TW202144569A

TW202144569A - 用於調節免疫細胞中精胺酸含量之方法及組合物

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Publication number: TW202144569A
Application number: TW110105930A
Authority: TW
Inventors: 國鳴張
Original assignee: 香港商天麗國際有限公司
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2021-12-01
Also published as: JP2023515806A; US20230265386A1; CN115427553A; KR20220157396A; CA3171901A1; WO2021164753A1; EP4107254A1; BR112022016571A2; AU2021223138A1; AR121392A1; IL295606A; MX2022010280A

Abstract

本文揭示遺傳修飾T細胞及CAR-T細胞，該等遺傳修飾T細胞及CAR-T細胞例如藉由過度表現胺基酸轉運體，尤其精胺酸轉運體而具有提高處理必需胺基酸精胺酸之能力。此類遺傳修飾T細胞及CAR-T細胞因其具有提高處理精胺酸之能力而可能更好地存活於時常敵意的腫瘤微環境。本文所述之方法及組合物用於增加可用於T細胞之精胺酸的量。本文所述之方法及組合物亦用於增加可用於CAR-T細胞之精胺酸的量，因此提供可藉由存活於該腫瘤微環境而有效治療實體腫瘤的CAR-T細胞。

Description

用於調節免疫細胞中精胺酸含量之方法及組合物

本發明係關於用於調節免疫細胞中精胺酸含量之組合物及方法，以例如延長腫瘤微環境中之細胞存活。

嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法已成為癌症治療之重大突破。在CAR-T療法中，收穫患者之T細胞且經基因工程改造以產生結合特異性預先選擇之抗原，例如癌細胞上之跨膜受體的CAR。將CAR-T細胞再引入患者身體中，從而允許其攻擊預先確定的目標，例如癌細胞。在CAR受體與其目標抗原結合之後，CAR-T細胞變得活化且發起對呈遞目標抗原之細胞的免疫反應。CAR-T細胞療法已成功誘發患者反應，且在一些情況下，使先前未能對標準治療作出反應之患者得以緩解。舉例而言，已證實在一些形式之白血病中，CAR-T療法之緩解率高達94%。

現有CAR-T細胞療法當前僅批准用於血液癌症。目前市面上存在兩種FDA批准的CAR-T細胞療法，威爾瑞(替沙津魯(tisagenlecleucel))及伊斯卡他(阿基侖賽(axicabtagene ciloleucel))，其在若干專門研究醫院中用於治療血液惡性病。此等治療已在若干個體中引起完全且持久的緩解，包括患有先前對標準治療方案具有抗性之癌症的個體。

先前CAR發展聚焦於靶向B淋巴細胞抗原CD19，一種將細胞質傳訊蛋白質募集至膜且降低B細胞受體傳訊路徑之臨限值的跨膜蛋白。由於此等必要功能，CD19在所有B細胞上普遍存在且用作由B細胞引起之惡性病，尤其B細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病及慢性淋巴球性白血病的生物標記物。已靶向CAR-T療法之其他域為CD22——在成熟B細胞表面上發現的糖結合跨膜蛋白，CD123——在急性骨髓性白血病亞型之間表現之介白素3傳遞素，及B細胞成熟抗原——腫瘤壞死因子受體超家族之細胞表面受體，其識別與多種白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤相關之B細胞活化因子。

實體腫瘤之腫瘤微環境(TME)對所有效應T細胞，包括經工程改造CAR-T細胞具有敵意。TME內之免疫抑制訊息及必需營養素的短缺導致T細胞衰竭。因此，CAR-T細胞穿透TME且在其中發揮作用的能力仍有限。

因此，需要對TME之攻擊具有抗性且能夠在TME內之癌細胞破壞方面發揮作用的CAR-T細胞及包含CAR-T細胞之醫藥組合物。亦需要用CAR-T細胞及包含CAR-T細胞之醫藥組合物有效治療癌症之方法，該等CAR-T細胞在此類患者難以用其他形式之癌症治療或其他CAR-T細胞治療方法治療之情況下有效誘導患者反應及緩解。此外，需要藉由投與有效破壞TME內之癌細胞而不經歷耗竭的優良CAR-T細胞來治療癌症之方法。

本發明至少部分地係關於表現胺基酸轉運蛋白，例如精胺酸轉運蛋白，及特異性結合目標細胞上之細胞表面抗原的CAR的T細胞。此類CAR-T細胞適用於治療惡性病，諸如癌症。本文所述之遺傳修飾T細胞及表現載體與例如未經歷遺傳修飾之T細胞群體相比在腫瘤微環境及資源耗乏型，例如精胺酸耗乏微環境中可具有增強之穩固性及/或存活。所述遺傳修飾T細胞及表現載體適用於治療癌症及需要將T細胞靶向至特異性細胞群體之其他疾病。

在另一態樣中，本發明係關於表現胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞。胺基酸轉運體可為重組胺基酸轉運體核苷酸序列之產物。本文所述之經遺傳修飾以表現或過度表現胺基酸轉運體的T細胞與例如未經遺傳修飾以表現或過度表現胺基酸轉運體之T細胞群體相比在腫瘤微環境及資源耗乏，例如精胺酸耗乏微環境中可具有增強之穩固性及/或存活。所述遺傳修飾T細胞及表現載體適用於治療癌症及需要將T細胞靶向至特異性細胞群體或需要增強之T細胞穩固性以便在一或多種胺基酸(例如精胺酸)耗乏之生物環境中存活的其他疾病。

在一個態樣中，本文揭示一種遺傳修飾T細胞，其經遺傳修飾以表現精胺酸轉運體及嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR具有至少一個特異性結合在目標細胞群體、跨膜域及胞內傳訊域上呈現之細胞表面抗原的抗原特異性靶向區。在一些實施例中，CAR具有至少一個特異性結合在目標細胞群體、跨膜域、至少一個共同刺激域及胞內傳訊域上呈現之細胞表面抗原的抗原特異性靶向區。

本文亦描述表現載體，其包括編碼CAR及/或胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核苷酸序列。在一些實施例中，本文所述之表現載體的轉錄使得產生編碼CAR及/或胺基酸轉運體(例如精胺酸轉運體核苷酸序列)之核糖核酸(RNA)，例如信使RNA (mRNA)序列。在一些實施例中，本文所述之表現載體能夠表現CAR及/或胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼抗原特異性靶向區、跨膜域、視情況至少一個共同刺激域、胞內傳訊域及精胺酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼抗原特異性靶向區、跨膜域、視情況至少一個共同刺激域及胞內傳訊域之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼精胺酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼抗原特異性靶向區、跨膜域、視情況至少一個共同刺激域、胞內傳訊域及胺基酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼胺基酸轉運體之經分離核酸序列。

本文亦描述表現載體，其包括編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核苷酸序列。在一些實施例中，本文所述之表現載體的轉錄使得產生編碼胺基酸轉運體(例如精胺酸轉運體核苷酸序列)之核糖核酸(RNA)，例如信使RNA (mRNA)序列。在一些實施例中，本文所述之表現載體能夠表現胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼精胺酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼精胺酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼胺基酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文描述一種表現載體，其包含編碼胺基酸轉運體之經分離核酸序列。在本文所述之實施例中，核酸序列可為例如核糖核酸(RNA)序列、去氧核糖核酸(DNA)序列或混合式DNA及RNA序列。

在一些實施例中，本文所述之表現載體包含編碼CAR及胺基酸轉運體之核苷酸序列，其中該等CAR及胺基酸轉運體核苷酸序列轉錄成獨立mRNA轉錄物。在一些實施例中，本文所述之表現載體包含編碼CAR及胺基酸轉運體之核苷酸序列，其中該等CAR及胺基酸轉運體核苷酸序列一起轉錄成單一mRNA轉錄物。在CAR及胺基酸轉運體核苷酸序列一起轉錄成單一mRNA轉錄物的實施例中，編碼CAR及胺基酸轉運體mRNA轉錄物之表現載體核苷酸序列可包括內部核糖體入口序列(IRES)。在一些實施例中，IRES安置於編碼CAR之核苷酸序列部分與編碼胺基酸轉運體之核苷酸序列部分之間。因此，在實施例中，CAR核苷酸序列及胺基酸轉運體核苷酸序列由IRES序列隔開。在CAR及胺基酸轉運體核苷酸序列一起轉錄成單一mRNA轉錄物的實施例中，編碼CAR及胺基酸轉運體mRNA轉錄物之表現載體核苷酸序列可包括安置於編碼CAR之核苷酸序列部分與編碼胺基酸轉運體之核苷酸序列部分之間的2A自裂解序列。因此，在一些實施例中，CAR核苷酸序列及胺基酸轉運體核苷酸序列由2A自裂解序列隔開。在一些實施例中，使由包括CAR核苷酸序列、2A自裂解序列及胺基酸轉運體核苷酸序列之mRNA轉譯的肽在2A自裂解位點轉譯之後裂解。

本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由表現載體編碼之CAR。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由表現載體編碼之CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由表現載體編碼之胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由第一表現載體編碼之CAR，及由第二表現載體編碼之胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。在本文所述之實施例中，由表現載體編碼之CAR可包括抗原特異性靶向區、跨膜域、視情況至少一個共同刺激域及胞內傳訊域。經修飾以表現由表現載體編碼的胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞可包括經修飾以表現重組胺基酸轉運體，例如重組精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞。

本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由病毒衍生之轉殖基因編碼的CAR。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由病毒衍生之轉殖基因編碼的CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由病毒衍生之轉殖基因編碼的胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由第一病毒衍生之轉殖基因編碼的CAR，及由第二病毒衍生之轉殖基因編碼的胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體。在本文所述之實施例中，由病毒衍生之轉殖基因編碼的CAR可包括抗原特異性靶向區、跨膜域、視情況至少一個共同刺激域及胞內傳訊域。經修飾以表現由病毒衍生之轉殖基因編碼的胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞可包括經修飾以表現重組胺基酸轉運體，例如重組精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞。

本文所述之遺傳修飾T細胞可表現特異性精胺酸轉運體。在一些實施例中，精胺酸轉運體包含單一精胺酸轉運蛋白。在一些實施例中，精胺酸轉運體包含兩種精胺酸轉運蛋白。舉例而言，本文所述之遺傳修飾T細胞可表現選自由以下組成之群的精胺酸轉運體：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ ，或其組合。

在一些實施例中，本文所述之表現載體包含編碼精胺酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文所述之表現載體包含兩種或更多種編碼共同包含精胺酸轉運體之蛋白質的經分離核酸序列。在一些實施例中，精胺酸轉運體核酸序列選自由以下之核酸序列組成之群：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ ，或其組合。

在一些實施例中，本文所述之病毒衍生之轉殖基因包含編碼精胺酸轉運體之經分離核酸序列。在一些實施例中，本文所述之病毒衍生之轉殖基因包含兩種或更多種編碼共同包含精胺酸轉運體之蛋白質的經分離核酸序列。在一些實施例中，精胺酸轉運體核酸序列選自由選自由以下組成之群之核酸序列組成之群：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 或其組合。

本文亦描述表現載體，其包括編碼胺基酸轉運體序列之核酸序列及包含編碼胺基酸轉運體之重組核酸序列的遺傳修飾T細胞。舉例而言，本文描述一種表現載體，其包含選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。本文亦描述一種表現載體，其包含SEQ ID NO:220-222中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:227-230中任一者之核苷酸序列。本文亦描述一種表現載體，其包含SEQ ID NO:214及215中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:227-230中任一者之核苷酸序列。本文亦描述一種表現載體，其包含SEQ ID NO:234-236中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:242之核苷酸序列。

本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其包含重組核酸序列，該重組核酸序列包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其包含重組核酸，該重組核酸包含SEQ ID NO:220-222中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:227-230中任一者之核苷酸序列。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其包含重組核酸，該重組核酸包含SEQ ID NO:214及215中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:227-230中任一者之核苷酸序列。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其包含重組核酸，該重組核酸包含SEQ ID NO:234-236中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:242之核苷酸序列。

在一些實施例中，本文所述之遺傳修飾T細胞經遺傳修飾以包含重組核酸序列，該重組核酸序列包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之遺傳修飾T細胞經修飾以包含選自由以下組成之群的核酸序列之一或多個額外複本：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。本文亦描述一種遺傳修飾T細胞，其包含表現載體，該表現載體包含選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。在一些實施例中，表現載體、遺傳修飾T細胞或包含本文所述之表現載體的遺傳修飾T細胞包含選自由以下組成之群的核酸序列之組合：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。在本文所述之一些實施例中，表現載體、包含重組核酸序列之遺傳修飾T細胞、經遺傳修飾以包含重組核酸序列之遺傳修飾T細胞、經遺傳修飾以包含核酸序列之一或多個額外複本的遺傳修飾T細胞或包含表現載體之遺傳修飾T細胞(該表現載體包含核酸序列)包含至少兩個選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。舉例而言，在本文所述之一些實施例中，表現載體、包含重組核酸序列之遺傳修飾T細胞、經遺傳修飾以包含重組核酸序列之遺傳修飾T細胞、經修飾以包含核酸序列之一或多個額外複本的遺傳修飾T細胞或包含含有核酸序列之表現載體的遺傳修飾T細胞包含以下核苷酸序列對中之一者：SEQ ID NO:220-222中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:227-230中任一者之核苷酸序列；SEQ ID NO:214及215中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:227-230中任一者之核苷酸序列；或SEQ ID NO:234-236中任一者之核苷酸序列及SEQ ID NO:242之核苷酸序列。

本文所述之遺傳修飾T細胞可包括與以下中之一者之核酸序列共用類似性的重組核酸序列：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之遺傳修飾T細胞包含與以下中之一者具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，約90%至約95%、約95%至約99%或約90%至約99%一致性百分比的核酸序列：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。在一些實施例中，本文所述之遺傳修飾T細胞包含與以下中之一者具有約90%、95%或99%一致性百分比的核酸序列：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。在一些實施例中，本文所述之遺傳修飾T細胞包含表現載體，該表現載體包含與以下中之一者具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，約90%至約95%、約95%至約99%或約90%至約99%一致性百分比的核酸序列：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。在一些實施例中，本文所述之遺傳修飾T細胞包含表現載體，該表現載體包含與以下中之一者具有約90%、95%或99%一致性百分比的核酸序列：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。

在另一態樣中，本文描述一種醫藥學上可接受之組合物，其包含本文所述之遺傳修飾T細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。

本文亦描述一種包含L-精胺酸之促發培養基，其用於促發遺傳修飾T細胞，例如本文所述之遺傳修飾T細胞。本文所述之促發培養基可增加遺傳修飾T細胞，例如表現精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞中的胞內精胺酸濃度。本文所述之促發培養基可促發遺傳修飾T細胞用於治療。舉例而言，本文所述之促發培養基在向有需要之患者，例如需要治療癌症之患者投與遺傳修飾T細胞之前可增加遺傳修飾T細胞中之胞內精胺酸濃度。在一些實施例中，本文描述一種促發培養基，其包含本文所述之遺傳修飾T細胞及L-精胺酸。

本文亦描述包含CAR-T細胞之醫藥組合物。舉例而言，本文描述一種醫藥組合物，其包含表現重組精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之CAR-T細胞。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物包含CAR-T細胞，其中CAR-T細胞包含一或多種表現載體，其包含編碼精胺酸轉運體及/或嵌合抗原受體蛋白質之核酸序列。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物包含表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物包含CAR-T細胞，其中CAR-T細胞包含一或多種編碼精胺酸轉運體及/或嵌合抗原受體蛋白質之重組核酸序列。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物包含表現精胺酸轉運體，例如重組蛋白質精胺酸轉運體之CAR-T細胞。在各種實施例中，精胺酸轉運體選自由以下組成之群：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 或其組合。在一些實施例中，一或多種編碼精胺酸轉運體之核酸序列包含一或多種重組精胺酸轉運體核酸序列，例如重組CAT-1核酸序列、重組CAT-2核酸序列、重組CAT-3核酸序列、重組CAT-4核酸序列、重組y⁺ LAT1核酸序列、重組4F2hc核酸序列、重組y⁺ LAT2核酸序列、重組y⁺ LAT1核酸序列及重組4F2hc核酸序列、重組y⁺ LAT2核酸序列及重組4F2hc核酸序列、重組b^0,+ AT核酸序列、重組rBAT核酸序列、重組b^0,+ AT核酸序列及重組rBAT核酸序列或重組ATB^0,+ 核酸序列。在一些實施例中，精胺酸轉運體為重組精胺酸轉運蛋白，例如重組CAT-1、重組CAT-2、重組CAT-3、重組CAT-4、重組y⁺ LAT1、重組4F2hc、重組y⁺ LAT2、重組y⁺ LAT1及重組4F2hc、重組y⁺ LAT2及重組4F2hc、重組b^0,+ AT、重組rBAT、重組b^0,+ AT及重組rBAT或重組ATB^0,+ 。

在另一態樣中，本文所述之醫藥組合物係封裝為套組。舉例而言，在一些實施例中，包含表現精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之CAR-T細胞(例如表現精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之遺傳修飾CAR-T細胞)的醫藥組合物係封裝為套組。在一些實施例中，包含表現精胺酸轉運體之T細胞(例如表現精胺酸轉運體，例如重組精胺酸轉運蛋白之遺傳修飾T細胞)的醫藥組合物係封裝為套組。本文所述之套組可包括向需要治療之患者投與CAR-T細胞的說明。本文所述之套組可包括用於促發CAR-T細胞以向需要治療之患者投與的說明。在一些實施例中，套組可包括緩衝液(例如包含足以促發T細胞之L-精胺酸含量的緩衝液)、試劑及用於產生、投與及/或促發CAR-T細胞的詳細說明中之至少一者。在一些實施例中，本文所述之套組可包括用於產生包括表現載體、病毒構築體、細胞、轉染試劑及培養基之CAR-T細胞的藥劑、用於細胞選擇(例如抗體)之藥劑及/或生長培養基。

本文亦描述使用本文所述之醫藥組合物治療癌症的方法。舉例而言，本文描述一種治療有需要之患者之實體腫瘤癌症的方法，該方法包含向該患者投與有效量的本文所述之醫藥組合物。舉例而言，本文描述一種治療有需要之患者之實體腫瘤癌症的方法，該方法包含向該患者投與有效量之醫藥組合物，其包含本文所述之遺傳修飾T細胞(例如經遺傳修飾以表現胺基酸轉運體之CAR-T細胞或T細胞)及醫藥學上可接受之賦形劑。

本文亦描述使用本文所述之醫藥組合物治療血液癌症的方法。舉例而言，本文描述一種治療有需要之患者之血液癌症的方法，該方法包含向該患者投與有效量的本文所述之醫藥組合物。舉例而言，本文描述一種治療有需要之患者之血液癌症的方法，該方法包含向該患者投與有效量之醫藥組合物，其包含本文所述之遺傳修飾T細胞(例如經遺傳修飾以表現胺基酸轉運體之CAR-T細胞或T細胞)及醫藥學上可接受之賦形劑。

本文亦描述一種調節有需要之患者之胞內精胺酸含量(例如胞內T細胞精胺酸含量)以影響T細胞介導之免疫反應的方法。舉例而言，本文描述一種調節有需要之患者之胞內精胺酸含量以影響T細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含調節遺傳修飾T細胞之胞內精胺酸含量。在一些實施例中，調節有需要之患者之胞內精胺酸含量以影響T細胞介導之免疫反應的方法進一步包含向該患者投與有效量的本文所述之醫藥組合物(例如包含本文所述之遺傳修飾T細胞及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物，其中該遺傳修飾T細胞已經受可有效增加胞內精胺酸含量之條件)。在一些實施例中，調節有需要之患者之胞內精胺酸含量以影響T細胞介導之免疫反應的方法包含調節遺傳修飾T細胞之胞內精胺酸含量且向該患者投與有效量的包含遺傳修飾T細胞及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。

在又一態樣中，本文描述一種用於治療有需要之人類患者之病狀的方法，該方法包含：向該人類患者投與治療有效量之包含表現精胺酸轉運體(例如重組精胺酸轉運體)及嵌合抗原受體蛋白質之CAR-T細胞(例如遺傳修飾CAR-T細胞)的組合物。在一些實施例中，用於治療有需要之人類患者之病狀的方法包含向該人類患者投與治療有效量的包含本文所述之CAR-T細胞，例如本文所述之遺傳修飾CAR-T細胞的組合物。舉例而言，在一些實施例中，用於治療有需要之人類患者之病狀的方法包含向該人類患者投與治療有效量之包含CAR-T細胞的組合物，其中該CAR-T細胞包含編碼精胺酸轉運體及/或嵌合抗原受體蛋白質之一或多種重組核酸序列。在本文所述之一些實施例中，用於治療有需要之人類患者之病狀的方法包含向該人類患者投與治療有效量之包含經遺傳修飾以表現或過度表現胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞的組合物。

本文亦描述一種調節有需要之患者之對表現細胞表面抗原之目標細胞群體的T細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含向該患者投與治療有效量之遺傳修飾T細胞。在一些實施例中，該等T細胞：a)經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體包含：至少一個抗原特異性靶向區，其特異性結合在該目標細胞群體、跨膜域、胞內傳訊域上呈現之該細胞表面抗原；及b)經遺傳修飾以表現精胺酸轉運體(例如重組精胺酸轉運體)。在一些實施例中，T細胞經遺傳修飾以表現精胺酸轉運體(例如重組精胺酸轉運體)。舉例而言，在一些實施例中，用於投與之T細胞包含一或多種編碼嵌合抗原受體及精胺酸轉運體之重組核酸序列，其中該嵌合抗原受體包含：至少一個抗原特異性靶向區，其特異性結合在該目標細胞群體、跨膜域、胞內傳訊域上呈現之該細胞表面抗原。在一些實施例中，用於投與之T細胞包含重組嵌合抗原受體蛋白質及重組精胺酸轉運蛋白，其中重組嵌合抗原受體蛋白質包含：至少一個抗原特異性靶向區，其特異性結合在該目標細胞群體、跨膜域、胞內傳訊域上呈現之該細胞表面抗原。在一些實施例中，用於投與之T細胞包含一或多種編碼精胺酸轉運體之重組核酸序列。在一些實施例中，用於投與之T細胞包含重組精胺酸轉運蛋白。

在另一態樣中，本發明係關於一種在低精胺酸環境中提高T細胞存活的方法，該方法包含：向低精胺酸環境投與包含重組精胺酸轉運體之T細胞。在某些實施例中，在該投與步驟之前，該方法包含用包含編碼該重組精胺酸轉運體之核苷酸序列的DNA構築體轉染該T細胞。在某些實施例中，該T細胞包含嵌合抗原受體及/或包含含有編碼嵌合抗原受體之核苷酸序列的DNA構築體。在某些實施例中，T細胞為CAR-T細胞。在某些實施例中，在投與步驟之前，該方法包含在包含精胺酸之培養基中培養T細胞或CAR-T細胞，例如直至該T細胞或CAR-T細胞之該胞內精胺酸含量累積至某一含量。在某些實施例中，該低精胺酸環境為細胞培養基。在某些實施例中，該低精胺酸環境為腫瘤微環境。

在本文所述之實施例中，所揭示之方法可包括在投與(例如向需要治療之患者投與)之前，在包含精胺酸之培養基中培養T細胞的步驟。舉例而言，本文描述一種用於治療有需要之人類患者之病狀的方法，該方法包含：在向該人類患者投與治療有效量之包含該等T細胞的組合物之前，在包含精胺酸之培養基中培養T細胞。本文亦描述一種調節有需要之患者之對表現細胞表面抗原之目標細胞群體的T細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含：在向該患者投與治療有效量之T細胞之前，在包含精胺酸之培養基中培養遺傳修飾T細胞。

在本文所述之方法中，精胺酸轉運體選自由以下組成之群：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 或其組合。舉例而言，本文描述一種用於治療有需要之人類患者之病狀的方法，該方法包含：向該人類患者投與治療有效量之包含CAR-T細胞的組合物，該CAR-T細胞表現選自由以下組成之群的嵌合抗原受體蛋白質及精胺酸轉運體(例如重組精胺酸轉運體)：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 或其組合。本文亦描述一種調節有需要之患者之對表現細胞表面抗原之目標細胞群體的T細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含向該患者投與治療有效量之T細胞，該T細胞經遺傳修飾以表現選自由以下組成之群的嵌合抗原受體及精胺酸轉運體(例如重組精胺酸轉運體)：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 或其組合。在一些實施例中，精胺酸轉運體為重組精胺酸轉運蛋白，例如重組CAT-1、重組CAT-2、重組CAT-3、重組CAT-4、重組y⁺ LAT1、重組4F2hc、重組y⁺ LAT2、重組y⁺ LAT1及重組4F2hc、重組y⁺ LAT2及重組4F2hc、重組b^0,+ AT、重組rBAT、重組b^0,+ AT及重組rBAT或重組ATB^0,+ 。在某些實施例中，精胺酸轉運體包含選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。在某些實施例中，該精胺酸轉運體包含表現與以下中之一者具有約90%、95%或99%一致性百分比之序列的核酸：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。

在一些實施例中，該方法進一步包含向人類患者投與第二治療劑。舉例而言，本文描述用於治療有需要之人類患者之病狀的方法，該等方法包含向該人類患者投與治療有效量之包含CAR-T細胞之組合物且向該人類患者投與第二治療劑。在一些實施例中，本文所述之方法包含在投與包含CAR-T細胞之組合物之前、期間或之後投與該第二治療劑。本文亦描述一種調節有需要之患者之對表現細胞表面抗原之目標細胞群體的T細胞介導之免疫反應的方法，該等方法包含向該患者投與治療有效量之遺傳修飾T細胞且向該人類患者投與第二治療劑。在一些實施例中，本文所述之方法包含在投與治療有效量之T細胞之前、期間或之後投與第二治療劑。

在一些實施例中，第二治療劑為檢查點蛋白質抑制劑，例如抑制檢查點蛋白質活性或檢查點蛋白質傳訊之檢查點蛋白質抑制劑，例如抑制檢查點蛋白質或檢查點蛋白質傳訊之抗體。舉例而言，在一些實施例中，第二治療劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體。在一些實施例中，第二治療劑為DNA損傷及修復抑制劑。舉例而言，在一些實施例中，DNA損傷及修復抑制劑為ATM/ATR抑制劑、PARP抑制劑、WEE1抑制劑、Chk1抑制劑、Chk2抑制劑或DNA依賴型蛋白激酶(DNA-PK)抑制劑。

在本文所述之實施例中，每週一次、每2週一次、每3週一次或每4週一次向人類患者投與包含CAR-T細胞之組合物。舉例而言，本文描述一種用於治療有需要之人類患者之病狀的方法，該方法包含每週一次、每2週一次、每3週一次或每4週一次向該人類患者投與治療有效量之包含CAR-T細胞的組合物。本文亦描述一種調節有需要之患者之對表現細胞表面抗原之目標細胞群體的T細胞介導之免疫反應的方法，該方法包含每週一次、每2週一次、每3週一次或每4週一次向該患者投與治療有效量之遺傳修飾T細胞。

在一些實施例中，本文所述之方法包含投與以患者之重量計指定數目之CAR-T細胞或投與以患者之重量計指定範圍之CAR-T細胞。在一些實施例中，本文所述之方法包含投與每公斤患者約10² 、約10³ 、約10⁴ 、約10⁵ 、約10⁶ 、約10⁷ 、約10⁸ 、約10⁹ 、約10¹⁰ 、約10¹¹ 、約10¹² 、約10¹³ 、約10¹⁴ 、約10¹⁵ 、約10¹⁶ 、約10¹⁷ 、約10¹⁸ 、約10¹⁹ 、約10²⁰ 、約10²⁵ 、約10³⁰ 、約10³⁵ 、約10⁴⁰ 、約10⁴⁵ 或約10⁵⁰ 個CAR-T細胞。在一些實施例中，本文所述之方法包含投與每公斤患者約10² 至10⁷ 、約10² 至10¹⁰ 、約10³ 至10¹⁰ 、約10⁴ 至10¹⁰ 、約10⁵ 至10¹⁰ 、約10⁶ 至10¹⁰ 、約10⁷ 至10¹⁰ 、約10⁸ 至10¹¹ 、約10⁹ 至10¹² 、約10¹⁰ 至10¹³ 、約10⁷ 至10¹⁵ 、約10⁵ 至10¹⁵ 、約10¹⁰ 至10²⁰ 、約10¹⁰ 至10²⁵ 、約10¹⁰ 至10³⁰ 、約10⁷ 至10²⁰ 、約10⁷ 至10²⁵ 、約10¹⁰ 至10⁵⁰ 或約10⁷ 至10⁵⁰ 個CAR-T細胞。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之方法包含投與每公斤患者約10⁷ 至10¹⁰ 個CAR-T細胞。

本文所述之實施例包括一種製備表現精胺酸轉運體之遺傳修飾CAR-T細胞的方法，該方法包含：用包含特異性嵌合抗原受體及精胺酸轉運體之核苷酸序列的DNA構築體轉染T細胞，藉此產生表現該嵌合抗原受體及該精胺酸轉運體兩者之遺傳修飾CAR-T細胞；及在包含精胺酸之培養基中培養該遺傳修飾CAR-T細胞。本文所述之實施例亦包括一種製備表現精胺酸轉運體之遺傳修飾CAR-T細胞的方法，該方法包含：用包括包含特異性嵌合抗原受體及精胺酸轉運體之核苷酸序列的核苷酸構築體之病毒轉導T細胞，藉此產生表現該嵌合抗原受體及該精胺酸轉運體兩者之遺傳修飾CAR-T細胞；及在包含精胺酸之培養基中培養該遺傳修飾CAR-T細胞。在一些實施例中，遺傳修飾CAR-T細胞表現重組精胺酸轉運體核苷酸序列。在一些實施例中，遺傳修飾CAR-T細胞表現重組精胺酸轉運蛋白。在一些實施例中，培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾CAR-T細胞，直至該CAR-T細胞之該胞內精胺酸含量累積至某一含量。在一些實施例中，CAR-T細胞之胞內精胺酸含量為使CAR-T細胞在腫瘤微環境中存活之胞內精胺酸含量。舉例而言，在一些實施例中，培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾CAR-T細胞，直至該CAR-T細胞之該胞內精胺酸含量為約500 µM、約600 µM、約700 µM、約800 µM、約900 µM、約1,000 µM、約1,100 µM、約1,200 µM、約1,300 µM、約1,400 µM、約1,500 µM、約1,600 µM、約1,700 µM、約1,800 µM、約1,900 µM、約2,000 µM、約2,500 µM、約3,000 µM、約3,500 µM或約4,000 µM。在一些實施例中，培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾CAR-T細胞，直至該CAR-T細胞之該胞內精胺酸含量為約500 µM至約1,000 µM、約800 µM至約1,200 µM、約1,000 µM至約1,500 µM、約1,000 µM至約2,000 µM、約1,500 µM至約2,000 µM、約700 µM至約900 µM、約900 µM至約1,100 µM、約900 µM至約1,200 µM或約1,300 µM至約1,500 µM。

本文所述之實施例亦包括一種製備表現精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞的方法，該方法包含：用包含精胺酸轉運體之核苷酸序列的DNA構築體轉染T細胞，藉此產生表現該精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；及在包含精胺酸之培養基中培養該遺傳修飾T細胞。本文所述之實施例亦包括一種製備表現精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞的方法，該方法包含：用包括包含精胺酸轉運體之核苷酸序列的核苷酸構築體之病毒轉導T細胞，藉此產生表現該精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；及在包含精胺酸之培養基中培養該遺傳修飾T細胞。在一些實施例中，培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾T細胞，直至該T細胞之該胞內精胺酸含量累積至某一含量。在一些實施例中，T細胞之胞內精胺酸含量為使T細胞在腫瘤微環境或精胺酸耗乏環境中存活之胞內精胺酸含量。舉例而言，在一些實施例中，培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾T細胞，直至該T細胞之該胞內精胺酸含量為約500 µM、約600 µM、約700 µM、約800 µM、約900 µM、約1,000 µM、約1,100 µM、約1,200 µM、約1,300 µM、約1,400 µM、約1,500 µM、約1,600 µM、約1,700 µM、約1,800 µM、約1,900 µM、約2,000 µM、約2,500 µM、約3,000 µM、約3,500 µM或約4,000 µM。在一些實施例中，培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾T細胞，直至該T細胞之該胞內精胺酸含量為約500 µM至約1,000 µM、約800 µM至約1,200 µM、約1,000 µM至約1,500 µM、約1,000 µM至約2,000 µM、約1,500 µM至約2,000 µM、約700 µM至約900 µM、約900 µM至約1,100 µM、約900 µM至約1,200 µM或約1,300 µM至約1,500 µM。

相關申請案的交叉引用

本申請案主張2020年2月21日申請之美國臨時專利申請案第62/979,805號之優先權及權益，且以全文引用的方式併入本文中。定義

如本文所用，術語「嵌合抗原受體」(CAR)一般係指經設計以結合至特異性抗原，例如在癌細胞表面上呈現之抗原的經基因工程改造受體。CAR可引入免疫細胞以幫助其識別及殺死表現特異性抗原之癌細胞。

如本文所用，術語「T淋巴細胞」或「T細胞」一般係指與其他淋巴細胞之區別在於細胞表面上存在T細胞受體的一類免疫細胞。分化T細胞在以下方面起到許多重要作用：經由若干免疫相關功能(諸如免疫介導之細胞死亡)控制及影響免疫反應、在經由細胞因子建立免疫反應時募集細胞、確定免疫系統之其他部分對特定感知到的威脅是否作出反應及反應程度、影響調節性B細胞，及在其他功能中將外來細胞與自身區分開。

如本文所用，術語「共同刺激傳訊區」係指包含共同刺激分子之胞內域的CAR之一部分。共同刺激分子為淋巴細胞對抗原之高效反應所需的除抗原受體或其配位體外之細胞表面分子。共同刺激傳訊分子之實例包括CD28、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、CD40、CD40L、TLR (例如 TLR2)、DAP10、IL-2RB、IL-2RA及MYD88。

如本文所用，術語「CAR-T細胞療法」一般係指受體蛋白質已經遺傳併入至現有淋巴細胞中的基因工程改造T細胞(CAR-T細胞)。此類受體蛋白質可賦予經工程改造CAR-T細胞靶向特異性蛋白質之能力。CAR-T細胞療法亦可指包括投與CAR-T細胞或CAR-T細胞醫藥組合物之治療方法。

如本文所用，術語「宿主細胞」意謂生物體之任何細胞，該細胞經選擇、修飾、轉化、生長、使用或操縱以藉由細胞產生物質，例如藉由細胞表現基因、DNA或RNA序列、蛋白質或酶。本發明之宿主細胞包括T細胞及NK細胞，其含有編碼嵌合受體之DNA或RNA序列且在細胞表面上表現嵌合受體。宿主細胞可用於在癌症治療中增強T淋巴細胞活性。

如本文所用，術語「表現(express)」及「表現(expression)」意謂允許或引起基因或DNA序列中之資訊表現，例如藉由活化與相應基因或DNA序列之轉錄及轉譯有關的細胞功能來產生蛋白質，諸如CAR或胺基酸轉運體。如本文所用，術語「過度表現(overexpression)」及「過度表現(overexpressing」通常係指藉由經工程改造異位表現來增強蛋白質表現，其引起基因之人工誘導或增強且目標模態在高於正常含量下之後續蛋白質表現。DNA序列在細胞中或由細胞表現以形成「表現產物」，諸如蛋白質。表現產物本身(例如所得蛋白質)亦可稱為由細胞「表現」。表現產物可表徵為胞內、胞外或跨膜。術語「胞內」意謂位於細胞內部。術語「胞外」意謂位於細胞外部。術語跨膜意謂細胞外部之胞外域、嵌入細胞膜中之一部分及細胞內部之胞內域。

如本文所用，術語「表現構築體編碼」或「表現載體工程改造」係指經設計用於細胞中之基因表現的質體。此載體用於將特異性基因引入至目標細胞中且可命令該細胞用於蛋白質合成之機制以產生由基因編碼之蛋白質。載體通常經工程改造以含有調節序列，該等調節序列充當強化子區及啟動子區且引起攜帶於表現載體上之基因的高效轉錄。表現載體可經由產生可轉譯成蛋白質之諸如信使RNA之模態而有效產生所關注蛋白質。

如本文所用，術語「胺基酸」一般係指含有至少一個胺基-NH₂ (其可以其電離形式存在)，-NH₃ ⁺ 及一個羧基-COOH (其可以其電離形式存在)，-COO⁻ ，其中羧酸在中性pH值下去質子化，具有NH₂ CHRCOOH之基本式的有機化合物。胺基酸且因此肽具有N (胺基)端殘基區及C (羧基)端殘基區。胺基酸類型包括被認為是「天然的」至少20個胺基酸，因為其在哺乳動物中包含大部分生物蛋白質且包括胺基酸，諸如離胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、蘇胺酸等。胺基酸亦可基於其側鏈分組，諸如具有羧酸基團(在中性pH值下)，包括天冬胺酸或天冬胺酸(Asp；D)及麩胺酸或麩胺酸(Glu；E)；及鹼性胺基酸(在中性pH值下)，包括離胺酸(Lys；L)、精胺酸(Arg；N)及組胺酸(His；H)之彼等胺基酸。

如本文所用，術語「胺基酸轉運體」(AAT)係指可轉運胺基酸(例如精胺酸)之膜轉運蛋白。更特定言之，此等為介導胺基酸轉移至細胞或細胞器中且轉移出細胞或細胞器中之膜轉運蛋白。如本文所用，術語「精胺酸轉運體」係指能夠跨細胞膜轉運精胺酸之膜轉運蛋白。「精胺酸轉運體」可轉運除精胺酸以外之其他胺基酸。精胺酸轉運體之非限制性實例展示於表1中。其在各種生物系統中起不同功能作用，其可調節代謝重新編程、酸鹼平衡及合成代謝及分解代謝反應等。

如本文所用，術語「腫瘤微環境」(TME)一般係指實體腫瘤(包括血管、免疫細胞、纖維母細胞、傳訊分子及胞外基質)內及周圍的環境。腫瘤進展主要受癌細胞與此微環境之相互作用影響且可確定癌轉移、生長及疾病進展。TME可藉由物理或化學上抑制治療因素或促成癌轉移來影響治療反應及抗性。

如本文所用，術語「T細胞之代謝重新編程」係指其在活化期間之代謝重新編程，其與其獲取不同分化型態相關。在抗原相遇及活化期間，T細胞增加了生物能量及合成代謝需求，以支持其快速複製及產生可溶性因子。為滿足此等需求，T細胞經由多種過程(包括但不限於糖酵解、麩醯胺酸分解、分支化胺基酸之分解代謝、脂肪酸之吸收、脂質合成及脂肪酸氧化)增加其攝取葡萄糖及胺基酸以利用葡萄糖及胺基酸。胺基酸作為T細胞分化及功能命運之關鍵代謝調節因子的作用得到充分記載。胺基酸能夠充當此等代謝需求期間之燃料來源以及用於合成蛋白質及核酸之前驅體。

如本文所用，術語「骨髓衍生之抑制細胞」用於係指來自骨髓譜系之免疫細胞的非均質群。此等細胞由於變化的血細胞生成而在病理性情境下強烈擴增。此等細胞具有較強免疫抑制活性且與其他免疫細胞類型(諸如T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及自然殺手細胞)相互作用以調控其功能。此等細胞在其存在及上調與不良患者預後及治療抗性相關之癌症中特別相關。

如本申請案之說明書及申請專利範圍中所用，術語「投與」包括可有效地引起嵌合抗原受體及精胺酸轉運體在個體之T淋巴細胞中表現的任何方法。一種用於投與嵌合抗原受體之方法因此係藉由用根據本發明之核酸構築體活體外轉染或轉導末梢血液T細胞或造血祖細胞(其最終為同種異體的)，且較佳地在擴展至個體個人之後傳回經轉染或轉導之細胞。在本文所述之實施例中，投與藥劑(例如投與CAR-T細胞或CAR表現載體)可包括接觸含有細胞之患者體液。舉例而言，投與藥劑可包括使含有癌細胞(例如腫瘤細胞)之患者體液與藥劑活體外接觸。在本文所述之實施例中，「投與」藥劑(例如投與CAR-T細胞或CAR表現載體)可包括使含有細胞，例如癌細胞(例如腫瘤細胞)之患者體液與藥劑活體內接觸。

如本文所用，術語「與……組合投與」、「組合投與」或「共投與」意謂同時或在一定時間間隔內向個體投與兩種或更多種藥劑，使得當兩者作為同一治療方案之一部分給出時，各藥劑對患者可存在累加或改進之治療效果。組合投與之兩種或更多種藥劑可同時或幾乎同時投與。組合投與之兩種或更多種藥劑不必一起投與。在一些實施例中，藥劑彼此在90天內(例如在80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1天內)、28天內(例如14、7、6、5、4、3、2或1天)、24小時內(例如12、6、5、4、3、2或1小時)或在約60、30、15、10、5或1分鐘內投與。在一些實施例中，將藥劑之投與相互間隔得足夠近，以便達成組合作用。

術語「癌症」係指任何由惡性贅生性細胞增生引起之疾病，諸如腫瘤、贅瘤、癌瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤。「實體腫瘤癌症」為包含組織之異常腫塊(例如肉瘤、癌瘤及淋巴瘤)之癌症。如在本文中可互換使用，「血液癌」或「液體癌」為存在於體液中的癌症，例如淋巴瘤及白血病。

術語「難治性癌症」係指對用當前使用之抗癌劑或當前抗癌方案治療無反應或可能無反應的癌症形式。難治性癌症可能對用抗癌劑治療最初展現出反應性且稍後變得對治療無反應。舉例而言，難治性癌症可包括一種形式之癌症，其中癌細胞未能反應於治療而停止增殖，或其最初反應於治療而停止增殖，但儘管進一步用抗癌劑治療仍再開始增殖。具有高復發頻率之明顯消退亦視為難治性的。難治性癌症可能對用第一線、第二線或甚至第三線當前治療之特異性抗癌治療無反應。罹患難治性癌症之患者在本文中可稱為難治性癌症患者。本文所述之本發明之方法可用於治療、預防或改善難治性癌症或治療罹患難治性癌症之患者。

如本文所用，術語藥劑(例如遺傳修飾T細胞)之「有效量」為足以影響有益或所需結果(諸如臨床結果)之量，且因此「有效量」視應用其之情形而定。

如本文所用，術語「醫藥組合物」表示與醫藥學上可接受之賦形劑一起調配的含有本文所述之化合物的組合物。在一些實施例中，在政府監管機構之批准下製造或銷售醫藥組合物作為用於治療哺乳動物之疾病的治療方案之部分。醫藥組合物可經調配，例如非經腸、經口、經肺、氣管內、鼻內、經皮或十二指腸內投與。在各種實施例中，本文所述之醫藥組合物可藉由一種或數種途徑投與，包括非經腸，例如藉由皮下或靜脈內注射。如本文所用，術語非經腸包括皮下注射、胰臟內投與及靜脈內、肌肉內、腹膜內及胸骨內注射或輸注技術。在本文所述之實施例中，可向需要治療癌症之患者靜脈內投與醫藥組合物。

如本文所用，「醫藥學上可接受之賦形劑」係指具有在患者中無毒性且無發炎性之特性的任何成分(例如能夠使活性化合物懸浮或溶解之媒劑)。賦形劑可包括例如：抗黏劑、抗氧化劑、黏合劑、包衣、壓製助劑、崩解劑、染料(著色)、潤滑劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調味劑、芳香劑、助滑劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、放射性保護劑、吸附劑、懸浮或分散劑、甜味劑或水合之水。例示性賦形劑包括但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(二元)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、預膠凝化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及木糖醇。

如本文所用，術語「多肽」係指一串藉由肽鍵彼此附接之至少兩個胺基酸。在一些實施例中，多肽可包括至少3-5個胺基酸，藉助於至少一個肽鍵其各自附接至其他胺基酸。一般熟習此項技術者應瞭解多肽可包括一或多種能夠整合至多肽鏈中之「非天然」胺基酸或其他實體。在一些實施例中，多肽可為糖基化的，例如多肽可含有一或多個共價連接糖部分。在一些實施例中，單一「多肽」(例如抗體多肽)可包含兩個或更多個個別多肽鏈，其可在一些情況下例如藉由一或多個二硫鍵或其他方式彼此間連接。

「患者」或「個體」意謂人類或非人類動物(例如哺乳動物)。在本文所述之一些實施例中，患者需要治療癌症。此類患者亦可稱為「癌症患者」。

「基本上一致」或「實質上一致」意指分別具有與參考序列相同之多肽或核苷酸序列，或分別具有指定百分比之胺基酸殘基或核苷酸的多肽或核苷酸序列，當最佳比對兩個序列時，其在參考序列內之對應位置處相同。舉例而言，與參考序列「實質上一致」之胺基酸序列與參考胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。對於多肽，比較序列之長度一般應為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350個連續胺基酸(例如全長序列)。類似地，與參考序列「實質上一致」的核苷酸序列與參考核苷酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。對於核苷酸，比較序列之長度一般將為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000或超過10,000個連續核苷酸(例如全長序列)。序列一致性可使用序列分析軟體，根據預設設定(例如Genetics Computer Group之序列分析套裝軟體, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)來量測。此類軟體可藉由對各種取代、缺失及其他修飾指定同源性程度來匹配相似序列。

如本文所用及如在此項技術中較好理解，「治療」病狀或病狀(例如本文所述之病狀，諸如癌症)之「治療」為用於獲得有益或所需結果(諸如臨床結果)之方法。有益或所需結果可包括但不限於緩解或改善一或多種症狀或病狀；減輕病症、疾病或病狀之程度；使病症、疾病或病狀之狀態穩定(亦即不惡化)；預防病症、疾病或病狀之傳播；延遲或減緩病症、疾病或病狀之進展；改善或緩和病症、疾病或病狀；及緩解(無論部分或全部)，無論可偵測或不可偵測。「緩和」病症、疾病或病狀意謂相比於不存在治療下的程度或時程而言病症、疾病或病狀之程度及/或不合需要的臨床表現減輕及/或進展之時程減緩或拉長。

如本文所用，術語「降低」、「減少」、「增加(increase)」、「增加(increased)」或「減少(reduction)」、「減少(reduced)」(例如，參考治療結果或效果)具有相對於參考含量之含義。在一些實施例中，參考含量為如在實驗動物模型或臨床試驗中藉由使用該方法在對照下確定的含量。在一些實施例中，參考含量在治療開始之前或開始時相同個體之含量。在一些實施例中，參考含量為未藉由該治療方法治療之群體的平均含量。

術語「DNA損傷及修復抑制劑(DDRi)」係指防止由內源性或外源性染色體損害引起之細胞DNA損傷的修復且經由抑制正常發生之DNA修復機制且維持細胞成活力所需之相關過程來起作用的藥劑。

術語「檢查點抑制劑」(亦稱為「免疫檢查點抑制劑」或「ICI」)係指阻斷免疫檢查點蛋白質之作用，例如阻斷此類免疫檢查點蛋白質與其搭配物蛋白質結合的藥劑。已知癌細胞表現免疫檢查點蛋白質，使得T細胞無法將此類癌細胞識別為破壞之目標。一般而言，檢查點抑制劑藉由阻斷T細胞及靶向細胞上特異性免疫檢查點蛋白質之間的相互作用而促進癌細胞被T細胞破壞，其中此類相互作用將另外充當抑制T細胞所破壞之靶向細胞的訊息。檢查點抑制劑包括阻斷PD-1與PD-L1相互作用或阻斷CTLA-4與B7-1/B7-2相互作用之藥劑。特異性檢查點抑制劑之實例包括以下抗體類藥物：伊派利單抗(ipilimumab)、納武單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及測米匹單抗(cemiplimab)。

如本文所用，術語「腫瘤相關抗原」或「腫瘤相關抗原」意謂以比正常細胞顯著更大量地在腫瘤細胞上呈現之抗原。

如本文所用，術語「腫瘤特異性抗原」或「腫瘤特異性抗原」係指僅在腫瘤細胞上內源性地呈現之抗原。

如本文所用，術語「癌細胞抗原」意謂在形成癌症(例如惡性贅生性細胞，諸如腫瘤、贅瘤、癌瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤)之一部分的細胞上呈現的抗原。個別癌細胞可表現一或多種癌細胞抗原。用於靶向之較佳癌細胞抗原係相對於個體中之健康細胞在癌細胞上具有顯著差異表現之抗原。

如本文所用，例如抗體、其抗原結合片段或CAR之抗原特異性結合域之術語「結合」或「結合」意謂與目標抗原之至少暫時相互作用或締合。舉例而言，「結合」或「結合」可指與表現癌細胞抗原之癌細胞暫時或持續接觸的CAR之抗原結合部分的過程。在本文所述之一些實施例中，CAR能夠結合癌細胞抗原。在此類實施例中，結合經由CAR之癌細胞抗原與抗原特異性結合區之間的相互作用發生。

如本文所用，「原發腫瘤」係指在原發部位處之原始腫瘤生長且不為癌轉移之產物。

如本文所用，「繼發性腫瘤」係指通常經由癌轉移過程自原發部位擴散至繼發性解剖部位之腫瘤生長。

「實體腫瘤」為異常組織塊，例如肉瘤、癌瘤及淋巴瘤。如本文所用，「液體腫瘤」為存在於體液中之癌症，例如淋巴瘤及白血病。

如本文所用，「冷腫瘤」係指特徵在於缺乏T細胞浸潤之腫瘤。冷腫瘤之特徵亦在於在用作單一療法時，檢查點抑制劑在治療功效方面無效。冷腫瘤之實例包括但不限於神經膠母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌及乳癌腫瘤，其特徵在於缺乏T細胞浸潤。嵌合抗原受體

嵌合抗原受體(CAR)為經設計以結合特異性抗原，例如在癌細胞表面上呈現之抗原的經基因工程改造細胞表面受體蛋白質。CAR可在免疫細胞，例如T淋巴細胞(T細胞或T細胞)中表現，以將T細胞引導至表現CAR結合抗原之目標細胞且引導至表現目標抗原之細胞進行破壞。本文所述之CAR可結合至例如蛋白質、碳水化合物或糖脂抗原。舉例而言，本文所述之CAR可結合至以下抗原中之任一者：α-葉酸受體、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、EphA2、EphA3、Erb-B2、Erb-B 2,3,4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、G_D2 、G_D3 、HER2、HMW-MAA、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、κ輕鏈、路易斯Y、L1-細胞黏附分子、黑素瘤相關抗原(MAGE)、間皮素、鼠類CMV感染細胞、MUC1、MUC16、NKG2D、NY-ESO-1/LAGE-1、癌胚抗原、PSCA、PSMA、ROR1、mAb IgE、TAG-72、VEGF-R2、類胰島素生長因子1受體(IGF-1R)、腫瘤內皮細胞標誌物1 (TEM-1)、α-胎蛋白(AFP)、癌症抗原125 (CA125)、癌症抗原15-3 (CA15-3)、碳水化合物抗原19-9 (CA19-9)、人類絨毛膜激性腺素(hCG或beta-hCG)、前列腺-特異性抗原(PSA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、不成熟層黏連蛋白受體、HPV E6、HPV E7、BING-4、鈣活化氯通道2、細胞週期調節蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、端粒酶、間皮素、SAP-1、存活素、livin、BAGE家族蛋白質、CAGE家族蛋白質、GAGE家族蛋白質、MAGE家族蛋白質、SAGE家族蛋白質、XAGE家族蛋白質、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、MART-2、Gp100/pmel17、酪胺酸酶、TRP-1/-2、P.多肽、MC1R、β-連環蛋白、β-連環蛋白-m、β-肌動蛋白/4/m、肌凝蛋白/m、HSP70-2/m、GM2、sTn、globo-H、HLA-A2-R17OJ、BRCA1/2、CDK4、CML66、纖維結合蛋白、p53、Ras、TGF-βRII或乳腺球蛋白-A。本文所述之CAR可結合至癌細胞抗原，包括腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原。

本文所述之CAR至少包括以下組分：抗原結合片段、跨膜域組分及細胞質活化域。CAR亦可包括一或多個細胞質共同刺激域。例示性CAR描述於例如Feins等人(2018)「引入嵌合抗原受體(CAR) T細胞免疫療法以用於人類癌症」Am. J. Hematol. 94:S3-9；Stoiber等人(2019)「癌症療法之嵌合抗原受體之設計中的限制」Cells, 8(472):1-26；及Sadelain等人(2013) 「嵌合抗原受體設計之基本原理」Cancer Discovery, 3(4):388-98。

在本文所述之實施例中，CAR可包括鉸鏈區或間隔區。CAR抗原結合片段一般經由鉸鏈區或間隔區連接至CAR跨膜域。鉸鏈區可為免疫球蛋白G (IgG)或CD8α或CD28胞外域之胺基酸序列或由其衍生。例示性鉸鏈域描述於例如Stoiber等人(2019)「癌症療法之嵌合抗原受體之設計中的限制」Cells, 8(472):1-26。CAR 抗原結合片段或域

CAR抗原結合片段可為單鏈可變片段(scFv)、抗原結合片段(Fab)、F(ab')₂ s片段或配位體，例如天然存在、人工或經工程改造配位體。scFv為由免疫球蛋白之重鏈(V_H )及輕鏈(V_L )的可變區組成且藉由肽連接子結合在一起的融合蛋白。scFv's之連接子的長度可為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個殘基，例如長度為10至20、15至20、15至25或10至25個殘基。scFv可在哺乳動物或細菌細胞中表現為單鏈肽。scFv亦可與連接區以串聯方式選殖，以產生二價及三價scFv。另外，可表現兩個或更多個V_H 及V_L 對，其中各V_H 及V_L 對藉由短連接子連接且各V_H 與另一連接的V_H 及V_L 對之V_L 二聚化以形成雙功能抗體(亦即藉由V_H /V_L 二聚化形成之兩個scFv's)或三功能抗體(亦即藉由V_H /V_L 二聚化形成之三個scFv's)。雙功能抗體及三功能抗體可包括較短長度之連接子，例如約5個胺基酸。scFv連接子可包括甘胺酸及絲胺酸重複序列，例如五肽(Gly₄ Ser) (SEQ ID NO: 275)、(Gly₄ Ser)₂ (SEQ ID NO: 276)、(Gly₄ Ser)₃ (SEQ ID NO: 30)或(Gly₄ Ser)₄ (SEQ ID NO: 277)。scFv胺基酸序列可為鼠類抗體序列、人類抗體序列或人類化抗體序列。在一些實施例中，CAR可包括兩個或三個抗原特異性靶向區域，例如結合至不同細胞表面抗原之兩個或三個scFv、Fab、F(ab')₂ 或配位體(例如突變蛋白)。

Fab由重鏈及輕鏈抗體鏈中之每一者的恆定域及可變域組成。Fab可藉由使用酶(諸如番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或IdeS)直接裂解抗體來製備。

可包括於CAR中之天然存在之配位體的實例包括但不限於CD8、CD4、CD25及CD16。

CAR包括識別且結合至特異性細胞表面抗原之抗原結合片段或抗原結合域。例示性CD33抗原識別域核苷酸序列包括以下：

；及

。

例示性CD33抗原結合片段胺基酸序列包括以下：抗CD33重鏈可變域：EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3)；及抗CD33輕鏈可變域：DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKRTV (SEQ ID NO:4)。CAR 鉸鏈區或間隔區

例示性CD8α衍生之鉸鏈區核苷酸序列包括：

；及

。

例示性CD8α衍生之鉸鏈區胺基酸序列包括：

；及

。

例示性CD28衍生之鉸鏈區核苷酸序列為序列SEQ ID NO:9：ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC。

例示性CD28衍生之鉸鏈區胺基酸序列為序列SEQ ID NO:10：IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP。

例示性IgG1衍生之鉸鏈區核苷酸序列為序列SEQ ID NO:11：GAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCC 。

例示性IgG1衍生之鉸鏈區胺基酸序列為序列SEQ ID NO: 12：EPKSCDKTHTCPPCP。

例示性IgG2衍生之鉸鏈區核苷酸序列為序列SEQ ID NO:13：ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC。

例示性IgG2衍生之鉸鏈區胺基酸序列為序列SEQ ID NO:14：ERKCCVECPPCP。

例示性IgG3衍生之鉸鏈區核苷酸序列為序列SEQ ID NO:15：GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA。

例示性IgG3衍生之鉸鏈區胺基酸序列為序列SEQ ID NO:16：ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP。

例示性IgG4衍生之鉸鏈區核苷酸序列包括：

；

；

；

；及

。

例示性IgG4衍生之鉸鏈區胺基酸序列包括：

；

；

；

；及

。

在本文所述之實施例中，CAR可包括間隔區。例示性間隔區核苷酸序列為：GGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGAAGC (SEQ ID NO:29)。

例示性間隔區胺基酸序列為：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:30)。CAR 跨膜域

本文所述之CAR的跨膜域連接抗原結合域及胞內傳訊域。CAR跨膜域可為例如來自或衍生自CD4、CD8α、CD28、CD3ζ或誘導性T細胞共同刺激因子(ICOS)之胺基酸序列。跨膜域可促成CAR與T細胞受體(TCR)複合物之二聚化以及CAR表面表現。例示性CAR跨膜域描述於例如Stoiber等人(2019)「癌症療法之嵌合抗原受體之設計中的限制」Cells, 8(472):1-26。

如本文所用，「CD4」(亦稱為T細胞表面醣蛋白CD4及CD4mut)係指由Entrez基因ID第920號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_000616.5、NM_001195014.3、NM_001195015.3、NM_001195016.3及NM_001195017.3之核苷酸序列。CD4蛋白質產物包括由CD4編碼之蛋白質，例如包含以下之NCBI參考序列之胺基酸序列的蛋白質：NP_000607.1、NP_001181943.1、NP_001181944.1、NP_001181945.1或NP_001181946.1。CD4之跨膜區包括例如由以下核苷酸序列編碼之NCBI參考序列NP_000607.1之胺基酸序列的胺基酸397-418：

。

如本文所用，「CD8α」(亦稱為CD8α分子，T細胞表面醣蛋白CD8、p32、Leu2及CD8a)係指由Entrez基因ID第925號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001145873.1、NM_001768.6及NM_171827.3之核苷酸序列。CD8蛋白質產物包括由CD8編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列：NP_001139345.1、NP_001759.3或NP_741969.1之胺基酸序列的蛋白質。CD8α之跨膜區包括分別例如由NCBI參考序列NP_001139345.1之胺基酸序列的胺基酸183-203、183-205或183-206：

；

；及

。

CD8α之跨膜區由以下核苷酸序列編碼：

；

；及

。

如本文所用，「CD28」(亦稱為T細胞特異性表面醣蛋白CD28、CD28分子、Tp44)係指由Entrez基因ID第940號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001243077.2、NM_001243078.1及NM_006139.4之核苷酸序列。CD28蛋白質產物包括由CD28編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列：NP_001230006.1、NP_001230007.1或NP_006130.1之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_006130.1之胺基酸序列的胺基酸19-220的成熟CD28蛋白質。CD28之跨膜區包括例如以下之NCBI參考序列NP_006130.1之胺基酸序列的胺基酸153-179：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:62)。

CD28之跨膜區由以下核苷酸序列編碼：

。

如本文所用，「CD3ζ」(亦稱為CD247、CD247分子、T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈、T3Z、CD3H、CD3Q、CD3Z、TCRZ、IMD25及CD3ζ)係指由Entrez基因ID第919號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_000734.4及NM_198053.2之核苷酸序列。CD3ζ蛋白質產物包括由CD3ζ編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列：NP_000725.1或NP_932170.1之胺基酸序列的蛋白質。CD3ζ之跨膜區包括例如以下之NCBI參考序列NP_000725.1之胺基酸序列的胺基酸31-51：LCYLLDGILFIYGVILTALFL (SEQ ID NO:68)。

CD3ζ之跨膜區由以下核苷酸序列編碼：

。

如本文所用，「ICOS」(亦稱為誘導性T細胞共同刺激因子、誘導性T細胞共同刺激因子前驅體、AILIM、CD278及CVID1)係指由Entrez基因ID第29851號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_012092.4之核苷酸序列。ICOS蛋白質產物包括由ICOS編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列NP_036224.1 (SEQ ID NO:71)之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_036224.1 (SEQ ID NO:72)之胺基酸序列的胺基酸21-199的成熟ICOS蛋白質。ICOS之跨膜區包括例如以下之NCBI參考序列NP_036224.1之胺基酸序列的胺基酸141-161：FWLPIGCAAFVVVCILGCILI (SEQ ID NO:73)。

在本文所述之一些實施例中，CAR可包括本文所述之跨膜域的全部或一部分，例如本文所述之CD4、CD8α、CD28、CD3ζ或ICOS跨膜域。舉例而言，在本文所述之一些實施例中，CAR包含約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個胺基酸，或約15至約20、約15至約25、約15至約22、約18至約20、約18至約22或約18至約25個胺基酸之跨膜域。舉例而言，在本文所述之一些實施例中，CAR包含本文所述之CD4、CD8α、CD28、CD3ζ或ICOS跨膜域之約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個胺基酸，或約15至約20、約15至約25、約15至約22、約18至約20、約18至約22或約18至約25個胺基酸的跨膜域。

在本文所述之一些實施例中，CAR包括具有與本文所述之CD4、CD8α、CD28、CD3ζ或ICOS跨膜域約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約90%至約95%、約95%至約100%或約90%至約100%一致之胺基酸序列的跨膜域。CAR 胞內傳訊及共同刺激域

本文所述之CAR的胞內部分可包括胞內傳訊域及視情況一或多個共同刺激域。例示性胞內傳訊域包括例如Fc受體γ鏈次單位(FcRγ)或CD3ζ傳訊域之胺基酸序列或由其衍生。例示性共同刺激域包括例如來自以下或衍生自以下之胺基酸序列：4-1BB (C137；TNFRS9)、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40 (CD134)、IL-2RB、IL-2RA、MYD88或ICOS (CD278)胞內域。舉例而言，本文所述之CAR可包括但不限於以下傳訊域與共同刺激域之組合：4-1BB/CD3ζ、CD27/CD3ζ、CD28/CD3ζ、DAP10/CD3ζ、OX40/CD3ζ、ICOS/CD3ζ、4-1BB/FcRγ、CD27/FcRγ、CD28/FcRγ、DAP10/FcRγ、OX40/FcRγ、ICOS/FcRγ、4-1BB/CD28/CD3ζ、4-1BB/CD28/FcRγ、OX40/CD28/CD3ζ、OX40/CD28/FcRγ、ICOS/4-1BB/CD3ζ及ICOS/4-1BB/FcRγ。

本文所述之CD3ζ傳訊域可包括例如包含以下之NCBI參考序列NP_000725.1之胺基酸序列的胺基酸52-163的蛋白質：

。

編碼CD3ζ傳訊之核苷酸序列為：

。

FcRγ蛋白質之實例為由Entrez基因ID第2207號鑑別的IgE受體Ig之Fc片段(亦稱為FCER1G、FCRG及高親和力免疫球蛋白ε受體次單位γ)。本文所述之FcRγ核苷酸序列可包括例如由Entrez基因ID第2207號編碼之對偶基因變異體、直系同源物及mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_004106.2之核苷酸序列。FcRγ蛋白質產物包括由NCBI參考序列NM_004106.2之核苷酸序列編碼的蛋白質，例如包含NCBI參考序列NP_004097.1之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_004097.1之胺基酸序列的胺基酸19-86的成熟FcRγ蛋白質。FcRγ之傳訊域包括例如NCBI參考序列NP_001552.2之胺基酸序列的胺基酸45-86：

。

FcRγ次單位及CD3ζ含有多個YXXL免疫受體酪胺酸類活化基元(「ITAM」)序列。不受理論束縛，咸信，例如在CAR之抗原結合部分結合細胞表面抗原後，ITAM之酪胺酸磷酸化促進T細胞活化。包括ITAM序列之CD3ζ胺基酸序列的實例為SEQ ID NO:74。包括編碼ITAM序列之CD3ζ核苷酸序列的實例為SEQ ID NO:75。

包括ITAM序列之CD3ζ胺基酸序列的實例為：

。

在本文所述之一些實施例中，CAR可包括本文所述之傳訊域的全部或一部分，例如本文所述之CD3ζ或FcRγ傳訊域。舉例而言，在本文所述之一些實施例中，CAR包含約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120或約130個胺基酸，或約20至約40、約30至約50、約40至約50、約40至約60、約100至約120、約110至約120或約110至約130個胺基酸之傳訊域。舉例而言，在本文所述之一些實施例中，CAR包含含有本文所述之CD3ζ或FcRγ傳訊域或其一部分之約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120或約130個胺基酸，或約20至約40、約30至約50、約40至約50、約40至約60、約100至約120、約110至約120或約110至約130個胺基酸。

在本文所述之一些實施例中，CAR包括具有與本文所述之CD3ζ或FcRγ傳訊域約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約90%至約95%、約95%至約100%或約90%至約100%一致之胺基酸序列的跨膜域。

如本文所用，「4-1BB」(亦稱為TNFRSF9，TNF受體超家族成員9、CD137、ILA、CDw137、腫瘤壞死因子受體超家族成員9及TNFRS9)係指由Entrez基因ID第3604號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_001561.6之核苷酸序列。4-1BB蛋白質產物包括由4-1BB編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列NP_001552.2之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_001552.2之胺基酸序列的胺基酸24-255的成熟4-1BB蛋白質。

4-1BB之跨膜區包括例如以下胺基酸序列：IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV (SEQ ID NO:84)。

4-1BB之跨膜區由以下核苷酸序列編碼：

。

4-1BB之共同刺激域包括例如NCBI參考序列NP_001552.2之胺基酸序列的胺基酸214-255：

。

4-1BB之共同刺激域由以下核苷酸序列編碼：

。

如本文所用，「CD27」(亦稱為CD27分子，T14、S152、Tp55、TNFRSF7、S152、LPFS2及CD27抗原)係指由Entrez基因ID第939號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_001242.4之核苷酸序列。CD27蛋白質產物包括由CD27編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列NP_001233.1之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_001233.1之胺基酸序列的胺基酸21-260的成熟CD27蛋白質。CD27之共同刺激域包括例如NCBI參考序列NP_001233.1之胺基酸序列的胺基酸213-260：

。

CD28之共同刺激域包括例如NCBI參考序列NP_006130.1之胺基酸序列的胺基酸180-220：

。

本文所述之CD28共同刺激域亦包括：

。

編碼CD28共同刺激域之核苷酸序列包括：AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO:94)；及

。

如本文所用，「CD40」(亦稱為CD40分子，p50、Bp50、CDW40、TNFRSF5及腫瘤壞死因子受體超家族成員5)係指由Entrez基因ID第958號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001250.6、NM_001302753.2、NM_001322421.2、NM_001322422.2、NM_001362758.2或NM_152854.4之核苷酸序列。CD40蛋白質產物包括由CD40編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列NP_001241.1、NP_001289682.1、NP_001309350.1、NP_001309351.1、NP_001349687.1、NP_690593.1之胺基酸序列的蛋白質，或例如包含NCBI參考序列NP_001241.1之胺基酸序列的胺基酸21-277的成熟CD40蛋白質。CD40之共同刺激域包括例如NCBI參考序列NP_001241.1之胺基酸序列的胺基酸216-277：

。

如本文所用，「CD40L」(亦稱為CD40配位體，CD40LG、IGM、IMD3、TRAP、gp39、CD154、HIGM1、T-BAM、TNFSF5及hCD40L)係指由Entrez基因ID第959號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_000074.3之核苷酸序列。CD40L蛋白質產物包括由CD40L編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列NP_000065.1之胺基酸序列的蛋白質。CD40L之共同刺激域包括例如NCBI參考序列NP_000065.1之胺基酸序列的胺基酸1-22：

。

如本文所用，「TLR2」(亦稱為toll樣受體2、TIL4及CD282)係指由Entrez基因ID第7097號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001318787.2、NM_001318789.2、NM_001318790.2、NM_001318791.2、NM_001318793.2、NM_001318795.2、NM_001318796.2及NM_003264.5之核苷酸序列。TLR2蛋白質產物包括由TLR2編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列：NP_001305716.1、NP_001305718.1、NP_001305719.1、NP_001305720.1、NP_001305722.1、NP_001305724.1、NP_001305725.1、NP_003255.2之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_001305716.1之胺基酸序列的胺基酸21-784的成熟TLR2蛋白質。TLR2之共同刺激域包括例如NCBI參考序列NP_001305716.1之胺基酸610-784：

；或

NCBI參考序列NP_001305716.1之胺基酸序列的胺基酸640-784：

。

如本文所用，「DAP10」(亦稱為HCST、造血細胞訊息轉導子、KAP10及PIK3AP)係指由Entrez基因ID第10870號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001007469.2或NM_014266.4之核苷酸序列。DAP10蛋白質產物包括由DAP10編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列：NP_001007470.1或NP_055081.1之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_001007470.1之胺基酸序列的胺基酸20-92的成熟DAP10蛋白質。DAP10之共同刺激域包括例如以下之NCBI參考序列NP_001007470.1之胺基酸序列的胺基酸70-92：CARPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO:137)。

如本文所用，「OX40」(亦稱為TNFRSF4、TNF受體超家族成員4、CD134、ACT35、IMD16、腫瘤壞死因子受體超家族成員4及TXGP1L)係指由Entrez基因ID第7293號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_003327.4之核苷酸序列。OX40蛋白質產物包括由OX40編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列NP_003318.1之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_003318.1之胺基酸序列的胺基酸29-277的成熟OX40蛋白質。OX40之共同刺激域包括例如以下之NCBI參考序列NP_003318.1之胺基酸序列的胺基酸236-277：ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:141)。

OX40之共同刺激域由以下核苷酸序列編碼：

。

ICOS之共同刺激域包括例如以下之NCBI參考序列NP_036224.1之胺基酸序列的胺基酸162-199或165-199：例如

。

ICOS之共同刺激域由以下核苷酸序列編碼：

。

如本文所用，「IL-2Rβ」(亦稱為IL2RB、介白素2受體次單位β、CD122、IMD63、IL15RB及P70-75)係指由Entrez基因ID第3560號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_000878.5、NM_001346222.1或NM_001346223.2之核苷酸序列。IL-2Rβ蛋白質產物包括由IL-2Rβ編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列：NP_000869.1、NP_001333151.1或NP_001333152.1之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_000869.1之胺基酸序列的胺基酸27-551的成熟IL-2Rβ蛋白質。IL-2Rβ之共同刺激域包括例如以下之NCBI參考序列NP_000869.1之胺基酸序列的胺基酸266-551：

。

如本文所用，「IL2RA」(亦稱為IL2RA、介白素2受體次單位α、p55、CD25、IL2R、IMD41、TCGFR及IDDM10)係指由Entrez基因ID第3559號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_000417.3、NM_001308242.2或NM_001308243.2之核苷酸序列。IL2RA蛋白質產物包括由IL2RA編碼之蛋白質，例如包含NCBI參考序列：NP_000408.1、NP_001295171.1或NP_001295172.1之胺基酸序列的蛋白質，或包含NCBI參考序列NP_000408.1之胺基酸序列的胺基酸22-272的成熟IL2RA蛋白質。IL2RA之共同刺激域包括例如NCBI參考序列NP_000408.1之胺基酸序列的胺基酸260-272。

如本文所用，「MYD88」(亦稱為MYD88固有免疫訊息轉導接附子、骨髓分化初級反應蛋白質MyD88及MYD88D)係指由Entrez基因ID第4615號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001172566.2、NM_001172567.2、NM_001172568.2、NM_001172569.3、NM_001365876.1、NM_001365877.1、NM_001374787.1、NM_001374788.1或NM_002468.5之核苷酸序列。MYD88蛋白質產物包括由MYD88編碼之蛋白質，例如包含以下之NCBI參考序列之胺基酸序列的蛋白質：NP_001166037.2、NP_001166038.2、NP_001166039.2、NP_001166040.2、NP_001352805.1、NP_001352806.1、NP_001361716.1、NP_001361717.1及NP_002459.3。MYD88之共同刺激域包括例如以下之NCBI參考序列NP_001166038.2之胺基酸序列的胺基酸160-304：

。

在本文所述之一些實施例中，CAR可包括本文所述之共同刺激域的全部或一部分，例如本文所述之4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88或ICOS共同刺激域。舉例而言，在本文所述之一些實施例中，CAR包含長度為約10、約12、約15、約20、約22、約25、約30、約35、約37、約40、約41、約45、約47、約50、約60、約61、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約134、約140、約144、約150、約160、約170、約174、約180、約190、約200、約225、約250、約275、約285、約290或約300個胺基酸之共同刺激域。舉例而言，在本文所述之一些實施例中，CAR包含長度為包含本文所述之4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88或ICOS共同刺激域，或其一部分的約10、約12、約15、約20、約22、約25、約30、約35、約37、約40、約41、約45、約47、約50、約60、約61、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約134、約140、約144、約150、約160、約170、約174、約180、約190、約200、約225、約250、約275、約285、約290或約300個胺基酸之共同刺激域。

在本文所述之一些實施例中，CAR包括具有與本文所述之4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88或ICOS共同刺激域約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約90%至約95%、約95%至約100%或約90%至約100%一致之胺基酸序列的共同刺激域。

本文所述之基因、核苷酸序列(例如mRNA序列)及蛋白質的直系同源物包括但不限於小鼠(亦即小家鼠 )直系同源物。CAR-T 細胞

表現CAR之T細胞(CAR-T細胞)為經分離且經基因工程改造以表現一或多種CAR之T淋巴細胞(T細胞或T細胞)。CAR-T細胞可為自患者(例如需要治療癌症之患者)中分離之T細胞，其經基因工程改造以表現一或多個CAR。可使用任何適合之方法(例如白細胞去除術或血球分離術)自患者中收集細胞，接著溶離以移除骨髓及其他污染細胞且富集T細胞。在分離後，T細胞可藉由任何適合之方式擴增及基因工程改造，例如病毒轉導(例如慢病毒或γ-反轉錄病毒轉導)，或用適合之表現載體轉染或電穿孔。遺傳修飾T細胞隨後可在向患者投與之前在活體外培養物中擴增。

在不受理論束縛之情況下，咸信CAR之表現允許目標細胞群體之CAR-T細胞靶向，例如表現與CAR (例如，scFv、Fab片段、F(ab')₂ 片段或配位體)之抗原特異性靶向區特異性結合的特異性細胞表面抗原之癌細胞。咸信，藉由CAR結合至與主要組織相容複合物分子複合之該特異性細胞表面抗原引起經由CAR之胞內傳訊域(例如，FcRγ或CD3ζ傳訊域)及(若存在)一或多個共同刺激域(例如，4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88及/或ICOS共同刺激域)之傳訊級聯活化。因此，咸信將CAR引入至T細胞中允許T細胞靶向且殺死表現細胞表面抗原之目標細胞群體，該細胞表面抗原經由野生型T細胞所用之相同效應功能(例如，FcRγ、CD3ζ或共同刺激蛋白質傳訊)由CAR識別以消除經感染或經轉化細胞。舉例而言，將本文所述之CAR引入至T細胞中可有效允許T細胞靶向且殺死表現細胞表面抗原之目標癌細胞群體，該細胞表面抗原經由FcRγ、CD3ζ及/或共同刺激蛋白質傳訊由CAR (例如癌細胞抗原、腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原)識別。

在本文所述之一些實施例中，本發明之CAR-T細胞可藉由將一或多種病毒載體引入至經分離T細胞或經分離T細胞群體來產生。在一些實施例中，病毒載體將編碼CAR核苷酸序列之轉殖基因遞送至T細胞。在一些實施例中，CAR核苷酸序列包括編碼抗原特異性靶向區、跨膜域及胞內傳訊域之核苷酸序列。在一些實施例中，CAR核苷酸序列亦包括編碼一或多個共同刺激域、鉸鏈域、間隔域及/或胺基酸轉運體域，例如精胺酸轉運體域之核苷酸序列。

本文提供表現精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之CAR-T細胞(在本文中或者稱為「精胺酸+CAR-T細胞」)，其可用於治療實體腫瘤癌症及血液癌症。

除表現CAR之外，CAR-T細胞亦可經遺傳修飾以共同表現可以增強CAR功能及持久性之一或多種分開之共同刺激蛋白質，包括細胞因子。舉例而言，CAR-T細胞可經編程，以共同表現CD28、CD80、4-1BB、4-1BBL、CD86、OX40L、IL-12、IL-15、IL-18及/或CD70蛋白質。另外，在一些實施例中，CAR-T細胞可經遺傳修飾以表現靶向不同細胞表面抗原之2種或更多種CAR。在一些實施例中，CAR-T細胞可經遺傳修飾以表現靶向單一細胞表面抗原之單一CAR。

本發明之CAR-T細胞包括第一代、第二代、第三代、第四代及第五代CAR。CAR-T技術描述於例如Petersen and Krenciute, (2019)「用於高級別膠質瘤之免疫療法的下一代CAR-T細胞(Next Generation CAR T Cells for the Immunotherapy of High-Grade Glioma)」Frontiers in Oncology, 9:1-9。

第一代CAR包括抗原結合蛋白質域(例如，CD8、CD4、CD25、CD16或抗體衍生之scFv)、鉸鏈/間隔域、跨膜域及傳訊域(諸如CD3ζ或FcRγ胞內傳訊域)之融合物。

第二代CAR包括抗原結合蛋白質域、鉸鏈/間隔域、跨膜域及CD3ζ或FcRγ傳訊域，且進一步包括胞內共同刺激域(例如，4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88或ICOS胞內共同刺激域)。

第三代CAR包括在第二代CAR中發現的所有組分，但包括多個共同刺激域(例如超過單一4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88及/或ICOS胞內共同刺激域)。

第四代及第五代CAR (亦稱為裝甲CAR或TRUCK)經進一步基因工程改造以表現CAR且表現編碼一或多種傳訊蛋白質(例如細胞介素或細胞介素受體蛋白質)之轉殖基因。舉例而言，在一些實施例中，CAR-T細胞經基因工程改造以過度表現IL-12、IL-15、IL-18、IL-7R、CD28、CD80、4-1BB、4-1BBL、CD86、OX40L或CD70。在一些實施例中，傳訊蛋白質，諸如細胞介素或細胞介素受體蛋白質之過度表現可有效地提供具有增強之持久性、增殖或抗腫瘤活性的CAR-T。

另外，CAR-T細胞可使用例如CRISPR/Cas9基因編輯工具經基因工程改造以刪除抑制細胞固有檢查點之基因，例如PD-1或CTLA4。因此，在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞經基因工程改造以刪除或減少PD-1或CTLA4基因表現。CAR-T細胞亦可經基因工程改造以刪除二醯基甘油激酶(DGK)。因此，在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞經基因工程改造以刪除或減少DGK基因表現，例如DGKα及/或DGKζ同功異型物表現。

在一些實施例中，CAR-T細胞可使用例如CRISPR/Cas9基因編輯工具經基因工程改造，以允許經靶向CAR轉殖基因插入T細胞之基因體中。在一些實施例中，CAR轉殖基因插入由編碼CAR核苷酸序列之腺相關病毒(AAV)載體，例如AAV6載體介導。舉例而言，在一些實施例中，CAR-T細胞經基因工程改造以將CAR轉殖基因插入內源性TCR基因序列中，例如TCRα鏈基因座中。在一些實施例中，CAR-T細胞可使用例如CRISPR/Cas9基因編輯工具經基因工程改造以用突變基因序列置換天然T細胞基因序列。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞經基因工程改造以分別用突變PD-1或CXCR4基因序列置換PD-1或CXCR4基因序列。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼CAR之游離基因體。在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼CAR之整合轉殖基因。

本文亦描述經基因工程改造以表現胺基酸轉運蛋白，例如精胺酸轉運蛋白之CAR-T細胞。在本文所述之一些實施例中，CAR-T細胞經基因工程改造以表現選自由以下組成之群的精胺酸轉運蛋白：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1、4F2hc、y⁺ LAT2、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT、rBAT、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 或其組合。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞經基因工程改造以包括編碼胺基酸轉運體之核苷酸序列，例如編碼精胺酸轉運體之核苷酸序列。在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之游離基因體。在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之轉殖基因。

本文亦描述經基因工程改造以表現CAR及胺基酸轉運蛋白，例如精胺酸轉運蛋白之CAR-T細胞。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞經基因工程改造以包括編碼CAR及胺基酸轉運體之核苷酸序列，例如編碼精胺酸轉運體之核苷酸序列。在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之游離基因體。在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之轉殖基因。在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼CAR之游離基因體及編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之游離基因體。在一些實施例中，本文所述之CAR-T細胞包含編碼CAR之轉殖基因及編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之轉殖基因。胺基酸轉運蛋白

本文描述經遺傳修飾以表現一或多種胺基酸轉運蛋白(AAT)之CAR-T細胞。胺基酸轉運體為膜轉運蛋白，其藉由經由胺基酸之轉運調節能量代謝、蛋白質合成、基因表現、氧化還原平衡訊息轉導路徑及在細胞及整個生物體層面上之生長而起重要作用。胺基酸不易在脂質膜之間擴散，因此需要跨膜轉運蛋白將胺基酸移入及移出細胞且在膜結合胞內隔室之間移動。胺基酸轉運可與包括Na⁺ 、H⁺ 、K⁺ 及/或Cl^- 之離子的移動以及其他胺基酸之反向移動耦接。AAT之失調引起代謝重新編程，其改變促成發病機制之胞內胺基酸含量。AAT之失調涉及多種病理性病狀，諸如但不限於自體吞噬及經由代謝重新編程之腫瘤細胞增殖，及遺傳人類代謝病症，諸如胱胺酸尿症。歸因於此等代謝能力，AAT可提供抗癌藥物中之潛在目標。

胺基酸轉運蛋白由屬於包括以下之多個家族的基因編碼：溶質載體(SLC)蛋白質；胺基酸-多元胺-有機陽離子(APC)超家族；胺基酸/生長素通透酶(AAAP)家族；二羧酸酯/胺基酸:陽離子(Na+或H+)同向轉運體(DAACS)家族；分支鏈胺基酸:陽離子同向轉運體(LIVCS)家族；羥基/芳族胺基酸通透酶(HAAAP)家族；分支鏈胺基酸輸出子(LIV-E)家族；6TMS中性胺基酸轉運體(NAAT)家族；鹼性胺基酸反向轉運體(ArcD)家族；及假定胺基酸通透酶(PAAP)家族。SLC蛋白質包含最大的胺基酸轉運蛋白群，且包括分佈於65個家族之間的超過400個蛋白質。

胺基酸轉運蛋白可分類為：鈉依賴性中性胺基酸轉運體、非鈉依賴性中性胺基酸轉運體、鈉依賴性陰離子胺基酸轉運體-系統X⁻ _AG 、非鈉依賴性陰離子胺基酸轉運體系統x_C ⁻ 、鈉依賴性陽離子胺基酸轉運體及非鈉依賴性陽離子胺基酸轉運體。胺基酸轉運蛋白控制胺基酸在細胞膜之間轉運，包括轉運精胺酸、麩醯胺酸及白胺酸，以及傳訊化合物，諸如γ-胺基丁酸(GABA)。胺基酸轉運蛋白之實例描述於例如Ren等人, (2017)「T細胞活化及分化中之胺基酸轉運體」Cell Death and Disease, 8, e2655中。精胺酸轉運蛋白

本文亦描述經遺傳修飾以表現一或多種精胺酸轉運蛋白之CAR-T細胞。精胺酸轉運蛋白由屬於溶質載體基因(SLC)家族之基因編碼。大多數SLC編碼定位至細胞膜之蛋白質，不過一些成員定位至粒線體或其他胞內細胞器。SLC家族蛋白質產物可在細胞膜之間轉運例如帶電有機分子、不帶電有機分子、無機離子及/或氨。特異性編碼能夠在細胞膜之間轉運精胺酸之轉運蛋白的SLC家族包括SLC3、SLC6及SLC7家族。

在哺乳動物中，細胞精胺酸可用性很大程度上由SLC7家族之成員調控，儘管在溶質載體基因超家族中存在6個主要的AAT家族。此等轉運體基因之蛋白質產物的特徵為具有圍繞中心孔區域組織之多個跨膜域。其在質膜中之效率及能力顯著確定細胞中之精胺酸可用性。

SLC7家族分成兩個子組：陽離子胺基酸轉運體(CAT)及L型胺基酸轉運體(LAT)。CAT充當質膜中之單體，而LAT為與單個跨膜跨醣蛋白(SLC3)形成二硫鍵連接之二聚體的絕對雜二聚體，該跨膜跨醣蛋白將轉運體運輸至質膜且有助於蛋白質穩定性。CAT及LAT家族展現出其與SLC3家族、受質特異性及轉運機制之相互作用的不同差異。CAT對包括精胺酸之陽離子胺基酸具有特異性。最初表示為系統y⁺ ，CAT以較高親和力介導陽離子胺基酸之非Na⁺ 依賴性攝取。在哺乳動物中，CAT充當交換劑或促進劑。經由陽離子胺基酸轉運體之此等y⁺ 系統的表現顯著調節精胺酸代謝。

精胺酸轉運蛋白包括：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT2、4F2hc、y⁺ LAT1、b^0,+ AT、rBAT及ATB^0,+ 。在本文所述之一些實施例中，精胺酸轉運體由單一SLC家族蛋白質組成，例如：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4或ATB^0,+ 。在一些實施例中，精胺酸轉運體由SLC家族蛋白質之組合組成，例如：y⁺ LAT2及4F2hc、y⁺ LAT1及4F2hc或b^0,+ AT及rBAT。

精胺酸轉運蛋白可為鈉依賴性及氯依賴性或非鈉依賴性胺基酸轉運蛋白。非鈉依賴性胺基酸轉運蛋白之實例包括以下成員：y⁺ (例如，CAT-1、CAT-2、CAT-3)、y⁺ L (例如，4F2hc，其與y⁺ LAT1或y⁺ LAT2組合)及b⁰ ^,+ 轉運體系統。鈉依賴性胺基酸轉運蛋白之實例包括B⁰ ^,+ 轉運體系統之成員。由單一蛋白質組成之精胺酸轉運體系統包括y⁺ 及B⁰ ^,+ 轉運體系統之成員。相比之下，y⁺ L及b⁰ ^,+ 精胺酸轉運體系統包含醣蛋白(例如，4F2hc)及蛋白質。

如本文所用，「SLC7A1」(亦稱為溶質載體家族7成員1、ERR、ATRC1、CAT-1、HCAT1及REC1L)係指由Entrez基因ID第6541號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_003045.5(SEQ ID NO:180)之核苷酸序列。

本文所述之陽離子胺基酸轉運體1 (CAT-1)蛋白質包括由SLC7A1編碼之蛋白質序列、NCBI參考序列NP_003036.1之胺基酸序列及NCBI共同編碼序列(CCDS) ID第CCDS9333.1號之胺基酸序列：

。

例示性CAT-1核苷酸序列為NCBI CCDS ID第CCDS9333.1號之核苷酸序列：

。

如本文所用，「SLC7A2」(亦稱為溶質載體家族7成員2、CAT2、ATRC2及HCAT2)係指由Entrez基因ID第6542號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001008539.4 (SEQ ID NO:184)、NM_001164771.2 (SEQ ID NO:185)、NM_001370337.1 (SEQ ID NO:186)、NM_001370338.1 (SEQ ID NO:187)或NM_003046.6 (SEQ ID NO:188)之核苷酸序列。

本文所述之陽離子胺基酸轉運體2 (CAT-2)蛋白質包括由SLC7A2編碼之蛋白質序列及NCBI參考序列：NP_001008539.3、NP_001158243.1、NP_001357266.1、NP_001357267.1或NP_003037.4之胺基酸序列。CAT-2可表現為多種同功異型物，包括CAT-2A (鑑別為NCBI CCDS ID第CCDS6002.2號之胺基酸序列：

；及 CAT-2B (鑑別為NCBI CCDS ID第CCDS34852.1號之胺基酸序列：

。

CAT-2A核苷酸序列為CCDS ID第CCDS6002.2號之核苷酸序列：

。

CAT-2B核苷酸序列為CCDS ID第CCDS34852.1號之核苷酸序列：

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本文亦描述CAT-2A蛋白質，其包括一或多個天然存在或經工程改造胺基酸突變。舉例而言，本文描述包括取代及/或插入突變之CAT-2A蛋白質。CAT-2A胺基酸序列可包括例如胺基酸突變R369E、N381i或R369E及N381i。包括R369E、N381i及R369E/N381i突變之CAT-2A胺基酸序列包括以下：

；

；及

。

編碼R369E、N381i及R369E/N381i突變之核酸序列包括以下：

；

；及

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如本文所用，「SLC7A3」(亦稱為溶質載體家族7成員3、CAT3、ATRC3及CAT-3)係指由Entrez基因ID第84889號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001048164.3 (SEQ ID NO:204)或NM_032803.6 (SEQ ID NO:205)之核苷酸序列。

本文所述之陽離子胺基酸轉運體3 (CAT-3)蛋白質包括由SLC7A3編碼之蛋白質序列、NCBI參考序列NP_001041629.1及NP_116192.4之胺基酸序列及NCBI CCDS ID第CCDS14404.1號之胺基酸序列：

。

CAT-3核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS14404.1號之核苷酸序列：

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如本文所用，「SLC7A4」(亦稱為溶質載體家族7成員4、VH、CAT4、CAT-4及HCAT3)係指由Entrez基因ID第6545號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_004173.3 (SEQ ID NO:210)之核苷酸序列。

本文所述之陽離子胺基酸轉運體4 (CAT-4)蛋白質包括由SLC7A4編碼之蛋白質序列、NCBI參考序列NP_004164.2之胺基酸序列及NCBI CCDS ID第CCDS33608.1號之胺基酸序列：

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CAT-4核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS33608.1號之核苷酸序列：

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如本文所用，「SLC7A6」(亦稱為溶質載體家族7成員6、LAT3、LAT-2及y⁺ LAT-2)係指由Entrez基因ID第9057號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001076785.3 (SEQ ID NO:214)或NM_003983.6 (SEQ ID NO:215)之核苷酸序列。

y⁺ L胺基酸轉運體2 (y⁺ LAT2)蛋白質包括由SLC7A6編碼之蛋白質序列、NCBI參考序列NP_001070253.1及NP_003974.3之胺基酸序列及NCBI CCDS ID第CCDS32470.1號之胺基酸序列：

。

y⁺ LAT2核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS32470.1號之核苷酸序列：

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如本文所用，「SLC7A7」(亦稱為溶質載體家族7成員7、LPI、LAT3、MOP-2、Y+LAT1及y⁺ LAT-1)係指由Entrez基因ID第9056號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001126105.3 (SEQ ID NO:220)、NM_003982.4 (SEQ ID NO:221)及NM_001126106.4 (SEQ ID NO:222)之核苷酸序列。

本文所述之y⁺ L胺基酸轉運體1 (y⁺ LAT1)蛋白質包括由SLC7A7編碼之蛋白質序列、NCBI參考序列NP_001119578.1及NP_003973.3之胺基酸序列及NCBI CCDS ID第CCDS9574.1號之胺基酸序列：

。

y⁺ LAT1核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS9574.1號之核苷酸序列：

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如本文所用，「SLC3A2」(亦稱為溶質載體家族3成員2、4F2、CD98、MDU1、4F2HC、4T2HC、NACAE及CD98HC)係指由Entrez基因ID第6520號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001012662.3 (SEQ ID NO:227)、NM_001012664.3 (SEQ ID NO:228)、NM_001013251.3 (SEQ ID NO:229)或NM_002394.6 (SEQ ID NO:230)之核苷酸序列。

本文所述之4F2細胞表面抗原重鏈(4F2hc)蛋白質包括由SLC3A2編碼之蛋白質及NCBI參考序列NP_002385.3及NCBI CCDS ID第CCDS8039.2號之胺基酸序列：

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4F2hc核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS8039.2號之核苷酸序列：

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如本文所用，「SLC7A9」(亦稱為溶質載體家族7成員9、BAT1及CSNU3)係指由Entrez基因ID第11136號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列：NM_001126335.2 (SEQ ID NO:234)、NM_001243036.2 (SEQ ID NO:235)、NM_014270.5 (SEQ ID NO:236)之核苷酸序列。

本文所述之鈉依賴性中性胺基酸轉運體BAT1 (b⁰ ^,+ AT)蛋白質包括由SLC7A9編碼之蛋白質及NCBI參考序列NP_001119807.1、NP_001229965.1、NP_055085.1及NCBI CCDS ID第CCDS12425.1號之胺基酸序列：

。

b^0,+ AT核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS12425.1號之核苷酸序列：

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如本文所用，「SLC3A1」(亦稱為溶質載體家族3成員1、D2H、ATR1、NBAT、RBAT及CSNU1)係指由Entrez基因ID第6519號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_000341.4 (SEQ ID NO:242)之核苷酸序列。

本文所述之中性及鹼性胺基酸轉運蛋白rBAT (rBAT)蛋白質包括由SLC3A1編碼之蛋白質及NCBI參考序列NP_000332.2及NCBI CCDS ID第CCDS1819.1號之胺基酸序列：

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rBAT核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS1819.1號之核苷酸序列：

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如本文所用，「SLC6A14」(亦稱為溶質載體家族6成員14及BMIQ11)係指由Entrez基因ID第11254號鑑別之基因、其對偶基因變異體、其直系同源物、其蛋白質產物及由基因編碼之mRNA轉錄物，包括NCBI參考序列NM_007231.5 (SEQ ID NO:246)之核苷酸序列。

本文所述之鈉依賴性及氯依賴性中性及鹼性胺基酸轉運體B⁰ ^,+ (ATB⁰ ^,+ )蛋白質包括由SLC6A14編碼之蛋白質及NCBI參考序列NP_009162.1及NCBI CCDS ID第CCDS14570.1號之胺基酸序列：

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ATB^0,+ 核苷酸序列包括NCBI CCDS ID第CCDS14570.1號之核苷酸序列：

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經活化T細胞經由上調陽離子胺基酸轉運體顯著增加精胺酸輸入。CAT之上調有助於T細胞增殖。精胺酸缺乏在炎症及癌症相關免疫抑止中係重要的，且導致嚴重損害T細胞功能。反應於精胺酸缺乏，T細胞誘導自體吞噬以增加胞內精胺酸之進入。此細胞保護機制保持T細胞成活力但無法維持細胞增殖。

骨髓衍生之抑制細胞可藉由剝奪基本代謝物，諸如精胺酸之T細胞或干擾T細胞成活力、遷移或活化而直接促進免疫功能不全。MDSC亦可藉由誘導其他免疫調節細胞(諸如T調節細胞及腫瘤相關巨噬細胞)來間接抑制T細胞，增大資源競爭。精胺酸可用性調節了許多此等活性。多形核MDSC (負載腫瘤之宿主中精胺酸酶1之主要來源)藉由分泌精胺酸酶1且經由陽離子胺基酸轉運體增強精胺酸攝取來降低胞外精胺酸。在精胺酸介導之腫瘤免疫逃避之情況下復原適應性免疫功能為用以增強免疫抗腫瘤反應之潛在治療策略。

本文描述在有限精胺酸可用性之環境中(其在骨髓細胞及癌細胞在對精胺酸的競爭中勝過T細胞時(例如在TME中)發生)拯救T細胞增殖及活性之方法。在一些實施例中，本文描述過度表現特異性胺基酸轉運體或胺基酸轉運體之組合的CAR-T細胞。在一些實施例中，本文描述過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞。在一些實施例中，本文描述表現或過度表現可將精胺酸自CAR-T細胞之胞外空間轉運至胞溶質中之胺基酸轉運體的CAR-T細胞。在一些實施例中，胺基酸轉運體為人類胺基酸轉運體以降低免疫原性，但可由其他物種修飾。舉例而言，在一些實施例中，胺基酸轉運體為人類化胺基酸轉運體。表1描述能夠雙向轉運諸如精胺酸之陽離子胺基酸的人類胺基酸轉運體。

表1
蛋白質	基因	mRNA序列寄存編號(SEQ ID NO)	表觀K _M (mmol/L)	Na⁺ 依賴性	反式刺激
CAT-1	SLC7A1	NM_003045.5 (SEQ ID NO:180)	.1-.16	否	是
CAT-2	SLC7A2	NM_001008539.4 (SEQ ID NO:184) NM_001164771.2 (SEQ ID NO:185) NM_001370337.1 (SEQ ID NO:186) NM_001370338.1 (SEQ ID NO:187) NM_003046.6 (SEQ ID NO:188)	3.4-3.9	否	否
CAT-3	SLC7A3	NM_001048164.3 (SEQ ID NO:204) NM_032803.6 (SEQ ID NO:205)	.2-.5	否	中毒
CAT-4	SLC7A4	NM_004173.3 (SEQ ID NO:210)	NA	NA	NA
y⁺ LAT1 & 4F2hc	SLC7A7 & SLC3A2	NM_001126105.3 (SEQ ID NO:220) NM_003982.4 (SEQ ID NO:221) NM_001126106.4 (SEQ ID NO:222) & NM_001012662.3 (SEQ ID NO:227) NM_001012664.3 (SEQ ID NO:228) NM_001013251.3 (SEQ ID NO:229) NM_002394.6 (SEQ ID NO:230)	.34	否	是
y⁺ LAT2 & 4F2hc	SLC7A6 & SLC3A2	NM_001076785.3 (SEQ ID NO:214) NM_003983.6 (SEQ ID NO:215) & NM_001012662.3 (SEQ ID NO:227) NM_001012664.3 (SEQ ID NO:228) NM_001013251.3 (SEQ ID NO:229) NM_002394.6 (SEQ ID NO:230)	.12-.14	否	是
b^0,+ AT & rBAT	SLC7A9 & SLC3A1	NM_001126335.2 (SEQ ID NO:234) NM_001243036.2 (SEQ ID NO:235) NM_014270.5 (SEQ ID NO:236) & NM_000341.4 (SEQ ID NO:242)	.08-.2	否	是
ATB⁰⁺	SLC6A14	NM_007231.5 (SEQ ID NO:246)	.1-.15	是	否

CAT家族成員藉由用胞內受質差異性反式刺激促進擴散來轉運基本上陽離子胺基酸。在一些細胞中，其可藉由控制L-精胺酸作為氧化氮合成酶之受質的攝取來調節NO合成速率。在正常生理濃度下，主要由陽離子胺基酸轉運體類型1 (CAT-1)表示之生物化學系統y⁺ 載體為經由質膜之主要細胞轉運體系統。CAT-1由SLC7A1基因編碼且廣泛分佈於多種系統中且對多種細胞功能至關重要。CAT-1為非Na⁺ 依賴性轉運體且對精胺酸具有最高親和力(最低K _M )，即使當精胺酸濃度較低時，其亦允許有效轉運。CAT-1之較強反式刺激指示其在交換中比在單向轉運模式下效果更好。

本發明亦涵蓋CAT-2A同功異型物之人工變異體，諸如CAT-2A^R369E 、CAT-2A^N381i 及CAT-2A^R369E ^/ ^N381i 。儘管陽離子胺基酸之表觀K _M 值及對CAT-1、CAT-2B及CAT-3之反式刺激的敏感性為系統y⁺ 之特徵，CAT-2A在膜之反側處展現出的受質親和力降低了10倍且很大程度上與受質無關。此變異體藉由將來自CAT-1之胞內域的兩個胺基酸移植至CAT-2A中之同源域而人工地產生。具體言之，369位置處之Arg殘基經Glu殘基(R369E)置換，而Asn殘基插入位置381中。所得變異體具有與CAT-1相當之K _M ，而不負載反式刺激。

CAR-T細胞呈現出與單株抗體相當之目標特異性且呈現出細胞毒素T細胞之效應功能，使CAR-T治療對多種疾病具有吸引力。此等特徵允許抗原識別與主要組織相容複合物無關且可經設計以特異性靶向抗原之保守及必需抗原決定基。

實體腫瘤中之TME為敵意環境，其中大量的免疫抑制訊息及必需營養素的短缺導致T細胞衰竭。特定言之，精胺酸由活性癌細胞迅速耗盡且由自經浸潤骨髓衍生之抑制細胞分泌的各種精胺酸酶降解。此外，T細胞不能自其他胺基酸再生精胺酸且依賴於外源性精胺酸供應。本發明人已發現，使用精胺酸轉運體增強CAR-T細胞可使得此等細胞在此等敵意微環境中更好地競爭精胺酸。

亦可採用精胺酸轉運體之過度表現，例如以在再輸注至患者中之前促發經擴增CAR-T細胞。表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞可在富含精胺酸條件下活體外培養，直至其獲取到足夠精胺酸以在TME內維持表現及後續抗腫瘤活性。經由T細胞之活體外促發進行的胞內精胺酸富集可促進CAR-T細胞之存活、生存期、活性及治療功效。

例示性精胺酸轉運體包括CAT-1、CAT-2、CAT-3及ATB⁰ ^,+ ，其可能不需要任何次單位。亦涵蓋精胺酸轉運體y⁺ LAT1+4F2hc、y⁺ LAT2+4F2hc或b⁰ ^,+ AT+rBAT。舉例而言，CAT-1、CAT-2及CAT-3不共轉運Na⁺ 或Cl^- ，且可在過度表現時對膜電位具有極小影響。CAT-1對精胺酸具有較高親和力(亦即最低K_m )，即使當精胺酸濃度較低時其亦可允許有效轉運。CAT-2之活性可不受反式刺激影響。

精胺酸+CAR-T細胞可表現包含一或多個突變之精胺酸轉運體。用於改進精胺酸轉運體之表現的適合之胺基酸修飾可為保守或非保守突變。可進行突變以使得經編碼轉運體經修飾成極性、非極性、鹼性或酸性胺基酸轉運體。經工程改造CAR-T細胞可自個體之全血產生，其中將T細胞與全血產物分離且在實驗室中藉由經由載體將基因插入至細胞中以在其表面上產生特異性靶向所關注抗原之嵌合抗原受體而再工程改造。此等經修飾T細胞經倍增且放回個體之血流中，其中其繼續倍增。在不受理論束縛之情況下，咸信在向個體投與時，CAR-T細胞便被吸引至癌細胞表面上之目標。在不受理論束縛之情況下，咸信CAR-T細胞鑑別表現目標抗原之細胞且將其殺死。CAR-T細胞可在急性攻擊之後留在體內且防止目標細胞恢復。CAR - T 細胞產生之方法

本文所述之CAR-T細胞可由自個體，例如需要治療之患者收穫的免疫細胞，例如CD4+及CD8+T細胞產生。適當T細胞群體可使用血球分離術/白細胞去除術與細胞分離方法(例如逆流離心淘析法)組合而自全血收穫及分離。分離T細胞群體之方法為此項技術中已知的且可使用適合之設備進行，例如Haemonetics細胞回收器(Haemonetics, Boston, MA)及/或CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec，Germany)。經分離T細胞可使用此項技術中已知之方法擴增且刺激，包括例如與飼養細胞及/或在生物反應器中且在例如抗CD3抗體、抗CD28抗體、磁珠共軛之抗CD3抗體、磁珠共軛之抗CD28抗體、生長因子(例如IL-2)及人工抗原呈現細胞存在下培養。適合之生物反應器系統包括CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec, Germany)、WAVE生物反應器(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)及G-Rex (Wilson Wolf Manufacturing, Saint Paul, MN)。舉例而言，經分離T細胞可在37℃下在5% CO₂ 下在補充有200 IU/mL IL-2及TransAct珠粒(Miltenyi Biotec, Germany)之TexMACS培養基(Miltenyi Biotec, Germany)中擴增。分離及擴增T細胞群體之方法描述於例如Levine等人, (2017)「CAR-T細胞療法之整體製造」Mol Ther Methods Clin Dev. 4:92-101。

本文所述之產生CAR-T細胞的方法亦可包括用編碼CAR、胺基酸轉運體或CAR及胺基酸轉運體之一或多種表現載體轉染經擴增T細胞群體的步驟。適合之轉染方法為此項技術中已知且包括例如磷酸鈣轉染、脂質體轉染、聚合物轉染、Fugene產物類轉染(Promega Corporation, Madison, WI)及電穿孔，例如使用CliniMACS電穿孔器(Miltenyi Biotec, Germany)。在本文所述之一些實施例中，產生CAR-T細胞之方法可包括用一或多種含轉座子之質體，例如編碼睡美人轉座子(Sleeping Beauty transposon)之質體及CAR、胺基酸轉運體或CAR及胺基酸轉運體轉染經擴增T細胞群體之步驟。

在本文所述之一些實施例中，產生CAR-T細胞之方法可包括使用病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒)以轉導具有一或多種編碼CAR、胺基酸轉運體或CAR及胺基酸轉運體之表現載體之經擴增T細胞群體的步驟。

經傳染之T細胞或經適當核苷酸構築體轉導之T細胞可在適合之培養基(例如補充有1mM L-精胺酸(Sigma-Aldrich，USA)之TexMACS培養基(Miltenyi Biotec, Germany))中進一步滋養且分析其成活力。

T細胞純度及輔助T細胞與殺手T細胞之比率可使用利用適合之抗體(例如，抗CD19、CD14、CD45、CD3、CD4及CD8抗體)的流式細胞量測術及螢光輔助細胞分選(FACS)方法確定。可使用對CAR之抗原識別域具有特異性或對精胺酸轉運體具有特異性之定製抗體確定CAR及精胺酸轉運蛋白之表現。

可使用L-精胺酸ELISA套組(ALPCO，USA)確定CAR-T胞內精胺酸含量。

本文所述之方法可包括基於所得細胞之數目收穫用於下游應用之CAR-T細胞的步驟。舉例而言，在一些實施例中，用於收穫之CAR-T細胞的量包括等效於以下之量：約1×10³ 、約1×10⁴ 、約1×10⁵ 、約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約2×10¹⁰ 、約3×10¹⁰ 、約4×10¹⁰ 、約5×10¹⁰ 、約6×10¹⁰ 、約7×10¹⁰ 、約8×10¹⁰ 、約9×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 、約1×10³ 至約3×10¹⁰ 、約1×10⁵ 至約3×10¹⁰ 、約1×10³ 至約1×10⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁷ 至約1×10¹² 、約1×10⁵ 至約1×10⁷ 、約1×10¹⁰ 至約9×10¹⁰ 或約1×10⁹ 至約1×10¹¹ 個細胞每公斤個體體重。在一些實施例中，用於收穫之CAR-T細胞的量包括約1×10⁵ 、約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10⁵ 至約1×10¹² 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁵ 至約1×10⁷ 、約1×10⁷ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁷ 至約1×10¹² 、約1×10⁹ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁶ 至約1×10⁸ 、約1×10⁷ 至約1×10⁹ 或約1×10⁹ 至約1×10¹¹ 個細胞。

本文所述之方法可包括基於所得細胞之精胺酸含量收穫用於下游應用之CAR-T細胞的步驟。舉例而言，在一些實施例中，用於收穫之CAR-T細胞包括具有以下胞內精胺酸含量之細胞：約10 µM、約20 µM、約30 µM、約40 µM、約50 µM、約60 µM、約70 µM、約80 µM、約90 µM、約100 µM、約200 µM、約300 µM、約400 µM、約500 µM、約600 µM、約700 µM、約800 µM、約900 µM、約1000 µM、約1500 µM、約2000 µM、約2500 µM、約3000 µM、約3500 µM、約4000 µM、約100 µM至約4000 µM、約100 µM至約1000 µM、約100 µM至約2000 µM、約1000 µM至約2000 µM、約1000 µM至約3000 µM、約1000 µM至約4000 µM、約500 µM至約1000 µM、約3000 µM至約4000 µM、約2000 µM至約4000 µM或約500 µM至約2000 µM精胺酸/細胞。

本文所述之CAR-T細胞可經遺傳修飾以表現特異性CAR及/或胺基酸轉運蛋白，例如精胺酸轉運蛋白。在一些實施例中，在編碼CAR之表現匣之前、之後或同時將編碼精胺酸轉運體之表現匣引入(例如藉由基因工程改造)T細胞中。編碼胺基酸轉運體之核苷酸序列可與編碼CAR者並排置放於相同載體上(例如CAR及轉運體兩者之一個載體)。此同時將CAR與轉運體兩者引入相同細胞中，使得每個所得精胺酸+CAR-T細胞均藉由轉運體增強。在一些實施例中，編碼胺基酸轉運體之核苷酸構築體置放於與編碼CAR者不同的載體上(例如CAR及轉運體之個別載體)。

本文所述之CAR-T細胞可藉由用一或多種編碼CAR及/或胺基酸轉運蛋白，例如精胺酸轉運蛋白之核酸序列的特異性表現載體使T細胞轉染、電穿孔或轉化產生。本文所述之CAR-T細胞亦可藉由用一或多種攜帶編碼CAR及/或胺基酸轉運蛋白，例如精胺酸轉運蛋白之核酸序列的特異性表現載體之病毒轉導T細胞產生。經分離T細胞可用一或多種反轉錄病毒載體，例如整合γ-反轉錄病毒載體或慢病毒載體轉導。將γ-反轉錄病毒載體或慢病毒載體隨機整合至T細胞基因體中。經分離T細胞亦可經一或多個整合人工轉座子轉化或經由用非整合RNA分子轉染。在一些實施例中，經分離T細胞可用CRISPR/Cas-9表現構築體電穿孔且經一或多種編碼特異性CAR及/或胺基酸轉運蛋白，例如精胺酸轉運蛋白之腺病毒或AAV載體轉染。

舉例而言，本文描述一種產生遺傳修飾T細胞(例如CAR-T細胞)之方法，其包括用包含編碼CAR之核酸序列及編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核酸序列的表現載體轉染T細胞。本文亦描述一種產生遺傳修飾T細胞(例如CAR-T細胞)之方法，其包括用包含編碼CAR之核酸序列的第一表現載體及包含編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核酸序列的第二表現載體轉染T細胞。在一些實施例中，轉染可藉由化學轉染方法(例如，磷酸鈣轉染、脂質體轉染、聚合物轉染(例如，DEAE-聚葡萄糖或聚伸乙亞胺(PEI)轉染)或由Fugene研發之轉染試劑(Promega Corporation, Madison, WI；例如，FuGENE HD或FuGENE 6轉染試劑))、非化學轉染方法(例如電穿孔、細胞擠壓、超音穿孔、光學轉染、原生質體融合、刺穿轉染(impalefection)或流體動力遞送)、粒子類轉染(基因槍轉染、磁輔助轉染)、核轉染或熱休克轉染進行。在一些實施例中，該方法包括同時或依次用第一表現載體及第二表現載體轉染T細胞。

本文亦描述一種產生遺傳修飾T細胞(例如CAR-T細胞)之方法，其包括用攜帶編碼CAR之核酸序列及編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核酸序列的病毒(例如腺病毒、AAV、慢病毒或反轉錄病毒)轉導T細胞。本文亦描述一種產生遺傳修飾T細胞(例如CAR-T細胞)之方法，其包括用攜帶編碼CAR之核酸序列的第一病毒(例如腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或反轉錄病毒)轉導T細胞且用攜帶編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核酸序列的第二病毒(例如腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或反轉錄病毒)轉導T細胞。在一些實施例中，該方法包括同時或依次用第一病毒及第二病毒轉導T細胞。

在一些實施例中，在產生遺傳修飾T細胞之方法包括用表現載體轉染T細胞或用病毒轉導該細胞之情況下，該方法亦可包括例如藉由抗生素抗性選擇轉染物之步驟。

在一些實施例中，在產生遺傳修飾T細胞之方法包括依次用第一表現載體及第二表現載體轉染T細胞之情況下，該方法亦可包括例如藉由抗生素抗性或適用於FACS之選擇標記物(諸如螢光蛋白)的表現選擇轉染物之步驟。舉例而言，此類方法可包括選擇第一表現載體之轉染物的步驟。此類方法可進一步包括選擇第二表現載體之轉染物的步驟。此類方法可進一步包括選擇第一及第二表現載體之轉染物的步驟。在一些實施例中，選擇第一表現載體之轉染物在用第二表現載體轉染之前進行。

在一些實施例中，在產生遺傳修飾T細胞之方法包括依次用第一病毒及第二病毒轉導T細胞之情況下，該方法亦可包括例如藉由抗生素抗性或藉由FACS選擇經轉導細胞之步驟。舉例而言，此類方法可包括選擇經第一病毒轉導之細胞的步驟。此類方法可進一步包括選擇經第二病毒轉導之細胞的步驟。此類方法可進一步包括選擇經第一及第二病毒轉導之細胞的步驟。在一些實施例中，選擇經第一病毒轉導之細胞在經第二病毒轉導之前進行。

在一些實施例中，一種產生遺傳修飾T細胞之方法包括用病毒轉導T細胞且用表現載體轉染T細胞，其中轉導及轉染可以任一順序進行(例如，先轉導再轉染，或先轉染再轉導)。舉例而言，在一些實施例中，一種產生遺傳修飾T細胞之方法包括用攜帶編碼CAR之核酸序列的病毒轉導T細胞且用包含編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核酸序列的表現載體轉染T細胞。在一些實施例中，一種產生遺傳修飾T細胞之方法包括用攜帶編碼胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之核酸序列的病毒轉導T細胞且用包含編碼CAR之核酸序列的表現載體轉染T細胞。CAR 及胺基酸轉運體表現載體及轉殖基因

本文所述之CAR-T核苷酸構築體(例如核苷酸表現載體及病毒核苷酸構築體)可包括標準組分，諸如但不限於啟動子、Kozak序列、基因表現匣、自裂解位點、選擇標記物(例如，螢光蛋白表現匣或抗生素抗性匣)、反向串聯重複序列及轉錄終止及polyA訊息訊息序列。

例示性啟動子序列包括以下：

；

；

；及

。

例示性轉錄終止及polyA訊息訊息序列包括以下：

；

；

；及

。

例示性反向串聯重複(TIR)序列包括以下pT4左側反向串聯重複(LIR)序列及右側反向串聯重複(RIR)序列：

；及

。

例示性自裂解位點核苷酸序列包括以下：

；

；

；及

。

例示性選擇標記物核苷酸序列包括以下螢光蛋白質及抗生素抗性蛋白質編碼序列： mEGFP (螢光蛋白質編碼序列)：

； mEmerald (螢光蛋白質編碼序列)：

； mCherry2 (螢光蛋白質編碼序列)：

； mScarlet-i (螢光蛋白質編碼序列)：

；嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶(嘌呤黴素抗性編碼序列)：

；胺基醣苷3'-磷酸轉移酶II (G418抗性編碼序列)：

；及潮黴素B磷酸轉移酶(潮黴素抗性編碼序列)：

。

舉例而言，本文所述之CAR-T表現載體可包括以下核苷酸組分：啟動子序列(例如，EF1α、cumate、CAG、CMV、UbC或PGK啟動子序列)、抗原特異性靶向序列、跨膜域序列(例如，CD4、CD8α、CD28、CD3ζ或ICOS核苷酸序列)、跨膜域序列(例如，CD4、CD8α、CD28、CD3ζ或ICOS跨膜域核苷酸序列)及胞內傳訊域序列(例如，FcRγ或CD3ζ胞內傳訊域序列)。本文所述之CAR-T表現載體可進一步包括以下一或多種組分：一或多個共同刺激域序列(例如，4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88或ICOS共同刺激域序列)、精胺酸轉運體序列(例如，SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A6、SLC7A7、SLC3A2、SLC3A1、SLC7A9或SLC6A14核苷酸序列)及鉸鏈域或間隔域序列。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T表現載體包括啟動子序列(例如，EF1α、cumate、CMV、CAG、UbC或PGK啟動子序列)及精胺酸轉運體序列(例如，SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A6、SLC7A7、SLC3A2、SLC3A1、SLC7A9或SLC6A14核苷酸序列)。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T表現載體亦可包括以下中之一或多者：抗生素選擇匣(例如，安比西林、遺傳黴素、吉歐黴素、潮黴素、殺稻瘟菌素、嘌呤黴素或康黴素抗性匣)及複製起始序列(例如，pUC、pMB1、pBR322、ColE1、R6K、p15A、pSC101、pMSCV或F1序列)。本文所述之慢病毒及γ-反轉錄病毒載體可包括以下中之一或多者：5'長末端重複(LTR)序列(包括U3、R及U5序列中之一或多者)、3' LTR序列(包括U3、R及U5序列中之一或多者)、psi (Ψ)序列、轉錄活化反應(TAR)元件序列、中央多聚嘌呤區(cPPT)序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列及Rev反應元件(RRE)序列。本文所述之腺病毒及AAV載體亦可包括反向末端重複(ITR)序列。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T表現載體可包括以下順序之組分：啟動子序列、Kozak序列、起始密碼子、一或多個編碼所關注蛋白質之核苷酸序列(例如，CAR核苷酸序列及/或胺基酸轉運體核苷酸序列，例如精胺酸轉運體核苷酸序列)、2A自裂解位點、一或多個選擇標記物核苷酸序列(例如抗生素抗性核苷酸序列及/或螢光蛋白質核苷酸序列)、終止密碼子及終止及多聚A訊息核苷酸序列。例示性CAR-T表現載體為pBCTex01G，其展示於圖 1 中。pBCTex01G之核苷酸序列如下：

。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T表現載體可包括以下順序之組分：啟動子序列、Kozak序列、起始密碼子、一或多個編碼所關注蛋白質之核苷酸序列(例如，CAR核苷酸序列及/或胺基酸轉運體核苷酸序列，例如精胺酸轉運體核苷酸序列)、終止密碼子及終止及polyA訊息核苷酸序列。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T表現載體可包括以下順序之組分：左側反向重複序列、啟動子序列(例如，EF-1α啟動子序列)、Kozak序列、起始密碼子、一或多個編碼所關注蛋白質之核苷酸序列(例如，CAR核苷酸序列及/或胺基酸轉運體核苷酸序列，例如精胺酸轉運體核苷酸序列)、終止密碼子、終止及polyA訊息核苷酸序列(例如bGH polyA訊息訊息序列)及右側反向末端重複序列。例示性CAR-T表現載體為pBCTex02mini，其展示於圖 2 中。pBCTex02mini之核苷酸序列如下：

。

本文所述之CAR-T整合慢病毒衍生的轉殖基因可包括以下核苷酸組分：5'長末端重複(LTR)序列(包括U3、R及U5序列中之一或多者)、啟動子序列(例如，EF1α、cumate、CAG、CMV、UbC或PGK啟動子序列)、抗原特異性靶向序列、跨膜域序列(例如，CD4、CD8α、CD28、CD3ζ或ICOS跨膜域核苷酸序列)、胞內傳訊域序列(例如，FcRγ或CD3ζ胞內傳訊域序列)及3' LTR序列(包括U3、R及U5序列中之一或多者)。本文所述之CAR-T整合轉殖基因可進一步包括以下一或多種組分：psi (Ψ)序列、RRE序列、一或多個共同刺激域序列(例如，4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD40L、TLR2、DAP10、OX40、IL-2RB、IL-2RA、MYD88或ICOS共同刺激域序列)、精胺酸轉運體序列(例如，SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A6、SLC7A7、SLC3A2、SLC3A1、SLC7A9或SLC6A14核苷酸序列)及鉸鏈域或間隔域序列。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T整合轉殖基因包括以下核苷酸組分：5'長末端重複(LTR)序列(包括U3、R及U5序列中之一或多者)、啟動子序列(例如，EF1α、cumate、CMV、CAG、UbC或PGK啟動子序列)、精胺酸轉運體序列(例如，SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A6、SLC7A7、SLC3A2、SLC3A1、SLC7A9或SLC6A14核苷酸序列)及3' LTR序列(包括U3、R及U5序列中之一或多者)。本文所述之CAR-T整合轉殖基因可進一步包括psi (Ψ)序列及RRE序列中之一或多者。

在一些實施例中，本文所述之表現匣可包括在T細胞中起作用之真核啟動子(例如，EF-1α、PGK、CAG或CMV啟動子)、具有或不具有前述Kozak序列之胺基酸轉運體的編碼序列及真核轉錄終止子及polyA訊息(例如，SV40、hGH、bGH、rbHBB及rbGlob)。表現匣可嵌入於轉座子(例如，睡美人、piggyBac、Tol2)中，以能夠在不使用慢病毒或反轉錄病毒之情況下進行基因體整合。

抗生素抗性基因(例如，嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶)、蛋白質標籤(例如，6xHis (SEQ ID NO: 278)、FLAG)及/或報導子(諸如但不限於螢光蛋白質)亦可包括於本文所述之表現載體中，其與胺基酸轉運體串聯(例如，呈融合蛋白質形式)或作為單獨實體(例如藉由IRES或2A裂解序列與胺基酸轉運體編碼序列分開)以促進下游選擇。

在一些實施例中，本文所述之胺基酸轉運體表現載體可具有以下順序之組分：IR/DR(SB) - P_EF1α ::Kozak -轉運體 - P2A - PAC-(G₄ S)₃ -mEGFP - BGHpolyA - DR/IR(SB) (「(G₄ S)₃ ，如SEQ ID NO: 30所揭示」)。腫瘤微環境

癌細胞產生一種腫瘤微環境(TME)，其部分地藉由自其環境消耗必需營養素而允許腫瘤生長及增殖。TME之代謝狀態係藉由癌細胞之代謝活性調節，該代謝活性改變了諸如葡萄糖、脂質及胺基酸之微環境中的營養素之可用性。例如，TME之特徵在於低含量之胺基酸精胺酸。精胺酸耗乏部分地由腫瘤細胞自TME中攝取精胺酸造成。精胺酸耗乏亦藉由活化腫瘤細胞、局部巨噬細胞、粒細胞及骨髓衍生之抑制細胞中的精胺酸酶及誘導型氧化氮合成酶(iNOS)來介導。

值得注意的是，天然存在之T細胞不能合成精胺酸。因此，T細胞取決於外源性精胺酸之可持續供應。然而，T細胞活化、存活及持久性受TME中之相對較低含量的精胺酸影響。特定言之，TME之條件(包括較低精胺酸含量，減弱的T細胞受體傳訊、糖解代謝、胺基酸吸收及代謝)導致腫瘤特異性T效應細胞之抗腫瘤效應功能減弱。此外，相對於胺基酸攝取而言主要依賴於脂肪酸氧化的Treg細胞可在TME條件下存活且對腫瘤特異性T效應細胞發揮免疫抑制作用。因此，TME之條件抑制T效應細胞分化且促進免疫抑制。當前可用之CAR-T細胞易受TME中之相同逆境的影響，因為其天然T細胞對應物造成實體腫瘤之CAR-T治療的功效不佳。本發明提供相較於此項技術中已知之CAR-T細胞，能夠與癌細胞及MDSC競爭精胺酸，增加其在實體腫瘤中之存活、持久性及抗腫瘤活性的CAR-T細胞。

特定言之，本發明提供具有增強之將胺基酸，尤其精胺酸自胞外空間轉運至胞溶質中之能力的CAR-T細胞。舉例而言，本文所述之CAR-T細胞經基因工程改造以表現能夠將胺基酸，例如精胺酸轉運至CAR-T細胞中之胺基酸轉運體。經基因工程改造以表現胺基酸轉運體之本文所述之CAR-T細胞的特徵為與未經基因工程改造以表現胺基酸轉運體的T細胞及CAR-T細胞相比具有更高的T細胞活化、持久性、增殖及/或抗腫瘤功效。另外，經基因工程改造以表現胺基酸轉運體之本文所述之CAR-T細胞的特徵為與未經基因工程改造以表現胺基酸轉運體的T細胞及CAR-T細胞相比具有更高的TME中之存活率及持久性。CAR-T 細胞促發

在一個態樣中，本發明包括一種調節CAR-T細胞(例如，本文所述之CAR-T細胞)中之胞內精胺酸含量以影響有需要之患者的T細胞介導之免疫反應的方法。舉例而言，在一些實施例中，本發明包括將表現精胺酸轉運體及CAR之CAR-T細胞暴露於包括精胺酸之培養基，其中將CAR-T細胞暴露於培養基有效增加CAR-T細胞之胞內精胺酸濃度。將表現精胺酸轉運體及CAR之CAR-T細胞暴露於包括精胺酸之培養基中，例如在富含精胺酸培養基中活體外培養此類CAR-T細胞，可引起相對於未暴露於培養基之CAR-T細胞具有增加的CAR-T胞內精胺酸濃度。此類胞內富含精胺酸之CAR-T細胞可與癌細胞及MDSC競爭胞外精胺酸，例如在TME之胞外空間中。因此，在一些實施例中，本發明包括將表現精胺酸轉運體及CAR之CAR-T細胞暴露於包括精胺酸之培養基，其中將CAR-T細胞暴露於培養基有效增加CAR-T存活、生存期及功能活性。舉例而言，在一些實施例中，將CAR-T細胞暴露於培養基有效增加CAR-T抗腫瘤活性(例如，將CAR-T細胞暴露於培養基有效增加實體腫瘤之TME中的CAR-T抗腫瘤活性)。因此，本文亦描述投與胞內富含精胺酸之CAR-T細胞的方法，其中該方法有效治療血液惡性病以及實體腫瘤。

在一些實施例中，可有效增加CAR-T細胞之胞內精胺酸濃度的培養基含有生理含量之L-精胺酸，包括但不限於0.2 g/L或100 µmol/L，或L-精胺酸之超生理含量，諸如但不限於100 µmol/L、200 µmol/L、300 µmol/L、400 µmol/L、500 µmol/L、600 µmol/L、700 µmol/L、800 µmol/L、900 µmol/L、1000 µmol/L或大於1000 µmol/L。培養基可為具有或不具有補充物之RPMI-1640。培養基可補充有血清及/或營養物，諸如但不限於胎牛血清、人類AB血清或人類血小板溶解物。經工程改造T細胞可在富含L-精胺酸培養基中培養及促發，直至胞內精胺酸累積至足夠含量，諸如但不限於20 µmol、30 µmol、40 µmol、50 µmol、60 µmol、70 µmol、80 µmol、90 µmol、100 µmol、200 µmol、2000 µmol或大於2000 µmol。在一些實施例中，CAR-T細胞可在富含L-精胺酸培養基中培養及促發，直至胞內精胺酸累積至約10 µM、約20 µM、約30 µM、約40 µM、約50 µM、約60 µM、約70 µM、約80 µM、約90 µM、約100 µM、約200 µM、約300 µM、約400 µM、約500 µM、約600 µM、約700 µM、約800 µM、約900 µM、約1000 µM、約1500 µM、約2000 µM、約2500 µM、約3000 µM、約3500 µM、約4000 µM、約100 µM至約4000 µM、約100 µM至約1000 µM、約100 µM至約2000 µM、約1000 µM至約2000 µM、約1000 µM至約3000 µM、約1000 µM至約4000 µM、約500 µM至約1000 µM、約3000 µM至約4000 µM、約2000 µM至約4000 µM或約500 µM至約2000 µM精胺酸每個細胞。套組

本文亦描述包括本文所述之醫藥組合物的套組。舉例而言，在一些實施例中，包含表現精胺酸轉運體及CAR之CAR-T細胞的醫藥組合物係封裝為套組。本文所述之套組可包括向需要治療之患者投與CAR-T細胞的說明。本文所述之套組可包括用於促發CAR-T細胞以向需要治療之患者投與的說明。本文所述之套組可包括用於產生表現精胺酸轉運體及CAR之CAR-T細胞的說明。在一些實施例中，套組可包括緩衝液(例如包含足以促發T細胞之L-精胺酸含量的緩衝液)、試劑及用於產生、擴增、投與及/或促發CAR-T細胞的詳細說明中之至少一者。

本文所述之用於產生CAR-T細胞的套組可包括編碼CAR之表現載體、編碼精胺酸轉運體之表現載體、編碼CAR及精胺酸轉運體之表現載體及/或編碼轉座酶之表現載體，以穩定合成CAR及/或精胺酸轉運體。套組可包括能夠表現CAR及精胺酸轉運體之多順反子表現載體。

本文所述之用於產生CAR-T細胞的套組可包括用於產生包括編碼CAR、精胺酸轉運體或CAR及精胺酸轉運體之核苷酸構築體的病毒的試劑，包括培養基、細胞、轉染試劑、緩衝液及核苷酸構築體。套組可包括能夠表現CAR及精胺酸轉運體之多順反子表現載體。

本文所述之套組可包括用於分析CAR-T細胞中之CAR及/或精胺酸轉運蛋白表現的試劑。舉例而言，本文所述之套組可包括對精胺酸轉運體具有特異性之抗體(例如多株抗體)。本文所述之套組可包括對CAR抗原識別域具有特異性之抗體(例如多株抗體)。治療癌症之方法

本發明之方法包括治療、預防、遏制、逆轉或改善疾病之方法。在本文所述之方法的一些實施例中，疾病為癌症。在一些實施例中，藉由投與治療有效劑量的本文所述之CAR-T細胞(例如，本文所述之精胺酸+CAR-T細胞)來達成治療、預防、遏制、逆轉或改善之方法。舉例而言，本文描述一種治療有需要之患者之實體腫瘤癌症的方法，其包含向患者投與有效量的本文所述之CAR-T細胞或包括本文所述之CAR-T細胞的醫藥組合物。本文亦描述一種治療有需要之患者之血液癌症的方法，其包含向患者投與有效量的本文所述之CAR-T細胞或包括本文所述之CAR-T細胞的醫藥組合物。本文亦描述一種用於治療有需要之人類患者之病狀的方法，其包含：向人類患者投與治療有效量的包含表現精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之CAR-T細胞的組合物，或包括表現精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之CAR-T細胞的醫藥組合物。

免疫系統中之複數個細胞的活性可藉由精胺酸調節，例如巨噬細胞、B細胞、T細胞、自然殺手細胞、嗜中性白血球及樹突狀細胞。調節胞內精胺酸可影響T細胞介導之免疫反應。因此，本文描述一種調節有需要之患者之胞內精胺酸含量以影響T細胞介導之免疫反應的方法，其包含向患者投與有效量的本文所述之CAR-T細胞或包括本文所述之CAR-T細胞的醫藥組合物。

本文描述用以治療、預防、遏制、逆轉或改善有需要之個體或患者之疾病的方法。在本文所述之實施例中，患者及個體可為人類、非人類靈長類動物(諸如黑猩猩及其他猿及猴物種)；家畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔、狗及貓；實驗室動物，包含嚙齒動物，諸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其類似動物。個體或患者可具有任何年齡。個體及患者可為例如老年人、成年人、青少年、前青少年、兒童、幼兒或嬰兒。

可用過度表現精胺酸轉運體之經工程改造CAR-T細胞，包括過度表現表1之精胺酸轉運體的經工程改造CAR-T細胞治療之疾病或病狀的實例包括血液惡性病、實體腫瘤惡性病、轉移性癌症、良性腫瘤、冷腫瘤、原發性腫瘤及繼發性腫瘤。

在一些實施例中，本文揭示一種用本文所述之經工程改造CAR-T細胞，例如過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞，包括過度表現表1之精胺酸轉運體的經工程改造CAR-T細胞治療癌症的方法。本文所述之治療癌症的方法包括治療例如以下中之任一者的方法：急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質癌、AIDS相關癌症、AIDS相關淋巴瘤、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、神經母細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤，諸如小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumors)、視覺路徑及下丘腦神經膠質瘤、乳癌、支氣管腺瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、原發灶不明癌(carcinoma of unknown primary origin)、中樞神經系統淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、子宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生病、結腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、促結締組織增生小型圓形細胞腫瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、生殖細胞腫瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸類癌、胃腸基質腫瘤、神經膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌症、肝細胞(肝)癌、霍奇金氏淋巴瘤、下嚥癌、眼內黑素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎癌、喉癌、唇及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌，諸如非小細胞肺癌及小細胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨之惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、神經管胚細胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、原發不明鱗狀細胞癌之頸部轉移(metastatic squamous neck cancer with occult primary)、口腔癌、多發性內分泌瘤症候群、骨髓發育不良症候群、骨髓白血病、鼻腔及鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨之惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、胰臟癌、胰臟癌胰島細胞、副鼻竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、松果體星形細胞瘤、松果體胚細胞瘤、垂體腺瘤、胸膜肺胚細胞瘤、漿細胞瘤形成、原發性中樞神經系統淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及輸尿管移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、皮膚癌梅克爾細胞(skin carcinoma merkel cell)、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、T細胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、(妊娠)滋養細胞腫瘤、原發位置未明癌症(cancer of unknown primary site)、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)及威爾姆斯腫瘤(Wilms tumor)。

在一些實施例中，在包括投與CAR-T細胞之步驟的用以治療癌症之方法中，CAR之抗原特異性目標區域可鑑別且結合細胞表面抗原。在一些實施例中，CAR可用於治療存在特異性單株抗體或能夠產生特異性單株抗體之癌症的方法中。特定言之，諸如神經母細胞瘤、小細胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、腎細胞癌、結腸癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及兒童急性淋巴母細胞白血病之癌症具有由本文所述之CAR識別的抗原。

本文所述之治療方法可包括用過度表現胺基酸轉運體之經基因工程改造CAR-T細胞，包括過度表現精胺酸轉運體之經工程改造CAR-T細胞治療個體(例如患有疾病之患者及/或患有病狀之實驗室動物)。該疾病可為血液惡性病。該疾病可為實體腫瘤惡性病。個體可為人類。可在臨床疾病發作之前向受試者提供治療。可在臨床疾病發作之後向受試者提供治療。

可在疾病之臨床發作之後約1天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年、5年或更久向個體提供治療。可在疾病之臨床發作之後約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、15小時、18小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年、5年或更久向個體提供治療。可在疾病之臨床發作之後大於1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、15小時、18小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年、5年或更久向個體提供治療。可在疾病之臨床發作之後小於1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、15小時、18小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年、5年或更久向個體提供治療。治療亦可包括在臨床試驗中治療人類。治療可包含向個體投與醫藥組合物，諸如整個本發明所述之醫藥組合物中之一或多者。治療可包含活體內調節內源性精胺酸含量。

細胞組分之再引入方法為此項技術中已知且包括諸如美國專利第4,844,893及4,690,915號中所例示之彼等程序。所用經活化T細胞之量可在活體外與活體內使用之間以及目標細胞之量及類型之間變化。投與之量亦將視患者之病狀而變化且應該由從業者考慮所有恰當因素之後確定。免疫檢查點療法與經工程改造 CAR - T 細胞之組合

本文亦揭示組合療法及其使用方法，其包含投與經工程改造CAR-T細胞(或其醫藥組合物)，例如過度表現本文所揭示之胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體，與第二治療劑之組合。舉例而言，本文描述一種治療癌症之方法，其包含投與：經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；及靶向免疫檢查點，例如免疫檢查點抑制劑之免疫療法。舉例而言，本文描述一種治療癌症之方法，其包含投與：經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；及阻斷PD-1與PD-L1相互作用或阻斷CTLA-4與B7-1/B7-2相互作用之藥劑。舉例而言，本文描述一種治療癌症之方法，其包含投與：經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；及抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗體。本文亦描述一種治療癌症之方法，其包含投與：經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；及選自由以下組成之群的化合物：伊派利單抗、納武單抗、帕博利珠單抗、阿替利珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗及測米匹單抗。可向個體共同投與本發明之組合療法以改善癌症治療之結果。在一些實施例中，同時或依次向需要治療之患者投與本文所述之CAR-T細胞及免疫檢查點抑制劑。

大部分免疫檢查點分子為免疫球蛋白超家族之成員，且通常為防止不受控制之免疫反應的抑制性受體。後天性免疫反應藉由此類檢查點分子控制，該等檢查點分子對於維持自身耐受性且最小化免疫反應期間可能發生的附帶組織損傷為重要的。在一些實施例中，靶向免疫檢查點且促進CAR-T細胞之胺基酸攝取，尤其精胺酸攝取之組合療法可對罹患實體惡性病及血液惡性病之個體產生較佳結果。

免疫檢查點為免疫系統固有之共同刺激及抑制性要素。免疫檢查點幫助維持自身耐受性且調節生理免疫反應之持續時間及幅度，以在免疫系統對病原性感染作出反應時防止組織損傷。當T細胞識別到腫瘤細胞所特有之抗原時，亦可開始免疫反應。用於控制來自T細胞之免疫反應的共同刺激訊息與抑制訊息之間的平衡可藉由免疫檢查點蛋白質調節。在T細胞在胸腺中成熟及活化之後，T細胞可行進至炎症及損傷部位以執行修復功能。T細胞功能可經由直接作用或經由募集參與免疫系統之細胞介素及膜配位體發生。涉及T細胞成熟、活化、增殖及功能之步驟可經由共同刺激及抑制訊息，亦即經由免疫檢查點蛋白質調節。腫瘤可使充當免疫抗性機制之檢查點蛋白質失調。因此，檢查點蛋白質之調節劑的開發可具有治療價值。免疫檢查點分子之非限制性實例包括CTLA4及PD-1。此等檢查點分子可在路徑中之IL-2上游操作。檢查點抑制劑包括阻斷PD-1與PD-L1相互作用或阻斷CTLA-4與B7-1/B7-2相互作用之藥劑。特異性檢查點抑制劑之實例包括以下抗體類藥物：伊派利單抗、納武單抗、帕博利珠單抗、阿替利珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗及測米匹單抗。

在一些情形下，本發明提供一種用於治療人類個體之病狀的方法，其包含：(a)向該人類個體投與治療有效量的包含異位地表現精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之CAR-T細胞的組合物；及(b)向該人類個體投與第二治療劑，其中該第二治療劑為抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗體。投與第二治療劑在投與包含CAR-T細胞組合物之組合物之前、期間或之後進行。

PD1為屬於CD28/CTLA-4家族且在經活化T細胞、B細胞、單核細胞、DC及自然殺手(NK)細胞之表面上表現的抑制性受體。與CTLA-4相反，PD-1之主要作用為在對感染作出炎症反應時限制周邊組織中T細胞之活性且限制自體免疫。慢性抗原暴露可導致持續高含量的PD-1表現，其可誘導抗原特異性T細胞之耗竭或無反應(anergy)狀態，該狀態可藉由PD-1阻斷至少部分逆轉。在一些實施例中，向罹患病狀之個體共投與本發明之經工程改造CAR-T細胞及抗PD-1或抗PD-L1抗體。

CTLA-4 (細胞毒性T淋巴細胞抗原4)亦稱為CD152 (分化簇152)。CTLA-4與共同刺激分子CD28共用序列同源性及配位體(CD80/B7-1及CD86/B7-2)，但不同之處在於將抑制性訊息遞送至作為受體的表現CTLA-4之T細胞。CTLA-4對兩種配位體具有高得多的總親和力且當配位體密度受到限制時在競爭結合中可能勝過CD28。CTLA-4表現於CD8+效應T細胞之表面上，且在初始T細胞及記憶T細胞兩者之初始活化階段中起功能性作用。CTLA-4在T細胞活化之早期階段期間經由增加對CD80及CD86之親和力來抵消CD28之活性。CTLA-4之主要功能包括下調輔助T細胞且增強調節T細胞免疫抑制活性。

CTLA-4亦可經由抑制IL-2產生及IL-2受體表現來下調免疫系統功能。CTLA-4可抑制IL-2之CD28依賴性上調，且抑制IL-2產生可能引起細胞週期停滯。IL-2之降低及後續細胞週期停滯可對在CTLA-4存在下觀測到的T細胞增殖減少做出解釋。其他組合療法

如上文所指出，本文亦揭示組合療法及其使用方法，其包含投與經工程改造CAR-T細胞，例如過度表現本文所揭示之胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體，或其醫藥組合物與第二治療劑之組合。在一些實施例中，同時或依次向需要治療之患者投與本文所述之CAR-T細胞或其藥物組合物及第二治療劑。在一些實施例中，該方法包含在投與治療有效量之T細胞或包含治療有效量之CAR-T細胞的組合物之前、期間或之後投與第二治療劑。

舉例而言，本文描述一種治療癌症之方法，其包含投與：經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；或其醫藥組合物，及DNA損傷反應抑制劑(DDRi)。在一些實施例中，DDRi選自由以下組成之群：ATM抑制劑、PARP抑制劑、ATR抑制劑、WEE1抑制劑、Chk1抑制劑、Chk2抑制劑及DNA蛋白質激酶抑制劑。在一些實施例中，DDRi為選自由以下組成之群的PARP抑制劑：尼拉帕尼、奧拉帕尼、帕米帕里、蘆卡帕尼(樟腦磺酸鹽)、拉唑帕尼、維利帕尼及其類似物。在一些實施例中，DDRi為ATM/ATR抑制劑。在一些實施例中，ATM/ATR抑制劑選自以下組成之群：AZ20、AZD0156、AZD1390、AZD6738、BAY-1895344、EPT-46464、M3541、M4344、M6620 (先前稱為VE-922或VX-970)、NU6027、VE-821及其類似物。在一些實施例中，PARPi為阿達替布、AZD2811或其類似物。在一些實施例中，DDRi為WEE1抑制劑、Chk1抑制劑或Chk2抑制劑。在一些實施例中，DDRi為選自由以下組成之群的DNA依賴性蛋白質激酶(DNA-PK)抑制劑：AZD7648、KU-0060648、NU7026、NU7441 (KU-57788)、PI-103、PIK-75 HCI、PP121、SF2523及其類似物。

在一些實施例中，該方法包含投與經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞或其醫藥組合物；及放射療法、化學療法、免疫療法、激素療法、血管生成抑制劑、幹細胞移植療法、骨髓移植療法或靶向療法。

放射療法之實例包括外部束放射療法、內部束放射療法、近接療法及全身放射療法。

化學治療劑之實例包括烷基化劑(例如六甲蜜胺、苯達莫司汀、白消安、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪、異環磷醯胺、洛莫司汀、氮芥、美法侖、奧沙利鉑、替莫唑胺、噻替派及曲貝替定)、亞硝基脲(例如卡莫司汀、洛莫司汀及鏈脲菌素)、抗代謝物(例如，阿紮胞苷、5-氟尿嘧啶(5-fu)、6-巰基嘌呤(6-mp)、卡培他濱(希羅達)、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷(ara-c)、地西他濱、氟尿苷、氟達拉賓、吉西他濱(健擇(gemzar))、羥基脲、甲胺喋呤、奈拉濱、培美曲塞(力比泰(alimta))、噴司他丁、普拉曲沙、硫鳥嘌呤及三氟胸苷/地匹福林(trifluridien/tipiracil))、蒽環黴素(例如，道諾黴素、小紅莓(阿德力黴素)、小紅莓脂質體、表柔比星、艾達黴素及伐柔比星)、非蒽環黴素抗腫瘤抗生素(例如博萊黴素、放線菌素、絲裂黴素-c及米托蒽醌)、拓樸異構酶抑制劑(例如，伊立替康、伊立替康脂質體、拓朴替康依託泊苷(vp-16)、米托蒽醌、替尼泊甙)、有絲分裂抑制劑，諸如紫杉醇及長春花生物鹼(例如卡巴利他索(capazitaxel)、多西他賽、白蛋白結合-紫杉醇、太平洋紫杉醇、長春花生物鹼，包括：長春鹼、長春新鹼、長春新鹼脂質體、長春瑞賓)、皮質類固醇(例如普賴松、甲普賴松及地塞米松)、全反式視黃酸、三氧化二砷、天冬醯胺酶、艾日布林、羥基脲、伊沙匹隆、米托坦、奧馬他辛、聚乙二醇-天冬醯胺酶(pegasparaginase)、丙卡巴肼、羅米地辛及伏立諾他。

免疫治療劑之實例包括免疫檢查點抑制劑、癌症治療疫苗(例如人類乳頭狀瘤病毒疫苗、B型肝炎疫苗、西普亮塞-T (Sipuleucel-T)(Provenge)及塔里穆尼拉赫帕雷普韋克(Talimogene laherparepvec) (T-VEC))、單株抗體(例如阿侖單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、吉妥單抗、奧佐米星、伊派利單抗、奧伐木單抗、帕尼單抗、帕博利珠單抗、蘭比珠單抗、利妥昔單抗及曲妥珠單抗)及免疫系統調節劑(例如介白素(例如IL-2、IL-7、IL-21及IL-12)、細胞介素(例如干擾素(IFN-α、IFN-β及IFN-γ)及G-CSF)、趨化激素(例如CCL3、CCL26及CXCL7)、免疫調節醯亞胺藥物(例如撒利多胺及其類似物(來那度胺、泊利度胺及阿普司特))、咪喹莫特、卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)、胞嘧啶-磷酸鹽-鳥嘌呤、寡去氧核苷酸及葡聚糖)

激素療法之實例包括阿比特龍(Zytiga®)、阿那曲唑(Arimidex®)、依西美坦(Aromasin®)、氟維司群(Faslodex®)、來曲唑(Femara®)、亮丙立德(Eligard®、抑那通Depot®)、托瑞米芬(Fareston®)、氟甲睾酮(Halotestin®)、乙酸甲地孕酮(Megace®)、比卡魯胺(Cased®)、尼魯胺(Nilandron®)、氟他胺(Eulexin®)、戈舍瑞林(Zoladex®)、地加瑞克(Firmagon®)及他莫昔芬(Nolvadex®)。

血管生成抑制劑之實例包括：阿西替尼(Inlyta®)、貝伐單抗(Avastin®)、卡博替尼(Cometriq®)、依維莫司(Afinitor®)、來那度胺(Revlimid®)、樂伐替尼甲磺酸鹽(Lenvima®)、帕佐泮尼(Votrient®)、雷莫蘆單抗(Cyramza®)、瑞戈非尼(Stivarga®)、索拉非尼(Nexavar®)、舒尼替尼(Sutent®)、撒利多胺(Synovir、Thalomid®)、凡德他尼(Caprelsa®)及Ziv-阿柏西普(Zaltrap®)。

靶向療法之實例包括：EGFR抑制劑(例如，西妥昔單抗(Erbitux®)及帕尼單抗(Vectibix®))、HER2抑制劑(例如，曲妥珠單抗(Herceptin®)、帕妥珠單抗(Perjeta®)及曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Kadcyla®))、激酶抑制劑(例如，阿西替尼(Inlyta®)、伯舒替尼(Bosulif®)、卡博替尼(Cometriq®)、克卓替尼(Xalkori®)、達拉非尼(Tafinlarâ)、達沙替尼(Sprycel®)、埃羅替尼(Tarceva®)、依魯替尼(Imbruvica®)、加以域(Gleevec®)、拉帕替尼(Tykerb®)、尼羅替尼(Tasigna®)、帕佐泮尼(Votrient®)、普納替尼(Iclusig®)、瑞戈非尼(Stivarga®)、索拉非尼(Nexavar®)、舒尼替尼(Sutent®)、曲美替尼(Mekinist®)、凡德他尼(Caprelsa®)及維羅非尼(Zelboraf®))、mTOR抑制劑(例如，西羅莫司(Rapamune®)、依維莫司(Afinitor®)及坦羅莫司(Toricel®))、hedgehod路徑抑制劑(例如，維莫德吉(Erivedge®))、免疫系統目標抑制劑(例如，阿侖單抗(Campath®)、貝倫妥單抗維多汀(Adcetris®)、伊派利單抗(Yervoy®)、替伊莫單抗(Zevalin®)、阿托珠單抗(Gazyva™)、奧伐木單抗(Azerra®)及利妥昔單抗(Rituxan®))、VEGF受體抑制劑(例如，貝伐單抗(Avastin®)及ziv-阿柏西普(Zaltrap®))、雌激素目標抑制劑(例如，阿那曲唑(Arimidex®)、依西美坦(阿諾新)、氟維司群(Faslodex®)、來曲唑(Femara®)、雷諾昔酚(Evista®)、他莫昔芬檸檬酸鹽及托瑞米芬檸檬酸鹽(Fareston®))、雄激素目標抑制劑(例如，乙酸阿比特龍(Zytiga®)、比卡魯胺(Casodex®)、恩雜魯胺(Xtandi®)、氟他胺及尼魯胺(Nilandron®))、蛋白酶體目標抑制劑(例如，硼替佐米(Velcade®)及卡非佐米(Kyprolis™))、組蛋白脫乙醯基酶目標抑制劑(例如，羅米地辛(Istodax®)及伏立諾他(Zolinza®))、葉酸目標抑制劑(例如，普拉曲沙(Folotyn®))及視黃酸受體目標抑制劑(例如，異維甲酸、維A酸、阿曲汀(Soriatane®)及貝瑟羅汀(Targretin®))。

在一些實施例中，本文所述之方法包含投與經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞或其醫藥組合物；且對患者進行手術。在一些實施例中，該方法包含投與經修飾以表現CAR及胺基酸轉運體，例如精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞或其醫藥組合物，其中該投與係向已經歷抗癌手術、將經歷抗癌手術或為抗癌手術之候選者的患者投與。抗癌手術包括例如冷凍手術、雷射手術、高熱、光動力療法、開放手術、微創手術。醫藥組合物

本發明之醫藥組合物可為本文所述之任何過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞與其他化學組分(諸如載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑)的組合。醫藥組合物有助於向生物體投與本文所述之經工程改造CAR-T細胞。醫藥組合物可以藉由各種形式及途徑以治療有效量作為醫藥組合物投與，包括例如腫瘤內、靜脈內、皮下、肌肉內、經直腸、氣霧劑、非經腸、經眼、經肺、經皮、經陰道、經眼、經鼻及局部投與。醫藥組合物可以局部或全身方式投與，例如經由將CAR-T細胞直接輸注至器官中。

在一些實施例中，本文所述之CAR-T醫藥組合物係靜脈內，例如藉由靜脈內滴注投與。在一些實施例中，經約20至約30分鐘之過程投與一定劑量之CAR-T醫藥組合物。在一些實施例中，經約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約10至約20分鐘、約10至約30分鐘、約10至約60分鐘、約30至約60分鐘、約40至約60分鐘、約20至約30分鐘、約20至約40分鐘、約1小時至約2小時、約1小時至約3小時、約1小時至約4小時、約1小時至約5小時、約1小時至約6小時、約2小時至約3小時、約2小時至約4小時或約3小時至約6小時之過程投與一定劑量之CAR-T醫藥組合物。

在一些實施例中，每天向個體投與一定劑量之CAR-T醫藥組合物持續1、2、3、4、5、6或7天。在一些實施例中，每週向個體投與一定劑量之CAR-T醫藥組合物持續1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約1至約2週、約1至約3週、約2至約3週、約1至約4週、約2至約4週、約3至約4週、約1至約12週、約4至約12週、約6至約12週、約8至約12週、約10至約12週、約6至約24週、約8至約24週、約10至約24週、約12至約24週、約6至約18週、約8至約18週、約10至約18週、約12至約18週、約14至約18週或約16至約18週。在一些實施例中，每2週向個體投與一定劑量之CAR-T醫藥組合物持續4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約1至約2週、約4至約12週、約6至約12週、約8至約12週、約10至約12週、約6至約24週、約8至約24週、約10至約24週、約12至約24週、約6至約18週、約8至約18週、約10至約18週、約12至約18週、約14至約18週或約16至約18週。

在實踐本文所提供之治療方法或用途時，向患有影響免疫系統之病狀的個體投與呈醫藥組合物形式之治療有效量的本文所述之過度表現精胺酸轉運體的CAR-T細胞。在一些實施例中，宿主為哺乳動物，諸如人類。治療有效量可視疾病嚴重度、個體之年齡及相對健康狀況、所用化合物之效力及其他因素而不盡相同。

本文所述之醫藥組合物可包括存活基因工程改造細胞，例如過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞。本文所述之CAR-T醫藥組合物可以離散劑量向個體投與。舉例而言，本文所述之CAR-T細胞醫藥組合物可以以下之劑量投與：10⁴ 至10¹¹ 個細胞/公斤體重、10⁵ 至10¹¹ 個細胞/公斤體重、10⁶ 至10¹¹ 個細胞/公斤體重、10⁷ 至10¹¹ 個細胞/公斤體重、10⁸ 至10¹¹ 個細胞/公斤體重、10⁹ 至10¹¹ 個細胞/公斤體重、10¹⁰ 至10¹¹ 個細胞/公斤體重、10⁴ 至10¹⁰ 個細胞/公斤體重、10⁵ 至10¹⁰ 個細胞/公斤體重、10⁶ 至10¹⁰ 個細胞/公斤體重、10⁷ 至10¹⁰ 個細胞/公斤體重、10⁸ 至10¹⁰ 個細胞/公斤體重、10⁹ 至10¹⁰ 個細胞/公斤體重、10⁴ 至10⁹ 個細胞/公斤體重、10⁵ 至10⁹ 個細胞/公斤體重、10⁶ 至10⁹ 個細胞/公斤體重、10⁷ 至10⁹ 個細胞/公斤體重、10⁸ 至10⁹ 個細胞/公斤體重、10⁴ 至10⁸ 個細胞/公斤體重、10⁵ 至10⁸ 個細胞/公斤體重、10⁶ 至10⁸ 個細胞/公斤體重、10⁷ 至10⁸ 個細胞/公斤體重、10⁴ 至10⁷ 個細胞/公斤體重、10⁵ 至10⁷ 個細胞/公斤體重、10⁶ 至10⁷ 個細胞/公斤體重、10⁴ 至10⁶ 個細胞/公斤體重、10⁵ 至10⁶ 個細胞/公斤體重或10⁴ 至10⁵ 個細胞/公斤個體體重。

在一些實施例中，CAR-T細胞醫藥組合物之劑量包括約1×10³ 、約1×10⁴ 、約1×10⁵ 、約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約2×10¹⁰ 、約3×10¹⁰ 、約4×10¹⁰ 、約5×10¹⁰ 、約6×10¹⁰ 、約7×10¹⁰ 、約8×10¹⁰ 、約9×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 、約1×10³ 至約3×10¹⁰ 、約1×10⁵ 至約3×10¹⁰ 、約1×10³ 至約1×10⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁷ 至約1×10¹² 、約1×10⁵ 至約1×10⁷ 、約1×10¹⁰ 至約9x10¹⁰ 或約1×10⁹ 至約1×10¹¹ 個細胞/公斤個體體重。

在一些實施例中，CAR-T細胞醫藥組合物之劑量包括約1×10⁵ 、約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹² 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁵ 至約1×10⁷ 、約1×10⁷ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁷ 至約1×10¹² 、約1×10⁹ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁶ 至約1×10⁸ 、約1×10⁷ 至約1×10⁹ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁰ 至約1×10¹⁵ 或約1×10⁹ 至約1×10¹¹ 個細胞。

在一些實施例中，向患者投與增加劑量之CAR-T細胞醫藥組合物。舉例而言，在一些實施例中，治療方法包括投與初始劑量之包括指定數目個細胞/公斤個體體重的CAR-T細胞醫藥組合物，且投與後續劑量之包括更多個CAR-T細胞/公斤個體體重的CAR-T細胞醫藥組合物(相比於初始劑量)。舉例而言，在一些實施例中，治療方法包括投與初始劑量之包括約1×10⁵ 個細胞/公斤個體體重的CAR-T細胞醫藥組合物，及投與一或多個後續劑量之包括以下之CAR-T細胞醫藥組合物：約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約2×10¹⁰ 、約3×10¹⁰ 、約4×10¹⁰ 、約5×10¹⁰ 、約6×10¹⁰ 、約7×10¹⁰ 、約8×10¹⁰ 、約9×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 、約1×10⁶ 至約3×10¹⁰ 、約1×10⁶ 至約3×10¹⁰ 、約1×10⁶ 至約1×10⁷ 、約1×10⁶ 至約1×10¹⁵ 、約1×10⁶ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁷ 至約1×10¹² 、約1×10⁶ 至約1×10⁸ 、約1×10¹⁰ 至約9×10¹⁰ 或約1×10⁹ 至約1×10¹¹ 個細胞/公斤個體體重。

在一些實施例中，CAR-T細胞醫藥組合物之初始劑量包括約1×10³ 、約1×10⁴ 、約1×10⁵ 、約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約2×10¹⁰ 、約3×10¹⁰ 、約4×10¹⁰ 、約5×10¹⁰ 、約6×10¹⁰ 、約7×10¹⁰ 、約8×10¹⁰ 、約9×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 、約1×10³ 至約3×10¹⁰ 、約1×10⁵ 至約3×10¹⁰ 、約1×10³ 至約1×10⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁷ 至約1×10¹² 、約1×10⁵ 至約1×10⁷ 、約1×10¹⁰ 至約9×10¹⁰ 或約1×10⁹ 至約1×10¹¹ 個細胞/公斤個體體重。

在一些實施例中，CAR-T細胞醫藥組合物之後續劑量包括約1×10³ 、約1×10⁴ 、約1×10⁵ 、約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約2×10¹⁰ 、約3×10¹⁰ 、約4×10¹⁰ 、約5×10¹⁰ 、約6×10¹⁰ 、約7×10¹⁰ 、約8×10¹⁰ 、約9×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 、約1×10³ 至約3×10¹⁰ 、約1×10⁵ 至約3×10¹⁰ 、約1×10³ 至約1×10⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁵ 、約1×10⁵ 至約1×10¹⁰ 、約1×10⁷ 至約1×10¹² 、約1×10⁵ 至約1×10⁷ 、約1×10¹⁰ 至約9×10¹⁰ 或約1×10⁹ 至約1×10¹¹ 個細胞/公斤個體體重。

包含本文所述之CAR-T細胞的醫藥組合物亦可以此等劑量投與多次。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如，Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。醫藥學上可接受之賦形劑之非限制性實例可見於例如以下各者中：Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第十九版(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)；Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975；Liberman, H.A.及Lachman, L.編, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第七版(Lippincott Williams & Wilkins1999)，其各自以全文引用的方式併入本文中。投與方法

可投與本文所述之含有過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞或過度表現精胺酸轉運體之功能片段之CAR-T細胞的醫藥組合物以用於預防性及/或治療性治療。在治療性應用中，可將組合物以足以治癒或至少部分地遏制疾病或病狀之症狀，或治癒、癒合、改善或減輕該病狀之量投與已患有疾病或病狀之個體。亦可投與過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞，以減輕罹患、感染或惡化該病狀之可能性。對此用途有效的量可根據疾病或病狀之嚴重程度及病程、先前治療、個體之健康狀態、體重及對藥物之反應，以及治療醫師之診斷而變化。

本文所述之過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞可在疾病或病狀出現之前、期間或之後投與，且投與含有過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞之組合物的時序可變化。舉例而言，過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞可用作預防劑，且可連續向具有患上病狀或疾病之傾向的個體投與，以便減小該疾病或病狀出現之可能性。過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞可在症狀發作期間或症狀發作後儘快地投與個體。投與過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞可緊接著在症狀發作內開始，在症狀發作之最初3小時內、在症狀發作之最初6小時內、在症狀發作之最初24小時內、在症狀發作之48小時內或在自症狀發作之任何時間段內開始。初始投與可經由任何實際途徑，諸如藉由本文所述之任何途徑使用本文所述之任何調配物。在偵測到或所懷疑之免疫疾病或病狀發作之後在可行之情況下儘快投與過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞，且持續治療免疫疾病所需之時長，諸如約24小時至約48小時、約48小時至約1週、約1週至約2週、約2週至約1個月、約1個月至約3個月。在一些實施例中，可投與過度表現精胺酸轉運體之CAR-T細胞持續至少24小時、至少48小時、至少72小時、至少96小時、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。各個體之治療時長可不同。

本文所述之CAR-T細胞的重組核苷酸序列之參考核苷酸序列的同源性可表示為序列同源性百分比。在一些實施例中，參考序列的同源性為重組序列的約60%鹼基至約100%鹼基。在一些實施例中，參考序列的同源性為重組序列的約60%鹼基至約70%鹼基、約60%鹼基至約80%鹼基、約60%鹼基至約90%鹼基、約60%鹼基至約100%鹼基、約70%鹼基至約80%鹼基、約70%鹼基至約90%鹼基、約70%鹼基至約100%鹼基、約80%鹼基至約90%鹼基、約80%鹼基至約100%鹼基或約90%鹼基至約100%鹼基。在一些實施例中，參考序列之同源性為重組序列的約60%鹼基、約70%鹼基、約80%鹼基、約90%鹼基或約100%鹼基。在一些實施例中，序列之同源性為重組序列的至少約60%鹼基、約70%鹼基、約80%鹼基或約90%鹼基。在一些實施例中，參考序列之同源性為重組序列的至多約70%鹼基、約80%鹼基、約90%鹼基或約100%鹼基。實例

藉由以下實例進一步說明本發明。提供實例僅用於說明之目的且不欲視為以任何方式限制本發明之範疇或申請專利範圍。實例 1. 精胺酸轉運體及精胺酸合成蛋白質表現對 T 細胞存活之影響

在低環境精胺酸條件下分析T細胞存活，以便評估外源性精胺酸轉運蛋白及精胺酸合成蛋白質之作用。使用脂染胺LTX (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)轉染Jurkat E6-1細胞(一種自急性T細胞白血病患者之末梢血液分離出的人類T淋巴細胞細胞株)。表現構築體藉由將陽離子胺基酸轉運體2 (CAT-2，縮寫為「CAT」)及精胺基丁二酸鹽合成酶1 (ASS-1，縮寫為「ASS」)之編碼序列選殖至緊接在P2A自裂解序列及螢光蛋白質之前且與自裂解序列及螢光蛋白質同框的pBCTex01G螢光表現載體中來產生。細胞經未經修飾pBCTex01G (「對照」)或編碼CAT或ASS之表現構築體轉染。所用之CAT-2核苷酸序列包括編碼R369E取代突變及N381i插入突變之突變，且對應於SEQ ID NO:203。所用之ASS-1核苷酸序列為以下：

。

在37℃下在5% CO₂ 下將Jurkat純系E6-1細胞(ATCC, USA)在含有2mM L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Transgen Biotech，中國)、10%過濾的非熱不活化胎牛血清(TransSerum EQ胎牛血清；Transgen Biotech，中國)、100 U/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素(Thermo Fisher Scientific，USA)之RPMI-1640培養基中培養。在達到約80%匯合之後，細胞以2×10⁵ 個細胞/毫升之密度再懸浮於新鮮完全培養基中。將細胞接種至24孔培養盤中(500 µL/孔，1×10⁵ 個細胞/孔)。

用各構築體(對照、CAT或ASS)轉染4個細胞孔。使用1 µL PLUS試劑將5 µg各純化質體稀釋於1mL OptiMEM還原的血清培養基(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中。在室溫下培育混合物15分鐘，其後添加2.75 µL LTX試劑以起始複合物形成。使複合物在室溫下形成持續25分鐘。向各孔中添加100 µL載體-脂質體複合物。在添加轉染複合物之後，使盤搖晃2分鐘。細胞隨後在37℃下在5% CO₂ 下培育24小時。使用錐蟲藍染色(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)計量細胞之成活力(＞90%)且藉由在顯微鏡(Zeiss Axio Observer, Germany)下分析螢光蛋白質表現量測細胞之轉染效率。

Jurkat E6-1細胞之轉染效率在7%與14%之間(平均轉染效率為10%)。在轉染之後，在37℃下在5% CO₂ 下使細胞在補充或未補充有400 ng/mL BCT-100之相同培養基中培養72小時，以實現培養基中之精胺酸耗乏(圖 3A )。對各樣品中存活的經轉染細胞之總數目進行計數。使用具有預設閘控參數之Countess II FL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)對各孔進行細胞計數，僅對顯示出螢光的細胞計數(圖 3B )。

計算經對照、CAT或ASS構築體轉染之細胞在富含精胺酸及精胺酸耗乏培養基中培養72小時之後的細胞數目之變化百分比(圖 3C )。細胞數目之變化百分比計算為在培養72小時之後經轉染細胞數目減去初始經轉染細胞數目，除以初始經轉染細胞數目，再全部乘以100 (100×((72小時之後經轉染細胞數目-經轉染細胞數目)/(經轉染細胞數目)))。自初始活細胞數目乘以估計的轉染效率來估計初始經轉染細胞數目(初始活細胞數目*轉染效率)。圖 3C 之各資料點代表經獨立轉染細胞之一個經分離孔之細胞數目的估計變化百分比。用對照、CAT或ASS構築體轉染細胞在富含精胺酸培養基中72小時之後皆使得細胞數目增加(圖 3C ，左側)。相比之下，用對照構築體轉染細胞使得細胞數目在精胺酸耗乏培養基中在72小時之後整體降低，但用CAT或ASS表現構築體轉染細胞均使得細胞數目在精胺酸耗乏培養基中在72小時之後整體增加(圖 3C ，右側)。

此等結果顯示，促進細胞精胺酸攝取或胞內精胺酸合成之蛋白質的表現在低胞外精胺酸濃度之條件下增加T細胞之存活及增殖。實例 2. 精胺酸轉運體對原發性人類 T 細胞存活之影響

在低環境精胺酸條件下分析T細胞存活，以便評定外源性精胺酸轉運蛋白之作用。自StemExpress (California, USA)獲取冷凍的初級人類CD4+T細胞，解凍且以1×10⁶ 個細胞/mL再懸浮與補充有GlutaMAX及HEPES (Thermo Fisher Scientific)之RPMI-1640中。在37℃下在5% CO₂ 下用25 µL/mL ImmunoCult人類CD3/CD28 T細胞活化劑(STEMCELL Technologies, Canada)及10 ng/mL rIL-2 (Solarbio, China)刺激細胞3天。收穫經活化T細胞，以1×10⁷ 個細胞/mL之密度再懸浮於Opti-MEM I還原血清培養基(Thermo Fisher Scientific)中。將一百微升細胞懸浮液轉移至Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus (Fisher Scientific, Pennsylvania, USA)且在ECM 830方波電穿孔系統(BTX, USA)中用編碼mNeonGreen (SEQ ID NO:274)作為對照或CAT (SEQ ID NO:203)之活體外轉錄mRNA電穿孔。所用之mNeonGreen核苷酸序列為以下：

將經電穿孔細胞轉移至含有補充有GlutaMAX、HEPES及rIL-2之900 µL RPMI-1640的6孔盤的一個孔且培養隔夜。使用錐蟲藍染色(Thermo Fisher Scientific)計量細胞之成活力(50-60%)且藉由在顯微鏡(Zeiss Axio Observer)下分析螢光蛋白質表現量測細胞之轉染效率。轉染效率大於80%。將五百微升培養物等分至相鄰空孔，且補充400 ng/ml BCT-100，以實現精胺酸耗乏。將盤在37℃下在5% CO₂ 下培養隔夜。再次如上所述確定細胞成活力。

計算經對照或CAT mRNA轉染之細胞在富含精胺酸及精胺酸耗乏培養基中培養24小時之後的細胞數目之變化百分比(圖4)。細胞數目之變化百分比計算為在培養24小時之後細胞數目減去初始細胞數目，除以初始細胞數目，再全部乘以100。

用對照或CAT mRNA轉染初級人類T細胞在富含精胺酸培養基中24小時之後皆使得細胞數目增加(圖 4 ，頂部)。相比之下，用GFP對照mRNA轉染細胞使得細胞數目在精胺酸耗乏培養基中在24小時之後淨減少，但用CAT mRNA轉染細胞均使得細胞數目在精胺酸耗乏培養基中在24小時之後整體增加(圖 4 ，底部)。

此等結果顯示，促進細胞精胺酸攝取之精胺酸轉運蛋白的表現在低胞外精胺酸濃度之條件下增加初級人類T細胞之存活及增殖。實例 3. 產生 CAR-T 細胞

此實例涵蓋產生本文所述之CAR-T細胞的方法。

使用具有管組TS520及CD4/CD8微珠之CliniMACS (Miltenyi Biotec, Germany)自全血分離出CD4+及CD8+T細胞。在37℃下在5% CO₂ 下將約1×10⁸ 經分離細胞在補充有200 IU/mL IL-2及TransAct beads (Miltenyi Biotec, Germany)之70 mL TexMACS培養基中培養以擴增持續3天。

使用CliniMACS電穿孔器(Miltenyi Biotec, Germany)用編碼CAR、精胺酸轉運體或CAR及精胺酸轉運體之表現載體轉染經擴增細胞。經擴增細胞亦可經編碼CAR之第一表現載體及編碼精胺酸轉運體之第二表現載體共轉染。一經轉染，在補充有1mM L-精胺酸(Sigma-Aldrich, USA)之TexMACS培養基(Miltenyi Biotec, Germany)中培養細胞。使用存活/死亡細胞雙重染色套組(Sigma-Aldrich, USA)對細胞每日取樣，以計量細胞數目及成活力。每日添加新鮮培養基以維持2×10⁵ 至1×10⁶ 個細胞/毫升之細胞密度。每隔一天置換一半培養基。

使用BD FACSAria III流式細胞儀及經標記抗CD19、CD14、CD45、CD3、CD4及CD8抗體(BD Biosciences, USA)確定T細胞純度及輔助T細胞與殺手T細胞之比率。CAR及精胺酸轉運蛋白表現係使用分別對CAR及精胺酸轉運體之抗原識別域具有特異性的定製抗體確定(GenScript, USA)。

藉由收集約1×10⁵ 個CAR-T細胞之等分試樣確定胞內精胺酸含量。將細胞集結且在10 mL PBS中洗滌兩次，且隨後溶解於100 µL RIPA緩衝液中。細胞溶解物之精胺酸含量使用L-精胺酸ELISA套組(ALPCO, USA)確定。將總精胺酸含量歸一化至溶解之細胞數目。

一經達成約1×10⁵ 至約3×10¹⁰ 個細胞/公斤個體體重，其中細胞具有約100 µM至約4000 µM/細胞之胞內精胺酸含量，收穫細胞用於下游應用。實例 4. 過度表現精胺酸轉運體之 CAR - T 細胞的 活體外 滋養及促發

此實例涵蓋一種用於促發表現精胺酸轉運蛋白之遺傳修飾CAR-T細胞之治療的方法。

經遺傳修飾以表現精胺酸轉運體及CAR之CAR-T細胞在含有或補充有L-精胺酸的培養基中培養。此培養基含有0.2 g/L與1000 µmol/L之間的L-精胺酸。將經工程改造T細胞在L-精胺酸培養基中培養，直至胞內精胺酸含量在100 µmol與4000 µmol之間。

除非另外規定，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬之熟習此項技術者通常所理解相同之含義。

在通篇說明書中，在組合物及套組描述為具有、包括或包含特定組分之情況下，或在製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟之情況下，另外預期存在基本上由所列組分組成或由所列組分組成的本發明之組合物及套組，且存在基本上由所列處理及方法步驟組成或由所列處理及方法步驟組成的根據本發明之製程及方法。

在其中稱一種元素或組分包括於所列元素或組分之清單中及/或選自所列元素或組分之清單的申請案中，應理解，該元素或組分可為所列元素或組分中之任一者，或該元素或組分可選自由所列元素或組分中之兩者或更多者組成之群。

此外，應理解，本文所描述之組合物或方法中的元素及/或特徵可以各種方式組合而不背離本發明之精神及範疇，無論在本文中為明確或隱含的。舉例而言，除非上下文另外理解，否則當提及特定化合物時，該化合物可用於本發明組合物之各種實施例及/或本發明之方法中。換言之，在本申請案內，實施例已以使得申請案能夠得到簡明書寫及繪製的方式描述且描繪，但希望且應瞭解，可在不脫離本發明教示及本發明之情況下以各種方式組合或分離實施例。舉例而言，應瞭解，本文中所描述及描繪之所有特徵可適用於本文中所描述及描繪之本發明之所有態樣。

除非上下文不適當，否則本發明中所用之冠詞「一(a及an)」係指冠詞之一個或一個以上(亦即，至少一個)語法賓語。舉例而言，「元件」意謂一個或一個以上元件。

除非另外指示，否則本發明中使用術語「及/或」以意謂「及」或「或」任一者。

應理解，除非自上下文及用途另外理解，否則表述「……中之至少一者」個別地包括該表述之後的所述對象中之每一者及所述對象中之兩者或更多者之各種組合。除非自上下文另外理解，否則表述「及/或」結合三個或更多個所述對象時應理解為具有相同含義。

除非另外特定陳述或自上下文中理解，否則使用術語「包括(include/includes/including)」、「具有(have/has/having)」、「含有(contain/contains/containing)」，包括其文法等效物，通常應理解為開端式及非限制性的，例如不排除其他未列元素或步驟。

在數量值之前使用術語「約」時，除非另外具體說明，否則本發明亦包括特定數量值本身。

除非另有說明或自上下文中理解，否則若提供例如聚合物之分子量而非絕對值，則該分子量應理解為平均分子量。

應理解步驟次序或用於執行某些行動之次序為非實質的，只要本發明保持可操作即可。此外，可同時進行兩個或超過兩個步驟或動作。

在本說明書中之各種位置，取代基以群組或範圍方式揭示。特定地期望本說明書包括該等群組及範圍之成員中的各個及每一個別次組合。舉例而言，0至40範圍內之整數特定地意欲個別地揭示0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39及40，且1至20範圍內之整數特定地意欲個別地揭示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20。

除非主張，否則本文中任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」或「包括」)的使用僅意欲更好地說明本發明且不對本發明之範疇造成限制。說明書中之語言不應理解為表示任何未主張之元素為實施本發明必不可少的。

一般而言，除非另有規定，否則指定百分比之組合物以重量計。此外，若變數未附定義，則隨後以該變數之先前定義為準。以引用方式併入

本文提及的所有科學文章、公開案及專利文獻均全文引用的方式併入本文中用於所有目的，如同各個別公開案或專利特定地且個別地以引用的方式併入一般。在有衝突的情況下，以本申請案(包括本文中之任何定義)為準。等效物

儘管已論述本發明之特定實施例，但以上說明為說明性而非限制性。熟習此項技術者在審閱本說明書時將顯而易知本發明之許多變化形式。本發明之完整範疇以及其等效物之完整範疇，及說明書，以及此類變化形式，應參照申請專利範圍確定。

除非另外指示，否則本說明書及申請專利範圍中所用之表示成分數量、反應條件等之所有數字理解為在所有情況下皆經術語「約」修飾。因此，除非相反指示，否則本說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為近似值，其可取決於本發明設法獲得之所要特性而變化。

SEQ ID NO:	序列
180	GCACTGCTGATGAAACCTGGCGCCGGAACCCGCCAGCCCTCGGCGCCCATTCAGTCCGCGCAGGCAGGTGTGAGCAGCGGGTCAACTACCTGGCAGGCGCGCACGCGGCCGCGGGCTCCCGCTAACCGCAGCCTCCACTCCTCTCCCCGCGCGCCGCGCCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCGGTCTCGCCGGCCGAGCGTCCGTTGGTCCTTGAGCGCGTCCGACAGTCTGTCTGTTCGCGATCCTGCCGGAGCCCCGCCGCCGCCGGCTTGGATTCTGAAACCTTCCTTGTATCCCTCCTGAGACATCTTTGCTGCAAGATCGAGGCTGTCCTCTGGTGAGAAGGTGGTGAGGCTTCCCGTCATATTCCAGCTCTGAACAGCAACATGGGGTGCAAAGTCCTGCTCAACATTGGGCAGCAGATGCTGCGGCGGAAGGTGGTGGACTGTAGCCGGGAGGAGACGCGGCTGTCTCGCTGCCTGAACACTTTTGATCTGGTGGCCCTCGGGGTGGGCAGCACACTGGGTGCTGGTGTCTACGTCCTGGCTGGAGCTGTGGCCCGTGAGAATGCAGGCCCTGCCATTGTCATCTCCTTCCTGATCGCTGCGCTGGCCTCAGTGCTGGCTGGCCTGTGCTATGGCGAGTTTGGTGCTCGGGTCCCCAAGACGGGCTCAGCTTACCTCTACAGCTATGTCACCGTTGGAGAGCTCTGGGCCTTCATCACCGGCTGGAACTTAATCCTCTCCTACATCATCGGTACTTCAAGCGTAGCGAGGGCCTGGAGCGCCACCTTCGACGAGCTGATAGGCAGACCCATCGGGGAGTTCTCACGGACACACATGACTCTGAACGCCCCCGGCGTGCTGGCTGAAAACCCCGACATATTCGCAGTGATCATAATTCTCATCTTGACAGGACTTTTAACTCTTGGTGTGAAAGAGTCGGCCATGGTCAACAAAATATTCACTTGTATTAACGTCCTGGTCCTGGGCTTCATAATGGTGTCAGGATTTGTGAAAGGATCGGTTAAAAACTGGCAGCTCACGGAGGAGGATTTTGGGAACACATCAGGCCGTCTCTGTTTGAACAATGACACAAAAGAAGGGAAGCCCGGTGTTGGTGGATTCATGCCCTTCGGGTTCTCTGGTGTCCTGTCGGGGGCAGCGACTTGCTTCTATGCCTTCGTGGGCTTTGACTGCATCGCCACCACAGGTGAAGAGGTGAAGAACCCACAGAAGGCCATCCCCGTGGGGATCGTGGCGTCCCTCTTGATCTGCTTCATCGCCTACTTTGGGGTGTCGGCTGCCCTCACGCTCATGATGCCCTACTTCTGCCTGGACAATAACAGCCCCCTGCCCGACGCCTTTAAGCACGTGGGCTGGGAAGGTGCCAAGTACGCAGTGGCCGTGGGCTCCCTCTGCGCTCTTTCCGCCAGTCTTCTAGGTTCCATGTTTCCCATGCCTCGGGTTATCTATGCCATGGCTGAGGATGGACTGCTATTTAAATTCTTAGCCAACGTCAATGATAGGACCAAAACACCAATAATCGCCACATTAGCCTCGGGTGCCGTTGCTGCTGTGATGGCCTTCCTCTTTGACCTGAAGGACTTGGTGGACCTCATGTCCATTGGCACTCTCCTGGCTTACTCGTTGGTGGCTGCCTGTGTGTTGGTCTTACGGTACCAGCCAGAGCAGCCTAACCTGGTATACCAGATGGCCAGTACTTCCGACGAGTTAGATCCAGCAGACCAAAATGAATTGGCAAGCACCAATGATTCCCAGCTGGGCTTTTTACCAGAGGCAGAGATGTTCTCTTTGAAAACCATACTCTCACCCAAAAACATGGAGCCTTCCAAAATCTCTGGGCTAATTGTGAACATTTCAACCAGCCTCATAGCTGTTCTCATCATCACCTTCTGCATTGTGACCGTGCTTGGAAGGGAGGCTCTCACCAAAGGGGCGCTGTGGGCAGTCTTTCTGCTCGCAGGGTCTGCCCTCCTCTGTGCCGTGGTCACGGGCGTCATCTGGAGGCAGCCCGAGAGCAAGACCAAGCTCTCATTTAAGGTTCCCTTCCTGCCAGTGCTCCCCATCCTGAGCATCTTCGTGAACGTCTATCTCATGATGCAGCTGGACCAGGGCACCTGGGTCCGGTTTGCTGTGTGGATGCTGATAGGCTTCATCATCTACTTTGGCTATGGCCTGTGGCACAGCGAGGAGGCGTCCCTGGATGCCGACCAAGCAAGGACTCCTGACGGCAACTTGGACCAGTGCAAGTGACGCACAGCCCCGCCCCCCGGAGGTGGCAGCAGCCCCGAGGGACGCCCCCAGAGGACCGGGAGGCACCCCACCCTCCCCACCAGTGCAACAGAAACCACCTGCGTCCACACCCTCACTGCAGCCAAAGGTGCAATTACTTGACCTGCAGCCCCAGCCCACCCTCGGCTCTGCAGCCGGTTCTCCGGGCCCTGGTCACCTCCAGACAGCTGCCTGGCCGGGGCCACTAGGCTGCGGCTGGCCACTGTGTCTCCTCACTTCTCTGAACAAAGCAGTTCCTCCCCTACCAGCTCAGCCCCGAGCTGCCGCAGCCTCAGGCAGAACGGAGGTCACCTTCTCTCCTTATCTTGGGAACCAGGCCTTCCTCCCGGGGACTGTTCTGGGATTGAAATTGTGCATACTCCAAACTTTCGCAGCCATCTTCCCGCTCAGCCCCAGACACCCAGCAATCAAGCCAGATGAGTACCACAAAACAGTGTGTCCCCAGCAGCTCCCCACCCCAGAGCCAAATGACAGTAGTGCACTTAAAAAGGAAAATCAGGCCTGTTGTCCTTCTCCGGTTGCATTCAGATGGGTCATTAGGGCCGGACCCTGCCTGCCCCTTGGCTTCTCAGGGCTTTGCTCTGACACCATGACAGCTGCCCGGGGCTGAGGGCAGCTGGCTCCACTCAAATGAGGAAGAAGGGATCACTCCCATTAGGGCCTGCTTTGCTTATGCATGTGTGTGCACATGCATGTAAACCAGGGACCTTCAGCTCACGGCCTCCAGGCCTGGGCCAGTTCTTGCTGCTCCTGCCGTCTCCCCCGACTGGCTGTGTCCTGAGTAACTGGAACATGAGACAGTATCTGCAGGACTGGCCCCATGGTGGCCGAGTCAGAAGTCTGTTTCCTGTGAGTCGCCACCGTTCACTCAGTCTTGCCCTCCCATGCTTTGGAGCCAGTCTGGTGGCTCCTGTAAGGTTCTCAAGGCTGGTGGCAGCTCAGTCTGGGGTCAGGACATGTCGGGGTCATGCGTTTCTGGCCCTGACATAAGCTGTCTGGCCTCTCTGTGACATGATGAAATTGAAATCAATCCACAGTCCATGAAATTGTGACACTCCACCAGATTAAGTTAGGGCATAACATTAACTTGGAAATGGCCATGTCATCACCCCTGCGGCTGTCCTATAGCTGAGATGCGTGGGTCGCAGGGGAGGTGATTTCTAGGCATATTGCTGTCCCTTTTGTGTATCTGTCATCCGGATGCTTCGGACCCCACGCCTCTGCAAGTGGGAGAGACCCGAGCATCCTCCCCACCCCCATAGCTCCAGTGCACGCCACCCCCGTCTTGCCTGGGTCGGGGCCTGCGGCCAGCACCATTTCACACACACTCCTTGTAGATGGGAGCCAGAGGAAACCTGAACGTGGGTGGAGCGTTCCACTGAGTCTACTTCAGGAGACAGAAGGCCCATGCTGATGGGGGAGGAGGAGGGATGTGGGCATTTTGGACACCAGGGGAAATGGAAATGCTGCTTTCAAAACTTAGTTTCCTTTCCATTTCTTCCTAGTCTGGCCTTTGACACAAATCTGGTAGAAAGAAGCCTGATAAATTGAGGGCACTTGTACCCTCCCTGTGCCCCCAGAAGGTTCTTGGAGAGAAGTGCAAGAATTTGTGAACACGGCGGTGGAGGGCGGGTGGATGGCCATGGGCTGAGCCTCCGTATCAGGCCTGCTCACCTTGCTGGGAGCTTTATTCTGATCTCATTTTGAATGTTCCAGAGGGAGCATCATAAGAGCCCAGAGCTCCGATTTCCAAAGAGTGATATTGACATTTATGGAGATTGGTGTTGTAACATATTTTGATAAATACTAACTTATTTTGTTGGGGTTTTGGTTGTCTCTTGTCTTAGGACCTGGTAGTTATTTGCTTGATTTTTTTTTCCGTTATTTTCTACATAGGCAAAGAGAATTCGAGGGATAGACAGTCTCCAAGAAAAGTGAAGTGGTGGGAGAGAATTGCTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTCTCTAGTTTTTCTTTCTGGCTGAGATTTCCGTGCAAGACAGCACCCAATAGACTATTTAGAGTTGACATTTGACATTTTAATGGGCGCCATGGCTCATTTTGTAGATTGAGAAGGTGCGTCTCCCCTGCTCCAAGTCTCATCATGACAGCGTGCTGACAGCTGGGAGTCTGTGGCCTTCCTCACGCAGAGGCCTTAAAGCTGGACACAGAAGCACGCCTAGGCTGGGCAGGGATGGGACCCATGCCCCCTCCTTAGAGGACGGGCTTCCTGGTTAGGAAAGGACACGTGGGGGTGCCTTGCATAATAGTTCACTGGTCACCGTGCTTTTATGAGTAGTGTTTTTGTGCACTTGCCAGGGGTTTTCTCTCTGTGTGAGAGGGGAGTGATTTAAGCAATGGTGTCTGGAGTAAGCCTTACAATTTTAATAGACTTTTTCTTATCATATCCCTCATTTCTTTCCCTGAAATAAAAATACACACAAGCAAAAAAAAAATGATAGTTTCACATCTCTTAGTTCCCTTGCCCAAACAAGAATATTCTTAGTTCCACTGGCCAGGATTTTCCTACATAGTCAGAACTTACACATTACTAGAGGCACACCCACCAAGGAGTATTGTGTCTACTTTTATCTGTGCACCAGCCACAAATACCCACATTGGAAAGACCCATTTGTGATGGGTAAACATCCCTTCCTGTCTCCCA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184	CTCCTTCTGCAGCGCGGCCGGCGGGCGCTCCTCTTCGCGGGACCAGCGAGGCGGCGGCCGCTGCTCCAGCGTCCCCCAGCCGCGGGCCCCCGACGCGCTGCAGCCGGCAGCCCACCGCCGCCTTCTTGGCGCGACCCCAACCCAGCCCCAGTCGCCTTCGTCAGACGTCAGAATGATTCCTTGCAGAGCCGCGCTGACCTTTGCCCGATGTCTGATCCGGAGAAAAATCGTGACCCTGGACAGTCTAGAAGACACCAAATTATGCCGCTGCTTATCCACCATGGACCTCATTGCCCTGGGCGTTGGAAGCACCCTTGGGGCCGGGGTTTATGTCCTCGCTGGGGAGGTGGCCAAGGCAGACTCGGGCCCCAGCATCGTGGTGTCCTTCCTCATTGCTGCCCTGGCTTCAGTGATGGCTGGCCTCTGCTATGCCGAATTTGGGGCCCGTGTTCCCAAGACGGGGTCTGCATATTTGTACACCTACGTGACTGTCGGAGAGCTGTGGGCCTTCATCACTGGCTGGAATCTCATTTTATCGTATGTGATAGGTACATCAAGTGTTGCAAGAGCCTGGAGTGGCACCTTTGATGAACTTCTTAGCAAACAGATTGGTCAGTTTTTGAGGACATACTTCAGAATGAATTACACTGGTCTTGCAGAATATCCCGATTTTTTTGCTGTGTGCCTTATATTACTTCTAGCAGGTCTTTTGTCTTTTGGAGTAAAAGAGTCTGCTTGGGTGAATAAAGTCTTCACAGCTGTTAATATTCTCGTCCTTCTGTTTGTGATGGTTGCTGGGTTTGTGAAAGGAAATGTGGCAAACTGGAAGATTAGTGAAGAGTTTCTCAAAAATATATCAGCAAGTGCCAGAGAGCCACCTTCTGAAAACGGAACAAGTATCTATGGGGCTGGTGGCTTTATGCCTTATGGCTTTACGGGAACGTTGGCTGGTGCTGCAACTTGCTTTTATGCCTTTGTGGGATTTGACTGCATTGCAACAACTGGTGAAGAAGTTCGGAATCCCCAGAAAGCTATTCCCATTGGAATTGTGACGTCTTTGCTTGTTTGCTTTATGGCCTATTTTGGGGTCTCTGCAGCTTTAACACTTATGATGCCGTACTACCTCCTCGATGAAAAAAGCCCCCTTCCTGTAGCGTTTGAATATGTGGGATGGGGTCCTGCCAAATATGTCGTCGCAGCTGGTTCTCTCTGCGCCTTGTCAACAAGTCTTCTTGGATCCATTTTCCCAATGCCTCGTGTAATCTATGCTATGGCGGAGGATGGGTTGCTTTTCAAATGTCTAGCTCAAATCAATTCCAAAACGAAGACACCAATAATTGCTACTTTATCATCGGGTGCAGTGGCAGCTTTGATGGCCTTTCTGTTTGACCTGAAGGCGCTTGTGGACATGATGTCCATTGGCACACTCATGGCCTACTCTCTGGTGGCAGCCTGTGTTCTCATCCTCAGGTACCAGCCTGGCTTATCTTACGACCAGCCCAAATGTTCTCCTGAGAAAGATGGTCTGGGATCGTCTCCCAGGGTAACCTCGAAGAGTGAGTCCCAGGTCACCATGCTGCAGAGACAGGGCTTCAGCATGCGGACCCTCTTCTGCCCCTCCCTTCTGCCAACACAGCAGTCAGCTTCTCTCGTGAGCTTTCTGGTAGGATTCCTAGCTTTCCTCGTGTTGGGCCTGAGTGTCTTGACCACTTACGGAGTTCATGCCATCACCAGGCTGGAGGCCTGGAGCCTCGCTCTCCTCGCGCTGTTTCTTGTTCTCTTCGTTGCCATCGTTCTCACCATCTGGAGGCAGCCCCAGAATCAGCAAAAAGTAGCCTTCATGGTTCCATTCTTACCATTTTTGCCAGCGTTCAGCATCTTGGTGAACATTTACTTGATGGTCCAGTTAAGTGCAGACACTTGGGTCAGATTCAGCATTTGGATGGCAATTGGCTTCCTGATTTACTTTTCTTATGGCATTAGACACAGCCTGGAGGGTCATCTGAGAGATGAAAACAATGAAGAAGATGCTTATCCAGACAACGTTCATGCAGCAGCAGAAGAAAAATCTGCCATTCAAGCAAATGACCATCACCCAAGAAATCTCAGTTCACCTTTCATATTCCATGAAAAGACAAGTGAATTCTAACACTTGCAGGAGCAGAGCTGGTCATCGTCTTAGCATACATATCCTACACTGAGTAAACCGTAACGGGATGTCATCAGCATGCTGGGTTGTCATGGGTTTGCTGCATACATAGTTCACCCTAATTTATACTTACTCATCTGGACAGCATCTCCTCAGATGGTGAATTATGTGCACGGGGAAACCTCCTGAGTGGAAGTTTCATTCATCAGTGATGAATAGCCCCCAAACAGTGGGAGTGTGTATGTATGTGTGTATGTATGTATCTATGTATATGCTTGGGAACATGAGTGTTACAAGTTAGCTGGTGTTTTACTATTATTGTGTTACATTTTTCCAGTGTCGTCATTAATCGGTGGCATATACTGCACATACTGAAATAGAGGGAAATCACTGAATGTAAAGAGGTTTCATCTATGCCCCCTGCAGTTGGGGAAATACTAGTAGCTTTACCTTGTTTGACTTCATTAATGTCAGTTTAGGGGATGCCAAAAATGCAGTTACTCATCATGGTGTCTGTCACTGGTTAGGGGTAAGATGAGGGGATAAGGAAAGAGACTTTTCAATAAGTTGTGAATGCCAACAGTGGGTTTAATGCAAATTTTTTTTCCTGTGAGGTATGACAGTTTGCTCAAACTTCAGCCAACAGGGGTGTCTGCTTCTGCTGCACTACACAGGCCAGGAGTGGCATTCCATGCCACTAGTTGGCATCCTTTTGAACTTTTGTCTCCTTTGCAAACAGTGGTCCTAAAATACGAGGTCTTCACTTGCTGTGAATGACGTATCCCCAGTCAGGGACTTAAGAGAGGCACTGTGATATACTTGGGACCCTTTAAATTAAAAAGTGAAGATAGTCACCAGGGCCAGAAAGCTCATGGAGTGGCCGTAATGAGAATATGTTTGAAGATCAAAGAGTTAGACCAATGCTTGAATAAGTAGACCCCAAGCATCCTTTTCTAAAAAGTGACTTAAAATAAGCCAACAGACTCTCCCAGACCACACAACTAGTGGAATGATTCCTCCTTTTTCCATTACTTACTTAATCACAGTTTAGTTTTTTTCTTAACCTCGTCAGGCCCAGAGTTCACTTCTTTGTTTCTCTGTTTCTTTTGTCTTGTCTTAGAGATGAGGGGGCTACAGCAGCATCATGCAAAGAGGGAAAGATGAAGGGATAGAAGAAGAGAAAATCCCCCTGTTCTGATAGGAACGGCCTGTTCCATTGTTAAATGGCAAATGGCCCAATTTAAGGGCTTTGGATCTAATTTGCCTCTGATGTTTCCTTTGGAAACATTTAGGAATATTTTTCTCCCCCTACCCCATAAATTGTGTAGCACTTTTTATTCCATTTGCTTTCAAATGACTACACTAAGCCTAATAATACAAGCTCCAGTGTTATACAATAACCCATCAGTGATTGGGGAATCAAACATTTTGGTTTAAAAAACATGATTATTTAAAACTGGAAACTAAAAAGAATCAAATTGAATTAAAGCTATATAAACACAGTTAACCCTTGTAAATGAGTAAACAAATTTTTACATGTAAGATTCTCTAATTGTCATATTTTACTTTTTAGGATTCCCTAATAGTGGACTGTTTATTTGCAGTGTATTTGCTTCTCATGAACTATTTCTCGTACAAATCATTAAATAGTTCATTGGATGAGGCTGGGTGACATTTCCCAGGACAGCATGGTGAACATTACCAGGCATGCTAGCTGGCCCGTGTAATCCCAAGACAAGGAAAACATTCGTTTTCCTCATGGGTCTTCCAAGAAATGAGCTATTTTATTGATGCCATTAAAAAGCAAGTTGCGATGGTTTTGTATAGCCAGGAGTTTATTGTGATTAAACATCAAAGAAACAGGTAGAAAGCCTGGGTTTCTGGCTGCTAGCGTTATAGCATCCATGACACAGAACTCATTACGGACATTCCACAACTTCCAGGGTGCACATGGTAAAATCTGAAGCCCAGAATTTTCTCTCAAGCTGCGTGGTTTACTGGAGAGAAGGAGTTGGATAAGCACAGGCTCGGGTATTTTGGTAGGGACTGTAGGCATGCTCATAAATCCTTGCTGTTGTCACAGTACGCTGAAAACCCGTTTGATTCTATACCCAATCAAGAATAGACCCTTCACACAGGAAATGTGAACAATTGTTATATATGAACACTCAAATCTTTTACTGTAACGAAACCAAGAAACTTGTTTAGAATGTGATAGGCAGCTAAAACTGTTATGCCCACTGTGCTCAATTTGAAGCAGAATTTAGTGAAAAATTATTTTTCCACATTGAAACACTTTGCAGACACAAATATCTATGAAAAGATGCTTTGTCAGCCACTGTGCCTTTTTTTCTGTGAAGACTCAACGGATGTGTGTGTTTGTATGTTTGTTAACAGTTACATATGTTTGTATGAGTGTATATATATATCTGTGTGTGTGTATCTCTAACGTCAGTGTATAAGTAAGTTGGGTTTATGGTGGGCTTTGACTATGTCATTAGGTGGGTACAAAACCCAACTGATGTGGAGAAAAATTGATGTTTGATGTTGATAGATATGCTTATACCTAATTTTTAGTTTTTAAACTATTTTAAAATATACTATGATTTTATATGTATATTTCCTATAGACTCTTTAAGACGTATTTATAATGTTTCTAATATGAAATCACTAAACTCTAGTACATTATAGCAGGTGCTTTGTAATCTGGAATGGAGAAGAGGTAGGGGCATTTGGGGATTCCTGTTTACTTGCTGCTGCCACACCTTTTCCGACTGATCTGTCCTGGTAGGTGTTTATTAGCAAAAGTCAGTATCACCAGCTCTTTGGCACCTTTCTGTTTCTGCT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186	CTCCTTCTGCAGCGCGGCCGGCGGGCGCTCCTCTTCGCGGGACCAGCGAGGCGGCGGCCGCTGCTCCAGCGTCCCCCAGCCGCGGGCCCCCGACGCGCTGCAGCCGGCAGCCCACCGCCGCCTTCTTGGCGCGACCCCAACCCAGCCCCACAGGAGACTCTCTGAAGACCAGCAGGAAAGCAGTGAGCCCTTACAGGTCGCCTTCGTCAGACGTCAGAATGATTCCTTGCAGAGCCGCGCTGACCTTTGCCCGATGTCTGATCCGGAGAAAAATCGTGACCCTGGACAGTCTAGAAGACACCAAATTATGCCGCTGCTTATCCACCATGGACCTCATTGCCCTGGGCGTTGGAAGCACCCTTGGGGCCGGGGTTTATGTCCTCGCTGGGGAGGTGGCCAAGGCAGACTCGGGCCCCAGCATCGTGGTGTCCTTCCTCATTGCTGCCCTGGCTTCAGTGATGGCTGGCCTCTGCTATGCCGAATTTGGGGCCCGTGTTCCCAAGACGGGGTCTGCATATTTGTACACCTACGTGACTGTCGGAGAGCTGTGGGCCTTCATCACTGGCTGGAATCTCATTTTATCGTATGTGATAGGTACATCAAGTGTTGCAAGAGCCTGGAGTGGCACCTTTGATGAACTTCTTAGCAAACAGATTGGTCAGTTTTTGAGGACATACTTCAGAATGAATTACACTGGTCTTGCAGAATATCCCGATTTTTTTGCTGTGTGCCTTATATTACTTCTAGCAGGTCTTTTGTCTTTTGGAGTAAAAGAGTCTGCTTGGGTGAATAAAGTCTTCACAGCTGTTAATATTCTCGTCCTTCTGTTTGTGATGGTTGCTGGGTTTGTGAAAGGAAATGTGGCAAACTGGAAGATTAGTGAAGAGTTTCTCAAAAATATATCAGCAAGTGCCAGAGAGCCACCTTCTGAAAACGGAACAAGTATCTATGGGGCTGGTGGCTTTATGCCTTATGGCTTTACGGGAACGTTGGCTGGTGCTGCAACTTGCTTTTATGCCTTTGTGGGATTTGACTGCATTGCAACAACTGGTGAAGAAGTTCGGAATCCCCAGAAAGCTATTCCCATTGGAATTGTGACGTCTTTGCTTGTTTGCTTTATGGCCTATTTTGGGGTCTCTGCAGCTTTAACACTTATGATGCCGTACTACCTCCTCGATGAAAAAAGCCCCCTTCCTGTAGCGTTTGAATATGTGGGATGGGGTCCTGCCAAATATGTCGTCGCAGCTGGTTCTCTCTGCGCCTTGTCAACAAGTCTTCTGGGCTCTATGTTTCCTTTACCCCGAATTCTGTTTGCCATGGCCCGGGATGGCTTACTGTTTAGATTTCTTGCCAGAGTGAGTAAGAGGCAGTCACCAGTTGCTGCCACGTTGACTGCAGGGGTCATTTCTGCTTTGATGGCCTTTCTGTTTGACCTGAAGGCGCTTGTGGACATGATGTCCATTGGCACACTCATGGCCTACTCTCTGGTGGCAGCCTGTGTTCTCATCCTCAGGTACCAGCCTGGCTTATCTTACGACCAGCCCAAATGTTCTCCTGAGAAAGATGGTCTGGGATCGTCTCCCAGGGTAACCTCGAAGAGTGAGTCCCAGGTCACCATGCTGCAGAGACAGGGCTTCAGCATGCGGACCCTCTTCTGCCCCTCCCTTCTGCCAACACAGCAGTCAGCTTCTCTCGTGAGCTTTCTGGTAGGATTCCTAGCTTTCCTCGTGTTGGGCCTGAGTGTCTTGACCACTTACGGAGTTCATGCCATCACCAGGCTGGAGGCCTGGAGCCTCGCTCTCCTCGCGCTGTTTCTTGTTCTCTTCGTTGCCATCGTTCTCACCATCTGGAGGCAGCCCCAGAATCAGCAAAAAGTAGCCTTCATGGTTCCATTCTTACCATTTTTGCCAGCGTTCAGCATCTTGGTGAACATTTACTTGATGGTCCAGTTAAGTGCAGACACTTGGGTCAGATTCAGCATTTGGATGGCAATTGGCTTCCTGATTTACTTTTCTTATGGCATTAGACACAGCCTGGAGGGTCATCTGAGAGATGAAAACAATGAAGAAGATGCTTATCCAGACAACGTTCATGCAGCAGCAGAAGAAAAATCTGCCATTCAAGCAAATGACCATCACCCAAGAAATCTCAGTTCACCTTTCATATTCCATGAAAAGACAAGTGAATTCTAACACTTGCAGGAGCAGAGCTGGTCATCGTCTTAGCATACATATCCTACACTGAGTAAACCGTAACGGGATGTCATCAGCATGCTGGGTTGTCATGGGTTTGCTGCATACATAGTTCACCCTAATTTATACTTACTCATCTGGACAGCATCTCCTCAGATGGTGAATTATGTGCACGGGGAAACCTCCTGAGTGGAAGTTTCATTCATCAGTGATGAATAGCCCCCAAACAGTGGGAGTGTGTATGTATGTGTGTATGTATGTATCTATGTATATGCTTGGGAACATGAGTGTTACAAGTTAGCTGGTGTTTTACTATTATTGTGTTACATTTTTCCAGTGTCGTCATTAATCGGTGGCATATACTGCACATACTGAAATAGAGGGAAATCACTGAATGTAAAGAGGTTTCATCTATGCCCCCTGCAGTTGGGGAAATACTAGTAGCTTTACCTTGTTTGACTTCATTAATGTCAGTTTAGGGGATGCCAAAAATGCAGTTACTCATCATGGTGTCTGTCACTGGTTAGGGGTAAGATGAGGGGATAAGGAAAGAGACTTTTCAATAAGTTGTGAATGCCAACAGTGGGTTTAATGCAAATTTTTTTTCCTGTGAGGTATGACAGTTTGCTCAAACTTCAGCCAACAGGGGTGTCTGCTTCTGCTGCACTACACAGGCCAGGAGTGGCATTCCATGCCACTAGTTGGCATCCTTTTGAACTTTTGTCTCCTTTGCAAACAGTGGTCCTAAAATACGAGGTCTTCACTTGCTGTGAATGACGTATCCCCAGTCAGGGACTTAAGAGAGGCACTGTGATATACTTGGGACCCTTTAAATTAAAAAGTGAAGATAGTCACCAGGGCCAGAAAGCTCATGGAGTGGCCGTAATGAGAATATGTTTGAAGATCAAAGAGTTAGACCAATGCTTGAATAAGTAGACCCCAAGCATCCTTTTCTAAAAAGTGACTTAAAATAAGCCAACAGACTCTCCCAGACCACACAACTAGTGGAATGATTCCTCCTTTTTCCATTACTTACTTAATCACAGTTTAGTTTTTTTCTTAACCTCGTCAGGCCCAGAGTTCACTTCTTTGTTTCTCTGTTTCTTTTGTCTTGTCTTAGAGATGAGGGGGCTACAGCAGCATCATGCAAAGAGGGAAAGATGAAGGGATAGAAGAAGAGAAAATCCCCCTGTTCTGATAGGAACGGCCTGTTCCATTGTTAAATGGCAAATGGCCCAATTTAAGGGCTTTGGATCTAATTTGCCTCTGATGTTTCCTTTGGAAACATTTAGGAATATTTTTCTCCCCCTACCCCATAAATTGTGTAGCACTTTTTATTCCATTTGCTTTCAAATGACTACACTAAGCCTAATAATACAAGCTCCAGTGTTATACAATAACCCATCAGTGATTGGGGAATCAAACATTTTGGTTTAAAAAACATGATTATTTAAAACTGGAAACTAAAAAGAATCAAATTGAATTAAAGCTATATAAACACAGTTAACCCTTGTAAATGAGTAAACAAATTTTTACATGTAAGATTCTCTAATTGTCATATTTTACTTTTTAGGATTCCCTAATAGTGGACTGTTTATTTGCAGTGTATTTGCTTCTCATGAACTATTTCTCGTACAAATCATTAAATAGTTCATTGGATGAGGCTGGGTGACATTTCCCAGGACAGCATGGTGAACATTACCAGGCATGCTAGCTGGCCCGTGTAATCCCAAGACAAGGAAAACATTCGTTTTCCTCATGGGTCTTCCAAGAAATGAGCTATTTTATTGATGCCATTAAAAAGCAAGTTGCGATGGTTTTGTATAGCCAGGAGTTTATTGTGATTAAACATCAAAGAAACAGGTAGAAAGCCTGGGTTTCTGGCTGCTAGCGTTATAGCATCCATGACACAGAACTCATTACGGACATTCCACAACTTCCAGGGTGCACATGGTAAAATCTGAAGCCCAGAATTTTCTCTCAAGCTGCGTGGTTTACTGGAGAGAAGGAGTTGGATAAGCACAGGCTCGGGTATTTTGGTAGGGACTGTAGGCATGCTCATAAATCCTTGCTGTTGTCACAGTACGCTGAAAACCCGTTTGATTCTATACCCAATCAAGAATAGACCCTTCACACAGGAAATGTGAACAATTGTTATATATGAACACTCAAATCTTTTACTGTAACGAAACCAAGAAACTTGTTTAGAATGTGATAGGCAGCTAAAACTGTTATGCCCACTGTGCTCAATTTGAAGCAGAATTTAGTGAAAAATTATTTTTCCACATTGAAACACTTTGCAGACACAAATATCTATGAAAAGATGCTTTGTCAGCCACTGTGCCTTTTTTTCTGTGAAGACTCAACGGATGTGTGTGTTTGTATGTTTGTTAACAGTTACATATGTTTGTATGAGTGTATATATATATCTGTGTGTGTGTATCTCTAACGTCAGTGTATAAGTAAGTTGGGTTTATGGTGGGCTTTGACTATGTCATTAGGTGGGTACAAAACCCAACTGATGTGGAGAAAAATTGATGTTTGATGTTGATAGATATGCTTATACCTAATTTTTAGTTTTTAAACTATTTTAAAATATACTATGATTTTATATGTATATTTCCTATAGACTCTTTAAGACGTATTTATAATGTTTCTAATATGAAATCACTAAACTCTAGTACATTATAGCAGGTGCTTTGTAATCTGGAATGGAGAAGAGGTAGGGGCATTTGGGGATTCCTGTTTACTTGCTGCTGCCACACCTTTTCCGACTGATCTGTCCTGGTAGGTGTTTATTAGCA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187	CTCCTTCTGCAGCGCGGCCGGCGGGCGCTCCTCTTCGCGGGACCAGCGAGGCGGCGGCCGCTGCTCCAGCGTCCCCCAGCCGCGGGCCCCCGACGCGCTGCAGCCGGCAGCCCACCGCCGCCTTCTTGGCGCGACCCCAACCCAGCCCCACAGGAGACTCTCTGAAGACCAGCAGGAAAGCAGTGAGCCCTTACAGGTCGCCTTCGTCAGACGTCAGAATGATTCCTTGCAGAGCCGCGCTGACCTTTGCCCGATGTCTGATCCGGAGAAAAATCGTGACCCTGGACAGTCTAGAAGACACCAAATTATGCCGCTGCTTATCCACCATGGACCTCATTGCCCTGGGCGTTGGAAGCACCCTTGGGGCCGGGGTTTATGTCCTCGCTGGGGAGGTGGCCAAGGCAGACTCGGGCCCCAGCATCGTGGTGTCCTTCCTCATTGCTGCCCTGGCTTCAGTGATGGCTGGCCTCTGCTATGCCGAATTTGGGGCCCGTGTTCCCAAGACGGGGTCTGCATATTTGTACACCTACGTGACTGTCGGAGAGCTGTGGGCCTTCATCACTGGCTGGAATCTCATTTTATCGTATGTGATAGGTACATCAAGTGTTGCAAGAGCCTGGAGTGGCACCTTTGATGAACTTCTTAGCAAACAGATTGGTCAGTTTTTGAGGACATACTTCAGAATGAATTACACTGGTCTTGCAGAATATCCCGATTTTTTTGCTGTGTGCCTTATATTACTTCTAGCAGGTCTTTTGTCTTTTGGAGTAAAAGAGTCTGCTTGGGTGAATAAAGTCTTCACAGCTGTTAATATTCTCGTCCTTCTGTTTGTGATGGTTGCTGGGTTTGTGAAAGGAAATGTGGCAAACTGGAAGATTAGTGAAGAGTTTCTCAAAAATATATCAGCAAGTGCCAGAGAGCCACCTTCTGAAAACGGAACAAGTATCTATGGGGCTGGTGGCTTTATGCCTTATGGCTTTACGGGAACGTTGGCTGGTGCTGCAACTTGCTTTTATGCCTTTGTGGGATTTGACTGCATTGCAACAACTGGTGAAGAAGTTCGGAATCCCCAGAAAGCTATTCCCATTGGAATTGTGACGTCTTTGCTTGTTTGCTTTATGGCCTATTTTGGGGTCTCTGCAGCTTTAACACTTATGATGCCGTACTACCTCCTCGATGAAAAAAGCCCCCTTCCTGTAGCGTTTGAATATGTGGGATGGGGTCCTGCCAAATATGTCGTCGCAGCTGGTTCTCTCTGCGCCTTGTCAACAAGTCTTCTTGGATCCATTTTCCCAATGCCTCGTGTAATCTATGCTATGGCGGAGGATGGGTTGCTTTTCAAATGTCTAGCTCAAATCAATTCCAAAACGAAGACACCAATAATTGCTACTTTATCATCGGGTGCAGTGGCAGCTTTGATGGCCTTTCTGTTTGACCTGAAGGCGCTTGTGGACATGATGTCCATTGGCACACTCATGGCCTACTCTCTGGTGGCAGCCTGTGTTCTCATCCTCAGGTACCAGCCTGGCTTATCTTACGACCAGCCCAAATGTTCTCCTGAGAAAGATGGTCTGGGATCGTCTCCCAGGGTAACCTCGAAGAGTGAGTCCCAGGTCACCATGCTGCAGAGACAGGGCTTCAGCATGCGGACCCTCTTCTGCCCCTCCCTTCTGCCAACACAGCAGTCAGCTTCTCTCGTGAGCTTTCTGGTAGGATTCCTAGCTTTCCTCGTGTTGGGCCTGAGTGTCTTGACCACTTACGGAGTTCATGCCATCACCAGGCTGGAGGCCTGGAGCCTCGCTCTCCTCGCGCTGTTTCTTGTTCTCTTCGTTGCCATCGTTCTCACCATCTGGAGGCAGCCCCAGAATCAGCAAAAAGTAGCCTTCATGGTTCCATTCTTACCATTTTTGCCAGCGTTCAGCATCTTGGTGAACATTTACTTGATGGTCCAGTTAAGTGCAGACACTTGGGTCAGATTCAGCATTTGGATGGCAATTGGCTTCCTGATTTACTTTTCTTATGGCATTAGACACAGCCTGGAGGGTCATCTGAGAGATGAAAACAATGAAGAAGATGCTTATCCAGACAACGTTCATGCAGCAGCAGAAGAAAAATCTGCCATTCAAGCAAATGACCATCACCCAAGAAATCTCAGTTCACCTTTCATATTCCATGAAAAGACAAGTGAATTCTAACACTTGCAGGAGCAGAGCTGGTCATCGTCTTAGCATACATATCCTACACTGAGTAAACCGTAACGGGATGTCATCAGCATGCTGGGTTGTCATGGGTTTGCTGCATACATAGTTCACCCTAATTTATACTTACTCATCTGGACAGCATCTCCTCAGATGGTGAATTATGTGCACGGGGAAACCTCCTGAGTGGAAGTTTCATTCATCAGTGATGAATAGCCCCCAAACAGTGGGAGTGTGTATGTATGTGTGTATGTATGTATCTATGTATATGCTTGGGAACATGAGTGTTACAAGTTAGCTGGTGTTTTACTATTATTGTGTTACATTTTTCCAGTGTCGTCATTAATCGGTGGCATATACTGCACATACTGAAATAGAGGGAAATCACTGAATGTAAAGAGGTTTCATCTATGCCCCCTGCAGTTGGGGAAATACTAGTAGCTTTACCTTGTTTGACTTCATTAATGTCAGTTTAGGGGATGCCAAAAATGCAGTTACTCATCATGGTGTCTGTCACTGGTTAGGGGTAAGATGAGGGGATAAGGAAAGAGACTTTTCAATAAGTTGTGAATGCCAACAGTGGGTTTAATGCAAATTTTTTTTCCTGTGAGGTATGACAGTTTGCTCAAACTTCAGCCAACAGGGGTGTCTGCTTCTGCTGCACTACACAGGCCAGGAGTGGCATTCCATGCCACTAGTTGGCATCCTTTTGAACTTTTGTCTCCTTTGCAAACAGTGGTCCTAAAATACGAGGTCTTCACTTGCTGTGAATGACGTATCCCCAGTCAGGGACTTAAGAGAGGCACTGTGATATACTTGGGACCCTTTAAATTAAAAAGTGAAGATAGTCACCAGGGCCAGAAAGCTCATGGAGTGGCCGTAATGAGAATATGTTTGAAGATCAAAGAGTTAGACCAATGCTTGAATAAGTAGACCCCAAGCATCCTTTTCTAAAAAGTGACTTAAAATAAGCCAACAGACTCTCCCAGACCACACAACTAGTGGAATGATTCCTCCTTTTTCCATTACTTACTTAATCACAGTTTAGTTTTTTTCTTAACCTCGTCAGGCCCAGAGTTCACTTCTTTGTTTCTCTGTTTCTTTTGTCTTGTCTTAGAGATGAGGGGGCTACAGCAGCATCATGCAAAGAGGGAAAGATGAAGGGATAGAAGAAGAGAAAATCCCCCTGTTCTGATAGGAACGGCCTGTTCCATTGTTAAATGGCAAATGGCCCAATTTAAGGGCTTTGGATCTAATTTGCCTCTGATGTTTCCTTTGGAAACATTTAGGAATATTTTTCTCCCCCTACCCCATAAATTGTGTAGCACTTTTTATTCCATTTGCTTTCAAATGACTACACTAAGCCTAATAATACAAGCTCCAGTGTTATACAATAACCCATCAGTGATTGGGGAATCAAACATTTTGGTTTAAAAAACATGATTATTTAAAACTGGAAACTAAAAAGAATCAAATTGAATTAAAGCTATATAAACACAGTTAACCCTTGTAAATGAGTAAACAAATTTTTACATGTAAGATTCTCTAATTGTCATATTTTACTTTTTAGGATTCCCTAATAGTGGACTGTTTATTTGCAGTGTATTTGCTTCTCATGAACTATTTCTCGTACAAATCATTAAATAGTTCATTGGATGAGGCTGGGTGACATTTCCCAGGACAGCATGGTGAACATTACCAGGCATGCTAGCTGGCCCGTGTAATCCCAAGACAAGGAAAACATTCGTTTTCCTCATGGGTCTTCCAAGAAATGAGCTATTTTATTGATGCCATTAAAAAGCAAGTTGCGATGGTTTTGTATAGCCAGGAGTTTATTGTGATTAAACATCAAAGAAACAGGTAGAAAGCCTGGGTTTCTGGCTGCTAGCGTTATAGCATCCATGACACAGAACTCATTACGGACATTCCACAACTTCCAGGGTGCACATGGTAAAATCTGAAGCCCAGAATTTTCTCTCAAGCTGCGTGGTTTACTGGAGAGAAGGAGTTGGATAAGCACAGGCTCGGGTATTTTGGTAGGGACTGTAGGCATGCTCATAAATCCTTGCTGTTGTCACAGTACGCTGAAAACCCGTTTGATTCTATACCCAATCAAGAATAGACCCTTCACACAGGAAATGTGAACAATTGTTATATATGAACACTCAAATCTTTTACTGTAACGAAACCAAGAAACTTGTTTAGAATGTGATAGGCAGCTAAAACTGTTATGCCCACTGTGCTCAATTTGAAGCAGAATTTAGTGAAAAATTATTTTTCCACATTGAAACACTTTGCAGACACAAATATCTATGAAAAGATGCTTTGTCAGCCACTGTGCCTTTTTTTCTGTGAAGACTCAACGGATGTGTGTGTTTGTATGTTTGTTAACAGTTACATATGTTTGTATGAGTGTATATATATATCTGTGTGTGTGTATCTCTAACGTCAGTGTATAAGTAAGTTGGGTTTATGGTGGGCTTTGACTATGTCATTAGGTGGGTACAAAACCCAACTGATGTGGAGAAAAATTGATGTTTGATGTTGATAGATATGCTTATACCTAATTTTTAGTTTTTAAACTATTTTAAAATATACTATGATTTTATATGTATATTTCCTATAGACTCTTTAAGACGTATTTATAATGTTTCTAATATGAAATCACTAAACTCTAGTACATTATAGCAGGTGCTTTGTAATCTGGAATGGAGAAGAGGTAGGGGCATTTGGGGATTCCTGTTTACTTGCTGCTGCCACACCTTTTCCGACTGATCTGTCCTGGTAGGTGTTTATTA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204	AAGCCGCAGCTTTGAAGCCTGAGCGGCCGAACTCGGCAGCTCCAACCCAACTCGGCTTAACTCCGCCTCACCGAGCCCAGTCCAAGACTCTGTGCTCCCTAGGTTTGCAACAGCTCTCTGGATGCCGTGGCAAGCATTTCGCAGATTTGGTCAAAAGCTGGTACGCAGACGTACACTGGAGTCAGGCATGGCTGAGACTCGCCTTGCCAGATGCCTAAGCACCCTGGATTTAGTGGCCCTGGGTGTGGGCAGCACATTGGGTGCAGGCGTGTATGTCCTAGCTGGCGAGGTGGCCAAAGATAAAGCAGGGCCATCCATTGTGATCTGCTTTTTGGTGGCTGCCCTGTCTTCTGTGTTGGCTGGGCTGTGCTATGCGGAGTTTGGTGCCCGGGTTCCCCGTTCTGGTTCGGCATATCTCTACAGCTATGTCACTGTGGGTGAACTCTGGGCCTTCACCACTGGCTGGAACCTCATCCTCTCCTATGTCATTGGTACAGCCAGTGTGGCCCGGGCCTGGAGCTCTGCTTTTGACAACCTGATTGGGAACCACATCTCTAAGACTCTGCAGGGGTCCATTGCACTGCACGTGCCCCATGTCCTTGCAGAATATCCAGATTTCTTTGCTTTGGGCCTCGTGTTGCTGCTCACTGGATTGTTGGCTCTCGGGGCTAGTGAGTCGGCCCTGGTTACCAAAGTGTTCACAGGCGTGAACCTTTTGGTTCTTGGGTTCGTCATGATCTCTGGCTTCGTTAAGGGGGACGTGCACAACTGGAAGCTCACAGAAGAGGACTACGAATTGGCCATGGCTGAACTCAATGACACCTATAGCTTGGGTCCTCTGGGCTCTGGAGGATTTGTGCCTTTCGGCTTCGAGGGAATTCTCCGTGGAGCAGCGACCTGTTTCTATGCATTTGTTGGTTTCGACTGTATTGCTACCACTGGAGAAGAAGCCCAGAATCCCCAGCGTTCCATCCCGATGGGCATTGTGATCTCACTGTCTGTCTGCTTTTTGGCGTATTTTGCTGTCTCTTCTGCACTCACCCTGATGATGCCTTACTACCAGCTTCAGCCTGAGAGCCCTTTGCCTGAGGCATTTCTCTACATTGGATGGGCTCCTGCCCGCTATGTTGTGGCTGTTGGCTCCCTCTGTGCTCTTTCTACCAGCCTCCTGGGCTCCATGTTCCCCATGCCTCGGGTGATCTACGCGATGGCAGAGGATGGCCTCCTGTTCCGTGTACTTGCTCGGATCCACACCGGCACACGCACCCCAATCATAGCCACCGTGGTCTCTGGCATTATTGCAGCATTCATGGCATTCCTCTTCAAACTCACTGATCTTGTGGACCTCATGTCAATTGGGACCCTGCTTGCTTACTCCCTGGTGTCGATTTGTGTTCTCATCCTCAGGTATCAACCTGATCAGGAGACAAAGACTGGGGAAGAAGTGGAGTTGCAGGAGGAGGCAATAACTACTGAATCAGAGAAGTTGACCCTATGGGGACTATTTTTCCCACTCAACTCCATCCCCACTCCACTCTCTGGCCAAATTGTCTATGTTTGTTCCTCATTGCTTGCTGTCCTGCTGACTGCTCTTTGCCTGGTGCTGGCCCAGTGGTCAGTTCCATTGCTTTCTGGAGACCTGCTGTGGACTGCAGTGGTTGTGCTGCTCCTGCTGCTCATTATTGGGATCATTGTGGTCATCTGGAGACAGCCACAGAGTTCCACTCCCCTTCACTTTAAGGTGCCTGCTTTGCCTCTCCTCCCACTAATGAGCATCTTTGTGAATATTTACCTTATGATGCAGATGACAGCTGGTACCTGGGCCCGATTTGGGGTCTGGATGCTGATTGGCTTTGCTATCTACTTCGGCTATGGGATCCAGCACAGCCTGGAAGAGATTAAGAGTAACCAACCCTCACGCAAGTCTAGAGCCAAAACTGTAGACCTTGATCCCGGCACTCTCTATGTCCACTCAGTTTGACATCGTCACACCTAAATGCTGTCTGGTCCCCTGCACAATAATGGAGAGTACTCCTGACCCCAGTGACAGCTAGCCCTCCCCTGTGATGGTGGTGGTGGATACTAATACAGTTCTGTACGATGTGAAGGATGTGTCTTTGCTATTTCTTGTCTATTTTAACCCGTCTGCTTCTAAATGATGTCTAGCTGCTTACCAACTTTAAAAAATGATATTAAAAGAAAGTAGAAAAATAAA
205	AAGCCGCAGCTTTGAAGCCTGAGCGGCCGAACTCGGCAGCTCCAACCCAACTCGGCTTAACTCCGCCTCACCGAGCCCAGTCCAAGACTCTGTGCTCCCTAGGTTTGCAACAGCTCTCTGATCATCTTCTTCAATTCCTGCTAGGATGCCGTGGCAAGCATTTCGCAGATTTGGTCAAAAGCTGGTACGCAGACGTACACTGGAGTCAGGCATGGCTGAGACTCGCCTTGCCAGATGCCTAAGCACCCTGGATTTAGTGGCCCTGGGTGTGGGCAGCACATTGGGTGCAGGCGTGTATGTCCTAGCTGGCGAGGTGGCCAAAGATAAAGCAGGGCCATCCATTGTGATCTGCTTTTTGGTGGCTGCCCTGTCTTCTGTGTTGGCTGGGCTGTGCTATGCGGAGTTTGGTGCCCGGGTTCCCCGTTCTGGTTCGGCATATCTCTACAGCTATGTCACTGTGGGTGAACTCTGGGCCTTCACCACTGGCTGGAACCTCATCCTCTCCTATGTCATTGGTACAGCCAGTGTGGCCCGGGCCTGGAGCTCTGCTTTTGACAACCTGATTGGGAACCACATCTCTAAGACTCTGCAGGGGTCCATTGCACTGCACGTGCCCCATGTCCTTGCAGAATATCCAGATTTCTTTGCTTTGGGCCTCGTGTTGCTGCTCACTGGATTGTTGGCTCTCGGGGCTAGTGAGTCGGCCCTGGTTACCAAAGTGTTCACAGGCGTGAACCTTTTGGTTCTTGGGTTCGTCATGATCTCTGGCTTCGTTAAGGGGGACGTGCACAACTGGAAGCTCACAGAAGAGGACTACGAATTGGCCATGGCTGAACTCAATGACACCTATAGCTTGGGTCCTCTGGGCTCTGGAGGATTTGTGCCTTTCGGCTTCGAGGGAATTCTCCGTGGAGCAGCGACCTGTTTCTATGCATTTGTTGGTTTCGACTGTATTGCTACCACTGGAGAAGAAGCCCAGAATCCCCAGCGTTCCATCCCGATGGGCATTGTGATCTCACTGTCTGTCTGCTTTTTGGCGTATTTTGCTGTCTCTTCTGCACTCACCCTGATGATGCCTTACTACCAGCTTCAGCCTGAGAGCCCTTTGCCTGAGGCATTTCTCTACATTGGATGGGCTCCTGCCCGCTATGTTGTGGCTGTTGGCTCCCTCTGTGCTCTTTCTACCAGCCTCCTGGGCTCCATGTTCCCCATGCCTCGGGTGATCTACGCGATGGCAGAGGATGGCCTCCTGTTCCGTGTACTTGCTCGGATCCACACCGGCACACGCACCCCAATCATAGCCACCGTGGTCTCTGGCATTATTGCAGCATTCATGGCATTCCTCTTCAAACTCACTGATCTTGTGGACCTCATGTCAATTGGGACCCTGCTTGCTTACTCCCTGGTGTCGATTTGTGTTCTCATCCTCAGGTATCAACCTGATCAGGAGACAAAGACTGGGGAAGAAGTGGAGTTGCAGGAGGAGGCAATAACTACTGAATCAGAGAAGTTGACCCTATGGGGACTATTTTTCCCACTCAACTCCATCCCCACTCCACTCTCTGGCCAAATTGTCTATGTTTGTTCCTCATTGCTTGCTGTCCTGCTGACTGCTCTTTGCCTGGTGCTGGCCCAGTGGTCAGTTCCATTGCTTTCTGGAGACCTGCTGTGGACTGCAGTGGTTGTGCTGCTCCTGCTGCTCATTATTGGGATCATTGTGGTCATCTGGAGACAGCCACAGAGTTCCACTCCCCTTCACTTTAAGGTGCCTGCTTTGCCTCTCCTCCCACTAATGAGCATCTTTGTGAATATTTACCTTATGATGCAGATGACAGCTGGTACCTGGGCCCGATTTGGGGTCTGGATGCTGATTGGCTTTGCTATCTACTTCGGCTATGGGATCCAGCACAGCCTGGAAGAGATTAAGAGTAACCAACCCTCACGCAAGTCTAGAGCCAAAACTGTAGACCTTGATCCCGGCACTCTCTATGTCCACTCAGTTTGACATCGTCACACCTAAATGCTGTCTGGTCCCCTGCACAATAATGGAGAGTACTCCTGACCCCAGTGACAGCTAGCCCTCCCCTGTGATGGTGGTGGTGGATACTAATACAGTTCTGTACGATGTGAAGGATGTGTCTTTGCTATTTCTTGTCTATTTTAACCCGTCTGCTTCTAAATGATGTCTAGCTGCTTACCAACTTTAAAAAATGATATTAAAAGAAAGTAGAAAAATAAA
210	AGAGCGGAGGCAGCGGCTGCGGCAGCAGCAGGTTCCAGTAGCTGGCTCGGTGCTCTTCTCGGCCACCTGCCATGGCCCGGGGGCTGCCCACCATTGCTAGCCTGGCACGCTTATGCCAGAAGCTGAACCGCCTGAAGCCGCTGGAGGACTCCACCATGGAGACGTCACTGCGGCGCTGCCTGTCCACGCTGGACCTGACTCTTCTGGGCGTGGGTGGCATGGTGGGCTCGGGTCTCTACGTGCTCACAGGTGCCGTGGCCAAGGAGGTGGCTGGCCCTGCTGTGCTCTTGTCCTTCGGTGTGGCCGCTGTGGCCTCCCTGCTGGCAGCCCTATGCTATGCAGAATTTGGGGCACGTGTGCCACGCACGGGCTCTGCCTACCTGTTCACCTACGTATCCATGGGCGAGCTGTGGGCCTTCCTCATCGGCTGGAATGTTCTCCTCGAATACATCATCGGTGGCGCCGCCGTGGCCCGTGCCTGGAGTGGCTACCTGGACTCTATGTTCAGCCACAGCATCCGCAACTTCACTGAGACCCACGTGGGTTCTTGGCAGGTGCCCCTCCTGGGCCACTACCCGGACTTCCTGGCTGCTGGCATCATCCTCCTGGCCTCTGCCTTTGTCTCCTGTGGAGCCCGCGTGTCCTCCTGGCTCAATCACACCTTCTCGGCCATCAGCCTGCTTGTCATTCTCTTCATTGTCATCCTGGGCTTCATCCTGGCCCAGCCTCACAACTGGAGCGCTGACGAAGGCGGCTTTGCACCCTTCGGCTTCTCCGGCGTCATGGCCGGCACTGCCTCCTGCTTCTATGCTTTCGTGGGCTTCGACGTCATTGCCGCCTCCAGTGAGGAGGCCCAGAACCCACGGCGGTCTGTGCCTCTGGCCATCGCCATCTCGCTTGCCATTGCAGCTGGTGCCTACATCCTTGTCTCCACCGTGCTAACCCTCATGGTGCCCTGGCACAGCCTGGACCCCGACTCAGCGCTTGCAGATGCCTTCTACCAGCGGGGCTACAGGTGGGCTGGCTTCATCGTGGCAGCTGGCTCCATCTGCGCCATGAACACCGTCCTGCTCAGCCTCCTCTTCTCCCTGCCACGCATTGTCTATGCCATGGCCGCCGATGGGCTCTTCTTCCAGGTGTTTGCCCATGTGCACCCCCGGACACAGGTGCCTGTGGCGGGCACCCTGGCGTTCGGGCTCCTCACGGCCTTCCTGGCACTGCTGCTGGACCTGGAGTCGCTGGTTCAGTTCCTGTCCCTTGGCACACTCCTGGCCTACACATTCGTGGCCACCAGTATCATTGTGCTGCGCTTCCAGAAGTCTTCCCCGCCCAGCTCCCCAGGCCCAGCCAGCCCTGGCCCCCTGACCAAGCAGCAGAGCTCCTTCTCAGACCACCTACAGCTGGTGGGCACTGTACACGCCTCCGTCCCTGAGCCAGGGGAGCTGAAGCCAGCCCTGAGGCCCTACCTGGGCTTCTTGGATGGGTACAGCCCTGGAGCAGTGGTGACTTGGGCGCTTGGCGTTATGTTGGCCTCAGCCATCACCATAGGCTGCGTGCTTGTCTTTGGGAACTCGACCCTGCACCTCCCACACTGGGGTTACATCCTGCTGCTCCTGCTCACCAGTGTCATGTTTCTGCTCAGCCTCCTTGTCCTGGGGGCTCACCAGCAACAGTATCGGGAAGACTTATTTCAGATCCCCATGGTTCCCCTGATTCCAGCCCTGAGCATCGTCCTCAACATCTGCCTCATGCTGAAACTTAGCTATCTGACCTGGGTGCGCTTCTCCATCTGGCTGCTGATGGGACTTGCAGTGTATTTCGGCTATGGCATCCGGCATAGCAAGGAGAACCAGCGGGAGCTGCCAGGGCTGAACTCCACACACTACGTGGTATTCCCCAGGGGCAGCCTGGAGGAGACAGTGCAGGCTATGCAGCCCCCCAGCCAGGCACCAGCACAGGACCCTGGCCATATGGAGTAGCTGATCAGCCCACACTTGCCCCGCCCTCCCACACCTGCTTGGGAGGCCAGAGAGGCCAGACAAGCCGAGAGCCCCTTCTGTTGTGGGCAGCCTGGGTTTGCAGGCCTGCACAGGCTGGGGAGTCCTCAGGACCTTAGGACCTTCATCCAGGGGCTGGGCTTCGGGTCTTCAGGAGTGGGCCTTGGCTGGTGCTGGTGCCATGGACTCTGCCCAGAGCCTTCTTGTTTATGATCAGCTCCAGCTACCTGGGCAGTTGTGGTGGGGTGGATGGGAAGGCCCACAGCCCAAGGGATCCATAATAATAATTGCTTGGCCAGCCATGTGGCCTGCTGGCGTA
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235	GCCATTTCTAGGGTTGGACCGTGCAGGCACGGGCGGTCAGCTGGGCCGCAGCTCCTCCGGCTCTGCAGGGTCACGGAGGAAGGTAAGTAAGCCAGCTCCCCTAGTCCAGGCCGAGCTTGCACTTGCGTCTTGTCTGCTGCTGCTGAACCAAGATTTAGCTGTGCGCCCTCCTTGCAGTCTCCTGGAACCAGCAGGAGGAAACATGGGGGATACTGGCCTGAGAAAGCGGAGAGAGGATGAGAAGTCGATCCAGAGCCAAGAGCCTAAGACCACCAGTCTCCAAAAGGAGCTGGGCCTCATCAGTGGCATCTCCATCATCGTGGGCACCATCATTGGCTCTGGGATCTTCGTTTCCCCCAAGTCTGTGCTCAGCAACACGGAAGCTGTGGGGCCCTGCCTCATCATATGGGCGGCTTGCGGGGTCCTCGCGACGCTGGGTGCCCTGTGCTTTGCGGAGCTTGGCACAATGATCACCAAGTCAGGGGGAGAGTATCCCTACCTGATGGAGGCCTACGGGCCCATCCCCGCCTACCTCTTCTCCTGGGCCAGCCTGATCGTCATTAAGCCCACGTCCTTCGCCATCATCTGCCTCAGCTTCTCCGAGTATGTGTGTGCGCCCTTCTATGTGGGCTGCAAGCCTCCTCAAATCGTTGTGAAATGCCTGGCCGCCGCCGCCATCTTGTTCATCTCGACAGTGAACTCACTGAGCGTGCGGCTGGGAAGCTACGTCCAGAACATCTTCACCGCGGCCAAGCTGGTGATCGTGGCCATCATCATCATCAGCGGGCTGGTGCTCCTGGCCCAAGGAAACACAAAGAATTTTGATAATTCTTTCGAGGGCGCCCAGCTGTCTGTGGGAGCCATCAGCCTGGCGTTTTACAATGGACTCTGGGCCTATGATGGATGGAATCAACTCAATTACATCACAGAAGAACTTAGAAACCCTTACAGAAACCTGCCTTTGGCCATTATCATCGGGATCCCCCTGGTGACGGCGTGCTACATCCTCATGAACGTGTCCTACTTCACCGTGATGACTGCCACCGAACTCCTGCAGTCCCAGGCGGTGGCTGTGACATTTGGTGACCGTGTTCTCTATCCTGCTTCTTGGATCGTTCCACTTTTTGTGGCATTTTCAACCATCGGTGCTGCTAACGGGACCTGCTTCACAGCGGGCAGACTCATTTACGTGGCGGGCCGGGAGGGTCACATGCTCAAAGTGCTTTCTTACATCAGCGTCAGGCGCCTCACTCCAGCCCCCGCCATCATCTTTTATGGTATCATAGCAACGATTTATATCATCCCTGGTGACATAAACTCGTTAGTCAATTATTTCAGCTTTGCCGCATGGCTGTTTTATGGCCTGACGATTCTAGGACTCATCGTGATGAGATTTACAAGGAAAGAGCTGGAAAGGCCTATCAAGGTGCCCGTAGTCATTCCCGTCTTGATGACACTCATCTCTGTGTTTTTGGTTCTGGCTCCAATCATCAGCAAGCCCACCTGGGAGTACCTCTACTGTGTGCTGTTTATATTAAGCGGCCTTTTATTTTACTTCCTGTTTGTCCACTACAAGTTTGGATGGGCTCAGAAAATCTCAAAGCCGATTACCATGCACCTTCAGATGCTAATGGAAGTGGTCCCACCGGAGGAAGACCCTGAGTAACAAGCTCCGTCTCTTGTAGCCAAGTCAGCTGAATTTATTTTCTTAAGCAATATTTGTGGTTATTTCTTCCTTTTTTTCTTACGAATAAAATATACTCAGATGTTTAAAA
236	GCCATTTCTAGGGTTGGACCGTGCAGGCACGGGCGGTCAGCTGGGCCGCAGCTCCTCCGGCTCTGCAGGGTCACGGAGGAAGCCAGCTCCCCTAGTCCAGGCCGAGCTTGCACTTGCGTCTTGTCTGCTGCTGCTGAACCAAGATTTAGCTGTGCGCCCTCCTTGCAGTCTCCTGGAACCAGCAGGAGGAAACATGGGGGATACTGGCCTGAGAAAGCGGAGAGAGGATGAGAAGTCGATCCAGAGCCAAGAGCCTAAGACCACCAGTCTCCAAAAGGAGCTGGGCCTCATCAGTGGCATCTCCATCATCGTGGGCACCATCATTGGCTCTGGGATCTTCGTTTCCCCCAAGTCTGTGCTCAGCAACACGGAAGCTGTGGGGCCCTGCCTCATCATATGGGCGGCTTGCGGGGTCCTCGCGACGCTGGGTGCCCTGTGCTTTGCGGAGCTTGGCACAATGATCACCAAGTCAGGGGGAGAGTATCCCTACCTGATGGAGGCCTACGGGCCCATCCCCGCCTACCTCTTCTCCTGGGCCAGCCTGATCGTCATTAAGCCCACGTCCTTCGCCATCATCTGCCTCAGCTTCTCCGAGTATGTGTGTGCGCCCTTCTATGTGGGCTGCAAGCCTCCTCAAATCGTTGTGAAATGCCTGGCCGCCGCCGCCATCTTGTTCATCTCGACAGTGAACTCACTGAGCGTGCGGCTGGGAAGCTACGTCCAGAACATCTTCACCGCGGCCAAGCTGGTGATCGTGGCCATCATCATCATCAGCGGGCTGGTGCTCCTGGCCCAAGGAAACACAAAGAATTTTGATAATTCTTTCGAGGGCGCCCAGCTGTCTGTGGGAGCCATCAGCCTGGCGTTTTACAATGGACTCTGGGCCTATGATGGATGGAATCAACTCAATTACATCACAGAAGAACTTAGAAACCCTTACAGAAACCTGCCTTTGGCCATTATCATCGGGATCCCCCTGGTGACGGCGTGCTACATCCTCATGAACGTGTCCTACTTCACCGTGATGACTGCCACCGAACTCCTGCAGTCCCAGGCGGTGGCTGTGACATTTGGTGACCGTGTTCTCTATCCTGCTTCTTGGATCGTTCCACTTTTTGTGGCATTTTCAACCATCGGTGCTGCTAACGGGACCTGCTTCACAGCGGGCAGACTCATTTACGTGGCGGGCCGGGAGGGTCACATGCTCAAAGTGCTTTCTTACATCAGCGTCAGGCGCCTCACTCCAGCCCCCGCCATCATCTTTTATGGTATCATAGCAACGATTTATATCATCCCTGGTGACATAAACTCGTTAGTCAATTATTTCAGCTTTGCCGCATGGCTGTTTTATGGCCTGACGATTCTAGGACTCATCGTGATGAGATTTACAAGGAAAGAGCTGGAAAGGCCTATCAAGGTGCCCGTAGTCATTCCCGTCTTGATGACACTCATCTCTGTGTTTTTGGTTCTGGCTCCAATCATCAGCAAGCCCACCTGGGAGTACCTCTACTGTGTGCTGTTTATATTAAGCGGCCTTTTATTTTACTTCCTGTTTGTCCACTACAAGTTTGGATGGGCTCAGAAAATCTCAAAGCCGATTACCATGCACCTTCAGATGCTAATGGAAGTGGTCCCACCGGAGGAAGACCCTGAGTAACAAGCTCCGTCTCTTGTAGCCAAGTCAGCTGAATTTATTTTCTTAAGCAATATTTGTGGTTATTTCTTCCTTTTTTTCTTACGAATAAAATATACTCAGATGTTTAAAA
242	ACTCTTCCACCTCCCTTACTGCAGGAAGGCACTCCGAAGACATAAGTCGGTGAGACATGGCTGAAGATAAAAGCAAGAGAGACTCCATCGAGATGAGTATGAAGGGATGCCAGACAAACAACGGGTTTGTCCATAATGAAGACATTCTGGAGCAGACCCCGGATCCAGGAAGCTCAACAGACAACCTGAAGCACAGCACCAGGGGCATCCTTGGCTCCCAGGAGCCCGACTTCAAGGGCGTCCAGCCCTATGCGGGGATGCCCAAGGAGGTGCTGTTCCAGTTCTCTGGCCAGGCCCGCTACCGCATACCTCGGGAGATCCTCTTCTGGCTCACAGTGGCTTCTGTGCTGGTGCTCATCGCGGCCACCATAGCCATCATTGCCCTCTCTCCAAAGTGCCTAGACTGGTGGCAGGAGGGGCCCATGTACCAGATCTACCCAAGGTCTTTCAAGGACAGTAACAAGGATGGGAACGGAGATCTGAAAGGTATTCAAGATAAACTGGACTACATCACAGCTTTAAATATAAAAACTGTTTGGATTACTTCATTTTATAAATCGTCCCTTAAAGATTTCAGATATGGTGTTGAAGATTTCCGGGAAGTTGATCCCATTTTTGGAACGATGGAAGATTTTGAGAATCTGGTTGCAGCCATACATGATAAAGGTTTAAAATTAATCATCGATTTCATACCAAACCACACGAGTGATAAACATATTTGGTTTCAATTGAGTCGGACACGGACAGGAAAATATACTGATTATTATATCTGGCATGACTGTACCCATGAAAATGGCAAAACCATTCCACCCAACAACTGGTTAAGTGTGTATGGAAACTCCAGTTGGCACTTTGACGAAGTGCGAAACCAATGTTATTTTCATCAGTTTATGAAAGAGCAACCTGATTTAAATTTCCGCAATCCTGATGTTCAAGAAGAAATAAAAGAAATTTTACGGTTCTGGCTCACAAAGGGTGTTGATGGTTTTAGTTTGGATGCTGTTAAATTCCTCCTAGAAGCAAAGCACCTGAGAGATGAGATCCAAGTAAATAAGACCCAAATCCCGGACACGGTCACACAATACTCGGAGCTGTACCATGACTTCACCACCACGCAGGTGGGAATGCACGACATTGTCCGCAGCTTCCGGCAGACCATGGACCAATACAGCACGGAGCCCGGCAGATACAGGTTCATGGGGACTGAAGCCTATGCAGAGAGTATTGACAGGACCGTGATGTACTATGGATTGCCATTTATCCAAGAAGCTGATTTTCCCTTCAACAATTACCTCAGCATGCTAGACACTGTTTCTGGGAACAGCGTGTATGAGGTTATCACATCCTGGATGGAAAACATGCCAGAAGGAAAATGGCCTAACTGGATGATTGGTGGACCAGACAGTTCACGGCTGACTTCGCGTTTGGGGAATCAGTATGTCAACGTGATGAACATGCTTCTTTTCACACTCCCTGGAACTCCTATAACTTACTATGGAGAAGAAATTGGAATGGGAAATATTGTAGCCGCAAATCTCAATGAAAGCTATGATATTAATACCCTTCGCTCAAAGTCACCAATGCAGTGGGACAATAGTTCAAATGCTGGTTTTTCTGAAGCTAGTAACACCTGGTTACCTACCAATTCAGATTACCACACTGTGAATGTTGATGTCCAAAAGACTCAGCCCAGATCGGCTTTGAAGTTATATCAAGATTTAAGTCTACTTCATGCCAATGAGCTACTCCTCAACAGGGGCTGGTTTTGCCATTTGAGGAATGACAGCCACTATGTTGTGTACACAAGAGAGCTGGATGGCATCGACAGAATCTTTATCGTGGTTCTGAATTTTGGAGAATCAACACTGTTAAATCTACATAATATGATTTCGGGCCTTCCCGCTAAAATGAGAATAAGGTTAAGTACCAATTCTGCCGACAAAGGCAGTAAAGTTGATACAAGTGGCATTTTTCTGGACAAGGGAGAGGGACTCATCTTTGAACACAACACGAAGAATCTCCTTCATCGCCAAACAGCTTTCAGAGATAGATGCTTTGTTTCCAATCGAGCATGCTATTCCAGTGTACTGAACATACTGTATACCTCGTGTTAGGCACCTTTATGAAGAGATGAAGACACTGGCATTTCAGTGGGATTGTAAGCATTTGTAATAGCTTCATGTACAGCATGCTGCTTGGTGAACAATCATTAATTCTTCGATATTTCTGTAGCTTGAATGTAACTGCTTTAAGAAAGGTTCTCAAATGTTTTGAAAAAAATAAAATGTTTAAAAGTAAATTATGGCTTATAGGAGCTTATAACTTTATTCAGATAGCATCAATCAGGGATGACCAGAACACATTAGGACCCCAGATTATTCAAAAACTTTAACGAATTTTAAGGGGAAGAATTTTATCTTTTCCCTTAAAATGCAGTCATAGAAATTAGAGGATGACTCACTGCCACAGTGTCTAAAAGCATTTGCTAGCAAAGAGGCAGGACACTAATTTGTAAACTGCTCAACTGTTCTGACTGGAAGGGAGGCCTGGAGCTCTGCTATCACCAATCCTTCCCTTCCCTCTACTCCACATCCTTCTAAGGAGCATGATTTGAAAATTACTTTCCTAGGTTAATGGGCATGTGCATCAATGGAGAGAATAGTATAAGCAAGTGAGATGTAGACTAAGCAAAATTTAGATGGAGAAGCACATTTTAAAAAATTAATAACTTAAAAGTCTCAAGTTATTAATTTTTTTTTTGCTAACTCAATTGGAAGTAAGACTATGAAATATTTCAGTGTGTTTCCAATTCCCAGTTGAATGCAGTGTTTCAGAATTTCAGGTATTTCTTAAGATCCTCGAAAACACTGGTGCTGTCAAGTCCAAGTTCCTCGTACAGGAATTTAATTTGGGCTGTAATCTAAAAGAAACACATTAAAAAAATTAAATAGAAGGCCTTTGTAGTAAAA
246	GGCTCACTCTGGCAGGTAGGAACAGGGGAGAGTGCACCTGCTACCAGTCAAGCTCAGCCAGACTGCAAGAGGAGGCGAGGCGGAGCCAGCCGAGGGAGTGAACCATGGACAAGTTGAAATGCCCGAGTTTCTTCAAGTGCAGGGAGAAGGAGAAAGTGTCGGCTTCATCAGAGAATTTCCATGTTGGTGAAAATGATGAGAATCAGGACCGTGGTAACTGGTCCAAAAAATCGGATTATCTTCTATCTATGATTGGATACGCAGTGGGATTAGGAAATGTGTGGAGATTTCCATATCTGACCTACAGCAATGGTGGAGGCGCCTTCTTGATACCTTATGCAATTATGTTAGCATTGGCTGGTTTACCTTTGTTCTTTCTGGAGTGTTCACTGGGACAATTTGCTAGCTTAGGTCCAGTTTCAGTTTGGAGGATTCTTCCATTGTTTCAAGGTGTGGGAATTACAATGGTCCTGATCTCCATTTTTGTGACAATCTATTACAATGTCATAATTGCCTATAGTCTTTACTACATGTTTGCTTCTTTTCAAAGTGAACTACCATGGAAAAATTGTTCTTCGTGGTCAGATAAAAACTGTAGCAGATCACCAATAGTAACTCACTGTAATGTGAGTACAGTGAATAAAGGAATACAAGAGATCATCCAAATGAATAAAAGCTGGGTAGACATCAACAATTTTACCTGCATCAACGGCAGTGAAATTTATCAGCCAGGGCAGCTTCCCAGTGAACAATATTGGAATAAAGTGGCGCTCCAACGGTCAAGTGGAATGAATGAGACTGGAGTAATTGTTTGGTATTTAGCACTTTGTCTTCTTCTGGCTTGGCTCATAGTTGGAGCAGCACTATTTAAAGGAATCAAATCGTCTGGCAAGGTGGTATATTTTACAGCTCTTTTCCCCTATGTGGTCCTACTCATCCTGTTAGTACGAGGTGCAACTCTGGAGGGTGCTTCAAAAGGCATTTCATACTATATTGGAGCCCAGTCAAATTTTACAAAACTTAAGGAAGCTGAGGTATGGAAAGATGCTGCCACTCAGATATTTTACTCCCTTTCAGTGGCTTGGGGTGGCTTAGTTGCTCTATCATCTTACAATAAGTTCAAAAACAACTGCTTCTCTGATGCCATTGTGGTTTGTTTGACAAACTGTCTCACTAGCGTGTTTGCTGGATTTGCTATTTTTTCTATATTGGGACACATGGCCCATATATCTGGAAAGGAAGTTTCTCAAGTTGTAAAATCAGGTTTTGATTTGGCATTCATTGCCTATCCAGAGGCTCTAGCCCAACTCCCAGGTGGTCCATTTTGGTCCATATTATTTTTTTTCATGCTTTTAACTTTGGGTCTCGATTCTCAGTTTGCTTCGATTGAAACGATCACAACAACAATTCAAGATTTATTTCCCAAAGTGATGAAGAAAATGAGGGTTCCCATAACTTTGGGCTGCTGCTTGGTTTTGTTTCTCCTTGGTCTCGTCTGTGTGACTCAGGCTGGAATTTACTGGGTTCATCTGATTGACCACTTCTGTGCTGGATGGGGCATTTTAATTGCAGCTATACTGGAGCTAGTTGGAATCATCTGGATTTATGGAGGGAACAGATTCATTGAGGATACAGAAATGATGATTGGAGCAAAGAGGTGGATATTCTGGCTATGGTGGAGAGCTTGCTGGTTTGTAATTACGCCTATCCTTTTGATTGCAATATTTATCTGGTCATTGGTGCAATTTCATAGACCTAATTATGGCGCAATTCCATACCCTGACTGGGGAGTTGCTTTAGGCTGGTGTATGATTGTTTTCTGCATTATTTGGATTCCAATTATGGCTATCATAAAAATAATTCAGGCTAAAGGAAACATCTTTCAACGCCTTATAAGTTGCTGCAGACCAGCTTCTAACTGGGGTCCATACCTGGAACAACATCGTGGGGAAAGATATAAAGACATGGTAGATCCTAAAAAAGAGGCTGACCATGAAATACCTACTGTTAGTGGCAGCAGAAAACCGGAATGAGATCTCATTGAAAAAAATATATGATTGTATAATGTGATTTTTTTTAGAATAGGGGGAACCTTATTTATTTGTGTGTTAACTGAATAGGAAAATGTACATACTATGTTCATGATAGTGTGATTTTTTTCACATTTAAGCAGGAATGCAATATAAAAATGTGAATCTCTTAATTCTCAGCCATGTGCTTATTATATTTCTTTTTAGATTGTCTATCTGTATAACACACACACACACACCTAAGAGTCTCTATTTCACAATTATATTTTTGTAAATAGTATATGCATTTTTAATACATTGGAGGCTTTATTTTGAACTAATTTCTTAGAGAATAGTTATATTTTCTATTACACAAGTTTAAAAATATTATTAACTTGTATTTTCTTAATATACAATCTATCTTTTCCACAAATATGAGTGGGAAATAAATCAGCACATTTGAAAGAAAGTGTTAAAACTGAAGGCCTCACTTAATTAGAAACGTGATAAATATATGGACAAATGGACTATACATACTATAAGAGGACTGTAGTTTAATACTTTTTACCCAAATATGTTTAAAAACTTCGTGCATTTGTTACAGCTCATGTTTTCTATATGAACTTAGTCATTAATGTTCTTTATAAAAAGTGAAATAAGATGGAAAAATAAGGATCCTACAGCCAGTAAGTGATAAATCTAGAAAATTGAGTTTTGAGTACCTCTTTTCCCATATACAATCTTCCTTCCTTAGGTAATTTGGAAGAAAACTATGACCCATTTAATTTCTATTGTGTTTCACAAAATTAAGTGTTGTTCATTATACTCTCTGAAATATAGGTTTAATTTCAAATAGAATATGGACTTAAATGTTAATGAGAAAATGGCTTTAATCAATTCTAGCATTTTATTACTGTAATACAGGGCTGATAGAGTGATTTTGTCTTATATGAGTAAGTTACTACTTACAGGTGATAACTTGCATACTATTGGAAGATAAACTTGTCAAACTTGTCAAGAATGAGAAAAGCCAAATTAGAAAATCCTATGTCCTAGTTTCCTTACCAAGGATAATTAAATATATCACTAAGAGCTTTATATATTGATTATATATTGTTGACAACTGGTTTAAGCATCATAGCCTATGATGATAAACACTGCCTATATATGTAAATAGCTTTTCATCAATTCTTAAATTTCTTAACCTAGGCTTCAGGGAGCATATGAAACCAAAATTATATGGAACATTTTCTGTGTGTACATGTACATGCATTTTTCTAGGGAGAGAGTCCGTAGGTTTATCAGAATATCAAGGAAAACTGTGACCCAAAGAAGTTTAAGAATCACATACACTGCTGCTGGCTTTTTGTGCTTGGCAAATGAGTGACAATAGAAGAAATAATTTTTCTTACACATTTTAAAACGTTTTCTCTTCCTTGTGATTGAAGATGAAAGGAGTAAGAAATTAAGGCATTTGTTTAATTTATACTGGTAACTTATTTAGGGGGGAGGGGACATGAAGGTAGGTAAATAGGTAGGCCTCTAATTGAACCACCTCTCTAAGTTATGTACGTATATATAAGCTGAAATTGTGTTTGACATTCTGAGGGTTTTCTTTTTCTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTGGTGGGGGGCTGGGGGTCAGAGTCTTGTTCTGTTGCCCGGGCTGGAGTGCAGTGGCATGATCTCAGCTCACTGCAACCTCTGCCTTCTGGATTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTTGAGTAGCTGGGACTACAGGTGCCCGCCACCACACCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGGCGAAGTTTCCCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCCGACCTCAAGTGATCTGTCTACCTCGGCCTCCTAAAGTGCTGAGATTACAGGTGTGAGCCACCGTGCCCGGCCCATTCTAAGGGTTTTCTTTGAAGACAGGTCAAATGCTGTTAGTAAGTTTCAGGAGATTGTTAATTCCTCAGTTATACCAGATTTTATAAAATATTTGAGAATAGATGGCTAACAAGAGGTTAGAAATACTTTTCCTTAATTTTAATCCACAGTATGTTACATGCATTCTACCACTACATTTTGGTGCTATTTAAGGTGTGCAATTTTCTATAGGTGACTTTTGCAATTCAGGGAAGATTTGGGCATATTAAATGAAAGAATATCTAATTGGGGGAGGTGTGAAGGGAAAGAAATTCTTTTCAAAAGCTGACCACAAAGAGTAGTTAAAAGTTTTTGTCACTATCTTCACAAGTGTGTAAAGCACAGATTTCAACAGAGTGCTTGGCATATTGTAGGGTGCTCAATGGTGGTTTTTATTATTATTACTCAGATTCCACAGTGGCAAGAAACATCATTCTACATAATGGAAAACATTTACATCAAATCCCACTTACTTTAATGCGAACTTGGAGATAATTTATGGTATTGTATTGTAAACCATTAATGAAAACTTTTTCACAGTTGAGTGAAATTAAAATCACTATATCTCAA

圖1 為pBCTex01G表現載體之圖。圖1揭示了呈SEQ ID NO: 30之「(G4S)3」。

圖2 為pBCTex02mini表現載體之圖。

圖3A 為展示實例1所述之實驗的轉染及精胺酸耗乏步驟的示意圖。

圖3B 為展示實例1所述之實驗的過濾及計數步驟的示意圖。

圖3C 為展示在富含精胺酸(左)或精胺酸耗乏(右)環境中72小時之後經表現構築體(對照、CAT或ASS)轉染之細胞百分比之估計變化的一組圖。各資料點代表經獨立轉染細胞之一個經分離孔之細胞數目的估計變化百分比。

圖4 為展示在對照(頂部)或精胺酸耗乏(底部)培養基中經對照(mNeonGreen)或CAT (精胺酸轉運體) mRNA轉染之初級人類T細胞的估計變化百分比的一組圖。在富含精胺酸培養基中24小時之後，在經GFP對照(約100%)及CAT (約200%)轉染細胞中見到細胞百分比增加。相比之下，在精胺酸耗乏培養基中，見到GFP對照細胞淨減少，而見到經CAT mRNA轉染細胞增加約15%。

Claims

一種遺傳修飾T細胞，其經遺傳修飾以表現： a)重組精胺酸轉運體及 b)嵌合抗原受體，其具有至少一個抗原特異性靶向區，可特異性結合呈現在目標細胞群體、跨膜域及胞內傳訊域上之細胞表面抗原。
一種表現載體，其包含編碼以下之經分離核酸：a)抗原特異性靶向區、b)跨膜域、c)視情況至少一個共同刺激域、d)胞內傳訊域、及e)精胺酸轉運體。
一種遺傳修飾T細胞，其經修飾以表現由如請求項2之表現載體編碼的嵌合抗原受體。
如請求項1或3之遺傳修飾T細胞，其中該精胺酸轉運體選自由以下組成之群：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 。
3或4中任一項之遺傳修飾T細胞，其中該遺傳修飾T細胞包含選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。
3或4之遺傳修飾T細胞，其中該遺傳修飾T細胞包含表現與以下中之一者具有約90%、95%或99%一致性百分比之序列的核酸：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。
一種醫藥學上可接受之組合物，其包含如請求項1或3至6中任一項之遺傳修飾T細胞，及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種促發培養基，其包含如請求項1或3至6中任一項之遺傳修飾T細胞及L-精胺酸。
一種醫藥組合物，其包含表現重組精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-1。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-2。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-3。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-4。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT1及4F2hc。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT2及4F2hc。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為b^0,+ AT及rBAT。
如請求項9之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為ATB^0,+ 。
如請求項9之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係封裝為套組。
一種治療有需要之患者之實體腫瘤癌症的方法，其包含向該患者投與有效量之如請求項7或9之醫藥組合物。
一種治療有需要之患者之血液癌症的方法，其包含向該患者投與有效量之如請求項7或9之醫藥組合物。
一種調節有需要之患者之胞內精胺酸含量以影響T細胞介導之免疫反應的方法，其包含向該患者投與有效量之如請求項7或9之醫藥組合物。
一種治療有需要之人類患者之病狀的方法，其包含：向該人類患者投與治療有效量之包含表現重組精胺酸轉運體及嵌合抗原受體蛋白質之嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)的組合物。
一種調節有需要之患者之對表現細胞表面抗原之目標細胞群體的T細胞介導之免疫反應的方法，其包含向該患者投與治療有效量之T細胞，該等T細胞a)經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體包含：至少一個抗原特異性靶向區，其特異性結合呈現在該目標細胞群體、跨膜域、胞內傳訊域上之該細胞表面抗原，及b)經遺傳修飾以表現重組精胺酸轉運體。
如請求項22或23之方法，其中該等T細胞在投與之前在包含精胺酸之培養基中培養。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-1。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-2。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-3。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-4。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT1及4F2hc。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT2及4F2hc。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為b^0,+ AT及rBAT。
如請求項22至24中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體為ATB^0,+ 。
如請求項22至24中任一項之方法，其包含投與如請求項1及3至6中任一項之T細胞。
如請求項22至32中任一項之方法，其進一步包含向該人類患者投與第二治療劑。
如請求項34之方法，其中該第二治療劑為抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗體。
如請求項34或35之方法，其中投與該第二治療劑係在投與包含該CAR-T細胞之該組合物之前、期間或之後進行。
如請求項34或35之方法，其中該投與該第二治療劑係在投與該治療有效量之T細胞之前、期間或之後進行。
如請求項22至37中任一項之方法，其中每週一次、每2週一次、每3週一次或每4週一次向該人類患者投與包含該等CAR-T細胞之該組合物。
如請求項22至37中任一項之方法，其包含投與每公斤該患者10⁷ 至10¹⁰ 個CAR-T細胞。
一種製備表現重組精胺酸轉運體之遺傳修飾CAR-T細胞的方法，其包含：用包含特異性嵌合抗原受體及精胺酸轉運體之核苷酸序列的DNA構築體轉染T細胞，藉此產生表現該嵌合抗原受體與該精胺酸轉運體兩者之遺傳修飾CAR-T細胞；及在包含精胺酸之培養基中培養該遺傳修飾CAR-T細胞。
如請求項40之方法，其中該培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾CAR-T細胞，直至該CAR-T細胞之該胞內精胺酸含量累積至某一含量。
一種遺傳修飾T細胞，其經遺傳修飾以表現重組精胺酸轉運體。
如請求項42之遺傳修飾T細胞，其中該精胺酸轉運體選自由以下組成之群：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 。
如請求項42或43之遺傳修飾T細胞，其中該遺傳修飾T細胞包含選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。
如請求項42或43之遺傳修飾T細胞，其中該遺傳修飾T細胞包含表現與以下中之一者具有約90%、95%或99%一致性百分比之序列的核酸：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。
一種醫藥學上可接受之組合物，其包含如請求項42至45中任一項之遺傳修飾T細胞，及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種促發培養基，其包含如請求項42至45中任一項之遺傳修飾T細胞及L-精胺酸。
一種醫藥組合物，其包含表現重組精胺酸轉運蛋白之T細胞。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-1。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-2。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-3。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為CAT-4。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT1及4F2hc。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT2及4F2hc。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為b^0,+ AT及rBAT。
如請求項48之醫藥組合物，其中該精胺酸轉運體為ATB^0,+ 。
如請求項48之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係封裝為套組。
一種治療有需要之患者之實體腫瘤癌症的方法，其包含向該患者投與有效量之如請求項46或48之醫藥組合物。
一種治療有需要之患者之血液癌症的方法，其包含向該患者投與有效量之如請求項46或48之醫藥組合物。
一種調節有需要之患者之胞內精胺酸含量以影響T細胞介導之免疫反應的方法，其包含向該患者投與有效量之如請求項46或48之醫藥組合物。
一種用於治療有需要之人類患者之病狀的方法，其包含：向該人類患者投與治療有效量之包含表現重組精胺酸轉運體之T細胞的組合物。
如請求項61之方法，其中該等T細胞在投與之前在包含精胺酸之培養基中培養。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-1。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-2。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-3。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為CAT-4。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT1及4F2hc。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為y⁺ LAT2及4F2hc。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為b^0,+ AT及rBAT。
如請求項61或62之方法，其中該精胺酸轉運體為ATB^0,+ 。
如請求項61或62之方法，其包含投與如請求項42至45中任一項之T細胞。
如請求項58至71中任一項之方法，其進一步包含向該人類患者投與第二治療劑。
如請求項72之方法，其中該第二治療劑為抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗體。
如請求項72或73之方法，其中該投與該第二治療劑係在投與包含該T細胞之該組合物之前、期間或之後進行。
如請求項72或73之方法，其中該投與該第二治療劑係在投與該治療有效量之T細胞之前、期間或之後進行。
一種製備表現重組精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞的方法，其包含：用包含精胺酸轉運體之核苷酸序列的DNA構築體轉染T細胞，藉此產生表現該精胺酸轉運體之遺傳修飾T細胞；及在包含精胺酸之培養基中培養該遺傳修飾T細胞。
如請求項76之方法，其中該培養包含在該培養基中培養該遺傳修飾T細胞，直至該T細胞之該胞內精胺酸含量累積至某一含量。
一種在低精胺酸環境中提高T細胞存活的方法，該方法包含：向低精胺酸環境投與包含重組精胺酸轉運體之T細胞。
如請求項78之方法，其中在該投與步驟之前，該方法包含用包含編碼該重組精胺酸轉運體之核苷酸序列的DNA構築體轉染該T細胞。
如請求項78或請求項79之方法，其中該T細胞包含嵌合抗原受體及/或包含編碼嵌合抗原受體之核苷酸序列的DNA構築體。
如請求項78至80中任一項之方法，其中在該投與步驟之前，該方法包含在包含精胺酸之培養基中培養該T細胞。
如請求項81之方法，其中該培養包含在該培養基中培養該T細胞，直至該T細胞之該胞內精胺酸含量累積至某一含量。
如請求項78至82中任一項之方法，其中該精胺酸轉運體選自由以下組成之群：CAT-1、CAT-2、CAT-3、CAT-4、y⁺ LAT1及4F2hc、y⁺ LAT2及4F2hc、b^0,+ AT及rBAT及ATB^0,+ 。
如請求項78至82中任一項之方法，其中包含編碼該重組精胺酸轉運體之核苷酸序列的該DNA構築體包含選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246，或其片段或變異體。
如請求項78至82中任一項之方法，其中包含編碼該重組精胺酸轉運體之核苷酸序列的該DNA構築體包含表現與以下中之一者具有約90%、95%或99%一致性百分比之序列的核酸：SEQ ID NO: 180、184-188、204、205、210、214、215、220-222、227-230、234-236、242及246。
如請求項78至85中任一項之方法，其中該低精胺酸環境為細胞培養基。
如請求項78至85中任一項之方法，其中該低精胺酸環境為腫瘤微環境。