TWI418566B - 與上皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）結合之抗原結合分子、編碼該抗原結合分子之載體及其用途 - Google Patents

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Description

與上皮生長因子受體(EGFR)結合之抗原結合分子、編碼該抗原結合分子之載體及其用途
本發明係關於抗原結合分子(ABM)。在特定實施例中，本發明係關於重組性單株抗體，其包括對人類上皮生長因子受體(EGFR)特異性之嵌合、靈長類化或人類化抗體。此外，本發明係關於編碼該等ABM之核酸分子及包含該等核酸分子之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於製備本發明之ABM的方法且係關於使用該等ABM來治療疾病的方法。此外，本發明係關於在糖基化作用得以改質的情況下具有經改良之治療特性的ABM，其包括具有經增加之Fc受體結合性及經增加之效應功能的抗體。
 EGFR及抗EGFR抗體
人類上皮生長因子受體(亦稱為HER－1或Erb－B1且本文中稱為"EGFR")為170 kDa由c－erbB原致癌基因編碼之跨膜受體且顯示固有酪胺酸激酶活性(Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996)；Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。SwissProt資料庫編目P00533提供EGFR之序列。亦存在EGFR之同功異型物及變異體(例如替代性RNA轉錄產物、截短形式、多態現象等)，其包括(但不限於)彼等藉由SwissProt資料庫編目流水號P00533－1、P00533－2、P00533－3及P00533－4鑑別之EGFR。已知EGFR與包括上皮生長因子(EGF)、轉化生長因子－α(TGf－α)、雙調蛋白、肝素結合性EGF(hb－EGF)、β細胞調節素及表皮調節素之配位體結合(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Mendelsohn及Baselga,Oncogene 79：6550－6565(2000))。EGFR經由酪胺酸激酶所介導之信號傳導途徑調節大量細胞代謝過程，其包括(但不限於)激活控制細胞增殖、分化、細胞存活、細胞凋亡、血管生成、致有絲分裂及轉移之信號傳導途徑(Atalay等人，Ann.Oncology 14：1346－1363(2003)；Tsao及Herbst,Signal 4：4－9(2003)；Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。
在大量人類惡性病狀中已報導EGFR之過度表現，該等病狀包括膀胱、腦、頭部及頸部、胰腺、肺、乳房、卵巢、結腸、前列腺及腎之癌症。(Atalay等人，Ann.Oncology 14：1346－1363(2003)；Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。在許多該等病狀中，EGFR之過度表現與患者之不良預後相關或與患者之不良預後相關聯。(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。EGFR亦表現於正常組織之細胞中，尤其表現於皮膚、肝臟及胃腸道之上皮組織中(儘管通常以比於惡性細胞中更低之水準表現)(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。
非結合性單株抗體(mAb)可為適用於治療癌症之藥品，如由美國食品與藥品管理署(U.S.Food and Drug Administration)批准曲妥珠單抗(Trastuzumab)(HerceptinTM ；Genentech Inc)用於治療晚期乳癌(Grillo－Lopez,A.－J.等人，Semin.Oncol 26：66－73(1999)；Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.27：309－18(1999))、批准利妥昔單抗(Rituximab)(RituxanTM ；IDEC Pharmaceuticals,San Diego,CA及Genentech Inc.,San Francisco,CA)用於治療CD20陽性B細胞低級或濾泡性非霍奇金(Non－Hodgkin)淋巴瘤、批准吉妥單抗(Gemtuzumab)(MylotargTM ,Celltech/Wyeth－Ayerst)用於治療復發性急性骨髓白血病且批准阿侖單抗(Alemtuzumab)(CAMPATHTM ,Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)用於治療B細胞慢性淋巴球性白血病所證明。該等產品之成功不僅依靠其功效且依靠其顯著之安全概況(Grillo－Lopez,A.J.等人，Semin.Oncol.26：66－73(1999)；Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.27：309－18(1999))。儘管該等藥物有如此成就，但當前存在獲得比通常由非結合性mAb療法所提供之特異性抗體活性更高之特異性抗體活性的極大興趣。
大量試驗結果表明Fc受體依賴機制大體上提供細胞毒性抗體針對腫瘤之作用且表明針對腫瘤之最適抗體將優先與活化Fc受體結合且最低限度與抑制性搭配物FcγRIIB結合。(Clynes,R.A.等人，Nature Medicine 6(4)：443－446(2000)；Kalergis,A.M.及Ravetch,J.V.,J.Exp.Med.195(12)：1653－1659(2002年6月))。舉例而言，至少一個試驗之結果表明FcγRIIIa受體中之多態現象尤其與抗體治療之功效強烈相關聯。(Cartron,G.等人，Blood 99(3)：754－757(2002年2月))。該試驗展示對於FcγRIIIa純合之患者對利妥昔單抗具有比雜合患者更佳之反應。該等作者推斷，優良反應歸因於抗體與FcγRIIIa之較佳活體內結合性，其導致針對淋巴瘤細胞之較佳ADCC活性。(Cartron,G.等人，Blood 99(3)：754－757(2002年2月))。
已報導各種靶向EGFR且阻斷EGFR信號傳導途徑之對策。如吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)及CI－1033之小分子酪胺酸激酶抑制劑阻斷EGFR在細胞內酪胺酸激酶區域中之自體磷酸化而藉此抑制後續信號傳導事件(Tsao及Herbst,Signal 4：4－9(2003))。另一方面，單株抗體靶向EGFR之細胞外部分，其導致阻斷配位體結合且藉此抑制諸如細胞增生之後續事件(Tsao及Herbst,Signal 4：4－9－(2003))。
已產生數種實現該活體外阻斷且已對其在小鼠異種移植模型中影響腫瘤生長之能力進行評估的鼠類單株抗體(Masui等人，Cancer Res.46：5592－5598(1986)；Masui等人，Cancer Res.44：1002－1007(1984)；Goldstein等人，Clin.Cancer Res.1：1311－1318(1995))。舉例而言，EMD 55900(EMD藥物)為鼠類抗EGFR單株抗體，其針對人類表皮樣癌細胞株A431而提出且在患有喉或咽下部之晚期鱗狀細胞癌的患者臨床試驗中得以測試(Bier等人，Eur.Arch.Otohinolaryngol.252：433－9(1995))。此外，已展示與EGFR之胞外域結合之大鼠單株抗體ICR16、ICR62及ICR80有效抑制EGF與TGF－α受體的結合。(Modjtahedi等人，Int.J.Cancer 75：310－316(1998))。鼠類單株抗體425為另一MAb，其針對人類A431癌細胞株而提出且發現其與多肽抗原決定基結合於人類上皮生長因子受體之外部域上。(Murthy等人，Arch.Biochem.Biophys.252(2)：549－560(1987))。鼠類抗體用於治療之潛在問題為，非人類單株抗體可由人類宿主識別成外來蛋白；因此反複注射該等外來抗體可導致誘導免疫反應從而導致有害過敏性反應。對於基於鼠類之單株抗體，其通常稱為人類抗小鼠抗體反應或"HAMA"反應或人類抗大鼠抗體反應或"HARA"反應。另外，該等"外來"抗體可遭受宿主之免疫系統攻擊使得其在其達至其靶點之前實際上失效。此外，非人類單株抗體(例如鼠類單株抗體)通常缺少人類效應因子官能基，亦即其尤其不能經由抗體依賴型細胞毒性或Fc受體介導型吞噬作用來介導補體依賴型溶胞或溶解人類靶標細胞。
已開發包含來自兩種或兩種以上不同物種(例如小鼠及人類)之抗體之諸部分的嵌合抗體作為"結合"抗體之替代物。舉例而言，美國專利第5,891,996號(Mateo de Acosta del Rio等人)論述針對EGFR之小鼠/人類嵌合抗體R3且美國專利第5,558,864號論述產生嵌合及人類化形式之鼠類抗EGFR MAb 425。IMC－C225(Erbitux；ImClone)亦為嵌合小鼠/人類抗EGFR單株抗體(基於小鼠M225單株抗體，其在人類臨床試驗中導致HAMA反應)，已報導該單株抗體在各種人類異種移植模型中證明抗瘤功效。(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。IMC－C225之功效已歸因於若干機制，包括由EGFR信號傳導途徑及可能由經增加之抗體依賴型細胞毒性(ADCC)活性調節之細胞事件的抑制(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。IMC－C225亦適用於臨床試驗，包括與放射線療法及化療法組合使用(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。近來，Abgenix,Inc.(Fremont,CA)開發用於癌症治療之ABX－EGF。ABX－EGF為全人抗EGFR單株抗體。(Yang等人，Crit.Rev.Oncol./Hematol.38：17－23(2001))。
抗體糖基化
寡醣組份可顯著影響與治療性醣蛋白之功效有關之特性，其包括物理穩定性、對蛋白酶攻擊之抗性、與免疫系統之相互作用、藥物代謝動力學及特異性生物活性。該等特性可不僅視寡醣之存在與否而定，且視寡醣之特異性結構而定。可獲得寡醣結構與醣蛋白功能之間的某些通則。舉例而言，某些寡醣結構經由與特異性醣結合蛋白相互作用而介導醣蛋白自血流中快速清除，而其他寡醣結構可由抗體結合且觸發不當免疫反應。(Jenkins等人，Nature Biotechnol 14：975－81(1996))。
由於哺乳動物細胞具有使蛋白質以對於人類應用之最相容形式糖基化的能力，故其為產生治療性醣蛋白之較佳宿主。(Cumming等人，Glycobiology 1：115－30(1991)；Jenkins等人，Nature Biotechnol.14：975－81(1996))。細菌極少使蛋白質糖基化且如其他類型之常見宿主(諸如酵母、絲狀真菌、昆蟲及植物細胞)產生與自血流中快速清除、不當免疫相互作用及(在某些特定情況中)低生物活性相關聯之糖基化模式。在哺乳動物細胞之中，在近二十年期間最通常使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。除提供適當糖基化模式之外，該等細胞允許穩定產生遺傳穩定性高度多產無性系細胞株。其可在簡單生物反應器中使用不含血清之培養基培養至較高密度且允許開發安全且可重現生物工藝。其他通常所用之動物細胞包括幼小倉鼠腎臟(BHK)細胞、NS0－及SP2/0－小鼠骨髓瘤細胞。近年來，亦測試來自轉殖基因動物之產品。(Jenkins等人，Nature Biotechnol 14：975－81(1996))。
所有抗體在重鏈恆定區中之保守位置上含有醣結構，且各同種型具有不同陣列之N－連接醣結構，該等結構不定地影響蛋白質組件、分泌或功能活性。(Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotech.15：26－32(1997))。所連接之N－連接醣結構視加工程度而顯著變化且可包括高甘露糖、多支鏈以及二天線複合寡醣。(Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotech.15：26－32(1997))。通常，存在連接於特定糖基化位點上之核心寡醣結構的異種加工使得甚至單株抗體以多糖型形式存在。同樣，已展示抗體糖基化中之主要差異出現於細胞株之間且甚至可見在不同培養條件下生長之給定細胞株之次要差異。(Lifely,M.R.等人，Glycobiology 5(8)：813－22(1995))。
一種獲得效能較大增加而保持簡單製造工藝且可能避免明顯不當副效應之方法為藉由如Umaa,P.等人，Nature Biotechnol.17：176－180(1999)及美國專利第6,602,684號中所述使寡醣組份工程化而增強單株抗體的天然細胞介導型效應功能，該等文獻內容據此以引入的方式全部併入本文中。癌症免疫療法中最常用抗體IgG1型抗體為在各CH2域中之Asn297處具有保守N－連接糖基化位點的醣蛋白。兩種連接於Asn297處之複合二天線寡醣埋藏於CH2域之間且形成與多肽主鏈之廣泛接觸，且其存在對於抗體介導諸如抗體依賴細胞毒性(ADCC)之效應功能必不可少(Lifely,M.R.等人，Glycobiology 5：813－822(1995)；Jefferis,R.等人，Immunol Rev.163：59－76(1998)；Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15：26－32(1997))。
Umaa等人先前展示，β(1,4)－N－乙醯胺基葡萄糖轉移酶III("GnTIII")(一種催化形成二等分寡醣之糖基轉移酶)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之過度表現顯著增加由工程化CHO細胞所製備之抗神經母細胞瘤嵌合單株抗體(chCE7)的活體外ADCC活性。(參見Umaa,P.等人，Nature Biotechnol.17：176－180(1999)；及國際公開案第WO 99/54342號，其全部內容據此以引入的方式併入本文中)。抗體chCE7屬於一大類當產生於缺乏GnTIII酶之標準工業細胞株中時具有高腫瘤親和力及特異性，但具有過少臨床上有用之效能的非結合性mAb(Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17：176－180(1999))。該試驗最先展示，可藉由使產生抗體之細胞工程化以表現GnTIII而獲得ADCC活性之大量增加，其亦導致恆定區(Fc)相關之二等分寡醣(包括二等分非岩藻糖基化寡醣)之比例增加而超出天然存在抗體中所見之水準。
保持對於靶向EGFR以治療靈長類(包括但不限於人類)細胞增生病症之經增強之治療方法的需要，其中該等病症特徵在於EGFR表現、尤其異常表現(例如過度表現)，其包括(但不限於)膀胱、腦、頭部及頸部、胰腺、肺、乳房、卵巢、結腸、前列腺及腎臟之癌症。詳言之，保持對於使向人類受檢者投與之抗原結合分子中之非人類殘基之數目最小化的需要。
認識到具有大鼠ICR62抗體之結合特異性(例如結合相同抗原決定基)且經糖工程化以增強Fc受體結合親和力及效應功能之抗原結合分子(ABM)的巨大治療潛能，故本發明者開發一種產生該等ABM之方法。該方法尤其涉及產生重組性嵌合抗體或其嵌合片段。該等ABM之功效藉由使抗體Fc區域之糖基化圖譜工程化而得以進一步增強。
因此，在一態樣中，本發明係關於一種包含大鼠ICR62單株抗體之一或多個互補決定區(CDR)之一或多個特異性決定殘基(SDR)及源自異源多肽之序列的抗原結合分子(ABM)，其中該ABM與EGFR特異性結合。在一特定實施例中，ABM並不包含選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：121組成之群的序列。
在一實施例中，該或該等SDR處於一或多個重鏈CDR中。在一特定實施例中，該或該等重鏈SDR係選自由Kabat位置29上之苯丙胺酸、Kabat位置52上之天冬醯胺酸、Kabat位置56上之酪胺酸及Kabat位置100b上之纈胺酸組成之群。在另一特定實施例中，該或該等重鏈SDR包含Kabat位置56上之酪胺酸及Kabat位置100b上之纈胺酸。在另一特定實施例中，該或該等重鏈SDR係選自由Kabat位置29上之苯丙胺酸、Kabat位置52上之天冬醯胺酸、Kabat位置56上之酪胺酸及Kabat位置100b上之纈胺酸組成之群。
在一實施例中，該或該等SDR處於一或多個輕鏈CDR中。在一特定實施例中，該或該等輕鏈SDR包含Kabat位置50上之天冬醯胺酸。在另一特定實施例中，該或該等輕鏈SDR包含Kabat位置34上之天冬醯胺酸及Kabat位置50上之天冬醯胺酸。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含大鼠ICR62抗體之至少兩個CDR或其至少含有該等CDR之SDR之變異體或截短形式的ABM。在一實施例中，該ABM包含大鼠ICR62抗體之至少三個CDR或其至少含有該等CDR之SDR的變異體或截短形式。在另一實施例中，該ABM包含大鼠ICR62抗體之至少四個CDR或其至少含有該等CDR之SDR的變異體或截短形式。在另一實施例中，該ABM包含大鼠ICR62抗體之至少五個CDR或其至少含有該等CDR之SDR的變異體或截短形式。在另一實施例中，該ABM包含大鼠ICR62抗體之六個CDR或其至少含有該等CDR之SDR的變異體或截短形式。在另一實施例中，大鼠ICR62抗體之CDR在一或多個胺基酸位置上包含取代且其中該ABM與未經取代之ABM相比保持結合活性。在另一實施例中，大鼠ICR62抗體之CDR在除該等特異性決定殘基外之任何位置上包含取代。在另一實施例中，大鼠ICR62抗體之CDR在除該等特異性決定殘基外之所有位置上包含取代。在一特定實施例中，該(等)CDR在Chothia重鏈CDR1之Kabat位置27、28或29、Kabat重鏈CDR1之位置31、Kabat重鏈CDR2之Kabat位置52、52a、53或57或Kabat重鏈CDR3之Kabat位置102之一或多者上包含取代。在另一特定實施例中，該(等)CDR在Kabat輕鏈CDR1之Kabat位置30或32、Kabat輕鏈CDR2之Kabat位置51、52、53或56、或Kabat重鏈CDR3之Kabat位置94之一或多者上包含取代。
在另一態樣中，本發明係關於其中結合反應之EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約10至約0.001倍的ABM。在一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約10至約1倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約10至約5倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約5至約0.1倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約5至約2倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約3至約1倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約2倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約1倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約0.1倍。在另一特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約0.001倍。在一些實施例中，如上列之調節包含EC50增加。在其他實施例中，該調節包含EC50降低。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含包括選自由以下序列組成之群的序列之多肽的ABM：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離多肽，其編碼包含大鼠ICR62單株抗體之經改良之重鏈CDR及源自一或多種人類生殖系可變區基因序列之重鏈構架區的免疫球蛋白重鏈可變區，其中該等經改良之重鏈CDR在選自由27、28、29、30、31、32、33、34、35、52、52a、53、54、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、95、96、97、98、99、100、100a、101、102及其任何組合組成之群的Kabat位置上包含一或多個胺基酸取代，且其中該多肽作為抗原結合分子之一部分與人類EGFR特異性結合。在一特定實施例中，經改良之重鏈CDR在Kabat位置27、28、29、31、52、53、54、58及102上包含一或多個胺基酸取代。在另一特定實施例中，經改良之重鏈CDR在Kabat位置27、28、31、53、54及58上包含一或多個胺基酸取代。在另一特定實施例中，經改良之重鏈CDR在Kabat及Chothia重鏈CDR內除SDR外之所有位置上包含胺基酸取代。在另一特定實施例中，經改良之重鏈CDR在Kabat及Chothia重鏈CDR內除Kabat位置29、52、56及100b外之所有位置上包含胺基酸取代。本發明亦係關於編碼該經分離多肽的經分離聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離多肽，其編碼包含大鼠ICR62單株抗體之經改良之輕鏈CDR及源自一或多種人類生殖系可變區基因序列之輕鏈構架區的免疫球蛋白輕鏈可變區，其中該等經改良之輕鏈CDR在選自由24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、51、52、53、54、55、56、89、90、91、92、93、94、95、96、97及其任何組合組成之群的Kabat位置上包含一或多個胺基酸取代，且其中該多肽作為抗原結合分子之一部分與人類EGFR特異性結合。在一特定實施例中，經改良之輕鏈CDR在Kabat及Chothia輕鏈CDR內除SDR外之所有位置上包含胺基酸取代。在另一特定實施例中，經改良之輕鏈CDR在Kabat及Chothia輕鏈CDR內除Kabat位置34及50外之所有位置上包含胺基酸取代。本發明亦係關於編碼該經分離多肽的經分離聚核苷酸。本發明亦係關於包含該經分離多肽的ABM。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其編碼包含選自由以下序列組成之群之序列的多肽：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ IDN O：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147，其中該多肽作為抗原結合分子之一部分與人類EGFR特異性結合。在另一態樣中，本發明係關於一種經聚核苷酸轉染之宿主細胞或包含該聚核苷酸之載體。在一實施例中，該載體為複製選殖性載體。在另一實施例中，該載體為表現載體。
在另一態樣中，本發明係關於一種產生能夠與大鼠ICR62單株抗體競爭結合於人類EGFR之抗原結合分子的方法，該方法包含在培養基中在允許表現一或多種編碼抗原結合分子之聚核苷酸之情況下培養本發明之宿主細胞且回收該抗原結合分子。
在另一態樣中，本發明之ABM經糖工程化以便在Fc區域中具有經改造之寡醣結構。在一特定實施例中，Fc區域具有與相應未經糖工程化之ABM相比更少數目之海藻糖殘基。
在另一態樣中，本發明係關於包含本發明之ABM及醫藥學上可接受之載劑的組合物。在另一態樣中，本發明係關於一種在受檢者中靶向表現EGFR之細胞的方法，其包含向受檢者投予本發明之組合物。在一特定實施例中，該等細胞過度表現EGFR。在另一特定實施例中，該方法經執行以治療該受檢者之可藉由阻斷EGFR所介導之細胞信號傳導來治療之病症。在另一實施例中，本發明係關於本發明適用於製造用於治療可藉由阻斷EGFR所介導之細胞信號傳導來治療病症之藥物的ABM。在一實施例中，該病症為細胞增生病症。在一特定實施例中，該細胞增生病症為癌症。在一更特定實施例中，該癌症係選自由乳癌、膀胱癌、頭部及頸部癌症、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌及腦癌組成之群。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含：(a)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：122及SEQ ID NO：124；(b)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106及SEQ ID NO：126；及(c)SEQ ID NO：108。在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含(a)選自由SEQ ID NO：112及SEQ ID NO：114組成之群的序列；(b)選自由SEQ ID NO：116及SEQ ID NO：118組成之群的序列；及(c)SEQ ID NO：119。在一實施例中，該等聚核苷酸之任一者編碼融合多肽。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ ID No：12、SEQ ID No：14、SEQ ID No：16、SEQ ID No：18、SEQ ID No：20、SEQ ID No：22、SEQ ID No：24、SEQ ID No：26、SEQ ID No：28、SEQ ID No：30、SEQ ID No：32、SEQ ID No：34、SEQ ID No：36、SEQ ID No：38、SEQ ID No：40及SEQ ID No：120組成之群的序列。在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含選自由SEQ ID No：44、SEQ ID No：46、SEQ ID No：50及SEQ ID No：52組成之群的序列。在一實施例中，該等聚核苷酸編碼融合多肽。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離聚核苷酸。
本發明進一步係關於一種經分離聚核苷酸，其包含與選自由SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ ID No：12、SEQ ID No：14、SEQ ID No：16、SEQ ID No：18、SEQ ID No：20、SEQ ID No：22、SEQ ID No：24、SEQ ID No：26、SEQ ID No：28、SEQ ID No：30、SEQ ID No：32、SEQ ID No：34、SEQ ID No：36、SEQ ID No：38、SEQ ID No：40及SEQ ID No：120組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性的序列，其中該經分離聚核苷酸編碼融合多肽。在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含與選自由SEQ ID No：44、SEQ ID No：46、SEQ ID No：50及SEQ ID No：52組成之群的序列具有至少80%一致性的序列，其中該經分離聚核苷酸編碼融合多肽。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離聚核苷酸。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離聚核苷酸。
本發明亦係關於一種編碼具有序列SEQ ID No：1之嵌合多肽之經分離的聚核苷酸。在一實施例中，該聚核苷酸包含編碼具有序列SEQ ID No：1之多肽的序列；及編碼具有來自除大鼠以外之物種的抗體Fc區域或其片段之序列之多肽的序列。本發明亦係關於一種經分離聚核苷酸，其編碼具有選自由以下序列組成之群之序列的嵌合多肽：SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121。在一實施例中，該聚核苷酸包含編碼具有選自由SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121組成之群的序列之多肽的序列；及編碼具有來自除大鼠以外的物種之抗體Fc區域或其片段之序列之多肽的序列。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等編碼該等多肽之經分離的聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其編碼具有序列SEQ ID No：43之嵌合多肽。在一實施例中，該聚核苷酸包含編碼具有序列SEQ ID No：43之多肽的序列；及編碼具有來自除大鼠以外之物種的抗體Fc區域或其片段之序列之多肽的序列。在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其編碼具有選自由SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群之序列的嵌合多肽。在一實施例中，該聚核苷酸包含編碼具有選自由SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群之序列之多肽的序列及編碼具有來自除大鼠以外的物種之抗體輕鏈恆定區(CL)或其片段之序列之多肽的序列。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等編碼該等多肽之經分離的聚核苷酸。
本發明亦係關於一種經分離聚核苷酸，其包含編碼具有ICR62抗體或其功能性變異體之VH區域之多肽的序列及編碼具有來自除大鼠以外之物種的抗體Fc區域或其片段之序列之多肽的序列。在另一態樣中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含編碼具有ICR62抗體或其功能性變異體之VL區域之多肽的序列及編碼具有來自除大鼠以外之物種的抗體CL區域或其片段之序列之多肽的序列。
本發明進一步係關於一種包含如上所述經分離聚核苷酸之任一者的表現載體且係關於包含該表現載體之宿主細胞。在另一態樣中，本發明係關於一種包含如上所述經分離聚核苷酸之任一者的宿主細胞。
在一態樣中，本發明係關於一種經分離多肽，其包含：(a)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：123及SEQ ID NO：125；(b)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：127；及(c)SEQ ID NO：107，其中該多肽為融合多肽。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離多肽。在另一態樣中，本發明係關於一種經分離多肽，其包含(a)選自由SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：113組成之群的序列；(b)SEQ ID NO：115；及(c)SEQ ID NO：117，其中該多肽為融合多肽。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離多肽。
本發明亦係關於一種包含序列SEQ ID NO：1或其變異體之嵌合多肽。本發明進一步係關於一種包含序列SEQ ID NO：43或其變異體之嵌合多肽。在一實施例中，該等多肽之任一者進一步包含人類Fc區域及/或人類CL區域。本發明亦係關於一種嵌合多肽，其包含選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121或其變異體。本發明進一步係關於一種嵌合多肽，其包含選自由SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51或其變異體組成之群的序列。在一實施例中，該等多肽之任一者進一步包含人類Fc區域及/或人類CL區域。在一實施例中，人類Fc區域包含IgG1。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含源自ICR62抗體之序列及源自異源多肽之序列的多肽且係關於一種包含該多肽之抗原結合分子。在一實施例中，該抗原結合分子為抗體。在一較佳實施例中，該抗體為嵌合的。在另一較佳實施例中，該抗體為人類化或靈長類化的。
在另一態樣中，本發明係關於一種能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合於EGFR且為嵌合的ABM。在一實施例中，該ABM為抗體或其片段。在另一實施例中，該ABM為包含具有選自由以下序列組成之群的胺基酸序列之VH區域的重組性抗體：SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121。在另一實施例中，該ABM為包含具有選自由SEQ ID No：43、SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群的胺基酸序列之VL區域的重組性抗體。在另一實施例中，該ABM為經靈長類化之重組性抗體。在另一實施例中，該ABM為經人類化之重組性抗體。在另一實施例中，該ABM為包含人類Fc區域之重組性抗體。在另一實施例中，上述所討論之ABM之任一者可與諸如毒素或放射性標記之部分結合。
本發明進一步係關於本發明之ABM，該ABM具有經改良之寡醣。在一實施例中，該等經改良之寡醣具有與未經改良之寡醣相比更低之岩藻糖基化。在其他實施例中，該等經改良之寡醣為雜交或複合的。在另一實施例中，該ABM在該分子之Fc區域中具有高比例之非岩藻糖基化寡醣或二等分非岩藻糖基化寡醣。在一實施例中，該等二等分非岩藻糖基化寡醣為雜交的。在另一實施例中，該等二等分非岩藻糖基化寡醣為複合的。在一實施例中，在該多肽之Fc區域中至少20%之寡醣為非岩藻糖基化或二等分非岩藻糖基化寡醣。在更佳實施例中，至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%或更多之寡醣為非岩藻糖基化或二等分非岩藻糖基化寡醣。
本發明進一步係關於一種編碼上述所討論之ABM之任一者的聚核苷酸且係關於包含該聚核苷酸之表現載體及細胞。
本發明進一步係關於一種產生能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合於EGFR且其中該ABM為嵌合之ABM的方法；該方法包含：(a)在培養基中在允許表現編碼該ABM之該聚核苷酸之情況下培養包含編碼本發明之ABM之聚核苷酸的宿主細胞；且(b)自所得培養物中回收該ABM。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含本發明之ABM的醫藥組合物。預期該醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、佐劑或其組合。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療以表現EGFR(例如異常或過度表現EGFR)為特徵之疾病的方法。該方法包含向需要其之受檢者、較佳哺乳動物受檢者且更佳人類投與治療有效量之本發明的ABM。在一較佳實施例中，藉由投與屬於嵌合(例如人類化)抗體或抗體之嵌合片段的ABM來治療該疾病。在一實施例中，以約1.0 mg/kg至約15.0 mg/kg之量投與該ABM。在另一實施例中，以約1.5 mg/kg至約12.0 mg/kg之量投與該ABM。在另一實施例中，以約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg之量投與該ABM。在另一實施例中，以約4.5 mg/kg至約12.0 mg/kg之量投與該ABM。在另一實施例中，以選自由約1.5 mg/kg、約4.5 mg/kg及約12.0 mg/kg組成之群的量投與該ABM。
在另一態樣中，本發明係關於一種經工程化以在由宿主細胞所產生之ABM之Fc區域中以足以改良寡醣之量表現至少一種編碼具有GnTIII活性之多肽之核酸的宿主細胞，其中該ABM能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合於EGFR且其中該ABM為嵌合的。在一實施例中，具有GnTIII活性之多肽為融合多肽。在另一實施例中，由宿主細胞所產生之ABM為抗體或抗體片段。在一實施例中，該抗體或抗體片段為人類化的。在另一實施例中，該ABM包含相當於人類IgG之Fc區域的區域。
本發明亦係關於一種經分離聚核苷酸，其包含大鼠ICR62抗體的至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個或六個)互補決定區，或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截短形式，其中該經分離聚核苷酸編碼融合多肽。該等經分離聚核苷酸較佳編碼屬於抗原結合分子之融合多肽。在一實施例中，該聚核苷酸包含大鼠ICR62抗體的三個互補決定區，或其至少含有對於該等三個互補決定區之每一者的特異性決定殘基之變異體或截短形式。在另一實施例中，該聚核苷酸編碼嵌合(例如人類化)抗體之輕鏈或重鏈之整個可變區。本發明進一步係關於由該等聚核苷酸編碼之多肽。
在另一實施例中，本發明係關於一種抗原結合分子，其包含大鼠ICR62抗體的至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個或六個)互補決定區，或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截短形式，且包含源自異源多肽之序列。在一實施例中，該抗原結合分子包含大鼠ICR62抗體的三個互補決定區，或其至少含有對於該等三個互補決定區之每一者的特異性決定殘基之變異體或截短形式。在另一態樣中，該抗原結合分子包含抗體輕鏈或重鏈之可變區。在一尤其有用之實施例中，該抗原結合分子為嵌合(例如人類化)抗體。本發明亦係關於製造該等抗原結合分子之方法及其在治療疾病中之用途，該疾病包括諸如膀胱、腦、頭部及頸部、胰腺、肺、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚及腎臟之癌症的惡性疾病。
本發明之宿主細胞可選自包括(但不限於)HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞之群。在一實施例中，本發明之宿主細胞進一步包含一種經轉染之聚核苷酸，其包含編碼大鼠ICR62抗體或其變異體之VL區域的聚核苷酸及編碼相當於人免疫球蛋白之Fc區域之區域的序列。在另一實施例中，本發明之宿主細胞進一步包含一種經轉染之聚核苷酸，其包含編碼大鼠ICR62抗體或其變異體之VH區域的聚核苷酸及編碼相當於人免疫球蛋白之Fc區域之區域的序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種由於改良其寡醣而產生顯示高Fc受體結合親和力及/或高效應功能之ABM的宿主細胞。在一實施例中，高結合親和力屬於Fc受體(尤其FcγRIIIA受體)。本文中所預期之效應功能可選自包括(但不限於)Fc介導型細胞毒性提高、與NK細胞之結合性提高、與巨噬細胞之結合性提高、與多形核細胞之結合性提高、與單核細胞之結合性提高、誘導細胞凋亡之直接信號傳導提高，樹突狀細胞成熟增加及T細胞引發性增加之群。
在另一實施例中，本發明之宿主細胞包含在運作上與組成型啟動子元件有關之至少一種編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸。
在另一態樣中，本發明係關於一種在宿主細胞中產生ABM之方法，其包含：(a)培養經工程化以在允許產生該ABM且允許改良存在於該ABM之Fc區域上之寡醣的情況下表現至少一種編碼具有GnTIII活性之融合多肽之聚核苷酸的宿主細胞；且(b)分離該ABM；其中該ABM能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合於EGFR且其中該ABM為嵌合(例如人類化)的。在一實施例中，具有GnTIII活性之多肽為較佳包含GnTIII之催化域及異源高基體內在多肽之高基體定位域的融合多肽，該高基體定位域係選自由甘露糖苷酶II之定位域、β(1,2)－N－乙醯胺基葡萄糖轉移酶I("GnTI")之定位域、甘露糖苷酶I之定位域、β(1,2)－N－乙醯胺基葡萄糖轉移酶II("GnTII")之定位域及α1－6核心岩藻糖基轉移酶之定位域組成之群。高基體定位域較佳係來自甘露糖苷酶II或GnTI。
在另一態樣中，本發明係關於一種改良由宿主細胞所產生之抗EGFR ABM之糖基化圖譜的方法，其包含將至少一種本發明之核酸或表現載體引入宿主細胞。在一實施例中，該ABM為較佳包含IgG之Fc區域的抗體或其片段。或者，該多肽為包括相當於人類IgG之Fc區域之區域的融合蛋白。
在一態樣中，本發明係關於一種能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合於EGFR且具有低岩藻糖基化之重組性嵌合抗體或其片段。
在另一態樣中，本發明係關於一種藉由使用具有GnTIII活性且包含異源高基體內在多肽之高基體定位域之融合多肽來改良本發明之重組性抗體或其片段之糖基化的方法。在一實施例中，本發明之融合多肽包含GnTIII之催化域。在另一實施例中，該高基體定位域係選自由以下各域組成之群：甘露糖苷酶II之定位域、GnTI之定位域、甘露糖苷酶I之定位域、GnTII之定位域及α1－6核心岩藻糖基轉移酶之定位域。高基體定位域較佳係來自甘露糖苷酶II或GnTI。
在一實施例中，本發明之方法致力於產生具有經改良之寡醣的重組性嵌合抗體或其片段，其中該等經改良之寡醣具有與未經改良之寡醣相比更低之岩藻糖基化。根據本發明，該等經改良之寡醣可為雜交或複合的。在另一實施例中，本發明之方法致力於產生在該多肽之Fc區域中具有高比例之二等分非岩藻糖基化寡醣的重組性嵌合(例如人類化)抗體或其片段。在一實施例中，該等二等分非岩藻糖基化寡醣為雜交的。在另一實施例中，該等二等分非岩藻糖基化寡醣為複合的。在另一實施例中，本發明之方法致力於產生在該多肽之Fc區域中具有至少20%之二等分非岩藻糖基化之寡醣的重組性嵌合抗體或其片段。在一較佳實施例中，在該多肽之Fc區域中至少30%之寡醣為二等分非岩藻糖基化寡醣。在另一較佳實施例中，其中在該多肽之Fc區域中至少35%之寡醣為二等分非岩藻糖基化寡醣。
在另一態樣中，本發明係關於一種由於改良其寡醣而顯示高Fc受體結合親和力及/或高效應功能之重組性嵌合抗體或其片段。在一實施例中，該高結合親和力屬於Fc活化受體。在另一實施例中，該Fc受體為Fcγ活化受體，尤其為FcγRIIIA受體。本文中所預期之效應功能可選自包括(但不限於)Fc介導型細胞毒性提高、與NK細胞之結合性提高、與巨噬細胞之結合性提高、與多形核細胞之結合性提高、與單核細胞之結合性提高、誘導細胞凋亡之直接信號傳導提高、樹突狀細胞成熟增加及T細胞引發性增加之群。
在另一態樣中，本發明係關於一種具有大鼠ICR62抗體之結合特異性且含有Fc區域的重組性嵌合(例如人類化)抗體片段，其經工程化以具有藉由本發明之方法之任一者所產生的高效應功能。
在另一態樣中，本發明係關於一種包括具有選自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ IDN o：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ IDN o：39及SEQ ID No：121組成之群的序列之多肽及相當於免疫球蛋白之Fc區域之區域且經工程化以具有藉由本發明之方法之任一者所產生之高效應功能的融合蛋白。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離多肽。
在另一態樣中，本發明係關於一種包括具有選自由SEQ ID No：43、SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群的序列之多肽及相當於免疫球蛋白之Fc區域之區域且經工程化以具有藉由本發明之方法之任一者所產生之高效應功能的融合蛋白。在另一態樣中，本發明排除任何或所有該等經分離多肽。
在一態樣中，本發明係關於一種包含由本發明之方法之任一者所產生之重組性嵌合(例如人類化)抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在另一態樣中，本發明係關於一種包含由本發明之方法之任一者所產生之重組性嵌合(例如人類化)抗體片段及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在另一態樣中，本發明係關於一種包含由本發明之方法之任一者所產生之融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種靶向活體內或活體外表現EGFR之細胞的方法。在一實施例中，本發明係關於一種在受檢者中靶向表現EGFR之細胞的方法，其包含向受檢者投予包含本發明之ABM之組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種活體內或活體外偵測EGFR在試樣中之存在而(例如)用於診斷與EGFR表現有關之病症的方法。在一實施例中，藉由使視情況連同對照試樣一起之待測試試樣與本發明之ABM在允許形成ABM與EGFR之複合物的情況下進行接觸來完成偵測。隨後(例如藉由ELISA或其他在此項技術中已知之方法)偵測複合物形成。當將對照試樣與測試試樣一起使用時，當比較測試試樣與對照試樣時在形成ABM－EGFR複合物中任何統計上顯著之差異指示EGFR存在於測試試樣中。
本發明進一步係關於一種治療與EGFR表現有關之病症(尤其其中表現EGFR且更特定言之其中異常表現(例如過度表現)EGFR之細胞增生病症，包括膀胱、腦、頭部及頸部、胰腺、肺、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚及腎臟之癌症)的方法，其包含向需要其之人類受檢者投與治療有效量之由本發明之方法之任一者所產生的重組性嵌合(例如人類化)抗體或其片段。
除非另作定義，否則本文中如下所用術語係如通常此項技術中所用者。
如本文中所用，術語抗體意欲包括所有抗體分子，其包括單株、多株及多特異性(例如雙特異性)抗體以及具有Fc區域且保持結合特異性之抗體片段，及包括相當於免疫球蛋白之Fc區域之區域且保持結合特異性的融合蛋白。亦涵蓋保持結合特異性之抗體片段，其包括(但不限於)VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab')2 片段、scFv片段、Fv片段、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體(參見例如Hudson及Souriau,Nature Med.9：129－134(2003))。亦涵蓋人類化、靈長類化及嵌合抗體。
如本文中所用，術語Fc區域意欲係指IgG重鏈之C末端區域。儘管IgG重鏈之Fc區域之邊界可稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區域通常界定為自在位置Cys226上之胺基酸殘基延伸至羧基末端。
如本文中所用，術語相當於免疫球蛋白之Fc區域之區域意欲包括免疫球蛋白之Fc區域之天然存在對偶基因變異體以及具有產生取代、添加或缺失之變化但並未大體上降低免疫球蛋白對介導效應功能(諸如抗體依賴細胞毒性)之能力的變異體。舉例而言，可在大體上不損失生物學功能之情況下自免疫球蛋白之Fc區域之N末端或C末端中缺失一或多個胺基酸。可根據在此項技術中已知之一般規則選擇該等變異體以便具有最低活性效應。(參見例如Bowie,J.U.等人，Science 247：1306－1310(1990))。
如本文中所用，術語EGFR係指人類上皮生長因子受體(亦稱為HER－1或Erb－B1)(Ulrich,A.等人，Nature 309：418－425(1984)；SwissProt Accession #P00533；次級寄存編號：O00688、O00732、P06268、Q14225、Q92795、Q9BZS2、Q9GZX1、Q9H2C9、Q9H3C9、Q9UMD7、Q9UMD8、Q9UMG5)以及天然存在之同功異型物及其變異體。該等同功異型物及變異體包括(但不限於)EGFRvIII變異體、替代性拼接產物(例如藉由SwissProt寄存編號P00533－1、P00533－2、P00533－3、P00533－4所鑑別)、變異體GLN－98、ARG－266、Lys－521、ILE－674、GLY－962及PRO－988(Livingston,R.J.等人，NIEHS－SNPs,environmental genome project,NIEHS ES15478,Department of Genome Sciences,Seattle,WA(2004))及其他藉由以下寄存編號所鑑別之變異體：NM_005228.3、NM_201282.1、NM_201283.1、NM_201284.1(REFSEQ mRNA)；AF125253.1、AF277897.1、AF288738.1、AI217671.1、AK127817.1、AL598260.1、AU137334.1、AW163038.1、AW295229.1、BC057802.1、CB160831.1、K03193.1、U48722.1、U95089.1、X00588.1、X00663.1；H54484S1、H54484S3、H54484S2(MIPS組件)；DT.453606、DT.86855651、DT.95165593、DT.97822681、DT.95165600、DT.100752430、DT.91654361、DT.92034460、DT.92446349、DT.97784849、DT.101978019、DT.418647、DT.86842167、DT.91803457、DT.92446350、DT.95153003、DT.95254161、DT.97816654、DT.87014330、DT.87079224(DOTS組件)。
如本文中所用，術語EGFR配位體係指與EGFR結合且/或活化EGFR之多肽。該術語包括膜結合性前驅體形式之EGFR配位體以及經蛋白分解加工之可溶性形式之EGFR配位體。
如本文中所用，術語EGFR之配位體活化係指EGFR配位體結合所介導之信號傳導(例如藉由在EGFR或受質多肽中磷酸化酪胺酸殘基之EGFR受體之細胞內激酶域所造成的信號傳導)。
如本文中所用，術語以異常活化或產生EGFR或EGFR配位體為特徵之疾病或病症或與EGFR表現有關之病症係指可能或可能不涉及惡性疾病或癌症之病肽，其中異常活化且/或產生EGFR及/或EGFR配位體發生於患有或傾向於該疾病或病症之受檢者的細胞或組織中。
如本文中所用，術語過度表現當與表現EGFR之細胞聯合使用時係指與相同組織類型之正常細胞相比於其表面上具有可測定之較高水準之EGFR的細胞。該過度表現可由基因擴增或藉由經增加之轉錄或轉譯引起。可在診斷性或預後性檢定中藉由在以下此項技術中已知之技術來評估存在於細胞表面上或細胞溶解產物中之EGFR的水準而測定EGFR表現(及因此過度表現)：例如經由免疫組織化學檢定、免疫螢光檢定、免疫酶法檢定、ELISA、流式細胞量測術、放射免疫檢定、西方墨點法、配位體結合法、激酶活性法等(通常參見CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK,Celis,J.編，Academic Press(第2版，1998)；CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE,Coligan,J.E.等人編，John Wiley & Sons(1995－2003)；亦參見Sumitomo等人，Clin.Cancer Res.10：794－801(2004)(描述西方墨點法、流式細胞量測術及免疫組織化學法)，其全部內容以引入的方式併入本文中)。或者或另外，可(例如)經由螢光原位雜交、Southern印跡法或PCR技術量測在細胞中編碼EGFR之核酸分子的水準。將EGFR在正常細胞中之水準與受細胞增生病症(例如癌症)影響之細胞之水準相比較以便確定是否過度表現EGFR。
如本文中所用，術語抗原結合分子在其最廣泛意義上來說係指特異性結合抗原決定位之分子。抗原結合分子可為(例如)可與抗原決定位特異性結合之抗體或其片段。更特定言之，結合EGFR之抗原結合分子為與170 kDa之跨膜受體(通常命名為上皮生長因子受體(EGFR)且亦稱為HER－1或ErbB1)特異性結合之分子。"特異性結合"意謂對於抗原之結合具有選擇性且可自不當或非特異性相互作用中區分。
如本文中所用，術語融合及嵌合在涉及諸如ABM之多肽而使用時係指包含源自兩種或兩種以上異源多肽(諸如來自不同物種之抗體之諸部分)之胺基酸序列的多肽。對於嵌合ABM，(例如)非抗原結合組份可源自多種物種，包括諸如黑猩猩及人類之靈長類。嵌合ABM之恆定區最佳大體上與天然人類抗體之恆定區一致；嵌合抗體之可變區最佳大體上與具有鼠類可變區之胺基酸序列之重組性抗EGFR抗體的可變區一致。人類化抗體尤其為較佳形式之融合或嵌合抗體。
如本文中所用，具有GnTIII活性之多肽係指能催化N－乙醯葡萄胺糖(GlcNAc)殘基以β－1－4鍵添加至N－連接寡醣之三甘露糖核心之β－連接甘露糖苷上的多肽。其包括顯示如在存在或不存在劑量依賴性之情況下在特定生物學檢定中所量測之與β(1,4)－N－乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(亦稱為β－1,4－甘露糖基－醣蛋白4－β－N－乙醯胺基葡萄糖－轉移酶(EC 2.4.1.144)，根據生物化學及分子生物學國際聯合會之名詞委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(NC－IUBMB))之活性相似但未必相同之酶活性的融合多肽。在其中劑量依賴性存在之情況下，其不必與GnTIII之劑量依賴性相同，但實際上與GnTIII相比大體上與所給活性之劑量依賴性相似(亦即備選多肽將顯示相對於GnTIII之更大活性或至多約25倍更低活性且較佳至多約十倍更低活性且最佳至多約三倍更低活性)。
如本文中所用，術語變異體(或類似物)係指由於使用(例如)重組性DNA技術所造成之胺基酸插入、缺失及取代而不同於本發明之特別所述之多肽的多肽。本發明之ABM之變異體包括其中一個或若干個胺基酸殘基藉由以大體上並未影響抗原(例如EGFR)結合親和力之該方式進行取代、添加及/或缺失而得以改良的嵌合、靈長類化或人類化抗原結合分子。可藉由比較特定多肽之序列與同源肽之序列且使在高同源性之區域(保守區域)中所造成之胺基酸序列變化的數目最小化或藉由將胺基酸替換為一致序列而發現確定胺基酸殘基可替換、添加或缺失且不破壞所關注之活性的規則。
或者，編碼該等相同或相似多肽之重組性變異體可藉由使用遺傳密碼中之"冗餘"來合成或選擇。各種密碼子取代(諸如產生各種限制性位點之靜止變化)可經引入以優化選殖於質體或病毒載體中或表現於特定原核或真核系統中。聚核苷酸序列中之突變可反映於多肽或其他添加至多肽中以改良多肽之任何部分之特性的肽之域中以便改變諸如配位體結合親和力、鏈間親和力或降解/轉換率之特徵。
胺基酸"取代"可為(例如)將一胺基酸替換為另一具有相似結構及/或化學特性之胺基酸的結果，亦即保守胺基酸替換。"保守"胺基酸取代可在所涉及之殘基之極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩性性質相似的基礎上進行。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺；帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。"插入"或"缺失"較佳為約1與20個胺基酸、更佳1至10個胺基酸之範圍內。所允許之變化可以實驗方式藉由在多肽分子中使用重組性DNA技術系統地進行胺基酸之插入、缺失或取代且檢定所得重組性變異體之活性來確定。
如本文中所用，術語人類化用以係指源自非人類抗原結合分子(例如鼠類抗體)之抗原結合分子，其保持或大體上保持母體分子之抗原結合特性但在人類中具有更低免疫原性。其可藉由各種方法獲得，包括(a)移植全部非人類可變域於人類恆定區上以產生嵌合抗體，(b)在保留或不保留關鍵框架殘基(例如彼等對於保持良好抗原結合親和力或抗體功能重要之殘基)之情況下，僅移植非人類CDR於人類框架區及恆定區上，或(c)移植全部非人類可變域，但使用人類樣部分替換表面殘基來"遮掩"其。該等方法揭示於Jones等人，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,81：6851－6855(1984)；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44：65－92(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534－1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28：489－498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3)：169－217(1994)中，其所有全部以引入的方式併入本文中。在抗體之重鏈及輕鏈可變域之每一者中通常存在3個互補決定區或CDR(CDR1、CDR2及CDR3)，其在抗體之重鏈及輕鏈可變域之每一者中以4個框架亞區(亦即FR1、FR2、FR3及FR4)側接：FR1－CDR1－FR2－CDR2－FR3－CDR3－FR4。人類化抗體之討論可尤其見於美國專利第6,632,927號及經公開之美國申請案第2003/0175269號中，其中兩者皆以引入的方式全部併入本文中。在其他實例中，僅對於結合必需之CDR之殘基可轉移(例如"移植")於人類序列上以產生具有抗原特異性之完整可變區序列。
同樣，如本文中所用，術語靈長類化用以係指源自非靈長類抗原結合分子(例如鼠類抗體)之抗原結合分子，其保持或大體上保持母體分子之抗原結合特性但在靈長類中具有更低免疫原性。
在其中存在兩種或兩種以上在此項技術中所用且/或所接受之術語之定義的情況下，除非明確相反地說明，否則如本文中所用之術語之定義意欲包括所有該等含義。特定實例為使用術語"互補決定區"("CDR")來描述見於重鏈與輕鏈多肽之可變區中的非鄰接抗原組合位點。該特定區域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901－917(1987)描述，其以引入的方式併入本文中，其中該等定義包括當相互比較時胺基酸殘基之重疊或子集。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之定義的應用意欲處於如本文中所定義且使用之術語的範疇內。涵蓋如以上所引用之參考文獻之每一者所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡明於下表1中作為比較。包涵特定CDR之精確殘基數目將視CDR之序列及大小而變化。在給定抗體之可變區胺基酸序列的情況下，熟習此項技術者通常可決定何等殘基構成特定CDR。
Kabat等人亦定義可適用於任何抗體之可變域序列的編號系統。一般熟習此項技術者可在不依靠除序列本身以外之任何實驗數據的情況下對任何可變域序列明確指定該"Kabat編號"系統。如本文中所用，"Kabat編號"係指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所闡明之編號系統。除非另有說明，否則參考Kabat編號系統編號ABM中之特定胺基酸殘基位置。序列表之序列(亦即SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：147)並不根據Kabat編號系統進行編號。然而如上所述，一般熟習此項技術者最好基於對存在於其中之序列進行編號而確定序列表中之任何可變區序列的Kabat編號方案。
核酸或聚核苷酸具有與本發明之參考核苷酸序列至少(例如)95%"一致"之核苷酸序列，其意欲除聚核苷酸序列可包括每100個參考核苷酸序列之核苷酸至多5點突變以外，聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列的聚核苷酸，在參考序列中至多5%之核苷酸可經缺失或經另一核苷酸取代，或一定數目之核苷酸(在參考序列中之總核苷酸之至多5%)可得以插入參考序列中。
實際上，可通常使用已知電腦程式確定任何特定核酸分子或多肽是否與本發明之核苷酸序列或多肽序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6：237－245(1990)之演算法的FASTDB電腦程式來確定用於確定查詢序列(本發明之序列)與受檢序列之間的最佳總匹配的較佳方法(亦稱為全局序列比對)。在序列比對中，查詢序列及受檢序列皆為DNA序列。RNA序列可藉由將U轉化成T來進行比較。該全局序列比對之結果以一致性百分數計。適用於DNA序列之FASTDB比對以計算一致性百分數之較佳參數為：矩陣＝歸一化、k－元組＝4、錯配罰分＝1、連接罰分＝30、隨機組長度＝0、截斷得分＝1、空隙罰分＝5、間隙大小罰分＝0.05、窗口大小＝500或受檢核苷酸序列之長度(任一較短者)。
若受檢序列由於5'或3'刪除(非內部刪除)而比查詢序列更短，則必須對該等結果進行手動校正。此係因為FASTDB程式當計算一致性百分數時並未考慮受檢序列之5'及3'截斷。對於相對於查詢序列在5'或3'端截短之受檢序列，一致性百分數藉由計算查詢序列之鹼基數目作為查詢序列之總鹼基的百分數而得以校正，該等鹼基為受檢序列之5'及3'且並不匹配/對準。藉由FASTDB序列比對之結果來確定核苷酸是否匹配/對準。隨後將該百分數自一致性百分數中減去，由上述FASTDB程式使用所規定參數進行計算以得出最終一致性百分數得分。該經校正之得分用於本發明之目的。如由FASTDB對準所展示，僅在受檢序列之5'及3'鹼基外並不與查詢序列匹配/對準之鹼基經計算用於手動調整一致性百分數得分。
舉例而言，將90個鹼基之受檢序列與100個鹼基之查詢序列進行比對以確定一致性百分數。刪除發生在受檢序列之5'末端且因此FASTDB對準並未展示在5'末端之前10個鹼基之匹配/對準。10個未配對鹼基相當於10%之序列(在5'及3'末端之鹼基數目不匹配/查詢序列中之鹼基之總數目)，因此將10%自由FASTDB程式所計算之一致性百分數得分中減去。若剩餘90個鹼基完全匹配，則最終一致性百分數將為90%。在另一實例中，將90個鹼基之受檢序列與100個鹼基之查詢序列相比較。此時，該等刪除為內部刪除以便於受檢序列之5'或3'上不存在並不與查詢序列匹配/對準之鹼基。在該情況下，並不手動校正由FASTDB所計算之一致性百分數。再次，僅手動校正並不與查詢序列匹配/對準之受檢序列的鹼基5'及3'。為達到本發明之目的，不進行其他手動校正。
多肽具有與本發明之查詢胺基酸序列至少(例如)95%"一致"之胺基酸序列，其意欲除受檢多肽序列可包括每100個查詢胺基酸序列之胺基酸至多5個胺基酸改變以外，受檢多肽之胺基酸序列與查詢序列一致。換言之，為獲得具有與查詢胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列之多肽，在受檢序列中至多5%之胺基酸殘基可經插入、刪除或經另一胺基酸取代。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或彼等末端位置之間的任何地方，個別散布於參考序列中之殘基之間或在參考序列內之一或多個鄰接基團中。
實際上，可通常使用已知電腦程式確定任何特定多肽是否與參考多肽至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6：237－245(1990)之演算法的FASTDB電腦程式來確定用於確定查詢序列(本發明之序列)與受檢序列之間的最佳總匹配的較佳方法(亦稱為全局序列比對)。在序列比對中，查詢序列及受檢序列皆為核苷酸序列或皆為胺基酸序列。該全局序列比對之結果以一致性百分數計。適用於FASTDB胺基酸對準之較佳參數為：矩陣＝PAM 0、k－元組＝2、錯配罰分＝1、連接罰分＝20、隨機組長度＝0、截斷得分＝1、窗口大小＝序列長度、空隙罰分＝5、間隙大小罰分＝0.05、窗口大小＝500或受檢胺基酸序列之長度(任一較短者)。
若受檢序列由於N或C末端刪除(非內部刪除)而比查詢序列更短，則必須對該等結果進行手動校正。此係因為FASTDB程式當計算全局一致性百分數時並未考慮受檢序列之N及C末端截斷。對於相對於查詢序列在N及C末端截短之受檢序列，一致性百分數藉由計算查詢序列之殘基數目作為查詢序列之總鹼基的百分數而得以校正，該等殘基為受檢序列之N及C末端且並不與相應受檢殘基匹配/對準。藉由FASTDB序列比對之結果來確定殘基是否匹配/對準。隨後將該百分數自一致性百分數中減去，由上述FASTDB程式使用所規定參數進行計算以得出最終一致性百分數得分。該最終一致性百分數得分用於本發明之目的。僅考慮並不與查詢序列匹配/對準之受檢序列之N及C末端的殘基用於手動調整一致性百分數得分之目的。其僅為受檢序列之最遠N及C末端殘基外之查詢殘基位置。
舉例而言，將90個胺基酸殘基之受檢序列與100個殘基之查詢序列進行對準以確定一致性百分數。刪除發生在受檢序列之N末端且因此FASTDB對準並未展示在N末端之前10個殘基之匹配/對準。10個未配對殘基相當於10%之序列(在N及C末端之殘基數目不匹配/查詢序列中之殘基總數目)，因此將10%自由FASTDB程式所計算之一致性百分數得分中減去。若剩餘90個殘基完全匹配，則最終一致性百分數將為90%。在另一實例中，將90個殘基之受檢序列與100個殘基之查詢序列相比較。此時，該等刪除為內部刪除以便於受檢序列之N或C末端上不存在並不與查詢序列匹配/對準之殘基。在該情況下，並不手動校正由FASTDB所計算之一致性百分數。再次，僅對在受檢序列之N及C末端外如FASTDB對準中所展示且並不與查詢序列匹配/對準之殘基位置進行手動校正。為達到本發明之目的，不進行其他手動校正。
如本文中所用，與本發明之核酸序列"在嚴格條件下雜交"的核酸係指在42℃下在包含50%甲醯胺、5x SSC(750 mM NaCl、75 mM檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、5x Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖及20 μg/ml變性剪切鮭魚精液DNA之溶液中進行隔夜培育雜交，接著於0.1x SSC中在約65℃下洗滌濾紙而所得之聚核苷酸。
如本文中所用，術語高基體定位域係指造成錨定多肽於高基體複合體內之位置中之高基體內在多肽的胺基酸序列。通常，定位域包含酶之胺基末端"尾巴"。
如本文中所用，術語效應功能係指彼等可歸因於抗體之Fc區域(天然序列Fc區域或胺基酸序列變異體Fc區域)的生物學活性。抗體效應功能之實例包括(但不限於)Fc受體結合親和力、抗體依賴細胞毒性(ADCC)、抗體依賴細胞吞噬作用(ADCP)、細胞激素分泌、由呈遞抗原之細胞所產生之免疫複合物所介導的抗原吸收、細胞表面受體之調降等。
如本文中所用，術語工程化及糖基化工程化視為包括天然存在或重組性之多肽或其片段之糖基化模式的任何操作。糖基化工程化包括細胞之糖基化機構之代謝工程化，其包括寡醣合成途徑之遺傳操作以獲得表現於細胞中之醣蛋白之經改造糖基化。此外，糖基化工程化包括突變及細胞環境對糖基化之影響。在一實施例中，糖基化工程化為糖基轉移酶活性之變化。在一特定實施例中，工程化導致胺基葡萄糖轉移酶活性及/或岩藻糖基轉移酶活性改變。
如本文中所用，術語宿主細胞涵蓋任何種類之可經工程化以產生本發明之多肽及抗原結合分子的細胞系統。在一實施例中，該宿主細胞經工程化以允許產生具有改良糖型之抗原結合分子。在一較佳實施例中，該抗原結合分子為抗體、抗體片段或融合蛋白。在某些實施例中，進一步操作該宿主細胞以表現高水準之一或多種具有GnTIII活性的多肽。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、HEK293－EBNA細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉幾個例子)，以及包含於轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內之細胞。
如本文中所用，術語Fc所介導之細胞毒性包括抗體依賴細胞毒性及由含有人類Fc區域之可溶性Fc融合蛋白所介導之細胞毒性。其為由"人類免疫效應細胞"導致"抗體靶向細胞"溶胞之免疫機理，其中：人類免疫效應細胞為一群於其表面上展示Fc受體之白血球，藉此該等Fc受體與抗體或Fc融合蛋白之Fc區域結合且執行效應功能。該群體可包括(但不限於)末梢血液單核細胞(PBMC)及/或自然殺傷(NK)細胞。
抗體靶向細胞為與抗體或Fc融合蛋白結合之細胞。抗體或Fc融合蛋白與靶標細胞經由相對於Fc區域處於N末端之蛋白質部分而結合。
如本文中所用，術語Fc所介導之細胞毒性增加定義為在給定時間內在所給濃度之抗體或Fc融合蛋白下在包裹靶標細胞之培養基中藉由以上所定義之Fc所介導之細胞毒性的機制溶解之"抗體靶向細胞"的數目增加，及/或抗體或Fc融合蛋白在包裹靶標細胞之培養基中實現在給定時間內藉由Fc所介導之細胞毒性之機制溶胞所給數目之"抗體靶向細胞"所需要的濃度降低。Fc所介導之細胞毒性增加與由相同類型之宿主細胞使用熟習此項技術者已知之相同標準製造、純化、調配及儲存法所產生(但並不由經工程化以藉由本文中所述之方法表現糖基轉移酶GnTIII的宿主細胞產生)之相同抗體或Fc融合蛋白所介導的細胞毒性有關。
具有經增加之抗體依賴細胞毒性(ADCC)之抗體意謂(當該術語定義於本文中時)具有如由一般熟習此項技術者已知之任何適當方法所測定之經增加之ADCC的抗體。公認活體外ADCC檢定之一實例如下：1)該檢定使用已知表現由抗體之抗原結合區域所識別之靶標抗原的靶標細胞；2)該檢定使用自隨機所選正常供體之血液中分離之人類末梢血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞；3)該檢定根據以下方案實現：i)將PBMC使用標準密度離心程序分離且以5×106 細胞/毫升懸浮於RPMI細胞培養基中；ii)藉由標準組織培養法使該等靶標細胞生長，在具有高於90%之生存率的指數生長期收穫，於RPMI細胞培養基中洗滌，以100微居里之51Cr標記，以細胞培養基洗滌兩次且以105細胞/毫升之密度再懸浮於細胞培養基中；iii)將100微升之上述最終靶標細胞懸浮液轉移至96孔微量滴定盤之各孔中；iv)將該抗體於細胞培養基中自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/ml且將50微升之所得抗體溶液添加至96孔微量滴定盤中之靶標細胞中，一式三份測試各種涵蓋上述所有濃度範圍之抗體濃度；v)對於最大釋放(MR)對照，使含有經標記之靶標細胞之平板中的3個額外孔接受50微升之2%(V/V)非離子型清潔劑水溶液(Nonidet,Sigma,St.Louis)以代替抗體溶液(上述要點iv)；vi)對於自發性釋放(SR)對照，使含有經標記之靶標細胞之平板中的3個額外孔接受50微升之RPMI細胞培養基以代替抗體溶液(上述要點iv)；vii)隨後將96孔微量滴定盤在50 x g下離心1分鐘且在4℃下培育1小時；viii)將50微升之PBMC懸浮液(上述要點i)添加至各孔中以產生25：1之效應因子：靶標細胞比且將平板置於培養室中在5% CO2 氣氛下在37℃下歷時4小時；ix)收集來自各孔之不含細胞之上清液且使用γ粒子計數管定量實驗釋放放射能(ER)；x)對於各抗體濃度根據公式(ER－MR)/(MR－SR)×100計算特定溶胞之百分數，其中ER為該抗體濃度之定量平均放射能(參見上述要點ix)，MR為MR對照(參見上述要點v)之定量平均放射能(參見上述要點ix)，且SR為SR對照(參見上述要點vi)之定量平均放射能(參見上述要點ix)；4)"經增加之ADCC"定義為在以上所測試之抗體濃度範圍內所觀測之特定溶胞的最大百分數增加及/或需要實現在以上所測試之抗體濃度範圍內所觀測之特定溶胞的最大百分數之一半的抗體濃度降低。ADCC增加與由相同類型之宿主細胞使用熟習此項技術者已知之相同標準製造、純化、調配及儲存法所產生(但並不由經工程化以過度表現GnTIII的宿主細胞產生)之相同抗體所介導的(例如以上述檢定所量測)ADCC有關。
在一態樣中，本發明係關於具有天鼠ICR62單株抗體之結合特異性(亦即大體上與相同抗原決定基結合)的抗原結合分子且係關於其效應功能可藉由經改造之糖基化而得以增強的發現。在一實施例中，該抗原結合分子為嵌合抗體。在一較佳實施例中，本發明係關於一種包含SEQ ID NOs：53－108及/或SEQ ID NOs：122－127之任一者之CDR之一或多者(例如一、二、三、四、五或六者)的嵌合抗體或其片段。具體言之，在一較佳實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含：(a)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：122及SEQ ID NO：124；(b)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106及SEQ ID NO：126；及(c)SEQ ID NO：108。在另一較佳實施例中，本發明係關於一種經分離聚核苷酸，其包含(a)選自由SEQ ID NO：112及SEQ ID NO：114組成之群的序列；(b)選自由SEQ ID NO：116及SEQ ID NO：118組成之群的序列；及(c)SEQ ID NO：119。在一實施例中，該等聚核苷酸之任一者編碼融合多肽。在其他態樣中，本發明可排除任何或所有該等聚核苷酸序列。
在另一實施例中，抗原結合分子包含由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2編碼之大鼠ICR62抗體之VH 域或其變異體；及非鼠類多肽。在另一較佳實施例中，本發明係關於一種包含由SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44編碼之大鼠抗體之VL 域或其變異體及非鼠類多肽的抗原結合分子。在其他態樣中，本發明可排除任何或所有該等聚核苷酸序列。
在另一態樣中，本發明係關於包含ICR62之一或多個(例如一、二、三、四、五或六個)截短或變異體CDR的抗原結合分子。該等截短或變異體CDR將至少含有所給CDR之特異性決定胺基酸殘基。"特異性決定殘基"意謂彼等直接涉及與抗原之相互作用的殘基。通常，僅約所給CDR中之殘基之五分之一至三分之一參與抗原之結合。特定CDR中之特異性決定殘基可藉由(例如)根據描述於Padlan等人，FASEB J.9(1)：133－139(1995)中之方法計量來自三維模型之原子間接觸且測定所給殘基位置上之序列變異性來鑑別，該文獻內容據此以引入的方式全部併入本文中。因此，如本文中所提及之本發明之抗原結合分子(ABM)亦意欲包涵包含(例如)包含一或多個特異性決定殘基之截短及/或變異體CDR或與參考CDR(例如大鼠ICR62 CDR)相比在CDR內之一或多個位置上包含取代的ABM。
因此，本發明亦係關於一種經分離聚核苷酸，其包含大鼠ICR62抗體的至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個或六個)互補決定區，或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截短形式，其中該經分離聚核苷酸編碼融合多肽。該等經分離聚核苷酸較佳編碼屬於抗原結合分子之融合多肽。在一實施例中，該聚核苷酸包含大鼠ICR62抗體的三個互補決定區，或其至少含有對於該等三個互補決定區之每一者的特異性決定殘基之變異體或截短形式。在一實施例中，該聚核苷酸包含下表2至5中所闡明之CDR之至少一者。在另一實施例中，該聚核苷酸編碼嵌合(例如人類化)抗體之輕鏈或重鏈之整個可變區。本發明進一步係關於由該等聚核苷酸編碼之多肽。
在另一實施例中，本發明係關於一種抗原結合分子，其包含大鼠ICR62抗體的至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個或六個)互補決定區，或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基(SDR)之變異體或截短形式，且包含源自異源多肽之序列。在一實施例中，該抗原結合分子包含大鼠ICR62抗體的三個互補決定區，或其至少含有對於該等三個互補決定區之每一者的特異性決定殘基之變異體或截短形式。在一實施例中，該抗原結合分子包含下表2至5中所闡明之CDR之至少一者。在其他態樣中，本發明可排除任何或所有下表2至5中所闡明之CDR序列。
在一實施例中，該抗原結合分子包含ICR62抗體之CDR之SDR的至少一者。在一實施例中，本發明之ABM之該或該等CDR在一或多個胺基酸位置上包含取代且該ABM與未經取代之ABM相比保持結合活性。可如本文所述且由在此項技術中常規且熟知之方法量測結合活性。在一些實施例中，結合經取代之ABM之EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約10倍至約0.001倍。在特定實施例中，EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約10至約1倍、約10至約5倍、約5至約0.1倍、約5至約2倍及約3至約1倍。在特定實施例中，經取代之抗體之EC50濃度與未經取代之ABM相比經調節低於約10倍、約9倍、約8倍、約7倍、約6倍、約5倍、約4倍、約3倍、約2倍、約1倍、約0.05倍、約0.25倍、約0.1倍、約0.005倍、約0.025倍及約0.001倍。在一特定實施例中，EC50濃度經調節低於約10倍。在其他實施例中，EC50係數經調節為約10倍、約9倍、約8倍、約7倍、約6倍、約5倍、約4倍、約3倍、約2倍、約1倍、約0.05倍、約0.25倍、約0.1倍、約0.005倍、約0.025倍及約0.001倍。在一些實施例中，該調節為EC50降低。在其他實施例中，該調節為EC50增加。
本發明之ABM之CDR可在任何殘基上包含取代(根據如本文中所定義或在此項技術中已知之Chothia或Kabat或任何其他CDR定義)。在一實施例中，該等CDR在除一或多個特異性決定殘基外之任何或所有位置上包含取代。在一特定實施例中，該等CDR在除特異性決定殘基外之所有位置上包含取代。在一實施例中，本發明之重鏈CDR在Kabat位置27、28、29、30、31、23、33、34、35、52、52a、53、54、55、57、58、58、60、61、62、63、64、65、94、96、97、98、99、100、100a、101、102或其任何組合之一或多者上包含取代。在另一實施例中，該(等)CDR在Chothia重鏈CDR1之Kabat位置27、28或29、Kabat重鏈CDR1之位置31、Kabat重鏈CDR2之Kabat位置52、52a、53或57或Kabat重鏈CDR3之Kabat位置102之一或多者上包含取代。
在一實施例中，該等輕鏈CDR包含在Kabat位置24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、51、52、53、54、55、56、89、90、91、92、93、94、95、96、97或其任何組合之一或多者上包含一或多個胺基酸取代。在另一實施例中，該(等)CDR在Kabat輕鏈CDR1之Kabat位置30或32、Kabat輕鏈CDR2之Kabat位置51、52、53或56、或Kabat重鏈CDR3之Kabat位置94之一或多者上包含取代。
在另一態樣中，本發明之ABM包含大鼠ICR62抗體之至少一個互補決定區之至少一個特異性決定殘基。在一些實施例中，該ABM包含重鏈CDR之特異性決定殘基。在更特定實施例中，該重鏈特異性決定殘基係選自由Kabat位置29上之苯丙胺酸、Kabat位置52上之天冬醯胺酸、Kabat位置56上之酪胺酸及Kabat位置100b上之纈胺酸組成之群。在一特定實施例中，該特異性決定殘基為Kabat位置56上之酪胺酸及Kabat位置100b上之纈胺酸。在另一特定實施例中，該等特異性決定殘基為Kabat位置29上之苯丙胺酸、Kabat位置52上之天冬醯胺酸、Kabat位置56上之酪胺酸及Kabat位置100b上之纈胺酸。在其他實施例中，該等特異性決定殘基處於輕鏈互補決定區中。在更特定實施例中，該輕鏈特異性決定殘基係選自由Kabat位置34上之天冬醯胺酸及Kabat位置50上之天冬醯胺酸組成之群。在一特定實施例中，該特異性決定殘基為Kabat位置34上之天冬醯胺酸。在另一特定實施例中，該特異性決定殘基為Kabat位置50上之天冬醯胺酸。在另一特定實施例中，該等特異性決定殘基為Kabat位置34上之天冬醯胺酸及Kabat位置50上之天冬醯胺酸。
在另一態樣中，該抗原結合分子包含抗體輕鏈或重鏈之可變區。在一尤其有用之實施例中，該抗原結合分子為嵌合(例如人類化)抗體。本發明亦係關於製造該等抗原結合分子之方法及其在治療尤其其中表現EGFR(尤其其中與相同細胞類型之正常組織相比異常表現(例如過度表現)EGFR)之細胞增生病症之疾病中的用途。該等病症包括(但不限於)膀胱、腦、頭部及頸部、胰腺、肺、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚及腎臟之癌症。EGFR表現量可由在此項技術中已知之方法及彼等本文中所述之方法(例如經由免疫組織化學檢定、免疫螢光檢定、免疫酶法檢定、ELISA、流式細胞量測術、放射免疫檢定、西方墨點法、配位體結合法、激酶活性法等)來測定。
本發明亦係關於一種靶向表現EGFR之活體內或活體外細胞之方法。可靶向表現EGFR之細胞而用於治療目的(例如用以治療可藉由(例如藉由阻斷配位體結合或藉由靶向表現EGFR之細胞而破壞免疫系統)使EGFR所介導之信號傳導中斷而治療之病症)。在一實施例中，本發明係關於一種在受檢者中靶向表現EGFR之細胞的方法，其包含向受檢者投予包含本發明之ABM之組合物。亦可靶向表現EGFR之細胞而用於診斷目的(例如用以確定其是否正常或異常表現EGFR)。由此，本發明亦係關於偵測EGFR或表現EGFR之細胞於活體內或活體外之存在的方法。一根據本發明偵測EGFR表現之方法包含在允許形成ABM與EGFR之間的複合物之情況下使待測試試樣視情況連同對照試樣一起與本發明之ABM接觸。隨後(例如藉由ELISA或其他在此項技術中已知之方法)偵測複合物形成。當將對照試樣與測試試樣一起使用時，當比較測試試樣與對照試樣時在形成ABM－EGFR複合物中任何統計上顯著之差異指示EGFR存在於測試試樣中。
應瞭解，若干機制與抗EGFR抗體之治療效能有關，其包括阻斷與EGFR結合之配位體(例如EGF、TGF－α等)及隨後活化信號傳導途徑、抗體依賴細胞毒性(ADCC)及誘導生長停止或最後分化。
大鼠單株抗體ICR62(IgG2b)論述於PCT公開案第WO 95/20045號中，其以引入的方式全部併入本文中。其係關於EGFR之C抗原決定基且展示抑制配位體結合、抑制表現EGFR之鱗狀細胞癌之活體外生長且誘導無胸腺小鼠中之腫瘤之異種移植退化(WO 95/20045；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。作為完全齧齒動物抗體，即使按照單次劑量向人類投與ICR62大鼠單株抗體亦導致某些患者之HARA反應。(WO 95/20045；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。
已描述嵌合小鼠/人類抗體。參見例如Morrison,S.L.等人，PNAS 11：6851－6854(1984年11月)；歐洲專利公開案第173494號；Boulianna, G.L等人，Nature 312：642(1984年12月)；Neubeiger,M.S.等人，Nature 314：268(1985年3月)；歐洲專利公開案第125023號；Tan等人，J.Immunol. 135：8564(1985年11月)；Sun,L.K等人，Hybridoma 5(1)：517(1986)；Sahagan等人，J.Immunol. 137：1066－1074(1986)。通常參見Muron,Nature 312：597(1984年12月)；Dickson,Genetic Engineering News 5(3)(1985年3月)；Marx,Science 229：455(1985年8月)；及Morrison,Science 229：1202－1207(1985年9月)。IMC－C225(Erbitux,Imclone)為針對EGFR且具有小鼠可變區及人類恆定區之嵌合單株抗體(參見Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。IMC－225之鼠類部分源自於M225，發現其在過度表現EGFR之腫瘤細胞株中結合EGFR且抑制EGF誘導型酪胺酸激酶依賴磷酸化以及誘導細胞凋亡(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。然而，在I期臨床試驗中M225引發以抗體治療之患者的HAMA反應(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。已在活體內及活體外測試IMC－225且在大量腫瘤類型(包括彼等與不良預後相關聯之腫瘤類型)中與放射治療及化療法組合使用(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。然而，在臨床試驗中投與IMC－225抗體之患者中IMC－225與諸如過敏性及皮膚反應之毒性相關聯(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。
在一尤其較佳實施例中，本發明之嵌合ABM為人類化抗體。在此項技術中已知使非人類抗體人類化之方法。舉例而言，本發明之人類化ABM可根據美國專利第5,225,539號(Winter)、美國專利第6,180,370號(Queen等人)、美國專利第6,632,927號(Adair等人)或美國專利申請公開案第2003/0039649號(Foote)之方法製備，其每一者之全部內容以引入的方式併入本文中。人類化抗體較佳具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為"引入"殘基，其通常取自"引入"可變域。可基本上按照Winter及同事之方法(Jones等人，Nature,321：522－525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323－327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534－1536(1988))藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行人類化。因此，該等"人類化"抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中大體上少於完整人類可變域之可變域經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為人類抗體，其中某些高變區殘基及可能之某些FR殘基經來自齧齒動物抗體中之類似位點之殘基取代。受檢人類化抗EGFR抗體將包含人免疫球蛋白之恆定區。
欲用於製造人類化抗體之人類可變域之備選者(輕鏈與重鏈)對降低抗原性極其重要。根據所謂"最佳擬合"法，相對於整個已知人類可變域序列庫篩選齧齒動物抗體之可變域序列。隨後將最接近齧齒動物之序列的人類序列當作人類化抗體之人類構架區(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196：901(1987))。選擇人類構架序列之另一方法為將完整醫齒動物構架之各單個亞區(亦即FR1、FR2、FR3及FR4)或單個亞區之某些組合(例如FR1與FR2)與對應於該構架亞區(例如如由Kabat編號所確定)之已知人類可變區序列庫進行比較且選擇對於各亞區或組合最接近齧齒動物之序列的人類序列(Leung，美國專利申請公開案第2003/0040606A1號，2003年2月27日公開)(其全部內容據此以引入的方式併入本文中)。另一方法使用源自輕鏈或重鏈之特定亞基之所有人類抗體之一致序列的特定構架區。相同構架可用於若干不同人類化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))(其每一者之全部內容以引入的方式併入本文中)。
更重要的係，使抗體人類化且保留對抗原之高親和力及其他有利生物特性。為實現該目標，根據一較佳方法，人類化抗體藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種設想之人類化產物的方法來製備。可使用為熟習此項技術者所熟知之電腦程式產生三維免疫球蛋白模型(例如InsightII,Accelrys,Inc.(前MSI)或在http：//swissmodel.expasy.org上)。該等電腦程式可說明且展示所選備選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構。對該等展示之檢視使分析殘基在備選免疫球蛋白序列中之可能作用(亦即分析影響備選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基)成為可能。以此方式，FR殘基可選自受體及引入序列且與受體及引入序列組合以便獲得所需抗體特徵，諸如對靶標抗原之親和力增加。一般而言，高變區殘基直接且極大體上涉及影響抗原結合。
在一實施例中，本發明之抗體包含人類Fc區域。在一特定實施例中，人類恆定區為如SEQ ID NOs 109及110中所闡明之IgG1，且闡明如下：IgG1核苷酸序列(SEQ ID NO：110)ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
IgG1胺基酸序列(SEQ ID NO：109)TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
然而，本發明亦涵蓋人類Fc區域之變異體及同功異型物。舉例而言，適用於本發明之變異體Fc區域可根據美國專利第6,737,056號(Presta)(歸因於一或多個胺基酸改良而具有經改造之效應功能的Fc區域變異體)；或美國專利申請案第60/439,498號、第60/456,041號、第60/514,549號或第WO 2004/063351號(歸因於胺基酸改良而具有經增加之結合親和力的變異體Fc區域)；或美國專利申請案第10/672,280號或第WO 2004/099249號(歸因於胺基酸改良而具有對FcγR之經改造之結合性的Fc變異體)中所教示之方法產生，其每一者之內容全部以引入的方式併入本文中。
在另一實施例中，根據(例如)美國專利申請公開案第2004/0132066號(Balint等人)中所揭示之方法使本發明之抗原結合分子工程化而具有經增強之結合親和力，其全部內容據此以引入的方式併入本文中。
在一實施例中，本發明之抗原結合分子與諸如放射性標記或毒素之附加部分結合。該等經結合之ABM可藉由許多在此項技術中所熟知之方法產生。
多種放射性核種適用於本發明且相信熟習此項技術者具有易於決定在不同情況下何種放射性核種為最適當之能力。舉例而言，131 碘為熟知用於靶向免疫療法之放射性核種。然而，131 碘之臨床適用性可受限於若干因素，其包括：8天之物理半衰期；於血液中與腫瘤部位上之碘化抗體之脫鹵作用；及可對於腫瘤中之區域化劑量沈積為次最佳的發射特性(例如大量γ組份)。隨著優良螯合劑的出現，將金屬螯合基連接於蛋白質之可能使使用諸如111 銦及90 釔之其他放射性核種的可能增加。90 釔提供若干用於放射免疫治療應用中之益處：90 釔之64小時半衰期係足夠長而允許藉由腫瘤進行抗體積累且不同於(例如)131碘，90 釔在100至1000個細胞直徑之組織的範圍內為高能量之純β發射體且在其衰減時無伴隨性γ輻射。此外，最小量之穿透性輻射允許對門診患者投與經90釔標記之抗體。另外，經標記之抗體之內化作用並非細胞致死所必需且電離輻射之局部發射對於缺少靶標抗原之鄰近腫瘤細胞將係致命的。
經90 釔標記之抗EGFR抗體之有效單次治療劑量(亦即治療有效量)為約5與約75 mCi之間、更佳約10與約40 mCi之間的範圍內。經131 碘標記之抗EGFR抗體之有效單次治療非骨髓去除劑量為約5與約70 mCi之間、更佳約5與約40 mCi之間的範圍內。經131 碘標記之抗EGFR抗體之有效單次治療去除劑量(亦即可能需要自體骨髓移植)為約30與約600 mCi之間、更佳約50與低於約500 mCi之間的範圍內。當與嵌合抗EGFR抗體結合使用時，由於相對於鼠類抗體之較長循環半衰期，故經131 碘標記之嵌合抗EGFR抗體之有效單次治療非骨髓去除劑量為約5與約40 mCi之間、更佳低於約30 mCi的範圍內。例如111 銦標記之成像標準通常低於約5 mCi。
對於經放射性標記之抗EGFR抗體，亦可使用單次療法或使用多次療法進行治療。由於放射性核種組份之存在，故較佳在治療之前，"收集"有輻射造成可能致命骨髓毒性之患者的周圍幹細胞("PSC")或骨髓("BM")。使用標準技術收集BM及/或PSC，隨後淨化且冷凍而用於可能的回輸。另外，最佳在治療之前對患者使用診斷性標記抗體(例如使用111 銦)進行診斷性劑量測定試驗，其目的在於確保治療性標記抗體(例如使用90 釔)不會不必要地「集中」於任何正常器官或組織中。
在一個較佳實施例中，本發明係關於一種分離之聚核苷酸，其包含一個序列編碼具有下表7中之胺基酸序列之多肽。在一個較佳實施例中，本發明係關於一種分離的聚核苷酸包含一個下表6中所示之序列。本發明進一步係關於一種分離之核酸包含一個序列與下表6中所示之一個核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在其他態樣中，本發明可排除表6中之任何核苷酸序列。在另一個實施例中，本發明係關於一種分離之核酸，其包含一個序列編碼一個多肽具有與表7中之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。本發明亦涵蓋一種分離之核酸，其包含一個序列編碼一個多肽具有表7中有保守胺基酸取代之任何構築體之胺基酸序列。本發明亦涵蓋一種分離之多肽包含表7之任何構築體之胺基酸序列。本發明亦涵蓋一種分離之多肽包含與表7中之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。本發明亦涵蓋一種分離之多肽包含一個表7中具有保守胺基酸取代之任何構築體之胺基酸序列。在其他態樣中，本發明可排除表7中之任何胺基酸序列。
本發明亦涵蓋一種包含包括與輕鏈可變區成對之EGFR特異性CDR之嵌合(例如人類化)重鏈可變區的抗原結合分子，其中輕鏈可變區具有低於10個非人類胺基酸殘基。在其他實施例中，該輕鏈可變區具有低於9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個非人類胺基酸殘基。在較佳實施例中，該輕鏈可變區具有低於2個或低於1個(亦即無)非人類胺基酸殘基。在一實施例中，該輕鏈可變區包含一或多個人類生殖系可變區基因序列。編碼輕鏈可變區之人類生殖系可變區基因序列為在此項技術中已知且可見於(例如)http：//imgt.cines.fr/home.html上可獲得之IMGT資料庫中。在一較佳實施例中，該人類生殖系序列源自於VK1－_6生殖系序列。在其他實施例中，人類生殖系輕鏈可變區胺基酸序列中之胺基酸殘基可經一或多個來自另一人類生殖系輕鏈可變區序列之殘基取代。
在一實施例中，本發明係關於一種包含選自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121組成之群之序列及包含由一或多個人類生殖系可變域基因序列編碼之多肽之輕鏈的抗原結合分子。在一較佳實施例中，該人類生殖系序列源自於VK1_6生殖系序列。
在另一實施例中，本發明係關於一種抗原結合分子，其包含：(a)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：122及SEQ ID NO：124；(b)選自由以下序列組成之群的序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106及SEQ ID NO：126；及(c)SEQ ID NO：108；及(d)包含由一或多個人類生殖系基因序列編碼之人類輕鏈可變區的多肽。在一特定實施例中，該人類生殖系序列源自於VK1_6生殖系序列。在另一實施例中，該人類生殖系可變區基因序列包含以來自不同人類生殖系輕鏈可變區基因序列之序列取代一或多個胺基酸密碼子的VK1_6生殖系基因序列。
在其他實施例中，本發明之抗原結合分子包含本發明之EGFR特異性重鏈可變區及SEQ ID NO：45之變異體。在一實施例中，SEQ ID NO：45之變異體包含在互補決定區(CDR)中之一或多個位置上的胺基酸取代。在特定實施例中，選自由以下位置組成之群之位置上的胺基酸殘基發生取代：SEQ ID NO：45之胺基酸位置30、SEQ ID NO：45之胺基酸位置32、SEQ ID NO：45之胺基酸位置34、SEQ ID NO：45之胺基酸位置50、SEQ ID NO：45之胺基酸位置51、SEQ ID NO：45之胺基酸位置52、SEQ ID NO：45之胺基酸位置53、SEQ ID NO：45之胺基酸位置56、SEQ ID NO：45之胺基酸位置94及其任何取代組合。在更特定實施例中，SEQ ID NO：45中之取代係選自由以下取代組成之群：在SEQ ID NO：45之位置30上精胺酸(R)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置32上色胺酸(W)取代酪胺酸(Y)；在SEQ ID NO：45之位置34上甘胺酸(G)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置50上蘇胺酸(T)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置51上丙胺酸(A)取代蘇胺酸(T)；在SEQ ID NO：45之位置52上絲胺酸(S)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置53上絲胺酸(S)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置56上絲胺酸(S)取代蘇胺酸(T)；在SEQ ID NO：之位置94上酪胺酸(Y)取代苯丙胺酸(F)；及其任何組合。在一特定實施例中，SEQ ID NO：45中之胺基酸殘基之所有該等取代併入單個輕鏈變異體中。在較佳實施例中，包含具有對於ICR62 CDR之胺基酸取代之輕鏈變異體的抗原結合分子當輕鏈變異體與包含本發明之重鏈可變區之多肽成對時(與包含包括SEQ ID NO：45之序列之輕鏈可變區的抗原結合分子相比)保持與EGFR之特異結合性。本發明亦係關於編碼任何上述多肽及/或抗原結合分子之聚核苷酸及包含該等聚核苷酸及/或多肽之宿主細胞及/或載體。本發明進一步係關於如上所述具有醫藥學上可接受之載劑的抗原結合分子。
本發明亦涵蓋一種包含包括EGFR特異性CDR之人類重鏈可變區的抗原結合分子，其中該重鏈可變區具有低於10個非人類胺基酸殘基且其中該抗原結合分子特異性結合EGFR。在其他實施例中，該重鏈可變區具有低於9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個非人類胺基酸殘基。在較佳實施例中，該輕鏈可變區具有低於5個非人類胺基酸殘基。在一實施例中，該重鏈可變區包含一或多個人類生殖系可變區基因序列。編碼重鏈可變區之人類生殖系可變區基因序列為在此項技術中已知且可見於(例如)http：//imgt.cines.fr/home.html上可獲得之IMGT資料庫中。在一實施例中，該人類生殖系序列源自於VH1_10生殖系序列。在其他實施例中，人類生殖系重鏈可變區胺基酸序列中之胺基酸殘基可經一或多個來自另一人類生殖系重鏈可變區序列之殘基取代。在較佳實施例中，包含具有對於ICR62重鏈CDR之胺基酸取代之重鏈變異體的抗原結合分子當重鏈變異體與包含與EGFR結合之輕鏈可變區(例如本發明之輕鏈可變區)之多肽成對時保持與EGFR之特異結合性。本發明亦係關於編碼任何上述多肽及/或抗原結合分子之聚核苷酸及包含該等聚核苷酸及/或多肽之宿主細胞及/或載體。本發明進一步係關於如上所述具有醫藥學上可接受之載劑的抗原結合分子。
在另一實施例中，本發明係關於一種包含一或多個本發明之經分離聚核苷酸的表現載體及/或宿主細胞。
通常，任何類型之培養細胞株皆可用於表現本發明之ABM。在一較佳實施例中，將HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞用作基礎細胞株以產生本發明之工程化宿主細胞。
本發明之ABM之治療效能可藉由在進一步表現編碼具有GnTIII活性之多肽之聚核苷酸的宿主細胞中產生其來加以增強。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含高基體內在多肽之高基體定位域的融合多肽。在另一較佳實施例中，於表現編碼具有GnTIII活性之多肽之聚核苷酸的宿主細胞中表現本發明之ABM產生具有經增加之Fc受體結合親和力及經增加之效應功能的ABM。因此，在一實施例中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含(a)包含編碼具有GnTIII活性之多肽之序列的經分離核酸；及(b)編碼本發明之ABM之經分離聚核苷酸，諸如結合人類EGFR之嵌合、靈長類化或人類化抗體。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含GnTIII之催化域的融合多肽且高基體定位域為甘露糖苷酶II之定位域。產生該等融合多肽且使用具產生具有經增加之效應功能之抗體的方法揭示於美國臨時專利申請案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817 A1號中，其每一者之全部內容明確以引入的方式併入本文中。在另一較佳實施例中，嵌合ABM為具有大鼠ICR62抗體之結合特異性的嵌合抗體或其片段。在一尤其較佳實施例中，該嵌合抗體包含人類Fc。在另一較佳實施例中，該抗體為靈長類化或人類化的。
在一實施例中，一或多個編碼本發明之ABM之聚核苷酸可在組成性啟動子或調節型表現系統之控制下表現。適當調節型表現系統包括(但不限於)四環素調節型表現系統、蛻皮激素誘導型表現系統、乳糖開關表現系統、糖皮質激素誘導型表現系統、溫度誘導型啟動子系統及金屬硫蛋白金屬誘導型表現系統。若宿主細胞系統內包含多個編碼本發明之ABM之不同核酸，則其某些可在組成性啟動子之控制下表現，而其他在調節型啟動子之控制下表現。最大表現量視為對細胞生長率並不具有明顯反效應之穩定多肽表現之最高可能的水準且將使用常規實驗測定。由通常在此項技術中已知之方法來測定表現量，包括使用對ABM特異之抗體或對與ABM融合之肽標記特異之抗體的西方墨點分析及北方墨點分析。在另一替代實施例中，聚核苷酸可在運作上與報導體基因相關；藉由量測與報導體基因之表現量相關之信號來測定具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合(例如人類化)ABM的表現量。報導體基因可與編碼該融合多肽之核酸一起轉錄成單個mRNA分子；其相應編碼序列可由內部核糖體入口位點(IRES)或由帽子非依賴性轉譯增強子(CITE)連接。報導體基因可與至少一個編碼具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合(例如人類化)ABM的核酸一起轉譯使得形成單個多肽鏈。編碼本發明之ABM之核酸可在單個啟動子之控制下在運作上與報導體基因有關，使得編碼融合多肽之核酸及報導體基因轉錄成或者剪接成兩個獨立信息RNA(mRNA)分子之RNA分子；所得mRNA之一者轉譯成該報導體蛋白且另一者轉譯成該融合多肽。
熟習此項技術者所熟知之方法可用於構建含有具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之ABM之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。該等方法包括活體外重組性DNA技術、合成技術及活體內重組/遺傳重組。參見例如該等描述於Maniatis等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中之技術。
多種宿主表現載體系統可用於表現本發明之ABM之編碼序列。哺乳動物細胞較佳用作經含有所關注之蛋白質之編碼序列及融合多肽之編碼序列之重組性質體DNA或黏質體DNA表現載體轉染的宿主細胞系統。最佳將HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞用作宿主細胞系統。表現系統及選擇法之某些實例描述於以下參考文獻及其中之參考文獻中：Borth等人，Biotechnol Bioen.71(4)：266－73(2000－2001)；Werner等人，Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8)：870－80(1998)；Andersen及Krummen,Curr.Op.Biotechnol.13：117－123(2002)；Chadd及Chamow,Curr.Op.Biotechnol.12：188－194(2001)及Giddings,Curr.Op.Biotechnol.12：450－454(2001)。在替代性實施例中，可使用其他真核宿主細胞系統，包括經含有本發明之ABM之編碼序列之重組性酵母表現載體轉型的酵母細胞，諸如於美國專利申請案第60/344,169號及第WO 03/056914號(於非人類真核宿主細胞中產生人類樣醣蛋白之方法)(其每一者之內容以引入的方式全部併入本文中)中所教示之表現系統；經含有具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合ABM的編碼序列之重組性病毒表現載體(例如桿狀病毒)轉染的昆蟲細胞系統；經含有本發明之ABM之編碼序列的重組性病毒表現載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉染或經含有本發明之ABM之編碼序列的重組性質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統，其包括(但不限於)於美國專利第6,815,184號(由遺傳工程化浮萍表現且分泌生物學活性多肽之方法)中所教示之表現系統；WO 2004/057002(在苔蘚植物細胞中藉由引入轉糖基酶基因而產生糖基化蛋白之方法)及WO 2004/024927(在苔蘚原生質體中產生細胞外異源非植物蛋白之方法)；及美國專利申請案第60/365,769號、第60/368,047號及第WO 2003/078614號(在包含功能性哺乳動物GnTIII酶之轉殖基因植物中之醣蛋白加工)(其每一者之內容以引入的方式全部併入本文中)；或經包括經工程化以含有多複本之DNA之細胞株之重組性病毒表現載體(例如腺病毒、痘瘡病毒)轉染的動物細胞系統，該DNA編碼具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合ABM且在雙微體(例如鼠類細胞株)中穩定擴增(CHO/dhfr)或不穩定擴增。在一實施例中，包含該(等)編碼本發明之ABM之聚核苷酸的載體具有多順反子性。又，在一實施例中，上述所討論之ABM為抗體或其片段。在一較佳實施例中，該ABM為人類化抗體。
對於本發明之方法，穩定表現通常優於瞬變表現，由此其通常獲得更多可重現之結果且亦更能經受大規模生產。宿主細胞可經受適當表現控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多聚腺嘌呤位點等)控制之相應編碼核酸及可選擇性標記轉型，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。繼引入外源DNA之後，可使工程化細胞於增殖培養基中生長1－2天且隨後轉入選擇性培養基中。重組性質體中之可選擇性標記對選擇賦予抵抗且允許選擇使質體穩定整合入其染色體中且生長以形成又可選殖且擴增成細胞株之變異區的細胞。
可使用許多選擇系統，包括(但不限於)疱疹單純型病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11：223(1977))基因、次黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026(1962))基因及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人，Cell 22：817(1980))基因，該等基因可分別用於tk細胞、hgprt細胞或aprt細胞。亦可使用抗代謝物抗性作為選擇以下各基因之基準：賦予對甲胺喋呤之抗性的dhfr基因(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567(1989)；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；賦予對黴酚酸之抗性的gpt基因(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；賦予對胺基糖苷G－418之抗性的neo基因(Colberre－Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981))；及賦予對勻黴素之抗性的hygro基因(Santerre等人，Gene 30：147(1984))。近來，已描述其他可選擇性基因，亦即允許細胞使用吲哚代替色胺酸之trpB；允許細胞使用組胺醇代替組胺酸之hisD(Hartman & Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047(1988))；麩醯胺合成酶系統；及賦予對鳥胺酸脫羧酶抑制劑(2－(二氟甲基)－DL－鳥胺酸，DFMO)之抗性的ODC(鳥胺酸脫羧酶)(McConlogue,Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory編(1987))。
本發明進一步係關於一種改良由宿主細胞產生之本發明之ABM之糖基化圖譜的方法，其包含於該宿主細胞中表現編碼本發明之ABM之核酸及編碼具有GnTIII活性之多肽之核酸或包含該等核酸之載體。經改良之多肽較佳為包含Fc區域之IgG或其片段。在一尤其較佳實施例中，該ABM為人類化抗體或其片段。在另一實施例中，該方法進一步包含於宿主細胞中表現編碼具有第二糖基轉移酶活性之多肽的核酸。在一特定實施例中，第二糖基轉移酶活性為甘露糖苷酶II(ManII)。
由本發明之宿主細胞產生之經改良的ABM顯示由於改良而引起之Fc受體結合親和力增加及/或效應功能增加。在一尤其較佳實施例中，該ABM為含有Fc區域之人類化抗體或其片段。Fc受體結合親和力增加較佳為對Fcγ活化受體(諸如FcγRIIIa受體)之結合性增加。效應功能增加較佳為以下各效應功能之一或多者增加：抗體依賴細胞毒性增加、抗體依賴細胞吞噬作用(ADCP)增加、細胞激素分泌增加、表現抗原之細胞之免疫複合物所介導的抗原吸收增加、Fc所介導之細胞毒性增加、與NK細胞之結合性增加、與巨噬細胞之結合性增加、與多形核細胞(PMN)之結合性增加、與單核細胞之結合性增加、靶標－結合抗體之交聯增加、誘導細胞凋亡之直接信號傳導增加、樹突狀細胞成熟增加及T細胞引發增加。
本發明亦係關於一種在宿主細胞中產生具有改良寡醣之本發明之ABM的方法，其包含(a)在允許產生本發明之ABM的情況下培養經工程化以表現至少一種編碼具有GnTIII活性之多肽之核酸的宿主細胞，其中該具有GnTIII活性之多肽以足以改良寡醣的量於由該宿主細胞所產生之該ABM之Fc區域中表現；且(b)分離該ABM。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含GnTIII之催化域的融合多肽。在一尤其較佳實施例中，該融合多肽進一步包含高基體內在多肽之高基體定位域。
高基體定位域較佳為甘露糖苷酶II或GnTI之定位域。或者，該高基體定位域係選自由以下各定位域組成之群：甘露糖苷酶I之定位域、GnTII之定位域及1－6個核心岩藻糖基轉移酶之定位域。由本發明之方法所產生之ABM具有經增加之Fc受體結合親和力及/或經增加之效應功能。效應功能增加較佳為以下各效應功能增加之一或多者：Fc所介導之細胞毒性增加(包括抗體依賴細胞毒性增加)、抗體依賴細胞吞噬作用(ADCP)增加、細胞激素分泌增加、表現抗原之細胞之免疫複合物所介導的抗原吸收增加、與NK細胞之結合性增加、與巨噬細胞之結合性增加、與單核細胞之結合性增加、與多形核細胞之結合性增加、誘導細胞凋亡之直接信號傳導增加、靶標－結合抗體之交聯增加、樹突狀細胞成熟增加或T細胞引發增加。Fc受體結合親和力增加較佳為與Fc活化受體(諸如FcγRIIIa)之結合性增加。在一尤其較佳實施例中，該ABM為人類化抗體或其片段。
在另一實施例中，本發明係關於一種由本發明之方法所產生之具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性的嵌合ABM，其於該多肽之Fc區域中具有經增加之比例的二等分寡醣。預期該ABM涵蓋包含Fc區域之抗體及其片段。在一較佳實施例中，該ABM為人類化抗體。在一實施例中，在ABM之Fc區域中二等分寡醣之百分數為總寡醣之至少50%、更佳至少60%、至少70%、至少80%或至少90%且最佳至少90%－95%。在另一實施例中，由於藉由本發明之方法改良其寡醣，故由本發明之方法所產生之ABM於Fc區域中具有經增加之比例的非岩藻糖基化寡醣。在一實施例中，非岩藻糖基化寡醣之百分數為至少50%、較佳至少60%至70%、最佳至少75%。非岩藻糖基化寡醣可呈雜交型或複合物型。在一尤其較佳實施例中，由宿主細胞及本發明之方法所產生之ABM於Fc區域中具有經增加之比例的二等分非岩藻糖基化寡醣。該等二等分非岩藻糖基化寡醣可為雜交或複合物。具體言之，本發明之方法可用以產生其中在ABM之Fc區域中至少15%、更佳至少20%、更佳至少25%、更佳至少30%、更佳至少35%之寡醣為二等分非岩藻糖基化的ABM。本發明之方法亦可用以產生其中在多肽之Fc區域中至少15%、更佳至少20%、更佳至少25%、更佳至少30%、更佳至少35%之寡醣為二等分雜交非岩藻糖基化寡醣的多肽。
在另一實施例中，本發明係關於一種具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性的嵌合ABM，該抗體由本發明之方法所產生且經工程化以具有經增加之效應功能及/或經增加之Fc受體結合親和力。效應功能增加較佳為以下各效應功能增加之一或多者：Fc所介導之細胞毒性增加(包括抗體依賴細胞毒性增加)、抗體依賴細胞吞噬作用(ADCP)增加、細胞激素分泌增加、表現抗原之細胞之免疫複合物所介導的抗原吸收增加、與NK細胞之結合性增加、與巨噬細胞之結合性增加、與單核細胞之結合性增加、與多形核細胞之結合性增加、誘導細胞凋亡之直接信號傳導增加、靶標－結合抗體之交聯增加、樹突狀細胞成熟增加或T細胞引發增加。在一較佳實施例中，Fc受體結合親和力增加為與Fc活化受體(最佳FcγRIIIa)之結合性增加。在一實施例中，該ABM為含有Fc區域之抗體、抗體片段或包括相當於免疫球蛋白之Fc區域之區域的融合蛋白。在一尤其較佳實施例中，該ABM為人類化抗體。
本發明進一步係關於包含本發明之ABM及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明進一步係關於該等醫藥組合物在治療癌症之方法中的用途。具體言之，本發明係關於一種治療癌症之方法，其包含投與治療有效量之本發明之醫藥組合物。
本發明進一步提供生成且使用宿主細胞系統以便產生本發明之ABM之糖型的方法，該等糖型具有經增加之Fc受體結合親和力(較佳經增加之Fc活化受體結合性)及/或具有經增加之效應功能(包括抗體依賴細胞毒性)。可用於本發明之ABM的糖工程化方法學已更詳細描述於美國專利第6,602,684號、美國專利申請公開案第2004/0241817 A1號、美國專利申請公開案第2003/0175884 A1號、美國臨時專利申請案第60/441,307號及第WO 2004/065540號中，其每一者之所有內容以引入的方式全部併入本文中。本發明之ABM可或者根據美國專利申請公開案第2003/0157108號(Genentech)、或EP 1 176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第2003/0115614號、第2004/093621號、第2004/110282號、第2004/110704號、第2004/132140號(Kyowa)中所揭示之技術進行糖工程化以於Fc區域中具有低海藻糖殘基。該等文獻之每一者的內容以引入的方式全部併入本文中。本發明之糖工程化ABM亦可於產生經改良之醣蛋白之表現系統中產生，諸如彼等於美國專利申請公開案第60/344,169號及第WO 03/056914號(GlycoFi,Inc.)或WO 2004/057002及WO 2004/024927(Greenovation)中所教示之表現系統，其每一者之內容據此以引入的方式全部併入本文中。
生成用於產生具有經改造之糖基化模式之蛋白質的細胞株本發明提供用於生成具有經改良之糖基化模式之本發明的ABM之宿主細胞表現系統。詳言之，本發明提供用於生成具有經改良之治療價值的本發明之ABM之糖型的宿主細胞系統。因此，本發明提供經選擇或經工程化以表現具有GnTIII活性之多肽的宿主細胞表現系統。在一實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含異源高基體內在多肽之高基體定位域的融合多肽。具體言之，該等宿主細胞表現系統可經工程化以包含編碼具有GnTIII之多肽且在運作上與組成性或調節型啟動子系統有關的重組性核酸分子。
在一特定實施例中，本發明提供一種經工程化以表現至少一種編碼具有GnTIII活性且包含異源高基體內在多肽之高基體定位域之融合多肽之核酸的宿主細胞。在一態樣中，該宿主細胞使用包含至少一種編碼具有GnTIII活性且包含異源高基體內在多肽之高基體定位域之融合多肽之基因的核酸分子來加以工程化。
在另一實施例中，該宿主細胞經工程化以表現編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸及具有另一糖基轉移酶活性之第二核酸。在一特定實施例中，該第二核酸編碼具有甘露糖苷酶(ManII)活性之多肽。
通常可使用任何類型之培養細胞株(包括該等上述所討論之細胞株)作為基礎來使本發明之宿主細胞株工程化。在一較佳實施例中，將HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞用作基礎細胞株以產生本發明之工程化宿主細胞。
預期本發明涵蓋表現具有GnTIII活性之多肽(包括包含如本文中所定義之異源高基體內在多肽之高基體定位域的融合多肽)的任何工程化宿主細胞。
一或多種編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸可在組成性啟動子或調節型表現系統之控制下表現。該等系統為在此項技術中所熟知且包括上述所討論之系統。若多種編碼具有GnTIII活性且包含異源高基體內在多肽之高基體定位域之融合多肽的不同核酸包含在宿主細胞系統內，則其某些可在組成性啟動子之控制下表現，而其他在調節型啟動子之控制下表現。通常由在此項技術中已知之方法測定具有GnTIII活性之融合多肽之表現量，該等方法包括西方墨點分析、北方墨點分析、報導體基因表現分析或量測GnTIII活性。或者，可使用與GnTIII之生物合成產物結合之凝集素(例如E4 －PHA凝集素)。或者，可使用量測由以編碼具有GnTIII活性之多肽之核酸工程化的細胞所產生之抗體所介導之Fc受體結合性增加或效應功能增加的功能性檢定。
鑑別表現具有經改良之糖基化模式之蛋白質的轉染子或轉型子該等含有具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合(例如人類化)ABM之編碼序列且表現生物學活性基因產物的宿主細胞可藉由至少4種一般方法來鑑別：(a)DNA－DNA或DNA－RNA雜交；(b)存在或缺少"標記"基因功能；(c)評估如由在宿主細胞中表現相應mRNA轉錄產物所量測之轉錄水準；及(d)偵測如由免疫檢定或其生物活性所量測之基因產物。
在第一種方法中，可藉由使用包含分別與相應編碼序列同源之核苷酸序列或其部分或衍生物之探針進行DNA－DNA或DNA－RNA雜交來偵測具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合(例如人類化)ABM之編碼序列及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的存在。
在第二種方法中，重組性表現載體/宿主系統可基於存在或缺少某些"標記"基因功能(例如胸苷激酶活性、對抗生素之抗性、對甲胺喋呤之抗性、轉化表型、桿狀病毒中之包涵體形成等)加以鑑別且選擇。舉例而言，若將本發明之ABM之編碼序列或其片段及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列插入載體之標記基因序列內，則可藉由缺乏標記基因功能來鑑別含有相應編碼序列之重組體。或者，可將標記基因在用以調控編碼序列之表現之相同或不同啟動子的控制下與編碼序列以串聯方式放置。回應誘導或選擇之標記的表現表明本發明之ABM之編碼序列及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的表現。
在第三種方法中，可藉由雜交檢定評估本發明之ABM之編碼區域或其片段及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的轉錄活性。舉例而言，可藉由北方墨點法使用與本發明之ABM之編碼序列或其片段及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列或其特定部分同源的探針分離且分析RNA。或者，可提取且檢定宿主細胞之全部核酸用於該等探針之雜交。
在第四種方法中，可以免疫學方式(例如)藉由西方墨點、諸如放射性免疫沈澱反應、酶聯免疫檢定及其類似檢定之免疫檢定評估蛋白質產物之表現。然而，表現系統之成功之最終測試涉及偵測生物學活性基因產物。
生成且使用具有包括抗體依賴細胞毒性之經增加之效應功能的ABM在較佳實施例中，本發明提供具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性且具有包括抗體依賴細胞毒性之經增加之效應功能的嵌合(例如人類化)ABM之糖型。先前已描述抗體之糖基化工程化。參見例如美國專利第6,602,684號，其以引入的方式全部併入本文中。
非結合性單株抗體(mAb)用於治療某些類型之癌症的臨床試驗近來獲得令人鼓舞的結果。Dillman,Cancer Biother.& Radiopharm.12：223－25 (1997)；Deo等人，Immunology Today 18：127 (1997)。已批准嵌合非結合性IgG1用於低級或濾泡性B細胞非霍奇金淋巴瘤。Dillman,Cancer Biother.& Radiopharm.12：223－25(1997)，而另一非結合性mAb(人類化IgG1靶向乳腺實性腫瘤)亦在III期臨床試驗中展示期望結果。Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。該等兩種mAb之抗原得以高度表現於其相應腫瘤細胞中且該等抗體藉由活體外及活體內之效應細胞而介導有效腫瘤破壞。與此相反，許多具有優良腫瘤特異性之其他非結合性mAb不能觸發臨床上有效之足夠效能的效應功能。Frost等人，Cancer 80 ：317－33(1997)；Surfus等人，J.Immunother. 19：184－91(1996)。對於某些該等較弱mAb，目前正測試輔助細胞因子療法。添加細胞激素可藉由增加循環淋巴細胞之活性及數目而激發抗體依賴細胞毒性(ADCC)。Frost等人，Cancer 80：317－33(1997)；Surfus等人，J.Immunother. 19：184－91(1996)。一旦使白血球受體與抗體之恆定區(Fc)結合後，將觸發ADCC(對於抗體靶向細胞之溶胞攻擊)。Deo等人，Immunology Today 18 ：127(1997)。
增加非結合性IgG1之ADCC活性之不同但互補的方法為使抗體之Fc區域工程化。蛋白質工程化試驗展示FcγR與IgG CH2域之較弱鉸鏈區相互作用。Lund等人，J.Immunol 157：4963－69(1996)。然而，FcγR結合亦需要共價連接於CH2區域中之保守Asn 297上之寡醣的存在。Lund等人，J.Immunol 157：4963－69(1996)；Wright及Morrison,Trends Biotech.15：26－31(1997)表明，寡醣與多肽皆直接有助於相互作用位點或需要寡醣保持活性CH2多肽構形。可因此探索改良寡醣結構來作為增加相互作用之親和力的方式。
IgG分子在其Fc區域中攜帶兩個N－連接寡醣且與各重鏈一一對應。如同任何醣蛋白一般，產生呈共有同一多肽主鏈但具有連接於糖基化位點上之不同寡醣的糖型群形式的抗體。該等通常見於血清IgG之Fc區域中的寡醣為具有低含量之末端唾液酸及二等分N－乙醯葡萄胺糖(GlcNAc)及不同程度之末端半乳糖苷化及核心岩藻糖基化的雙觸角型複合物(Wormald等人，Biochemistry 36：130－38(1997))。某些試驗表明FcγR結合所需之最小醣結構位於寡醣核心內。Lund等人，J.Immunol. 157：4963－69(1996)。
適用於工業及學術界用以產生非結合性治療性mAb之由小鼠或倉鼠衍生的細胞株通常將所需寡醣決定子連接至Fc位點。然而，表現於該等細胞株中之IgG缺乏以較低量見於血清IgG中之二等分GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318：813－22(1995)。與此相反，近來觀察到由大鼠骨髓瘤產生之人類化IgG1(CAMPATH－1H)在某些其糖型中攜帶二等分GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318：813－22(1995)。大鼠細胞衍生型抗體達到與於標準細胞株中但在明顯較低抗體濃度下所產生之CAMPATH－1H抗體相似之最大活體外ADCC活性。
CAMPATH抗原通常以高水準存在於淋巴瘤細胞上且在不存在二等分GlcNAc之情況下該嵌合mAb具有高ADCC活性。Lifely等人，Glycobiology 318：813－22(1995)。在N－連接糖基化途徑中，藉由GnTIII添加二等分GlcNAc。Schachter,Biochem.Cell Biol. 64：163－81(1986)。
預先試驗使用產生單一抗體之CHO細胞株，其預先經工程化以便以外部調節型方式表現不同水準之經選殖的GnTIII基因酶(Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17：176－180(1999))。該方法第一次確定GnTIII之表現與改良抗體之ADCC活性之間的嚴密相關性。因此，本發明涵蓋具有大鼠ICR62抗體之結合特異性且具有由GnTIII活性增加所產生之經改造之糖基化的重組性嵌合抗體或其片段。GnTIII活性增加導致在ABM之Fc區域中二等分寡醣之百分數增加以及海藻糖殘基之百分數降低。This抗體或其片段具有經增加之Fc受體結合親和力及經增加之效應功能。此外，本發明係關於包含相當於免疫球蛋白之Fc區域之區域的抗體片段及融合蛋白。在一較佳實施例中，該抗體為人類化抗體。
根據本發明之方法所產生之ABM的治療應用由最廣泛意義來看，本發明之ABM可用於靶向活體內或活體外表現EGFR之細胞。可靶向表現EGFR之細胞而用於診斷或治療目的。在一態樣中，本發明之ABM可用於偵測EGFR於試樣中之存在。在另一態樣中，本發明之ABM可用於在表現EGFR於表面上之細胞中抑制或減少EGFR所介導之信號傳導。與相同細胞類型之非腫瘤組織相比，EGFR異常表現(例如過度表現)於許多人類腫瘤中。因此，本發明之ABM尤其適用於預防腫瘤形成、根除腫瘤及抑制腫瘤生長。藉由阻斷EGFR配位體與EGFR結合，本發明之ABM抑制EGF依賴性腫瘤細胞活化，包括EGFR酪胺酸磷酸化、細胞外酸化速率增加及細胞增生。本發明之ABM亦有助於使細胞週期停止，促使靶標細胞(例如腫瘤細胞)之細胞凋亡及抑制血管生成及/或分化靶標細胞。本發明之ABM可用於治療表現EGFR之任何腫瘤。可以本發明之ABM治療之特定惡性疾病包括(但不限於)表皮及鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳癌、膀胱癌、頭部及頸部癌症及腎細胞癌。
本發明之ABM可單獨用於靶向且致死活體內腫瘤細胞。該等ABM亦可與適當治療劑結合使用以治療人類癌瘤。舉例而言，該等ABM可與諸如化療法、放射治療之標準或習知治療方法組合使用或可與治療藥物或毒素以及淋巴激素或腫瘤抑制性生長因子結合或相關聯使用以便輸送治療劑至癌瘤之位點上。本發明之ABM之最重要結合物為(1)免疫毒素(ABM與細胞毒性部分之結合物)及(2)經標記(例如經放射性標記、經酶標記或經螢光染料標記)之ABM，其中該標記提供鑑別包括經標記之ABM之免疫複合物的方法。該等ABM亦可用以經由天然互補過程誘導溶胞且用以與通常存在之抗體依賴細胞毒性細胞相互作用。
免疫毒素之細胞毒性部分可為細胞毒性藥物或細菌或植物來源之酶促活性毒素或該毒素之酶促活性片段("A鏈")。所用酶促活性毒素及其片段為白喉A鏈、白喉毒素之非結合性活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α－帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美國商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP－S)、苦瓜抑制因子、痲瘋樹毒蛋白(curein)、巴豆毒素、肥皂草抑制因子、天堂果蛋白、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素及伊諾黴素(enomycin)。在另一實施例中，該等ABM與小分子抗癌藥物結合。使用多種雙官能蛋白偶合劑製造ABM與該等細胞毒性部分之結合物。該等試劑之實例為SPDP、IT、亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)已二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙－(對重氮苯甲醯基)－乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6－二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5－二氟－2,4－二硝基苯)。毒素之溶解部分可為與ABM之Fab片段結合。其他適當毒素為此項技術中所已知，如(例如)於美國專利申請案第2002/0128448號中所證明，該文獻以引入的方式全部併入本文中。
在一實施例中，具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合(例如人類化)糖工程化ABM與蓖麻毒素A鏈結合。最有利的是，經由重組性方式使蓖麻毒素A鏈去糖基化且產生蓖麻毒素A鏈。製造蓖麻毒素免疫毒素之有利方法描述於Vitetta等人，Science 238,1098(1987)中，其以引入的方式據此併入本文中。
當用以活體外殺死人類癌細胞以達到診斷目的時，該等結合物將通常以至少約10 nM之濃度添加至細胞培養基中。活體外使用時之投與之調配物及模式並不係關鍵的。通常將使用與培養物或灌注培養基相容之含水調配物。可藉由習知技術讀取細胞毒性以便確定癌症之存在或程度。
如以上所討論，用於治療癌症之細胞毒性放射性藥物可藉由使放射性同位素(例如I、Y、Pr)與具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合糖工程化ABM結合來製造。如本文中所用，術語"細胞毒性部分"意欲包括該等同位素。
在另一實施例中，以細胞毒性藥物填充脂質體且以本發明之ABM塗佈該等脂質體。因為於表現EGFR之惡性細胞之表面上存在許多EGFR分子，所以該方法允許輸送大量藥物至合適細胞類型上。
用於使該等治療劑與抗體結合之技術為所熟知(參見例如Arnon等人，"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy"，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld等人(編)，第243－56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery"，Controlled Drug Delivery (第2版),Robinson等人(編)，第623－53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe，"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review"，Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications, Pinchera等人(編)，第475－506頁(1985)；及Thorpe等人，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody－Toxin Conjugates"，Immunol.Rev., 62：119－58(1982))。
本發明之ABM之其他治療應用仍包括(例如)藉由重組性DNA技術來結合或連接能夠將前藥轉化成細胞毒性藥物之酶且將該抗體－酶結合物與前藥組合使用以便在腫瘤位點上將前藥轉化成細胞毒性藥劑(參見例如Senter等人，"Anti－Tumor Effects of Antibody－alkaline Phosphatase"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4842－46(1988)；"Enhancement of thein vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody－Alkaline Phosphatase Conjugates"，Cancer Research 49：5789－5792(1989)；及Senter，"Activation of Prodrugs by Antibody－Enzyme Conjugates：A New Approach to Cancer Therapy，"FASEBJ. 4：188－193(1990))。
本發明之ABM之另一治療用途仍涉及在補體存在下使用非結合性ABM或用作抗體－藥物或抗體－毒素結合物之一部分以便自癌症患者之骨髓中移除腫瘤細胞。根據該方法，自體性骨髓可藉由以抗體進行治療而加以離體淨化且將骨髓注回患者中[參見例如Ramsay等人，"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies"，J.Clin.Immunol.,8(2)：81－88(1988)]。
此外，預期本發明包含包含允許與大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性的抗原結合域(例如包含大鼠ICR62抗體之CDR的多肽)且進一步包含毒素多肽的單鏈免疫毒素。本發明之單鏈免疫毒素可用以治療人類活體內癌瘤。
同樣，至少包含與至少具有抗腫瘤活性之第二蛋白(例如淋巴激素或製瘤素)之功能活性部分結合的本發明之ABM之抗原結合區域的融合蛋白可用於治療人類活體內癌瘤。
本發明提供一種用於選擇性殺死表現EGFR之腫瘤細胞的方法。該方法包含使本發明之免疫結合物(例如免疫毒素)與該等腫瘤細胞反應。該等腫瘤細胞可來自人類癌瘤。
另外，本發明提供一種治療活體內癌瘤(例如人類癌瘤)之方法。該方法包含向受檢者投與醫藥學上有效量之含有本發明之免疫結合物(例如免疫毒素)之至少一者的組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種用於治療其中表現EGFR(尤其其中異常表現(例如過度表現)EGFR)之細胞增生病症的改良方法，該等病症包括膀胱、腦、頭部及頸部、胰腺、肺、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚及腎臟之癌症，該方法包含向需要其之人類受檢者投與治療有效量之本發明之ABM。在一較佳實施例中，該ABM為具有與大鼠ICR62抗體之結合特異性大體上相同之結合特異性的糖工程化抗EGFR抗體。在另一較佳實施例中，該抗體為人類化抗體。在另一較佳實施例中，該人類化抗體包含經改良之CDR，其在除彼等保持結合活性所必需之位置(例如SDR)以外之任何位置上包含取代。可由本發明之ABM治療之細胞增生病症的實例包括(但不限於)位於以下部位之贅瘤：腹部、骨、乳房、消化系統、肝臟、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭部及頸部、神經系統(中樞及外周神經)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部及尿殖系統。
同樣，亦可由本發明之ABM治療其他細胞增生病症。該等細胞增生病症之實例包括(但不限於)：高加馬球蛋白血症、淋巴組織增生病症、異常血蛋白症、紫癜病、類肉瘤病、西澤裏症候群(Sezary Syndrome)、瓦爾登斯巨球蛋白血症(Waldenstron's Macroglobulinemia)、高歇氏病(Gaucher's Disease)、組織細胞增多症及除瘤形成之外位於上列器官系統中之任何其他細胞增生疾病。
根據本發明之實踐，該受檢者可為人類、馬類、豬類、牛類、鼠類、犬類、貓類及鳥類受檢者。本發明亦包括其他溫血動物。
本發明進一步提供用於抑制人類腫瘤細胞生長、治療受檢者腫瘤及治療受檢者增生型疾病之方法。該等方法包含向受檢者投予有效量之本發明之組合物。
本發明進一步係關於用於治療哺乳動物中以EGFR或一或多種EGFR配位體之異常活化或產生為特徵之非惡性疾病或病症的方法，其包含向該哺乳動物投與治療有效量之本發明之ABM。該受檢者將通常(例如在其患病組織中)具有表現EGFR之細胞使得本發明之ABM能夠與受檢者內之細胞結合。
EGFR或EGFR配位體之異常活化或表現可發生在受檢者之細胞中，例如發生在受檢者之患病組織中。EGFR之異常活化可歸因於EGFR及/或EGFR配位體之擴增、過度表現或異常產生。在本發明之一實施例中，將進行診斷或預後性檢定以確定EGFR(或EGFR配位體)之異常產生或活化是否在受檢者中發生。舉例而言，可確定EGFR及/或配位體之基因擴增及/或過度表現。各種用於確定該擴增/過度表現之檢定可在此項技術中獲得且包括IHC、FISH及如上所述之脫落抗原檢定。或者或另外，可根據已知程序測定在試樣中或與試樣相關之EGFR配位體(諸如TGF－α)之含量。該等檢定可在欲測試之試樣中偵測編碼其之蛋白質及/或核酸。在一實施例中，可使用免疫組織化學法(IHC)測定試樣中之EGFR配位體含量；參見例如Scher等人，Clin.Cancer Research 1：545－550(1995)。或者或另外，可(例如)經由FISH、Southern印跡法或PCR技術評估欲測試試樣中之編碼EGFR之核酸的含量。
此外，可使用活體內診斷檢定(例如藉由投與結合欲偵測之分子且經可偵測標記(例如放射性同位素)標記之分子(諸如抗體)且外部掃描患者以定位標記)來評估EGFR或EGFR配位體過度表現或擴增。
或者，可在治療之前偵測患者中(例如其患病組織中)之EGFR雜二聚體，尤其EGFR－ErbB2、EGFR－ErbB3或EGFR－ErbB4雜二聚體。可獲得各種偵測非共價蛋白質－蛋白質相互作用或者指示所關注之蛋白質之間的接近度之方法。偵測EGFR雜二聚體之例示性方法包括(但不限於)基於免疫親和性之方法，諸如免疫沈澱法；螢光共振能量傳遞法(FRET)(Selvin,Nat.Struct.Biol.7：730－34(2000)；Gadella & Jovin,J.Cell Biol.129：1543－58(1995)；及Nagy等人，Cytometry 32：120－131(1998))；使用標準直接或間接免疫螢光技術及共焦雷射掃描顯微鏡術進行EGFR與ErbB2或ErbB3之協同定位；在諸如微孔板之高產量形式中偵測抗體結合及EGFR與ErbB2或ErbB3之協同定位的雷射掃描成像(LSI)(Zuck等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：11122－11127(1999))；或eTag/m檢定系統(Aclara Bio Sciences,Mountain View,Calif.；及美國專利申請案2001/0049105，2001年12月6日公開)。
因此顯而易見，本發明涵蓋用於治療諸如膀胱、腦、頭部及頸部、胰腺、肺、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚及腎臟之癌症之人類惡性疾病的醫藥組合物、組合及方法。舉例而言，本發明包括適用於治療人類惡性疾病之醫藥組合物，其包含醫藥學上有效量之本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
可使用習知投藥模式投與本發明之ABM組合物，該等模式包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、經口、淋巴內投藥或直接向腫瘤投藥。較佳為靜脈內投藥。
在本發明之一態樣中，藉由使具有所需純度之抗體與可選醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980))混合來製備含有本發明之ABM之治療調配物以便以凍乾調配物或水溶液形式儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑係在所用劑量及濃度下對受體無毒的且包括：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯苄烷銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；烷基對羥基苯甲酸酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3－戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他醣類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成性抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn－蛋白複合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
可單獨或以與(例如)化療劑及/或放射治療組合治療方式向受檢者投與本發明之ABM以治療以異常EGFR或EGFR配位體活性為特徵之疾病或病症(諸如腫瘤)。Herbst及Shen,Cancer 94(5)：1593－1611中描述例示性抗EGFR抗體調配物。合適化療劑包括順鉑(cisplatin)、阿黴素(doxorubicin)、拓朴替康(topotecan)、紫杉醇、長春花鹼、卡波鉑(carboplatin)及依託泊苷(etoposide)。
WO 97/04801中描述適合於皮下投藥之凍乾調配物。可使用合適稀釋劑復水該等凍乾調配物至高蛋白濃度且可向本文中欲治療之哺乳動物皮下投予該復水調配物。
本文中之調配物亦可含有一種以上作為所治療之特定適應症所必需的活性化合物，較佳含有彼等具有彼此並無不利影響之互補活性的活性化合物。舉例而言，可能需要進一步提供細胞毒性藥劑、化療劑、細胞激素或免疫抑制劑(例如作用於T細胞者，諸如環孢素或結合T細胞之抗體，例如結合LFA－1之抗體)。該等其他藥劑之有效量視存在於調配物中之拮抗劑的量、疾病或病症或療法之類型及其他上述所討論之因素而定。該等藥劑通常以與在上文中所用相同之劑量及給藥途徑使用或以此前所用劑量之約1%至99%使用。
亦可(例如)藉由凝聚技術或藉由介面聚合將活性成份圈閉於所製備之微囊中，例如羥基甲基纖維素或明膠微囊及聚－(甲基丙烯酸甲酯)微囊分別圈閉於膠狀藥物輸送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米囊劑)中或於巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放性製劑。持續釋放性製劑之合適實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成型物品之形式，例如薄膜或微囊。持續釋放性基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2－羥乙基－甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L－麩胺酸與γ乙基－L－麩胺酸酯之共聚物、不可降解伸乙基－乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸－乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸酯(leuprolide acetate)組成之可注射性微球體)之可降解乳酸－乙醇酸共聚物及聚－D－(－)－3－羥丁酸。
欲用於活體內投藥之調配物必須為無菌的。其易於藉由經由無菌過濾膜進行過濾來實現。
本發明之組合物可呈多種劑型，其包括(但不限於)液體溶液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、栓劑、聚合微囊或微泡、脂質體及可注射或不熔化溶液。較佳形式視投藥模式及治療應用而定。
本發明之組合物亦較佳包括在此項技術中已知之習知醫藥學上可接受之載劑及佐劑，諸如人血清白蛋白、離子交換劑、氧化鋁、卵磷脂、緩衝物質(諸如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀及鹽或電解質(諸如硫酸精蛋白)。
本發明之醫藥組合物之投藥及給藥方案之最有效模式視疾病之嚴重程度及進程、患者健康情況及對療法之反應及治療醫師之診斷而定。因此，對於個別患者，將以滴定法量測組合物之劑量。然而，有效劑量之本發明之組合物將通常在約0.01 mg/kg至約2000 mg/kg之範圍內。在一實施例中，該有效劑量在約1.0 mg/kg至約15.0 mg/kg之範圍內。在一更特定實施例中，該劑量在約1.5 mg/kg至約12 mg/kg之範圍內。在其他實施例中，該劑量在約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg或約4.5 mg/kg至約12 mg/kg之範圍內。本發明之劑量亦可為該等範圍內之任何劑量，其包括(但不限於)1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、5.0 mg/kg、5.5 mg/kg、6.0 mg/kg、6.5 mg/kg、7.0 mg/kg、7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、8.5 mg/kg、9.0 mg/kg、9.5 mg/kg、10.0 mg/kg、10.5 mg/kg、11.0 mg/kg、11.5 mg/kg、12.0 mg/kg、12.5 mg/kg、13.0 mg/kg、13.5 mg/kg、14.0 mg/kg、14.5 mg/kg或15.0 mg/kg。
本文中所述之分子可呈多種劑型，其包括(但不限於)液體溶液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、栓劑、聚合微囊或微泡、脂質體及可注射或不熔化溶液。較佳形式視投藥模式及治療應用而定。
可在某些情況下藉由使用預示性生物標記來確定本發明之劑量。預示性生物標記為用以確定(亦即觀測及/或量化)腫瘤相關基因或蛋白之表現模式及/或活化或腫瘤相關信號傳導途徑之細胞組份的分子標記。闡明靶向療法於腫瘤組織中之生物學效應且使該等效應與臨床反應相關聯可幫助鑑別腫瘤中有效之顯著生長及存活途徑，藉此建立可能反應者之概況且逆向提供合理設計對策以克服抗性。舉例而言，用於抗EGFR療法之生物標記可包含處於引起細胞增生病症之EGFR後續信號傳導途徑中的分子，其包括(但不限於)Akt、RAS、RAF、MAPK、ERK1、ERK2、PKC、STAT3、STAT5(Mitchell,Nature Biotech.22：363－364(2004)；Becker,Nature Biotech 22：15－18(2004)；Tsao及Herbst,Signal 4：4－9(2003))。用於抗EGFR療法之生物標記亦可包含諸如EGFR、ErbB－2(HER2/neu)及ErbB－3(HER3)之生長因子受體且可為患者對抗EGFR療法之反應的陽性或陰性預測器。舉例而言，確定生長因子受體ErbB－3(HER3)為抗EGFR抗體ABX－EGF之陰性預示性生物標記(美國專利申請公開案第2004/0132097 A1號)。
可藉由在此項技術中所熟知之細胞檢定量測預示性生物標記，該等檢定包括(但不限於)免疫組織化學、流式細胞量測術、免疫螢光法、捕捉及偵測檢定及逆相檢定及/或美國專利申請公開案第2004/0132097 A1號中所闡明之檢定，該文獻全部內容以引入的方式併入本文中。抗EGFR療法之預示性生物標記本身可根據美國專利申請公開案第2003/0190689 A1號中所闡明之技術鑑別，其全部內容據此以引入的方式併入本文中。
在一態樣中，本發明提供一種治療EGFR相關病症之方法，其包含：藉由在使用一種或複數種試劑治療之前檢定來自人類受檢者之試樣來預測需要治療之人類受檢者對抗EGFR療法的反應，該等試劑偵測EGFR相關病症(諸如癌症)之預示性生物標記的表現及/或活化；確定預示性生物標記之一或多者的表現及/或活化模式，其中該模式預測人類受檢者對抗EGFR療法之反應；且向經預測明確對抗EGFR療法具有反應之人類受檢者投與治療有效量之包含本發明之ABM的組合物。如本文中所用，經預測明確對抗EGFR治療具有反應之人類受檢者為抗EGFR將具有對EGFR相關病症之可量測效應(例如腫瘤退化/萎縮)且抗EGFR療法之益處超過反效應(例如毒性)的人類受檢者。如本文中所用，試樣意謂任何來自生物體(尤其人類)之生物試樣，其包含一或多種細胞(包括任何來源之單細胞)、自器官(諸如乳房、肺、胃腸道、皮膚、子宮頸、卵巢、前列腺、腎臟、腦、頭部及頸部或身體之任何其他器官或組織)中移除之組織或生檢試樣、及包括(但不限於)塗片、唾液、分泌物、腦脊髓液、膽汁、血液、淋巴液、尿及糞便之其他身體試樣。
將以符合良好醫療實踐之方式調配、給藥且投與包含本發明之ABM的組合物。本上下文中所考慮之因素包括所治療之特定疾病或病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、疾病或病症之成因、藥劑輸送部位、投藥方法、投藥時程及醫師已知之其他因素。欲投與之拮抗劑之治療有效量將取決於該等考慮因素。
一般主張，每劑量非經腸投與之抗體之治療有效量將在每日約0.1至20毫克/公斤患者體重之範圍內，且所用拮抗劑之典型初始範圍在約2 mg/kg至10 mg/kg之範圍內。在一實施例中，該治療有效量在約1.0 mg/kg至約15.0 mg/kg之範圍內。在一更特定實施例中，該劑量在約1.5 mg/kg至約12 mg/kg之範圍內。在其他實施例中，該劑量在約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg或約4.5 mg/kg至約12 mg/kg之範圍內。本發明之劑量亦可為該等範圍內之任何劑量，其包括(但不限於)1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、5.0 mg/kg、5.5 mg/kg、6.0 mg/kg、6.5 mg/kg、7.0 mg/kg、7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、8.5 mg/kg、9.0 mg/kg、9.5 mg/kg、10.0 mg/kg、10.5 mg/kg、11.0 mg/kg、11.5 mg/kg、12.0 mg/kg、12.5 mg/kg、13.0 mg/kg、13.5 mg/kg、14.0 mg/kg、14.5 mg/kg或15.0 mg/kg。
在一較佳實施例中，該ABM為抗體，較佳為人類化抗體。該非結合性抗體之合適劑量為(例如)約20 mg/m2 至約1000 mg/m2 之範圍內。舉例而言，可向患者投與一或多種大體上低於375 mg/m2 之抗體劑量，例如其中該劑量為約20 mg/m2 至約250 mg/m2 之範圍內，(例如)為約50 mg/m2 至約200 mg/m2 之範圍內。
此外，可投與一或多種抗體初始劑量，接著投與一或多種後續劑量，其中後續劑量中之mg/m2 抗體劑量超過初始劑量中之mg/m2 抗體劑量。舉例而言，該初始劑量可為約20 mg/m2 至約250 mg/m2 (例如約50 mg/m2 至約200 mg/m2 )之範圍內且該後續劑量可為約250 mg/m2 至約1000 mg/m2 之範圍內。
然而如上所述，ABM之該等建議量在治療中須經諸多斟酌決定。如上所指出，選擇適當劑量及時程之關鍵因素為所獲結果。舉例而言，最初可能需要相對較高劑量以治療進行性及急性疾病。為獲得最有效結果，視疾病或病症而定，當盡可能臨近疾病或病症之首次病徵、診斷、出現或發生時或在疾病或病症之緩解期間投與拮抗劑。
在用以治療腫瘤之抗EGFR抗體的情況下，通常以足以使EGF受體於靶標細胞上完全飽和之劑量獲得最佳治療結果。為獲得飽和所必需之劑量將視每腫瘤細胞所表現之EGF受體之數目(在不同腫瘤類型之間其可具有顯著差異)而定。低至30 nM之血清濃度對治療某些腫瘤有效，而超過100 nM之濃度可為對其他腫瘤獲得最佳治療效應所必需。為對於所給腫瘤獲得飽和所必需之劑量可易於活體外藉由放射免疫檢定或免疫沈澱來確定。
一般而言，當與輻射組合治療時，一合適之治療性療法涉及8次每週進行之以100－500 mg/m2 之負荷劑量注射本發明之抗EGFR ABM，接著維持100－250 mg/m2 之劑量且以70.0 Gy之量以每日2.0 Gy之劑量進行輻射。當與化療法組合治療時，一合適之治療性療法涉及以100/100 mg/m2 、400/250 mg/m2 或500/250 mg/m2 之每週負荷/維持劑量且與以每三週100 mg/m2 之劑量的順鉑組合投與本發明之抗EGFR ABM。或者，可使用吉西他濱(gemcitabine)或伊立替康(irinotecan)代替順鉑。
藉由任何合適方式投與本發明之ABM，該等方式包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內及(若需要用於局部免疫抑制治療)病灶內投藥。非經腸注射包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。此外，可適當藉由脈搏注射(例如)以拮抗劑之遞減劑量投予拮抗劑。較佳藉由注射，最佳靜脈內或皮下注射(部分視投藥是否為短暫或持續而定)進行投藥。
可與本文中之拮抗劑一起投與其他化合物，諸如之細胞毒性藥劑、化療劑、免疫抑制劑及/或細胞激素。組合投藥包括使用獨立調配物或單一醫藥調配物之共同投藥及按任何一種順序連續投藥，其中較佳當兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物學活性時存在時限。
顯然，實現治癒所需之本發明之組合物的劑量可進一步根據時程最佳化而得以降低。
根據本發明之實踐，醫藥載劑可為脂質載劑。脂質載劑可為磷脂。此外，脂質載劑可為脂肪酸。脂質載劑亦可為清潔劑。如本文中所用，清潔劑為任何改變液體表面張力(通常降低表面張力)之物質。
在本發明之一實例中，該清潔劑可為非離子清潔劑。非離子清潔劑之實例包括(但不限於)聚山梨醇酯80(亦稱為Tween 80或聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、Brij及Triton(例如Triton WR－1339及Triton A－20)。
或者，該清潔劑可為離子清潔劑。離子清潔劑之實例包括(但不限於)溴化烷基三甲銨。
另外，根據本發明，脂質載劑可為脂質體。當用於該應用時，"脂質體"為含有本發明之任何分子或其組合的任何膜結合性微脂粒。
在另一實施例中，本發明係關於一種根據本發明適用作藥物(尤其適用於治療或預防癌症或適用於癌症前期病狀或病變)之ABM。該癌症可為(例如)肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌症、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌症、胃癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門癌、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊椎軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤，其包括任何上述癌症之難治癒形式或上述癌症之一或多者的組合。癌症前期病狀或病變包括(例如)由以下各病狀或病變組成之群：口腔黏膜白斑、光化性角化腫瘤(日光性角化病)、結腸或直腸之癌症前期息肉、胃上皮發育異常、腺瘤發育異常、遺傳性非息肉病性結腸癌症候群(HNPCC)、巴瑞特氏食道症(Barrett's esophagus)、膀胱發育異常及癌症前期子宮頸病狀。
該癌症較佳係選自由乳癌、膀胱癌、頭部及頸部癌症、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌及腦癌組成之群。
另一實施例為本發明之ABM用於製造用以治療或預防癌症之藥物的用途。癌症係如以上所定義。
該癌症較佳係選自由乳癌、膀胱癌、頭部及頸部癌症、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌及腦癌組成之群。
亦較佳以約1.0 mg/kg至約15.0 mg/kg之治療有效量使用該抗原結合分子。
亦更佳以約1.5 mg/kg至約12 mg/kg之治療有效量使用該抗原結合分子。
亦更佳以約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg之治療有效量使用該抗原結合分子。
亦更佳以約4.5 mg/kg至約12 mg/kg之治療有效量使用該抗原結合分子。
最佳以約1.5 mg/kg之治療有效量使用該抗原結合分子。
亦最佳以約4.5 mg/kg之治療有效量使用該抗原結合分子。
亦最佳以約12 mg/kg之治療有效量使用該抗原結合分子。
在另一實施例中，本發明係關於治療需要其治療之哺乳動物之EGFR相關病症的方法，其包含向哺乳動物投與本發明之ABM，其中該治療導致該ABM之血清濃度處於約1 μg/kg與約500 μg/ml之間歷時至少4週時間且其中該治療並不於該哺乳動物中產生臨床上顯著性水準之毒性。在其他實施例中，血清濃度為選自由超過1 μg/ml、超過25 μg/ml、超過50 μg/ml、超過100 μg/ml、超過200 μg/ml、超過300 μg/ml、超過400 μg/ml、超過500 μg/ml、約1 μg/kg與約100 μg/ml之間、約1μg/kg與約200 μg/ml之間、約1 μg/kg與約300 μg/ml之間、約1 μg/kg與約400 μg/ml之間及約1 μg/kg與約500 μg/ml之間組成之群的量。在一較佳實施例中，該哺乳動物為人類。在一實施例中，該ABM為抗體。在一較佳實施例中，該抗體經糖工程化且與非糖工程化形式之抗體相比具有經增加之FcγRIII結合性。
在一態樣中，本發明係關於一種特異性結合EGFR之抗原結合分子(ABM)，其中該ABM進一步包含免疫球蛋白Fc區域或其片段且其中該Fc區域或其片段經糖工程化以便與非糖工程化形式相比具有經增加之效應功能。在一特定實施例中，該效應功能為Fc所介導之細胞毒性增加。
在另一態樣中，本發明係關於特異性結合EGFR之ABM，其中該ABM進一步包含免疫球蛋白Fc區域或其片段且其中該Fc區域或其片段經糖工程化以便與非糖工程化形式相比具有經增加之Fc受體結合親和力。
在另一態樣中，本發明係關於一種特異性結合EGFR之ABM，其中該ABM當以治療有效量向受檢者投與時並不產生臨床上顯著性水準之毒性。在一實施例中，該ABM進一步包含免疫球蛋白Fc區域或其片段。在一特定實施例中，Fc區域或其片段經工程化以便與非工程化形式相比具有經增加之效應功能。在一更特定實施例中，該效應功能為Fc所介導之細胞毒性增加。在另一實施例中，Fc區域或其片段經工程化以便與非工程化形式相比具有經增加之Fc受體結合親和力。在一特定實施例中，該治療有效量為約1.0 mg/kg至約15 mg/kg之範圍內。在另一特定實施例中，該治療有效量為每毫升超過1微克之血清濃度。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療需要該治療之受檢者中之EGFR相關病症的方法，該方法包含向受檢者投予如上所述之ABM。在另一態樣中，本發明係關於一種治療需要該治療之哺乳動物受檢者中之EGFR相關病症的方法，該方法包含向受檢者投予特異性結合EGFR之ABM，其中該ABM當以治療有效量向哺乳動物受檢者投與時並不產生臨床上顯著性水準之毒性。在一實施例中，該治療有效量提供每毫升約1與約100微克之間的ABM之血清濃度歷時至少4週時間。在另一實施例中，適用於該方法之ABM進一步包含免疫球蛋白Fc區域或其片段。在一更特定實施例中，Fc區域或其片段經工程化以便與非工程化形式相比具有經增加之效應功能。在一特定實施例中，該效應功能為Fc所介導之細胞毒性增加。在另一特定實施例中，Fc區域或其片段經工程化以便與非工程化形式相比具有經增加之Fc受體結合親和力。在一較佳實施例中，該Fc受體為FcγRIII。
製品在本發明之另一實施例中，提供一種含有適用於治療如上所述之病症之物質的製品。該製品包含容器及於該容器上或與該容器相關聯之標記或藥品說明書。合適之容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。該容器保存對治療病狀有效之組合物且可具有無菌入口孔(例如該容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。在組合物中至少一種活性劑為抗EGFR抗體。該標記或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀(諸如非惡性病或病症)，其中該疾病或病症涉及EGFR受體及/或EGFR配位體之異常活化或產生，例如良性過度增生性疾病或病症。此外，該製品可包含(a)一具有含於其中之組合物的第一容器，其中該組合物包含與EGFR結合且抑制過度表現EGFR之細胞生長的第一抗體；及(b)一具有含於其中之組合物的第二容器，其中該組合物包含與EGFR結合且阻斷EGFR受體之配位體活化的第二抗體。在本發明之該實施例中，該製品可進一步包含指示第一及第二抗體組合物可用於治療來自該等以上定義部分中之疾病或病症之列表的非惡性疾病或病症之藥品說明書。此外，該藥品說明書可指示組合物(包含與EGFR結合且阻斷EGFR受體之配位體活化之抗體)之使用者使用抗體與前述部分中所述之任何輔助療法(例如化療劑、EGFR靶向型藥物、抗血管生成劑、免疫抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、抗激素化合物、保心劑及/或細胞激素)進行組合治療。或者或另外，該製品可進一步包含一包含醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林葛爾氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。其可進一步包括其他由商品化及使用者觀點出發所需之物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾紙、針及注射器。
以下實例更詳細說明本發明。給出以下製備方法及實例以使熟習該項技術者能夠更清楚地瞭解並實施本發明。然而，本發明並不在範疇方面受例示性實施例限制，該等實施例僅意欲作為本發明之單個態樣之說明且功能上等效之方法係在本發明之範疇內。實際上，除本文中所述之彼等改良之外，本發明之各種改良將根據上述描述及附隨圖示對熟習此項技術者明瞭化。該等改良意欲屬於附加申請專利範圍之範圍內。
本申請案中所引用之所有專利、申請案及公開案據此以引入的方式全部併入本文中。
實例
除非另有說明，否則根據Kabat編號系統提及以下實例中之特定胺基酸殘基位置的編號。除非另作說明，否則用以製造該等工作實例中所述之抗體之物質及方法為根據彼等美國專利申請案第10/981,738號之實例中所闡明之物質及方法，該專利以引入的方式全部併入本文中。
實例1
物質及方法高同源性受體法藉由使大鼠ICR62蛋白序列與人類生殖系序列之集合比對且選擇展示最高序列一致性之人類序列而於功能水準上保留所有正規殘基(canonical residues)來尋找高同源性抗體受體構架。此時，選擇來自VBase資料庫中之VH1家族之序列1－e作為重鏈構架受體序列且選擇來自VBase資料庫之VK1家族之A30序列作為輕鏈之構架受體。接枝大鼠ICR62重鏈及輕鏈可變域之三個互補決定區(CDR)及/或彼等CDR之特異性決定殘基於該等兩種受體構架上。因為構架4區域並不為生殖系基因之可變區之一部分，所以單獨對該位置進行比對。選擇JH6區域作為重鏈且選擇JK2區域作為輕鏈。經設計之免疫球蛋白域之分子模型顯示Kabat CDR1外之一位置可能需要鼠類胺基酸殘基代替CDR外之人類胺基酸殘基。將鼠類胺基酸殘基再引入人類構架中將產生所謂"回復突變"。舉例而言，Kabat位置27上之人類受體胺基酸殘基(1－e中之甘胺酸)得以回復突變成酪胺酸殘基。為展示殘基對於抗原結合性之重要性，設計包括或省略回復突變之人類化抗體變異體。人類化抗體輕鏈並不需要任何回復突變。在設計蛋白序列之後，如以下詳述般合成編碼該等蛋白質之DNA序列。
混合構架法為避免需要在人類受體構架之關鍵位置(對保持良好抗原結合親和力或抗體功能關鍵)處引入回復突變，研究功能上人類化抗體之構架區1(FR1)、構架區1(FR1)連同2(FR2)或構架區3(FR3)是否可在天然人類生殖系序列中之重要殘基位置處替換為己具有供體殘基或功能上等效於供體殘基之胺基酸殘基的人類抗體序列。為達該目的，單獨將大鼠ICR62 VH序列之VH構架1、2及3與人類生殖系序列比對。此時，最高序列一致性並不用於選擇受體構架；代之以對若干關鍵殘基進行匹配。彼等關鍵殘基包含所謂正規殘基以及彼等在位置27、28及30(Kabat編號)上之殘基，其處於Kabat所界定之CDR1外，但通常與抗原結合性有關。此外，當可使用分子模型加以確定時，關鍵殘基為彼等展示與CDR之重要相互作用的殘基。選擇來自VH1家族之IMGT序列IGHV1－58(寄存編號M29809)、IGHV5－51(寄存編號M99686)以及VBase序列1－02用作用以替換FR1、2或3之合適序列。簡言之：IGHV1－58在Kabat位置27至30中展示有前途之模式，但並不滿足規範位置71之標準。IGFTV5－51具有匹配殘基71，因此可使用其FR3。其FR1亦靠近所需FR1序列。
VH1之1－e滿足除位置27以外之所有標準。將序列1－02視為可為FR1及FR2區域所接受，但將於FR3中需要回復突變。
在設計蛋白序列之後，如以下詳述般合成編碼該等蛋白質之DNA序列。使用該方法，在大多數重鏈結構中回復突變對於保持良好水準之抗原結合性並非必需。混合構架構築體之年代學及原因在結果部分中加以解釋。
合成抗體基因在設計人類化抗體V區域之胺基酸序列之後產生DNA序列。個別構架區域之DNA序列資料見於人類生殖系序列之資料庫(例如IMGT或VBase)中。CDR區域之DNA序列資訊取自大鼠ICR62抗體之公開序列(參見例如PCT公開案WO 95/20045)。實際上使用該等序列裝配完整DNA序列。使用該DNA序列資料，將診斷限制性位點藉由引入沉默突變且產生限制性核酸內切酶之識別位點而引入有效序列中。為獲得物理DNA鏈，進行基因合成(參見例如Wheeler等人，1995)。在該方法中，由所關注之基因來設計寡核苷酸使得一系列寡核苷酸源自於編碼鏈且另一系列來自於非編碼鏈。各寡核苷酸(除該列中頭一個與最後一個之外)之3'及5'末端始終展示兩種源自反向鏈之引子的互補序列。當將該等寡核苷酸置於適用於任何熱穩定聚合酶之反應緩衝液中且添加Mg2＋ 、dNTP及DNA聚合酶時，各寡核苷酸自其3'末端延伸。隨後使一引子之新近形成之3'末端與反向鏈之下一引子黏接且進一步在適用於模板依賴性DNA鏈延長之條件下延長其序列。將最終產物選殖於用於大腸桿菌(E.coli)增殖之習知載體中。
抗體產生為構建嵌合(亦即全大鼠V區域及人類C區域)及人類化抗EGFR輕鏈及重鏈表現載體，在可變區DNA序列之上游添加人類重鏈及輕鏈前導序列(用於分泌)。在可變區之下游，使用標準分子生物學技術添加重鏈之IgG1之恆定區及輕鏈之恆定區。在MPSV啟動子及合成polyA位點之上游之控制下將所得全部抗體重鏈及輕鏈DNA序列次選殖於哺乳動物表現載體中(一者用於輕鏈且另一者用於重鏈)，各載體攜帶EBV OriP序列。
藉由以哺乳動物抗體重鏈及輕鏈表現載體使用磷酸鈣轉染法共轉染HEK293－EBNA細胞來產生抗體。藉由磷酸鈣法轉染指數生長之HEK293－EBNA細胞。為產生未改良之抗體，僅使用抗體重鏈及輕鏈表現載體以1：1比率轉染該等細胞。為產生糖工程化抗體，分別使用四種質體(兩種用於抗體表現、一種用於融合GnTIII多肽表現且一種用於甘露糖苷酶II表現)以4：4：1：1之比率協同轉染該等細胞。使用補充以10% FCS之DMEM培養基使細胞生長成T燒瓶中之黏附性單層培養物且細胞當其為50%與80%長滿率之間時加以轉染。為轉染T75燒瓶，在轉染前24小時將8百萬個細胞接種於14 ml補充以FCS(最終為10% V/V)、250 μg/ml新黴素之DMEM培養基中且將細胞在37℃下置於具有5% CO2 氣氛之培養室中隔夜。對於欲轉染之各T75燒瓶，藉由混合47 μg輕鏈與重鏈表現載體平分之全部質體載體DNA、235 μl 1 M CaCl2 溶液且添加水至469 μl之最終體積來製備DNA、CaCl2 及水之溶液。將469 μl 50 mMHEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na2 HPO4 溶液在pH值7.05下添加至該溶液中，立即混合10秒且在室溫下靜置20秒。將懸浮液以12 ml補充以2% FCS之DMEM稀釋且添加至代替現有培養基之T75中。將該等細胞在37℃、5% CO2 下培育約17至20小時，隨後用12 ml DMEM、10% FCS替換培養基。轉染5至7天後收集改良性培養基，在1200 rpm下離心5分鐘，接著在4000 rpm下進行第二次離心10分鐘且保持在4℃。
藉由於Superdex 200管柱(Amersham Pharmacia)上進行蛋白質A親和性層析、接著陽離子交換層析及最終尺寸排除層析步驟以使緩衝液交換磷酸鹽緩衝液鹽水且收集純單體IgG1抗體來純化所分泌之抗體。使用分光光度計根據280 nm下之吸光率估算抗體濃度。將該等抗體調配於pH值為6.7之25 mM磷酸鉀、125 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸溶液中。
藉由使抗體表現載體與GnT－III糖基轉移酶表現載體一起共轉染或與GnT－III表現載體加上高基體甘露糖苷酶II表現載體一起共轉染來產生人類化抗體之糖工程化變異體。如以上對於非糖工程化抗體所述般純化且調配糖工程化抗體。藉由如下所述之MALDI/TOF－MS分析連接於抗體之Fc區域的寡醣。
寡醣分析藉由PNGaseF消化作用自抗體中酶促釋放寡醣且該等抗體得以固定於PVDF膜上或溶液中。
含有經釋放之寡醣之所得消化溶液得以直接製備用於MALDI/TOF－MS分析或在MALDI/TOF－MS分析之試樣製備之前進一步以EndoH糖苷酶消化。
PVDF膜固定化抗體之寡醣釋放方法將用PVDF(Immobilon P,Millipore,Bedford,Massachusetts)膜製成之96孔板之孔以100 μl甲醇潤濕且使用真空抽濾多聯裝置(Millipore,Bedford,Massachusetts)施加之真空抽吸該液體通過PVDF膜。將PVDF膜以300 μl水洗滌3次。隨後以50 μl RCM緩衝液(8 M尿素、360 mM Tris、3.2 mM EDTA、pH值為8.6)洗滌該等孔。將30－40 μg抗體裝填於含有10 μl RCM緩衝液之孔中。藉由施加真空抽吸孔中之液體通過該膜且隨後以50 μl RCM緩衝液洗滌該膜2次。藉由添加50 μl 0.1 M二硫蘇糖醇於RCM中且在37℃下培育1小時來還原雙硫橋。
繼還原之後，施加真空以自孔中移除二硫蘇糖醇溶液。以300 μl水洗滌該等孔3次，隨後藉由添加50 μl 0.1 M碘乙酸於RCM緩衝液中且在室溫下在黑暗中培育30分鐘來進行半胱胺酸殘基羧甲基化。
在羧甲基化之後，將該等孔以真空抽吸且隨後以300 μl水洗滌3次。隨後藉由在室溫下培育100 μl 1%聚乙烯吡咯啶酮360水溶液1小時來阻斷PVDF膜以防止吸附內切糖苷酶。然後藉由平緩真空移除阻斷試劑，接著以300 μl水洗滌3次。
藉由將2.5 mU肽－N－糖基酶F(重組性N－聚糖酶,GLYKO,Novato,CA)及0.1 mU唾液酸酶(GLYKO,Novato,CA)添加於pH為7.0之20 mM NaHCO3 中至25 μl之最終體積而釋放N－連接寡醣以移除任何潛在帶電單醣殘基。在37℃下消化3小時。
在溶液中抗體之寡醣釋放方法將40 μg至50 μg之抗體與2.5 mU PNGaseF(Glyko,U.S.A.)混合於2 mM Tris(pH 7.0)中至25微升之最終體積且將該混合液在37℃下培育3小時。
PNGaseF釋放之寡醣之內切糖苷酶H消化作用用於分配雜交二等分寡醣結構體至MALDI/TOF－MS中性寡醣峰值的用途隨後以內切糖苷酶H(EC 3.2.1.96)消化PNGaseF釋放之寡醣。對於EndoH消化作用，將15 mU EndoH(Roche,Switzerland)添加至PNGaseF消化物(以上溶液法中之抗體)中以提供30微升之最終體積且將混合物在37℃下培育3小時。EndoH於N－連接寡醣之殼二糖核心之N－乙醯葡萄胺糖殘基之間裂解。該酶僅可消化寡甘露糖及大多數混合型多醣，而並不水解複合物型寡醣。
MALDI/TOF－MS之試樣製備方法將含有經釋放之寡醣之酶水解物在添加乙酸至150 mM之最終濃度後在室溫下另外培育3小時且隨後通過填塞於微生物紡紗層析管柱(BioRad,Switzerland)中之0.6 ml陽離子交換樹脂(AG50W－X8樹脂，氫形式，100－200網目，BioRad,Switzerland)以移除陽離子及蛋白質。將1微升所得試樣塗覆於不銹鋼目標板上且與1 μl sDHB基質混合於該板上。藉由溶解2 mg 2,5－二羥基苯甲酸加上0.1 mg 5－甲氧基水楊酸於1 ml乙醇/10 mM氯化鈉水溶液1：1(v/v)中來製備sDHB基質。風乾該等試樣，塗覆0.2 μl乙醇且最後允許該等試樣在空氣下再結晶。
MALDI/TOF－MS用以獲取質譜之MALDI－TOF質譜儀為Voyager Elite(Perspective Biosystems)。以線性組態且在20 kV之加速度及80 ns延遲下運轉該儀器。使用寡醣標準之外部校準用於離子之質量數測定。統計200次雷射發射之波譜以獲得最終波譜。
抗原結合性檢定使用基於流式細胞量測術之檢定對經純化之單體人類化抗體變異體測試與A431人類表皮細胞株上之人類上皮生長因子受體(EGFR，亦在文獻中稱為HER－1或ErbB1)的結合性。將180 μl FACS緩衝液(含有2% FCS及5 mM EDTA之PBS)中之200,000個細胞(例如來自人類A431細胞株)轉移至5 ml聚苯乙烯管中且添加20 μl經10倍濃縮之抗EGFR抗體(一級抗體)試樣(1－5000 ng/ml最終濃度)或僅添加PBS。在稍微混合該等試樣之後，將該等管在4℃下在黑暗中培育30分鐘。隨後，將試樣以FACS緩衝液洗滌兩次且在300 x g下成團3分鐘。將上清液吸出且將細胞溶解於50 μl FACS緩衝液中且添加2 μl二級抗體(抗Fc特異性F(ab')2－FITC片段(Jackson Immuno Research Laboratories,USA))且將該等管在4℃下培育30分鐘。將試樣以FACS緩衝液洗滌兩次且溶解於500 μl FACS緩衝液中以用於流式細胞量測術分析。藉由繪製相對於抗體濃度之幾何平均螢光強度來確定結合性。
單體IgG1糖變異體與表現FcγRIIIA之CHO細胞株的結合性藉由使用編碼FcγRIIIA－Vall58 α－鏈及γ－鏈之表現載體進行電穿孔(280 V,950 μF,0.4 cm)來轉染CHO細胞。藉由添加6 μg/ml嘌呤黴素來選擇轉染子且藉由使用10 μl FITC－結合型－抗FcγRIII 3G8單株抗體(BD Biosciences,Allschwil/Switzerland)進行FACS來對106個細胞分析穩定純系。使IgG1與FcγRIIIA－Vall58－表現型CHO細胞結合。簡言之，以10 μg/ml之濃度添加抗FcγRIIIA 3G8 F(ab')2片段(Ancell,Bayport,MN/USA)以競爭結合抗體糖變異體(3 μg/ml)。於FACSCalibur(BD Biosciences,Allschwil/Switzerland)上測定關於結合型抗體變異體之螢光強度。
ADCC檢定將人類末梢血液單核細胞(PBMC)用作效應細胞且基本上根據製造商之用法說明書使用Histopaque－1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO63178 USA)製備。簡言之，使用肝素化注射器自健康志願者中獲取靜脈血。將血液使用PBS(不含Ca＋＋ 或Mg＋＋ )稀釋1：0.75－1.3且分層於Histopaque－1077上。將該梯度液在400 x g下在室溫(RT)下不間斷離心30分鐘。將含有PBMC之中間相收集且以PBS(來自兩種梯度之每細胞50 ml)洗滌且藉由在300 x g下在RT下離心10分鐘進行收集。在使用PBS使離心塊再懸浮之後，將PBMC計數且藉由在200 x g下在RT下離心10分鐘來洗滌2次。隨後將該等細胞再懸浮於適當培養基中以用於隨後程序。
用於ADCC檢定之效應因子與靶標之比率對於PBMC與NK細胞分別為25：1及10：1。於AIM－V培養基中以適當濃度製備效應細胞以便圓底96孔板之每孔上添加50 μl。靶標細胞為生長於含有10% FCS之DMEM中的人類EGFR表現型細胞(例如A431、EBC－1或LN229)。將靶標細胞於PBS中洗滌、計數且以每ml 30萬之量再懸浮於AIM－V中以便添加30,000個細胞於每微孔100 μl中。將抗體稀釋於AIM－V中，以50 μl添加至預先平鋪之靶標細胞中且允許與靶標在RT下結合10分鐘。隨後添加該等效應細胞且將該板在37℃下於含有5% CO2 之加濕氣氛中培育4小時。藉由使用細胞毒性偵測套組(Roche Diagnostics,Rotkreuz,Switzerland)量測受損細胞中之乳酸脫氫酶(LDH)釋放量來評估靶標細胞之致死率。在4小時培育之後，將該板在800 x g下離心。將100 μl來自各孔之上清液轉移至新透明平底96孔板上。每孔添加100 μl來自套組之有色受質緩衝液。於ELISA讀取器中在490 nm下歷時至少10分鐘使用SOFTmax PRO軟體(Molecular Devices,Sunnyvale,CA94089,USA)測定顯色反應之Vmax值。自僅含有靶標及效應細胞但無抗體之孔中量測自發性LDH釋放量。自僅含有靶標細胞及1% Triton X－100之孔中測定最大釋放量。特異性抗體所介導之致死率百分數計算如下：(x－SR)/(MR－SR)*100，其中x為在特異性抗體濃度下之Vmax平均值，SR為自發性釋放量之Vmax平均值且MR為最大釋放量之Vmax平均值。
實例2
結果及討論比較與嵌合ICR62輕鏈或人類化ICR62輕鏈(I－KA、I－KB或I－KC)複合的抗體變異體I－HHA、I－HHB、I－HHC、I－HLA、I－HLB、I－HLC、I－HLA1、I－HLA2、I－HLA3、I－HLA4、I－HLA5、I－HLA6、I－HLA7、I－HLA8、I－HLA－9、I－HHD、I－HHE、I－HHF及I－HHG及親本嵌合抗體ch－ICR62與人類EGF受體的結合性展示所有抗體具有不超過1對數單位之相似EC50值。僅I－HHA具有經強烈減弱之結合活性(參見圖2)。圖1展示個別嵌合ICR62(ch－ICR62)多肽鏈當分別與人類化構築體I－HHC及I－KB組合時之功能活性。在該實驗中，ch－ICR62之輕鏈、重鏈或兩種鏈同時替換為上述人類化構築體。其展示VH/VL介面形成似乎亦作用於齧齒動物抗體以及人類化構築體中。
如圖2中所示，人類化重鏈I－HHA不能恢復與I－KA或I－KB輕鏈之結合活性。因為I－HLA展示與I－KA與I－KB之結合性，所以本發明者推斷I－HHA之重鏈在抗原結合性中並不產生功能。圖1及圖2且連同圖3展示，輕鏈構築體I－KA、I－KB及I－KC展示與齧齒動物對應物不可區分之結合特性。變異體I－KC並不具有任何回復突變且另外具有其部分人類化之CDR1使得殘基24－29可源自於人類受體序列(如以上所提及之VK1之A30)。
在該等系列I－HHA、I－HHB及I－HHC中，僅後兩種變異體展示符合要求之結合特性(圖2及3)。I－HHA之序列分析揭示3個造成該特性之可能胺基酸殘基：Lys33、His35及Tyr50。Lys33替換為酪胺酸之構築體以及Tyr50替換為色胺酸之構築體展示良好結合性。僅當該等兩種殘基分別替換為丙胺酸及甘胺酸時結合性喪失。因為I－HHC並未展示比I－HHB更佳之結合性，所以本發明者推斷殘基Asn60、Glu61、Lys64及Ser65不必來源於齧齒動物；或其可分別替換為Ala、Glin、Gln及Gly。因為胺基酸位置60至65屬於Kabat CDR定義之一部分，但對於該抗體不必接枝齧齒動物供體殘基，所以該程序產生其中CDR2經更大程度人類化之構築體。
圖4及5對系列I－HLA1、1－HLA2、I－HLA3、I－HLA4、I－HLA5及I－HLA6之構築體進行比較。在具有約300 ng/ml之EC50值之構築體ch－ICR62、I－HLA1及IHLA2中觀察到最佳結合特性。其他構築體具有增加至兩倍之該值且因此具有稍微降低之結合活性。由此資料所得之第一個結論為在Kabat CDR1內允許Lys33Tyr及Ile34Met取代。該等兩個位置位於CDR1之Kabat定義內，但在Chothia CDR邊界(其基於結構性分析而非序列分析)外。在CDR1之後一部分中則允許至少某些混雜。
第二個結論為，在CDR2之內除上述由非供體殘基替換殘基Asn60及Glu61之外，在Kabat CDR內亦允許Asn60Ser、Glu61Pro及Lys62Ser非供體取代。該等殘基源自於用作FR3受體序列之人類生殖系IGHV5－51受體序列。構築體I－HLA3及I－HLA4僅僅藉由移除Phe27Tyr回復突變而不同於I－HLA1及I－HLA2且I－HLA3與I－HLA4構築體與其親本構築體相比喪失親和力。因此，比較I－HLA1、I－HLA2、I－HLA3、I－HLA4、I－HLA5及I－HLA6之第三個結論為Phe27直接或間接經由改良CDR1之環狀構形而涉及抗原結合性。
變異體I－HLA5及I－HLA6分別具有替換為具有天然存在之Phe27之另一生殖系受體序列(亦即IGHV1－58)的I－HLA1及I－HLA2之FR1。其僅可藉由同時引入若干其他以下突變而獲得：Val2Met、Ala9Pro及Ala16Thr。藉此再次消除(再)引入Phe27之有利效應。
評估I－HLA7構築體以確定與ICR62相比I－HLA6構築體之重鏈CDR1及CDR2中之其他供體殘基之修復是否將恢復全部結合活性。如圖6中所示，情況並非如此。
如圖7及8中所示，兩種其他構築體I－HLA8及I－HLA9經測試以確定與ch－ICR62相比是否可獲得全部結合活性。由I－HHB構築體起始，將Chothia CDR1區域內FR1區域替換為具有最大同源性之FR1區域。I－HLA8構築體具有IGHV1－58序列之FR1，I－HLA9具有IGHV5－51FR1區域。兩種構築體至少與ch－ICR62抗體同樣結合抗原。事實上，I－HLA8構築體可能更佳，其具有低2倍之EC50。I－HLA8構築體具有與I－HLA5及I－HLA6構築體相同之FR1序列，且因此具有相同非供體殘基(亦即Val2Met、Ala9Pro及Ala16Thr)，其表明該等非供體殘基之存在對結合性並不具有負面影響。發生於I－HLA5及I－HLA6中之非有利突變係由VH1 FR1與VH5 FR3成對組合所引起，其可能藉由具有相同VH家族之FR1及FR3而補償。
圖8中展示含有非供體殘基於CDRs內之構築體。由於非供體殘基出現於選作該等構築體之人類構架區中，因此該等構築體甚至在CDRs內進一步人類化。I－HHE(His35Ser)、I－HHF(Thr58Asn)及I－HHG(Ser57Ala)構築體皆具有1個人類化之殘基在CDR1或CDR2內(與I－HHB構築體相比)。亦檢定構築體I－HHD(Gly24Ala)。I－HHF展示降低之結合性，顯示Thr58之重要性。與Kabat CDR殘基58對比，因為Ser57Ala突變顯然對結合性無影響(圖8)，所以胺基酸57更可容忍取代。
因為IGHV5－51之FR3區域在I－HLA1及2構築體中似乎顯示有希望之性質，且同一生殖系(germ－line)序列之FR1已證明適用於I－HLA9構築體，所以IGHV5－51之FR1、FR2及FR3經設計一起用作環狀接枝之接受體。
人類化ICR62構築體中正規殘基分析之概要：VL：Kabat位置2：Ile可能需要。Kabat位置71：允許Ile或Phe。
VH：位置24，允許Gly、Thr、Ala、Val、Ser。位置26，允許Gly。位置29，允許Phe、Ile、Leu、Val、Ser。位置34，允許Ile、Met、Leu、Val、Trp、Tyr、Thr。位置71，允許Ala、Leu、Val、Thr。位置94，允許Arg、Gly、Asn、Lys、Ser、His、Thr、Ala。
ADCC實驗結果圖9展示嵌合ICR62抗體之各種糖型與人類化變異體I－HLA4之抗體介導型細胞毒性(ADCC)的比較。該等不同糖型藉由表明非糖工程化(WT)、糖型1(G1)或糖型2(G2)之標記物進行標記。"G1"係指抗體藉由與GnTIII共表現而進行之糖工程化。"G2"係指抗體藉由與GnTIII及ManII共表現而進行之糖工程化。"WT"係指未經糖工程化之抗體。所有人類化構築體之輕鏈為I－KC變異體且並未明確標記。
嵌合以及人類化抗體在其效能及功效上藉由兩種不同糖工程化法加以改良。ch－ICR62構築體表現稍微好過相應野生型或糖型之I－HLA4。如圖4所示，當比較兩種抗體對於其抗原之親和力時，ch－ICR62具有低兩倍之EC50值。親和力上之該差異此時差別反映於功效中。
圖10展示非糖工程化("野生型")與人類化ICR62抗體構築體I－HHB及I－HLA7之G2糖型之抗體介導型細胞毒性(ADCC)的比較。將相同抗體施加於兩種不同靶標細胞株上。在圖10之圖A中，使用靶標細胞株LN229；且在圖10之圖B中，使用細胞株A431。A431細胞比LN229細胞顯然更易受抗體介導型細胞致死之影響。更重要地，糖工程化增強兩種抗體之效能。該效應對於I－HLA7似乎比對於I－HHB更顯著。當使用LN229靶標細胞株時對於I－HHB，在最大抗體濃度下之細胞致死百分數可藉由引入G2糖工程化變異體自約30%移至約40%。當使用A431細胞株時，該值顯然不變。該特性對於I－HLA7抗體完全不同。藉由引入G2糖工程化變異體，對於LN229細胞在最大抗體濃度下之靶標細胞致死率自約10%移至約50%且對於A431細胞自約40%移至約70%。在該情況下，即使對於相對於I－HHB之I－HLA7在非糖工程化抗體中具有較低活性，但對於糖工程化抗體活性等級得以反轉。圖11及12亦展示嵌合ICR62及人類化ICR62抗體構築體I－HHB及I－HLA7之非糖工程化形式(WT)與G2糖型的比較。
實例3
藉由向獼猴靜脈內(快速)投藥之初步毒性試驗－－生物分析引言糖工程化抗EGFR檢定 該生物分析描述繼如以下本文中所闡明之方案中所述般靜脈內(快速)投與抗EGFR(由經具有如上所述之重鏈I－HHB及輕鏈I－KC基因之抗體表現載體轉染且經如上所述純化之哺乳動物培養細胞產生的重組性糖工程化抗EGFR抗體)之後抗EGFR在源自於獼猴之試樣中的量測。將總共78個猴血清試樣冷凍保存於約－20℃下直至使用。
用於測定抗EGFR之生物分析法使用ELISA法以量測抗EGFR之血清濃度。對於精確性及偏差，接受準則設定在±20%(±25%低QC)。
物質及方法目標：該試驗之目標為評估向獼猴靜脈內(快速)投與Glyco－mAb(抗EGFR)，接著進行8週恢復期之全身性毒性潛在性。
劑量水準選擇之基本原則對於人類試驗，1.5－7.5 mg/kg為預期範圍(7.5 mg/kg為人類中之類似化合物的相應劑量)。
組織學
免疫檢定程序將板以每孔100 μl經添加至11495 μl碳酸氫鹽緩衝液(0.05 M，pH 9.6)中之塗佈溶液(5 μl綿羊抗人類IgG(經猴吸附之IgG,the Binding Site,UK))塗佈且在室溫下培育近2小時。將該板以每孔400 μl洗液(PBS(Sigma Chemical Co.,UK)、0.01%(v/v)Triton－X100(Sigma Chemical Co.,UK))洗滌3次且放液乾燥。
以每孔200 μl添加檢定緩衝液(1% w/v BSA,Sigma Chemical Co.,UK)且在室溫下培育近1小時。將該板以每孔400 μl洗液洗滌3次且放液乾燥。
以每孔100 μl添加校準標準物、質量控制物(QC)及/或試樣且在室溫下培育近2小時，此後將該板以每孔400 μl洗液洗滌3次且放液乾燥。
以每孔100 μl添加結合溶液(6 μl添加至12 ml檢定緩衝液中之山羊抗人類IgG－HRP結合物(Bethyl Laboratories Inc.,USA))且在室溫下培育近1小時。將該板以每孔400 μl洗液洗滌3次且放液乾燥。
以每孔100 μl添加三甲基聯苯胺(TMB；Europa Bioproducts,Ely,UK)。將該板覆蓋且在室溫下培育近15分鐘。隨後將100 μl停止溶液(0.5 M HCl,Fisher,UK)添加至各孔中。用DYNATECH MRX微板讀取器(Mettler Instruments,UK)在450 nm(參考濾波器630 nm)下讀取吸光率。
結果及討論測試試樣分析藉由對78個根據本文中以上所述之方案所產生之猴血清試樣執行免疫檢定法(ELISA)來量測抗EGFR之濃度。該等結果呈現於下表19－21中。
表21繼在第1、8、15及22天靜脈內投與15 mg/kg抗EGFR之後，抗EGFR在猴血清中之血清濃度(μg/ml)(組3)
實例4
藉由向獼猴靜脈內(快速)投藥之初步毒性試驗－－毒物動力學概要在28天毒性研究之第1、8、15及22天向三組獼猴(每組1雄性及1雌性)靜脈內快速給藥投與抗EGFR以便評估動物對抗EGFR之全身性暴露。藉助於免疫檢定法測定在首次給藥後672小時收集之試樣中之抗EGFR的血清濃度。血清濃度－時間數據之藥物代謝動力學分析產生以下藥物代謝動力學參數：
血清抗EGFR濃度－時間曲線下之面積(AUC168 )與第1天之劑量水準之間的關係呈現如下：
猴對抗EGFR之全身性暴露之速率及程度(以AUC168 為特徵)隨著1.5至4.5毫克/公斤/時刻之劑量範圍內之劑量增加近乎成比例地增加，但在第1天4.5至12毫克/公斤/時刻之劑量範圍內超過成比例劑量增加。在最高劑量(12毫克/公斤/時刻)下，AUC168 比由線性關係所預測者高大約2.8倍。
雌性猴對抗EGFR之全身性暴露之程度(AUC168 )通常與雄性猴之暴露情況相似。
在反覆靜脈內給藥之後，抗EGFR之給藥前血清濃度通常比彼等在單次給藥之後的值高且指明在整個試驗期間抗EGFR積累於血清中。
不能對所有動物適當估算終半衰期，但其中可估算其處於32.5至63.1小時範圍內且看來似乎在雄性動物中隨劑量增加。在雄性及雌性猴中，抗EGFR之總血清清除率在1.5－4.5毫克/公斤/時刻之範圍以上似乎與劑量無關，但在最高劑量水準下降低。
總之，獼猴對抗EGFR之全身性暴露之程度似乎在1.5至12毫克/公斤/時刻之劑量範圍上在靜脈內毒性試驗之第1天以非線性(劑量依賴)動力學為特徵。使抗EGFR之劑量增加超過4.5毫克/公斤/時刻可能產生比將由線性關係所預測之全身性暴露更高之全身性暴露，其與用於消除抗EGFR之容量限制過程的可能情況一致。
此外，該試驗亦提供證據表明，通常在雄性猴與雌性猴對抗EGFR之全身性暴露中不存在差異且在反覆靜脈內投藥之後存在積累作用。
簡介在初步毒性試驗之第1、8、15及22天以1.5、4.5及12毫克/公斤/時刻之劑量水準藉由靜脈內快速注射向三個由1雄性及1雌性獼猴組成之測試組投與抗EGFR。在繼第1天投藥後之以下時點時自各動物中採集血樣：投藥後1、4、12、24、72及120小時。此外，在第8、15及22天給藥前及給藥後1小時及在第1天首次給藥之後672小時採集試樣。在藉由免疫檢定法分析抗EGFR之血清濃度前將經分離血清冷凍於大約－20℃下。
縮寫AUC 至無窮大時間之血清濃度－時間曲線下的面積AUC168 在168小時投藥間距期間之血清濃度－時間曲線下的面積BLQ 低於定量限制ca 大約CL 總血清清除率Cmax 血清濃度最大值F 雌性k 最終速率常數M 雄性t1/2 終半衰期Tmax Cmax出現之時間Vss 在穩態時分布體積
用於試驗之抗體如上所述產生、純化且表徵Glyco－mAb(抗EGFR)，其為一種經Fc工程化以增加Fc－FcγRIII受體結合親和力且增加ADCC之抗EGFR抗體。簡言之，藉由以質體DNA載體共轉染HEK－293－EBNA細胞以便表現I－HHB抗體重鏈、I－KC抗體輕鏈、GnT－III及ManII來產生抗體。使用如上所述之線性放大型轉染法轉染培養於代替T形燒瓶之滾瓶中之單細胞層。另一使用Q－瓊脂糖基質之流經式陰離子交換層析步驟包括於該純化過程中，隨後立即進行如上所述之尺寸排除式層析步驟。
如上所述使用酶促釋放之Fc衍生型寡醣之MALDI/TOF－MS質譜分析法分析Fc工程化抗體之糖基化模式。圖23中展示寡醣圖譜。
藉由如上所述分別使用A431及COS－7細胞進行全細胞結合及基於FACS之分析來證明與人類EGFR及猴EGFR之結合性。圖24及25中分別展示結合曲線。
如上所述使用全細胞與經工程化以表面表現人類FcγRIII之CHO細胞結合及基於FACS之分析來證明由施加Fc工程化所產生之FcγRIII受體結合性增加。圖26中展示結果。另外，工程化抗體具有對在別處(Ferrara,C.等人，J Biol Chem.2005年12月5日[E－publication ahead of print])所描述之"Glyco－2"抗體(Fc寡醣上之75%為非岩藻糖化型)相當程度的Fc工程化。相對於標準非Fc工程化抗體而言，該等Fc工程化抗體具有對於人類FcγRIII增加50倍之結合親和力(對於人類受體之158V及158F多形態變異體之平衡解離常數為15 nM及150 nM，對比之下，當與非Fc工程化人類IgG1抗體結合時，與相同受體變異體之平衡解離常數分別為750 nM及5000 nM)。
如上所述使用兩種靶標細胞株量測ADCC：A549人類肺癌細胞及CYNOM－K1獼猴角質細胞。圖27及28中分別展示結果。
數據處理使用電腦程式WinNonlin Pro version 3.3(Pharsight Corporation,USA)計算藥物代謝動力學參數。
作為該試驗之一部分所提供之所有血清濃度得以報導至4個有效數字或3個小數位。藥物代謝動力學參數報導如下：4個有效數字之Cmax、AUC168 、CL及Vss；4個小數位之k；1個小數位之。
將屬於BLQ(<0.195 μg/mL)之值算作零帶入藥物代謝動力學處理中。
毒物動力學抗EGFR之血清濃度最大值(Cmax)及其出現時間(Tmax)為觀測值。藉由線性梯形法則估算在168小時投藥間距內之血清抗EGFR濃度－時間曲線下的面積(AUC168 )。在計算AUC168 值時，藉由向後外推法基於頭兩個採樣時間使用對數線性回歸分析估算在零時之血清抗EGFR濃度，然而若血清濃度在此期間並不下降，則將在零時之血清濃度視為等於第一次採樣時間之濃度。藉由以下表達式估算至無窮大時間之血清抗EGFR濃度－時間曲線下的面積(AUC)：AUC＝AUC168 ＋Clast/k其中Clast為在最後可計量採樣點之預測血清濃度且k為最終速率常數。
藉由相對於時間擬合對數濃度之線性回歸來估算最終速率常數(k)。為估算視作可靠之k，規定以下標準：1.最終數據點顯然隨機分布在單直線周圍(目測)2.可獲得最少3個數據點用於回歸3.回歸係數0.95且所涉及之方差之分率0.904.包括選作回歸之數據點之間隔時間係大於本身半衰期至少兩倍
以ln2/k之方式計算終半衰期()。以劑量/AUC之方式計算總血清清除率(CL)。以劑量.AUMC/AUC2之方式計算在穩態時之分布體積(Vss)。以繼最後給藥(第22天)後之最低濃度與繼首次給藥(第1天)後之最低濃度的比率(亦即在672小時之血清濃度/在168小時(第8天給藥前)之濃度)來評估積累(R)。
結果及討論在毒性試驗期間，在第1天給藥後至多120小時採集血樣；在第8、15且22天給藥前及給藥後1小時及在第1天給藥後672小時採集血樣以便繼在試驗之第1、8、15及22天以1.5、4.5及12毫克/公斤/時刻之劑量水準靜脈內快速投與抗EGFR之後評估雄性及雌性猴對抗EGFR之全身性暴露。給藥後至多168小時所採集之試樣中之抗EGFR的血清濃度呈現於表27－29中且圖18及19中說明血清濃度－時間平均分布。
抗EGFR之藥物代謝動力學參數呈現於表50中且AUC168 值總結如下：
血清濃度最大值出現之時間(Tmax )通常為給藥後1小時(第一採樣點)，但在雌性2F462(4.5 mg/kg)及3F612(12 mg/kg)中出現在給藥後4小時(第二採樣點)。然而對於該等兩種雌性，在給藥後4小時之濃度與彼等在給藥後1小時之濃度極為相似且可能在檢定之變化性內。因此，Tmax中之表觀延遲不可能具有任何顯著性。
在除雄性2M461外之所有動物中在繼續給藥前之抗EGFR之血清濃度在第22天為可計量的(4.5毫克/公斤/時刻劑量水準)，因此通常在給藥間隔期間使動物連續暴露於可計量濃度之抗EGFR。
血清抗EGFR濃度－時間曲線下之面積(AUC168 )與第1天之劑量水準之間的關係呈現如下：
猴對抗EGFR之全身性暴露之速率及程度(以AUC168 為特徵)隨著1.5至4.5毫克/公斤/時刻之劑量範圍內之劑量增加近乎成比例地增加，但在第1天4.5至12毫克/公斤/時刻之劑量範圍內超過成比例劑量增加。在最高劑量(12毫克/公斤/時刻)下，AUC168 比由線性關係(圖20)所預測者高大約2.8倍。
雌性猴對抗EGFR之全身性暴露之程度(AUC168 )通常與雄性猴之暴露情況相似。
在反覆靜脈內給藥之後，抗EGFR之給藥前血清濃度通常比彼等在單次給藥之後的值高(圖21－22)且指明在整個試驗期間抗EGFR積累於血清中。除在最高給藥水準下之外，該積累通常在雌性中比在雄性中低。繼第22天最後給藥(第1天給藥後672小時)後之最低(給藥前)濃度與繼第1天首次給藥後之最低濃度的比率呈現於下表26中：
在第1天之抗EGFR之最終速率常數(k)及相應終半衰期()呈現於表30中。不能對所有動物適當估算終半衰期，但其中可估算其處於32.5至63.1小時範圍內且看來似乎在雄性動物中隨劑量增加。在雄性及雌性猴中，抗EGFR之總血清清除率在1.5－4.5毫克/公斤/時刻之範圍上似乎與劑量無關，但在最高劑量水準下降低。
總之，獼猴對抗EGFR之全身性暴露之程度似乎在1.5至12毫克/公斤/時刻之劑量範圍上在靜脈內毒性試驗之第1天以非線性(劑量依賴)動力學為特徵。使抗EGFR之劑量增加超過4.5毫克/公斤/時刻可能產生比將由線性關係所預測之全身性暴露更高之全身性暴露，其與用於消除抗EGFR之容量限制過程的可能情況一致。
此外，該試驗亦提供證據表明，通常在雄性猴與雌性猴對抗EGFR之全身性暴露中不存在差異且在反覆靜脈內投藥之後存在積累作用。
血液化學及血液學在第1、8、15及22天藉由靜脈內快速注射GlycoMAB向非洲綠猴投與抗EGFR，且自該等非洲綠猴之股靜脈中採集血樣。繼隔夜除去食物(未死)之後自未用於投藥之四肢中採集試樣。在第二次給藥後三天及結束時在預處理中使用肝素鋰作為抗凝劑對於以下參數檢驗試樣：鹼性磷酸酶丙胺酸胺基轉移酶天冬胺酸胺基轉移酶總膽紅素尿素肌酸酐葡萄糖總膽固醇甘油三酯鈉鉀氯鈣磷總蛋白蛋白質電泳圖白蛋白/球蛋白比
正常獼猴血液化學分析平均數據呈現於表31中。
在第1、8、15及22天向非洲綠猴藉由靜脈內快速注射GlycoMAB投與抗EGFR且自該非洲綠猴之股靜脈中採集血液學末梢血液分析的試樣。繼隔夜除去食物(未死)之後自未用於投藥之四肢中採集試樣。在第二次給藥後三天及結束時在預處理中對於以下參數檢驗試樣：1)使用EDTA作為抗凝劑－血容比血紅蛋白濃度紅血球計數網狀紅血球平均細胞血紅蛋白平均細胞血紅蛋白濃度平均細胞容積總白血球計數差異白血球計數血小板計數血液形態學異常紅血球大小不均小紅血球症大紅血球症染色過淺染色過深
2)使用檸檬酸鹽作為抗凝劑－凝血酶原時間活化部分凝血活酶時間
正常獼猴血液學分析平均數據呈現於表32中。
該等猴之生物化學累積個別值呈現於下表33a－h中：
該等猴之血液學累積個別值呈現於下表34a－1中：
微觀病理－－治療相關性發現在以12毫克/公斤/天給藥之雌性猴中報導出現膽管周圍炎(膽管四周之結締組織炎症)，但未出現於任何其他雌性或雄性猴中。該觀測結果可能與以Glyco－mAb(抗EGFR)進行治療有關，但對於該等小數目之動物而言顯著性不確定。將所有其他觀測結果視為偶然的且無毒理學顯著性。
肉眼病理學及組織病理學下表35中闡明所有經試驗之動物之組織病理學概要：
所有動物之個別觀測結果下表36中闡明個別動物之病理觀測：
獼猴之個別體重呈現於下表37中：
結論在注射部位不存在治療效應且無視為與以Glyco－mAb(抗EGFR)進行治療有關之臨床觀測結果。體重變化在正常預期範圍內。在宏觀檢定下不存在視為與治療有關之觀測結果且動物之器官重量在正常預期範圍內。總之，在無全身性毒性之清晰觀測結果的情況下，較佳允許以1.5、4.5或12毫克/公斤/時刻進行治療。
因為EGFR存在於各種正常組織(包括肝臟、腎臟及皮膚)之表面上，所以其不為腫瘤特異性靶標。預先向人類投與具有人類IgG1 Fc區域之抗EGFR抗體且展示可容忍之副作用概況(Vanhoefer,U.等人，Clin.Oncol.2004年1月1日；22(1)：175－84；Needle MN,Semin Oncol.2002年10月；29(5增刊14)：55－60)。顯而易見，由於可展示之相對於關鍵正常組織(諸如肝臟、腎臟及皮膚)經增強之致死活性，故將明顯關注向人類或其他哺乳動物投與具有經明顯增加之ADCC之抗EGFR抗體。本發明者令人驚訝地發現，向哺乳動物活體內投與如上所述經Fc工程化且具有至多1000倍ADCC活性增加之該抗EGFR抗體並不產生明顯毒性。使抗體濃度保持在每毫升1微克之上歷時至少4週(且對於某些動物保持在每毫升100微克之上)。對於抗體治療，該等暴露水準係典型的。在每毫升1微克之濃度下已獲得該試驗之抗體的最大ADCC。向人類癌症患者單次劑量投與40及100 mg劑量之抗EGFR抗體(親本大鼠ICR62抗體)展示特異性靶向活體內腫瘤(Modjtahedi,H.等人，Br J Cancer.1996年1月；73(2)：228－35)。獼猴效應細胞具有高度同源FcγRIII受體且展示以Fc工程化抗體(及以經糖工程化以便使非岩藻糖化寡醣於Fc區域中之水準增加的抗體)介導ADCC增強。ADCC水準增加與使用人類效應細胞(PBMC)所觀測之情況極為相似。
總而言之，發現可向哺乳動物投與經Fc工程化以便增加Fc－FcγRIII結合親和力且增加ADCC之抗EGFR抗體以提供超過每毫升血清1微克抗體之濃度歷時至少4週時間以便提供通常與抗體於活體內靶標細胞上之明顯積累相關聯的藥物暴露且不產生明顯毒性。
可使用任何本文中以上所述之方法及/或參數(例如血液化學值、組織病理學指示劑等)或以任何熟習此項技術者已知之方法量測且/或確定本發明之抗原結合分子的毒性。熟習此項技術者將毒性之臨床顯著性水準理解成超過由美國食品與藥品管理署(U.S.Food and Drug Administration)對於臨床上所投與者抗體之一般公認水準的水準。
實例5
輕鏈CDR之改良：確定特異性決定殘基使用如上所述之方法，由I－KC輕鏈可變區構築體(SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：45)產生抗EGFR輕鏈可變區變異體，其中在大鼠ICR62 CDR中之各種位置上編碼胺基酸殘基之序列經來自人類生殖系可變域基因序列之相應胺基酸殘基置換。其允許鑑別如上文中所論述作為與抗原相互作用之殘基且其中改良可對結合親和力有效的特異性決定殘基。表38展示產生於I－KC輕鏈可變區構築體(SEQ ID NO：45)之CDR內的取代：
除Y32W交換外，以上所鑑別之所有經取代之殘基源自於人類VK1_6受體序列，其中在SEQ ID NO：45中之位置32上相關人類生殖系序列之W由Y取代。
使I－KC變異體構築體(I－KC1至I－KC9)之每一者與包含構築體I－HHD(SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：15)之重鏈可變區成對且根據先前實例中所述之方法執行結合性檢定。將構築體I－KC1至I－KC9與I－KC構築體(SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：45)對於與A431靶標細胞中之EGFR之結合親和力進行比較(圖29及圖30)。如圖29所示，改良其相應人類序列之殘基34(N34G)而導致結合親和力稍微降低(EC50值增加10倍)。如圖30中所示，改良人類殘基之殘基50(N50T)亦導致結合親和力稍微降低。因此，該等數據表明I－KC抗EGFR輕鏈構築體之N34及N50為與抗原結合性有關之特異性決定殘基。所有其他構築體保持可與I－KC構築體(SEQ ID NO：45)相比較之結合活性(圖29及30)。
基於該等數據，對於人類化過程之CDR循環接枝而言，僅需要CDR之某些部分。舉例而言，對於I－KC構築體之CDR1，位置24至27及29至33不必由供體(例如ICR62)接枝。在CDR3中，F94殘基為大鼠ICR62抗體與最近人類生殖系對應物(VK1_6)之間的唯一差異且在保留結合親和力之情況下允許其與人類殘基之交換。因此，CDR3可藉由選擇適當受體VH及J序列而給予全人序列(例如CDR3無需循環接枝)。
因此，該等數據表明當與對於EGFR特異性之嵌合(例如人類化)重鏈構築體成對時，即使結合親和力與其中保留來自供體之特異性決定殘基之輕鏈相比稍微降低，該輕鏈可全部來自人類(例如來自人類輕鏈V基因序列)且仍保持對EGFR之特異結合性。
實例6
重鏈CDR之改良：確定特異性決定殘基使用如上所述之方法，由I－HHD輕鏈可變區構築體(SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：15)產生抗EGFR重鏈可變區變異體，其中在大鼠ICR62 CDR中之各種位置上編碼胺基酸殘基之序列經來自人類生殖系可變域基因序列(例如VH1_10、IGHV5_51)之相應Kabat位置上之胺基酸殘基置換。表39展示產生於I－HHD重鏈可變區構築體(SEQ ID NO：15)之CDR內的取代：
使I－HHD變異體構築體(I－HHD－1至I－HHD－11)之每一者與包含構築體I－KC(SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：45)之輕鏈可變區成對且根據先前實例中所述之方法執行結合性檢定。將構築體I－HHD－1至I－HHD－11與I－KC構築體(SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：45)對於與A431靶標細胞中之EGFR之結合親和力進行比較(圖31及32)。如圖31及32所示，Chothia CDR1之位置27上之殘基取代(F27G)(構築體I－HHD－1)及Chothia CDR1之位置28上之殘基取代(T28S)(構築體I－HHD－2)及Kabat CDR1之位置31之殘基取代(D31E)(構築體I－HHD－4)並未展示對抗原結合性之影響(亦即與I－HHD親本構築體相比保持抗原結合性)。同樣，Kabat CDR2之位置52a上之殘基取代(P52aA)(構築體I－HHD－6)及Kabat CDR2之位置53上之殘基取代(N53I)(構築體I－HHD－7)及Kabat CDR2之位置57之殘基取代(S57A)(構築體I－HHD－9)及Kabat CDR3之位置102之殘基取代(A102V)(構築體I－HHD－11)並未展示對抗原結合性之影響。
如圖31所示，相應人類殘基之Chothia CDR1之殘基29的改良(F29I)(構築體I－HHD－3)及相應人類殘基之Kabat CDR2之殘基52的改良(N52T)(構築體I－HHD－5)與I－HHD親本構築體相比各自導致結合親和力適度降低(EC50值增加2－3倍)。
如圖32中所示，相應人類殘基之Kabat CDR2之殘基56的改良(Y56T)(構築體I－HHD－8)及相應人類殘基之Kabat CDR3之殘基100b的改良(V100bG)(構築體I－HHD－10)與I－HHD親本構築體相比各自展示抗原結合親和力明顯降低(EC值增加10倍)。
因此，該等數據表明I－HHD抗EGFR重鏈構築體之F29及N52為對抗原結合性具有適度影響之特異性決定殘基。該等數據亦表明I－HHD抗EGFR重鏈構築體之Y56及V100b為對抗原結合性具有明顯影響之特異性決定殘基。
本說明書中所提及之諸如教科書，期刊文章、GenBank或其他序列資料庫條目，公開申請案及專利申請案之所有出版物係以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已特定地及個別地將各個公開案或專利申請案以引用的方式併入一般。
圖1展示單個嵌合大鼠－人類ICR62多肽重鏈及輕鏈當與人類化ICR62構築體I－HHC(重鏈)及I－KB(輕鏈)組合時之功能活性。rVL表示嵌合輕鏈且rV H表示嵌合重鏈。該"r"標示表明該等可變域係來自最初大鼠抗體。
圖2展示包含以各種組態成對之重鏈可變區構築體I－HHC、I－HHA及I－HLA與人類化輕鏈可變區構築體I－KA及I－KB之人類化ICR62抗體的結合活性。
圖3展示包含以各種組態成對之重鏈可變區構築體I－HLB、I－HLC及I－HLA與人類化輕鏈可變區構築體I－KA及I－KC之人類化ICR62抗體的結合活性。
圖4展示包含重鏈可變區構築體I－HLA2、I－HLA3及I－HLA4及人類化輕鏈可變區構築體I－KC之人類化ICR62抗體與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比的結合活性。
圖5展示包含重鏈可變區構築體I－HLA1、I－HLA3、I－HLA5及I－HLA6及人類化輕鏈可變區構築體I－KC之人類化ICR62抗體與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比的結合活性。
圖6展示包含重鏈可變區構築體I－HLA7、I－HLA6及I－HHB及人類化輕鏈可變區構築體I－KC之人類化ICR62抗體與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比的結合活性。
圖7展示包含重鏈可變區構築體I－HHF、I－HLA9及I－HLA8及人類化輕鏈可變區構築體I－KC之人類化ICR62抗體與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比的結合活性。
圖8展示包含重鏈可變區構築體I－HHB、I－HHD、I－HHG、I－HHF、I－HLA7及I－HLA9及人類化輕鏈可變區構築體I－KC之人類化抗體的結合活性。
圖9展示嵌合ICR62抗體之各種糖型與人類化變異體I－HLA4之抗體介導型細胞毒性(ADCC)的比較。"G1"係指抗體藉由與GnTIII共表現而進行糖工程化。"G2"係指抗體藉由與GnTIII及ManII共表現而進行糖工程化。"WT"係指未經糖工程化之抗體。人類化重鏈構築體與I－KC輕鏈構築體成對。
圖10展示人類化ICR62抗體構築體I－HHB及I－HLA7之未經糖工程化形式(WT)與G2糖型(亦即藉由與GnTIII及ManII共表現進行糖工程化)之ADCC的比較。將相同抗體施加於兩種不同靶標細胞株中：在圖A中，使用靶標細胞株LN229；在圖B中，使用細胞株A431。人類化重鏈構築體與I－KC輕鏈構築體成對。
圖11A及11B展示嵌合ICR62及人類化ICR62抗體構築體I－HHB及I－HLA7之未經糖工程化形式(WT)與G2糖型之ADCC的比較。使用靶標細胞株A431。人類化重鏈構築體與I－KC輕鏈構築體成對。
圖12展示嵌合ICR62與人類化ICR62抗體構築體I－HHB及I－HLA7之G2糖型之72小時ADCC的比較。人類化重鏈構築體與I－KC輕鏈構築體成對。
圖13展示人類化ICR62重鏈可變區構築體與大鼠ICR62序列相比之胺基酸序列比對。點表示胺基酸殘基在所給構築體內之所給位置上之一致性。
圖14展示使用展示重組性人類FcγRIIIa之CHO細胞的FcγRIIIa－Fc結合檢定。將糖工程化I－HHB/KC之人類化抗EGFRIgG1抗體與未經糖工程化(Wt)抗體相比較。
圖15展示經糖工程化人類化抗EGFRIgG1抗體I－HHB/KC之M ALD/TOF－MS寡醣圖譜。藉由使編碼具有GnTIII及高基體甘露糖苷酶II活性之酶的基因在產生抗體之細胞中過度表現所獲之糖工程化產生超過70%之非岩藻糖化Fc－Asn297－鍵聯型寡醣。
圖16展示用於1%猴血清基質(猴血清庫CMS25/31/33，由HLS提供)中抗EGFR之測定的抗EGFR精確圖譜(在校正範圍上n＝6個重複)。
圖17展示用於測定於1%猴血清基質中之抗EGFR之代表性抗EGFR校正曲線。
圖18展示在每週向雄性非洲綠猴靜脈內投與抗EGFR之第1天時抗EGFR之血清濃度。
圖19展示在每週向雌性非洲綠猴靜脈內投與抗EGFR之第1天時抗EGFR之血清濃度。
圖20展示在血清抗EGFR濃度－時間曲線下之面積(AUC168 )與在每週向非洲綠猴靜脈內投與抗EGFR之第1天時之劑量水準之間的關係。
圖21展示在每週向雄性非洲綠猴靜脈內投與抗EGFR期間抗EGFR之血清濃度。
圖22展示在每週向雌性非洲綠猴靜脈內投與抗EGFR期間抗EGFR之血清濃度。
圖23展示來自用於本文以下實例中所述之猴活體內試驗的Fc工程化(糖工程化)抗EGFR抗體之寡醣的MALDI/TOF－MS圖譜。
圖24展示表現於人類A431表皮樣癌細胞之表面上之EGFR的結合性。用於結合試驗之抗體為用於本文以下實例中所述之猴活體內試驗的Fc工程化抗EGFR抗體(I－HHB構築體)。
圖25展示表現於猴COS－7腎臟細胞之表面上之EGFR的結合性。所用抗體為抗EGFR抗體(I－HHB重鏈、I－KC輕鏈)。展示低人類EGFR表現性細胞MCF－7乳癌細胞之結合性而僅供參考。
圖26展示使用完整細胞(經工程化以於其表面上表現人類FcgRIIIa之CHO細胞)之Fc－FcγRIIIa結合性。所用抗體為用於本文以下實例中所述之猴活體內試驗的Fc工程化(糖工程化)抗EGFR抗體。展示非Fc工程化(未改良)之對照IgG1抗體之結合性以便對比。
圖27展示由Fc工程化(糖工程化)抗EGFR抗體所介導之ADCC。靶標細胞為A549人類肺癌細胞。展示非Fc工程化(未改良)形式之抗體之ADCC活性以便對比。使用A-549靶標(T)細胞進行4小時ADCC檢定。藉由基於LDH釋放之方法量測ADCC。效應因子(E)人類PBMC。E：T比=25：1。
圖28展示由Fc工程化(糖工程化)抗EGFR抗體所介導之ADCC。靶標細胞為CYNOM-K1獼猴角質細胞細胞株。展示非Fc工程化(未改良)形式之抗體之ADCC活性以便對比。使用CYNOM-K1靶標(T)細胞進行4小時ADCC檢定。藉由基於LDH釋放之方法量測ADCC。效應因子(E)人類PBMC。E：T比=25：1。
圖29展示各種基於與重鏈I-HHD構築體成對之I-KC構築體之輕鏈構築體變異體的EGFR靶向結合性。與A431靶標細胞之EGFR靶標結合性。
圖30展示各種基於與重鏈I-HHD構築體成對之I-KC構築體之輕鏈構築體變異體的EGFR靶向結合性。與A431靶標細胞(輕鏈變異體)之EGFR靶標結合性。
圖31展示各種基於與輕鏈I-KC構築體成對之I-HHD構築體之重鏈構築體變異體的EGFR靶向結合性。與A431靶標細胞(重鏈變異體)之EGFR靶標結合性。
圖32展示各種基於與輕鏈I-KC構築體成對之I-HHD構築體之重鏈構築體變異體的EGFR靶向結合性。與A431靶標細胞(重鏈變異體)之EGFR靶標結合性。
<110> 瑞士商克雷雅生物公司<120> 與上皮生長因子受體(EGFR)結合之抗原結合分子、編碼該抗原結合分子之載體及其用途<130> 1975.043003/TJS/T－M <140> 096129232 <141> 2007－08－8 <150> 60/836,371 <151> 2006－08－09 <160> 147 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1<211> 120 <212> PRT <213> 家鼠屬種<220> <223> ICR62 VH <400> 1<210> 2 <211> 359 <212> DNA <213> 家鼠屬種<220> <223> ICR62 VH <400> 2<210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 3<210> 4 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 4<210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 5<210> 6 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 6<210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 7 <210> 8 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 8<210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 9 <210> 10 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 10<210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 11 <210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 12<210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 13 <210> 14 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 14<210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 15 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 16<210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 17 <210> 18 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 18<210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 19 <210> 20 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 20<210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 21 <210> 22 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 22<210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 23 <210> 24 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 24<210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 25<210> 26 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 26<210> 27 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 27<210> 28 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 28<210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 29<210> 30 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 30<210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 31<210> 32 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 32<210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 33<210> 34 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 34 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 35<210> 36 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 36 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 37<210> 38 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 38 <210> 39 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 39<210> 40 <211> 360 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 40<210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> 智人<400> 41<210> 42 <211> 57 <212> DNA <213> 智人<400> 42<210> 43 <211> 108 <212> PRT <213> 家鼠屬種<220> <223> ICR62 VL <400> 43 <210> 44 <211> 324 <212> DNA <213> 家鼠屬種<220> <223> ICR62 VL <400> 44<210> 45 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 45 <210> 46 <211> 324 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 46<210> 47 <211> 22 <212> PRT <213> 智人<400> 47<210> 48 <211> 66 <212> DNA <213> 智人<400> 48<210> 49 <211> 109 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 49<210> 50 <211> 327 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 50 <210> 51 <211> 109 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 51<210> 52 <211> 327 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 52 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 53<210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 54<210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 55<210> 56 <211> 15 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 56<210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 57<210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 58<210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 59<210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 60<210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 61<210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 62<210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 63<210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 64<210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 65<210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 66<210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 67<210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 68<210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 69<210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 70<210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 71<210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 72<210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 73<210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 74<210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 75<210> 76 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 76<210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 77<210> 78 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 78<210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2K abat <400> 79<210> 80 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 80<210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 81<210> 82 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 82<210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 83<210> 84 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 84<210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 85<210> 86 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 86<210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 87<210> 88 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 88<210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 89<210> 90 <211> 51 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 90<210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 91<210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 92<210> 93 <211> 8<212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 93<210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 94<210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 95<210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 96<210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 97<210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 98<210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 99<210> 100 <211> 30<212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 100<210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 101<210> 102 <211> 30 <212> DNA <2l3> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 102<210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 103<210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 104<210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 105<210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR2 AbM<400> 106<210> 107 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR3 Kabat Chothia AbM <400> 107<210> 108 <211> 33 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈CDR3 Kabat Chothia AbM <400> 108<210> 109 <211> 328 <212> PRT <213> 智人<220> <223> IgG1恆定區<400> 109 <210> 110 <211> 987 <212> DNA <213> 智人<220> <223> IgG1恆定區<400> 110<210> 111 <211> 11<212> PRT <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 111<210> 112 <211> 33 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 112<210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 113<210> 114 <211> 33 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 114<210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR2 <400> 115<210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR2 <400> 116<210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR3 <400> 117<210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR2 <400> 118<210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> Kabat輕鏈CDR3 <400> 119<210> 120 <211> 361 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合DNA <400> 120 <210> 121 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 大鼠－人類嵌合多肽<400> 121<210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR1 <400> 122<210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR1 <400> 123<210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> AbM重鏈CDR1 <400> 124<210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> AbM重鏈CDR1 <400> 125<210> 126 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR2 <400> 126<210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR2 <400> 127<210> 128 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－1) <400> 128<210> 129 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－2) <400> 129 <210> 130 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－3) <400> 130 <210> 131 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－4) <400> 131<210> 132 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－5) <400> 132<210> 133 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－6) <400> 133 <210> 134 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－7) <400> 134<210> 135 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－8) <400> 135<210> 136 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－9) <400> 136 <210> 137 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－10) <400> 137<210> 138 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－HHD－11) <400> 138<210> 139 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KCl) <400> 139 <210> 140 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC2) <400> 140<210> 141 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC3) <400> 141<210> 142 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC4) <400> 142 <210> 143 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC5) <400> 143<210> 144 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC6) <400> 144 <210> 145 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC7) <400> 145 <210> 146 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC8) <400> 146<210> 147 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 嵌合大鼠－人類序列(I－KC9) <400> 147
(無元件符號說明)

Claims (115)

  1. 一種分離之多肽，其包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137及SEQ ID NO：138。
  2. 一種特異性結合EGFR之抗原結合分子，該抗原結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136及SEQ ID NO：138；及包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147。
  3. 如請求項2之抗原結合分子，其中該抗原結合分子為抗體。
  4. 如請求項2之抗原結合分子，其中該抗原結合分子為抗體片段。
  5. 如請求項4之抗原結合分子，其中該抗體片段係選自由以下組成之群：scFv片段、Fv片段、F(ab')2 片段、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體。
  6. 如請求項2之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 人類Fc區域。
  7. 如請求項6之抗原結合分子，其中該人類Fc區域為人類IgG Fc區域。
  8. 如請求項6之抗原結合分子，其中該抗原結合分子經糖工程化(glyco engineered)以修飾Fc區域之寡醣。
  9. 如請求項8之抗原結合分子，其中該Fc區域與未經糖工程化之抗原結合分子相比具有減少數目之海藻糖殘基(fucose residue)。
  10. 如請求項8之抗原結合分子，其中與未經糖工程化之抗原結合分子相比較，該經糖工程化之抗原結合分子在該Fc區中具有增加之GlcNAc殘基對海藻糖殘基之比率。
  11. 如請求項8之抗原結合分子，其中與未經糖工程化之抗原結合分子相比較，該Fc區具有增加比例之二等分寡醣(bisected oligosaccharide)。
  12. 如請求項8之抗原結合分子，其中該經修飾寡醣係二等分複合物(bisected complex)。
  13. 如請求項8之抗原結合分子，其中與未經糖工程化之抗原結合分子相比較，該經修飾寡醣在該抗原結合分子之Fc區中具有增加比例之二等分、非岩藻糖基化(nonfncdsylared)寡醣。
  14. 如請求項13之抗原結合分子，其中該二等分、非岩藻糖基化寡醣係雜交的。
  15. 如請求項13之抗原結合分子，其中該二等分、非岩藻糖基化寡醣係複合的。
  16. 如請求項8之抗原結合分子，其中該抗原結合分子與未經糖工程化之抗原結合分子相比具有增加之效應子功能(effector function)。
  17. 如請求項16之抗原結合分子，其中該增加之效應子功能係選自由以下組成之群：Fc介導型細胞毒性提高、與NK細胞之結合性提高、與巨噬細胞之結合性提高、與單核細胞之結合性提高、與多形核細胞之結合性提高、引導信號傳導誘發之細胞凋亡、樹突狀細胞成熟增加及T細胞引發性增加。
  18. 如請求項8之抗原結合分子，其中該抗原結合分子與未經糖工程化之抗原結合分子相比具有增加之Fc受體結合。
  19. 如請求項18之抗原結合分子，其中該Fc受體係Fc活化受體。
  20. 如請求項18之抗原結合分子，其中該Fc受體係FcγRIIIa受體。
  21. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少50%之寡醣係二等分的。
  22. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少70%之寡醣係二等分的。
  23. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少90%之寡醣係二等分的。
  24. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少50%之寡醣係非岩藻糖基化的。
  25. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少75%之寡醣係非岩藻糖基化的。
  26. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少90%之寡醣係非岩藻糖基化的。
  27. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少20%之寡醣係二等分及非岩藻糖基化的。
  28. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少35%之寡醣係二等分及非岩藻糖基化的。
  29. 如請求項6之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少70%之寡醣係二等分及非岩藻糖基化的。
  30. 一種組合物，其包含如請求項2之抗原結合分子及醫藥上可接受之載劑。
  31. 如請求項30之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  32. 一種專一性地結合EGFR之抗體，該抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136及SEQ ID NO：138；及包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147；及包含人類Fc區。
  33. 如請求項32之抗體，其中該抗體經糖工程化以修飾Fc區 域之寡醣。
  34. 如請求項33之抗體，其中該抗體與未經糖工程化之抗體相比，其在Fc區域具有減少數目之海藻糖殘基。
  35. 如請求項33之抗體，其中該抗體與未經糖工程化之抗體相比較，其在該Fc區中具有增加之GlcNAc殘基對海藻糖殘基之比率。
  36. 如請求項33之抗體，其中該抗體與未經糖工程化之抗體相比較，其Fc區具有增加比例之二等分寡醣。
  37. 如請求項33之抗體，其中該經修飾寡醣係二等分複合物。
  38. 如請求項33之抗體，其中與未經糖工程化之抗體相比較，該經修飾寡醣在Fc區中具有增加比例之二等分、非岩藻糖基化寡醣。
  39. 如請求項33之抗體，其中該二等分、非岩藻糖基化寡醣係雜交的。
  40. 如請求項33之抗體，其中該二等分、非岩藻糖基化寡醣係複合的。
  41. 如請求項33之抗體，其中該抗體與未經糖工程化之抗體相比具有增加之效應功能或增加之Fc受體結合。
  42. 如請求項32之抗體，其中在該Fc區中至少50%之寡醣係二等分的。
  43. 如請求項32之抗體，其中在該Fc區中至少50%之寡醣係非岩藻糖基化的。
  44. 如請求項32之抗體，其中在該Fc區中至少20%之寡醣係 二等分及非岩藻糖基化的。
  45. 如請求項32之抗體，其中當將該抗體以每毫升血清大於1微克之濃度投與哺乳動物個體時，該抗體在該個體中未引起臨床顯著程度之毒性。
  46. 一種抗原結合分子，其包含經工程化以具有增加之效應子功能之Fc區域，其係由包含以下之方法製造：(a)在允許生產抗原結合分子及修飾存在於抗原結合分子Fc區域之寡醣之條件下培養宿主細胞，該宿主細胞經工程化以表現至少編碼具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性之多肽之核酸；及(b)分離該抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136及SEQ ID NO：138；及包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147。
  47. 一種抗原結合分子，其包含經工程化以具有增加之Fc受體結合親和力之Fc區域，其係由包含以下之方法製造：(a)在允許生產抗原結合分子及修飾存在於抗原結合分子Fc區域之寡醣之條件下培養宿主細胞，該宿主細胞 經工程化以表現至少編碼具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性之多肽之核酸；及(b)分離該抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136及SEQ ID NO：138；及包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147。
  48. 如請求項46之抗原結合分子，其中該抗原結合分子為抗體。
  49. 如請求項46之抗原結合分子，其中該增加之效應子功能係選自由以下組成之群：Fc介導型細胞毒性提高、與NK細胞之結合性提高、與巨噬細胞之結合性提高、與單核細胞之結合性提高、與多形核細胞之結合性提高、引導信號傳導誘發之細胞凋亡、樹突狀細胞成熟增加及T細胞引發性增加。
  50. 如請求項49之抗原結合分子，其中該增加之效應子功能係與NK細胞之結合性提高。
  51. 如請求項46之抗原結合分子，其中該宿主細胞進一步經工程化以表現編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽之核 酸。
  52. 如請求項47之抗原結合分子，其中該抗原結合分子為抗體。
  53. 如請求項47之抗原結合分子，其中該Fc受體係Fc活化受體。
  54. 如請求項47之抗原結合分子，其中該Fc受體係FcγRIIIa受體。
  55. 如請求項47之抗原結合分子，其中該宿主細胞進一步經工程化以表現編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽之核酸。
  56. 一種分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1之多肽。
  57. 如請求項56之分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步編碼一個多肽，該多肽包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147。
  58. 一種載體，其包含如請求項56之聚核苷酸。
  59. 如請求項58之載體，其中該載體進一步包含編碼一個多肽之聚核苷酸，該多肽包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147。
  60. 如請求項58之載體，其中該載體係複製選殖載體。
  61. 如請求項58之載體，其中該載體係表現載體。
  62. 一種宿主細胞，其包含如請求項56之聚核苷酸或如請求項58之載體。
  63. 如請求項62之宿主細胞，其中該宿主細胞係經工程化以表現至少一個核酸，該核酸係編碼具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性之多肽。
  64. 如請求項63之宿主細胞，其中該宿主細胞進一步經工程化以表現至少一個核酸，該核酸係編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽。
  65. 一種生產能夠與大鼠ICR62單株抗體競爭結合於人類EGFR之抗原結合分子的方法，該方法包含：(a)將如請求項62之宿主細胞在允許表現該編碼該多肽之聚核苷酸的條件下在培養基中培養，該多肽包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137及SEQ ID NO：138，其中該多肽為一重鏈可變區，其為該抗原結合分子之一部份；及其中該抗原結合分子進一步包含一輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO： 144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147；及(b)回收該抗原結合分子。
  66. 一種宿主細胞，其包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸，其中該第一聚核苷酸編碼一多肽，該多肽包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137及SEQ ID NO：138；及其中該第二聚核苷酸編碼一多肽，該多肽包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：147。
  67. 如請求項66之宿主細胞，其中該宿主細胞係經工程化以表現至少一個核酸，該核酸係編碼具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性之多肽。
  68. 如請求項67之宿主細胞，其中該宿主細胞進一步經工程化以表現至少一個核酸，該核酸係編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽。
  69. 一種生產能夠與大鼠ICR62單株抗體競爭結合於人類EGFR之抗原結合分子的方法，該方法包含：(a)將如請求項66之宿主細胞在允許表現該第一聚核苷 酸及第二聚核苷酸的條件下在培養基中培養，其中該第一聚核苷編碼一重鏈可變區，該重鏈可變區為該抗原結合分子之一部份，及該第二聚核苷編碼一輕鏈可變區，該輕鏈可變區為該抗原結合分子之一部份；及(b)回收該抗原結合分子。
  70. 一種如請求項2至29及46至55中任一項之抗原結合分子或請求項32至45中任一項之抗體之用途，其係用於製造引發表現EGFR之腫瘤細胞溶裂之藥物，其中該抗原結合分子或抗體係用於以引發腫瘤細胞溶裂之有效量與腫瘤細胞接觸，且其中該抗原結合分子或抗體結合至表現於該腫瘤細胞的EGFR且能夠與ICR62抗體競爭結合EGFR。
  71. 如請求項70之用途，其中該抗原結合分子或抗體包含經糖基化設計之Fc區且具有增加之抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性。
  72. 如請求項71之用途，其中該抗原結合分子或抗體具有高達1000倍增加之ADCC活性。
  73. 如請求項70之用途，其中該腫瘤細胞呈現異常EGFR過度表現或異常增加之EGFR介導之訊號轉導。
  74. 如請求項70之用途，其中該抗原結合分子或抗體共軛至一標記，且其中該標記提供鑑別結合至EGFR之抗原結合分子或抗體之複合物之方法。
  75. 如請求項74之用途，其中該標記係選自由放射性標記、酶標記及螢光物標記所組成之群。
  76. 如請求項70之用途，其中該腫瘤細胞係選自由下列所組成之群：乳癌細胞、膀胱癌細胞、頭頸癌細胞、皮膚癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞、前列腺癌細胞、腎癌細胞及腦癌細胞。
  77. 如請求項70之用途，其中該藥物係用於投與需要之個體，且其中該藥物不會導致該個體之全身性毒性。
  78. 如請求項77之用途，其中該個體為人類。
  79. 如請求項70之用途，其中該藥物係用於投與有需要之個體，且其中該藥物不會導致該個體之肝毒性。
  80. 如請求項79之用途，其中該個體為人類。
  81. 如請求項70之用途，其中該量從約1.0mg/kg至約15mg/kg。
  82. 如請求項70之用途，其中該量從約1.5mg/kg至約4.5mg/kg。
  83. 如請求項70之用途，其中該抗原結合分子或抗體與治療劑結合，且其中該抗原結合分子或抗體將該治療劑遞送至腫瘤細胞。
  84. 如請求項83之用途，其中該治療劑係選自由下列所組成之群：治療藥物、毒素、放射線同位素、淋巴素及腫瘤抑制生長因子。
  85. 一種如請求項2至29及46至55中任一項之抗原結合分子或請求項32至45中任一項之抗體之用途，其係用於製造靶向個體中表現EGFR之細胞之藥物，其中該抗原結合分子或抗體結合細胞上表現之EGFR且能夠與ICR62抗體 競爭結合EGFR。
  86. 如請求項85之用途，其中投與該藥物導致該抗原結合分子或抗體之血清濃度為約1μg/ml至約500μg/ml達至少四星期之期間。
  87. 如請求項85之用途，其中該藥物用於與化學療法或放射療法併用。
  88. 如請求項85之用途，其中該細胞過度表現EGFR。
  89. 如請求項85之用途，其中該藥物之靶向作用係用於治療細胞增生疾病。
  90. 如請求項89之用途，其中該細胞增生疾病為癌症。
  91. 如請求項90之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群：乳癌、膀胱癌、頭頸癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌及腦癌。
  92. 如請求項85之用途，其中該藥物之靶向作用係用於診斷個體中特徵為EGFR表現之疾病。
  93. 一種如請求項2至29及46至55中任一項之抗原結合分子或請求項32至45中任一項之抗體之用途，其係用於製造於活體內或活體外偵測樣品中存在EGFR之偵測劑，其中該抗原結合分子或抗體係用於在允許該抗原結合分子或抗體與EGFR之間形成複合物之條件下與待測樣品(視情況與對照樣品)接觸；且其中藉由抗原結合分子-EGFR或抗體-EGFR錯合物之偵測指示EGFR之存在。
  94. 如請求項93之用途，其中該待測樣品包含呈現異常之EGRF過度表現或異常增加之EGFR-介導訊號轉導之細 胞。
  95. 如請求項93之用途，其中該抗原結合分子或抗體共軛至一標記，其中該標記提供鑑別結合至EGFR之抗原結合分子或抗體之複合物之方法。
  96. 如請求項95之用途，其中該標記係選自由放射性標記、酶標記及螢光物標記所組成之群。
  97. 如請求項93之用途，其中該待測樣品包含選自由下列所組成之群之腫瘤細胞：乳癌細胞、膀胱癌細胞、頭頸癌細胞、皮膚癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞、前列腺癌細胞、腎癌細胞及腦癌細胞。
  98. 如請求項93之用途，其中活體內之樣品係與該抗原結合分子或抗體接觸，且其中該抗原結合分子或抗體在活體內不會導致全身性毒性。
  99. 如請求項98之用途，其中該樣品為人類樣品。
  100. 如請求項93之用途，其中活體內之樣品係與該抗原結合分子或抗體接觸，且其中該抗原結合分子或抗體在活體被不會導致肝毒性。
  101. 如請求項100之用途，其中該樣品為人類樣品。
  102. 如請求項2至29及46至55中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子結合至一標記。
  103. 如請求項102之抗原結合分子，其中該標記係選自由放射性標記、酶標記及螢光物標記所組成之群。
  104. 如請求項2至29及46至55中任一項之抗原結合分子，其 中該抗原結合分子結合至一治療劑。
  105. 如請求項104之抗原結合分子，其中該治療劑係選自由下列所組成之群：治療藥物、毒素、淋巴素及腫瘤抑制生長因子。
  106. 如請求項2至29及46至55中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子結合至細胞毒性部分。
  107. 如請求項106之抗原結合分子，其中該細胞毒性部分係選自由下列所組成之群：細胞毒性藥物、酶促活性毒素、該毒素之酶促活性片段及放射性同位素。
  108. 如請求項2至29及46至55中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子結合至能夠將前藥轉化成細胞毒性藥物之酶。
  109. 如請求項32至45中任一項之抗體，其中該體結合至一標記。
  110. 如請求項109之抗體，其中該標記係選自由放射性標記、酶標記及螢光物標記所組成之群。
  111. 如請求項32至45中任一項之抗體，其中該抗體結合至一治療劑。
  112. 如請求項111之抗體，其中該治療劑係選自由下列所組成之群：治療藥物、毒素、淋巴素及腫瘤抑制生長因子。
  113. 如請求項32至45中任一項之抗體，其中該抗體結合至細胞毒性部分。
  114. 如請求項113之抗體，其中該細胞毒性部分係選自由下 列所組成之群：細胞毒性藥物、酶促活性毒素、該毒素之酶促活性片段及放射性同位素。
  115. 如請求項32至45中任一項之抗體，其中該抗體結合至能夠將前藥轉化成細胞毒性藥物之酶。
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