JP2000515007A - Ｔ細胞選択的インターロイキン―４アゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＴ細胞活性化活性を有するが、減少した内皮細胞活性化活性を有する、野生型ＩＬ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質に関する。特に、本発明は野生型ＩＬ−４のＤヘリックスの表面に露出した残基を突然変異させ、それにより得られる突然変異タンパク質がＴ細胞増殖を引き起こし且つ野生型ＩＬ−４に比較して減少したＨＵＶＥＣからのＩＬ−６分泌をもたらすヒトＩＬ−４突然変異タンパク質に関する。本発明は毒性が低いＩＬ−４突然変異体を実現し、それによりこのインターロイキンのより多くの治療用途が可能になる。さらに、本発明は野生型ＩＬ−４（Ｈｉｓ＝１）に従って番号をつけられた場合に名称Ｒ１２１Ａ、Ｒ１２１Ｄ、Ｒ１２１Ｅ、Ｒ１２１Ｆ、Ｒ１２１Ｈ、Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１２１Ｋ、Ｒ１２１Ｎ、Ｒ１２１Ｐ、Ｒ１２１Ｔ、Ｒ１２１Ｗ；Ｙ１２４Ａ、Ｙ１２４Ｑ、Ｙ１２４Ｒ、Ｙ１２４Ｓ、Ｙ１２４Ｔ；Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａ、Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ及びＲ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑにより表される単一、二重及び三重の突然変異を有するＩＬ−４突然変異タンパク質に関する。また、本発明は本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドを含有するベクター、形質転換された宿主細胞、突然変異タンパク質を含んでなる製薬学的組成物及び治療的処置方法も含む。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞選択的インターロイキン−４アゴニスト 発明の背景１．発明の分野 本発明は一般的に薬理学及び免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明 はＴ細胞を選択的に活性化し且つ内皮細胞または繊維芽細胞の減少した活性化を 有する物質の新規組成物に関する。これらの新規組成物はサイトカインファミリ ー、特にヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４）の変異体を含む。２．関連する分野の説明 インターロイキン−４（ＩＬ−４）は免疫系の細胞、内皮細胞及び繊維芽細胞 の性質のものに対する活性を有する多面的サイトカインである。ＩＬ−４投与の 報告されたインビトロ作用はＢ細胞の増殖、Ｂ細胞における免疫グロブリンクラ スのスイッチを含む。Ｔ細胞では、ＩＬ−４はマイトジェンでの前活性化後にＴ 細胞増殖を刺激し、ＩＦＮ−γ生産をダウンレギュレートする。単球では、ＩＬ −４はクラスII ＭＨＣ分子の発現、リポ多糖により誘導されるｔＰＡの放出及 びＣＤ２３の発現を誘導する。内皮細胞（ＥＣ）では、ＩＬ−４はＶＣＡＭ−１ の発現及びＩＬ−６の放出を誘導し、ＩＣＡＭ−１の発現を減らす（Ｍａｈｅｒ 、ＤＷ 、等、Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４；Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｍ ｏｄｕｌａｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ ｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、３：４３−５６（１９９１））。 ＩＬ−２にさらされることにより活性化されたＴ細胞の増殖を刺激するＩＬ− ４の能力のために、ＩＬ−４治療が進められている。例えば、ＩＬ−４は腎癌の 動物モデルにおいて抗腫瘍活性を示し、マウスでは腫瘍の退縮を誘導した（Ｂｏ ｓｃｏ、Ｍ ．等、Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ＩＬ−４ Ｉｎｊｅｃｔｅｄ Ｐ ｅｒｉｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ Ｍｉ ｃｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｐｏｏｒｌｙ ａｎｄ Ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｅ ａ Ｔｕｍｏｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｅｍｏ ｒｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５：３１３６−４３（１９９０））。しかし ながら、その毒性のためにヒトにおける投与量は限定される（Ｍａｒｇｏｌｉｎ 、Ｋ ．等、Ｐｈａｓｅ II Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂ ｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｎａ ｌ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ 、１５：１４７−１５３（１９９４））。 ＩＬ−４の免疫調節活性のために、多数の臨床用途がＩＬ−４に対して提示さ れている。これらの臨床用途の中には免疫系の不均衡により引き起こされる疾患 、特に抗原に対するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞反応の不均衡により引き起こされる ものがある。これらの疾患はある種の自己免疫疾患、リウマチ性疾患、皮膚科学 的疾患及び感染性疾患を含む。一連の多くの実験研究からＴｈ細胞がＴｈ１及び Ｔｈ２と呼ばれる２つの広いクラスに分かれることが確立している（Ｍｏｓｍａ ｎｎ、Ｔ．Ｒ．、Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ、Ｈ．、Ｂｏｎｄ、Ｍ．Ｗ．、Ｇｉｅｄ ｌｉｎ、 Ｍ．Ａ．及びＣｏｆｆｍａｎ、Ｒ．Ｌ ．、Ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｍｕｒｉ ｎｅ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ．Ｉ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ ．、１３６：２３４８−２３５７（１９８６）；Ｍｏｓｍａｎｎ、 Ｔ．Ｒ ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆ ｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．、１−６（１９９５）） 。これらのＴ細胞クラスはそれらが発現するサイトカインにより特定され、Ｔｈ １細胞はＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを産生し、一方、Ｔｈ２細胞はＩ Ｌ−４及びＩＬ−５を産生する。Ｔｈ１及びＴｈ２細胞はナイーブ（ｎａｉｖｅ ）ＣＤ４⁺Ｔ細胞から生じる。Ｔｈ１またはＴｈ２サブセットへの分化は抗原刺 激中に存在するサイトカインにより決まり、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２はナイー ブ細胞のＴｈ１表現型への分化を導き、一方、ＩＬ−４はＴｈ２表現型への分化 を導く。Ｔｈ１及びＴｈ２サブセットはＴｈ細胞表現型の連続的系列に沿った両 極端に相当するかもしれないが（例えば、低レベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の 両方を発現するＴｈ０細胞が記述されている）、それにもかかわらずこの分類は 免疫反応の特徴を記述するための免疫学の分野の重要なパラダイムである。ある 種の器官特異的自己免疫疾患が自己抗原に対する主にＴｈ１ Ｔ細胞反応に関係 することが認められている（Ｌｉｂｌａｕ ＲＳ：Ｓｉｎｇｅｒ ＳＭ；ＭｃＤ ｅｖｉｔｔ ＨＯ 、Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ ＣＤ４⁺ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｅｓｉｓ ｏｆ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉ ｓｅａｓｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１６：３４−３８（１９９５）） 。そのような自己免疫疾患の一つは、Ｔ細胞が介在する膵臓β細胞の破壊を特徴 とする疾患のインシュリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）である。いくつかの方面の 証拠からＴｈ−１型細胞が膵臓β細胞破壊の主な原因であることが示唆されてい る（Ｔｉｓｃｈ、Ｒ．等、Ｒｅｖｉｅｗ：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ、Ｃｅｌｌ、８５：２９１−２９７（１ ９９６）中に概説される）。ＩＤＤＭの動物モデルとして使えるＮＯＤマウスへ のＩＬ−４の投与は、Ｔｈ１細胞集団をダウンレギュレートし、糖尿病の発症を 著しく遅らせる（Ｒａｐｏｐｏｒｔ、等、ＩＬ−４ Ｒｅｖｅｒｓｅｓ Ｔ ｃ ｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ａ ｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ Ｏｎｓｅｔ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ＮＯＤ Ｍｉｃｅ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７８：８７−９９（１９９３） ）。別のそのような自己免疫疾患は神経細胞の周りのミエリン鞘への自己免疫攻 撃を特徴とする疾病の多発性硬化症（ＭＳ）である。ＭＳにかかっているヒトに おける研究から、ＭＳの悪化が自己抗原特異的Ｔｈ１及びＴｈ０細胞の存在に関 係し、寛解が自己抗原特異的Ｔｈ２及びＴｈ０細胞の存在に関係することが示さ れている（Ｃｏｒｒｅａｌｅ、Ｊ．等、Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉ ｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｌ ｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏ ｓｉｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ ．、１５４：２９５９−２９６８（１９９５））。ＭＳの動物モデルである実 験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）にかかっているマウスもＴｈ１細胞偏向を示す （Ｃｕａ、ＤＪ、Ｈｉｎｔｏｎ、ＤＲ及びＳｔｏｃｈｌｍａｎ、ＳＡ、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ ．、１５５：４０５２−４０５９（１９９５））。ＥＡＥモデルにお ける研究からの間接的な証拠から、ＩＬ−４が寛容原ペプチドでの処置から生じ る疾病の緩和に重要な役割を果たすことが示唆されている（Ｂｒｏｃｋｅ、Ｓ． 等 Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｎｃｅｐｈａｌ ｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３７９：３４３ −３４６（１９９６））。 慢性関節リウマチ（ＲＡ）のような他の自己免疫疾患もＩＬ−４に基づく治療 の標的である。ＲＡの動物モデルはＴｈ１細胞に偏よる細胞特性の不均衡を示し ており、ＴＮＦ−αを過剰発現するマウスでは抗−ＴＮＦ−α抗体が疾病の緩和 を示しており、Ｔｈ１細胞集団のダウンレギュレーションをもたらすＩＬ−４治 療が抗−ＴＮＦ−α作用も有する可能性があることを示唆している（Ｆｅｌｄｍ ａｎｎ、Ｍ ．等、Ｒｅｖｉｅｗ：Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｃｅｌｌ 、８５：３０７−３１０（１９９６）を参照）。 尋常性乾癬は冒された皮膚の単球及びＴ細胞での浸潤を特徴とする慢性皮膚疾 患である。いくつかの報告から乾癬性皮膚障害性Ｔ細胞及びＰＢＬが主にＴｈ１ 表現型のものであることが示されている（Ｕｙｅｍｕｒａ Ｋ；Ｙａｍａｍｕｒ ａ Ｍ；Ｆｉｖｅｎｓｏｎ ＤＦ；Ｍｏｄｌｉｎ ＲＬ；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ＢＪ 、Ｔｈｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎ ｌｅｓｉｏｎａｌ ａｎｄ ｌｅｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ｓｋｉｎ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ａ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ １ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｐｏ ｎｓｅ、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０１：７０１−７０５（１ ９９３）：Ｓｃｈｌａａｋ ＪＦ；Ｂｕａｌａｕ Ｍ；Ｊｏｃｈｕｍ Ｗ；Ｈｅ ｒｍａｎｎ Ｅ；Ｇｉｒｎｄｔ Ｍ；Ｇａｌｌａｔｉ Ｈ；Ｍｅｙｅｒ ｚｕｍ Ｂｕｓｃｈｅｎｆｅｌｄｅ ＫＨ；Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ Ｂ 、Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｂｅｌｏ ｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｈ１ ｓｕｂｓｅｔ、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔ ｏｌ ．、１０２：１４５−１４９（１９９４））。さらに、乾癬にかかってい患 者に対して臨床的に有益であると報告されている薬剤のモノメチルフマレートが ＰＢＭＣからのＴｈ２サイトカイン分泌を選択的に刺激することが示されている （ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｒ；Ｂｅｚｅｍｅｒ ＡＣ；Ｚｏｍｅｒｄｉｊｋ ＴＰ；ｖ ａｎ ｄｅ Ｐｏｕｗ−Ｋｒａａｎ Ｔ；Ｏｔｔｅｎｈｏｆｆ ＴＨ；Ｎｉｂｂ ｅｒｉｎｇ ＰＨ 、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ２ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ａ ｎｔｉ−ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ａｇｅｎｔ ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｆｕｍａｒａ ｔｅ、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２６：２０６７−２０７４（１９９６）） 。従って、ＩＬ−４はＴｈ偏向を逆にすると予想され、乾癬において臨床的に有 益である。 ある種の感染性疾患は感染性病原体に対する偏ったＴｈ細胞反応と関係する。 Ｔｈ２反応はある場合において感染性病原体に対する抵抗性に 関係している。例としてはライム病の感染性病原体のボレリア・ブルグドルフェ リ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）がある。ボレリア・ブルグド ルフェリに感染したヒトは主にＴｈ１様サイトカイン特性を示す（Ｏｋｓｉ Ｊ ；Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ Ｊ；Ｐｅｎｅ Ｊ；Ｂｏｕｓｑｕｅｔ Ｊ；Ｌａｉｐ ｐａｌａ Ｐ；Ｖｉｌｊａｎｅｎ ＭＫ 、Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅ ｕｋｉｎ−４ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇａｍｍａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ ｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎ ｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｌｙｍｅ ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６４：３６２０−３６ ２３（１９９６））。ボレリア・ブルグドルフェリが引き起こす関節炎のマウス モデルにおいて、疾病に対する抵抗性はＩＬ−４生産に関係し、一方、罹患性は ＩＦＮ−γ生産に関係する（Ｍａｔｙｎｉａｋ ＪＥ；Ｒｅｉｎｅｒ ＳＬ、Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐ ｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓ ｅ、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８１（３）：１２５１−１２５４（１９９５）；Ｋ ｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓ Ａ；Ｎｉｃｋｅｌｌ ＳＰ 、Ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＬ−４ ａｎｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕ ｎｉｔｙ ｔｏ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｉｎ ｍｉｃｅ 、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５５：２０２０−２０２８（１９９５））。ボレリア ・ブルグドフェリに感染したマウスのＩＬ−４での処置は感染に対する抵抗性を 高める（Ｋｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓ Ａ；Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ ＣＲ；Ｆｉｎ ｋｅｌｍａｎ ＦＤ；Ｎ ｉｃｋｅｌｌ ＳＰ 、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ−４ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒ ｇｄｏｒｆｅｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｓ ｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｓｕ ｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｉｃｅ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５６：２４８８−２ ４９４（１９９６））。 ＩＬ−４はリンパ腫及び白血病の成長を阻害することに直接的な作用を有する ことが報告されている（Ａｋａｓｈｉ、Ｋ、Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅ ｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏ ｍａ 、９：２０５−９（１９９３））。例えば、ＩＬ−４は急性リンパ芽球性白 血病にかかっている患者からの細胞においてアポトーシスを誘導することが報告 されており（Ｍａｎａｂｅ、Ａ、等、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｉｎｄｕｃ ｅｓ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）ｉ ｎ ｃｅｓｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａ ｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｂｌｏｏｄ、８３：１７３１−７（１９９４）） 、非ホジキンＢ細胞リンパ腫にかかっている患者からの細胞の増殖を阻害する（Ｄｅｆｒａｎｃｅ、Ｔ 、等、Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃ ｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｏｎ ｆｒｅｓｈｌｙ ｉｓｏｌａ ｔｅｄ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ、Ｂｌｏｏｄ、７９：９９０−６（１９９２））。 また、ＩＬ−４はそれが変形性関節症において臨床的に有益であるこ とを示唆する活性を示すことも報告されている。変形性関節症は軟骨の退行が主 な病変である疾病である（Ｓａｃｋ、ＫＥ、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ、Ｗｅｓｔ Ｊ Ｍｅｄ、１６３ ：５７９−８６（１９９５）；Ｏｄｄｉｓ、ＣＶ、Ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉ ｖｅｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ、１００：１ ０Ｓ−１５Ｓ（１９９６））。ＩＬ−４は変形性関節症患者からの単球及び滑液 細胞によるＴＮＦ−α及びＩＬ−１β生産を抑制する（Ｂｅｎｄｒｕｐｓ、Ａ、 Ｈｉｌｔｏｎ、Ａ、Ｍｅａｇｅｒ、Ａ及びＨａｍｉｌｔｏｎ、ＪＡ 、Ｒｅｄｕｃ ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｂｅｔａ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｈｕｍ ａｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ、１２： ２１７−２０（１９９３）；Ｓｅｉｔｚ、Ｍ、等、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｉ ｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ ｂｙ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｎｄ ｏ ｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏ ｎ ｂｙ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ａｎｄ ＩＬ−４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５ ２：２０６０−５（１９９４））。さらに、ＩＬ−４はエクスビボ軟骨外植片に おいて軟骨の退行を直接阻止することが報告されている（Ｙｅｈ、ＬＡ、Ａｕｇ ｕｓｔｉｎｅ、ＡＪ、Ｌｅｅ、Ｐ、Ｒｉｖｉｅｒｅ，ＬＲ及びＳｈｅｌｄｏｎ、 Ａ 、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ −４、ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｂｒｅａｋｄｏ ｗｎ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｘｐ ｌａｎｔｓ、Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２２：１７４０−６〔１９９５））。こ れらの活性はＩＬ−４が変形性関節症において臨床的に有益であることを示唆す る。 しかしながら、ＩＬ−４の臨床使用は血管漏出症候群として現れるその急性毒 性のために限られている（Ｍａｒｇｏｌｉｎ、Ｋ、等、Ｐｈａｓｅ II Ｓｔｕ ｄｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉ ｎ−４ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍａｌ ｉｇｎａｎｔ Ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１５：１ ４７−１５３（１９９４））。ＩＬ−４の急性毒性作用の機構を示すか、または 免疫調節活性を保持するが減少した急性毒性を有するＩＬ−４の類似体もしくは 突然変異体を示す技術は文献にない。 ＩＬ−４突然変異体タンパク質（「突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎｓ）」 ）は知られている。ＩＬ−４突然変異タンパク質ＩＬ−４／Ｙ１２４ＤはＴ細胞 アンタゴニストである（Ｋｒｕｓｅ Ｎ、Ｔｏｎｙ ＨＰ、Ｓｅｂａｌｄ Ｗ、 Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｉｎ ｔｏ ａ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｂｙ ａ ｓ ｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏａｃｉｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｅｍｂｏ Ｊ、１ １：３２３７−４４（１９９２））。 特許または特許出願に見いだされるＩＬ−４の治療用途は以下のもの：化学療 法薬の抗癌作用の強化のためのＩＬ−４の使用、特にホジキン 病及び非ホジキンリンパ腫（ＷＯ第９６０７４２２号を参照）；ＩＬ−４の結合 活性を抑制または模倣することによりＩＬ−４関連疾患を処置するため（ＷＯ第 ９５２４４８１号を参照）並びにＩＬ−４を検出、測定及び免疫精製するため（ ＷＯ第９３１７１０６号を参照）の抗体を作製するためのＩＬ−４の抗原フラグ メントの使用；免疫グロブリン分泌細胞への前駆体Ｂ細胞の分化を誘導するため で、成熟Ｂ細胞は免疫妥協患者で免疫機能を回復するために有用である（ＷＯ第 ９４０４６５８号を参照）；白血病、リンパ腫、炎症性腸疾患及び遅延型過敏症 （例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）の処置のための治療としてＩＬ−１０ と組み合わせて用いられる場合（ＷＯ第９４０４１８０号を参照）；単球及びマ クロファージにおけるウイルスの複製を阻害するため及びいくつかの腫瘍細胞に 対するそれらの細胞毒性を増すためにＩＬ−４を投与することによるＨＩＶ感染 の処置（ＷＯ第９４０４１７９号を参照）；糖尿病及び免疫妥協患者において損 傷を処置するために皮膚繊維芽細胞増殖を刺激するため（ＷＯ第９２１１８６１ 号を参照）；細菌、トキソイド及びウイルスワクチン、特に破傷風トキソイドワ クチンを投与する場合に一次免疫応答を高めるため（ＷＯ第９２１１０３０号を 参照）；Ｂ細胞悪性腫瘍、特に慢性リンパ性白血病、非ホジキン悪性リンパ腫の ＩＬ−２が誘導する増殖を阻害するため（ＷＯ第９２１０２０１号参照）；黒色 腫、腎癌及び基底細胞癌を処置するためのＩＬ−４の使用（ＷＯ第９２０４０４ ４号を参照）を含む。 特許文献はＩＬ−４タンパク質及びいくつかの突然変異タンパク質を開示して いるが、いずれも減少した副作用を有するＩＬ−４治療に関するものではない。 Ｌｅｅ等、米国特許番号第５，０１７，６９１号（「６ ９１特許」）はＢ細胞増殖因子活性及びＴ細胞増殖因子活性の両方を示す哺乳類 タンパク質及びヒトＩＬ−４の突然変異タンパク質に関する。それはＩＬ−４活 性を示すポリペプチドをコードする核酸並びにポリペプチド自体及びそれらの製 造方法を開示している。インビトロでＢ及びＴ細胞の両方の増殖を刺激する能力 を保持するアミノ酸位置での野生型ＩＬ−４に対する突然変異タンパク質が開示 されている。しかしながら、ＬｅｅではいかなるＴ細胞選択的ＩＬ−４突然変異 タンパク質、ＩＬ−４の投与に伴うＥＣの予想される活性化または内皮細胞漏出 も示唆されていない。従って、ＩＬ−４自体は投与量を制限する毒性のために治 療方法として可能ではない。 米国特許番号第５，０１３，８２４号は天然のｈＩＬ−４の６から４０個まで のアミノ酸を含んでなるｈＩＬ−４ペプチド誘導体を記述している。また開示さ れたものはペプチド及び担体のコンジュゲートを含んでなる免疫原である。担体 は赤血球、バクテリオファージ、タンパク質、合成粒子またはコンジュゲートペ プチドに対して抗体生産を引き起こすことができるあらゆる物質を含む。ＩＬ− ４の突然変異タンパク質は開示されていない。 ＷＯ第９６／０４３０６−Ａ２号はｈＩＬ−２及びｈＩＬ−１３のアンタゴニ スト及び部分的アゴニストである単一の突然変異タンパク質を開示している。Ｉ Ｌ−４に関するデータは開示されていない。ＷＯ第９５／２７０５２号はエキソ ン１、２及び４を含有するＩＬ−２及びＩＬ−４のスプライス突然変異体を開示 している。 減少した毒性を有し、より一般的に許容される改善されたＩＬ−４分子が必要 とされている。 発明の要約 本発明はＴ細胞活性化活性を有するが、減少した内皮細胞活性化活性を有する 、野生型ＩＬ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質に 関する。具体的には、野生型ＩＬ−４のＤヘリックスの表面に露出した残基を突 然変異させ、それにより得られる突然変異タンパク質がＴ細胞増殖を引き起こし 且つ野生型ＩＬ−４に比較して減少したＨＵＶＥＣからのＩＬ−６分泌をもたら すヒトＩＬ−４突然変異タンパク質に関する。本発明は毒性のより低いＩＬ−４ 突然変異タンパク質を実現し、それによりこのインターロイキンのより広い治療 用途を可能にする。 さらに、本発明は野生型ＩＬ−４（Ｈｉｓ＝１）に従って番号をつけられた場 合に名称Ｒ１２１Ａ、Ｒ１２１Ｄ、Ｒ１２１Ｅ、Ｒ１２１Ｆ、Ｒ１２１Ｈ、Ｒ１ ２１Ｉ、Ｒ１２１Ｋ、Ｒ１２１Ｎ、Ｒ１２１Ｐ、Ｒ１２１Ｔ、Ｒ１２１Ｗ；Ｙ１ ２４Ａ、Ｙ１２４Ｑ、Ｙ１２４Ｒ、Ｙ１２４Ｓ、Ｙ１２４Ｔ；Ｙ１２４Ａ／Ｓ１ ２５Ａ、Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ；及びＲ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑによ り表される単一、二重及び三重の突然変異を有するＩＬ−４突然変異タンパク質 に関する。また、本発明は本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレ オチド、それらのポリヌクレオチドを含有するベクター、形質転換された宿主細 胞、突然変異タンパク質を含んでなる製薬学的組成物及び治療的処置方法も含む 。 本発明は本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで なるベクター、Ｔ細胞活性化活性を有するが減少した内皮細胞活性化活性を有す るヒトＩＬ−４突然変異タンパク質の発現を導くベク ター、標的生物のトランフェクション及びそれに続く該ポリヌクレオチドにより コードされる該ヒトＩＬ−４突然変異タンパク質のインビボ発現を可能にするこ とができるベクターにも関する。 本発明は野生型ＩＬ−４のＤヘリックスの表面に露出した残基を突然変異させ 、それにより得られる突然変異タンパク質がＴ細胞増殖を引き起こし且つ野生型 に比較して減少したＨＵＶＥＣからのＩＬ−６分泌をもたらすことを含んでなる 、Ｔ細胞活性化活性を有するが減少した内皮細胞活性化活性を有する、野生型Ｉ Ｌ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質を選択する方 法にも関する。 本発明はＴ細胞活性化活性を有するが減少した内皮細胞活性化活性を有する、 野生型ＩＬ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質の治 療的に有効量を投与することによりＩＬ−４で治療できる疾患に苦しむ患者を処 置する方法にも関する。この方法はＩＬ−４で治療できる疾患が自己免疫疾患、 癌、感染性疾患、軟骨性疾患及び乾癬性疾患である場合に適用できる。 図面の簡単な説明 図１はこの研究に用いる成熟野生型ヒトＩＬ−４のアミノ酸配列（配列番号１ ）である。ヘリックスに下線を引き、順次Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと呼ぶ。突然変異し た場合に細胞選択的ＩＬ−４アゴニストを生じる位置をボールド体で示す。 図２はＴ細胞選択的アゴニストの概念の略図的説明である。 図３はＨＵＶＥＣ ＩＬ−６分泌アッセイにおける選択的アゴニスト突然変異 タンパク質の複合用量応答曲線である。パネルＡ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｒ １２１Ｅ；▽、Ｒ１２１Ｐ；▼Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２ Ｆ／Ｙ１２４Ｑ。パネルＢ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｙ１２４Ｑ；▽、Ｙ１２ ４Ｒ；▼Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａ。 図４はＨＵＶＥＣ ＩＬ−６分泌アッセイにおける選択的アゴニスト突然変異 タンパク質の個々の用量応答曲線である。パネルＡ：○、野生型ＩＬ−４；●、 Ｒ１２１Ｅ。パネルＢ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｒ１２１Ｐ。パネルＣ：○、 野生型ＩＬ−４；●、Ｙ１２４Ｑ。パネルＤ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｙ１２ ４Ｒ。パネルＥ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａ。パネルＦ ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑ。 図５は１°Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＬ−４突然変異タンパク質の生物学 的反応のための選択的アゴニスト突然変異タンパク質の複合用量応答曲線である 。パネルＡ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｒ１２１Ｅ；▽、Ｒ１２１Ｐ；▼、Ｒ１ ２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑ。パネルＢ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｙ１２ ４Ｑ；▽、Ｙ１２４Ｒ；▼Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａ。 図６は１°Ｔ細胞増殖アッセイの個々の用量応答曲線である。パネルＡ：○、 野生型ＩＬ−４；●、Ｒ１２１Ｅ。パネルＢ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｒ１２ １Ｐ。パネルＣ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｙ１２４Ｑ。パネルＤ：○、野生型 ＩＬ−４；●、Ｙ１２４Ｒ。パネルＥ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｙ１２４Ａ／ Ｓ１２５Ａ。パネルＦ：○、野生型ＩＬ−４；●、Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ １２４Ｑ。 図７はＴ細胞選択的アゴニストＩＬ−４突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｅ（●） 及びＹ１２４Ｑ（▽）によるＨＵＶＥＣでＩＬ−４により誘導されるＩＬ−６分 泌の拮抗作用を示す個々の用量応答曲線である。ＩＬ −４アンタゴニストＲ１２１Ｄ／Ｙ１２４Ｄ（○）の投与量反応をコントロール として含む。 図８Ａ、８Ｂは個々の用量応答曲線であり、パネルＡは１°Ｔ細胞増殖アッセ イにおけるＲ１２１Ｄ突然変異タンパク質の生物学的反応を示し（○＝ＩＬ−４ 、●＝Ｒ１２１Ｄ）、パネルＢはＲ１２１ＤがＨＵＶＥＣでＩＬ−６分泌を誘導 することができないことを示す（○＝ＩＬ−４、●＝Ｒ１２１Ｄ）。 図９Ａは１°Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＩＬ−４（○）並びにＴ細胞選択的 アゴニスト突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｅ（△）及びＴ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ（▲ ）の個々の用量応答曲線である。 図９ＢはＴ細胞選択的ＩＬ−４アゴニスト突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｅ（△ ）及びＴ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ（▲）によるＨＵＶＥＣでＩＬ−４により誘導され るＩＬ−６分泌の拮抗作用を示す個々の用量応答曲線である。 好ましい態様の説明 Ａ．背景 ＩＬ−４はＢ細胞、Ｔ細胞及び単球並びに内皮細胞に対する各種作用を初めと して、インビトロで様々な細胞反応を媒介することが示されている（Ｍａｈｅｒ ＤＷ、Ｄａｖｉｓ Ｉ、Ｂｏｙｄ ＡＷ、Ｍｏｒｓｔｙｎ Ｇ；Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４：ａｎ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｗｉｔ ｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ．Ｐｒｏｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ ３：４３−５６、１９９１ ；Ｐｏｗｒｉｅ Ｆ、Ｃｏｆｆｍａｎ ＲＬ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｇｕｌａ ｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４：２７０−４、１９９３）。特に、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１； （Ｓｗｅｒｌｉｃｋ ＲＡ、Ｌｅｅ ＫＨ、Ｌｉ ＬＪ、Ｓｅｐｐ ＮＴ、Ｃａ ｕｇｈｍａｎ ＳＷ、Ｌａｗｌｅｙ ＴＪ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａ ｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｏｎ ｈ ｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ ｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：６９８−７０５、１９９２）の アップレギュレーション並びにＩＬ−６（Ｃｏｌｏｔｔａ Ｆ、Ｓｉｒｏｎｉ Ｍ、Ｂｏｒｒｅ Ａ、Ｌｕｉｎｉ Ｗ、Ｍａｄｄａｌｅｎａ Ｆ、Ｍａｎｔｏｖ ａｎｉ Ａ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４ ａｍｐｌｉｆｉｅｓ ｍｏｎｏｃｙ ｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅ ｉｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕ ｋｉｎ ６ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４：２４−８、１９９２）及び単球誘引物質タンパク質 −１（ＭＣＰ−１；Ｃｏｌｏｔｔａ Ｆ、Ｓｉｒｏｎｉ Ｍ、Ｂｏｒｒｅ Ａ、 Ｌｕｉｎｉ Ｗ、Ｍａｄｄａｌｅｎａ Ｆ、Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ：Ｉｎｔｅ ｒｌｅｕｋｉｎ ４ ａｍｐｌｉｆｉｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａ ｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｐｒｏｄｕ ｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４：２４−８、１９９２；Ｒｏｌｌｉｎｓ ＢＪ、Ｐｏｂｅｒ ＪＳ：Ｉｎｔｅ ｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＭＣＰ−１／ＪＥ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １３８：１３１５−９、１９９１）の誘導は培養した 内皮細胞に対するＩＬ−４の直接的な作用であり、ＶＣＡＭ−１のアップレギュ レーションはインビトロ（Ｃａｒｌｏｓ ＴＭ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＢＲ、Ｋｏ ｖａｃｈ ＮＬ、Ｙｅｅ Ｅ、Ｒｏｓａ Ｍ、Ｏｓｂｏｒｎ Ｌ、Ｃｈｉ−Ｒｏ ｓｓｏ Ｇ、Ｎｅｗｍａｎ Ｂ、Ｌｏｂｂ Ｒ、Ｒｏｓｓｏ Ｍ、等：Ｖａｓｃ ｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｍｅｄｉａｔ ｅｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｃｙｔｏｋｉｎｅ− ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ７６：９６５−７０、１９９０；Ｔｈｏｒｎｈｉｌ ｌ ＭＨ、Ｗｅｌｌｉｃｏｍｅ ＳＭ、Ｍａｈｉｏｕｚ ＤＬ、Ｌａｎｃｈｂｕ ｒｙ ＪＳ、Ｋｙａｎ−Ａｕｎｇ Ｕ、Ｈａｓｋａｒｄ ＤＯ：Ｔｕｍｏｒ ｎ ｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ＩＬ−４ ｏｒ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｎ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ ｆｏｒ Ｔ ｃｅ ｌｌｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌ ｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ ｉｍ ｍｕｎｏｌ １４６：５９２−８、１９９１）及びインビボ（Ｂｒｉｓｃｏｅ ＤＭ、Ｃｏｔｒａｎ ＲＳ、Ｐｏｂｅｒ ＪＳ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｕｍ ｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ，ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ ｅ，ａｎｄ ＩＬ−４ ｏ ｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄ ｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏ ｎ ｗｉｔｈ ＣＤ３＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍ ｍｕｎｏｌ １４９：２９５４−６０、１９９２）の両方におけるリンパ球の増 加した接着と相関する。 ＩＬ−４突然変異タンパク質ＩＬ−４／Ｙ１２４Ｄ（位置１２４のチロシンの 代わりにアスパラギン酸の置換）はＴ細胞アンタゴニストである（Ｋｒｕｓｅ Ｎ、Ｔｏｎｙ ＨＰ、Ｓｅｂａｌｄ Ｗ：Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍ ａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｉｎｔｏ ａ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔ ｙ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｅｍｂｏ Ｊ １１：３２３７−４４、１９９２）。 本発明者等により実施されたインビボ実験で、以前に記述されていない結果の、 ＩＬ１−４／Ｙ１２４Ｄがサルにおいて野生型ＩＬ−４のものに類似した急性毒 性を示すことが実証されている。野生型ＩＬ−４及びＩＬ−４／Ｙ１２４Ｄの両 方がもたらす毒性に関係する細胞事象はＶＣＡＭ−１のアップレギュレーション 、血清中のＭＣＰ−１のアップレギュレーション、循環するリンパ球の付随する 減少と共に循環する単球の増加、及びヘマトクリットの増加を含む。類似した細 胞輸送がヒトにおけるＩＬ−４を用いた臨床試験で観察されている（Ｗｏｎｇ ＨＬ、Ｌｏｔｚｅ ＭＴ、Ｗａｈｌ ＬＭ、Ｗａｈｌ ＳＭ：Ａｄｍｉｎｉｓｔ ｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩＬ−４ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏ ｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１１８−２５、１９９２）。ＩＬ −４／Ｙ１２４ＤのＴ細胞のアンタゴニストとしての特性のために、これらの結 果はそれにより示される毒性がＴ細胞以外の細胞に対するアゴニスト活性による ものであり、そしてそれらを通してもたらされることを示唆する。ＩＬ−４／Ｙ １２４Ｄを用いて観察されたインビボでの毒性及び内皮細胞に対するＩＬ−４の 既知の作用は、インビボのＩＬ−４毒性が血管内皮細胞に対するＩＬ−４の直接 作用を通してもたらされる機構と一致する。 これら（及び関連する）研究を通して、本発明者等は新規なＩＬ−４受容体が 内皮細胞（「ＥＣ」）上に存在する可能性があることを見いだした。この可能性 からＴ細胞を選択的に活性化するがＥＣを活性化しないＩＬ−４突然変異タンパ ク質を合成しようと努力した。Ｔ細胞はＩＬ−４Ｒα及びＩＬ−２Ｒγサブユニ ットからなるＩＬ−４受容体を発現するが、本発明者等はヒト臍帯静脈内皮細胞 （ＨＵＶＥＣ）がＩＬ−４Ｒαを発現するがＩＬ−２Ｒγを発現しないことを見 いだした。架橋研究から２個の受容体鎖がＨＵＶＥＣの細胞表面に発現され、一 方の分子量はＩＬ−４Ｒαと一致し、もう一方はより低分子量鎖であることが示 された。これらの結果はＩＬ−２Ｒγに機能が類似するが配列が異なる新規なＩ Ｌ−４受容体成分がＨＵＶＥＣ上に発現されることを示唆する。従って、これら ２種の受容体間の特定の分子構造の違いを利用して一方の受容体にもう一方より 選択的であるＩＬ−４変異体（例えば、Ｔ細胞選択的アゴニスト）を作製した。 図２に選択的アゴニストの概念を図式的に示す。ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−２Ｒγ サブユニットを含んでなるＴ細胞ＩＬ−４受容体及びＩＬ−４ Ｒα／γ様受容体サブユニットを含んでなる内皮細胞ＩＬ−４受容体を示す。例 示の目的のためだけにここで一緒に示すが、ＩＬ−４のこれら２種の受容体は異 なる細胞型上に発現される。Ｔ細胞受容体はＩＬ−４Ｒα及びＩＬ−２Ｒγから なり、ＩＬ−４結合は受容体ヘテロダイマーの形成を誘導し、それは細胞シグナ リングを生じる。ＩＬ−４により誘導される受容体ヘテロダイマー形成は、ＩＬ −４の受容体がＩＬ−４Ｒα及びγ様受容体成分からなることを除いてＥＣ上で 同様に起こる。γ様受容体成分はＩＬ−２Ｒγと異なる。Ｔ細胞選択的ＩＬ−４ アゴニストはＴ細胞受容体ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−２Ｒγと相互作用する能力を保 持するが、非Ｔ細胞受容体ＩＬ−４Ｒα／γ様サブユニットのヘテロダイマー化 、従ってシグナリングを誘導できないＩＬ−４の変異体である。そのようなＴ細 胞選択的ＩＬ−４アゴニストはＩＬ−４Ｒαと相互作用するそれらの能力を保持 し、そして細胞選択的活性化特性をそれらに与えるのはＩＬ−２Ｒγとγ様サブ ユニットを区別するそれらの能力である。 Ｔ細胞受容体の２つの成分のＩＬ−４Ｒα及びＩＬ−２ＲγはＩＬ−４分子の 異なる領域に接触し、それ故、本発明者等はＩＬ−４の小さい領域に焦点を当て て改変した。新規な受容体サブユニットはＩＬ−２Ｒγと同じＩＬ−４の領域に 接触すると仮定して、本発明者等はＤ−ヘリックス、特に残基１２１、１２４及 び１２５における多数の置換を実施した。 Ｄ−ヘリックスはＩＬ−２Ｒγ及びＨＵＶＥＣ上の推定される新規な受容体の 両方との相互作用に関係している（具体的に、ＩＬ−４突然変異タンパク質Ｒ１ ２１Ｄ／Ｙ１２４ＤはＨＵＶＥＣアンタゴニストであ る）。ＩＬ−４のＤ−ヘリックス（残基１１０ないし１２６；Ｈｉｓ＝１）に対 する改変を含有する突然変異タンパク質をＴ細胞増殖またはヒト臍帯静脈内皮細 胞（ＨＵＶＥＣ）ＩＬ−６分泌のいずれかを刺激するそれらの能力に関してスク リーニングした。ＨＵＶＥＣに比較してＴ細胞に対して異なる反応を誘導する突 然変異タンパク質をさらなる突然変異誘発によりさらに特性化した。 相互作用の可能性のある領域を決定するためにＤヘリックスの初めの走査を試 みた。さらに、ＡＢループはサイトカインリガンドとＤ−ヘリックス相互作用受 容体サブユニットの相互作用に関与することが示唆されているので、この領域の アラニン走査置換も作製した。特に、表面に露出した残基Ｇｌｕ−１１０、Ａｓ ｎ−１１１、Ｇｌｕ−１１４、Ａｒｇ−１１５、Ｌｙｓ−１１７、Ｔｈｒ−１１ ８、Ａｒｇ−１２１、Ｇｌｕ−１２２、Ｔｙｒ−１２４、Ｓｅｒ−１２５及びＬ ｙｓ−１２６を研究の標的とし、これらは突然変異分析の好ましい標的である。 部位１１８−１２６がより好ましく、部位１２１−１２５が最も好ましい。この 領域のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７及びＩＬ−１５間の比較から、おそらくＨ ＵＶＥＣ受容体相互作用をもたらす特定の残基を示唆している、ＩＬ−４とＩＬ −２、ＩＬ−７とＩＬ−１５の違いも同定された。ＩＬ−２とＩＬ−４の整列か ら得られる特定の置換をＩＬ−４中に導入した。これらはＡｒｇ−１１５→Ｐｈ ｅ；Ｌｙｓ−１１７→Ａｓｎ；Ｇｌｕ−１２２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ−１２６→Ｉｌ ｅ並びに３個の同時変異Ａｒｇ−１２１→Ｔｈｒ、Ｇｌｕ−１２２→Ｐｈｅ及び Ｔｙｒ−１２４→Ｇｌｎを含んだ。 位置指定突然変異誘発を用いて野生型ヒトＩＬ−４ ｃＤＮＡに突然 変異を導入した。異種起源の系（例えば、大腸菌、バキュロウイルスまたはＣＨ Ｏ細胞）における発現のために適した発現ベクターに正しいクローンをサブクロ ーン化した。精製されたタンパク質をＴ細胞増殖及びＨＵＶＥＣサイトカイン分 泌アッセイ（ＩＬ−６）で試験した。ＥＣ₅₀または最大反応（プラトー）のいず れかにおいてこれらのアッセイ間で個々の突然変異タンパク質から得られる異な る反応は、これらの活性をもたらす突然変異を示す。具体的には、ＨＵＶＥＣへ の反応（対野生型ＩＬ−４）に比較した場合にＴ細胞アッセイ（対野生型ＩＬ− ４）において比較的より強い反応を刺激する突然変異タンパク質は、新規なＨＵ ＶＥＣ ＩＬ−４受容体とＩＬ−４の相互作用よりＩＬ−２ＲγとＩＬ−４の相 互作用に対して重要な位置を示唆する。同定された位置のさらなる分析及び突然 変異誘発（例えば、組み合わせの変異、全てのアミノ酸での置換）からＴ細胞Ｉ Ｌ−４受容体の選択的アゴニスト特性を有するＩＬ−４突然変異タンパク質が作 製される。このタンパク質はＩＬ−４により誘導されるＨＵＶＥＣ反応の選択的 アンタゴニストでもある。 Ｂ．定義 本明細書に記述されるものは新規な突然変異タンパク質並びにＴ細胞に対する 選択的アゴニスト特性及び減少した毒性を有する新規なＩＬ−４突然変異タンパ ク質を得るための手段である。同様な方法を用いてＴ細胞選択的アンタゴニスト を同定することができる。 本明細書に用いられる場合、「野生型ＩＬ−４」は例えば図１に示されるよう な天然のヒトＩＬ−４の１２９個の通常存在するアミノ酸配列を有する天然また は組み換えのＩＬ−４を意味する。 本明細書に用いられる場合、「ＩＬ−４突然変異タンパク質」はヒト 成熟インターロイキン−４タンパク質に対して特定の置換がなされているポリペ プチドを意味する。本明細書に具体的に開示されるものは、野生型ＩＬ−４に従 って番号がつけられた場合に、位置１２１のアルギニン残基（Ｒ）（「Ａｒｇ− １２１」）がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フ ェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ） 、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）もしくはトリプトフ ァン（Ｗ）で置換されているか；または位置１２２のグルタミン酸（Ｅ）残基が フェニルアラニン（Ｆ）で置換されているか；または位置１２４のチロシン残基 がアラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）もしく はトレォニン（Ｔ）で置換されているか；または位置１２５のセリン（Ｓ）残基 がアラニン（Ａ）で置換されている。最も好ましいＩＬ−４突然変異タンパク質 は他の未置換残基で野生型ＩＬ−４と同一のアミノ酸配列を有する。しかしなが ら、本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質は天然のＩＬ−４ポリペプチド鎖の１ 個もしくはそれ以上の部位または他の残基でのアミノ酸の挿入、欠失、置換及び 改変を特徴としてもよい。本発明によるあらゆるそのような挿入、欠失、置換及 び改変は、内皮細胞を活性化する減少した能力を有しながらＴ細胞選択的活性を 保持するＩＬ−４突然変異タンパク質をもたらす。 ＩＬ−４の他の位置での保存的改変及び置換（すなわち、突然変異タンパク質 の二次または三次構造に対して最小限の影響を有するもの）が好ましい。そのよ うな保存的置換はＤａｙｈｏｆｆによりＴｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（１９７８）中及び ＡｒｇｏｓによりＥＭＢＯ Ｊ．、 ８：７７９−７８５（１９８９）中に記述されたものを含む。例えば、以下の群 ‐ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ； ‐ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ； ‐ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ； ‐ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ； ‐ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；及び ‐ａｓｐ、ｇｌｕ のいずれかに属するアミノ酸は保存的変異を表す。 また、さらなる分子間架橋または不適切なジスルフィド結合形成の部位を導入 しない改変または置換も好ましい。例えば、ＩＬ−４は野生型の位置３、２４、 ４６、６５、９９及び１２７に６個のｃｙｓ残基を有することが知られている。 「野生型ＩＬ−４に従って番号がつけられた」は、選択したアミノ酸が野生型 ＩＬ−４において通常存在する位置に関してそのアミノ酸を同定することを意味 する。ＩＬ−４突然変異タンパク質に挿入または欠失が作製されると、位置１２ ５に通常存在するｓｅｒ（Ｓ）が、野生型ＩＬ−４に従って番号をつけられた場 合に、突然変異タンパク質での位置が移動する可能性があることを当業者は認識 する。しかしながら、隣接するアミノ酸を調べて野生型ＩＬ−４でｓｅｒに隣接 するものと相関させることにより、移動したｓｅｒ（Ｓ）の位置を容易に決定す ることができる。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質を当該技術分野で知られているあらゆる 好適な方法により製造することができる。そのような方法は本 発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築し、それらの 配列を好適に形質転換された宿主で発現させることを含む。この方法により本発 明の組み換え突然変異タンパク質が製造される。しかしながら、優先度は低いが 、化学合成または化学合成と組み換えＤＮＡ技術の組み合わせにより本発明の突 然変異タンパク質を製造してもよい。 本発明の突然変異タンパク質を製造するための組み換え法の一つの態様として 、野生型ＩＬ−４をコードするＤＮＡ配列を単離または合成し、次に部位特異的 突然変異誘発によりａｒｇ１２１のコドンをアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（ Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソ ロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、トレオ ニン（Ｔ）またはトリプトファン（Ｗ）のコドンに変えることによりＤＮＡ配列 を構築する。この技術はよく知られている。例えば、引用することにより本明細 書に組み込まれる、Ｍａｒｋ等、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅ ｎｅｓｉｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｉｎｔｅｒｆ ｅｒｏｎ Ｇｅｎｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１ 、ｐｐ．５６６２−６６（１９８４）；米国特許第４，５８８，５８５号を参照 。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築するため の別の方法は化学合成である。例えば、所望するＩＬ−４突然変異タンパク質を コードする遺伝子をオリゴヌクレオチド合成機を用いて化学的方法により合成す ることができる。そのようなオリゴヌクレオチドは所望するＩＬ−４突然変異タ ンパク質のアミノ酸配列に基づいて、好ましくは組み換え突然変異タンパク質が 生産される宿主細胞で好まれ るコドンを選択して設計される。これに関連して、遺伝暗号が縮重していること 、--アミノ酸を１種以上のコドンでコードすることができることはよく認識され ている。例えば、ｐｈｅ（Ｆ）は２つのコドンＴＴＣまたはＴＴＴによりコード され、ｔｙｒ（Ｙ）はＴＡＣまたはＴＡＴによりコードされ、ｈｉｓ（Ｈ）はＣ ＡＣまたはＣＡＴによりコードされる。Ｔｒｐ（Ｗ）は単一のコドンＴＧＧによ りコードされる。従って、特定のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードする一定 のＤＮＡ配列に対して、そのＩＬ−４突然変異タンパク質をコードする多数のＤ ＮＡ縮重配列があることが理解される。例えば、配列番号３に示される突然変異 タンパク質Ｒ１２１Ｅの好ましいＤＮＡ配列に加えて、示されるＩＬ−４突然変 異タンパク質をコードする多数の縮重ＤＮＡ配列があることが理解される。これ らの縮重ＤＮＡ配列は本発明の範囲内と考えられる。従って、本発明の文脈上「 その縮重変異体」は特定の突然変異タンパク質をコードする全てのＤＮＡ配列を 意味する。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、位置指定突 然変異誘発、合成または他の方法により調製されようとも、シグナル配列をコー ドするＤＮＡ配列を含んでもよくまたは含まなくてもよい。そのようなシグナル 配列は、存在する場合、ＩＬ−４突然変異タンパク質の発現のために選択された 細胞により認識されるものでなければならない。それは原核生物、真核生物また はこれら２つの組み合わせのものであってもよい。それは天然のＩＬ−４のシグ ナル配列であってもよい。シグナル配列の包含はＩＬ−４突然変異タンパク質が 生産される組み換え細胞からそれを分泌することが適切かどうかによる。選択さ れる細胞が原核細胞のものである場合は、通常、ＤＮＡ配列がシグナル 配列をコードしないことが好ましい。選択される細胞が真核生物のものである場 合は、通常、シグナル配列をコードすることが好ましく、野生型ＩＬ−４シグナ ル配列を用いることが最も好ましい。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードする遺伝子を合成するために標 準的な方法を適用することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて逆翻 訳された遺伝子を構築してもよい。ＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするヌ クレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、 所望するポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチド を合成し、次に連結してもよい。典型的に個々のオリゴヌクレオチドは相補的組 み立てのために５’または３’突出を含む。 （合成、位置指定突然変異誘発または別の方法により）いったん組み立てられ ると、本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現ベク ター中に挿入し、そして所望する形質転換宿主におけるＩＬ−４突然変異タンパ ク質の発現のために適切な発現制御配列に機能的に連結する。ヌクレオチドシー クエンシング、制限マッピング及び好適な宿主における生物学的活性ポリペプチ ドの発現により正しい組み立てを確認することができる。当該技術分野でよく知 られているように、宿主においてトランスフェクト遺伝子の高い発現レベルを得 るためには、選択した発現宿主で機能できる転写及び翻訳発現制御配列に遺伝子 を機能的に連結しなければならない。 発現制御配列及び発現ベクターの選択は宿主の選択による。多種多様な発現宿 主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主のために有用な 発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマ ウィルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含ん でなるベクターを含む。バクテリア宿主のために有用な発現ベクターはｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＥＲ３２ｚ、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を初めとする大腸 菌からのプラスミドのような既知のバクテリアプラスミド、ＲＰ４のようなより 広い宿主範囲のプラスミド、ファージＤＮＡ、例えばファージラムダの多数の誘 導体、例えばＮＭ９８９、並びにＭ１３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージのような 他のＤＮＡファージを含む。酵母細胞のために有用な発現ベクターは２μプラス ミド及びその誘導体を含む。昆虫細胞のために有用なベクターはｐＶＬ９４１を 含む。ｐＦａｓｔＢａｃ^TM１（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ、ＭＤ）が好ましい。Ｃａｔｅ等、「ｌｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｍｕｌｌｅｒｉａ ｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ」 、Ｃｅｌｌ、４５、ｐｐ．６８５−９８（１９８６）。 さらに、あらゆる多種多様な発現制御配列をこれらのベクターに用いることが できる。そのような有用な発現制御配列は前述の発現ベクターの構造遺伝子に関 係する発現制御配列を含む。有用な発現制御配列の例は、例えば、ＳＶ４０また はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣま たはＴＲＣ系、ファージラムダの主要なオペレーター及びプロモーター領域、例 えばＰＬ、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ または他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ、例えばＰｈｏＡのプ ロモータ ー、酵母α−接合系のプロモーター、バキュロウイルスのポリヘドロンプロモー ター、並びに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制 御することが知られている他の配列、並びにそれらの各種組み合わせを含む。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質を製造するために、バクテリア、（酵母 を初めとする）真菌、植物、昆虫、哺乳類または他の適切な動物細胞もしくは細 胞系及びトランスジェニック動物もしくは植物を初めとするあらゆる好適な宿主 を用いることができる。より具体的には、これらの宿主はエシェリキアコリ（Ｅ ．ｃｏｌｉ ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株、真菌、 酵母、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ ａ ）（Ｓｆ９）のような昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）のよ うな動物細胞及びＮＳ／Ｏのようなマウス細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１ 、ＢＳＣ４０及びＢＮＴ１０のようなアフリカミドリザル細胞、及びヒト細胞、 並びに組織培養の植物細胞のようなよく知られている真核生物及び原核生物の宿 主を含むことができる。動物細胞発現のためには培養物のＣＨＯ細胞及びＣＯＳ ７細胞、特にＣＨＯ細胞系ＣＨＯ（ＤＨＦＲ^-）が好ましい。 もちろん、本明細書に記述されるＤＮＡ配列を発現させるために全てのベクタ ー及び発現制御配列が同等によく機能するとは限らないことが理解されるはずで ある。また、全ての宿主が同じ発現系で同等によく機能するとは限らない。しか しながら、当業者は無理な実験なしにこれらのベクター、発現制御配列及び宿主 の中で選択をすることができる。例 えば、ベクターの選択では、ベクターは宿主の中で複製しなければならないので 宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力 、及び抗生物質マーカーのようなベクターによりコードされるあらゆる他のタン パク質の発現も考慮すべきである。例えば、本発明に用いるために好ましいベク ターは、ＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするＤＮＡをコピー数で増幅する ものを含む。そのような増幅できるベクターは当該技術分野でよく知られている 。それらは例えばＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ、米国特許第４，４７ ０，４６１号、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃＤＮＡ Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｕｔｉｌｉ ｚｅｄ Ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅ ｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２、ｐｐ．１３０４−１９（１９８２）を参照）またはグル タミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４ 号及び欧州開示出願第３３８，８４１号を参照）により増幅することができるベ クターを含む。 発現制御配列を選択する場合には、各種因子も考慮すべきである。これらは例 えば本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードする実際のＤＮＡ配列との配 列の相対的な強さ、その制御能力及びその適合性を含み、特に可能性のある二次 構造に関する。宿主は選択したベクターとそれらの適合性、本発明のＤＮＡ配列 によりコードされる産物の毒性、それらの分泌特性、ポリペプチドを正しく折り たたむそれらの能力、それらの発酵または培養条件、及びＤＮＡ配列によりコー ドされる産物の精製の容易さにより選択されるべきである。 これらのパラメーターの範囲内で、発酵でまたは例えばＣＨＯ細胞もしくはＣ ＯＳ７細胞を用いる大規模動物培養で所望するＤＮＡ配列を発現する各種ベクタ ー／配列制御配列／宿主の組み合わせを当業者は選択することができる。 本発明により得られるＩＬ−４突然変異タンパク質をその突然変異タンパク質 を製造するために用いる宿主生物によりグリコシル化または非グリコシル化する ことができる。バクテリアを宿主として選択する場合にはＩＬ−４突然変異タン パク質はグリコシル化されない。一方、真核細胞はおそらく天然のＩＬ−４がグ リコシル化されるのと同じようにではないがＩＬ−４突然変異タンパク質をグリ コシル化する。 形質転換された宿主により生産されるＩＬ−４突然変異タンパク質をあらゆる 好適な方法により精製することができる。ＩＬ−４を精製するための様々な方法 が知られている。例えば、米国特許第５，０１３，８２４号、第５，０１７，６ ９１号及びＷＯ第９６０４３０６−Ａ２号を参照。免疫アフィニティー精製が好 ましい。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ等、「Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｏｉ ｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ：Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈ ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａｎｄ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃ ｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９、ｐｐ．３８３１−３５（ １９８０）を参照。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質の生物学的活性を当該技術分野で知られ ているあらゆる好適な方法によりアッセイすることができる。そのようなアッセ イはＥＰ−Ｂ１−第４１３１３号に記述されたような、抗ウイルス活性の抗体中 和、プロテインキナーゼ、オリゴアデニル酸２， ５−Ａシンテターゼまたはホスホジエステラーゼ活性の誘導を含む。そのような アッセイは免疫制御アッセイ（例えば、米国特許第４，７５３，７９５号を参照 ）、増殖抑制アッセイ、Ｔ細胞増殖、ＥＣでのＩＬ−６（ＭＣＰ−１またはＶＣ ＡＭ−１）の誘導及びインターロイキン−４受容体を発現する細胞への結合の測 定も含む。Ｓｐｉｔｓ Ｈ、Ｙｓｓｅｌ Ｈ、Ｔａｋｅｂｅ Ｙ、等、Ｒｅｃｏ ｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ Ｇ ｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ、Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ １３９ ：１１４２−４７（１９８７）も参照。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質は野生型の天然または組み換えのＩＬ− ４での治療において用いられるものにほぼ等しいかまたはそれより多い用量で投 与される。好ましくは有効量のＩＬ−４突然変異タンパク質が投与される。「有 効量」は処置される疾患または徴候の重さまたは広がりを防ぐかまたは緩和する ことができる量を意味する。ＩＬ−４突然変異タンパク質が単独または他の治療 薬と共に投与されようとも、ＩＬ−４突然変異タンパク質の有効量がとりわけ疾 病、投与量、ＩＬ−４突然変異タンパク質の投与計画、組成物の血清半減期及び 患者の一般的な健康により決まることは当業者にとって明らかである。 好ましくは、ＩＬ−４突然変異タンパク質は製薬学的に許容しうる担体を含有 する組成物で投与される。「製薬学的に許容しうる担体」は投与される患者にお いていかなる不都合な作用も生じない担体を意味する。そのような製薬学的に許 容しうる担体は当該技術分野においてよく知られている。ｐＨ７．０の２％ＨＳ Ａ／ＰＢＳが好ましい。 本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をよく知られている方法により 製薬学的組成物中に配合することができる。例えば、引用することにより本明細 書に組み込まれる、好適な配合物を記述するＥ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍ ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅを参照。Ｉ Ｌ−４突然変異タンパク質の製薬学的組成物を液体、ゲル、凍結乾燥またはあら ゆる他の好適な形態を初めとする各種形態に配合することができる。好ましい形 態は処置される特定の徴候により決まり、当業者にとって明らかである。 ＩＬ−４突然変異タンパク質の製薬学的組成物を経口、エアロゾルにより、静 脈内、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下にまたはあらゆる他の許容しうる方法 で投与することができる。投与の好ましい様式は処置される特定の徴候により決 まり、当業者にとって明らかである。ＩＬ−４突然変異タンパク質の製薬学的組 成物を他の治療薬と共に投与することができる。これらの薬剤を同じ製薬学的組 成物の一部として混和してもよく、またはＩＬ−４突然変異タンパク質とは別に 同時にかもしくはあらゆる他の許容しうる処置計画に従って投与してもよい。さ らに、ＩＬ−４突然変異タンパク質の製薬学的組成物を他の治療の補助薬として 用いることができる。 従って、本発明はあらゆる好適な動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒ トにおける免疫疾患、癌もしくは腫瘍、異常な細胞増殖の処置のためまたは免疫 制御のための組成物及び方法を提供する。発明の背景の項で先に記述したように 、ＩＬ−４は多数の作用を有する。これらのいくつかはＴ細胞増殖の刺激、Ｔ− ヘルパー細胞分化、ヒトＢ細胞活性化及び増殖の誘導並びにリンホカインによる 免疫グロブリンクラススイッチである。リンパ系に対する作用はＭＨＣクラスII 抗原（Ｎｏｅｌｌｅ、 Ｒ．等 、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉａ Ａｎｔｉｇ ｅｎｓ ｏｎ ｒｅｓｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌｓ：ａ Ｎｅｗ Ｒｏｌｅ ｆｏ ｒ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８１：６ １４９−５３（１９８４））及びＢ細胞上のＣＤ２３（Ｋｉｋｕｔａｎｉ、Ｈ． 等 、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈ ｏｃｙｔｅ Ｒｅｃｅｐｔ ｏｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｃ ｅｌｌ ４７：６５７−６１（１９８６））の発現を増加することを含む。Ｔ− ヘルパー細胞１型（Ｔｈ１）及び２型（Ｔｈ２）は免疫反応に関与する。刺激さ れたＴｈ２細胞はＩＬ−４を分泌し、Ｔｈ１の発達を阻止する。従って、Ｔｈ１ が関係するあらゆる疾病はＩＬ−４またはその類似体による処置に反応しやすい 。 また意図されるものは遺伝子治療用途における本発明のＩＬ−４突然変異タン パク質をコードするＤＮＡ配列の使用である。意図される遺伝子治療用途はＩＬ −４がその免疫制御活性のために有効な治療を与えると予想される疾病、例えば 、多発性硬化症（ＭＳ）、インシュリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リ ウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ぶどう膜炎、精巣炎、原 発性胆汁性肝硬変、マラリア、ライ、ライム病、接触皮膚炎、乾癬、Ｂ細胞リン パ腫、急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、癌、変形性関節症、及び ほかの点でＩＬ−４に反応する疾病またはＩＬ−４が介在する免疫反応に感受性 の感染性病原体の処置を含む。 遺伝子治療を用いたＩＬ−４突然変異タンパク質の局所的運搬は標的領域に治 療薬を与えることができる。インビトロ及びインビボの両方の 遺伝子治療方法論が考えられる。特定の細胞集団に可能性のある治療遺伝子を導 入するためのいくつかの方法が知られている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、「Ｔ ｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃ ｉｅｎｃｅ 、２６０：９２６−３１（１９９３）を参照。これらの方法は １）直接遺伝子導入、例えば、Ｗｏｌｆｆ等、「Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｓｃｌｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」 、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６５−６８（１９９０）を参照； ２）リポソームによるＤＮＡ導入、例えば、Ｃａｐｌｅｎ等、「Ｌｉｐｏ ｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＦＴＲ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｎａｓａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔ ｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：３９−４ ６（１９９５）；Ｃｒｙｓｔａｌ、 「Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ａｓ Ａ Ｄｒｕｇ 」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１５−１７（１９９５）；Ｇａｏ及びＨｕａｎ ｇ 、「Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｍｍａ ｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ ．、１７９：２８０−８５（１９９１）を参照； ３）レトロウイルスによるＤＮＡ導入、例えば、Ｋａｙ等、「Ｉｎ Ｖｉ ｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ：Ｓｕｓｔ ａｉｎｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｆａｃｔｏｒ IX −Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｏｇｓ」、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ 、２６２：１１７−１９（１９９３）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、「Ｈｕｍａ ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：８０８−１３（１ ９９２）を参照、 ４）ＤＮＡウイルスによるＤＮＡ導入、そのようなＤＮＡウイルスはアデ ノウイルス（好ましくはＡｄ−２またはＡｄ−５に基づくベクター）、ヘルペス ウイルス（好ましくは単純ヘルペスウイルスに基づくベクター）及びパルボウイ ルス（好ましくは「欠損」または非自律的パルボウイルスに基づくベクター、よ り好ましくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはＡＡＶ−２ に基づくベクター）を含む、例えば、Ａｌｉ等、「Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ ＤＮ Ａ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ａｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ ｙ」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：３６７−８４（１９９４）；引用するこ とにより本明細書に組み込まれる米国特許第４，７９７，３６８号及び引用する ことにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３９，９４１号を参照、 を含む。 目的の遺伝子を導入するための特定のベクター系の選択は様々な因子による。 一つの重要な因子は標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベクターは詳細 に研究され、多数の遺伝子治療用途に用いられているが、通常、これらのベクタ ーは非分裂細胞に感染するためには不適当である。さらに、レトロウイルスは腫 瘍原性の可能性を有する。 アデノウイルスは広い宿主範囲を有するという利点があり、ニューロンまたは 肝細胞のような静止または最終分化細胞に感染することができ、そして本質的に 非腫瘍原性のようである。例えば、Ａｌｉ等、上記、ｐ ３６７を参照。アデノウイルスは宿主ゲノム中に組込むとは思われない。それら は染色体外に存在するので、挿入突然変異誘発の危険が非常に下げられる。Ａｌ ｉ 等、上記、ｐ３７３。 アデノ随伴ウイルスはアデノウイルスに基づくベクターと類似した利点を示す 。しかしながら、ＡＡＶはヒト染色体１９で部位特異的組込みを示す。Ａｌｉ等 、上記、ｐ３７７。 好ましい態様として、本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするＤＮ ＡはＭＳ、ＩＤＤＭ及びＲＡのような自己免疫疾患、ライム病及びライのような 感染性疾患、非ホジキンリンパ腫及びＡＬＬのような癌、変形性関節症のような 軟骨性疾患、並びに乾癬のような乾癬性疾患の遺伝子治療に用いられる。 この態様により、本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするＤＮＡで の遺伝子治療がそれを必要とする患者に診断と同時にかまたはそのすぐ後に与え られる。 この方法は本発明のＩＬ−４突然変異タンパク質の選択的活性を利用して望ま れない自己免疫刺激を防ぐ。ＩＬ−４突然変異タンパク質ＤＮＡを含有するあら ゆる好適な遺伝子治療ベクターをこの態様に従って使用できることを当業者は認 識する。そのようなベクターを構築するための技術は知られている。例えば、Ｏ ｈｎｏ等 、上記、ｐ７８４；Ｃｈａｎｇ等、上記、ｐ５２２を参照。標的部位へ のＩＬ−４突然変異タンパク質ＤＮＡを含有するベクターの導入は、例えばＯｈ ｎｏ等 、上記、ｐ７８４に記述されたような既知の技術を用いて達成することが できる。 本発明をよりよく理解できるように以下の実施例が記述される。これらの実施 例は例示の目的のためだけであり、本発明の範囲をいかように も制限すると解釈されるものではない。 実施例一般的に 、 この研究に用いる成熟ヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を以下に示す。置換により Ｔ細胞選択的アゴニストを生じるアミノ酸をボールド体で示す。 突然変異タンパク質をバキュロウイルス系で発現させ、均質まで精製し、異な るＩＬ−４受容体使用を反映する生物学的アッセイで評価した。選択的アゴニス ト活性を試験するために、２種のアッセイ、ＩＬ−４により誘導されるＨＵＶＥ Ｃ ＩＬ−６分泌アッセイ及び陽性のＩＬ−４活性には１°Ｔ細胞増殖アッセイ を用いた。１°Ｔ細胞増殖を誘導する能力を有するが、ＩＬ−６分泌を誘導する 減少した能力を有する化合物はＴ細胞特異的ＩＬ−４アゴニストであり、本発明 の範囲内に入る。より具体的には、別のＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒα／γ様受 容体成分）による活性を評価するためにヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を 用 いた。 実施例１．突然変異タンパク質の製造 本質的にＫｕｎｋｅｌ ＴＡ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＤ及びＺａｋｏｕｒ ＲＡ 、「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃ ｔｉｏｎ」（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７− ３８２により記述されたように、所望する突然変異に対応するコドンを含有する プライマーを用いて位置指定突然変異誘発により突然変異タンパク質を作製した 。簡潔に言えば、制限酵素部位ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを含有するヒトＩＬ−４ ｃＤＮＡをＭ１３ファージベクターＭ１３ ｍｐ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中に同じ部位を用いてサブクローン 化した。ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（１０ｎｇ／ｍｌ） で２４時間誘導したヒト末梢血リンパ球から単離したｍＲＮＡより作製したｃＤ ＮＡプールからポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を用いて野生型IL−４ ｃ ＤＮＡを得た。用いたＰＣＲプライマーは、ＩＬ−４の読み枠の５’末端には ＩＬ−４の読み枠の３’末端には であった。 制限酵素部位ＢａｍＨＩ（５’末端）及びＸｂａＩ（３’末端）を各オリゴヌ クレオチド中に包含し、それらをイタリック体で示す。用いたＰＣＲ条件は９４ ℃で１分、５８．７℃で１分及び７２℃で１分を２５ サイクルであった。このようにして得られた正しいＩＬ−４ ｃＤＮＡ配列をシ ーケナーゼ^R（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^R）（商標）シークエンシングキット（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔ ｓ、ＩＬ）を製造業者により記述されたように用いてシークエンシングにより確 認した。ＩＬ−４ ｃＤＮＡを含有するＭ１３ ｍｐ１９で大腸菌株ＣＪ２３６（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を形質 転換することによりウラシルを含有する一本鎖ＤＮＡ（Ｕ−ＤＮＡ）を得た。位 置指定突然変異誘発は一般的に突然変異誘発の標的となるコドンの５’の鋳型Ｕ −ＤＮＡに相同な１５ヌクレオチド、所望する変異を組み込んだヌクレオチド及 び最後の改変ヌクレオチドの３’の鋳型Ｕ−ＤＮＡに相同なさらなる１０ヌクレ オチドを含有するプライマーを利用した。用いた特定のプライマーは であった。 突然変異ヌクレオチドの領域に下線を引く。製造業者のプロトコルを用いてＴ ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅ ｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いてプライマーをリン酸化した。プライマーをＵ−ＤＮ Ａ鋳型にアニーリングさせ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で伸長した後、大腸菌株ＤＨ５ α^TM（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の細胞を ５μｌの反応混合物で形質転換し、０．７％の寒天を含有するＬＢ培地で平板培 養した。３７℃でインキュベーション後、単一のプラークを選び、２ｍｌのＬＢ 培地に移すことによりプラークを広げ、３７℃で一晩増殖させた。Ｍ１３精製キ ット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を製造業者のプ ロトコルに従って用いて一本鎖ＤＮＡを単離し、シーケナーゼ^Rシークエンシン グキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏ ｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を製造業者のプロトコルに従って用いて一本鎖ＤＮ Ａをシークエンシングすることにより所望する突然変異を含有するクローンを同 定した。正しい突然変異配列を含有するプラークに対応する複製型ＤＮＡからの ＩＬ−４突然変異タンパク質ｃＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いて単離し 、プラスミドベクターｐＦａｓｔＢａｃ^TM１（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａ ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にサブクローン化した。サブクローニング後に、 突然変異タンパク質ｃＤＮＡを含有するｐＦａｓｔＢａｃ^TM１を大腸菌株ＤＨ１ ０Ｂａｃ^TM（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に 製造業者により記述されたように形質転 換することにより組み換えバキュロウイルスＤＮＡ（以下、バクミド（Ｂａｃｍ ｉｄ）と称する）を作製した。突然変異タンパク質をＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（Ｇ ｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）バキュロウイルス発現系を 用いてスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）９細胞で発現させた。全ての昆虫細 胞インキュベーションは２８℃であった。簡潔に言えば、Ｓｆ９細胞の２ｍｌ培 養物をＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＤ）を用いて５μｌの組み換えバクミドでトランスフェクトした。トランスフ ェクション４後６０時間で上清を集め、グレース（Ｇｒａｃｅ’ｓ）培地（Ｇｉ ｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中１ｘ１０⁶Ｓｆ９細胞／ｍ ｌの１００−２００ｍｌ培養物に感染させるために用いた。製造業者のプロトコ ルに従って、ＧＳＡローター（Ｄｕｐｏｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、 Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いてＳｏｒｖａｌｌ^R（商標）ＲＣ−５Ｂ 遠心機で５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによりインフェクション後 ４８−６０時間で上清を集め、ウイルス力価をアッセイした（典型的に、＞１ｘ １０⁸プラーク形成単位／ｍｌが得られた）。タンパク質生産のために、５００ ｍｌのＳＦ９００ II培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍ Ｄ）中２−３ｘ１０⁶Ｓｆ９細胞／ｍｌに４−１０の間の感染多重度で感染させ 、感染の６０−７２時間後にＧＳＡローター（Ｄｕｐｏｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ ｎｔ Ｃｏ．、Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いてSｏｒｖａｌ１^RＲＣ− ５Ｂ遠心機で５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより上清を集め、滅 菌した０．２μＭフィルター装置を通して濾過した。 実施例２．突然変異タンパク質の精製． 組み換えヒトＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｍｂ ｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を免疫原として用いてマウスから標準プロトコルを用いて抗 −ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体Ｃ４００．１及びＣ４００．１７を作製し、 腹水液として製造し、精製し、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓ ｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に製造業者のプロ トコルに従って結合した。それぞれのＩＬ−４突然変異タンパク質を含有する組 み換えバキュロウイルスによるＳｆ９細胞の感染から得られたＳｆ９細胞上清を ＩＬ−４アフィニティーマトリックスのｌｍｌカラム上に添加し、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３で洗浄し、塩を除くために水で 洗浄し、８カラム容量の１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。０．１容 量の１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を含有するシリコン処理したバイアル中に画分 を集めた。バッファーＡからＢ（バッファーＡ、水；バッファーＢ、アセトニト リル、０．１％トリフルオロ酢酸）への０−１００％勾配でＤｙｎａｍａｘ^R（ 商標）−３００ÅＣ₁₈カラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、 Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いて逆相クロマトグラフィーにより突然変異タンパク 質をさらに精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、突然変異タンパク 質を含有する画分を保存のために凍結乾燥し、アッセイのために滅菌リン酸緩衝 食塩水に再懸濁した。このようにして精製された突然変異タンパク質はＳＤＳ− ＰＡＧＥ（銀染色）で見た場合に典型的に単一のバンドであり、アミノ酸分析に よりそれらを定量した（精度、典型的に＞９０％）。 実施例３．１°Ｔ細胞増殖アッセイ． 一次Ｔ細胞を正常な提供者からの新鮮血から得、本質的にＫｒｕｓｅ、Ｎ．、 Ｔｏｎｙ、Ｈ．Ｐ．及びＳｅｂａｌｄ、Ｗ．「Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｈ ｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｉｎｔｏ ａ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎ ｉｔｙ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉ ｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ」、Ｅｍｂｏ Ｊ．１１：３２３７−４４（１９９ ２）により記述されたようにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ^R（商標）Ｐｌｕｓ（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｓａｌｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて遠心分離により精 製した。精製された末梢血単核細胞を１０μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に７日間 インキュベートし、遠心分離により集め、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で洗浄した。５ｘ１０⁴活性化Ｔ細 胞／ウェル（ＰＨＡ−ブラスト（ｂｌａｓｔｓ））を９６ウェルプレートで１０ ％ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、 １００ユニット／ｍｌペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫 酸塩を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で異なる量のＩＬ−４または突然変異 タンパク質と共に３７℃で７２時間インキュベートし、１μＣｉ ³Ｈ−チミジン （ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ^R（商標）、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）／ウェルで６時間パル ス標識し、集め、ＴｏｐＣｏｕｎｔ^TM（商標）シンチレーションカウンター（Ｐ ａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で放射 能を測定した。 実施例４．ＨＵＶＥＣ ＩＬ−６分泌アッセイ． ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ^R（商標）Ｃｏｒ ｐ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、製造業者のプロトコルに従って 維持した。細胞（３ないし６継代培養）をトリプシン／ＥＤＴＡとのインキュベ ーションにより集め、洗浄し、ウシ脳抽出物（ＢＢＥ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ^RＣ ｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＥＧＭ^R（商標）培地（Ｃｌ ｏｎｅｔｉｃｓ^RＣｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中４８ウェルプレー トでわずかに融合した密度で平板培養した。融合すると（３７℃で３−４日）培 地を取り除き、ＢＢＥを含まないＥＧＭ^R培地で置き換えた。２４時間後に、Ｂ ＢＥを含まない新しいＥＧＭ^R中の細胞に異なる濃度のＩＬ−４または突然変異 タンパク質を添加し、さらに２４時間インキュベートした。上清を集め、ヒトＩ Ｌ−６ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−６の濃度を分析した。アンタゴニストアッセイ では一定濃度の１００ｐＭ ＩＬ−４に対して異なる濃度の突然変異タンパク質 を添加したことを除いて条件は同一であった。簡潔に言えば、９６ウェルＩｍｍ ｕｎｏｌｏｎ^R（商標）２プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）を５μｇ／ｍｌの抗体−ヒトＩＬ −６ＭＡｂカタログ番号１６１８−０１（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で４℃で一晩被覆した。ヒトＩＬ−６標準（ Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）または サンプルを二重に滴定し、被覆プレートでインキュベートし、洗浄後に二次抗体 ウサギ抗−ヒトＩＬ−６ ＰＡｂ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、カタログ番号ＰＳ−３７）を １：１０００希釈で添加した。結合 したウサギ抗−ＩＬ−６ ＰＡｂの存在を１：２０００希釈したアルカリホスフ ァターゼ結合ロバ抗−ウサギＩｇＰＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、Ｐ Ａ、カタログ番号７１１−０５５−１５２）を用いて検出し、ｐＮＰＰ（Ｓｉｇ ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ、カタログ番号Ｎ ２７７０またはＮ１８９１）を用いて発色させた。Ｖｍａｘ^TM（商標）動的（ｋ ｉｎｅｔｉｃ）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて４０５ｎｍで吸光度を 読み取った。 実施例５．突然変異タンパク質の活性． 表１に上記の２つのアッセイにおける突然変異タンパク質の結果を要約する。 「ＥＣ₅₀、ｐＭ」はピコモル／リットルの濃度で測定される５０％の最大反応を 生じる有効濃度である。活性は力価（ＥＣ₅₀）及び最大反応（Ｒ_max）の両方の 関数である。細胞選択的突然変異タンパク質はＴ細胞アッセイに対してＨＵＶＥ ＣアッセイにおいてＲ_maxの相対的減少及び／または力価の相対的減少（ＥＣ₅₀ の増加）のいずれかの示差的活性を示した。「Ｒ_max、％ｗｔ」は野生型ＩＬ− ４に比較して測定される最大反応である。定義により、野生型ＩＬ−４は１００ ％の反応を生じる。全ての突然変異タンパク質はＴ細胞増殖アッセイで活性があ った。突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑは減少した最大 反応を有したが、突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｄ、Ｒ１２１Ｅ、Ｒ１２１Ｐ及び Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑはこのアッセイで野生型ＩＬ−４より有効 であった。突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｑ、Ｙ １２４Ｒ及びＹ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａは野生型より２−３倍増加したＥＣ₅₀値及 び減少した最大反応であった。しかしながら、それらはＴ細胞に対するＩＬ−４ 活性のかなりの割合を保持するようである。突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｅ、Ｙ １２４Ｑ及びＲ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４ＱはＨＵＶＥＣアッセイで測定 できる活性がなく、それらを明らかにＴ細胞選択的、従ってＴ細胞上に発現され るＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−２Ｒγ）に対して選択的にしている。 これらの突然変異タンパク質は通常ＩＬ−４Ｒαと相互作用するが、複合体ＩＬ −４Ｒα／γ様サブュニットを活性化しないので、それらは内皮細胞に対するＩ Ｌ−４アンタゴニストである。突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｐ及びＹ１２４Ｒは ＨＵＶＥＣアッセイで活性を示すが、それらのＥＣ₅₀値は５０−１５０倍の間で 増加し、Ｔ細胞を刺激するそれらの能力に比較して減少した最大反応を有する。 これら２つのタンパク質は完全にＴ細胞選択的であるようではないが、それらは ＨＵＶＥＣ ＩＬ−４受容体よりＴ細胞ＩＬ−４受容体の活性化に対して優先的 である。 表１．内皮細胞に対してＴ細胞に選択的活性を有する突然変異タンパク質実施例６．ＨＵＶＥＣアッセイにおけるＩＬ−４突然変異タンパク質の生物学的 反応． 図３Ａ及びＢは野生型に比較したＴ細胞選択的アゴニストによるＨＵＶＥＣ ＩＬ−６分泌の一連の用量応答プロットである。突然変異タンパク質活性をアッ セイするために用いる各プレートで内部コントロールとしてＩＬ−４を含有し、 代表的な曲線を示す。図４Ａは野生型ＩＬ−４に対するＲ１２１Ｅの用量応答曲 線である。同様に、図４Ｂ−Ｆは野生型ＩＬ−４に対するそれぞれＲ１２１Ｐ、 Ｙ１２４Ｑ、Ｙ１２４Ｒ、Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａ及びＲ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ ／Ｙ１２４Ｑの用 量応答曲線である。活性はＩＬ−４コントロール反応に対して標準化されている 。突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｅ、Ｙ１２４Ｑ及びＲ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ １２４Ｑはこのアッセイで何の活性も示さない。突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｐ 及びＹ１２４Ｒはこのアッセイで部分的アゴニスト活性を示すが、１°Ｔ細胞ア ッセイにおけるよりも野生型ＩＬ−４に対して比較的効力が弱い。従って、それ らの活性にもかかわらず、それらはなおＴ細胞ＩＬ−４受容体の優先的活性化を 示す。 実施例７．１°Ｔ細胞アッセイにおけるＩＬ−４突然変異タンパク質の生物学 的反応． 図５Ａ及びＢは正常な提供者からの細胞を用いた代表的なアッセイにおけるＴ 細胞選択的アゴニスト突然変異タンパク質の用量応答曲線を示す。突然変異タン パク質活性をアッセイするために用いる各プレートで内部コントロールとしてＩ Ｌ−４を含有し、代表的な曲線を示す。図６Ａは野生型ＩＬ−４に対するＲ１２ １Ｅの用量応答曲線である。同様に、図６Ｂ−Ｆは野生型ＩＬ−４に対するそれ ぞれＲ１２１Ｐ、Ｙ１２４Ｑ、Ｙ１２４Ｒ、Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａ及びＲ１２ １Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑの用量応答曲線である。活性はＩＬ−４コントロ ール反応に対して標準化されている。突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２ Ｆ／Ｙ１２４Ｑはこのアッセイで部分的なアゴニストにすぎないが、突然変異タ ンパク質Ｒ１２１Ｅ、Ｒ１２４Ｐ及びＲ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑは野 生型ＩＬ−４より有効である。このアッセイで野生型ＩＬ−４ほど有効ではない が、突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｑ、Ｙ１２４Ｒ及びＹ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａは なお有効な部分的アゴニストである（野生型の６０−７０％のＲ_max値）。図６ で、活性は各突然変異タンパク 質の同じプレートで見られるＩＬ−４反応に対してである。特に際立っているも のは突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｅ及びＹ１２４Ｑであり、それらはＴ細胞アッ セイにおいて著しい活性を示すが、ＨＵＶＥＣアッセイでは明らかな活性を示さ ない。これらの突然変異タンパク質の各々は明らかなＴ細胞選択的アゴニストで ある。 実施例８．Ｔ細胞選択的突然変異タンパク質によるＨＵＶＥＣ ＩＬ−４誘導 性ＩＬ−６分泌の拮抗作用． Ｔ細胞選択的ＩＬ−４突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｅ（●）及びＹ１２４Ｑ（ ▽）並びにＩＬ−４アンタゴニストＲ１２１Ｄ／Ｙ１２４Ｄ（○）（図７）を一 定濃度の１００ｐＭＩＬ−４に対して滴定した。ＩＬ−４アンタゴニストＲ１２ １Ｄ／Ｙ１２４Ｄはこれらの条件下で〜１．５ｎＭのＫ₁でＩＬ−４に拮抗する 。ＨＵＶＥＣはＩＬ−２Ｒγを発現しないが、ＩＬ−４受容体γ様サブユニット を発現する。Ｒ１２１Ｅ及びＹ１２４Ｑの置換された残基はＩＬ−４のＤ−ヘリ ックス中にあり、従って、ＩＬ−２Ｒγ（機能的相互作用）及びγ様サブユニッ ト（機能的相互作用がないかまたは非機能的相互作用）とＩＬ−４の相互作用に のみ影響を及ぼすが、これらの突然変異タンパク質がＩＬ−４Ｒαに結合する能 力には影響を及ぼさない。従って、Ｔ細胞選択的アゴニストＲ１２１Ｅ及びＹ１ ２４Ｑは内皮細胞上のγ様受容体サブユニットの活性化を促進せずにＴ細胞上の ＩＬ−２Ｒγと選択的に相互作用するそれらの能力のために、これらの内皮細胞 でＩＬ−４により誘導される反応と競合することができる（これらの条件下でＫ₁ 〜０．８−１ｎＭ）。Ｔ細胞選択的ＩＬ−４突然変異タンパク質によるそのよ うな拮抗作用は、該突然変異タンパク質を用いたＴ細胞への治療中に内因的に生 産された ＩＬ−４の内皮細胞への作用と拮抗することができる。 実施例９．ＩＬ−４突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｄの生物学的反応． ＩＬ−４突然変異タンパク質Ｒ１２１Ｄ（Ａｓｐで置換されたＡｒｇ−１２１ ）を記述したように作製し、１°Ｔ細胞及びＨＵＶＥＣアッセイでアッセイした 。図８Ａ及び８Ｂに関して、データはＴ細胞（図８Ａ）及びＨＵＶＥＣ（図８Ｂ ）アッセイの両方でＩＬ−４（○）及びＲ１２１Ｄ（●）に対して示される。Ｔ 細胞アッセイでは、Ｒ１２１Ｄは野生型ＩＬ−４に比較して〜１００ｐＭのＥＣ₅₀ 及び〜６０％のＲ_max値を示した。それはＨＵＶＥＣアッセイでは不活性であ った（ＥＣ₅₀＝０；Ｒ_max＝０）。これらの結果から、ヒトＩＬ−４のＡｒｇ− １２１のＡｓｐでの単一置換によりＴ細胞に対して選択的活性を有し且つ内皮細 胞に対してはいかなる明白な活性も欠くタンパク質が生じることが示される。突 然変異タンパク質Ｒ１２１ＤはＴ細胞アッセイにおいて部分的アゴニストである が、それは野生型ＩＬ−４より有効である。しかしながら、突然変異タンパク質 Ｒ１２１Ｅのように、Ｒ１２１ＤはＨＵＶＥＣアッセイで全く活性を示さず、そ れが明らかなＴ細胞選択的アゴニストであることを示している。 実施例１０．ＩＬ−４突然変異タンパク質Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅの生物学的活 性． ＩＬ−４突然変異タンパク質Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ（Ｇｌｕで置換されたＡｒ ｇ−１２１と共にＡｓｐで置換されたＴｈｒ−１３）を記述したように作製し、 １°Ｔ細胞及びＨＵＶＥＣアッセイでアッセイした。図９Ａ−Ｂに関して具体的 に、Ｔ細胞アッセイ（パネルＡ）では、Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ（▲）はＩＬ−４ （〇）またはＲ１２１Ｅ（△）より 約２−３倍優れた〜１００ｐＭのＥＣ₅₀及びＩＬ−４に比較して１００％のＲ_{ma x} 値を示した。ＨＵＶＥＣアンタゴニストアッセイ（パネルＢ）で、Ｔ１３Ｄ／ Ｒ１２１Ｅ（▲）はＲ１２１Ｅ（△）より〜２７倍有効なＩＬ−４活性のアンタ ゴニストであり、それぞれ〜２．２ｎＭ対〜６０ｎＭのＩＣ₅₀を示す。Ｔｈｒ− １３のＡｓｐへの置換はＲ１２１Ｅに比較してＴ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅの効力を増 し（Ｔ細胞アッセイにおけるアゴニストとして及びＨＵＶＥＣアッセイにおける アンタゴニストとしての両方）、一方、Ａｒｇ−１２１のＧｌｕへの置換はＴ１ ３Ｄ／Ｒ１２１ＥにＴ細胞選択的活性を与える（Ｔ細胞アッセイにおける完全な アゴニスト、ＨＵＶＥＣアッセイにおけるＩＬ−４アンタゴニスト）。 実施例１１．病理モデルにおけるＩＬ−４選択的アゴニストの評価 約４ないし６ｋｇの体重の成体オスｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓサル（マカカ・ファ シクラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉ ｖｅｒ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｉｍｐｏｒｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）をこれ らの研究のために利用する。動物を開いた金網カゴで環境的に制御された部屋で 個々に飼育し、餌を毎日２回そして水を随意与える。研究の第一日目の前に約１ ２時間各動物に餌を与えない。 各研究のためにケタミン塩酸塩（ケタセット（Ｋｅｔａｓｅｔ）、１０ｍｇ／ ｋｇ）の筋肉内注射で動物を麻酔する。各動物の上背部を剪断し、７０％アルコ ール−ベタジン溶液で洗浄する。ＩＬ−４、ＩＬ−４選択的アゴニストまたはビ ヒクル（０．２％ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）を１ｍｌツベルクリン注射器を 用いて０．１ｍｌの容量で動物の背中に皮内注射する。注射部位は少なくとも１ ０ｃｍ離れ、消えないマー カーで印をつける。６ｍｍパンチ生検道具を用いて組織生検サンプルを得、サン プルをＯＣＴに置き、液体窒素で即座に冷凍する。注射後０、４、８及び２４時 間で生検を得る。 ＩＬ−４、ＩＬ−４選択的アゴニストまたはビヒクルの全身反応を以下のよう に評価する。試験品をそれぞれ０、５、５０及び５００μｇ／ｋｇの総日量をも たらす０、２．５、２５または２５０μｇ／ｋｇの投与量で０．１ｍｌ／ｋｇの 容量で（約１０−１２時間離して）毎日２回連続して４日にわたって皮下に投与 する。ビヒクルまたはＩＬ−４の最初の注射の前及び研究の各日の最初に末梢血 サンプルを各動物から得、アリコートを全血球数及び分類、並びに末梢血単核細 胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析に関して分析する。血液サンプルの 残りを遠心分離し、血漿アリコートを次のケモカインレベルの分析のために−７ ０℃で保存する。 凍結切片を調製し、室温に平衡化させ、風乾し、アセトン中で４℃で５分間固 定する。スライドを０．１％ ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＰＢＳに５分間移す。ヒト ＶＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体Ｃ３１３．３を用いてＶＣＡＭ−１の 位置を特定する。適切な濃度の関係のない、イソタイプが一致する免疫グロブリ ンをネガティブコントロールとして用いる。ベクタービオチンブロッキングキッ ト（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｋｉｔ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて内在性ビ オチンをブロックする。切片を０．１％ ＢＳＡ及び１％正常ウサギ血清を含有 するＰＢＳで希釈した示した抗血清と共に湿潤室（ｈｕｍｉｄ ｃｈａｍｂｅｒ ）中で室温で１．５時間インキュベートする。ＰＢＳで３回洗 浄した後、スライドをベクターＡＢＣエリートキット（Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ ｋｉｔ）を製造業者の説明書に従って用いて染色し、スラィドを３ −アミノ−９−エチルカルバゾール／過酸化水素（ＡＥＣ基質キット、Ｖｅｃｔ ｏｒ）中でインキュベートすることにより抗体コンジュゲートを検出する。切片 を０．１Ｍ酢酸バッファーで完全に洗浄し、蒸留水で洗浄し、Ｌｅｒｎｅｒ Ａ ＱＵＱ−ＭＯＵＮＴ（Ｌｅｒｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂ ｕｒｇｈ、ＰＡ）に載せる。 染色の強度及び分布を評価するために考案された０ないし３＋の間の規定尺度 を用いて盲検で２人の別々の観察者により標本を評点する。ＶＣＡＭ−１発現の 評点方法は：０染色がないかまたはところどころの血管のわずかな染色；１＋い くつかの血管のわずかな染色；２＋大部分の血管の中程度の強さの染色；３＋大 部分の血管の強い染色である。フォンビルブラント因子に対して染色した連続切 片で血管を同定する（ポリクローナルウサギ抗−ヒトＶＷＦ；Ｄａｋｏｐｌａｔ ｔｓ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）。 赤血球数、ヘマトクリット、白血球数及び血小板数の分析をＳｅｒｏｎｏ ９ ０００血液分析機（Ｂａｋｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ 、ＰＡ）を用いてヘパリン添加血サンプルで実施する。白血球分類をＤｉｆｆ− Ｑｕｉｃｋ染色血液塗抹標本で評価し、その場合、全部で２００個の細胞を数え 、各細胞型のパーセンテージを記録した。 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）表面マーカーの分析を以下のように実施する。ヘ パリン添加血の４ｍｌサンプルをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳ Ｓ、Ｍｇ⁺⁺またはＣａ⁺⁺を含まない）に希釈し、４ｍｌのパーコール（１．０７ ０ｇｍ／ｍｌ密度）上に重ねる。チューブを２４℃で１８００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋ ｍａｎ ＧＳ−６Ｒ）で２０分間遠心分離する。リンパ球を含有する層を吸引し 、１１００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。得られる細胞ペレットを０．１％ア ジ化物及び５％ヤギ血清を含有する６ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸 濁する。１ｍｌのアリコートを以下に記述するような細胞表面マーカー分析のた めに利用する。 ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ４９及びＨ ＬＡ−ＤＲに対する抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、 ＭＮ）をフローサイトメトリーによる分析のために利用する。マーカー抗体の２ ０μｌアリコートを細胞懸濁液の１ｍｌアリコートと共に４℃で暗所で６０分間 インキュベートし、サンプルを遠心分離する（１０００ｒｐｍ、４℃で１０分） 。ペレットを０．１％アジ化物及び５％ヤギ血清を含有する１ｍｌのＰＢＳで３ 回洗浄し、続いてＦＡＣ分析する。 各研究中に得られる血漿サンプルを特定のＥＬＩＳＡによりＭＣＰ−１のレベ ルに関して分析する。簡潔に言えば、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｋａｓｔ ｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を５０μｌ／ウェルのウサギ抗−ＭＣＰ−１で４℃で １６時間被覆し、次にＰＢＳ、ｐＨ７．５、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（洗 浄バッファー）で洗浄する。非特異的結合部位をＰＢＳ中２％のＢＳＡ（２００ μｌ）でブロックし、プレートを３７℃で９０分間インキュベートする。プレー トを洗浄バッファーで３回すすぎ、二重の希釈された（ストレート（ｎｅａｔ） 、１：５及び１：１０）試験サンプル（５０μｌ）を添加し、続いて３７℃ で１時間インキュベートする。プレートを４回洗浄し、５０μｌ／ウェルのビオ チン化ウサギ抗−ＭＣＰ−１を３７℃で４５分間添加する。プレートを４回洗浄 し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１０μｇ／ｍｌ） （Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を添加し、プレートを ３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを３回洗浄し、１００μｌの発 色性基質（０．６７ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミンジクロリド（Ｄａｋｏ ｐａｔｔｓ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ））を添加する。プレートを２５℃ で６分間インキュベートし、２％ ＦＣＳを加えた洗浄バッファー中の３Ｍ Ｈ₂ ＳＯ₄溶液５０μｌ／ウェルで反応を停止する。プレートをＥＬＩＳＡ読み取り 装置で４９０ｎｍで読み取る。標準は１００ｎｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌまでの 組み換えＭＣＰ−１の０．５ ｌｏｇ希釈物である（５０μｌ／ウェル）。ＥＬ ＩＳＡは＞５０ｐｇ／ｍｌのＭＣＰ−１濃度を一貫して検出する。 実施例１２．ＩＬ−４選択的アゴニストでの多発性硬化症の処置 ヒトにおける薬理学的有用性を予測するものとして動物モデルを用いることは 広く認められている研究手段である。多発性硬化症（ＭＳ）に対するＩＬ−４選 択的アゴニストの最初の試験を組み換えヒトＩＬ−４選択的アゴニストタンパク 質を用いてマーモセットモデルで実施する。急性の徴候及び慢性の再発−寛解疾 病の両方に関して疾病の発症及び重さに対する予防及び治療処置の効果を調べる ためにこれらの研究を実施する。 実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）はＣＤ４＋Ｔ細胞が介在する中枢神経系の 自己免疫炎症疾患である。Ｍａｓｓａｃｅｓｉ等、Ａｎｎ．Ｎ ｅｕｒｏｌ．、３７：５１９（１９９５）に記述されたように３ｍｇ／ｍｌの死 菌マイコバクテリウム ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）を含有する完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）と共 に乳化した２００ｍｇの新鮮凍結した死後ヒト脳白質ホモジネート（ＢＨ）での 免疫により３００ないし４００ｇｍの重さのマーモセット（カリトリックス ジ ャックス（Ｃ．ｊａｃｃｈｕｓ））でＥＡＥの発症を誘導する。免疫の日及び２ 日後に再び、１０¹⁰の不活化ボルデテラ ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ）微生物を１０ｍｌの食塩水溶液に希釈し、静脈内に投与 する。 ＥＡＥを臨床及び病理学的規準により評価する。臨床疾患の重さを記録するた めに標準化した評点方法：０＝正常な神経学的所見；１＝無気力、食欲不振、体 重減少；２＝運動失調、及び対不全麻痺／単不全麻痺（ｍｏｎｏｐａｒｅｓｉｓ ）、感覚喪失もしくは注視麻痺を初めとする脳幹症候群のいずれかまたは失明； ３＝対麻痺または片麻痺；４＝四肢麻痺用いる。 磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）はＭＳの初期及び後期の免疫による損傷を特性化す るための有用な技術であることが示されている（Ｓｔｅｗａｒｔ等、Ｂｒａｉｎ 、１１４：１０６９（１９９１）。時間にわたる疾病の経過を調べるために、Ｍ ＲＩを用いて免疫後の動物を評価する。画像を得るための１５ｃｍの開口部を有 するレシーバーコイルを０．１５テスラの場の強さで操作するＰｉｃｋｅｒ Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＮＭＲ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ「２０００」システム でＭＲＩデータを集める。多切片スピン−エコー及び反転回復パルスシークエン スを用 いる。４０及び６０ｍｓまたは４０及び８０ｍｓのいずれかのエコー−遅延時間 をスピン−エコーシークエンスに用いる。反転回復シークエンスでは１８０−９ ０パルス間遅延は４００ｍｓである。 マーモセットをケタミン塩酸塩で麻酔し、目頭が静磁場の方向に垂直に並ぶよ うに持続的調整のために利用できるレーザーを用いてスキャナー中に置く。免疫 前、次に免疫後９日目から毎日動物を走査する。各日の走査前に、動物を神経学 的損傷の徴候に関して調べる。 免疫後の異なる時間で動物を屠殺する。ＣＮＳを取り出し、１０％ホルマリン で固定する。脳及び脊髄のパラフィン切片を調製し、ヘマトキシリン及びエオシ ンで染色する。各冠状脳切片または水平脊髄切片を炎症及び脱髄の組織病理学的 所見に関して任意の尺度：炎症；０＝炎症が存在しない、＋＝稀な血管周囲カフ （ｃｕｆｆ）／平均の全切片；＋＋＝中程度の数の血管周囲カフ／切片；髄膜の 炎症がある可能性がある；＋＋＋＝大きく広がった血管周囲カフ及び炎症細胞に よる実質組織浸潤、脱髄評点；０＝脱髄が存在しない；＋＝脱髄の稀な病巣；＋ ＋＝中程度の脱髄；＋＋＋＝大きな融合性損傷を含む広範囲の脱髄により分析す る。 急性疾患病理に対する前処理研究のために、試験薬剤を疾病症状の発症前に１ 日当たり１投与ないし１週当たり１投与の投薬計画に従って１ないし５００μｇ ／ｋｇの間の用量範囲で皮下に投与する。存在する疾病の治療介入のためには、 試験品を数カ月の間にわたって１日当たり１処置ないし１週当たり１処置の長い 投薬計画に従って１ないし５００μｇ／ｋｇの間の用量範囲で皮下に投与する。 実施例１３：慢性関節リウマチの処置 慢性関節リウマチ（ＲＡ）は常在及び浸潤滑液細胞の慢性活性化が軟 骨及び骨の破壊を引き起こし、線維症及び機能の喪失をもたらす衰弱炎症疾患で ある。活性化Ｔ細胞から放出されるサイトカインが慢性炎症反応の持続に役割を 果たすと考えられる。 Ｊｏｏｓｔｅｎ等、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ；３９：７ ９７（１９９６）により記述されたようにII型コラーゲンを用いてＤＢＡ／１マ ウスでＲＡを誘導する。１００μｇのコラーゲンを含有する１００μｌのエマル ジョンを用いて尾の基部で皮内注射によりマウスを免疫することによりコラーゲ ン誘導性関節炎（ＣＩＡ）を誘導する。２１日目に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ ）に溶解したII型コラーゲン（１００μｇ）の腹腔内ブースター注射を動物に与 える。 末梢関節における関節炎の発生に関してマウスを肉眼で調べることによりＣＩ Ａの評価を実施し、関節炎の重さの評点を特定する。赤さ及び／または腫れの著 しい変化が最低２脚の指または他の部分に認められる場合にマウスは関節炎にか かっているとみなされる。 関節炎の臨床重度を赤さ及び腫れの変化により各脚に対して０−２の尺度で評 点する（０＝変化なし、０．５＝有意、１．０＝中程度、１．５＝著しい及び２ ．０＝重い最大の腫れ及び赤み）。少なくとも２人の盲検観察者により評点を決 定する。 研究の最後に、数匹の動物を屠殺し、病理学的及び組織病理学的試験のために 脚及び関節組織を得る。免疫組織化学染色のために組織を処理（凍結切片）また は固定し、パラフィンに包埋し、切片にし、細胞浸潤の分析のためにＨ ＆ Ｅで 染色する。 ＣＩＡモデルにおける本発明のＩＬ−４選択的アゴニストのネズミ類似体の評 価をネズミの同等なタンパク質分子を用いて実施する。当業者 はネズミＩＬ−４構造をヒトＩＬ−４構造と比較し、同様なネズミＩＬ−４突然 変異タンパク質を作製し、Ｔ細胞及びＨＵＶＥＣとヒトＩＬ−４突然変異タンパ ク質に対して用いられたものと同様にＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−２ＲγまたはＩＬ− ４Ｒα／γ様サブユニットのいずれかを発現する細胞系を利用するインビトロア ッセイにおける反応に基づいてあらゆる必要な調整を実施することができる。コ ラーゲンのブースター投与の１日前に動物に投薬し、研究の期間（４０＋日）の 間１日に１回ないし週に１回の間の範囲の投薬計画を続ける。１ないし１００μ ｇ／ｋｇの間であるＩＬ−４選択的アゴニストの濃度の範囲で動物に投薬する。 実施例１４．インシュリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）の処置 ヒトのＩＤＤＭ及びヒト疾病の動物モデルにおけるＴ細胞関与のいくつかの証 拠が文献にある。ＩＤＤＭの処置におけるＩＬ−４選択的アゴニストのネズミＩ Ｌ−４同等物の効能を調べるために非肥満体糖尿病（ＮＯＤ）マウスを利用する 。当業者はネズミＩＬ−４構造をヒトＩＬ−４構造と比較し、同様なネズミＩＬ −４突然変異タンパク質を作製し、Ｔ細胞及びＨＵＶＥＣとヒトＩＬ−４突然変 異タンパク質に対して用いられたものと同様にＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−２Ｒγまた はＩＬ−４Ｒα／γ様サブユニットのいずれかを発現する細胞系を利用するイン ビトロアッセイにおける反応に基づいてあらゆる必要な調整を実施することがで きる。前糖尿病ＮＯＤマウス（約７週）はＴ細胞刺激後にインビトロで増殖無反 応性を示す。この無反応性のタイミングはインシュリンに関係なく、２４週の年 齢で起こる糖尿病の発症まで持続する。 ＮＯＤマウスにおけるＩＬ−４選択的アゴニストの評価をＲａｐｏｐｏｒｔ等 、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１７８；ｐ８７（１９９３）により報 告された研究と同様に実施する。ＮＯＤマウスが１５週齢になるまで１２週の間 にわたって毎日１回の処置または週に１回の処置の投薬計画に従って約３週齢で 試験物質をＮＯＤマウスに注射する。コントロール群の動物には不活性タンパク 質同等物での処置を与える。 マウスをＴｅｓ−Ｔａｐｅを用いて糖尿に関して試験し、少なくとも連続して ２週間糖尿であることにより決定されるように糖尿病を診断する。５２週の最後 に、動物を屠殺して病理学評価のために各種器官及び組織を得る。各マウスから の膵臓、顎下唾液腺及び腎臓からの組織を固定し、パラフィンに包埋し、切片に し、染色する。膵臓切片のアルデヒドフクシン染色を用いて膵島（ｉｎｓｕｌｉ ｔｉｃ）浸潤物が顆粒化β細胞の大きさを縮小している程度を調べる。Ｚｉｐｒ ｉｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６；ｐ３７６３（１９９１）により記述され たように腹水中の抗−Ｔｈｙ−１．２、抗−ＣＤ４及び抗−ＣＤ８ｍａｂを用い てＦＡＣＳｃａｎ分析により脾臓白血球を数える。 本発明の他の態様は当業者にとって明らかになる。本発明は本明細書に具体的 に記述されないが、Ｔ細胞活性化活性及び減少した内皮細胞活性化活性を有する 突然変異タンパク質をどのようにして得るかを教示し、それによりそれらの突然 変異タンパク質は本発明の意図及び範囲内に入る。本明細書に記述される概念及 び実験方法は異種起源のマルチマー受容体系を利用する他のサイトカイン、特に ＩＬ−２及び関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１ ５）、ＩＬ−１０、インターフェロンα並びにインターフェロンγに適用できる はずである。 配列 以下の配列はこの出願の範囲内に含まれる。 配列番号１：ｈＩＬ−４（アミノ酸） 配列番号２：ｈＩＬ−４（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号３：Ｒ１２１Ａ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号４：Ｒ１２１Ｄ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号５：Ｒ１２１Ｅ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号６：Ｒ１２１Ｆ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号７：Ｒ１２１Ｈ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号８：Ｒ１２１Ｉ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号９：Ｒ１２１Ｋ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１０：Ｒ１２１Ｎ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１１：Ｒ１２１Ｐ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１２：Ｒ１２１Ｔ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１３：Ｒ１２１Ｗ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１４：Ｙ１２４Ａ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１５：Ｙ１２４Ｑ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１６：Ｙ１２４Ｒ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１７：Ｙ１２４Ｓ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１８：Ｙ１２４Ｔ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号１９：Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号２０：Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号２１：Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑ（アミノ酸、ｃＤＮＡ） 配列番号２２：５’ＰＣＲプライマー、ＩＬ−４ 配列番号２３：３’ＰＣＲプライマー、ＩＬ−４ 配列番号２４：Ｒ１２１Ａの突然変異誘発プライマー 配列番号２５：Ｒ１２１Ｄの突然変異誘発プライマー 配列番号２６：Ｒ１２１Ｅの突然変異誘発プライマー 配列番号２７：Ｒ１２１Ｆの突然変異誘発プライマー 配列番号２８：Ｒ１２１Ｈの突然変異誘発プライマー 配列番号２９：Ｒ１２１Ｉの突然変異誘発プライマー 配列番号３０：Ｒ１２１Ｋの突然変異誘発プライマー 配列番号３１：Ｒ１２１Ｎの突然変異誘発プライマー 配列番号３２：Ｒ１２１Ｐの突然変異誘発プライマー 配列番号３３：Ｒ１２１Ｔの突然変異誘発プライマー 配列番号３４：Ｒ１２１Ｗの突然変異誘発プライマー 配列番号３５：Ｙ１２４Ａの突然変異誘発プライマー 配列番号３６：Ｙ１２４Ｑの突然変異誘発プライマー 配列番号３７：Ｙ１２４Ｒの突然変異誘発プライマー 配列番号３８：Ｙ１２４Ｓの突然変異誘発プライマー 配列番号３９：Ｙ１２４Ｔの突然変異誘発プライマー 配列番号４０：Ｙ１２４Ａ／Ｓ１２５Ａの突然変異誘発プライマー 配列番号４１：Ｔ１３Ｄの突然変異誘発プライマー 配列番号４２：Ｒ１２１Ｔ／Ｅ１２２Ｆ／Ｙ１２４Ｑの突然変異誘発プライマー 備考：Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ突然変異タンパク質にはプライマー配列番号２６及 び４１を用いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 19/02 19/02 19/08 19/08 25/00 １０１ 25/00 １０１ 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/00 31/00 35/00 35/00 35/02 35/02 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，Ａ Ｕ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ， ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ 【要約の続き】 関する。また、本発明は本発明の突然変異タンパク質を コードするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチ ドを含有するベクター、形質転換された宿主細胞、突然 変異タンパク質を含んでなる製薬学的組成物及び治療的 処置方法も含む。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｔ細胞活性化活性を有するが、減少した内皮細胞活性化活性を有する、 野生型ＩＬ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質。 ２． 該野生型ＩＬ−４のＤヘリックスの表面に露出した残基を突然変異させ 、それにより得られる突然変異タンパク質がＴ細胞増殖を引き起こし且つ野生型 ＩＬ−４に比較して減少したＨＵＶＥＣからのＩＬ−６分泌をもたらす請求の範 囲１のヒトＩＬ−４突然変異タンパク質。 ３． 野生型に比較して位置１２１が置換されている請求の範囲２のヒトＩＬ −４突然変異タンパク質。 ４． 該位置がアラニンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４突然変 異タンパク質。 ５． 該位置がアスパラギン酸で置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４ 突然変異タンパク質。 ６． 該位置がグルタミン酸で置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４突 然変異タンパク質。 ７． 該位置がフェニルアラニンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ− ４突然変異タンパク質。 ８． 該位置がヒスチジンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４突然 変異タンパク質。 ９． 該位置がイソロイシンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４突 然変異タンパク質。 １０． 該位置がリシンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４突然変 異タンパク質。 １１． 該位置がアスパラギンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４ 突然変異タンパク質。 １２． 該位置がプロリンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４突然 変異タンパク質。 １３． 該位置がトレオニンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ−４突 然変異タンパク質。 １４． 該位置がトリプトファンで置換されている請求の範囲３のヒトＩＬ− ４突然変異タンパク質。 １５． 野生型に比較して位置１２４が置換されている請求の範囲２のヒトＩ Ｌ−４突然変異タンパク質。 １６． 該位置がアラニンで置換されている請求の範囲１５のヒトＩＬ−４突 然変異タンパク質。 １７． 該位置がグルタミンで置換されている請求の範囲１５のヒトＩＬ−４ 突然変異タンパク質。 １８． 該位置がアルギニンで置換されている請求の範囲１５のヒトＩＬ−４ 突然変異タンパク質。 １９． 該位置がセリンで置換されている請求の範囲１５のヒトＩＬ−４突然 変異タンパク質。 ２０． 該位置がトレオニンで置換されている請求の範囲１５のヒトＩＬ−４ 突然変異タンパク質。 ２１． 野生型に比較して位置１２４及び１２５が置換されている請求の範囲 ２のヒトＩＬ−４突然変異タンパク質。 ２２． 位置１２４及び１２５の両方がアラニンで置換されている請求の範囲 ２１のヒトＩＬ−４突然変異タンパク質。 ２３． 野生型に比較して位置１２１、１２２及び１２４が置換されている請 求の範囲２のヒトＩＬ−４突然変異タンパク質。 ２４． 位置１２１がトレオニンで置換され、１２２がフェニルアラニンで置 換され、そして１２４がグルタミンで置換されている請求の範囲２３のヒトＩＬ −４突然変異タンパク質。 ２５． 該突然変異タンパク質が該野生型ＩＬ−４のＡ−またはＣ−αヘリッ クスのいずれかの結合面中に少なくとも１個のアミノ酸置換をさらに含んでなり 、それにより該突然変異タンパク質が天然のＩＬ−４より少なくとも大きい親和 性でＩＬ−４Ｒα受容体に結合する請求の範囲１のヒトＩＬ−４突然変異タンパ ク質。 ２６． 位置１３がアスパラギン酸で置換され、そして位置１２１がグルタミ ン酸で置換されている請求の範囲２５のヒトＩＬ−４突然変異タンパク質。 ２７． Ｔ細胞活性化活性を有するが、減少した内皮細胞活性化活性を有する 野生型ＩＬ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質の有 効量を製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて含んでなる製薬学的組成物。 ２８． 請求の範囲１のヒトＩＬ−４突然変異タンパク質をコードするポリヌ クレオチド分子及びその縮重変異体。 ２９． 請求の範囲２８のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。 ３０． Ｔ細胞活性化活性を有するが、減少した内皮細胞活性化活性を有する ヒトＩＬ−４突然変異タンパク質の発現を導く請求の範囲２８のポリヌクレオチ ドを含んでなるベクターで、標的生物のトランスフェ クション及びそれに続く該ポリヌクレオチドによりコードされる該ヒトＩＬ−４ 突然変異タンパク質のインビボ発現を可能にすることができるベクター。 ３１． 野生型ＩＬ−４のＤヘリックスの表面に露出した残基を突然変異させ 、それにより得られる突然変異タンパク質がＴ細胞増殖を引き起こし且つ野生型 に比較して減少したＨＵＶＥＣからのＩＬ−６分泌をもたらすことを含んでなる 、Ｔ細胞活性化活性を有するが、減少した内皮細胞活性化活性を有する野生型Ｉ Ｌ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質の選択方法。 ３２． Ｔ細胞活性化活性を有するが、減少した内皮細胞活性化活性を有する 野生型ＩＬ−４に従って番号をつけられたヒトＩＬ−４突然変異タンパク質の治 療的に有効量を投与することによるＩＬ−４で治療できる疾患にかかっている患 者の処置方法。 ３３． 該ＩＬ−４で治療できる疾患が自己免疫疾患である請求の範囲３２の 方法。 ３４． 該自己免疫疾患が多発性硬化症である請求の範囲３３の方法。 ３５． 該自己免疫疾患が慢性関節リウマチである請求の範囲３３の方法。 ３６． 該自己免疫疾患がインシュリン依存型糖尿病である請求の範囲３３の 方法。 ３７． 該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである請求の範囲３３の方 法。 ３８． 該ＩＬ−４で治療できる疾患が感染性疾患である請求の範囲３２の方 法。 ３９． 該感染性疾患がライム病である請求の範囲３８の方法。 ４０． 該ＩＬ−４で治療できる疾患がＴｈ１偏向疾患である請求の範囲３２ の方法。 ４１． 該Ｔｈ１偏向疾患が乾癬である請求の範囲４０の方法。 ４２． 該ＩＬ−４で治療できる疾患が癌である請求の範囲３２の方法。 ４３． 該癌が急性リンパ芽球性白血病及び非ホジキンリンパ腫よりなる群か ら選択される請求の範囲４２の方法。 ４４． 該ＩＬ−４で治療できる疾患が軟骨性疾患である請求の範囲３２の方 法。 ４５． 該軟骨性疾患が変形性関節症である請求の範囲４４の方法。