ES2951552T3 - Polipéptidos inmunomoduladores y composiciones y métodos relacionados - Google Patents

Polipéptidos inmunomoduladores y composiciones y métodos relacionados Download PDF

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Abstract

En el presente documento se proporcionan polipéptidos inmunomoduladores que contienen primera y segunda subunidades de una citocina o una quimiocina conectadas por una región de unión que contiene un resto de dirección que se une a una molécula diana. En algunos aspectos, la divulgación se refiere además a células diseñadas y composiciones que comprenden los polipéptidos inmunomoduladores y métodos para su administración a sujetos. En algunas realizaciones, las células diseñadas para contener el polipéptido inmunomodulador, como las células T, contienen además un receptor de antígeno diseñado genéticamente que se une específicamente a antígenos, como un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas realizaciones, las características de los polipéptidos, las células diseñadas y los métodos proporcionan un tratamiento mejorado de enfermedades o trastornos, tal como reduciendo los efectos adversos de la terapia con citocinas o quimiocinas, o aumentando la actividad, eficacia y/o persistencia o disminuyendo la inmunogenicidad de la célula adoptiva. terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos inmunomoduladores y composiciones y métodos relacionados
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N°. 62/369,017 presentada el 29 de julio de 2016, titulada "IMMUNOMODULATORY POLYPEPTIDES AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS".
Listado de secuencias
La presente solicitud se presenta con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado 735042004240seqlist.txt, creado el 27 de julio de 2017, que tiene un tamaño de 139 kilobytes.
Campo
La presente invención se refiere en algunos aspectos con polipéptidos inmunomoduladores que contienen un primer que comprende la subunidad p35 de IL-12 y un segundo péptido que la subunidad p40 de IL-12, conectados por una región de unión que contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En algunos aspectos, la invención se refiere además a células manipuladas y composiciones que comprenden los polipéptidos inmunomoduladores y su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o un trastorno. En algunas realizaciones, las células manipuladas para contener el polipéptido inmunomodulador, como las células T, contienen además un receptor recombinante manipulado genéticamente que se une específicamente a antígenos, como un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas realizaciones, las características de los polipéptidos, las células manipuladas y los métodos proporcionan un tratamiento mejorado de enfermedades o afecciones, por ejemplo, cáncer, como reduciendo efectos adversos de la terapia con citoquinas o quimiocinas o aumentando la actividad, eficacia y/o persistencia de la terapia celular.
Antecedentes
Hay disponibles varias estrategias para el tratamiento de enfermedades o afecciones como cánceres o tumores, incluyendo la administración de citoquinas o quimiocinas. Además, hay disponibles estrategias para manipular células inmunitarias para que expresen receptores recombinantes manipulados genéticamente, como receptores de antígenos quiméricos (CAR), y administrar composiciones que contienen tales células a sujetos. Se necesitan estrategias mejoradas para aumentar la eficacia de los tratamientos, por ejemplo, reduciendo los efectos adversos de la administración de citoquinas o quimioquinas, mejorando la persistencia y/o supervivencia de las células manipuladas o reduciendo la inmunogenicidad de tales terapias tras la administración a los sujetos. Se proporcionan composiciones, celdas y métodos que satisfacen tales necesidades.
La WO01/10912 describe múltiples complejos de citoquina-anticuerpo
Sumario
La presente invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la presente invención proporciona un polipéptido inmunomodulador que comprende: a) un primer péptido que comprende una subunidad p35 de IL-12; b) un segundo péptido que comprende una subunidad p40 de IL-12; y c) una región de unión que conecta el primer y el segundo péptidos, en donde la región de unión comprende una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. La invención proporciona además un polinucleótido que codifica el polipéptido inmunomodulador de la invención. La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención. La invención también proporciona una célula manipulada que comprende el polipéptido inmunomodulador de la invención, el polinucleótido de la invención o el vector de la invención. La invención también proporciona una composición que comprende el polipéptido inmunomodulador de la invención o la célula manipulada de la invención. La invención también proporciona una composición que comprende el polipéptido inmunomodulador de la invención, la célula manipulada de la invención o la composición de la invención, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno.
Se divulga pero no se reivindica un polipéptido inmunomodulador que contiene un primer péptido; un segundo péptido; y una región de unión que conecta el primer y el segundo péptidos, en donde la región de unión contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En alguno ejemplos, por lo menos uno del primer y el segundo péptidos es una citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina o es una porción funcional de la citoquina o quimioquina.
En algunos de tales ejemplos, el primer péptido es una citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina, o es una porción funcional de la citoquina o quimioquina. En algunos de tales ejemplos, el segundo péptido es una citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina, o es una porción funcional de la citoquina o quimioquina. En algunos de tales ejemplos, tanto el primer como el segundo péptido son independientemente una citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de la citoquina o quimioquina.
En algunos de tales ejemplos, el primer péptido y el segundo péptido son la misma citoquina o quimioquina, o porciones funcionales de la misma, o son la misma subunidad de la misma citoquina o quimioquina. En algunos de tales ejemplos, el primer y el segundo péptido son una citoquina o quimioquina diferente, o porciones funcionales de la misma, o son una subunidad diferente de la misma citoquina o quimioquina o una diferente. En algunos de tales ejemplos, el primer péptido es una primera subunidad de una citoquina o quimioquina y el segundo péptido es una segunda subunidad de la citoquina o quimioquina.
En algunos de tales ejemplos, la citoquina o quimioquina es un monómero. En algunas de tales realizaciones, el primer y/o el segundo péptido contiene o contienen independientemente una subunidad de una citoquina o quimioquina que es una proteína multimérica.
En algunos de tales ejemplos, el primer o el segundo péptido es una etiqueta o marcador.
Se divulga pero no se reivindica un polipéptido inmunomodulador que contiene un primer péptido que contiene una primera subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de la misma; un segundo péptido que contiene una segunda subunidad de la citoquina o quimioquina o una porción funcional de la misma; y una región de unión que conecta el primer y el segundo péptidos, en donde la región de unión contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En algunas de tales realizaciones, la citoquina o quimioquina es un homodímero o heterodímero.
En algunos de tales ejemplos, la región de unión contiene además por lo menos un conector polipeptídico que enlaza la fracción de direccionamiento al primer o al segundo péptido.
En algunos de tales ejemplos, la citoquina o quimioquina o subunidad o parte funcional de la misma se selecciona del grupo que consiste en iL-12, IL-15, IL-2, IL-18, GM-CSF, IL-7, IL-21, IFNa, IFNp, IFNy, IL-17, IL-23, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-27, eritropoyetina, G-CSF, hormona del crecimiento, prolactina, oncostatina M y factor inhibidor de la leucemia o una subunidad o porción funcional de los mismos. En algunas de tales realizaciones, el primer o el segundo péptido contiene independientemente una subunidad de una citoquina o quimioquina seleccionada de IL-12, IL-23, IL-27 e IL-35 o una porción funcional de las mismas.
En algunos de tales ejemplos, el primer o segundo péptido es independientemente una subunidad de IL-12 o una porción funcional de la misma. En algunas realizaciones, el primer péptido contiene una subunidad p35 de IL-12 o una subunidad p40 de IL-12 o una parte funcional de la misma y el segundo péptido contiene la otra subunidad p35 de IL-12 y la subunidad p40 de IL-12 o una porción funcional de la misma. La presente invención proporciona un polipéptido inmunomodulador que comprende: (a) un primer péptido que contiene una subunidad p35 de IL-12; (b) un segundo péptido que contiene una subunidad p40 de IL-12; y (c) una región de unión que conecta el primer y el segundo péptidos, en donde la región de unión contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En algunas de tales realizaciones, la subunidad p35 contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la misma y/o la subunidad p40 contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la misma. En algunos de tales casos, la subunidad p35 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 y/o la subunidad p40 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11.
En algunas de tales realizaciones, la región de unión contiene además por lo menos un conector polipeptídico que enlaza la fracción de direccionamiento con la subunidad p35 o la subunidad p40. En algunas de tales realizaciones, el conector polipeptídico contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas de tales realizaciones, el conector polipeptídico contiene la secuencia GGGGS(n), en donde n es 1-5 (SEQ ID NO:29). En algunas de tales realizaciones, el conector polipeptídico contiene la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-9.
En algunas de tales realizaciones, la región de unión contiene dos conectores polipeptídicos. En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento está contenida entre un primer conector polipeptídico y un segundo conector polipeptídico. En algunas de tales realizaciones, la molécula objetivo está asociada con una enfermedad o trastorno. En algunos aspectos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o un tumor o cáncer.
En algunas de tales realizaciones, la molécula objetivo está asociada con un tumor o presente en un tumor. En algunas de tales realizaciones, la molécula objetivo es un antígeno tumoral. En algunas de tales realizaciones, la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), heparina, VEGF, VEGF-A, VEGFR2, VEGFR3, HER2, PD-1, tenascina-C, CTLA-4, LAG3, PD-L1, EGFR, EPCAM, RANKL, proteoglicano NG2, CD20, CD52, CD19, CD3, CD30, IL-6, CD38, SLAMF7, GD2, CD13, CD274, CD279, CD40L y CD47.
En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento contiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 300 aminoácidos, de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 aminoácidos o aproximadamente 10 aminoácidos. En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento muestra una tasa de koff para unirse a la molécula objetivo que es de aproximadamente 0,5 x 10-4 seg-1 o menos, de aproximadamente 1 x 10-4 seg-1 o menos, de aproximadamente 2 x 10-4 seg-1 o menos, de aproximadamente 3 x 10-4 seg-1 o menos, de aproximadamente 4 x 10-4 seg-1 o menos, de aproximadamente 5 x 10-4 seg-1 o menos, de aproximadamente 1 x 10-3 seg-1 o menos, de aproximadamente 1,5 x 10-3 seg-1 o menos, de aproximadamente 2 x 10-3 seg-1 o menos, de aproximadamente 3 x 10-3 seg-1 o menos, de aproximadamente 4 x 10-3 seg-1 o menos, de aproximadamente 5 x 10-3 seg-1 o menos, de aproximadamente 1 x 10-2 seg o menos, o de aproximadamente 5 x 10­ 1 seg-1 o menos. En algunas de tales realizaciones, la constante de disociación (Kd) de la fracción de direccionamiento para la molécula objetivo es o es aproximadamente o menor de aproximadamente 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nM, como entre de o de aproximadamente 1 nM a o a aproximadamente 15 nM, por ejemplo, entre de o de aproximadamente 5 a o a aproximadamente 10 nM.
En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento es o contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de cadena sencilla. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de dominio único que contiene la región de cadena pesada variable. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo contiene regiones variables de anticuerpo unidas por un conector flexible. En algunas de tales realizaciones, el fragmento de anticuerpo contiene un scFv.
En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento contiene una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: trastuzumab, pertuzumab, ramucirumab, atezolizumab, bevacizumab, panitumumab, cetuximab, necitumumab, denosumab, nivolumab, pembrolizumab, rituximab, ofatumumab, obinutuzumab, alemtuzumab, blinatumomab, brentuximab vedotin, siltuximab, ipilimumab, daratumumab, elotuzumab, dinutuximab, catumaxomab. En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento contiene una cadena Vh y/o cadena Vl de un anticuerpo anti-EPCAM. En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 17, 24 o 25, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, 24 o 25 y se une a la molécula objetivo.
En algunas de tales realizaciones, el polipéptido inmunomodulador contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO 6, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con dicha secuencia.
En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento es o contiene un motivo de unión a péptido. En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento es un péptido de unión a heparina. En algunos aspectos, el péptido de unión a heparina (HBP) se deriva de fibronectina o BMP4 y/o es de origen bovino.
En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en un péptido de unión al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a VEGF-A, un péptido de unión a VEGFR2, un péptido de unión a EPCAM, un péptido de unión a HER2, un péptido de unión a PD-1, un péptido de unión a tenascina-C, un péptido de unión a CTLA-4, un péptido de unión a LAG3, un péptido de unión a PD-L1, un péptido de unión a EGFR, un péptido de unión a RANKL, un péptido de unión a CD20 péptido, un péptido de unión a CD52, un péptido de unión a CD19, un péptido de unión a CD3, un péptido de unión a CD30, un péptido de unión a IL-6, un péptido de unión a CD38, un péptido de unión a SLAMF7, un péptido de unión a GD2, un péptido de unión a CD274, un péptido de unión a CD279, un péptido de unión a CD40L y un péptido de unión a CD47. En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento contiene un péptido de unión a HGF y un péptido de unión a EGFR (EGFRBP).
En algunas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento contiene la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 26, 27 o 28, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con dicha secuencia y se une a la molécula objetivo.
En algunas de tales realizaciones, el polipéptido inmunomodulador contiene la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-5, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con dicha secuencia.
En algunas de tales realizaciones, el polipéptido inmunomodulador muestra una actividad aumentada para estimular a través de IL-12R en comparación con una IL-12 recombinante que no contiene la región de unión. En algunas de tales realizaciones, el polipéptido inmunomodulador muestra una unión aumentada a una célula objetivo que expresa la molécula objetivo en comparación con su unión a una célula que no expresa la molécula objetivo. En algunas realizaciones, la actividad y/o la unión aumentadas es o son más de 1,2 veces, más de 1,5 veces, más de 2,0 veces, más de 3,0 veces, más de 4,0 veces, más de 5,0 veces o superior a 10,0 veces. En algunas realizaciones, la actividad y/o la unión aumentada es mayor que la mostrada por un polipéptido inmunomodulador de referencia que contiene un conector polipeptídico entre subunidades pero que no contiene la fracción de direccionamiento.
La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido inmunomodulador de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunos aspectos, el polinucleótido contiene además una secuencia señal. En algunos casos, la secuencia señal codifica un péptido señal derivado de CD33. En algunos aspectos, el péptido señal contiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO 18, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con dicha secuencia.
En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido contiene además por lo menos un promotor que está enlazado operativamente para controlar la expresión del polipéptido inmunomodulador. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido inmunomodulador es inducible o condicional. En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido contiene además un promotor, potenciador o transactivador condicional. En algunos aspectos, el promotor, potenciador o transactivador condicional es un promotor, potenciador o transactivador inducible o un promotor, potenciador o transactivador reprimible.
En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador es un factor de activación de células T. Por ejemplo, el promotor, potenciador o transactivador contiene un sitio de unión para uno o más factores de transcripción de células T. En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador contiene un sitio de unión para el factor nuclear de células T activadas (NFAT), C/EBP, STAT1, STAT2 y/o NEkB.
En algunas realizaciones, la activación del promotor, potenciador o transactivador es un promotor, potenciador o transactivador condicional, opcionalmente uno inducible, o un promotor, potenciador o transactivador reprimible.
En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador es activo en presencia de una o más condiciones presentes en el microambiente tumoral. La una o más condiciones presentes en el microambiente tumoral pueden seleccionarse de hipoxia, glucosa baja, pH ácido y/o estrés oxidativo.
En algunas realizaciones, la una o más condiciones presentes en el microambiente tumoral es la hipoxia. En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor, y el promotor es un promotor sensible a HIF-1-alfa. En algunas realizaciones, el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor, y el promotor contiene uno o más elementos de respuesta a la hipoxia. Un elemento de respuesta a la hipoxia ejemplar contiene la secuencia 5'-(A/G)CGT(G/C)(G/C)-3\ En tales realizaciones, el promotor puede ser un promotor de eritropoyetina (Epo), VEGF-A, fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1), lactato deshidrogenasa A (LDH A), aldolasa A (ALDA) o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). El promotor puede tener la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 85-90.
En algunas realizaciones, la una o más condiciones presentes en el microambiente tumoral es glucosa baja. En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido se enlaza operativamente a un promotor que es un promotor de GRP78 o hexoquinasa II.
En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador es inducible por radiación, calor o en presencia de un fármaco.
En algunas realizaciones, el promotor es un promotor inducible por radiación. Los promotores inducibles por radiación ejemplares pueden contener un elemento CArG o un motivo CC(rico en A+T)6GG. En algunas realizaciones, el promotor inducible por radiación es un promotor de EGR-1, Waf-1, RecA o cIAP2 o es un promotor sintético, como un promotor con una secuencia expuesta en las SEQ ID NO 92-95.
En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador es un promotor, potenciador o transactivador inducible por calor. En algunas de tales realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador inducible por calor contiene un elemento de choque térmico (HSE). En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador inducible por calor es un promotor de choque térmico (HSP), como un promotor de HSP70B o un promotor de Gadd 153.
En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador es un promotor, potenciador o transactivador inducible por fármacos. En algunos casos, el promotor, potenciador o transactivador inducible contiene una secuencia operadora Lac, una secuencia operadora de tetraciclina, una secuencia operadora de galactosa, una secuencia operadora de doxiciclina, una secuencia operadora de rapamicina, una secuencia operadora de tamoxifeno o una secuencia operadora sensible a hormonas, o un análogo de las mismas. En algunas realizaciones, el promotor inducible contiene un elemento de respuesta a tetraciclina (TRE). En algunas realizaciones, el promotor, potenciador o transactivador inducible por fármacos contiene un promotor del gen de resistencia a múltiples fármacos (mdr1).
En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido contiene una única secuencia de ácidos nucleicos. En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido contiene una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido inmunomodulador y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un receptor recombinante. En algunos aspectos, el receptor recombinante es o contiene un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas realizaciones, el polinucleótido contiene además por lo menos un promotor que está enlazado operativamente para controlar la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante.
En algunas de tales realizaciones, el polinucleótido contiene además un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) entre la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos para producir productos de traducción de la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos después de la traducción. En algunas realizaciones, el polinucleótido contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de enlace entre la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos, en donde el péptido de enlace separa los productos de traducción de la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos durante o después de la traducción. En algunos aspectos, el péptido de enlace contiene un péptido autoescindible, o un péptido que provoca el salto de ribosomas, opcionalmente un péptido T2A.
Cualquiera de los polinucleótidos incorporados puede optimizarse para eliminar motivos CpG y/o optimizarse con codones. En algunas realizaciones, el polinucleótido tiene codones humanos optimizados.
La presente invención también proporciona un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunos aspectos, el vector es un vector retroviral. En algunos casos, el vector es un vector lentiviral o un vector gammaretroviral.
La presente invención también proporciona una célula manipulada que contiene el polipéptido inmunomodulador de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas de tales realizaciones, se proporciona una célula manipulada que contiene el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la célula manipulada contiene el vector de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.
En algunas de tales realizaciones, la célula manipulada secreta el polipéptido inmunomodulador. En algunas realizaciones, la célula manipulada contiene además un receptor recombinante. En algunos casos, el receptor recombinante se une a un antígeno objetivo que está asociado con una enfermedad o trastorno. En algunos aspectos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o un tumor o cáncer. En algunas realizaciones, el antígeno objetivo es un antígeno tumoral.
En algunas de tales realizaciones, el antígeno objetivo se selecciona del grupo que consiste en ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, receptor fetal de acetilcolina e, g D2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R- alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, nY-eSo -1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, TAG72, VEGF -R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata, PSMA, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1) y ciclina A1 (CCNA1). En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento es humana o se deriva de una proteína humana.
En algunas de tales realizaciones, la proteína inmunomoduladora no es inmunogénica y/o no induce una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se administra.
En algunas de tales realizaciones, el receptor recombinante es un receptor de antígeno no TCR funcional o un TCR transgénico. En algunas realizaciones, el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas de tales realizaciones, el receptor recombinante contiene una porción extracelular que contiene un dominio de unión a antígeno. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno es o contiene un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de cadena sencilla. En algunas realizaciones, el fragmento contiene regiones variables de anticuerpo unidas por un conector flexible. En algunas de tales realizaciones, el fragmento contiene un scFv.
En algunas de tales realizaciones, el receptor recombinante contiene una región de señalización intracelular. En algunos aspectos, la región de señalización intracelular es capaz de inducir una señal de activación primaria en una célula T, es un componente del receptor de células T (TCR) y/o contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM). En algunos casos, la región de señalización intracelular es o contiene un dominio de señalización intracelular de una cadena CD3-zeta (CD3Z) o una porción de señalización de la misma.
En algunas de tales realizaciones, la célula manipulada contiene además un dominio transmembrana que enlaca la porción extracelular y la región de señalización intracelular. En algunas realizaciones, la región intracelular contiene un dominio de señalización intracelular. En algunas de tales realizaciones, el receptor recombinante contiene además un dominio de señalización coestimulador. En algunos casos, el dominio de señalización coestimulador contiene un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora de células T o una porción de señalización de la misma. En algunos aspectos, el dominio de señalización coestimulador contiene un dominio de señalización intracelular de CD28, 4-1BB o ICOS o una porción de señalización del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimulador está entre el dominio transmembrana y la región de señalización intracelular.
En algunas de tales realizaciones, la célula manipulada es una célula T. En algunas de tales realizaciones, la célula manipulada es una célula T CD8+ o una célula T CD4+.
En algunas de tales realizaciones, la célula manipulada muestra una persistencia y/o supervivencia aumentadas en comparación con las células no manipuladas o en comparación con las células que contienen un receptor recombinante pero no el polipéptido inmunomodulador. En algunas de tales realizaciones, la célula manipulada muestra una actividad aumentada para estimular a través de IL-12R en comparación con una IL-12 recombinante que no contiene la región de unión. En algunas realizaciones, la IL-12 de referencia no contiene una región de unión o contiene una región de unión que consiste en cualquiera de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO 7-9.
En algunas de tales realizaciones, la célula manipulada secreta un polipéptido inmunomodulador que muestra una unión aumentada a una célula objetivo que expresa la molécula objetivo en comparación con su unión a una célula que no expresa la molécula objetivo. En algunas de tales realizaciones, los efectos de células manipuladas aumentaron la muerte de una célula objetivo que expresa la molécula objetivo en comparación con la muerte de células que no expresan la molécula objetivo. En algunas de tales realizaciones, la persistencia, la actividad, la unión y/o la muerte aumentadas es mayor que las efectuadas por una célula manipulada de referencia que expresa o secreta un polipéptido inmunomodulador que contiene un conector polipeptídico entre las subunidades pero que no contiene la fracción de direccionamiento.
La presente invención también proporciona una composición que contiene el polipéptido inmunomodulador de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En la presente se proporciona una composición que contiene la célula manipulada de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la composición contiene además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se describe, pero no se reivindica, como parte de la divulgación un método de tratamiento que incluye administrar el polipéptido inmunomodulador de acuerdo con cualquiera de los casos descritos anteriormente, la célula manipulada de acuerdo con cualquiera de los casos descritos anteriormente, o la composición de acuerdo con cualquiera de los casos descritos anteriormente, a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se une específicamente a una molécula objetivo expresada por una célula asociada con la enfermedad o trastorno. En algunos aspectos, la célula manipulada expresa un receptor recombinante que se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o condición. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es un cáncer, un tumor, una enfermedad o trastorno autoinmune o una enfermedad infecciosa.
La presente invención también proporciona una composición que comprende el polipéptido inmunomodulador de cualquiera de los casos descritos anteriormente, la célula manipulada de cualquiera de los casos descritos anteriormente, o la composición de cualquiera de los casos descritos anteriormente, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es un cáncer, un tumor, una enfermedad o trastorno autoinmune o una enfermedad infecciosa.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 representa la secreción de interferón gamma (IFN-y) en blastos de PHA después de la estimulación con IL-12 humana recombinante (rHuIL-12), un scIL-12 o polipéptidos inmunomoduladores que contienen o una fracción de direccionamiento de HBP (IL-12 HBP) o una fracción de direccionamiento de EGFR (IL-12EGFR). La FIG. 2 representa el cambio en el número total de células después de la estimulación de las células con la proteína inmunomoduladora de IL-12 probada en varias proporciones de células objetivo efectoras.
La FIG. 3 representa el índice de muerte de las células después de la estimulación de las células con la proteína inmunomoduladora de IL-12 probada en varias proporciones de células objetivo efectoras.
La FIG. 4 representa las afinidades de unión de las proteínas inmunomoduladoras de IL-12 evaluadas mediante resonancia de plasmones de superficie.
Descripción detallada
Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos y aspectos siguientes.
En la se describen polipéptidos inmunomoduladores, incluyendo aquellos que contienen un primer y un segundo péptido conectados por una región de unión que contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En algunos casos, el primer y el segundo péptido son independientemente una primera y una segunda citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de una citoquina o quimioquina. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora contiene una primera subunidad y una segunda subunidad de una citoquina o quimiocina conectadas por una región de unión que contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En algunos casos, la citoquina es IL-12 y el polipéptido inmunomodulador contiene una subunidad p35 y p40 de IL-12 enlazada por una región de unión que contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En algunos casos, la molécula objetivo es una molécula sobreexpresada en o específica de un entorno enfermo, como un microambiente tumoral, como en una célula presente en un microambiente tumoral o enfermo. También se describen composiciones y células manipuladas que contienen polipéptidos inmunomoduladores y métodos para administrar tales composiciones y células.
La administración de varios péptidos, como citoquinas y quimioquinas, puede ser eficaz en el tratamiento de enfermedades y afecciones, como el cáncer. Sin embargo, ciertos de tales tratamientos, como los que implican la administración sistémica de citoquinas naturales o no modificadas, pueden estar asociados con efectos no deseados, como los que surgen de la actividad de las moléculas en sitios distintos de las células o tejidos de la enfermedad o afección, por ejemplo, células tumorales. Como tales, los métodos actuales pueden no ser completamente satisfactorios y se desea una eficacia y seguridad mejoradas.
En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores descritos en la presente se unen específicamente a una molécula objetivo expresada por una célula asociada con la enfermedad o afección. Por tanto, en algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se dirige a tejidos y células que expresan moléculas objetivo conocidas, por ejemplo, células tumorales. En algunos casos, el direccionamiento del polipéptido inmunomodulador a las células que contienen la molécula objetivo se asocia con resultados menos no deseados, o más deseados, en comparación con el tratamiento con los péptidos, como citoquinas o quimiocinas, por ejemplo, citoquinas o quimiocinas humanas recombinantes, que no contienen un conector o fracción de direccionamiento.
En algunos aspectos, los casos muestran una seguridad comparable y una eficacia mejorada, en comparación con un régimen o composición de tratamiento de referencia, como en comparación con la administración basada en células o basada en la administración local de la citoquina o una versión relacionada o no modificada de la misma, generalmente diseñada para la localización tumoral de la citoquina. En algunos aspectos, los casos incluyen la administración sistémica, con un perfil de seguridad aumentado en comparación con la administración sistémica de la versión nativa o no modificada de la molécula de citoquina.
En algunos aspectos, la citoquina es la interleucina 12 (IL-12). La IL-12 típicamente es un mediador de la inmunidad innata y celular. En algunos contextos, la IL-12 tiene actividad antitumoral y antimetastásica. Generalmente, la IL-12 actúa sobre las células T y las células NK. Las funciones de la IL-12 incluyen el cebado de las respuestas inmunitarias de las auxiliares T 1 (Th 1) y la secreción de IFN-y por de las células NK. Típicamente, la IL-12 genera la respuesta de Th1 promoviendo la diferenciación de las células T vírgenes, durante el encuentro inicial con un antígeno, en una población de células Th1 capaces de producir grandes cantidades de IFN-y después de la activación. En algunos contextos, la IL-12 sirve como coestímulo para la secreción máxima de IFN-y por células Th1 diferenciadas que responden a un antígeno específico. IL-12, en algunos contextos, estimula el desarrollo de células Th1 productoras de IFN-y a partir de poblaciones de células T de memoria en reposo que interactúan con un antígeno al que han estado expuestas con anterioridad. Por tanto, en algunos aspectos, la IL-12 puede promover o mediar en las funciones efectoras inmunitarias para potenciar las respuestas inmunitarias antitumorales, incluso en relación con la administración de células en la terapia celular adoptiva.
En algunos casos, como se produce con muchas otras citoquinas, se ha observado que ciertos estudios que implican la administración sistémica de IL-12 nativa humana recombinante están asociados con la toxicidad, como la toxicidad sistémica. En algunos casos, los ensayos clínicos en pacientes con cáncer han revelado actividades terapéuticas prometedoras, pero típicamente también han demostrado que la IL-12 humana recombinante nativa administrada sistémicamente puede tener efectos secundarios (Lasek et al. (2014) Cancer Immunol. Immunother., 63: 419-435). En algunos aspectos, ciertos tipos de administración de dicha IL-12 recombinante pueden dar como resultado una toxicidad de grado 3 o grado 4 según se evalúa de acuerdo con la National Cancer Institute Groups Toxicity Criteria Scale (Creekmore et al. (eds): Biologic Therapy of Cancer. Philadelphia, PA, Lippincott, 1991, p. 76). En algunos casos, los síntomas clínicos de toxicidad pueden incluir, por ejemplo, uno o más de fatiga, disnea, estomatitis, acidosis o hemorragia gastrointestinal. En algunos casos, los eventos adversos de laboratorio pueden incluir uno o más de leucopenia, neutropenia, hiperbilirrubinemia, AST elevada, ALT elevada, trombocitopenia, creatinina elevada o fosfatasa alcalina elevada. Se conocen ensayos para evaluar y determinar la presencia o ausencia de efectos potencialmente adversos (ver, por ejemplo, Leonard et al. (1997) Blood, 90:2541-2548). Sin embargo, se ha observado que varias otras vías de administración y constructos modificados, como la administración local, por ejemplo, en el sitio del tumor de IL-12 y/o la introducción de células como las células T que secretan naturalmente o están manipuladas para secretar IL-12, por ejemplo, de manera dirigida al tumor, son seguros y se asocian con menos o ningún resultado tóxico o riesgo de los mismos. En algunos ejemplos, se ha informado de células T manipuladas, como las que expresan receptores de antígenos quiméricos, que también expresan IL-12 recombinante o exógena, por ejemplo, un formato heterodimérico de cadena sencilla, que se secreta, con resultados alentadores (Pegram et al. (2012) Blood, 119:4133-4141).
En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores descritos, como los polipéptidos inmunomoduladores de IL-12, cuando se administran, pueden dar como resultado una toxicidad reducida, como una toxicidad sistémica reducida, en comparación con otros tratamientos, como otros tipos de terapia que implican la administración, como la administración sistémica, de IL-12 humana recombinante. En algunos casos, las células descritas que expresan tales polipéptidos inmunomoduladores, cuando se administran a un paciente, pueden dar como resultado una toxicidad reducida, como una toxicidad sistémica reducida, en comparación con otros tratamientos, como otros tipos de terapia que implican la administración de células que expresan IL-12 humana recombinante. En algunos casos, la toxicidad resultante de las células descritas se reduce, o se reduce adicionalmente, modificando el polinucleótido que proporciona la IL-12 recombinante o exógena, de tal manera que la expresión sea inducible o dependiente de la condición, como mediante la incorporación de uno o más promotores y/o elementos reguladores inducibles o dependientes de la condición como se describe a continuación en la presente. Por ejemplo, el polinucleótido puede modificarse para que emplee uno o más promotores inducibles de tal manera que la expresión de IL-12 se efectúe tras la administración de un agente exógeno, como radiación, calor o un fármaco o molécula pequeña, y de lo contrario no se expresa. En otros ejemplos, la expresión de IL-12 recombinante o exógena puede restringirse de tal manera que la expresión sólo se produzca en microentornos particulares, como microentornos tumorales (por ejemplo, condiciones hipóxicas). La regulación de la expresión de IL-12 de tal manera que la IL-12 recombinante se exprese solamente en las regiones objetivo del cuerpo y/o solamente en condiciones particulares puede mitigar la toxicidad de administrar células que expresan IL-12.
En algunos casos, los sujetos, cuando se les administra un polipéptido inmunomodulador descrito que contiene una fracción de direccionamiento o células que expresan o secretan dicho polipéptido inmunomodulador, como un polipéptido inmunomodulador de IL-12 descrito que contiene una fracción de direccionamiento, no muestran, o no muestran de media de los sujetos administrados, una toxicidad grave o una toxicidad asociada a IL-12 de grado 3 o mayor. En algunos aspectos, en comparación con otros métodos, los sujetos muestran la misma o una toxicidad reducida o ausencia de la misma y una eficacia aumentada, como un aumento en los efectos inmunomoduladores de la IL-12 como se describe en la presente.
En algunos casos, la estructura del polipéptido inmunomodulador es tal que cuando la fracción de direccionamiento se une a la molécula objetivo, por ejemplo, en la superficie de una célula objetivo, el primer y el segundo péptidos (por ejemplo, las subunidades de la citoquina o la quimiocina) se orientan lejos de la célula objetivo. En algunos de tales casos, las subunidades de la citoquina o la quimiocina están orientadas hacia una célula no objetivo adyacente, como una célula inmunitaria. En algunos casos, tal orientación puede desalentar que la citoquina o quimiocina se una a su receptor en las células objetivo. En algunos aspectos, tal orientación puede promover la unión de la citoquina o quimioquina a su receptor en las células inmunitarias, por ejemplo, las células T. En algunos casos, dicha orientación puede efectuar una estimulación mejorada de las células T en comparación con otros polipéptidos inmunomoduladores no diseñados para ser orientados alejándose de la célula objetivo o diseñados para orientarse hacia la célula objetivo. En algunos casos, la estructura, por ejemplo, el orden y el tamaño de los componentes, de la región de unión está diseñada para promover la unión de la fracción de direccionamiento a una célula objetivo a la vez que promueve la unión del primer y el segundo péptidos, por ejemplo, primera y segunda citoquinas o subunidades de citoquinas, hacia una célula no objetivo adyacente, por ejemplo, de tal manera que las subunidades estén orientadas alejándose de la célula objetivo.
En algunos aspectos, la fracción de direccionamiento está conectado a uno o ambos péptidos, como una o ambas subunidades. En algunos casos, la fracción de direccionamiento se configura entre el primer y el segundo péptido, como la primera y la segunda subunidad de una citoquina o quimiocina (por ejemplo, IL-12). En algunos casos, la fracción de direccionamiento está conectada directa o indirectamente, como a través de uno o más conectores. En algunos casos, la región de unión contiene además por lo menos un conector polipeptídico que enlaza la fracción de direccionamiento con el primer o el segundo péptido, como la primera o segunda subunidad de una citoquina o quimioquina. En algunos casos, la región de unión contiene dos o más conectores polipeptídicos. Por ejemplo, en algunos aspectos, el primer péptido (por ejemplo, la primera subunidad) se une a un primer conector polipeptídico, el primer conector polipeptídico se une a un primer extremo de la fracción de direccionamiento, y un segundo conector polipeptídico se une al segundo extremo de la fracción de direccionamiento y al segundo péptido (por ejemplo, la segunda subunidad). Por tanto, en algunos contextos, la fracción de direccionamiento está flanqueada entre dos o más conectores polipeptídicos que la unen a uno o ambos péptidos (por ejemplo, subunidades de una citoquina o quimioquina). En algunos casos, tal orden de los componentes de la región de unión promueve la orientación de los péptidos (por ejemplo, subunidades de citoquina o quimiocina) lejos de la célula objetivo.
En algunos aspectos, el tamaño, por ejemplo, la longitud, de la región de unión es tal que el primer y el segundo péptidos (por ejemplo, las subunidades de citoquina o quimiocina) estarán orientados en la orientación deseada. En algunos casos, la región de unión no tiene más de 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos. En algunos aspectos, la longitud de la región de unión está entre o entre aproximadamente 200 y 400 aminoácidos, entre o entre aproximadamente 100 y 200 aminoácidos, o entre o entre aproximadamente 5 y 50 aminoácidos, como entre o entre aproximadamente 10 y 50 aminoácidos, 10 y 40 aminoácidos, 10 y 30 aminoácidos, 10 y 20 aminoácidos, 20 y 50 aminoácidos, 20 y 40 aminoácidos, 20 y 30 aminoácidos, 30 y 50 aminoácidos o 30 y 40 aminoácidos ácidos.
En algunos casos, la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunomodulador se enlaza operativamente a un promotor, como un promotor o potenciador inducible, condicional o inducido por activación. En algunos casos, el promotor o potenciador controla la expresión del polipéptido inmunomodulador. Por tanto, en algunos contextos, el polipéptido inmunomodulador se expresa esencialmente solo cuando el promotor o potenciador está activo. Por ejemplo, en algunos casos, un promotor condicional puede activarse mediante la coadministración de una molécula o compuesto o puede regularse por disminución tras la coadministración con una molécula o compuesto.
En algunos aspectos, la expresión del polipéptido inmunomodulador se efectúa en presencia de activación de células inmunitarias, por ejemplo, células T, como por un factor de activación de células T. Por ejemplo, en algunos casos, el promotor, potenciador u otro elemento de respuesta o parte del mismo es reconocido por un factor de transcripción para impulsar la expresión de un gen cuya actividad normalmente se inicia mediante la activación de células T. En algunos casos, el factor de activación de células T puede ser un dominio o región reguladora (por ejemplo, promotor, potenciador u otro elemento de respuesta) de un factor de transcripción cuya actividad se inicia mediante la activación de células T. En algunos casos, el factor de activación de células T responde a uno o más de la activación de células T, la intensidad de la señal de la señalización de TCR y/o la calidad de la señalización de TCR.
En algunos casos, el factor de activación de células T puede ser un elemento regulador, como un elemento o elementos promotores, potenciadores o de respuesta, que contiene un sitio de unión para un factor de transcripción de células T y que, por lo tanto, está asociado con la actividad en sentido descendente de un factor de transcripción de células T. En algunos casos, el factor de transcripción es el factor nuclear de células T activadas (NFAT), C/EBP, STAT1, STAT2 o NFkB. Por ejemplo, en algunos casos, el factor de activación de células T contiene un elemento o elementos de respuesta reconocidos por un factor nuclear de células T activadas (NFAT), C/EBP, STAT1, STAT2 y NFkB. En algunos casos, el factor de activación de células T puede contener un elemento o elementos reguladores reconocidos o sensibles a uno o dos, y en algunos casos tres o más, factores de transcripción únicos.
En algunos aspectos, cuando la expresión del polipéptido inmunomodulador está controlada por dicho promotor o potenciador condicional, inducible o inducido por activación, se mejora la eficacia del polipéptido inmunomodulador en comparación con una citoquina o quimiocina humana recombinante o con un polipéptido inmunomodulador no enlazado operativamente con dicho promotor o potenciador. En algunos aspectos, se reduce el riesgo de potenciales efectos secundarios o resultados indicativos de toxicidad del polipéptido inmunomodulador enlazado operativamente a dicho promotor o potenciador en comparación con una citoquina o quimiocina humana recombinante o con un polipéptido inmunomodulador no enlazado operativamente con dicho promotor o potenciador. En algunos aspectos, la eficacia se aumenta comparativamente. Por ejemplo, en algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores descritos cuya expresión se controla inducible o condicionalmente pueden tener una expresión disminuida o nula en tejidos no objetivo, pero pueden activarse en la proximidad de los tejidos objetivo. En algunos casos, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunomoduladores descritos enlazados operativamente a un promotor inducido por activación pueden tener una expresión disminuida o nula en tejidos no objetivo, pero pueden activarse en las cercanías de tejidos objetivo donde se ha provocado una respuesta inmunitaria. Tales enfoques pueden dar como resultado un potencial reducido de resultados no deseados o una eficacia aumentada en comparación con otras composiciones y métodos.
En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador muestra actividad para estimular un receptor reconocido por el primer o el segundo péptido, por ejemplo, un receptor de citoquinas o quimioquinas. En algunos casos, la actividad del polipéptido inmunomodulador para estimular el receptor aumenta en comparación con una proteína inmunomoduladora que no contiene la fracción de direccionamiento, como una citoquina o quimiocina recombinante que no comprende la región de unión. En algunos aspectos, el polipéptido inmunomodulador muestra una unión aumentada a una célula objetivo que expresa la molécula objetivo en comparación con su unión a una célula que no expresa la molécula objetivo. En algunos aspectos, la actividad y/o la unión aumentadas es mayor que las efectuadas por un polipéptido inmunomodulador de referencia que contiene un conector polipeptídico entre las subunidades pero que no contiene la fracción de direccionamiento. En cualquiera de tales aspectos, el aumentos es de más de 1,2 veces, de más de 1,5 veces, de más de 2,0 veces, de más de 3,0 veces, de más de 4 veces, de más de 5 veces o de más de 10,0 veces.
En algunos casos, la proteína inmunomoduladora no es inmunogénica. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador no induce una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se le administra. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador es menos inmunogénico que las moléculas polipeptídicas, por ejemplo, citoquinas o quimiocinas, enlazadas a una fracción de direccionamiento más grande y/o conectadas a través de regiones de unión más grandes. En algunos casos, un sujeto al que se le administra la proteína inmunomoduladora o una célula que expresa la proteína inmunomoduladora no muestra o muestra una respuesta inmunitaria reducida o un tipo o grado particular de respuesta inmunitaria contra la proteína inmunomoduladora en comparación con la administración de tales otras moléculas alternativas o administración de células que expresan tales otras moléculas alternativas, respectivamente. El tipo de respuesta inmunitaria que se reduce puede ser un respuesta inmunitaria detectable, una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria mediada por células.
En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se proporciona en o en combinación con células que codifican un receptor recombinante, como un receptor de antígeno quimérico (CAR), que combina un dominio de unión a ligando (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que proporciona especificidad para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con una porción de dominio intracelular de activación, como un dominio de activación de células T, que proporciona una señal de activación primaria. En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores y los receptores recombinantes descritos, cuando se manipulan genéticamente en células inmunitarias, pueden modular la estimulación y/o activación de células T, dando como resultado de este modo células manipuladas genéticamente con longevidad, supervivencia y/o persistencia mejoradas in vivo, como para su uso en métodos de terapia celular adoptiva.
Por tanto, también se describen células, como células que contienen el polipéptido inmunomodulador y/o un receptor recombinante manipulado, como se describe en la presente. En algunos casos, las células son capaces de secretar o están diseñadas para secretar el péptido inmunomodulador, como la citoquina, como el polipéptido IL-12 modificado. Los métodos para manipular células para que secreten polipéptidos se describen, por ejemplo, en Pegram et al. (2012) Blood, 119:4133-4141; Publicación de Estados Unidos N° US20160045551 y la Publicación de Estados Unidos N2 US20100178276.
En algunos casos, la célula manipulada secreta el polipéptido inmunomodulador que muestra una unión aumentada a una célula objetivo que expresa la molécula objetivo en comparación con su unión a una célula que no expresa la molécula objetivo y/o muestra una unión aumentada a la célula objetivo y/o una eficacia aumentada en comparación con una célula que expresa una citoquina, por ejemplo, IL-12, que es por lo demás igual o sustancialmente igual o similar al polipéptido inmunomodulador, pero que no contiene modificaciones, no es una molécula de cadena sencilla, no incluye un conector, no es una molécula de cadena sencilla heterodimérica y/o no tiene la fracción de direccionamiento. En algunos aspectos, los efectos de la célula manipulada aumentaron la destrucción de una célula objetivo que expresaba la molécula objetivo en comparación con la destrucción de células que no expresaban la molécula objetivo.
En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores y los receptores recombinantes pueden expresarse en células para producir células T manipuladas genéticamente que, cuando se administran a un sujeto, muestran una o más propiedades que mejoran en comparación con una composición celular de referencia que no expresa ni secreta la proteína inmunomoduladora. En algunos casos, la persistencia, la actividad, la unión y/o la destrucción aumentada es mayor que la efectuada por una composición de referencia que comprende una célula manipulada que no expresa un polipéptido inmunomodulador o que expresa o secreta un polipéptido inmunomodulador que comprende un conector polipeptídico entre subunidades pero que no comprende la fracción objetivo. Por tanto, en algunos casos, una o más propiedades de las células manipuladas genéticamente administradas que pueden mejorarse o aumentarse o son mayores en comparación con las células administradas de una composición de referencia incluyen inmunogenicidad disminuida, activación aumentada y supervivencia y/o persistencia aumentadas.
En algunos casos, las células manipuladas que contienen el polipéptido inmunomodulador y un receptor recombinante muestran una persistencia y/o supervivencia aumentada en comparación con las células no manipuladas o en comparación con las células que comprenden un receptor recombinante pero no el polipéptido inmunomodulador. En algunos casos, una célula manipulada genéticamente con persistencia aumentada muestra mejor potencia en un sujeto al que se administra. En algunos aspectos, la persistencia de las células administradas aumenta por lo menos o por lo menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más.
En algunos casos, el grado o extensión de la persistencia de las células administradas puede detectarse o cuantificarse después de la administración a un sujeto. Por ejemplo, en algunos aspectos, se usa PCR cuantitativa (qPCR) para evaluar la cantidad de células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, células que expresan CAR) en la sangre o suero u órgano o tejido (por ejemplo, el sitio de la enfermedad) del sujeto.. En algunos aspectos, la persistencia se cuantifica como copias de ADN o plásmido que codifica el receptor, por ejemplo, CAR, por microgramo de ADN, o como el número de células que expresan el receptor, por ejemplo, que expresan CAR, por microlitro de la muestra, por ejemplo, de sangre o suero, o por número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o glóbulos blancos o células T por microlitro de la muestra. En algunos casos, también pueden realizarse ensayos de citometría de flujo que detectan células que expresan el receptor usando generalmente anticuerpos específicos para los receptores. También pueden usarse ensayos basados en células para detectar el número o porcentaje de células funcionales, como células capaces de unirse y/o neutralizar y/o inducir respuestas, por ejemplo, respuestas citotóxicas, contra células de la enfermedad o afección o que expresan la antígeno reconocido por el receptor. En cualquiera de tales realizaciones, puede usarse la extensión o el nivel de expresión de otro marcador asociado con el receptor recombinante (por ejemplo, células que expresan CAR) para distinguir las células administradas de las células endógenas en un sujeto.
También se describen métodos y usos de los polipéptidos inmunomoduladores y células manipuladas que contienen o secretan los polipéptidos inmunomoduladores, como para su uso en terapia adoptiva en el tratamiento de cánceres. Además se describen métodos para manipular, preparar y producir células y polipéptidos inmunomoduladores, composiciones que contienen las células y polipéptidos inmunomoduladores, y kits y dispositivos que contienen y para usar, producir y administrar las composiciones o células. También se describen métodos, compuestos y composiciones para producir las células manipuladas. Se describen ácidos nucleicos, como constructos, por ejemplo, vectores virales que codifican los polipéptidos inmunomoduladores y/o los receptores recombinantes manipulados genéticamente, y métodos para introducir tales ácidos nucleicos en las células, como mediante transducción. También se describen composiciones que contienen polipéptidos inmunomoduladores y células manipuladas, y métodos, kits y dispositivos para administrar las células y composiciones a sujetos, como para terapia celular adoptiva. En algunos aspectos, las células se aíslan de un sujeto, se manipulan y se administran al mismo sujeto. En otros aspectos, se aíslan de un sujeto, se manipulan y se administran a otro sujeto.
I. Polipéptidos inmunomoduladores
En algunas casos se describen polipéptidos inmunomoduladores, como los que contienen un primer péptido, un segundo péptido y una región de unión que conecta el primer y el segundo péptidos. En algunos casos, el primer y el segundo péptido pueden ser o derivarse de una citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de una citoquina o quimioquina del mismo. En algunos casos, el primer péptido es una primera subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de la misma y el segundo péptido es una segunda subunidad de la citoquina o quimioquina o una porción funcional de la misma, que están unidos por una región de unión que conecta la primera y la segunda subunidades. En algunos casos, el término "porción funcional" puede significar una porción suficiente de una citoquina o quimioquina o una subunidad de una citoquina o quimioquina que es capaz de unirse a su receptor afín para transducir su señal y efectuar la actividad de inmunomodulación. Una porción funcional contiene típicamente por lo menos o por lo menos aproximadamente un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de la secuencia de longitud completa, como la secuencia madura de longitud completa que carece del péptido señal. En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores descritos o las células que contienen dicho péptido muestran una actividad aumentada o disminuida para estimular o suprimir la actividad o respuesta de un receptor afín, en comparación con un polipéptido de referencia, en donde el polipéptido de referencia es el polipéptido, como una proteína recombinante, que no contiene la región de unión o el polipéptido de referencia es una proteína recombinante que contiene la región de unión, pero que no contiene una fracción de direccionamiento. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador muestra una afinidad aumentada por uno o más receptores afines y muestra una actividad aumentada para estimular a través de uno o más receptores afines, en comparación con el polipéptido de referencia. En otros casos, el polipéptido inmunomodulador muestra una afinidad reducida por uno o más receptores afines y muestra una estimulación disminuida a través de uno o más receptores afines, en comparación con el polipéptido de referencia. En algunos casos, el receptor inmunomodulador modula la actividad mostrando una afinidad de unión aumentada o disminuida por el receptor afín, en comparación con el polipéptido de referencia.
En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador muestra una afinidad de unión por la molécula objetivo con una Kd (es decir, una constante de disociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de M; igual a la relación de la tasa de disociación [koff o kd] a la tasa de asociación [kon o ka] para esta reacción de asociación, suponiendo una interacción bimolecular) igual o inferior a 10-5 M. Por ejemplo, la constante de disociación de equilibrio KD varía de o de aproximadamente 10-5 M a o a aproximadamente 10-15 M, como de o de aproximadamente 10-6 M a o a aproximadamente 10-12 M, de o de aproximadamente 10-7 M a o a aproximadamente 10-11 M, de o de aproximadamente 10-6 M a o a aproximadamente 10-8 M, o de o e aproximadamente 10-7 M a o a aproximadamente 10-8 M. En algunos casos, la Kd de la fracción de direccionamiento para la molécula objetivo es de o aproximadamente o menor de o aproximadamente 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 o 0,1 nM, como entre o aproximadamente 0,1 nM y o aproximadamente 15 nM, por ejemplo, entre o aproximadamente 1 y o aproximadamente 10 nM. En algunos casos, la KD de la fracción de direccionamiento para la molécula objetivo es de o de aproximadamente o menor de o aproximadamente 1 nM, 100 picomolar (μM), 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM, 50 μM, 40 μM, 30 μM, 25 μM, 20 μM, 15 μM, 10 μM o 1 μM, como entre o aproximadamente 10 μM y o aproximadamente 100 μM, por ejemplo, entre o aproximadamente 25 μM y o aproximadamente 75 μM.
En algunos aspectos, la actividad y/o la unión aumentadas son mayores o menores que la actividad y/o la unión efectuadas por un polipéptido inmunomodulador de referencia que contiene un conector polipeptídico entre subunidades pero que no contienen una fracción de direccionamiento. En algunos de tales aspectos, el aumento es de más de 1,2 veces, de más de 1,5 veces, de más de 2,0 veces, de más de 3,0 veces, de más de 4,0 veces, de más de 5,0 veces o de más de 10,0 veces.
En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador se une específica o preferentemente a una molécula objetivo expresada por una célula asociada con la enfermedad o trastorno. En algunos casos, la región de unión contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo. En algunos casos, la región de unión contiene además por lo menos un conector polipeptídico que enlaza la fracción de direccionamiento a la primera o la segunda subunidad.
A. Citoquinas/Quimioquinas
En algunos casos, la citoquina o quimiocina o una subunidad o porción funcional de la misma es una citoquina o quimiocina que se une a un receptor en una célula inmunitaria, como una célula T, una célula NK, un macrófago, una célula dendrítica u otra célula inmunitaria. En algunos casos, la célula inmunitaria es una célula T, como una célula T CD4+ o CD8+.
En algunos casos, la primera o segunda citoquina o quimioquina o una primera o segunda subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de la misma se selecciona independientemente de IL-12, IL-15, IL-2, IL-18, GM-CSF, IL-7, IL-21, IFNa, IPNp, IFNy, IL-17, IL-23, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-27, eritropoyetina, G-CSF, hormona del crecimiento, prolactina, oncostatina M, factor inhibidor de la leucemia, IL-22 e IL-10, o una subunidad o porción funcional de los mismos. En algunos casos, es un mamífero, como un humano. En la Tabla 1 se exponen ejemplos no limitativos de citoquinas y quimioquinas ejemplares de una proteína inmunomoduladora descrita. En algunos casos, el primer y el segundo péptido, como una primera y segunda citoquina o quimiocina, subunidad de una citoquina o quimiocina o porción funcional de la misma, no contiene un péptido señal o propéptido.
En algunos casos, el primer o segundo péptido, como una primera o segunda citoquina o quimioquina, subunidad de una citoquina o quimioquina o porción funcional de la misma contiene independientemente una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 11 y 30-69 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las s Eq ID NO: 10, 11 y 30-69.
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En algunos casos, por lo menos uno del primer o el segundo péptido es una citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de la misma. En algunos casos, el otro del primer o segundo péptido es una etiqueta u otra fracción peptídica.
En algunos casos, tanto el primer como el segundo péptidos son una citoquina o quimioquina, una subunidad de una citoquina o quimioquina o una porción funcional de la misma. En algunos casos, la citoquina o quimioquina es un monómero. En algunos casos, la citoquina o quimioquina es homodímero o heterodímero y la primera o segunda citoquina es una subunidad del homodímero o heterodímero. En algunos casos, el primer y el segundo péptidos son la misma citoquina o quimiocina o porción funcional de la misma o son la misma subunidad de la misma citoquina o quimiocina. En algunos casos, el primer y el segundo péptidos son una citoquina o quimioquina diferente o una porción funcional de la misma o son una subunidad diferente de la misma citoquina o quimioquina o una diferente.
En algunos casos, la citoquina o quimiocina es una proteína multimérica, como un homodímero o heterodímero, en la que el primer péptido es una primera subunidad de una citoquina o quimiocina y el segundo péptido es una segunda subunidad de la citoquina o quimiocina. En algunos aspectos, la región de unión que contiene la fracción de direccionamiento conecta la primera y la segunda subunidades, como la primera y la segunda subunidades de una citoquina o quimioquina que es un homodímero o heterodímero.
En algunos casos, la citoquina o quimiocina es interleucina-12 (IL-12). En general, la IL-12 es una citoquina heterodimérica que contiene una subunidad p35 y una p40 enlazada covalentemente por un puente disulfuro. En algunos casos, la primera subunidad del polipéptido inmunomodulador de IL-12 es p35 o p40 o una porción funcional de la misma y la segunda subunidad es la otra de p35 y p40 o una porción funcional de la misma. En algunos de tales casos, la región de unión que contiene la fracción de direccionamiento conecta o une las subunidades p35 y p40 de IL-12. En algunos aspectos, la subunidad p35 tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:10. En algunos aspectos, la subunidad p40 tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11.
En algunos casos, la citoquina o quimioquina es interleuquina-23 (IL-23). Generalmente, la IL-23 es una citoquina heterodimérica que contiene una subunidad IL-12p40 y una IL-23alfa. En algunos casos, la primera subunidad del polipéptido inmunomodulador de IL-23 es IL-12p40 o IL-23alfa o una porción funcional de las mismas y la segunda subunidad es la otra de IL-12p40 e IL-23alfa o una porción funcional de las mismas. En algunos de tales casos, la región de unión que contiene la fracción de direccionamiento conecta o une la IL-12p40 y una subunidad IL-23alfa de IL-23. En algunos aspectos, la subunidad IL-23alfa tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 52 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:52. En algunos aspectos, la subunidad p40 tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11.
En algunos casos, la citoquina o quimiocina es interleucina-27 (IL-27). Generalmente, la IL-27 es una citoquina heterodimérica que contiene una subunidad IL-27 alfa (p28) y una IL-27 beta (EBI3). En algunos casos, la primera subunidad del polipéptido inmunomodulador de IL-27 es p28 o EBI3 o una porción funcional de las mismas y la segunda subunidad es la otra de p28 y EBI3 o una porción funcional de las mismas. En algunos de tales casos, la región de unión que contiene la fracción de direccionamiento conecta o une las subunidades p28 y EBI3 de IL-27. En algunos aspectos, la subunidad p28 tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 60 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con al SEQ ID NO:60. En algunos aspectos, la subunidad EBI3 tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 61 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con al s Eq ID NO:61.
En algunos casos, la citoquina o quimiocina es interleucina-35 (IL-35). En general, la IL-35 es una citoquina heterodimérica que contiene una subunidad IL-12p35 y una IL-27 beta (EBI3) enlazadas covalentemente por un puente disulfuro. En algunos casos, la primera subunidad del polipéptido inmunomodulador de IL-35 es p35 o EBI3 o una porción funcional de las mismas y la segunda subunidad es la otra de p35 y EBI3 o una porción funcional de las mismas. En algunos de tales casos, la región de unión que contiene la fracción de direccionamiento conecta o une las subunidades p35 y EBI3 de IL-35. En algunos aspectos, la subunidad p35 tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:10. En algunos aspectos, la subunidad EBI3 tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 61 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con al SEQ ID NO:61.
En algunos casos, la citoquina o quimiocina es o comprende interleucina-15 (IL-15). Generalmente, la IL-15 es una citoquina y puede ser soluble o estar unida a la membrana. En algunos casos, la IL-15 es monomérica y en otros casos, la IL-15 es heterodimérica. En algunos casos, la IL-15 está asociada con la IL-15Ra. En algunos casos, la primera subunidad del polipéptido inmunomodulador de IL-15 es IL-15 o IL-15Ra o una porción funcional de la misma y la segunda subunidad es la otra de IL-15 o IL-15Ra o una porción funcional de la misma. En algunos de tales casos, la región de unión que contiene la fracción de direccionamiento conecta o se une a los péptidos de IL-15 o IL-15Ra.
B. Región de unión
En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador contiene una región de unión que conecta el primer y el segundo péptidos, como la primera y la segunda citoquina o quimiocina o la primera y la segunda subunidad de la citoquina o quimiocina o porciones funcionales de las mismas. En algunos aspectos, la región de unión contiene una fracción de direccionamiento, como un péptido de direccionamiento, que se une a una molécula objetivo. En algunos casos, la fracción de direccionamiento está conectada directamente a por lo menos uno del primer y el segundo péptidos y, en algunos casos, tanto al primer como al segundo péptido. En algunos casos, la fracción de direccionamiento está conectada indirectamente a por lo menos uno del primer y el segundo péptidos y, en algunos casos, tanto al primer como al segundo péptido, como conexión indirecta a través de un conector. En algunos casos, la región de unión contiene además uno o más conectores polipeptídicos que conectan la fracción de direccionamiento a uno o ambos del primer y el segundo péptido. En algunos aspectos, la fracción de direccionamiento está flanqueada por dos conectores polipeptídicos que conectan el primer y el segundo péptidos.
En algunos aspectos, la proteína inmunomoduladora comprende: un primer péptido, una fracción de direccionamiento y un segundo péptido. En algunos aspectos, la proteína inmunomoduladora comprende: un primer péptido, un conector, una fracción de direccionamiento y un segundo péptido. En algunos aspectos, la proteína inmunomoduladora comprende: un primer péptido, una fracción de direccionamiento, un conector y un segundo péptido. En algunos aspectos, la proteína inmunomoduladora comprende: un primer péptido, un conector, una fracción de direccionamiento, un conector y un segundo péptido. En cualquiera de tales casos, el primer y el segundo péptido pueden invertirse en posición.
En algunos casos, la región de unión no excede una longitud máxima. En algunos casos, la longitud máxima de la región de unión es o es de aproximadamente no más de 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos. En algunos casos, la longitud de la región de unión supera los 400 aminoácidos. En algunos aspectos, la longitud de la región de unión, como incluye la fracción de direccionamiento y, opcionalmente, uno o dos conectores, tiene entre o entre aproximadamente 5 y 400 aminoácidos, como entre o entre aproximadamente 10 y 400 aminoácidos, 10 y 300 aminoácidos, 10 y 200 aminoácidos, 10 y 100 aminoácidos, 10 y 50 aminoácidos, 10 y 30 aminoácidos, 10 y 20 aminoácidos, 20 y 400 aminoácidos, 20 y 300 aminoácidos, 20 y 200 aminoácidos, 20 y 100 aminoácidos, 20 y 50 aminoácidos, 20 y 30 aminoácidos, 30 y 400 aminoácidos, 30 y 300 aminoácidos, 30 y 200 aminoácidos, 30 y 100 aminoácidos, 30 y 50 aminoácidos, 50 y 400 aminoácidos, 50 y 300 aminoácidos, 50 y 200 aminoácidos, 50 y 100 aminoácidos, 100 y 400 aminoácidos, 100 y 300 aminoácidos, 100 y 200 aminoácidos, 200 y 400 aminoácidos o 200 y 300 aminoácidos. En algunos casos, la longitud de la región de unión tiene entre o entre aproximadamente 5 y 50 aminoácidos, como 5 y 40 aminoácidos, 5 y 30 aminoácidos, 5 y 20 aminoácidos, 5 y 10 aminoácidos, 10 y 50 aminoácidos, 10 y 40 aminoácidos, 10 y 30 aminoácidos, 10 y 20 aminoácidos, 20 y 50 aminoácidos, 20 y 40 aminoácidos, 20 y 30 aminoácidos, 30 y 50 aminoácidos, 30 y 40 aminoácidos o 40 y 50 aminoácidos.
1. Fracción de direccionamiento
En algunos aspectos, la región de unión contiene una fracción de direccionamiento, como un péptido de direccionamiento que se une a una molécula objetivo en la superficie de una célula. En algunos casos, la región de unión contiene dos o más fracciones de direccionamiento. En algunos de tales casos, las dos o más fracciones de direccionamiento pueden ser iguales o diferentes. En algunos casos, la fracción de direccionamiento es humana o se deriva de una proteína humana. En algunos casos, la fracción de direccionamiento es un péptido de unión. En algunos casos, la fracción de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunos casos, la fracción de direccionamiento se une a una molécula objetivo que es una proteína, glicoproteína o lípido. En algunos casos, la molécula objetivo está asociada con una enfermedad o trastorno. En algunos aspectos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o un tumor o cáncer. En algunos casos, la molécula objetivo está asociada con un tumor o presente en un tumor. En algunos aspectos, la molécula objetivo es un antígeno tumoral. En algunos casos, la molécula objetivo se expresa en la superficie de una célula, como una célula tumoral.
En algunos casos, la molécula objetivo se selecciona entre: factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), heparina, VEGF, VEGF-A, VEGFR2, VEGFR3, HER2, PD-1, tenascina-C, CTLA-4, LAG3, PD-L1, EGFR, EPCAM, RANKL, proteoglicano NG2, CD20, CD52, CD19, CD3, CD30, IL-6, CD38, SLAMF7, GD2, CD13, CD274, CD279, CD40L y CD47.
En algunos aspectos, la fracción de direccionamiento tiene una longitud de no más de 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos. En algunos aspectos, la longitud de la fracción de direccionamiento es de entre o entre aproximadamente 5 y 400 aminoácidos, como entre o entre aproximadamente 10 y 400 aminoácidos, 10 y 300 aminoácidos, 10 y 200 aminoácidos, 10 y 100 aminoácidos, 10 y 50 aminoácidos, 10 y 30 aminoácidos, 10 y 20 aminoácidos, 20 y 400 aminoácidos, 20 y 300 aminoácidos, 20 y 200 aminoácidos, 20 y 100 aminoácidos, 20 y 50 aminoácidos, 20 y 30 aminoácidos, 30 y 400 aminoácidos, 30 y 300 aminoácidos, 30 y 200 aminoácidos, 30 y 100 aminoácidos, 30 y 50 aminoácidos, 50 y 400 aminoácidos, 50 y 300 aminoácidos, 50 y 200 aminoácidos, 50 y 100 aminoácidos, 100 y 400 aminoácidos, 100 y 300 aminoácidos, 100 y 200 aminoácidos, 200 y 400 aminoácidos o 200 y 300 aminoácidos. En algunos casos, la longitud de la región de unión tiene entre o entre aproximadamente 5 y 50 aminoácidos, como 5 y 40 aminoácidos, 5 y 30 aminoácidos, 5 y 20 aminoácidos, 5 y 10 aminoácidos, 10 y 50 aminoácidos, 10 y 40 aminoácidos, 10 y 30 aminoácidos, 10 y 20 aminoácidos, 20 y 50 aminoácidos, 20 y 40 aminoácidos, 20 y 30 aminoácidos, 30 y 50 aminoácidos, 30 y 40 aminoácidos o 40 y 50 aminoácidos.
En algunos casos, la fracción de direccionamiento se une a la molécula objetivo con por lo menos cierta afinidad, medida por cualquiera de varios métodos conocidos. En algunos casos, la afinidad está representada por una constante de disociación (KD) o una constante de asociación (KA). En algunos casos, la afinidad está representada por la EC50. En algunos casos, la fracción de direccionamiento se une, por ejemplo, se une específicamente, a la molécula objetivo con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M; igual a la proporción de la tasa de asociación [kon o ka] con la tasa de disociación [koff o kd] para esta reacción de asociación, suponiendo una interacción bimolecular) igual o mayor de 105 M-1.
En algunos casos, la fracción de direccionamiento muestra una afinidad de unión por la molécula objetivo con una KD (es decir, una constante de disociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de M; igual a la relación de la tasa de disociación [koff o kd] con la tasa de asociación [kon o ka] para esta reacción de asociación, suponiendo una interacción bimolecular) igual o inferior a 10-5 M. Por ejemplo, la constante de disociación de equilibrio Kd varía de o de aproximadamente 10- 5 M a o a aproximadamente 10-15 M, como de o de aproximadamente 10-6 M a o a aproximadamente 10-12 M, de o de aproximadamente 10-7 M a o a aproximadamente 10-11 M, de o de aproximadamente 10-6 M a o a aproximadamente 10-8 M, o de o de aproximadamente 10-7 M a o a aproximadamente 10-8 M. En algunos casos, la Kd de la fracción de direccionamiento a la molécula objetivo es igual 0 menor de o de aproximadamente 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nM, como de o de aproximadamente 1 nM a o a aproximadamente 15 nM, por ejemplo, entre o entre aproximadamente 5 nM y entre o entre aproximadamente 10 nM. En algunos casos, la Kd de la fracción de direccionamiento a la molécula objetivo es igual o menor de o aproximadamente o menor de o aproximadamente 1 nM, 100 picomolar (μM), 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM, 50 μM, 40 μM, 30 μM, 25 μM, 20 μM, 15 μM, 10 μM o 1 μM, como entre de o aproximadamente 10 μM y de o aproximadamente 100 μM, por ejemplo, entre o aproximadamente 25 μM y o aproximadamente 75 μM.
La tasa de asociación (constante de tasa de asociación; kon o ka; unidades de 1/Mseg o M-1seg-1) y la tasa de disociación (constante de tasa de disociación; koff o kd; unidades de 1/s o seg-1) puede determinarse usando cualquiera de los métodos de ensayo conocidos en la técnica, por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales (SPR, por ejemplo, usando un instrumento Biacore). En algunos casos, la fracción de direccionamiento se une a la molécula objetivo con una afinidad más alta que con la que se une la citoquina o la quimiocina a su receptor.
En algunos casos, la fracción de direccionamiento muestra una tasa de koff para unirse a la molécula objetivo que es de aproximadamente 0,5 x 10-4 seg-1 o menos, aproximadamente 1 x 10-4 seg-1 o menos, aproximadamente 2 x 10-4 seg- 1 o menos, aproximadamente 3x10-4 seg-1 o menos, aproximadamente 4x10-4 seg-1 o menos, aproximadamente 5 x 10-4 seg-1 o menos, aproximadamente 1 x 10-3 seg-1 o menos, aproximadamente 1,5x10-3 seg-1 o menos, aproximadamente 2 x 10-3 seg-1 o menos, aproximadamente 3 x 10-3 seg-1 o menos, aproximadamente 4 x 10-3 seg-1 o menos, aproximadamente 5 x 10-3 seg-1 o menos, aproximadamente 1 x 10-2 seg o menos, o aproximadamente 5 x 10-1 seg-1 o menos.
En algunos casos, la fracción de direccionamiento es o contiene un motivo de unión a péptido. En algunos aspectos, la fracción de direccionamiento es o se deriva de un péptido de unión al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (HGFBP), un péptido de unión a heparina (HBP) (por ejemplo, BMP4 o fibronectina), un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a VEGF-A un péptido, un péptido de unión a VEGFR (por ejemplo, VEGFR2 o VEGFR3), un péptido de unión a EPCAM, un péptido de unión a HER2, un péptido de unión a PD-1, un péptido de unión a tenascina-C, un péptido de unión a CTLA-4, un péptido de unión a LAG3, un péptido de unión a PD-L1, un péptido de unión a EGFR, un péptido de unión a RANKL, un péptido de unión a CD20, un péptido de unión a CD52, un péptido de unión a CD19, un péptido de unión a CD3, un péptido de unión a CD30, un péptido de unión a IL-6, un péptido de unión a CD38, un péptido de unión a SLAMF7, un péptido de unión a GD2, un péptido de unión a CD274, un péptido de unión a CD279, un péptido de unión a CD40L, un péptido de unión a CD47, un péptido de unión a CD13, un motivo NGR, un motivo RGD o un péptido de unión a proteoglicano NG2. En algunos casos, la fracción de direccionamiento es o contiene un péptido de unión a HGF (HGFBP), un péptido de unión a HBP o EGFR (EGFRBP). En algunos casos, el péptido de unión a heparina (HBP) se deriva de la fibronectina o BMP4 y/o es de origen bovino. Se conocen ejemplos de tales péptidos de unión, ver, por ejemplo, Tam et al. (2009) Journal of Molecular Biology, 385:79-90; Ahsan et al. (2014) Neoplasia, 16:105-14; Binetruy-Tournaire et al. (2000) EMBO J., 19:1525-1533; Vicari et al. (2011) J. Biol. Chem., 286:13612-25; Andersson et al. (2004) FEBS J., 271: 1219-1226; Abcam N° de Cat. ab152112 (Cambridge, MA); Chen et al. (2015) BioMed Research International, Article ID 237969; Patente de Estados Unidos N° 8.188.220. Las fracciones de direccionamiento también pueden ser péptido que se identifican en ensayos de unión como péptidos que se unen a una molécula objetivo seleccionada.
La Tabla 2 proporciona ejemplos no limitativos de motivos de unión a péptidos que pueden ser una fracción de direccionamiento. En algunos casos, la fracción de direccionamiento es o comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 13-16 y 27-28 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 13-16 y 27-28.
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En algunos aspectos, la fracción de direccionamiento es o comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Entre los anticuerpos se encuentran los anticuerpos humanos, incluyendo los que se sabe que se unen a una molécula de direccionamiento como se describe.
El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno), incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiones de cadena pesada variable (Vh) capaces de unirse específicamente al antígeno, fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluyendo fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas manipuladas genéticamente y/o modificadas de otro modo, como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y subclases de las mismas, IgM, IgE, IgA e IgD.
En algunos casos, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo pueden ser de longitud completa o pueden ser una porción de unión a antígeno (un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv)). En otros casos, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo se elige de, por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, particularmente de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). En otro caso, la región constante de cadena ligera del anticuerpo se elige de, por ejemplo, kappa o lambda, particularmente kappa.
Entre los anticuerpos descritos se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones de cadena pesada variable (Vh), moléculas de anticuerpo de cadena sencilla como scFvs y anticuerpos individuales de Vh de dominio único; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En caso particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, como scFvs.
El término "región variable" o "dominio variable", cuando se usa en referencia a un anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo, se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (Vh y Vl, respectivamente) de un anticuerpo nativo que tiene generalmente estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres CDR. (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio de Vh o Vl individual puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que use unen a un antígeno particular puede aislarse usando un Vh o Vl de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios Vl o Vh complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson y col., Nature 352:624-628 (1991).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos casos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano.
Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias técnicas, incluyendo pero no limitadas a, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes. En algunos casos, los anticuerpos son fragmentos producidos recombinantemente, como fragmentos que comprenden disposiciones que no se producen de manera natural, como aquellos con dos o más regiones o cadenas de anticuerpos unidas por conectores sintéticos, por ejemplo, conectores peptídicos, y/o que no pueden producirse por digestión enzimática de un anticuerpo intacto natural. En algunos aspectos, los fragmentos de anticuerpos son scFv.
En algunos de tales aspectos, la fracción de direccionamiento es o comprende un fragmento de anticuerpo que es un fragmento de cadena sencilla. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo comprende regiones variables de anticuerpo unidas por un conector flexible, como un conector expuesto en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 22 o la SEQ ID NO: 23. En algunos ejemplos, el fragmento de anticuerpo es o contiene un scFv. Por tanto, en algunos casos, la fracción de direccionamiento contiene una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL). En algunos casos, la fracción de direccionamiento es o contiene una cadena VH, pero no contiene una cadena VL. En algunos de tales aspectos, la fracción de direccionamiento es o contiene una cadena VH de alta afinidad, por ejemplo, de súper alta afinidad. En algunos casos, la fracción de direccionamiento es o contiene una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo.
En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo anti-heparina y un anticuerpo anti-VEGF, y un anticuerpo anti-VEGF-A, un anticuerpo anti-VEGFR, un anticuerpo anti-VEGFR2, un anticuerpo anti-HER2, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-tenascina-C, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EPCAM, un anticuerpo anti-RANKL y un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD52, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-IL-6, un anticuerpo anti-CD38, un anticuerpo anti-SLAMF7, un anticuerpo anti-GD2, un anticuerpo anti-CD274, un anticuerpo anti-CD279, un anticuerpo anti-CD40L y un anticuerpo anti-CD47 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En algunos de tales casos, el anticuerpo es o se deriva de una cadena VH y/o VL de trastuzumab, pertuzumab, ramucirumab, atezolizumab, bevacizumab, panitumumab, cetuximab, necitumumab, denosumab, nivolumab, pembrolizumab, rituximab, ofatumumab, obinutuzumab, alemtuzumab, blinatumomab, brentuximab vedotin, siltuximab, ipilimumab, daratumumab, elotuzumab, dinutuximab o catumaxomab o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En algunos casos, la fracción de direccionamiento es o contiene un anticuerpo anti-EPCAM. En algunos casos, la fracción de direccionamiento tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 17, o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con dicha secuencia y se une a la molécula objetivo.
2. Conector polipeptídico
En algunos casos, la región de unión contiene además por lo menos un conector polipeptídico que enlaza la fracción de direccionamiento al primer o el segundo péptido, como la primera o segunda subunidad de la citoquina o quimiocina. En algunos casos, la región de unión contiene dos conectores polipeptídicos. En algunos de tales casos, uno de los conectores polipeptídicos enlaza el primer péptido, como la primera subunidad de la citoquina o la quimiocina, a la fracción de direccionamiento y el otro conector polipeptídico enlaza el segundo péptido, como la segunda subunidad de la citoquina o la quimiocina, con la fracción de direccionamiento. Por tanto, en algunos casos, la fracción de direccionamiento está contenida entre un primer y un segundo conector polipeptídico, que juntos forman la región de unión.
En algunos casos, el conector polipeptídico contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 aminoácidos, como de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos, como de 15 o aproximadamente 15 aminoácidos. En algunos casos, el conector polipeptídico tiene la secuencia GGGGS(n), en donde n es mayor o igual que uno. Por ejemplo, en algunos casos, donde n=1, el conector polipeptídico tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7. En algunos casos, donde n=2, el conector polipeptídico tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8 En algunos aspectos, donde n=3, el conector polipeptídico tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9.
C. Polipéptidos inmunomoduladores ejemplares
En algunos aspectos, el polipéptido inmunomodulador es o contiene un polipéptido de IL-12. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador contiene una subunidad p35 de IL-12, una subunidad p40 de IL-12 y una región de unión que conecta las subunidades p35 y p40. En algunas de tales realizaciones, la región de unión contiene una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo.
En algunos casos, la región de unión contiene además por lo menos un conector polipeptídico que enlaza la fracción de direccionamiento con la subunidad p35 o la subunidad p40. Por ejemplo, en algunos aspectos, la subunidad p40 está conectada a un primer conector polipeptídico que también está unido a un primer extremo de la fracción de direccionamiento, y el segundo extremo de la fracción de direccionamiento está conectada a un segundo conector polipeptídico que también está unido a un extremo de la subunidad p35.
En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador de IL-12 muestra una actividad aumentada para estimular a través de IL-12R en comparación con una IL-12 recombinante que no comprende la región de unión. En algunos aspectos, el polipéptido inmunomodulador muestra una unión aumentada a una célula objetivo que expresa la molécula objetivo en comparación con su unión a una célula que no expresa la molécula objetivo. En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores de IL-12 o las células que contienen dicho péptido muestran una actividad aumentada o disminuida para estimular a través de IL-12R en comparación con una IL-12 recombinante que no contiene la región de unión.
En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador de IL-12 muestra una afinidad de unión aumentada por IL-12R. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador de IL-12 muestra una afinidad de unión disminuida por IL-12R. En algunos ejemplos, la constante de disociación de equilibrio Kd del polipéptido inmunomodulador de IL-12 y el IL-12R es de o de aproximadamente 10-5 M a o a aproximadamente 10-15 M, como de o de aproximadamente 10­ 6 M a o a aproximadamente 10-12 M, de o de aproximadamente 10-7 M a o a aproximadamente 10-11 M, de o de aproximadamente 10-6 M a o a aproximadamente 10-8 M, o de o de aproximadamente 10-7 M a o a aproximadamente 10-8 M. En algunos casos, la Kd del polipéptido inmunomodulador de IL-12 y el IL-12R es o es de aproximadamente o menos de o aproximadamente 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nM, como entre o entre aproximadamente 1 nM y o aproximadamente 15 nM, por ejemplo, entre o entre aproximadamente 5 y o aproximadamente 10 nM. En algunos casos, la Kd del polipéptido inmunomodulador de IL-12 y el IL-12R es de o de aproximadamente o menos de o aproximadamente 1 nM, 100 picomolar (μM), 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM, 50 μM, 40 μM, 30 μM., 25 μM, 20 μM, 15 μM, 10 μM o 1 μM, como entre o entre aproximadamente 10 μM y o aproximadamente 100 μM, por ejemplo entre o entre aproximadamente 25 μM y o aproximadamente 75 μM.
En algunos aspectos, la actividad y/o la unión aumentada es mayor que las efectuadas por un polipéptido inmunomodulador de referencia que contiene un conector polipeptídico entre las subunidades pero que no contiene la fracción de direccionamiento. En algunos de tales aspectos, el aumento es de más de 1,2 veces, de más de 1,5 veces, de más de 2,0 veces, de más de 3,0 veces, de más de 4,0 veces, de más de 5,0 veces o de más de 10,0 veces.
En algunos casos, la proteína inmunomoduladora contiene: una subunidad p35 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:10; una región de unión que comprende una fracción de direccionamiento expuesta en la SEQ ID NO: 13 (HBP BMP4); y una subunidad p40 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11. Los componentes pueden estar en el orden especificado o en orden inverso. En algunos casos, la región de unión contiene la fracción de direccionamiento flanqueada a cada lado por un conector, cada uno expuesto independientemente en la SEQ ID NO:29, como se expone en la SEQ ID NO:7. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2.
En algunos casos, la proteína inmunomoduladora contiene: una subunidad p35 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:10; una región de unión que comprende una fracción de direccionamiento expuesta en la SEQ ID NO: 14 (HBP FBN); y una subunidad p40 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11. Los componentes pueden estar en el orden especificado o en orden inverso. En algunos casos, la región de unión contiene la fracción de direccionamiento flanqueada a cada lado por un conector, cada uno expuesto independientemente en la SEQ ID NO:29, como se expone en la SEQ ID NO:7. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID No :3.
En algunos casos, la proteína inmunomoduladora contiene: una subunidad p35 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID No :10; una región de unión que comprende una fracción de direccionamiento expuesta en la SEQ ID NO: 15 (péptido de unión a HGF); y una subunidad p40 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11. Los componentes pueden estar en el orden especificado o en orden inverso. En algunos casos, la región de unión contiene la fracción de direccionamiento flanqueada a cada lado por un conector, cada uno expuesto independientemente en la SEQ ID NO:29, como se expone en la SEQ ID NO:7. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NON o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID No :4.
En algunos casos, la proteína inmunomoduladora contiene: una subunidad p35 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID No :10; una región de unión que comprende una fracción de direccionamiento expuesta en la SEQ ID NO: 16 (EGFRBP); y una subunidad p40 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:11. Los componentes pueden estar en el orden especificado o en orden inverso. En algunos casos, la región de unión contiene la fracción de direccionamiento flanqueada a cada lado por un conector, cada uno expuesto independientemente en la SEQ ID NO:29, como se expone en la SEQ ID NO:7. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5.
En algunos casos, la proteína inmunomoduladora contiene: una subunidad p35 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SeQ ID NO: 10; una región de unión que comprende una fracción de direccionamiento que es un anticuerpo anti-EPCAM que comprende la cadena VH expuesta en la SEQ ID NO 25 y/o la cadena VL expuesta en la SEQ ID NO 24, como un scFv expuesto en la SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 17, 24 y 25; y una subunidad p40 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11. Los componentes pueden estar en el orden especificado o en orden inverso. En algunos casos, la región de unión contiene la fracción de direccionamiento flanqueada a cada lado por un conector, cada uno de los cuales se expone independientemente en la SEQ ID NO: 29, como se expone en la SEQ ID NO:7. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6.
II. Receptores recombinantes
En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores se usan en combinación y/o se expresan en o a partir de células manipuladas que expresan receptores recombinantes.
Por tanto, se describen receptores manipulados o recombinantes y células que expresan tales receptores. En algunos casos, los receptores manipulados o recombinantes incluyen receptores quiméricos, incluyendo los que contienen dominios de unión a ligandos o fragmentos de unión de los mismos, como receptores de antígenos no TCR funcionales, como receptores de antígenos quiméricos (CAR), y también incluyen receptores de células T (TCR), como TCR transgénicos y componentes de los mismos. El receptor quimérico, como un CAR, generalmente incluye el dominio de unión al antígeno extracelular (o ligando) enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, en algunos aspectos a través de conectores y/o dominio o dominios transmembrana.
En casos particulares, el receptor recombinante, como el receptor quimérico, contiene un dominio de señalización intracelular, que incluye un dominio de señalización citoplasmático de activación (también llamado indistintamente región de señalización intracelular), como un dominio citoplasmático (intracelular) de activación capaz de inducir una señal de activación primaria en una célula T, por ejemplo, un dominio de señalización citoplásmico de un componente del receptor de células T (TCR) (por ejemplo, un dominio de señalización citoplásmico de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z) o una variante funcional o porción de señalización de la misma) y/o que comprende un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM).
En algunos casos, el receptor quimérico contiene además un dominio de unión a ligando extracelular que se une específicamente a un antígeno de ligando (por ejemplo, antígeno). En algunos casos, el receptor quimérico es un CAR que contiene un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente a un antígeno. En algunos casos, el ligando, como un antígeno, es una proteína expresada en la superficie de las células. En algunos casos, el CAR es un CAR tipo TCR y el antígeno es un antígeno peptídico procesado, como un antígeno peptídico de una proteína intracelular que, como un TCR, se reconoce en la superficie celular en el contexto de una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
Los receptores recombinantes ejemplares, incluyendo los CAR y los TCR recombinantes, así como los métodos para manipular e introducir los receptores en las células, incluyen los descritos, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente internacional números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353 y 8.479.118, y la solicitud de patente europea número EP2537416, y/o los descritas por Sadelain et al., Cancer Discov. abril 2013; 3(4): 388-398; Dávila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opinión inmunol., octubre 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, marzo de 2012 18(2): 160-75. En algunos casos, los receptores de antígeno manipulados genéticamente incluyen un CAR como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190, y los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO/2014055668 A1. En algunos casos, pueden emplearse métodos similares para la construcción e introducción o transferencia en células inmunitarias para los receptores quiméricos descritos.
En algunos casos, el receptor recombinante, como un receptor quimérico (por ejemplo, CAR), incluye un dominio de unión a ligando que se une, como se une específicamente, a un antígeno (o un ligando). Entre los antígenos a los que se dirigen los receptores quiméricos se encuentran los expresados en el contexto de una enfermedad, afección o tipo de célula a los que se dirige a través de terapia celular adoptiva. Entre las enfermedades y afecciones se encuentran enfermedades y trastornos proliferativos, neoplásicos y malignos, incluyendo cánceres y tumores, incluyendo cánceres hematológicos, cánceres del sistema inmunitario, como linfomas, leucemias y/o mielomas, como leucemias B, T y mieloides, linfomas y mielomas múltiples.
En algunos casos, el antígeno (o un ligando) es un polipéptido. En algunos casos, es un carbohidrato u otra molécula. En algunos casos, el antígeno (o un ligando) se expresa selectivamente o se sobreexpresa en células de la enfermedad o afección, por ejemplo, células tumorales o patógenas, en comparación con células o tejidos normales o no objetivo. En otros casos, el antígeno se expresa en células normales y/o se expresa en células manipuladas.
En algunos casos, el antígeno (o un ligando) es un antígeno tumoral o un marcador de cáncer.
En ciertos casos, el antígeno es integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículo, antígeno de cáncer/testículo 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, ligando 1 de quimiocinas del motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24 , CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44vH8, CD123, CD138, CD171, proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína del factor de crecimiento epidérmico truncada (tEGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrina B2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógeno, receptor Fc similar a 5 (FCRL5; también conocido como homólogo del receptor Fc 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, receptor de acetilcolina fetal, gangliósido GD2, GD20-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), Her2/neu (receptor de tirosina quinasa erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-AI), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor de IL-22 alfa (IL-22Ra), receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, miembro A de la familia 8 que contiene repeticiones ricas en leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovirus murino (CMV ), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos del miembro D del grupo 2 de asesinas naturales (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma expresado preferencialmente (PRAME), receptor de progesterona, un antígeno prostático específico, antígeno prostático de células madre (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor 1 huérfano similar a la tirosina quinasa de receptores (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG también conocida como 5T4), glicoproteína asociada a tumores 72 (TAG72), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una neoplasia maligna de células B, como cualquiera de una serie de marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno al que se dirige el receptor es CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30.
En algunos casos, el antígeno es un antígeno específico de un patógeno. En algunos casos, el antígeno es un antígeno viral (como un antígeno viral de VIH, VHC, VHB, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.
A. Dominio de unión al ligando
En algunos casos, el receptor recombinante, por ejemplo, el receptor de antígeno, contiene un dominio de unión a ligando, como un dominio de unión a antígeno. En algunos casos, el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En algunos casos, el CAR se construye con una especificidad para un antígeno particular (o marcador o ligando), como un antígeno expresado en un tipo de célula particular para ser el objetivo de la terapia adoptiva, por ejemplo, un marcador de cáncer y/o un antígeno destinado a inducir una respuesta amortiguadora, como un antígeno expresado en un tipo de célula normal o no enferma. Por tanto, el CAR típicamente incluye en su porción extracelular una o más moléculas de unión a antígeno, como uno o más fragmentos, dominios o porciones de unión a antígeno, o uno o más dominios variables de anticuerpos y/o moléculas de anticuerpos. En algunos casos, el CAR incluye una porción o porciones de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) derivado de las cadenas variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb).
El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno), incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiones de cadena pesada variable (Vh) capaces de unirse específicamente al antígeno, fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluyendo fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas manipuladas genéticamente y/o modificadas de otro modo, como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y subclases de las mismas, IgM, IgE, IgA e IgD.
En algunos casos, las proteínas de unión a antígeno, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos reconocen específicamente un antígeno de un anticuerpo de longitud completa. En algunos casos, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo pueden ser de longitud completa o pueden ser una porción de unión a antígeno (un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv)). En otros casos, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo se elige de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, particularmente de, por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). En otro caso, la región constante de la cadena ligera del anticuerpo se elige de, por ejemplo, kappa o lambda, particularmente kappa.
Entre los anticuerpos descritos se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero nose limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones de cadena pesada variable (Vh), moléculas de anticuerpo de cadena sencilla como scFvs y anticuerpos individuales de Vh de dominio único; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En casos particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, como scFvs.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (Vh y Vl, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) conservadas y tres CDR. (Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio de Vh o Vl único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular puede aislarse usando un dominio Vh o Vl de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios Vl o Vh complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos casos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano. En algunos casos, el CAR comprende un dominio de cadena pesada de anticuerpo que se une específicamente al antígeno, como un marcador de cáncer o antígeno de superficie celular de una célula o enfermedad a la que se dirige, como una célula tumoral o una célula cancerosa, como cualquiera de los antígenos objetivo descritos en la presente o que se conocen en la técnica.
Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias técnicas incluyendo, pero no limitadas a, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes. En algunos casos, los anticuerpos son fragmentos producidos recombinantemente, como fragmentos que comprenden disposiciones que no se producen de forma natural, como aquellos con dos o más regiones o cadenas de anticuerpos unidas por conectores sintéticos, por ejemplo, conectores peptídicos, y/o que pueden no ser producido por la digestión enzimática de un anticuerpo intacto natural. En algunos casos, los fragmentos de anticuerpos son scFv.
Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en el que todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de CDR derivan de CDR no humanas y todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de FR derivan de FR humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir opcionalmente por lo menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo no humano se refiere a una variante del anticuerpo no humano que se sometido a humanización, típicamente para reducir la inmunogenicidad para los humanos, a la vez que retiene la especificidad y la afinidad del anticuerpo original no humano. En algunos casos, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno, como un antígeno intacto, expresado en la superficie de una célula.
En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo similar a TCR, como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno intracelular, como un antígeno asociado a un tumor, presentado en la superficie celular como un complejo MHC-péptido. En algunos casos, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que reconoce un complejo MHC-péptido puede expresarse en células como parte de un receptor recombinante, como un receptor de antígeno. Entre los receptores de antígenos se encuentran los receptores de antígenos no TCR funcionales, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR). En general, un CAR que contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que muestra una especificidad similar a la de TCR dirigida contra complejos de péptido-MHC también puede denominarse CAR tipo TCR.
La referencia al “complejo mayor de histocompatibilidad” (MHC) se refiere a una proteína, generalmente una glicoproteína, que contiene un sitio de unión de péptidos polimórficos o un surco de unión que puede, en algunos casos, formar complejos con antígenos peptídicos de polipéptidos, incluyendo los antígenos peptídicos procesados por la maquinaria celular. En algunos casos, las moléculas del MHC pueden mostrarse o expresarse en la superficie celular, incluso como un complejo con un péptido, es decir, un complejo MHC-péptido, para la presentación de un antígeno en una conformación reconocible por un receptor de antígeno en las células T, como los TCR. o anticuerpo tipo TCR. Generalmente, las moléculas de MHC de clase I son heterodímeros que tienen una cadena a que abarca la membrana, en algunos casos con tres dominios a, y una microglobulina p2 asociada no covalentemente. Generalmente, las moléculas de MHC de clase II están compuestas por dos glicoproteínas transmembrana, a y p, ambas de los cuales típicamente abarcan la membrana. Una molécula de MHC puede incluir una porción eficaz de un MHC que contiene un sitio o sitios de unión a antígeno para unir un péptido y las secuencias necesarias para el reconocimiento por parte del receptor de antígeno apropiado. En algunos casos, las moléculas MHC de clase I administran péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, donde un complejo MHC-péptido es reconocido por las células T, como generalmente células T CD8+, pero en algunos casos células T CD4+. En algunos casos, las moléculas del MHC de clase II administran péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, donde típicamente son reconocidos por las células T CD4+. En general, las moléculas del MHC están codificadas por un grupo de loci enlazados, que se denominan colectivamente H-2 en el antígeno leucocitario de ratón y humano (HLA) en humanos. Por lo tanto, el MHC típicamente humano también puede denominarse antígeno leucocitario humano (HLA).
El término “complejo MHC-péptido” o “complejo péptido-MHC” o variaciones del mismo, se refiere a un complejo o asociación de un antígeno peptídico y una molécula de MHC como, generalmente, por interacciones no covalentes del péptido en el surco o hendidura de unión de la molécula de MHC. En algunos casos, el complejo MHC-péptido está presente o se muestra en la superficie de las células. En algunos casos, el complejo MHC-péptido puede ser reconocido específicamente por un receptor de antígeno, como un TCR, CAR tipo TCR o porciones de unión a antígeno de los mismos.
En algunos casos, un péptido, como un antígeno o epítopo peptídico, de un polipéptido puede asociarse con una molécula de MHC, como para el reconocimiento por un receptor de antígeno. Generalmente, el péptido se deriva o se basa en un fragmento de una molécula biológica más larga, como un polipéptido o una proteína. En algunos casos, el péptido típicamente tiene una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 aminoácidos. En algunos casos, un péptido tiene una longitud de aproximadamente 9 a 22 aminoácidos para el reconocimiento en el complejo MHC de clase II. En algunos casos, un péptido tiene una longitud de o de aproximadamente 8 a 13 aminoácidos para el reconocimiento en el complejo MHC de Clase I. En algunos casos, tras el reconocimiento del péptido en el contexto de una molécula de MHC, como el complejo MHC-péptido, el receptor de antígeno, como TCR o CAR tipo TCR, produce o desencadena una señal de activación a la célula T que induce una respuesta de células T, como la proliferación de células T, la producción de citoquinas, una respuesta de células T citotóxicas u otra respuesta.
En algunos casos, puede producirse un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un complejo MHC-péptido inmunizando a un huésped con una cantidad eficaz de un inmunógeno que contiene un complejo MHC-péptido específico. En algunos casos, el péptido del complejo MHC-péptido es un epítopo de antígeno capaz de unirse al MHC, como un antígeno tumoral, por ejemplo, un antígeno tumoral universal, antígeno de mieloma u otro antígeno como se describe a continuación. En algunos casos, se administra luego una cantidad eficaz del inmunógeno a un huésped para provocar una respuesta inmunitaria, en donde el inmunógeno retiene una forma tridimensional del mismo durante un período de tiempo suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra la presentación tridimensional del péptido en el surco de unión de la molécula de MHC. Luego, se analiza el suero recogido del huésped para determinar si se están produciendo los anticuerpos deseados que reconocen una presentación tridimensional del péptido en el surco de unión de la molécula de MHC. En algunos casos, los anticuerpos producidos pueden evaluarse para confirmar que el anticuerpo puede diferenciar el complejo MHC-péptido de la molécula de MHC sola, el péptido de interés solo y un complejo de MHC y péptido irrelevante. Luego, pueden aislarse los anticuerpos deseados.
En algunos casos, puede producirse un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un complejo MHC-péptido empleando métodos de presentación de bibliotecas de anticuerpos, como bibliotecas de anticuerpos de fagos. En algunos casos, pueden generarse bibliotecas de presentación en fagos de Fab, scFV u otras formas de anticuerpo mutantes s, por ejemplo, en las que los miembros de la biblioteca están mutados en uno o más residuos de una CDR o varias CDR. Se conocen ejemplos de tales métodos en la técnica (ver, por ejemplo, la solicitud publicada de Estados Unidos N° US20020150914, US2014/0294841; y Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332).
1. Receptores de células T (TCR)
En algunos casos, los receptores recombinantes incluyen receptores de células T recombinantes (TCR) y/o TCR clonados a partir de células T de origen natural.
En algunos casos, un receptor de células T (TCR) contiene cadenas a y p variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) o cadenas y y S variables (también conocidas como TCRy y TCR5, respectivamente), o un fragmento funcional de las mismas de tal manera que la molécula es capaz de unirse específicamente a un péptido antigénico unido a un receptor de MHC. En algunos casos, el TCR está en forma ap. Por lo general, los TCR que existen en las formas ap y yS son estructuralmente similares, pero las células T que los expresan pueden tener funciones o localizaciones anatómicas distintas. Un TCR puede encontrarse en la superficie de una célula o en forma soluble. Generalmente, un TCR se encuentra en la superficie de las células T (o linfocitos T) donde generalmente es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). En algunos casos, un TCR también puede contener un dominio constante, undominio transmembrana y/o una cola citoplásmica corta (ver, por ejemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). Por ejemplo, en algunos casos, cada cadena del TCR puede poseer un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplásmica corta en el extremo C-terminal. En algunos casos, un TCR está asociado con proteínas invariantes del complejo CD3 implicadas en la mediación de la transducción de señales.
A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "TCR" abarca fragmentos de TCR funcionales del mismo. El término también abarca los TCR intactos o de longitud completa, incluyendo los TCR en forma ap o forma yS. Por tanto, para los propósitos de la presente, la referencia a un TCR incluye cualquier TCR o fragmento funcional, como una porción de unión a antígeno de un TCR que se une a un péptido antigénico específico unido en una molécula MHC, es decir, un complejo MHC-péptido. Una "porción de unión a antígeno" o fragmento de unión a antígeno" de un TCR, que puede usarse indistintamente, se refiere a una molécula que contiene una porción de los dominios estructurales de un TCR, pero que se une al antígeno (por ejemplo, complejo MHC-péptido) al que se une el TCR completo. En algunos casos, una porción de unión a antígeno contiene los dominios variables de un TCR, como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficientes para formar un sitio de unión para unirse a un complejo MHC-péptido específico, como de manera general donde cada cadena contiene tres regiones determinantes de la complementariedad.
En algunos casos, los dominios variables de las cadenas de TCR se asocian para formar giros o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) análogas a las inmunoglobulinas, que confieren reconocimiento de antígenos y determinan la especificidad del péptido formando el sitio de unión de la molécula de TCR y determinan la especificidad del péptido. Típicamente, como las inmunoglobulinas, las CDR están separadas por regiones marco (FR) (ver, por ejemplo, Jores et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; see also Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). En algunos casos, la CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena alfa interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que la CDR1 de la cadena beta interactúa con la parte C-terminal del péptido. Se cree que CDR2 reconoce la molécula de MHC. En algunos casos, la región variable de la cadena p puede contener una región de hipervariabilidad adicional (HV4).
En algunos casos, las cadenas de TCR contienen un dominio constante. Por ejemplo, como las inmunoglobulinas, la porción extracelular de las cadenas de TCR (por ejemplo, cadena a, cadena p) puede contener dos dominios de inmunoglobulina, un dominio variable (por ejemplo, Va o Vp; típicamente aminoácidos 1 a 116 basado en la numeración de Kabat, Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5a ed.) en el extremo N-terminal, y un dominio constante (por ejemplo, dominio constante de cadena a o Ca, típicamente los aminoácidos 117 a 259 basados en Kabat, dominio constante de cadena p o Cp, típicamente los aminoácidos 117 a 295 basados en Kabat) adyacentes a la membrana celular. Por ejemplo, en algunos casos, la porción extracelular del TCR formada por las dos cadenas contiene dos dominios constantes proximales a la membrana y dos dominios variables distales a la membrana que contienen CDR. El dominio constante del dominio TCR contiene secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro, formando un enlace entre las dos cadenas. En algunos casos, un TCR puede tener un residuo de cisteína adicional en cada una de las cadenas a y p de tal manera que el TCR contenga dos enlaces disulfuro en los dominios constantes.
En algunos casos, las cadenas de TCR pueden contener un dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana está cargado positivamente. En algunos casos, la cadena de TCR contiene una cola citoplásmica. En algunos casos, la estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como CD3. Por ejemplo, un TCR que contiene dominios constantes con una región transmembrana puede anclar la proteína en la membrana celular y asociarse con subunidades invariables del aparato o complejo de señalización de CD3.
Generalmente, CD3 es un complejo multiproteico que puede poseer tres cadenas distintas (y, S y s) en mamíferos y la cadena Z. Por ejemplo, en los mamíferos, el complejo puede contener una cadena CD3y, una cadena CD35, dos cadenas CD3s y un homodímero de cadenas CD3Z. Las cadenas CD3y, CD3S y CD3s son proteínas de superficie celular altamente relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulina. Las regiones transmembrana de las cadenas CD3y, CD3S y CD3s están cargadas negativamente, lo cual es una característica que permite que estas cadenas se asocien con las cadenas receptoras de células T cargadas positivamente. Cada una de las colas intracelulares de las cadenas CD3y, CD3S y CD3s contiene un único motivo conservado conocido como motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor o ITAM, mientras que cada cadena CD3Z tiene tres. Generalmente, los ITAM están implicados en la capacidad de señalización del complejo TCR. Estas moléculas accesorias tienen regiones transmembrana cargadas negativamente y desempeñan un papel en la propagación de la señal del TCR hacia la célula. Las cadenas CD3- y Z, junto con el TCR, forman lo que se conoce como complejo receptor de células T.
En algunos casos, el TCR puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente y y S) o puede ser un constructo de TCR de cadena sencilla. En algunos casos, el TCR es un heterodímero que contiene dos cadenas separadas (cadenas a y p o cadenas y y S) que están enlazadas, como por un enlace disulfuro o enlaces disulfuro.
En algunos casos, se identifica un TCR para un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno canceroso) y se introduce en las células. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el TCR puede obtenerse a partir de una variedad de fuentes, como por amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de secuencias de ADN de TCR disponibles públicamente. En algunos casos, el TCR se obtiene de una fuente biológica, como de células tales como de una célula T (por ejemplo, una célula T citotóxica), hibridomas de células T u otra fuente disponible públicamente. En algunos casos, las células T pueden obtenerse de células aisladas in vivo. En algunos casos, puede aislarse un clon de células T de alta afinidad de un paciente y aislar el TCR. En algunos casos, las células T pueden ser un hibridoma o clon de células T cultivadas. En algunos casos, el clon de TCR para un antígeno objetivo se ha generado en ratones transgénicos manipulados con genes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, el sistema de antígenos leucocitarios humanos o HLA). Ver, por ejemplo, antígenos tumorales (ver, por ejemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 and Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808. En algunos casos, se usa la presentación en fagos ara aislar TCR frente a un antígeno objetivo (ver, por ejemplo, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 y Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354 En algunos casos, el Tc R o la porción de unión a antígeno del mismo puede generarse sintéticamente a partir del conocimiento de la secuencia del TCR.
En algunos casos, después de obtener el clon de células T, las cadenas alfa y beta de TCR se aíslan y se clonan en un vector de expresión génica. En algunos casos, los genes de TCR alfa y beta se enlazan a través de un péptido de salto ribosómico 2A de picornavirus de tal manera que se coexpresen ambas cadenas. En algunos casos, la transferencia genética del TCR se logra mediante vectores retrovirales o lentivirales, o mediante transposones (ver, por ejemplo, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy.
13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy.
18:1748-1757; y Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18: 674-683.
B. Dominios transmembrana e intracelulares
En algunos casos, el receptor recombinante como el CAR, como la porción de anticuerpo del mismo, incluye además un espaciador, que puede ser o incluir por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina o una variante o versión modificada de la misma, como una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra de IgG4 y/o una región CH1/CL y/o Fc. En algunos casos, la porción o región constante es una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunos aspectos, la porción de la región constante sirve como región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, scFv, y el dominio transmembrana. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una mayor capacidad de respuesta de la célula después de la unión al antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. En algunos ejemplos, el espaciador tiene una longitud de o de aproximadamente 12 aminoácidos o no tiene más de 12 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen aquellos que tienen por lo menos aproximadamente de 10 a 229 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 200 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 175 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 150 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 125 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 100 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 75 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 50 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 40 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 30 aminoácidos, de aproximadamente 10 a 20 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a 15 aminoácidos, e incluyendo cualquier número entero entre los puntos finales de cualquiera de los intervalos enumerados. En algunos casos, una región espaciadora tiene aproximadamente 12 aminoácidos o menos, aproximadamente 119 aminoácidos o menos, o aproximadamente 229 aminoácidos o menos. Los espaciadores ejemplares incluyen la bisagra de IgG4 sola, la bisagra de IgG4 enlazada a los dominios CH2 y CH3, o la bisagra de IgG4 enlazada al dominio CH3. Los espaciadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 o el número de publicación de solicitud de patente internacional WO2014031687. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 70 y está codificado por la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 71. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 72 En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 73.
En algunos casos, la región o porción constante es de IgD. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:74. En algunos casos, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 70, 72, 73 y 74.
El dominio de reconocimiento de antígeno generalmente está enlazado con uno o más componentes de señalización intracelular, como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo receptor de antígeno, como un complejo TCR, en el caso de un CAR, y/o señal a través de otro receptor de superficie celular. Por tanto, en algunos casos, el componente de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) está enlazado a uno o más dominios de señalización intracelular y transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana se fusiona con el dominio extracelular. En un caso, se usa un dominio transmembrana que se asocia de manera natural con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante la sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de la membrana de la superficie para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.
El dominio transmembrana en algunos casos se deriva o de una fuente natural o de una sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína transmembrana o unida a la membrana. Las regiones transmembrana incluyen las derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la o las regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154. Alternativamente, el dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, el enlace es mediante conectores, espaciadores, y/o dominios transmembrana.
Entre los dominios de señalización intracelular están los que imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo. En algunos casos, está presente un conector oligopeptídico o polipeptídico corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contiene glicinas y serinas, por ejemplo, doblete de glicina-serina, y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmica del CAR.
El receptor, por ejemplo, el CAR, generalmente incluye por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunos casos, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo TCR, como una cadena TCR CD3 que media en la activación y citotoxicidad de las células T, por ejemplo, la cadena zeta CD3. Por tanto, en algunos aspectos, el CAR está enlazado a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunos casos, el receptor, por ejemplo, CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales, como el receptor y de Fc, CD8, CD4, CD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor y de Fc y CD8, CD4, CD25 o c D16.
En algunos casos, tras la ligación de CAR, el dominio citoplásmico o el dominio de señalización intracelular de CAR activa por lo menos una de las funciones o respuestas efectoras normales de la célula inmunitaria, por ejemplo, célula T manipulada para que exprese el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T-auxiliar, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunos casos, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente de receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también aquellos coreceptores que en el contexto natural actúan junto con tal receptor para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento con el receptor de antígeno, y/o cualquier derivado o variante de tales moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.
En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no solo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, se expresa un CAR adicional en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora.
En algunos aspectos, la activación de las células T se describe como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplásmicas: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplásmicas primaria) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar un señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos componentes de señalización.
En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplásmica primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Las secuencias de señalización citoplásmicas primarias que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de secuencias de señalización citoplásmicas primarias que contienen ITAM incluyen las derivadas de TCR o CD3 zeta, FcR gamma o FcR beta. En algunos casos, la molécula o moléculas de señalización citoplásmicas en el CAR contienen un dominio de señalización citoplásmica , una porción del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.
En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador.
En algunos casos, el dominio de activación está incluido dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador es proporcionado por otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunos casos, los CAR incluyen CAR activadores o estimuladores y CAR coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (ver la WO2014/055668).
En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende una transmembrana de CD28 y un dominio de señalización enlazado a un dominio intracelular de CD3 (por ejemplo, CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores quiméricos CD28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9), enlazados a un dominio intracelular CD3 zeta.
En algunos casos, el CAR abarca uno o más, por ejemplo, dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, por ejemplo, dominio de activación primario, en la porción citoplásmica. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.
En algunos casos, el CAR u otro receptor de antígeno puede incluir además un marcador o la célula puede expresar además un marcador, como un marcador sustituto, que puede usarse para confirmar la transducción o manipulación de la célula para que exprese el receptor, como un versión truncada de un receptor de superficie celular, como EGFR truncado (tEGFR). En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (por ejemplo, forma truncada) de CD34, un NGFR o receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, tEGFR). En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible, por ejemplo, T2A. Consular la WO2014031687. En algunos casos, la introducción de un constructo que codifica el CAR y EGFRt separados por un interruptor de ribosoma T2A puede expresar dos proteínas del mismo constructo, de tal manera que el EGFRt puede usarse como marcador para detectar células que expresan dicho constructo. En algunos casos, un marcador y, opcionalmente una secuencia conectora, pueden ser cualquiera de los divulgados en la solicitud de patente publicada N° WO2014031687. Por ejemplo, el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, enlazado a una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible de T2A. Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (por ejemplo, tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO 75 o 101 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SeQ ID NO: 75 o 101. Una secuencia conectora T2A de ejemplo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 76 o 96 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SeQ ID NO: 76 o 96.
En algunos casos, el marcador es una molécula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular, que no se encuentra de manera natural en las células T o que no se encuentra de manera natural en la superficie de las células T, o una porción de la misma.
En algunos casos, la molécula es una molécula no propia, por ejemplo, una proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunitario del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.
En algunos casos, el marcador no cumple ninguna función terapéutica y/o no produce ningún otro efecto que no sea el de ser usado como marcador para la ingeniería genética, por ejemplo, para seleccionar células manipuladas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que ejerza de otro modo algún efecto deseado, como un ligando para que una célula se encuentre in vivo, como una molécula coestimuladora o de punto de control inmunitario para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.
En algunos casos, a los CAR se hace referencia como CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es aquel que únicamente proporciona una señal inducida por la cadena CD3 tras la unión al antígeno; en algunos aspectos, un CAR de segunda generación es uno que proporciona dicha señal y una señal coestimuladora, como una que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación en algunos aspectos es uno que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.
En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento descrito en la presente. En algunos aspectos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento descrito en la presente y un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv o un anticuerpo Vh de dominio único y el dominio intracelular contiene un ITAM. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z). En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular.
En algunos aspectos, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28. El dominio extracelular y la transmembrana pueden enlazarse directa o indirectamente. En algunos casos, el dominio extracelular y la transmembrana están enlazados por un espaciador, como cualquiera descrito en la presente. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T, como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 4-1BB.
En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de CD28 o una variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o una variante funcional de la misma. En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de un 4-1BB o variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunos de tales casos, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula de Ig, como una molécula de Ig humana, como una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra de IgG4, como un espaciador solo bisagra.
En algunos casos, el dominio transmembrana del receptor, por ejemplo, el CAR es un dominio transmembrana de CD28 humano o una variante del mismo, por ejemplo, un dominio transmembrana de 27 aminoácidos de un CD28 humano (N° de registro: P10747.1), o es un dominio transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 77 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:77; en algunos casos, la porción que contiene el dominio transmembrana del receptor recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 78 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos o aproximadamente un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la misma.
En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 4-1BB.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD28 humano o una variante o porción funcional del mismo, como un dominio de 41 aminoácidos del mismo y/o un dominio de este tipo con una sustitución de LL por GG en las posiciones 186-187 de una proteína CD28 nativa. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 79 u 80 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 79 u 80. En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador intracelular de 4-1 BB o una variante o porción funcional del mismo, como un dominio citoplásmico de 42 aminoácidos de un 4-1BB humano (N° de registro Q07011.1) o variante o porción funcional del mismo, como la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 81 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 81.
En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización estimulador de CD3 zeta humano o una variante funcional del mismo, como un dominio citoplásmico 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humano (N° de registro: P20963.2) o un dominio de señalización de CD3 zeta como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190 o la Patente de Estados Unidos N° 8.911.993. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO 82, 83 u 84 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 82, 83 u 84.
En algunos aspectos, el espaciador contiene solo una región bisagra de una IgG, como solo una bisagra de IgG4 o IgG 1, como el espaciador solo bisagra expuesto en la SEQ ID NO:70. En otros casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a dominios CH2 y/o CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a los dominios CH2 y CH3, como se expone en la SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a un dominio CH3 solamente, como se expone en la SEQ ID NO:72. En algunos casos, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro conector flexible, como los conectores flexibles conocidos.
Por ejemplo, en algunos casos, el CAR incluye un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, scFvs, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagras de Ig, un dominio transmembrana de CD28, un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización zeta de CD3. En algunos casos, el CAR incluye el dominio de unión a antígeno, por ejemplo, scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagras Ig, un dominio transmembrana de CD28, un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización zeta de CD3. En algunos casos, tales constructos de CAR incluyen además un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia de tEGFR, por ejemplo, en sentido descendente del CAR.
III. Ácidos nucleicos, vectores y células manipuladas
También se describen polinucleótidos (moléculas de ácidos nucleicos) que codifican los péptidos inmunomoduladores y los receptores recombinantes, vectores para células manipuladas genéticamente para que expresen tales polipéptidos y receptores, y métodos para producir polipéptidos inmunomoduladores, receptores recombinantes y células manipuladas genéticamente.
A. Polinucleótidos
En algunos casos, se proporcionan polinucleótidos que codifican cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores descritos en la presente. En algunos aspectos, el polinucleótido contiene una secuencia de ácidos nucleicos señal, como una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido inmunomodulador. En otros casos, el polinucleótido contiene una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido inmunomodulador y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un receptor recombinante. En algunos aspectos, el receptor recombinante es o contiene un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos aspectos, el receptor recombinante es o contiene un receptor de células T (TCR), por ejemplo, un TCR transgénico.
Cualquiera de los polinucleótidos descritos puede modificarse para eliminar motivos CpG y/o para optimizar codones para la traducción en una especie particular, como especie humana, canina, felina, equina, ovina, bovina, etc. En algunos casos, los polinucleótidos se optimizan para el uso de codones humanos (es decir, optimizados con codones humanos). En algunos casos, los polinucleótidos se modifican para eliminar motivos CpG. En otros casos, los polinucleótidos descritos se modifican para eliminar los motivos CpG y se optimizan con codones, como optimizados con codones humanos. Los métodos de optimización con codones y detección y modificación de motivos CpG son bien conocidos. Típicamente, la optimización de polinucleótidos potencia la expresión de transgenes, aumenta la estabilidad de los transgenes y conserva la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Las secuencias de polinucleótidos optimizadas ejemplares, que codifican polipéptidos inmunomoduladores ejemplares, se exponen las SEQ ID NO: 102-107.
En algunos casos, el polinucleótido contiene una secuencia señal que codifica un péptido señal. Por ejemplo, la secuencia señal puede codificar un péptido señal derivado de CD33, IL-12p40 o IL-12p35. Algunos de tales péptidos señal CD33, iL-12p40 o IL-12p35 pueden tener la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 18, 12 o 19, respectivamente, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con dicha secuencia.
En algunos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante contiene por lo menos un promotor que está enlazado operativamente para controlar la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante. En algunos ejemplos, el polinucleótido contiene dos, tres o más promotores enlazados operativamente para controlar la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante.
En algunos casos, la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o del receptor recombinante es inducible o condicional. Por tanto, en algunos aspectos, el polinucleótido que codifica el polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante contiene un promotor, potenciador o transactivador condicional. En algunos de tales aspectos, el promotor, potenciador o transactivador condicional es un promotor, potenciador o transactivador inducible o un promotor, potenciador o transactivador reprimible. Por ejemplo, en algunos casos, puede usarse un promotor inducible o condicional para restringir la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o receptor recombinante a un microambiente específico, como un microambiente tumoral. El microambiente tumoral incluye condiciones como hipoxia y glucosa baja. En algunos casos, el promotor inducible o condicional es activo en presencia de una o más condiciones en el microambiente tumoral como hipoxia, glucosa baja, pH ácido y/o estrés oxidativo. En otros casos, la expresión impulsada por el promotor inducible o condicional está regulada por la exposición a un agente exógeno, como calor, radiación o fármaco.
En algunos casos, la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o del receptor recombinante se limita a condiciones hipóxicas. Por ejemplo, la transcripción mediada por el factor de transcripción 1 alfa (HIF-1 alfa) inducible por hipoxia se une a motivos de ADN conocidos como elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) en condiciones hipóxicas. Por lo tanto, los HRE pueden usarse para impulsar la expresión transgénica específicamente dentro de áreas de hipoxia, como los tumores. Por ejemplo, puede construirse un promotor que proporcione una expresión génica inducible por hipoxia combinando uno o más elementos de respuesta a la hipoxia (HRE), de genes sensibles a HIF-1, que tienen la secuencia central de consenso 5'-(A/G)CGT(G/C)(G/C)-3' con un promotor, como un promotor basal (por ejemplo, promotor de CMV, SV40 o factor de elongación 1 (EF-1)). Los genes sensibles a HIF-1 ejemplares incluyen eritropoyetina (Epo), VEGF-A, fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1), lactato deshidrogenasa A (LDH A), aldolasa A (ALDA) y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y sus HRE respectivos se exponen en las SEQ ID NO: 85-90.
En algunos casos, la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante está restringida a condiciones de glucosa baja. En tales ejemplos, puede usarse un promotor sensible a la glucosa para impulsar la expresión transgénica en células expuestas a condiciones de glucosa baja, como las células presentes en un ambiente tumoral. Los ejemplos de promotores sensibles a la glucosa incluyen el promotor de la proteína GRP78 regulada por glucosa y el promotor de la hexocinasa II.
En algunos casos, pueden usarse promotores inducibles controlados exógenamente para regular la expresión del polipéptido modulador y/o del receptor recombinante. Por ejemplo, pueden usarse promotores inducibles por radiación, promotores inducibles por calor y/o promotores inducibles por fármacos para impulsar selectivamente la expresión transgénica en, por ejemplo, regiones objetivo. En tales casos, la localización, la duración y el nivel de expresión transgénica pueden regularse mediante la administración de la fuente de inducción exógena.
En algunos casos, la expresión transgénica se limita a un campo de radiación tras la aplicación de radioterapia, usando un promotor inducible por radiación. Pueden aprovecharse los métodos de radioterapia, como la radioterapia conformada, la radioterapia intersticial, la braquiterapia o la administración dirigida de radioisótopos para inducir la expresión localizada del polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante bajo la regulación de un promotor inducible por radiación. En respuesta a la radiación ionizante, las células activan la transcripción de una variedad de genes, como c-jun, NFP, EGR-1 y p21(WAF-1). Los promotores inducibles por radiación ejemplares incluyen: promotores de EGR-1, Waf-1, RecA y cIAP2. Los elementos CArG del promotor de EGR-1 contienen el motivo de secuencia de consenso CC(rico en A+T)6GG (por ejemplo, CCTTATTTGG; SEQ ID NO: 91), y también confieren una expresión dependiente de la dosis en respuesta a la exposición a la radiación. Los promotores sintéticos ejemplares pueden contener 1 o más elementos CArG, como 1, 2, 4, 6 , 8 , 10, 12, 14 o más elementos CArG. Los promotores que contienen CArG sintéticos ejemplares se exponen en las SEQ ID NO: 92-95. Cuando se emplean promotores inducibles por radiación, las células descritas en la presente, que contienen los constructos descritos en la presente, contienen un promotor inducible por radiación.
En algunos casos, la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o del receptor recombinante está regulada por un promotor inducible por calor. La respuesta celular a la hipertermia está asociada con la síntesis de proteínas de choque térmico (HSP). Por tanto, la expresión del polipéptido modulador y/o el receptor recombinante puede regularse mediante un promotor de HSP, como un promotor de HSP70B, que activará selectivamente la expresión transgénica después del tratamiento de hipertermia, controlando de este modo la localización, la duración y el nivel de expresión transgénica. En algunos casos, pueden introducirse elementos de choque térmico (HSE) en el promotor de HSP u otro promotor para mejorar la respuesta transcripcional al calor. Gadd 153 es otro promotor inducible por calor ejemplar. También pueden usarse campos ultrasónicos y electromagnéticos para estimular la expresión transgénica bajo la regulación de un promotor de HSP. Pueden determinarse empíricamente las temperaturas y otras formas exógenas de transferencia de energía, como ultrasonidos y radiación electromagnética, que dan como resultado la expresión transgénica en dichos sistemas. En algunos casos, pueden incorporarse giros de retroalimentación para mejorar la expresión transgénica (ver, por ejemplo, Emilusen et al., Urol Int. 2001; 67(3):216-223).
En algunos casos, la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante se regula utilizando un promotor inducible por fármacos. Por ejemplo, en algunos casos, el promotor, potenciador o transactivador comprende una secuencia operadora de Lac, una secuencia operadora de tetraciclina, una secuencia operadora de galactosa, una secuencia operadora de doxiciclina, una secuencia operadora de rapamicina, una secuencia operadora de tamoxifeno o una secuencia operadora de respuesta hormonal, o un análogo de las mismas. En algunos casos, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a tetraciclina (TRE). En algunos casos, el promotor inducible comprende un elemento de respuesta a estrógenos (ERE), que puede activar la expresión génica en presencia de tamoxifeno. En algunos casos, puede combinarse un elemento inducible por fármacos, como un TRE, con un promotor seleccionado para potenciar la transcripción en presencia de un fármaco, como la doxiciclina. En algunos casos, el promotor inducible por fármacos es un promotor inducible por moléculas pequeñas. Típicamente, un operador inducible por fármacos, como un operador de tetraciclina, es un sistema alostérico en el que la administración de un fármaco seleccionado, como la doxiciclina, inicia la transcripción de un transgén por lo demás silencioso. En algunos casos, puede emplearse el promotor del gen de resistencia a múltiples fármacos (mdr1 ), que contiene elementos de respuesta inducibles por fármacos, para impulsar la expresión dependiente de fármacos del transgén. Las dosis eficaces de fármaco u hormona para lograr los niveles deseados de expresión transgénica pueden determinarse empíricamente, y los métodos para determinar las dosis eficaces son bien conocidos.
En algunos aspectos, la expresión del polipéptido inmunomodulador se efectúa en presencia de una célula inmune, por ejemplo, activación de células T, como por un factor de activación de células T. Por ejemplo, en algunos casos, el promotor, potenciador u otro elemento de respuesta o porción del mismo es reconocido por un factor de transcripción para impulsar la expresión de un gen cuya actividad se enciende normalmente mediante la activación de células T. En algunos casos, el factor de activación de células T puede ser un dominio o región reguladora (por ejemplo, promotor, potenciador u otro elemento de respuesta) de un factor de transcripción cuya actividad se enciende mediante la activación de células T. En algunos casos, el factor de activación de células T responde a uno o más de la activación de células T, la intensidad de la señal de la señalización de TCR y/o la calidad de la señalización de TCR.
En algunos casos, el factor de activación de células T puede ser un elemento regulador, como un elemento o elementos promotores, potenciadores o de respuesta, que contiene un sitio de unión para un factor de transcripción de células T y que, por lo tanto, está asociado con la actividad en sentido descendente de un factor de transcripción de células T. En algunos casos, el factor de transcripción es el factor nuclear de células T activadas (NFAT), C/EBP, STAT1, STAT2 o NFkB. Por ejemplo, en algunos casos, el factor de activación de células T contiene un elemento de respuesta o elementos reconocidos por un factor nuclear de células T activadas (NFAT), C/EBP, STAT1, STAT2 y NFkB. En algunos casos, el factor de activación de células T puede contener un elemento regulador o elementos reconocidos por o sensibles a uno o dos, y en algunos casos tres o más, factores de transcripción únicos.
Se contempla que uno o más de los promotores y/o elementos reguladores inducibles, dependientes de la condición y/o específicos de células puedan combinarse para restringir y/o sensibilizar la expresión del polipéptido inmunomodulador y/o receptor recombinante descrito en la presente.
En algunos casos, como en los que el polinucleótido contiene una primera y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, el polinucleótido contiene además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de enlace entre la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos. En algunos de tales casos, el péptido de enlace separa los productos de traducción de la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos durante o después de la traducción. En algunos aspectos, el péptido de enlace contiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), un péptido autoescindible o un péptido que provoca el salto del ribosoma, como un péptido T2A.
En algunos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante se introduce en una composición que contiene células cultivadas, como por transducción, transfección o transformación retroviral.
En algunos casos, el polinucleótido (molécula de ácido nucleico) es uno que codifica el polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante, por ejemplo, el receptor quimérico, como cualquiera de los descritos anteriormente. También se describen vectores o constructos que contienen tales moléculas de ácidos nucleicos. En algunos casos, los vectores o constructos contienen uno o más promotores enlazados operativamente al nucleótido que codifica el polipéptido o receptor para impulsar la expresión del mismo. En algunos casos, el promotor se enlaza operativamente a una o más de una molécula de ácido nucleico.
Por tanto, también se describen vectores, como los que contienen cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente. En algunos casos, el vector es un vector viral, como un vector retroviral, por ejemplo, un vector lentiviral o un vector gammaretroviral.
En algunos casos, el vector o constructo puede contener un único promotor que impulsa la expresión de una o más moléculas de ácidos nucleicos. En algunos casos, tales promotores pueden ser multicistrónicos (bicistrónicos o tricistrónicos, ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.060.273). Por ejemplo, en algunos casos, las unidades de transcripción pueden diseñarse como una unidad bicistrónica que contiene un IRES (sitio interno de entrada al ribosoma), que permite la coexpresión de productos génicos (por ejemplo, que codifican un primer y un segundo receptores recombinantes) mediante un mensaje de un único promotor. Alternativamente, en algunos casos, un único promotor puede dirigir la expresión de un ARN que contiene, en un único marco de lectura abierto (ORF), dos o tres genes (por ejemplo, que codifican la molécula implicada en la modulación de una vía metabólica y que codifican el receptor recombinante) separados entre sí por secuencias que codifican un péptido autoescindible (por ejemplo, secuencias 2A) o un sitio de reconocimiento de proteasa (por ejemplo, furina). Por tanto, el ORF codifica un solo polipéptido que, ya sea durante (en el caso de 2A) o después de la traducción, se procesa en las proteínas individuales. En algunos casos, el péptido, como T2A, puede hacer que el ribosoma salte (salto de ribosoma) la síntesis de un enlace peptídico en el extremo C-terminal de un elemento 2A, lo que lleva a la separación entre el final de la secuencia 2A y el siguiente péptido en sentido descendente (ver, por ejemplo, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) y deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). En la técnica se conocen muchos elementos 2A. Ejemplos de secuencias 2A que pueden usarse en los métodos y ácidos nucleicos divulgados en la presente, sin limitación, secuencias 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 100), virus de la rinitis equina A (E2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 99), virus de Thosea asigna (T2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 76 o 96) y teschovirus-1 porcino (P2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 97 o 98) como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20070116690.
B. Células y preparación de células para manipulación
También se describen células, como células que contienen el polipéptido inmunomodulador y/o un receptor recombinante manipulado, como se describe en la presente. En algunos casos, las células son capaces de secretar o están diseñadas para secretar el péptido inmunomodulador. En algunos casos, la célula manipulada secreta un polipéptido inmunomodulador que muestra una unión aumentada a una célula objetivo que expresa la molécula objetivo en comparación con su unión a una célula que no expresa la molécula objetivo. En algunos aspectos, los efectos de la célula manipulada aumentaron la destrucción de una célula objetivo que expresaba la molécula objetivo en comparación con la destrucción de células que no expresaban la molécula objetivo. En algunos casos, la persistencia, actividad, unión y/o destrucción aumentada es mayor que la efectuada por una célula manipulada de referencia que expresa o secreta un polipéptido inmunomodulador que comprende un conector polipeptídico entre subunidades pero que no comprende la fracción de direccionamiento.
También se describen poblaciones de tales células, composiciones que contienen tales células y/o enriquecidas para tales células, como en las que las células que expresan el polipéptido inmunomodulador y/o el receptor quimérico constituyen por lo menos el 50, 60, 70, 80, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o más por ciento del total de células en la composición o células de cierto tipo como células T o células CD8+ o CD4+. Entre las composiciones se encuentran composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración, como para terapia celular adoptiva. También se describen métodos terapéuticos para administrar las células y composiciones a sujetos, por ejemplo, pacientes.
Por tanto, también se describen células manipuladas genéticamente que expresan los polipéptidos inmunomoduladores y/o los receptores recombinantes, por ejemplo, CAR. Las células generalmente son células eucarióticas, como células de mamíferos, y típicamente son células humanas. En algunos casos, las células se derivan de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente T células y/o células NK. Otras células ejemplares incluyen células madre, como células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las típicamente son células primarias, como las que se aíslan directamente de un sujeto y/o se aíslan de un sujeto y se congelan. En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, capacidades de recirculación, localización y/o persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcador o citoquina y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen métodos ya existentes. En algunos aspectos, como en el caso de las tecnologías ya existentes, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como células madre, como células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o manipularlas, como se describe en la presente, y volverlas a introducir en el mismo paciente, antes o después de la crioconservación.
Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o de células T CD8+ se encuentran las células T vírgenes ( n), células T efectoras (Teff), células T de memoria y subtipos de las mismas, como células madre T de memoria (Tscm), memoria central T (Tcm), memoria efectora T (Tem), o células T de memoria efectoras diferenciadas terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), células T reguladoras (Treg) de origen natural y adaptativas, células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22 células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.
En algunos casos, las células son células asesinas naturales (NK). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.
En algunos casos, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética y, por lo tanto, expresan productos recombinantes o manipulados genéticamente de tales ácidos nucleicos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como la obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está manipulando y/o o un organismo del que se deriva dicha célula. En algunos casos, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.
En algunos casos, la preparación de las células manipuladas incluye uno o más pasos de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción del polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante, por ejemplo, CAR, pueden aislarse de una muestra, como una muestra biológica, por ejemplo, una obtenida o derivada de un sujeto. En algunos casos, el sujeto del que se aísla la célula es uno que tiene la enfermedad o afección o que necesita una terapia celular o al que se le administrará la terapia celular. El sujeto en algunos casos es un humano que necesita una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la cual se aíslan, procesan y/o manipulan las células.
Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, ingeniería genética (por ejemplo, transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se está procesando. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo las muestras procesadas derivadas de los mismos.
En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucoféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a la mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdala u otro órgano y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.
En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo, líneas de células T. Las células en algunos casos se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano o cerdo.
En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación de células basadas en la no afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer los componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan sobre la base de una o más propiedades, como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.
En algunos ejemplos, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto, por ejemplo, por aféresis o leucoféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de glóbulos rojos y plaquetas.
En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, se realiza un paso de lavado en una centrífuga semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, se logra un paso de lavado mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. En ciertos casos, los componentes de una muestra de células sanguíneas se eliminan y las células se vuelven a suspender directamente en medios de cultivo.
En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación de células basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante la lisis de los glóbulos rojos y la centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.
En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células sobre la base de la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido para la separación basado en tales marcadores. En algunos casos, la separación es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones celulares sobre la base de la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, mediante incubación con un anticuerpo o pareja de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o a la pareja de unión, de las células que no se han unido al anticuerpo o pareja de unión.
Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se conservan para su uso posterior, y/o la selección negativa, en la que se conservan las células que no se han unido al anticuerpo o a la pareja de unión. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no hay ningún anticuerpo disponible que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se realiza sobre la base de marcadores expresados por células distintas de la población deseada.
No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular particular o células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere al aumento del número o porcentaje de dichas células, pero no necesariamente da como resultado una ausencia total de células que no expresan el marcador. De igual manera, la selección negativa, la eliminación o el agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de tales células, pero no es necesario que dé como resultado una eliminación completa de todas esas células.
En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un solo paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o parejas de unión, cada uno específico para un marcador objetivo de selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente simultáneamente múltiples tipos de células incubando células con una pluralidad de anticuerpos o parejas de unión expresados en los varios tipos de células.
Por ejemplo, en algunos aspectos, se aíslan subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y/o CD45RO+, mediante técnicas de selección positiva o negativa.
Por ejemplo, las células T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente usando perlas magnéticas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, el expansor de células T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).
En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo mediante el enriquecimiento de una población celular particular mediante selección positiva, o el agotamiento de una población celular particular mediante selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se logra incubando las células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se une específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.
En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante la selección negativa de marcadores expresados en células que no son T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunos aspectos, se usa un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y las células T citotóxicas CD8+. Tales poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para marcadores expresados o expresados en un grado relativamente más alto en una o más subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y/o efectoras.
En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente o se agotan en células madre vírgens, de memoria central, memoria efectora y/o memoria central, como por selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento de células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto después de la administración, que en algunos aspectos es particularmente sólido en tales sub- poblaciones Ver Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunos casos, combinar células T CD8+ enriquecidas con Tcm y células T CD4+ mejora adicionalmente la eficacia.
En casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de linfocitos de sangre periférica CD8+. Las PBMC pueden enriquecerse o empobrecerse en fracciones de CD62L-CD8+ y/o cD62L+cD8+, como por ejemplo usando anticuerpos anti-cD8 y anti-cD62L.
En algunos casos, el enriquecimiento para las células T de memoria central (Tcm) se basa en la expresión superficial alta o positiva de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa de células que expresan o expresan en gran medida CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población CD8+ enriquecida en células Tcm se lleva a cabo mediante el agotamiento de las células que expresan CD4, CD14, CD45RA y la selección positiva o enriquecimiento de células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento para las células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo partiendo de una fracción negativa de células seleccionadas basadas en la expresión de CD4, que se someten a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA, y una selección positiva basada en CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 que se usa para preparar la población o subpoblación de células CD8+, también se usa para generar la población o subpoblación de células CD4+, de tal manera que se retienen tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4- y se usan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente después de uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales.
En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se retienen tanto las fracciones negativas como las positivas. La fracción negativa luego se somete a selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o ROR1, y selección positiva basada en un marcador característico de las células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positiva y negativa se llevan a cabo en orden.
Las células auxiliares T CD4+ se clasifican en células vírgenes, de memoria central y efectoras identificando las poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunos casos, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células efectoras CD4+ son CD62L- y CD45RO-.
En un ejemplo, para enriquecer células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o la pareja de unión se une a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o una perla paramagnética, para permitir la separación de células para selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones celulares se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o magnéticas por afinidad) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Editado por: S.A. Brooks y U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).
En algunos aspectos, la muestra o composición de células a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o magnéticamente sensible, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, perlas Dynabeads o MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, una partícula, generalmente se une directa o indirectamente a una pareja de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo un marcador de superficie, presente en la célula, las células o la población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.
En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otra pareja de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se usan en los métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4.452.773, y en la Memoria Descriptiva de la Patente Europea EP 452342 B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 4.795.698de Owen , y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5.200.084 son otros ejemplos.
La incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones por las que los anticuerpos o parejas de unión, o moléculas, como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a tales anticuerpos o parejas de unión, que están unidos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.
En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a las mismas serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células sin marcar). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde las fracciones positivas y negativas se retienen y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.
En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles están recubiertas en anticuerpos primarios u otras parejas de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células a través de un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o una pareja de unión, y luego se añaden partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico de tipo celular u otra pareja de unión (por ejemplo, estreptavidina). En ciertos casos, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se usan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.
En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan unidas a las células que se van a incubar, cultivar y/o manipular posteriormente; en algunos aspectos, las partículas se dejan unidas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se eliminan de las células. Se conocen métodos para eliminar partículas magnetizables de las células e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos competitivos no marcados, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles, etc. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.
En algunos casos, la selección basada en la afinidad se realiza a través de la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Los sistemas de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) son capaces de una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a las mismas. En ciertas realizaciones, la MACS funciona en un modo en el que las especies no objetivo y objetivo se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células unidas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no unidas. Luego, después de que se haya completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y a las que se les impidió eluir se liberan de alguna manera de tal manera que puedan eluirse y recuperarse. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y agotan de la población de células heterogénea.
En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se usa para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un ambiente cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar el error, la manipulación por el usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003 o US 20110003380 A1.
En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo, todos los pasos de aislamiento, procesamiento, manipulación y formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de manera automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o un programa informático en comunicación con el sistema o aparato, que permite al usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar varios aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, manipulación y formulación.
En algunos aspectos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por ejemplo, para la separación automatizada de células a nivel de escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de manguito. El ordenador integrado en algunos aspectos controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. La unidad de separación magnética en algunos aspectos incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de manguito, asegura el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.
El sistema CliniMACS en algunos aspectos usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirógena. En algunos casos, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. Luego, se conecta una bolsa de preparación de células al conjunto de tubos, que a su vez se conecta a una bolsa que contiene tampón y una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste en tubos estériles preensamblados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son de un solo uso. Después de iniciar el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra de células en la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se marcan y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.
En ciertos casos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). El sistema CliniMACS Prodigy en algunos aspectos está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y el fraccionamiento automatizados de células por centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el criterio de valoración de fraccionamiento celular óptimo discerniendo las capas macroscópicas del producto celular de origen. Por ejemplo, la sangre periférica puede separarse automáticamente en eritrocitos, glóbulos blancos y capas de plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que lleva a cabo protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción estéril y la reposición de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Ver, por ejemplo, Klebanoff et al. (2012 ) J Immunother. 35(9): 651 -660, Terakura et al. (2012 ) Blood.1:72-82, y Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o empobrece) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluida. En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o empobrece) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población de células descrita en la presente se recoge y enriquece (o reduce) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, por ejemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite el aislamiento de subconjuntos de células T bien definidos con alta pureza.
En algunos casos, los anticuerpos o parejas de unión están marcados con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otras parejas de unión específicos para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), incluyendo la escala preparativa (FACS) y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.
En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, por ejemplo, crioconservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, la incubación y/o la manipulación. En algunos casos, el paso de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos en la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunos aspectos puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos. Un ejemplo implica el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otro medio de congelación celular adecuado. Luego esto se diluye 1:1 con medio para que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y el 4%, respectivamente. Luego, las células se congelan a -80° C a una tasa de 1 ° por minuto y se almacena en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.
En algunos casos, los métodos descritos incluyen pasos de cultivo, incubación, cultivo y/o ingeniería genética. Por ejemplo, en algunos casos, se describen métodos para incubar y/o manipular las poblaciones de células empobrecidas y las composiciones de inicio del cultivo.
Por tanto, en algunos casos, las poblaciones celulares se incuban en una composición de inicio de cultivo. La incubación y/o la manipulación pueden llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para cultivo o cultivar células.
En algunos casos, las células se incuban y/o cultivan antes o en conexión con la ingeniería genética. Los pasos de incubación pueden incluir cultivo, cultivación, estimulación, activación y/o propagación. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o un agente estimulador. Tales condiciones incluyen las diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o cebar las células para la ingeniería genética, como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.
Las condiciones pueden incluir uno o más medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimulantes, como citoquinas, quimiocinas, antígenos, parejas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
En algunos casos, las condiciones o agentes estimulantes incluyen uno o más agentes, por ejemplo, un ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos de un TCR, por ejemplo, anti-CD3. En algunos casos, las condiciones de estimulación incluyen uno o más agentes, por ejemplo, un ligando, que es capaz de estimular un receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD28. En algunos casos, tales agentes y/o ligandos pueden estar unidos a un soporte sólido como una perla y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes de estimulación incluyen IL-2, IL-15 y/o IL-7. En algunos aspectos, la concentración de IL-2 es de por lo menos unas 10 unidades/ml.
En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a la composición iniciadora de cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que no se dividen (por ejemplo, de tal manera que la población de células resultante contenga por lo menos aproximadamente 5, 10, 20, o 40 o más células alimentadoras de PBMC para cada linfocito T en la población inicial que se va a expandir); e incubar el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de añadir las poblaciones de células T.
En algunos casos, las condiciones de estimulación incluyen temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados y generalmente aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además añadir células linfoblastoides (LCL) transformadas por EBV que no se dividen como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.
En casos, las células T específicas de antígeno, como las células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T vírgenes o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, pueden generarse líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.
C. Vectores y métodos para ingeniería genética
Son bien conocidos varios métodos para la introducción de componentes manipulados genéticamente, por ejemplo, polipéptidos inmunomoduladores y receptores recombinantes, por ejemplo, CAR o TCR, y pueden usarse con los métodos y composiciones descritos. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos o receptores, incluyendo a través de vectores virales, por ejemplo, vectores o transposones retrovirales o lentivirales, no virales, por ejemplo, el sistema de transposones de la Bella Durmiente. Los métodos de transferencia de genes pueden incluir transducción, electroporación u otro método que dé como resultado la transferencia de genes a la célula.
En algunos casos, la transferencia de genes se logra estimulando primero la célula, como combinándola con un estímulo que induce una respuesta como proliferación, supervivencia y/o activación, por ejemplo, como se mide por la expresión de una citoquina o marcador de activación. seguido de la transducción de las células activadas y expansión en cultivo a números suficientes para aplicaciones clínicas.
En algunos contextos, puede ser deseable protegerse contra la posibilidad de que la sobreexpresión de un factor estimulador (por ejemplo, una linfoquina o una citoquina) pueda dar como resultado un resultado no deseado o una menor eficacia en un sujeto, como un factor asociado con la toxicidad en un sujeto. Por tanto, en algunos contextos, las células manipuladas incluyen segmentos de genes que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, como tras la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células se manipulan para que puedan eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del paciente al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple tipo I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2:223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT), la citosina desaminasa bacteriana (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando partículas de virus infecciosos recombinantes, como, por ejemplo, vectores derivados del virus de simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células T usando vectores retrovirales o vectores lentivirales recombinantes, como vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril de 2014. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. Noviembre de 2011 29(11):550-557.
En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), virus de células madre embrionarias murinas (MESV), virus de células madre (MSCV), virus formador de focos de bazo (SFFV) o virus adenoasociado (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente de células de aves o mamíferos. Los retrovirus típicamente son anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluyendo los humanos. En un caso, el gen a expresar reemplaza las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito varios sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740; 6.207.453, 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109..
Se conocen métodos de transducción lentiviral. Los métodos ejemplares se describen, por ejemplo, en Wang et al. (2012 ) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.
En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación (ver, por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (ver, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 ). Otros métodos para introducir y expresar material genético en células inmunitarias incluyen transfección con fosfato de calcio (por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican los productos recombinantes son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, número de publicación: WO2014055668 y la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190.
En algunos casos, las células, por ejemplo, las células T, pueden transfectarse durante o después de la expansión, por ejemplo, con un polipéptido inmunomodulador, un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR). Esta transfección para la introducción del gen del polipéptido o receptor deseado puede llevarse a cabo con cualquier vector retroviral adecuado, por ejemplo. La población de células modificadas genéticamente puede entonces liberarse del estímulo inicial (el estímulo de CD3/CD28, por ejemplo) y posteriormente estimularse con un segundo tipo de estímulo, por ejemplo, a través de un receptor introducido de novo). Este segundo tipo de estímulo puede incluir un estímulo antigénico en forma de una molécula de péptido/MHC, el ligando afín (reticulación) del receptor introducido genéticamente (por ejemplo, ligando natural de un CAR) o cualquier ligando (como un anticuerpo) que se una directamente dentro del marco del nuevo receptor (por ejemplo, reconociendo regiones constantes dentro del receptor). Ver, por ejemplo, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012 ; 907:645-66 o Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).
Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes para la introducción son los que mejoran la eficacia de la terapia, por ejemplo, promoviendo la viabilidad y/o la función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como para evaluar la supervivencia o localización in vivo; genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como se describe en Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); ver también las publicaciones de PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Ver, por ejemplo, Riddell et al., Patente de Estados Unidos N° 6.040.177, en las columnas 14-17.
IV. Composiciones, formulaciones y formas de administración
También se describen composiciones que contienen el receptor quimérico, como CAR o TCR, y composiciones que contienen las células manipuladas, incluyendo las composiciones y formulaciones farmacéuticas. También se describen métodos de uso y los usos de las composiciones, como en el tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos en los que se expresa el antígeno, o en métodos de detección, diagnóstico y pronóstico. A. Composiciones/Formulaciones
El término “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto para el cual se administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.
En algunos aspectos, la elección del portador está determinada en parte por la célula particular y/o por el método de administración. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como polietilenglicol (PEG).
En algunos aspectos se incluyen en las composiciones agentes de tamponamiento. Los agentes de tamponamiento adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes de tamponamiento. El agente de tamponamiento o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21 a edición. (1 de mayo de 2005).
La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se está tratando con las células, preferiblemente aquellas con actividades complementarias a la célula, donde las actividades respectivas no se afectan negativamente entre sí. Tales ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por tanto, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina., vincristina, etc. En algunos casos, las células o anticuerpos se administran en forma de sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, como los ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico.
Los ingredientes activos pueden quedar atrapados en microcápsulas, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. En ciertos casos, la composición farmacéutica se formula como un complejo de inclusión, como un complejo de inclusión de ciclodextrina, o como un liposoma. Los liposomas pueden servir para dirigir las células huésped (por ejemplo, células T o células NK) a un tejido particular. Hay muchos métodos disponibles para preparar liposomas, como los descritos, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) y las Patentes de Estados Unidos 4.235.871,4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
La composición farmacéutica en algunos aspectos puede emplear sistemas de administración de liberación prolongada, liberación retardada y liberación sostenida de tal manera que la administración de la composición se produzca antes y con tiempo suficiente para provocar la sensibilización del sitio a tratar. Se conocen y hay disponibles muchos tipos de sistemas de administración de liberación. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de la composición, aumentando de este modo la comodidad para el sujeto y el médico.
La composición farmacéutica en algunos casos contiene polipéptidos inmunomoduladores y/o células manipuladas en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. La eficacia terapéutica o profiláctica en algunos casos se monitoriza mediante la evaluación periódica de los sujetos tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles y pueden determinarse otros regímenes de dosificación. La dosificación deseada puede administrarse mediante la administración única en bolo de la composición, mediante administraciones múltiples en bolo de la composición o mediante la administración por infusión continua de la composición.
Los polipéptidos inmunomoduladores y/o las células manipuladas pueden administrarse usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. Se describen formulaciones y dispositivos, como jeringuillas y viales, para el almacenamiento y la administración de las composiciones. La administración de las células manipuladas puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo, pueden obtenerse células o progenitores inmunosensibles de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto compatible diferente. Las células inmunosensibles derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo, derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene una célula inmunosensible modificada genéticamente), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión).
Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorio. En algunos casos, las poblaciones celulares se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en la presente, incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunos casos, las poblaciones de células se administran a un sujeto usando administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
Las composiciones en algunos casos se proporcionan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas normalmente son más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y las composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente mediante inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un solvente o un medio dispersante que contiene, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando las células en un solvente, como mezcladas con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones también pueden liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponantes del pH, gelificantes o aditivos que mejoran la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. En algunos aspectos pueden consultarse textos estándar para preparar preparaciones adecuadas.
Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones para el uso para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
B. Métodos de administración
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden el polipéptido inmunomodulador, la célula manipulada o la composición de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno. Se describen métodos de administración de polipéptidos inmunomoduladores, células manipuladas y composiciones para tratar o prevenir enfermedades, afecciones y trastornos, incluyendo cánceres. En algunos casos, los polipéptidos inmunomoduladores, las células manipuladas y las composiciones se administran a un sujeto o paciente que tiene la enfermedad o afección particular que se va a tratar, por ejemplo, a través de terapia celular adoptiva, como terapia de células T adoptivas. En algunos casos, las células y composiciones descritas se administran a un sujeto, como un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad o afección. En algunos aspectos, los métodos tratan de este modo, por ejemplo, mejoran uno o más síntomas de la enfermedad o afección, como disminuyendo la carga tumoral en un cáncer que expresa un antígeno reconocido por una célula T manipulada.
Se conocen métodos para la administración de células manipuladas para terapia celular adoptiva y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones descritos. Por ejemplo, los métodos de terapia de células T adoptivas se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; la Patente de Estados Unidos N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Ver, por ejemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un humano u otro animal, y típicamente es un humano. En algunos casos, el sujeto, por ejemplo, el paciente, al que se administran los polipéptidos inmunomoduladores, las células manipuladas o las composiciones, es un mamífero, típicamente un primate, como un humano. En algunos casos, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser masculino y femenino y puede tener cualquier edad adecuada, incluyendo sujetos bebes, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos. En algunos casos, el sujeto es un mamífero no primate, como un roedor.
Como se usa en la presente, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, como "tratar" o "que trata") se refiere a la mejora o reducción completa o parcial de una enfermedad, afección o trastorno, o un síntoma, efecto adverso o resultado, o fenotipo asociado con los mismos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación de la estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. Los términos no implican la curación completa de una enfermedad o la eliminación completa de cualquier síntoma o efecto en todos los síntomas o resultados.
Como se usa en la presente, "retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa diferir, dificultar, ralentizar, retardar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (como el cáncer). Este retraso puede variar en la duración del tiempo, dependiendo del historial de la enfermedad y/o del individuo que se está tratando. Como es evidente para los expertos en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolle la enfermedad. Por ejemplo, puede retrasarse un cáncer en etapa tardía, como el desarrollo de metástasis.
"Prevenir", como se usa en la presente, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que aún no se le ha diagnosticado la enfermedad. En algunos casos, las células y composiciones descritas se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
Como se usa en la presente, "suprimir" una función o actividad es reducir la función o actividad en comparación con las mismas condiciones excepto por una condición o parámetro de interés, o alternativamente, en comparación con otra condición. Por ejemplo, las células que suprimen el crecimiento del tumor reducen la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia de células.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, células o composición, en el contexto de la administración, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones/cantidades y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado deseado, como como resultado terapéutico o profiláctico.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica o células manipuladas, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, como para el tratamiento de una enfermedad, afección, o trastorno, y/o efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y los polipéptidos inmunomoduladores o las células manipuladas administradas. En algunos casos, los métodos descritos implican la administración de polipéptidos inmunomoduladores, células manipuladas o composiciones en cantidades eficaces, por ejemplo, cantidades terapéuticamente eficaces.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, como se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
La enfermedad o afección que se está tratando puede ser cualquiera en la que la expresión de un antígeno esté asociada y/o implicada en la etiología de una enfermedad, afección o trastorno, por ejemplo, provoque, exacerbe o esté implicada de otro modo en dicha enfermedad, afección o trastorno. Las enfermedades y afecciones ejemplares pueden incluir enfermedades o afecciones asociadas con enfermedad maligna o transformación de células (por ejemplo, cáncer), enfermedad autoinmune o inflamatoria, o una enfermedad infecciosa, por ejemplo, provocada por un patógeno bacteriano, viral u otro. Los antígenos ejemplares, que incluyen antígenos asociados con varias enfermedades y afecciones que pueden tratarse, se han descrito anteriormente. En casos particulares, el polipéptido inmunomodulador y/o el receptor recombinante, por ejemplo, el receptor de antígeno quimérico o el TCR transgénico, se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección.
En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor, como un tumor sólido, linfoma, leucemia, tumor sanguíneo, tumor metastásico u otro tipo de cáncer o tumor.
En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa como, pero no limitadas a, infecciones virales, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus BK. En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide (RA), diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, esclerodermia, enfermedad de tiroides autoinmune, enfermedad de Grave, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, asma y/o una enfermedad o condición asociada con el trasplante.
En algunos casos, el antígeno asociado con la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en receptor de tirosina quinasa huérfano ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de hepatitis B, receptor anti-folato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 o 4, FBP, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, Hm W-MAA, IL -22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, efrinaB2, c D123, CS-1, c-Met, GD-2, y Ma Ge A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, como la ciclina A1 (CCNA1 ),y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos.
Los métodos y usos descritos incluyen métodos y usos para la terapia celular adoptiva. En algunos casos, los métodos incluyen la administración de las células manipuladas o una composición que contiene las células a un sujeto, tejido o célula, como una que tiene, está en riesgo o se sospecha que tiene la enfermedad, afección o trastorno. En algunos casos, las células, poblaciones y composiciones se administran a un sujeto que tiene la enfermedad o afección particular que se va a tratar, por ejemplo, a través de terapia celular adoptiva, como terapia de células T adoptivas. En algunos casos, las células o composiciones se administran al sujeto, como un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad o afección, mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o afección.
En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia de células T adoptivas, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra derivada de dicho sujeto. Por tanto, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, que necesita un tratamiento y las células, después del aislamiento y el procesamiento, se administran al mismo sujeto.
En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia de células T adoptivas, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir de un sujeto distinto del sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la terapia celular, por ejemplo, un primer sujeto. En tales casos, luego las células se administran a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos, el primer y el segundo sujetos son genéticamente idénticos. En algunos casos, el primer y el segundo sujetos son genéticamente similares. En algunos casos, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto. Las células pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado. La dosificación y la administración pueden depender en parte de si la administración es breve o crónica. Varios programas de dosificación incluyen, pero no se limitan a, administraciones individuales o múltiples durante varios puntos temporales, administración en bolo e infusión de pulsos.
En ciertos casos, las células, o poblaciones individuales de subtipos de células, se administran al sujeto en un intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones de células y/o esa cantidad de células por kilogramo de peso corporal como, por ejemplo, de 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1 mil millones de células, aproximadamente 5 mil millones de células, aproximadamente 20 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 40 mil millones células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), como de aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10 mil millones de células, aproximadamente 25 mil millones de células, aproximadamente 50 mil millones de células, aproximadamente 75 mil millones de células, aproximadamente 90 mil millones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), y en algunos casos de aproximadamente 100 millones de células a aproximadamente 50 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones células, aproximadamente 3 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 45 mil millones de células) o cualquier valor entre estos intervalos y/o por kilogramo de peso corporal. Las dosificaicones pueden variar dependiendo de los atributos particulares de la enfermedad o trastorno y/o del paciente y/u otros tratamientos.
En algunos casos, por ejemplo, cuando el sujeto es un humano, la dosis incluye menos de aproximadamente 1 x 108 células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, CAR) total, células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 108 de tales células, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 o 1 x 108 o el total de tales células, o el intervalo entre dos cualquiera de los valores anteriores.
En algunos casos, las células se administran como parte de un tratamiento de combinación, como simultánea o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, como un anticuerpo o una célula manipulada o un receptor o agente, como un agente citotóxico o terapéutico. Las células en algunos casos se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en relación con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente próxima en el tiempo como para que las poblaciones de células potencien el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunos casos, las células se administran antes que el uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, las células se administran después del uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, el uno o más agentes adicionales incluyen una citoquina, como IL-2, por ejemplo, para mejorar la persistencia. En algunos casos, los métodos comprenden la administración de un agente quimioterapéutico.
Después de la administración de las células, en algunos casos se mide la actividad biológica de las poblaciones de células manipuladas, por ejemplo, mediante cualquiera de varios métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T manipulada o natural u otra célula inmunitaria al antígeno, in vivo, por ejemplo, mediante imagenología, o ex vivo, por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células manipuladas para destruir las células objetivo puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos, por ejemplo, en Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) y Herman et al. J. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). En ciertos casos, la actividad biológica de las células se mide analizando la expresión y/o secreción de una o más citoquinas, como CD 107a, IFNy, IL-2, y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide analizando el resultado clínico, como la reducción de la carga tumoral.
En ciertos casos, las células manipuladas se modifican adicionalmente de varias maneras, de tal manera que se aumenta su eficacia terapéutica o profiláctica. Por ejemplo, el CAR o TCR manipulado expresado por la población puede conjugarse directa o indirectamente a través de un conector a una fracción de direccionamiento. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, el CAR o el TCR, a fracciones de direccionamiento es conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), y la Patente de Estados Unidos N° 5.087.616.
V. Definiciones
Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en el presente incluyen aspectos y variaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente en".
A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de intervalos. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalos es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, está incluido dentro de la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están incluidos dentro de la materia reivindicada, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la materia reivindicada. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) casos que están dirigidos a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a “aproximadamente X” incluye la descripción de “X”.
Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "positiva" para un marcador particular se refiere a la presencia detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión superficial detectada por citometría de flujo, por ejemplo, al teñir con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectar dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable por citometría de flujo a un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada al llevar a cabo el mismo procedimiento con un control emparejado por isotipo en condiciones por lo demás idénticas y/o a un nivel sustancialmente similar al de las células que se sabe que son positivas para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente mayor que el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.
Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de una presencia detectable sustancial sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión superficial detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior al de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control emparejado por isotipo en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente inferior al de las células que se sabe que son positivas para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.
El término "expresión", como se usa en la presente, se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido sobre la base de la secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico, como un gen. El proceso puede incluir transcripción, control postranscripcional, modificación postranscripcional, traducción, control postraduccional, modificación postraduccional o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en la presente, un sujeto incluye cualquier organismo vivo, como humanos y otros mamíferos. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos y animales no humanos, incluyendo animales de granja, animales deportivos, roedores y mascotas.
Como se usa en la presente, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado por el condición de interés. Un control también puede ser un control interno.
Tal como se usa en la presente, "enlazado operativamente" se refiere a la asociación de componentes, como una secuencia de ADN, por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo, y una secuencia o secuencias reguladoras, de tal manera que se permita la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) se unen a la secuencia reguladora. Por lo tanto, significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista.
Como se usa en la presente, "porcentaje (%) de identidad de secuencia" y "porcentaje de identidad" cuando se usan con respecto a una secuencia de nucleótidos (secuencia de nucleótidos de referencia) o una secuencia de aminoácidos (secuencia de aminoácidos de referencia) se definen como el porcentaje de residuos de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede lograrse de varias maneras que están dentro de la capacidad de la técnica, por ejemplo, usando software disponible públicamente como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando.
El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan en la presente "vectores de expresión". Entre los vectores se encuentran vectores virales, como vectores lentivirales.
A menos que se defina de otro modo, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología técnica y científica usados en la presente tengan el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica.
Los encabezados de las secciones usados en la presente tienen únicamente propósitos organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.
VI. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente con propósitos ilustrativos.
Ejemplo 1: Diseño de polipéptidos inmunomoduladores de IL-12
Se diseñaron polipéptidos inmunomoduladores de IL-12 de cadena sencilla (scIL-12) que incluían una o más fracciones de direccionamiento que se unen específicamente a una molécula o motivo objetivo particular, por ejemplo, para su uso en el direccionamiento, localización u orientación del polipéptido en o cerca de o en una orientación particular con respecto a una célula que expresa la molécula o motivo objetivo. Los constructos se sintetizaron como secuencias de cadena sencilla que codifican la subunidad p35 (expuesta en la SEQ ID NO: 10) y la subunidad p40 (expuesta en la SEQ ID NO: 11) de IL-12 unidas por un conector polipeptídico que contiene la fracción de direccionamiento y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos G4S(3) (SEQ ID NO:7) que unen la fracción de direccionamiento a las subunidades de IL-12.
La Tabla 3 expone las secuencias de polipéptidos inmunomoduladores de IL-12 ejemplares que contienen varias fracciones de direccionamiento derivados de: un péptido de unión a heparina de BMP4 (HBP BMP4; SEQ ID NO: 13), un péptido de unión a heparina de fibronectina (HBP FBN, SEQ ID NO: 14), un péptido de unión al factor de crecimiento de hepatocitos (HGFBP, SEQ ID NO: 15), un péptido de unión al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRBP; SEQ ID NO: 16) o un anticuerpo scFv anti-EPCAM (SEQ ID NO: 17). También se diseñó un polipéptido de control en el que el conector polipeptídico contenía un único conector G4S(3) (expuesto en la SEQ ID NO: 9) y ninguna fracción de direccionamiento que se uniera a las subunidades (designado scIL-12). Cada secuencia también se diseñó para que codificase una secuencia señal N-terminal derivada de CD33 (MPLLLLLPLLWAGALAM, SEQ ID NO:18) para la secreción de la proteína inmunomoduladora cuando se expresa en una célula. En algunos casos, se incluyeron una o más etiquetas en el extremo C-terminal (por ejemplo 6x etiquetas His, SEQ ID NO:20 o Strep-tag® II, SEQ ID NO:21).
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Ejemplo 2: Evaluación de la estimulación celular mediada por IL-12 por los polipéptidos inmunomoduladores Los polipéptidos inmunomoduladores de IL-12 ejemplares, scIL-12-HBP FBN (SEQ ID NO: 3) y scIL-12-EGFRBP (SEQ ID NO: 5), como se describe en el Ejemplo 1, se probaron para su actividad para estimular la secreción de citoquinas de células que expresan el receptor de IL-12 (IL-12R). Como control, se usaron como controles scIL-12 (SEQ ID NO: 1) que no contenía una fracción de direccionamiento integrada en su conector o IL-12 humana recombinante (rHuIL-12) (R&D Systems).
Se estimularon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con fitohemaglutinina (PHA) para generar blastos de PHA para regular por incremento la expresión superficial del receptor de IL-12 (IL-12R). Los blastos de PHA se estimularon con concentraciones aumentadas de varios polipéptidos inmunomoduladores o controles en concentraciones que variaban entre 0 y 25 ng/ml. A las 24 horas y 72 horas después de la estimulación de las células, se recogió el sobrenadante y se midió el interferón gamma (IFNy) de GM-CSF mediante ELISA. Los resultados se muestran en la FIG. 1.
Como se muestra en la FIG. 1, se observó un aumento dependiente de la dosis en IFNy y GM-CSF después de la estimulación de los blastos de PHA con los polipéptidos inmunomoduladores de IL-12 o controles. A las 24 horas posteriores a la estimulación, los blastos de PHA tratados con los polipéptidos de prueba scIL-12-HBP FBN y scIL-12-EGFRBP, así como el polipéptido de control scIL-12, mostraron niveles similares de IFNy y GM-CSF que los tratados con rHuIL- 12 en las varias concentraciones. Sin embargo, a las 72 horas después de la estimulación, los niveles de IFNy y GM-CSF fueron sustancialmente más altos en los blastos de PHA estimulados con cada uno de los polipéptidos de cadena sencilla (scIL-12-HBP FBN, scIL-12-EGFRBP o sc IL-12 G4S (3) polipéptidos) en comparación con blastos de PHA estimulados con rHuIL-12. Los resultados demostraron que las formas de cadena sencilla de polipéptidos inmunomoduladores de IL-12 que comprenden las subunidades p35 y p40 unidas por un conector polipeptídico, y que opcionalmente comprende una fracciónd e direccionamiento, pueden ser activadores de células inmunitarias más potentes que rHuIL-12.
Ejemplo 3: Evaluación de la proliferación de células T después de la estimulación con polipéptidos inmunomoduladores de IL-12
Se aislaron células T mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad de tres sujetos donantes humanos y las células de cada donante se activaron y transdujeron con un vector viral que codifica un CAR anti-CD19. El CAR contenía un scFv anti-CD19, un espaciador derivado de Ig, un dominio transmembrana derivado de CD28 humano, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB humano y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta humano. Se incubaron células objetivo que expresaban CD19 (células K562 transducidas para que expresasen CD19, K562-CD19) a 20.000 células por pocillo por triplicado en una placa recubierta con poli-D-lisina de 96 pocillos con las varias células T que expresaban CAR (a varias proporciones de efector: objetivo (5:1, 2,5:1, 1:1), solo o en presencia del polipéptido inmunomodulador scIL-12-HBP FBN (SEQ ID NO:3) ejemplar descrito en el Ejemplo 1 (ya sea a 0,5 ng /ml o 5 ng/ml). Se usó la incubación en presencia de las células objetivo sin el sclL2 como un control "no tratado".
Se determinó el cambio de veces en el número total de células en el Día 0 antes de la estimulación en comparación con el Día 5 después de la estimulación. Como se muestra en la FIG. 2, se observó un mayor aumento en el número de células en las células tratadas en presencia de scIL-12-HBP FBN, a 0,5 o 5 ng/ml, en comparación con las células de control no tratadas, en todas las proporciones de E:T probadas, consistente con la capacidad del polipéptido inmunomodulador para potenciar la proliferación y/o supervivencia celular en presencia de células objetivo que expresan antígenos.
Ejemplo 4: Actividad de destrucción de células T después de la exposición a polipéptidos inmunomoduladores de IL-12
Se cocultivaron células objetivo K562-CD19 que expresaban CD19 con células T que expresaban CAR anti-CD19 a varias proporciones de E:T, incluyendo 5:1, 2,5:1 y 1:1, como se describe en el Ejemplo 3. Los cocultivos se incubaron en presencia de scIL-12-HBP FBN (SEQ ID NO:3) como se describe en el Ejemplo 1 a 0,5 o 5 ng/ml o se dejaron sin tratar. Se monitorizó en tiempo real la lisis celular durante un período de tiempo de 0 a aproximadamente 110 horas mediante la adición de un reactivo de caspasa 3/7 fluorescente IncuCyte™ a los cocultivos para detectar células apoptóticas. La muerte de las células objetivo se cuantificó mediante análisis de imágenes automatizado a lo largo del tiempo. Se determinó el área bajo la curva (AUC) de la señal fluorescente a lo largo del tiempo para cada concentración. Se determinó un índice de destrucción usando la fórmula: 1/AUC.
La FIG. 3 expone el índice de destrucción para cada condición probada. Como se muestra en la FIG. 3, la estimulación de células en presencia de polipéptidos scIL-12-HBP FBN mejoró la destrucción de células T de células objetivo en todas las proporciones de E:T en comparación con las células de control no tratadas.
Ejemplo 5: Unión al receptor de IL-12 (IL-12Rb)
Se probaron polipéptidos inmunomoduladores de IL-12 de cadena sencilla (scIL-12), scIL-12-G4S (SEQ ID NO:1), scIL-12-HBP FBN (SEQ ID NO:3) y scIL-12-EGFRBP (SEQ ID NO:3) y scIL-12-EGFRBP (SEQ ID NO: 5) ejemplares, como se describe en el Ejemplo 1, para determinar la unión funcional a la subunidad beta del receptor de IL-12 (IL-12Rb) mediante resonancia de plasmones superficiales. También se evaluó la unión de ROR1-Fc a IL-12Rb como control negativo. Se usó un chip de captura anti-hIgG para inmovilizar IL-12Rb-hIgG1 Fc (adquirido de R&D Systems). Se hicieron fluir aproximadamente 30 nM de moléculas de scIL-12 sobre el IL-12Rb inmovilizado para evaluar la unión usando un instrumento de resonancia de plasmones de superficie Biacore. Los resultados se muestran en la FIG. 4. Los resultados muestran que scIL-12 que contiene una secuencia conectora sola (G4S) o conectores que contienen una fracción de direccionamiento, pero no ROR1-Fc, pudieron unirse funcionalmente al receptor de IL-12 (IL-12Rb).
Ejemplo 6: Unión a células que expresan moléculas objetivo
Los polipéptidos inmunomoduladores de scIL-12 ejemplares descritos en el Ejemplo 1 se marcan detectablemente y se incuban con células objetivo que se sabe (o que están manipuladas para) que expresan moléculas objetivo ejemplares (incluyendo heparina, EGFR o HGFR), capaces individualmente de unirse a la fracción de direccionamiento contenida dentro de uno de los polipéptidos inmunomoduladores de scIL-12 dado. Como controles, las células también se incuban con scIL-12 de control que no contiene la fracción de direccionamiento respectiva y/o se incuba rhIL-12 y/o scIL-12 que contiene la fracción de direccionamiento en presencia de células que no expresan la molécula o motivo objetivo de la misma reconocido por la fracción de direccionamiento, o lo hace a niveles más bajos.
La unión se evalúa mediante citometría de flujo u otros métodos, según sea apropiado, y se compara entre las diferentes condiciones; en algunos aspectos, la unión aumentada en la condición que implica a scIL-12 con una fracción de direccionamiento en comparación con uno o más de los controles, indica la especificidad del reactivo de IL-12 de cadena sencilla manipulado para moléculas o motivos objetivo reconocidos por la fracción de direccionamiento, apoyando aún más la utilidad de scIL-12 en una enfermedad, afección o entorno en el que el objetivo se expresa o se sospecha que se expresa o se expresa preferiblemente.
E EN IA
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Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido inmunomodulador que comprende:
a) un primer péptido que comprende una subunidad p35 de IL-12;
b) un segundo péptido que comprende una subunidad p40 de IL-12; y
c) una región de unión que conecta el primer y el segundo péptidos, en donde la región de unión comprende una fracción de direccionamiento que se une a una molécula objetivo.
2. El péptido inmunomodulador de la reivindicación 1, en donde la subunidad p35 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la misma y/o la subunidad p40 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la misma.
3. El péptido inmunomodulador de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la subunidad p35 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 y/o la subunidad p40 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11.
4. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la fracción de direccionamiento está comprendida entre un primer conector polipeptídico y un segundo conector polipeptídico.
5. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la molécula objetivo es un antígeno tumoral; y/o
la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (hGfR), heparina, VEGF, VEGF-A, VEGFR2, VEGFR3, HER2 , PD-1, tenascina-C , CTLA-4, LAG3, PD-L1, EGFR, EPCAM, RANKL, proteoglicano NG2, CD20, CD52, CD19, CD3, CD30, IL-6, CD38, SLAMF7, GD2, CD13, CD274, CD279, CD40L y CD47.
6. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la fracción de direccionamiento es o comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, opcionalmente en donde la fracción de direccionamiento comprende una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: trastuzumab, pertuzumab, ramucirumab, atezolizumab, bevacizumab, panitumumab, cetuximab, necitumumab, denosumab, nivolumab, pembrolizumab, rituximab, ofatumumab, obinutuzumab, alemtuzumab, blinatumomab, brentuximab vedotin, siltuximab, ipilimumab, daratumumab, elotuzumab, dinutuximab , Catumaxomab; o una cadena Vh y /o una cadena Vl de un anticuerpo anti-EPCAM.
7. El polipéptido inmunomodulador de la reivindicación 6, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento de cadena sencilla, en donde opcionalmente el fragmento de anticuerpo comprende un anticuerpo de dominio único que comprende la región de cadena pesada variable o un scFv.
8. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la fracción de direccionamiento comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 17, 24 o 25, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, 24 o 25 y se une a la molécula objetivo.
9. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el polipéptido inmunomodulador comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con dicha secuencia.
10. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la fracción de direccionamiento es o comprende un motivo de unión a péptido, opcionalmente en donde la fracción de direccionamiento es un péptido de unión a heparina (HBP), opcionalmente en donde el HBP se deriva de fibronectina o BMP4, y/ o es de origen bovino; y/o
opcionalmente en donde la fracción de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en: un péptido de unión al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a VEGF-A, un péptido de unión a VEGFR2, un péptido de unión a EPCAM, un péptido de unión a HER2, un péptido de unión a PD-1, un péptido de unión a tenascina-C, un péptido de unión a CTLA-4, un péptido de unión a LAG3, un péptido de unión a PD-L1, un péptido de unión a EGFR, un péptido de unión a RANKL, un péptido de unión a CD20, un péptido de unión a CD52, un péptido de unión a CD19, un péptido de unión a CD3, un péptido de unión a CD30, un péptido de unión a IL-6, un péptido de unión a CD38, un péptido de unión a SLAMF7, un péptido de unión a GD2, un péptido de unión a CD274, un péptido de unión a CD279, un péptido de unión a CD40L y un péptido de unión a CD47.
11. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la reivindicación 10, en donde (a) la fracción de direccionamiento comprende un péptido de unión a HGF o un péptido de unión a EGFR (EGFRBP); y/o
(b) la fracción de direccionamiento comprende la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 26, 27 o 28, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ iD NO: 13, 14, 15, 16, 26, 27 o 28 y se une a la molécula objetivo.
12. El polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o las reivindicaciones 10-11, en donde el polipéptido inmunomodulador comprende la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 2-5, o una secuencia que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2-5.
13. Un polinucleótido que codifica el polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14. El polinucleótido de la reivindicación 13, que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido inmunomodulador y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un receptor recombinante, en donde opcionalmente el receptor recombinante es o comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR).
15. Un vector, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde opcionalmente el vector es un vector vírico, opcionalmente en donde el vector es un vector retroviral.
16. Una célula manipulada que comprende el polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1­ 12, el polinucleótido de la reivindicación 13 o 14, o el vector de la reivindicación 15, opcionalmente en donde la célula manipulada secreta el polipéptido inmunomodulador.
17. La célula manipulada de la reivindicación 16, que comprende además un receptor recombinante, opcionalmente en donde el receptor recombinante se une a un antígeno objetivo que está asociado con una enfermedad o trastorno, opcionalmente en donde el antígeno objetivo es un antígeno tumoral, opcionalmente en donde el receptor recombinante es un CAR .
18. La célula manipulada de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en donde la célula manipulada es una célula T, opcionalmente una célula T CD8+ o una célula T CD4+.
19. Una composición que comprende el polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o la célula manipulada de cualquiera de las reivindicaciones 16-18, que opcionalmente comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
20. Una composición que comprende el polipéptido inmunomodulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, la célula manipulada de cualquiera de las reivindicaciones 16-18, o la composición de la reivindicación 19, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno, en donde opcionalmente la enfermedad o trastorno es un cáncer, un tumor, una enfermedad o trastorno autoinmune, o una enfermedad infecciosa.
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