CN101535343A - 结合egfr的抗原结合分子，编码其的载体，及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在特定的实施方案中，本发明涉及重组单克隆抗体，包括特异于人EGFR的嵌合的、灵长类化或人源化的抗体。此外，本发明涉及编码这些ABMs的核酸分子，和包括这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的ABMs的方法，并且涉及使用这些ABMs治疗疾病的方法。此外，本发明涉及具有修饰的糖基化的ABMs，所述具有修饰的糖基化的ABMs具有改善的治疗性质，其包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。

Description

结合EGFR的抗原结合分子，编码其的载体，及其应用
发明背景
发明领域
[0001]本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在具体的实施方案中，本发明涉及重组单克隆抗体，包括特异于人表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合的、灵长类化(primatized)或人源化的抗体。此外，本发明涉及编码这些ABMs的核酸分子，和包括这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及产生本发明的ABMs的方法，和将这些ABMs用在治疗疾病中的方法。此外，本发明涉及具有修饰的糖基化作用ABMs，所述具有修饰的糖基化作用ABMs具有改善的治疗特性的，其包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
背景技术
EGFR和抗-EGFR抗体
[0002]人表皮生长因子受体(也已知为HER-1或Erb-B1，并且在本文中称作＂EGFR＂)是170kDa的跨膜受体，其由c-erbB原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73：228-235(1996)；Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。SwissProt数据库登录号P00533提供了EGFR的序列。还存在EGFR的同种型和变体(例如，可变RNA转录物，截短形式，多态性等)，包括但不限于Swissprot数据库登录号P00533-1，P00533-2，P00533-3，和P00533-4确定的那些。已知EGFR结合包括以下各项的配体：表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGf-α)，双调蛋白，肝素结合EGF(hb-EGF)，β动物纤维素，和epiregulin(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002)；Mendelsohn和Baselga，致癌基因(Oncogene)19：6550-6565(2000))。EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径(Atalay等，肿瘤学年刊(Ann.Oncology)14：1346-1363(2003)；Tsao和Herbst，信号(Signal)4：4-9(2003)；Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002)；Modjtahedi等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73：228-235(1996))。
[0003]EGFR的过表达已经在许多人类恶性病症中报道，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌。(Atalay等，肿瘤学年刊(Ann.Oncology)14：1346-1363(2003)；Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002)Modjtahedi等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73：228-235(1996))。在许多这些病症中，EGFR的过表达与患者的差的预后相关或关联。(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002)Modjtahedi等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73：228-235(1996))。EGFR也在正常组织的细胞中表达，特别是皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织，尽管通常以比在恶性细胞中低的水平表达(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。
[0004]未缀合的单克隆抗体(mAbs)可以是有效用于治疗癌症的药，如由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)所批准的下列药物所证明：用于治疗晚期乳腺癌的曲妥单抗(HerceptinTM；GenentechInc，)(Grillo-Lopez，A.-J.，等，肿瘤学研究会(Semin.Oncol.)26：66-73(1999)；Goldenberg，M.M.，临床治疗(Clin.Ther.)21：309-18(1999))，用于治疗CD20阳性B细胞，低级或滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔单抗(RituxanTM；IDEC制药(IDEC Pharmaceuticals)，圣地亚哥，CA，和Genentech Inc.，旧金山，CA)，用于治疗复发性急性骨髓白血病的吉姆单抗(MylotargTM，Celltech/Wyeth-Ayerst)，和用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的阿仑单抗(CAMPATHTM，Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)。这些产品的成功不仅依赖于它们的功效，还依赖于它们突出的安全模式(Grillo-Lopez，A.-J.，等，肿瘤学研究会(Semin.Oncol.)26：66-73(1999)；Goldenberg，M.M.，临床治疗(Clin.Ther.)21：309-18(1999))。尽管在这些药物上所取得的成就，目前在获得更高特异性抗体活性方面存在巨大的兴趣，所述特异性活性比典型地由未缀合的mAb疗法所提供的要高。
[0005]许多研究的结果显示Fc-受体依赖性机制相当大地有利于对针对肿瘤的细胞毒性抗体的作用，并且指示针对肿瘤的最佳抗体将优先结合激活Fc受体，并且与抑制性配偶体FcγRIIB结合程度最小。(Clynes，R.A.，等，自然医学(Nature Medicine)6(4)：443-446(2000)；Kalergis，A.M.，和Ravetch，J.V.，实验医学杂志(J.Exp.Med.)195(12)：1653-1659(2002年6月)。例如，至少一项研究的结果显示FcγRIIIa受体中的多态性特别地与抗体疗法的功效紧密相关(Cartron，G.，等，血液(Blood)99(3)：754-757(2002年2月))。该研究显示对于FcγRIIIa是纯合的患者，与对于FcγRIIIa是杂合的患者相比，具有更好的针对利妥昔单抗的应答。作者得出结论为更优的应答是由于抗体与FcγRIIIa的更好的体内结合，其导致了针对淋巴瘤细胞的更好的ADCC活性(Cartron，G.，等，血液(Blood)99(3)：754-757(2002年2月))。
[0006]已经报道了靶向EGFR和阻断EGFR信号传导途径的各种策略。小分子酪氨酸激酶抑制剂如gefitinib，erlotinib和CI-1033在胞内酪氨酸激酶区域内阻断EGFR的自磷酸化，由此抑制下游信号传导事件(Tsao和Herbst，信号(Signal)4：4-9(2003))。另一方面，单克隆抗体，靶向EGFR的胞外部分，这导致阻断配体结合并由此抑制下游事件如细胞增殖(Tsao和Herbst，信号(Signal)4：4-9(2003))。
[0007]已经产生了几种鼠单克隆抗体，其在体外获得这种阻断并且已经在小鼠异种移植模型中评估它们影响肿瘤生长的能力(Masui，等，癌症研究(Cancer Res.)46：5592-5598(1986)；Masui，等，癌症研究(Cancer Res.)44：1002-1007(1984)；Goldstein，等，癌症研究(Cancer Res.)1：1311-1318(1995))。例如，EMD 55900(EMD Pharmaceuticals)是针对人表皮样癌细胞系A431产生的鼠抗-EGFR单克隆抗体，并且在喉或下咽部晚期鳞状细胞癌患者的临床研究中检验(Bier等，欧洲耳鼻喉学纪录(Eur.Arch.Otohinolaryngol.)252：433-9(1995))。另外，结合EGFR胞外结构域的大鼠单克隆抗体ICR16，ICR62，和ICR80已经显示有效抑制EGF和TGF-α受体的结合(Modjtahedi等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)75：310-316(1998))。鼠单克隆抗体425是另一种针对人A431癌细胞系产生的Mab，并且发现与在人表皮生长因子受体的外部结构域上的多肽表位结合。(Murthy等，生物化学和生物物理纪录(Arch.Biochem.Biophys.)252(2)：549-560(1987)。在治疗性治疗中使用鼠抗体的潜在问题是非人单克隆抗体可以被人宿主识别为外源蛋白；因此，重复注射这些外源抗体可导致诱导免疫反应，导致有害的超敏反应。对于基于鼠的单克隆抗体，这经常被称为人抗小鼠抗体应答，或＂HAMA＂应答，或人抗大鼠抗体，或＂HARA＂应答。此外，这些“异源”抗体可以被宿主的免疫系统所攻击从而使它们，在达到它们的靶位点前被有效地中和。另外，非人单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)典型地缺乏人效应子功能度，即它们不能，特别是通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性的裂解或溶解人靶标细胞。
[0008]已经开发了嵌合抗体作为“缀合”抗体的替换物，所述嵌合抗体包含来自两种或多种不同物种(例如，小鼠和人类)的抗体的部分。例如美国专利No.5,891,996(Mateo de Acosta del Rio等)讨论了小鼠/人嵌合抗体，R3，其针对EGFR，并且美国专利No.5,558,864讨论了产生嵌合和人源化形式的鼠抗-EGFR MAb 425。此外，IMC-C225(Erbitux
Figure A200780037124D0011085347QIETU
；ImClone)是嵌合小鼠/人抗-EGFR单克隆抗体(基于小鼠M225单克隆抗体，其在人临床试验中导致HAMA应答)，已经报道其在各种人异种移植模型中显示除抗肿瘤功效。(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。IMC-C225的功效已经归因于几个机制，包括抑制通过EGFR信号传导途径调节的细胞事件，和可能通过增加的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)活性(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。IMC-C225也用于临床试验中，包括与放射疗法和化学疗法联合(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。最近，Abgenix，公司(Fremont，CA)开发了用于癌症治疗的ABX-EGF。ABX-EGF是一种完全人的抗-EGFR单克隆抗体。(Yang等，肿瘤学/血液学评论综述(Crit.Rev.Oncol./Hematol.)38：17-23(2001))。
抗体糖基化
[0009]寡糖成分可以显著地影响与治疗性糖蛋白的功效有关的性质，包括物理稳定性，对蛋白酶攻击的抗性，与免疫系统的相互作用，药物代谢动力学，和特异性生物活性。这些性质可以不仅依赖于寡糖的存在或缺乏，还依赖于寡糖的特定结构。可以在寡糖结构和糖蛋白功能之间进行一些总结。例如，某些寡糖结构通过与特异性糖结合蛋白相互作用介导糖蛋白从血流中快速清除，而其它的可以被抗体结合并且触发不需要的免疫反应。(Jenkins等，Nature Biotechnol.14：975-81(1996))。
[0010]哺乳动物细胞是用于产生治疗性糖蛋白的优选宿主，由于它们具有以对于人应用的最相容的形式使蛋白质糖基化的能力。(Cumming等，糖生物学(Glycobiology)1：115-30(1991)；Jenkins等，自然生物技术(NatrreBiotechnol.)14：975-81(1996))。细菌极少使蛋白质糖基化，并且类似的其它类型的常见宿主，诸如酵母，丝状真菌，昆虫和植物细胞，产生糖基化模式，所述糖基化模式与从血流中快速清除、不理想的免疫相互作用有关，并且在一些特别的情形中，减少生物学活性。在哺乳动物细胞中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是过去的20年间最常用的细胞。除了给出适合的糖基化模式之外，这些细胞容许持续的产生遗传稳定的、高生产性的克隆细胞系。使用无血清培养基，它们可以在简单生物反应器中被培养到高密度，并且容许开发安全和可再现的生物工艺。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞，NS0-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。最近，还已经测试了来自转基因动物的生产。(Jenkins等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14：975-81(1996))。
[0011]所有的抗体在重链恒定区的保守位置包含糖结构，其中每种同种型都具有N-联的糖结构的独特阵列，其可变地影响蛋白质组装，分泌或功能活性。(Wright，A.，和Morrison，S.L，生物技术趋势(Trends Biotech.)15：26-32(1997))。连接的N-联糖的结构取决于加工的程度而相当大地变化，并且可以包括高-甘露糖，多支链以及双触角的复合物寡糖。(Wright，A.，和Morrison，S.L，生物技术趋势(TrendsBiotech.)15：26-32(1997))。典型地，存在在特定糖基化位点连接的核心寡糖结构的不均匀加工从而使均一的单克隆抗体作为多种糖形存在。类似地，已经显示在抗体糖基化中的主要不同发生在不同细胞系之间，并且甚至在不同培养条件下，观察到对于给定细胞系的微小差异。(Lifely，M.R.等，糖生物学(Glycobiology)5(8)：813-22(1995))。
[0012]获得潜能的大的增加，同时维持简单的生产过程并潜在地避免明显的、不理想的副作用的一种方式是通过改造它们的寡糖成分增加单克隆抗体的天然的、细胞介导的效应子功能，如在,P等，自然生物技术(Natrre Biotechnol.)17：176-180(1999)和美国专利号6,602,684中所述，将它们全部内容并入作为参考。IgG1型抗体，在癌症的免疫疗法中最常用的抗体是在每个CH2结构域的Asn297具有保守的N-联糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)是必要的(Lifely，M.R.，等，糖生物学(Glycobiology)5：813-822(1995)；Jefferis，R.，等，免疫学综述(ImmunolRev.)163：59-76(1998)；Wright，A.和Morrison，S.L.，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)15：26-32(1997))。
[0013]等先前显示，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)，一种催化分叉(bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了由改造的CHO细胞产生的抗-成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(见，P等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17：176-180(1999)；和国际公开号WO 99/54342，将其全部内容并入作为参考)。抗体chCE7属于未缀合的mAbs的大类，其具有高肿瘤亲和性和特异性，但是当在缺乏GnTIII酶的标准工业化细胞系中生产时，效力过低而无法进行临床应用(Umana，P，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17：176-180(1999))。该研究首先显示ADCC活性的大量增加可以通过将产生抗体的细胞改造为表达GnTIII而获得，其也导致了恒定区(Fc)-关联的、分叉的寡糖的比例增加到在天然存在的抗体中发现的水平以上，所述寡糖包括分叉的、非岩藻糖基化的寡糖。
[0014]仍旧存在对于靶向EGFR的增强的治疗方法，以治疗灵长类动物的细胞增殖病症的需要，所述灵长类动物包括，但不限于，人，其中所述病症其特征在于EGFR表达，特别是异常表达(例如，过表达)，包括但不限于膀胱癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，和肾癌。具体地，保持着使向人受试者施用的抗原结合分子中的非人残基数目最小化的需求。
发明概述
[0015]认识到抗原结合分子(ABMs)的巨大治疗潜能，本发明人开发了生产这些ABMs的方法，所述ABMs具有大鼠ICR62抗体的结合特异性(例如，结合相同表位)，并且已经进行了糖基改造(glycoengineered)以增加Fc受体结合亲和性和效应子功能。特别地，该方法包括产生重组的、嵌合抗体或其嵌合片段。这些ABMs的功效还通过改变抗体Fc区域的糖基化模式而增加。
[0016]因此，在一方面，本发明涉及抗原结合分子(ABM)，其包括：大鼠ICR62单克隆抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的一个或多个特异性决定残基(SDR)，和源自异源多肽的序列，其中所述ABM特异地结合EGFR。在具体实施方案中，所述ABM不包括选自由下列各项组的组中的序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：49，SEQID NO：51，和SEQ ID NO：121。
[0017]在一个实施方案中，所述一个或多个SDR位于一个或多个重链CDR中。在具体的实施方案中，所述一个或多个重链SDR选自由下列各项组成的组：位于Kabat位置29处的苯丙氨酸、位于Kabat位置52处的天冬酰胺、位于Kabat位置56处的酪氨酸、和位于Kabat位置100b处的缬氨酸。在另一个具体的实施方案中，所述一个或多个重链SDR包括位于Kabat位置56处的酪氨酸和位于Kabat位置100b处的缬氨酸。在另一个具体的实施方案中，所述一个或多个重链SDR是位于Kabat位置29处的苯丙氨酸、位于Kabat位置52处的天冬酰胺、位于Kabat位置56处的酪氨酸、和位于Kabat位置100b处的缬氨酸。
[0018]在一个实施方案中，所述一个或多个SDR位于一个或多个轻链CDR中。在具体的实施方案中，所述一个或多个轻链SDR包括位于Kabat位置50处的天冬酰胺。在另一个具体的实施方案中，所述一个或多个轻链SDR包括位于Kabat位置34处的天冬酰胺和位于Kabat位置50处的天冬酰胺。
[0019]在另一方面，本发明涉及ABM，其包括大鼠ICR62抗体的至少两个CDR，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含所述CDR的SDR。在一个实施方案中，所述ABM包括大鼠ICR62抗体的至少3个CDR，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含所述CDR的SDR。在另一个实施方案中，所述ABM包括大鼠ICR62抗体的至少4个CDR，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含所述CDR的SDR。在另一个实施方案中，所述ABM包括大鼠ICR62抗体的至少5个CDR，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含所述CDR的SDR。在另一个实施方案中，所述ABM包括大鼠ICR62抗体的至少6个CDR，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含所述CDR的SDR。在再一个实施方案中，大鼠ICR62抗体的CDR包括位于一个或多个氨基酸位置处的替换，且其中所述ABM与未替换的ABM相比，保持结合活性。在再一个实施方案中，大鼠ICR62抗体的CDR包括位于除特异性决定残基以外任一位置处的替换。在再一个实施方案中，大鼠ICR62抗体的CDR包括位于除特异性决定残基以外所有位置处的替换。在具体的实施方案中，所述CDR包括位于Chothia重链CDR1的Kabat位置27、28、或29，Kabat重链CDR1的位置31，Kabat重链CDR2的Kabat位置52、52a、53、或57，或Kabat重链CDR3的Kabat位置102中一处或多处的替换。在另一个具体的实施方案中，所述CDR包括位于Kabat轻链CDR1的Kabat位置30或32，Kabat轻链CDR2的Kabat位置51、52、53、或56，或Kabat重链CDR3的Kabat位置94中一处或多处的替换。
[0020]另一方面，本发明涉及ABM，其中与未替换的ABM相比，关于结合的EC50浓度受到小于约10-约0.001倍的调节。在特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约10-约1倍的调节。在另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约10-约5倍的调节。另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约5-约0.1倍的调节。另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约5-约2倍的调节。另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约3-约1倍的调节。另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约2倍的调节。另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约1倍的调节。另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约0.1倍的调节。另一个特定实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约0.001倍的调节。在一些实施方案中，以上列出的调节作用包括EC50的增加。在其他实施方案中，所述调节作用包括EC50的减小。
[0021]另一方面，本发明涉及ABM，其包括多肽，所述多肽包括选自由下列各项组成的组中的序列：SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQID NO：130，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ IDNO：134，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ IDNO：138，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ IDNO：142，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：145，SEQ IDNO：146，和SEQ ID NO：147。
[0022]另一方面，本发明涉及编码免疫球蛋白重链可变区的分离的多肽，所述免疫球蛋白重链可变区包括大鼠ICR62单克隆抗体的修饰的重链CDR和源自一种或多种人种系可变区基因序列的重链构架区，其中所述修饰的重链CDR包括位于选自由下列各项组成的组的Kabat位置处的一个或多个氨基酸替换：27，28，29，30，31，32，33，34，35，52，52a，53，54，55，57，58，59，60，61，62，63，64，65，95，96，97，98，99，100，100a，101，102，和其任意组合，且其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。在特定的实施方案中，所述修饰的重链CDR包括位于Kabat位置27，28，29，31，52，53，54，58，和102处的一个或多个氨基酸替换。在另一个特定实施方案中，所述修饰的重链CDR包括位于Kabat位置27，28，31，53，54，和58处的一个或多个氨基酸替换。在另一个特定实施方案中，所述修饰的重链CDR包括位于Kabat和Chothia重链CDR中除SDR以外所有位置处的氨基酸替换。在另一个特定实施方案中，所述修饰的重链CDR包括位于Kabat和Chothia重链CDR中除Kabat位置29，52，56，和100b以外所有位置处的氨基酸替换。本发明还涉及编码所述分离的多肽的分离的多核苷酸。
[0023]另一方面，本发明涉及编码免疫球蛋白轻链可变区的分离的多肽，所述免疫球蛋白轻链可变区包括大鼠ICR62单克隆抗体的修饰的轻链CDR和源自一种或多种人种系可变区基因序列的轻链构架区，其中所述修饰的轻链CDR包括位于选自由下列各项组成的组的Kabat位置处的一个或多个氨基酸替换：24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，51，52，53，54，55，56，89，90，91，92，93，94，95，96，97，和其任意组合，且其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。在特定的实施方案中，所述修饰的轻链CDR包括位于Kabat和Chothia轻链CDR中除SDR以外所有位置处的氨基酸替换。在另一个特定实施方案中，所述修饰的轻链CDR包括位于Kabat和Chothia轻链CDR中除Kabat位置34和50以外所有位置处的氨基酸替换。本发明还涉及编码所述分离的多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包括所述分离的多肽的ABM。
[0024]另一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码包括选自由下列各项组成的组中的序列的多肽：SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQID NO：130，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ IDNO：134，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ IDNO：138，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ IDNO：142，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：145，SEQ IDNO：146，和SEQ ID NO：147，其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。另一方面，本发明涉及用所述多核苷酸，或包括所述多核苷酸的载体转染的宿主细胞。在一个实施方案中，所述载体是复制克隆载体。在另一个实施方案中，所述载体是表达载体。
[0025]另一方面，本发明涉及生成能够与大鼠ICR62单克隆抗体竞争结合人EGFR的抗原结合分子的方法，所述方法包括在容许一种或多种编码抗原结合分子的多核苷酸表达的条件下，在培养基中培养本发明的宿主细胞，和回收所述抗原结合分子。
[0026]另一方面，对本发明的ABM进行糖基改造，以使在Fc区域内具有改变的寡糖结构。在具体的实施方案中，当与相对应的非糖基改造ABM相比较时，所述Fc区域具有减少数量的岩藻糖残基。
[0027]另一方面，本发明涉及包括本发明的ABM和药用载体的组合物。另一方面，本发明涉及靶向受试者中表达EGFR的细胞的方法，其包括向所述受试者施用本发明的组合物。在具体的实施方案中，所述细胞过表达EGFR。在另一个具体的实施方案中，执行所述方法，从而在所述受试者中治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞-信号传导进行治疗的病症。在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的ABM用于制造治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞信号传导进行治疗的病症的药物。在一个实施方案中，所述病症是细胞增殖病症。在具体的实施方案中，所述细胞增殖病症是癌症。在更具体的实施方案中，所述癌症选自由下列各项组成的组：乳腺癌，膀胱癌，头颈癌，皮肤癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，和脑癌。
[0028]另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包括：(a)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：122，和SEQ ID NO：124；(b)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，SEQID NO：96，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：102，SEQ IDNO：104，SEQ ID NO：106，和SEQ ID NO：126；和(c)SEQ ID NO：108。另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包括(a)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：114；(b)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：118；和(c)SEQ ID NO：119。在一个实施方案中，这些多核苷酸的任何一个编码融合多肽。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多核苷酸排除在外。
[0029]在另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包括：选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID No：2；SEQ ID No：4；SEQ ID No：6；SEQ ID No：8；SEQ ID No：10；SEQ ID No：12；SEQ ID No：14；SEQ ID No：16；SEQ ID No：18；SEQ ID No：20；SEQ ID No：22；SEQ ID No：24；SEQ ID No：26；SEQ ID No：28；SEQ ID No：30；SEQ ID No32；SEQ ID No：34；SEQ ID No：36；SEQ ID No：38；SEQ ID No：40和SEQ ID NO：120。另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包括：选自由下列各项组成的组的序列：SEQ IDNo：44；SEQ ID No：46；SEQ ID No：50；和SEQ ID No.：52。在一个实施方案中，这些多核苷酸编码融合多肽。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多核苷酸排除在外。
[0030]本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其包括：与选自由下列各项组成的组的序列具有至少80％，85％，90％，95％，或99％相同性的序列：SEQ ID No：2；SEQ ID No：4；SEQ ID No：6；SEQ ID No：8；SEQ ID No：10；SEQ ID No：12；SEQ ID No：14；SEQ ID No：16；SEQ ID No：18；SEQ ID No：20；SEQ ID No：22；SEQ ID No：24；SEQ ID No：26；SEQ ID No：28；SEQ ID No：30；SEQ ID No 32；SEQ ID No：34；SEQ ID No：36；SEQ ID No：38；SEQ ID No：40和SEQ ID No：120，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。在另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包括：与选自由下列各项组成的组的序列具有至少80％相同性的序列：SEQ ID No：44；SEQ ID No：46；SEQ IDNo：50；和SEQ ID No.：52，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多核苷酸排除在外。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多核苷酸排除在外。
[0031]本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有SEQ ID No.：1的序列的嵌合多肽。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括编码具有SEQID No.：1的序列的多肽的序列；和来自除大鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有选自由下列各项组成的组的序列的嵌合多肽：SEQ ID No：3；SEQ ID No：5；SEQ ID No：7；SEQ ID No：9；SEQ ID No：11；SEQ ID No：13；SEQ ID No：15；SEQ ID No：17；SEQ ID No：19；SEQ ID No：21；SEQ ID No：23；SEQ ID No：25；SEQ ID No：27；SEQ ID No：29；SEQ ID No：31；SEQ ID No33；SEQ ID No：35；SEQ ID No：37；SEQ ID No：39；和SEQ IDNo：121。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括编码具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽的序列：SEQ ID No：3；SEQ ID No：5；SEQ ID No：7；SEQ ID No：9；SEQ ID No：11；SEQ ID No：13；SEQ ID No：15；SEQ ID No：17；SEQ ID No：19；SEQ ID No：21；SEQ ID No：23；SEQ ID No：25；SEQ ID No：27；SEQ ID No：29；SEQ ID No：31；SEQ ID No33；SEQ ID No：35；SEQ ID No：37；SEQ ID No：39；和SEQ ID No：121；和来自除大鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。另一方面，本发明将任何或全部这些编码所述多肽的分离的多核苷酸排除在外。
[0032]在还有的另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有SEQ ID No.：43的序列的嵌合多肽。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括编码具有SEQ ID No.：43的序列的多肽的序列；和来自除大鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。在还有的另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有选自由下列各项组成的组的序列的嵌合多肽：SEQ ID No：45；SEQ ID No：49；和SEQ ID No.：51。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括编码具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽的序列：SEQ ID No：45；SEQ ID No：49；和SEQ ID No.：51，和来自除大鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体轻链恒定区(CL)的序列的多肽，或其片段。另一方面，本发明将任何或全部这些编码所述多肽的分离的多核苷酸排除在外。
[0033]本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其包括：编码具有ICR62抗体的VH区域的多肽或其功能变体的序列，和来自除大鼠以外的物种的序列，该序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。另一方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包括：编码具有ICR62抗体的VL区域的多肽或其功能变体的序列，和来自除大鼠以外的物种的序列，该序列编码具有抗体CL区域的序列的多肽，或其片段。
[0034]本发明进一步涉及包括以上所述的任一分离的多核苷酸的表达载体，并且涉及包括这样的表达载体的宿主细胞。在另一方面，本发明涉及包含任一上述分离的多核苷酸的宿主细胞。
[0035]一方面，本发明涉及分离的多肽，其包括：(a)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：53SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：123，和SEQ IDNO：125；(b)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：75，SEQ IDNO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：103，SEQ IDNO：105，和SEQ ID NO：127；和(c)SEQ ID NO：107。其中所述多肽是融合多肽。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多肽排除在外。另一方面，本发明涉及分离的多肽，其包括(a)选自由下列各项组成的组的序列SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：113；(b)SEQ ID NO：115；和(c)SEQ IDNO：117，其中所述多肽是融合多肽。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多肽排除在外。
[0036]本发明还涉及嵌合多肽，其包含SEQ ID NO.：1或其变体的序列。本发明进一步涉及嵌合多肽，其包含SEQ ID NO.：43或其变体的序列。在一个实施方案中，任一这些多肽另外包括人Fc区域和/或人CL区域。本发明还涉及包括选自由下列各项组成的组的序列的嵌合多肽：SEQ IDNo：3；SEQ ID No：5；SEQ ID No：7；SEQ ID No：9；SEQ ID No：11；SEQ IDNo：13；SEQ ID No：15；SEQ ID No：17；SEQ ID No：19；SEQ ID No：21；SEQID No：23；SEQ ID No：25；SEQ ID No：27；SEQ ID No：29；SEQ ID No：31；SEQ ID No33；SEQ ID No：35；SEQ ID No：37；SEQ ID No：39；和SEQ IDNo：121，或其变体。本发明进一步涉及包括选自由下列各项组成的组的序列的嵌合多肽：SEQ ID No：45；SEQ ID No：49；和SEQ ID No.：51，或其变体。在一个实施方案中，任一这些多肽还包括人Fc区域和/或人CL区域。在一个实施方案中，人Fc区域包括IgG1。
[0037]另一方面，本发明涉及一种多肽，其包括来源于ICR62抗体的序列和来源于异源多肽的序列，并且涉及包括该多肽的抗原结合分子。在一个实施方案中，所述抗原结合分子是抗体。在一个优选实施方案中，抗体是嵌合的。在另一个优选实施方案中，抗体被人源化或灵长类化。
[0038]另一方面，本发明涉及ABM，其能够与大鼠ICR62抗体竞争结合EGFR，并且是嵌合的。在一个实施方案中，ABM是抗体或其片段。在另一个实施方案中，ABM是包括VH区域的重组抗体，所述VH区域具有选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO.：1；SEQ ID No：3；SEQ ID No：5；SEQ ID No：7；SEQ ID No：9；SEQ ID No：11；SEQ ID No：13；SEQ ID No：15；SEQ ID No：17；SEQ ID No：19；SEQ ID No：21；SEQ ID No：23；SEQ ID No：25；SEQ ID No：27；SEQ ID No：29；SEQ ID No：31；SEQ ID No33；SEQ ID No：35；SEQ ID No：37；SEQ ID No：39；和SEQ ID No：121。在另一个实施方案中，ABM是包括VL区域的重组抗体，所述VL区域具有选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：43，SEQ ID No：45；SEQ IDNo：49；和SEQ ID No.：51。在另一实施方案中，ABM是被灵长类化的重组抗体。在另一个实施方案中，ABM是人源化的重组抗体。在另一个实施方案中，ABM是包括人Fc区域的重组抗体。在另一个实施方案中，以上讨论的任何ABMs可以与诸如毒素或放射性标记的部分缀合。
[0039]本发明还涉及本发明的ABM，所述ABM具有修饰的寡糖。在一个实施方案中，与未修饰的寡糖相比，修饰的寡糖具有减少的岩藻糖基化。在其它的实施方案中，修饰的寡糖是杂合的或复合的。在另一个实施方案中，ABM在所述分子的Fc区域中具有增加比例的非岩藻糖基化的寡糖或分叉的非岩藻糖基化的寡糖。在一个实施方案中，所述分叉的、非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，该分叉的、非岩藻糖基化的寡糖是复合的。在一个实施方案中，在所述多肽的Fc区域中，寡糖的至少20％是非岩藻糖基化的或分叉的、非岩藻糖基化的。在更优选的实施方案中，寡糖的至少30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％或75％或更多是非岩藻糖基化的或分叉的、非岩藻糖基化的。
[0040]本发明还涉及编码上述讨论的ABMs的任一种的多核苷酸，并涉及包括这样的多核苷酸的表达载体和细胞。
[0041]本发明还涉及生产ABM的方法，所述ABM能够与大鼠ICR62抗体竞争结合EGFR，并且其中所述ABM是嵌合的；所述方法包括(a)在容许编码所述ABM的所述多核苷酸表达的条件下，在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明ABM的多核苷酸；和(b)从获得的培养物中回收所述ABM。
[0042]在另一个方面，本发明涉及包括本发明的ABM的药物组合物。考虑到该药物组合物还可以包含药用载体，辅剂或其组合。
[0043]另一方面，本发明涉及治疗其特征在于EGFR表达(例如EGFR的异常或过表达)的病症的方法。该方法包括将治疗有效量的本发明的ABM施用于受试者，优选哺乳动物受试者，并且更优选是需要其的人。在一个优选实施方案中，该疾病通过施用ABM来治疗，所述ABM是嵌合的(例如，人源化)抗体，或抗体的嵌合片段。在一个实施方案中，将ABM以约1.0mg/kg至约15.0mg/kg的量施用。在另一个实施方案中，将ABM以约1.5mg/kg至约12.0mg/kg的量施用。在另一个实施方案中，将ABM以约1.5mg/kg至约4.5mg/kg的量施用。在另一个实施方案中，将ABM以约4.5mg/kg至约12.0mg/kg的量施用。在另一个实施方案中，将ABM以约1.5，约4.5，和约12.0mg/kg的量施用。
[0044]在另一方面，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而以足以修饰由该宿主细胞产生的ABM的Fc区域中寡糖的量，表达编码具有GnTIII活性的多肽的至少一种核酸，其中所述ABM能够与大鼠ICR62抗体竞争结合EGFR，并且其中ABM是嵌合的。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。在另一个实施方案中，由宿主细胞产生的ABM是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段被人源化。在另一个实施方案中，该ABM包括与人IgG的Fc区域等价的区域。
[0045]本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其包括：大鼠ICR62抗体的至少一个(例如，一个，两个，三个，四个，五个，或六个)互补决定区，或至少包含所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。优选地，这些分离的多核苷酸编码作为抗原结合分子的融合多肽。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括大鼠ICR62抗体的三个互补决定区，或包括至少包含对每个所述三个互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式。在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码嵌合(例如，人源化)抗体的轻链或重链的整个可变区。本发明还涉及由这些多核苷酸编码的多肽。
[0046]在另一个实施方案中，本发明涉及抗原结合分子，其包括：大鼠ICR62抗体的至少一个(例如，一个，两个，三个，四个，五个，或六个)互补决定区，或至少包含所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式，并且包括来源于异源多肽的序列。在一个实施方案中，所述抗原结合分子包括大鼠ICR62抗体的三个互补决定区，或至少包含所述三个互补决定区的每一个的特异性决定残基的其变体或截短形式。另一方面，所述抗原结合分子包括抗体轻链或重链的可变区。在一个特别有用的实施方案中，所述抗原结合分子是嵌合的，例如人源化抗体。本发明还涉及制备该抗原结合分子的方法，及其在治疗疾病中的应用，所述疾病包括恶性肿瘤如膀胱癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，皮肤癌，和肾癌。
[0047]本发明的宿主细胞可以选自下组，其包括但不限于，HEK293-EBNA细胞，CHO细胞，BHK细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞还包括转染的多核苷酸，其包括：编码大鼠ICR62抗体的VL区域或其变体的多核苷酸，和编码等价于人免疫球蛋白的Fc区域的区域的序列。在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞还包括转染的多核苷酸，其包括：编码大鼠ICR62抗体的VH区域或其变体的多核苷酸，和编码等价于人免疫球蛋白的Fc区域的区域的序列。
[0048]在另一方面，本发明涉及生产ABM的宿主细胞，由于其寡糖修饰的结果，所述ABM显示增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。在一个实施方案中，所述增加的结合亲和性是针对Fc受体，特别是FcγRIIIA受体。这里考虑的效应子功能可以选自包括但不限于以下各项的组：增加的Fc-介导的细胞毒性；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡；增加的树突细胞成熟；和增加的T细胞初敏。
[0049]在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞包括可操作地连接于组成型启动子元件的至少一种核酸，所述核酸编码具有GnTIII活性的多肽。
[0050]另一方面，本发明涉及在宿主细胞中生产ABM的方法，该方法包括：(a)在容许所述ABM产生，并容许对存在于所述ABM的Fc区域上的寡糖进行修饰的条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而表达编码具有GnTIII活性的融合多肽的至少一种核酸；和(b)分离所述ABM；其中所述ABM能够与大鼠ICR62抗体竞争结合EGFR，并且其中所述ABM是嵌合的(例如，人源化的)。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，优选含有GnTIII的催化结构域和异源高尔基体定居(resident)多肽的高尔基体定位结构域，所述定位结构域选自由下列组成的组：甘露糖苷酶II的定位结构域，β(1，2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I(“GnTI”)的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，β(1，2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II(“GnTII”)的定位结构域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或GnTI。
[0051]在另一个方面，本发明涉及修饰由宿主细胞产生的抗-EGFRABM的糖基化模式的方法，所述方法包括向该宿主细胞引入至少一种本发明的核酸或表达载体。在一个实施方案中，该ABM是抗体或其片段；优选地包括IgG的Fc区域。或者，所述多肽是融合蛋白质，其包括等价于人IgG的Fc区域的区域。
[0052]在一个方面，本发明涉及重组的、嵌合抗体，或其片段，其能够与大鼠ICR62抗体竞争结合EGFR并具有减少的岩藻糖基化。
[0053]在另一个方面，本发明涉及通过使用融合多肽，来改进本发明的重组抗体或其片段的糖基化的方法，所述融合多肽具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结合域。在一个实施方案中，本发明的融合多肽包括GnTIII的催化结构域。在另一个实施方案中，高尔基体定位结构域选自由下列组成的组：甘露糖苷酶II的定位结构域，GnTI的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，GnTII的定位结构域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或GnTI。
[0054]在一个实施方案中，本发明的方法涉及产生具有修饰的寡糖的重组的、嵌合的抗体或其片段，其中所述修饰的寡糖与未修饰的寡糖相比具有减少的岩藻糖基化。按照本发明，这些修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及产生重组的、嵌合的(例如人源化的)抗体或其片段，其在所述多肽的Fc区域中具有增加比例的分叉的、非岩藻糖基化的寡糖。在一个实施方案中，分叉的、非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，分叉的、非岩藻糖基化的寡糖是复合的。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及产生重组的、嵌合的抗体或其片段，其在所述多肽的Fc区域中具有至少20％的寡糖，所述寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。在优选的实施方案中，在所述多肽的Fc区域中至少30％的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。在另一个优选的实施方案中，其中在所述多肽的Fc区域中，至少35％的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
[0055]在另一个方面，本发明涉及重组的、嵌合的抗体或其片段，其由于其寡糖的修饰而显示出增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。在一个实施方案中，增加的结合亲和性是针对Fc激活受体。在另一个实施方案中，Fc受体是Fcγ激活受体，特别地是FcγRIIIA受体。本文考虑的效应子功能可以选自这样的组，所述组包括，但不限于：增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡；增加的树突细胞成熟；和增加的T细胞初敏。
[0056]在另一个方面，本发明涉及重组的、嵌合的(例如，人源化的)抗体片段，其具有大鼠ICR62抗体的结合特异性，并包含Fc区域，所述抗体片段被进行了改造从而具有由本发明的任一种方法所产生的增加的效应子功能。
[0057]在另一个方面，本发明涉及融合蛋白，其包括具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽：SEQ ID NO.：1；SEQ ID No：3；SEQ ID No：5；SEQ ID No：7；SEQ ID No：9；SEQ ID No：11；SEQ ID No：13；SEQ ID No：15；SEQ ID No：17；SEQ ID No：19；SEQ ID No：21；SEQ ID No：23；SEQ ID No：25；SEQ ID No：27；SEQ ID No：29；SEQ ID No：31；SEQ ID No33；SEQ ID No：35；SEQ ID No：37；SEQ ID No：39；和SEQ ID No：121，和等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一种方法所产生的增加的效应子功能。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多肽排除在外。
[0058]在另一个方面，本发明涉及融合蛋白，其包括具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽：SEQ ID NO：43，SEQ ID No：45；SEQ ID No：49；和SEQ ID No.：51，和等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一种方法所产生的增加的效应子功能。另一方面，本发明将任何或全部这些分离的多肽排除在外。
[0059]一方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一种方法所产生的重组的、嵌合的(例如，人源化的)抗体，和药用载体。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一种方法所产生的重组的、嵌合的(例如，人源化的)抗体片段，和药用载体。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一种方法所产生的融合蛋白和药用载体。
[0060]在另一方面，本发明涉及体内或体外靶向表达EGFR的细胞的方法。在一个实施方案中，本发明涉及靶向受试者中表达EGFR的细胞的方法，该方法包括向受试者施用包含本发明的ABM的组合物。
[0061]在另一方面，本发明涉及一种在体内或在体外检测样品中EGFR存在的方法，例如用于诊断与EGFR表达相关的病症。在一个实施方案中，该检测是这样进行的：在允许ABM和EGFR之间形成复合物的条件下，将待测样品，任选地与对照样品一起，与本发明的ABM接触。然后检测复合物形成(例如通过ELISA或本领域已知的其它方法)。当与试验样品一起使用对照样品时，当比较试验和对照样品时在ABM-EGFR复合物形成方面的任何统计学显著差异指示在试验样品中EGFR的存在。
[0062]本发明还涉及治疗与EGFR表达相关的病症的方法，特别是其中表达EGFR的细胞增殖病症，并且更具体地，其中EGFR异常表达(例如，过表达)的病症，包括膀胱癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，皮肤癌和肾癌，该方法包括向需要其的人受试者施用治疗有效量的通过本发明任一种方法制备的重组、嵌合(例如人源化)抗体或其片段。
附图简述
[0063]图1显示当与人源化ICR62构建体I-HHC(重链)和I-KB(轻链)联合时，单个重链和轻链嵌合大鼠-人ICR62多肽链的功能活性。rVL表示嵌合轻链，并且rVH表示嵌合重链。“r”名称表示可变结构域是来自原始大鼠抗体。
[0064]图2显示人源化ICR62抗体的结合活性，所述人源化ICR62抗体包含以各种构型配对的重链可变区构建体I-HHC，I-HHA和I-HLA和人源化轻链可变区构建体I-KA和I-KB。
[0065]图3显示人源化ICR62抗体的结合活性，所述人源化ICR62抗体包含以各种构型配对的重链可变区构建体I-HLB，I-HLC和I-HLA和人源化轻链可变区构建体I-KA和I-KC。
[0066]图4显示与嵌合大鼠-人ICR62抗体相比，人源化ICR62抗体的结合活性，所述人源化ICR62抗体包含重链可变区构建体I-HLA2，I-HLA3和I-HLA4和人源化轻链可变区构建体I-KC。
[0067]图5显示与嵌合大鼠-人ICR62抗体相比，人源化ICR62抗体的结合活性，所述人源化ICR62抗体包含重链可变区构建体I-HLA1，I-HLA3，I-HLA5和I-HLA6和人源化轻链可变区构建体I-KC。
[0068]图6显示与嵌合大鼠-人ICR62抗体相比，人源化ICR62抗体的结合活性，所述人源化ICR62抗体包含重链可变区构建体I-HLA7，I-HLA6，和I-HHB和人源化轻链可变区构建体I-KC。
[0069]图7显示与嵌合大鼠-人ICR62抗体相比，人源化ICR62抗体的结合活性，所述人源化ICR62抗体包含重链可变区构建体I-HHF，I-HLA9，和I-HLA8和人源化轻链可变区构建体I-KC。
[0070]图8显示人源化抗体的结合活性，所述人源化抗体包含重链可变区构建体I-HHB，I-HHD，I-HHG，I-HHF，I-HLA7，和I-HLA9，以及人源化轻链可变区构建体I-KC。
[0071]图9显示嵌合ICR62抗体的各种糖形以及人源化变体I-HLA4的抗体介导的细胞毒性作用(ADCC)的比较。＂G1＂是指通过与GnTIII共表达进行的抗体的糖基改造。＂G2＂是指通过与GnTIII和ManII共表达进行的抗体的糖基改造。＂WT＂是指未进行糖基改造的抗体。人源化重链构建体与I-KC轻链构建体配对。
[0072]图10显示非糖基改造形式(WT)和G2糖形(glycoform)(即，通过与GnTIII和ManII共表达进行的糖基改造)的人源化ICR62抗体构建体I-HHB和I-HLA7的ADCC比较。将相同的抗体施加于两种不同靶细胞系：在图A中，使用靶细胞系LN229；在图B中，使用细胞系A431。将人源化重链构建体与I-KC轻链构建体配对。
[0073]图11A和11B显示非糖基改造形式(WT)和G2糖形的嵌合ICR62和人源化ICR62抗体构建体I-HHB和I-HLA7的ADCC的比较。使用靶细胞系A431。将人源化重链构建体与I-KC轻链构建体配对。
[0074]图12显示对于G2糖形的嵌合ICR62和人源化ICR62抗体构建体I-HHB和I-HLA7的72h ADCC的比较。将人源化重链构建体与I-KC轻链构建体配对。
[0075]图13人源化ICR62重链可变区构建体与大鼠ICR62序列比较的氨基酸序列比对。点表示在给定构建体内在给定位置上氨基酸残基的相同性。
[0076]图14显示使用CHO细胞的FcγRIIIa-Fc结合测定，所述CHO细胞展示重组人FcγRIIIa。将糖基改造的I-HHB/KC人源化抗-EGFR IgG1抗体与非糖基改造的(Wt)抗体比较。
[0077]图15显示对于糖基改造的人源化抗-EGFR IgG1抗体I-HHB/KC的MALD/TOF-MS寡糖曲线。通过在产生抗体的细胞中过表达编码具有GnTIII和高尔基甘露糖苷酶II活性的酶的基因而实现糖基改造，获得超过70％的非岩藻糖基化Fc-Asn297-连接的寡糖。
[0078]图16显示抗-EGFR精确曲线(n＝6在校准范围内平行测定(replicate across))，用于测定在1％猴血清基质(猴血清库CMS25/31/33，由HLS提供)中的抗-EGFR。
[0079]图17显示代表性抗-EGFR校准曲线，用于测定在1％猴血清基质中的抗-EGFR。
[0080]图18显示在将抗-EGFR每周一次静脉内给药于雄性食蟹猴(cynomolgous monkeys)的第1天时抗-EGFR的血清浓度。
[0081]图19显示在将抗-EGFR每周一次静脉内给药于雌性食蟹猴的第1天时抗-EGFR的血清浓度。
[0082]图20显示血清抗-EGFR浓度-时间曲线下面积(AUC168)和每周一次将抗-EGFR静脉内给药于食蟹猴的第1天的剂量水平之间的关系。
[0083]图21显示在将抗-EGFR每周一次静脉内给药于雄性食蟹猴期间抗-EGFR的血清浓度。
[0084]图22显示在每周一次静脉内给药抗-EGFR于雌性食蟹猴期间抗-EGFR的血清浓度。
[0085]图23显示来自Fc-改造(糖基改造)的抗-EGFR抗体的寡糖的MALDI/TOF-MS曲线，该抗体用于本文下述实施例中所述的体内猴研究中。
[0086]图24显示与在人A431表皮样癌细胞表面上表达的EGFR的结合。用于结合研究的抗体是Fc-改造的抗-EGFR抗体(I-HHB构建体)，其用于本文下述实施例中所述的体内猴研究中。
[0087]图25显示与在猴COS-7肾细胞的表面上表达的EGFR的结合。所用的抗体是抗-EGFR抗体(I-HHB重链；I-KC轻链)。为了参考，显示了与低人EGFR-表达细胞，MCF-7乳腺癌细胞的结合。
[0088]图26显示Fc-FcγRIIIa结合，其使用完整的细胞(被改造而在它们的表面上表达人FcgRIIIa的CHO细胞)。所用抗体是Fc-改造的(糖基改造的)抗-EGFR抗体，其用于本文下述实施例中所述的体内猴研究中。显示非Fc-改造的(未修饰的)对照IgG1抗体的结果作为比较。
[0089]图27显示通过Fc-改造(糖基改造)的抗-EGFR抗体的ADCC。靶细胞是A549人肺癌细胞。为了比较，显示非-Fc改造(未修饰)形式的抗体的ADCC活性。
[0090]图28显示通过Fc-改造(糖基改造的)的抗-EGFR抗体介导的ADCC。靶细胞是CYNOM-K1食蟹猴角质形成细胞系。为了比较，显示非-Fc改造(未修饰)形式的抗体的ADCC活性。
[0091]图29显示基于与重链I-HHD构建体配对的I-KC构建体的各种轻链构建体变体的EGFR靶结合。
[0092]图30显示基于与重链I-HHD构建体配对的I-KC构建体的各种轻链构建体变体的EGFR靶结合。
[0093]图31显示基于与轻链I-KC构建体配对的I-HHD构建体的各种重链构建体变体的EGFR靶结合。
[0094]图32显示基于与轻链I-KC构建体配对的I-HHD构建体的各种重链构建体变体的EGFR靶结合。
发明详述
[0095]本文所用的术语如本领域通常所用的，除非如下另外指出。
[0096]用于本文时，术语抗体意欲包括整个抗体分子，以及具有Fc区域并保留结合特异性的抗体片段，和融合蛋白，所述融合蛋白包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域并保留结合特异性，所述整个抗体分子包括单克隆抗体，多克隆抗体和多特异性(例如，二特异性)的抗体。还包括保留结合特异性的抗体片段，包括但不限于VH片段，VL片段，Fab片段，F(ab’)2片段，scFv片段，Fv片段，小抗体(minibodies)，二抗体，三链抗体，和四链抗体(参见，例如Hudson和Souriau，自然医学(Nature Med.)9：129-134(2003))。还包括人源化、灵长类化和嵌合的抗体。
[0097]用于本文时，术语Fc区域意欲指IgG重链的C-末端区域。尽管IgG重链的Fc区域的范围可以轻微变化，人IgG重链Fc区域通常定义为从位点Cys226的氨基酸残基延伸到羧基末端的一段序列。
[0098]用于本文时，术语“等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域”意欲包括免疫球蛋白的Fc区域的天然存在的等位基因变体以及具有改变的变体，所述改变产生替换，插入，或缺失，但是基本不会减少免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性的细胞毒性作用)的能力。例如，在免疫球蛋白的Fc区域的N-末端或C末端可以缺失一个或多个氨基酸，而基本不丧失生物学功能。可以按照本领域已知的一般规则来选择这些变体从而对活性具有最小的影响。(见，例如Bowie，J.U.等，科学(Science)247：1306-10(1990)。
[0099]用于本文时，术语EGFR是指人表皮生长因子受体(也称为HER-1或Erb-B1)(Ulrich，A.等，自然(Nature)309：418-425(1984)；SwissProt Accession #P00533；二级登记号：O00688，O00732，P06268，Q14225，Q92795，Q9BZS2，Q9GZX1，Q9H2C9，Q9H3C9，Q9UMD7，Q9UMD8，Q9UMG5)，以及其天然存在的同种型和变体。这些同种型和变体包括但不限于，EGFRvIII变体，可变剪接产物(例如，SwissProt登记号P00533-1，P00533-2，P00533-3，P00533-4鉴定的)，变体GLN-98，ARG-266，Lys-521，ILE-674，GLY-962，和PRO-988(Livingston，R.J.等，NIEHS-SNPs，环境基因组计划，NIEHS ES15478，基因组科学部，西雅图，WA(2004))，和通过下列登记号鉴定的其它变体：NM_005228.3，NM_201282.1，NM_201283.1，NM_201284.1(REFSEQ mRNAs)；AF125253.1，AF277897.1，AF288738.1，AI217671.1，AK127817.1，AL598260.1，AU137334.1，AW163038.1，AW295229.1，BC057802.1，CB160831.1，K03193.1，U48722.1，U95089.1，X00588.1，X00663.1；H54484S1，H54484S3，H54484S2(MIPS装配)；DT.453606，DT.86855651，DT.95165593，DT.97822681，DT.95165600，DT.100752430，DT.91654361，DT.92034460，DT.92446349，DT.97784849，DT.101978019，DT.418647，DT.86842167，DT.91803457，DT.92446350，DT.95153003，DT.95254161，DT.97816654，DT.87014330，DT.87079224(DOTS装配)。
[0100]用于本文时，术语EGFR配体是指结合和/或激活EGFR的多肽。术语包括EGFR配体的膜结合的前体形式，以及EGFR配体的蛋白裂解加工的可溶性形式。
[0101]用于本文时，术语EGFR的配体激活是指EGFR配体结合介导的信号转导(例如，通过EGFR受体的胞内激酶结构域磷酸化EGFR或底物多肽内酪氨酸残基导致)。
[0102]用于本文时，术语疾病或特征在于EGFR或EGFR配体的异常活化或生产的病症或与EGFR表达有关的病症，是指可以包括或可以不包括恶性肿瘤或癌症的病症，其中在受试者的细胞或组织中发生EGFR和/或EGFR配体的异常活化和/或生产，所述受试者患有或倾向于患所述疾病或病症。
[0103]用于本文时，与表达EGFR的细胞连同使用的术语过表达、过表达的(overexpressed)和过表达的(overexpressing)是指与相同组织类型的正常细胞相比，在其表面上具有可测量程度的更高水平的EGFR的细胞。该过表达可以由基因扩增或增加的转录或翻译而导致。EGFR表达(和，因此，过表达)可以在诊断或预后测定中通过本领域已知的技术评估存在于细胞表面上或细胞裂解物中的EGFR水平来测定：例如，经由免疫组织化学测定，免疫荧光测定，免疫酶测定，ELISA，流式细胞术，放射免疫测定法，蛋白质印迹，配体结合，激酶活性等。(一般参见，细胞生物学：实验室手册(
Figure A200780037124D0032160958QIETU
A 
Figure A200780037124D0032161010QIETU
)，Celis，J.，编，学院出版社(Academic Press)(第2版，1998)；蛋白质科学通用方法(
Figure A200780037124D0032161027QIETU
)，Coligan，J.E.等，编，John Wiley & Sons(1995-2003)；还参见，Sumitomo等，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)10：794-801(2004)(描述蛋白质印迹，流式细胞术和免疫组织化学)，将它们的全部内容结合于此作为参考))。备选地，或另外地，例如通过原位杂交中的荧光、DNA印迹法、或PCR技术，可以测量细胞中编码EGFR的核酸分子的水平。将正常细胞中的EGFR水平与受细胞增殖病症(例如癌症)影响的细胞的水平比较，以确定EGFR是否过表达。
[0104]用于本文时，在其最广义上讲，术语抗原结合分子指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子可以是，例如，能够与抗原决定簇特异性结合的抗体或其片段。更具体地，结合EGFR的抗原结合分子是特异性结合170kDa的跨膜受体的分子，所述170kDa的跨膜受体典型地称为表皮生长因子受体(EGFR)，但也称为HER-1或ErbB1。所谓“特异性结合”指结合对于所述抗原是选择性的，并且可以与不需要的或非特异性相互作用区别开。
[0105]用于本文时，当用在涉及多肽诸如ABMs中时，术语融合的和嵌合的，指这样的多肽，所述多肽包括来自两个或更多异种多肽的氨基酸序列，诸如来自不同物种的抗体的部分。例如，对于嵌合ABMs而言，非抗原结合成分可以来自广泛种类的物种，包括灵长类动物诸如黑猩猩和人。最优选嵌合ABM的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同；最优选嵌合抗体的可变区与重组抗-EGFR抗体的可变区基本相同，所述重组抗-EGFR抗体具有鼠可变区的氨基酸序列。人源化的抗体是融合或嵌合抗体的特别优选的形式。
[0106]用于本文时，具有GnTIII活性的多肽指这样的多肽，所述多肽能够催化以β-1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-联寡糖中的三甘露糖基核心的β连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽，所述多肽显示出类似于但不必须相同于β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性，如在特别的生物测定中所测量的，具有或不具有剂量依赖性，按照国际生化和分子生物学命名委员会(NC-IUBMB)，其也被称为β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC 2.4.1.144)。在其中确实存在剂量依赖性的情形中，其不需要与GnTIII的剂量依赖性相同，但是与GnTIII活性相比，基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即，相对于GnTIII，候选多肽将显示更大的活性或不超过约25倍更少，并且优选地，不超过约10倍更少的活性，并且最优选地，不超过约三倍更少的活性)。
[0107]用于本文时，术语变体(或类似物)指通过使用，例如重组DNA技术产生的氨基酸插入、缺失、和替换而与本发明特别陈述的多肽区别开的多肽。本发明的ABMs的变体包括嵌合的、灵长类化或人源化的抗原结合分子，其中氨基酸残基的一个或数个通过以这样的方式替换，添加和/或缺失进行修饰，所述方式基本上不影响抗原(例如，EGFR)结合亲和性。可以通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较并使在高同源性的区域(保守区域)中所作的氨基酸序列变化的数量最少化，或通过用共有序列来替代氨基酸来发现确定哪种氨基酸可以被替换，添加，或缺失而不会破坏目标活性的指导。
[0108]或者，编码这些相同或类似多肽的重组变体可以通过使用在遗传密码中的“丰余性”来合成或选择。可以引入各种密码子替换，诸如产生各种限制性位点的沉默改变，从而最优化克隆到质粒或病毒载体中，或在特定原核或真核系统中的表达。在多核苷酸序列中的突变可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的结构域中从而修饰多肽的任何部分的特性，从而改变特性诸如配体结合亲和性，链间亲和性，或降解/更新率。
[0109]氨基酸“替换”可以是，例如，用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换一个氨基酸的结果，即保守性氨基酸替换。“保守性”氨基酸替换可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”优选地在约1-20个氨基酸的范围内，更优选在1—10个氨基酸范围内。容许的变化可以使用重组DNA技术和测定得到的重组变体的活性，通过系统性在多肽分子中进行氨基酸插入，缺失或替换来实验性地进行确定。
[0110]用于本文时，术语人源化用于指来自非人抗原结合分子，例如，鼠抗体的抗原结合分子，其保持或基本保持母体分子的抗原结合特性，但是在人中具有更少的免疫原性。这可以通过各种方法来实现，所述方法包括(a)将整个非人的可变结构域移植到人恒定区上从而产生嵌合抗体，(b)仅将非人CDRs移植到人构架和恒定区上，保留或不保留关键的构架残基(例如，对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是重要的那些)，或(c)移植整个非人的可变结构域，但是通过表面残基的替换用人样部分来“遮蔽”它们。这些方法公开于Jones等，Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，高级免疫学(Adv.Immunol.)，44：65-92(1988)；Verhoeyen等，科学(Science)，239：1534-1536(1988)；Padlan，分子免疫学(Molec.Immun.)，28：489-498(1991)；Padlan，分子免疫学(Molec.Immun.)，31(3)：169-217(1994)，将它们全部并入本文作为参考。在抗体的重链和轻链可变结构域中的每一个通常存在3个互补决定区，或CDRs，(CDR1，CDR2和CDR3)，其侧邻抗体的重链和轻链可变结构域的每个中的四个构架亚区域(即，FR1，FR2，FR3，和FR4)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可以，见于特别是美国专利号6,632,927，和公开的美国申请号2003/0175269中，将它们两者全文并入本文作为参考。在其他实例中，可以仅将结合所需的CDR残基转移(例如“移植”)到人序列上，从而创建具有抗原-特异性的完整可变区序列。
[0111]类似地，用于本文时，术语灵长类化用于指这样的来自非灵长类动物抗原结合分子，例如，鼠抗体，的抗原结合分子，其保留或基本保留母体分子的抗原结合性质，但是在灵长类动物中具有更少的免疫原性。
[0112]在本领域使用和/或接受的术语存在两个或多个定义的情形中，用于本文时的术语的定义倾向于包括所有的这些含义，除非明确地以相反的意思指出。具体的实例是使用术语“互补决定区”(＂CDR＂)来描述在重链和轻链多肽的可变区中发现的非连续抗原结合位点。这种特别的区域已经在Kabat等，美国健康和公共事业部(U.S.Dept.of Health and HumanServices)，“免疫学兴趣蛋白序列”(＂Sequences of Proteins ofImmunological Interest＂)(1983)和Chothia等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917(1987)中进行了描述，将它们并入本文作为参考，其中当针对彼此比较时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。但是，将任一定义用于指抗体或其变体的CDR的应用倾向于在本文所限定和使用的术语的范围内。涵盖如上面引用的参考文献的每个所定义的CDRs的适合的氨基酸残基在下面的表I中提出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。假定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪一种残基包含特定的CDR。
表1.CDR定义1
 
Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中的所有的CDR定义的编号是按照Kabat等(见下)的编号方式进行的
2＂AbM＂是指Oxford Molecular′s＂AbM＂抗体建模软件定义的CDRs.
[0113]Kabat等还定义了用于可变结构域序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域普通技术人员之一可以明确地将这种“Kabat编号”系统赋予任何可变结构域序列，而不依赖于超出序列本身之外的任何实验数据。用于本文时，“Kabat编号”指由Kabat等，美国健康和公共事业部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，“免疫学兴趣蛋白序列”＂Sequence ofProteins of Immunological Interest＂(1983)提出的编号系统。除非另外指出，对于在ABM中特定氨基酸残基位点的编号的参考是按照Kabat编号系统进行的。序列表的序列(即，SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：147)不是按照Kabat编号系统进行编号的。然而，如上所述，基于本文提供的序列的编号，确定序列表中任何可变区序列的Kabat编号方案完全在本领域技术人员的常规技术范围内。
[0114]至于具有与本发明的参比核苷酸序列存在至少，例如95％“相同性”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指多核苷酸的核苷酸序列与参比序列相同，除了多核苷酸序列可以包括参比核苷酸序列的每100个核苷酸中多到5个的点突变以外。换言之，为了获得具有与参比核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，在参比序列中多到5％的核苷酸可以缺失或被另一个核苷酸所替换，或在参比序列中多到5％的总核苷酸数目的核苷酸可以插入参比序列中。
[0115]作为实践的问题，可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的核酸分子或多肽与本发明的核苷酸序列或多肽序列具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法，也被称为全域序列比对(global sequence alignment)，可以使用基于Brutlag等，比较和应用生物科学(Comp.App.Biosci.)6：237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中，查询序列和目标序列都是DNA序列。RNA序列可以通过将U′s转化为T′s进行比较。所述全域序列比对的结果以百分比相同性表示。用在DNA序列的FASTDB比对中计算百分比相同性的优选参数是：矩阵＝单式，k-元组＝4，不匹配罚分＝1，合并罚分(JoiningPenalty)＝30，随机组长度＝0，截断值评分＝1，空隙罚分＝5，空隙大小罚分0.05，窗口大小＝500或目标核苷酸序列的长度，无论哪一个更短。
[0116]如果目标序列比查询序列更短是因为5′或3′缺失，而不是因为内部缺失，应当对结果进行手工校正。这是因为当计算百分比相同性时，该FASTDB程序并不说明目标序列的5′和3′截短。对于相对于查询序列，在5′或3′末端被截短的目标序列，通过将不匹配/比对的在目标序列的5′和3′的查询序列的碱基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比相同性进行校正。通过FASTDB序列排列的结果来确定是否核苷酸匹配/比对。接着，将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比相同性中减去来达到最终的百分比相同性评分。这种校正评分用于本发明的目的。如通过FASTDB比对展示，仅有不与查询序列匹配/比对的，在目标序列的5′和3′碱基外侧的碱基出于手工调整百分比相同性评分的目的进行计算。
[0117]例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列进行比对来确定百分比相同性。该缺失发生在目标序列的5′末端，并且因此，FASTDB比对没有显示在5′末端最先的10个碱基的匹配/比对。这10个未配对碱基代表序列的10％(未匹配的在5′和3′末端碱基的数量/与查询序列的碱基总数)，因此将10％从通过FASTDB程序计算的百分比相同性评分中减去。如果剩余的90个碱基完全匹配，最终的百分比相同性将是90％。在另一个实例中，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列进行比较。这次，缺失是内部缺失从而使在目标序列的5′或3′上不存在与查询序列不匹配/比对的碱基。在该情形中，通过FASTDB计算的百分比相同性没有进行手工校正。再一次，只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的5′和3′碱基进行手工校正。出于本发明的目的，没有进行其它的手工校正。
[0118]至于具有与本发明的查询氨基酸序列有至少例如95％“相同性”的氨基酸序列的多肽而言，意指目标多肽的氨基酸序列与查询序列相同，除了目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括多到5个氨基酸改变以外。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列有至少95％相同性的氨基酸序列的多肽，在目标序列中多到5％的氨基酸残基可以被插入，缺失，或被另一个氨基酸替换。参比序列的这些改变可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位点，或在那些末端位点之间的任何地方，其单独散在参比序列的残基中或在参比序列的一个或多个连续组中。
[0119]作为实践的问题，可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的多肽与参比多肽具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法，也被称为全域序列比对，可以使用基于Brutlag等，比较和应用生物科学(Comp.App.Biosci.)6：237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中，查询序列和目标序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全域序列比对的结果以百分比相同性表示。用在FASTDB氨基酸比对中的优选参数是：矩阵＝PAM0，k-元组＝2，不匹配罚分＝1，合并罚分(Joining Penalty)＝20，随机组长度＝0，截断值评分＝1，窗口大小＝序列长度，空隙罚分＝5，空隙大小罚分0.05，窗口大小＝500或目标氨基酸序列的长度，无论哪一个更短。
[0120]如果目标序列比查询序列更短是因为N端或C端缺失，而不是因为内部缺失，必须对结果进行手工校正。这是因为当计算全域百分比相同性时，该FASTDB程序并不说明目标序列的N端和C端截短。对于相对于查询序列，在N端和C端被截短的目标序列，通过将与相应的目标残基不匹配/比对的在目标序列的N端和C端的查询序列的残基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比相同性进行校正。通过FASTDB序列比对的结果来确定是否残基是匹配/比对的。接着，将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比相同性中减去来达到最终的百分比相同性评分。这种最终百分比相同性评分用于本发明的目的。出于手工调整百分比相同性评分的目的，仅考虑不与查询序列匹配/比对的，在目标序列的N端和C端的残基。即，仅是在目标序列的最远N和C端残基外侧的查询残基位点。
[0121]例如，将90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比对来确定百分比相同性。该缺失发生在目标序列的N端，并且因此，FASTDB比对没有显示在N端前10个残基的匹配/比对。这10个未配对残基代表序列的10％(未匹配的在N端和C端残基的数量/查询序列的残基总数)，因此将10％从通过FASTDB程序计算的百分比相同性评分中减去。如果剩余的90个残基完全匹配，最终的百分比相同性将是90％。在另一个实例中，将90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这次，缺失是内部缺失从而使在目标序列的N端或C端上不存在与查询序列不匹配/比对的残基。在该情形中，通过FASTDB计算的百分比相同性没有进行手工校正。再一次，如通过FASTDB比对所显示的，只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的N端和C端末端残基外侧的残基位点进行手工校正。出于本发明的目的，没有进行其它的手工校正。
[0122]用于本文时，“在严格条件下杂交”于本发明的核酸序列的核酸是指在这样的条件下进行杂交的多核苷酸，所述条件为在包括以下各项的溶液中于42℃进行过夜温育：50％的甲酰胺，5 x SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml的变性的、已剪切的鲑精DNA，随后于约65℃在0.1xSSC中洗涤滤器。
[0123]用于本文时，术语高尔基体定位结构域指负责将多肽锚定在高尔基复合体的位置中的高尔基体定居多肽的氨基酸序列。通常，定位结构域包括酶的氨基末端“尾”。
[0124]用于本文时，术语效应子功能指可归因于抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸序列变体Fc区域)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括，但不限于，Fc受体结合亲和性，抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原吸收，细胞表面受体的下调等。
[0125]用于本文时，术语改造，被改造，进行改造和糖基化改造被认为包括天然存在或重组多肽或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化改造包括细胞的糖基化作用的代谢改造，所述代谢改造包括对寡糖合成途径进行遗传操作从而获得改变的在细胞中表达的糖蛋白的糖基化。此外，糖基化改造包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化改造是糖基转移酶活性的改变。在一个具体实施方案中，改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
[0126]用于本文时，术语宿主细胞包括任何种类的细胞系统，其可以被进行改造从而生产本发明的多肽和抗原结合分子。在一个实施方案中，对宿主细胞进行改造从而容许产生具有修饰的糖形的抗原结合分子。在一个优选的实施方案中，抗原结合分子是抗体，抗体片段，或融合蛋白。在某些实施方案中，还对宿主细胞进行操作从而使其表达增加水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞，例如，哺乳动物培养细胞，诸如CHO细胞，HEK293-EBNA细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞，和植物细胞，仅举几个例子，但是还包括被包含在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
[0127]用于本文时，术语Fc-介导的细胞毒性包括抗体依赖性细胞毒性作用和由包含人Fc-区域的可溶Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。这是一种导致由“人免疫效应细胞”裂解“抗体靶向细胞”的免疫机制，其中：
[0128]人免疫效应细胞是在它们的表面上展示Fc受体的白细胞群，通过所述Fc受体它们结合于抗体或Fc-融合蛋白的Fc-区域并且执行效应子功能。这样的群可以包括，但不限于，外周血单核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。
[0129]抗体靶向细胞是由抗体或Fc融合蛋白结合的细胞。抗体或Fc融合蛋白通过对于Fc区域来讲为N端的蛋白部分来结合于靶细胞。
[0130]用于本文时，将术语增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性定义为通过上述定义的Fc-介导的细胞的细胞毒性的机制，在围绕靶细胞的培养基中，以给定浓度的抗体，或给定浓度的Fc-融合蛋白，在给定时间内裂解的“抗体-靶向细胞”的数量的增加，和/或将其定义为通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制，在给定的时间内，获得给定数量的“抗体靶向细胞”的裂解所需要的在围绕靶细胞的培养基中抗体浓度，或Fc-融合蛋白的浓度的减少。Fc-介导的细胞的细胞毒性的增加涉及由相同的抗体，或Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性，所述抗体或Fc-融合蛋白使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生，纯化，配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生，若非不是由通过本文所述的方法进行了改造从而表达糖基转移酶GnTIII的宿主细胞产生。
[0131]所谓具有增加的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)的抗体，意指如本文所定义的术语的抗体，所述抗体如通过本领域那些普通技术人员已知的任何适合方法所确定的具有增加的ADCC。被接受的体外ADCC测定的一个实例如下：
1)该测定使用已知表达靶抗原的靶细胞，所述靶抗原由抗体的抗原结合区域所识别；
2)该测定使用分离自随机选择的健康供体的血液的人外周血单核细胞(PBMCs)，来作为效应细胞；
3)该测定按照下列方法进行：
i)使用标准的密度离心方法来分离PBMCs并将其以5 x 106细胞/ml悬浮在RPMI细胞培养基中；
ii)通过标准的组织培养方法培养靶细胞，在生存力大于90％的指数生长阶段来收集细胞，在RPMI细胞培养基中将其进行洗涤，用100微居的51Cr将其进行标记，并用细胞培养基将其洗涤两次，并以105细胞/ml的密度将其重悬于细胞培养基中；
iii)将100微升的上述最终靶细胞混悬液转移到96孔微量滴定板的每孔中；
iv)将抗体从4000ng/ml到0.04ng/ml在细胞培养基中进行系列稀释，将50微升的得到的抗体溶液加入96孔微量滴定板中的靶细胞，以三次重复测试各个抗体浓度，所述抗体浓度覆盖整个的上述范围的抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的2％(V/V)的非离子去污剂(Nonidet，西格玛(Sigma)，St.Louis)的水溶液，替换抗体溶液(上述的第iv点)；
vi)对于自发释放(SR)对照而言，在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的RPMI细胞培养基，替换抗体溶液(上述的第iv点)；
vii)接着将96孔微量滴定板以50xg离心1分钟并在4℃温育1小时；
viii)将50微升的PBMC混悬液(上述第i点)加入每个孔中从而产生25：1的效应物：靶细胞比率，并将板置于温箱中于37℃在5％CO2气氛下达4小时。
ix)从每个孔中收集无细胞的上清液，并使用γ射线计数器来量化实验释放的放射性(ER)；
x)按照式(ER-MR)/(MR-SR)x100来计算每个抗体浓度的特定裂解的百分比，其中ER是对于该抗体浓度量化的平均放射性(见上述第ix点)，MR是对于MR对照而言(见上面的第v点)量化的平均放射性(见上面的第ix点)，并且SR是对于SR对照而言(见上面的第vi点)量化的平均放射性(见上面的第ix点)；
4)将“增加的ADCC”定义为在上述测试的抗体浓度范围内观察的特定裂解的最大百分比的增加，和/或在上面测试的抗体浓度范围内观察到的获得特定裂解的最大百分比的一半所需要的抗体的浓度的减少。在ADCC中的增加与这样的ADCC相关，例如，其是用上述测定测量的，由相同抗体介导的ADCC，所述抗体使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生、纯化、配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生，但不是由被改造过量表达GnTIII的宿主细胞所产生。
[0132]在一个方面，本发明涉及具有对大鼠ICR62单克隆抗体结合特异性(即，结合基本上相同的表位)的抗原结合分子，并涉及可以通过改变糖基化来增加它们的效应子功能的发现。在一个实施方案中，抗原结合分子是嵌合抗体。在一个优选实施方案中，本发明涉及嵌合抗体，或其片段，其包含SEQ ID NOs：53-108和/或SEQ ID NO：s122-127任一的CDRs的一个或多个(例如，一个，两个，三个，四个，五个，或六个)。具体地，在一个优选实施方案中，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含：(a)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：54 SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：122，和SEQ ID NO：124；(b)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，SEQID NO：96，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：102，SEQ IDNO：104，SEQ ID NO：106，和SEQ ID NO：126；和(c)SEQ ID NO：108。在另一个优选实施方案中，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包括：(a)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：114；(b)选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：118；和(c)SEQ ID NO：119。在一个实施方案中，这些多核苷酸的任何一个编码融合多肽。在其他方面，本发明可以将任何或全部这些多核苷酸序列排除在外。
[0133]在另一个实施方案中，抗原结合分子包括由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2编码的大鼠ICR62抗体的VH结构域，或其变体；和非鼠多肽。在另一个优选实施方案中，本发明涉及抗原结合分子，其包括由SEQID NO：43或SEQ ID NO：44编码的大鼠抗体的VL结构域，或其变体；和非鼠多肽。在其他方面，本发明可以将任何或全部这些多核苷酸序列排除在外。
[0134]在另一个方面，本发明涉及抗原结合分子，其包括ICR62的一个或多个(例如，一个，两个，三个，四个，五个或六个)截短的或变体CDRs。这些截短的或变体CDRs将至少包括，给定的CDR的特异性决定氨基酸残基。所谓“特异性决定残基”意为直接涉及与抗原的相互作用的那些残基。通常，在给定的CDR中只有约1/5到1/3的残基参与与抗原的结合。在特定的CDR中的特异性决定残基可以通过，例如计算来自三维建模的原子间的接触和按照全部内容并入本文作为参考的Padlan等，FASEB J.9(1)：133-139(1995)所述方法在给定的残基位点确定序列可变性来鉴别。因此，本文中通篇提到的本发明的抗原结合分子(ABM)还意欲包括这样的ABM，其包括，例如，包含一个或多个特异性决定残基的截短的和/或变体CDR，或包括与参考CDR(例如，大鼠ICR62 CDR)相比，位于CDR中一个或多个位置处的替换。
[0135]因此，本发明还涉及分离的多核苷酸，其包括大鼠ICR62抗体的至少一个(例如，一个，两个，三个，四个，五个或六个)互补决定区，或包含至少所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。优选地，这些分离的多核苷酸编码作为抗原结合分子的融合多肽。在一个实施方案中，多核苷酸包括大鼠ICR62抗体的三个互补决定区，或包含至少所述三个互补决定区的每个的特异性决定残基的其变体或其截短形式。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括至少一个在以下表2-5中列出的CDR。在另一个实施方案中，多核苷酸编码嵌合(例如，人源化)抗体的轻链或重链的整个可变区。本发明还涉及由这些多核苷酸编码的多肽。
[0136]在另一个实施方案中，本发明涉及抗原结合分子，其包括大鼠ICR62抗体的至少一个(例如，一个，两个，三个，四个，五个或六个)互补决定区，或其包含至少所述互补决定区的特异性决定残基(SDR)的变体或截短形式，并包含来自异源多肽的序列。在一个实施方案中，抗原结合分子包括大鼠ICR62抗体的三个互补决定区，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式包含至少所述三个互补决定区的每个的特异性决定残基。在一个实施方案中，抗原结合分子包括至少一个在以下表2-5中列出的CDR。在其他方面，本发明可以将下表2-5中列出的任何或全部CDR序列排除在外。
[0137]在一个实施方案中，所述抗原结合分子包括ICR62抗体的CDR的至少一个SDR。在一个实施方案中，本发明ABM的一个或多个CDR包括位于一个或多个氨基酸位置处的替换，且所述ABM与未替换的ABM相比，保持结合活性。可以如本文中所述地和通过本领域中的常规和众所周知的方法测量结合活性。在一些实施方案中，与未替换的ABM相比，结合替换的ABM的EC50浓度受到小于约10-约0.001倍的调节。在具体的实施方案中，与未替换的ABM相比，EC50浓度受到小于约10-约1倍，约10-约5倍，约5-约0.1倍，约5-约2倍，和约3-约1倍的调节。在具体的实施方案中，与未替换的ABM相比，被替换的抗体的EC50浓度受到小于约10，约9，约8，约7，约6，约5，约4，约3，约2，约1，约.05.，约.25，约.1，约.005，约.025，和约.001倍的调节。在具体的实施方案中，EC50浓度受到小于约10倍的调节。在其他实施方案中，EC50因子受到约10，约9，约8，约7，约6，约5，约4，约3，约2，约1，约.05.，约.25，约.1，约.005，约.025，and约.001倍的调节。在一些实施方案中，所述调节作用是EC50的减小。在其他实施方案中，所述调节作用是EC50的增加。
[0138]本发明ABM的CDR能够包括位于任何残基(按照Chothia或Kabat或如本文中定义的或本领域中已知的任何其他CDR定义)处的替换。在一个实施方案中，所述CDR包括除一个或多个特异性决定残基以外的任何或全部位置中的替换。在具体的实施方案中，所述CDR包括位于除特异性决定残基以外的所有位置处的替换。在一个实施方案中，本发明的重链CDR包括位于Kabat位置27，28，29，30，31，23，33，34，35，52，52a，53，54，55，57，58，58，60，61，62，63，64，65，94，96，97，98，99，100，100a，101，102，或其任意组合中的一处或多处的替换。在另一个实施方案中，所述CDR包括位于Chothia重链CDR1的Kabat位置27、28、或29，Kabat重链CDR1的位置31，Kabat重链CDR2的Kabat位置52、52a、53、或57，或Kabat重链CDR3的Kabat位置102中一处或多处的替换。
[0139]在一个实施方案中，本发明的轻链CDR包括位于Kabat位置24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，51，52，53，54，55，56，89，90，91，92，93，94，95，96，97，或其任意组合中的一处或多处的替换。在另一个实施方案中，所述CDR包括位于Kabat轻链CDR1的Kabat位置30或32，Kabat轻链CDR2的Kabat位置51、52、53、或56，或Kabat重链CDR3的Kabat位置94中一处或多处的替换。
另一方面，本发明的ABM包括大鼠ICR62抗体的至少一个互补决定区的至少一个特异性决定残基。在一些实施方案中，ABM包括重链CDR的特异性决定残基。在更具体的实施方案中，所述重链特异性决定残基选自由下列各项组成的组：位于Kabat位置29处的苯丙氨酸、位于Kabat位置52处的天冬酰胺、位于Kabat位置56处的酪氨酸、和位于Kabat位置100b处的缬氨酸。在特定实施方案中，所述特异性决定残基是位于Kabat位置56处的酪氨酸和位于Kabat位置100b处的缬氨酸。在另一个特定实施方案中，所述特异性决定残基是位于Kabat位置29处的苯丙氨酸、位于Kabat位置52处的天冬酰胺、位于Kabat位置56处的酪氨酸、和位于Kabat位置100b处的缬氨酸。在其他实施方案中，所述特异性决定残基位于轻链互补决定区内。在更具体的实施方案中，所述轻链特异性决定残基选自由下列各项组成的组：位于Kabat位置34处的天冬酰胺和位于Kabat位置50处的天冬酰胺。在特定实施方案中，所述特异性决定残基是位于Kabat位置34处的天冬酰胺。在另一个特定实施方案中，所述特异性决定残基是位于Kabat位置50处的天冬酰胺。在另一个特定实施方案中，所述特异性决定残基是是位于Kabat位置34处的天冬酰胺和位于Kabat位置50处的天冬酰胺。
[0140]在另一个方面，所述抗原结合分子包括抗体的轻链或重链的可变区。在一个特别有用的实施方案中，抗原结合分子是嵌合的，例如人源化的抗体。本发明还涉及制备这些抗原结合分子的方法，和将其用在治疗疾病中的应用，所述疾病特别是其中表达EGFR、特别是其中与相同细胞类型的正常组织相比EGFR异常表达(例如，过表达)的细胞增殖性病症。这些病症包括但不限于，膀胱癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，皮肤癌，和肾癌。EGFR表达水平可以通过本领域已知的方法和本文所述的那些方法来测定(例如，经由免疫组织化学测定，免疫荧光测定，免疫酶法测定，ELISA，流式细胞术，放射免疫测定，蛋白质印迹，配体结合，激酶活性等)。
[0141]本发明还涉及一种在体内或在体外靶向表达EGFR的细胞的方法。表达EGFR的细胞可以被靶向而用于治疗目的(例如，治疗可通过中断EGFR介导的信号传导进行治疗的病症，例如通过阻断配体结合，或靶向表达EGFR的细胞以通过免疫系统破坏)。在一个实施方案中，本发明涉及一种在受试者中靶向表达EGFR的细胞的方法，该方法包括向受试者施用包含本发明的ABM的组合物。表达EGFR的细胞也可以被靶向而用于诊断目的(例如，确定它们是否正常或异常地表达EGFR)。因此，本发明还涉及在体内或在体外检测EGFR存在或表达EGFR的细胞的存在的方法。一种根据本发明的检测EGFR表达的方法包括：在允许ABM和EGFR之间形成复合物的条件下，将待测样品任选地与对照样品一起与本发明的ABM接触。然后检测复合物形成(例如，通过ELISA或本领域已知的其它方法)。当与试验样品一起使用对照样品时，当比较试验和对照样品时在ABM-EGFR复合物形成方面的任何统计学显著差异指示在试验样品中EGFR的存在。
表2
Figure A200780037124D00471
Figure A200780037124D00481
表3
Figure A200780037124D00482
Figure A200780037124D00491
表4
Figure A200780037124D00492
表5
[0142]已知几种机制参与抗-EGFR抗体的治疗功效，其包括阻断配体(例如，EGF，TGF-α，etc.)与EGFR结合和随后的信号传导途径的活化，抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)，和诱导生长停滞或终末分化。
[0143]大鼠单克隆抗体ICR62(IgG2b)在PCT公开号WO 95/20045中讨论，其通过参考完全结合于此。它针对EGFR的C表位，并且显示出抑制配体结合，抑制表达EGFR的鳞状细胞癌的体外生长，和诱导无胸腺小鼠中肿瘤异种移植物的消退(WO 95/20045；Modjtahedi等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73：228-235(1996))。作为完全的啮齿动物抗体，将ICR62大鼠单克隆抗体施用于人导致一些患者中的HARA反应，即使在单次给药之后。(WO 95/20045；Modjtahedi等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)73：228-235(1996))。
[0144]已经描述了嵌合小鼠/人抗体。见，例如，Morrison，S.L等，PNASI1：6851-6854(1984年11月)；欧洲专利公开号173494；Boulianna，G.L，等，自然(Nature)312：642(1984年12月)；Neubeiger，M.S.等，自然(Nature)314：268(1985年3月)；欧洲专利公开号125023；Tan等，免疫学杂志(J.Immunol.)135：8564(1985年11月)；Sun，L.K等，杂交瘤(Hybridoma)5(1)：517(1986)；Sahagan等，免疫学杂志(J.Immunol.)137：1066-1074(1986)。通常见，Muron，自然(Nature)312：597(1984年12月)；Dickson，遗传工程新闻(Genetic Engineering News)5(3)(1985年3月)；Marx，科学(Science)229：455(1985年8月)；和Morrison，科学(Science)229：1202-1207(1985年9月)。IMC-C225
Figure A200780037124D00511
Imclone)是针对EGFR的嵌合单克隆抗体并且具有小鼠可变区和人恒定区(见Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。IMC-225的鼠源部分来源于M225，其被发现结合EGFR并且抑制EGF-诱导的酪氨酸激酶依赖型磷酸化，以及在过表达EGFR的肿瘤细胞系中诱导程序性细胞死亡(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。然而，M225在I期临床试验中在用所述抗体治疗的患者中引发HAMA应答(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。已经在体内或体外检验了IMC-225，并且已经与放射性疗法和化学疗法联合用于许多肿瘤类型，包括与差的预后相关的那些(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。然而，在临床试验中在施用IMC-225抗体的患者中IMC-225已经与诸如变态反应和皮肤反应的毒性关联(Herbst和Shin，癌症(Cancer)94：1593-1611(2002))。
[0145]在特别优选的实施方案中，本发明的嵌合ABM是人源化的抗体。使非人的抗体人源化的方法是本领域已知的。例如，本发明的人源化ABMs可以按照Winter的美国专利号5,225,539，Queen等的美国专利号6,180,370，Adair等的美国专利号6,632,927，或Foote的美国专利申请公开号2003/0039649的方法来进行制备，将其每个的全部内容特此并入作为参考。优选地，人源化的抗体具有一个或多个从非人的来源被引入其中的氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基通常被称作“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以按照Winter和合作者的方法(Jones等，自然(Nature)，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，科学(Science)，239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替换人抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上(substantially)小于完整的人可变结构域被非人的物种的相应序列所替换。实际上，人源化的抗体典型地是人抗体，其中一些高变区残基和可能地一些FR残基被来自啮齿类动物抗体的类似位点的残基所替换。目标人源化抗-EGFR抗体将包括人免疫球蛋白的恒定区。
[0146]选择待用于制备人源化抗体的人可变结构域，轻链和重链两者的可变结构域对于减少抗原性是非常重要的。按照所谓的“最佳-拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库来筛选啮齿类动物抗体的可变结构域的序列。接着，最接近于啮齿类动物的序列的人序列被接受作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等，免疫学杂志(J.Immunol.)，151：2296(1993)；Chothia等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，196：901(1987))。选择人构架序列的另一方法是针对相应于该构架亚区(例如，通过Kabat编号所确定)的已知人可变区序列的文库，比较完整啮齿类动物构架的每个单独的亚区(即，FR1，FR2，FR3，和FR4)或单独亚区的组合(例如，FR1和FR2)的序列，并选择对于每个亚区或组合最接近啮齿类动物的序列的人序列(Leung美国专利申请公开号2003/0040606A1，2003年2月27日公开)(其全部内容通过参考结合于此)。另一种方法使用来自特定亚组的轻链或重链的所有的人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可以用于一些不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志(J.Immunol.)，151：2623(1993))(其每个的全部内容通过参考结合于此)。
[0147]也是重要的是，抗体被人源化，同时保持对于抗原的高亲和性和其它有利的生物学性质。为了达到这个目标，按照优选的方法，通过使用母体序列和人源化序列的三维模型分析母体序列和各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型可以利用本领域那些技术人员所熟悉的计算机程序(例如，InsightII，Accelrys，公司(从前的MSI)，或在http://swissmodel.expasy.org)来获得。这些计算机程序可以举例说明并显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示的检查容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，FR残基可以从受体和输入序列中进行选择和组合从而获得所需的抗体特性，诸如对于靶抗原的增加的亲和性。通常，高变区残基直接和最主要地参与影响抗原结合。
[0148]在一个实施方案中，本发明的抗体包括人Fc区域。在特定实施方案中，所述人恒定区是IgG1，如SEQ ID NOs 109和110阐述，和如下所述：
IgG1核苷酸序列(SEQ ID NO：110)
ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGC
ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG
TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT
CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCC
AGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA
GCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA
CTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA
TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG
AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG
CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC
CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA
GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC
CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT
CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT
CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAATGA
IgG1氨基酸序列(SEQ ID NO：109)
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0149]然而，本发明还包括人Fc区域的变体和同种型。例如，适合用于本发明的变体Fc区域可以根据Presta的美国专利号6,737,056(由于一个或多个氨基酸修饰而具有改变的效应子功能的Fc区域变体)；或美国专利申请号60/439,498；60/456,041；60/514,549；或WO 2004/063351(由于氨基酸修饰，具有增加的结合亲和性的变体Fc区域)；或美国专利申请号10/672,280或WO 2004/099249(由于氨基酸修饰，具有改变的与FcγR的结合的Fc变体)中教导的方法生产，这些文献各自通过参考完整地结合于此。
[0150]在另一个实施方案中，根据例如Balint等的美国专利申请公布号2004/0132066(其完整内容通过参考结合于此)描述的方法，将本发明的抗原结合分子改造而具有增强的结合亲和性。
[0151]在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子与另外的部分如放射性标记或毒素缀合。这样的缀合的ABMs可以通过本领域众所周知的许多方法来生产。
[0152]可以将多种放射性核素用于本发明，并且本领域那些技术人员有能力容易地确定哪种核素在多种情况下是最合适的。例如，131碘是用于靶向免疫疗法的众所周知的放射性核素。然而，131碘的临床有效性可以被下列一些因素所限制，其包括：8天生理半衰期；在血液和在肿瘤位点的碘化抗体的脱卤；和会对于在肿瘤中的局部化剂量沉积不是最佳的发射特性(例如，大量γ组成)。随着更好的螯合剂的出现，将金属螯合基团连接于蛋白质的机会已经增加了使用其它的放射性核素诸如111铟和90钇的机会。90钇提供了用于放射性免疫治疗应用中的一些优点：90钇的64小时半衰期足够持久以容许肿瘤聚集抗体，并且不像，例如131碘，90钇是高能量的纯β放射体，并且在其衰变中没有伴随γ辐射，在100-1000个细胞直径的组织范围内。此外，贯穿辐射的最少量容许给门诊病人施用90钇标记的抗体。此外，对于细胞杀伤不需要被标记的抗体的内在化，并且电离辐射的局部发射应该对于缺乏靶抗原的邻近肿瘤细胞是致死性的。
[0153]90钇标记的抗-EGFR抗体的有效单一治疗剂量(即，治疗有效量)的范围在约5和约75mCi之间；更优选地在约10和约40mCi之间。131碘标记的抗-EGFR抗体的有效单一治疗非骨髓消融剂量在约5和约70mCi之间，更优选地在约5和约40mCi之间。131碘标记的抗-EGFR抗体的有效单一治疗消融剂量(即，可能需要自体骨髓移植)的范围在约30和约600mCi之间，更优选地在约50和少于约500mCi之间。结合嵌合的抗-EGFR抗体，由于同鼠抗体相比具有更长的循环半衰期，131碘标记的嵌合抗-EGFR抗体的有效单一治疗非骨髓消融剂量范围在约5和约40mCi之间，更优选地少于约30mCi。对于例如，111铟标记的成像标准典型地少于约5mCi。
[0154]关于放射性标记的抗-EGFR抗体，以其进行的疗法也可以使用单次疗法治疗或使用多次治疗来进行。因为放射性核素成分，优选的是在治疗前，“收集”外周干细胞(＂PSC＂)或骨髓(＂BM＂)用于经历了由辐射引起的潜在致命骨髓毒性的患者。使用标准技术来收集BM和/或PSC，并且接着进行清洗和冷冻用于可能的再输注。此外，最优选的是在治疗前，使用诊断标记的抗体(例如，使用111铟)对患者进行诊断剂量学研究，其目的是确保治疗性标记的抗体(例如，使用90钇)将不会导致在任何正常器官或组织中的不必要的“浓缩”。
[0155]在一个优选的实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括编码具有在下表7中显示的氨基酸序列的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含下表6所示的序列。本发明还涉及分离的核酸，其包括与在下表6中显示的核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的序列。在其他方面，本发明可以将表6中的任何核苷酸序列排除在外。在另一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸，所述核酸包括编码多肽的序列，所述多肽具有与表7中的氨基酸序列有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。本发明还涵盖分离的核酸，其包括编码多肽的序列，所述多肽具有表7中的任一种构建体的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有保守性氨基酸替换。本发明还包括分离的多肽，其包括表7中任一种构建体的氨基酸序列。本发明还包括分离的多肽，其包括与表7中的氨基酸序列有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。本发明还包括分离的多肽，其包括表7中任一种构建体的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有保守性氨基酸替换。在其他方面，本发明可以将表7中的任何氨基酸序列排除在外。
表6
 
构建体 核苷酸序列 SEQ ID NO
ICR62 VH CAGGTCAACCTACTGCAGTCTGGGGCTGCACTGGTGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGTTGTCTTGCAAAGGTTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATACACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGGTATTTTAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAATGAAAAGTTCAAGAGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCACCGATACAGCCTATATGGAGCTTACCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAACCTATTACTGTACAAGACTATCCCCAGGGGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAGCTTCAGTCACTGTCTCCTC 2
I-HHA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTTACATTCACTGACTACGCCATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGAGGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 4
I-HHB CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTTACATTCACTGACTACAAGATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 6
 
构建体 核苷酸序列 SEQ ID NO
I-HHC CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACAATGAAAAGTTCAAGAGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 8
I-HLA CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCGCCGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 10
I-HLB CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATCCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATACTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATGACCGCCGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 12
I-HLC CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATCCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATACTTCAACCCTAACAGCGGTTACAGTACTTACAACGAGAAGTTCAAGAGCCGGGTCACCATGACCGCCGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGGGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 14
 
构建体 核苷酸序列 SEQ ID NO
I-HHD CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTCACATTCACTGACTACAAGATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 16
I-HHE CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTTCACATTCACTGACTACAAGATATCCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 18
I-HHF CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATTCGAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 20
I-HHG CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATGCCACGTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 22
 
构建体 核苷酸序列 SEQ ID NO
I-HLA1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAGCCCAAGCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 24
I-HLA2 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAACGAGAAGTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 26
I-HLA3 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACACATTCACTGACTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAGCCCAAGCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 28
I-HLA4 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACACATTCACTGACTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAACGAGAAGTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 30
 
构建体 核苷酸序列 SEQ ID NO
I-HLA5 CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAACCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTTTACATTCACTGACTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAGCCCAAGCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 32
I-HLA6 CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAACCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAACGAGAAGTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 34
I-HLA7 CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAACCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATCCACTGGGTGCGACAGGCCCGCGGACAACGGCTCGAGTGGATCGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAACGAGAAGTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 36
I-HLA8 CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAACCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATCCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 38
 
构建体 核苷酸序列 SEQ ID NO
I-HLA9 GAGGTGCAGCTCGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGAGTCGTTGAAGATCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTATTCATTCACTGACTACAAGATCCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA 40
I-HLA10 GAGGTGCAGCTCGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGAGTCGTTGAAGATCTCCTGCAAGGGTTCTGGTTATTCATTCACTGACTACAAGATCCACTGGGTGCGACAGATGCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGATGGGCTACTTCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAGCCCAAGCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCCTCAG 120
VH信号序列 ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCC 42
ICR62 VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCATTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTATCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAATTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAACGCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTACACACTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTTGCAGCATAATAGTTTTCCCACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGTACG 44
I-KC GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAACAATTACTTAAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATAATACCAACAACTTGCAGACAGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGCATAATAGTTTTCCCACGTTTGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG 46
VL信号序列 ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGCCTCCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTGCCAGGTGT 48
 
构建体       核苷酸序列                                 SEQ ID NO    
I-KA GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAACAATTACTTAAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATAATACCAACAACTTGCAGACAGGCGTCCCATCAAGGITCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAATACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATIACTGCTTGCAGCATAATAGTTTTCCCACGTTTGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTG                                50
I-KB GATATCCAGATGACCCAGTCTOCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCAAAGCAAGTCAGAATATAACAATTACTTAAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATAATACCAACAACTTGCAGACAGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAATACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAGCATAATAGTTTTCCCACGTTTGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTG                              52
表7
Figure A200780037124D00621
 
构建体 氨基酸序列 SEQ ID NO
I-HLC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGFTFTDYKIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGYSTYNEKFKSRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSS 13
I-HHD OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVROAPGOGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOGTTVTVSS 15
I-HHD-1 OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTDYKIHWVR OAPGOGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 128
I-HHD-2 OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSFTDYKIHWVR OAPGOGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTTTADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 129
I-HHD-3 OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTITDYKIHWVR OAPGQGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTTADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 130
I-HHD-4 QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTEYKIHWVR OAPGOGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 131
I-HHD-5 OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR QAPGOWMGYFTPNSGYSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 132
I-HHD-6 QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR QAPGOGLEWMGYFNANSGYSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 133
I-HHD-7 OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR QAPGOGLEWMGYFNPISGYSTYAOKFOGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOGT TVTVSS 134
I-HHD-8 OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR OAPGOGLEWMGYFNPNSGTSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 135
I-HHD-9 QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR QAPGOGLEWMGYFNPNSGYATYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 136
I-HHD-10 QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR QAPGOGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYGMDAWGOG TTVTVSS 137
 
构建体 氨基酸序列 SEQ ID NO
I-HHD-11 QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR OAPGOGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDVWGOG TTVTVSS 138
I-HHE QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGFTFTDYKISWVR OAPGOGLEWMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 17
I-HHF OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGFTFTDYKIHWVR QAPGQGLEWMGYFNPNSGYSNYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 19
I-HHG OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKGSGFTFTDYKIHWVR QAPGOGLEWMGYFNPNSGYATYAOKFOGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS 21
I-HLA1 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTDYYMHWV ROAPGOGLEWMGWINPNSGYSTYSPSFOGOVTISADKSI STAYLOWSSLKASDTAMYYCARLSPGGYYVMDAWGO GTTVTVSS 23
I-HLA2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGYSTYNEKFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSS 25
I-HLA3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGYSTYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSS 27
I-HLA4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGYSTYNEKFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSS 29
I-HLA5 OMOLVOSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTDYYMHWV RQAPGOGLEWMGWINPNSGYSTYSPSFOGOVTISADKSI STAYLOWSSLKASDTAMYYCARLSPGGYYVMDAWGQ GTTVTVSS 31
I-HLA6 QMOLVOSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTDYYMHWV RQAPGOGLEWMGWINPNSGYSTYNEKFOGOVTISADKS ISTAYLOWSSLKASDTAMYYCARLSPGGYYVMDAWGQ GTTVTVSS 33
I-HLA7 QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVRQARGQRLEWIGWINPNSGYSTYNEKFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSS 35
I-HLA8 QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGYSTYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGQGTTVTVSS 37
Figure A200780037124D00651
[0156]本发明还预期了包括嵌合(例如，人源化)重链可变区的抗原结合分子，所述重链可变区包括与轻链可变区配对的EGFR-特异性CDR，其中所述轻链可变区具有少于10个非人氨基酸残基。在其他实施方案中，所述轻链可变区具有少于9、8、7、6、5、4、3、2、或1个非人氨基酸残基。在优选的实施方案中，所述轻链可变区具有少于2或少于1个(即，无)非人氨基酸残基。在一个实施方案中，所述轻链可变区包括一种或多种人种系可变区基因序列。编码轻链可变区的人种系可变区基因序列是本领域已知的，且可以例如在http://imgt.cines.fr/home.html中存在的IMGT数据库中找到。在优选的实施方案中，所述人种系序列源自VK1_6种系序列。在其他实施方案中，在所述人种系轻链可变区氨基酸序列中的氨基酸残基可以被来自另一种人种系轻链可变区序列的一个或多个残基替换。
[0157]在一个实施方案中，本发明涉及抗原结合分子，所述抗原结合分子包括：选自由下列各项组成的组中的序列：SEQ ID NO.：1；SEQ IDNo：3；SEQ ID No：5；SEQ ID No：7；SEQ ID No：9；SEQ ID No：11；SEQ IDNo：13；SEQ ID No：15；SEQ ID No：17；SEQ ID No：19；SEQ ID No：21；SEQID No：23；SEQ ID No：25；SEQ ID No：27；SEQ ID No：29；SEQ ID No：31；SEQ ID No33；SEQ ID No：35；SEQ ID No：37；SEQ ID No：39；和SEQ IDNo：121，和包括由一种或多种人种系可变基因序列编码的多肽的轻链。在优选的实施方案中，所述人种系序列源自VK1_6种系序列。
[00100]在另一个实施方案中，本发明涉及抗原结合分子，所述抗原结合分子包括：选自由下列各项组成的组中的序列：SEQ ID NO：54，SEQID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：122，和SEQ ID NO：124；(b)选自由下列各项组成的组中的序列：SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ IDNO：92，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：106，和SEQ ID NO：126；(c)SEQ ID NO：108；和(d)包括由一种或多种人种系基因序列编码的轻链可变区的多肽。在特殊的实施方案中，所述人种系序列源自VK1_6种系序列。在另一个实施方案中，所述人种系可变区基因序列包括VK1_6种系基因序列，该VK1_6种系基因序列中的一个或多个氨基酸密码子被来自不同人种系轻链可变区基因序列的序列所替换。
[0158]在其他实施方案中，本发明的抗原结合分子包括本发明的EGFR-特异性重链可变区，和SEQ ID NO：45的变体。在一个实施方案中，所述SEQ ID NO：45的变体包括位于互补决定区(CDR)中的一个或多个位置处的氨基酸替换。在特定的实施方案中，所述替换是位于选自由下列各项组成的组的位置处的氨基酸残基的替换：SEQ ID NO：45的氨基酸位置30；SEQ ID NO：45的氨基酸位置32；SEQ ID NO：45的氨基酸位置34；SEQ ID NO：45的氨基酸位置50；SEQ ID NO：45的氨基酸位置51；SEQ IDNO：45的氨基酸位置52；SEQ ID NO：45的氨基酸位置53；SEQ ID NO：45的氨基酸位置56；SEQ ID NO：45的氨基酸位置94；及其替换的任意组合。在更特定的实施方案中，SEQ ID NO：45中的替换选自由下列各项组成的组：在SEQ ID NO：45的氨基酸位置30处用精氨酸(R)替换天冬酰胺(N)；在SEQ ID NO：45的氨基酸位置32处用色氨酸(W)替换酪氨酸(Y)；在SEQ ID NO：45的氨基酸位置34处用甘氨酸(G)替换天冬酰胺(N)；在SEQ ID NO：45的氨基酸位置50处用苏氨酸(T)替换天冬酰胺(N)；在SEQ ID NO：45的氨基酸位置51处用丙氨酸(A)替换苏氨酸(T)；在SEQID NO：45的氨基酸位置52处用丝氨酸(S)替换天冬酰胺(N)；在SEQ IDNO：45的氨基酸位置53处用丝氨酸(S)替换天冬酰胺(N)；在SEQ IDNO：45的氨基酸位置56处用丝氨酸(S)替换苏氨酸(T)；在SEQ ID NO：45的氨基酸位置94处用酪氨酸(Y)替换苯丙氨酸(F)；及其任意组合。在特殊的实施方案中，将SEQ ID NO：45中的所有这些氨基酸残基替换引入到单轻链变体中。在优选的实施方案中，包括所述轻链变体的抗原结合分子，所述轻链变体具有对ICR62CDR的氨基酸替换，在该轻链变体与包括本发明重链可变区的多肽配对时，保持与EGFR的特异性结合(与包括包含SEQ ID NO：45序列的轻链可变区的抗原结合分子相比时)。本发明还涉及编码任意上述多肽和/或抗原结合分子的多核苷酸，和包括所述多核苷酸和/或多肽的宿主细胞和/或载体。本发明还涉及上述抗原结合分子，其具有药用载体。
[0159]本发明还预期了包括人重链可变区的抗原结合分子，所述重链可变区包括EGFR-特异性CDR，其中所述重链可变区具有少于10个非人氨基酸残基，且其中所述抗原结合分子特异性结合EGFR。在其他实施方案中，所述重链可变区具有少于9、8、7、6、5、4、3、2、或1个非人氨基酸残基。在优选的实施方案中，所述轻链可变区具有少于5个非人氨基酸残基。在一个实施方案中，所述重链可变区包括一种或多种人种系可变区基因序列。编码重链可变区的人种系可变区基因序列是本领域已知的，且可以例如在http://imgt.cines.fr/home.html中存在的IMGT数据库中找到。在一个实施方案中，所述人种系序列源自VK1_10种系序列。在其他实施方案中，在所述人种系重链可变区氨基酸序列中的氨基酸残基可以被来自另一种人种系重链可变区序列的一个或多个残基替换。在优选的实施方案中，包括重链变体的抗原结合分子，所述重链变体在ICR62重链CDR中的具有氨基酸替换，在该重链变体与包括与EGFR结合的轻链可变区(例如本发明的轻链可变区)的多肽配对时，保持与EGFR的特异性结合。本发明还涉及编码任意上述多肽和/或抗原结合分子的多核苷酸，和包括所述多核苷酸和/或多肽的宿主细胞和/或载体。本发明还涉及上述抗原结合分子，其具有药用载体。
[0160]在另一个实施方案中，本发明涉及表达载体和/或宿主细胞，其包括一种或多种本发明的分离的多核苷酸。
[0161]一般而言，任何类型的培养的细胞系可以用于表达本发明的ABM。在一个优选的实施方案中，将HEK293-EBNA细胞，CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，其它哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，或植物细胞用作背景细胞系以产生本发明的被改造的宿主细胞。
[0162]本发明的ABMs的治疗功效可以通过将它们在这样的宿主细胞中产生来得以增加，所述宿主细胞还表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸。在优选的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包括高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。在另一个优选的实施方案中，在宿主细胞中表达本发明的ABMs导致了具有增加的Fc受体结合亲和性和增加的效应子功能的ABMs，所述宿主细胞表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明涉及这样的宿主细胞，所述宿主细胞包括(a)包括编码具有GnTIII活性的多肽的序列的分离的核酸；和(b)编码本发明的ABM的分离的多核苷酸，所述ABM诸如结合人EGFR的嵌合的、灵长类化或人源化的抗体。在优选的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化结构域的融合多肽，并且该高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II的定位结构域。产生这样的融合多肽的方法和使用它们产生具有增加的效应子功能的抗体的方法公开于美国临时专利申请号60/495,142和美国专利申请公布号2004/0241817A1，将其各自的全部内容特别并入本文作为参考。在另一个优选的实施方案中，嵌合的ABM是嵌合的抗体或其片段，其具有大鼠ICR62抗体的结合特异性。在特别优选的实施方案中，嵌合抗体包括人Fc。在另一个优选的实施方案中，该抗体被灵长类化或人源化。
[0163]在一个实施方案中，一个或多个编码本发明的ABM的多核苷酸可以在组成型启动子或备选地调节表达系统的控制下进行表达。适合的调节表达系统包括，但不限于，四环素调节的表达系统，可蜕皮素诱导的表达系统，1ac-转换表达系统，可糖皮质激素诱导的表达系统，可温度诱导的启动子系统，和金属硫蛋白金属可诱导表达系统。如果编码本发明的ABM的一些不同核酸被包括在宿主细胞系统中，它们中的一些可以在组成型启动子的控制下进行表达，而其它的可以在调节启动子的控制下进行表达。认为最大表达水平是稳定的多肽表达的最高可能水平，其对细胞生长速率不具有显著的不利影响，并且将使用常规实验进行测定。表达水平通过本领域通常了解的方法进行确定，所述方法包括使用特异于ABM的抗体或特异于融合ABM的肽标签的抗体进行的蛋白质印迹分析；和RNA印迹分析。在另外的备选方案中，多核苷酸可以操作性地连接于报道基因；具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性的嵌合(例如，人源化)ABM的表达水平通过测量与报道基因的表达水平相关的信号来进行确定。报道基因可以与编码所述融合多肽的核酸一起被转录为单个mRNA分子；它们各自的编码序列可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或通过不依赖帽的翻译增强子(CITE)进行连接。该报道基因可以与至少一个编码嵌合(例如，人源化)ABM的核酸一起翻译从而形成单一的多肽链，所述ABM具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性。编码本发明的ABMs的核酸可以在单一启动子控制下操作性地连接于报道基因从而使编码融合多肽的核酸和报道基因转录成RNA分子，所述RNA分子可变剪接成两个单独的信使RNA(mRNA)分子；得到的mRNAs之一翻译成所述报告蛋白，而另一个被翻译成所述融合多肽。
[0164]本领域那些技术人员众所周知的方法可以用于构建表达载体，所述表达载体包含具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性的ABM的编码序列以及适合的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。见，例如，描述在Maniatis等，分子克隆实验手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约(1989)和Ausubel等，分子生物学通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene PublishingAssociates和Wiley Interscience，纽约(1989)中的技术。
[0165]多种宿主表达载体系统可以用于表达本发明的ABMs的编码序列。优选地，将哺乳动物细胞用作用重组质粒DNA或黏粒DNA表达载体转染的宿主细胞系统，所述重组质粒DNA或黏粒DNA表达载体包含目标蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列。最优选地，将HEK293-EBNA细胞，CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，其它哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，或植物细胞用作宿主细胞系统。表达系统和选择方法的一些实例描述在下列参考文献，及其中的参考文献中：Borth等，生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioen.)71(4)：266-73(2000-2001)，Werner等，Arzneimittelforschung/DrugRes.48(8)：870-80(1998)，Andersen和Krummen，当前生物技术观点(Curr.Op.Biotechnol.)13：117-123(2002)，Chadd和Chamow，当前生物技术观点(Curr.Op.Biotechnol.)12：188-194(2001)，和Giddings，当前生物技术观点(Curr.Op.Biotechnol.)12：450-454(2001)。在备选的实施方案中，可以使用其它的真核生物宿主细胞系统，包括用重组酵母表达载体转化的酵母细胞，所述表达载体包含本发明的ABM的编码序列，如在美国专利申请号60/344,169和WO 03/056914中教导的表达系统(用于在非人真核宿主细胞中生产类人糖蛋白的方法)(其各自的内容通过参考完整结合于此)；用重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，所述病毒表达载体包含嵌合ABM的编码序列，所述嵌合ABM具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性；用重组的病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统，所述质粒表达载体包含本发明的ABM的编码序列，包括但不限于在以下文献中教导的表达系统：美国专利号6,815,184(从遗传改造的浮萍表达和分泌生物活性多肽的方法)；WO 2004/057002(通过导入糖基转移酶基因在苔藓植物细胞中生产糖基化蛋白)和WO 2004/024927(在苔藓原生质体中生产胞外异源非植物蛋白的方法)；和美国专利申请号60/365,769，60/368,047，和WO 2003/078614(在包含功能性哺乳动物GnTIII酶的转基因植物中的糖蛋白加工)(其各自的内容通过参考完整结合于此)；或用重组病毒表达载体(例如腺病毒，痘苗病毒)感染的动物细胞系统，包括被改造从而包含编码嵌合ABM的DNA的多个拷贝的细胞系，所述嵌合ABM具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性，所述DNA的多个拷贝稳定扩增(CHO/dhfr)或在双-微染色体(例如，鼠细胞系)中不稳定扩增。在一个实施方案中，包含编码本发明的ABM的多核苷酸的载体是多顺反子的。此外，在一个实施方案中，上面讨论的ABM是抗体或其片段。在一个优选的实施方案中，该ABM是人源化的抗体。
[0166]对于本发明的方法而言，稳定的表达通常优选进行瞬时表达，因为其典型地获得更可再现的结果并且对于大规模生产也是易于控制的。优于使用包含病毒的复制起点的表达载体，宿主细胞可以用受适合的表达控制元件(例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的各自的编码核酸，和可选择的标志物转化。在引入外源DNA后，被改造的细胞可以容许在富集培养基中生长1-2天，并接着转到选择性培养基中。在重组质粒中的可选择标志物赋予对于选择的抗性并容许细胞的选择，所述细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长形成转化灶，其又可以克隆和扩增成细胞系。
[0167]可以使用许多种选择系统，包括，但不限于，单纯疱疹病毒的胸苷激酶(Wigler等，细胞(Cell)11：223(1977))，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48：2026(1962))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，细胞(Cell)22：817(1980))基因，它们分别可以用在tk-，hgprt-或aprt-细胞中。此外，抗代谢物抗性可以用作对于下列的选择的基础：赋予针对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(Wigler等，美国国家科学院(Natl.Acad.Sci.USA)77：3567(1989)；O′Hare等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78：1527(1981))；赋予针对霉酚酸的抗性的gpt基因(Mulligan & Berg，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78：2072(1981))；赋予针对氨基糖苷G-418的抗性的neo基因(Colberre-Garapin等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)150：1(1981))；和赋予针对潮霉素的抗性的hygro基因(Santerre等，基因(Gene)30：147(1984)。最近，已经描述了另外的可选择基因，即容许细胞使用吲哚替换色氨酸的trpB基因；容许细胞使用组氨醇替换组氨酸的hisD(Hartman & Mulligan，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：8047(1988))；谷氨酰胺合成酶系统；和赋予针对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO的抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue，在：分子生物学的当前通讯(CurrentCommunications in Molecular Biology)，冷泉港实验室版本(Cold SpringHarbor Laboratory ed.)(1987)中)。
[0168]本发明还涉及修饰由宿主细胞产生的本发明的ABMs的糖基化模式的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中表达编码本发明的ABM的核酸和编码具有GnTIII活性的多肽的核酸或包括这些核酸的载体。优选地，修饰的多肽是IgG或其片段，所述IgG或其片段包含Fc区域。在特别优选的实施方案中，该ABM是人源化的抗体或其片段。在另一个实施方案中，本方法还包括在宿主细胞中表达编码具有第二糖基转移酶活性的多肽的核酸。在特定的实施方案中，所述第二糖基转移酶活性是甘露糖苷酶II(ManII)。
[0169]由本发明的宿主细胞产生的被修饰的ABMs作为修饰的结果，显示出增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。在特别优选的实施方案中，该ABM是包含Fc区域的人源化的抗体或其片段。优选地，增加的Fc受体结合亲和性是与Fcγ激活受体，诸如FcγRIIIa受体的增加的结合。增加的效应子功能优选地是下列的一个或多个的增加：增加的抗体依赖性细胞毒性作用，增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)，增加的细胞因子分泌，增加的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收，增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性，增加的与NK细胞的结合，增加的与巨噬细胞的结合，增加的与多形核细胞(PMNs)的结合，增加的与单核细胞的结合，增加的靶结合抗体的交联，增加的定向信号传导诱导的程序性细胞调亡，增加的树突细胞成熟，和增加的T细胞初敏。
[0170]本发明还涉及在宿主细胞中产生具有修饰的寡糖的本发明的ABM的方法，所述方法包括(a)在容许产生按照本发明的ABM的条件下，培养被改造从而表达至少一个编码具有GnTIII活性的多肽的核酸的宿主细胞，其中所述具有GnTIII活性的多肽以一定量来进行表达，所述量足以修饰在由所述宿主细胞产生的所述ABM的Fc区域中的寡糖；和(b)分离所述ABM。在优选的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化结构域的融合多肽。在特别优选的实施方案中，该融合多肽还包括高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。
[0171]优选地，高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位结构域。或者，高尔基体定位结构域选自由下列组成的组：甘露糖苷酶I的定位结构域，GnTII的定位结构域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。由本发明的方法产生的ABMs具有增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。优选地，增加的效应子功能是下列的一个或多个：增加的Fc-介导的细胞毒性(包括增加的抗体依赖性细胞毒性作用)，增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)，增加的细胞因子分泌，增加的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收，增加的与NK细胞的结合，增加的与巨噬细胞的结合，增加的与单核细胞的结合，增加的与多形核细胞的结合，增加的定向信号传导诱导的程序性细胞调亡，增加的靶结合抗体的交联，增加的树突细胞成熟，或增加的T细胞初敏。优选地，增加的Fc受体结合亲和性是与Fc激活受体，诸如FcγRIIIa的增加的结合。在特别优选的实施方案中，该ABM是人源化抗体或其片段。
[0172]在另一个实施方案中，本发明涉及嵌合的ABM，其具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性，其通过本发明的方法产生，在所述多肽的Fc区域中具有增加比例的分叉寡糖。考虑这样的ABM涵盖包括Fc区域的抗体和其片段。在优选的实施方案中，该ABM是人源化抗体。在一个实施方案中，在ABM的Fc区域中的分叉的寡糖的百分比是总寡糖的至少50％，更优选地，至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％，并且最优选地是至少90-95％。在另一个实施方案中，通过本发明的方法产生的ABM作为其通过本发明的方法修饰其寡糖的结果在Fc区域中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中，非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少50％，优选地，至少60％到70％，最优选地至少75％。非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的类型。在特别优选的实施方案中，由宿主细胞和本发明的方法产生的ABM在Fc区域中具有增加比例的分叉的，非岩藻糖基化的寡糖。该分叉的、非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的。具体而言，本发明的方法可以用于产生ABMs，其中在ABM的Fc区域中的至少15％，更优选地至少20％，更优选地至少25％，更优选地至少30％，更优选地至少35％的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。本发明的方法还可以用于产生多肽，其中在多肽的Fc区域中的至少15％，更优选地至少20％，更优选地至少25％，更优选地至少30％，更优选地至少35％的寡糖是分叉的杂合非岩藻糖基化的。
[0173]在另一个实施方案中，本发明涉及嵌合ABM，其具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性，被改造从而具有增加的效应子功能和/或增加的Fc受体结合亲和性，其通过本发明的方法产生。优选地，增加的效应子功能是下列的一个或多个：增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性(包括增加的抗体依赖性细胞毒作用)，增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)，增加的细胞因子分泌，增加的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收，增加的与NK细胞的结合，增加的与巨噬细胞的结合，增加的与单核细胞的结合，增加的与多形核细胞的结合，增加的定向信号传导诱导的程序性细胞调亡，增加的靶结合抗体的交联，增加的树突细胞成熟，或增加的T细胞初敏。在优选的实施方案中，增加的Fc受体结合亲和性增加与Fc激活受体，最优选地，FcγRIIIa结合。在一个实施方案中，该ABM是包含Fc区域的抗体，抗体片段，或包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域的融合蛋白。在特别优选的实施方案中，该ABM是人源化抗体。
[0174]本发明还涉及药物组合物，其包括本发明的ABMs和药用载体。
[0175]本发明还涉及将这些药物组合物用在治疗癌症的方法中的应用。具体而言，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明药物组合物。
[0176]本发明还提供产生和使用宿主细胞系统用于产生本发明的ABMs的糖形的方法，所述ABM具有增加的Fc受体结合亲和性，优选地增加的与Fc激活受体的结合，和/或具有增加的效应子功能，所述效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性作用。可以用于本发明的ABMs的糖基改造方法更详细描述于美国专利号6,602,684，美国专利申请公布号2004/0241817 A1，美国专利申请公布号2003/0175884 A1，临时美国专利申请号60/441,307和WO 2004/065540，将其每个的全部内容并入本文作为参考。或者，本发明的ABMs可以进行糖改造从而在Fc区域中具有减少的岩藻糖残基，所述糖改造按照公开于美国专利申请公布号2003/0157108(Genentech)，或EP 1 176 195 A1，WO 03/084570，WO03/085119和美国专利申请公布号2003/0115614，2004/093621，2004/110282，2004/110704，2004/132140(Kyowa)中的技术进行。将这些文献各自的全部内容并入本文作为参考。本发明的糖基改造的ABMs也可以在产生修饰的糖蛋白的表达系统中生产，如在美国专利申请公布号60/344,169和WO03/056914(GlycoFi，公司.)或WO 2004/057002和WO 2004/024927(Greenovation)中教导的那些，这些文献各自的内容通过参考完整地结合于此。
用于制备具有改变的糖基化模式的蛋白质的细胞系的产生
[0177]本发明提供这样的宿主细胞表达系统，其用于产生具有修饰的糖基化模式的本发明的ABMs。特别地，本发明提供这样的宿主细胞系统，其用于产生具有提高的治疗价值的本发明的ABMs的糖形。因此，本发明提供被选择或被改造以用于表达具有GnTIII活性的多肽的宿主细胞表达系统。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。具体而言，这样的宿主细胞表达系统可以进行改造从而包括编码具有GnTIII的多肽的重组核酸分子，其操作性地连接于组成型或调节性启动子系统。
[0178]在一个具体实施方案中，本发明提供宿主细胞，其已经被改造从而表达至少一个编码融合多肽的核酸，所述融合多肽具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。在一个方面，宿主细胞被改造具有这样的核酸分子，所述核酸分子包括编码融合多肽的至少一个基因，所述融合多肽具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。
[0179]在另一个实施方案中，已经将宿主细胞改造为表达编码具有GnTIII活性的多肽的核酸和具有另一种糖基转移酶活性的第二核酸。在特殊的实施方案中，所述第二核酸编码具有甘露糖苷酶(ManII)活性的多肽。
[0180]一般而言，任何类型的培养的细胞系，包括上述讨论的细胞系，可以用作背景来改造本发明的宿主细胞系。在一个优选的实施方案中，将HEK293-EBNA细胞，CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，其它哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，或植物细胞用作背景细胞系以产生本发明的被改造的宿主细胞。
[0181]本发明意欲涵盖任何被改造的宿主细胞，其表达具有GnTIII活性的多肽，包括包含如本文定义的异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。
[0182]一个或数个编码具有GnTIII活性的多肽的核酸可以在组成型启动子，或备选地，调节性表达系统控制下进行表达。这些系统是本领域众所周知的，并且包括上面讨论的系统。如果编码具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的几种不同核酸被包括在宿主细胞系统中，它们中的一些可以在组成型启动子的控制下进行表达，而其它的在调节性启动子的控制下进行表达。具有GnTIII活性的融合多肽的表达水平由本领域通常了解的方法所确定，所述方法包括蛋白质印迹分析，RNA印迹分析，报道基因表达分析或测量GnTIII活性。或者，可以使用结合GnTIII的生物合成产物的凝集素，例如，E4-PHA凝集素。或者，可以使用功能性测定，其测量由这样的细胞生产的抗体介导的增加的Fc受体结合或增加的效应子功能，所述细胞用编码具有GnTIII活性的多肽的核酸进行改造。
表达具有修饰的糖基化模式的蛋白质的转染子或转化体的鉴定
[0183]包含嵌合(例如，人源化)ABM的编码序列并表达生物学活性基因产物的宿主细胞可以通过至少下列四个常规方法进行鉴定；(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(b)“标志物”基因功能的存在或缺乏；(c)如通过各个mRNA转录物在宿主细胞中表达所测量的评估转录的水平；和(d)如通过免疫测定或通过其生物学活性所测量的来检测基因产物，所述嵌合ABM具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性。
[0184]在第一个方法中，嵌合(例如，人源化)ABM的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的存在可以使用包含核苷酸序列的探针，通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交来进行检测，所述嵌合ABM具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性，所述核苷酸序列与各个编码序列，或其部分或衍生物分别具有同源性。
[0185]在第二个方法中，重组表达载体/宿主系统可以基于某些“标志物”基因功能(例如，胸苷激酶活性，对抗生素的抗性，对甲氨蝶呤的抗性，转化表型，在杆状病毒中的包含体形成等)的存在或缺乏来进行鉴定和选择。例如，如果本发明的ABM的编码序列，或其片段，和具有GnTIII活性的多肽的编码序列被插入载体的标志物基因序列中，包含各个编码序列的重组体可以通过标志物基因功能的缺乏而进行鉴定。或者，标志物基因可以在用于控制编码序列的表达的相同或不同启动子控制下与编码序列一起串联排列。响应于诱导或选择的标志物的表达显示本发明的ABM的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的表达。
[0186]在第三个方法中，本发明的ABM的编码区，或其片段，和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的转录活性可以通过杂交测定进行评估。例如，RNA可以使用探针通过RNA印迹来进行分离和分析，所述探针与本发明的ABM的编码序列，或其片段，和具有GnTIII活性的多肽的编码序列，或其特定部分具有同源性。或者，可以对宿主细胞的总核酸进行抽提并测定与这些探针的杂交。
[0187]在第四个方法中，蛋白质产物的表达可以，例如通过蛋白质印迹法，免疫测定诸如放射免疫沉淀法，酶联免疫测定等来进行免疫活性地评估。然而，表达系统成功的最终检验包括检测生物学活性的基因产物。
产生和使用具有增加的效应子功能的ABMs，所述效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性作用
[0188]在优选的实施方案中，本发明提供嵌合的(例如，人源化)ABMs的糖形，所述嵌合的ABMs具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性并具有增加的效应子功能，所述效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性作用。已经在前面描述了抗体的糖基化改造。见，例如美国专利号6,602,684，将其全部内容并入本文作为参考。
[0189]将未缀合的单克隆抗体(mAbs)用于治疗一些类型的癌症的临床试验最近已经产生了令人鼓舞的结果。Dillman，癌症生物疗法和放射药理学(Cancer Biother.& Radiopharm.)12：223-25(1997)；Deo等，今日免疫学(Immunology Today)18：127(1997)。一种嵌合的，未缀合的IgG1已经被批准用于低级或滤泡性的B-细胞非霍奇金氏淋巴瘤。Dillman，癌症生物疗法和放射药理学(Cancer Biother.& Radiopharm.)12：223-25(1997)，而另一种未缀合的mAb，靶向实体乳腺肿瘤的人源化IgG1已经显示了在III期临床试验中的有前景的结果。Deo等，今日免疫学(Immunology Today)18：127(1997)。这两种mAbs的抗原在它们各自的肿瘤细胞中高度表达并且抗体在体外和体内通过效应细胞介导有效的肿瘤破坏。与此相对，许多其它的具有优良肿瘤特异性的未缀合mAbs不能引发在临床上有用的足够潜能的效应子功能。Frost等，癌症(Cancer)80：317-33(1997)；Surfus等，免疫疗法杂志(J.Immunother.)19：184-91(1996)。对于这些弱mAbs中的一些，目前测试了辅助的细胞因子疗法。细胞因子的加入可以通过增加循环淋巴细胞的活性和数量而刺激抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。Frost等，癌症(Cancer)80：317-33(1997)；Surfus等，免疫疗法杂志(J.Immunother.)19：184-91(1996)。ADCC，一种对抗体靶向的细胞的溶胞攻击，在白细胞受体与抗体的恒定区(Fc)结合后得以引发。Deo等，今日免疫学(Immunology Today)18：127(1997)。
[0190]一种增加未缀合的IgG1s的ADCC活性的不同的、但是补充性的方法是改造抗体的Fc区域。蛋白质改造研究已经显示FcγRs与IgG CH2结构域的低级铰链区相互作用。Lund等，免疫学杂志(J.Immunol.)157：4963-69(1996)。然而，FcγR结合也需要在CH2区域中的保守Asn297处共价连接的寡糖的存在。Lund等，免疫学杂志(J.Immunol.)157：4963-69(1996)；Wright和Morrison，生物技术趋势(Trends Biotech.)15：26-31(1997)，提示寡糖和多肽都直接有利于相互作用的位点或需要寡糖来维持活性CH2多肽构象。因此可以开发对寡糖结构的修饰用作增加相互作用亲和性的方式。
[0191]IgG分子在其Fc区域中携带两个N连接的寡糖，每个在各自的重链上。作为任何糖蛋白，抗体作为糖形的群体产生，其共享相同的多肽主链但是具有不同的连接于糖基化位点的寡糖。通常见于血清IgG的Fc区域中的寡糖是复合的双触角的类型(Wormald等，生物化学(Biochemistry)36：130-38(1997)，其具有低水平的末端唾液酸和分叉的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，和不同程度的末端半乳糖基化和核心岩藻糖基化。一些研究显示FcγR结合所需要的最小糖结构位于寡糖核心中。Lund等，免疫学杂志(J.Immunol.)157：4963-69(1996)。
[0192]用于产生未缀合的治疗性mAbs的用在工业和学术界中的小鼠或仓鼠来源的细胞系通常将所需的寡糖决定子连接于Fc位点。然而，在这些细胞系中表达的IgGs，缺乏以低量见于血清IgGs的分叉GlcNAc。Lifely等，糖生物学(Glycobiology)318：813-22(1995)。与此相对，最近观察到大鼠的骨髓瘤产生的，人源化IgG1(CAMPATH-1H)在其糖形的一些中携带分叉的GlcNAc。Lifely等，糖生物学(Glycobiology)318：813-22(1995)。大鼠的细胞衍生的抗体与由标准的细胞系产生的CAMPATH-1H抗体相比，达到了相似的最大体外ADCC活性，但是其以显著更低的抗体浓度存在。
[0193]CAMPATH抗原通常以高水平存在于淋巴瘤细胞上，并且这种嵌合的mAb在缺乏分叉的GlcNAc时具有高ADCC活性。Lifely等，糖生物学(Glycobiology)318：813-22(1995)。在N-联糖基化途径中，分叉的GlcNAc通过GnTIII加入。Schachter，生物化学和细胞生物学(Biochem.CellBiol.)64：163-81(1986)。
[0194]以前的研究使用产生单一抗体的CHO细胞系，其被预先改造从而以外部调节的方式，表达不同水平的克隆的GnT III基因酶(Umana，P.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol.)17：176-180(1999))。这种方法首次在修饰的抗体的GnTIII的表达和ADCC活性之间建立严格的关联。因此，本发明意欲这样的重组的、嵌合抗体或其片段，其具有大鼠ICR62抗体的结合特异性，具有由增加的GnTIII活性所导致的改变的糖基化。增加的GnTIII活性导致在ABM的Fc区域中，分叉的寡糖的百分比中的增加，以及岩藻糖残基的百分比的减少。这种抗体，或其片段，具有增加的Fc受体结合亲和性和增加的效应子功能。此外，本发明涉及抗体片段和融合蛋白，它们包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域。在一个优选实施方案中，所述抗体被人源化。
按照本发明的方法生产的ABMs的治疗性应用
[0195]在广义上，本发明的ABMs可以用于体内或体外靶向表达EGFR的细胞。可以靶向表达EGFR的细胞用于诊断或治疗目的。一方面，本发明的ABMs可以用于检测样品中EGFR的存在。另一方面，本发明的ABMs可以用于抑制或减少在表面上表达EGFR的细胞中EGFR-介导的信号转导。与相同细胞类型的非肿瘤组织相比，EGFR在许多人肿瘤中被异常表达(过表达)。因此，本发明的ABMs特别用于预防肿瘤形成，肿瘤根除和肿瘤生长抑制。通过阻断EGFR配体与EGFR的结合，本发明的ABMs抑制EGF-依赖型肿瘤细胞活化，包括EGFR酪氨酸磷酸化，增加的胞外酸化率，和细胞增殖。本发明的ABMs还用于停滞细胞周期，导致靶细胞(例如肿瘤细胞)的程序性细胞死亡，和抑制血管生成和/或靶细胞的分化。本发明的ABMs可以用于治疗表达EGFR的任何肿瘤。可以用本发明的ABMs治疗的具体恶性肿瘤包括但不限于，表皮和鳞状细胞癌，非小细胞肺癌，胶质瘤，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，乳腺癌，膀胱癌，头颈癌，和肾细胞癌。
[0196]本发明的ABMs可以单独用于体内靶向和杀伤肿瘤细胞。ABMs还可以与适合的治疗剂组合使用以治疗人癌症。例如，该ABMs可以与标准或常规治疗方法诸如化学疗法，放射治疗组合使用或可以缀合或连接于治疗性药物，或毒素，以及淋巴因子或肿瘤抑制生长因子，以将治疗剂递送给癌症位点。非常重要的本发明的ABMs的缀合物是(1)免疫毒素(ABM和细胞毒性部分的缀合物)和(2)标记的(例如，放射性标记的，酶标记的或荧光染料标记的)ABMs，其中该标记提供鉴定包括标记的ABM的免疫复合物的方法。该ABM还可以用于通过天然补体方法来诱导裂解，并且与正常存在的抗体依赖性细胞毒性细胞相互作用。
[0197]免疫毒素的细胞毒性部分可以是细胞毒性药物或细菌或植物起源的酶促活性毒素，或这样的毒素的酶促活性片段(“A链”)。所用的酶促活性毒素及其片段是白喉毒素A链，白喉毒素、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相似豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白IIA链、α-帚曲霉素、光桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序登陆蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦瓜蛋白抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白，sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素，和伊诺毒素的非结合活性片段。在另一个实施方案中，该ABMs与小分子抗癌药物缀合。ABM和这些细胞毒性部分的缀合物使用多种双功能蛋白偶联剂进行制备。这些试剂的实例是SPDP，IT，亚氨酸酯的双功能衍生物诸如二甲基adipimidate盐酸，活性酯诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯，醛诸如戊二醛，二叠氮化合物诸如二-(p-二叠氮苯甲基)己???二胺，二重氮化衍生物诸如二-(p-二重氮苯甲基)-乙二胺，二异硫氰酸酯诸如甲苯基2，6-二异硫氰酸酯，和双活性氟化合物诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。毒素的溶解部分可以连接于ABMs的Fab片段。本领域已知另外的适合毒素，如在例如公开的美国专利申请号2002/0128448中显示的，将其全部内容并入本文作为参考。
[0198]在一个实施方案中，具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性的嵌合的(如人源化的)糖基改造的ABM缀合于蓖麻毒蛋白A链。最有利地，蓖麻毒蛋白A链是脱糖基化并通过重组方式产生的。制备该蓖麻毒蛋白的免疫毒素的有利方法描述于Vitetta等，科学(Science)238，1098(1987)，将其并入作为参考。
[0199]当出于诊断目的，在体外用于杀伤人癌细胞时，该缀合物将典型地以至少约10nM的浓度加入细胞培养基中。配制和进行体外应用的施用方式不是关键的。将通常使用与培养或灌流介质相容的水性制剂。可以通过常规技术来读出细胞毒性以确定癌症的存在或程度。
[0200]如上讨论的，可以通过将放射性的同位素(例如，I，Y，Pr)缀合于嵌合的，糖基改造的ABM而制备细胞毒性的放射性药物以治疗癌症，所述ABM具有与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性。用于本文时，术语“细胞毒性部分”倾向于包括这些同位素。
[0201]在另一个实施方案中，将脂质体填充以细胞毒性药物并将脂质体包被以本发明的ABMs。因为在表达EGFR的恶性细胞的表面上存在许多EGFR分子，该方法容许将大量药物递送给正确的细胞类型。
[0202]将这些治疗剂缀合于抗体的技术是众所周知的(见，例如Arnon等，“癌症治疗中用于免疫靶向药物的单克隆抗体”(＂MonoclonalAntibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy＂)，在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Reisfeld等(版本)，243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)中；Hellstrom等，“用于药物递送的抗体，，(＂Antibodies For Drug Delivery＂)，在受控的药物递送(ControlledDrug Delivery)(第2版)中，Robinson等(版本)，623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒性试剂的抗体载体：综述”(＂Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review＂)，在单克隆抗体’84：生物学和临床应用(Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications)，Pinchera等(版本)，475-506页(1985)中；和Thorpe等，“抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性特性”(＂ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates＂)，免疫学综述(Immunol.Rev.)，62：119-58(1982))。
[0203]另外，本发明的ABMs的其它治疗性应用包括，例如通过重组DNA技术缀合或连接于能够将前药转化成细胞毒性药物的酶，和将抗体-酶缀合物与药物前体(prodrug)组合使用从而在肿瘤位点将药物前体转化成细胞毒性剂(见，例如Senter等，“抗体-碱性磷酸酶的抗-肿瘤作用(＂Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase＂)，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：4842-46(1988)；由单克隆抗体-碱性磷酸酶缀合物引起的磷酸化的Mitocycin C和表鬼臼毒吡喃葡糖苷衍生物的体外和体内抗肿瘤活性的增强”(＂Enhancement of the in vitro and in vivoAntitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivativesby Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates＂)，癌症研究(Cancer Research)49：5789-5792(1989)；和Senter，“由抗体-酶缀合物引起的前药的活化：癌症治疗的新方案”(＂Activation of Prodrugs byAntibody-Enzyme Conjugates：A New Approach to Cancer Therapy，＂)FASEB杂志(FASEBJ.)4：188-193(1990))。
[0204]此外，本发明的ABMs的另外的治疗性应用，包括，在存在补体的情况下使用未缀合的，或作为抗体-药物或抗体毒素缀合物的部分从而从癌症患者的骨髓中去除肿瘤细胞。按照该方法，可以通过用抗体处理并将骨髓输注回患者来对自体骨髓进行离体清洗[见，例如Ramsay等，“利用单克隆抗体的骨髓净化”(＂Bone Marrow Purging Using MonoclonalAntibodies＂)，临床免疫学杂志(J.Clin.Immunol.)，8(2)：81-88(1988)]。
[0205]此外，考虑本发明包括单链免疫毒素，其包括容许与大鼠ICR62抗体基本相同的结合特异性的抗原结合结构域(例如，包括大鼠ICR62抗体的CDRs的多肽)和另外包括毒素多肽。本发明的单链免疫毒素可以用于体内治疗人癌症。
[0206]类似地，可以将融合蛋白用于体内治疗人癌症，所述融合蛋白包括与第二蛋白的至少功能活性部分连接的本发明的ABM的至少抗原结合区，所述第二蛋白具有抗肿瘤活性，例如淋巴因子或制癌蛋白。
[0207]本发明提供用于选择性杀伤表达EGFR的肿瘤细胞的方法。该方法包括将本发明的免疫缀合物(例如，免疫毒素)与所述肿瘤细胞反应。这些肿瘤细胞可以来自人癌症。
[0208]此外，本发明提供体内治疗癌症(例如，人癌症)的方法。该方法包括将药用有效量的组合物施用于受试者，所述组合物包括至少一种本发明的免疫缀合物(如免疫毒素)。
[0209]在另一个方面，本发明涉及一种改善的方法，该方法用于治疗其中EGFR被表达的细胞增殖性病症，特别是其中EGFR被异常表达(例如过表达)的病症，包括膀胱癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，皮肤癌，和肾癌，所述方法包括将治疗有效量的本发明的ABM施用于需要其的人受试者。在优选的实施方案中，该ABM是具有与大鼠ICR62抗体的结合特异性基本相同的结合特异性的糖基改造的抗-EGFR抗体。在另一个优选的实施方案中，该抗体是人源化的。在另一个优选的实施方案中，该人源化的抗体包括修饰的CDR，其包括位于除保持结合活性所必需的那些(例如，SDR)外任意位置处的替换。通过本发明的ABM可以治疗的细胞增殖性病症的实例包括但不限于，位于以下部分的肿瘤：腹部，骨，乳腺，消化系统，肝脏，胰腺，腹膜，内分泌腺(肾上腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼睛，头和颈，神经系统(中枢和外周)，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾脏，胸部，和泌尿生殖系统。
[0210]类似地，通过本发明的ABMs也可以治疗其它细胞增殖性病症。这些细胞增殖性病症的实例包括但不限于：高丙球蛋白血症，淋巴增殖性病症，病变蛋白血，紫癜，结节病，赛塞利综合征，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，戈谢病，组织细胞增多病，和其它任何细胞增殖性疾病，包括瘤形成，位于以上列出的器官系统内。
[0211]按照本发明的实践，受试者可以是人，马，猪，牛，鼠，犬，猫，和禽受试者。其它的温血动物也包括在本发明中。
[0212]本发明还提供用于抑制人肿瘤细胞的生长的方法，治疗受试者中肿瘤的方法，和治疗受试者中增殖型疾病的方法。这些方法包括向受试者施用有效量的本发明的组合物。
[0213]本发明进一步涉及治疗哺乳动物中非恶性疾病或病症的方法，所述疾病或病症其特征在于EGFR或一种或多种EGFR配体的异常活化或生产，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本发明的ABMs。受试者通常具有表达EGFR的细胞，例如在其患病组织中，因此本发明的ABMs能够结合受试者内的细胞。
[0214]EGFR或EGFR配体的异常活化或表达可以在受试者细胞内发生，例如在受试者的患病组织中。EGFR的异常活化可以归因于EGFR和/或EGFR配体的扩增，过表达或异常生产。在本发明的一个实施方案中，进行诊断或预后测定来确定受试者是否发生EGFR(或EGFR配体)的异常生产或活化。例如，可以测定EGFR和/或配体的基因扩增和/或过表达。本领域可提供用于测定该扩增/过表达的各种测定，并且包括IHC，FISH和以上描述的shed抗原测定。备选地，或另外地，按照已知方法可以测定样品中或与样品相关的EGFR配体如TGF-α的水平。该测定可以检测待测样品中的蛋白质和/或编码它的核酸。在一个实施方案中，样品中的EGFR配体水平可以使用免疫组织化学(IHC)测定；参见，例如Scher等临床癌症研究(Clin.Cancer Research)1：545-550(1995)。备选地，或另外地，例如通过FISH，DNA印迹，或PCR技术，可以评估待测样品中编码EGFR的核酸的水平。
[0215]此外，EGFR或EGFR配体过表达或扩增可以使用体内诊断测定评估，例如通过施用结合待检测分子并用可检测标记(例如放射性同位素)标记的分子(如抗体)和外部扫描患者的标记定位。
[0216]备选地，在患者中，例如在其患病组织中，在治疗前，可以检测EGFR杂二聚体，特别是EGFR-ErbB2，EGFR-ErbB3或EGFR-ErbB4杂二聚体。可获得各种方法来检测非共价蛋白-蛋白相互作用或者另外指示目标蛋白之间的邻近。检测EGFR杂二聚体的例举方法包括但不限于，基于免疫亲和性的方法，如免疫沉淀法；荧光共振能量转移(FRET)(Selvin，自然结构生物学(Nat.Struct.Biol.)7：730-34(2000)；Gadella & Jovin，细胞生物学杂志(J.CellBiol.)129：1543-58(1995)；和Nagy等，细胞计数(Cytometry)32：120-131(1998))；EGFR与ErbB2或ErbB3的共定位，使用标准直接或间接免疫荧光技术和共焦激光扫描显微术；激光扫描成像(LSI)，以高通量格式检测抗体结合和EGFR与ErbB2或ErbB3的共定位，如微孔平板(Zuck等，美国国家科学院学报(Proc、Natl.Acad.Sci.USA)96：11122-11127(1999))；或eTag/m分析系统(Aclara Bio Sciences，MountainView，Calif.；和美国专利申请2001/0049105，公开日期为2001年12月6日)。
[0217]因此，显而易见的是，本发明涵盖药物组合物，组合和方法来治疗人恶性肿瘤，如膀胱癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，皮肤癌和肾癌。例如，本发明包括用于治疗人恶性肿瘤的药物组合物，其包括药学上有效量的本发明的抗体和药用载体。
[0218]本发明的ABM组合物可以使用常规给药方式进行施用，所述方式包括，但不限于，静脉内、腹膜内、口服、淋巴内或直接施用于肿瘤中。静脉内施用是优选的。
[0219]在本发明的一个方面，以冻干制剂或水溶液形式存在的包含本发明的ABMs的治疗性制剂通过将具有所需纯度的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷明顿制药科学(
Figure A200780037124D0086164647QIETU
)，第16版，Osol，A.版本(1980))混和来进行制备以用于贮存。可接受的载体，赋形剂，或稳定剂在所用的剂量和浓度上对于受者是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化已烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环已醇；3-戊醇；和间甲苯酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它的糖，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；鳌合剂诸如EDTA；糖诸如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂诸如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
[0220]本发明的ABMs可以单独或在联合治疗中与例如化学治疗剂和/或放射性疗法一起施用于受试者以治疗其特征在于异常EGFR或EGFR配体活性的疾病或病症，如肿瘤。例举性的抗-EGFR抗体制剂在Herbst和Shen，癌症(Cancer)94(5)：1593-1611中描述。适当的化学治疗剂包括顺铂，多柔比星，托泊替康，紫杉醇，长春碱，卡铂，和依托泊苷。
[0221]适合用于皮下给药的冻干制剂在WO97/04801中描述。这些冻干制剂可以用适当的稀释剂重建至高蛋白浓度，并且重建的制剂可以皮下施用于本文待治疗的哺乳动物。
[0222]根据被治疗的具体适应症的需要，本文的制剂也可以含有多于一种的活性化合物，优选具有互补活性而不彼此不利影响的那些。例如，可能理想的是另外提供细胞毒剂，化学治疗剂，细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的一种，如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的一种)。这些其它试剂的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的量，疾病或病症或治疗的类型，和以上讨论的其它因素。这些通常以相同剂量和以上文所用的给药途径使用或迄今使用的剂量的约1至99％使用。
[0223]活性成分还可以被包裹在，例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开在雷明顿制药科学第16版(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition)，Osol，A.版本(1980)中。
[0224]可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的适合的实例包括包含拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质以成形制品，例如薄膜，或微胶囊的形式存在。持续释放的基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙立德组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
[0225]用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过过滤通过无菌过滤膜来容易地实现。
[0226]本发明的组合物可以以多种剂型存在，所述剂型包括，但不限于，液体溶液或混悬液，片剂，丸剂，粉末剂，栓剂，聚合物微胶囊或微泡，脂质体，和可注射的或可输注的溶液。优选的形式取决于施用和治疗应用的方式。
[0227]本发明的组合物还优选地包括本领域已知的常规药用载体和佐剂诸如人血清白蛋白，离子交换剂，钒土，卵磷脂，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸，抗坏血酸，山梨酸钾，和盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白。
[0228]用于本发明的药物组合物的最有效施用方式和剂量方案取决于疾病的严重性和进程，患者的健康和对治疗的反应，以及主治医师的判断。因此，对个体患者应该对该组合物的剂量进行滴定。然而，本发明的组合物的有效剂量将通常在约0.01到约2000mg/kg的范围内。在一个实施方案中，有效剂量在约1.0mg/kg至约15.0mg/kg的范围内。在更具体的实施方案中，剂量在约1.5mg/kg至约12mg/kg的范围内。在其它实施方案中，剂量在约1.5mg/kg至约4.5mg/kg，或约4.5mg/kg至约12mg/kg的范围内。本发明的剂量也可以是这些范围内的任何剂量，包括但不限于，1.0mg/kg，1.5mg/kg，2.0mg/kg，2.5mg/kg，3.0mg/kg，3.5mg/kg，4.0mg/kg，4.5mg/kg，5.0mg/kg，5.5mg/kg，6.0mg/kg，6.5mg/kg，7.0mg/kg，7.5mg/kg，8.0mg/kg，8.5mg/kg，9.0mg/kg，9.5mg/kg，10.0mg/kg，10.5mg/kg，11.0mg/kg，11.5mg/kg，12.0mg/kg，12.5mg/kg，13.0mg/kg，13.5mg/kg，14.0mg/kg，14.5mg/kg，或15.0mg/kg。
[0229]本文所述的分子可以以多种剂型存在，所述剂型包括，但不限于，液体溶液或混悬液，片剂，丸剂，粉末剂，栓剂，聚合物微胶囊或微泡，脂质体，和可注射的或可输注的溶液。优选的形式取决于施用和治疗应用的方式。
[0230]本发明的剂量在一些情形中可以通过使用预测性生物标记来确定。预测性生物标记是用于确定(即，观察和/或定量)肿瘤相关基因或蛋白，或肿瘤相关信号传导途径的细胞组分的表达和/或活化模式的分子标记。阐述肿瘤组织中靶向治疗的生物学效果和将这些效果与临床应答关联，帮助鉴定在肿瘤中主要的生长和生存途径，由此确立可能的应答模式和相反地提供理论来设计克服抗性的策略。例如抗-EGFR疗法的生物标记可以包括在导致细胞增殖病症的EGFR下游信号传导途径中的分子，包括但不限于Akt，RAS，RAF，MAPK，ERK1，ERK2，PKC，STAT3，STAT5(Mitchell，自然生物技术(Nature Biotech.)22：363-364(2004)；Becker，自然生物技术(Nature Biotech.)22：15-18(2004)；Tsao和Herbst，信号(Signal)4：4-9(2003))。抗-EGFR疗法的生物标记还包括生长因子受体如EGFR，ErbB-2(HER2/neu)，和ErbB-3(HER3)，并且可以是患者对抗-EGFR疗法的阳性或阴性预测物。例如，生长因子受体ErbB-3(HER3)被确定为抗-EGFR抗体ABX-EGF的阴性预测性生物标记(美国专利申请公布号2004/0132097 A1)。
[0231]预测性生物标记可以通过本领域公知的细胞测定来测量，包括但不限于免疫组织化学，流式细胞术，免疫荧光，捕获-和-检测测定，和反相测定，和/或在美国专利申请公布号2004/0132097 A1(其全部内容通过参考结合于此)中列出的测定。抗-EGFR疗法的预测性生物标记它们本身可以按照美国专利申请公布号2003/0190689A1(其全部内容通过参考结合于此)中阐述的技术进行鉴定。
[0232]一方面，本发明提供治疗EGFR-相关病症的方法，该方法包括通过在治疗之前用一种或多种试剂分析来自人受试者的样品来预测需要治疗的人受试者中对抗-EGFR治疗的响应，所述试剂检测针对EGFR-相关病症如癌症的预测性生物标记的表达和/或活化；确定一个或多个所述预测性生物标记的表达和/或活化模式，其中所述模式预测所述人受试者对抗-EGFR治疗的响应；和向人受试者施用治疗有效量的包含本发明的ABM的组合物，所述人受试者被预测确实(positively)响应所述抗-EGFR治疗。如本文所用，被预测确实响应抗-EGFR治疗的人受试者是对其抗-EGFR将对EGFR-相关病症(例如，肿瘤消退/收缩)具有可测量效果和抗-EGFR治疗的益处不被副作用(例如，毒性)超过的人受试者。如本文所用，样品是指来自组织、特别是人的任何生物学样品，包括一个或多个细胞，包括任何来源的单个细胞，已经从器官(如乳房，肺，胃肠道，皮肤，子宫颈，卵巢，前列腺，肾，脑，头和颈，活身体的其它任何器官或组织)摘除的组织或活组织检查样品，和其它身体样品，包括但不限于涂片，痰，分泌物，脑脊髓液，胆汁，血液，淋巴液，尿液和粪便。
[0233]包括本发明的ABM的组合物将以与良好的医疗实践保持一致的方式来进行配制、给药和施用。在该环境中考虑的因素包括被治疗的具体疾病或病症，被治疗的具体哺乳动物，个体患者的临床条件，疾病或病症的起因，递送该试剂的位点，施用的方法，施用的时间表，和执业医生已知的其它因素。待施用的拮抗剂的治疗有效量将由这些考虑因素所支配。
[0234]作为一般的建议，每剂量中肠胃外施用的抗体的治疗有效量将在约0.1到20mg/kg患者体重/日范围内，其中所用的拮抗剂的典型起始范围在约2到10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，所述治疗有效量在约1.0mg/kg至约15.0mg/kg的范围内。在更具体的实施方案中，剂量在约1.5mg/kg至约12mg/kg的范围内。在其它实施方案中，剂量在约1.5mg/kg至约4.5mg/kg，或约4.5mg/kg至约12mg/kg范围内。本发明的剂量也可以是这些范围内的任何剂量，包括但不限于，1.0mg/kg，1.5mg/kg，2.0mg/kg，2.5mg/kg，3.0mg/kg，3.5mg/kg，4.0mg/kg，4.5mg/kg，5.0mg/kg，5.5mg/kg，6.0mg/kg，6.5mg/kg，7.0mg/kg，7.5mg/kg，8.0mg/kg，8.5mg/kg，9.0mg/kg，9.5mg/kg，10.0mg/kg，10.5mg/kg，11.0mg/kg，11.5mg/kg，12.0mg/kg，12.5mg/kg，13.0mg/kg，13.5mg/kg，14.0mg/kg，14.5mg/kg，或15.0mg/kg。
[0235]在一个优选的实施方案中，该ABM是抗体，优选地是人源化的抗体。这种未缀合的抗体的适合的剂量在，例如，约20mg/m2到约1000mg/m2的范围内。例如，可以向患者施用一次或多次基本少于375mg/m2的抗体的剂量，例如其中该剂量在约20mg/m2到约250mg/m2的范围内，例如从约50mg/m2到约200mg/m2的范围内。
[0236]而且，可以施用一次或多次起始剂量的抗体，随后施用一次或多次随后的剂量，其中在随后的剂量中的抗体的mg/m2剂量的量超过在起始剂量中的抗体的mg/m2剂量的量。例如，起始剂量可以在约20mg/m2到约250mg/m2(例如，从约50mg/m2到约200mg/m2)的范围内，并且随后的剂量可以在约250mg/m2到约1000mg/m2的范围内。
[0237]然而，如上指出，ABM的这些建议量要进行大量的治疗性判断。在选择适当的剂量和时间表中的关键因素是如上所示的获得的结果。例如，起初可能需要相对更高的剂量用于进行中的和急性疾病的治疗。为了获得最有效的结果，取决于疾病或病症，将拮抗剂在尽可能接近于疾病或病症的首次症状，诊断，征兆或发生的时候施用或在疾病或病症减轻的时候进行施用。
[0238]在用于治疗肿瘤的抗-EGFR抗体的情形中，以足以完全饱和靶细胞上的EGF受体的剂量通常获得最佳的治疗结果。获得饱和所需的剂量将取决于每个肿瘤细胞表达的EGF受体的数目(其可以在不同肿瘤类型之间显著变化)。低至30nM的血清浓度已经在治疗一些肿瘤中有效，而100nM以上的浓度可能对于其它肿瘤获得最佳治疗效果是必需的。对于给定肿瘤获得饱和所需的剂量可以容易地通过放射免疫测定或免疫沉淀法体外测定。
[0239]通常，对于与放射的联合治疗，一种适当的治疗方案包括8周输注本发明的抗-EGFR ABM，装载剂量为100-500mg/m2，接着100-250mg/m2的维持剂量和每天2.0Gy剂量的70.0Gy的量的辐射。对于与化学疗法的组合疗法，一种适当的治疗方案包括施用本发明的抗-EGFRABM，装载/维持剂量为每周100/100mg/m2，400/250mg/m2，或500/250mg/m2，联合每三周100mg/m2剂量的顺铂。备选地，可以使用吉西他滨或伊立替康替代顺铂。
[0240]通过任何适合的方式来施用本发明的ABM，所述方式包括肠胃外，皮下，腹膜内，intrapulinonary，和鼻内，和如果对于局部免疫抑制性治疗是需要而言，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。此外，拮抗剂可以通过脉冲输注，例如以下降剂量的拮抗剂来适当地施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的，优选地，将给药通过输注，最优选地静脉内或皮下注射进行。
[0241]可以与本文的拮抗剂一起，施用其它的化合物，诸如细胞毒性剂，化学治疗剂，免疫抑制剂和/或细胞因子。组合的施用包括使用单独的制剂或单独的药物制剂的共同施用，和以任一顺序的连续施用，其中优选地，在两种(或所有的)活性剂同时发挥它们的生物学活性的时候，存在时间周期。
[0242]将清楚的是实现治愈所需要的本发明的组合物的剂量可以随时间表优化进一步地减少。
[0243]按照本发明的实践，药用载体可以是脂质载体。该脂质载体可以是磷脂。此外，脂质载体可以是脂肪酸。此外，脂质载体可以是去污剂。用于本文时，去污剂是改变液体的表面张力，通常是降低其的任何物质。
[0244]在本发明的一个实例中，所述去污剂可以是非离子型去污剂。非离子型去污剂的实例包括，但不限于，聚山梨醇酯80(也称为吐温80或(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯)，Brij，和Triton(例如Triton WR-1339和Triton A-20)。
[0245]或者，所述去污剂可以是离子型去污剂。离子型去污剂的实例包括，但不限于，烷基三甲基溴化铵。
[0246]另外，根据本发明，所述脂质载体可以是脂质体。如本申请中所用的，“脂质体”是任何膜束缚的囊泡，其包含本发明的任何分子或其组合。
[0247]在还有的另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的ABM，其用作药物，特别是用于治疗或预防癌症或用于癌前病症或病变(lesion)。癌症可以是例如肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织癌，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，慢性或急性白血病，淋巴细胞淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，脊椎轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，成髓细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种活多种上述癌症的组合。癌前病症或病变包括，例如，由下列各项组成的组：口腔白斑，光化性角化病(日光性角化病)，结肠或直肠的癌前息肉，胃上皮发育异常，腺瘤发育异常，遗传性非息肉结肠癌综合征(HNPCC)，巴雷特食管，膀胱发育异常，和癌前子宫颈病症。
[0248]优选地，所述癌症选自由下列各项组成的组：乳腺癌，膀胱癌，头&颈癌，皮肤癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，和脑癌。
[0249]还有另一个实施方案是根据本发明的ABM在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或预防癌症。癌症如上定义。
[0250]优选地，所述癌症选自由下列各项组成的组：乳腺癌，膀胱癌，头颈癌，皮肤癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，和脑癌。
[0251]还优选地，所述抗原结合分子以约1.0mg/kg至约15mg/kg的治疗有效量使用。
[0252]还更优选地，所述抗原结合分子以约1.5mg/kg至约12mg/kg的治疗有效量使用。
[0253]还更优选地，所述抗原结合分子以约1.5mg/kg至约4.5mg/kg的治疗有效量使用。
[0254]还更优选地，所述抗原结合分子以约4.5mg/kg至约12mg/kg的治疗有效量使用。
[0255]最优选地，所述抗原结合分子以约1.5mg/kg的治疗有效量使用。
[0256]还最优选地，所述抗原结合分子以约4.5mg/kg的治疗有效量使用。
[0257]还最优选地，所述抗原结合分子以约12mg/kg的治疗有效量使用。
[0258]在另一个实施方案中，本发明涉及在需要其治疗的哺乳动物中治疗EGFR-相关病症的方法，该方法包括向哺乳动物施用本发明的ABM，其中治疗导致所述ABM的血清浓度在约1和约500μg/ml之间达至少4周的时间，并且其中所述治疗在所述哺乳动物中不导致临床显著水平的毒性。在其它实施方案中，血清浓度是选自由下列各项组成的组的量：1μg/ml以上，25μg/ml以上，50μg/ml以上，100μg/ml以上，200μg/ml以上，300μg/ml以上，400μg/ml以上，500μg/ml以上，在约1和约100μg/ml之间，在约1和约200μg/ml之间，在约1和约300μg/ml之间，在约1和约400μg/ml之间，和在约1和约500μg/ml之间。在一个优选实施方案中，哺乳动物是人。在一个实施方案中，ABM是抗体。在一个优选实施方案中，抗体是糖基改造的并且与非糖基改造的抗体形式相比，具有增加的FcγRIII结合。
[0259]在一方面，本发明涉及特异性结合EGFR的抗原结合分子(ABM)，其中所述ABM还包括免疫球蛋白Fc区域或其片段，且其中将Fc区域或其片段糖基改造为与非-糖基化形式相比，具有增强的效应子功能。在特殊的实施方案中，所述效应子功能是增强的Fc-介导的细胞毒性。
[0260]在另一方面，本发明涉及特异性结合EGFR的ABM，其中所述ABM还包括免疫球蛋白Fc区域或其片段，且其中将Fc区域或其片段糖基改造为与非-糖基化形式相比，具有增强的Fc受体结合亲和性。
[0261]在另一方面，本发明涉及特异性结合EGFR的ABM，其中在以治疗有效量向受试者施用所述ABM时，不引起临床显著水平的毒性。在一个实施方案中，该ABM还包括免疫球蛋白Fc区域或其片段。在特定的实施方案中，将该Fc区域或其片段已被糖基改造为与非-糖基化形式相比，具有增强的效应子功能。在更特定的实施方案中，所述效应子功能是增强的Fc-介导的细胞毒性。在另一个实施方案中，将该Fc区域或其片段已被糖基改造为与非-糖基化形式相比，具有增强的Fc受体结合亲和性。在特定的实施方案中，所述治疗有效量是约1.0mg/kg-约15mg/kg。在另一个特定的实施方案中，所述治疗有效量是高于1微克/毫升的血清浓度。
[0262]在另一方面，本发明涉及在需要该治疗的受试者中治疗与EGFR-相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如上所述的ABM。在另一方面，本发明涉及在需要该治疗的哺乳动物受试者中治疗与EGFR-相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用特异性结合EGFR的ABM，其中所述ABM在以治疗有效量向哺乳动物受试者施用时，不引起临床显著水平的毒性。在一个实施方案中，所述治疗有效量提供ABM的血清浓度为约1-约100微克/毫升，持续至少4周的时间。在另一个实施方案中，本发明中使用的ABM还包括免疫球蛋白Fc区域或其片段。在更特定的实施方案中，将Fc区域或其片段已被糖基改造为与非-糖基化形式相比，具有增强的效应子功能。在特殊的实施方案中，所述效应子功能是增强的Fc-介导的细胞毒性。在另一个特殊的实施方案中，将该Fc区域或其片段已被糖基改造为与非-糖基化形式相比，具有增强的Fc受体结合亲和性。在优选的实施方案中，所述Fc受体是FcγRIII。
制造物品
[0263]在本发明的另一个实施方案中，提供含有物质的制造物品，所述物质用于治疗以上所述的病症。制造物品包括容器和在容器上或与其关联的标记或包装说明书。适当的容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器等。容器可以由各种各样的材料形成，如玻璃或塑料。容器容纳有效治疗病症的组合物和可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉液袋或具有塞子的小瓶，所述塞子可通过皮下注射针穿过)。在组合物中的至少一种活性剂是抗-EGFR抗体。所述标记或包装说明书指示组合物用于治疗所选病症，如非恶性肿瘤疾病或病症，其中所述疾病或病症涉及EGFR受体和/或EGFR-配体的异常激活或生产，例如良性过度增殖性疾病或病症。此外，制造物品可以包括(a)第一容器，其中含有组合物，其中所述组合物包括第一抗体，该抗体结合EGFR和抑制过表达EGFR的细胞的生长；和(b)第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包括第二抗体，所述抗体结合EGFR并且阻止EGFR受体的配体激活。本发明这个实施方案中的制造物品可以进一步包括包装说明书，其指示第一和第二抗体组合物可以用于治疗来自以上定义部分中的这些疾病和病症列表的非恶性肿瘤疾病和病症。此外，包装说明书可以指导组合物(包含抗体，所述抗体结合EGFR和阻断EGFR受体的配体活化)的使用者将施用抗体的治疗与前面部分描述的任何辅助治疗(例如，化学治疗剂，EGFR-靶向药物，抗血管生成剂，免疫抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，抗激素化合物，保心药和/或细胞因子)联合。备选地，或另外地，制造物品可以另外包括第二(或第三)个容器，所述容器包含药用缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场来看是理想的其它物质，包括其它缓冲剂，稀释剂，滤器，针头，和注射器。
[0264]下面的实施例更加详细地解释本发明。给出下列制备和实施例以使得本领域技术人员能够更加清楚地理解并实施本发明。不过，本发明的范围并不受示例的实施方案所限制，所述实施方案只是意在作为发明单一方面的举例说明，并且功能上等同的方法在本发明的范围之内。事实上，由前述描述和附图，对于本领域技术人员来说，除了本文所述之外，本发明的各种改进将是显而易见的。这些改进将会落入后附的权利要求书的范围之内。
[0265]本申请引用的所有专利，申请，和出版物由此通过参考完整地结合于此。
实施例
[0266]除非另外指定，在下列实施例中的特定氨基酸残基位置的编号是按照Kabat编号系统进行的。除非另外指出，用于制备在这些工作实施例中描述的抗体的材料和方法是按照美国专利申请号10/981,738的实施例中阐述的那些，该文献通过参考完整地结合于此。
实施例1
材料和方法
高同源性受体方法
[0267]通过将大鼠ICR62蛋白序列与人种系序列标本收藏(collection)进行比对并挑选出显示最高序列相同性的人序列来进行高同源性抗体受体构架搜索，同时将所有规范残基保留在功能水平上。在此，来自VBase数据库的序列VH1家族的序列1-e被选作重链构架受体序列，而来自Vbase数据库的VK1家族的A30序列被选为轻链的构架受体。向这两种受体构架上移植大鼠ICR62重链和轻链可变结构域的三个互补决定区(CDRs)和/或那些CDRs的特异性决定残基。由于构架4区不是种系基因可变区的部分，对该位置进行个别地比对。对于重链选择JH6区，对于轻链选择JK2区。设计的免疫球蛋白结构域的分子建模揭示一个位置，该位置在Kabat CDR1外侧，其可能需要在CDR外侧存在鼠氨基酸残基而非人氨基酸残基。将鼠氨基酸残基重新引入人构架将产生所谓的“回复突变”。例如，位于Kabat位点27上的人受体氨基酸残基(1-e中的甘氨酸)回复突变为酪氨酸残基。为了显示残基对抗原结合的重要性，设计人源化的抗体变体，其包括或忽略回复突变。人源化的抗体轻链不需要任何回复突变。在已经设计了蛋白质序列后，如下面所详述的来合成编码这些蛋白质的DNA序列。
混合构架方法
[0268]为了避免在人受体构架的关键性位点(对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是关键性的)上引入回复突变，研究了功能化人源化抗体的构架区1(FR1)，或构架区1(FR1)和2(FR2)一起或构架区3(FR3)，是否能够被人抗体序列所替代，所述人抗体序列在天然人种系序列的那些重要残基位点上已经具有供体残基，或功能等同于供体残基的氨基酸残基。为此目的，将大鼠ICR62VH序列的VH构架1，2和3个别地与人种系序列相比对。在此，最高的序列相同性不用于选择受体构架，而是进行几个关键残基的匹配。那些关键性残基包含所谓的规范残基，并且是在位点27，28，和30(Kabat编号)上的那些，其位于Kabat的CDR1定义范围外，但是经常参与抗原结合。另外，关键残基是显示与CDRs的重要相互作用的那些，如可以使用分子建模测定。选择IMGT序列IGHV1-58(登记号M29809)，IGHV5-51(登记号M99686)，以及来自VH1家族的Vbase序列1-02作为替换FR1，2，或3的适当序列。简而言之：IGHV1-58在Kabat位点27-30显示有希望的模式，但是不满足对于规范位点71的标准。IGHV5-51具有匹配残基71，因此可以使用它的FR3。此外它的FR1接近于所需的FR1序列。
[0269]除了位点27，VH1的1-e满足所有标准。序列1-02被认为对于FR1和FR2区域是可接受的，但是将要求FR3中的回复突变。
[0270]在设计蛋白质序列之后，如下详述，合成编码这些蛋白质的DNA序列。使用该方法，在大多数重链构建体中不需要回复突变，以便保留良好的抗原结合水平。混合构架构建体的年表和推理在结果部分解释。
合成抗体基因
[0271]在已经设计了人源化抗体V区的氨基酸序列之后，产生DNA序列。单个构架区域的DNA序列数据在关于人种系序列的数据库(例如IMGT或VBase)中找到。CDR区域的DNA序列信息获自大鼠ICR62抗体的公开序列(参见，例如，PCT公布WO95/20045)。使用这些序列，虚拟装配了整个DNA序列。具有该DNA序列数据，通过引入沉默突变将诊断性限制位点引入虚拟序列(virtual sequence)，产生限制内切酶的识别位点。为了获得物理的DNA链，进行基因合成(参见，例如，Wheeler等1995)。在此方法中，由目标基因设计寡核苷酸，从而使一系列寡核苷酸源自编码链，而另一系列源自非编码链。每个寡核苷酸的3’和5’端(除了一行中的第一个和最后一个)总是显示与源自相反链的两条引物的互补序列。当将这些寡核苷酸放入适于任何热稳定聚合酶的反应缓冲液中，并加入Mg2+，dNTPs和DNA聚合酶时，每个寡核苷酸都从其3’端延伸。新形成的一条引物的3’端随后与相反链的下一个引物退火，并且在适于模板依赖型DNA链延伸的条件下进一步延伸其序列。将最终产物克隆入传统载体中以便在大肠杆菌中进行增殖。
抗体生产
[0272]为了构建嵌合(即，完全大鼠V区域和人C区域)和人源化抗-EGFR轻链和重链链表达载体，将人重链和轻链前导序列(用于分泌)插入可变区DNA序列的上游。在可变区的下游，使用标准分子生物学技术，插入对于重链的IgG1的恒定区，和对于轻链的κ恒定区。将得到的完整抗体重链和轻链DNA序列亚克隆到哺乳动物表达载体(一种对于轻链的，一种对于重链的)在MPSV启动子控制之下并且在合成的聚腺苷酸位点上游，每个载体携带EBV OriP序列。
[0273]通过使用磷酸钙-转染方法，将HEK293-EBNA用哺乳动物抗体重链和轻链表达载体共转染，生产抗体。指数生长的HEK293-EBNA细胞通过磷酸钙方法转染。为了生产未修饰的抗体，仅用比率为1∶1的抗体重链和轻链表达载体转染细胞。为了生产糖基改造的抗体，将细胞用四个质粒共转染，两个用于抗体表达，一个用于融合GnTIII多肽表达，和一个用于甘露糖苷酶II表达，各自比率为4:4:1:1。将细胞在T摇瓶中作为贴壁单层培养物培养，使用补充有10％ FCS的DMEM培养基，并且当它们在50和80％汇合之间时转染。对于T75烧瓶的转染，在转染前24小时将8百万个细胞接种于添加了FCS(于10％V/V终浓度)，250μg/ml新霉素的14ml DMEM培养基中，并将细胞于37℃置于具有5％CO2气氛的培养箱中过夜。对于每个待转染的T75烧瓶，通过将在轻链和重链表达载体之间平分的47μg总质粒载体DNA，235μl的1M CaCl2溶液混合，并加水至终体积469μl而制备DNA、CaCl2和水的溶液。向此溶液中加入469μl的50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4溶液pH7.05，立即混合10秒并留置于室温20秒。用添加了2％FCS的12ml DMEM稀释混悬液，并加入到T75中代替现有的培养基。将细胞于37℃，5％CO2温育约17到20小时，随后以12ml DMEM，10％FCS替换培养基。在转染后5-7天收获条件培养物，在1200rpm离心5分钟，接着在4000rpm第二次离心10分钟，并保持在4℃。
[0274]通过蛋白质A亲和层析，接着进行阳离子交换层析和最后大小排阻层析步骤在Superdex 200柱(安玛西亚法玛西亚(AmershamPharmacia))上交换缓冲液至磷酸盐缓冲溶液和收集纯单体IgG1抗体来纯化分泌的抗体。利用分光光度计由280nm处的吸光度来估计抗体浓度。在25mM磷酸钾，125mM氯化钠，100mM pH6.7的甘氨酸溶液中配制抗体。
[0275]通过共转染以下各项来生产人源化抗体的糖基改造的变体：抗体表达质粒以及GnT-III糖基转移酶表达载体，或以及GnT-III表达载体加上高尔基甘露糖苷酶II表达载体。糖基改造的抗体的纯化和配制如上关于非糖基改造的抗体所述。与抗体Fc区域连接的寡糖通过下述MALDI/TOF-MS分析。
寡糖分析
[0276]通过PNGaseF消化从抗体中酶促释放出寡糖，其中抗体固定于PVDF膜上或在溶液中。
[0277]对得到的含有释放的寡糖的消化溶液直接进行制备用于MALDI/TOF-MS分析，或在样品制备之前用EndoH糖苷酶进一步消化以进行MALDI/TOF-MS分析。
PVDF膜-固定的抗体的寡糖释放方法
[0278]用100μl甲醇湿润用PVDF(Immobilon P，Millipore，Bedford，Massachusetts)膜制作的96孔板的孔，并且使用被应用到Multiscreenvacuum manifold(Millipore，Bedford，Massachusetts)上的真空将液体吸附穿过PVDF膜。用300μl水将PVDF膜洗涤三次。随后用50μl RCM缓冲液(8M尿素，360mM Tris，3.2mM EDTA，pH8.6)洗涤孔。将30-40μg之间的抗体上样到包含10μl RCM缓冲液的孔中。通过应用真空将孔中的液体吸附穿过膜，随后用50μl RCM缓冲液将膜洗涤两次。通过加入50μl的0.1M二硫苏糖醇于RCM中并于37℃温育1小时进行二硫键的还原。
[0279]还原作用后，应用真空从孔中除去二硫苏糖醇溶液。在通过将50μl的0.1M碘乙酸加入RCM缓冲液中并于室温避光温育30分钟进行半胱氨酸残基的羧甲基化作用之前，用300μl水将孔洗涤三次。
[0280]在羧甲基化作用之后，将孔抽真空并且随后以300μl水洗涤三次。随后通过将100μl的1％聚乙烯吡咯烷酮360的水溶液在室温温育1小时来封闭PVDF膜，以防止内切糖苷酶的吸附作用。随后通过温和真空而后通过用300μl水洗涤三次来去除封闭剂。
[0281]随后通过在25μl终体积的20mM NaHCO3，pH7.0中加入2.5mU肽-N-glycosydase F(重组N-聚糖酶，GLYKO，Novato，CA)和0.1mU唾液酸酶(GLYKO，Novato，CA)以去除任何潜在带电荷的单糖残基来释放N联寡糖。于37℃进行消化3小时。
溶液中抗体的寡糖释放方法
[0282]将介于40-50μg之间的抗体与2.5mU的PNGaseF(Glyko，美国)在2mM Tris，pH7.0中于25微升的最终体积中混合，并将混合物于37℃温育3小时。
将PNGaseF释放的寡糖的内切糖苷酶H消化物用于将杂合分叉的寡糖结构分配到MALDI/TOF-MS中性寡糖峰上
[0283]随后将PNGaseF释放的寡糖用内切糖苷酶H(EC 3.2.1.96)进行消化。为了进行EndoH消化，将15mU的EndoH(罗氏(Roche)，瑞士)加入到PNGaseF消化物中(上述抗体溶液方法)以给出30微升的终体积，并将混合物于37℃温育3小时。EndoH在N联寡糖的几丁二糖核心的N-乙酰葡糖胺残基之间裂解。所述酶只能消化寡甘露糖和大多数杂合型聚糖，而不水解复合型寡糖。
MALDI/TOF-MS的样品制备
[0284]在加入醋酸至终浓度150mM后将含有释放的寡糖的酶消化物于室温再温育3h，并随后通过塞入micro-bio-spin层析柱(BioRad，瑞士)的0.6ml阳离子交换树脂(AG50W-X8树脂，氢形式，100-200网眼，BioRad，瑞士)以去除阳离子和蛋白质。将1微升的得到的样品施用到不锈钢目标板上，并在所述板上与1微升的sDHB基质混合。通过溶解2mg的2，5-二羟基苯甲酸加0.1mg的5-甲氧基水杨酸于1ml的乙醇/10mM水性氯化钠1:1(v/v)中来制备sDHB基质。将样品风干，施加0.2微升的乙醇，最后允许样品在空气下进行再结晶。
MALDI/TOF-MS
[0285]用来获得质谱的MALDI-TOF质谱仪是Voyager Elite(透视生物系统(Perspective Biosystems))。以线性构型操作该仪器，其中具有20kV的加速和80ns的延迟。将使用寡糖标准物的外部校准进行离子的质量评定。将来自200次激光射击的光谱相加以获得最终的光谱。
抗原结合测定
[0286]使用基于流式细胞术的测定，检测纯化的、单体人源化抗体变体与A431人表皮细胞系上的人表皮生长因子受体(EGFR，在文献中也称为HER-1或ErbB1)的结合。将在180μl FACS缓冲液(包含2％FCS和5mM EDTA的PBS)中的200,000个细胞(例如，来自人A431细胞系)转移到5ml聚苯乙烯试管中，并加入20μl10倍浓缩的抗-EGFR抗体(一级抗体)样品(1-5000ng/ml终浓度)，或只加入PBS。在轻柔混合样品后，将试管于黑暗中4℃温育30分钟。随后，用FACS缓冲液将样品洗涤两次并于300xg沉淀3分钟。吸去上清液并使细胞被50μl FACS缓冲液吸收，加入2μl第二抗体(抗-Fc-特异性F(ab’)2-FITC片段(杰克逊免疫研究实验室(Jackson Immuno Research Laboratories)，美国))，并将试管于4℃温育30分钟。用FACS缓冲液将样品洗涤两次并吸收于500μlFACS缓冲液中，以通过流式细胞计量术进行分析。通过相对于抗体浓度测绘几何级数的平均荧光来测定结合。
单体IgG1糖基变体与表达FcγRIIIA的CHO细胞系的结合
[0287]通过用编码FcγRIIIA-Val158α-链和γ-链的表达载体进行电穿孔(280V，950μF，0.4cm)来转染CHO细胞。通过加入6μg/ml嘌罗霉素来选择转染子，并通过FACS利用10μl FITC-缀合的抗FcγRIII 3G8单克隆抗体(BD生物科学(BD Biosciences)，Allschwil/瑞士)对106细胞分析稳定的克隆。进行IgG1与表达FcγRIIIA-Val158的CHO细胞的结合。简而言之，将抗-FcγRIIIA 3G8F(ab’)2片段(Ancell，Bayport，MN/美国)以10μg/ml浓度加入，以竞争结合抗体糖基变体(3μg/ml)。在FACSCalibur(BD生物科学(BD Biosciences)，Allschwil/瑞士)上测定关于结合的抗体变体的荧光强度。
ADCC测定
[0288]将人外周血单核细胞(PBMC)用作效应细胞并利用Histopaque-1077(西格玛诊断公司(Sigma Diagnostics Inc.)，圣路易斯(St.Louis)，MO63178美国)基本上按照生产商的说明书进行制备。简言之，以肝素化的注射器从健康志愿者体内取静脉血。用PBS(不含Ca++或Mg++)将血液稀释1：0.75-1.3并铺于Histopaque-1077上。将梯度于室温(RT)以400xg不间断离心30分钟。收集含有PBMC的中间相并用PBS进行洗涤(来自两种梯度的每一种细胞50ml)并通过于RT以300xg离心10分钟进行收集。在用PBS重悬沉淀物后，对PBMC计数并通过于RT以200xg离心10分钟进行第二次洗涤。随后将细胞重悬于适当的培养基中以便进行接下来的操作。
[0289]对于PBMC和NK细胞而言，用于ADCC测定的效应细胞与靶标的比率分别是25:1和10:1。于适当的浓度在AIM-V培养基中制备效应细胞，以便加入50微升/圆底96孔板的孔。靶细胞是生长于含有10％FCS的DMEM中的表达人EGFR的细胞(例如，A431，EBC-1，或LN229)。在PBS中洗涤靶细胞，计数并以0.3百万/ml重悬于AIM-V中以便以100μl/微孔加入30,000细胞。将抗体稀释在AIM-V中，加入50μl到预铺板的靶细胞中并让其于RT结合靶标10分钟。随后加入效应细胞并于37℃在含有5％CO2的加湿气氛中将板温育4小时。通过使用细胞毒性检测试剂盒(罗氏诊断(Roche Diagnostics)，Rotkreuz，瑞士)测量由受损细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)来评估靶细胞的杀伤。在4小时的温育后将板于800xg进行离心。将来自每孔中的100μl上清液转移到新的透明平底96孔板中。每孔加入100μl来自试剂盒的颜色底物缓冲液。使用SOFTmax PRO软件(分子装置(Molecular Devices)，Sunnyvale，CA94089，美国)，在ELISA读数器中于490nm测定颜色反应的Vmax值至少10min。由只包含靶和效应细胞但不包含抗体的孔测定自发的LDH释放。由只包含靶细胞和1％ Triton X-100的孔测定最大释放。将特异性抗体介导的杀伤百分比计算如下：((x-SR)/(MR-SR)*100，其中x是在特定抗体浓度上Vmax的平均值，SR是自发释放的Vmax的平均值，而MR是最大释放的Vmax的平均值。
实施例2
结果和讨论
[0290]抗体变体I-HHA，I-HHB，I-HHC，I-HLA，I-HLB，I-HLC，I-HLA1，I-HLA2，I-HLA3，I-HLA4，I-HLA5，I-HLA6，I-HLA7，I-HLA8，I-HLA-9，I-HHD，I-HHE，I-HHF，和I-HHG，或者与嵌合ICR62轻链复合或与人源化ICR62轻链(I-KA，I-KB，或I-KC)和母体、嵌合抗体ch-ICR62复合，比较与人EGF-受体的结合，显示出所有抗体具有一个对数单位内的类似EC50值。仅I-HHA具有强烈消失的结合活性(见图2)。图1显示当分别与人源化构建体I-HHC和I-KB结合时单个嵌合ICR62(ch-ICR62)多肽链的功能活性。在本实验中，ch-ICR62的轻链、重链或两个链同时被上述人源化构建体替换。这表明VH/VL界面形成似乎在啮齿动物抗体以及人源化构建体中起同样作用。
[0291]如图2所示，使用I-KA或I-KB轻链，人源化重链I-HHA不能恢复结合活性。由于I-HLA不显示与I-KA和I-KB两者的结合，本发明人推断I-HHA的重链在抗原结合中没有功能。图1和2，结合图3，表明，轻链构建体I-KA、I-KB、和I-KC显示出不能区别于啮齿动物对应物的结合行为。变体I-KC不具有任何回复突变，并且另外其CDR1部分被人源化，使得残基24-29可以来源于人受体序列(VK1的A30，如上所述)。
[0292]在系列I-HHA，I-HHB，和I-HHC中，仅后两种变体显示令人满意的结合行为(图2和3)。I-HHA的序列分析揭示三个潜在的氨基酸残基负责该行为：Lys33，His35，和Tyr50。Lys33被酪氨酸替换的构建体显示良好的结合，Tyr50被色氨酸替换的构建体同样如此。仅当这两个残基分别被丙氨酸和甘氨酸替代时，结合丧失。由于I-HHC未显示比I-HHB更好的结合，本发明人推断残基Asn60，Glu61，Lys64，和Ser65不必是啮齿动物来源的；或者它们可以分别被Ala，Gln，Gln，和Gly替换。该方法导致其中CDR2更加人源化的构建体，因为氨基酸位点60-65是Kabat CDR定义的一部分，但是没有必要对该抗体移植啮齿动物供体残基。
[0293]图4和5比较系列I-HLA1，I-HLA2，I-HLA3，I-HLA4，I-HLA5，和I-HLA6的构建体。在构建体ch-ICR62，I-HLA1，和IHLA2中观察到最佳的结合行为，EC50值约为300ng/ml。其它构建体的该值增加两倍，因此具有稍微降低的结合活性。从该数据获得的第一个结论是，在KabatCDR1内，Lys33Tyr和Ile34Met替换是被容忍的。这两个位置位于CDR1的Kabat定义内，但是在Chothia CDR边界(其是基于结构而不是序列分析)之外。于是，在CDR1的较后部分，至少一些混杂是允许的。
[0294]第二个结论是，在CDR2内，除了上述提及的残基Asn60和Glu61被非供体残基替换，在Kabat CDR内的Asn60Ser，Glu61Pro，和Lys62Ser非供体替换也是允许的。这些残基来源于人种系IGHV5-51受体序列，其可以用作FR3受体序列。构建体I-HLA3和I-HLA4不同于I-HLA1和I-HLA2仅在于去除Phe27Tyr回复突变，并且与它们的母体构建体相比，I-HLA3和I-HLA4构建体两者都损失亲和性。因此，I-HLA1，I-HLA2，I-HLA3，I-HLA4，I-HLA5，和I-HLA6比较的第三个结论是Phe27参与抗原结合，该结合是直接或间接的，通过修饰CDR1的环构象进行。
[0295]变体I-HLA5和I-HLA6使得I-HLA1和I-HLA2的FR1分别被天然存在Phe27的另一种系受体序列(即，IGHVl-58)替换。这仅可以通过同时引入几个其它突变来实现，所述突变是：Val2Met，Ala9Pro，和Ala16Thr。通过这样做，(再-)引入Phe27的有益效果再次被消除。
[0296]评估I-HLA7构建体以确定与ICR62相比，I-HLA6构建体的重链CDR1和CDR2中的另外的供体残基的恢复是否将恢复完全的结合活性。如图6所示，这并非如此。
[0297]如图7和8所示，另外两个构建体，I-HLA8和I-HLA9，被检测以确定与ch-ICR62相比，是否可以实现完全的结合活性。从I-HHB构建体开始，将FR1区域用在Chothia CDR1区域内具有最大同源性的FR1区域替换。I-HLA8构建体具有IGHV1-58序列的FR1，并且I-HLA9具有IGHV5-51FR1区域。两个构建体与抗原的结合至少与ch-ICR62抗体同样好。I-HLA8构建体，实际上，可能甚至更好，EC50降低2倍。I-HLA8构建体具有与I-HLA5和I-HLA6构建体相同的FR1序列，因此具有相同的非供体残基(即，Val2Met，Ala9Pro，和Ala16Thr)，提示这些非供体残基的存在对结合没有负面影响。在I-HLA5和6中存在的非有益突变来自与VH5FR3配对的VH1FR1组合，其可以潜在地通过具有相同VH家族的FR1和FR3来补偿。
[0298]图8所示的是在CDR内含有非供体残基的构建体。因此，这些构建体甚至进一步在CDRs内人源化，因为在人构架区域中存在非供体残基，选择所述区域用于这些构建体。I-HHE(His35Ser)，I-HHF(Thr58Asn)和I-HHG(Ser57Ala)构建体全部在CDR1或CDR2内具有一个被人源化的残基(与I-HHB构建体相比)。还测定了构建体I-HHD(Gly24Ala)。I-HHF显示出减少的结合，指示Thr58的重要性。与Kabat CDR残基58相对比，氨基酸57对替换更耐受，因为Ser57Ala突变显然对于结合没有影响(图8)。
[0299]由于IGHV5-51的FR3区域在I-HLA1和2构建体中似乎显示出有希望的性质，相同种系序列的FR1被证明在I-HLA9构建体中是有用的，将IGHV5-51的FR1，FR2，和FR3设计一起用作环移植的受体。
人源化ICR62构建体中规范残基的分析总结：
[0300]VL：Kabat位置2：Ile可能需要.
          Kabat位置71：Ile或Phe被允许.
      VH：Pos.24，Gly，Thr，Ala，Val，Ser被允许.
          Pos.26，Gly被允许.
          Pos.29，Phe，Ile，Leu，Val，Ser被允许.
  Pos.34，Ile，Met，Leu，Val，Trp，Tyr，Thr被允许.
  Pos.71，Ala，Leu，Val，Thr被允许.
  Pos94，Arg，Gly，Asn，Lys，Ser，His，Thr，Ala被允许.
ADCC实验结果
[0301]图9显示抗体介导的细胞毒性作用(ADCC)的比较，显示关于嵌合ICR62抗体的各种糖形以及对于人源化变体I-HLA4的比较。通过标签来标记不同的糖形，所述标记显示非糖基改造的(WT)，糖形1(G1)，或糖形2(G2)。＂G1＂是指通过与GnTIII共表达的抗体的糖基改造。＂G2＂是指通过与GnTIII和ManII的共表达的抗体的糖基改造。＂WT＂是指未糖基改造的抗体。所有人源化构建体的轻链是I-KC变体，并且没有明确标记。
[0302]通过两种不同糖基改造方法改善嵌合以及人源化抗体它们的效力和功效。分别对于野生型或糖形，ch-ICR62构建体比I-HLA4稍微更好。如图4所示，当将两个抗体对它们的抗原的亲和性进行比较时，ch-ICR62具有两倍更低的EC50值。该亲和性的差异这里反映在功效的差异方面。
[0303]图10显示对于非糖基改造的(＂野生型＂)和G2糖形的人源化ICR62抗体构建体I-HHB和I-HLA7的抗体介导的细胞毒性作用(ADCC)的比较。将相同抗体应用于两种不同靶细胞系。在图10的图A中，使用靶细胞系LN229；在图10的图B中，使用细胞系A431。A431细胞显然比LN229细胞对抗体介导的细胞杀伤更敏感。更重要地，糖基改造增强了两种抗体的功效。该效果似乎对于I-HLA7比对于I-HHB更突出。在最大抗体浓度下对于I-HHB的细胞杀伤的百分比可以通过在使用LN229靶细胞系时引入G2糖基改造的变体而从～30％转变为～40％。当使用A431细胞系时，该值似乎未改变。对于I-HLA7抗体，该行为完全不同。通过引入G2糖基改造变体，在最大抗体浓度下的靶细胞杀伤对于LN229细胞从约10％转变至约50％，对于A431细胞从约40％转变至约70％。在该情形中，尽管I-HLA7相对于I-HHB在非糖基改造的抗体中具有较低活性，活性等级对于糖基改造的抗体是倒转的。图11和12也显示了非糖基改造形式(WT)和G2糖形的嵌合ICR62和人源化ICR62抗体构建体I-HHB和I-HLA7的比较。
实施例3
通过静脉内(推注)给药于食蟹猴的初步毒性研究—生物分析介绍
糖基-改造的抗-EGFR测定
[0304]该生物分析描述了样品中抗-EGFR的测量，所述样品来源于食蟹猴，该分析是在静脉内(推注)给药抗-EGFR(重组的、糖基改造的抗-EGFR抗体，由培养物中用抗体表达载体转染的哺乳动物细胞生产并如上所述纯化，所述表达载体含有如上所述的重链I-HHB和轻链I-KC基因)之后进行的，如下文阐述的方案中所述。将总共78只猴子血清样品贮存冷冻在约-20℃直至使用。
[0305]用于测定抗-EGFR的生物分析方法使用ELISA方法来测量抗-EGFR的血清浓度。对于精确度和不准确度，可接受的标准是设定为±20％(±25％低QC)。
材料和方法
[0306]目的：本研究的目的是评估Glyco-mAb(抗-EGFR)静脉内(推注)给药于食蟹猴，接着8周恢复期的系统毒性的可能性。
表8
 
动物模型 食蟹猴，被管理机构接受，可提供背景数据
使用灵长类动物的合理性 灵长类动物是选择的非啮齿动物物种，因为它单独保留两个关键参数：通过试验抗体的EGFR抗原识别，和通过免疫系统Fc受体的试验抗体Fc区域识别
途径 静脉内(推注)，模拟临床给药的情形
表9：治疗组和剂量
 
组   1         2            3
化合物 _____Glyco-mAb(抗-EGFR)_______
剂量(mg/kg/天)  1.5       4.5           12
剂量水平选择原理
[0307]1.5-7.5mg/kg是人研究的期望范围(7.5mg/kg是在人中对于类似化合物的相应剂量。
表10：治疗组的身份
Figure A200780037124D01081
#以提供的测试物质表示
表11：动物
 
物种 食蟹猴(定向繁殖).
接收年龄 约15个月.
定购的重量范围 1.5至2.5kg.
表12：施用抗-EGFR
 
途径 静脉注射
治疗 恒定剂量，mg/kg/次.
体积剂量 预先计算，基于最近记录的体重
单个剂量体积 1ml/kg/天
频率 第1，8，15和22天，在即将喂食前
顺序 按组.
剂量给药部位 使用左隐静脉
注射 推注，每只动物新的无菌一次性针头
制剂 基于体重保持制剂使用的记录。将该结算(balance)与预期的用量比较，作为正确给药的核对。
表13：临床观察
 
动物和它们的笼支架 每天至少两次视觉检查，证明对治疗的反应或不健康
偏离正常时记录这些方面 自然和严重.发作的日期和时间观察的病症的持续时间和进展
身体检查 对于所有动物每周一次
笼支架的每日记录 对于呕吐物，血液，腹泻等
表14：剂量给药频率：
 
频率 1.在剂量给药前立即.2.在完成剂量给药后1/2至2小时3.在工作日尽可能晚
注射部位 每日.
表15：毒物代谢动力学
 
天 动物 在剂量给药后的样品时间小时
1 所有动物 1，4，12，24，72，120.
8 所有动物 剂量给药前，剂量给药后1小时(第一天给药后169小时)
15 所有动物 剂量给药前，剂量给药后1小时(第一天给药后337小时)
22 所有动物 剂量给药前，剂量给药后1小时(第一天给药后505小时)
29 所有动物 在第1天给药后672小时
表16：样品
 
采样部位 适当静脉
抗凝剂/样品体积 无抗凝剂/0.7ml.
所采样品总数 104.
血清分离 通过在环境温度下离心，除非另外指出，当可能时，提供最少0.3ml
血清贮存 适当标记的塑料管。深度冷冻(约-20℃)，同时等待生物分析
组织学
表17：组织固定
 
标准 10％中性缓冲福尔马林
其它 睾丸和附睾：最初在Bouin’s液体中眼睛：最初在Davidson’s液体中
表18：组织学
 
处理 所有动物.
常规染色 用苏木精和曙红染色4-5μm切片
免疫测定方法
[0308]将平板用100μl/孔的包被溶液(5μl绵羊抗人IgG(猴吸附的IgG，结合位点，UK)加入11495μl碳酸氢盐缓冲液(0.05M，pH9.6))包被，并在室温下温育约2小时。将平板用400μl/孔洗涤溶液(PBS(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)，英国)0.01％(v/v)Triton-X100(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)，英国))洗涤3次，并轻敲至干。
[0309]将测定缓冲液(1％w/v BSA，西格玛化学公司(Sigma ChemicalCo.)，英国)以200μl/孔加入，并在室温下温育约1小时。将平板用400μl/孔洗涤溶液洗涤3次，并轻敲至干。
校准标准，质量对照(QC)和/或样品以100μl/孔加入，并在室温下温育约2小时，之后将平板用400μl/孔的洗涤缓冲液洗涤3次并轻敲至干。
[0310]将缀合溶液(6μl山羊抗-人IgG kappa-HRP缀合物(BethylLaboratories Inc.，美国)加入12ml测定缓冲液)以100μl/孔加入，并在室温下温育约1小时。将平板用400μl/孔的洗涤溶液洗涤3次并轻敲至干。
[0311]将三甲基联苯胺(TMB；Europa Bioproducts，Ely，英国)以100μl/孔加入。将平板覆盖，并在室温下温育约15分钟。然后将100μl终止液(0.5M HCl，Fisher，英国)加入每孔。在450nm下在DYNATECHMRX微量培养板读数器(Mettler Instruments，英国)上读取吸光度。
结果和讨论
测试样品分析
[0312]在按照上文所述方案产生的78个猴血清样品中通过免疫测定法测量抗-EGFR的浓度。这些结果在以下表19-21中提供。
表29
在第1，8，15和22天，在静脉内施用1.5mg/kg抗-EGFR后在猴血清中的抗-EGFR血清浓度(μg/ml)
(组1)
 
时间点 动物数1M623       1F590 平均值     sd
第1天  1小时第1天  4小时第1天  12小时第1天  24小时第1天  72小时第1天  120小时第8天  剂量给药前第8天  1小时第15天剂量给药前第15天  1小时第22天剂量给药前第22天 1小时第1天  672小时 33.42       30.8627.3P       327.4913.09       17.019.656       9.4682.528       0.7860.845       04310.538       0.28730.02       19.070.902       0.38217.91       33.081.065       0.59519.41       33.001.202       0.362 32.14      1.827.41      0.115.05      2.89.562      0.11.657      1.20.638      0.30.413      0.224.55      7.70.642      0.425.50      10.70.830      0.326.21      9.60.782      0.6
sd标准偏差
表20
在第1，8，15和22天，在静脉内施用5.0mg/kg抗-EGFR后在猴血清中的抗-EGFR血清浓度(μg/ml)
(组2)
 
时间点 动物数2M 461     2F 462 平均值      sd
第1天  1小时第1天  4小时第1天  12小时第1天  24小时第1天  72小时第1天  120小时第8天  剂量给药前第8天  1小时第15天 剂量给药前第15天 1小时第22天剂量给药前第22天 1小时第1天  672小时 3245       29.5132.39      29.5728.05      25.8823.70      23.7814.03      14.3810.42      8.1374.672      3.68325.91      31.065.752      5.45032.20      35.38BLQ        6.49726.98      30.23BLQ        4.845 30.98       2.130.98       2.026.97       1.523.74       0.114.21       0.29.279       1.64.178       0.728.49       3.65.601       0.233.79       2.23.249       -28.61       2.32.423       -
BLQ低于定量范围(<0.195μg/ml)
sd标准偏差
注意：在计算中BLQ作为零进入
表21
在第1，8，15和22天，在静脉内施用15mg/kg抗-EGFR后在猴血清中的抗-EGFR血清浓度(μg/ml)
(组3)
 
时间点 动物数3M 463       3F 612 平均值     sd
第1天  1小时第1天  4小时第1天  12小时第1天  24小时第1天  72小时第1天  120小时第8天  剂量给药前第8天  1小时第15天 剂量给药前第15天 1小时第22天剂量给药前第22天 1小时第1天  672小时 262.2        168.0223.         3174.5164.9        165.7141.7        146.099.54        86.6486.64        69.0865.86        45.21282.1        209.998.43        71.21385.9        231.4117.3        105.6234.1        402.5127.5        122.9 215.1      66.6198.9      34.5165.3      0.6143.9      3.093.09      9.177.86      12.455.54      14.6246.0      51.184.82      19.2308.7      109.2111.5      8.3318.3      119.1125.2      3.3
sd标准偏差
实施例4
通过静脉内(推注)施用于食蟹猴的初步毒性研究--毒物代谢动力学概述
[0313]在28-天的毒性研究的第1，8，15和22天将三组食蟹猴(1只雄性和1只雌性/组)静脉内推注施用抗-EGFR的剂量，以便评估动物对抗-EGFR的系统暴露。在第一次剂量给药后收集最高达672小时的样品中抗-EGFR的血清浓度通过免疫测定法来测定。血清浓度-时间数据的药物代谢动力学分析获得下列药物代谢动力学参数：
表22
Figure A200780037124D01141
[0314]血清抗-EGFR浓度-时间曲线下面积(AUC168)和第1天的剂量水平之间的关系提供如下：
表23
Figure A200780037124D01142
[0315]猴子系统暴露于抗-EGFR的比率和程度，通过AUC168表征，在1.5至4.5mg/kg/次的剂量范围内随着剂量增加而近似成比例地增加，但是在第1天4.5至12mg/kg/次的剂量范围内的增加要超过成比例的剂量增加。在最高剂量(12mg/kg/次)，AUC168约比线性关系预测高2.8倍。
[0316]雌性猴向抗-EGFR的系统暴露的程度(AUC168)通常类似于在雄性猴中的暴露。
[0317]在重复静脉内剂量给药后，抗-EGFR的剂量给药前血清浓度通常高于在单一剂量后的那些值，并且指示在研究整个期间血清中抗-EGFR的累积。
[0318]不能充分地对所有动物估计末期半衰期，但是可以估计的是在32.5至63.1小时范围内，并且似乎在雄性动物中随着剂量而增加。在雄性和雌性猴子中，抗-EGFR的总血清清除率似乎在1.5-4.5mg/kg/次的范围内不依赖于剂量，但是在最高剂量水平减少。
[0319]总之，食蟹猴对抗-EGFR的系统暴露的程度似乎在静脉内毒性研究的第1天1.5至12mg/kg/次的范围内，通过非线性(剂量-依赖型)动力学表征。将抗-EGFR的剂量增加到4.5mg/kg/次以上可能导致比从线性关系预测的更高的系统暴露，这与对于消除抗-EGFR的能力限制过程的可能性一致。
[0320]另外，该研究还提供证据表明，通常在雄性和雌性猴对抗-EGFR的系统暴露中没有差别，并且在重复静脉内给药后存在累积。
介绍
[0321]将三组(一只雄性和一只雌性)食蟹猴通过静脉推注注射施用抗-EGFR，剂量水平是在初步毒性研究的第1，8，15和22天为1.5，4.5和12mg/kg/次。在第1天给药后的下列时刻从每只动物采取血样：剂量给药后1，4，12，24，72和120小时。另外，在剂量给药前和第8，15和22天给药后1小时和在第1天第一剂量之后672小时剂量采样。分离的血清冷冻在约-20℃，之后通过免疫测定法分析抗-EGFR的血清浓度。
缩略语
AUC      在血清浓度-时间曲线下至无限时间的面积
AUC168   在血清浓度-时间曲线下在168-小时剂量给药时间间隔期间的面积
BLQ      在定量范围之下
ca       近似
CL       总血清清除率
Cmax     最大血清浓度
F        雌性
k        末期速率常数
M        雄性
t1/2    末期半衰期
Tmax    Cmax出现的时间
Vss     稳态时分布体积
用于研究的抗体
[0322]如上所述生产、纯化并表征Glyco-mAb(抗-EGFR)，一种为了提高Fc-FcgammaRIII受体结合亲和性和提高ADCC的Fc-改造的抗-EGFR抗体。简而言之，通过将HEK-293-EBNA细胞用表达I-HHB抗体重链，I-KC抗体轻链，GnT-III和ManII的质粒DNA载体共转染来生产抗体。利用上述转染方法的线性放大形式，转染培养在转瓶而不是T-烧瓶中的细胞单层。将另外的使用Q-琼脂糖基质的流过阴离子交换色谱步骤包括在纯化工艺中，之后立即进行上述大小排阻层析步骤。
[0323]Fc-改造抗体的糖基化模式如上所述分析，使用酶促释放的Fc-来源的寡糖的MALDI/TOF-MS光谱法。寡糖分布在图23中显示。
[0324]通过如上所述分别使用A431和COS-7细胞的全细胞结合，和基于FACS的分析，证明与人EGFR和猴EGFR的结合。结合曲线分别在图24和25中显示。
[0325]如上所述使用与CHO细胞的全细胞结合和基于FACS的分析，证明由应用的Fc改造导致的增加的FcγRIII受体结合，所述CHO细胞被改造用于人FcγRIII的表面表达。结果在图26中显示。另外，改造的抗体具有与别处描述的“Glyco-2”抗体(在Fc-寡糖上75％是非岩藻糖基化类型)(Ferrara，C.等，生物化学杂志(J Biol Chem.)2005 Dec 5；[在印刷之前E-出版])具有等价程度的Fc改造。相对应标准的非Fc改造的抗体，该Fc改造的抗体具有可达提高50倍的对人FcγRIII的结合亲和性(对于人受体的158V和158F多态变体的平衡离解常数分别为15和150nM，相对于当与非Fc改造的人IgG1抗体结合时对于相同受体变体分别为750和5000nM)。
[0326]如上所述使用两种靶细胞系测量ADCC：A549人肺癌细胞和CYNOM-K1食蟹猴角化细胞。结果分别在图27和28中显示。
数据处理
[0327]使用计算机程序WinNonlin Pro version 3.3(PharsightCorporation，美国)计算药物代谢动力学参数。
[0328]作为本研究一部分提供的所有血清浓度被报道至4个有效数字或3个小数位。药物代谢动力学参数报道如下：Cmax，AUC168，CL和Vss至4个有效数字；k至4个小数位；t1/2至1个小数位。
[0329]BLQ(<0.195μg/mL)的值在药物代谢动力学处理中作为零进入。
毒物代谢动力学
[0330]抗-EGFR的最大血清浓度(Cmax)和它们出现的时间(Tmax)是观察值。在168小时剂量给药时间间隔内的血清抗-EGFR浓度-时间曲线下面积(AUC168)是通过线性梯形法则估计的。在AUC168值的计算中，在0小时的血清抗-EGFR浓度是通过反向外推法估计的，其中使用log-线性回归分析，基于最初两个取样时间，然而，如果血清浓度在该期间没有下降，那么在0小时的血清浓度被认为等于第一次取样时间时的浓度。至无穷时间的血清抗-EGFR浓度-时间曲线下面积(AUC)，是通过下列表达式估计的：
AUC＝AUC168+Clast/k
其中Clast是在最后一个可定量的样品点的预测血清浓度，k是末期速率常数。
[0331]末期速率常数(k)是通过将log浓度对时间的线性回归拟合来预测的。为了k的评估值被接受为可靠，施加下列标准：
1.末端数据点表面上随机分布在约单一直线上(视觉检查)
2.从回归上可以获得最少3个数据点
3.回归系数≥0.95，并且为此的差异分数≥0.90
4.包括选择用于回归的数据点的间隔比半衰期本身大至少两倍。
[0332]末端半衰期(t1/2)计算为ln2/k。总血清清除率(CL)计算为剂量/AUC。稳态分布体积(Vss)计算为剂量.AUMC/AUC2。累积(R)作为以下比率评估：在最后一次剂量(第22天)后的槽(trough)浓度对在第一次剂量(第1天)后的槽浓度，即672小时时的血清浓度/在168小时时(在第8天剂量给药前)的血清浓度。
结果和讨论
[0333]在毒性研究期间，在第1天剂量给药后直至120小时；在第8，15和22天剂量给药前和剂量给药后1小时，和在第1天剂量给药后672小时采取血样，以评价在静脉内推注施用抗-EGFR后雄性和雌性猴对抗-EGFR的系统暴露，在研究的第1，8，15和22天所述抗-EGFR的剂量水平为1.5，4.5和12mg/kg/次。在表27-29中提供在采样至剂量给药后168小时的样品中抗-EGFR的血清浓度，平均血清浓度-时间曲线在图18和19中显示。
[0334]抗-EGFR的药物代谢动力学参数在表50中显示，并且AUC168值总结如下：
表24
Figure A200780037124D01181
[0335]最大血清浓度出现的时间(Tmax)通常是剂量给药后1小时(第一个样品点)，但是在雌性2F462(4.5mg/kg)和3F612(12mg/kg)中出现在剂量给药后4小时(第二个样品点)。然而，对于这两只雌性，在剂量给药后4小时的浓度非常类似于在剂量给药后1小时的那些浓度，并且可能在测定的变异范围内。因此，Tmax的表面延迟不太可能是有任何意义的。
[0336]在随后剂量给药之前的抗-EGFR血清浓度在第22天(4.5mg/kg/次的剂量水平)在除雄性2M461以外的所有动物中均可定量，因此，通常，在剂量给药间隔期间将动物连续暴露于可定量浓度的抗-EGFR。
[0337]血清抗-EGFR浓度-时间曲线下面积(AUC168)和第1天的剂量水平之间的关系在下面提供：
表25
[0338]猴子系统暴露于抗-EGFR的比率和程度，通过AUC168表征，在1.5至4.5mg/kg/次的剂量范围内随着剂量增加而近似成比例地增加，但是在第1天4.5至12mg/kg/次的剂量范围内的增加要超过成比例的剂量增加。在最高剂量(12mg/kg/次)，AUC168约比线性关系预测高2.8倍(图20)。
[0339]雌性猴向抗-EGFR的系统暴露的程度(AUC168)通常类似于在雄性猴中的暴露。
[0340]在重复静脉内剂量给药后，抗-EGFR的剂量给药前血清浓度通常高于在单一剂量后的那些值(图21-22)，并且指示在研究整个期间血清中抗-EGFR的累积。除了在最高剂量水平，该累积通常在雌性中比在雄性中较低。在第22天最后一次剂量(第1天后672小时的剂量)之后的槽(剂量给药前)浓度与第1天第一次剂量后的槽浓度的比率在以下表26中提供：
表26
Figure A200780037124D01192
[0341]在第1天的抗-EGFR的末期速率常数(k)，和相应的末期半衰期(t1/2)在表30中提供。末期半衰期不能充分地对所有动物评估，但是在32.5至63.1小时范围内可以评估，并且似乎在雄性动物中随剂量而增加。在雄性和雌性猴中，抗-EGFR的总血清清除率似乎在范围1.5-4.5mg/kg/次内与剂量无关，但是在最高剂量水平下减少。
[0342]总之，食蟹猴对抗-EGFR的系统暴露的程度似乎在静脉内毒性研究的第1天1.5至12mg/kg/次的范围内，通过非线性(剂量-依赖型)动力学表征。将抗-EGFR的剂量增加到4.5mg/kg/次以上可能导致比从线性关系预测的更高的系统暴露，这与对于消除抗-EGFR的能力限制过程的可能性一致。
[0343]另外，该研究还提供证据表明，通常在雄性和雌性猴对抗-EGFR的系统暴露中没有差别，并且在重复静脉内给药后存在累积。
表27
在第1，8，15和22天，在静脉内施用1.5mg/kg抗-EGFR后在猴血清中的抗-EGFR血清浓度(μg/ml)
Figure A200780037124D01201
表28
在第1，8，15和22天，在静脉内施用4.5mg/kg抗-EGFR后在猴血清中的抗-EGFR血清浓度(μg/ml)
Figure A200780037124D01211
表29
在第1，8，15和22天，在静脉内施用12mg/kg抗-EGFR后在猴血清中的抗-EGFR血清浓度(μg/ml)
表30
在将抗-EGFR每周一次静脉内施用至食蟹猴的第1天的抗-EGFR的药物代谢动力学参数
 
剂量(mg/kg) 动物 Cmax     Tmax   AUCt        AUC          CL         Vss       k        t1/2(μg/mL)  (h)   (μg.h/mL)    (μg.h/mL)   (mL/h/kg)  (mL/kg)   (1/h)     (h)
1.51.54.54.51212 1M6231F5902M4612F4623M4633F612 3342      1     830.4        849.4       1.778      60.79     0.0214   32.530.86     1     748.4        774.9a      1.962a     57.85a    0.0105a  66.0a3245      1     2537         3005        1.488      133.6     0.0110   63.129.57     4     2378         2719        1.663      133.2     0.0121   57.4262.2     1     18310        29870a      0.4058a    71.33a    0.0056a  124.3a174.5     4     15980        21400a      0.5552a    66.94a    0.0082a  84.4a
a数值是估计值，因为数据没有符合在数据处理中限定的所有接受标准，并且应当小心处理
血液化学和血液学
[0344]从食蟹猴的股静脉采取血样，所述食蟹猴已经在第1，8，15，和22天施用了静脉内推注注射GlycoMAB抗-EGFR。样品获自未用于剂量给药的一肢，接着过夜去血(非死者)。在治疗前，第二次剂量给药后三天，和终止后检查样品的下列参数，使用肝素锂作为抗凝剂：
碱性磷酸酶
丙氨酸氨基-转移酶
天冬氨酸氨基-转移酶
胆红素-总共
尿素
肌酐
葡萄糖
胆固醇-总共
甘油三酯
钠
钾
氯化物
钙
磷
总蛋白
蛋白电泳图
白蛋白/球蛋白比率
[0345]在表31中提供平均正常食蟹猴血液化学分析数据。
表31
食蟹猴(源于毛里求斯)—血液化学
 
参数 性别 n 1％ 5％ 50％ 95％ 99％ 平均值 s.d.
ALP M 949 837 1339 2147 3201 3899 2175.5 565.44
F 881 946 1342 2144 3163 3740 2164.1 552.82
ALP-N M 511 481 579 881 1453 1771 928.0 260.88
F 499 427 546 846 1362 1694 879.5 240.24
ALT M 1489 24 30 50 87 127 53.7 19.07
F 1407 23 28 46 84 111 49.3 18.65
AST M 1487 26 30 41 63 101 43.6 17.57
F 1404 25 29 39 61 89 41.7 13.59
 
参数 性别 n 1％ 5％ 50％ 95％ 99％ 平均值 s.d.
gGT M 663 95 118 178 292 342 188.5 52.47
F 641 81 102 153 232 266 158.6 38.38
LAP M 207 18 26 40 79 217 45.1 28.25
F 205 15 20 35 62 89 37.1 12.73
GLDH M 159 8 10 17 35 126 20.1 16.46
F 159 6 8 15 27 35 16.3 5.97
胆红素 M 1494 1 1 3 8 11 3.8 2.04
F 1413 1 2 4 8 11 4.1 2.07
LDH M 99 160 596 808 1166 2029 838.3 218.75
F 82 477 529 711 945 1021 715.0 117.07
CPK M 331 68 83 179 713 1867 287.4 464.03
F 335 57 77 184 925 2628 309.7 534.02
间接胆红素 M 59 1 2 4 10 11 4.2 2.15
F 57 1 2 4 5 7 3.6 1.13
直接胆红素 M 59 0 0 0 2 3 0.2 0.65
F 57 0 0 0 1 3 0.2 0.52
胆汁酸 M 386 0.9 2.5 6.4 15.3 234 7.38 4.574
F 380 1.4 3.0 7.0 12.9 17.8 7.41 3.474
尿素 M 1457 3.01 3.66 5.50 8.81 10.53 5.775 1.5710
F 1379 2.77 342 5.33 8.56 9.90 5.559 1.5432
肌酐 M 1458 55 59 71 87 94 71.6 8.67
F 1383 56 60 72 87 85 72.7 8.36
葡萄糖 M 1455 2.22 2.64 3.71 5.21 6.37 3.809 0.8135
F 1380 2.23 2.65 3.63 5.18 6.34 3.735 0.7990
胆固醇 M 1455 1.69 1.93 2.68 3.55 3.96 2.706 1.4909
F 1382 1.83 2.15 2.86 3.69 4.05 2.885 0.4813
Chol HDL M 45 1.26 1.34 1.79 2.23 2.59 1.784 0.3128
F 45 1.09 1.31 1.82 243 2.35 1.844 0.3179
Chol VLDL M 45 0.00 0.00 0.00 0.03 0.11 0.004 0.0175
F 45 0.00 0.00 0.00 0.12 0.19 0.012 0.0370
NEFA M 132 0.10 0.28 0.98 1.84 2.44 0.994 0.4700
F 132 0.14 0.22 1.06 1.90 2.18 1.070 0.4704
甘油三酯 M 1453 0.26 0.32 0.53 0.86 1.30 0.561 0.2051
F 1374 0.26 0.34 0.57 0.90 1.14 0.587 0.1778
Ph脂质 M 64 1.65 1.68 2.18 2.91 3.15 2.254 0.3769
F 49 1.77 1.83 2.44 2.91 2.98 2.405 0.3267
尿酸 M 17 0 0 0 8 8 1.1 2.34
F 17 0 0 0 1 1 0.4 0.51
Na M 1461 141 142 147 152 155 146.8 3.00
F 1382 140 142 147 153 157 147.3 3.34
 
参数 性别 n 1％ 5％ 50％ 95％ 99％ 平均值 s.d.
K M 1460 3.2 3.4 4.0 5.0 5.6 4.08 0.511
F 1382 3.2 3.3 4.0 4.9 5.4 4.01 0.484
Cl M 1461 102 104 108 112 115 107.7 2.71
F 1382 102 104 108 113 116 1084 2.83
Ca M 1462 2.31 2.39 2.56 2.76 2.87 2.568 0.1176
F 1382 2.32 2.39 2.57 2.77 2.89 2.572 0.1168
Phos M 1172 1.16 1.40 1.93 2.43 2.69 1.921 0.3126
F 1098 1.17 1.37 1.84 2.35 2.60 1.844 0.2978
Chol LDL M 45 0.54 0.62 1.20 1.87 1.92 1.253 0.3694
F 45 0.69 0.78 1.19 1.83 1.88 1.233 0.2906
碳酸氢盐 M 288 7 10 17 22 25 16.5 3.51
F 283 6 10 16 22 25 15.9 3.81
总蛋白 M 1455 71 74 80 87 90 80.2 4.06
F 1381 71 74 81 89 92 81.2 4.32
白蛋白(化学) M 346 34 38 43 46 49 42.6 2.67
F 342 36 38 43 47 49 42.7 2.60
白蛋白 M 1089 33 36 45 51 54 44.3 4.46
F 1019 34 37 45 52 55 44.7 4.58
球蛋白 M 289 31 32 36 41 45 36.3 2.83
F 285 30 32 37 43 48 37.5 3.59
A/G比率(化学) M 340 0.79 0.98 1.17 1.39 1.45 1.172 0.1215
F 336 0.84 0.95 1.14 1.34 1.42 1.143 0.1274
A/G比率 M 1068 0.68 0.80 1.26 1.65 1.82 1.252 0.2522
F 998 0.67 0.79 1.26 1.66 1.81 1.247 0.2647
A1球蛋白 M 1105 2 2 3 4 4 2.8 0.62
F 1035 2 2 3 4 5 2.8 0.64
A2球蛋白 M 1105 3 3 4 6 7 4.2 0.92
F 1035 3 3 4 6 7 4.2 1.01
β球蛋白 M 1105 12 13 16 22 24 16.6 2.63
F 1035 12 13 16 22 25 16.8 2.85
γ球蛋白 M 1105 8 9 12 17 18 12.6 2.26
F 1035 8 9 13 17 20 13.1 2.52
醛缩酶 M 96 9 14 21 38 57 22.0 748
F 97 10 13 19 48 84 21.9 11.91
 
参数 性别 n 1％ 5％ 50％ 95％ 99％ 平均值 s.d.
血浆CHE M 17 4159 4159 5745 9160 9160 5919.8 1181.68
F 17 3371 3371 5869 8367 8367 5689.2 1512.98
CRP M 57 0.000 0.000 0.002 0.013 0.026 0.0032 0.00414
F 56 0.000 0.000 0.002 0.004 0.007 0.0017 0.00167
T3 M 40 1.90 1.90 2.50 3.38 3.58 2.537 0.4011
F 40 1.71 1.96 2.59 3.06 4.02 2.631 0.3799
T4 M 40 35 42 59 86 92 59.7 11.84
F 40 38 40 56 81 107 58.6 14.37
[0346]用于血液学、外周血分析的样品采自食蟹猴的股静脉，所述食蟹猴已经在第1，8，15，和22天施用静脉内推注GlycoMAB抗-EGFR。样品获自未用于剂量给药的一肢，接着过夜去血(非死者)。在治疗前，第二次剂量给药后三天，和终止后检查样品的下列参数：
1)使用EDTA作为抗凝剂-
血细胞比容血红蛋白浓度
红血球数
网状细胞
平均细胞血红蛋白
平均细胞血红蛋白浓度
平均细胞体积
总白细胞数
白细胞分类计数
血小板数
血液形态学异常
红细胞大小不均
小红细胞症
大红细胞症
着色不足
着色过度
2)使用柠檬酸盐作为抗凝剂-
凝血酶原时间
活化部分组织促凝血酶原激酶时间
[0347]在表32中提供平均正常食蟹猴血液学分析数据。
表32
食蟹猴(源于毛里求斯)—血液学
 
参数 性别 n 1％ 5％ 50％ 95％ 99％ 平均值 s.d.
HCT M 1495 0.385 0.401 0.443 0.488 0.512 0.4435 0.02776
F 1426 0.376 0.399 0.442 0.489 0.508 0.4424 0.02947
血红蛋白 M 1495 11.4 12.1 13.3 14.5 15.1 13.31 0.769
F 1426 11.2 11.9 13.2 14.5 15.1 13.21 0.855
RBC M 1495 5.67 6.04 6.74 7.51 7.92 6.744 0.4792
F 1426 5.58 5.96 6.71 745 7.73 6.707 0.4894
Retic(1)％ M 20 0.1 0.1 0.4 1.8 1.8 0.48 0.438
F 20 0.1 0.1 0.3 0.9 0.9 0.42 0.268
Retic(2)％ M 1476 0.21 0.27 0.49 0.95 1.58 0.551 0.3804
F 1408 0.22 0.28 0.54 1.06 1.60 0.595 0.2934
MCH M 1495 17.0 17.8 19.8 21.6 22.5 19.80 1.432
F 1425 16.7 17.7 19.7 21.8 22.6 19.74 1.216
MCHC M 1495 27.2 28.2 30.1 31.9 32.7 30.06 1.801
F 1425 27.0 27.9 29.9 31.8 32.6 29.88 1.174
MCV M 1495 57.9 60.5 65.8 71.4 73.5 65.88 3.278
F 1425 58.3 60.4 66.0 71.7 74.5 66.07 3.353
RDW M 280 12.6 12.9 14.4 16.1 16.7 14.40 0.934
F 285 12.4 12.8 14.2 15.7 16.3 14.21 0.879
WBC M 1507 5.61 6.62 10.52 18.59 30.24 11.372 4.7766
F 1432 5.39 6.58 10.62 19.55 28.79 11.637 4.7307
嗜中性粒细胞 M 1507 0.88 1.28 3.49 10.24 16.27 4.319 3.1741
F 1432 1.06 1.62 4.45 12.27 17.41 5.392 3.4777
淋巴细胞 M 1507 2.19 2.96 5.53 9.81 15.91 6.021 3.4066
F 1432 2.16 2.67 4.86 8.55 13.95 5.265 2.9997
嗜曙红细胞 M 1507 0.00 0.01 0.17 0.81 1.49 0.254 0.3127
F 1432 0.00 0.01 0.14 0.73 1.55 0.232 0.3188
嗜碱细胞 M 1507 0.01 0.02 0.04 0.10 0.25 0.053 0.0627
F 1432 0.01 0.02 0.04 0.10 0.21 0.051 0.0540
单核细胞 M 1507 0.17 0.25 0.51 1.03 1.45 0.562 0.2575
F 1432 0.16 0.23 0.49 1.04 1.56 0.547 0.2705
大的未染色细胞 M 1507 0.04 0.06 0.14 0.32 0.60 0.163 0.1330
F 1432 0.04 0.06 0.13 0.29 0.50 0.148 0.1147
 
参数 性别 n 1％ 5％ 50％ 95％ 99％ 平均值 s.d.
血小板 M 1495 158 238 359 497 575 362.1 81.69
F 1426 181 234 359 496 560 360.5 80.04
PT M 1481 9.6 9.9 10.8 12.0 14.8 10.88 0.877
F 1406 9.7 10.0 10.8 12.1 14.1 10.93 0.847
ActPTT M 1483 23.1 24.4 29.1 37.9 50.1 30.06 5.267
F 1408 22.8 24.4 29.4 37.4 47.2 30.19 5.185
纤维蛋白原 M 265 1.61 1.86 2.61 3.51 4.88 2.664 0.6178
F 252 1.58 1.84 243 3.27 3.89 2.487 0.4545
[0348]对于猴的生物化学累积单个值在下表33a-h中提供：
表33a
Figure A200780037124D01281
表33b
表33c
表33d
Figure A200780037124D01301
表33e
Figure A200780037124D01302
表33f
表33g
Figure A200780037124D01312
表33h
Figure A200780037124D01321
[0349]在下表34a-1中提供对猴的血液学累积单个值：
表34a
Figure A200780037124D01322
表34b
表34c
Figure A200780037124D01332
表34d
表34e
Figure A200780037124D01342
表34f
Figure A200780037124D01351
表34g
表34h
Figure A200780037124D01361
表34i
Figure A200780037124D01362
表34j
Figure A200780037124D01363
表34k
Figure A200780037124D01371
表34l
Figure A200780037124D01372
显微病理学--治疗-相关的发现
[0350]在12mg/kg/天的剂量下的雌猴中报道了外周胆管炎(在胆管周围的结缔组织的炎症)，但是在其它任何雌或雄猴中没有报道。该发现可能与用Glyco-mAb(抗-EGFR)的治疗相关，但是使用如此少量的动物，其意义是不确定的。其它所有发现被认为是偶然的并且没有毒理学意义。
宏观病理学和组织病理学
[0351]所有测试的动物的组织病理学总结在以下表35中列出：
表35
组织病理学-对于所有动物发现的组分布和严重性
Figure A200780037124D01373
Figure A200780037124D01381
Figure A200780037124D01391
Figure A200780037124D01401
对于所有动物的单个发现
[0352]对于单个动物的病理学观察在下表36中列出：
表36
宏观病理学和组织病理学-对于所有动物的单个发现
病理学观察
Figure A200780037124D01403
Figure A200780037124D01411
Figure A200780037124D01431
Figure A200780037124D01451
结论
[0354]在注射部位没有治疗效果，并且没有认为与用Glyco-mAb(抗-EGFR)的治疗相关的临床发现。体重变化在正常预期范围内。在肉眼检查时没有认为与治疗相关的发现，动物的器官体重在正常预期范围内。总之，以1.5，4.5或12mg/kg/次的治疗是很好耐受的，没有明显的系统毒性发现。
[0355]EGFR不是肿瘤特异性靶标，因为它存在于各种正常组织的表面上，包括肝脏，肾脏和皮肤。具有人IgGl Fc区域的抗-EGFR抗体先前被施用于人，并且已经显示出可耐受的副作用性质(profile)(Vanhoefer，U.等，临床肿瘤学(Clin.Oncol.)2004年1月1日；22(1)：175-84；Needle MN，肿瘤学研讨会(Semin Oncol.)2002年10月；29(5Suppl 14)：55-60)。清楚地，对于将具有显著增加的ADCC的抗-EGFR抗体施用于人或其它哺乳动物，将存在重大的担忧，因为增强的杀伤活性可以针对关键正常组织如肝脏、肾脏和皮肤来展示。令人惊讶地，本发明已经发现体内施用该抗-EGFR抗体至哺乳动物不导致显著的毒性，所述抗-EGFR抗体如上所述Fc改造并且具有提高可达1000-倍的ADCC活性。抗体浓度被保持在1微克/毫升以上达至少4周(并且对于一些动物在100微克/毫升以上)。该暴露水平对于抗体治疗是典型的。对于本研究的抗体的最大ADCC已经在1毫克/毫升的浓度实现。对人癌症患者的单一剂量给药40和100mg的抗-EGFR抗体(母体大鼠ICR62抗体)的剂量已经显示体内特异性靶向肿瘤(Modjtahedi，H.等，英国癌症杂志(Br J Cancer.)1996 Jan；73(2)：228-35.)。食蟹猴效应细胞具有高度同源的FcγRIII受体并且已经显示与Fc改造的抗体(和与糖基改造的抗体，该抗体被改造而在Fc区域具有增加水平的非岩藻糖基化寡糖)介导增强的ADCC。ADCC的水平的提高非常类似于人效应细胞(PBMCs)所观察到的。
[0356]总之，我们已经发现被Fc改造而具有增加的Fc-FcγRIII结合亲和性和增加的ADCC的抗-EGFR抗体可以被施用于哺乳动物以给出1毫克抗体/毫升血清以上的浓度达至少4周的时间，以便提供通常与抗体在体内靶细胞上显著累积相关的药物暴露，而不导致显著毒性。
[0357]本发明的抗原结合分子的毒性可以使用上文所述的任何方法和/或参数(例如，血液化学值，组织病理学指标，等)、或通过本领域技术人员已知的任何方法来测量和/或测定。临床显著水平的毒性被本领域技术人员理解为超出美国食品和药物管理局对于临床施用的抗体通常接受的水平的水平。
实施例5
对轻链CDRs的修饰：确定特异性-决定残基
[0358]使用上述方法，从I-KC轻链可变区构建体(SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：45)产生抗-EGFR轻链可变区变体，其中编码大鼠ICR62CDRs中不同位置的氨基酸残基的序列被来自人种系可变区基因序列的相应氨基酸残基所替换。这容许特异性-决定残基的识别，所述特异性-决定残基，如上文所述，是与抗原相互作用的残基，且对于所述特异性-决定残基，修饰可能对结合亲和性具有影响。表38显示在I-KC轻链可变区构建体(SEQ ID NO：45)的CDRs内部进行的替换。
表38：最小化轻链CDRs
 
构建体名称 在I-KC(KABAT编号)中进行的氨基酸替换 其中进行替换的轻链CDR 对与抗原结合的影响
I-KC(SEQ ID NO：45) 无修饰；SDR变体的母体构建体 N/A ++
I-KC1 N30R* CDR1 ++
I-KC2 Y32W CDR1 ++
I-KC3 N34G CDR1 +/-
I-KC4 N50T CDR2 +/-
I-KC5 T51A CDR2 ++
I-KC6 N52S CDR2 ++
I-KC7 N53S CDR2 ++
I-KC8 T56S CDR2 ++
I-KC9 F94Y CDR3 ++
*按照标准命名法鉴别(例如，＂N30R＂是指SEQ ID NO：45的30位上的天冬酰胺(N)残基被精氨酸(R)残基替换)。对于这些替换，SEQ ID NO：45编号与Kabat编号相对应。
[0359]所有以上鉴别的替换的残基来源于人VK1_6受体序列，除了Y32W交换以外，其中相关人种系序列的W替代SEQ ID NO：45的32位上的Y。
[0360]I-KC变体构建体(I-KC1至I-KC9)的每一个与包含构建体I-HHD(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：15)的重链可变区配对，并且按照先前实施例所述的方法进行结合测定。将构建体I-KC1至I-KC9与I-KC构建体(SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：45)比较在A431靶向细胞中对EGFR的结合亲和性(图29和图30)。如在图29中所示，将残基34修饰成它相应的人序列(N34G)导致结合亲和性的轻微的降低(EC50值增加10倍)。如在图30中所示，将残基50修饰成人残基(N50T)也导致结合亲和性的轻微降低。因此，这些数据显示I-KC抗-EGFR轻链构建体的N34和N50是抗原-结合中涉及的特异性决定残基。所有其它构建体保留与I-KC构建体(SEQ ID NO：45)相当的结合活性(图29和30)。
[0361]基于这些数据，对于人源化过程的CDR环-移植，仅需要CDR的某些部分。例如，对于I-KC构建体的CDR1，不必须从供体(例如，ICR62)移植位置24-27和29-33。在CDR3中，F94残基是大鼠ICR62抗体和最接近的人种系对应物(VK1_6)的唯一区别，且就维持结合亲和性而言，允许其交换为人残基。因此，通过选择适合的接受体VH和J序列，可以将CDR3变为完全人的(例如，对于CDR3不需要环移植)。
[0362]因此，这些数据表明，当与对EGFR特异的嵌合(例如，人源化)重链构建体配对时，轻链可以是完全人的(例如，来自人轻链V基因序列)并且仍保留对EGFR的特异性结合，尽管与其中维持来自供体的特异性决定残基的轻链相比，结合亲和性的轻微减小。
实施例6
对重链CDR的修饰：确定特异性-决定残基
[0363]使用上述方法，从I-HHD轻链可变区构建体(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：15)产生抗-EGFR重链可变区变体，其中编码大鼠ICR62CDRs中不同位置的氨基酸残基的序列被来自人种系可变区基因序列(例如，VH1_10，IGHV5_51)中相应Kabat位置的氨基酸残基所替换。表39显示在I-HHD重链可变区构建体(SEQ ID NO：15)的CDRs内部进行的替换。
表39：最小化重链CDRs
 
构建体名称 在I-HHD(KABAT编号)中进行的氨基酸替换* SEQIDNo：15中相应的氨基酸位置* 其中进行替换的重链CDR 对与抗原结合的影响
I-HHD 无修饰；SDR变体的母体构建体 N/A N/A ++
I-HHD-1 F27G** 27 CDR1(Chothia) ++
I-HHD-2 T28S 28 CDR1(Chothia) ++
I-HHD-3 F29I 29 CDR1(Chothia) +
I-HHD-4 D31E 31 CDR1 ++
I-HHD-5 N52T 52 CDR2 +
I-HHD-6 P52aA 53 CDR2 ++
I-HHD-7 N53I 54 CDR2 ++
I-HHD-8 Y56T 57 CDR2 +/-
I-HHD-9 S57A 58 CDR2 ++
I-HHD-10 V100bG 106 CDR3 +/-
I-HHD-11 A102V 109 CDR3 ++
*重链的Kabat编号与SEQ ID NO：15编号不同，因为Kabat编号容许CDR中存在另外的氨基酸。表39中的编号引用Kabat编号。本领域中的普通技术人员可以容易地确定在SEQ ID NO：15中相应的位置，并将其显示在上方。
**按照标准命名法鉴别(例如，＂F27G＂是指I-HHD-1的Kabat位置27(SEQ IDNO：15的位置27)处的苯丙氨酸(F)残基被甘氨酸(G)残基替换)。
[0364]I-HHD变体构建体(I-HHD-1至I-HHD-11)的每一个与包含构建体I-KC(SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：45)的重链可变区配对，并且按照先前实施例所述的方法进行结合测定。将构建体I-HHD-1至I-HHD-11与I-KC构建体(SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：45)比较在A431靶向细胞中对EGFR的结合亲和性(图31和图32)。如图31和32中所示，Chothia CDR1的位置27(F27G)(构建体I-HHD-1)和28(T28S)(构建体I-HHD-2)和Kabat CDR1的位置31(D31E)(构建体I-HHD-4)处的残基替换没有显示出对抗原结合的影响(即，与I-HHD母体构建体相比，保持了抗原结合)。同样地，KabatCDR2的位置52a(P52aA)(构建体I-HHD-6)、53(N53I)(构建体I-HHD-7)、和57(S57A)(构建体I-HHD-9)处的残基替换，和KabatCDR3的位置102处的残基替换(A102V)(构建体I-HHD-11)没有显示出对抗原结合的影响。
[0365]如在图31中所示，将Chothia CDR1的残基29修饰成相应的人残基(F29I)(构建体I-HHD-3)和将Kabat CDR的残基52修饰成相应的人残基(N52T)(构建体I-HHD-5)，与I-HHD母体构建体相比，各自导致结合亲和性的中等降低(EC50值增加2-3倍)。
[0366]如图32中所示，将Kabat CDR2的残基56修饰成相应的人残基(Y56T)(构建体I-HHD-8)和将Kabat CDR3的残基100b修饰成相应的人残基(V100bG)(构建体I-HHD-10)，与I-HHD母体构建体相比，各自导致结合亲和性的显著的降低(EC50值增加10倍)。
[0367]因此，这些数据表明I-HHD抗-EGFR重链构建体的F29和N52是对抗原-结合具有中等影响的特异性决定残基。这些数据还表明I-HHD抗-EGFR重链构建体的Y56和V100b是对抗原结合具有显著影响的特异性决定残基。
                         *       *      *
[0368]本说明书中提到的所有出版物如教科书，期刊论文，GenBank或其它序列数据库条目，公开的申请，和专利申请在此以相同的程度通过引用结合于此，所述程度如同每个单独的出版物或专利申请被专门地和单独地指示要通过引用结合一样。
序列表
<110>巴勃罗·乌马纳
     埃克哈德·默斯纳
<120>结合EGFR的抗原结合分子，编码其的载体，及其应用
<130>1975.043PC04/TJS/T-M
<150>US 60/836,371
<151>2006-08-09
<160>147
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus sp.)
<220>
<223>ICR62VH
<400>1
Figure A200780037124D01511
<210>2
<211>359
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>ICR62 VH
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<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>3
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<213>人工序列
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<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>5
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<223>大鼠-人嵌合DNA
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<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>7
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<213>人工序列
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<223>大鼠-人嵌合DNA
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<223>大鼠-人嵌合多肽
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<213>人工序列
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<223>大鼠-人嵌合DNA
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<213>人工序列
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<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>11
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<213>人工序列
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<223>大鼠-人嵌合DNA
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<223>大鼠-人嵌合多肽
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<223>大鼠-人嵌合多肽
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<223>大鼠-人嵌合多肽
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<223>大鼠-人嵌合DNA
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<223>大鼠-人嵌合多肽
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<223>大鼠-人嵌合多肽
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<213>人工序列
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<223>大鼠-人嵌合DNA
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Figure A200780037124D01681
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<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
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Figure A200780037124D01682
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<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>32
Figure A200780037124D01691
<210>33
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>33
Figure A200780037124D01692
<210>34
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>34
Figure A200780037124D01701
<210>35
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>35
Figure A200780037124D01702
Figure A200780037124D01711
<210>36
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>36
Figure A200780037124D01712
<210>37
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>37
Figure A200780037124D01713
Figure A200780037124D01721
<210>38
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>38
Figure A200780037124D01722
<210>39
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>39
Figure A200780037124D01723
<210>40
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>40
Figure A200780037124D01732
<210>41
<211>19
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
Figure A200780037124D01733
<210>42
<211>57
<212>DNA
<213>智人
<400>42
Figure A200780037124D01741
<210>43
<211>108
<212>PRT
<213>大鼠
<220>
<223>ICR62VL
<400>43
Figure A200780037124D01742
<210>44
<211>324
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<223>ICR62 VL
<400>44
Figure A200780037124D01751
<210>45
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>45
Figure A200780037124D01752
<210>46
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>46
Figure A200780037124D01761
<210>47
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>47
Figure A200780037124D01762
<210>48
<211>66
<212>DNA
<213>智人
<400>48
Figure A200780037124D01763
<210>49
<211>109
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>49
Figure A200780037124D01764
<210>50
<211>327
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>50
Figure A200780037124D01772
<210>51
<211>109
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>51
<210>52
<211>327
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>52
Figure A200780037124D01782
<210>53
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Kabat
<400>53
Figure A200780037124D01791
<210>54
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Kabat
<400>54
Figure A200780037124D01792
<210>55
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Kabat
<400>55
<210>56
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Kabat
<400>56
<210>57
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Kabat
<400>57
<210>58
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Kabat
<400>58
Figure A200780037124D01802
<210>59
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Chothia
<400>59
Figure A200780037124D01803
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Chothia
<400>60
Figure A200780037124D01804
<210>61
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Chothia
<400>61
Figure A200780037124D01805
<210>62
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Chothia
<400>62
Figure A200780037124D01811
<210>63
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Chothia
<400>63
Figure A200780037124D01812
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 Chothia
<400>64
Figure A200780037124D01813
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>65
Figure A200780037124D01814
<210>66
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>66
Figure A200780037124D01821
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>67
Figure A200780037124D01822
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>68
Figure A200780037124D01823
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>69
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>70
Figure A200780037124D01831
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>71
Figure A200780037124D01832
<210>72
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>72
Figure A200780037124D01833
<210>73
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>73
Figure A200780037124D01834
<210>74
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR1 AbM
<400>74
<210>75
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>75
Figure A200780037124D01841
<210>76
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>76
Figure A200780037124D01842
<210>77
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>77
Figure A200780037124D01843
<210>78
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>78
Figure A200780037124D01851
<210>79
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>79
Figure A200780037124D01852
<210>80
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>80
Figure A200780037124D01853
<210>81
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>81
<210>82
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>82
Figure A200780037124D01861
<210>83
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>83
Figure A200780037124D01862
<210>84
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>84
Figure A200780037124D01863
<210>85
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>85
Figure A200780037124D01864
<210>86
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>86
Figure A200780037124D01871
<210>87
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>87
Figure A200780037124D01872
<210>88
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>88
<210>89
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>89
Figure A200780037124D01874
<210>90
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Kabat
<400>90
Figure A200780037124D01881
<210>91
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Chothia
<400>91
Figure A200780037124D01882
<210>92
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Chothia
<400>92
Figure A200780037124D01883
<210>93
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Chothia
<400>93
Figure A200780037124D01884
<210>94
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Chothia
<400>94
Figure A200780037124D01891
<210>95
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2　Chothia
<400>95
Figure A200780037124D01892
<210>96
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 Chothia
<400>96
Figure A200780037124D01893
<210>97
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>97
Figure A200780037124D01894
<210>98
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>98
Figure A200780037124D01901
<210>99
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>99
Figure A200780037124D01902
<210>100
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>100
Figure A200780037124D01903
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>101
Figure A200780037124D01904
<210>102
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>102
Figure A200780037124D01905
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>103
Figure A200780037124D01911
<210>104
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>104
Figure A200780037124D01912
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR 2AbM
<400>105
Figure A200780037124D01913
<210>106
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR2 AbM
<400>106
Figure A200780037124D01914
<210>107
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR3 Kabat Chothia AbM
<400>107
Figure A200780037124D01921
<210>108
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>重链CDR3 Kabat Chothia AbM
<400>108
<210>109
<211>328
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>IgG1恒定区
<400>109
Figure A200780037124D01923
Figure A200780037124D01931
Figure A200780037124D01941
<210>110
<211>987
<212>DNA
<213>智人
<220>
<223>IgG1恒定区
<400>110
Figure A200780037124D01942
<210>111
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR1
<400>111
Figure A200780037124D01951
<210>112
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR1
<400>112
<210>113
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR1
<400>113
Figure A200780037124D01953
<210>114
<211>33
>212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR1
<400>114
Figure A200780037124D01954
<210>115
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR2
<400>115
Figure A200780037124D01955
<210>116
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR2
<400>116
Figure A200780037124D01961
<210>117
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR3
<400>117
Figure A200780037124D01962
<210>118
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR2
<400>118
Figure A200780037124D01963
<210>119
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kabat轻链CDR3
<400>119
Figure A200780037124D01964
<210>120
<211>361
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合DNA
<400>120
<210>121
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大鼠-人嵌合多肽
<400>121
Figure A200780037124D01972
Figure A200780037124D01981
<210>122
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Kabat重链CDR1
<400>122
Figure A200780037124D01982
<210>123
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Kabat重链CDR1
<400>123
Figure A200780037124D01983
<210>124
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>AbM重链CDR1
<400>124
Figure A200780037124D01984
<210>125
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>AbM重链CDR1
<400>125
Figure A200780037124D01985
<210>126
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Kabat重链CDR2
<400>126
<210>127
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Kabat重链CDR2
<400>127
Figure A200780037124D01992
<210>128
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-1)
<400>128
Figure A200780037124D01993
Figure A200780037124D02001
<210>129
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-2)
<400>129
Figure A200780037124D02002
<210>130
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-3)
<400>130
Figure A200780037124D02011
<210>131
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-4)
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Figure A200780037124D02012
Figure A200780037124D02021
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<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-5)
<400>132
Figure A200780037124D02022
Figure A200780037124D02031
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<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-6)
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Figure A200780037124D02032
<210>134
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<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-7)
<400>134
Figure A200780037124D02041
<210>135
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<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-8)
<400>135
Figure A200780037124D02042
Figure A200780037124D02051
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<212>PRT
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<223>嵌合的大鼠-人序列(I-HHD-9)
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Figure A200780037124D02052
Figure A200780037124D02061
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Figure A200780037124D02071
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<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC1)
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Figure A200780037124D02072
Figure A200780037124D02081
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Figure A200780037124D02082
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<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC3)
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Figure A200780037124D02091
<210>142
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<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC4)
<400>142
Figure A200780037124D02092
Figure A200780037124D02101
<210>143
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC5)
<400>143
<210>144
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC6)
<400>144
Figure A200780037124D02111
<210>145
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC7)
<400>145
Figure A200780037124D02121
<210>146
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC8)
<400>146
Figure A200780037124D02122
<210>147
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合的大鼠-人序列(I-KC9)
<400>147
Figure A200780037124D02131
权利要求书(按照条约第19条的修改)
PCT19条修改的声明
申请人要求将下述修改加入到本申请中。
修改
请加入下述修改：
在权利要求书中：
请用替换页第1，3和5-6页替换第1，3和5-6页。
修改解释
修改了权利要求1和30，增加了新权利要求62-66，并删除了权利要求52。通过本修改方式没有引入新内容。
修改了权利要求1和30，并入原始权利要求52中叙述的限制，其叙述了在以治疗有效量向受试者施用时，ABM不引起临床显著水平的毒性。删除了权利要求52。
增加新权利要求62-66。可以在原始权利要求52中找到对权利要求62的支持。可以在段落[0258]和[0262]中找到对权利要求63-64的支持，所述段落公开了对需要治疗的哺乳动物中的EGFR-相关病症的治疗包括向该哺乳动物施用本发明的ABM，其中所述治疗引起所述ABM血清浓度为约1-约500μg/ml，持续至少4周的时间，且其中所述治疗在所述哺乳动物中不引起临床显著水平的毒性。在一个实施方案中，所述治疗引起所述ABM血清浓度为约1-约100μg/ml，持续至少4周的时间。可以在段落[0261]中找到对权利要求65的支持，该段落公开了在具体实施方案中，所述治疗有效量可以是约1.0mg/kg-约15mg/kg。可以在段落[0357]中找到对权利要求66的支持，该段落公开可以利用，例如，血液化学值或组织病理学指标测量ABM的毒性。
总结
通过本文中所述的修改没有增加新内容。申请人恭敬地要求如上所示地将此处提供的替换页引入到本申请中。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.抗原结合分子(ABM)，其包括大鼠ICR62单克隆抗体的一个或多个互补决定区(CDRs)中的一个或多个特异性决定残基(SDRs)，和源自异源多肽的序列，其中所述ABM特异性结合EGFR，但当以治疗有效量向受试者施用时不引起临床显著水平的毒性，且其中所述ABM不包括选自由下列各项组成的组中的序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，和SEQ ID NO：121。
2.权利要求1的ABM，其中所述一个或多个SDRs位于一个或多个重链CDRs中。
3.权利要求2的ABM，其中所述一个或多个重链SDRs选自由下列各项组成的组：在Kabat位置29处的苯丙氨酸、Kabat位置52处的天冬酰胺、Kabat位置56处的酪氨酸、和Kabat位置100b处的缬氨酸。
4.权利要求3的ABM，其中所述一个或多个重链SDRs包括Kabat位置56处的酪氨酸和Kabat位置100b处的缬氨酸。
5.权利要求3的ABM，其中一个或多个重链SDRs是Kabat位置29处的苯丙氨酸、Kabat位置52处的天冬酰胺、Kabat位置56处的酪氨酸和Kabat位置100b处的缬氨酸。
6.权利要求1的ABM，其中所述一个或多个SDRs位于一个或多个轻链CDRs中。
7.权利要求6的ABM，其中所述一个或多个轻链SDRs包括Kabat位置50处的天冬酰胺。
8.权利要求6的ABM，其中所述一个或多个轻链SDRs包括Kabat位置34处的天冬酰胺和Kabat位置50处的天冬酰胺。
9.权利要求1的ABM，其包括大鼠ICR62抗体的至少2个CDRs，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含关于所述CDRs的SDRs。
21.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约10-约5倍。
22.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约5-约0.1倍。
23.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约5-约2倍。
24.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约3-约1倍。
25.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约2倍。
26.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约1倍。
27.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约0.1倍。
28.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约0.001倍。
29.权利要求1的ABM，其中所述ABM包括多肽，所述多肽包括选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQ IDNO：130，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ IDNO：134，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ IDNO：138，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ IDNO：142，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：145，SEQ IDNO：146，和SEQ ID NO：147。
30.编码免疫球蛋白重链可变区的分离的多肽，所述免疫球蛋白重链可变区包括大鼠ICR62单克隆抗体的修饰的重链CDRs和源自一种或多种人种系可变区基因序列的重链构架区，其中所述修饰的重链CDRs包括位于选自由下列各项组成的组的Kabat位置处的一个或多个氨基酸替换：27，28，29，30，31，32，33，34，35，52，52a，53，54，55，57，58，59，60，61，62，63，64，65，95，96，97，98，99，100，100a，101，102和其任意组合，且其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR，但当以治疗有效量向受试者施用时不引起临床显著水平的毒性。
NO：146，和SEQ ID NO：147，其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。
41.用权利要求38-40中任一项的多核苷酸转染的宿主细胞。
42.包括权利要求38-40中任一项的多核苷酸的载体。
43.权利要求42的载体，其中所述载体是复制克隆载体。
44.权利要求42的载体，其中所述载体是表达载体。
45.包括权利要求42-44中任一项的载体的宿主细胞。
46.生成能够与大鼠ICR62单克隆抗体竞争结合人EGFR的抗原结合分子的方法，所述方法包括；
(a)在容许所述编码所述抗原结合分子的多核苷酸表达的条件下，在培养基中培养权利要求41或权利要求45的宿主细胞；和
(b)回收所述抗原结合分子。
47.包括权利要求30-37中任一项的多肽的ABM。
48.按照权利要求1-29或47中任一项的ABM，其中所述ABM包括Fc区域。
49.权利要求48的ABM，其中将所述Fc区域糖基改造为具有改变的寡糖结构。
50.权利要求49的ABM，其中当与相对应的非糖基改造ABM相比较时，所述Fc区域具有减少数量的岩藻糖残基。
51.权利要求48的ABM，其中将所述Fc区域糖基改造为与相对应的非糖基改造的ABM相比，具有增强的效应子功能或增高的Fc受体结合亲和性。
52.
53.包括权利要求1-29或46-52中任一项的ABM和药用载体的组合物。
54.靶向受试者中表达EGFR的细胞的方法，其包括向所述受试者施用权利要求53的组合物。
55.权利要求54的方法，其中所述细胞过表达EGFR。
56.权利要求54的方法，其中执行所述方法，从而在所述受试者中治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞-信号传导进行治疗的病症。
57.权利要求1-29或46-52中任一项的ABM，其用于制造药物，所述药物用于治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞信号传导进行治疗的病症。
58.权利要求1-29或46-52中任一项的ABM在制造药物中的应用，所述药物用于治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞信号传导进行治疗的病症。
59.权利要求54的方法，权利要求57的ABM，或权利要求58的应用，其中所述病症是细胞增殖病症。
60.权利要求59的方法、ABM、或应用，其中所述细胞增殖病症是癌症。
61.权利要求60的方法、ABM、或应用，其中所述癌症是选自由下列各项组成的组：乳腺癌，膀胱癌，头颈癌，皮肤癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，和脑癌。
62.权利要求39或权利要求40的ABM，其中当以治疗有效量向受试者施用时，所述抗原结合分子不引起临床显著水平的毒性。
63.权利要求1，30，39或40任一项的ABM，其中所述治疗有效量导致所述ABM的血清浓度在至少4周的时期内为约1μg/ml-约500μg/ml。
64.权利要求63的ABM，其中所述治疗有效量导致所述ABM的血清浓度在至少4周的时期内为约1μg/ml-约100μg/ml。
65.权利要求1，30，39或40任一项的ABM，其中所述ABM的所述治疗有效量是约1.0mg/kg-约15mg/kg。
66.权利要求1，30，39或40任一项的ABM，其中利用血液化学值或组织病理学指示剂测量所述ABM的毒性。

Claims (61)

1.抗原结合分子(ABM)，其包括大鼠ICR62单克隆抗体的一个或多个互补决定区(CDRs)中的一个或多个特异性决定残基(SDRs)，和源自异源多肽的序列，其中所述ABM特异性结合EGFR，且其中所述ABM不包括选自由下列各项组成的组中的序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQID NO：45，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，和SEQ ID NO：121。
2.权利要求1的ABM，其中所述一个或多个SDRs位于一个或多个重链CDRs中。
3.权利要求2的ABM，其中所述一个或多个重链SDRs选自由下列各项组成的组：在Kabat位置29处的苯丙氨酸、Kabat位置52处的天冬酰胺、Kabat位置56处的酪氨酸、和Kabat位置100b处的缬氨酸。
4.权利要求3的ABM，其中所述一个或多个重链SDRs包括Kabat位置56处的酪氨酸和Kabat位置100b处的缬氨酸。
5.权利要求3的ABM，其中一个或多个重链SDRs是Kabat位置29处的苯丙氨酸、Kabat位置52处的天冬酰胺、Kabat位置56处的酪氨酸和Kabat位置100b处的缬氨酸。
6.权利要求1的ABM，其中所述一个或多个SDRs位于一个或多个轻链CDRs中。
7.权利要求6的ABM，其中所述一个或多个轻链SDRs包括Kabat位置50处的天冬酰胺。
8.权利要求6的ABM，其中所述一个或多个轻链SDRs包括Kabat位置34处的天冬酰胺和Kabat位置50处的天冬酰胺。
9.权利要求1的ABM，其包括大鼠ICR62抗体的至少2个CDRs，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含关于所述CDRs的SDRs。
10.权利要求9的ABM，其包括大鼠ICR62抗体的至少3个CDRs，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含关于所述CDRs的SDRs。
11.权利要求9的ABM，其包括大鼠ICR62抗体的至少4个CDRs，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含关于所述CDRs的SDRs。
12.权利要求9的ABM，其包括大鼠ICR62抗体的至少5个CDRs，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含关于所述CDRs的SDRs。
13.权利要求9的ABM，其包括大鼠ICR62抗体的至少6个CDRs，或其变体或截短形式，所述变体或截短形式至少包含关于所述CDRs的SDRs。
14.权利要求9-14中任一项的ABM，其中所述大鼠ICR62抗体的一个或多个CDRs包括在一个或多个氨基酸位置处的替换，且其中所述ABM与未替换的ABM相比，保持结合活性。
15.权利要求14的ABM，其中所述大鼠ICR62抗体的一个或多个CDRs包括位于除特异性决定残基以外任一位置处的替换。
16.权利要求15的ABM，其中所述大鼠ICR62抗体的一个或多个CDRs包括位于除特异性决定残基以外所有位置处的替换。
17.权利要求15的ABM，其中所述CDR包括位于Chothia重链CDR1的Kabat位置27、28、或29，位于Kabat重链CDR1的位置31，位于Kabat重链CDR2的Kabat位置52、52a、53、或57，或位于Kabat重链CDR3的Kabat位置102中一处或多处的替换。
18.权利要求17的ABM，其中所述CDR包括位于Kabat轻链CDR1的Kabat位置30或32，位于Kabat轻链CDR2的Kabat位置51、52、53、或56，或位于Kabat重链CDR3的Kabat位置94中一处或多处的替换。
19.权利要求1-18中任一项的ABM，其中与未替换的ABM相比，关于结合的EC50浓度增高小于约10-约0.001倍。
20.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约10-约1倍。
21.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约10-约5倍。
22.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约5-约0.1倍。
23.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约5-约2倍。
24.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约3-约1倍。
25.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约2倍。
26.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约1倍。
27.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约0.1倍。
28.权利要求19的ABM，其中与未替换的ABM相比，EC50浓度增高小于约0.001倍。
29.权利要求1的ABM，其中所述ABM包括多肽，所述多肽包括选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQ IDNO：130，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ IDNO：134，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ IDNO：138，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ IDNO：142，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：145，SEQ IDNO：146，和SEQ ID NO：147。
30.编码免疫球蛋白重链可变区的分离的多肽，所述免疫球蛋白重链可变区包括大鼠ICR62单克隆抗体的修饰的重链CDRs和源自一种或多种人种系可变区基因序列的重链构架区，其中所述修饰的重链CDRs包括位于选自由下列各项组成的组的Kabat位置处的一个或多个氨基酸替换：27，28，29，30，31，32，33，34，35，52，52a，53，54，55，57，58，59，60，61，62，63，64，65，95，96，97，98，99，100，100a，101，102和其任意组合，且其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。
31.权利要求30的多肽，其中所述修饰的重链CDRs包括位于Kabat位置27，28，29，31，52，53，54，58，和102处的一个或多个氨基酸替换。
32.权利要求30的多肽，其中所述修饰的重链CDRs包括位于Kabat位置27，28，31，53，54，和58处的一个或多个氨基酸替换。
33.权利要求30的多肽，其中所述修饰的重链CDRs包括位于Kabat和Chothia重链CDRs中除SDRs以外所有位置处的氨基酸替换。
34.权利要求30的多肽，其中所述修饰的重链CDRs包括位于Kabat和Chothia重链CDRs中除Kabat位置29，52，56，和100b以外所有位置处的氨基酸替换。
35.编码免疫球蛋白轻链可变区的分离的多肽，所述免疫球蛋白轻链可变区包括大鼠ICR62单克隆抗体的修饰的轻链CDRs和源自一种或多种人种系可变区基因序列的轻链构架区，其中所述修饰的轻链CDRs包括位于选自由下列各项组成的组的Kabat位置处的一个或多个氨基酸替换：24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，51，52，53，54，55，56，89，90，91，92，93，94，95，96，97和其任意组合，且其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。
36.权利要求35的多肽，其中所述修饰的轻链CDRs包括位于Kabat和Chothia轻链CDRs中除SDRs以外所有位置处的氨基酸替换。
37.权利要求35的多肽，其中所述修饰的轻链CDRs包括位于Kabat和Chothia轻链CDRs中除Kabat位置34和50以外所有位置处的氨基酸替换。
38.编码权利要求30-37中任一项的多肽的分离的多核苷酸。
39.编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包括选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130，SEQ IDNO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：134，SEQ IDNO：135，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。
40.编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包括选自由下列各项组成的组的序列：SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ IDNO：142，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：145，SEQ IDNO：146，和SEQ ID NO：147，其中所述多肽，作为抗原结合分子的一部分，特异性结合人EGFR。
41.用权利要求38-40中任一项的多核苷酸转染的宿主细胞。
42.包括权利要求38-40中任一项的多核苷酸的载体。
43.权利要求42的载体，其中所述载体是复制克隆载体。
44.权利要求42的载体，其中所述载体是表达载体。
45.包括权利要求42-44中任一项的载体的宿主细胞。
46.生成能够与大鼠ICR62单克隆抗体竞争结合人EGFR的抗原结合分子的方法，所述方法包括；
(a)在容许所述编码所述抗原结合分子的多核苷酸表达的条件下，在培养基中培养权利要求41或权利要求45的宿主细胞；和
(b)回收所述抗原结合分子。
47.包括权利要求30-37中任一项的多肽的ABM。
48.按照权利要求1-29或47中任一项的ABM，其中所述ABM包括Fc区域。
49.权利要求48的ABM，其中将所述Fc区域糖基改造为具有改变的寡糖结构。
50.权利要求49的ABM，其中当与相对应的非糖基改造ABM相比较时，所述Fc区域具有减少数量的岩藻糖残基。
51.权利要求48的ABM，其中将所述Fc区域糖基改造为与相对应的非糖基改造的ABM相比，具有增强的效应子功能或增高的Fc受体结合亲和性。
52.权利要求1-29或46-51中任一项的ABM，其中当以治疗有效量向受试者施用时，所述ABM不引起临床显著水平的毒性。
53.包括权利要求1-29或46-52中任一项的ABM和药用载体的组合物。
54.靶向受试者中表达EGFR的细胞的方法，其包括向所述受试者施用权利要求53的组合物。
55.权利要求54的方法，其中所述细胞过表达EGFR。
56.权利要求54的方法，其中执行所述方法，从而在所述受试者中治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞-信号传导进行治疗的病症。
57.权利要求1-29或46-52中任一项的ABM，其用于制造药物，所述药物用于治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞信号传导进行治疗的病症。
58.权利要求1-29或46-52中任一项的ABM在制造药物中的应用，所述药物用于治疗能通过阻断EGFR-介导的细胞信号传导进行治疗的病症。
59.权利要求54的方法，权利要求57的ABM，或权利要求58的应用，其中所述病症是细胞增殖病症。
60.权利要求59的方法、ABM、或应用，其中所述细胞增殖病症是癌症。
61.权利要求60的方法、ABM、或应用，其中所述癌症是选自由下列各项组成的组：乳腺癌，膀胱癌，头颈癌，皮肤癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，和脑癌。
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