JP2021507690A - Il−2ムテインおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年8月23日に出願された米国仮出願第62/721,644号、2018年5月24日に出願された米国仮出願第62/675,972号、2017年12月6日に出願された米国仮出願第62/595,357号、2018年8月23日に出願された米国本出願第16/109,875号、および2018年8月23日に出願された米国本出願第16/109,897号の優先権を主張するものであり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(配列番号1)
成熟IL−2の野生型配列は次の通りである:
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(成熟IL−2配列)(配列番号2)
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATEIKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(配列番号3)
を含む。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHIQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(配列番号4)
を含む。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHIRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(配列番号5)
を含む。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFINRWITFSQSIISTLT(配列番号6)
を含む。
DKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号8)
を含む。
いくつかの実施形態において、Fc領域は、配列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号15)
を含む。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATEIKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号11)
を含む。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHIQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号12)
を含む。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHIRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号13)
を含む。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGISNHKNPRLARMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEALRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFINRWITFSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号14)
を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたタンパク質をコードするベクター、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。本明細書に記載されたタンパク質をコードする任意の核酸はベクターに含有されてもよく、ベクターは、例えば、宿主における増殖のための選択可能なマーカーおよび複製起点を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来するものなどの適切な転写または翻訳制御配列をさらに含む。そのような制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が標的タンパク質をコードするDNAと機能的に関連する場合、作動可能に連結されている。故に、プロモーターヌクレオチド配列が核酸分子の転写を指示するならば、プロモーターヌクレオチド配列は、核酸分子に作動可能に連結されている。
別の態様において、本実施形態は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される、本明細書に記載された治療的化合物(IL−2ムテイン)を含む組成物、例えば、薬学的に許容される組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、局部、局所、脊髄または皮膚投与(例えば、注射または点滴による)に適していてもよい。
本明細書に記載されたタンパク質は、患者が患っている状態を処置するのに有用な他の薬剤と併用して投与することもできる。そのような薬剤の例には、タンパク質性および非タンパク質性の両方の薬物が含まれる。複数の治療薬が共投与される場合、投与量は、関連する技術分野で認識されているように適宜調整され得る。「共投与」および併用療法は同時投与に限定されないが、患者への少なくとも1つの他の治療剤の投与を含む処置過程中に、Treg選択的IL−2タンパク質が少なくとも1回投与される治療レジメンも含む。
本明細書で言及される任意の疾患の「処置(treatment)」は、疾患の少なくとも1つの症状の軽減、疾患の重症度の低下、または、場合によっては疾患もしくは少なくとも1つの他の疾患に伴って起こり得るより重篤な症状への疾患進行の遅延もしくは予防を包含する。処置は、疾患が完全に治癒されることを意味する必要はない。有用な治療剤は、疾患の重症度を低下させ、疾患もしくはその処置に伴う症状の重症度を低下させ、または状態処置後に一定の頻度で生じ得るより重篤な症状もしくはより重篤な疾患の発症を遅延させる必要があるのみである。例えば、疾患が炎症性腸疾患であれば、治療剤は、腸内の明白な炎症部位の数、罹患した腸の総範囲を低減し、疼痛および/もしくは腫脹を低減し、下痢、便秘、または嘔吐などの症状を低減し、ならびに/または腸の穿孔を予防し得る。患者の状態は、バリウム注腸もしくは高位浣腸後に行われるx線、内視鏡検査、結腸内視鏡検査、および/または生検などの標準的な手法によって評価することができる。適切な手技は、患者の状態および症状に従って異なる。
1. 73、76、100、または138位に変異を含む、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド。
2. 変異が73、76、100、または138位のLからIへの変異である、実施形態1に記載のペプチド。
3. 49、51、55、57、68、89、91、94、108、および145位の1つまたは複数に変異をさらに含む、実施形態1に記載のペプチド。
4. E35、H36、Q42、D104、E115、もしくはQ146位の1つもしくは複数に変異をさらに含む、またはE35、H36、Q42、D104、E115、もしくはQ146の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは各々が野生型である、実施形態1に記載のペプチド。
5. 変異がE35Q、H36N、Q42E、D104N、E115Q、またはQ146Eの1つまたは複数である、実施形態4のペプチド。
6. N49S変異を含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のペプチド。
7. Y51SまたはY51H変異を含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のペプチド。
8. K55R変異を含む、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のペプチド。
9. T57A変異を含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のペプチド。
10. K68E変異を含む、実施形態1〜9のいずれか1つに記載のペプチド。
11. V89A変異を含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のペプチド。
12. N91R変異を含む、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のペプチド。
13. Q94P変異を含む、実施形態1〜12のいずれか1つに記載のペプチド。
14. N108DまたはN108R変異を含む、実施形態1〜13のいずれか1つに記載のペプチド。
15. C145AまたはC145S変異を含む、実施形態1〜14のいずれか1つに記載のペプチド。
15.1. V89A、Q94P、N108RまたはN108D、およびL73I、L76I、L100I、L118I変異の1つまたは複数、および場合によりC145AまたはC145S変異を含む、実施形態1〜15のいずれか1つに記載のペプチド。
16. 53、56、80、または118位に変異を含む、配列番号2のアミノ酸配列を含むペプチド。
17. 変異が53、56、80、または118位のLからIへの変異である、実施形態16のペプチド。
18. 29、31、35、37、48、69、71、74、88、および125位の1つまたは複数にさらに変異を含む、実施形態16または17に記載のペプチド。
19. E15、H16、Q22、D84、E95、もしくはQ126位の1つもしくは複数に変異をさらに含む、またはE15、H16、Q22、D84、E95、もしくはQ126位の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは各々が野生型である、実施形態16に記載のペプチド。
20. 変異がE15Q、H16N、Q22E、D84N、E95Q、またはQ126Eの1つまたは複数である、実施形態19に記載のペプチド。
21. N29S変異を含む、実施形態16〜20のいずれか1つに記載のペプチド。
22. Y31SまたはY51H変異を含む、実施形態16〜21のいずれか1つに記載のペプチド。
23. K35R変異を含む、実施形態16〜22のいずれか1つに記載のペプチド。
24. T37A変異を含む、実施形態16〜23のいずれか1つに記載のペプチド。
25. K48E変異を含む、実施形態16〜24のいずれか1つに記載のペプチド。
26. V69A変異を含む、実施形態16〜25のいずれか1つに記載のペプチド。
27. N71R変異を含む、実施形態16〜26のいずれか1つに記載のペプチド。
28. Q74P変異を含む、実施形態16〜27のいずれか1つに記載のペプチド。
29. N88DまたはN88R変異を含む、実施形態16〜28のいずれか1つに記載のペプチド。
30. C125AまたはC125S変異を含む、実施形態16〜29のいずれか1つに記載のペプチド。
31. V69A、Q74P、N88RまたはN88D、およびL53I、L56I、L80I、L118I変異の1つまたは複数、および場合によりC125AまたはC125S変異を含む、実施形態16〜30のいずれか1つに記載のペプチド。
32. 30、31、および/または35位に対応する変異を含まない、実施形態1〜31のいずれか1つに記載のペプチド。
33. Fcペプチドをさらに含む、実施形態1〜32のいずれか1つに記載のペプチド。
33A. Fcペプチドが、Kabatナンバリングを使用するとL247、L248、およびG250位に、またはEUナンバリングを使用するとL234、L235、およびG237位に変異を含む、実施形態33に記載のペプチド。
33B. Fcペプチドが、以下の変異:L247A、L248A、およびG250A(Kabatナンバリング)またはL234A L235A、およびG237A(EUナンバリング)を含む、実施形態33に記載のペプチド。
34. Fcペプチドが、配列番号8または配列番号15の配列を含む、実施形態33に記載のペプチド。
35. 配列番号1または配列番号2のペプチドおよびFcペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態1〜34のいずれか1つに記載のペプチド。
36. リンカーが、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSまたはGGGGSGGGGSGGGGSの配列を含む、実施形態35のペプチド。
37. 配列番号17〜43の配列を含む、実施形態1〜36のいずれか1つに記載のペプチド。
38. 配列番号27のアミノ酸配列を含むペプチド。
39. 配列番号7の配列を有するN末端リーダーペプチドをさらに含む、実施形態38に記載のペプチド。
40. C末端にリンカーペプチドをさらに含む、実施形態1に記載のペプチド。
41. リンカーペプチドが、(GGGGS)n(式中、nは1、2、3、または4である)の配列を含む、実施形態40のペプチド。
42. nが1である、実施形態41のペプチド。
43. nが2である、実施形態41のペプチド。
44. nが3である、実施形態41のペプチド。
45. nが4である、実施形態41のペプチド。
46. Fcペプチドをさらに含む、実施形態48〜45のいずれか1つに記載のペプチド。
47. Fcペプチドが、配列番号8または配列番号15の配列を含む、実施形態46のペプチド。
48. N末端に配列番号7の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、実施形態47のペプチド。
49. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのC末端にある、実施形態46のペプチド。
50. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのN末端にある、実施形態46のペプチド。
51. 配列番号27のペプチドおよびFcペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態1に記載のペプチド。
52. リンカーペプチドが、(GGGGS)n(nは1、2、3、または4である)である、実施形態51に記載のペプチド。
53. nが4である、実施形態52に記載のペプチド。
54. Fcペプチドが、配列番号8または配列番号15の配列を含む、実施形態51〜53に記載のペプチド。
55. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのC末端にある、実施形態51〜54に記載のペプチド。
56. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのN末端にある、実施形態51〜54に記載のペプチド。
57. 配列番号37、38、39、または40の配列を含むペプチドを含む、実施形態14に記載のペプチド。
58. 実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドを含む医薬組成物。
59. T制御性細胞を活性化する方法であって、T制御性細胞を実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む前記方法。
60. 対象における炎症性障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する工程を含む前記方法。
61. 炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症(MS)、喘息、COPD、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、I型糖尿病、甲状腺炎(例えば、グレーブス病)、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病(GVHD)、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応(例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等)、腎臓損傷、C型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、微小変化群、膜性腎症、ANCA関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、IgA腎症、ループス腎炎等である、実施形態60に記載の方法。
62. T制御性細胞におけるSTAT5リン酸化を促進または刺激する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する前記方法。
63. 炎症性障害の処置のための医薬品の製造における、実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物の使用。
64. 炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症(MS)、喘息、COPD、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、I型糖尿病、甲状腺炎(例えば、グレーブス病)、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病(GVHD)、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応(例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等)、腎臓損傷、C型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、微小変化群、膜性腎症、ANCA関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、IgA腎症、ループス腎炎等である、実施形態63に記載の使用。
65. 実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドをコードする核酸分子。
66. 実施形態65の核酸分子を含むベクター。
67. 実施形態65の核酸分子を含むプラスミド。
68. 実施形態65の核酸分子を含む細胞。
69. 実施形態67のプラスミドを含む細胞。
70. 実施形態66のベクターを含む細胞。
71. 実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは本明細書に記載されているペプチドを含むまたは発現する細胞。
ヒトIgG1 FcドメインにN末端(配列番号40)またはC末端(配列番号41)融合したヒトIL−2Mポリペプチドをコードする単一遺伝子を含有するpTT5ベクターを、HEK293 Expi細胞にトランスフェクトした。5〜7日後、IL−2Mを発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、0.22um濾過装置を通して濾過した。IL−2MをプロテインA樹脂に捕捉した。樹脂をPBS pH7.4で洗浄し、10分の1容量の1M Tris pH8.0を使用して中和しながら、0.25%酢酸、pH3.5を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を30mM HEPES 150mM NaCl pH7に緩衝液交換し、Superdex 200 3.2/300カラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。Bis−Tris 4−12%ゲルで還元および非還元SDS−PAGEによる精製材料5ugの分析を行った。IL−2Mは、サイズ排除クロマトグラフィーおよび還元/非還元SDS−PAGEによって示されたように、精製後に10mg/L以上で発現し、95%以上単分散した。
免疫吸着プレートを、PBS pH7.4中、濃度0.5μg/mL、75ul/ウェルのCD25でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを、0.05% Tween−20を含有するPBS pH7.4(洗浄緩衝液)で3回洗浄し、次いでPBS pH7.4中200ul/ウェル1% BSA(ブロック緩衝液)を用いて室温で2時間ブロックした。洗浄緩衝液で3回洗浄後、IL−2M分子を、1% BSAおよび0.05% Tween−20を含有するPBS(アッセイ緩衝液)中、最高濃度2nMで12倍連続希釈に希釈した。希釈材料を、室温で1時間、75ul/ウェルでCD25コートプレートに添加した。洗浄緩衝液で3回洗浄後、アッセイ緩衝液中0.05μg/mLに希釈したヤギビオチン化抗IL−2ポリクローナル抗体を、室温で1時間、75ul/ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で3回洗浄後、アッセイ緩衝液中1:5000で希釈したストレプトアビジンHRPを、室温で15分間、75ul/ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で3回、および洗浄緩衝液(tween−20なし)で1回洗浄後、アッセイをTMBで展開し、1N HCLで停止した。OD450nmを測定した。実験には、CD25の非存在下、プレート/ブロックへのIL−2M分子の非特異的結合に関する適当な対照、およびCD25に結合することができない陰性対照分子が含まれた。
末梢血単核細胞(PBMC)を、単離したばかりのヘパリン化ヒト全血からFICOLL−PAQUE PremiumおよびSepmateチューブを使用して製造した。野生型IL−2または実施例12のIL−2Mの存在下、PBMCを10%ウシ胎児血清RPMI培地で20分間培養し、次いでBD Cytofixで10分間固定した。
IL−2ムテイン変異体配列を、www「ドット」cbs 「ドット」dtu「ドット」dk/services/NetMHCIIpan/で見出すことができるNetMHCIIPan 3.2ソフトウェアを使用して分析した。人工ニューラルネットワークを使用してMHCクラスII対立遺伝子に対するペプチド親和性を決定した。その分析の中で、MHCクラスII分子との直接相互作用を有する可能性がある9残基ペプチドを結合コアとして認識した。結合に間接的に影響を与える可能性を有する、結合コアに隣接する残基もマスキング残基として調べた。MHCクラスII分子に対する予測KDが50nMより低い場合、結合コアおよびマスキング残基の両方を含むペプチドを強いバインダーとしてマークした。強いバインダーは、T細胞免疫原性を導入する可能性がより高まる。
ヒトIL−2MまたはヒトIgG1 FcドメインのN末端に融合したIL−2Mを有する単一IL−2M(IL−2ムテイン)配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40(およびIL−2M対照;配列番号34)ポリペプチドをコードする単一遺伝子を含有するpTT5ベクターを、HEK293 Expi細胞にトランスフェクトした。5〜7日後、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40(およびIL−2M対照;配列番号34)を発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、0.22um濾過装置を通して濾過した。配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40(およびIL−2M対照;配列番号34)をプロテインA樹脂に捕捉した。樹脂をPBS pH7.4で洗浄し、10分の1容量の1M Tris pH8.0を使用して中和しながら、0.25%酢酸、pH3.5を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を30mM HEPES 150mM NaCl pH7に緩衝液交換し、Superdex 200 3.2/300カラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。Bis−Tris 4〜12%ゲルで還元および非還元SDS−PAGEによる精製材料5ugの分析を行った。
免疫吸着プレートを、PBS pH7.4中、濃度0.5μg/mL、75ul/ウェルのCD25でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルを、0.05% Tween−20を含有するPBS pH7.4(洗浄緩衝液)で3回洗浄し、次いでPBS pH7.4中200ul/ウェル1% BSA(ブロック緩衝液)を用いて室温で2時間ブロックした。洗浄緩衝液で3回洗浄後、IL−2M配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40を、1% BSAおよび0.05% Tween−20を含有するPBS(アッセイ緩衝液)中、最高濃度2nMで12倍連続希釈に希釈した。希釈材料を、室温で1時間、75ul/ウェルでCD25コートプレートに添加した。洗浄緩衝液で3回洗浄後、アッセイ緩衝液中0.05μg/mLに希釈したヤギビオチン化抗IL−2ポリクローナル抗体を、室温で1時間、75ul/ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で3回洗浄後、アッセイ緩衝液中1:5000で希釈した高感受性ストレプトアビジンHRPを、室温で15分間、75ul/ウェルでプレートに添加した。洗浄緩衝液で3回、および洗浄緩衝液(tween−20なし)で1回洗浄後、アッセイをTMBで展開し、1N HCLで停止した。OD450nmを測定した。実験には、CD25の非存在下、プレート/ブロックへの分子の非特異的結合に関する適当な対照を含めた。結果は、2nM〜1.9pMで、実施例7のムテインはナノモル以下のEC50でCD25に結合できたことを示した。さらに、CD25がプレート表面に存在しなかった場合、テストした任意の濃度ではいかなる化合物も検出されず、テスト化合物がプレート表面と非特異的に相互作用していないことを示した。故に、実施例7のムテインは、CD25に結合することができる。
末梢血単核細胞(PBMC)を、単離したばかりのヘパリン化ヒト全血からFICOLL−PAQUE PremiumおよびSepmateチューブを使用して製造した。野生型IL−2または実施例7のムテインの存在下、PBMCを10%ウシ胎児血清RPMI培地で20分間培養し、次いでBD Cytofixで10分間固定した。固定した細胞を、BD Perm IIIおよび次いでBioLegend FOXP3透過処理緩衝液で連続的に透過処理した。ヒト血清を用いて10分間ブロックした後、細胞をホスホ−STAT5 FITC(CST)、CD25 PE、FOXP3 AF647およびCD4 PerCP Cy5.5(全てBD)対する抗体で30分間染色し、次いでプレートリーダーを備えたAttune NXTで取得を行った。実施例7のIL−2ムテインは、強力であり、Teffと比べてTregに対して選択性を有することが見出された。L118I変異を有するムテインは、他のムテインと比較して活性および選択性を増加させることが見出された。
ヒトCD34+ 造血幹細胞によりヒト化したNSGマウスをJackson Labsから購入した。0および7日目に、1ug IL−2ムテイン配列番号34または他のIL−2ムテイン配列番号37、配列番号38、配列番号39、もしくは配列番号40をマウスに皮下投与した。7日目にマウスを安楽死させ、全血および脾臓を回収した。全血を96ウェルのディープウェルプレートに等分し、BD Fix Lyseを使用して10分間固定した。70umフィルター(BD)を使用して脾細胞を単離し、BioLegend製RBC溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。2%ウシ胎児血清PBSで洗浄後、脾細胞を近赤外線生死染色(Invitrogen)で20分間標識し、次いでBioLegend固定化緩衝液を使用して20分間固定した。全血細胞および脾細胞の両方を、次いで、BioLegend FOXP3透過処理緩衝液を使用して透過処理し、ヒト血清でブロックし、ヒトCD8a FITC(BL)、ヒトCD25 PE(BD)、ヒトFOXP3 AF647(BD)、CD4 PerCP Cy5.5(BD)、ヒトSiglec−8 PE Cy7(BL)、ヒトCD3 BV421(BL)、ヒトCD45 BV605(BL)、ヒトCD56 BV785(BL)およびマウスCD45(BV711)に対する抗体で30分間染色し、プレートリーダーを備えたAttune NXTで取得を行った。
末梢血単核細胞(PBMC)を、単離したばかりのヘパリン化ヒト全血からFICOLL−PAQUE PremiumおよびSepmateチューブを使用して製造した。IL−2Mの存在下、PBMCを10%ウシ胎児血清RPMI培地で60分間培養した。細胞を次いで3回洗浄し、さらに3時間インキュベートした。細胞を、次いでBD Cytofixで10分間固定した。固定した細胞を、BD Perm IIIおよび次いでBioLegend FOXP3透過処理緩衝液で連続的に透過処理した。ヒト血清を用いて10分間ブロックした後、細胞をホスホ−STAT5 FITC、CD25 PE、FOXP3 AF647およびCD4 PerCP Cy5.5に対する抗体で30分間染色し、次いでプレートリーダーを備えたAttune NXTで取得を行った。実施例19の4つのIL−2ムテイン全てが、対照と比較してTregにおいて永続的なシグナル伝達を誘導したが、Teffでは誘導しなかった。配列番号40は、配列番号39、配列番号38または配列番号37より優れていた。これらの結果は、インビボでのより大きなTreg拡大をもたらし、低頻度投与を可能にしてTreg拡大を達成するはずの永続的および選択的なシグナル伝達を、IL−2がTregにおいて誘導し得ることを示している。
本明細書に提供されるL234A、L235A、およびG237A変異を含むFc領域に連結したV69A、Q74P、N88D、およびC125Sの変異、ならびに以下の変異L53I、L56I、L80I、またはL118Iの1つを有するIL−2ムテインを、HEK293 Expi細胞にpTT5ベクターをトランスフェクトして該ベクターで発現させた。IL−2ムテインを4GGGGSリピートを有するFc領域のN末端に連結した。5〜7日後、異なるIL−2ムテインを発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、0.22um濾過装置を通して濾過した。IL−2ムテインをプロテインA樹脂に捕捉した。樹脂をPBS pH7.4で洗浄し、10分の1容量の1M Tris pH8.0を使用して中和しながら、0.25%酢酸、pH3.5を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を30mM HEPES 150mM NaCl pH7に緩衝液交換し、目的とするピーク(POI)パーセントについてAdvanceBio SECカラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。結果は、種々のムテインが60mg/L以上で発現したことを示している。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーによって示されたように、L80IまたはL118I変異を有するムテインは90%超が単分散したが、L53IまたはL56I変異を有するムテインではそうならなかったことが、驚くべきことに見出された。故に、L80IまたはL118I置換を有するムテインは凝集が少なかった。4つの分子(L80I、L118I、L53I、およびL56Iを含むIL−2ムテイン)の間の凝集の差は、作製されている変異のタイプのために意外であった。したがって、L80IまたはL118I変異を有するムテインは、他のムテインほど凝集しないという点で他のムテインと比べて驚くべき利点を有する。
実施例12に記載したムテインを、効力についてインビトロアッセイで分析した。簡単には、PBMCをヘパリン化ヒト全血から単離し、37℃で30分間、一定濃度の種々のムテインを用いて刺激した。固定化によって刺激を停止した。透過処理後、細胞内FoxP3およびホスホ−STAT5レベルならびに表面CD4およびCD25発現についてPBMCを染色し、フローサイトメトリーによって分析した。制御性T細胞(Treg)およびエフェクターT細胞(Teff)を、それぞれCD4+CD25hiFoxP3+またはCD4+CD25loFoxP3−としてゲーティングした。ホスホ−STAT5について陽性染色した細胞の割合を示した。このアッセイは、Teffを刺激することなくTregを特異的に刺激するムテインの能力を測定した。各テスト物質の最適用量反応曲線を使用してEC50値を計算した。
V69A、Q74P、およびN88Dを有するIL−2ムテインを、異なる長さのGGGGSリピートを使用してL234A、L235AおよびG237A変異の変異を含むFc領域に融合させた。3および4つのGGGGSリピートを含むリンカーによりムテインのc末端を介してヒトIgG1 Fcのn末端に融合されたIL2−ムテイン分子をテストして、リンカーの長さがIL−2ムテインの効力に影響を与えるかどうかを決定した。単一GGGGSリピートによりムテインのn末端を介してヒトIgG1 Fcのc末端に融合されたムテインもテストした。簡単には、ヒトCD34+ 造血幹細胞で再構成したNod−Scid−IL−2Rガンマ欠損(NSG)マウスに、リンカー長が異なる種々のIL−2ムテインまたはビヒクル1マイクログラムを0日目に皮下注射した。7日目に、マウスを殺処分し、ヘパリンを含有するチューブへの心臓穿刺により血液を回収した。末梢血白血球(PBL)を赤血球の溶解によって単離し、ヒトマーカーCD45、CD3、CD8、CD4、FoxP3、CD25およびCD56に反応する抗体で染色した。ヒト制御性T細胞(Treg、CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3+)、活性化エフェクターT細胞(act Teff、CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3−)およびNK細胞(CD45+CD56+)の割合をフローサイトメトリーによって決定した。全CD45+、全CD4+および全CD8+細胞の頻度は変わらなかった。同様の結果がマウスの脾臓で観察された。
配列番号37、38、39、または40の配列を含むIL−2ムテインタンパク質を含む医薬組成物を、活動性関節リウマチ患者に投与した。IL−2ムテインは、患者における活動性関節リウマチを処置する上で有効であることが見出された。
配列番号37、38、39、または40の配列を含むIL−2ムテインタンパク質を含む医薬組成物を、活動性全身性エリテマトーデス患者に投与した。IL−2ムテインは、活動性全身性エリテマトーデスを処置する上で有効であることが見出された。
配列番号37、38、39、または40の配列を含むIL−2ムテインタンパク質を含む医薬組成物を、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病患者に投与した。IL−2ムテインは、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病を処置する上で有効であることが見出された。
6名の健康なドナー由来のヘパリン化全血からの精製PBMCを、配列番号39または40の配列を含むIL−2ムテインタンパク質の連続希釈物を用いて37℃で30分間処置した。細胞を固定し、洗浄し、透過処理し、洗浄した。表面マーカーおよび細胞内/核マーカー(pSTAT5およびFOXP3)の両方を検出する抗体で細胞を染色した。データをAttune NxTサイトメーターで回収した。Tregを、単核、シングレット、CD3pos、CD4pos、CD25hi、FoxP3posとしてゲーティングした。リン酸化STAT5を発現するゲーティングしたTregの割合を測定した。最適曲線をpSTAT5の用量反応にフィットさせ、EC50値を決定した。6名の全ドナーの平均EC50値を、配列番号39のIL−2(37.26±7.30;n=16)および配列番号40のIL−2(23.11±5.35;n=15)について決定した。データは、IL−2ムテインがヒトTregにおいてpSTAT5を誘導できることを示した。配列番号40の配列を含むIL−2は配列番号39を含むIL−2配列より強力であったが、両方とも細胞の複数の集団にわたって活性であった。
3匹の健康なサル由来のヘパリン化全血からの精製PBMCを、配列番号39または40の配列を含むIL−2ムテインタンパク質の連続希釈物を用いて37℃で30分間処置した。蛍光色素コンジュゲート抗CD25および抗CD4を、IL−2ムテイン処置の最後の30分間に添加した。細胞を固定し、洗浄し、透過処理し、洗浄した。表面マーカーおよび細胞内/核マーカー(pSTAT5およびFOXP3)の両方を検出する残りの抗体で細胞を染色した。データをAttune NxTサイトメーターで回収した。Tregを単核、シングレット、CD4pos、CD25hi、FoxP3posとしてゲーティングした。リン酸化STAT5を発現するゲーティングしたTregの割合を測定した。IL−2ムテインは、サルにおいてpSTAT5を誘導することが見出された。
静脈全血をサル(カニクイザル)から、配列番号39または40のIL−2ムテインを投与する前(2時点/匹、5匹)、および配列番号39(5時点/匹、2匹)または配列番号40(5時点/匹、3匹)のどちらかを投与した後でK2EDTAチューブに回収した。試料を2つに分け、2つのFACSパネルについて別々に染色した。1つは「Tregパネル」であり、1つは一般的な免疫表現型検査パネルであった。RBCを溶解し、固定化および透過処理後に表面および細胞内マーカーについて細胞を染色した。FAC分析のために、全細胞/ulの数をADVIAによって決定した。所与の下位集団/ulの細胞数を、次いで総数/ulおよび全細胞に対する割合で計算した。「投与前からの倍数変化」が決定されるように、サルごとに2回の投与前採血の所与の細胞タイプ/ulの平均数を平均し、投与後採血を正規化するのに使用した。血清サイトカインおよびケモカインを分析するために、K2EDTA全血からの血漿を試験の終了まで凍結した。ケモカインおよびサイトカイン量を、基準対照の連続希釈物を使用してマルチプレックスMSDアッセイによって定量化した。MCP−1およびIP−10の平均および範囲を投与前採血で決定した。両方のムテインが、サルにおいてTregを拡大し、Treg増殖を誘導することが見出された。これらの結果は、ヒトと類似したインビボ動物モデルでIL−2ムテインが機能することを示している。また、どちらの分子も、サル(非ヒト霊長類)においてTconv細胞、CD4細胞(Tnaive)またはCD8細胞(細胞傷害性T)、NK細胞を有意に拡大しないことも見出された。また、どちらの分子も、血清ケモカインを有意に誘導しないことも見出された。このデータは、IL−2ムテインが、他の経路を不要に拡大または活性化することなくTreg細胞を拡大し、Treg細胞増殖を誘導できることを示している。故に、IL−2ムテインは、Treg拡大および増殖に関して驚くほど強力であり、有効であり、選択的である。
1. 73、76、100、または138位に変異を含む、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド。
2. 変異が73、76、100、または138位のLからIへの変異である、実施形態1に記載のペプチド。
3. 49、51、55、57、68、89、91、94、108、および145位の1つまたは複数に変異をさらに含む、実施形態1に記載のペプチド。
4. E35、H36、Q42、D104、E115、もしくはQ146位の1つもしくは複数に変異をさらに含む、またはE35、H36、Q42、D104、E115、もしくはQ146の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは各々が野生型である、実施形態1に記載のペプチド。
5. 変異がE35Q、H36N、Q42E、D104N、E115Q、またはQ146Eの1つまたは複数である、実施形態4のペプチド。
6. N49S変異を含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のペプチド。
7. Y51SまたはY51H変異を含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のペプチド。
8. K55R変異を含む、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のペプチド。
9. T57A変異を含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のペプチド。
10. K68E変異を含む、実施形態1〜9のいずれか1つに記載のペプチド。
11. V89A変異を含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のペプチド。
12. N91R変異を含む、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のペプチド。
13. Q94P変異を含む、実施形態1〜12のいずれか1つに記載のペプチド。
14. N108DまたはN108R変異を含む、実施形態1〜13のいずれか1つに記載のペプチド。
15. C145AまたはC145S変異を含む、実施形態1〜14のいずれか1つに記載のペプチド。
15.1. V89A、Q94P、N108RまたはN108D、およびL73I、L76I、L100I、L118I変異の1つまたは複数、および場合によりC145AまたはC145S変異を含む、実施形態1〜15のいずれか1つに記載のペプチド。
16. 53、56、80、または118位に変異を含む、配列番号2のアミノ酸配列を含むペプチド。
17. 変異が53、56、80、または118位のLからIへの変異である、実施形態16のペプチド。
18. 29、31、35、37、48、69、71、74、88、および125位の1つまたは複数にさらに変異を含む、実施形態16または17に記載のペプチド。
19. E15、H16、Q22、D84、E95、もしくはQ126位の1つもしくは複数に変異をさらに含む、またはE15、H16、Q22、D84、E95、もしくはQ126位の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは各々が野生型である、実施形態16に記載のペプチド。
20. 変異がE15Q、H16N、Q22E、D84N、E95Q、またはQ126Eの1つまたは複数である、実施形態19に記載のペプチド。
21. N29S変異を含む、実施形態16〜20のいずれか1つに記載のペプチド。
22. Y31SまたはY51H変異を含む、実施形態16〜21のいずれか1つに記載のペプチド。
23. K35R変異を含む、実施形態16〜22のいずれか1つに記載のペプチド。
24. T37A変異を含む、実施形態16〜23のいずれか1つに記載のペプチド。
25. K48E変異を含む、実施形態16〜24のいずれか1つに記載のペプチド。
26. V69A変異を含む、実施形態16〜25のいずれか1つに記載のペプチド。
27. N71R変異を含む、実施形態16〜26のいずれか1つに記載のペプチド。
28. Q74P変異を含む、実施形態16〜27のいずれか1つに記載のペプチド。
29. N88DまたはN88R変異を含む、実施形態16〜28のいずれか1つに記載のペプチド。
30. C125AまたはC125S変異を含む、実施形態16〜29のいずれか1つに
記載のペプチド。
31. V69A、Q74P、N88RまたはN88D、およびL53I、L56I、L80I、L118I変異の1つまたは複数、および場合によりC125AまたはC125S変異を含む、実施形態16〜30のいずれか1つに記載のペプチド。
32. 30、31、および/または35位に対応する変異を含まない、実施形態1〜31のいずれか1つに記載のペプチド。
33. Fcペプチドをさらに含む、実施形態1〜32のいずれか1つに記載のペプチド。
33A. Fcペプチドが、Kabatナンバリングを使用するとL247、L248、およびG250位に、またはEUナンバリングを使用するとL234、L235、およびG237位に変異を含む、実施形態33に記載のペプチド。
33B. Fcペプチドが、以下の変異:L247A、L248A、およびG250A(Kabatナンバリング)またはL234A L235A、およびG237A(EUナンバリング)を含む、実施形態33に記載のペプチド。
34. Fcペプチドが、配列番号8または配列番号15の配列を含む、実施形態33に記載のペプチド。
35. 配列番号1または配列番号2のペプチドおよびFcペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態1〜34のいずれか1つに記載のペプチド。
36. リンカーが、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号9)またはGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号16)の配列を含む、実施形態35のペプチド。
37. 配列番号17〜43の配列を含む、実施形態1〜36のいずれか1つに記載のペプチド。
38. 配列番号27のアミノ酸配列を含むペプチド。
39. 配列番号7の配列を有するN末端リーダーペプチドをさらに含む、実施形態38に記載のペプチド。
40. C末端にリンカーペプチドをさらに含む、実施形態1に記載のペプチド。
41. リンカーペプチドが、(GGGGS)n(配列番号10)(式中、nは1、2、3、または4である)の配列を含む、実施形態40のペプチド。
42. nが1である、実施形態41のペプチド。
43. nが2である、実施形態41のペプチド。
44. nが3である、実施形態41のペプチド。
45. nが4である、実施形態41のペプチド。
46. Fcペプチドをさらに含む、実施形態48〜45のいずれか1つに記載のペプチド。
47. Fcペプチドが、配列番号8または配列番号15の配列を含む、実施形態46のペプチド。
48. N末端に配列番号7の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、実施形態47のペプチド。
49. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのC末端にある、実施形態46のペプチド。
50. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのN末端にある、実施形態46のペプチド。
51. 配列番号27のペプチドおよびFcペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、実施形態1に記載のペプチド。
52. リンカーペプチドが、(GGGGS)n(配列番号10)(nは1、2、3、または4である)である、実施形態51に記載のペプチド。
53. nが4である、実施形態52に記載のペプチド。
54. Fcペプチドが、配列番号8または配列番号15の配列を含む、実施形態51〜53に記載のペプチド。
55. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのC末端にある、実施形態51〜54に記載のペプチド。
56. Fcペプチドが、配列番号27を含むペプチドのN末端にある、実施形態51〜54に記載のペプチド。
57. 配列番号37、38、39、または40の配列を含むペプチドを含む、実施形態14に記載のペプチド。
58. 実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドを含む医薬組成物。
59. T制御性細胞を活性化する方法であって、T制御性細胞を実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む前記方法。
60. 対象における炎症性障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する工程を含む前記方法。
61. 炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症(MS)、喘息、COPD、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、I型糖尿病、甲状腺炎(例えば、グレーブス病)、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病(GVHD)、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応(例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等)、腎臓損傷、C型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、微小変化群、膜性腎症、ANCA関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、IgA腎症、ループス腎炎等である、実施形態60に記載の方法。
62. T制御性細胞におけるSTAT5リン酸化を促進または刺激する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する前記方法。
63. 炎症性障害の処置のための医薬品の製造における、実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは実施形態58に記載の医薬組成物の使用。
64. 炎症性障害が、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾
癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スチル病、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症(MS)、喘息、COPD、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、I型糖尿病、甲状腺炎(例えば、グレーブス病)、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病(GVHD)、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応(例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等)、腎臓損傷、C型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、微小変化群、膜性腎症、ANCA関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、IgA腎症、ループス腎炎等である、実施形態63に記載の使用。
65. 実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドをコードする核酸分子。
66. 実施形態65の核酸分子を含むベクター。
67. 実施形態65の核酸分子を含むプラスミド。
68. 実施形態65の核酸分子を含む細胞。
69. 実施形態67のプラスミドを含む細胞。
70. 実施形態66のベクターを含む細胞。
71. 実施形態1〜57のいずれか1つに記載のペプチドまたは本明細書に記載されているペプチドを含むまたは発現する細胞。
本明細書に提供されるL234A、L235A、およびG237A変異を含むFc領域に連結したV69A、Q74P、N88D、およびC125Sの変異、ならびに以下の変異L53I、L56I、L80I、またはL118Iの1つを有するIL−2ムテインを、HEK293 Expi細胞にpTT5ベクターをトランスフェクトして該ベクターで発現させた。IL−2ムテインを4GGGGS(配列番号10)リピートを有するFc領
域のN末端に連結した。5〜7日後、異なるIL−2ムテインを発現する細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄化し、0.22um濾過装置を通して濾過した。IL−2ムテインをプロテインA樹脂に捕捉した。樹脂をPBS pH7.4で洗浄し、10分の1容量の1M Tris pH8.0を使用して中和しながら、0.25%酢酸、pH3.5を使用して捕捉タンパク質を溶出した。タンパク質を30mM HEPES 150mM NaCl pH7に緩衝液交換し、目的とするピーク(POI)パーセントについてAdvanceBio SECカラムでサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。結果は、種々のムテインが60mg/L以上で発現したことを示している。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーによって示されたように、L80IまたはL118I変異を有するムテインは90%超が単分散したが、L53IまたはL56I変異を有するムテインではそうならなかったことが、驚くべきことに見出された。故に、L80IまたはL118I置換を有するムテインは凝集が少なかった。4つの分子(L80I、L118I、L53I、およびL56Iを含むIL−2ムテイン)の間の凝集の差は、作製されている変異のタイプのために意外であった。したがって、L80IまたはL118I変異を有するムテインは、他のムテインほど凝集しないという点で他のムテインと比べて驚くべき利点を有する。
V69A、Q74P、およびN88Dを有するIL−2ムテインを、異なる長さのGGGGS(配列番号10)リピートを使用してL234A、L235AおよびG237A変
異の変異を含むFc領域に融合させた。3および4つのGGGGS(配列番号10)リピートを含むリンカーによりムテインのc末端を介してヒトIgG1 Fcのn末端に融合されたIL2−ムテイン分子をテストして、リンカーの長さがIL−2ムテインの効力に影響を与えるかどうかを決定した。単一GGGGS(配列番号10)リピートによりムテインのn末端を介してヒトIgG1 Fcのc末端に融合されたムテインもテストした。簡単には、ヒトCD34+ 造血幹細胞で再構成したNod−Scid−IL−2Rガンマ欠損(NSG)マウスに、リンカー長が異なる種々のIL−2ムテインまたはビヒクル1マイクログラムを0日目に皮下注射した。7日目に、マウスを殺処分し、ヘパリンを含有するチューブへの心臓穿刺により血液を回収した。末梢血白血球(PBL)を赤血球の溶解によって単離し、ヒトマーカーCD45、CD3、CD8、CD4、FoxP3、CD25およびCD56に反応する抗体で染色した。ヒト制御性T細胞(Treg、CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3+)、活性化エフェクターT細胞(act Teff、CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3−)およびNK細胞(CD45+CD56+)の割合をフローサイトメトリーによって決定した。全CD45+、全CD4+および全CD8+細胞の頻度は変わらなかった。同様の結果がマウスの脾臓で観察された。
Claims (63)
- 配列番号27のアミノ酸配列を含むペプチド。
- 配列番号7の配列を有するN末端リーダーペプチドをさらに含む、請求項1に記載のペプチド。
- C末端にリンカーペプチドをさらに含む、請求項1に記載のペプチド。
- リンカーペプチドは、(GGGGS)n(式中、nは1、2、3、または4である)の配列を含む、請求項3に記載のペプチド。
- nは1である、請求項4に記載のペプチド。
- nは2である、請求項4に記載のペプチド。
- nは3である、請求項4に記載のペプチド。
- nは4である、請求項4に記載のペプチド。
- Fcペプチドをさらに含む、請求項1に記載のペプチド。
- Fcペプチドは、配列番号8または配列番号15の配列を含む、請求項9に記載のペプチド。
- N末端に配列番号7の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項9に記載のペプチド。
- FcペプチドはC末端にある、請求項9に記載のペプチド。
- FcペプチドはN末端にある、請求項9に記載のペプチド。
- 配列番号27のペプチドおよびFcペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、請求項1に記載のペプチド。
- N末端に配列番号7の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項14に記載のペプチド。
- リンカーペプチドは、(GGGGS)n(nは1、2、3、または4である)である、請求項14に記載のペプチド。
- nは4である、請求項16に記載のペプチド。
- Fcペプチドは、配列番号8または配列番号15の配列を含む、請求項14に記載のペプチド。
- FcペプチドはC末端にある、請求項14に記載のペプチド。
- FcペプチドはN末端にある、請求項14に記載のペプチド。
- 配列番号40の配列を含むペプチドを含む、請求項14に記載のペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項14に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項19に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項24に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 配列番号26のアミノ酸配列を含むペプチド。
- 配列番号7の配列を有するN末端リーダーペプチドをさらに含む、請求項16に記載のペプチド。
- C末端にリンカーペプチドをさらに含む、請求項26に記載のペプチド。
- リンカーペプチドは、(GGGGS)n(式中、nは1、2、3、または4である)の配列を含む、請求項28に記載のペプチド。
- nは1である、請求項29に記載のペプチド。
- nは2である、請求項29に記載のペプチド。
- nは3である、請求項29に記載のペプチド。
- nは4である、請求項29に記載のペプチド。
- Fcペプチドをさらに含む、請求項26に記載のペプチド。
- Fcペプチドは、配列番号8または配列番号15の配列を含む、請求項34に記載のペプチド。
- N末端に配列番号7の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項34に記載のペプチド。
- FcペプチドはC末端にある、請求項34に記載のペプチド。
- FcペプチドはN末端にある、請求項34に記載のペプチド。
- 配列番号26のペプチドおよびFcペプチドを連結するリンカーペプチドをさらに含む、請求項26に記載のペプチド。
- N末端に配列番号7の配列を有するリーダーペプチドをさらに含む、請求項39に記載のペプチド。
- リンカーペプチドは、(GGGGS)n(nは1、2、3、または4である)である、請求項49に記載のペプチド。
- nは4である、請求項41に記載のペプチド。
- Fcペプチドは、配列番号8または配列番号15の配列を含む、請求項39に記載のペプチド。
- FcペプチドはC末端にある、請求項39に記載のペプチド。
- FcペプチドはN末端にある、請求項39に記載のペプチド。
- 配列番号39の配列を含むペプチドを含む、請求項39に記載のペプチド。
- 請求項25に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項39に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項43に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項46に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- T制御性細胞を活性化する方法であって、T制御性細胞を請求項1〜46のいずれか1項に記載のペプチドまたは請求項47〜50のいずれか1項に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む前記方法。
- 対象における炎症性障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項1〜47のいずれか1項に記載のペプチドまたは請求項48〜50のいずれか1項に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する工程を含む前記方法。
- 炎症性障害は、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、乾癬、ループス、移植片対宿主病(GVHD)、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、スチル病、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症(MS)、喘息、COPD、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、I型糖尿病、甲状腺炎(例えば、グレーブス病)、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応(例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等)、腎臓損傷、C型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、微小変化群、膜性腎症、ANCA関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、IgA腎症、ループス腎炎等である、請求項52に記載の方法。
- T制御性細胞におけるSTAT5リン酸化を促進または刺激する方法であって、それを必要とする対象に、請求項1〜47のいずれか1項に記載のペプチドまたは請求項48〜50のいずれか1項に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を投与する前記方法。
- 炎症性障害の処置のための医薬品の製造における、請求項1〜47のいずれか1項に記載のペプチドまたは請求項48〜50のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
- 炎症性障害は、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、乾癬、ループス、移植片対宿主病(GVHD)、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性、腱付着部症、関節症症候群)、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、スチル病、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症(MS)、喘息、COPD、副鼻腔炎、ポリープを伴う副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー病、I型糖尿病、甲状腺炎(例えば、グレーブス病)、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ステロイド抵抗性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応(例えば腎臓、肺、心臓、皮膚、等)、腎臓損傷、C型肝炎誘発性血管炎、自然妊娠喪失、脱毛症、白斑、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、微小変化群、膜性腎症、ANCA関連糸球体腎症、膜性増殖性糸球体腎症、IgA腎症、ループス腎炎等である、請求項55に記載の使用。
- 請求項1〜47のいずれか1項に記載のペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項57に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項57に記載の核酸分子を含むプラスミド。
- 請求項57に記載の核酸分子を含む細胞。
- 請求項59に記載のプラスミドを含む細胞。
- 請求項58に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項1〜47のいずれか1項に記載のペプチドまたは本明細書に記載されているペプチドを含むまたは発現する細胞。
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