KR20220133943A - 치료 단백질의 리간드-매개된 전달 및 이의 용도 - Google Patents

치료 단백질의 리간드-매개된 전달 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220133943A
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마르사 엘. 피게이레도
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Abstract

본 발명은 일반적으로 유전자 전달 및 다양한 질환의 치료적 처치를 위한 옵션에 유용한 조성물 물질 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 케모카인 또는 시토카인의 유전자, 표적화 폴리펩티드에 대한 유전자 및 하나 이상의 폴리펩티드 링커에 대한 유전자를 포함하는 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 사용 방법 및 조성물 물질은 본 개시내용의 범위 내에 있다.

Description

치료 단백질의 리간드-매개된 전달 및 이의 용도
정부 지원 조항
본 발명은 둘 다 국립 보건원에 의해 수여된 계약 CA196947 및 AR069079 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 특허 출원은 2020년 1월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/967,767에 관한 것으로 이의 우선권 이익을 주장하며, 이의 내용은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록의 진술
서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형태 (CRF)가 본 출원과 함께 제출된다. 68875-02_Seq_Listing_ST25_txt라는 명칭의 파일은 2020년 12월 28일에 생성되었다. 본 출원인은 컴퓨터 판독 가능 형태의 내용이 동일하고 컴퓨터 판독 가능 형태에 기록된 정보가 본원에서의 서면의 서열 목록과 동일하다고 진술한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 유전자 전달 및 다양한 질환의 치료적 처치를 위한 옵션에 유용한 조성물 물질 및 방법, 특히 하나 이상의 링커와 함께 케모카인 또는 시토카인, 표적화 폴리펩티드의 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 사용 방법 및 조성물 물질은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
이 섹션은 본 개시내용의 더 나은 이해를 용이하게 하는데 도움이 될 수 있는 측면을 소개한다. 따라서, 이들 진술은 이러한 관점에서 읽어야 하며 선행 기술인지 아닌지에 대한 인정으로 이해되어서는 안된다.
본 발명자들의 그룹 및 다른 그룹은 이전에 시토카인 인터루킨-27 (IL-27)이 이의 다기능 (면역 자극, 항-혈관형성, 골형성촉진) 활성을 기반으로 관절염1 및 악성 종양2-4에 대한 유망한 치료제임을 밝혔다. 예컨대, IL-27은 파골세포 형성을 방지하고 골-전이성 종양 치료를 위한 주요 치료 특색인 조골세포 분화2,3를 촉진하는데 도움이 되었다. 이와 같이, IL-27의 생체내 유전자 전달은 종양 성장 속도를 상당히 감소시키고 골 밀도를 정상화시켰다4. IL-27은 각각 IL-12 서브유닛 p35 및 p40과 관련된 서브유닛 IL-27p28 및 EBI3 (엡스테인-바르 바이러스-유도된 유전자 3)으로 구성된 이종이량체 시토카인이다. IL-27은 면역조절제이며 원래 미생물 또는 숙주 면역 자극에 대한 반응으로 항원-제시 세포에 의해 주로 생성되는 것으로 생각되었다. 그러나, 최근 IL-27은 종양 발달에 대한 면역 반응을 조절하고 골 복구를 촉진하기 위해 염증 또는 감염 반응을 감지하는 '알람' 역할을 하는 것에 관여하는 것으로 밝혀졌다5. WSX1 및 gp130 서브유닛으로 구성된 이종이량체인 IL-27에 대한 수용체는 림프 기관, 골, 정상 및 종양 상피 세포6,7, 흑색종8 및 백혈병9에서 고도로 발현된다. IL-27 신호전달은 T-bet, IFNγ 및 IL12-Rβ2 발현을 유도하여 Th1 분화의 개시를 촉진한다10,11. 전신12 또는 종양내2 IL-27 치료는 독성 없이 종양을 제거한다. IL-27은 또한 CXCL9-10의 유도를 통한 자연 살해 및 세포독성 T 림프구 반응의 유도 또는 혈관형성의 억제와 같은 간접적인 메커니즘을 통해 항종양 활성을 나타낸다12.
생체내 IL-27 요법 전달과 관련하여, 본 발명자들은 임상적으로 안전한 초음파 (US) 주파수를 활용하여 세포 공동화를 유도하고 소노포레이션 (sonoporation) (즉, 소노딜리버리 (sonodelivery))을 통해 플라스미드 DNA를 전달하는 방법을 선택하였다2. 이 방법을 이용한 이전 연구에서는 유전자 전달 효율이 아데노바이러스와 비슷할 수 있음을 보여주었다2. 본 발명자들은 이전에 리포터 유전자 플라스미드를 사용하여 소노딜리버리 조건을 최적화하였으며, 마이크로버블-보조된 소노포레이션의 존재 하에서 플라스미드 DNA (pDNA)를 rNLSd로 불리는 신규한 양이온성 중합체와 복합화하는 것으로 이루어진 최상의 접근 방식을 발견하였다13. 이전 연구에서 본 발명자들은 야생형 IL-27 소노딜리버리가 골 파괴를 늦추고 종양 성장을 억제한다는 것을 관찰하였다4. 그러나, 이 접근법의 하나의 한계는 종양 성장 속도는 감소했지만 종양이 완전히 근절되지 않는 중간 정도의 효능이었다. 아주 최근에, IL-27 전달은 자가면역 관절염을 제어하기 위해 펩티드-접합된 리포솜 (ART1-IL-27) 내에 시토카인을 삽입하는 것을 포함하는 창의적인 방법을 이용하였다14. 이들 ART-1-IL-27 리포솜은, 관절염 래트에게 정맥내 주사했을 때, 동등한 용량에서 ART-1 또는 유리 IL-27이 없는 대조군 IL-27 리포솜보다 질환 진행 억제에 더 효과적이었다. ART-1-유도된 리포솜 IL-27은 더 높은 안전성 프로필 및 개선된 치료 지수를 제공하였으며, 이는 펩티드가 향상된 효능 및 감소된 전신 노출과 함께 생물제제 또는 소분자 화합물을 포함하는 표적화된 전달을 위한 단백질 또는 나노입자를 표적화하는데 사용될 수 있다는 개념을 뒷받침한다. 본 발명자들은 인터루킨-6 (IL-6) 수용체와 같은 종양 세포에서 상향조절된 수용체에 결합할 수 있는 펩티드를 활용하여 종양 조직에 시토카인을 표적화하는 것이 IL-27 생체활성을 증가시키는데 도움이 될 수 있다고 가정하였다.
IL-6 수용체를 표적화하기 위해, 본 발명자들은 문헌으로부터의 후보 헵타펩티드인 LSLITRL (S7 및 'pepL'; 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1)을 선택하였으며, 이는 7-mer 무작위 사이클릭 파지 디스플레이 스크린으로부터 처음으로 확인되었으며, IL-6 수용체 알파 서브유닛 (IL-6Rα)을 표적화한다15. 이 pepL은 용량-의존적 방식으로 IL-6Rα에 대한 IL-6 결합을 억제하였으며, IL-6Rα-발현 세포주의 형질막에 결합할 수 있었다. pepL의 활성은 IL-6Rα에 대한 IL-6 결합을 길항하고 Akt 및 ERK1/2 MAPK의 포스포릴화를 억제하는 능력에 기인하였다. 이 펩티드는 생체내에서 C33A 인간 자궁경부 암종 성장을 ~75%까지 감소시키고 종양에서 아폽토시스 세포 사멸을 유도하여 pepL을 치료 및 표적화 펩티드 둘 다로 확립하였다.
본 발명자들은 또한 짧은 링커 (GGGGS; 서열식별번호: 2)를 통해 시토카인의 C-말단에 부착된 ~7-12개의 아미노산 펩티드 리간드를 사용하여 표적화를 촉진하는 시토카인 조작을 위한 "모델" 전략을 보고하였다16. 분비되는 분자의 이러한 C-말단 변형은 종양 부위에서의 표적화 및 축적을 가능하게 한다. 본 발명자들은 종양에서 치료 시토카인 분비, 표적화 및 축적을 모방하기 위해 분비되는 루시페라제 (가우시아 (Gaussia) Luc 또는 GLuc)로 이 개념을 조사하였다. 소노딜리버리는 pDNA에 복합화된 생체적합성 중합체와 함께 이용되어 나노플렉스를 생성하였으며, 이는 마이크로버블과 함께 전달되고 초음파-강화된 근육 트랜스펙션을 달성하기 위해 음파처리되었다.
병든 골 조직을 회복시키면서 전립선 종양을 동시에 효과적으로 치료할 수 있는 치료제가 없다. 시토카인 면역요법은 1차 및 원위 2차 종양 둘 다에 도달하고 이를 치료할 수 있는 분비되는 분자이기 때문에 큰 가능성을 가지고 있다. 따라서, 이중의 치료 및 표적화 C-말단 펩티드인 pepL을 사용한 IL-27 표적화는 생체내에서 전립선 종양에 대한 시토카인 생체활성 및 효능을 증강시킬 수 있다.
이제 본 개시내용의 실시양태가 첨부된 도면을 참조하여 예로서 더 상세하게 설명될 것이다.
도 1A-1D는 C-말단 '펩티드 L' (pepL)이 조작된 시토카인 모델 단백질 (가우시아 Luc)을 종양 세포로 표적화할 수 있음을 도시한다. 도 1A는 마우스 및 인간 IL6-Rα의 정렬을 나타내고 이 두 종 사이의 구조적 상동성의 정도를 나타내고; 도 1B는 재료 및 방법에서 자세히 설명되는 바와 같이 마우스 또는 인간 IL6Rα와의 pepL 상호작용 모델을 나타낸다. 도 1C는 STAT1- 또는 STAT3-luc 리포터 검정이 비-특이적 대조군 유리 펩티드 (ns pep)에 비해 유리 pepL (IL6-Rα를 표적화하는 펩티드)에 의한 STAT1의 상향조절 뿐만 아니라 STAT3의 상향조절을 나타낸다는 것을 입증한다. 관련 없는 단백질 (가우시아 Luc 또는 Gluc)에 대한 pepL 또는 비특이적 대조군의 조작은 pepL이 ns pep 대조군에 비해 STAT1을 활성화시키는 것을 가능하게 하였지만 STAT3에 대해서는 그러하지 못하였다. 세포를 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 STAT3-luc 리포터 벡터로 트랜스펙션시키고 대조군 또는 펩티드-변형된 Gluc를 함유하는 조건 조절된 배지 (C2C12 세포에서 생성됨)로 처리하였다. *, p<0.05 STAT1- 또는 STAT3-Luc 활성의 대조군 (ns pep 또는 Gluc.ns) 수준 대비. 도 1D는 세포에 대한 Gluc 결합을 검출하기 위한 시험관내 검정을 나타낸다. C-말단에서 조작된 Gluc (Gluc-ns 또는 pepL)는 C2C12 근육 세포에서 포유동물 발현 벡터로부터 발현되었다. 배양 조건 조절된 배지 (CCM)를 수집하여 정상 (AD293, HEPG2 또는 NHPre1), 종양 세포 (PC3, RM1, TC2R), 또는 분화 골 세포 (OB, MC3T3E1-14 프리조골세포 및 OC, RAW264.7, 제4일)를 사용하는 결합 검정에 사용하였다. *, p<0.05 Gluc-ns CCM 대비.
도 2A-2B는 생체내에서 GLuc 융합 단백질의 소노딜리버리를 입증한다. 도 2A는 마우스 근육에서 가우시아 루시페라제 (GLuc) 단백질을 발현하기 위한 소노딜리버리의 개략도를 나타낸다. 나노플렉스는 참조문헌11에 기재된 바와 같이 제조된 rNLSd 중합체에 의해 형성되고, GLuc를 코딩하는 플라스미드 DNA와 복합화되었다. 이 나노플렉스는 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 마이크로버블 (MB)의 존재 하에 전달된다. MB를 파괴하기 위해 초음파 자극 (US)이 적용되고, 중합체:pGluc의 나노플렉스가 골격근 세포 트랜스펙션을 매개한다. 분비되는 단백질은 IL6-Rα (pepL)을 표적화하거나 표적화되지 않는 (비-특이적 펩티드 대조군) C-말단 펩티드 태그를 함유한다. 도 2B는 유전자 전달 후 생체외 GLuc 이미징을 나타낸다. 생물발광 이미징은 대조군 (Gluc-ns) 또는 리간드 표적화된 GLuc (Gluc-pepL)을 받은 동물로부터 단리된 기관에서 코엘렌테라진 기질을 사용하여 표시된다. 컬러 바, p/sec/cm2/sr. 신호는 표적화된 Gluc-pepL이 근육에 전달될 때만 종양:골 영역에 존재한다. 우측 플롯, 전달 후 제10일 및 제14일부터 생체외에서 풀링된 종양:골로부터의 평균 Gluc 신호 (*, p<0.013 종양 조직에서 GL.ns 축적 대비 GL.pepL을 비교하기 위함) (정상 기관에서의 축적은 GL.ns와 GL.pepL 사이에 유의한 차이가 없음). 마우스는 경골내에 TC2R 종양을 보유하고 있었다.
도 3A-3C는 리간드-표적화된 인터루킨-27이 생체내에서 향상된 생체활성을 갖고 표적 세포에서 STAT1 및 IFNγ 신호전달을 자극함을 입증한다. 도 3A는 IL-27p28 및 EBI3 서브유닛, G4S 링커, 및 pepL 펩티드를 나타내는 IL-27pepL의 모델을 나타낸다. 도 3B는 TC2Ras 전립선암 세포를 사용한 생체내에서의 IL-27pepL의 생체활성을 나타낸다. 세포를 STAT1 결합 부위 또는 IFNγ 프로모터를 함유하는 루시페라제 리포터 벡터로 트랜스펙션시켜 '리포터 세포'를 생성하였다. 동일한 수의 리포터 세포 (7.7x105)를 12.5 μg의 플라스미드 DNA (빈 대조군 pMCS, C-말단에 비-특이적 펩티드 (ns)를 갖는 IL-27, 또는 C-말단-표적화된 IL-27 (IL-27pepL))를 소노포레이션에 의해 3일 전에 뒤쪽 대퇴부에 받은 C57BL6 수컷 (n=6)의 옆구리에 이식하였다. pDNA를 소노딜리버리 (중합체 NLSd+초음파+MB)를 통해 전달하였다. 세포 주사 후 24시간 (즉, pDNA의 소노포레이션 후 제4일)에, IL-27ns 또는 IL-27pepL의 효과는 루시페린 기질의 존재 하에 시각화될 수 있다. 생물발광 신호는 IVIS100 제노겐 (Xenogen) 이미저를 사용하여 pIL-27ns 및 pIL-27pepL을 받은 동물에서만 검출 가능하였고 pMCS 대조군 벡터에서는 그렇지 않았다. 컬러 바, p/sec/cm2/sr. 도 3C는 pMCS-처리 대비 pIL-27ns 또는 pIL-27pepL의 루시페라제 활성의 배수 증가를 나타낸다. pIL-27ns로 처리된 동물은 pMCS 대조군 벡터에 비해 Luc 활성이 증가하였다 (*, p<0.04). pIL-27pepL을 받은 동물은 pIL-27ns 처리 부위 대비 Luc 활성이 추가로 증가하였다 (#, p<0.03).
도 4A-4B는 표적화된 IL-27이 파라크린 및 오토크린 신호전달 둘 다를 활용함을 입증한다. 도 4A는 pepL-변형된 IL-27이 신호전달의 오토크린 모드를 활용함을 나타낸다. 오토크린 설계에서, IL-27을 발현하는 플라스미드는 리포터 플라스미드 (STAT1/GAS/ISRE-Luc 또는 STAT1-luc)와 함께 전달되었다. IL-27 C-말단 pepL (IL-27pepL)은 과발현된 표적화 수용체 (IL6Rα)에 시토카인의 앵커링을 허용한다. 시토카인은 발현되고 IL27R에 작용하여 STAT1 신호전달을 매개한다. 도 4B는 PepL이 파라크린 모드에서도 IL-27 신호전달을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 파라크린 설계에서, 분화 조골세포 (OB, MC3T3E1-14, 제4일) 또는 상피 세포 (TC2r)를 STAT1/GAS/ISRE-Luc (STAT1-luc)로 트랜스펙션시킨 다음, IL-27ns, IL-27pepL 또는 빈 벡터 대조군을 발현하는 다른 세포 유형과 혼합하였다. 신호를 전달하기 위해, IL-27pepL은 한 세포 유형으로부터 분비되고 신호전달을 유도하기 위해 다른 세포 유형 (STAT1-luc 보유)에 결합해야 했다. 오토크린 설계에서, pSTAT1-Luc 및 pIL-27을 공동트랜스펙션시켰다. 파라크린 신호전달 효과는 항-IL6Ra 차단 항체 (Ab)로 전처리 (30분)하여 차단될 수 있다. *, p<0.04 vs ctrl, #, p<0.05 vs IL-27ns. *, p<0.05 vs 대조군 mcs 또는 세포 공동배양 없음 (comix); #, p<0.05 vs 27ns; $, p<0.05 AB 27L vs 27L
도 5A-5D는 TC2R에서 유전자 전달 후 qPCR 분석에 의한 차등적 유전자 발현을 입증한다. 대조군 (pMCS), pIL27ns, 및 pIL27pepL을 사용한 TC2R 세포의 유전자 전달, 및 qPCR 분석 후, pIL27ns 또는 pIL27pepL로 트랜스펙션된 세포는 대조군 대비 유전자 발현의 상향-조절 (적색) 및 하향-조절 (청색)의 상이한 패턴을 가졌다. 대조군 pMCS 대비 발현의 배수 변화는 트랜스펙션 후 24시간에 표시된다: 도 5A는 전달된 유전자 (IL27p28 및 EBI3)를 나타내고, 도 5B는 IL-6 및 IL-27 반응성 또는 표적 유전자를 나타낸다. 도 5C는 종양 미세환경 중의 시토카인을 나타내는 유전자를 나타내고, 도 5D는 면역원성 유전자를 나타낸다. *, p<0.05 대조군 pMCS 트랜스펙션된 세포 대비; #, p<0.05 pIL27.ns 트랜스펙션된 세포 대비.
도 6A-6B는 IPA에 의해 IL27ns와 IL27pepL을 발현하는 세포 사이에서 변경될 것으로 예측되는 표준 경로의 히트맵을 도시한다. 재료 및 방법에 기재된 IPA 분석에 따라 IL27ns 및 IL27pepL을 발현하는 플라스미드 (둘 모두 pMCS 벡터 대조군에 대해 보정됨)로 트랜스펙션된 TC2R 세포 샘플 간에 비교 분석을 수행하였다. 도 6A는 IL27.ns와 IL27.pepL 처리 간에 상이한 표준 경로를 나타낸다. 컬러 바, 활성화 z-점수; 도 6B는 IL-27ns와 IL-27pepL 처리 간에 상이한 세포 및 유기체 기능을 나타낸다. 컬러 바, -log(B-H p-값).
도 7A-7C는 IL-27 표적화가 생체내에서 항종양 활성을 향상시킨다는 것을 입증한다. 도 7A는 TC2R 전립선 종양 모델을 나타낸다. 암 세포를 C57/BL6 수컷 마우스에 피하 이식하고 종양 성장에 이어 시간 경과에 따른 캘리퍼 측정을 수행하였으며 mm3으로 표시한다. pIL-27-pepL은 TC2R 종양 성장을 감소시키는데 있어 pIL-27ns 및 빈 벡터 대조군 (pMCS)보다 효과적이다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 마이크로버블 및 초음파의 존재 하에 NLSd 중합체에 복합화된 pMCS, pIL-27ns, 또는 pIL-27pepL을 코딩하는 플라스미드 (12.5 μg)는 뒤쪽 대퇴부에 I.M. 소노포레이션에 의해 전달되었다. *, p<0.05 pMCS-처리된 대조군 종양 대비; #, p<0.05 pIL-27ns로 처리된 마우스 대비. 도 7B는 초기 시점 (제7-11일)을 제외하고 일반적으로 pIL-27ns 또는 pIL-27pepL을 받은 동물 사이에서 IL-27의 혈청 수준이 유의하게 다르지 않음을 나타낸다 (*, p<0.05). 도 7C는 IL-27 표적화가 TC2R 전립선 종양에 대한 이펙터 세포 동원을 향상시킨다는 것을 입증한다. *, p<0.05 pMCS 대비; #, p<0.05 pIL27ns 대비.
표 1. 독창적 경로 분석 (Ingenuity Pathway Analysis)에 의해 분석된 qPCR 데이터 - 처리에 따른 업스트림 조절자 - 예측된 활성화 또는 억제 및 데이터세트에서 이들의 표적 분자.
서열 목록의 간단한 설명
서열식별번호: 1 및 8-17은 표적화 폴리펩티드이다:
Figure pct00001
.
서열식별번호: 2, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser은 링커 펩티드이다.
서열식별번호: 3, EDLGREK는 비-특이적 대조군 펩티드이다.
서열식별번호: 4, Val-Lys-Arg-Lys-Lys-Lys-Pro는 제형에 사용되는 중합체에 대한 펜던트 펩티드이다.
IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 마우스의 IL-27:
Figure pct00002
IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 인간 IL27에 대해:
Figure pct00003
.
IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 개 IL27에 대해:
Figure pct00004
.
상세한 설명
본 개시내용의 원리에 대한 이해를 촉진하기 위해, 이제 도면에 예시된 실시양태를 참조할 것이며, 이를 설명하기 위해 특정 언어가 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고 이에 의해 본 개시내용의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다.
본 개시내용에서 용어 "약"은 값 또는 범위에서 어느 정도의 가변성, 예컨대 명시된 값 또는 명시된 범위 한계의 20% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 또는 1% 이내를 허용할 수 있다.
본 개시내용에서, 용어 "실질적인" 또는 "실질적으로"는 값 또는 범위에서 어느 정도의 가변성, 예컨대 명시된 값 또는 명시된 범위 한계의 80% 이내, 90% 이내, 95% 이내, 또는 99% 이내를 허용할 수 있다.
본 문서에서, 단수 형태의 용어는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 포함하는데 사용된다. 용어 "또는"은 달리 지시되지 않는 한 비배타적인 "또는"을 지칭하는데 사용된다. 또한, 달리 정의되지 않은, 본원에 사용된 어구 또는 용어는 단지 설명을 위한 것이며 제한을 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 임의의 섹션 제목의 사용은 문서의 읽기를 돕기 위한 것이며 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 섹션 제목과 관련된 정보는 해당 특정 섹션 내부 또는 외부에서 발생할 수 있다. 또한, 본 문서에서 언급된 모든 공개문, 특허 및 특허 문서는 참조로 개별적으로 포함된 것처럼 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본 문서와 참조로 포함된 문서 사이에 사용이 일치하지 않는 경우, 포함된 참조문헌에서의 사용은 본 문서의 사용을 보완하는 것으로 간주되어야 하며; 양립할 수 없는 불일치의 경우 본 문서에서의 사용이 우선한다.
본원에 사용된 용어 "염" 및 "제약상 허용되는 염"은 모 화합물이 이의 산 또는 염기 염을 제조함으로써 변형되는 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 제약상 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 기의 무기산 또는 유기산 염; 및 카르복실산과 같은 산성 기의 알칼리 또는 유기 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은, 예컨대 비-독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 비-독성 염 또는 4차 암모늄 염을 포함한다. 예컨대, 이러한 통상적인 비-독성 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 술팜산, 인산 및 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 염; 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산 및 이세티온산 등과 같은 유기산으로부터 제조된 염을 포함한다.
제약상 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매에서, 또는 이 둘의 혼합물에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조될 수 있으며; 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아진다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 관련 기술분야에서 인정되며, 임의의 대상 조성물 또는 이의 성분을 운반 또는 수송하는데 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상-허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭한다. 각각의 담체는 대상 조성물 및 이의 성분과 맞고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 제약상 허용되는 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 하기를 포함한다: (1) 락토스, 글루코스 및 슈크로스과 같은 슈가; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 이의 유도체; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원이 없는 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 버퍼 용액; 및 (21) 제약 제형에 사용되는 다른 비-독성의 적합한 물질.
본원에 사용된 용어 "투여하는"은 경구 (po), 정맥내 (iv), 근육내 (im), 피하 (sc), 경피, 흡입, 협측, 안구, 설하, 질, 직장 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 환자에게 본원에 기재된 화합물 및 조성물을 도입하는 모든 수단을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 통상적인 비독성의 제약상 허용되는 담체, 애주번트 및 비히클을 함유하는 단위 투여 형태 및/또는 제형으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 예시적인 포맷은 정제, 캡슐, 엘릭시르, 시럽 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 예시적인 경로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막외, 요도내, 흉골내, 근육내 및 피하 뿐만 아니라 비경구 투여의 임의의 다른 관련 기술분야에서 인정된 경로를 포함한다.
비경구 투여의 예시적인 수단은 바늘 (미세바늘 포함) 인젝터, 바늘이 없는 인젝터 및 주입 기술 뿐만 아니라 관련 기술분야에서 인정되는 임의의 다른 비경구 투여 수단을 포함한다. 비경구 제형은 전형적으로 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 약 3 내지 약 9 범위의 pH)와 같은 부형제를 함유할 수 있는 수용액이지만, 일부 적용의 경우에는 멸균된 비-수성 용액으로 또는 멸균된 발열원이 없는 물과 같은 적합한 비히클과 함께 사용되는 무수 형태로 더욱 적합하게 제형화될 수 있다. 멸균 조건 하에, 예컨대 동결건조에 의한 비경구 제형의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 제약 기술을 이용하여 용이하게 달성될 수 있다. 화합물의 비경구 투여는 예시적으로 식염수 용액의 형태로 또는 리포솜에 삽입된 화합물로 수행된다. 화합물이 그 자체로는 용해될 만큼 충분히 가용성이 아닌 경우, 에탄올과 같은 가용화제가 적용될 수 있다.
청구된 조합물의 각각의 화합물의 용량은 투여 방법, 치료될 병태, 병태의 중증도, 병태가 치료 또는 예방되어야 하는지의 여부, 및 치료될 사람의 연령, 체중, 및 건강을 포함하는 여러 요인에 따라 다르다. 또한, 특정 환자에 대한 약리유전체학 (치료제의 약동학, 약력학 또는 효능 프로필에 대한 유전형의 영향) 정보가 사용되는 투여 요법에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 기재된 방법에서, 공동-투여의 개별 성분, 또는 조합은 임의의 적합한 수단에 의해 동시 발생적으로, 동시에, 순차적으로, 개별적으로 또는 단일 제약 제형으로 투여될 수 있음을 이해해야 한다. 공동-투여되는 화합물 또는 조성물이 별도의 투여 형태로 투여되는 경우, 각각의 화합물에 대해 1일당 투여되는 용량의 수는 동일하거나 상이할 수 있다. 화합물 또는 조성물은 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 화합물 또는 조성물은 동시 또는 교대 요법에 따라 요법의 과정 동안 동일하거나 상이한 시간에 공동으로 분할 또는 단일 형태로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 치료 중인 질환 또는 장애의 증상 완화를 포함하는, 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는, 조직 시스템, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 활성 화합물 또는 약제의 양을 지칭한다. 한 측면에서, 치료 유효량은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험 비율로 질환 또는 질환의 증상을 치료 또는 완화할 수 있는 양이다. 그러나, 본원에 기재된 화합물 및 조성물의 총 1일 사용은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있음을 이해해야 한다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단: 투여 시간, 투여 경로 및 사용되는 특정 화합물의 배설 속도; 치료 기간; 사용되는 특정 화합물과 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 및 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 숙련된 임상의에게 널리 공지된 유사한 요인을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
투여 경로에 따라, 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg 범위에 속하는 용량을 포함하는 광범위한 허용 가능한 용량이 본원에서 고려된다. 용량은 단일 또는 분할될 수 있으며, q.d. (하루에 한 번), b.i.d. (하루에 두 번), t.i.d. (하루에 세 번), 또는 격일로, 1주일에 한 번, 1개월에 한 번, 1분기에 한 번 등을 포함한 다양한 프로토콜에 따라 투여될 수 있다. 이들 경우 각각에서, 본원에 기재된 치료 유효량은 투여 사례에 상응하거나, 또는 대안적으로 투여 프로토콜에 의해 결정되는 바와 같이 총 일별, 주별, 개월별 또는 분기별 용량에 상응하는 것으로 이해된다.
본원에 기재된 예시적인 용량 및 투여 프로토콜에 더하여, 본원에 기재된 화합물 중 임의의 하나 또는 화합물의 혼합물의 유효량은 공지된 기술을 이용하여 및/또는 유사한 상황에서 수득된 결과를 관찰함으로써 주치 진단전문의 또는 주치의에 의해 결정될 수 있음을 이해해야 한다. 유효량 또는 유효 용량을 결정할 때, 주치 진단전문의 또는 주치의에 의해 인간을 포함한 포유동물의 종, 이의 크기, 연령, 및 일반적인 건강, 관련된 특정 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 정도 또는 연루 또는 중증도, 개별 환자의 반응, 투여되는 특정 화합물, 투여 방식, 투여되는 제제의 생체이용률 특징, 선택되는 용량 요법, 동반 약물의 사용, 및 다른 관련된 상황을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 요인이 고려된다.
용어 "환자" 또는 "대상체"는 인간 및 반려동물 (개 및 고양이 등) 및 가축과 같은 비-인간 동물을 포함한다. 가축은 식량 생산을 위해 길러지는 동물이다. 치료될 환자는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
"핵산"은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체 및 이의 상보체를 지칭한다. 이 용어는 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생이고 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포괄한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체, 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드, 펩티드, 또는 폴리펩티드 융합물의 단편을 지칭하기 위해 (달리 명시적으로 언급되지 않는 한) 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동적으로 연결"된다. 예컨대, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로 "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 리더의 경우, 인접하고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 반드시 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 리게이션에 의해 수행될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용될 수 있다.
폴리펩티드 서열에 대한 참조와 관련하여 "아미노산 서열 동일성 백분율 (%)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서, 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은, 예컨대 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "요법" (및 "치료하다", "치료하는" 및 "치료적"과 같은 이의 문법적 변형)은 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경하려는 시도에서 치유적 및/또는 예방적 개입을 포함한다. 보다 특히, 치유적 치료는 특정 장애의 증상의 진행 지연 뿐만 아니라 증상의 완화, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화 (예컨대, 더 진행된 단계로의 진행 실패) 중 임의의 것을 지칭한다. 예방적 처치는 하기 중 임의의 것을 지칭한다: 특정 장애의 증상의 발병 중단, 발달 위험 감소, 발생 감소, 발병 지연, 발달 감소, 및 발병 시간 증가. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 질환 및/또는 종양의 발달을 지연시키거나, 질환 및/또는 종양 성장의 진행을 늦추기 위해 (또는 심지어 중단시키기 위해) 사용된다.
일부 측면에서, 본 발명은 일반적으로 유전자 전달 및 다양한 질환의 치료적 처치를 위한 옵션에 유용한 조성물 물질 및 방법, 특히 케모카인 또는 시토카인, 표적화 폴리펩티드 및 하나 이상의 링커의 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 사용 방법 및 조성물 물질이 본 개시내용의 범위 내에 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 벡터는 치료 케모카인 또는 시토카인, 표적화 폴리펩티드, 및 하나 이상의 임의적 링커의 복수의 유전자의 융합물을 포함한다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 시토카인은 인터루킨-27 (IL-27), IL27p28 (IL-30), 엡스테인-바르 바이러스-유도된 유전자 3 (EBI3), IL-23, IL-18, IL-17, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 시토카인은 마우스, 인간, 또는 개 기원이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 시토카인은 하기 서열을 갖는 IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛으로 구성된 IL-27이다:
Figure pct00005
(서열식별번호: 5; IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 마우스 IL27); 또는
Figure pct00006
(서열식별번호: 6; IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 인간 IL27); 또는
Figure pct00007
(서열식별번호: 7; IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 개 IL27).
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 치료 기능을 추가로 갖는다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 IL-6 수용체 알파 서브유닛을 표적화하는 S7 또는 'pepL', EGFR을 표적화하는 GE11, GRP78을 표적화하는 GRP78p, BMPR1b를 표적화하는 pepB1, pepB2, CLP12, IL-7Ra, GGP, TGFβ-모방체, IL-17Rp, 및 ACE2p를 포함한다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 Leu-Ser-Leu-Ile-Thr-Arg-Leu (서열식별번호: 1), EG를 표적화하는 YHWYGYTPQNVI (서열식별번호: 8), GRP78을 표적화하는 SNTRVAP (서열식별번호: 9), BMPR1b를 표적화하는 AISMLYLDENEKVVL (서열식별번호: 10), TPLSYLKGLVTV (서열식별번호: 11), NPYHPTIPQSVH (서열식별번호: 12), ASACPPH (서열식별번호: 13), GGPNLTGRW (서열식별번호: 14), FLPASGL (서열식별번호: 15, TGFβ-모방체), TPIVHHVA (서열식별번호: 16), 또는 TVALPGGYVRV (서열식별번호: 17)의 서열을 갖는다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 단일 펩티드, 동종이량체 또는 이종이량체의 조합이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 임의적 링커는 부재하거나 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열식별번호: 2)의 단일 또는 복수의 반복 단위를 포함한다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질에 관한 것으로, 여기서 상기 조성물 물질은 중합체를 추가로 포함하고, 여기서 상기 중합체는 하기를 포함하는 것: 역 핵 국소화 신호 (rNLS), rNLSd, 펜던트 테트라라이신 및 Val-Lys-Arg-Lys-Lys-Lys-Pro (서열식별번호: 4)의 서열을 갖는 rNLS 올리고펩티드를 갖는 폴리사이클로옥텐 중합체이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조성물 물질의 치료 유효량을 하나 이상의 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 악성 종양 또는 면역 질환의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법에 관한 것이다:
a. 치료 단백질/생물제제, 표적화 폴리펩티드, 및 하나 이상의 임의적 링커의 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 조작된 플라스미드 벡터를 제조하는 단계.
b. 펜던트 테트라라이신 및 Val-Lys-Art-Lys-Lys-Lys-Pro (서열식별번호: 4)의 서열을 갖는 rNLS 올리고펩티드를 갖는 폴리사이클로옥텐 중합체 골격에 부착된 rNLSd로 불리는 역 핵 국소화 신호 (rNLS)를 포함하는 중합체를 제조하는 단계;
c. 상기 플라스미드 벡터 및 상기 중합체를 조합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
d. 음파처리 (초음파-강화된 근육 트랜스펙션)의 임의적 보조로 상기 혼합물을 전달하는 단계.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단계에 따라 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 치료 단백질은 케모카인 또는 시토카인이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단계에 따라 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 시토카인은 마우스, 인간, 및 개로부터의 인터루킨-27 (IL-27) 및 IL27p28 (IL-30) 또는 EBI3 단량체, IL-23, IL-18, 또는 IL-17을 포함하는 관련된 시토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단계에 따라 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 치료 단백질은 서열식별번호: 5, 6, 및 7의 서열을 포함한다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단계에 따라 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 치료 기능을 추가로 갖는다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단계에 따라 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 Leu-Ser-Leu-Ile-Thr-Arg-Leu (서열식별번호: 1), EG를 표적화하는 YHWYGYTPQNVI (서열식별번호: 8), GRP78을 표적화하는 SNTRVAP (서열식별번호: 9), BMPR1b를 표적화하는 AISMLYLDENEKVVL (서열식별번호: 10), TPLSYLKGLVTV (서열식별번호: 11), NPYHPTIPQSVH (서열식별번호: 12), ASACPPH (서열식별번호: 13), GGPNLTGRW (서열식별번호: 14), FLPASGL (서열식별번호: 15, TGFβ-모방체), TPIVHHVA (서열식별번호: 16), 또는 TVALPGGYVRV (서열식별번호: 17)의 서열을 갖는다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단계에 따라 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 임의적 링커는 부재하거나 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열식별번호: 3)의 단일 또는 복수의 반복 단위를 포함한다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 조성물 물질은
a. 치료 단백질, 표적화 폴리펩티드, 및 하나 이상의 임의적 링커의 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 조작된 플라스미드 벡터; 및
b. 하기를 포함하는 중합체: 역 핵 국소화 신호 (rNLS), rNLSd, 펜던트 테트라라이신 및 Val-Lys-Art-Lys-Lys-Lys-Pro (서열식별번호: 4)의 서열을 갖는 rNLS 올리고펩티드를 갖는 폴리사이클로옥텐 중합체
를 포함한다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 치료 단백질은 케모카인 또는 시토카인이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 시토카인은 마우스, 인간, 및 개로부터의 인터루킨-27 (IL-27) 및 IL27p28 (IL-30) 또는 EBI3 단량체, IL-23, IL-18, 또는 IL-17을 포함하는 관련된 시토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 치료 단백질은 서열식별번호: 5, 6, 또는 7의 서열을 포함한다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 치료 기능을 추가로 갖는다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 표적화 폴리펩티드는 Leu-Ser-Leu-Ile-Thr-Arg-Leu (서열식별번호: 1), EG를 표적화하는 YHWYGYTPQNVI (서열식별번호: 8), GRP78을 표적화하는 SNTRVAP (서열식별번호: 9), BMPR1b를 표적화하는 AISMLYLDENEKVVL (서열식별번호: 10), TPLSYLKGLVTV (서열식별번호: 11), NPYHPTIPQSVH (서열식별번호: 12), ASACPPH (서열식별번호: 13), GGPNLTGRW (서열식별번호: 14), FLPASGL (서열식별번호: 15, TGFβ-모방체), TPIVHHVA (서열식별번호: 16), 또는 TVALPGGYVRV (서열식별번호: 17)의 서열을 갖는다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 임의적 링커는 부재하거나 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열식별번호: 3)의 단일 또는 복수의 반복 단위를 포함한다.
하기는 본원에 개시된 바와 같이 본 발명을 추가로 개설하고 설명하기 위한 비제한적 실시예의 세트이다.
C-말단 펩티드 리간드의 조작은 종양 세포에 대해 가우시아 Luc를 표적화할 수 있다.
본 발명자들은 다양한 유형의 종양에서 상향조절되는 것으로 점점 더 보고되는 수용체인 IL-6Rα에 시토카인을 표적화하는 전략을 설계하였다15. 본 발명자들은 인간 및 마우스 기원의 세포 모두에 대한 시토카인의 표적화를 활용하려고 했으므로, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 마우스 IL-6Rα에 대한 모델을 생성하고 이를 인간 IL-6Rα 결정 구조 모델에 정렬하였다. 정렬은 두 수용체가 높은 구조적 상동성을 공유함을 시사하였다 (도 1A). 이전에 IL-6Rα에 결합하는 것으로 밝혀진 펩티드 (pepL, LSLITRL, 서열식별번호: 1)는 두 종에 대한 수용체 모델에서 구조적 유사성을 갖는 영역에 도킹한다 (도 1B). 이 pepL은 또한 이 수용체를 통한 신호전달을 감소시키는 것으로 보고되었으므로 치료 활성을 갖는다15. 본 발명자들은 또한 인간 IL6Ra를 갖는 모델을 생성하여 pepL이 IL-6과 IL-6Rα/gp130 수용체 복합체 사이의 계면에서 IL6Rα와 상호작용할 수 있음을 확인하였다.
시토카인 표적화를 모델링하고 세포에 대한 결합을 검출하기 위해, 본 발명자들은 C-말단에서 pepL 펩티드로 변형된 가우시아 루시페라제 (GLuc) 분자를 설계하였다. 본 발명자들은 가우시아 루시페라제를 이상적인 '시토카인 모델'로 선택하였으며, 이 리포터 단백질이 세포로부터의 분비가 가능하도록 하는 신호 펩티드를 갖기 때문이다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이, Gluc 플라스미드는 링커 및 대조군 비-특이적 서열 (Gluc-ns) 또는 IL6Rα를 표적화하는 펩티드, pepL (Gluc-pepL)를 갖는 Gluc 단백질의 발현을 매개하도록 조작되었다. 시토카인-기반 치료제의 생체내 적용을 가장 잘 모방하기 위해, 본 발명자들의 이론적 근거는 먼저 분비된 Gluc를 함유하는 배양 조건 조절된 배지 (CCM)를 생성하는 것이었다. Gluc 분자는 포유동물 발현 벡터로 트랜스펙션된 C2C12 근육 세포에 의해 발현되었고, CCM은 세포 결합 검정을 위해 수집되었다. 본 발명자들은 STAT1 및 STAT3 활성에 대한 반딧불이 루시페라제 (luc) 검정을 활용하여 유리 펩티드 (ns pep 및 pepL)와 펩티드가 단백질의 C-말단에 연결된 Gluc.ns 및 Gluc.pepL 사이의 신호전달의 유사성 또는 차이점을 비교하였다. pepL의 효과는 STAT1 활성화 측면에서 유리 펩티드로서 상대적으로 더 강한 것으로 보이지만, 발암성 STAT3 신호전달을 활성화하는 해로운 효과도 관찰되었으며 (도 1C), 여기서 STAT3는 2개의 전립선암 세포주에서 상향조절되었다. 대조적으로, 펩티드가 Gluc와 같은 단백질의 C-말단에 연결되었을 때, pepL은 STAT1만을 활성화시킨 반면, STAT3는 Gluc-ns 대조군과 비교하여 Gluc-pepL로 처리된 3개의 전립선암 세포주에서 ~80% (p<0.05)로 상당히 하향조절되었다 (도 1C). CCM은 다양한 인간 및 마우스 세포와의 결합 검정에 사용되었다 (도 1D). 정상 세포는 Ad293, HEPG2, 또는 정상 전립선 상피 세포 (NHPre1)에서 CCM을 사용한 Gluc 결합 검정에 의해 평가되는 바와 같이 유의한 양의 대조군 (Gluc-ns) 또는 표적화된 Gluc (Gluc-pepL)에 결합하지 않은 반면, 전립선 종양 세포 PC3, RM1 및 TC2R은 Ad293 정상 세포에 비해 Gluc 결합이 ~최대 10배 증가하는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 분화하는 골 세포 (OB, MC3T3E1-14 또는 OC, RAW264.7)도 Gluc-pepL에 결합하는 상당한 능력을 나타내었다 (도 1D).
생체내 소노포레이션 전달은 GLuc.pepL이 종양에서 검출될 수 있음을 나타내었다.
본 발명자들의 그룹은 생체내에서 단백질 발현을 촉진하기 위해 소노포레이션 전달 (소노딜리버리)을 활용한다. 도 2A는 마우스 근육에서 Gluc 단백질을 발현하기 위한 소노딜리버리를 도시한다. 마이크로버블의 존재 하에서 플라스미드 DNA 및 양이온성 중합체에 의해 형성된 나노플렉스에 초음파 (US) 자극을 가한다. 골격근에 나노플렉스를 전달한 후, 시토카인 모델 단백질 (Gluc)은 C-말단 펩티드/리간드 태그 (pepL)와 함께 생체내에서 발현된다 (도 2A). GLuc는 뒤쪽 대퇴부 근육 (등쪽)에서 발현되는 반면, 종양 세포는 경골내 이식 (무릎 인접) 후 복부에 위치된다. 민감한 생물발광 이미징 (BLI)을 통한 제10-14일의 생체외 평가는 표적화된 GLuc.pepL의 신호 (대조군 GLuc.ns는 아님)가 표적화된 영역 (즉, 종양:골 경계)에서만 상당히 향상되었고, 경골내 TC2Ras 종양이 있는 마우스의 정상 기관에서는 그렇지 않음을 나타내었다 (도 2B) (컬러 바, p/sec/cm2/sr). 평가된 정상 기관은 간, 폐, 심장, 소장, 신장, 췌장, 및 비장을 포함하였다. 놀랍게도, 종양 샘플에서 Gluc.pepL 축적이 ~13배 증가하였으며, 이는 종양 조직 신호의 생체외 정량화에서 표적화되지 않은 Gluc-처리된 동물에 비해 유의하였다 (p<0.012) (도 2B, 우측 플롯).
본 발명자들은 이전에 Gluc에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 종양 및 골 모두에 대한 유망한 치료제인 IL-273,4로 확인한 시토카인의 C-말단의 변형을 진행하였다. 마우스 EBI3-IL-27p28 '하이퍼 IL-27'은 각각의 단일 단량체를 전달하는 것보다 강력하기 때문에17 이종이량체 성분의 융합 단백질로 선택되었다. 이어서, 이 IL-27을 IL-27pepL 또는 IL-27ns를 생성하기 위해 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 GGGGS 링커 및 펩티드 리간드 pepL 또는 비-특이적 대조군 (ns)으로 C-말단에서 조작되었다. 이들 C-말단-변형된 IL-27 벡터는 STAT1-luc와 같은 리포터 유전자 구축물에 의해 평가되는 바와 같이 IL-27을 발현하는 능력 (데이터 제시되지 않음) 및 IL-27 다운스트림 신호전달을 자극하는 능력에 대해 시험관내에서 시험되었다. 리포터 검정에서 유리 pepL이 발암성 STAT3 활성화를 나타내었으므로 (도 1C), 본 발명자들은 3개의 전립선암 세포주에서 STAT1을 상당히 활성화시키면서 STAT3을 상당히 하항조절하는 C-말단 연결된 pepL 설계만을 활용하여 다음 연구를 진행하였다 (도 1C). 본 발명자들은 하기 섹션에 기재된 바와 같이 생체내에서 이러한 C-말단-변형된 IL-27 단백질의 생체활성을 조사하였다.
표적화된 IL-27pepL의 생체내 생체활성은 표적화되지 않은 IL-27ns에 비해 향상되었다.
pepL이 IL-27의 표면에서 접근할 수 있음을 나타내는 모델의 생성 및 검사에 따라 (도 3A), 본 발명자들은 이식된 "센서" 세포가 IL-27에 대한 반응으로 리포터 유전자 루시페라제를 발현할 수 있는 생체내 생체활성 검정을 설계하였다. 이 검정은 IL-27 활성의 실시간 생체내 검출을 가능하게 할 것이다. 먼저, 동물에게 3일 동안 시토카인 발현 (IL-27ns 또는 IL-27pepL)을 촉진하기 위해 소노딜리버리를 통해 플라스미드 pMCS (빈 벡터, pcDNA3.1), pIL-27ns 또는 pIL-27pepL을 근육내로 투여하였다. 뒤쪽 대퇴부 근육에 초음파 자극의 존재 하에 중합체 rNLSd 및 마이크로버블과 복합화된 12.5 μg의 플라스미드를 투여하였다. 소노딜리버리 3일 후, '센서' 세포 (STAT1 또는 IFNγ-반응성 Luc 벡터로 트랜스펙션된 TC2R 세포)를 동물의 옆구리에 이식하였다. TC2R 전립선암 세포는 IL6-Rα 상향조절을 나타내기 때문에 선택되었다. 루시페린 기질은 24시간 후에 복강내 투여되었고, 신호는 IL-27 생체활성에 대한 대용물로 검출되었다 (도 3B). STAT1- 또는 IFNγ-루시페라제 신호는 IL-27ns 또는 IL-27pepL가 투여된 동물에서만 검출될 수 있었다 (도 3B). 생물발광 신호의 정량화는 pIL-27ns로 처리된 동물은 세포 이식 부위에서 대조군 벡터 (pMCS) 대비 2배 증가된 Luc 활성을 갖는다는 것을 나타내었다 (도 3C). pIL-27pepL가 투여된 동물은 또한 대조군 pMCS (*, p<0.05) 및 pIL-27ns (#, p<0.05) 둘 다에 비해 luc 신호가 상당히 증가하였다 (도 3C). 이는 pepL C-말단 융합물에 의해 더 높은 생체활성이 달성되었음을 시사한다.
IL-27 표적화 메커니즘은 파라크린 및 오토크린 신호전달을 모두 포함하는 것으로 보인다.
다음으로, 본 발명자들은 C-말단-변형된 IL-27에 대한 잠재적인 신호전달 모드를 조사하였다. 본 발명자들은 펩티드가 표적화 수용체 (예컨대, IL6Rα)를 발현하는 세포에 시토카인의 고정을 허용하는 모델을 시사한다 (도 4A). 이 모델은 CCM의 IL-27이 오토크린 모드 및 파라크린 모드 둘 다로 상이한 세포에서 신호를 보낼 수 있음을 제시한다 (도 4). 본 발명자들은 이 모델을 조사하기 위한 실험을 설계하여 C-말단 pepL 변형이 시험관내에서 IL-27 신호전달을 향상시킨다는 것을 확인하였다. 오토크린 설계에서, pSTAT1-Luc 및 pIL-27은 공동-트랜스펙션되었다 (도 4A).
파라크린 설계에서, 분화 조골세포 (OB, MC3T3E1-14, 제4일) 또는 상피 세포 (TC2R)를 STAT1-Luc로 트랜스펙션시킨 다음, IL-27ns, IL-27pepL 및 빈 벡터 대조군 (pMCS)을 발현하는 다른 세포 유형과 혼합하였다. 신호를 전달하기 위해 IL-27pepL은 한 세포 유형으로부터 분비되고 신호전달을 유도하기 위해 다른 세포 유형 (STAT1-luc 보유)에 결합해야 했다 (도 4B). 두 설계에서, C-말단 pepL은 IL-27 신호전달 (p<0.04 vs ctrl, #, p<0.05 vs IL-27)을 pMCS 또는 기본 공동-배양 대조군 대비 최대 4.4배 (오토크린 설계) 및 최대 3배 (파라크린 설계) 향상시키는 것으로 나타났다. 파라크린 신호전달 효과의 IL-27pepL-매개된 증가는 특정 항 IL-6Rα 항체를 추가하여 차단될 수 있었다 (도 4B).
pepL을 사용한 IL-27 표적화는 종양 세포에서 유전자 발현을 변형시킨다.
IL27pepL과 IL27ns 사이의 생체활성 차이의 근저에 있는 잠재적인 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 트랜스펙션된 TC2R 세포에서 대조군 벡터 (MCS)에 비해 IL-27ns 및 IL-27pepL에 의해 상향- 또는 하향-조절되는 유전자를 조사하였다. 예상된 바와 같이, IL-27ns 벡터는 IL-27p28 및 EBI3 서브유닛에 특이적인 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 평가된 바와 같이 ~20배의 트랜스진 발현 상향조절을 촉진하였다 (도 5A, p<0.05 대조군 MCS 대비). 흥미롭게도, 본 발명자들은 IL27pepL이 전달되었을 때 IL27ns에 비해 ~60-80배의 IL-27p28 및 EBI3 상향조절을 향한 트랜스진 발현의 추가 상향조절을 관찰하였다 (도 5A; #, p<0.05). 관찰된 IL-6 상향조절은 본 발명자들이 문헌18에 기재된 바와 같이 IL-6 또는 IL-27 반응과 관련된 여러 표적 유전자의 발현을 조사하게 하였다. IL-27pepL 효과는 주로 SOCS3 및 XCL1의 상당한 상향조절을 촉진함으로써 IL-27ns 대조군과 상이하였다 (도 5B). 종양 미세환경과 관련된 여러 시토카인의 유전자 발현도 평가되었으며, 두 IL-27 구축물은 모두 IL-6, IL-18 및 CXCL10을 ~2-3배까지 상당한 상향조절을 촉진하였다 (도 5C, *, p<0.05). 그러나, IL-27pepL 구축물은 IL-27ns 대비 IL-6, IL-18 및 CXCL10의 추가 상향조절 뿐만 아니라 TNF 및 IL1β의 상향조절을 촉진하였다 (도 5C; #, p<0.05). IL-27이 림프구의 종양으로의 침윤을 조정하였다는 이전 연구를 기반으로2,4, 본 발명자들은 주요 면역원성 유전자도 조사하였다19. 모든 면역원성 유전자가 대조군 MCS에 비해 IL-27ns에 의해 상당히 상향조절되었지만, IL-27pepL 전달은 ~2-3.5배까지 상향조절을 상당히 향상시켰다 (도 5D). 이러한 유형의 유전자 발현 변화는 또한 qPCR을 사용하여 종양에서 확인되었으며, 여기서 본 발명자들은 IL-27ns에 비해 IL-27pepL로 처리된 종양에서 ~2.7-4.9배까지 IL27p28, EBI3, TBX21, XCL1, 및 IFNγ의 상당한 상향조절을 검출하였다 (데이터 제시되지 않음).
독창적 경로 분석 (IPA)은 (1) IL27ns 대 IL27pepL로 처리된 TC2R 세포 간의 비교 분석 (둘 모두 대조군 pMCS qPCR 발현 수준에 대해 보정됨), 및 (2) 각각의 처리군 대 pMCS의 개별 코어 분석을 포함하였다. 표준 경로 분석 표현은 순위가 지정된 활성화 z-점수 (-2.0 내지 +2.5)를 갖는 히트맵을 산출하였으며 (도 6A), 세포 및 유기체 기능은 또한 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 p-값의 -log(B-H) (도 6B) 및 업스트림 조절자20에 의해 히트맵에서 순위가 지정되었다 (표 1). 업스트림 조절자 분석은 대조군 pMCS에 비해 IL27ns-처리된 TC2R 세포가, 전체적으로 백혈구의 기능 축적과 관련이 있는, IL-12를 포함하는 IPA-예측된 업스트림 또는 인과성 조절자, LPS-유사 효과, IFNγ, 및 TLR4 (p<0.01) 및 주로 IL-18 뿐만 아니라 FOXO1, IRF4, 및 IFNγ의 활성화 및 MYC의 억제를 포함하는 상위 (top) 조절자 효과 네트워크를 갖는다는 것을 나타내었다. IL-27pepL-처리된 TC2R은 IL-12 및 TLR4를 포함한 일부 동일한 IPA-예측된 업스트림 또는 인과성 조절자를 가졌고 또한 림프 조직 구조 및 발달 및 면역 세포 트래피킹 (trafficking) 기능과 관련된 IL-27RA, IL-10, 및 NOD2를 포함한 일부 상이한 예측된 조절자를 가졌다. 세포 및 유기체 기능은 면역 세포 간의 소통, 변경된 면역 세포 신호전달, IL-10 신호전달, 및 여러 다른 면역-관련된 기능을 포함하였다.
<표 1>
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IL-27 표적화는 전립선 종양에 대한 항종양 활성 및 이펙터 세포 동원을 향상시킨다.
이어서, 본 발명자들은 생체내에서 IL-27ns 또는 대조군 (pMCS) 벡터 전달 대비 IL-27pepL 발현 효과를 조사하였다. TC2R 세포를 C57/BL6 수컷 마우스에 피하 이식하고; 종양 성장을 캘리퍼 측정에 의해 모니터링하였다. 플라스미드 (12.5 μg)를 소노포레이션을 이용하여 제4일에 뒤쪽 대퇴부에 근육내로 전달하였다. IL-27pepL은 IL-27ns 또는 빈 벡터 대조군 (pMCS)보다 종양 성장 중단에 더 효과적인 것으로 입증되었다 (도 7A; *p<0.05 pMCS 대조군 대비; #, p<0.05 IL-27ns 대비). 종양 성장 억제는 제3일과 제18일 사이에 계산되었으며, 성장 속도는 대조군 pMCS-처리된 종양에 비해 pIL27-처리된 종양의 경우 50%, pIL27pepL-처리된 종양의 경우 89%까지 억제되었다. IL-27p28에 대해 ELISA를 이용하여 검출된 IL-27의 혈청 수준은 IL27ns 및 IL27pepL 둘 다에 대해 초기에 정점에 이르렀고 연구 전반에 걸쳐 감소한 수준을 나타내었다 (도 7B). IL-27-처리된 그룹 둘 다는 일반적으로 pMCS 대조군에 비해 IL-27 혈청 수준이 상당히 더 높았지만 (도 7B), 이러한 증가는 초기- 및 중간-시점에 대해서만 상당하였다. IL27pepL은 IL27ns에 비해 초기 시점에 상당히 더 높은 IL27p28 혈청 수준을 가졌다.
마지막으로, 본 발명자들은 요법이 종양-침윤 림프구 집단의 범위를 변형시키는지의 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 IL-27 요법 둘 다에 대해 γδT 및 NKT에서 상당한 상향조절을 관찰하였다 (도 7C; *, p<0.05). 그러나, IL-27pepL은 더 높은 수준의 CD3/8 및 NKT 세포 (#, p<0.05 IL-27ns 대비), CD19 세포의 감소, 및 CD4/25 및 NK의 대조군 pMCS-처리된 수준으로의 정상화 (p<0.05)를 포함하여 IL-27ns 대조군과 약간의 차이를 나타내었다.
본원에서 본 발명자들은 시토카인 모델 단백질인 가우시아 Luc 및 치료 시토카인인 인터루킨-27에 C-말단 펩티드 리간드의 융합을 설명하였다. 본 발명자들은 인터루킨-6 수용체 알파 (IL-6Rα)에 대해 표적화 능력이 있는 것으로 보고된 펩티드를 선택하였다. 본 발명자들의 결과는 수용체 및 STAT3 신호전달 축이 정상 조직에 비해 전립선암 종양 전이의 ~95%에서 상향조절되기 때문에21 이 펩티드가 공격적인 전립선 종양을 표적화하고 이를 치료하는데 생체내에서 효과적임을 시사한다. 본 발명자들은 또한 이 수용체가 분화 조골세포 및 파골세포를 표적화하는데 유용할 수 있다는 것을 관찰하였으며, 이는 문헌에 의해 뒷받침되며, 여기서 IL-6Rα의 수준은 조골세포22 및 파골세포23가 분화함에 따라 생체내에서 유의하게 상향조절된다고 보고되었다. 헵타펩티드 LSLITRL (pepL)은 hIL6-Rα/gp130 복합체의 이용 가능한 결정 구조에 따라 모델링되었으며, 이는 pepL이 이 수용체 쌍을 통한 신호전달을 방해할 것임을 시사한다. 또한, 본 발명자들의 시험관내 및 생체내 데이터와 함께 마우스/인간 수용체 모델 정렬은 pepL이 마우스 세포에서 기능적임을 나타낸다. IL6-Rα를 통한 신호전달은 Luc 리포터 벡터를 사용하여 측정된 STAT3 활성에 의해 평가 시 Gluc.pepL 융합물에 의해서는 억제되지만 유리 pepL에 의해서는 억제되지 않는 것으로 나타났다. 또한, pepL의 효과는 STAT1 활성화 측면에서 유리 펩티드로서 더 강한 것으로 나타났지만, 발암성 STAT3 신호전달의 활성화도 관찰되어 유리 pepL을 활용하는 것이 요법 전략에 해로울 수 있음을 시사한다. 이 결과는 pepL이 (C-말단에 연결되는) 올바른 맥락에서 제공된다면, 다른 종양에 대해 제시된 바와 같이15 전립선암 적용을 위한 이중의 표적화 및 치료 기능을 가질 수 있음을 나타낸다. Gluc.pepL은 또한 생체내에서 정상 조직보다 종양/골 경계에 우선적으로 축적될 수 있으며, 이는 이 펩티드가 특정 위치에 시토카인 모델 단백질 (GLuc)을 표적화하는 것과 관련이 있음을 나타낸다. pepL과 가우시아 루시페라제 융합물 (Gluc-pepL)은 정상 대조군 세포에 비해 종양 세포에 대한 결합이 ~10 내지 13배 증가하는 것으로 나타났다.
관심 치료 시토카인인 IL-27의 C-말단에서 pepL을 사용한 조작은 반응성 세포에서 IFNγ 및 STAT1 신호 검출에 의해 평가 시 비-특이적 대조군 펩티드에 비해 생체내에서 더 높은 생체활성을 초래하였다. 이 더 높은 생체활성으로 인해 표적화 메커니즘이 파라크린 및/또는 오토크린 신호전달 메커니즘을 포함할 수 있는지의 여부를 조사하게 되었다. 시험관내 실험은 IL-27pepL에 대한 신호전달 방식이 오토크린 및 파라크린 메커니즘 둘 다를 모두 포함할 수 있다고 제시하였으며, 즉 이는 동일한 또는 인접 세포에 효과를 갖고 luc 리포터에 의해 평가되는 바와 같이 STAT1 신호전달을 촉진시킬 수 있다. 이는 IL-27이 표적화된 세포 (종양) 뿐만 아니라 인접 세포 (예컨대, 골 세포 또는 다른 종양 세포) 모두에 영향을 미칠 수 있기 때문에 유전자 전달에 중요하다. 도 4에 나타낸 실험은 특정 항체로 IL-6Rα를 차단하면 STAT1 신호전달을 감소시키지만 야생형 IL-27과 동등한 수준으로만 감소시키기 때문에 키메라 IL27-pepL 분자가 여전히 자체 수용체를 통해 신호를 보낼 수 있음을 시사한다. 따라서, C-말단 변형된 시토카인은 이중 기능 (프로-IL27 및 항-IL6 신호전달)을 가지며 새로운 치료 시토카인을 구성한다. 전반적으로, pepL은 생체내에서 IL-27의 항종양 활성을 향상시키는 것으로 보이며, 이는 IL-27이 이미 외인성 및 내인성 종양에 대해 대항할 수 있는 보호 면역 반응을 증대시키며24, IL-27-기반 치료제의 향후 개발을 위한 기초로 중요하다. IL-27의 생체활성에 대한 대용물으로 생체내에서 활용되는 강화된 STAT1 및 IFNγ 발현은 표적화를 강화한 C-말단 변형 (pepL)이 이러한 경로를 통해 신호를 보내는 IL-27의 능력을 방해하지 않는다는 것을 검증하는데 특히 중요하였다. Gluc-ns와 비교하여 Gluc-pepL로 시각화된 표적화와 조합하여, 데이터는 pepL이 시토카인을 종양으로 표적화할 수 있음을 시사한다. 효과는 IL-27과 같은 시토카인과 조합 시 확대되어 IL-27 생체활성 및/또는 신호전달을 더욱 향상시킬 수 있는 것으로 보인다.
qPCR 및 IPA 분석에 의한 유전자 발현 분석은 치료 시토카인이 많은 측면에서 상이함을 나타내었다. 흥미롭게도, 대조군 또는 IL-27 벡터의 전달 후 유전자 발현 결과는 IL-27pepL이 세포 및 생체내에서 잠재적으로 더 강력한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 이 효과는 IL-27 및 조절된 유전자의 양성 피드백 상향조절을 촉진하는 능력에 기인할 수 있다. 또한, IL-27pepL은 여러 면역원성 유전자의 발현을 향상시키고 종양 미세환경에서 신호전달을 크게 변경할 수 있는 여러 시토카인의 발현을 차등적으로 조정한다. TNF, IL-18, IL-1β, 및 CXCL10의 상향조절은 종양에 대한 면역 반응에 참여하도록 동원된 면역 이펙터의 프로필을 변경할 수 있다. 특히, CXCL10은 NKT 및 CD8 세포에 대한 케모탁틴으로 보고되었으며25, 이는 본 발명자들이 TC2R 종양에서 검출한 증강된 NKT 및 CD8 침윤의 기초가 될 수 있다. 흥미롭게도, IL-27pepL은 아마도 pepL-매개된 신호전달 억제에 대한 보상 메커니즘으로 IL-6도 상향조절하였다. IL-6 또는 IL-27 반응성 유전자를 조사한 결과18, IL-27ns가 3개의 IL-6 반응성 유전자를 하향조절하고 경향 상 3개의 IL-27 반응성 유전자 모두를 (일부는 유의하지 않지만) 상향조절한다는 것이 분명해졌다. 대조적으로, IL-27pepL은 IL-6 반응성 유전자 SOCS3를 상당히 상향조절하였고, 경향 상 PPARγ를 상향조절하였다. 이 활성은 IL-6 유전자 발현 활성화로 인한 것 같다. IL-27pepL은 IFNγ 및 XCL1 (또 다른 강력한 림프구 케모탁틴)을 상당히 상향조절하였으며, 이는 pepL이 다른 IL-27 신호에 대항하면서 일부를 확대할 수 있음을 시사한다. 이 IL-27pepL 또는 유사 표적 요법의 추가 개발은 IL-6 상향조절을 감소시키고 증강된 치료 효과를 위한 IL-27 신호전달을 추가로 향상시키는 것을 목표로 할 것이다. 이러한 유형의 유전자 발현 변화는 종양에서 확인되었으며, 여기서 본 발명자들은 종양을 IL-27ns와 대비하여 IL-27pepL로 처리하였을 때 IL27p28, EBI3, TBX21, XCL1 및 IFNγ의 상향조절을 검출하였다.
pMCS와 대비하여 각각의 IL-27 데이터세트의 개별 IPA 분석은 여러 표준 경로가 IL-27ns와 대비하여 IL-27pepL에 의해 상이하게 영향을 받는다는 것을 나타내었다. 업스트림 조절자 분석은 처리 간에 몇 가지 잠재적인 업스트림 조절자 차이를 나타내었으며, 이는 향후 연구에서 IL-27pepL 요법의 효능 또는 효과를 증가시키기 위해 공동-발현을 위한 후보물을 제공하는데 탁월할 것이다. IPA 분석은 IL-18을 포함하여 림프구 동원에서 잠재적으로 시너지 효과를 달성하기 위해 IL-27과 함께 활용될 수 있는 다른 네트워크를 암시한다. IL-6 효과의 균형 유지를 도울 수 있는 다른 잠재적 기여 네트워크는 IL-37의 하향조절을 포함한다. 본 발명자들 벡터와 함께 IL-37 공동-발현은 TLR2, 4/Myd88 또는 p38MAPK-관련된 염증촉진 신호에 대항하여 IL-6 효과를 감소시키는데 도움이 될 수 있다. IL-37은 IL-18 수용체 알파 (IL-18Rα) 쇄에 결합하여 선천적 및 후천적 면역을 억제하고 IL-6을 포함한 시토카인 수준을 억제하는 새로운 IL-1 계열 구성원이다26. IL-37, IL-18 또는 IL-12 상향조절은 IL-27 유전자 전달 프로토콜을 향상시켜 IL-6 또는 전염증 신호전달을 감소시켜 잠재적으로 IL-27 효과를 향상시키는데 도움이 될 수 있다. IL-27ns와 대비하여 IL-27pepL 처리에서 상향조절된 다른 조절자는 IFNγ 및 STAT1을 포함하였으며, 이들은 SOCS1의 예측된 하향조절의 기초가 될 수 있다27. IRF 전사의 조절자인 TNFAIP3의 감소는 증가된 IFNγ 수준의 기초가 될 수 있다. 유전자 상향조절은 IL27pepL이 IL27ns보다 높은 수준으로 IL27p28 및 EBI3을 상향조절한다는 것을 나타내었으며, 이는 STAT1-제어된 경로의 피드-포워드 (feed-forward) 상향조절과 관련될 수 있다. STAT1은 EBI3, IL27p28, MYC, RELA, IRF4, IL27RA를 포함한 여러 IL-27 경로-관련된 프로모터 영역의 조절자이다28.
(기준 pMCS로 수정된) IL-27 데이터세트의 IPA를 사용한 비교 분석은 두 데이터세트 간에 차이나는 몇몇 흥미로운 표준 경로 및 세포 및 유기체 기능을 산출하였다. 예컨대, 수지상 세포 성숙, TREM1 및 HMGB1 신호전달은 상향조절되었고 LXR/RXR 신호전달은 하향조절되었다. TREM1 신호전달은 상향조절된 전염증 시토카인 유전자의 근본적인 원인이 될 수 있는 반면, HMGB1 신호전달은 관찰된 면역원성 유전자의 상향조절의 기초가 될 수 있다. 잠재적인 면역-관련된 과정의 이러한 변화로 인해 본 발명자들은 생체내에서 여러 면역 이펙터의 침윤을 조사하게 되었다. 종양 성장 억제는 pIL27로 처리된 종양에서 상당하였고 (~50%), IL-27pepL-처리된 종양에서 89% 성장 억제로 더욱 향상되었다. 이 결과는 종양 세포에 대한 직접적인 효과 (STAT3의 감소) 뿐만 아니라 IL27ns 유전자 전달을 받은 마우스에 비해 IL-27pepL-처리된 그룹에 대한 CD3/8의 완만하지만 상당한 증가, CD19의 상당한 감소, CD4/25의 정상화, 및 NKT 세포의 상당한 증가를 포함한 이펙터 세포의 더 높은 동원과 같은 종양에 대한 간접적 효과를 포함한 이 치료에서의 여러 개선에 기인할 수 있다. 본 발명자들 그룹 및 다른 그룹은 전립선 종양을 포함한 면역원성 종양의 경우 IL-27이 CD8 T 세포 및 다른 이펙터 유형의 증가를 통해 종양 성장 및 전이를 억제할 수 있음을 보여주었다2,4,29. NKT 및 CD8은 종양 세포를 사멸시키고 다른 이펙터 세포 유형을 동원하는 능력을 갖는 강력한 이펙터 림프구이고; 특히, NKT 세포는 선천적 면역-조절 세포의 역할을 한다. CD19 세포 감소는 IL-27pepL로 처리된 종양에서 B 세포의 손실을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 IL-27ns와 비교하여 CD4/25 수준의 정상화를 나타낼 수 있으며, 이는 IL-27pepL이 종양 내 Treg 수준을 어느 정도 역전시키거나 정상화할 수 있음을 시사한다. 본 발명자들이 이 종양 모델에서 증가된 NK 동원을 검출하지 못하였다는 것이 흥미롭다. IL-27pepL은 γδT 동원에 대한 시토카인의 효과를 감소시키는 것으로 보이지 않았으며, 이는 γδT 세포가 종양 항원-독립적 방식으로 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있어 잠재적으로 전이성 종양에 대한 보호 면역 감시를 제공할 수 있기 때문에 중요하다30. 비록 본 발명자들은 어떠한 유의한 림프구 침윤도 관찰하지 못하였지만, 향후 연구에서는 이펙터 세포에 의한 다른 기관의 잠재적인 침윤을 조사할 수 있다2. 그러나, 이러한 연구는 이 치료 양식에 대한 잠재적인 독성을 평가할 것이다. 생체내에서 본 발명자들은 IL27ns에 비해 IL27pepL에서 훨씬 더 높은 항종양 활성을 관찰하였다. 본 발명자들 연구의 하나의 한계는 종양을 침윤하는 면역 이펙터에 대한 본 발명자들의 주된 주안점에 기인하여 생체내에서 전립선 종양의 조직병리학을 조사하지 않았다는 것이며 향후 연구에서는 이를 설계에 통합해야 한다. 흥미롭게도, 본 발명자들이 IL27의 발현 수준을 조사한 결과, 혈청 수준은 초기 시점 (제7-11일)에 두 치료제 모두에 대해 가장 높았지만 시간이 지남에 따라 감소하였으며, 이는 유전자 발현의 침묵을 시사한다. 향후 연구에서는 hEF1α/HTLV와 같은 하이브리드 프로모터를 갖는 벡터 또는 더 오랜 기간 동안 유전자 발현을 유지할 수 있는 다른 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 야생형 또는 C-말단 표적화된 IL-27을 골형성촉진성인 일부 시토카인을 포함하여 종양, 골 및 면역계에서 상이한 경로를 조정하는 시토카인과 조합하는 연구가 진행 중이다. 현재 연구는 동종- 또는 이종-이량체화를 통해 관심 수용체에 대해 마이크로몰 수준을 초과한 친화도로 표적화 펩티드의 친화도를 증가시키는 전략을 포함한다. 향후 연구는 IL-27의 효능을 더욱 향상시키기 위해 시토카인을 생체내에서 골 세포 및/또는 골 기질로 표적화하는 pepL 또는 다른 관련된 펩티드의 능력을 탐색할 수 있다.
재료 및 방법
세포 배양. 마우스 TRAMP-C2 세포는 ATCC로부터 얻었고, 10% FBS 및 1 x 항생제-항진균제 (AA, 집코 (Gibco))를 갖는 DMEM:F12 (메디아테크 (Mediatech), 버지니아주 마나사스)에서 유지되었다. TRAMP-C2 세포는 TC2R 라인을 생성하기 위해 각각 감염 다중도 1 (m.o.i. = 1)의 활성화된 H-rasG12V를 발현하는 렌티바이러스 및 m.o.i. = 1의 마우스 안드로겐 수용체를 함유하는 렌티바이러스로 형질도입되었으며2, 모 TC2와 TC2R 간의 성장 비교는 문헌31에 기재되어 있다. NHPre1 및 RM1은 에스. 헤이워드 박사 (Dr. S. Hayward)로부터의 현물이었다. RM1 뮤린 전립선암 세포주는 문헌2에 기재되어 있다. TC2R 및 RM1은 10% FBS 및 1x AA (집코)를 갖는 DMEM:F12 (메디아테크, 버지니아주 마나사스)에서 배양되었다. RAW264.7 (뮤린 단핵구)은 ATCC (미국 버지니아주 마나사스)로부터 얻었고, 세포 리프터를 활용하여 계대되었다. MC-3T3-E1 클론 14 마우스 전조골세포는 ATCC로부터 얻었고, 1x AA (집코)를 갖는 알파-MEM (인비트로겐 (Invitrogen)) 배지 중의 10% 열 비활성화된 ATCC FBS에서 배양되었다. HepG2, AML12, HEK293 및 C2C12는 ATCC로부터 얻었고, 10% FBS 및 1x AA (집코)를 갖는 DMEM에서 성장시켰다. 정상 전립선 세포 (Rwpe1 또는 NHpre1)는 ATCC로부터 얻거나 에스. 헤이워드로부터의 관대한 현물로 얻었고, 각질세포 혈청 비함유 배지 키트 (ATCC)를 사용하여 성장시켰다. PC3은 ATCC로부터 얻었고, 10% FBS 및 1 x AA (집코)를 갖는 RPMI1640에서 성장시켰다. RAW264.7을 제외한 모든 세포는 트립신처리 (0.05% (v/v) 트립신, 0.53 mM EDTA) (집코)에 의해 계대되었다.
배양 조건 조절된 배지 및 분화. Gluc 결합 또는 STAT3 리포터 검정을 위해, C2C12 근육 세포로부터 조건 조절된 배양 배지 (CCM)를 하기와 같이 얻었다: C2C12 세포를 70-80% 합류까지 성장시키고, 리포펙타민 2000을 사용하여 플라스미드로 트랜스펙션시키고, 배지를 6시간 후에 완전한 DMEM/10% FBS로 교체하고, 세포를 밤새 (~16시간) 회복시켰다. 다음날, 세포를 PBS에서 2x 세척하고, 2% DMEM:F12/1 x AA (집코)를 받고, CCM을 48시간 후에 수집하였다. GLuc 결합 검정에 사용된 투입 CCM은 발광 수준에서 유의한 차이를 나타내지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). MC3T3E1 클론 14 세포를 조골세포로 분화시키기 위해, FBS (ATCC)의 열-비활성화를 55℃에서 30분 동안 수행한 후, 배지에 첨가하기 전에 4℃에서 저장하였다. GLuc 세포 결합 검정 전에 골형성 키트 (밀리포어 (Millipore), ECM810)로부터 아스코르브산 및 베타-글리세롤 포스페이트로 1주일 동안 MC3T3E1을 처리하여 분화 조골세포 (OB)를 얻었다. RAW264.7 마우스 세포를 파골세포로 분화시키기 위해, 세포를 1x AA를 갖는 DMEM/10% FBS에서 배양하고, 계대를 위해 부드럽게 긁어내었다. 이들 세포는 세포 결합 검정 전에 6일 동안 완전 배지에서 35 ng/ml RANKL (RnD 시스템스 (RnD systems)) 처리에 의해 파골세포 (OC)로 분화되었다.
펩티드, 수용체 분석 기술, 및 루시페라제 검정. 반딧불이 루시페라제 (Luc) 리포터 검정을 위해, 활성 (포스포릴화된) 형태의 STAT1에 반응하는 구축물 (STAT1.GAS/ISRE-Luc; LR0026, 파노믹스 (Panomics), 캘리포니아주 프레몬트) 또는 IFN□-Luc (아드진 (Addgene), #17599)을 사용하여 문헌32에 기재된 바와 같이 각각의 세포 유형 및 시토카인 자극에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 세포를 트랜스펙션시켰다. STAT3-luc 검정을 위해, C2C12 CCM을 상기 기재된 바와 같이 생성한 후, CCM을 리포펙타민 2000을 사용하여 STAT3-luc 벡터 (시그노시스 (Signosis), LR-2004 파노믹스, 캘리포니아주 프레몬트)로 트랜스펙션된 HEK293, PC3, RM1, 및 TC2R 세포와 함께 인큐베이션하였다. 유리 펩티드를 합성하고, 셀렉켐 (Selleckchem) (텍사스주 휴스톤)으로부터 얻었다. 세포를 IL-27 (또는 대조군) 자극 5시간 또는 24시간에 수집하고, 수동 용해 버퍼 (프로메가 (Promega), 위스콘신주 매디슨)에서 용해시키고, 루시페린 기질 (프로메가)을 갖는 글로막스 (Glomax) 루미노미터를 사용하여 96-웰 포맷으로 검정하였다.
IL-27 실험에 대한 파라크린 대 오토크린 작용 모드의 경우, STAT1-luc 검정을 이용하여, 변형된 IL-27이 오토크린 및 파라크닌 모드로 신호를 보내는지의 여부의 검정을 통해 pepL-변형된 IL-27을 pIL27ns 또는 빈 pcDNA3.1 대조군 벡터 (pMCS)와 비교하였다. 파라크린 설계에서, 분화 조골세포 (OB, MC3T3E1-14) 또는 TC2r 상피 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 STAT1-Luc로 트랜스펙션시켰다. 다음날, 세포를 리프팅하고, 계수한 다음, 3x103개의 각각의 세포 유형을 96-웰 백색 플레이트에서 2% FBS 배지에서 IL-27ns, IL-27pepL 및 빈 벡터 대조군을 발현하는 다른 세포 유형과 공동-혼합하였다. 신호를 전달하기 위해 IL-27pepL은 하나의 세포 유형으로부터 분비되고 신호전달을 유도하기 위해 다른 세포 유형 (STAT1-luc 보유)에 결합해야 했다. 오토크린 설계에서, pSTAT1-Luc 및 pIL-27은 동일한 세포에서 공동트랜스펙션되었다. IL-6Rα 신호전달을 차단하는데 사용되는 항체는 100 uL 중 0.2 ug으로 파라크린 실험에서 세포 시딩 시 첨가되었다 (바이오레전드 (Biolegend), 115811).
Gluc 결합 검정을 위해, CCM을 상기 기재된 바와 같이 생성하고, 백색 플레이트 (코닝 (Corning))에서 96-웰 포맷에 시딩된 (OB에 대해 104개/웰, OC에 대해 6x104개/웰, 및 기타에 대해 3x104개/웰) 세포를 처리하는데 활용하였으며, 투입물 중의 Gluc의 수준은 샘플 전체에 걸쳐 동일하였다 (데이터는 제시되지 않음). CCM을 37℃ 5% CO2에서 16시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하고, 배지를 제거하고, 1x DPBS로 세척하고, 세포를 1x 레닐라 (Renilla) 용해 버퍼 (프로메가) 40 uL에 용해시켰다. 50-100 uL 레닐라 기질을 첨가하고, 10초 통합 시간으로 글로막스 (Glomax) 루미노미터 (프로메가)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 결과는 RLU/초로 표시된다.
IL6-Rα 쇄에 대한 pepL 결합 분석을 위해, 본 발명자들은 상호작용을 모델링하기 위해 인간 IL6-Rα PDB 1p9m 파일을 활용하였다. 인간 및 마우스 IL6-Rα의 정렬은 iTASSER에 의한 마우스 IL6-Rα의 모델링에 따라 PyMol을 사용하여 수행되었다33. PepL은 GalaxyPepDock를 활용하여 인간 및 마우스 IL6-Rα 둘 다에 도킹되었으며34, 이는 구조 데이터베이스 및 에너지-기반 최적화에서 발견되는 유사한 상호작용을 이용하여 투입 단백질 구조 및 펩티드 서열 정보로부터 3D 단백질-펩티드 복합 구조 상호작용을 예측하는 것을 가능하게 한다. 모델링은 pepL의 결합에 대한 IL6Ra 구조의 유사한 위치를 예측하였으며, 이는 두 종에서 이 수용체와의 상호작용을 지원한다.
벡터. IL-27 발현을 위한 플라스미드 DNA 벡터는 pcDNA3.1 골격을 사용하여 제조되었다. PCR 클로닝을 활용하여 펩티드 링커 (GGGGS; 서열식별번호: 2)를 코딩하는 서열35 + 표적화 펩티드 서열 (s7 또는 pepL: LSLITRL; 서열식별번호: 1 및 비-특이적 (ns) 대조군으로서: EDLGREK (서열식별번호: 3) (이전에 IL6/gp130에 대해 어떠한 특이성도 없는 것으로 밝혀짐)36)의 3' 삽입을 갖는 pORF9-mEBI3/p28 (인비보젠 (Invivogen))으로부터 hyper-IL-27 cDNA를 클로닝하였다. IL-27 cDNA-링커-펩티드 서열을 pDrive (프로메가)에 서브클로닝한 다음, 절단하고, BamHI 및 NheI 말단을 사용하여 pcDNA3.1로 클로닝하였으며; 빈 벡터 대조군은 pcDNA3.1-MCS (pMCS)였다. 엔도프리 (Endofree) 키트 (퀴아젠 (Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 모든 실험에 대해 벡터를 제조하였다. 중합체와의 효율적인 복합화를 위해, 벡터를 먼저 침전시키고, 물에 재현탁하였다. 간단히 말해서, 침전은 1:10 부피의 3 M NaOAc 및 2 부피의 냉각된 100% 에탄올에 이은 -80℃에서의 30분 인큐베이션 및 4℃에서 15분 동안 12,000 rpm에서의 원심분리, 및 실온에서의 5분 회전과 함께 2 부피의 70% 에탄올을 사용한 세척을 이용하였다. 펠릿을 건조시키고, 멸균 뉴클레아제 비함유 물에 재현탁시켰다. 근육내 벡터의 소노포레이션은 이전에 자세히 설명되었다13.
독창적 경로 분석 (IPA) 및 실시간 PCR. qPCR을 위해, 본 발명자들은 제조업체의 프로토콜 (인비트로겐)에 따라 5x105개 세포 및 리포펙타민 3000을 사용하여 6-웰 포맷으로 TC2R 세포를 트랜스펙션시켜 pcDNA3.1 빈 벡터 (pMCS)를 도입하거나 IL27ns 또는 IL27pepL을 발현시키고, 트랜스펙션 후 24시간에 RNA를 수집하였다. cDNA 합성 및 qPCR은 마우스-특이적 프라이머 (요청 시 사용 가능한 서열)를 사용하여 이전에 본 발명자들 그룹에 의해 공개된 절차3를 따랐다. 네트워크 분석, 업스트림 조절자 분석, 및 다운스트림 효과 분석을 위해, 실시간 qPCR 데이터를 문헌37에 기재된 바와 같이 독창적 경로 분석 (IPA, 퀴아젠 레드우드 시티 (QIAGEN Redwood City))에 입력하였다. qPCR 데이터를 문헌3에 기재된 바와 같이 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 생성하였다. 간단히 말해서, 가져온 qPCR 데이터를 독창적 지식 베이스 (Ingenuity Knowledge Base)와 비교하여, 관련된 네트워크, 업스트림 조절자 및 연결성을 기반으로 알고리즘적으로 생성된 기계적 네트워크의 목록을 얻었다. p-값 ≤ 0.05인 유전자만 고려되었으며, 직접적 및 간접적 관계가 모두 고려되었다. 업스트림 조절자 분석을 이용하여 문헌에 기반하고 독창적 지식 베이스에 컴파일링된 데이터세트로부터 업스트림 전사 조절자를 예측하였다. 분석은 업스트림 조절자의 공지된 표적이 처리된 세포 데이터세트에 얼마나 많이 존재하는지 및 대조군과 비교하여 변화 방향을 조사한다. 중복 p-값은 예측을 위한 활성화 z-점수 알고리즘과 함께 데이터세트의 유전자와 전사 조절자에 의해 조절되는 공지된 표적 간의 유의한 중복을 기반으로 하여 계산된다. 다운스트림 효과 분석을 이용하여 변화 방향이 생물학적 기능의 활성화 상태와 일치하는 경우 활성화 상태 (증가 또는 감소)를 예측하였다. 상위 기능 (세포 및 유기체 기능)은 IPA에 의해 점수가 매겨지고, p 값이 <2.2e-12인 히트맵으로 플로팅되고, 예측된 활성화 및 분자 수에 따라 분류되고, 상위 10개 경로 또는 세포/유기체 기능이 표시되었다. IPA는 업스트림 조절자 및 인과성 네트워크에 대해 벤자미니-호크베르그 (Benjamini-Hochberg: B-H) 수정된 p-값을 계산하여 코어 분석에서 이러한 결과의 통계적 엄격성을 높인다.
FACS에 의한 생체내 연구 및 종양내 림프구 침윤. 동물 관리 및 절차는 퍼듀 대학교 기관 검토 위원회 지침 (PACUC)에 따라 수행되었다. 생체내 생체활성 검정을 위해, TC2R 세포를 STAT1 결합 부위 또는 IFNγ 프로모터를 함유하는 루시페라제 리포터 벡터로 트랜스펙션시켜 '리포터 세포'를 생성하였다. 동일한 수의 리포터 세포 (7.7x105개)를 12.5 μg의 플라스미드 DNA (빈 대조군 pMCS, C-말단에 비-특이적 펩티드 (ns)를 갖는 IL-27, 또는 C-말단-표적화된 IL-27 (IL-27pepL))가 소노포레이션에 의해 2일 전에 뒤쪽 대퇴부에 투여된 C57BL6 수컷 (n=6)의 옆구리에 이식하였다. pDNA는 소노딜리버리 (중합체 NLSd+초음파+MB)을 통해 전달되었다. 리포터 세포 주입 후, 동물은 pDNA의 소노포레이션 후 제3일 또는 제7일에 Luc 활성에 대해 이미지 처리되었다. 생물발광 신호는 IVIS100 제노겐 이미저를 사용하여 pIL-27ns 또는 pIL-27pepL이 투여된 동물에서만 검출 가능하였으며 pMCS 대조군 벡터가 투여된 동물에서는 그렇지 않았다. IL-27 치료 연구를 위한 종양 이식을 위해, 본 발명자들은 10% FBS 및 1x AA를 갖는 DMEM:F12에서 성장된 TC2R 세포를 트립신처리하고, 1xDBPS 원심분리 단계에서 세척한 다음, 펠릿을 멸균 1xDPBS에 재현탁하고, 이소플루란 마취 하에 이식하기 전에 세포를 얼음 상에 유지하였다. 수컷 C57/BL6 마우스 (8-10주령) 옆구리를 면도하고, 5x105개의 TC2R 세포를 피하 이식하였다. 종양 성장을 버니어 (Vernier) 캘리퍼스를 사용하여 시간 경과에 따라 모니터링하여 mm3 단위의 종양 부피 측정값을 생성하였다.
유전자 전달을 위해, 본 발명자들은 문헌13,38에 기재된 바와 같이 합성된 하기를 함유하는 중합체: 역 핵 국소화 신호 (rNLS), rNLSd, 펜던트 테트라라이신 및 rNLS 올리고펩티드 (VKRKKKP; 서열식별번호: 4)를 갖는 폴리사이클로옥텐 중합체를 활용하였다. 본 발명자들은 낮은 보유 에펜도르프 튜브에서 중합체를 제조하고, 뉴클레아제-비함유 물에 용해시키고, 여과로 멸균하였다. NLSd의 스톡 용액을 6의 N/P 비율 (즉, 중합체에서 양성자화 가능한 질소 N 대 DNA 포스페이트 P의 비율)로 pGluc 플라스미드 DNA와 복합체를 형성할 수 있도록 희석하였다. 뉴클레아제-비함유 물 중의 DNA (12.5 μg)를 뉴클레아제-비함유 물 중의 중합체와 1:1 비율로 조합하고, 멸균 조건에서 최소 35분 동안 평형을 유지하였다. 폴리플렉스 형성 후, 5.5% 멸균 마이크로마커 마이크로버블 (비주얼소닉스 (VisualSonics), 캐나다 온타리오 토론토)을 튜브당 첨가하고, 수컷 마우스의 뒷다리에 근육내 주사하였다. 초음파 겔을 적용한 후, 본 발명자들은 60초 동안 1 MHz, 20% 듀티 사이클 및 3 W/cm2의 소니진 (Sonigene) 기기 (비주얼소닉스)를 사용하여 GLuc 또는 IL-27 플라스미드의 유전자 전달을 매개하도록 근육을 소노포레이션하였다. 근육에서 루시페라제 발현에 대한 생체내 이미징은 정맥내 루시페린 기질 투여하고 CCD 장치를 갖는 IVIS 이미저를 사용하여 15분 이내에 이미지를 수집하는 이전에 공개된 절차를 이용하여 소노포레이션 후 제4일에 수행되었다39,40. IL-27 요법 연구를 위해, 본 발명자들은 제4일에 (평균 ~30 mm3의 종양 크기) 플라스미드를 근육내 1회 투여하였다. 마우스는 시험된 처리와 관련하여 종양 크기에 의해 3개의 그룹으로 무작위 처리되었으며, 그룹 (pMCS, pIL27ns, pIL27pepL)당 n=6이었다. 침윤 림프구 검출을 위한 유동 세포 측정은 이전에 기재된 방법 및 항체를 활용하였다4.
통계 분석. 검정은 삼중으로 수행되었으며, 값은 평균±SEM 또는 95% 신뢰 구간으로 제공되었다. 독립표본 t-시험 및 보네페로니 (Bonferroni) t-시험을 이용한 일원 배치 분산 분석을 이용하여 수행되었으며, p<0.05는 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주되었다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 기재된 특정 구현에 대해 많은 변형이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 구현은 설명된 특정 제한 사항으로 제한되어서는 안된다. 다른 구현이 가능할 수 있다.
본 발명이 도면 및 전술한 설명에서 상세하게 예시되고 설명되었지만, 이는 예시적인 것으로서 특징이 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 하며, 단지 특정 실시양태만 나타내고 설명되었으며 본 발명의 취지 내에 있는 모든 변화 및 변형이 보호되는 것이 바람직하다는 것이 이해되어야 한다.
본 방법 및 장치의 범위는 하기 청구범위에 의해 정의되는 것으로 의도된다. 그러나, 본 개시내용은 이의 취지 또는 범위를 벗어나지 않으면서 구체적으로 설명되고 예시된 것과 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 기재된 실시양태에 대한 다양한 대안이 하기 청구범위에서 정의된 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 청구범위를 실시하는데 이용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되어야 한다.
참조문헌
Figure pct00009
Figure pct00010
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Figure pct00012
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Pro Gln Val Ala Ala Ile Ile 770 775 780 Glu Gly Cys Trp Thr Asn Glu Pro Trp Lys Arg Pro Ser Phe Ala Thr 785 790 795 800 Ile Met Asp Leu Leu Arg Pro Leu Ile Lys Ser Ala Val Pro Pro Pro 805 810 815 Asn Arg Ser Asp Leu 820 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> G4S linker <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Non-specific control peptide <400> 3 Glu Asp Leu Gly Arg Glu Lys 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> rNLS oligopeptide <400> 4 Val Lys Arg Lys Lys Lys Pro 1 5 <210> 5 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mouse IL27 with linked subunits of IL27B (EBI3) and IL27A (IL27p28) <400> 5 Met Ser Lys Leu Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Trp Ala Ser Arg Ser 1 5 10 15 Pro Gly Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Val Ala Leu Ser Gln Pro Arg Val 20 25 30 Gln Cys His Ala Ser Arg Tyr Pro Val Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr 35 40 45 Pro Leu Gln Ala Pro Asn Ser Thr Arg Ser Thr Ser Phe Ile Ala Thr 50 55 60 Tyr Arg Leu Gly Val Ala Thr Gln Gln Gln Ser Gln Pro Cys Leu Gln 65 70 75 80 Arg Ser Pro Gln Ala Ser Arg Cys Thr Ile Pro Asp Val His Leu Phe 85 90 95 Ser Thr Val Pro Tyr Met Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Gly Gly 100 105 110 Ala Ser Ser Ser Leu Leu Ala Phe Val Ala Glu Arg Ile Ile Lys Pro 115 120 125 Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Arg Thr Ala Gly Gln Arg Leu Gln 130 135 140 Val Leu Trp His Pro Pro Ala Ser Trp Pro Phe Pro Asp Ile Phe Ser 145 150 155 160 Leu Lys Tyr Arg Leu Arg Tyr Arg Arg Arg Gly Ala Ser His Phe Arg 165 170 175 Gln Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Thr Phe Thr Leu Arg Asn Ser Lys 180 185 190 Pro His Ala Lys Tyr Cys Ile Gln Val Ser Ala Gln Asp Leu Thr Asp 195 200 205 Tyr Gly Lys Pro Ser Asp Trp Ser Leu Pro Gly Gln Val Glu Ser Ala 210 215 220 Pro His Lys Pro Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Phe Pro 225 230 235 240 Thr Asp Pro Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Phe Thr Val Ser 245 250 255 Leu Tyr Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu Val Gln Gly Tyr Val His 260 265 270 Ser Phe Ala Glu Ser Arg Leu Pro Gly Val Asn Leu Asp Leu Leu Pro 275 280 285 Leu Gly Tyr His Leu Pro Asn Val Ser Leu Thr Phe Gln Ala Trp His 290 295 300 His Leu Ser Asp Ser Glu Arg Leu Cys Phe Leu Ala Thr Thr Leu Arg 305 310 315 320 Pro Phe Pro Ala Met Leu Gly Gly Leu Gly Thr Gln Gly Thr Trp Thr 325 330 335 Ser Ser Glu Arg Glu Gln Leu Trp Ala Met Arg Leu Asp Leu Arg Asp 340 345 350 Leu His Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu Ala Ala Gly Phe Lys Cys 355 360 365 Ser Lys Glu Glu Glu Asp Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 370 375 380 Glu Lys Lys Leu Pro Leu Gly Ala Leu Gly Gly Pro Asn Gln Val Ser 385 390 395 400 Ser Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Tyr Thr Tyr Gln Leu Leu His 405 410 415 Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Asp Leu Leu Leu Leu 420 425 430 Ser Leu Pro Arg Arg Pro Gly Ser Ala Trp Asp Ser 435 440 <210> 6 <211> 454 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human IL27 linked subunits IL27B (EBI3) and IL27A (IL27p28) <400> 6 Met Thr Pro Gln Leu Leu Leu Ala Leu Val Leu Trp Ala Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Cys Ser Gly Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg 20 25 30 Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser Trp 35 40 45 Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe Ile Ala 50 55 60 Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys Leu 65 70 75 80 Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln Leu 85 90 95 Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Trp 100 105 110 Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile Lys 115 120 125 Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gln 130 135 140 Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu Ile 145 150 155 160 Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala Arg 165 170 175 Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg Ala 180 185 190 Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Ile Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu 195 200 205 Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr 210 215 220 Met Ser Leu Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Phe 225 230 235 240 Pro Arg Pro Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg 245 250 255 Glu Phe Thr Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ala Glu Val 260 265 270 Arg Gly Gln Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val Asn 275 280 285 Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu Thr 290 295 300 Phe Gln Ala Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe Ile 305 310 315 320 Ser Thr Thr Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly Thr 325 330 335 Gln Gly Arg Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met Arg 340 345 350 Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu Ala 355 360 365 Ala Gly Phe Asn Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 370 375 380 Glu Glu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Leu 385 390 395 400 Gln Gly Pro Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr Arg 405 410 415 Leu Leu His Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu Leu 420 425 430 Leu Leu Leu Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe Pro 435 440 445 Thr Leu Ser Pro Gln Pro 450 <210> 7 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CANINE IL27 with linked subunits of IL27B (EBI3) and IL27A (IL27p28) <400> 7 Met Ala Pro Gly Leu Leu Leu Val Leu Ala Leu Trp Val Gly Cys Ser 1 5 10 15 Pro Cys Arg Gly Arg Glu Gly Ala Pro Ala Ala Pro Thr Gln Pro Arg 20 25 30 Val Arg Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Val Ala Val Asp Cys Phe Trp 35 40 45 Thr Leu Pro Pro Ala Pro Arg Ser Ala Thr Pro Thr Ser Phe Ile Ala 50 55 60 Thr Tyr Arg Leu Gly Val Ala Ala His Gly Glu Ser Leu Pro Cys Leu 65 70 75 80 Gln Gln Thr Pro Glu Ala Thr Ser Cys Thr Ile Pro Asp Val His Met 85 90 95 Phe Ser Met Val Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val Arg Pro Trp 100 105 110 Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Val Pro Glu Gln Leu Ile Lys 115 120 125 Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Val Leu Pro Arg Gln Arg 130 135 140 Leu Trp Val Gln Trp Glu Pro Pro Arg Ser Trp Pro Phe Pro Glu Leu 145 150 155 160 Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys His His Gly Ser Pro Arg 165 170 175 Phe Arg Gln Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Thr Phe Arg Ala 180 185 190 Val Arg Pro Gln Ala Arg Tyr Cys Ile Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu 195 200 205 Thr Asp Tyr Gly Glu Ser Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Ala Pro Ser 210 215 220 Thr Pro Leu Gly Lys Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Phe 225 230 235 240 Pro Arg Pro Pro Gly Arg Ser Pro Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg 245 250 255 Glu Phe Lys Val Ser Leu Gln Leu Ala Lys Lys Leu Phe Ser Glu Val 260 265 270 Arg Ile Gln Ala His His Phe Ala Glu Ser Gln Leu Pro Gly Val Ser 275 280 285 Leu Asp Leu Leu Pro Leu Gly Asp Gln Leu Pro Asn Val Ser Leu Pro 290 295 300 Phe Gln Ala Trp His Ser Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe Leu 305 310 315 320 Ser Met Met Leu His Pro Phe His Ala Leu Leu Glu Ser Leu Gly Ser 325 330 335 Gln Gly Gly Trp Thr Ser Ser Glu Lys Met His Leu Trp Thr Met Arg 340 345 350 Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Glu Tyr 355 360 365 Pro Pro Thr Cys Ser Thr Pro Arg Asp Gln Gln Glu Glu Glu Glu Glu 370 375 380 Gln His Glu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Ala Ala Ala Pro Gly Gly Pro 385 390 395 400 Ser Gln Thr Ala Val Gln Pro Ser Trp Pro Gln Leu Leu Tyr Thr Tyr 405 410 415 Gln Leu Leu His Ser Leu Glu Leu Ala Leu Ala Arg Ala Val Arg Asp 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Ser Gln Ala Gly Asn Pro Ala Pro Pro Val Gly His 435 440 445 Ser Thr Phe Gly Ser Gln Pro 450 455 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide targeting EG <400> 8 Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> peptide targeting GRP78 <400> 9 Ser Asn Thr Arg Val Ala Pro 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> peptide targeting BMPR1b <400> 10 Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> targeting petpide 11 <400> 11 Thr Pro Leu Ser Tyr Leu Lys Gly Leu Val Thr Val 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> targeting peptide 12 <400> 12 Asn Pro Tyr His Pro Thr Ile Pro Gln Ser Val His 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> targeting peptide 13 <400> 13 Ala Ser Ala Cys Pro Pro His 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Targeting peptide 14 <400> 14 Gly Gly Pro Asn Leu Thr Gly Arg Trp 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> targeting petpide 15 <400> 15 Phe Leu Pro Ala Ser Gly Leu 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> targeting petpide 16 <400> 16 Thr Pro Ile Val His His Val Ala 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE2p targeting peptide <400> 17 Thr Val Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Val Arg Val 1 5 10

Claims (25)

  1. 조작된 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물 물질이며, 상기 벡터는 치료 케모카인 또는 시토카인, 표적화 폴리펩티드, 및 하나 이상의 임의적 링커의 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 것인 조성물 물질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시토카인이 인터루킨-27 (IL-27), IL27p28 (IL-30), 엡스테인-바르 바이러스-유도된 유전자 3 (EBI3), IL-23, IL-18, IL-17, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물 물질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시토카인이 마우스, 인간, 또는 개 기원의 것인 조성물 물질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 시토카인이 하기 서열을 갖는 IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛으로 구성된 IL-27인 조성물 물질:
    Figure pct00013
    (서열식별번호: 5; IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 마우스 IL27); 또는
    Figure pct00014
    (서열식별번호: 6; IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 인간 IL27); 또는
    Figure pct00015
    (서열식별번호: 7; IL27B (EBI3) 및 IL27A (IL27p28)의 연결된 서브유닛을 갖는 개 IL27).
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 치료 기능을 추가로 갖는 것인 조성물 물질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 IL-6 수용체 알파 서브유닛을 표적화하는 S7 또는 'pepL', EGFR을 표적화하는 GE11, GRP78을 표적화하는 GRP78p, BMPR1b를 표적화하는 pepB1, pepB2, CLP12, IL-7Ra, GGP, TGFβ-모방체, IL-17Rp, 및 ACE2p를 포함하는 것인 조성물 물질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 Leu-Ser-Leu-Ile-Thr-Arg-Leu (서열식별번호: 1), EG를 표적화하는 YHWYGYTPQNVI (서열식별번호: 8), GRP78을 표적화하는 SNTRVAP (서열식별번호: 9), BMPR1b를 표적화하는 AISMLYLDENEKVVL (서열식별번호: 10), TPLSYLKGLVTV (서열식별번호: 11), NPYHPTIPQSVH (서열식별번호: 12), ASACPPH (서열식별번호: 13), GGPNLTGRW (서열식별번호: 14), FLPASGL (서열식별번호: 15, TGFβ-모방체), TPIVHHVA (서열식별번호: 16), 또는 TVALPGGYVRV (서열식별번호: 17)의 서열을 갖는 것인 조성물 물질.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 단일 펩티드, 동종이량체 또는 이종이량체의 조합인 조성물 물질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 임의적 링커가 부재하거나 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열식별번호: 2)의 단일 또는 복수의 반복 단위를 포함하는 것인 조성물 물질.
  10. 제1항에 있어서, 중합체를 추가로 포함하고, 상기 중합체는 하기를 포함하는 것: 역 핵 국소화 신호 (rNLS), rNLSd, 펜던트 테트라라이신 및 Val-Lys-Arg-Lys-Lys-Lys-Pro (서열식별번호: 4)의 서열을 갖는 rNLS 올리고펩티드를 갖는 폴리사이클로옥텐 중합체인 조성물 물질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물 물질의 치료 유효량을 하나 이상의 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 악성 종양 또는 면역 질환의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법.
  12. 하기 단계를 포함하는, 치료 단백질의 유전자를 전달하는 방법:
    a. 치료 단백질/생물제제, 표적화 폴리펩티드, 및 하나 이상의 임의적 링커의 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 조작된 플라스미드 벡터를 제조하는 단계.
    b. 펜던트 테트라라이신 및 Val-Lys-Art-Lys-Lys-Lys-Pro (서열식별번호: 4)의 서열을 갖는 rNLS 올리고펩티드를 갖는 폴리사이클로옥텐 중합체 골격에 부착된 rNLSd로 불리는 역 핵 국소화 신호 (rNLS)를 포함하는 중합체를 제조하는 단계;
    c. 상기 플라스미드 벡터 및 상기 중합체를 조합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
    d. 음파처리 (초음파-강화된 근육 트랜스펙션)의 임의적 보조로 상기 혼합물을 전달하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 치료 단백질이 케모카인 또는 시토카인인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 시토카인이 마우스, 인간, 및 개로부터의 인터루킨-27 (IL-27) 및 IL27p28 (IL-30) 또는 EBI3 단량체, IL-23, IL-18, 또는 IL-17을 포함하는 관련된 시토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 치료 단백질이 서열식별번호: 5, 6, 및 7의 서열을 포함하는 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 치료 기능을 추가로 갖는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 Leu-Ser-Leu-Ile-Thr-Arg-Leu (서열식별번호: 1), EG를 표적화하는 YHWYGYTPQNVI (서열식별번호: 8), GRP78을 표적화하는 SNTRVAP (서열식별번호: 9), BMPR1b를 표적화하는 AISMLYLDENEKVVL (서열식별번호: 10), TPLSYLKGLVTV (서열식별번호: 11), NPYHPTIPQSVH (서열식별번호: 12), ASACPPH (서열식별번호: 13), GGPNLTGRW (서열식별번호: 14), FLPASGL (서열식별번호: 15, TGFβ-모방체), TPIVHHVA (서열식별번호: 16), 또는 TVALPGGYVRV (서열식별번호: 17)의 서열을 갖는 것인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 임의적 링커가 부재하거나 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열식별번호: 3)의 단일 또는 복수의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
  19. 치료 유효량의 조성물 물질을 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 악성 종양 및 면역 질환의 완화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양 또는 면역 질환을 치료하는 방법이며, 여기서 상기 조성물 물질은
    a. 치료 단백질, 표적화 폴리펩티드, 및 하나 이상의 임의적 링커의 것을 포함하는 복수의 유전자의 융합물을 포함하는 조작된 플라스미드 벡터; 및
    b. 하기를 포함하는 중합체: 역 핵 국소화 신호 (rNLS), rNLSd, 펜던트 테트라라이신 및 Val-Lys-Art-Lys-Lys-Lys-Pro (서열식별번호: 4)의 서열을 갖는 rNLS 올리고펩티드를 갖는 폴리사이클로옥텐 중합체
    를 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 치료 단백질이 케모카인 또는 시토카인인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 시토카인이 마우스, 인간, 및 개로부터의 인터루킨-27 (IL-27) 및 IL27p28 (IL-30) 또는 EBI3 단량체, IL-23, IL-18, 또는 IL-17을 포함하는 관련된 시토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 치료 단백질이 서열식별번호: 5, 6, 및 7의 서열을 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 치료 기능을 추가로 갖는 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩티드가 Leu-Ser-Leu-Ile-Thr-Arg-Leu (서열식별번호: 1), EG를 표적화하는 YHWYGYTPQNVI (서열식별번호: 8), GRP78을 표적화하는 SNTRVAP (서열식별번호: 9), BMPR1b를 표적화하는 AISMLYLDENEKVVL (서열식별번호: 10), TPLSYLKGLVTV (서열식별번호: 11), NPYHPTIPQSVH (서열식별번호: 12), ASACPPH (서열식별번호: 13), GGPNLTGRW (서열식별번호: 14), FLPASGL (서열식별번호: 15, TGFβ-모방체), TPIVHHVA (서열식별번호: 16), 또는 TVALPGGYVRV (서열식별번호: 17)의 서열을 갖는 것인 방법.
  25. 제19항에 있어서, 상기 임의적 링커가 부재하거나 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열식별번호: 3)의 단일 또는 복수의 반복 단위를 포함하는 것인 방법.
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