ES2576137T3 - Moléculas de unión a antígeno que se unen a EGFR, vectores que las codifican, y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-EGFR humanizado, modificado por glucoingeniería que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de rata ICR62 que comprende (i) una región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:128 SEQ ID NO:129; SEQ ID NO:131; SEQ ID NO:133; SEQ ID NO:134; SEQ ID NO:136; SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:130; SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:137; y (ii) una región variable de cadena ligera de SEC ID Nº:45; en la que dicho anticuerpo comprende una región Fc y en la que dicho anticuerpo se ha modificado por glucoingeniería: (a) para tener un número reducido de restos de fucosa en la región Fc en comparación con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniería; (b) para tener una afinidad de unión a receptor de Fc aumentada en comparación con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniería. y (c) para tener una función efectora aumentada en comparación con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniería.

Description

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DESCRIPCION

Moleculas de union a antfgeno que se unen a EGFR, vectores que las codifican, y usos de las mismas Antecedentes de la invencion Campo de la Invencion

La presente invencion esta relacionada con un anticuerpo humanizado anti-EGFR modificado por glucoingeniena, que se une al mismo epttopo que el anticuerpo de rata ICR62 que comprende

(ii) una region variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 137; y (ii)una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 45

en el que dicho anticuerpo comprende una region Fc y en el que dicho anticuerpo ha sido modificado por glucoingeniena:

(a) para tener un numero reducido de restos de fucosa en la region Fc en comparacion con el correspondiente anticuerpo no modificado por glucoingeniena;

b) para tener una afinidad mayor de union al receptor Fc en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena, y

(c) para tener una mayor funcion efectora en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena.

La divulgacion en general esta relacionada con moleculas de union a antfgeno (ABM, por sus siglas en ingles). En realizaciones particulares, la divulgacion esta relacionada con anticuerpos monoclonales recombinantes, incluyendo anticuerpos quimericos, primatizado o humanizados espedficos para el receptor del factor de crecimiento epidermico humano (EGFR, por sus siglas en ingles). Ademas, la divulgacion esta relacionada con moleculas de acido nucleico que codifican dichas ABM, y vectores y celulas huesped que comprenden dichas moleculas de acido nucleico. La divulgacion ademas esta relacionada con metodos para producir las ABM descritas en el presente documento, y con composiciones que comprenden estas ABM para utilizar en el tratamiento de una enfermedad. Ademas, la divulgacion esta relacionada con ABM con glicosilacion modificada que tienen propiedades terapeuticas mejoradas, que incluye anticuerpos con union al receptor de Fc aumentada y de la funcion efectora aumentada.

Antecedentes

EGFR y anticuerpos anti-EGFR

El receptor del factor de crecimiento epidermico humano (tambien conocido como HER-1 o Erb-B1, y referido en el presente documento como "EGFR") es un receptor transmembrana de 170 kDa codificado por el protooncogen c- erbB, y presenta una actividad tirosina quinasa intnnseca (Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996); Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). La entrada de la base de datos SwissProt P00533 proporciona la secuencia de EGFR. Existen tambien isoformas y variantes de EGFR (por ejemplo, transcritos de ARN alternativos, versiones truncadas, polimorfismos; etc.) que incluyen pero no se limitan a aquellos identificados por los numeros de entrada de la base de datos SwissProt P00533-1, P00533-2, P00533-3, y P00533-4. Se sabe que EGFR une a ligandos que incluyen el factor de crecimiento epidermico (EGFR), factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), anfirregulina, EGF de union a heparina (hb-EGF), betacelulina, y epiregulina (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Mendelsohn y Baselga, Oncogene 19: 6550-6565 (2000)). EGFR regula numerosos procesos celulares mediante las vfas de transduccion de senales mediadas por tirosina quinasas, que incluyen, pero no se limitan a, activacion de las vfas de transduccion de senales que controlan la proliferacion celular, diferenciacion, supervivencia celular, apoptosis, angiogenesis, mitogenesis, y metastasis (Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Tsao y Herbst, Signal 4:4-9 (2003); Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).

La sobreexpresion de EGFR se ha descrito en muchas afecciones malignas humanas, que incluyen canceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, pancreas, pulmon, mama, ovario, colon, prostata, y rinon. (Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228235 (1996)). En muchas de estas afecciones, la sobreexpresion de EGFR se correlaciona o se asocia con un mal pronostico de los pacientes. (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228235 (1996)). EGFR tambien se expresa en las celulas de tejidos normales, en particular los tejidos epiteliales de la piel, tngado, y tracto gastrointestinal, aunque en niveles generalmente inferiores a los de las celulas malignas (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)).

Los anticuerpos monoclonales (mAb) no conjugados pueden ser medicinas utiles para el tratamiento del cancer, tal

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como se demuestra por la aprobacion de Agencia del Medicamento de EE.UU.(U.S. Food and Drug Administration) del Trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc,) para el tratamiento del cancer de mama avanzado (Grillo-Lopez, A.- J., et al. Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)), Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, y Genentech Inc., San Francisco, CA), para el tratamiento del linfoma no Hodgkin de bajo grado o folicular con linfocitos CD20 positivos, Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Weth-Ayerst) para el tratamiento de la recafda de la leucemia mieloide aguda, y Alemtuzurnab (CAMPATH ™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de leucemia linfoide cronica de linfocitos B. El exito de estos productos no solo se debe a su eficacia sino tambien en sus excelentes perfiles de seguridad (Grillo-Lopez, AJ., et al., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)). A pesar de los logros de estos medicamentos, en la actualidad existe un gran interes en obtener mayor actividad espedfica del anticuerpo de lo que normalmente proporciona la terapia de un mAb conjugado.

Los resultados de una serie de estudios sugieren que los mecanismos dependientes de receptor de Fc contribuyen sustancialmente a la accion de los anticuerpos citotoxicos contra los tumores e indican que un anticuerpo optimo contra los tumores se unina preferentemente a los receptores de Fc de activacion y mmimamente a la pareja inhibidora FcyRIIB. (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis, A.M., y Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195(12):1653-1659 (junio de 2002). Por ejemplo, los resultados de por lo menos un estudio sugieren que el polimorfismo en el receptor de FcRIIIa, en particular, se asocia fuertemente con la eficacia de la terapia de anticuerpo (Cartron, G., et al., Blood 99 (3): 754-757 (febrero de 2002)). Este estudio demostro que los pacientes homocigotos para FcRIIIa tienen una mejor respuesta al rituximab que los pacientes heterocigotos. Los autores concluyeron que la superior respuesta se debfa a una mejor union in vivo del anticuerpo a FcyRIII2, lo que resulto en una mejor actividad CCDA contra las celulas del linfoma. (Cartron, G., et al., Blood 99 (3):754-757 (febrero de 2002)).

Se han descrito varias estrategias para dirigirse a EGFR y bloquear las vfas de senalizacion del EGFR. Los inhibidores tirosina quinasa de moleculas pequenas, como gefitinib, erlotinib, y CI-1033 bloquean la autofosforilacion de EGFR en la region intracelular tirosina quinasa, inhibiendo con ello los eventos de senalizacion posteriores (Tsao y Herbst, Senal 4: 4-9 (2003)). Los anticuerpos monoclonales, por otro lado, se dirigen a la porcion extracelular de EGFR, lo que resulta en el bloqueo de la union del ligando y de este modo inhibe los procesos posteriores, tales como la proliferacion celular (Tsao y Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)).

Se han generado varios anticuerpos monoclonales murinos que logran un bloqueo de este tipo in vitro y que han sido evaluados para determinar su capacidad para afectar el crecimiento del tumor en modelos de xenoinjertos de raton (Masui, et al., Cancer Res. 46: 5592-5598 (1986); Masui, et al., Cancer Res. 44:1002-1007 (1984); Goldstein, et al., Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318 (1995)). Por ejemplo, EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals) es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR murino que se produjo contra la lmea celular A431 de carcinoma epidermoide humano y se puso a prueba en estudios clmicos de pacientes con carcinoma avanzado de celulas escamosas de la laringe o hipofaringe (Bier et al., Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 252:433-9 (1995)). Ademas, se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales ICR16, ICR62, e ICR80 de rata, que se unen al dominio extracelular de EGFr son eficaces en la inhibicion de la union de EGF y TGF-a al receptor. (Modjtahedi et al., Int. J. Cancer 75:310-316 (1998)). El anticuerpo monoclonal murino 425 es otro MAb que se produjo en contra de la lmea de celulas de carcinoma humano A431 y se encontro que se une a un epftopo de polipeptido en el dominio externo del receptor del factor de crecimiento epidermico humano. (Murthy et al., Arch. Biochem Biophys. 252 (2): 549-560 (1987). Un problema potencial con el uso de anticuerpos murinos en los tratamientos terapeuticos es que los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huesped humano como una protema extrana, por lo tanto, la inyeccion repetida de tales anticuerpos extranos puede conducir a la induccion de respuestas inmunes que conducen a reacciones de hipersensibilidad daninas. Para los anticuerpos monoclonales murinos, esto se suele designar como una respuesta de anticuerpo anti-raton humano, o respuesta "HAMA", por sus siglas en ingles, o una respuesta de anticuerpo anti-rata humano, o respuesta "HARA". Ademas, estos anticuerpos "extranos" pueden ser atacados por el sistema inmune del huesped de manera que son, en efecto, neutralizados antes de que alcancen su sitio diana. Ademas, los anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales murinos) normalmente carecen de funcionalidad efectora humana, es decir, no son capaces de, entre otras cosas, mediar la lisis dependiente de complemento o lisar celulas diana humanas a traves de la toxicidad celular dependiente de anticuerpo o fagocitosis meditada por receptor de Fc.

Los anticuerpos quimericos que comprenden porciones de anticuerpos de dos o mas especies diferentes (por ejemplo, raton y humano) se han desarrollado como alternativa a los anticuerpos “conjugados”. Por ejemplo, la patente EE.UU. N° 5.891.996 (Mateo de Acosta del Rio et al.) describe un anticuerpo quimerico de raton/humano, R3, dirigido contra EGFR, y la patente EE.UU. N° 5.558.864 describe la generacion de formas quimericas y humanizadas del MAb 425 anti-EGFR murino. Tambien, IMC-C225 (Erbitux®; ImClone) es un anticuerpo monoclonal quimerico raton/humano anti-EGFR (basado en el anticuerpo monoclonal de raton M225, que dio como resultado respuestas HAMA en los ensayos clmicos en seres humanos) que se han descrito para demostrar la eficacia antitumoral en varios modelos de xenoinjerto humano. (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). La eficacia de IMC-C225 se ha atribuido a varios mecanismos, que incluyen la inhibicion de eventos celulares regulados mediante las vfas de senalizacion de EGFR, y posiblemente mediante el aumento de la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) (Herbst y Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). IMC-C225 tambien se utilizo en

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ensayos clmicos, incluyendo en combinacion con radioterapia y quimioterapia (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). Recientemente, Abgenix, Inc. (Fremont, CA) desarrollo ABX-EGF para la terapia contra el cancer. ABX-EGF es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR completamente humano. (Yang et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38: 17-23 (2001)). El documento WO 2005 /056606 desvela variantes humanizadas del anticuerpo de rata IC R62.

Glicosilacion de anticuerpos

El componente de oligosacarido puede afectar significativamente a propiedades relevantes para la eficacia de una glucoprotema terapeutica, que incluyen la estabilidad ffsica, la resistencia al ataque de proteasas, las interacciones con el sistema inmunologico, la farmacocinetica, y la actividad biologica espedfica. Tales propiedades pueden depender no solo de la presencia o ausencia, sino tambien de las estructuras especificas, de oligosacaridos. Se pueden hacer algunas generalizaciones entre la estructura de oligosacarido y la funcion de la glucoprotema. Por ejemplo, determinadas estructuras de oligosacarido median en el rapido aclaramiento de la glucoprotema de la circulacion sangumea a traves de interacciones con protemas especificas de union a hidratos de carbono, mientras que otros pueden unirse mediante anticuerpos y desencadenar reacciones inmunes no deseadas. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).

Las celulas de mamffero son los huespedes preferidos para la produccion de glucoprotemas terapeuticas, debido a su capacidad de glicosilar protemas en la forma mas compatible para la aplicacion en seres humanos. (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Las bacterias muy raramente glicosilan protemas, e igualmente otros tipos de huespedes comunes, como levaduras, hongos filamentosos, insectos y celulas de plantas, proporcionan patrones de glucosilacion asociados con un rapido aclaramiento de la corriente sangumea, interacciones inmunes no deseables, y en algunos casos espedficos, reduccion de la actividad biologica. Entre las celulas de mairnfero, las celulas de ovario de hamster chino (CHO) se han utilizado con mayor frecuencia durante las dos ultimas decadas. Ademas de proporcionar patrones de glicosilacion adecuados, estas celulas permiten la generacion sistematica de lmeas celulares clonales geneticamente estables, de alta productividad. Estas pueden cultivarse a altas densidades en biorreactores sencillos utilizando medios libres de suero, y permiten el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducibles. Otras celulas animales comunmente utilizadas incluyen celulas de rinon de cna de hamster (bHk), y celulas de mieloma de raton NSO SP2/O. Mas recientemente, la produccion a partir de animales transgenicos tambien se ha probado. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).

Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidrato en posiciones conservadas en las regiones constantes de cadena pesada, con cada isotipo que posee una disposicion distinta de las estructuras de carbohidratos N- ligadas, que afectan de forma variable al ensamblaje, la actividad funcional o la secrecion de las protemas. (Wright, A., y Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). La estructura de los carbohidratos unidos N-ligados vana considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir alta manosa, oligosacaridos complejos tanto multirramificados asf como complejos biantenados. (Wright, A., y Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). Normalmente, existe un procesamiento heterogeneo de las estructuras centrales del oligosacarido unidas a un sitio de glicosilacion particular de forma que incluso los anticuerpos monoclonales existen con multiples glucoformas. De forma similar, se ha demostrado que aparecen importantes diferencias en la glicosilacion del anticuerpo entre lmeas celulares, y se observan incluso diferencias menores para una lmea celular determinada crecida en diferentes condiciones de cultivo. (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22 (1995)).

Una manera de obtener grandes incrementos de potencia, manteniendo al mismo tiempo un proceso de produccion simple y evitando potencialmente efectos secundarios no deseados significativos, es aumentar las funciones efectoras naturales, mediadas por celulas de los anticuerpos monoclonales modificando mediante ingeniena su componente oligosacarido tal como se describe en Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999) y en la patente EE.UU. N ° 6.602.684. Los anticuerpos de tipo IgG1, los anticuerpos mas comunmente utilizados en la inmunoterapia del cancer, son glucoprotemas que tienen un sitio de glicosilacion conservado N-ligado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos complejos de oligosacaridos biantenados unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando extensos contactos con el armazon de polipeptido, y su presencia es esencial para que el anticuerpo medie funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. y Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997)).

Umana et al. demostraron anteriormente que la sobreexpresion de p (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIN"), una glicosiltransferasa que cataliza la formacion de oligosacaridos biseccionados en celulas ovario de hamster chino (CHO), aumenta significativamente la actividad CCDA in vitro de un anticuerpo monoclonal quimerico antineuroblastoma (chCE7) producido por celulas CHO modificadas por ingeniena. (Vease Umana, P. et al., Nature Biotechnology, 17:176-180 (1999); y publicacion Internacional N° wO 99/54342). El anticuerpo chCE7 pertenece a una clase grande de mAb no conjugados que tienen alta afinidad y especificidad tumoral, pero tienen muy poca potencia para ser clmicamente utiles cuando se producen en las lmeas celulares industriales estandar sin la enzima GnTIII (Umana, P., et al., Naturaleza Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Ese estudio fue el primero en demostrar que podnan obtenerse grandes aumentos de la actividad CCDA mediante la modificacion por ingeniena de las celulas productoras de anticuerpo para expresar GnTIII, lo que tambien dio lugar a un aumento de la proporcion de

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oligosacaridos biseccionados asociados a (Fc), en la region constante, que incluye oligosacaridos biseccionados, no fucosilados, por encima de los niveles que se encuentran en los anticuerpos que aparecen de forma natural.

Sigue existiendo una necesidad de enfoques terapeuticos mejorados dirigidos a EGFR para el tratamiento de los trastornos de proliferacion celular en los primates, que incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, en la que tales trastornos se caracterizan por la expresion de EGFR, particularmente la expresion anomala (por ejemplo, la sobreexpresion) que incluyen, pero no se limitan a, canceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, pancreas, pulmon, mama, ovario, colon, prostata, y rinon. En particular, sigue habiendo una necesidad de reducir al mmimo el numero de restos no humanos en moleculas de union a antigeno administradas a sujetos humanos.

Breve resumen de la invencion

Reconociendo el enorme potencial terapeutico de las moleculas de union a antigeno (ABM) que tienen la especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 (por ejemplo, unirse al mismo epttopo) y que se han modificado por glucoingeniena para mejorar la afinidad de union al receptor de Fc y la funcion efectora, se ha desarrollado un metodo para producir dichas ABM. Entre otras cosas, este metodo implica la produccion de anticuerpos recombinantes quimericos, o fragmentos quimericos de los mismos. La eficacia de estas ABM se mejora aun mas mediante la modificacion por ingeniena del perfil de glicosilacion de la region Fc del anticuerpo. La invencion esta relacionada con los siguientes anticuerpos humanizados anti-EGFR, celulas huesped Y metodos parrafo producir un anticuerpo que es capaz de competir con el anticuerpo monoclonal de rata ICR62 por la union a EGFR humano:

[1] Un anticuerpo anti-EGFR humanizado, modificado por glucoingeniena que se une al mismo epftopo que el anticuerpo de rata ICR62, que comprende

(i) una region variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:128 SEQ ID NO:129; SEQ ID NO:131; SEQ ID NO:133; SEQ ID NO:134; SEQ ID NO:136; SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:130; SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:137; y

(ii) una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 45;

en el que dicho anticuerpo comprende una region Fc y en el que dicho anticuerpo se ha modificado por glucoingeniena

(a) para tener un numero reducido de restos de fucosa en la region Fc en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena,

(b) para tener una afinidad de union a receptor de Fc aumentada en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena, y/o

(c) para tener una funcion efectora aumentada en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena,

[2] El anticuerpo de [1], en el que dicho anticuerpo modificado por glucoingeniena tiene un mayor porcentaje de oligosacaridos biseccionados en la region Fc en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena.

[3] El anticuerpo de [1] o [2] en el que dicha region Fc es una region Fc humana.

[4] El anticuerpo de [1] en el que la funcion efectora aumentada se selecciona de entre el grupo que consiste en citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada, union a celulas NK aumentada, union a macrofagos aumentada, union a celulas polimorfonucleares aumentada, union a monocitos aumentada, senalizacion directa inductora de apoptosis aumentada, maduracion de celulas dendnticas aumentada y sensibilizacion de linfocitos T aumentada.

[5] Una celula huesped que comprende un polinucleotido que codifica una region variable de cadena pesada tal como se ha definido en [1] y un polinucleotido que codifica una region variable de cadena ligera como se ha definido en [1], o un vector que comprende dichos polinucleotidos y en la que dicha celula huesped esta modificada por ingeniena para expresar al menos un acido nucleico que codifica un polipeptido que posee actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII).

[6] La celula huesped de [5], en el que dicho polipeptido que tiene actividad p(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III es un polipeptido de fusion que comprende ademas el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi.

[7] La celula huesped de [6], en el que dicho dominio de localizacion en el Golgi se selecciona de entre el dominio de localizacion de la manosidasa II, el dominio de localizacion de p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I, p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II, manosidasa I o a1-6 fucosiltransferasa central.

[8] Un metodo para producir un anticuerpo que es capaz de competir con el anticuerpo monoclonal de rata ICR62 por la union a EGFR humano, comprendiendo dicho metodo:

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(a) cultivar la celula huesped de uno cualquiera de [5] a [7] en condiciones que permiten la expresion de dicho polinucleotido que codifica dicho anticuerpo; y

(b) recuperar dicho anticuerpo

[9] Un anticuerpo que se une a EGFR, preferentemente a EGFR humano, en el que dicho anticuerpo se produce mediante el metodo de [8].

[10] Una composicion que comprende el anticuerpo de uno cualquiera de [1] a [4] o [9] y un veldculo farmaceuticamente aceptable.

[11] Un anticuerpo de uno cualquiera de [1], a [4] o [9] para su uso en el tratamiento del cancer.

[12] El anticuerpo para su uso en el tratamiento del cancer de acuerdo con [11] en el que dicho cancer se selecciona de entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de pancreas, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de rinon, y cancer de cerebro.

La divulgacion esta dirigida en general a una molecula de union a antigeno (ABM), que comprende uno o mas restos determinantes de especificidad (SDR) de uno o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal de rata ICR62, y una secuencia procedente de un polipeptido heterologo, en el que la ABM se une espedficamente a EGFR. En una realizacion particular, la ABM no comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11,

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39,

SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, y SEQ ID NO: 121.

En una realizacion, una o mas SDR estan en una o mas CDR de cadena pesada. En una realizacion particular, la una o mas SDR de cadena pesada se seleccionan de entre el grupo que consiste en fenilalanina en la posicion Kabat 29, asparagina en la posicion Kabat 52, tirosina en la posicion Kabat 56, y valina en la posicion Kabat 100b. En otra realizacion particular, uno o mas SDR de cadena pesada comprende una tirosina en la posicion Kabat 56 y valina en la posicion Kabat 100b. En otra realizacion particular, la una o mas SDR de cadena pesada son fenilalanina en la posicion Kabat 29, asparagina en la posicion Kabat 52, tirosina en la posicion Kabat 56 y valina en la posicion Kabat 100b.

En una realizacion, una o mas SDR estan en una o mas CDR de cadena ligera. En una realizacion particular, la una o mas SDR de cadena ligera comprende asparagina en la posicion Kabat 50. En otra realizacion particular, la una o mas SDR de cadena ligera comprende asparagina en la posicion Kabat 34 y asparagina en la posicion Kabat 50.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM que comprende al menos dos CDR del anticuerpo de rata ICR62, o una variante o forma truncada de las mismas que contiene al menos las SDR de dichas CDR. En una realizacion, la ABM comprende al menos tres CDR del anticuerpo de rata ICR62, o una variante o forma truncada de las mismas que contiene al menos las SDR de dichas CDR. En otra realizacion, la ABM comprende al menos cuatro CDR del anticuerpo de rata ICR62, o una variante o forma truncada de las mismas que contiene al menos las SDR de dichas CDR. En otra realizacion, la ABM comprende seis CDR del anticuerpo de rata ICR62, o una variante o forma truncada de las mismas que contiene al menos las SDR de dichas CDR. En otra realizacion, las CDR del anticuerpo de rata ICR62 comprende sustituciones en una o mas posiciones de aminoacido, y en el que dicha ABM conserva la actividad de union en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion, las CDR del anticuerpo de rata ICR62 comprenden sustituciones en cualquier posicion excepto en los restos determinantes de la especificidad. En otra realizacion, las CDR del anticuerpo de rata ICR62 comprenden sustituciones en todas las posiciones excepto para los restos determinantes de la especificidad. En una realizacion particular, las CDR comprenden sustituciones en una o mas posiciones Kabat 27, 28, o 29 de la CDR1 de cadena pesada de Chothia, posicion Kabat 31 de la CDR1 de cadena pesada de Kabat, posiciones Kabat 52, 52a, 53, o 57 de la CDR2 de cadena pesada de Kabat, o posicion Kabat 102 de la CDR3 de cadena pesada de Kabat. En otra realizacion particular, las CDR comprenden sustituciones en una o mas de las posiciones Kabat 30 o 32 de la CDR1 de cadena ligera de Kabat, posiciones Kabat 51, 52, 53, o 56 de la CDR2 de cadena ligera de Kabat, o posicion Kabat 94 de la CDR3 de cadena ligera de Kabat.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a ABM en las que la concentracion CE50 para la union esta modulada por menos de un factor de alrededor de 10 a alrededor de 0,001, en comparacion con la ABM no sustituida. En una realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 10 a alrededor de 1, en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 10 a alrededor de 5, en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 5 a alrededor de 0,1, en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 5 a alrededor de 2, en comparacion con la ABM no

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sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 3 a alrededor de 1, en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 2, en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 1, en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 0,1, en comparacion con la ABM no sustituida. En otra realizacion espedfica, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 0,001, en comparacion con la ABM no sustituida. En algunas realizaciones, la modulacion tal como se enumera anteriormente comprende un aumento en la CE50. En otras realizaciones, la modulacion comprende una disminucion en la CE50.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM que comprende un polipeptido que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SeQ ID NO: 128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, y SEQ ID NO:147.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polipeptido aislado que codifica una region variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende CDR modificadas de cadena pesada del anticuerpo monoclonal de rata ICR62 y una region marco conservada de cadena pesada procedente de una o mas secuencias genicas de region variable de lmea germinal humana, en las que dichas CDR modificadas de cadena pesada comprenden una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion Kabat seleccionada de entre el grupo que consiste en 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 52, 52a, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 101, 102, y cualquier combinacion de las mismas, y en el que dicho polipeptido, como parte de una molecula de union a antfgeno, se une espedficamente a EGFR humano. En una realizacion espedfica, las CDR modificadas de cadena pesada comprenden una o mas sustituciones de aminoacidos en las posiciones Kabat 27, 28, 29, 31, 52, 53, 54, 58, y 102. En otra realizacion espedfica, las CDR modificadas de cadena pesada comprenden una o mas sustituciones de aminoacidos en las posiciones Kabat 27, 28, 31, 53, 54, y 58. En otra realizacion espedfica, las CDR modificadas de cadena pesada comprenden sustituciones de aminoacidos en todas las posiciones Kabat y Chothia dentro de las CDR de cadena pesada excepto en las SDR. En otra realizacion espedfica, las CDR modificadas de cadena pesada comprenden sustituciones de aminoacidos en todas las posiciones dentro de las CDR de cadena pesada de Kabat y Chothia excepto en las posiciones Kabat 29, 52, 56, y 100b. La divulgacion tambien esta dirigida a polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos aislados.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polipeptido aislado que codifica una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende las CDR modificadas de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de rata ICR62 y una region marco conservada de cadena ligera procedente de una o mas secuencias genicas de region variable de lmea germinal humana, en el que dicha CDR modificada de cadena ligera comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en la posicion Kabat seleccionada de entre el grupo que consiste en 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, y cualquier combinacion de las mismas, y en el que dicho polipeptido, como parte de una molecula de union a antfgeno, se une espedficamente a EGFR humano. En una realizacion espedfica, las CDR modificadas de cadena ligera comprenden sustituciones de aminoacidos en todas las posiciones dentro de las CDR de cadena ligera de Kabat y Chothia, excepto en las SDR. En otra realizacion espedfica, las CDR modificadas de cadena ligera comprenden sustituciones de aminoacidos en todas las posiciones dentro de las CDR de cadena ligera de Kabat y Chothia excepto en las posiciones Kabat 34 y 50. La divulgacion tambien esta dirigida a polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos aislados. La divulgacion tambien esta dirigida a una ABM que comprende los polipeptidos aislados.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID nO: 128, SEQ ID nO:129, sEq ID NO:130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, y SEQ ID NO:147, en el que dicho polipeptido, como parte de una molecula de union a antfgeno, se une espedficamente a EGFR humano. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una celula huesped transfectada con el polinucleotido, o a un vector que comprende el polinucleotido. En una realizacion, el vector es un vector de clonacion replicativo. En otra realizacion, el vector es un vector de expresion.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un metodo para producir una molecula de union a antfgeno que es capaz de competir con el anticuerpo monoclonal de rata ICR62 por la union a EGFR humano, comprendiendo el metodo cultivar una celula huesped de la divulgacion en un medio en condiciones que permiten la expresion de uno o mas polinucleotidos que codifican una molecula de union a antfgeno, y recuperar la molecula de union a antfgeno.

En otro aspecto, las ABM de la divulgacion se han modificado por glucoingeniena para tener una estructura de oligosacarido alterada en la region Fc. En una realizacion particular, la region Fc posee un numero reducido de restos de fucosa en comparacion con la ABM correspondiente no modificada por glucoingeniena.

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En otro aspecto la divulgacion esta dirigida a composiciones que comprenden una ABM de la divulgacion y un vetnculo farmaceuticamente aceptable. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un metodo dirigirse a celulas que expresan EGFR en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composicion de la presente invencion. En una realizacion particular, las celulas sobreexpresan EGFR. En otra realizacion particular, el metodo se realiza para tratar un trastorno tratable mediante el bloqueo de la senalizacion celular mediada por EGFR en dicho sujeto. En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a ABM de la invencion para utilizar en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno tratable mediante el bloqueo de la senalizacion celular mediada por EGFR. En una realizacion, el trastorno es un trastorno de la proliferacion celular. En una realizacion particular, el trastorno de la proliferacion celular es cancer. En una realizacion mas particular, el cancer se selecciona de entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de vejiga, cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de pancreas, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de rinon, y cancer de cerebro.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de entre un grupo que consiste en: SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO: 122, y SEQ ID NO:124; (b) una secuencia seleccionada de entre un grupo que consiste en: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, y SEQ ID NO:126; y (c) SEQ ID NO:108. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114; (b) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:116 y SEQ ID NO:118; y (c) SEQ ID NO:119. En una realizacion, cualquiera de estos polinucleotidos codifica un polipeptido de fusion. En otra realizacion, la presente invencion excluye cualquiera o todos estos polinucleotidos aislados.

En otro aspecto mas, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO: 120. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID nO:44; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:50; y SEQ ID NO.:52. En una realizacion, dichos polinucleotidos codifican polipeptidos de fusion. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos estos polinucleotidos aislados.

La divulgacion esta ademas dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos una identidad del 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:120, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. En un aspecto adicional, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos una identidad del 80 % con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:50; y SEQ ID NO.:52, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos de estos polinucleotidos aislados. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos de estos polinucleotidos aislados.

La divulgacion tambien esta dirigida a un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido quimerico que posee la secuencia de SEQ ID NO.:1. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de SEQ ID NO:1; y una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie diferente de la rata. La divulgacion tambien esta dirigida a un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido quimerico que posee una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO.:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:121. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:121; y una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie diferente de la rata. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos estos polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos.

En otro aspecto mas, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido quimerico que posee la secuencia de SEQ ID NO.:43. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de SEQ ID NO.:43; y una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie diferente de la rata.

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En otro aspecto mas, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido quimerico que posee una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; e SEQ ID NO.:51. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:45; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO.:51, y una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de una region constante de cadena ligera de anticuerpo (CL), o un fragmento de la misma, de una especie diferente de la rata. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos estos polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos.

La divulgacion tambien esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee la region VH del anticuerpo ICR62, o variantes funcionales de la misma, y una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie diferente de la rata. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee la region VL del anticuerpo ICR62, o variantes funcionales del mismo, y una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de una region CL de un anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie diferente de la rata.

La divulgacion esta dirigida tambien a un vector de expresion que comprende cualquiera de los polinucleotidos aislados descritos anteriormente, y a una celula huesped que comprende dicho vector de expresion. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una celula huesped que comprende cualquiera de los polinucleotidos aislados descritos anteriormente.

En un aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polipeptido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de entre un grupo que consiste en: SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:123, y SEQ ID NO:125; (b) una secuencia seleccionada de entre un grupo que consiste en: SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, y SEQ ID NO:127; y (c) SEQ ID NO:107, en el que dicho polipeptido es un polipeptido de fusion. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos de estos polipeptidos aislados. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un polipeptido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:113; (b) SEQ ID NO:115, y (c) SEQ ID NO: 117, en el que dicho polipeptido es un polipeptido de fusion. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos de estos polipeptidos aislados.

La divulgacion tambien esta dirigida a un polipeptido quimerico que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 o una variante de la misma. La divulgacion esta dirigida tambien a un polipeptido quimerico que comprende la secuencia de SEQ ID NO:43 o una variante de la misma. En una realizacion, cualquiera de estos polipeptidos comprende ademas una region Fc humana y/o una region CL humana. La divulgacion tambien esta dirigida a un polipeptido quimerico que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:121, o una variante de las mismas. La divulgacion esta dirigida tambien a un polipeptido quimerico que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID nO:45; SeQ ID NO:49; y SEQ ID NO:51, o una variante de las mismas. En una realizacion, cualquiera de estos polipeptidos comprende ademas una region Fc humana y/o una region CL humana. En una realizacion, la region Fc humana comprende IgG1.

En otro aspecto la divulgacion esta dirigida a un polipeptido que comprende una secuencia procedente del anticuerpo ICR62 y una secuencia procedente de un polipeptido heterologo y a una molecula de union a antfgeno que comprende dicho polipeptido. En una realizacion la molecula de union a antfgeno es un anticuerpo. En una realizacion preferida, el anticuerpo es quimerico. En otra realizacion preferida, el anticuerpo esta humanizado o primatizado.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM, que es capaz de competir con el anticuerpo de rata ICR62 por la union a EGFR y que es quimerico. En una realizacion, la ABM es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En otra realizacion, la ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una region VH que posee una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1; SEQ ID nO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:121. En otra realizacion, la ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una region VL que posee una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:43, SeQ ID NO:45; SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:51. En otra realizacion la ABM es un anticuerpo recombinante que esta primatizado. En otra realizacion mas, la ABM es un anticuerpo recombinante que esta humanizado. En otra realizacion, la ABM es un anticuerpo recombinante que comprenden una region Fc humana. En otra realizacion, cualquiera de las ABM discutidas anteriormente puede conjugarse con una porcion como una toxina o un marcador radiactivo.

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La divulgacion esta relacionada ademas con una ABM como se ha descrito en el presente documento, teniendo dicha ABM oligosacaridos modificados. En una realizacion los oligosacaridos modificados poseen fucosilacion reducida en comparacion con los oligosacaridos no modificados. En otras realizaciones, los oligosacaridos modificados son hforidos o complejos. En otra realizacion, la ABM posee una proporcion aumentada de oligosacaridos no fucosilados o biseccionados, oligosacaridos no fucosilados en la region Fc de dicha molecula. En una realizacion, los oligosacaridos no fucosilados biseccionados, son hforidos. En otra realizacion, los oligosacaridos no fucosilados biseccionados, son complejos. En una realizacion, al menos el 20 % de los oligosacaridos en la region Fc de dicho polipeptido son no fucosilados o biseccionados, no fucosilados. En realizaciones mas preferidas, al menos el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 % o mas de los oligosacaridos son no fucosilados o biseccionados, no fucosilados.

La divulgacion esta relacionada ademas con un polinucleotido que codifica cualquiera de las ABM descritas anteriormente, y con vectores de expresion y celulas que comprenden dicho polinucleotido.

La divulgacion esta relacionada ademas con un metodo para producir una ABM, que es capaz de competir con el anticuerpo de rata ICR62 por la union a EGFR y en el que dicha ABM es quimerica; comprendiendo dicho metodo:

(a) cultivar una celula huesped que comprende un polinucleotido que codifica una ABM descrita en el presente documento en un medio en condiciones que permiten la expresion de dicho polinucleotido que codifica dicha ABM; y

(b) recuperar dicha ABM del cultivo resultante.

En otro aspecto, la divulgacion esta relacionada con una composicion farmaceutica que comprende la ABM descrita en el presente documento. Se contempla que la composicion farmaceutica puede comprender ademas un vehfculo, un adyuvante o una combinacion de los mismos farmaceuticamente aceptables.

En otro aspecto, la divulgacion esta relacionada con el tratamiento de una enfermedad que se caracteriza por la expresion de EGFR (por ejemplo, expresion anomala o sobreexpresion de EGFR). El tratamiento comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de la ABM descrita en el presente documento a un sujeto, preferentemente un sujeto mairnfero, y mas preferentemente un humano que lo necesite. En una realizacion preferida, la enfermedad debe tratarse mediante la administracion de una ABM que es un anticuerpo quimerico (por ejemplo humanizado), o un fragmento quimerico de un anticuerpo. En una realizacion, la ABM debe administrarse en una cantidad de alrededor de 1,0 mg/kg a alrededor de 15,0 mg/kg. En otra realizacion, la ABM debe administrarse en una cantidad de alrededor de 15 mg/kg a alrededor de 12,0 mg/kg. En otra realizacion, la ABM debe administrarse en una cantidad de alrededor de 1,5 mg/kg a alrededor de 4,5 mg/kg. En otra realizacion, la ABM debe administrarse en una cantidad de alrededor de 4,5 mg/kg a alrededor de 12,0 mg/kg. En otra realizacion, la ABM debe administrarse en una cantidad seleccionada de entre el grupo que consiste en alrededor de 1,5, alrededor de 4,5, y alrededor de 12,0 mg/kg.

En otro aspecto mas, la divulgacion esta relacionada con una celula huesped modificada por ingeniena para expresar al menos un acido nucleico que codifica un polipeptido que posee actividad GnTIII en una cantidad suficiente para modificar los oligosacaridos en la region Fc de la ABM producida por la celula huesped, en la que la ABM es capaz de competir con el anticuerpo de rata ICR62 por la union a EGFR y en el que la aBm es quimerica. En una realizacion, el polipeptido que posee actividad GnTIII es un polipeptido de fusion. En otra realizacion, la ABM producida por la celula huesped es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo esta humanizado. En otra realizacion, la ABM comprende una region equivalente a la region Fc de una IgG humana.

La divulgacion tambien esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) region determinante de la complementariedad del anticuerpo de rata lCR62, o una variante o forma truncada de la misma que contiene al menos los restos determinantes de la especificidad para dicha region determinante de la complementariedad, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. Preferentemente, dichos polinucleotidos aislados codifican un polipeptido de fusion que es una molecula de union a antfgeno. En una realizacion, el polinucleotido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo de rata ICR62, o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen al menos los restos determinantes de la especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de la complementariedad. En otra realizacion, el polinucleotido codifica toda la region variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo quimerico (por ejemplo, humanizado). La divulgacion esta dirigida tambien a los polipeptidos codificados por dichos polinucleotidos.

En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a una molecula de union a antfgeno que comprende al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) region determinante de la complementariedad del anticuerpo de rata lCR62, o una variante o forma truncada de la misma que contiene al menos los restos determinantes de la especificidad para dicha region determinante de la complementariedad, y que comprende una secuencia procedente de un polipeptido heterologo. En una realizacion, la molecula de union a antfgeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo de rata ICR62, o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen al menos los restos determinantes de la especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de la complementariedad. En otro aspecto, la molecula de union a antfgeno comprende la region

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variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo. En una realizacion particularmente util, la molecula de union a antigeno es un anticuerpo quimerico, por ejemplo, humanizado. La divulgacion tambien esta dirigida a metodos para elaborar dichas moleculas de union a antigeno, y al uso de las mismas en el tratamiento de enfermedades, que incluyen neoplasias malignas como canceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, pancreas, pulmon, mama, ovario, colon, prostata, piel y rinon.

La celula huesped como se ha descrito en el presente documento pueden seleccionarse de entre el grupo que incluye, pero no se limita a, una celula HEK293-EBNA, una celula CHO, una celula BHK, una celula NSO, una celula SP2/0, una celula de mieloma YO, una celula de mieloma de raton P3X63, una celula PER, una celula PER.C6 o una celula de hibridoma. En una realizacion, la celula huesped como se ha descrito en el presente documento comprende ademas un polinucleotido transfectado que comprende un polinucleotido que codifica la region VL del anticuerpo de rata ICR62 o variantes del mismo y una secuencia que codifica una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina humana. En otra realizacion, la celula huesped como se ha descrito en el presente documento comprende ademas un polinucleotido transfectado que comprende un polinucleotido que codifica la region VH del anticuerpo de rata ICR62 o variantes del mismo y una secuencia que codifica una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina humana.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una celula huesped que produce una ABM que presenta una afinidad de union aumentada al receptor de Fc y/o una funcion efectora aumentada como resultado de la modificacion de sus oligosacaridos. En una realizacion, la afinidad de union aumentada es por un receptor de Fc, en particular, el receptor FcyRIIIA. La funcion efectora contemplada en el presente documento puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, pero no se limita a, aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc; aumento de la union a celulas NK; aumento de la union a macrofagos; aumento de la union a celulas polimorfonucleares; aumento de la union a monocitos; aumento de apoptosis inducida por senalizacion directa; aumento de la maduracion de celulas dendnticas; y aumento de la sensibilizacion de linfocitos T.

En otra realizacion, la celula huesped como se ha descrito en el presente documento comprende al menos un acido nucleico que codifica un polipeptido que posee actividad GnTIII que esta unido de forma operativa a un elemento constitutivo del promotor.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un metodo para producir una ABM en una celula huesped, que comprende: (a) cultivar una celula huesped modificada para expresar al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de fusion que posee actividad GnTIII en condiciones que permiten la produccion de dicha ABM y que permiten la modificacion de los oligosacaridos presentes en la region Fc de dicha ABM; y (b) aislar dicha ABM; en el que dicha ABM es capaz de competir con el anticuerpo de rata ICR62 por la union a EGFR y en el que dicha ABM es quimerica (por ejemplo, humanizada). En una realizacion, el polipeptido que posee actividad GnTIII es un polipeptido de fusion, preferentemente que comprende el dominio catalttico de GnTIII y el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi seleccionado de entre el grupo que consiste en el dominio de localizacion de manosidasa II, el dominio de localizacion de p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I ("GnTI"), el dominio de localizacion de manosidasa I, el dominio de localizacion de p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II ("GnTII"), y el dominio de localizacion de al-6 fucosiltransferasa central. Preferentemente, el dominio de localizacion en el Golgi es de manosidasa II o GnTI.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un metodo para modificar el perfil de glicosilacion de una ABM anti- EGFR producida mediante una celula huesped que comprende introducir en la celula huesped al menos un acido nucleico o vector de expresion de la invencion. En una realizacion, la ABM es un anticuerpo o un fragmento del mismo; preferentemente que comprende la region Fc de un IgG. Alternativamente, el polipeptido es una protema de fusion que incluye una region equivalente a la region Fc de una IgG humana.

En un aspecto, la divulgacion esta relacionada con un anticuerpo quimerico, recombinante, o un fragmento del mismo, capaz de competir con el anticuerpo de rata ICR62 por la union a EGFR y tener una fucosilacion reducida.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un metodo para modificar la glicosilacion del anticuerpo recombinante o un fragmento del mismo de la invencion mediante el uso de un polipeptido de fusion que posee actividad GnTIII y que comprende el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi. En una realizacion, los polipeptidos de fusion de la invencion comprenden el dominio catalttico de GnTIII. En otra realizacion, el dominio de localizacion en el Golgi se selecciona de entre el grupo que consiste en: el dominio de localizacion de manosidasa II, el dominio de localizacion de GnTI, el dominio de localizacion de manosidasa I, el dominio de localizacion de GnTII y el dominio de localizacion de al-6 fucosiltransferasa central. Preferentemente, el dominio de localizacion en el Golgi es de manosidasa II o GnTI.

En una realizacion, el metodo como se ha descrito en el presente documento esta dirigido hacia la produccion de un anticuerpo quimerico recombinante, o un fragmento del mismo, con oligosacaridos modificados en los que dichos oligosacaridos modificados poseen fucosilacion reducida en comparacion con oligosacaridos no modificados. De acuerdo con la presente invencion, estos oligosacaridos modificados pueden ser hfbridos o complejos. En otra realizacion, el metodo como se ha descrito en el presente documento esta hacia la produccion de un anticuerpo

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quimerico recombinante, (por ejemplo, humanizado) o un fragmento del mismo que posee una proporcion aumentada de oligosacaridos no fucosilados biseccionados, en la region Fc de dicha molecula. En una realizacion, los oligosacaridos biseccionados no fucosilados son tnbridos. En otra realizacion, los oligosacaridos biseccionados no fucosilados son complejos. En otra realizacion, el metodo como se ha descrito en el presente documento esta dirigido hacia la produccion de un anticuerpo quimerico recombinante, o un fragmento del mismo que posee al menos un 20 % de los oligosacaridos en la region Fc de dicho polipeptido, que son biseccionados, no fucosilados. En una realizacion preferida, al menos el 30 % de los oligosacaridos en la region Fc de dicho polipeptido son biseccionados, no fucosilados. En otra realizacion preferida, en la que al menos el 35 % de los oligosacaridos en la region Fc de dicho polipeptido son biseccionados, no fucosilados.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un anticuerpo quimerico recombinante, o un fragmento del mismo, que presenta una afinidad de union aumentada al receptor de Fc y/o una funcion efectora aumentada como resultado de la modificacion de sus oligosacaridos. En una realizacion, el aumento de la afinidad de union se debe a un receptor activador de Fc. En otra realizacion, el receptor de Fc es un receptor activador de Fcy, en particular, el receptor FcyRIIIA. La funcion efectora contemplada en el presente documento puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, pero no se limita a, aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc; aumento de la union a celulas NK; aumento de la union a macrofagos; aumento de la union a celulas polimorfonucleares; aumento de la union a monocitos; aumento de la apoptosis inducida por senalizacion directa; aumento de la maduracion de celulas dendnticas; y aumento de la sensibilizacion de linfocitos T.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a un fragmento de anticuerpo quimerico recombinante, (por ejemplo, humanizado), que posee la especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 y que contiene la region Fc, que esta modificada por ingeniena para tener una funcion efectora aumentada producida por cualquiera de los metodos de la presente invencion.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una protema de fusion que incluye un polipeptido que posee una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1; SeQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:9; SEQ m No:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:121, y una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina y modificada por ingeniena para tener una funcion efectora aumentada producida por cualquiera de los metodos descritos en el presente documento. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos estos polipeptidos aislados.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una protema de fusion que incluye un polipeptido que posee una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45; SEQ ID nO:49; e SEQ ID NO:51 y una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina y modificada por ingeniena para tener una funcion efectora aumentada producida por cualquiera de los metodos descritos en el presente documento. En otro aspecto, la divulgacion excluye cualquiera o todos estos polipeptidos aislados.

En un aspecto, la divulgacion esta dirigida a una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo recombinante, quimerico (por ejemplo, humanizado), producido por cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, y un vehmulo farmaceuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a una composicion farmaceutica que comprende un fragmento recombinante, quimerico (por ejemplo, humanizado) de anticuerpo producido por cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, y un vehmulo farmaceuticamente aceptable. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una composicion farmaceutica que comprende una protema de fusion producida por cualquiera de los metodos de la presente invencion, y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invencion esta dirigida a un metodo para dirigirse in vivo o in vitro a celulas que expresan EGFR. En una realizacion, la presente invencion esta dirigida a una composicion que comprende una ABM descrita en el presente documento para su uso para dirigirse a celulas que expresan EGFR en un sujeto.

En otro aspecto mas, la divulgacion esta dirigida a un metodo para la deteccion in vivo o in vitro de la presencia de EGFR en una muestra, por ejemplo, para el diagnostico de un trastorno relacionado con la expresion de EGFR. En una realizacion, la deteccion se realiza poniendo en contacto una muestra a analizar, opcionalmente con una muestra control, con una ABM como se ha descrito en el presente documento, en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre la ABM y EGFR. La formacion del complejo se detecta entonces (por ejemplo, mediante ELISA u otros metodos conocidos en la tecnica). Cuando se utiliza una muestra control con las muestras de analisis, cualquier diferencia estadfsticamente significativa en la formacion de complejos ABM-EGFR cuando se comparan las muestras de analisis y control es indicativa de la presencia de EGFR en la muestra de analisis.

La divulgacion esta dirigida tambien a un metodo para tratar un trastorno relacionado con la expresion de EGFR, en particular, un trastorno de proliferacion celular en el que se expresa EGFR, y mas en particular, en el que EGFR se expresa de forma anomala (por ejemplo, se sobreexpresa), que incluye canceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, pancreas, pulmon, mama, ovario, colon, prostata, piel y rinon, que comprende administrar una cantidad

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terapeuticamente eficaz del anticuerpo quimerico recombinante, (por ejemplo, humanizado) o fragmento del mismo, producido por cualquiera de los metodos como se ha descrito en el presente documento, a un sujeto humano que lo necesite.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra la actividad funcional de cadenas ligeras y pesadas de polipeptido individuales de ICR62 quimerico de rata-humano cuando se combina con las construcciones ICR62 humanizadas 1-HHC (cadena pesada) e I-KB (cadena ligera). rVL representa la cadena ligera quimerica, y rVH representa la cadena pesada quimerica. La designacion "r" indica que los dominios variables son del anticuerpo de rata original La Figura 2 muestra la actividad de union de anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden construcciones de region variable de cadena pesada I-HHC, I-HHA y I-HLA y construcciones de region variable de cadena ligera I-KAy I-KB emparejadas en varias configuraciones.

La Figura 3 muestra la actividad de union de anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden construcciones de region variable de cadena pesada I-HLB, I-HLC y I-HLA y construcciones de region variable de cadena ligera I-KAy I-KC emparejadas en varias configuraciones.

La Figura 4 muestra la actividad de union de anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden construcciones de region variable de cadena pesada I-HLA2, I-HLA3 y I-HLA4 y construcciones de region variable de cadena ligera I-KC humanizadas en comparacion con anticuerpo quimerico ICR62 de rata-humano.

La Figura 5 muestra la actividad de union de anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden construcciones de region variable de cadena pesada I-HLA1, I-HLA3, I-HLA5 y I-HLA6 y construcciones de region variable de cadena ligera de I-KC humanizadas en comparacion con anticuerpo quimerico ICR62 de rata-humano La Figura 6 muestra la actividad de union de anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden construcciones de region variable de cadena pesada I-HLA7, I-HLA6, y I-HHB y construcciones de region variable de cadena ligera I-KC humanizadas en comparacion con anticuerpo quimerico ICR62 de rata-humano La Figura 7 muestra la actividad de union de anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden construcciones de region variable de cadena pesada I-HHF, I-HLA9. y I-HLA8 y construcciones de region variable de cadena ligera de I-KC humanizados en comparacion con anticuerpo quimerico ICR62 de rata-humano La Figura 8 muestra la actividad de union de anticuerpos humanizados que comprenden construcciones de region variable de cadena pesada I-HHB, I-HHD, I-HHG, I-HHF, I-HLA7, y I-HLA9 y construcciones de region variable de cadena ligera de I-KC humanizados.

La Figura 9 muestra una comparacion de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (CCDA) para varias glucoformas del anticuerpo quimerico ICR62, asf como para las variantes de I-HLA4 humanizadas. "G1" se refiere a la modificacion por glucoingeniena del anticuerpo mediante coexpresion con GnTIII "G2" se refiere a la modificacion por glucoingeniena del anticuerpo mediante coexpresion con GnTIII y ManII. "WT" se refiere a anticuerpos que no se han modificado por glucoingeniena. Las construcciones de cadena pesada humanizadas se emparejaron con la construccion de cadena ligera de I-KC.

La Figura 10 muestra una comparacion de CCDA para la forma no modificada por glucoingeniena (WT) y la glucoforma G2 (es decir, modificada por glucoingeniena mediante la coexpresion con GnTIII y ManII) de las construcciones de anticuerpos ICR62 humanizados I-HHB y IHLA7. Los mismos anticuerpos se aplicaron a dos lmeas celulares diana diferentes: En el Panel A, se utilizo la lmea celular diana LN229; en el Panel B, se utilizo la lmea celular diana A431. Las construcciones de cadena pesada humanizadas se emparejaron con la construccion de cadena ligera de I-KC.

Las Figuras 11A y 11B muestran una comparacion de CCDA para formas no modificadas por glucoingeniena (WT, de wild type, natural) y glucoformas G2 de ICR62 quimerico y las construcciones de anticuerpo ICR62 humanizadas I-HHB y I-HLA7. Se utilizo la lmea celular diana A431. Las construcciones de cadena pesada humanizadas se emparejaron con la construccion de cadena ligera de I-KC.

La Figura 12 muestra una comparacion de CCDA en 72h para las glucoformas G2 de ICR62 quimerico y las construcciones de anticuerpo ICR62 humanizadas I-HHB e I-HLA7. Las construcciones de cadena pesada humanizadas se emparejaron con la construccion de cadena ligera de I-KC.

La Figura 13 muestra un alineamiento de secuencias de aminoacido de construcciones de region variable de cadena pesada de ICR62 humanizadas en comparacion con las secuencias de ICR62 de rata. Los puntos representan identidad de restos de aminoacido en una posicion determinada en una construccion determinada.

La Figura 14 muestra un ensayo de union FcgammaRIIIa-Fc utilizando celulas CHO que presentan FcgammaRIIIa recombinante humano. Un anticuerpo IgG1 anti-EGFR humanizado I-HHB/KC modificado por glucoingeniena en comparacion con un anticuerpo no modificado por glucoingeniena (WT).

La Figura 15 muestra un perfil de oligosacarido EM-MALDI/TOF para un anticuerpo IgG1 anti-EGFR humanizado I-HHB/KC modificado por glucoingeniena. La modificacion por glucoingeniena se logro mediante la sobreexpresion en las celulas productoras de anticuerpo de los genes que codifican enzimas con actividades GnTIII y Manosidasa II de Golgi, proporcionando alrededor de un 70 % de oligosacaridos unidos Fc-Asn297 no fucosilados.

La Figura 16 muestra un perfil de precision anti-EGFR (n=6 replicas a lo largo del intervalo de calibracion) para la determinacion de anti-EGFR en matriz de suero de mono al 1 % (suero de mono CMS25/31/33, suministrado por HLS).

La Figura 17 muestra una curva de calibracion representativa anti-EGFR para la determinacion de anti-EGFR en de matriz de suero de mono al 1 %.

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La Figura 18 muestra concentraciones sericas de anti-EGFR el dfa 1 de la administracion intravenosa semanal de anti- EGFR a monos cinomolgos macho.

La Figura 19 muestra concentraciones sericas de anti-EGFR el dfa 1 de la administracion intravenosa semanal de anti- EGFR a monos cinomolgos hembra.

La Figura 20 muestra la relacion entre areas bajo la curva de tiempos de concentracion serica de anti-EGFR (ABC16B) y nivel de dosis el dfa 1 de la administracion intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos.

La Figura 21 muestra concentraciones sericas de anti-EGFR durante la administracion intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos macho.

La Figura 22 muestra concentraciones sericas de anti-EGFR durante la administracion intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos hembra.

La Figura 23 muestra el perfil de oligosacaridos EM-MALDI/TOF de anticuerpo anti- EGFR (modificado por glucoingeniena) con Fc modificado por glucoingeniena utilizado en los estudios en mono in vivo descritos en los ejemplos siguientes en el presente documento.

La Figura 24 muestra la union a EGFR expresada en la superficie de celulas de carcinoma epidermoide A431 humano. El anticuerpo utilizado para el estudio de union fue el anticuerpo anti-EGFR con Fc modificado por glucoingeniena (construccion I-HHB) utilizado para los estudios en mono in vivo descritos en los ejemplos siguientes en el presente documento.in vivo

La Figura 25 muestra la union a EGFR expresado en la superficie de celulas de rinon de mono COS-7. El anticuerpo utilizado fue anticuerpo anti-EGFR (cadena pesada I-HHB; cadena ligera I-KC). Para referencia, se muestra la union a celulas con baja expresion de EGFR humano, celulas de cancer de mama MCF-7.

La Figura 26 muestra la union Fc-FcgammaRIIIa utilizando una celula completa (celulas CHO modificadas por ingeniena para expresar FcgRIIIa humano en su superficie). El anticuerpo utilizado fue el anticuerpo anti-EGFR con Fc-modificado por ingeniena (modificado por glucoingeniena) utilizado para los estudios en mono in vivo descritos en los ejemplos que vienen a continuacion. Para comparacion, se muestra la union a de un anticuerpo IgG1 control con Fc no modificado por glucoingeniena (no modificado).

La Figura 27 muestra CCDA mediada por anticuerpo anti-EGFR con Fc modificado por ingeniena (modificado por glucoingeniena). Las celulas diana son A549 humano celulas de carcinoma de pulmon. Para comparacion, se muestra la actividad CCDA para la forma con Fc no modificado por ingeniena (no modificada)del anticuerpo.

La Figura 28 muestra CCDA mediada por anticuerpo anti-EGFR con Fc modificado (modificado por glucoingeniena). Las celulas diana son de la lmea celular de queratinocito de mono cinomolgos CYNOM-K1. Para comparacion, se muestra la actividad CCDA para la forma con Fc no modificado por ingeniena (no modificada)

La Figura 29 muestra la union a la diana de EGFR de varias variantes de construccion de cadena ligera basadas en la construccion I-KC emparejada con la construccion de cadena pesada I-HHD.

La Figura 30 muestra la union a la diana de EGFR de varias variantes de construccion de cadena ligera basadas en la construccion I-KC emparejada con la construccion de cadena pesada I-HHD.

La Figura 31 muestra la union a la diana de EGFR de varias variantes de construccion de cadena pesada basadas en la construccion I-HHD emparejada con la construccion de cadena ligera I-KC.

La Figura 32 muestra la union a la diana de EGFR de varias variantes de construccion de cadena pesada basadas en la construccion I-HHD emparejada con la construccion de cadena ligera I-KC.

Descripcion detallada de la invencion

Los terminos que se utilizan en el presente documento son en general los mismos que se utilizan en la tecnica, a no ser que se definan de otra manera como sigue a continuacion.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino anticuerpo pretende incluir las moleculas de anticuerpo completas, que incluyen anticuerpos monoclonales, policlonales y multiespedficos (por ejemplo, biespedficos), asf como fragmentos de anticuerpo que poseen la region Fc y conservan la especificidad de union, y protemas de fusion que incluyen una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina y que conservan la especificidad de union. Tambien estan abarcados los fragmentos de anticuerpo que conservan la especificidad de union que incluye, pero no se limita a, fragmentos VH, fragmentos VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos (vease, por ejemplo, Hudson y Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)). Tambien estan abarcados los anticuerpos humanizados, primatizados y quimericos.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion region Fc pretende referirse a una region C-terminal de una cadena pesada de IgG. Aunque los lfmites de la region Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la region Fc de la cadena pesada de IgG humana esta definida normalmente para abarcar desde el resto de aminoacido en la posicion Cys226 hasta el carboxilo terminal.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina pretende incluir variantes alelicas de la region Fc de una inmunoglobulina que aparecen de forma natural asf como variantes que poseen alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o eliminaciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina de mediar funciones efectoras (como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo). Por ejemplo, uno o mas aminoacidos pueden delecionarse del extremo N terminal o extremo C terminal de la region Fc de una inmunoglobulina sin una perdida sustancial de la funcion biologica. Dichas

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variantes pueden seleccionarse de acuerdo con las reglas generales conocidas en la tecnica para tener un mmimo efecto sobre la actividad. (Vease, por ejemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990).

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino EGFR se refiere al receptor del factor de crecimiento epidermico humano (tambien conocido como HER-1 o Erb-B1) (Ulrich, A. et al., Nature 309:418-425 (1984); SwissProt N° de acceso P00533; numeros de acceso secundarios: 000688, 000732, P06268, Q14225, Q92795, Q9BZS2, Q9GZX1, Q9H2C9, Q9H3C9, Q9UMD7, Q9UMD8, Q9UMG5), asf como las isoformas naturales y variantes de las mismas. Dichas isoformas y variantes incluyen pero no se limitan a la variante EGFRvIII, los productos alternativos de corte y empalme (por ejemplo, los identificados por el SwissProt con numero de acceso P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4), variantes GLN-98, ARG-266, Lys-521, ILE-674, GLY-962, y PRO-988 (Livingston, R.J. et al., NIEHS-SNPs, environmental genome project, NIEHs ES15478, Department of Genome Sciences, Seattle, WA (2004)), y otros identificados mediante los siguientes numeros de acceso: NM_005228.3, NM_201282.1, NM_201283.1, NM_201284.1 (REFSEQ mRNAs); AF125253.1, AF277897.1, AF288738.1,

AI217671.1, AK127917.1, AL598260.1, AU137334.1, AW163038.1, AW295229.1, BC0S7802.1, CB160831.1, K03193.1, U48722.1, U95089.1, X00588.1, X00663.1; H54484S1, H54484S3, H54484S2 (ensamblaje MIPS); DT.453606, DT.86855651, DT.95165593, DT. 97822681, DT.95165600, DT.100752430, DT.91654361,

DT.92034460, DT.92446349, DT.97784849, DT.101978019, DT.418647, DT.86842167, DT-91803457,

DT.92446350, DT.95153003, DT.95254161, DT97816654, DT.87014330, DT.87079224 (ensamblaje DOTS).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion ligando de EGFR se refiere a un polipeptido que se une a y/o activa EGFR. La expresion incluye formas precursoras unidas a membrana del ligando de EGFR, asf como formas solubles procesadas proteolfticamente del ligando de EGFR.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion activacion de EGFR por ligando se refiere a la transduccion de senales (por ejemplo, las provocadas por un dominio quinasa intracelular de los restos de tirosina que fosforilan el receptor de EGFR en el EGFR o un polipeptido sustrato) mediada por la union del ligando de EGFR.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion enfermedad o trastorno caracterizado por la activacion o produccion anomala de EGFR o un ligando de EGFR o trastorno relacionado con la expresion de EGFR, se refiere a una afeccion, que puede o no involucrar neoplasia maligna o cancer, en el que la activacion y/o produccion anomala de EGFR y/o un ligando de EGFR ocurre en celulas o tejidos de un sujeto que tiene, o esta predispuesto a la enfermedad o trastorno.

Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos sobreexpresar, sobreexpresado, y sobreexpresion, tal como se utiliza en conexion con las celulas que expresan EGFR, se refiere a celulas que tienen niveles mayores mesurables de EGFR en la superficie de las mismas en comparacion con una celula normal del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresion puede estar provocada por amplificacion genica o mediante aumento de la transcripcion o traduccion. La expresion de EGFR (y por lo tanto, la sobreexpresion) puede estar determinada en un ensayo diagnostico o pronostico mediante la evaluacion de los niveles de EGFR presentes en la superficie de una celula o en un lisado celular mediante tecnicas que son conocidas en la tecnica: por ejemplo, mediante un ensayo inmunohistoqmmico, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo inmunoenzimatico, ELISA, citometna de flujo, radioinmunoensayo, transferencia de Western, union a ligando, actividad quinasa, etc. (vease en general, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J., ed., Academic Press (2a ed., 1998); CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coligan, J.E. et al., eds., John Wiley & Sons (1995-2003); vease tambien, Sumitomo et al., Clin. Cancer Res. 10: 794-801 (2004) (que describen la transferencia de Western, la citometna de flujo, y la inmunohistoqmmica)). De forma alternativa o adicional, uno puede medir los niveles de moleculas de acido nucleico en la celula que codifican EGFR, por ejemplo, mediante hibridacion fluorescente in situ, transferencia de Southern, o tecnicas de PCR. Los niveles de EGFR en celulas normales se comparan con los niveles de celulas afectadas por un trastorno de proliferacion celular (por ejemplo, cancer) para determinar si EGFR se sobreexpresa.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion molecula de union a andgeno se refiere en su sentido mas amplio a una molecula que se une espedficamente a un determinante antigenico. Una molecula de union a antfgeno puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se puede unir espedficamente a un determinante antigenico. Mas espedficamente, una molecula de union a antfgeno que se une a EGFR es una molecula que se une espedficamente a un receptor transmembrana de 170 kDa, denominado normalmente como receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR), pero tambien conocido como HER-1 o ErbB1. Por "se une espedficamente" se entiende que la union es selectiva para el antfgeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no espedficas.

Tal como se utiliza en el presente documento, los las expresiones de fusion y quimerico, cuando se utilizan en referencia a polipeptidos como las ABM se refieren a polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos procedentes de dos o mas polipeptidos heterologos, tales como porciones de anticuerpos de diferentes especies. Para las ABM quimericas, por ejemplo, los componentes que no se unen a antfgenos pueden proceder de una amplia variedad de especies, que incluyen primates como los chimpances y seres humanos. La region constante de la ABM quimerica es mas preferentemente sustancialmente identica a la region constante de un anticuerpo natural humano; la region variable del anticuerpo quimerico es mas preferentemente sustancialmente a la de un anticuerpo

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recombinante anti-EGFR que posee una secuencia de aminoacidos de una region variable murina. Los anticuerpos humanizados son una forma particularmente preferida de anticuerpo de fusion o quimerico.

Tal como se utiliza en el presente documento, un polipeptido que posee actividad GnTIII se refiere a polipeptidos que son capaces de catalizar la adicion de un resto de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en una union p-1-4 al manosido p-ligado de un nucleo trimanosil de oligosacaridos N-ligados. Esto incluye polipeptidos de fusion que presentan actividad enzimatica similar a, pero no necesariamente identica a, una actividad de p(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III, tambien conocida como p-1,4-manosil-glucoprotema 4-beta- -acetilglucosaminil- transferasa (EC 2.4.1.144), de acuerdo con el Comite de Nomenclatura de la Union Internacional de Bioqmmica y Biologfa Molecular (NC-IUBMB, por sus siglas en ingles), tal como se mide en un ensayo biologico particular, con o sin dependencia de dosis. En el caso en el que exista la dependencia de dosis, no necesita ser identica a la de GnTIII, sino mas bien sustancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad determinada en comparacion con GnTIII (es decir, el polipeptido candidato presentara mayor actividad o no mas de alrededor de 25 veces menos y preferentemente, no mas de alrededor de diez veces menos actividad, y mas preferentemente, no mas de alrededor de tres veces menos actividad en relacion a la de GnTIII.)

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino variante (o analogo) se refiere a un polipeptido que difiere a un polipeptido espedficamente detallado de la invencion mediante inserciones, eliminaciones, y sustituciones de aminoacidos, creado mediante el uso por ejemplo, de tecnicas de ADN recombinante. Las variantes de ABM tal como se ha descrito en el presente documento incluyen moleculas de union a antfgeno quimericas, primatizadas o humanizadas en las que uno o varios de los restos de aminoacido estan modificados mediante sustitucion, adicion y/o eliminacion de forma que no afectan sustancialmente a la afinidad de union al antfgeno (por ejemplo, EGFR). Las grnas para determinar que restos de aminoacido pueden sustituirse, anadirse o eliminarse sin eliminar las actividades de interes, pueden encontrarse comparando la secuencia del polipeptido particular con la de los peptidos homologos y reduciendo al mmimo el numero de cambios en la secuencia de aminoacido realizados en las regiones de gran homologfa (regiones conservadas) o mediante la sustitucion de aminoacidos con la secuencia consenso.

Alternativamente, las variantes recombinantes que codifican estos mismos o polipeptidos similares pueden sintetizarse o seleccionarse mediante el uso de la "redundancia" del codigo genetico. Pueden introducirse Varias sustituciones de codones, tales como los cambios silenciosos que producen varios sitios de restriccion, para optimizar la clonacion en un plasmido o vector viral o la expresion en un sistema procariota o eucariota particular. Las mutaciones en la secuencia de polinucleotido puede reflejarse en el polipeptido o los dominios de otros peptidos anadidos al polipeptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipeptido, para cambiar caractensticas tales como las afinidades de union a ligando, afinidades intercadena, o tasa de degradacion/renovacion.

Las "sustituciones" de aminoacidos pueden ser, por ejemplo, el resultado de sustituir un aminoacido con otro aminoacido que posee propiedades estructurales y/o qmmicas similares, es decir, sustituciones conservadoras de aminoacido. Las sustituciones "conservadoras" de aminoacidos pueden realizarse sobre la base de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza antipatica de los restos involucrados. Por ejemplo, los aminoacidos apolares (hidrofobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, y metionina; los aminoacidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cistema, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoacidos cargados positivamente (basicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y los aminoacidos cargados negativamente (acidos) incluyen acido aspartico y acido glutamico. Las "Inserciones" o "eliminaciones" estan preferentemente en el intervalo de alrededor de 1 a 20 aminoacidos, mas preferentemente 1 a 10 aminoacidos. La variacion permitida puede determinarse experimentalmente mediante la realizacion sistematica de inserciones, eliminaciones, o sustituciones de aminoacidos en una molecula de polipeptido utilizando tecnicas de ADN recombinante y analizando la actividad de las variantes recombinantes resultantes.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino humanizado se utiliza para referirse a una molecula de union a antfgeno procedente de una molecula de union a antfgeno no humana, por ejemplo, un anticuerpo murino, que conserva o sustancialmente conserva las propiedades de union a antfgeno de la molecula precursora pero que es menos inmunogenica en humanos. Esto puede lograrse mediante varios metodos que incluyen (a) injertar la totalidad de dominios variables no humanos en las regiones constantes humanas para generar anticuerpos quimericos, (b) injertar solo las CDR humanas en las regiones marco conservadas y las constantes con o sin retencion de restos marco conservados cnticos (por ejemplo, aquellos que son importantes para conservar buena afinidad de union a antfgeno o funciones del anticuerpo), o (c) trasplantar la totalidad de dominios variables no humanos, pero "camuflandolos" con una seccion similar a la humana mediante la sustitucion de restos de la superficie. Dichos metodos se describen en Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al.; Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). Existen generalmente 3 regiones determinantes de la complementariedad, o CDR, (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada uno de los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo, que estan flanqueados por cuatro subregiones marco conservadas (es decir, FR1, FR2, FR3, y FR4) en cada uno de los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Puede encontrarse una discusion de los anticuerpos humanizados, entre otros, en la Patente EE.UU. N° 6.632.927, y en la solicitud publicada de EE.UU. N° 2003/0175269. En otros

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ejemplos, solo los pueden transferirse restos de las CDR que son necesarios para la union (por ejemplo, "injertarse") en una secuencia humana para crear una secuencia completa de region variable con especificidad de antigeno.

De forma similar, tal como se utiliza en el presente documento, el termino primatizado se utiliza para referirse a una molecula de union a antigeno procedente de una molecula de union a antigeno no primate, por ejemplo, un anticuerpo murino, que conserva o sustancialmente conserva las propiedades de union a antigeno de la molecula precursora pero que es menos inmunogenico en primates.

En el caso que existan dos o mas definiciones de un termino que se utiliza y/o acepta en la tecnica, la definicion del termino tal como se utiliza en el presente documento pretende incluir todos estos significados a no ser que se especifique lo contrario de forma explfcita. Un ejemplo espedfico es el uso de la expresion "region determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de antigeno combinados no contiguos encontrados en la region variable de ambos polipeptidos de cadena ligera y pesada. Esta region particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), en la que las definiciones incluyen el solapamiento o subgrupos de restos de aminoacidos cuando se comparan entre otros. Sin embargo, la aplicacion de cualquier definicion para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de las mismas pretende estar dentro del alcance del termino como se ha definido y utilizado en el presente documento. Los restos de aminoacido apropiados que abarcan las CDR como se ha definido por cada una de las referencias citadas anteriormente se describen mas adelante en la tabla I como comparacion. Los numeros de resto exactos que abarcan una CDR particular variaran dependiendo de la secuencia y tamano de la CDR. Los expertos en la tecnica pueden determinar de forma rutinaria que restos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoacidos de la region variable del anticuerpo.

TABLA 1. Definiciones de CDR 1

Kabat Chothia AbM2

Vh CDR1

31-35 26-32 26-35

Vh CDR2

50-65 52-58 50-58

Vh CDR3

95-102 95-102 95-102

Vl CDR1

24-34 26-32 24-34

Vl CDR2

50-56 50-52 50-56

Vl CDR3

89-97 91-96 89-97

1 La numeracion de todas la definiciones de CDR en la Tabla 1 esta de acuerdo con las convenciones de numeracion descritas por Kabat et al. (vease mas adelante). 2 "AbM" se refiere a las CDR tal como se define en el programa de modelizacion de anticuerpos Oxford Molecular's "AbM".

Kabat et al. tambien definieron un sistema de numeracion para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la tecnica puede asignar sin ambiguedades este sistema de "numeracion Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningun dato experimental mas alla de la propia secuencia. Tal como se utiliza en el presente documento, "la numeracion Kabat" se refiere al sistema se numeracion descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A no ser que se especifique de otra manera, las referencias a la numeracion de posiciones espedficas de restos de aminoacido en una ABM son de acuerdo con el sistema de numeracion Kabat. Las secuencias del listado de secuencias (es decir, SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:147) no estan numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion Kabat. No obstante, tal como se ha dicho anteriormente, un experto en la tecnica podra determinar el esquema de numeracion Kabat de cualquier secuencia de la region variable en el listado de secuencias sobre la base de la numeracion de las secuencias tal como se presenta aqrn.

Mediante un acido nucleico o polinucleotido que posee una secuencia de nucleotido al menos, por ejemplo, un 95 % "identico" a una secuencia de nucleotidos de referencia tal como se ha descrito en el presente documento, se pretende que la secuencia de nucleotidos del polinucleotido sea identica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polinucleotidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleotidos de la secuencia de nucleotidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleotido que posee una secuencia de nucleotidos al menos un 95 % identica a una secuencia de nucleotidos de referencia, puede eliminarse o sustituirse con otro nucleotido hasta un 5 % de nucleotidos en la secuencia de referencia, o puede insertarse un numero de nucleotidos de hasta un 5 % de los nucleotidos totales en la secuencia de referencia.

De forma practica, si cualquier molecula o polipeptido de acido nucleico particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a una secuencia de nucleotidos o secuencia de polipeptidos de la presente invencion puede determinarse de forma convencional utilizando programas de computador conocidos. Un metodo preferido para determinar el mejor emparejamiento global entre una secuencia de busqueda (una secuencia descrita en el presente documento) y una secuencia objeto, tambien designada como alineamiento global de secuencia, puede determinarse utilizando el programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp.

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App. Biosci. 6:237-245 (1990). En un alineamiento de secuencias las secuencias de busqueda y problema son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse mediante la conversion de U a T. El resultado de dicho alineamiento global de secuencia es en porcentaje de identidad. Los parametros preferidos utilizados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria, k-tuple=4, Penalizacion por desemparejamiento=1, Penalizacion por union=30, Longitud del grupo de aleatorizacion =0, Puntuacion de corte =1, Penalizacion por hueco=5, Penalizacion por tamano de hueco 0,05, Tamano de ventana=500 o la longitud de la secuencia de nucleotidos objeto, lo que sea mas corto.

Si la secuencia objeto es mas corta que la secuencia de busqueda debido a eliminaciones 5' o 3', no debido a eliminaciones internas, debe hacerse una correccion manual de los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos 5' y 3' de la secuencia objeto cuando se calcula el porcentaje de identidad. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos 5' o 3', en relacion a la secuencias de busqueda, el porcentaje de identidad se corrige calculando el numero de bases de la secuencia de busqueda que estan en 5' y 3' con respecto a la secuencia objeto, que no estan emparejadas/alineadas, como porcentaje de las bases totales de las secuencias de busqueda. Se determina si un nucleotido esta emparejado/alineado mediante los resultados de la secuencia de alineamiento FASTDB. Este porcentaje se sustrae entonces del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior utilizando los parametros especificados, para llegar a un porcentaje final de puntuacion de identidad. Esta puntuacion corregida es lo que se utiliza con el proposito de la presente invencion. Solo las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia objeto, tal como se muestra para el alineamiento FASTDB, que no estan emparejadas/alineadas con las secuencias de busqueda, se calculan con el proposito ajustar manualmente el porcentaje de puntuacion de identidad.

Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se alinea con una secuencia de busqueda de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las eliminaciones aparecen en el extremo 5' de la secuencia objeto y por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases desemparejadas representan el 10 % de la secuencia (numero de bases en los extremos 5' y 3' no emparejadas/ numero total de bases en las secuencias de busqueda) por lo que el 10 % se sustrae de la puntuacion del porcentaje de identidad calculado mediante el programa FASTDb. Si las 90 bases restantes se emparejan perfectamente, el porcentaje de identidad final sena del 90 %. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se compara con una secuencia de busqueda de 100 bases. Esta vez las eliminaciones son eliminaciones internas por lo que no hay bases en el 5' o 3' de la secuencia objeto que no esten emparejadas/alineadas con la de busqueda. En este caso el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez mas, solamente las bases en 5' y 3' de la secuencia objeto que no estan emparejadas/alineadas con la secuencia de busqueda se corrigen manualmente. No se hacen mas correcciones manuales con el proposito de la presente invencion.

Mediante un polipeptido que posee una secuencia de aminoacidos "identica" en al menos, por ejemplo, un 95 % a una secuencia de busqueda de aminoacidos descrita en el presente documento, se pretende que la secuencia de aminoacido del polipeptido objeto sea identica a la secuencia de busqueda excepto en que la secuencia de polipeptido objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoacido por cada 100 aminoacidos de la secuencia de busqueda de aminoacidos. En otras palabras, para obtener un polipeptido que posee una secuencia de aminoacidos identica en al menos un 95 % a una secuencia de busqueda de aminoacidos, puede insertarse, eliminarse, o sustituirse con otro aminoacido hasta un 5 % de los restos de aminoacido en la secuencia objeto. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxi terminal de la secuencia de aminoacido de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los restos de la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

De forma practica, si cualquier polipeptido particular es identico en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a un polipeptido de referencia puede determinarse convencionalmente utilizando programas de ordenador conocidos. Un metodo preferible para determinar el mejor emparejamiento global entre una secuencia de busqueda (una secuencia descrita en el presente documento) y una secuencia objeto, tambien designada como un alineamiento de secuencia global, puede determinarse utilizando el programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). En un alineamiento de secuencia las secuencias objeto y de busqueda son, bien ambas secuencias de nucleotidos o bien ambas secuencias de aminoacidos. El resultado de dicho alineamiento global de secuencias es en porcentaje de identidad. Los parametros preferibles utilizados en el alineamiento de aminoacidos FASTDB son: Matriz =PAM 0, k-tuple= 2, Penalizacion por desemparejamiento =1, Penalizacion por union =20, Longitud del grupo de aleatorizacion =0, Puntuacion de corte =1, Tamano de ventana = longitud de la secuencia, Penalizacion por hueco =5, Penalizacion por tamano de hueco =0,05, tamano de ventana =500 o la longitud de la secuencia de nucleotidos objeto, lo que sea mas corto.

Si la secuencia objeto es mas corta que la secuencia de busqueda debido a eliminaciones en N- o C-terminal, no debido a eliminaciones internas, debe realizarse una correccion manual a los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos de la secuencia objeto en N- y C-terminal cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas en el extremo N- y C-terminal, en relacion a las secuencias de busqueda, el porcentaje de identidad se corrige calculando el numero de restos de la secuencia de busqueda que estan en N- y C-terminal de la secuencia objeto, que no estan emparejados/ alineados

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con el correspondiente resto sujeto, como porcentaje de las bases totales de las secuencias de busqueda. Se determina si un resto esta emparejado/alineado mediante el resultado del alineamiento de secuencia FASTDB. Este porcentaje se sustrae despues del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior utilizando los parametros especificados, para llegar a la puntuacion de porcentaje de identidad final. Esta puntuacion de porcentaje de identidad final es lo que se utiliza para los propositos de la presente invencion. Solamente los restos de los extremos N- y C-terminal de la secuencia objeto, que no estan emparejados/alineados con las secuencias de busqueda, se consideran para el proposito del ajuste manual de la puntuacion del porcentaje de identidad. Esto es, solamente las posiciones del resto de busqueda fuera de los restos N- y C-terminal mas lejanos de la secuencia objeto.

Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos de aminoacidos esta alineada con una secuencia de busqueda de 100 restos para determinar el porcentaje de identidad. Las eliminaciones aparecen en el extremo N terminal de la secuencia objeto y por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de las primeros 10 restos del extremo N terminal. Los 10 restos desemparejados representan el 10 % de la secuencia (numero de restos en los extremos N- y C- terminal no emparejados/ numero total de restos en las secuencias de busqueda) por lo que el 10 % se sustrae de la puntuacion del porcentaje de identidad calculado mediante el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes se emparejan perfectamente, el porcentaje de identidad final sena del 90 %. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos se compara con una secuencia de busqueda de 100 restos. Esta vez las eliminaciones son eliminaciones internas por lo que no hay restos en los extremos N- o C- terminal de la secuencia objeto que no esten emparejados/alineados con la de busqueda. En este caso el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez mas, solamente las posiciones de resto fuera de los extremos N- y C-terminal de la secuencia objeto, tal como se muestra en el alineamiento FASTDB, que no estan emparejadas/ alineadas con la secuencia de busqueda se corrigen manualmente. No se hacen mas correcciones manuales con el proposito de la presente invencion.

Tal como se utiliza en el presente documento, un acido nucleico "que hibrida en condiciones rigurosas" con una secuencia de acido nucleico de la invencion, se refiere a un polinucleotido que hibrida en una incubacion durante la noche a 42 °C en una solucion que comprende formamida al 50 %, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato sodico 75 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), solucion de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 pg/ml ADN de esperma de salmon fragmentado, seguido por el lavado de filtros en SSC 0,1x a alrededor de 65°C.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion dominio de localizacion en el Golgi se refiere a la secuencia de aminoacidos de un polipeptido residente en el Golgi que es responsable de anclar el polipeptido en la localizacion dentro del complejo de Golgi. En general, los dominios de localizacion comprenden las "colas" amino terminal de una enzima.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion funcion efectora se refiere a aquellas actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una secuencia nativa de la region Fc o variante de la secuencia de aminoacidos de la region Fc) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, afinidad de union al receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CcdA), fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (FCDA), secrecion de citoquinas, captacion de antfgeno mediada por inmunocomplejos mediante celulas presentadoras de antfgeno, regulacion negativa de receptores de superficie celular, etc.

Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos modificar por ingeniena, modificado, por ingeniena, modificacion por ingeniena y modificacion por glucoingeniena de la glicosilacion se considera que incluyen cualquier manipulacion del patron de glicosilacion de un polipeptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La modificacion por glucoingeniena de la glicosilacion incluye modificacion metabolica por ingeniena de la maquinaria de glicosilacion de una celula, que incluye manipulaciones geneticas de las vfas de smtesis de oligosacaridos para lograr la glicosilacion alterada de glucoprotemas expresadas en celulas. Ademas, la modificacion por glucoingeniena de la glicosilacion incluye los efectos de mutaciones y ambiente celular en la glicosilacion. En una realizacion, la modificacion por glucoingeniena de la glicosilacion es una alteracion en la actividad glicosiltransferasa. En una realizacion particular, la modificacion resulta en la alteracion de la actividad glucosaminiltransferasa y/o actividad fucosiltransferasa.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion celula huesped cubre cualquier tipo de sistema celular que puede modificarse por ingeniena para generar los polipeptidos y moleculas de union a antfgeno descritas en el presente documento. En una realizacion, la celula huesped esta modificada por ingeniena para permitir la produccion de una molecula de union a antfgeno con glucoformas modificadas. En una realizacion preferida, la molecula de union a antfgeno es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o protema de fusion. En ciertas realizaciones, las celulas huesped han sido posteriormente manipuladas para expresar niveles aumentados de uno o mas polipeptidos que poseen actividad GnTIII. Las celulas huesped incluyen celulas cultivadas, por ejemplo, celulas de mamffero cultivadas, tales como celulas CHO, celulas HEK293-EBNA, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, celulas de levadura, celulas de insecto, y celulas vegetales, por nombrar solo unas cuantas, pero tambien celulas comprendidas dentro de un animal transgenico, planta transgenica o planta cultivada o tejido animal.

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Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion citotoxicidad celular mediada por Fc incluye citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y citotoxicidad celular mediada por una protema de fusion-Fc soluble que contiene una region Fc humana. Es un mecanismo inmune que conduce a la lisis de "celulas marcadas con anticuerpo" mediante "celulas inmunoefectoras humanas", en las que:

Las celulas inmunoefectoras humanas, son una poblacion de leucocitos que presentan receptores de Fc en su superficie a traves de los cuales se unen a la region Fc de anticuerpos o de protemas de fusion-Fc y realizan funciones efectoras. Dicha poblacion puede incluir, pero no se limita a, celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) y/o celulas citolfticas naturales (NK).

Las celulas marcadas con anticuerpo son celulas unidas por los anticuerpos o protemas de fusion-Fc. Los anticuerpos o protemas de fusion-Fc se unen a celulas diana mediante la parte de protema N-terminal a la region Fc.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada se define como un aumento en el numero de "celulas marcadas con anticuerpo" que se lisan en un tiempo determinado, a una concentracion de anticuerpo determinada, o de protema de fusion-Fc, en el medio que rodea las celulas diana, mediante el mecanismo de la citotoxicidad celular mediada por Fc, definido anteriormente, y/o una reduccion en la concentracion de anticuerpo, o de protema de fusion-Fc, en el medio que rodea a las celulas diana, necesario para lograr la lisis de un numero determinado de "celulas marcadas con anticuerpo", en un tiempo determinado, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc. El aumento en la citotoxicidad celular mediada por Fc, esta relacionado con la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo, o protema de fusion-Fc, producido por el mismo tipo de celulas huesped, utilizando los mismos metodos estandar, de produccion, purificacion, formulacion y almacenaje, que son conocidos por los expertos en la tecnica, pero que no ha sido producido por celulas huesped modificadas por ingeniena para expresar la glicosiltransferasa GnTIII mediante los metodos descritos en el presente documento.

Por anticuerpo que posee citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) aumentada se quiere decir un anticuerpo, como el termino definido en el presente documento, que posee CCDA aumentada la tal como se ha determinado por cualquier metodo adecuado conocido por los expertos en la tecnica. Un ejemplo de un ensayo CCDA aceptado in vitro es el que sigue:

1) el ensayo utiliza celulas diana que se sabe que expresan el antfgeno diana reconocido por la region de union a antfgeno del anticuerpo;

2) el ensayo utiliza celulas mononucleares de sangre periferica humanas (CMSP), aisladas de la sangre de un donante sano escogido aleatoriamente, como celulas efectoras;

3) el ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo:

i) las CMSP se afslan utilizando procedimientos de centrifugacion por densidad estandar y se suspenden a 5 x 106 celulas/ml en medio de cultivo celular RPMI;

ii) las celulas diana se hacen crecer mediante metodos de cultivo celular estandar, se recogen en la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90 %, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 micro-Curios de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular, y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 10i) * * * 5 celulas/ml;

iii) se transfieren 100 microlitros de la suspension final de celulas diana anterior a cada pocillo de una placa de 96 pocillos;

iv) el anticuerpo se diluye en serie desde 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml) en medio de cultivo celular y se anaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las celulas diana de la placa de 96 pocillos, analizando por triplicado varias concentraciones de anticuerpo que cubren el intervalo completo de concentracion anterior;

v) para los controles de maxima liberacion (MR), 3 pocillos adicionales de la placa que contiene las celulas diana marcadas, reciben 50 microlitros de una solucion acuosa al 2 % (V/V) de detergente no ionico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solucion de anticuerpo (punto iv anterior);

vi) para los controles de liberacion espontanea (SR), 3 pocillos adicionales de la placa que contiene las celulas diana marcadas, reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solucion de anticuerpo (punto iv anterior);

vii) la placa de 96 pocillos se centrifuga entonces a 50 x g durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4°C;

viii) se anaden 50 microlitros de la suspension de CMSP (punto i anterior) a cada pocillo para proporcionar una proporcion de celulas efectoras:diana de 25:1 y las placas se colocan en un incubador en atmosfera de CO2 al 5 % a 37°C durante 4 horas;

ix) el sobrenadante libre de celulas de cada pocillo se recoge y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifica utilizando un contador gamma;

x) el porcentaje de lisis espedfica se calcula para cada concentracion de anticuerpo de acuerdo con la formula (ER-MR) /(MR-SR) x 100, en la que eR es la radioactividad media cuantificada (vease el punto ix anterior) para esa concentracion de anticuerpo, MR es la radioactividad media cuantificada (vease el punto ix anterior) para los controles MR (vease el punto v anterior), y SR es la radioactividad media cuantificada (vease el punto ix anterior) para los controles SR (vease el punto vi anterior);

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4) "CCDA aumentada" se define como un aumento en el porcentaje maximo de lisis espedfica observada dentro del intervalo de concentracion de anticuerpo analizado anterior, y/o una reduccion en la concentracion de anticuerpo necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje maximo de lisis espedfica observada dentro del intervalo de concentracion de anticuerpo analizado anterior. El aumento en la CCDA es relativo a la CCDA, medida, por ejemplo, con el anterior ensayo, mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de celulas huesped, utilizando los mismos metodos estandar de produccion, purificacion, formulacion y almacenamiento, que son conocidos por los expertos en la tecnica, pero que no ha sido producido por celulas huesped modificadas para sobreexpresar GnTIII.

En un aspecto, la divulgacion esta relacionada con moleculas de union a antigeno que poseen la especificidad de union del anticuerpo monoclonal de rata ICR62 (es decir, se une a sustancialmente el mismo epttopo), y con el descubrimiento de que sus funciones efectoras pueden aumentarse mediante la alteracion de la glicosilacion. En una realizacion, la molecula de union a antigeno es un anticuerpo quimerico, En una realizacion preferida, la divulgacion esta dirigida a un anticuerpo quimerico, o un fragmento del mismo, que comprende una o mas (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDR de cualquiera de SEQ ID NO:53-108 y/o SEQ ID NO: 122-127. Espedficamente, en una realizacion preferida, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, y SEQ ID NO:124; (b) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, y SEQ ID NO:126; y (c) SEQ ID NO:108. En otra realizacion preferida, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:112 e SEQ ID NO:114; (b) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:118; y (c) SEQ ID NO:119. En una realizacion, cualquiera de estos polinucleotidos codifica un polipeptido de fusion. En otros aspectos la divulgacion, puede excluir cualquiera o todas estas secuencias de polinucleotido.

En otra realizacion, la molecula de union a antfgeno comprende el dominio Vh del anticuerpo de rata ICR62 codificado por SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, o una variante del mismo; y un polipeptido no murino. En otra realizacion preferida, la divulgacion esta dirigida a una molecula de union a antfgeno que comprende el dominio Vl del anticuerpo de rata codificado por SEQ ID NO:43 o SEQ ID NO:44, o una variante de las mismas; y un polipeptido no murino. En otros aspectos la divulgacion puede excluir cualquiera o todas estas secuencias de polinucleotidos.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a moleculas de union a antfgeno que comprenden una o mas (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDR truncadas o CDR variantes de ICR62. Dichas CDR truncadas o CDR variantes contendran, como mmimo, los restos de aminoacido determinantes de la especificidad para dicha CDR. Por "resto determinante de la especificidad" se quiere decir aquellos restos que estan directamente implicados en la interaccion con el antfgeno. En general, solamente alrededor de un quinto a un tercio de los restos en una CDR determinada, participan en la union a antfgeno. Los restos determinantes de la complementariedad en una CDR particular pueden identificarse mediante, por ejemplo, computacion de contactos interatomicos a partir del modelaje tridimensional y determinacion de la variabilidad de secuencia en una posicion de resto determinada de acuerdo con los metodos descritos en Padlan et al., FASEB J. 9(1):133-139 (1995). Por lo tanto, las moleculas de union a antfgeno (ABM) de la presente invencion, tal como se refieren en el presente documento tambien pretenden abarcar las ABM que comprenden, por ejemplo, CDR truncadas o CDR variantes que comprenden uno o mas restos determinantes de la especificidad, o que comprenden sustituciones en una o mas posiciones dentro de la CDR en comparacion con una CDR de referencia (por ejemplo, las CDR de rata ICR62).

De acuerdo con esto, la divulgacion tambien esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo de rata ICR62, o una variante o forma truncada del mismo que contiene al menos los restos determinantes de la complementariedad para dicha region determinante de la complementariedad, en la que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. Preferentemente, dichos polinucleotidos aislados codifican un polipeptido de fusion que es una molecula de union a antfgeno. En una realizacion, el polinucleotido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo de rata ICR62, o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen al menos los restos determinantes de la complementariedad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En una realizacion, el polinucleotido comprende al menos una de las CDR descritas en las tablas 2-5, mas adelante. En otra realizacion, el polinucleotido codifica la region variable completa de cadena pesada o ligera de un anticuerpo quimerico (por ejemplo, humanizado). La divulgacion esta dirigida tambien a los polipeptidos codificados por dichos polinucleotidos.

En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a una molecula de union a antfgeno que comprende al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) region(es) determinante(s) de la complementariedad del anticuerpo de rata ICR62, o una variante o forma truncada de las mismas que contiene al menos los restos determinantes de la complementariedad (SDR) para dicha region determinante de la complementariedad, y que comprende una

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secuencia procedente de un polipeptido heterologo. En una realizacion, la molecula de union a antigeno comprende tres regiones determinates de complementariedad del anticuerpo de rata ICR62, o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen al menos los restos determinates de la especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de la complementariedad. En una realizacion, la molecula de union a antigeno comprende al menos una de las CDR descritas en las tablas 2-5, mas adelante. En otros aspectos, la presente invencion puede excluir cualquiera o todas las secuencias CDR descritas en las tablas 2-5, mas adelante.

En una realizacion, la molecula de union a antigeno comprende al menos una de las SDR de las CDR del anticuerpo ICR62. En una realizacion, la una o mas CDR de la ABM descritas en el presente documento comprende sustituciones en una o mas posiciones de aminoacido, y la ABM conserva actividad de union en comparacion con la ABM sin sustituir. La actividad de union puede medirse como se ha descrito en el presente documento y mediante los metodos que son rutina y bien conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, la concentracion cE50 para la union de la ABM sustituida esta modulada por menos de un factor de alrededor 10 a alrededor de 0,001 en comparacion con la ABM sin sustituir. En realizaciones particulares, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de 10 a alrededor de 1, alrededor de 10 a alrededor de 5, alrededor de 5 a alrededor de 0,1, alrededor de 5 a alrededor de 2, y alrededor de 3 a alrededor de 1 en comparacion con la ABM sin sustituir. In realizaciones particulares, la concentracion CE50 del anticuerpo sustituido esta modulada por menos de un factor de alrededor de 10, alrededor de 9, alrededor de 8, alrededor de 7, alrededor de 6, alrededor de 5, alrededor de 4, alrededor de 3, alrededor de 2, alrededor de 1, alrededor de 0,05, alrededor de 0,25, alrededor de 0,1, alrededor de 0,005, alrededor de 0,025, y alrededor de 0,001 en comparacion con la ABM sin sustituir. En una realizacion particular, la concentracion CE50 esta modulada por menos de un factor de alrededor de 10. En otras realizaciones, el factor CE50 esta modulado por un factor de alrededor de 10, alrededor de 9, alrededor de 8, alrededor de 7, alrededor de 6, alrededor de 5, alrededor de 4, alrededor de 3, alrededor de 2, alrededor de 1, alrededor de 0,05., alrededor de 0,25, alrededor de 0,1, alrededor de 0,005, alrededor de 0,025, y alrededor de 0,001. En algunas realizaciones, la modulacion es un descenso en la CE50. En otras realizaciones, la modulacion es un aumento en la CE50.

Las CDR de las ABM descritas en el presente documento pueden comprender sustituciones en cualquier resto (de acuerdo con cualquiera de Chothia o Kabat o cualquier otra definicion de CDR como se ha definido en el presente documento o se conoce en la tecnica). En una realizacion, las CDR comprenden sustituciones en cualquiera o todas las posiciones excepto para uno o mas restos determinantes de la especificidad. En una realizacion particular, las CDR comprenden sustituciones en todas las posiciones excepto para los restos determinantes de la especificidad. En una realizacion, las CDR de cadena pesada de la presente invencion comprenden sustituciones en una o mas de las posiciones Kabat 27, 28, 29, 30, 31, 23, 33, 34, 35, 52, 52a, 53, 54, 55, 57, 58, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 101, 102, o cualquier combinacion de las mismas. En otra realizacion, las CDR comprenden sustituciones en una o mas de las posiciones Kabat 27, 28, o 29 de la CDR1 de cadena pesada de Chothia, posicion 31 de la CDR1 de cadena pesada Kabat, posiciones Kabat 52, 52a, 53, o 57 de la CDR2 de cadena pesada Kabat, o la posicion Kabat 102 de la CDR3 de cadena pesada de Kabat.

En una realizacion las CDR de cadena ligera comprenden una o mas sustituciones de aminoacidos en una o mas de las posiciones Kabat 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, o cualquier combinacion de las mismas. En otra realizacion, la(s) CDR comprende(n) sustituciones en una o mas de las posiciones Kabat 30 o 32 de la CDR1 de cadena ligera de Kabat, posiciones Kabat 51, 52, 53, o 56 de la CDR2 de cadena ligera de Kabat, o posicion Kabat 94 de la CDR3 de cadena ligera de Kabat.

En otro aspecto, la ABM descrita en el presente documento comprende al menos un resto determinante de la especificidad de al menos una region determinante de la complementariedad del anticuerpo de rata ICR62. En algunas realizaciones, la ABM comprende restos determinantes de especificidad de las CDR de cadena pesada. En realizaciones mas particulares, el resto determinante de la especificidad de la cadena pesada se selecciona de entre el grupo que consiste en fenilalanina en la posicion Kabat 29, asparagina en la posicion Kabat 52, tirosina en la posicion Kabat 56, y valina en la posicion Kabat 100b. En una realizacion espedfica, los restos determinantes de especificidad son tirosina en la posicion Kabat 56 y valina en la posicion Kabat 100b. En otra realizacion espedfica, los restos determinantes de especificidad son fenilalanina en la posicion Kabat 29, asparagina en la posicion Kabat 52, tirosina en la posicion Kabat 56 y valina en la posicion Kabat 100b. En otras realizaciones, los restos determinantes de especificidad estan en la cadena ligera de la region determinante de la complementariedad. En realizaciones mas particulares, el resto determinante de la especificidad de la cadena ligera se selecciona de entre el grupo que consiste en asparagina en la posicion Kabat 34, y asparagina en la posicion Kabat 50. En una

realizacion espedfica, el resto determinante de la especificidad es asparagina en la posicion Kabat 34. En otra

realizacion espedfica, el resto determinante de la especificidad es asparagina en la posicion Kabat 50. En otra

realizacion espedfica, los restos determinantes de la especificidad son asparagina en la posicion Kabat 34 y

asparagina en la posicion Kabat 50.

En otro aspecto, la molecula de union a antfgeno comprende la region variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo. En una realizacion particularmente util, la molecula de union a antfgeno es un anticuerpo quimerico, por ejemplo, humanizado. La divulgacion tambien esta dirigida a metodos de realizar dichas moleculas de union a antfgeno, y el uso de las mismas en el tratamiento de enfermedades, particularmente trastornos de proliferacion

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celular en los que se expresa EGFR, particularmente en los que EGFR se expresa anormalmente (por ejemplo, se sobreexpresa) en comparacion con tejido normal del mismo tipo celular. Dichos trastornos incluyen, pero no se limitan a cancer de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, pancreas, pulmon, mama, ovario, colon, prostata, piel, y rinon. Los niveles de expresion de EGFR pueden determinarse mediante metodos conocidos en la tecnica y aquellos descritos en el presente documento (por ejemplo, mediante ensayo inmunohistoqmmico, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo inmunoenzimatico, ELISA, citometna de flujo, radioinmunoensayo, transferencia de Western, ensayo de union a ligando, actividad quinasa, etc.).

La divulgacion tambien esta dirigida a una composicion para utilizar en la direccion in vivo o in vitro hacia celulas que expresan EGFR. Las celulas que expresan EGFR pueden localizarse con propositos terapeuticos (por ejemplo, para tratar un trastorno que es tratable mediante la alteracion de la senalizacion mediada por EGFR por ejemplo mediante el bloqueo de la union a ligando, o mediante la direccion hacia celulas que expresan EGFR para la destruccion por el sistema inmunitario). En una realizacion, la divulgacion esta dirigida a una composicion que comprende una ABM descrita en el presente documento para utilizar en la localizacion de celulas que expresan EGFR en un sujeto.

Las celulas que expresan EGFR pueden tambien localizarse con propositos diagnosticos (por ejemplo, para determinar si expresan EGFR, de forma normal o anomala). Asf, la divulgacion tambien esta dirigida a metodos para la deteccion de la presencia de EGFR o una celula que expresa EGFR, ya sea in vivo o in vitro. Un metodo para detectar la expresion de EGFR de acuerdo con la divulgacion comprende poner en contacto una muestra a analizar opcionalmente con una muestra control, con una ABM de la presente invencion, en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre la ABM y EGFR. La formacion del complejo se detecta entonces (por ejemplo, mediante ELISA u otros metodos conocidos en la tecnica). Cuando se utiliza una muestra control con la muestra de analisis, cualquier diferencia estadfsticamente significativa en la formacion de complejos ABM-EGFR cuando se comparan con las muestras de analisis y control es indicativa de la presencia de EGFR en la muestra de analisis.

TABLA 2

CDR

Secuencia de nucleotidos SEQ ID NO

CDR1 de cadena pesada

Kabat GACTACAAGATACAC 54

GACTACGCCATCAGC

56

GACTACTATATGCAC

58

GACTACAAGATATCC

122

Chothia

GGTTTTACATTCACTCACTAC 60

GGTTACACATTCACTGACTAC

62

GGTTATTCATTCACTGACTAC

64

AbM

GGTTTTACATTCACTGACTACAAGATACAC 66

GGTTTTACATTCACTGACTACGCCATCAGC

68

GGTTTTACATTCACTGACTACTATATGCAC

70

GGTTACACATTCACTGACTACTATATGCAC

72

GGTTATTCATTCACTGACTACAAGATACAC

74

GGTTTCACATTCACTGACTACAACATATCC

124

CDR2 de cadena pesada

Kabat TATTTTAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAATGAAAAGTTCAAGAGC 76

GGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGC

78

TATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGC

80

TGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACGCACAGAAGTTTCAGGGC

82

TGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAGCCCAAGCTTCCAAGGC

84

TGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAACGAGAAGTTCCAAGGC

86

TATTTCAACCCTAACAGCGGTTATTCGAACTGCGCACAGAAGTTCCAGGGC

88

TATTTCAACCCTAACAGCGGTTATGCCACGTACGCACAGAAGTTCCAGGGC

90

TACTTCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACCTACAGCCCAAGCTTCCAAGGC

126

Chothia

AATCCTAACAGTGGTTATAGTACC 92

AACCCTAACAGCGGTTATTCGAAC

94

AACCCTAACAGCGGTTATGCCACG

96

AbM

TATTTTAATCCTAACAGTGGTTATAGTACC 98

GGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACC

100

TGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAGTACC

102

TATTTCAACCCTAACAGCGGTTATTCGAAC

104

TATTTCAACCCTAACAGCGGTTATGCCACG

106

CDR3 de cadena pesada

Kabat Chothia AbM CTATCCCCAGGCGGTTACTATGTTATGGATGCC 108

TABLA 3

CDR

Secuencia de nucleotido SEQ ID NO

CDR1 de cadena pesada

Kabat DYKIH 53

DYAIS

55

DYYMH

57

DYKIS

123

Chothia

GFTFTDY 59

GYTFTDY

61

GYSFTDY

63

AbM

GFTFTDYKIH 65

GFTFTDYAIS

67

GFTFTDYYMH 69

GYTFTDYYMH

71

GYSFTDYKIH

73

GFTFTDYKIS

125

CDR2 de cadena pesada

Kabat YFNPNSGYSTYNEKFKS 75

GINPNSGYSTYAQKFQG

77

YFNPNSGYSTYAQKFQG

79

WINPNSGYSTYAQKFQG

81

WINPNSGYSTYSPSFQG

83

WINPNSGYSTYNEKFQG

85

YFNPNSGYSNYAQKFQG

87

YFNPNSGYATYAQKFQG

89

YFNPNSGYSTYSPSFQG

127

Chothia

NPNSGYST 91

NPNSGYSN

93

NPNSGYAT

95

AbM

YFNPNSGYST 97

GINPNSGYST

99

WINPNSGYST

101

YFNPNSGYSN

103

YFNPNSGYAT

105

CDR3 de cadena pesada

Kabat Chothia AbM LSPGGYYVMDA 107

TABLA 4

CDR

Secuencia de aminoacido SEQ ID NO

CDR1 de cadena ligera Kabat

KASQNINNYLN 111

RASQGINNYLN

113

CDR2 de cadena ligera Kabat

NTNNLQT 115

CDR3 de cadena ligera Kabat

LQHNSFPT 117

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TABLA 5

CDR

Secuencia de nucleotidos SEQ ID NO

CDR1 de cadena ligera Kabat

AAAGCAAGTCAGAATATTAACAATTACTTAAAC 112

CGGGCAAGTCAGGGCATTAACAATTACTTAAAT

114

CDR2 de cadena ligera Kabat

AATACAAACAATTTGCAAACA 116

AATACCAACAACTTGCAGACA

118

CDR3 de cadena ligera Kabat

TTGCAGCATAATAGTTTTCCCACG 119

Se sabe que estan involucrados varios mecanismos en la eficacia terapeutica de los anticuerpos anti-EGFR, que incluyen el bloqueo de ligando (por ejemplo, EGF, TGF-a, etc.), la union a EGFR y la posterior activacion de las vfas 10 de senalizacion, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA), y la induccion de la detencion del crecimiento o diferenciacion terminal.

El anticuerpo monoclonal de rata ICR62 (IgG2b) se discutio en la Publicacion PCT N° WO 95/20045. Se dirigio contra el epftopo C de EGFR, y se demostro que inhi^a la union a ligando, inhibfa el crecimiento in vitro de 15 carcinomas de celulas escamosas que expresan EGFR, e inducen la regresion de xenoinjertos de tumores en ratones atfmicos (documento WO 95/20045; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). Como anticuerpo total de roedor, la administracion de anticuerpo monoclonal de rata ICR62 a humanos resulto en una respuesta HARA en algunos pacientes incluso tras una sola dosis. (WO 95/20045; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).

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Se han descrito anticuerpos de raton/humano quimericos. Vease, por ejemplo, Morrison, S. L. et al., PNAS I1: 68516854 (noviembre 1984); Publicacion de Patente Europea N° 173494; Boulianna, G. L, et al., Nature 312:642 (Diciembre 1984); Neubeiger, M. S. et al., Nature 314:268 (marzo 1985); Publicacion de Patente Europea N° 125023; Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (noviembre 1985); Sun, L. K et al., Hybridoma 5(1):517 (1986); Sahagan et al., J. immunol. 137:1066-1074 (1986). Vease en general, Muron, Nature 312:597 (Diciembre 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (marzo 1985); Marx, Science 229:455 (agosto 1985); y Morrison, Science 229:1202-1207 (septiembre 1985). IMC-C225 (Erbitux®, Imclone) es un anticuerpo quimerico monoclonal dirigido contra EGFR y que posee una region variable de raton y una region constante humana (Vease Herbsty Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). La porcion murina de IMC-C225 procede de M225, que se ha encontrado que se une a EGFR e inhibe la fosforilacion dependiente de tirosina quinasa inducida por EGF, e induce la apoptosis en las lmeas de celulas tumorales que sobreexpresa EGFR (Herbst y Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). No obstante, M225 provoco una reaccion HAMA en pacientes tratados con el anticuerpo en ensayos clmicos de fase I (Herbst y Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). IMC-225 se ha probado in vivo e in vitro, y se ha utilizado en combinacion con radioterapia y quimioterapia en un numero de tipos de tumor, que incluyen aquellos asociados con un mal pronostico (Herbst y Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). No obstante, IMC-225 se ha asociado con toxicidades tales como reacciones alergicas y de piel en pacientes a los que se ha administrado el anticuerpo IMC-225 en ensayos clmicos (Herbst y Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)).

En una realizacion particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, ABM humanizadas como se ha descrito en el presente documento pueden prepararse de acuerdo con los metodos de los documentos U.S. Pat. N° 5.225.539 de Winter, U.S. Pat. N° 6.180.370 de Queen et al., U.S. Pat. N° 6.632.927 de Adair et al., o la solicitud de patente de EE.UU. N° 2003/0039649 de Foote. Preferentemente, un anticuerpo humanizado posee uno o mas restos de aminoacido introducidos en el mismo a partir de una fuente no humana. Estos restos de aminoacido no humanos se designan a menudo como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), sustituyendo secuencias de region hipervariable por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (documento U.S. Pat. N° 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos normalmente humanos en los que algunos restos de region hipervariable y posiblemente algunos restos FR estan sustituidos por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedores. Los anticuerpos anti-EGFR humanizados comprenderan regiones constantes de inmunoglobulina humana.

La eleccion de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizar en la fabricacion de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado metodo "del mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza frente a toda la biblioteca de secuencias humanas de dominio variable conocidas. La secuencia humana que esta mas cercana a la del roedor se acepta entonces como region marco conservada humana (FR) para el anticuerpo humanizado. (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro metodo de seleccion de secuencia marco conservada humana es comparar la secuencia de cada subregion individual de la region marco conservada completa de roedor (es decir, FR1, FR2, FR3, y FR4) o alguna combinacion de las subregiones individuales (por ejemplo, FR1 y FR2) frente a la biblioteca de secuencias humanas de region variable conocidas que corresponden a esa subregion marco conservada (por ejemplo, la determinada por la numeracion Kabat), y escoger la secuencia humana de cada subregion o combinacion que sea mas cercana a la del roedor (Leung, Publicacion de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2003/0040606A1, publicada el 27de febrero de 2003).

Otro metodo utiliza una region marco conservada particular procedente de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse la misma region marco conservada para varios anticuerpos humanizados (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Tambien es importante que los anticuerpos esten humanizados con retencion de alta afinidad para el antfgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un metodo preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de analisis de las secuencias precursoras y varios productos conceptuales humanizados utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina pueden generarse utilizando programas de ordenador familiares para los expertos en la tecnica (por ejemplo, InsightII, Accelrys, Inc. (anteriormente MSI), o en
http://swissmodel. expasy.org). Estos programas de ordenador pueden ilustrar y mostrar estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas seleccionadas de inmunoglobulina. La inspeccion de estas estructuras permite el analisis del probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antfgeno. De esta manera, los restos fR pueden seleccionarse y combinarse a partir del receptor e importar secuencias de forma que se consiga la caractenstica deseada del anticuerpo, tal como el aumento de la afinidad por el antfgeno diana. En general, los restos de region hipervariable estan directamente y mas sustancialmente involucrados en

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influir la union al antigeno.

En una realizacion, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden una region Fc humana. En una realizacion espedfica, la region constante humana es IgG1, tal como se explica en las SEQ ID NO: 109 y 110, y se explica a continuacion:

Secuencia de nucleotidos de IgG1 (SEQ ID NO 110)

AeCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCA-CCTCTGGGGGC

ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAjGGACTACTTCCOCGAACCGGTGACGGTGTCG

TGG.AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCrrACAGTCCr

C AGG ACTCTACTCCCTCAGC AGOGTG GTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTG GG CACCC

AGACCTaCATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA

GCAGAGCCCAAATCTrGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA

CTCCTGGGGGGACCGTCAGTC1TCCTCTTCCCGCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA

TCTCCCGGACCGCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAjCGAAGACCCTa

aggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag

ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctg

CACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAOA AGTG C AAGGTCTCC AACAAAGCCCTC CCAGOCCCCATCGAGAAAACa^TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA

ggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgac

CTGCCTGGTCAAAGGCrrCTATCCCAGCGACATCGCCOTGGAGTGGGAGAGCAATGG

GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT

cttcctctacagcaagctcacogtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtctt

CTCATGCTCCGTGATGCAtGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

cctgtctccgggtaaatga

Secuencia de aminoacidos IgG1 (SEQ ID NO 109)

nCGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTTPAVLQSSGL Y SLS S V VTVPS S S LGTQTYlCNVKEiKPSAniCVDiCKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS V FLFPPJCPKDTI.MiSR.TPEVTCVVVEJVSHEDPEVKFT^WYVDGVEVHNAJCTKPREEQYNST YRWSVLTVLHQDWLNGKLEYKClCVSNKALPAPIEKTlSKAKlGQPREPQVyTLPPSRDELT KLNQ V SLTCLVKGfYPSDIAVEWESNGQPENKYKTITF VLD SDGSFf L YS tCLTVDKSRWQ QGNYFSCSVMHEALnNHYTQKSLSUSPGK

No obstante, tambien se abarcan las variantes e isoformas de la region Fc humana en el presente documento. Por ejemplo, las variantes de regiones Fc adecuadas para utilizar en la divulgacion pueden producirse de acuerdo con los metodos descritos en la el documento U.S. Pat. N° 6.737.056 de Presta (variantes de region Fc con funcion efectora alterada debido a una o mas modificaciones de aminoacido); o en las solicitudes de patente de EE.UU. N° 60/439.498; 60/456.041; 60/514.549; o el documento WO 2004/063351 (variantes de regiones Fc con aumento de la afinidad de union debido a la modificacion de aminoacidos); o en la solicitud de patente de EE.UU. N° 10/672,280 o WO 2004/099249 (variantes Fc con union alterada a FcyR debido a la modificacion de aminoacidos).

En otra realizacion, las moleculas de union a antigeno descritas en el presente documento estan modificadas por ingeniena para tener afinidad de union aumentada de acuerdo, por ejemplo, con los metodos descritos en la solicitud de patente de EE.UU. N° 2004/0132066 de Balint et al.

En una realizacion, la molecula de union a antfgeno descrita en el presente documento esta conjugada con una porcion adicional, como un marcaje radiactivo o una toxina. Dichas ABM conjugadas pueden producirse mediante numerosos metodos que son bien conocidos en la tecnica.

Son aplicables a la divulgacion una serie de radionuclidos y los expertos en la tecnica tienen la capacidad de determinar facilmente que radionuclido es el mas apropiado en una serie de circunstancias. Por ejemplo, el yodo131 es un radionuclido bien conocido utilizado para la inmunoterapia dirigida. No obstante, la utilidad clmica del yodo131 puede estar limitada por varios factores que incluyen: semivida ffsica de ocho dfas; deshalogenacion del anticuerpo yodado tanto en la sangre como en las localizaciones tumorales; y caractensticas de emision (por ejemplo, gran componente gamma) que puede ser suboptimas para del deposito localizado de la dosis en el tumor. Con la llegada de agentes quelantes superiores, la oportunidad de unir grupos quelantes de metales a protemas ha aumentado las oportunidades de utilizar otros radionuclidos como el indio111 y el itrio90. El itrio90 proporciona varios beneficios para la utilizacion en aplicaciones radioinmunoterapeuticas: La semivida a las 64 horas del itrio90 es lo suficientemente

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larga para permitir la acumulacion de anticuerpo por el tumor y, a diferencia de por ejemplo, el yodo131, el itrio90 es un emisor beta puro de alta energfa sin radiacion gamma acompanante en su desintegracion, con un intervalo en el tejido de 100 a 1000 diametros celulares. Ademas, la cantidad mmima de radiacion penetrante permite la administracion ambulatoria de anticuerpos marcados con itrio90. De forma adicional, la internalizacion de anticuerpo marcado no es necesaria para la muerte celular, y la emision local de radiacion ionizante debena ser letal en las celulas tumorales adyacentes que carecen del antigeno diana.

Las dosificaciones individuales eficaces del tratamiento (es decir, cantidades terapeuticamente eficaces) de anticuerpos anti-EGFR marcados con itrio90 estan en el intervalo entre alrededor de 5 y alrededor de 75 mCi, mas preferentemente entre alrededor de 10 y alrededor de 40 mCi. Las dosificaciones individuales eficaces de tratamiento no ablativo de la medula con anticuerpos anti-EGFR marcados con yodo131 estan en el intervalo entre alrededor de 5 y alrededor de 70 mCi, mas preferentemente entre alrededor de 5 y alrededor de 40 mCi. Las dosificaciones individuales eficaces de tratamiento ablativo (es decir, que puede requerir trasplante autologo de medula osea) de anticuerpos anti-EGFR marcados con yodo131 estan en el intervalo entre alrededor de 30 y alrededor de 600 mCi, mas preferentemente entre alrededor de 50 y menos de alrededor de 500 mCi. En conjunto con un anticuerpo anti-EGFR quimerico, debido a la semivida en circulacion mas larga de los anticuerpos murinos, las dosificaciones individuales eficaces de tratamiento no ablativo de la medula con anticuerpos anti-EGFR quimericos marcados con yodo131 estan en el intervalo entre alrededor de 5 y alrededor de 40 mCi, mas preferentemente menos de alrededor de 30 mCi. Los criterios de generacion de imagenes para, por ejemplo, el marcaje con indio111, son normalmente menos de alrededor de 5 mCi.

Respecto a los anticuerpos anti-EGFR marcados radiactivamente, la terapia con ellos puede producirse tambien utilizando un tratamiento de terapia unica o utilizando tratamientos multiples. Debido al componente de radionuclido, es preferible que antes del tratamiento, se "recojan" las celulas madre perifericas ("CMP") o de medula osea ("MO") para pacientes que padecen una mielotoxicidad potencialmente fatal debida a la radiacion. Se recoge MO y/o CMP utilizando tecnicas estandar, y despues se purga y se congela para una posible reinfusion. Adicionalmente, es mas preferible que antes del tratamiento se realice en el paciente un estudio de dosimetna diagnostica utilizando un anticuerpo de diagnostico marcado (por ejemplo, utilizando indio111), cuyo proposito es asegurar que el anticuerpo marcado terapeuticamente (por ejemplo, utilizando itrio90) no se "concentre" innecesariamente en ningun organo o tejido normal.

En una realizacion preferida, la divulgacion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee una secuencia de aminoacidos mostrada en la tabla 7 siguiente. En una realizacion preferida, la invencion esta dirigida a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia mostrada en la tabla 6 siguiente. La divulgacion esta dirigida tambien a un acido nucleico aislado que comprende una secuencia identica en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a una secuencia de nucleotidos mostrada en la tabla 6 siguiente. En otros aspectos, la divulgacion puede excluir cualquiera de las secuencias de nucleotidos de la tabla 6. En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee una secuencia de aminoacidos identica en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a una secuencia de aminoacidos de la tabla 7. La divulgacion tambien abarca un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que posee la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las construcciones de la tabla 7con sustituciones conservadoras de aminoacido. La divulgacion tambien abarca un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos de cualquiera de las construcciones de la tabla 7. La divulgacion tambien abarca un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacido identica en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a una secuencia de aminoacidos de la tabla 7. La divulgacion tambien abarca un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos de cualquiera de las construcciones de la tabla 7 con sustituciones de aminoacidos conservadoras. En otros aspectos, la divulgacion puede excluir cualquiera de las secuencias de aminoacido de la tabla 7.

TABLA 6

CONSTRUCCION VH ICR62

SECUENCIA DE NUCLEOTIDO___________________________

caggtcaacctactgcagtctggggctgcactggt

GAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGTTCjTCTTGCAAAG

gttctggttttacattcactgactacaagatacac

SEQ ID NO 2

tgggtgaagcagagtcatogaaagagccttgagt

Q GATTGG GT ATTTT AATCCT AACAGTGGTTATAGT ACCT ACAATG AA AAGTTC AAGaGC AAGGCCAC AT TG ACTGGAGACAAATCC ACCG ATAC A GCCTAT ATG gagcttaccagtctgacatctgaggactctgcaac CTATTACTGTACAAGACTATCCCCAGGGGGTTACT ATGTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAGCTTCAGTC

ACTGTCTOCTC

CONSTRUCCION I-HHA

I-HHB

I-HHC

SECUENCIA DE NUCLEOTIDO

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGA AGAAGCCIGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAG GCTTCTGGATTTACATrCACTGACTACGCCATCAG CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAG TGGATGG GAGGG ATCAATCCTAAC AGTGGTTATAG TAOCrACGCACAGAAGrrCCAGGGCAGGGTCACC ATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACAT GGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCC

gtgtattactgtgcgagactatccccaggcggtta

CTATGTTATGGATGOCTGGGGCCAAGGGACCACCG

TGACCGTCTCCTCA_________________________________

CAGGTGCAGGTGGTGCAGTCTGGGCCT'GAGGTGA

ag aagcctgggtcctcggtg aaggtctcctgcaag

GGTTCTGGTTTTACATTC ACTG ACT AC AAGAT AC A CTGGGTGCG AC AGGCCCCTG G ACAAGGGCTOG AG TGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAG

tacctacgcacagaagttccagggcagggtcacc

ATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACAT GG AGCTG AGC AGCCTG AG ATCTG AGG AC ACGG CC gtgtattactgtgcgagactatccccaggcggtta

CTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGOACCACCG TGACCGTCTCCTCA_________________________________

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGA AGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAO GGTTCT GGTTTTACATTCACTGACTACA AG ATACA CTGGGTGCGACAGGOCCCTGGACAAGGGCTCGAG TGGATGGGATATTTCAACOCTAACAGCGGTTATAG TACCTACAATGAAAAGTTCAAGAGCAGGGTCACC ATTACCGCGG AC AAATCCACGAGC ACAGCCTACAT GG AGCTG AGC AGCCTG AGATCTG AGG ACACGGCC

GTGTATT actgtgcgagactatccccaggcggtta ctatgttatggatgcctggggccaagggaccaccg

TGACCGTCTCCTCA

SEQJD NO 4

6

8

I-HLA

I-HLB

caggtgcagctggtgcagtctogggctgaggtga

AG AAGCCTGGGGCCTCGGTG AAGGTCTCCTGCAA GGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTACTATATGCA

ctoggtgcgacaggcccctggacaagggctcgag

tggatgggctgcatcaatcctaacagtggttatag

tacctacgcacagaagtttcagggcagggtcacca

TGA C CGCC GACACGTCC AT CAGCACAGC CTAC ATG

gagctgagcaggctgagatctgacgacacggccg

tgtattactgtgcgagactatccccaggcggttac

tatgttatggatgcctggggccaagggaccaccgt

G ACCGTCTOCTC A__________________________________

CAGGTGC AGCT GGTGCAGTCTGGGGCTG AGGTGA AGAAGCCTGGAGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAA GGGTTCTGGTTTTACATTCACTGACTACAAGATCC ACTGGGTGCGACAGGC CCCTGGAC AAGGGCTCGA GTGGATGGGATACTTCAACCCTAACAGCGGTTATA

gtacctacgcacagaagttccagggcagggtcac

CATGACCGCCGACACGTCCAT’CAGCACAGCCTACA

tggagctgagcaggctgagatctgacgacacggc

CGTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTr

actatgttatggatgcctggggocaagggaccacc

GTGACCGTCTCCTCA .

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12

I-HLC

I-HHD

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGA AG AAGCCTGGAGCCTCAGTGAA GGTCXOCTGCAA

gggttctggttttacattcactgactacaagatcc

acigggtgogacaggcccctggacaagggctcga

GTGGATGGGATACTTCAAOOCTAACAGCGGTTACA

GTACTTACAACGAGAAGrrCAAGAGCCGGGTCAC

catgaccgccgacacgtccatcagcacagcctaca TGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGC CGTGTATT ACTGTGCG AG ACTATCCCCAGGGGGTT

actatgttatggatgcciggggccaagggaccacc GTGACCGTCTCCTCA________________________________

CAGGTG CAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTG AGGTG A AGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAG G CCTCTG GTTT C AC ATT CACTGACT ACAA GAT AC A CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAG TGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAG

tacctacgcacagaagttccaggggaqggtcacc

attaccgcggacaaatocacgagcacagcctacat

ggagctgagcagoctgagatctgaggacacggcc

GTGTATTACTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTA

SEQ ID NO 14

16

I-HHE

CTATGl'TATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCG

TGACCGTCTCCTCA_________________________________

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGA

AGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAG

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ggttctggtttcacattcactgactacaagatatc

I-HHF

I-HHG

ctgggtgcgacaggctcctggacaagggctcgag

TCtGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCGGTTATAG

TACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACC

attaccgcggacaaatccacgagcacagcctacat

ggagctgagcagcctgagatutgaggacacggoc

GTGT ATTACTGTGCG A GACTATCCCC AGGCGGTTA CTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCG TGACCGTCTCCTCA__________________________________

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtga 1

AGAAGCCTGGGTCCICGGTGAAGGTCTCCTGCAAG GGTTCTG GTTTTACATTCACTG ACTAC AAGATACA CTGGGTGCG AC A GGCCCCTGGACAAGGGCTCGAG TGGATGGGATATrTCAACCCTAACAGCGGTTATTC

gaactacgcacagaagttocagggcagggtcacc

ATTACCGCGGACAAATCCACGACjCACAGCCTACAT GG AGCTGAGCAGCCTGAG ATCTG AGG ACACGGCC GTGTATT ACTGTGCGAG ACIATCCCC AG GCGGTT A CTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCG TGACCGTCTCCTCA__________________________________

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtga

AGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAG GGTT CTGGTTTTACATTC ACTG ACTAC AAG ATACA

ctgggtgcgacaggcccctggacaagggctcgag

tggatgggatatttcaaccctaacagcggttatgc

CACGTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACC

attaccgcggacaaatccacgagcacagoctacat

GGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCC GTG TATTACTGTGCGAGA CTATCCCCAGGCGGTTA

ctatgttatggatgcctggggccaagggaccaocg

TGACCGTCTCCTCA

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I-HLA1

I-HLA2

I-HLA3

I-HLA4

I-HLA5

caggtgcagctggtgcagtctgggg ctgaggtga agaagcctggagcctcggtgaaogtctcctgcaa

G CrCCTC TGGTTTTAC ATTCACTG ACT ACTATATGCA CTGGGTGCGACAGGCCCCTGCACAAGGGCTCGAG

tggatgggciggatcaatcctaacagtggttatag

tacctacagcccaagcttccaaggccaggtcacca

TCJCAGCCGACAAGTCGATCAGCACCGCCTAOCTCr

cagtggagcagoctgaaggcctoggacaocgcca

tgtattactgtgcgagactatccccaggcggttac

TAT GTTATGG ATGCCTGGGGCC AAGG GACCACCGT G ACCQT CTCCTCA__________________________________

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtga

AGAAGCCTGGAGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAA G GCCTCTGG TTTT AC ATTCACTG ACT ACT ATAT GCA CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAG TGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATAG TAOCT ACAACG AG AAGTTCCAAGGCCAGGTC ACC ATCTCAGCCG AC AAGTCCATC AGC ACCGCCT ACCT gcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgcc ATGTATF ACTGTGCG AG ACT ATCCCCAGGCGGTTA CTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCG

tgaoogtctcctca_________________________________

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtga

AG AAGOCTGG AGCCTGGGTG AAGGTCTCCTGCAA

ggcctctggttacacattcactgactactatatgc ACTGGGTGCGACAGGCCOCrrGGACAAGGGCTCGA GTGGATGGGCTGGATCAATCCTAACAGTGGTTATA GTACCT AC AGCCCAAGCTTCCAAGGCCAGGTC ACC ATCTCAGCCG AC AAGTCC ATCAGCACCGCCT AOCT

gcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgcc

atgtattactgtgcgagactatccccaggcggtta

CTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCG

tgaccgtctcctca_________________________________

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGA

agaagcctggagcctcggtgaaggtctcctgcaa

GGCCTCTGGTTACACATTCACTGACTACTATATGC

ACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGA

gtggatgggctggatcaatcctaacagtggttata

gtacctacaacgagaagttccaaggccaggtcac

catctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacc

tgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgc

catgtattactgtgcgagactatccccaggcggtt

actatgttatggatgcctggggccaagggaccacc

gtgaccgtctcctca_______________________;_______

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCAGAGGTGA

AGAAGCCTGGAACCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAA

ggcctctggttttacattcactgactactatatgca

SEQ ID NO 24

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32

CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAG

tggatgggctggatcaatcctaacagtggttatag

TAOCTACAGCGCAAGCTTCCAAGGCCAGGTC ACCA

tctcagccgacaagtccatcagcacogcctacctg

cagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgcca

tgtattactgtgcgagactatccccaggcggttac

tatgttatggatgcctggggccaagggaccaccgt

gaccgtctcctca

I-HLA6

I-HLA7

I-HLA8

I-HLA9

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCAGAGGTGA

agaagcctggaacctcggtgaacgtctcctgcaa

GGCCT CT GGTTTTAC ATTC ACTGACTACTATATGCA

CTGGGTGCGACAGGOCOCTGGACAAGGGCrCGAG

TGG ATGGGCTGGATC AATCCTAACAGTGGTTATAG

TACCTACAACGAGAAGTTCCAAGGCCAGGTCACC

ATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCT

GCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCrCGGACACCGCC

ATGTATTaCTGTGCGAGACTATCCCCAGGCGGTTA

CTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCG

TGACCQTCTCCTCA ________________________________

cagatgcagctggtgcagtctgggccagaggtga

agaagcctqgaacctcggtgaaggtctcctgcaa

GGCCT CTGGTTTTACATTC ACTG ACTAC AAG AT CC ACTGGGTGCGACAGGCCCGCGGACAACGGCTCGA ■ GTGGATCGGCTGGATCAATCCTAACA GTGGTTATA

gtacctacaacgagaagttccaaggocaggtcac

catctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacc

T G CAGTG GAG CAGCCTGAAG G C CTCGG AC AC C G C

catgtattactgtgcgagactatccccaggcggtt

actatgttatggatgcctggggccaagggaccaoc

GTGACCGTCTCCTCA_______________________________

cagatgcagctggtgcagtctgggccagaggtga

AGAAGCCTGGAAjCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAA

GGCCTCTGGTTTTACATTCACTGACTAC AAGATCC

ACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGA

GTGGATGGGATATTTCAACCCTAACAGCaGTTATA

GTACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCAC

cattaccgcggacaaatccacgagcacagcctac

ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGG

ccgtgtattactgtgcgagactatccccaggoggt

TACTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCAC

CGTGACCGTCTCCTCA ________________________

gaggtgcagctcgtgcagtctggcgctgaggtga

agaagcctggcgagtcgttgaagatctcctgcaag

ggttctggttattcattcactgactacaagatcca

CTG GGTGCGACAGGCCCCrGGACAAGGGCTCGAG

SEQ ID NO 34

36

38

40

I-HLA10

tggatgggatatttcaaccctaacagcggttatag

TACCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACC

ATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACAT

ggagctgagcagcctgagatctgaggacacggcc

G TGTATT ACT GTG CGA GACT ATCCCCAGGC GG TTA CTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACCACCG

TGACCGTCTCCTCA_________________________________

GAGGTGCAGCTCGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGA

AGAAGCCTGGCGAGTCGTTGAAGATCTCCTGCAAG

ggttctggttattcattcactgactacaagatcca CTGGGTGCGACAGATGCCTGGAAAGGGCCTCGAG TGG ATGGGCTACTTCAATCCTAAC AGTGGTTATAG TACCTACAGCCCAAGCrrTCCAAGGCCAGGTCACCA TCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTG C AGTG G AGCAG CCTG AAGGCCTCGGACACCGCCA TGTATTACTGTGCGAGACTATCOCCAGGCGGTTAC TATGTTATGGATGCCIGGGGCCAAGGGACCACCGT

gaccgtctcctcag

120

imagen1

Secuencia senal VL

I-KA

I-KB

TTTTCOC ACGTTFGCCCAGGOC ACCAAGCTOG AGA TCAAQCGTACG_____________________________________

atggacatgagggtccccgctcagctcctgggcct

OCTGCrGCTCTGGTTCCCAGqTGCCAGGTGT

gatatccagatgaccgagtctocatcgtccctgtc

TGCATCTGTCGGAGACCGGGTCACCATCACCTGCC

gggcaagtcagggcattaacaattacttaaattgg

T ACCAGC AGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCC TGATCTATAATACCAACAACTTGCAGACAGGCGTC

ccatcaaggttcagcggcagtggatccgggacag

aatacactctcaccatcagcaggctgcagcctgaa

G ATTTTGCC ACCTATTACTGCTTGC AGC ATAATAG TmCC C ACGTTT GGC C AG G GC ACC AA GCT C G AG A TCAAGCOTACGGTG________________________________

GATATCCAGATGACCGAGTCTCCATCCrCCCTGTC

tgcatctgtcggagaccgggtcaccatcacctgca

AAGCAAGTCAGAATATTAACAATTACTTAAACTGG TACCAGCAGAAG CCAGGG AAAGCCCCTAAGCGCC TGATCTATAATACCAACAACTTGC AGACAGGCGTC CCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAG aatacactctcaccatcagcagcctgcagcctgaa

GA TTTTG C CACCTATT A CTGCTTGC AGC ATAATAG

TTTTCCCACGTTTGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGA

TCAAGCGTAOGGTG

48

50

52

TABLA 7

SEQ ID NO

VH ICR62

QVNLLQS GAALVKFGASVXLS CXGSGTTTTDYKlH WVK QSHGKSLEWIGYFNPNSGYSTYNEKPKSKATLTADKSTD TAYMELTSLTS HDSATVYCrRLSPGG YYVMD AWGQGA SVTV5S

I-HHA

QVQLVQS GAEVKKPGSS VK VSCKASGFTFTDYAIS WVR

qapgqglewmgoimpnsgystyaqkfqgrvtitadkst

staymelsslrsedtavyycaejlspggyyvmdawgqg

TTVTVSS

I-HHB

QVQLVQSGAEVKKPGSSVECVSCK.GSGFTFTDYKIHWVR

qapgqglewmgyfnpnsgystyaqkfqgrvtitadkst

staymelsslrsedtavyycarlspggyyvmdawgqg

TTVTVSS

I-HHC

QVOLVOSGAEVKKPGBSVKVSCKGSGFrFTDYK IHWVR QAFGOGLEWMGYFNPNS GYSTYNEKFKSRVTITAOKST STAYMEI BBLRSEDTAVYYGA.RLSPGGYYYN'JDAWGOG TTVTVSS

I-HLA

OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGFrFT'DYYMHWV RO APGOGLEWMGW [NPNSGY5TVACTTOGRVTMTA&T S1STA YMEi -SRJLRSDDTAVYYC ARLSPGG YYVMDA WGO GTTVTVSS .........

1-HLB

Q V QL.V QSGAEVKKPG AS VKVSCKGSGFTFTDYKlHWVTft. QAEGQGLET.VMGYFNPNSGYSTYAQKFQGRVTMTADTSI STAYMEL SRLRSDDTAVYYCARLSPGGYYVMDAWGQG TTVTVSS

11

I-HLC

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGFrFTDYKJHWVR

QAPGQGLEWMGYFNPNSGySTYNEKFKSRVTMTADTSr

STAYMELSRLRSDDTAVYYCAjRLSPGGYYVMDAWGQG

TTVTVSS

13

I-HHD

OVOLVnSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDYKIHWVR OAPGOGLEV^MGYFNPNSGYSTYAOKFriGRVnTADKST ST AYMELSSLR5EDTAVYYCARLSPGGYYVMD A WGOG TTVTVSS "

15

I-HHD-1

■QYOLVPSGABVKKPGSSVKVSCKASGGTFTPYKIHWVR O AFGOGI .HWTVjq YFNP^SGYSTVAOKFQGR vm ADKST ST AYMET -SSI .RSEDTAVYYCARTSPGGYYVMDAWGnG TTVTVSS

128

I-HHD-2

OVOTVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSFTDYKIHWVR O AFGQGLE WMG YFNF N S G YSrrY A.OKPOGR VT1T ADK ST STAYMETSSLRSHTrAVYYCARLSPGGYYVMDAWGOG TTVTySS

129

I-HHD-3

nVOI,VOSGAEVKKFGSSVKVSCK:ASGFT3TDYKIHWVR OAPGQGLE WMGYFNPNSGYSTYAOKFOGRVTTrAPK ST

staymelsslrsedtavyycarlsfggyyvmdawgqg

xryjvss________________________________________________

130

I-HHD-4

OVOLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTEYK THWVR O AFGO GLE WM GYFKFN 5G YSTY AOKFQGKVTTTADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCAKLSPGGYYVMDAWGOG TTVTVSS

131

1

3

5

7

9

imagen2

I-HLA4

I-HLA5

I-HLA6

QVQLVQSG AEVKJKPGAS VKVSCKASGYTFTDYYMHWV RQAFGQGLEWMGWINPNSGYSTYNEKFQQQVTISADKS

istaylqwsslkasdtamyycarlspggyyvmdawgq

GTTVTVSS___________________________________________

QMQL VQSGFEVKKPGTS VK VSCKASGFTFTP Y~YMH WV RQAJPG OGLE WMG W1NPNSG YSTYSPSFOOOVTIK ADKST SIA YLQ3YS SLKA_SJ)~TAM Y YCARLSPGG YYVMD A WGO

GTTVTVSS___________________________________________

OMOLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGTTFTDYYMIIWV

SEQ ID NO 29

31

33

I-HLA7

I-HLA8

ROAPGQGLEWMGWINPNSGYSTYNEKFOGOYTISADKS

istaylowsslkasdtamyycarlspggyyvmdawgo

GTTVTVSS

qmqlvqsgpevkkpgtsvkvsckasgftftdyohwvr

QARGQRl^WlGWtNPNSGYSTYNEKPQGQVnSAJDKSlS

taylqwsslkasdtamyycarlspogyyvmdawgqg

TTVTVSS__________________________________

qmqlvqsgpevkkpgtsvkvsckasgftftdykihwvr

QAPGOGLEW MGYFNPNSGYSTYAQKTQGRVTTTADKST

staymelsslrsedtavyycarlspggyyvmdawgqg

35

37

I-HLA9

I-HLA10

Secuencia

senal

TTVTVSS___________________________________

EVQLyQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSPTDYTCIHWVRO

AFGQGLEWMGYFNPHSGYSTYAOKFOGRVTTTADKSTS

taymelsblrsedtavyycarlspggyyvmdawgogt

TVTVSS________________________________________________

EVOT.VOSG AEVKKFGEST KISCKGSG YBITOYiaHWVRC

mfgkglewmgyfnfnsgystyspspogovtisadksist

A YLO WSSLKA SDT AM YYC ARL5PGG YY v MDAWGOGT TVTVSS

MDWTWRILFVAAATGAHS

39

121

41

VH_____

ICR62 VL

I-KC

I-KC1

I-KC2

I-KC3

I-KC4

I-KC5

DIOMTOSPSFL5ASVGT>RVTTNCKASONlNNYLNWYOOK LGEAPOLLIYNTXNLOTGIFS RFSGS GSGTD YTLT1SSLOP EDFATYFCLOHNSFPTFGAGTKLELTCRT________________

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTlTCEASQGaWYLNWYQCjK PGKAPKRJLIYNTNNLQTG VPSRFSGSGSGTEFIXTIS SLQP EDFATYYCLQHNSFFTFGQGTKLE1KRT________________

DIQMTQSPS Sl^ASVGDRVTTTCRASQGIRNYLN WYQQK

p gkafkrliyntnnlqtgvpsrtsgsgsgteftltisslqp edfatyyclqhnsfptfgqgtkleikrt________________

DIQMTQSPS SLSAS VGDRVTTTCRASQGINNWLNWYQQK

pgkapkrliyntnhlqtgvpsrfsgsgsgteftltisslqp edfatyyclqhnsfptfgqgtkleikrt________________

DIQMTQSPS s LS AS VGDRVTTTCRASQGINNYLG WYQQK

fgkapkrliyntnnlqtgvpsrfsgsgsgteftlttsslqp

EDFATYYCLQHNSFPTFG QGTKLEBCRT________________

DIQMTQ SFSSLSAS VGDRVTTTCRASQGINNYLNWYQQK PGKAPKRLIYTTNNLQTGVPSRFSGSGSGTEFTTTTSSLQP edfatyyclqhn sfptfgqgtkleikkt_________________

DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQG)KNYLNWYQQK

PGKAPKRLIYNANNLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTTSSIjQP

edfatyyclqhnsfftfgqgtkleikrt

43

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142

143

5

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I-KC6

I-KC7

I-KC8

I-KC9

Secuencia

senal

DJQMTQSPS SLSASV GDRVT1TCRASQGINNYLNWYQQ1C PGKAPKniYNTSNLQTGVPSRFSGSGSG'J EFTLT3SSLQP EDfATYYCLQHNSPPTFGQGTKLEIKRT________________

diqmtqspsslsasvgdrvtttcrasqginnylnwyqqk

PGKAPKRlJYKTNSLQTGVPSRFSGSGSGTEFi'LTISSLQP EDFATYYCLQHNSFPTFGQGTKLEIKRT________________

DlQMTQSPS SLS ASVGlJRVTTTCRASQGllWLNWYQQK PGKAPK3HmMTNNLQSGVPSRFSGSGSGTEFrLTTSSLQP

edfatyyclqhnsfpitgqgtkleikrt

DIQMTQSPSS LS ASV GDRVTITCRASQGINNYLNWYQQK

pgbcapkrliyntnnlqtgvpsrfsgsgsgteftltisslqp

EDFATYYCLQHNSYTTFGQGTELEIKRT

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC

SEQ ID NO 144

145

146

147

47

VL

I-KA

I-KB

DIQMTQSPSSLSASVGBRVTrTCRASQGINNYLNWYQQK PGKAPKRUYNTNNLQ'KiVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQ PEDF ATVYCLQHWSFP1TGOGTKLEIKRTV

49

DlQNTn^SPSSLSASVGDftVTlTCKASQHINNTLNWYQQt:

PGKAPKEOJTNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTEYrLTISSLQ

pecfatyyclqhnsfpttfgogtkleikrtv

51

La divulgacion tambien contempla una molecula de union a antfgeno que comprende una region variable quimerica de cadena pesada (por ejemplo, humanizada) que comprende CDR espedficas de EGFR emparejada con una region variable de cadena ligera, en la que la region variable de cadena ligera posee menos de diez restos de aminoacido no humanos. En otras realizaciones, la region variable de cadena ligera posee menos de nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos, o un resto(s) de aminoacido no humano(s). En realizaciones preferidas, la region variable de cadena ligera posee menos de dos o menos de uno (es decir, ninguno) restos de aminoacido no humanos. En una realizacion, la region variable de cadena ligera comprende una o mas secuencias genicas de region variable de lmea germinal humana. Las secuencias genicas de region variable de lmea germinal humana que codifican las regiones variables de cadena ligera son conocidas en la tecnica, y pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos IMGT, disponible en
http://imgt.cines.fr/home.html. En una realizacion preferida, la secuencia de lmea germinal humana procede de la secuencia de lmea germinal VK1_6. En otras realizaciones, los restos de aminoacido dentro de la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera de lmea germinal humana pueden sustituirse con uno o mas restos de otra secuencia de region variable de cadena ligera de lmea germinal humana.

En una realizacion, la divulgacion esta dirigida a una molecula de union a antfgeno que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO.:1; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SeQ ID NO: 7; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO: 121, y una cadena ligera que comprende un polipeptido codificado por uno o mas secuencias genicas de region variable de lmea germinal humana. En una realizacion preferida, la secuencia de lmea germinal humana procede de la secuencia de lmea germinal VK1_6.

En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a una molecula de union a antfgeno que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO.54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, y SEQ ID NO:124; (b) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, y SEQ ID NO:126; (c) SEQ ID NO:108; y (d) un polipeptido que comprende una region variable de cadena ligera humana codificada por una o mas secuencias genicas de lmea germinal humana. En una realizacion particular, la secuencia de lmea germinal humana procede de la secuencia de lmea germinal VK1_6. En otra realizacion, la secuencia genica de region variable de lmea germinal humana comprende la secuencia genica de lmea germinal VK1_6 con una sustitucion de uno o mas codones de aminoacido con una secuencia de una secuencia genica de region variable de cadena ligera de lmea germinal humana diferente.

En otras realizaciones, la molecula de union a antfgeno de la divulgacion comprende una region variable de cadena pesada espedfica de EGFR descrita en el presente documento, y una variante de SEQ ID NO: 45. En una

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realizacion, la variante de SEQ ID NO:45 comprende una sustitucion de aminoacidos en una o mas posiciones en las regiones determinates de complementariedad (CDR). En realizaciones espedficas, la sustitucion es de un resto de aminoacido en una posicion seleccionada entre el grupo que consiste en: posicion de aminoacido 30 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 32 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 34 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 50 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 51 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 52 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 53 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 56 de SEQ ID NO:45; posicion de aminoacido 94 de SEQ ID NO:45; y cualquier combinacion de sustituciones de las mismas. En realizaciones mas espedficas, la sustitucion en SEQ ID NO:45 se selecciona del grupo que consiste en: sustitucion de una arginina (R) por asparagina (N) en la posicion 30 de SEQ ID NO:45; sustitucion de un triptofano (W) por la tirosina (Y) en la posicion 32 de SEQ ID NO:45; sustitucion de una glicina (G) por la asparagina (N) en la posicion 34 de SEQ ID NO:45; sustitucion de una treonina (T) por la asparagina (N) en la posicion 50 de SEQ ID nO:45; sustitucion de una alanina (A) por la treonina (T) en la posicion 51 de SEQ ID NO:45; sustitucion de una serina (S) por la asparagina (N) en la posicion 52 de SEQ ID NO:45; sustitucion de una serina (S) por la asparagina (N) en la posicion 53 de SEQ ID NO:45; sustitucion de una serina (S) por la treonina (T) en la posicion 56 de SEQ ID NO:45; sustitucion de una tirosina (Y) por la fenilalanina (F) en la posicion 94 de SEQ ID NO:45; y cualquier combinacion de las mismas. En una realizacion particular, todas estas sustituciones de restos de aminoacido en SEQ ID NO:45 se incorporan en una variante de cadena ligera unica. En realizaciones preferidas, las moleculas de union a antfgeno que comprenden las variantes de cadena ligera con sustituciones de aminoacidos para las CDR ICR62 conservan la union espedfica a EGFR (en comparacion con una molecula de union a antfgeno que comprende una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:45) cuando la variante de cadena ligera esta emparejada con un polipeptido que comprende una region variable de cadena pesada de la presente invencion. La divulgacion tambien esta dirigida a polinucleotidos que codifican cualquiera de los anteriores polipeptidos y/o moleculas de union a antfgeno, y celulas huesped y/o vectores que comprenden los polinucleotidos y/o polipeptidos. La divulgacion esta dirigida tambien a las moleculas de union a antfgeno descritas anteriormente, con un vehnculo farmaceuticamente aceptable.

La divulgacion tambien contempla una molecula de union a antfgeno que comprende una region variable de cadena pesada humana que comprende CDR espedficas de EGFR, en las que la region variable de cadena pesada posee menos de diez restos de aminoacido no humanos, y en las que la molecula de union a antfgeno se une espedficamente a EGFR. En otras realizaciones, la region variable de cadena pesada posee menos de nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos, o un resto(s) de aminoacido no humano(s). En realizaciones preferidas, la region variable de cadena ligera posee menos de cinco restos de aminoacido no humanos. En una realizacion, la region variable de cadena pesada comprende una o mas secuencias genicas de region variable de lmea germinal humana. Las secuencias genicas de region variable de lmea germinal humana que codifican regiones variables de cadena pesada son conocidas en la tecnica, y pueden encontrarse en, por ejemplo, la base de datos IMGT, disponible en
http://imgt.cines.fr/home.html. En una realizacion, la secuencia de lmea germinal humana procede de la secuencia de lmea germinal VH1_10. En otras realizaciones, los restos de aminoacido dentro de la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de lmea germinal humana pueden sustituirse con uno o mas restos de otra secuencia de la region variable de cadena pesada de la lmea germinal humana. En realizaciones preferidas, las moleculas de union a antfgeno que comprenden las variantes de cadena pesada con sustituciones de aminoacidos en las CDR de la cadena pesada de ICR62 conservan la union espedfica a EGFR cuando la variante de cadena pesada esta emparejada con un polipeptido que comprende una region variable de cadena ligera que se une a EGFR (por ejemplo una region variable de cadena ligera de la presente invencion). La divulgacion tambien esta dirigida a polinucleotidos que codifican cualquiera de los anteriores polipeptidos y/o moleculas de union a antfgeno, y celulas huesped y/o vectores que comprenden los polinucleotidos y/o polipeptidos. La divulgacion esta dirigida tambien a las moleculas de union a antfgeno descritas anteriormente, con un vetnculo farmaceuticamente aceptable.

En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a un vector de expresion y/o una celula huesped que comprende uno o mas polinucleotidos aislados descritos en el presente documento.

En general, cualquier tipo de lmea celular cultivada puede utilizarse para expresar la ABM de la presente invencion. En una realizacion preferida, se utilizan celulas HEK293-EBNA, celulas CHO, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, otras celulas de mairnfero, celulas de levadura, celulas de insecto o celulas vegetales como lmea celular base para generar las celulas huesped modificadas por ingeniena tal como se ha descrito en el presente documento.

La eficacia terapeutica de las ABM descritas en el presente documento puede aumentarse produciendolas en una celula huesped que exprese ademas un polinucleotido que codifica un polipeptido con actividad GnTIII. En una realizacion preferida, el polipeptido que posee actividad GnTIII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido residente en el Golgi. En otra realizacion preferida, la expresion de las ABM de la presente invencion en una celula huesped que expresa un polinucleotido que codifica un polipeptido que posee actividad GnTIII resulta en ABM con aumento de la afinidad de union al receptor de Fc y aumento de la funcion efectora. De acuerdo con esto, en una realizacion, la divulgacion esta dirigida a una celula huesped que comprende (a) un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido con actividad GnTIII; y (b) un polinucleotido aislado que codifica una ABM de la presente invencion, como un anticuerpo quimerico, primatizado o humanizado que se une a EGFR humano. En una realizacion preferida, el polipeptido que posee

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actividad GnTIII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio catalttico de GnTIII y el dominio de localizacion en el Golgi es el dominio de localizacion de manosidasa II. Los metodos para generar dichos polipeptidos de fusion y utilizarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras aumentadas estan descritos en la solicitud de patente provisional de eE:UU. N° 60/495.142 y en la publicacion de la solicitud de patente provisional de EE.UU. N° 2004/0241817 A1.

En otra realizacion preferida, la ABM quimerica es un anticuerpo quimerico o un fragmento de la misma, que posee la especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62. En una realizacion particularmente preferida, el anticuerpo quimerico comprende un Fc humano. En otra realizacion preferida, el anticuerpo esta primatizado o humanizado.

En una realizacion, uno o varios polinucleotidos que codifican una ABM descrita en el presente documento puede expresarse bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresion regulado. Los sistemas de expresion regulados adecuados incluyen, pero no se limitan a, un sistema de expresion regulado de tetraciclina, un sistema de expresion inducible por ecdisona, un sistema de expresion de cambio de lac, un sistema de expresion inducible por glucocorticoides, un sistema de promotor inducible por temperatura, y un sistema de expresion inducible por metalotionema metalica. Si varios acidos nucleicos diferentes que codifican una ABM como se ha descrito en el presente documento estan comprendidos dentro del sistema de la celula huesped, alguno de ellos puede expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. El maximo nivel de expresion se considera el nivel mas alto posible de expresion estable de polipeptido que no posee un efecto adverso significativo sobre la el mdice de crecimiento celular, y se determinara utilizando experimentos rutinarios. Los niveles de expresion se determinan mediante metodos generalmente conocidos en la tecnica, que incluyen analisis de transferencia de Western utilizando un anticuerpo espedfico para la ABM o un anticuerpo espedfico para una etiqueta peptfdica fusionada con la ABM; y analisis de transferencia de Northern. En una alternativa, el polinucleotido puede estar operativamente unido a un gen indicador; los niveles de expresion de una ABM quimerica (por ejemplo, humanizada) que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 se determinan midiendo una senal correlacionada con el nivel de expresion del gen indicador. El gen indicador puede transcribirse junto con los acidos nucleicos que codifican dicho polipeptido de fusion como una molecula de ARNm unica; sus correspondientes secuencias codificantes pueden estar unidas mediante un sitio interno de entrada al ribosoma(SIER) o mediante un potenciador de la traduccion independiente de la proteccion terminal (cap) (CITE, por sus siglas en ingles). El gen indicador puede traducirse junto con al menos un acido nucleico que codifica una ABM quimerica (por ejemplo, humanizada) que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 de forma que se forma una unica cadena de polipeptido. Los acidos nucleicos que codifican las ABM de la presente invencion pueden estar operativamente unidas al gen indicador bajo el control de un promotor unico, de forma que el acido nucleico que codifica el polipeptido de fusion y el gen indicador se transcriben en una molecula de ARN que esta alternativamente cortada y empalmada en dos moleculas separadas de ARN mensajero (ARNm); uno de los ARNm resultantes se traduce en dicha protema marcadora, y el otro se traduce en dicho polipeptido de fusion.

Pueden utilizarse metodos que son bien conocidos por los expertos en la tecnica para construir vectores de expresion que contienen la secuencia codificante de una ABM que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 junto con senales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos metodos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas de smtesis y tecnicas de recombinacion/geneticas in vivo. Veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989).

Puede utilizarse una serie de sistemas de expresion huesped-vector para expresar la secuencia codificante de las ABM de la presente invencion. Preferentemente, se utilizan celulas de mairnfero como sistemas de celulas huesped transfectadas con vectores de expresion recombinantes de ADN de plasmido o ADN de cosmido que contienen la secuencia codificante de la protema de interes y la secuencia codificante del polipeptido de fusion. Mas preferentemente, se utilizan como sistema de celulas huesped las celulas HEK293-EBNA, celulas CHO, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, otras celulas de marnffero, celulas de levadura, celulas de insecto, o celulas vegetales. Algunos ejemplos de sistemas de expresion y metodos de seleccion se describen en las siguientes referencias, y las referencias contenidas en ellas: Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), en Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), en Andersen y Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), en Chadd y Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), y en Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001). En realizaciones alternativas, pueden utilizarse otros sistemas de celulas huesped eucariotas, que incluyen celulas de levadura transformadas con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificante de una ABM descrita en el presente documento, como los sistemas de expresion descritos en las solicitudes de patente de EE.UU. N° 60/344,169 y WO 03/056914 (metodos para producir glucoprotema similar a la humana en una celula huesped eucariota no humana); sistemas de celulas de insecto infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes(por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia codificante de una ABM quimerica que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes(por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, VMCo; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformadas con vectores de expresion recombinantes de plasmido (por ejemplo, plasmido Ti) que contiene la secuencia codificante de la ABM de

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la invencion, que incluye, pero no se limita a, los sistemas de expresion descritos en los documentos U.S. Pat. N° 6.815.184 (metodos para la expresion y secrecion de polipeptidos biologicamente activos a partir de lentejas de agua modificadas por ingeniena genetica); WO 2004/057002 (produccion de protemas glicosiladas en celulas vegetales de briofitas mediante la introduccion de un gen de la glicosil transferasa) y WO 2004/024927 (metodos para generar protema no vegetal heterologa extracelular en protoplasto de musgo); y la solicitud de patente de EE.UU:. N° 60/365.769, 60/368.047, y WO 2003/078614 (procesamiento de glucoprotema en plantas transgenicas que comprenden una enzima de mairnfero GnTIII funcional); o sistemas de celulas animales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes(por ejemplo, adenovirus, virus de la vacuna) que incluyen lmeas celulares modificadas por ingeniena para contener multiples copias del ADN que codifica una ABM quimerica que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 ya sea amplificado de forma estable (CHO/dhfr) o amplificado de forma inestable en cromosomas de doble minuto (por ejemplo, lmeas celulares murinas). En una realizacion, el vector que comprende el/los polinucleotido(s) que codifican la ABM de la invencion es policistronico. Tambien, en una realizacion la ABM discutida anteriormente es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una realizacion preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado.

Para los metodos descritos en el presente documento, la expresion estable se prefiere generalmente para la expresion transitoria debido a que normalmente se logran resultados mas reproducibles y tambien es mas flexible para la produccion a gran escala. En lugar de utilizar vectores de expresion que contienen ongenes de replicacion virales, las celulas huesped pueden transformarse con los correspondientes acidos nucleicos codificantes controlados mediante elementos de control de la expresion apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripcion, lugares de poliadenilacion, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introduccion de ADN extrano, las celulas modificadas por ingeniena pueden dejarse crecer 1-2 dfas en un medio enriquecido, y despues se cambian en un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plasmido recombinante confiere resistencia en la seleccion y permite la seleccion de celulas que han integrado de forma estable el plasmido en sus cromosomas y crecen para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en lmeas celulares.

Pueden utilizarse una serie de sistemas de seleccion, que incluyen, pero no se limitan a, genes de la timidina quinasa (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) de virus herpes simplex, que pueden utilizarse en celulas tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Tambien, pueden utilizarse genes de resistencia a antimetabolitos como base de seleccion para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a acido micofenolico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucosido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, denominados trpB, que permiten a las celulas utilizar indol en lugar de triptofano; hisD, que permite a las celulas utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); el sistema de glutamina sintasa; y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).

La divulgacion esta dirigida tambien a un metodo para modificar el perfil de glicosilacion de las ABM de la presente invencion que estan producidas por una celula huesped, que comprenden la expresion en dicha celula huesped de un acido nucleico que codifica una ABM descrita en el presente documento y un acido nucleico que codifica un polipeptido con actividad GnTIII, o un vector que comprende dichos acidos nucleicos. Preferentemente, el polipeptido modificado es una IgG o un fragmento de la misma que comprende la region Fc. En una realizacion particularmente preferida la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo. En otra realizacion, el metodo comprende ademas la expresion en la celula huesped de un acido nucleico que codifica un polipeptido con una segunda actividad glicosiltransferasa. En una realizacion espedfica, la segunda actividad glicosiltransferasa es manosidasa II (ManII).

Las ABM modificadas producidas por las celulas huesped de la invencion presentan una afinidad de union aumentada al receptor de Fc y/o una funcion efectora aumentada como resultado de la modificacion. En una realizacion particularmente preferida la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que contiene la region Fc. Preferentemente, la afinidad de union aumentada al receptor de Fc es un aumento de la union a un receptor activador Fcy, como el receptor FcYRIIIa. La funcion efectora aumentada es preferentemente un aumento en uno o mas de los siguientes: aumento de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, aumento de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (FCDA), aumento de la secrecion de citoquinas, aumento de la captacion de antfgeno mediada por inmunocomplejos por celulas presentadoras de antfgeno, aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc, aumento de la union a celulas NK, aumento de la union a macrofagos, aumento de la union a celulas polimorfonucleares (PMN), aumento de la union a monocitos, aumento de la reticulacion de anticuerpos unidos a diana, aumento de la senalizacion directa inductora de apoptosis , aumento de la maduracion de celulas dendnticas, y aumento de la sensibilizacion de linfocitos T.

La divulgacion tambien esta dirigida a un metodo para producir una ABM tal como se ha descrito en el presente documento, con oligosacaridos modificados en una celula huesped que comprende (a) cultivar una celula huesped

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modificada por ingeniena para expresar al menos un acido nucleico que codifica un polipeptido que posee actividad GnTIII en condiciones que permiten la produccion de una ABM de acuerdo con la divulgacion, en el que dicho polipeptido que posee actividad GnTIII se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacaridos en la region Fc de dicha ABM producida por dicha celula huesped; y (o) aislar dicha ABM. En una realizacion preferida, el polipeptido que posee actividad GnTlII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio catalttico de GnTIII. En una realizacion particularmente preferida, el polipeptido de fusion comprende ademas el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido residente en el Golgi.

Preferentemente, el dominio de localizacion en el Golgi es el dominio de localizacion de manosidasa II o GnTI.

Alternativamente, el dominio de localizacion en el Golgi se selecciona del grupo que consiste en: el dominio de

localizacion de manosidasa I, el dominio de localizacion de GnTII, y el dominio de localizacion de a 1-6

fucosiltransferasa central. Las ABM producidas por los metodos descritos en el presente documento poseen una

afinidad de union aumentada al receptor de Fc y/o funcion efectora aumentada. Preferentemente, la funcion efectora aumentada es una o mas de las siguientes: aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc (que incluye aumento de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo), aumento de fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (FCDA), aumento de secrecion de citoquinas, aumento de captacion de antfgeno mediada por inmunocomplejos por celulas presentadoras de antigeno, aumento de la union a celulas NK, aumento de la union a macrofagos, aumento de la union a monocitos, aumento de la union a celulas polimorfonucleares, aumento de la senalizacion directa inductora de apoptosis , aumento de la reticulacion de anticuerpos unidos a diana, aumento de la maduracion de celulas dendnticas, o aumento de la sensibilizacion de linfocitos T. El aumento de la afinidad de union al receptor de Fc es preferentemente un aumento de la union a receptores activadores de Fc como FcYRIIIa. En una realizacion particularmente preferida la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.

En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a una ABM quimerica que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 producida por los metodos descritos en el presente documento que posee una proporcion aumentada de oligosacaridos biseccionados en la region Fc de dicho polipeptido. Se contempla que dicha ABM abarque anticuerpos y fragmentos de los mismos que comprenden la region Fc. En una realizacion preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. En una realizacion, el porcentaje de oligosacaridos biseccionados en la region Fc de la ABM es de al menos un 50 %, mas preferentemente, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o al menos un 90 %, y lo mas preferentemente al menos un 90-95 % del total de oligosacaridos. En otra realizacion mas, la ABM producida por los metodos descritos en el presente documento posee una proporcion aumentada de oligosacaridos no fucosilados en la region Fc como resultado de la modificacion de sus oligosacaridos mediante los metodos descritos en el presente documento. En una realizacion, el porcentaje de oligosacaridos no fucosilados es al menos un 50 %, preferentemente, al menos entre un 60 % y un 70 %, lo mas preferentemente al menos un 75 %. Los oligosacaridos no fucosilados pueden ser del tipo Idbrido o complejo. En una realizacion particularmente preferida, la ABM producida por las celulas huesped y los metodos descritos en el presente documento poseen una proporcion aumentada de oligosacaridos no fucosilados, biseccionados en la region Fc. Los oligosacaridos no fucosilados biseccionados pueden ser bien Idbridos o bien complejos. Espedficamente, los metodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para producir ABM en el que al menos un 15 %, mas preferentemente al menos un 20 %, mas preferentemente al menos un 25 %, mas preferentemente al menos un 30 %, mas preferentemente al menos un 35 % de los oligosacaridos en la region Fc de la ABM son biseccionados, no fucosilados. Los metodos descritos en el presente documento pueden tambien utilizarse para producir polipeptidos en los que al menos un 15 %, mas preferentemente al menos un 20 %, mas preferentemente al menos un 25 %, mas preferentemente al menos un 30 %, mas preferentemente al menos un 35 % de los oligosacaridos en la region Fc del polipeptido son biseccionados Idbridos no fucosilados.

En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a un ABM quimerico que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 modificado para tener una funcion efectora aumentada y/o una afinidad de union al receptor de Fc aumentada, producida por los metodos el presente documento de la invencion. Preferentemente, la funcion efectora aumentada es uno o mas de los siguientes: aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc (que incluyen aumento de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo), aumento de fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (FCDA), aumento de secrecion de citoquinas, aumento de captacion de antfgeno mediado por inmunocomplejos por celulas presentadoras de andgeno, aumento de la union a celulas NK, aumento de la union a macrofagos, aumento de la union a monocitos, aumento de la union a celulas polimorfonucleares, aumento de la senalizacion directa inductora de apoptosis, aumento de la reticulacion de anticuerpos unidos a diana, aumento de la maduracion de celulas dendnticas, o aumento de la sensibilizacion de linfocitos T. En una realizacion preferida, la afinidad de union al receptor de Fc aumentada es un aumento de la union al receptor activador de Fc, lo mas preferentemente FcYRIIIa. En una realizacion, la ABM es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la region Fc, o una protema de fusion que incluye una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina. En una realizacion particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado.

La divulgacion esta dirigida tambien a composiciones farmaceuticas que comprenden la ABM descrita en el presente documento y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

La divulgacion esta dirigida tambien a dichas composiciones farmaceuticas para utilizar en el metodo de tratamiento del cancer. Espedficamente, la descripcion esta dirigida a una composicion farmaceutica tal como se ha descrito en

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el presente documento para utilizar en un metodo para el tratamiento del cancer.

La divulgacion proporciona ademas metodos para la generacion y uso de sistemas de celula huesped para la produccion de glucoformas de ABM como se ha descrito en el presente documento, con una afinidad de union aumentada por el receptor de Fc, preferentemente un union a los receptores activadores de Fc aumentada, y/o con funciones efectoras aumentadas, que incluyen citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. La metodologfa de modificacion por glucoingeniena que puede utilizarse con las ABM de la presente invencion ha sido descrita en mayor detalle en el documento U. S. Pat. N° 6.602.684, la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. N° 2004/0241817 A1, la publicacion de solicitud de patente de EE.Uu. N° 2003/0175884 A1, la solicitud provisional de patente de EE.UU. N° 60/441,307 y el documento WO 2004/065540.

Las ABM como se han descrito en el presente documento pueden alternativamente estar modificadas por glucoingeniena para tener restos de fucosa reducidos en la region Fc de acuerdo con las tecnicas descritas en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU: N° 2003/0157108 (Genentech), o en los documentos PE 1 176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 y las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU: N° 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140 (Kyowa).

Las ABM modificadas por glucoingeniena descritas en el presente documento pueden tambien producirse en sistemas de expresion que producen glucoprotemas modificadas, como las mostradas en la solicitud de publicacion de patente de EE.UU: N° 60/344,169 y el documento WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) o en los documentos WO 2004/057002 y WO 2004/024927 (Greenovation).

Generacion de lmeas celulares para la produccion de protemas con un patron de glicosilacion alterado

La divulgacion describe sistemas de expresion de celulas huesped para la generacion de ABM de la presente invencion que poseen patrones de glicosilacion modificados. En particular, la divulgacion describe sistemas de celula huesped para la generacion de glucoformas de ABM descritas en el presente documento que poseen un valor terapeutico mejorado. Por lo tanto, la divulgacion describe sistemas de expresion de celulas huesped seleccionados o modificados por ingeniena para expresar un polipeptido que posee actividad GnTIII. En una realizacion, el polipeptido que posee actividad GnTIII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi. Espedficamente, dichos sistemas de expresion de celulas huesped pueden modificarse por ingeniena para comprender una molecula de acido nucleico recombinante que codifica un polipeptido que posee GnTIII, operativamente unido a un sistema promotor constitutivo o regulado.

En una realizacion espedfica, la divulgacion describe una celula huesped que ha sido modificada por glucoingeniena para expresar al menos un acido nucleico que codifica un polipeptido de fusion que posee actividad GnTIII y que comprende el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi. En un aspecto, la celula huesped esta modificada por ingeniena con una molecula de acido nucleico que comprende al menos un gen que codifica un polipeptido de fusion que posee actividad GnTIII y que comprende el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi.

En otra realizacion, la celula huesped ha sido modificada por ingeniena para expresar un acido nucleico que codifica un polipeptido que posee actividad GnTIII y un segundo acido nucleico que posee otra actividad glicosiltransferasa. En una realizacion particular, el segundo acido nucleico codifica un polipeptido que posee actividad manosidasa (ManII).

En general, cualquier tipo de lmea celular cultivada, que incluye las lmeas celulares descritas anteriormente, pueden utilizarse como base para modificar las lmeas celulares huesped de la presente invencion. En una realizacion preferida, se utilizan celulas HEK293-EBNA, celulas CHO, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, otras celulas de mairnfero, celulas de levadura, celulas de insecto, o celulas vegetales como lmea celular de base para generar las celulas huesped modificadas descritas en el presente documento.

La divulgacion contempla abarcar cualquier celula huesped modificada por ingeniena que exprese un polipeptido que posea actividad GnTIII, incluyendo un polipeptido de fusion que comprende el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi tal como se ha definido en el presente documento.

Pueden expresarse uno o varios acidos nucleicos que codifican un polipeptido que posee actividad GnTIII bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresion regulado. Dichos sistemas son bien conocidos en la tecnica, e incluyen los sistemas descritos anteriormente. Si varios acidos nucleicos diferentes que codifican polipeptidos de fusion que poseen actividad GnTIII y que comprenden el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente Golgi estan comprendidos dentro del sistema de celula huesped, alguno de ellos puede expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. Los niveles de expresion de los polipeptidos de fusion que poseen actividad GnTIII se determinan mediante metodos generalmente conocidos en la tecnica, que incluyen analisis de transferencia de Western, analisis de transferencia de Northern, analisis de expresion de gen indicador o medicion de la actividad

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GnTIII. Alternativamente, puede emplearse una lectina que se une a productos biosinteticos de GnTIII, por ejemplo, lectina E4-PHA. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo funcional que mide la union aumentada al receptor de Fc o la funcion efectora aumentada mediada por anticuerpos producidos por las celulas modificadas por glucoingeniena con el acido nucleico que codifica un polipeptido con actividad GnTIII.

Identificacion de transfectantes o transformantes que expresan la protema que posee un patron de glicosilacion modificado

Las celulas huesped que contienen la secuencia codificante de un ABM quimerico (por ejemplo, humanizado) que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 y que expresa los productos genicos biologicamente activos pueden identificarse por al menos cuatro abordajes generales; (a) hibridacion ADN- ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de funciones de gen "marcador"; (c) evaluacion del nivel de transcripcion medida mediante la expresion de los correspondientes transcritos de ARNm en la celula huesped; y (d) deteccion del producto genico medido mediante immunoensayo o mediante su actividad biologica.

En el primer abordaje, la presencia de la secuencia codificante de una ABM quimerica (por ejemplo, humanizada) que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 y la secuencia codificante del polipeptido que posee actividad GnTIII puede detectarse mediante hibridacion ADN-ADn o ADN-ARN utilizando sondas que comprenden secuencias de nucleotido que son homologas con las correspondientes secuencias codificantes, respectivamente, o porciones o derivados de las mismas.

En el segundo abordaje, el vector de expresion/ sistema huesped recombinante puede identificarse y seleccionarse sobre la base de la presencia o ausencia de ciertas funciones de gen "marcador" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibioticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformacion, formacion de cuerpos oclusivos en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si la secuencia codificante de la ABM como se ha descrito en el presente documento, o de 0un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipeptido que posee actividad GnTIII se insertan dentro de una secuencia de gen indicador del vector, pueden identificarse recombinantes que contienen las correspondientes secuencias codificantes mediante la ausencia de la funcion del gen indicador. Alternativamente, puede colocarse un gen indicador en tandem con las secuencias codificantes bajo el control del mismo o de diferente promotor que el utilizado para controlar la expresion de las secuencias codificantes. La expresion del marcador en respuesta a la induccion o seleccion indica expresion de la secuencia codificante de la ABM descrita en el presente documento y la secuencia codificante del polipeptido que posee actividad GnTIII.

En el tercer abordaje, la actividad transcripcional para la region codificante de la ABM descrita en el presente documento o un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipeptido que posee actividad GnTIII pueden evaluarse mediante ensayos de hibridacion. Por ejemplo, el ARN puede aislarse y analizarse mediante transferencia de Northern utilizando una sonda homologa a las secuencias codificantes de la ABM descrita en el presente documento, o un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipeptido que posee actividad GnTIII o porciones particulares del mismo. Alternativamente, pueden extraerse los acidos nucleicos totales de la celula huesped y analizarse la hibridacion a dichas sondas.

En el cuarto abordaje, la expresion de los productos de protema puede evaluarse inmunologicamente, por ejemplo mediante transferencia de Western, inmunoensayos como la radioinmunoprecipitacion, inmunoensayos unidos a enzima y similares. El ultimo ensayo del exito del sistema de expresion, no obstante, implica la deteccion de los productos genicos biologicamente activos.

Generacion y uso de ABM que poseen una funcion efectora aumentada que incluye citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo

En realizaciones preferidas, la divulgacion describe glucoformas de ABM quimericas (por ejemplo, humanizadas) que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62 y que posee una funcion efectora aumentada que incluye citotoxicidad celular dependiente del presente documento. La modificacion por glucoingeniena de anticuerpos se ha descrito previamente. Vease por ejemplo, el documento U.S. Pat. N° 6.602.684.

Los ensayos clmicos de anticuerpos monoclonales (mAb) no conjugados para el tratamiento de algunos tipos de cancer han proporcionado recientemente resultados prometedores. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:22325 (1997); Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Se ha aprobado una IgG1 quimerica, no conjugada para el linfoma no Hodgkin de bajo grado o de linfocitos B foliculares. Dillman, Cancer Blother. & Radiopharin. 12:223-25 (1997), mientras que otro mAb no conjugado, una IgG1 humanizada dirigida contra tumores de mama solidos, tambien ha mostrado resultados prometedores en ensayos clmicos de fase III. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Los antfgenos de estos dos mAb se expresan abundantemente en sus correspondientes celulas tumorales y los anticuerpos median una potente destruccion tumoral mediante celulas efectoras in vitro e in vivo. Por contra, muchos otros mAb no conjugados con buenas especificidades tumorales no desencadenan funciones efectoras de suficiente potencia para ser clmicamente utiles. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Para algunos de estos mAb mas debiles, se esta analizando en la actualidad la terapia conjunta

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de citoquinas. La adicion de citoquinas puede estimular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) mediante el aumento de la actividad y numero de linfocitos circulantes. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). La CCDA, un ataque lftico sobre las celulas marcadas con anticuerpo, se desencadena tras la union de los receptores de leucocitos a la region constante (Fc) de los anticuerpos. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997).

Un abordaje diferente, pero complementary, para aumentar la actividad CCDA de IgG1 no conjugada es modificar por ingeniena la region Fc del anticuerpo. Los estudios de modificacion por ingeniena de protemas han demostrado que los FcyR interaccionan con la region bisagra inferior del dominio CH2 de IgG. Lund et al., J. Immunol. 157:496369 (1996). No obstante, la union a FcyR tambien requiere la presencia de oligosacaridos covalentemente unidos a la Asn 297 conservada en la region CH2. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright y Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), lo que sugiere que tanto el oligosacarido como el polipeptido contribuyen directamente al sitio de interaccion o que el oligosacarido es necesario para mantener una conformacion de polipeptido CH2 activo. La modificacion de la estructura de oligosacarido puede por lo tanto explorarse como un medio de aumentar la afinidad de la interaccion.

Una molecula de IgG es portadora de dos oligosacaridos N-ligados en su region Fc, uno en cada cadena pesada. Como cualquier glucoprotema, un anticuerpo se produce como una poblacion de glucoformas que comparten la misma estructura de polipeptido pero que posee diferentes oligosacaridos unidos a los sitios de glicosilacion. Los oligosacaridos que normalmente se encuentran en la region Fc de la IgG serica son del tipo complejo biantenado (Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997), con un nivel bajo de acido sialico terminal y N-acetilglucosamina biseccionante (GlcNAc), y un grado variable de galactosilacion terminal y fucosilacion central. Algunos estudios sugieren que la estructura de carbohidrato minima necesaria para la union de FcyR reside dentro del nucleo del oligosacarido. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996).

Las lmeas celulares procedentes de raton o hamster utilizadas en la industria y academia para la produccion de mAb terapeuticos no conjugados normalmente unen los oligosacarido necesarios determinantes a sitios Fc. Las IgG expresadas en estas lmeas celulares carecen, no obstante, de las GlcNAc biseccionantes que se encuentran en bajas cantidades en las IgG sericas. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). Por contra, se ha observado recientemente que una IgG1 humanizada producida en mieloma de rata, (CAMPATH-1H) es portadora de una GlcNAc biseccionante en algunas de sus glucoformas. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). El anticuerpo procedente de celulas de rata alcanzo una actividad CCDA in vitro maxima similar a los anticuerpos CAMPATH-1H producidos en las lmeas celulares estandar, pero a concentraciones de anticuerpo significativamente inferiores.

El antfgeno CAMPATH esta presente normalmente en niveles altos en celulas de linfoma, y este mAb quimerico posee una actividad CCDA alta en ausencia de una GlcNAc biseccionante. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). En la via de glicosilacion N-ligada, se anade una GlcNAc biseccionada mediante GnTIII. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).

Estudios previos utilizan una lmea celular CHO productora de un solo anticuerpo, que se modifico por ingeniena previamente para expresar, de una forma regulada externamente, diferentes niveles de un gen clonado de una enzima GnTIII (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). este abordaje establecio por primera vez una correlacion rigurosa entre la expresion de GnTIII y la actividad CCDA del anticuerpo modificado. Asf, la invencion contempla un anticuerpo quimerico recombinante, o un fragmento del mismo con la especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62, que posee glicosilacion alterada resultante del aumento de actividad GnTIII. El aumento de actividad GnTIII resulta en un aumento en el porcentaje de oligosacaridos biseccionados, asf como en un descenso en el porcentaje de restos de fucosa, en la region Fc de la ABM. Este anticuerpo, o fragmento del mismo, posee una afinidad de union aumentada al receptor de Fc y una funcion efectora aumentada. Ademas, la divulgacion esta dirigida a un fragmento de anticuerpo y protemas de fusion que comprenden una region que es equivalente a la region Fc de las inmunoglobulinas. En una realizacion preferida, el anticuerpo esta humanizado.

Aplicaciones terapeuticas de ABM producidas de acuerdo con los metodos de la invencion.

En el sentido mas amplio, las ABM descritas en el presente documento pueden utilizarse celulas diana in vivo o in vitro que expresan eGfR. Se pueden dirigir a las celulas que expresan EGFR pueden localizarse con propositos diagnosticos o terapeuticos. En un aspecto, las ABM descritas en el presente documento pueden utilizarse para detectar la presencia de EGFR en una muestra. En otro aspecto, las ABM descritas en el presente documento pueden utilizarse para inhibir o reducir la transduccion de senales mediada por EGFR en celulas que expresan EGFR en la superficie. EGFR esta expresado de forma anomala (por ejemplo, sobreexpresado) en muchos tumores humanos en comparacion con tejido no tumoral del mismo tipo celular. Asf, las aBm descritas en el presente documento son particularmente utiles en la prevencion de la formacion de tumores, erradicacion de tumores e inhibicion de crecimiento tumoral. Mediante el bloqueo de la union de ligandos de EGFR a EGFR, las ABM descritas en el presente documento inhiben la activacion de celulas tumorales dependiente de EGF, que incluyen fosforilacion de tirosina de EGFR , aumento del mdice de acidificacion extracelular, y de la proliferacion celular. Las ABM descritas en el presente documento tambien actuan para parar el ciclo celular, provocando la apoptosis de las celulas diana (por ejemplo, celulas tumorales), e inhibir la angiogenesis y/o diferenciacion de celulas diana. Las ABM

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de la invencion pueden utilizarse para tratar cualquier tumor que expresa EGFR. Las neoplasias malignas particulares que pueden tratarse con las ABM descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de celulas epidermicas y escamosas, carcinomas no microcfticos de pulmon, gliomas, cancer de pancreas, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, y carcinoma de celulas renales.

Las ABM descritas en el presente documento pueden utilizarse solas para dirigirse y destruir celulas tumorales in vivo. Las ABM pueden tambien utilizarse junto con un agente terapeutico apropiado para tratar el carcinoma humano. Por ejemplo, las ABM pueden utilizarse en combinacion con metodos de tratamiento estandar o convencional como la quimioterapia, radioterapia o pueden conjugarse o unirse a un farmaco terapeutico, o toxina, asf como a una linfoquina o un factor de crecimiento inhibidor de tumores, para la liberacion del agente terapeutico al lugar del carcinoma. Los conjugados de las ABM descritas en el presente documento que son de vital importancia son (1) inmunotoxinas (conjugados de la ABM y una porcion citotoxica) y (2) ABM marcadas (por ejemplo marcadas con radiactividad, marcadas con enzima o marcadas con fluorocromos) en las que el marcaje proporciona un medio para identificar los inmunocomplejos que incluye la ABM marcada. Las ABM pueden tambien utilizarse para inducir la lisis a traves del proceso natural del complemento, y de interaccionar con las celulas citotoxicas dependientes de anticuerpo normalmente presentes.

La porcion citotoxica de la inmunotoxina puede ser un farmaco citotoxico o una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano o vegetal, o un fragmento enzimaticamente activo ("cadena A ") de dicha toxina. Las toxinas enzimaticamente activas y los fragmentos de las mismas utilizados son la cadena A de la difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina de la difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modeccina alfa-sarcina, protemas de Aleurites fordii, protemas de diantina. Protemas de Phytolacca americans (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y enomicina. En otra realizacion, las ABM estan conjugadas con farmacos anticancengenos de molecula pequena. Los conjugados de ABM y dichas porciones citotoxicas estan hechos utilizando una serie de agentes de acoplamiento a protema bifuncional. Ejemplos de dichos reactivos son SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoesteres como adipimidato de dimetilo HCl, esteres activos como suberato de disuccinimidilo, aldehndos como glutaraldehndo, compuestos bis- azido como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazonio como bis-(p-diazoniobenzoil)- etilendiamina, diisocianatos como tolileno 2,6-diisocianato, y compuestos bis-activos de fluor como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenceno. La porcion lisante de una toxina puede unirse al fragmento Fab de las ABM. Se conocen en la tecnica toxinas adicionales apropiadas tal como se evidencia en por ejemplo, la solicitud publicada de Patente de EE:UU: N° 2002/0128448

En una realizacion, una ABM quimerica (por ejemplo, humanizada), modificada por glucoingeniena que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62, esta conjugada con la cadena A de ricina. Lo mas ventajosamente, la cadena A de ricina se desglicosila y se produce mediante metodos recombinantes. Un metodo ventajoso para producir la inmunotoxina de ricina se describe en Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987).

Cuando se utilizan para destruir celulas cancengenas humanas in vitro con fines diagnosticos, los conjugados se anadiran normalmente al medio de cultivo celular a una concentracion de al menos alrededor de 10 nM. La formulacion y forma de administracion para la utilizacion in vitro no son cnticas. Se utilizaran normalmente formulaciones acuosas que sean compatibles con el cultivo o medio de perfusion. La citotoxicidad puede interpretarse mediante tecnicas convencionales para determinar la presencia o grado de cancer.

Como se ha descrito anteriormente, puede fabricarse un radiofarmaco citotoxico para tratar el cancer mediante la conjugacion de un isotopo radioactivo (por ejemplo, I, Y, Pr) con una ABM quimerica, modificada por glucoingeniena que posee sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo de rata ICR62. La expresion "porcion citotoxica " tal como se utiliza en el presente documento pretende incluir dichos isotopos.

En otra realizacion, los liposomas se rellenan con un farmaco citotoxico y los liposomas se recubren con las ABM de la presente invencion. Debido a que existen muchas moleculas de EGFr en la superficie de la celula maligna que expresa EGFR, este metodo permite la liberacion de grandes cantidades de farmaco en el tipo celular correcto.

Las tecnicas para conjugar dichos agentes terapeuticos con anticuerpos son bien conocidas (vease, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pags. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pags. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pags. 475-506 (1985); y Thorpe et al., "The Reparation and Cytotoxic Properties Of Antibody - Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).

Otras aplicaciones erapeuticas mas para las ABM descritas en el presente documento incluye conjugacion o union, por ejemplo, mediante tecnicas de ADN recombinante, con una enzima capaz de convertir un profarmaco en un farmaco citotoxico y el uso de ese conjugado anticuerpo-enzima en combinacion con el profarmaco para convertir el

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profarmaco en un agente citotoxico en el sitio del tumor (vease, por ejemplo, Senter et al., "Anti-Tumor Effects of antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Fosforylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); y Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody - Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy,", FASEB J. 4: 188-193 (1990)).

Otro uso terapeutico mas para las ABM descritas en el presente documento incluye el uso, bien no conjugadas, en presencia del complemento, o bien como parte de un conjugado anticuerpo-farmaco o anticuerpo-toxina, para eliminar las celulas tumorales de la medula osea de los pacientes con cancer. De acuerdo con este abordaje, la medula osea autologa puede purgarse ex vivo mediante el tratamiento con el anticuerpo y la medula se infunde de nuevo en el paciente [vease, por ejemplo, Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].

Ademas, se contempla que la divulgacion comprende una inmunotoxina de cadena unica que comprende dominios de union a antfgeno que permiten sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo de rata ICR62 (por ejemplo, polipeptidos que comprenden la CDR del anticuerpo de rata ICR62) y que comprenden ademas una toxina polipeptfdica. Las inmunotoxinas de cadena unica descritas en el presente documento pueden utilizarse para tratar el carcinoma humano in vivo.

De forma similar, una protema de fusion que comprende al menos la region de union a antfgeno de una ABM descrita en el presente documento unida al menos a una porcion funcionalmente activa de una segunda protema que posee actividad antitumoral in vivo. La divulgacion describe la reaccion del inmunoconjugado (por ejemplo, la inmunotoxina en un metodo para destruir selectivamente celulas tumorales que expresan EGFR. Estas celulas tumorales pueden ser de un carcinoma humano.

De forma adicional, esta divulgacion describe una composicion que contiene al menos uno de los inmunoconjugados (por ejemplo, la inmunotoxina) descrita en el presente documento para utilizar en un metodo de tratamiento de carcinomas (por ejemplo, carcinomas humanos) in vivo.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM descrita en el presente documento para utilizar en un metodo mejorado para tratar trastornos de proliferacion celular en los que se expresa EGFR, particularmente en los que EGFR se expresa de forma anomala (por ejemplo se sobreexpresa), que incluye cancer de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, pancreas, pulmon, mama, ovario, colon, prostata, piel, y rinon.

En una realizacion preferida, la ABM es un anticuerpo anti-EGFR modificado por glucoingeniena con sustancialmente la misma especificidad de union que la del anticuerpo de rata ICR62. En otra realizacion preferida el anticuerpo es humanizado. En otra realizacion preferida, el anticuerpo humanizado comprende CDR modificadas que comprenden sustituciones en cualquier posicion excepto aquellas que son necesarias para conservar la actividad de union (por ejemplo, las SDR). Ejemplos de trastornos de proliferacion celular que pueden tratarse mediante una ABM de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a neoplasias localizadas en: abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, tngado, pancreas, peritoneo, glandulas endocrinas (adrenales, paratiroideas, pituitarias, testmulos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periferico), sistema linfatico, pelvico, piel, tejido blando, bazo, region toracica, y sistema urogenital.

De forma similar, otros trastornos de proliferacion celular pueden tambien tratarse mediante las ABM descritas en el presente documento. Ejemplos de dichos trastornos de proliferacion celular incluyen, pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, purpura, sarcoidosis, smdrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis, y cualquier otra enfermedad de proliferacion celular, ademas de neoplasia, localizada en un sistema de organos de la lista anterior.

De acuerdo con la practica de esta divulgacion, el sujeto puede ser un ser humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino, y sujetos aviares. Tambien se incluyen en el presente documento otros animales de sangre caliente.

La divulgacion en cuestion tambien describe la composicion descrita en el presente documento para utilizar en metodos para inhibir el crecimiento de celulas tumorales humanas, tratar un tumor en un sujeto, y tratar una enfermedad de tipo proliferativa en un sujeto.

La invencion esta dirigida tambien a ABM descritas en el presente documento para utilizar en metodos para tratar enfermedades o trastornos no malignos en un mairnfero que se caracterizan por una activacion o produccion anomala de EGFR o de uno o mas ligandos de EGFR. El sujeto generalmente tendra celulas que expresan EGFR, por ejemplo en tejido enfermo del mismo, de forma que las ABM descritas en el presente documento sean capaces de unirse a celulas dentro del sujeto.

La activacion o expresion anomala de EGFR o de un ligando de EGFR puede estar produciendose en celulas del sujeto, por ejemplo en tejido enfermo del sujeto. La activacion anomala de EGFR puede atribuirse a la amplificacion, sobreexpresion o produccion aberrante de EGFR y/o ligando de EGFR. En una realizacion de la invencion se

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realizara un ensayo diagnostico o pronostico para determinar si la se esta produciendo una produccion o activacion anomala de EGFR (o ligando de EGFR) en el sujeto. Por ejemplo, puede determinarse la amplificacion genica y/o sobreexpresion de EGFR y/o ligando. Estan disponibles en la tecnica varios ensayos para determinar dicha amplificacion/sobreexpresion e incluyen los ensayos IHC, FISH y antigeno circulante descritos anteriormente. De forma alternativa o adicional, los niveles de un ligando de EGFR, como TGF-a en o asociado con la muestra pueden determinarse de acuerdo con procedimientos conocidos. Dichos ensayos pueden detectar protema y/o acido nucleico que la codifica en la muestra a analizar. En una realizacion, los niveles de ligando de EGFR en una muestra pueden determinarse utilizando inmunohistoqmmica (IHC); vease, por ejemplo, Scher et al. Clin. Cancer Research 1:545-550 (1995). De forma alternativa o adicional, se pueden analizar los niveles de EGFR que codifica un acido nucleico en la muestra a analizar; por ejemplo mediante FISH, transferencia de Southern, o tecnicas de PCR.

Ademas, la sobreexpresion o amplificacion de EGFR o ligando de EGFR puede analizarse utilizando un ensayo diagnostico in vivo, por ejemplo mediante la administracion de una molecula (como un anticuerpo) que se une a la molecula a detectar y esta marcada con un marcaje detectable (por ejemplo un isotopo radioactivo) y explorando externamente al paciente para localizar el marcaje.

Alternativamente, se pueden detectar heterodfmeros de EGFR, especialmente heterodfmeros de EGFR-ErbB2, EGFR - ErbB3 o EGFR -ErbB4, en el paciente, por ejemplo en tejido enfermo del mismo, antes de la terapia. Estan disponibles varios metodos para detectar las interacciones no covalentes protema-protema o para indicar de otro modo la proximidad entre protemas de interes. Los metodos de ejemplo para la deteccion de heterodfmeros de EGFR incluyen, sin limitacion, metodos basados en la inmunoafinidad, como inmunoprecipitacion; transferencia de energfa por resonancia de la fluorescencia (FRET, por sus siglas en ingles) (Selvin, Nat. Struct. Biol. 7:730-34 (2000); Gadelia & Jovin, J. Cell Biol. 129:1543-58 (1995); y Nagy et al., Cytometry 32:120-131 (1998)); colocalizacion de EGFR con ErbB2 o ErbB3 utilizando tecnicas estandar de inmunofluorescencia directa o indirecta y microscopia confocal de barrido laser; generacion de imagenes por barrido con laser (LSI, por sus siglas en ingles) para detectar la union al anticuerpo y colocalizacion de bien con EGFR o bien con ErbB2 o ErbB3 en un formato de alto rendimiento, como una placa de micropocillos (Zuck et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11122-11127 (1999)); o sistema de ensayo eTag/m (Aclara Bio Sciences, Mountain View, Calif.; y solicitud de Patente de EE.UU. 2001/0049105, publicada el 6 de diciembre, 2001).

Es evidente, por lo tanto, que la divulgacion abarca composiciones, combinaciones y metodos farmaceuticos para tratar neoplasias malignas humanas como canceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, pancreas, pulmon, mama, ovario, colon, prostata, piel, y rinon. Por ejemplo, la divulgacion incluye composiciones farmaceuticas para utilizar en el tratamiento de neoplasias malignas humanas que comprenden una cantidad farmaceuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente invencion y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones de ABM descritas en el presente documento pueden administrarse utilizando modos convencionales de administracion que incluyen, pero no se limitan a, administracion intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfatica o directa en el tumor. Se prefiere la administracion intravenosa.

En un aspecto de la divulgacion, las formulaciones terapeuticas que contiene las ABM descritas en el presente documento se preparan para almacenar mediante la mezcla de un anticuerpo que posee el grado deseado de pureza con vehmulos excipientes o estabilizantes opcionales farmaceuticamente aceptables, (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los transportadores excipientes o estabilizantes aceptables atoxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato, y otros acidos organicos; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetillbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butflico o bendlico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 restos); protemas, como seroalbumina, gelatina, o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos como polivinilpirrolidona; aminoacidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azucares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protema); y/o tensioactivos no ionicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Las ABM descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto para tratar una enfermedad o trastorno que se caracteriza por una actividad anomala de EGFR o ligando de EGFR, como un tumor, bien solas o bien en terapia de combinacion con, por ejemplo, un agente quimioterapico y/o radioterapia. Ejemplos de formulaciones de anticuerpo anti-EGFR se describen en Herbst y Shen, Cancer 94(5):1593-1611. Los agente quimioterapicos adecuados incluye cisplatino, doxorubicina, topotecan, paclitaxel, vinblastina, carboplatino, y etoposido.

En el documento WO97/04801 se describen formulaciones liofilizadas adaptadas para la administracion subcutanea. Dichas formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un diluyente adecuado a una alta concentracion de protema y la formulacion reconstituida puede administrarse por via subcutanea al marnffero a tratar.

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La formulacion del presente documento puede tambien contener mas de un compuesto activo que sea necesario para la indicacion particular a tratar, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre st Por ejemplo, podna ser deseable proporcionar ademas un agente citotoxico, agente quimioterapico, citoquina o agente inmunodepresor (por ejemplo uno que actue sobre las linfocitos T, como ciclosporina o un anticuerpo que se una a linfocitos T, por ejemplo, uno que se une a LFA-1). La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de antagonista presente en la formulacion, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores descritos anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con las vfas de administracion tal como se ha utilizado anteriormente alrededor de 1 a 99 % de las dosis empleadas hasta ahora.

Los principios activos pueden tambien atraparse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberacion farmacologica coloidal (por ejemplo: liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartfculas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas estan descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edicion, Osol. A. Ed. (1980).

Pueden prepararse preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmeros solidos hidrofobos que contienen el antagonista, matrices que estan en forma de artfculos con forma, por ejemplo, pelfculas, o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (documento U.S. Pat. N° 3.773.919), copolfmeros de acido L-glutamico y Yetil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolfmeros degradables de acido lactico-acido glicolico como LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico- acido glicolico y acetato de leuprolida), y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco.

Las formulaciones a utilizar para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se logra facilmente mediante la filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden estar en una serie de formas de dosificacion que incluyen, pero no se limitan a, soluciones o suspensiones lfquidas, comprimidos, pfldoras, polvos, supositorios, microcapsulas o microvesfculas polimericas, liposomas, y soluciones inyectables o infusibles. La forma preferida depende del modo de administracion y la aplicacion terapeutica.

Las composiciones de la invencion tambien incluyen preferentemente vetnculos y adyuvantes convencionales farmaceuticamente aceptables conocidos en la tecnica como seroalbumina humana, intercambiadores de iones, alumina, lecitina, sustancias tamponadoras como fosfatos, glicina, acido sorbico, sorbato de potasio, y sales o electrolitos como sulfato de protamina.

El modo mas eficaz de administracion y regimen de dosificacion de las composiciones farmaceuticas como se ha descrito en el presente documento depende de la gravedad y curso de la enfermedad, de la salud y de la respuesta al tratamiento del paciente y el juicio del medico que atiende. De acuerdo con esto, las dosificaciones de las composiciones deberan ajustarse al paciente individual. Sin embargo, una dosis eficaz de las composiciones de esta invencion estara generalmente en el intervalo de alrededor de 0,01 a alrededor de 2000 mg/kg. En una realizacion, la dosis eficaz esta en el intervalo de alrededor de 1,0 mg/kg a alrededor de 15,0 mg/kg. En una realizacion mas espedfica, la dosis esta en el intervalo de alrededor de 1,5 mg/kg a alrededor de 12 mg/kg. En otras realizaciones, la dosis esta en el intervalo de alrededor de 1,5 mg/kg a alrededor de 4,5 mg/kg, o de alrededor de 4,5 mg/kg a alrededor de 12 mg/kg. La dosis tal como se utiliza en el presente documento puede tambien ser cualquier dosis dentro de estos intervalos, que incluyen, pero no se limitan a, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg,

3.5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10,0 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11,0 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12,0 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13,0 mg/kg,

13.5 mg/kg, 14,0 mg/kg, 14,5 mg/kg, o 15,0 mg/kg.

Las moleculas descritas en el presente documento pueden estar en una serie de formas de dosificacion que incluyen, pero no se limitan a, soluciones o suspensiones lfquidas, comprimidos, pfldoras, polvos, supositorios, microcapsulas o microvesfculas polimericas, liposomas, y soluciones inyectables o infusibles. La forma preferida depende del modo de administracion y la aplicacion terapeutica.

Las dosificaciones descritas en el presente documento pueden determinarse en algunos casos, mediante el uso de biomarcadores predictivos. Los biomarcadores predictivos son marcadores moleculares que se utilizan para determinar (es decir, observar y/o cuantificar) un patron de expresion y/o activacion de genes o protemas relacionados con el tumor, o componentes celulares de una via de senalizacion relacionada con el tumor. Descubrir los efectos biologicos de las terapias dirigidas en los tejidos tumorales y correlacionar estos efectos con la respuesta clmica ayuda a identificar el crecimiento y vfas de supervivencia predominantes operativos en tumores, con lo que se establece un perfil de pacientes con respuesta positiva probables y a la inversa, proporcionando una justificacion para disenar estrategias para superar la resistencia. Por ejemplo, los biomarcadores para la terapia anti-EGFR

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pueden comprender moleculas que estan en la v^a de senalizacion posterior de EGFR que conduce a un trastorno de proliferacion celular que incluyen, pero no se limitan a, Akt, RAS, RAF, MAPK, ERK1, ERK2, PKC, STAT3, STAT5 (Mitchell, Nature Biotech. 22: 363-364 (2004); Becker, Nature Biotech 22: 15-18 (2004); Tsao y Herbst, Signal 4:4-9 (2003)). Los biomarcadores para la terapia anti-EGFR pueden comprender tambien receptores del factor de crecimiento como EGFR, ErbB-2 (HER2/neu), y ErbB-3 (HER3), y pueden ser predictores positivos o negativos de la respuesta del paciente a la terapia anti-EGFR. Por ejemplo, se determino que el receptor del factor de crecimiento ErbB-3 (HER3) era un biomarcador predictivo negativo para el anticuerpo anti-EGFR ABX-EGF (la Publicacion de solicitud de patente de EE.UU.N0 2004/0132097 A1).

Los biomarcadores predictivos pueden medirse mediante ensayos celulares que son bien conocidos en la tecnica que incluyen, pero no se limitan a inmunohistoqmmica, citometna de flujo, inmunofluorescencia, ensayos de captura y deteccion, y ensayos de fase reversa, y/o ensayos descritos en la Solicitud de publicacion de patente de EE.UU. N° 2004/0132097 Al. Los propios biomarcadores predictivos de terapia anti-EGFR, pueden identificarse de acuerdo con las tecnicas descritas en la Solicitud de publicacion de patente de EE.UU. N° 2003/0190689 A1.

En un aspecto, la divulgacion describe una composicion que comprende una ABM descrita en el presente documento para utilizar en un metodo para tratar un trastorno relacionado con EGFR que comprende predecir una respuesta a una terapia anti-EGFR en un sujeto humano que necesita el tratamiento en un sujeto humano que se ha predicho que respondera positivamente al tratamiento anti-EGFR mediante el analisis de una muestra del sujeto humano antes de la terapia con uno o una serie de reactivos que detectan la expresion y/o activacion de biomarcadores predictivos para un trastorno relacionado con EGFR como el cancer; determinando un patron de expresion y/o activacion de uno o mas de los biomarcadores predictivos, en el que el patron predice la respuesta de un sujeto humano a la terapia anti-EGFR.

Tal como se utiliza en el presente documento, un sujeto humano que se predice que respondera positivamente a un tratamiento anti-EGFR es uno para los que anti- EGFR tendra un efecto medible sobre el trastorno relacionado con EGFR- (por ejemplo, regresion / encogimiento del tumor) y para el que los beneficios de la terapia anti-EGFR no esta sobrepasado por los efectos adversos (por ejemplo, toxicidad). Tal como se utiliza en el presente documento, una muestra significa cualquier muestra biologica de un organismo, particularmente un humano, que comprende una o mas celulas, que incluye celulas unicas de cualquier origen, muestras de tejido o biopsia que han sido eliminadas de los organos como mama, pulmon, tracto gastrointestinal, piel, cervix, ovario, prostata, rinon, cerebro, cabeza y cuello ,o cualquier otro organo o tejido del cuerpo, y otras muestras corporales que incluyen, pero no se limitan a, frotis, esputo, secreciones, lfquido cefalorraqrndeo, bilis, sangre, lfquido linfatico, orina y heces.

La composicion que comprende una ABM descrita en el presente documento se formulara, dosificara, y administrara de una manera coherente con las buenas practicas medicas. Los factores para consideracion en este contexto incluyen la enfermedad o trastorno particular a tratar, el mairnfero particular a tratar, la condicion clmica del paciente, la causa de la enfermedad o trastorno, el lugar de liberacion del agente, el metodo de administracion, la pauta de administracion, y otros factores conocidos por los medicos practicantes. La cantidad terapeuticamente eficaz del antagonista a administrar estara regido por estas consideraciones.

Como proposicion general, la cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo administrado por via parenteral por cada dosis estara en el intervalo de alrededor de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal del paciente por dfa, estando el intervalo inicial tfpico de antagonista utilizado en el intervalo de alrededor de 2 a 10 mg/kg. En una realizacion, la cantidad terapeuticamente eficaz esta en el intervalo desde alrededor de 1,0 mg/kg a alrededor de 15,0 mg/kg. En una realizacion mas espedfica, la dosis esta en el intervalo desde alrededor de 1,5 mg/kg a alrededor de 12 mg/kg. En otras realizaciones, la dosis esta en el intervalo desde alrededor de 1,5 mg/kg a alrededor de 4.5 mg/kg, o desde alrededor de 4,5 mg/kg a alrededor de 12 mg/kg. La dosis de la presente invencion puede tambien ser cualquier dosis dentro de estos intervalos, que incluyen, pero no se limitan a, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10,0 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11,0 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12,0 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13,0 mg/kg, 13,5 mg/kg, 14,0 mg/kg, 14,5 mg/kg, o 15,0 mg/kg.

En una realizacion preferida, la ABM es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo humanizado. Las dosificaciones adecuadas para dicho anticuerpo no conjugado estan, por ejemplo, en el intervalo desde alrededor de 20 mg/m2 a alrededor de 1000 mg/m2. Por ejemplo, uno puede administrar al paciente una o mas dosis de sustancialmente menos de 375 mg/m2 de anticuerpo, por ejemplo, en el que la dosis esta en el intervalo desde alrededor de 20 mg/m2 a alrededor de 250 mg/m2, por ejemplo desde alrededor de 50 mg/m2 a alrededor de 200 mg/m2.

Ademas, uno puede administrar una o mas dosis iniciales del anticuerpo seguidas de una o mas dosis(s) posterior(es), en las que la dosis en mg/m2 del anticuerpo en las dosis posteriores excede la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la dosis inicial. Por ejemplo, la dosis inicial puede estar en el intervalo desde alrededor de 20 mg/m2 a alrededor de 250 mg/m2 (por ejemplo, desde alrededor de 50 mg/m2 a alrededor de 200 mg/m2) y la dosis posterior puede estar en el intervalo desde alrededor de 250 mg/m2 a alrededor de 1000 mg/m2.

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Tal como se ha dicho antes, no obstante, estas cantidades sugeridas de ABM estan sujetas a una gran cantidad de criterios terapeuticos. El factor clave en la seleccion de una dosis y pauta apropiadas es el resultado obtenido, tal como se ha indicado antes. Por ejemplo, las dosis relativamente altas pueden ser necesarias inicialmente para el tratamiento de enfermedades agudas y en curso. Para obtener los resultados mas eficaces, dependiendo de la enfermedad o trastorno, el antagonista se administra tan cerca del primer signo, diagnostico, aparicion, u ocurrencia de la enfermedad o trastorno como sea posible o durante las remisiones de la enfermedad o trastorno.

En el caso de los anticuerpos anti-EGFR utilizados para tratar tumores, los resultados terapeuticos optimos se han logrado generalmente con una dosis que es suficiente para saturar completamente los receptores de EGF sobre las celulas diana. La dosis necesaria para lograr la saturacion dependera del numero de receptores EGF expresados por celula tumoral (que pueden variar significativamente entre diferentes tipos de tumores). Las concentraciones sericas tan bajas como 30 nM han sido eficaces en el tratamiento de algunos tumores, mientras que pueden ser necesarias concentraciones por encima de 100 nM para lograr el efecto terapeutico optimo con otros tumores. La dosis necesaria para lograr la saturacion para un tumor determinado puede determinarse facilmente in vitro mediante radioinmumoensayo o inmunoprecipitacion.

En general, para la terapia de combinacion con radiacion, un regimen terapeutico adecuado implica ocho infusiones semanales de una ABM anti-EGFR descrita en el presente documento en una dosis de carga de 100-500 mg/m2 seguida de dosis de mantenimiento de 100-250 mg/m2 y radiacion en la cantidad de 70,0 Gy en una dosis diaria de 2,0 Gy. Para la terapia de combinacion con quimioterapia, un regimen terapeutico adecuado implica la administracion de una ABM anti-EGFR descrita en el presente documento con una dosis de carga/ mantenimiento semanal de 100/100 mg/m2, 400/250 mg/m2, o 500/250 mg/m2 en combinacion con cisplatino a una dosis de 100 mg/m2 cada tres semanas. Alternativamente, pueden utilizarse gemcitabina o irinotecan en lugar de cisplatino.

La ABM descritas en el presente documento es para administrar mediante cualquier medio adecuado, que incluye administracion parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y si se desea para el tratamiento inmunodepresor local, administracion intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutanea. Ademas, el antagonista puede administrarse adecuadamente mediante infusion pulsada, por ejemplo, con dosis decrecientes del antagonista. Preferentemente la dosificacion se da mediante inyecciones, mas preferentemente inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administracion es corta o cronica.

Se pueden administrar otros compuestos, como agentes citotoxicos, agentes quimioterapicos, agentes inmunodepresores y/o citoquinas con los antagonistas del presente documento. La administracion combinada incluye coadministracion, utilizando formulaciones separadas o una formulacion farmaceutica unica, y administracion consecutiva en cualquier orden, en el que preferentemente existe un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos simultaneamente ejercen su actividad biologica.

Quedara claro que la dosis necesaria de la composicion descrita en el presente documento para lograr curaciones puede reducirse aun mas con una optimizacion de la pauta.

De acuerdo con la practica de la divulgacion, el vetnculo farmaceutico puede ser un vetnculo lipfdico. El vetnculo lipfdico puede ser un fosfolfpido. Ademas, el vetnculo lipfdico puede ser un acido graso. Tambien, el vetnculo lipfdico puede ser un detergente. Tal como se utiliza en el presente documento, un detergente es cualquier sustancia que altera la tension superficial de un lfquido, generalmente disminuyendola.

En un ejemplo de la divulgacion, el detergente puede ser un detergente no ionico. Los ejemplos de detergentes no ionicos incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 80 (tambien conocido como Tween 80 o (monooleato de polioxietilensorbitano), Brij, y Triton (por ejemplo Triton WR-1339 y Triton A-20).

Alternativamente, el detergente puede ser un detergente ionico. Un ejemplo de un detergente ionico incluye, pero no se limita a, bromuro de alquiltrimetilamonio.

Adicionalmente, de acuerdo con la invencion, el vetnculo lipfdico puede ser un liposoma. Tal como se utiliza en esta solicitud, un "liposoma" es cualquier vesfcula unida a una membrana que contiene cualquier molecula de la invencion o combinaciones de las mismas.

En otra realizacion mas, la divulgacion esta relacionada con una ABM como se ha descrito en el presente documento para utilizar como medicamento, en particular para utilizar en el tratamiento o profilaxis del cancer o para utilizar en una afeccion o lesion precancerosa. El cancer puede ser, por ejemplo, cancer de pulmon, cancer no microcftico de pulmon (CNMP), cancer de pulmon de celulas bronquioalveolares, cancer de huesos, cancer pancreatico, cancer de piel, cancer de cabeza o cuello, melanoma cutaneo o intraocular, cancer de utero, cancer de ovario, cancer rectal, cancer de la region anal, cancer de estomago, cancer gastrico, cancer de colon , cancer de mama, cancer de utero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cervix, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad de Hodgkin, cancer de esofago, cancer de intestino delgado, cancer de sistema endocrino, cancer de glandula tiroides, cancer de glandula paratiroides, cancer de glandula

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adrenal, sarcoma de tejido blando, cancer de uretra, cancer de pene, cancer de prostata, cancer de vejiga, cancer de rinon o ureter, carcinoma de celulas renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cancer hepatocelular, cancer biliar, leucemia cronica o aguda, linfoma linfoide, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma de cerebro, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinoma de celulas escamosas, adenomas pituitarios, que incluyen versiones resistentes de cualquiera de los canceres anteriores, o una combinacion de uno o mas de los canceres anteriores. La afeccion o lesion precancerosa incluye, por ejemplo, el grupo que consiste en leucoplaquia oral, queratosis actmica (queratosis solar), polipos precancerosos del colon o recto, displasia del epitelio gastrico, displasia adenomatosa, smdrome de cancer de colon no poliposo hereditario (CCNPH), esofago de Barrett, displasia de vejiga, y afecciones precancerosas del cuello uterino.

Preferentemente, dicho cancer se selecciona de entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de pancreas, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de rinon, y cancer de cerebro.

Otra realizacion mas es el uso de la ABM como se ha descrito en el presente documento para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del cancer. El cancer es como se ha definido anteriormente.

Preferentemente, dicho cancer se selecciona de entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de pancreas, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de rinon, y cancer de cerebro.

Tambien preferentemente, dicha molecula de union a antfgeno se utiliza en una cantidad terapeuticamente eficaz desde alrededor de 1,0 mg/kg a alrededor de 15 mg/kg.

Tambien mas preferentemente, dicha molecula de union a antfgeno se utiliza en una cantidad terapeuticamente eficaz desde alrededor de 1,5 mg/kg a alrededor de 12 mg/kg.

Tambien mas preferentemente, dicha molecula de union a antfgeno se utiliza en una cantidad terapeuticamente eficaz desde alrededor de 1,5 mg/kg a alrededor de 4,5 mg/kg.

Tambien mas preferentemente, dicha molecula de union a antfgeno se utiliza en una cantidad terapeuticamente eficaz desde alrededor de 4,5 mg/kg a alrededor de 12 mg/kg.

Lo mas preferentemente, dicha molecula de union a antfgeno se utiliza en una cantidad terapeuticamente eficaz de alrededor de 1,5 mg/kg.

Tambien lo mas preferentemente, dicha molecula de union a antfgeno se utiliza en una cantidad terapeuticamente eficaz de alrededor de 4,5 mg/kg.

Tambien lo mas preferentemente, dicha molecula de union a antfgeno se utiliza en una cantidad terapeuticamente eficaz de alrededor de 1,2 mg/kg.

En otra realizacion, la divulgacion esta dirigida a un metodo de tratamiento de un trastorno relacionado con EGFR en un mairnfero que necesita de este tratamiento que comprende administrar al mairnfero una ABM de la presente invencion, en el que el tratamiento resulta en concentraciones sericas de dicha ABM entre alrededor de 1 y alrededor de 500 pg/ml , durante un periodo de al menos 4 semanas, y en el que el tratamiento no provoca un nivel de toxicidad clmicamente significativo en dicho mairnfero. En otras realizaciones, la concentracion en suero esta en la cantidad seleccionada de entre el grupo que consiste en por encima de 1 pg/ml , por encima de 25 pg/ml , por encima de 50 pg/ml , por encima de 100 pg/ml , por encima de 200 pg/ml , por encima de 300 pg/ml , por encima de 400 pg/ml , alrededor de 500 pg/ml, entre alrededor de 1 y alrededor de 100 pg/ml , entre alrededor de 1 y alrededor de 200 pg/ml , entre alrededor de 1 y alrededor de 300 pg/ml , entre alrededor de 1 y alrededor 400 p g/ml , y entre alrededor de 1 y alrededor de 500 pg/ml . En una realizacion preferida, el mairnfero es un ser humano. En una realizacion la aBm es un anticuerpo. En una realizacion preferida, el anticuerpo esta modificado por glucoingeniena y posee una union de FcgammaRlII aumentada en comparacion con una forma no modificada por glucoingeniena del anticuerpo.

En un aspecto, la divulgacion esta dirigida a una molecula de union a antfgeno (ABM) que se une espedficamente a EGFR, en la que la ABM comprende ademas una region Fc de inmunoglobulina o un fragmento de la misma, y en la que la region Fc o fragmento de la misma ha sido modificado por glucoingeniena para tener una funcion efectora aumentada en comparacion con una forma no modificada por glucoingeniena. En una realizacion particular, la funcion efectora es una citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM que se une espedficamente a EGFR, en la que la ABM comprende ademas una region Fc de inmunoglobulina o fragmento de la misma, y en la que la region Fc o fragmento de la misma ha sido modificada por glucoingeniena para tener una afinidad de union aumentada al

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receptor de Fc en comparacion con una forma no disenada por glucoingeniena.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM que se une espedficamente a EGFR, en la que la ABM no provoca un nivel clmicamente significativo de toxicidad cuando se administra a un sujeto en una cantidad terapeuticamente eficaz. En una realizacion, la ABM comprende ademas una region Fc de inmunoglobulina o fragmento de la misma. En una realizacion espedfica, la region Fc o fragmento de la misma ha sido modificada por ingeniena para tener una funcion efectora aumentada en comparacion con una forma no modificada por ingeniena. En una realizacion mas espedfica, la funcion efectora es un citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada. En otra realizacion, la region Fc o fragmento de la misma ha sido modificada por ingeniena para tener una afinidad de union al receptor de Fc aumentada en comparacion con una forma no modificada por ingeniena. En una realizacion espedfica, la cantidad terapeuticamente eficaz es desde alrededor de 1,0 mg/kg a alrededor de 15 mg/kg. En otra realizacion espedfica, la cantidad terapeuticamente eficaz es una concentracion serica de alrededor de un microgramo por mililitro.

En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM como se ha descrito anteriormente para utilizar en el tratamiento de un trastorno relacionado con EGFR en un sujeto que necesita dicho tratamiento. En otro aspecto, la divulgacion esta dirigida a una ABM que se une espedficamente a EGFR para utilizar un metodo de tratamiento de un trastorno relacionado con EGFR en un sujeto mamffero que necesita dicho tratamiento, en el que la ABM no provoca un nivel clfnicamente significativo de toxicidad cuando se administra a un sujeto mairnfero en una cantidad terapeuticamente eficaz. En una realizacion, la cantidad terapeuticamente eficaz proporciona concentraciones sericas de la ABM de entre alrededor 1 y alrededor de 100 microgramos por mililitro durante un periodo de al menos 4 semanas. En otra realizacion, la ABM utilizada en el tratamiento comprende ademas una region Fc de inmunoglobulina o fragmento de la misma. En una realizacion mas espedfica, la region Fc o fragmento de la misma ha sido modificada por ingeniena para tener una funcion efectora aumentada en comparacion con una forma no modificada. En una realizacion particular, la funcion efectora una citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada. En otra realizacion particular, la region Fc o fragmento de la misma ha sido modificada por ingeniena para tener una afinidad de union aumentada al receptor de Fc en comparacion con una forma no modificada. En una realizacion preferida, el receptor de Fc es FcyRIII.

Artfculos de fabricacion

En otra realizacion descrita en el presente documento, se proporciona un artfculo de fabricacion que contiene materiales utiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artfculo de fabricacion comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar formados por una serie de materiales como vidrio o plastico. El envase mantiene una composicion que es eficaz para tratar la afeccion y puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo el envase puede ser una bolsa de solucion intravenosa o un vial que posee un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Al menos un agente activo de la composicion es un anticuerpo anti-EGFR. La etiqueta o prospecto indica que la composicion se utiliza para tratar la afeccion de eleccion, como una enfermedad o trastorno no maligno, en el que la enfermedad o trastorno implica activacion o produccion anomala de un receptor de EGFR y/o un ligando de EGFR, por ejemplo una enfermedad o trastorno hiperproliferativo benigno. Ademas, el artfculo de fabricacion puede comprender (a) un primer envase con una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un primer anticuerpo que se une a EGFR e inhibe el crecimiento de las celulas que sobreexpresan EGFR; y (b) un segundo envase con una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un segundo anticuerpo que se une a EGFR y bloquea la activacion por ligando de un receptor EGFR. El artfculo de fabricacion en esta realizacion de la invencion puede comprender ademas un prospecto que indica que las composiciones del primer y segundo anticuerpo pueden utilizarse para tratar una enfermedad o trastorno no maligno del listado de dichas enfermedades o trastornos en la seccion de definiciones anterior. Ademas, el prospecto puede instruir al usuario de la composicion (que comprende un anticuerpo que se une a EGFR y bloquea la activacion por ligando de un receptor de EGFR) para combinar la terapia con el anticuerpo y cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la seccion precedente (por ejemplo un agente quimioterapico, un farmaco dirigido contra EGFR, un agente antiangiogenico, un agente inmunodepresor, un inhibidor de la tirosina quinasa, un compuesto anti-hormonal, un cardioprotector y/o una citoquina). De forma alternativa o adicional, el artfculo de fabricacion puede comprender ademas un segundo (o tercer) envase que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable, como agua bacteriostatica para inyeccion (ABPI), solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. Puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.

Los siguientes ejemplos explican la invencion en mas detalle.

Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para permitir a los expertos en la tecnica entender mas claramente y poner en practica la invencion.

Ejemplos

A no ser que se especifique de otra manera, las referencias a la numeracion de posiciones espedficas de restos de

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aminoacido en los siguientes ejemplos estan de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat.

EJEMPLO 1 Materiales y metodos

Procedimiento del aceptor de alta homologfa

La busqueda dela region marco conservada aceptora de alta homologfa de un anticuerpo se realizo alineando la secuencia de la protema ICR62 de rata con una coleccion de secuencias humanas de lmea germinal y escogiendo las secuencias humanas que muestran una mayor identidad de secuencia, al tiempo que conservan todos los restos canonicos a nivel funcional. En este punto, la secuencia 1-e de la familia VH1 de la base de datos VBase se escogio como secuencia marco conservada aceptora de cadena pesada, y la secuencia A30 de la familia VK1 de la base de datos VBase se escogio como region marco conservada aceptora de cadena ligera. En estas dos regiones marcoconservadas aceptoras se injertaron las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) y/o los restos determinantes de la especificidad de esas CDR de los dominios variables pesados y ligeros de la ICR62 de rata. Como la region marco conservada 4 no forma parte del gen de la region variable de la lmea germinal, el alineamiento para esa posicion se realizo de forma individual. La region JH6 se escogio como cadena pesada, y la region JK2 se escogio como cadena ligera. El modelado molecular del dominio de inmunoglobulina disenado revelo una posicion fuera de la CDR1 de Kabat que potencialmente requena los restos de aminoacido murinos en lugar de los humanos fuera de la CDR. La reintroduccion de restos de aminoacido murinos en la region maco conservada humana generana las denominadas "retromutaciones". Por ejemplo, el resto de aminoacido del aceptor humano en la posicion 27 de Kabat (Glicina en 1-e) se retromuto a un resto de tirosina. Para mostrar la importancia de los restos de union a antfgeno, se disenaron variantes de anticuerpo humanizado que inclrnan u omitfan las retromutaciones. La cadena ligera del anticuerpo humanizado no requirio ninguna retromutacion. Tras disenar las de secuencias de protema, las secuencias de ADN que codifican estas protemas se sintetizaron como se detalla a continuacion.

Procedimiento de mezcla de regiones marco conservadas

Para evitar la necesidad de introducir retromutaciones en posiciones cnticas (cnticas para mantener una buena afinidad de union al antfgeno o las funciones del anticuerpo) de la region marco conservada aceptora humana, se investigo si la region marco conservada 1 (FR1), las regiones marco conservadas 1 (FR1) y 2 (FR2) juntas, o la region marco conservada 3 (FR3) de un anticuerpo funcionalmente humanizado podfan reemplazarse con secuencias de anticuerpo humano que ya poseen restos del donante, o restos de aminoacido que son funcionalmente equivalentes a los restos del donante, en posiciones de resto importantes en la secuencia humana natural de lmea germinal. Para este fin, las regiones marco conservadas 1, 2 y 3 de VH de la secuencia VH de ICR62 de rata se alinearon individualmente con las secuencias humanas de lmea germinal. Aqu no se utilizo la identidad de secuencia mas alta para escoger las regiones marco conservadas aceptoras; en cambio, se realizo un emparejamiento de varios restos cnticos. Estos restos cnticos comprenden los denominados restos canonicos, y tambien aquellos restos en la posicion 27, 28 y 30 (numeracion de Kabat), que estan fuera de la definicion de la CDR1 de Kabat, pero que a menudo estan involucrados en la union a antfgeno. Ademas, los restos cnticos son aquellos que muestran una importante interaccion con las CDR, lo que puede determinarse utilizando el modelado molecular. Las secuencias IMGT IGHV1-58 (N° registro M29809), IgHv5-51 (N° registro M99686), asf como la secuencia de VBase 1-02 de la familia VH1 se escogieron como las adecuadas para reemplazar la FR1, 2 o 3. Brevemente: la IGHV1-58 mostro un patron prometedor en las posiciones de Kabat de 27 a 30, pero no cumple los criterios para la posicion canonica 71. La IGHV5-51 posefa un resto 71 emparejado, de forma que podfa utilizarse su FR3. Tambien su FR1 es cercana a la secuencia FR1 deseada.

La 1-e de VH1 cumplio todos los criterios aparte de la posicion 27. La secuencia 1-02 se considero aceptable para las regiones FR1 y FR2, pero requerina una retromutacion en FR3.

Tras disenar las secuencias de protema, se sintetizaron las secuencias de ADN que codifican estas protemas como se detalla a continuacion. Utilizando este procedimiento no eran necesarias las retromutaciones en la mayona de las construcciones de cadena pesada, para mantener buenos niveles de union a antfgeno. La cronologfa y los razonamientos de las construcciones mixtas de las regiones marco conservadas se explican en la seccion de resultados.

Smtesis los genes del anticuerpo

Tras haber disenado la secuencia de aminoacidos de la region V del anticuerpo humanizado, se genero la secuencia de ADN. Los datos de la secuencia de ADN de las regiones marco conservadas individuales se encontraron en las bases de datos (por ejemplo IMGT o VBase) de secuencias humanas de lmea germinal. La informacion de la secuencia de ADN de las regiones CDR se tomo de la secuencia publicada del anticuerpo de rata ICR62 (vease, por ejemplo, la publicacion PCT WO 95/20045). Con estas secuencias, la secuencia de ADN completa se ensamblo virtualmente. Con los datos de esta secuencia de ADN, se introdujeron sitios de restriccion diagnosticos en la secuencia virtual mediante la introduccion de mutaciones silentes, creando sitios de reconocimiento para las

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endonucleasas de restriccion. Para obtener la cadena de ADN ffsica, se realizo smtesis genica (vease por ejemplo, Wheeler et al. 1995). En este metodo, se disenaron los oligonucleotidos a partir de los genes de interes, de forma que una serie de oligonucleotidos procede de la cadena codificante, y la otra serie es de la cadena no codificante. Los extremos 3' y 5' de cada oligonucleotido (excepto el primero y el ultimo de la fila) siempre muestran secuencias complementarias a los dos cebadores procedentes de la cadena opuesta. Cuando se anaden estos oligonucleotidos en un tampon de reaccion adecuado para una polimerasa termoestable, y se anade Mg2+, dNTP y una polimerasa de ADN, cada oligonucleotido se elonga a partir de su extremo 3'. El extremo 3' recien formado de un cebador hibrida entonces con el siguiente cebador de la cadena opuesta, y elonga mas su secuencia en condiciones adecuadas para la elongacion de la cadena de ADN dependiente de molde. El producto final se clono en un vector convencional para la propagacion en E. coli.

Produccion de anticuerpo

Para la construccion de los vectores de expresion de la cadena ligera y pesada de anti-EGFR quimerico (es decir, region V completamente de rata y region C humana) y humanizado, se anadieron secuencias lfder (de secrecion) de la cadena pesada y ligera humana en direccion 5' de las secuencias de ADN de la region variable. En direccion 3' de las regiones variables, se anadieron las regiones constantes de la IgG1 para la cadena pesada, y la region constante kappa de cadena ligera utilizando tecnicas estandar de biologfa molecular. Las secuencias resultantes de ADN de cadena pesada y ligera del anticuerpo completo se subclonaron en vectores de expresion de mairnferos (uno para la cadena ligera y uno para la cadena pesada) bajo el control del promotor MPSV y en direccion 5' con respecto a un sitio de polyA sintetico, y cada vector era portador de una secuencia OriP de EBV.

Los anticuerpos se obtuvieron por cotransfeccion de las celulas HEK293-EBNA con los vectores de expresion de cadena pesada y ligera del anticuerpo de marnffero utilizando una estrategia de transfeccion con fosfato calcico. Las celulas HEK293-EBNA en crecimiento exponencial se transfectaron mediante el metodo del fosfato calcico. Para la produccion de anticuerpo no modificado, las celulas se transfectaron solo con los vectores de expresion de cadena pesada y ligera del anticuerpo en una proporcion 1:1. Para la produccion del anticuerpo modificado por glucoingeniena, las celulas se cotransfectaron con cuatro plasmidos, dos para la expresion del anticuerpo, uno para la expresion de un polipeptido de fusion de GnTIII, y uno para la expresion de manosidasa II a una proporcion 4:4:1:1, respectivamente. Las celulas se hicieron crecer como cultivos en monocapa adherente en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM complementado con SBF al 10 %, y se transfectaron cuando estaban en una confluencia entre el 50 y 80 %. Para la transfeccion de un matraz T75, se sembraron 8 millones de celulas 24 horas antes de la transfeccion en 14 ml de medio de cultivo DMEM complementado con SBF (al 10 % V/V final) y 250 |jg/ml de neomicina, y las celulas se colocaron a 37 °C en un incubador con una atmosfera de CO2 al 5 % durante toda la noche. Para cada matraz T75 a transfectar, se preparo una solucion de ADN, CaCl2 y agua mezclando 47 jg totales de ADN del vector de plasmido dividido a partes iguales entre los vectores de expresion de cadena ligera y la pesada, 235 jl de una solucion 1M de CaCl2, y anadiendo agua hasta un volumen final de 469 jl. A esta solucion se anadieron 469 jl de una solucion de HEPES 50mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM a pH 7,05, se mezclo inmediatamente durante 10 s. y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 20 s. La suspension se diluyo con 12 ml de DMEM complementado con al SBF 2 %, y se anadio al T75 en lugar del medio existente. Las celulas se incubaron a 37 °C, con CO2 al 5 % durante alrededor de 17 a 20 horas, luego el medio se reemplazo con 12 ml de DMEM, SBF al 10 %. El medio de cultivo acondicionado se recogio entre 5 y 7 dfas post-transfeccion, se centrifugo durante 5 min. a 1200 rpm, seguido de una segunda centrifugacion durante 10 min a 4000 rpm y se mantuvo a 4°C.

Los anticuerpos secretados se purificaron mediante una cromatograffa de afinidad a protema A, seguida de una cromatograffa de intercambio cationico y una etapa final de cromatograffa de exclusion por tamano en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) intercambiando el tampon por solucion salina tamponada con fosfato y recogiendo los anticuerpos IgG1 monomericos puros. La concentracion de anticuerpo se estimo utilizando un espectrofotometro a partir de la absorbancia a 280 nm. Los anticuerpos se formularon en una solucion de fosfato potasico 25 mM, cloruro sodico 125 mM, glicina 100 mM, a pH 6,7.

Las variantes modificadas por glucoingeniena del anticuerpo humanizado se produjeron por cotransfeccion de los vectores de expresion de anticuerpo junto con un vector de expresion de glucosiltransferasa GnT-III, o junto con un vector de expresion de GnT-III mas un vector de expresion de manosidasa II de Golgi. Los anticuerpos modificados por glucoingeniena se purificaron y se formularon como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos no modificados por glucoingeniena. Los oligosacaridos unidos a la region Fc de los anticuerpos se analizaron mediante EM-MALDI/TOF como se describe a continuacion.

Analisis de oligosacaridos

Los oligosacaridos se liberaron enzimaticamente de los anticuerpos mediante digestion con PNGasaF, estando los anticuerpos bien inmovilizados sobre una membrana de PVDF o bien en solucion.

La solucion de digestion resultante que contiene los oligosacaridos liberados se preparo directamente para su analisis EM-MALDI/TOF o se digirio posteriormente con glucosidasa EndoH antes de la preparacion de la muestra para su analisis por EM-MALDI/TOF.

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Metodo de liberacion de oligosacaridos para anticuerpos inmovilizados en una membrana de PVDF

Los pocillos de una placa de 96 pocillos hechos con una membrana de PYDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) se humedecieron con 100 jl de metanol y el lfquido se extrajo a traves de la membrana de PVDF utilizando vado aplicado al colector de vado Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). Las membranas de PVDP se lavaron tres veces con 300 jl de agua. Entonces se lavaron los pocillos con 50 jl de tampon RCM (Urea 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6). Se cargaron entre 30-40 jg de anticuerpo en un pocillo que contiene 10 jl de tampon RCM. El lfquido del pocillo se extrajo a traves de la membrana aplicando vado, y la membrana se lavo a continuacion dos veces con 50 jl de tampon RCM. La reduccion de los puentes disulfuro se realizo mediante la adicion de 50 jl de ditiotreitol 0,1 M en RCM y la incubacion a 37°C durante 1 h.

Tras la reduccion, se aplico vado para eliminar la solucion de ditiotreitol del pocillo. Los pocillos se lavaron tres veces con 300 jl de agua antes de realizar la carboximetilacion de los restos de cistema mediante la adicion de 50 jl de acido yodoacetico 0,1 M en tampon RCM e incubacion a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 min.

Tras la carboximetilacion, los pocillos se extrajeron con vado y a continuacion se lavaron tres veces con 300 jl de agua. La membrana de PVDF se bloqueo entonces, para evitar la adsorcion de la endoglucosidasa, mediante la incubacion con 100 jl de una solucion acuosa al 1 % de polivinilpirrolidona 360 a temperatura ambiente durante 1 hora. El reactivo de bloqueo se elimino entonces mediante vado suave seguido de tres lavados con 300 jl de agua.

Los oligosacaridos N-ligados se liberaron mediante la adicion de 2,5 mU de peptido-N-glucosidasa F (N-Glucanasa recombinante, GLYKO, Novato, CA) y 0,1 mU de sialidasa (GLYKO, Novato, CA), para eliminar cualquier resto monosacarido potencialmente cargado, en un volumen final de 25 jl en NaHCO3 20 mM, pH 7,0). La digestion se realizo durante 3 horas a 37°C.

Metodo de liberacion de oligosacaridos para anticuerpos en solucion

Se mezclaron entre 40 y 50 jg de anticuerpo con 2,5 mU de PNGasa F (Glyko, U.S.A.) en Tris 2 mM, pH 7,0 en un volumen final de 25 microlitros y la mezcla se incubo durante 3 horas a 37 °C.

Utilizacion de la digestion con endoglucosidasa H de los oligosacaridos liberados con PNGasa F para la asignacion de estructuras de oligosacaridos biseccionados hfbridos a los picos de oligosacaridos neutros de EM-MALDI/TOF

Los oligosacaridos liberados con PNGasa F se digirieron a continuacion con endoglucosidasa H (EC 3.2.1.96). Para la digestion con Endo H, se anadieron 15 mU de Endo H (Roche, Suiza) a la digestion de PNGasa F (metodo anterior para anticuerpo en solucion) para proporcionar un volumen final de 30 microlitros, y la mezcla se incubo durante 3 horas a 37 °C. La ando escinde entre los restos N-acetilglucosamina del nucleo chitobiosa de los oligosacaridos N-ligados. La enzima solo puede digerir oligomanosa y la mayona de glucanos de tipo hfbrido, mientras que los oligosacaridos de tipo complejo no se hidrolizan.

Preparacion de las muestras para EM MALDI/TOF

Las digestiones enzimaticas que contienen los oligosacaridos liberados se incubaron durante 3 h adicionales a temperatura ambiente tras la adicion de acido acetico hasta una concentracion final de 150 mM, y a continuacion se hicieron pasar a traves de una resina de intercambio cationico de 0,6 ml (resina AG50W-X8, forma hidrogenada, tamano de poro 100-200, BioRad, Suiza) empaquetada en una columna de cromatograffa micro-bio-spin (BioRad, Suiza) para eliminar los cationes y protemas. Un microlitro de la muestra resultante se aplico en una placa diana de acero inoxidable, y se mezclo sobre la placa con 1 jl de matriz sDHB. La matriz sDHB se preparo disolviendo 2 mg de acido 2,5-dihidroxibenzoico mas 0,1 mg de acido 5-metoxisalidlico en 1 ml de etanol/ cloruro sodico acuoso 10 mM 1:1 (v/v). Las muestras se secaron al aire, se aplicaron 0,2 jl de etanol y finalmente las muestras se dejaron recristalizar al aire.

EM-MALDI/TOF

El espectrometro de masas MALDI-TOF utilizado para adquirir los espectros de masas fue un Voyager Elite (Perspective Biosystems). El instrumento se hizo funcionar en configuracion lineal, con una aceleracion de 20 kV y un retraso de 80 ns. Se utilizo una calibracion externa utilizando patrones de oligosacarido para la asignacion de masa de los iones. Para obtener el espectro final se sumaron los espectros de 200 disparos laser.

Ensayo de union a antfgeno

La union de las variantes humanizadas de anticuerpo monomerico purificado al receptor del factor de crecimiento epidermico humano (EGFR, tambien denominado en la bibliograffa HER-1 o ErbB1) en la lmea celular epidermica humana A431, se analizo utilizando un ensayo basado en la citometna de flujo. Se transfirieron 200.000 celulas (por ejemplo, de la lmea celular humana A431) en 180 jl de tampon FACS (PBS que contiene SBF al 2 % y EDTA 5 mM) a tubos de poliestireno de 5 ml y se anadieron 20 jl de muestras de anticuerpo anti-EGFR (anticuerpo primario)

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concentradas 10 veces (1-5000 ng/ml concentracion final) o solo PBS. Tras mezclar suavemente las muestras, los tubos se incubaron a 4°C durante 30 min en la oscuridad. A continuacion, las muestras se lavaron dos veces con tampon FACS y se sedimentaron a 300 x g durante 3 min. El sobrenadante se elimino por aspiracion y las celulas se recogieron en 50 pl de tampon FACS y se anadieron 2 pl de fragmentos de anticuerpo secundario (F(ab')2-FITC anti- Fc espedfico (Jackson Immuno Research Laboratories, USA) y los tubos se incubaron a 4°C durante 30 min. Las muestras se lavaron dos veces con tampon FACS y se recogieron en 500 pl de tampon FACS para su analisis mediante citometna de flujo. La union se determino mediante la representacion de la media geometrica de la fluorescencia frente a las concentraciones de anticuerpo.

Union de glucovariantes monomericas de IgG1 a una lmea celular CHO que expresa FcyRIIIA

Se transfectaron celulas CHO mediante electroporacion (280 V, 950 mF, 0,4 cm) con un vector de expresion que codifica la cadena a y la cadena y del Fc gammaRNIA-Val158. Los transfectantes se seleccionaron mediante la adicion de 6 pg/ml de puromicina y los clones estables se analizaron mediante FACS utilizando 10 pl de anticuerpo monoclonal anti-FcgammaRIII 3G8 conjugado con FITC (BD Biosciences, Allschwill/ Suiza) para 106 celulas. Se realizo la union de la IgG1 a las celulas CHO que expresan el Fc gammaRINA-Val158. Brevemente, se anadieron los fragmentos F(ab')2 anti-FcgammaRIIIA 3G8 (Ancell, Bayport, MN/USA) a una concentracion de 10 p g/ml para competir por la union de las glucovariantes de anticuerpo (3 p g/ml ). La intensidad de la fluorescencia referida a las variantes de anticuerpo unido se determino en un FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil /Suiza).

Ensayo de CCDA

Se utilizaron celulas mononucleares de sangre periferica humana (CMSP) como celulas efectoras y se prepararon utilizando un Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA) siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante. En forma breve, se recogio sangre venosa de voluntarios sanos en jeringas heparinizadas. La sangre se diluyo 1: 0,75-1,3 con PBS (que no contiene Ca++ ni Mg++) y se separo en capas en un Histopaque-1077. El gradiente se centrifugo a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente (TA) sin freno. La interfase que contiene las CMSP se recolecto y se lavo con PBS (50 ml por celulas de dos gradientes) y se recogieron mediante centrifugacion a 300 x g durante 10 minutos a TA. Tras la resuspension del sedimento con PBS, las CMSP se contaron y se lavaron una segunda vez mediante centrifugacion a 200 x g durante 10 minutos a TA. Las celulas se resuspendieron entonces en el medio apropiado para los subsiguientes procedimientos.

La proporcion entre efector y diana utilizada para los ensayos de CCDA fue de 25:1 y de 10:1 para las celulas CMSP y NK, respectivamente. Las celulas efectoras se prepararon en medio AIM-V a la concentracion apropiada para anadir 50 pl por pocillo a placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las celulas diana fueron celulas que expresan EGFR humano (por ejemplo, A431, EBC-1 o LN229) que habfan crecido en DMEM que contiene un 10 % de SBF. Las celulas diana se lavaron en PBS, se contaron y se resuspendieron en AIM-V a 0,3 millones por ml para anadir 30.000 celulas en 100 pl por micropocillo. Los anticuerpos se diluyeron en AIM-V, se anadieron en 50 pl a las celulas diana presembradas y se dejaron unir a las celulas diana durante 10 minutos a TA. Luego se anadieron las celulas efectoras y la placa se incubo durante 4 horas a 37°C en una atmosfera humidificada que contiene CO2 al 5 %. La muerte de las celulas diana se valoro midiendo la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) de las celulas danadas utilizando el kit Cytotoxicity Detection kit (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza). Tras la incubacion de 4 horas, las placas se centrifugaron a 800 x g. Se transfirieron 100 pl del sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano transparente. Se anadieron 100 pl de tampon de sustrato coloreado del kit por pocillo. Los valores de Vmax de la reaccion de color se determinaron en un lector de ELISA a 490 nm durante al menos 10 min utilizando el programa SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). La liberacion espontanea de LDH se midio en los pocillos que conteman solo celulas diana y efectoras pero no anticuerpos. La liberacion maxima se determino en los pocillos que conteman solo celulas diana y Triton X-100 al 1 %. El porcentaje de muerte mediada por el anticuerpo espedfico se calculo como sigue: ((x - SR)/(MR - SR)*100, en la que x es la media de Vmax a una concentracion de anticuerpo espedfico, SR es la media de las Vmax de liberacion espontanea y MR es la media de las Vmax de liberacion maxima.

EJEMPLO 2

Resultados y discusion

La comparacion de la union al receptor EGF humano de las variantes de anticuerpo I-HHA, I-HHB, I-HHC, I-HLA, I-HLB, I-HLC, I-HLA1, 1-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5, I-HLA6, I-HLA7, I-HLA8, I-HLA-9, I-HHD, I-HHE, I-HHF e I-HHG, en complejo con la cadena ligera del ICR62 quimerico o con las cadenas ligeras humanizada de ICR62 (I- KA, I-KB o I-KC) y el anticuerpo ch-ICR62 quimerico precursor, muestra que todos los anticuerpos poseen valores de CE50 similares dentro de una unidad logantmica. Solo la I-HHA posee una actividad de union fuertemente reducida (vease la figura 2). La figura 1 muestra la actividad funcional de las cadenas de polipeptido individuales del ICR62 quimerico (ch-ICR62) cuando se combinan con las construcciones humanizadas I-HHC e I-KB, respectivamente. En este experimento, la cadena ligera, la cadena pesada o ambas cadenas de ch-ICR62 simultaneamente se reemplazaron por las construcciones humanizadas anteriormente mencionadas. Esto demuestra que la formacion de la interfaz VH/VL parece funcionar tanto en el anticuerpo de roedor como en las

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construcciones humanizadas.

Como se muestra en la figura 2, la cadena pesada humanizada I-HHA no pudo restaurar la actividad de union ni con la cadena ligera I-KA ni con I-KB. Como I-HLA mostro union tanto con I-KA como con I-KB, los presentes inventores concluyeron que la cadena pesada I-HHA no es funcional en la union a antfgeno. Las figuras 1 y 2, combinadas con la figura 3, muestran que las construcciones de cadena ligera I-KA, I-KB e I-KC tienen un comportamiento en su union que es indistinguible de su homologo de roedor. La variante I-KC no posee ninguna retromutacion, y ademas tiene la CDR1 parcialmente humanizada, de forma que los restos 24-29 pueden proceder de la secuencia aceptora humana (A30 de VK1, como se ha mencionado anteriormente).

En la serie I-HHA, I-HHB e I-HHC, solo las ultimas dos variantes mostraron un comportamiento de union satisfactorio (figuras 2 y 3). El analisis de la secuencia de I-HHA revelo tres potenciales restos de aminoacido responsables de este comportamiento: Lys33, His35 y Tyr50. Las construcciones que posefan la Lys33 reemplazada por tirosina mostraron una buena union, asf como las construcciones con la Tyr50 reemplazada por triptofano. Solo cuando estos dos restos se reemplazaron con alanina y glicina, respectivamente, se perdio la union. Como I-HHC no mostro una mayor union que I-HHB, los presentes inventores concluyeron que los restos Asn60, Glu61, Lys64 y Ser65 no han de ser necesariamente de origen roedor; o pueden reemplazarse por Ala, Gln, Gln y Gly, respectivamente. Este procedimiento conduce a una construccion en la que la CDR2 esta mas humanizada, ya que las posiciones de aminoacido de 60 a 65 son parte de la definicion de CDR de Kabat, pero no es necesario injertar los restos donantes de roedor para este anticuerpo.

Las figuras 4 y 5 comparan las construcciones de la serie I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5 e I-HLA6. El mejor comportamiento de union se observo en las construcciones ch-ICR62, I-HLA1 e IHLA2, con un valor de CE50 de aprox. 300 ng/ml. El resto de construcciones mostraban este valor aumentado en un factor de dos, y por lo tanto mostraron una actividad de union ligeramente reducida. La primera conclusion de estos datos es que, dentro de la CDR1 de Kabat, las sustituciones Lys33Tyr e Ile34Met se toleraban. Estas dos posiciones estan localizadas dentro de la definicion de Kabat de la CDR1, pero fuera de los lfmites de la CDR de Chothia (que se basaron en un analisis estructural en lugar de un analisis de la secuencia). En la ultima parte de la CDR1, entonces, se permite al menos cierta promiscuidad.

La segunda conclusion es que, dentro de la CDR2, ademas del reemplazo anteriormente mencionado de los restos Asn60 y Glu61 por los restos que no son de donante, tambien se permitieron las sustituciones no de donante Asn60Ser, Glu61Pro y Lys62Ser dentro de la CDR de Kabat. Estos restos procedfan de la secuencia aceptora IGHV5-51 de lmea germinal humana, que se utilizo como una secuencia aceptora de FR3. Las construcciones I- HLA3 y I-HLA4 difieren de la I-HLA1 e I-HLA2 solo por la eliminacion de la retromutacion Phe27Tyr, y tanto las construcciones I-HLA3 como I-HLA4 pierden afinidad en comparacion con su construccion precursora. Por lo tanto, la tercera conclusion de la comparacion de I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5 e I-HLA6 es la implicacion de la Phe27 en la union a antfgeno, bien directamente o bien indirectamente, a traves de la modificacion de la conformacion del bucle de la CDR1.

Las variantes I-HLA5 e I-HLA6 poseen la FR1 de I-HLA1 e I-HLA2, respectivamente, reemplazada por otra secuencia aceptora de lmea germinal con la Phe27 presente de forma natural (es decir, IGHV1-58). Esto solo pudo conseguirse mediante la introduccion simultanea de varias mutaciones distintas, que son: Val2Met, Ala9pro y Ala16Thr. Mediante este procedimiento, el efecto beneficioso de (re)introducir la Phe27 se anulo de nuevo.

La construccion I-HLA7 se analizo para determinar si la restauracion de los restos donantes adicionales en las CDR1 y CDR2 de cadena pesada de la construccion I-HLA6 podfa restaurar la actividad completa de union en comparacion con ICR62. Como se muestra en la figura 6, este no fue el caso.

Como se muestra en las figuras 7 y 8, se analizaron dos construcciones adicionales, I-HLA8 y I-HLA9, para determinar si podfa conseguirse la actividad completa de union en comparacion con ch-ICR62. Empezando a partir de la construccion I-HHB, las regiones FR1 se reemplazaron con regiones FR1 con una homologfa maxima dentro de la region CDR1 de Chothia. La construccion I-HLA8 posee la FR1 de la secuencia IGHV1-58, y la I-HLA9 posee la region IGHV5-51 FR1. Ambas construcciones unen el antfgeno al menos como el anticuerpo ch-ICR62. La construccion I-HLA8, de hecho, puede unirse incluso mejor, con la CE50 reducida en un factor de 2. La construccion I-HLA8 posee la misma secuencia FR1 que las construcciones I-HLA5 y I-HLA6 y por lo tanto posee los mismos restos no donantes (es decir, Val2Met, Ala9Pro y Ala16Thr), lo que sugiere que la presencia de estos restos no donantes no posee un efecto negativo sobre la union. Las mutaciones no beneficiosas que ocurren en las I-HLA5 y 6 surgen de la combinacion de una FR1 VH1 emparejada con una FR3 VH5, que potencialmente puede compensarse si tiene una FR1 y una FR3 de la misma familia VH.

En la figura 8 se muestran las construcciones que contienen restos no donantes dentro de las CDR. Asf, estas construcciones estan incluso mas humanizadas dentro de las CDR ya que los restos no donantes aparecen en las regiones marco conservadas humanas que se escogieron para estas construcciones. Las construcciones. Las construcciones I-HHE (His35Ser), I-HHF (Thr58Asn) e I-HHG (Ser57Ala) poseen todas ellas un resto en la CDR1 o CDR2 que esta humanizado (en comparacion con la construccion I-HHB). Tambien se analizo la construccion I-HHD

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(Gly24Ala). I-HHF mostro una union reducida, lo que indica la importancia de la Thr58. Al contrario del resto 58 de la CDR de Kabat, el aminoacido 57 es mas tolerante a las sustituciones, ya que la mutacion Ser57Ala aparentemente no ejerce ninguna influencia sobre la union (figura 8).

Como la region FR3 de IGHV5-51 pareda mostrar propiedades prometedoras en las construcciones I-HLA1 y 2, y la FR1 de la misma secuencia de lmea germinal demostro ser util en la construccion I-HLA9, las FR1, FR2 y FR3 de IGHV5-51 se disenaron para su uso conjunto como un aceptor para el injerto de bucles.

Resumen del analisis de los restos canonicos en las construcciones ICR62 humanizadas:

VL: posicion 2 de Kabat: Ile probablemente necesario.

posicion 71 de Kabat: Ile o Phe permitidos.

VB: pos. 24, Gly, Thr, Ala, Val, Ser permitidos.

pos. 26, Gly permitido. pos. 29, Phe, Ile, Leu, Val, Ser permitidos. pos. 34, Ile, Met, Leu, Val, Trp, Tyr, Thr permitidos. pos. 71, Ala, Leu, Val, Thr permitido. pos 94, Arg, Gly, Asn, Lys, Ser, His, Thr, Ala permitidos.

Resultados de los experimentos de CCDA

La figura 9 muestra una comparacion de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (CCDA) de las distintas glucoformas del anticuerpo ICR62 quimerico, asf como la variante humanizada I-HLA4. Las diferentes glucoformas estan marcadas mediante una etiqueta que indica no modificado por glucoingeniena (WT), glucoforma 1 (G1) o glucoforma 2 (G2). "G1" se refiere una modificacion por glucoingeniena del anticuerpo mediante coexpresion con la GnTIII. "G2" se refiere a una modificacion por glucoingeniena del anticuerpo mediante la coexpresion con GoTIII y ManII. "WT" se refiere a los anticuerpos que no fueron modificados por glucoingeniena. La cadena ligera para todas las construcciones humanizadas es la variante I-KC, y no se etiqueto explfcitamente.

Tanto el anticuerpo quimerico, como el humanizado, se mejoraron en cuanto a potencia y eficacia mediante las dos estrategias diferentes de modificacion por glucoingeniena. La construccion ch-ICR62 funciono ligeramente mejor que la I-HLA4 para la forma no modificada por glucoingeniena o las glucoformas, respectivamente. Como se ha visto en la figura 4, cuando se compararon las afinidades de los dos anticuerpos frente a su antfgeno, ch-ICR62 posefa un valor de CE50 dos veces menor. Esta diferencia en la afinidad se refleja aqu en diferencias en la eficacia.

La figura 10 muestra una comparacion de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (CCDA) entre la forma no modificada por glucoingeniena ("natural") y la glucoforma G2 de las construcciones de anticuerpo ICR62 humanizado I-HHB y I-HLA7. Los mismos anticuerpos se aplicaron a dos lmeas celulares diana diferentes. En el panel A de la figura 10, se utilizo la lmea celular diana LN229; y en el panel B de la figura 10, se utilizo la lmea celular A431. Las celulas A431 son aparentemente mas sensibles a la muerte celular mediada por anticuerpo que las celulas LN229. De forma mas importante, la modificacion por glucoingeniena mejoro la potencia de ambos anticuerpos. Este efecto parecio ser mas pronunciado para I-HLA7 que para I-HHB. El porcentaje de muerte celular a la concentracion maxima de anticuerpo para I-HHB pudo cambiarse de ~30 % a -40 % introduciendo la variante modificada por glucoingeniena G2, cuando se utilizo la lmea celular diana LN229. Cuando se utilizo la lmea celular A431, este valor aparentemente quedo sin modificacion. Este comportamiento fue completamente diferente para el anticuerpo I-HLA7. La muerte de las celulas diana a la concentracion maxima de anticuerpo se modifico de alrededor del 10 % a alrededor del 50 %, para las celulas LN229, y de alrededor del 40 % a alrededor del 70 % para las celulas A431 mediante la introduccion de variantes G2modificadas por glucoingeniena. En este caso, a pesar de tener una actividad menor en el anticuerpo no modificado por glucoingeniena de IHLA7 en relacion con I-HHB, el grado de actividad es inverso para los anticuerpos modificados por glucoingeniena. Las figuras 11 y 12 tambien muestran comparaciones de formas no modificadas por glucoingeniena (WT) y glucoformas G2 del ICR62 quimerico las construcciones I-HHB e I-HLA7 del anticuerpo ICR62 humanizado,.

EJEMPLO 3

Estudio preliminar de toxicidad mediante administracion intravenosa (en bolo) a monos cinomolgos - Analisis bioanalttico

INTRODUCCION

Ensayo anti-EGFR modificado por glucoingeniena

Este analisis bioanalftico describe la determinacion de anti-EGFR en muestras originadas de monos cinomolgos tras la administracion intravenosa (en bolo) de anti-EGFR (anticuerpo anti-EGFR recombinante, modificado por glucoingeniena producido a partir de celulas de mairnfero transfectadas en cultivo con vectores de expresion de anticuerpo que son portadores de los genes de la cadena pesada IHHB y la cadena ligera I-KC como se han descrito

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anteriormente, y purificados como se ha descrito anteriormente) tal como se describe en el protocolo que se indica en el presente documento a continuacion. Un total de 78 muestras de suero de mono se almacenaron congeladas a alrededor de -20°C hasta su uso.

Los metodos bioanaltticos utilizados para la determinacion de anti-EGFR utilizaron un metodo de ELISA para medir las concentraciones sericas de anti-EGFR. Los criterios de aceptacion se fijaron al ±20 % (±25 % control calidad bajo) para la precision y la inexactitud.

MATERIALES y METODOS

Objetivo: El objetivo de este estudio fue la valoracion del potencial toxico sistemico de la administracion intravenosa (en bolo) de Glico-mAb (anti-EGFR) a monos cinomolgos seguida de un periodo de recuperacion de 8 semanas.

TABLA 8

Modelo animal

Monos cinomolgos, aceptados por las agencias reguladoras, disponibles datos de antecedentes.

Justificacion para utilizar el primate

El primate fue la especie no roedora de eleccion ya que por sf misma conserva dos parametros cnticos: Reconocimiento del antigeno EGFR por el anticuerpo de prueba, y reconocimiento de la region Fc del anticuerpo de prueba por los receptores Fc del sistema inmune.

Via

Intravenosa (bolo), para simular las condiciones de administracion clmica.

TABLA 9: Grupos de tratamiento y dosificaciones

Grupo

1 2 3

Compuesto

Glyco-mAb(Anti-EGFR)

Dosificacion (mg/kg/dfa)

1,5 4,5 12

Razonamiento para la seleccion del nivel de dosificacion

El intervalo esperado para los estudios humanos es 1,5-7,5 mg/kg (siendo 7,5 mg/kg la dosis correspondiente para un compuesto similar en humanos).

TABLA 10: Identidad de los grupos de tratamiento

Grupo

Tratamiento Dosis (mg/kg/dfa) # Numero de animales Numeros Id. animal

Macho

Hembra Macho Hembra

1

Glico-mAb (Anti-EGFR) 1,5 1 1 623 590

2

Glico-mAb (Anti-EGFR) 4,5 1 1 461 462

3

Glico-mAb (Anti-EGFR) 12 1 1 463 612

# Expresado con respecto a la sustancia de prueba tal y como se suministra.

TABLA 11: Animales

Especies

Mono cinomolgo (criado para este proposito).

Edad a la recepcion

Aproximadamente 15 meses.

Intervalo de peso pedido

De 1,5 a 2,5 kg.

TABLA 12: Administracion de anti-EGFR

Via

Inyeccion intravenosa

Tratado a

Dosificaciones constantes en mg/kg/vez.

Volumen de la dosificacion

Calculado previamente, sobre la base del peso corporal registrado mas reciente

Volumen de dosificacion individual

1 ml/ kg/dfa

Frecuencia

Dfas 1, 8, 15 y 22, inmediatamente antes de alimentarse

Secuencia

Por grupo

Puntos de dosificacion

Utilizando las venas safenas izquierdas

Inyeccion

Bolo, nueva aguja desechable esteril por animal

Formulacion

Se mantuvo un registro de la utilizacion de formulaciones en funcion del peso. Este balance se comparo con la utilizacion esperada como comprobacion de la correcta administracion

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TABLA 13: Observaciones clmicas

Animales y sus bandejas de jaula

Inspeccion visual al menos dos veces diarias en busca de evidencia de reaccion al tratamiento o mala salud.

Desviaciones de la normalidad registradas en el momento respecto a

Naturaleza y gravedad Fecha y momento de aparicion Duracion y avance de la afeccion observada

Examen ffsico

Una vez cada semana a todos los animales

Registro diario de las bandejas de jaula

En busca de vomitos, sangre, diarrea, etc

TABLA 14: Frecuencia de dosificacion

Frecuencia

1. Inmediatamente antes de la dosificacion . 2. A a 2 horas tras completarse la dosificacion. 3. Tan tarde como sea posible en la jornada laboral.

Puntos de inyeccion

Diaria

TABLA 15: Toxicocinetica

Dfa

Animales Tiempos de muestreo en horas tras la dosificacion.

1

Todos los animales 1, 4, 12, 24, 72, 120

8

Todos los animales Antes de la dosis, 1 hora tras la dosis (169 horas tras la dosis del dfa 1).

15

Todos los animales Antes de la dosis, 1 hora tras la dosis (337 horas tras la dosis del dfa 1).

22

Todos los animales Antes de la dosis, 1 hora tras la dosis (505 horas tras la dosis del dfa 1).

29

Todos los animales 672 horas tras la dosis del dfa 1

TABLA 16: Muestras

Punto de muestreo

Vena adecuada

Volumen de anticoagulante/ muestra

Sin anticoagulante/ 0,7 ml.

Numero total de muestras tomadas

104

Separacion de suero

Mediante centrifugacion a temperatura ambiente a no ser que se indique de otro modo para proporcionar un mmimo de 0,3 ml, cuando sea posible.

Almacenamiento del suero

Tubos de plastico etiquetados de forma apropiada. Congelados a baja temperatura (aproximadamente -20°C), mientras se espera al analisis biologico

Histologfa

TABLA 17: Fijacion del tejido

Estandar

Formalina tamponada neutra al 10 %

Otras

Testfculos y epidfdimos: Inicialmente en lfquido de Bouin. Ojos: Inicialmente en lfquido de Davidson.

TABLA 18: Histologia

Procesamiento

Todos los animales

Tincion de rutina

Secciones de 4-5 pm tenidas con hematoxilina y eosina

Procedimiento del inmunoensayo

Una placa se recubrio con 100 pl por pocillo de una solucion de recubrimiento (5 pl de IgG de oveja anti-humano (IgG adsorbida de mono, the Binding Site, RU), anadidos a 11495 pl de tampon bicarbonato (0,05M, pH 9,6)) y se incubo durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lavo 3 veces con 400 pl por pocillo de solucion de lavado (PBS (Sigma Chemical Co., RU) al 0,01 % (v/v) Triton-X100 (Sigma Chemical Co., RU)) y se golpeo suavemente para secarla.

Se anadieron 200 pl por pocillo de tampon de ensayo (BSA al 1 % p/v, Sigma Chemical Co., RU) y se incubo durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavo 3 veces con 400 pl por pocillo de solucion de lavado y se golpeo suavemente para secarla.

Los patrones de calibracion, controles de calidad (CC) y/o muestras se anadieron a 100 pl por pocillo y se incubaron durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente, tras lo cual la placa se lavo 3 veces con 400 pl por pocillo de solucion de lavado y se golpeo suavemente para secarla.

La solucion de conjugado (6 pl de conjugado IgG kappa de cabra anti-humano -HRP (Bethyl Laboratories Inc., EE.UU.) se anadio a 12 ml de tampon de ensayo) se anadio a 100 pl por pocillo y se incubo durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavo 3 veces con 400 pl por pocillo de solucion de

lavado y se golpeo suavemente para secarla.

Se anadieron 100 pl de trimetilbencidina (TMB; Europa Bioproducts, Ely, RU) por pocillo. La placa se cubrio y se incubo durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Entonces se anadieron 100 pl de solucion de 5 parada (HCl 0,5 M, Fisher, RU) a cada pocillo. Las absorbancias se leyeron a 450 nm (filtro de referencia 630 nm) en un lector de microplaca DYNaTeCH mRx (Mettler Instruments, RU).

RESULTADOS y DISCUSION

10 Determinaciones en las muestras de analisis

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Las concentraciones de anti-EGFR se midieron mediante un metodo de inmunoensayo (ELISA) en 78 muestras de suero de mono generadas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente en el presente documento. Estos resultados se presentan en las tablas 19-21, mas adelante.

TABLA 29

Concentracion serica de anti-EGFR en suero de mono (pg/ml ) tras la administracion intravenosa de 1,5 mg/kg de anti-EGFR en los dfas 1, 8, 15 y 22 (GRUPO 1)

Punto temporal

Numero del animal 1M 623 1H 590 Media DE

Dfa 1 1 hora

33,42 30,86 32,14 1,8

Dfa 1 4 horas

27,33 27,49 27,41 0,1

Dfa 1 12 horas

13,09 17,01 15,05 2,8

Dfa 1 24 horas

9,656 9,468 9,562 0,1

Dfa 1 72 horas

2,528 0,786 1,657 1,2

Dfa 1 120 horas

0,845 0,431 0,638 0,3

Dfa 8 antes de la dosis

0,538 0,287 0,413 0,2

Dfa 8 1 hora

30,02 19,07 24,55 7,7

Dfa 15 antes de la dosis

0,902 0,382 0,642 0,4

Dfa 15 1 hora

17,91 33,08 25,50 10,7

Dfa 22 antes de la dosis

1,065 0,595 0,830 0,3

Dfa 22 1 hora

19,41 33,00 26,21 9,6

Dfa 1 672 horas

1,202 0,362 0,782 0,6

DE desviacion estandar

TABLA 20

Concentracion serica de anti-EGFR en suero de mono (pg/ml ) tras la administracion intravenosa de 5,0 mg/kg de anti-EGFR en los dfas 1, 8, 15 y 22 (GRUPO 2)

Punto temporal

Numero del animal 2M 461 2F 462 Media DE

Dfa 1 1 hora

32,45 32,39 29,51 30,98 2 1

Dfa 1 4 horas

28,05 23,70 29,57 30,98 2 0

Dfa 1 12 horas

14,03 25,88 26,97 1 5

Dfa 1 24 horas

10,42 23,78 23,74 0 1

Dfa 1 72 horas

4,672 14,38 14,21 0 2

Dfa 1 120 horas

25,91 8,137 9,279 1 6

Dfa 8 antes de la dosis

5,752 3,683 4,178 0 7

Dfa 8 1 hora

32,20 31,06 28,49 3 6

Dfa 15 antes de la dosis

BLQ 5,450 5,601 0 2

Dfa 15 1 hora

26,98 35,38 33,79 2 2

Dfa 22 antes de la dosis

BLC 6,497 3,249 28,61 -

Dfa 22 1 hora

30,23 2,423 2 3

Dfa 1 672 horas

4,845 -

BLC por debajo del lfmite de cuantificacion, < 0,195 p g/ml ) DE desviacion estandar Nota: BLC se introdujo como cero en los calculos

Concentracion serica de anti-EGFR en suero de mono (pg/ml ) tras la administracion intravenosa de 15 mg/kg de anti-EGFR en los dfas 1, 8, 15 y 22 (GRUPO 3)

Punto temporal

Numero del animal 3M 463 3F 612 Media DE

Dfa 1 1 hora

262,2 168,0 215,1 66,6

Dfa 1 4 horas

223,3 174,5 198,9 34,5

Dfa 1 12 horas

164,9 165,7 165,3 0,6

Dfa 1 24 horas

141,7 146,0 143,9 3,0

Dfa 1 72 horas

99,54 86,64 93,09 9,1

Dfa 1 120 horas

86,64 69,08 77,86 12,4

Dfa 8 antes de la dosis

65,86 45,21 55,54 14,6

Dfa 8 1 hora

282,1 209,9 246,0 51,1

Dfa 15 antes de la dosis

98,43 71,21 84,82 19,2

Dfa 15 1 hora

385,9 231,4 308,7 109,2

Dfa 22 antes de la dosis

117,3 105,6 111,5 8,3

Dfa 22 1 hora

234,1 402,5 318,3 119,1

Dfa 1 672 horas

127,5 122,9 125,2 3,3

DE desviacion estandar

EJEMPLO 4 5

Estudio preliminar de toxicidad mediante la administracion intravenosa (en bolo) a monos cinomolgos - Toxicocinetica

Sumario

10

Se administraron dosis de anti-EGFR por bolo intravenoso a tres grupos de monos cinomolgos (1 macho y 1 hembra por grupo) en los dfas 1, 8, 15 y 22 de un estudio de toxicidad de 28 dfas para valorar la exposicion sistemica de los animales al anti-EGFR. Las concentraciones sericas de anti-EGFR en las muestras recogidas hasta 672 horas tras la primera dosis se determinaron mediante un metodo de inmunoensayo. El analisis farmacocinetico de los datos de 15 concentracion serica -tiempo dio como resultado los siguientes parametros farmacocineticos:

Las relaciones entre las areas bajo las curvas de concentracion serica de anti-EGFR -tiempo (ABC168) y el nivel de

Dosis (mq/kq)

Animal Cnia,, (pq/ml) Timax (h) ABCt (uq.h/ml) ABC (uah/ml) CL (ml/ h/kal Veefml/ Kq) k (l/h) tus(h)

1,5

1M623 33,42 1 830,4 849,4 1,778 60,79 0,0214 32,5

1,5

1F590 30,86 1 748.4 774,9s 1,962s 57,85s 0,0105s 66,0s

4,5

2M461 32,45 1 2537 3005 1,488 133,6 0,0110 63,1

4,5

2F462 29.57 4 2378 2719 1,663 133,2 0.0121 57,4

12

3M463 262,2 1 18310 29870s 0,4058s 71,33s 0.0056s 124,3s

12

3F612 174,5 4 15980 21400s 0,5552s 66,94s 0,0082s 84,4s

a

El valor es una estimacion ya que los datos no cumplieron todos los criterios de aceptacion definidos en el procesamiento de datos y debe tratarse con cautela

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

dosificacion del dfa I se presentan a continuacion:

Nivel de dosis

Nivel de dosis

Proporcion del ABC168

(mg/kg/vez)

proporcion Machos Hembras

1,5

1 1 1

4,5

3,0 3,1 3,2

12

8,0 22,0 21,4

El mdice y grado de la exposicion sistemica de los monos al anti-EGFR, caracterizados por el ABC168, aumentaron aproximadamente de forma proporcional al aumentar la dosis por encima del intervalo de dosis de 1,5 a 4,5 mg/kg/vez pero el aumento era mayor al aumento proporcional de la dosis por encima del intervalo de dosis de 4,5 a 12 mg/kg/vez en el dfa 1. A la dosis mas elevada (12 mg/kg/ vez) el ABC168 fue aproximadamente de 2,8 veces mayor que el valor predecible por una relacion lineal.

El grado (ABC168) de exposicion sistemica de los monos hembra al anti-EGFR en general fue similar a la exposicion en monos machos.

Tras repetidas dosis intravenosas, las concentraciones sericas de anti-EGFR antes de la dosis en general fueron superiores a los valores obtenidos tras una sola dosis e indicaron que habfa acumulacion del anti-EGFR en suero a lo largo del periodo de estudio.

La semivida terminal no pudo estimarse adecuadamente para todos los animales, pero pudo estimarse en el intervalo de 32,5 a 63,1 horas, y parecio aumentar con la dosis en los animales macho. La eliminacion total en suero de anti-EGFR parecio ser independiente de la dosis a lo largo del intervalo 1,5- 4,5 mg/kg/vez pero se redujo en el nivel de dosificacion maximo en monos machos y hembras.

En conclusion, el grado de exposicion sistemica de los monos cinomolgos al anti-EGFR parecio caracterizarse por una cinetica no lineal (dependiente de dosis) a lo largo del intervalo de dosis de 1,5 a 12 mg/kg/vez el dfa 1 del estudio de toxicidad intravenosa. El aumento de la dosis de anti-EGFR, por encima de 4,5 mg/kg/vez probablemente resulta en una exposicion sistemica mayor de la que podna predecirse a partir de una respuesta lineal, lo cual es coherente con la posibilidad de un proceso de capacidad de eliminacion del anti-EGFR limitada.

Ademas, el estudio tambien proporciono evidencias de que en general no existieron diferencias en la exposicion sistemica de monos machos y hembras al anti-EGFR y de que hubo acumulacion tras una administracion intravenosa repetida.

Introduccion

A tres grupos de monos cinomolgos de un macho y una hembra se les administro anti-EGFR mediante una inyeccion de bolo intravenoso, a niveles de dosis de 1,5, 4,5 y 12 mg/kg/vez en los dfas 1, 8, 15 y 22 de un estudio preliminar de toxicidad. Las muestras de sangre se tomaron de cada animal en los siguientes puntos temporales tras la administracion del dfa 1: 1, 4, 12, 24, 72 y 120 horas despues de la dosis. Ademas, las muestras se tomaron antes de la dosis y 1 hora despues de la dosis en los dfas 8, 15 y 22, y a las 672 horas tras la primera dosis del dfa 1. El suero separado se congelo a alrededor de -20°C previamente al analisis de las concentraciones sericas de anti- EGFR mediante un metodo de inmunoensayo.

Abreviaturas

ABC Area bajo la curva de concentracion serica-tiempo hasta tiempo infinito

ABC168 Area bajo la curva de concentracion serica-tiempo durante un intervalo de dosificacion de 168 horas

BLC Bajo el lfmite de cuantificacion

ca Aproximadamente

CL Aclaramiento serico total

Cmax Concentracion serica maxima

H Hembra

k Constante de mdice terminal

M Macho

t-i/2 Semivida terminal

Tmax Momento en el que aparece la Cmax

Vee Volumen de distribucion en estado estacionario

Anticuerpo utilizado para el estudio

El Glico-mAb (anti-EGFR), un anticuerpo anti-EGFR con el Fc modificado por ingeniena para obtener una afinidad

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de union Fc-receptor FcgammaRIII aumentada y una CCDA aumentada, se produjo, se purifico y se caracterizo tal y como se ha descrito anteriormente. Brevemente, el anticuerpo se produjo mediante la cotransfeccion de celulas HEK-293-EBNA con vectores de plasmidos de ADN para la expresion de cadena pesada del anticuerpo I-HHB, la cadena ligera del anticuerpo I-KC, GnT-III y ManII. Se utilizo una version de aumento a escala lineal del metodo de transfeccion descrito anteriormente, transfectando monocapas celulares cultivadas en frascos rotatorios en vez de en matraces T. Inmediatamente antes de la etapa cromatografica de exclusion por tamano descrita con anterioridad, se incluyo en el proceso de purificacion un paso adicional de flujo continuo de cromatograffa de intercambio anionico mediante la utilizacion de una matriz de Q-sefarosa.

El patron de glicosilacion del anticuerpo con Fc modificado por ingeniena se analizo tal y como se ha descrito anteriormente mediante la utilizacion de espectrometna EM-MALDI/TOF de oligosacaridos procedentes del Fc, liberados enzimaticamente. El perfil oligosacarido se muestra en la figura 23.

La union a EGFR humano y a EGFR de mono se demostro mediante la union de celulas completas, tal y como se ha descrito anteriormente, mediante la utilizacion de celulas A431 y COS-7, respectivamente, y el analisis basado en FACS. Las curvas de union se muestran en las figuras 24 y 25, respectivamente.

La union al receptor FcgammaRIII aumentada que resulta de la aplicacion de la modificacion por ingeniena del Fc se demostro, tal y como se ha descrito anteriormente, mediante la union de celulas completas a celulas CHO disenadas por ingeniena para la expresion superficial del FcgammaRIII humano, y analisis basado en FACS. Los resultados se muestran en la figura 26. Ademas, el anticuerpo modificado por ingeniena tiene un grado de modificacion por ingeniena del Fc equivalente al anticuerpo "glico-2" (75 % de los oligosacaridos del Fc son de tipo no fucosilado) y esto se describe en otro documento (Ferrara, C. et al., J Biol Chem. 5 de diciembre de 2005; [publicacion electronica pendiente de impresion]). Tales anticuerpos con Fc modificado por ingeniena tienen una afinidad de union al FcgammaRIII humano aumentada en hasta 50 veces en relacion con un anticuerpo patron con Fc no modificado por ingeniena (constantes de equilibrio de disociacion de 15 y 150 nM para las variantes polimorficas 158V y 158F del receptor humano frente a 750 y 5000 nM para las mismas variantes del receptor, respectivamente, cuando se unen a anticuerpos IgG1 con Fc no modificado por ingeniena).

La CCDA se midio, tal y como se ha descrito anteriormente, mediante la utilizacion de dos lmeas celulares diana; celulas de carcinoma de pulmon A549 y celulas de queratinocito de mono cinomolgo CYNOM-K1. Los resultados se muestran en las figuras 27 y 28, respectivamente.

Procesamiento de los datos

Los parametros farmacocineticos se calcularon mediante el programa de ordenador WinNonlin Pro version 3.3 (Pharsight Corporation, EE.UU.).

Todas las concentraciones sericas aportadas como parte de este estudio se describieron en 4 cifras significativas o 3 decimales. Los parametros farmacocineticos se describieron de la siguiente manera: Cmax, ABC168, CL y Vee hasta 4 cifras significativas; k hasta 4 decimales; t1/2 hasta 1 decimal.

Los valores BLQ (<0,195 pg/ml ) se introdujeron como cero en el procesamiento farmacocinetico.

Toxicocinetica

Las concentraciones sericas maximas de anti-EGFR (Cmax) y sus momentos de aparicion (Tmax) fueron los valores observados. Las areas bajo la curva de concentracion serica de anti-EGFR-tiempo en un intervalo de dosificacion de 168 horas (ABC158) se estimaron mediante la regla del trapecio lineal. En el calculo de los valores de ABC168 se estimaron las concentraciones sericas de anti-EGFR a las cero horas mediante retroextrapolacion utilizando un analisis de regresion lineal-logantmica, basado en los dos primeros tiempos de muestreo. No obstante, si la concentracion serica no disminuyo durante ese periodo, se considero que la concentracion serica a las cero horas era equivalente a la concentracion en el primer tiempo de muestreo. Las areas bajo la curva de concentracion serica de anti-EGFR-tiempo hasta un tiempo infinito (ABC) se estimaron mediante la siguiente expresion:

ABC=ABCi68+ Cult/k

en la que Cult es la concentracion serica predicha en el ultimo punto cuantificable de la muestra y k es la constante de mdice terminal.

Las constantes de mdice terminal (k) se estimaron mediante el ajuste de una regresion lineal de una concentracion logantmica frente al tiempo. Para considerar que la k estimada es fiable, se imponen los siguientes criterios:

1. Aparentemente, los puntos de datos terminales se distribuyeron aleatoriamente alrededor de una unica lmea recta (a la inspeccion visual).

2. Para la regresion se utilizaron un mmimo de 3 puntos de datos.

5

10

15

20

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50

3. El coeficiente de regresion fue >0,95, y la fraccion de la varianza contabilizada fue >0,090.

4. El intervalo que incluyen los puntos de datos escogidos para la regresion fue, al menos, dos veces mayor a la semivida en sl

Las semividas terminales (ti/2) se calcularon como In2/k. El aclaramiento serico total (CL) se calculo mediante dosis/ABC. El volumen de distribucion en estado estacionario (Vee) se calculo mediante dosis AMBC (area media bajo la curva) /ABC2. La acumulacion (R) se evaluo mediante la proporcion entre la concentracion mmima tras la ultima dosis (dfa 22) y la concentracion minima tras la primera dosis (dfa 1), es decir, la concentracion serica a las 672 horas/concentracion serica a las 168 horas (antes de la dosis el dfa 8).

Resultados y discusion

Se tomaron muestras de sangre hasta 120 horas despues de la dosificacion del dfa 1; antes de la dosis y 1 hora despues de la dosis los dfas 8, 15 y 22, y a las 672 horas despues de la dosificacion del dfa 1 durante un estudio de toxicidad para evaluar la exposicion sistemica de monos macho y hembra al anti-EGFR, despues de la administracion intravenosa en bolo de anti-EGFR a niveles de dosis de 1,5, 4, 5 y 12 mg/kg/vez en los dfas 1, 8, 15 y 22 del estudio. En las tablas 27-29 se presentan las concentraciones sericas del anti-EGFR en las muestras tomadas a las 168 horas de la dosificacion, y los perfiles de concentracion serica media-tiempo se ilustran en las figuras 18 y 19.

Los parametros farmacocineticos del anti-EGFR se presentan en la TABLA 50, y los valores del ABC168 se resumen a continuacion:

TABLA 24

Nivel de dosis

ABC168 (pg.h/ml )

(mg/kg/ vez

Machos Hembras

1,5

830,4 748,4

4,5

2537 2378

12

18310 15980

Habitualmente, los momentos en los que aparecen las concentraciones maximas (Tmax) fueron 1 hora despues de la dosis (el primer punto de muestreo), pero en las hembras 2F462 (4,5 mg/kg) y 3F612 (12 mg/kg), aparecieron 4 horas despues de la dosis (el segundo punto de muestreo). No obstante, para estos dos grupos de hembras, las concentraciones a las 4 horas de la dosis fueron muy similares a las concentraciones de la primera hora posterior a la dosis y, probablemente, formaron parte de la variabilidad del ensayo. Por consiguiente, es improbable que el retraso aparente del Tmax tenga alguna significacion.

Se pudieron cuantificar concentraciones sericas de anti-EGFR previas a la siguiente dosis en todos los animales excepto en los machos 2M461 el dfa 22 (nivel de dosis de 4,5 mg/kg/vez) y por consiguiente, en general los animales estuvieron continuamente expuestos a concentraciones cuantificables de anti-EGFR durante la dosificacion interna.

A continuacion se presentan las relaciones entre las areas bajo la curva de concentracion serica de anti-EGFR- tiempo (ABC168) y el nivel de dosificacion en el dfa 1:

TABLA 25

Nivel de dosis

Nivel de dosis

Proporcion de ABC168

(mg/kg/vez)

Proporcion Machos Hembras

1,5

1 1 1

4,5

3,0 3,1 3,2

12

8,0 22,0 21,4

La proporcion y grado de exposicion sistemica de los monos al anti-EGFR, caracterizadas mediante el ABC168, aumento de manera aproximadamente proporcional al aumento de la dosis en el intervalo entre los 1,5 y los 4,5 mg/kg/vez, pero lo hizo mas alla de la proporcionalidad respecto a la dosis en el intervalo de dosis de entre 4,5 y 12 mg/kg/vez el dfa 1. Con la dosis mayor (12 mg/kg/vez), el ABC168 fue ca. 2,8 veces mayor a la predicha segun la relacion lineal (figura 20).

Habitualmente, el grado de exposicion sistemica (ABC168) de los monos hembra al anti-EGFR fue similar a la exposicion de los monos macho.

5

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25

Generalmente, tras repetidas dosis intravenosas, las concentraciones sericas de anti-EGFR previas a la dosis fueron mayores a los valores tras una unica dosis (figuras 21-22) e indicaron la acumulacion del anti-EGFR en el suero a lo largo del periodo del estudio. Habitualmente, esta acumulacion fue menor en las hembras que en los machos, excepto en el nivel de dosis mayor. Las proporciones de concentraciones minimas previas a la dosis tras la ultima dosis el dfa 22 (672 horas despues de la dosis del dfa 1) respecto a la concentracion minima tras la primera dosis el dfa 1 se presentan en la TABLA 26, a continuacion:

TABLA 26

Nivel de dosis

R

(mg/kg/vez)

Machos Hembras

1,5

2,23 1,26

4,5

* 1,32

12

1,94 2,72

*No se pudo calcular, ya que la concentracion minima estuvo BLC

Las constantes de indice terminal (k), y las correspondientes semividas terminales (ti/2), del anti-EGFR el dfa 1 se presentan en la tabla 30. La semivida terminal no se pudo estimar adecuadamente en todos los animales, pero si pudo estimarse en el intervalo de entre las 32,5 y las 63,1 horas, y parecio aumentar con la dosis en los animales macho. El aclaramiento serico total del anti-EGFR parecio ser independiente de la dosis en el intervalo de 1,5-4,5 mg/kg/vez pero se redujo con el nivel mayor de dosis en los monos hembra y macho.

En conclusion, el grado de exposicion sistemica de los monos cinomolgos al anti-EGFR parecio caracterizarse por una cinetica no lineal (dosis-dependiente) en el intervalo de dosis de entre 1,5 y 12 mg/kg/vez el dfa 1 del estudio de toxicidad intravenosa. El incremento de la dosis de anti-EGFR por encima de los 4,5 mg/kg/vez probablemente resulte en una mayor exposicion sistemica que podrfa predecirse a partir de una relacion lineal, lo cual es congruente con la posibilidad de un proceso de capacidad limitada para la eliminacion del anti-EGFR.

Ademas, el estudio tambien proporciona pruebas de que, en general, no hubo diferencias en la exposicion sistemica al anti-EGFR entre monos machos y hembras, y de que se presento acumulacion tras la administracion intravenosa repetida.

TABLA 27

Concentraciones sericas (pg/ml ) de anti-EGFR en suero de mono tras la administracion intravenosa de 1,5 mg/kg de anti-EGFR en los dfas 1, 8, 15 y 22

Punto temporal

Numero del animal

1M623

1F590

Dfa 1, 1 hora

33,42 30,86

Dfa 1, 4 horas

27,33 27,49

Dfa 1, 12 horas

13,09 17,01

Dfa 1, 24 horas

9,656 9,468

Dfa 1, 72 horas

2,528 0,786

Dfa 1, 120 horas

0,845 0,431

Dfa 8, antes de la dosis

0,538 0,287

Dfa 8, 1 hora

30,02 19,07

Dfa 15, antes de la dosis

0,902 0,382

Dfa 15, 1 hora

17,91 33,08

Dfa 22, antes de la dosis

1,065 0,595

Dfa 22, 1 hora

19,41 33,00

Dfa 1, 672 horas

1,202 0,362

_________________________________________TABLA 28_________________________________________

Concentraciones sericas (pg/ml ) de anti-EGFR en suero de mono cinomolgo tras la administracion intravenosa de 4,5 mg/kg de anti-EGFR en los dfas 1, 8, 15 y 22

Punto temporal

Numero del animal

2M461

2F462

Dfa 1, 1 hora

32,45 29,51

Dfa 1, 4 horas

32,39 29,57

D^a 1, 12 horas

28,05 25,88

Dfa 1, 24 horas

23,70 23,78

Dfa 1 72 horas

14,03 14,38

Dfa 1, 120 horas

10,42 8,137

D^a 8, antes de la dosis

4,672 3,683

Dfa 8, 1 hora

25,91 31,06

D^a 15, antes de la dosis

5,572 5,450

Dfa 15, 1 hora

32,20 35,38

Dfa 22, antes de la dosis

BLC 6,497

Dfa 22, 1 hora

26,98 30,23

Dfa 1, 672 horas

BLC 4,845

TABLA 29

Concentraciones sericas (|jg/ml ) de anti-EGFR en suero de mono cinomolgos tras la administracion intravenosa de 12 mg/kg de anti-EGFR en los dfas 1, 8, 15 y 22

Punto temporal

Numero del animal

1M623

1F590

Dfa 1, 1 hora

262,2 168,0

Dfa 1, 4 horas

223,3 174,5

Dfa 1, 12 horas

164,9 165,7

Dfa 1, 24 horas

141,7 146,0

Dfa 1 72 horas

99,54 86,64

Dfa 1, 120 horas

86,64 69,08

Dfa 8, antes de la dosis

65,86 45,21

Dfa 8, 1 hora

282,1 209,9

Dfa 15, antes de la dosis

98,43 71,21

Dfa 15, 1 hora

385,9 231,4

Dfa 22, antes de la dosis

117,3 105,6

Dfa 22, 1 hora

234,1 402,5

Dfa 1, 672 horas

127,5 122,9

5

10

15

20

25

30

Parametros farmacocineticos del anti-EGFR el dfa 1 de la administracion intravenosa semanal de anti-EGFR a los monos cinomolgos

Dosis (mg/kg)

Animal Cmax (pg/ml ) Tmax (h) ABCt (pg.h/ml ) ABC (pg.h/ml ) CL (ml/ Vee h/kg) (ml/ kg) K (l/h) T1/2 (h)

1,5

1M623 33,42 1 830,4 849,4 1,778 60,79 0,0214 32,5

1,5

1F590 30,86 1 748,4 774,9a 1,962a 57,85a 0,0105a 66,0a

4,5

2M461 32,45 1 2537 3005 1,488 133,6 0,0110 63,1

4,5

2F462 29,57 4 2378 2719 1,663 133,2 0,0121 57,4

12

3M463 262,2 1 18310 29870a 0,4058a 71,33a 0,0056a 124,3a

12

3F612 174,5 4 15980 21400a 0,5552a 66,94a 0,0082a 84,4a

a Estos valores son estimaciones debido a que los datos no cumplieron todos los criterios de aceptacion definidos en el procesamiento de los datos y, por tanto, deben ser tratados con precaucion

Hematologfa y bioqmmica sangurnea

Las muestras de sangre se tomaron de la vena femoral de monos cinomolgos a los que se habfa administrado una inyeccion intravenosa en bolo de GlycomAb anti-EGFR los dfas 1, 8, 15, y 22. Las muestras se tomaron de la extremidad que no se utilizo para la administracion de la dosis, despues de la privacion de comida durante la noche (no fallecidos). Las muestras se examinaron antes del tratamiento, tres dfas despues de la segunda dosis y al finalizar para evaluar los siguientes parametros, utilizando heparina de litio como anticoagulante

Fosfatasa alcalina Alanina aminotransferasa Aspartato aminotransferasa Bilirrubina - total Urea

Creatinina

Glucosa

Colesterol - total

Trigliceridos

Sodio

Potasio

Cloro

Calcio

Fosforo

Protemas totales Electroforetograma proteico Proporcion de albumina/globulina

Los datos normales promedio del analisis de la bioqmmica sangurnea de los monos cinomolgos se presentan en la tabla 31.

_______________________TABLA 31________________________

Bioqmmica sangurnea de monos cinomolgos (originarios de Mauricio)

Parametro

Sexo n 1 % 5 % 50 % 95 % 99 % Media DE

ALP

M 949 837 1339 2147 3201 3899 2175,5 565,44

H 881 946 1342 2144 3163 3740 2164,1 552,82

ALP-N

M 511 481 579 881 1453 1771 928,0 260,88

H 499 427 546 846 1362 1694 879,5 240,24

Bioqmmica sangumea de monos cinomolgos (originarios de Mauricio)

Parametro

Sexo n 1 % 5 % 50 % 95 % 99 % Media DE

ALT

M 1489 24 30 50 87 127 53,7 19,07

H 1407 23 28 46 84 111 49,3 18,65

AST

M 1487 26 30 41 63 101 43,6 17,57

H 1404 25 29 39 61 89 41,7 13,59

gGT

M 663 95 118 178 292 342 188,5 52,47

H 641 81 102 153 232 158,6 38,38

FAL

M 207 18 26 40 79 217 45,1 28,25

H 205 15 20 35 62 89 37,1 12,73

GLDH

M 159 8 10 17 35 126 20,1 16,46

H 159 6 8 15 27 35 16,3 5,97

Bilirrubina

M 1494 1 1 3 8 11 3,8 2,04

H 1413 1 2 4 8 11 4,1 2,07

LDH

M 99 160 596 808 1166 2029 838,3 218,75

H 82 477 529 711 945 1021 715,0 117,07

CPK

M 331 68 83 179 713 1867 287,4 464,03

H 335 57 77 184 925 2628 309,7 534,02

Bil. indirecta

M 59 1 2 4 10 11 4,2 2,15

H 57 1 2 4 5 7 3,6 1,13

Bil. directa

M 59 0 0 0 2 3 0,2 0,65

H 57 0 0 0 1 3 0,2 0,52

Acidos Biliares

M 386 0,9 2,5 6,4 15,3 23,4 7,38 4,574

H 380 1,4 3,0 7,0 12,9 17,8 7,41 3,474

Urea

M 1457 3,01 3,66 5,50 8,81 10,53 5,775 1,5710

H 1379 2,77 3,42 5,33 8,56 9,90 5,559 1,5432

Creatinina

M 1458 55 59 71 87 94 71,6 8,67

H 1383 56 60 72 87 85 72,7 8,36

Glucosa

M 1455 2,22 2,64 3,71 5,21 6,37 3,809 0,8135

H 1380 2,23 2,65 3,63 5,18 6,34 3,735 0,7990

Colesterol

M 1455 1,69 1,93 2,68 3,55 3,96 2,706 1,4909

H 1382 1,83 2,15 2,86 3,69 4,05 2,885 0,4813

Col. HDL

M 45 1,26 1,34 1,79 2,23 2,59 1,784 0,3128

H 45 1,09 1,31 1,82 2,43 2,55 1,844 0,3179

Col. VLDL

M 45 0,00 0,00 0,00 0,03 0,11 0,004 0,0175

H 45 0,00 0,00 0,00 0,12 0,19 0,012 0,0370

Acidos grasos no esenciales

M 132 0,10 0,28 0,98 1,84 2,44 0,994 0,4700

H 132 0,14 0,22 1,06 1,90 2,18 1,070 0,4704

Trigliceridos

M 1453 0,26 0,32 0,53 0,86 1,30 0,561 0,2051

H 1374 0,26 0,34 0,57 0,90 1,14 0,587 0,1778

Bioqmmica sangumea de monos cinomolgos (originarios de Mauricio)

Parametro

Sexo n 1 % 5 % 50 % 95 % 99 % Media DE

pH lipfdico

M 64 1,65 1,68 2,18 2,91 3,15 2,254 0,3769

H 49 1,77 1,83 2,44 2,91 2,98 2,405 0,3267

Acido urico

M 17 0 0 0 8 8 1,1 2,34

H 17 0 0 0 1 1 0,4 0,51

Na

M 1461 141 142 147 152 155 146,8 3,00

H 1382 140 142 147 153 157 147,3 3,34

K

M 1460 3,2 3,4 4,0 5,0 5,6 4,08 0,511

H 1382 3,2 3,3 4,0 4,9 5,4 4,01 0,484

Cl

M 1461 102 104 108 112 115 107,7 2,71

H 1382 102 104 108 113 116 108,4 2,83

Ca

M 1462 2,31 2,39 2,57 2,76 2,87 2,568 0,1176

H 1382 2,32 2,39 2,57 2,77 2,89 2,572 0,1168

Fosforo

M 1172 1,16 1,40 1,93 2,43 2,69 1,921 0,3126

H 1098 1,17 1,37 1,84 2,35 2,60 1,844 0,2978

Col. LDL

M 45 0,54 0,62 1,20 1,87 1,92 1,253 0,3694

H 45 0,69 0,78 1,19 1,83 1,88 1,233 0,2906

Bicarbonato

M 288 7 10 17 22 25 16,5 3,51

H 283 6 10 16 22 25 15,9 3,81

Protemas totales

M 1455 71 74 80 87 90 80,2 4,06

H 1381 71 4774 81 89 92 81,2 4,32

Albumina (bioqmmica)

M 346 34 38 43 46 49 42,6 2,67

H 342 36 38 43 47 49 42,7 2,60

Albumina

M 1089 33 36 45 51 54 44,3 4,46

H 1019 34 37 45 52 55 44,7 4,58

Globulina

M 289 31 32 36 41 45 36,3 2,83

H 285 30 32 37 43 48 37,5 3,59

Proporcion A/G (bioqmmica)

M 340 0,79 0,98 1,17 1,39 1,45 1,172 0,1215

H 336 0,84 0,95 1,14 1,34 1,42 1,143 0,1274

Proporcion A/G

M 1068 0,68 0,80 1,26 1,65 1,82 1,252 0,2522

H 998 0,67 0,79 1,26 1,66 1,81 1,247 0,2647

Globulina A1

M 1105 2 2 3 4 4 2,8 0,62

H 1035 2 2 3 4 5 2,8 0,64

Globulina A2

M 1105 3 3 4 6 7 4,2 0,92

H 1035 3 3 4 6 7 4,2 1,01

Beta globulina

M 1105 12 13 16 22 24 16,6 2,63

H 1035 12 13 16 22 25 16,8 2,85

Gammaglobulina

M 1105 8 9 12 17 18 12,6 2,26

H 1035 8 9 13 17 20 13,1 2,52

5

10

15

20

25

30

35

Bioqmmica sangumea de monos cinomolgos (originarios de Mauricio)

Parametro

Sexo n 1 % 5 % 50 % 95 % 99 % Media DE

Aldolasa

M 96 9 14 21 38 57 22,0 7,48

H 97 10 13 19 48 84 21,9 11,91

Colinesterasa plasmatica

M 17 4159 4159 5745 9160 9160 5919,8 1181,68

H 17 3371 3371 5869 8367 8367 5689,2 1512,98

PCR

M 57 0,000 0,000 0,002 0,013 0,026 0,0032 0,00414

H 56 0,000 0,000 0,002 0,004 0,007 0,0017 0,00167

T3

M 40 1,90 1,90 2,50 3,38 3,58 2,537 0,4011

H 40 1,71 1,96 2,59 3,06 4,02 2,631 0,3799

T4

M 40 35 42 59 86 92 59,7 11,84

H 40 38 40 56 81 107 58,6 14,37

Las muestras para el analisis hematologico de la sangre periferica se tomaron de la vena femoral de monos cinomolgos a los que se administro una inyeccion intravenosa en bolo de GlycomAb anti-EGFR los d^as 1, 8, 15, y 22. Las muestras se tomaron de la extremidad que no se utilizo para la administracion de la dosis, despues de la privacion de comida durante la noche (no fallecidos). Las muestras se examinaron antes del tratamiento, tres dfas despues de la segunda dosis y al finalizar para evaluar los siguientes parametros:

1) Utilizando EDTA como anticoagulante.

Hematocrito

Concentracion de hemoglobina Recuento eritrocitario Reticulocitos

Hemoglobina celular media

Concentracion de hemoglobina celular media

Volumen celular medio

Recuento leucocitario total

Recuento leucocitario diferencial

Recuento plaquetario

Anomalfas morfologicas sangumeas

Anisocitosis

Microcitosis

Macrocitosis

Hipocroirna

Hipercroirna

2) Utilizando citrato como anticoagulante.

Tiempo de protrombina

Tiempo de tromboplastina parcial activada

Los datos normales promedio del analisis hematologico de los monos cinomolgos se presentan en la tabla 32.

TABLA 32

Hematologfa de monos cinomolgos (originarios de Mauricio)

Parametro

Sexo n 1 % 5 % 50 % 95 % 99 % Media DE

Hematocrito

M 1495 0,385 0,401 0,443 0,488 0,512 0,4435 0,02776

H 1426 0,376 0,399 0,442 0,489 0,508 0,4424 0,02947

Hemoglobina

M 1495 11,4 12,1 13,3 14,5 15,1 13,31 0,769

H 1426 11,2 11,9 13,2 14,5 15,1 13,21 0,855

Eritrocitos

M 1495 5,67 6,04 6,74 7,51 7,92 6,744 0,4792

Hematolog^a de monos cinomolgos (originarios de Mauricio)

Parametro

Sexo n 1 % 5 % 50 % 95 % 99 % Media DE

H 1426 5,58 5,96 6,71 7,45 7,73 6,707 0,4894

Reticulocitos (1) %

M 20 0,1 0,1 0,4 1,8 1,8 0,48 0,438

H 20 0,1 0,1 0,3 0,9 0,9 0,42 0,268

Reticulocitos (2) %

M 1476 0,21 0,27 0,49 0,95 1,58 0,551 0,3804

H 1408 0,22 0,28 0,54 1,06 1,60 0,595 0,2934

HCM

M 1495 17,0 17,8 19,8 21,6 22,5 19,80 1,432

H 1425 16,7 17,7 19,7 21,8 22,6 19,74 1,216

CHCM

M 1495 27,2 28,2 30,1 31,9 32,7 30,06 1,801

H 1425 27,0 27,9 29,9 31,8 32,6 29,88 1,174

VCM

M 1495 57,9 60,5 65,8 71,4 73,5 65,88 3,278

H 1425 58,3 60,4 66,0 71,7 74,5 66,07 3,353

Distribucion de volumen (RDW)

M 280 12,6 12,9 14,4 16,1 16,7 14,40 0,934

H 285 12,4 12,8 14,2 15,7 16,3 14,21 0,879

Leucocitos

M 1507 5,61 6,62 10,52 18,59 30,24 11,372 4,7766

H 1432 5,39 6,58 10,62 19,55 28,79 11,637 4,7307

Neutrofilos

M 1507 0,88 1,28 3,49 10,24 16,27 4,319 3,1741

H 1432 1,06 1,62 4,45 12,27 17,41 5,392 3,4777

Linfocitos

M 1507 2,19 2,96 5,53 9,81 15,91 6,021 3,4066

H 1432 2,16 2,67 4,86 8,55 13,95 5,265 2,9997

Eosinofilos

M 1507 0,00 0,01 0,17 0,81 1,49 0,254 0,3127

H 1432 0,00 0,01 0,14 0,73 1,55 0,232 0,3188

Basofilos

M 1507 0,01 0,02 0,04 0,10 0,25 0,053 0,0627

H 1432 0,01 0,02 0,04 0,10 0,21 0,051 0,0540

Monocitos

M 1507 0,17 0,25 0,51 1,03 1,45 0,562 0,2575

H 1432 0,16 0,23 0,49 1,04 1,56 0,547 0,2705

Celulas grandes no tenidas (LUC)

M 1507 0,04 0,06 0,14 0,32 0,60 0,163 0,1330

H 1432 0,04 0,06 0,13 0,29 0,50 0,148 0,1147

Plaquetas

M 1495 158 238 359 497 575 362,1 81,69

H 1426 181 234 359 496 560 360,5 80,04

TP

M 1481 9,6 9,9 10,8 12,0 14,8 10,88 0,877

H 1406 9,7 10,0 10,8 12,1 14,1 10,93 0,847

TTPA

M 1483 23,1 24,4 29,1 37,9 50,1 30,06 5,267

H 1408 22,8 24,4 29,4 37,4 47,2 30,19 5,185

Fibrinogeno

M 265 1,61 1,86 2,61 3,51 4,88 2,664 0,6178

H 252 1,58 1,84 2,43 3,27 3,89 2,487 0,4545

Los valores bioqmmicos individuals acumulados de los monos se muestran en las TABLAS 33a-h, a continuacion:

Numero de animal

Grupo/ Sexo Codigo occn. ALP U/l ALT U/l AST U/l Bil. pmol/l Urea mmol/l Creat. pmol/l Gluc. mmol/l Col. mmol/l

615

1M PT 740 36 39 3 5,35 69 3,65 2,34

D11 743 35 33 3 5,43 73 3,66 2,00

TERM 597 29 31 2 5,16 76 3,74 2,30

465

2M PT 647 44 33 3 5,73 70 4,69 2,50

PD 755 47 36 2 3,60 73 4,50 2,72

D11 655 74 46 5 4,34 74 3,35 2,64

TERM 768 48 38 3 4,42 73 3,67 2,54

639

2M PD 741 29 26 2 4,41 87 3,31 3,22

D11 629 29 28 3 3,87 99 2,64 2,99

TERM 599 34 22 2 3,62 83 3,46 2,45

613

3M PT 1003 37 31 5 3,80 90 5,72 2,61

D11 793 36 29 4 4,45 80 3,28 2,70

TERM 931 34 32 5 5,16 83 2,78 2,46

631

4M PD 590 34 37 2 3,43 83 3,92 2,49

D11 508 38 36 3 3,33 82 3,38 2,30

TERM 578 25 25 2 4,00 89 3,70 2,26

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Un anticuerpo anti-EGFR humanizado, modificado por glucoingeniena que se une al mismo epftopo que el anticuerpo de rata ICR62 que comprende

   (i) una region variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:128 SEQ ID NO:129; SEQ ID NO:131; SEQ ID NO:133; SEQ ID NO:134; SEQ ID NO:136; SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:130; SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:137; y

   (ii) una region variable de cadena ligera de SEC ID N°:45;

   en la que dicho anticuerpo comprende una region Fc y en la que dicho anticuerpo se ha modificado por glucoingeniena:

   (a) para tener un numero reducido de restos de fucosa en la region Fc en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena;

   (b) para tener una afinidad de union a receptor de Fc aumentada en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena. y

   (c) para tener una funcion efectora aumentada en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena.
2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en la que dicho anticuerpo modificado por glucoingeniena tiene un porcentaje aumentado de oligosacaridos biseccionados en la region Fc en comparacion con un anticuerpo correspondiente no modificado por glucoingeniena.
3. 3. El anticuerpo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicha region Fc es una region Fc humana.
4. 4. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en la que la funcion efectora aumentada se selecciona de entre el grupo que consiste en citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada, union a celulas NK aumentada, union a macrofagos aumentada, union a celulas polimorfonucleares aumentada, union a monocitos aumentada, senalizacion directa inductora de apoptosis aumentada, maduracion de celulas dendnticas aumentada y sensibilizacion de linfocitos T aumentada.
5. 5. Una celula huesped que comprende un polinucleotido que codifica una region variable de cadena pesada tal como se define en la reivindicacion 1 y un polinucleotido que codifica una region variable de cadena ligera tal como se define en la reivindicacion 1, o un vector que comprende dichos polinucleotidos y en la que dicha celula huesped esta modificada por ingeniena para expresar al menos un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III.
6. 6. La celula huesped de la reivindicacion 5, en la que dicho polipeptido que tiene actividad p(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III es un polipeptido de fusion que comprende ademas el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido heterologo residente en el Golgi.
7. 7. La celula huesped de la reivindicacion 6, en la que dicho dominio de localizacion en el Golgi se selecciona de entre el dominio de localizacion de manosidasa II, el dominio de localizacion de p(1,2)-N- acetilglucosaminiltransferasa I, p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II, manosidasa I o a1-6 fucosiltransferasa central.
8. 8. Un metodo para producir un anticuerpo que es capaz de competir con el anticuerpo monoclonal de rata ICR62 por la union a EGFr humano, comprendiendo dicho metodo

   (a) cultivar la celula huesped de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en condiciones que permiten la expresion de dicho polinucleotido que codifica dicho anticuerpo; y

   (b) recuperar dicho anticuerpo.
9. 9. Un anticuerpo que se une a EGFR, preferentemente EGFR humano, en el que dicho anticuerpo se produce mediante el metodo de la reivindicacion 8.
10. 10. Una composicion que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
11. 11. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 para su uso en el tratamiento del cancer.
12. 12. El anticuerpo para su uso en el tratamiento del cancer de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que dicho cancer se selecciona de entre el grupo que consiste en cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, cancer de piel, cancer de pancreas, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de rinon, y cancer de cerebro.

    164

    imagen1

    imagen2

    Cone, de anticuerpo . pg/ml

    165

    400 t 350 - 300 -

    * 250 -

    2

    5 200 -

    0

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    | 100 -

    §

    imagen3

    0,1

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    166

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    167

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    168

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    0,1 1

    Cone, de anticue rpo ngfml

    ■ I-HLA1/I-KC l-HLA3/l'KC

    ■ I-HLA5/I-KC I-HLA6/I-KC

    ■ ch-ICR62

    169

    imagen7

    0,01 0,1 1

    Cone, de anticue rpo Jig/ml

    — l-HLWVKC -*-<SMCR62 I-HLA6/I-KC -•-l-HHaft-KC

    Cone, de anticuerpo nit

    o

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    imagen8

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    o

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    o

    Figura 7

    imagen10

    to niuertedependiente deAc

    imagen11

    173

    imagen12

    174

    imagen13

    imagen14

    Figura 11

    175

    imagen15

    Figura 12

    % inhibition

    imagen16

    HLAJO.pep SI T

    Intensidad de fluorescencia media

    Ensayo de union FcgammaRllla-Fc utilizando celulas CHO que muestran FcgammaRllla recombinante humano

    imagen17

    Figura 14

    - [a.u.)

    Perfil de oligosacarido EM-MALDI/TOF para el anticuerpolgd anti- EGFR humanizado IHHB-KC modificado por glucoingenieria

    00

    imagen18

    mb

    Intens. Rel. Rti- f ftlOti sw

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    * 1)11 n,7) 1,8

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    JOTl^TI

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    XIVM

    4 »1 V

    imagen19

    PERFIL DE PRECISION ANTI-EGFR

    01 05-HFIK-O7 .HI

    NIVEL SM: EVALUACION: CURVA PATRON 134 0RJ002

    EJE X

    ESCALA CONC.: LOG
13. 3.0-

    EJE Y

    ESCALA RESP.: MEDICION

    ALGORITMO DE AJUSTE

    PESODEMUESTRA

    L0 aui
14. 0.05 0.2 0.5

    imagen20

    CURVA DE CAUBRACION REPRESENTATIVA ANTI-EGFR

    NIVEL S.M.: EVALUACION: CURVA PATRON

    134 ORJ0BZ

    12 05-flflH-21.ai

    l,e1

    EJE X

    ESCALACONC.: LOG

    -

    1,4-

    / EJE Y

    1,2-

    ^ E3CALARESP.; MEDICION

    1,0-

    / " ALGOR ITMO DE A JUSTE

    BfS-

    y -

    7t PESO DE MUESTRA

    0,6-

    / -

    ■

    0,4-

    -

    -

    -------------1—'—■ i ■ ■1 ■ i i ■ ■ .................. 1

    imagen21

    Concentraciones sericas de anti-EGFR el dia 1 de la administration

    intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos macho

    300

    1.5 fTlg/kg

    ■4,5 mgrtig

    12 mg/kg

    200

    15D

    100

    120

    144

    168

    Tiempo (horas)

    Conoentracion iv9ml)

    Concentraciones sericas de anti-EGFR el dia 1 de la administration intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos hembra

    imagen22

    imagen23

    Relacion entre las areas bajo la curva (ABC168) de tiempo-concentracion

    dia 1 de la administracion

    serica de anti-EGFR y mvel de dosis

    intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos

    Machos

    20000 -

    Hembras

    18000

    16000

    14000

    12000

    O 10000

    8000

    0000

    4000

    2000

    Dosis (mg/kg)

    imagen24

    Concentracion serica de anti-EGFR durante la administration

    intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos macho

    1,5 rug/hg

    'IDO -

    4,5 irgJkg

    12 mg/kg

    300

    200

    Tiempo (horas)

    (|uvfi rt) i u op e j ju ao u o o

    Concentracion serica de anti-EGFR durante la administracidn intravenosa semanal de anti-EGFR a monos cinomolgos hembra

    imagen25

    mmnmmnmtmmr%r;%m

    _ — — — — — — — © “2S<N8"*'I}”M-ri"-0 •*

    imagen26

    mJf

    187

    Union de IHHB-KC a EGFR en celulas A431

    IW,

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    «Sfl

    ICO

    — A431-IHHB-KC a G2R2 (mono g2)

    B 119

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    Concentration de anticuerpo yg/fff

    M V »

    Intensidad de fluorescencia

    imagen27

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    3

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    Figura 25

    189

    Union de FcR a celulas CHO que expresan FcgammaRllla humano

    imagen29

    Cuarto ensayo de CCDA utilizando celulas diana A-549 (T). CCDA medida mediante el metodo basado en la liberacion de LDH. CMSP efectoras humanas (E). Proportion E:T = 25:1

    imagen30

    Concentracbn de anticuerpo (ng/ml)

    Cuarto ensayo de CODA utilizando celulas diana (D) CYNOM-K1 CCDA medida mediante el metodo basado en la liberacion de LDH. CMSP efectoras humanas (E). Proporcion E:T = 25:1

    imagen31

    Concentracion de anticuerpo (ng/ml)

    192

    Union a la diana de EGFR con celulas diana A431

    E

    s

    U)

    rs

    1

    20000

    18000

    16000

    14000

    12000

    10000

    imagen32

    0,001

    0 01 0,1 6onc. de anticuerpo .fig/mi

    10

    193

    20000 18000 16000 14000 12000 1 10000 8000

    3

    imagen33

    2000

    imagen34

    0,001

    0,01 0,1 Cone, de anticuerpo j^Q/ml

    10

    194

    3

    20000

    18000

    16000

    14000

    12000

    I 10000 8000 6000 4000 2000 0

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    (0

    0)

    0,001

    ■ IHHD-IKC

    ■ IHHD-1 {F27G)

    - IHHO-4 I • IHHO-5 i -IHHD-61

    imagen35

    0,01

    0,1

    10

    Cone, de anticuerpo

    195

    imagen36