ糖は、混成体又は複合体である。別の実施形態によれば、本発明の方法は、ポリペプチドのＦｃ領域に含まれる切断非フコシル化オリゴ糖の割合が増加した組換キメラ（例えばヒト化）抗体又はその断片の産生に関する。一実施形態によれば、切断非フコシル化オリゴ糖は混成体である。別の実施形態によれば、切断非フコシル化オリゴ糖は複合体である。さらに別の実施形態によれば、本発明の方法は、ポリペプチドのＦｃ領域にあるオリゴ糖のうちの少なくとも２０％が切断非フコシル化オリゴ糖である組換キメラ抗体又はその断片の産生に関する。好適な実施形態によれば、ポリペプチドのＦｃ領域にあるオリゴ糖のうちの少なくとも３０％が切断非フコシル化オリゴ糖である。別の好適な実施形態によれば、ポリペプチドのＦｃ領域にあるオリゴ糖のうちの少なくとも３５％が切断非フコシル化オリゴ糖である。
さらに別の態様によれば、本発明は、オリゴ糖が変化した結果として増加したＦｃ受容体結合親和性及び／又は増加したエフェクター機能を示す組換キメラ抗体又はその断片に関する。一実施形態によれば、増加した結合親和性は、Ｆｃ活性化受容体に対するものである。さらに別の実施形態によれば、Ｆｃ受容体はＦｃγ活性化受容体、その中でも特にＦｃγＲIIIＡ受容体である。本明細書で考慮されるエフェクター機能は、Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞への結合の増加、単球への結合の増加、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達の増加、樹状細胞の成熟の増加、Ｔ細胞のプライミングの増加からなる群から選択できるが、これらに限定されるわけではない。
別の態様によれば、本発明は、ラットＩＣＲ６２抗体の結合特異性を有するとともに、本発明の任意の方法によってエフェクター機能が増加するように操作されたＦｃ領域を含有する組換キメラ（例えばヒト化）抗体断片に関する。
別の態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号１２１からなる群から選択される配列と、免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域であって、本発明のいずれかの方法によってエフェクター機能が増加するように操作された領域とを有するポリペプチドを含有する融合タンパク質に関する。別の態様によれば、これらの単離ポリペプチドのいずれか、又は全てが本発明から除外される。
別の態様によれば、本発明は、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１からなる群から選択される配列と、免疫グロブリンのＦｃ領域と同等で本発明のいずれかの方法によってエフェクター機能が増加するように操作された領域とを有するポリペプチドを含有する融合タンパク質に関する。別の態様によれば、これらの単離ポリペプチドのいずれか、又は全てが本発明から除外される。
一の態様によれば、本発明は、本発明の任意の方法によって製造された組換キメラ（例えばヒト化）抗体と、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる医薬組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の方法によって製造された組換キメラ（例えばヒト化）抗体断片と、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる医薬組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の方法によって製造された融合タンパク質と、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
別の態様によれば、本発明は、試験管内又はインビボでＥＧＦＲを発現している細胞を標的とする方法に関する。本発明の一実施形態は、対象においてＥＧＦＲを発現している細胞を標的とする方法であって、その対象に、本発明のＡＢＭを含んでなる組成物を投与する工程を含んでなる方法に関する。
さらに別の態様によれば、本発明は、例えばＥＧＦＲの発現に関連する疾患の診断を目的として、インビボ又はインビトロでサンプル中のＥＧＦＲの存在を検出する方法に関する。一実施形態によれば、この検出は、本発明のＡＢＭとＥＧＦＲとの間の複合体の形成を可能にする条件下で、調べるサンプルを、場合によっては対照サンプルとともに、ＡＢＭと接触させることによって実施する。その後、（例えば従来技術で知られているＥＬＩＳＡその他の方法によって）複合体の形成を検出する。試験サンプルとともに対照サンプルを用いる場合には、試験サンプルと対照サンプルとを比較した場合にＡＢＭ−ＥＧＦＲ複合体の形成に統計的な有意差が少しでもあれば、試験サンプルの中にＥＧＦＲが存在していることを示すものとする。
さらに、本発明は、ＥＧＦＲの発現に関係する疾患、中でも特にＥＧＦＲが発現している、特に異常に発現している（例えば過剰発現している）細胞増殖疾患（例えば膀胱がん、脳腫瘍、頭部と頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、腎臓がん等）を治療する方法であって、本発明の任意の方法によって製造された組換キメラ（例えばヒト化）抗体又はその断片の治療に有効な量を、それを必要とするヒト患者に投与する工程を含んでなる方法に関する。
キメラ・ラット−ヒトＩＣＲ６２ポリペプチドの重鎖及び軽鎖を、ヒト化ＩＣＲ６２構造体Ｉ−ＨＨＣ（重鎖）及びＩ−ＫＢ（軽鎖）とそれぞれ組み合わせた場合の機能的活性を示している。ｒＶＬはキメラ軽鎖を表わし、ｒＶＨはキメラ重鎖を表わす。「ｒ」は、可変領域が元のラット抗体に由来することを示す。 重鎖可変領域構造体Ｉ−ＨＨＣ、Ｉ−ＨＨＡ、Ｉ−ＨＬＡと、ヒト化軽鎖可変領域構造体Ｉ−ＫＡ、Ｉ−ＫＢとを、種々の構成の組み合わせとして含んでなるヒト化ＩＣＲ６２抗体の結合活性を示す。 重鎖可変領域構造体I−ＨＬＢ、I−ＨＬＣ、Ｉ−ＨＬＡと、ヒト化軽鎖可変領域構造体Ｉ−ＫＡ、Ｉ−ＫＣとを、種々の構成の組み合わせとして含んでなるヒト化ＩＣＲ６２抗体の結合活性を示す。 重鎖可変領域構造体Ｉ−ＨＬＡ２、Ｉ−ＨＬＡ３、Ｉ−ＨＬＡ４と、ヒト化軽鎖可変領域構造体Ｉ−ＫＣとを含んでなるヒト化ＩＣＲ６２抗体の結合活性を、キメラ・ラット−ヒトＩＣＲ６２抗体と比較して示す。 重鎖可変領域構造体Ｉ−ＨＬＡ１、Ｉ−ＨＬＡ３、Ｉ−ＨＬＡ５、Ｉ−ＨＬＡ６と、ヒト化軽鎖可変領域構造体Ｉ−ＫＣとを含んでなるヒト化ＩＣＲ６２抗体の結合活性を、キメラ・ラット−ヒトＩＣＲ６２抗体と比較して示す。 重鎖可変領域構造体Ｉ−ＨＬＡ７、Ｉ−ＨＬＡ６、Ｉ−ＨＨＢと、ヒト化軽鎖可変領域構造体Ｉ−ＫＣとを含んでなるヒト化ＩＣＲ６２抗体の結合活性を、キメラ・ラット−ヒトＩＣＲ６２抗体と比較して示す。 重鎖可変領域構造体Ｉ−ＨＨＦ、Ｉ−ＨＬＡ９、Ｉ−ＨＬＡ８と、ヒト化軽鎖可変領域構造体Ｉ−ＫＣとを含んでなるヒト化ＩＣＲ６２抗体の結合活性を、キメラ・ラット−ヒトＩＣＲ６２抗体と比較して示す。 重鎖可変領域構造体Ｉ−ＨＨＢ、Ｉ−ＨＨＤ、Ｉ−ＨＨＧ、Ｉ−ＨＨＦ、Ｉ−ＨＬＡ７、Ｉ−ＨＬＡ９と、ヒト化軽鎖可変領域構造体Ｉ−ＫＣとを含んでなるヒト化ＩＣＲ６２抗体の結合活性を示す。 キメラＩＣＲ６２抗体の様々な糖形態とヒト化変異体Ｉ−ＨＬＡ４に関し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を比較して示す。“Ｇ１”は、ＧｎＴIIIと共発現させることによる抗体の糖改変を意味する。“Ｇ２”は、ＧｎＴIII及びＭａｎIIと共発現させることによる抗体の糖改変を意味する。“ＷＴ”は、糖改変していない抗体を意味する。ヒト化重鎖構造体は、Ｉ−ＫＣ軽鎖構造体と組み合わせた。 ヒト化ＩＣＲ６２抗体構造体Ｉ−ＨＨＢとＩ−ＨＬＡ７の非糖改変形態（ＷＴ）とＧ２糖形態（すなわちＧｎＴIIIとＭａｎIIの共発現による糖改変）に関するＡＤＣＣの比較結果を示す。同じ抗体を２つの異なる標的細胞系列に適用した。図１０Ａでは標的細胞系列ＬＮ２２９を使用し、図１０Ｂでは細胞系列Ａ４３１を使用した。ヒト化重鎖構造体は、Ｉ−ＫＣ軽鎖構造体と組み合わせた。 キメラＩＣＲ６２の非糖改変形態（ＷＴ）とＧ２糖形態、ならびにヒト化ＩＣＲ６２抗体構造体Ｉ−ＨＨＢとＩ−ＨＬＡ７に関する比較結果を示す。標的細胞系列Ａ４３１を使用した。ヒト化重鎖構造体は、Ｉ−ＫＣ軽鎖構造体と組み合わせた。 キメラＩＣＲ６２のＧ２糖形態、ならびにヒト化ＩＣＲ６２抗体構造体Ｉ−ＨＨＢとＩ−ＨＬＡ７に関する７２時間のＡＤＣＣの比較結果を示す。ヒト化重鎖構造体は、Ｉ−ＫＣ軽鎖構造体と組み合わせた。 ヒト化ＩＣＲ６２重鎖可変領域構造体をラットＩＣＲ６２配列と比較したアミノ酸配列のアラインメントである。点は、与えられた構造体内の与えられた位置のアミノ酸残基が一致していることを示す。 組換ヒトＦｃγＲIIIａを提示するＣＨＯ細胞を用いたＦｃγＲIIIａ−Ｆｃ結合アッセイを示す。糖改変Ｉ−ＨＨＢ／ＫＣヒト化抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ１抗体を非糖改変（Ｗｔ）抗体と比較した。 糖改変ヒト化抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ１抗体であるＩ−ＨＨＢ／ＫＣに関するＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳオリゴ糖プロファイルである。抗体産生細胞内でＧｎＴIII活性及びゴルジマンノシダーゼII活性を有する酵素をコードする遺伝子を過剰発現させることによって実現した糖改変により、７０％を超える非フコシル化Ｆｃ−Ａｓｎ２９７結合オリゴ糖が生成した。 １％サル血清マトリックス（ＨＬＳ社から供給されたサル血清プールＣＭＳ２５／３１／３３）に含まれる抗ＥＧＦＲを調べるための抗ＥＧＦＲ精度プロファイルを示す（ｎ＝６個のコピーが較正曲線を横断している）。 １％サル血清マトリックス中の抗ＥＧＦＲを調べるための代表的な抗ＥＧＦＲ較正曲線である。 オスのカニクイザルへの抗ＥＧＦＲの毎週静脈内投与における、第１日目の投与後の血清濃度を示す。 メスのカニクイザルへの抗ＥＧＦＲの毎週静脈内投与における、第１日目の投与後の血清濃度を示す。 カニクイザルへの抗ＥＧＦＲの毎週静脈内投与時の第１日目の投与レベルと抗ＥＧＦＲの血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ168）との関係を示す。 オスのカニクイザルへの抗ＥＧＦＲの毎週静脈内投与時の抗ＥＧＦＲの血清濃度を示す。 メスのカニクイザルへの抗ＥＧＦＲの毎週静脈内投与時の抗ＥＧＦＲの血清濃度を示す。 実施例記載のサルのインビボ試験で使用した、Ｆｃ操作（糖改変）抗ＥＧＦＲ抗体からのオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳプロファイルである。 ヒトＡ４３１類表皮癌細胞の表面に発現したＥＧＦＲへの結合を示す。本結合試験に用いた抗体は、実施例記載のサルのインビボ試験に使用したＦｃ操作抗ＥＧＦＲ抗体（Ｉ−ＨＨＢ構造体）であった。 サルＣＯＳ−７腎細胞の表面に発現したＥＧＦＲへの結合を示す。使用した抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｉ−ＨＨＢ重鎖；Ｉ−ＫＣ軽鎖）であった。参考として、ＥＧＦＲの発現が少ないヒト細胞であるＭＣＦ−７乳がん細胞への結合を示す。 全細胞（ヒトＦｃγＲIIIａを表面に発現するように操作したＣＨＯ細胞）を用いたＦｃ−ＦｃγＲIIIａの結合を示す。使用した抗体は、実施例記載のサルのインビボ試験で使用したＦｃ操作（糖改変）抗ＥＧＦＲ抗体であった。比較のため、Ｆｃ操作していない（未改変）対照ＩｇＧ１抗体に関する結合を示す。 Ｆｃ操作（糖改変）抗ＥＧＦＲ抗体により媒介されるＡＤＣＣを示す。標的細胞は、Ａ５４９ヒト肺がん細胞である。比較のため、Ｆｃ操作していない（未改変）形態の抗体のＡＤＣＣ活性を示す。 Ｆｃ操作（糖改変）抗ＥＧＦＲ抗体により媒介されるＡＤＣＣを示す。標的細胞は、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１カニクイザルのケラチノサイト細胞系である。比較のため、Ｆｃ操作していない（未改変）形態の抗体のＡＤＣＣ活性を示す。 Ｉ−ＫＣ構造体と重鎖構造体Ｉ−ＨＨＤとの組み合わせに基づく種々の軽鎖構造体変異体のＥＧＦＲに対する結合を示す。 Ｉ−ＫＣ構造体と重鎖構造体Ｉ−ＨＨＤとの組み合わせに基づく種々の軽鎖構造体変異体のＥＧＦＲに対する結合を示す。 軽鎖構造体Ｉ−ＫＣとペアにしたＩ−ＨＨＤ構造体をベースとした様々な重鎖構造体変異体のＥＧＦＲに対する結合を示す。 軽鎖構造体Ｉ−ＫＣとペアにしたＩ−ＨＨＤ構造体をベースとした様々な重鎖構造体変異体のＥＧＦＲに対する結合を示す。
本明細書では、用語は、特に断わらない限り、従来技術で一般に用いられている意味で使用する。
本明細書における「抗体」という用語には、抗体全分子（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性（例えば二重特異性）抗体）のほか、Ｆｃ領域を有するとともに結合特異性を保持する抗体断片や、免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を有するとともに結合特異性を保持する融合タンパク質が含まれるものとする。また、結合特異性を保持する抗体断片であるＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体等も含まれる（例えばHudsonとSouriau、Nature Med.、第9巻、129〜134ページ、2003年を参照のこと）。ヒト化抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体も含まれる。
本明細書において「Ｆｃ領域」という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を意味するものとする。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は僅かに変動し得るものの、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基からカルボキシル末端までの領域として定義される。
本明細書において「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等な領域」という表現には、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然アレル変異体が含まれるほか、置換、付加、欠失を生じさせる変更を有するが、その変更によって免疫グロブリンがエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞毒性）を媒介する能力が実質的に低下しない変異体も含まれるものとする。例えば、生物学的機能を実質的に喪失することなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から１又は２以上のアミノ酸を除去し得る。かかる変異体は、当業者に公知の一般的な規則に従い、活性への影響ができるだけ少なくなるように選択することができる（例えばBowie, J.U.他、Science、第247巻、1306〜1310ページ、1990年を参照のこと）。
本明細書において「ＥＧＦＲ」という用語は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても知られる）（Ulrich, A.他、Nature、第309巻、418〜425ページ、1984年；SwissProt登録番号Ｐ００５３３；二次登録番号：Ｏ００６８８、Ｏ００７３２、Ｐ０６２６８、Ｑ１４２２５、Ｑ９２７９５、Ｑ９ＢＺＳ２、Ｑ９ＧＺＸ１、Ｑ９Ｈ２Ｃ９、Ｑ９Ｈ３Ｃ９、Ｑ９ＵＭＤ７、Ｑ９ＵＭＤ８、Ｑ９ＵＭＧ５）、並びに、その天然のアイソフォーム及び変異体を意味する。かかるアイソフォーム及び変異体としては、ＥＧＦＲvIII変異体、選択的スプライシング産物（例えばSwissProt登録番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、Ｐ００５３３−４によって特定される）、変異体Ｇｌｎ−９８、Ａｒｇ−２６６、Ｌｙｓ−５２１、Ｉｌｅ−６７４、Ｇｌｙ−９６２、Ｐｒｏ−９８８（Livingston, R.J.他、NIEHS-SNPs、環境ゲノムプロジェクト、NIEHS ES15478、ゲノムサイエンス部、シアトル、ワシントン州、2004年）、以下の登録番号によって特定される他のもの：ＮＭ ００５２２８．３、ＮＭ ２０１２８２．１、ＮＭ ２０１２８３．１、ＮＭ ２０１２８４．１（ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡｓ）；ＡＦ１２５２５３．１、ＡＦ２７７８９７．１、ＡＦ２８８７３８．１、ＡＩ２１７６７１．１、ＡＫ１２７８１７．１、ＡＬ５９８２６０．１、ＡＵ１３７３３４．１、ＡＷ１６３０３８．１、ＡＷ２９５２２９．１、ＢＣ０５７８０２．１、ＣＢ１６０８３１．１、Ｋ０３１９３．１、Ｕ４８７２２．１、Ｕ９５０８９．１、Ｘ００５８８．１；Ｘ００６６３．１、Ｈ５４４８４Ｓ１、Ｈ５４４８４Ｓ３、Ｈ５４４８４Ｓ２（ＭＩＰＳアセンブリ）；ＤＴ．４５３６０６、ＤＴ．８６８５５６５１、ＤＴ．９５１６５５９３、ＤＴ．９７８２２６８１、ＤＴ．９５１６５６００、ＤＴ．１００７５２４３０、ＤＴ．９１６５４３６１、ＤＴ．９２０３４４６０、ＤＴ．９２４４６３４９、ＤＴ．９７７８４８４９、ＤＴ．１０１９７８０１９、ＤＴ．４１８６４７、ＤＴ．８６８４２１６７、ＤＴ．９１８０３４５７、ＤＴ．９２４４６３５０、ＤＴ．９５１５３００３、ＤＴ．９５２５４１６１、ＤＴ．９７８１６６５４、ＤＴ．８７０１４３３０、ＤＴ．８７０７９２２４（ＤＯＴＳアセンブリ）等が挙げられる。
本明細書において「ＥＧＦＲリガンド」という用語は、ＥＧＦＲと結合するポリペプチド、及び／又は、ＥＧＦＲを活性化するポリペプチドを意味する。この用語には、ＥＧＦＲリガンドの膜結合前駆体のほか、ＥＧＦＲリガンドのタンパク質分解による可溶形態が含まれる。
本明細書において「ＥＧＦＲのリガンド活性化」という用語は、ＥＧＦＲリガンドの結合により媒介されるシグナル伝達を意味する。例えば、ＥＧＦＲ又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＥＧＦＲ受容体の細胞内キナーゼドメインによって生じるシグナル伝達が挙げられる。
本明細書において「ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲリガンドの異常な活性化又は産生を特徴とする疾患又は病気、又はＥＧＦＲの発現に関係する病気」という表現は、その疾患又は病気を有する対象の細胞又は組織内、又はその疾患又は病気になり易い対象の細胞又は組織内で、ＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲリガンドの異常な産生及び／又は活性化が生じている状態を意味する。かかる状態は、悪性腫瘍又はがんを含んでいてもよく、いなくてもよい。
本明細書において、ＥＧＦＲを発現する細胞との関連で用いられる「過剰発現」、「過剰発現した」、「過剰発現する」等の用語は、細胞表面で測定されるＥＧＦＲのレベルが、同組織型の正常細胞と比べてより高い細胞を意味する。かかる過剰発現は、遺伝子増幅や転写又は翻訳の増大によって生じ得る。ＥＧＦＲの発現（及び過剰発現）は、診断アッセイ又は予後アッセイにおいて、細胞表面又は細胞溶解物中に存在するＥＧＦＲのレベルを、当業者に公知の方法（例えば免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、リガンドの結合、キナーゼ活性等）で評価することにより測定できる（一般には、『細胞生物学：実験室ハンドブック』、Celis, J.編、アカデミック出版、第2版、1998年；『タンパク質科学における最新のプロトコル』、Coligan, J.E.他編、ジョン・ワイリー＆サンズ社、１９９５〜２００３年を参照のこと；Sumitomo他、Clin. Cancer Res.、第10巻、794〜801ページ、2004年（ウェスタン・ブロット、フロー・サイトメトリー、免疫組織化学について記載されている）も参照のこと。なお、これら文献は何れもその全体が、援用により本明細書に組み込まれる）。かかる測定法の代わりに、或いはかかる測定法に加えて、細胞内でＥＧＦＲをコードする核酸分子のレベルを、例えば蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション法、サザン・ブロット法、ＰＣＲ法により測定してもよい。正常細胞内のＥＧＦＲのレベルを、細胞増殖疾患（例えばがん）に罹患する細胞のレベルと比較し、ＥＧＦＲが過剰発現しているか否かを決定する。
本明細書において使用される「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味では、抗原決定基に特異的に結合する分子を意味する。抗原結合分子としては、例えば、抗原決定基に特異的に結合し得る抗体又はその断片が挙げられる。より具体的には、「ＥＧＦＲに結合する抗原結合分子」は、一般に上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と表される１７０ｋＤａの膜貫通受容体（別名ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１）に特異的に結合する分子である。「特異的に結合する」とは、結合がその抗原に選択的であり、不所望の相互作用や非特異的な相互作用から区別し得ることを意味する。
本明細書において「融合」及び「キメラ」という用語は、ポリペプチドに関して用いる場合、２以上の異種ポリペプチド（例えば異なる種に由来する抗体の一部）に由来するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを意味する。例えば、キメラＡＢＭの場合、非抗原結合成分としては、様々な種（チンパンジーやヒト等の霊長類を含む）に由来するものを使用し得る。キメラＡＢＭの定常領域は、天然のヒト抗体の定常領域と実質的に一致していることが最も好ましい。キメラＡＢＭの可変領域は、マウス可変領域のアミノ酸配列を有する組換抗ＥＧＦＲ抗体の可変領域と実質的に一致していることが最も好ましい。ヒト化抗体は、融合抗体又はキメラ抗体の形態であることが特に好ましい。
本明細書において「ＧｎＴIII活性を有するポリペプチド」という用語は、β−１−４結合中のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシル・コアのβ結合マンノシドに付加する反応を触媒し得るポリペプチドを意味する。この用語には、特定の生物学的アッセイで測定した場合に、β（１,４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（別名β−１,４−マンノシル−グリコプロテイン ４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１４４）。生化学・分子生物学国際連合の命名委員会（NC-IUBMB）による。）と類似の（但し必ずしも同一でなくてもよい）酵素活性を示す融合ポリペプチドが含まれる。この酵素活性には、投与量依存性のある場合と、投与量依存性のない場合とがある。投与量依存性がある場合には、ＧｎＴIIIの投与量依存性と同じである必要はなく、むしろ所定の活性においてＧｎＴIIIと比べて実質的に類似の投与量依存性を示す（すなわち候補ポリペプチドの活性は、ＧｎＴIIIと比べて、約２５分の１超又はそれ以上であり、好ましくは約１０分の１以上であり、最も好ましくは約３分の１以上である）。
本明細書において「変異体」（又は「類似体」）という用語は、例えば組換ＤＮＡ技術を用いて作製される、アミノ酸の挿入、欠失、及び置換により、具体的に例示される本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを意味する。本発明のＡＢＭの変異体としては、抗原（例えばＥＧＦＲ）結合親和性に実質的に影響を与えることなく１又は複数のアミノ酸残基が置換、及び／又は付加、及び／又は欠失により改変された、キメラ抗原結合分子、霊長類化抗原結合分子、ヒト化抗原結合分子等が挙げられる。着目する活性を消失することなく置換、付加、又は欠失し得るアミノ酸残基を特定するための指針は、特定のポリペプチドの配列を相同なペプチドの配列と比較し、相同性が大きい領域（保存された領域）におけるアミノ酸配列の変更の数を最小化することによって、又はアミノ酸をコンセンサス配列で置き換えることによって見出し得る。
或いは、遺伝暗号の「冗長性」を利用して、同一又は類似のポリペプチドをコードする組換変異体を合成又は選択することができる。様々なコドン置換（例えば様々な制限部位を生み出すサイレントな変化）を導入することにより、プラスミドベクター又はウイルスベクターへのクローニングや、特定の原核細胞系又は真核細胞系における発現を最適化することができる。ポリヌクレオチド配列における突然変異が、ポリペプチドや、そのポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映されることで、リガンド結合親和性、鎖間親和性、分解／代謝回転速度等の性質が変化し得る。
アミノ酸「置換」は、例えば１つのアミノ酸を、類似の構造及び／又は化学的性質を有する別のアミノ酸で置換した結果、すなわち保存アミノ酸置換であってもよい。「保存」アミノ酸置換は、関係する残基の極性、及び／又は電荷、及び／又は溶解度、及び／又は疎水性、及び／又は親水性、及び／又は両性特性に基づいて実現できる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。正帯電（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシン、ヒスチジンが挙げられる。負帯電（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。「挿入」又は「欠失」は、アミノ酸約１〜２０個の範囲が好ましく、アミノ酸１〜１０個の範囲がより好ましい。許容される変化は、組換ＤＮＡ技術を利用してポリペプチド分子内で系統的にアミノ酸の挿入、欠失、置換を行ない、得られた組換変異体の活性を調べることによって実験的に決定できる。
本明細書において「ヒト化」という用語は、非ヒト抗原結合分子（例えばマウス抗体）に由来し、親分子の抗原結合特性を保持又は実質的に保持しているが、ヒトに対する免疫原性がより少ない抗原結合分子を意味するのに用いられる。これは、様々な方法で実現できる。例えば、（ａ）ヒト定常領域に非ヒト可変領域全体をグラフトしてキメラ抗体を生成する方法、（ｂ）重要なフレームワーク残基（例えば優れた抗原結合親和性又は抗体機能を保持する上で重要な残基）を保持した状態又は保持しない状態で、ヒト・フレームワーク及び定常領域に非ヒトＣＤＲのみをグラフトする方法、（ｃ）非ヒト可変領域全体を移植するが、表面残基の置換によってそれをヒト様区画で「覆う（cloaking）」方法がある。これらの方法は、Jones、Morrison他、Proc. Natl. Acad. Sci.、第81巻、6851〜6855ページ、1984年；MorrisonとOi、Adv. Immunol.、第44巻、65〜92ページ、1988年；Verhoeyen他、Science、第239巻、1534〜1536ページ、1988年；Padlan、Molec. Immun.、第28巻、489〜498ページ、1991年；Padlan、Molec. Immun.、第31巻(3)、169〜217ページ、1994年に開示されている（これらの文献はいずれも、その内容の全体が援用により本明細書に組み込まれる）。通常、抗体の重鎖及び軽鎖の各可変領域には、３つの相補性決定領域、すなわちＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が存在する。それらに隣接して、抗体の重鎖及び軽鎖の各可変領域内には、４つのフレームワーク下部領域（すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）が存在する。すなわち、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４となっている。ヒト化抗体に関する議論は、特に、米国特許第６，６３２，９２７号と、米国特許出願公開第２００３／０１７５２６９号（両者の全内容は援用により本明細書に組み込まれる）に見いだすことができる。別の例では、結合に必要なＣＤＲの残基だけをヒト配列に移し（「グラフト」し）、抗原特異性を有する完全な可変領域配列を作り出すことができる。
同様に、本明細書において「霊長類化された」という用語は、非霊長類抗原結合分子（例えばマウス抗体）に由来し、親分子の抗原結合特性を保持又は実質的に保持しているが、ヒトに対する免疫原性がより少ない抗原結合分子を意味するのに用いる。
従来技術において、ある用語に２つ以上の定義が使用及び／又は許容される場合には、本明細書で用いるその用語の定義には、かかる意味が全て含まれる（但し、逆を明示する場合を除く）。一例として、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語が挙げられる。これは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両可変領域に見られる不連続な抗原結合部位を表す言葉である。この特別な領域については、Kabat他、米国厚生省、「免疫学的に興味深いタンパク質の配列」（1983年）と、Chothia他、J. Mol. Biol.、第196巻、901〜917ページ、1987年（これらの内容は援用により本明細書に組み込まれる）とに説明がある。これらの定義を互いに比較すると、アミノ酸残基の重複や部分集合が含まれる。しかし、何れの定義を用いた抗体のＣＤＲ又はその変異体の記載も、本明細書で定義及び使用される本用語の範囲に含まれる。上記各引用文献で定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を以下の表１に比較して示す。特定のＣＤＲを包含する残基の正確な番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて異なる。当業者であれば、抗体の可変領域の所与のアミノ酸配列に基づいて、個々のＣＤＲにいかなる残基が含まれるかを定型的な手法で決定できよう。
Figure 2010500020
また、Kabat等は、任意の抗体に使用し得る可変領域配列の番号付け系も定義した。当業者であれば、配列自体を超えるいかなる実験データにも頼ることなく、この「Kabat番号付け」系を任意の可変領域配列に、曖昧さなく適用することができよう。本明細書において「Kabat番号付け」とは、Kabat他、米国厚生省、「免疫学的に興味深いタンパク質の配列」（1983年）に記載の番号付け系を意味する。特に断わらない限り、ＡＢＭ内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けに言及する場合は、Kabat番号付け系に従う。配列リストの配列（すなわち配列番号１〜配列番号１４７）は、Kabat番号付け系に従って番号付けられたものではない。しかし上述のように、本明細書に提示した配列の番号付けに基づいて配列リストの任意の可変領域配列のKabat番号付けスキームを決定することは、当業者の能力範囲であろう。
例えば、少なくとも９５％が本発明の参照ヌクレオチド配列と「一致する」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と概ね一致するが、そのポリヌクレオチド配列内に、参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個当たり最大５個の点突然変異が含まれていてもよいことを意味するものとする。言い換えるならば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％一致するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列の最大５％のヌクレオチドを欠失させ、或いは他のヌクレオチドで置換してもよく、参照配列の全ヌクレオチドの最大５％のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。
実際問題として、ある特定の核酸分子又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％一致しているか否かは、公知のコンピュータ・プログラムを利用して容易に調べることができる。問合配列（本発明の配列）と対象配列との最適な全体的一致（別名「全体的配列アラインメント」）を調べる好ましい方法は、Brutlagら（Comp. App. Biosci.、第6巻、237〜245ページ、1990年）のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータ・プログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいて、問合配列と対象配列とは両方ともＤＮＡ配列である。ＵをＴに変換すると、ＲＮＡ配列を比較することができる。この全体的配列アラインメントの結果は％同一性である。％同一性を計算するためにＤＮＡ配列のFASTDBアラインメントで用いられる好ましいパラメータは、行列＝ユニタリ、ｋ組＝４、ミスマッチのペナルティ＝１、合体のペナルティ＝３０、ランダム化グループの長さ＝０、カットオフ・スコア＝１、ギャップのペナルティ＝５、ギャップ・サイズのペナルティ＝０．０５、ウインドウのサイズ＝５００と対象ヌクレオチド配列長との何れか短い方とする。
対象配列が問合配列よりも短く、その理由が内部の欠失ではなくて、５’又は３’の欠失による場合には、結果を手作業で訂正する必要がある。FASTDBプログラムでは、％同一性を計算するときに対象配列の５’及び３’の切断を考慮しないからである。問合配列から５’末端又は３’末端が切断された対象配列に関しては、％同一性は、問合配列の塩基に一致／アラインしない対象配列の５’及び３’の塩基の数を、問合配列の全塩基に対する割合として計算して訂正する。あるヌクレオチドが一致／アラインするか否かは、FASTDB配列のアラインメントの結果から分かる。次に、指定パラメータを用いて上記のFASTDBプログラムで計算した％同一性からこの割合を差し引くことで、最終的な％同一性の値が得られる。この訂正値が、本発明の目的で使用される値である。％同一性の値を手作業で調節する目的であれば、FASTDBアラインメントによって表示される対象配列の５’塩基と３’塩基以外の塩基のうち、問合配列に一致／アラインしない塩基だけを計算する。
例えば、９０塩基の対象配列を１００塩基の問合配列とアラインして％同一性を求める。欠失が対象配列の５’末端に起こるため、FASTDBアラインメントでは５’末端の最初の１０塩基の一致／アラインメントが示されない。対形成しない１０個の塩基は配列の１０％である（５’末端及び３’末端の一致しない塩基数／問合配列中の総塩基数）から、FASTDBプログラムで計算される％同一性スコアから１０％を差し引く。残る９０塩基が完全に一致していれば、最終％同一性は９０％になろう。別の例では、９０塩基の対象配列を１００塩基の問合配列と比較する。この場合には欠失が内部の欠失であるため、対象配列の５’末端又は３’末端には、問合配列と一致／アラインしない塩基は存在しない。この場合、FASTDBで計算される％同一性の手作業による訂正は行わない。やはり、対象配列の５’末端及び３’末端の塩基のうち、問合配列と一致／アラインしない塩基だけが手作業で訂正される。本発明の目的では、他の訂正が手作業でなされることはない。
本発明の問合アミノ酸配列と、例えば少なくとも９５％「一致」するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、問合アミノ酸配列のアミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸変化を含んでいてもよいことを除き、その問合配列と一致することを意味する。言い換えれば、問合アミノ酸配列と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対象配列の最大５％のアミノ酸残基を挿入してもよく、対象配列の最大５％のアミノ酸残基を欠失させ、又は他のヌクレオチドで置換してもよい。かかる参照配列の変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端の位置で起こるか、これら末端位置間の任意の場所で、参照配列中の残基間に個別に分散されて、又は参照配列内に１又は２以上の連続したグループになって起こる可能性がある。
実際問題として、ある特定のポリペプチドが、参照ポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％と一致しているか否かは、公知のコンピュータ・プログラムを利用して容易に調べることができる。問合配列（本発明の配列）と対象配列の間の最適な全体的一致（全体的配列アラインメントとも呼ばれる）を調べる好ましい１つの方法は、Brutlagら（Comp. App. Biosci.、第6巻、237〜245ページ、1990年）のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータ・プログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいて、問合配列と対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるか、両方ともアミノ酸配列である。この全体的配列アラインメントの結果は％同一性である。FASTDBアミノ酸アラインメントで用いられる好ましいパラメータは、行列＝ＰＡＭ ０、k個の組＝２、ミスマッチのペナルティ＝１、合体のペナルティ＝２０、ランダム化グループの長さ＝０、カットオフ・スコア＝１、ウインドウのサイズ＝配列の長さ、ギャップのペナルティ＝５、ギャップ・サイズのペナルティ＝０．０５、ウインドウのサイズ＝５００と対象アミノ酸配列の長さのどちらか短いほう、である。
対象配列が、内部の欠失ではなくてＮ末端又はＣ末端の欠失が理由で問合配列よりも短い場合には、結果を手作業で訂正する必要がある。なぜならFASTDBプログラムでは、％同一性を計算するときに対象配列のＮ末端とＣ末端の切断が考慮されていないからである。問合配列と比べてＮ末端又はＣ末端が切断された対象配列に関しては、％同一性は、問合配列の残基で対象配列のＮ末端とＣ末端に対応していて対応する対象残基と一致／アラインしない残基の数を、問合配列の全塩基に対する割合として計算して訂正する。ある残基が一致する／アラインメントされるか否かは、FASTDB配列のアラインメントの結果から明らかにされる。次に、指定したパラメータを用いて上記のFASTDBプログラムで計算した％同一性からこの割合を差し引くことで、最終的な％同一性の値に到達する。この訂正された値が、本発明の目的で使用される値である。％同一性の値を手作業で調節することを目的として、対象配列のＮ末端とＣ末端の残基のうちで問合配列と一致／アラインしない残基だけが計算される。すなわち対象配列の最も遠いＮ末端の残基とＣ末端の残基の外側の質問残基の位置だけが考慮される。
例えば９０個のアミノ酸残基からなる対象配列を１００残基からなる問合配列とアラインして％同一性を決定する。欠失が対象配列のＮ末端で起こるため、FASTDBアラインメントではＮ末端の最初の１０残基のマッチング／アラインメントが示されない。ペアにならない１０個の残基は配列の１０％になる（Ｎ末端とＣ末端にあって一致しない残基の数／問合配列の全残基数）ため、FASTDBプログラムによって計算される％同一性の値から１０％を差し引く。残る９０個の残基が完全に一致する場合には、最終％同一性は９０％になろう。別の一例では、９０残基の対象配列を１００残基の問合配列と比較する。この場合には、欠失は内部欠失であるため、対象配列のＮ末端又はＣ末端には、問合配列と一致／アラインしない残基はない。この場合、FASTDBによって計算される％同一性が手作業で訂正されることはない。ここでも、FASTDBアラインメントによって表示される対象配列のＮ末端とＣ末端の外側の残基のうちで問合配列と一致／アラインしない残基だけが手作業で訂正される。本発明の目的で他の訂正が手作業でなされることはない。
本明細書では、本発明の核酸配列に「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」核酸は、５０％ホルムアミドと、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸アトリウム）と、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）と、５×デンハルト溶液と、１０％硫酸デキストランと、２０μｇ／ｍｌの変性し剪断されたサケの精子ＤＮＡとを含んでなる溶液の中で４２℃にて一晩にわたってインキュベートしてハイブリダイズさせた後、フィルタを０.１×ＳＳＣの中で約６５℃にて洗浄したポリヌクレオチドを意味する。
本明細書において「ゴルジ局在ドメイン」という用語は、ゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列であって、そのポリペプチドをゴルジ複合体の中に固定する上で重要なアミノ酸配列を意味する。一般に、局所ドメインは、１つの酵素のアミノ末端「尾部」を含んでなる。
本明細書において「エフェクター機能」という用語は、１つの抗体のＦｃ領域（元々の配列のＦｃ領域、又はアミノ酸配列変異体のＦｃ領域）に帰することのできる生物活性を意味する。抗体のエフェクター機能の例として、Ｆｃ受容体結合親和性、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞性貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカインの分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を媒介とした抗原の取り込み、細胞表面受容体の下方調節等がある。
本明細書において「操作」、「操作された」、「操作する」、「糖改変する」という用語に、天然のポリペプチド又は組換ポリペプチド、又はその断片のグリコシル化パターンのあらゆる操作が含まれると見なす。グリコシル化操作には、細胞のグリコシル化機構の代謝操作が含まれる。例として、オリゴ糖合成経路の遺伝子操作により細胞内で発現する糖タンパク質のグリコシル化を変化させることが挙げられる。さらに、グリコシル化操作には、グリコシル化に対する突然変異や細胞環境の効果が含まれる。一実施形態によれば、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の変化である。特定の実施形態によれば、この操作によってグルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はフコシルトランスフェラーゼの活性が変化する。
本明細書において「宿主細胞」という用語に、操作して本発明のポリペプチドと抗原結合分子を生成させることのできるあらゆる種類の細胞系が含まれる。一実施形態によれば、宿主細胞を操作し、糖形態が変化した抗原結合分子を産生させ得る。好適な実施形態によれば、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、融合タンパク質のいずれかである。いくつかの実施形態によれば、宿主細胞をさらに操作し、ＧｎＴIII活性を有する１種類以上のポリペプチドの発現レベルを増大させてある。宿主細胞としては、培養された細胞（ほんのいくつか挙げるならば、例えば哺乳動物の培養細胞（ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞等）、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞）だけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、培養した植物組織、培養した動物組織も挙げられる。
本明細書において「Ｆｃを媒介とした細胞毒性」という用語に、抗体依存性細胞毒性と、ヒトＦｃ領域を含有する可溶性Ｆｃ−融合タンパク質によって媒介される細胞毒性が含まれる。これは、「ヒト免疫エフェクター細胞」によって「抗体が標的とする細胞」の溶解につながる免疫機構である。
「ヒト免疫エフェクター細胞」は、Ｆｃ受容体を表面に提示する白血球の集団である。その提示を通じて白血球は抗体のＦｃ領域又はＦｃ−融合タンパク質に結合し、エフェクター機能を発揮する。かかる集団として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び／又はナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞等がある。
「抗体が標的とする細胞」は、抗体又はＦｃ融合タンパク質が結合する細胞である。抗体又はＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域のタンパク質部分のＮ末端を通じて標的細胞に結合する。
本明細書において「Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加」は、抗体又はＦｃ−融合タンパク質の濃度が所定の値のとき、上に定義したＦｃを媒介とした細胞毒性の機構によって所定の時間内に溶解する「抗体が標的とする細胞」の数が標的細胞を取り囲む媒体中で増加することとして、及び／又は所定の時間内にＦｃを媒介とした細胞毒性の機構によって所定数の「抗体が標的とする細胞」の溶解を実現するのに必要な抗体の濃度又はＦｃ−融合タンパク質が標的細胞を取り囲む媒体中で減少することとして定義される。Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加は、当業者に知られている同じ標準的な産生法、精製法、製剤化法、貯蔵法を利用して同じタイプの宿主細胞によって産生され、本明細書に記載した方法によってグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴIIIを発現するように操作された宿主細胞によって産生されたのではない同じ抗体又はＦｃ−融合タンパク質によって媒介される細胞毒性との比較である。
「増加した抗体依存性細胞毒性性（ＡＤＣＣ）を有する抗体」とは、当業者に知られている適切な任意の方法で測定したＡＤＣＣが増加した、本明細書で定義した用語としての抗体を意味する。許容されている試験管内ＡＤＣＣアッセイの一例は以下の通りである。
１）本アッセイでは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を用いる。
２）本アッセイでは、ランダムに選択した健康なドナーの血液からエフェクター細胞として単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いる。
３）本アッセイは、以下のプロトコルに従って実施する。
ｉ）標準的な遠心分離手続きを利用してＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ細胞培地の中に５×１０6細胞／ｍｌの割合で懸濁させる；
ii）標準的な組織培養法によって標的細胞を増殖させ、生存率が９０％を超える指数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培地の中で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培地で２回洗浄し、細胞培地の中に１０5細胞／ｍｌの密度で再び懸濁させる。
iii）上記の最終標的細胞懸濁液１００マイクロリットルを９６ウエル微量滴定プレートの各ウエルに移す；
iv）抗体を細胞培地の中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで段階希釈し、得られた抗体溶液５０マイクロリットルを９６ウエル微量滴定プレートの標的細胞に添加し、上記の全濃度範囲をカバーする様々な抗体濃度を３通りテストする；
ｖ）最大放出（ＭＲ）の対照として、標識した標的細胞を含有するプレート内の別の３つのウエルに、抗体溶液（上記のiv）の代わりに５０マイクロリットルの２％（ｖ／ｖ）非イオン性洗浄剤水溶液（Nonidet、シグマ社、セントルイス）を入れる；
vi）自発的放出（ＳＲ）の対照として、標識した標的細胞を含有するプレート内の別の３つのウエルに、抗体溶液（上記のiv）の代わりに５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培地を入れる；
vii）次に、９６ウエル微量滴定プレートを５０×ｇで１分間にわたって遠心分離した後、４℃にて１時間にわたってインキュベートする；
viii）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記のｉ）を各ウエルに添加してエフェクター標的細胞：標的細胞の比を２５：１にし、プレートを、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にしたインキュベータに４時間にわたって入れる；
ix）各ウエルから無細胞の上清を回収し、実験で放出された放射線（ＥＲ）をγ線カウンタを用いて定量化する；
ｘ）公式（ＥＲ − ＭＲ）／（ＭＲ − ＳＲ）×１００に従って特異的溶解の割合を各抗体濃度について計算する（ただし、ＥＲは、抗体の濃度に関して定量化された放射線の平均値（上記のix参照）であり、ＭＲは、ＭＲの対照（上記のｖ参照）に関して定量化された放射線の平均値（上記のix参照）であり、ＳＲは、ＳＲの対照（上記のvi参照）に関して定量化された放射線の平均値（上記のix参照）である）。
４）「増加したＡＤＣＣ」は、テストした抗体の上記濃度範囲内で観察された特異的溶解の割合の最大値の増加として、及び／又はテストした抗体の上記濃度範囲内で観察された特異的溶解の割合の最大値の半分の値を実現するのに必要な抗体の濃度の減少として定義される。ＡＤＣＣの増加は、当業者に知られている同じ標準的な産生法、精製法、製剤化法、貯蔵法を利用して同じタイプの宿主細胞によって産生され、本明細書に記載した方法によってグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴIIIを発現するように操作された宿主細胞によって産生されたのではない同じ抗体又はＦｃ−融合タンパク質によって媒介されるＡＤＣＣ（例えば上記のアッセイで測定する）との比較である。
一態様によれば、本発明は、ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体の結合特異性を有する（すなわち実質的に同じエピトープに結合する）抗原結合分子と、変化したグリコシル化によってそのエフェクター機能を大きくできるという発見とに関する。一実施形態によれば、抗原結合分子はキメラ抗体である。本発明の好適な実施形態は、配列番号５３〜１０８及び／又は配列番号１２２〜１２７いずれかの１又は２以上（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個いずれか）のＣＤＲを含んでなるキメラ抗体、又はその断片に関する。特に、本発明の好適な実施形態は、（ａ）配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号１２２、配列番号１２４からなる群から選択される配列と；（ｂ）配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１２６からなる群から選択される配列と；（ｃ）配列番号１０８とを含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。本発明の別の好適な実施形態は、（ａ）配列番号１１２及び配列番号１１４からなる群から選択される配列と；（ｂ）配列番号１１６及び配列番号１１８からなる群から選択される配列と；（ｃ）配列番号１１９とを含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。一実施形態によれば、これらポリヌクレオチドのどれも、融合ポリペプチドをコードする。本発明の別の態様によれば、これらポリヌクレオチド配列のどれか、又は全てを本発明から除外し得る。
別の実施形態によれば、抗原結合分子は、配列番号１又は配列番号２によってコードされるラットＩＣＲ６２抗体又はその変異体のＶＨドメインと、非マウスのポリペプチドとを含んでなる。本発明の別の好適な実施形態は、配列番号４３又は配列番号４４によってコードされるラット抗体又はその変異体のＶＬドメインと、非マウスのポリペプチドとを含んでなる抗原結合分子に関する。本発明の別の態様によれば、これらポリヌクレオチド配列のどれか、又は全てを本発明から除外し得る。
本発明の別の特徴は、ＩＣＲ６２の１又は２以上（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個いずれか）の切断されたＣＤＲ又は変異体ＣＤＲを含んでなる抗原結合分子に関する。かかる切断されたＣＤＲ又は変異体ＣＤＲは、所定のＣＤＲに関する特異性決定アミノ酸残基を少なくとも含有することになろう。「特異性決定残基」とは、抗原との相互作用に直接関与する残基を意味する。一般に、所定のＣＤＲに含まれる残基の約１／５〜１／３だけが抗原への結合に関与する。特定のＣＤＲ中の特異性決定残基は、例えばPadlan他、FASEB J.、第9巻(1)、133〜139ページ、1995年（その全内容が参考として本明細書に含まれているものとする）に記載されている方法に従って三次元モデルから原子間接触を計算し、所定の残基位置において配列が変化する可能性を明らかにすることによって特定できる。したがって本明細書全体で言及する本発明の抗原結合分子（ＡＢＭ）には、例えば１又は２以上の特異性決定残基を含む切断されたＣＤＲ及び／又は変異体ＣＤＲを含んでなるＡＢＭ、又は参照ＣＤＲ（例えばラットＩＣＲ６２のＣＤＲ）と比べてＣＤＲ内の１又は２以上の位置に置換を有するＡＢＭも含まれるものとする。
したがって本発明は、ラットＩＣＲ６２抗体の少なくとも１つの（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個いずれかの）相補性決定領域を含んでなるか、その相補性決定領域の少なくとも特異性決定残基を含有する変異体又はその切断形態を含んでなり、融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。単離されたかかるポリヌクレオチドは、抗原結合分子である融合ポリペプチドをコードすることが好ましい。一実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、ラットＩＣＲ６２抗体の３つの相補性決定領域を含んでなるか、その３つの相補性決定領域それぞれの少なくとも特異性決定残基を含有する変異体又はその切断形態を含んでなる。一実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、以下の表２〜表５に記載したＣＤＲのうちの少なくとも１つを含んでなる。別の実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、キメラ（例えばヒト化）抗体の軽鎖又は重鎖の全可変領域をコードする。さらに、本発明は、かかるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。
別の実施形態によれば、ラットＩＣＲ６２抗体の少なくとも１つの（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個いずれかの）相補性決定領域か、その相補性決定領域の少なくとも特異性決定残基（ＳＤＲ）を含有する変異体又はその切断形態と、異種ポリペプチドに由来する配列とを含んでなる抗原結合分子に関する。一実施形態によれば、その抗原結合分子は、ラットＩＣＲ６２抗体の３つの相補性決定領域を含んでなるか、その３つの相補性決定領域それぞれの少なくとも特異性決定残基を含有する変異体又はその切断形態を含んでなる。一実施形態によれば、その抗原結合分子は、以下の表２〜表５に記載したＣＤＲのうちの少なくとも１つを含んでなる。別の態様によれば、以下の表２〜表５に記載したＣＤＲ配列のどれか、又は全てを本発明から除外し得る。
一実施形態によれば、抗原結合分子は、ＩＣＲ６２抗体のＣＤＲのＳＤＲのうちの少なくとも１つを含んでなる。一実施形態によれば、本発明によるＡＢＭの１又は２以上のＣＤＲは、１又は２以上のアミノ酸位置に置換を含んでおり、このＡＢＭは、未置換のＡＢＭと比べて結合活性を保持している。結合活性は、本明細書に記載したようにして測定することや、従来技術でよく知られた一般的な方法によって測定することができる。いくつかの実施形態によれば、置換されたＡＢＭの結合に関するＥＣ50濃度は、未置換のＡＢＭと比べて約１０〜約０．００１倍未満に変化する。特別な実施形態によれば、ＥＣ50濃度は、未置換のＡＢＭと比べて１０〜約１倍未満、約１０〜約５倍未満、約５〜約０．１倍未満、約５〜約２倍未満、約３〜約１倍未満に変化する。特別な実施形態によれば、置換された抗体のＥＣ50濃度は、未置換のＡＢＭと比べて約１０倍未満、約９倍未満、約８倍未満、約７倍未満、約６倍未満、約５倍未満、約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１倍未満、約０．５倍未満、約０．２５倍未満、約０．１倍未満、約０．０５倍未満、約０．０２５倍未満、約０.０１倍未満に変化する。特定の実施形態によれば、ＥＣ50濃度は、約１０倍未満に変化する。別の実施形態によれば、ＥＣ50因子は、約１０倍、約９倍、約８倍、約７倍、約６倍、約５倍、約４倍、約３倍、約２倍、約１倍、約０．５倍、約０．２５倍、約０．１倍、約０．０５倍、約０．０２５倍、約０．０１倍に変化する。いくつかの実施形態によれば、変化はＥＣ50の低下である。別の実施形態によれば、変化はＥＣ50の増加である。
本発明によるＡＢＭのＣＤＲは、任意の残基位置に置換を含むことができる（Chothia又はKabatによるか、ＣＤＲに関して本明細書に記載した他の任意の定義、又は当業者に公知の他の任意の定義による）。一実施形態によれば、ＣＤＲは、１又は２以上の特異性決定残基以外の任意の位置又はあらゆる位置に置換を有する。特定の実施形態によれば、ＣＤＲは、特異性決定残基以外のあらゆる位置に置換を有する。一実施形態によれば、本発明の重鎖ＣＤＲは、Kabat２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、５２位、５２ａ位、５３位、５４位、５５位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、９４位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１００ａ位、１０１位、１０２位のうちの１又は２以上の位置、又はこれらの位置の任意の組み合わせに置換を有する。別の実施形態によれば、ＣＤＲは、Chothia重鎖ＣＤＲ１のKabat２７位、２８位、２９位、Kabat重鎖ＣＤＲ１のKabat３１位、Kabat重鎖ＣＤＲ２のKabat５２位、５２ａ位、５３位、５７位、Kabat重鎖ＣＤＲ３のKabat１０２位のうちの１又は２以上に置換を有する。
一実施形態によれば、軽鎖ＣＤＲは、Kabat２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位のうちの１又は２以上の位置、又はこれらの位置の任意の組み合わせに置換を有する。別の実施形態によれば、ＣＤＲは、Kabat軽鎖ＣＤＲ１のKabat３０位、３２位、Kabat軽鎖ＣＤＲ２のKabat５１位、５２位、５３位、５６位、Kabat重鎖ＣＤＲ３のKabat９４位のうちの１又は２以上に置換を有する。
別の態様によれば、本発明のＡＢＭは、ラットＩＣＲ６２抗体の少なくとも１つの相補性決定領域の少なくとも１つの特異性決定残基を含んでなる。いくつかの実施形態によれば、ＡＢＭは、重鎖ＣＤＲの特異性決定残基を含んでなる。より特別な実施形態によれば、重鎖特異性決定残基の選択は、Kabat２９位のフェニルアラニン、Kabat５２位のアスパラギン、Kabat５６位のチロシン、Kabat１００ｂ位のバリンからなる群の中からなされる。特定の実施形態によれば、特異性決定残基は、Kabat５６位のチロシンとKabat１００ｂ位のバリンである。別の特定の実施形態によれば、特異性決定残基は、Kabat２９位のフェニルアラニン、Kabat５２位のアスパラギン、Kabat５６位のチロシン、Kabat１００ｂ位のバリンである。別の実施形態によれば、特異性決定残基は、軽鎖相補性決定領域にある。より特別な実施形態によれば、軽鎖特異性決定残基の選択は、Kabat３４位のアスパラギンと、Kabat５０位のアスパラギンからなる群の中からなされる。特定の実施形態によれば、特異性決定残基は、Kabat３４位のアスパラギンである。別の特定の実施形態によれば、特異性決定残基は、Kabat５０位のアスパラギンである。別の特定の実施形態によれば、特異性決定残基は、Kabat３４位のアスパラギンとKabat５０位のアスパラギンである。
別の態様によれば、抗原結合分子は、抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を含んでなる。特に有用な一実施形態によれば、抗原結合分子はキメラ抗体（例えばヒト化抗体）である。本発明は、かかる抗原結合分子を製造する方法と、それを利用した疾患を治療する方法にも関する。その疾患は、特に、ＥＧＦＲが発現する細胞増殖疾患、その中でも特に、ＥＧＦＲの発現が、同じタイプの細胞の正常な組織と比べて異常である（過剰発現している）疾患である。かかる疾患として、膀胱がん、脳腫瘍、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、直腸がん、前立腺がん、腎臓がん等がある。ＥＧＦＲの発現レベルは、当業者に公知の方法と、本明細書に記載した方法（例えば免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、リガンドの結合、キナーゼ活性等）によって調べることができる。
本発明は、インビボ又はインビトロでＥＧＦＲを発現している細胞を標的とする方法にも関する。ＥＧＦＲを発現している細胞は、治療（例えばＥＧＦＲを媒介としたシグナル伝達の遮断（例えばリガンドの結合阻止）によって、又はＥＧＦＲを発現している細胞を免疫系が破壊の標的とすることによって治療できる疾患の治療）を目的とした標的となる可能性がある。本発明の一実施形態は、対象内でＥＧＦＲを発現している細胞を標的とする方法であって、その対象に本発明のＡＢＭを含んでなる組成物を投与する工程を含んでなる方法に関する。ＥＧＦＲを発現している細胞は、診断（例えばその細胞のＥＧＦＲの発現が正常であるか異常であるかを判断すること）を目的とした標的となる可能性もある。したがって本発明は、ＥＧＦＲの存在、又はＥＧＦＲを発現している細胞を、インビボ又はインビトロで検出する方法にも関する。本発明に従ってＥＧＦＲの発現を検出する１つの方法は、ＡＢＭとＥＧＦＲの間の複合体の形成を可能にする条件下で、調べるサンプルを、場合によっては対照サンプルとともに、本発明のＡＢＭと接触させる工程を含んでなる。次に複合体の形成を（例えばＥＬＩＳＡや、当業者に公知の他の方法によって）検出する。対照サンプルを試験サンプルとともに用いる場合には、試験サンプルと対照サンプルを比較したときにＡＢＭ−ＥＧＦＲ複合体の形成に統計的に有意な差があれば、試験サンプル中にＥＧＦＲが存在していることを意味する。
Figure 2010500020
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いくつかの機構が、抗ＥＧＦＲ抗体の治療効果（例えばリガンド（例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α等）がＥＧＦＲに結合するのを阻止することで、シグナル伝達経路の活性化を阻止する）、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、増殖停止又は最終分化の誘導に関与していることが知られている。
ラットのモノクローナル抗体ＩＣＲ６２（ＩｇＧ２b）は、PCT公開番号WO 95/20045（その全内容は援用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。これはＥＧＦＲのＣエピトープに対するものであり、リガンドの結合を阻止し、ＥＧＦＲを発現している扁平細胞がんの増殖をインビトロで抑制することと、無胸腺マウスにおいて腫瘍の異種移植片の退縮を誘導することが見いだされた（WO 95/20045；Modjtahedi他、Br. J. Cancer、第73巻、228〜235ページ、1996年）。ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体を完全にマウスの抗体としてヒトに投与すると、１回だけの投与の後でさえ、何人かの患者でＨＡＲＡ反応が生じた（WO 95/20045；Modjtahedi他、Br. J. Cancer、第73巻、228〜235ページ、1996年）。
キメラ・マウス／ヒト抗体が以前から報告されている。例えばMorrison, S.L.他、PNAS、第11巻、6851〜6854ページ、1984年11月；ヨーロッパ特許出願公開第173494号；Boulianna, G.L.他、Nature、第312巻、642ページ、1984年12月；Neubeiger, M.S.他、Nature、第314巻、268ページ、1985年3月；ヨーロッパ特許出願公開第125023号；Tan他、J. Immunol.、第135巻、8564ページ、1985年11月；Sun, L.K.他、Hybridoma、第5巻(1)、517ページ、1986年；Sahagan他、J. Immunol.、第137巻、1066〜1074ページ、1986年を参照のこと。一般には、Muron、Nature、第312巻、597ページ、1984年12月；Dickson、Genetic Engineering News、第5巻(3)、1985年3月；Marx、Science、第229巻、455ページ、1985年8月；Morrison、Science、第229巻、1202〜1207ページ、1985年9月を参照のこと。IMC-C225（エルビタックス（登録商標）、イムクローン社）は、ＥＧＦＲに対するキメラ・モノクローナル抗体であり、マウス可変領域とヒト定常領域を有する（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年を参照のこと）。IMC-C225のマウス部分はM225に由来する。このM225は、ＥＧＦＲに結合することで、ＥＧＦによって誘導されるチロシンキナーゼ依存性リン酸化を抑制するとともに、ＥＧＦＲを過剰発現している腫瘍細胞系のアポトーシスを誘導することが見いだされた（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。しかしM225は、第１相の臨床試験でその抗体を用いて治療した患者にＨＡＭＡ反応を引き起こした。IMC-C225はインビボとインビトロでテストされてきており、多くのタイプの腫瘍（予後が悪い腫瘍を含む）で放射線療法及び化学療法と組み合わせて利用されてきた（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。しかしIMC-C225は、臨床試験においてIMC-C225抗体を投与された患者における毒性（例えばアレルギー反応や皮膚反応）と関係づけられてきた（HerbstとShin、Cancer、第94巻、1593〜1611ページ、2002年）。
特に好適な実施形態によれば、本発明のキメラＡＢＭはヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当業者に公知の。例えば本発明のヒト化ＡＢＭは、Winterの米国特許第5,225,539号、Queenらの米国特許第6,180,370号、Adairらの米国特許第6,632,927号、Footeの米国特許出願公開第2003/0039649号の方法に従って調製することができる（これら特許文献の全内容は援用により本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体には非ヒト供給源からの１又は２以上のアミノ酸残基が導入されていることが好ましい。その非ヒト・アミノ酸残基は、一般に「輸入」可変領域から取られ、「輸入」残基と呼ばれることがしばしばある。ヒト化は、本質的に、Winterとその共同研究者の方法に従って超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって実施できる（Jones他、Nature、第321巻、522〜525ページ、1986年；Riechmann他、Nature、第332巻、323〜327ページ、1988年；Verhoeyen他、Science、第239巻、1534〜1536ページ、1988年）。したがってかかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号）、実質的に完全ではないヒト可変領域が、非ヒト種からの対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、一般に、いくつかの超可変領域とおそらくはいくつかのＦＲ残基とが、マウス抗体の似た部位からの残基で置換されたヒト抗体である。問題のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含むことになろう。
抗原性を減らすには、ヒト化抗体を作るのに用いる軽鎖と重鎖両方のヒト可変領域の選択が非常に重要である。いわゆる「最適フィット」法によれば、マウス抗体の可変領域の配列を、既知のヒト可変領域の配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。マウス配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒト・フレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる（Sims他、J. Immunol.、第151巻、2296ページ、1993年；Chothia他、J. Mol. Biol.、第196巻、901ページ、1987年）。ヒト・フレームワーク配列を選択する別の方法は、マウス完全フレームワークの個々の下部領域（すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）又は個々の下部領域のなんらかの組み合わせ（例えばＦＲ１とＦＲ２）の配列を、（例えばKabat番号付けによって決まる）そのフレームワーク下部領域に対応する既知のヒト可変領域の配列のライブラリと比較し、それぞれの下部領域又は組み合わせについて、マウス配列に最も近いヒト配列を選択するというものである（Leung、2003年2月27日に公開された米国特許出願公開第2003/0040606A1）（その全内容は援用により本明細書に組み込まれる）。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定の部分集合の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特別なフレームワーク領域を利用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体で使用することができる（Carter他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、4285ページ、1992年；Presta他、J. Immunol.、第151巻、2623ページ、1993年）（そのそれぞれの全内容は援用により本明細書に組み込まれる）。
抗原に対する大きな親和性と他の有利な生物学的特性を保持したまま抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するため、好ましい１つの方法では、親配列とヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列と様々な想像上のヒト化産物を分析することによってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリン・モデルは当業者は馴染みのあるいろいろなコンピュータ・プログラムを用いて作り出すことができる（例えばInsightII、アクセルリス社（以前のMSI社）又はhttp://swissmodel.expasy.org）。これらコンピュータ・プログラムは、選択された候補免疫グロブリン配列の確からしい三次元コンフォメーション構造を描いて表示することができる。その表示されたものを調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の確からしい役割を分析すること、すなわち候補免疫グロブリンが抗原に結合する能力に影響を与える残基を分析することができる。このようにして、ＦＲ残基をレシピエント配列及び輸入配列から選択して組み合わせ、抗体の望ましい性質（例えば標的抗原に対する親和性の増加）を実現する。一般に、超可変領域の残基が、抗原の結合に直接的に、そして最も実質的に関与する。
一実施形態によれば、本発明の抗体は、ヒトＦｃ領域を含んでいる。特定の実施形態によれば、ヒト定常領域は、以下の配列番号１０９と１１０に示したＩｇＧ１である。
ＩｇＧ１ヌクレオチド配列（配列番号１１０）
Figure 2010500020
ＩｇＧ１アミノ酸配列（配列番号１０９）
Figure 2010500020
しかしヒトＦｃ領域の変異体とアイソフォームも本発明に含まれる。例えば本発明で用いるのに適した変異したＦｃ領域は、Prestaの米国特許第6,７３７，０５６号（１又は２以上のアミノ酸が変化したためにエフェクター機能が変化したＦｃ領域変異体）；又は米国特許出願第６０／４３９，４９８号、第６０／４５６，０４１号、第６０／５１４，５４９号、ＷＯ ２００４／０６３３５１（アミノ酸が変化したために結合親和性が増大した、変異したＦｃ領域）；又は米国特許出願第１０／６７２，２８０号、ＷＯ ２００４／０９９２４９（アミノ酸が変化したためにＦｃγＲに対する結合が変化したＦｃ変異体）に教示されている方法に従って作り出すことができる（各特許文献の全内容は援用により本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態によれば、本発明の抗原結合分子は、例えばBalintらの米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（その全内容は援用により本明細書に組み込まれる）に開示されている方法に従って操作されて結合親和性が増大する。
一実施形態によれば、本発明の抗原結合分子は、付加部分（例えば放射性標識や毒素）と共役にされる。かかる共役したＡＢＭは、従来技術でよく知られている多数の方法で作り出すことができる。
多彩な放射性核種を本発明に適用することができ、この分野の当業者は、どの放射性核種が様々な状況下でもっとも適切であるかを容易に判断する能力を有すると考えられる。例えば131ヨウ素は、標的免疫療法で用いられるよく知られた放射性核種である。しかし131ヨウ素の臨床での有用性はいくつかの因子によって制限される可能性がある。その因子とは、物理的半減期が８日であること；血液中と腫瘍部位の両方でヨウ素化された抗体が脱ハロゲン化すること；腫瘍の中に局所的に投与量を留置するには最適ではない放射特性（例えば大きなγ成分）を持つことである。より優れたキレート剤が出現してタンパク質に金属キレート基を結合させ得るようになったため、111インジウムや90イットリウムといった他の放射性核種を用いる機会が増大した。90イットリウムは放射性免疫療法の用途で用いる上でいくつかの利点がある。その利点とは、90イットリウムの６４時間という半減期は、腫瘍に抗体を蓄積させるのに十分に長いこと、そして131ヨウ素とは異なり、90イットリウムは高エネルギーの純粋なβ放射体であり、崩壊時にγ線の放射がなく、範囲が組織内の１００個〜１０００個の細胞の直径であることである。さらに、侵入する最少量の放射線により、90イットリウムで標識した抗体を外来患者に投与することができる。それに加え、細胞を殺す上で標識した抗体の内部が必要とされず、イオン化放射線の局所的放射は、標的抗原が欠如している隣接した腫瘍細胞にとって致命的であるはずである。
抗ＥＧＦＲ抗体を標識した90イットリウムの１回の治療での有効な線量（すなわち治療に有効な量）は、約５〜約７５ｍＣｉの範囲であり、約１０〜約４０ｍＣｉがより好ましい。抗ＥＧＦＲ抗体を標識した131ヨウ素が骨髄を破壊しない１回の治療での有効な線量は、約５〜約７０ｍＣｉの範囲であり、約５〜約４０ｍＣｉがより好ましい。抗ＥＧＦＲ抗体を標識した131ヨウ素の１回の治療で有効な破壊線量（すなわち自己骨髄移植を必要とする可能性がある）は、約３０〜約６００ｍＣｉであり、約５０〜約５００ｍＣｉ未満がより好ましい。キメラ抗ＥＧＦＲ抗体に関しては、マウス抗体よりも循環半減期が長いため、キメラ抗ＥＧＦＲ抗体を標識した131ヨウ素が骨髄を破壊しない１回の治療での有効な線量は、約５〜約４０ｍＣｉの範囲であり、約３０ｍＣｉ未満がより好ましい。例えば111インジウム標識のイメージングの臨界値は一般に約５ｍＣｉ未満である。
放射性標識をした抗ＥＧＦＲ抗体に関しては、それを用いた１回だけの治療、又は多数回の治療も可能である。放射性核種成分であるため、照射の結果として骨髄が致命的な損傷を受ける可能性のある患者のために治療前に末梢幹細胞（「ＰＳＣ」）又は骨髄（「ＢＭ」）を「回収」することが好ましい。ＢＭ及び／又はＰＳＣは、標準的な方法を利用して回収した後、再び注入するときのためにパージし、凍結させる。それに加え、治療前に、診断用に標識した抗体（例えば111インジウムを用いる）を用いて診断用の線量測定調査を患者に対して実施することが非常に好ましい。その目的は、治療用の標識した抗体（例えば90イットリウムを用いる）が、正常な器官又は組織に不必要に「濃縮される」ことがないことを確認するためである。
本発明の好適な実施形態は、以下の表７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。本発明の好適な実施形態は、以下の表６に示した配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、以下の表６に示したヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％一致する配列を含んでなる単離された核酸に関する。別の態様によれば、表６のヌクレオチド配列のどれかを本発明から除外し得る。本発明の別の実施形態は、表７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離された核酸に関する。本発明には、表７に示した任意の構造体のアミノ酸配列に保存されたアミノ酸置換があるポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離された核酸も含まれる。本発明には、表７に示した任意の構造体のアミノ酸配列を含んでなる単離ポリペプチドも含まれる。本発明には、表７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％一致するアミノ酸配列を含んでなる単離ポリペプチドも含まれる。本発明には、表７に示した任意の構造体のアミノ酸配列に保存されたアミノ酸置換があるアミノ酸配列を含んでなる単離ポリペプチドも含まれる。別の態様によれば、表７のアミノ酸配列のどれかを本発明から除外し得る。
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本発明では、非ヒト・アミノ酸残基が１０個未満の軽鎖可変領域とペアになったＥＧＦＲ特異的ＣＤＲを含むキメラ（例えばヒト化）重鎖可変領域を含んでなる抗原結合分子も考える。別の実施形態によれば、軽鎖可変領域は、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、１個未満の非ヒト・アミノ酸残基を有する。好ましい実施形態によれば、軽鎖可変領域は、２個又は１個未満（すなわち０個）の非ヒト・アミノ酸残基を有する。一実施形態によれば、軽鎖可変領域は、１又は２以上のヒト生殖系列可変領域遺伝子配列を含んでなる。軽鎖可変領域をコードするヒト生殖系列可変領域遺伝子配列は従来技術で知られており、例えばhttp://imgt.cines.fr/home.htmlで入手可能なIMGTデータベースに見いだすことができる。好適な実施形態によれば、ヒト生殖系列配列は、ＶＫ１ ６生殖系列配列に由来する。別の実施形態によれば、ヒト生殖系列軽鎖可変領域遺伝子配列中のアミノ酸残基は、他のヒト生殖系列軽鎖可変領域配列の１又は２以上の残基で置換することができる。
本発明の別の実施形態は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号１２１からなる群から選択される配列と、１又は２以上のヒト生殖系列可変遺伝子配列によってコードされるポリペプチドを含む軽鎖とを含んでなる抗原結合分子に関する。好適な実施形態によれば、ヒト生殖系列配列は、ＶＫ１ ６生殖系列配列に由来する。
本発明の別の実施形態は、（ａ）配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号１２２、配列番号１２４からなる群から選択される配列と；（ｂ）配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１２６からなる群から選択される配列と；（ｃ）配列番号１０８と；（ｄ）１又は２以上のヒト生殖系列遺伝子配列によってコードされるヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドを含んでなる抗原結合分子に関する。特定の実施形態によれば、ヒト生殖系列配列は、ＶＫ１ ６生殖系列配列に由来する。別の実施形態によれば、ヒト生殖系列可変領域遺伝子配列は、異なるヒト生殖系列軽鎖可変領域遺伝子配列からの配列で１又は２以上のアミノ酸コドンが置換されたＶＫ１ ６生殖系列遺伝子配列を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗原結合分子は、本発明のＥＧＦＲ特異的重鎖可変領域と、配列番号４５の変異体とを含んでなる。一実施形態によれば、配列番号４５の変異体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の１又は２以上の位置にアミノ酸置換を有する。特別な実施形態によれば、置換は、配列番号４５の３０位のアミノ酸、配列番号４５の３２位のアミノ酸、配列番号４５の３４位のアミノ酸、配列番号４５の５０位のアミノ酸、配列番号４５の５１位のアミノ酸、配列番号４５の５２位のアミノ酸、配列番号４５の５３位のアミノ酸、配列番号４５の５６位のアミノ酸、配列番号４５の９４位のアミノ酸からなる群から選択した位置におけるアミノ酸残基の置換と、これら置換の任意の組み合わせである。より特別な実施形態によれば、配列番号４５の置換の選択は、配列番号４５の３０位に位置するアルギニン（R）のアスパラギン（N）による置換；配列番号４５の３２位に位置するトリプロファン（W）のチロシン（Y）による置換；配列番号４５の３４位に位置するグリシン（G）のアスパラギン（N）による置換；配列番号４５の５０位に位置するトレオニン（T）のアスパラギン（N）による置換；配列番号４５の５１位に位置するアラニン（A）のトレオニン（T）による置換；配列番号４５の５２位に位置するセリン（S）のアスパラギン（N）による置換；配列番号４５の５３位に位置するセリン（S）のアスパラギン（N）による置換；配列番号４５の５６位に位置するセリン（S）のトレオニン（T）による置換；配列番号４５の９４位に位置するチロシン（Y）のフェニルアラニン（F）による置換；ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群の中からなされる。特定の実施形態によれば、配列番号４５におけるアミノ酸のこれら置換の全てが単一の軽鎖変異体の中に組み込まれている。好ましい実施形態によれば、ＩＣＲ６２のＣＤＲにアミノ酸置換を有する軽鎖変異体を含んでなる抗原結合分子は、その軽鎖変異体を、本発明の重鎖可変領域を含んでなるポリペプチドとペアにするとき、（配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域を含んでなる抗原結合分子と比べて）ＥＧＦＲに対する結合特異性を保持している。本発明は、上記のポリペプチド及び／又は抗原結合分子のどれかをコードするポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含んでなる宿主細胞及び／又はベクターにも関する。さらに、本発明は、医薬的に許容し得る担体を伴った上記の抗原結合分子に関する。
本発明では、ＥＧＦＲ特異的ＣＤＲを含むヒト重鎖可変領域を含んでなる抗原結合分子であって、その重鎖可変領域が１０個未満の非ヒト・アミノ酸残基を有することと、ＥＧＦＲに特異的に結合することを特徴とする抗原結合分子も考える。別の実施形態によれば、重鎖可変領域は、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、１個未満の非ヒト・アミノ酸残基を有する。好ましい実施形態によれば、軽鎖可変領域は、５個未満の非ヒト・アミノ酸残基を有する。一実施形態によれば、重鎖可変領域は、１又は２以上のヒト生殖系列可変領域遺伝子配列を含んでなる。重鎖可変領域をコードするヒト生殖系列可変領域遺伝子配列は従来技術で知られており、例えばhttp:imgt.cines.fr/home.htmlで入手できるIMGTデータベースに見いだすことができる。一実施形態によれば、ヒト生殖系列配列は、ＶＨ１ １０生殖系列配列に由来する。別の実施形態によれば、ヒト生殖系列重鎖可変領域のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は、別のヒト生殖系列重鎖可変領域配列からの１又は２以上の残基で置換することができる。好ましい実施形態によれば、ＩＣＲ６２重鎖ＣＤＲにアミノ酸置換がある重鎖変異体を含んでなる抗原結合分子は、その重鎖変異体を、ＥＧＦＲに結合する軽鎖可変領域（例えば本発明の軽鎖可変領域）を含んでなるポリペプチドとペアにするときにＥＧＦＲに対する結合特異性を保持している。本発明は、上記のポリペプチド及び／又は抗原結合分子のどれかをコードするポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含んでなる宿主細胞及び／又はベクターにも関する。さらに、本発明は、医薬的に許容し得る担体を伴った上記の抗原結合分子に関する。
本発明の別の実施形態は、本発明の単離された１種類以上のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター及び／又は宿主細胞に関する。
一般に、あらゆるタイプの培養細胞系列を用いて本発明のＡＢＭを発現させ得る。好適な実施形態によれば、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物の細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞を背景細胞系列として用いて本発明の遺伝子操作された宿主細胞を生成させる。
本発明のＡＢＭの治療効果は、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに発現する宿主細胞の中でそのＡＢＭを産生させることによって増大させ得る。好適な実施形態によれば、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは、ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなる融合ポリペプチドである。別の好適な実施形態によれば、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞の中で本発明のＡＢＭを発現させることで、増加したＦｃ受容体結合親和性と増加したエフェクター機能を得る。したがって本発明の一実施形態は、（ａ）ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離された核酸と；（ｂ）本発明のＡＢＭ（例えばヒトＥＧＦＲに結合するキメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体）をコードする単離ポリヌクレオチドとを含んでなる宿主細胞に関する。好適な実施形態によれば、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴIIIの触媒ドメインを含んでなる融合ポリペプチドであり、ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼIIの局在ドメインである。かかる融合ポリペプチドを産生させる方法と、それを用いてエフェクター機能が増加した抗体を産生させる方法は、米国仮特許出願第60/495,142号と米国特許出願公開第2004/0241817 A1号（それぞれの全内容は参考として本明細書に明示的に組み込まれているものとする）に開示されている。別の好適な実施形態によれば、キメラＡＢＭは、ラットＩＣＲ６２抗体の結合特異性を有するキメラ抗体又はその断片である。特に好ましい実施形態によれば、キメラ抗体はヒトＦｃを含んでなる。別の好適な実施形態によれば、抗体は霊長類化又はヒト化されている。
一実施形態によれば、本発明のＡＢＭをコードする１つ又はいくつかのポリヌクレオチドは、構成的プロモータ又は調節された発現系の制御下で発現させ得る。適切に調節された発現系として、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導発現系、ｌａｃ−スイッチ発現系、グルココルチコイド誘導発現系、温度誘導プロモータ系、メタロチオネイン金属誘導発現系等があるが、これだけに限定されるわけではない。本発明のＡＢＭをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系に含まれている場合には、そのうちのいくつかの核酸を構成的プロモータの制御下で発現させることができ、他の核酸は調節されたプロモータの制御下で発現する。最大発現レベルは、細胞増殖速度に対して顕著なマイナス効果を持たない安定なポリペプチドの可能な最大発現レベルであると考えられ、定型的な実験を利用して決定されよう。発現レベルは、従来技術で一般に知られている方法によって明らかにされる。方法としては、ＡＢＭに対して特異的な抗体又はＡＢＭに融合させたペプチド・タグに対して特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析や、ノーザン・ブロット分析等がある。さらに別の方法として、ポリヌクレオチドをレポータ遺伝子と作動式に連結させ得る。ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラ（例えばヒト化）ＡＢＭの発現レベルは、レポータ遺伝子の発現レベルと相関する信号を測定することによって明らかにされる。レポータ遺伝子は、融合ポリペプチドをコードする核酸とともに単一のｍＲＮＡ分子として転写することができる。それぞれのコード配列は、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）又はキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）によってリンクさせ得る。レポータ遺伝子は、ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラ（例えばヒト化）ＡＢＭをコードする少なくとも１つの核酸とともに翻訳し、単一のポリペプチド鎖が形成されるようにすることができる。本発明のＡＢＭをコードする核酸を単一のプロモータの制御下でレポータ遺伝子と作動式に連結させ、融合ポリペプチドとレポータ遺伝子をコードする核酸がＲＮＡ分子の中に転写されるようにすることができる。そのＲＮＡ分子は、選択的スプライシングによって２つの別々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子になる。得られるｍＲＮＡの一方は翻訳されて上記レポータ・タンパク質になり、他方は翻訳されて上記融合ポリペプチドになる。
当業者によく知られた方法を利用し、ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を持つＡＢＭのコード配列と、適切な転写／翻訳制御信号とを含んでなる発現ベクターを構成することができる。そうした方法として、試験管内組換ＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組換／遺伝子組換等がある。例えば、Maniatis他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、1989年と、Ausbel他、『分子生物学における最新プロトコル』、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ＆ワイリー・インターサイエンス社、ニューヨーク、1989年に記載されている技術を参照のこと。
様々な宿主発現ベクター系を利用して本発明のＡＢＭのコード配列を発現させ得る。哺乳動物の細胞を宿主細胞系として用い、興味の対象となるタンパク質のコード配列と融合ポリペプチドのコード配列を含んでなる組換プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡの発現ベクターをトランスフェクトすることが好ましい。ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物の細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞を宿主細胞系として用いることが最も好ましい。発現系と選択法のいくつかの例が、以下の参考文献と、その中にある参考文献に記載されている：Borth他、Biotechnol. Bioen.、第71巻(4)、266〜273ページ、2000年〜2001年；Werner他、Arzneimittelforschung/Drug Res.、第48巻(8)、870〜880ページ、1998年；AndersenとKrummen、Curr. Op. Biotechnol.、第13巻、117〜123ページ、2002年；ChaddとChamow、Curr. Op. Biotechnol.、第12巻、188〜194ページ、2001年；Giddings、Curr. Op. Biotechnol.、第12巻、450〜454ページ、2001年。別の実施形態によれば、他の真核宿主細胞系を使用することができる。その例として、本発明のＡＢＭのコード配列を有する組換酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母細胞（米国特許出願第60/344,169号とWO 03/056914（非ヒト真核宿主細胞の中でヒト様糖タンパク質を産生させる方法）に教示されている発現系等（それぞれの全内容は援用により本明細書に組み込まれる））；ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラＡＢＭのコード配列を有する組換ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系、又は本発明のＡＢＭのコード配列を有する組換プラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系（発現ベクターとしては、米国特許第6,815,184号（遺伝子操作されたウキクサからの生物学的に活性なポリペプチドの発現法と分泌法）；WO 2004/057002（グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の導入によるコケ植物細胞におけるグリコシル化タンパク質の産生）とWO 2004/024927（コケのプロトプラストにおいて細胞外異種非植物タンパク質を作製する方法）；米国特許出願第60/365,769号、第60/368,047号、WO 2003/078614（機能性哺乳動物ＧｎＴIII酵素を含んでなるトランスジェニック植物における糖タンパク質のプロセシング）に教示されているもの等が挙げられる（それぞれの全内容は援用により本明細書に組み込まれる））；DM染色体の中で安定に増幅された（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）又は不安定に増幅されたラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラＡＢＭをコードするＤＮＡの多数のコピーを含有するように操作された細胞系列（例えばマウス細胞系列）を含む組換ウイルス発現ベクター（例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系がある。一実施形態によれば、本発明のＡＢＭをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、ポリシストロン性である。また、一実施形態によれば、上記のＡＢＭは、抗体又はその断片である。好適な実施形態によれば、ＡＢＭはヒト化抗体である。
本発明の方法に関しては、安定な発現が一時的な発現よりも一般に好ましい。なぜならそのほうがより再現性のある結果が得られるからであり、大スケールの生産がより容易だからでもある。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現制御エレメント（例えばプロモータ、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）によって制御されるそれぞれのコード核酸と選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を強化培地の中で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り換える。組換プラスミドに含まれる選択マーカーによって選択に対する耐性が与えられるため、プラスミドが染色体の中に安定に一体化されて増殖してフォーカスを形成した細胞を選択することができる。そのフォーカスが今度はクローニングされて細胞系列の中に広がることができる。
多数の選択系を使用することができる。例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler他、Cell、第11巻、223ページ、1977年）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（SzybalskaとSzybalski、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第48巻、2026ページ、1962年）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy他、Cell、第22巻、817ページ、1980年）をそれぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、ａｐｒｔ細胞で使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子を選択するためのベースとして利用すること（Wigler他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第77巻、3567ページ、1989年；O'Hare他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第78巻、1527ページ、1981年）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ遺伝子を選択するためのベースとして利用すること（MulliganとBerg、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第78巻、2072ページ、1981年）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子を選択するためのベースとして利用すること（Colberre-Garapin他、J. Mol. Biol.、第150巻、1ページ、1981年）；ハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ遺伝子を選択するためのベースとして利用すること（Santerre他、Gene、第30巻、147ページ、1984年）ができる。最近、追加の選択遺伝子、すなわち細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（HartmanとMulligan、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻、8047ページ、1988年）；グルタミンシンターゼ系；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（『分子生物学における最新の話題』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー編、1987年の中のMcConlogueの項）が報告された。
さらに、本発明は、宿主細胞によって産生される本発明のＡＢＭのグリコシル化プロファイルを変化させる方法であって、その宿主細胞の中で、本発明のＡＢＭをコードする核酸と、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする核酸とを発現させるか、かかる核酸を含んでなるベクターを発現させる工程を含んでなる方法に関する。変化したポリペプチドは、ＩｇＧ、又はＦｃ領域を含むその断片であることが好ましい。特に好適な実施形態によれば、ＡＢＭは、ヒト化抗体又はその断片である。別の実施形態によれば、この方法はさらに、宿主細胞の中で、第２のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程を含んでいる。特定の実施形態によれば、第２のグリコシルトランスフェラーゼ活性はマンノシダーゼII（ＭａｎII）である。
本発明の宿主細胞によって産生される変化したＡＢＭは、変化した結果として、増加したＦｃ受容体結合親和性及び／又は増加したエフェクター機能を示す。特に好適な実施形態によれば、ＡＢＭは、ヒト化抗体、又はＦｃ領域を含むその断片である。増加したＦｃ受容体結合親和性は、Ｆｃγ活性化受容体（例えばＦｃγＲIIIａ受容体）に対する増加した活性であることが好ましい。増加したエフェクター機能は、以下に示す事柄のうちの１又は２以上であることが好ましい：抗体依存性細胞毒性の増加、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカインの分泌の増加、免疫複合体を媒介とした抗原提示細胞による抗原の取り込みの増加、Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞（PMN）への結合の増加、単球への結合の増加、標的に結合する抗体の架橋の増加、直接的なシグナル伝達によって誘導されるアポトーシスの増加、樹状細胞の成熟の増加、Ｔ細胞のプライミングの増加。
本発明は、変化したオリゴ糖を有する本発明のＡＢＭを宿主細胞の中で産生させる方法であって、（ａ）ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を、本発明のＡＢＭの産生を可能にするとともに、ＧｎＴIII活性を有するそのポリペプチドが十分に発現することで宿主細胞によって産生されるそのＡＢＭのＦｃ領域に存在するオリゴ糖を変化させることが可能である条件下で培養し；（ｂ）そのＡＢＭを単離する工程を含んでなるにも関する。好適な実施形態によれば、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴIIIの触媒ドメインを含んでなる融合ポリペプチドである。特に好適な実施形態によれば、融合ポリペプチドはらに、ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでいる。
ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼII又はＧｎＴＩの局在ドメインであることが好ましい。或いはゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼIの局在ドメイン、ＧｎＴIIの局在ドメイン、α１−６コア・フコシルトランスフェラーゼの局在ドメインからなる群から選択される。本発明の方法によって産生されるＡＢＭは、増加したＦｃ結合親和性及び／又は増加したエフェクター機能を有する。増加したエフェクター機能は、以下に示す事柄のうちの１又は２以上であることが好ましい：Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加（抗体依存性細胞毒性の増加を含む）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカインの分泌の増加、免疫複合体を媒介とした抗原提示細胞による抗原の取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的なシグナル伝達によって誘導されるアポトーシスの増加、標的に結合する抗体の架橋の増加、樹状細胞の成熟の増加、Ｔ細胞のプライミングの増加。増加したＦｃ結合親和性は、Ｆｃγ活性化受容体（例えばＦｃγＲIIIａ受容体）に対する結合の増加であることが好ましい。特に好適な実施形態によれば、ＡＢＭは、ヒト化抗体又はその断片である。
本発明の別の実施形態は、ラットＩＣＲ６２と実質的に同じ結合特異性を持っていて、ポリペプチドのＦｃ領域に含まれる切断オリゴ糖の割合が増加した、本発明の方法で産生されたキメラＡＢＭに関する。かかるＡＢＭには、ヒト化抗体、又はＦｃ領域を含むその断片が含まれると考えられる。好適な実施形態によれば、ＡＢＭはヒト化抗体である。一実施形態によれば、ＡＢＭのＦｃ領域に含まれる切断オリゴ糖の割合は全オリゴ糖の少なくとも５０％であり、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％のいずれかであり、最も好ましくは少なくとも９０〜９５％である。さらに別の実施形態によれば、本発明の方法で産生されたＡＢＭは、本発明の方法によってオリゴ糖が変化した結果として、Ｆｃ領域に含まれるフコシル化されていないオリゴ糖の割合が増加している。一実施形態によれば、非フコシル化オリゴ糖の割合は少なくとも５０％であり、より好ましくは少なくとも６０％〜７０％であり、少なくとも７５％であることが最も好ましい。非フコシル化オリゴ糖は、混成体又は複合体のタイプが可能である。特に好適な実施形態によれば、宿主細胞と本発明の方法によって産生されたＡＢＭは、Ｆｃ領域に含まれる切断非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。切断非フコシル化オリゴ糖は、混成体又は複合体が可能である。特に、本発明の方法を利用し、ＡＢＭのＦｃ領域に含まれるオリゴ糖の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％が切断非フコシル化ＡＢＭを産生させ得る。本発明の方法を利用し、ポリペプチドのＦｃ領域に含まれるオリゴ糖の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％が切断非フコシル化ポリペプチドを産生させることもできる。
本発明の別の実施形態は、ラットＩＣＲ６２と実質的に同じ結合特異性を持っていて、増加したエフェクター機能及び／又は増加したＦｃ結合親和性を持つように操作された、本発明の方法によって産生されるキメラＡＢＭに関する。増加したエフェクター機能は、以下に示す事柄のうちの１又は２以上であることが好ましい：Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加（抗体依存性細胞毒性の増加を含む）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカインの分泌の増加、免疫複合体を媒介とした抗原提示細胞による抗原の取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的なシグナル伝達によって誘導されるアポトーシスの増加、標的に結合する抗体の架橋の増加、樹状細胞の成熟の増加、Ｔ細胞のプライミングの増加。好適な実施形態によれば、増加したＦｃ結合親和性は、Ｆｃ活性化受容体（ＦｃγＲIIIａが最も好ましい）への結合の増加である。一実施形態によれば、ＡＢＭは、抗体、又はＦｃ領域を含む抗体断片、又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等な領域を含む融合タンパク質である。特に好適な実施形態によれば、ＡＢＭはヒト化抗体である。
さらに、本発明は、本発明のＡＢＭと、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
さらに、本発明は、がんの治療法におけるかかる医薬組成物の利用に関する。より詳細には、本発明は、がんの治療法であって、本発明の医薬組成物の治療に有効な量を投与する工程を含んでなる方法に関する。
本発明によりさらに、増加したＦｃ結合親和性（Ｆｃ活性化受容体への結合の増加であることが好ましい）及び／又は増加したエフェクター機能（抗体依存性細胞毒性が含まれる）を有する本発明のＡＢＭの糖形態を産生させるための宿主細胞系の生成法と利用法が提供される。本発明のＡＢＭで利用できる糖改変の方法がより詳しく記載されているのは、米国特許第6,602,684号、米国特許出願公開第2004/0241817 A1号、第2003/0175884 A1号、米国特許仮出願第60/441,307号、WO 2004/065540である（これらの全内容は援用により本明細書に組み込まれる）。本発明のＡＢＭは、米国特許出願公開第2003/0157108号（ジェネンテック社）又はヨーロッパ特許第1 176 195 A1号、WO 03/084570、WO 03/085119、米国特許出願公開第2003/0115614号、第2004/093621号、第2004/110282号、第2004/110704号、第2004/132140号（協和社）に開示されている技術に従ってＦｃ領域に含まれるフコース残基が減るように糖改変することもできる。これら特許文献のそれぞれの内容は、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。本発明の糖改変されたＡＢＭは、米国特許仮出願第60/344,169号とWO 03/056914（グライコファイ社）又はWO 2004/057002とWO 2004/024927（グリーノヴェーション社）に教示されているように、変化した糖タンパク質を産生する発現系の中で産生させることもできる。
グリコシル化パターンが変化したタンパク質を産生させるための細胞系列の生成
本発明により、グリコシル化パターンが変化した本発明のＡＢＭを生成させるための宿主細胞発現系が提供される。特に、本発明により、治療効果が改善された本発明のＡＢＭの糖形態を生成させるための宿主細胞系が提供される。したがって本発明により、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドを発現するように選択又は操作された宿主細胞発現系が提供される。一実施形態によれば、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドは、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなる融合ポリペプチドである。より詳細には、かかる宿主細胞発現系を操作し、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする組換核酸分子が構成的プロモータ系又は調節されたプロモータ系に作動式に連結した状態で含まれるようにできる。
本発明の特定の実施形態により、ＧｎＴIII活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように操作されていて、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなる宿主細胞が提供される。一の態様によれば、宿主細胞は、ＧｎＴIII活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むとともに、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなる核酸分子を用いて操作される。
別の実施形態によれば、宿主細胞は、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする核酸と、別のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の核酸とを発現するように操作されている。特定の実施形態によれば、第２の核酸は、マンノシダーゼ（ＭａｎII）活性を有するポリペプチドをコードする。
一般に、任意のタイプの培養された細胞系列（上記の細胞系列を含む）を背景として用いて本発明の宿主細胞系を操作することができる。好適な実施形態によれば、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物の細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞を背景細胞系列として使用して本発明の操作された宿主細胞が生成される。
本発明には、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチド（例えば本明細書に記載した異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなる融合ポリペプチド）を発現する操作された任意の宿主細胞が含まれると考えられる。
ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする１つ又はいくつかの核酸は、構成的プロモータ又は調節された発現系の制御下で発現させ得る。かかる系は従来技術でよく知られており、例えば上記の系が挙げられる。ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードしていて、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含んでなるいくつかの異なる核酸が宿主細胞系に含まれる場合には、そのうちのいくつかの核酸を構成的プロモータの制御下で発現させることができ、他の核酸は調節されたプロモータの制御下で発現する。ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドの発現レベルは、従来技術で一般に知られている方法（例えばウエスタンブロット分析、ノーザン・ブロット分析、レポータ遺伝子発現分析、ＧｎＴIII活性の測定）によって明らかにされる。或いはＧｎＴIIIの生合成産物と結合するレクチン（例えばＥ4−ＰＨＡレクチン）を使用できる。或いはＧｎＴIII活性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いて操作された細胞によって産生される抗体を媒介とした増加したＦｃ結合親和性又は増加したエフェクター機能を測定する機能アッセイを利用することもできる。
変化したグリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するトランスフェクタント又は形質転換体の同定
ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラ（例えばヒト化）ＡＢＭのコード配列を含有していて生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、以下の少なくとも４つの一般的な方法で同定することができる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在又は不在；（ｃ）宿主細胞に含まれるそれぞれのｍＲＮＡ転写産物の発現によって測定される転写レベルの評価；（ｄ）イムノアッセイ又は遺伝子産物の生物活性によって測定される遺伝子産物の検出。
第１の方法では、ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラ（例えばヒト化）ＡＢＭのコード配列とＧｎＴIII活性を有するポリペプチドのコード配列の存在を、それぞれのコード配列と相同なヌクレオチド配列、又はその一部、又はその誘導体を含んでなるプローブを用いてＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。
第２の方法では、組換発現ベクター／宿主系は、ある「マーカー」遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける封入体の形成等）の存在又は不在に基づいて同定又は選択することができる。例えばベクターのマーカー遺伝子配列の中に、本発明のＡＢＭ又はその断片のコード配列と、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドのコード配列とが挿入される場合には、それぞれのコード配列を有する組換体は、そのマーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。或いはマーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するのに用いる同じプロモータ又は異なるプロモータの制御下でそのコード配列とタンデムに配置することができる。誘導又は選択に応答したマーカーの発現は、本発明のＡＢＭのコード配列とＧｎＴIII活性を有するポリペプチドのコード配列の発現を意味する。
第３の方法では、本発明のＡＢＭのコード領域又はその断片と、ＧｎＴIII活性を有するポリペプチドのコード配列とについて転写活性をハイブリダイゼーション・アッセイによって評価することができる。例えばＲＮＡを単離し、本発明のＡＢＭのコード配列又はその断片及びＧｎＴIII活性を有するポリペプチドのコード配列又はその特定の部分と相同なプローブを用いてノーザン・ブロットによって分析することができる。或いは宿主細胞の全ての核酸を抽出し、かかるプローブへのハイブリダイゼーションを調べることができる。
第４の方法では、タンパク質産物の発現を免疫学的に評価することができる（例えばウエスタンブロット、イムノアッセイ（放射性免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等））。しかし発現系の成功に関する究極のテストは、生物学的に活性な遺伝子産物の検出が関係する。
抗体依存性細胞毒性を含む増加したエフェクター機能を有するＡＢＭの生成と利用
本発明の好ましい実施形態により、ラットＩＣＲ６２と実質的に同じ結合特異性を持っていて、増加したエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞毒性）を持つキメラ（例えばヒト化）ＡＢＭの糖形態が提供される。抗体のグリコシル化操作は以前に報告されている。例えば米国特許第6,602,684号を参照のこと（参考としてその全内容は本明細書に組み込まれているものとする）。
最近、いくつかのタイプのがんを治療するための非結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験から有望な結果が得られている。Dillman、Cancer Biother. & Radiopharm.、第12巻、223〜225ページ、1997年；Deo他、Immunology Today、第18巻、127ページ、1997年。キメラ非結合ＩｇＧ１が、軽度の、又は濾胞性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫に対して認可されている（Dillman、Cancer Biother. & Radiopharm.、第12巻、223〜225ページ、1997年）のに対し、別の非結合ｍＡｂである固形乳がんを標的としたヒト化ＩｇＧ１も第III相の臨床試験で有望な結果が見られている（Deo他、Immunology Today、第18巻、127ページ、1997年）。これら２つのｍＡｂの抗原はそれぞれの腫瘍細胞において高度に発現し、抗体は、試験管内とインビボでエフェクター細胞による腫瘍の強力な破壊を媒介する。逆に、腫瘍に対する特異性が優れた他の多くの非結合ｍＡｂは、十分なエフェクター機能を始動させることができないため臨床的に有用でない。Frost他、Cancer、第80巻、317〜333ページ、1997年；Surfus他、J. Immunother.、第19巻、184〜191ページ、1996年。これらの弱いｍＡｂのいくつかに関し、付加サイトカイン療法が現在テストされているところである。サイトカインの付加によって循環するリンパ球の活性と数を増大させることにより、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激することができる。Frost他、Cancer、第80巻、317〜333ページ、1997年；Surfus他、J. Immunother.、第19巻、184〜191ページ、1996年。リンパ球受容体が抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合すると、ＡＤＣＣにより抗体が標的とする細胞に対する溶解を開始させる。Deo他、Immunology Today、第18巻、127ページ、1997年。
非結合ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増大させるための別の相補的な１つの方法は、抗体のＦｃ領域を操作するというものである。タンパク質工学の研究から、ＦｃγRは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインの下部ヒンジ領域と相互作用することがわかった（Lund他、J. Immunol.、第157巻、4963〜4969ページ、1996年）。しかしＦｃγRの結合には、ＣＨ２ドメインの保存されたＡｓｎ２９７に共有結合するオリゴ糖の存在も必要とされる（Lund他、J. Immunol.、第157巻、4963〜4969ページ、1996年；WrightとMorrison、Trends Biotech、第15巻、26〜31ページ、1997年）。これは、オリゴ糖とポリペプチドの両方が相互作用部位に直接寄与するか、活性なＣＨ２ポリペプチドのコンフォメーションを維持するのにオリゴ糖が必要とされることを示唆している。したがってオリゴ糖構造の変化を、相互作用の親和性を大きくする手段として検討することができる。
ＩｇＧ分子は、２つのＮ結合型オリゴ糖をＦｃ領域のそれぞれの重鎖上に含んでいる。抗体は、糖タンパク質と同様、同じポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に結合したオリゴ糖が異なる糖形態の集団として産生される。通常は血清ＩｇＧのＦｃ領域に見いだされるオリゴ糖は二アンテナ・タイプの複合体であり（Wormald他、Biochemistry、第36巻、130〜138ページ、1997年）、末端シアル酸とbisecting Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が低レベルで、末端のガラクトシル化とコアのフコシル化の程度は様々である。いくつかの研究から、ＦｃγRの結合に最低限必要な炭水化物構造は、オリゴ糖コアの中にあることが示唆される（Lund他、J. Immunol.、第157巻、4963〜4969ページ、1996年）。
治療用の非結合ｍＡｂを産生させるために産学で利用されているマウス又はハムスターに由来する細胞系列は、通常、必要なオリゴ糖決定基をＦｃ部位に有する。しかしこれら細胞系列で発現するＩｇＧは、血清ＩｇＧに少量が見いだされるbisecting ＧｌｃＮＡｃを欠いている（Lifely他、Glycobiology、第318巻、813〜822ページ、1995年）。逆に、ラット骨髄腫によって産生されるヒト化ＩｇＧ１（キャンパス−１Ｈ）が、いくつかの糖形態ではbisecting ＧｌｃＮＡｃを有することが最近観察された（Lifely他、Glycobiology、第318巻、813〜822ページ、1995年）。ラット細胞に由来する抗体は、標準的な細胞系列の中で産生されるキャンパス−１H抗体とインビトロで同様の最大ＡＤＣＣ活性に到達したが、抗体濃度は著しく低かった。
キャンパス抗原は通常はリンパ腫細胞に高レベルで存在しており、このキメラｍＡｂは、bisecting ＧｌｃＮＡｃの不在下で大きなＡＤＣＣ活性を有する（Lifely他、Glycobiology、第318巻、813〜822ページ、1995年）。Ｎ結合型グリコシル化経路では、bisecting ＧｌｃＮＡｃがＧｎＴIIIによって付加される（Schacheter、Biochem. Cell Biol.、第64巻、163〜181ページ、1986年）。
以前の研究では、クローニングされたＧｎＴIII遺伝子酵素が様々なレベルで発現するように外部から調節する操作を以前に施した単一の抗体産生ＣＨＯ細胞系列が使用された（Umana, P.他、Nature Biotechnol.、第17巻、176〜180ページ、1999年）。この方法により、初めて、ＧｎＴIIIの発現と変化した抗体のＡＤＣＣ活性の間の厳密な相関が確立された。したがって本発明では、ラットＩＣＲ６２抗体の結合特異性を持ち、増加したＧｎＴIII活性の結果としてグリコシル化が変化した組換キメラ抗体又はその断片を考える。ＧｎＴIII活性が増加した結果、切断オリゴ糖の割合が増大するとともに、ＡＢＭのＦｃ領域に含まれるフコース残基の割合が低下する。この抗体又はその断片は、増加したＦｃ受容体結合親和性と増加したエフェクター機能を有する。さらに、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域と同等な領域を含んでなる抗体断片と融合タンパク質に関する。好適な実施形態によれば、抗体はヒト化されている。
本発明の方法によって生成されるＡＢＭの治療への応用
最も広い意味では、本発明のＡＢＭを用い、インビボ又はインビトロでＥＧＦＲを発現している細胞を標的とすることができる。ＥＧＦＲを発現している細胞は、診断又は治療を目的とした標的にすることができる。一の態様によれば、本発明のＡＢＭを用いてサンプル中のＥＧＦＲの存在を検出することができる。別の態様によれば、本発明のＡＢＭを用いて表面にＥＧＦＲを発現している細胞内のＥＧＦＲを媒介としたシグナル伝達を抑制又は減少させ得る。ＥＧＦＲは、多くのヒト腫瘍において、同じタイプの細胞の腫瘍ではない組織と比べて異常に発現している（例えば過剰発現）。したがって本発明のＡＢＭは、腫瘍の形成予防、腫瘍の駆逐、腫瘍の増殖抑制に特に有用である。本発明のＡＢＭは、ＥＧＦＲへのＥＧＦＲリガンドの結合を阻止することで、ＥＧＦに依存する腫瘍細胞の活性化（例えばＥＧＦＲチロシンリン酸化、増加した細胞外酸性化速度の増加、細胞増殖）を抑制する。本発明のＡＢＭは、細胞周期を停止させ、標的細胞（例えば腫瘍細胞）のアポトーシスを引き起こし、血管新生及び／又は標的細胞の分化を抑制する機能も有する。本発明のＡＢＭを用いてＥＧＦＲを発現しているあらゆる腫瘍を治療できる可能性がある。本発明のＡＢＭを用いて治療できる可能性のある特別な悪性腫瘍として、上皮細胞がん、扁平細胞がん、非小細胞肺がん、グリオーマ、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、頭部及び頸部のがん、腎細胞がん等がある。
本発明のＡＢＭを単独で用いてインビボの腫瘍細胞を標的として殺すことができる。ＡＢＭを適切な治療薬と共役させて使用し、ヒトのがんを治療することもできる。例えばＡＢＭを標準的な治療法又は従来からある治療法（例えば化学療法、放射線療法）と組み合わせて用いること、又はＡＢＭを治療薬又は毒素のほか、リンホカイン又は腫瘍抑制増殖因子と共役又は連結させてがんの部位にその治療薬を送達することができる。本発明のＡＢＭの最も重要な共役体は、（１）免疫毒素（ＡＢＭと細胞傷害部分）と（２）標識された（例えば放射性標識、酵素標識、蛍光色素標識）ＡＢＭである。なお標識は、標識されたＡＢＭを含む免疫複合体を同定する手段を提供する。ＡＢＭを用い、天然の補体プロセスを通じて溶解を誘導することや、通常存在する抗体依存性細胞傷害細胞と相互作用することもできる。
免疫毒素の細胞傷害部分としては、細菌又は植物が起源の細胞傷害薬又は酵素的に活性な毒素、又はかかる毒素の酵素的に活性な断片（「Ａ鎖」）が可能である。使用される酵素的に活性な毒素とその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォルディのタンパク質、ジアンチン・タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII、ＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランティア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンである。別の実施形態によれば、ＡＢＭを共役させて小分子抗がん薬にする。ＡＢＭとかかる細胞傷害部分の共役体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作られる。かかる試薬の例は、ＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性なエステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば２,６−ジイソシアン酸トリレン）、ビス活性フッ素化合物（例えば１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）である。毒素の溶解部分は、ＡＢＭのＦａｂ断片と結合させ得る。別の適切な毒素が従来技術で知られており、例えば米国特許出願公開第２００２／０１２８４４８で確認される（その全内容は援用により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態によれば、ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有する糖改変されたキメラ（ヒト化）ＡＢＭをリシンＡ鎖と共役させる。リシンA鎖は、脱グリコシル化して組換手段を通じて産生させることが最も望ましい。リシン免疫毒素を作る有利な１つの方法がVitetta他、Science、第238巻、1098ページ、1987年に記載されている（その内容は援用により本明細書に組み込まれる）。
インビトロでヒトがん細胞を殺すための診断を目的として用いる場合の共役体は、一般に、細胞培地に少なくとも約１０ｎＭの濃度で添加される。インビトロでの用途では、製剤と投与法は重要ではない。通常は培地又は灌流媒体と適合性のある水性製剤が使用される。細胞傷害は、がんの存在又は程度を明らかにするための従来からある技術によって読み取ることができる。
上述のように、がんを治療するための細胞傷害放射性医薬は、放射性同位体（例えばＩ、Ｙ、Ｐｒ）を、ラットのＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有する糖改変されたキメラＡＢＭと共役させて作ることができる。本明細書において「細胞傷害部分」にかかる同位体が含まれるものとする。
別の実施形態によれば、リポソームに細胞傷害薬を満たし、そのリポソームを本発明のＡＢＭでコーティングする。ＥＧＦＲを発現している悪性細胞の表面には多数のＥＧＦＲ分子が存在しているため、この方法によって大量の薬を正しいタイプの細胞に送達することができる。
かかる治療薬を抗体に共役させる方法はよく知られている（例えば『モノクローナル抗体とがんの治療』、Reisfeld他（編）（アラン R.リス社、1985年）の中のArnon他、「がんの治療における免疫標的のためのモノクローナル抗体」、243〜256ページ；『制御されたドラッグ・デリバリー』（第2版）、Robinson他（編）（マルセル・デッカー社、1987年）の中のHellstrom他、「ドラッグ・デリバリーのための抗体」、623〜653ページ；『モノクローナル抗体'84：生物学と臨床への応用』、Pinchera他（編）の中のThorpe、「がんの治療における細胞傷害剤の抗体担体：レビュー」、475〜506ページ、1985年；Thorpe他、「抗体−毒素共役体の調製と細胞傷害特性」、Immunol. Rev.、第62巻、119〜158ページ、1982年を参照のこと）。
治療における本発明のＡＢＭのさらに別の応用として、プロドラッグを細胞傷害薬に変換できる酵素に例えば組換ＤＮＡ技術によって共役又は連結させ、その抗体−酵素共役体をプロドラッグと組み合わせて用いることでそのプロドラッグを腫瘍部位において細胞傷害剤に変換することがある（例えばSenter他、「抗体−アルカリホスファターゼの抗腫瘍効果」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻、4842〜4846ページ、1988年；「モノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ共役体による、リン酸化されたマイトマイシンCとエトポシド誘導体の試験管内とインビボでの抗腫瘍活性の増大」、Cancer Research、第49巻、5789〜5792ページ、1989年；Senter、「抗体−酵素共役体によるプロドラッグの活性化」、FASEB J.、第4巻、188〜193ページ、1990年を参照のこと）。
治療における本発明のＡＢＭのさらに別の利用法には、補体の存在下にて非結合状態で、又は抗体−薬共役体又は抗体毒素共役体の一部として用い、がん患者の骨髄から腫瘍細胞を除去する利用法がある。この方法によれば、抗体を用いた治療によって自己の骨髄を生体外にパージし、輸液によって患者の体内に骨髄を戻すことができる（例えばRamsay他、「モノクローナル抗体を用いた骨髄パージング」、J. Clin. Immunol.、第8巻(2)、81〜88ページ、1988年を参照のこと）。
さらに本発明には、ラットＩＣＲ６２抗体（例えばラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲを含んでなるポリペプチド）と実質的に同じ結合特異性を可能にする抗原結合ドメインを含むとともに、さらに毒素ポリペプチドも含んでなる単鎖免疫毒素が含まれると考えられる。本発明の単鎖免疫毒素を用いてインビボのヒトがんを治療できる可能性がある。
同様に、抗腫瘍活性を有する第２のタンパク質の機能的に活性な少なくとも１つの部分（例えばリンフォカイン又はオンコスタチン）に結合した本発明のＡＢＭの少なくとも１つの抗原結合ドメインを含んでなる融合タンパク質を用いてインビボのヒトがんを治療できる可能性がある。
本発明により、ＥＧＦＲを発現している腫瘍細胞を選択的に殺す方法が提供される。この方法は、本発明の免疫共役体（例えば免疫毒素）をその腫瘍細胞と反応させる工程を含んでなる。腫瘍細胞としては、ヒトがんからのものが可能である。
それに加え、本発明により、インビボのがん（例えばヒトがん）を治療する方法が提供される。この方法は、本発明の少なくとも１つの免疫共役体（例えば免疫毒素）を含んでなる組成物の医薬として有効な量を対象に投与する工程を含んでなる。
本発明のさらに別の特徴は、ＥＧＦＲが発現している、その中でも特にＥＧＦＲが異常に発現している（例えば過剰発現する）細胞増殖疾患（例えば膀胱がん、脳腫瘍、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、皮膚がん、腎臓がん）を治療するための改善された方法であって、治療を必要としている対象に、本発明のＡＢＭの治療に有効な量を投与する工程を含んでなる方法に関する。好適な実施形態によれば、ＡＢＭは、ラットＩＣＲ６２抗体と実質的に同じ結合特異性を有する糖改変された抗ＥＧＦＲ抗体である。別の好適な実施形態によれば、抗体はヒト化されている。別の好適な実施形態によれば、ヒト化抗体は、結合活性の保持に必要な位置（例えばＳＤＲ）を除く望む任意の位置に置換を有する変化したＣＤＲを含んでなる。本発明のＡＢＭによって治療できる可能性のある細胞増殖疾患の例として、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭部と頸部、神経系（中枢神経系と末梢神経系）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭領域、尿生殖系等に位置する新生物がある。
同様に、他の細胞増殖疾患も本発明のＡＢＭによって治療できる可能性がある。かかる細胞増殖疾患の例として、高ガンマグロブリン過剰血症、リンパ球増殖疾患、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症等と、上に列挙した臓器系に位置する新生物を除く他の細胞増殖疾患がある。
本発明を実施するときの対象としては、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ、トリが可能である。他の温血動物も本発明に含まれる。
本発明によりさらに、ヒト腫瘍細胞の増殖を抑制する方法、対象の腫瘍を治療する方法、対象の増殖タイプの疾患を治療する方法が提供される。これらの方法は、本発明の組成物の有効量を対象に投与する工程を含んでなる。
さらに、本発明は、哺乳動物におけるＥＧＦＲ又は１又は２以上のＥＧＦＲリガンドの異常な活性化又は産生を特徴とする非悪性の疾患又は病気を治療する方法であって、本発明の組成物の有効量をその哺乳動物に投与する工程を含んでなる方法に関する。対象は、一般に、ＥＧＦＲを発現している細胞を例えば病気の組織内に有するため、本発明のＡＢＭは対象の体内で細胞に結合することができる。
ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲリガンドの異常な活性化又は発現は、対象の細胞（例えば対象の病気の組織）内で起こる可能性がある。ＥＧＦＲの異常な活性化は、ＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲリガンドの増幅、過剰発現、異常な産生に帰することができる。本発明の一実施形態によれば、診断アッセイ又は予後アッセイを実施し、ＥＧＦＲ（又はＥＧＦＲリガンド）の異常な産生又は活性化が対象に起こっているか否かを調べる。例えばＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲリガンドの遺伝子増幅及び／又は過剰発現を明らかにすることができる。かかる増幅／過剰発現を調べるための様々なアッセイが従来技術で利用でき、例えば上に説明したＩＨＣアッセイ、ＦＩＳＨアッセイ、シェッド（shed）抗原アッセイ等がある。或いは、又はそれに加えて、サンプル中の、又はサンプルに付随するＥＧＦＲリガンド（例えばＴＧＦ−α）のレベルを公知の手続きに従って調べることができる。かかるアッセイでは、テストするサンプル中でそのＥＧＦＲリガンドをコードするタンパク質及び／又は核酸を検出することができる。一実施形態によれば、サンプル中のＥＧＦＲリガンドのレベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）を利用して調べることができる；例えばScher他、Clin. Cancer Research、第1巻、545〜550ページ、1995年を参照のこと。或いは、又はそれに加えて、ＥＧＦＲをコードする核酸がテストするサンプル中に含まれているレベルを、例えばFISH法、サザン・ブロッティング法、ＰＣＲ法で評価することができる。
さらに、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲリガンドの過剰発現又は増幅をインビボ診断アッセイを利用して評価することができる。そのためには、例えば、検出可能な標識（例えば放射性同位体）が付けられていて検出する分子に結合する分子（例えば抗体）を投与し、患者を外部から走査してその標識の位置を探す。
或いは治療の前にＥＧＦＲヘテロ二量体（特にＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体、ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体、ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４ヘテロ二量体）を患者（例えば患者の病気の組織）で検出してもよい。様々な方法を利用して非共有結合のタンパク質−タンパク質相互作用を検出したり、他の方法で興味の対象であるタンパク質の間の近さを示したりすることができる。ＥＧＦＲヘテロ二量体を検出する方法の例として、免疫親和性に基づく方法（例えば免疫沈降）；蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Selvin、Nat. Struct. Biol.、第7巻、730〜734ページ、2000年；GadellaとJovin、J. Cell Biol.、第129巻、1543〜1558ページ、1995年；Nagy他、Cytometry、第32巻、120〜131ページ、1998年）；標準的な直接的又は間接的な免疫蛍光技術と共焦点レーザー走査顕微鏡法を利用した、ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ３を有するＥＧＦＲの位置同時特定；抗体の結合と、ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ３を有するＥＧＦＲの位置同時特定を高スループット形式（例えばマイクロウエル・プレート）で検出するためのレーザー走査イメージング（ＬＳＩ）（Zuck他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第96巻、11122〜11127ページ、1999年）；ｅＴａｇ／アッセイ系（アクララ・バイオ・サイエンシーズ社、マウンテン・ヴュー、カリフォルニア州；2001年12月6日に公開された米国特許出願公開第２００１／００４９１０５号）等がある。
したがって、ヒトの悪性腫瘍（例えば膀胱がん、脳腫瘍、頭部と組部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、皮膚がん、腎臓がん）を治療するための医薬組成物、組み合わせ、方法が本発明に含まれるのは明らかである。例えば本発明には、本発明による抗体の医薬として有効な量と、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる、ヒトの悪性腫瘍の治療に用いる医薬組成物が含まれる。
本発明のＡＢＭ組成物は、従来の投与法を利用して投与することができる。例えば、静脈内、腹腔内、経口、リンパ節内への投与や、腫瘍への直接的な投与が挙げられる。静脈内投与が好ましい。
本発明の一の態様によれば、本発明のＡＢＭを含有する治療用製剤は、保管のため、望む純度の抗体を、場合によっては医薬的に許容し得る担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥製剤又は水溶液の形態にすることによって調製される（『レミントンの薬理科学』、第16版、Osol, A.編、1980年）。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は、使用する投与量と濃度ではレシピエントにとって非毒性であり、緩衝剤（例えばリン酸塩、クエン酸塩、他の有機酸）；酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン）；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチルアルコール、ベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；m−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシン）；単糖、二糖、他の炭水化物（例えばグルコース、マンノース、デキストリン）；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖類（例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；非イオン性界面活性剤（例えばトゥイーン（登録商標）、プルロニクス（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））等がある。
本発明のＡＢＭは、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲリガンドの異常な活性を特徴とする疾患又は病気（例えば腫瘍）を治療するため、対象に対し、単独で投与すること、又は組み合わせ療法において例えば化学療法剤及び／又は放射線療法とともに投与することができる。抗ＥＧＦＲ抗体製剤の例は、HerbstとShin、Cancer、第94巻(5)、1593〜1611ページ、2002年に記載されている。適切な化学療法剤として、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、パクリタキセル、ビンブラスチン、カルボプラチン、エトポシド等がある。
皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、WO 97/04801に記載されている。かかる凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤を用いて高濃度のタンパク質に再構成し、その再構成された製剤を、本明細書に記載した治療する哺乳動物に皮下投与することができる。
本明細書の製剤は、治療する特定の症状に必要な２種類以上の化合物を含有していてもよい。その化合物は、互いにマイナスの効果を与えない相補的な活性を有するものであることが好ましい。例えば細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤（例えばＴ細胞に作用するシクロスポリンや、Ｔ細胞に結合する抗体（例えばLFA−１に結合する抗体））。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するアンタゴニストの量、疾患又は病気のタイプ、治療のタイプのほか、これら以外の上記因子に依存する。これら化合物は一般に、上記のようにして使用する場合と同じ投与量及び同じ投与経路で使用されるか、上に示した投与量の約１〜９９％で使用される。
活性成分は、例えばコロイド・ドラッグ・デリバリー・系（例えばリポソーム、アルブミン・マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル）又はマイクロエマルジョンに含まれるマイクロカプセルの中に収容することもできる。マイクロカプセルは、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製される（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロース製又はゼラチン製のマイクロカプセルとポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）。かかる技術は、『レミントンの薬理科学』、第16版、Osol, A.編、1980年に開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例として、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが成形品の形態（例えば膜やマイクロカプセル）にされたもの挙げられる。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）やポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えばLUPRON DEPOTTM（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア））、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸等が挙げられる。
生体に投与するための製剤は殺菌されていなければならない。これは、殺菌濾過膜を通過させる濾過によって容易に実現される。
本発明の組成物は、様々な剤形にすることができる。例えば、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座薬、ポリマー製マイクロカプセル、ポリマー製微小胞、リポソーム、注射溶液、輸液用溶液等がある。好ましい剤形は、投与法と治療の用途によって異なる。
本発明の組成物は、従来からある医薬的に許容し得る担体や、当業者に公知のアジュバントも含有することが好ましい。それは例えば、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、緩衝物質（リン酸塩等）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、塩や電解質（硫酸プロタミン等）である。
本発明による医薬組成物の最も有効な投与法と投与計画は、疾患の重篤度と経過、患者の健康、治療に対する反応、治療に当たる医師の判断によって異なる。したがって組成物の投与量は、個々の患者に合わせる必要がある。しかし本発明の組成物の有効投与量は、一般に、約０．０１〜約２０００ｍｇ／ｋｇの範囲になろう。一実施形態によれば、有効投与量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。より具体的な実施形態によれば、投与量は、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。別の実施形態によれば、投与量は、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約４．５ｍｇ／ｋｇの範囲、又は約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。本発明の投与量は、これらの範囲内の任意の値が可能であり、例えば、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１１．０ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１２．０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１３．０ｍｇ／ｋｇ、１３．５ｍｇ／ｋｇ、１４．０ｍｇ／ｋｇ、１４．５ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
本明細書に記載した分子は様々な剤形にすることができる。例えば、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座薬、ポリマー製マイクロカプセル、ポリマー製微小胞、リポソーム、注射溶液、輸液用溶液等がある。好ましい剤形は、投与法と治療の用途によって異なる。
本発明の投与量は、予測用バイオマーカーを使用して決定できる場合がある。予測用バイオマーカーは、腫瘍に関係する遺伝子又はタンパク質の発現及び／又は活性化のパターンを明らかにする（すなわち観察及び／又は定量化する）のに用いる分子マーカー、又は腫瘍に関係するシグナル伝達経路の細胞成分である。腫瘍組織における標的療法の生物学的効果を明らかにし、そうした効果を臨床反応と相関させると、腫瘍において機能している優勢な増殖経路と生存経路を特定するのに役立つ。その結果、もっともらしい反応物のプロファイルが確立され、逆に、耐性を克服する戦略を設計するための根拠が提供される。例えば抗ＥＧＦＲ療法のためのバイオマーカーは、ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達経路にあって細胞増殖疾患へとつながる分子（例えばＡｋｔ、ＲＡＳ、RAF、MAPK、ERK１、ERK２、PKC、STAT３、STAT５等）を含むことができる（Mitchell、Nature Biotech.、第22巻、363〜364ページ；Becker、Nature Biotech.、第22巻、15〜18ページ、2004年；TsaoとHerbst、Signal、第4巻、4〜9ページ、2003年）。抗ＥＧＦＲ療法のためのバイオマーカーは、増殖因子受容体（例えばＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）も含むことができ、抗ＥＧＦＲ療法に対する患者の反応がプラスであるかマイナスであるかを予測する材料となりうる。例えば増殖因子受容体ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）は、抗ＥＧＦＲ抗体ＡＢＸ−ＥＧＦのマイナス面予測用バイオマーカーであることが明らかになった（米国特許出願公開第２００４／０１３２０９７Ａ１号）。
予測用バイオマーカーは、従来技術でよく知られている細胞アッセイによって測定できる。例えば免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫蛍光、捕獲と検出アッセイ、逆相アッセイ、米国特許出願公開第２００４／０１３２０９７Ａ１号（その全内容は援用により本明細書に組み込まれる）に記載されているアッセイ等がある。抗ＥＧＦＲ療法の予測用バイオマーカーそのものは、米国特許出願公開第２００３／０１９０６８９Ａ１号（その全内容は援用により本明細書に組み込まれる）に記載されている技術に従って同定できる。
本発明の１つの特徴により、ＥＧＦＲに関係する疾患を治療する方法であって、治療を必要とするヒト患者において抗ＥＧＦＲ療法に対する反応を、治療の前に、がん等のＥＧＦＲに関係する疾患の予測用マーカーの発現及び／又は活性化を検出する１種類又は複数種類の試薬を用いてそのヒト患者からのサンプルを調べることによって予測し；１又は２以上の予測用マーカーの発現及び／又は活性化のパターンを明らかにし（そのパターンが、抗ＥＧＦＲ療法に対するそのヒト患者の反応を予測している）；抗ＥＧＦＲ療法にプラスの反応をすることが予測されるヒト患者に、本発明のＡＢＭを含んでなる組成物の治療に有効な量を投与する工程を含んでなる方法が提供される。本明細書において「抗ＥＧＦＲ療法にプラスの反応をすることが予測されるヒト患者」は、抗ＥＧＦＲ療法がＥＧＦＲに関係する疾患に対して効果を持つこと（例えば腫瘍の退縮／縮小）が予測される患者、抗ＥＧＦＲ療法の利益が副作用（例えば毒性）よりも大きい患者である。本明細書では、サンプルは、生物、特にヒトに由来し、１種類以上の細胞（例えば乳房、肺、胃腸管、皮膚、子宮頸管、卵巣、前立腺、腎臓、脳、頭部と頸部等の臓器や、身体の他のあらゆる臓器又は組織から取り出したあらゆる起源のサンプル、組織サンプル、バイオプシー・サンプルの１種類の細胞）を含んでなるあらゆる生物サンプルと、身体からの他のサンプル（例えばスミア、痰、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿、糞便）を意味する。
本発明のＡＢＭを含んでなる組成物は、優れた医学的操作に従って製剤化、処方、投与される。この文脈で考慮する因子として、治療する個々の疾患又は病気、治療する個々の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患又は病気の原因、薬の送達部位、投与法、投与スケジュールや、医療を実践する人に知られている他の因子等が挙げられる。投与するアンタゴニストの治療に有効な量は、こうした考慮事項によって決まるであろう。
一般的な提案として、１回ごとに非経口投与する抗体の治療に有効な量は、１日に患者の体重１kg当たり約０．１〜２０ｍｇの範囲になろう。使用するアンタゴニストの典型的な初期投与量の範囲は、約２〜１０ｍｇ／ｋｇである。一実施形態によれば、治療に有効な量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。より具体的な実施形態によれば、投与量は、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。別の実施形態によれば、投与量は、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約４．５ｍｇ／ｋｇの範囲、又は約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。本発明の投与量は、これらの範囲内の任意の投与量でもよく、例えば、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１１．０ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１２．０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１３．０ｍｇ／ｋｇ、１３．５ｍｇ／ｋｇ、１４．０ｍｇ／ｋｇ、１４．５ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇが可能である。
好適な実施形態によれば、ＡＢＭは抗体であり、ヒト化抗体であることが好ましい。かかる非結合化抗体の適切な投与量は、例えば約２０ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2の範囲である。例えば患者に対し、抗体を実質的に３７５ｍｇ／ｍ2未満の１又は２以上の投与量で投与することができる。その場合には、例えば投与量が約２０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2の範囲（例えば約５０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2の範囲）である。
さらに、抗体を１通り以上の初期投与量で投与し、それに続けて１通り以上の投与量で投与することができる。その場合、あとから投与する抗体のｍｇ／ｍ2を単位とした投与量は、初期投与量での抗体のｍｇ／ｍ2を単位とした投与量よりも多い。例えば初期投与量は、約２０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2（例えば約５０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2）の範囲が可能であり、あとからの投与量は、約２５０ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2の範囲が可能である。
しかし上述のように、ＡＢＭＡＢＭに関して推奨されるこれらの量は、治療上の判断によって大きく変化する。適切な投与量とスケジュールを選択する際にカギとなる因子は、上に指摘したように、得られる結果である。例えば進行中の疾患や急性の疾患の治療では最初に必要とされる投与量が比較的多くなる可能性がある。最も効果のある結果を得るためには、疾患又は病気が何であるかに応じ、アンタゴニストを、その疾患又は病気の最初の徴候、診断、所見、発生にできるだけ合わせて投与するか、疾患又は病気の緩和中に投与する。
腫瘍の治療に用いる抗ＥＧＦＲ抗体の場合には、最適な治療結果は、一般に、標的細胞の表面にあるＥＧＦ受容体を完全に飽和させるのに十分な投与量で実現されてきた。飽和の実現に必要な投与量は、腫瘍細胞１個当たりに発現するＥＧＦ受容体の数に依存するであろう（腫瘍のタイプが異なると大きく変動する可能性がある）。３０ｎＭという低い血清濃度がいくつかの腫瘍を治療するのに有効であったのに対し、他の腫瘍では最適な治療効果を実現するのに１００ｎＭを超える濃度が必要となる可能性がある。所定の腫瘍で飽和を実現するのに必要な投与量は、ラジオイムノアッセイ又は免疫沈降によってインビトロで容易に決定することができる。
一般に、放射線との組み合わせ療法では、適切な１つの治療計画に、本発明の抗ＥＧＦＲ ＡＢＭを１００〜５００ｍｇ／ｍ2の負荷用量で８週間にわたって輸液した後、１００〜２５０ｍｇ／ｍ2の維持用量で輸液するとともに、毎日２．０Ｇｙの線量で７０．０Ｇｙの量を照射する操作が含まれる。化学療法との組み合わせ療法では、１つの適切な治療計画に、本発明の抗ＥＧＦＲ ＡＢＭを毎週の負荷／維持用量として１００／１００ｍｇ／ｍ2、４００／２５０ｍｇ／ｍ2、５００／２５０ｍｇ／ｍ2のいずれかにすることを、３週間ごとに１００ｍｇ／ｍ2の投与量のシスプラチンと組み合わせることが含まれる。或いはシスプラチンの代わりにゲムシタビン又はイリノテカンを用いてもよい。
本発明のＡＢＭは、適切な任意の手段で投与される。例えば、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内に投与され、望むのであれば、局所的に免疫抑制治療を行なうため、病変内に投与される。非経口の輸液としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下への投与等がある。それに加え、アンタゴニストは、例えば投与量を減らしながらパルス輸液によって投与することも好ましい。投与が短期であるか長期であるかを一部考慮することになるが、投与は注射によることが好ましく、静脈内注射又は皮下注射が最も好ましい。
他の化合物（例えば細胞傷害剤、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン）を本明細書に記載したアンタゴニストとともに投与することができる。組み合わせ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を用いた同時投与と、いずれかの順番での逐次投与が含まれる。その場合、両方（又は全て）の活性剤が同時にその生物活性を及ぼす時間が存在することが好ましい。
治癒をもたらすのに必要な本発明の組成物の投与量は、スケジュールの最適化によってさらに減らせる可能性がある。
本発明を実施するにあたり、医薬用担体として脂質担体が可能である。脂質担体としては、リン脂質が可能である。さらに、脂質担体は脂肪酸でもよい。また、脂質担体は洗浄剤でもよい。本明細書では、洗浄剤は、液体の表面張力を変化させる（一般に低下させる）あらゆる物質である。
本発明の一例では、洗浄剤は非イオン性洗浄剤である。非イオン性洗浄剤の例として、ポリソルベート８０（トゥイーン８０又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンとしても知られる）、Brij、トリトン（例えばトリトンWR-1339やトリトンA-20）等がある。
或いは洗浄剤はイオン性洗浄剤でもよい。イオン性洗浄剤の一例はアルキルトリメチルアンモニウムブロミドだが、これだけに限定されるわけではない。
以上に加え、本発明では、脂質担体はリポソームでもよい。この出願では、「リポソーム」は、本発明の任意の分子又はその組み合わせを含有するあらゆる膜結合小胞である。
本発明のさらに別の実施形態は、薬として用いるための、その中でも特にがんの治療又は予防で用いるための、又は前がん状態又は病変で用いるための本発明のＡＢＭに関する。がんは、例えば肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部及び頸部のがん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、大腸がん、乳がん、ファローピウス管の腫瘍、子宮内膜の腫瘍、子宮頸管の腫瘍、膣の腫瘍、陰門の腫瘍、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓のがん、尿管のがん、腎細胞腫瘍、腎盂の腫瘍、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、慢性又は急性の白血病、リンパ球リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性グリア芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平細胞腫瘍、下垂体線腫が可能であり、その中には、これらのがんの難治性のものや、１又は２以上の組み合わせが含まれる。前がん状態又は病変として、例えば、口腔の白斑症、光線性角化症（日光性角化症）、大腸又は直腸の前がん性ポリープ、胃上皮異形成症、線腫性異形成症、遺伝性非ポリポシス大腸がん症候群（ＨＮＰＣＣ）、バレット食道、膀胱異形成症、前がん性子宮頸管状態からなる群が挙げられる。
そのがんの選択は、乳がん、膀胱がん、頭部及び頸部のがん、皮膚がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍からなる群の中からなされることが好ましい。
さらに別の実施形態は、本発明のＡＢＭを用いてがんを治療又は予防するための薬を製造する方法である。
そのがんの選択は、乳がん、膀胱がん、頭部及び頸部のがん、皮膚がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍からなる群の中からなされることが好ましい。
抗原結合分子は、治療に有効な量として約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇで使用することも好ましい。
より好ましいのは、抗原結合分子を治療に有効な量として約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇで使用することである。
より好ましいのは、抗原結合分子を治療に有効な量として約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約４．５ｍｇ／ｋｇで使用することである。
より好ましいのは、抗原結合分子を治療に有効な量として約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇで使用することである。
最も好ましいのは、抗原結合分子を治療に有効な量として約１．５ｍｇ／ｋｇで使用することである。
やはり最も好ましいのは、抗原結合分子を治療に有効な量として約４．５ｍｇ／ｋｇで使用することである。
やはり最も好ましいのは、抗原結合分子を治療に有効な量として約１２ｍｇ／ｋｇで使用することである。
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲに関係する疾患の治療を必要としている哺乳動物においてその疾患を治療する方法であって、本発明のＡＢＭをその哺乳動物に投与する工程を含んでなり、治療の結果としてそのＡＢＭの血清濃度が少なくとも４週間にわたって約１〜約５００μｇ／ｍｌになるとともに、その治療によってその哺乳動物に臨床的に深刻なレベルの毒性をもたらさない方法に関する。別の実施形態によれば、血清濃度は、１μｇ／ｍｌ超、２５μｇ／ｍｌ超、５０μｇ／ｍｌ超、１００μｇ／ｍｌ超、２００μｇ／ｍｌ超、３００μｇ／ｍｌ超、４００μｇ／ｍｌ超、５００μｇ／ｍｌ超、約１〜約１００μｇ／ｍｌ、約１〜約２００μｇ／ｍｌ、約１〜約３００μｇ／ｍｌ、約１〜約４００μｇ／ｍｌ、約１〜約５００μｇ／ｍｌからなる群から選択された量である。好適な実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。一実施形態によれば、ＡＢＭは抗体である。好適な実施形態によれば、抗体は糖改変されていて、糖改変されていない形態の抗体と比べてＦｃγＲIIIの結合が増加している。
一の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片をさらに含んでなり、そのＦｃ領域又はその断片は糖改変されていて、糖改変されていない形態と比べてエフェクター機能が増加しているＡＢＭに関する。特定の実施形態によれば、エフェクター機能は、Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加である。
別の一の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片をさらに含んでなり、そのＦｃ領域又はその断片は糖改変されていて、糖改変されていない形態と比べてＦｃ受容体結合親和性が増加しているＡＢＭに関する。
別の一の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、治療に有効な量を対象に投与したとき、臨床的に深刻なレベルの毒性を示さないＡＢＭに関する。一実施形態によれば、ＡＢＭは、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片をさらに含んでなる。特定の実施形態によれば、Ｆｃ領域又はその断片は糖改変されていて、糖改変されていない形態と比べてエフェクター機能が増加している。より具体的な実施形態によれば、エフェクター機能は、Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加である。別の実施形態によれば、Ｆｃ領域又はその断片は糖改変されていて、糖改変されていない形態と比べてＦｃ受容体結合親和性が増加している。特定の実施形態によれば、治療に有効な量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。別の特定の実施形態によれば、治療に有効な量は、１μｇ／ｍｌを超える血清濃度である。
別の一の態様によれば、本発明は、治療を必要とするヒト患者においてＥＧＦＲに関係する疾患を治療する方法であって、その患者に上記のＡＢＭを投与する工程を含んでなる方法に関する。別の一の態様によれば、本発明は、治療を必要とする哺乳動物においてＥＧＦＲに関係する疾患を治療する方法であって、その哺乳動物に、ＥＧＦＲに特異的に結合するＡＢＭを投与する工程を含んでなり、前記ＡＢＭが、治療に有効な量を対象に投与したとき、臨床的に深刻なレベルの毒性を示さない方法に関する。一実施形態によれば、治療に有効な量により、ＡＢＭの血清濃度が少なくとも４週間にわたって約１〜約１００μｇ／ｍｌになる。別の実施形態によれば、この方法で使用されるＡＢＭは、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片をさらに含んでなる。より具体的な実施形態によれば、Ｆｃ領域又はその断片は糖改変されていて、糖改変されていない形態と比べてエフェクター機能が増加している。特定の実施形態によれば、エフェクター機能は、Ｆｃを媒介とした細胞毒性の増加である。別の特定の実施形態によれば、Ｆｃ領域又はその断片は糖改変されていて、糖改変されていない形態と比べてＦｃ受容体結合親和性が増加している。好適な実施形態によれば、Ｆｃ受容体はＦｃγＲIIIである。
製品
本発明の一実施形態によれば、上記疾患の治療に役立つ材料を含有する製品が提供される。この製品は、容器と、その容器の表面のラベル又はその容器に付随するパッケージ挿入物とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、注射器等がある。容器は、様々な材料（例えばガラスやプラスチック）で形成することができる。容器は、疾患を治療するための組成物を保持し、無菌アクセス・ポートを備えることができる（例えば容器は、皮下注入用の注射針によって穴を開けることのできるストッパが付いた静脈内溶液用の袋又はバイアルにすることができる）。組成物に含まれる少なくとも１つの活性剤は抗ＥＧＦＲ抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、その組成物が選択した疾患（例えばＥＧＦＲ受容体及び／又はＥＧＦＲリガンドの異常な活性化又は産生が関与する非悪性の疾患又は病気（例えば良性の超増殖性の疾患又は病気））の治療に使用されることを示している。さらに、製品は、（ａ）ＥＧＦＲに結合してＥＧＦＲを過剰発現している細胞の増殖を抑制する第１の抗体を含んでなる組成物が中に収容される第１の容器と；（ｂ）ＥＧＦＲに結合してＥＧＦＲ受容体のリガンド活性化を阻止する第２の抗体を含んでなる組成物が中に収容される第２の容器を含まれ得る。本発明のこの実施形態の製品はさらに、上の定義の項にある疾患又は病気のリストからの非悪性の疾患又は病気を第１の抗体組成物と第２の抗体組成物を用いて治療できることを示すパッケージ挿入物を含まれ得る。さらに、パッケージ挿入物は、（ＥＧＦＲに結合してＥＧＦＲ受容体のリガンド活性化を阻止する第２の抗体を含んでなる）組成物のユーザーに、前項で説明した抗体を用いた治療法や付随する治療薬（例えば化学療法剤、ＥＧＦＲ標的薬、抗血管新生剤、免疫抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ホルモン化合物、心臓保護物質、サイトカイン）のいずれかと組み合わせることの説明をしてもよい。或いは、又はそれに加えて、製品は、医薬的に許容し得る緩衝液（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器を含まれ得る。製品はさらに、商業的な観点やユーザーの観点から望ましい他の材料（例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、注射器）も含まれ得る。
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。以下の調製物と実施例は、当業者が本発明をより明確に理解して実施できるようにするために提示する。しかし本発明の範囲が、本発明の単独の特徴の説明だけを目的として例示した実施形態に限定されることはなく、機能的に同等な方法は本発明の範囲内である。実際、これまでの説明と添付の図面から、本明細書に記載した以外の本発明の様々な変更が当業者には明らかであろう。かかる変更は、添付の請求項の範囲に含まれるものとする。
本出願の中で引用した全ての特許、出願、刊行物は、その全内容が援用により本明細書に組み込まれる。
特に断わらない限り、以下の実施例で特定のアミノ酸残基の番号に言及するときは、Kabat番号付け系に従う。特に断わらない限り、これらの実施例に記載されている抗体を作るのに用いられる材料と方法は、米国特許出願第１０／９８１，７３８号（その全内容が援用により本明細書に組み込まれる）に記載されているものと同様である。
［実施例１］
材料と方法
相同性の大きなアクセプタの方法
相同性の大きな抗体アクセプタ・フレームワークの検索を、ラットＩＣＲ６２タンパク質配列をヒト生殖系列配列の集合とアラインメントさせた後、全てのカノニカル残基が機能しているレベルを維持しながら配列が最も一致したヒト配列を選択することによって実施した。ここでは、VBaseデータベースのＶＨ１ファミリーからの配列１−ｅを重鎖のためのアクセプタ・フレームワーク配列として選択し、VBaseデータベースのＶＫ１ファミリーからのＡ３０配列を軽鎖のためのアクセプタ・フレームワーク配列として選択した。これら２つのアクセプタ・フレームワークに、ラットＩＣＲ６２の重鎖と軽鎖の可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又はそのＣＤＲの特異性決定残基をグラフトした。フレームワーク４領域は生殖系列遺伝子の可変領域の一部ではないため、その位置のアラインメントは個別に実施した。Ｊ重鎖に関してはＨ６領域を選択し、軽鎖に関してはＪＫ２領域を選択した。設計した免疫グロブリンドメインの分子モデルから、Kabat ＣＤＲ１の外側の１つの位置が、ＣＤＲの外側でヒトのアミノ酸残基ではなくマウスのアミノ酸残基を必要としている可能性のあることが明らかになった。マウスのアミノ酸残基をヒトのフレームワークに再び導入すると、いわゆる「復帰突然変異」が生じるであろう。例えばKabat２７位のヒト・アクセプタ・アミノ酸残基（１−ｅのグリシン）を復帰突然変異によってチロシン残基にした。抗原の結合に残基が重要であることを示すため、復帰突然変異を含むか省略したヒト化抗体変異体を設計した。このヒト化抗体の軽鎖は、いかなる復帰突然変異も必要としなかった。タンパク質の配列を設計した後、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を以下に詳述するようにして合成した。
混合フレームワークの方法
ヒト・アクセプタ・フレームワークの復帰突然変異を（優れた抗原結合親和性又は抗体機能を維持する上で）重要な位置に導入する必要がないようにするため、天然のヒト生殖系列配列の重要な残基位置において、機能的ヒト化抗体のフレームワーク領域１（ＦＲ１）、フレームワーク領域１（ＦＲ１）と２（ＦＲ２）を合わせた領域、フレームワーク領域３（ＦＲ３）のいずれを、すでにドナー配列を有するか、ドナー残基と機能的に同等なアミノ酸残基を有するヒト抗体配列で置換できるかを調べた。その目的で、ラットＩＣＲ６２ ＶＨ配列のＶＨフレームワーク１、２、３を個別にヒト生殖系列配列とアラインメントさせた。ここでは、アクセプタ・フレームワークを選択するのに配列の最大一致を利用せず、いくつかの重要な残基の一致を調べた。これらの重要な残基には、いわゆるカノニカル残基が含まれるとともに、Kabatが定義するＣＤＲ１の外側に位置するが抗原の結合にはしばしば関与する２７位、２８位、３０位（Kabat番号付け）の残基も含まれている。それに加え、重要な残基は、ＣＤＲと大きな相互作用を示す残基である。それは、分子モデルを利用して明らかにすることができる。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３と置き換えるのに適切な配列として、IMGT配列であるＩＧＨＶ１−５８（登録番号M２９８０９）、ＩＧＨＶ５−５１（登録番号M９９６８６）と、ＶＨ１ファミリーからのVBase配列１−０２をそれぞれ選択した。簡単に説明すると、ＩＧＨＶ１−５８は、Kabat２７位と３０位で有望なパターンを示したが、カノニカル７１位の基準は満たしていない。ＩＧＨＶ５−５１は一致残基７１を有するため、このＩＧＨＶ５−５１のＦＲ３を使用できよう。また、このＩＧＨＶ５−５１のＦＲ１は望むＦＲ１配列に近い。
ＶＨ１の１−eは、２７位を除いて全ての基準を満たしていた。配列１−０２に関しては、ＦＲ１領域とＦＲ２領域は許容できると考えられたが、ＦＲ３に復帰突然変異が必要となろう。
タンパク質配列を設計した後、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を以下のようにして合成した。この方法を利用すると、抗原の結合を優れたレベルに維持するのにたいていの重鎖構造体で復帰突然変異は不要であった。混合フレームワーク構造体の歴史と推理法は、結果の項で説明する。
抗体遺伝子の合成
ヒト化抗体のV領域のアミノ酸配列を設計した後、ＤＮＡ配列を生成させた。個々のフレームワーク領域のＤＮＡ配列のデータは、ヒト生殖系列配列のデータベース（例えばIMGT又はVBase）で見つけた。ＣＤＲ領域のＤＮＡ配列情報は、ラットＩＣＲ６２抗体に関して公開されている配列から取った（例えばＰＣＴ公開WO 95/20045を参照のこと）。これらの配列を用いて仮想的なＤＮＡ配列の全体を組み立てた。このＤＮＡ配列のデータが得られたため、サイレント突然変異を導入することによって診断用制限部位をこの仮想的な配列に導入し、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を作り出した。物理的ＤＮＡ鎖を得るため、遺伝子を合成した（例えばWheeler他、1995年を参照のこと）。この方法では、一連のオリゴヌクレオチドがコード鎖に由来し、別の一連の配列が非コード鎖に由来するようにして、興味の対象となる遺伝子からオリゴ糖を設計した。各オリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端（配列の最初と最後のヌクレオチドは除く）は、反対側の鎖に由来する２つのプライマーと常に相補的な配列になる。熱に対して安定なあらゆるポリメラーゼに適した反応緩衝液の中にこれらオリゴヌクレオチドを入れてＭｇ2+、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼを添加すると、各オリゴヌクレオチドは３’末端から伸長する。次に、１つのプライマーの新たに形成された３’末端を、反対側の鎖の次のプライマーとアニールし、鋳型に依存したＤＮＡ鎖の伸長に適した条件下で配列をさらに伸長させる。最終産物をクローニングし、大腸菌の中での増殖に適した従来からあるベクターに入れた。
抗体の産生
キメラ（すなわち完全なラットV領域とヒトC領域）ヒト化抗ＥＧＦＲの軽鎖と重鎖の発現ベクターを構成するため、（分泌のための）ヒト重鎖／軽鎖リーダー配列を可変領域ＤＮＡ配列の上流に付加した。可変領域の下流では、分子生物学の標準的な方法を利用し、重鎖のためのＩｇＧ１の定常領域と軽鎖のためのκ定常領域を付加した。得られた完全な抗体重鎖／軽鎖ＤＮＡ配列をMPSVプロモータの制御下でサブクローニングし、哺乳動物の発現ベクターの合成ポリＡ部位の上流に入れた。それぞれのベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を有する。
リン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法を利用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物抗体の重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターと同時にトランスフェクトすることによって抗体を産生させた。指数増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。変化していない抗体を産生させるため、細胞に抗体の重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターだけを１：１の比でトランスフェクトした。糖改変された抗体を産生させるため、細胞に４つのプラスミドを同時にトランスフェクトした。２つは抗体を発現させるため、１つは融合ＧｎＴIIIポリペプチドを発現させるため、１つはマンノシダーゼIIを発現させるためであり、比は４：４：１：１である。Ｔフラスコの中で、１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ培地を用い、細胞を接着単層培養物として増殖させ、５０〜８０％の集密度になったときにトランスフェクトした。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションのため、トランスフェクションの２４時間前に、ＦＣＳ（最終濃度１０％ｖ／ｖ）と２５０μｇ／ｍｌのネオマイシンを補足したＤＭＥＭ培地１４ｍｌの中に８００万個の細胞を入れ、５％ＣＯ2雰囲気にしたインキュベータの中で細胞を一晩にわたって３７℃にした。トランスフェクトされる各Ｔ７５フラスコのため、軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターに等分された合計で４７μgのプラスミドベクターＤＮＡと１MのＣａＣｌ2溶液２３５μｌを混合した後、最終体積が４６９μｌとなるように水を添加することにより、ＤＮＡとＣａＣｌ2と水からなる溶液を調製した。この溶液に、５０ｍＭのヘペスと、２８０ｍＭのＮａＣｌと、１．５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4からなる４６９μｌの溶液（ｐＨ７．０５）を添加し、ただちに１０秒間混合し、室温にて２０秒間放置した。２％ＦＣＳを補足した１２ｍｌのＤＭＥＭを用いてこの懸濁液を希釈した後、Ｔ７５フラスコの中にすでに存在している培地に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2の条件で約１７〜２０時間にわたってインキュベートした後、１０％ＦＣＳを補足した１２ｍｌのＤＭＥＭで培地を置き換えた。トランスフェクションの５〜７日後に５分間にわたって１２００ｒｐｍで遠心分離した後、１０分間にわたって４０００ｒｐｍで２回目の遠心分離を行なうことによってこのならし培地を回収し、４℃に維持した。
分泌された抗体をプロテインＡアフィニティ・クロマトグラフィによって精製した後、陽イオン交換クロマトグラフィを実施し、最後に緩衝液をリン酸緩衝化生理食塩水に置き換えてサイズ排除クロマトグラフィをSuperdex 200カラム（アマーシャム・ファルマシア社）で実施し、純粋なモノマーＩｇＧ１抗体を回収した。分光光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度から抗体の濃度を推定した。２５ｍＭのリン酸カリウムと、１２５ｍＭの塩化ナトリウムと、１００ｍＭのグリシンからなる溶液（ｐＨ６．７）の中で抗体を製剤化した。
抗体発現ベクターをＧｎＴ−IIIグリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターと同時に、又はＧｎＴ−III発現ベクター＋ゴルジマンノシダーゼII発現ベクターと同時にトランスフェクトすることにより、ヒト化抗体の糖改変された変異体を産生させた。この糖改変された抗体を精製し、糖改変されていない抗体に関して上に説明したのと同様にして製剤化した。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖を以下に説明するようにしてＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。
オリゴ糖の分析
ＰＮＧアーゼFという酵素を用いた消化によってオリゴ糖を抗体から放出させた。抗体は、ＰＶＤＦ膜に固定化されているか、溶液中に存在している。
放出されたオリゴ糖を含有する得られた消化溶液は、直接ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析用のサンプルにするか、EndoHグリコシダーゼでさらに消化させた後に、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析のためのサンプルにした。
ＰＶＤＦ膜に固定化された抗体のためにオリゴ糖を放出させる方法
ＰＶＤＦ（Immobilon P、ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）膜を用いて製造した９６ウエルのプレートのウエルを１００μｌのメタノールで湿らせた後、マルチスクリーン真空マニホールド（ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を真空にしてその液体をＰＶＤＦ膜を通過させた。ＰＶＤＦ膜を３００μｌの水で３回洗浄した。次にウエルを５０μｌのRCM緩衝液（８Mの尿素、３６０ｍＭのトリス、３．２ｍＭのEDTA、ｐＨ８．６）で洗浄した。１０μｌのＲＣＭ緩衝液を含有するウエルに３０〜４０μgの抗体を装填した。真空にすることによってウエルの中の液体を膜を通過させた後、膜を５０μｌのRCM緩衝液で２回洗浄した。０．１Mのジチオトレイトールを含むRCMを５０μｌ添加し、３７℃にて１時間にわたってインキュベーションすることによってジスルフィド架橋を還元した。
還元の後、真空にしてジチオトレイトール溶液をウエルから除去した。ウエルを３００μｌの水で３回洗浄した後、０．１Mのヨード酢酸を含むRCM緩衝液５０μｌを添加して室温にて暗所で３０分間にわたってインキュベートすることにより、システイン残基のカルボキシメチル化を実施した。
カルボキシメチル化の後、ウエルを真空にし、次いで３００μｌの水で３回洗浄した。次に、ポリビニルピロリドン３６０の１％水溶液１００μｌを室温にて１時間にわたってインキュベートすることによってＰＶＤＦ膜をブロックし、エンドグリコシダーゼの吸着を阻止した。次に、わずかに真空にした後、３００μｌの水で３回洗浄することによって阻止試薬を除去した。
２．５ｍＵのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（組換Ｎ−グリコシダーゼ、グライコ社、ノヴァト、カリフォルニア州）と０．１ｍＵのシアリダーゼ（グライコ社、ノヴァト、カリフォルニア州）を添加することによってＮ結合型オリゴ糖を放出させて残っている可能性のある帯電したあらゆる単糖残留物を除去し、２０ｍＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ７．０）の中に最終体積２５μｌが含まれているようにした。消化を３７℃にて３時間にわたって実施した。
抗体のためにオリゴ糖を溶液中に放出させる方法
２ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）の中で４０〜５０μgの抗体を２．５ｍＵのＰＮＧアーゼＦ（グライコ社、米国）と混合して最終体積を２５μｌにし、この混合物を３７℃にて３時間にわたってインキュベートした。
ＰＮＧアーゼFによって放出されたオリゴ糖をエンドグリコシダーゼHを用いて消化させ、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳの中性オリゴ糖のピークに混成切断オリゴ糖構造を割り当てる方法
次に、ＰＮＧアーゼＦによって放出されたオリゴ糖をエンドグリコシダーゼH（ＥＣ ３．２．１．９６）を用いて消化させた。EndoHを用いた消化のため、１５ｍＵのEndoH（ロッシュ社、スイス国）を、ＰＮＧアーゼＦ消化産物に添加して最終体積を３０μｌにした後、この混合物を３７℃にて３時間にわたってインキュベートした。EndoHは、Ｎ結合型オリゴ糖のキトビオース・コアのＮ−アセチルグルコサミン残基の間を切断する。この酵素は、オリゴマンノースと大半の混成タイプのグリカンだけを消化できるが、複合体タイプのオリゴ糖は加水分解されない。
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳのサンプル調製
放出されたオリゴ糖を含有する酵素消化産物を室温にてさらに３時間にわたってインキュベートした。酢酸を添加して最終濃度を１５０ｍＭにした後、マイクロ−バイオ−スピン・クロマトグラフィ・カラム（バイオラド社、スイス国）に装填した０．６ｍｌの陽イオン交換樹脂（AG50W-X8樹脂、水素形態、１００〜２００メッシュ、バイオラド社、スイス国）を通過させ、陽イオンとタンパク質を除去した。得られたサンプル１μｌをステンレス鋼製の標的プレートに付着させ、そのプレート上で１μｌのｓＤＨＢマトリックスと混合した。ｓＤＨＢマトリックスは、２ｍｇの２,５−ジヒドロキシ安息香酸＋０.１ｍｇの５−メトキシサリチル酸を含む１ｍｌのエタノール／１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液（１：１（ｖ／ｖ））に溶かすことによって調製した。サンプルを風乾させ、０.２μｌのエタノールを添加し、最後にサンプルを空気中で再結晶させた。
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ
質量スペクトルを得るのに用いたＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析器は、Voyager Elite（パースペクティブ・バイオ系ズ社）であった。この装置は直線配置で作動させ、加速電圧を２０ｋＶ、遅延時間を８０ナノ秒にした。イオンの質量を特定するのに基準オリゴ糖を用いた外部較正を利用した。２００個のレーザー・ショットからのスペクトルを合計して最終スペクトルを得た。
抗原結合アッセイ
フローサイトメトリーに基づくアッセイを利用し、Ａ４３１ヒト上皮細胞系列のヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、文献ではＨＥＲ−１又はＥｒｂＢ１とも呼ばれる）に対する精製したモノマー・ヒト化抗体変異体の結合をテストした。（例えばＡ４３１ヒト細胞系列からの）２００,０００個の細胞を含む１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳと５ｍＭのEDTAを含有するＰＢＳ）を５ｍｌのポリスチレン製チューブに移し、１０倍に濃縮した抗ＥＧＦＲ抗体（一次抗体）サンプル（最終濃度１〜５０００ｎｇ／ｍｌ）又はＰＢＳだけを２０μｌ添加した。サンプルを軽く混合した後、チューブを暗所で４℃にて３０分間にわたってインキュベートした。その後、サンプルをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、３００×ｇで３分間かけてペレット化した。上清を吸引して除去し、細胞を５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液の中に採取し、２μｌの二次抗体（抗Ｆｃ特異的Ｆ（ａｂ’）2−FITC断片（ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラボラトリーズ、米国））を添加し、チューブを４℃にて３０分間にわたってインキュベートした。サンプルをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液の中に採取してフローサイトメトリーによって分析した。結合は、抗体の濃度に対して蛍光の幾何学的平均をプロットすることによって調べた。
ＦｃγＲIIIＡを発現しているＣＨＯ細胞系列に対するモノマーＩｇＧ１糖変異体の結合
電気穿孔（２８０V、９５０μF、０．４cm）により、ＦｃγＲIIIＡ−Ｖａｌ１５８のα鎖とγ鎖をコードする発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。６μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加することによってトランスフェクタントを選択し、１０6個の細胞につき１０μｌのFITC共役抗ＦｃγＲIIIＡ ３G８モノクローナル抗体（BDバイオサイエンシーズ社、アルシュヴィル／スイス国）を用いたＦＡＣＳによって安定なクローンを分析した。ＦｃγＲIIIＡ−Ｖａｌ１５８を発現しているＣＨＯ細胞にＩｇＧ１を結合させた。簡単に説明すると、抗ＦｃγＲIIIＡ ３G８Ｆ（ａｂ’）2断片（アンセル社、ベイポート、ミネソタ州／米国）を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加して抗体糖変異体（３μｇ／ｍｌ）の結合と競合させた。抗体変異体の結合を示す蛍光の強度をFACSCalibur（BDバイオサイエンシーズ社、アルシュヴィル／スイス国）で測定した。
ＡＤＣＣアッセイ
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、Histopaque-1077（シグマ・ディアグノスティクス社、セント・ルイス、MO63178、米国）を製造者の指示に実質的に従って用いて調製した。簡単に説明すると、ヘパリン処理した注射器を用いて健康なボランティアから静脈血を採取した。その血をＰＢＳ（Ｃａ2+又はＭｇ2+を含まない）を用いて１：０．７５〜１．３に希釈し、Histopaque-1077の上で層状にした。その勾配をこわさないようにして室温（ＲＴ）にて４００×ｇで３０分間にわたって遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する内側相を回収し、ＰＢＳ（２つの勾配からの細胞ごとに５０ｍｌ）で洗浄し、ＲＴにて３００×ｇで３０分間にわたって遠心分離することによって回収した。ペレットをＰＢＳの中に再び懸濁させた後、ＰＢＭＣをカウントし、ＲＴにて２００×ｇで３０分間にわたって遠心分離することによって２回目の洗浄を行なった。次に、その後の手続きのため、細胞を適切な培地の中に再び懸濁させた。
ＡＤＣＣアッセイで用いたエフェクターと標的の比は、ＰＢＭＣに関しては２５：１、ＮＫ細胞に関しては１０：１であった。エフェクター細胞を適切な濃度のＡＩＭ−Ｖ培地の中で調製し、丸底の９６ウエルのプレートの各ウエルに５０μｌを添加した。標的細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭの中で増殖させたヒトＥＧＦＲ発現細胞（例えばＡ４３１、ＥＢＣ−１、ＬＮ２２９のいずれか）であった。標的細胞をＰＢＳの中で洗浄し、カウントし、ＡＩＭ−Ｖの中に３０万個／ｍｌの割合で再び懸濁させ、マイクロウエル１つにつき１００μｌ中に３０,０００個の細胞となるようにした。抗体をＡＩＭ−Ｖの中に希釈し、あらかじめプレートに入れてある標的細胞に５０μｌを添加し、ＲＴにて１０分間にわたって結合させた。次にエフェクター細胞を添加し、５％ＣＯ2を含む湿潤な雰囲気下でプレートを３７℃にて４時間にわたってインキュベートした。標的細胞の死は、損傷した細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を細胞傷害検出キット（ロッシュ・ディアグノスティックス社、ロートクロイツ、スイス国）を用いて測定することによって調べた。４時間インキュベートした後、プレートを８００×ｇで遠心分離した。各ウエルからの上清１００μｌを新しい透明な平底の９６ウエルのプレートに移した。キットからの１００μｌの着色基質緩衝液を各ウエルに添加した。着色反応のＶmax値は、ＥＬＩＳＡ読取装置において４９０ｎｍで少なくとも１０分間にわたってSOFTmax PROソフトウエア（モレキュラー・デバイシーズ社、サニーヴェイル、カリフォルニア州94089、米国）を用いることによって決定した。自発的なLDHの放出は、標的細胞とエフェクター細胞だけを含有していて抗体なしウエルから測定した。最大放出は、標的細胞と１％トリトンＸ−１００だけを含有するウエルから決定した。特異的抗体を媒介とした殺傷の割合は、（（ｘ − ＳＲ）／（ＭＲ − ＳＲ））×１００から計算した（ただしｘは、特異的抗体の１つの濃度でのＶmaxの平均値であり、ＳＲは自発的放出のＶmaxの平均値であり、ＭＲは最大放出のＶmaxの平均値である）。
［実施例２］
結果と考察
抗体変異体Ｉ−ＨＨＡ、Ｉ−ＨＨＢ、Ｉ−ＨＨＣ、ＩＨＬＡ、I−ＨＬＢ、Ｉ−ＨＬＡ１、Ｉ−ＨＬＡ２、Ｉ−ＨＬＡ３、Ｉ−ＨＬＡ４、Ｉ−ＨＬＡ５、Ｉ−ＨＬＡ６、Ｉ−ＨＬＡ７、Ｉ−ＨＬＡ８、Ｉ−ＨＬＡ９、Ｉ−ＨＨＤ、Ｉ−ＨＨＥ、Ｉ−ＨＨＦ、Ｉ−ＨＨＧがキメラＩＣＲ６２軽鎖又はヒト化ＩＣＲ６２軽鎖（Ｉ−ＫＡ、Ｉ−ＫＢ、Ｉ−ＫＣ）と複合体化したもののヒトＥＧＦ−受容体への結合と、親キメラ抗体ｃｈ−ＩＣＲ６２のヒトＥＧＦ−受容体への結合を比較することで、全ての抗体が、１桁の範囲内で似たＥＣ50の値を持つことがわかる。Ｉ−ＨＨＡだけが、著しく小さな結合活性を有する（図２参照）。図１は、個々のキメラＩＣＲ６２（ｃｈ−ＩＣＲ６２）ポリペプチド鎖をヒト化ＩＣＲ６２構造体Ｉ−ＨＨＣ及びＩ−ＫＢとそれぞれ組み合わせたときの機能的活性を示している。この実験では、ｃｈ−ＩＣＲ６２の軽鎖又は重鎖、又は両方の鎖を上記のヒト化構造体で置き換えた。その結果から、ＶＨ／ＶＬ界面の形成がマウス抗体とヒト化構造体のどちらでもうまくいくように見える。
図２に示すように、ヒト化重鎖Ｉ−ＨＨＡは、Ｉ−ＫＡ軽鎖とＩ−ＫＢ軽鎖のいずれを用いても結合活性を回復することができなかった。Ｉ−ＨＨＡはＩ−ＫＡとＩ−ＫＢの両方に結合するため、本発明の発明者は、Ｉ−ＨＨＡの重鎖は抗原の結合において機能していないと結論した。図１と図２に図３を組み合わせると、軽鎖構造体Ｉ−ＫＡ、Ｉ−ＫＢ、Ｉ−ＫＣは、マウスの対応物と区別できない結合の挙動を示すことがわかる。変異体Ｉ−ＫＣはいかなる復帰突然変異も持たないことに加え、ＣＤＲ１が一部ヒト化されているため、残基２４〜２９はヒト・アクセプタ配列に由来するものが可能である（既出のＶＫ１、Ａ３０）。
Ｉ−ＨＨＡ、Ｉ−ＨＨＢ、Ｉ−ＨＨＣの中では、最後の２つの変異体だけが十分に結合した（図２と図３）。Ｉ−ＨＨＡの配列を分析することにより、この挙動にとって重要である可能性のあるＬｙｓ３３、Ｈｉｓ３５、Ｔｙｒ５０という３つのアミノ酸残基が明らかになった。Ｌｙｓ３３がチロシンで置換された構造体は優れた結合を示し、Ｔｙｒ５０がトリプトファンで置換された構造体も優れた結合を示した。これら２つの残基がそれぞれアラニンとグリシンで置換された場合だけ、結合が失われた。Ｉ−ＨＨＣはＩ−ＨＨＢよりも優れた結合を示さなかったため、本発明の発明者は、残基Ａｓｎ６０、Glu６１、Ｌｙｓ６４、Ｓｅｒ６５はマウス起源である必要はないこと、又はこれらの残基をＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙでそれぞれ置換できることを結論した。この手続きにより、ＣＤＲ２がよりヒト化されている構造体になる。なぜならアミノ酸位置６０〜６５はKabatのＣＤＲの定義の一部だが、この抗体のためにマウス・ドナー残基をグラフトする必要はないからである。
図４と図５は、一連の構造体１−ＨＬＡ１、１−ＨＬＡ２、１−ＨＬＡ３、１−ＨＬＡ４、１−ＨＬＡ５、１−ＨＬＡ６の比較である。最高の結合は、構造体ｃｈ−ＩＣＲ６２、１−ＨＬＡ１、１−ＨＬＡ２で観察され、ＥＣ50の値は約３００ｎｇ／ｍｌであった。他の構造体はこの値の２倍であるため、結合活性がわずかに小さい。このデータからの第１の結論として、Kabat ＣＤＲ１の中ではＬｙｓ３３ＴｙｒとＩｌｅ３４Ｍｅｔという置換が許容されたことが挙げられる。これら２つの位置はKabatの定義によるＣＤＲ１の中に位置するが、（配列分析ではなく構造分析に基づいた）ChothiaのＣＤＲの境界の外側である。したがってＣＤＲ１の後半では、少なくともある程度無差別な混合が許される。
第２の結論として、ＣＤＲ２の中では、残基Ａｓｎ６０とGlu６１が非ドナー残基によって上記のように置換されていることに加え、Kabat ＣＤＲの中でＡｓｎ６０Ｓｅｒ、Glu６１Ｐｒｏ、Ｌｙｓ６２Ｓｅｒという非ドナー置換も許されたことが挙げられる。これらの残基は、ＦＲ３アクセプタ配列として用いたヒト生殖系列ＩＧＨＶ５−５１アクセプタ配列に由来していた。構造体１−ＨＬＡ３と１−ＨＬＡ４は、１−ＨＬＡ１と１−ＨＬＡ２とはＰｈｅ２７Ｔｙｒ復帰突然変異が除去されている点だけが異なっていて、構造体１−ＨＬＡ３と１−ＨＬＡ４の両方とも、その親構造体と比べて親和性を失っている。したがって１−ＨＬＡ１、１−ＨＬＡ２、１−ＨＬＡ３、１−ＨＬＡ４、１−ＨＬＡ５、１−ＨＬＡ６を比較した第３の結論として、抗原の結合には、Ｐｈｅ２７が、ＣＤＲ１のループ・コンフォメーションを変化させることを通じて直接又は間接に関与していることが挙げられる。
変異体Ｉ−ＨＬＡ５とＩ−ＨＬＡ６は、天然の状態でＰｈｅ２７が存在する別の生殖系列アクセプタ配列（すなわちＩＧＨＶ１−５８）によって置換されたＩ−ＨＬＡ１とＩ−ＨＬＡ２のＦＲ１をそれぞれ有する。これは、他のいくつかの突然変異（すなわちＶａｌ２Ｍｅｔ、Ａｌａ９Ｐｒｏ、Ａｌａ１６Ｔｈｒ）を同時に導入することによってしか実現できないであろう。そうすることにより、Ｐｈｅ２７を（再）導入することの有利な効果が再び失われた。
１−ＨＬＡ７構造体を調べ、１−ＨＬＡ６構造体の重鎖ＣＤＲ１とＣＤＲ２に含まれる追加のドナー残基を回復すると、ＩＣＲ６２と比べて完全な結合活性が回復するか否かを明らかにした。図６からわかるように、そうはならなかった。
図７と図８に示してあるように、追加の２つの構造体Ｉ−ＨＬＡ８とＩ−ＨＬＡ９をテストし、ｃｈ−ＩＣＲ６２と比べて完全な結合活性を実現できるか否かを調べた。Ｉ−ＨＨＢ構造体から出発し、ＦＲ１領域を、Chothia ＣＤＲ１領域の中で相同性が最大のＦＲ１領域で置換した。Ｉ−ＨＬＡ８構造体はＩＧＨＶ１−５８配列のＦＲ１を持ち、Ｉ−ＨＬＡ９はＩＧＨＶ５−５１のＦＲ１領域を持つ。どちらの構造体も、少なくともｃｈ−ＩＣＲ６２抗体と同じ程度に抗原と結合した。Ｉ−ＨＬＡ８構造体は実際にはより優れている可能性があり、ＥＣ50が１／２であった。Ｉ−ＨＬＡ８構造体は、Ｉ−ＨＬＡ５構造体及びＩ−ＨＬＡ６構造体と同じＦＲ１配列を持つため、同じ非ドナー残基（すなわちＶａｌ２Ｍｅｔ、Ａｌａ９Ｐｒｏ、Ａｌａ１６Ｔｈｒ）を持つ。これは、これら非ドナー残基の存在が結合に対してマイナスの効果を持たないことを示唆している。Ｉ−ＨＬＡ５とＩ−ＨＬＡ６に起こる有利でない突然変異が、ＶＨ１ ＦＲ１とＶＨ５ ＦＲ３をペアにした組み合わせから生じる。これは、同じＶＨファミリーのＦＲ１とＦＲ３を持つことによって打ち消せる可能性がある。
図８には、ＣＤＲの中に非ドナー残基を含有する構造体を示す。したがってこれらの構造体は、ＣＤＲの中がさらにヒト化される。なぜなら、これら構造体のために選択したヒト・フレームワーク領域の中に非ドナー残基が存在するからである。Ｉ−ＨＨＥ（Ｈｉｓ３５Ｓｅｒ）、Ｉ−ＨＨＦ（Ｔｈｒ５８Ａｓｎ）、Ｉ−ＨＨＧ（Ｓｅｒ５７Ａｌａ）という構造体はどれも、（Ｉ−ＨＨＢ構造体と比べて）ヒト化されたＣＤＲ１又はＣＤＲ２に１つの残基を有する。Ｉ−ＨＨＤ構造体（Ｇｌｙ２４Ａｌａ）も調べた。Ｉ−ＨＨＦは結合が少なかった。これはＴｈｒ５８の重要性を示している。Kabat ＣＤＲ残基５８とは対照的に、アミノ酸５７は置換に対してより寛容である。なぜならＳｅｒ５７Ａｌａ突然変異は明らかに結合に対して影響を持たないからである（図８）。
ＩＧＨＶ５−５１のＦＲ３領域が構造体１−ＨＬＡ１と１−ＨＬＡ２において有望な特性を示しているように見えたこと、そして同じ生殖系列配列のＦＲ１が１−ＨＬＡ９構造体において有用であると証明されたことが理由で、ＩＧＨＶ５−５１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３を設計してループ・グラフティングのためのアクセプタとしてまとめて用いた。
ヒト化ＩＣＲ６２構造体に含まれる残基の分析のまとめ
ＶＬ：Kabat２位：Ｉｌｅがおそらく必要。
Kabat７１位：Ｉｌｅ又はＰｈｅが許容される。
ＶＨ：２４位：Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒが許容される。
２６位：Ｇｌｙが許容される。
２９位：Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒが許容される。
３４位：Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒが許容される。
７１位：Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒが許容される。
９４位：Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａが許容される。
ＡＤＣＣ実験の結果
図９には、キメラＩＣＲ６２抗体の様々な糖形態とヒト化変異体Ｉ−ＨＬＡ４について抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を比較した結果を示す。異なる糖形態は、糖改変されていない（ＷＴ）、糖形態１（Ｇ１）、糖形態２（Ｇ２）いずれかの記号によって示す。「Ｇ１」は、ＧｎＴIIIとの同時発現による抗体の糖改変を意味する。「Ｇ２」は、ＧｎＴIII及びＭａｎIIとの同時発現による抗体の糖改変を意味する。「ＷＴ」は、糖改変されていない抗体を意味する。ヒト化された全ての構造体の軽鎖はＩ−ＫＣ変異体であり、記号で明示はしなかった。
異なる２通りの糖改変法によってキメラのヒト化抗体の力価と効果を向上させた。ｃｈ−ＩＣＲ６２構造体は、それぞれ野生型又は糖形態に関してＩ−ＨＬＡ４よりもわずかに優れていた。図４からわかるように、抗原に対するこれら２つの抗体の親和性を比較すると、ｃｈ−ＩＣＲ６２はＥＣ50の値が１／２であった。親和性のこの差は、ここでは効果の差に反映されている。
図１０には、ヒト化ＩＣＲ６２抗体構造体Ｉ−ＨＨＢとＩＨＬＡ７の糖改変されていない形態（「野生型」）とＧ２糖形態について、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を比較して示す。同じ抗体を２つの異なる標的細胞系列に適用した。図１０Ａでは標的細胞系列ＬＮ２２９を使用した。図１０Ｂでは細胞系列Ａ４３１を使用した。Ａ４３１細胞は、ＬＮ２２９細胞よりも明らかに抗体を媒介とした細胞の殺傷の影響を受けやすい。より重要なことに、糖改変によって両方の抗体の力価が増大した。この効果は、Ｉ−ＨＨＢよりもＩＨＬＡ７で顕著であるように見えた。Ｉ−ＨＨＢの最大抗体濃度における細胞殺傷の割合は、ＬＮ２２９標的細胞系列を使用したとき、Ｇ２糖改変された変異体を導入することによって約３０％から約４０％へとシフトさせることができた。Ａ４３１細胞系列を使用したときには、この値は明らかに変化しなかった。この挙動は、Ｉ−ＨＬＡ７抗体とはまったく異なっていた。最大抗体濃度での標的細胞の殺傷は、Ｇ２糖改変された変異体を導入することにより、ＬＮ２２９細胞では約１０％から約５０％へとシフトし、Ａ４３１細胞では約４０％から約７０％へとシフトした。この場合、Ｉ−ＨＬＡ７では糖改変されていない抗体で活性がＩ−ＨＨＢよりも小さいにもかかわらず、活性のランキングは糖改変された抗体に関して逆転する。図１１と図１２にも、キメラＩＣＲ６２とヒト化ＩＣＲ６２抗体構造体Ｉ−ＨＨＢ及びＩ−ＨＬＡ７について、糖改変されていない形態（ＷＴ）とＧ２糖形態の比較を示す。
［実施例３］
カニクイザルに静脈内投与（ボーラス）することによる毒性の予備研究 − 生物分析
はじめに
糖改変された抗ＥＧＦＲのアッセイ
この生物分析では、以下に示すプロトコルに記載したようにして抗ＥＧＦＲ（この抗ＥＧＦＲは、重鎖Ｉ−ＨＨＢ遺伝子と軽鎖Ｉ−ＫＣ遺伝子を有する抗体発現ベクターを上記のようにしてトランスフェクトした培地中の哺乳動物の細胞から産生させた後、上記のようにして精製した、糖改変された組換抗ＥＧＦＲ抗体である）を静脈内投与（ボーラス）した後のカニクイザルからのサンプルに含まれる抗ＥＧＦＲの測定について説明する。サルの血清サンプルを合計で７８個、使用するまで約−２０℃で凍結させて保管した。
抗ＥＧＦＲの決定に用いる生物分析法では、ＥＬＩＳＡ法を利用して抗ＥＧＦＲの血清濃度を測定した。正確さと不正確さに関する許容基準は±２０％（±２５％低ＱＣ）に設定した。
材料と方法
目的：本研究の目的は、カニクイザルに静脈内投与（ボーラス）して８週間の回復期間が経過した後のグリコ−ｍＡｂ（抗ＥＧＦＲ）の全身毒性能力を評価することである。
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投与レベルを選択する根拠
ヒトの研究では１．５〜７．５ｍｇ／ｋｇが想定範囲である（７．５ｍｇ／ｋｇは、ヒトでの同様の化合物についての対応する投与量である）。
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組織学
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イムノアッセイの手続き
プレートをウエル１つにつき１００μｌのコーティング溶液（５μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（サルの吸着されたＩｇＧ、ザ・バインディング・サイト社、イギリス国）を１．４９５μｌの炭酸水素塩緩衝液（０．０５M、ｐＨ９．６）に添加したもの）で覆い、室温にて約２時間にわたってインキュベートした。プレートをウエル１つにつき４００μｌの洗浄溶液（ＰＢＳ（シグマ・ケミカル社、イギリス国）、０．０１％（ｖ／ｖ）トリトン−Ｘ１００（シグマ・ケミカル社、イギリス国））で３回洗浄した後、乾燥させた。
アッセイ用緩衝液（１％ｗ／ｖ ＢＳＡ、シグマ・ケミカル社、イギリス国）をウエル１つにつき２００μｌ添加し、室温にて約１時間にわたってインキュベートした。プレートをウエル１つにつき４００μｌの洗浄溶液で３回洗浄した後、乾燥させた。
較正基準である品質の対照（ＱＣ）及び／又はサンプルをウエル１つにつき１００μｌ添加し、室温にて約２時間にわたってインキュベートした後、プレートをウエル１つにつき４００μｌの洗浄溶液で３回洗浄した後、乾燥させた。
共役体溶液（６μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ κ−HRP共役体（ベシル・ラボラトリーズ社、米国）を１２ｍｌのアッセイ用緩衝液に添加したもの）をウエル１つにつき１００μｌ添加し、室温にて約１時間にわたってインキュベートした。プレートをウエル１つにつき４００μｌの洗浄溶液で３回洗浄した後、乾燥させた。
トリメチルベンジジン（ＴＭＢ：ヨーロッパ・バイオプロダクツ社、イーリ、イギリス国）をウエル１つにつき１００μｌ添加した。プレートを覆い、室温にて約１５分間にわたってインキュベートした。次に１００μｌの停止溶液（０．５MのHCl、フィッシャー社、イギリス国）を各ウエルに添加した。DYNATECH MRXマイクロプレート読み取り機（メトラー・インスツルメンツ社、イギリス国）を用いて吸光度を４５０ｎｍで読み取った（基準フィルタ６３０ｎｍ）。
結果と考察
試験サンプルの分析
上述のプロトコルに従って作製した７８個のサル血清サンプルについて、抗ＥＧＦＲの濃度をイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。その結果を以下の表１９〜表２１に示す。
Figure 2010500020
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［実施例４］
カニクイザルへの静脈内（ボーラス）投与による予備的毒性研究 − トキシコキネティックス
要約
２８日間の毒性研究の１日目、８日目、１５日目、２２日目にカニクイザルの３つの群（各群にオス１匹とメス１匹）に抗ＥＧＦＲを静脈内ボーラス投与し、その動物の全身への抗ＥＧＦＲの曝露を評価した。最初の投与量を決定した後、イムノアッセイ法によってサンプル中の抗ＥＧＦＲの血清濃度を６７２時間まで集めた。設計濃度−時間データの薬物動態分析によって以下の薬物動態パラメータが得られた。
Figure 2010500020
抗ＥＧＦＲの血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ168）と１日目の投与レベルの関係を以下に示す。
Figure 2010500020
サルでの抗ＥＧＦＲの全身曝露の速度と程度（ＡＵＣ168によって特徴づけられる）は、１日目の１．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ／回の範囲の投与量では投与量を増やすのにほぼ比例して大きくなったが、４．５〜１２ｍｇ／ｋｇ／回の範囲の投与量では比例関係を超えて増加した。最大投与量（１２ｍｇ／ｋｇ／回）では、ＡＵＣ168は、線形関係で予測されるよりも約２．８倍大きかった。
メスのサルに対する抗ＥＧＦＲの全身曝露の程度（ＡＵＣ168）は、一般に、オスのサルにおける曝露と同様であった。
静脈内投与を繰り返した後の投与前の抗ＥＧＦＲの血清濃度は、１回だけ投与した後の値よりも一般に大きかった。これは、研究期間を通じて血清中に抗ＥＧＦＲが蓄積したことを示している。
最終半減期を全ての動物について十分に推定することはできなかったが、推定できた場合には３２．５〜６３．１時間の範囲であり、オスの動物では投与量とともに大きくなるように見えた。オスとメスのサルにおいて、抗ＥＧＦＲの全血清クリアランスは１．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ／回の範囲で投与量とは独立であるように見えたが、最高投与レベルでは減少した。
結論として、カニクイザルにおける抗ＥＧＦＲの全身曝露の程度は、静脈内毒性研究の１日目の１．５〜１２ｍｇ／ｋｇ／回の範囲の投与量では非線形（投与量に依存した）動態によって特徴づけられるように見えた。抗ＥＧＦＲの投与量を４．５ｍｇ／ｋｇ／回を超えて増やすと線形関係で予測されるよりも大きな全身曝露になるようである。これは、抗ＥＧＦＲの除去能力が限られたプロセスである可能性があることと整合性がある。
それに加え、この研究から、オスとメスのサルで抗ＥＧＦＲの全身曝露には一般に差がないという証拠と、静脈内投与を繰り返した後に蓄積したことの証拠も得られた。
はじめに
予備毒性研究の１日目、８日目、１５日目、２２日目に、１匹のオスと１匹のメスのカニクイザルからなる３つの群に静脈内ボーラス投与によって１．５、４．５、１２ｍｇ／ｋｇ／回の投与レベルで抗ＥＧＦＲを投与した。１日目に投与した後、１、４、１２、２４、７２、１２０時間の時点で各動物から血液サンプルを採取した。さらに、８日目、１５日目、２２日目の投与前と投与してから１時間後と、１日目に最初に投与してから６７２時間後にサンプルを採取した。分離した血清を約−２０℃で凍結させた後、イムノアッセイ法によって抗ＥＧＦＲの血清濃度を分析した。
略号
ＡＵＣ：時間を無限大まで取ったときの血清濃度−時間曲線下面積
ＡＵＣ168：１６８時間という投与期間の間の血清濃度−時間曲線下面積
ＢＬＱ：定量化限界未満
ｃａ：約
ＣＬ：全血清クリアランス
Ｃmax：最大血清濃度
Ｆ：メス
ｋ：最終速度定数
Ｍ：オス
ｔ1/2：最終半減期
Ｔmax：Ｃmaxになる時間
Ｖｓｓ：定常状態における分布の体積
研究で用いる抗体
増加したＦｃ−ＦｃγＲIII受容体結合親和性と増加したＡＤＣＣにするためにＦｃ操作された抗ＥＧＦＲ抗体であるグリコ−ｍＡｂ（抗ＥＧＦＲ）を上記のようにして産生させ、精製し、特徴を明らかにした。簡単に説明すると、Ｉ−ＨＨＢ抗体重鎖を発現させるためのプラスミドＤＮＡベクターと、Ｉ−ＫＣ抗体軽鎖を発現させるためのプラスミドＤＮＡベクターと、ＧｎＴ−IIIを発現させるためのプラスミドＤＮＡベクターと、ＭａｎIIを発現させるためのプラスミドＤＮＡベクターをＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時にトランスフェクトすることによって抗体を産生させた。上記のトランスフェクション法を線形にスケールアップし、Ｔフラスコではなくローラー・ボトルの中でトランスフェクト細胞の単層を培養した。精製プロセスには、上記のサイズ排除クロマトグラフィ・ステップの直前にＱセファロース・マトリックスを通過させる追加の陽イオン交換クロマトグラフィ・ステップが含まれていた。
酵素によって放出されたＦｃ由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ質量分析を利用し、Ｆｃ操作した抗体のグリコシル化パターンを上記のようにして分析した。このオリゴ糖のプロファイルを図２３に示す。
ヒトＥＧＦＲとサルＥＧＦＲに対する結合を、Ａ４３１細胞とＣＯＳ−７細胞をそれぞれ使用した上記のような全細胞の結合と、ＦＡＣＳに基づく分析とによって調べた。結合曲線をそれぞれ図２４と図２５に示す。
ヒトＦｃγＲIIIが表面で発現するように操作したＣＨＯ細胞への全細胞の結合と、ＦＡＣＳに基づく分析とを利用し、実施したＦｃ操作の結果として得られる増加したＦｃγＲIII受容体結合を上記のようにして調べた。結果を図２６に示す。さらに、操作した抗体は、Ｆｃ操作の程度が、他の文献（Ferrara, C.他、J. Biol. Chem.、2005年12月5日；印刷前の電子公開版）に記載されている「グリコ−２」抗体と同等である（Ｆｃ−オリゴ糖の７５％がフコシル化されていないタイプ）。Ｆｃ操作されたかかる抗体は、ヒトＦｃγＲIIIに対する結合親和性がＦｃ操作されていない標準的な抗体と比べて５０倍まで増加している（平衡解離定数が、ヒト受容体の１５８Ｖ多形変異体に関しては１５ｎＭ、１５８Ｆ多形変異体に関しては１５０ｎＭであるのに対し、Ｆｃ操作されていないヒトＩｇＧ１抗体に結合した同じ受容体変異体に関してはそれぞれ７５０ｎＭと５０００ｎＭである）。
２種類の標的細胞系列、すなわちＡ５４９ヒト肺がん細胞と、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１カニクイザル・ケラチノサイト細胞を使用し、ＡＤＣＣを上記のようにして測定した。結果をそれぞれ図２７と図２８に示す。
データ処理
コンピュータ・プログラムWinNonlin Pro、バージョン３.３（ファーサイト社、米国）を用いて薬物動態パラメータを計算した。
この研究の一部として提供される血清濃度は、全て有効数字４桁又は小数点以下３桁で示した。薬物動態パラメータに関しては、ＡＵＣ168、ＣＬ、Ｖｓｓは有効数字４桁、kは小数点以下４桁、ｔ1/2は小数点以下１桁で示した。
ＢＬＱであった値（０．１９５μｇ／ｍｌ未満）は薬物動態の処理ではゼロとして入力した。
トキシコキネティックス
抗ＥＧＦＲの最大血清濃度（Ｃmax）とそれが起こる時点（Ｔmax）は観測値であった。１６８時間の投与間隔における抗ＥＧＦＲの血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ168）は、直線的台形規則によって推定した。ＡＵＣ168値の計算では、時刻ゼロにおける抗ＥＧＦＲの血清濃度は、最初の２つのサンプリング時刻に基づき、対数−直線回帰分析を利用して逆外挿によって推定した。しかし血清濃度がこの期間に低下しない場合には、時刻ゼロにおける血清濃度は、最初のサンプリング時点での濃度と等しいと見なした。時間を無限大まで取ったときの血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、以下の式：
ＡＵＣ ＝ＡＵＣ168 ＋ Ｃｌａｓｔ／k
によって推定した。ただしＣｌａｓｔは、定量化可能な最後のサンプリング点における予想血清濃度であり、kは最終速度定数である。
最終速度定数（ｋ）は、濃度の対数値と時間の間の回帰直線にフィットさせることによって推定した。ｋの推定値が信頼できるとして受け入れられるためには、以下の条件が必要とされた。
１．最終データ点は、（目視によると）一本の直線のまわりにランダムに分布しているように見えた。
２．回帰のために最低で３つのデータ点が利用できた。
３．回帰係数は≧０．９５であり、説明される分散の割合は≧０．９０であった。
４．回帰のために選択したデータ点が中に含まれている間隔は、半減期そのものの少なくとも２倍であった。
最終半減期（ｔ1/2）をln ２／ｋとして計算した。全血清クリアランス（ＣＬ）を投与量／ＡＵＣとして計算した。定常状態における分布の体積（Ｖｓｓ）を投与量・ＡＵＭＣ／ＡＵＣ２として計算した。蓄積（R）を、最初の投与（１日目）の後の最低濃度に対する最後の投与（２２日目）の後の最低濃度の比、すなわち６７２時間後の血清濃度／１６８時間後の血清濃度（８日目の投与前）として計算した。
結果と考察
研究の１日目、８日目、１５日目、２２日目に静脈内ボーラス投与によって１．５、４．５、１２ｍｇ／ｋｇ／回の投与レベルで抗ＥＧＦＲを投与した後のオスとメスのサルの抗ＥＧＦＲの全身曝露を評価するため、毒性研究の期間中、１日目に投与してから１２０時間後までと；８日目、１５日目、２２日目の投与前と投与してから１時間後と；１日目に投与してから６７２時間後に血液サンプルを採取した。投与後１６８時間までのサンプル中の抗ＥＧＦＲの血清濃度を表２７〜表２９に示してあり、平均血清濃度−時間プロファイルを図１８と図１９に示す。
抗ＥＧＦＲの薬物動態パラメータを表５０に示す。ＡＵＣ168の値は以下のようにまとめられる。
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最大血清濃度が生じる時間（Ｔmax）は、一般に、投与してから１時間後（最初のサンプリング時点）だが、メス２Ｆ４６２（４．５ｍｇ／ｋｇ）と３Ｆ６１２（１２ｍｇ／ｋｇ）では投与してから４時間後（第２のサンプリング時点）であった。しかしこれら２匹のメスのどちらにおいても、投与してから４時間後の濃度は投与してから１時間後の濃度とよく似ているため、おそらくアッセイの変動範囲内であったろう。したがってＴmaxの見かけ上の遅れには意味がなさそうである。
あとに続く投与前の抗ＥＧＦＲの血清濃度は、２２日目のオス２Ｍ４６１以外の全ての動物で定量化可能であったため、一般に、動物は、投与間隔の間の期間を通じて定量化可能な濃度の抗ＥＧＦＲに連続的に曝露されていた。
抗ＥＧＦＲの血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ168）と１日目の投与量の関係を以下に示す。
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サルにおける抗ＥＧＦＲの全身曝露の速度と程度（ＡＵＣ168によって特徴づけられる）は、１日目の１．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ／回の範囲の投与量では投与量を増やすのにほぼ比例して大きくなったが、４．５〜１２ｍｇ／ｋｇ／回の範囲の投与量では比例関係を超えて増加した。最大投与量（１２ｍｇ／ｋｇ／回）では、ＡＵＣ168は、線形関係で予測されるよりも約２．８倍大きかった（図２０）。
メスのサルにおける抗ＥＧＦＲの全身曝露の程度（ＡＵＣ168）は、一般に、オスのサルにおける曝露と同様であった。
静脈内投与を繰り返した後、投与前の抗ＥＧＦＲの血清濃度は、１回だけ投与した後の値（図２１〜図２２）よりも一般に大きかった。これは、研究期間を通じて血清中に抗ＥＧＦＲが蓄積したことを示している。この蓄積は、最大投与レベルを除いて一般にオスよりもメスのほうが少なかった。１日目の最初の投与後の最低濃度に対する２２日目の最終投与（１日目に投与してから６７２時間後）の後の最低（投与前）濃度の比を以下の表２６に示す。
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１日目の抗ＥＧＦＲの最終速度定数（ｋ）と対応する最終半減期（ｔ1/2）を表３０に示す。最終半減期を全ての動物で十分に推定することはできなかったが、推定できた場合には３２．５〜６３．１時間の範囲であり、オスの動物では投与量とともに大きくなるように見えた。オスとメスのサルにおいて、抗ＥＧＦＲの全血清クリアランスは、１．５〜４．５ｍｇ／ｋｇ／回の範囲で投与量とは独立であるように見えたが、最高投与レベルでは減少した。
結論として、カニクイザルにおける抗ＥＧＦＲの全身曝露の程度は、静脈内毒性研究の１日目の１．５〜１２ｍｇ／ｋｇ／回の範囲の投与量では非線形（投与量に依存した）動態によって特徴づけられるように見えた。抗ＥＧＦＲの投与量を４．５ｍｇ／ｋｇ／回を超えて増やすと線形関係で予測されるよりも大きな全身曝露になるようである。これは、抗ＥＧＦＲの除去能力が限られたプロセスである可能性があることと整合性がある。
それに加え、この研究から、オスとメスのサルで抗ＥＧＦＲの全身曝露には一般に差がないという証拠と、静脈内投与を繰り返した後に蓄積したことの証拠も得られた。
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血液化学と血液学
１日目、８日目、１５日目、２２日目にグリコ−ｍＡｂ抗ＥＧＦＲを静脈内ボーラス注射したカニクイザルの大腿静脈から血液サンプルを採取した。一晩にわたって絶食させた後、投与に使用しない腕からサンプルを採取した（死亡した個体ではない）。サンプル（抗凝固剤としてリチウムヘパリンを用いた）について、治療前と、２回目の投与の３日後と、終了時に、以下のパラメータを調べた：
アルカリホスファターゼ
アラニンアミノ−トランスフェラーゼ
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ビリルビン − 合計
尿素
クレアチニン
グルコース
コレステロール − 合計
トリグリセリド
ナトリウム
カリウム
塩化物
カルシウム
リン
全タンパク質
タンパク質の電気泳動図
アルブミン／グロブリンの比
正常なカニクイザルの平均血液化学分析データを表３１に示す。
Figure 2010500020
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１日目、８日目、１５日目、２２日目にグリコ−ｍＡｂ抗ＥＧＦＲを静脈内ボーラス注射したカニクイザルの大腿静脈から末梢血の血液学的分析用サンプルを採取した。一晩にわたって絶食させた後、投与に使用しない腕からサンプルを採取した（死亡した個体ではない）。サンプルについて、治療前（ＰＴ）と、２回目の投与の３日後（Ｄ１１）と、終了時（ＴＥＲＭ）に、以下のパラメータを調べた：
１）抗凝固剤としてEDTAを使用
ヘマトクリットヘモグロビン濃度（Ｈｃｔ）
赤血球数（ＲＢＣ）
網状赤血球（Ｒｅｔｉｃ）
平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）
平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）
平均赤血球容積（ＭＣＶ）
全白血球数（ＷＢＣ）
白血球分画
血小板数（Ｐｌｔ）
血液形態の異常
赤血球大小不同症
小赤血球症
大赤血球症
血色素減少症
血色素増加症
２）抗凝固剤としてクエン酸塩を使用
プロトロンビン時間（ＰＴ）
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）
正常なカニクイザルの平均血液学的分析データを表３２に示す。
Figure 2010500020
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サルに関する個々の血液化学的累積値を以下の表３３ａ〜表３３ｈに示す。
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サルに関する個々の血液学的累積値を以下の表３４ａ〜表３４ｌに示す。
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微視的症状 − 治療に関係する知見
１２ｍｇ／ｋｇ／日を投与されたメスのサルで胆管周囲炎（胆管の周囲の結合組織の炎症）が報告されたが、この症状は他のどのメスとオスのサルでも見られなかった。この知見は、グリコ−ｍＡｂ（抗ＥＧＦＲ）を用いた治療と関係している可能性があるが、このように少数の動物では有意であるか否か確かでない。他のあらゆる知見は同じであり、毒物学的に有意でないと判断した。
巨視的症状と組織病理学
テストした全ての動物に関する組織病理学のまとめを以下の表３５に示す。
Figure 2010500020
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全ての動物に関する個別の知見
個々の動物に関する病理所見を以下の表３６に示す。
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それぞれのカニクイザルの体重を以下の表３７に示す。
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結論
注射部位には治療の効果はなく、どの臨床的知見もグリコ−ｍＡｂ（抗ＥＧＦＲ）を用いた治療と関係しているとは判断されなかった。体重変化は通常予想される範囲内であった。巨視的検査では治療と関係すると見なされる知見はなく、動物の臓器の重量は通常予想される範囲内であった。結論として、１．５、４．５、１２ｍｇ／ｋｇ／回での治療はよく許容され、全身毒性の明らかな知見はなかった。
ＥＧＦＲは様々な正常組織（肝臓、腎臓、皮膚等）の表面に存在するため、腫瘍特異的標的ではない。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する抗ＥＧＦＲ抗体が以前にヒトに投与されていて、許容できる副作用プロファイルを示したことがわかっている（Vanhoefer, U.他、Clin. Oncol.、2004年1月1日、第22巻(1)、175〜184ページ；Needle, M.N.、Semin. Oncol.、2002年10月、第29巻（5補巻14）、55〜60ページ）。明らかに、ＡＤＣＣが著しく大きくなった抗ＥＧＦＲ抗体をヒトその他の哺乳動物に投与すると重要な正常組織（肝臓、腎臓、皮膚等）に大きな殺傷活性が現われる可能性があるため、かかる投与には大きな不安があろう。驚くべきことに、本発明の発明者は、Ｆｃが上記のように操作されていてＡＤＣＣ活性が１０００倍まで増加したかかる抗ＥＧＦＲ抗体の投与によって大きな毒性に至らないことを見いだした。抗体の濃度は、少なくとも４週間にわたって１μｇ／ｍｌを超えた状態が維持された（何匹かの動物では１００μｇ／ｍｌを超えた）。かかる曝露レベルは抗体療法では一般的である。この研究における抗体の最大ＡＤＣＣは、１μｇ／ｍｌの濃度ですでに実現される。ヒトのがん患者に抗ＥＧＦＲ抗体（親ラットＩＣＲ６２抗体）を４０ｍｇと１００ｍｇの投与量で１回だけ投与すると、インビボで腫瘍が特異的な標的とされることがわかっている（Modjtahedi, H.他、Br. J. Cancer、1996年1月、第73巻(2)、228〜235ページ）。カニクイザルのエフェクター細胞はＦｃγＲIII受容体との相同性が大きく、Ｆｃ操作された抗体（と、糖改変によってＦｃ領域の非フコシル化オリゴ糖のレベルを大きくした抗体）を用いるとＡＤＣＣを増加させることがわかった。ＡＤＣＣの増加レベルは、ヒト・エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）で観察されるレベルに非常に近い。
まとめると、Ｆｃを操作して増加したＦｃ−ＦｃγＲIII結合親和性と増加したＡＤＣＣを持つようにした抗ＥＧＦＲ抗体を哺乳動物に投与して少なくとも４週間の期間にわたって血清１ｍｌ当たり抗体が１μgを超える濃度にすると、深刻な毒性なしに、インビボの標的細胞に抗体が大量に蓄積することに通常伴う薬の曝露を実現することができる。
本発明の抗原結合分子の毒性は、上記の方法及び／又はパラメータ（例えば血液化学の値、組織病理学の指標等）のいずれかを利用して、又は当業者に知られている任意の手段によって、測定及び／又は決定することができる。臨床的に深刻な毒性レベルとは、当業者の間では、臨床投与される抗体に関して米国食品医薬品局が一般に許可しているレベルを超えるレベルであると理解される。
［実施例５］
軽鎖ＣＤＲの変更：特異性決定残基の決定
上記の方法を利用し、ラットＩＣＲ６２のＣＤＲの様々な位置のアミノ酸残基をコードする配列がヒト生殖系列可変遺伝子配列からの対応するアミノ酸残基で置換されたＩ−ＫＣ軽鎖可変領域構造体（配列番号４６及び配列番号４５）から、抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域変異体を生成させた。こうすることによって特異性決定残基を同定できた。この特異性決定残基は、上に説明したように抗原と相互作用する残基であり、この変更によって結合親和性に影響を与えることができる。表３８に、Ｉ−ＫＣ軽鎖可変領域構造体（配列番号４５）のＣＤＲ内の置換を示す。
Figure 2010500020
同定された置換された残基は全て、関係するヒト生殖系列配列のWが配列番号４５の３２位のＹで置換されたＹ３２Ｗという交換を除き、ヒトＶＫ ６アクセプタ配列に由来していた。
それぞれのＩ−ＫＣ変異構造体（Ｉ−ＫＣ１〜Ｉ−ＫＣ９）を、構造体Ｉ−ＨＨＤ（配列番号１６及び配列番号１５）を含んでなる重鎖可変領域とペアにし、これまでの実施例で説明した方法に従ってアッセイを実施した。Ａ４３１標的細胞において、ＥＧＦＲに対する結合親和性を構造体Ｉ−ＫＣ１〜Ｉ−ＫＣ９とＩ−ＫＣ構造体（配列番号４６及び配列番号４５）で比較した（図２９と図３０）。図２９からわかるように、残基３４を対応するヒト配列に変える（Ｎ３４Ｇ）と、結合親和性がわずかに低下した（ＥＣ50の値が１０倍になった）。図３０からわかるように、残基５０をヒト残基に変える（Ｎ５０Ｔ）とやはり結合親和性がわずかに低下した。したがってこれらのデータから、Ｉ−ＫＣ抗ＥＧＦＲ軽鎖構造体のＮ３４とＮ５０は、抗原の結合に関与する特異性決定残基であることがわかる。他の全ての構造体は、Ｉ−ＫＣ構造体（配列番号４５）に匹敵する結合活性を保持していた（図２９と図３０）。
これらのデータに基づくと、ヒト化プロセスのＣＤＲループ・グラフティングに関し、ＣＤＲの所定の部分だけが必要とされる。例えばＩ−ＫＣ構造体のＣＤＲ１に関しては、２４位〜２７位と２９位〜３３位はドナー（例えばＩＣＲ６２）からグラフトされる必要がない。ＣＤＲ３では、F９４残基が、ラットＩＣＲ６２抗体と、対応する最も近いヒト生殖系列（ＶＫ１ ６）との間の唯一の違いであり、結合親和性を維持する際にそれをヒト残基に変えることが許される。したがって適切なアクセプタ配列ＶＨとＪを選択することにより、ＣＤＲ３を完全にヒト化することができる（例えばＣＤＲ３ではループ・グラフティングが必要とされない）。
したがってこれらのデータから、軽鎖は、ＥＧＦＲに特異的なキメラ（ヒト化）重鎖構造体とペアにすると、ドナーからの特異性決定残基が維持されている軽鎖と比べて結合親和性がわずかに低下するとはいえ、完全にヒト化して、しかもＥＧＦＲに対する結合特異性を相変わらず保持できることがわかる。
［実施例６］
重鎖ＣＤＲの変更：特異性決定残基の決定
上記の方法を利用し、ラットＩＣＲ６２のＣＤＲの様々な位置のアミノ酸残基をコードする配列がヒト生殖系列可変遺伝子配列（例えばＶＨ１ １０、ＩＧＨＶ５ ５１）の対応するKabat位からのアミノ酸残基で置換されたＩ−ＨＨＤ軽鎖可変領域構造体（配列番号１６及び配列番号１５）から、抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域変異体を生成させた。表３９に、Ｉ−ＨＨＤ重鎖可変領域構造体（配列番号１５）のＣＤＲ内の置換を示す。
Figure 2010500020
それぞれのＩ−ＨＨＤ変異構造体（Ｉ−ＨＨＤ−１〜I−ＨＨＤ−１１）を、構造体Ｉ−ＫＣ（配列番号４６及び配列番号４５）を含んでなる軽鎖可変領域とペアにし、これまでの実施例で説明した方法に従ってアッセイを実施した。Ａ４３１標的細胞において、ＥＧＦＲに対する結合親和性を構造体Ｉ−ＨＨＤ−１〜I−ＨＨＤ−１１とＩ−ＫＣ構造体（配列番号４６及び配列番号４５）で比較した（図３１と図３２）。図３１と図３２からわかるように、Chothia ＣＤＲ１の２７位の残基の置換（Ｐ２７Ｇ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−１）と２８位の残基の置換（Ｔ２８Ｓ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−２）、ならびにKabat ＣＤＲ１の３１位の残基の置換（Ｄ３１Ｅ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−４）では、抗原の結合に影響が見られなかった（すなわちＩ−ＨＨＤ親構造体と比べて抗原の結合が維持された）。同様に、Kabat ＣＤＲ２の５２ａ位の残基の置換（Ｐ５２ａＡ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−６）、５３位の残基の置換（Ｎ５３Ｉ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−７）、５７位の残基の置換（Ｓ５７Ａ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−９）、ならびにKabat ＣＤＲ３の１０２位の残基の置換（Ａ１０２Ｖ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−１１）でも、抗原の結合に影響が見られなかった。
図３１からわかるように、Chothia ＣＤＲ１の残基２９を対応するヒト残基に変え（Ｆ２９１）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−３）、Kabat ＣＤＲ２の残基５２を対応するヒト残基に変える（Ｎ５２Ｔ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−５）と、Ｉ−ＨＨＤ親構造体と比べてそれぞれ結合親和性がわずかに低下した（ＥＣ50の値が２〜３倍になった）。
図３２からわかるように、Kabat ＣＤＲ２の残基５６を対応するヒト残基に変え（Ｙ５６Ｔ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−８）、Kabat ＣＤＲ３の残基１００ｂを対応するヒト残基に変える（Ｖ１００ｂＧ）（構造体Ｉ−ＨＨＤ−１０）と、Ｉ−ＨＨＤ親構造体と比べてそれぞれ結合親和性が著しく低下した（ＥＣ50の値が１０倍になった）。
したがってこれらのデータから、Ｉ−ＨＨＤ抗ＥＧＦＲ重鎖構造体のＦ２９とＮ５２が、抗原の結合にわずかに影響を与える特異性決定残基であることがわかる。これらのデータから、Ｉ−ＨＨＤ抗ＥＧＦＲ重鎖構造体のＹ５６とＶ１００ｂが、抗原の結合に大きな影響を与える特異性決定残基であることもわかる。
あらゆる刊行物（教科書、論文誌の論文、GenBank、他の配列データベース入力、公開された出願、本明細書で言及した特許出願）は、個々の刊行物又は特許出願が特別かつ個別に指示されて参考として組み込まれているかのようにして、援用により本明細書に組み込まれる。

Claims (61)

  1. ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体の１又は２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１又は２以上の特異性決定残基（ＳＤＲ）と、異種ポリペプチドに由来する配列とを含んでなる抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、ＥＧＦＲに特異的に結合するとともに、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号１２１からなるグループの中から選択される配列を有さないＡＢＭ。
  2. 前記１又は２以上のＳＤＲが、１又は２以上の重鎖ＣＤＲ内に存在する、請求項１記載のＡＢＭ。
  3. 前記１又は２以上の重鎖ＳＤＲが、Kabat２９位のフェニルアラニン、Kabat５２位のアスパラギン、Kabat５６位のチロシン、及びKabat１００ｂ位のバリンからなる群より選択される、請求項２記載のＡＢＭ。
  4. 前記１又は２以上の重鎖ＳＤＲが、Kabat５６位のチロシン及びKabat１００ｂ位のバリンを含んでなる、請求項３記載のＡＢＭ。
  5. 前記１又は２以上の重鎖ＳＤＲが、Kabat２９位のフェニルアラニン、Kabat５２位のアスパラギン、Kabat５６位のチロシン、Kabat１００ｂ位のバリンである、請求項３記載のＡＢＭ。
  6. 前記１又は２以上のＳＤＲが、１又は２以上の軽鎖ＣＤＲ内に存在する、請求項１記載のＡＢＭ。
  7. 前記１又は２以上の軽鎖ＳＤＲが、Kabat５０位のアスパラギンを含んでなる、請求項６記載のＡＢＭ。
  8. 前記１又は２以上の軽鎖ＳＤＲが、Kabat３４位のアスパラギン及びKabat５０位のアスパラギンを含んでなる、請求項６記載のＡＢＭ。
  9. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも２つ含んでなる、請求項１記載のＡＢＭ。
  10. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも３つ含んでなる、請求項９記載のＡＢＭ。
  11. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも４つ含んでなる、請求項９記載のＡＢＭ。
  12. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも５つ含んでなる、請求項９記載のＡＢＭ。
  13. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲ、或いは、ＣＤＲの少なくともＳＤＲを有するその変異体又は切断形態を、少なくとも６つ含んでなる、請求項９記載のＡＢＭ。
  14. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲが、１又は２以上のアミノ酸位置に置換を有し、前記ＡＢＭが、未置換のＡＢＭと比べて結合活性を保持する、請求項９〜１３の何れか一項に記載のＡＢＭ。
  15. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲが、特異性決定残基以外の任意の位置に置換を有する、請求項１４記載のＡＢＭ。
  16. ラットＩＣＲ６２抗体のＣＤＲが、特異性決定残基以外の全ての位置に置換を有する、請求項１５記載のＡＢＭ。
  17. 前記ＣＤＲが、Chothia重鎖ＣＤＲ１のKabat２７位、２８位、２９位、Kabat重鎖ＣＤＲ１の３１位、Kabat重鎖ＣＤＲ２のKabat５２位、５２ａ位、５３位、５７位、Kabat重鎖ＣＤＲ３のKabat１０２位のうちの１又は２以上に置換を有する、請求項１５記載のＡＢＭ。
  18. 前記ＣＤＲが、Kabat軽鎖ＣＤＲ１のKabat３０位、３２位、Kabat軽鎖ＣＤＲ２のKabat５１位、５２位、５３位、５６位、Kabat軽鎖ＣＤＲ３のKabat９４位のうちの１又は２以上に置換を有する、請求項１７記載のＡＢＭ。
  19. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約１０〜約０．００１倍未満の割合で増加する、請求項１〜１８の何れか一項に記載のＡＢＭ。
  20. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約１０〜約１倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  21. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約１０〜約５倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  22. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約５〜約０．１倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  23. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約５〜約２倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  24. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約３〜約１倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  25. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約２倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  26. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約１倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  27. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約０．１倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  28. 結合に関するＥＣ50濃度が、未置換のＡＢＭと比べて、約０．００１倍未満の割合で増加する、請求項１９記載のＡＢＭ。
  29. 配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを含んでなる、請求項１記載のＡＢＭ。
  30. ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体の変化した重鎖ＣＤＲと、１又は２以上のヒト生殖系列可変領域遺伝子配列に由来する重鎖フレームワーク領域とを含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする単離ポリペプチドであって、前記変化した重鎖ＣＤＲが、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５２、５２ａ、５３、５４、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００ａ、１０１、１０２からなる群から選択されるKabat位、又はこれらの任意の組み合わせの位置に１又は２以上のアミノ酸置換を有するとともに、前記ポリペプチドが抗原結合分子の一部として、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、ポリペプチド。
  31. 前記変化した重鎖ＣＤＲが、Kabat２７位、２８位、２９位、３１位、５２位、５３位、５４位、５８位、１０２位に１又は２以上のアミノ酸置換を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
  32. 前記変化した重鎖ＣＤＲが、Kabat２７位、２８位、３１位、５３位、５４位、５８位に１又は２以上のアミノ酸置換を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
  33. 前記変化した重鎖ＣＤＲが、Kabat及びChothia重鎖ＣＤＲ内のＳＤＲを除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
  34. 前記変化した重鎖ＣＤＲが、Kabat及びChothia重鎖ＣＤＲ内のKabat位置２９位、５２位、５６位、１００ｂ位を除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
  35. ラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体の変化した軽鎖ＣＤＲと、１又は２以上のヒト生殖系列可変領域遺伝子配列に由来する軽鎖フレームワーク領域とを含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする単離ポリペプチドであって、変化した軽鎖ＣＤＲが、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、５１、５２、５３、５４、５５、５６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７からなる群から選択されたKabat位、又はこれらの任意の組み合わせの位置に１又は２以上のアミノ酸置換を有するとともに、前記ポリペプチドが抗原結合分子の一部として、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、ポリペプチド。
  36. 変化した軽鎖ＣＤＲが、Kabat及びChothia軽鎖ＣＤＲ内のＳＤＲを除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する、請求項３５記載のポリペプチド。
  37. 変化した軽鎖ＣＤＲが、Kabat及びChothia軽鎖ＣＤＲ内のKabat位置３４位及び５０位を除くあらゆる位置にアミノ酸置換を有する、請求項３５記載のポリペプチド。
  38. 請求項３０〜３７の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
  39. 配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、及び配列番号１３８からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが抗原結合分子の一部として、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
  40. 配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが抗原結合分子の一部として、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
  41. 請求項３８〜４０の何れか一項に記載のポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた宿主細胞。
  42. 請求項３８〜４０の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
  43. 複製クローニングベクターである、請求項４２記載のベクター。
  44. 発現ベクターである、請求項４２記載のベクター。
  45. 請求項４２〜４４の何れか一項に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
  46. ヒトＥＧＦＲに結合するラットＩＣＲ６２モノクローナル抗体と競合し得る抗原結合分子を作製する方法であって、
    （ａ）請求項４１又は請求項４５に記載の宿主細胞を培地中、抗原結合分子をコードする１又は２以上のポリヌクレオチドを発現させる条件下で培養する工程；及び
    （ｂ）前記抗原結合分子を回収する工程を含んでなる方法。
  47. 請求項３０〜３７の何れか一項に記載のポリペプチドを含んでなるＡＢＭ。
  48. Ｆｃ領域を含んでなる、請求項１〜２９、４７の何れか一項に記載のＡＢＭ。
  49. Ｆｃ領域が糖改変され、変化したオリゴ糖構造を有する、請求項４８記載のＡＢＭ。
  50. Ｆｃ領域におけるフコース残基数が、対応する非糖改変ＡＢＭと比べて少ない、請求項４９記載のＡＢＭ。
  51. Ｆｃ領域が糖改変されることにより、対応する非糖改変ＡＢＭと比べて、エフェクター機能が増大し、又はＦｃ受容体結合親和性が増大している、請求項４８記載のＡＢＭ。
  52. 対象に治療有効量を投与した場合に、臨床的に有意なレベルの毒性を引き起こさない、請求項１〜２９、４６〜５１の何れか一項に記載のＡＢＭ。
  53. 請求項１〜２９、４６〜５２の何れか一項に記載のＡＢＭと、医薬的に許容し得る担体とを含んでなる組成物。
  54. 対象においてＥＧＦＲを発現する細胞を標的とする方法であって、その対象に請求項５３記載の組成物を投与する工程を含んでなる方法。
  55. 前記細胞がＥＧＦＲを過剰に発現している、請求項５４記載の方法。
  56. 前記対象におけるＥＧＦＲ媒介性細胞シグナル伝達の遮断により治療し得る病気を治療するために実施される、請求項５４記載の方法。
  57. ＥＧＦＲ媒介性細胞シグナル伝達の遮断により治療し得る病気を治療するための医薬の製造に使用される、請求項１〜２９、４６〜５２の何れか一項に記載のＡＢＭ。
  58. ＥＧＦＲ媒介性細胞シグナル伝達の遮断により治療し得る病気を治療するための医薬の製造における、請求項１〜２９、４６〜５２の何れか一項に記載のＡＢＭの使用。
  59. 前記病気が細胞増殖疾患である、請求項５４記載の方法、請求項５７記載のＡＢＭ、又は請求項５８記載の使用。
  60. 前記細胞増殖疾患ががんである、請求項５９記載の方法、ＡＢＭ、又は使用。
  61. 前記がんが、乳がん、膀胱がん、頭部及び頸部のがん、皮膚がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、直腸がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍からなる群から選択される、請求項６０記載の方法、ＡＢＭ、又は使用。
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