KR20090058518A

KR20090058518A - Ｅｇｆｒ 에 결합하는 항원 결합 분자, 이를 암호화하는 벡터, 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20090058518A
Application number: KR1020097004840A
Authority: KR
Inventors: 파블로 우마나; 에케하르트 모쓰너
Original assignee: 글리카트 바이오테크놀로지 아게
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2009-06-09
Also published as: AR062223A1; ZA200901590B; US8273328B2; CA2660584C; EP2444422A2; BRPI0716639B8; US9074008B2; IL196732A0; JP2010500020A; BRPI0716639B1; TW200817436A; EP2444422A3; WO2008017963A3; US8088380B2; JP5421105B2; CL2007002318A1; US20120149033A1; WO2008017963A4; US20080095770A1; NO20090406L

Abstract

본 발명은 항원 결합 분자 (ABM) 에 관한 것이다. 특별한 구현예에서, 본 발명은 인간 EGFR 에 대해 특이적인 키메라성, 영장류화된 또는 인간화된 항체를 포함하여 재조합 모노클로날 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 ABM 을 암호화하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 ABM 의 제조 방법, 및 질환 치료에 있어서 상기 ABM 의 사용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증가된 Fc 수용체 결합 및 증가된 효과기 기능이 있는 항체를 포함하여, 향상된 치료 특성을 갖는 개질된 당화가 있는 ABM 에 관한 것이다.

항원 결합 분자, EGFR

Description

ＥＧＦＲ 에 결합하는 항원 결합 분자, 이를 암호화하는 벡터, 및 그의 용도 {ANTIGEN BINDING MOLECULES THAT BIND EGFR, VECTORS ENCODING SAME, AND USES THEREOF}

본 발명은 항원 결합 분자 (ABM) 에 관한 것이다. 특별한 구현예에서, 본 발명은 인간 외피 성장 인자 수용체 (EGFR) 에 특이적인 키메라성, 영장류화된 또는 인간화된 항체를 포함하여, 재조합 모노클로날 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 ABM 를 암호화하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 ABM 의 제조 방법, 및 질환 치료에 있어서 이들 ABM 의 사용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증가된 Fc 수용체 결합 및 증가된 효과기 기능을 가진 항체를 포함하여, 향상된 치료 특성을 가진 개질된 당화가 있는 ABM 에 관한 것이다.

EGFR 및 항- EGFR 항체

인간 외피 성장 인자 수용체 (HER-1 또는 Erb-B1 이라고도 함, 및 본원에서는 "EGFR" 이라고 함) 는 c-erbB 전암성 유전자에 의해 암호화되는 170 kDa 막관통 수용체이고, 내인성 타이로신 키나아제 활성을 나타낸다 (Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996); Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). SwissProt 데이타베이스 엔트리 (SwissProt database entry) P00533 은 EGFR 의 서열을 제공한다. 또한, SwissProt 데이타베이스 엔트리 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3, 및 P00533-4 에 의해 규명된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 EGFR 의 아이소폼 및 변이체 (예를 들어, 대체 RNA 전사체, 절단된 버전, 다형체 등) 가 있다. EGFR 은 외피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자-α (TGf-α), 암피레굴린 (amphiregulin), 헤파린-결합 EGF (hb-EGF), 베타셀룰린 (betacellulin), 및 에피레굴린 (epiregulin) 을 포함하여 리간드에 결합하는 것으로 알려져 있다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Mendelsohn 및 Baselga, Oncogene 79:6550-6565 (2000)). EGFR 은 세포 증식, 분화, 세포 생존, 세포자살, 혈관신생, 유사분열, 및 전이를 조절하는 신호 전달 경로의 활성화를 포함하나 이에 제한되지 않는 타이로신-키나아제 매개 신호 전달 경로를 통해 많은 세포 과정을 조절한다 (Atalay 등, Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Tsao 및 Herbst, Signal 4:4-9 (2003); Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).

EGFR 의 과발현은 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선, 및 신장의 암을 포함하여 많은 인간 악성 조건에서 보고되어 있다 (Atalay 등, Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). 이러한 많은 조건에서, EGFR 의 과발현은 환자의 불량한 예후와 상호연관 또는 관련있다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). EGFR 은 또한, 악성 세포에서보다 일반적으로 더 낮은 수준이더라도, 정상 조직, 특히 피부, 간 및 위장관의 외피 조직 세포에서 발현된다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)).

진행성 유방암 치료를 위한 트라스투주마브 (Trastuzumab) (Herceptin™; Genentech Lac,), CD20 양성 B-세포, 저등급 또는 낭포성 비-호지킨스 림프종의 치료를 위한 리툭시마브 (Rituximab) (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, 및 Genentech Inc., San Francisco, CA), 재발성 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 겜투주마브 (Gemtuzumab)(Mylotar™, Celltech/Wyeth-Ayerst), 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병의 치료를 위한 알렘투주마브 (Alemtuzumab) (CAMPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) 에 대한 미국 식약청의 승인에 나타난 바와 같이, 비공액 모노클로날 항체 (mAb) 는 암 치료에 유용한 약제일 수 있다 (Grillo-Lopez, A.-J., 등, Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 27:309-18 (1999)). 이들 제품의 성공은 그의 효능뿐만 아니라 그의 두드러진 안전성 때문이다 (Grillo-Lopez, A.J., 등, Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 27:309-18 (1999)). 이들 약물의 성취에도 불구하고, 현재는 비공액 mAb 치료법에 의해 전형적으로 제공되는 것보다 더 높은 특이적인 항체 활성을 수득하는데 큰 관심이 있다.

많은 연구 결과는, Fc-수용체-의존성 기작이 종양에 대한 세포독성 항체의 작용에 실질적으로 기여한다고 제안하고, 종양에 대한 최적의 항체는 활성화 Fc 수용체에 우선적으로 결합하고, 억제성 파트너인 FcγRIIB 에는 최소한으로 결합할 것임을 가리킨다 (Clynes, R. A., 등, Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis, A.M., 및 Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195(12): 1653-1659 (June 2002). 예를 들어, 하나 이상의 연구 결과는, FcγRIIIa 수용체의 다형성은 특히, 항체 치료의 효능과 크게 연관있다고 제안한다 (Cartron, G., 등, Blood 99(3):754-757 (February 2002)). 상기 연구는, FcγRIIIa 에 대해 동형접합성인 환자는 이형접합성인 환자보다 리툭시마브에 대해 더 양호한 반응을 가지는 것을 보여주었다. 저자는, 우월한 반응은 FcγRIIIa 에의 더 양호한 생체 내 항체 결합으로 인한 것이었으며, 이는 림프종 세포에 대한 더 양호한 ADCC 활성을 초래하였다고 결론지었다 (Cartron, G., 등, Blood 99(3):754-757 (February 2002)).

EGFR 을 표적화하고, EGFR 신호화 경로를 차단하기 위한 다양한 전략이 보고되었다. 게피티니브 (gefitinib), 에를로티니브 (erlotinib), 및 CI-1033 과 같은 소분자 타이로신 키나아제 억제제는 세포내 타이로신 키나아제 영역에서 EGFR 의 자가인산화를 차단하여, 하류 신호화 사건을 억제시킨다 (Tsao 및 Herbst, Singal 4: 4-9 (2003)). 한편, 모노클로날 항체는 EGFR 의 세포외 부분을 표적으로 하고, 리간드 결합을 차단하여, 세포 증식과 같은 하위 사건을 억제시킨다 (Tsao 및 Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)).

다수의 쥣과 모노클로날 항체는 생성되어서, 시험관 내에서 그러한 차단을 달성하고, 마우스 이종 이식 모델에서 종양 성장에 영향을 주는 그의 능력에 대해 평가받았다 (Masui, 등, Cancer Res. 46:5592-5598 (1986); Masui, 등, Cancer Res. 44:1002-1007 (1984); Goldstein, 등, Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318 (1995)). 예를 들어, EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals) 는 인간 유표피암 세포주 A431 에 대해 제조되고, 후두 또는 하인두의 진행성 편평 세포 암종 환자의 임상 연구에서 테스트된 쥣과 항-EGFR 모노클로날 항체이다 (Bier 등, Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252:433-9 (1995)). 또한, EGFR 의 세포외 도메인에 결합하는 래트 모노클로날 항체 ICR16, ICR62, 및 ICR80 은 EGF 및 TGF-α 가 수용체에 결합하는 것을 억제시키는데 효과적인 것으로 나타났다 (Modjtahedi 등, Int. J. Cancer 75:310-316 (1998)). 쥣과 모노클로날 항체 425 는 인간 A431 암종 세포주에 대해 제조되고 인간 외피 성장 인자 수용체의 외부 도메인 상의 폴리펩타이드 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀진 또다른 MAb 이다 (Murthy 등, Arch. Biochem. Biophys. 252(2): 549-560 (1987). 치료에서 쥣과 항체를 사용할 때의 잠재적인 문제점은 상기 항체가 인간 숙주에 의해 외래 단백질로서 인지될 수 있는 비-인간 모노클로날 항체라서 ; 상기 외래 항체의 반복적인 주입은 면역 반응의 유도를 초래하여 해로운 초민감성 반응을 초래할 수 있다는 점이다. 쥣과-기재 모노클로날 항체에 대해, 이를 종종 인간 항-마우스 항체 반응, 또는 "HAMA" 반응, 또는 인간 항-래트 항체, 또는 "HARA" 반응이라고 한다. 추가로, 이들 "외래" 항체는 숙주의 면역계에 의해 공격당해서, 사실상 상기 항체가 그의 표적 부위에 도달하기 전에 중화될 수 있다. 더욱이, 비-인간 모노클로날 항체 (예를 들어, 쥣과 모노클로날 항체) 는 전형적으로 인간 효과기 기능성이 결여되어 있는데, 즉, 상기 항체는 보체 의존성 파쇄를 매개할 수 없거나, 또는 항체 의존성 세포 독성 또는 Fc-수용체 매개 식세포작용을 통해 인간 표적 세포를 파쇄할 수 없 다.

2 가지 이상의 상이한 종 (예를 들어, 마우스 및 인간) 의 항체 부분을 포함하는 키메라성 항체는 "공액된" 항체에 대한 대체물로서 개발되었다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,891,996 호 (Mateo de Acosta del Rio 등) 는 EGFR 에 대한 마우스/인간 키메라성 항체, R3 을 논의하고, 미국 특허 제 5,558,864 호는 쥣과 항-EGFR MAb 425 의 키메라성 및 인간화된 형태의 생성을 논의한다. 또한, IMC-C225 (Erbitux®; ImCIone) 는 다양한 인간 이종 이식 모델에서 항종양 효능을 나타내는 것으로 보고된 키메라성 마우스/인간 항-EGFR 모노클로날 항체 (마우스 M225 모노클로날 항체를 기재로 한 것, 인간 임상 시도에서 HAMA 반응을 초래함) 이다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). IMC-C225 의 효능은 EGFR 신호화 경로에 의해, 그리고 가능하게는 증가된 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 활성에 의해 조절되는 세포 사건의 억제를 포함하여, 다수의 기작으로 인한 것이다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). IMC-C225 는 또한, 방사선치료 및 화학치료와의 병용을 포함하여 임상 시도에서 사용되었다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611. (2002)). 최근, Abgenix, Inc. (Fremont, CA) 는 암 치료를 위해 ABX-EGF 를 개발하였다. ABX-EGF 는 전체 인간 항-EGFR 모노클로날 항체이다 (Yang 등, Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38: 17-23 (2001)).

항체 당화

올리고사카라이드 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약물동력성, 및 특정 생물학적 활성을 포함하여 치료 당단백질 의 효능과 관련된 특성에 유의하게 영향을 줄 수 있다. 상기 특성은 올리고사카라이드의 존재 또는 부재뿐만 아니라, 특정 구조에 따라 크게 다를 수 있다. 올리고사카라이드 구조 및 당단백질 기능 간의 일부 일반화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 올리고사카라이드 구조는 특정 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터 당단백질의 빠른 소거를 매개하고, 한편, 다른 구조는 항체에 의해 결합되어 불필요한 면역 반응을 유도할 수 있다 (Jenkins 등, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).

포유류 세포는 인간 적용을 위한 가장 융화성의 형태로 단백질을 당화시키는 그의 능력으로 인해, 치료 당단백질의 제조에 바람직한 숙주이다 (Gumming 등, Glycobiology 7:115-30 (1991); Jenkins 등, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). 효모, 섬유성 진균류, 곤충 및 식물 세포와 같은 일반적인 다른 유형의 숙주처럼, 박테리아는 단백질을 거의 드물게 당화시키고, 혈류로부터의 빠른 소거, 불필요한 면역 반응, 및 일부 특정 경우 감소된 생물학적 활성과 연관된 당화 패턴을 초래한다. 포유류 세포 중에서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포는 지난 20 년 동안 가장 흔하게 사용되어 왔다. 적합한 당화 패턴을 제공하는 것 외에도, 상기 세포는 유전적으로 안정하고, 고도로 생산적인 클론 세포주가 지속적으로 생성될 수 있게 한다. 상기 세포는 혈청 없는 배지를 사용한 단순한 생물반응기에서 높은 밀도로 배양될 수 있고, 안전하고 재생가능한 생물공정의 발달을 허용한다. 다른 흔하게 사용되는 동물 세포에는 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, NSO- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포가 포함된다. 더욱 최근에는, 유전자 도입 동물로부터의 생성도 테스트되었다 (Jenkins 등, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).

모든 항체는 중쇄 불변 영역 내 보존된 위치에서 탄수화물 구조를 함유하고, 각각의 아이소타입은 N-연결된 탄수화물 구조의 분명한 어레이를 갖고 있으며, 이는 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 다양하게 영향을 준다 (Wright, A., 및 Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). 부착된 N-연결된 탄수화물 구조는 가공 정도에 따라 상당히 다양하고, 고-만노스 (high-mannose), 다중-분지 뿐만 아니라, 바이안테나리 (biantennary) 복합체 올리고사카라이드를 포함할 수 있다 (Wright, A., 및 Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). 전형적으로, 특정 당화 부위에 부착된 코어 올리고사카라이드 구조의 이종접합성 가공이 있어서, 모노클로날 항체이더라도 다중 글리코형태로서 존재한다. 마찬가지로, 항체 당화의 주요 차이는 세포주 사이에 발생하고, 심지어 최소의 차이라도 상이한 배양 조건 하에 배양된 해당 세포주에서 나타난다 (Lifely, M. R. 등, Glycobiology 5(8):813-22 (1995)).

간단한 제조 방법을 유지하고, 유의하고, 불필요한 부작용을 상당히 피하면서, 잠재성을 크게 증가시키기 위한 한 방법은 [Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999)] 및 미국 특허 제 6,602,684 에서 기술된 바와 같이 모노클로날 항체의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 상기 항체의 본래의, 세포-매개성 효과기 기능을 향상시키는 것이며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입되어 있다. 암 면역치료에 가장 흔하게 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 내 Asn297 에, 보존된 N-연결된 당화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 2 개의 복합체 바이안테나리 올리고사카라이드는 CH2 도메인 사이에 묻혀서 폴리펩타이드 골격과의 광범위한 접촉을 형성하고, 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 기능을 매개하기 위해서는 항체에 있어서 상기 올리고사카라이드의 존재가 필수적이다 (Lifely, M. R., 등, Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., 등, Immunol Rev. 163:59-16 (1998); Wright, A. 및 Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997)).

Umana 등은, 양분된 올리고사카라이드의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III ("GnTIII") 가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 과발현되는 것이, 조작된 CHO 세포에 의해 생성되는 항-신경아세포종 키메라성 모노클로날 항체 (chCE7) 의 시험관 내 ADCC 활성을 유의하게 증가시킨다는 것을 이미 나타내었다 (전체 내용이 본원에 참조로써 삽입된 [Umafia, P. 등, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)] ; 및 국제 공개 제 99/54342 호 참조). 항체 chCE7 은 높은 종양 친화성 및 특이성을 가지나, GnTIII 효소가 결여된 표준 산업 세포주에서 생성되는 경우 임상적으로 유용한 능력이 거의 없는 비공액 mAb 의 큰 부류에 속한다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). 상기 연구는, ADCC 활성의 큰 증가는 GnTIII 을 발현하도록 항체-생성 세포를 조작함으로써 수득될 수 있으며, 이는 또한 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드를 포함하여 불변 영역 (Fc)-연관된, 양분된 올리고사카라이드의 비율을 자연 발생 항체에서 발견된 수준 초과로 증가시킴을 보여 주는 첫번째 연구였다.

인간을 포함하나 이에 제한되지 않는 영장류에서 세포 증식 장애의 치료를 위해 EGFR 을 표적으로 하는 향상된 치료 접근법에 대한 요구는 여전하며, 여기서 상기 장애는 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선, 및 신장암을 포함하나 이에 제한되지 않는 EGFR 발현, 특히 비정상 발현 (예를 들어, 과발현) 을 특징으로 한다. 특히, 인간 개체에 투여되는 항원 결합 분자 내 비-인간 잔기의 수를 최소화할 필요가 있다.

발명의 간략한 개요

래트 ICR62 항체 (예를 들어, 동일한 에피토프에 결합) 의 결합 특이성을 갖고, Fc 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 향상시키도록 당개질된 항원 결합 분자 (ABM) 의 대단한 치료 능력을 인지하고서, 본 발명자들은 상기 ABM 을 제조하는 방법을 개발하였다. 즉, 상기 방법은 재조합, 키메라성 항체 또는 그의 키메라성 절편을 제조하는 것을 포함한다. 상기 ABM 의 효능은 항체 Fc 영역의 당화 프로파일을 조작함으로써 추가로 향상된다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 래트 ICR62 모노클로날 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 하나 이상의 특이성 결정 잔기 (SDR), 및 이형접합성 폴리펩타이드 유래 서열을 포함하는 항원 결합 분자 (ABM) 에 관한 것으로서, 여기서, ABM 은 EGFR 에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, ABM 은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하지 않는다.

한 구현예에서, 하나 이상의 SDR 은 하나 이상의 중쇄 CDR 에 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 중쇄 SDR 은 Kabat 위치 29 에 있는 페닐알라닌, Kabat 위치 52 에 있는 아스파라긴, Kabat 위치 56 에 있는 타이로신, 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 중쇄 SDR 은 Kabat 위치 56 에 있는 타이로신 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 중쇄 SDR 은 Kabat 위치 29 에 있는 페닐알라닌, Kabat 위치 52 에 있는 아스파라긴, Kabat 위치 56 에 있는 타이로신 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린을 포함한다.

한 구현예에서, 하나 이상의 SDR 은 하나 이상의 경쇄 CDR 에 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 경쇄 SDR 은 Kabat 위치 50 에 있는 아스파라긴을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 경쇄 SDR 은 Kabat 위치 34 에 있는 아스파라긴 및 Kabat 위치 50 에 있는 아스파라긴을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 래트 ICR62 항체의 2 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 하나 이상의 SDR 을 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 ABM 에 관한 것이다. 한 구현예에서, ABM 은 래트 ICR62 항체의 3 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 하나 이상 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 구현예에서, ABM 은 래트 ICR62 항체의 4 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 구현예에서, ABM 은 래트 ICR62 항체의 5 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 구현예에서, ABM 은 래트 ICR62 항체의 6 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 추가의 구현예에서, 래트 ICR62 항체의 CDR(들) 은 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환을 포함하고, 여기서, 상기 ABM 은 비치환 ABM 과 비교해 결합 활성을 유지한다. 추가의 구현예에서, 래트 ICR62 항체의 CDR(들) 은 특이성 결정 잔기를 제외하고 어느 위치에나 치환을 포함한다. 추가의 구현예에서, 래트 ICR62 항체의 CDR(들) 은 특이성 결정 잔기를 제외하고 모든 위치에서 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR(들) 은 Chothia 중쇄 CDR1 의 Kabat 위치 27, 28, 또는 29, Kabat 중쇄 CDR1 의 위치 31, Kabat 중쇄 CDR2 의 Kabat 위치 52, 52a, 53, 또는 57, 또는 Kabat 중쇄 CDR3 의 Kabat 위치 102 중 하나 이상에서 치환을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, CDR(들) 은 Kabat 경쇄 CDR1 의 Kabat 위치 30 또는 32, Kabat 경쇄 CDR2 의 Kabat 위치 51, 52, 53, 또는 56, 또는 Kabat 중쇄 CDR3 의 Kabat 위치 94 중 하나 이상에서 치환을 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 결합에 대한 EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해, 약 10 내지 약 0.001 배 미만만큼 조정되는 ABM 에 관한 것이다. 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 10 내지 약 1 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 10 내지 약 5 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 5 내지 약 0.1 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 5 내지 약 2 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 3 내지 약 1 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 2 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 1 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 0.1 배 미만만큼 조정된다. 또다른 특정 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 에 비해, 약 0.001 배 미만만큼 조정된다. 일부 구현예에서, 상기 열거된 조정은 EC50 의 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 조정은 EC50 의 감소를 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, 및 SEQ ID NO:147 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 ABM 에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 래트 ICR62 모노클로날 항체의 개질된 중쇄 CDR, 및 하나 이상의 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열에서 유래된 중쇄 골격 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 여기서, 상기 개질된 중쇄 CDR 은 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 52, 52a, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 101, 102, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Kabat 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 항원 결합 분자의 부분으로서 인간 EGFR 에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 개질된 중쇄 CDR 은 Kabat 위치 27, 28, 29, 31, 52, 53, 54, 58, 및 102 에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, 개질된 중쇄 CDR 은 Kabat 위치 27, 28, 31, 53, 54, 및 58 에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, 개질된 중쇄 CDR 은 SDR 을 제외하고 Kabat 및 Chothia 중쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, 개질된 중쇄 CDR 은 Kabat 위치 29, 52, 56, 및 100b 를 제외하고 Kabat 및 Chothia 중쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명은 또한, 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 래트 ICR62 모노클로날 항체의 개질된 경쇄 CDR, 및 하나 이상의 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열 유래의 경쇄 골격 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 여기서, 상기 개질된 경쇄 CDR 은 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Kabat 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 항원 결합 분자의 일부로서 인간 EGFR 에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 개질된 경쇄 CDR 은 SDR 을 제외하고, Kabat 및 Chothia 경쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 또다른 특정 구현예에서, 개질된 경쇄 CDR 은 Kabat 위치 34 및 50 을 제외하고, Kabat 및 Chothia 경쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명은 또한, 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 ABM 에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, 및 SEQ ID NO:147 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 항원 결합 분자의 일부로서 인간 EGFR 에 특이적으로 결합한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드로 트랜스펙션된 숙주 세포, 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 구현예에서, 벡터는 복제 클로닝 벡터이다. 또다른 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 인간 EGFR 에 결합하기 위해 래트 ICR62 모노클로날 항체와 경쟁할 수 있는 항원 결합 분자의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현할 수 있는 조건 하에 배지 내에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하고, 항원 결합 분자를 회수하는 것을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명의 ABM 은 Fc 영역에 변경된 올리고사카라이드 구조를 갖도록 당개질된다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 상응하는 당개질화되지 않은 ABM 과 비교해 감소된 수의 푸코스 잔기를 갖는다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 ABM 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체 내에서 EGFR 을 발현하는 세포를 표적화하는 것이다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 EGFR 을 과발현한다. 또다른 특정 구현예에서, 상기 방법은 상기 개체에서 EGFR-매개 세포-신호화를 차단함으로써 치료가능한 장애를 치료하기 위해 수행된다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 EGFR-매개 세포 신호화를 차단함으로써 치료가능한 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되기 위한 ABM 에 관한 것이다. 한 구현예에서, 장애는 세포 증식 장애이다. 특정 구현예에서, 세포 증식 장애는 암이다. 더욱 특정한 구현예에서, 암은 유방암, 방광암, 두경부암, 피부암, 췌장암, 폐암, 난소암, 대장암, 전립선암, 신장암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:124 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ; (b) SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:.88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, 및 SEQ ID NO:126 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ; 및 (c) SEQ ID NO:108 을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:112 및 SEQ ID NO:114 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ; (b) SEQ ID NO:116 및 SEQ ID NO:118 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ; 및 (c) SEQ ID NO:119 를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 이들 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 이들 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의 또는 모두를 제외한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 및 SEQ ID NO:120 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:50; 및 SEQ ID NO:52 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 이들 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의 또는 모두를 제외한다.

본 발명은 추가로, SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 및 SEQ ID NO:120 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 여기서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:50; 및 SEQ ID NO:52 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 여기서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 이들 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의 또는 전부를 제외한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 이들 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의 또는 전부를 제외한다.

본 발명은 또한, SEQ ID NO:1 의 서열을 갖는 키메라성 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 래트 이외의 종의 SEQ ID NO:1 의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 ; 및 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 분절을 포함한다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID No:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 키메라성 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 래트 이외의 종으로부터, SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:ll; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID No:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 ; 및 래트 이외의 종의, 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 분절에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩타이드를 암호화하는 이들 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의 또는 전부를 제외한다.

더욱 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:43 의 서열을 갖는 키메라성 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:43 의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 ; 및 래트 이외의 종으로부터, 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 분절을 포함한다. 더욱 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; 및 SEQ ID NO:51 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 키메라성 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; 및 SEQ ID NO:51 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 및 래트 이외의 종으로부터, 항체 경쇄 불변 영역 (CL) 의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 분절을 포함한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩타이드를 암호화하는 이들 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의 또는 전부를 제외한다.

본 발명은 ICR62 항체의 VH 영역을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 기능성 변이체, 및 래트 이외의 종으로부터, 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 분절을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 ICR62 항체의 VL 영역을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 기능성 변이체, 및 래트 이외의 종으로부터, 항체 CL 영역의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 또는 그의 분절을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 상기 기술된 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 단리된 폴리뉴클레오타이드 중 임의를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:123, 및 SEQ ID NO:125 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ; (b) SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, 및 SEQ ID NO:127 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 및 (c) SEQ ID NO:107 을 포함하는 단리된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 이들 단리된 폴리펩타이드 중 임의 또는 모두를 제외한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:111 및 SEQ ID NO:113 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열; (b) SEQ ID NO:115; 및 (c) SEQ ID NO:117 을 포함하는 단리된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 이들 단리된 폴리펩타이드 중 임의 또는 모두를 제외한다.

본 발명은 또한, SEQ ID NO::1 의 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, SEQ ID NO:43 의 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 이들 폴리펩타이드 중 임의의 하나는 추가로, 인간 Fc 영역 및/또는 인간 CL 영역을 포함한다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11 ; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31 ; SEQ ID No:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; 및 SEQ ID NO:51 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 이들 폴리펩타이드 중 임의 또는 모두는 추가로 인간 Fc 영역 및/또는 인간 CL 영역을 포함한다. 한 구현예에서, 인간 Fc 영역은 IgG1 을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 ICR62 항체 유래 서열 및 이형접합성 폴리펩타이드 유래 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항원-결합 분자에 관한 것이다. 한 구현예에서, 항원-결합 분자는 항체이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 키메라성이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 인간화 또는 영장류화된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 EGFR 에의 결합에 대해 래트 ICR62 항체와 경쟁할 수 있고 키메라성인 ABM 에 관한 것이다. 한 구현예에서, ABM 은 항체 또는 그의 분절이다. 추가의 구현예에서, ABM 은 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ DD No33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 재조합 항체이다. 또다른 구현예에서, ABM 은 SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; 및 SEQ ID NO:51 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 재조합 항체이다. 추가의 구현예에서, ABM 은 영장류화된 재조합 항체이다. 더욱 추가의 구현예에서, ABM 은 인간화된 재조합 항체이다. 또다른 구현예에서, ABM 은 인간 Fc 영역을 포함하는 재조합 항체이다. 추가의 구현예에서, 상기 논의된 ABM 중 임의는 독소 또는 방사성표지와 같은 부분에 공액될 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명의 ABM, 개질된 올리고사카라이드를 갖는 상기 ABM 에 관한 것이다. 한 구현예에서, 개질된 올리고사카라이드는 비-개질된 올리고사카라이드와 비교해 감소된 푸코실화를 갖는다. 다른 구현예에서, 개질된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체이다. 추가의 구현예에서, ABM 은 상기 분자의 Fc 영역 내에 비푸코실화된 올리고사카라이드 또는 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드를 증가된 비율로 갖는다. 한 구현예에서, 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드이다. 추가의 구현예에서, 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드는 복합체이다. 한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 Fc 영역 내 20% 이상의 올리고사카라이드는 비푸코실화된 또는 양분된, 비푸코실화된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 또는 그 이상의 올리고사카라이드는 비푸코실화된 또는 양분된, 비푸코실화된다.

본 발명은 추가로, 상기 기술된 ABM 중 임의를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 세포에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, EGFR 에 결합하기 위해 래트 ICR62 항체와 경쟁할 수 있는 ABM 의 제조 방법에 관한 것으로서, 여기서, 상기 ABM 은 키메라성이고 ; 상기 방법은 (a) 상기 폴리뉴클레오타이드 암호화하는 상기 ABM 을 발현할 수 있는 조건 하에 배지 내에서 본 발명의 ABM 을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고 ; (b) 생성 배양물로부터 상기 ABM 을 회수하는 것을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 ABM 을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 약학적 조성물은 추가로, 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 EGFR 의 발현 (예를 들어, EGFR 의 비정상 또는 과발현) 을 특징으로 하는 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 ABM 을, 이를 필요로 하는 개체, 바람직하게는 포유류 개체, 및 더욱 바람직하게는 인간에 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 질환은 키메라성 (예를 들어 인간화된) 항체, 또는 항체의 키메라성 절편인 ABM 을 투여함으로써 치료된다. 한 구현예에서, ABM 은 약 1.0 mg/kg 내지 약 15.0 mg/kg 의 양으로 투여된다. 또다른 구현예에서, ABM 은 약 1.5 mg/kg 내지 약 12.0 mg/kg 의 양으로 투여된다. 추가의 구현예에서, ABM 은 약 1.5 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg 의 양으로 투여된다. 추가의 구현예에서, ABM 은 약 4.5 mg/kg 내지 약 12.0 mg/kg 의 양으로 투여된다. 추가의 구현예에서, ABM 은 약 1.5, 약 4.5, 및 약 12.0 mg/kg 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양으로 투여된다.

더욱 또다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에 의해 생성되는 ABM 의 Fc 영역의 올리고사카라이드를 개질하기에 충분한 양으로 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포에 관한 것으로서, 여기서, ABM 은 EGFR 에의 결합에 대해 래트 ICR62 항체와 경쟁할 수 있고, ABM 은 키메라성이다. 한 구현예에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드이다. 또다른 구현예에서, 숙주 세포에 의해 생성되는 ABM 은 항체 또는 항체 절편이다. 한 구현예에서, 항체 또는 항체 절편은 인간화된다. 추가의 구현예에서, ABM 은 인간 IgG 의 Fc 영역에 대응하는 영역을 포함한다.

본 발명은 또한, 래트 ICR62 항체의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의) 상보성 결정 영역, 또는 적어도 상기 상보성 결정 영역에 대한 특이성-결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 여기서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 항원 결합 분자인 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 래트 ICR62 항체의 3 개의 상보성 결정 영역, 또는 적어도 상기 3 개의 상보성 결정 영역의 각각에 대한 특이성-결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 항체의 경쇄 또는 중쇄의 전체 가변 영역을 암호화한다. 본 발명은 추가로, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 래트 ICR62 항체의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개) 상보성 결정 영역, 또는 적어도 상기 상보성 결정 영역에 대한 특이성-결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하고, 이형접합성 폴리펩타이드의 서열을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 구현예에서, 항원 결합 분자는 래트 ICR62 항체의 3 개의 상보성 결정 영역, 또는 적어도 상기 3 개의 상보성 결정 영역의 각각에 대한 특이성-결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 측면에서, 항원 결합 분자는 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 한 특히 유용한 구현예에서, 항원 결합 분자는 키메라성, 예를 들어, 인간화된, 항체이다. 본 발명은 또한, 상기 항원 결합 분자의 제조 방법, 및 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선, 피부, 및 신장의 암과 같은 악성 질환을 포함하여 질환의 치료에서의 상기 분자의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 숙주 세포는 HEK293-EBNA 세포, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 추가로, 래트 ICR62 항체 또는 그의 변이체의 VL 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역에 대응하는 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 트랜스펙션된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 추가로, 래트 ICR62 항체 또는 그의 변이체의 VH 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역에 대응하는 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 트랜스펙션된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 올리고사카라이드의 개질 결과, 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 효과기 기능을 나타내는 ABM 을 생성하는 숙주 세포에 관한 것이다. 한 구현예에서, 증가된 결합 친화성은 Fc 수용체, 특히, FcγRIIIA 수용체에 관한 것이다. 본원에서 생각하는 효과기 기능은 증가된 Fc-매개 세포성 세포독성 ; NK 세포에의 증가된 결합 ; 대식세포에의 증가된 결합 ; 다형핵 세포에의 증가된 결합 ; 단핵구에의 증가된 결합 ; 세포자살을 포함하여 증가된 직접 신호화 ; 증가된 수지상 세포 성숙화 ; 및 증가된 T 세포 프라이밍을 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 항상 발현되는 프로모터 요소 (constitutive promoter element) 에 조작적으로 연결된, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 ABM 을 제조하는 방법에 관한 것이다 :

(a) 상기 ABM 의 생성을 허용하고, 상기 ABM 의 Fc 영역 상에 존재하는 올리고사카라이드의 개질을 허용하는 조건 하에, GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 배양하는 단계 ; 및

(b) 상기 ABM 을 단리하는 단계 ;

(여기서, 상기 ABM 은 EGFR 에의 결합을 위해 래트 ICR62 항체와 경쟁할 수 있고, 상기 ABM 은 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 임). 한 구현예에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드, 바람직하게는 GnTIII 의 촉매 도메인, 및 만노시다제 II 의 위치화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I ("GnTI") 의 위치화 도메인, 만노시다제 I 의 위치화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II ("GnTII") 의 위치화 도메인, 및 α1-6 코어 푸코실트랜스퍼라제의 위치화 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이형접합성 골지 체류 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 골지 위치화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI 로부터 비롯된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 핵산 또는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는, 숙주 세포에 의해 생성되는 항-EGFR ABM 의 당화 프로파일을 개질하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, ABM 은 항체 또는 그의 분절 ; 바람직하게는 IgG 의 Fc 영역을 포함한다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 인간 IgG 의 Fc 영역에 대응하는 영역을 포함하는 융합 단백질이다.

한 측면에서, 본 발명은 EGFR 에의 결합에 대해 래트 ICR62 항체와 경쟁할 수 있고, 감소된 푸코실화를 갖는 재조합, 키메라성 항체, 또는 그의 분절에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 GnTIII 활성을 갖고 이형접합성 골지 체류 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 사용함으로써, 본 발명의 재조합 항체 또는 그의 분절의 당화를 개질하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 GnTIII 의 촉매 도메인을 포함한다. 또다른 구현예에서, 골지 위치화 도메인은 만노시다제 II 의 위치화 도메인, GnTI 의 위치화 도메인, 만노시다제 I 의 위치화 도메인, GnTII 의 위치화 도메인 및 α1-6 코어 푸코실트랜스퍼라제의 위치화 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 골지 위치화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI 로부터 비롯된다.

한 구현예에서, 본 발명의 방법은 개질된 올리고사카라이드가 있는 재조합, 키메라성 항체 또는 그의 분절의 제조에 관한 것으로서, 여기서, 상기 개질된 올리고사카라이드는 비-개질된 올리고사카라이드와 비교해 감소된 푸코실화를 갖는다. 본 발명에 따르면, 이들 개질된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 폴리펩타이드의 Fc 영역에 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드를 증가된 비율로 갖는, 재조합, 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 항체 또는 그의 분절의 제조 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드이다. 또다른 구현예에서, 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드는 복합체이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법은 양분된, 비푸코실화된 상기 폴리펩타이드의 Fc 영역에 올리고사카라이드를 20% 이상 갖는 재조합, 키메라성 항체 또는 그의 분절의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 Fc 영역 내 올리고사카라이드 중 30% 이상은 양분된, 비푸코실화된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 Fc 영역 내 올리고사카라이드 중 35% 이상은 양분된, 비푸코실화된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 올리고사카라이드의 개질 결과, 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 효과기 기능을 나타내는 재조합, 키메라성 항체 또는 그의 분절에 관한 것이다. 한 구현예에서, 증가된 결합 친화성은 Fc 활성화 수용체이다. 추가의 구현예에서, Fc 수용체는 Fcγ 활성화 수용체, 특히, FcγRIIIA 수용체이다. 본원에서 생각하는 효과기 기능은 증가된 Fc-매개 세포성 세포독성 ; NK 세포에의 증가된 결합 ; 대식세포에의 증가된 결합 ; 다형핵 세포에의 증가된 결합 ; 단핵구에의 증가된 결합 ; 세포자살을 유도하는 증가된 직접 신호화 ; 증가된 수지상 세포 성숙화 ; 및 증가된 T 세포 프라이밍을 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 래트 ICR62 항체의 결합 특이성을 갖고, 본 발명의 방법 중 임의의 방법에 의해 생성되는 효과기 기능이 증가되도록 조작된 Fc 영역을 함유하는 재조합, 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 항체 절편에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID No:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 면역글로불린의 Fc 영역에 해당하고 본 발명의 방법 중 임의의 방법에 의해 효과기 기능이 증가되도록 조작된 영역을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 이들 단리된 폴리펩타이드 중 임의 또는 모두를 제외한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; 및 SEQ ID NO:51 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 면역글로불린의 Fc 영역에 해당하고 본 발명의 방법 중 임의의 방법에 의해 효과기 기능이 증가되도록 조작된 영역을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 이들 단리된 폴리펩타이드 중 임의 또는 모두를 제외한다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 임의의 방법에 의해 생성되는 재조합, 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 항체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 임의의 방법에 의해 생성되는 재조합, 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 항체 절편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 임의의 방법에 의해 생성되는 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 생체 내 또는 시험관 내에서 EGFR 을 발현하는 세포를 표적으로 하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 ABM 을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체 내에서 EGFR 을 발현하는 세포를 표적으로 하는 방법에 관한 것이다.

더욱 또다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어, EGFR 발현과 관련된 장애를 진단하기 위해, 생체 내 또는 시험관 내에서 샘플 내 EGFR 의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 검출은 ABM 및 EGFR 간에 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에, 테스트되는 샘플을 임의로 대조군 샘플과 함께, 본 발명의 ABM 과 접촉시킴으로써 수행된다. 다음, 상기 복합체 형성을 검출한다 (예를 들어, ELISA 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해). 대조군 샘플을 테스트 샘플과 함께 사용하는 경우, 테스트 샘플 및 대조군 샘플을 비교할 때 ABM-EGFR 복합체의 형성에 있어서 임의의 통계적으로 유의한 차이가 테스트 샘플 내 EGFR 의 존재를 가리키는 지표이다.

본 발명은 추가로, 본 발명의 방법 중 임의의 방법에 의해 생성되는 치료적 유효량의 재조합, 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 항체 또는 그의 절편을 이를 필요로 하는 인간 개체에 투여하는 것을 포함하는, 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선, 피부, 및 신장의 암을 포함하여 EGFR 발현과 관련된 장애, 특히, 세포 증식 장애의 치료 방법에 관한 것으로서, 여기서, EGFR 은 발현되고, 더욱 특히, EGFR 은 비정상적으로 발현된다 (예를 들어, 과발현).

도 1 은 인간화된 ICR62 구축물 I-HHC (중쇄) 및 I-KB (경쇄) 와 조합된 경우, 개별 중쇄 및 경쇄 키메라성 래트-인간 ICR62 폴리펩타이드 사슬의 기능성 활성을 보여준다. rVL 는 키메라성 경쇄를 나타내고, rVH 는 키메라성 중쇄를 나타낸다. "r" 은 가변 도메인이 본래 래트 항체에서 비롯되었음을 가리킨다.

도 2 는 다양한 배열로 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역 구축물 I-HHC, I-HHA 및 I-HLA 및 인간화된 경쇄 가변 영역 구축물 I-KA 및 I-KB 를 포함하는 인간화된 ICR62 항체의 결합 활성을 보여준다.

도 3 은 다양한 배열로 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역 구축물 I-HLB, I-HLC 및 I-HLA 및 인간화된 경쇄 가변 영역 구축물 I-KA 및 I-KC 를 포함하는 인간화된 ICR62 항체의 결합 활성을 보여준다.

도 4 는 키메라성 래트-인간 ICR62 항체와 비교해, 중쇄 가변 영역 구축물 I-HLA2, 1-HLA3 및 I-HLA4 및 인간화된 경쇄 가변 영역 구축물 I-KC 을 포함하는 인간화된 ICR62 항체의 결합 활성을 보여준다.

도 5 는 키메라성 래트-인간 ICR62 항체와 비교해, 중쇄 가변 영역 구축물 I-HLA1, I-HLA3, I-HLA5 및 I-HLA6 및 인간화된 경쇄 가변 영역 구축물 I-KC 를 포함하는 인간화된 ICR62 항체의 결합 활성을 보여준다.

도 6 은 키메라성 래트-인간 ICR62 항체와 비교해, 중쇄 가변 영역 구축물 I-HLA7, 1-HLA6, 및 I-HHB 및 인간화된 경쇄 가변 영역 구축물 I-KC 를 포함하는 인간화된 ICR62 항체의 결합 활성을 보여준다.

도 7 은 키메라성 래트-인간 ICR62 항체와 비교해, 중쇄 가변 영역 구축물 I-HHF, I-HLA9, 및 I-HLA8 및 인간화된 경쇄 가변 영역 구축물 I-KC 를 포함하는 인간화된 ICR62 항체의 결합 활성을 보여준다.

도 8 은 중쇄 가변 영역 구축물 I-HHB, I-HHD, I-HHG, I-HHF, I-HLA7, 및 I-HLA9 및 인간화된 경쇄 가변 영역 구축물 I-KC 를 포함하는 인간화된 항체의 결합 활성을 보여준다.

도 9 는 키메라성 ICR62 항체의 다양한 글리코형태에 대해서 뿐만 아니라, 인간화된 변이체 I-HLA4 에 대해서 항체 매개 세포성 세포독성 (ADCC) 의 비교를 보여준다. "G1" 은 GnTIII 과의 공동발현에 의한 항체의 당개질에 관한 것이다. "G2" 는 GnTIII 및 ManII 와의 공동발현에 의한 항체의 당개질에 관한 것이다. "WT" 은 당개질되지 않은 항체이다. 인간화된 중쇄 구축물은 I-KC 경쇄 구축물과 쌍을 이루었다.

도 10 은 인간화된 ICR62 항체 구축물 I-HHB 및 I-HLA7 의 비-당개질된 형태 (WT) 및 G2 글리코형태 (즉, GnTIII 및 ManII 와의 공동발현에 의해 당개질된 형태) 에 대한 ADCC 의 비교를 보여준다. 동일한 항체를 2 개의 상이한 표적 세포주에 적용하였다 : 패널 A 에서는 표적 세포주 LN229 를 사용하였고 ; 패널 B 에서는 세포주 A431 을 사용하였다. 인간화된 중쇄 구축물은 I-KC 경쇄 구축물과 쌍을 이루었다.

도 11A 및 11B 는 키메라성 ICR62 및 인간화된 ICR62 항체 구축물 I-HHB 및 I-HLA7 의 비-당개질된 형태 (WT) 및 G2 글리코형태에 대한 ADCC 의 비교를 보여준 다. 표적 세포주 A431 을 사용하였다. 인간화된 중쇄 구축물은 I-KC 경쇄 구축물과 쌍을 이루었다.

도 12 는 키메라성 ICR62 및 인간화된 ICR62 항체 구축물 I-HHB 및 I-HLA7 의 G2 글리코형태에 대한 72 시간째 ADCC 의 비교를 보여준다. 인간화된 중쇄 구축물은 I-KC 경쇄 구축물과 쌍을 이루었다.

도 13 은 래트 ICR62 서열과 비교해 인간화된 ICR62 중쇄 가변 영역 구축물의 아미노산 서열 배치를 보여준다. 점 (dot) 은 주어진 구축물 내 주어진 위치에서의 아미노산 잔기의 동일성을 나타낸다.

도 14 는 재조합 인간 FcgammaRIIIa 를 제시하는 CHO 세포를 사용한 FcgammaRIIIa-Fc 결합 어세이를 보여준다. 당개질된 I-HHB/KC 인간화된 항-EGFR IgG1 항체를 비-당개질된 (Wt) 항체와 비교하였다.

도 15 는 당개질된 인간화된 항-EGFR IgG1 항체인 I-HHB/KC 에 대한 MALD/TOF-MS 올리고사카라이드 프로파일을 보여준다. 당개질화는 GnTIII 및 골지 만노시다제 II 활성을 가진 효소를 암호화하는 유전자를 항체-생성 세포에서 과발현시켜, 70% 초과의 비푸코실화된 Fc-Asn297-연결된 올리고사카라이드를 제공함으로써 달성된다.

도 16 은 1% 원숭이 혈청 매트릭스 (원숭이 혈청 풀 (serum pool) CMS25/31/33, HLS 에 의해 공급됨) 내 항-EGFR 의 측정에 대한 항-EGFR 정밀도 프로파일 (보정 범위에 걸쳐서 n = 6 개의 복제물) 을 보여준다.

도 17 은 1% 원숭이 혈청 매트릭스 내 항-EGFR 의 측정에 대한 대표적인 항- EGFR 검량 곡선을 보여준다.

도 18 은 항-EGFR 을 수컷 필리핀 원숭이 (male cynomolgous monkey) 에 매주 정맥 내 투여 시, 제 1 일째의 항-EGFR 의 혈청 농도를 보여준다.

도 19 는 항-EGFR 을 암컷 필리핀 원숭이에 매주 정맥 내 투여 시, 제 1 일째의 항-EGFR 의 혈청 농도를 보여준다.

도 20 은 항-EGFR 을 필리핀 원숭이에 에 매주 정맥 내 투여 시, 제 1 일째의 혈청 항-EGFR 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC₁₆₈) 및 투여량 수준 간의 관계를 보여준다.

도 21 은 항-EGFR 을 수컷 필리핀 원숭이에 매주 정맥 내 투여하는 동안의 항-EGFR 의 혈청 농도를 보여준다.

도 22 는 항-EGFR 을 암컷 필리핀 원숭이에 매주 정맥 내 투여하는 동안의 항-EGFR 의 혈청 농도를 보여준다.

도 23 은 하기 본원 실시예에서 기술된 생체 내 원숭이 연구에 사용된 Fc-조작된 (당개질된) 항-EGFR 항체로부터 올리고사카라이드의 MALDI/TOF-MS 프로파일을 보여준다.

도 24 는 인간 A431 유표피암 세포의 표면 상에 발현된 EGFR 에의 결합을 보여준다. 결합 연구에 사용된 항체는 하기 본원 실시예에서 기술된 생체 내 원숭이 연구에 사용된 Fc-조작된 항-EGFR 항체 (I-HHB 구축물) 이었다.

도 25 는 원숭이 COS-7 신장 세포의 표면 상에 발현된 EGFR 에의 결합을 보 여준다. 사용된 항체는 항-EGFR 항체 (I-HHB 중쇄; I-KC 경쇄) 였다. 참고로, 저 (low) 인간 EGFR-발현 세포인 MCF-7 유방암 세포에의 결합을 보여준다.

도 26 은 전체 세포 (그의 표면 상에 인간 FcgRIIIa 를 발현하도록 조작된 CHO 세포) 를 사용하여 Fc-FcgammaRIIIa 결합을 보여준다. 사용된 항체는 본원 하기 실시예에서 기술된 생체 내 원숭이 연구에 사용된 Fc-조작된 (당개질된) 항-EGFR 항체였다. 비-Fc-조작된 (비개질된) 대조군 IgG1 항체에의 결합을 비교로 보여준다.

도 27 은 Fc-조작된 (당개질된) 항-EGFR 항체에 의해 매개된 ADCC 를 보여준다. 표적 세포는 A549 인간 폐 암종 세포이다. 항체의 비-Fc 조작된 (비개질된) 형태에 대한 ADCC 활성을 비교로 보여준다.

도 28 은 Fc-조작된 (당개질된) 항-EGFR 항체에 의해 매개된 ADCC 를 보여준다. 표적 세포는 CYNOM-K1 필리핀 원숭이 케라틴세포 세포주이다. 항체의 비-Fc 조작된 (비개질된) 형태에 대한 ADCC 활성을 비교로 보여준다.

도 29 는 중쇄 I-HHD 구축물과 쌍을 이룬 I-KC 구축물을 바탕으로 한 다양한 경쇄 구축물 변이체의 EGFR 표적 결합을 보여준다.

도 30 은 중쇄 I-HHD 구축물과 쌍을 이룬 I-KC 구축물을 바탕으로 한 다양한 경쇄 구축물 변이체의 EGFR 표적 결합을 보여준다.

도 31 은 경쇄 I-KC 구축물과 쌍을 이룬 I-HHD 구축물을 바탕으로 한 다양한 중쇄 구축물 변이체의 EGFR 표적 결합을 보여준다.

도 32 는 경쇄 I-KC 구축물과 쌍을 이룬 I-HHD 구축물을 바탕으로 한 다양한 중쇄 구축물 변이체의 EGFR 표적 결합을 보여준다.

발명의 상세한 설명

용어는 하기와 같이 달리 정의되지 않는 한, 당업계에서 일반적으로 사용된 바와 같이 본원에서 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체는 모노클로날, 폴리클로날 및 다중특이적 (예를 들어, 이특이적) 항체를 포함하여 전체 항체 분자뿐만 아니라, Fc 영역을 갖고 결합 특이성을 갖는 항체 절편, 및 면역글로불린의 Fc 영역에 대응하는 영역을 포함하고 결합 특이성을 유지하는 융합 단백질을 포함하는 것이다. 또한, VH 절편, VL 절편, Fab 절편, F(ab')₂ 절편, scFv 절편, Fv 절편, 미니체, 이체 (diabodies), 삼체 (triabodies), 및 사체 (tetrabodies) 를 포함하나 이에 제한되지 않는, 결합 특이성을 유지하는 항체 절편이 포함된다 (예를 들어, [Hudson 및 Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)] 참조). 또한, 인간화된, 영장류화된 및 키메라성 항체가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 Fc 영역은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 말하는 것이다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 상이할지라도, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 위치 Cys226 의 아미노산 잔기에서 카르복실-말단까지 뻗어 있는 것으로 정의된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 면역글로불린의 Fc 영역에 대응하는 영역은 면역글로불린의 Fc 영역의 자연 발생 대립유전자 변이체 뿐만 아니라, 치환, 첨가, 또는 소실을 생성하나 효과기 기능 (예컨대 항체 의존성 세포성 세포독성) 을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변형을 가진 변이체를 포함하는 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 소실될 수 있다. 그러한 변이체는 활성에 최소한의 효과를 갖도록 하기 위해, 당업계에 알려진 일반적인 법칙에 따라 선택될 수 있다 (예를 들어, [Bowie, J. U. 등, Science 247:1306-1310 (1990)] 참조).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 EGFR 은 인간 외피 성장 인자 수용체 (HER-1 또는 Erb-B1 이라고도 함) (Ulrich, A. 등, Nature 309:418-425 (1984); SwissProt 등록 #P00533 ; 2 차 등록 번호 : 000688, 000732, P06268, Q14225, Q92795, Q9BZS2, Q9GZX1, Q9H2C9, Q9H3C9, Q9UMD7, Q9UMD8, Q9UMG5) 뿐만 아니라, 그의 자연-발생 아이소폼 및 변이체를 말한다. 상기 아이소폼 및 변이체는 EGFRvIII 변이체, 대체 스플라이싱 생성물 (예를 들어, SwissProt 등록 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4 에 의해 규명되는 것), 변이체 G1N-98, ARG-266, Lys-521, ILE-674, GLY-962, 및 PRO-988 (Livingston, R.J. 등, NIEHS-SNPs, environmental genome project, NIEHS ES 15478, Department of Genome Sciences, Seattle, WA (2004)), 및 하기 등록 번호 : NM_005228.3, NM_201282.1 , NM_201283.1, NM_201284.1 (REFSEQ mRNA) ; AF125253.1, AF277897.1, AF288738.1, AI217671.1, AK127817.1, AL598260.1, AU137334.1, AW163O38.1, AW295229.1, BC057802.1, CB160831.1, K03193.1, U48722.1, U95089.1, X00588.1, X00663.1 ; H54484S1, H54484S3, H54484S2 (MIPS 어셈블리) ; DT.453606, DT.86855651, DT.95165593, DT.97822681, DT.95165600, DT.100752430, DT.91654361, DT.92034460, DT.92446349, DT.97784849, DT.101978019, DT.418647, DT.86842167, DT.91803457, DT.92446350, DT.95153003, DT.95254161, DT.97816654, DT.87014330, DT.87079224 (DOTS 어셈블리) 에 의해 규명되는 기타 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 EGFR 리간드는 EGFR 에 결합하고/거나, 또는 이를 활성화시키는 폴리펩타이드를 말한다. 상기 용어는 막-결합 전구체 형태의 EGFR 리간드 뿐만 아니라, 단백분해 처리된 가용성 형태의 EGFR 리간드를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 EGFR 의 리간드 활성화는 EGFR 리간드 결합에 의해 매개되는 신호 전달 (예를 들어, EGFR 또는 기질 폴리펩타이드 내 타이로신 잔기를 인산화시키는 EGFR 수용체의 세포내 키나아제 도메인에 의해 야기되는 신호 전달) 을 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 EGFR 또는 EGFR 리간드의 비정상 활성화 또는 생성을 특징으로 하는 질환 또는 장애, 또는 EGFR 발현과 관련된 장애는 악성종양 또는 암을 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 없는 상태를 말하며, 여기서, EGFR 및/또는 EGFR 리간드의 비정상 활성화 및/또는 생성은 질환 또는 장애를 갖는, 또는 질환 또는 장애에 걸리기 쉬운 개체의 세포 또는 조직에서 발생한다.

본원에 사용된 바와 같이, EGFR 을 발현하는 세포와 관련되어 사용되는 용어 과발현, 과발현된, 및 과발현화는 동일 조직 유형의 정상 세포와 비교해 그의 표면 상에 측정할만하게 더 높은 수준의 EGFR 을 갖는 세포를 말한다. 상기 과발현은 유전자 증폭에 의해, 또는 증가된 전사나 번역에 의해 야기될 수 있다. EGFR 발현 (및 심지어 과발현) 은 예를 들어, 면역조직화학 어세이, 면역형광 어세이, 면역효소 어세이, ELISA, 유세포 분석, 방사성면역어세이, 웨스턴 블롯, 리간드 결합, 키나아제 활성 등 (일반적으로, Cell BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J., ed., Academic Press (2d ed., 1998); CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coligan, J.E. 등, eds., John Wiley & Sons (1995-2003) 를 참조하고 ; 또한, Sumitomo 등, Clin. Cancer Res. 10: 794-801 (2004) (웨스턴 블롯, 유세포 분석, 및 면역조직화학에 대해 기술함) 를 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로써 삽입됨)) 을 통해, 당업계에 공지된 기술에 의해, 세포 표면 상에 또는 세포 파쇄물 내에 존재하는 EGFR 의 수준을 평가함으로써, 진단 또는 예후 어세이에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 당업자는 예를 들어, 형광 제자리 혼성화, 서던 블랏팅, 또는 PCR 기술을 통해, 세포 내 EGFR-암호화 핵산 분자의 수준을 측정할 수 있다. 정상 세포의 EGFR 의 수준을 세포 증식 장애 (예를 들어, 암) 에 의해 영향받는 세포의 수준과 비교하여, EGFR 이 과발현되었는지를 결정한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 항원 결합 분자는 최광의 범위에서 항원 결정소에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 항원 결합 분자는 예를 들어, 항원 결정소에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 분절일 수 있다. 더욱 구체적으로, EGFR 에 결합하는 항원 결합 분자는 전형적으로 외피 성장 인자 수용체 (EGFR) 라고 지정되었으며 또한 HER-1 또는 ErbB1 이라고도 하는 170 kDa 의 막관통 수용체에 특이적으로 결합하는 분자이다. "특이적으로 결합한다" 는, 상기 결합이 항원에 대해 선택적이고 원하지 않는 또는 불특정 상호작용과 구분될 수 있음을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, ABM 과 같은 폴리펩타이드를 말할 때 사용되는 경우 용어 융합 및 키메라성은 상이한 종으로부터 유래된 항체의 부분과 같이 2 개 이상의 이형접합성 폴리펩타이드로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 키메라성 ABM 에 대해, 예를 들어, 비-항원 결합 성분은 침팬지 및 인간과 같은 영장류를 포함하여 다양한 종으로부터 유래될 수 있다. 키메라성 ABM 의 불변 영역은 가장 바람직하게는 본래 인간 항체의 불변 영역과 실질적으로 동일하며 ; 키메라성 항체의 가변 영역은 가장 바람직하게는 쥣과 가변 영역을 갖는 아미노산 서열을 갖는 재조합 항-EGFR 항체의 가변 영역과 실질적으로 동일하다. 인간화된 항체는 특히 바람직한 형태의 융합 또는 키메라성 항체이다.

본원에 사용된 바와 같이, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 N-연결된 올리고사카라이드의 트리만노실 코어의 β-연결된 만노사이드에의 β-1-4 연결에 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 잔기를 첨가하는 것을 촉매시킬 수 있는 폴리펩타이드를 말한다. 이는 투여량 의존성이 있거나 또는 없이, 특별한 생물학적 어세이에서 측정된 바와 같이, [Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)] 에 따라, β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코스아미닐-트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.144) 라고도 알려진 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III 의 활성과 유사하나 본질적으로 동일하지는 않은 효소 활성을 나타내는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 투여량 의존성이 있는 경우, GnTIII 의 것과 동일할 필요는 없으나, GnTIII 와 비교해 주어진 활성이 투여량-의존성과 실질적으로 유사하다 (즉, 후보 폴리펩타이드는 GnTIII 와 비교해 약 25-배 미만 이하의 더 큰 활성, 및 바람직하게는 약 10 배 미만 이하의 더 큰 활성, 및 가장 바람직하게는 약 3-배 미만 이하의 더 큰 활성을 나타낼 것임).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 변이체 (또는 유사체) 는 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 형성된 아미노산 삽입, 삭제, 및 치환에 의해 본 발명의 구체적으로 언급된 폴리펩타이드와 상이한 폴리펩타이드를 말한다. 본 발명의 ABM 의 변이체는 키메라, 영장류화된 또는 인간화된 항원 결합 분자를 말하고, 여기서, 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기는 실질적으로 항원 결합 친화성에 영향을 미치지 않는 방식으로 대체, 첨가 및/또는 삭제에 의해 개질된다. 아미노산 잔기가 흥미있는 활성을 없애지 않으면서 대체, 첨가 또는 삭제될 수 있는지를 결정하는데 대한 지침은 특정 폴리펩타이드의 서열을 상동성 펩티드의 것과 비교하고 고도의 상동성 영역 (보존된 영역) 에서 형성되는 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써, 또는 아미노산을 보존 서열로 대체함으로써 발견될 수 있다.

대안적으로, 이러한 동일 또는 유사한 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 변 이체는 유전적 코드 내 "잉여부분 (redundancy)" 을 사용함으로써 합성 또는 선택될 수 있다. 다양한 제한 부위를 생성하는 침묵 변화와 같은 다양한 코돈 치환은 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로의 클로닝 또는 원핵 또는 진핵 시스템 내에서의 발현을 최적화시키기 위해 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열 내 돌연변이는 폴리펩타이드의 부분의 특성을 개질시키고, 리간드-결합 친화성, 내부사슬 친화성, 또는 분해/턴오버 비율과 같은 특징을 변화시키기 위해, 폴리펩타이드에 첨가되는 다른 펩티드의 폴리펩타이드 또는 도메인에서 반영될 수 있다.

아미노산 "치환" 은 하나의 아미노산을, 유사한 구조 및/또는 화학 특성을 가진 또다른 아미노산으로 대체함으로써, 즉 보존성 아미노산 대체에 이루어질 수 있고, "보존성" 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사성을 바탕으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고 ; 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되고 ; 양전하성 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함되고 ; 음전하성 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. "삽입" 또는 "삭제" 는 바람직하게는 약 1 내지 20 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 개의 아미노산 범위에서 이루어진다. 변이는 재조합 DNA 기술을 사용하여 폴리펩타이드 분자 내 아미노산의 삽입, 삭제, 또는 치환을 시스템적으로 생성하고 생성된 재조합 변이체를 활성에 대해 어세이함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 인간화된 항체는 모 분자의 항원-결합 특성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하나 인간에서 거의 면역원성이지 않은 비-인간 항원-결합 분자, 예를 들어, 쥣과 항체로부터 유래된 항원 결합 분자를 말한다. 이는 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역에 이식하여 키메라 항체를 생성하는 것, (b) 단지 비-인간 CDR 을 중요한 골격 잔기 (예를 들어, 양호한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 골격 잔기) 가 있거나 또는 없는 인간 골격 및 불변 영역에 이식하는 것, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하나, 표면 잔기를 대체하여 인간-형 부분으로 그것들을 "가리는 것" 을 포함하여 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 [Jones 등, Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol, 44:65-92 (1988); Verhoeyen 등, Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)] 에 개시되어 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 각각에 일반적으로 3 개의 상보성 결정 영역 또는 CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3) 이 있으며, 이는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 각각에 있는 4 개의 골격 하위 영역 (즉, FR1, FR2, FR3, 및 FR4) 에 인접하여 위치한다 : FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 인간화된 항체에 관한 토의는 즉, 미국 특허 제 6,632,927 호에서 찾을 수 있고, 미국 출원 2003/0175269 에 개시되어 있으며, 이 둘 다 그 전체가 본원에 참조로써 삽입되어 있다. 다른 예에서는, 결합에 필요한 CDR 의 잔기만이 인간 서열에 옮겨져서 (예를 들어, "그래피팅" 되어) , 항원 -특이성을 가진 완전한 가변 영역 서열을 만들 수 있다.

유사하게는, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 영장류화된은 모 분자의 항원-결합 특성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하나 영장류에서 거의 면역원성이지 않은 비-영장류 항원-결합 분자, 예를 들어 쥣과 항체로부터 유래된 항원-결합 분자를 말할 때 사용된다.

당 기술분야에 사용되고/거나 또는 허용되는 2 가지 이상의 정의가 있는 경우, 본원에 사용된 바와 같이 용어의 정의는 명백히 달리 언급되지 않는 한, 모든 그러한 의미를 포함하는 것으로 여긴다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견된 비-연속적인 항원 조합 부위를 말하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR") 의 사용이다. 이러한 특별한 영역은 본원에 참조로써 삽입된 [Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 [Chothia 등, J Mol Biol. 196:901-917 (1987)] 에 의해 기술되었고, 상기 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기를 오버랩하거나 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR 을 말하기 위한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 용어의 범주 내에 있다. 상기 언급된 참조의 각각에 의해 정의된 CDR 을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1 에 나타나 있다. 특별한 CDR 을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR 의 크기 및 서열에 따라 다양할 것이다. 당업자는 잔기가 주어진 항체의 가변 영역 아미노산 서열에 특별한 CDR 을 포함한다는 것을 통상적으로 측정할 수 있다.

[표 1]

CDR 정의¹
	Kabat	Chothia	AbM ²
V_H CDR1	31-35	26-35	26-35
V_H CDR2	50-65	52-58	50-58
V_H CDR3	95-102	95-102	95-102
V_L CDR1	24-34	26-32	24-34
V_L CDR2	50-56	50-52	50-56
V_L CDR3	89-97	91-96	89-97
¹표 1 의 모든 CDR 정의의 번호화는 Kabat 등 (하기 참조) 에 나와 있는 번호화 규정에 따른 것이다. ²"AbM" 은 Oxford 분자 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 CDR 을 말한다.

Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호화 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체의 범위를 넘어서는 실험 데이타에 의존하지 않고 명백히 이러한 "Kabat 번호화" 시스템을 가변 도메인 서열에 지정하였다. 본원에 사용된 바와 같이, "Kabat 번호화" 는 [Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 에 나타낸 번호화 시스템을 말한다. 달리 언급되지 않는 한, ABM 내 특정 아미노산 잔기 위치의 번호화에 대한 참조는 Kabat 번호화 시스템에 따른 것이다. 서열 목록의 서열 (즉, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:147) 은 Kabat 번호화 시스템에 따라 번호화되지 않는다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 당업자는 그에 제시된 바와 같은 서열 번호화를 바탕으로 서열 목록에 있는 임의의 가변 영역 서열의 Kabat 번호화 도식을 결정한다.

본 발명의 대조군 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상 "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 대 조군 뉴클레오타이드 서열의 각 100 개의 뉴클레오타이드 당 5 개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 대조군 서열과 동일함을 말한다. 즉, 대조군 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해서는, 대조군 서열 내 5% 이하의 뉴클레오타이드가 삭제되거나 또다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 또는 대조군 서열 내 총 뉴클레오타이드의 5% 이하의 수의 뉴클레오타이드가 대조군 서열에 삽입될 수 있다.

실질적인 문제로서, 특별한 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지는 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용해 통상적으로 측정될 수 있다.

글로벌 서열 정렬이라고도 하는 쿼리 서열 (본 발명의 서열) 및 대상 서열 사이의 최상의 전체적인 매치를 측정하는 바람직한 방법은 [Brutlag 등, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)] 의 알고리즘을 바탕으로 한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 서열 정렬에서, 쿼리 및 대상 서열은 둘 다 DNA 서열이다. RNA 서열은 U 를 T 로 변환시킴으로써 비교될 수 있다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 % 동일성으로 나타낸다. % 동일성을 계산하는 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용되는 바람직한 파라미터는 : 매트릭스 (Matrix) = 일원 (Unitary), k-(터플) = 4, 미스매치 페널티 (Mismatch Penalty) = 1, 조이닝 페널티 (Joining Penalty) = 30, 랜덤화 그룹 길이 (Randomization Group Length) = 0, 컷오프 스코어 (Cutoff Score) = 1, 갭 페널티 (Gap Penalty) = 5, 갭 사이즈 페널티 (Gap Size Penalty) = 0.05, 윈도우 사이즈 (Window Size) = 500, 또는 어느 것이 더 짧든 간에 대상 뉴클레오타이드 서열 길이이다.

대상 서열이 내부 삭제가 아니라 5' 또는 3' 삭제 때문에 쿼리 서열보다 더 짧다면, 결과에 수동 보정이 이루어져야만 한다. 이는, FASTDB 프로그램이 % 동일성을 계산할 때, 대상 서열의 5' 및 3' 절단을 이해하지 못하기 때문이다. 5' 또는 3' 말단에서 절단된 대상 서열에 대해, 쿼리 서열과 비교해, 쿼리 서열의 총 염기의 % 로서, 매치/정렬되지 않은 대상 서열의 5' 및 3' 인 쿼리 서열의 염기수를 계산함으로써 % 동일성을 보정한다. 뉴클레오타이드가 매치/정렬되었는지는 FASTDB 서열 정렬 결과에 의해 결정된다. 다음, 구체적인 파라미터를 사용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 % 에서 이 % 를 감하여, 최종 % 동일성을 수득한다. 이렇게 보정된 스코어는 본 발명의 목적에 사용되는 스코어이다. FASTDB 정렬에 의해 나타낸 바와 같이, 쿼리 서열에 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 5' 및 3' 염기 외부의 염기만이 % 동일성 스코어를 수동 조정하기 위해 계산된다.

예를 들어, % 동일성을 측정하기 위해 90 개 염기 대상 서열이 100 개의 염기 쿼리 서열에 정렬된다. 삭제는 대상 서열의 5' 말단에 일어나고, 따라서, FASTDB 정렬은 5' 말단에 있는 처음 10 개의 염기의 매치/정렬을 보여주지는 않는다. 10 개의 짝을 이루지 않는 염기는 서열의 10% (매치되지 않은 5' 및 3' 말단에 있는 염기수/쿼리 서열 내 총 염기수) 를 나타내고, 따라서 10% 는 FASTDB 프 로그램에 의해 계산된 % 동일성 스코어에서 감해진다. 만일 남아 있는 90 개의 염기가 완전히 매치된다면, 최종 % 동일성은 90% 일 것이다. 또다른 예에서, 90 개의 대상 서열은 100 개의 염기 쿼리 서열과 비교된다. 이 때, 삭제는 내부 삭제여서, 쿼리와 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 5' 또는 3' 말단에 어떤 염기도 없다. 이 경우, FASTDB 에 의해 계산된 % 동일성이 수동 보정되지 않는다. 일단 다시, 쿼리 서열과 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 5' 및 3' 말단에 있는 염기만이 수동 보정된다. 다른 어떤 수동 보정도 본 발명의 목적을 위해 이루어지지 않는다.

본 발명의 쿼리 아미노산 서열과 예를 들어 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는, 대상 폴리펩타이드 서열이 쿼리 아미노산 서열의 각각의 100 개의 아미노산 당 5 개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 점을 제외하고는, 대상 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 쿼리 서열과 동일하다는 것을 말한다. 즉, 쿼리 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해서는, 대상 서열 중 5% 이하의 아미노산 잔기가 삽입, 삭제 또는 또다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 대조군 서열의 변경은 대조군 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서, 또는 대조군 서열 또는 대조군 서열 내의 하나 이상의 연속 기에 있는 잔기 중에서 개별적으로 산재된 그러한 말단 위치 사이의 어디에서나 일어날 수 있다.

실용적인 문제로서, 특별한 폴리펩타이드가 대조군 폴리펩타이드와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지는 공지된 컴퓨터 프로그램을 사 용하여 통상 측정될 수 있다. 글로벌 서열 정렬이라고도 하는, 쿼리 서열 (본 발명의 서열) 및 대상 서열 사이의 최상의 전체적인 매치를 측정하는 바람직한 방법은 [Brutlag 등, Comp. App. Biosci. (5:237-245 (1990)] 의 알고리즘을 바탕으로 한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 서열 정렬에서, 쿼리 및 대상 서열은 둘 다 뉴클레오타이드 서열이거나 또는 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 % 동일성으로 나타난다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용되는 바람직한 파라미터는 : 매트릭스 = PAM 0, k-터플 = 2, 미스매치 페널티 = 1, 조이닝 페널티 = 20, 랜덤화 그룹 길이 = O, 컷오프 스코어 = 1, 윈도우 사이즈 = 서열 길이, 갭 페널티 = 5, 갭 사이즈 페널티 = 0.05, 윈도우 사이즈 = 500 또는 어느 것이 더 짧든지간에 대상 아미노산 서열의 길이이다.

내부 삭제 때문이 아니라 N- 또는 C-말단 삭제로 인해 대상 서열이 쿼리 서열보다 짧다면, 결과에 수동 보정이 이루어져야만 한다. 이는, FASTDB 프로그램이 글로벌 % 동일성을 계산할 때, 대상 서열의 N- 및 C-말단 절단을 이해하지 못하기 때문이다. 쿼리 서열에 대해 N- 및 C-말단에서 절단된 대상 서열에 대해, % 동일성을 대상 서열의 N- 및 C-말단인 쿼리 서열의 잔기의 수를 계산함으로써 보정하고, 이는 쿼리 서열의 총 염기의 % 로서, 상응하는 대상 잔기와 매치/정렬되지 않는다. 잔기가 매치/정렬되는지는 FASTDB 서열 정렬 결과 측정된다. 다음, 구체적인 파라미터를 사용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 % 에서 이러한 % 를 감하여, 최종 % 동일성 스코어를 수득한다. 이러한 최종 % 동일성 스코어는 본 발명의 목적에 사용되는 스코어이다. 쿼리 서열에 매 치/정렬되지 않는 대상 서열의 N- 및 C-말단의 잔기만이 % 동일성 스코어를 수동 조정하는데 고려된다. 즉, 단지 쿼리 잔기는 단지 대상 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단에 위치한다.

예를 들어, 90 개의 아미노산 잔기 대상 서열이 100 개의 잔기 쿼리 서열과 정렬되어, % 동일성을 결정한다. 삭제는 대상 서열의 N-말단에서 일어나고, 따라서, FASTDB 정렬은 N-말단에서 처음 10 개의 잔기의 매칭/정렬을 보여주지 않는다. 10 개의 짝을 이루지 않은 잔기는 서열의 10% 를 나타내고 (매치되지 않은 N-및 C-말단의 잔기의 수/쿼리 서열 내 잔기의 총 수), 따라서 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 % 동일성 스코어에서 10% 를 제한다. 만약 남아있는 90 개의 잔기가 완전히 매칭된다면, 최종 % 동일성은 90% 일 것이다. 또다른 예에서, 90 개의 잔기 대상 서열은 100 개의 잔기 쿼리 서열과 비교된다. 이 때, 삭제는 내부 삭제여서, 쿼리와 매칭/정렬되지 않은 대상 서열의 N- 또는 C-말단에는 잔기가 없다. 이 경우, FASTDB 에 의해 계산된 % 동일성은 수동 보정되지 않는다. 다시 한번, FASTDB 정렬에서 나타낸 바와 같이, 쿼리 서열과 매칭/정렬되지 않은 단지 대상 서열의 N- 및 C-말단 외부에 있는 잔기 위치는 수동 보정된다. 다른 어떤 수동 보정도 본 발명의 목적을 위해 행해지지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 핵산 서열에 "엄격한 조건 하에서 혼성화하는" 핵산은 50% 포름아마이드, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.6), 5 x Denhardt's 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 μg/ml 변성, 쉬어드 연어 정자 (sheared salmon sperm) DNA 를 포함하 는 용액 내에서 42℃ 에서 밤새 인큐베이션하고, 약 65℃ 에서 0.1 x SSC 에서 필터를 세정함으로써 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 골지 위치화 도메인은 골지 복합체 내에 폴리펩타이드가 위치되게 하는 골지 체류 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 말한다. 일반적으로, 위치화 도메인은 효소의 아미노 말단 "꼬리" 를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 효과기 기능은 항체의 Fc 영역 (본래의 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역) 으로 인한 생물학적 활성을 말한다. 항체 효과기 기능의 예에는, Fc 수용체 결합 친화성, 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포의 식균작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 면역-복합체-매개 항원 습득, 세포 표면 수용체의 하향-조절 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 조작, 조작된, 조작화, 및 당화 조작은 자연 발생 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 그의 절편의 당화 패턴의 조작을 포함하는 것으로 생각된다. 당화 조작은 세포 내에서 발현되는 당단백질의 당화를 변형시키기 위한 올리고사카라이드 합성 경로의 유전적 조작을 포함하여, 세포의 당화 머시너리의 대사 조작을 포함한다. 한 구현예에서, 당화 조작은 글리코실트랜스퍼라제 활성의 변형이다. 특별한 구현예에서, 조작은 글루코스아미닐트랜스퍼라제 활성 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 활성을 변형시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩타이드 및 항원-결합 분자를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 포함한 다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 개질된 당형태 (glycoform) 을 가진 항원 결합 분자의 제조를 허용하도록 조작된다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 분자는 항체, 항체 절편, 또는 융합 단백질이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 GnTIII 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현시키도록 추가 조작되었다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 몇 개만 언급하자면, CHO 세포, BHK 세포, HEK293-EBNA 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포와 같은 포유류 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하고, 또한 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 Fc-매개 세포의 세포독성은 항체-의존성 세포의 세포독성, 및 인간 Fc-영역을 함유하는 용해성 Fc-융합 단백질에 의해 매개되는 세포의 세포독성을 포함한다. 이는 "인간 면역 효과기 세포" 에 의한 "항체-표적화된 세포" 의 파쇄를 초래하는 면역 기작으로서, 여기서 :

인간 면역 효과기 세포는 항체 또는 Fc-융합 단백질의 Fc-영역에의 결합을 통해 세포 표면에서 Fc 수용체를 제시하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구 군이다. 그러한 세포군에는 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및/또는 자연 살해 (NK) 세포가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

항체-표적화된 세포는 항체 또는 Fc-융합 단백질에 의해 결합된 세포이다. 항체 또는 Fc 융합-단백질은 Fc 영역에 대한 단백질 부분 N-말단을 통해 표적 세 포에 결합한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 증가된 Fc-매개 세포의 세포독성은, 상기 정의된 Fc-매개 세포의 세포독성의 기작에 의해, 표적 세포를 둘러싼 배지 내에서 주어진 시간, 주어진 항체 또는 Fc-융합 단백질 농도에서 파쇄되는 "항체-표적화된 세포" 수의 증가, 또는 Fc-매개 세포의 세포독성의 기작에 의해, 주어진 시간 내에 주어진 수의 "항체-표적화된 세포" 의 파쇄에 필요한, 표적 세포를 둘러싼 배지 내의 항체 또는 Fc-융합 단백질의 농도의 감소로서 정의된다. Fc-매개 세포의 세포독성의 증가는 당업자에게 알려진 동일한 표준 제조, 정제, 제형 및 저장 방법을 사용해 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되나, 본원에 기술된 방법에 의해 글리코실트랜스퍼라제 GnTIII 를 발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해서는 생성되지 않는 동일한 항체 또는 Fc-융합 단백질에 의해 매개되는 세포의 세포독성과 비례한다.

증가된 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 을 가진 항체는 본원에 정의된 용어처럼, 당업자에게 알려진 적합한 방법에 의해 측정되는 ADCC 가 증가된 항체를 의미한다. 허용된 시험관 내 ADCC 어세이의 한 예는 하기와 같다 :

1) 항체의 항원-결합 영역에 의해 인지되는 표적 항원을 발현하는 것으로 알려진 표적 세포를 사용하는 어세이 ;

2) 무작위로 선별된 건강한 공여자의 혈액에서 단리한 인간 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 를 효과기 세포로서 사용하는 어세이 ;

3) 하기 프로토콜에 따라 수행하는 어세이 ;

i) PBMC 를 표준 밀도 원심분리 과정을 사용해 단리하고, RPMI 세포 배양 배지 내에서 5 x 10⁶ 세포/ml 로 현탁시킴 ;

ii) 표적 세포를 표준 조직 배양 방법에 의해 배양하고, 90% 초과의 생존성을 가진 지수생장기 (exponential growth phase) 에서 수합하고, RPMI 세포 배양 배지에서 세정하고, 100 마이크로-큐리 (micro-Curies) 의 ⁵¹Cr 으로 표지하고, 세포 배양 배지로 2 회 세정하고, 세포 배양 배지 내에 10⁵ 세포/ml 의 밀도로 재현탁시킴 ;

iii) 상기 최종 표적 세포 현탁액 중 100 ㎕ 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 옮김 ;

iv) 항체를 세포 배양 배지 내에서 4000 ng/ml 에서 0.04 ng/ml 로 단계희석시키고, 생성 항체 용액 중 50 ㎕ 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 있는 표적 세포에 첨가하고, 상기 전체 농도 범위를 포함하는 다양한 항체 농도에서 3 벌 중복 테스트함 ;

v) 최대 방출 (MR) 대조군을 위해, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트에 있는 3 개의 추가의 웰에 항체 용액 (상기 iv 참조) 대신에 2% (V/V) 비-이온성 세제 (Nonidet, Sigma, St. Louis) 수용액 50 ㎕ 를 첨가함 ;

vi) 지속 방출 (SR) 대조군을 위해, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트에 있는 3 개의 추가의 웰에 항체 용액 (상기 iv 참조) 대신에 RPMI 세포 배양 배지 50 ㎕ 를 첨가함 ;

vii) 다음, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 50 x g 에서 1 분 동안 원심분리하고, 40℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시킴 ;

viii) PBMC 현탁액 (상기 i 참조) 50 ㎕ 를 효과기 : 표적 세포의 비가 25 : 1 이 되도록 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂ 분위기 하 37℃ 에서 4 시간 동안 인큐베이터 내에 놔둠 ;

ix) 각 웰에서 세포-없는 상청액을 수합하고, 실험적 방출 방사능 (ER) 을 감마 계수기를 사용해 정량함 ;

x) 식 (ER-MR)/(MR-SR) x 100 에 따라, 특정 분해의 % 를 각 항체 농도에 대해 계산함 (여기서, ER 은 항체 농도 (상기 ix 참조) 에 대해 정량화된 평균 방사능이고, MR 은 MR 대조군 (상기 v 참조) 에 대해 정량화된 평균 방사능이고, SR 은 SR 대조군 (상기 ix 참조) 에 대해 정량화된 평균 방사능임) ;

4) "증가된 ADCC" 는 상기 테스트된 항체 농도 내에서 관찰된 특정 분해의 최대 % 의 증가, 및/또는 상기 테스트된 항체 농도 내에서 관찰된 특정 분해의 최대 % 의 절반을 달성하는데 필요한 항체 농도의 감소로서 정의된다. ADCC 의 증가는 당업자에게 알려진 동일한 표준 제조, 정제, 제형 및 저장 방법을 사용해 동일한 숙주 세포에 의해 생성되나, GnTIII 을 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해서는 생성되지 않은 동일한 항체에 의해 매개되는, 상기 어세이에서 측정된 ADCC 에 비례한다.

한 측면에서, 본 발명은 래트 ICR62 모노클로날 항체 (즉, 동일한 에피토프 에 실질적으로 결합함) 의 결합 특이성을 갖는 항원 결합 분자, 및 그의 효과기 기능이 변형된 당화에 의해 향상될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 한 구현예에서, 항원 결합 분자는 키메라성 항체이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:53 ~ 108 및/또는 SEQ ID NO:122 ~ 127 중 임의의 CDR 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개) 을 포함하는 키메라성 항체, 또는 그의 분절에 관한 것이다. 특이적으로, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다 :

(a) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:124 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ;

(b) SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, 및 SEQ ID NO:126 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ; 및

(c) SEQ ID NO:108.

또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다 :

(a) SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO:114 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ;

(b) SEQ ID NO:116 및 SEQ ID NO:118 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ; 및

(c) SEQ ID NO:119.

한 구현예에서, 이들 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드이다. 다른 측면에서, 본 발명은 이들 폴리뉴클레오타이드 서열 중 임의 또는 모두를 배제할 수 있다.

또다른 구현예에서, 항원 결합 분자는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 에 의해 암호화되는 래트 ICR62 항체의 VH 도메인, 또는 그의 변이체 ; 및 비-쥣과 폴리펩타이드를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:43 또는 SEQ ID NO:44 에 의해 암호화되는 래트 항체의 VL 도메인, 또는 그의 변이체 ; 및 비-쥣과 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 이들 폴리뉴클레오타이드 서열 중 임의 또는 모두를 배제할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 ICR62 의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개) 절단된 또는 변이체 CDR 을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 상기 절단된 또는 변이체 CDR 은 최소한 해당 CDR 에 대한 특이성-결정 아미노산 잔기를 함유할 것이다. "특이성-결정 잔기" 란, 항원과의 상호작용에 직접 관여하는 잔기를 의미한다. 일반적으로, 주어진 CDR 내 잔기 중 단지 약 1/5 내지 1/3 만이 항원과의 결합에 참여한다. 특정 CDR 내 특이성-결정 잔기는 예를 들어, [Padlan 등, FASEB J. 9(l):133-139 (1995)] (이의 전체 내용은 참조로써 본원에 삽입됨) 에 기술된 바와 같은 방법에 따라, 3 차원 모델링으로부터의 상호 작용성 접촉의 자동화 및 주어진 잔기 위치에서의 서열 가변성의 측정에 의해 규명될 수 있다. 따라서, 본원 전체를 통해서 언급되는 본 발명의 항원 결합 분자 (ABM) 는 또한, 예를 들어, 하나 이상의 특이성 결정 잔기를 포함하는 절단된 및/또는 변이체 CDR 을 포함하거나, 또는 대조군 CDR (예를 들어, 래트 ICR62 CDR)과 비교되는 CDR 내 하나 이상의 위치에 치환을 포함하는 ABM 을 포함하는 것이다.

따라서, 본 발명은 또한, 래트 ICR62 항체의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개) 상보성 결정 영역, 또는 적어도 상기 상보성 결정 영역에 대한 특이성-결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로, 여기서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 항원 결합 분자인 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 래트 ICR62 항체의 3 개의 상보성 결정 영역, 또는 상기 3 개의 상보성 결정 영역의 각각에 대한 특이성-결정 잔기를 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하기 표 2 ~ 5 에 나타낸 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 또다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 항체의 경쇄 또는 중쇄의 전체 가변 영역을 암호화한다. 본 발명은 추가로, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 래트 ICR62 항체의 하나 이상 (예를 들어", 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개) 의 상보성 결정 영역, 또는 상기 상보성 결정 영역에 대 한 하나 이상의 특이성-결정 잔기 (SDR) 를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하고, 이형접합성 폴리펩타이드로부터 유래된 서열을 포함하는 개질된 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 구현예에서, 항원 결합 분자는 래트 ICR62 항체의 3 개의 상보성 결정 영역, 또는 상기 3 개의 상보성 결정 영역의 각각에 대한 특이성-결정 잔기를 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 한 구현예에서, 항원 결합 분자는 하기 표 2 ~ 5 에 나타낸 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 하기 표 2 ~ 5 에 나타낸 CDR 중 임의 또는 모두를 배제할 수 있다.

한 구현예에서, 항원 결합 분자는 ICR62 항체의 CDR 의 SDR 중 하나 이상을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 ABM 의 하나 이상의 CDR 은 하나 이상의 아미노산 위치에 치환을 포함하고, 상기 ABM 은 비치환 ABM 과 비교해 결합 활성을 유지한다. 결합 활성은 본원에 기술된 바와 같이 그리고 당업계에 잘 알려지고 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 치환 ABM 의 결합에 대한 EC50 농도는 비치환 ABM 과 비교해 약 10 내지 약 0.001 배보다 더 적게 조정된다. 특별한 구현예에서, EC50 농도는 비치환 ABM 과 비교해 10 내지 약 1, 약 10 내지 약 5, 약 5 내지 약 0.1, 약 5 내지 약 2, 및 약 3 내지 약 1 배보다 더 적게 조정된다. 특별한 구현예에서, 치환 항체의 EC50 농도는 비치환 ABM 과 비교해 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.05, 약 0.25, 약 0.1, 약 0.005, 약 0.025, 및 약 0.001 배보다 더 적게 조정된다. 특정 구현예에서, EC50 농도는 약 10 배보다 더 적게 조정된다. 다른 구현예에서, EC50 인자는 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.05., 약 0.25, 약 0.1, 약 0.005, 약 0.025, 및 약 0.001 배만큼 조정된다. 일부 구현예에서, 조정은 EC50 의 감소이다. 다른 구현예에서, 조정은 EC50 의 증가이다.

본 발명의 ABM 의 CDR 은 임의의 잔기 (Chothia 또는 Kabat 에 따라, 또는 본원에 정의되거나 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 CDR 정의에 따라) 에서의 치환을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, CDR 은 하나 이상의 특이성 결정 잔기를 제외한 임의의 또는 모든 위치에서 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR 은 특이성 결정 잔기를 제외한 임의의 또는 모든 위치에서 치환을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 중쇄 CDR 은 Kabat 위치 27, 28, 29, 30, 31, 23, 33, 34, 35, 52, 52a, 53, 54, 55, 57, 58, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 101, 102, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상에서 치환을 포함한다. 또다른 구현예에서, CDR(들) 은 Chothia 중쇄 CDR1 의 Kabat 위치 27, 28, 또는 29, Kabat 중쇄 CDR1 의 위치 31, Kabat 중쇄 CDR2 의 Kabat 위치 52, 52a, 53, 또는 57, 또는 Kabat 중쇄 CDR3 의 Kabat 위치 102 중 하나 이상에서 치환을 포함한다.

한 구현예에서, 경쇄 CDR 은 하나 이상의 Kabat 위치 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다. 또다른 구현예에서, CDR(들) 은 Kabat 경쇄 CDR1 의 Kabat 위치 30 또는 32, Kabat 경 쇄 CDR2 의 Kabat 위치 51, 52, 53, 또는 56, 또는 Kabat 중쇄 CDR3 의 Kabat 위치 94 중 하나 이상에서 치환을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명의 ABM 은 래트 ICR62 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역의 하나 이상의 특이성 결정 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, ABM 은 중쇄 CDR 의 특이성 결정 잔기를 포함한다. 더욱 특정 구현예에서, 중쇄 특이성 결정 잔기는 Kabat 위치 29 에 있는 페닐알라닌, Kabat 위치 52 에 있는 아스파라긴, Kabat 위치 56 에 있는 타이로신, 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 특이성 결정 잔기는 Kabat 위치 56 에 있는 타이로신 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린이다. 또다른 특정 구현예에서, 특이성 결정 잔기는 Kabat 위치 29 에 있는 페닐알라닌, Kabat 위치 52 에 있는 아스파라긴, Kabat 위치 56 에 있는 타이로신 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린이다. 다른 구현예에서, 특이성 결정 잔기는 경쇄 상보성 결정 영역에 있다. 더욱 특정 구현예에서, 경쇄 특이성 결정 잔기는 Kabat 위치 34 에 있는 아스파라긴, 및 Kabat 위치 50 에 있는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 특이성 결정 잔기는 Kabat 위치 34 에 있는 아스파라긴이다. 또다른 특정 구현예에서, 특이성 결정 잔기는 Kabat 위치 50 에 있는 아스파라긴이다. 또다른 특정 구현예에서, 특이성 결정 잔기는 Kabat 위치 34 에 있는 아스파라긴 및 Kabat 위치 50 에 있는 아스파라긴이다.

또다른 측면에서, 항원 결합 분자는 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 한 특정 유용한 구현예에서, 항원 결합 분자는 키메라성, 예를 들어, 인간화된 항체이다. 본 발명은 또한, 상기 항원 결합 분자의 제조 방법, 및 질환, 특히 EGFR 이 발현되는, 특히 EGFR 이 동일 세포 유형의 정상 조직과 비교해 비정상적으로 발현되는 (예를 들어, 과발현되는) 세포 증식 장애의 치료에서 상기 분자의 용도에 관한 것이다. 상기 장애는 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선, 피부, 및 신장의 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. EGFR 발현 수준은 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, 면역조직화학 어세이, 면역형광 어세이, 면역효소 어세이, ELISA, 유세포 분석, 방사성면역어세이, 웨스턴 블롯, 리간드 결합, 키나아제 활성 등을 통해).

본 발명은 또한, EGFR 을 발현하는 세포를 생체 내 또는 시험관 내에서 표적화하는 방법에 관한 것이다. EGFR 을 발현하는 세포는 치료 목적을 위해 표적화될 수 있다 (예를 들어, EGFR-매개 신호화를 파괴함으로써, 예를 들어 리간드 결합을 차단함으로써, 또는 EGFR-발현 세포가 면역계에 의해 파괴되도록 표적화함으로써 치료가능한 장애를 치료하기 위해). 한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 ABM 을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서의 EGFR 발현 세포의 표적화 방법에 관한 것이다. EGFR 을 발현하는 세포는 또한, 진단 목적을 위해 (예를 들어, 세포가 정상 또는 비정상적으로 EGFR 을 발현하는지 알아보기 위해) 표적화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 생체 내 또는 시험관 내에서, EGFR 또는 EGFR 을 발현하는 세포의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 EGFR 발현을 검출하는 한 방법은, ABM 및 EGFR 간에 복합체가 형성 될 수 있게 하는 조건 하에, 테스트할 샘플을 임의로 대조군 샘플과 함께, 본 발명의 ABM 과 접촉시키는 것을 포함한다. 다음, 복합체 형성을 검출한다 (예를 들어, ELISA 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해). 테스트 샘플과 함께 대조군 샘플을 사용하는 경우, 테스트 및 대조군 샘플을 비교한 경우, ABM-EGFR 복합체의 형성에 있어서 통계적으로 유의한 차이는 테스트 샘플 내 EGFR 의 존재를 가리키는 지표이다.

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

리간드 (예를 들어, EGF, TGF-α 등) 가 EGFR 에 결합하는 것을 차단하고, 이어서 신호화 경로의 활성화, 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC), 및 성장 중지 또는 말기 분화의 유도를 초래하는 것을 포함하여 여러 기작이 항-EGFR 항체의 치료 효능에 관여하는 것으로 알려져 있다.

래트 모노클로날 항체 ICR62 (IgG2b) 는 PCT 공개 번호 제 95/20045 호에서 논의되며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 삽입되어 있다. 상기는 EGFR 의 C 에피토프에 관한 것이고, 리간드 결합을 억제시키고, EGFR 을 발현하는 편평 세포 암종의 시험관 내 성장을 억제시키고, 가슴샘없는 마우스에서 종양의 이종 이식의 퇴화를 유도하는 것으로 나타났다 (WO 95/20045; Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). 전체 설치류 항체로서, ICR62 래트 모노클로날 항체를 인간에 투여하면, 일부 환자에서 단일 투여량으로 받은 후에라도 HARA 반응을 초래하였다 (WO 95/20045; Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73:228- 235 (1996)).

예를 들어, [Morrison, S. L. 등, PNAS 11:6851-6854 (November 1984); 유럽 특허 공개 번호 173494; Boulianna, G. L, 등, Nature 312:642 (December 1984); Neubeiger, M. S. 등, Nature 314:268 (March 1985); 유럽 특허 공개 번호 125023; Tan 등, J Immunol. 135:8564 (November 1985); Sun, L. K 등, Hybridoma 5(1):517 (1986); Sahagan 등, J. Immunol. 137:1066- 1074 (1986)] 를 참조한다. 일반적으로, [Muron, Nature 312:597 (December 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (March 1985); Marx, Science 229:455 (August 1985); 및 Morrison, Science 229:1202-1207 (September 1985)] 를 참조한다. IMC-C225 (Erbitux

, Imclone) 는 EGFR 에 대한 키메라성 모노클로날 항체이고, 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 갖는다 (Herst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002) 참조). IMC-C225 의 쥣과 부분은 M225 유래이고, 이는 EGFR 에 결합하고 EGF-유도 타이로신 키나아제-의존성 인산화를 억제시킬 뿐만 아니라, EGFR 을 과발현하는 종양 세포주에서 세포자살을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Herst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002) 참조). 그러나, M225 는 임상 I 기 시도에서 항체로 처리한 환자에서 HARA 반응을 유도하였다 (Herst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). IMC-225 는 생체 내 및 시험관 내에서 테스트되었고, 불량한 예후와 관련된 많은 종양 유형에서 방사선 치료 및 화학치료와 병용되었다 (Herst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). 그러나, IMC-225 는 임상 시도에서 IMC-225 항체를 투여받은 환자에서 알레르기 및 피부 반응과 같은 독성과 연관있었다 (Herst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)).

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키메라 ABM 은 인간화된 항체이다. 비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간화된 ABM 은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 Winter 의 미국 특허 제 5,225,539 호, Queen 등의 미국 특허 제 6,180,370 호, 또는 Adair 등의 미국 특허 제 6,632,927 호, Foote의 미국 특허 출원공개 번호 2003/0039649 의 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기를 종종 통상 "수입 (import)" 가변 도메인으로부터 수득되는 "수입" 잔기라고 한다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환시킴으로써 Winter 및 공동연구자 (Jones 등, Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann 등, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science, 239: 1534-1536 (1988)) 의 방법에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체 (미국 특허 제 4,816,567 호) 로서, 여기서 실질적으로 본래의 인간 가변 도메인 미만의 도메인은 비-인간 종의 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내 유사 부위의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 목적의 인간화된 항-EGFR 항체는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다.

인간화된 항체의 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 둘 다인 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해서는 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 다음, 설치류 서열에 가장 밀접한 인간 서열은 인간화된 항체를 위한 인간 골격 영역 (FR) 으로서 수용된다 (Sims 등, J. Immunol, 151 :2296 (1993); Chothia 등, J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). 인간 골격 서열을 선택하는 또다른 방법은, 전체 설치류 골격의 각각 의 개별 하위영역 (즉, FR1, FR2, FR3 및 FR4) 또는 개별 하위영역의 일부 조합 (예를 들어, FR1 및 FR2) 의 서열을, 골격 하위영역에 상응하는 공지된 (예를 들어, Kabat 번호화에 의해 결정됨) 인간 가변 영역 서열의 라이브러리와 비교하고, 설치류의 것에 가장 밀접한 각각의 하위영역 또는 조합에 대한 인간 서열을 선택하는 것이다 (각각의 전체 내용이 참조로써 본원에 삽입된 2003 년 2 월 27 일에 공개된 Leung 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0040606A1). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 보존성 서열로부터 유래된 특정 골격 영역을 사용한다. 동일한 골격은 여러 상이한 인간화된 항체에 사용될 수 있다 (각각의 전체 내용이 참조로써 본원에 삽입된 Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta 등, J Immunol., 151 :2623 (1993)).

추가로 항체는 항원에 대한 높은 친화성 및 기타 선호할만한 생물학적 특성을 가진 체류로 인간화될 수 있다는 것이 중요하다. 이를 이루기 위해, 바람직한 방법에 따르면, 인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 3-차원 모델을 사용해 모 서열 및 다양한 개념상 인간화된 생성물의 분석에 의해 제조된다. 3-차원 면역글로불린 모델은 당업자에게 친숙한 컴퓨터 프로그램을 사용해 생성될 수 있다 (예를 들어 InsightII, accelrys inc (이전의 MSI), 또는 http://swissmodel.expasy.org/ 에서). 이들 컴퓨터 프로그램은 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 3-차원 형태 구조를 예시하고 제시할 수 있다. 이러한 제시의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 유사한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린의 그의 항원에의 결합능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들) 에 대한 증가된 친화성과 같은 목적하는 항체 특성을 달성하도록 FR 잔기는 수여자 및 수입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접 및 가장 실질적으로 관여한다.

한 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 불변 영역은 IgG1 로서, 이는 SEQ ID NO: 109 및 110, 및 하기에 나타난 바대로이다 :

IgG1 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:110)

IgG1 아미노산 서열 (SEQ ID NO:109)

그러나, 인간 Fc 영역의 변이체 및 아이소폼 (isoform) 또한 본 발명에 포함 된다. 예를 들어, 본 발명에 사용되기에 적합한 변이체 Fc 영역은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 Presta 의 미국 특허 제 6,737,056 호 (하나 이상의 아미노산 개질로 인해 효과기 기능이 변형된 Fc 영역 변이체) ; 또는 미국 특허 출원 제 60/439,498 호 ; 제 60/456,041 호 ; 제 60/514,549 호 ; 또는 WO 2004/063351 (아미노산 개질로 인해 결합 친화성이 증가된 변이체 Fc 영역) ; 또는 미국 특허 출원 제 10/672,280 호 또는 WO 2004/099249 (아미노산 개질로 인해 Fc감마R 에의 결합이 변형된 Fc 변이체) 에서 교시된 방법에 따라 제조될 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 예를 들어, 그 전체가 참조로써 본원에 삽입된 Balint 등의 미국 특허 출원 공개 제 2004/0132066 호에서 공개된 방법에 따라, 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작된다.

한 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 방사선표지 또는 독소와 같은 추가의 부분에 콘쥬게이션된다. 상기 콘쥬게이션된 ABM 은 당업계에 잘 공지된 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다.

다양한 방사선핵종이 본 발명에 적용되며, 당업자는 다수의 상황 하에 어떤 방사선핵종이 가장 적당한지 용이하게 결정하는 능력을 갖는다. 예를 들어, ¹³¹요오드가 표적 면역치료법에 대해 사용되는 잘 공지된 방사선핵종이다. 그러나, ¹³¹요오드의 임상적인 유용성은 하기를 포함하는 다수의 인자에 의해 제한될 수 있다: 8 일간의 물리적 반감기; 혈액 및 종양 부위 모두에서의 요오드화 항체의 탈할로겐화; 및 종양에 적용된 국소적용 투여량에 대한 차선이 될 수 있는 발광 특징 (예를 들어, 대형 감마 성분). 월등한 킬레이트화제의 출현으로, 단백질에 금속 킬레이트기를 부착하는 기회가, ¹¹¹인듐 및 ⁹⁰이트륨과 같은 기타 방사선핵종을 사용하는 기회를 증가시켰다. ⁹⁰이트륨은 방사 면역치료 적용에서의 용도에 대한 다수의 장점을 제공한다: ⁹⁰이트륨의 64 시간 반감기는 종양에 의한 항체 축적을 허용하기 위해 충분히 길고, ¹³¹요오드와는 달리 ⁹⁰이트륨은 100 내지 1,000 세포 직경의 조직의 범위에서 그의 붕괴시 감마 방사를 동반하지 않는 고에너지의 순수한 베타 방출자이다. 더욱이, 최소 방사선 침투량은 ⁹⁰이트륨-표지 항체의 외래환자에 대한 투여를 가능하게 한다. 추가로, 표지된 항체의 내재화 (internalization) 는 세포 살해에 필요하지 않으며, 이온화된 방사선의 국소적인 방출은 표적 항원이 결핍된 근접한 종양 세포에 대해 치명적이 될 것이다.

본 발명의 ⁹⁰이트륨 표지 항-EGFR 의 유효한 단독 치료 투여량 (즉, 치료적 유효량) 은 약 5 내지 약 75 mCi, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi 의 범위이다. ¹³¹요오드 표지 항-EGFR 의 유효한 단독 치료 비-골수 제거 (ablative) 투여량은 약 5 내지 약 70 mCi, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi 의 범위이다. ¹³¹요오드 표지 항-EGFR 항체의 유효한 단독 치료 제거 투여량 (즉, 동종 골수 이식을 필요로 할 수 있음) 은 약 30 내지 약 600 mCi, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi 미만의 범위이다. 본 발명에 따른 키메라성 항체와 함께, 마주한 (vis-a-vis) 쥣과동물 항체의 더 긴 순환 반감기로 인해, ¹³¹요오드 표지 키메라 항-EGFR 항체의 유효한 단독 치료 비-골수 제거 투여량은 약 5 내지 약 40 mCi, 더욱 바람직하게는 약 30 mCi 미만이다. 예를 들어, ¹¹¹인듐 표지에 대한 조영 기준은 일반적으로 약 5 mCi 미만이다.

본 발명의 방사선표지 항-EGFR 항체에 대하여, 본원에서의 치료법은 또한 단독 요법 치료 또는 다중 치료를 사용하여 수행될 수 있다. 방사선핵종 성분 때문에, 치료에 앞서 말초 줄기 세포 ("PSC") 또는 골수 ("BM") 가 방사선 조사로 인한 잠재적으로 치명적인 골수 독성을 겪는 환자를 위해 "수합" 되는 것이 바람직하다. BM 및/또는 PSC 는 표준 기술을 사용하여 수합된 후, 일소되고, 재주입가능하도록 동결된다. 추가로, 치료 전에 환자에 대한 진단 표지 항체 (예를 들어, ¹¹¹인듐) 를 사용한 진단 약량 측정 연구가 수행되는 것이 가장 바람직한데, 그의 목적은 치료 표지 항체 (예를 들어, ⁹⁰이트륨) 가 임의의 정상적인 장기 또는 조직에 불필요하게 "농축" 되지 않음을 확인하기 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 표 7 에 나타낸 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 표 6 에 나타낸 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 하기 표 6 에서 개시된 뉴클레오타이드 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 표 7 의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 보존성 아미노산 치환이 있는, 표 7 의 구축물 중 임의의 구축물의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다. 본 발명은 또한, 표 7 의 구축물 중 임의의 구축물의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명은 또한, 표 7 의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명은 또한, 보존성 아미노산 치환이 있는 표 7 의 구축물 중 임의의 구축물의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 표 7 의 아미노산 서열 중 임의의 아미노산 서열을 배제할 수 있다.

[표 6]

[표 7]

본 발명은 또한, 경쇄 가변 영역과 쌍을 이룬 EGFR-특이적 CDR 을 포함하는 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 분자를 고려하며, 여기서, 경쇄 가변 영역은 10 개 미만의 비-인간 아미노산 잔기를 갖는다. 다른 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 9 개, 8 개, 7 개, 6 개, 5 개, 4 개, 3 개, 2 개 또는 1 개 미만의 비-인간 아미노산 잔기를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 2 개 미만 또는 1 개 미만의 (즉, 0 개의) 비-인간 아미노 산 잔기를 갖는다. 한 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열을 하나 이상 포함한다. 경쇄 가변 영역을 암호화하는 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, IMGT 데이타베이스 http://imgt.cines.fr/home.html. 에서 이용가능하다. 바람직한 구현예에서, 인간 생식선 서열은 VK1_6 생식선 서열로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 인간 생식선 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 내 아미노산 잔기는 또다른 인간 생식선 경쇄 가변 영역 서열의 하나 이상의 잔기로 치환될 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID No:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 하나 이상의 인간 생식선 가변 유전자 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 인간 생식선 서열은 VK1 6 생식선 서열로부터 유래된다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다 :

(a) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO: 122, 및 SEQ ID NO:124 로 이루어진 군으로부터 선택되 는 서열;

(b) SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, 및 SEQ ID NO:126 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 ;

(c) SEQ ID NO:108 ; 및

(d) 하나 이상의 인간 생식선 유전자 서열에 의해 암호화되는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드. 특정 구현예에서, 인간 생식선 서열은 VK1_6 생식선 서열로부터 유래된다. 또다른 구현예에서, 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열은 하나 이상의 아미노산 코돈이 치환된 VK1_6 생식선 유전자 서열과 함께 상이한 인간 생식선 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 서열을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 본 발명의 EGFR-특정 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:45 의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, SEQ ID NO:45 의 변이체는 상보성 결정 영역 (CDR) 내 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 치환은 SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 30 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 32 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 34 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 50 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 51 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 52 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 53 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 56 ; SEQ ID NO:45 의 아미노산 위치 94 ; 및 그의 임의의 치환 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서의 아미노산 잔기의 치환이다. 더욱 특정 구현예에서, SEQ ID NO:45 에서의 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다 : SEQ ID NO:45 의 위치 30 에 있는 아스파라긴 (N) 을 아르기닌 (R) 으로 치환 ; SEQ ID NO:45 의 위치 32 에 있는 타이로신 (Y) 를 트립토판 (W) 로 치환 ; SEQ ID NO:45 위치 34 에 있는 아스파라긴 (N) 을 글리신 (G) 으로 치환 ; SEQ ID NO:45 의 위치 50 에 있는 아스파라긴 (N) 을 트레오닌 (T) 으로 치환 ; SEQ ID NO:45 의 위치 51 에 있는 트레오닌 (T) 을 알라닌 (A) 으로 치환 ; SEQ ID NO:45 의 위치 52 에 있는 아스파라긴 (N) 을 세린 (S) 으로 치환 ; SEQ ID NO:45 의 위치 53 에 있는 아스파라긴 (N) 을 세린 (S) 으로 치환 ; SEQ ID NO:45 의 위치 56 에 있는 트레오닌 (T) 을 세린 (S) 으로 치환 ; SEQ ID NO:45 의 위치 94 에 있는 페닐알라닌 (F) 을 타이로신 (Y) 으로 치환 ; 및 그의 임의의 조합. 특정 구현예에서, SEQ ID NO:45 내 아미노산 잔기의 이러한 치환 모두는 단일 경쇄 변이체에 삽입된다. 바람직한 구현예에서, ICR62 CDR 에 대한 아미노산 치환이 있는 경쇄 변이체를 포함하는 항원 결합 분자는 경쇄 변이체가 본 발명의 중쇄 가변 영역의 폴리펩타이드와 짝을 이루는 경우, EGFR 에 대한 특정 결합을 유지한다 (SEQ ID NO:45 의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 분자와 비교해). 본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드 및/또는 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포 및/또는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 상기 기술된 항원 결합 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한, EGFR-특정 CDR 을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역을 포함하 는 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 여기서, 중쇄 가변 영역은 10 개 미만의 비-인간 아미노산 잔기를 갖고, 항원 결합 분자는 특이적으로 EGFR 에 결합한다. 다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개 미만의 비-인간 아미노산 잔기(들) 를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 5 개 미만의 비-인간 아미노산 잔기를 갖는다. 한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 하나 이상의 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열을 갖는다. 중쇄 가변 영역을 암호화하는 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, http://imgt.cines.fr/home.html 에서 이용가능한 IMGT 데이타베이스에서 찾을 수 있다. 한 구현예에서, 인간 생식선 서열은 VH1_1O 생식선 서열로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 인간 생식선 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 내 아미노산 잔기는 또다른 인간 생식선 중쇄 가변 영역 서열의 하나 이상의 잔기로 치환될 수 있다. 바람직한 구현예에서, ICR62 중쇄 CDR 에서 아미노산 치환이 있는 중쇄 변이체를 포함하는 항원 결합 분자는, 중쇄 변이체가 EGFR 에 결합하는 경쇄 가변 영역 (예를 들어 본 발명의 경쇄 가변 영역) 을 포함하는 폴리펩타이드와 짝을 이룰 때, EGFR 에의 특이적인 결합을 유지한다. 본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드 및/또는 항원 결합 분자 중 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포 및/또는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 상기 기술된 항원 결합 분자에 관한 것이다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오 타이드를 포함하는 발현 벡터 및/또는 숙주 세포에 관한 것이다.

일반적으로, 임의의 유형의 배양된 세포주가 본 발명의 ABM 을 발현시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, HEK293-EBNA 세포, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 다른 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포가 본 발명의 조작된 숙주 세포를 생성하는데 있어서, 배경 세포주로서 사용된다.

본 발명의 ABM 의 치료 효능은 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 발현하는 숙주 세포에서 ABM 을 생성함으로써 향상될 수 있다. 바람직한 구현예에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 골지 체류 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 개질된 ABM 의, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 숙주 세포에서의 발현은 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및 증가된 효과기 기능을 갖는 개질된 ABM 을 제공한다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 (a) GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 ; 및 (b) 인간 EGFR 에 결합하는 키메라, 영장류화된 또는 인간화된 항체와 같은 본 발명의 ABM 을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 GnTIII 의 촉매 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이고, 골지 위치화 도메인은 만노시다제 II 의 위치화 도메인이다. 그러한 융합 폴리펩타이드의 제조 방법 및 증가된 효과기 기능을 갖는 항체의 제조에 이를 사용하는 방법은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 Provisional Pat. Appl. No. 60/495,142 및 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0241817 에 개시되어 있다. 또다른 바람직한 구현예에서, 키메라 ABM 은 래트 ICR62 항체의 결합 특이성을 갖는 키메라 항체 또는 그의 절편이다. 특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 Fc 를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 영장류화된 또는 인간화된 것이다.

한 구현예에서, 본 발명의 ABM 을 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오타이드는 구성적 프로모터 또는 대안적으로는 조절된 발현 시스템의 조절 하에 발현될 수 있다. 적합한 조절된 발현 시스템에는 테트라사이클린-조절된 발현 시스템, 엑디손-유도성 발현 시스템, 락(lac)-스위치 발현 시스템, 글로코코르티코이드-유도성 발현 시스템, 온도-유도성 프로모터 시스템, 및 메탈로티오네인 금속-유도성 발현 시스템이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 ABM 을 암호화하는 여러 상이한 핵산이 숙주 세포 시스템 내에 포함된다면, 이들 중 일부는 구성적 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있고, 한편 다른 것들은 조절된 프로모터의 조절 하에 발현된다. 최대 발현 수준은 세포 성장률에 유의한 역효과를 갖지 않는 안정한 폴리펩타이드 발현의 최고 가능한 수준으로 간주되고, 일반 실험을 사용하여 측정될 것이다. 발현 수준은 ABM 에 특이적인 항체 또는 ABM 에 융합된 펩티드 태그에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석 ; 및 노던 블롯 분석을 포함하여 당업계에 일반적으로 알려진 방법에 의해 측정된다. 추가의 대안 에서, 폴리뉴클레오타이드는 리포터 유전자에 조작적으로 연결될 수 있고 ; 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 키메라성 (예를 들어, 인간화된) ABM 의 발현 수준을 리포터 유전자의 발현 수준과 관련된 신호를 측정하여 측정한다. 리포터 유전자는 단일 mRNA 분자로서 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(들) 과 함께 전사될 수 있고 ; 그의 각각의 코딩 서열은 내부 리보좀 도입 부위 (IRES) 또는 캡-비의존성 번역 인핸서 (CITE) 에 의해 연결될 수 있다. 리포터 유전자는 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 키메라성 (예를 들어, 인간화된) ABM 을 암호화하는 하나 이상의 핵산과 함께 번역될 수 있어서, 단일 폴리펩타이드 사슬이 형성된다. 본 발명의 ABM 을 암호화하는 핵산은 단일 프로모터의 조절 하에 리포터 유전자에 조작적으로 연결될 수 있어서, 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 리포터 유전자는 2 개의 개별 전령 RNA (mRNA) 분자로 대안적으로 나뉘어지는 RNA 분자로 전사되고 ; 생성 mRNA 중 하나는 상기 리포터 단백질로 번역되고, 나머지 다른 하나는 상기 융합 폴리펩타이드로 번역된다.

당업자에게 잘 알려진 방법은 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 재조합/유전 재조합을 포함한다. 예를 들어, [Maniatis 등, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989)] 및 [Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)] 에 기재된 기술을 참조한다.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 ABM 의 코딩 서열을 발현하도록 사용될 수 있다. 바람직하게는, 포유류 세포는 흥미있는 단백질의 코딩 서열 및 융합 폴리펩타이드의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 트랜스펙션되는 숙주 세포 시스템으로서 사용된다. 가장 바람직하게는, CHO 세포, HEK293-EBNA 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 기타 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포가 숙주 세포 시스템으로서 사용된다. 발현 시스템 및 선별 방법의 일부 예는 하기 참조문헌에 기술되어 있다 : [Borth 등, Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001)], [Werner 등, Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998)], [Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002)], [Chadd and Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001)], 및 [Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001)]. 대안적인 구현예에서, 다른 진핵숙주 세포 시스템이 고려될 수 있는데, 미국 특허 출원 제 60/344,169 호 및 WO 03/056914 에서 교시된 발현 시스템과 같은 (비-인간 진핵 숙주 세포에서 인간-형 당단백질을 제조하는 방법) (그 전체가 참조로써 본원에 삽입됨) 본 발명의 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 세포 ; 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 키메라성 ABM 의 코딩 서열을 함유하는, 재조합 바이러 스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템 ; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크병 바이러스, CaMV ; 담배 모자이크병 바이러스, TMV) 로 감염되거나, 또는 미국 특허 제 6,815,184 호 (유전적으로 조작된 개구리밥으로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 발현 및 분비하는 방법), WO 2004/057002 (선태류 식물 세포에서 글리코실 트랜스퍼라제 유전자의 도입에 의해 당화된 단백질을 제조하는 방법) 및 WO 2004/024927 (이끼 원형질체에서의 세포외 이종 비-식물 단백질의 제조 방법) 및 미국 특허 출원 제 60/365,769 호, 제 60/368,047 호, 및 WO 2003/078614 (기능성 포유류 GnTIII 효소를 포함하는 유전자도입 식물에서의 당단백질 처리) (각 내용이 그 전체가 본원에 참조로써 삽입됨) 에 교시된 발현 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 본 발명의 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드) 로 형질전환된 식물 세포 시스템 ; 또는 이중-미세 염색체 (예를 들어, 쥣과 세포주) 에서 안정적으로 증폭되거나 (CHO/dhfr) 또는 불안정하게 증폭되는 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 키메라성 ABM 을 암호화하는 DNA 의 복사본을 여러 개 함유하도록 조작된 세포주를 포함하여 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아바이러스) 로 감염된 동물 세포 시스템이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 본 발명의 ABM 을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들) 를 포함하는 벡터는 폴리시스트론성이다. 또한, 한 구현예에서, 상기 논의된 ABM 은 항체 또는 그의 절편이다. 바람직한 구현예에서, ABM 은 인간화된 항체이다.

본 발명의 방법을 위해, 안정한 발현은 일반적으로 일시적인 발현에 바람직한데, 그 이유는 그것이 더욱 재현가능한 결과를 달성하게 하고 또한 대규모 생산에 더욱 용이하기 때문이다. 복제 바이러스 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 원소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종료자, 폴리아데닐화 부위 등) 에 의해 조절되는 각각의 코딩 핵산, 및 선택성 마커로 형질전환될 수 있다. 외부 DNA 의 도입 후, 조작된 세포는 풍부한 배지 내에서 1 ~ 2 일 동안 성장하도록 방치될 수 있고, 그런 다음 선별 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드 내 선택성 마커는 선별에 대한 저항성을 부여하고, 플라스미드를 그의 염색체에 안정하게 혼입한 세포의 선별을 가능하게 하고, 성장해서 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있는 포키 (foci) 를 형성하게 한다.

각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 적용될 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 (WiG1er 등, Cell 11:223 (1977)), 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 48:2026 (1962)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy 등, Cell 22:817 (1980)) 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 선별 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성은 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (WiG1er 등, Natl Acad. Sci. USA 77:3567 (1989) ; O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 1527 (1981)); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:2072 (1981)) ; 아미노글리코시 드 G-418 에 대한 저항성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin 등, J. Mol Biol 150:1 (1981)) ; 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro 유전자 (Santerre 등, Gene 30:147 (1984) 에 대한 선별의 기준으로서 사용될 수 있다. 최근, 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하게 하는 trpB ; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하게 하는 hisD (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci USA S5:8047 (1988)) ; 글루타민 합성효소 시스템 ; 및 오르니틴 탈탄소효소 억제제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DEMO 에 대한 저항성을 부여하는 ODC (오르니틴 탈탄소효소) (McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)) 로서 추가의 선별 유전자가 기술되었다.

본 발명은 추가로, 본 발명의 ABM 을 암호화하는 핵산 및 GnTIII 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 그러한 핵산을 포함하는 벡터를 상기 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 숙주 세포에 의해 생성되는 본 발명의 ABM 의 당화 프로파일을 개질시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 개질된 폴리펩타이드는 IgG 또는 Fc 영역을 포함하는 그의 절편이다. 특히 바람직한 구현예에서, ABM 은 인간화된 항체 또는 그의 절편이다. 또다른 구현예에서, 상기 방법은 제 2 글리코실트랜스퍼라제 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서 발현시키는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제 2 글리코실트랜스퍼라제 활성은 만노시다제 II (ManII) 이다.

본 발명의 숙주 세포에 의해 생성된 개질된 ABM 은 개질 결과, 증가된 Fc 수 용체 결합 친화성 및/또는 증가된 효과기 기능을 나타낸다. 특히 바람직한 구현예에서, ABM 은 인간화된 항체 또는 Fc 영역을 함유하는 그의 절편이다. 바람직하게는, 증가된 Fc 수용체 결합 친화성은 FcγRIIIa 수용체와 같은 Fcγ 활성화 수용체에의 증가된 결합이다. 증가된 효과기 기능은 바람직하게는 하기 중 하나 이상의 증가이다 : 항체-의존성 세포의 세포독성 증가, 항체-의존성 세포의 식균작용 (ADCP) 증가, 사이토카인 분비 증가, 항원-제시 세포에 의한 면역-복합체-매개 항원 습득 증가, Fc-매개 세포의 세포독성 증가, NK 세포에의 결합 증가, 대식세포에의 결합 증가, 다핵성 세포 (PMN) 에의 결합 증가, 단핵구에의 결합 증가, 표적-결합된 항체의 가교 증가, 직접 신호 유도성 세포자멸사 증가, 수지상 세포 성숙화 증가, 및 T 세포 프라이밍 증가.

본 발명은 또한, 하기를 포함하는, 개질된 올리고사카라이드를 갖는 본 발명의 ABM 을 숙주 세포에서 제조하는 방법에 관한 것이다 :

(a) 본 발명에 따른 ABM 의 제조를 허용하는 조건 하에, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포를 배양하고, 여기서 상기 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 상기 숙주 세포에 의해 생성되는 상기 ABM 의 Fc 영역 내에서 올리고사카라이드를 개질시키기에 충분한 양으로 발현됨 ; 및

(b) 상기 ABM 을 단리함. 바람직한 구현예에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 GnTIII 의 촉매 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 추가로 골지 거주 폴리펩타이드의 골지 위치화 도 메인을 포함한다.

바람직하게는, 골지 위치화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI 의 위치화 도메인이다. 대안적으로, 골지 위치화 도메인은 : 만노시다제 I 의 위치화 도메인, GnTII 의 위치화 도메인, 및 α1-6 코어 푸코실트랜스퍼라제의 위치화 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 ABM 은 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 효과기 기능을 갖는다. 바람직하게는, 증가된 효과기 기능은 하기 중 하나 이상이다 : Fc-매개 세포의 세포독성 (항체-의존성 세포의 세포독성 증가 포함) 증가, 항체-의존성 세포의 식균작용 (ADCP) 증가, 사이토카인 분비 증가, 항원-제시 세포에 의한 면역-복합체-매개 항원 습득 증가, NK 세포에의 결합 증가, 대식세포에의 결합 증가, 다핵성 세포 (PMN) 에의 결합 증가, 단핵구에의 결합 증가, 직접 신호 유도성 세포자멸사 증가, 표적-결합된 항체의 가교 증가, 수지상 세포 성숙화 증가, 및 T 세포 프라이밍 증가. 증가된 Fc 수용체 결합 친화성은 바람직하게는 FcγRIIIa 와 같은 Fc 활성화 수용체에의 증가된 결합이다. 특히 바람직한 구현예에서, ABM 은 인간화된 항체 또는 그의 절편이다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 증가된 비율의 양분된 올리고사카라이드를 상기 폴리펩타이드의 Fc 영역에 갖는 본 발명의 방법에 의해 생성되는 래트 ICR62 항체의 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 키메라성 ABM 에 관한 것이다. 상기 ABM 은 항체, 및 Fc 영역을 포함하는 그의 절편을 포함한다. 바람직한 구현예에서, ABM 은 인간화된 항체이다. 한 구현예에서, ABM 의 Fc 영역 내 양분된 올리고사카라이드의 비율은 총 올리고사카라이드의 50% 이상, 더욱 바람직하게는, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 90 ~ 95% 이상이다. 더욱 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 ABM 은 본 발명의 방법에 의해 그의 올리고사카라이드가 개질된 결과, 증가된 비율의 비푸코실화된 올리고사카라이드를 Fc 영역 내에 가진다. 한 구현예에서, 비푸코실화된 올리고사카라이드의 % 는 50% 이상, 바람직하게는, 60% 내지 70% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이다. 비푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체 유형일 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포 및 방법에 의해 생성되는 ABM 은 Fc 영역에 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드를 증가된 비율로 갖는다. 양분된, 비푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 ABM 의 Fc 영역 내 15% 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 35% 이상의 올리고사카라이드가 양분된, 비푸코실화된 ABM 을 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한, 폴리펩타이드의 Fc 영역 내 15% 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 35% 이상의 올리고사카라이드가 양분된 하이브리드 비푸코실화된 폴리펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된, 증가된 효과기 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖도록 조작된 래트 ICR62 의 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 키메라성 ABM 에 관한 것이다. 바람직하 게는, 증가된 효과기 기능은 하기 중 하나 이상을 포함한다 :

증가된 Fc-매개 세포성 세포독성 (증가된 항체-의존성 세포성 세포독성 포함), 증가된 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP), 증가된 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 증가된 면역-복합체-매개 항원 취득, NK 세포에의 증가된 결합, 대식세포에의 증가된 결합, 단핵구에의 증가된 결합, 다형핵 세포에의 증가된 결합, 세포자살을 유도하는 증가된 직접 신호화, 표적-결합된 항체의 증가된 가교, 증가된 수지상 세포 성숙화, 또는 증가된 T 세포 프라이밍.

바람직한 구현예에서, 증가된 Fc 수용체 결합 친화성은 바람직하게는 FcγRIIIa 와 같은 Fc 활성화 수용체에의 증가된 결합이다. 한 구현예에서, ABM 은 항체, Fc 영역을 함유하는 항체 절편, 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 특히 바람직한 구현예에서, ABM 은 인간화된 항체이다.

본 발명은 본 발명의 ABM 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 암 치료 방법에서의 상기 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 증가된 Fc 수용체 결합 친화성, 바람직하게는 증가된 Fc 활성화 수용체에의 결합, 및/또는 항체-의존성 세포의 세포독성을 포함하여 증가된 효과기 기능을 가진, 본 발명의 개질된 ABM 의 당형의 제조를 위한 숙주 세포 시스 템의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 개질된 ABM 으로 사용될 수 있는 당개질화 방법은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 제 6,602,684 호, 미국 특허 출원 공개 제 2004/0241817 A1 호, 미국 특허 출원 공개 제 2003/0175884 A1 호, 미국 특허 출원 공개 제 2004/0241817 A1 호, 및 WO 2004/065540 에 더욱 상세히 나타나 있다. 본 발명의 ABM 은 대안적으로는, 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 출원 공개 제 2003/0157108 호 (Genentech), 또는 EP 1 176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 및 미국 특허 출원 공개 제 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2007/132140 (Kyowa) 에서 개시된 기술에 따라 Fc 영역 내에 감소된 푸코스 잔기를 갖도록 조작될 수 있다. 이들 문서 각각의 내용은 참조로써 본원에 삽입되어 있다. 본 발명의 당개질된 ABM 은 또한, 미국 특허 출원 공개 제 60/344,169 호 및 WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) 또는 WO 2004/057002 및 WO 2004/024927 (Greenovation) 에서 교시된 것과 같은, 개질된 당단백질을 제조하는 발현 시스템에서 제조될 수 있으며, 상기 문헌의 각각의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 삽입되어 있다.

변형된 당화 패턴을 가진 단백질의 제조를 위한 세포주의 생성

본 발명은 개질된 당화 패턴을 갖는 본 발명의 개질된 ABM 의 생성을 위한 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 향상된 치료가치를 가진 본 발명의 ABM 의 당형의 생성을 위한 숙주 세포 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명은 GnTIII 활성을 가진 폴리펩타이드를 발현하도록 선별 또는 조작된 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 한 구현예에서, GnTIII 활성을 가진 폴리펩타이드는 이종 골지 거주 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 구체적으로는, 그러한 숙주 세포 발현 시스템은 구조성 또는 조절된 프로모터 시스템에 조작적으로 연결된, GnTIII 을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산 분자를 포함하도록 조작될 수 있다.

한 구체적인 구현예에서, 본 발명은 GnTIII 활성을 가지고 이종 골지 거주 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포를 제공한다. 한 측면에서, 숙주 세포는 GnTIII 활성을 가지고 이종 골지 거주 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 핵산 분자로 조작된다.

또다른 구현예에서, 숙주 세포는 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 제 1 핵산, 및 또다른 글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 제 2 핵산을 발현하도록 조작된다. 특정 구현예에서, 제 2 핵산은 만노시다제 (ManII) 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.

일반적으로, 상기 논의된 세포주를 포함하여 임의의 배양 세포주는 본 발명의 숙주 세포주를 조작하기 위한 배경으로서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 기타 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포는 본 발명의 조작된 숙주 세포를 생성하는 데 있어서 배경 세포주로서 사용된다.

본 발명은 본원에 정의된 이종 골지 거주 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하여, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 숙주 세포를 포함하는 것으로 생각된다.

GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 또는 다수의 핵산은 구성적 프로모터 또는 대안적으로 조절된 발현 시스템의 조절 하에 발현될 수 있다. 상기 시스템은 당업계에 잘 알려져 있고, 상기 기술된 시스템을 포함한다. GnTIII 활성을 갖고 이종 골지 거주 폴리펩타이드의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 여러 상이한 핵산이 숙주 세포 시스템에 포함된다면, 이들 중 일부는 구성적 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있는 한편, 나머지 다른 것들은 조절된 프로모터의 조절 하에 발현된다. GnTIII 활성을 가진 융합 폴리펩타이드의 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 리포터 유전자 발현 분석 또는 GnTIII 활성의 측정을 포함하여, 당업계에 일반적으로 알려진 방법에 의해 측정된다. 대안적으로, 렉틴은 GnTIII, 예를 들어, E4-PHA 렉틴의 생합성 생성물에 결합하도록 적용될 수 있다. 대안적으로, GnTIII 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로 조작된 세포에 의해 생성되는 항체에 의해 매개되는 증가된 Fc 수용체 결합 또는 증가된 효과기 기능을 측정하는 기능성 어세이가 사용될 수 있다.

개질된 당화 패턴을 가진 단백질을 발현하는 세포감염물 (Transfectant) 또는 형질전환체의 규명

래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 키메라성 (예를 들어, 인간화된) ABM 의 코딩 서열을 함유하고 생물학적 활성 유전자 생성물을 발현하는 숙주 세포를 4 가지 일반적인 접근법에 의해 규명할 수 있다 :

(a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 ;

(b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재 ;

(c) 숙주 세포 내 각각의 mRNA 전사체의 발현에 의해 측정되는 전사 수준의 평가 ; 및

(d) 면역어세이 또는 그의 생물학적 활성에 의해 측정된 유전자 생성물의 검출.

제 1 접근법에서, 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 키메라성 (예를 들어, 인간화된) ABM 의 코딩 서열의 존재 및 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드의 코딩 서열의 존재는 각각의 코딩 서열, 개별적으로는 또는 그의 부분 또는 유도체에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 사용하여, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화에 의해 측정될 수 있다.

제 2 접근법에서, 재조합 발현 벡터/숙주 시스템은 특정 "마커" 유전자 기능 (예를 들어, 티미딘 키나아제 활성, 항생제에 대한 저항성, 메토트렉세이트에 대한 저항성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스 내 폐색체 형성 등) 의 존재 또는 부재를 바탕으로 규명 및 선별될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ABM 또는 그의 절편의 코딩 서열, 및 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드의 코딩 서열이 벡터의 마커 유전자 서열 내에 삽입된다면, 각각의 코딩 서열을 함유하는 재조합은 마커 유전자 기능의 부재에 의해 규명될 수 있다. 대안적으로, 마커 유전자는 코딩 서열의 발현을 조절하는데 사용되는 동일 또는 상이한 프로모터의 조절 하에 코딩 서열과 함께 위치될 수 있다. 유도 또는 선별에 반응하는 마커의 발현은 본 발명의 ABM 의 코딩 서열 및 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드의 코딩 서열의 발현을 지시한다.

제 3 접근법에서, 본 발명의 ABM, 또는 그의 절편의 코딩 서열, 및 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드의 코딩 서열을 위한 전사 활성을 혼성화 어세이에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, RNA 는 본 발명의 ABM, 또는 그의 절편의 코딩 서열, 및 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 특정 부분의 코딩 서열에 상동성인 프로브를 사용하여 노던 블롯에 의해 단리 및 분석될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포의 총 핵산은 상기 프로브에의 혼성화를 위해 추출 및 어세이될 수 있다.

제 4 접근법에서, 단백질 생성물의 발현은 예를 들어 웨스턴 블롯, 면역방사선-침전과 같은 면역어세이, 효소-연결 면역어세이 등에 의해 면역학적으로 평가될 수 있다. 그러나, 발현 시스템의 성공에 대한 궁극적인 테스트는 생물학적 활성 유전자 생성물의 검출을 포함한다.

항체-의존성 세포의 세포독성을 포함하여 증가된 효과기 기능을 가진 ABM 의 생성 및 용도

바람직한 구현예에서, 본 발명은 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 가지고 항체-의존성 세포의 세포독성을 포함하여 증가된 효과기 기능을 가진 키메라성 (예를 들어, 인간화된) ABM 의 당형을 제공한다. 항체의 당화 조작은 이미 기술되었다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 제 6,602,684 호를 참조한다.

일부 유형의 암의 치료를 위한 비컨쥬게이션 모노클로날 항체 (mAb) 의 임상적 시도는 최근 유망한 결과를 제공하였다 (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo 등, Immunology Today 18:127 (1997)). 키메라, 비컨쥬게이션 IgG1 은 저등급 또는 여포성 B-세포 비-호지킨스 림프종에 승인되었고 (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997)), 한편 고형 유방 종양을 표적화하는 인간화된 IgG1 인 또다른 비컨쥬게이션 mAb 또한 임상 III 기 시도에서 유망한 결과를 보여주고 있다 (Deo 등, Immunology Today 18:127 (1997)). 이러한 2 가지 mAb 의 항원은 그의 개별 종양 세포에서 고도로 발현되고, 항체는 시험관 내 및 생체 내에서 효과기 세포에 의한 강력한 종양 파괴를 매개한다. 반대로, 양호한 종양 특이성을 가진 많은 다른 비컨쥬게이션 mAb 는 임상적으로 유용한 충분한 잠재력의 효과기 기능을 유도할 수 없다 (Frost 등, Cancer 80:317-33 (1997); Surfus 등, J. Immunother. 19:184-91 (1996)). 이러한 더 약한 mAb 중 일부를 위해서, 부가의 사이토카인 치료법이 현재 테스트되고 있다. 사이토카인의 첨가는 순환 림프구의 활성 및 수를 증가시킴으로써 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 을 자극시킬 수 있다 (Frost 등, Cancer 80:317-33 (1997); Surfus 등, J. Immunother. 19:184-91 (1996)). 항체-표적화된 세포에 대한 용해성 공격인 ADCC 는 항체의 불변 영역 (Fc) 에 림프구 수용체가 결합했을 때 유도된다 (Deo 등, Immunology Today 18: 127 (1997)).

비컨쥬게이션 IgG1 의 ADCC 활성을 증가시키는 상이한, 그러나 상보적인 접근법은 항체의 Fc 영역을 조작하는 것이다. 단백질 조작 연구는 FcγR 가 IgG CH2 도메인의 하위 힌지 영역과 상호작용하는 것을 보여준다 (Lund 등, J. Immunol. 157:4963-69 (1996)). 그러나, FcγR 결합은 또한 CH2 영역의 보존된 Asn 297 에 공유 부착된 올리고사카라이드의 존재를 필요로 하며 (Lund 등, J. Immunol 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997)), 이는 올리고사카라이드 및 폴리펩타이드 둘 다가 상호작용 부위에 직접 기여하거나 또는 올리고사카라이드가 활성 CH2 폴리펩타이드 형성을 유지하는데 필요하다는 것을 제안한다. 따라서, 올리고사카라이드 구조의 개질은 상호작용의 친화성을 증가시키는 수단으로서 사용될 수 있다.

IgG 분자는 그의 Fc 영역에서, 각각의 중쇄 상에서 하나씩, 2 개의 N-연결 올리고사카라이드를 운반한다. 임의의 당단백질로서, 항체는 동일한 폴리펩타이드 골격을 공유하나, 당화 부위에 부착된 상이한 올리고사카라이드를 가진 당형의 군으로서 생성된다. 정상적으로는 혈청 IgG 의 Fc 영역에서 발견되는 올리고사카라이드는 복합체 바이-안테나리 (bi-antennary) 유형 (Wormald 등, Biochemistry 5(5:130-38 (1997) 으로서, 말단 시알산 및 양분화 N-아세틸글루코스아민 (GlcNAc) 의 수준이 낮고, 다양한 정도의 말단 갈락토실화 및 코어 푸코실화가 있다. 일부 연구는, FcγR 결합에 필요한 최소한의 탄수화물 구조가 올리고사카라이드 코어 내에 놓여 있다고 한다 (Lund 등, J. Immunol. 757:4963-69 (1996)).

비컨쥬게이션 치료성 mAb 의 제조를 위해 산업 및 학계에서 사용되는 마우스- 또는 햄스터-유래 세포주는 정상적으로는 필요한 올리고사카라이드 결정소를 Fc 부위에 부착한다. 그러나, 이러한 세포주에서 발현되는 IgG 은 혈청 IgG 에서 소량으로 발견되는 양분화 GlcNAc 가 없다 (Lifely 등, Glycobiology 375:813-22 (1995)). 반대로, 최근, 래트 골수종-생성, 인간화된 IgG1 (CAMPATH-1H) 이 그의 당형의 일부에서 양분화 GlcNAc 를 운반한다는 것이 관찰되었다 (Lifely 등, Glycobiology 375:813-22 (1995)). 래트 세포-유래 항체는 표준 세포주에서 생성되는 CAMPATH-1H 항체로서 시험관 내 ADCC 활성이 유사한 최대값에 도달하였으나, 유의하게 더 낮은 항체 농도에서 상기 값에 도달하였다.

CAMPATH 항원은 정상적으로는 림프종 세포 상에 높은 수준으로 존재하고, 이러한 키메라 mAb 는 양분화 GlcNAc 의 부재 하에 높은 ADCC 활성을 가진다 (Lifely 등, Glycobiology 375:813-22 (1995)). N-연결 당화 경로에서, 양분화 GlcNAc 는 GnTIII 에 의해 첨가된다 (Schachter, Biochem. Cell Biol. 54:163-81 (1986)).

이전의 연구는 상이한 수준의, 클로닝된 GnIII 유전자 효소를 외부-조절된 방식으로 발현하도록 이미 조작된 단일 항체-생성 CHO 세포주를 사용하였다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999)). 상기 접근법은, 처음에 GnTIII 의 발현 및 개질된 항체의 ADCC 활성 사이의 엄격한 연관을 구축하였다. 따라서, 본 발명은 증가된 GnTIII 활성으로 인한 변형된 당화를 가진, 래트 ICR62 항체의 결합 특이성을 가진 재조합, 키메라 항체 또는 그의 절편을 고려 한다. 증가된 GnTIII 활성은 ABM 의 Fc 영역에서 양분된 올리고사카라이드의 % 의 증가뿐만 아니라, 푸코스 잔기의 % 의 감소를 초래한다. 이러한 항체 또는 그의 절편은 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및 증가된 효과기 기능을 가진다. 또한, 본 발명은 면역글로불린의 Fc 영역에 상응하는 영역을 포함하는 항체 절편 및 융합 단백질에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 인간화된 것이다.

본 발명의 방법에 따라 생성된 ABM 의 치료 적용

광범위하게는, 본 발명의 ABM 은 생체 내 또는 시험관 내에서 EGFR 을 발현하는 표적 세포에 사용될 수 있다. EGFR 을 발현하는 세포는 진단 또는 치료 목적을 위해 표적으로 할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 ABM 은 EGFR 의 존재를 샘플 내에서 검출하는데 사용될 수 있다. 또다른 측면에서, 본 발명의 ABM 은 표면 상에 EGFR 을 발현하는 세포에서 EGFR-매개 신호전달을 억제 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. EGFR 은 동일한 세포 유형의 비-종양 조직과 비교해 많은 인간 종양에서 비정상적으로 발현된다 (예를 들어, 과발현됨). 따라서, 본 발명의 ABM 은 특히 종양 형성의 방지, 종양의 제거 및 종양 성장의 억제에 유용하다. EGFR 리간드가 EGFR 에 결합하는 것을 차단함으로써, 본 발명의 ABM 은 EGFR 타이로신 인산화, 증가된 세포외 산성화 세포자살률 및 세포 증식을 포함하여, EGF-의존성 종양 세포 활성화를 억제시킨다. 본 발명의 ABM 은 또한, 세포 주기를 억제시키도록 작용하고, 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포) 의 자살을 야기하고, 표적 세포의 혈관신생 및/또는 분화를 억제시킨다. 본 발명의 ABM 은 EGFR 을 발현하는 임의의 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 ABM 을 사용해 치료될 수 있는 특정 악성종양은 외피 및 편평 세포암종, 비소세포폐암종, 신경교종, 췌장암, 난소암, 전립선암, 유방암, 방광암, 두경부암, 및 신세포암종을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 ABM 은 생체 내에서 종양 세포를 표적화하고 살해하는데 단독으로 사용될 수 있다. ABM 은 또한, 인간 암종을 치료하는 적절한 치료제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, ABM 은 치료제를 암종 부위로 전달하기 위해, 화학치료법, 방사선치료법과 같은 표준 또는 통상적인 치료 방법과 함께 사용되거나, 치료 약물, 또는 독소, 및 림포카인 또는 종양-억제 성장 인자에 컨쥬게이션되거나 결합될 수 있다. 본 발명의 ABM 의 컨쥬게이트 중에는 (1) 면역독소 (ABM 및 세포독성 부분의 컨쥬게이트) 및 (2) 표지된 (예를 들어, 동위원소표지, 효소-표지 또는 형광염색-표지) ABM 이 포함되며, 여기서 표지는, 표지된 ABM 을 포함하는 면역 복합체를 확인하기 위한 방법을 제공한다. ABM 은 또한 천연 보체 과정을 통해 파쇄를 유도하고, 일반적으로 존재하는 항체 의존성 세포독성 세포와 상호작용하기 위해 사용될 수 있다.

면역독소의 세포독성 부분은 세포독성 약물 또는 박테리아 또는 식물 원천의 효소 활성 독소, 또는 그러한 독소의 효소 활성 단편 ("A 쇄") 일 수 있다. 사용되는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (수도모나스 아루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 로부터의), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알루라이츠 포르 디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제, 커르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스토릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신이다. 또다른 구현예에서는, ABM 이 소분자 항암 약물에 컨쥬게이션된다. ABM 및 그러한 세포독성 부분의 컨쥬게이트는 다양한 2기능의 단백질 결합제를 사용하여 제조된다. 이러한 시약의 예는 SPDP, IT, 디메틸 아디피미데이트 HCl 과 같은 이미도에스테르의 2기능 유도체, 디석시니미딜 수베레이트와 같은 활성 에스테르, 글루타르알데하이드와 같은 알데하이드, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민과 같은 비스-아지도 화합물, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은 비스-디아조늄 유도체, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트와 같은 디이소시아네이트, 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은 비스-활성 플루오린 화합물이다. 독소의 용해 부분은 ABM 의 Fab 단편에 결합시킬 수 있다. 부가적인 적합한 독소는, 예를 들어 여기에 그대로 참조로서 포함된, 미국 특허 출원 제 2002/0128448 호에 공개된 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다.

한 구현예에서, 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 본 발명의 키메라 (예를 들어, 인간화된) 당개질화된 ABM 은 리신 A 쇄에 컨쥬게이션된다. 가장 유리하게는, 리신 A 쇄는 재조합 방법을 통해 탈당화되고 제조된다. 리신 면역독소를 제조하는 유리한 방법은 여기에 참조로서 포함된, [Vitetta et al ., Science 238, 1098 (1987)] 에 기술되어 있다.

진단 목적을 위해 시험관 내에서 인간 암 세포를 죽이기 위해 사용되는 경우, 컨쥬게이트는 전형적으로 약 10 nM 의 농도로 세포 배양 배지에 첨가될 것이다. 시험관내 용도를 위한 제형 및 투여 방법은 결정적이지 않다. 일반적으로 배양물 또는 관류 배지와 친화성인 수성 제형이 사용될 것이다. 세포독성은 통상적인 기법으로 읽어 암의 존재 또는 정도를 측정한다.

상기에 기술된 바와 같이, 암을 치료하기 위한 세포독성 방사성약제는 방사성 동위원소 (예를 들어, I, Y, Pr) 를 래트 ICR62 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 갖는 키메라성, 당개질화된 ABM 에 컨쥬게이션시켜 제조할 수 있다. 여기에 사용된 용어 "세포독성 부분" 은 상기 동위원소를 포함하는 것을 의미한다.

또다른 구현예에서는, 리포좀은 세포독성 약물로 충전되어 있고, 그 리포좀은 본 발명의 ABM 으로 코팅되어 있다. 많은 EGFR 분자가 EGFR-발현 악성 세포 표면 상에 발현되기 때문에, 이러한 방법은 정확한 세포 유형에, 다량의 약물 전달을 허용한다.

상기 치료제를 항체에 컨쥬게이션시키기 위한 기법은 잘 알려져 있다 (예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and Thorpe et al ., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev ., 62:119-58 (1982) 참조).

본 발명의 ABM 을 위한 또 다른 치료 적용은, 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의한, 약물전구체를 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소로의 컨쥬게이션 또는 결합, 및 그러한 항체-효소 컨쥬게이트를 약물전구체와 함께 사용하여, 그 약물전구체를 종양 부위에서 세포독성 제제로 전환시키는 것을 포함한다 (예를 들어, Senter et al., "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-alkaline phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); and Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy," FASEB J. 4:188-193 (1990) 참조).

본 발명의 ABM 의 또다른 치료 용도는 암 환자의 골수로부터 종양 세포를 제거하기 위해, 보체의 존재 하에서 비컨쥬게이션되어, 또는 항체-약물 또는 항체-독소 컨쥬게이트의 일부로서 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법에 따라, 자가 골수가 항체로의 처리에 의해 생체외에서 제거되고, 골수가 환자에 다시 주입될 수 있다 [예를 들어, Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin . Immunol., 8(2):81-88 (1988) 참조].

추가로, 본 발명은 래트 ICR62 항체 (예를 들어, 래트 ICR62 항체의 CDR 을 함유하는 폴리펩타이드) 와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 허용하는 항체 결합 도메인을 포함하고, 추가로 독소 폴리펩타이드를 포함하는 단쇄 면역독소를 포함한다. 본 발명의 단쇄 면역독소는 인간 암종을 생체내에서 치료하기 위해 사용될 수 있다.

마찬가지로, 예컨대 림포카인 또는 온코스타틴과 같이 항-종양 활성을 가진 제 2 의 단백질 중 하나 이상의 관능활성부분에 연결된 본 발명의 ABM 의 항체-결합 영역을 하나 이상 포함하는 융합 단백질이 사용되어 생체내 인간 암종을 치료할 수 있다.

본 발명은 EGFR 을 발현하는 종양 세포를 선택적으로 살해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 면역컨쥬게이트 (예를 들어, 면역독소) 를 상기 종양 세포와 반응시키는 것을 포함한다. 이러한 종양 세포는 인간 암종의 기원일 수 있다.

추가로, 본 발명은 생체 내에서 암종 (예를 들어, 인간 암종) 을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 하나 이상의 면역컨쥬게이트 (예를 들어, 면역독소) 을 함유하는 조성물을 약학적 유효량으로 해서 개체에 투여하는 것을 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 치료적 유효량의 ABM 을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, EGFR 이 발현되는, 특히 EGFR 이 비정상 적으로 발현되는 (예를 들어, 과발현되는) 세포 증식 장애 (방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선, 피부 및 신장 암 포함) 의 향상된 치료 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, ABM 은 래트 ICR62 항체의 것과 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 당개질화된 항-EGFR 항체이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 인간화된 것이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 인간화된 항체는 결합 특이성을 유지하는데 필요한 위치 (예를 들어, SDR) 를 제외한 임의의 위치에서 치환을 포함하는 개질된 CDR 을 포함한다. 본 발명의 ABM 에 의해 치료가능한 세포 증식 장애의 예에는, 제한 없이, 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선 (부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계 (중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부, 및 비뇨생식계에 위치한 신생물이 포함된다.

유사하게는, 기타 세포 증식 장애 또한 본 발명의 ABM 으로 치료될 수 있다. 그러한 세포 증식 장애의 예에는, 상기 열거된 기관계에 위치한 신조직형성 외에도, 고감마글로불린혈증, 림프구증식 장애, 이상단백혈증, 자반증, 사코이드증, 세자리 (Sezary) 증후군, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 (Waldenstron's MacroG1obulinemia), 고체 (Gaucher's) 질환, 조직구증식증, 및 기타 세포 증식 질환이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시에 의하면, 대상체는 인간, 말, 돼지, 소, 설치류, 갯과 동물, 고양잇과 동물, 및 조류 대상체일 수 있다. 기타 온혈 동물이 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명은 추가로 인간 종양 세포의 성장 저해, 대상체 내 종양 치료, 및 대상체 내 증식 유형의 질환 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 추가로, 치료적 유효량의 본 발명의 ABM 을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, EGFR 또는 하나 이상의 EGFR 리간드의 비정상 활성화 또는 생성을 특징으로 하는, 포유류에서 비-악성 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 개체는 일반적으로 예를 들어, 그의 질환 조직에 EGFR-발현 세포를 가져서, 본 발명의 ABM 은 개체 내 세포에 결합할 수 있다.

EGFR 또는 EGFR 리간드의 비정상 활성화 또는 발현은 개체의 세포 내, 예를 들어, 개체의 병든 조직에서 발생할 수 있다. EGFR 의 비정상 활성화는 EGFR 및/또는 EGFR 리간드의 증폭, 과발현 또는 비정상적인 생성으로 인한 것일 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, EGFR (또는 EGFR 리간드) 의 비정상 생성 또는 활성화가 개체에서 발생하는지 측정하기 위해 진단 또는 예후 어세이가 수행될 수 있다. 예를 들어, EGFR 및/또는 리간드의 유전자 증폭 및/또는 과발현이 측정될 수 있다. 상기 증폭/과발현을 측정하는 다양한 어세이가 당업계에서 이용가능하고, 상기 기술된 DFIC, FISH 및 shed 항원 어세이가 포함된다. 대안적으로, 또는 추가로, TGF-α, 또는 샘플과 관련된 것과 같은 EGFR 리간드의 수준을 공지된 과정에 따라 측정할 수 있다. 상기 어세이는 테스트되는 샘플 내에서 암호화하는 단백질 및/또는 핵산을 검출할 수 있다. 한 구현예에서, 샘플 내 EGFR 리간드 수준은 면역조직화학 (IHC) 을 사용하여 측정될 수 있으며 ; 예를 들 어, [Scher 등, Clin. Cancer Research 7:545-550 (1995)] 를 참조한다. 대안적으로, 또는 추가로, 당업자는 예를 들어 FISH, 서던 블랏팅, 또는 PCR 기술을 통해, 테스트되는 샘플 내에서 EGFR - 암호화하는 핵산의 수준을 평가할 수 있다.

더욱이, EGFR 또는 EGFR 리간드 과발현 또는 증폭은 예를 들어, 검출될 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사성 아이소토프) 로 태깅한 분자 (항체와 같은 분자) 를 투여하고, 표지의 위치화를 위해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써, 생체 내 진단 어세이를 사용하여 평가될 수 있다.

대안적으로, 당업자는 치료 전에, EGFR 이종이합체, 특히 EGFR-ErbB2, EGFR -ErbB3 또는 EGFR-ErbB4 이종이합체를 환자, 예를 들어, 환자의 병든 조직에서 검출할 수 있다. 비공유 단백질-단백질 상호작용 또는 흥미있는 단백질 간의 근접성을 검출하는 다양한 방법을 사용할 수 있다. EGFR 이종이합체를 검출하는 실례의 방법은 제한 없이, 면역친화성-기재 방법, 예컨대 면역침전 ; 형광 공명 에너지 전이 (FRET) (Selvin, Nat. Struct. Biol. 7:730-34 (2000); Gadella & Jovin, J. Cell Biol. 729:1543-58 (1995); 및 Nagy 등, Cytometry 32:120-131 (1998)) ; 표준 직접 또는 간접 면역형광 기술 및 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용한, ErbB2 또는 ErbB3 와 EGFR 과의 공-위치화 ; ErbB2 또는 ErbB3 과 EGFR 과의 공-위치화 및 항체 결합을 마이크로웰 플레이트와 같은 고-출력 형태로 검출하기 위한 레이저 스캐닝 영상 (LSI) (Zuck 등, Proc. Natl. Acad. ScL USA 96: 11122-11127 (1999)) ; 또는 eTag/m 어세이 시스템 (Aclara Bio Sciences, Mountain View, Calif.; 및 U.S. Patent Application 2001/0049105, published Dec. 6, 2001) 을 포함한다.

따라서, 본 발명은 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선, 피부, 및 신장의 암과 같은 인간 악성종양을 치료하기 위한 약학적 조성물, 병용물 및 방법을 포함하는 것이 분명하다. 예를 들어, 본 발명은 약학적으로 유효량의 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 인간 악성종양의 치료에서 사용하기 위한 약학적 조성물을 포함한다.

본 발명의 ABM 조성물은 이에 한정되지는 않지만, 정맥내 투여, 복막내 투여, 경구투여, 림프액내(intralymphatic) 투여 또는 종양으로의 직접 투여를 포함하는 종래의 투여 방식을 사용해 투여될 수 있다. 정맥내 투여가 바람직하다.

본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 ABM 을 함유하는 치료학적 제형물은 감압하에 동결건조된 제형물 또는 수용액의 형태로, 임의적으로는 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 원하는 정도의 순도를 가진 항체를 혼합함으로써 저장하기 위해 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980)). 활용된 투여량 및 농도로의 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 수혈자에게 비독성이고, 하기를 포함한다: 완충용액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보호제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 미만 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및, 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN^TM, PLURONIC^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).

본 발명의 ABM 은 종양과 같이, 비정상 EGFR 또는 EGFR 리간드 활성을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 개체에 단독으로 또는 예를 들어, 화학치료제 및/또는 방사선 치료와의 병용 치료로서 투여될 수 있다. 실례의 항-EGFR 항체 제제는 [Herbst 및 Shen, 암 94(5):1593-1611] 에 기술되어 있다. 적합한 화학치료제는 시스플라틴, 독소루비신, 토포테칸, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 카르보플라틴 및 에토포시드를 포함한다.

피하 투여에 채택되는 동결건조된 제제는 WO97/04801 에서 기술된다. 상기 동결건조된 제제는 적합한 희석제와 함께 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제는 본원에서 치료될 포유류에 피하 투여될 수 있다.

또한 본원에서 제형물은 치료될 특정 지시에 필수적인 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부작용을 일으키지 않는 보완적인 활성을 가진 것을 함유할 수 있다. 예를 들면, 추가로 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인 또는 면 역억제제(예를 들면, T 세포상에 작용하는 것, 예컨대 시클로스포린 또는 T 세포에 결합하는 항체, 예컨대 LFA-1 를 결합하는 것)를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 유효량의 상기 기타 작용제는 제형물 내에 존재하는 안타고니스트의 양, 질환 또는 장애 또는 치료 유형 및 상기에서 논의되는 기타 인자에 좌우된다. 상기는 일반적으로 동일 투여량 및 이하에 사용된 바와 같은 투여 경로로 사용되거나 또는 약 1 내지 99% 의 이전까지 활용된 투여량으로 사용된다.

활성 성분은 또한 예컨대 코르아세르베이션 기술 또는 계면 중합으로써, 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각 콜로이드성 약물전달계(예컨대, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼내의 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐로 들어갈 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시된다.

서방성 제제는 제조될 수 있다. 적합한 서방성 제제의 예에는 안타고니스트를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투성 기질이 포함되며, 여기서 기질은 모양지어진 성형품, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 기질의 예에는 하기가 포함된다: 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (U.S. 특허 제 3,773,919 호), L-글루타민산 및 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해가능성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해가능성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT^TM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산.

생체내 투여에 사용될 제형물은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통해 여과함으로써 용이하게 성취된다.

본 발명의 조성물은 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함하는 각종 투약 형태일 수 있다: 액형 용액 또는 현탁물, 정제, 환약, 분말, 좌제 중합체성 마이크로캡슐 또는 마이크로소낭, 리포좀 및 주사가능한 또는 불용해성 용액. 바람직한 형태는 투여 양태 및 치료학적 적용에 좌우된다.

본 발명의 조성물은 또한 바람직하게 종래의 약학적으로 허용가능한 담체 및 당기술에 공지된 보조물, 예컨대 인간 혈청 알부민, 이온 교환제, 알루미나, 레시틴, 완충 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트 및 염 또는 전해물, 예컨대 프로타민 술페이트를 포함한다.

가장 효과적인 본 발명의 약학 조성물 용의 투여 양태 및 투약 양생법은 질환의 중증도 및 진행과정, 치료에 대한 환자의 건강 및 반응 및 치료 의사의 판단에 좌우된다. 따라서, 조성물의 투여량은 개인 환자에 맞게 적정되어야 한다. 그럼에도 불구하고 본 발명의 조성물의 유효 투여량은 일반적으로 약 0.01 내지 약 2000 mg/kg 일 것이다. 한 구현예에서, 유효량은 약 1.0 mg/kg 내지 약 15.0 mg/kg 의 범위이다. 더욱 특정 구현예에서, 투여량은 약 1.5 mg/kg 내지 약 12 mg/kg 의 범위이다. 다른 구현예에서, 투여량은 약 1.5 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg, 또는 약 4.5 mg/kg 내지 약 12 mg/kg 의 범위이다. 본 발명의 투여량은 또한, 상기 범위 내 임의의 투여량일 수 있으며, 이는 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg, 또는 15.0 mg/kg 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 기재된 분자는 이에 제한되지 않으나 하기를 포함하는 각종 투약 형태일 수 있다: 액형 용액, 또는 현탁물, 정제, 환약, 분말, 좌제, 중합체성 마이크로캡슐 또는 마이크로소낭, 리포좀, 및 주사가능한 또는 불용해성 용액. 바람직한 형태는 투여 양태 및 치료학적 적용에 좌우된다.

본 발명의 투여량은 일부 경우, 예고성 생물마커의 사용에 의해 결정될 수 있다. 예고성 생물마커는 종양 관련 유전자 또는 단백질, 또는 종양-관련 신호 경로의 세포 성분의 발현 및/또는 활성화 패턴을 결정 (즉, 관찰 및/또는 정량화) 하는데 사용되는 분자 마커이다. 종양 조직 내 표적화된 치료의 생물학적 효과 및 이러한 효과와 임상 반응과의 상호작용을 해명하는 것은 종양에서 지배적인 성장 및 생존 경로를 규명하는데 도움을 주어서, 잘 반응하는 물질의 프로파일을 구축하고, 반대로 말하면 치료에 대한 내성을 극복하게 하는 전략을 디자인하는 근본원리를 제공한다. 예를 들어, 항-EGFR 치료에 대한 생물마커는 Akt, RAS, RAF, MAPK, ERK1, ERK2, PKC, STAT3, STAT5 를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 증식 장애를 초래하는 EGFR 하위 신호 경로에 있는 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다 (Mitchell, Nature Biotech. 22: 363-364 (2004); Becker, Nature Biotech 22: 15-18 (2004); Tsao and Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)). 항-EGFR 치료에 대한 생물마커는 또한 EGFR, ErbB-2 (HER2/neu), 및 ErbB-3 (HER3) 와 같은 성장 인자 수용체를 포함할 수 있고, 항-EGFR 치료에 대한 환자의 반응의 양성 또는 음성 예고자일 수 있다. 예를 들어, 성장 인자 수용체 ErbB-3 (HER3) 을 항-EGFR 항체 ABX-EGF 에 대한 음성 예고성 생물마커로 결정하였다 (미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132097 Al).

예고성 생물마커는 면역조직화학법, 유세포분석법, 면역형광법, 캡처 및 검출 어세이, 및 역상 어세이, 및/또는 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132097 A1 에서 나타낸 어세이를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 잘 알려진 세포성 어세이에 의해 측정될 수 있다. 항-EGFR 치료의 예고성 생물마커는 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0190689 A1 에 나타낸 기술에 따라 규명될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 암과 같은 EGFR-관련 장애에 대한 예고성 생물마커의 발현 및/또는 활성화를 검출하는 하나 또는 다수의 시약을 사용한 치료 전에 인간 개체로부터 샘플을 어세이함으로써 치료가 필요한 인간 개체에 항-EGFR 치료에 대한 반응을 예고하고 ; 하나 이상의 생물마커의 발현 및/또는 활성화 패턴을 측정하고, 여기서, 패턴은 항-EGFR 치료에 대한 인간 개체의 반응을 예고하며 ; 그리고, 치료적 유효량의 본 발명의 ABM 을 포함하는 조성물을, 항-EGFR 치료에 대해 양성 반응하는 것으로 예고된 인간 개체에 투여하는 것을 포함하는, EGFR-여관 장애의 치료 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항-EGFR 치료에 양성 반응하는 것으로 예고된 인간 개체는 항-EGFR 이 EGFR-관련 장애에 대해 측정가능한 효과 (예를 들어, 종양 퇴화/축소) 를 가질 것이고, 항-EGFR 치료의 이점이 부작용 (예를 들어, 독성) 에 의해 과중되지 않을 개체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 샘플은 단일 기원 세포, 조직 또는 생검을 포함하여, 하나 이상의 세포를 포함하는, 개체, 특히 인간의 생물학적 샘플을 의미하며, 유방, 폐, 위장관로, 피부, 경부, 난소, 전립선, 신장, 뇌, 두경부, 또는 임의의 다른 생체 기관 또는 조직에서 제거한 것으로서, 스미어 (smear), 객혈, 분비물, 뇌척수액, 담즙, 혈액, 림프액, 소변 및 배설물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 ABM 을 포함하는 조성물은 양호한 의약 관행에 따른 방식으로 제형화, 조제 및 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려해야 할 요소는 특히 치료될 질환 또는 장애, 특히 치료할 포유동물, 각 환자의 임상 상태, 질환 또는 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의학 수행자에게 공지된 기타 인자가 포함된다. 투여될 치료학적 유효량의 안타고니스트는 상기 고려사항에 의해 통제받을 것이다.

일반적인 제안으로서, 투여량 당 비경구적으로 투여된 항체의 치료학적 유효량의 범위는 1일당 약 0.1 내지 20 mg/kg 의 환자 체중이고, 사용된 안타고니스트의 전형적인 초기 범위는 약 2 내지 10 mg/kg 이다. 한 구현예에서, 치료학적 유효량의 범위는 약 1.0 mg/kg 내지 약 15.0 mg/kg 이다. 더욱 특정 구현예애 서, 투여량의 범위는 약 1.5 mg/kg 내지 약 12 mg/kg 이다. 다른 구현예에서, 투여량의 범위는 약 1.5 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg, 또는 약 4.5 mg/kg 내지 약 12 mg/kg 이다. 본 발명의 투여량은 또한, 상기 범위 내 임의의 투여량일 수 있으며, 이는 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg, 또는 15.0 mg/kg 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 구현예에서, ABM 은 항체, 바람직하게는 인간화된 항체이다. 적합한 상기 비콘쥬게이션된 항체용 투여량의 범위는 예를 들면 약 20 mg/m² 내지 약 1000 mg/m² 이다. 예를 들면, 이는 환자에게 실질적으로 375 mg/m² 미만의 항체 하나 이상의 투여량으로 환자에게 투여할 수 있고, 여기서 예를 들면, 상기 투여량의 범위는 약 20 mg/m² 내지 약 250 mg/m², 예를 들면 약 50 mg/m² 내지 약 200 mg/m² 이다.

더욱이, 이는 항체 하나 이상의 초기 투여량 후에 하나 이상의 후속적인 투여량으로 투여할 수 있고, 여기서 후속적인 투여량 내 항체의 mg/m² 투여량은 초기 투여량내 항체 mg/m² 투여량을 초과한다. 예를 들면, 초기 투여량의 범위는 약 20 mg/m² 내지 약 250 mg/m² (예컨대 약 50 mg/m² 내지 약 200 mg/m² )이고, 후속적인 투여량의 범위는 약 250 mg/m² 내지 약 1000 mg/m² 일 수 있다.

그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 상기 제안된 양의 ABM 은 치료학적 측면으로 매우 신중해야 한다. 적절한 투여량을 선별하고 계획하는데 있어서 주요 요소는 상기에서 언급된 바와 같이 수득된 결과이다. 예를 들면, 비교적으로 고 투여량은 진행중이고 급발성인 질환 치료용으로 처음에 요구될 수 있다. 가장 효능있는 결과를 수득하기 위해, 질환 또는 장애에 따라 안타고니스트는 첫번째 증상, 진단, 외형 또는 질환 또는 장애의 발생에 가능한 근처 또는 질환 또는 장애의 완화 동안에 투여된다.

종양 치료에 사용되는 항-EGFR 항체의 경우, 최적 치료 결과는 일반적으로 표적 세포 상의 EGF 수용체를 완전히 포화시키기에 충분한 투여량을 사용하여 달성되었다. 포화를 달성하는데 필요한 투여량은 종양 세포 당 발현되는 EGF 수용체의 수 (상이한 종양 유형 간에 유의하게 다양할 수 있음) 에 따라 상이할 것이다. 30 nM 의 낮은 혈청 농도는 일부 종양을 치료하는데 있어서는 효과적이었으나, 한편 다른 종양에서 최적의 치료 효과를 달성하는데 있어서는 100 nM 초과의 농도가 필요할 수 있다. 주어진 종양에 대해 포화를 달성하는데 필요한 투여량은 방사성면역어세이 또는 면역침전에 의해 시험관 내에서 쉽게 결정될 수 있다.

일반적으로, 방사선과의 병용 치료에 있어서, 하나의 적합한 치료 섭생은 본 발명의 항-EGFR ABM 을, 로딩 투여량은 100 ~ 500 mg/m² 으로 하고, 이어서 지속 투여량은 100 ~ 250 mg/m² 으로 해서 매주 8 회 주사하고, 매일 2.0 Gy 의 선량에서 70.0 Gy 의 양으로 방사선을 쪼이는 것을 포함한다. 화학치료와의 병용 치료에 있어서, 하나의 적합한 치료 섭생은 본 발명의 항-EGFR ABM 을, 매주 로딩 투여량/지속 투여량을 100/100 mg/m², 400/250 mg/m², 또는 500/250 mg/m² 으로 투여하고, 3 주마다 100 mg/m² 의 투여량으로 시스플라틴을 병용 투여하는 것을 포함한다. 대안적으로, 겜시타빈 또는 이리노테칸을 시스플라틴 대신에 사용할 수 있다.

본 발명의 개질된 ABM 은 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비강내, 국소 면역억제성 치료용으로 원하는 경우에는, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단으로써 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 게다가, 안타고니스트는 맥박 주입, 예를 들면 안타고니스트의 투여량을 하락시키면서 적합하게 투여될 수 있다. 바람직하게는 투여는 주사, 가장 바람직하게는 부분적으로 투여가 단기성 또는 만성인지에 대해 따라 정맥내 주사 또는 피하 주사로써 제공된다.

기타 화합물, 예컨대 본원에서 안타고니스트와 함께 사이토카인, 세포내 독성제, 화학요법제 및/또는 면역억제제와 같은 기타 화합물을 투여할 수 있다. 조합된 투여에는 분리된 제형물 또는 단일 약제학적 제형물 및 양쪽 각각의 순서로의 연속 투여를 사용한 공동투여가 포함되며, 여기서 바람직하게는 양자(또는 모 두) 활성제가 동시에 그것의 생활성을 발휘하는 시간 기간이 있다.

치유를 달성하기 위해 요구되는 본 발명의 조성물의 투여량은 추가로 스케쥴 최적화로 감소될 수 있음이 분명하다.

본 발명의 실시에 따라, 약제학적 담체는 지질 담체일 수 있다. 지질 담체는 인지질 일 수 있다. 추가로, 지질 담체는 지방산일 수 있다. 또한 지질 담체는 세제일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 세제는 지질의 표면 장력을 변경, 일반적으로는 그것을 낮추는 임의의 물질이다.

본 발명의 한 실시예에서, 세제는 비이온성 세제일 수 있다. 비이온성 세제의 예에는 이에 한정되지는 않지만, 폴리소르베이트 80 (또한 Tween 80 또는 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트), Brij, 및 Triton (예를 들면 Triton WR-1339 및 Triton A-20)이 포함된다.

대안적으로, 세제는 이온성 세제일 수 있다. 이온성 세제의 예에는 이에 한정되지는 않지만 알킬트리메틸암모늄 브로마이드를 포함한다.

추가로, 본 발명에 따라, 지질 담체는 리포좀일 수 있다. 본 적용에서 사용된 바와 같이, "리포좀"은 본 발명의 임의 분자 또는 그의 조합물을 함유하는 소낭 결합의 임의의 막이다.

더욱 또다른 구현예에서, 본 발명은 약제로서의 용도, 특히 암의 치료 또는 예방에서의 용도, 또는 전암성 상태 또는 병변에서의 용도를 위한 본 발명의 ABM 에 관한 것이다. 암은 예를 들어, 폐암, 비소세포폐암 (NSCL), 기관지폐포암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장 암, 항문부암, 소화기암, 위암, 대장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨스 질환, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담즙암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 중추신경계 (CNS) 신생물, 척수 축 종양, 뇌간 교종, 악성 신경교종, 별아세포교종, 신경초종, 상의세포종, 수아세포종, 수막종, 편평 세포 암종, 뇌하수체 선종, 상기 암들 중 임의의 난치성 버전 포함, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 포함한다. 전암성 상태 또는 병변은 예를 들어, 구강 백반증, 광선 각화증 (일광 각화증), 결장 또는 직장의 전암성 용종, 위 상피성 이형성증, 선종성 이형성증, 유전성 비용종증 결장암 증후군 (HNPCC), 바렛 식도, 방광 이형성증, 및 전암성 자궁경부 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 상기 암은 유방암, 방광암, 두경부암, 피부암, 췌장암, 폐암, 난소암, 대장 암, 전립선암, 신장암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱 또다른 구현예는 본 발명은 또한, 암 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 ABM 의 용도이다.

또한 바람직하게는, ABM 은 약 1.0 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 의 치료적 유효량으로 사용된다.

또한 바람직하게는, ABM 은 약 1.5 mg/kg 내지 약 12 mg/kg 의 치료적 유효량으로 사용된다.

또한 바람직하게는, ABM 은 약 1.5 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg 의 치료적 유효량으로 사용된다.

또한 바람직하게는, ABM 은 약 4.5 mg/kg 내지 약 12 mg/kg 의 치료적 유효량으로 사용된다.

또한 바람직하게는, 상기 항원 결합 분자는 약 1.5 mg/kg 의 치료적 유효량으로 사용된다.

또한 가장 바람직하게는, 상기 항원 결합 분자는 약 4.5 mg/kg 의 치료적 유효량으로 사용된다.

또한 가장 바람직하게는, 상기 항원 결합 분자는 약 12 mg/kg 의 치료적 유효량으로 사용된다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 ABM 을 치료가 필요한 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유류에서 EGFR-관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서, 치료는 상기 ABM 의 혈청 농도를 약 1 및 약 500 μg/ml 으로 되게 하고, 4 주 이상 기간 동안 수행하며, 치료는 상기 포유류에서 유의한 수준의 독성을 야기하지 않는다. 다른 구현예에서, 혈청 농도는 약 1 μg/ml 초과, 약 25μg/ml 초과, 약 50 μg/ml 초과, 약 100 μg/ml 초과, 약 200 μg/ml 초과, 약 300 μg/ml 초과, 약 400 μg/ml 초과, 약 500 μg/ml 초과, 약 1 내지 약 100 μg/ml, 약 1 내지 약 200 μg/ml, 약 1 내지 약 300 μg/ml, 약 1 내지 약 400 μ g/ml, 및 약 1 내지 약 500 μg/ml 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이다. 바람직한 구현예에서, 포유류는 인간이다. 한 구현예에서, ABM 은 항체이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 당개질되고, 항체의 비-당개질된 형태와 비교해 증가된 FcgammaRIII 결합을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 EGFR 에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자 (ABM)에 관한 것으로서, 여기서, ABM 은 추가로, 면역글로불린 Fc 영역 또는 그의 절편을 포함하고, Fc 영역 또는 그의 절편은 비-당개질된 형태와 비교해 증가된 효과기 기능을 갖도록 당개질된다. 특정 구현예에서, 효과기 기능은 증가된 Fc-매개 세포성 세포독성이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 EGFR 에 특이적으로 결합하는 ABM 에 관한 것으로서, 여기서, ABM 은 추가로, 면역글로불린 Fc 영역 또는 그의 절편을 포함하고, Fc 영역 또는 그의 절편은 비-당개질된 형태와 비교해 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖도록 당개질된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 EGFR 에 특이적으로 결합하는 ABM 에 관한 것으로서, 여기서, ABM 은 치료적 유효량으로 개체에 투여된 경우, 임상적으로 유의한 수준의 독성을 야기하지 않는다. 한 구현예에서, ABM 은 추가로, 면역글로불린 Fc 영역 또는 그의 절편을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 영역 또는 그의 절편은 비-당개질된 형태와 비교해 증가된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 더욱 특정 구현예에서, 상기 효과기 기능은 증가된 Fc-매개 세포성 세포독성이다. 또다른 구현예에서, Fc 영역 또는 그의 절편은 비-당개질된 형태와 비교해 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효량은 약 1.0 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 이다. 또다른 특정 구현예에서, 치료적 유효량은 ㎖ 당 1 ㎍ 초과의 혈청 농도이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같이 ABM 을 EGFR-관련 장애의 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 EGFR-관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 EGFR-관련 장애의 치료가 필요한 포유류 개체에 EGFR 에 특이적으로 결합하는 ABM 을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 EGFR-관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서, ABM 은 치료적 유효량으로 포유류 개체에 투여된 경우 임상적으로 유의한 수준의 독성을 야기하지 않는다. 한 구현예에서, 치료적 유효량은 4 주 이상의 기간 동안 ㎖ 당 약 1 내지 약 100 ㎍ 의 혈청 ABM 농도를 제공한다. 또다른 구현예에서, 상기 방법에 사용되는 ABM 은 추가로, 면역글로불린 Fc 영역 또는 그의 절편을 포함한다. 더욱 특정 구현예에서, Fc 영역 또는 그의 절편은 비-조작된 형태와 비교해 증가된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정 구현예에서, 효과기 기능은 증가된 Fc-매개 세포성 세포독성이다. 또다른 특정 구현예에서, Fc 영역 또는 그의 절편은 비-조작된 형태와 비교해 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 바람직한 구현예에서, Fc 수용체는 FcγRIII 이다.

제조 물품

본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 기술된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 상기 제조 물품은 용기, 및 용기 상이나 또는 이와 관련한 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기에는 상태의 치료에 효과적인 조성물이 들어 있고, 멸균 이용 포트 (sterile access port) (예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개 (stopper) 를 가진 바이알일 수 있음) 가 있을 수 있다. 조성물 내 하나 이상의 활성 성분은 항-EGFR 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은, 조성물이 비-악성 질환 또는 장애와 같은 만성 상태의 치료에 사용되며, 여기서, 질환 또는 장애는 양성 초증식 질환 또는 장애과 같이, EGFR 수용체 및/또는 EGFR-리간드의 비정상 활성화 또는 생성을 포함함을 가리킨다. 더욱이, 제조 물품은 하기를 포함한다 :

(a) EGFR 에 결합하고 EGFR 을 과발현하는 세포의 성장을 억제시키는 제 1 항체를 포함하는 조성물이 함유된 제 1 용기 ; 및

(b) EGFR 에 결합하고 EGFR 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 제 2 항체를 포함하는 조성물이 함유된 제 2 용기. 본 발명의 상기 구현예에서 제조 물품은 추가로, 제 1 항체 및 제 2 항체가 상기 정의 부문에 있는 질환 또는 장애의 목록의 비-악성 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있음을 가리키는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 더욱이, 포장 삽입물은 조성물 (EGFR 에 결합하고 EGFR 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체를 포함하는 조성물) 의 사용자에게 선행한 부문에서 기술된 보조 치료 (예를 들어 화학치료제, EGFR-표적 약물, 항-혈관신생제, 면역억제제, 타이로신 키나아제 억제제, 항-호르몬성 화합물, 심장보호제 및/ 또는 사이토카인) 중 임의의 치료와 항체 치료를 병용할 것을 지시할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제조 물품은 추가로, 정균주사용수 (BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로-허용가능한 완충액을 포함하는 제 2 용기 (또는 제 3 용기) 를 포함할 수 있다. 제조 물품은 추가로, 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 시판되면서 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 포함할 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명을 더욱 자세히 설명한다. 하기의 제제 및 실시예는 당업자가 더 분명히 이해하고 본 발명을 실시할 수 있도록 제공된다. 본 발명은 그러나 실례가 되는 구현예에 의해 그 범위가 한정되지 않으며, 이는 본 발명의 단지 단일 국면의 설명으로써 의도된 것이며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본원에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 개질은 당업자에게는 상기의 설명 및 수반되는 도면으로부터 분명해질 것이다. 상기 개질은 첨가된 청구항의 범위 내에서 이르도록 의도된다.

본 출원에서 언급되는 모든 특허, 출원 및 공개물은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된다.

구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 하기 실시예에서의 특정 아미노산 잔기 위치의 번호화(numbering)은 Kabat 번호화 시스템에 부합한다. 달리 주지되지 않는 한, 본 실시예에서 기술되는 항체의 제조에 사용되는 재료 및 방법은 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 출원 제 10/981,738 호의 실시예에서 나타낸 바에 따른다.

실시예 1

재료 및 방법

고 상동성 수용체 접근

고 상동성 항체 수용체 골격 조사는, 래트 ICR62 단백질 서열을 인간 생식선 서열의 수합에 정렬시켜 가장 높은 서열 동일성을 보이면서, 기능적 수준에서 모든 정규 잔기를 보존한 인간 서열을 골라냄으로써 수행되었다. 여기서, VBase 데이터베이스의 서열 VH1 패밀리의 서열 1-e 는 중쇄 골격 수용체 서열로서 선택되었고, VBase 데이터베이스의 서열 VK1 패밀리의 서열 A30 은 경쇄에 대한 골격 수용체로 선택되었다. 이러한 2 개의 수용체 골격에, 래트 ICR62 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 3 개의 상보성 결정 영역 (CDR) 및/또는 이러한 CDR 의 특이성-결정 잔기를 이식시켰다. 골격 4 영역이 생식선 유전자의 가변 영역의 일부가 아니기 때문에, 위치 정렬이 개별적으로 수행되었다. 중쇄로는 JH6 영역이, 경쇄로는 JK2 영역이 선택되었다. 디자인된 면역글로불린 도메인의 분자 모델링은, CDR 의 밖에 인간의 아미노산 잔기 대신에 쥣과 아미노산 잔기를 잠재적으로 필요로 하는 Kabat CDR1 의 외부에 있는 하나의 위치를 밝혀내었다. 인간 골격에 쥣과 아미노산 잔기를 재도입하는 것은 소위 역돌연변이를 일으킬 것이다. 예를 들어, Kabat 위치 27 에 있는 인간 수용체 아미노산 잔기 (1-e 에 있는 글리신) 는 타이로신 잔기로 역돌연변이 되었다. 항원 결합에 대한 잔기의 중요성을 나타내기 위해, 인간화 항체 변이체는 역돌연변이를 포함하거나 또는 생략하도록 디 자인되었다. 인간화 항체 경쇄는 임의의 역돌연변이를 필요로 하지 않았다. 단백질 서열을 디자인한 후, 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 하기와 같이 합성하였다.

혼합 골격 접근

인간 수용체 골격의 결정적인 위치(양호한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지한는 데 결정적인)에 역돌연변이를 도입하는 것을 피하기 위해, 골격 영역 1 (FR1), 또는 골격 영역 1(FR1) 및 2(FR2)가 함께, 또는 골격 영역 3 (FR3) 이 공여자 잔기, 또는 본래 인간 생식선 서열에 있는 중요한 잔기 위치에서 공여자 잔기에 기능적으로 상응하는 아미노산 잔기를 이미 갖는 인간 항체 서열에 의해 대체될 수 있는지 알아보았다. 이러한 목적을 위해, 래트 ICR62 VH 서열의 VH 골격 1, 2 및 3 을 인간 생식선 서열에 개별적으로 정렬시켰다. 여기서, 가장 높은 서열 동일성은 수용체 골격을 선택하는데 사용되지 않았으나 대신 다수의 주요한 잔기의 매칭이 더 중요하게 고려되었다. 이러한 주요한 잔기는 소위 정규 잔기, 및 또한, Kabat 에 의한 CDR1 정의의 외부에 위치하는 위치 27, 28, 및 30 (Kabat 번호화) 에 있는 잔기를 포함하나, 종종 항원 결합에 관여한다. IMGT 서열 IGHV1_58 (Acc No. M29809), IGHV5_51 (Acc No. M99686), 뿐만 아니라, VH1 패밀리의 VBase 서열 1-02 가 FR1, 2, 또는 3 을 대체하는데 있어서 적합한 것으로 선택되었다. 간략하게는, IGHV1_58 은 Kabat 위치 27 내지 30 에서 약속할만한 패턴을 나타내었으나, 위치 71 에 대해서는 기준을 충족시키지 못한다. IGHV5_51 은 매칭 잔기 71 을 가지고 있어서, 그의 FR3 이 사용될 수 있었다. 그의 FR1 또한 목적하는 FR1 서열에 근접하다.

VH1 의 1-e 는 위치 27 에서 떨어진 모든 기준을 충족시켰다. 서열 1-02 는 FR1 및 FR2 영역에 대해 수용적인 것으로 생각되었으나, FR3 에서 백돌연변이를 필요로 할 것이다.

단백질 서열을 디자인한 후, 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 하기와 같이 합성하였다. 이러한 접근을 이용해, 백돌연변이는 중쇄의 구축물 대부분에서 필요하지 않았고, 그리하여, 항원 결합의 양호한 수준을 유지하였다. 혼합된 골격 구축물의 연대 및 이유는 결과 부문에서 설명된다.

항체 유전자의 합성

인간화 항체 V 영역의 아미노산 서열을 디자인 한 후, DNA 서열을 발생시켜야 했다. 개별적 골격 영역의 DNA 서열 데이터를 인간 생식선 서열의 데이터베이스 (예를 들어, IMGT 또는 VBase) 에서 찾았다. CDR 영역의 DNA 서열 정보는 래트 ICR62 항체의 공개된 서열로부터 취했다. 이러한 서열로, 전체 DNA 서열을 실질적으로 어셈블리하였다. 이러한 DNA 서열 데이타를 가지고, 침묵 돌연변이 (silent mutation) 의 도입, 내부제한효소에 대한 제한 부위 생성에 의해 진단 제한 부위를 실질적인 서열에 도입하였다. 물리적 DNA 사슬을 수득하기 위해, 유전자 합성을 수행하였다(예, Wheeler 등 1995). 이 방법에서, 올리고뉴클레오타이드를 관심유전자로부터 디자인하였는데, 일련의 올리고뉴클레오타이드는 코딩 가닥으로부터 유도되고, 다른 하나의 일련의 올리고뉴클레오타이드는 비(non)-코딩 가닥으로부터 유도된다. 각 올리고뉴클레오타이드의 3' 및 5' 말 단 (열에서 가장 처음 및 마지막을 제외) 은 항상 반대 가닥으로부터 유래된 2 개의 프라이머에 상보적인 서열을 보인다. 이러한 올리고뉴클레오타이드를 임의의 열 안정성 중합효소에 적합한 반응 완충액에 넣고, Mg² ⁺, dNTP 및 DNA 중합효소를 첨가하면, 각 올리고뉴클레오타이드가 그의 3' 말단에서부터 연장된다. 다음, 하나의 프라이머의 새로 형성된 3' 말단은 반대 가닥의 다음 프라이머에 어닐링되어, 템플레이트 의존성 DNA 사슬 신장에 적합한 조건 하에 추가로 그의 서열을 연장시킨다. 최종 생성물은 E. coli 에서의 증식을 위한 통상적인 벡터에 클로닝되었다.

항체 생성

키메라성 (즉, 전체 래트 V 영역 및 인간 C 영역) 및 인간화된 항-EGFR 경쇄 및 중쇄 발현 벡터의 구축을 위해, 인간 중쇄 및 경쇄 선도 서열 (분비를 위한) 을 상기 가변 영역 DNA 서열의 상류에 첨가하였다. 가변 영역의 하류에, 중쇄용 IgG1 의 불변 영역을 첨가하고, 표준 분자생물학 기술을 사용해 경쇄용 카파 불변 영역을 첨가하였다. MPSV 프로모터의 조절 하 및 합성 폴리A 위치의 상류에서, 생성 전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 포유류 발현 벡터 (경쇄용 1 개 및 중쇄용 1 개) 에 서브클로닝하였고, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 가지고 있었다.

칼슘 인산염-트랜스펙션 접근을 사용하여 포유류 항체 경쇄 및 중쇄 발현 벡터로 HEK293-EBNA 를 공-트랜스펙션시켜서 항체를 제조하였다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 칼슘 인산염 방법에 의해 트랜스펙션시켰다. 비 개질 항체의 제조를 위해, 세포를 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터만으로 1:1 비율로 트랜스펙션시켰다. 당개질화된 항체의 제조를 위해, 세포를 4 개의 플라스미드로 공-트랜스펙션시키고, 2 개는 항체 발현용이었는데, 하나는 융합 GnTIII 폴리펩타이드 발현용이고, 다른 하나는 만노시다제 II 발현용으로서, 각각 4:4:1:1 의 비율이었다. 10% FCS 가 보충된 DMEM 배지를 사용하여 T 플라스크에서 부착하는 단층 배양물로서 세포를 키우고, 50% 내지 80% 정도로 풍부하게 되었을 때 트랜스펙션시켰다. T75 플라스크의 트랜스펙션을 위해서, FCS 가 보충된 DMEM 배지 (최종 10% V/V) 14 ml 에 8 백만개의 세포를 트랜스펙션 전 24 시간째에 심었고, 5% CO2 분위기에서 밤새 인큐베이터에서 37℃ 에서 세포를 놔두었다. 트랜스펙션되는 각각의 T75 플라스크에 대해, 경쇄 및 중쇄 발현 벡터 간에 동등하게 분할된 47 ㎍ 총 플라스미드 벡터 DNA, 1 M CaCl2 용액 235 ㎕ 를 DNA, CaCl2 및 물의 용액과 혼합하고, 최종 부피가 469 ㎕ 가 되게 물을 첨가하였다. 상기 용액에, pH 7.05 인 469 ㎕ 의 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 용액을 첨가하고, 10 초 동안 즉시 혼합하고, 실온에서 20 초 동안 놔두었다. 상기 현탁액을 2%FCS 가 보충된 DMEM 12 ml 과 희석하고, 기존의 배지 대신에 T75 에 첨가하였다. 세포를 5% CO2, 37℃ 에서 약 17 내지 20 시간 동안 인큐베이션시키고, 배지를 12 ml DMEM, 10% FCS 로 교환하였다. 조건화된 배양 배지를 트랜스펙션 후 5 내지 7 일째에 수합하고, 1200 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하고, 이어서 4000 rpm 에서 10 분 동안 제 2 원심분리한 후 4℃ 에서 보관하였다.

분비된 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이어서 양 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, 완충액을 인산염 식염수로 교환하고 순수한 단량체성 IgG1 항체를 수합하면서 Superdex 200 칼럼 (Amersharm Pharmacia) 상에서 최종 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 항체 농도는 280 nm 에서의 흡광도로부터 분광계를 사용해 측정하였다. 항체를 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, pH 6.7의 100 mM 글리신 용액 중에 제형하였다.

인간화 항체 변이체의 당개질화된 변이체를, GnT-Ⅲ 글리코실트랜스퍼라제 발현 벡터와 함께, 또는 GnT-Ⅲ 발현 벡터 + 골지 만노시다제 Ⅱ 발현벡터와 함께, 항체 발현 벡터를 공-트랜스펙션시켜 생성하였다. 당개질화된 항체를 상기 비-당개질화된 항체에 대해 상기에 기술된 바와 같이 정제 및 제형화하였다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드를 하기와 같이 MALDI/TLF-MS로 분석하였다.

올리고사카라이드 분석

올리고사카라이드를 효소작용적으로 PNGaseF 분해로써 항체로부터 방출시키고, 이 때 상기 항체는 PVDF 막 또는 용액 내에서 고정된다.

방출된 올리고사카라이드를 함유한 생성 분해 용액을 MALDI/TOF-MS 분석용으로 직접 제조하거나 MALDI/TOF-MS 분석용 시료 제조 전의 EndoH 글리코시다아제로 추가로 분해시켰다.

PVDF 막-고정 항체용 올리고사카라이드 방출 방법

PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford Massachusetts) 막으로 만들어진 96 웰 플레이트의 웰을 100 ㎕ 의 메탄올으로 적시고 액체를 다중스크린 진공 매니폴 드(Multiscreen vacuum manifold: Millipore, Bedford, Massachusetts)에 적용된 진공을 사용하여 PVDF 막을 통해 가져왔다. PVDF 막을 3회 300 ㎕ 물로 세척했다. 웰을 이어서 50 ㎕ RCM 완충액(8M 우레아, 360mM Tris, 3.2mM EDTA, pH 8.6)으로 세척했다. 30 내지 40 ㎍ 항체를 10 ㎕ RCM 완충액을 함유하는 웰에 적재했다. 웰 내 액체를 진공을 적용시켜 막을 통해 끌어내고, 상기 막을 후속적으로 2 회 50 ㎕ RCM 완충액으로 세척했다. 디술파이드 교락의 환원을 RCM 내 50 ㎕ 의 0.1 M 디티오트레이톨을 첨가하고 1시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켜 실시했다.

환원 후에, 진공을 웰로부터 디티오트레이톨 용액을 제거하기 위해 적용시켰다. 웰을 RCM 완충물 내 50 ㎕ 0.1 M 요오도아세트산의 첨가 및 실온 어두운 곳에서 30 분간 인큐베이션시켜 시스테인 잔기를 카르복시메틸화하기 전에 3 회 300 ㎕ 물로 세척했다.

카르복시메틸화 후, 웰을 진공으로 가져오고 후속적으로 3 회 300 ㎕ 물로 세척했다. 이어서 엔도글리코시다아제의 흡수를 막기위해, 실온에서 1 시간 동안 1% 폴리비닐피롤리돈 360 수용액 100㎕ 를 인큐베이션시킴으로써 PVDF 막을 차단시켰다. 차단 시약을 이어서 일반 진공(gentle vacuum) 으로써 제거한 후 3 회 300 ㎕ 물로 세척했다.

임의의 잠재 충전된 단당류 잔기를 제거하기 위해, 2.5 mU 펩티드-N-글리코시다아제 F (재조합체 N-글리카나아제, GLYKO, Novato, CA) 및 0.1 mU 시알리다아 제(GLYKO, Novato, CA)를 첨가함으로써 20mM NaHCO₃, pH7.0, 최종 부피 25 ㎕으로 N-결합된 올리고사카라이드를 방출시켰다. 분해작용을 3 시간 동안 37℃에서 실시했다.

용액 내 항체를 위한 올리고사카라이드 방출 방법

40 내지 50 ㎍ 의 항체를 2mM Tris, pH7.0 최종부피 25 마이크로리터로 2.5 mU PNGaseF(GLYko, U. S. A.)과 혼합하고, 혼합물을 3 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.

하이브리드 양분된 올리고사카라이드 구조의 MALDI/TOF-MS 중성 올리고사카라이드 피크로 할당되기 위한 PNGaseF-방출 올리고사카라이드의 엔도글리코시다아제 H 분해 사용

PNGaseF 방출 올리고사카라이드를 후속적으로 엔도글리코시다아제 H로 분해시켰다 (EC 3.2.1.96). EndoH 분해를 위해, 15 mU 의 EndoH (Roche, 스위스)를 PNGaseF 분해물(상기 용액 방법 내 항체)로 첨가해 최종 부피 30 ㎕ 을 제공하고 혼합물을 3 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션시켰다. EndoH 는 N-결합된 올리고사카라이드의 키토바이오스(chitobiose) 중심의 N-아세틸글리코사민 잔기 사이를 절단한다. 효소는 오직 올리고만노오스 및 하이브리드 유형 글리칸을 분해할 수 있는 반면에 복합 유형 올리고사카라이드는 가수분해되지 않는다.

MALDI/TOF-MS 용 시료 제조

실온에서 추가 3시간 동안 최종 농도 150 mM 로 아세트산 첨가 후에 방출된 올리고사카라이드를 함유하는 효소작용 분해물을 인큐베이션시키고, 후속적으로 마이크로-바이오-스핀 크로마토그래프 컬럼(BioRad, 스위스)로 가득채워진 0.6 ㎖ 의 양이온 교환 수지(AG50W-X8 수지, 수소 형태, 100-200 메시, BioRad, 스위스)를 통해 통과시켜 양이온 및 단백질을 제거했다. 1 ㎕ 의 생성 시료를 스테인레스 스틸 목적 플레이트로 적용하고 플레이트 상에서 1 ㎕ 의 sDHB 매트릭스로 혼합했다. sDHB 매트릭스를 1 ㎖ 의 에탄올/10 mM 수성 나트륨 클로라이드 1:1(v/v) 내 2 mg 의 2,5-디히드록시벤조산 + 0.1 mg 의 5-메톡시살리실산을 용해함으로써 제조했다. 시료를 공기중 건조시키고 0.2 ㎕ 에탄올을 적용하고 시료를 최종적으로 공기 하에서 재결정화시켰다.

MALDI/TOF-MS

질량 스펙트럼을 수득하기 위해 사용한 MALDI-TOF 질량 분석기는 Voyager Elite(Perspective Biosystems)이었다. 이 기계는, 20 kV 의 가속 및 80 ns 의 지체(delay)와 함께 선형 배열로 조작되었다. 올리고사카라이드 표준을 사용한 외부 측정은 이온의 질량 할당(mass assignment)에 사용되었다. 200 레이저 발사로부터의 스펙트럼들을 종합하여 최종 스펙트럼을 수득하였다.

항원 결합 어세이

A431 인간 외피 세포주 상에서 인간 외피 성장 인자 수용체 (EGFR, HER-1 또는 ErbB1 이라고도 함) 에의 결합에 대해 정제된, 단량체성 인간화된 항체 변이체를 유세포 분석-기재 어세이를 사용해 테스트하였다. 180 μl FACS 완충액 (2% FCS 및 5mM EDTA 함유 PBS) 내 200,000 개의 세포 (예를 들어, 인간 A431 세포주) 를 5 ml 폴리스티렌 튜브에 옮기고, 20 μl 의 10 배 농축된 항-EGFR 항체 (일차 항체) 샘플 (1 ~ 5000 ng/ml 최종 농도) 또는 PBS 만을 첨가하였다. 샘플을 부드럽게 혼합한 후, 튜브를 암실, 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 FACS 완충액으로 2 회 세정하고, 및 300 x g 에서 30 분 동안 펠렛화시켰다. 상청액을 흡인해내고, 세포를 50 μl FACS 완충액 내에서 취하고, 및 2 μl 이차 항체 (항-Fc- 특정 F(ab')2-FITC 절편 (Jackson Immuno Research Laboratories, USA)) 를 첨가하고, 튜브를 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 FACS 완충액으로 2 회 세정하고, 유세포 분석에 의한 분석을 위해, 500 μl 의 FACS 완충액 내에서 취하였다. 항체 농도에 대한 기하 평균 형광을 플롯화하여, 결합을 측정하였다.

단량체성 IgG1 글리코변이체의 , Fc γ RIIlA -발현 CHO 세포주에의 결합

CHO 세포를 전기천공 (280 V, 950 μF, 0.4 cm) 에 의해 FcgammaRIlIA-Val158 α-쇄 및 γ-쇄를 암호화하는 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 6 μg/ml 퓨로마이신을 첨가하여 트랜스펙션물 (transfectant) 을 선별하고, 10⁶ 개의 세포에 대해 10 μl FITC-공액된-항-FcgammaRIII 3G8 모노클로날 항체 (BD Biosciences, Allschwil/Switzerland) 를 사용하여 FACS 에 의해, 안정한 클론을 분석하였다. IgG1 의, FcgammaRIIIA-Val158-발현 CHO 세포에의 결합을 확인하였다. 간략하게는, 항-FcgammaRIIIA 3G8 F(ab')2 절편 (AnCell, Bayport, MN/USA) 를 10 μg/ml 의 농도로 첨가하여, 항체 글리코변이체 (3 μg/ml) 의 결합 을 완전히 하였다. 결합된 항체 변이체를 나타내는 형광 세기를 FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil /Switzerland) 상에서 측정하였다.

ADCC 어세이

인간 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 를 효과기 세포로 사용하였고, Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) 를 사용하여, 본질적으로 제조업자의 설명에 따라 제조하였다. 간단히, 정맥혈을 지원자들로부터 헤파린화시킨 주사기로 취하였다. 혈액을 PBS(Ca++ 또는 Mg++ 미함유) 와 1 : 0.75 - 1.3 이 되도록 희석시키고, Histopaque-1077에 층으로 놓았다. 구배를 실온 (RT) 에서 400 × g 에서 30 분 동안 쉬지 않고 원심분리하였다. PBMC 를 함유하는 중간상을 수합하고, PBS (두 구배로부터 세포 당 50 ㎖) 로 세척하고, 실온에서 300 × g 에서 10 분 동안 원심분리하여 수확하였다. 펠렛을 PBS 로 재현탁시킨 후, PBMC 를 계수하고, 실온에서 200 × g 에서 10 분 동안 원심분리하여, 두 번째로 세척하였다. 다음, 후속한 과정을 위해 세포를 적절한 배지에 재현탁시켰다.

ADCC 어세이에 사용되는 효과기 대 표적의 비율은 PBMC 및 NK 세포에 대해 각각 25 : 1 및 10 : 1 이었다. 효과기 세포를 AIM-V 배지에서 적절한 농도로 제조하여, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 50 ㎕ 로 첨가하였다. 표적 세포는 10% FCS 함유 DMEM 에서 배양된 인간 EGFR 을 발현하는 세포 (예, A431, EBC-1 또는 LN229) 였다. 표적 세포를 PBS 중에서 세척, 계수하고, ㎖ 당 30 만 개로 AIM-V 에 재현탁시켜, 마이크로 웰 당 100 ㎕ 중에 30,000 개를 첨가하였다. 항체를 AIM-V 에 희석시키고, 미리-플레이트시킨 표적 세포에 50 ㎕ 로 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 방치하여 표적에 결합하도록 하였다. 다음, 효과기 세포를 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂ 함유 습한 대기 중 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션시켰다. 손상된 세포로부터 방출된 락테이트 디히드로게나제 (LDH) 를 세포독성 검출 키트 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland) 를 사용하여 측정함으로써, 표적 세포 사멸을 평가하였다. 인큐베이션 4 시간 후, 플레이트를 800×g 에서 원심분리하였다. 각 웰의 100 ㎕ 상청액을 새로운 투명한 평바닥 96 웰 플레이트에 옮겼다. 키트의 색상 기질 완충액을 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. 색 반응의 Vmax 수치를, SOFTmax PRO 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA) 를 사용하는 ELISA 리더기 내 490 nm 에서 10 분 이상 측정하였다. 계속적인 LDH 방출을 표적 및 효과기 세포만 함유하고, 항체는 없는 웰에서 측정하였다. 최대 방출을 오직 표적 세포 및 1% Triton X-100 만을 함유하는 웰에서 측정하였다. 특정 항체-매개 살해 백분율을 하기와 같이 계산하였다 : ((x-SR)/(MR-SR)*100 (여기서, x 는 특정 항체 농도에서의 Vmax 평균이고, SR은 계속적인 방출의 Vmax 의 평균이고, MR은 최대 방출의 Vmax 의 평균임).

실시예 2

결과 및 토의

항체 변이체 I-HHA, I-HHB, I-HHC, I-HLA, I-HLB, I-HLC, I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5, I-HLA6, I-HLA7, I-HLA8, I-HLA-9, I-HHD, I-HHE, I-HHF, 및 I-HHG 의 인간 EGF-수용체에의 결합을 비교하는 것은 키메라성 ICR62 경쇄 또는 인간화된 ICR62 경쇄 (I-KA, I-KB, 또는 I-KC) 와 복합체를 이룬 항체 및 모, 키메라성 항체 ch-ICR62 는 모든 항체가 하나의 로그 단위 내에서 유사한 EC50 값을 가짐을 보여준다. 단지 I-HHA 는 크게 감소된 결합 활성을 나타낸다 (도 2 참조). 도 1 은 인간화된 구축물 I-HHC 및 I-KB 와 각각 병용했을 때, 개별 키메라성 ICR62 (ch-ICR62) 폴리펩타이드 사슬의 기능성 활성을 보여준다. 상기 실험에서, ch-ICR62 의 경쇄, 중쇄 또는 두 가지 사슬 모두를 동시에 상기 언급된 인간화된 구축물로 대체하였다. 이는, VH/VL 경계 제제가 인간화된 구축물에서 뿐만 아니라 쥣과 항체에서도 마찬가지로 작동함을 보여준다.

도 2 에 나타낸 바와 같이, 인간화된 중쇄 I-HHA 는 I-KA, 또는 I-KB 경쇄와의 결합 활성을 복구할 수 없었다. I-HLA 가 I-KA, 및 I-KB 둘 다와의 결합을 보여주었기 때문에, 본 발명자들은 I-HHA 의 중쇄가 항원 결합에서 기능적이지 않다고 결론내렸다. 도 1 및 2 와 함께 도 3 은 경쇄 구축물 I-KA, I-KB, 및 I-KC 는 설치류 대응물과 구분불가능한 결합 거동을 나타낸다. 변이체 I-KC 는 임의의 백돌연변이를 가지지 않고, 추가로 그의 부분적으로 인간화된 CDR1 을 가지며, 그리하여, 잔기 24 ~ 29 는 인간 수용자 서열 (전술한 바와 같이, VK1 의 A30) 로부터 유래될 수 있다.

연속물 I-HHA, I-HHB, 및 I-HHC 에서, 단지 I-HHB, 및 I-HHC 인 2 개의 변이체만이 만족할 만한 결합 거동을 보여주었다 (도 2 및 3). I-HHA 의 서열을 분석한 결과, 상기 거동을 맡는 3 개의 능력 아미노산 잔기가 드러났다 : Lys33, His35, 및 Tyr50. Lys33 이 타이로신에 의해 대체된 구축물은 양호한 결합을 나타내었고, 이는 Tyr50 이 트립토판에 의해 대체된 구축물에서도 마찬가지였다. 단지 이들 2 개의 잔기를 알라닌 및 글리신으로 각각 대체하였을 때만 결합이 상실되었다. I-HHC 는 I-HHB 보다 더 양호한 결합을 나타내지 않았기 때문에, 본 발명자들은 잔기 Asn60, G1uβ1, Lys64, 및 Ser65 가 쥣과 기원의 것일 필요는 없거나 ; 또는 이들을 각각 Ala, GIn, GIn, 및 GIy 으로 대체할 수 있을 것으로 결론내렸다. 상기 과정은 CDR2 가 더욱 인간화된 구축물을 생성하는데, 그 이유는 "아미노산 위치 60 내지 65 가 Kabat CDR 정의의 일부" 이나, 상기 항체에 대한 쥣과 공여자 잔기를 이식할 필요는 없기 때문이다.

도 4 및 5 는 연속물 I-HLA1, 1-HLA2, 1-HLA3, 1-HLA4, I-HLA5, 및 I-HLA6 의 구축물을 비교한다. 대략 300 ng/ml 의 EC50 을 가진 구축물 ch-ICR62, I-HLA1, 및 IHLA2 에서 최상의 결합 거동을 관찰하였다. 다른 구축물은 상기 값이 2 만큼 증가되었고, 따라서 약간 감소된 결합 활성을 가졌다. 상기 데이타로부터 얻어낸 첫번째 결론은, Kabat CDR1 내에서, Lys33Tyr 및 Ile34Met 치환이 관용적이라는 것이었다. 이들 2 개의 위치는 CDR1 의 Kabat 정의 내에 그러나, Chothia CDR 경계 (서열 분석보다 구조 분석에 기반을 두었음) 의 외부에 위치하고 있다. CDR1 의 뒷부분에서는, 적어도 일부 혼잡이 허용된다.

두번째 결론은, CDR2 내에서 잔기 Asn60 및 Glu61 를 비-공여자 잔기로 대체하는 상기 언급된 대체 외에도, Kabat CDR 내 Asn60Ser, Glu61Pro, 및 Lys62Ser 을 비-공여자 치환하는 것 또한 허용되었다. 이들 잔기는 FR3 수용자 서열로 사용 되었던 인간 생식선 IGHV5-51 수용자 서열로부터 유래된 것이었다. 구축물 I-HLA3 및 I-HLA4 는 Phe27Tyr 후 돌연변이의 제거에 의해서만 I-HLA1 및 I-HLA2 와 상이하였고, I-HLA3 및 I-HLA4 구축물 둘 다 그의 모 구축물과 비교해 친화성을 상실하였다. 따라서, I-HLA1, 1-HLA2, 1-HLA3, 1-HLA4, 1-HLA5, 및 I-HLA6 의 비교의 세번째 결과는, CDR1 의 루프 구조를 개질함으로써 직접 또는 간접적으로, 항원 결합에서 Phe27 의 포함이다.

변이체 I-HLA5 및 I-HLA6 은 각각 I-HLA1 및 I-HLA2 의 FR1 이 본래 존재하는 Phe27 이 있는 또다른 생식선 수용자 서열로 대체되었다 (즉, IGHV1-58). 이는, Val2Met, Ala9Pfo, 및 Ala16Thr 인 여러 다른 돌연변이를 동시에 도입함으로써 수행될 수 있었다. 그렇게 함으로써, Phe27 을 (재)도입한 유리한 효과를 다시 없앴다.

I-HLA6 구축물의 중쇄 CDR1 및 CDR2 내 추가의 공여자 잔기의 복구는 ICR62 와 비교해 전체 결합 활성을 복구할 것인지 결정하기 위해 I-HLA7 구축물을 평가하였다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, 이는 그 경우가 아니었다.

도 7 및 8 에 나타낸 바와 같이, 2 개의 추가 구축물인 I-HLA8 및 I-HLA9 를 테스트하여, ch-ICR62 와 비교해 전체 결합 활성이 달성될 수 있는지 결정하였다. I-HHB 구축물에서 시작해서, FR1 영역을, Chothia CDR1 영역 내 최대 상동성을 가진 FR1 영역으로 대체하였다. I-HLA8 구축물은 IGHV1-58 서열의 FR1 을 가지고, 및 1-HLA9 는 IGHV5-51 FR1 영역을 가진다. 항원에 결합된 2 개의 구축물은 적어도 ch-ICR62 항체만큼이었다. I-HLA8 구축물은 사실상 2 만큼 낮아진 EC50 을 가지고 있으며 더 양호할 수 있다. I-HLA8 구축물은 I-HLA5 및 I-HLA6 구축물과 동일한 FR1 서열을 가지고 있어서, 동일한 비-공여자 잔기 (즉, Val2Met, Ala9Pro, 및 Ala16Thr) 를 가지고 있고, 이는 이들 비-공여자 잔기의 존재가 결합에 있어서 부정적인 영향을 미치지 못함을 제시한다. I-HLA5 및 6 에서 발생하는 비-유리한 돌연변이는 VH5 FR3 과 쌍을 이룬 VH1 FR1 의 조합으로 인한 것이고, 이는 동일한 VH 패밀리의 FR1 및 FR3 을 가짐으로써 보상될 수 있었다.

도 8 에는 CDR 내 비-공여자 잔기를 함유하는 구축물이 있다. 따라서, 이들 구축물은 CDR 내에 추가로 인간화가 되어 있는데, 그 이유는 비-공여자 잔기가 이들 구축물에 대해 선택되었던 인간 골격 영역 내에서 발생하기 때문이다. I-HHE (His35Ser), I-HHF (Thr58Asn) 및 I-HHG (Ser57Ala) 구축물은 모두 인간화된 CDR1 또는 CDR2 내에 하나의 잔기를 갖고 있다 (I-HHB 구축물과 비교해). 구축물 I-HHD (GLY24Ala) 를 또한 어세이하였다. I-HHF 는 Thr58 의 중요성을 가리키는 감소된 결합을 나타내었다. Kabat CDR 잔기 58 과는 달리, 아미노산 57 은 치환에 대해 더욱 내성인데, 그 이유는 Ser57Ala 돌연변이가 결합에 있어서 아무런 영향을 가지고 있지 않기 때문이다 (도 8).

IGHV5-51 의 FR3 영역은 I-HLA1 및 2 구축물에서 약속할 만한 특성을 나타내었고, 동일한 생식선 서열의 FR1 은 I-HLA9 구축물에서 유용한 것으로 판명되었기 때문에, IGHV5-51 의 FR1, FR2, 및 FR3 은 루프 그래프팅에 대한 수용자로서 함께 사용될 것으로 지정되었다.

인간화된 ICR62 구축물에서 규범적인 잔기의 분석 요약 :

VL: Kabat 위치 2: Ile 가 아마도 필요함.

Kabat 위치 71 : Ile 또는 Phe 이 허용됨.

VH: Pos. 24, Gly, Thr, Ala, Val, Ser 이 허용됨.

Pos. 26, Gly 이 허용됨.

Pos. 29, Phe, Ile, Leu, Val, Ser 이 허용됨.

Pos. 34, Ile, Met, Leu, Val, Trp, Tyr, Thr 이 허용됨.

Pos. 71, Ala, Leu, Val, Thr 이 허용됨.

Pos 94, Arg, Gly, Asn, Lys, Ser, His, Thr, Ala 이 허용됨.

ADCC 실험 결과

도 9 는 키메라성 ICR62 항체의 다양한 글리코형태에 대해서, 뿐만 아니라, 인간화된 변이체 I-HLA4 에 대해서 나타나 있는 항체 매개 세포성 세포독성 (ADCC) 의 비교를 보여준다. 상이한 글리코형태는 비-당개질된 (WT), 글리코형태 1 (G1), 또는 글리코형태 2 (G2) 를 가리키는 표지에 의해 마킹된다. "G1" 은 GnTIII 와의 공동발현에 의해 항체를 당개질하는 것을 말한다. "G2" 는 GnTIII 및 ManII 를 사용한 공동발현에 의해 항체를 당개질하는 것을 말한다. "WT" 는 당개질되지 않은 항체를 말한다. 인간화된 구축물 모두에 대한 경쇄는 I-KC 변이체이고, 명시적으로 표지되지 않았다.

키메라성, 뿐만 아니라 인간화된 항체는 2 개의 상이한 당개질 시도에 의해 그의 능력 및 효능이 향상되었다. ch-ICR62 구축물은 야생형 또는 글리코형태 각각에 대한 I-HLA4 보다 약간 더 양호하게 거동하였다. 도 4 에서 나타낸 바 와 같이, 그의 항원에 대한 2 개의 항체의 친화성을 비교하였을 때, ch-ICR62 는 2 배 더 낮은 EC50 값을 가졌다. 이러한 친화성에서의 차이는 효능의 차이를 반영한다.

도 10 은 인간화된 ICR62 항체 구축물 I-HHB 및 1-HLA7 의 비-당개질된 ("야생형") 및 G2 글리코형태에 대한 항체 매개 세포성 세포독성 (ADCC) 을 비교한 것을 보여준다. 동일한 항체를 2 개의 상이한 표적 세포주에 적용하였다. 도 10 의 패널 A 에서, 표적 세포주 LN229 를 사용하였고 ; 도 10 의 패널 B 에서, 세포주 A431 을 사용하였다. A431 세포는 LN229 세포보다 항체 매개 세포 살해에 대해 더욱 분명히 수용적이었다. 더욱 중요하게는, 당개질은 2 가지 항체 모두의 능력을 향상시켰다. 이러한 효과는 I-HHB 보다 I-HLA7 에 대해 더욱 분명한 것으로 보였다. I-HHB 에 대한 최대 항체 농도에서의 세포 살해 % 는 G2 당개질된 변이체를 도입함으로써, LN229 표적 세포주를 사용하였을 때 -30% 에서 -40% 로 이동할 수 있었다. A431 세포주를 사용하였을 때, 이 값은 확실히 변하지 않았다. 이러한 거동은 I-HLA7 항체에 대해서는 완전히 상이하였다. 최대 항체 농도에서의 표적 세포 살해는 G2 당개질 변이체를 도입함으로써, LN229 세포에 대해서는 약 10% 에서 약 50% 로 이동하였고, A431 세포에 대해서는 약 40% 에서 약 70% 로 이동하였다. 이러한 경우, 1-HHB3 과 비교해 I-HLA7 에 대해 비 당개질된 항체에서 더 낮은 활성을 가짐에도 불구하고, 활성 순위는 당개질된 항체에서 역전되었다. 도 11 및 12 는 또한, 키메라성 ICR62 의 비-당개질된 형태 (WT) 및 G2 글리코형태 및 인간화된 ICR62 항체 구축물 1-HHB 및 I-HLA7 의 비교를 보여준다.

실시예 3

필리핀 원숭이에의 정맥내 ( 볼루스 ( Bolus )) 투여에 의한 예비 독성 연구 -- 생물분석적 분석

도입

글리코 -조작된 항- EGFR 어세이

본 생물분석적 분석은 하기 프로토콜에서 기술된 바와 같이, 필리핀 원숭이로부터 기원한 샘플 내에서 항-EGFR 을 측정하고, 이어서 항-EGFR (상기 기술된 바와 같이 중쇄 I-HHB 및 경쇄 I-KC 유전자를 갖는 항체 발현 벡터와 함께, 배양물 내에서 트랜스펙션된 포유류 세포로부터 생성되고 상기 기술된 바와 같이 정제된 재조합, 당개질된 항-EGFR 항체) 을 정맥내 (볼루스) 투여하는 것을 기술한다. 총 78 마리의 원숭이 혈청 샘플을 사용 전까지 약 -20℃ 에서 냉동 보관하였다.

항-EGFR 의 혈청 농도 측정을 위한 ELISA 방법에 사용된 항-EGFR 의 측정에 사용되는 생물분석적 방법을 사용하였다. 허용가능한 범주는 정확성 및 부정확성에 대해 ±20% (±25% low QC) 에서 세팅하였다.

재료 및 방법

목적 : 본 연구의 목적은 필리핀 원숭이에 글리코-mAb (항-EGFR) 정맥내 (볼루스) 투여하고, 8-주 회복 기간에서, 전신성 독성 능력 평가였다.

[표 8]

동물 모델	필리핀 원숭이
영장류 사용에 대한 정의	영장류는 선택되는 비-쥣과 종이었는데, 그 이유는 그것만이 2 가지 파라미터를 보존하기 때문임 : 테스트 항원에 의한 EGFR 항원 인자, 및 면역계 Fc 수용체에 의한 테스트 항체 Fc 영역 인지.
경로	정맥내 (볼루스), 임상 투여의 조건을 시뮬레이션하기 위함.

[표 9]

처리군 및 투여량
군	1	2	3
화합물	-----------------글리코-mAb(항-EGFR)-----------------
투여량 (mg/kg/일)	1.5	4.5	12

투여량 수준 선별 원칙

1.5 ~ 7.5 mg/kg 이 인간 연구에 있어서 기대되는 범위이다 (7.5 mg/kg 은 인간에서 유사한 화합물에 대한 상응하는 투여량임).

[표 10]

처리군의 규명
군	처리	투여량 (mg/kg/일)	동물 수		동물 ID 번호
군	처리	투여량 (mg/kg/일)	수컷	암컷	수컷	암컷
1	글리코-mAb (항-EGFR)	1.5	1	1	623	590
2	글리코-mAb (항-EGFR)	4.5	1	1	461	462
3	글리코-mAb (항-EGFR)	12	1	1	463	612
# 은 적용되는 테스트 성분으로서 표현됨.

[표 11]

동물
종	필리핀 원숭이 (사육용)
수여받는 연령	대략 15 개월
주문되는 체중 범위	1.5 내지 2.5 kg

[표 12]

항-EGFR 투여
경로	정맥 내 투여
투여 시점	mg/kg/회로 일정한 투여량
투여량 부피	가장 빈번하게 기록되는 체중을 바탕으로, 우선 계산
개개별 투여량 부피	1 mg/kg/일
빈도	사육 전 즉시, 제 1 일, 제 8 일, 제 15 일 및 제 22 일
순서	군별로
투여량 부위	좌측 정맥 사용
주사	볼루스, 동물 당 새 멸균 일회용 바늘
제제	제제의 사용 기록은 체중을 바탕으로 유지되었음. 이러한 균형은 올바른 투여의 체크로서 예상되는 사용량과 비교됨.

[표 13]

임상 관찰
케이지 트레이 및 동물	치료 또는 질환 상태에 대한 반응의 증거에 대해 매일 적어도 2 회 시각적으로 조사하였음.
시점에서 기록된 정상과의 편차	자연스러움 및 심각함. 시작 날짜 및 시간. 관찰되는 조건의 기간 및 경과
물리적 실험	모든 동물에 대해 매주 1 회만
케이지 트레이의 매일 기록	구토, 혈액, 설사 등에 대해

[표 14]

투여 빈도
빈도	1. 즉시 투여전 2. 투여 완료 후 1/2 내지 2 시간째 3. 실험 일에서 가능한 한 늦게
주사 부위	매일

[표 15]

독성약물학
일	동물	투여 후 샘플 시간
1	모든 동물	1, 4, 12, 24, 72, 120
8	모든 동물	투여전, 투여후 1 시간 (제 1 일 투여 후 169 시간)
15	모든 동물	투여전, 투여후 1 시간 (제 1 일 투여 후 337 시간)
22	모든 동물	투여전, 투여후 1 시간 (제 1 일 투여 후 505 시간)
29	모든 동물	제 1 일 투여 후 672 시간

[표 16]

샘플
샘플 부위	적합한 정맥
항응고제/샘플 부피	0.7 ml 당 항응고제 없음
취득한 샘플 총 수	104
혈청 분리	달리 언급되지 않는 한 주위 온도에서 원심분리에 의해 가능한 한 최소 0.3 ml 을 제공
혈청 보관	대략 표지된 플라스틱 튜브. 생물분석 대기 동안 깊게 냉동 보관 (대략 -20℃ 에서)

조직학

[표 17]

조직 고정
표준	10% 중성 완충 포르말린
기타	전립선 및 부고환 : Boulin's 유체에서 시작 눈 : Davidson's 유체에서 시작

[표 18]

조직학
처리	모든 동물
일반 염색	헤마톡실린 및 에오신으로 4 ~ 5 ㎛ 섹션 염색

면역어세이 과정

11495 μl 중탄산염 완충액 (0.05M, pH9.6) 에 첨가된 코팅액 (5 μl 양 항-인간 IgG (원숭이 흡착 IgG, 결합 부위, UK) 으로 웰 당 100 μl 으로 플레이트를 코팅하고, 실온에서 대략 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세정액 (PBS (Sigma Chemical Co., UK) 0.01% (v/v) Triton- XlOO (Sigma Chemical Co., UK)) 으로 웰 당 400 μl 으로 3 회 세정하고, 두드려서 건조시켰다.

어세이 완충액 (1% w/v BSA, Sigma Chemical Co., UK) 을 웰 당 200 μl 에서 첨가하고, 실온에서 대략 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세정액으로 웰 당 400 μl 으로 3 회 세정하고, 두드려서 건조시켰다.

보정 표준, 품질 대조군 (QC) 및/또는 샘플을 웰 당 100 μl 으로 첨가하고, 실온에서 대략 2 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 세정액으로 웰 당 400 μl 으로 3 회 세정하고, 두드려서 건조시켰다.

컨쥬게이트 용액 (6 μl 염소 항-인간 IgG kappa-HRP 컨쥬게이트 (Bethyl Laboratories Inc., USA) 를 12 ml 어세이 완충액에 첨가) 을 웰 당 100 μl 으로 첨가하고, 실온에서 대략 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세정액으로 웰 당 400 μl 으로 3 회 세정하고, 두드려서 건조시켰다.

트리메틸벤지딘 (TMB; Europa Bioproducts, Ely, UK) 을 웰 당 100 μl 으로 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 실온에서 대략 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 100 μl 의 정지액 (0.5M HCl, Fisher, UK) 을 각 웰에 첨가하였다. 흡광도를 DYNATECH MRX 마이크로플레이트 판독기 (Mettler Instruments, UK) 상, 450 nm (reference filter 630 nm) 에서 판독하였다.

결과 및 토의

테스트 샘플 분석

본원 상기에서 기술된 프로토콜에 따라 생성된 78 마리 원숭이 혈청 샘플에서 면역어세이 방법 (ELISA) 을 사용해, 항-EGFR 의 농도를 측정하였다. 이들 결과를 하기 표 19 ~ 21 에 나타내었다.

[표 19]

1.5 mg/kg 항-EGFR 의 정맥 내 투여 후 1, 8, 15 및 22 일째 원숭이 혈청 내 항-EGFR 의 혈청 농도 (μg/ml)

[표 20]

5.0 mg/kg 항-EGFR 의 정맥 내 투여 후 1, 8, 15 및 22 일째 원숭이 혈청 내 항-EGFR 의 혈청 농도 (μg/ml)

[표 21]

15 mg/kg 항-EGFR 의 정맥 내 투여 후 1, 8, 15 및 22 일째 원숭이 혈청 내 항-EGFR 의 혈청 농도 (μg/ml)

sd : 표준 편차

실시예 4

필리핀 원숭이에의 정맥내 ( 볼루스 ) 투여에 의한 예비 독성 연구 -- 약물독성학

요약

3 개의 필리핀 원숭이 군 (1 군 당 1 마리는 수컷이고, 1 마리는 암컷임) 에 28-일 독성 연구의 제 1, 8, 15 및 22 일에 항-EGFR 을 정맥내 볼루스 투여하여, 동물을 항-EGFR 에 전신 노출시킨 것을 평가하였다. 제 1 투여 후 672 시간 이하까지 수합한 샘플 내 항-EGFR 의 혈청 농도를 면역어세이 방법애 의해 측정하였다. 혈청 농도-시간 데이타의 약물동력학적 분석은 하기 약물동력학적 파라미터에서 나타났다 :

[표 22]

혈청 항-EGFR 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC168) 및 투여량 수준 간의 관계를 하기에 나타내었다 :

[표 23]

AUC168 을 특징으로 하는 항-EGFR 에 대한 원숭이의 전신 노출 비율 및 범위는 1.5 내지 4.5 mg/kg/회의 투여량 범위에 걸쳐서 투여량을 증가시킴에 따라 대략 비례해서 증가하였으나, 비례 투여량 초과는 제 1 일째의 투여량 범위 4.5 내지 12 mg/kg/회에 걸쳐서 증가한다. 최고 투여량 (12 mg/kg/회) 에서, AUC168 은 선형 관계식에 의해 예상되는 것보다 약 2.8 배 더 높았다.

항-EGFR 에 대한 암컷 원숭이의 전신 노출 범위 (AUC168) 는 수컷 원숭이와 일반적으로 유사하엿다.

반복된 정맥내 투여 후, 항-EGFR 의 투여전 혈청 농도는 단일 투여 후의 값 보다 일반적으로 더 높았고, 연구 기간을 통틀어서 혈청 내 항-EGFR 의 축적을 가리켰다.

말기 반감기는 모든 동물에 대해서 적합하게 평가될 수 없었으나, 측정 범위가 32.5 내지 63.1 시간이었고, 수컷 동물에서 투여량에 따라 증가한 것으로 나타났다. 항-EGFR 의 총 혈청 소거는 1.5 - 4.5 mg/kg/회의 범위에 걸친 투여량에 독립적인 것으로 보였으나, 수컷 및 암컷 원숭이에서 최고 투여량 수준에서 감소되었다.

결론적으로, 필리핀 원숭이를 항-EGFR 에 전신 노출시킨 범위는 정맥내 독성 연구 제 1 일째에 1.5 내지 12 mg/kg/회의 투여량 범위에 걸쳐서, 비-선형 (투여량-의존성) 약동학을 특징으로 하는 것으로 보였다. 항-EGFR 의 투여량을 4.5 mg/kg/회 초과로 증가시키면, 선형 관계식에서 예상되는 것보다 더 높은 전신 노출을 초래하는 경향이 있고, 이는 항-EGFR 의 제거에 대한 용량 제한적 과정의 가능성과 일치한다.

또한, 본 연구는 또한, 일반적으로, 수컷 및 암컷 원숭이의 항-EGFR 에 대한 전신 노출에 있어서 차이가 없었으며, 반복된 정맥 내 투여 후 축적된 증거를 제공하였다.

도입

예비 독성 연구 제 1, 8, 15 및 22 일에 1.5, 4.5 및 12 mg/kg/회의 투여량 수준에서, 1 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷 필리핀 원숭이로 이루어진 3 개의 군에 항-EGFR 을 정맥내 볼루스 주사하였다. 제 1 일의 투여 후 하기 시점에서 혈액 샘플을 각 동물에서 취하였다 : 투여 후 1, 4, 12, 24, 72 및 120 시간. 또한, 샘플을 투여 전에, 그리고 제 1 일의 제 1 투여 후 8, 15 및 22 일째, 그리고 672 시간째에 취하였다. 면역어세이 방법에 의해 항-EGFR 의 혈청 농도를 분석하기 전에, 분리된 혈청을 약 -20℃ 에서 냉동보관하였다.

약어

AUC 한정된 시간에 따른 혈청 농도-시간 곡선 하 면적

AUC168 168-시간 투여 간격 동안 혈청 농도-시간 곡선 하 면적

BLQ 정량화 한계 하

ca 대략

CL 총 혈청 소거

Cmax 최대 혈청 농도

F 암컷

k 말단 속도 상수

M 수컷

ty2 말단 반감기

Tmax Cmax 가 발생한 시간

Vss 꾸준한 상태에 있는 분포 부피

연구에 사용된 항체

글리코-mAb (항-EGFR), 증가된 Fc-FcgammaRlII 수용체 결합 친화성 및 증가된 ADCC 를 위해 Fc-조작된 항-EGFR 항체를 제조하고, 정제하고, 상기 기술된 바와 같이 특징화하였다. 간략하게는, I-HHB 항체 중쇄, I-KC 항체 경쇄, GnT-III 및 ManII 의 발현을 위한 플라스미드 DNA 벡터로 HEK-293-EBNA 세포를 공동트랜스펙션시켜 항체를 제조하였다. 상기 기술된 선형 규모-업 버전의 트랜스펙션 방법을 이용하였고, T-플라스크 대신 롤러 병에서 배양된 세포 단일층을 트랜스펙션시켰다. Q-세파로스 매트릭스를 사용하는 추가의 유류 (flow-through) 음이온-교환 크로마토그래피 단계는 상기 기술된 크기 배제 크로마토그래피 단계 바로 직전의 정제 과정에 포함되었다.

효소분해적 방출 Fc-유래 올리고사카라이드의 MALDI/TOF-MS 스펙트럼을 사용하여 상기 기술된 바와 같이, Fc-조작된 항체의 당화 패턴을 분석하였다. 올리고사카라이드 프로파일을 도 23 에 나타내었다.

인간 EGFR 및 원숭이 EGFR 에의 결합을 각각 A431 및 COS-7 세포를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 전체-세포 결합에 의해 그리고 및 FACS-기재 분석에 의해 평가하였다. 결합 커브를 각각 도 24 및 25 에 나타내었다.

적용된 Fc 조작의 결과 증가된 FcgammaRIII 수용체 결합은 인간 FcgammaRIII 의 표면 발현에 대해 조작된 CHO 세포에의 전체 세포 결합 및 FACS-기재 분석을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 나타내었다. 결과를 도 26 에 나타내었다. 추가로, 조작된 항체는 어디에서나 기술된 "글리코-2" 항체 (Fc-올리고사카라이드 상 75% 가 비푸코실화된 유형임) 에 상응하는 정도의 Fc-조작화를 나타내었다 (Ferrara, C. 등, J Biol Chem. 2005 Dec 5; [E-publication ahead of print]). 상기 Fc-조작된 항체는 표준 비-Fc 조작된 항체 (인간 수용체의 158V 및 158F 다 형성 변이체에 대해 각각 15 및 150 nM 의 평형 해리 상수 대 (vs) 동일한 수용체 변이체에 대한 750 및 5000 nM, 비-Fc 조작된 인간 IgG1 항체에의 결합 시) 에 비해 인간 FcgammaRIII 에 대해 50-배 이하 증가된 결합 친화성을 가진다.

ADCC 를 2 개의 표적 세포주 : A549 인간 폐 암종 세포 및 CYNOM-K1 필리핀 원숭이 케라틴세포 세포를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 측정하였다. 결과를 각각 도 27 및 28 에 나타내었다.

데이타 처리

약물동력학적 파라미터를 컴퓨터 프로그램 WinNonlin Pro version 3.3 (Pharsight Corporation, USA) 을 사용하여 처리하였다.

본 연구의 일부분으로서 제공된 모든 혈청 농도는 4 개의 유의한 도 또는 3 개의 십진법 자리에 보고되었다. 약물동력학적 파라미터를 하기와 같이 기록하였다 : Cmax, AUC168 CL 및 Vss 내지 4 개의 유의한 도; k 내지 4 십진법 자리 (decimal places) ; t/2 내지 1 십진법 자리.

BLQ (< 0.195 μg/mL) 이었던 값을 약물동력학적 처리에서 0 으로서 삽입하였다.

약물독성학

항-EGFR 의 최대 혈청 농도 (Cmax) 및 그의 발생 시간 (Tmax) 은 관찰값이었다. 168-시간 투여량 간격 내의 혈청 항-EGFR 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC168) 을 선형 사다리꼴 적분에 의해 평가하였다. AUC168 값 계산 시, 0 시간째의 혈청 항-EGFR 농도를, 처음 2 개의 샘플링 시간을 바탕으로 한, 로그-선형 회귀 분석을 사용한 역외삽법에 의해 평가하였으나, 만약 혈청 농도가 상기 기간 동안 감소되지 않았다면, 0 시간째의 혈청 농도를 첫번째 샘플링 농도에서의 농도에 상응하는 것으로 생각하였다. 한정된 시간 내 혈청 항-EGFR 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC) 을 하기 표현에 의해 평가하였다 :

(여기서, Clast 는 마지막 정량화가능한 샘플 포인트에서의 예정된 혈청 농도이고, k 는 말단 속도 상수임).

말단 속도 상수 (k) 를 시간에 대한 농도의 선형 회귀 로그를 맞춤으로써 평가한다. 안정할만하게 허용되는 k 값에 대해서는, 하기 범주를 부과하였다 :

1. 말단 데이타 포이트는 단일 직선에 대해 무작위로 분포되었다 (시각적 조사 시).

2. 최소 3 개의 데이타 포인트가 회귀에 이용가능하였음.

3. 회귀 계수는 ≥ 0.95 이었고, 계수된 분산 분수는 ≥ 0.90 이었음.

4. 회귀에 선택된 데이타 포인트를 포함하여 간격은 그 자체 반감기보다 적어도 2-배 더 컸음.

말단 반감기 (t/2) 를 ln2/k 로서 계산하였다. 총 혈청 소거 (CL) 를 투여량/AUC 로서 계산하였다. 꾸준한 상태의 분포 부피 (Vss) 를 투여량.AUMC/AUC2 로서 계산하였다. 축적 (R) 을 최초 투여 (제 1 일) 후 최저 농도에 대한 마지막 투여 (제 22 일) 후 최저 농도의 비율로서, 즉, 672 시간째 혈청 농도/168 시간째 혈청 농도 (제 8 일에 전-투여) 로서 평가하였다.

결과 및 토의

연구의 제 1, 8, 15 및 22 일째에 1.5, 4.5 및 12 mg/kg/회의 투여량 수준에서 항-EGFR 을 정맥내 볼루스 투여한 후, 항-EGFR 에의 수컷 및 암컷 원숭이의 전신 노출을 평가하기 위한 독성 연구 동안에, 제 1 일 투여 후 120 시간 이하에 ; 제 1 일 투여 후 제 8, 15 및 22 일 및 672 시간째에 전-투여 및 1 시간 후-투여 시에 혈액 샘플을 취하였다. 168 시간 이하의 후-투여에 취한 샘플 내 항-EGFR 의 혈청 농도를 표 27 ~ 29 에 나타내었고, 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 도 18 및 19 에 나타내었다.

항-EGFR 의 약물동력학적 파라미터를 표 50 에 나타내고, AUC168 값을 하기에 요약하였다 :

[표 24]

투여량 수준	AUC168 (ug.h/mL)
(mg/kg/회)	수컷	암컷
1.5	830.4	748.4
4.5	2537	2378
12	18310	15980

최대 혈청 농도가 발생한 시간 (Tmax) 은 일반적으로 1 시간 후-투여 (제 1 샘플 포인트) 때였으나, 암컷 2F462 (4.5 mg/kg) 및 3F612 (12 mg/kg) 에서는 4 시간 후-투여 (제 2 샘플 포인트) 에도 발생하였다. 그러나, 이들 암컷 둘 다에 대해, 4 시간 후-투여 시 농도는 1 시간 후-투여 시 농도와 매우 유사하였고, 어세이의 가변성 내에서 있었다. 따라서, Tmax 의 뚜렷한 지연은 중요하게 되지 않을 것이다.

연속 투여 전의 항-EGFR 의 혈청 농도는 제 22 일째 수컷 2M461 을 제외하고는 (4.5 mg/kg/회 투여량 수준) 모든 동물에서 정량가능하였고, 따라서, 일반적으로, 동물은 투여 간격 동안에 정량가능한 농도의 항-EGFR 에 지속적으로 노출되었다.

혈청 항-EGFR 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC168) 과 제 1 일째 투여량 수준 간의 관계를 하기에 나타낸다 :

[표 25]

투여량 수준	투여량 수준	AUC168 비율 (ug.h/mL)
(mg/kg/회)	비율	수컷	암컷
1.5	1	1	1
4.5	3.0	3.1	3.2
12	8.0	22.0	21.4

원숭이를 항-EGFR 에 전신 노출시키는 속도 및 범위는 1.5 내지 4.5 mg/kg/회의 투여량 범위에 걸쳐 투여량을 증가시킴에 따라 대략 비례헤서 증가되는 AUC168 을 특징으로 하나, 비례하는 투여량 초과는 제 1 일째 투여량 범위 4.5 내지 12 mg/kg/회에 걸쳐서 증가한다. 최고 투여량 (12 mg/kg/회) 에서, AUC168 은 선형 관계식에서 예상된 것보다 2.8-배 더 높았다 (도 20).

암컷 원숭이를 항-EGFR 에 전신 노출시킨 범위 (AUC168) 는 일반적으로 수컷 원숭이에서의 노출과 유사하였다.

반복된 정맥내 투여량 후에, 항-EGFR 의 전-투여량 혈청 농도는 일반적으로 단일 투여 후의 값보다 더 높았고 (도 21 ~ 22), 이는 연구 기간을 통틀어서 혈청 내 항-EGFR 의 축적을 가리킨다. 이러한 축적은 일반적으로 수컷에서보다 암컷에서 더 낮았는데, 최고 투여량 수준에서는 예외였다. 제 1 일째 최초 투여 후 최정 농도에 대한 제 22 일째 (제 1 투여 후 672 시간째) 마지막 투여 후 최저 (전-투여량) 농도의 비율을 하기 표 26 에 나타내었다 :

[표 26]

투여량 수준	R
(mg/kg/회)	수컷	암컷
1.5	2.23	1.26
4.5	*	1.32
12	1.94	2.72
* 최저 농도가 BLQ 였기 때문에 계산될 수 없었음.

제 1 일째 항-EGFR 의 말단 속도 상수 (k), 및 상응하는 말단 반감기 (t1/2) 를 표 30 에 나타내었다. 말단 반감기는 모든 동물에 대해 적합하게 평가될 수 없었으나, 평가될 수 있었던 경우, 이는 32.5 내지 63.1 시간의 범위 내에 있엇고, 수컷 동물에서 투여량에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 항-EGFR 의 총 혈청 소거는 1.5 - 4.5 mg/kg/회 범위에 걸친 투여량에 독립적인 것으로 나타났으나, 수컷 및 암컷 원숭이에서 최고 투여량 수준에서는 감소되었다.

결론적으로, 필리핀 원숭이를 항-EGFR 에 전신 노출시킨 범위는 정맥내 독성 연구의 제 1 일째 투여량 범위 1.5 내지 12 mg/kg/회에 걸쳐서 비-선형 (투여량-의존성) 약동학을 특징으로 하는 것으로 나타났다. 항-EGFR 의 투여량을 4.5 mg/kg/회 초과로 증가시키면, 선형 관계에서 예상될 것보다 더 높은 전신 노출을 초래하는 경향이 있었고, 이는 항-EGFR 의 제거에 대한 용량 제한 방법의 가능성과 일치한다.

또한, 상기 연구는 수컷 및 암컷 원숭이를 항-EGFR 에 전신 노출시켰을 때 차이가 없었고, 반복된 정맥내 투여 후에 축적이 있었다는 증거를 제공하기도 하였 다.

[표 27]

1.5 mg/kg 항-EGFR 을 정맥내 투여한 후 1, 8, 15 및 22 째에 원숭이 혈청 내 항-EGFR 의 혈청 농도 (μg/ml)

[표 28]

4.5 mg/kg 항-EGFR 을 정맥내 투여한 후 1, 8, 15 및 22 째에 필리핀 원숭이 혈청 내 항-EGFR 의 혈청 농도 (μg/ml)

[표 29]

12 mg/kg 항-EGFR 을 정맥내 투여한 후 1, 8, 15 및 22 째에 필리핀 원숭이 혈청 내 항-EGFR 의 혈청 농도 (μg/ml)

[표 30]

필리핀 원숭이에 항-EGFR 을 매주 정맥 내 투여한 후 제 1 일의 항-EGFR 의 약물동력학적 파라미터

a 값은 데이타 처리에서 정의된 허용 범주를 모두 충족시키지 못하였고 의문점으로 처리되어야 했던 측정값임.

혈액 화학 및 혈액학

제 1, 8, 15, 및 22 일에 글리코MAB 항-EGFR 을 정맥내 볼루스 주사받았던 필리핀 원숭이의 대퇴 정맥에서 혈액 샘플을 취하였다. 투여량 투여에 사용되지 않은 사지에서 샘플을 취하였고, 이어서 밤새 음식을 주지 않았다 (죽은 원숭이 제외). 샘플을 전처리 시, 제 2 투여 후 3 일째, 그리고 하기 파라미터에 대한 종결 시에, 항응고제로서 리튬 헤파린을 사용하여 시험하였다 :

알칼리 포스파타제

알라닌 아미노-트랜스퍼라제

아스파테이트 아미노-트랜스퍼라제

비릴루빈 - 총

우레아

크레아틴

글루코스

콜레스테롤 - 총

트리글리세라이드

나트륨

칼륨

클로라이드

칼슘

인

총 단백질

단백질 전기영동도

알부민/글로불린 비율

평균 정상 필리핀 원숭이 혈액 화학 분석 데이타를 표 31 에 나타내었다.

[표 31]

필리핀 원숭이 (기원 : 마우리티우스 (Mauritius)) - 혈액 화학

제 1, 8, 15, 및 22 일에 글리코MAB 항-EGFR 을 정맥내 볼루스 주사받았던 필리핀 원숭이의 대퇴 정맥에서 조직학적 말초 혈액 분석용 샘플을 취하였다. 투여량 투여에 사용되지 않은 사지에서 샘플을 취하였고, 이어서 밤새 음식을 주지 않았다 (죽은 원숭이 제외). 샘플을 전처리 시, 제 2 투여 후 3 일째, 그리고 하기 파라미터에 대한 종결 시에, 항응고제로서 리튬 헤파린을 사용하여 시험하였다 :

1) 항응고제로서 EDTA 사용 -

헤마토크리헤모글로빈 농축물

적혈구 수

레티쿨로사이트

평균 세포 헤모글로빈

평균 세포 헤모글로빈 농도

평균 세포 부피

총 백혈구 수

감별 백혈구 수

혈소판 수

혈액 형태의 비정상

적혈구 부동증

소 적혈구증

대적혈구증다증

저색소증

과색소증

2) 항응고제로서 시트레이트 사용 -

프로트롬빈 시간

활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간

평균 정상 필리핀 원숭이 혈액학 분석 데이타를 표 22 에 나타내었다.

[표 32]

필리핀 원숭이 (기원 : 마우리티우스 (Mauritius)) - 혈액학

원숭이에 대한 생화학 누적 값을 하기 표 33a ~ h 에 나타내었다 :

[표 33a]

[표 33b]

[표 33c]

[표 33d]

[표 33e]

[표 33f]

[표 33g]

[표 33h]

원숭이에 대한 혈액 누적 개별 값을 하기 표 34a-l 에 나타내었다 :

[표 34a]

[표 34b]

[표 34c]

[표 34d]

[표 34e]

[표 34f]

[표 34g]

[표 34h]

[표 34i]

[표 34j]

[표 34k]

[표 34l]

현미경 병리학-처리-관련 발견

12 mg/kg/일로 투여된 암컷 원숭이에서 담도주위염 (담관 주위 결합 조직의 염증) 이 보고되었으나, 임의의 다른 암컷 또는 수컷 원숭이에서는 발견되지 않았다. 이러한 발견은 글리코-mAb (항-EGFR) 를 사용한 치료에 연관이 있을 수 있으나, 그러한 소수의 동물을 사용해서는 유의성이 불확실하다. 모든 다른 발견을 고려하여, 일시적이고 독성학적 유의성이 없는 것으로 사료되었다.

육안적 병리학 및 조직학

모든 동물에 대한 조직병리학적 요약을 하기 표 35 에 나타내었다 :

[표 35]

조직병리학 - 모든 동물에 대한 군 분포 및 심각성 발견

모든 동물에 대한 개별 발견들

개별 동물들에 대한 병리학적 관찰을 하기 표 36 에 나타내었다 :

[표 36]

거시병리학 및 조직병리학 - 모든 동물에 대한 개별 발견

병리학 관찰사항

필리핀 원숭이의 개별 체중을 하기 표 37 에 나타내었다 :

[표 37]

체중 : 개별값

결론

주사 부위에서의 치료 효과 및 글리코-mAb (항-EGFR) 를 사용한 치료와 관련된 것으로 생각되는 임상적 발견은 없었다. 체중 변화는 정상 예상 범위 내에 서 있었다. 거시적인 시험 시에도 치료와 관련된 발견은 없었고, 동물의 기관 중량도 정상 예상 범위 내에 있었다. 결론적으로, 1.5, 4.5 또는 12 mg/kg/회의 치료는 전신 독성이 분명하게 발견되지 않은 채 잘 관용적이었다.

EGFR 은 종양 특정 표적이 아닌데, 그 이유는 간, 신장 및 피부를 포함하여 다양한 정상 조직의 표면 상에 EGFR 이 존재하기 때문이다. 인간 IgG1 Fc 영역이 있는 항-EGFR 항체는 이미 인간에게 투여되었었고, 관용할 만한 부작용 프로파일을 나타내었다 (Vanhoefer, U. 등, Clin. Oncol. 2004 Jan 1;22(1): 175-84; Needle MN, Semin Oncol. 2002 Oct;29 (5 Suppl 14):55-60). 분명하게는, 유의하게 증가된 ADCC 가 있는 항-EGFR 항체를 인간 또는 다른 동물에 투여하는 데 있어서, 향상된 살해 활성으로 인해, 간, 신장 및 피부와 같은 중요한 정상 조직에 대해서도 나타날 수 있을 거라는 유의한 근심이 있을 것이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 상기 기술된 바와 같이 Fc 조작되고 1000-배 이하의 증가된 ADCC 활성을 가진 항-EGFR 항체를 포유류에 생체 내 투여하는 것이 유의한 독성을 초래하지 않았음을 발견하였다. 항체 농도를 4 주 이상 동안 ㎖ 당 1 ㎍ 초과로 유지하였다 (일부 동물에 있어서는 ㎖ 당 100 ㎍ 초과로 유지). 그러한 노출 수준은 항체 치료에 있어서 전형적이다. 본 연구의 항체의 최대 ADCC 는 이미 ㎖ 당 1 ㎍ 초과의 농도에서 달성되었다. 투여량이 40 및 100 mg 인 항-EGFR 항체 (모 래트 ICR62 항체) 를 단일 투여량으로 해서 인간 암 환자에 투여하는 것은 생체 내 종양을 특이적으로 표적화함을 보여주었다 (Modjtahedi, H. 등, Br J Cancer. 1996 Jan;73(2):228-35.). 필리핀 원숭이 효과기 세포는 FcgammaRIII 수용체와 고도 로 상동성이고, Fc 조작된 항체를 사용하여 (및 Fc 영역 내 비푸코실화된 올리고사카라이드의 증가된 수준을 위해 당개질된 항체 사용) 향상된 ADCC 를 매개하는 것으로 나타났다. ADCC 증가 수준은 인간 효과기 세포 (PBMC) 에서 관찰된 것과 매우 유사하다.

요약하면, 본 발명자들은, 증가된 Fc-FcgammaRIII 결합 친화성 및 증가된 ADCC 를 위해 Fc 조작된 항-EGFR 항체를 4 주 이상의 기간 동안 혈청 ㎖ 당 항체 1 ㎍ 초과의 농도로 포유류에 투여하여, 유의한 독성을 초래하지 않으면서, 생체 내 표적 세포 상의 항체의 유의한 축적과 정상적으로 관련된 약물 노출을 제공할 수 있음을 발견하였다.

방법 및/또는 파라미터 (예를 들어 혈액 화학 값, 조직병리학적 지표 등) 를 사용해, 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해, 본 발명의 항원 결합 분자의 독성을 측정할 수 있고/거나, 또는 결정할 수 있다. 당업자는, 임상적으로 유의한 수준의 독성은 임상 투여되는 항체에 대해 미국 식품 의약청에 의해 일반적으로 허용된 수준을 초과하는 수준인 것으로 생각한다.

실시예 5

경쇄 CDR 에의 변형 ;

특이성-결정 잔기의 결정

상기 기술된 방법을 사용하여, I-KC 경쇄 가변 영역 구축물 (SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:45) 로부터 항-EGFR 경쇄 가변 영역 변이체를 생성하였고, 여기서, 래트 ICR62 CDR 내 다양한 위치에 있는 아미노산 잔기를 암호화하는 서열은 인간 생식선 가변 유전자 서열의 상응하는 아미노산 잔기로 대체되었다. 이는 본원 상기에 토의된 바와 같이 항원과 상호작용하고 이의 개질이 결합 친화성에 영향을 줄 수 있는 잔기인 특이성-결정 잔기를 규명할 수 있게 하였다. 표 38 은 I-KC 경쇄 가변 영역 구축물의 CDR 내에 이루어진 치환을 보여준다 (SEQ ID NO:45) :

[표 38]

최소화된 경쇄 CDR

* 표준 명칭에 따라 규명됨 (예를 들어, "N30R" 은 SEQ TD NO:45 의 위치 30 에 있는 아스파라긴 (N) 잔기가 아르기닌 (R) 잔기로 대체되었음을 의미함). SEQ ID NO:45 의 번호화는 이들 치환에 대한 Kabat 번호화에 상응함.

상기 규명된 모든 치환된 잔기는 Y32W 교환을 제외하고는 인간 VK1_6 수용자 서열로부터 유래된 것이었고, 여기서, SEQ ID NO:45 의 위치 32 의 Y 대신에 관련 인간 생식선 서열의 W 로 치환되었다.

I-KC 변이체 구축물 (I-KC1 내지 I-KC9) 의 각각은 구축물 I-HHD (SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO:15) 를 포함하는 중쇄 가변 영역과 쌍을 이루었고, 결합 어세이는 이전 실시예에서 기술된 방법에 따라 수행되었다. 구축물 I-KC1 내지 I-KC9 를 A431 표적 세포 내 EGFR 에의 결합 친화성에 대해 I-KC 구축물 (SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:45) 와 비교하였다 (도 29 및 도 30). 도 29 에 나타낸 바와 같이, 잔기 34 를 그의 상응하는 인간 서열로 개질한 것은 (N34G) 결합 친화성에 있어서 약간의 감소를 초래하였다 (EC50 값이 10 배만큼 증가되었음). 도 30 에 나타낸 바와 같이, 잔기 50 을 인간 잔기로 개질하는 것 (N50T) 또한, 결합 친화성에 있어서 약간의 감소를 초래하였다. 따라서, 이러한 데이타는, I-KC 항-EGFR 경쇄 구축물의 N34 및 N50 이 항원-결합에 관련된 특이성 결정 잔기임을 보여주었다. 모든 다른 구축물은 I-KC 구축물에 상당하는 결합 활성을 유지하였다 (SEQ ID NO:45) (도 29 및 30).

이러한 데이타를 바탕으로, 인간화 방법의 CDR 루프-그래프팅을 위해, 단지 특정 부분의 CDR 이 필요하다. 예를 들어, I-KC 구축물의 CDR1 에 대해서는, 위치 24 내지 27 및 29 내지 33 은 공여자 (예를 들어, ICR62) 로부터 이식될 필요가 없다. CDR3 에서, F94 잔기는 래트 ICR62 항체 및 최밀접한 인간 생식선 대응물 (VK1_6) 간의 유일한 차이이고, 이를 인간 잔기로 변화시키는 것은 결합 친화성을 유지하는데 있어서 관용적이다. 따라서, 적절한 수용자 VH 및 J 서열을 선택함으로써, CDR3 은 완전히 인간적인 것으로 남아 있을 수 있다 (예를 들어, CDR3 에 필요한 루프 그래프팅이 없음).

따라서, 이러한 데이타는, EGFR 에 특이적인 키메라성 (예를 들어, 인간화된) 중쇄 구축물과 짝을 이루는 경우, 경쇄는 완전히 인간 (예를 들어, 인간 경쇄 V 유전자 서열) 적이고, 여전히 EGFR 에 대한 특이적 결합을 유지하고, 단지 경쇄와 비교해 약간 감소된 결합 친화성을 가진다 (여기서, 공여자의 특이성 결정 잔기는 유지되어 있음).

실시예 6

중쇄 CDR 의 변형 :

특이성-결정 잔기의 결정

상기 기술된 방법을 사용하여, 항-EGFR 중쇄 가변 영역 변이체를 I-HHD 경쇄 가변 영역 구축물 (SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO:15) 로부터 생성하였고, 여기서, 래트 ICR62 CDR 의 다양한 위치에 있는 아미노산 잔기를 암호화하는 서열을 인간 생식선 가변 유전자 서열 (예를 들어, VH1 10, IGHV5_51) 의 상응하는 Kabat 위치에 있는 아미노산 잔기로 대체한다. 표 39 는 I-HHD 중쇄 가변 영역 구축물의 CDR 내에서 이루어진 치환을 보여준다 (SEQ ID NO:15) :

[표 39]

최소화된 중쇄 CDR

* Kabat 번호화가 CDR 내 추가 아미노산의 존재를 허용하기 때문에, SEQ ID NO:15 의 번호화로부터 중쇄에 대한 Kabat 번호화는 다양함. 표 39 의 번호화는 Kabat 번호화를 말함. SEQ ID NO:15 내 상응하는 위치는 당업자에 의해 측정될 수 있고 상기 지시됨.

** 표준 명칭법에 따라 규명됨 (예를 들어, "F27G" 는 I-HHD-1 (위치 27 of SEQ ID NO:15) 의 Kabat 위치 27 에 있는 페닐알라닌 (F) 잔기가 글리신 (G) 잔기로 대체된 것을 의미함).

I-HHD 변이체 구축물 (I-HHD-1 내지 I-HHD-11) 은 구축물 I-KC (SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:45) 를 포함하는 경쇄 가변 영역과 짝을 이루었고, 이전 실시예에서 기술된 방법에 따라 결합 어세이를 수행하였다. A431 표적 세포 내 EGFR 에의 결합 친화성에 대해, 구축물 I-HHD-1 내지 I-HHD-11 를 I-KC 구축물 (SEQ ID NO:46 및 SEQ ID NO:45) 과 비교하였다 (도 31 및 32). 도 31 및 32 에 나타낸 바와 같이, Chothia CDR1 의 위치 27 (F27G) (구축물 I-HHD-1) 및 28 (T28S) (구축물 I-HHD-2), 및 Kabat CDR1 의 위치 31 (D31E) (구축물 I-HHD-4) 에 있는 잔기의 치환은 항원 결합에 있어서 아무런 영향을 미치지 못하였다 (즉, I-HHD 모 구축물과 비교해 항원 결합은 유지되었음). 마찬가지로, Kabat CDR2 의 위치 52a (P52aA) (구축물 I-HHD-6), 53 (N53I) (구축물 I-HHD-7), 및 57 (S57A) (구축물 I-HHD-9) 의 잔기 치환, 및 Kabat CDR3 (A 102V) 의 위치 102 (구축물 I-HHD-11) 의 잔기 치환은 항원 결합에 아무런 영향을 미치지 못하였다.

도 31 에 나타낸 바와 같이, Chothia CDR1 의 잔기 29 를 상응하는 인간 잔기 (F29I) (구축물 I-HHD-3) 로 변형시키고, Kabat CDR2 의 잔기 52 를 상응하는 인간 잔기 (N52T) (구축물 I-HHD-5) 로 개질시키는 것은 각각 I-HHD 모 구축물과 비교해 결합 친화성에 있어서 어느 정도의 감소를 초래하였다 (EC50 값이 2 ~ 3 배만큼 증가하였음).

도 32 에 나타낸 바와 같이, Kabat CDR2 의 잔기 56 을 상응하는 인간 잔기 (Y56T) (구축물 I-HHD-8) 로 개질시키는 것, 및 Kabat CDR3 의 잔기 100b 를 상응하는 인간 잔기 (V100bG) (구축물 I-HHD-10) 로 개질시키는 것은 각각 I-HHD 모 구축물과 비교해 항원 결합 친화성에 있어서 어느 정도의 감소를 초래하였다 (EC 값이 10 배만큼 증가하였음).

따라서, 이들 데이타는, I-HHD 항-EGFR 중쇄 구축물의 F29 및 N52 가 항원 결합에 있어서 어느 정도 영향을 갖는 특이성 결정 잔기임을 가리킨다. 이들 데이타는 또한, I-HHD 항-EGFR 중쇄 구축물의 Y56 및 V1OOb 가 항원-결합에 있어서 유의한 영향을 가진 특이성 결정 잔기임을 가리킨다.

본 명세서에서 언급된 서적, 저널과 같은 모든 출판물, GenBank 또는 다른 서열 데이타베이스 내용, 공개된 출원, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물 또는 특허 출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참조로써 삽입되는 것으로 가리켜진 것과 동일한 범위로, 본원에 참조로써 삽입되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Umana, Pablo Mossner, Ekkehard <120> Antigen Binding Molecules That Bind EGFR, Vectors Encoding Same, And Uses Thereof <130> 1975.043PC04/TJS/T-M <150> US 60/836,371 <151> 2006-08-09 <160> 147 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <223> ICR62 VH <400> 1 Gln Val Asn Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 359 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <223> ICR62 VH <400> 2 caggtcaacc tactgcagtc tggggctgca ctggtgaagc ctggggcctc tgtgaagttg 60 tcttgcaaag gttctggttt tacattcact gactacaaga tacactgggt gaagcagagt 120 catggaaaga gccttgagtg gattgggtat tttaatccta acagtggtta tagtacctac 180 aatgaaaagt tcaagagcaa ggccacattg actgcagaca aatccaccga tacagcctat 240 atggagctta ccagtctgac atctgaggac tctgcaacct attactgtac aagactatcc 300 ccagggggtt actatgttat ggatgcctgg ggtcaaggag cttcagtcac tgtctcctc 359 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 4 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggatt tacattcact gactacgcca tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcaatccta acagtggtta tagtacctac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 6 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg gttctggttt tacattcact gactacaaga tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggatat ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 8 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg gttctggttt tacattcact gactacaaga tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggatat ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180 aatgaaaagt tcaagagcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 10 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctctggttt tacattcact gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggctgg atcaatccta acagtggtta tagtacctac 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accgccgaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 12 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggagcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg gttctggttt tacattcact gactacaaga tccactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggatac ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatg accgccgaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 14 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggagcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg gttctggttt tacattcact gactacaaga tccactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggatac ttcaacccta acagcggtta cagtacttac 180 aacgagaagt tcaagagccg ggtcaccatg accgccgaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccagggggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 16 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctctggttt cacattcact gactacaaga tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggatat ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn 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tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric DNA <400> 24 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag 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gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggctgg atcaatccta acagtggtta tagtacctac 180 aacgagaagt tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat-human chimeric polypeptide <400> 35 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 360 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Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Kabat Heavy Chain CDR1 <400> 122 gactacaaga tatcc 15 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Kabat Heavy Chain CDR1 <400> 123 Asp Tyr Lys Ile Ser 1 5 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AbM Heavy Chain CDR1 <400> 124 ggtttcacat tcactgacta caagatatcc 30 <210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AbM Heavy Chain CDR1 <400> 125 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Lys Ile Ser 1 5 10 <210> 126 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Kabat Heavy Chain CDR2 <400> 126 tacttcaatc ctaacagtgg ttatagtacc tacagcccaa gcttccaagg c 51 <210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Kabat Heavy Chain CDR2 <400> 127 Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 128 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-1) <400> 128 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 129 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-2) <400> 129 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 130 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-3) <400> 130 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 131 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-4) <400> 131 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 132 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-5) <400> 132 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 133 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-6) <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Ala Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 134 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-7) <400> 134 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Ile Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 135 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-8) <400> 135 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 136 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-9) <400> 136 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 137 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-10) <400> 137 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 138 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-HHD-11) <400> 138 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 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Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-KC2) <400> 140 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 141 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-KC3) <400> 141 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 142 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-KC4) <400> 142 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 143 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-KC5) <400> 143 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 144 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric rat-human sequence (I-KC6) <400> 144 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 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Claims

래트 ICR62 모노클로날 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 의 하나 이상의 특이성 결정 잔기 (SDR), 및 이형접합성 폴리펩타이드 유래 서열을 포함하는 항원 결합 분자 (ABM) 로서, 여기서, 상기 ABM 은 EGFR 에 특이적으로 결합하나, 치료적 유효량으로 개체에 투여된 경우 임상적으로 유의한 수준의 독성을 야기하지 않고, 여기서, 상기 ABM 은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, 및 SEQ ID NO:121 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하지 않는 항원 결합 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 SDR 은 하나 이상의 중쇄 CDR 에 있는 ABM.
제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 중쇄 SDR 은 Kabat 위치 29 에 있는 페닐알라닌, Kabat 위치 52 에 있는 아스파라긴, Kabat 위치 56 에 있는 타이로신, 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ABM.
제 3 항에 있어서, 상기 하나 이상의 중쇄 SDR 은 Kabat 위치 56 에 있는 타이로신 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린을 포함하는 ABM.
제 3 항에 있어서, 하나 이상의 중쇄 SDR 은 Kabat 위치 29 에 있는 페닐알라닌, Kabat 위치 52 에 있는 아스파라긴, Kabat 위치 56 에 있는 타이로신 및 Kabat 위치 100b 에 있는 발린인 ABM.
제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 SDR 은 하나 이상의 경쇄 CDR 내에 존재하는 ABM.
제 6 항에 있어서, 상기 하나 이상의 경쇄 SDR 은 Kabat 위치 50 에 있는 아스파라긴을 포함하는 ABM.
제 6 항에 있어서, 상기 하나 이상의 경쇄 SDR 은 Kabat 위치 34 에 있는 아스파라긴 및 Kabat 위치 50 에 있는 아스파라긴을 포함하는 ABM.
제 1 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 2 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 ABM.
제 9 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 3 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 ABM.
제 9 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 4 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 ABM.
제 9 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 5 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 ABM.
제 9 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 6 개 이상의 CDR, 또는 상기 CDR 에 대한 SDR 을 적어도 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 ABM.
제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 상기 CDR(들) 은 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환을 포함하고, 상기 ABM 은 비치환 ABM 과 비교해 결합 활성을 유지하는 ABM.
제 14 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 상기 CDR(들) 은 특이성 결정 잔기를 제외한 임의의 위치에서 치환을 포함하는 ABM.
제 15 항에 있어서, 래트 ICR62 항체의 상기 CDR(들) 은 특이성 결정 잔기를 제외한 모든 위치에서 치환을 포함하는 ABM.
제 15 항에 있어서, 상기 CDR 은 Chothia 중쇄 CDR1 의 Kabat 위치 27, 28, 또는 29, Kabat 중쇄 CDR1 의 위치 31, Kabat 중쇄 CDR2 의 Kabat 위치 52, 52a, 53, 또는 57, 또는 Kabat 중쇄 CDR3 의 Kabat 위치 102 중 하나 이상에서 치환을 포함하는 ABM.
제 17 항에 있어서, 상기 CDR 은 Kabat 경쇄 CDR1 의 Kabat 위치 30 또는 32, Kabat 경쇄 CDR2 의 Kabat 위치 51, 52, 53, 또는 56, 또는 Kabat 중쇄 CDR3 의 Kabat 위치 94 중 하나 이상에서 치환을 포함하는 ABM.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합에 대한 EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 10 내지 약 0.001 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 10 내지 약 1 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 10 내지 약 5 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 5 내지 약 0.1 배보 다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 5 내지 약 2 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 3 내지 약 1 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 2 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 1 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 0.1 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 19 항에 있어서, EC50 농도가 비치환 ABM 에 비해 약 0.001 배보다 더 적게 증가되는 ABM.
제 1 항에 있어서, 상기 ABM 이 SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, 및 SEQ ID NO:147 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 ABM.
래트 ICR62 모노클로날 항체의 개질된 중쇄 CDR 및 하나 이상의 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열로부터 유래된 중쇄 골격 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 개질된 중쇄 CDR 은 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 52, 52a, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 101, 102, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Kabat 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 항원 결합 분자의 부분으로서, 인간 EGFR 에 특이적으로 결합하나, 치료적 유효량으로 개체에 투여된 경우 임상적으로 유의한 수준의 독성을 야기하지 않는 단리된 폴리펩타이드.
제 30 항에 있어서, 상기 개질된 중쇄 CDR 은 Kabat 위치 27, 28, 29, 31, 52, 53, 54, 58, 및 102 에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
제 30 항에 있어서, 상기 개질된 중쇄 CDR 은 Kabat 위치 27, 28, 31, 53, 54, 및 58 에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
제 30 항에 있어서, 상기 개질된 중쇄 CDR 은 SDR 을 제외한 Kabat 및 Chothia 중쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
제 30 항에 있어서, 상기 개질된 중쇄 CDR 은 Kabat 위치 29, 52, 56, 및 100b 를 제외한 Kabat 및 Chothia 중쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
래트 ICR62 모노클로날 항체의 개질된 경쇄 CDR 및 하나 이상의 인간 생식선 가변 영역 유전자 서열로부터 유래된 경쇄 골격 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 개질된 경쇄 CDR 은 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Kabat 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 항원 결합 분자의 부분으로서, 인간 EGFR 에 특이적으로 결합하는 단리된 폴리펩타이드.
제 35 항에 있어서, 상기 개질된 경쇄 CDR 은 SDR 을 제외한 Kabat 및 Chothia 경쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
제 35 항에 있어서, 상기 개질된 경쇄 CDR 은 Kabat 위치 34 및 50 을 제외한 Kabat 및 Chothia 경쇄 CDR 내 모든 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
제 30 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 항원 결합 분자의 부분으로서, 인간 EGFR 에 특이적으로 결합함).
SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, 및 SEQ ID NO:147 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 항원 결합 분자의 부분으로서, 인 간 EGFR 에 특이적으로 결합함).
제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드로 트랜스펙션된 숙주 세포.
제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
제 42 항에 있어서, 상기 벡터가 복제 클로닝 벡터인 벡터.
제 42 항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인 벡터.
제 42 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
하기 단계를 포함하는, 인간 EGFR 에의 결합에 대해 래트 ICR62 모노클로날 항체와 경쟁할 수 있는 항원 결합 분자를 제조하는 방법 :

(a) 상기 항원 결합 분자를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 배지 내에서 제 41 항 또는 제 45 항의 숙주 세포를 배양하는 단계 ; 및

(b) 상기 항원 결합 분자를 회수하는 단계.
제 30 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 ABM.
제 1 항 내지 제 29 항 또는 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABM 이 Fc 영역을 포함하는 ABM.
제 48 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 변경된 올리고사카라이드 구조를 갖도록 당개질된 ABM.
제 49 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 상응하는 당개질화되지 않은 ABM 에 비해 감소된 수의 푸코스 잔기를 갖는 ABM.
제 48 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 상응하는 당개질화되지 않은 ABM 에 비해 증가된 효과기 기능 또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 갖도록 당개질된 ABM.
제 1 항 내지 제 29 항, 또는 제 46 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항의 ABM 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
제 52 항의 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체 내 EGFR 발 현 세포를 표적화하는 방법.
제 53 항에 있어서, 상기 세포가 EGFR 을 과발현하는 방법.
제 53 항에 있어서, 상기 개체 내에서 EGFR-매개 세포-신호화를 차단함으로써 치료가능한 장애를 치료하기 위해 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 29 항, 또는 제 46 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR-매개 세포 신호화를 차단함으로써 치료가능한 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용되기 위한 ABM.
EGFR-매개 세포 신호화를 차단함으로써 치료가능한 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 1 항 내지 제 29 항, 또는 제 46 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항의 ABM 의 용도.
상기 장애가 세포 증식 장애인 제 53 항의 방법, 제 56 항의 ABM, 또는 제 57 항의 용도.
제 58 항에 있어서, 상기 세포 증식 장애가 암인 방법, ABM, 또는 용도.
제 59 항에 있어서, 상기 암이 유방암, 방광암, 두경부암, 피부암, 췌장암, 폐암, 난소암, 대장암, 전립선암, 신장암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법, ABM, 또는 용도.
제 39 항 또는 제 40 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 치료적 유효량으로 개체에 투여된 경우, 임상적으로 유의한 수준의 독성을 야기하지 않는 ABM.
제 1 항, 제 30 항, 제 39 항 또는 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 4 주 이상의 기간 동안 약 1 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml 의 상기 ABM 의 혈청 농도를 초래하는 ABM.
제 62 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 4 주 이상의 기간 동안 약 1 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml 의 상기 ABM 의 혈청 농도를 초래하는 ABM.
제 1 항, 제 30 항, 제 39 항 또는 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABM 의 상기 치료적 유효량은 약 1.0 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 인 ABM.
제 1 항, 제 30 항, 제 39 항 또는 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABM 의 독성은 혈액 화학 값 또는 조직병리학적 지표를 사용하여 측정되는 ABM.