BRPI0716639B1 - Molécula de ligação ao antígeno, seu método de produção, composição e seus usos. - Google Patents

Abstract

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, COMPOSIÇÃO E SEUS USOS A presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antígeno (ABMs). Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos, primatizados ou humanizados específicos para EGFR humano. Ainda, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico codificando tais ABMs, e vetores e células hospedeiras compreendendo tais moléculas de ácido nucleico. A invenção refere-se ainda a métodos para produção das ABMs da invenção e a métodos de uso dessas ABMs no tratamento de doença. Ainda, a presente invenção refere-se a ABMs com glicosilação modificada tendo propriedades terapêuticas aperfeiçoadas, incluindo anticorpos com ligação de receptor Fc aumentada e função efetora aumentada.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antígeno (ABMs). Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos, primatizados ou humanizados específicos para receptor de fator de crescimento epidermal humano (EGFR). Ainda, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico codificando tais ABMs e vetores e células hospedeiro compreendendo as ditas moléculas de ácido nucleico. A invenção refere-se ainda a métodos para produção das ABMs da invenção e a métodos de uso dessas ABMs em tratamento de doença. Ainda, a presente invenção refere-se a ABMs com glicosilação modificada tendo propriedades terapêuticas aperfeiçoadas, incluindo anticorpos com ligação a receptor Fc aumentada e função efetora aumentada.

Técnica Anterior EGFR e Anticorpos Anti-EGFR

Receptor de fator de crescimento epidermal humano (também conhecido como HER-1 ou Erb-B1 e referido aqui como "EGFR") é um receptor de transmembrana de 170 kDa codificado pelo protooncogene c- erbB e exibe atividade de tirosina cinase intrínseca (Modjtahedi e outros, Br. J. Cancer73:228-235 (1996); Herbst e Shin, Cancer94:1593-1611 (2002)). O lançamento do banco de dados SwissProt P00533 provê a sequência de EGFR. Há também isoformas e variantes de EGFR (por exemplo, transcritos de RNA alternativos, versões truncadas, polimorfismos, etc) incluindo, mas não limitado a, aqueles identificados pelos números de lançamento do banco de dados Swissprot P00533-1, P00533-2, P-00533-3 e P-00533-4. EGFR é conhecido se ligar a ligantes incluindo fator de crescimento epidermal (EGF), fator-a de crescimento transformante (TGF-a), anfirregulina, EGF de ligação à heparina (hb-EGF), betacelulina e epirregulina (Herbst e Shin, Cancer94:1593-1611 (2002); Mendelsohn e Baselga, Oncogene 19:6550-6565 (2000)). EGFR regula vários processos celulares através de cursos de transdução de sinal mediados por tirosina-cinase, incluindo, mas não limita¬do a, ativação de cursos de transdução de sinal que controlam proliferação, diferenciação celular, sobrevivência celular, apoptose, angiogênese, mitogê- nese e metástase (Atalay e outros, Ann. Oncology14:1346-1363 (2003); Tsao e Herbst, Signal 4:4-9 (2003); Herbst e Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi e outros, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).

Superexpressão de EGFR foi relatada em várias condições ma¬lignas humanas, incluindo cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, mama, ovário, cólon, próstata e rim. (Atalay e outros, Ann. Oncology14:1346-1363 (2003); Herbstand Shin, Cancer94:1593-1611 (2002) Modjtahedi e outros, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). Em muitas dessas condições, a superexpressão de EGFR se relaciona a ou está asso¬ciada com prognóstico pobre dos pacientes. (Herbst e Shin, Cancer 94:1593- 1611 (2002); Modjtahedi e outros, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). EGFR é também expresso nas células de tecidos normais, particularmente dos teci¬dos epiteliais da pele, fígado e trato intestinal, embora em níveis geralmente menores do que em células malignas (Herbst e Shin, Cancer 94/1593-1611 (2002)).

Anticorpos monoclonais não-conjugados (mAbs) podem ser re¬médios úteis para o tratamento de câncer, conforme demonstrado pela apro¬vação da U.S. Food and Drug Administration de Trastuzumabe (Herceptin®, Genentech Inc.) para o tratamento de câncer de mama avançado (Grillo- Lopez, A. J. e outros, Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Then 21:309-18 (1999)), Rituximabe (Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, e Genentech Inc., San Francisco, CA), para o tratamento de célula B positiva para CD20, linfoma de grau baixo ou de Não-Hodgkin foli- cular, Gentuzumabe (Mylotarg®, Celltech/Wyeth-Ayerst) para o tratamento de leucemia mielóide aguda com relapso e Alemtuzumabe (CAMPATH®, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para o tratamento de leucemia lin- focítica crônica de célula B. O sucesso desses produtos está não apenas em sua eficácia, mas também em seus perfis de segurança notáveis (Grillo- Lopez, A.J. e outros, Semin. Oncol.26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther.27:309-18 (1999)). Apesar da obtenção desses fármacos, há atu¬almente um grande interesse na obtenção de atividade de anticorpo especí¬fico maior do que o que tipicamente dado por terapia de mAb não- conjugada.

Os resultados de vários estudos sugerem que mecanismos de¬pendentes de receptor Fc contribuem substancialmente para a ação de anti¬corpos citotóxicos contra tumores e indica que um anticorpo ótimo contra tumores se ligaria de preferência à ativação de receptores Fc e minimamen¬te ao parceiro inibidor FcyRIIB. (Clynes, R. A. e outros, Nature Medicine 6(4/443-446 (2000); Kalergis, A.M. e Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195(12):1653-1659 (Junho 2002). Por exemplo, os resultados de pelo menos um estudo sugerem que polimorfismo no receptor FcyRllla, em particular, está fortemente associado com a eficácia de terapia de anticorpo. (Cartron, G., e outros, Blood99(3/754-757 (Fevereiro, 2002)). Este estudo mostrou que pacientes homozigotos para FcyRllla têm uma resposta melhor para Rituximabe do que pacientes heterozigotos. Os autores concluíram que a resposta superior foi devido à melhor ligação in vivo do anticorpo a FcyRllla, que resultou em melhor atividade ADCC contra células de linfoma (Cartron, G., e outros, Blood 99(3):754-757 (Fevereiro 2002)).

Várias estratégias para se direcionar a EGFR e bloquear cursos de sinalização de EGFR foram relatadas. Inibidores de tirosina cinase de molécula pequena tal como gefitimibc, erlotinibe e CI-1033 bloqueiam a au- tofosforilação de EGFR na região tirosina cinase intracelular, deste modo inibindo eventos de sinalização a jusante (Tsao e Herbst, Signal4:4-9 (2003)). Anticorpos monoclonais, por outro lado, se direcionam à porção ex- tracelular de EGFR, que resulta em bloqueio de ligante se ligando e então inibe os eventos a jusante tal como proliferação celular (Tsao e Herbst, Sig¬nal4:4-9 (2003)).

Vários anticorpos monoclonais de murino foram gerados, os quais atingem tal bloqueio in vitroe que foram avaliados quanto à sua habili- dade em afetar crescimento de tumor em modelos de xenoenxerto de ca¬mundongo (Masui e outros, Cancer Res. 46:5592-5598 (1986); Masui e ou¬tros, Cancer Res. 44:1002-1007 (1984); Goldstein e outros, Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318 (1995)). Por exemplo, EMD 55900 (EMD Pharmaceuti¬cals) é um anticorpo monoclonal anti-EGFR de murino que foi criado contra linhagem de célula de carcinoma epidermóide humano A431 e foi testado em estudos clínicos de pacientes com carcinoma de célula escamosa avan¬çado da laringe e hipofaringe (Bier e outros, Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252:433-9 (1995)). Ainda, os anticorpos monoclonais de rato ICR16, ICR62 e ICR80, que se ligam ao domínio extracelular de EGFR, foram mostrados ser eficazes na inibição da ligação de EGF e TGF-a ao receptor. (Modjtahedi e outros, Int. J. Cancer 75:310-316 (1998)). O anticorpo monoclonal de murino 425 é outro mAb que foi criado contra a linhagem de célula de carcinoma A431 humano e foi verificado se ligar a um epítopo de polipeptideo no domí¬nio externo do receptor de fator de crescimento epidermal humano. (Murthy e outros, Arch. Biochem. Biophys. 252(2/549-560 (1987). Um problema po¬tencial com o uso de anticorpo de murino em tratamentos terapêuticos é que anticorpos monoclonais não-humanos podem ser reconhecidos pelo hospe¬deiro humano como uma proteína estranha; então, injeções repetidas de tais anticorpos estranhos podem levar à indução de resposta imune levando a reações de hipersensibilidade perigosas. Para anticorpos monoclonais com base em murino, isto é frequentemente referido como resposta de Anticorpo Anticamundongo Humana ou resposta "HAMA" ou uma resposta Anticorpo Anti-rato Humana ou resposta "HARA". Ainda, esses anticorpos "estranhos" podem ser atacados pelo sistema imune do hospedeiro de modo que eles são, na prática, neutralizados antes de atingirem seu sítio-alvo. Ainda, anti¬corpos monoclonais não-humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais de murino) tipicamente não têm funcionalidade efetora humana, isto é, eles são incapazes, inter alia, de mediar lise dependente de complemento ou lisar células-alvo humanas através de toxidez celular dependente de anticorpo ou fagocitose mediada pelo receptor Fc. Anticorpos quiméricos compreendendo porções de anticorpos de duas ou mais espécies diferentes (por exemplo, camundongo e humano) foram desenvolvidos como uma alternativa a anticorpos "conjugados". Por exemplo, a Patente U.S. N° 5.891.996 (Mateo de Acosta dei Rio e outros) discute um anticorpo quimérico de camundongo/humano, R3, direcionado contra EGFR, e a Patente U.S. N° 5.558.864 discute geração de formas quiméricas e humanizadas do anti-EGFR de murino MAb 425. Também, IMC-C225 (Erbitux®; ImClone) é um anticorpo monoclonal anti-EGFR de ca¬mundongo/humano quimérico (com base no anticorpo monoclonal de ca¬mundongo M225, que resultou em respostas HAMA em testes clínicos hu¬mano) que foi relatado demonstrar eficácia antitumor em vários modelos de xenoenxerto humano. (Herbst e Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). A eficá¬cia de IMC-C225 foi atribuída a vários mecanismos, incluindo inibição de eventos celulares regulados por cursos de sinalização de EGFR, e possi¬velmente por atividade de toxidez celular dependente de anticorpo aumenta¬da (ADCC) (Herbst e Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). IMC-C225 foi tam¬bém usado em testes clínicos, incluindo em combinação com radioterapia e quimioterapia (Herbst e Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). Recentemente, Abgenix, Inc. (Fremont, CA) desenvolveu ABX-EGF para terapia de câncer. ABX-EGF é um anticorpo monoclonal anti-EGFR integralmente humano (Yang e outros, Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38: 17-23 (2001)).

Glicosilação de Anticorpo

O Componente de oligossacarídeo pode significantemente au¬mentar as propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteína te¬rapêutica, incluindo estabilidade física, resistência a ataque de protease, in¬terações com o sistema imune, farmacocinética e atividade biológica especí¬fica. Tais propriedades podem depender não apenas da presença ou ausên¬cia, mas também da estrutura específica, de oligossacarídeos. Algumas ge¬neralizações entre estrutura de oligossacarídeo e função de proteína podem ser feitas. Por exemplo, certas estruturas de oligossacarídeo fazem a media¬ção de liberação rápida da glicoproteína da corrente sanguínea através da interação com proteínas de ligação de carboidrato especificas, enquanto outras podem ser encontradas por anticorpos e disparam reações imunes indesejadas. (Jenkins e outros, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).

Células de mamífero são os hospedeiros preferidos para produ¬ção de glicoproteínas terapêuticas, devido à sua capacidade de glicosilar proteínas na forma mais compatível para aplicação humana. (Cumming e outros, Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins e outros, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Bactérias muito raramente glicosilam proteínas, e tal co¬mo outros tipos de células comuns, tal como leveduras, fungos filamentosos, células de inseto e planta, dão padrões de glicosilação associados com libe¬ração rápida da corrente sanguínea, interações imunes indesejadas e em alguns casos específicos, atividade biológica reduzida. Dentre outras células de mamífero, células de ovário de hamster Chinês (CHO) têm sido mais ge¬ralmente usadas durante as duas últimas décadas. Em adição a dar padrões de glicosilação adequados, essas células permitem geração consistente de linhagens de célula clonal altamente produtoras, geneticamente estáveis. Elas podem ser culturadas para altas densidades em biorreatores simples usando meio livre de soro, e permitem o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reproduzíveis. Outras células de animais geralmente usadas in-cluem células de rim de hamster bebê (BHK), células de mieloma de camun¬dongo NS0- e SP2/0. Mais recentemente, produção a partir de animais transgênicos foi também testada. (Jenkins e outros, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).

Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidrato em posi¬ções conservadas nas regiões constantes de cadeia pesada, com cada isó¬topo possuindo uma disposição distinta de estruturas de carboidrato N- ligados, que variavelmente afeta a montagem, secreção ou atividade funcio¬nal da proteína. (Wright, A. e Morrison, S. L, Trends Biotech.75:26-32 (1997)). A estrutura do carboidrato N-ligado anexado varia consideravelmen¬te, dependendo do grau de processamento, e pode incluir oligossacarídeos complexos com muita manose, multiplamente ramificados bem como biante- nários. (Wright, A. e Morrison, S. L., Trends Biotech.75:26-32 (1997)). Tipi¬camente, há processamento heterogêneo das estruturas de oligossacarídeo do núcleo anexadas em um sítio de glicosilação particular de modo que mesmo anticorpos monoclonais existem como glicoformas múltiplas. Da mesma maneira, foi mostrado que diferenças grandes em glicosilação de anticorpo acontecem entre linhagens de célula, e até mesmo pequenas dife¬renças são vistas para uma dada linhagem de célula cultivada sob condições de cultura diferentes. (Lifely, M. R. e outros, Glycobiology 5(8/813-22 (1995)).

Um modo de se obter aumentos em potência grandes, enquanto mantendo um processo de produção simples e potencialmente evitando efei¬tos colaterais indesejados, significantes, é aumentar as funções efetoras mediadas por célula, naturais, de anticorpos monoclonais através da enge¬nharia de seu componente de oligossacarídeo conforme descrito em Umana, P. e outros, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999) e Patente U.S. N° 6.602.684, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Anticorpos tipo lgG1, os anticorpos mais comumente usados em imunoterapia de câncer, são glicoproteínas que têm um sítio de glicosila¬ção N-ligado conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligos- sacarídeos biantenários complexos ligados a Asn297 são enterrados entre os domínios CH2, formando contatos extensivos com a estrutura principal do polipeptideo, e sua presença é essencial para o anticorpo mediar as funções efetoras tal como citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) (Lifely, M. R., e outros, Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R. e outros, Immu¬nol Rev.763:59-76 (1998); Wright, A. e Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 75:26-32 (1997)).

Umanã e outros mostraram anteriormente que superexpressão em células de ovário de hamster Chinês (CHO) de P(1,4)-N- acetilglicosaminiltransferase III ("GnTIU"), uma glicosiltransferase catalisando a formação de oligossacarídeos bissectados, significantemente aumenta a atividade de ADCC in vitrode um anticorpo monoclonal quimérico antineuro¬blastoma (chCE7) produzido pelas células CHO engenheiradas. (Vide Umana, P. e outros, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999); e Publicação In¬ternacional No. WO 99/54342, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a titulo de referência). O anticorpo chCE7 pertence a uma classe grande de mAbs não-conjugados que têm afinidade e especificidade de tumor altas, mas têm muito pouca potência para serem clinicamente úteis quando produzidos em linhagens de célula industrial padrão sem a enzima GnTIll (Umana, P., e outros, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999)). Este estudo foi o primeiro a mostrar que grandes aumentos de atividade de ADCC poderiam ser obtidos através da engenharia das células produtoras de anti-corpo para expressar GnTIll, que também levou a um aumento na proporção de oligossacarídeos bissectados, associados à região constante (Fc), inclu¬indo oligossacarídeos monofucosilados, bissectados, acima dos níveis en¬contrados em anticorpos de ocorrência natural.

Permanece a necessidade de abordagens terapêuticas melhores se direcionando a EGFR para o tratamento de distúrbios de proliferação ce¬lular em primatas, incluindo, mas não limitado a, humanos, onde tais distúr¬bios são caracterizados pela expressão de EGFR, particularmente expres¬são anormal (por exemplo, superexpressão), incluindo, mas não limitado a, cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, mama, ovário, cólon, próstata e rim. Em particular, permanece a necessidade de minimizar o número de resíduos não-humanos em moléculas de ligação de antígeno administradas a indivíduos humanos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Reconhecendo o grande potencial terapêutico de moléculas de adesão de antígeno (ABMs) que têm a especificidade de ligação do anticor¬po ICR62 de rato (por exemplo, liga ao mesmo epítopo) e que foram glico- engenheiradas para aumentar a afinidade de ligação do receptor Fc e função efetora, os presentes inventores desenvolveram um método para produção de tais ABMs. Inter alia, este método envolve produção de anticorpos quimé¬ricos, recombinantes, ou fragmentos quiméricos dos mesmos. A eficácia dessas ABMs é melhorada mais através da engenharia do perfil de glicosila- ção da região Fc do anticorpo.

Deste modo, em um aspecto, a invenção refere-se a uma molé¬cula de ligação de antígeno (ABM) compreendendo um ou mais resíduos de determinação de especificidade (SDRs) de uma ou mais regiões de determi-

nação de complementaridade (CDRs) do anticorpo monoclonal ICR62 de rato, e uma sequência derivada de um polipeptideo heterólogo, onde a ABM se liga especificamente a EGFR. Em uma modalidade particular, a ABM não compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21,

SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID

NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39,

SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 121.

Em uma modalidade, o um ou mais SDRs estão em uma ou mais CDRs de cadeia pesada. Em uma modalidade particular, o um ou mais SDRs de cadeia pesada são selecionados do grupo consistindo em fenilala¬nina na posição Kabat 29, asparagina na posição Kabat 52, tirosina na posi¬ção Kabat 56 e valina na posição Kabat 100b. Em outra modalidade particu¬lar, o um ou mais SDRs de cadeia pesada compreendem tirosina na posição Kabat 56 e valina na posição Kabat 100b. Em outra modalidade particular, os um ou mais SDRs de cadeia pesada são fenilalanina na posição Kabat 29, asparagina na posição Kabat 52, tirosina não posição Kabat 56 e valina na posição Kabat 100b.

Em uma modalidade, os um ou mais SDRs estão em uma ou mais CDRs de cadeia leve. Em uma modalidade particular, os um ou mais SDRs de cadeia leve compreendem asparagina na posição Kabat 50. Em outra modalidade particular, os um ou mais SDRs de cadeia leve compreen¬dem asparagina na posição Kabat 34 e asparagina na posição Kabat 50.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma ABM compreen¬dendo pelo menos duas CDRs do anticorpo ICR62 de rato, ou uma variante ou forma truncada das mesmas, contendo pelo menos os SDRs para as di¬tas CDRs. Em uma modalidade, a ABM compreende pelo menos três CDRs do anticorpo ICR62 de rato ou uma variante ou forma truncada das mesmas contendo pelo menos os SDRs para as ditas CDRs. Em outra modalidade, a ABM compreende pelo menos quatro CDRs do anticorpo ICR62 de rato, ou uma variante ou forma truncada das mesmas, contendo pelo menos os S- DRs para as ditas CDRs. Em outra modalidade, a ABM compreende pelo menos cinco CDRs do anticorpo ICR62 de rato, ou uma variante ou forma truncada das mesmas, contendo pelo menos os SDRs para as ditas CDRs. Em outra modalidade, a ABM compreende seis CDRs do anticorpo ICR62 de rato, ou uma forma ou variante truncada das mesmas, contendo pelo menos os SDRs para as ditas CDRs. Em uma modalidade adicional, a(s) CDR(s) do anticorpo ICR62 de rato compreende(m) substituições em uma ou mais po¬sições de aminoácido, e onde a dita ABM retém a atividade de ligação com¬parado com a ABM não-substituída. Em uma modalidade adicional, a(s) CDR(s) do anticorpo ICR62 de rato compreende(m) substituições em qual¬quer posição exceto pelos resíduos de determinação de especificidade. Em uma modalidade adicional, a(s) CDR(s) do anticorpo ICR62 de rato compre- ende(m) substituições em todas as posições exceto pelos resíduos de de¬terminação de especificidade. Em uma modalidade particular, a(s) CDR(s) compreendem substituições em uma ou mais posições Kabat 27, 28 ou 29 da CDR1 de cadeia pesada Chothia, posição 31 da CDR1 de cadeia pesada Kabat, posição 52, 52a, 53 ou 57 Kabat de CDR2 de cadeia pesada ou posi¬ção Kabat 102 da CDR3 de cadeia pesada Kabat. Em outra modalidade par¬ticular, a(s) CDR(s) compreende(m) substituições em uma ou mais posições Kabat 30 ou 32 da CDR1 de cadeia leve Kabat, posição Kabat 51, 52, 53 ou 56 da CDR2 da cadeia leve Kabat ou posição 94 Kabat da CDR de cadeia pesada Kabat.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a ABMs onde a concentração EC50 para ligação é modulada por menos do que um fator de cerca de 10 a cerca de 0,001, comparado com a ABM não- substituída. Em uma modalidade específica, a concentração EC50 é modu¬lada por menos de um fator de cerca de 10 a cerca de 1, comparado com a ABM não-substituída. Em outra modalidade específica a concentração EC50 é modulada por um fator de menos do que cerca de 10 a cerca de 5, compa¬rado com a ABM não-substituída. Em outra modalidade específica, a con¬centração EC50 é modulada por menos do que um fator de cerca de 5 a cerca de 0,1, comparado com a ABM não-substituída. Em outra modalidade específica, a concentração EC50 é modulada por menos do que um fator de cerca de 5 a cerca de 2, comparado com a ABM não-substituída. Em outra modalidade específica, a concentração EC50 é modulada por menos do que um fator de cerca de 3 a cerca de 1, comparado com a ABM não-substituida.

Em outra modalidade específica, a concentração EC50 é modulada por me¬nos do que um fator de cerca de 2, comparado com a ABM não-substituída. Em outra modalidade específica, a concentração EC50 é modulada por me¬nos do que um fator de cerca de 1, comparado com a ABM não-substituída. Em outra modalidade específica, a concentração EC50 é modulada por me¬nos do que um fator de cerca de 0,1, comparado com a ABM não- substituída. Em outra modalidade específica, a concentração EC50 é modu¬lada por menos do que um fator de cerca de 0,001, comparado com a ABM não-substituída. Em algumas modalidades, a modulação conforme acima listado compreende um aumento na EC50. Em outras modalidades, a modulação compreende uma diminuição na EC50.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma ABM

que compreende um polipeptideo compreendendo uma sequência selecio¬nada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146 eSEQ ID NO:147.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptideo isola¬do codificando uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDRs de cadeia pesada modificadas do anticorpo mono¬clonal ICR62 de rato e uma região de estrutura principal de cadeia leve deri¬vada de uma ou mais sequências de gene de região variável de linhagem germinativa humana, onde as ditas CDRs de cadeia pesada modificadas compreendem uma ou mais substituições de aminoácido em uma posição Kabat selecionada do grupo consistindo em 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 52, 52a, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 101, 102 e qualquer combinação das mesmas, e onde o dito poli¬peptideo, como parte de uma molécula de ligação de antígeno, especifica¬mente se liga a EGFR humano. Em uma modalidade específica, as CDRs de cadeia pesada modificadas compreendem uma ou mais substituições de aminoácido nas posições Kabat 27, 28, 29, 31, 52, 53, 54, 58 e 102. Em ou¬tra modalidade específica, as CDRs de cadeia pesada modificadas compre¬endem uma ou mais substituições de aminoácido nas posições Kabat 27, 28, 31, 53, 54 e 58. Em outra modalidade específica, as CDRs de cadeia pesada modificadas compreendem substituições de aminoácido em todas as posi¬ções dentro das CDRs de cadeia pesada Kabat e Chothia exceto os SDRs. Em outra modalidade específica, as CDRs de cadeia pesada modificadas compreendem substituições de aminoácido em todas as posições dentro das CDRs de cadeia pesada Kabat e Chothia exceto as posições Kabat 29, 52, 56 e 100b. A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos isola¬dos codificando os polipeptideos isolados.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptideo isola¬do codificando uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com¬preendendo CDRs de cadeia leve modificadas do anticorpo monoclonal I- CR62 de rato e uma região de estrutura principal de cadeia leve derivada de uma ou mais sequências de gene de região variável de linhagem germinati- va humana, onde as ditas CDRs de cadeia leve modificadas compreendem uma ou mais substituições de aminoácido em uma posição Kabat seleciona¬da do grupo consistindo em 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 e qualquer combinação das mesmas, e onde o dito polipeptideo, como parte de uma molécula de ligação de antígeno, especificamente se liga a EGFR humano. Em uma modalidade específica, as CDRs de cadeia leve modificadas compreendem substituições de aminoácido em todas as posições dentro das CDRs de cadeia leve Kabat e Chothia, exceto os SDRs. Em outra modalidade específica, as CDRs de cadeia leve modificadas compreendem substituições de aminoácido em to¬das as posições dentro das CDRs de cadeia leve Kabat e Chothia exceto asposições Kabat 34 e 50. A presente invenção refere-se também a polinucleo¬tídeos isolados codificando os polipeptideos isolados. A presente invenção refere-se também a uma ABM compreendendo os polipeptideos isolados.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotideo isolado codificando um polipeptideo compreendendo uma sequência sele¬cionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:129, SEQ ID

e SEQ ID NO: 147, onde o dito polipeptideo, como parte de uma molécula de ligação de antígeno, especificamente se liga a EGFR humano. Em outro as¬pecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeiro transfectada com o po¬linucleotideo ou um vetor compreendendo o polinucleotideo. Em uma moda¬lidade, o vetor é um vetor de clonagem replicativo. Em outra modalidade, o vetor é um vetor de expressão.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produ¬ção de uma molécula de ligação de antígeno que é capaz de competir com o anticorpo monoclonal de ICR62 de rato para ligação a EGFR humano, o mé¬todo compreendendo cultura de uma célula hospedeiro da invenção em um meio sob condições que permitem a expressão de um ou mais polinucleotí¬deos codificando uma molécula de ligação de antígeno, e recuperação da molécula de ligação de antígeno.

Em outro aspecto, as ABMs da presente invenção foram glico- engenheiradas para ter uma estrutura de oligossacarídeo alterada na região Fc. Em uma modalidade particular, a região Fc tem um número reduzido de resíduos de fucose comparado com uma ABM não-glicoengenheirada cor¬respondente.

Em outro aspecto a invenção refere-se a composições compre¬endendo uma ABM da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de direcio¬namento de células expressando EGFR em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição da presente invenção. Em uma modalidade particular, as células superexpressam EGFR. Em outra modali¬dade particular, o método é realizado para tratar um distúrbio tratável através do bloqueio de sinalização de célula mediada por EGFR no dito indivíduo. Em outra modalidade, a invenção refere-se a ABMs da invenção para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio tratável através do bloqueio de sinalização de célula mediada por EGFR. Em uma modalidade, o distúrbio é um distúrbio de proliferação celular. Em uma mo¬dalidade particular, o distúrbio de proliferação celular é câncer. Em uma mo¬dalidade mais particular, o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de có¬lon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um polinucleo¬tideo isolado compreendendo: (a) uma sequência selecionada do grupo con¬sistindo em: SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NQ:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NQ:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, e SEQ ID NO:124; (b) uma sequência selecionada de um grupo consistindo em: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NQ:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, SEQ ID NQ:102, SEQ ID NQ:104, SEQ ID NQ:106 e SEQ ID NO:126; e (c) SEQ ID NQ:108. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotideo isolado compreendendo (a) uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO.H2 e SEQ ID NO:114; (b) uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:118; e (c) SEQ ID NO:119. Em uma modali¬dade, qualquer um desses polinucleotídeos codifica um polipeptideo de fu¬são. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polinucleotídeos isolados.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um polinucleo¬tideo isolado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consis- tindo em SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:10; SEQ ID No:12; SEQ ID No:14; SEQ ID No:16; SEQ ID No:18; SEQ ID No:20; SEQ ID No:22; SEQ ID No:24; SEQ ID No:26; SEQ ID No:28; SEQ ID No:30; SEQ ID No32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40 e SEQ ID No: 120. Em outro aspecto, a invenção refere-se a urn poli-nucleotideo isolado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:46; SEQ ID NQ:50; e SEQ ID NO:52. Em uma modalidade, tais polinucleotídeos codificam polipeptideos de fusão. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou to¬dos esses polinucleotídeos isolados.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotideo isolado com¬preendendo uma sequência tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:10; SEQ ID No:12; SEQ ID No:14; SEQ ID No:16; SEQ ID No:18; SEQ ID No:20; SEQ ID No:22; SEQ ID No:24; SEQ ID No:26; SEQ ID No:28; SEQ ID No;30; SEQ ID No32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40 e SEQ ID No:120, onde o dito polinucleotideo isolado codifica um polipepti¬deo de fusão. Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um polinu¬cleotideo isolado compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade com uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:46; SEQ ID NQ:50 e SEQ ID NO:52, onde o dito poli¬nucleotideo isolado codifica um polipeptideo de fusão. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polinucleotídeos isola¬dos. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polinucleotídeos isolados.

A invenção refere-se também a um polinucleotideo isolado codi¬ficando um polipeptideo quimérico tendo a sequência de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o polinucleotideo compreende uma sequência codificando um polipeptideo tendo a sequência de SEQ ID NO:1, e uma sequência codi¬ficando um polipeptideo tendo a sequência de uma região Fc de anticorpo, ou um fragmento da mesma, de uma espécie outra que não rato. A invenção

refere-se também a um polinucleotideo isolado codificando um polipeptideo quimérico tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; e SEQ ID No:121. Em uma modalidade, o polinucleotideo compreende uma sequência codificando um polipeptideo tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11 SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21 SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31 SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; e SEQ ID No:121; e uma sequência codificando um polipeptideo tendo a sequência de uma região Fc de anticorpo, ou um fragmento da mesma, de uma espécie outra que não rato. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polinucleotídeos isolados codificando os polipeptideos.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleoti¬deo isolado codificando um polipeptideo quimérico tendo a sequência de SEQ ID NO:43. Em uma modalidade, o polinucleotideo compreende uma sequência codificando um polipeptideo tendo a sequência da SEQ ID NO:43; e uma sequência codificando um polipeptideo tendo a sequência de uma região Fc de anticorpo, ou um fragmento da mesma, de uma espécie outra que não rato. Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleo¬tideo isolado codificando um polipeptideo quimérico tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:50. Em uma modalidade, o polinucleotideo compreende uma sequên¬cia codificando um polipeptideo tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:51 e uma se¬quência codificando um polipeptideo tendo a sequência de uma região cons¬tante de cadeia leve de anticorpo (CL), ou um fragmento da mesma, de uma espécie outra que não rato. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polinucleotídeos isolados codificando os poli- peptideos.

A invenção refere-se também a um polinucleotideo isolado com¬preendendo uma sequência codificando um polipeptideo tendo a região VH do anticorpo ICR62, ou variantes funcionais da mesma, e uma sequência codificando um polipeptideo tendo a sequência de uma região Fc de anticor¬po, ou um fragmento da mesma, de uma espécie outra que não rato. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotideo isolado compreen¬dendo uma sequência codificando um polipeptideo tendo uma região VL de anticorpo ICR62, ou variantes funcionais da mesma, e uma sequência codifi¬cando um polipeptideo tendo a sequência de uma região CL de anticorpo, ou um fragmento da mesma, de uma espécie outra que não rato.

A invenção refere-se ainda a um vetor de expressão compreen¬dendo qualquer um dos polinucleotídeos isolados descritos acima, e a uma célula hospedeiro que compreende tal vetor de expressão. Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma célula hospedeiro compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos isolados descritos acima.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptideo isolado SEQ ID NO;53 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:123 e SEQ ID NO:125; (b) uma se¬quência selecionada de um grupo consistindo em: SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NQ:105, e SEQ ID NO:127; e (c) SEQ ID NQ:107, onde o dito polipeptideo é um polipeptideo de fusão. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polipeptideos isolados. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptideo isolado compreendendo (a) uma se¬quência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:111 e SEQ ID NO:113; (b) SEQ ID NO:115; e (c) SEQ ID NO:117, onde o dito polipeptideo é um polipeptideo de fusão. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polipeptideos isolados.

A invenção refere-se também a um polipeptideo quimérico com¬preendendo a sequência de SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma. A invenção refere-se ainda a um polipeptideo quimérico compreendendo a se¬quência de SEQ ID NO:43 ou uma variante da mesma. Em uma modalidade, qualquer um desses polipeptideos compreende ainda uma região Fc huma¬na e^u região CL humana. A invenção refere-se também a um polipeptideo quimérico compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; e SEQ ID No: 121, ou uma variante da mesma. A invenção refere-se ainda a um poli¬peptideo quimérico compreendendo sequência s selecionada do grupo con¬sistindo em SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:51 ou uma variante da mesma. Em uma modalidade, qualquer um desses polipeptideos com¬preende ainda uma região Fc humana e^u região CL humana. Em uma mo¬dalidade, a região Fc humana compreende lgG1.

Em outro aspecto a invenção refere-se a um polipeptideo com¬preendendo uma sequência derivada do anticorpo ICR62 e uma sequência derivada de um polipeptideo heterólogo e a uma molécula de ligação de an¬tígeno compreendendo tal polipeptideo. Em uma modalidade a molécula de ligação de antígeno é um anticorpo. Em uma modalidade preferida, o anti¬corpo é quimérico. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é humaniza¬do ou primatizado.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma ABM, que é ca¬paz de competir com o anticorpo ICR62 de rato para ligação a EGFR e que é quimérica. Em uma modalidade, a ABM é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade adicional, a ABM é um anticorpo recombinante compreendendo uma região VH tendo uma sequência de aminoácido sele¬cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO.: 1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; e SEQ ID No:121. Em outra modalida¬de, a ABM é um anticorpo recombinante compreendendo uma região VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; e SEQ ID NO:51. Em uma modalidade adicional a ABM é um anticorpo recombinante que é primatiza- do. Em ainda uma modalidade adicional a ABM é um anticorpo recombinan¬te que é humanizado. Em outra modalidade a ABM é um anticorpo recombi¬nante compreendendo uma região Fc humana. Em uma modalidade adicio¬nal, qualquer uma das ABMs discutidas acima pode ser conjugada a uma porção tal como uma toxina ou um radiomarcador.

A invenção refere-se ainda a uma ABM da presente invenção, a dita ABM tendo oligossacarídeos modificados. Em uma modalidade os oli- gossacarídeos modificados têm fucosilação reduzida conforme comparado com os oligossacarídeos não-modificados. Em outras modalidades, os oli¬gossacarídeos modificados são híbridos ou complexos. Em uma modalidade adicional, a ABM tem uma proporção alta de oligossacarídeos não- fucosilados ou bissectados, oligossacarídeos não-fucosilados na região Fc da dita molécula. Em uma modalidade, os oligossacarídeos bissectados, não-fucosilados, são híbridos. Em uma modalidade adicional, os oligossaca¬rídeos bissectados, não-fucosilados, são complexos. Em uma modalidade, pelo menos 20% dos oligossacarídeos na região Fc do dito polipeptideo são não-fucosilados ou bissectados, não-fucosilados. Em modalidades mais pre¬feridas, pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75% ou mais dos oligossacarídeos são não-fucosilados ou bissectados, não- fucosilados.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotideo codificando qualquer uma das ABMs discutidas acima, e a vetores de expressão e célu¬las compreendendo tais polinucleotídeos.

A invenção refere-se ainda a um método de produção de uma ABM, que é capaz de competir com o anticorpo ICR62 de rato para ligação a EGFR e onde a dita ABM é quimérica; o dito método compreendendo: (a) cultura de uma célula hospedeiro compreendendo um polinucleotideo que codifica uma ABM da presente invenção em um meio sob condições que permitem a expressão do dito polinucleotideo codificando a dita ABM; e (b) recuperação da dita ABM da cultura resultante.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição far¬macêutica compreendendo a ABM da invenção. É compreendido que a composição farmacêutica pode compreender ainda um veículo farmaceuti- camente aceitável, um adjuvante ou uma combinação dos mesmos.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença caracterizado por expressão de EGFR (por e- xemplo, expressão anormal ou superexpressão de EGFR). O método com¬preende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da ABM da presente invenção a um indivíduo, de preferência um indivíduo mamífero, e com mais preferência um ser humano com necessidade do mesmo. Em uma modalidade preferida, a doença é tratada através da administração da ABM que é um anticorpo quimérico (por exemplo, humanizado) ou um frag¬mento quimérico de um anticorpo. Em uma modalidade, a ABM é adminis¬trada em uma quantidade de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15,0 mg/kg. Em outra modalidade, a ABM é administrada em uma quantidade de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. Em uma modalidade adicional, a ABM é administrada em uma quantidade de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 4,5 mg/kg. Em uma modalidade adicional, a ABM é administrada em uma quan¬tidade de cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 12,0 mg/kg. Em uma modalidade adicional, a ABM é administrada em uma quantidade selecionada do grupo consistindo em cerca de 1,5, cerca de 4,5 e cerca de 12,0 mg/kg.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula hos¬pedeiro engenheirada para expressar pelo menos um ácido nucleico codifi¬cando um polipeptideo tendo atividade de GnTIll em uma quantidade sufici¬ente para modificar os oligossacarídeos na região Fc da ABM produzida pela célula hospedeiro, onde a ABM é capaz de competir com o anticorpo ICR62 de rato para ligação a EGFR e onde a ABM é quimérica. Em uma modalida¬de, o polipeptideo tendo atividade de GnTIll é um polipeptideo de fusão. Em outra modalidade, a ABM produzida pela célula hospedeiro é um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é humanizado. Em uma modalidade adicional, a ABM compre¬ende uma região equivalente à região Fc de uma IgG humana.

A invenção refere-se também a um polinucleotideo isolado com¬preendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quaro, cinco ou seis) região de determinação de complementaridade do anticorpo ICR62 de rato, ou uma variante ou forma truncada da mesma contendo pelo menos os resíduos de determinação de especificidade para a dita região de determina¬ção de complementaridade, onde o dito polinucleotideo isolado codifica um polipeptideo de fusão. De preferência, tais polinucleotídeos isolados codifi¬cam um polipeptideo de fusão que é uma molécula de ligação de antígeno. Em uma modalidade, o polinucleotideo compreende três regiões de determi¬nação de complementaridade do anticorpo ICR62 de rato, ou variantes ou formas truncadas das mesmas, contendo pelo menos os resíduos de deter¬minação de especificidade para cada uma das ditas três regiões de determi¬nação de complementaridade. Em outra modalidade, o polinucleotideo codi¬fica a região variável inteira da cadeia leve ou pesada de um anticorpo qui¬mérico (por exemplo, humanizado). A invenção refere-se ainda ao polipepti¬deo codificado por tais polinucleotídeos.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígeno compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis) região de determinação de complementa¬ridade do anticorpo ICR62 de rato, ou uma variante ou forma truncada da mesma, contendo pelo menos os resíduos de determinação de especificida¬de para a dita região de determinação de complementaridade, e compreen-dendo uma sequência derivada de um polipeptideo heterólogo. Em uma mo¬dalidade, a molécula de ligação de antígeno compreende três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo ICR62 de rato, ou varian¬tes ou formas truncadas das mesmas, contendo pelo menos os resíduos de determinação de especificidade para cada uma das três regiões de determi¬nação de complementaridade. Em outro aspecto, a molécula de ligação de antígeno compreende a região variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo. Em uma modalidade particularmente útil, a molécula de ligação de antígeno é um anticorpo quimérico, por exemplo, humanizado. A invenção refere-se também a métodos de fabricação de tais moléculas de ligação de antígeno, e ao uso dos mesmos no tratamento de doença, incluindo males tal como cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, mama, ovário, cólon, próstata, pele e rim.

A célula hospedeiro da presente invenção pode ser selecionada do grupo que inclui, mas não está limitado a, uma célula HEK293-EBNA, uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula NOS, uma célula SP2/0, uma célula de mieloma YO, uma célula de mieloma de camundongo P3X63, uma célula PER, uma célula PER.C6 ou uma célula de hibridoma. Em uma moda¬lidade, a célula hospedeiro da invenção compreende ainda um polinucleoti¬deo transfectado compreendendo um polinucleotideo codificando a região VL do anticorpo ICR62 de rato ou variantes da mesma e uma sequência co¬dificando uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina huma¬na. Em outra modalidade, a célula hospedeiro da invenção compreende ain¬da um polinucleotideo transfectado compreendendo um polinucleotideo codi¬ficando a região VH do anticorpo ICR62 de rato ou variantes da mesma e uma sequência codificando uma região equivalente à região Fc de uma imu-noglobulina humana.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma célula hospedeiro que produz uma ABM que exibe afinidade de ligação de receptor Fc aumentada etiu função efetora aumentada como um resultado da modifi¬cação de seus oligossacarídeos. Em uma modalidade, a afinidade de ligação aumentada é para um receptor Fc, particularmente o receptor FcyRIIIA. A função efetora compreendida aqui pode ser selecionada do grupo que inclui, mas não é limitado a, citotoxidez celular mediada por Fc aumentada; ligação aumentada a células NK; ligação aumentada a macrófago; ligação aumenta¬da a células polimorfonucleares; ligação aumentada a monócitos; sinalização direta aumentada induzindo apoptose; maturação de célula dendrítica au¬mentada; e inicialização de célula T aumentada.

Em uma modalidade adicional, a célula hospedeiro da presente invenção compreende pelo menos um ácido nucleico codificando um poli¬peptideo tendo atividade de GnTIll que é operavelmente ligado a um ele¬mento promotor constitutivo.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para pro¬dução de uma ABM em uma célula hospedeiro compreendendo: (a) cultura de uma célula hospedeiro engenheirada para expressar pelo menos um po¬linucleotideo codificando um polipeptideo de fusão tendo atividade de GnTIll sob condições que permitem a produção da dita ABM e que permitem a mo¬dificação dos oligossacarídeos presentes na região Fc da dita ABM; e (b) isolamento da dita ABM; onde a dita ABM é capaz de competir com o anti¬corpo ICR62 de rato para ligação a EGFR e onde a dita ABM é quimérica (por exemplo, humanizada). Em uma modalidade, o polipeptideo tendo ativi¬dade de GnTIll é um polipeptideo de fusão, de preferência compreendendo o domínio catalítico de GnTIll e o domínio de localização de Golgi de um polipeptideo residente em Golgi heterólogo selecionado do grupo consistindo no domínio de localização de manosidase II, no domínio de localização de P(1,2)-N-acetilglicosaminiltransferase I ("GnTI"), no domínio de localização de manosidase I, no domínio de localização de P(1,2)-N- acetilglicosaminiltransferase II ("GnTH") e no domínio de localização de fuco- siltransferase de núcleo cH-6. De preferência, o domínio de localização de Golgi é de manosidase II ou GnTI.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para modificação do perfil de glicosilação de uma ABM anti-EGFR produzida por uma célula hospedeiro compreendendo introdução na célula hospedeiro de pelo menos um ácido nucleico ou vetor de expressão da invenção. Em uma modalidade, a ABM é um anticorpo ou fragmento do mesmo; de prefe¬rência compreendendo a região Fc de uma IgG. Alternativamente, o polipep¬tideo é uma proteína de fusão que inclui uma região equivalente à região Fc de um IgG humano.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo quimérico, recombinante, ou um fragmento do mesmo, capaz de competir com o anti- corpo ICR62 de rato para ligação a EGFR e tendo fucosilação reduzida.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de modificação da glicosilação de um anticorpo recombinante ou um frag¬mento do mesmo da invenção usando um polipeptideo de fusão tendo ativi¬dade de GnTIll e compreendendo o domínio de localização de Golgi de um polipeptideo residente em Golgi heterólogo. Em uma modalidade, os poli¬peptideos de fusão da invenção compreendem o domínio catalítico de GnTIl- I. Em outra modalidade, o domínio de localização de Golgi é selecionado do grupo consistindo em: o domínio de localização de manosidase I, o domínio de ligação de GnTI, o domínio de localização de manosidase II, o domínio de localização de GnTIl e o domínio de localização de fucosiltransferase de nú¬cleo a1-6. De preferência o domínio de localização de Golgi é de manosida¬se II ou GnTI.

Em uma modalidade, o método da invenção refere-se à produ¬ção de um anticorpo quimérico, recombinante, ou um fragmento do mesmo, com oligossacarídeos modificados onde os ditos oligossacarídeos modifica¬dos têm fucosilação reduzida comparado com oligossacarídeos não- modificados. De acordo com a presente invenção, esses oligossacarídeos modificados podem ser híbridos ou complexos. Em outra modalidade, o mé¬todo da invenção refere-se à produção de anticorpo quimérico, recombinante (por exemplo, humanizado), ou um fragmento do mesmo tendo uma propor-ção aumentada de oligossacarídeos não-fucosilados, bissectados, na região Fc do dito polipeptideo. Em uma modalidade, os oligossacarídeos não- fucosilados, bissectados, são híbridos. Em outra modalidade, os oligossaca¬rídeos não-fucosilados, bissectados, são complexos. Em uma modalidade adicional, o método da invenção refere-se à produção de um anticorpo qui¬mérico, recombinante, ou um fragmento do mesmo tendo pelo menos 20% dos oligossacarídeos na região Fc do dito polipeptideo que são bissectados, não-fucosilados. Em uma modalidade preferida, pelo menos 30% dos oligos¬sacarídeos na região Fc do dito polipeptideo são bissectados, não- fucosilados. Em outra modalidade preferida, onde pelo menos 35% dos oli¬gossacarídeos na região Fc do dito polipeptideo são bissectados, não- fucosilados.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo quimérico, recombinante, ou um fragmento do mesmo, que exibe afinidade de ligação de receptor Fc aumentada e/ou função efetora aumentada como um resultado da modificação de seus oligossacarídeos. Em uma modalida¬de, a afinidade de ligação aumentada é para um receptor de ativação Fc. Em uma modalidade adicional, o receptor Fc é receptor de ativação Fcy, particu¬larmente, o receptor FcyRIIIA. A função efetora compreendida aqui pode ser selecionada do grupo que inclui, mas não é limitado a, citotoxidez celular mediada por Fc aumentada; ligação aumentada a células NK; ligação au¬mentada a macrófagos; ligação aumentada a células polimorfonucleares; ligação aumentada a monócito; sinalização direta aumentada induzindo a- poptose; maturação de célula dendritica aumentada; e inicialização de célula T aumentada.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um fragmento de anti¬corpo quimérico (por exemplo, humanizado), recombinante, tendo a especifi¬cidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato e contendo a região Fc, que é engenheirado para ter função efetora aumentada produzido através de qual¬quer um dos métodos da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que inclui um polipeptideo tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO.: 1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; e SEQ ID No:121, e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e engenheirada para ter função efetora aumenta¬da produzido através de qualquer um dos métodos da presente invenção. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polipeptideos isolados.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que inclui um polipeptideo tendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:51 e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e engenheirada para ter função efetora aumentada produzido através de qual¬quer um dos métodos da presente invenção. Em outro aspecto, a presente invenção exclui qualquer um ou todos esses polipeptideos isolados.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composi¬ção farmacêutica compreendendo um anticorpo quimérico, recombinante, (por exemplo, humanizado), produzido através de qualquer um dos métodos da presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um fragmento de anticorpo quimérico, recombinante, (por exemplo, humanizado), produzido através de qualquer um dos métodos da presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro as¬pecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica com¬preendendo uma proteína de fusão produzida através de qualquer um dos métodos da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para direcionamento in vivoou in vitro de células expressando EGFR. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para direcio¬namento de células expressando EGFR em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição compreendendo uma ABM da in¬venção.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um mé¬todo para detecção in vivoou in vitroda presença de EGFR em uma amos¬tra, por exemplo, para diagnóstico de um distúrbio relacionado com expres¬são de EGFR. Em uma modalidade, a detecção é realizada através de con¬tato de uma amostra a ser testada, opcionalmente com uma amostra de con¬trole, com uma ABM da presente invenção, sob condições que permitem a formação de um complexo entre a ABM e EGFR. A formação de complexo é então detectada (por exemplo, através de ELISA ou outros métodos conhe¬cidos na técnica). Quando usando uma amostra de controle com a amostra de teste, qualquer diferença estatisticamente significante na formação de complexos de ABM-EGFR quando comparando as amostras de teste e de controle é indicativa da presença de EGFR na amostra de teste.

A invenção refere-se ainda a um método de tratamento de um distúrbio relacionado com expressão de EGFR, em particular, um distúrbio de proliferação celular onde EGFR é expresso e, mais particularmente, onde EGFR é anormalmente expresso (por exemplo, superexpresso), incluindo cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, mama, ovário, cólon, próstata, pele e rim compreendendo administrar uma quanti¬dade terapeuticamente eficaz do anticorpo quimérico, recombinante, (por exemplo, humanizado), ou um fragmento do mesmo, produzido através de qualquer um dos métodos da presente invenção, a um indivíduo humano com necessidade do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS Figuras

A Figura 1 mostra a atividade funcional de cadeias de polipepti¬deo de ICR62 de rato-humano quimérico pesadas e leves quando combina¬das com os construtos de ICR62 humanizados l-HHC (cadeia pesada) e I- KB (cadeia leve). rVL representa a cadeia leve quimérica e rVH representa a cadeia pesada quimérica. A designação "r" indica que os domínios variáveis são do anticorpo de rato original.

A Figura 2 mostra atividade de ligação de anticorpos ICR62 hu¬manizado compreendendo construtos de região variável de cadeia pesada I- HHC, l-HHA e l-HLA e construtos de região variável de cadeia leve humani¬zados l-KA e l-KB emparelhados em várias configurações.

A Figura 3 mostra a atividade de ligação de anticorpos ICR62 humanizados compreendendo construtos de região variável de cadeia pesa¬da l-HLB, l-HLC e l-HLA e construtos de região variável de cadeia leve hu¬manizados l-KA e l-KC emparelhados em várias configurações.

A Figura 4 mostra atividade de ligação de anticorpos ICR62 hu¬manizados compreendendo construtos de região variável de cadeia pesada I-HLA2, I-HLA3 e I-HLA4 e construto de região variável de cadeia leve hu¬manizado l-KC comparado com anticorpo ICR62 de rato-humano quimérico.

A Figura 5 mostra atividade de ligação de anticorpos ICR62 hu¬manizados compreendendo construtos de região variável de cadeia pesada I-HLA1, I-HLA3, I-HLA5 e I-HLA6 e construto de região variável de cadeia leve humanizado l-KC comparado com anticorpo ICR62 de rato-humano quimérico.

A Figura 6 mostra atividade de ligação de anticorpos ICR62 hu¬manizados compreendendo construtos de região variável de cadeia pesada I-HLA7, I-HLA6 e l-HHB e construto de região variável de cadeia leve huma¬nizado l-KC comparado com anticorpo ICR62 de rato-humano quimérico.

A Figura 7 mostra atividade de ligação de anticorpos ICR62 hu¬manizados compreendendo construtos de região variável de cadeia pesada l-HHF, I-HLA9 e I-HLA8 e construto de região variável de cadeia leve huma¬nizado l-KC comparado com anticorpo ICR62 de rato-humano quimérico.

A Figura 8 mostra atividade de ligação de anticorpos humaniza¬dos compreendendo construtos de região variável de cadeia pesada l-HHB, l-HHD, l-HHG, l-HHF, I-HLA7 e I-HLA9 e construto de região variável de ca¬deia leve l-KC.

A Figura 9 mostra uma comparação de citotoxidez celular medi¬ada por anticorpo (ADCC) para várias glicoformas do anticorpo ICR62 qui¬mérico, bem como para a variante I-HI-A4 humanizada. "G1"refere-se à gli- coengenharia do anticorpo através de co-expressão com GnTIll. "G2"refere- se à glicoengenharia do anticorpo através de co-expressão com GnTIll e Manll. "WT"refere-se a anticorpos que não foram glicoengenheirados. Os construtos de cadeia pesada humanizados foram emparelhados com o cons¬truto de cadeia leve l-KC.

A Figura 10 mostra uma comparação de ADCC para a forma não-glicoengenheirada (WT) e a glicoforma G2 (isto é, glicoengenheirada através de coexpressão com GnTIll e Manll) dos construtos de anticorpo ICR62 humanizados l-HHB e I-HLA7. Os mesmos anticorpos foram aplica¬dos a duas linhagens de célula-alvo diferentes: no Painel A, a linhagem de célula-alvo LN229 foi usada; no painel B, a linhagem de célula A431 foi usa¬da. Os construtos de cadeia pesada humanizados foram emparelhados com o construto de cadeia leve l-KC.

As Figuras 11A e 11B mostram uma comparação de ADCC para formas não-glicoengenheiradas (WT) e glicoformas G2 de ICR62 quimérico e os construtos de anticorpo ICR62 humanizado l-HHB e I-HLA7. A linhagem de célula-alvo A431 foi usada. Os construtos de cadeia pesada humanizados foram emparelhados com o construto de cadeia leve l-KC.

A Figura 12 mostra uma comparação de 72 horas de ADCC para glicoformas G2 de construtos de anticorpo ICR62 quimérico e anticorpo I- CR62 humanizado l-HHB e I-HLA7. Os construtos de cadeia pesada huma¬nizados foram emparelhados com o construto de cadeia leve l-KC.

A Figura 13 mostra um alinhamento de sequência de aminoácido de construtos de região variável de cadeia pesada de ICR62 humanizado comparado com as sequências de ICR62 de rato. Pontos representam iden¬tidade de resíduos de aminoácido em uma dada posição dentro de um dado construto.

A Figura 14 mostra um ensaio de ligação de FcgamaRllla-Fc usando células CHO mostrando FcgamaRllla humano recombinante. Um anticorpo lgG1 anti-EGFR humanizado l-HHB/KC glicoengenheirado foi comparado a um anticorpo não-glicoengenheirado (Wt).

A Figura 15 mostra um perfil de oligossacarídeo MALD/TOF-MS para anticorpo lgG1 anti-EGFR humanizado glicoengenheirado, l-HHB/KC. Glicoengenharia conseguida através de superexpressão nas células de pro¬dução de anticorpo de genes codificando enzimas com atividades de GnTIll e Manosidase de Golgi dando mais de 70% de oligossacarídeos ligados a Fc-Asn297 não-fucosilados.

A Figura 16 mostra um perfil de precisão anti-EGFR (n=6 répli¬cas na faixa de calibragem) para a determinação de anti-EGFR em matriz de soro de macaco a 1% (agrupamento de soro de macaco CMS25/31/33, for¬necido pela HLS).

A Figura 17 mostra uma curva de calibragem anti-EGFR repre¬sentativa para a determinação de anti-EGFR em matriz de soro de macaco a 1%.

A Figura 18 mostra concentrações no soro de anti-EGFR no Dia 1 de administração intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos cinomó- logos machos.

A Figura 19 mostra concentrações no soro de anti-EGFR no Dia 1 de administração intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos cinomó- logos fêmeas.

A Figura 20 mostra a relação entre áreas sob as curvas de con¬centração-tempo anti-EGFR de soro (AUCi6s) e nível de dose no Dia 1 de administração intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos cinomólogos.

A Figura 21 mostra concentrações no soro de anti-EGFR duran¬te administração intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos cinomólogos machos.

A Figura 22 mostra concentrações no soro de anti-EGFR duran¬te administração intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos cinomólogos fêmeas.

A Figura 23 mostra o perfil de MALDI/TOF-MS de oligossacarí¬deos de anticorpo anti-EGFR de Fc-engenheirada (glicoengenheirado) usa¬dos para os estudos in vivo de macaco descritos nos Exemplos abaixo.

A Figura 24 mostra ligação a EGFR expresso na superfície de células de carcinoma epidermóide A431 humano. O anticorpo usado para o estudo de ligação foi o anticorpo anti-EGFR de Fc-engenheirada (construto I- HHB) usado para os estudos de macaco in vivo descritos nos Exemplos a- baixo.

A Figura 25 mostra a ligação a EGFR expresso na superfície de células de rim COS-7 de macaco. O anticorpo usado era anticorpo anti- EGFR (cadeia pesada l-HHB; cadeia leve l-KC). Para referência, ligação a células expressando EGFR humanas inferiores, células de câncer de mama MCF-7, é mostrada.

A Figura 26 mostra ligação de Fc-FcgamaRIII usando uma célula integral (células CHO engenheiradas para expressar FcRglIla humano em sua superfície). O anticorpo usado era um anticorpo anti-EGFR de Fc- engenheirada (glicoengenheirada) usado para os estudos de macaco in vivo descritos nos Exemplos abaixo. Ligação a um anticorpo lgG1 controle de não-Fc-engenheirada (não-modificada) é mostrada para comparação.

A Figura 27 mostra ADCC mediada por anticorpo anti-EGFR de Fc-engenheirada (glicoengenheirada). Células-alvo são células de carcino¬ma de pulmão humanas A549. Atividade de ADCC para a forma de não-Fc- engenheirada (não-modificada) do anticorpo é mostrada para comparação.

A Figura 28 mostra ADCC mediada por anticorpo anti-EGFR de Fc-engenheirada (glicoengenheirada). Células-alvo são linhagem de célula de queratinócito de macaco cinomólogo CYNOM-K1. Atividade de ADCC para a forma de não-Fc engenheirada (não-modificada) do anticorpo é mos¬trada para comparação.

A Figura 29 mostra ligação direcionada a EGFR de várias vari¬antes de construto de cadeia leve com base no construto l-KC emparelhado com o construto l-HHD de cadeia pesada.

A Figura 30 mostra ligação direcionada de EGFR de várias vari¬antes de construto de cadeia leve com base no construto l-KC emparelhado com o construto l-HHD de cadeia pesada.

A Figura 31 mostra ligação direcionada a EGFR de várias vari¬antes de construto de cadeia pesada com base no construto l-HHD empare¬lhado com o construto l-KC de cadeia leve.

A Figura 32 mostra a ligação direcionada a EGFR de várias vari¬antes de construto de cadeia pesada com base no construto l-HHD empare¬lhado com o construto l-KC de cadeia leve.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

São usados aqui termos conforme geralmente usado na técnica, a menos que de outro modo definido como segue.

Conforme aqui usado, o termo anticorpo pretende incluir molécu¬las de anticorpo inteiras, incluindo anticorpos monoclonais, policlonais e mul- tiespecificos (por exemplo, biespecificos), bem como fragmentos de anticor¬po tendo a região Fc e retendo especificidade de ligação, e proteínas de fu¬são que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e que retêm especificidade de ligação. Também compreendidos são frag¬mentos de anticorpo que retêm especificidade de ligação incluindo, mas não limitado a, fragmentos de VH, fragmentos de VL, fragmentos de Fab, frag¬mentos de F(ab')2, fragmentos de scFv, fragmentos de Fv, minicorpos, dia- corpos, triacorpos e tetracorpos (vide, por exemplo, Hudson e Souriau, Natu¬re Med.9: 129-134 (2003)). Também compreendidos são anticorpos huma¬nizados, primatizados e quiméricos.

Conforme aqui usado, o termo região Fc pretende se referir a uma região C-terminal de uma cadeia pesada de IgG. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar ligeiramente, a regi¬ão Fc de cadeia pesada de IgG humano é geralmente definida se estender do resíduo de aminoácido na posição Cys226 até o terminal carboxila.

Conforme aqui usado, o termo região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina pretende incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina bem como variantes tendo alterações que produzem substituições, adições ou deleções, mas que não diminuem substancialmente a habilidade da imunoglobulina em mediar funções efeto- ras (tal como citotoxidez celular dependente de anticorpo). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletados do N-terminal ou C-terminal da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial de função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas de acordo com regras gerais conhe¬cidas na técnica de modo a ter efeito mínimo sobre atividade. (Vide, por e- xemplo, Bowie, J.U. e outros, Science 247:1306-1310 (1990).

Conforme aqui usado, o termo EGFR refere-se ao receptor de fator de crescimento epidermal humano (também conhecido como HER-1 ou Erb-B1) (Ulrich, A. e outros, Nature309:418-425 (1984); No. de Acesso SwissProt P00533; números de acesso secundários: 000688, 000732, P06268, Q14225, Q92795, Q9BZS2, Q9GZX1, Q9H2C9, Q9H3C9, Q9UMD7, Q9UMD8, Q9UMG5), bem como isoformas de ocorrência natural e suas variantes. Tais isoformas e variantes incluem, mas não estão limita¬das a, variante de EGFRvIII, produtos de união alternativos (por exemplo, conforme identificado através dos números de acesso SwissProt P00533-1, P00533-2, P00533-3, P-00533-4), variantes GLN-98, ARG-266, Lys-521, ILE-674, GLY-962 e PRO-988 (Livingston, R.J. e outros,NIEHS-SNPs, envi¬ronmental genome project, NIEHS ES15478, Department of Genome Scien¬ces, Seattle, WA (2004)) e outros identificados através dos números de a- cesso que seguem: NM 005228.3, NM_201282.1, NM_201283.1, NM_201284.1 (REFSEQ mRNAs); AF125253.1, AF277897.1, AF288738.1, AI217671.1, AK127817.1, AL598260.1, AU137334.1, AW163038.1, AW295229.1, BC057802.1, CB160831.1, K03193.1, U48722.1, U95089.1, X00588.1, X00663.1; H54484S1, H54484S3, H54484S2 (montagem MIPS); DT.453606, DT.86855651, DT.95165593, DT.97822681, DT.95165600, DT. 100752430, DT.91654361, DT.92034460, DT.92446349, DT.97784849, DT.101978019, DT.418647, DT.86842167, DT.91803457, DT.92446350, DT.95153003, DT.95254161, DT.97816654, DT.87014330, DT.87079224 (montagem DOTS).

Conforme aqui usado, o termo ligante de EGFR refere-se a um polipeptideo que se liga a e/ou ativa EGFR. O termo inclui formas precurso¬ras ligadas à membrana do ligante de EGFR, bem como formas solúveis proteoliticamente processadas do ligante de EGFR.

Conforme aqui usado, o termo ativação de ligante de EGFR refe¬re-se à transdução de sinal (por exemplo, aquela causada por um domínio de cinase intracelular de resíduos de tirosina de fosforilação de receptor de EGFR no EGFR ou um polipeptideo substrato) mediada por ligação de ligan¬te de EGFR.

Conforme aqui usado, o termo doença ou distúrbio caracterizado por ativação ou produção anormal de EGFR ou um ligante de EGFR ou dis¬túrbio relacionado com expressão de EGFR refere-se a uma condição que pode ou não envolver malignidade ou câncer, onde ativação e/ou produção anormal de EGFR e/ou um ligante de EGFR está ocorrendo em células ou tecidos de um indivíduo tendo, ou predisposto a, doença ou distúrbio.

Conforme aqui usado, os termos superexpressa, superexpresso e superexpressão conforme usado em conexão com células expressando EGFR referem-se a células que têm níveis mensuravelmente maiores de EGFR sobre a sua superfície comparado com uma célula normal do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou através de transcrição ou tradução aumentada. Expressão de EG¬FR (e, então, superexpressão) pode ser determinada em um ensaio de diag¬nóstico ou prognóstico através da avaliação de EGFR presente na superfície de uma célula ou em um lisato de célula através de técnicas que são conhe¬cidas no campo; por exemplo, através de um ensaio de imunoistoquimica, ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoenzima, ELISA, citometria de fluxo, radioimunoensaio, Western blot,ligação de ligante, atividade de cina- se, etc (Vide geralmente CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J., ed., Academic Press (2aed., 1998); CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIEN¬CE, Coligan, J.E. e outros,eds., John Wiley & Sons (1995-2003); vide tam-bém,Sumitomo e outros, Clin. Cancer Res. 10: 794-801 (2004) (descreven¬do Western blot, citometria de fluxo e imunoistoquimica) cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Alternativamente, ou adicionalmente, uma pessoa pode medir níveis de moléculas de ácido nucleico codificando EGFR na célula, por exemplo, através de técnicas de hibridização in situfluorescente, Southern blottingou PCR. Os níveis de EGFR em células normais são comparados aos níveis de células afetadas por um distúrbio de proliferação celular (por exemplo, câncer) para determi¬nar se EGFR é superexpresso.

Conforme aqui usado, o termo molécula de ligação de antígeno refere-se em seu sentido mais amplo a uma molécula que se liga especifi¬camente a um determinante antigênico. Uma molécula de ligação de antíge¬no pode ser, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que pode especificamente se ligar a um determinante antigênico. Mais especifi¬camente, uma molécula de ligação de antígeno que se liga a EGFR é uma molécula que especificamente se liga a um receptor de transmembrana de 170 kDa, tipicamente chamado receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR), mas também conhecido como HER-1 ou ErbB1. Por "se liga especi¬ficamente" quer dizer que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada de interações indesejadas ou não-específicas.

Conforme aqui usado, os termos fusão e quimérico,quando u- sados em referência a polipeptideos tal como ABMs, referem-se a polipepti¬deos compreendendo sequências de aminoácido derivadas de dois ou mais polipeptideos heterólogos, tal como porções de anticorpos de espécies dife¬rentes. Para ABMs quiméricas, por exemplo, os componentes de ligação de não-antígeno podem ser derivados de uma variedade ampla de espécies, incluindo primatas tal como chimpanzés e seres humanos. A região constan¬te da ABM quimérica é com mais preferência substancialmente idêntica à região constante de um anticorpo humano natural; a região variável do anti¬corpo quimérico é com mais preferência substancialmente idêntica àquela de um anticorpo anti-EGFR recombinante tendo a sequência de aminoácido da região variável de murino. Anticorpos humanizados são uma forma particu¬larmente preferida de anticorpo de fusão ou quimérico.

Conforme aqui usado, um polipeptideo tendo atividade de GnTIll refere-se a polipeptideos que são capazes de catalisar a adição de um resí¬duo de N-acetilglicosamina (GlcNAc) em ligação de £-1-4 ao manosídeo [3- ligado do núcleo trimanosila de oligossacarídeos N-ligados. Isto inclui poli¬peptideos de fusão exibindo atividade enzimática similar a, mas não neces¬sariamente idêntica a, uma atividade de |3(1,4)-N- acetilglicosaminiltransferase III, também conhecida como [3-1,4-manosil- glicoproteína 4-beta-N-acetilglicosaminil-transferase (EC 2.4.1.144), de a- cordo com o Nomenclature Committee of the International Union of Bioche¬mistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), conforme medido em um ensaio biológico particular, com ou sem dependência de dose. No caso onde de¬pendência de dose existe, ela não precisa ser idêntica àquela de GnTIll, mas substancialmente similar à dependência de dose em uma dada atividade comparado com o GnTIll (isto é, o polipeptideo candidato vai exibir atividade maior ou não menos do que cerca de 25 vezes menos e, de preferência, não mais do que cerca de dez vezes menos atividade, e com mais preferência não mais do que cerca de três vezes menos atividade com relação a GnTIll).

Conforme aqui usado, o termo variante (ou análogo) refere-se a um polipeptideo diferindo de um polipeptideo especificamente mencionado da invenção por inserções, deteções e substituições de aminoácido, criados usando, por exemplo, técnicas de DNA recombinante. Variantes da ABMs da presente invenção incluem moléculas de ligação de antígeno quiméricas, primatizadas ou humanizadas onde um ou vários dos resíduos de aminoáci¬do são modificados por substituição, adição e/ou deleção de uma maneira tal que não afete substancialmente afinidade de ligação de antígeno (por exem¬plo, EGFR). Orientação na determinação de quais resíduos de aminoácido podem ser substituídos, adicionados ou deletados sem abolir atividades de interesse pode ser encontrada através da comparação da sequência do poli¬peptideo particular com aquela de peptideos homólogos e minimização do número de mudanças de sequência de aminoácido feitas em regiões de ho- mologia alta (regiões conservadas) ou substituindo aminoácidos com se¬quência consenso.

Alternativamente, variantes recombinantes codificando esses mesmos polipeptideos ou similares podem ser sintetizadas ou selecionadas fazendo uso da "redundância" no código genético. Várias substituições de códon, tal como as mudanças silenciosas que produzem vários sítios de res¬trição, podem ser introduzidas para otimizar clonagem em um plasmideo ou vetor virai ou expressão em um sistema procariótico ou eucariótico particu¬lar. Mutações na sequência de polinucleotideo podem ser refletidas no poli¬peptideo ou domínios de outros peptideos adicionados ao polipeptideo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptideo, para mudar características tal como afinidades de ligação de ligante, afinidades interca- deia ou taxa de degradação/mudança.

"Substituições" de aminoácido podem ser, por exemplo, o resul¬tado de substituição de um aminoácido com outro aminoácido tendo proprie¬dades estruturais e/ou químicas similares, isto é, substituições de aminoáci¬do conservatives. Substituições de aminoácido "conservativas" podem ser feitas com base em similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofo- bicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfifática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não-polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leuci- na, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoáci¬dos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, aspa- ragina e glutamina; aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. "Inserções" ou "deleções" estão de preferência na faixa de a partir de cerca de 1 a 20 aminoácidos, com mais preferência 1 a 10 aminoácidos. A variação permitida pode ser experimen¬talmente determinada ao sistematicamente fazer inserções, deleções ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptideo usando téc¬nicas de DNA recombinante e ensaiando as variantes recombinantes resul¬tantes quanto à atividade.

Conforme aqui usado, o termo humanizado é usado para se re¬ferir a uma molécula de ligação de antígeno derivada de uma molécula de ligação de antígeno não-humana, por exemplo, um anticorpo de murino, que retém ou substancialmente retém as propriedades de ligação de antígeno da molécula de origem, mas que é menos imunogênica em seres humanos. Isto pode ser conseguido através de vários métodos incluindo (a) enxerto dos domínios variáveis não-humanos inteiros em regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos, (b) enxerto apenas das CDRs não- humanas em estrutura principal e regiões constantes humanas com ou sem retenção de resíduos de estrutural principal críticos (por exemplo, aqueles que são importantes para retenção de boa afinidade de ligação de antígeno ou funções de anticorpo) ou (c) transplante dos domínios variáveis não- humanos inteiros, mas cobrindo-os com uma seção tipo humana através da substituição de resíduos da superfície. Tais métodos são descritos em Jones e outros, Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol.,44:65-92 (1988); Verhoeyen e outros, Scien¬ce, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Pad- lan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994), todos aqui incorporados a título de referência em sua totalidade aqui. Existem geralmente 3 regiões de de¬terminação de complementaridade, ou CDRs, (CDR1, CDR2 e CDR3) em cada um dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve de um anticorpo, que são flanqueadas por quatro subregiões de estrutura principal (isto é, FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada um dos domínios variáveis de cadeias pe-

sada e leve de um anticorpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma discussão de anticorpos humanizados pode ser encontrada, inter alia, na Patente U.S. N° 6.632.927 e no Pedido de Patente U.S. publicado No. 2003/0175269, ambos aqui incorporados a título de referência em sua totali¬dade. Em outros exemplos, apenas os resíduos das CDRs que são necessá¬rios para ligação podem ser transferidos (por exemplo, "enxertados") em uma sequência humana para criar uma sequência de região variável comple¬ta com especificidade de antígeno.

Similarmente, conforme aqui usado, o termo primatizado é usa¬do para se referir a uma molécula de ligação de antígeno derivada de uma molécula de ligação de antígeno de não-primata, por exemplo, um anticorpo de murino, que retém ou substancialmente retém as propriedades de ligação de antígeno da molécula de origem, mas que é menos imunogênica em pri¬matas.

No caso onde houver duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, a definição do termo conforme aqui usado pretende incluir todos tais significados a menos que explicitamente declara¬do ao contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região de deter¬minação de complementaridade" ("CDR") para descrever os sítios de combi¬nação de antígeno não-contíguos encontrados dentro da região variável de ambos polipeptideos de cadeias pesada e leve. Esta região particular foi descrita por Kabat e outros, U.S. Dept, of Health and Human Services,"Se¬quences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia e ou¬tros, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que são aqui incorporados a título de referência, onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados um com o outro. Não obstante, aplicação de qualquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes da mesma pretende estar dentro do escopo do termo conforme definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados que compre¬endem as CDRs conforme definido por cada uma das referências citadas acima são mostrados abaixo na Tabela I como uma comparação. Os núme¬ros de resíduo exatos que compreendem uma CDR particular vão variar de-pendendo da sequência e do tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica podem rotineiramente determinar quais resíduos compreendem uma CDR particular dada a sequência de aminoácido da região variável do anticorpo.

1 Numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 de acordo com as convenções de numeração mostradas por Kabat e outros (vide abaixo).

2"AbM"refere-se às CDRs conforme definido pelo software de modelagem de anticorpo "AbM" da Oxford Molecular.

Kabat e outros também definiram um sistema de numeração pa¬ra sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Uma pessoa de habilidade comum na técnica pode designar sem ambiguidade este sistema de "numeração Kabat" para qualquer sequência de domínio variável, sem confiar em nenhum dado experimental além da própria se¬quência. Conforme aqui usado, "numeração Kabat"refere-se ao sistema de numeração mostrado por Kabat e outros, U.S. Dept, of Health e Human Ser-vices,"Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que de outro modo especificado, referências à numeração de posições de resí¬duo de aminoácido específico em uma ABM estão de acordo com o sistema de numeração Kabat. As sequências da listagem de sequência (Isto é, SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:147) não são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat. No entanto, conforme acima declarado, está bem dentro da habilidade comum de uma pessoa na técnica determinar o esquema de numeração Kabat de qualquer sequência de região variável na Listagem de Sequência com base na numeração das sequências conforme aqui apresen¬tado.

Por um ácido nucleico ou polinucleotideo tendo uma sequência de nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de nucleotídeo de referência da presente invenção quer dizer que a sequên¬cia de nucleotídeo do polinucleotideo é idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polinucleotideo pode incluir até cinco mutações por ponto por cada 100 nucleotideos da sequência de nucleotídeo de refe¬rência. Em outras palavras, para se obter um polinucleotideo tendo uma se¬quência de nucleotídeo pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nu¬cleotídeo de referência, até 5% de nucleotideos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos com outro nucleotídeo, ou vários nu¬cleotideos de até 5% dos nucleotideos totais na sequência de referência po¬dem ser inseridos na sequência de referência.

Como uma questão prática, se qualquer molécula de ácido nu¬cleico ou polinucleotideo particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeo ou se¬quência de polipeptideo da presente invenção pode ser determinado con¬vencionalmente usando programas de computador conhecidos. Um método preferido para determinação da melhor combinação geral entre uma se¬quência de investigação (uma sequência da presente invenção) e uma se¬quência objeto, também referida como um alinhamento de sequência global, pode ser determinado usando o programa de computador FASTDB com ba¬se no algoritmo de Brutlag e outros, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequência as sequências de investigação e objeto são ambas sequências de DNA. Uma sequência de RNA pode ser compara¬da convertendo U's em T's. O resultado do dito alinhamento de sequência global é em identidade percentual. Parâmetros preferidos usados em um alinhamento FASTDB de sequências de DNA para calcular identidade per¬centual são: Matrix=Unitary, k-tuple-4, Mismatch Penalty=1, Joining Pe- nalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 ou o comprimento da sequência de nucleotídeo objeto, a que for menor.

Se a sequência objeto for menor do que a sequência de investi¬gação por causa de deleções 3' ou 5', não por causa de deleções internas, uma correção manual pode ser feita nos resultados. Isto é porque o progra¬ma FASTDB não considera truncamentos 5' e 3' da sequência objeto quando calculando a identidade percentual. Para sequências objeto truncadas nas extremidades 5' e 3', com relação à sequência de investigação, a identidade percentual é corrigida através do cálculo do número de bases da sequência de investigação que são 5' e 3' da sequência objeto, que não são combina- das/alinhadas, como uma porcentagem de bases totais da sequência de in¬vestigação. Se um nucleotídeo é combinado/alinhado é determinado por re¬sultados do alinhamento de sequência FASTDB. Esta porcentagem é então subtraída da identidade percentual, calculada através do programa FASTDB acima usando os parâmetros específicos, para chegar a um scorede identi¬dade percentual final. Este scorecorrigido é o que é usado para os propósi¬tos da presente invenção. Apenas bases fora das bases 5' e 3’ da sequência objeto, conforme mostrado pelo alinhamento FASTDB, que não são combi- nadas/alinhadas com a sequência de investigação, são calculadas para os propósitos de ajuste manual do scorede identidade percentual.

Por exemplo, uma sequência objeto de 90 bases é alinhada com uma sequência de investigação de 100 bases para determinar a identidade percentual. As deleções acontecem na extremidade 5' da sequência objeto e então, o alinhamento FASTDB não mostra uma combinação/alinhamento das 10 primeiras bases na extremidade 5'. As 10 bases não-emparelhadas representam 10% da sequência (número de bases nas extremidades 5' e 3' não combinadas/número total de bases na sequência de investigação) então 10% são subtraídos do scorede identidade percentual calculado pelo pro¬grama FASTDB. Se as 90 bases restantes combinaram perfeitamente a i- dentidade percentual final seria 90%. Em outro exemplo, uma sequência ob¬jeto de 90 bases é comparada com uma sequência de investigação de 100 bases. Neste momento as deleções são deleções internas de modo que não há bases na 5' ou 3' da sequência objeto que não são combinadas/alinhadas com a investigação. Neste caso a identidade percentual calculada por FASTDB não é manualmente corrigida. Novamente, apenas bases 5' e 3' da sequência objeto que não são combinadas/alinhadas com a sequência de investigação são manualmente corrigidas. Quaisquer outras correções ma¬nuais são feitas para os propósitos da presente invenção.

Por um polipeptideo tendo uma sequência de aminoácido pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de aminoácido de in¬vestigação da presente invenção quer dizer que a sequência de aminoácido do polipeptideo objeto é idêntica à sequência de investigação exceto que a sequência de polipeptideo objeto pode incluir até cinco alterações de amino¬ácido por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácido de investiga¬ção. Em outras palavras, para se obter um polipeptideo tendo uma sequên¬cia de aminoácido pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácido de investigação, até 5% dos resíduos de aminoácido na sequência objeto podem ser inseridos, deletados ou substituídos com outro aminoácido. Es¬sas alterações da sequência de referência podem acontecer nas posições amino ou carbóxi terminais da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer outro lugar entre essas posições terminais, interespaçadas ou indi¬vidualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Como uma questão prática, se qualquer polipeptideo particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a um polipeptideo de referência pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. Um método preferido para determi¬nação da melhor combinação geral entre uma sequência de investigação (uma sequência da presente invenção) e uma sequência objeto, também referido como um alinhamento de sequência global, pode ser determinado usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Bru- tlag e outros, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequência as sequências de investigação e objeto ou são ambas sequências de nucleotídeo ou ambas sequências de aminoácido. O resultado do dito alinhamento de sequência global é em identidade percentual. Parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoácido FASTDB são: Ma- trix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomiza¬tion Group Length=0, Cutoff Score=1, Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 ou comprimento da sequência de aminoácido objeto, o qual for menor.

Se a sequência objeto for menor do que a sequência de investi¬gação devido a deleções N- ou C-terminais, não por causa de deleções in¬ternas, uma correção interna deve ser feita nos resultados. Isto é porque o programa FASTDB não considera truncamentos N- e C-terminais da se¬quência objeto quando calculando identidade percentual global. Para se¬quências objeto truncadas nos terminais N- e C-, com relação à sequência de investigação, a identidade percentual é corrigida através do cálculo do número de resíduos da sequência de investigação que são N- e C-terminais da sequência objeto, que não são combinados/alinhados com o resíduo ob¬jeto correspondente, como uma porcentagem das bases totais da sequência de investigação. Se um resíduo é combinado/alinhado é determinado atra¬vés dos resultados do alinhamento de sequência FASTDB. Esta porcenta-gem é então subtraída da identidade percentual, calculada através do pro¬grama FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar a um scorede identidade percentual final. Este scorede identidade percentual final é o que é usado para os propósitos da presente invenção. Apenas resí¬duos para os terminais N- e C- da sequência objeto, que não são combina¬dos/alinhados com a sequência de investigação, são considerados para os propósitos de ajuste manual do scorede identidade percentual. Isto é, ape¬nas posições de resíduo de investigação fora dos resíduos N- e C-terminais da sequência objeto.

Por exemplo, uma sequência objeto de resíduo de 90 aminoáci¬dos é alinhada com uma sequência de investigação de 100 resíduos para determinar a identidade percentual. A deleção acontece no terminal N da sequência objeto e, então, o alinhamento FASTDB não mostra uma combi- nação/alinhamento dos 10 primeiros resíduos no terminal N. Os 10 resíduos não-emparelhados representam 10% da sequência (número de resíduos nos terminais N- e C- não-combinados/número total de resíduos na sequência de investigação) então 10% são subtraídos do scorede identidade percentual calculado através do programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes com- binaram perfeitamente a identidade percentual final seria 90%. Em outro e- xemplo, uma sequência objeto de 90 resíduos é comparada com uma se¬quência de investigação de 100 resíduos. Neste momento as deleções são deleções internas, então não há quaisquer resíduos no terminal N- ou C da sequência objeto que não sejam combinados/alinhados com a investigação. Neste caso a identidade percentual calculada através de FASTDB não é manualmente corrigida. Novamente, apenas posições de resíduo fora dos terminais N- e C- da sequência objeto, conforme mostrado no alinhamento FASTDB, que não são combinadas/alinhadas com a sequência de investiga¬ção são manualmente corrigidas. Quaisquer outras correções manuais de¬vem ser feitas para os propósitos da presente invenção.

Conforme aqui usado, um ácido nucleico que "hibridiza sob con¬dições estringentes" para uma sequência de ácido nucleico da invenção re¬fere-se a um polinucleotideo que hibridiza em uma incubação da noite para o dia a 42° C em uma solução compreendendo 50% de formamida, 5x SSC (NaCl a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e 20 pg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 0,1x SSC em cerca de 65° C.

Conforme aqui usado, o termo domínio de localização de Golgi refere-se à sequência de aminoácido de um polipeptideo residente em Golgi que é responsável pelo ancoramento do polipeptideo em local dentro do complexo de Golgi. Em geral, domínios de localização compreendem "cau¬das"amino terminais de uma enzima.

Conforme aqui usado, o termo função efetorarefere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de variante de sequência de aminoácido) de um anticor¬po. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem, mas não estão limi¬tadas a, afinidade de ligação de receptor Fc, citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocina, absorção de antígeno mediada por complexo imune por células apresentando antígeno, suprarregulagem de receptores de su- perfície celular, etc.

Conforme aqui usado, os termos engenheirar, engenheirado, engenharia e engenharia de glicosilação são considerados incluir qualquer manipulação do padrão de glicosilação de um polipeptideo de ocorrência natural ou recombinante ou um fragmento do mesmo. Engenharia de glicosi¬lação inclui engenharia metabólica do maquinário de glicosilação de uma célula, incluindo manipulações genéticas dos cursos de síntese de oligossa¬carídeo para atingir glicosilação alterada de glicoproteínas expressas em células. Ainda, engenharia de glicosilação inclui os efeitos de mutações e ambiente de célula sobre glicosilação. Em uma modalidade, a engenharia de glicosilação é uma alteração na atividade de glicosiltransferase. Em uma modalidade particular, a engenharia resulta em atividade de glicosaminil- transferase e/ou atividade de fucosiltransferase.

Conforme aqui usado, o termo célula hospedeiro compreende qualquer tipo de sistema celular que possa ser engenheirado para gerar os polipeptideos e moléculas de ligação de antígeno da presente invenção. Em uma modalidade, a célula hospedeiro é engenheirada para permitir a produ¬ção de uma molécula de ligação de antígeno com glicoformas modificadas. Em uma modalidade preferida, a molécula de ligação de antígeno é um anti¬corpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão. Em certas modalidades, as células hospedeiro foram manipuladas mais para expressar níveis au¬mentados de um ou mais polipeptideos tendo atividade de GnTIll. Células hospedeiro incluem células culturadas, por exemplo, células culturadas de mamífero, tal como células CHO, células HEK293-EBNA, células BHK, célu¬las NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ca¬mundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células hibridoma, célu¬las de levedura, células de inseto e células de planta, para mencionar algu¬mas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou planta culturada ou tecido de animal.

Conforme aqui usado, o termo citotoxidez celular mediada por Fc inclui citotoxidez celular dependente de anticorpo e citotoxidez celular mediada por uma proteína de fusão de Fc solúvel contendo uma região Fc humana. Ela é um mecanismo imune levando à lise de "células direcionadas a anticorpo" por "células efetoras imunes humanas", onde:

As células efetoras imunes humanas são uma população de leu¬cócitos que mostra receptores de Fc em sua superfície através dos quais eles se ligam à região Fc de anticorpos ou de proteínas de fusão de Fc e realizam funções efetoras. Tal população pode incluir, mas não está limitada a, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e/ou células assas¬sinas naturais (NK).

As células direcionadas a anticorpo são células ligadas pelos anticorpos ou proteínas de fusão de Fc. Os anticorpos ou proteínas de fusão de Fc se ligam às células-alvo através de uma parte de proteína N-terminal para região Fc.

Conforme aqui usado, o termo citotoxidez celular mediada por Fc aumentada é definida ou como um aumento no número de "células dire¬cionadas a anticorpo" que são lisadas em um dado momento, em uma dada concentração de anticorpo ou de uma proteína de fusão de Fc, no meio cir¬cundando as células-alvo, através do mecanismo de citotoxidez celular me¬diada por Fc definido acima, e/ou uma redução na concentração de anticor¬po, ou de proteína de fusão Fc, no meio circundando as células-alvo, reque¬rido para atingir a lise de um dado número de "células direcionadas a anti¬corpo", em um dado momento, através do mecanismo de citotoxidez celular mediada por Fc. O aumento em citotoxidez celular mediada por Fc é relativo à citotoxidez celular mediada pelo mesmo anticorpo, ou proteína de fusão de Fc, produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiro, usando os mesmos métodos de produção, purificação, formulação e armazenamento padrão, que são conhecidos daqueles versados na técnica, mas que não foram pro¬duzidos por células hospedeiro engenheiradas para expressar a glicosil- transferase GnTIll através dos métodos descritos aqui.

Por anticorpo tendo citotoxidez celular dependente de anticorpo aumentada (ADCC) quer dizer um anticorpo, como o termo é aqui definido, tendo ADCC aumentada conforme determinado através de qualquer método conhecido adequado daquele de habilidade comum na técnica. Um exemplo de um ensaio de ADCC in vitro aceito é como segue: LIST 1

o ensaio usa células-alvo que são conhecidas expressar o antígeno-alvo reconhecido pela região de ligação de antígeno do anticorpo;

o ensaio usa células mononucleares de sangue periférico hu¬manas (PBMCs), isoladas de sangue de um doador saudável aleatoriamente escolhido, como células efetoras;

o ensaio é realizado de acordo com o protocolo que segue:

as PBMCs são isoladas usando procedimentos de centrifuga¬ção de densidade padrão e são suspensas a 5 x 106 células/ml em meio de cultura de célula RPMI;

as células-alvo são culturadas através de métodos de cultura de tecido padrão, coletadas da fase de crescimento exponencial com uma viabilidade maior do que 90%, lavadas em meio de cultura de célula RPMI, marcadas com 100 micro-Curies de 51 Cr, lavadas duas vezes com meio de cultura celular e ressuspensas em meio de cultura celular em uma densida¬de de 105 células/ml;

100 microlitros da suspensão de célula-alvo final acima são transferidos para cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavi¬dades;

o anticorpo é serialmente diluído de 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml em meio de cultura de célula e 50 microlitros das soluções de anticorpo re¬sultante são adicionados às células-alvo na placa de microtitulação de 96 cavidades, testando em triplicata várias concentrações de anticorpo compre¬endendo a faixa de concentração integral acima;

para os controles de liberação máxima (MR), 3 cavidades adi¬cionais na placa contendo as células-alvo marcadas recebem 50 microlitros de uma solução aquosa a 2% (v/v) de detergente não-iônico (Nonidet, Sig¬ma, St. Louis), ao invés da solução de anticorpo (ponto iv acima);

para os controles de liberação espontânea (SR), 3 cavidades adicionais na placa contendo as células-alvo marcados recebem 50 microli¬tros de meio de cultura celular RPMI ao invés da solução de anticorpo (ponto iv acima);

a placa de microtitulação de 96 cavidades é então centrifu¬gada a 50 x g por 1 minuto e incubada por 1 hora a 4o C;

50 microlitros da suspensão PBMC (ponto i acima) são adi¬cionados a cada cavidade para dar uma razão de célula efetora:alvo de 25:1 e as placas são postas em uma incubadora sob atmosfera de CO2 a 5% a 37° C por 4 horas;

o sobrenadante livre de célula de cada cavidade é coletado e a radioatividade experimentalmente liberada (ER) é quantificada usando um contador gama;

a porcentagem de lise específica é calculada para cada con¬centração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, onde ER é a radioatividade média quantificada (vide ponto ix acima) para aquela concentração de anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (vide ponto ix acima) para os controles MR (vide ponto v acima) e SR é a radioatividade média quantificada (vide ponto ix acima) para os controles SR (vide ponto vi acima);

"ADCC aumentada" é definida ou como um aumento na por¬centagem máxima de lise específica observado dentro da faixa de concen¬tração de anticorpo testada acima e/ou uma redução na concentração de anticorpo requerida para atingir metade da porcentagem máxima de lise es¬pecífica observada dentro da faixa de concentração de anticorpo testada acima. O aumento em ADCC é relativo á ADCC, medida, por exemplo, com o ensaio acima, mediada pelo menos anticorpo, produzido pelo menos tipo de células hospedeiro, usando os mesmos métodos de produção, purifica¬ção, formulação e armazenamento padrão, que são conhecidos daqueles versados na técnica, mas que não foram produzidos por células hospedeiro engenheiradas para superexpressar GnTIll.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antígeno tendo a especificidade de ligação do anticorpo monoclo¬nal ICR62 de rato (isto é, se liga substancialmente ao mesmo epítopo) e à constatação de que suas funções efetoras podem ser aumentadas por glico¬silação alterada. Em uma modalidade, a molécula de ligação de antígeno é um anticorpo quimérico. Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um anticorpo quimérico, ou um fragmento do mesmo, compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) das CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOs:53-108 e/ou SEQ ID NOs:122-127. Espe¬cificamente, em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um poli¬nucleotideo isolado compreendendo: (a) uma sequência selecionada de um grupo consistindo em: SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NQ:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, e SEQ ID NO: 124; (b) uma sequência selecionada de um grupo consistindo em SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NQ:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, SEQ ID NQ:102, SEQ ID NQ:104, SEQ ID NQ:106 e SEQ ID NO:126; e (c) SEQ ID NO:108. Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se a um polinucleotideo isolado compreendendo: (a) uma sequência selecionada do grupo consistin¬do em SEQ ID NO:112 e SEQ ID NO:114; (b) uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:118; e (c) SEQ ID NO: 119. Em uma modalidade, qualquer um desses polinucleotídeos codifica um polipeptideo de fusão. Em outros aspectos a invenção pode excluir qual¬quer uma ou todas essas sequências de polinucleotideo.

Em outra modalidade, a molécula de ligação de antígeno com¬preende o domínio VH do anticorpo ICR62 de rato codificado pela SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 ou uma variante da mesma; e um polipeptideo de não-murino. Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se a uma mo¬lécula de ligação de antígeno compreendendo o domínio VL do anticorpo de rato codificado pela SEQ ID NO:43 ou SEQ ID NO:44 ou uma variante da mesma; e um polipeptideo de não-murino. Em outros aspectos a invenção pode excluir qualquer uma ou todas essas sequências de polinucleotideo.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a moléculas de ligação de antígeno compreendendo uma ou mais CDRs de ICR62 truncadas ou variantes (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis). Tais CDRs truncadas ou variantes vão conter, no mínimo, os resíduos de aminoácido de determinação de especificidade para a dada CDR. Por "resíduo de determi¬nação de especificidade" quer dizer aqueles resíduos que são diretamente envolvidos na interação com o antígeno. Em geral, apenas cerca de um quinto a um terço dos resíduos em uma dada CDR participa na ligação a antígeno. Os resíduos de determinação de especificidade em uma CDR par¬ticular podem ser identificados através, por exemplo, computação de conta¬tos interatômicos a partir da modelagem tridimensional e determinação da variabilidade de sequência em uma dada posição de residuo de acordo com os métodos descritos em Padlan e outros, FASEB J. 9(1): 133-139 (1995), cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totali¬dade. Deste modo, as moléculas de ligação de antígeno (ABMs) da presente invenção conforme referido aqui pretendem também compreender ABMs compreendendo, por exemplo, CDRs truncadas ou variantes que compreen¬dem um ou mais resíduos de determinação de especificidade, ou compreen¬dendo substituições em uma ou mais posições dentro das CDRs comparado com uma CDR de referência (por exemplo, as CDRs de ICR62 de rato).

Deste modo, a invenção refere-se também a um polinucleotideo isolado compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) região de determinação de complementaridade do an¬ticorpo ICR62 de rato, ou uma variante ou forma truncada da mesma, con¬tendo pelo menos os resíduos de determinação de especificidade para a dita região de determinação de complementaridade, onde o dito polinucleotideo isolado codifica um polipeptideo de fusão. De preferência, tais polinucleotí-deos isolados codificam um polipeptideo de fusão que é uma molécula de ligação de antígeno. Em uma modalidade, o polinucleotideo compreende três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo ICR62 de rato, ou variantes ou formas truncadas das mesmas, contendo pelo menos os resíduos de determinação de especificidade para cada uma das ditas três regiões de determinação de complementaridade. Em uma modalidade, o polinucleotideo compreende pelo menos uma das CDRs mostradas nas Ta¬belas 2-5, abaixo. Em outra modalidade, o polinucleotideo codifica a região variável inteira da cadeia leve ou pesada de um anticorpo quimérico (por exemplo, humanizado). A invenção refere-se ainda aos polipeptideos codifi¬cados por tais polinucleotídeos.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígeno compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) região(ões) de determinação de comple¬mentaridade do anticorpo ICR62 de rato, ou uma variante ou forma truncada da mesma, contendo pelo menos os resíduos de determinação de especifi¬cidade (SDRs) para a dita região de determinação de complementaridade, e compreendendo uma sequência derivada de um polipeptideo heterólogo. Em uma modalidade, a molécula de ligação de antígeno compreende três regi-ões de determinação de complementaridade do anticorpo ICR62 de rato, ou variantes ou formas truncadas das mesmas, contendo pelo menos os resí¬duos de determinação de especificidade para cada uma das ditas três regi¬ões de determinação de complementaridade. Em uma modalidade, a molé¬cula de ligação de antígeno compreende pelo menos uma das CDRs mos¬tradas nas Tabelas 2-5, abaixo. Em outros aspectos, a presente invenção pode excluir qualquer uma ou todas as sequências de CDR mostradas nas Tabelas 2-5, abaixo.

Em uma modalidade, a molécula de ligação de antígeno com¬preende pelo menos um dos SDRs das CDRs do anticorpo ICR62. Em uma modalidade, as uma ou mais CDRs da ABM da invenção compreendem substituições em uma ou mais posições do aminoácido, e a ABM retém ati¬vidade de ligação comparado com a ABM não-substituída. Atividade de liga¬ção pode ser medida conforme aqui descrito e através de métodos que são rotina e bem-conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a concentra¬ção EC50 para ligação da ABM substituída é modulada por menos do que um fator de cerca de 10 a cerca de 0,001 comparado com a ABM não- substituída. Em modalidades particulares, a concentração EC50 é modulada por menos do que um fator de 10 a cerca de 1, cerca de 10 a cerca de 5, cerca de 5 a cerca de 0,1, cerca de 5 a cerca de 2 e cerca de 3 a cerca de 1 comparado com a ABM não-substituída. Em modalidades particulares, a concentração EC50 do anticorpo substituído é modulada por menos do que um fator de cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cer¬ca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,05, cerca de 0,25, cerca de 0,1, cerca de 0,005, cerca de 0,025 e cerca de 0,001 com¬parado com a ABM não-substituída. Em uma modalidade particular, a con¬centração EC50 é modulada por menos do que um fator de cerca de 10. Em outras modalidades, o fator EC50 é modulado por um fator de cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,05, cerca de 0,25, cerca de 0,1, cer¬ca de 0,005, cerca de 0,025 e cerca de 0,001. Em algumas modalidades, a modulação é uma diminuição na EC50. Em outras modalidades, a modula¬ção é um aumento na EC50.

As CDRs das ABMs da invenção podem compreender substitui¬ções em qualquer resíduo (de acordo ou com a Chothia ou Kabat ou qual¬quer outra definição de CDR conforme aqui definido ou conhecido na técni¬ca). Em uma modalidade, as CDRs compreendem substituições em qualquer uma ou todas as posições exceto por um ou mais resíduos de determinação de especificidade. Em uma modalidade particular, as CDRs compreendem substituições em todas as posições exceto os resíduos de determinação de especificidade. Em uma modalidade, as CDRs de cadeia pesada da presen¬te invenção compreendem substituições em uma ou mais de posições Kabat 27, 28, 29, 30, 31, 23, 33, 34, 35, 52, 52a, 53, 54, 55, 57, 58, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 101, 102 ou qualquer combinação das mesmas. Em outra modalidade, a(s) CDR(s) compreendem substitui¬ções em uma ou mais da posição Kabat 27, 28 ou 29 da CDR1 de cadeia pesada Chothia, posição 31 da CDR1 de cadeia pesada Kabat, posição 52, 52a, 53 ou 57 de Kabat de CDR2 de cadeia pesada Kabat ou posição 102 Kabat da CDR3 de cadeia pesada Kabat.

Em uma modalidade, as CDRs de cadeia leve compreendem uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais da posição Kabat 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 ou qualquer combinação das mesmas. Em outra modali- dade, a(s) CDR(s) compreende(m) substituições em uma ou mais da posi¬ção Kabat 30 ou 32 da CDR1 de cadeia leve Kabat, posição 51, 52, 53 ou 56 Kabat da CDR2 de cadeia leve Kabat ou posição Kabat 94 da CDR3 de ca¬deia pesada Kabat.

Em outro aspecto, a ABM da presente invenção compreende pelo menos um resíduo de determinação de especificidade de pelo menos uma região de determinação de complementaridade do anticorpo ICR62 de rato. Em algumas modalidades, a ABM compreende resíduos de determina¬ção de especificidade das CDRs de cadeia pesada. Em modalidades mais particulares, o resíduo de determinação de especificidade de cadeia pesada é selecionado do grupo consistindo em fenilalanina na posição 29 Kabat, asparagina na posição 52 Kabat, tirosina na posição 56 Kabat e valina na posição 100b Kabat. Em uma modalidade específica, os resíduos de deter¬minação de especificidade são tirosina na posição 56 Kabat e valina na po¬sição 100b Kabat. Em outra modalidade específica, os resíduos de determi¬nação de especificidade são fenilalanina na posição 29 Kabat, asparagina na posição 52 Kabat, tirosina na posição 56 Kabat e valina na posição 100b Kabat. Em outras modalidades, os resíduos de determinação de especifici¬dade estão nas regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve. Em modalidades mais particulares, o resíduo de determinação de es¬pecificidade de cadeia leve é selecionado do grupo consistindo em aspara¬gina na posição 34 Kabat e asparagina na posição 50 Kabat. Em uma moda¬lidade específica, o resíduo de determinação de especificidade é asparagina na posição 34 Kabat. Em outra modalidade específica, o residuo de determi¬nação de especificidade é asparagina na posição 50 Kabat. Em outra moda¬lidade específica, os resíduos de determinação de especificidade são aspa¬ragina na posição 34 Kabat e asparagina na posição 50 Kabat.

Em outro aspecto, a molécula de ligação de antígeno compreen¬de a região variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo. Em uma modalidade particularmente útil, a molécula de ligação de antígeno é um an¬ticorpo quimérico, por exemplo, humanizado. A invenção refere-se também a métodos de fabricação de tais moléculas de ligação de antígeno e ao uso das mesmas no tratamento de doença, particularmente distúrbios de prolife¬ração celular onde EGFR é expresso, particularmente onde EGFR é anor¬malmente expresso (por exemplo, superexpresso) comparado com tecido normal do mesmo tipo de célula. Tais distúrbios incluem, mas não estão limi¬tados a, cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, mama, ovário, cólon, próstata, pele e rim. Níveis de expressão de EGFR po¬dem ser determinados através de métodos conhecidos na técnica e aqueles descritos aqui (por exemplo, através de ensaio de imunoistoquímica, ensaio de imunofluorescéncia, ensaio de imunoenzima, ELISA, citometria de fluxo, radioimunoensaio, Western blot,ligação de ligante, atividade de cinase, etc).

A invenção refere-se também a um método para direcionamento in vivoou in vitro de células expressando EGFR. Células que expressam EGFR podem ser direcionadas para propósitos terapêuticos (por exemplo, para tratar um distúrbio que é tratável através de rompimento da sinalização mediada por EGFR, por exemplo, através de bloqueio de ligação de ligante, ou através de direcionamento das células expressando EGFR para destrui¬ção pelo sistema imune). Em uma modalidade, a presente invenção refere- se a um método para direcionamento de células expressando EGFR em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição com¬preendendo uma ABM da invenção. Células que expressam EGFR podem ser também direcionadas para propósitos de diagnóstico (por exemplo, para determinar se elas estão expressando EGFR, ou normalmente ou anormal-mente). Então, a invenção refere-se também a métodos para detecção da presença de EGFR ou uma célula expressando EGFR, ou in vivoou in vitro. Um método de detecção de expressão de EGFR de acordo com a presente invenção compreende contato de uma amostra a ser testada, opcionalmente com uma amostra de controle, com uma ABM da presente invenção, sob condições que permitem a formação de um complexo entre a ABM e EGFR. A formação de complexo é então detectada (por exemplo, através de ELISA ou outros métodos conhecidos na técnica). Quando usando uma amostra controle com a amostra de teste, qualquer diferença estatisticamente signifi- cante na formação dos complexos ABM-EGFR quando comparando as a¬mostras de teste e de controle é indicativa da presença de EGFR na amostrade teste.

Sabe-se que vários mecanismos estão envolvidos na eficácia terapêutica de anticorpos anti-EGFR, incluindo bloqueio de ligante (por e- xemplo, EGF, TGF-a, etc) se ligando a EGFR e subsequente ativação de cursos de sinalização, citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) e a indução de parada de crescimento ou diferenciação terminal.

O anticorpo monoclonal de rato ICR62 (lgG2b) foi discutido na Publicação PCT No. WO 95/20045, que é aqui incorporada a título de refe¬rência em sua totalidade. Ele foi direcionado ao epítopo C de EGFR, e foi mostrado inibir a ligação de ligante, inibir crescimento in vitrode carcinomas de célula escamosa expressando EGFR e induzir regressão de xenoenxer- tos de tumores em camundongos atímicos (WO 95/20045; Modjtahedi e ou¬tros, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). Como um anticorpo integralmente de roedor, administração de anticorpo monoclonal de rato ICR62 a humanos resultou em uma resposta HARA em alguns pacientes seguindo até mesmo uma única dose. (WO 95/20045; Modjtahedi e outros, Br. J. Cancer73:228- 235 (1996)).

Anticorpos de camundongo/humanos quiméricos foram descri¬tos. Vide, por exemplo, Morrison, S. L. e outros, PNAS 11:6851-6854 (No¬vembro 1984); Publicação de Patente Européia No. 173494; Boulianna,G. L, e outros, Nature 312:642 (Dezembro 1984); Neubeiger, M. S. e outros, Natu¬re 314:268 (Março 1985); Pedido de Patente Europeu No. 125023; Tan e outros, J. Immunol. 135:8564 (Novembro 1985); Sun, L. K e outros, Hybri- doma 5(1):517 (1986); Sahagan e outros, J. Immunol. 137:1066-1074 (1986). Vide em geral, Muron, Nature 312:597 (Dezembro 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (Março 1985); Marx, Science 229:455 (Agos¬to 1985); e Morrison, Science 229:1202-1207 (Setembro 1985). IMC-C225 (Erbitux®, Imclone) é um anticorpo monoclonal quimérico direcionado contra EGFR e tendo uma região variável de camundongo e uma região constante humana (Vide Herbst e Shin, Cancer94: 1593-1611 (2002)). A porção de murino de IMC-225 é derivada de M225, que foi verificada se ligar a EGFR e inibir fosforilação dependente de tirosina cinase induzida por EGF, bem co¬mo indução de apoptose em linhagens de célula de tumor superexpressando EGFR (Herbst e Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). No entanto, M225 eli- citou uma reação HAMA em pacientes tratados com o anticorpo na Fase I de testes clínicos (Herbst e Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). IMC-225 foi testada in vivoe in vitro e tem sido usada em combinação com terapia de radiação e quimioterapia em vários tipos de tumor, incluindo aqueles associ¬ados com prognóstico pobre (Herbst e Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). No entanto, IMC-225 foi associada com toxidezes tal como reações alérgicas e de pele em pacientes administrados com o anticorpo IMC-225 em testes clínicos (Herbst e Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)).

Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM quimérica da presente invenção é um anticorpo humanizado. Métodos para humaniza¬ção de anticorpos não-humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, ABMs humanizadas da presente invenção podem ser preparadas de acordo com os métodos da Patente U.S. N° 5.225.539 para Winter, Patente U.S. N° 6.180.370 para Queen e outros, Patente U.S. N° 6.632.927 para Adair e ou¬tros ou Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2003/0039649 para Foote, os conteúdos de cada um são aqui incorporados a titulo de referência. De preferência, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoá¬cido introduzidos nele a partir de uma fonte que é não-humana. Esses resí- duos de aminoácido não-humanos são frequentemente referidos como resí¬duos "importantes", que são tipicamente obtidos de um domínio variável "im¬portante". Humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o mé¬todo de Winter e colaboradores (Jones e outros, Nature,321:522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyen e ou¬tros, Science, 239:1534-1536 (1988)), através da substituição de sequências de região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Deste modo, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quimé¬ricos (Patente U.S. N° 4.816.567) onde substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspon¬dente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos onde alguns resíduos de região hipervariá¬vel e possivelmente de alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor. Os anticorpos anti-EGFR humani¬zados objeto vão compreender regiões de imunoglobulina humana.

A escolha de domínios variáveis humanos, ambos leves e pesa¬dos, a serem usados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito im¬portante para reduzir antigenicidade. De acordo com o chamado método "best-fit",a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é ava¬liada contra toda a biblioteca de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que é mais próxima daquela do roedor é então aceita como a região de estrutura principal humana (FR) para o anti¬corpo humanizado (Sims e outros, J. Immunol.,151:2296 (1993); Chothia e outros, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método de seleção da sequência de estrutura principal humana é comparar a sequência de cada sub-região individual da estrutura de roedor integral (isto é, FR1, FR2, FR3 e FR4) ou alguma combinação das sub-regiões individuais (por exemplo, FR1 e FR2) contra uma biblioteca de sequências de região variável humanas conhecidas que correspondem àquela sub-região de estrutura principal (por exemplo, conforme determinado através da numeração Kabat) e escolher a sequência humana para cada sub-região ou combinação que é a mais próxima daquela do roedor (Leung, Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2003/0040606A1, publicada em 27 de fevereiro de 2003) (cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência). Outro méto¬do usa uma região de estrutura principal particular derivada da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura principal pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta e outros, J. Immunol.,151:2623 (1993)) (cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de refe¬rência).

É ainda importante que anticorpos sejam humanizados com re¬tenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológica fa¬voráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências de origem e vários produtos humanizados conceituais usan¬do modelos tridimensionais das sequências de origem e humanizadas. Mo¬delos de imunoglobulina tridimensionais podem ser gerados usando progra-mas de computador familiares àqueles versados na técnica (por exemplo, Insightll, Accelrys, Inc. (antes MSI) ou no http://swissmodel.expasy.org). Es¬ses programas de computador podem ilustrar e mostrar prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina candida¬tas selecionadas. Inspeção dessas amostras permite análise do papel pro¬vável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina can¬didata, isto é, a análise de residuos que influenciam a habilidade da imuno¬globulina candidata em ligar seu antígeno. Desta maneira, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados das sequências recipientes e impor¬tadas de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como uma afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo(s), seja conseguida. Em ge¬ral, os resíduos de região hipervariável são diretamente e mais substancial¬mente envolvidos em influenciamento de ligação de antígeno.

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção com¬preendem uma região Fc humana. Em uma modalidade específica, a região constante humana é lgG1, conforme mostrado na SEQ ID NOs: 109 e 110, e conforme mostrado abaixo:

Sequência de Nucleotídeo de lgG1 (SEQ ID NO: 110) ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTG ACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAA TCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCC TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGG TCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA

Sequência de Aminoácido de lgG1 (SEQ ID NO:109)

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

No entanto, variantes e isoformas da região Fc humana são também compreendidas pela presente invenção. Por exemplo, as regiões Fc variantes adequadas para uso na presente invenção podem ser produzidas de acordo com os métodos ensinados na Patente U.S. N° 6.737.056 para Presta (variantes da região Fc com função efetora alterada devido a uma ou mais modificações de aminoácido); ou no Pedido de Patente U.S. N°s 60/439.498; 60/456.041; 60/514.549 ou WO 2004/063351 (regiões Fc varian¬tes com afinidade de ligação aumentada devido à modificação de aminoáci¬do); ou no Pedido de Patente U.S. N° 10/672.280 ou WO 2004/099249 (vari¬antes Fc com ligação alterada a FcyR devido à modificação de aminoácido), cujos conteúdos de cada um são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação de antígeno da presente invenção são engenheiradas para ter afinidade de ligação aumen¬tada de acordo com, por exemplo, os métodos revelados na Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2004/0132066 para Balint e outros, cujos conteú¬dos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.

Em uma modalidade, a molécula de ligação de antígeno da pre¬sente invenção é conjugada a uma porção adicional, tal como um radiomar- cador ou uma toxina. Tais ABMs conjugadas podem ser produzidas através de vários métodos que são bem-conhecidos na técnica.

Uma variedade de radionuclídeos é aplicável à presente inven¬ção e aqueles versados na técnica têm a habilidade de prontamente deter¬minar qual radionuclídeo é mais apropriado sob uma variedade de circuns¬tâncias. Por exemplo,131 iodo é um radionuclídeo bem-conhecido usado para imunoterapia direcionada. No entanto, a utilidade clínica do 131iodo pode ser limitada por vários fatores incluindo: meia-vida física de oito dias; desaloge- nação de anticorpo iodado ambos no sangue e em sítios de tumor; e carac¬terísticas de emissão (por exemplo, componente gama grande) que podem ser subótimas para deposição de dose localizada em tumor. Com o advento de agentes de quelação superiores, a oportunidade para ligação de grupos de quelação de metal a proteínas aumentou as oportunidades de utilizar ou¬tros radionuclídeos tal como 111índio e 90ítrio. 90ítrio provê vários benefícios para utilização em aplicações radioimunoterapêuticas: a meia-vida de 64 horas de "ítrio é longa o suficiente para permitir acúmulo de anticorpo pelo tumor e, diferente, por exemplo, de 131iodo, "ítrio é um emissor beta puro de alta energia sem nenhuma irradiação gama acompanhante em seu declínio, com uma faixa em tecido de 100 a 1000 diâmetros de célula. Ainda, a quan¬tidade mínima de radiação de penetração permite a administração de paci¬ente externo de anticorpos marcados com "ítrio. Adicionalmente, internali- zação de anticorpo marcado não é requerida para morte celular, e a emissão local de radiação ionizante deve ser letal para células de tumor adjacentes sem o antígeno alvo.

Dosagens de tratamento únicas eficazes (isto é, quantidades terapeuticamente eficazes) de anticorpos anti-EGFR marcados com "ítrio variam entre cerca de 5 e cerca de 75 mCi, com mais preferência entre cer¬ca de 10 e cerca de 40 mCi. Dosagens ablativas de não-medula óssea de tratamento únicas eficazes de anticorpos anti-EGFR marcado com 131 iodo variam entre cerca de 5 e cerca de 70 mCi, com mais preferência entre cer¬ca de 5 e cerca de 40 mCi. Dosagens ablativas de tratamento únicas efica¬zes (isto é, podem requerer transplante de medula-óssea autólogo) de anti¬corpos anti-EGFR marcado com 131 iodo variam entre cerca de 30 e cerca de 600 mCi, com mais preferência entre cerca de 50 e menos do que cerca de 500 mCi. Em conjunto com um anticorpo anti-EGFR quimérico, devido à meia-vida circulante maior vis-à-vis anticorpos de murino, uma dosagem a- blativa de não-medula-óssea de tratamento única eficaz de anticorpos anti- EGFR quiméricos marcados com 131 iodo varia entre cerca de 5 e cerca de 40 mCi, com mais preferência menos do que cerca de 30 mCi. Critérios de descrição para, por exemplo, o marcador111 índio, são tipicamente menos do que cerca de 5 mCi.

Com relação a anticorpos anti-EGFR radiomarcados, terapia com eles pode também acontecer usando um tratamento de terapia único ou usando tratamentos múltiplos. Por causa do componente radionuclídeo, é preferido que antes do tratamento células-tronco periféricas ("PSC") ou me¬dula-óssea ("BM") sejam "coletadas" para pacientes sofrendo toxidez de medula-óssea potencialmente fatal resultante de radiação. BM e/ou PSC são coletadas usando técnicas padrão, e então purgadas e congeladas para possível reinfusão. Ainda, é mais preferido que antes do tratamento um es¬tudo de dosimetria de diagnóstico usando um anticorpo marcado de diagnós¬tico (por exemplo, usando 111 índio) seja conduzido no paciente, cujo propósi¬to é assegurar que o anticorpo terapeuticamente marcado (por exemplo, u- sando 90ítrio) não vai se tornar desnecessariamente "concentrado" em qual¬quer órgão ou tecido normal.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência que codifica um polipeptideo tendo uma sequência de aminoácido na Tabela 7 abaixo. Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência mostrada na Tabela 6 abaixo. A invenção refere-se ainda a um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeo mostrada na Tabela 6 abaixo. Em outros aspec¬tos, a presente invenção pode excluir qualquer uma das sequências de nu¬cleotídeo na Tabela 6. Em outra modalidade, a invenção refere-se a um áci¬do nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica um polipep¬tideo tendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido na Tabela 7. A invenção também compreende um polipeptideo isolado compre¬endendo uma sequência de aminoácido de qualquer um dos construtos na Tabela 7 com substituições de aminoácido conservatives. Em outros aspec¬tos, a presente invenção pode excluir qualquer uma das sequências de ami¬noácido na Tabela 7.

A presente invenção também compreende uma molécula de li¬gação de antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada quimérica (por exemplo, humanizada) compreendendo CDRs específicas de EGFR emparelhadas com uma região variável de cadeia leve, onde a região variável de cadeia leve tem menos do que dez resíduos de aminoácido não- humanos. Em outras modalidades, a região variável de cadeia leve tem me¬nos do que nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou um resíduo(s) de aminoácido não-humano. Em modalidades preferidas, a região variável de cadeia leve tem menos do que dois ou menos do que um (isto é, ne¬nhum) resíduo de aminoácido não-humano. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende uma ou mais sequências de gene de região variável de linhagem germinativa humana. Sequências de gene de região variável de linhagem germinativa humana codificando regiões variá¬veis de cadeia leve são conhecidas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, no banco de dados IMGT, disponível em http://imgt.cines.fr/home.html. Em uma modalidade preferida, a sequência de linhagem germinativa humana é derivada da sequência de linhagem germi-nativa VK1_6. Em outras modalidades, os resíduos de aminoácido dentro da sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de linhagem germinativa humana podem ser substituídos com um ou mais resíduos de outra sequência de região variável de cadeia leve de linhagem germinativa humana.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma mo¬lécula de ligação de antígeno compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO.:1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; e SEQ ID No:121 e uma cadeia leve compreendendo um polipeptideo codificado por uma ou mais sequência de gene variável de linhagem germinativa humana. Em uma modalidade preferida, a sequência de linhagem germinativa humana é derivada da sequência de linhagem ger- minativa VK1J5.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma mo¬lécula de ligação de antígeno compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NQ:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, e SEQ ID NO: 124; (b) uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NQ:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NQ:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, SEQ ID NQ:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NQ:106 e SEQ ID NO:126; (c) SEQ ID NQ:108; e (d) um polipeptideo compreendendo uma região variável de cadeia leve hu¬mana codificada por uma ou mais sequências de linhagem germinativa hu-mana. Em uma modalidade particular, a sequência de linhagem germinativa humana é derivada da sequência de linhagem germinativa VK1_6. Em outra modalidade, a sequência de gene da região variável de linhagem germinati¬va humana compreende a sequência de gene de linhagem germinativa VK1J5 com uma substituição de um ou mais códons de aminoácido com uma sequência de uma sequência de gene de região variável de cadeia leve de linhagem germinativa humana diferente.

Em outras modalidades, a molécula de ligação de antígeno da presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada espe¬cífica de EGFR da presente invenção e uma variante de SEQ ID NO:45. Em uma modalidade, a variante da SEQ ID NO:45 compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições nas regiões de determinação de complementaridade (CDRs). Em modalidades específicas, a substituição é de um resíduo de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consis-tindo em: posição de aminoácido 30 de SEQ ID NO:45; posição de aminoá¬cido 32 da SEQ ID NO:45; posição de aminoácido 34 da SEQ ID NO:45; po¬sição de aminoácido 50 da SEQ ID NO:45; posição de aminoácido 51 da SEQ ID NO:45; posição de aminoácido 52 da SEQ ID NO:45; posição 53 de aminoácido da SEQ ID NO:45; posição de aminoácido 56 da SEQ ID NO:45, posição de aminoácido 94 da SEQ ID NO:45; e qualquer combinação de substituições das mesmas. Em modalidades mais específicas, a substituição na SEQ ID NO:45 é selecionada do grupo consistindo em: substituição de uma asparagina (N) por uma arginina (R) na posição 30 da SEQ ID NO:45; substituição de uma tirosina (Y) por um triptofano (W) na posição 32 da SEQ ID NO:45; substituição de uma asparagina (N) por glicina (G) na posição 34 da SEQ ID NO:45; substituição de uma asparagina (N) por uma treonina (T) na posição 50 da SEQ ID NO:45; substituição de uma treonina (T) por uma alanina (A) na posição 51 da SEQ ID NO:45; substituição de uma asparagina (N) por serina (S) na posição 52 da SEQ ID NO:45; substituição de uma as¬paragina (N) por serina (S) na posição 53 da SEQ ID NO:45; substituição de uma treonina (T) por serina (S) na posição 56 da SEQ ID NO:45; substitui¬ção de uma fenilalanina (F) por tirosina (Y) na posição 94 da SEQ ID NO:45; e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade particular, todas essas substituições de resíduos de aminoácido na SEQ ID NO:45 são incor¬poradas em uma variante de cadeia leve única. Em modalidades preferidas, moléculas de ligação de antígeno compreendendo as variantes de cadeia leve com substituições de aminoácido para as CDRs de ICR62 retêm ligação específica para EGFR (comparado com uma molécula de ligação de antíge¬no compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO:45) quando a variante de cadeia leve é empare¬lhada com um polipeptideo compreendendo uma região variável de cadeia pesada da presente invenção. A presente invenção refere-se também a poli¬nucleotídeos que codificam qualquer um dos polipeptideos acima e/ou molé¬culas de ligação de antígeno, e células hospedeiro e/ou vetores que com¬preendem os polinucleotídeos e/ou polipeptideos. A presente invenção refe- re-se ainda às moléculas de ligação de antígeno descritas acima, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também compreende uma molécula de li¬gação de antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRs específicas de EGFR, onde a região variável de ca¬deia pesada tem menos do que dez resíduos de aminoácido não-humanos, e onde a molécula de ligação de antígeno especificamente se liga a EGFR. Em outras modalidades, a região variável de cadeia pesada tem menos do que nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou um resíduo(s) de ami¬noácido não-humano(s). Em modalidades preferidas, a região variável de cadeia leve tem menos do que cinco resíduos de aminoácido não-humanos. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma ou mais sequências de gene de região variável de linhagem germinativa humana. Sequências de gene de região variável de linhagem germinativa humana codificando regiões variáveis de cadeia pesada são conhecidas na técnica, e podem ser encontradas, por exemplo, no banco de dados IMGT, disponível no http://imqt.cines.fr/home.html. Em uma modalidade, a sequên¬cia de linhagem germinativa humana é derivada da sequência de linhagem germinativa VH1_10. Em outras modalidades, os resíduos de aminoácido dentro da sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de linhagem germinativa humana podem ser substituídos com um ou mais resí¬duos de outra sequência de região variável de cadeia pesada de linhagem germinativa humana. Em modalidades preferidas, moléculas de ligação de antígeno compreendendo as variantes de cadeia pesada com uma substitui¬ção de aminoácido nas CDRs de cadeia pesada de ICR62 retêm ligação es¬pecífica a EGFR quando a variante de cadeia pesada é emparelhada com um polipeptideo compreendendo uma região variável de cadeia leve que se liga a EGFR (por exemplo, uma região variável de cadeia leve da presente invenção). A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos que codificam qualquer um dos polipeptideos acima e/ou moléculas de ligação de antígeno e células hospedeiro e/ou vetores que compreendem os polinu¬cleotídeos e/ou polipeptideos. A presente invenção refere-se ainda às molé¬culas de ligação de antígeno descritas acima, com um veículo farmaceuti¬camente aceitável.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão e/ou uma célula hospedeiro que compreende um ou mais poli¬nucleotídeos isolados da presente invenção.

Em geral, qualquer tipo de linhagem de célula culturada pode ser usado para expressar a ABM da presente invenção. Em uma modalidade preferida, células HEK293-EBNA, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/9, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou célula de hibridoma, outras células de mamífero, células de levedura, células de inseto ou células de planta são usadas como uma linhagem de célula de base para gerar as células hospe¬deiro engenheiradas da invenção.

A eficácia terapêutica das ABMs da presente invenção pode ser aumentada através da sua produção em uma célula hospedeiro que expres¬sa ainda um polinucleotideo codificando um polipeptideo tendo atividade de GnTIll. Em uma modalidade preferida, o polipeptideo tendo atividade de Gn- Tlll é um polipeptideo de fusão compreendendo o domínio de localização de Golgi de um polipeptideo residente em Golgi. Em outra modalidade preferi¬da, a expressão da ABM da presente invenção em uma célula hospedeiro que expressa um polinucleotideo codificando um polipeptideo tendo ativida¬de de GnTIll resulta em ABMs com afinidade de ligação de receptor Fc au¬mentada e função efetora aumentada. Deste modo, em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeiro compreendendo (a) um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência codificando um polipeptideo tendo atividade de GnTIll; e (b) um polinucleotideo isolado codi-ficando uma ABM da presente invenção, tal como um anticorpo quimérico, primatizado ou humanizado que se liga a EGFR humano. Em uma modali¬dade preferida, o polipeptideo tendo atividade de GnTIll é um polipeptideo de fusão compreendendo o domínio catalítico de GnTIll e o domínio de loca¬lização de Golgi é o domínio de localização de manosidase II. Métodos para geração de tais polipeptideos de fusão e uso deles para produzir anticorpos com funções efetoras aumentadas são revelados no Ped. de Pat. Provisório U.S. N° 60/495.142 e Publ. de Ped. de Pat. U.S. N° 2004/0241817 A1, cujos conteúdos em sua totalidade são expressamente aqui incorporados a título de referência. Em outra modalidade preferida, a ABM quimérica é um anti¬corpo quimérico ou um fragmento do mesmo, tendo a especificidade de liga¬ção do anticorpo ICR62 de rato. Em uma modalidade particularmente prefe- rida, o anticorpo quimérico compreende um Fc humano. Em outra modalida¬de preferida, o anticorpo é primatizado ou humanizado.

Em uma modalidade, um ou vários polinucleotídeos codificando uma ABM da presente invenção podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regula¬do. Sistemas de expressão regulados adequados incluem, mas não estão limitados a, sistema de expressão regulado por tetraciclina, um sistema de expressão induzivel por ecdisona, um sistema de expressão regulado por lac, um sistema de expressão induzivel por glucocorticóide, um sistema promotor induzivel por temperatura e um sistema de expressão induzivel por metal metalotioneína. Se vários ácidos nucléicos codificando uma ABM da invenção forem compreendidos dentro do sistema de célula hospedeiro, al¬guns deles podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controle de um promotor regulado. O nível de expressão máximo é considerado ser o nível mais alto possível de expressão de polipeptideo estável que não tem um efeito adverso significan- te sobre a taxa de crescimento celular, e será determinado usando experi¬mentação de rotina. Níveis de expressão são determinados através de mé¬todos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise Western blotu- sando um anticorpo específico para a ABM ou um anticorpo específico para um tagde peptídeo fundido à ABM; e análise Northern blot.Em uma alterna¬tiva adicional, o polinucleotideo pode ser operativamente ligado a um gene repórter; os níveis de expressão de uma ABM quimérica (por exemplo, hu¬manizada) tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato são determinados através da medição de um sinal correlacionado com o nível de expressão do gene repórter. O gene repórter pode ser transcrito junto com o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando o dito po¬lipeptideo de fusão como uma molécula de mRNA única; suas respectivas sequências de codificação podem ser ligadas ou através de um sítio de en¬trada de ribossoma interno (IRES) ou através de um acentuador de tradução independente de cap (CITE). O gene repórter pode ser traduzido junto com pelo menos um ácido nucleico codificando uma ABM quimérica (por exem- pio, humanizada) tendo substancialmente a mesma especificidade de liga¬ção do anticorpo ICR62 de rato de modo que uma cadeia de polipeptideo simples é formada. Os ácidos nucléicos codificando as ABMs da presente invenção podem ser operativamente ligados ao gene repórter sob o controle de um promotor único, de modo que o ácido nucleico codificando o polipep¬tideo de fusão e o gene repórter são transcritos em uma molécula de RNA que é alternativamente unida a duas moléculas de RNA mensageiro (mRNA) separadas; um dos mRNAs resultantes é traduzido na dita proteína repórter e o outro é traduzido no dito polipeptideo de fusão.

Métodos que são bem-conhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequên¬cia de codificação de uma ABM tendo substancialmente a mesma especifici¬dade de ligação do anticorpo ICR62 de rato junto com sinais de controle transcripcional/traducional apropriados. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vivo, técnicas sintéticas e recombinação in vi- vo/recombinação genética. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Ma- niatis e outros, Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) e Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y (1989).

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedei¬ro pode ser utilizada para expressar a sequência de codificação das ABMs da presente invenção. De preferência, células de mamífero são usadas co¬mo sistemas de célula hospedeiro transfectados com DNA de plasmideo recombinante ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo a sequência de codificação da proteína de interesse e a sequência de codifi¬cação do polipeptideo de fusão. Com mais preferência, células HEK293- EBNA, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, célu¬las PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamífero, células de levedura, células de inseto ou células de planta são usadas como sistema de célula hospedeiro. Alguns exemplos de sistemas de expressão e métodos de seleção são descritos nas referências que seguem, e referências em: Borth e outros, Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), em Werner e outros, Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), em Andersen e Krummen, Cure Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), em Chadd e Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001) e em Giddings, Curr. Op. Biotech¬nol. 12: 450-454 (2001). Em modalidades alternativas, outros sistemas de célula hospedeiro eucariótica podem ser usados, incluindo células de leve¬dura transformadas com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo a sequência de codificação de uma ABM da presente invenção, tal como os sistemas de expressão ensinados no Ped. de Pat. U.S. N° 60/344.169 e WO 03/056914 (métodos para produção de glicoproteína tipo humano em uma célula hospedeiro eucariótica não-humana) (cujos conteú¬dos de cada um são aqui incorporados a título de referência em sua totalida¬de); sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo a sequência de co¬dificação de uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especifi¬cidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato; sistemas de célula de planta infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmideo recombinantes (por exemplo, plasmideo Ti) contendo a sequência de codificação da ABM da invenção, incluindo, mas não limitado a, os sistemas de expressão ensina¬dos na Patente U.S. N° 6.815.184 (métodos para expressão e secreção de polipeptideos biologicamente ativos de planta flutuante "duckweed"geneti¬camente engenheirada); WO 2004/057002 (produção de proteínas glicosila- das em células de planta briófita através da introdução de um gene de glico- sil transferase) e WO 2004/024927 (métodos de geração de proteína de não- planta heteróloga extracelular em protoplasto de musgo); e Ped. de Pat. U.S. N°s 60/365.769, 60/368.047 e WO 2003/078614 (processamento de glico¬proteína em plantas transgênicas compreendendo uma enzima GnTIll de mamífero funcional) (os conteúdos de cada um são aqui incorporados a títu¬lo de referência em sua totalidade); ou sistemas de célula de animal infecta¬dos com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, adeno- vírus, vírus vaccinia) incluindo linhagens de célula engenheiradas para con¬ter cópias múltiplas do DNA codificando uma ABM quimérica tendo substan¬cialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato ou estavelmente amplificado (CHO/dhfr) ou instavelmente amplificado em cro¬mossomos double-minute(por exemplo, linhagens de célula de murino). Em uma modalidade, o vetor compreendendo o(s) polinucleotídeo(s) codificando a ABM da invenção é policistrônico. Também, em uma modalidade, a ABM discutida acima é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Em uma moda¬lidade preferida, a ABM é um anticorpo humanizado.

Para os métodos da presente invenção, expressão estável é ge¬ralmente preferida à expressão transiente porque ela tipicamente atinge re¬sultados mais reproduzíveis e também é mais condescendente à produção em grande escala. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm ori¬gens virais de replicação, células hospedeiro podem ser transformadas com os respectivos ácidos nucléicos de codificação controlados por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, acentuador, se-quências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc) e um marcador selecionável. Seguindo a introdução de DNA estranho, células en¬genheiradas podem ser deixadas crescer por 1-2 dias em um meio enrique¬cido, e então são mudadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmideo recombinante confere resistência à seleção e permite seleção de células que têm estavelmente integrado o plasmideo em seus cromos-somos e crescem para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens de célula.

Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, mas não limitado a, genes de timidina cinase do vírus herpes simplex (Wigler e outros, Cell 11:223 (1977)), fosforribosiltransferase hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2026 (1962)) e fosfor¬ribosiltransferase adenina (Lowy e outros, Cell22:817 (1980), que podem ser empregados em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Também, resistência antimetabólica pode ser usada como a base de seleção de genes dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler e outros, Natl. Acad. Sei.

USA 77:3567 (1989); O'Hare e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin e outros, J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre e outros, Gene 30:147 (1984). Recentemente, genes selecionáveis adicionais foram descritos, a saber trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano; hisD, que permite que células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman &Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); o sistema glutamine sintase; e ODC (ornitinina descarboxilase) que confere resistência ao inibidor de ornitina descarboxilase, 2-(difluormetil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue; em: Current Communications in Molecular Biology, Cold S- pring Harbor Laboratory ed. (1987)).

A presente invenção refere-se ainda a um método para modifi¬cação do perfil de glicosilação das ABMs da presente invenção que são pro¬duzidas por uma célula hospedeiro, compreendendo expressão na dita célu¬la hospedeiro de um ácido nucleico codificando uma ABM da invenção e um ácido nucleico codificando um polipeptideo com atividade de GnTIll, ou um vetor compreendendo tais ácidos nucléicos. De preferência, o polipeptideo modificado é IgG ou um fragmento do mesmo compreendendo a região Fc. Em uma modalidade particularmente preferida a ABM é um anticorpo huma¬nizado ou um fragmento do mesmo. Em outra modalidade, o método com¬preende ainda expressão na célula hospedeiro de um ácido nucleico codifi¬cando um polipeptideo com uma segunda atividade de glicosiltransferase. Em uma modalidade especifica, a segunda atividade de glicosiltransferase é manosidase II (Manll).

As ABMs modificadas produzidas pelas células hospedeiro da invenção exibem afinidade de ligação a receptor Fc aumentada e/ou função efetora aumentada como um resultado da modificação. Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado ou um frag¬mento do mesmo contendo a região Fc. De preferência, a afinidade de liga¬ção do receptor Fc aumentada é ligação aumentada a um receptor de ativa-ção de Fcy, tal como o receptor FcyRllla. A função efetora aumentada é de preferência um aumento em um ou mais dos que seguem: citotoxidez celular dependente de anticorpo aumentada, fagocitose celular dependente de anti¬corpo aumentada (ADCP), secreção de citocina aumentada, absorção de antígeno mediada por complexo imune aumentada por células apresentando antígeno, citotoxidez celular mediada por Fc aumentada, ligação aumentada a células NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada a células polimorfonucleares (PMNs), ligação aumentada a monócitos, reticulação aumentada de anticorpos ligados a alvo, sinalização direta aumentada indu¬zindo apoptose, maturação de célula dendrítica aumentada e inicialização de célula T aumentada.

A presente invenção refere-se também a um método para pro¬dução de uma ABM da presente invenção tendo oligossacarídeos modifica¬dos em uma célula hospedeiro compreendendo (a) cultura de uma célula hospedeiro engenheirada para expressar pelo menos um ácido nucleico co¬dificando um polipeptideo tendo atividade de GnTIll sob condições que per¬mitem a produção de uma ABM de acordo com a presente invenção, onde o dito polipeptideo tendo atividade de GnTIll é expresso em uma quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região Fc da dita ABM pro¬duzida pela dita célula hospedeiro; e (b) isolamento da dita ABM. Em uma modalidade preferida, o polipeptideo tendo atividade de GnTIll é um polipep¬tideo de fusão compreendendo o domínio catalítico de GnTIll. Em uma mo¬dalidade particularmente preferida, o polipeptideo de fusão compreende ain¬da o domínio de localização de Golgi de um polipeptideo residente em Golgi.

De preferência, o domínio de localização de Golgi é o domínio de localização de manosidase II ou GnTI. Alternativamente, o domínio de localização de Golgi é selecionado do grupo consistindo em: o domínio de localização de manosidase I, o domínio de localização de GnTIl e o domínio de localização de fucosiltransferase de núcleo a 1-6. As ABMs produzidas através dos métodos da presente invenção têm afinidade de ligação de re-ceptor Fc aumentada e/ou função efetora aumentada. De preferência, a fun¬ção efetora aumentada é uma ou mais das que seguem: citotoxidez celular mediada por Fc aumentada (incluindo citotoxidez celular dependente de an¬ticorpo aumentada), fagocitose celular dependente de anticorpo aumentada (ADCP), secreção de citocina aumentada, absorção de antígeno mediada por complexo imune aumentada pelas células apresentando antígeno, liga-ção aumentada a células NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação au¬mentada a monócitos, ligação aumentada a células polimorfonucleares, sina¬lização direta aumentada induzindo apoptose, reticulação aumentada de an¬ticorpos ligados a alvo, maturação de célula dendrítica aumentada ou inicia¬lização de célula T aumentada. A afinidade de ligação de receptor Fc au¬mentada é de preferência ligação aumentada a receptores de ativação de Fc tal como FcyRllla. Em uma modalidade particularmente preferida a ABM é um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato produzida através dos métodos da invenção que tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bissectados na região Fc do dito polipeptideo. É compreendido que tal ABM compreende anticor¬pos e fragmentos dos mesmos compreendendo a região Fc. Em uma moda¬lidade preferida, a ABM é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, a porcentagem de oligossacarídeos bissectados na região Fc da ABM é pelo menos 50%, com mais preferência pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% e com mais preferência pelo menos 90-95% dos oligossacarídeos totais. Em ainda outra modalidade, a ABM produzida através dos métodos da invenção tem uma proporção aumentada de oligos¬sacarídeos não-fucosilados na região Fc como um resultado da modificação de seus oligossacarídeos através dos métodos da presente invenção. Em uma modalidade, a porcentagem de oligossacarídeos não-fucosilados é pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60% a 70%, com mais preferência pelo menos 75%. Os oligossacarídeos não-fucosilados podem ser do tipo híbrido ou complexo. Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM produzida pelas células hospedeiro e métodos da invenção tem uma propor¬ção aumentada de oligossacarídeos não-fucosilados, bissectados, na região Fc. Os oligossacarídeos não-fucosilados, bissectados, podem ser ou híbri¬dos ou complexos. Especificamente, os métodos da presente invenção po¬dem ser usados para produzir ABMs, onde pelo menos 15%, com mais pre¬ferência pelo menos 20%, com mais preferência pelo menos 25%, com mais preferência pelo menos 30%, com mais preferência pelo menos 35% dos oligossacarídeos na região Fc da ABM são bissectados, não-fucosilados. Os métodos da presente invenção podem ser também usados para produzir polipeptideos onde pelo menos 15%, com mais preferência pelo menos 20%, com mais preferência pelo menos 25%, com mais preferência pelo menos 30%, com mais preferência pelo menos 35% dos oligossacarídeos na região Fc do polipeptideo são não-fucosilados híbridos bissectados.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato engenheirada para ter função efetora aumentada e/ou afinidade de ligação de receptor Fc aumentada, produzida através dos métodos da invenção. De preferência, a função efetora aumentada é uma ou mais das que seguem: citotoxidez celular mediada por Fc aumentada (inclu¬indo citotoxidez celular dependente de anticorpo aumentada), fagocitose ce¬lular dependente de anticorpo aumentada (ADCP), secreção de citocina au¬mentada, absorção de antígeno mediada por complexo imune aumentada pelas células apresentando antígeno, ligação aumentada a células NK, liga¬ção aumentada a macrófago, ligação aumentada a monócitos, ligação au¬mentada a células polimorfonucleares, sinalização direta aumentada indu¬zindo apoptoase, reticulação aumentada de anticorpos ligados a alvo, matu¬ração de célula dendrítica aumentada ou inicialização de célula T aumenta¬da. Em uma modalidade preferida, a afinidade de ligação de receptor Fc aumentada é aumentada ligando a um receptor de ativação de Fc, com mais preferência FcyRllla. Em uma modalidade, a ABM é um anticorpo, um frag¬mento de anticorpo contendo a região Fc, ou uma proteína de fusão que in¬clui uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina. Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado.

A presente invenção refere-se ainda a composições farmacêuti¬cas compreendendo as ABMs da presente invenção e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.

A presente invenção refere-se ainda ao uso de tais composições farmacêuticas no método de tratamento de câncer. Especificamente, a pre¬sente invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer compre¬endendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composi¬ção farmacêutica da invenção.

A presente invenção provê ainda métodos para a geração e uso de sistemas de célula hospedeiro para a produção de glicoformas das ABMs da presente invenção, tendo afinidade de ligação de receptor Fc aumentada, de preferência ligação aumentada a receptores de ativação de Fc e/ou tendo funções efetoras aumentadas, incluindo citotoxidez celular dependente de anticorpo. A metodologia de glicoengenharia que pode ser usada com as ABMs da presente invenção foi descrita em mais detalhes na Patente U.S. N° 6.602.684, Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2004/0241817 A1, Publ. de Ped. de Pat. U.S. N° 2003/0175884 A1, Pedido de Patente U.S. Provisório No. 60/441.307 e WO 2004/065540, os conteúdos de cada um deles é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. As ABMs da presente invenção podem ser alternativamente glicoengenheiradas para ter resíduos de fucose reduzidos na região Fc de acordo com as técnicas reveladas na Publ. de Pat. U.S. N° 2003/0157108 (Genentech) ou na EP 1 176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 e Publ. de Pat. U.S. N°s 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140 (Kyowa). Os conteúdos de cada um desses documentos são aqui incorpora¬dos a título de referência em suas totalidades. ABMs glicoengenheiradas da invenção podem ser também produzidas em sistemas de expressão que produzem glicoproteinas modificadas, tal como aqueles ensinados na Pub. de Ped. de Patente U.S. N° 60/344.169 e WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) ou no WO 2004/057002 e no WO 2004/024927 (Greenovation), cujos conteú¬dos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Geração de Linhagens de Célula para a Produção de Proteínas com Padrão de Glicosilação Alterado

A presente invenção provê sistemas de expressão de célula hospedeiro para a geração das ABMs da presente invenção tendo padrões de glicosilação modificados. Em particular, a presente invenção provê siste¬mas de célula hospedeiro para a geração de glicoformas das ABMs da pre¬sente invenção tendo um valor terapêutico aperfeiçoado. Então, a invenção provê sistemas de expressão de célula hospedeiro selecionados ou enge-nheirados para expressar um polipeptideo tendo atividade de GnTIll. Em uma modalidade, o polipeptideo tendo atividade de GnTIll é um polipeptideo de fusão compreendendo o domínio de localização de Golgi de um polipep¬tideo residente em Golgi heterólogo. Especificamente, tais sistemas de ex¬pressão de célula hospedeiro podem ser engenheirados para compreender uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando um polipeptideo tendo GnTIll, operavelmente ligada a um sistema promotor constitutivo ou regulado.

Em uma modalidade específica, a presente invenção provê uma célula hospedeiro que foi engenheirada para expressar pelo menos um ácido nucleico codificando um polipeptideo de fusão tendo atividade de GnTIll e compreendendo o domínio de localização de Golgi de um polipeptideo resi¬dente em Golgi heterólogo. Em um aspecto, a célula hospedeiro é engenhei¬rada com uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos um gene codificando um polipeptideo de fusão tendo atividade de GnTIll e com-preendendo o domínio de localização de Golgi de um polipeptideo residente em Golgi heterólogo.

Em outra modalidade, a célula hospedeiro foi engenheirada para expressar um ácido nucleico codificando um polipeptideo tendo atividade de GnTIll e um segundo ácido nucleico tendo outra atividade de glicosiltransfe- rase. Em uma modalidade particular, o segundo ácido nucleico codifica um polipeptideo tendo atividade de manosidase (Manll).

Em geral, qualquer tipo de linhagem de célula culturada, incluin¬do as linhagens de célula discutidas acima, pode ser usado como uma base para engenheirar as linhagens de célula hospedeiro da presente invenção. Em uma modalidade preferida, células HEK293-EBNA, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mielo¬ma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hi- bridoma, outras células de mamífero, células de levedura, células de inseto ou células de planta são usadas como a linhagem de célula de base para gerar células hospedeiro engenheiradas da invenção.

A invenção compreende quaisquer células hospedeiro engenhei¬radas expressando um polipeptideo tendo atividade de GnTIll, incluindo um polipeptideo de fusão que compreende o domínio de localização de Golgi de um polipeptideo residente em Golgi heteròlogo conforme aqui definido.

Um ou vários ácidos nucléicos codificando um polipeptideo ten¬do atividade de GnTIll podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulado. Tais sistemas são bem-conhecidos na técnica e incluem os sistemas discutidos acima. Se vários ácidos nucléicos diferentes codificando polipeptideos de fusão tendo atividade de GnTIll e compreendendo domínio de localização de Golgi de um polipeptideo residente em Golgi heteròlogo forem compreendi¬dos dentro do sistema de célula hospedeiro, alguns deles podem ser ex¬pressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controle de um promotor regulado. Níveis de expressão dos polipeptideos de fusão tendo atividade de GnTIll são determinados através de métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise Western blot,análise Northern blot,análise de expressão de gene repórter ou medi¬ção de atividade de GnTIll. Alternativamente, uma lectina pode ser empre¬gada, a qual se liga a produtos biossintéticos do GnTIll, por exemplo, lectina E4-PHA. Alternativamente, um ensaio funcional que mede a ligação de re¬ceptor Fc aumentada ou função efetora aumentada mediada por anticorpos produzidos pelas células engenheiradas com o ácido nucleico codificando um polipeptideo com atividade de GnTIll pode ser usado.

Identificação de Transfectantes ou Transformantes que Expressam a Proteí-na Tendo um Padrão de Glicosilação Modificado

As células hospedeiro que contêm a sequência de codificação de uma ABM quimérica (por exemplo, humanizada) tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato e que ex¬pressam os produtos de gene biologicamente ativos podem ser identificadas através de pelo menos quatro abordagens: (a) hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA; (b) a presença ou ausência de funções de gene "marcador"; (c) avaliação do nível de transcrição conforme medido através da expressão dos respectivos transcritos de mRNA na célula hospedeiro; e (d) detecção do produto de gene conforme medido através de imunoensaio ou através de sua atividade biológica.

Na primeira abordagem, a presença da sequência de codificação de uma ABM quimérica (por exemplo, humanizada) tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato e a sequên¬cia de codificação do polipeptideo tendo atividade de GnTIll pode ser detec¬tada através de hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA usando sondas compreendendo sequências de nucleotídeo que são homólogas às respecti-vas sequências de codificação, respectivamente, ou porções ou derivados das mesmas.

Na segunda abordagem, o sistema de vetor de expres- são/hospedeiro recombinante pode ser identificado e selecionado com base na presença ou ausência de certas funções de gene "marcador" (por exem¬plo, atividade de timidina cinase, resistência a antibióticos, resistência a me- totrexato, fenótipo de transformação, formação de corpo de oclusão em ba- culovírus, etc). Por exemplo, se a sequência de codificação da ABM da in-venção, ou um fragmento da mesma, e a sequência de codificação do poli¬peptideo tendo atividade de GnTIll forem inseridas em uma sequência de gene marcador do vetor, recombinantes contendo as respectivas sequências de codificação podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser posto em tandem com as sequências de codificação sob o controle do mesmo promotor ou diferentes usados para controlar a expressão das sequências de codificação. Expressão do marcador em resposta à indução ou seleção indica expressão da sequência de codificação da ABM da invenção e da sequência de codifi¬cação do polipeptideo tendo atividade de GnTIll.

Na terceira abordagem, atividade transcripcional para a região de codificação da ABM da invenção, ou um fragmento da mesma, e a se¬quência de codificação do polipeptideo tendo atividade de GnTIll pode ser avaliada através de ensaios de hibridização. Por exemplo, RNA pode ser isolado e analisado através de Northern blotusando uma sonda homóloga às sequências de codificação da ABM da invenção, ou um fragmento das mesmas, e a sequência de codificação do polipeptideo tendo atividade de GnTIll ou porções particulares da mesma. Alternativamente, ácidos nucléi- cos totais da célula hospedeiro podem ser extraídos e ensaiados quanto à hibridização para tais sondas.

Na quarta abordagem, a expressão dos produtos de proteína pode ser avaliada imunologicamente, por exemplo, através de Western blots, imunoensaios tal como rádio-imunoprecipitação, imunoensaios ligados à en¬zima e similar. O último teste do sucesso do sistema de expressão, no en¬tanto, envolve a detecção dos produtos de gene biologicamente ativos. Geração e Uso das ABMs tendo Função Efetora Aumentada Incluindo Cito¬toxidez Celular Dependente de Anticorpo

Em modalidades preferidas, a presente invenção provê glicofor- mas de ABMs quiméricas (por exemplo, humanizadas) tendo substancial¬mente a mesma especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato e ten¬do função efetora aumentada incluindo citotoxidez celular dependente de anticorpo. Engenharia de glicosilação de anticorpos foi previamente descrita. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 6.602.684, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade.

Testes clínicos de anticorpos monoclonais não-conjugados (mAbs) para o tratamento de alguns tipos de câncer recentemente deram resultados encorajadores. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223- 25 (1997); Deo e outros, Immunology Today 18:127 (1997). Um lgG1 não- conjugado, quimérico, foi aprovado para linfoma de não-Hodgkin de célula B de grau baixo ou folicular. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223- 25 (1997), enquanto outro mAb não-conjugado, um lgG1 humanizado se direcionado a tumores de mama sólidos, tem também mostrado resultados promissores em testes clínicos de fase III. Deo e outros, Immunology Today 78:127 (1997). Os antígenos desses mAbs são altamente expressos em su¬as respectivas células de tumor e os anticorpos fazem a mediação de des¬truição de tumor potente pelas células efetoras in vitroe in vivo. Em contras¬te, muitos outros mAbs não-conjugados com especificidades de tumor boas não podem disparar funções efetoras de potência suficiente para serem cli¬nicamente úteis. Frost e outros,Cancer 80:317-33 (1997); Surfus e outros, J. Immunother. 79:184-91 (1996). Para alguns desses mAbs mais fracos, tera¬pia de citocina adjunta está sendo atualmente testada. Adição de citocinas pode estimular a citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) au¬mentando a atividade e número de linfócitos em circulação. Frost e outros, Cancer80:317-33 (1997); Surfus e outros, J. Immunother. 79:184-91 (1996). ADCC, um ataque lítico em células direcionadas a anticorpo, é disparado quando da ligação de receptores de leucócitos à região constante (Fc) de anticorpos. Deo e outros, Immunology Today 18:127 (1997).

Uma abordagem diferente, mas complementar, para aumentar atividade de ADCC de lgG1s não-conjugados é engenheirar a região Fc do anticorpo. Estudos de engenharia de proteína mostraram que FcyRs intera¬gem com a região de impedimento inferior do domínio CH2 de IgG. Lund e outros, J. Immunol.757:4963-69 (1996). No entanto, ligação de FcyR tam¬bém requer a presença de oligossacarídeos covalentemente ligados no Asn 297 conservado na região CH2. Lund e outros, J. Immunol.757:4963-69 (1996); Wright e Morrison, Trends Biotech. 75:26-31 (1997), sugerindo que cada um oligossacarídeo e polipeptideo ambos contribuem diretamente para o sítio de interação ou que o oligossacarídeo é requerido para manter uma conformação de polipeptideo CH2 ativo. Modificação da estrutura do oligos¬sacarídeo pode então ser explorada como um meio para aumentar a afinida¬de da interação.

Uma molécula de IgG carrega dois oligossacarídeos N-ligados na região Fc, um em cada cadeia pesada. Como qualquer glicoproteína, um anticorpo é produzido como uma população de glicoformas que comparti¬lham a mesma estrutura principal de polipeptideo, mas têm oligossacarídeos diferentes ligados aos sítios de glicosilação. Os oligossacarídeos normal¬mente encontrados na região Fc de IgG de soro são do tipo bi-antenário complexo (Wormaid e outros, Biochemistry36:130-38 (1997), com um nível baixo de ácido siálico terminal e N-acetilglicosamina que bissecta (GlcNAc), e um grau variável de galactosilação terminal e fucosilação de núcleo. Al¬guns estudos sugerem que a estrutura de carboidrato mínima requerida para ligação de FcyR se encontra dentro do núcleo de oligossacarídeo. Lund e outros, J. Immunol.157:4963-69 (1996).

As linhagens de célula derivadas de camundongo ou hamster usadas em indústria e academia para produção de mAbs terapêuticos não- conjugados normalmente ligam os determinantes de oligossacarídeo reque¬ridos a sítios de Fc. IgGs expressos nessas linhagens celulares não têm, no entanto, o GlcNa que bissecta encontrado em quantidades pequenas em IgGs no soro. Lifely e outros, Glycobiology 318:813-22 (1995). Em contraste, foi recentemente observado que um lgG1 humanizado, produzido por mie¬loma de rato (CAMPATH-1H) carregava um GlcNA que bissecta em algumas de suas glicoformas. Lifely e outros, Glycobiology 318:813-22 (1995). O anti¬corpo derivado de célula de rato atingiu uma atividade de ADCC in vitromá¬xima similar a anticorpos CAMPATH-1H produzidos em linhagens de célula padrão, mas em concentrações de anticorpo significantemente menores.

O antígeno CAMPATH está normalmente presente em níveis altos em células de linfoma, e este mAb quimérico tem atividade de ADCC alta na ausência de um GlcNAc que bissecta. Lifely e outros, Glycobiology 318:813-22 (1995). No curso de glicosilação N-ligado, um GlcNAc que bis¬secta é adicionado através de GnTIll. Schachter, Biochem. Cell Biol.64:163- 81 (1986).

Estudos anteriores usaram uma linhagem de célula CHO produ¬tora de anticorpo única, que foi previamente engenheirada para expressar, de uma maneira externamente regulada, níveis diferentes de uma enzima de gene GnTIll clonado (Umana, P., e outros, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Esta abordagem estabeleceu pela primeira vez uma correlação rigo¬rosa entre expressão de GnTIll e a atividade de ADCC do anticorpo modifi- cado. Então, a invenção compreende um anticorpo quimérico, recombinante, ou um fragmento do mesmo, com a especificidade de ligação do anticorpo ICR62 de rato, tendo glicosilação alterada resultante da atividade de GnTIll aumentada. A atividade de GnTIll aumentada resulta em um aumento na porcentagem de oligossacarídeos bissectados, bem como uma diminuição na porcentagem de resíduos de fucose, na região Fc da ABM. Este anticor¬po, ou fragmento do mesmo, tem afinidade de ligação ao receptor Fc au¬mentada e função efetora aumentada. Ainda, a invenção refere-se a frag¬mento de anticorpo e proteínas de fusão compreendendo uma região que é equivalente à região Fc de imunoglobulinas. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é humanizado.

Aplicações Terapêuticas de ABMs Produzidas de Acordo com os Métodos da Invenção

No sentido mais amplo, as ABMs da presente invenção podem ser usadas para se direcionar a células in vivoou in vitroque expressam EGFR. As células expressando EGFR podem ser direcionadas para propósi¬tos de diagnóstico ou terapêuticos. Em um aspecto, as ABMs da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença de EGFR em uma amostra. Em outro aspecto, as ABMs da presente invenção podem ser usa-das para inibir ou reduzir transdução de sinal mediada por EGFR em células expressando EGFR na superfície. EGFR é anormalmente expresso (por e- xemplo, superexpresso) em muitos tumores humanos comparado com tecido de não-tumor do mesmo tipo de célula. Então, as ABMs da invenção são particularmente úteis na prevenção de formação de tumor, erradicação de tumores e inibição de crescimento de tumor. Através do bloqueio da ligação de ligantes de EGFR a EGFR, as ABMs da invenção inibem ativação de cé¬lula de tumor dependente de EGF, incluindo fosforilação de tirosina de EG¬FR, taxa de acidificação extracelular aumentada e proliferação celular. As ABMs da invenção também agem para parar o ciclo celular, causar apoptose das células-alvo (por exemplo, células de tumor) e inibir angiogênese e/ou diferenciação de células-alvo. As ABMs da invenção podem ser usadas para tratar qualquer tumor expressando EGFR. Males particulares que podem ser tratados com as ABMs da invenção incluem, mas não estão limitados a, car¬cinomas de células epidermal e escamosa, carcinomas pulmonares de célu¬la não-pequena, gliomas, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço e carcinomas de célula renal.

A ABMs da presente invenção podem ser usadas sozinhas para se direcionar e matar células de tumor in vivo. As ABMs podem ser também usadas em conjunto com um agente terapêutico apropriado para tratar carci¬noma humano. Por exemplo, as ABMs podem ser usadas em combinação com métodos de tratamento padrão ou convencional tal como quimioterapia, terapia de radiação ou podem ser conjugadas ou ligadas a um fármaco tera-pêutico, ou toxina, bem como a uma linfocina ou um fator de crescimento inibidor de tumor, para aplicação do agente terapêutico ao sítio do carcino¬ma. Os conjugados das ABMs da presente invenção que são de principal importância são (1) imunotoxinas (conjugados da ABM e uma porção citotó- xica) e (2) ABMs marcadas (por exemplo, radiomarcadas, marcadas com enzima ou marcadas com fluorcromo) onde o marcador provê um meio para identificação de complexos imunes que incluem a ABM marcada. As ABMs podem ser também usadas para induzir lise através do processo de com¬plemento natural e interagir com células citotóxicas dependentes de anticor¬po normalmente presentes.

A porção citotóxica da imunotoxina pode ser um fármaco citotó- xico ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana ou de planta ou um fragmento enzimaticamente ativo ("cadeia A") de tal toxina. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas usados são cadeia A da difteria, fragmentos ativos de não-ligação de toxina da difteria, cadeia A da eotoxina (de Pseudomonas aeruginosa),cadeia A da ricina, cadeia A da a- brina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, pro-teínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP- S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e enomicina. Em outra modalidade, as ABMs são conjugadas a fármacos anticâncer de molé- cuia pequena. Conjugados da ABM e tais porções citotóxicas são feitos u- sando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais. Exemplos de tais reagentes são SPDP, IP, derivados bifuncionais de imido- ésteres tal como HCI de dimetil adipimidato, ésteres ativos tal como dissuc- cinimidil suberato, aldeídos tal como glutaraldeído, compostos bis-azido tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazônio tal co¬mo bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina, diisocianatos tal como tolileno 2,6-diisocianato e compostos fluor bis-ativos tal como 1,5-difluor-2,4- dinitrobenzeno. A porção de lise de uma toxina pode ser unida ao fragmento Fab das ABMs. Toxinas apropriadas adicionais são conhecidas na técnica, conforme evidenciado, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. publicado No. 2002/0128448, incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.

Em uma modalidade, uma ABM glicoengenheirada, quimérica (por exemplo, humanizada), tendo substancialmente a mesma especificida¬de de ligação do anticorpo ICR62 de rato, é conjugada à cadeia A de ricina. Mais vantajosamente, a cadeia A de ricina é desglicosilada e produzida atra¬vés de meios recombinantes. Um método vantajoso de fabricação da imuno- toxina ricina é descrito em Vitetta e outros, Science 238, 1098 (1987), aqui incorporado a título de referência.

Quando usados para matar células de câncer humanas in vitro para propósitos de diagnóstico, os conjugados serão tipicamente adiciona¬dos ao meio de cultura celular em uma concentração de pelo menos cerca de 10 nM. A formulação e o modo de administração para uso in vitronão são críticos. Formulações aquosas que são compatíveis com o meio de cultura ou perfusão serão normalmente usadas. Citotoxidez pode ser lida através de técnicas convencionais para determinar a presença ou grau de câncer.

Conforme acima discutido, um radiofarmacêutico citotóxico para tratamento de câncer pode ser feito através da conjugação de um isótopo radioativo (por exemplo, I, Y, Pr) a uma ABM glicoengenheirada, quimérica, tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo I- CR62 de rato. O termo "porção citotóxica" conforme aqui usado pretende incluir tais isótopos.

Em outra modalidade, lipossomas são cheios com um fármaco citotóxico e os lipossomas são revestidos com as ABMs da presente inven¬ção. Devido ao fato de existirem muitas moléculas de EGFR na superfície da célula maligna expressando EGFR, este método permite aplicação de gran¬des quantidades do fármaco ao tipo de célula correto.

Técnicas para conjugação de tais agentes terapêuticos a anti¬corpos são bem-conhecidas (vide, por exemplo, Arnon e outros, "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs em Cancer Therapy", em Monoclo¬nal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld e outros(eds.), pp. 243-56 (A- lan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros,"Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery(2aEd.), Robinson e outros(eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological E Clinical Applications, Pinchera e outros (eds.), pp. 475-506 (1985); e Thorpe e outros,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Con¬jugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).

Ainda outras aplicações terapêuticas para as ABMs da invenção incluem conjugação ou ligação, por exemplo, através de técnicas de DNA recombinante, a uma enzima capaz de converter um pró-fármaco em um fármaco citotóxico e o uso deste conjugado anticorpo-enzima em combina¬ção com o pró-fármaco para converter o pró-fármaco em um agente citotóxi¬co no sítio de tumor (vide, por exemplo, Senter e outros, "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phos¬phorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Anti¬body-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); e Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy", FASEB J. 4:188-193 (1990)).

Ainda outro uso terapêutico para as ABMs da invenção envolve uso, ou não-conjugado, na presença de complemento, ou como parte de um conjugado de anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina, para remover células de tumor da medula óssea de pacientes com câncer. De acordo com esta abordagem, medula óssea autóloga pode ser purgada ex vivo através de tratamento com o anticorpo e a medula óssea infundida novamente no paci-ente [vide, por exemplo, Ramsay e outros, "Bone Marrow Purging Using Mo¬noclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].

Ainda, é compreendido que a invenção compreende uma imuno- toxina de cadeia única compreendendo domínios de ligação de antígeno que permitem substancialmente a mesma especificidade de ligação que o anti¬corpo ICR62 de rato (por exemplo, polipeptideos compreendendo as CDRs do anticorpo ICR62 de rato) e compreendendo ainda um polipeptideo de to¬xina. Essas imunotoxinas de cadeia longa da invenção podem ser usadas para tratar carcinoma humano in vivo.

Similarmente, uma proteína de fusão compreendendo pelo me¬nos a região de ligação de antígeno de uma ABM da invenção unida a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma segunda proteína tendo atividade antitumor, por exemplo, uma linfocina ou oncostatina, pode ser u- sada para tratar carcinoma humano in vivo.

A presente invenção provê um método para seletivamente matar células de tumor expressando EGFR. Este método compreende reação do imunoconjugado (por exemplo, a imunotoxina) da invenção com as ditas cé¬lulas de tumor. Essas células de tumor podem ser de um carcinoma huma¬no.

Adicionalmente, a presente invenção provê um método de tra¬tamento de carcinomas (por exemplo, carcinomas humanos) in vivo. Este método compreende administrar a um indivíduo uma quantidade farmaceuti- camente eficaz de uma composição contendo pelo menos um dos imuno- conjugados (por exemplo, a imunotoxina) da invenção.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método aperfeiçoado para tratamento de distúrbios de proliferação celular onde EG¬FR é expresso, particularmente onde EGFR é anormalmente expresso (por exemplo, superexpresso), incluindo cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, mama, ovário, cólon, próstata, pele e rim, com¬preendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ABM da presente invenção a um indivíduo humano com necessidade do mesmo. Em uma modalidade preferida, a ABM é um anticorpo anti-EGFR glicoengenheirado com uma especificidade de ligação substancialmente a mesma que aquela do anticorpo ICR62 de rato. Em outra modalidade prefe¬rida, o anticorpo é humanizado. Em outra modalidade preferida, o anticorpo humanizado compreende CDRs modificadas que compreendem substitui¬ções em qualquer posição exceto aquelas que são necessárias para reter a atividade de ligação (por exemplo, os SDRs). Exemplos de distúrbios de pro¬liferação celular que podem ser tratados por uma ABM da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, neoplasmas localizados no: abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritôneo, glândulas endó- crinas (adrenal, paratireóide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireóide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, região pélvica, pele, tecido mole, baço, toráxica e sistema urogenital.

Similarmente, outros distúrbios de proliferação de célula podem ser também tratados pelas ABMs da presente invenção. Exemplos de tais distúrbios de proliferação de célula incluem, mas não estão limitados a: hi- pergamaglobulinemia, distúrbios linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpu¬ra, sarcoidose, Síndrome Sezary, Macroglobulinemia de Waldenstron, Doen¬ça de Gaucher, histiocitose e qualquer outra doença de proliferação celular, além da neoplasia, localizada em um sistema de órgão listado acima.

De acordo com a prática da presente invenção, o indivíduo pode ser um indivíduo humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino e ave. Outros animais de sangue quente são também incluídos na presente invenção.

A presente invenção provê ainda métodos para inibição do cres¬cimento de células de tumor humanas, tratamento de um tumor em um indi¬víduo e tratamento de uma doença do tipo proliferativa em um indivíduo. Es¬ses métodos compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição da invenção.

A invenção refere-se ainda a métodos para tratamento de doen¬ças ou distúrbios não-malignos em um mamífero caracterizados por ativação ou produção anormal de EGFR ou um ou mais ligantes de EGFR, compre¬endendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz das ABMs da invenção. O indivíduo terá geralmente células expressando EGFR, por exemplo, em tecido doente do mesmo, de modo que as ABMs da invenção são capazes de se ligar a células dentro do indivíduo.

Ativação ou expressão anormal de EGFR ou um ligante de EG¬FR pode estar ocorrendo em células do indivíduo, por exemplo, em tecido doente do indivíduo. Ativação anormal de EGFR pode ser atribuível à ampli¬ficação, superexpressão ou produção aberrante do EGFR e/ou ligante de EGFR. Em uma modalidade da invenção, um ensaio de diagnóstico ou prognóstico será realizado para determinar se produção ou ativação anormal de EGFR (ou ligante de EGFR) está acontecendo no indivíduo. Por exemplo, amplificação de gene e/ou superexpressão de EGFR e/ou ligante pode ser determinada. Vários ensaios para determinação de tal amplifica- ção/superexpressâo estão disponíveis na técnica e incluem os ensaios de antígeno IHC, FISH e shed descritos acima. Alternativamente, ou adicional¬mente, níveis de um ligante de EGFR, tal como TGF-a, em ou associado com a amostra podem ser determinados de acordo com procedimentos co¬nhecidos. Tais ensaios podem detectar proteína e/ou ácido nucleico codifi- cando-a na amostra a ser testada. Em uma modalidade, níveis de ligante de EGFR em uma amostra podem ser determinados usando imuno- histoquímica (IHC); vide, por exemplo, Scher e outros, Clin. Cancer Resear-ch 1:545-550 (1995). Alternativamente, ou adicionalmente, uma pessoa pode avaliar níveis de ácido nucleico codificando EGFR na amostra a ser testada, por exemplo, através de técnicas FISH, southern blottingou PCR.

Além disso, superexpressão ou amplificação de EGFR ou ligante de EGFR pode ser avaliada usando um ensaio de diagnóstico in vivo, por exemplo, através da administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que se liga à molécula a ser detectada e é marcada com um marcador de- tectável (por exemplo, um isótopo radioativo) e varredura externa do pacien¬te para localização do marcador.

Alternativamente, uma pessoa pode detectar heterodímeros de EGFR, especialmente heterodímeros de EGFR-ErbB2, EGFR-ErbB3 ou EG- FR-ErbB4, no paciente, por exemplo, em tecido doente do mesmo, antes da terapia. Vários métodos para detectar interações proteína-proteína não- covalentes ou de outro modo indicar proximidade entre proteínas de interes¬se estão disponíveis. Métodos exemplares para detecção de heterodímeros de EGFR incluem, sem limitação, métodos baseados em imunoafinidade, tal como imunoprecipitação; transferência de energia de ressonância de fluo¬rescência (FRET) (Selvin, Nat. Struct. Biol. 7:730-34 (2000); Gadella & Jovin, J. Cell Biol. 129:1543-58 (1995); e Nagy e outros, Cytometry32:120-131 (1998)); colocalização de EGFR ou com ErbB2 ou ErbB3 usando técnicas de imunofluorescência direta ou indireta padrão e microscopia de varredura a laser confocal; imagem de varredura por laser (LSI) para detectar ligação de anticorpo e colocalização de EGFR ou com ErbB2 ou ErbB3 em formato de alto rendimento, tal como uma placa de microcavidade (Zuck e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11122-11127 (1999)); ou sistema de ensaio eTag/m (Aclara Bio Sciences, Mountain View, Calif.; e Pedido de Patente U.S. 2001/0049105, publicado em 6 de dezembro de 2001).

É aparente, então, que a presente invenção compreende com¬posições farmacêuticas, combinações e métodos para tratamento de males humanos tal como cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pân¬creas, pulmão, mama, ovário, cólon, próstata, pele e rim. Por exemplo, a invenção inclui composições farmacêuticas para uso no tratamento de males humanos compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições de ABM da invenção podem ser administradas usando modos de administração convencionais incluindo, mas não limitado a, intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou administração diretamen¬te no tumor. Administração intravenosa é permitida.

Em um aspecto da invenção, formulações terapêuticas contendo as ABMs da invenção são preparadas para armazenamento através de mis¬tura de um anticorpo tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipi- entes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (REMING- TON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não-tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tal como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos talcomo metil ou propil parabeno; ca- tecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptideos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal co¬mo polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros car¬boidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; con- traíons de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exem¬plo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos tal como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).

As ABMs da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo para tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade de EGFR ou ligante de EGFR anormal, tal como um tumor, ou sozinha ou em terapia de combinação com, por exemplo, um agente quimioterapêutico e/ou terapia de radiação. Formulações de anticorpo anti-EGFR exemplares são descritas em Herbst e Shen, Cancer94(5/1593-1611. Agentes quimiotera- pêuticos adequados incluem cisplatina, doxorrubicina, topotecano, paclitaxel, vinblastina, carboplatina e etoposídeo.

Formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutâ¬nea são descritas no WO 97/04801. Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado para uma concentração de proteí¬na alta e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutaneamen- te ao mamífero a ser tratado aqui.

A presente formulação pode também conter mais de um com¬posto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não afetam de modo adverso um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável prover ainda um agente citotóxico, agente quimioterapêutico, citocina ou agente imunos- supressor (por exemplo, um que aja sobre células T, tal como ciclosporina ou um anticorpo que se ligue a células T, um que se ligue a LFA-1). A quan¬tidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de antagonista presente na formulação, do tipo de doença ou distúrbio ou tratamento e ou¬tros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme aqui usado antes ou cerca de a partir de 1 a 99% das dosagens empregadas até agora.

Os ingredientes ativos podem ser também aprisionados em mi- crocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hi- droximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de aplicação de fármaco coloidais (por exem¬plo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Re¬mington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem ma¬trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antago¬nista, matrizes que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, pelícu¬las, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada inclu¬em poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou po- li(vinilálcool)), polilactídeos (Patente U.S. N° 3.773.919), copolímeros de áci¬do L-glutâmico e yetil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não-degradáveis, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como LUPRON DEPOTTM (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lácti¬co-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo de¬vem ser estéreis. Isto é prontamente realizado através de filtragem em

membranas de filtragem estéreis.

As composições da invenção podem estar em uma variedade de formas de dosagem que incluem, mas não estão limitadas a, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injetáveis ou que po¬dem ser infundidas. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

As composições da invenção também de preferência incluem veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis convencionais conheci¬dos na técnica tal como albumina de soro humano, trocadores de íon, alumi¬na, lecitina, substâncias tampão tal como fosfato, glicina, ácido sórbico, sor- bato de potássio e sais ou eletrólitos tal como sulfato de protamina.

O modo de administração e o regime de dosagem mais eficazes para as composições farmacêuticas da invenção dependem da severidade e curso da doença, da saúde do paciente e da resposta a tratamento e julga¬mento do médico que está tratando. Deste modo, as dosagens das compo¬sições devem ser tituladas para o paciente individual. Não obstante, uma dose eficaz das composições da presente invenção estará geralmente na faixa de a partir de cerca de 0,01 a cerca de 2000 mg/kg. Em uma modalida¬de, a dose eficaz está na faixa de a partir de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15,0 mg/kg. Em uma modalidade mais específica, a dose está na faixa de a partir de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. Em outras modalidades, a dose está na faixa de a partir de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 4,5 mg/kg ou de a partir de cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. A dose da presente invenção pode ser também qualquer dose dentro dessas faixas, incluindo, mas não limitado a, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10,0 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11,0 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12,0 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13,0 mg/kg, 13,5 mg/kg, 14,0 mg/kg, 14,5 mg/kg ou 15,0 mg/kg.

As moléculas descritas aqui podem estar em uma variedade de formas de dosagem que incluem, mas não estão limitadas a, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injetáveis ou que po¬dem ser infundidas. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

As dosagens da presente invenção podem, em alguns casos, ser determinadas através do uso de biomarcadores previsivos. Biomarcado- res previsivos são marcadores moleculares que são usados para determinar (isto é, observar e/ou quantificar) um padrão de expressão e/ou ativação de genes ou proteínas relacionados a tumor ou componentes celulares de um curso de sinalização relacionado a tumor. Elucidação dos efeitos biológicos de terapias direcionadas em tecido de tumor e correlação desses efeitos com resposta clinica ajudam a identificar os cursos de crescimento e sobre¬vivência predominantes operativos em tumores, deste modo estabelecendo um perfil de respondedores prováveis e de modo oposto provendo um racio¬cínio para designação de estratégias para superar resistência. Por exemplo, biomarcadores para terapia anti-EGFR podem compreender moléculas que estão no curso de sinalização a jusante de EGFR que leva a um distúrbio de proliferação celular incluindo, mas não limitado a, Akt, RAS, RAF, MARK, ERK1, ERK2, PKC, STAT3, STAT5 (Mitchell, Nature Biotech. 22: 363-364 (2004); Becker, Nature Biotech 22:15-18 (2004); Tsao e Herbst, Signal 4:4-9 (2003)). Biomarcadores para terapia anti-EGFR podem também compreen¬der receptores de fator de crescimento tal como EGFR, ErbB-2 (HER2/neu) e ErbB-3 (HER3) e podem ser previsivos positivos ou negativos de resposta de paciente à terapia anti-EGFR. Por exemplo, o receptor de fator de cres¬cimento ErbB-3 (HER3) foi determinado ser um biomarcador previsivo nega¬tivo para o anticorpo anti-EGFR ABX-EGF (Publicação de Patente U.S. N° 2004/0132097 A1).

Biomarcadores previsivos podem ser medidos através de ensai¬os celulares que são bem-conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, imuno-histoquimica, citometria de fluxo, imunofluorescência, ensaios de captura-e-detecção e ensaios de fase reversa e/ou ensaios mostrados na Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2004/0132097 A1, cujos conteú- dos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Biomar- cadores previsivos de terapia anti-EGFR, em si, podem ser identificados de acordo com as técnicas mostradas na Pub. de Ped. de Pat. U.S. 2003/0190689A1, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.

Em um aspecto, a presente invenção provê um método para tra¬tamento de um distúrbio relacionado com EGFR compreendendo previsão de uma resposta à terapia anti-EGFR em um indivíduo humano com neces¬sidade de tratamento através do ensaio de uma amostra do indivíduo huma¬no antes da terapia com um ou uma pluralidade de reagentes que detectam expressão e/ou ativação de biomarcadores previsivos para um distúrbio re¬lacionado com EGFR tal como câncer; determinação de um padrão de ex-pressão e/ou ativação de um ou mais dos biomarcadores previsivos, onde o padrão prevê a resposta do indivíduo humano à terapia anti EGFR; e admi¬nistração a um indivíduo humano que é previsto responder positivamente a tratamento anti-EGFR de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo uma ABM da presente invenção. Conforme aqui usado, um indivíduo humano que é previsto responder positivamente a tratamento anti-EGFR é um ao qual anti-EGFR terá um efeito mensurável sobre o distúrbio relacionado com EGFR (por exemplo, regres- são/reticulação de tumor) e para o qual os benefícios de terapia anti-EGFR não são superados pelos efeitos adversos (por exemplo, toxidez). Conforme aqui usado, uma amostra significa qualquer amostra biológica de um orga¬nismo, particularmente um ser humano, compreendendo uma ou mais célu¬las, incluindo células únicas de qualquer origem, amostras de tecido ou bi¬ópsia que foram removidas de órgãos tal como mama, pulmão, trato gastro¬intestinal, pele, cólon, ovário, próstata, rim, cérebro, cabeça e pescoço, ou qualquer outro órgão ou tecido do corpo, e outras amostras de corpo incluin¬do, mas não limitado a, gorduras, esputo, secreções, fluido cerebroespinhal, bile, sangue, fluido linfático, urina e fezes.

A composição compreendendo uma ABM da presente invenção será formulada, dosada e administrada de uma maneira de acordo com prá¬tica médica boa. Fatores para consideração neste contexto incluem a doen¬ça ou distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa da doença ou distúrbio, o sítio de aplicação do agente, o método de administração, o programa de administração e outros fatores conhecidos de praticantes de medicina. A quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista a ser administrada será governada por tais considerações.

Como uma proposição geral, a quantidade terapeuticamente efi¬caz do anticorpo administrado parenteralmente por dose estará na faixa de cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso do corpo do paciente por dia, com a faixa inicial típica de antagonista usada aqui sendo de 2 a 10 mg/kg. Em uma mo¬dalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz está na faixa de a partir de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15,0 mg/kg. Em uma modalidade mais espe¬cífica, a dose está na faixa de a partir de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. Em outras modalidades, a dosa está na faixa de a partir de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 4,5 mg/kg ou de a partir de cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. A dose da presente invenção pode ser também qualquer dose dentro dessas faixas, incluindo, mas não limitado a, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10,0 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11,0 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12,0 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13,0 mg/kg, 13,5 mg/kg, 14,0 mg/kg, 14,5 mg/kg ou 15,0 mg/kg.

Em uma modalidade preferida, a ABM é um anticorpo, de prefe¬rência um anticorpo humanizado. Dosagens adequadas para tal anticorpo não-conjugado estão, por exemplo, na faixa de a partir de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 1000 mg/m2. Por exemplo, uma pessoa pode administrar ao paciente uma ou mais doses de substancialmente menos do que 375 mg/m2 do anticorpo, por exemplo, onde a dose está na faixa de a partir de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2, por exemplo, de a partir de cerca de 50 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2.

Além disso, uma pessoa pode administrar uma ou mais dose(s) inicial(ais) do anticorpo seguido por uma ou mais dose(s) subsequente(s), onde a dose de mg/m2 do anticorpo na(s) dose(s) subsequente(s) excede a dose de mg/m2 do anticorpo na(s) dose(s) inicial(ais). Por exemplo, a dose inicial pode estar na faixa de a partir de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2 (por exemplo, de a partir de cerca de 50 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2) e a dose subsequente pode estar na faixa de a partir de cerca de 250 mg/m2 a cerca de 1000 mg/m2.

Conforme acima mencionado, no entanto, essas quantidades sugeridas de ABM são submetidas a uma grande ponderação terapêutica. O fator-chave na seleção de uma dose e um programa apropriado é o resulta¬do obtido, conforme acima indicado. Por exemplo, doses relativamente maio¬res podem ser necessárias inicialmente para o tratamento de doenças exis¬tentes e agudas. Para obter os resultados mais eficazes, dependendo da doença ou distúrbio, o antagonista é administrado o mais próximo do primei-ro sinal, diagnóstico, aparecimento ou ocorrência da doença ou distúrbio possível ou durante a remissão da doença ou distúrbio.

No caso de anticorpos anti-EGFR usados para tratar tumores, resultados terapêuticos ótimos foram geralmente conseguidos com uma do¬se que é suficiente para saturar completamente os receptores de EGF nas células-alvo. A dose necessária para atingir saturação vai depender do nú¬mero de receptores de EGF expressos por célula de tumor (que pode variar significantemente entre tipos de tumor diferentes). Concentrações no soro tão baixas quanto 30 nM foram eficazes no tratamento de alguns tumores, enquanto concentrações acima de 100 nM podem ser necessárias para atin¬gir efeito terapêutico ótimo com outros tumores. A dose necessária para a- tingir saturação para um dado tumor pode ser prontamente determinada in vitroatravés de rádio-imunoensaio ou imunoprecipitação.

Em geral, para terapia de combinação com radiação, um regime terapêutico adequado envolve oito infusões semanais de ABM anti-EGFR da invenção em uma dose de carga de 100-500 mg/m2 seguido por doses de manutenção a 100-250 mg/m2 e radiação na quantidade de 70,0 Gy em uma dose de 2,0 Gy diária. Para terapia de combinação com quimioterapia, um regime terapêutico adequado envolve administração de uma ABM anti- EGFR da invenção como doses de carga/manutenção semanais de 100/100 mg/m2, 400/250 mg/m2 ou 500/250 mg/m2 em combinação com cisplatina em uma dose de 100 mg/m2 a cada três semanas. Alternativamente, gencitabina ou irinotecano pode ser usado no lugar de cisplatina.

A ABM da presente invenção é administrada através de qualquer meio adequado, incluindo parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapul- monar e intranasal, e, se desejado, para tratamento imunossupressor local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração in¬tramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Ainda, o antagonista pode ser adequadamente administrado através de infusão por pulso, por exemplo, com doses em declínio do antagonista. De preferência, a dosagem é dada através de injeções, com mais preferência injeções intra¬venosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é rápida ou crônica.

Uma pessoa pode administrar outros compostos, tal como agen¬tes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, agentes imunossupressores e/ou citocinas com os presentes antagonistas. A administração combinada inclui co-administração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e administração consecutiva em qualquer ordem, onde de preferência há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agen¬tes ativos simultaneamente exercem suas atividades biológicas.

Seria claro que a dose da composição da invenção requerida para atingir curas pode ser reduzida mais com otimização do programa.

De acordo com a prática da invenção, o veículo farmacêutico pode ser um veículo de lipídeo. O veículo de lipídeo pode ser um fosfolipí- deo. Ainda, o veículo de lipídeo pode ser um ácido graxo. Também, o veícu¬lo de lipídeo pode ser um detergente. Conforme aqui usado, um detergente é qualquer substância que altera a tensão de superfície de um líquido, geral¬mente diminuindo-a.

Em um exemplo da invenção, o detergente pode ser um deter¬gente não-iônico. Exemplos de detergentes não-iônicos incluem, mas não estão limitados a, polisorbato 80 (também conhecido como Tween 80 ou (monooleato de polioxietilenossorbitano), Brij e Triton (por exemplo, Triton WR-1339e Triton A-20).

Alternativamente, o detergente pode ser um detergente iônico. Um exemplo de um detergente iônico inclui, mas não está limitado a, brome¬to de alquiltrimetilamônio.

Adicionalmente, de acordo com a invenção, o veículo de lipídeo pode ser um lipossoma. Conforme usado no presente pedido, um "liposso- ma" é qualquer vesícula ligada à membrana que contém quaisquer molécu¬las da invenção ou combinação das mesmas.

Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a uma ABM de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento, em parti¬cular para uso no tratamento ou profilaxia de câncer ou para uso em uma condição ou lesão pré-cancerosa. O câncer pode ser, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não-pequena (NSCL), câncer de pulmão de célula bronquioalveolar, câncer ósseo, câncer pancreático, cân¬cer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocu¬lar, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma do cólon, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, cân¬cer da glândula adrenal, sarcoma do tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer de próstata, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, car¬cinoma de célula renal, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, câncer he- patocelular, câncer biliar, leucemia crônica ou aguda, linfomas linfocíticos, neoplasmas do sistema nervoso central (CNS), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwan¬nomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de célu¬la escamosa, adenomas da pituitária, incluindo versões refratárias de qual¬quer um dos cânceres acima, ou uma combinação de um ou mais dos cân- ceres acima. A condição ou lesão pré-cancerosa inclui, por exemplo, o grupo consistindo em leucoplasia oral, queratose actinica (queratose solar), pólipos pré-canceroso do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displasia adeno- matosa, sindrome do câncer de cólon de não-polipose hereditária (HNPCC), esôfago de Barret, displasia da bexiga e condições cervicais pré-cancerosas.

De preferência, o dito câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro

Ainda outra modalidade é o uso da ABM de acordo com a pre¬sente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de câncer. Câncer é conforme definido acima.

De preferência, o dito câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer renal e câncer de cérebro.

Também de preferência, a dita molécula de ligação de antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de a partir de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15 mg/kg.

Também com mais preferência, a dita molécula de ligação de antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de a partir de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg.

Também com mais preferência, a dita molécula de ligação de antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de a partir de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 4,5 mg/kg.

Também com mais preferência, a dita molécula de ligação de antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de a partir de cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg.

Com mais preferência, a dita molécula de ligação de antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,5 mg/kg.

Também com mais preferência, a dita molécula de ligação de antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 4,5 mg/kg.

Também com mais preferência, a dita molécula de ligação de antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 12 mg/kg.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a método de tratamento de um distúrbio relacionado com EGFR em um mamífero com necessidade de tratamento para o mesmo compreendendo administrar ao dito mamífero uma ABM da presente invenção, onde o tratamento resulta em concentrações no soro da dita ABM entre cerca de 1 e cerca de 500 pg/ml, por um período de pelo menos 4 semanas, e onde o tratamento não causa um nível clinicamente significante de toxidez no dito mamífero. Em outras modalidades, a concentração no soro é uma quantidade selecionada do gru¬po consistindo em acima de 1 pg/ml, acima de 25 pg/ml, acima de 50 pg/ml, acima de 100 pg/ml, acima de 200 pg/ml, acima de 300 pg/ml, acima de 400 pg/ml, acima de 500 pg/ml, entre cerca de 1 e cerca de 100 pg/ml, entre cer¬ca de 1 e cerca de 200 pg/ml, entre cerca de 1 e cerca de 300 pg/ml, entre cerca de 1 e cerca de 400 pg/ml e entre cerca de 1 e cerca de 500 pg/ml. Em uma modalidade preferida, o mamífero é um humano. Em uma modali¬dade, a ABM é um anticorpo. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é glicoengenheirado e tem ligação de FcgamaRIII aumentada comparado com uma forma não-glicoengenheirada do anticorpo.

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígeno (ABM) que especificamente se liga a EGFR, onde a ABM com¬preende ainda uma região Fc de imunoglobulina ou fragmento da mesma, e onde a região Fc ou fragmento da mesma foi glicoengenheirada para ter função efetora aumentada comparado com uma forma não- glicoengenheirada. Em uma modalidade particular, a função efetora é citoto¬xidez celular mediada por Fc aumentada.

Em outro aspecto, a invenção refere-se à ABM que especifica¬mente se liga a EGFR, onde a ABM compreende ainda uma região Fc de imunoglobulina ou fragmento da mesma, e onde a região Fc ou fragmento da mesma foi glicoengenheirada para ter afinidade de ligação de receptor Fc aumentada comparado com uma forma não-glicoengenheirada.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma ABM que especi¬ficamente se liga a EGFR, onde a ABM não causa um nível clinicamente significante de toxidez quando administrada a um indivíduo em uma quanti¬dade terapeuticamente eficaz. Em uma modalidade, a ABM compreende ainda uma região Fc de imunoglobulina ou fragmento da mesma. Em uma modalidade específica, a região Fc ou fragmento da mesma foi engenheira- da para ter função efetora aumentada comparado com uma forma não- engenheirada. Em uma modalidade mais específica, a função efetora é cito¬toxidez celular mediada por Fc aumentada. Em outra modalidade, a região Fc ou fragmento da mesma foi engenheirada para ter afinidade de ligação de receptor Fc aumentada comparado com uma forma não-engenheirada. Em uma modalidade específica, a quantidade terapeuticamente eficaz é de a partir de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15 mg/kg. Em outra modalidade es-pecífica, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma concentração no soro acima de um micrograma por mililitro.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de trata¬mento de um distúrbio relacionado com EGFR em um indivíduo com neces¬sidade de tal tratamento, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma ABM conforme acima descrito. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um distúrbio relacionado com EG¬FR em um indivíduo mamífero com necessidade de tal tratamento, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma ABM que especificamente se liga a EGFR, onde a ABM não causa um nível clinicamente significante de toxidez quando administrada a um indivíduo mamífero em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamen¬te eficaz provê concentrações no soro da ABM entre cerca de 1 e cerca de 100 microgramas por mililitro por um período de pelo menos 4 semanas. Em outra modalidade, a ABM usada no método compreende ainda uma região Fc de imunoglobulina ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade mais específica, a região Fc ou fragmento da mesma foi engenheirada para ter função efetora aumentada comparado com uma forma não- engenheirada. Em uma modalidade particular, a função efetora é citotoxidez celular mediada por Fc aumentada. Em outra modalidade particular, a região Fc ou fragmento da mesma foi engenheirada para ter afinidade de ligação com receptor Fc aumentada comparado com uma forma não-engenheirada. Em uma modalidade preferida, o receptor Fc é FcyRIII.

Artigos de Fabricação

Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação con¬tendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima é pro¬vido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou em associação com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser forma¬dos de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bol¬sa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha que pode ser fura¬da por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti-EGFR. O rótulo ou bula indica que a com¬posição é usada para tratamento da condição de escolha, tal como uma do¬ença ou distúrbio não-maligno, onde a doença ou distúrbio envolve ativação ou produção anormal de receptor EGFR e/ou ligante de EGFR, por exemplo, uma doença ou distúrbio hiperproliferativo benigno. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composi¬ção contida nele, onde a composição compreende uma primeira modalidade que se liga a EGFR e inibe crescimento de células que superexpressam EGFR; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida nele, onde a composição compreende um segundo anticorpo que se liga a EGFR e blo¬queia ativação de ligante de um receptor EGFR. O artigo de fabricação nesta modalidade da invenção pode compreender ainda uma bula indicando que as primeira e segunda composições de anticorpo podem ser usadas para tratar uma doença ou distúrbio não-maligno da lista de tais doenças ou dis¬túrbios na seção de definição acima. Além disso, a bula pode instruir o usuá¬rio da composição (compreendendo um anticorpo que se liga a EGFR e blo¬queia ativação de ligante de um receptor EGFR) a combinar terapia com o anticorpo e qualquer uma das terapias adjuntas descritas na seção anterior (por exemplo, um agente quimioterapêutico, uma fármaco direcionado a EGFR, um agente antiangiogênico, um agente imunossupressor, um inibidor de tirosina cinase, um composto anti-hormonal, um cardioprotetor e/ou uma citocina). Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para in¬jeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluen- tes, filtros, agulhas e seringas.

Os exemplos abaixo explicam a invenção em mais detalhes. As preparações e exemplos que seguem são dados para permitir que aqueles versados na técnica compreendam mais claramente e pratiquem a presente invenção. A presente invenção, no entanto, não é limitada em escopo pelas modalidades exemplificadas, que pretendem ser ilustrações de aspectos únicos da invenção apenas, e métodos que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Na verdade, várias modificações da invenção em adição àquelas descritas aqui se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição acima e desenhos acompanhan¬tes. Tais modificações pretendem estar dentro do escopo das reivindicações apensas.

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações menciona¬dos neste pedido são aqui incorporados a título de referência em sua totali¬dade.

EXEMPLOS

A menos que de outro modo especificado, referências à nume¬ração de posições de resíduo de aminoácido específico nos Exemplos que seguem estão de acordo com o sistema de numeração Kabat. A menos que de outro modo mencionado, os materiais e métodos usados para fazer os anticorpos descritos nesses exemplos de trabalho estão de acordo com a¬queles mostrados nos exemplos do Ped. de Patente U.S. N° 10/981.738, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

EXEMPLO 1 Materiais e Métodos Abordagem de Aceptor de Homoloqia Alta

A pesquisa de estrutura principal de aceptor de anticorpo de homologia alta foi realizada através de alinhamento da sequência de proteí¬na de ICR62 de rato com uma coleção de sequências de linhagem germina¬tiva humana e escolha daquela sequência humana que mostrou a identidade de sequência mais alta, enquanto conservando todos os resíduos canônicos em um nível funcional. Aqui, a sequência 1-e da família VH1 dentro do ban¬co de dados VBase foi escolhida como a sequência aceptora de estrutura principal de cadeia pesada e a sequência A30 da família VK1 do banco de dados VBase foi escolhida para ser a aceptora de estrutura principal para a cadeia leve. Nessas duas estruturas principais aceptoras as três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e/ou resíduos de determinação de especificidade dessas CDRs dos domínios variáveis pesados e leves de ICR62 de rato foram enxertados. Uma vez que a região 4 da estrutura prin¬cipal não é parte da região variável do gene da linhagem germinativa, o ali¬nhamento para esta posição foi realizado individualmente. A região JH6 foi escolhida para a cadeia pesada, e a região JK2 foi escolhida para a cadeia leve. Modelagem molecular do domínio de imunoglobulina produzido revelou uma posição fora da CDR1 capa potencialmente requerendo os resíduos de aminoácido de murino ao invés dos humanos fora da CDR. Reintrodução de resíduos de aminoácido de murino na estrutura principal humana geraria as chamadas "mutações reversas". Por exemplo, o resíduo de aminoácido a- ceptor humano na posição Kabat 27 (Glicina em 1-e) foi mutado reverso pa¬ra um resíduo tirosina. Para mostrar a importância dos resíduos para ligação de antígeno, variantes de anticorpo humanizado foram produzidas que ou incluíam ou omitiam as mutações reversas. A cadeia leve do anticorpo hu¬manizado não requereu quaisquer mutações reversas. Após a produção das sequências de proteína, sequências de DNA codificando essas proteínas foram sintetizadas conforme detalhado abaixo.

Abordagem de Estrutura Principal Mista

Para evitar a necessidade de introdução de mutações reversas em posições críticas (crítica para reter boa afinidade de ligação de antígeno ou funções de anticorpo) da estrutura principal aceptora humana, foi investi¬gado se a região 1 da estrutura principal (FR1), regiões 1 (FR1) e 2 (FR2) da estrutura principal juntas ou região 3 de estrutura principal (FR3) de um anti¬corpo funcionalmente humanizado poderiam ser substituídas por sequências de anticorpo humano já tendo resíduos de doador, ou resíduos de aminoáci¬do que são funcionalmente equivalentes aos resíduos de doador, em posi¬ções de resíduo importantes na sequência de linhagem germinativa humana natural. Para este propósito, as estruturas 1, 2 e 3 de VH da sequência VH de ICR62 de rato foram alinhadas individualmente a sequências de linhagem germinativa humana. Aqui, identidade de sequência mais alta não foi usada para escolha de estruturas principais de aceptor; ao contrário, combinação de vários resíduos críticos foi realizada. Esses resíduos críticos compreen¬dem os chamados resíduos canônicos, e também aqueles resíduos nas po¬sições 27, 28 e 29 (numeração Kabat), que se encontram fora da definição de CDR1 por Kabat, mas frequentemente estão envolvidos em ligação de antígeno. Ainda, resíduos críticos são aqueles que mostram interação impor¬tante com as CDRs, como pode ser determinado usando modelagem mole¬cular. As sequência de IMGT IGHV1-58 (No. de Acesso M29809), IGHV5-51 (No. de Acesso M99686), bem como a sequência VBase 1-02 da família VH1 foram escolhidas como adequadas para substituição ou de FR1, 2 ou 3. Resumindo: IGHV1-58 mostrou um padrão promissor nas posições 27 a 30 Kabat, mas não satisfez os critérios para posição canônica 71. A IGHV5-51 tem um resíduo compatível 71, então sua FR3 poderia ser usada. Também sua FR1 é próxima à sequência FR1 desejada.

A 1-e de VH1 satisfez todos os critérios com exceção da posição 27. A sequência 1-02 foi considerada aceitável para as regiões FR1 e FR2, mas requereriam uma mutação reversa em FR3.

Após a produção das sequências de proteína, sequências de DNA codificando essas proteínas são sintetizadas conforme detalhada abai¬xo. Usando esta abordagem mutações reversas não foram necessárias na maioria dos construtos da cadeia pesada, a fim de reter bons níveis de liga¬ção de antígeno. A cronologia e o raciocínio dos construtos de estrutura principal mistos são explicados na seção de resultados.

Sintese dos genes de anticorpo

Após ter produzido a sequência de aminoácido da região V de anticorpo humanizado, a sequência de DNA foi gerada. Os dados de se¬quência de DNA das regiões de estrutura principal individuais foram encon¬trados nos bancos de dados (por exemplo, IMGT ou VBase) para sequên¬cias de linhagem germinativa humana. A informação de sequência de DNA das regiões CDR foi obtida da sequência publicada do anticorpo ICR62 de rato (vide, por exemplo, Publicação PCT WO 95/20045). Com essas se¬quências, a sequência de DNA integral foi virtualmente montada. Tendo es¬ses dados de sequência de DNA, sítios de restrição de diagnóstico foram introduzidos na sequência virtual através da introdução de mutações silen¬ciosas, criando sítios de reconhecimento para endonucleases de restrição. Para obter a cadeia de DNA física, síntese de gene foi realizada (vide, por exemplo, Wheeler e outros, 1995). Neste método, oligonucleotídeos são produzidos a partir dos genes de interesse, de modo que uma série de oli¬gonucleotídeos é derivada do filamento de codificação e a outra série é do filamento de não-codificação. As extremidades 3' e 5' de cada oligonucleoti¬deo (exceto os primeiro e último na fileira) sempre mostram sequências complementares a dois iniciadors derivados do filamento oposto. Quando pondo esses oligonucleotídeos em um tampão de reação adequado para qualquer polimerase estável a aquecimento, e adicionando Mg2+, dNTPs e uma DNA polimerase, cada oligonucleotideo é estendido de sua extremida¬de 3'. A extremidade 3' recém-formada de um iniciador então anela com o próximo iniciador do filamento oposto, e estendendo sua sequência mais sob condições adequadas para alongamento de cadeia de DNA dependente de molde. O produto final foi clonado em um vetor convencional para propaga¬ção em E. coli.

Produção de anticorpo

Para construção dos vetores de expressão de cadeias pesada e leve anti-EGFR quiméricos (isto é, região V de rato integralmente e região C humana) e humanizados, sequências líderes de cadeias pesadas e leve hu¬manas (para secreção) foram adicionadas a montante das sequências de DNA de região variável. A jusante das regiões variáveis, as regiões constan¬tes de lgG1 para a cadeia pesada foram adicionadas, e a região constante capa para a cadeia leve usando técnicas de biologia molecular padrão. As sequências de DNA de cadeias pesada e leve de anticorpo integrais resul¬tantes foram subclonadas em vetores de expressão de mamífero (um para a cadeia leve e um para a cadeia pesada) sob o controle do promotor MPSV e a montante de um sítio polyA sintético, cada vetor carregando uma sequên¬cia OriP EBV.

Anticorpos foram produzidos através de co-transfecção de célu¬las HEK293-EBNA com os vetores de expressão de cadeias pesada e leve de anticorpo de mamífero usando uma abordagem de transfecção de fosfato de cálcio. Células HEK293-EBNA exponencialmente crescendo foram trans- fectadas através do método de fosfato de cálcio. Para a produção de anti¬corpo não-modificado, as células foram transfectadas apenas com vetores de expressão de cadeias pesada e leve de anticorpo em uma razão 1:1. Pa¬ra a produção do anticorpo glicoengenheirado, as células foram co- transfectadas com quatro plasmideos, dois para expressão de anticorpo, um para expressão de um polipeptideo GnTIll de fusão e um para expressão de manosidase II em uma razão 4:4:1:1, respectivamente. As células foram cul¬tivadas como culturas de monocamada aderentes em frascos T usando meio de cultura DMEM suplementado com FCS a 10%, e foram transfectadas quando elas eram entre 50 e 80% confluentes. Para a transfecção de um frasco T75, 8 milhões de células foram semeadas 24 horas antes da trans¬fecção em 14 ml de meio de cultura DMEM suplementado com FCS (a 10% V/V final), 250 pg/ml de neomicina e as células foram postos a 37° C em uma incubadora com uma atmosfera de CO2 a 5% da noite para o dia. Para cada frasco T75 a ser transfectado, uma solução de DNA, CaCh e água foi preparada misturando 47 pg de DNA de vetor de plasmideo total divididos igualmente entre os vetores de expressão de cadeias leve e pesada, 235 pl de solução de CaCh 1M e adicionando água para um volume final de 469 pl. A esta solução, 469 pl de uma solução de HEPES 50 mM, NaCI 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM em pH 7,05 foram adicionados, misturados imediatamente por 10 segundos e deixados descansar em temperatura ambiente por 20 segundos. A suspensão foi diluída com 12 ml de DMEM suplementado com FCS 2% e adicionada ao T75 no lugar do meio existente. As células foram incubadas a 37° C, CO2 5% por cerca de 17 a 20 horas, então 0 meio foi substituído com 12 ml de DMEM, FCS 10%. O meio de cultura condicionado foi coletado 5 a 7 dias pós-transfecção, centrifugado por 5 minutos a 1200 rpm, seguido por uma segunda centrifugação por 10 minutos a 4000 rpm e mantido a 4o C.

Os anticorpos secretados foram purificados através de cromato¬grafia de afinidade de Proteína A, seguido por cromatografia de troca de cá¬tion e uma etapa cromatográfica de exclusão de tamanho final em uma colu¬na Superdex 200 (Amersham Pharmacia) trocando o tampão para solução salina tamponada com fosfato e coletando os anticorpos lgG1 monoméricos puros. Concentração de anticorpo foi estimada usando um espectrofotôme- tro da absorbância a 280 nm. Os anticorpos foram formulados em uma solu¬ção de fosfato de potássio 25 mM, cloreto de sódio 125 mM, solução de gli- cina 100 mM de pH 6,7.

Variantes glicoengenheiradas do anticorpo humanizado foram produzidas através de co-transfecção dos vetores de expressão de anticorpo junto com um vetor de expressão de glicosiltransferase de GnT-lll ou junto com um vetor de expressão de GnT-lll mais um vetor de expressão de ma¬nosidase II de Golgi. Anticorpos glicoengenheirados foram purificados e for¬mulados conforme acima descrito para os anticorpos não-engenheirados. Os oligossacarídeos ligados à região Fc dos anticorpos foram analisados atra¬vés de MALDI/TOF-MS conforme descrito abaixo.

Análise de Oligossacarídeo

Oligossacarídeos foram enzimaticamente liberados dos anticor- pos através de digestão de PNGaseF, com os anticorpos sendo ou imobili¬zados em uma membrana PVDF ou em solução.

A solução de digestão resultante contendo os oligossacarídeos liberados ou preparada diretamente para análise MALDI/TOF-MS ou foi dige¬rida mais com EndoH glicosidase antes da preparação da amostra para aná¬lise MALDI/TOF-MS.

Método de liberação de oligossacarídeo para anticorpos imobilizados em membrana PVDF

As cavidades de uma placa de 96 cavidades feita com uma membrana PVDF (Immobilon P., Millipore, Bedford, Massachusetts) foram umedecidas com 100 pl de metanol e o líquido foi drenado da membrana PVDF usando vácuo aplicado à mangueira de vácuo Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). As membranas PVDF foram lavadas três vezes com 300 pl de água. As cavidades foram então lavadas com 50 pl de tam¬pão RCM (Ureia 8M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6). Entre 30-40 pg de anticorpo foram carregados em uma cavidade contendo 10 pl de tampão RCM. O líquido na cavidade foi drenado através da membrana com aplica¬ção de vácuo, e a membrana foi subsequentemente lavada duas vezes com 50 pl de tampão RCM. A redução de pontes dissulfeto foi realizada através da adição de 50 pl de ditiotreitol 0,1 M em RCM e incubação a 37° C por 1 hora.

Seguindo redução, um vácuo foi aplicado para remover a solu¬ção de ditiotreitol da cavidade. As cavidades foram lavadas três vezes com 300 pl de água antes da realização da carboximetilação dos resíduos cistei¬na através da adição de 50 pl de ácido iodoacético 0,1M em tampão RCM e incubação em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.

Após carboximetilação, as cavidades foram drenadas com vácuo e subsequentemente lavadas três vezes com 300 pl de água. A membrana PVDF foi então bloqueada, para prevenir adsorção da endoglicosidase, in¬cubando 100 pl de uma solução aquosa 1% de polivinilpirrolidona 360 em temperatura ambiente por 1 hora. O reagente de bloqueio foi então removido através de vácuo suave seguido por três lavagens com 300 pl de água.

Oligossacarídeos N-ligados foram liberados através da adição de 2,5 um de peptídeo-N-glicosidase F (N-Glicanase recombinante, GLYKO, Novato, CA) e 0,1 um de Sialidase (GLYKO, Novato, CA), para remover quaisquer resíduos de monossacarídeo carregados potenciais, em um volu¬me final de 25 pl em NaHCo3 20 mM, pH 7,0). Digestão foi realizada por 3 horas a 37° C.

Método de liberação de oligossacarídeo para anticorpos em solução

Entre 40 e 50 pg de anticorpo foram misturados com 2,5 um de PNGaseF (Glyko, U.S.A.) em Tris 2mM, pH 7,0, em um volume final de 25 microlitros e a mistura foi incubada por 3 horas a 37° C.

Uso de Digestão de Endoqlicosidase H de Oligossacarídeos Liberados por PNGase para a Designação de Estruturas de Oligossacarídeo Bissectado Híbrido para Picos de Oligossacarídeo Neutros MALDI/TOF-MS

Os oligossacarídeos liberados de PNGaseF foram subsequen¬temente digeridos com Endoglicosidase H (EC 3.2.1.96). Para a digestão de EndoH, 15 mU de EndoH (Roche, Suíça) foram adicionados à digestão de PNGaseF (anticorpo em método de solução acima) para dar um volume final de 30 microlitros, e a mistura foi incubada por 3 horas a 37° C. EndoH cliva entre os resíduos de N-acetilglicosamina do núcleo de quitobiose de oligos¬sacarídeos N-ligados. A enzima pode apenas digerir oligomanose e a maio¬ria dos glicanos do tipo híbrido, enquanto oligossacarídeos do tipo complexo não são hidrolisados.

Preparação de amostra para MALDI/TOF-MS

As digestões enzimáticas contendo os oligossacarídeos libera¬dos foram incubadas por mais 3 horas em ambiente após a adição de ácido acético para uma concentração final de 150 mM e foram subsequentemente passadas por 0,6 ml de resina de troca de cátion (resina AG50W-X8, forma hidrogênio, 100-200 mesh, BioRad, Suíça) acumulado em uma coluna de cromatografia de micro-bio-spin (BioRad, Suíça) para remover cátions e pro¬teínas. Um microlitro da amostra resultante foi aplicado a uma placa-alvo de aço inoxidável e misturado na placa com 1 pl de matriz sDHB. Matriz sDHB foi preparada dissolvendo 2 mg de ácido 2,5-diidroxibenzóico mais 0,1 mg de ácido 5-metoxisalicílico em 1 ml de etanol/cloreto de sódio aquoso 10 mM 1:1 (v/v). As amostras foram secas ao ar, 0,2 pl de etanol foi aplicado e as amostras foram finalmente deixadas recristalizar sob ar.

MALDI/TOF-MS

O espectrômetro de massa MALDI-TOF usado para adquirir os espectros de massa era um Voyager Elite (Perspective Biosystems). O ins¬trumento foi operado na configuração linear, com uma aceleração de 20 kV e 80 ns de retardo. Calibragem externa usando padrões de oligossacarídeo foi usada para designação de massa dos íons. Os espectros de 200 tiros de laser foram somados para obter o espectro final.

Ensaio de ligação de antígeno

As variantes de anticorpo humanizado monomérico, purificado, foram testadas quanto à ligação a receptor de fator de crescimento epider¬mal humano (EGFR, também referido na literatura como HER-1 ou ErbB1) na linhagem de célula epidermal humana A431, usando um ensaio baseado em citometria de fluxo. 200.000 células (por exemplo, de linhagem de célula A431 humana) em 180 pl de tampão FACS (PBS contendo FCS2% e EDTA 5 mM) foram transferidas para tubos de poliestireno de 5 mL e 20 pl de a- mostras de anticorpo anti-EGFR 10 vezes concentrado (anticorpo primário) (concentração final de 1-5000 ng/ml) ou PBS apenas foram adicionados. Após mistura suave das amostras, os tubos foram incubados a 4o C por 30 minutos no escuro. Subsequentemente, amostras foram lavadas duas vezes com tampão FACS e peletizadas a 300 x g por 3 minutos. Sobrenadante foi aspirado e as células foram absorvidas em 50 pl de tampão FACS e 2 pl de anticorpo secundário (fragmentos F(ab')2-FITC específicos anti-Fc (Jackson Immuno Research Laboratories, USA)) foram adicionados e os tubos foram incubados a 4o C por 30 minutos. Amostras foram lavadas duas vezes com tampão FACS e absorvidos em 500 pl de tampão FACS para análise através de Citometria de Fluxo. Ligação foi determinada pondo em gráfico a fluores¬cência média geométrica contra as concentrações de anticorpo.

Ligação de qlicovariantes de lgG1 monomérico á linhagem de célula CHO expressando FcyRIIIA

Células CHO foram transfectadas através de eletroporação (280 V, 950 pF, 0,4 cm) com um vetor de expressão codificando a cadeia a e a cadeia y de FcgamaRIIIA-Val158. Transfectantes foram selecionados atra¬vés da adição de 6 pg/ml de puromicina e clones estáveis foram analisados através de FACS usando 10 pl de anticorpo monoclonal anti-FcgamaRIII 3G8 conjugado a FITC (BD Biosciences, Allschwil/Suíça) para 106 células. Ligação de lgG1 a células CHO expressando FcgamaRIIIA-Val158 foi reali¬zada. Resumidamente, os fragmentos anti-FcgamaRIIIA 3G8 F(ab')2 (Ancell, Bayport, MN/USA) foram adicionados em uma concentração de 10 pg/ml para competir com a ligação de glicovariantes de anticorpo (3 pg/ml). A in¬tensidade de fluorescência se referindo a variantes de anticorpo ligadas foi determinada em um FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil/Suíça).

Ensaio de ADCC

Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram usadas como células efetoras e foram preparadas usando Histopa- que-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178, USA) seguindo es¬sencialmente as instruções do fabricante. Resumindo, sangue venoso foi tirado com seringas heparinizadas de voluntários saudáveis. O sangue foi diluído 1:0,75-1,3 com PBS (não contendo Ca++ ou Mg++) e posto em cama¬da em Histopaque-1077. O gradiente foi centrifugado a 400 x g por 30 minu¬tos em temperatura ambiente (RT) sem intervalos. A interfase contendo a PBMC foi coletada e lavada com PBS (50 ml por células de dois gradientes) e coletada através de centrifugação a 300 x g por 10 minutos em temperatu¬ra ambiente. Após ressuspensão do pélete com PBS, as PBMC foram con¬tadas e lavadas uma segunda vez através de centrifugação a 200 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. As células foram então ressuspensas no meio apropriado para os procedimentos subsequentes.

A razão de efetor para alvo usada para os ensaios ADCC era 25:1 e 10:1 para células PBMC e NK, respectivamente. As células efetoras foram preparadas em meio AIM-V na concentração apropriada a fim de adi¬cionar 50 pl por cavidade de placas de 96 cavidades de fundo redondo. As células-alvo eram células expressando EGFR (por exemplo, A431, EBC-1 ou LN229) cultivadas em DMEM contendo 10% de FCS. As células-alvo foram lavadas com PBS, contadas e ressuspensas em AIM-V a 0,3 milhão por ml a fim de adicionar 30.000 células em 100 pl e microcavidade. Anticorpos foram diluídos em AIM-V, adicionados em 50 pl às células-alvo pré-plaqueadas e deixados ligar aos alvos por 10 minutos em temperatura ambiente. Então as células efetoras foram adicionadas e a placa foi incubada por 4 horas a 37° C em uma atmosfera umidificada contendo CO2 a 5%. Morte das células- alvo foi avaliada através da medição da liberação de lactato desidrogenase (LDH) de células danificadas usando o Cytotoxicity Detection Kit (Roche Di¬agnostics, Rotkreuz, Suíça). Após a incubação de 4 horas as placas foram centrifugadas a 800 x g. 100 pl de sobrenadante de cada cavidade foram transferidos para uma nova placa de 96 cavidades de fundo plano transpa¬rente. 100 pl de tampão de substrato colorido do estojo foram adicionados por cavidade. Os valores Vmax da reação colorida foram determinados em uma leitora ELISA a 490 nm por pelo menos 10 minutos usando software SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Liberação de LDH espontânea foi medida de cavidades contendo apenas células-alvo e efetoras, mas quaisquer anticorpos. Liberação máxima foi determinada de cavidades contendo apenas células-alvo e Triton X-100 1%. Porcentagem de morte mediada por anticorpo específico foi calculada como segue: ((x - SR)/(MR - SR)*100, onde x é a média de Vmax em uma concentração de anticorpo específica, SR é a média de Vmax da liberação espontânea e MR é a média de Vmax da liberação máxima.

EXEMPLO 2 Resultados e Discussão

Comparação da ligação a receptor EGF humano de variantes de anticorpo l-HHA, l-HHB, l-HHC, l-HLA, l-HLB, l-HLC, I-HLA1, I-HLA2, I- HLA3, I-HLA4, I-HLA5, I-HLA6, I-HLA7, I-HLA8, l-HLA-9, l-HHD, l-HHE, I- HHF e l-HHG, ou complexadas com a cadeia leve de ICR62 quimérico ou com as cadeias leves de ICR62 humanizado (l-KA, l-KB ou l-KC) e o anti¬corpo ch-ICR62 de origem, quimérico, mostra que todos os anticorpos têm dentro valores EC50 similares de uma unidade log. Apenas a l-HHA tem ati- vidade de ligação muito diminuída (vide Figura 2). A Figura 1 mostra a ativi¬dade funcional das cadeias de polipeptideo de ICR62 quimérico individual (ch-ICR62) quando combinado com os construtos humanizados l-HHC e I- KB, respectivamente. Neste experimento, ou a cadeia leve, a cadeia pesada ou ambas cadeias simultaneamente do ch-ICR62 foram substituídas pelos construtos humanizados mencionados acima. Isto mostra que a formação da interface VH/VL parece funcionar bem no anticorpo de roedor bem como nos construtos humanizados.

Conforme mostrado na Figura 2, a l-HHA de cadeia pesada hu¬manizada não pôde restaurar atividade de ligação com a cadeia leve nem de l-KA ou l-KB. Uma vez que l-HLA mostrou ligação com ambas l-KA e l-KB, os presentes inventores concluíram que a cadeia pesada de l-HHA não é funcional em ligação de antígeno. As Figuras 1 e 2, combinadas com a Figu¬ra 3, mostram que os construtos de cadeia leve l-KA, l-KB e l-KC mostram comportamento de ligação indistinguível do contraparte de roedor. A variante l-KC não possui quaisquer mutações reversas e adicionalmente ela tem sua CDR1 parcialmente humanizada, de modo que os resíduos 24-29 podem ser derivados da sequência aceptora humana (A30 de VK1, conforme mencio¬nado antes).

Nas séries l-HHA, l-HHB e l-HHC, apenas as duas últimas vari¬antes mostraram comportamento de ligação satisfatório (Figuras 2 e 3). Aná¬lise de sequência da l-HHA revelou três resíduos de aminoácido potenciais responsáveis por este comportamento: Lys33, His35 e Tyr50. Construtos que têm Lys33 substituído por tirosina mostraram boa ligação, bem como construtos tendo o Tyr50 substituído por triptofano. Apenas quando esses dois resíduos foram substituídos por alanina e glicina, respectivamente, a ligação foi perdida. Uma vez que l-HHC não mostrou ligação melhor do que l-HHB, os presentes inventores concluíram que os resíduos Asn60, Glu61, Lys64 e Ser65 não precisam ser de origem de roedor; ou eles podem ser substituídos por Ala, Gin, Gin e Gly, respectivamente. Este procedimento leva a um construto onde a CDR2 é mais humanizada, uma vez que as posi-ções de aminoácido 60 a 65 são parte da definição de CDR Kabat, mas não há nenhuma necessidade de enxertar os resíduos de doador de roedor para este anticorpo.

As Figuras 4 e 5 comparam os construtos das séries I-HLA1, I- HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5 e l-HI_A6. O melhor comportamento de liga¬ção foi observado nos construtos ch-ICR62, I-HLA1 e I-HLA2, com um valor EC50 de aproximadamente 300 ng/ml. Os outros construtos tiveram este valor aumentado em um fator de dois, e então têm atividade de ligação ligei¬ramente reduzida. A primeira conclusão a partir desses dados é que, dentro da CDR1 Kabat, as substituições Lys33Tyr e lle34Met foram toleradas. Es¬sas duas posições estão localizadas dentro da definição Kabat de CDR1, mas fora dos limites de CDR Chothia (que eram baseados em análise estru¬tural ao invés de sequência). Na última parte de CDR1, então, pelo menos alguma promiscuidade é permitida.

A segunda conclusão é que, dentro da CDR2, em adição à subs¬tituição acima mencionada dos resíduos Asn60 e Glu61 pelos resíduos não- doadores, substituições de não-doador AsnGOSer, Glu61Pro e Lys62Ser dentro da CDR Kabat foram também permitidas. Esses resíduos foram deri¬vados da sequência de aceptor IGHV5-51 de linhagem germinativa humana, que foi usada como uma sequência aceptora de FR5. Construtos I-HLA3 e I- HLA4 diferem de I-HLA1 e I-HLA2 apenas pela remoção da mutação reversa Phe27Tyr, e ambos construtos I-HLA3 e I-HLA4 perdem afinidade compara¬do com seu construto de origem. Então, a terceira conclusão da comparação de I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5 e I-HLA6 é o envolvimento do Phe27 em ligação de antígeno, ou diretamente ou indiretamente, através da modificação da conformação de alça de CDR1.

Variantes I-HLA5 e I-HLA6 têm a FR1 de l-HLA 1 e I-HLA2, res¬pectivamente, substituída por outra sequência aceptora de linhagem germi¬nativa com o Phe27 naturalmente presente (isto é, IGHV1-58). Isto poderia ser apenas conseguido introduzindo simultaneamente várias outras muta¬ções que são: Val2Met, Ala9Pro e Ala16Thr. Ao fazer isso, o efeito benéfico de (re)introdução de Phe27 foi novamente anulado.

O construto I-HLA7 foi avaliado para determinar se a restaura¬ção de resíduos de doador adicionais na CDR1 e CDR2 de cadeia pesada do construto I-HLA6 restauraria atividade de ligação integral comparado com ICR62. Conforme mostrado na Figura 6, este não foi o caso.

Conforme mostrado nas Figuras 7 e 8, dois construtos adicio¬nais, I-HLA8 e I-HLA9, foram testados para determinar se a atividade de li¬gação integral comparado com ch-ICR62 poderia ser conseguida. Partindo do construto l-HHB, as regiões FR1 foram substituídas por regiões FR1 ten¬do homologia máxima dentro da região CDR1 Chothia. O construto I-HLA8 tem a FR1 da sequência IGHV1-58 e o I-HLA9 tem a região FR1 de IGHV5- 51. Ambos construtos se ligam ao antígeno pelo menos tão bem quanto o anticorpo ch-ICR62. O construto I-HLA8 pode, na realidade, ser até melhor, com a EC50 diminuída por um fator de 2. O construto I-HLA8 tem a mesma sequência FR1 que os construtos I-HLA5 e I-HLA6 e então tem os mesmos resíduos não-doadores (isto é, Val2Met, Ala9Pro e Ala16Thr), sugerindo que a presença desses resíduos não-doadores não tem um efeito negativo sobre ligação. Mutações não-benéficas acontecendo nos I-HLA5 e 6 surgem da combinação de uma FR1 VH1 emparelhada com uma FR3 VH5, que poderi¬am ser potencialmente compensadas tendo uma FR1 e uma FR3 da mesma família VH.

São mostrados na Figura 8 construtos que contêm resíduos não- doadores dentro das CDRs. Então, esses construtos são ainda mais huma¬nizados dentro das CDRs porque os resíduos não-doadores acontecem nas regiões de estrutura principal humana que foram escolhidas para esses construtos. Os construtos l-HHE (His35Ser), l-HHF (Thr58Asn) e l-HHG (Ser57Ala) todos têm um resíduo dentro da CDR1 ou CDR2 que é humani¬zado (comparado com o construto l-HHB). O construto l-HHD (Gly24Ala) foi também ensaiado. I-HHF mostrou ligação reduzida indicando a importância de Thr58. Em contraste com o resíduo 58 de CDR Kabat, aminoácido 57 é mais tolerante a substituições, uma vez que a mutação Ser57Ala aparente¬mente não tem nenhuma influência sobre ligação (Figura 8).

Uma vez que a região FR3 de IGHV5-51 parecia mostrar propri¬edades promissoras nos construtos I-HLA1 e 2, e a FR1 da mesma sequên¬cia de linhagem germinativa provou ser útil no construto I-HLA9, as FR1, FR2 e FR3 de IGHV5-51 foram feitas para serem usadas juntas como um aceptor para enxerto em alça.

• Sumário da análise dos resíduos canônicos em construtos I-
• CR62 humanizados:
• VL: Posição Kabat 2: lie provavelmente requerido.
• Posição Kabat 71: lie ou Phe permitido.
• VH: Pos. 24, Gly, Thr, Ala, Vai, Ser permitidos.
• Pos. 26, Gly permitido.
• Pos. 29, Phe, lie, Leu, Vai, Ser permitidos.
• Pos. 34, He, Met, Leu, Vai, Trp, Thr permitidos.
• Pos. 71, Ala, Leu, Vai, Thr permitidos.
• Pos. 94, Arg, Gly, Asn, Lys, Ser, His, Thr, Ala permitidos.

A Figura 9 mostra uma comparação da citotoxidez celular mediada por anticorpo (ADCC) que é mostrada para as várias glicoformas do an-ticorpo ICR62 quimérico, bem como para a variante humanizada I-HLA4. As glicoformas diferentes são marcadas por um marcador que ou indica não- glicoengenheirada (WT), Glicoforma 1 (G1) ou Glicoforma 2 (G2). "G1" refere-se à glicoengenharia do anticorpo através de co-expressão com GnTIll. "G2" refere-se à glicoengenharia do anticorpo através de co-expressão com GnTIll e Manll. "WT" refere-se a anticorpos que não foram glicoengenheira- dos. A cadeia leve para todos os construtos humanizados é a variante l-KC, e não foi marcada explicitamente.

O anticorpo quimérico, bem como o humanizado foram aperfeiçoados em sua potência e eficácia através de duas abordagens de glicoen-genharia diferentes. O construto ch-ICR62 teve desempenho um pouco me¬lhor do que I-HLA4 para o tipo selvagem ou as glicoformas, respectivamente. Conforme visto na Figura 4, quando comparando as afinidades dos dois anticorpos com relação ao seu antígeno, o ch-ICR62 tinha um valor de EC50 duas vezes menor. Esta diferença em afinidade é aqui refletida em diferen¬ças em eficácia.

A Figura 10 mostra uma comparação da citotoxidez celular me¬diada por anticorpo (ADCC) para a glicoforma não-glicoengenheirada ("tipo selvagem") e a G2 dos construtos de anticorpo ICR62 humanizado l-HHB e I-HLA7. Os mesmos anticorpos foram aplicados a duas linhagens de célula- alvo diferentes. No painel A da Figura 10, a linhagem de célula-alvo LN229 é usada; e no painel B da Figura 10, a linhagem de célula A431 foi usada. As células A431 são aparentemente mais suscetíveis com relação à morte celu¬lar mediada por anticorpo do que células LN229. Mais importante, a glicoen- genharia acentuou a potência de ambos anticorpos. Este efeito parecia ser mais pronunciado para o I-HLA7 do que para o l-HHB. A porcentagem de morte celular em concentração de anticorpo máxima para o l-HHB poderia ser mudada de ~30% a ~40% através da introdução da variante glicoenge- nheirada G2, quando usando a linhagem de célula-alvo LN229. Quando u- sando a linhagem de célula A431, este valor era aparentemente não- modificado. Este comportamento era completamente diferente para o anti¬corpo de I-HLA7. Morte de célula-alvo em concentração de anticorpo máxi¬ma foi mudada a partir de cerca de 10% a cerca de 50%, para as células LN229, e a partir de cerca de 40% a cerca de 70% para as células A431 a- través da introdução das variantes de glicoengenharia G2. Neste caso, ape¬sar de ter atividade menor no anticorpo não-glicoengenheirado para o I- HLA7 relativo a l-HHB, a classificação de atividade é revertida para os anti¬corpos glicoengenheirados. As Figuras 11 e 12 também mostram compara¬ções de formas não-glicoengenheiradas (WT) e glicoformas G2 de ICR62 quimérico e os construtos de anticorpo ICR62 humanizado l-HHB e I-HLA7. EXEMPLO 3

Estudo de Toxidez Preliminar através de Administração Intravenosa (Bolo) a Macacos Cinomólogos - Análise Bioanalítica

INTRODUÇÃO Ensaio de Anti-EGFR Glicoengenheirado

Esta Análise Bioanalítica descreve a medição de anti-EGFR em amostras se originando de macacos cinomólogos seguindo administração intravenosa (bolo) de anti-EGFR (anticorpo anti-EGFR glicoengenheirado, recombinante, produzido de células de mamífero transfectadas em cultura com vetores de expressão de anticorpo carregando os genes de l-HHB de cadeia pesada e l-KC de cadeia leve conforme acima descrito, e purificado conforme acima descrito) conforme descrito no protocolo mostrado abaixo.

Um total de 78 amostras de soro de macaco foi armazenado em cerca de - 20° C até uso.

Os métodos Bioanalíticos usados para determinação de anti- EGFR usaram um método ELISA para medir as concentrações no soro de anti-EGFR. Critérios de aceitação foram ajustados a ±20% (±25% de QC 10 baixo) para precisão e imprecisão.

MATERIAIS E MÉTODOS

Objetivo: O objetivo do presente estudo era a avaliação do po¬tencial tóxico sistêmico de administração intravenosa (bolo) de Glyco-mAb (anti-EGFR) a Macacos Cinomólogos seguido por um período de recupera- 15 ção de 8 semanas.

Raciocínio para seleção do nível de dosagem 1,5-7,5 mg/kg é a faixa esperada para estudos humanos (7,5 20 mg/kg sendo a dose correspondente para um composto similar em seres humanos).

TABELA 10: Identidade de grupos de tratamento

N° Expresso em termos da substância de teste conforme fornecida.

Procedimento de Imunoensaio

Uma placa foi revestida com 100 pl por cavidade de solução de revestimento (5 pl de IgG anti-humano de cabra (IgG adsorvida de macaco, o Sítio de Ligação, UK) adicionada a 11495 pl de tampão de bicarbonato (0,05M, pH 9,6) e incubada por aproximadamente 2 horas em temperatura 10 ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com 400 pl por cavidade de solução de lavagem (PBS (Sigma Chemical Co., UK) 0,01% (v/v) Triton-100 (Sigma Chemical Co., UK)) e seca com leves batidas.

Tampão de ensaio (1% p/v de BSA, Sigma Chemical CO., UK) foi adicionado a 200 pl por cavidade e incubado por aproximadamente 1 ho- 15 ra em temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes com 400 pl por ca¬vidade de solução de lavagem e seca com leves batidas.

Os padrões de calibragem, Controles de Qualidade (QC) e/ou amostras foram adicionados a 100 pl por cavidade e incubados por aproxi¬madamente 2 horas em temperatura ambiente, após o que a placa foi lavada 3 vezes com 400 pl por cavidade de solução de lavagem e seca com leves batidas.

A solução de conjugado (6 pl de conjugado de kappa IgG anti- humano de cabra-HRP (Bethyl Laboratories, Inc., USA) adicionados a 12 ml de tampão de ensaio) foi adicionada a 100 pl por cavidade e incubada por aproximadamente 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 ve¬zes com 400 pl por cavidade de solução de lavagem e seca com leves bati¬das.

Trimetilbenzidina (TMB; Europa Bioproducts, Ely, UK) foi adicio¬nada a 100 pl por cavidade. A placa foi coberta e incubada por aproximada¬mente 15 minutos em temperatura ambiente. 100 pl de solução de lavagem (HCI 0,5M, Fisher, UK) foram então adicionados a cada cavidade. Absorbân- cias foram lidas a 450 nm (filtro de referência 630 nm) em uma leitora de microplaca DYNATECH MRX (Mettler Instruments, UK).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise da Amostra de Teste

Concentrações de anti-EGFR foram medidas através de um mé¬todo de imunoensaio (ELISA) em 78 amostras de soro de macaco geradas de acordo com o protocolo descrito acima. Esses resultados são apresenta¬dos nas Tabelas 19-21 abaixo.

Concentração no soro de anti-EGFR em soro de macaco (pg/ml) seguindo administração intravenosa de 1,5 mg/kg de anti-EGFR nos dias 1,8, 15 e 22 (GRUPO 1)

EXEMPLO 4

Estudo de toxidez preliminar através da administração intravenosa (bolo) a macacos cinomólogos - Toxicocinética

Sumário

Três grupos de macacos cinomólogos (1 macho e 1 fêmea porgrupo) foram administrados com doses de bolo intravenosas de anti-EGFR nos Dias 1, 8, 15 e 22 de um estudo de toxidez de 28 dias a fim de avaliar a exposição sistêmica dos animais a anti-EGFR. Concentrações no soro de anti-EGFR em amostras coletadas até 672 horas após a primeira dose foram determinadas por meio de um método de imunoensaio. Análise farmacociné- tica de dados de concentração no soro-tempo resultou nos parâmetros far- macocinéticos gue seguem:

As relações entre áreas sob as curvas de concentração de anti-EGFR no soro-tempo (AUC168) e nível de dose no Dia 1 são apresentadas abaixo.

A taxa e a extensão de exposição sistêmica de macacos a anti-EGFR, caracterizada por AUC168, aumentaram aproximadamente e propor¬cionalmente com dose maior na faixa de dose de 1,5 a 4,5 mg/kg/ocasião, mas mais do que o aumento de dose proporcional na faixa de dose de 4,5 a 10 12 mg/kg/ocasião no Dia 1. Na dose mais alta (12 mg/kg/ocasião) a AUCies era cerca de 2,8 vezes maior do que 0 previsto por uma relação linear.

A extensão (AUCI68) de exposição sistêmica de macacos fê¬meas a anti-EGFR era geralmente similar à exposição em macacos machos.

Após doses intravenosas repetidas, as concentrações no soro 15 de pré-dose de anti-EGFR foram geralmente maiores do que aqueles valo¬res após uma dose única e indicaram acúmulo de anti-EGFR em soro duran-

te todo o período do estudo.

A meia-vida terminal não poderia ser estimada adequadamente para todos os animais, mas onde ela podia ser estimada estava na faixa de 32,5 a 63,1 horas, e pareceu aumentar com dose animais machos. Libera¬ção do soro total de anti-EGFR pareceu ser independente de dose na faixa de 1,5-4,5 mg/kg/ocasião, mas foi reduzida no nível de dose de topo em ma¬cacos machos e fêmeas.

Concluindo, a extensão de exposição sistêmica de macacos ci¬nomólogos a anti-EGFR pareceu ser caracterizada por cinética não-linear (dependente da dose) na faixa de dose de 1,5 a 12 mg/kg/ocasião no Dia 1 do estudo de toxidez intravenosa. Aumento da dose de anti-EGFR acima de 4,5 mg/kg/ocasião é provável de resultar em exposição sistêmica mais alta do que seria previsto a partir de uma relação linear, que está de acordo com a possibilidade de um processo limitado em capacidade para a eliminação de anti-EGFR.

Ainda, o estudo também proveu evidência de que em geral não há diferenças na exposição sistêmica de macacos machos e fêmeas a anti- EGFR e que houve um acúmulo após administração intravenosa repetida. Introdução

Três grupos de um macaco cinomólogo macho e um fêmea fo¬ram administrados com anti-EGFR através de injeção de bolo intravenosa, em níveis de dose de 1,5, 4,5 e 12 mg/kg/ocasião nos Dias 1, 8, 15 e 22 de um estudo de toxidez preliminar. Amostras de sangue foram tiradas de cada animal nos pontos de tempo que seguem seguindo administração no Dia 1: 1,4, 12, 24, 72 e 120 horas pós-dose. Ainda, amostras foram tomadas pré- dose em 1 hora pós-dose nos Dias 8, 15 e 22 e em 672 horas após a primei¬ra dose no Dia 1. O soro separado foi congelado em cerca de -20° C antes da análise de concentrações no soro de anti-EGFR através de um método de imunoensaio.

Abreviações

• AUC Área sob a curva de concentração-tempo no soro para tempo infinito
• AUC168 Área sob a curva de concentração-tempo no soro durante urn intervalo de dose de 168 horas
• BLQ Abaixo do limite de quantificação
• ca Aproximadamente
• CL Liberação do soro total
• Cmax Concentração máxima no soro
• F Fêmea
• k Constante de taxa terminal
• M Macho
• ti/2 Meia-vida terminal
• Tmax Momento quando Cmax aconteceu
• Vss Volume de distribuição em estado uniforme
• Anticorpo usado para estudo

Glyco-mAb (Anti-EGFR), um anticorpo anti-EGFR com Fc enge¬nheirada para afinidade de ligação de receptor Fc-FcgamaRIII aumentada e ADCC aumentada, foi produzido, purificado e caracterizado conforme acima descrito. Resumidamente, anticorpo foi produzido através de co-transfecção de células HEK293-EBNA com vetores de DNA de plasmideo para expres¬são de cadeia pesada de anticorpo de l-HHB, cadeia leve de anticorpo de I- KC, GnT-lll e Manll. Uma versão melhorada do método de transfecção des¬crito acima foi empregada, transfectando monocamadas de célula culturadas em garrafas redondas ao invés de frascos T. Uma etapa cromatográfica de troca de ânion de fluxo adicional usando matriz Q-sepharose foi incluída no processo de purificação imediatamente antes da etapa cromatográfica de exclusão de tamanho descrita acima.

O padrão de glicosilação do anticorpo com Fc engenheirada foi analisado conforme acima descrito usando espectrometria MALDI/TOF-MS de oligossacarídeos derivados de Fc enzimaticamente liberados. O perfil de oligossacarídeo é mostrado na Figura 23.

Ligação a EGFR humano e EGFR de macaco foi demonstrada através de ligação de célula integral conforme acima descrito usando células A431 e COS-7, e análise baseada em FACS. Curvas de ligação são mostra-

das nas Figuras 24 e 25 respectivamente.

Ligação de receptor FcgamaRIII aumentada resultante da enge¬nharia de Fc aplicada foi demonstrada conforme acima descrito usando liga¬ção de célula integral a células CHO engenheiradas para expressão na su¬perfície de FcgamaRIII humano e análise baseada em FACS. Os resultados são mostrados na Figura 26. Adicionalmente, o anticorpo engenheirado tem grau equivalente de engenharia de Fc para o anticorpo "Glyco-2" (75% em oligossacarídeos de Fc sendo do tipo não-fucosilado) descrito em outro local (Ferrara, C. e outros, J. Biol. Chem. 2055 Dez. 5; [publicação E ahead of print]).Tais anticorpos de Fc engenheirada têm afinidade de ligação até 50 vezes maior para FcgamaRIII com relação a um anticorpo não-Fc engenhei¬rado padrão (constante de dissociação de equilíbrio de 15 e 150 nM para as variantes polimórficas 158V e 158F dos receptor humano vs. 750 e 5000 nM para as variantes do mesmo receptor, respectivamente, quando ligando a anticorpos lgG1 humanos não-Fc engenheirados).

ADCC foi medida conforme acima descrito usando duas linha¬gens de célula-alvo: células de carcinoma de pulmão humano A549 e células de queratinócito de macaco cinomólogo CYNOM-K1. Os resultados são mostrados nas Figuras 27 e 28, respectivamente.

Processamento de dados

Parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando o pro¬grama de computador WinNonlin Pro Versão 3.3 (Pharsight Corporation, USA).

Todas as concentrações no soro fornecidas como parte deste estudo foram relatadas para 4 figuras significantes ou 3 casas decimais. Pa¬râmetros farmacocinéticos foram relatados como segue: Cmax, AUCies, CL e Vss para 4 figuras significantes; k para 4 casas decimais; ti/2 para 1 casa decimal.

Valores que eram BLQ (<0,195 pg/mL) foram inseridos como zero no processamento farmacocinético.

Toxicocinétíca

Concentração no soro máxima de anti-EGFR (Cmax) e seus momentos de ocorrência (Tmax) foram os valores observados. Áreas sob as curvas de concentração de anti-EGFR do soro-tempo dentro de um intervalo de dose de 168 horas (AUC^s) foram estimadas através da regra trapezoidal linear. No cálculo de AUC168 valores das concentrações anti-EGFR no soro em zero hora foram também estimados através de extrapolação reversa u- sando análise de regressão log-linear, com base nos dois primeiros momen¬tos de amostragem, no entanto, se a concentração no soro não declinou du¬rante este período então a concentração no soro em zero hora era conside¬rada ser equivalente á concentração no primeiro momento de amostragem. Áreas sob as curvas de concentração de anti-EGFR no soro-tempo para o tempo infinito (AUC) foram estimadas através da expressão que segue: AUC = AUC168 + Clast/k

em que Clast é a concentração no soro prevista no ponto de amostra menos quantificável e k é a constante de taxa terminal.

Constantes de taxa terminal (k) foram estimadas ajustando uma regressão linear de concentração log contra tempo. Para que a estimativa de k seja aceita como confiável, os critérios que seguem foram impostos:

Os pontos de dados terminais foram aparentemente aleatori¬amente distribuídos em uma única linhagem reta (em inspeção visual)

Um mínimo de 3 pontos de dados estava disponível para a regressão

O coeficiente de regressão era >0,95 e a fração da variância considerada era >0,90

O intervalo incluindo os pontos de dados escolhidos para a regressão era pelo menos duas vezes maior do que a própria meia-vida.

As meias-vidas terminais (tv2) foram calculadas como 1n2/k. Li¬beração do soro total (CL) foi calculada como Dose/AUC. Volume de distri¬buição em estado uniforme (Vss) foi calculado como Dose.AUMC/AUC2. Acúmulo (R) foi avaliado como a razão da concentração no canal seguindo a última dose (Dia 22) para a concentração no canal seguindo a primeira dose (Dia 1), isto é, concentração no soro em 672 horas/concentração no soro em 168 horas (pré-dose no Dia 8).

Resultados e Discussão

Amostras de sangue foram tomadas até 120 horas após dosa¬gem no Dia 1; em pré-dose e 1 hora pós-dose nos Dias 8, 15 e 22 e em 672 horas pós dosagem no Dia 1 durante um estudo de toxidez para avaliar a exposição sistêmica de macacos machos e fêmeas a anti-EGFR seguindo administração de bolo intravenosa de anti-EGFR em níveis de dose de 1,5, 4,5 e 12 mg/kg/ocasião nos Dias 1, 8, 15 e 22 do estudo. Concentrações no soro de anti-EGFR em amostras tomadas até 168 horas pós-dose são re¬presentadas nas Tabelas 27-29 e os perfis de concentração no soro média- tempo são ilustrados nas Figuras 18 e 19.

Parâmetros farmacocinéticos de anti-EGFR são apresentados na Tabela 50 e os valores de AUCI68 são sumarizados abaixo:

Os momentos quando concentrações no soro máximas aconte ceram (Tmax) foram geralmente 1 hora pós-dose (o primeiro ponto de amos¬tra), mas aconteceram em 4 horas pós-dose (o segundo ponto de amostra) em fêmeas 2F462 (4,5 mg/kg) e 3F612 (12 mg/kg). No entanto, para ambas fêmeas, as concentrações em 4 horas pós-dose eram muito similares àque¬las concentrações em 1 hora pós-dose e estavam provavelmente dentro da variabilidade do ensaio. Então o aparente retardo em Tmax é improvável de ser de qualquer significância.

Concentrações no soro de anti-EGFR antes da dose seguinte eram quantificáveis em todos os animais exceto macho 2M461 no Dia 22 (nível de dose de 4,5 mg/kg/ocasião) então, em geral, os animais foram con¬tinuamente expostos a concentrações quantificáveis de anti-EGFR durante um intervalo de dosagem.

As relações entre áreas sob as curvas de concentração de anti- EGFR no soro-tempo (AUC^s) e nível de dose no Dia 1 são apresentadas abaixo.

A taxa e a extensão de exposição sistêmica de macacos a anti-EGFR, caracterizada por AUC168, aumentaram aproximadamente proporcio¬nalmente com dose maior na faixa de dose de 1,5 a 4,5 mg/kg/ocasião, mas mais do que o aumento de dose proporcional na faixa de dose de 4,5 a 12 mg/kg/ocasião no Dia 1. Na dose mais alta (12 mg/kg/ocasião) a AUCies era cerca de 2,8 vezes maior do que o previsto por uma relação linear (Figura 20).

A extensão (AUCies) de exposição sistêmica de macacos fê¬meas a anti-EGFR era geralmente similar à exposição em macacos machos.

Após doses intravenosas repetidas, as concentrações no soro de pré-dose de anti-EGFR foram geralmente maiores do que aqueles valo¬res após uma dose única (Figuras 21-22) e indicaram acúmulo de anti-EGFR em soro durante todo o periodo do estudo. Este acúmulo foi geralmente me¬nor em fêmeas do que em machos, exceto no nível de dose mais alto. As razões de concentrações no canal (pré-dose) seguindo a última dose no Dia 22 (672 horas pós-dose Dia 1) para a concentração de canal seguindo a primeira dose no Dia 1 são representadas na Tabela 26 abaixo:

As constantes de taxa terminal (k), e meias-vidas corresponden-

tes terminais (ti/2), de anti-EGFR no Dia 1 são apresentadas na Tabela 30. A meia-vida terminal não podia ser estimada adequadamente para todos os animais, mas onde ela podia ser estimada estava na faixa de 32,5 a 63,1 horas e parecia aumentar com dose em animais machos. Liberação do soro total de anti-EGFR parecia ser independente de dose na faixa de 1,5 - 4,5 mg/kg/ocasião mas foi reduzida no nível de dose mais alto em macacos ma¬chos e fêmeas.

Concluindo, a extensão de exposição sistêmica de macacos ci¬nomólogos a anti-EGFR pareceu ser caracterizada por cinética não-linear (dependente da dose) na faixa de dose de 1,5 a 12 mg/kg/ocasião no Dia 1 do estudo de toxidez intravenosa. Aumento da dose de anti-EGFR acima de 4,5 mg/kg/ocasião é provável de resultar em uma exposição sistêmica maior do que seria previsto de uma relação linear, que está de acordo com a pos-sibilidade de um processo limitado em capacidade para a eliminação de anti- EGFR.

Ainda, 0 estudo também proveu evidência de que em geral não houve quaisquer diferenças na exposição sistêmica de macacos machos e fêmeas a anti-EGFR e que não houve nenhum acúmulo após administração intravenosa repetida.

Química de Sangue e Hematologia

Amostras de sangue foram tomadas da veia femoral de macacos cinomólogos gue tinham sido administrados com uma injeção de bolo intra- venosa de anti-EGFR GlycoMAB nos dias 1,8, 15 e 22. Amostras foram ob¬tidas do membro não usado para administração de dose, seguindo privação da noite para o dia de alimento (não falecidos). As amostras foram examina¬das no pré-tratamento, três dias após a segunda dose e no término dos pa¬râmetros que seguem, usando heparina de lítio como anticoagulante:

• Fosfatase alcalina
• Alanino amino-transferase
• Aspartato amino-transferase
• Bilirrubina - total
• Ureia
• Creatinina
• Glicose
• Colesterol - total
• Triglicerideos Sódio Potássio Cloro Cálcio Fósforo
• Proteína total
• Eletroforetograma de proteína
• Razão de albumina/globulina
• Dados de análise de química de sangue de macaco cinomólogo
• normal médio são apresentados na Tabela 31.

Amostras para análise de sangue periférico, hematológica, foram obtidas da veia femoral de macaco cinomólogo que tinha sido administrado com uma injeção de bolo intravenosa de anti-EGFR GlycoMAB nos dias 1, 8, 15 e 22. Amostras foram tomadas do membro não usado para administração de dose, seguindo privação da noite para o dia de alimento (não falecidos). Amostras foram examinadas no pré-tratamento, três dias após a segunda dose e no término quanto aos parâmetros que seguem:

1. 1) Usando EDTA como anticoagulante -
2. Concentração de Hematócrito/Hemoglobina
3. Contagem de eritrócito
4. Reticulócitos
5. Hemoglobina de célula média
6. Concentração de hemoglobina de célula média
7. Volume de célula média
8. Contagem de leucócito total
9. Contagem de leucócito diferencial
10. Contagem de plaqueta
11. Anormalidades de morfologia do sangue
12. Anisocitose
13. Microcitose
14. Macrocitose
15. Hipocromasia
16. Hipercromasia
17. 2) Usando citrato como anticoagulante -
18. Tempo de pró-trombina
19. Tempo de tromboplastina parcial ativada.
20. Dados de análise de hematologia de macaco cinomólogo normais médios são apresentados na Tabela 32.

Os Valores Individuais Cumulativos de Bioquímica para macacos são apresentados nas Tabelas 33a-h, abaixo:

Patologia Microscópica - Constatações relacionadas a tratamento

Pericolangite (inflamação de tecido conectivo em torno do duto da bile) foi relatada no macaco fêmea dosado em 12 mg/kg/dia, mas não em

quaisquer outros macacos fêmeas ou machos. Esta constatação pode ser relacionada a tratamento com Glyco-mAb (Anti-EGFR), mas com tais núme¬ros pequenos de animais a significância é incerta. Todas as outras constata¬ções foram consideradas ser incidentais e de nenhuma significância toxico- lógica.

Macropatoloqia e Histopatoloqia

O sumário de histopatologia para todos os animais testados é mostrado na Tabela 35 abaixo:

Conclusões

Não houve nenhum efeito de tratamento nos sítios de injeção e quaisquer constatações clínicas consideradas estar relacionadas com trata¬mento com Glyco-mAb (anti-EGFR). Mudanças no peso do corpo estavam dentro de faixas esperadas normais. Não houve quaisquer constatações consideradas estar relacionadas com tratamento no exame macroscópico e pesos de órgão de animais estavam dentro de faixas esperadas normais. Concluindo, tratamento em 1,5, 4,5 ou 12 mg/kg foi bem tolerado sem quais¬quer constatações claras de toxidez sistêmica.

EGFR não é um alvo específico de tumor, uma vez que ele está presente na superfície de vários tecidos normais incluindo fígado, rim e pele. Anticorpos anti-EGFR com região Fc de IgG humano foram previamente administrados a seres humanos e mostraram um perfil de efeito colateral tolerável (Vanhoefer, U. e outros, Clin. Oncol.2004 Jan 1 ;22(1): 175-84; Ne¬edle M.N., Semin Oncol. 2002 Oct;29 (5 Supl.14):55-60). Claramente, have- ria preocupações significantes para administração a um humano ou outro mamífero de um anticorpo anti-EGFR com ADCC significantemente aumen¬tada, devido à atividade de morte aumentada que poderia ser mostrada con¬tra tecidos normais críticos tal como fígado, rim e pele. Surpreendentemente, os presentes inventores constataram que administração de tal anticorpo anti- EGFR, Fc engenheirada conforme acima descrito e com atividade de ADCC até 100 vezes aumentada, in vivo a mamífero não levou a toxidezes signifi¬cantes. As concentrações de anticorpo foram mantidas acima de 1 micro- grama por mililitro por pelo menos 4 semanas (e acima de 10 microgramas por mililitro para alguns animais). Tais níveis de exposição são típicos para terapia de anticorpo. ADCC máxima para o anticorpo deste estudo já é atin¬gida em concentrações de 1 micrograma por mililitro. Administrações de do¬se únicas de doses de 40 e 100 mg de anticorpo anti-EGFR (o anticorpo I- CR62 de rato de origem) a paciente de câncer humanos mostraram direcio¬namento específico de tumores in vivo (Modjtahedi, H. e outros, Br J Cancer. 1996 Jan;73(2):228-35.). Células efetoras de macaco cinomólogo têm recep¬tor FcgamaRIII altamente homólogo e foram mostradas mediar a ADCC au- mentada com anticorpos com Fc engenheirada (e com anticorpos glicoenge- nheirados para níveis aumentados de oligossacarídeos não-fucosilados na região Fc). O nível de aumento de ADCC é muito similar àquele observado com células efetoras de ser humano (PBMCs).

Resumindo, foi constatado que anticorpos anti-EGFR com Fc engenheirada para afinidade de ligação de Fc-FcgamaRIII aumentada e para ADCC aumentada podem ser administrados a mamíferos para dar concen¬trações acima de 1 micrograma de anticorpo por mililitro de soro por um pe¬ríodo de pelo menos 4 semanas a fim de dar exposições de fármaco nor¬malmente associadas com acúmulo significante de anticorpo em células-alvo in vivo, sem levar à toxidez significante.

Toxidez de uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode ser medida e/ou determinada usando qualquer um dos méto¬dos e/ou parâmetros (por exemplo, valores de química no sangue, indicado¬res histopatológicos, etc.) descritos acima, ou através de quaisquer meios conhecidos daqueles de habilidade na técnica. Um nível clinicamente signifi¬cante de toxidez é compreendido por uma pessoa de habilidade na técnica ser um nível que excede níveis geralmente aceitos pela U.S. Food and Drug Administrationpara anticorpos administrados clinicamente.

EXEMPLO 5

Modificações nas CDRs de Cadeia Leve: Determinação de Resíduos de De-terminação de Especificidade

Usando métodos descritos acima, variantes de região variável de cadeia leve de anti-EGFR foram geradas a partir do construto de região variável de cadeia leve l-KC (SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:45), onde a se¬quência codificando o resíduo de aminoácido em várias posições nas CDRs de ICR62 de rato foi substituída com o resíduo de aminoácido corresponden¬te de uma sequência de gene variável de linhagem germinativa humana. Isto permitiu a identificação de resíduos de determinação de especificidade, que, conforme discutido acima, são resíduos que interagem com antígeno e para os quais modificações podem ter um efeito sobre afinidade de ligação. A Ta¬bela 38 mostra as substituições que foram feitas dentro das CDRs do cons-

truto de região variável de cadeia leve l-KC (SEQ ID NO:45):

identificadas de acordo com nomenclatura padrão (por exemplo, "N30R" significa que o resíduo asparagina (N) na posição 30 da SEQ ID NO:45 é

substituído com um resíduo arginina (R)). A numeração da SEQ ID NO:45 corresponde à numeração Kabat para essas substituições.

Todos os resíduos substituídos identificados acima foram deri¬vados da sequência aceptora VK1_6 humana exceto pela troca de Y32W, onde o W de uma sequência de linhagem germinativa humana relacionada 10 substituiu Y na posição 32 na SEQ ID NO:45.

Cada um dos construtos de variante l-KC (I-KC1 a I-KC9) foi emparelhado com uma região variável de cadeia pesada compreendendo construto l-HHD (SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:15) e um ensaio de ligação realizado de acordo com os métodos descritos nos exemplos anteriores. Os 15 construtos I-KC1 e I-KC9 foram comparados com o construto l-KC (SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:45) quanto à afinidade de ligação a EGFR em células- alvo A431 (Figura 29 e Figura 30). Como visto na Figura 29, a modificação do resíduo 34 em sua sequência humana correspondente (N34G) resultou em uma leve diminuição em afinidade de ligação (valor de EC50 aumentou em um fator de 10). Conforme mostrado na Figura 30, a modificação de re¬síduo 50 em um resíduo humano (N50T) também resultou em uma leve di¬minuição em afinidade de ligação. Então, esses dados indicam que N34 e N50 dos construtos de cadeia leve anti-EGFR l-KC são resíduos de determi¬nação de especificidade que estão envolvidos em ligação de antígeno. To¬dos os outros construtos retiveram atividade de ligação comparável com os construto l-KC (SEQ ID NO:45) (Figuras 29 e 30).

Com base nesses dados, para enxerto de alça de CDR do pro¬cesso de humanização, apenas certas partes das CDRs são requeridas. Por exemplo, para CDR1 do construto l-KC, posições 24 a 27 e 29 a 33 não têm que ser enxertadas do doador (por exemplo, ICR62). Na CDR3, o resíduo F94 é a única diferença entre o anticorpo ICR62 de rato e a contraparte de linhagem germinativa humana mais próximo (VK1_6) e sua mudança para um resíduo humano é tolerada com relação à manutenção da afinidade de ligação. Então, ao escolher a VH aceptora e a sequência J apropriados, a CDR3 pode ser tornada completamente humana (por exemplo, nenhum en¬xerto de alça necessário para CDR3).

Então, esses dados indicam que, quando emparelhada com um construto de cadeia pesada quimérico (por exemplo, humanizado) específico para EGFR, a cadeia leve pode ser totalmente humana (por exemplo, de uma sequência de gene V de cadeia leve humana) e ainda reter ligação es¬pecífica para EGFR, embora afinidade de ligação ligeiramente reduzida comparado com cadeias leves onde os resíduos de determinação de especi¬ficidade do doador são mantidos.

EXEMPLO 6

Modificações nas CDRs de Cadeia Pesada: Determinação de Resíduos de Determinação de Especificidade

Usando métodos descritos acima, variantes de região variável de cadeia pesada anti-EGFR foram geradas a partir do construto de região variável de cadeia leve l-HHD (SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:15), onde a se-

quência codificando o resíduo de aminoácido em várias posições nas CDRs de ICR62 de rato foi substituída com um resíduo de aminoácido da posição Kabat correspondente em uma sequência de gene variável de linhagem germinativa humana (por exemplo, VH110, IGHV5_51). A Tabela 39 mostra 5 as substituições que foram feitas dentro das CDRs do construto de região variável de cadeia pesada l-HHD (SEQ ID NO: 15).

nais nas CDRs. A numeração na Tabela 39 refere-se à numeração Kabat. A posição correspondente na SEQ ID NO:15 pode ser prontamente determina¬da por uma pessoa de habilidade comum na técnica e é indicada acima.

** Identificada de acordo com nomenclatura padrão (por exemplo, "F27G" significa que o resíduo Fenilalanina (F) na posição Kabat 27 de l-HHD-1 (po¬sição 27 da SEQ ID NO: 15) é substituído com resíduo glicina (G)).

Cada um dos construtos de variante l-HHD (l-HHD-1 a l-HHD- 11) foi emparelhado com uma região variável de cadeia leve compreenden¬do construto l-KC (SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:45) e um ensaio de ligação realizado de acordo com os métodos descritos nos exemplos anteriores. Os construtos l-HHD-1 a l-HHD-11 foram comparados com o construto l-KC (SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:45) quanto à afinidade de ligação para EGFR em células-alvo A431 (Figuras 31 e 32). Conforme visto nas Figuras 31 e 32, substituições de resíduos nas posições 27 (F27G) (construto l-HHD-1) e 28 (T28S) (construto l-HHD-2) da CDR1 Chothia e posição 31 (D31E) (constru- to l-HHD-4) de CDR1 de Kabat não mostraram uma influência sobre ligação de antígeno (isto é, ligação de antígeno foi retida comparado com o constru- to de origem l-HHD). Da mesma maneira, substituições de resíduos nas po¬sições 52a (P52aA) (construto l-HHD-6), 53 (N53I) (construto l-HHD-7) e 57 (S57A) (construto l-HHD-9) da CDR2 de Kabat, e substituição do residuo na posição 102 de CDR3 de Kabat (A102V) (construto l-HHD-11) não mostra¬ram uma influência sobre ligação de antígeno.

Como visto na Figura 31, modificação de resíduo 29 de CDR1 de Chothia 29 em um resíduo humano correspondente (F29I) (construto I- HHD-3) e modificação de resíduo 52 de CDR2 de Kabat para um resíduo humano correspondente (N52T) (construto l-HHD-5) resultaram, cada uma, em uma diminuição modesta na afinidade de ligação comparado com o construto de origem l-HHD (valor EC50 aumentou em um fator de 2-3).

Conforme visto na Figura 32, modificação de resíduo 56 de C- DR2 de Kabat em um residuo humano correspondente (Y56T) (construto I- HHD-8) e modificação do resíduo de 100b em CDR3 de Kabat em um resí¬duo humano correspondente (V100bG) mostraram, cada uma, uma diminui¬ção significante na afinidade de ligação de antígeno comparado com o cons¬truto de origem l-HHD (valor EC aumentou em um valor de 10).

Então, esses dados indicam que F29 e N52 do construto de ca¬deia pesada l-HHD anti-EGFR são residuos de determinação de especifici- 5 dade que têm uma influência modesta sobre ligação de antígeno. Esses da¬dos também indicam que Y56 e V100b do construto de cadeia pesada anti- EGFR l-HHD são resíduos de determinação de especificidade que têm uma influência significante sobre ligação de antígeno.

Todas as publicações tal como livros, artigos de jornal, lança- 10 mentos de GenBank ou outros bancos de dados de sequência, pedidos pu¬blicados e pedidos de patente mencionados no relatório são aqui incorpora¬dos a título de referência até o mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indica¬do ser incorporado a título de referência.

Claims (8)

1. Método de produção de uma molécula de ligação ao antígeno que é capaz de competir com o anticorpo monoclonal ICR62 de rato para ligação ao receptor do fator de crescimento epidérmico humano (EGFR), caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) cultura de uma célula hospedeira em um meio sob condições que permitem a expressão do primeiro polipeptideo e do segundo polipepti¬deo da célula hospedeira, em que o dito primeiro polipeptideo é um domínio variável de cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em: SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136 e SEQ ID NO:138 que é parte da dita molécula de ligação ao antígeno, e o dito segundo polipeptideo é um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo consistindo em: SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:139, SEQ ID NQ:140, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146 e SEQ ID NO:147 que é parte da dita molécula de ligação ao antígeno; e

   (b) recuperação da dita molécula de ligação de antígeno.
2. Molécula de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao EGFR, caracterizada pelo fato de que apresenta: um domínio variável de cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em: NO: 128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136 e SEQ ID NO:138; e um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo consistindo em: SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:139, SEQ ID NQ:140, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146 e SEQ ID NO:147,

   em que a molécula de ligação ao antígeno apresenta uma região Fc humana e pelo menos 50% dos oligossacarídeos na região Fc são não- fucosilados.
3. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindica¬ção 2, caracterizada pelo fato de que é um anticorpo.
4. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ligação ao antígeno como definida na reivindicação 2 ou 3, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. Uso da molécula de ligação de antígeno como definida na rei-vindicação 2 ou 3, ou da composição como definida na reivindicação 4, ca¬racterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o 5 tratamento de uma desordem tratável por bloqueio da sinalização celular mediada por EGFR.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita desordem é uma desordem de proliferação celular.
7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato 10 de que a dita desordem de proliferação celular é câncer.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de ma¬ma, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de 15 próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.

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