ES2225977T3 - Agonistas de interleuquina 4 selectivos para linfocitos t. - Google Patents

Agonistas de interleuquina 4 selectivos para linfocitos t.

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ES2225977T3 ES97927864T ES97927864T ES2225977T3 ES 2225977 T3 ES2225977 T3 ES 2225977T3 ES 97927864 T ES97927864 T ES 97927864T ES 97927864 T ES97927864 T ES 97927864T ES 2225977 T3 ES2225977 T3 ES 2225977T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A MUTEINAS DE LA IL - 4 HUMANA NUMERADAS SEGUN LA IL - 4 TIPO SALVAJE QUE POSEE LA CAPACIDAD DE ACTIVAR CELULAS T PERO POSEE UNA CAPACIDAD REDUCIDA DE ACTIVACION DE LAS CELULAS ENDOTELIALES. EN PARTICULAR, LA INVENCION SE REFIERE A MUTEINAS DE LA IL - 4 HUMANA EN QUE LOS RESIDUOS EXPUESTOS A LA SUPERFICIE DE LA HELICE D DE LA IL - 4 TIPO SALVAJE SE MUTAN CON LO QUE LA MUTEINA RESULTANTE PROVOCA LA PROLIFERACION DE CELULAS T Y PROVOCA UNA SECRECION REDUCIDA DE LA IL - 6 DE LOS HUVECS RESPECTO A LA IL - 4 TIPO SALVAJE. CON ESTA INVENCION SE CONSIGUE UN MUTANTE MENOS TOXICO DE LA IL - 4 LO QUE PERMITE UN MAYOR USO TERAPEUTICO DE ESTA INTERLEUQUINA. ADEMAS LA INVENCION SE REFIERE A MUTEINAS DE LA IL - 4 QUE TIENEN MUTACIONES SENCILLAS, DOBLES Y TRIPLES REPRESENTADAS POR LAS DESIGNACIONES R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W; Y124A, Y124Q, Y124R, Y124S, Y124T; Y124A/S125A, T13D/R121E; Y R212T/E122F/Y124Q, CUANDO SE NUMERAN SEGUN LA IL - 4 TIPO SALVAJE (HIS=1). EN LA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTAN POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LAS MUTEINAS DE LA INVENCION, VECTORES QUE CONTIENEN LOS POLINUCLEOTIDOS, CELULAS HUESPEDES TRANSFORMADAS, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN LAS MUTEINAS Y PROCEDIMIENTOS TERAPEUTICOS DE TRATAMIENTO.

Description

Agonistas de interleuquina 4 selectivos para linfocitos T.
1. Campo de la invención
La invención se refiere generalmente a los campos de farmacología e inmunología. Más específicamente, la invención se refiere a composiciones novedosas de materia para activar selectivamente las células T, y que tienen activación reducida de las células endoteliales o los fibroblastos. Las composiciones novedosas incluyen variantes de la familia de las citocinas, y en particular la interleucina-4 humana (IL-4).
2. Descripción de la técnica relativa
La interleucina 4 (IL-4) es una citocina pleiotrópica, que tiene actividades sobre las células del sistema inmune, el endotelio y las de naturaleza fibroblástica. Los efectos descritos in vitro de la administración de la IL-4 incluyen la proliferación de las células B, la clase de las inmunoglobulinas que se intercambian en las células B. En las células T, la IL-4 estimula la proliferación de las células T después de la preactivación con mitógenos y regula hacia abajo la producción de IFN-\gamma. En los monocitos, la IL-4 induce la expresión de las moléculas de MHC de clase II, la liberación del tPA inducida por lipopolisacáridos, y la expresión de CD23. En las células endoteliales (abreviadamente en inglés EC), la IL-4 induce la expresión de la VCAM-1 y la liberación de la IL-6, y disminuye la expresión de ICAM-1 (Maher, DW, y col., Human Interleukin-4: An Immunomodulator with Potencial Therapeutic Applications, Progress in Growth Factor Research, 3: 43-56 (1991)).
Debido a su capacidad para estimular la proliferación de las células T activada por la exposición a la IL-4, se ha perseguido la terapia con IL-4. Por ejemplo, la IL-4 ha demostrado la actividad anti-neoplásica en modelos animales de carcinomas renales, y ha inducido la regresión tumoral en ratones (Bosco, M y col., Low Doses of IL-4 Injected Perilymphatically in Tumor-bearing Mice Inhibit the Growth of Poorly and Apparently Nonimmunogenic Tumors and Induce a Tumor Specific Immune Memory, J. Immunol., 145: 3136-43 (1990)). Sin embargo, su toxicidad limita la dosificación en seres humanos (Margolin, K, y col., Phase II Studies of Human Recombinant Interleukin-4 in Advanced Renal Cancer and Malignant Melanoma, J. Immunotherapy, 15: 147-153 (1994)).
Debido a su actividad inmunorreguladora, se sugieren numerosas aplicaciones clínicas para la IL-4. Entre estas aplicaciones clínicas están los trastornos producidos por el desequilibrio del sistema inmune, particularmente las producidas por los desequilibrios de las respuestas de las células auxiliares T (Th) al antígeno. Estas enfermedades incluyen ciertas enfermedades autoinmunes, enfermedades reumáticas, enfermedades dermatológicas, y enfermedades infecciosas. Una gran cantidad de trabajo experimental ha establecido que las células Th caen en dos amplias clases, denominadas Th1 y Th2 (Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A. and Coffman, R. L., Two types of murine helper T cell clone I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins, J. Immunol., 136: 2348-2357 (1986); Mosmann, T. R., Cytokines, differentiation and functions of subsets of CD4 y CD8 T cells, Behring Inst. Mitt., 1-6 (1995)). Estas clases de células T se definen mediante las citocinas que expresan: las células Th1 elaboran la IL-2, el INF-\gamma, y el TNF-\alpha, mientras que las células Th2 elaboran la IL-4 y la IL-5. Las células Th1 y Th2 se forman a partir de las células T CD4+. La diferenciación en los subconjuntos Th1 y Th2 depende de la citocina presente durante la estimulación de antígenos: el IFN-\gamma y la IL-12 dirigen la diferenciación de células indeterminadas para el fenotipo de Th1, mientras que la IL-A dirige la diferenciación para el fenotipo de Th2. Mientras que los subconjuntos Th1 y Th2 pueden representar extremos junto con una continuación de los fenotipos de las células T (por ejemplo, se han descrito las células Th0, que expresan bajos niveles de tanto el INF-\gamma como de la IL-4), no obstante esta clasificación es el paradigma principal en el campo de la inmunología para describir el carácter de la respuesta inmune.
Se ha observado que ciertas enfermedades autoinmunes específicas de órganos se asocian predominantemente a una respuesta de las células T Th1 contra el autoantígeno (Liblau RS; Singer SM; McDevitt HO, Th1 and Th2 CD4* T cells in the patogénesis of organ-specific autoimmune diseases, Immunol. Today, 16: 34-38 (1995)). Una de tales enfermedades autoinmunes es la diabetes insulinodependiente (abreviadamente en inglés IDDM), un trastorno caracterizado por la destrucción mediada por las células T de las células pancreáticas \beta. Varias líneas de evidencia sugieren que las células de tipo Th1 son responsables principalmente de la destrucción de las células pancreáticas \beta (revisado en Tisch, R. y col., revisión: Insulin-dependent Diabetes Mellitus, Cell, 85: 291-297 (1996)). La administración de la IL-4 a ratones NOD, que sirve como un modelo animal de la IDDM, regula hacia abajo la población de células Th1 y significativamente retrasa la aparición de diabetes (Rapoport, y col., IL-4 Reverses T cell Proliferation Unresponsiveness and Prevents the Onset of Diabetes in NOD Mice, J. Exp. Med., 178: 87-99 (1993)). Otra tal enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple (abreviadamente en inglés MS), una enfermedad que se caracteriza por un ataque autoinmune sobre la cubierta de mielina que rodea las células nerviosas. Los estudios en seres humanos con MS han demostrado que la exacerbación de MS está asociada a la presencia de células Th1 y Th0 específicas de autoantígenos y esa remisión está asociada a la presencia de células Th2 y Th0 específicas de autoantígenos (Correale,. y col., Patterns of cytokine secretion by autoreactive proteolipid protein-specific T cells clones during the course of multiple sclerosis, J. Immunol., 154: 2959-2968 (1995)). Los ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (abreviadamente en inglés EAE), un modelo animal para la MS, también muestran la polarización de las células Th1 (Cua, DJ, Hinton, DR, y Stohlman, SA, J. Immunol., 155: 4052-4059 (1995)). La evidencia indirecta de un estudio en el modelo EAE sugiere que la IL-4 juega un papel crítico en la atenuación de la enfermedad que se produce del tratamiento con un péptido tolerogénico (Broche, S y col., Treatment of experimental encephalomyelitis with a peptide analogue of myellin basic protein, Nature, 379: 343-346 (1996)).
Otras enfermedades autoinmunes tal como artritis reumatoide (RA) son también objetivos de las terapias basadas en la IL-4. Los modelos animales de la RA han mostrado un desequilibrio de los perfiles de las células que se inclinan hacia las células Th1, y en ratones que sobreexpresan el TNF-\alpha, los anticuerpos anti TNF-\alpha han mostrado atenuación de la enfermedad, sugiriendo que las terapias con la IL-4 que dan como resultado la regulación hacia debajo de las poblaciones de las células Th1 pueden tener también un efecto anti-TNF-\alpha. (véase Feldmann, M., y col., Revisión: Rheumatoid Artritis, Cell, 85: 307-310 (1996)).
La soriasis vulgar es un trastorno dermatológico crónico caracterizado por infiltración de la piel afectada con monocitos y células T. Varias reseñas indican que las células T de las lesiones de la piel soriática y PBL son predominantemente del fenotipo Th1 (Uyemura K; Yamamura M; Fivenson DF; Modlin RL; Nickoloff BJ, The cytokine network in lesional and lesion-free psoriatic skin is characterized by a T-helper type 1 cell-mediated response, J. Invest Dermatol., 101: 701-705 (1993); Schlaak JF; Buslau M; Jochum W; Hermann E; Girndt M; Gallati H; Meyer zum Buschenfelde KH; Fleischer B, T cells involved in psoriasis vulgaris belong to the Th1 subset, J. Invest Dermatol, 102: 145-149 (1994)). Además, el fumarato de monometilo, un fármaco que se ha descrito que es de beneficio clínico para los pacientes con soriasis, se ha mostrado que estimula selectivamente la secreción de citocinas Th2 a partir de PMBC (de Jong R; Bezemer AC; Zomerdijk TP; van de POUM-Kraan T; Ottenhoff TH; Nibbering PH, Selective stimulation of T helper 2 cytokine responses by the anti-psoriasis agent monomethylfumarate, Eur J Immunol, 126: 2067-2074 (1996)).
Por lo tanto, se esperaría que la IL-4 revirtiera la polarización de Th y que sea de beneficio clínico en la soriasis.
Ciertas enfermedades infecciosas están asociadas a las respuestas de las células Th polarizadas al agente infeccioso. Las respuestas de Th2 se han asociado en algunos casos a la resistencia al agente infeccioso. Un ejemplo es Borrelia burgdorfei, el agente infeccioso de la enfermedad de Lyme. Los seres humanos infectados con B. burgdorfei muestran un perfil de citocinas similar a Th1 (Oksi J; Savolainen J; Pene J; Bousquet J; Laippala P; Viljanen MK, Decreased interleukin-4 and increased gamma interferon production by peripheral blood mononuclear cells of patients with Lyme borreliosis, Infect. Immun., 64: 3620-3623 (1996)). En un modelo de ratones de artritis inducida por B. burgdorferi, la resistencia está asociada a la producción de la IL-4 mientras la susceptibilidad está asociada a la producción de INF-\alpha (Matyniak JE; Reiner SL; T helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme disease, J. Exp Med, 183: (3): 1251-1254 (1995); Keane-Myers A; Nickell SP, Role of IL-4 and IFN-gamma in modulation of immunity to Borrelia burgdorferi in mice, J Immunol, 155: 2020-2028 (1995)). El tratamiento ratones infectados con B. burgdorferi-con la IL-4 aumenta la resistencia a la infección (Keane-Myers A; Maliszewski CR; Finkelman FD; Nickell SP, Recombinant IL-4 treatment augments resistance to Borrelia burgdorferi infections in both normal susceptible and antibody-deficient susceptible mice, J Immunol., 156: 2488-2494 (1996)).
Se ha descrito que la IL-4 tiene un efecto diferente sobre la inhibición del crecimiento de linfomas y leucemias (Akashi, K, The role of interleukin-4 in the negative regulation of leucemia cell growth, Leuk Lymphoma, 9: 205-9 (1993)). Por ejemplo, la IL-4 se ha descrito que induce apoptosis en las células de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (Manabe, A y col., Interleukin-4 induces programmed cell death (apoptosis) in cases of high-risk acute
lymphoblastic leucemia, Blood, 83: 1731-7 (1994)), e inhibe el crecimiento de las células de los pacientes con linfoma no Hodgkin de células B (Defrance, T, y col., Antiproliferative effects of interleukin-4 on freshly isolated non-Hodgkin malignant B-lympohoma cells, Blood, 79: 990-6 (1992)).
También se ha descrito que la IL-4 exhibe actividades que sugiere que sería de beneficio clínico en osteoartritis. La osteoartritis es una enfermedad en la que la degradación del cartílago es la patología principal (Sack, KE, Osteoar- thritis, A continuing challenge, West J Med, 163: 579-86 (1995); Oddis, CV, New perspectives on osteoarthritis, Am J Med, 100: 10S-15S (1996)). La IL-4 inhibe la producción del TNF-\alpha y de la IL-1 beta por monocitos y sinoviocitos de pacientes osteoartríticos (Bendrups, A, Hilton, A, Meager, A and Hamilton, JA, Reduction of tumor necrosis factor alpha and interleukin-1 beta levels in human synovial tissue by interleukin-4 and glucocorticoid , Rheumatol Int, 12: 217-210 (1993); Seitz, M y col., Production of interleukin-1 receptor antagonist, inflammatory chemotactic proteins, and prostaglandin E by rheumatoid and osteoarthritic sinoviocytes-regulation by IFN-gamma and IL-4, J Immunol, 152: 2060-5 (1994)). Adicionalmente, la IL-4 se ha descrito que bloquea directamente la degradación de cartílago en explantes de cartílagos ex vivo (Yeh, LA, Augustine, AJ, Lee, P, Riviere, LR and Sheldon, A, Interleukin-4, an inhibitor of cartilage breakdown in bovine articular cartilage explants, J Rheumatol, 22: 1740-6 (1995)). Estas actividades sugieren que la IL-4 será de beneficio clínico en osteoartritis.
Sin embargo, el uso clínico de la IL-4 ha estado limitado debido a su toxicidad aguda, que se manifiesta como un síndrome de escape vascular (Margolin, K., y col., Phase II studies of Human recombinant Interleukin-4 Advanced Renal Cancer and Malignant Melanoma, J Immunotherapy, 15: 147-153 (1994)). No existe técnica en la bibliografía que describa el mecanismo del efecto tóxico agudo de la IL-4, ni que describa análogos o mutantes de la IL-4 que mantiene las actividades inmunorreguladoras pero que tienen toxicidad aguda reducida.
Se conocen las proteínas mutantes de la IL-4 ("muteínas"). La muteína de la IL-4 IL-4/Y124D es un antagonista de las células T (Kruse N, Tony HP, Sebald W, Conversión of human interleukin-4 into a high affinity by a single amino acid replacement, Embo J, 11: 3237-44 (1992)).
Los usos terapéuticos de la IL-4 encontrados en pacientes o aplicaciones a pacientes incluyen lo siguiente: el uso de la IL-4 para potenciación de los efectos anticáncer de agentes quimioterapéuticos, particularmente la enfermedad de Hodgkin y linfoma no Hodgkin (véase el documento WO 9607422); el uso de fragmentos antigénicos de la IL-4 para generar anticuerpos para tratar las enfermedades relativas a la IL-4 suprimiendo o imitando la actividad de unión de la IL-4 (véase el documento WO 9524481), y detectar, medir e inmunopurificar la IL-4 (véase el documento WO 9317106); para inducir la diferenciación precursor de las células B precursoras a las células secretoras de inmunoglobulinas, las células B maduras siendo útiles para restaurar la función inmune de pacientes inmunocomprometidos (véase el documento WO 9404658); cuando se usa en combinación la IL-10, como terapia para tratamiento de leucemia, linfoma, enfermedad inflamatoria del intestino e hipersensibilidad de tipo retardado (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Chron) (véase el documento WO 9404180); el tratamiento de la infección por VIH mediante la administración de la IL-4 para inhibir la replicación viral en monocitos y macrófagos, e incrementar su citotoxicidad hacia algunas células tumorales (véase el documento WO 9404179); para la estimulación de la proliferación de fibroblastos cutáneos para tratar heridas en pacientes diabéticos e inmunocomprometidos (véase el documento WO 9211861); para potenciar la respuesta inmune primaria cuando se administran vacunas bacterianas, toxoides, y virales, especialmente vacuna de toxoides de tétanos (véase el documento 9211030); para la inhibición de la proliferación de las malignidades de las células B inducidas por la IL-2, especialmente leucemia linfocítica crónica, linfoma maligno no Hodgkin (véase el documento 9210201); uso de la IL-4 para tratar melanomas, carcinomas renales y de células basales (véase el documento WO 9204044).
La bibliografía de patentes describe las proteínas de IL-4 y algunas muteínas, pero ninguna se refieren a una terapia por la IL-4 con efectos secundarios reducidos. Lee y col., patente de estados Unidos Nº 5.017.691 ("la patente 691") se refiere a proteínas y muteínas de mamíferos de la IL-4 humana que describen tanto la actividad del factor de crecimiento de las células B como la actividad del factor de crecimiento de las células T. Describe ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que muestran actividad de la IL-4, así como los propios polipéptidos y procedimientos para su producción. Las muteínas para la IL-4 de tipo salvaje en las posiciones de los aminoácidos se describe que retienen su capacidad para estimular tanto la proliferación de las células B como de las células T in vitro. Sin embargo, nada en Lee sugiere cualquier muteína de la IL-4 selectiva de las células T, activación anticipada de las EC o la pérdida de las células endoteliales que acompaña la administración de la IL-4. Así pues, la propia IL-4 no es posible como modalidad terapéutica debido a la toxicidad limitante de la dosis.
La patente de estados Unidos Nº 5.013.824 describe los derivados peptídicos de la hIL-4 que comprenden entre 6 y 40 aminoácidos de la hIL-4 nativa. También se describen imunógenos que comprenden conjugados de los péptidos y vehículos. Los vehículos incluyen eritrocitos, bacteriófagos, proteínas, partículas sintéticas o cualquier sustancia capaz de provocar producción contra el péptido conjugado. No se describen ninguna de las muteínas de la IL-4.
El documento WO 96/04306-A2 describe las muteínas individuales que son antagonistas y agonistas parciales de la hIL-4 y de la hIL-13. No se describe ningún dato con relación a la IL-4. El documento WO 95/27052 describe mutantes de ayuste de la IL-2 y de la IL-4 que contienen los exones 1, 2 y 4.
Existe una necesidad de una molécula de IL-4 mejorada que tenga toxicidad reducida y se tolere generalmente más.
Sumario de la invención
La invención se refiere a las muteínas de la IL-4 humanas numeradas de acuerdo con la IL-4 de tipo salvaje que tienen actividad activadora de las células T, pero que tienen actividad activadora reducida de las células endoteliales. En particular, las muteínas de la IL-4 humanas en las que los residuos expuestos en la superficie de la hélice D de la IL-4 de tipo salvaje están mutadas por lo que la muteína resultante produce proliferación de las células T, y produce secreción reducida de la IL-6 a partir de las HUVEC, con relación a la IL-4 de tipo salvaje. Esta invención lleva a cabo una muteína de la IL-4 menos tóxica que permite un mayor uso terapéutico de esta interleucina.
Además, la invención se refiere a las muteínas de la IL-4 que tienen mutaciones individuales, dobles y triples representadas por los designadores R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W; Y124A, T124Q, Y124R, Y124S, Y124T; Y124A/S125A, T13D/R121E; y R121T/E122F/Y124Q, cuando se numeran de acuerdo a la IL-4 de tipo salvaje (His = 1). La invención también incluye polinucleótidos que codifican las muteínas de la invención, vectores que contienen los polinucleótidos, células transformadas de huésped, composiciones farmacéuticas que comprenden las muteínas, y procedimientos terapéuticos de tratamiento.
La invención también se refiere a un vector que comprende el polinucleótido que codifica una muteína de esta invención, el vector que se refiere a la expresión de una muteína de la IL-4 humana que tiene actividad activadora de las células T pero que tiene actividad activadora reducida de las células endoteliales, el vector siendo capaz de permitir la transfección de un organismo diana y posterior expresión in vivo de dicha muteína de la IL-4 humana codificada por dicho polinucleótido.
La invención también se refiere a un procedimiento de selección de una muteína de la IL-4 humana numerada de acuerdo con la IL-4 de tipo salvaje que tiene actividad activadora de las células T pero teniendo actividad activadora reducida de las células endoteliales, que comprende la mutación de los residuos expuestos sobre la superficie de la hélice D de la IL-4 de tipo salvaje mediante la que la muteína resultante produce la proliferación de las células T, y produce la secreción reducida de la IL-6 a partir de las HUVEC, con relación al tipo salvaje.
La invención también se refiere a un procedimiento de tratamiento de un paciente aquejado con una afección tratable con la IL-4 mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una muteína de la IL-4 humana numerada de acuerdo con la IL-4 de tipo salvaje que tiene actividad activadora de las células T pero que tiene actividad activadora reducida de las células endoteliales. Este procedimiento es aplicable cuando la afección tratable con la IL-4 es un trastorno autoinmune, cáncer, enfermedad infecciosa, trastorno de cartílagos, y trastornos psoriáticos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 1) de la IL-4 humana de tipo salvaje madura usada en este estudio. Las hélices están subrayadas y marcadas secuencialmente A, B, C, y D. Las posiciones que, cuando mutan produjeron agonistas de las IL-4 selectivos de las células, se indican en letra negrita.
La figura 2 es una presentación gráfica del concepto agonista selectivo de las células T.
La figura 3 es una curva dosis-respuesta de un material compuesto para las muteínas agonistas selectivas en el ensayo de secreción de la IL-6 en las HUVEC. Panel A: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121E; \nabla, R121P; \blacktriangledown, R121T/
E122FY124Q. Panel B: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124Q; \nabla, Y124R; \blacktriangledown, Y124A/S125A.
La figura 4 son curvas dosis-respuesta individuales de las muteínas agonistas selectivas en el ensayo de secreción de la IL-6 en las HUVEC. Panel A: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121E; Panel B: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121P. Panel C: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124Q. Panel D: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124R,. Panel E: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124A/S125A. Panel F: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121T/E122F/Y124Q.
La figura 5 es una curva dosis-respuesta para las muteínas agonistas selectivas para la respuesta biológica de las muteínas de la IL-4 en los ensayos de proliferación de las células T primarias. Panel A: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121E; \nabla, R121P; \medbullet, R121T/E122FY124Q. Panel B: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124Q; \nabla, Y124R; \blacktriangledown, Y124A/S125A.
La figura 6 son curvas dosis-respuesta individuales de las muteínas agonistas selectivas para el ensayo de proliferación de las células T primarias. Panel A: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121E; Panel B: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121P. Panel C: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124Q. Panel D: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124R,. Panel E: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, Y124A/S125A. Panel F: \medcirc, IL-4 de tipo salvaje; \medbullet, R121T/E122F/Y124Q.
La figura 7 son curvas individuales dosis-respuesta que muestran el antagonismo de la secreción de la IL-6 inducida por la IL-4 sobre las HUVEC mediante las muteínas de la IL-4 agonistas selectivas de las células T R121E (\medbullet) e Y124Q (\nabla). La dosis respuesta de la R121D/Y124D antagonista de la IL-4 (\medcirc) se incluye como control.
Las figuras 8A, 8B son curvas dosis-respuesta: el panel A muestra la respuesta biológica de la muteína R121D en el ensayo de proliferación de las células T primarias (\medcirc = IL-4, \medbullet, = R121D); el panel B muestra la incapacidad de R121D de inducir la secreción de la IL-6 sobre las HUVEC (\medcirc = IL-4, \medbullet, = R121D).
La figura 9A son curvas-dosis respuesta para la IL-4 (\medcirc) y las muteínas agonistas selectivas de las células T R121E (\triangle) y T13D/R121E (\blacktriangle) en el ensayo de proliferación de las células T primarias.
La figura 9B son curvas individuales dosis-respuesta que muestran el antagonismo de la secreción de la IL-6 inducida por la IL-4 sobre las HUVEC mediante las muteínas de la IL-4 agonistas selectivas de las células T R121E (\triangle) y T13D/R121E (\blacktriangle).
Descripción de las realizaciones preferidas A. Antecedentes
B. 
\hskip5mm
La IL-4 se ha mostrado que media una diversidad de respuestas celulares in vitro, incluyendo diversos efectos sobre las células B, sobre las células T, y sobre los monocitos, así como las células endoteliales (Maher DW, Davis I, Boyd AW, Morstyn G: Human interleukin-4: an immunomodulator with potencial therapeutic applications, Prog Growth Factor Res 3: 43-56, 1991; Powrie F, Coffman RL: Cytokine regulation of T cell function: potential for therapeutic intervention. Immunol Today 14: 270-4, 1993). En particular, la regulación hacia arriba de la molécula 1 de adhesión de células vasculares (abreviadamente en inglés VCAM-1); (Swerlick RA, Lek, Li LJ, Sepp NT, Caughman SW, Lawley TJ: Regulation of vascular cell adhesión molecule 1 on human dermal microvascular endothelial cells J Immunol 149: 698-705, 1992)) e inducción de la IL-6 (Colotta F, Sironi M, Borre A, Luini W, Maddalena F, Mantovani A: Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 ptoduction by endotelial cells, Cytokine 4: 24-8, 1992), y la proteína quimioatractiva de monocitos (MCP-1; Colotta F, Sironi M, Borre A, Luini W, Maddalena F, Mantovani A: Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 ptoduction by endotelial cells, Cytokine 4: 24-8, 1992; Rollins BJ, Pober JS: Interleukin-4 induces the synthesis and secretion of MCP-1/JE by human endotelial cells. Am J Pathol 138: 1315-9, 1991)) son efectos directos de la IL-4 sobre las células endoteliales cultivadas; la regulación hacia arriba de la VCAM-1 está correlacionada con el aumento de adhesión de linfocitos tanto in vitro (Carlos TM, Schwartz BR, Kovach NL, Yee E, Rosa M, Osborn L, Chi-Rosso G, Newman B, Lobb R, Rosso M, y col.; Vascular cell adhesion molecule-1 mediates lymphocyte adherente to cytokine-activated cultured human endotelial cells. Blood 76: 965-970, 1990; Thornhill MH, Wellicome SM. Mahiouz DL, Lanchbury JS, Kyan-Aung U, Haskard DO: Tumor necrosis factor combines with IL-4 or IFH-gamma to selective enhance endothelial cell adhesiveness for T cells. The contribution of vascular cell adhesion molecule-1 dependent and-independent binding mechanisms. J Immunol 146: 592-8, 1991) e in vivo (Briscoe DM, Cotran RS, Pober JS: Effects of tumor necrosis factor, lipopolysacharide, and IL-4 on the expression of vascular cell adhesion molecule-1 in vivo. Correlation with CD3 + T cell infiltration. J Immunol 149: 2954-60, 1992).
La muteína de IL-4 IL-4/Y124D (sustitución de ácido aspártico por tirosina en la posición 124) es un antagonista de las células T (Kruse N, Tony HP, Sebald W: Conversión of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement. Embo J 11: 3237-44, 1992). Los experimentos realizados in vivo realizados por los interventores han demostrado que IL-4/Y124D muestra una toxicidad aguda similar a la IL-4 de tipo salvaje en monos, una observación no descrita previamente. Los casos celulares asociados a la toxicidad mediada tanto por la IL-4 de tipo salvaje como la IL-4/Y124D incluyen la regulación hacia arriba de la VCAM-1, regulación hacia arriba del MCP-1 en suero, incrementa los monocitos circulantes junto con un descenso simultáneo de linocitos circulantes, y un incremento de hematocrito. Se ha observado un tráfico celular similar en ensayos clínicos usando la IL-4 en seres humanos (Wong HL, Lotze MT, Wahl LM, Wahl SM: Administration of recombinant IL-4 to humans regulates gene s, phenotype, and function in circulating monocytes. J Immunol 148: 2118-25, 1992). Debido a sus propiedades como antagonistas de las células T, estos resultados sugieren que las toxicidades demostradas por la IL-4/Y124D se deben a las actividades agonistas sobre y que están mediadas a través de otras células distintas de las células T. Las toxicidades observadas in vivo usando la IL-4/Y124D y los efectos conocidos de la IL-4 sobre las células endoteliales son consistentes con el mecanismo que la toxicidad de la IL-4 in vivo se media a través de los efectos directos de la IL-4 sobre el endotelio vascular.
A través de estas investigaciones (y relacionadas), los inventores han descubierto que puede existir un nuevo receptor de la IL-4 sobre las células endoteliales ("EC"). Esta posibilidad condujo a esfuerzos para sintetizar las muteínas de la IL-4 que activarían selectivamente las células T, pero no las EC. Mientras las células T expresan un receptor de la IL-4 compuesto de las subunidades IL-4R\alpha e IL-2R\gamma, los inventores han descubierto que las células endoteliales de cordón umbilical humano (abreviadamente HUVEC), expresan la IL-4\alpha pero no la IL-2\gamma. Estudios de entrecruzamiento han mostrado que dos cadenas receptoras se expresan en la superficie celular de las HUVEC: el peso molecular de una es consistente con la IL-4\alpha, y una segunda, cadena de peso molecular inferior. Estos resultados sugieren que un componente del receptor de la IL-4 novedoso similar en función a la IL-2R\gamma, pero diferente en secuencia, se expresa sobre las HUVEC. Las diferencias en las estructuras moleculares específicas entre estos dos receptores se explotaron así para generar una variante de la IL-4 que es selectivo para un receptor sobre el otro (por ejemplo, un agonista selectivo de las células T).
La figura 2 muestra gráficamente el concepto agonista selectivo. Muestra el receptor de la IL-4 de las células T comprendiendo la subunidad IL-4\alpha/IL-2R\gamma, y un receptor de la IL-4 de las células endoteliales comprendiendo la subunidad de los receptores de IL-4\alpha/tipo \gamma. Aunque mostrados aquí juntos para propósitos de ilustración solamente, los dos receptores para la IL-4 se expresan sobre diferentes tipos de células. El receptor de las células T está compuesto de la IL-4\alpha y la IL-2R\gamma; la unión a la IL-4 induce la formación de heterodímeros de los receptores que da como resultado la señalización celular. La formación de heterodímeros de los receptores inducida por la IL-4 se produce de una manera similar sobre las EC, excepto que el receptor para la IL-4 se compone de IL-4\alpha y un componente receptor de tipo \gamma. El componente receptor de tipo \gamma es diferente de la IL-2R\gamma. Los agonistas de la IL-4 selectivos de las células T son aquellos variantes de la IL-4 que mantienen su capacidad para interactuar con el receptor de las células T IL-4\alpha/IL-2R\gamma, pero son incapaces de inducir heterodimerización, y por lo tanto señalización, de la subunidad IL-4\alpha/tipo \gamma de los receptores de las células no T. Tales agonistas de la IL-4 selectivos de las células T mantienen su capacidad para interactuar con la IL-4\alpha; es su capacidad para discriminar entre la IL-2R\gamma y la subunidad de tipo \gamma que les proporciona sus propiedades de activación selectiva de las células.
Los dos componentes del receptor de las células T, IL-4\alpha e IL-2R\gamma, ponen en contacto diferentes regiones de la molécula de la IL-4, y por lo tanto los inventores se han centrado sobre una pequeña región de la IL-4 a modificar. Suponiendo que la subunidad novedosa de los receptores pusiera en contacto la misma región de la IL-4 como lo hace la IL-2R\gamma, los inventores realizaron un número de sustituciones en la hélice D, particularmente los residuos 121, 124 y 125.
La hélice D ha estado implicada en las interacciones con tanto la IL-2R\gamma como con el receptor novedoso supuesto sobre las HUVEC (específicamente, la muteína de la IL-4 R121D/Y124D es un antagonista de las HUVEC). Las muteínas que contienen modificaciones de la hélice D de la IL-4 (residuos 110 a 126; His = 1) se seleccionaron por su capacidad para estimular bien la proliferación de las células T o la secreción en las células endoteliales del cordón umbilical humano (abreviadamente en inglés HUVEC) de la IL-6. Las muteínas que inducen una respuesta diferencial sobre las células T relativa a las HUVEC se caracterizaron además a través de mutagénesis posterior.
Se emprendió un barrido inicial de la hélice para determinar las áreas potenciales de la interacción. Adicionalmente, también se generaron las sustituciones por barrido de alanina del bucle AB, ya que esta región se sugiere que está implicada en la interacción del ligando de las citocinas y la subunidad de los receptores que interactúan en la hélice D. En particular los residuos expuestos sobre la superficie Glu-110, Asn-111, Glu-114, Arg-115, Lys-117, Thr-118, Arg-121, Glu-122, Tyr-124, Ser-125, y Lys-126 se dirigieron para investigación y se prefieren las dianas para análisis de mutaciones. Se prefieren más los sitios 118-126, y los sitios 121-125 son los más preferidos. Las comparaciones entre IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15 en esta región también identifican diferencias entre IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15, posiblemente sugiriendo residuos específicos responsables para la interacción de los receptores de las HUVEC. Las sustituciones específicas derivadas de un alineamiento entre la IL-2 y la IL-4 se introdujeron en la IL-4. Estos incluyen: Arg-115 a Phe; Lys-117 a Asn; Glu-122 a Phe; Lys-126 a Ile; y tres cambios simultáneos Arg-121 a Thr, Glu-122 a Phe, y Tyr-124 a Gln.
Las mutaciones se introdujeron usando mutagénesis dirigida al sitio sobre el cDNA de la IL-4 humana de tipo salvaje. Los clones correctos se subclonaron a un vector de expresión adecuado para la expresión en un sistema heterólogo (por ejemplo, E. coli, baculovirus, o células CHO). Las proteínas purificadas se ensayaron en los ensayos de proliferación de las células T y de secreción de citocinas en las HUVEC (IL-6). Respuestas diferentes generadas por muteínas individuales entre estos ensayos, bien en la respuesta de la CE_{50} o en la máxima (meseta) indican mutaciones que efectúan estas actividades. Específicamente, las muteínas que estimulan una respuesta relativamente más fuerte en el ensayo de las células T (frente a la IL-4 de tipo salvaje) cuando se compara con la respuesta sobre las HUVEC (frente a la IL-4 de tipo salvaje) sugerirán posiciones que son más importantes para la interacción de la IL-4 con la IL-2R\gamma que la interacción de la IL-4 con el receptor novedoso de la IL-4 de las HUVEC. El análisis y mutagénesis adicional (por ejemplo, cambios combinatorios, sustitución con todos los aminoácidos) de las posiciones identificadas producirán una muteína de la IL-4 con propiedades agonistas selectivas para el receptor de la IL-4 de las células T. Esta proteína también será un antagonistra selectivo para las respuestas de las HUVEC inducidas por la IL-4.
C. Definiciones
En esta memoria descriptiva se describen las muteínas novedosas y un mecanismo para la liberación de las muteínas de la IL-4 novedosas con propiedades agonistas selectivas sobre las células T y toxicidad reducida. Una estrategia similar se puede usar para identificar un antagonista selectivo de las células T.
Como se usa en esta memoria descriptiva, "IL-4 de tipo salvaje" significa la IL-4, bien nativa o recombinante, que tienen la secuencia de 129 aminoácidos de origen natural de una IL-4 humana nativa, como se muestra, por ejemplo, en la figura 1.
Como se usa en esta memoria descriptiva, "muteína de la IL-4" significa un polipéptido en el que se han realizado las sustituciones específicas para la proteína de la interleucina 4 madura humana. Específicamente descrito en esta memoria descriptiva el residuo arginina (R) en la posición 121 ("Arg-121"), cuando se numeran de acuerdo con la IL-4 de tipo salvaje, se sustituye con alanina (A), aspartato (D), glutamato (E), fenilalanina (F), histidina (H), isoleucina (I), lisina (K), asparagina (N), prolina (P), treonina (T) o triptófano (W); o el residuo glutamato (E) en la posición 122 está sustituido con fenilalanina (F); o el residuo tirosina en la posición 124 está sustituido con alanina (A), glutamina (Q), arginina (R), serina (S) o treonina (T); o el residuo serina (S) en la posición 125 está sustituido con alanina (A). Las muteínas más preferidas por los investigadores tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a la IL-4 de tipo salvaje en los otros residuos no sustituidos. Sin embargo, las muteínas de la IL-4 de esta invención también se pueden caracterizar mediante inserciones, supresiones, sustituciones y modificaciones de aminoácidos en uno o más sitios dentro de o en los otros residuos de la cadena polipeptídica de la IL-4 nativa. De acuerdo con esta invención cualquiera de dichas inserciones, supresiones, sustituciones y modificaciones dan como resultado una muteína de la IL-4 que conserva una actividad selectiva de las células T mientras que tienen una capacidad reducida para activar las células endoteliales.
Los autores prefieren modificaciones conservadoras en otras posiciones de la IL-4 (es decir, las que tienen un efecto mínimo sobre la estructura secundaria o terciaria de la muteína). Tales sustituciones conservadoras incluyen las descritas por Dayhoff en The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), y por Argos en EMBO J., 8: 779-785 (1989). Por ejemplo, los aminoácidos que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios conservadores:
-
ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr;
-
cys, ser, tyr, thr;
-
val, ile, leu, met, ala, phe;
-
lys, arg, his;
-
phe, tyr, trp, his; y
-
asp, glu.
Los autores también prefieren modificaciones o sustituciones que no introducen sitios para entrecruzamiento intramolecular adicional o formación incorrecta de enlaces disulfuro. Por ejemplo, la IL-4 se sabe que tiene seis residuos cys, en las posiciones de tipo salvaje 3, 24, 46, 65, 99 y 127.
Por "numerada de acuerdo con la IL-4 de tipo salvaje" los autores quieren decir identificación de un aminoácido elegido con referencia a la posición en la que el aminoácido de origen natural en la IL-4 de tipo salvaje. Cuando se realizan inserciones o supresiones en la muteína de la IL-4, los expertos en la técnica apreciarán que la ser (S) de origen natural en la posición 125, cuando se numeran de acuerdo con la IL-4 de tipo salvaje, se pueden desplazar en posición en la muteína. Sin embargo, la localización de la ser (S) desplazada se puede determinar fácilmente mediante inspección y correlación de los aminoácidos flanqueantes con las ser flanqueantes en la IL-4 de tipo salvaje.
Las muteínas de la IL-4 de la presente invención se pueden producir por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Tales procedimientos incluyen la construcción de una secuencia de DNA que codifica las muteínas de la IL-4 de esta invención y que expresa las secuencias en un huésped transformando adecuadamente. Este procedimiento producirá muteínas recombinantes de esta invención. Sin embargo, también se pueden producir las muteínas de esta invención, aunque menos preferiblemente, mediante síntesis química o una combinación de la tecnología de síntesis química y de DNA recombinante.
En una realización de un procedimiento recombinante para producir una muteína de esta invención, una secuencia de DNA se construye mediante el aislamiento o síntesis de una secuencia de DNA que codifica la IL-4 de tipo salvaje y después cambiando el codón para arg 121 a un codón para alanina (A), aspartato (D), glutamato (E), fenilalanina (F), histidina (H), isoleucina (I), lisina (K), asparagina (N), prolina (P), treonina (T) o triptófano (W) mediante mutagénesis específica en el sitio. Esta técnica se conoce bien. Véase por ejemplo, Mark y col., "\cdotSite-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, pp. 5662-66 (1984); la patente de Estados Unidos 4.588.585.
Otro procedimiento de construcción de una secuencia de DNA que codifica las muteínas de la IL-4 de esta invención sería la síntesis química. Por ejemplo, un gen que codifica la muteína de la IL-4 deseada se puede sintetizar mediante medios químicos usando un sintetizador de oligonucleótidos. Tales oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de aminoácidos de la muteína de la IL-4 deseada, y preferiblemente seleccionando los codones que están favorecidos en la célula huésped en los que se producirá la muteína recombinante. A este respecto, se reconoce bien el código genético se degenera - - que un aminoácido puede estar codificado por mas de un codón. Por ejemplo, phe (F) está codificada por dos codones, TTC o TTT, tyr (Y) está codificada por TAC O TAT e his (H) está codificada por CAC o CAT. Trp (W) está codificado por un solo codón, TGG. De acuerdo a lo anterior, se apreciará que para una secuencia de DNA dada que codifica una muteína particular de IL-4, existirán muchas secuencias degeneradas de DNA que codificarán esa muteína de la IL-4. Por ejemplo, se apreciará que además de la secuencia preferida de DNA para la muteína R121E mostrada en la SEC ID Nº 3, existirán muchas secuencias degeneradas de DNA que codifican la muteína de la IL-4 mostrada. Estas secuencias de DNA degenerado se consideran que están dentro del alcance de esta invención. Por lo tanto, "variantes degeneradas de los mismos" en el contexto de esta invención significa todas las secuencias de DNA que codifican una muteína particular.
La secuencia de DNA que codifica la muteína de la IL-4 de esta invención, bien preparada por mutagénesis dirigida al sitio, síntesis u otros procedimientos, puede o puede también incluir secuencias de DNA que codifican una secuencia señal. Tal secuencia señal, si está presente, debe ser una reconocida por la célula elegida para la expresión de la muteína de la IL-4. Puede ser procariótica, eucariótica o una combinación de las dos. También puede ser la secuencia señal de la IL-4 nativa. La inclusión de una secuencia señal depende de si se desea secretar la muteína de la IL-4 a partir de las células recombinantes en las que está elaborada. Si las células elegidas son procarióticas, generalmente se prefiere que la secuencia de DNA no codifique una secuencia señal. Si las células elegidas son eucarióticas, generalmente se prefiere que la secuencia señal esté codificada y lo más preferiblemente que se use la secuencia señal de la IL-4 de tipo salvaje.
Se pueden aplicar procedimientos habituales para sintetizar un gen que codifica una muteína de la IL-4 según esta invención. Por ejemplo, la secuencia completa de aminoácidos se puede usar para construir un gen traducido de forma inversa. Se puede sintetizar un oligómero de DNA que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una muteína de la IL-4. Por ejemplo, se pueden sintetizar y luego ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado. Los oligonucleótidos pequeños típicamente contienen extremos protuberantes en 5' y 3' para ensamblaje complementario.
Una vez que se han ensamblado (mediante síntesis, mutagénesis directa al sitio u otro procedimiento), las secuencias de DNA que codifican una muteína de la IL-4 de esta invención se insertará en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la muteína de la IL-4 en el huésped transformado deseado. El ensamblaje apropiado se puede confirmar mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción, y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como se conoce en la técnica, con el fin d obtener niveles altos de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen se debe unir operativamente a secuencias de control de expresión transcripcional y traduccional que son funcionales en el huésped de expresión elegido.
La elección de la secuencia de control de expresión y vector de expresión dependerá de la elección del huésped. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de huéspedes/vectores de expresión. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucarióticos, incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus de papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli, incluyendo col E1, pCR1, PER32z, pMB9 y sus derivados, plásmidos de intervalo más amplio de huésped, tales como RP4, los DNA de fago, por ejemplo, los numerosos derivados de fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de DNA, tales como M13 y fagos de DNA con filamentos de cadena sencilla. Los vectores de expresión útiles para células de levaduras incluyen el plásmido de 2 \mu y los derivados de los mismos. Los vectores útiles para células de insectos incluyen pVL 941. Los autores prefieren pFastBac™ I (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Cate y col., "Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986).
Además, cualquiera de una amplia variedad de las secuencias de control de expresión se puede usar en estos vectores. Tales secuencias de control de expresión útiles incluyen las secuencias de control de expresión asociadas a genes estructurales de los vectores de expresión anteriores. Los ejemplos de las secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos de SV40 o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, las regiones principales de los operadores y promotores del fago lambda, por ejemplo PL las regiones de control de la proteína de revestimiento de fd, el promotor para la 3-fosfogliceratoquinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, por ejemplo, PhoA, los promotores del sistema de acoplamiento de levaduras \alpha, el promotor de polihedron de baculovirus, y otras secuencias conocidas que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.
Cualquier huésped adecuado se puede usar para producir las muteínas de la IL-4 de esta invención, incluyendo bacterias, hongos (incluyendo levaduras), células vegetales, de insectos, de mamíferos, o de otras células de animales o líneas celulares, así como animales o plantas transgénicas. Más particularmente, estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos conocidos, tales como cepas de E. coli, Psudomonas, Bacillus, Streptomyces, células de hongos, levaduras, insectos tales como Spodoptera frugiperda (Sf9), células animales tales como células de ovario de hámster chino (abreviadamente en inglés CHO) y células de ratones tales como células NS/O, de mono verde africano tales como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, y BNT 10, y células humanas, así como células vegetales en cultivo de tejidos. Para la expresión de células animales, los autores prefieren células CHO y células COS 7 en cultivos y particularmente la línea celular de CHO CHO (D HFR-).
Por supuesto, se debe entender que no todos los vectores y secuencias de control de expresión funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de DNA descritas en esta memoria descriptiva. Ninguno de todos los huéspedes funcionará igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden hacer una selección entre estos vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes sin experimentación indebida. Por ejemplo, al seleccionar un vector, se debe considerar el huésped debido a que el vector se debe replicar en él. El número de copias de los vectores, la capacidad para controlar ese número de copias, y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tales como marcadores de antibióticos, también se deben considerar. Por ejemplo, los vectores preferidos para uso en esta invención incluyen los que permiten que el DNA que codifica las muteínas de la IL-4 se amplifique en número de copias. Tales vectores amplificables se conocen bien en la técnica. Incluyen, por ejemplo, vectores capaces de amplificarse mediante amplificación por DHFR (véase, por ejemplo, Kaufman, la patente de Estados Unidos 4.470.461, Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expresión", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) o amplificación por glutaminasinetasa ("GS") (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.122.464 y la solicitud europea publicada 338.841).
Cuando se selecciona una secuencia de control de expresión, también se deben considerar una diversidad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la resistencia de la secuencia, su controlabilidad, y su compatibilidad con la secuencia real de DNA que codifica la muteína de la IL-4 de esta invención, particularmente con referencia a las estructuras secundarias potenciales. Los huéspedes se deben seleccionar por la consideración de su compatibilidad con el vector elegido, la toxicidad del producto codificado por las secuencias de DNA de esta invención, sus características de secreción, su capacidad para plegar correctamente los polipéptidos, sus requerimientos de fermentación o de cultivo, y la facilidad de purificación de los productos codificados por las secuencias de DNA.
Dentro de estos parámetros los expertos en la técnica pueden seleccionar diversas combinaciones secuencia/huésped de control de vector/expresión que expresarán las secuencias de DNA deseadas en la fermentación o en cultivos animales a gran escala, por ejemplo, usando células CHO o células 7.
Las muteínas de la IL-4 obtenidas según la presente invención se pueden glicosilar o no glicosilar dependiendo del organismo huésped usado para producir la muteína. Si se eligen las bacterias como huésped entonces la muteína de la IL-4 producida será no glicosilada. Por otra parte, las células eucarióticas, glicosilarán las muteínas de la IL-4, aunque quizás no de la misma forma que se glicosila la IL-4.
La muteína de la IL-4 producida por el huésped transformado se puede purificar según cualquier procedimiento adecuado. Se conocen diversos procedimientos para purificar la IL-4. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.013.824; 5.017.691; y el documento WO 9604306-A2. Los autores prefieren la purificación por inmunoafinidad. Véase, por ejemplo, Okamura y col., "Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography And N-Terminal Amino Secuence", Biochem., 19: pp. 3831-35 (1980).
La actividad biológica de las muteínas de la IL-4 de esta invención se pueden ensayar mediante cualquier procedimiento conocido adecuado en la técnica. Tales ensayos incluyen neutralización de anticuerpos de actividad antiviral, inducción de proteinaquinasa, actividades de la oligoadenilato 2-5-A sintetasa o fosfodiesterasa, como se describe en el documento EP-B1-41313. Tales ensayos también incluyen ensayos inmunomoduladores (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 4.753.795), ensayos de inhibición de crecimiento, proliferación de células T, inducción de la IL-6 (MCP-1 o VCAM-1) sobre las EC y medición de la unión a células que expresan los receptores de la interleucina 4. Véase también, Spits H, Yssel H, Takebe Y, y col., Recombinant Interleukin-4-Promotes the Growth of Human T Cells, J. IMMUNOL 139: 1142-47 (1987).
La muteína de la IL-4 de esta invención se administrará a una dosis aproximadamente paralela a o mayor que la empleada en terapia con la IL-4 de tipo nativo o recombinante. Se administra preferiblemente una cantidad eficaz de la muteína de la IL-4. Una "cantidad eficaz" significa una cantidad capaz de prevenir o reducir la gravedad o extensión de la afección o indicación que se está tratando. Será evidente para los expertos en la técnica que la cantidad de la muteína de la IL-4 dependerá, entre otros, de la enfermedad, de la dosis, del programa de administración de la muteína de la IL-4, de si la muteína de la IL-4 se administra sola o junto con otros agentes terapéuticos, de la vida media en suero de la composición, y de la salud general del paciente.
La muteína de la IL-4 se administra preferiblemente en una combinación que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo que no produce ningún efecto adverso en pacientes a los que se administra. Tales vehículos farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica. Los autores prefieren HSA al 2%/PBS a pH 7,0.
Las muteínas de la IL-4 de la presente invenciones pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante procedimientos bien conocidos. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmacuetical Science de E. W. Martín que describe formulaciones adecuadas. La composición farmacéutica de la muteína de la IL-4 se puede formular en una diversidad de formas, incluyendo una forma líquida, gelificada, liofilizada, o cualquier otra forma adecuada. La forma preferida dependerá de la indicación particular que se está tratando y será evidente para los expertos en la
técnica.
La composición farmacéutica de las muteínas de la IL-4 se puede administrar por vía oral, mediante aerosol, por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea o en cualquier otra manera aceptable. La forma preferida de administración dependerá de la indicación particular que se está tratando y será evidente para los expertos en la técnica. La composición farmacéutica de la muteína de la IL-4 se puede administrar junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte de la misma composición farmacéutica o se pueden administrar separadamente de la muteína de la IL-4, bien simultáneamente o de acuerdo con cualquier otro programa de tratamiento aceptable. Además, la composición farmacéutica de las muteínas de la IL-4 se puede usar como un auxiliar para otras terapias.
De acuerdo a lo anterior, esta invención proporciona composiciones y procedimientos para tratar trastornos inmunes, cánceres o tumores, crecimiento de células anormales, o para inmunomodulación en cualquier animal adecuado, preferiblemente un mamífero, lo más preferiblemente un ser humano. Como se ha indicado anteriormente en la sección de antecedentes, la IL-4 tiene muchos efectos. Algunos de éstos son la estimulación de la proliferación de las células T, diferenciación de las células auxiliares T, inducción de activación y proliferación de las células B, e intercambio de las clases de inmunoglobulinas dirigida por linfocinas. Los efectos sobre el sistema linfático incluyen la expresión de antígeno de clase II del MHC (Noelle, R., y col., Increased Expression of Ia Antigens on resting B cells: a New Role for B Cell Growth Factor, PNAS USA, 81: 6149-53 (1984)), y las células CD 23 sobre las células B (Kikutani, H . y col., Molecular Structure of Human Lymphocyte Receptor for Immunoglobulin, Cell 47: 657-61 (1986)). El tipo 1 de células auxiliares T (Th1) y el tipo 2 (Th2) están implicados en la respuesta inmune. La células Th2 estimuladas secretan la IL-4 y bloquean la progresión de Th1. Así pues, cualquier enfermedad que implica las Th1 se puede someter a tratamiento mediante la IL-4 o análogos de la misma.
También se contempla el uso de las secuencias de DNA que codifican las muteínas de la IL-4 de esta invención en aplicaciones de terapia génica. Las aplicaciones de terapia génica contempladas incluyen tratamiento de las enfermedades en las que se espera que la IL-4 proporcione una cantidad eficaz debida a su actividad inmunomoduladora, por ejemplo, esclerosis múltiple (MS), diabetes melitus insulinodependiente (IDDM), artritis reumatodide (RA), lupus eritematoso sistémico (SLE), uveitis, orquitis, cirrosis biliar primaria, malaria, lepra, enfermedad de Lyme, dermatitis de contacto, soriasis, linfoma de células B, linfoma linfoblástico agudo, linfoma no Hodgkins, cáncer, osteoartritis y enfermedades que son sensibles de otra manera a la IL-4 o agentes infecciosos sensibles a la respuesta inmune mediada por la IL-4.
La distribución local de las muteínas de la IL-4 que usan terapia génica puede proporcionar el agente terapéutico al área diana. Se contemplan las metodologías de terapia génica tanto in vitro como in vivo. Se conocen varios procedimientos para transferir genes potencialmente terapéuticos que definen poblaciones celulares. Véase, por ejemplo, Mulligan, "The Basis Science Of Gene Therapy", Science, 260: 926-31 (1993). Estos procedimientos incluyen:
1)
Transferencia génica directa. Véase por ejemplo Wolff y col., "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In Vivo", Science, 247: 1465-68 (1990);.
2)
Transferencia de DNA mediada por liposomas. Véase, por ejemplo, Caplen y col., "Liposome-Mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients UIT Cystic Fibrosis", Nature Med. 3: 39-46 (1995); Crystal, "The Gene As A Drug", Nature Med. 1: 15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 179: 280-85(1995);
3)
Transferencia de DNA mediada por retrovirus. Véase, por ejemplo, Kay y col., "In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs", Science, 262: 117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256: 808-13 (1992).
4)
Transferencia de DNA mediada por virus con DNA. Tales virus de DNA incluyen adenovirus (preferiblemente vectores a base de Ad-2 o Ad-5), virus herpes (preferiblemente vectores a base de virus herpes simplex), y parvovirus (preferiblemente vectores a base de parvovirus "defectuosos" o no autónomos, más preferiblemente vectores a base de virus asociados a adeno, lo más preferiblemente vectores a base de AAV-2). Véase, por ejemplo, Ali y col., "The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy", Gene Therapy, 1: 367-84 (1994); la patente de estados Unidos 4.797.368, y la patente de Estados Unidos 5.139.941.
La elección de un sistema de vectores particular para transferir el gen de interés dependerá de una diversidad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la población celular diana. Aunque los vectores retrovirales se han estudiado extensamente y usado en numerosas aplicaciones de terapia génica, estos vectores son generalmente inapropiados para infectar células que no se dividen. Además, los retrovirus tienen potencial para oncogeni-
cidad.
Los adenovirus tienen la ventaja de que tienen una amplia gama de huéspedes, pueden infectar células latentes o diferenciadas terminalmente, tales como neuronas o hepatocitos, y parecen esencialmente no oncogénicos. Véase, por ejemplo, Ali col, anteriormente, p. 367. Los adenovirus no parecen integrarse en el genoma del huésped. Debido a que existen extracromosómicamente, el riesgo de mutágenesis insercional se reduce en gran medida. Ali y col, anteriormente, p. 373.
Los virus asociados a adeno muestran ventajas similares a los vectores basados en adenovirus. Sin embargo, los AAV muestran integración específica del sitio en el cromosoma humano 19. Ali y col., anteriormente, p. 377.
En una realización preferida, el DNA que codifica la muteína de la IL-4 de esta invención se usa en terapia génica para enfermedades autoinmunes tales como MS, IDDM, y RA, enfermedades infecciosas tales como enfermedad de Lyme y lepra, cánceres, tales como linfoma no Hodgkins y ALL (leucemia linfocítica aguda), trastornos cartilaginosos tales como osteoartritis, y afecciones soriáticas, tales como soriasis.
Según esta realización, la terapia génica con DNA que codifica las muteínas de la IL-4 de esta invención se proporciona a un paciente en necesidad del mismo, simultáneamente con, o inmediatamente después de la diag-
nosis.
Este planteamiento se aprovecha de la actividad selectiva de las muteínas de la IL-4 de esta invención para prevenir la estimulación autoinmune no deseada. Los expertos en la técnica apreciarán que cualquier vector de terapia génica adecuado que contiene DNA de las muteínas de la IL-4 se puede usar de acuerdo con esta realización. Se conocen las técnicas para construir tal vector. Véase, por ejemplo, Ohno y col., anteriormente, p. 784; Chang y col., anteriormente, p. 522. La introducción del vector que contiene DNA de las muteínas de la IL-4 en el sitio diana se puede llevar a cabo usando técnicas conocidas, por ejemplo, como se describe en Ohno y col., anteriormente, p. 784.
Con el fin de que esta invención se entienda mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solamente para propósitos de ilustración, y no se construyen como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplos Genéricamente
La secuencia de aminoácidos de la IL-4 madura humana en este estudio se muestra más adelante. Los aminoácidos en los que las sustituciones produjeron agonistas selectivos de las células T se indican en letra negrita:
1
Las muteínas se expresaron en un sistema de vaculovirus, purificado hasta homogeneidad, y se evaluaron en ensayos biológicos que reflejan el uso de los diferentes receptores de la IL-4. Se usaron dos ensayos para ensayar la actividad agonista selectiva el ensayo de secreción de la IL-6 en las HUVEC inducida por la IL-4, y un ensayo de la proliferación de las células T primarias para actividad positiva de la IL-4. Los compuestos que tienen la capacidad de inducir la proliferación de células T primarias, tienen todavía una capacidad reducida para inducir la secreción de la IL-6, son agonistas selectivos de la IL-4 de las células T y están dentro del alcance de esta invención. Más específicamente, las células endoteliales del cordón umbilical humano (abreviadamente en inglés HUVEC) se usaron para determinar la actividad por medio del receptor alternativo de la IL-4 (componente de los receptores IL-4R\alpha/de
tipo \gamma).
Ejemplo 1 Producción de muteínas
Las muteínas se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio usando cebadores que contienen codones correspondientes a la mutación deseada como describe Kunkel TA, Roberts JD, y Zakour RA, "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" (1987), Methods Enzymol 154: 367-382. Brevemente, el cDNA de la IL-4 que contiene los sitios de la enzima de restricción BamHI y XbaI se subclonaron en el vector del fago M13 (New Englands Biolabs, Beverly, MA) usando los mismos sitios. El cDNA de la IL-4 de tipo salvaje se obtuvo usando la reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente en inglés "PCR") de un conjunto de cDNA generado a partir de mRNA aislado de linfocitos humanos de sangre periférica inducidos 24 horas con 12-miristato 13-acetato de forbol (10 ng/ml). Los cebadores de la PCR usados fueron, para el extremo 5' de la fase abierta de lectura,
5'-CGC GGA TCC ATG GGT CTC ACC TCC-3' (SEC ID Nº 22);
y para el extremo 3' de la fase de lectura abierta de la IL-4,
5'-CGC TCT AGA CTA GCT CGA ACA CTT TGA AT-3' (SEC ID Nº 23).
Los sitios de las enzimas de restricción BamHI (extremo 5') y XbaI (extremo 3') se incorporaron en cada oligonucleótido y se indican mediante letras itálicas. Las condiciones de la PCR usadas fueron 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 58,7ºC, y 1 minuto a 72ºC durante 25 ciclos. La secuencia correcta del cDNA de la IL-4 así obtenida se confirmó mediante secuenciación usando el kit de secuenciación de Sequenase ® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) como describe el fabricante. El DNA de cadena sencilla que contiene uracilo (U-DNA) se obtuvo transformando la cepa de E. coli CJ236 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con el M13 mp19 que contiene cDNA de la IL-4. La mutagénesis dirigida al sitio utilizó en general cebadores que contienen 15 nucleótidos homólogos al cebador U-DNA 5' para el codón/los codones diana de la mutagénesis, los nucleótidos que incorporan el cambio deseado, y 10 nucleótidos adicionales homólogos al cebador U-DNA 3' del último nucleótido alterado. Los cebadores específicos usados fueron:
2
Las regiones de los nucleótidos mutados están subrayadas. Los cebadores se fosforilaron usando la polinucleótidoquinasa de T4 (New England, Beverly, MA) usando el protocolo del fabricante. Después de la fijación por calor del cebador del molde de U-DNA y extensión con la DNA polimerasa del T7 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), las células de la E. coli cepa DH5\alpha™ (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) se transformaron con 5 \mul de mezcla de reacción y se sembraron en medio LB que contenía agar al 0,7%. Después de la incubación a 37ºC, las placas se expandieron recogiendo una placa individual y transfiriendo a 2 ml del medio LB y se desarrollaron durante una noche a 37ºC. El DNA de cadena sencilla se aisló usando un kit de purificación de M13 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) según el protocolo del fabricante, y los clones que contienen la mutación deseada se identificaron mediante secuenciación del DNA de cadena sencilla usando el kit se secuenciación Sequenase ® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) según el protocolo del fabricante. El cDNA de la muteína de la IL-4 del DNA de la forma replicativa que corresponde a las placas que contien la secuencia mutada correcta se aisló usando Bam HI y Xba I, y se subclonaron al vector del plásmido pFastBac ™ 1 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Después de la subclonación, el DNA de baculovirus recombinante (de aquí en adelante denominado Bacmid) se generó transformando el pFastBac™ 1 que contiene el cDNA de la muteína a la cepa de E. coli DH10Bac™ (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) como describe el fabricante. La muteínas se expresaron en las células 9 de Spodoptera frugiperda (Sf) usando el sistema de expresión de baculovirus Bac - to-Bac (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Todas las incubaciones de las células de insecto se produjeron a 28ºC. En resumen, cultivos de 2 ml de células 9 de Sf se transfectaron con 5 \mul de Bacmido recombinante usando CellFECTIN (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). El sobrenadante se recogió 60 horas después de la infección, y se usó para infectar un cultivo de 100-200 ml de 1 x 10^{6} células de Sf/ml en medio de Grace (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), según el protocolo del fabricante, los sobrenadantes se recogieron 48-60 horas después de la infección mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Sorval ® RC-5B usando un rotor GSA (Dupont Instrument Co., Willmington, DE) y se ensayaron para la titulación de los virus (típicamente, se obtuvieron > 1 x 10^{8} de unidades formadores de placas/ml). Para la producción de proteínas, 2-3 x 10^{6} de células 9 de Sf/ml en 500 ml de medio SF900 II x 10^{8} (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) se infectaron a una multiplicidad de infección entre 4-10 y el sobrenadante se recogió 60-72 horas después de la infección mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Sorval ® RC-5B usando un rotor GSA (Dupont Instrument Co., Willmington, DE) y se filtraron a través de una unidad de filtración estéril de 0,2 \mum.
Ejemplo 2 Purificación de muteínas
Los anticuerpos monoclonales de la IL-4 anti-humanos C400.1 y C400.17 se generaron usando protocolos habituales de ratones usando la IL-4 (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) como inmunógeno, se produjeron en forma de fluido de ascites, se purificaron, y se acoplaron a Sefarosa activada por CNBr (Pharmacia, Uppsala, Suecia) según el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes de las células 9 de Sf generadas a partir de la infección de las células 9 de Sf mediante baculovirus recombinantes que contenían la muteína de la IL-4 respectiva se cargaron en una columna de 1 ml de matriz de afinidad de la IL-4, se lavaron con NaHCO_{3} 100 mM, NaCl 500 mM, pH 8,3, se lavaron con agua para retirar la sal, y se eluyeron con 8 volúmenes de columna de glicina 100 mM, pH 3,0. Las fracciones se recogieron en viales siliconizados que contenían 0,1 volúmenes de Tris 1 M, pH 8,0. La proteína de la muteína se purificó después mediante cromatografía en fase inversa usando una columna Dynamax®-300\ring{A} C_{18} (Rainin Instrument Co., Woburn, MA) con un gradiente de 0-100% de tampón A a B (tampón A, agua; B, acetonitrilo, ácido trifluoroacético al 0,1%). Las fracciones se evaluaron mediante SDS-PAGE, y las fracciones que contenían muteína se liofilizaron para almacenamiento, y se volvieron a suspender en solución salina estéril tamponada con fosfato para ensayos. La muteína así purificada fue típicamente una sola banda como se observó mediante SDS-PAGE (tinción con plata), y se cuantificó mediante análisis de aminoácidos (típicamente precisión > 90%).
Ejemplo 3 Ensayo de proliferación de células T primarias
Las células T primarias se obtuvieron a partir de sangre reciente de donante normales y se purificaron mediante centrifugación usando Ficoll-Plaque® Plus (Pharmacia, Upsalla, Suecia) esencialmente como describe Kruse, N., Tony, H. P. y Sebald, W. "Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement", Embo J. 11: 3237-44 (1992). Las células purificadas mononucleares de sangre periférica se incubaron durante 7 días con 10 \mug/ml de fitohemaglutinina (Sigma Chemical Co., San Luis, MO), se cosecharon mediante centrifugación, y se lavaron en medio RPMI 1640 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). 5 x 10^{4} células T activadas/pocillo (blastos PHA) se incubaron con cantidades variables de la IL-4 o muteína en medio RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino al 10%, HEPES 10 mM, pH 7,5, glutamina L 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina G, y 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina en placas de 96 pocillos durante 72 horas a 37ºC, se pulsaron con 1 \muCi de ^{3}H-timidina (DuPont NEN ®, Boston, MA)/pocillo durante 6 horas, se recogieron, y se midió la radiactividad en un contador de centelleo TopCount ™ (Packard Instrument Co., Meriden, CT).
Ejemplo 4 Ensayo de secreción de la IL-6 de las HUVEC
Las células endoteliales del cordón umbilical humano se obtuvieron de Clonetics ® Corp. (San Diego, CA), y se mantuvieron según los protocolos del fabricante. Las células (3 a 6 pases) se recogieron mediante incubación con Tripsina/EDTA, se lavaron, y se sembraron a densidades subconfluentes en placas de 48 pocillos en medio EGM ® (Clonetics ® Corp, San Diego, CA) que contenían extracto de cerebro bovino (BBE; Clonetics ® Corp, San Diego, CA). En la confluencia (3-4 días a 37ºC), el medio se retiró y se reemplazó con medio EGM ® sin BBE. 24 horas más tarde, concentraciones variables de la IL-4 o muteína se añadieron a las células en EGM ® reciente sin BBE, y se dejó incubar 24 horas adicionales. Los sobrenadantes se recogieron y se analizó la concentración de la IL-6 usando un ELISA de la IL-6 humana. Las condiciones fueren idénticas excepto que para los ensayos de los antagonistas, se añadieron concentraciones variables de muteína a una concentración de la IL-4 de 100 pM. En resumen, 2 placas de 96 pocillos Immunlon ® (Dynatech Laboratories, Inc, Chantilly, VA) se recubrieron con 5 \mug/ml de IL-6 Mab antihumana nº de cat. 1618-01 (Genzyme Diagnostics, MA) durante una noche a 4ºC. El patrón de IL-6 humana (Genzyme Diagnostics, MA) o muestras se titularon por duplicado y se incubaron con la placa recubierta; después de lavar, se añadió IL-6 Pab antihumano de conejos de anticuerpos secundarios (Caltag Laboratories, South San Francisco, CA, nº de catálogo PS-37) a una dilución 1:1000. La presencia de anti-IL-6 PAb de conejos unido se detectó usando anti-conejo Ig PAb de burros acoplado a fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, nº de catálogo 711-055-152 diluido 1:2000, y se desarrolló usando pNNP (Sigma Chemical Co., San Luis, MO, nº de catálogo N72770 ó N1891). La absorbancia se leyó a 405 nm usando un lector de microplacas cinético Vmax ™ (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA).
Ejemplo 5 Actividades de muteínas
La tabla 1 resume los resultados de las muteínas en los dos ensayos descritos anteriormente. "CE_{50}, pM" es la concentración eficaz que produce una respuesta máxima del 50% en la concentración de picomoles/litro. La actividad es una función de tanto la eficacia (CE_{50}) como de la respuesta máxima (R_{máx}). las muteínas selectivas de células mostraron actividad diferencial de bien una reducción relativa en la R_{máx} y/o una reducción relativa en eficacia (incremento en CE_{50}) en el ensayo de las HUVEC frente al ensayo de las células T. "R_{máx}, % en peso" es la respuesta máxima medida relativa a la IL-4 de tipo salvaje. Por definición, la IL-4 de tipo salvaje proporciona una respuesta de 100%. Todas las muteínas fueron activas en el ensayo de proliferación de las células T. La muteínas R121D, T121E, R121P, y R121T/122F/Y124Q fueron más eficaces que la IL-4 de tipo salvaje, aunque la muteína R121T/122F/Y124Q tuvo una respuesta máxima reducida. La muteínas Y124Q, Y124R, e Y124A/S125A tuvieron unos valores de CE_{50} incrementados 2-3 veces que la de tipo salvaje, así como una respuesta máxima reducida. Sin embargo, parecen mantener una proporción significativa de la actividad de la IL-4 sobre las células T. Las muteínas R121E, Y124Q y R121T/E122F/Y124Q no tuvieron actividad medible en el ensayo de las HUVEC, haciéndolas claramente selectivas de las células T, y por lo tanto selectivas para el receptor de la IL-4 expresado en las células T (IL-4R\alpha/IL-2R\gamma). Estas muteínas son antagonistas de la IL-4 sobre las células endoteliales debido a que, aunque interactúan normalmente con la IL-4R\alpha, no activan el complejo IL-4R\alpha/subunidad de tipo \gamma. Las muteínas R121P e Y124R muestran actividad en el ensayo de las HUVEC, pero sus valores de CE_{50}se incrementan entre 50-150 veces, y tienen respuestas máximas reducidas relativas a su capacidad de estimular las células T. Aunque estas dos proteínas no parecen ser absolutamente selectivas de las células T, son preferenciales para su activación del receptor de la IL-4 de las células T en el receptor de la IL-4 de las HUVEC.
TABLA 1 Muteínas con actividad preferencial sobre las células T frente a las células endoteliales
3
Ejemplo 6 Respuesta biológica de las muteínas de la IL-4 en ensayos de las HUVEC
Las figuras 2A y B son una serie de diagramas dosis-respuesta de la secreción de la IL-6 de las HUVEC mediante los agonistas selectivos de las células T relativa al tipo salvaje. La IL-4 se incluyó como un control interno en cada placa usada para ensayar la actividad de la muteína; se muestra una curva representativa. La figura 4A es la curva dosis-respuesta para la R121R frente a la IL-4 de tipo salvaje. De manera similar, la figura 4B-F son las curvas dosis-respuesta para R121P, Y124Q, Y124R, Y124/S125A, y R121T/E122F/Y124Q, respectivamente, frente a la IL-4 de tipo salvaje. Las actividades se han normalizado con relación a las respuestas control de IL-4R. Las muteínas R121E, Y124Q, y R121T/E122F/Y124Q no muestran ninguna actividad en este ensayo. Las muteínas R121 e Y124R, aunque muestras actividad agonista parcial en este ensayo, son relativamente menos eficaces para la IL-4 de tipo salvaje que lo son en el ensayo de células T primarias. Así pues, a pesar de su actividad, todavía muestran activación preferencial del receptor de la IL-4 de las células T.
Ejemplo 7 Respuesta biológica de las muteínas de la IL-4 en los ensayos de las células T primarias
Las figuras 4A y B muestran las curvas dosis-respuesta de las muteínas agonistas selectivas de las células T en un ensayo representativo que usa células de un donante normal. La IL-4 se incluyó como un control interno sobre cada placa usada para ensayar la actividad de las muteínas; se muestra una curva representativa. La figura 6A es la curva dosis-respuesta para la R121E frente a la IL-4 de tipo salvaje. De manera similar, la Figura 6B-F son las curvas dosis-respuesta para las R121P, Y124Q, Y124R, Y124A/S124A, y R121T/E122F/Y124Q, respectivamente, frente a la IL-4 de tipo salvaje. Las actividades se han normalizado con relación a las respuestas control de la IL-4. Las muteínas R121E, R121P, y R121T/E122F/Y124Q son más eficaces que la IL-4 de tipo salvaje, aunque la R121T/E122F/Y124Q es solamente un agonista parcial en este ensayo. Aunque no es tan eficaz como la IL-4 de tipo salvaje en este ensayo, las muteínas Y124Q, Y124R, E Y124A/S125A son todavía agonistas parciales (valores de R_{máx} 60-70% de tipo salvaje). En la figura 6, la actividad es relativa a la respuesta de la IL-4 observada en la misma placa para cada muteína. De particular importancia son las muteínas R121E e Y124Q, que muestran actividad significativa en el ensayo de las células T todavía sin actividad aparente en el ensayo de las HUVEC. Cada una de estas muteínas es un agonista claro selectivo de las células T.
Ejemplo 8 Antagonismo de la secreción de la IL-6 inducida por la IL-4 de las HUVEC mediante las muteínas selectivas de las células T
Las muteínas de la IL-4 selectivas de las células T R121E (\medbullet) e Y124Q (\nabla), y el antagonista de la IL-4 R121D/
Y124D (\medcirc) (figura 7), se titularon frente a una concentración constante de la IL-4 100 pM. El antagonista de la IL-4 R121D/Y124D antagoniza la IL-4 con una K_{I} de aproximadamente 1,5 nM en estas condiciones. Las HUVEC no expresan la IL-2R\gamma, pero expresa la subunidad de tipo \gamma del receptor de la IL-4. Los residuos sustituidos de la R121E e Y124Q están en la hélice D de la IL-4 y por lo tanto solamente afectan a las interacciones de la IL-4 con la IL-2R\gamma (interacción funcional) y la subunidad de tipo \gamma (sin o interacción no funcional), pero no afectan la capacidad de estas muteínas de unirse a la IL-4R\alpha. Así pues, los agonistas selectivos de las células T R121E e Y124Q, en virtud de su capacidad de interactuar selectivamente con la IL-2R\gamma sobre las células T sin promoción de la activación de la subunidad de los receptores de tipo \gamma sobre células endoteliales, son capaces de completar las respuestas inducidas por la IL-4 sobre estas células endoteliales (K_{I} de aproximadamente 0,8-1 nM en estas condiciones). Tal antagonismo mediante las muteínas de la IL-4 selectivas de las células T pueden antagonizar los efectos de la IL-4 producida endógenamente sobre las células endoteliales durante la terapia dirigida por las células T con dichas muteínas.
Ejemplo 9 Respuesta biológica de la muteína de la IL-4 R121D
La muteína de la IL-4 R121D (Arg-121 sustituida con Asp) se generó como se describió y se ensayó en los ensayos de las células T primarias y de las HUVEC. Con relación a las figuras 8A y 8B, se muestran los datos para la IL-4 (\medcirc) y R121D (\medbullet) tanto en los ensayos de las células T (figura 8A) como de las HUVEC (figura 8B). En el ensayo de las células T, la R121D mostró un valor de CE_{50} de aproximadamente 100 pM y un valor de R_{máx} de aproximadamente 60% con relación a la IL-4 de tipo salvaje. Fue inactiva en el ensayo de las HUVEC (CE_{50} \medbullet; R_{máx} = \medcirc). Estos resultados muestran que la sustitución individual de Arg-121 de la IL-4 humana con Asp produce una proteína que tiene actividad selectiva sobre las células T, y carece de cualquier actividad aparente sobre las células endoteliales. Aunque la muteína R121D es un agonista parcial en el ensayo de las células T, es más eficaz que la IL-4 de tipo salvaje. Sin embargo, del mismo modo que la muteína R121E, la R121D no muestra actividad en el ensayo de las HUVEC, que demuestra que es un claro agonista selectivo de las células T.
Ejemplo 10 Actividad biológica de la muteína de al IL-4 T12D/R121E
La muteína de la IL-4 T13D/R121E (Thr-13 sustituido con Asp junto con Arg-121 sustituido con Glu) se generó como se ha descrito y ensayado en los ensayos de las células T primarias y de las HUVEC. Específicamente con referencia a las figuras 9A-B, en el ensayo de las células T (panel A), T13D/R121E (\Box) mostró una CE_{50} de aproximadamente 100 pM, aproximadamente 2-3 veces mejor que la IL-4 (\medcirc) o R121E (\triangle), y un valor de R_{máx} de 100% con relación a la IL-4. En los ensayos antagonistas de las HUVEC (panel B), la T13D/R121E (\Box) fue un antagonista de la actividad de la IL-4 aproximadamente 27 veces más eficaz que la R121E (\triangle), que muestra una CI_{50} de aproximadamente 2,2 nM frente a aproximadamente 60 nM, respectivamente. La sustitución de Thr-13 a Asp incrementa la eficacia de la T13D/R121E con relación a la R121E (ambas como un agonista en el ensayo de las células T, y como un antagonista en el ensayo de las HUVEC), mientras la sustitución Arg-121 a Glu confiere actividad selectiva de las células T para la T13D/R121E (agonista total en el ensayo de las células T, agonista de la IL-4 en el ensayo de las HUVEC).
Ejemplo 11 Evaluación del agonista selectivo de al IL-4 en el modelo de patología
Monos machos cinomolgus adultos (Macaca fasicularis, Charles River Primate Imports, Boston, Mass.), pesando aproximadamente entre 4 y 6 kg se utilizan para estos estudios. Los animales se alojan individualmente en habitaciones controladas ambientalmente en jaulas de mallas abiertas y se les proporciona alimento dos veces al día y agua a voluntad. Cada animal está en ayunas durante aproximadamente 12 horas antes del primer día de estudio.
Cada uno de los animales de estudio se anestesian con una inyección intramuscular de clorhidrato de cetamina (Ketaset, 10 mg/kg). El área de la espalda superior de cada animal se trasquila y se limpia con alcohol al 70%-solución de betadina. La IL-4, agonista selectivo de la IL-4 o vehículo (albúmina sérica bovina al 0,2%, HSA) se inyecta por vía intradérmica en las espaldas de los animales en un volumen de 0,1 ml usando una jeringa de tuberculina de 1 ml. Los sitios inyectados se separan mediante al menos 10 cm y se marcan con un marcador indeleble. Se obtienen muestras de biopsia de tejidos usando una herramienta de biopsia de perforación de 6 mm y las muestras se colocan en OCT y se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido. Se obtienen las biopsias a las 0, 4, 8 y 24 horas después de la inyección.
La respuesta sistémica a la IL-4, agonista selectivo de la IL-4 o vehículo se determina de la siguiente manera. El artículo de ensayo se administra por vía subcutánea dos veces al día (separadas aproximadamente 10-12 horas) durante 4 días consecutivos en un volumen de 0,1 ml/kg a dosificaciones de 0, 2,5, 25 ó 250 \mugkg dando como resultado una dosis total diaria de 0, 5, 50 y 500 \mul/kg, respectivamente. Se obtiene una muestra de sangre periférica de cada animal antes de la primera inyección de vehículo o IL-4 al comienzo de cada día del estudio, y se analizan alícuotas para recuentos totales y diferenciales de glóbulos rojos, y análisis de citometría de flujo de marcadores superficiales de células moononucleares de sangre periférica. El resto de la muestra de sangre se centrifuga y se almacenan alícuotas de plasma a -70ºC para análisis posterior de niveles de quimiocina.
Las secciones congeladas se preparan y se deja que se equilibren hasta temperatura ambiente, se secan al aire y se fijan en acetona a 4ºC durante 5 minutos. Los portaobjetos se transfieren a PBS 10 mM con BSA al 0,1% durante 5 minutos. La VCAM-1 se localiza con el uso de C313.3, un anticuerpo monoclonal a la VCAM-1 humana. Se usa una inmunoglobulina irrelevante, de idéntico isotipo en la concentración apropiada como un control negativo. La biotina endógena se bloquea usando el kit de bloqueo Vector Biotin (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las secciones se incuban durante 1,5 horas a temperatura ambiente en una cámara húmeda con los antisueros indicados diluidos en PBS con BSA al 0,1% y suero de conejo normal al 1%. Después de tres lavados con PBS, los portaobjetos se tiñen con el kit Vector ABC Elite según las direcciones de los fabricantes y el anticuerpo se detecta mediante incubación de los portaobjetos en 3-amino-9-etilcarbazol/peróxido de hidrógeno (kit de sustrato AEC, Vector). Las secciones se lavan detenidamente en tampón acetato 0,1 M, se lavan en agua destilada y se montan en AQUA-MOUNT de Lerner (Lerner Laboratories, Pittsburg, PA).
Los especimenes se puntúan mediante dos observadores independientes de una manera ciega usando escalas establecidas entre 0 y +3, designados para determinar la intensidad así como la distribución de la tinción. El sistema de puntuación para la expresión de la VAAM-1 es: 0 = ausente o tinción débil del vaso ocasional: 1 + tinción débil de varios vasos; 2 + tinción de intensidad moderada de la mayoría de los vasos; 3 + tinción intensa de la mayoría de los vasos: Los vasos sanguíneos son idénticos en secciones en serie teñidos para el factor de von Willebrans (VWF anti-humano de conejo policlonal; Dakoplatts, Carpintería, CA).
El análisis del recuento de eritrocitos, hematocrito, recuento de leucocitos y recuentos de plaquetas se realizan sobre muestras de sangre heparinizada con un analizador de sangre Serono 9000 (Baker Diagnostics, Allentown, PA). Los recuentos diferenciales de leucocitos se evalúan sobre frotis de sangre teñida con Diff-Quick donde se cuentan un total doscientas células y se registra el porcentaje de cada tipo de célula.
El análisis de los marcadores superficiales de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se realiza de la siguiente manera. Una muestra de 4 ml de sangre heparinizada se diluye en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, sin Mg^{++} o Ca^{++}) y se separan en fases en 4 ml de Percoll (1,070 g/ml de densidad). Los tubos se centrifugan a 1800 rpm (Beckman GS-6R) durante 20 minutos a 24ºC. La capa que contiene linfocitos se aspira y se centrifuga a 1100 rpm durante 10 minutos. El sedimento celular resultante se vuelve a suspender en 6 ml de solución salina tamponada con fosfato (abreviadamente en inglés PBS) que contiene azida al 0,1% y suero de cabra al 5%. Se utilizan alícuotas de 1 ml para análisis de marcadores superficiales celulares como se describe más adelante.
Los anticuerpos contra CD2, CD4, CD8, CD11b, CD16, CD25, CD49 y HLA-DR (R & D Systems Mineápolis, MN) se utilizan para análisis mediante citometría de flujo. Alícuotas de veinte \mul de anticuerpos de marcadores se incuban con alícuotas de 1 ml de suspensión de células en la oscuridad durante 60 minutos a 4ºC, y se centrifugan las muestras (1000 rpm, 10 minutos a 4ºC). Los sedimentos se lavan tres veces con 1 ml de PBS que contiene azida al 0,1% y suero de cabra al 5%, seguido de análisis de barrido de FAC.
Las muestras de plasma obtenidas durante cada estudio se analizan para los niveles de la MPC-1 mediante ELISA específico. En resumen, placas de 96 pocillos (Nunc, Kamstrup, Dinamarca) se recubren con 50 \mug/pocillo de anti-MCP de conejos durante 16 horas a 4ºC y después se lavan en PBS, pH 7,5, Tween-20 al 0,005% (tampón de lavado). Los sitios de unión no específica se bloquean con BSA al 2% en PBS ( 200 \mul) y las placas se incuban durante 90 minutos a 37ºC. Las placas se enjuagan tres veces con tampón de lavado, y se añade muestra (50 \mul) de ensayo diluida (pura, 1:5 y 1:10) por duplicado seguido de incubación durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavan cuatro veces, y se añaden 50 \mul/pocillo de anti-PCP-1 biotinilado durante 45 minutos a 37ºC. Las placas se lavan cuatro veces, se añade conjugado de estreptavidina-peroxidasa (100 \mul/ml) (Dakopatts, Carpintería, CA) y la placa se incuba durante 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavan tres veces, y se añaden 100 \mul de sustrato de cromogen (0,67 mg/ml de dicloruro de ortofenilendiamina (Darkopatts, Carpintería, CA). Se incuban las placas a 25ºC durante 6 minutos y se termina la reacción con 50 \mul/pocillo de solución de H_{2}SO_{4} 3 M en tampón de lavado más FCS al 2%. Las placas se leen a 490 nm en un lector de ELISA. Los patrones son diluciones semilogarítmicas de recombinante de MCP-1 a partir de 100 ng/ml a 1 pg/ml (50 \mul/pocillo). El ELISA detecta consistentemente concentraciones de MCP-1 > 50 pg/ml.
Ejemplo 12 Tratamiento de esclerosis múltiple con agonista selectivo de la IL-4
El uso de un modelo animal como predictor de la utilidad farmacológica en seres humanos es una herramienta de investigación bien aceptada. El ensayo inicial de la proteína agonista selectiva de la IL-4 para esclerosis múltiple (MS) se lleva a cabo en un modelo de marmotas usando proteína agonista selectiva de la IL-4 humana recombinante. Estos estudios se llevan a cabo para examinar el efecto de tratamiento profiláctico y terapéutico sobre la inducción y gravedad patológica de tanto la sintomatología aguda así como enfermedad remitente-reincidente.
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es una enfermedad inflamatoria, autoinmune mediada por células T CD4 + del sistema nervioso central. La inducción de la EAE se realiza en marmotas (C. jacchus) que pesan 300 a 400 gramos mediante inmunización con 200 mg de homogeneizado de materia blanca de cerebro humano postmortem congelado recientemente (BH) emulsionado con adyuvante de Freund completo (CFA) que contiene 3 mg/ml de Micobacterium tuberculosis matado como describen Massacesi y col., Ann. Neurol., 37: 519 (1995). El día de la inmunización y de nuevo 2 días más tarde, 10^{10} organismos inactivados de Bordetella pertussis se diluyen en 10 ml de solución salina y se administra por vía intravenosa.
La EAE se determina mediante criterios clínicos y patológicos. Un sistema de puntuación normalizado se emplea para registrar la gravedad de la enfermedad clínica: 0 = hallazgos neurológicos normales; 1 = letargo, anorexia, pérdida de peso; 2 = ataxia, y cualquier paraparesis/monoparesis, pérdida de sensibilidad, o síndrome del tronco cerebral que incluye parálisis visual, o ceguera; 3 = paraplejia o hemiplejia; 4 = cuadriplegia.
La formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) se ha mostrado que es una técnica útil para caracterizar lesiones mediadas inmunes tempranas así como tardías de MS (Stewart y col., Brain, 114: 1069 (1991). La MRI se usa para evaluar los animales después de la inmunización y controlar la progresión de la enfermedad con el tiempo. Los datos de MRI se recogen sobre un sistema "2000" criogénico Picker Internacional NMR, que funciona en una intensidad de campo de 0,15 Tesla; una bobina receptora con una apertura de 15 cm para obtener las imágenes. Se emplean eco del espín de división múltiple y secuencias de pulsos inversión-recuperación. Los tiempos de retraso de eco de bien 40 y 60 ms, o 40 y 80 ms se usan en las secuencias de eco del espín. En las secuencias inversión-recuperación el retraso del interpulso 180-90 es 400 ms.
Se anestesian las marmotas con clorhidrato de cetamina y se colocan en el escáner usando un láser disponible para una alineación del paciente de manera que los ángulos internos de los ojos se alineen perpendicularmente a la dirección del campo magnético estático. Los animales se escanean antes de la inmunización y después diariamente desde el día 9 después de la inmunización. Antes de escanear cada día, los animales se inspeccionaron para signos de alteración neurológica.
Los animales se sacrifican a diferentes momentos después de la inmunización. Se retira el SNC y se fija en formalina al 10%. Las secciones en parafina de cerebro y médula espinal se preparan y se tiñen con hematoxilina y eosina. Cada sección coronal del cerebro o sección horizontal de la médula espinal se analiza para hallazgos histopatológicos de inflamación y desmielinación según una escala arbitraria: inflamación; 0 = sin presencia de inflamación, + = pliegues perivasculares raros/media de la sección completa; ++ = números moderados de pliegues/sección; pueden tener inflamación de la meninge; +++ = plegamiento perivascular extenso e infiltración parenquimal mediante células inflamatorias. Puntuación de desmielinación; 0 = sin presencia de desmielinación; + focos raros de desmielinación; ++ = desmielinación moderada; +++ = desmielinación extensa con grandes lesiones confluentes.
Para estudios de pretratamientos sobre la patología de la enfermedad aguda, se administra el fármaco de ensayo por vía subcutánea a un intervalo de dosificación entre 1 y 500 \mug/kg después de un régimen de dosificación de 1 administración al día a 1 administración a la semana antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad. Para la intervención terapéutica en la enfermedad existente, el artículo de ensayo se administra por vía subcutánea a un intervalo de dosificación entre 1 y 500 \mug/kg después de un régimen de dosificación extenso de 1 tratamiento al día a 1 tratamiento a la semana durante el curso de varios meses.
Ejemplo 13 Tratamiento de artritis reumatoide
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria debilitante en la que la activación crónica de células sinoviales residentes e infiltrantes produce la destrucción de cartílago y hueso y conduce a fibrosis y pérdida de función. Las citocinas liberadas de las células T activadas se cree que juegan un papel en el mantenimiento de la reacción inflamatoria crónica.
La RA se induce en ratones DBA/l usando colágeno tipo II como describen Joosten y col., Artritis & Rheumatism; 39: 797 (1996). La artritis inducida por colágeno (CIA) se induce mediante la inmunización de ratones por medio de inyección intradérmica a la base de la cola con 100 \mul de emulsión que contiene 100 \mug de colágeno. El día 21, se proporciona a los animales una inyección de recuerdo intraperitoneal de colágeno tipo II (100 \mug) disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
La determinación de la CIA se realiza examinando los ratones visualmente para la aparición de artritis en las articulaciones periféricas y se asignan las puntuaciones para gravedad de artritis. Se considera que los ratones tienen artritis cuando se describen cambios significativos en el enrojecimiento y/o inflamación en los dígitos o en otras partes de un mínimo de 2 patas.
La gravedad clínica de la artritis se puntúa en una escala de 0-2 para cada pata según los cambios en el enrojecimiento e inflamación (0 = sin cambio, 0,5 = significante, 1,0 = moderado, 1,5 = marcada y 2,0 = inflamación y enrojecimiento máximos. La puntuación se determina mediante al menos dos observadores de tipo ciego.
Al final del estudio, alguno de los animales se sacrifican y el tejido de las patas y articulaciones se obtiene para examen patológico e inmunohistoquímico. El tejido se trata para tinción inmunohistoquímica (secciones congeladas) o se fijan y se embeben en parafina, se cortan y se tiñen con H y E para análisis de infiltración celular.
La evaluación de un análogo murino del agonista selectivo de la IL-4 de la presente invención en el modelo de CIA se realiza con el uso de una molécula de proteína equivalente. Los expertos en la técnica son capaces de comparar la estructura de la IL-murina con la estructura de la IL-4 humana, generando muteínas de la IL-4 murinas paralelas, y haciendo cualquier ajuste necesario basándose en las respuestas en ensayos in vitro utilizando líneas celulares que expresan bien la IL-4R\alpha/IL-2R\gamma o la IL-4R\alpha/subunidad de tipo \gamma de una manera análoga a la usada para muteínas de la IL-4 humanas con las células T y las HUVEC. Los animales se dosifican un día antes de la administración de recuerdo de colágeno y se mantienen en un régimen de dosificación que varía entre una vez al día y una vez a la semana durante la duración del estudio (+ de 40 días) Los animales se dosifican con un intervalo de concentraciones del agonista selectivo de la IL-4 que varía entre 1 y 100 \mug/kg.
Ejemplo 14 Tratamiento de diabetes melitus insulinodependiente (IDDM)
Existe alguna evidencia en la bibliografía de la implicación de las células Th1 en la IDDM en modelos humanos y de animales. Ratones diabéticos no obesos (abreviadamente en inglés NOD) se utilizan para examinar la eficacia de un equivalente de la IL-4 murina de un agonista selectivo de la IL-4 que trata la IDDM. Los expertos en la técnica son capaces de comparar la estructura de la IL-4 murina con la estructura de la IL-4 humana, generando muteínas paralelas de la IL-4 murina, y haciendo cualquier ajuste necesario basándose en las respuestas en los ensayos in vivo que utilizan líneas celulares que expresan bien la IL-4R\alpha/IL-2R\gamma o IL-4R\alpha/subunidad de tipo \gamma de una manera análoga a la usada para las muteínas de la IL-4 humana con las células T y las HUVEC. Ratones NOD prediabéticos (de aproximadamente 7 semanas) muestran una insensibilidad proliferativa in vivo después de la estimulación de las células T. La regulación del tiempo de esta insensibilidad no está relacionada con la insulitis y persiste hasta el comienzo de la diabetes que se produce a las 24 semanas de edad.
La evaluación del agonista selectivo de la IL-4 en ratones NOD se lleva a cabo de manera similar a los estudios descritos por Rapoport y col., J. Exp. Med; 178; p. 87 (1993). Ratones NOD se inyectan con material de ensayo a aproximadamente 3 semanas de edad después de un régimen de dosificación del tratamiento de una vez al día o tratamiento una vez a la semana durante el curso de 12 semanas hasta que los ratones tienen 15 se manas de edad. Un grupo de control de animales recibirá tratamiento con un equivalente de proteína inerte.
Se ensayaron los ratones para glicosuria usando Tes-Tape y se diagnosticó para diabetes como se determina siendo glicosuria durante al menos dos semanas consecutivas. Al final de 52 semanas, los animales se sacrifican para obtener diversos órganos y tejido para evaluación patológica. Tejido de páncreas, glándulas salivares submandibulares y riñón se cada ratón se fija y se embebe en parafina, se secciona y se tiñe. La tinción con aldehído fucsina de las secciones de páncreas se usa para examinar el grado en el que los infiltrados insulínicos han reducido la masa de células \beta granuladas. Los leucocitos esplénicos se cuentan mediante análisis de barrido de FAS usando mabs anti-Thy -1.2, anti-CD4 y anti-CD8 en ascites como describen Zipris y col., J. Immunol 146; p. 3763 (1991).
Otras realizaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica. Esta invención enseña cómo obtener muteínas no descritas específicamente en esta memoria descriptiva pero que tienen capacidad activadora de las células T y capacidad reducida de activadora de las células endoteliales, y por lo tanto esas muteínas entran dentro del espíritu y alcance de la invención. El concepto y planteamiento experimental descrito en esta memoria descriptiva será aplicable a otras citocinas utilizando sistemas de receptores multímericos heterólogos, en particular la IL-2 y citocinas relativas (por ejemplo, la IL-7, la IL-9 y la IL-15), la IL-10, el interferón \alpha, y el interferón \gamma.
Secuencias
Las siguientes secuencias están contenidas en esta solicitud:
SEC ID Nº 1: hIL-4 (aminoácido)
SEC ID Nº 2: hIL-4 (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 3: R121A (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 4: R121D (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 5: R121E (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 6: R121F (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 7: R121H (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 8: R121I (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 9: R121K (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 10: R121N (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 11: R121P (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 12: R121T (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 13: R12W (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 14: Y124A (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 15: Y124Q (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 16: Y124R (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 17: Y124S (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 18: R121T (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 19: Y124/S125A (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 20: T13D/R121E (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 21: R121T/E122F/Y124Q (aminoácido, cDNA)
SEC ID Nº 22: cebador de PCR en 5', IL-4
SEC ID Nº 23: cebador de PCR en 3', IL-4
SEC ID Nº 24: cebador de mutagénesis para la R121A
SEC ID Nº 25: cebador de mutagénesis para la R121D
SEC ID Nº 26: cebador de mutagénesis para la R121E
SEC ID Nº 27: cebador de mutagénesis para la R121F
SEC ID Nº 28: cebador de mutagénesis para la R121H
SEC ID Nº 29: cebador de mutagénesis para la R121I
SEC ID Nº 30: cebador de mutagénesis para la R121K
SEC ID Nº 31: cebador de mutagénesis para la R121N
SEC ID Nº 32: cebador de mutagénesis para la R121P
SEC ID Nº 33: cebador de mutagénesis para la R121T
SEC ID Nº 34: cebador de mutagénesis para la R121W
SEC ID Nº 35: cebador de mutagénesis para la Y124A
SEC ID Nº 36: cebador de mutagénesis para la Y124Q
SEC ID Nº 37: cebador de mutagénesis para la Y124R
SEC ID Nº 38: cebador de mutagénesis para la Y124S
SEC ID Nº 39: cebador de mutagénesis para la Y124T
SEC ID Nº 40: cebador de mutagénesis para la Y124A/S125A
SEC ID Nº 41: cebador de mutagénesis para la T13D
SEC ID Nº 42: cebador de mutagénesis para la R121T/E122F/Y124Q
Nota: para la muteína T13D/R121E, se usan los cebadores de las SEC ID Números 26 y 41.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTES: Shanefelt, Armen; Greve, Jeffrey; Gungel, Robert
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Agonistas de la interleucina 4 selectivos de las células T
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 42
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Bayer Corporation, Pharmaceutical Division
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 400 Morgan Lane
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: West Haven
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CT
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
Código: 06516-4175
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete, de 3,5 pulgadas (7,62 cm),
\vskip0.500000\baselineskip
1,44 Mb de almacenamiento.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS v. 6.30
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFRWARE: Word para Windows 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: no disponible.
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/663.856
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 de junio de 1996
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Huw R. Jones
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.916
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 5013P1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE TELÉFONO: (203) 812-2317
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (203) 812-5492
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 129
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: proteína de la interleucina 4 humana
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO : ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: proteína de la IL-4 humana
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121A
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121D
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121E
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121F
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121H
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121I
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121K
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121N
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121P
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121T
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121W
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/Y124A
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: IL-4/Y124Q
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: IL-4/Y124R
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: IL-4/Y124S
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: IL-4/Y124T
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: IL-4/Y124A/S125A
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: IL-4/T13D/R121E
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: hIL-4/R121T/E122F/Y124Q
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de PCR en 5', IL-4
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGATCCA TGGGTCTCAC CTCC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de PCR en 3', IL-4
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTCTAGAC TAGCTCGAAC ACTTTGAAT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121A
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGGCTGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121D
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTAAAGACG ATCATGGACG AGAAATATTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121E
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTAAAGACG ATCATGGAAG AGAAATATTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121F
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGTTTGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121H
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGCACGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121I
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGATAGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121K
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGAAAGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121N
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGAACGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121P
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTAAAGACG ATCATGCCAG AGAAATATTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121T
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGACTGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121W
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAAAGACGA TCATGTGGGA GAAATATT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/Y124A
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCATGAGAG AGAAAGCATC AAAGTGTT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/Y124Q
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCATGAGAG AGAAACAATC AAAGTGTT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/Y124R
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCATGAGAG AGAAACGATC AAAGTGTT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/Y124S
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCATGAGAG AGAAATCATC AAAGTGTT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/Y124T
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCATGAGAG AGAAAACATC AAAGTGTT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/Y124A/S125A
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGATCATGAG AGAGAAAGCT GCTAAGTGTT CGA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/T13D: sustitución de T13D
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGAGATCA TCAAAGATTT GAACAGCC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: cebador de mutagénesis, IL-4/R121T/E122F/Y124Q
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DE SENTIDO OPUESTO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTAAAGACG ATCATGACCT TCAAACAGTC AAAG 
\hfill
34

Claims (34)

1. Una muteína de la IL-4 numerada de acuerdo con la IL-4 de tipo salvaje, que tiene sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo constituido por R121A, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W, Y124A, T124Q, Y124R, Y124S, e Y124T, en la que dichas sustituciones conservan la actividad activadora de las células T nativas pero tienen actividad activadora reducida de las células endoteliales.
2. Una muteína de la IL-4 humana en la que los residuos expuestos en la superficie de la hélice D de dicha IL-4 de tipo salvaje están mutados con un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por alanina, ácido glutámico, fenilalanina, histidina, isoleucina, prolina, teronina y triptófano, en la que la muteína resultante produce proliferación de las células T, y produce secreción reducida de la IL-6 a partir de las HUVEC, con relación a la IL-4 de tipo salvaje y en la que los residuos expuestos en al superficie de la hélice D de dicha IL-4 de tipo salvaje son Glu-110, Asn-111, Glu-114, Arg-115, Lys-117, Thr-118, Arg-121, Glu-122, Tyr-124, Ser-125, y Lys-126 o cualquiera de los residuos 118-126.
3. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que dicha posición 121 se sustituye con alanina.
4. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con ácido glutámico.
5. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con fenilalanina.
6. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con histidina.
7. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con isoleucina.
8. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con lisina.
9. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con asparagina.
10. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con prolina.
11. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con treonina.
12. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con triptófano.
13. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 124 se sustituye con alanina.
14. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 124 se sustituye con glutamina.
15. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 124 se sustituye con arginina.
16. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 124 se sustituye con serina.
17. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 124 se sustituye con treonina.
18. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que dichas posiciones 124 y 125 se sustituyen con alanina.
19. La muteína de la IL-4 humana de la reivindicación 1 en la que la posición 121 se sustituye con treonina, la 122 se sustituye con fenilalanina, y la 124 se sustituye con glutamina.
20. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1.
21. Una molécula de polinucleótido que codifica la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1.
22. Una célula huésped transformada con el polinucleótido de la reivindicación 21.
23. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 21 que dirige la expresión de la muteína de la IL-4 que tiene la actividad activadora de las células T pero que tiene la actividad activadora reducida de las células endoteliales, el vector siendo capaz de permitir la transfección de un organismo diana y la posterior expresión in vivo de dicha muteína de la IL-4 codificada por dicho polinucleótido.
24. Un procedimiento de selección de una muteína de la IL-4 humana numeradas de acuerdo a la IL-4 de tipo salvaje que tiene actividad activadora de las células T pero que tiene actividad activadora reducida de las células endoteliales, el procedimiento comprendiendo la mutación de los residuos expuestos en la superficie de la hélice D con un aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por alanina, glutamina, arginina, serina, treonina en el que la muteína resultante produce la proliferación de las células T y produce secreción reducida de la IL-6 a partir de las HUVEC, con relación a la de tipo salvaje.
25. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección tratable con la IL-4.
26. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno autoinmune.
27. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple.
28. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide.
29. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes melitus.
30. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de lupus eritematoso sistémico.
31. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad infecciosa.
32. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad de Lyme.
33. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad polarizada por Th-1.
34. Uso de la muteína de la IL-4 de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de soriasis.
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