CN117425679A

CN117425679A - 经修饰的粒细胞集落刺激因子(g-csf)和结合其的嵌合细胞因子受体

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Publication number: CN117425679A
Application number: CN202280039955.0A
Authority: CN
Inventors: M·J·布朗格; B·尼尔森; C·鲍威尔; M·富勒
Original assignee: Victoria Industrial Co ltd, University of; Provincial Health Services Authority
Current assignee: Victoria Industrial Co ltd, University of; Provincial Health Services Authority
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2024-01-19

Abstract

本文描述了用于使用变体细胞因子受体和细胞因子对来选择性活化细胞的方法和组合物，其中所述细胞因子受体包含粒细胞集落刺激因子受体(G‑CSFR)的胞外结构域(ECD)。在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于专门活化用于过继细胞转移疗法的细胞。因此，本文包括产生表达变体受体的细胞的方法，所述变体受体由不结合其天然受体的细胞因子选择性活化。本文还公开了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达包含G‑CSFR的胞外结构域的变体受体的细胞以及共同施用活化所述变体受体的变体细胞因子。

Description

经修饰的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和结合其的嵌合细胞因子受体

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年4月7日提交的美国临时申请第63/171,933号；2021年4月7日提交的美国临时申请第63/171,950号；2021年4月7日提交的美国临时申请第63/171,980号和2021年4月7日提交的美国临时申请第63/172,025号的权益，其中每件临时申请据此以引用方式全文并入以用于所有目的。

序列表

不适用。

背景技术

技术领域

在某些方面，本文描述了用于使用变体细胞因子受体和细胞因子对来选择性活化细胞的方法和组合物，其中所述细胞因子受体包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)。本文还公开了通过过继细胞转移治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达变体受体的细胞并施用变体细胞因子以向表达变体受体的细胞发送信号。本公开包括用于产生表达变体细胞因子和受体的细胞的核酸、表达载体和试剂盒，以及还提供用于结合变体受体的细胞因子的试剂盒。在某些方面，本文描述了嵌合细胞因子受体，其包含各种细胞因子受体的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)胞外结构域和胞内结构域以用于选择性活化所关注细胞中的细胞因子信号传导。本公开还包括用于过继细胞转移(ACT)的方法、细胞和试剂盒，其包括表达嵌合细胞因子受体的细胞和/或编码嵌合细胞因子受体和/或结合所述嵌合细胞因子受体的细胞因子的表达载体。在某些方面，本文描述了用于包含嵌合细胞因子受体的受控旁分泌信号传导的系统和方法，所述嵌合细胞因子受体包含各种细胞因子受体的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)胞外结构域和胞内结构域以用于选择性活化所关注细胞中的细胞因子信号传导。

本文还描述了使用变体细胞因子受体和细胞因子对选择性活化细胞的方法和组合物，其中细胞因子受体包含白介素-7受体α(IL-7Rα)的胞外结构域(ECD)。

过去二十年，在通过过继细胞转移(ACT)治疗癌症方面取得了很大进展。用天然存在的肿瘤浸润T细胞(TIL)进行的ACT现在为可重现的，在晚期黑色素瘤中产生>50％的客观临床反应率。用被工程化以识别B谱系白血病(使用CD19-定向嵌合抗原受体或CD19 CAR)的T细胞进行的ACT产生高达90％的完全反应率，大多数患者实现持久反应。用表达工程化T细胞受体(TCR)的T细胞进行的ACT显示出对抗各种实体瘤的前景。还报道了使用其他效应细胞类型代替T细胞的成功ACT，包括自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)和巨噬细胞。受这些显著结果的激励，几家公司正在将TIL、CAR和工程化TCR ACT方法商业化。

用于ACT的T细胞或其他效应细胞的移植、扩增和持久性是临床安全性和有效性的重要决定因素。在T细胞的情况下，这通常通过在ACT转移后施用全身IL-2以及在转移前在体外将T细胞用IL-2扩增来解决。除了预期的免疫刺激作用外，全身IL-2治疗还可能导致需要严格控制以确保患者安全的严重毒性，例如血管渗漏综合征。为了管理这些风险，患者通常需要住院2-3周，并作为预防措施进入ICU。此外，IL-2诱导效应和调节(抑制性)T细胞的增殖(5)；因此，给予患者IL-2类似于同时按压油门踏板和制动踏板。CAR T细胞带来了相反的问题，即T细胞扩增和持久性在一些患者中超过了安全水平，而在另一些患者中过早地衰退。此外，它们普遍根除正常B细胞(也表达CD19)，使患者部分具有免疫缺陷。理想地，人们希望在ACT后精确控制肿瘤反应性T细胞的数量，包括安全地增强T细胞的增殖、持久性和效力的能力，以及一旦癌症被根除就清除转移的细胞的能力。其他基于细胞的疗法(例如干细胞疗法)也将受益于对输注细胞的扩增、分化和持久性的改善的控制。

人G-CSF(NeupogenFilgrastim)和聚乙二醇化形式的人G-CSF(Neulasta/>Pegfilgrastim)是被批准用于治疗癌症患者的中性粒细胞减少症的治疗剂。G-CSF是四螺旋束(Hill,CP等人Proc Natl Acad Sci U S A.1993年6月1日；90(11):5167-71)，并且G-CSF与其受体G-CSFR复合物的结构得到了很好的表征(Tamada,T等人Proc Natl Acad SciU S A.2006年2月28日；103(9):3135-40)。G-CSF:G-CSFR复合物是2:2的异二聚体。G-CSF与G-CSFR有两个结合界面。一个界面称为位点II；它是G-CSF与G-CSFR的细胞因子受体同源(CRH)结构域之间的较大界面。第二界面称为位点III；它是G-CSF与G-CSFR的N末端Ig样结构域之间的较小界面。

白介素7(IL-7)是一种安全、耐受性良好的细胞因子，但在癌症免疫疗法的情形中效力有限。IL-7是T细胞和B细胞的生长因子，并且对胸腺发育和支持原初和记忆T细胞的存活和体内平衡很重要。与IL-2不同，IL-7诱导最小的Treg增殖，因为IL-7Rα在这种抑制性淋巴细胞群中以低水平表达。IL-7不由造血细胞产生，而是由基质细胞分泌。IL-7已用于癌症免疫疗法，目的是增加T细胞数量、持久性和活性(Barata JT等人Nat Immunol.2019年12月；20(12):1584-1593)。其已被证明耐受性良好；然而，其作为单一疗法显示出可忽略不计的抗癌功效(Rosenberg等人J Immunother.2006年5月至6月；29(3):313-9),(Sportès C.等人,Clin Cancer Res.2010年1月15日；16(2):727-35)，和(Sportès C.等人,J ExpMed.2008年7月7日；205(7):1701-14)。此外，在大肠杆菌(E.coli)中制备的重组IL-7被证明是高度免疫原性的，尽管此问题通过在哺乳动物细胞中产生IL-7而得以改善(Conlon KC等人,J Interferon Cytokine Res.2019年1月；39(1):6-21)。由于这些原因，相对于治疗上更有效的细胞因子(诸如IL-2和IL-15)，IL-7在肿瘤学中具有有限的临床发展。然而，IL-7作为嵌合受体的配体是有吸引力的，嵌合受体诱导比通过天然IL-7受体所实现的更强的胞内信号。

为了减轻与细胞因子的全身递送相关的毒性问题，几个小组已经工程化T细胞或NK细胞以以自分泌/旁分泌的方式产生和分泌细胞因子。目标是让工程化的T/NK细胞产生足够的细胞因子供自己和邻近细胞消耗，但不足以引起全身毒性。例如，这种策略已经应用于使用细胞因子(诸如IL-2、IL-15、IL-12和IL-18)来改善嵌合抗原受体(CAR)T细胞和CARNK细胞疗法。一种常见的方法是使用逆转录病毒或慢病毒在T细胞或NK细胞群体中稳定引入CAR基因和细胞因子基因。这可以通过多种方法，诸如两种病毒载体的共转导，或通过使用携带两种转基因的双顺反子病毒载体来实现。共表达CAR和细胞因子转基因的T细胞和NK细胞通常被称为“装甲的CAR”或“TRUCKS”。

装甲的CAR已经在鼠肿瘤模型中进行了评估，并且在较小的程度上，也在人临床试验中进行了评估。在几项研究中，已证明装甲的CAR T/NK细胞相对于标准CAR T/NK细胞(即具有CAR但没有细胞因子转基因的细胞)既安全又有效。然而，在一些小鼠研究(AtacaAtilla P.等人,J Immunother Cancer.2020年9月；8(2):e001229)和临床试验(Zhang L.等人,Clin Cancer Res.2015年5月15日；21(10):2278-88中观察到了毒性。此外，对于赋予T/NK细胞(或任何细胞类型)产生自分泌生长因子的能力的概念，总是存在理论上的关注；这有可能导致不受控制的T/NK细胞生长，导致继发性淋巴增生性疾病或恶性肿瘤。一些研究人员试图通过共表达“自杀基因”来减轻这种风险，如果出现毒性、不受控制的生长或其他问题，这种“自杀基因”可以用于杀死对药物作出反应的T/NK细胞。然而，根据定义，自杀基因的部署终止了细胞疗法，潜在地给患者留下了残余的肿瘤负担。因此，需要新的组合物和方法来降低与装甲的CAR方法相关的毒性和安全风险，以使治疗相关的细胞因子信号能够以安全和可控的方式递送给免疫细胞。

发明内容

本文描述了变体粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其中变体G-CSF包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合；其中位点II界面区中的至少一个突变选自由以下组成的突变组：L108R、D112R、E122R、E122K、E123K和E123R及它们的组合；其中位点II界面区突变相对于SEQ ID NO.1所示的序列的对应氨基酸位置；其中位点III界面区中的至少一个突变包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R；并且其中变体G-CSF选择性地结合包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)的受体。

在某些方面，本文描述了一种用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：(a)对应于SEQ ID NO:83或84的变体G-CSF；和(b)包含G-CSFR的变体ECD的受体；其中与其他方面相同的野生型G-CSFR ECD相比，变体G-CSF优先结合包含G-CSFR的变体ECD的受体，并且与其他方面相同的野生型G-CSF相比，包含G-CSFR的变体ECD的受体优先结合变体G-CSF；并且其中变体G-CSFR包含G2R-3或G12/2R-1。

在一些实施方案中，所述变体G-CSF结合由细胞表达的包含G-CSFR的变体ECD的受体。在一些实施方案中，表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD8+T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

在一些实施方案中，变体G-CSF与包含G-CSFR的变体ECD的受体的选择性结合引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种。在一些实施方案中，包含G-CSFR的变体ECD的所述受体包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。在一些实施方案中，包含G-CSFR的变体ECD的受体包含G-CSFR ECD的位点II界面区中的至少一个突变，所述突变包括R141E或R167D突变中的一或两者；其中G-CSFR ECD的位点III界面区中的至少一个突变包括R41E突变；并且其中变体G-CSFR突变对应于SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸位置。在一些实施方案中，包含G-CSFR的变体ECD的受体是嵌合受体。

在某些方面，本公开描述了编码本文所述的变体G-CSF的一种或多种核酸序列。在某些方面，本公开描述了包含核酸序列的一种或多种表达载体。在某些方面，本公开描述了经工程化以表达本文所述的变体G-CSF的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

在某些方面，本文描述了用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：(a)如权利要求1至[0014]中任一项所述的变体G-CSF；和(b)包含G-CSFR的变体ECD的受体；其中与其他方面相同的野生型G-CSFR ECD相比，所述变体G-CSF优先结合包含G-CSFR的变体ECD的受体，并且与其他方面相同的野生型G-CSF相比，包含G-CSFR的变体ECD的受体优先结合变体G-CSF。在一些实施方案中，所述变体G-CSF包含表4A中的G-CSF变体编号的位点II和位点III界面的突变的组合；其中变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1中所示的序列的氨基酸位置。

在一些实施方案中，所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R、E122R和E123R；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。在一些实施方案中，所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E122K；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的受体包含相对于SEQID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。在一些实施方案中，所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E123K；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。在一些实施方案中，所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E122R；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。在一些实施方案中，所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E123R；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。在一些实施方案中，所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R、E122K和E123K；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。

在一些实施方案中，所述系统还包含一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，所述系统还包含抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括至少一种选自由以下组成的组的受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体和模式识别受体。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体是CAR。在一些实施方案中，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1和CCL19，以及受体NKG2D。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-18。在一些实施方案中，所述细胞因子是人的。

在某些方面，本文描述了选择性活化在细胞表面上表达的受体的方法，其包括使包含G-CSFR的变体ECD的受体与本文描述的变体G-CSF接触。在一些实施方案中，包含G-CSFR的变体ECD的受体在免疫细胞上表达，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞的选择性活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种。

在某些方面，本公开描述了一种增强有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括：施用表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞，并且施用或提供本文所述的变体G-CSF。在某些方面，本公开描述了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括：施用表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞，并且向受试者施用或提供本文所述的变体G-CSF。在一些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗炎症性病症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述方法用于治疗退行性疾病。在一些实施方案中，所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。在一些实施方案中，所述方法用于预防或治疗移植排斥。在一些实施方案中，所述方法用于治疗传染性疾病。在一些实施方案中，所述方法还包括施用或提供一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

在一些实施方案中，向受试者施用两种或更多种各自表达以下中的一者或两者的细胞群体：(i)包含G-CSFR ECD的不同嵌合受体和(ii)G-CSF的至少一种不同的变体形式。其中至少一种细胞群体还表达至少一种不同的抗原结合信号传导受体；并且任选地，其中至少一种不同的抗原结合信号传导受体包括至少一种CAR。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下中的一者或两者：(a))至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述方法还包括一种或多种额外的免疫细胞群体；其中每种额外的免疫细胞群表达以下中的至少一种：(i)包含G-CSFR的不同变体ECD的不同受体，(ii)不同的变体G-CSF，(iii)不同的激动或拮抗信号传导蛋白和(iv)不同的抗原结合信号传导受体。

在方法的一些实施方案中，表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞还表达至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括选自由以下组成的组的至少一种受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括一种或多种CAR。在一些实施方案中，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1和CCL19，和受体NKG2D，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-18。在一些实施方案中，所述细胞因子是人的。

在某些方面，本文描述了治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括：i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用编码包含G-CSFR的变体ECD的至少一种受体的核酸序列转导或转染免疫细胞，(iii)向受试者施用来自(ii)的免疫细胞；和(iv)使免疫细胞与选择性结合受体的本文所述的一种或多种变体G-CSF接触。在一些实施方案中，在向受试者施用所述细胞之前，受试者已经经历了免疫耗竭治疗。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从施用细胞的受试者分离的。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从来源于施用细胞的受试者或来源于不同于施用细胞的受试者的受试者的细胞产生的，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。在一些实施方案中，在向受试者施用所述细胞之前，使免疫细胞在体外与至少一种变体G-CSF接触。在一些实施方案中，使免疫细胞与结合受体的至少一种变体G-CSF接触足够长的时间以活化来自受体的信号传导。

在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：编码包含G-CSFR的变体ECD的至少一种受体的细胞和使用说明书；并且其中所述试剂盒包括如权利要求1至6所述的至少一种变体G-CSF；并且任选地，其中所述细胞是免疫细胞。在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：(a)编码包含G-CSFR的变体ECD的一种或多种受体的一种或多种核酸序列，(b)本文所述的至少一种变体G-CSF、本文所述的核酸序列或本文所述的一种或多种表达载体；和(c)使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括编码一种或多种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1和CCL19，和受体NKG2D，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码至少一种抗原结合受体的一种或多种表达载体。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码嵌合抗原受体的一种或多种表达载体。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1和CCL19，和受体NKG2D，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种抗原结合信号传导受体的一种或多种表达载体。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种CAR的一种或多种表达载体，并且任选地，所述CAR是间皮素CAR。

在某些方面，本文描述了嵌合受体，其包含：(a)可操作地连接至至少一个第二结构域的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包括：(b)胞内结构域(ICD)，其包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点；其中所述至少一个信号传导分子结合位点选自由以下组成的组：白介素(IL)-2Rβ的SHC结合位点、IL-2Rβ的STAT5结合位点、IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点、IL-4Rα的STAT6结合位点、gp130的SHP-2结合位点、gp130的STAT3结合位点、EPOR的SHP-1或SHP-2结合位点、红细胞生成素受体(EPOR)的STAT5结合位点、干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的STAT1或STAT2结合位点和干扰素γ受体1(IFNγR1)的STAT1结合位点，或它们的组合，其中所述ICD还包含选自由以下组成的组的至少一种蛋白质的至少一个框1区和至少一个框2区：G-CSFR、gp130、EPOR和干扰素γ受体2(IFNγR2)或它们的组合；和(c)包含跨膜结构域(TMD)的至少一个第三结构域；其中所述ECD在所述TMD的N末端，并且所述TMD在所述ICD的N末端。

在某些方面，本文描述了嵌合受体，其包含：可操作地连接至第二结构域的ECD；所述第二结构域包括ICD，其中所述ICD包含：

(i)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(ii)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iii)

(a)红细胞生成素受体(EPOR)的框1区和框2区；

(b)EPOR的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iv)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(v)

(a)干扰素γ受体2(IFNγR2)的框1区和框2区；

(b)干扰素γ受体1(IFNγR1)的至少一个信号传导分子结合位点；其中所述ECD在所述TMD的N末端，并且所述TMD在所述ICD的N末端。

在某些实施方案中，嵌合受体的ECD是G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的ECD。在某些实施方案中，嵌合受体的TMD是G-CSFR的TMD，并且任选地，所述TMD是野生型TMD。在某些实施方案中，嵌合受体的活化形式形成同二聚体，并且任选地，嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种，并且任选地，嵌合受体在与G-CSF接触时被活化，并且任选地，G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域。

在某些实施方案中，嵌合受体在细胞中表达，并且任选地是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在某些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

在某些实施方案中，所述ICD包含：

(a)SEQ ID NO.90或91中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(b)SEQ ID NO.90或92中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(c)SEQ ID NO.93的氨基酸序列；或者

(d)SEQ ID NO.94的氨基酸序列；或者

(e)SEQ ID NO.95或96中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(f)SEQ ID NO.97或98的氨基酸序列；或者

(g)SEQ ID NO.99或100的氨基酸序列。

在某些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO.88中所示的序列。

在某些方面，本公开描述了编码本文所述的嵌合受体的一种或多种核酸序列。在某些实施方案中，G-CSFR的ECD的核酸序列由SEQ ID NO.85、86或87中的任一个中所示的核酸序列编码。在某些实施方案中，本公开描述了包含核酸序列的一种或多种表达载体。在某些实施方案中，所述表达载体选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和质粒。

在某些方面，本公开描述了编码嵌合受体的一种或多种核酸序列；其中所述嵌合受体包含：可操作地连接至第二结构域的ECD；所述第二结构域包含：

(i)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(ii)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iii)

(a)红细胞生成素受体(EPOR)的框1区和框2区；

(b)EPOR的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iv)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(v)

(a)干扰素γ受体2(IFNγR2)的框1区和框2区；

(b)干扰素γ受体1(IFNγR1)的至少一个信号传导分子结合位点。

在本文所述的核酸的某些实施方案中，ECD是G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的ECD。在本文所述的核酸的某些实施方案中，TMD是G-CSFR的TMD，并且任选地，TMD是野生型TMD。在本文所述的核酸的某些实施方案中，G-CSFR的ECD由SEQ ID NO.85、86或者87中的任一个中所示的核酸序列编码。在某些实施方案中，所述核酸序列包含：(a)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.90或91中的一者或两者的氨基酸序列；或(b)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.90或92中的一者或两者的氨基酸序列；或(c)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.93的氨基酸序列；或(d)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.94的氨基酸序列；或(e)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.95或96中的一者或两者的氨基酸序列；或(f)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.97或98的氨基酸序列；或(g)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.99或100的氨基酸序列。

在某些实施方案中，一种或多种表达载体包含本文所述的核酸序列。在某些实施方案中，所述表达载体选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和质粒。

在某些方面，本文描述了一种包含编码本文描述的嵌合受体的核酸序列的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在某些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。在某些实施方案中，所述细胞包含本文所述的核酸序列。在某些实施方案中，所述细胞包含本文所述的表达载体。

在某些方面，本文描述了选择性活化在细胞表面上表达的嵌合受体的方法，其包括使嵌合受体与选择性结合所述嵌合受体的细胞因子接触。在某些实施方案中，嵌合受体的活化形式形成同二聚体，并且任选地，嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种，并且任选地，所述嵌合受体在与细胞因子接触时被活化。

在某些实施方案中，选择性结合嵌合受体的细胞因子是G-CSF，并且任选地，嵌合受体在与G-CSF接触时被活化，并且任选地，G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域。在某些实施方案中，所述嵌合受体在细胞中表达，并且任选地是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。

在一些实施方案中，第一免疫细胞群体表达嵌合受体，第二免疫细胞群体表达结合嵌合受体的细胞因子；任选地，其中第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达至少一种不同的抗原结合信号传导受体；并且任选地，其中至少一种不同的抗原结合信号传导受体包括至少一种CAR。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体各自表达包含G-CSFR的不同变体ECD的不同的嵌合受体和不同的变体G-CSF。在一些实施方案中，所述方法还包括一种或多种额外的免疫细胞群体；其中每种额外的免疫细胞群表达以下中的至少一种：(i)包含G-CSFR的不同变体ECD的不同受体，(ii)不同的变体G-CSF，(iii)不同的激动或拮抗信号传导蛋白和(iv)不同的抗原结合信号传导受体。

在某些方面，本文描述了在细胞中产生嵌合受体的方法，其包括：向细胞中引入本文所述的一种或多种核酸序列或本文所述的一种或多种表达载体；并且任选地，所述方法包括基因编辑；并且任选地，所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。

在某些方面，本文描述了治疗有需要的受试者的方法，其包括：向受试者施用表达本文所述的嵌合受体的细胞，并且向受试者提供特异性结合嵌合受体的细胞因子。

在某些实施方案中，嵌合受体的活化形式形成同二聚体；并且任选地，嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种，并且任选地，嵌合受体在与细胞因子接触时被活化。在某些实施方案中，所述细胞因子是G-CSF；并且任选地，所述G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，所述G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域。

在本文所述的方法的某些实施方案中，所述嵌合受体在细胞中表达，并且任选地是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。

在某些实施方案中，所述方法还包括施用或提供至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在某些实施方案中，向受试者施用两种或更多种各自表达包含G-CSFR ECD的不同嵌合受体并且各自表达G-CSF的不同变体形式的细胞群体。在某些实施方案中，表达嵌合受体的细胞还表达至少一种抗原结合信号传导受体。在某些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括至少一种选自由以下组成的组的受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在某些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体是CAR。在某些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，以及它们的组合。在某些实施方案中，所述细胞因子是IL-18。在某些实施方案中，所述细胞因子是人的。

在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症，诸如但不限于胆管癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、血液系统恶性肿瘤、肾癌(肾细胞)、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤和甲状腺癌。在某些实施方案中，方法用于治疗自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述方法用于治疗炎症性病症。在某些实施方案中，所述方法用于治疗退行性疾病。在某些实施方案中，所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。在某些实施方案中，所述方法用于治疗或预防同种异体移植物排斥。

在某些实施方案中，所述方法还包括施用或提供至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，向受试者施用两种或更多种各自表达不同的嵌合受体并且各自表达细胞因子的不同变体形式的细胞群体。

在某些实施方案中，所述方法包括：i)分离含免疫细胞的样品；(ii)向免疫细胞引入编码嵌合细胞因子受体的核酸序列；(iii)向受试者施用来自(ii)的免疫细胞；以及(iv)使免疫细胞与结合嵌合受体的细胞因子接触。在某些实施方案中，在向受试者施用或输注所述细胞之前，受试者已经历免疫耗竭治疗。在某些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从将施用细胞的受试者分离的。

在某些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从不同于将施用细胞的受试者的受试者分离的。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从来源于将施用细胞的受试者或不同于将施用细胞的受试者的受试者的细胞产生的，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。在某些实施方案中，在向受试者施用或输注所述细胞之前，使所述免疫细胞与细胞因子体外接触。在某些实施方案中，使所述免疫细胞与细胞因子接触足够长的时间以活化来自嵌合受体的信号传导。在某些实施方案中，所述细胞因子是G-CSF；并且任选地，所述G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，所述G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域。

在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：编码本文所述的一种或多种嵌合受体的至少一种表达载体和使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括结合嵌合受体的至少一种细胞因子。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白的一种或多种表达载体；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码一种或多种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，以及它们的组合。,在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码至少一种抗原结合受体的一种或多种表达载体。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码一种或多种CAR的一种或多种表达载体，并且任选地，其中所述CAR是间皮素CAR。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码本文所述的一种或多种不同嵌合受体的一种或多种表达载体。

在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括编码本文所述的一种或多种嵌合受体的细胞，并且任选地，所述细胞是免疫细胞；和

使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括结合嵌合受体的至少一种细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白的一种或多种表达载体；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种抗原结合信号传导受体的一种或多种表达载体。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种CAR的一种或多种表达载体，并且任选地，其中所述CAR是间皮素CAR。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种本文所述不同的嵌合受体的一种或多种表达载体。

在某些方面，本文描述了用于选择性活化细胞的系统，所述系统包含：(i)包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)的受体；和(ii)选择性结合(i)的受体的变体G-CSF；和以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂，以及(b)至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，至少一种额外的细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一种：白介素(IL)-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述至少一种额外的细胞因子包括IL-18。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括以下中的至少一种：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括CAR；并且任选地，所述CAR是间皮素CAR。在一些实施方案中，G-CSFR的变体ECD包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。在一些实施方案中，位点II界面区中的至少一个突变位于选自由以下组成的组的G-CSFR ECD的氨基酸位置：SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸位置141、167、168、171、172、173、174、197、199、200、202和288。在一些实施方案中，G-CSFR ECD的位点II界面区中的至少一个突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2中所示的序列的R141E、R167D、K168D、K168E、L171E、L172E、Y173K、Q174E、D197K、D197R、M199D、D200K、D200R、V202D、R288D和R288E。

在一些实施方案中，G-CSFR ECD的位点III界面区中的至少一个突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸2-308的氨基酸位置30、41、73、75、79、86、87、88、89、91和93。在一些实施方案中，G-CSFR ECD的位点III界面区中的至少一个突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2中所示的序列的S30D、R41E、Q73W、F75KF、S79D、L86D、Q87D、I88E、L89A、Q91D、Q91K和E93K。在一些实施方案中，G-CSFR ECD包含表4、22和23中所示的设计编号的多个突变的组合；其中所述突变对应于SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸位置。

在一些实施方案中，G-CSFR ECD包含SEQ ID NO.2中所示的序列的突变：R41E、R141E和R167D。在一些实施方案中，包含G-CSFR的变体ECD的受体是嵌合受体。

在一些实施方案中，所述嵌合受体可操作地连接至至少一个第二结构域；所述第二结构域包含来自一种或多种细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一个信号传导分子结合位点；其中所述至少一个信号传导分子结合位点选自由以下组成的组：G-CSFR的STAT3结合位点、糖蛋白130(gp130)的STAT3结合位点、gp130的SHP-2结合位点、IL-2Rβ的SHC结合位点、IL-2Rβ的STAT5结合位点、IL-2Rβ的STAT3结合位点、IL-2Rβ的STAT1结合位点、IL-7Rα的STAT5结合位点、IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点、IL-12Rβ₂的STAT4结合位点、IL-12Rβ₂的STAT5结合位点、IL-12Rβ₂的STAT3结合位点、IL-21R的STAT5结合位点、IL-21R的STAT3结合位点、IL-21R的STAT1结合位点、IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点、IL-4Rα的STAT6结合位点、红细胞生成素受体(EPOR)的SHP-1或SHP-2结合位点、EPOR的STAT5结合位点、干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的STAT1或STAT2结合位点和干扰素γ受体1(IFNγR1)的STAT1结合位点，或它们的组合；任选地，所述ICD包含选自由以下组成的组的蛋白质的框1区和框2区：G-CSFR、gp130 EPOR和干扰素γ受体2(IFNγR2)或它们的组合；并且任选地，所述嵌合受体包含第三结构域，所述第三结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域(TMD)：G-CSFR、gp130(糖蛋白130)和IL-2Rβ，并且任选地，所述TMD是野生型TMD。

在一些实施方案中，所述嵌合受体可操作地连接至至少一个第二结构域；所述第二结构域包含：

(i)

(a)gp130的框1区和框2区；和

(b)IL-2Rβ的C末端区；或者

(ii)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-2Rβ的C末端区；或者

(iii)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-12Rβ₂的C末端区；或者

(iv)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的C末端区；或者

(v)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；和

(b)IL-2Rβ的C末端区；或者

(vi)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-7Rα的C末端区；或者

(vii)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的C末端区；或者

(viii)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的C末端区；或者

(ix)

(a)红细胞生成素受体(EPOR)的框1区和框2区；

(b)EPOR的C末端区；或者

(x)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的C末端区；或者

(xi)

(a)干扰素γ受体2(IFNγR2)的框1区和框2区；

(b)干扰素γ受体1(IFNγR1)的C末端区。

在一些实施方案中，所述ECD在TMD的N末端，并且所述TMD在ICD的N末端。在一些实施方案中，包含G-CSFR的变体ECD的受体在细胞上表达。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞；并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。在一些实施方案中，变体G-CSF对包含G-CSFR的变体ECD的受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆、增强活性中的至少一种及它们的组合。在一些实施方案中，变体G-CSF包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。在一些实施方案中，变体G-CSF的位点II界面区中的至少一个突变位于选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.1中所示的序列的氨基酸位置12、16、19、20、104、108、109、112、115、116、118、119、122和123。在一些实施方案中，变体G-CSF的位点II界面区中的至少一个突变选自以下突变组，所述突变组选自由以下组成的组：S12E、S12K、S12R、K16D、L18F、E19K、Q20E、D104K、D104R、L108K、L108R、D109R、D112R、D112K、T115E、T115K、T116D、Q119E、Q119R、E122K、E122R和E123R。在一些实施方案中，变体G-CSF的位点III界面区中的至少一个突变选自以下突变组，所述突变组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.1中所示的序列的38、39、40、41、46、47、48、49和147。

在一些实施方案中，变体G-CSF的位点III界面区中的至少一个突变选自以下突变组：所述突变组选自由以下组成的组：T38R、Y39E、K40D、K40F、L41D、L41E、L41K、E46R、L47D、V48K、V48R、L49K和R147E。在一些实施方案中，所述细胞表达包含G-CSFR的变体ECD的受体和至少一种额外的细胞因子或趋化因子两者。在一些实施方案中，两种或更多种细胞群体各自表达包含G-CSFR ECD的一种或多种不同的嵌合受体，并且各自表达G-CSF的一种或多种不同的变体形式。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体还表达以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞；并且其中所述免疫细胞还表达抗原结合信号传导受体；并且其中所述抗原结合信号传导受体选择性地结合在第二细胞上表达的抗原。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括嵌合抗原受体(CAR)，并且任选地是间皮素CAR。在一些实施方案中，所述额外的细胞因子包括IL-18。在一些实施方案中，所述第二种细胞是癌细胞。

在某些方面，本公开描述了编码本文所述的系统的一种或多种核酸序列。在某些方面，本公开描述了包含本文所述的核酸序列的一种或多种表达载体。在某些方面，本公开描述了被工程化以表达本文所述的系统的一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞；并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD8+T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

在某些方面，本文描述了选择性活化在细胞表面上表达的包含G-CSFR的变体ECD的受体的方法，其包括：向细胞中引入一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列编码包含本文所述的系统的G-CSFR的变体ECD的一种或多种受体；和以下中的一者或两者：(i))至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括本文所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(ii)本文所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体；并且使包含G-CSFR的变体ECD的受体与一种或多种变体G-CSF或本文所述的系统的变体G-CSF接触。在一些实施方案中，所述受体在免疫细胞上表达，并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。在一些实施方案中，在免疫细胞上表达的受体的选择性活化引起细胞反应，所述细胞反应包括免疫细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆、增强的活性中的至少一种及它们的组合。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体表达包含G-CSFR的变体ECD的受体，并且第二免疫细胞群体表达变体G-CSF；任选地，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达至少一种不同的抗原结合信号传导受体；并且任选地，其中所述至少一种不同的抗原结合信号传导受体包括至少一种CAR。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下一者或两者：(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

在一些实施方案中，第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体各自表达至少一种包含G-CSFR的不同变体ECD的不同的受体和至少一种不同的变体G-CSF。在一些实施方案中，所述方法还包括一种或多种额外的免疫细胞群体；其中每种额外的免疫细胞群表达以下中的至少一种：(i)包含G-CSFR的不同变体ECD的不同受体，(ii)不同的变体G-CSF，(iii)不同的激动或拮抗信号传导蛋白和(iv)不同的抗原结合信号传导受体。

在某些方面，本公开描述了产生细胞的方法，所述细胞表达一种或多种包含本文所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一者或两者：(i))至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括本文所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(ii)本文所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体；所述方法包括向所述细胞中引入编码所述受体以及(i)和(ii)中的一者或两者的一种或多种核酸或表达载体。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体表达包含G-CSFR的变体ECD的受体，并且第二免疫细胞群体表达变体G-CSF。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体中的一种或两种还表达以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

在某些方面，本文描述了增强有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括向受试者施用本文所述的免疫细胞。在某些方面，本文描述了治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括：向受试者施用本文的免疫细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用或提供变体G-CSF。在一些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗炎症性病症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫性疾病或病症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗退行性疾病。在一些实施方案中，所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。在一些实施方案中，所述方法用于预防或治疗移植排斥。在一些实施方案中，所述方法用于治疗传染性疾病。在一些实施方案中，所述方法还包括施用或提供至少一种额外的活性剂；任选地，其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

在某些方面，本文描述了治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括：(i)分离含免疫细胞的样品；(ii)向免疫细胞中引入一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列编码一种或多种包含如权利要求[0048]至[0054]中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的活性剂；任选地，其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括本文所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；以及任选地，(b)本文所述的系统的抗原结合信号传导受体；(iii)向所述受试者施用来自(ii)的所述免疫细胞；和(iv)使免疫细胞与特异性结合包含G-CSFR的变体ECD的受体的变体G-CSF接触。在一些实施方案中，在向受试者施用或输注所述免疫细胞之前，受试者已经历免疫耗竭治疗。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从施用细胞的受试者中分离的。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从不同于施用细胞的受试者的受试者分离的。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品由来源于将施用来源细胞的受试者的来源细胞产生，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品由来源于不同于将施用来源细胞的受试者的受试者的来源细胞产生，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。在一些实施方案中，在向受试者施用免疫细胞之前，使免疫细胞在体外与变体G-CSF或额外的细胞因子或趋化因子接触。在一些实施方案中，使免疫细胞与变体G-CSF接触足够长的时间以活化来自包含本文所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体的信号传导。

在某些方面，本文描述了包括细胞的试剂盒，所述细胞编码包含本文所述的系统的G-CSFR的变体ECD的一种或多种受体；和以下中的一者或两者：(a)本文所述的系统的一种或多种额外的细胞因子和趋化因子；和(b)本文所述的系统的一种或多种抗原结合信号传导受体；以及使用说明书；并且任选地，其中所述细胞是免疫细胞。在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：(i)一种或多种核酸序列或表达载体，所述一种或多种核酸序列或表达载体编码包含本文所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的活性剂；任选地其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括本文所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)本文所述的系统的一种或多种抗原结合信号传导受体；和(ii)一种或多种变体G-CSF；以及(iii)使用说明书；其中受体和(a)和(b)中的一者或两者位于相同或单独的核酸序列或表达载体上。

在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：(i)包含一种或多种核酸序列或表达载体的细胞，所述一种或多种核酸序列或表达载体编码包含本文所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的活性剂；任选地其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括本文所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)本文所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体；以及(ii)使用说明书；并且任选地，其中所述试剂盒包括特异性结合包含G-CSFR的变体ECD的受体的一种或多种变体G-CSF。

在某些方面，本文公开了嵌合受体，其包含：(i)白介素受体α(IL-7Rα)的胞外结构域(ECD)；(ii)跨膜结构域(TMD)；和(iii)细胞因子受体的胞内结构域(ICD)，其不同于SEQID NO:109中所示的野生型人IL-7Rα胞内信号传导结构域；其中ECD和TMD各自可操作地连接至ICD。在一些实施方案中，ECD的羧基末端(C末端)连接至TMD的氨基末端(N末端)，并且TMD的C末端连接至ICD的N末端。在一些实施方案中，所述ECD是天然人IL-7Rα的ECD。在一些实施方案中，所述TMD是IL-7Rα的TMD。在一些实施方案中，所述TMD是天然人IL-7Rα的TMD。在一些实施方案中，所述ICD包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点，并且任选地，所述至少一个信号传导分子结合位点包括：(a)IL-2Rβ、IL-4Rα、IL-7Rα、IL-21R或gp130的JAK1结合位点(框1区和2区)；(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；(c)IL-2Rβ或IL-7Rα的STAT5结合位点；(d)IL-21R或gp130的STAT3结合位点；(e)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；(f)IL-4Rα的STAT6结合位点；(g)IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点；和(h)gp130的SHP-2结合位点；(i)IL-7Rα的PI3K结合位点；或它们的组合。在一些实施方案中，所述ICD包含通过与共同γ链(gc)的同二聚化或异二聚化而被活化的受体的至少一个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述ICD包含细胞因子受体的至少一个细胞内信号传导结构域，所述细胞因子受体选自由以下组成的组：IL-2Rβ(白介素-2受体β)、IL-4Rα(白介素-4受体α)、IL-9Rα(白介素-9受体α)、IL-12Rβ2(白介素-12受体)、IL-21R(白介素-21受体)和糖蛋白130(gp130)以及它们的组合。

在某些方面，本文描述了嵌合受体，其包含IL-7Rα的ECD和可操作地连接至ICD的TMD，所述ICD包含：

(i)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；和

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；或者

(ii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；和

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；或者

(iii)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；或者

(iv)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；或者

(v)

(a)IL-21R的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(vi)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(vii)

(a)IL-21R的框1区和框2区；

(b)IL-21R的STAT3结合位点；和

(c)IL-7Rα的STAT5和PI3激酶结合位点；

(viii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-21R的STAT3结合位点；和

(c)IL-7Rα的STAT5和PI3激酶结合位点；

(ix)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(x)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(xi)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；

(d)IL12Rβ2的STAT4结合位点；和

(e)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(xii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；

(d)IL12Rβ2的STAT4结合位点；和

(e)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(xiii)

(a)IL-4Rα的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点；和

(c)IL-4Rα的STAT6结合位点；或者

(xiv)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-4α的IRS-1或IRS-2结合位点；和

(c)IL-4α的STAT6结合位点；或者

(xv)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的SHP-2结合位点；和

(c)gp130的STAT3结合位点；或者

(xvi)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)gp130的SHP-2结合位点；和

(c)gp130的STAT3结合位点。

在一些实施方案中，(b)在(c)的N末端；或(c)在(b)的N末端；或(c)在(d)的N末端；或(d)在(c)的N末端；或(d)在(e)的N末端；或(e)在(d)的N末端。

在一些实施方案中，所述ICD包含与SEQ ID NO:192-214中的至少一个中所示的序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，嵌合受体的活化形式形成异二聚体，并且任选地，嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达嵌合受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种，并且任选地，嵌合受体在与白介素(IL)-7接触时被活化。在一些实施方案中，IL-7是野生型人IL-7。在一些实施方案中，与野生型IL-7相比，IL-7包含1个、2个、3个、4个或5个突变。在一些实施方案中，IL-7包含一种或多种化学修饰。

在一些实施方案中，所述嵌合受体在细胞上表达。所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。在一些实施方案中，IL-7对受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种。

在某些方面，本公开描述了编码本文所述的受体的一种或多种核酸序列。在某些方面，本公开描述了包含本文所述的核酸序列的一种或多种表达载体。在某些方面，本公开描述了包含本文所述的核酸序列或表达载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞；并且任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

在某些方面，本公开描述了用于活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：(a)本文所述的嵌合受体；和(b)IL-7。

在某些方面，本公开描述了一种用于活化免疫细胞的系统，所述系统包含：(a)本文所述的嵌合受体；(b)IL-7；和(c)抗原结合信号传导受体。

在某些方面，本公开描述了一种用于活化免疫细胞的系统，所述系统包含：(a)本文所述的嵌合受体；(b)IL-7；和(c)至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

在一些实施方案中，所述系统还包含至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体包括选自由以下组成的组的至少一种受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体是CAR。在一些实施方案中，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-18。在一些实施方案中，所述细胞因子是人的。

在某些方面，本文描述了活化在细胞表面上表达的嵌合受体的方法，其包括：使嵌合受体与IL-7接触以活化嵌合受体；其中所述嵌合受体包含：(i)IL-7Rα的胞外结构域(ECD)；(ii)跨膜结构域(TMD)；和(iii)细胞因子受体的胞内结构域(ICD)，其不同于SEQ IDNO:109中所示的野生型人IL-7Rα胞内信号传导结构域；其中所述ECD和所述TMD各自可操作地连接至所述ICD。在一些实施方案中，所述嵌合受体是本文所述的嵌合受体。

在某些方面，本文描述了一种在细胞中产生嵌合受体的方法，所述方法包括：向细胞中引入本文所述的核酸序列或本文所述的表达载体。在一些实施方案中，所述方法还包括将载体的一种或多种序列编辑到细胞的基因组中。

在本文所述方法的一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞；并且，任选地，所述免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

在某些方面，本文描述了增加有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括：向受试者施用表达本文所述的嵌合受体的细胞，并且向受试者施用或提供IL-7。

在某些方面，本文描述了治疗有需要的受试者的方法，其包括：向受试者施用表达本文所述的嵌合受体的细胞，并且向受试者施用或提供IL-7。在一些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述方法用于治疗炎症性病症。在一些实施方案中，所述方法用于治疗退行性疾病。在一些实施方案中，所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。在一些实施方案中，所述方法用于预防或治疗移植排斥。在一些实施方案中，所述方法用于治疗传染性疾病。

在某些实施方案中，所述方法用于治疗退行性疾病或病症。退行性疾病或病症的实例包括但不限于与衰老相关的神经退行性疾病和病症。

在某些实施方案中，所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。

在一些实施方案中，所述方法还包括施用或提供至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，向受试者施用表达至少一种额外的不同嵌合受体的细胞。在一些实施方案中，至少一种额外的不同嵌合受体是包含粒细胞刺激因子受体(G-CSFR)的变体ECD的嵌合受体。在一些实施方案中，使表达包含G-CSFR的变体ECD的至少一种额外的不同嵌合受体的细胞与一种或多种变体G-CSF接触，并且任选地，向受试者施用一种或多种变体G-CSF。在一些实施方案中，所述方法包括：i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用编码嵌合细胞因子受体的核酸序列转导或转染免疫细胞；(iii)向受试者施用来自(ii)的免疫细胞；和(iv)使免疫细胞与IL-7接触。

在一些实施方案中，所述方法还包括向免疫细胞中引入编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白的核酸序列；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。在一些实施方案中，所述方法还包括向免疫细胞引入编码至少一种抗原结合信号传导受体的核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，在向受试者施用所述细胞之前，受试者已经经历了免疫耗竭治疗。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从施用细胞的受试者中分离的。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品是从不同于施用细胞的受试者的受试者分离的。在一些实施方案中，所述含免疫细胞的样品由来源于不同于将施用细胞的受试者的受试者的细胞产生，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。在一些实施方案中，在向受试者施用细胞之前，使免疫细胞在体外与IL-7或变体G-CSF中的一者或两者接触。在一些实施方案中，使免疫细胞与IL-7或变体G-CSF中的一者或两者接触足够长的时间以活化来自本文所述的嵌合受体的信号传导。

在一些实施方案中，向受试者施用的细胞还表达至少一种抗原结合信号传导受体，所述受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞还表达包含G-CSFR的变体ECD的受体。在一些实施方案中，G-CSFR的变体ECD包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞还表达IL-18。

在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：编码本文所述的嵌合受体的细胞，并且任选地，所述细胞是免疫细胞；以及使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括IL-7，并且任选地，所述试剂盒包括本文所述的变体G-CSF。在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：包含编码本文所述的嵌合受体的核酸序列的一种或多种表达载体和使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括IL-7，并且任选地，所述试剂盒包括本文所述的变体G-CSF。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种表达载体，其编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码至少一种受体的一种或多种表达载体，所述受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括编码嵌合抗原受体的表达载体。在一些实施方案中，所述细胞还包含一种或多种表达载体，其编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种抗原结合信号传导受体的一种或多种表达载体。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种CAR的一种或多种表达载体。

附图说明

参考以下描述和附图将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中：

图1呈现示出2:2G-CSF:G-CSFR异二聚体复合物的位点II和III界面的结构的图。

图2呈现概述用于G-CSF:G-CSFR界面设计的策略的图。

图3呈现示出位点II界面相互作用的能量分量的图表。

图4呈现示出位点II界面的结构以及G-CSFR(CRH)的Arg167(左)和Arg141(右)与位点II界面处的G-CSF残基的相互作用的图。

图5呈现示出位点II处的野生型G-CSF(左)和位点II设计#35的一式三份ZymeCAD^TM均值场包的相同区域的叠加(右)的图。

图6呈现SDS-PAGE的图像，其示出G-CSF设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36(上图)以及共表达和纯化的位点II设计复合物#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36(下图)、第一泳道WT G-CSF对照、第二泳道WT G-CSF:G-CSFR(CRH)对照的G-CSF下拉测定(pulldownassay)结果。

图7呈现SDS-PAGE的图像，示出了与WT-G-CSFR共表达的G-CSF设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36的G-CSF下拉测定(上图)和与G-CSFR设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36共表达的WT G-CSF的G-CSF下拉测定(下图、第一泳道WT:WT G-CSF:G-CSFR下拉对照的结果。

图8呈现示出位点III界面相互作用的能量分量的图表。

图9呈现示出位点III界面的结构以及G-CSFR(Ig)的R41(左)和E93(右)与位点III界面处的G-CSF残基的相互作用的图。

图10呈现SDS-PAGE的图像，示出了设计#401和402(上图)和共表达和纯化的位点II/III设计复合物#401和402以及WT G-CSFR的G-CSF下拉测定和与设计#401和402G-CSFR(下图)共表达的WT G-CSF、第一泳道WT G-CSF对照、第二泳道WT G-CSF:G-CSFR(Ig-CRH)对照的下拉的结果。

图11呈现示出在TEV裂解后WT(SX75)G-CSF和设计130(SX75)、303(SX200)和401(SX200)G-CSF_E突变体的尺寸排阻色谱图谱的图表。

图12呈现示出在TEV裂解后纯化的WT(SX75)和纯化的设计401(SX200)和402(SX200)G-CSFR(Ig-CRH)_E突变体的尺寸排阻色谱图谱的图表。

图13呈现示出WT、设计#130、#401、#402G-CSF与它们的同源或错配G-CSFR(Ig-CRH)结合的结合SPR传感图的图表。每个G-CSF与G-CSFR对都标记在每个图的底部。用于推导设计#401和#402的同源对的KD的代表性稳态拟合示出在它们各自的传感图下。

图14呈现示出以下的图表：左上图：WT G-CSF、设计#130和#134G-CSF_E的DSC热分析图；右上图：WT G-CSFR(Ig-CRH)、设计#130和#134G-CSFR(Ig-CRH)_E的DSC热分析图；左下图：设计#401和#402G-CSF_E的DSC热分析图；右下图：设计#300、#303、#304和#307G-CSF_E的DSC热分析图。

图15呈现示出溴脱氧尿苷(BrdU)测定结果的图表，其示出表达以下的增殖32D-IL-2RβIL2Rb细胞：A)G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rb(同二聚体)或B)G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rb+G-CSFR_WT-ICD_gc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)或G-CSF_WT(A中的100ng/ml或B中的30ng/ml)刺激细胞。

图16呈现示出BrdU测定结果的图表，其示出表达以下的32D-IL-2Rβ细胞的增殖：A)G-CSFR₁₃₇-ICD_gp130-IL-2Rb(同二聚体)；或B)G-CSFR₁₃₇-ICD_IL-2Rb+G-CSFR₁₃₇-ICD_gc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、G-CSF_WT(30ng/ml)或G-CSFR₁₃₇(30ng/ml)刺激细胞。

图17呈现示出BrdU测定结果的图表，其示出表达以下的32D-IL-Rβ细胞的增殖：A)G-CSFR_WT-ICD_gp130-IL-2Rb(同二聚体)；或B)G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rb+G-CSFR_WT-ICD_gc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、G-CSF_WT(30ng/ml)或G-CSFR₁₃₇(30ng/ml)刺激细胞。

图18呈现蛋白质印迹，其示出表达以下的32D-IL-2Rβ细胞的信号传导：G-CSFR_WT-ICD_gp130-IL-2Rb(同二聚体)、G-CSFR₁₃₇-ICD_gp130-IL-2Rb(同二聚体)、G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rb+G-CSFR_WT-ICD_gc(异二聚体)或G-CSFR₁₃₇-ICD_IL-2Rb+G-CSFR₁₃₇-ICD_gc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、G-CSF_WT(30ng/ml)或G-CSFR₁₃₇(30ng/ml)刺激细胞。

图19呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估响应于未用细胞因子刺激、用IL-2或WT、130、304或307细胞因子的刺激而表达所指示嵌合受体的原代鼠T细胞(或未转导细胞)的细胞周期进展。A和B表示实验重复。

图20呈现天然IL-2Rβ、IL-2Rγc和G-CSFR亚基以及G2R-1受体亚基设计的示意图。

图21呈现示出32D-IL-2Rβ细胞(其是稳定表达人IL-2Rβ亚基的32D细胞系)的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表，所述细胞表达所指示的G-CSFR嵌合受体亚基并且用WT G-CSF、IL-2刺激或未用细胞因子刺激。将G/γc在其N末端用Myc表位标记(Myc/G/γc)，并且将G/IL-2Rβ在其N末端用Flag表位标记(Flag/G/IL-2Rβ)；这些表位标签有助于通过流式细胞术进行检测，并且不会影响受体的功能。此外，B-D中的下图示出了在每种培养条件下表达G-CSFR ECD(％G-CSFR+)的细胞的百分比。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。

图22呈现示出表达仅Flag-标记的G/IL-2Rβ亚基、仅Myc-标记的G/γc亚基或全长G-CSFR的人T细胞的扩增(细胞数的倍数变化)的图表。A-D)PBMC来源的T细胞；E-H)肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。

图23呈现天然受体和嵌合受体的示意图，其示出JAK、STAT、Shc、SHP-2和PI3K结合位点。阴影方案包括来自图20的受体。

图24呈现嵌合受体的示意图，其示出JAK、STAT、Shc、SHP-2和PI3K结合位点。阴影方案包括来自图20和23的受体。

图25呈现含有G2R-2cDNA插入物的慢病毒质粒的图。

图26呈现示出用G2R-2转导的细胞中通过流式细胞术评估的G-CSFR ECD表达的图表。A)32D-IL-2Rβ细胞系；B)PBMC来源的人T细胞和人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。

图27呈现示出与未转导细胞相比表达G2R-2的细胞的扩增(细胞数的倍数变化)的图表。A)人PBMC来源的T细胞；B、C)来自两次独立实验的人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。

图28呈现示出与未转导细胞相比表达G2R-2的CD4-或CD8-选择的人肿瘤相关淋巴细胞的扩增(细胞数的倍数变化)的图表。A)未转导的CD4-选择的细胞；B)未转导的CD8-选择的细胞；C)用G2R-2转导的CD4-选择的细胞；D)用G2R-2转导的CD8-选择的细胞。灰色虚线表示用IL-2刺激的细胞。黑色实线表示用G-CSF刺激的细胞。灰色虚线表示未用细胞因子刺激的细胞。

图29呈现示出表达G2R-2的CD4+或CD8+肿瘤相关淋巴细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。正如所示，使细胞最初在G-CSF或IL-2中扩增。然后将细胞铺板在IL-2、G-CSF或仅培养基中。灰色实线表示用IL-2刺激的细胞。灰色实线表示用IL-2刺激的细胞。黑色实线表示用G-CSF刺激的细胞。浅灰色虚线表示在IL-2中扩增并然后仅用培养基刺激的细胞。深灰色虚线表示在G-CSF中扩增并然后仅用培养基刺激的细胞。

图30呈现示出在G-CSF或IL-2中扩增后表达G2R-2嵌合受体构建体的CD4-或CD8-选择的肿瘤相关淋巴细胞(TAL)相对于未转导细胞的免疫表型(通过流式细胞术)的图表。A)示出CD4+、CD8+或CD3-CD56+细胞表面表型的活细胞的百分比。B)示出基于CD45RA和CCR7表达的所指示细胞表面表型的活细胞的百分比。

图31呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达G2R-2的原代人T细胞相对于未转导细胞的增殖。正如所示，在测定之前，通过在IL-2或G-CSF中培养来选择T细胞。A)肿瘤相关淋巴细胞；B)PBMC来源的T细胞。

图32呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达G2R-2或单链G/IL-2Rβ(G2R-1的组分)的原代鼠T细胞相对于模拟(mock)转导细胞的增殖。A)转导效率，如通过在所指示细胞因子中培养后表达G-CSFR ECD的细胞百分比(通过流式细胞术)所反映；B)所有活细胞中响应于所指示细胞因子的BrdU掺入百分比；C)表达G-CSFR ECD的细胞(G-CSFR+细胞)的BrdU掺入百分比。在测定之前，将所有细胞在IL-2中扩增3天。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。

图33呈现蛋白质印迹，以检测表达G2R-2的人原代T细胞相对于未转导细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白、总Akt和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。A、B)肿瘤相关淋巴细胞(TAL)；C)PBMC来源的T细胞。

图34呈现蛋白质印迹，以检测表达G2R-2或单链G/IL-2Rβ(来自G2R-1)的原代鼠T细胞相对于模拟转导细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。箭头指示特定的磷酸-JAK2条带；其他较大条带被推测是第一抗磷酸-JAK2抗体与磷酸-JAK1交叉反应的结果。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图35呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达所指示嵌合受体的32D-IL-2Rβ细胞(或未转导细胞)响应于未用细胞因子刺激、用IL-2(300IU/mL)、WT G-CSF(30ng/mL)或130G-CSF(30ng/mL)的刺激的细胞周期进展。

图36呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估响应于未用细胞因子刺激、用IL-2、WT G-CSF或G-CSF变体130、304或307的刺激而表达所指示嵌合受体的原代鼠T细胞(或未转导细胞)的细胞周期进展。A和B表示实验重复。

图37呈现蛋白质印迹，以检测表达所指示嵌合受体亚基的32D-IL-2Rβ细胞(或未转导细胞)响应于未用细胞因子刺激、用IL-2、WT G-CSF或130G-CSF的刺激的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图38呈现A)蛋白质印迹，以检测表达所指示嵌合受体亚基的原代鼠T细胞响应于未用细胞因子刺激、用IL-2、WT G-CSF、130G-CSF或304G-CSF的刺激的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。B)图A中所用的细胞的转导效率，如通过流式细胞术用对人G-CSF受体的胞外结构域具有特异性的抗体所评估。

图39呈现示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)中得到的G-CSFR ECD表达的图。对活的CD3+、CD56-细胞针对CD8或CD4设门，并示出每个群体的G-CSFR ECD表达。

图40呈现示出表达G2R-3的原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)相对于未转导细胞的扩增、增殖和信号传导的图表和图像。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用G2R-3编码慢病毒转导，洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。每3-4天对活细胞进行计数。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。B)蛋白质印迹，评估细胞内信号传导事件。从扩增测定中收获细胞，并用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激。箭头指示在125kDa处的特定的磷酸-JAK2条带；较大条带被推测是第一抗磷酸-JAK2抗体与磷酸-JAK1交叉反应的结果。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。C)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。

图41呈现示出表达具有WT ECD的G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的扩增倍数和G-CSFR ECD表达的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用编码G2R-3的慢病毒转导。在第1天，向培养物中添加WT G-CSF(100ng/ml)或不添加细胞因子(仅培养基)。此后，至第21天，用含有WT G-CSF或无细胞因子的培养基补充细胞。在扩增第21天，将细胞洗涤并重新铺板在WT G-CSF(100ng/mL)、IL-7(20ng/mL)和IL-15(20ng/mL)或无细胞因子中。每2-4天对活细胞进行计数。正方形表示用G-CSF刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激，并在第21天重新铺板在IL-7和IL-15中的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。菱形表示用G-CSF刺激，并且在第21天重新铺板在仅培养基中的细胞。B)示出G-CSFR ECD的表达的图表，如在扩增第21天或第42天通过流式细胞术所测定。

图42呈现示出表达G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的细胞内信号传导和免疫表型的图表。A)蛋白质印迹，以评估细胞内信号传导事件。从扩增测定中收获细胞，并用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激。β-肌动蛋白充当蛋白质负载对照。B、C)代表性流式细胞术图和图表，其示出在扩增第42天通过流式细胞术评估的表达G2R-3的细胞相对于未转导细胞的免疫表型。

图43呈现示出表达具有304或307ECD的G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的扩增倍数的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用编码G2R-3304ECD的慢病毒转导。B)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用编码G2R-3307ECD的慢病毒转导。C)示出未转导细胞的T细胞扩增测定结果的图表。正如所示，在第2天向培养物中添加IL-2(300IU/mL)、304G-CSF(100ng/ml)、307G-CSF(100ng/mL)或不添加细胞因子(仅培养基)，且此后每两天补充一次。每3-4天对活细胞进行计数。菱形表示用304G-CSF刺激的细胞。正方形表示用307G-CSF刺激的细胞。三角形表示用IL-2刺激的细胞。倒三角形表示未用细胞因子刺激的细胞。

图44呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达具有304或307ECD的G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的增殖。用编码G2R-3 304ECD或307ECD的慢病毒转导细胞，并在304或307G-CSF(100ng/mL)中扩增。使未转导细胞在IL-2(300IU/mL)中扩增。在扩增第12天洗涤细胞，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。

图45呈现示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞中得到的G-CSFR ECD表达的图表。

图46示出在表达G21R-1或G21R-2的原代PBMC来源的人T细胞中G-CSF诱导的STAT3磷酸化(通过流式细胞术检测)。将细胞细分(即设门)为G-CSFR阳性(上图)或G-CSFR阴性(下图)群体。

图47呈现示出在表达G21R-1或G12R-1的原代鼠T细胞中G-CSF诱导的生化信号传导事件的图表和图像。A)示出用G21R-1转导并未用细胞因子刺激、用IL-21或G-CSF刺激的CD4+或CD8+细胞中STAT3(通过流式细胞术检测)的磷酸化的图表。B)示出在没有用细胞因子(黑色圆圈)、用IL-21(正方形)或WT G-CSF(灰色圆圈)刺激后磷酸-STAT3染色呈阳性的细胞百分比的图表。对活细胞针对CD8或CD4设门，并示出每个群体的磷酸-STAT3-阳性细胞百分比。C)蛋白质印迹，以评估表达G21R-1或G12R-1并用IL-21、IL-12或WT G-CSF刺激的细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图48呈现示出表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1和G27/2R-1的原代鼠T细胞或模拟转导T细胞中的增殖、G-CSFR ECD表达和WT G-CSF诱导的细胞内信号传导事件的图表和图像。A、B)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。图A和B是实验重复。C)示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞中得到的G-CSFR ECD表达的图表。D)蛋白质印迹，以评估表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1和G27/2R-1的细胞或模拟转导T细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。用IL-2(300IU/mL)、IL-7(10ng/mL)、IL-21(10ng/mL)、IL-27(50ng/mL)或G-CSF(100ng/mL)刺激细胞。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图49呈现示出表达G21/2R-1、G12/2R-1和21/12/2R-1的原代鼠T细胞或模拟转导T细胞的增殖、G-CSFR ECD表达和G-CSF诱导的生化信号传导事件的图表和图像。A、B)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。图A和B是实验重复。C)示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞中得到的G-CSFR ECD表达的图表。D)蛋白质印迹，以评估表达G21/2R-1、G12/2R-1和G21/12/2R-1的细胞或模拟转导T细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。用IL-2(300IU/mL)、IL-21(10ng/mL)、IL-12(10ng/mL)或G-CSF(100ng/mL)刺激细胞。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图50呈现示出表达具有134ECD的G12/2R-1的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的扩增倍数和G-CSFR ECD表达的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中将细胞用编码G12/2R-1 134ECD的慢病毒转导并在IL-2(300IU/mL)、130G-CSF(100ng/ml)或培养基中扩增。每4-5天对活细胞进行计数。正方形表示未用细胞因子刺激的细胞。三角形表示用130G-CSF刺激的细胞。菱形表示用IL-2刺激的细胞。B)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞如在图A中被转导。在扩增第19天，洗涤细胞并在IL-2、130G-CSF或仅培养基中重新铺板。每4-5天对活细胞进行计数。正方形表示未用细胞因子刺激的细胞。浅灰色菱形表示用130G-CSF刺激的细胞。深灰色菱形表示用IL-2刺激的细胞。浅灰色倒置三角形表示最初用IL-2刺激且然后在第19天重新铺板在仅培养基中的细胞。深灰色三角形表示最初用130G-CSF刺激然后在第19天重新铺板在仅培养基中的细胞。C)示出G-CSFR ECD的表达的图表，如在扩增第4天或第16天通过流式细胞术所测定。

图51呈现示出表达G12/2R-1 134ECD的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的增殖和免疫表型的图表。A)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。将细胞收获、洗涤并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、IL-2+IL-12(分别为300IU/ml和10ng/mL)、130G-CSF(300ng/ml)或仅培养基中。B、C)代表性流式细胞术图和图表，其示出在扩增第16天通过流式细胞术评估的表达具有134ECD的G12/2R-1的细胞相对于未转导细胞的免疫表型。

图52呈现示出表达具有304ECD的G12/2R-1的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的扩增倍数和增殖的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中将细胞用编码G12/2R-1 134ECD的慢病毒转导，并且在IL-2(300IU/mL)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)或仅培养基中扩增。在IL-2、130G-CSF、304G-CSF或仅培养基中培养未转导细胞。每3-4天对活细胞进行计数。倒三角形表示未用细胞因子刺激的细胞。三角形表示用IL-2刺激的细胞。圆圈表示用130G-CSF刺激的细胞。菱形表示用304G-CSF刺激的细胞。B)在第12天从扩增测定中收获细胞，并洗涤并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(300ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307G-CSF(100ng/ml)或仅培养基中。

图53呈现蛋白质印迹，以检测在表达具有304ECD的G2R-3、具有304ECD的G12/2R-1的原代PBMC来源的T细胞或未转导T细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。从扩增测定中收获细胞，并如所示用304G-CSF(100ng/mL)、IL-2(300IU/mL)、IL-2和IL-12(10ng/mL)或仅培养基刺激。黑色箭头和右侧出露图指示蛋白质阶梯的115kDa和140kDa处的分子量标记。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图54呈现重折叠的130a1 G-CSF(标记为GCSF_130a1)以及用考马斯蓝(Coomassieblue)染色的对应SDS PAGE纯度凝胶的尺寸排阻UV迹线。重折叠的130a1 G-CSF以相对于已知分子量的标准物的预期体积洗脱。

图55呈现BrdU掺入测定的结果，以评估(A、B、C)OCI-AML1细胞(天然表达野生型(WT)人G-CSFR)或(D、E)32D克隆3细胞(天然表达WT鼠G-CSFR)的增殖。用下列细胞因子刺激细胞：(A)WT G-CSF或G-CSF变体130、130a1、130b1、130a2或130b2；(B)WT G-CSF或G-CSF变体130、130a1或130b1，或仅培养基(未添加细胞因子)；(C)WT G-CSF或G-CSF变体130、130a1或130a1b1，或仅培养基；(D)WT G-CSF或G-CSF变体130、130a1或130b1，或仅培养基；和(E)WT G-CSF或G-CSF变体130、130a1或130a1b1，或仅培养基。实心正方形表示WT G-CSF；实心三角形表示130G-CSF；实心倒三角形表示130a1 G-CSF；空心圆圈表示130a2 G-CSF；实心菱形表示130b1 G-CSF；空心正方形表示130bd G-CSF；空心菱形表示130a1b1 G-CSF。

图56呈现BrdU掺入测定的结果，以评估表达G12/2R-1 134ECD的PBMC来源的人T细胞的增殖。用(A)仅培养基或培养基加IL-2、IL-2+IL-12或G-CSF变体130、130a1、130b1、130a2或130b2；或(B)仅培养基或培养基加IL-2、IL-2+IL-12或G-CSF变体130或130a1b1刺激细胞。示出表达G12/2R-1 134ECD的T细胞的结果(即，通过流式细胞术检测为G-CSFR+的T细胞)。

图57呈现体内实验的结果，以确定用肿瘤特异性CD8 T细胞(Thy1.1+OT-I T细胞)进行过继细胞疗法的安全性和有效性，所述肿瘤特异性CD8 T细胞被逆转录病毒转导以表达G2R-3 134ECD，然后被输注到携带已确定的乳腺肿瘤(NOP23肿瘤系)的同系具免疫力的小鼠中。从T细胞输注当天(第0天)开始，将小鼠随机分组，并且每天用媒介物(n＝4只动物)或130a1 G-CSF(10mg/剂量；n＝4只动物)处理14天，然后每隔一天处理14天，总共21次剂量。(A)从第-2天至第80天的肿瘤面积(长×宽)。每条线表示来自单独动物的结果。(B)从第-2天至第20天的肿瘤面积的更高分辨率视图。(C)示出从第0天至第80天存活的动物的百分比的Kaplan-Meier图。(D)示出为Thy1.1+(OT-I)细胞相对于所有CD8+T细胞的平均百分比(平均值+/-SEM)的外周血中OT-I T细胞的扩增。(E)外周血中嗜中性粒细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。(F)外周血中嗜酸性粒细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。(G)外周血中单核细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。灰色圆圈表示媒介物处理的动物，并且黑色三角形表示130a1 G-CSF处理的动物。

图58呈现体内实验的结果，以确定用肿瘤特异性CD8 T细胞(Thy1.1+OT-I T细胞)进行过继细胞疗法的安全性和有效性，所述肿瘤特异性CD8 T细胞被逆转录病毒转导以表达G12/2R-1 134ECD，然后被输注到携带已确定的乳腺肿瘤(NOP23肿瘤系)的同系具免疫力的小鼠中。从T细胞输注当天(第0天)开始，将小鼠随机分组，并且每天用媒介物(n＝4只动物)或130a1 G-CSF(10mg/剂量；n＝3只动物)处理14天，然后每隔一天处理14天，总共21次剂量。(A)从第-2天至第80天的肿瘤面积(长×宽)。每条线表示来自单独动物的结果。(B)从第-2天至第20天的肿瘤面积的更高分辨率视图。(C)示出从第0天至第80天存活的动物的百分比的Kaplan-Meier图。(D)示出为Thy1.1+(OT-I)细胞相对于所有CD8+T细胞的平均百分比(平均值+/-SEM)的外周血中OT-I T细胞的扩增。(E)外周血中嗜中性粒细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。(F)外周血中嗜酸性粒细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。(G)外周血中单核细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。灰色圆圈表示媒介物处理的动物，并且黑色三角形表示130a1 G-CSF处理的动物。

图59呈现来自图4和图5中所示的实验的三个对照组的结果。肿瘤特异性CD8 T细胞(Thy1.1+OT-I T细胞)经历了模拟逆转录病毒转导程序，然后被输注到携带已确定的乳腺肿瘤(NOP23肿瘤系)的同系具免疫力的小鼠中。从T细胞输注当天(第0天)开始，将小鼠随机分组，并且每天用媒介物(n＝4只动物)、IL-2(30,000IU/剂量；n＝5只动物)或130a1(10mg/剂量；n＝5只动物)处理14天，然后每隔一天处理14天，总共21次剂量。(A)从第-2天至第80天的肿瘤面积(长×宽)。每条线表示来自单独动物的结果。(B)从第-2天至第20天的肿瘤面积的更高分辨率视图。(C)示出从第0天至第80天存活的动物的百分比的Kaplan-Meier图。(D)示出为Thy1.1+(OT-I)细胞相对于所有CD8+T细胞的平均百分比(平均值+/-SEM)的外周血中OT-I T细胞的扩增。(E)外周血中嗜中性粒细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。(F)外周血中嗜酸性粒细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。(G)外周血中单核细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。灰色圆圈表示媒介物处理的动物；灰色正方形表示IL-2处理的动物；黑色三角形表示130a1 G-CSF处理的动物。

图60呈现野生型细胞因子受体亚基和额外的嵌合受体设计的示意图。

图61呈现示出用G4R 134ECD转导的人PBMC来源的CD3+T细胞上G-CSFR 134ECD的细胞表面表达的流式细胞术数据。未转导的T细胞充当阴性对照。

图62呈现示出表达(A)用仅培养基或培养基加IL-2、130a1 G-CSF或130a1 G-CSF+IL-2培养的G4R 134ECD的人PBMC来源的T细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。(B)用仅培养基或培养基加IL-2或130a1 G-CSF+307G-CSF培养的未转导的T细胞的结果。307G-CSF变体包括在后一条件中，以充当此实验的另一组的对照(未示出)；我们以前建立并在此证实，130a1 G-CSF和307G-CSF都不能诱导未转导的T细胞的增殖。菱形表示用130a1 G-CSF(图A)或130a1G-CSF+307G-CSF(图B)培养的细胞。三角形表示用IL-2培养的细胞。浅灰色圆圈表示用130a1 G-CSF和IL-2培养的细胞。黑色圆圈表示用仅培养基(未添加细胞因子)培养的细胞。

图63呈现示出BrdU掺入测定的结果的图表，以评估表达(A)G4R 134ECD的原代人T细胞相对于(B)未转导的T细胞的增殖。用仅培养基、IL-2、IL-4、IL2+IL-4、130a1 G-CSF或130a1 G-CSF+IL-2刺激细胞。单独呈现CD4+和CD8+T细胞亚群的数据。对图A中的数据针对表达G4R 134ECD的T细胞设门(使用抗人G-CSFR的抗体检测)。

图64呈现蛋白质印迹，以检测表达G4R 134ECD的人PBMC来源的T细胞相对于未转导的细胞中的所指示生化信号传导事件。用IL-2、IL-4或130a1 G-CSF刺激细胞。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图65呈现示出用编码G6R 134ECD的慢病毒转导的人PBMC来源的CD3+T细胞上G-CSFR 134ECD的细胞表面表达的流式细胞术数据。未转导的T细胞充当阴性对照。

图66呈现示出表达(A)G6R 134ECD的人PBMC来源的T细胞或(B)在仅培养基或具有IL-2、130a1 G-CSF或130a1 G-CSF+IL-2的培养基中培养的未转导的T细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。菱形表示用130a1 G-CSF刺激的细胞。三角形表示用IL-2刺激的细胞。浅灰色圆圈表示用130a1 G-CSF+IL-2刺激的细胞。黑色圆圈表示用仅培养基(未添加细胞因子)刺激的细胞。

图67呈现示出BrdU掺入测定的结果的图表，以评估与(B)未转导的T细胞相比，表达(A)G6R 134ECD的PBMC来源的人T细胞的增殖。用仅培养基或培养基加IL-2、IL-6、IL-2+IL-6、130a1 G-CSF或130a1 G-CSF+IL-2刺激细胞。单独示出CD4+和CD8+T细胞亚群的数据。对图A中的数据针对表达G4R 134ECD的T细胞设门(使用抗人G-CSFR的抗体检测)。

图68呈现蛋白质印迹，以检测表达G6R 134ECD的人PBMC来源的T细胞相对于未转导的细胞中的所指示生化信号传导事件。用IL-2、IL-6或130a1 G-CSF刺激细胞。组蛋白H3充当蛋白质负载对照。注意，在P-STAT3图像上，在IL-2刺激的条件下(特别是在未转导的T细胞中)出现了一条暗的、更高分子的条带。这是以前用磷酸-STAT5抗体探查此膜的残余信号。较低分子量的条带(箭头)表示磷酸-STAT3。

图69呈现示出用GEPOR 134ECD转导的人PBMC来源的CD3+T细胞上G-CSFR 134ECD的细胞表面表达的流式细胞术数据。未转导的T细胞充当阴性对照。

图70呈现示出表达(A)GEPOR 134ECD的原代人PBMC来源的T细胞或(B)在仅培养基或具有IL-2、130a1 G-CSF或130a1 G-CSF+IL-2的培养基中培养的未转导的T细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。对于未转导的T细胞，将307G-CSF添加至130a1 G-CSF条件中，以充当此实验的另一组的对照(未示出)；我们以前建立并在此证实，130a1 G-CSF和307G-CSF都不能诱导未转导的T细胞的增殖。菱形表示在130a1 G-CSF+/-307G-CSF中培养的细胞。三角形表示在IL-2中培养的细胞。浅灰色圆圈表示在130a1 G-CSF+IL-2中培养的细胞。黑色圆圈表示在仅培养基中培养的细胞。

图71呈现蛋白质印迹，以检测表达GEPOR 134ECD的人PBMC来源的T细胞相对于未转导的细胞中的所指示生化信号传导事件。用仅培养基或培养基加IL-2或130a1 G-CSF刺激细胞。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图72呈现示出用GIFNAR 134ECD转导的人PBMC来源的CD3+T细胞上G-CSFR 134ECD的细胞表面表达的流式细胞术数据。未转导的T细胞充当阴性对照。

图73呈现示出(A)未经转导或(B)经转导以表达GIFNAR 134ECD并在仅培养基或具有IL-2、130a1 G-CSF或130a1 G-CSF+IL-2的培养基中培养的原代人PBMC来源的T细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。菱形表示在130a1 G-CSF中培养的细胞。三角形表示在IL-2中培养的细胞。浅灰色圆圈表示在130a1 G-CSF+IL-2中培养的细胞。黑色圆圈表示在仅培养基中培养的细胞。

图74呈现蛋白质印迹，以检测表达GIFNAR 134ECD的人PBMC来源的T细胞相对于未转导的细胞中的所指示生化信号传导事件。用仅培养基或培养基加IL-2、IFNa或130a1 G-CSF刺激细胞。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图75呈现示出用(A)GIFNGR-1 307ECD、(B)G2R3 134ECD、(C)GIFNGR-1 307ECD和G2R3 134ECD转导的人PBMC来源的T细胞或(D)未转导的T细胞的表面上的Myc标签和Flag标签表达的流式细胞术数据。G2R3 134ECD在其N末端用Myc表位(EQKLISEEDL)标记，并且GIFNGR-1 307ECD在其N末端用Flag表位(DYKDDDDK)标记；表位标签有助于通过流式细胞术进行检测，并且不会影响受体的功能。对图针对CD3+细胞设门。

图76呈现示出用(A)GIFNGR-2 307ECD、(B)G2R3 134ECD、(C)GIFNGR-2 307ECD和G2R3 134ECD转导的人PBMC来源的T细胞或(D)未转导的T细胞的表面上的Myc标签和Flag标签表达的流式细胞术数据。G2R3 134ECD在其N末端用Myc表位(EQKLISEEDL)标记，并且GIFNGR-2 307ECD在其N末端用Flag表位(DYKDDDDK)标记；表位标签有助于通过流式细胞术进行检测，并且不会影响受体的功能。对图针对CD3+细胞设门。

图77呈现示出(A)未经转导、(B)经转导以表达GIFNGR-1 307ECD或(C)经共转导以表达GIFNGR-1 307ECD和G2R-3 134ECD的原代人PBMC来源的T细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。在仅培养基中或具有IL-2、130a1 G-CSF和307G-CSF的所指示组合的培养基中培养T细胞。菱形和浅灰色圆圈表示在130a1 G-CSF、307G-CSF和IL-2的所指示组合中培养的细胞。三角形表示在IL-2中培养的细胞。黑色圆圈表示在仅培养基中培养的细胞。

图78呈现示出(A)未经转导、(B)经转导以表达GIFNGR-2 307ECD或(C)经共转导以表达GIFNGR-2 307ECD和G2R-3 134ECD的原代人PBMC来源的T细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。在仅培养基中或具有IL-2、130a1 G-CSF和307G-CSF的所指示组合的培养基中培养T细胞。菱形和浅灰色圆圈表示在130a1 G-CSF、307G-CSF和IL-2的所指示组合中培养的细胞。三角形表示在IL-2中培养的细胞。黑色圆圈表示在仅培养基中培养的细胞。

图79呈现示出BrdU掺入测定的结果的图表，以评估表达G2R-3134ECD和/或GIFNGR-1 307ECD的人PBMC来源的T细胞的增殖。示出了(A)未转导的T细胞或表达所指示嵌合受体的(B)CD4+和(C)CD8+T细胞的数据(见X轴)。用IL-2、IFNg、130a1 G-CSF、307G-CSF的所指示组合或仅培养基刺激细胞。

图80呈现示出BrdU掺入测定的结果的图片，以评估表达G2R-3134ECD和/或GIFNGR-2 307ECD的人PBMC来源的T细胞的增殖。示出了(A)未转导的T细胞或表达所指示嵌合受体的(B)CD4+和(C)CD8+T细胞的数据(见X轴)。用IL-2、IFNg、130a1 G-CSF、307G-CSF的所指示组合或仅培养基刺激细胞。

图81呈现蛋白质印迹，以检测表达GIFNGR-1 307ECD或GIFNGR-2 307ECD的人PBMC来源的T细胞相对于未转导的细胞中的所指示生化信号传导事件。用仅培养基或培养基加IL-2、IFNg或307G-CSF刺激细胞。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。

图82呈现示出在用下列单顺反子或双顺反子慢病毒构建体转导的人PBMC来源的CD3+T细胞上G2R-3 134ECD和间皮素特异性CAR的细胞表面表达的流式细胞术数据：(A)未转导的T细胞(阴性对照)；(B)仅间皮素CAR；(C)仅G2R-3 134ECD；(D)CAR_T2A_G2R-3-134ECD，其具有呈下列顺序的基因片段：间皮素CAR、T2A位点和G2R-3 134ECD；和(E)G2R-3-134ECD_T2A_CAR，其具有呈下列顺序的基因片段：间皮素CAR、T2A位点和G2R-3 134ECD。

图83呈现示出在用下列单顺反子或双顺反子慢病毒构建体转导的人PBMC来源的CD3+T细胞上G12/2R-1 134ECD和间皮素特异性CAR的细胞表面表达的流式细胞术数据：(A)未转导的T细胞(阴性对照)；(B)仅间皮素CAR；(C)仅G2R-3 134ECD；(D)CAR_T2A_G12/2R-1-134ECD，其具有呈下列顺序的基因片段：间皮素CAR、T2A位点、G12/2R-1 134ECD；和(E)G12/2R-1-134ECD_T2A_CAR，其具有呈下列顺序的基因片段：间皮素CAR、T2A位点和G12/2R-1134ECD。

图84呈现BrdU掺入测定的结果，以评估如下修饰的PBMC来源的人T细胞的增殖：(A)未转导或仅表达间皮素CAR；或(B)表达G2R3 134ECD，或双顺反子CAR_T2A_G2R3-134ECD，或双顺反子CAR_T2A_G12/2R-1-134ECD，或双顺反子G12/2R-1-134ECD_T2A_CAR构建体。用仅培养基或培养基加IL-2或130a1 G-CSF刺激细胞。图B中的结果示出通过流式细胞术对G-CSFR ECD表达呈阳性的T细胞。

图85呈现体外共培养测定的结果，以评估在表达以下的PBMC来源的人CD4+T细胞中间皮素CAR的功能特性：(A)仅间皮素CAR；(B)仅G12/2R-1 134ECD，或含有间皮素CAR的下列双顺反子构建体；(C)CAR_T2A_G2R3-134 ECD；(D)G2R3-134 ECD_T2A_CAR；(E)CAR_T2A_G12/2R-1-134ECD；或(F)G12/2R-1-134ECD_T2A_CAR。细胞未经刺激或用OVCAR3细胞刺激13小时，然后用细胞内流式细胞术检测细胞因子IFNg、TNFa和IL-2以及表面分子CD69和CD137的表达。对图A、图C、图D、图E和图F中的结果针对表达间皮素CAR的细胞设门。

图86是天然细胞因子受体的示意图，包括IL-7Ra、IL-2Rb、gp130、IL-21R、IL-12Rb2和IL-4Ra。

图87是7/2R-1、7/2R-2、7/2/12R-1、7/2/12R-2、7/21R-1、7/21R-2、7/7/21R-1、7/7/21R-2、7/2/21R-1、7/2/21R-27/2/12/21R-1、7/2/12/21R-2、7/2/12/21R-3、7/2/12/21R-4、7/4R-1、7/4R-2、7/6R-1和7/6R-2受体亚基设计的示意图。

图88呈现示出通过流式细胞术在以下中评估的人CD127(IL-7Ra)和Flag-tag表达的图表：(A)用7/2R-1转导的原代人PBMC来源的T细胞，(B)未转导的T细胞，或(C)用7/2R-1转导但作为荧光减一(FMO)对照染色的T细胞(即，抗CD127的抗体被排除在抗体染色组之外)。将7/2R-1在其N末端用Flag表位标记；表位标签有助于通过流式细胞术进行检测，并且不影响受体的功能。在慢病毒转导后12天分析受体表达。

图89呈现示出(A)表达7/2R-1的原代人PBMC来源的T细胞相对于(B)未转导的T细胞和用IL-7、IL-7+IL-15或无细胞因子培养的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。菱形表示用IL-7刺激的细胞。三角形表示用IL-7和IL-15刺激的细胞。圆圈表示在仅培养基(未添加细胞因子)中培养的细胞。

图90呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达(A)7/2R-1的原代人T细胞相对于(B)未转导的细胞的增殖。用IL-7、IL-2、IL-2+IL-7或仅培养基(未添加细胞因子)刺激细胞。单独示出CD4+和CD8+T细胞亚群的结果。

图91呈现蛋白质印迹，以检测表达7/2R-1的人原代T细胞相对于未转导的细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。用IL-7、IL-2、IL-2+IL-7或仅培养基(未添加细胞因子)刺激细胞。

图92呈现SDS-PAGE凝胶，以检测未修饰的130a1 G-CSF和聚乙二醇化形式的130a1G-CSF(PEG20k_G-CSF_130a1)和307G-CSF(PEG20k_G-CSF_307)。用考马斯亮蓝对凝胶染色。

图93呈现体内实验的结果，以确定用肿瘤特异性CD8 T细胞(Thy1.1+OT-I T细胞)进行过继细胞疗法的安全性和有效性，所述肿瘤特异性CD8 T细胞被逆转录病毒转导以表达G4R 134ECD，然后被输注到携带已确定的乳腺肿瘤(NOP23肿瘤系)的同系具免疫力的小鼠中。从T细胞输注当天(第0天)开始，将小鼠随机分组，并且每天用媒介物(n＝3只动物)或130a1 G-CSF(10mG/剂量；n＝3只动物)处理14天，然后每隔一天处理14天，总共21次剂量。(A)从第0天至第46天的肿瘤面积(长×宽)。每条线表示来自单独动物的结果。(B)示出为Thy1.1+(OT-I)细胞相对于所有CD8+T细胞的平均百分比(平均值+/-标准偏差[SD])的外周血中OT-I T细胞的扩增。(C)表现出T效应记忆(Tem；CD44+CD62L-)表型的OT-I T细胞(Thy1.1+)的百分比(平均值+/-SD)。(D)表现出Tem表型的宿主(Thy1.1-)CD8+T细胞的百分比(平均值+/-SD)。(E)表达程序性死亡-1(PD-1)的OT-I T细胞(Thy1.1+)的百分比(平均值+/-SD)。(F)表达PD-1的宿主(Thy1.1-)CD8+T细胞的百分比(平均值+/-SD)。(G)外周血中宿主(Thy1.1-)CD3+T细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SD)。(H)外周血中宿主(Thy1.1-)CD19+B细胞相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SD)。灰色圆圈表示媒介物处理的动物，并且黑色三角形表示130a1 G-CSF处理的动物。

图94呈现体外实验的结果，以比较聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化版本的G-CSF(野生型，130a1和307)刺激表达G2R-3 134ECD或天然G-CSF受体的细胞的增殖的能力。数据呈现为重复孔的平均值和标准偏差。(A)用所指示细胞因子刺激表达G2R-3 134ECD的人PBMC来源的CD4和CD8 T细胞：人IL-2(Proleukin，300IU/ml，阳性对照)、仅培养基(阴性对照)或所指示浓度的野生型G-CSF、聚乙二醇化的野生型G-CSF、130a1 G-CSF或聚乙二醇化的130a1 G-CSF。将细胞培养48小时并通过BrdU掺入测定进行评估。示出了对人G-CSFR呈阳性的T细胞的结果。(B)使用天然表达野生型人G-CSF受体的人髓样细胞系OCI-AML-1进行类似的实验。用所指示细胞因子刺激细胞：人GM-CSF(20ng/ml，阳性对照)、仅培养基(阴性对照)或所指示浓度的野生型G-CSF、聚乙二醇化野生型G-CSF、130a1G-CSF、聚乙二醇化130a1G-CSF、307G-CSF或聚乙二醇化307G-CSF。将细胞培养48小时并通过BrdU掺入测定进行评估。

图95呈现比较聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化版本的130a1G-CSF在表达G2R-3134ECD的人PBMC来源的T细胞中诱导所指示生化信号传导事件的能力的体外蛋白质印迹实验的结果。用人IL-2(Proleukin，300IU/ml)或所指示浓度(ng/ml)的非聚乙二醇化或聚乙二醇化(PEG)版本的130a1 G-CSF刺激T细胞20分钟。组蛋白H3和总S6充当凝胶负载对照。

图96呈现比较每天、每三天或每周间隔给予的聚乙二醇化(PEG)相对于非聚乙二醇化版本的130a1 G-CSF的效力的体内实验的结果。肿瘤特异性CD8 T细胞(Thy1.1+OT-I T细胞)被逆转录病毒转导以表达G2R-3 134ECD，然后被输注到携带已确定的乳腺肿瘤(NOP23肿瘤系)的同系具免疫力的小鼠中。绘制46天为周期内的肿瘤尺寸(长×宽)。每条线代表来自单独动物的结果。右图是左图的扩展版本。从T细胞输注当天(第0天)开始，将小鼠随机分组，并且按照指示用媒介物、130a1 G-CSF或PEG-130a1 G-CSF处理。(A、B)“每日”给药队列每天接受所指示的细胞因子(或媒介物)持续14天，然后每隔一天接受持续14天，总共21次剂量。(C、D)“每三天”给药队列每三天接受所指示的细胞因子，总共9次剂量。(E、F)“每周”给药队列每七天接受所指示的细胞因子，总共4次剂量。

图97示出来自图96中所示的实验的指定时间点的外周血中OT-IT细胞的扩增和效应记忆(Tem)表型。左图示出Thy1.1+(OT-I)T细胞相对于所有CD8+T细胞的百分比(平均值+/-SD)。右图示出具有Tem(CD44+CD62L-)表型的Thy1.1+(OT-I)T细胞的百分比(平均值+/-SD)。(A、D)“每日”给药队列。(B、E)“每三天”给药队列。(C、F)“每周”给药队列。

图98示出在来自图102和图103中所示的实验的“每三天”队列的指定时间点的外周血中所指示免疫细胞亚群(相对于所有CD45+细胞)的百分比。绘制了平均值和标准偏差。(A)嗜中性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G+)。(B)单核细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、SSC-低(Ly6C+或Ly6C-)。(C)嗜酸性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、SSC-高)。(D)CD3+T细胞。(E)CD19+B细胞。(F)NK1.1+自然杀伤细胞。

图99示出来自IL-18控制的旁分泌信号传导(CPS)实验的体外数据。用编码间皮素特异性CAR、T2A位点和G12/2R-1 134ECD的双顺反子载体(Meso CAR_G12/2R-1)或编码间皮素特异性CAR、T2A位点、G12/2R-1 134ECD和人IL-18的三顺反子载体(Meso CAR_G12/2R-1+h18)转导人PBMC来源的T细胞。(A)通过流式细胞术评估T细胞的间皮素CAR(X轴)和G12/2R-1 134ECD(Y轴)的表达。(B)使用体外BrdU测定来评估响应于以下的T细胞增殖：仅培养基；人IL-2(Proleukin，300IU/ml)；人IL-18(100ng/ml)；人IL-2+人IL-12(20ng/ml)；IL-2+IL-12+IL-18；或130a1 G-CSF(100ng/ml)。(C)使用ELISA来评估来自用以下刺激48小时的T细胞的培养上清液中的人IL-18水平：仅培养基；人IL-2(Proleukin，300IU/ml)+人IL-12(20ng/ml)；或130a1 G-CSF(100ng/ml)。

图100示出用鼠T细胞进行的体外IL-18CPS实验的结果。将小鼠CD4和CD8 T细胞用编码G12/2R-1 134ECD的单顺反子载体或编码G12/2R 134ECD、T2A位点和小鼠IL-18的双顺反子载体(G12/2R-1134ECD+m18)转导。(A)通过流式细胞术评估T细胞的G12/2R-1 134ECD的表达。(B)使用体外BrdU测定来评估响应于以下的T细胞增殖：仅培养基；人IL-2(Proleukin，300IU/ml)；鼠IL-18(100ng/ml)；人IL-2+鼠IL-12(10ng/ml)；IL-2+IL-12+IL-18；或130a1 G-CSF(100ng/ml)。(C)使用ELISA来评估来自用以下刺激48小时的T细胞的培养上清液中的鼠IL-18水平：仅培养基；人IL-2(Proleukin，300IU/ml)+鼠IL-12(10ng/ml)；或130a1 G-CSF(100ng/ml)。

图101示出用鼠OT-I T细胞进行的体外IL-18CPS实验的结果。用编码G2R-2134ECD、G2R-3 134ECD、G12/2R-1 134ECD或G12/2R-1 134ECD+m18(在图中缩写为G12/2R/18C)的逆转录病毒载体转导OT-I T细胞。为了检测分泌的细胞因子，五天后洗涤T细胞并在仅培养基(阴性对照)或具有人IL-2(Proleukin 300IU/ml)、人IL-2+鼠IL-12(10ng/ml)或聚乙二醇化(Peg)130a1(100ng/ml)的培养基中培养48小时，随后进行多重测定以检测32种细胞因子。示出了(A)鼠IL-18和(B)鼠IFN-γ的结果。其他细胞因子的结果示于表35中。

图102呈现比较NOP23乳腺肿瘤模型中的OT-I T细胞中的G7R-1、G2R-2、G12/2R-1和G12/2R-1+m18(缩写为G12/2R/18C)(均具有134ECD)的特性的体内实验的结果。肿瘤特异性CD8 T细胞(Thy1.1+OT-I T细胞)被逆转录病毒转导以表达G7R-1、G2R-2、G12/2R-1或G12/2R-1+m18(均具有134ECD)，然后被输注到携带已确定的NOP23乳腺肿瘤的同系具免疫力的小鼠中。从T细胞输注当天(第0天)开始，将小鼠随机分组以每周一次接受媒介物或聚乙二醇化(PEG)130a1 G-CSF(10mG/剂量)，总共四次处理。(A-D)示出在T细胞输注当天(第0天)转导的OT-I T细胞上受体(G-CSFR)表达的流式细胞术结果。(E-H)50天周期内的肿瘤尺寸(长×宽)。每条线表示单独的动物。(I-L)Thy1.1+OT-I细胞在系列血液样品中的扩增和持久性。(M-P)血液中表现出T效应记忆(Tem)表型(CD44+CD62L-)的Thy1.1+OT-I T细胞的百分比。

图103呈现比较不同剂量的聚乙二醇化(PEG)130a1 G-CSF或野生型IL-2的NOP23乳腺肿瘤模型中的体内实验的结果。将表达G2R-3134ECD的Thy1.1+OT-I T细胞输注到携带已确定的肿瘤的同系具免疫力的小鼠中。从T细胞输注当天(第0天)开始，将小鼠随机分组到六个细胞因子处理组：仅媒介物(在所有图中示出)；PEG-130a1 G-CSF 2mg/剂量，每周四次剂量(图A、图F、图K、图P)；(3)PEG-130a1G-CSF 0.4mg/剂量，每周四次剂量(图B、图G、图L、图Q)；(4)PEG-130a1 G-CSF 0.08mg/剂量，每周四次剂量(图C、图H、图M、图R)；(5)PEG-130a1 G-CSF，0.1mg的每日四次剂量，随后0.4mg的每周三次剂量(图D、图I、图N、图S)；或(6)人IL-2(Proleukin)，30,000IU/天，持续14天，然后每两天30,000IU，持续14天(图E、图J、图O、图T)。通过流式细胞术分析系列血液样品的以下参数：(A-E)Thy1.1+OT-I细胞相对于所有CD8+T细胞的百分比(平均值+/-SD)。(F-J)具有T效应记忆(Tem)表型(CD44+CD62L-)的Thy1.1+OT-I细胞的百分比(平均值+/-SD)。(K-O)嗜中性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G+)相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SD)。(P-T)嗜酸性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、SSC-高)相对于所有CD45+细胞的百分比(平均值+/-SD)。

具体实施方式

简言之，并如下文更详细描述，本文描述用于使用变体细胞因子受体和细胞因子对来选择性活化细胞的方法和组合物，其中所述细胞因子受体包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)。在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于专门活化用于过继细胞转移疗法(ACT)的细胞。因此，本文包括用于产生表达变体受体的细胞的方法，所述变体受体由不结合其天然受体的细胞因子选择性活化。本文还公开了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞，以及共同施用与G-CSFR的变体ECD结合的G-CSF的变体。在某些方面，本文所述的组合物和方法解决了对用于过继细胞转移方法的细胞的选择性活化的迫切需要，并且可以减少或消除对在过继细胞转移之前受试者的免疫耗竭或施用宽作用的刺激性细胞因子诸如IL-2的需要。

定义

除非另有规定，否则如下文所阐述的对权利要求书和说明书中使用的术语进行定义。

术语“治疗”是指在治疗疾病状态(例如癌症疾病状态)时的任何治疗方面有益的结果，包括其严重性或进展减轻、其缓解或其治愈。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠类、牛、马和猪。

术语“足够的量”是指足以产生所需效果的量，例如足以选择性地活化在细胞上表达的受体的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。

术语“可操作地连接”是指核酸或氨基酸序列被置于分别与另一种核酸或氨基酸序列的功能性关系中。通常，“可操作地连接”意指所连接的核酸序列或氨基酸序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相中。

如本文所用，术语“胞外结构域”(ECD)是指当在细胞表面上表达时位于质膜外部的受体(例如，G-CSFR)的结构域。在某些实施方案中，G-CSFR的ECD包含SEQ ID NO.2或SEQID NO.7的至少一部分。

如本文所用，术语“胞内结构域”(ICD)是指当受体在细胞表面上表达时位于细胞内的受体的结构域。

如本文所用，术语“跨膜结构域”(TMD或TM)是指当受体在细胞表面上表达时位于质膜内的细胞表面受体的结构域或区。

术语“细胞因子”是指与细胞因子受体结合并且在与细胞上表达的细胞因子受体结合并活化后可诱导细胞信号传导的小蛋白质(约5-20kDa)。细胞因子的实例包括但不限于：白介素、淋巴因子、集落刺激因子和趋化因子。

术语“细胞因子受体”是指与细胞因子结合的受体，包括1型和2型细胞因子受体。细胞因子受体包括但不限于G-CSFR、IL-2R(白介素-2受体)、IL-7R(白介素-7受体)、IL-12R(白介素-12受体)和IL-21R(白介素-21受体)。

如本文所用，术语“嵌合受体”是指经工程化以具有至少一个结构域(例如，ECD、ICD、TMD或C末端区)的至少一部分的跨膜受体，所述至少一个结构域源自一种或多种不同跨膜蛋白或受体的序列。

如本文所用，术语“位点II界面”、“位点II区”、“位点II界面区”或“位点II”是指G-CSF与G-CSFR的G-CSF:G-CSFR 2:2异二聚体结合界面中的较大者，位于G-CSF与G-CSFR的细胞因子受体同源(CRH)结构域之间的界面处。

如本文所用，术语“位点III界面”、“位点III区”、“位点III界面区”或“位点III”是指G-CSF与G-CSFR的G-CSF:G-CSFR 2:2异二聚体结合界面中的较小者，并且位于G-CSF与G-CSFR的N末端Ig样结构域之间的界面。

如本文所用，术语“至少一部分”或“一部分”在某些方面是指本文所述SEQ ID NO的连续核酸碱基或氨基酸长度的大于75％、大于80％、大于90％、大于95％、大于99％。在某些方面，本文所述的结构域或结合位点(例如，ECD、ICD、跨膜、C末端区或信号传导分子结合位点)的至少一部分可以与本文所述的SEQ ID NO.具有大于75％、大于80％、大于90％、大于95％、大于99％同一性。

术语“野生型”是指多肽的天然氨基酸序列或编码本文所述多肽的基因的天然核酸序列。蛋白质或基因的野生型序列是所述蛋白质或基因的物种的多肽或基因的最常见序列。

术语“变体细胞因子-受体对”、“变体细胞因子和受体对”、“变体细胞因子和受体设计”、“变体细胞因子-受体开关”或“正交细胞因子-受体对”是指通过氨基酸改变来修饰以(a)缺乏与天然细胞因子或同源受体的结合；并(b)特异性结合对应工程化(变体)配体或受体的基因工程化蛋白质对。

如本文所用，术语“变体受体”或“正交受体”是指变体细胞因子-受体对的基因工程化受体，并且包括嵌合受体。

如本文所用，术语“变体ECD”是指变体细胞因子-受体对的受体(例如，G-CSFR)的基因工程化胞外结构域。

如本文所用，术语“变体细胞因子”、“变体G-CSF”或“正交细胞因子”是指变体细胞因子-受体对的基因工程化细胞因子。

如本文所用，“不结合(do not bind)”、“不结合(does not bind)”或“不能结合”是指没有可检测的结合或结合不明显，即具有远低于天然配体的结合亲和力。

如本文所用，术语“选择性活化(selectively activates)”或“选择性活化(selective activation)”当提及细胞因子和变体受体时是指优先与变体受体结合的细胞因子，并且所述受体在细胞因子与变体受体结合后被活化。在某些方面，细胞因子选择性地活化已经共同演化以特异性结合细胞因子的嵌合受体。在某些方面，细胞因子是野生型细胞因子，并且它选择性地活化在细胞上表达的嵌合受体，而细胞因子的天然野生型受体不在细胞中表达。

如本文所用，术语“活性增强”是指在细胞上表达的变体受体在用变体细胞因子刺激时活性增加，其中所述活性是在用天然细胞因子刺激时对于天然受体观察到的活性。

术语“抗原结合信号传导受体”是指任何细胞表面蛋白或蛋白复合物，其可以结合抗原并在结合抗原时产生胞内信号。

如本文所用，术语“激动信号传导蛋白”是指结合靶结合分子(例如，蛋白质受体或抗原)的蛋白质，并且所述结合在含有靶结合分子的靶细胞中诱导一种或多种信号传导事件。相反，术语“拮抗信号传导蛋白”是指结合靶结合分子(例如，蛋白质受体或抗原)的蛋白质，并且所述结合在含有靶结合分子的靶细胞中抑制一种或多种信号传导事件(例如，通过干扰其他激动蛋白质以结合相同的靶分子)。

如本文所用，术语“亲和试剂”是指具有结合任何靶分子的能力的任何分子(例如，蛋白质、核酸等)。

术语“免疫细胞”是指已知起到支持生物体的免疫系统(包括先天免疫反应和适应性免疫反应)的功能的任何细胞，并且包括但不限于淋巴细胞(例如，B细胞、浆细胞和T细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞和粒细胞。免疫细胞包括干细胞、未成熟免疫细胞和分化细胞。免疫细胞还包括任何细胞亚群，无论在生物体中多么罕见或丰富。在某些实施方案中，通过携带免疫细胞类型和亚群体的已知标志物(例如，细胞表面标志物)来鉴定免疫细胞。

术语“T细胞”是指哺乳动物免疫效应细胞，其特征可以在于CD3和/或T细胞抗原受体的表达，所述细胞可以被工程化以表达直系同源细胞因子受体。在一些实施方案中，所述T细胞选自原初CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞，例如T_H2、T_H9、T_H11、T_H22、T_FH；调节性T细胞，例如T_R1、天然T_Reg、诱导型T_Reg；记忆T细胞，例如中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞和γδT细胞。

术语“G-CSFR”是指粒细胞集落刺激因子受体。G-CSFR也可以称为：GCSFR、G-CSF受体、集落刺激因子3受体、CSF3R、CD114抗原或SCN7。人G-CSFR由Ensembl识别号为ENSG00000119535的基因编码。人G-CSFR由与GeneBank登录号NM_156039.3相对应的cDNA序列编码。

术语“G-CSF”是指粒细胞集落刺激因子。G-CSF也可以称为集落刺激因子3和CSF3。人G-CSF由Ensembl识别号为ENSG00000108342的基因编码。人G-CSF由与GeneBank登录号KP271008.1相对应的cDNA序列编码。

“JAK”也可以称为Janus激酶。JAK是通过JAK-STAT途径转导细胞因子介导的信号的细胞内非受体酪氨酸激酶家族，并且包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。人JAK1由Ensembl识别号为ENSG00000162434的基因编码。人JAK1由与GeneBank登录号NM_002227相对应的cDNA序列编码。人JAK2由Ensembl识别号为ENSG00000096968的基因编码。人JAK2由与GeneBank登录号NM_001322194相对应的cDNA序列编码。人JAK3由Ensembl识别号为ENSG00000105639的基因编码。人JAK3由与GeneBank登录号NM_000215相对应的cDNA序列编码。人TYK2由Ensembl识别号为ENSG00000105397的基因编码。人TYK2由与GeneBank登录号NM_001385197相对应的cDNA序列编码。

STAT也可以称为信号转导及转录活化蛋白。STAT是7个STAT蛋白STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6的家族。人STAT1由Ensembl识别号为ENSG00000115415的基因编码。人STAT1由与GeneBank登录号NM_007315相对应的cDNA序列编码。人STAT2由Ensembl识别号为ENSG00000170581的基因编码。人STAT2由与GeneBank登录号NM_005419相对应的cDNA序列编码。人STAT3由Ensembl识别号为ENSG00000168610的基因编码。人STAT3由与GeneBank登录号NM_139276相对应的cDNA序列编码。人STAT4由Ensembl识别号为ENSG00000138378的基因编码。人STAT4由与GeneBank登录号NM_003151相对应的cDNA序列编码。人STAT5A由Ensembl识别号为ENSG00000126561的基因编码。人STAT5A由与GeneBank登录号NM_003152相对应的cDNA序列编码。人STAT5B由Ensembl识别号为ENSG00000173757的基因编码。人STAT5B由与GeneBank登录号NM_012448相对应的cDNA序列编码。人STAT6由Ensembl识别号为ENSG00000166888的基因编码。人STAT6由与GeneBank登录号NM_003153相对应的cDNA序列编码。

SHC也可以称为含有转化蛋白的Src同源2结构域。Shc是三个同种型的家族，并且包括p66Shc、p52Shc和p46Shc、SHC1、SHC2和SHC3。人SHC1由Ensembl识别号为ENSG00000160691的基因编码。人SHC1由与GeneBank登录号NM_183001相对应的cDNA序列编码。人SHC2由Ensembl识别号为ENSG00000129946的基因编码。人SHC2由与GeneBank登录号NM_012435相对应的cDNA序列编码。人SHC3由Ensembl识别号为ENSG00000148082的基因编码。人SHC3由与GeneBank登录号NM_016848相对应的cDNA序列编码。

SHP-2也可以称为蛋白酪氨酸磷酸酶非受体类型11(PTPN11)和蛋白酪氨酸磷酸酶1D(PTP-1D)。人SHP-2由Ensembl识别号为ENSG00000179295的基因编码。人SHP-2由与GeneBank登录号NM_001330437相对应的cDNA序列编码。

PI3K也可以称为磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶。PI3K的催化亚基可以称为PIK3CA。人PIK3CA由Ensembl识别号为ENSG00000121879的基因编码。人PIK3CA由与GeneBank登录号NM_006218相对应的cDNA序列编码。

EPOR也可以被称为红细胞生成素受体。人EPOR由Ensembl识别号为ENSG00000187266的基因编码。人EPOR由与GeneBank登录号NM_000121相对应的cDNA序列编码。

IFNγR1也可以被称为干扰素γ受体1。人IFNγR1由Ensembl识别号为ENSG00000027697的基因编码。人IFNγR1由与GeneBank登录号NM_000416相对应的cDNA序列编码。

IFNγR2也可以被称为干扰素γ受体2。人IFNγR2由Ensembl识别号为ENSG00000159128的基因编码。人IFNγR2由与GeneBank登录号NM_001329128相对应的cDNA序列编码。

IFNAR2也可称为干扰素α和β受体亚基2。人IFNAR2由Ensembl识别号为ENSG00000159110的基因编码。人IFNAR2由与GeneBank登录号NM_000874相对应的cDNA序列编码。

本申请中使用的缩写包括以下：ECD(胞外结构域)、ICD(胞内结构域)、TMD(跨膜结构域)、G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、IL(白介素)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-12R(白介素12受体)、IL-21R(白介素-21受体)和IL-7R或IL-7Rα(白介素-7受体)、IL-18(白介素-18)、IL-21(白介素-21)、IL-17(白介素-17)、TNF-a(肿瘤坏死因子α)、CXCL13(C-X-C基序趋化因子配体13)、CCL3(C-C基序趋化因子配体3或MIP-1a)、CCL4(C-C基序趋化因子配体4或MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21(C-C基序趋化因子配体21)、CCL5(C-C基序趋化因子配体5)、XCL1(X-C基序趋化因子配体1)、CCL19(C-C基序趋化因子配体19)和NKG2D(杀伤细胞凝集素样受体K1)。IL-2Rγ在本文中也可称为：IL-2RG、IL-2Rgc、γc或IL-2Rγ。对于选择的嵌合细胞因子受体设计：“G-CSFRwt-ICDIL-2Rb”在本文中也称为“G/IL-2Rb”；“G-CSFRwt-ICDgc”在本文中也称为“G/gc”；“G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rb”在本文中也称为“具有137ECD的G2R-2”；并且“G-CSFR137-ICDIL-2Rb GCSFR137-ICDgc”在本文中也称为“具有137ECD的G2R-1”。

必须注意的是，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。

在提供数值范围的情况下，应理解，还明确公开了所述范围的上下限之间的各中间值，其中除非上下文另外明确地规定，下限精确到十分位。所述范围中的任何所述值或中间值与所述范围中的任何其他所述值或中间值之间的每个较小的范围都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限或下限可独立地包括或不包括在所述范围内，并且任一个限值、没有限值或两个限值都包括在较小范围内的每个范围也涵盖在本发明内，并受限于所述范围中的任何明确排除的限值。当所明示范围包括所述极限中的一个或两个时，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包含于本发明中。

变体细胞因子和受体设计

本文描述了用于选择性活化变体受体的变体细胞因子和受体对。本公开的变体受体包含G-CSFR的胞外结构域；并且变体细胞因子包括G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，其结合并活化变体受体。在某些实施方案中，所述变体受体是嵌合受体，其包含G-CSFR的ECD和与G-CSFR不同的受体的ICD的至少一部分。

变体G-CSF和变体G-CSFR ECD对

在某些方面，本文所述的变体G-CSF和受体设计包含至少一个位点II界面区突变、至少一个位点III界面区突变及其组合。在某些方面，本文所述的变体G-CSF和受体设计包含表2、2A、4或6中列出的至少一个位点II或位点III界面区突变。

在某些方面，位点II界面区中的变体受体上的至少一个突变位于G-CSFR胞外结构域的选自由以下氨基酸位置组成的组的氨基酸位置：G-CSFR胞外结构域(SEQ ID NO.2)的141、167、168、171、172、173、174、197、199、200、202和288。

在某些方面，变体G-CSF位点II界面区上的至少一个突变位于G-CSF的选自由以下氨基酸位置组成的组的氨基酸位置：G-CSF(SEQ ID NO.1)的12、16、19、20、104、108、109、112、115、116、118、119、122和123。

在某些方面，变体受体位点II界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSFR胞外结构域的突变的组：R141E、R167D、K168D、K168E、L171E、L172E、Y173K、Q174E、D197K、D197R、M199D、D200K、D200R、V202D、R288D和R288E。

在某些方面，变体G-CSF位点II界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSF的突变的组：K16D、R、S12E、S12K、S12R、K16D、L18F、E19K、E19R,Q20E、D104K、D104R、L108K、L108R、D109R、D112R、D112K、T115E、T115K、T116D、Q119E、Q119R、E122K、E122R和E123R。

在某些方面，变体位点III界面区上的至少一个突变选自由以下氨基酸位置组成的组的G-CSFR胞外结构域的突变的组：SEQ ID NO.2的30、41、73、75、79、86、87、88、89、91和93。

在某些方面，变体位点III界面区上的至少一个突变选自由以下氨基酸位置组成的组的G-CSF的突变的组：SEQ ID NO.1的38、39、40、41、46、47、48、49和147。

在某些方面，变体受体位点III界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSFR胞外结构域的突变的组：S30D、R41E、Q73W、F75K、S79D、L86D、Q87D、I88E、L89A、Q91D、Q91K和E93K。

在某些方面，变体G-CSF位点III界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSF的突变的组：T38R、Y39E、K40D、K40F、L41D、L41E、L41K、E46R、L47D、V48K、V48R、L49K和R147E。

本文所述的变体细胞因子和受体对可包含仅位点II区、仅位点III区或位点II区和位点III区两者中的突变。

本文所述的变体细胞因子和受体对可具有任何数量的本文所述的位点II突变和/或位点III突变。在某些方面，变体G-CSF和受体具有表4中列出的突变。在某些方面，变体受体和/或变体G-CSF可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个本文所述的突变。在某些方面，本文所述的变体细胞因子与本文所述的变体细胞因子共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸同一性。在某些方面，本文所述的变体细胞因子与表21的变体细胞因子共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸同一性。

在某些方面，本文所述的变体受体包含与本文所述的G-CSFR ECD SEQ ID NO.共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性的G-CSFR ECD结构域。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.2、3、6或8的氨基酸序列的G-CSFR的ECD。

在某些方面，本文所述的变体G-CSF包含与G-CSFR ECD SEQ ID NO.1共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性的氨基酸序列。

在某些方面，G-CSFR的ECD包含至少一种选自由R41E、R141E和R167D组成的组的氨基酸取代。

变体细胞因子和/或受体不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽(例如信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的其他多肽)的融合多肽产生。通常，信号序列可以是载体的组分，或者它也可以是插入到载体中的编码序列的一部分。所选异源信号序列优选地为由宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列可以是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌前导序列。在某些实施方案中，所述信号序列是G-CSFR或GM-CSFR的信号序列。在某些实施方案中，所述信号序列是SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。

在某些方面，变体受体和/或变体G-CSF被天然或合成地修饰(例如糖基和聚乙二醇(PEG))以增强稳定性。例如，在某些实施方案中，例如通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化等，将变体细胞因子与IgG、白蛋白或其他分子的Fc结构域融合以延长其半衰期。在某些实施方案中，通过化学聚乙二醇化修饰本文所述的变体细胞因子。在某些实施方案中，表21的变体G-CSF细胞因子是聚乙二醇化的。在某些实施方案中，通过聚乙二醇化修饰对应于SEQ ID NO:83、83-1、83-2、83-3、83-4、83-5和84的变体G-CSF细胞因子。在某些实施方案中，本文所述的变体G-CSF细胞因子和/或嵌合细胞因子受体通过在蛋白质的N末端和/或C末端添加PEG来修饰。在某些实施方案中，通过添加包含PEG的化合物来修饰本文所述的变体G-CSF细胞因子和/或嵌合细胞因子受体。在某些实施方案中，PEG或含PEG的化合物为约20kDa或更少。在某些实施方案中，PEG或含PEG的化合物为20kDa或更少、15kDa或更少、10kDa或更少、5kDa或更少或1kDa或更少。

Fc-融合还可以在体内促进备选的Fc受体介导的特性。“Fc区”可以是天然存在的或合成的多肽，其与通过用木瓜蛋白酶消化IgG而产生的IgG C末端结构域同源。IgG Fc的分子量为约50kDa。变体细胞因子可以包含整个Fc区或保留延长其为一部分的嵌合多肽的循环半衰期的能力的较小部分。此外，全长或片段化Fc区可以是野生型分子的变体。

在所述变体细胞因子与所述变体受体结合后，所述变体受体活化通过天然细胞元件转导的信号传导，以提供模拟天然反应的生物活性，但其对经工程化以表达所述变体受体的细胞是特异性的。在某些方面，变体受体和G-CSF对不结合其天然的野生型G-CSF或天然的野生型G-CSFR。因此，在某些实施方案中，变体受体不结合内源性对应细胞因子，包括变体细胞因子的天然对应物，而变体细胞因子不结合任何内源性受体，包括变体受体的天然对应物。在某些实施方案中，与天然细胞因子和天然细胞因子受体的结合相比，变体细胞因子结合天然受体的亲和力显著降低。在某些实施方案中，变体细胞因子对天然受体的亲和力是天然细胞因子对天然细胞因子受体的亲和力的小于10倍、小于100倍、小于1,000倍或小于10,000倍。在某些实施方案中，变体细胞因子以以下K_D结合天然受体：大于1X10^-4 M、1X10^-5 M、大于1X10^-6 M；大于1X10^-7 M、大于1X10^-8 M或大于1X10^-9 M。在某些实施方案中，与天然细胞因子受体与天然细胞因子的结合相比，变体细胞因子受体以显著降低的亲和力结合天然细胞因子。在某些实施方案中，变体细胞因子受体与天然细胞因子受体的结合为天然细胞因子与天然细胞因子受体的结合的小于10倍、小于100倍、小于1,000倍或小于10,000倍。在某些实施方案中，变体细胞因子受体以以下K_D结合天然细胞因子：大于1X10^-4 M、1X10^-5 M、大于1X10^-6 M；或大于1x10^-7 M、大于1x10^-8 M、或大于1x10^-9 M。在一些实施方案中，变体细胞因子对变体受体的亲和力可与天然细胞因子对天然受体的亲和力相当，例如具有的亲和力为天然细胞因子受体对亲和力的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％，并且可以更高，例如天然细胞因子对天然受体的亲和力的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。亲和力可以通过本领域技术人员熟知的任何数量的测定来确定。例如，可以通过竞争性结合实验来确定亲和力，所述竞争性结合实验在存在各种浓度的未标记配体的情况下使用单一浓度的标记配体来测量受体的结合。通常，未标记配体的浓度在至少六个数量级上变化。通过竞争结合实验，可以确定IC₅₀。如本文所用，“IC₅₀”是指受体和标记配体之间的缔合受到50％抑制所需的未标记配体的浓度。IC₅₀是配体-受体结合亲和力的指标。低IC₅₀表示高亲和力，而高IC₅₀表示低亲和力。

变体细胞因子与细胞表面上表达的变体细胞因子受体的结合，可能会或可能不会影响变体细胞因子受体的功能(与天然细胞因子受体活性相比)；天然活性并非在所有情况下都需要或期望。在某些实施方案中，变体细胞因子与变体细胞因子受体的结合将诱导天然细胞因子信号传导的一个或多个方面。在某些实施方案中，变体细胞因子与在细胞表面上表达的变体细胞因子受体的结合引起细胞反应，所述细胞反应选自由以下组成的组：增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性。

表1：人WT G-CSF和人WT G-CSFR Ig-CRH结构域的序列

表1A：人WT G-CSF和人WT G-CSFR Ig-CRH结构域的序列

表1的SEQ ID NO.2中所示的G-CSFR氨基酸序列对应于本文所用的突变编号的G-CSFR氨基酸位置。表1A中列出的SEQ ID NO.101中所示的G-CSFR序列与SEQ ID NO.2相同，但N末端的一个氨基酸(谷氨酸)被除去。因此，本文使用的突变编号的G-CSFR氨基酸位置对应于SEQ ID NO.101的氨基酸2-308。

表2：具有G-CSF_E和G-CSFR_E突变的位点II设计。

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表3：位点III设计。

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表4：位点II和III设计的组合产生的设计实例。

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表4A：示例性G-CSFR和G-CSF对

嵌合受体

在某些方面，本文所述的变体受体是嵌合受体。嵌合受体可包含本文所述的任何变体G-CSFR ECD结构域。在某些方面，嵌合受体还包含不同细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一部分。不同细胞因子受体的胞内结构域可选自由以下组成的组：gp130(糖蛋白130、白介素-6受体的亚基或IL-6R)、IL-2Rβ或IL-2Rb(白介素-2受体β)、IL-2Rγ或γc或IL-2RG(白介素-2受体γ)、IL-7Rα(白介素-7受体α)、IL-12Rβ₂(白介素-12受体β2)、IL-21R(白介素-21受体)、IL-4R(白介素-4受体)、EPOR(红细胞生成素受体)、IFNAR(干扰素α/β受体)或IFNgR(干扰素γ受体)。在某些方面，胞内结构域的至少一部分包含与本文所述的细胞因子受体ICD的氨基酸序列共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸同一性的氨基酸序列。在某些方面，细胞因子受体ICD的至少一部分与SEQ ID NO.4、7或9共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性。在某些方面，胞内结构域的至少一部分包含与表26中列出的细胞因子受体的细胞因子受体ICD的氨基酸序列共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本文描述了嵌合细胞因子受体，其包含可操作地连接至第二结构域的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包含多亚基细胞因子受体(例如IL-2R)的胞内结构域(ICD)的至少一部分。在某些方面，嵌合细胞因子受体包含来自表15A、表15B、表23和表24的ICD的一部分。在某些方面，嵌合细胞因子受体包含选自表15A和表15B的跨膜结构域。在某些方面，嵌合细胞因子受体ICD包含表15A、表15B、表16、表23和表24中的框1区和框2区。

在某些方面，嵌合细胞因子受体包含来自表15A、表15B、表16、表23、表24和表27的至少一个信号传导分子结合位点。在一些实施方案中，ICD的信号传导分子结合位点包含SEQ ID NO.118-146中所示的序列。在一些实施方案中，ICD的信号传导分子结合位点包含与SEQ ID NO.118-146中的至少一个中所示的序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。

在某些方面，本文所述的嵌合受体包含表17-20、表23、表24、表26和表32中每一个所公开的序列的N末端至C末端顺序的氨基酸序列。在某些方面，本文所述的嵌合受体的序列包含表17-20中每一个所公开的序列的5'至3'顺序的核酸序列。在某些方面，嵌合细胞因子受体与表17-20以及表23、表24、表26和表32中每一个所公开的氨基酸序列的N末端至C末端顺序的氨基酸序列共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在某些方面，嵌合细胞因子受体与表17-20中每一个所公开的核酸序列的5'至3'顺序的核酸序列共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％核酸同一性。

在某些方面，本文所述的嵌合受体包含与本文所述的ICD SEQ ID NO.共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸或核酸序列同一性的细胞因子受体的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQID NO.26、29、31、39、41、43、45、47或49的氨基酸序列的IL-2Rβ的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.54、57、59、67、69、71、73、75或77的核酸序列的IL-2Rβ即IL-2Rb的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.51的氨基酸序列或SEQ ID NO.79的核酸序列的IL-7Rα的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.53的氨基酸序列或SEQ ID NO.81的核酸序列的IL-7R的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.35或37的氨基酸序列的IL-21R的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.63或65的核酸序列的IL-21R的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.33、42或46的氨基酸序列的IL-12Rβ₂的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.61、70或74的核酸序列的IL-12Rβ₂的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.30、32、34、36、38、40、44、50或52的氨基酸序列的G-CSFR的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQID NO.58、60、62、64、66、68、72、78或80的核酸序列的G-CSFR的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.28或48的氨基酸序列的gp130的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.56或76的核酸序列的gp130的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.27的氨基酸序列的IL-2R γ(即IL-2RG、IL-2Rgc、γc或IL-2Rγ)的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有SEQ ID NO.55的核酸序列的IL-2Rγ(即IL-2RG、IL-2Rgc、γc或IL-2Rγ)的ICD的至少一部分。

在某些方面，本文所述的ICD的至少一部分包含至少一个信号传导分子结合位点。在某些方面，至少一个信号传导分子结合位点是G-CSFR的STAT3结合位点；gp130的STAT3结合位点；gp130的SHP-2结合位点；IL-2Rβ的Shc结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-2Rβ的STAT3结合位点；IL-2Rβ的STAT1结合位点；IL-7Rα的STAT5结合位点；IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点；IL-12Rβ₂的STAT5结合位点；IL-12Rβ₂的STAT4结合位点；IL-12Rβ₂的STAT3结合位点；IL-21R的STAT5结合位点；IL-21R的STAT3结合位点；和IL-21R的STAT1结合位点。在某些方面，至少一个信号传导分子结合位点包含还含有表16中列出的氨基酸的序列。

在某些实施方案中，嵌合受体包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点。在某些实施方案中，嵌合受体包含来自表24中的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点。在某些实施方案中，至少一个信号传导分子结合位点选自由以下组成的组：白介素(IL)-2Rβ的SHC结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点；IL-4Rα的STAT6结合位点；gp130的SHP-2结合位点；gp130的STAT3结合位点；红细胞生成素受体(EPOR)的SHP-1或SHP-2结合位点；EPOR的STAT5结合位点；干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的STAT1或STAT2结合位点；和干扰素γ受体1(IFNγR1)的STAT1结合位点；或它们的组合。

在某些实施方案中，嵌合受体ICD还包含选自由以下组成的组的至少一种蛋白质的至少一个框1区和至少一个框2区：G-CSFR、gp130、EPOR和干扰素γ受体2(IFNγR2)或它们的组合。

在某些方面，本文所述的ICD的至少一部分包含gp130或G-CSFR的框1区和框区。在某些方面，框1区包含表2中列出的氨基酸序列。在某些方面，框1区包含与表16中列出的框1序列具有大于50％同一性的氨基酸序列。

在某些方面，ICD包含：(a)SEQ ID NO.90或91中的一者或两者的氨基酸序列；或(b)SEQ ID NO.90或92中的一者或两者的氨基酸序列；或(c)SEQ ID NO.93的氨基酸序列；或(d)SEQ ID NO.94的氨基酸序列；或(e)SEQ ID NO.95或96中的一者或两者的氨基酸序列；或(f)SEQ ID NO.97或98的氨基酸序列；或(g)SEQ ID NO.99或100的氨基酸序列。

在某些方面，不同细胞因子受体的胞内结构域是野生型胞内结构域。

在某些方面，本文所述的嵌合变体受体还包含G-CSFR的跨膜结构域(TMD)的至少一部分。在某些方面，本文所述的嵌合变体受体还包含不同细胞因子受体的跨膜结构域(TMD)的至少一部分。不同细胞因子受体的TMD可以选自由以下组成的组：G-CSFR、gp130(糖蛋白130)、IL-2Rβ(白介素-2受体β)、IL-2Rγ或γc(IL-2受体γ)、IL-7Rα(白介素-7受体α)、IL-12Rβ₂(白介素-12受体β2)和IL-21R(白介素-21受体)。在某些方面，TMD的至少一部分包含与本文所述的细胞因子受体TMD的氨基酸序列共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸同一性的氨基酸序列。在某些方面，细胞因子受体TMD的至少一部分与SEQ ID NO.4、5、7或9共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性。

在某些方面，如在图20、23和24的嵌合受体设计中所示，本文所述的嵌合受体包含G-CSFR ECD结构域、跨膜结构域(TMD)和以N末端至C末端顺序排列的一个ICD的至少一部分。

在某些方面，嵌合受体包含SEQ ID NO.3的G-CSFR ECD、SEQ ID NO.4的gp130 TMD和ICD的一部分和SEQ ID NO.5的IL-2RβICD的一部分。在某些方面，嵌合受体包含SEQ IDNO.6的G-CSFR ECD和SEQ ID NO.7的IL-2RβICD的一部分。在某些方面，嵌合受体包含SEQID NO.8的G-CSFR ECD和SEQ ID NO.9的IL-2RγICD的一部分。

变体或野生型细胞因子与细胞表面上表达的嵌合细胞因子受体的结合，可能会或可能不会影响变体细胞因子受体的功能(与天然细胞因子受体活性相比)；天然活性并非在所有情况下都需要或期望。在某些实施方案中，变体细胞因子与嵌合细胞因子受体的结合将诱导天然细胞因子信号传导的一个或多个方面。在某些实施方案中，变体细胞因子与在细胞表面上表达的嵌合细胞因子受体的结合引起细胞反应，所述细胞反应选自由以下组成的组：增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性。

包含IL-7Rα的ECD的受体

在某些方面，本文公开了嵌合受体，其包含：(i)白介素-7受体α(IL-7Rα)的胞外结构域(ECD)；(ii)跨膜结构域(TMD)；和(iii)细胞因子受体的胞内结构域(ICD)，其不同于SEQ ID NO:109中所示的野生型人IL-7Rα胞内信号传导结构域；其中所述ECD和所述TMD各自可操作地连接至所述ICD。在一些实施方案中，ECD的羧基末端(C末端)连接至TMD的氨基末端(N末端)，并且TMD的C末端连接至ICD的N末端。在一些实施方案中，所述ECD是天然人IL-7Rα的ECD。在一些实施方案中，所述TMD是IL-7Rα的TMD。在一些实施方案中，所述TMD是天然人IL-7Rα的TMD。在一些实施方案中，ICD包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点，并且任选地，至少一个信号传导分子结合位点包括：(a)IL-2Rβ、IL-4Rα、IL-7Ra、IL-21R或gp130的JAK1结合位点(框1区和框2区)；(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；(c)IL-2Rβ或IL-7Ra的STAT5结合位点；(d)IL-21R或gp130的STAT3结合位点；(e)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；(f)IL-4Rα的STAT6结合位点；(g)IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点；(h)gp130的SHP-2结合位点；(i)IL-7Rα的PI3K结合位点；或它们的组合。在一些实施方案中，当ICD是其天然受体的一部分时，ICD包含通过与共同γ链(gc)的异二聚化而被活化的受体的至少一个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体的ICD不与共同的γ链异二聚化。在一些实施方案中，嵌合受体的ICD在活化时同二聚化。在一些实施方案中，ICD包含细胞因子受体的至少一种细胞内信号传导结构域，所述细胞因子受体选自由以下组成的组：IL-2Rβ(白介素-2受体β)、IL-4Rα(白介素-4受体α)、IL-9Rα(白介素-9受体α)、IL-12Rβ2(白介素-12受体)、IL-21R(白介素-21受体)和糖蛋白130(gp130)以及它们的组合。

(i)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；和

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；或者

(ii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；和

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；或者

(iii)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；或者

(iv)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；或者

(v)

(a)IL-21R的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(vi)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(vii)

(a)IL-21R的框1区和框2区；

(b)IL-21R的STAT3结合位点；和

(c)IL-7Rα的STAT5和PI3激酶结合位点；

(viii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-21R的STAT3结合位点；和

(c)IL-7Rα的STAT5和PI3激酶结合位点；

(ix)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(x)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(xi)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；

(d)IL12Rβ2的STAT4结合位点；和

(e)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(xii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；

(d)IL12Rβ2的STAT4结合位点；和

(e)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(xiii)

(a)IL-4Rα的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点；和

(c)IL-4Rα的STAT6结合位点；或者

(xiv)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-4α的IRS-1或IRS-2结合位点；和

(c)IL-4α的STAT6结合位点；或者

(xv)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的SHP-2结合位点；和

(c)gp130的STAT3结合位点；或者

(xvi)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)gp130的SHP-2结合位点；和

(c)gp130的STAT3结合位点。

在一些实施方案中，本文所述的ICD包含gp130或G-CSFR的框1区和框2区。在某些方面，框1区包含表16中列出的氨基酸序列。在某些方面，框1区包含与表16中列出的框1序列具有大于50％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，ICD包含与SEQ ID NO:192-214中的至少一个中所示的序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，ICD的信号传导分子结合位点包含SEQ ID NO.118-146中所示的序列。在一些实施方案中，ICD的信号传导分子结合位点包含与SEQ ID NO.118-146中的至少一个中所示的序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在某些方面，嵌合细胞因子受体与表32中所公开的氨基酸序列的N末端至C末端顺序的氨基酸序列共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。

包含嵌合受体和IL-7的系统

在某些方面，本公开描述了用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：(a)本文所述的嵌合受体；和(b)IL-7。

在某些方面，本公开描述了用于选择性活化免疫细胞的系统，所述系统包含：(a)本文所述的嵌合受体；(b)IL-7；和(c)抗原结合信号传导受体。

在某些方面，本公开描述了用于选择性活化免疫细胞的系统，所述系统包含：(a)本文所述的嵌合受体；(b)IL-7；和(c)至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、NKG2D及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-18。在一些实施方案中，所述细胞因子是人的。

在一些实施方案中，所述系统还包含至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体包括选自由以下组成的组的至少一种受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，所述至少一种抗原结合信号传导受体是CAR。

激动或拮抗信号传导蛋白

在某些方面，本文描述的系统和方法包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，至少一种额外的细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一种：白介素(IL)-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19和受体NKG2D，以及它们的组合。

抗原结合信号传导受体

在某些方面，本文所述的系统和方法包含抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括以下中的至少一种：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。可以使用本领域已知的任何CAR，包括但不限于间皮素CAR或本文所述的任何CAR。可以使用本领域已知的任何TCR，包括但不限于本文所述的任何TCR。

编码变体细胞因子和受体的核酸

本公开中包括编码本文所述的受体和变体G-CSF中的任一个的核酸。

变体受体或变体G-CSF不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽(例如，信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的其他多肽)的融合多肽产生。通常，信号序列可以是载体的组分，或者它也可以是插入到载体中的编码序列的一部分。所选异源信号序列优选地为由宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列可以是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌前导序列。在某些方面，信号序列可以是包含在SEQ ID NO.2、3、6或8的N末端区域处的信号序列的氨基酸序列。在某些方面，信号序列可以是氨基酸序列MARLGNCSLTWAAL IILLLPGSLE(SEQ ID NO.11)。

本公开中包括编码本文所述的受体、IL-7和变体G-CSF中的任一者的核酸。

变体受体、或者野生型或变体IL-7、或者变体G-CSF不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽(例如，信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的其他多肽)的融合多肽产生。通常，信号序列可以是载体的组分，或者它也可以是插入到载体中的编码序列的一部分。所选异源信号序列优选地为由宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列可以是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌前导序列。在某些方面，信号序列可以是包含在SEQ ID NO.2、3、6或8的N末端区域处的信号序列的氨基酸序列。在某些方面，信号序列可以是氨基酸序列MTILGTTFGMVFSLLQVVSG(SEQ IDNO.84)。在某些方面，信号序列可以是MARLGNCSLTWAALIILLLPGSLE(SEQ ID NO.11)的氨基酸序列。

编码变体细胞因子或受体的表达载体

本文还描述了表达载体和表达载体试剂盒，其包括编码本文所述的变体受体、变体G-CSF或野生型或变体IL-7中的一种或多种的一种或多种核酸序列。

在某些实施方案中，将编码变体受体或变体G-CSF的核酸插入到可复制载体中用于表达。这种载体可用于将核酸序列引入到宿主细胞中，使得其表达本文所述的变体受体或细胞因子。许多此类载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或基于转座子的载体或合成mRNA。载体可能够转染或转导细胞(例如，T细胞、NK细胞或其他细胞)。

表达载体通常包含选择基因，也称为可选择标记。这种基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将无法在培养基中存活。典型的选择基因编码如下蛋白，所述蛋白(a)赋予对抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中无法获得的关键营养物质。

在某些方面，表达载体含有被宿主生物体识别并可操作地连接至变体蛋白编码序列的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100至1000bp内)，其控制它们可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子通常分为诱导型和组成型两类。诱导型启动子是在其控制下响应于培养条件的某些变化(例如，营养物的存在或不存在或温度变化)来启动由DNA转录的水平升高的启动子。由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。

可以例如通过启动子对哺乳动物宿主细胞中载体的转录进行控制，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容，所述启动子获自病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(例如鼠类干细胞病毒)、乙型肝炎病毒，并且最优选猿猴病毒40(SV40)的基因组；来自异源哺乳动物的启动子，例如肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子；来自热休克启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子可以还包含SV40病毒复制起始点的SV40限制性片段的形式方便地获得。

通常通过将增强子序列插入载体中来增加由高等真核细胞进行的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其作用于启动子以增加其转录。增强子是相对定向且位置独立的，在内含子内以及编码序列本身中发现在转录单元的5'和3'处。已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起始点后侧(late side)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起始点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。增强子可剪接入表达载体中编码序列的5'位或3'位，但是优选位于启动子的5'位点。

真核宿主细胞中使用的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。此类序列通常可得自真核或病毒DNA或cDNA的5'(有时为3')非翻译区。包含上文列出的组分中的一个或多个的合适载体的构建采用标准技术。

在某些方面，本文公开了编码本文公开的嵌合受体的慢病毒载体。在某些方面，慢病毒载体包含HIV-1 5’LT和3’LTR。在某些方面，慢病毒载体包含EF1a启动子。在某些方面，慢病毒载体包含SV40聚a终止子序列。在某些方面，载体是psPAX2、12260、pCMV-VSV-G或/>8454。

在一些实施方案中，还描述了与本文所述序列具有高序列同一性(例如95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性)的核酸和多肽序列。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语序列“同一性”百分比是指具有指定百分比的当针对最大对应而进行比较和比对时为相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或其他技术人员可用的算法)或通过视觉检查来测量。根据应用，“同一性”百分比可以存在于所比较的序列的区上，例如，存在于功能结构域上，或者可替代地存在于待比较的两个序列的全长上。

对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

例如，用于比较的最佳序列比对可以通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过目视检查(一般参见Ausubel等人,下文)来进行。

适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述的BLAST算法。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

表达变体受体和变体细胞因子的细胞

本文还描述了表达变体受体的细胞。宿主细胞(包括工程化免疫细胞)可以用上述表达载体转染或转导以用于变体细胞因子或受体表达。

在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞，其包含本文所述的变体受体或变体细胞因子中的一种或多种。细胞可包含编码本文所述的变体受体或变体细胞因子的核酸或载体。本公开还提供了产生表达变体受体的细胞的方法。在某些方面，通过将本文所述的核酸或表达载体引入到细胞中来产生细胞。可以通过任何方法将核酸或表达载体引入到细胞中，所述方法包括但不限于病毒载体的转染、转导、转座或基因编辑。可以使用本领域已知的任何基因编辑技术，包括但不限于包括聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR-Cas)系统、锌指核酸酶、基于转录活化因子样效应子的核酸酶和大范围核酸酶的技术。

宿主细胞可以是体内的任何细胞。在某些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞，包括但不限于原初CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞，例如T_H1、T_H2、T_H9、T_H11、T_H22、T_FH；调节性T细胞，例如T_R1、天然T_Reg、诱导型T_Reg；记忆T细胞，例如中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、γδT细胞；等。在某些实施方案中，细胞是B细胞，包括但不限于原初B细胞、生发中心B细胞、记忆B细胞、细胞毒性B细胞、产生细胞因子的B细胞、调节性B细胞(Breg)、中心母细胞、中心细胞、抗体分泌细胞、浆细胞等。在某些实施方案中，细胞是先天性淋巴样细胞，包括但不限于NK细胞等。在某些实施方案中，细胞是髓样细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、髓样来源的抑制细胞等。

在某些实施方案中，细胞是干细胞，包括但不限于造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。

在一些实施方案中，在转移到受试者中之前，细胞在离体程序中被遗传修饰。细胞可以单位剂量提供以用于治疗，并且可以相对于预期的接受者是同种异体的、自体的等。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起核心作用的一种类型的淋巴细胞。通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)，可以将它们与其他淋巴细胞(例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))区分开。T细胞有多种类型，如下所汇总。

辅助T辅助细胞(Th细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括使B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。Th细胞在其表面上表达CD4。当Th细胞被抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，它们会被活化。这些细胞可以分化为几种亚型之一，包括Th1、Th2、Th3、Th17、Th9或Tfh，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫反应。

溶细胞性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并也参与移植排斥。大多数CTL在其表面上表达CD8。这些细胞通过与同存在于所有有核细胞表面上的MHC I类缔合的抗原结合来识别其靶标。

记忆T细胞是在感染消退后长期存在的一小组抗原特异性T细胞。它们在重新暴露于其同源抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

调节性T细胞(Treg细胞)以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞。已经描述了两个主要类别的CD4+Treg细胞，即天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。

天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并与发育中的T细胞和已被TSLP活化的髓样(CD1 1c+)和浆细胞样(CD123+)树突细胞之间的相互作用有关。Treg细胞可以通过存在称为FoxP3的细胞内分子来与其他T细胞区分开。

适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可起源于正常的免疫反应。细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统的一部分。NK细胞以MHC独立性方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速反应。

在某些方面，表达本文所述的变体受体或变体细胞因子的细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。在某些方面，TIL或TAL包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞及其组合。

在某些实施方案中，本文所述的T细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其已被基因工程化以产生用于免疫疗法的人工T细胞受体。在某些方面，CAR-T细胞来源于患者自身血液中的T细胞(即自体)。在某些方面，CAR-T来源于另一健康供体的T细胞(即同种异体)。在某些方面，CAR-T细胞来源于非免疫细胞类型或由非免疫细胞类型合成，诸如多能干细胞。

在某些实施方案中，本文所述的T细胞是工程化T细胞受体(eTCR-T细胞)，其已经被基因工程化以产生用于免疫疗法的特定T细胞受体。在某些方面，eTCR-T细胞来源于患者自身血液中的T细胞(即自体)。在某些方面，eTCR-T细胞来源于供体的T细胞(即同种异体)。在某些方面，eTCR-T细胞来源于非免疫细胞类型或由非免疫细胞类型合成，诸如多能干细胞。

在某些方面，本文所述的表达嵌合细胞因子受体的细胞是NK细胞。NK细胞(属于先天淋巴样细胞组)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成第三种由产生B淋巴细胞和T淋巴细胞的普通淋巴祖细胞分化的细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化并成熟，然后进入循环。在某些方面，NK细胞来源于患者自身血液中的NK细胞(即自体)。在某些方面，NK细胞来源于供体的NK细胞(即同种异体)。在某些方面，NK细胞来源于非免疫细胞类型或由非免疫细胞类型合成，诸如多能干细胞。

在某些方面，本文所述的表达嵌合细胞因子受体的细胞是B细胞。B细胞包括但不限于原初B细胞、生发中心B细胞、记忆B细胞、细胞毒性B细胞、产生细胞因子的B细胞、调节性B细胞(Breg)、成中心细胞、中心细胞、抗体分泌细胞、浆细胞等。在某些方面，B细胞来源于患者自身血液中的B细胞(即自体)。在某些方面，B细胞来源于供体的B细胞(即同种异体)。在某些方面，B细胞来源于非免疫细胞类型或由非免疫细胞类型合成，诸如多能干细胞。

在某些方面，表达本文所述的嵌合细胞因子受体的细胞是髓样细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、髓样来源的抑制细胞等。在某些方面，髓样细胞来源于患者自身血液中的髓样细胞(即自体)。在某些方面，髓样细胞来源于供体的髓样细胞(即同种异体)。在某些方面，髓样细胞来源于非免疫细胞类型或由非免疫细胞类型合成，诸如如多能干细胞。

本文所述的表达变体受体或变体细胞因子的细胞可以是任何细胞类型。在某些方面，本文所述的表达变体受体或变体细胞因子的细胞是造血系统的细胞。根据本发明的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以由患者本身的外周血(第1方)离体产生，或者在从供体外周血(第2方)进行造血干细胞移植的情况下产生，或由来自未联系的供体(第3方)的外周血产生。或者，本文所述的免疫细胞可以来源于诱导型祖细胞或胚胎祖细胞向免疫细胞的离体分化。或者，可以使用保留其效应功能并可用作治疗剂的永生化免疫细胞系(例如，保持其裂解功能的T细胞或NK细胞系；保留其抗体产生功能的血浆细胞系，或保留其吞噬和抗原呈递功能的树突细胞系或巨噬细胞)。在所有这些实施方案中，表达变体受体的细胞是通过多种方式之一引入编码每个变体受体的DNA或RNA来产生的，所述多种方式包括用病毒载体转导或用DNA或RNA转染。

本文所述的细胞可以是来源于受试者的被离体工程化以表达变体受体和/或变体细胞因子的免疫细胞。免疫细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品或肿瘤样品。免疫细胞可以在用编码提供根据本发明第一方面的变体受体或变体细胞因子的分子的核酸转导之前被活化和/或扩增，例如通过用抗-CD3单克隆抗体和/或IL-2处理。本发明的免疫细胞可以通过以下方式制备：(i)从受试者或上文列出的其他来源分离含免疫细胞的样品；和(ii)用编码变体受体或变体细胞因子的一种或多种核酸序列转导或转染免疫细胞。

可以在常规营养培养基中培养细胞，这些培养基在适当时改变以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基，例如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM),(Sigma))、RPMI 1640(Sigma)以及达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)((DMEM),Sigma)，适于培养宿主细胞。这些培养基中的任何一种可根据需要用激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷)、抗生素、微量元素以及葡萄糖或等量的能量源进行补充。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必要的补充剂。培养条件，诸如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。

然后，免疫细胞可以通过纯化，例如基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达来选择。在某些实施方案中，通过表达可选择标记(例如，蛋白质、荧光标记或表位标签)或通过本领域已知用于选择、分离和/或纯化细胞的任何方法来选择细胞。

试剂盒

本公开还描述了用于产生表达本文所述的任何变体受体或变体G-CSF中的至少一种的细胞的试剂盒。在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：编码本文所述的嵌合受体的细胞，并且任选地，所述细胞是免疫细胞；以及使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括IL-7和/或变体G-CSF。在某些方面，本文描述了试剂盒，其包括：包含编码本文所述的嵌合受体的核酸序列的一种或多种表达载体和使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括IL-7和/或变体G-CSF。在某些实施方案中，试剂盒包括编码至少一种变体受体的至少一种表达载体和使用说明书。在某些方面，试剂盒还包括药物制剂中的至少一种变体细胞因子或编码与本文所述变体受体中的至少一种结合的变体G-CSF的表达载体。在某些实施方案中，试剂盒包括细胞，所述细胞包含编码本文所述的变体受体的表达载体。

在某些实施方案中，试剂盒包括细胞，所述细胞包含编码(CAR)/工程化T细胞受体(eTCR)等(例如，工程化非天然TCR受体)的表达载体。在某些实施方案中，试剂盒包括编码嵌合抗原受体(CAR)/工程化T细胞受体(eTCR)等的表达载体。在某些实施方案中，试剂盒包括编码本文所述的变体受体和嵌合抗原受体(CAR)/工程化T细胞受体(eTCR)等的表达载体。

在某些方面，本文所述的试剂盒还包括变体细胞因子。在某些实施方案中，试剂盒还包括至少一种另外的变体细胞因子。在某些方面，试剂盒还包括药物制剂中的至少一种变体细胞因子。在某些方面，本文所述的试剂盒还包括至少一种细胞因子(例如，IL-7和/或变体G-CSF)。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种表达载体，其编码至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

在某些实施方案中，组分以剂型、液体或固体形式以任何方便包装提供。

在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种表达载体，其编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物或其他亲和试剂；在某些实施方案中，试剂盒还包括编码细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，以及它们的组合。在某些实施方案中，试剂盒还包括编码至少一种抗原结合受体的一种或多种表达载体。在某些实施方案中，至少一种抗原结合受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在某些实施方案中，试剂盒还包括编码嵌合抗原受体的表达载体。

在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，以及它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞还包含编码至少一种抗原结合信号传导受体的一种或多种表达载体。

在某些方面，至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在一些实施方案中，细胞还包含编码至少一种CAR的一种或多种表达载体，并且任选地，CAR是间皮素CAR。在某些实施方案中，组分以剂型、液体或固体形式以任何方便包装提供。

可以提供另外的试剂用于如本文所述提供的细胞或产生的细胞的生长、选择和制备。例如，试剂盒可以包括用于细胞培养的组分、生长因子、分化剂、用于转染或转导的试剂等。

在某些实施方案中，除了上述组分之外，试剂盒还可以包括使用说明书。说明书可以以任何方便的形式提供。例如，说明书可以作为印刷信息、在试剂盒的包装中、在包装插页中等提供。说明书还可以作为其上记录有信息的计算机可读介质提供。此外，可以在可用于访问信息的网站地址上提供说明书。

选择性活化变体受体的方法

本公开提供了用于选择性活化在细胞表面上表达的变体受体的方法，所述方法包括使本文所述的变体受体与选择性活化嵌合受体的细胞因子接触。在某些方面，选择性活化嵌合受体的细胞因子是变体G-CSF。G-CSF可以是野生型G-CSF或包含与天然(野生型)细胞因子受体相比赋予G-CSF与变体受体的优先结合和活化的一个或多个突变的G-CSF。

在某些方面，通过细胞因子与变体受体结合而选择性活化变体受体导致同二聚化、异二聚化或其组合。

在某些方面，变体受体的活化导致下游信号传导分子的活化。在某些方面，变体受体活化了通过天然细胞信号传导分子转导的信号传导分子或途径，以提供模拟天然反应的生物活性，但其对经工程化以表达变体受体的细胞是特异性的。在某些实施方案中，嵌合受体的活化形式形成同二聚体；并且任选地，嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种以及它们的组合，并且任选地，嵌合受体在与细胞因子接触时被活化。

在某些方面，下游信号传导分子的活化包括活化刺激细胞周期进程、增殖、活力和/或增强活性的细胞信号传导途径。在某些方面，活化的信号传导途径或分子是但不限于JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、Shc、ERK1/2、IRS-1、IRS-2和Akt。在某些方面，在施用结合受体的细胞因子后，变体受体的活化导致细胞增殖增加。在某些方面，增殖程度是当细胞被IL-2刺激时观察到的增殖的0.1-10倍之间。

在某些方面，本文描述了活化在细胞表面上表达的一种或多种嵌合受体的方法，其包括：使一种或多种嵌合受体与IL-7接触以活化嵌合受体；其中所述嵌合受体包含：(i)IL-7Rα的胞外结构域(ECD)；(ii)跨膜结构域(TMD)；和(iii)细胞因子受体的胞内结构域(ICD)，其不同于SEQ ID NO:109中所示的野生型人IL-7Rα胞内信号传导结构域；其中所述ECD和所述TMD各自可操作地连接至所述ICD。在一些实施方案中，嵌合受体是包含本文所述的ICD的嵌合受体。

选择性活化细胞的方法和系统

在某些方面，本文描述了用于选择性活化细胞的方法和系统，其包含(i)包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)的受体；和(ii)选择性结合(i)的受体的变体G-CSF；和以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，受体在免疫细胞上表达，并且任选地，免疫细胞是：T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，细胞是干细胞，并且任选地，细胞是原代细胞，并且任选地，细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。在一些实施方案中，至少一种额外的细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一种：白介素(IL)-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1和CCL19，和受体NKG2D，以及它们的组合。在某些实施方案中，包含G-CSFR的变体ECD的受体是本文所述的嵌合受体。

在某些实施方案中，系统还包含抗原结合信号传导受体。在某些实施方案中，抗原结合信号传导受体包括以下中的至少一种：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。可以使用本领域已知的任何CAR，包括但不限于间皮素CAR。

在某些方面，本文描述产生细胞的方法，所述细胞表达包含本文所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一者或两者：(i))至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括本文所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(ii)本文所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体。在一些实施方案中，所述方法包括向细胞中引入编码受体以及(i)和(ii)中的一者或两者的一种或多种核酸或表达载体。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体表达包含G-CSFR的变体ECD的受体，并且第二免疫细胞群体表达变体G-CSF。在一些实施方案中，第一免疫细胞群体和第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下中的一者或两者：(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

在某些方面，本文描述了用于活化包含嵌合受体的细胞的方法和系统，所述嵌合受体包含：(a)白介素受体α(IL-7Rα)的胞外结构域(ECD)；(b)跨膜结构域(TMD)；和(c)细胞因子受体的胞内结构域(ICD)，其不同于SEQ ID NO:109中所示的野生型人IL-7Rα胞内信号传导结构域；其中所述ECD和所述TMD各自可操作地连接至所述ICD。

过继细胞转移方法

本发明提供了一种用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用表达本文所述的变体受体和/或变体细胞因子的细胞(例如在如下所述的药物组合物中)的步骤。

用于治疗疾病的方法涉及本文所述的细胞，例如T细胞、NK细胞或表达变体受体的任何其他免疫或非免疫细胞的治疗用途。可以向患有现有疾病或病症的受试者施用细胞，以减轻、减少或改善与所述疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断所述疾病的进展。预防疾病的方法涉及本公开的细胞的预防性使用。此类细胞可以施用于尚未感染疾病和/或未表现出疾病的任何症状的受试者，以预防或损害疾病的原因或减少或防止与疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可能有所述疾病的易感性，或被认为有发展所述疾病的风险。

在一些实施方案中，本发明的组合物、方法和试剂盒用于增强免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应针对期望通过全身施用细胞因子(例如肌内、腹膜内、静脉内等)来消耗或调节靶细胞(例如癌细胞、感染细胞、参与自身免疫性疾病的免疫细胞等)的病症。

方法可包括以下步骤：(i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用核酸序列或载体(例如表达变体受体)转导或转染此类细胞；(iii)向受试者施用(即，输注)来自(ii)的细胞，以及(iv)施用刺激输注细胞的变体细胞因子。在某些方面，在向受试者施用所述细胞之前，受试者已经经历了免疫耗竭治疗。在某些方面，在向受试者施用所述细胞之前，受试者未经历免疫耗竭治疗。在某些方面，受试者在向受试者施用所述细胞之前已经经历了在不使用本文所述的变体受体的情况下必需的严重性、剂量和/或持续时间得到减少的免疫耗竭治疗。

在某些实施方案中，方法还包括施用或提供至少一种额外的活性剂；和任选地，至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物或其他亲和试剂。在某些实施方案中，向受试者施用两种或更多种细胞群体，每种细胞群体表达不同的嵌合受体，并且每种细胞群体表达细胞因子的不同变体形式。在某些实施方案中，表达嵌合受体的细胞还表达至少一种抗原结合信号传导受体。在某些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体包括至少一种选自由以下组成的组的受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。在某些实施方案中，所述抗原结合信号传导受体是CAR。在某些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，以及它们的组合。

含免疫细胞的样品可以从受试者或其他来源分离，例如如上所述。免疫细胞可以从受试者本身的外周血(第1方)中分离，或者在从供体外周血(第2方)进行造血干细胞移植的情况下产生，或由来自未联系的供体(第3方)的外周血产生。免疫细胞也可以来源于体外方法，例如从干细胞或其他形式的前体细胞诱导分化。

在一些实施方案中，使免疫细胞与变体细胞因子体内接触，即，其中免疫细胞被转移至接受者，并且向接受者施用有效剂量的变体细胞因子并且允许所述变体细胞因子在其天然位置(例如在淋巴结等)接触所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述接触在体外进行。当细胞在体外与变体细胞因子接触时，将细胞因子以足以活化来自受体的信号传导的剂量和时间段添加至细胞，所述信号传导可以利用天然细胞机制的方面，例如辅助蛋白、共受体等。活化的细胞可用于任何目的，包括但不限于与抗原特异性测定、细胞因子谱分析和体内递送有关的实验目的。

在某些方面，向受试者施用治疗有效数量的细胞。在某些方面，在多个不同的情形下向受试者施用或输注表达变体受体的细胞。在某些实施方案中，施用至少1x10⁶个细胞/kg、至少1x10⁷个细胞/kg、至少1x10⁸个细胞/kg、至少1x10⁹个细胞/kg、至少1x10¹⁰个细胞/kg或更多，有时受限于在收集过程中获得的细胞，例如转染的T细胞的数量。转染的细胞可以任何生理上可接受的介质(通常是血管内)输注至受试者，尽管它们也可以引入任何其他方便的位点，在所述位点细胞可以找到适合生长的位点。

在某些方面，向受试者施用治疗有效量的变体细胞因子。在某些方面，在多个不同的情形下向受试者施用变体细胞因子。在某些方面，施用的变体细胞因子的量是足以实现治疗上期望的结果(例如，减轻受试者的疾病症状)的量。在某些方面，施用的变体细胞因子的量是足以刺激本文所述的表达变体细胞因子受体的细胞的细胞周期进程、增殖、活力和/或功能活性的量。在某些方面，变体细胞因子以实现治疗上期望的结果所必需的剂量和/或持续时间施用。在某些方面，变体细胞因子以足以刺激本文所述的表达变体细胞因子受体的细胞的细胞周期进展、增殖、活力和/或功能活性的剂量和/或持续时间施用。剂量和频率可能因剂；施用模式；细胞因子的性质；等而变化。本领域技术人员将理解，此类准则将针对个情况进行调整。对于局部施用(例如鼻内、吸入等)、对于全身给药(例如肌内、腹膜内、血管内等)，也可以改变剂量。

过继细胞转移的适应症

本发明提供了一种表达本文所述的变体受体的细胞，其用于治疗和/或预防疾病。本发明还涉及表达本文所述的变体受体的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌性疾病，例如但不限于胆管癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、血液系统恶性肿瘤、肾癌(肾细胞)、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤和甲状腺癌。

待治疗和/或预防的疾病可以是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的特征是T淋巴细胞和B淋巴细胞异常靶向自身蛋白、多肽、肽和/或其他自身分子，从而导致体内器官、组织或细胞类型(例如，胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)损伤和或障碍，以引起疾病的临床表现。自身免疫性疾病包括影响特定组织的疾病以及可以影响多个组织的疾病，这可部分取决于反应是针对局限于特定组织的抗原还是针对广泛分布在体内的抗原。自身免疫性疾病包括但不限于1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺疾病和格雷夫斯病(Graves’disease)。

待治疗和/或预防的疾病可以是炎症性病症，例如心脏纤维化。通常，炎症性病症或疾患通常会导致免疫系统攻击人体自身的细胞或组织，并可能导致异常炎症，从而导致慢性疼痛、发红、肿胀、僵硬和对正常组织的损害。炎症性病症的特征在于炎症或由炎症引起，并且包括但不限于乳糜泻、血管炎、狼疮、慢性阻塞性肺病(COPD)、肠易激性疾病、动脉粥样硬化、关节炎、肌炎、硬皮病、痛风、干燥综合征(Sjorgren’s syndrome)、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征和牛皮癣。

在某些实施方案中，所述方法用于治疗传染性疾病。

在某些实施方案中，待治疗的病症是预防和治疗移植物排斥。在某些实施方案中，待治疗和/或预防的病症是同种异体移植排斥。在某些方面，同种异体移植排斥是急性同种异体移植排斥。

待治疗和/或预防的疾病可涉及将细胞、组织、器官或其他解剖结构移植到受影响的个体。细胞、组织、器官或其他解剖结构可以来自同一个体(自体或“自体”移植)或来自不同个体(同种异体或“异体”移植)。细胞、组织、器官或其他解剖结构也可以使用体外方法产生，包括细胞克隆、诱导细胞分化或用合成生物材料制造。

本发明提供了一种用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用本文所述的变体细胞因子和/或细胞(例如在如上所述的药物组合物中)的一个或多个步骤。

用于治疗和/或预防疾病的方法涉及本公开的细胞的治疗用途。在本文中，可以向患有现有疾病或病症的受试者施用细胞，以减轻、减少或改善与所述疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断所述疾病的进展。预防疾病的方法涉及本公开的细胞的预防性使用。此类细胞可以施用于尚未感染疾病和/或未表现出疾病的任何症状的受试者，以预防或损害疾病的原因或减少或防止与疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可能有所述疾病的易感性，或被认为有发展所述疾病的风险。方法可包括以下步骤：(i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞，以及(iv)施用刺激输注细胞的变体细胞因子。含免疫细胞的样品可分离自受试者或其他来源，例如如上所述。免疫细胞可以从受试者本身的外周血(第1方)中分离，或者在从供体外周血(第2方)进行造血干细胞移植的情况下产生，或由来自未联系的供体(第3方)的外周血产生。

治疗可以与其他活性剂组合，所述其他活性剂例如但不限于抗生素、抗癌剂、抗病毒剂和其他免疫调节剂(例如，针对程序性细胞死亡蛋白-1[PD-1]途径的抗体或针对CTLA-4的抗体)。还可以包括其他细胞因子(例如，干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白介素12等)。

使用表达变体细胞因子受体的干细胞的方法

本发明提供了一种治疗和/或预防病症或疾病的方法，其包括施用表达本文所述的变体受体和/或变体细胞因子的干细胞的步骤。在某些实施方案中，表达本文所述的变体细胞因子受体和/或变体细胞因子的干细胞用于再生医学、细胞/组织/器官移植、组织重建或组织修复。

药物组合物

本公开还涉及一种药物组合物，其包含表达本文所述的变体受体和/或本文所述的细胞因子的多个细胞。本发明还涉及一种药物组合物，其含有本文所述的变体细胞因子。本发明的细胞可以配制成药物组合物。除表达本文所述的变体受体的细胞中的一种或多种之外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或为本领域技术人员所熟知的其他物质。所述物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。这种制剂可以是例如适用于静脉内输注的形式。

对于根据本发明的待给予个体的表达本文所述的变体受体和变体细胞因子的细胞，优选的是以足以显示对个体有益的“治疗有效量”进行施用。当足以显示对个体有益时，也可以施用“预防有效量”。细胞因子的实际量或施用的细胞数量以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。对治疗的指定例如关于剂量的决定等在普通从业者和其他医师的职责范围内，并且通常考虑待治疗的疾患、单个患者的状况、递送部位、施用方法以及为从业者所知的其他因素。以上提及的技术和方案的实例可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编),1980中。

视待治疗的病症而定，药物组合物可单独施用，或与其他治疗进行组合，同时或依序施用。

实施例

以下是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如数量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。

除非另外指明，否则本发明的实施将利用本领域的技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术、细胞培养、过继细胞转移和药理学的常规方法。此类技术在文献中充分说明。参见，例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,本期新增)；Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版。(Plenum Press)第A和B卷(1992)。

实施例1：G-CSF:G-CSFR(CRH)的专用位点II界面的合理设计

野生型(WT)G-CSF_WT:G-CSFR_WT复合物是2:2异二聚体。G-CSF与G-CSFR的胞外结构域(ECD)具有两个结合界面。G-CSF与G-CSFR的细胞外细胞因子受体同源(CRH)结构域之间的较大界面被称为位点II。G-CSF与G-CSFR的N末端Ig样(Ig)胞外结构域之间的较小界面被称为位点III(参见图1)。

为了设计共同进化的、工程化的(E)G-CSF_E:G-CSFR_E细胞因子:受体对，将WT G-CSF和G-CSFR的Ig-CRH胞外结构域之间的2:2复合物(蛋白质数据库ID 2D9Q，Tamada等人PNAS2006)分离成包含位点II和位点III界面的两个不同的亚复合物，其分别由G-CSF:G-CSFR(CRH)和G-CSF:G-CSFR(Ig)(参见图1)组成，序列参见表1和表1A。表1的SEQ ID NO.2中所示的G-CSFR氨基酸序列对应于本文用于G-CSFR的突变编号的氨基酸位置。表1A中列出的SEQ ID NO.101中所示的G-CSFR序列与SEQ ID NO.2相同，但是在N末端去除了一个氨基酸(谷氨酸)。因此，本文所用的突变编号的氨基酸位置对应于SEQ ID NO.101的氨基酸2-308。

方法

为了创建共同演化的专用G-CSF_E:G-CSFR_E突变体对(设计)，采用了计算设计工作流程(参见图2)。首先，在位点II处创建了专用设计。

对G-CSF_WT:G-CSFR(CRH)_WT的位点II界面相互作用的计算机结构分析表明大多数分子相互作用由带电荷残基产生，所述相互作用有助于位点II处的总吸引AMBER能量为109.64kcal/mol(参见图3)。深入检查主要揭示了静电和氢键相互作用，例如G-CSFR(CRH)的R167与G-CSF的D112/D109之间的相互作用，这贡献了位点II处28％的总吸引AMBER能量。另一个重要的静电相互作用存在于G-CSFR(CRH)的R141与G-CSF的E122/E123之间(参见图4)，这贡献了位点II处21.4％的总吸引AMBER能量(参见图3)。同样地，细胞因子的E19和受体CRH结构域的R288之间的盐桥贡献了17.3％，通过与受体CRH结构域的D200的静电和氢键相互作用来使精氨酸进一步稳定。

位点II的每个设计都由G-CSF_E和G-CSFR(CRH)_E的突变体对组成。首先，例如通过反转电荷，通过在结合配偶体上将碱性残基突变为酸性残基并且反之亦然，在位点II处创建积极设计，同时在必要时通过另外的突变来保持堆积和疏水相互作用。将突变体对G-CSF_E:G-CSFR(CRH)_E通过ZymeCAD^TM的平均场包装工作流程来包装。目视检查了设计的在位点II上包装的计算机模型的结构完整性，并通过ZymeCAD^TM度量对其进行了评估。具体来说，旨在设计G-CSF_E突变体，以具有对其相应G-CSFR(CRH)_E突变体的<10kcal/mol的ZymeCAD^TM计算机dAMBER结合亲和力(配对相互作用)。此度量将Lennard Jones亲和力和静电亲和力的总和即AMBER亲和力与WT:WT细胞因子受体对的AMBER亲和力进行比较。排除dAMBER_折叠>80kcal/mol的设计。dAMBER折叠度量对Lennard Jones键合折叠和突变后静电折叠之和的变化进行评分。还排除了dDDRW载脂蛋白稳定性(apostability)得分高于400kcal/mol的设计。这个度量描述了蛋白质从其载脂蛋白形式突变后，基于知识的潜在稳定性的变化。

接下来，用ZymeCAD^TM将每种设计的G-CSF_E突变体包装在与WT G-CSFR的复合物中(并且反之亦然G-CSFR_E与G-CSF_WT)，以评估当形成以下两种复合物时在错配条件下每种阳性设计的度量：G-CSF_WT:G-CSFR(CRH)_E和G-CSF_E:G-CSFR(CRH)_WT。用ZymeCAD^TM计算机计算错配取向的ddAMBER度量(DdAMBER_亲和力_Awt_Bmut是配对的工程化复合物的AMBER亲和力减去错配的复合物G-CSF_WT:G-CSFR(CRH)_E的AMBER亲和力，ddAMBER_亲和力_Amut_Bwt是配对的工程化复合物的AMBER亲和力减去错配的复合物G-CSF_E:G-CSFR(CRH)_WT的AMBER亲和力。使错配ddAMBER亲和力度量最小化的设计被认为对其配对结合配偶体的选择性大于与野生型细胞因子或受体结合的结合。

对所有位点II设计进行聚类，并且G-CSF_E:G-CSFR(CRH)_E、G-CSF_WT:G-CSFR(CRH)_E、G-CSF_E:G-CSFR(CRH)_WT的包装度量被认为是评估配对的强度(阳性设计)和对与WT G-CSF和G-CSFR(CRH)的错配的选择性(阴性设计)和排序设计。

结果

表2中列出的设计在ZymeCAD^TM中具有包装度量，所述度量有利于在计算机中配对G-CSF_E:G-CSFR(CRH)_E(参见表5)，并在视觉检查中在计算机中显示出令人满意的相互作用，例如盐桥、氢键的存在和严重冲突的不存在(参见图5)。这些设计还显示出针对与WT G-CSF或G-CSFR(CRH)错配的高选择性(参见表5)。

因此，预测表2中所示的相同变体G-CSF和受体设计的位点II突变表现出分别相对于野生型G-CSFR和G-CSF的优先结合。

表5：具有使用ZymeCAD^Tm的来自一式三份计算机平均场包装的以kcal/mol计的AMBER度量的位点II设计。

实施例2：位点II设计的体外筛选

在下拉实验中以G-CSF_E:G-CSFR(CRH)_E格式筛选所选的位点II设计，以确保它们在基于杆状病毒的昆虫细胞系统中共表达时形成位点II复合物的能力。还评估了设计是否可以通过将每个设计G-CSF_E突变体与G-CSFR(CRH)_WT共表达来与WT受体或细胞因子形成错配的复合物，并且反之亦然，每个设计G-CSFR(CRH)_E突变体与GCSF_WT共表达。通过细胞因子突变体的单次感染来验证了仅G-CSF_E的表达。

方法

简言之，将位点II G-CSF设计和相应的配对G-CSFR(CRH)突变体分别克隆到昆虫细胞转染载体中。将G-CSF WT(残基1-173，表1)和突变体克隆到经修饰的pAcGP67b转移载体(Pharmingen)中，在框架中具有N末端分泌信号和C末端TEV可切割的Twin Strep标签，其序列为AAAENLYFQ/GSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHP QFEK。在受体胞外结构域中，仅将具有位点II设计突变的CRH结构域(残基98-308，表1)克隆到经修饰的pAcGP67b转移载体中，在框架内具有N末端分泌信号和TEV可切割六聚组氨酸标签，其序列为HHHHHHSSGRENLYFQ/GSMG。合成了所有构建体，并针对昆虫细胞表达(Genscript)进行了密码子优化。转移载体DNA通过Midi-prep(ThermoScientific，目录K0481)制备，不含内毒素，并且A_260/280吸光度比为1.8-2.0。如制造商(Expression Systems，California)所述，通过使用贴壁方法将重组线性化杆状病毒DNA与载体DNA共转染在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)9(Sf9)细胞中来实现重组病毒产生。转染前约1h，6孔组织培养板(Greiner，目录657-160)每孔以0.46x10⁶个细胞ml^-1接种2mL健康的对数期Sf9细胞。如下制备转染混合物：将100μl转染培养基(Expression Systems，California，目录95-020-100)分别放入两个无菌1.5ml微量离心管A和B中的每一个中。向管A中添加0.4μg重组BestBac 2.0Δv-cath/chiA线性化DNA(Expression Systems，California，目录91-002)和2μg载体DNA。向管B中添加1.2μl的5XExpress²TR转染试剂(Expres2ION，目录S2-55A-001)。将溶液A和B在约24℃下孵育5分钟，然后合并并孵育30分钟。孵育后，将800μl转染培养基添加到每个转染反应中以增加体积至1ml。从孔中移除旧的ESF 921培养基，并用逐滴施用以便不干扰细胞单层的1mL转染混合物置换。将板前后和左右轻轻摇动以均匀分布转染混合物，并在27℃下孵育4小时。4小时后，将转染混合物从共转染板中移除并逐滴添加含有10μg/ml庆大霉素(目录15750-060)的2mL新鲜ESF 921昆虫细胞培养基(Expression Systems，California，目录96-001-01)。为防止蒸发，将板包裹在莎伦包装膜(saran wrap)中，放置在无菌塑料盒中，并在27℃下孵育4-5天。在转染后第4天或第5天，收集P1上清液，并通过在5000rpm下离心5分钟来澄清，并转移到新的无菌管中，并在4℃下储存，避光。

将如上所述产生的重组P1原液进一步扩增成高效价的低传代P2原液，以用于蛋白质表达研究。以下工作流程使用从共转染收获的病毒的P1种子原液作为接种物来产生50-100mL病毒。将50mL对数期Sf9细胞以1.5x10⁶个细胞ml^-1接种到250mL摇瓶中(FisherScientific，目录PBV 250)，并添加0.5mL P1病毒原液。在27℃下孵育细胞，以135rpm振摇，并监测感染。感染后5-7天收获P2病毒上清液，并通过以4000rpm离心10分钟来澄清。为了使效价损失最小化，添加10％热灭活FBS(VWR，目录97068-085)，并在黑暗中在4℃下储存P2病毒。

对P2病毒原液进行了小规模的蛋白质表达测试。在12孔板中在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Tni)细胞中使用P2病毒共感染G-CSF_E突变体与其相应G-CSFR_E突变体。使用G-CSF_WT和GCSFR(CRH)_WT的P2原液对每个设计突变体进行单独的共感染并且对于仅G-CSF_E突变体进行感染。对于每个反应，用20μl P2病毒以2x10⁶个细胞ml^-1接种2mL健康对数相Tni。将板在27℃下孵育约70h，伴以135rpm振摇。通过以5000rpm离心3分钟来澄清上清液，并以分批模式使用streptactin-XT工作流平台(IBA Lifesciences，目录2-4010-010)通过G-CSF_E突变体和G-CSF_WT上的双链霉标签(TST)来下拉分泌的蛋白质。简言之，向每1.8mL反应上清液中添加0.2mL 10倍HEPES缓冲盐水(HBS：20mM HEPES pH8、150mM NaCl)至1倍，添加20μl床体积(b.v)的纯化珠，并在24℃下在倾覆混合的情况下将反应物孵育30分钟。另外添加20μl b.v纯化珠，然后第二次孵育30分钟。通过以2200rpm离心3分钟使珠粒沉淀，除去上清液，并用1X HBS缓冲液洗涤珠粒。用30μl BXT洗脱缓冲液(100mM Tris-CLpH8、150mM NaCl、1mM EDTA、50mM生物素(IBA Lifesciences，目录2-1042-025))洗脱蛋白质，用SDS-PAGE样品缓冲液煮沸，并在200V下在还原条件下运行12％Bolt Bis-Tris plus,12孔凝胶(Thermo Fisher Scientific，目录NW00122BOX)上分析30分钟。

结果

位点II设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35、36示出了仅G-CSF_E的表达，并形成了足够稳定的配对G-CSF_E:G-CSFR_E复合物，这些复合物通过G-CSF_E上的Twin Strep标签被下拉(参见图6)。例如，工程化复合物的位点II设计#6下拉后在SDS-PAGE上显示了在约22kDa处的G-CSF_E突变体以及在约33kDa处的相应的共表达G-CSFR(CRH)_E突变体的条带(参见图6)。

在共表达测定中，位点II设计#8、9、15和34也针对与WT G-CSF和WT G-CSFR的错配具有选择性(参见图7)，因为它们没有被WT G-CSF下拉(参见图7下图)，并且WT受体没有被G-CSF_E突变体下拉(参见图7上图)。位点II G-CSFR_E设计30和35在共表达测定中针对与WTG-CSF的错配具有选择性，因为它们没有被WT G-CSF下拉(参见图7下图)，但是在共表达测定中，反向G-CSF_E设计针对与WT G-CSFR的错配不具有选择性，因为WT G-CSFR被下拉(参见图7上图)。在共表达测定中，位点II设计6、7、17和36针对与WT G-CSF或WT G-CSFR的错配没有选择性(参见图7)，因为它们下拉了WT G-CSFR并被WT G-CSF下拉。

在残基R288处具有突变的位点II受体突变体在没有Ig结构域的G-CSFR(CRH)受体链形式中不表达。通过SPR与Ig结构域上的位点III设计的组合来评估含有R288的设计的配对复合物形成(参见实施例6)。因此，鉴别了几种位点II设计，它们形成了足够稳定的配对G-CSF_E:G-CSFR_E复合物，所述复合物也针对与WT G-CSF和WT G-CSFR的错配具有选择性。

因此，表2中所示的相同变体G-CSF和受体设计的各种位点II突变表现出分别相较于野生型G-CSFR和G-CSF的优先结合。

实施例3：G-CSF:G-CSFR(Ig)的专用位点III界面的合理设计

位点III受体Ig结构域与G-CSF结合的亲合力效应有助于形成2:2异二聚体化学计量的G-CSF:G-CSFR(Ig-CRH)复合物(参见图1)。仅在具有WT位点III界面的位点II上存在的选择性设计似乎不足以创建完全专用的2:2G-CSF_E:G-CSFR(Ig-CRH)_E复合物。为了有利于使配对的、共同演化的设计的结合相较于与WT细胞因子或受体的错配结合具有选择性，将实施例1中描述的计算机设计工作流应用于位点III界面，以创建选择性位点III设计(参见图2)。

方法

首先，对位点III界面相互作用进行了结构分析。位点III界面为G-CSF:G-CSFR复合物贡献了55.64kcal/mol AMBER能量，并且与界面面积为的位点II相比，其整体界面面积较小，为/>与位点II界面相比，对位点III界面的深入检查揭示了更少的静电和氢键相互作用(参见图8)。位点III的关键相互作用例如是G-CSF的E46与受体Ig结构域的R41之间的盐桥，此外，G-CSF的R147与受体Ig结构域的E93之间的盐桥(参见图9)。两种相互作用分别为位点III的总吸引AMBER能量贡献15.9％和15.4％。例如，通过受体Ig结构域的Q87进行进一步的相互作用，所述结构域与G-CSF位点III的主链的侧链酰胺形成氢键相互作用，并与细胞因子的周围侧链例如E46和L49具有Lennard Jones相互作用。这种相互作用构成了位点III处总吸引AMBER能量的12.3％。

接下来，在位点III创建了阳性设计，其中G-CSF_E突变体对其共同演化的G-CSFR(Ig)_E突变体在计算机上具有良好的AMBER结合亲和力(配对相互作用)。例如，这是通过反转电荷或改变形状互补性，同时保持有利的Lennard Jones和氢键相互作用来完成的。将突变体对G-CSF_E:G-CSFR(Ig)_E通过ZymeCAD^TM的平均场包装工作流程来包装。目视检查了设计在位点III上包装的计算机模型设计的结构完整性，并通过ZymeCAD^TM度量对其进行了评估，如实施例1中所述。接下来，用ZymeCAD^TM包装具有WT G-CSFR(Ig)的每个设计的G-CSF_E突变体(关于G-CSFR(Ig)_E和G-CSF_WT，反之亦然)，以评估在与WT细胞因子和受体错配的条件下的度量。使用如之前在实施例1中对于位点II所述的ZymeCAD^TM(参见表6)计算位点III设计的ddAMBER亲和力度量(G-CSF_WT:G-CSFR(Ig)_E、G-CSF_E:G-CSFR(Ig)_WT)。

对位点III设计进行聚类，并将所有三个计算机复合物G-CSF_E:G-CSFR(Ig)_E、G-CSF_WT:G-CSFR(Ig)_E、G-CSF_E:G-CSFR(Ig)_WT的包装度量与目视检查一起考虑，以评估配对的强度和针对与WT的错配的选择性，以便对设计进行排序。

结果

表3中列出的设计在ZymeCAD^TM中具有计算机包装度量，有利于G-CSF_E:G-CSFR(Ig)_E的配对，相对于与WT G-CSF或G-CSFR(Ig)的错配具有高选择性。

因此，预测表3中所示的相同变体G-CSF和受体设计的各个位点III突变表现出分别相对于野生型G-CSFR和G-CSF的优先结合。

表6：在ZymeCAD^Tm中具有来自一式三份计算机平均场包装的以kcal/mol计的AMBER度量的位点III设计。

实施例4：位点II和位点III的创建变体的共同进化的细胞因子-受体开关的组合

为了开发一种完全选择性的设计对G-CSF_E:G-CSF(Ig-CRH)_E，它能够通过2:2异二聚体工程化复合物进行结合和信号传导，并且与野生型细胞因子或受体具有低的或完全消除的交叉反应性，将来自实施例1和3的所选位点II和III设计组合(参见表4)并在体外进行测试。

以相同的方式，将表4中的设计组合，实施例1的位点II设计(表2)与实施例3的位点III设计(表3)的任何其他组合可导致可实现变体信号传导的组合的完全选择性G-CSF_E:G-CSFR(Ig-CRH)_E设计。在实施例2所述的共表达测定中测试组合设计401和402形成工程化G:CSF_E:G-CSFR(Ig-CRH)_E复合物的能力以及它们结合WT细胞因子或受体的能力。

方法

如以上实施例2所述进行通过细胞因子TST标签的下拉共表达测定，不同之处在于受体构建体含有称为G-CSFR(Ig-CRH)的Ig和CRH结构域(残基2-308，表1)。

结果

组合设计401和402在共表达测定中具有完全选择性，因为设计细胞因子下拉了其共同演化的工程化受体，而非WT受体，并且反之亦然，WT G-CSF不会下拉工程化受体(参见图10)。

这些结果表明，将选择位点II和位点III突变组合的变体G-CSF和包含变体G-CSFRECD设计的受体能够特异性结合工程化细胞因子受体对，并且分别不结合野生型受体或细胞因子。

实施例5：产生G-CSF和G-CSFR野生型和突变体

为了产生野生型和工程化细胞因子和受体变体并比较它们的生物物理特性，从昆虫细胞中表达并纯化了重组蛋白。

方法

如上所述克隆G-CSF_E和G-CSF_WT。在2-4L健康的对数期Tni细胞中如下进行重组蛋白质的制备规模生产：用每2ml细胞20μl细胞因子变体P2病毒接种800mL的2x10⁶个细胞ml^-1的Tni，并且将其在27℃下在以135rpm振摇下孵育70h。孵育后，通过以5500rpm离心15分钟来使细胞沉淀，并将上清液过滤两次，首先通过1μm的A/E型玻璃纤维过滤器(PALL，目录61631)过滤，随后通过0.45μmPVDF膜过滤器(Sigma Aldrich，目录HVLP04700)过滤。添加蛋白酶抑制剂混合物III(Sigma Aldrich，目录加539134)并将上清液缓冲液交换到HBS(20mMHEPES pH8、150mM NaCl)中并在切向流上浓缩至300mL。用3x3mL b.v Streptactin-XT工作流平台以分批模式纯化蛋白质，并在搅拌下孵育2x1h，并在4℃下孵育1x过夜。在洗脱之前，用10CV HBS缓冲液洗涤树脂。在4x5mL BXT洗脱缓冲液中洗脱蛋白质。通过nanodrop A280和还原SDS-PAGE分析洗脱液，将其浓缩至约2mL，并通过与TEV以1:80的TEV:蛋白质比率在18℃下孵育过夜并进行倾覆混合，从而裂解TST纯化标签。在装载到SX7516/600或SX20016/600尺寸排阻柱(GE Healthcare，目录28-9893-33或28-9893-35)上之前，通过SDS-PAGE确认切割蛋白，所述柱在20mM BisTris pH 6.5、150mM NaCl中平衡(参见图11)。通过还原SDS-PAGE分析含有蛋白质的级分，将其合并，并通过nanodrop A280测量来测量浓度。

对于受体变体的蛋白质纯化，如上所述克隆野生型和G-CSFR(Ig-CRH)_E突变体，用于纯化的受体构建体除CRH结构域外还包含Ig结构域(Uniprot ID Q99062的残基3-308，表1)。如上所述，制备了病毒原液并将其用于2-4L规模的感染。将澄清的上清液缓冲液交换到Ni-NTA结合缓冲液(20mM HEPES pH8、1M NaCl、30mM咪唑)中，并如上所述浓缩至300mM。用3x3mL b.v Ni-NTA工作流平台以分批结合模式纯化蛋白质，并在搅拌下孵育2x1h，并在4℃下孵育1x过夜。在洗脱之前，用10CV结合缓冲液洗涤树脂。在4x5mL Ni-NTA洗脱缓冲液(20mM HEPES pH8、1M NaCl、250mM咪唑)中洗脱蛋白质。分析洗脱液，将其缓冲液交换到20mM Bis-Tris pH6.5、150mM NaCl中，浓缩并如上所述裂解过夜。随后将切割蛋白装载到SX 75 16/600或SX200 16/600尺寸排阻柱(GE Healthcare)上，所述柱在20mM BisTris pH6.5、150mM NaCl中平衡(参见图12)。通过还原SDS-PAGE分析含有蛋白质的级分，将其合并，并通过nanodrop A280测量来测量浓度。

结果

野生型、G-CSF_E和G-CSFR_E突变体在SEC后为>90％纯的，如通过还原SDS-PAGE判断(参见图11和12)。设计401和402G-CSF_E的每1L培养物在SEC后的产率分别为2.7mg和1.6mg。设计401和402G-CSFR_E的每1L产物在SEC后的产率分别为1.7mg和1.5mg。将WT G-CSF以每1L培养物在SEC后2.1mg的产率纯化，将WT G-CSFR以每1L培养物在SEC后3.1mg的产率纯化。

这些结果证实，用于纯化变体G-CSF和受体的方法可有效地产生纯化的蛋白质，以用于体外分析生物物理特性。

实施例6：通过SPR确定设计对其配对和错配的结合配偶体的亲和力

为了确定设计细胞因子对其共同演化的受体突变体的亲和力，测量了G-CSF_E对G-CSFR_E的亲和力。还通过SPR(错配)确定设计子集的G-CSF_E对G-CSFR_WT的亲和力和G-CSF_WT对G-CSFR_E的亲和力。

方法

使用PBS-T(PBS+0.05％(v/v)Tween 20)运行缓冲液在25℃温度下在BiacoreT200仪器(GE Healthcare，Mississauga，ON，Canada)上进行SPR结合测定。CM5系列S传感器芯片、Biacore胺偶联试剂盒(NHS、EDC和1m乙醇胺)以及10mM乙酸钠缓冲液全部都购自GEHealthcare。具有0.05％Tween20(PBS-T)的PBS运行缓冲液购自Teknova Inc.(Hollister,CA)。在三种不同的固定取向上评估了设计。

为了确定G-CSF_E与G-CSFR_E的结合亲和力，如制造商(GE LifeSciences)所述，通过标准胺偶联捕获G-CSFR_E突变体。简言之，在EDC/NHS活化后，立即以5μL/min的流速注射G-CSFR_E于10mM NaOAc pH 5.0中的5μg/mL溶液，直到达到约700-900RU的受体密度。通过以10μL/min 420s注射1M乙醇胺盐酸盐-NaOH pH 8.5来淬灭剩余的活性基团。使用单循环动力学，将使用空白缓冲液对照以200nM开始的两倍连续稀释的相应G-CSF_E突变体的六个浓度以25μL/min依次注射300s，并存在1800s解离阶段，产生一组具有缓冲液空白参考的传感图。也对没有捕获变体的参考细胞进行相同的样品滴定。通过以30μL/min持续30s进行10mM甘氨酸/HCl pH 2.0的一个脉冲来再生芯片，以准备下一个注射循环。

为了评估G-CSF_WT与G-CSFR_E的结合亲和力，如上所述，将G-CSF_E以约700-900RU的密度捕获在芯片上。使用单循环动力学，将使用用空白缓冲液对照以200nM开始的两倍连续稀释的每个G-CSFR_WT的六个浓度以25μL/min依次注射300s，并存在1800s总解离时间，产生一组具有缓冲液空白参考的传感图。也对没有捕获变体的参考细胞进行相同的样品滴定，并且如上所述再生芯片。

为了评估G-CSF_E与G-CSFR_WT的结合亲和力，如上文在本实施例中所述，捕获如实施例5中所述纯化的重组G-CSFR_WT。使用单循环动力学，如上所述，依次注射使用空白缓冲液对照以200mM开始的两倍连续稀释的每个G-CSF_E突变体的六个浓度。也对没有捕获变体的参考细胞进行相同的样品滴定。如上所述再生G-CSFR_WT表面。

作为对照，在每个实验中评估WT G-CSF与WT G-CSFR(Ig-CRH)的结合，并将其用于计算每个独立测量中的K_D倍数变化。

使用Biacore^TM T200评估软件v3.0分析来自一式两份或一式三份重复注射的双参考传感图，并拟合至1:1Langmuir结合模型。

结果

动力学推导的亲和常数(K_D)，其中通过拟合曲线的缔合相和离解相获得。WT G-CSF对WT G-CSFR(Ig-CRH)的K_D的范围在1.8-2.5E-9之间。对于动力学参数无法拟合的情况，尝试推导出稳态亲和常数。在这些情况下，由WT G-CSF:WT G-CSFR(Ig-CRH)对的稳态推导出的K_D计算KD倍数变化，并在表7中指示。

设计9、130、134、137、307、401和402显示出对其共同演化的结合配偶体的亲和力不大于WT:WT KD的2倍(参见表7和图13)。

设计9、30和34G-CSFR(Ig-CRH)_E突变体显示出对WT G-CSF的亲和力与WT G-CSFR(Ig-CRH)相比弱超过700倍。设计#35G-CSFR(Ig-CRH)_E针对与WT细胞因子的错配的选择性较低，其对WT G-CSF的亲和力与WT:WT亲和力相比降低了约19倍。设计130、134、401、402、300、3003、304和307G-CSFR(Ig-CRH)_E突变体针对与WT G-CSF的错配的选择性最强，并且在滴定的浓度下未显示出与WT G-CSF的明显结合(参见表8、图13)。

设计124、130、401、402、300、303、304和307G-CSF_E突变体在滴定的浓度下未显示出与WT G-CSFR(Ig-CRH)的明显结合。设计9、30和34G-CSF_E突变体显示对WT G-CSFR(Ig-CRH)的K_D与WT:WT KD相比弱至少约20倍。设计#134G-CSF_E显示出对WT G-CSFR(Ig-CRH)的亲和力弱约500倍(参见表9、图13)。设计35和117G-CSF_E突变体显示与WT G-CSFR(Ig-CRH)的结合类似于WT:WT KD。

这些结果表明，所选变体G-CSF设计不结合野生型G-CSFR ECD或与野生型G-CSFRECD的亲和力显着降低(弱至少约20倍的KD)。

表7：通过SPR确定的G-CSF_E突变体对其相应G-CSFR(Ig-CRH)_E突变体的结合亲和力(KD)与WT:WT结合亲和力相比的变化

^ss表示稳态推导的亲和常数。

表8：通过SPR确定的WT G-CSF与设计G-CSFR(Ig-CRH)_E的结合亲和力与WT:WT结合亲和力相比的变化

^ss表示稳态推导的亲和常数

表9：通过SPR确定的G-CSF_E与野生型G-CSFR(Ig-CRH)的结合亲和力与WT:WT结合亲和力相比的变化

实施例7：设计G-CSF_E突变体热稳定性的测定

为了测定G-CSF_E和G-CSFR_E突变体与WT细胞因子和受体相比的热稳定性，进行了差示扫描量热法(DSC)。

方法

通过差示扫描量热法(DSC)如下评估变体的热稳定性：将950mL浓度为1-2mg/mL的纯化样品用于使用Nano DSC(TA instruments,New Castle,DE)进行的DSC分析。在每次运行开始时，进行缓冲液空白注射以稳定基线。在60psi氮气压力下，以60℃/h的速率从25℃至95℃扫描每个样品。参考所得的热分析图并使用NanoAnalyze软件进行分析，以确定作为热稳定性指标的熔解温度(Tm)。

结果

将工程化变体的热稳定性报告为在相同条件和实验设置下测得的工程化分子与等效野生型分子的最显着转变(最高焓)之间的差异。在独立实验中，测量的WT GCSF Tm在52.2℃和55.4℃之间变化，而WT G-CSFR显示出Tm为50.5℃。除设计#15和34外，测试的G-CSF_E突变体显示出小于5℃的Tm，与WT G-CSF的Tm不同(参见表10和图14)。所有测试的受体突变体显示出与WT受体相同的热稳定性(参见表10和图14)。

这些结果表明，变体G-CSF和具有变体G-CSFR ECD设计的受体与野生型G-CSF和G-CSFR具有相似的热稳定性；并且位点II和/或位点III突变不会破坏G-CSF或G-CSFR ECD的热稳定性。

表10：通过DSC测定的设计细胞因子和受体突变体的熔解温度(Tm)与野生型相比的变化。

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*在150mM NaCl,20mM BisTris pH 6.5中测定

实施例8：通过UPLC-SEC测定G-CSF_E突变体的单分散性

为了测定G-CSF_E突变体与WT G-CSF相比的单分散性，通过UPLC-SEC分析了突变体。

方法

使用Acquity BEH125 SEC柱(4.6x150mm，不锈钢，1.7μm颗粒)(Waters LTD，Mississauga，ON)对SEC纯化的蛋白质样品进行UPLC-SEC，所述柱设置为30℃并安装在具有PDA检测器的Agilent Technologies 1260infinity II系统上。运行时间由7分钟组成，其中运行缓冲液为150mM NaCl、20mM HEPES pH 8.0或150mM NaCl、20mM BisTris pH 6.5，流速为0.4mL/min。通过在210-500nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并在280nm处提取色谱图。使用OpenLAB^TMCDS ChemStation^TM软件进行峰值积分。

结果

WT G-CSF和设计34、35和130G-CSF_E突变体为100％单分散(参见表11)。突变体8、9、15、117、135显示出在65.3-79.5％之间的较低单分散性。设计#134细胞因子在pH 8.0下显示出57.3％单分散性，在pH 6.5下改善至86.6％单分散性。流动相在较低pH下的单分散性的改善可能是由于pI的偏移，例如从针对WT G-CSF的计算的5.41的pI偏移到针对设计#134G-CSF_E的计算的8.35的pI。

这些结果表明，某些变体G-CSF设计与野生型G-CSF具有100％单分散性。表明位点II和/或位点III突变的子集不会破坏G-CSF的单分散性；而其他变体G-CSF设计导致单分散性降低，在较低pH值下增加。

表11：通过UPLC-SEC测定的G-CSF_E设计突变体的单分散性。

G-CSF_E设计突变体	单分散性％
		WT	100.0(96.7*)
8	73.7
		9	65.3
15	57.3
		34	100.0
35	100.0
		117	74.7*
130	100.0*
		134	57.3(86.6*)
135	79.5*
		401	89.6*

*在150mM NaCl、BisTris pH 6.5中

实施例9：构建具有细胞内IL-2受体信号传导结构域的嵌合G-CSF受体

为了研究设计G-CSF_E细胞因子突变体是否能够通过设计G-CSFR(Ig-CRH)_E受体突变体发出信号并引起免疫细胞增殖，使用融合到gp130跨膜(TM)结构域和细胞内信号传导结构域(ICD)的G-CSFR ECD以及IL-2Rβ细胞内信号传导结构域(G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ})来构建单链嵌合G-CSF受体。我们还利用了嵌合的G-CSFR，其由被设计成作为异二聚体受体共表达的两个亚基组成：1)G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ亚基由与IL-2RβTM和ICD融合的G-CSFR ECD组成；和2)G-CSFR_WT-ICD_γc亚基由与共同γ链(γc，IL-2Rγ)TM和ICD融合的G-CSFR ECD组成。

方法

单链嵌合受体构建体被设计为包含G-CSFR信号肽和ECD，随后是gp130 TM和部分ICD以及IL-2Rβ部分ICD(表12)。异二聚体嵌合受体构建体被设计为包含：1)G-CSFR信号肽和ECD，随后是IL-2RβTM和ICD(表13)；和2)G-CSFR信号肽和ECD，随后是γc TM和ICD(表14)。将嵌合受体构建体克隆到慢病毒转移质粒中，并通过桑格测序(Sanger sequencing)验证构建体序列。如下将转移质粒和慢病毒包装质粒(psPAX2、pVSVG)共转染到慢病毒包装细胞系HEK293T/17细胞(ATCC)中：将细胞在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中铺板过夜，并在转染前2-4小时更换培养基。将质粒DNA和水在聚丙烯管中混合，并逐滴添加CaCl₂(0.25M)。孵育2至5分钟后，通过与2x HEPES缓冲盐水(0.28M NaCl、1.5mM Na₂HPO₄、0.1M HEPES)1:1混合来沉淀DNA。将沉淀的DNA混合物添加到细胞上，将其在37℃、5％CO₂下孵育过夜。第二天更换HEK293T/17培养基，并将细胞再孵育24小时。第二天早上，从板上收集细胞上清液，短暂离心以除去碎片，并通过0.45μm过滤器过滤。在Beckman Optima L-XP超速离心机中使用SW-32Ti转子以25,000rpm将上清液旋转90分钟。除去上清液，并将沉淀重悬浮在合适体积的Opti-MEM培养基中。通过将病毒连续稀释液添加到BAF3细胞(在含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和100IU/ml hIL-2的RPMI中生长)上来测定病毒效价。转导后48-72小时，将细胞与抗人G-CSFR APC缀合抗体(1:50稀释)和eBioscience^TMFixableViability Dye eFluor^TM450(1:1000稀释)一起在4℃下孵育15分钟，洗涤并在CytekAurora或BD FACS Calibur流式细胞仪上分析。使用通过这个方法测定的估计效价，用编码嵌合受体构建体的MOI为0.5的慢病毒上清液转导32D-IL-2Rβ细胞系(在含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和300IU/ml hIL-2的RPMI中生长)。通过向细胞中添加相关量的病毒上清液、孵育24小时并替换细胞培养基来进行转导。转导后3-4天，如上所述，通过流式细胞术来验证人G-CSFR的表达。在进行BrdU测定之前，将细胞在G-CSF_WT中扩增约14-28天。

将如上所述在G-CSF_WT中扩增的32D-IL-2Rβ细胞在PBS中洗涤三次，并重新铺板在含有相关测定细胞因子的新鲜培养基中(没有细胞因子、hIL-2(300IU/ml)、G-CSF_WT(30ng/ml)或G-CSF_E(30ng/ml)持续48小时。BrdU测定程序遵循BD Pharmingen^TM APC BrdU Flow试剂盒(557892)的说明手册，并添加以下内容：将细胞与BrdU和eBioscience^TMFixableViability Dye eFluor^TM450(1:5000)共同孵育30分钟。使用Cytek Aurora仪器进行分析流式细胞术。

结果

在BrdU测定中，与hIL-2(300IU/ml)相比，用单链嵌合受体构建体G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}或异二聚体受体构建体G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ加上G-CSFR_WT-ICD_γc转染的细胞响应于G-CSF_WT(30ng/ml)而表现出相似或优异的增殖。细胞在没有细胞因子的情况下不增殖(参见图15)。

这些结果表明，在G-CSF刺激下，单链和异二聚体嵌合受体构建体可以被活化以诱导细胞增殖。

实施例10：通过BrdU检查的用设计137G-CSFR_E-ICD_IL-2转导并用野生型或设计G- CSF₁₃₇处理的32D-IL-2Rβ细胞的增殖

在体外测试如通过SPR或共表达测定法判断的具有足够选择性的位点II/III组合设计诱导32D-IL-2Rβ细胞增殖的能力。

方法

将设计137的点突变引入到表12-14中所述的构建体中。G-CSFR₁₃₇-ICD_{gp130-IL-2Rβ}(同二聚体)或G-CSFR₁₃₇-ICD_IL-2Rβ加上G-CSFR₁₃₇-ICD_γc(异二聚体)构建体的克隆和表达遵循与上文所述相同的程序。在进行BrdU测定之前，将细胞在G-CSF₁₃₇中扩增约14-28天。

使用上述BrdU测定程序测定在G-CSF₁₃₇中扩增的32D-IL-2Rβ细胞在G-CSF₁₃₇(30ng/ml)、G-CSF_WT(30ng/ml)、hIL-2(300IU/ml)或无细胞因子中的增殖。

结果

在BrdU测定中，与hIL-2(300IU/ml)相比，用单链嵌合受体构建体G-CSFR₁₃₇-ICD_{gp130-IL-2Rβ}或异二聚体受体构建体G-CSFR₁₃₇-ICD_IL-2Rβ加上G-CSFR₁₃₇-ICD_γc转导的细胞在G-CSF₁₃₇(30ng/ml)中表现出相似或优异的增殖。细胞在没有细胞因子的情况下不增殖，并且在G-CSF_WT(30ng/ml)中表现出较差的增殖(图16)。

这些结果表明，变体G-CSF特异性活化工程化受体；并且相反，工程化受体被变体G-CSF活化，但明显少于野生型G-CSF。因此，变体G-CSF可以特异性活化具有变体G-CSFRECD的嵌合受体，从而特异性诱导表达嵌合受体的细胞的增殖。

实施例11：通过BrdU检查的用野生型G-CSFR-ICD_IL-2转导并用野生型或设计G-CSF_E 处理的32D-IL-2Rβ细胞的增殖

随后测试了能够在32D-IL-2R2Rβ细胞中恢复配对信号传导的位点II/III组合设计诱导用单链嵌合受体构建体G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}或异二聚体受体构建体G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ加G-CSFR_WT-ICD_γc转导的32D-IL-2R2Rβ细胞的增殖的能力。

方法

G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}(同二聚体)或G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ加上G-CSFR_WT-ICD_γc(异二聚体)构建体的克隆和表达遵循与上文所述相同的程序。在进行BrdU测定之前，将细胞在G-CSF_WT中扩增约14-28天。

使用上述BrdU测定程序测定在G-CSF_WT中扩增的32D-IL-2Rβ细胞在G-CSF₁₃₇(30ng/ml)、G-CSF_WT(30ng/ml)、hIL-2(300IU/ml)或无细胞因子中的增殖。

结果

在BrdU测定中，与G-CSF_WT(30ng/ml)相比，用单链嵌合受体构建体G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}或异二聚体受体构建体G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ和G-CSFR_WT-ICD_γc转导的细胞在G-CSF₁₃₇(30ng/ml)中表现出较差的增殖。细胞在没有细胞因子的情况下不增殖(参见图17)。

这些结果表明，变体G-CSF不能有效地结合野生型G-CSFR，并且变体G-CSF特异性活化工程化受体，而不是野生型G-CSFR，以诱导细胞增殖。

实施例12：通过蛋白质印迹法分析的在用WT或设计137G-CSFR_E-ICD_IL-2转导并用野生型或设计G-CSF₁₃₇处理的32D-IL-2Rβ细胞中的信号传导

位点II/III组合设计能够通过32D-IL-2Rβ细胞中的工程化细胞因子-受体复合物恢复增殖信号传导并且通过结合G-CSF_WT或WT-GCSFR-ICD-IL2不会显著传导信号，通过蛋白质印迹评估所述组合设计响应于G-CSF_WT或G-CSF₁₃₇而活化下游信号传导分子的能力。

方法

G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}(同二聚体)或G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ加上G-CSFR_WT-ICD_γc(异二聚体)构建体的克隆和表达遵循与上文所述相同的程序。在进行蛋白质印迹测定之前，将细胞在G-CSF₁₃₇或G-CSF_WT中扩增约14-28天。将未转导细胞保持在IL-2中。

为了进行蛋白质印迹，将细胞在PBS中洗涤三次，并在不含细胞因子的培养基中放置16-20小时。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、G-CSF₁₃₇(30ng/ml)或G-CSF_WT(30ng/ml)在37℃下刺激细胞20分钟。在含有10mM HEPES pH 777.9、1mM MgCl₂、0.05mMEGTA、0.5mM EDTA pH 8.0、1mM DTT和1x Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂小型片剂(A32961)的洗涤缓冲液中将细胞洗涤一次。将细胞在上述洗涤缓冲液中裂解，其中添加0.2％IgepalCA630(Sigma)，在冰上裂解10分钟，并在4℃下以13,000rpm离心10分钟，之后收集上清液(细胞质部分)。将沉淀重悬浮并溶解在上述洗涤缓冲液中，添加0.42M NaCl和20％甘油。将细胞在冰上裂解30分钟，频繁涡旋，并在4℃下以13,000rpm离心20分钟，之后收集核部分(上清液)。将细胞质和核级分还原(70℃)10分钟，并在NuPAGE^TM4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上运行。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上(在20V下在SD Semi-Dry TransferCell中60min)，干燥并在TBS中的/>封闭缓冲液(927-50000)中封闭1h。在4℃下在含有0.1％Tween20的TBS中的/>封闭缓冲液中将印迹与一抗(1:1,000)一起孵育过夜。所用的一抗获自Cell Signaling Technologies：磷酸-Shc(Tyr239/240)抗体#2434、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)/>兔mAb#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体#9101、β-肌动蛋白(13E5)兔mAb#4970、磷酸-Stat3(Tyr705)(D3A7)/>兔mAb#9145、磷酸-Stat5(Tyr694)(C11C5)兔mAb#9359和组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638。将印迹在含有0.1％Tween20的TBS中洗涤三次，并在室温下将其与二抗(1:10,000)在含有0.1％Tween20的TBS缓冲液中孵育30-60分钟。二抗获自CellSignaling Technologies：抗小鼠IgG(H+L)(DyLight^TM8004X PEG缀合物)#5257和抗兔IgG(H+L)(DyLight^TM800 4X PEG缀合物)#5151。将印迹洗涤并暴露在LI-COR Odyssey成像仪上。

结果

在未转导的32D-IL-2Rβ细胞中，仅检测到响应于用IL-2刺激的活化的IL-2R相关信号传导分子。在表达G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}或G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ加G-CSFR_WT-ICD_γc的32D-IL-2Rβ细胞中观察到响应于IL-2或G-CSF_WT的活化的信号传导分子的相似模式。没有观察到IL-2R相关信号传导分子响应于表达G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}的32D-IL-2Rβ细胞或表达G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ加G-CSFR_WT-ICD_γc的细胞的G-CSF₁₃₇刺激的活化。在表达G-CSFR₁₃₇-ICD_{gp130-IL-2Rβ}或G-CSFR₁₃₇-ICD_IL-2Rβ加G-CSFR₁₃₇-ICD_γc的32D-IL-2Rβ细胞中观察到响应于IL-2或G-CSF₁₃₇的活化的信号传导分子的相似模式。没有观察到在表达G-CSFR₁₃₇-ICD_{gp130-IL-2Rβ}的32D-IL-2Rβ细胞或表达G-CSFR₁₃₇-ICD_IL-2Rβ加G-CSFR₁₃₇-ICD_γc的细胞中响应于G-CSF_WT刺激的IL-2R2R2R相关信号传导分子的活化(参见图18)。

这些结果表明，变体G-CSF能够活化表达变体G-CSFR ECD的嵌合受体，从而在表达嵌合受体的细胞中诱导天然细胞因子信号传导的方面。

实施例13-30的方法

原代细胞和细胞系：在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中培养慢病毒包装细胞系HEK293T/17(ATCC)。先前通过将人IL-2Rβ亚基稳定转染到BAF3细胞系中来产生BAF3-IL-2Rβ细胞，并且使所述细胞在含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和100IU/ml IL-2(hIL-2)(Novartis Pharmaceuticals Canada)的RPMI-1640中生长。先前通过将人IL-2Rβ亚基稳定转染到32D细胞系中来产生32D-IL-2Rβ细胞，并且使所述细胞在含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和300IU/ml hIL-2或所示其他细胞因子的RPMI-1640中生长。使人PBMC来源的T细胞(Hemacare)在含有3％人AB血清(Sigma-Aldrich,H4522)和300IU/ml hIL-2或所示其他细胞因子的TexMACS^TM培养基(Milenyi Biotec,130-097-196)中生长。通过在T细胞培养基中培养原发性腹水样品14天来产生人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)，所述T细胞培养基是以下各项的50:50混合物：1)含有10％胎牛血清、50uMβ-巯基乙醇、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素的RPMI-1640；和2)含有最终浓度为3000IU/ml hIL-2的AIM V^TM培养基(ThermoFisher,12055083)。在这种高剂量IL-2扩增之后，将TAL在含有300IU/ml hIL-2或所示其他细胞因子的T细胞培养基中培养。将逆转录病毒包装细胞系Platinum-E(Cell Biolabs，RV-101)在含有10％FBS、青霉素/链霉素、嘌呤霉素(1mcg/ml)和杀稻瘟菌素(10mcg/ml)的DMEM中培养。

慢病毒产生和32D-IL-2Rβ细胞的转导：将嵌合受体构建体克隆到慢病毒转移质粒中，并通过桑格测序(Sanger sequencing)验证所得序列。使用磷酸钙转染方法如下将转移质粒和慢病毒包装质粒共转染到HEK293T/17细胞中：将细胞铺板过夜，并在转染前2-4小时更换培养基。将质粒DNA和水在聚丙烯管中混合，并逐滴添加CaCl₂(0.25M)。孵育2至5分钟后，通过与2x HEPES缓冲盐水(0.28M NaCl、1.5mM Na₂HPO₄、0.1M HEPES)1:1混合来沉淀DNA。将沉淀的DNA混合物添加到细胞上，将其在37℃、5％CO₂下孵育过夜。第二天更换HEK293T/17培养基，并将细胞再孵育24小时。第二天早上，从板上收集细胞上清液，短暂离心以除去碎片，并通过0.45微米过滤器过滤上清液。在Beckman Optima L-XP超速离心机中使用SW-32Ti转子以25000rpm将上清液旋转90分钟。除去上清液并将沉淀重悬浮在合适体积的Opti-MEM培养基中。通过将病毒连续稀释液添加到BAF3-IL-2Rβ细胞上来确定病毒效价。在转导后48-72小时，将细胞与抗人G-CSFR APC缀合抗体(1:50；Miltenyi Biotec，130-097-308)和Fixable Viability Dye eFluor^TM450(1:1000,eBioscience^TM,65-0863-14)一起在4℃下孵育15分钟，洗涤，并在Cytek Aurora或BD FACS Calibur流式细胞仪上进行分析。使用通过这个方法确定的估计效价，以感染复数(MOI)为0.5用编码嵌合受体构建体的慢病毒上清液转导32D-IL-2Rβ细胞系。通过向细胞中添加相关量的病毒上清液、孵育24小时并随后替换培养基来进行转导。转导后3-4天，如上所述通过流式细胞术测定人G-CSFR的表达。

人原代T细胞的慢病毒转导：为了转导PBMC来源的T细胞和TAL，根据制造商的指南，将细胞解冻并在人T细胞TransAct^TM(Miltenyi Biotec,130-111-160)存在下铺板。活化后24小时，以MOI为0.125-0.5添加慢病毒上清液。活化48小时后，将细胞分到新鲜培养基，去除残留的病毒和活化试剂。转导后两至四天，如上所述通过流式细胞术测定转导效率。对于其中分别测定CD4+和CD8+级分的转导效率的实验，利用针对人G-CSFR、CD4(1:50，Alexa700缀合物，BioLegend,300526)、CD8(1:50,PerCP缀合物，BioLegend,301030)、CD3(1:50，Brilliant Violet 510^TM缀合物，BioLegend,300448)和CD56(1:50,BrilliantViolet 711^TM缀合物，BioLegend,318336)的抗体以及Fixable Viability DyeeFluor^TM450(1:1000)。

人T细胞和32D-IL-2Rβ扩增测定：将表达上文产生的所示嵌合受体构建体的人原代T细胞或32-IL-2Rβ细胞在PBS中洗涤三次，并在新鲜培养基中重新铺板，或使其培养基逐渐更换，正如所示。将完全培养基更换为含有野生型人G-CSF(内部产生或Amgen Canada)、突变G-CSF(内部产生)、hIL-2或无细胞因子。每3-5天，通过台盼蓝排除测定细胞活力和密度，并相对于起始细胞数计算扩增倍数。如上所述，通过流式细胞术评估G-CSFR表达。

CD4+和CD8+人TAL扩增测定：为了检查TAL的CD4+和CD8+级分的扩增，将离体腹水样品解冻，并使用人CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-096-533)和人CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-096-495)来富集CD4+和CD8+级分。在含细胞因子的培养基中扩增后，通过流式细胞术使用以下各者来评估细胞的免疫表型：针对人G-CSFR、CD4(1:50，Alexa700缀合物，BioLegend,300526)、CD8(1:50,PerCP缀合物，BioLegend,301030)、CD3(1:50，Brilliant Violet 510^TM缀合物，BioLegend,300448)和CD56(1:50,Brilliant Violet 711^TM缀合物，BioLegend,318336)的抗体以及FixableViability Dye eFluor^TM450(1:1000)。

原代人T细胞免疫表型测定：在含细胞因子的培养基中扩增后，通过流式细胞术利用以下各者评估T细胞的免疫表型：针对G-CSFR、CD4(1:100，Alexa700缀合物，BioLegend，300526；或PE缀合物，eBioscience^TM，12-0048-42；或Brilliant Violet 570^TM缀合物，Biolegend，317445)、CD8(1:100，PerCP缀合物，BioLegend，301030)、CD3(1:100，Brilliant Violet 510^TM或Brilliant Violet 750^TM缀合物，BioLegend，300448或344845)、CD56(1:100，Brilliant Violet 711^TM缀合物，BioLegend，318336)、CCR7(1:50，APC/Fire^TM750缀合物，Biolegend，353246)、CD62L(1:33，PE/Dazzle^TM594缀合物，Biolegend，304842)、CD45RA(1:33，FITC缀合物，Biolegend，304148)、CD45RO(1:25，710缀合物，eBioscience^TM，46-0457-42)、CD95(1:33，PE-Cyanine7缀合物，eBioscience^TM,25-0959-42)的抗体以及Fixable Viability Dye eFluor^TM450或5106(1:1000)。

逆转录病毒转导：通过限制性内切核酸酶克隆来改变pMIG转移质粒(质粒#9044，Addgene)以去除IRES-GFP(BglII至PacI位点)，并引入编码定制多克隆位点的退火引物。将嵌合受体构建体克隆到定制转移质粒中，并通过桑格测序(Sanger sequencing)验证所得序列。如上所述，使用磷酸钙转染方法将转移质粒转染到Platinum-E细胞中。转染后24小时，将培养基更换为5ml新鲜的完全培养基。转染后48小时，从板中收集细胞上清液，并通过0.45微米过滤器过滤。向上清液中添加海美溴铵(1.6mcg/ml，Sigma-Aldrich)和鼠IL-2(2ng/ml，Peprotech)。如下所述，使用纯化的逆转录病毒上清液来转导鼠淋巴细胞。

在收集逆转录病毒上清液前48小时，将24孔粘附板用未缀合的抗鼠CD3(5mcg/ml，BD Biosciences，553058)和抗鼠CD28(1mcg/ml，BD Biosciences，553294)抗体包被，在PBS中稀释，并储存在4摄氏度下。在收集逆转录病毒上清液前24小时，根据维多利亚大学动物护理委员会(University of Victoria Animal Care Committee)批准的动物使用方案对C57Bl/6J小鼠(内部产生)实施安乐死。如下收获脾脏并分离鼠T细胞：手动分离脾脏并通过100微米过滤器过滤。通过在室温下在ACK裂解缓冲液(Gibco，A1049201)中孵育五分钟，然后在含血清的培养基中洗涤一次来将红细胞裂解。使用特定的基于珠粒的分离试剂盒(Miltenyi Biotec，分别为130-104-075或130-095-130)分离CD8a-阳性或Pan-T细胞。将细胞添加到用抗CD3和抗CD28抗体包被的板的鼠T细胞扩增培养基(含有10％FBS、青霉素/链霉素、0.05mMβ-巯基乙醇和2ng/ml鼠IL-2(Peprotech，212-12)或300IU/mL人IL-2(Proleukin)的RPMI-1640)中并在37摄氏度、5％CO₂下孵育24小时。在转导当天，用上文产生的逆转录病毒上清液替换大约一半的培养基。将细胞用逆转录病毒上清液在30摄氏度下以1000g旋转转染(spinfected)90分钟。将板返回到培养箱中0-4小时，然后用新鲜的T细胞扩增培养基替换大约一半的培养基。如上所述，在24小时后重复逆转录病毒转导，总共进行两次转导。最终转导后24小时，将T细胞分到6孔板，并从抗体刺激中去除。

转导后48-72小时，通过流式细胞术评估转导效率，以如上所述检测人G-CSFR，CD4(Alexa Fluor 532缀合物，eBioscience^TM，58-0042-82)、CD8a(PerCP-eFluor 710缀合物，eBioscience^TM，46-0081-82)和Fixable Viability Dye eFluor^TM450(1:1000稀释)。

BrdU掺入测定：将如上所述产生的人原代T细胞、32D-IL-2Rβ细胞或鼠原代T细胞在PBS中洗涤三次，并在含有以下相关测定细胞因子的新鲜培养基中重新铺板48小时：无细胞因子、hIL-2(300IU/ml)、野生型或工程化G-CSF(在单个实验中指示的浓度)。BrdU测定程序遵循BD Pharmingen^TM APC BrdU Flow试剂盒(BD Biosciences,557892)的说明书手册，并添加以下内容：将细胞与BrdU和Fixable Viability Dye eFluor^TM450(1:5000)在37摄氏度下共同孵育30分钟至4小时。使用Cytek Aurora仪器进行流式细胞术。为了特异性评估表达嵌合受体的鼠T细胞的增殖，在固定之前，在冰上对人G-CSFR(1:20稀释)，CD4(1:50稀释)和CD8(1:50稀释)进行15分钟额外染色。

蛋白质印迹：将如上所述产生的人原代T细胞、32D-IL-2Rβ细胞或鼠原代T细胞在PBS中洗涤三次，并在不含细胞因子的培养基中放置16-20小时。在37摄氏度下，未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(以在单个实验中指示的浓度)或G-CSF₁₃₇(30ng/ml)刺激细胞20分钟。将细胞在含有10mM HEPES pH7.9、1mM MgCl₂、0.05mM EGTA、0.5mM EDTA pH 8.0、1mM DTT和1x Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂小型片剂(A32961)的缓冲液中洗涤一次。将细胞在冰上在上述洗涤缓冲液中裂解10分钟，其中添加0.2％NP-40(Sigma)。将裂解物在4摄氏度下以13000rpm离心10分钟，并收集上清液(细胞质级分)。将沉淀(含有核蛋白)重悬浮于上述洗涤缓冲液中，其中添加0.42M NaCl和20％甘油。将核在冰上孵育30分钟，频繁涡旋，并在4摄氏度下以13,000rpm离心20分钟后收集上清液(核部分)。将细胞质和核级分还原(70摄氏度)10分钟，并在NuPAGE^TM4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上运行。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上(在20V下在SD Semi-Dry Transfer Cell中60min)，干燥并在TBS中的/>封闭缓冲液(927-50000)中封闭1h。在4摄氏度下在含有0.1％Tween20的TBS中的/>封闭缓冲液中将印迹与一抗(1:1000)一起孵育过夜。所用的一抗获自Cell Signaling Technologies：磷酸-JAK1(Tyr1034/1035)(D7N4Z)兔mAb#74129、磷酸-JAK2(Tyr1007/1008)#3771、磷酸-JAK3(Tyr980/981)(D44E3)兔mAb#5031、磷酸-p70 S6激酶(Thr421/Ser424)抗体#9204、磷酸-Shc(Tyr239/240)抗体#2434、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)/>兔mAb#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体#9101、β-肌动蛋白(13E5)兔mAb#4970、磷酸-STAT1(Tyr701)(58D6)兔mAb#9167、磷酸-STAT3(Tyr705)(D3A7)/>兔mAb#9145、磷酸-STAT4(Tyr693)抗体#5267、磷酸-STAT5(Tyr694)(C11C5)兔mAb#9359和组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638。将印迹在含有0.1％Tween20的TBS中洗涤三次，并在室温下将其与二抗(1:10,000)在含有0.1％Tween20的TBS缓冲液中孵育30-60分钟。从Cell SignalingTechnologies获得的二抗是抗小鼠IgG(H+L)(DyLight^TM800 4X PEG缀合物)#5257和抗兔IgG(H+L)(DyLight^TM800 4X PEG缀合物)#5151。将印迹洗涤并暴露在LI-COR Odyssey成像仪上。

检测磷酸化蛋白质的流式细胞术：将如上所述产生的人原代T细胞、32D-IL-2Rβ细胞或鼠原代T细胞在PBS中洗涤三次，并在不含细胞因子的培养基中放置16-20小时。在Fixable Viability Dye eFluor^TM450(1:1000)和所示抗G-CSFR(1:20)、抗CD4(1:50)和抗CD8a(1:50)存在下，在37摄氏度下，未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激细胞20分钟。使细胞沉淀并在室温下用BD Phosflow^TM固定缓冲液I(BDBiosciences,557870)固定15分钟。洗涤细胞，然后在冰上用BD Phosflow^TM透化缓冲液III(BD Biosciences,558050)透化15分钟。将细胞洗涤两次，并重新悬浮于含有20ul BDPhosflow^TMPE小鼠抗-Stat3(pY705)(BD Biosciences,612569)或PE小鼠IgG2aκ同型对照(BD Biosciences,558595)的缓冲液中。洗涤细胞，并使用Cytek Aurora仪器进行流式细胞术。

实施例13：表达G2R-1、仅G-CSFR/IL-2RΒ亚基、仅MYC标记的G-CSFR/Γ-C亚基或全长G-CSFR的人T细胞的扩增。

用编码图20、图24和图24中所示的嵌合受体构建体的慢病毒转导PBMC来源的T细胞或肿瘤相关性淋巴细胞(TAL)，并且将细胞洗涤并重新铺板在所指示的细胞因子中。每3-4天计数细胞。将G/γc在其N末端用Myc表位标记(Myc/G/γc)，并且将G/IL-2Rβ在其N末端用Flag表位标记(Flag/G/IL-2Rβ)；这些表位标签有助于通过流式细胞术进行检测，并且不会影响受体的功能。正如预期，所有T细胞培养物均显示出响应于阳性对照细胞因子IL-2(300IU/ml)的增殖。用G-CSF(100ng/ml)刺激后，仅观察到PMBC来源的T细胞和表达G2R-1嵌合细胞因子受体的TAL的增殖(图22)。注意，慢病毒转导效率小于100％，使得小于100％的T细胞表达所指示的嵌合细胞因子受体，这可能解释了由G2R-1介导的增殖速率相对于IL-2更低的原因。类似地，在表达G-CSFR嵌合受体亚基G2R-1和G2R-2并用G-CSF刺激的32D-IL-2Rβ细胞(稳定表达人IL-2Rβ亚基)中观察到增殖增加(图21)。与T细胞相反，仅表达G/IL-2Rβ嵌合受体亚基的32D-IL-2Rβ细胞在响应G-CSF时增殖(图21)；在仅表达G/γc嵌合受体亚基的32D-IL-2Rβ细胞中未见G-CSF诱导的增殖(图21)。

这些结果表明G-CSF能够刺激PMBC来源的T细胞和表达G2R-1嵌合受体的TAL以及表达G/IL-2Rβ，G2R-1和G2R-2嵌合受体的32D-IL-2Rβ细胞的增殖和活力。

实施例14：G-CSFR ECD在用G/IL-2Rβ、G2R-1和G2R-2转导的细胞的表面上表达。

在用编码G2R-2嵌合细胞因子受体的慢病毒载体转导后，对32D-IL-2Rβ细胞系、PBMC来源的人T细胞和人肿瘤相关淋巴细胞进行流式细胞术(在图23和25中示意性示出)，以确定细胞是否在细胞表面表达G-CSFR ECD。在所有转导的细胞类型中均检测到G-CSF R阳性细胞(图26)。在单独的实验中，通过流式细胞术测得，表达G/IL-2Rβ，G2R-1和G2R-2嵌合受体的32D-IL-2Rβ细胞对G-CSFR ECD呈阳性(图21B至图21D中的下图)。

这些结果表明G/IL-2Rβ、G2R-1和G2R-2嵌合受体在细胞表面上表达。

实施例15：与未转导细胞相比，表达G2R-2的细胞的扩增

将人PBMC来源的T细胞和人肿瘤相关淋巴细胞用G2R-2受体构建体进行慢病毒转导(图23和25)，洗涤，并用所指示的细胞因子重新铺板。在某些实验中，也通过用TransAct刺激而定期重新活化T细胞。每3-4天对活细胞进行计数。用G-CSF(100ng/ml)刺激之后在表达G2R-2嵌合受体的细胞中但不在未转导细胞中，观察到PMBC来源的T细胞(图27A)和肿瘤相关淋巴细胞(图27B、图27C中的两次独立实验)的增殖。

这些结果表明G-CSF诱导的G2R-2嵌合受体的活化足以诱导免疫细胞的增殖和活力。

实施例16：与未转导细胞相比，表达G2R-2的CD4选择或CD8选择的人肿瘤相关淋巴细胞的扩增和免疫表型

将CD4选择的和CD8选择的人T细胞用编码G2R-2的慢病毒载体转导(图25)，或如所指示保持未转导。将细胞洗涤并用指示的细胞因子重新铺板并每3-4天计数一次。在用G-CSF(100ng/ml)或IL-2(300IU/ml)刺激后观察到表达G2R-2的CD4选择或CD8选择的TAL的增殖，但在不存在添加的细胞因子(仅培养基)的情况下未观察到(图28和29)。在图28中，每条线表示来自5个患者样品之一的结果。

通过流式细胞术进行的免疫表型分析表明，在G-CSF或IL-2中培养的T细胞保留其CD4+或CD8+同一性(图30A)，缺乏NK细胞表型(CD3-CD56+)(图30A)，并且在这些培养条件下表现出CD45RA-CCR7-T效应记忆(T_EM)表型(图30B)。

进行BrdU测定以确认在用G-CSF刺激后表达G2R-2的T细胞的细胞周期进程增加(图31)。正如所示，在测定之前，通过在IL-2或G-CSF中培养来选择T细胞。评估了肿瘤相关淋巴细胞(图31A)和PBMC来源的T细胞(图31B)。

这些结果表明，G-CSF可以通过活化嵌合细胞因子受体G2R-2来选择性地活化细胞周期进程和原代人TAL的长期扩增。这些结果还表明，通过形成同二聚体活化G2R-2嵌合受体足以活化TAL中的细胞因子样信号传导和增殖。此外，表达G2R-2的TAL仍依赖于细胞因子，因为它们在撤除G-CSF时经历细胞死亡，类似于对IL-2撤除的反应。在G-CSF中培养的TAL与在IL-2中培养的TAL保持相似的免疫表型。

实施例17：表达G2R-2的原代鼠T细胞响应于G-CSF而增殖。

进行BrdU掺入测定以评估在用G-CSF刺激时表达G2R-2或单链G/IL-2Rβ(G2R-1的组分)的原代鼠T细胞相对于模拟转导细胞的增殖。在测定之前，将所有细胞在IL-2中扩增3天。通过流式细胞术证实G2R-2或G/IL-2Rβ的细胞表面表达(图32A)。正如所示，然后将细胞铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。在表达G2R-2的细胞中观察到在用G-CSF刺激后增加的细胞周期进程高于未转导细胞或表达单链G/IL-2Rβ(的细胞中(图32B、图32C)。图B和图C分别示出了所有活细胞或G-CSFR+细胞的结果。

这些结果表明，响应于G-CSF诱导的同二聚化，G2R-2嵌合受体比单链G/IL-2Rβ受体更有效地活化鼠T细胞中的细胞因子样信号传导和增殖。

实施例18：在表达G2R-2的人原代T细胞中响应于G-CSF或IL-2而活化细胞因子相关的细胞内信号传导事件

为了证实与IL-2相似，嵌合细胞因子受体确实能够活化细胞因子信号传导，评估了细胞因子受体活化各种信号传导分子的能力。使表达G2R-2的肿瘤相关淋巴细胞和PBMC来源的T细胞先前在G-CSF中扩增，而未转导细胞先前在IL-2中扩增。将细胞洗涤，然后用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子刺激，并且使用针对所指示的信号传导分子的抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹(图33)。图A和图B示出了TAL的结果，并且图C示出了PBMC来源的T细胞的结果。表达G2R-2的T细胞在用G-CSF刺激时活化IL-2相关信号传导分子，其程度与IL-2刺激未转导细胞或转导细胞后可见的活化相似，但预期的例外是G-CSF诱导JAK2磷酸化，而IL-2诱导JAK3磷酸化。

这些结果证实，G2R-2嵌合受体能够在用G-CSF刺激时活化IL-2受体样细胞因子受体信号传导。

实施例19：在表达G2R-2的鼠原代T细胞中响应于G-CSF而活化细胞因子信号传导。

为了评估嵌合细胞因子受体G2R-2或单链G/IL-2Rβ(来自G2R-1)是否能够活化细胞因子信号传导，通过对表达G2R-2或G/IL-2Rβ的鼠原代T细胞相对于模拟转导细胞的细胞裂解物进行蛋白质印迹来评估这些细胞因子受体活化各种信号传导分子的能力。在测定之前，将所有细胞在IL-2中扩增3天。然后洗涤细胞并用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子刺激细胞。表达G2R-2的细胞在用G-CSF刺激时活化IL-2相关信号传导分子，其程度与IL-2刺激未转导细胞或转导细胞后可见的活化相似，但预期的例外是G-CSF诱导JAK2磷酸化，而IL-2诱导JAK3磷酸化(图34)。相反，G/IL-2Rβ在暴露于G-CSF时不会活化细胞因子信号传导。

这些结果在原代鼠T细胞中证实，在G-CSF刺激后，G2R-2嵌合受体能够通过同二聚化活化IL-2受体样细胞因子受体信号传导，而单独的单链G/IL-2Rβ不能通过响应于G-CSF的同二聚化来活化细胞因子信号传导。

实施例20：嵌合受体的表达在用正交G-CSF刺激后导致32D-IL-2RΒ细胞和原代鼠 T细胞的增殖。

为了确定表达嵌合细胞因子受体的细胞是否可以响应于正交版本的G-CSF而被选择性活化，用包含野生型G-CSFR ECD(G2R-1WT ECD、G2R-2WT ECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2以及包含携带氨基酸取代R41E、R141E和R167D的G-CSFR ECD(G2R-1 134ECD、G2R-2134ECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2转导32D-IL-2Rβ细胞或原代鼠T细胞。用IL-2、野生型G-CSF或正交G-CSF(130G-CSF)刺激细胞，所述正交G-CSF能够结合G2R-1 134ECD和G2R-2134ECD，但与野生型G-CSFR的结合显著降低。进行BrdU掺入测定以评估细胞在细胞因子刺激下促进细胞周期进程的能力(图35)。表达G2R-2 134ECD的32D-IL-2Rβ细胞在用130G-CSF(包含氨基酸取代E46R、L108K和D112R；30ng/ml)刺激后显示出细胞周期进程，但在用野生型G-CSF(30ng/ml)刺激后未经历细胞周期进程。通过在“十字形(criss-cross)”增殖测定中刺激原代鼠T细胞，进一步证明了工程化细胞因子:受体ECD对的正交性质，其中将表达具有WT、130、134、304或307ECD的G2R-3的细胞(图23)用WT、130、304或307细胞因子(100ng/ml)刺激(图36)。130ECD具有氨基酸取代：R41E和R167D。304ECD具有氨基酸取代：R41E、E93K和R167D；而304细胞因子具有氨基酸取代：E46R、L108K、D112R和R147E。307ECD具有氨基酸取代：R41E、D197K、D200K和R288E；而307细胞因子具有氨基酸取代：S12E、K16D、E19K和E46R。图36中的图A和图B表示实验重复。

这些结果表明，表达正交嵌合细胞因子受体的细胞能够在用正交G-CSF CSF刺激后选择性活化和细胞周期进程。

实施例21：在表达正交嵌合细胞因子受体的32D-IL2RΒ细胞和原代人T细胞中活化细胞内信号传导，并用正交G-CSF刺激。

为了确定表达嵌合细胞因子受体的细胞是否可以响应于正交版本的G-CSF而选择性活化细胞内细胞因子信号传导事件，用包含野生型G-CSFR ECD(G2R-1WT ECD和G2R-2WTECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2以及包含携带氨基酸取代R41E、R141E和R167D的G-CSFR ECD(G2R-1 134ECD、G2R-2 134ECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2转导32D-IL-2Rβ细胞。用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(30ng/ml)或正交G-CSF(130G-CSF-E46R_L108K_D112R；30ng/ml)刺激细胞，所述正交G-CSF能够结合G2R-1 134ECD、G2R-2 134ECD，但与野生型G-CSFR的结合显著降低。对细胞裂解物进行蛋白质印迹，以评估细胞在暴露于细胞因子后活化细胞因子信号传导的能力(图37)。表达G2R-2 134ECD的细胞在用130G-CSF而不是野生型G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。此外，表达G2R-2WT ECD的细胞在用130G-CSF刺激后不能活化细胞因子信号传导。

通过对原代鼠T细胞进行蛋白质印迹分析，进一步证明了工程化细胞因子:受体对的正交性质，其中将表达具有WT、134或304ECD(R41E_E93K_R167D)的G2R-3的细胞用WT、130或304G-CSF(E46R_L108K_D112R_R147E；100ng/ml)刺激并测量所指示的信号传导事件(图38A)。IL-2(300IU/ml)和IL-12(10ng/ml)用作对照细胞因子。表达G2R-3WT ECD的细胞在用IL-2、IL-12或WT G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。表达G2R-3 134ECD的细胞在用IL-2、IL-12或130G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。表达G2R-3 304ECD的细胞在用IL-2、IL-12或304G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。

G2R-3的三种ECD变体的细胞表面表达通过流式细胞术证实(图38B)。

这些结果表明，表达正交嵌合细胞因子受体的细胞能够在用正交G-CSF刺激后选择性活化细胞内细胞因子信号传导事件。

实施例22：G2R-3的表达导致原代人T细胞的扩增、细胞周期进程和细胞因子相关的细胞内信号传导和免疫表型

为了确定G2R-3嵌合受体在原代人T细胞中用G-CSF刺激后是否可以促进细胞因子信号传导相关事件，用编码G2R-3的慢病毒载体转导TAL。进行T细胞扩增测定以测试在用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子刺激时细胞的增殖。每3-4天对活细胞进行计数。与其未转导对应物相反，表达G2R-3的原代TAL在培养物中响应于G-CSF而扩增(图40A)。为了确定在用G-CSF刺激后细胞因子信号传导事件是否被活化，对细胞裂解物进行蛋白质印迹以评估细胞内信号传导。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激。表达G2R-3的原代TAL表现出响应于G-CSF的IL-2相关性信号传导事件，但预期的例外是G-CSF诱导JAK2磷酸化，而IL-2诱导JAK3磷酸化(图40B)。

进行BrdU掺入测定以评估用G-CSF刺激后的细胞周期进程。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。表达G2R-3的原代TAL显示出响应于G-CSF的细胞周期进展(图40C)。

使用原代PBMC来源的人T细胞也证明了G-CSF诱导的表达G2R-3的细胞的扩增(图41)。表达G2R-3WT ECD的细胞响应于WT G-CSF而扩增，而不是仅培养基(图41A)。为了证明细胞对外源性细胞因子的持续依赖性，在培养第21天，将来自G-CSF扩增条件的细胞洗涤并重新铺板在WT G-CSF(100ng/mL)、IL-7(20ng/mL)+IL-15(20ng/mL)或仅培养基中。仅在G-CSF或IL-7+IL-15存在下重新铺板的细胞随时间保持存活。

如通过流式细胞术评估的，G-CSFR ECD的表达在扩增第21-42天之间在CD4+和CD8+T细胞上均保持稳定(图41B)。

通过蛋白质印迹证实，表达G2R-3的原代PBMC来源的T细胞显示出响应于G-CSF的IL-2相关信号传导事件(图42A)。对在WT G-CSF相对于IL-7+IL-15中扩增42天的原代PBMC来源的T细胞进行基于流式细胞术的免疫表型分析。表达G2R-3WT ECD并在G-CSF中培养的细胞保留与在IL-7+IL-15中培养的未转导细胞相似的表型，主要具有CD62L+、CD45RO+表型，这指示干细胞样记忆T细胞表型(T_SCM)(图42B、图42C)。同样，中央记忆(T_CM)、效应记忆(T_EM)和终末分化(T_TE)T细胞的分数也相似。

这些结果证实，G2R-3嵌合细胞因子受体能够活化细胞因子信号传导事件并促进原代细胞中的细胞周期进展和扩增。表达G2R-3并在G-CSF中长期扩增的T细胞的免疫表型与在IL-7+IL-15中扩增的未转导细胞相似。

实施例23：正交G-CSF诱导在表达具有正交ECD的G2R-3的原代人T细胞中的扩增和增殖

评估了具有304(R41E_E93K_R167D)或307(R41E_D197K_D200K_R288E)ECD的嵌合细胞因子受体G2R-3是否能够诱导响应于用正交配体130、304或307G-CSF的刺激的增殖和扩增，用编码GR-3 304ECD或G2R-3 307(R41E_D197K_D200K_R288E)ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。进行T细胞生长测定，以评估当用IL-2(300IU/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子培养时细胞的扩增倍数。每3-4天对活细胞进行计数。表达G2R-3 304ECD的T细胞在培养物中响应于IL-2或304G-CSF而扩增(图43A)。表达G2R-3 307ECD的T细胞在培养物中响应于IL-2或307G-CSF而扩增(图43B)。未转导的T细胞仅响应于IL-2而扩增(图43C)。

进行BrdU掺入测定以评估在十字形设计中用130、304和307G-CSF刺激后的细胞周期进程。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。表达G2R-3304ECD的原代人T细胞表现出响应于130或304G-CSF，而不是响应于307G-CSF的细胞周期进程(图44)。表达G2R-3 307ECD的T细胞表现出响应于307G-CSF，而不是响应于130或304G-CSF的细胞周期进程。所有T细胞均显示出响应于IL-2的细胞周期进程。

结果表明，嵌合受体G2R-3 304ECD和G2R-3 307ECD能够分别在用正交304或307G-CSF刺激后诱导原代人CD4+和CD8+T细胞的选择性细胞周期进程和扩增。此外，130G-CSF可以刺激表达G2R-3 304ECD，而不是G2R-3 307ECD的细胞增殖。

实施例24：G-CSFRECD在用G21R-1、G21R-2、G12R-1和G2R-3嵌合受体构建体转导的原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)表面上表达

为了评估嵌合细胞因子受体构建体是否可以在原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)的表面上表达，用编码G21R-1、G21R-2、G12R-1和G2R-3嵌合受体的慢病毒载体转导TAL，并且通过流式细胞术测试细胞在细胞表面上的G-CSFR ECD表达(图39)。对于所有四种嵌合细胞因子受体设计，均检测到G-CSFR ECD阳性细胞。

这些结果表明，G21R-1、G21R-2、G12R-1和G2R-3嵌合受体能够在原代细胞表面上表达。这些结果还表明G-CSFR ECD嵌合受体设计在原代细胞表面上表达。

实施例25：G-CSFR ECD在用G12R-1和G21R-1嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞表面上表达

为了确定G12R-1和G21R-1嵌合受体是否能够在原代T细胞的表面上表达，用编码G12R-1和G21R-1嵌合受体的逆转录病毒载体转导原代鼠T细胞，并通过流式细胞术分析(图45)。

结果表明，G-CSFR ECD在用编码G12R-1和G21R-1的逆转录病毒载体转导的原代鼠CD4+和CD8+T细胞表面上表达。

实施例26：G-CSF在表达G21R-1或G21R-2的原代PBMC来源的人T细胞中诱导细胞因子信号传导事件

为了确定G21R-1和G21R-2构建体是否能够在原代细胞中诱导细胞因子信号传导事件，用编码G21R-1或G21R-2嵌合细胞因子受体的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。用磷酸-STAT3(p-STAT3)特异性抗体对细胞进行细胞内染色，并通过流式细胞术评估以确定STAT3磷酸化的程度，即STAT3活化的量度(图46)。在用G-CSF(100ng/ml)刺激后，在用G21R-1或G21R-2转导的G-CSFR阳性细胞亚群中表达磷酸化STAT3的细胞数量增加。相反，G-CSFR阴性(即不表达)细胞在用G-CSF刺激后不表现出磷酸化STAT3的增加，但在用IL-21刺激后表现出增加。

这些结果表明，G21R-1和G21R-2嵌合受体能够在原代人T细胞中用G-CSF刺激后活化IL-21相关细胞因子信号传导事件。

实施例27：G-CSF在表达G21R-1或G-12R-1的原代鼠T细胞中诱导细胞内信号传导事件

为了确定嵌合细胞因子受体G21R-1是否能够活化细胞因子信号传导事件，用编码G21R-1的逆转录病毒载体转导原代鼠T细胞，并通过流式细胞术评估，以在用G-CSF刺激后检测磷酸化STAT3。对活细胞针对CD8或CD4设门，并测定CD8和CD4细胞群在未用细胞因子刺激、用IL-21(1ng/ml)或G-CSF(100ng/ml)刺激后磷酸-STAT3染色呈阳性的细胞百分比。在用G-CSF刺激后，表达G21R-1的细胞(但未转导细胞)显示出磷酸化STAT3的量增加(图47A和47B)。进行蛋白质印迹，以评估表达G21R-1或G12R-1的细胞在用G-CSF刺激后的细胞内细胞因子信号传导。正如预期，表达G21R-1并用G-CSF刺激的细胞显示STAT3的磷酸化增加，其中磷酸-STAT4和磷酸-STAT5略有增加(图47C)。也正如预期，在表达G12R-1的细胞中，发现响应于G-CSF的STAT4的强磷酸化。G-CSF在模拟转导细胞中未诱导任何信号传导事件。(应注意，在G12R-1组中，阳性对照(hIL-12 10ng/ml)似乎未诱导任何信号传导事件；这可能是由于人IL-12与鼠IL-12R的结合较差。)

结果表明，在用G-CSF刺激后，G21R-1和G12R-1能够在原代鼠T细胞中诱导细胞因子信号传导事件。

实施例28：G-CSF诱导表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1、G27/2R-1、G21/2R-1、 G12/2R-1或G21/12/2R-1的原代鼠T细胞的增殖和细胞内信号传导事件

为了评估由嵌合细胞因子受体介导的细胞因子信号传导事件和细胞增殖，用编码G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1、G27/2R-1、G21/2R-1、G12/2R-1或G21/12/2R-1的逆转录病毒载体转导原代鼠T细胞。进行BrdU掺入测定以评估用G-CSF刺激后的细胞周期进程。收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。在表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1或G27/2R-1(图48A、图48B)或G21/2R-1、G12/2R-1或G21/12/2R-1(图49A、图49B)的原代鼠T细胞中观察到G-CSF诱导的细胞周期进程。G-CSFRECD的表达也可通过流式细胞术检测到(图48C，图49C)。

通过蛋白质印迹，在表达所指示的嵌合细胞因子受体的细胞中，而非在模拟转导的细胞中，观察到响应于G-CSF(100ng/ml)的多个细胞因子信号传导事件(图48D、图49D)。通常，观察到的细胞因子信号传导事件是基于掺入到各种ICD设计中的信号传导结构域所预期的(图23和图24)。作为一个实例，G7R-1嵌合受体诱导STAT5的磷酸化(图48D)，这预期是由于来自IL-7Rα的STAT5结合位点的掺入(图23)。作为第二实例，G21/2R-1嵌合受体诱导STAT3的磷酸化(图49D)，这预期是由于来自G-CSFR的STAT3结合位点的掺入(图24)。作为第三实例，G12/2R-1嵌合受体诱导STAT4的磷酸化，这预期是由于来自IL-12Rβ2的STAT4结合位点的掺入(图24)。其他嵌合细胞因子受体显示出其他不同模式的细胞内信号传导事件。

结果表明，G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1、G27/2R-1、G21/2R-1、G12/2R-1和G21/12/2R-1能够在用G-CSF刺激后诱导原代鼠T细胞的细胞因子信号传导事件和增殖。此外，可以通过将不同的信号传导结构域并入到嵌合受体的ICD中来产生不同模式的细胞内信号传导事件。

实施例29：正交G-CSF诱导表达具有正交ECD的G12/2R-1的原代人T细胞的扩增、增殖、细胞因子相关细胞内信号传导和免疫表型

为了确定具有134ECD的嵌合细胞因子受体G12/2R-1是否能够响应于用正交配体130G-CSF的刺激而诱导增殖和扩增，用编码G12/2R-1 134ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。当用IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子培养时，进行T细胞生长测定，以评估细胞的扩增倍数。每4-5天对活细胞进行计数。表达G12/2R-1 134ECD的原代人T细胞在培养物中响应于IL-2或130G-CSF而扩增(图50A)，但在仅培养基中表现出有限的瞬时扩增。

在这个实验的第19天，将已在130G-CSF或IL-2中扩增的T细胞洗涤三次，重新铺板在IL-2、130G-CSF或仅培养基中。在仅培养基中，T细胞显示出活力降低和数量下降(图50B)。相反，重新铺板在IL-2或G-CSF 130中的T细胞显示出持续的活力和稳定的数量。

通过流式细胞术使用针对G-CSF受体的抗体检测到的G12/2R-1134ECD的表达在第4天至第16天之间在通过用130G-CSF刺激而扩增的CD4+和CD8+T细胞上增加(图50C)。进行BrdU掺入测定以评估用130G-CSF刺激后的细胞周期进程。

为了通过BrdU测定评估细胞周期进程，从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、IL-2和IL-12(10ng/mL)、130G-CSF(300ng/ml)或无细胞因子中。表达G12/2R-1 134ECD的原代人T细胞显示出响应于130G-CSF、IL-2或IL-2+IL-12的细胞周期进程，而未转导细胞仅响应于IL-2或IL-2+IL-12(图51A)。

在16天培养期之后，通过流式细胞术使用针对CD62L和CD45RO的抗体进行免疫表型分析，以比较在130G-CSF中扩增的表达G12/2R-1 134ECD的T细胞与在IL-2中扩增的未转导细胞。这两个T细胞群显示出相似比例的干细胞样记忆(T_SCM)、中央记忆(T_CM)、效应记忆(T_EM)和终末分化(T_TE)表型(图51B、图51C)。

用具有304ECD(与134ECD相对)的嵌合细胞因子受体G12/2R-1进行类似的实验。用编码G12/2R-1 304ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。进行T细胞生长测定，以评估当用IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/mL)或仅培养基培养时细胞的扩增倍数。每4-5天对活细胞进行计数。表达具有304ECD的G12/2R-1的T细胞可以在IL-2、130G-CSF或304G-CSF的存在下扩增，但在仅培养基中不扩增，而未转导细胞仅可响应于IL-2而扩增(图52A)。

为了通过BrdU测定评估细胞周期进程，从扩增测定中收获表达G12/2R-1 304ECD的先前在130G-CSF或304G-CSF中扩增的T细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/mL)、307G-CSF(100ng/mL)或仅培养基中。表达G12/2R-1 304ECD的T细胞表现出响应于130或304G-CSF，但不响应于307G-CSF或仅培养基的细胞周期进程(图52B)。

结果表明，G12/2R-1 134ECD能够在用正交130G-CSF刺激后诱导原代人CD4+和CD8+T细胞的细胞周期进程和扩增。表达G12/2R-1 134ECD并用130G-CSF扩增的细胞的T细胞记忆表型类似于用IL-2扩增的未转导细胞。此外，G12/2R-1 304ECD能够在用130或304G-CSF刺激后但不响应于307G-CSF而诱导T细胞的选择性细胞周期进程和扩增。

实施例30：正交G-CSF在表达具有正交ECD的G2R-3或G12/2R-1的原代人T细胞中诱导不同的细胞内信号传导事件

为了评估细胞内信号传导事件，用编码G2R-3 304ECD或G12/2R-1 304ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。进行蛋白质印迹，以评估在用304G-CSF(100ng/mL)、IL-2(300IU/mL)、IL-2和IL-12(10ng/mL)或仅培养基刺激后表达G2R-3 304ECD或G12/2R-1304ECD的细胞或未转导细胞中的细胞内细胞因子信号传导。在转导和未转导T细胞中，响应于用IL-2+IL-12或仅IL-2的刺激，检测到STAT5的强磷酸化(图53)。响应于用IL-2+IL-12两者的刺激，检测到STAT4的强磷酸化，但响应于用仅IL-2刺激，仅检测到STAT4的弱磷酸化。在表达G2R-3 304ECD的细胞中，响应于用304G-CSF的刺激，检测到STAT4的弱磷酸化和STAT5的强磷酸化，这类似于响应于仅IL-2所观察到的模式。在表达G12/2R-1 304ECD的细胞中，响应于用304G-CSF的刺激，检测到STAT4和STAT5的强磷酸化，这类似于响应于IL-2+IL-12所观察到的模式。未转导T细胞显示对304G-CSF无反应。

结果表明，具有304ECD的G12/2R-1能够诱导细胞因子信号传导事件，包括响应于用304G-CSF的刺激的STAT4和STAT5的强磷酸化。用304G-CSF刺激后，在表达G2R-3 304ECD的细胞中观察到不同的信号传导事件模式，包括STAT5而非STAT4的强磷酸化。

实施例31：新型G-CSF变体的设计

本文描述的发明是选择性结合G-GCSF受体(G-CSFR)的对应工程化胞外结构域(ECD)的工程化变体G-CSF细胞因子。使用基于细胞的测定来确立选择性的阈值，所述测定测量变体G-CSF与WT G-CSFR之间以及WT G-CSF与变体G-CSFR之间的结合和诱导的细胞增殖的程度。如本文所述，开发了一组第一代和第二代工程化G-CSF/G-CSFR对。在这个实施例中，我们公开了第三代G-CSF设计(130a1、130b1、130a2、130b2、130a1b1)(表4A)，其示出改进的热稳定性和选择性。

相对于WT G-CSF，第二代G-CSF 130变体含有三个氨基酸取代(E46R、L108K和D112R)。为了鉴定突变时有可能减少细胞因子与WT G-CSFR结合的额外的残基，我们首先分析了所有我们以前设计的G-CSF变体的生物物理和基于细胞的数据，其中使用G-CSF/G-CSFR共晶体结构作为进一步的指导。通过反复分析，串联谷氨酸残基(E122和E123)被鉴定为取代的先导候选物。值得注意的是，除E46R、L108K和D112R外，这两种谷氨酸在先前设计的第二代G-CSF 134变体中被取代为精氨酸，这被证明是不稳定的。这里，我们使用与精氨酸或赖氨酸的“电荷交换”策略单独取代E122和E123。我们还用赖氨酸同时取代E122和E123。基于结构分析，预期细胞因子上的位置122和/或123的新的带正电荷的残基排斥WTG-CSFR ECD上的位置141处对应带正电荷的精氨酸，导致结合减少并因此增强选择性。通过修饰仅一个位置(即E122或E123)，我们预期减少在先前设计的134G-CSF中观察到的稳定性问题，其中两个位置同时被取代。此外，基于结构分析，在位置122和123处掺入赖氨酸(而不是精氨酸)预期产生比G-CSF 134更稳定的变体。这些新的G-CSF变体(命名为130a1、130b1、130a2、130b2、130a1b1)(表4A)由于互补的R141E取代而预期能有效地与G-CSFR 134ECD配对。

实施例32：在大肠杆菌中重组生产WT和工程化变体G-CSF细胞因子

为了重组产生WT和工程化G-CSF细胞因子变体，使用基于大肠杆菌的表达系统来产生包涵体，通过重折叠从包涵体中纯化正确折叠的所关注的蛋白质。

方法

将野生型和工程化G-CSF变体克隆到受T7病毒启动子控制的pET大肠杆菌表达载体中。在2L BL21(DE3)细胞培养物中进行重组细胞因子的制备规模大肠杆菌生产，并且通过基于乳糖的自诱导，由ZYP-5052自诱导培养基中lac操纵子的自然操作来控制来诱导表达，之后使细胞培养物在30℃下以200rpm摇动生长约16小时。然后通过以8,200RCF离心10分钟沉淀细胞并弃去上清液。将细胞沉淀(约10g)重悬于40ml裂解缓冲液(50mM TRIS pH8，1mM EDTA)中，随后添加蛋白酶抑制剂混合物III(Sigma Aldrich，目录号539134)。将大肠杆菌细胞通过弗氏压碎器(French press)裂解，并且将裂解物用裂解缓冲液稀释至250ml，然后以30,000RCF离心30分钟。弃去上清液，并且将含有包涵体的沉淀完全重悬于70ml洗涤缓冲液#1(50mM TRIS pH8，5mM EDTA，1％triton x-100)中并再次离心。然后将细胞沉淀洗涤两次以上；一次用70ml洗涤缓冲液#2(50mM TRIS pH8，5mM EDTA，1％脱氧胆酸钠)，一次用70ml洗涤缓冲液#3(50mM TRIS pH8，5mM EDTA，1M NaCl)。最后，将包涵体重悬于100ml溶解缓冲液(50mM TRIS pH10，8M尿素，10mM 2-巯基乙醇)中。将此溶液在室温下搅拌1-2小时以确保包涵体完全溶解，然后在30,000RCF下离心30分钟以去除任何残留的不溶物质。然后用透析缓冲液#1(50mM TRIS pH8，1M尿素，100mM NaCl，5mM还原型谷胱甘肽)将溶解的包涵体稀释至500ml。将溶解的G-CSF使用截留分子量(mwco)为8,000Da的透析管(BioDesignInc.，目录号D104)在4℃下用3L透析缓冲液#1透析40小时，随后在4℃下用3L透析缓冲液#2(50mM TRIS pH8，100m mM NaCl，1mM还原型谷胱甘肽)透析8小时，最后在4℃下用3L透析缓冲液#3(25mM乙酸钠pH4，50mM NaCl)透析16小时。使用具有10kDa mwco的Ultra-15离心过滤单元(Millipore Sigma，目录号UFC901024)浓缩重折叠的G-CSF，并且进一步通过阳离子交换色谱法使用在透析缓冲液#3中平衡的ENrich^TMS 5x50柱(Bio-Rad，目录号7800021)纯化并用50mM至500mM NaCl的梯度洗脱。在负载到在25mM乙酸钠pH 4.0、150mMNaCl中平衡的ENrich^TMSEC70 10x300尺寸排阻柱(Bio-Rad，目录号7801070)之前，将含有重折叠G-CSF的级分合并并浓缩(图1)。通过还原SDS-PAGE分析含蛋白质的级分，合并并通过nanodrop A280测量使用0.836的消光系数来测量浓度。

结果

野生型和工程化G-CSF变体以相对于SEC 70标准品的预期体积洗脱。与正确折叠的蛋白质一致，其显示出足够的稳定性以经受色谱纯化。此外，没有观察到聚集蛋白质峰，从而进一步证实了重折叠方案的有效性。示出G-CSF_130a1的代表性SEC UV迹线和SDS-PAGE凝胶(图54)。每升培养物的产量范围为2.5-5mg纯化的重折叠蛋白质，这取决于G-CSF变体。

实施例33：工程化G-CSF变体的热稳定性的测定

差示扫描荧光测定法(DSF)用于测量重折叠G-CSF变体与WT G-CSF相比的热稳定性。DSF通过监测一种染料的荧光变化来测量蛋白质去折叠，这种染料对蛋白质的疏水部分具有亲和力，当蛋白质去折叠时，这些疏水部分就会暴露出来。

方法

使用激发和发射波长分别设置为587nm和607nm的Applied BiosystemsStepOnePlus^TMRT-PCR仪器(ThermoFisher Scientific，目录号4376600)进行差示扫描荧光测定法。简而言之，将20μl浓度为1mg/mL的纯化G-CSF(WT或变体)一式三份地分配到96孔板中。为了接近用于治疗性WT G-CSF(10mM乙酸钠pH4，5％山梨醇，0.004％聚山梨酯-20)(PMID:17822802)的临床验证配方，用于DSF的测定缓冲液为10mM乙酸钠pH4、25mM NaCl。将SYPRO orange(Invitrogen)从5,000x储备液稀释至2x浓度。对于热稳定性测量，温度扫描速率固定为0.5℃/min，并且温度范围为20℃至95℃。使用Protein Thermal Shift软件v1.4(ThermoFisher Scientific，目录号4466038)进行数据分析，所述软件通过将荧光数据拟合到双态玻尔兹曼模型(Boltzman model)来确定单个重复的解链温度(Tm)，之后对每个变体的三个Tm取平均值。

结果

当在临床相关缓冲液中测量时，发现所有测试的变体G-CSF设计的解链温度比WTG-CSF高10-17℃(表6A)，从而证明了工程化突变赋予的显著改善的热稳定性。

表6A：由DSF确定的WT和工程化G-CSF变体的解链温度(Tm)。

*在10mM乙酸钠pH 4.0、25mM NaCl中测定

实施例34：在野生型G-CSF或工程化细胞因子130、130a1、130a2、130b1、130b2和 130a1b1中表达野生型G-CSF受体的人和小鼠细胞系的增殖

测试预测与WT G-CSFR ECD结合的交叉反应性低于130G-CSF，但通过实施例31至33中的体外测定表现出可接受的生物物理特性和热稳定性的细胞因子诱导细胞系OCI-AML1(其天然表达WT人G-CSFR)和32D克隆3(其天然表达WT鼠G-CSFR)的增殖的能力。

方法

将OCI-AML1细胞系(DSMZ)维持在含有20％胎牛血清(Sigma)、20ng/ml人GM-CSF(Peprotech)和1％青霉素和链霉素(Gibco)的α-MEM培养基(Gibco)中。将32D克隆3细胞系(ATCC)(下文称为“32D”)维持在含有10％胎牛血清、1ng/ml鼠IL-3(Peprotech)和1％青霉素和链霉素的RPMI 1640(ATCC改良)培养基(Gibco)中。

为了进行BrdU掺入测定，收获OCI-AML1或32D细胞并分别在PBS中洗涤两次并在α-MEM或RPMI中洗涤一次。将细胞重新铺在含有所指示浓度的所指示分析细胞因子的新鲜完全培养基中，并在37℃、5％CO₂下孵育48小时。BrdU测定程序遵循BD Pharmingen^TM FITCBrdU Flow试剂盒(557891)的说明书手册，增加了以下内容：使用浓度为1:600的eFluor^TM450Fixable Viability Dye(eBioscience^TM)进行活性染色。使用Cytek^TMAurora仪器进行流式细胞术。

结果

在利用OCI-AML1细胞系的BrdU掺入测定中，与WT G-CSF相比，响应于G-CSF变体130、130a1、130a2、130b1和130b2，细胞表现出较低的增殖(图55A)。此外，与130相比，响应于G-CSF变体130a1、130a2、130b1和130b2，细胞表现出较低的增殖(图55A)。

在BrdU测定中使用更宽范围的细胞因子浓度进一步评估细胞因子WT G-CSF和G-CSF变体130、130a1和130b1(图55B)。与WT G-CSF相比，诱导OCI-AML1细胞的增殖需要更高浓度的三种变体细胞因子。与130G-CSF相比，诱导OCI-AML1细胞的增殖需要更高浓度的130a1和130b1 G-CSF(图55B)。

进行了独立的BrdU测定以将WT G-CSF和G-CSF变体130、130a1和130a1b1进行比较(图55C)。与WT G-CSF相比，诱导OCI-AML1细胞的增殖需要更高浓度的三种变体细胞因子。与130G-CSF相比，诱导OCI-AML1细胞的增殖需要更高浓度的130a1和130a1b1 G-CSF(图55C)。

在涉及32D细胞的BrdU测定中观察到类似的结果(图55D、图55E)。与WT G-CSF相比，诱导32D细胞的增殖需要更高浓度的G-CSF变体130、130a1、130b1和130a1b1(图55D、图55E)。

因此，与人或鼠WT G-CSF相比，G-CSF变体130、130a1、130b1、130a2、130b2和130a1b1在表达人或鼠WT G-CSFR的细胞中诱导增殖的能力显著降低。此外，与130G-CSF相比，变体130a1、130b1、130a2、130b2和130a1b1显示诱导OCI-AML1细胞系的增殖的能力降低。

实施例35：在工程化细胞因子130、130a1、130a2、130b1、130b2和130a1b1中表达具有134 ECD的G12/2R-1的原代人T细胞的增殖

测试G-CSF变体130、130a1、130a2、130b1、130b2和130a1b1诱导表达G12/2R-1134ECD的PBMC来源的人T细胞的增殖的能力。

方法

合成G12/2R-1 134ECD cDNA并克隆到慢病毒转移质粒中。如下将转移质粒和慢病毒包装质粒(psPAX2，pMD2.G，Addgene)共转染到慢病毒包装细胞系HEK293T/17(ATCC)中。将细胞在含有5％胎牛血清和0.2mM丙酮酸钠的Opti-MEM^TMI还原血清培养基Gluta MAX^TM补充剂(Gibco^TM)中铺板过夜。质粒DNA和Lipofectamine^TM 3000转染试剂(Gibco^TM)根据制造商的说明书混合并逐滴添加到细胞上。将细胞在37℃、5％CO₂下孵育6小时，然后替换培养基并进一步孵育过夜。第二天，从板收集细胞上清液，储存在4℃下并替换培养基。第二天，再次从细胞收集细胞上清液并与前一天的上清液合并。将上清液短暂离心以去除碎片并通过0.45μm过滤器过滤。在Beckm an Optima L-XP超速离心机中使用SW-32Ti转子以25,000rpm将上清液旋转90分钟。去除上清液，并且将沉淀重悬于Opti-MEM I培养基中，轻轻摇动30分钟。

如下所述从健康供体白细胞单采产品中分离人T细胞。使用密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。按照制造商的说明书，使用人CD4和CD8微珠(Miltenyi Biotec)分离CD4+和CD8+T细胞。将分离的T细胞以5x10⁵个/孔的密度铺在48孔板中的含有3％人血清(Sigma)和0.5％庆大霉素(DIN 0226853)的TexMACS^TM培养基(Milt enyi Biotec)(下文称为“完全TexMACS”)中。添加人T细胞TransAct ^TM(Miltenyi Biotec)(10ml/孔)，并且在37℃、5％CO₂下孵育细胞。活化后20至28小时，用编码G12/2R-1 134ECD构建体的慢病毒转导T细胞。转导后二十四小时，将含有130a1 G-CSF(100ng/ml)的新鲜培养基添加到T细胞中。此后，每两天用新鲜培养基和/或细胞因子补充细胞培养物并保持每毫升约5×10⁵至1×10⁶个细胞的密度。

对于BrdU掺入测定，在扩增的第10-14天收获T细胞，并且在PBS中洗涤两次并在完全TexMACS中洗涤一次。将细胞重新铺在含仅培养基或培养基加下列细胞因子的完全TexMACS中：IL-2(300IU/ml)、IL-2+IL-12(各自10ng/ml)或单独的G-CSF变体(130、130a1、130b1、130a2、130b2或130a1b1，各自100ng/ml)。将T细胞在37℃、5％CO₂下孵育48小时。除了细胞另外用抗人G-CSFR APC缀合的和CD3 BV750缀合的抗体染色以外，如实施例34中所述进行BrdU测定的其余部分。

结果

与IL-2或IL-2+IL-12相比，G-CSF变体130、130a1、130b1、130a2、130b2和130a1b1都诱导了表达G12/2R-1 134ECD的人T细胞的相似水平的增殖(图56A)。用仅培养基观察到可忽略的增殖。在使用G-CSF变体130和130a1b1的重复BrdU测定中获得了类似的结果(图56B)。

因此，G-CSF变体130、130a1、130b1、130a2、130b2和130a1b1可以有效地诱导表达嵌合受体G12/2R-1 134ECD的T细胞的增殖，从而导致类似于由IL-2或IL-2+IL-12引发的增殖反应。

实施例36：在鼠乳腺癌模型中，用变体细胞因子130a1处理选择性地增强了表达 G2R-3 134 ECD的肿瘤特异性T细胞的扩增和抗肿瘤活性

基于130a1 G-CSF刺激表达G12/2R-1 134ECD的T细胞的增殖的能力，以及其与WT鼠和人G-CSFR的低交叉反应性，其被推进到在鼠乳腺癌模型中的体内测试。

方法

所有程序都遵循加拿大动物护理委员会(Canadian Council for Animal Care)指南并得到了维多利亚大学动物护理委员会(University of Victoria Animal CareCommittee)的批准。将在MMTV启动子控制下在乳腺上皮中表达Neu^OT-I/OT-II转基因的C57Bl/6小鼠用作肿瘤宿主(Wall等人,2007)。从T细胞受体(TCR)转基因OT-I小鼠(以下称为“OT-I”小鼠；Jackson Laboratories)获得肿瘤特异性CD8+T细胞；OT-IT细胞识别由I类MHC呈递的鸡卵清蛋白的残基257-264。我们还获得了携带T淋巴细胞特异性Thy1a(Thy1.1)等位基因的同源小鼠(以下称为“Thy1.1+”小鼠；Jackson Laboratories)。将OT-I和Thy1.1+品系杂交至纯合性，以产生“Thy1.1+OT-I”小鼠；这使得Thy1.1标志物可用于通过流式细胞术鉴定OT-I T细胞。NOP23是同系乳腺肿瘤细胞系，其来源于在乳腺上皮中表达Neu^OT-I/OT-II和显性阴性版本的p53的转基因小鼠中的自发肿瘤(Wall等人,2007)(Yang等人,2009)。NOP23细胞呈递I类MHC上鸡卵清蛋白的残基257-264，并且因此可以被OT-I T细胞识别。将NOP23细胞维持在早期代并在含有10％胎牛血清、1x胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(Corning)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM-高葡萄糖(Hyclone)中培养。对细胞系进行了针对小鼠病原体和支原体种的常规测试。

在宿主MMTV Neu^OT-I/OT-II小鼠的后侧腹皮下植入1×10⁶个NOP23细胞。一旦肿瘤达到20-50mm²的平均面积(植入后约15天)，小鼠接受5×10⁶个经逆转录病毒转导以表达G2R-3134ECD的供体Thy1.1+OT-I淋巴细胞的静脉内输注，如以下段落中所述。

将逆转录病毒包装细胞系Platinum-E(Cell Biolabs，RV-101)在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素、嘌呤霉素(1mg/ml)和杀稻瘟菌素(10mg/ml)的DMEM中培养。合成嵌合受体构建体并克隆到已经通过限制性内切酶克隆改变的pMIG逆转录病毒转移质粒(质粒#9044，Addgene)中以去除IRES-GFP(BglII至PacI位点)并引入编码定制多个克隆位点的退火引物。通过桑格测序验证所得序列。如上所述，使用Lipofectamine 3000转染方法将转移质粒转染到Platinum-E细胞中。在转染后24和48小时从板收集逆转录病毒上清液并通过0.45微米过滤器过滤。向上清液中添加海美溴铵(1.6mg/ml，Sigma-Aldrich)和人IL-2(300IU/ml)。如下所述，使用纯化的逆转录病毒上清液来转导鼠淋巴细胞。

在收集逆转录病毒上清液前四十八小时，用未缀合的抗鼠CD3(10mg/ml，BDBiosciences，553058)和抗鼠CD28(2mg/ml，BD Biosciences，553294)抗体包被24孔粘附板，在PBS中稀释并储存在4℃下。在收集逆转录病毒上清液前二十四小时，将Thy1.1+OT-I小鼠安乐死，并且如下从脾脏收获T细胞。脾脏被人工分离并通过100微米过滤器过滤。通过在室温下在ACK裂解缓冲液(Gibco，A1049201)中孵育五分钟，然后在含血清的培养基中洗涤一次来将红细胞裂解。使用基于珠的分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-104-075)分离CD8a阳性T细胞。将细胞添加到鼠T细胞扩增培养基(含有10％FBS、青霉素/链霉素、0.05mMβ-巯基乙醇和300IU/mL人IL-2的RPMI-1640)中的包被有抗CD3和抗CD28抗体的板中，并且在37℃、5％CO₂下孵育24小时。

如下连续两天(第1天和第2天)进行逆转录病毒转导。用逆转录病毒上清液(如上所述产生)替换大约一半的培养基。在30℃下，以1000g用逆转录病毒上清液旋转感染细胞90分钟。将板放回培养箱0-4小时，然后用新鲜的T细胞扩增培养基替换大约一半的培养基。第二天重复这一程序。第二次转导后二十四小时，将T细胞分至6孔板中，从抗体刺激中去除并在标准条件下培养。

在第5天，收获转导的T细胞，并且如上所述，通过流式细胞术用针对人G-CSFR和CD8a的抗体(PerCP-eFluor 710缀合物，eBioscience^TM，46-0081-82)以及FixableViability Dye eFluor^TM506(1:1000稀释)来评估转导效率。将细胞在PBS中洗涤三次，然后通过尾静脉注射输注到携带已确定的NOP23肿瘤的宿主小鼠中。

在T细胞输注后，监测小鼠的外周血中Thy1.1+OT-I细胞的肿瘤生长和移植。将小鼠随机分组以接受每天腹膜内注射媒介物与130a1 G-CSF(10mg/剂量)持续14天，随后每隔一天持续另外14天，总共21次剂量。在整个细胞因子处理期间，操作者不知道细胞因子注射器的内容物(即，媒介物对130a1 G-CSF)。在ACT后的第1天、第4天、第7天、第10天、第14天和第19天，从每只小鼠收集外周血液样品品。将PBMC在ACK裂解后分离(如上所述)，在小鼠Fc封闭物和Zombie NIR活性染料(1:4,000)中孵育，并用对小鼠CD45(PerCP缀合的抗体，1:200)、CD3(AlexaFluor^TM 700缀合的抗体，1:100)、CD8a(APC缀合的抗体，1:80)、NK1.1(PECy7缀合的抗体，1:25)、CD19(SuperBright^TM 780缀合的抗体，1:100)、CD11b(FITC缀合的抗体，1:25)、CD11c(BV510缀合的抗体，1:50)、Ly6C(BV605缀合的抗体，1:10)和Ly6G(PE缀合的抗体，1:80)具有特异性的抗体染色。在Cytek Aurora仪器上进行流式细胞术。

监测小鼠的肿瘤尺寸、体重和总体健康状况并在它们达到实验终点(>150mm²肿瘤面积)时进行安乐死，或对于经历完全肿瘤消退的小鼠，在T细胞输注后第80天进行安乐死。

结果

所有小鼠接受同等剂量(5×10⁶个)的经转导的Thy1.1+OT-I细胞以表达G2R-3134ECD。转导效率为36％，如通过流式细胞术测定表达人G-CSFR的Thy1.1+细胞的百分比所评估。在130a1 G-CSF处理组中，4/4的小鼠经历了其肿瘤的完全消退(CR)并保持无肿瘤状态直到第80天，此时由于实际原因停止研究(图57A和图57B)。相比之下，在媒介物处理组中，只有1/4的小鼠经历了CR，而其余3/4的小鼠具有进展到实验终点的肿瘤。这转化为在130a1 G-CSF处理组中100％的小鼠存活，和在媒介物处理组中25％的小鼠存活(图57C)。

在从小鼠收集的系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的扩增和持久性。在130a1G-CSF处理组中，Thy1.1+OT-I细胞在第7天达到所有CD8+T细胞的49.8％的平均峰值移植，而在媒介物处理组中，Thy1.1+OT-I细胞在第7天达到所有CD8+T细胞的仅8.6％的平均峰值移植(图57D)。

还评估了外周血液样品中髓样细胞亚群相对于所有CD45+细胞的百分比。随着时间的推移，130a1 G-CSF处理组和媒介物处理组在外周血中的嗜中性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G+)、嗜酸性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、SSC^高)或单核细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、SSC^低)相对于所有CD45+细胞的百分比没有显示出显著差异(图57E、图57F和图57G)。

在整个研究过程中，两组中的所有小鼠都保持正常体重，并且表现出良好的总体健康状况，尽管有些小鼠出现了肿瘤进展。

因此，130a1 G-CSF能够诱导表达G2R-3 134ECD的肿瘤特异性CD8+T细胞的选择性和深度扩增。与媒介物处理组中的25％相比，这导致了100％的持久CR率。用130a1 G-CSF处理不影响外周血中的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或单核细胞计数。没有与130a1 G-CSF处理相关的明显毒性。

实施例37：在鼠乳腺癌模型中，用变体G-CSF 130a1处理选择性地增强了表达G12/ 2R-1 134 ECD的肿瘤特异性T细胞的扩增和抗肿瘤活性

在体内鼠乳腺癌模型中，进一步测试了变体细胞因子130a1G-CSF增强经工程化以表达G12/2R-1 134ECD的T细胞的扩增和抗肿瘤活性的能力。

方法

除了将Thy1.1+OT-I细胞逆转录病毒转导以表达G12/2R-1 134ECD而不是G2R-3134ECD以外，我们使用与实施例36中所述相同的方法。

结果

所有小鼠接受同等剂量(5×10⁶个)的经转导的Thy1.1+OT-I细胞以表达G12/2R-1134ECD。转导效率为43％，如通过流式细胞术测定表达人G-CSFR+的Thy1.1+细胞的百分比所评估。在130a1 G-CSF处理组中，3/3的小鼠经历了其肿瘤的完全消退(CR)并保持无肿瘤状态直到第80天，此时由于实际原因停止研究(图58A和图58B)。相比之下，在媒介物处理组中，只有1/4的小鼠经历了CR，而其余3/4的小鼠具有进展到实验终点的肿瘤。这转化为在130a1 G-CSF处理组中100％的小鼠存活，和在媒介物处理组中25％的小鼠存活(图58C)。

在从小鼠收集的系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的扩增和持久性。在130a1G-CSF处理组中，Thy1.1+OT-I细胞在第7天达到所有CD8+T细胞的34.3％的平均峰值移植，而在媒介物处理组中，Thy1.1+OT-I细胞在第7天达到所有CD8+T细胞的仅7.7％的平均峰值移植(图58D)。

还评估了外周血液样品中髓样细胞亚群相对于所有CD45+细胞的百分比。随着时间的推移，130a1 G-CSF处理组和媒介物处理组在外周血中的嗜中性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G+)、嗜酸性粒细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、SSC^高)或单核细胞(CD3-、CD19-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、SSC^低)相对于所有CD45+细胞的百分比没有显示出显著差异(图58E、图58F和图58G)。

因此，130a1 G-CSF能够诱导表达G12/2R-1 134ECD的肿瘤特异性CD8+T细胞的选择性和深度扩增。与媒介物处理组中的25％相比，这导致了100％的持久CR率。用130a1 G-CSF处理不影响外周血中的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或单核细胞计数。没有与130a1G-CSF处理相关的明显毒性。

实施例38：130a1 G-CSF的治疗效果需要肿瘤特异性OT-I T细胞表达同源工程化细胞因子受体

为了证明130a1 G-CSF通过含有G-CSFR 134ECD的受体介导其免疫和抗肿瘤作用，使用模拟转导的OT-I T细胞(即经历逆转录病毒转导程序但不包括逆转录病毒构建体的OT-I T细胞)进行上述体内实验。将130a1 G-CSF的活性也与人IL-2的活性进行比较。

方法

遵循相同的处理方案，我们使用与实施例36中所述相同的方法，但有两个例外：(a)使用来自模拟转染的Platinum-Eco细胞的上清液模拟转导Thy1.1+OT-I细胞；逆转录病毒转导过程的所有其他方面都是相同的；和(b)我们包括了接受人白介素-2(30,000IU/剂；Proleukin)代替媒介物或130a1 G-CSF的另外对照组小鼠。

结果

所有小鼠都接受了同等剂量(5×10⁶个)的经历模拟转导过程的Thy1.1+OT-I细胞。然后将小鼠随机分组以接受媒介物、130a1 G-CSF或IL-2。在130a1 G-CSF处理组中，3/5的小鼠经历了其肿瘤的完全消退(CR)并保持无肿瘤状态直到第80天，此时由于实际原因停止研究(图59A和图59B)。在IL-2处理组中，4/5的小鼠经历了CR并保持无瘤状态直到第80天。在媒介物处理组中，3/4的小鼠经历了CR并保持无肿瘤直到第80天(图59A和图59B)。这转化为130a1 G-CSF处理组和IL-2处理组中80％的小鼠存活，和媒介物处理组中75％的小鼠存活(图59C)。

由模拟转导的OT-I T细胞获得的完全反应率高于用媒介物处理的表达G2R-3134ECD或G12/2R-1 134ECD的OT-I T细胞所观察到的完全反应(实施例36和37)，尽管这些组中没有一组受益于通过G2R-3 134ECD或G12/2R-1 134ECD的信号传导。转导的媒介物处理的OT-I T细胞的较低功效可能反映了由逆转录病毒转导引起的T细胞功能的适度损伤。

在从小鼠收集的系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的扩增和持久性。在所有三个组中，Thy1.1+OT-I细胞数量在第4天达到峰值，在130a1 G-CSF处理组、IL-2处理组和媒介物处理组中，达到所有CD8+T细胞的8.0％、10.6％和9.9％的水平(图59D)。

在130a1 G-CSF处理组、IL-2处理组或媒介物处理组之间，嗜中性粒细胞或单核细胞的数量占所有外周血CD45+细胞的百分比没有显著差异(图59E和图59G)。

在第7天，嗜酸性粒细胞在IL-2处理组中平均达到所有CD45+细胞的6.7％，而在130a1 G-CSF处理组和媒介物处理组中分别为2.9％和2.7％(图59F)。嗜酸性粒细胞增多是小鼠和人全身施用IL-2的已知效果。

因此，在接受模拟转导的Thy1.1+OT-I细胞的小鼠中，130a1G-CSF未能介导抗肿瘤活性或诱导T细胞扩增。如上所述，130a1G-CSF对外周血中嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或单核细胞计数没有影响。没有与130a1 G-CSF处理相关的明显毒性。尽管诱导短暂的嗜酸性粒细胞增多，IL-2(在所用的剂量和方案下)对T细胞扩增和抗肿瘤活性具有非常适度的作用。

实施例39：具有来自G-CSFR受体的变体胞外结构域和来自IL-4受体α的胞内信号传导结构域的嵌合受体的构建和功能评估

我们合成了称为G4R 134ECD的嵌合受体，其含有与人IL-4受体α的胞内结构域的一部分融合的人G-CSFR的胞外结构域(134变体)、跨膜结构域以及框1区和框2区(图60)。嵌合受体亚基编码在慢病毒载体中，所述载体用于转导人CD4+和CD8+T细胞。通过流式细胞术分析转导的T细胞(和未转导的对照T细胞)以检测G4R 134ECD的细胞表面表达。体外评估G4R 134ECD诱导T细胞扩增和增殖的能力。通过蛋白质印迹使用针对STAT6和与IL-4信号传导相关的其他信号传导中间体的磷酸特异性抗体评估由G4R 134ECD介导的生化信号传导事件。

方法

合成嵌合受体构建体G4R 134ECD并克隆到慢病毒转移质粒(Twist Bioscience)中。如下将转移质粒和慢病毒包装质粒(psPAX2，pMD2.G，Addgene)共转染到慢病毒包装细胞系HEK293T/17(ATCC)中。将细胞在含有5％胎牛血清和0.2mM丙酮酸钠的Opti-MEM^TMI还原血清培养基GlutaMAX^TM补充剂(Gibco^TM)中铺板过夜。根据制造商的说明书，将质粒DNA和Lipofectamine^TM 3000转染试剂(Gibco^TM)混合并逐滴添加到细胞上。将细胞在37℃、5％CO₂下孵育6小时，然后替换培养基并进一步孵育过夜。第二天，从板收集细胞上清液并储存在4℃下，并且替换培养基。第二天，再次从细胞收集细胞上清液并与前一天的上清液合并。将上清液短暂离心以去除碎片并通过0.45μm过滤器过滤。在Beckman Optima L-XP超速离心机中使用SW-32Ti转子以25,000rpm将上清液旋转90分钟。去除上清液，并且将沉淀重悬于Opti-MEM I培养基中，轻轻摇动30分钟。

如下从健康供体白细胞单采产品中分离原代人T细胞。使用密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。按照制造商的说明书，使用人CD4和CD8微珠(Miltenyi Biotec)分离CD4+和CD8+T细胞。对于一些实验，T细胞可被冷冻并解冻后用于分析。将分离的T细胞以5×10⁵个/孔的密度铺在48孔板中的含3％人血清(Sigma)和0.5％庆大霉素(DIN 0226853)的TexMACS^TM培养基(Miltenyi Biotec)(下文称为“完全TexMACS”)中。添加人T细胞TransAct^TM(Miltenyi Biotec)(10ml/孔)，并且在37℃、5％CO₂下孵育细胞。活化后20至28小时，用编码受体构建体的慢病毒转导T细胞。第二天，向T细胞中添加新鲜培养基，同时添加IL-2(300IU/ml)、130a1 G-CSF(100ng/ml)、IL-2加130a1 G-CSF(分别为300IU/ml或100ng/ml)或不添加细胞因子。(对于未转导的T细胞，将307G-CSF变体与130a1 G-CSF一起添加，以充当作另一组实验的对照[未示出]；130a1 G-CSF和307G-CSF都不诱导未转导的T细胞的增殖或其他信号传导事件的事实证明了使用这个实验便利性的合理性。)通过每两天添加新鲜培养基和/或所指示的细胞因子来维持T细胞，同时维持每ml约5×10⁵个至1×10⁶个细胞的密度。

转导后八天，通过流式细胞术对从IL-2培养条件下收获的T细胞评估G4R 134ECD的表达。将T细胞在4℃下与抗人G-CSFR APC缀合抗体(1:50稀释)、抗人CD3 BV750^TM缀合抗体(1:50稀释)、抗人CD4 PE缀合抗体(1:25稀释)、抗人CD8 PerCP缀合抗体(1:100)和eBioscience^TMFixable Viability Dye eFluor^TM506(1:1000稀释)一起孵育15分钟。然后将细胞洗涤两次并在Cytek^TMAurora流式细胞仪上进行分析。

为了评估T细胞扩增，在第4天、第8天、第12天和第16天使用Cytek^TMAurora流式细胞仪对每种培养条件下的细胞进行计数。

为了评估细胞周期进程(BrdU掺入)，在第12天收获细胞(来自130a1 G-CSF+IL-2培养条件)，在PBS中洗涤两次并在完全TexMACS培养基中洗涤一次，并重新铺在含有所指示细胞因子的新鲜完全TexMACS培养基中：IL-2(300IU/ml)、IL-4(50ng/ml)、IL-2+IL-4(分别为300IU/ml和50ng/ml)、130a1 G-CSF(100ng/ml)、130a1G-CSF+IL-2或仅培养基(不添加细胞因子)。将细胞在37℃、5％CO₂下培养48小时。BrdU测定程序遵循BD Pharmingen^TM FITCBrdU Flow试剂盒(557891)的说明书手册，有一个例外：细胞也被染色以检测G-CSFR ECD的细胞表面表达(如实施例35中所述)。使用Cytek^TMAurora仪器进行流式细胞术。

对于蛋白质印迹实验，从130a1 G-CSF+IL-2培养条件收获细胞，洗涤三次，并在完全TexMACS中静置过夜。第二天，在37℃下，用仅培养基或培养基加IL-2(300IU/ml)、IL-4(50ng/ml)或130a1 G-CSF(100ng/ml)刺激细胞20分钟。将细胞在含有10mM HEPES pH 7.9、1mM MgCl₂、0.05mM EGTA、0.5mM EDTA pH 8.0、1mM DTT和1x Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂小型片剂(A32961)的缓冲液中洗涤一次。在含有0.2％NP-40取代物(Sigma)的洗涤缓冲液中的冰上裂解细胞10分钟。将裂解物在4℃下以13,000rpm离心10分钟，之后收集上清液(细胞质部分)。为了提取细胞核部分，将来自裂解步骤的沉淀重悬于添加0.42M NaCl和20％甘油的上述洗涤缓冲液中。将细胞核部分在冰上孵育30分钟，频繁涡旋，并且在4℃下以13,000rpm离心20分钟，之后收集细胞核部分(上清液)。将细胞质和细胞核部分在还原条件下加热(70℃)10分钟并在NuPAGE^TM4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上运行。将凝胶内容物转移到硝酸纤维素膜上(在20V下在SD Semi-Dry Transfer Cell中60min)，干燥并在TBS中的/>封闭缓冲液(927-600001，LI-COR)中封闭1小时。在4℃下在含有0.1％Tween20的TBS中的/>封闭缓冲液中将印迹与一抗(1:1,000)一起孵育过夜。一抗体获自Cell Si gnaling Technologies：磷酸-Shc(Tyr239/240)抗体#2434、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)/>兔单克隆抗体#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体#9101、β-肌动蛋白(13E5)兔单克隆抗体#4970、磷酸-JAK1(Tyr1034/1035)(D7N4Z)兔单克隆抗体#74129、磷酸-JAK3(Tyr980/981)(D44E3)兔单克隆抗体#5031、磷酸-Stat6(Tyr641)(C11C5)兔单克隆抗体#9361和组蛋白H3(96C10)小鼠单克隆抗体#3638。将印迹在含有0.1％Tween20的TBS中洗涤三次，并在室温下将其与二抗(1:10,000)在含有0.1％Tween20的TBS缓冲液中孵育30-60分钟。二抗获自CellSignaling Technologies：抗小鼠IgG(H+L)(DyLight^TM800 4X PEG缀合物)#5257和抗兔IgG(H+L)(DyLight^TM800 4X PEG缀合物)#5151。将印迹洗涤并暴露在LI-COR Odyssey成像仪上。

结果

通过流式细胞术(图61)，用编码G4R 134ECD的慢病毒载体转导的大部分(93.7％)CD3+T细胞表达G-CSFR ECD，而未转导的T细胞不表达。

因此，G4R 134ECD可以在工程化T细胞的表面上表达。

如图62中所示，用编码G4R 134ECD的慢病毒载体转导的T细胞在含有IL-2或IL-2+130a1 G-CSF的培养基中扩增良好并显示出响应于仅130a1 G-CSF的中等水平的扩增(图62A)。未转导的T细胞响应于IL-2扩增良好，但对130a1 G-CSF加G-CSF变体307的组合没有显示出响应(后者被包括作为这个实验的单独组的对照；未示出)(图62B)。两种培养都不能在仅培养基中很好地扩增。

因此，T细胞上G4R 134ECD的表达导致响应于130a1 G-CSF的扩增增加，从而表明G4R 134ECD的杂合胞内结构域在T细胞中转导功能性生长信号。

如图63中所示，表达G4R 134ECD的CD4+和CD8+T细胞展示响应于IL-2、IL-4、IL-2+IL-4、130a1 G-CSF或130a1 G-CSF+IL-2的增殖(BrdU掺入)(图63A)。相比之下，未转导的CD4+和CD8+T细胞响应于IL-2、IL-4、IL-2+IL-4和130a1 G-CSF+IL-2增殖但不响应于单独130a1 G-CSF增殖(图63B)。除了在这个特定的实验中具有升高的背景增殖的表达G4R134ECD的CD8+T细胞外，没有培养物在仅培养基中增殖。

因此，CD4+和CD8+T细胞上G4R 134ECD的表达导致响应于130a1 G-CSF的增殖增加，从而达到相当于或甚至超过IL-2或IL-4诱导的水平。这表明G4R 134ECD的杂合胞内结构域在T细胞中转导功能性增殖信号。

如图64中所示，在未转导的T细胞和表达G4R 134ECD的T细胞中，IL-2诱导JAK1、JAK3、Shc、Erk1/2、Akt和S6的磷酸化。IL-4诱导STAT6、JAK1和JAK3的磷酸化，仅伴有Erk1/2、Akt和S6的中度磷酸化，而没有Shc的磷酸化。在表达G4R 134ECD的T细胞中，130a1 G-CSF诱导STAT6和JAK1的磷酸化，伴有Erk1/2、Akt和S6的中度磷酸化(相对于IL-2)，而没有JAK3或Shc的磷酸化。鉴于G4R 134ECD使用人G-CSFR的框1区和框2区(其结合JAK2而不是JAK3)，预计缺乏JAK3的磷酸化。正如所预期，130a没有在未转导的T细胞中诱导任何信号传导事件。

因此，G4R 134ECD的杂合胞内结构域活化与天然IL-4受体相同的许多生化信号传导事件，特别是STAT6的酪氨酸磷酸化。

实施例40：具有来自G-CSFR受体的变体胞外结构域和来自IL-6受体β (gp130)的胞内信号传导结构域的嵌合受体的构建和功能评估

我们合成了称为G6R 134ECD的嵌合受体，其含有与人IL-6受体β(gp130)的胞内结构域的一部分融合的人G-CSFR的胞外结构域(134变体)、跨膜结构域以及框1区和框2区(图60)。嵌合受体亚基编码在慢病毒载体中，所述载体用于转导人CD4+和CD8+T细胞。通过流式细胞术分析转导的T细胞(和未转导的对照T细胞)以检测G6R 134ECD的细胞表面表达。体外评估G6R 134ECD诱导T细胞扩增和增殖的能力。使用针对STAT3和STAT5的磷酸特异性抗体，通过蛋白质印迹评估G6R 134ECD介导的生化信号传导事件。

方法

总的来说，我们遵循实施例39中描述的类似方法；然而，所述实验被调整为集中于IL-6信号传导机制。例如，使用IL-6代替IL-4作为参考细胞因子。

按照实施例39，将人T细胞工程化以表达G6R 134ECD并在第8天通过流式细胞术测定转导效率。

使T细胞在IL-2(300IU/ml)、130a1 G-CSF(100ng/ml)、IL-2+130a1 G-CSF(分别为300IU/ml和100ng/ml)或仅培养基(未添加细胞因子)中扩增16天，其中每两天更新培养基和指定的细胞因子。在扩增的第4天、第8天、第12天和第16天，使用Cytek^TMAurora流式细胞仪对T细胞进行计数。

对于BrdU掺入测定，在扩增的第12天，从IL-2培养条件收获T细胞并在PBS中洗涤两次并在完全TexMACS培养基中洗涤一次。将细胞重新铺在含有相关测定细胞因子的新鲜完全TexMACS培养基中：IL-2(300IU/ml)、IL-6(100ng/ml)、IL-2+IL-6(分别为300IU/ml和100ng/ml)、130a1 G-CSF(100ng/ml)、130a1 G-CSF+IL-2(分别为300IU/ml和100ng/ml)或仅培养基(未添加细胞因子)。将细胞在37℃、5％CO₂下培养48小时。如实施例39中所述进行BrdU掺入测定。

对于蛋白质印迹实验，使细胞在IL-2(300IU/ml)中扩增18天，然后如上所述洗涤并在完全TexMACS培养基中静置过夜。第二天，在37℃下用仅培养基或含有IL-2(300IU/ml)、IL-6(100ng/ml)或130a1 G-CSF(100ng/ml)的培养基刺激细胞20分钟。如实施例39中所述制备细胞质和细胞核部分并进行蛋白质印迹。一抗获自Cell SignalingTechnologies：磷酸-Stat3(Tyr705)(D3A7)兔mAb#9145、磷酸-Stat5(Tyr694)(C11C5)兔mAb#9359和组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638。

结果

通过流式细胞术(图65)，用编码G6R 134ECD的慢病毒载体转导的大部分(93.7％)CD3+T细胞表达G-CSFR ECD，而未转导的T细胞不表达。

因此，G6R 134ECD可以在工程化T细胞的表面上表达。

如图66中所示，用编码G6R 134ECD的慢病毒载体转导的T细胞在含有IL-2的培养基中扩增良好，显示出响应于IL-2+130a1G-CSF的中等水平的扩增，和响应于仅130a1 G-CSF的差的扩增(图66A)。未转导的T细胞响应于IL-2扩增良好，但响应于130a1 G-CSF扩增不良(图66B)。两种培养都不能在仅培养基中很好地扩增。

因此，G6R 134ECD似乎不能在T细胞中诱导生长信号，如这种扩增测定所评估。

如图67中所示，表达G6R 134ECD的CD4+和CD8+T细胞展示响应于IL-2、IL-2+IL-6或130a1 G-CSF+IL-2的增殖(BrdU掺入)；130a1 G-CSF诱导CD4+T细胞的适度增殖，以及CD8+T细胞的微弱增殖(图67A)。相比之下，未转导的CD4+和CD8+T细胞响应于IL-2、IL-2+IL-6和130a1 G-CSF+IL-2增殖而不响应于单独IL-6或130a1 G-CSF增殖(图67B)。除了在这个特定的实验中具有升高的背景增殖的表达G6R 134ECD的CD8+T细胞外，没有培养物在仅培养基中增殖。

因此，G6R 134ECD似乎分别在CD8+和CD4+T细胞中诱导弱或中度增殖信号。

如图68中所示，在未转导的T细胞和表达G6R 134ECD的T细胞中，IL-2诱导STAT3(箭头)和STAT5的酪氨酸磷酸化，而IL-6诱导STAT3而非STAT5的酪氨酸磷酸化。在表达G6R134ECD的T细胞中，130a1 G-CSF诱导STAT3而非STAT5的酪氨酸磷酸化。130a不诱导未转导的T细胞中STAT3或STAT5的酪氨酸磷酸化。注意，在P-STAT3图像上，在IL-2刺激的条件下(特别是在未转导的T细胞中)出现了一条暗的、更高分子的条带。这是以前用磷酸-STAT5抗体探查此膜的残余信号。较低分子量的条带(箭头)表示磷酸-STAT3。

因此，G6R 134ECD的杂合胞内结构域诱导了与IL-6在T细胞中诱导的相似的STAT磷酸化模式。

实施例41：具有来自G-CSFR受体的变体胞外结构域和EPO受体的胞内结构域的嵌合受体的构建和功能评估

我们合成了称为GEPOR 134ECD的嵌合受体，其含有与人EPO受体的整个胞内结构域融合的人G-CSFR的胞外结构域(134变体)和跨膜结构域(图60)。嵌合受体亚基编码在慢病毒载体中，所述载体用于转导人CD4+和CD8+T细胞。通过流式细胞术分析转导的T细胞(和未转导的对照T细胞)以检测GEPOR 134ECD的细胞表面表达。体外评估GEPOR 134ECD诱导T细胞扩增的能力。通过蛋白质印迹使用针对STAT5和其他信号传导中间体的磷酸特异性抗体评估GEPOR 134ECD介导的生化信号传导事件。

方法

总的来说，我们遵循实施例39中描述的类似方法；然而，所述实验被调整为集中于EPO-R和IL-2信号传导机制。

按照实施例39，将人T细胞工程化以表达GEPOR 134ECD并在第8天通过流式细胞术测定转导效率。

使T细胞在IL-2(300IU/ml)、130a1 G-CSF(100ng/ml)、IL-2+130a1 G-CSF(分别为300IU/ml和100ng/ml)或仅培养基(未添加细胞因子)中扩增16天，其中每两天更新培养基和指定的细胞因子。对于未转导的T细胞，将307G-CSF与130a1 G-CSF一起添加，以充当另一组实验的对照(未示出)；130a1 G-CSF和307G-CSF都不诱导未转导的T细胞的增殖或其他信号传导事件的事实证明了使用这个实验便利性的合理性。在扩增的第4天、第8天、第12天和第16天，使用Cytek^TMAurora流式细胞仪对T细胞进行计数。

对于蛋白质印迹实验，使细胞在IL-2(300IU/ml)中扩增18天，然后如上所述洗涤并在完全TexMACS培养基中静置过夜。第二天，在37℃下用仅培养基或含有IL-2(300IU/ml)或130a1 G-CSF(100ng/ml)的培养基刺激细胞20分钟。如实施例39中所述制备细胞质和细胞核部分并进行蛋白质印迹。一抗获自Cell Signaling Technologies：磷酸-Stat5(Tyr694)(C11C5)兔mAb#9359、组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638、磷酸-JAK2(Tyr1007/1008)抗体#3771、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)兔mAb#4060、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体#9101和β-肌动蛋白(13E5)兔mAb#4970。

结果

通过流式细胞术(图69)，用编码GEPOR 134ECD的慢病毒载体转导的大部分(96.5％)CD3+T细胞表达G-CSFR ECD，而未转导的T细胞不表达。

因此，GEPOR 134ECD可以在工程化T细胞的表面上表达。

如图70中所示，用编码GEPOR 134ECD的慢病毒载体转导的T细胞在含有IL-2或IL-2+130a1 G-CSF的培养基中扩增良好，并且显示出响应于仅130a1 G-CSF的中等水平的扩增(图64A)。未转导的T细胞响应于IL-2扩增良好，但响应于130a1 G-CSF+307G-CSF扩增不良(图70B)。两种培养都不能在仅培养基中很好地扩增。

因此，GEPOR 134ECD似乎在T细胞中诱导中等生长信号，如通过这个扩增测定所评估。

如图71中所示，在未转导的T细胞和表达GEPOR 134ECD的T细胞中，IL-2诱导STAT5、Akt和ERK1/2的磷酸化；响应于IL-2的JAK2的明显磷酸化是由于抗磷酸-JAK2抗体与磷酸-JAK3的交叉反应性(注意与实际JAK2相比蛋白质大小的差异，由箭头指示)。在表达GEPOR 134ECD的T细胞中，130a1 G-CSF诱导STAT5、JAK2(箭头)和ERK1/2的磷酸化以及Akt的弱磷酸化。正如所预期，130a1G-CSF没有在未转导的T细胞中诱导任何生化信号传导事件。

因此，GEPOR 134ECD诱导类似于IL-2诱导的生化信号传导事件，但Akt的磷酸化较弱，并且预期JAK2代替JAK3活化。

实施例42：具有来自G-CSFR受体的变体胞外结构域和干扰素α受体2的胞内结构域的嵌合受体的构建和功能评估

我们合成了称为GIFNAR 134ECD的嵌合受体，其含有与人干扰素受体α2的胞内结构域的一部分融合的人G-CSFR的胞外结构域(134变体)、跨膜结构域以及框1区和框2区(图60)。嵌合受体亚基编码在慢病毒载体中，所述载体用于转导人CD4+和CD8+T细胞。通过流式细胞术分析转导的T细胞(和未转导的对照T细胞)以检测GIFNAR 134ECD的细胞表面表达。体外评估GIFNAR 134ECD诱导T细胞扩增的能力。通过蛋白质印迹使用针对STAT1、STAT2和其他信号传导中间体的磷酸特异性抗体评估GIFNAR 134ECD介导的生化信号传导事件。

方法

总的来说，我们遵循实施例39中描述的类似方法；然而，实验被调整为集中于IFNα信号传导机制。

按照实施例39，将人T细胞工程化以表达GIFNAR 134ECD并在第8天通过流式细胞术测定转导效率。

对于蛋白质印迹实验，使细胞在IL-2(300IU/ml)中扩增18天，然后如上所述洗涤并在完全TexMACS培养基中静置过夜。第二天，在37℃下用仅培养基或含有IL-2(300IU/ml)、IFNa(300IU/ml)或130a1 G-CSF(100ng/ml)的培养基刺激细胞20分钟。如实施例39中所述制备细胞质和细胞核部分并进行蛋白质印迹。一抗获自Cell SignalingTechnologies：磷酸-Stat1(Tyr701)(58D6)兔mAb#9167、磷酸-Stat2(Tyr690)(D3P2P)兔mAb#88410、组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638、磷酸-JAK1(Tyr1034/1035)(D7N4Z)兔mAb#74129、磷酸Akt(Ser473)(D9E)兔mAb#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211和β-肌动蛋白(13E5)兔mAb#4970。

结果

通过流式细胞术(图72)，用编码GIFNAR 134ECD的慢病毒载体转导的大部分(97.9％)CD3+T细胞表达G-CSFR ECD，而未转导的T细胞不表达。

因此，GIFNAR 134ECD可以在工程化T细胞的表面上表达。

如图73中所示，用编码GIFNAR 134ECD的慢病毒载体转导的T细胞在含有IL-2的培养基中扩增良好，但在含有仅130a1 G-CSF或IL-2+130a1 G-CSF的培养基中扩增明显减少；事实上，后两种条件下的扩增水平似乎比使用仅培养基看到的扩增水平更低(图73B)。未转导的T细胞响应于IL-2扩增良好，但响应于130a1 G-CSF扩增不良(图73A)。两种培养都不能在仅培养基中很好地扩增。

因此，GIFNAR 134ECD似乎诱导了T细胞中的生长抑制信号，如通过这个扩增测定所评估。

如图74中所示，在未转导的T细胞和表达GIFNAR 134ECD的T细胞中，IL-2诱导STAT1的弱磷酸化和JAK1、Akt和S6的典型磷酸化水平。在未转导的T细胞和表达GIFNAR134ECD的T细胞中，IFNa诱导STAT1和STAT2的强磷酸化，而没有JAK1、Akt或S6的明显磷酸化。在表达GIFNAR 134ECD的T细胞中，130a1 G-CSF诱导STAT1、STAT2和JAK1的强磷酸化，而没有Akt或S6的明显磷酸化。130a在未转导的T细胞中不诱导任何生化信号传导事件。

因此，GIFNAR 134ECD诱导类似于IFNa诱导的生化信号传导事件。

实施例43：具有来自G-CSFR受体的变体胞外结构域和来自干扰素γ受体的胞内信号传导结构域的嵌合受体的构建和功能评估

我们合成了称为GIFNGR-1 307ECD和GIFNGR-2 307ECD的两种嵌合受体(图60)。GIFNGR-1 307ECD含有与人IFNgR2的框1区和框2区以及来自人IFNgR1的胞内结构域的STAT1结合位点融合的人G-CSFR的胞外结构域(307变体)和跨膜结构域。GIFNGR-2 307ECD含有与来自人IFNgR1的胞内结构域的STAT1结合位点融合的人G-CSFR的胞外结构域(307变体)、跨膜结构域以及框1区和框2区。在用于转导人CD4+和CD8+T细胞的单独慢病毒载体中编码嵌合受体亚基。通过流式细胞术分析转导的T细胞(和未转导的对照T细胞)，以检测GIFNGR-1 307ECD和GIFNGR-2 307ECD的细胞表面表达。体外评估GIFNGR-1 307ECD和GIFNGR-2 307ECD诱导T细胞扩增的能力。通过蛋白质印迹使用针对STAT1和其他信号传导中间体的磷酸特异性抗体评估GIFNGR-1 307ECD和GIFNGR-2 307ECD介导的生化信号传导事件。

方法

总的来说，我们遵循实施例39中描述的类似方法；然而，所述实验被调整为集中于IFNγ信号传导机制。

用编码GIFNGR-1 307ECD或GIFNGR-2 307ECD的慢病毒载体转导人T细胞。此外，用编码GIFNGR-1 307ECD和G2R-3 134ECD，或GIFNGR-2 307ECD和G2R-3 134ECD的慢病毒载体共转导一些T细胞。G2R-3 134ECD在N末端用Myc表位(EQKLISEEDL)标记，而GIFNGR-1307ECD和GIFNGR-2 307ECD在N末端用Flag表位(DYKDDDDK)标记，这使得不同的受体亚基能够通过流式细胞术区分。

按照实施例39，在第8天通过流式细胞术测定转导效率。分别使用BV421缀合的和AlexaFluorTM 488缀合的抗体检测Flag和Myc标签。

使T细胞在IL-2(300IU/ml)、130a1 G-CSF和/或307(每种100ng/ml)、IL-2+130a1G-CSF(分别为300IU/ml和100ng/ml)、IL-2+307G-CSF(分别为300IU/ml和100ng/ml)或仅培养基(未添加细胞因子)中扩增18天。每两天更新培养基和所指示细胞因子。在扩增的第4天、第8天、第12天和第16天，使用Cytek^TMAurora流式细胞仪对T细胞进行计数。

对于BrdU掺入测定，第12天收获在IL-2中扩增的T细胞，并且在PBS中洗涤两次并在完全TexMACS培养基中洗涤一次。将细胞重新铺在含有仅培养基或具有以下的培养基的新鲜完全TexMACS培养基中：IL-2(300IU/ml)、IFNg(100ng/ml)、IL-2+IFNg(分别为300IU/ml和100ng/ml)、130a1 G-CSF(100ng/ml)、307G-CSF(100ng/ml)、130a1 G-CSF+307G-CSF(各自100ng/ml)、130a1 G-CSF+IFNg(各自100ng/ml)或307G-CSF+IL-2(分别为100ng/ml和300IU/ml)。将细胞在37℃、5％CO2下孵育48小时。如实施例39中所述进行BrdU测定。

对于蛋白质印迹实验，使T细胞在IL-2(300IU/ml)中扩增18天，如上洗涤，并且在完全TexMACS培养基中静置过夜。第二天，用仅培养基或具有IL-2(300IU/ml)、IFNg(100ng/ml)或307G-CSF(100ng/ml)的培养基在37℃下刺激细胞20分钟。如实施例39中所述制备细胞质和细胞核部分并进行蛋白质印迹。一抗获自Cell Signaling Technologies：磷酸-Stat1(Tyr701)(58D6)兔mAb#9167、组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638、磷酸-JAK2(Tyr1007/1008)抗体#3771、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)兔mAb#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211和β-肌动蛋白(13E5)兔mAb#4970。

结果

通过流式细胞术(图75)，用编码GIFNGR-1 307ECD的慢病毒载体转导的大部分(93.8％)CD3+T细胞表达G-CSFR 307ECD上的Flag表位(图75A)。同样，用编码G2R-3 134ECD的慢病毒载体转导的大部分(51.7％)CD3+T细胞表达G-CSFR 134ECD上的Myc表位(图75B)。对于用编码GIFNGR-1 307ECD和G2R-3 134ECD的慢病毒载体共转导的T细胞，32.0％分别共表达G-CSFR 307和134ECD上的Flag和Myc表位(图69C)。如所预期，未转导的T细胞不表达Myc或Flag表位(图75D)。

因此，GIFNGR-1 307ECD可以在具有或不具有G2R-3 134ECD的工程化T细胞的表面上表达。

使用GIFNGR-2 307ECD获得了类似的流式细胞术结果(图76)。用编码GIFNGR-2307ECD的慢病毒载体转导的大部分(97.6％)CD3+T细胞表达G-CSFR 307ECD上的Flag表位(图76A)。同样，用编码G2R-3 134ECD的慢病毒载体转导的大部分(51.7％)CD3+T细胞表达G-CSFR 134ECD上的Myc表位(图76B；这与图75B中的数据相同)。对于用编码GIFNGR-2307ECD和G2R-3 134ECD的慢病毒载体共转导的T细胞，32.6％分别共表达G-CSFR 307和134ECD上的Flag和Myc表位(图76C)。如所预期，未转导的T细胞不表达Myc或Flag表位(图76D；这与图75D中的数据相同)。

因此，GIFNGR-2 307ECD可以在具有或不具有G2R-3 134ECD的工程化T细胞的表面上表达。

如图71中所示，用编码GIFNGR-1 307ECD的慢病毒载体转导的T细胞在含有IL-2或IL-2+307G-CSF的培养基中扩增良好，但在仅307G-CSF或仅培养基中扩增不良(图77B)。用编码GIFNGR-1307ECD和G2R-3 134ECD的慢病毒载体共转导的T细胞在含有IL-2或IL-2+130a1 G-CSF的培养基中扩增良好(图77C)。当这些T细胞在130a1 G-CSF+307G-CSF中培养时，其在第12天显示出减少的扩增，在第16天增加(图77C)。未转导的T细胞响应于IL-2扩增良好，但响应于130a1 G-CSF+307G-CSF扩增不良(图77A)。没有T细胞系在仅培养基中很好地扩增。

因此，GIFNGR-1 307ECD似乎对T细胞生长的影响可以忽略不计，如通过扩增测定所评估。

如图78中所示，用编码GIFNGR-2 307ECD的慢病毒载体转导的T细胞在含有IL-2的培养基中扩增良好，但在含有仅307G-CSF、IL-2+307G-CSF的培养基或仅培养基中扩增不良(图78B)。用编码GIFNGR-2 307ECD和G2R-3 134ECD的慢病毒载体共转导的T细胞在含有IL-2或IL-2+130a1 G-CSF的培养基中扩增良好(图78C)。当在130a1 G-CSF+307G-CSF中培养时，这些T细胞未能扩增(图78C)。未转导的T细胞响应于IL-2扩增良好，但响应于130a1 G-CSF+307G-CSF扩增不良(图78A，其显示了与图77A相同的数据)。没有T细胞系在仅培养基中很好地扩增。

因此，GIFNGR-2 307ECD似乎能抑制T细胞生长，如通过扩增测定所评估。

如图79中所示，未转导的CD4+和CD8+T细胞表现出响应于IL-2、IL-2+IFNg和307G-CSF+IL-2的增殖(BrdU掺入)(图79A)。

表达仅G2R-3 134ECD的CD4+和CD8+T细胞表现出响应于IL-2、IL-2+IFNg、130a1G-CSF、130a1 G-CSF+307G-CSF、130a1G-CSF+IFNg和307G-CSF+IL-2的增殖(图79B、图79C)。

表达仅GIFNGR-1 307ECD的CD4+和CD8+T细胞表现出响应于IL-2、IL-2+IFNg和307G-CSF+IL-2的增殖(图79B、图79C)。

共表达GIFNGR-1 307ECD和G2R-3 134ECD的CD4+和CD8+T细胞表现出响应于IL-2、IL-2+IFNg、130a1 G-CSF、130a1 G-CSF+307G-CSF、130a1 G-CSF+IFNg和307G-CSF+IL-2的增殖(图79B、图79C)。其还显示出响应于仅307G-CSF的弱增殖(图79B、图79C)。

因此，GIFNGR-1 307ECD似乎对CD8+和CD4+T细胞增殖具有中性或可忽略的影响。

图80显示了GIFNGR-2的增殖结果。未转导的T细胞和表达仅G2R-3 134ECD的CD4+和CD8+T细胞的数据与图79中所示的相同并且因此不再描述。

表达仅GIFNGR-2 307ECD的CD4+和CD8+T细胞表现出响应于IL-2、IL-2+IFNg、307G-CSF、130a1 G-CSF+307G-CSF和307G-CSF+IL-2的增殖(图80B、图80C)。

共表达GIFNGR-2 307ECD和G2R-3 134ECD的CD4+和CD8+T细胞表现出响应于IL-2、IL-2+IFNg、130a1 G-CSF、307、130a1G-CSF+307G-CSF、130a1 G-CSF+IFNg和307G-CSF+IL-2的增殖(图80B、图80C)。

因此，尽管在长期培养中抑制T细胞扩增(图78)，GIFNGR-2 307ECD似乎增强了CD4+和CD8+T细胞的增殖，如BrdU测定所评估。

如图81中所示，在未转导的T细胞和表达GIFNGR-1 307ECD或GIFNGR-2 307ECD的T细胞中，IL-2诱导STAT1的弱/可忽略的磷酸化，Akt的强磷酸化，和(在这个特定的实验中)S6的弱磷酸化。IFNg似乎没有诱导任何这些信号传导事件。在表达GIFNGR-1 307ECD或GIFNGR-2 307ECD的T细胞中，307G-CSF诱导STAT1的强磷酸化。在表达GIFNGR-2 307ECD的T细胞中，307G-CSF也诱导了JAK2和Akt的强磷酸化。

因此，GIFNGR-1 307ECD和GIFNGR-2 307ECD诱导STAT1的酪氨酸磷酸化，但在其他方面不同于天然IFNg受体信号。

实施例44：编码嵌合受体G12/2R-1 134ECD或G2R-3 134ECD和间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)的双顺反子构建体的构建和功能评估

我们合成了称为CAR_T2A_G2R-3-134-ECD、G2R-3-134-ECD_T2A_CAR、CAR_T2A_G12/2R-1-134-ECD和G12/2R-1-134-ECD_T2A_CAR的双顺反子构建体，以及驱动仅间皮素CAR的表达的单顺反子构建体。双顺反子构建体的命名法指示基因片段如何从5’端到3’端排序。例如，CAR_T2A_G2R-3-134-ECD编码(从5'到3')间皮素特异性CAR、T2A核糖体跳跃元件和G2R-3 134ECD。双顺反子构建体使用编码间皮素CAR和G2R-3 134ECD或G12/2R-1ECD的单一慢病毒载体表达，由T2A核糖体跳跃元件分隔。这些双顺反子构建体用于转导人CD4+和CD8+T细胞，并且通过流式细胞术分析转导的T细胞(和未转导的对照T细胞)，以检测G-CSFRECD和CAR的细胞表面表达。体外评估了130a1 G-CSF通过G2R-3 134ECD或G12/2R-1 134ECD诱导T细胞增殖的能力。响应于通过T细胞与间皮素阳性人卵巢癌细胞系OVCAR3共孵育活化CAR，还通过胞内流式细胞术评估T细胞以测量细胞因子IFNg、TNFa和IL-2以及细胞表面标志物CD69和CD137的表达。

方法

总的来说，我们遵循实施例31中描述的类似方法；然而，如下所述，所述实验被调整为集中于间皮素CAR和工程化嵌合细胞因子受体G2R-3 134ECD和G12/2R-1 134ECD的共表达和功能。

对于检测G-CSFR ECD和间皮素CAR的流式细胞术，使细胞在IL-7和IL-15(各自10ng/ml)中扩增8天。将细胞与特异性针对CD3(BV750缀合)、CD4(PE缀合)、CD8(PerCP缀合)和G-CSFR ECD(APC缀合)以及重组Fc标记的间皮素蛋白(FITC缀合)和efluor506^TM活性染料的抗体一起孵育。

对于胞内流式细胞术，使转导的T细胞在130a1 G-CSF中扩增13天。使OVCAR3细胞(ATCC)在含有0.01mg/ml牛胰岛素和20％胎牛血清的ATCC配制的RPMI-1640培养基中生长。在37摄氏度、5％CO2下，在存在或不存在OVCAR3细胞(效应细胞:靶细胞比率为2:1)的情况下，洗涤T细胞并将其重新铺在完全TexMACS培养基中13小时。最后四小时的孵育是在蛋白转运抑制剂(Brefeldin A)的存在下进行的。在孵育结束时，用Zombie NIR^TM FixableViability试剂盒对细胞进行染色，随后用抗CD3(BV510缀合)、CD4(AlexaFluor^TM 700缀合)、G-CSFR(APC缀合)、CD69(BV785缀合)和CD137(BV605缀合)以及重组间皮素(FITC缀合)和Fc封闭物的抗体混合物进行染色。然后将细胞固定并透化(BD Cytofix/Cytoperm^TM set)并针对细胞因子IFNg(BV650缀合)、TNFa(PECy7缀合)和IL-2(PE-CF594缀合)进行染色。使用Cytek Aurora流式细胞仪分析细胞。

结果

通过流式细胞术测得(图82和图83)测得，未转导的细胞表现G-CSFR ECD和间皮素CAR的可忽略不计的表达(图66A和图67A)，而55.3％用编码仅间皮素CAR构建体的慢病毒转导的CD3+T细胞表达CAR(图82B和图83B)，并且13.1％用编码G2R-3 134ECD的慢病毒转导的T细胞表达G-CSFR ECD(图82C)。26.7％用编码CAR_T2A_G2R-3-134ECD的慢病毒转导的T细胞表达G-CSFR ECD和间皮素CAR(图82D)，而25.2％用编码G2R-3-134ECD_T2A_CAR的慢病毒转导的CD3+T细胞表达G-CSFR ECD和间皮素CAR(图82E)。同样地，13.1％用编码仅G12/2R-1134ECD的慢病毒转导的T细胞表达G-CSFR ECD(图83C)。30.8％用编码CAR_T2A_G12/2R-1-134ECD的慢病毒转导的T细胞表达G-CSFR ECD和间皮素CAR(图83D)，并且36.0％用编码G12/2R-1-134ECD_T2A_CAR的慢病毒转导的T细胞表达G-CSFR ECD和间皮素CAR(图83E)。

因此，编码间皮素CAR加G2R-3 134ECD或间皮素CAR加G12/2R-1 134ECD的双顺反子慢病毒载体可引起CAR和嵌合细胞因子受体的细胞表面表达。

通过BrdU掺入测定(图84)测得，未转导的T细胞或经工程化以表达仅间皮素CAR的T细胞响应于IL-2增殖，而响应于130a1 G-CSF或仅培养基的增殖可忽略不计。表达仅G2R-3134ECD的T细胞响应于IL-2或130a1 G-CSF增殖(图84B)。用编码CAR_T2A_G2R-3-134ECD、CAR_T2A_G12/2R-1-134ECD或G12/2R-1-134ECD_T2A_CAR的慢病毒载体转导的T细胞响应IL-2或130a1 G-CSF增殖。没有T细胞群体显示出响应于仅培养基的显著增殖。

因此，当作为双顺反子构建体的一部分与间皮素CAR共表达时，G2R-3 134ECD和G12/2R-1 134ECD保留了它们的功能特性，不管它们是排列在CAR的上游还是下游。

通过胞内流式细胞术(图85)测得，响应于用OVCAR3细胞刺激，表达单顺反子间皮素CAR构建体的T细胞上调细胞因子IFNg、TNFa和IL-2以及活化标志物CD69和CD137的表达(图85A)。相比之下，在经工程化以表达仅G12/2R-1 134ECD并用OVCAR3细胞刺激的T细胞中，未观察到IFNg、TNFa、IL-2、CD69或CD137的表达变化(图85B)。响应于OVCAR3细胞，表达双顺反子构建体CAR_T2A_G2R-3-134ECD的T细胞显示IFNg、TNFa、IL-2、CD69和CD137的表达增加(图85C)。同样地，响应于用OVCAR3细胞刺激，表达G2R-3-134ECD_T2A_CAR、CAR_T2A_G12/2R-1-134ECD或G12/2R-1-134ECD_T2A_CAR构建体的T细胞显示这些细胞因子和标志物的表达增加(图85D、图85E和图85F)。

因此，响应于用OVCAR3细胞上的同源抗原刺激，间皮素CAR在作为具有G2R-3134ECD或G12/2R-1 134ECD的双顺反子慢病毒构建体的一部分表达时保留了其功能特性，如通过上调IFNg、TNFa和IL-2以及活化标志物CD69和CD137所证实。当排列在G2R-3 134ECD或G12/2R-1 134ECD的上游或下游时，CAR是功能性的。

实施例45：共表达间皮素特异性CAR和IL-2模拟嵌合细胞因子受体的人T细胞显示出对表达间皮素的靶细胞的细胞毒性

进行实验以显示CAR构建体和嵌合细胞因子受体在共表达时表现出它们预期的功能特性，并且嵌合细胞因子受体(诸如G2R-3 134ECD)的刺激增强了CAR介导的针对表达适当CAR抗原的靶细胞的细胞毒性。以下实施例使用与G2R-3 134ECD共表达的间皮素特异性CAR。

方法

使用标准磷酸钙转染方案和第2代包装载体(AddGene)将编码萤火虫荧光素酶pCCL Luc嘌呤霉素的哺乳动物表达转移质粒引入慢病毒载体中。用编码荧光素酶的慢病毒转导表达间皮素的OVCAR3细胞系，并且针对嘌呤霉素抗性(1.5μg/ml，Sigma，目录号P8833)选择2周以上以产生嘌呤霉素抗性细胞系以用作细胞毒性测定中的靶细胞群体。

将表达荧光素酶的靶OVCAR3系以2×10⁴个细胞接种于96孔板(Corning，目录号3917)中，每孔100μl，并且孵育过夜以使其粘附于板上。将人PBMC来源的T细胞经慢病毒转导以表达仅间皮素特异性CAR或与G2R-3 134ECD一起表达。将T细胞铺在96孔板中(100μl/孔)并分成2倍稀释系列，以达到20:1至0.625:1的效应物与靶(E:T)比率范围。然后将稀释的T细胞悬浮液添加到粘附肿瘤细胞培养物中以使总体积达到200μl。将IL-2(300IU/ml)、130a1 G-CSF(100ng/ml)或PBS添加到一些孔中以确定细胞毒性是否被IL-2或130a1 G-CSF增强。一式三份地测试所有条件。将三个单独的靶细胞孔和3个单独的培养基孔铺板以确定用于测定的最大和最小相对发光单位(RLU)。将细胞在5％CO₂中在37℃下培养24-48小时。

分析当天，将22μl 10X Xenolight^TM D-荧光素储备液(Perkin Elmer，目录号122799)添加到每个孔中，并且将板在室温下在黑暗中孵育10分钟。在发光酶标仪(PerkinElmer Wallac Envision 2104Multilable Reader)上扫描板。对来自三个孔的RLU取平均值，并且通过以下等式确定细胞毒性百分比：细胞毒性百分比＝100×(最大发光RLU-测试发光RLU)/(最小发光RLU-最大发光RLU)。此外，在24和48小时时，对靶细胞进行细胞死亡的形态学标志的成像。

预期结果

表达间皮素特异性CAR的T细胞以剂量依赖性方式引起靶细胞裂解。通过添加IL-2增加靶细胞裂解，如较低的E:T比率下的杀伤增加所反映。对于共表达间皮素特异性CAR与G2R-3 134ECD的T细胞，靶细胞裂解随着添加130a1 G-CSF增加到与IL-2相似的程度。这些结果表明，在共表达间皮素特异性CAR与G2R-3 134ECD的T细胞中，CAR如预期的那样介导靶细胞识别和杀伤，并且T细胞的细胞毒性可以通过用130a1 G-CSF刺激G2R-3 134ECD而选择性增强。

实施例46：与CAR配对的受控旁分泌信号传导系统的构建和功能评估

使用实施例41中所述的方法，使用G12/2R 134ECD、IL-18和间皮素特异性CAR的实例，CPS系统与CAR配对(参见表31中称为CAR_P2A_G12-2R1-134_T2A_hIL-18的构建体)。将此组合系统在体外和体内进行功能评估。

方法

三个cDNA被P2A和T2A位点分隔以允许从单个mRNA转录物中产生三种蛋白质。使用这种三顺反子构建体，一个cDNA比另一个cDNA表达水平高的情况并不少见，并且最佳构型需要根据经验确定。因此，构建了至少三种构型(从5'到3'列出)：(a)G12/2R-1 134ECD、IL-18、Meso CAR；(b)IL-18、G12/2R-1 134ECD、Meso CAR；和(c)Meso CAR G12/2R-1 134ECD、IL-18(图82-85)(表31)。

将使用与实施例49类似的方法评估T细胞转导、扩增、增殖、IL-18分泌和生化信号传导。将使用与实施例44类似的方法评估CAR表达以及对间皮素阳性肿瘤细胞的识别和杀伤。

预期结果

用两种不同的慢病毒构建体转导T细胞：一种编码与IL-18和Meso CAR串联的G12/2R-1 134ECD(在本实施例中称为CPS^2/12+18+Meso CAR；表31中也称为CAR_P2A_G12-2R1-134_T2A_hIL-18)，并且另一种编码G12/2R-1 134ECD和Meso CAR(表31)(以充当对照)。

通过流式细胞术测得，表达CPS^2/12+18+Meso CAR或G12/2R-1+Meso CAR的T细胞展示了人G-CSFR ECD和Meso CAR在显著比例的T细胞上的共表达(15-90％)。与实施例44类似，当暴露于表达间皮素的靶细胞时，表达Meso CAR的T细胞上调活化标志物(诸如CD69或CD137)的表达。

通过BrdU测定，表达Meso CAR的T细胞响应于表达间皮素的靶细胞增殖。

通过IFN-g ELISA测得，表达Meso CAR的T细胞响应于表达间皮素的靶细胞分泌IFN-g。通过向培养物中添加IL-2、IL-2+IL-12和/或130a1 G-CSF来增强IFN-g分泌。130a1G-CSF的作用在表达CPS^2/12+18+Meso CAR的细胞中更显著，因为IL-18可以增强T细胞的IFN-g分泌，特别是当与IL-2和IL-12信号组合时。

通过体外细胞毒性测定(类似于实施例45)测得，表达Meso CAR的T细胞杀死表达间皮素的靶细胞。由于IL-2和IL-12都可以增强T细胞的细胞毒性，因此在培养物中添加IL-2、IL-2+IL-12和/或130a1G-CSF可以增强这种作用。130a1 G-CSF的作用在表达CPS^2/12+18+Meso CAR的细胞中更明显，因为当与IL-2和IL-12信号结合时，IL-18可以进一步增强T细胞的细胞毒性。

在体内肿瘤退化模型中，表达Meso CAR的T细胞诱导表达间皮素的肿瘤细胞退化。由于IL-2可以增强T细胞的细胞毒性，因此通过向培养物中施用IL-2或130a1 G-CSF可以增强这种作用。(IL-12毒性太大，不能安全地全身施用。)130a1 G-CSF具有比IL-2更强的抗肿瘤作用，因为来自G12/2R 134ECD的组合IL-2+IL-12信号应该比单独的IL-2更强。130a1 G-CSF的作用在表达CPS^2/12+18+Meso CAR的细胞中甚至更显著，因为当与IL-2和IL-12信号组合时，IL-18进一步增强T细胞的抗肿瘤活性。

通过诸如流式细胞术和免疫组织学的方法测得，表达CPS^2/12+18+Meso CAR的T细胞(与表达G12/2R-1+Meso CAR的T细胞相比)诱导更强的抗肿瘤免疫反应。这通过由于肿瘤微环境中IL-18的旁分泌作用，活化的宿主T细胞、NK细胞、髓样细胞和其他细胞类型对肿瘤的浸润增加来反映。

因此，本实施例中的实验证明了表达CPS^2/12+18的T细胞的效应功能优于表达仅G12/2R-1的T细胞，这是由于IL-18对诸如IFN-g分泌和T细胞的细胞毒性的刺激作用，以及对宿主免疫细胞的旁分泌作用。

实施例47：双细胞因子控制的旁分泌信号传导系统的构建和功能评估

慢性信号传导可对细胞具有非所需或有害的影响。例如，长期或慢性暴露于IL-12信号可以促进T细胞的终末分化，从而限制它们的增殖潜力和/或持久性。因此，在某些情况下，可能需要使用CPS系统，其中例如IL-2和IL-12信号由不同的正交细胞因子控制。以这种方式，诱导T细胞以响应于一种细胞因子增殖(例如，通过用130a1G-CSF刺激G2R-3以模拟IL-2信号)，并且在稍后时间响应于另一种细胞因子分化(例如，通过用307G-CSF刺激G12R-1以模拟IL-12信号)。为了实现这种控制，使用上述实施例中描述的方法来构建和评估由编码G2R-3 134ECD、G12R-1 307ECD和IL-18的三顺反子载体构成的CPS系统(称为CPS^2+12+18)。将此组合系统在体外和体内进行功能评估。

实施例48：模拟其他细胞因子组合的受控旁分泌信号传导系统的构建和功能评估

使用实施例41中描述的方法，通过用编码其他ICD的嵌合细胞因子受体替代G12/2R-1来模拟其他细胞因子组合，如图31中所示。这些嵌合受体可以使用人G-CSFR的134ECD或人G-CSFR的其他变体ECD(例如，307ECD)，或来自其他细胞因子受体的ECD。

代替IL-18cDNA，插入编码其他细胞因子或趋化因子的cDNA，诸如CXCL13、IL-21、CCL3、CCL4、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、IFN-g、IFN-a、IL-17或TNF-a。插入其他细胞表面蛋白，诸如受体NKG2D(表30)。根据预期的应用，使用人、鼠或其他版本的这种因子。

实施例49：具有来自IL-7α受体亚基的胞外结构域和跨膜结构域以及来自IL-2/ IL-15受体β亚基的胞内结构域的嵌合受体的构建和表达

我们合成了称为7/2R-1的嵌合受体(图92和图93)，其含有与人IL-2/IL-15受体β亚基的胞内结构域融合的人IL-7受体α亚基的胞外结构域和跨膜结构域。IL-7受体α亚基在其N末端用标准Flag表位标记(DYKDDDDK)，以便能够将这种嵌合受体亚基与也经常由T细胞表达的天然IL-7受体α亚基区分开。嵌合受体亚基编码在慢病毒载体中，所述载体用于转导人CD4+和CD8+T细胞。十二天后，通过流式细胞术分析转导的细胞(和未转导的对照细胞)，以检测嵌合受体亚基相对于天然IL-7受体α亚基的表达。

方法

合成Flag标记的嵌合受体(7/2R-1)并克隆到慢病毒转移质粒(TwistBioscience)中。如下将转移质粒和慢病毒包装质粒(psPAX2，pMD2.G，Addgene)共转染到慢病毒包装细胞系HEK293T/17(ATCC)中。将细胞在含有5％胎牛血清和0.2mM丙酮酸钠的Opti-MEM^TMI还原血清培养基GlutaMAX^TM补充剂(Gibco^TM)中铺板过夜。根据制造商的说明书，将质粒DNA和Lipofectamine^TM 3000转染试剂(Gibco^TM)混合并逐滴添加到细胞上。将细胞在37℃、5％CO₂下孵育6小时，然后替换培养基并进一步孵育过夜。第二天，从板收集细胞上清液，储存在4℃下并替换培养基。第二天，从细胞收集细胞上清液并与前一天的上清液合并。将上清液短暂离心以去除碎片并通过0.45μm过滤器过滤。在Beckman Optima L-XP超速离心机中使用SW-32Ti转子以25,000rpm将上清液旋转90分钟。去除上清液，并将沉淀通过30分钟的温和摇动重悬于合适体积的Opti-MEM I培养基中。

如下从健康供体白细胞单采产品中分离原代人T细胞。使用密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。按照制造商的说明书，使用人CD4和CD8微珠(Miltenyi Biotec)分离CD4+和CD8+T细胞。对于一些实验，T细胞可被冷冻并在稍后的时间点解冻。将分离的T细胞以5×10⁵/孔的密度铺在48孔板中的含3％人血清(Sigma)和0.5％庆大霉素(DIN 0226853)的TexMACS^TM培养基(Miltenyi Biotec)(以下称为“完全TexMACS”)中。添加人T细胞TransAct^TM(Miltenyi Biotec)(10ml/孔)，并且在37℃、5％CO₂下孵育细胞。活化后20至28小时，用编码受体构建体的慢病毒转导T细胞。转导后二十四小时，将新鲜培养基与IL-7(10ng/ml)、IL-7和IL-15(各10ng/ml)或无细胞因子一起添加到T细胞中，并且将细胞再孵育48小时。在扩增的第12天，如下通过流式细胞术评估受体表达。将细胞在4℃下与抗人CD127eFluor^TM450缀合的抗体(1:50稀释)、与PE或PECy7缀合的抗Flag抗体(1:50稀释)、与BV750^TM缀合的抗人CD3抗体(1:50稀释)、与PE或AlexaFluor^TM700缀合的抗人CD4抗体(1:25稀释)、与PerCP缀合的抗人CD8抗体(1:100)和eBioscience^TMFixable Viability DyeeFluor^TM506(1:1000稀释)一起孵育15分钟。然后将细胞在缓冲液中洗涤两次并在Cytek^TMAurora流式细胞仪上进行分析。图88示出CD3+T细胞的结果，包括CD4+和CD8+亚群。

结果

用编码7/2R-1的慢病毒载体转导的大部分(48.5％)CD3+T细胞共表达CD127(IL-7Rα)和Flag表位标签(图88A)，而未转导的T细胞显示天然CD127的低/中度表达，但不表达Flag表位标签(图88B)。CD127 FMO对照证实了CD127检测的特异性(图88C)。

因此，7/2R-1可以在慢病毒转导的T细胞的表面上表达。

实施例50：用7/2R-1转导并用IL-7刺激的人T细胞的扩增

为了确定7/2R-1是否促进T细胞扩增(细胞数量的增加)，在仅培养基中相对于IL-7+IL-15或相对于IL-7培养来自实施例49的转导和未转导条件的T细胞并定期计数。选择IL-7+IL-15的组合作为仅IL-7的比较物，因为IL-7+IL-15通常用于在慢病毒转导后扩增人T细胞。

方法

如实施例49(第0天)所述，分离并转导人T细胞以表达7/2R-1。使细胞在IL-7(10ng/ml)、IL-7和IL-15(各自10ng/ml)或仅培养基中扩增总共16天，其中每两天更新培养基和细胞因子。在扩增的第4天、第8天、第12天和第16天，使用Cytek^TMAurora流式细胞仪对活T细胞进行计数以评估相对于第0天的倍数扩增。

结果

如图57中所示，用编码7/2R-1的慢病毒载体转导的CD3+T细胞在IL-7或IL-7+IL-15中表现出同等的扩增(图89A)，而未转导的CD3+T细胞在IL-7+IL-15中扩增良好，但在IL-7中仅适度扩增(图89B)。两种培养都不能在仅培养基中很好地扩增。

因此，T细胞上7/2R-1的表达导致响应于IL-7的扩增增加，从而达到与IL-7+IL-15诱导的细胞密度相当的细胞密度。这提供了IL-2/IL-15受体β亚基的胞内结构域在7/2R-1嵌合受体的情形中起作用的功能证据。

实施例51：通过BrdU掺入测定评估的用7/2R-1转导并用IL-7刺激的人T细胞的增殖

为了确定7/2R-1是否促进细胞增殖(细胞周期)，在仅培养基中相对于含有IL-2、IL-7或IL-2+IL-7组合的培养基中培养来自实施例49的转导和未转导条件的T细胞。通过48小时BrdU测定测量细胞增殖。

方法

如实施例49中所述，分离细胞并工程化以表达7/2R-1。使表达7/2R-1的细胞在IL-7(10ng/ml)中扩增，并且使未转导的细胞在IL-7和IL-15(各自10ng/ml)中扩增。在扩增的第12天，收集细胞，并且在PBS中洗涤两次并在完全TexMACS培养基中洗涤一次，并且在37℃、5％CO₂下重新铺在含有相关测定细胞因子(10ng/ml的IL-7、300IU/ml的IL-2、分别为10ng/ml和300IU/ml的IL-7和IL-2，或无细胞因子)的新鲜完全TexMACS培养基中持续48小时。BrdU测定程序遵循BD Pharmingen^TM FITC BrdU Flow试剂盒(557891)的说明书手册，增加了以下内容：如实施例49所述进行表面染色，以评估除BrdU掺入之外的7/2R-1表达。使用Cytek^TMAurora仪器进行流式细胞术。

结果

如图58中所示，用编码7/2R-1的慢病毒载体转导的CD4+和CD8+T细胞显示出响应于IL-2、IL-7或IL-2+IL-7的等同的增殖(图90A)，而未转导的CD4+和CD8+T细胞响应于IL-2和IL-2+IL-7增殖良好，但响应于IL-7仅适度增殖(图90B)。除了在这种特定的测定中具有高背景增殖的表达7/2R-1的CD8+T细胞外，没有培养物在仅培养基中增殖良好。

因此，T细胞上7/2R-1的表达导致响应于IL-7的增殖增加，从而达到与IL-2或IL-2+IL-7诱导的水平相当的水平。这提供了IL-2/IL-15受体β亚基的胞内结构域在7/2R-1嵌合受体的情形中起作用的功能证据。

实施例52：表达7/2R-1的人T细胞中生化信号传导事件的蛋白质印迹检测

为了确定7/2R-1是否诱导与天然IL-2受体相似的生化信号传导事件，在仅培养基中相对于含有IL-2、IL-7或IL-2+IL-7组合的培养基中培养来自实施例31的转导和未转导条件的T细胞。制备细胞裂解物并通过蛋白质印迹用抗IL-7和IL-2受体信号传导中涉及的各种蛋白质的抗体进行探测(图91)。

方法

如实施例49中所述，分离细胞并工程化以表达7/2R-1。使表达7/2R-1的细胞在IL-7(10ng/ml)中扩增，并且使未转导的细胞在IL-7和IL-15(各自10ng/ml)中扩增。在扩增的第12天，收获细胞，在PBS中洗涤两次并在完全TexMACS培养基中洗涤一次，并且在37℃、5％CO₂下在未添加细胞因子的完全TexMACS培养基中静置过夜。

为了进行蛋白质印迹，在37℃下用无细胞因子、IL-2(300IU/ml)、IL-7(10ng/ml)或IL-2和IL-7(分别为300IU/ml和10ng/ml)刺激细胞20分钟。在含有10mM HEPES pH 7.9、1mM MgCl₂、0.05mM EGTA、0.5mM EDTA pH 8.0、1mM DTT和1x Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂小型片剂(A32961)的缓冲液中洗涤细胞一次。将细胞在上述洗涤缓冲液中裂解，其中添加0.2％NP-40取代物(Sigma)，在冰上裂解10分钟并在4℃下以13,000rpm离心10分钟，之后收集上清液(细胞质部分)。将细胞核沉淀重悬浮并在添加0.42M NaCl和20％甘油的上述洗涤缓冲液中萃取。将细胞核沉淀在冰上萃取30分钟，频繁涡旋，并在4℃下以13,000rpm离心20分钟，之后收集可溶性细胞核部分(上清液)。将细胞质和细胞核部分在还原缓冲液中加热(70℃)10分钟并在NuPAGE^TM4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上运行。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上(在20V下在SD Semi-Dry Transfer Cell中60min)，干燥并在TBS中的/>封闭缓冲液(927-50000，LI-COR)中封闭1小时。在4℃下在含有0.1％Tween20的TBS中的/>封闭缓冲液中将印迹与所指示的一抗(1:1,000)一起孵育过夜。所用的一抗获自Cell Signaling Technologies：磷酸-Shc(Tyr239/240)抗体#2434、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)/>兔单克隆抗体#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体#9101、β-肌动蛋白(13E5)兔单克隆抗体#4970、磷酸-JAK1(Tyr1034/1035)(D7N4Z)兔单克隆抗体#74129、磷酸-JAK3(Tyr980/981)(D44E3)兔单克隆抗体#5031、磷酸-Stat5(Tyr694)(C11C5)兔单克隆抗体#9359和组蛋白H3(96C10)小鼠单克隆抗体#3638。将印迹在含0.1％Tween20的TBS中洗涤三次并在室温下与含0.1％Tween20的TBS缓冲液中的二抗(1:10,000)一起孵育30-60分钟。二抗获自CellSignaling Technologies：抗小鼠IgG(H+L)(DyLight^TM800 4X PEG缀合物)#5257和抗兔IgG(H+L)(DyLight^TM800 4X PEG缀合物)#5151。将印迹洗涤并暴露在LI-COR Odyssey成像仪上。

结果

如图59中所示，在未转导的T细胞和表达7/2R-1的T细胞中，IL-2诱导STAT5、JAK1、JAK3、Shc、Erk1/2、Akt和S6的磷酸化。在两种T细胞培养物中，观察到响应于IL-2+IL-7的相似的模式。在未转导的T细胞中，与IL-2刺激相比，IL-7刺激诱导较少的STAT5、Shc、Akt和S6的磷酸化。相反，在表达7/2R-1的T细胞中，由IL-7和IL-2诱导的磷酸化模式是不可区分的。组蛋白H3和β-肌动蛋白充当负载对照。

因此，IL-7刺激7/2R-1在T细胞中导致类似的生化信号传导事件，如刺激天然IL-2受体后所见，从而提供了IL-2/IL-15受体β亚基的胞内结构域在7/2R-1嵌合受体的情形中起作用的生化证据。

实施例53：含有IL-7受体α结构域的胞外结构域和跨膜结构域以及IL-2受体β亚基的胞内结构域的替代嵌合受体的构建和评估

我们设计了7/2R-1的替代版本，我们称之为7/2R-2(图92和图93)。关键的区别在于IL-7Rα和IL-2Rβ之间的融合位点被移动，使得7/2R-2包含IL-7Ra而不是IL-2Rb的框1区和框2区。例如，如果7/2R-1中的融合位点被证明在人中具有免疫原性，则所述受体可能是有利的。按照实施例49-52中的方法，在慢病毒载体中构建并编码7/2-R2的Flag表位标记版本，并且将此慢病毒载体转导到T细胞中。通过流式细胞仪评估7/2R-2的表达；通过扩增和增殖测定评估7/2R-2的功能特性，并且通过蛋白质印迹评估7/2R-2的生化信号传导特性。

实施例54：将PEG20k部分化学添加到130a1G-CSF的N末端

我们合成了称为PEG20K_G-CSF_130a1的修饰蛋白(图93)(也称为PEG-130a1 G-CSF)，其包括130a1 G-CSF的完整序列，其中20kDa的聚乙二醇(PEG)部分化学连接到蛋白质的N末端。此外，我们合成了类似版本的307G-CSF，我们称之为PEG20K_G-CSF_307或PEG-307G-CSF。

方法

将20mg纯化的130a1 G-CSF与44mg 20kDa甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD，Creative PEGworks)混合。添加反应缓冲液(10mM乙酸钠pH 5.0，5mM NaCl)至2ml的最终体积。通过添加40μl 1.0M氰基硼氢化钠溶液(最终[NaBH₃CN]＝20mM)并充分混合来引发聚乙二醇化反应。然后将反应物在旋转器上在18℃下孵育8小时。通过添加3ml终止缓冲液(10mM乙酸钠pH 3.5，5mM NaCl)终止反应。然后将最终的5ml样品在阳离子交换柱上运行，以将单聚乙二醇化的蛋白质与任何剩余的未修饰的蛋白质或多聚乙二醇化种类分离。用307G-CSF成功完成了相同的方案。

结果

SDS-PAGE显示了单聚乙二醇化的130a1 G-CSF和307G-CSF的同质群体，其在体外显示了与未修饰的蛋白质相似的信号传导活性。

实施例55：在鼠乳腺癌模型中，用130a1 G-CSF处理选择性地增强了表达G4R-1 134 ECD的肿瘤特异性T细胞的扩增和抗肿瘤表型

在体内鼠乳腺癌模型中，测试了变体细胞因子130a1 G-CSF增强经工程化以表达G4R 134ECD的T细胞的扩增、表型和抗肿瘤活性的能力。

方法

除了将Thy1.1+OT-I细胞逆转录病毒转导以表达G4R 134ECD而不是G2R-3134ECD，我们使用了与实施例36中所述类似的方法。用于血液样品的流式细胞术的抗体组包括：鼠CD45(克隆30-F11，APC缀合)、CD3(克隆17A2，AF700缀合)、CD8a(克隆53-6.7，PerCP缀合)、CD4(克隆RM4-5，BV510缀合)、NK1.1(克隆PK136，PECy7缀合)、CD19(克隆6D5，SparkNIR685缀合)、CD11b(克隆M1/70，FITC缀合)、CD11c(克隆N418，BV711缀合)、Ly6C(克隆HK1.4,BV605缀合)和Ly6G(克隆1A8,PE缀合)。在Cytek Aurora仪器上进行流式细胞术。

结果

所有小鼠接受同等剂量(5×10⁶个)的经转导的Thy1.1+OT-I细胞以表达G4R134ECD。转导效率为74.7％，如在第0天通过流式细胞术对表达人G-CSFR+的Thy1.1+细胞的百分比所评估。

在130a1 G-CSF处理组中，1/3的小鼠经历了其肿瘤的完全消退(CR)并保持无瘤状态直到第46天，此时研究因实际原因而停止(图93A)。类似地，在媒介物处理组中，1/3的小鼠经历CR。因此，130a1G-CSF处理组和媒介物处理组没有显示出统计学上的显著差异。

通过流式细胞术在从小鼠收集的系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的扩增和持久性。在130a1 G-CSF处理组中，与峰值为3.3％的媒介物处理组相比，Thy1.1+OT-I细胞在第4天达到所有CD8+T细胞的6.1％的平均峰值移植(图93B)。

通过系列血液样品的流式细胞术监测Thy1.1+OT-I细胞的表型。在130a1 G-CSF处理组中，与平均值为27.9％的媒介物处理组相比，到第8天，大多数(平均值＝70.4％)Thy1.1+OT-I细胞采用了T效应记忆(Tem)表型(CD44+CD62L-)(图93C)。相比之下，宿主(Thy1.1-)CD8+T细胞显示在130a1 G-CSF处理组和媒介物处理组之间的Tem细胞百分比在任何时间点均无显著差异(图93D)。

通过流式细胞术评估程序性死亡-1(PD-1)分子的表达。在130a1G-CSF处理组中，与平均值为15.5％的媒介物处理组相比，到第12天，只有一小部分(平均值＝1.3％)Thy1.1+OT-I细胞表达PD-1(图93E)。相比之下，宿主(Thy1.1-)CD8+T细胞显示在130a1 G-CSF处理组和媒介物处理组之间的PD-1+细胞的百分比在任何时间点均无显著差异(图93F)。

流式细胞术证明，在任何时间点，130a1 G-CSF处理组和媒介物处理组之间的宿主(Thy1.1-)CD4+T细胞和CD19+B细胞(相对于宿主CD45+细胞)的总百分比没有显著差异(图93G,H)。同样，用130a1G-CSF处理不影响外周血中的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或单核细胞计数(数据未显示)。

因此，130a1 G-CSF能够诱导表达G4R 134ECD的肿瘤特异性CD8+T细胞的适度但选择性扩增。这导致了33％的持久CR率。用130a1 G-CSF处理诱导显著比例的肿瘤特异性CD8+T细胞采用Tem表型并降低PD-1的表达。没有与130a1 G-CSF处理相关的明显毒性。

实施例56：在细胞增殖测定中，与非聚乙二醇化的版本相比，聚乙二醇化版本的G- CSF 130a1和307显示出相似的效力和选择性

进行体外细胞增殖实验以比较聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化版本的G-CSF(野生型，130a1和307)刺激表达G2R-3 134ECD或野生型人G-CSF受体的细胞的增殖的能力。

方法

在图94A中，使用类似于实施例35中的方法，将来自健康供体的PBMC的人CD4和CD8T细胞慢病毒转导以表达G2R-3 134ECD。为了评估增殖(BrdU掺入)，将T细胞在PBS中洗涤两次并在培养基中洗涤一次，然后重新铺在含有所指示细胞因子的新鲜培养基中：人IL-2(Proleukin，300IU/ml，阳性对照)、仅培养基(阴性对照)或所指示浓度(ng/ml)的野生型G-CSF、聚乙二醇化的野生型G-CSF(PEG-WT G-CSF)、130a1 G-CSF或PEG-130a1 G-CSF。将细胞培养48小时。BrdU测定程序遵循BD PharmingenTM FITC BrdU Flow试剂盒(557891)的说明书手册，有一个例外：细胞也被染色以检测G-CSFR ECD的细胞表面表达(如实施例35中所述)。使用Cytek Aurora仪器进行流式细胞术。为对G-CSFR表达呈阳性的T细胞显示BrdU掺入。

在图94B中，使用天然表达野生型人G-CSF受体并响应于野生型G-CSF增殖的人髓样细胞系OCI-AML-1进行了类似的实验(参见实施例34)。将细胞在PBS中洗涤两次并在培养基中洗涤一次，然后重新铺在含有所指示细胞因子的培养基中：人GM-CSF(20ng/ml，阳性对照)、仅培养基(阴性对照)或所指示浓度(ng/ml)的野生型G-CSF、PEG-WT G-CSF、130a1 G-CSF、PEG-130a1 G-CSF、307G-CSF或PEG-307G-CSF。将细胞培养48小时并通过流式细胞仪评估BrdU掺入。

结果

如图94A中所示，在一系列细胞因子浓度范围内，表达G2R-3 134ECD的人T细胞显示对聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化130a1 G-CSF的相似增殖响应。这些细胞还显示对聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化的野生型G-CSF的相似增殖响应；然而，响应明显弱于130a1版本的G-CSF。

如图94B中所示，人OCI-AML1髓样细胞在一定浓度范围内显示对聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化130a1 G-CSF的相似增殖响应；唯一值得注意的区别是，需要稍高浓度的聚乙二醇化130a1 G-CSF来诱导相同水平的细胞增殖。OCI-AML1细胞显示对聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化的307G-CSF的相似增殖响应。最后，OCI-AML1细胞显示对聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化的野生型G-CSF的相似增殖响应；在较低浓度下，对聚乙二醇化G-CSF的响应大于对非聚乙二醇化G-CSF的响应。OCI-AML1细胞对野生型版本的G-CSF的响应比对130a1或307版本的G-CSF的响应强得多。

因此，130a1 G-CSF的聚乙二醇化对通过G2R-3 134ECD受体诱导细胞增殖的能力具有可忽略不计的影响。此外，130a1 G-CSF或307G-CSF的聚乙二醇化对这些细胞因子对G2R-3 134ECD相对于野生型G-CSF受体的特异性具有可忽略不计的影响。

实施例57：聚乙二醇化和非聚乙二醇化版本的130a1 G-CSF在T细胞中诱导相似的生化信号传导事件

进行体外蛋白质印迹实验以比较聚乙二醇化相对于非聚乙二醇化130a1 G-CSF在表达G2R-3 134ECD的人T细胞中诱导生化信号传导事件的能力。

方法

类似于实施例39制备表达G2R-3 134ECD的人PBMC来源的T细胞，然后用以下刺激20分钟：仅培养基；人IL-2(Proleukin，300IU/ml)；或范围从1ng/ml至400ng/ml的非聚乙二醇化或聚乙二醇化版本的130a1 G-CSF。类似于实施例39，制备细胞和细胞核提取物，并且使用图95所指示的抗体进行蛋白质印迹并在前面的实施例中详细描述。

结果

如图95中所示，聚乙二醇化和非聚乙二醇化版本的130a1 G-CSF都诱导了类似于IL-2的信号传导事件，包括STAT5、STAT3、Erk-1/2、Akt和S6的磷酸化。与IL-2不同，聚乙二醇化和非聚乙二醇化的130a1G-CSF诱导JAK2的磷酸化，这是基于它们的设计预期的。聚乙二醇化的130a1 G-CSF似乎比非聚乙二醇化的130a1 G-CSF稍弱，这由1ng/ml时磷酸化事件的轻微减少所证明。

因此，聚乙二醇化和非聚乙二醇化版本的130a1 G-CSF在人T细胞中诱导相似的生化信号传导事件，并且只有微小的效力差异。

实施例58：在鼠乳腺癌模型中，用聚乙二醇化G-CSF 130a1处理选择性地增强了表达G2R-3 134 ECD的肿瘤特异性T细胞的扩增和抗肿瘤活性

在鼠乳腺癌模型中，在三个给药方案中测试了聚乙二醇化形式的变体细胞因子130a1 G-CSF增强表达G2R-3 134ECD的T细胞的扩增、表型和抗肿瘤活性的能力。

方法

我们使用与实施例36中所述类似的方法。所有小鼠接受同等剂量(5×10⁶个)的经转导的Thy1.1+OT-I细胞以表达G2R-3 134ECD。用于血液样品的流式细胞术的抗体组与实施例59中的相同。

结果

转导效率为79.8％，如在第0天通过流式细胞术对表达人G-CSFR+的Thy1.1+细胞的百分比所评估。从过继细胞转移的当天(第0天)开始，将小鼠随机分组至不同的细胞因子处理组。在“每日”组中，将小鼠随机分组以按以下方案接受媒介物、130a1 G-CSF(10mg/剂量)或聚乙二醇化(PEG)130a1 G-CSF(10mg/剂量)：每天，持续14天，然后每隔一天，持续14天。在“每三天”组中，将小鼠随机分组以接受130a1 G-CSF或聚乙二醇化130a1 G-CSF，每三天一次，共9个周期。在“每周”组，将小鼠随机分组以接受130a1 G-CSF或聚乙二醇化130a1G-CSF，每七天一次，共四个周期。

在媒介物处理组中，1/4的小鼠经历了肿瘤的完全消退(CR)并保持无肿瘤状态直到第46天，此时由于实际原因停止研究(图96A、图96B)。在“每日”130a1 G-CSF和PEG-130a1G-CSF处理组中，4/4的小鼠经历了CR。在“每三天”130a1 G-CSF和PEG-130a1 G-CSF处理组中，分别有3/4和4/4的小鼠经历了CR(图96C、图96D)。在“每周”130a1 G-CSF和PEG-130a1G-CSF处理组中，分别有3/3和4/4的小鼠经历了CR(图96E、图96F)。

通过流式细胞术在从小鼠收集的系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的扩增和持久性(图97A至图97C)。在“每日”队列中，在第4天，对于媒介物、130a1 G-CSF和PEG-130a1G-CSF处理组，Thy1.1+OT-I细胞分别达到8.85％、52.75％和43.63％(相对于所有CD8+T细胞)的平均峰值水平(图97A)。在“每三天”队列中，在第4天，对于130a1G-CSF和PEG-130a1G-CSF处理组，Thy1.1+OT-I细胞分别达到8.41％和31.13％的平均峰值水平(图97B)。在“每周”队列中，在第4天，对于130a1 G-CSF和PEG-130a1 G-CSF处理组，Thy1.1+OT-I细胞分别达到13.63％和41.93％的平均峰值水平(图97C)。

也通过流式细胞术在系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的T效应记忆(Tem，CD44+CD62L-)表型(图97D至图97F)。在“每日”队列中，在第4天，对于媒介物、130a1 G-CSF和PEG-130a1 G-CSF处理组，显示Tem表型的Thy1.1+OT-I细胞的平均百分比分别为24.50％、49.35％和74.40％(图97D)。在“每三天”队列中，在第4天，对于130a1 G-CSF和PEG-130a1 G-CSF处理组，显示Tem表型的Thy1.1+OT-I细胞的平均百分比分别为32.03％和71.53％(图97E)。在“每周”队列中，在第4天，对于130a1 G-CSF和PEG-130a1 G-CSF处理组，显示Tem表型的Thy1.1+OT-I细胞的平均百分比分别为32.33％和70.58％(图97F)。

也通过流式细胞术在一系列血液样品中评估程序性死亡-1(PD-1)分子的表达。在三个给药方案中的任一个的任何时间点，在130a1G-CSF和PEG-130a1 G-CSF处理组之间没有观察到PD-1+OT-I T细胞的百分比的显著差异(数据未示出)。

也通过流式细胞术在系列血液样品中评估T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白质3(TIM-3)分子的表达。在三个给药方案中的任一个的任何时间点，在130a1 G-CSF和PEG-130a1 G-CSF处理组之间没有观察到TIM-3+OT-I T细胞的百分比的显著差异(数据未示出)。

图98示出了来自“每三天”给药队列的系列血液样品的宿主嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、CD3+T细胞、CD19+B细胞和NK1.1+自然杀伤细胞的基于流式细胞术的评估。在任何时间点，在媒介物、130a1 G-CSF或PEG-130a1 G-CSF处理组之间没有观察到任何这些细胞类型的百分比的实质性差异。

在整个研究过程中，所有处理组的所有小鼠都保持正常体重并表现出良好的总体健康状况，尽管有些小鼠出现了肿瘤进展。

因此，在这个模型中，就抗肿瘤功效而言，PEG-130a1 G-CSF似乎至少相当于130a1G-CSF。与130a1 G-CSF相比，PEG-130a1 G-CSF在“每三天”和每周给药方案中诱导了显著更大的OT-I T细胞扩增。在所有三种给药方案中，与130a1 G-CSF相比，PEG-130a1 G-CSF诱导更大比例的OT-I T细胞采用Tem表型。不存在与用任何形式的130a1 G-CSF处理相关的明显毒性。

实施例59：模拟人T细胞中的IL-2、IL-12和IL-18信号的组合的受控旁分泌信号传导策略的体外证明

用编码间皮素特异性CAR和G12/2R的双顺反子载体或编码间皮素特异性CAR、G12/2R 134ECD和人IL-18的三顺反子载体转导来自健康供体PBMC的人CD4和CD8 T细胞。体外评估T细胞的CAR和G12/2R-1 134ECD的表达；增殖和IL-18产生。

方法

使用类似于实施例35的方法，用编码(从5’到3’的顺序)间皮素特异性CAR、T2A核糖体跳跃位点、G12/2R-1 134ECD、T2A核糖体跳跃位点和成熟形式的人IL-18(SEQ ID NO:102)的三顺反子慢病毒载体转导来自健康供体PBMC的人CD4和CD8 T细胞。对照包括未转导的T细胞和用编码间皮素特异性CAR、T2A核糖体跳跃位点和G12/2R 134ECD的双顺反子慢病毒载体转导的T细胞。将未转导的T细胞在IL-2中扩增12天；将转导的T细胞在130a1 G-CSF中扩增。在扩增后，用对G-CSFR ECD具有特异性的抗体(APC缀合)和重组Fc标记的间皮素蛋白(FITC缀合)对T细胞进行流式细胞术分析。

按照实施例60，用下列细胞因子通过BrdU掺入测定评估T细胞增殖：人IL-2(Proleukin，300IU/ml)；人IL-18(100ng/ml)；人IL-2+人IL-12(100ng/ml)；IL-2+IL-12+IL-18；或130a1 G-CSF(100ng/ml)。

通过ELISA检测人IL-18产生。将T细胞以1×10⁶个/ml铺板并在含有仅培养基、人IL-2(Proleukin，300IU/ml)+人IL-12(20ng/ml)或130a1 G-CSF(100ng/ml)的培养基中培养。48小时后收集上清液并根据制造商的说明书进行ELISA(R&D Systems，Human TotalIL-18DuoSet ELISA试剂盒，目录号DY318-05与DuoSet ELISA辅助试剂盒一起使用，目录号DY008)。使用用试剂盒提供的标准曲线确定绝对IL-18浓度。

结果

如图99A中所示，在用双顺反子载体转导的38.18％的T细胞和用三顺反子载体转导的78.40％的T细胞中观察到间皮素CAR和G12/2R 134ECD的共表达。如所预期，在未转导的T细胞中没有检测到这两种受体。

如图99B中所示，用双顺反子或三顺反子载体转导的T细胞响应于IL-2、IL-2+IL-12、IL-2+IL-12+IL-18或130a1 G-CSF增殖；或响应于培养基或仅IL-18没有观察到增殖。对于T细胞的CD4+和CD8+亚群，观察到类似的结果(数据未示出)。

如图99C中所示，人IL-18由表达三顺反子载体的T细胞产生并用130a1 G-CSF刺激。在其他条件下检测到可忽略不计的IL-18水平。

因此，在用编码G12/2R 134ECD和人IL-18的载体(在本实施例中与间皮素特异性CAR一起)转导的人T细胞中，响应于130a1 G-CSF以及各种含IL-2的细胞因子组合诱导T细胞增殖。响应于130a1G-CSF诱导IL-18的表达。

实施例60：小鼠T细胞中基于IL-18的受控旁分泌信号传导系统的体外证明

用编码G12/2R 134ECD或G12/2R 134ECD加成熟形式的鼠IL-18(m18)的逆转录病毒载体转导鼠CD4和CD8 T细胞。通过流式细胞术评估转导受体的表达。评估T细胞的增殖和鼠IL-18的产生。

方法

使用类似于实施例36的方法，从健康供体小鼠(C57Bl/6J)中分离大量CD4和CD8 T细胞，用可溶性抗CD3和抗CD28活化并在人IL-2(300IU/ml)存在下扩增4天。用编码G12/2R-1 134ECD或G12/2R-1134ECD+m18的逆转录病毒载体转导细胞。模拟转导的T细胞经历了转导方案但没有逆转录病毒。在扩增后，将细胞洗涤并在下列细胞因子条件下重新铺板：仅培养基；人IL-2(Proleukin，300IU/ml)；鼠IL-18(100ng/ml)；IL-2+mIL-12(10ng/ml)；IL-2+IL-12+18；或130a1G-CSF(100ng/ml)。48小时后通过BrdU掺入评估T细胞增殖。为了评估IL-18产生，洗涤转导的T细胞并以2×10⁶个细胞/ml的密度铺在以下中48小时：仅培养基；人IL-2(300IU/ml)+鼠IL-12(10ng/ml)；或130a1 G-CSF(100ng/ml)。通过ELISA(R&DSystems，小鼠IL-18ELISA试剂盒，目录号7625)检测细胞培养上清液中的小鼠IL-18。

结果

如图100A中所示，在所有转导的T细胞群体中检测到人G-CSFR ECD的表达，从而指示转导成功。与其本身相比，G12/2R 134ECD在IL-18CPS的情形中的表达较低；这似乎反映了这种逆转录病毒载体的技术问题，因为在用等价的慢病毒载体转导的人T细胞中没有观察到这个问题(参见实施例57)。

如图100B中所示，用G12/2R 134ECD或G12/2R 134ECD+m18转导的T细胞响应于IL-2、IL-2+IL-12、IL-2+IL-12+IL-18或130a1G-CSF增殖。

如图100C中所示，鼠IL-18由用G12/2R 134ECD+m18转导并用IL-2+IL-12或130a1G-CSF刺激的T细胞产生。

因此，在用G12/2R 134ECD+m18转导的鼠T细胞中，用130a1G-CSF刺激诱导增殖和鼠IL-18分泌。

实施例61：通过工程化受体和IL-18CPS刺激的鼠T细胞的体外细胞因子分泌特征

用编码G2R-2、G2R-3、G12/2R-1或G12/2R-1+m18(都具有134ECD)的逆转录病毒载体转导OT-I T细胞。通过流式细胞术评估转导受体的表达。用多重基于珠粒的测定评估IL-18和32种其他细胞因子的表达。

方法

使用类似于实施例36的方法，用编码G2R-2、G2R-3、G12/2R-1或G12/2R-1+m18(都具有134ECD)的逆转录病毒载体转导来自健康供体小鼠的OT-I T细胞。五天后，用对G-CSFRECD具有特异性的抗体对T细胞进行流式细胞术分析。为了检测分泌的细胞因子，用PBS洗涤T细胞三次并在48孔板中在不补充任何物质(仅培养基，阴性对照)、补充有人IL-2(Proleukin 300IU/ml)、人IL-2+鼠IL-12(10ng/ml)或PEG-130a1 G-CSF(100ng/ml)的组织培养基中以2×10⁶个细胞/ml培养。48小时后，收获培养物上清液并在-80℃下冷冻。上清液被运送到Eve Technologies(Calgary,Alberta,Canada)并进行基于珠粒的多重细胞因子测定(小鼠细胞因子/趋化因子31-Plex Discovery阵列，MD31)和IL-18检测测定(小鼠IL-18Single Plex Discovery/>阵列，MDIL18)。

结果

图101的上图显示了鼠IL-18产生的结果。只有表达G12/2R 134ECD+m18的T细胞产生可检测水平的鼠IL-18。通过用IL-2+IL-12或PEG-130a1 G-CSF刺激，这些细胞对鼠IL-18的表达增加。

如表35中所示，IL-2或IL-2+IL-12诱导了下列细胞因子的表达：GM-CSF、TNF-α、IL-10和VEGF。IL-2+IL-12另外诱导IFN-γ的表达(表35和图101的下图)。在表达G12/2R134ECD+m18的T细胞中，IL-2+IL-12还诱导了IP-10的表达并增加了IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的表达(表35)。

在表达G2R-2 134ECD、G2R-3 134ECD或G12/2R-1 134ECD(不具有IL-18CPS)的T细胞中，PEG-130a1 G-CSF诱导下列细胞因子的表达：GM-CSF、TNF-α、IL-10和VEGF。在表达G12/2R-1 134ECD+m18的T细胞中，PEG-130a1 G-CSF另外诱导IFN-γ和IP-10的表达并增加GM-CSF、TNF-α和IL-10的表达(表35)。

因此，响应于PEG-130a1 G-CSF，G2R-2和G2R-3诱导了类似于IL-2诱导的细胞因子分泌模式。在表达G2/12R 134ECD+m18的细胞中，用IL-2+IL-12或PEG-130a1 G-CSF刺激诱导IL-18产生增加，并且用PEG-130a1 G-CSF刺激诱导类似于IL-2+IL-12诱导的细胞因子分泌模式。

实施例62：模拟IL-2、IL-12和IL-18信号的组合的受控旁分泌信号传导策略导致鼠乳腺癌模型中抗肿瘤活性增强

使用NOP 23乳腺肿瘤模型，评估用编码G12/2R-1 134ECD+m18的逆转录病毒载体工程化的OT-I T细胞的体内扩增、效应子表型和抗肿瘤活性。为了比较，其他组的小鼠接受表达G7R-1、G2R-2或G12/2R-1的OT-I T细胞(都具有134ECD)。

方法

我们使用与实施例36中所述类似的方法。将Thy1.1+OT-I细胞逆转录病毒转导以表达G7R-1、G2R-2、G12/2R-1或G12/2R-1+m18(都具有134ECD)。用于血液样品的流式细胞术的抗体组类似于实施例59中的抗体组。

结果

如图102A-D中所示，在过继细胞转移的当天(第0天)，转导的OT-I T细胞表达G7R、G2R-2或G12/2R-1(都具有134ECD)，如使用抗人G-CSFR的抗体所检测。与其本身相比，G12/2R-1 134ECD在IL-18CPS的情形中的表达较低；这似乎反映了这种逆转录病毒载体的技术问题，因为在用等价的慢病毒载体转导的人T细胞中没有观察到这个问题(参见实施例59)。

所有小鼠接受同等剂量(2.5×10⁶个)的转导Thy1.1+OT-I细胞。在过继细胞转移(第0天)后，每七天将小鼠随机分组以接受媒介物或PEG-130a1 G-CSF(10mg/剂量)，持续四个周期。

在G7R-1队列中，与PEG-130a1 G-CSF处理组中的2/4 4小鼠相比，接受仅媒介物的2/4小鼠经历了其肿瘤的完全消退(CR)(图102E)。在G2R-2队列中，与PEG-130a1 G-CSF处理组中的3/4小鼠相比，接受仅媒介物的1/5小鼠经历了其肿瘤的完全消退(CR)(图102F)。在G12/2R-1队列中，与PEG-130a1 G-CSF处理组中的3/4小鼠相比，接受仅媒介物的1/4小鼠经历了CR，尽管后一组动物中的一只在约35天后经历了肿瘤复发(图102G)。在G12/2R-1+m18队列中，与PEG-130a1 G-CSF处理组中的4/4小鼠相比，接受仅媒介物的3/4小鼠经历了CR(图102H)。在所有队列中，经历持久CR的小鼠保持无瘤状态直到第53天，此时研究因实际原因停止。

通过流式细胞术在从小鼠收集的系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的扩增和持久性。在G7R队列中，在第4天，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，Thy1.1+OT-I细胞分别达到1.99％和15.31％的平均峰值水平(相对于所有CD8+T细胞)(图102I)。在G2R-2队列中，在第4天，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，Thy1.1+OT-I细胞分别达到1.21％和13.78％的平均峰值水平(图102J)。在G12/2R-1队列中，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，Thy1.1+OT-I细胞分别达到2.18％和11.63％的平均峰值水平(图102K)。在G12/2R-1+m18队列中，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，Thy1.1+OT-I细胞分别达到2.35％和6.21％的平均峰值水平(图102L)。

也通过流式细胞术在系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的T效应记忆(Tem，CD44+CD62L-)表型。在G7R队列中，在第4天，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，显示Tem表型的Thy1.1+OT-I细胞的平均百分比分别为17.75％和34.65％(图102M)。在G2R-2队列中，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，这些值分别为15.12％和57.85％(图102N)。在G12/2R-1队列中，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，这些值分别为14.78％和48.80％(图102O)。在G12/2R/18C队列中，对于媒介物和PEG-130a1 G-CSF处理组，这些值分别为42.03％和57.55％(图102P)。

因此，响应于聚乙二醇化130a1 G-CSF的OT-I体内扩增和效应子分化的程度受到受体胞内结构域和CPS细胞因子的影响。G12/2R-1+m18在这个模型中显示出最强的抗肿瘤功效。

实施例63：在小鼠乳腺癌模型中，PEG-130a1 G-CSF与IL-2相比的体内剂量反应特性

使用NOP23乳腺肿瘤模型，评估表达G2R-3 134ECD的OT-I T细胞响应于不同剂量的PEG-130a1 G-CSF或人IL-2(Proleukin)的体内扩增和效应子表型。还评估了这些细胞因子对外周血中嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数的影响。

方法

我们使用与实施例36中所述类似的方法。逆转录病毒转导Thy1.1+OT-I细胞以表达G2R-3 134ECD。所有小鼠接受2.5×10⁶个OT-I T细胞的剂量。在过继细胞转移的当天(第0天)，将小鼠随机分组六个细胞因子处理组：(1)仅媒介物；(2)PEG-130a1 G-CSF 2mg/剂量，每周四次剂量；(3)PEG-130a1 G-CSF 0.4mg/剂量，每周四次剂量；(4)PEG-130a1 G-CSF0.08mg/剂量，每周四次剂量；(5)PEG-130a1 G-CSF，0.1mg的每日四次剂量，随后0.4mG的每周三次剂量；或(6)人IL-2(Proleukin)，30,000IU/天，持续14天，然后每两天30,000IU，持续14天。用于血液样品流式细胞术的抗体组类似于实施例55中使用的抗体组。

结果

通过流式细胞术在从小鼠收集的系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的扩增和持久性。图103A-E显示了不同细胞因子处理组在第4天Thy1.1+OT-I细胞(相对于所有CD8+T细胞)的平均峰值百分比：仅媒介物组＝0.70％(显示在每个图中)；(A)2mg PEG-130a1G-CSF组＝9.38％(B)0.4mg PEG-130a1 G-CSF组＝4.09％；(C)0.08mg PEG-130a1 G-CSF组＝1.50％；(D)0.1，然后0.4mg PEG-130a1G-CSF组＝18.80％；(E)人IL-2组＝4.56％。

也通过流式细胞术在系列血液样品中监测Thy1.1+OT-I细胞的T效应记忆(Tem，CD44+CD62L-)表型。图103F-J显示了在第4天表现Tem表型的Thy1.1+OT-I细胞的平均百分比：媒介物组＝27.05％(显示在每个图中)；(A)2mg PEG-130a1 G-CSF组＝66.38％；(B)0.4mg PEG-130a1 G-CSF组＝74.80％；(C)0.08mg PEG-130a1 G-CSF组＝33.03％；(D)0.1，然后0.4mg PEG-130a1 G-CSF组＝74.90％；(E)人IL-2组＝64.30％。

在各个时间点，所有细胞因子处理组与媒介物组相比显示相似的嗜中性粒细胞水平(图103K至图103O)。

在各个时间点上，所有细胞因子处理组与媒介物组相比显示出相似的嗜酸性粒细胞水平(图103P至图103S)，但IL-2处理组除外，其在第8天和第12天显示出嗜酸性粒细胞的增加(图103T)。

在整个研究中，所有处理组中的所有小鼠都保持正常体重，并且表现出良好的总体健康状况，只有一个例外：IL-2处理组中的一只小鼠在第19天死亡，可能是由于IL-2相关的毒性。

因此，外周血中OT-I T细胞体内扩增和效应细胞分化的程度受聚乙二醇化130a1G-CSF的剂量的影响。聚乙二醇化130a1 G-CSF和IL-2诱导血液中相似的OT-I T细胞扩增和分化。在评估的剂量下，两种细胞因子对血液中的嗜中性粒细胞水平都没有显著影响。IL-2独特地诱导嗜酸性粒细胞增多，并且可能导致一例治疗相关死亡。

尽管本发明已参考优选实施方案和各种替代性实施方案进行特定显示和描述，但相关领域技术人员将了解可在不脱离本发明的精神和范围下在其中进行各种形式和细节变化。

在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请都据此出于所有目的以引用的方式整体在此并入。

参考文献：

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Yang，T.，Martin，M.L.，Nielsen，J S.，Milne，K.，Wall，E.M.，Lin，W.，Watson，P.H.，&Nelson，B.H.(2009).Mammary tumors with diverse immunological phenotypesshow differing sensitivity to adoptively transferred CD8+T cells lacking theCbl-b gene.Cancer Immunology，Immunotherapy，58(11)，1865-1875.

表12：G-CSFR_WT-ICD_{gp130-IL-2Rβ}的序列

表13：G-CSFR_WT-ICD_IL-2Rβ的序列

表14：G-CSFR_WT-ICD_γc的序列

表15A：嵌合细胞因子受体

表15B：嵌合细胞因子受体

表16：细胞因子受体ICD上的框1和其他结合位点

表17：信号肽

表18：野生型G-CSFR胞外结构域(ECD)：

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表19：跨膜结构域(TM)

表20：胞内结构域(ICD)

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表21：重组人G-CSF细胞因子的WT和变体形式以及设计用于提高稳定性的130a1SEQ ID NO.83-1至83-5的变型的蛋白质序列。

表22：人G-CSF受体胞外结构域和跨膜结构域和信号肽的WT和变体形式的蛋白质序列

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表23：胞内结构域(ICD)

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表24：嵌合细胞因子受体的结构域组成

表25：G-CSF和G-CSFR变体中的突变

表26：人细胞因子受体的蛋白质序列

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表27：ICD衔接蛋白结合位点。

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表28：工程化T细胞受体(eTCR)的实例

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表29：嵌合抗原受体(CAR)的实例

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表30：细胞因子、趋化因子和其他信号传导蛋白：

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表32：人IL-7Rα胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域和信号肽的蛋白质序列

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表33：胞内结构域(ICD)。ICD由以下中的一者组成：

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表34：嵌合细胞因子受体的结构域组成

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表35：在用编码嵌合细胞因子受体的逆转录病毒载体转导的鼠OT-I T细胞中受控的旁分泌信号传导和分泌细胞因子的检测

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Claims

1.一种变体粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其中

所述变体G-CSF包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合；其中所述位点II界面区中的所述至少一个突变包括以下中的至少一种：L108R、D112R、E122R、E122K、E123K和E123R及它们的组合；其中所述位点II界面区突变相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置；其中

所述位点III界面区中的所述至少一个突变包括相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R；并且其中

所述变体G-CSF选择性地与包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)的受体结合。

2.一种用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：

(a)对应于SEQ ID NO:83或84的变体G-CSF；和

(b)包含G-CSFR的变体ECD的受体；其中

与其他方面相同的野生型G-CSFR ECD相比，所述变体G-CSF优先结合包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体，并且与其他方面相同的野生型G-CSF相比，包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体优先结合所述变体G-CSF；并且其中所述变体G-CSFR包含G2R-3或G12/2R-1。

3.如权利要求1所述的变体G-CSF，其中所述变体G-CSF结合由细胞表达的包含G-CSFR的变体ECD的受体。

4.如权利要求3所述的变体G-CSF，其中表达包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体的所述细胞是免疫细胞。

5.如权利要求4所述的变体G-CSF，其中表达包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体的所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

6.如权利要求5所述的变体G-CSF，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD8+T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

7.如权利要求1至6中任一项所述的变体G-CSF，其中

所述变体G-CSF与包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体的选择性结合引起细胞反应，所述细胞反应包括表达所述受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种及它们的组合。

8.如上述权利要求中任一项所述的变体G-CSF，其中包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。

9.如上述权利要求中任一项所述的变体G-CSF，其中包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体包含所述G-CSFR ECD的所述位点II界面区中的至少一个突变，所述突变包括R141E或R167D突变中的一者或两者；其中

所述G-CSFR ECD的所述位点III界面区中的所述至少一个突变包括R41E突变；并且其中

所述变体G-CSFR突变对应于SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸位置。

10.如上述权利要求中任一项所述的变体G-CSF，其中包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体是嵌合受体。

11.如上述权利要求中任一项所述的变体G-CSF，其中所述G-CSF经化学修饰。

12.如权利要求11所述的变体G-CSF，其中所述化学修饰包括聚乙二醇化。

13.如权利要求12所述的变体G-CSF，其中所述G-CSF在所述G-CSF的N末端或C末端处被聚乙二醇化。

14.一种或多种核酸序列，其编码权利要求1至6或10至12中任一项所述的变体G-CSF。

15.一种或多种表达载体，其包含权利要求10所述的核酸序列。

16.一种细胞，其被工程化以表达权利要求1至6或10至12中任一项所述的变体G-CSF。

17.如权利要求12所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。

18.如权利要求13所述的细胞，其中所述免疫细胞是

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

19.如权利要求14所述的细胞，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、细胞毒性CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

20.一种用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：

(a)权利要求1至6或10至12中任一项所述的变体G-CSF；和

(b)包含G-CSFR的变体ECD的受体；其中

与其他方面相同的野生型G-CSFR ECD相比，所述变体G-CSF优先结合包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体，并且与其他方面相同的野生型G-CSF相比，包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体优先结合所述变体G-CSF。

21.如权利要求16所述的系统，其中所述变体G-CSF包含表4A中的G-CSF变体编号的位点II和位点III界面的突变的组合；其中所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1中所示的序列的氨基酸位置。

22.如权利要求17所述的系统，其中所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R、E122R和E123R；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。

23.如权利要求17所述的系统，其中所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E122K；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。

24.如权利要求17所述的系统，其中所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E123K；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。

25.如权利要求17所述的系统，其中所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E122R；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。

26.如权利要求17所述的系统，其中所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R和E123R；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。

27.如权利要求17所述的系统，其中所述变体G-CSF包含相对于SEQ ID NO.1中所示的序列的对应氨基酸位置的突变E46R、L108K、D112R、E122K和E123K；并且其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体包含相对于SEQ ID NO.2中所示的序列的对应氨基酸位置的突变R41E、R141E和R167D。

28.如权利要求20至27中任一项所述的系统，其中所述变体G-CSF经化学修饰。

29.如权利要求28所述的系统，其中所述变体G-CSF的所述化学修饰包括聚乙二醇化。

30.如权利要求29所述的系统，其中所述变体G-CSF在所述G-CSF的N末端或C末端处被聚乙二醇化。

31.如权利要求16至30中任一项所述的系统，其还包含一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

32.如权利要求16至31中任一项所述的系统，其还包含一种或多种抗原结合信号传导受体。

33.如权利要求32所述的系统，其中所述一种或多种抗原结合信号传导受体包括至少一种选自由以下组成的组的受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

34.如权利要求33所述的系统，其中所述抗原结合信号传导受体包括一种或多种CAR；并且任选地，所述CAR是间皮素CAR。

35.如权利要求31所述的系统，其中所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。

36.如权利要求35所述的系统，其中所述细胞因子是IL-18。

37.如权利要求35或36所述的系统，其中所述细胞因子是人的。

38.一种选择性活化在细胞表面上表达的受体的方法，其包括使包含G-CSFR的变体ECD的受体与权利要求1至6或10至12的变体G-CSF接触。

39.如权利要求38所述的方法，其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体在免疫细胞上表达，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、细胞毒性CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

41.如权利要求39所述的方法，其中所述免疫细胞的所述选择性活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达所述受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种。

42.一种增强有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括：

向所述受试者施用表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞，并且施用或提供权利要求1至6或10至12中任一项所述的变体G-CSF。

43.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括：

44.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法用于治疗癌症。

45.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法用于治疗炎症性病症。

46.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法用于治疗自身免疫性疾病。

47.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法用于治疗退行性疾病。

48.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。

49.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法用于预防或治疗移植排斥。

50.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法用于治疗传染性疾病。

51.如权利要求42或43所述的方法；其还包括施用或提供一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

52.如权利要求42至51中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用两种或更多种各自表达以下中的一者或两者细胞群体：(i)包含G-CSFR ECD的不同的嵌合受体或(ii)G-CSF的至少一种不同的变体形式。

53.如权利要求42所述的方法，其中至少一种细胞群体还表达至少一种不同的抗原结合信号传导受体；并且任选地，其中所述至少一种不同的抗原结合信号传导受体包括至少一种CAR。

54.如权利要求52所述的方法，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下中的一者或两者：

(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和

(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

55.如权利要求52至54中任一项所述的方法，其还包含一种或多种额外的免疫细胞群体；其中每种额外的免疫细胞群表达以下中的至少一种：(i)包含G-CSFR的不同变体ECD的不同受体，(ii)不同的变体G-CSF，(iii)不同的激动或拮抗信号传导蛋白和(iv)不同的抗原结合信号传导受体。

56.如权利要求42至55中任一项所述的方法，其中表达包含G-CSFR的变体ECD的至少一种受体的所述细胞还表达至少一种抗原结合信号传导受体。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述抗原结合信号传导受体包括至少一种选自由以下组成的组的受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述抗原结合信号传导受体包括CAR。

59.如权利要求55所述的方法，其中所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞因子是IL-18。

61.如权利要求61或62所述的方法，其中所述细胞因子是人的。

62.一种治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括:

i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用编码包含G-CSFR的变体ECD的受体的核酸序列转导或转染所述免疫细胞；(iii)向所述受试者施用来自(ii)的所述免疫细胞；和(iv)使所述免疫细胞与选择性结合所述受体的权利要求1至6或10至12所述的变体G-CSF接触。

63.如权利要求62所述的方法，其中在向所述受试者施用所述细胞之前所述受试者已经历免疫耗竭治疗。

64.如权利要求62所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从将施用所述细胞的所述受试者分离的。

65.如权利要求62所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从不同于将施用所述细胞的所述受试者的受试者分离的。

66.如权利要求62所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从来源于施用所述细胞的所述受试者或来源于不同于施用所述细胞的所述受试者的受试者的细胞产生的，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。

67.如权利要求62所述的方法，其中在向所述受试者施用所述细胞之前，使所述免疫细胞在体外与所述变体G-CSF接触。

68.如权利要求62所述的方法，其中使所述免疫细胞与结合所述受体的所述变体G-CSF接触足够长的时间以活化来自所述受体的信号传导。

69.一种试剂盒，其包括：

编码包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞和使用说明书；并且其中

所述试剂盒包括权利要求1至6或10至12所述的变体G-CSF；并且任选地，其中所述细胞是免疫细胞。

70.一种试剂盒，其包括：

(a)编码包含G-CSFR的变体ECD的受体的一种或多种核酸序列；

(b)权利要求1至6或10至12中任一项所述的变体G-CSF、权利要求7所述的核酸序列或权利要求11所述的一种或多种表达载体；和

(c)使用说明书。

71.如权利要求70所述的试剂盒，其还包括编码一种或多种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。

72.如权利要求70所述的试剂盒，其还包括编码至少一种抗原结合受体的一种或多种表达载体。

73.如权利要求70或72所述的试剂盒，其中所述至少一种抗原结合受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

74.如权利要求73所述的试剂盒，其还包括编码嵌合抗原受体的一种或多种表达载体。

75.如权利要求69所述的试剂盒，其中所述细胞还包含一种或多种表达载体，所述表达载体编码至少一种细胞因子或趋化因子，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL19、受体NKG2D及它们的组合。

76.如权利要求69或75所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种抗原结合信号传导受体的一种或多种表达载体。

77.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

78.如权利要求77所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种CAR的一种或多种表达载体，并且任选地，所述CAR为间皮素CAR。

79.一种嵌合受体，其包含：

(a)胞外结构域(ECD)，其可操作地连接至至少一个第二结构域；所述第二结构域包括：

(b)胞内结构域(ICD)，其包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点；其中

所述至少一个信号传导分子结合位点选自由以下组成的组：白介素(IL)-2Rβ的SHC结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点、IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点、IL-4Rα的STAT6结合位点、gp130的SHP-2结合位点、gp130的STAT3结合位点、EPOR的SHP-1或SHP-2结合位点、红细胞生成素受体(EPOR)的STAT5结合位点、干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的STAT1或STAT2结合位点和干扰素γ受体1(IFNγR1)的STAT1结合位点或它们的组合；其中

所述ICD还包含选自由以下组成的组的至少一种蛋白质的至少一个框1区和至少一个框2区：G-CSFR、gp130、EPOR和干扰素γ受体2(IFNγR2)或它们的组合；和

(c)至少一个第三结构域，其包括跨膜结构域(TMD)；其中

所述ECD在所述TMD的N末端，并且所述TMD在所述ICD的N末端。

80.一种嵌合受体，其包含：

可操作地连接至第二结构域的ECD；所述第二结构域包括ICD，其中所述ICD包含：

(i)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(ii)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iii)

(a)红细胞生成素受体(EPOR)的框1区和框2区；

(b)EPOR的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iv)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(v)

(a)干扰素γ受体2(IFNγR2)的框1区和框2区；

(b)干扰素γ受体1(IFNγR1)的至少一个信号传导分子结合位点；其中

所述ECD在所述TMD的N末端，并且所述TMD在所述ICD的N末端。

81.如权利要求79或80所述的嵌合受体，其中所述ECD为G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的ECD，任选地其中G-CSFR的所述ECD包括权利要求2至10中任一项所述的G-CSFR的所述ECD。

82.如权利要求79至81中任一项所述的嵌合受体，其中所述TMD为G-CSFR的TMD，并且任选地，所述TMD为野生型TMD。

83.如权利要求79至82所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体的活化形式形成同二聚体，并且任选地，

所述嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达所述受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种，并且任选地，所述嵌合受体在与G-CSF接触时被活化，并且任选地，

所述G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，

所述G-CSFR的所述胞外结构域是野生型胞外结构域。

84.如权利要求79至81所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体在细胞中表达，并且任选地，在免疫细胞中表达，并且任选地所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

85.如权利要求84所述的嵌合受体，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

86.如上述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述ICD包含：

(a)SEQ ID NO.90或91中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(b)SEQ ID NO.90或92中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(c)SEQ ID NO.93的氨基酸序列；或者

(d)SEQ ID NO.94的氨基酸序列；或者

(e)SEQ ID NO.95或96中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(f)SEQ ID NO.97或98的氨基酸序列；或者

(g)SEQ ID NO.99或100的氨基酸序列。

87.如上述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述跨膜结构域包含SEQ IDNO.88中所示的序列。

88.一种用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：

(a)权利要求1至6或10至12中任一项所述的变体G-CSF；和

(b)权利要求79至87中任一项所述的包含G-CSFR的变体ECD的受体；其中

89.一种或多种核酸序列，其编码上述权利要求任一项所述的嵌合受体。

90.如权利要求89所述的核酸序列，其中所述G-CSFR的所述ECD由SEQ ID NO.85、86或87中的任一者中所示的核酸序列编码。

91.一种或多种表达载体，其包含权利要求89或90所述的核酸序列。

92.如权利要求91所述的表达载体，其中所述载体选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和质粒。

93.编码嵌合受体的一种或多种核酸序列；其中所述嵌合受体包含：

可操作地连接至第二结构域的ECD；所述第二结构域包含：

(i)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(ii)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iii)

(a)红细胞生成素受体(EPOR)的框1区和框2区；

(b)EPOR的至少一个信号传导分子结合位点；或者

(iv)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(v)

(a)干扰素γ受体2(IFNγR2)的框1区和框2区；

(b)干扰素γ受体1(IFNγR1)的至少一个信号传导分子结合位点。

94.如权利要求93所述的核酸，其中，所述ECD是G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的ECD。

95.如权利要求93或94所述的核酸，其中所述TMD是G-CSFR的TMD，并且任选地，所述TMD是野生型TMD。

96.如权利要求94或95所述的核酸序列，其中所述G-CSFR的所述ECD由SEQ ID NO.85、86或87中的任一者中所示的核酸序列编码。

97.如权利要求93至96中任一项所述的核酸序列，其包含：

(a)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.90或91中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(b)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.90或92中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(c)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.93的氨基酸序列；或者

(d)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.94的氨基酸序列；或者

(e)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.95或96中的一者或两者的氨基酸序列；或者

(f)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.97或98的氨基酸序列；或者

(g)编码ICD的序列，所述ICD包含SEQ ID NO.99或100的氨基酸序列。

98.一种或多种表达载体，其包含如权利要求93至97中任一项所述的核酸序列。

99.如权利要求98所述的表达载体，其中所述载体选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和质粒。

100.一种细胞，其包含编码权利要求79至87中任一项所述的嵌合受体的核酸序列。

101.如权利要求100所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

102.如权利要求101所述的细胞，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

103.一种细胞，其包含权利要求93至97中任一项所述的核酸序列。

104.一种细胞，其包含权利要求98或99所述的表达载体。

105.一种选择性活化在细胞表面上表达的嵌合受体的方法，其包括使权利要求79至87中任一项所述的嵌合受体与选择性结合所述嵌合受体的细胞因子接触。

106.如权利要求105所述的方法，其中所述嵌合受体的活化形式形成同二聚体，并且任选地，

所述嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达所述受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种，并且任选地，所述嵌合受体在与所述细胞因子接触时被活化。

107.如权利要求105或106所述的方法，其中选择性结合所述嵌合受体的所述细胞因子是G-CSF，并且任选地，所述嵌合受体在与G-CSF接触时被活化，并且任选地，

所述G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，

所述G-CSFR的所述胞外结构域是野生型胞外结构域。

108.如权利要求105至107中任一项所述的方法，其中所述嵌合受体在细胞中表达，并且任选地，

在免疫细胞中表达，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

109.如权利要求108所述的方法，其中第一免疫细胞群体表达所述嵌合受体，并且第二免疫细胞群体表达结合所述嵌合受体的细胞因子；任选地，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达至少一种不同的抗原结合信号传导受体；并且任选地，其中所述至少一种不同的抗原结合信号传导受体包括至少一种CAR。

110.如权利要求109所述的方法，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下中的一者或两者：

(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

111.如权利要求109或110所述的方法，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体各自表达包含G-CSFR的不同变体ECD的不同的嵌合受体和不同的变体G-CSF。

112.如权利要求109至111中任一项所述的方法，其还包含一种或多种额外的免疫细胞群体；其中每种额外的免疫细胞群表达以下中的至少一种：(i)包含G-CSFR的不同变体ECD的不同受体，(ii)不同的变体G-CSF，(iii)不同的激动或拮抗信号传导蛋白和(iv)不同的抗原结合信号传导受体。

113.一种在细胞中产生嵌合受体的方法，其包括：

向所述细胞中引入权利要求89、90或93至97中任一项所述的核酸序列或权利要求91、92、98或99中任一项所述的表达载体；并且任选地，所述方法包括基因编辑；并且任选地，

所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

114.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括：

向所述受试者施用表达权利要求79至87中任一项所述的嵌合受体的细胞，并且向所述受试者提供特异性结合所述嵌合受体的细胞因子。

115.如权利要求114所述的方法，其中所述嵌合受体的活化形式形成同二聚体；并且任选地，

116.如权利要求114或115所述的方法，其中所述细胞因子是G-CSF；并且任选地，

所述G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，

所述G-CSFR的所述胞外结构域是野生型胞外结构域。

117.如权利要求114至116中任一项所述的方法，其中

所述嵌合受体在细胞中表达，并且任选地，

在免疫细胞中表达，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

118.如权利要求106至117中任一项所述的方法；其还包括施用或提供至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

119.如权利要求114至118中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用两种或更多种各自表达不同的嵌合受体且各自表达细胞因子的不同变体形式的细胞群体。

120.如权利要求114至119中任一项所述的方法，其中表达所述嵌合受体的所述细胞还表达至少一种抗原结合信号传导受体。

121.如权利要求120所述的方法，其中所述抗原结合信号传导受体包括至少一种选自由以下组成的组的受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

122.如权利要求121所述的方法，其中所述抗原结合信号传导受体是CAR。

123.如权利要求118的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，及它们的组合。

124.如权利要求123所述的方法，其中所述细胞因子是IL-18。

125.如权利要求123或124所述的方法，其中所述细胞因子是人的。

126.如权利要求114至125中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗癌症。

127.如权利要求114至125中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗自身免疫性疾病。

128.如权利要求114至125中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗炎症性病症。

129.如权利要求114至125中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗退行性疾病。

130.如权利要求114至125中任一项所述的方法，其中所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。

131.如权利要求114至125中任一项所述的方法，其中所述方法用于预防或治疗同种异体移植排斥。

132.如权利要求114所述的方法，其中所述方法包括：

i)分离含免疫细胞的样品；(ii)向所述免疫细胞引入编码所述嵌合细胞因子受体的核酸序列；(iii)向所述受试者施用来自(ii)的所述免疫细胞；以及(iv)使所述免疫细胞与结合所述嵌合受体的所述细胞因子接触。

133.如权利要求132所述的方法；其中在向所述受试者施用或输注所述细胞之前所述受试者已经历免疫耗竭治疗。

134.如权利要求132所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从将施用所述细胞的受试者分离的。

135.如权利要求132所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从不同于将施用所述细胞的所述受试者的受试者分离的。

136.如权利要求132中任一项所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从来源于将施用所述细胞的受试者或来源于不同于将施用所述细胞的所述受试者的受试者的细胞产生的，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。

137.如权利要求132所述的方法，其中在向所述受试者施用或输注所述细胞之前使所述免疫细胞在体外与所述细胞因子接触。

138.如权利要求132所述的方法，其中使所述免疫细胞与所述细胞因子接触足够长的时间以活化来自所述嵌合受体的信号传导。

139.如权利要求132至138中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是G-CSF；并且任选地，

所述G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，

所述G-CSFR的所述胞外结构域是野生型胞外结构域。

140.一种试剂盒，其包括：

编码权利要求79至87中任一项所述的一种或多种嵌合受体的细胞，

并且任选地，所述细胞是免疫细胞；以及

使用说明书；

并且任选地，所述试剂盒包括结合所述嵌合受体的至少一种细胞因子。

141.一种试剂盒，其包括：

编码权利要求79至87中任一项所述的一种或多种嵌合受体的至少一种表达载体和使用说明书；

142.如权利要求141所述的试剂盒，其还包括编码一种或多种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，及它们的组合。

143.如权利要求141或142所述的试剂盒，其还包括编码至少一种抗原结合受体的一种或多种表达载体。

144.如权利要求142所述的试剂盒，其中所述至少一种抗原结合受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

145.如权利要求144所述的试剂盒，其还包括编码至少一种CAR的表达载体，并且任选地，其中所述CAR为间皮素CAR。

146.如权利要求140所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白的一种或多种表达载体；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

147.如权利要求140所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，及它们的组合。

148.如权利要求142中任一项所述的试剂盒，其还包括编码至少一种额外激动或拮抗信号传导蛋白的一种或多种表达载体；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

149.如权利要求148所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CD40配体、B细胞活化因子(BAFF)、Flt3配体、CCL21、CCL5、XCL1或CCL19，或受体NKG2D，及它们的组合。

150.如权利要求140、146或147中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种抗原结合信号传导受体的一种或多种表达载体。

151.如权利要求150所述的试剂盒，其中所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

152.如权利要求140、146、147、150或151中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种CAR的一种或多种表达载体，并且任选地，其中所述CAR为间皮素CAR。

153.如权利要求140、146、147、150或151中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码权利要求79至87中任一项所述的一种或多种不同嵌合受体的一种或多种表达载体。

154.如权利要求141至145、148或149中任一项所述的试剂盒，其还包括编码权利要求79至87中任一项所述的一种或多种不同嵌合受体的一种或多种表达载体。

155.一种用于选择性活化细胞的系统，所述系统包含：

(i)包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)的受体；和

(ii)选择性结合(i)的所述受体的变体G-CSF；和以下中的一或两者：

(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；

和

(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

156.如权利要求155所述的系统，其中所述变体G-CSF包括权利要求1至6或10至12中的任一者。

157.如权利要求155或156所述的系统，其中所述受体包含权利要求79至87中任一项所述的G-CSFR的变体ECD。

158.如权利要求155中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述至少一种额外的细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一种：白介素(IL)-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)和CCL19，和受体NKG2D，及它们的组合。

159.如权利要求158所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述至少一种额外的细胞因子包括IL-18。

160.如权利要求155至159中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

所述抗原结合信号传导受体包括以下中的至少一种：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

161.如权利要求160所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述抗原结合信号传导受体包括CAR；并且任选地，其中所述CAR是间皮素CAR。

162.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统；其中G-CSFR的所述变体ECD包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。

163.如权利要求162所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

所述位点II界面区中的所述至少一个突变位于所述G-CSFR ECD的选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸位置141、167、168、171、172、173、174、197、199、200、202和288。

164.如权利要求162所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述G-CSFR ECD的所述位点II界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2中所示的序列的R141E、R167D、K168D、K168E、L171E、L172E、Y173K、Q174E、D197K、D197R、M199D、D200K、D200R、V202D、R288D和R288E。

165.如权利要求162所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

所述G-CSFR ECD的所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸2-308的氨基酸位置30、41、73、75、79、86、87、88、89、91和93。

166.如权利要求162所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

所述G-CSFR ECD的所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2中所示的序列的S30D、R41E、Q73W、F75KF、S79D、L86D、Q87D、I88E、L89A、Q91D、Q91K和E93K。

167.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述G-CSFRECD包含表4中所示的设计编号的多个突变的组合；其中所述突变对应于SEQ ID NO.2中所示的序列的氨基酸位置。

168.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述G-CSFRECD包含以下突变：SEQ ID NO.2中所示的序列的R41E、R141E和R167D。

169.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中包含G-CSFR的变体ECD的所述受体是嵌合受体。

170.如权利要求169所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

所述嵌合受体可操作地连接至至少一个第二结构域；所述第二结构域包含来自一种或多种细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一个信号传导分子结合位点；其中所述至少一个信号传导分子结合位点选自由以下组成的组：

G-CSFR的STAT3结合位点、糖蛋白130(gp130)的STAT3结合位点、gp130的SHP-2结合位点、IL-2Rβ的SHC结合位点、IL-2Rβ的STAT5结合位点、IL-2Rβ的STAT3结合位点、IL-2Rβ的STAT1结合位点、IL-7Rα的STAT5结合位点、IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点、IL-12Rβ₂的STAT4结合位点、IL-12Rβ₂的STAT5结合位点、IL-12Rβ₂的STAT3结合位点、IL-21R的STAT5结合位点、IL-21R的STAT3结合位点、IL-21R的STAT1结合位点、IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点、IL-4Rα的STAT6结合位点、红细胞生成素受体(EPOR)的SHP-1或SHP-2结合位点、EPOR的STAT5结合位点、干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的STAT1或STAT2结合位点和干扰素γ受体1(IFNγR1)的STAT1结合位点或它们的组合；

任选地，所述ICD包含选自由以下组成的组的蛋白质的框1区和框2区：G-CSFR、gp130EPOR和干扰素γ受体2(IFNγR2)或它们的组合；并且，

任选地，所述嵌合受体包含第三结构域，所述第三结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域(TMD)：G-CSFR、gp130(糖蛋白130)和IL-2Rβ，并且任选地，所述TMD是野生型TMD。

171.如权利要求169所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述嵌合受体可操作地连接至至少一个第二结构域；所述第二结构域包含：

(i)

(a)gp130的框1区和框2区；和

(b)IL-2Rβ的C末端区；或者

(ii)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-2Rβ的C末端区；或者

(iii)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-12Rβ₂的C末端区；或者

(iv)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的C末端区；或者

(v)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；和

(b)IL-2Rβ的C末端区；或者

(vi)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；和

(b)IL-7Rα的C末端区；或者

(vii)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的C末端区；或者

(viii)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的C末端区；或者

(ix)

(a)红细胞生成素受体(EPOR)的框1区和框2区；

(b)EPOR的C末端区；或者

(x)

(a)G-CSFR的框1区和框2区；

(b)干扰素α和β受体亚基2(IFNAR2)的C末端区；或者

(xi)

(a)干扰素γ受体2(IFNγR2)的框1区和框2区；

(b)干扰素γ受体1(IFNγR1)的C末端区。

172.如权利要求170或171所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述ECD在所述TMD的N末端，并且所述TMD在所述ICD的N末端。

173.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

包含G-CSFR的变体ECD的所述受体在所述细胞上表达。

174.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是:

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

175.如权利要求174所述的系统，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、细胞毒性CD4⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

176.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述变体G-CSF对包含G-CSFR的变体ECD的所述受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达所述受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆、增强的活性中的至少一种或它们的组合。

177.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述变体G-CSF包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。

178.如权利要求177所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述变体G-CSF的所述位点II界面区中的所述至少一个突变位于选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.1中所示的序列的氨基酸位置12、16、19、20、104、108、109、112、115、116、118、119、122和123。

179.如权利要求178所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

所述变体G-CSF的所述位点II界面区中的所述至少一个突变选自以下突变组，所述突变组选自由以下组成的组：S12E、S12K、S12R、K16D、L18F、E19K、Q20E、D104K、D104R、L108K、L108R、D109R、D112R、D112K、T115E、T115K、T116D、Q119E、Q119R、E122K、E122R和E123R。

180.如权利要求177至179中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述变体G-CSF的所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自以下突变组，所述突变组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.1中所示的序列的38、39、40、41、46、47、48、49和147。

181.如权利要求180所述的用于选择性活化细胞的系统，其中

所述变体G-CSF的所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自以下突变组，所述突变组选自由以下组成的组：T38R、Y39E、K40D、K40F、L41D、L41E、L41K、E46R、L47D、V48K、V48R、L49K和R147E。

182.如上述权利要求中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述细胞表达包含G-CSFR的变体ECD的所述受体和所述至少一种额外的细胞因子或趋化因子两者。

183.如权利要求155至181中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中两种或更多种细胞群体各自表达包含G-CSFR ECD的不同嵌合受体，且各自表达G-CSF的不同变体形式。

184.如权利要求183所述的系统，其中所述第一免疫细胞群体还表达以下中的一者或两者：

(a)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和

(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

185.如权利要求182所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述细胞是免疫细胞；并且其中所述免疫细胞还表达至少一种抗原结合信号传导受体；并且其中所述抗原结合信号传导受体选择性地结合在第二细胞上表达的抗原。

186.如权利要求184所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述抗原结合信号传导受体包括嵌合抗原受体(CAR)，并且任选地，其中所述CAR为间皮素CAR。

187.如权利要求186所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述额外的细胞因子包括IL-18。

188.如权利要求184至187中任一项所述的用于选择性活化细胞的系统，其中所述第二细胞是癌细胞。

189.一种或多种核酸序列，其编码上述权利要求中任一项所述的系统。

190.一种或多种表达载体，其包含权利要求189所述的核酸序列。

191.一种或多种细胞，其被工程化以表达权利要求155至188中任一项所述的系统。

192.如权利要求191所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

193.如权利要求192所述的细胞，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、细胞毒性CD4⁺T细胞、原初CD8+T细胞、原初CD4⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

194.一种选择性活化在细胞表面上表达的包含G-CSFR的变体ECD的受体的方法，其包括：

向所述细胞中引入一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列编码包含权利要求155至188中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的至少一种受体；和以下中的一者或两者

(i))至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括权利要求155至188中任一项所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和

(ii)权利要求155至188中任一项所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体；和

使包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体与变体G-CSF或权利要求155至188中任一项所述的变体G-CSF接触。

195.如权利要求194所述的方法，其中所述受体在免疫细胞上表达，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

196.如权利要求195所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、细胞毒性CD4⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

197.如权利要求195所述的方法，其中在所述免疫细胞上表达的所述受体的所述选择性活化引起细胞反应，所述细胞反应包括所述免疫细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆、增强的活性中的至少一种或它们的组合。

198.如权利要求195所述的方法，其中第一免疫细胞群体表达包含G-CSFR的所述变体ECD的一种或多种受体，并且第二免疫细胞群体表达一种或多种变体G-CSF；任选地，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达至少一种不同的抗原结合信号传导受体；并且任选地，其中所述至少一种不同的抗原结合信号传导受体包括至少一种CAR。

199.如权利要求198所述的方法，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下中的一者或两者：

(a))至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和

(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

200.如权利要求198或199所述的方法，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体各自表达至少一种包含G-CSFR的不同变体ECD的不同的受体和至少一种不同的变体G-CSF。

201.如权利要求198至200中任一项所述的方法，其还包含一种或多种额外的免疫细胞群体；其中每个额外的免疫细胞群表达以下中的至少一种：(i)包含G-CSFR的不同变体ECD的不同受体，(ii)不同的体G-CSF，(iii)不同的激动或拮抗信号传导蛋白和(iv)不同的抗原结合信号传导受体。

202.一种产生细胞的方法，所述细胞表达包含权利要求155至188中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一或两者：

(i))至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述至少一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括权利要求155至188中任一项所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和

(ii)权利要求155至188中任一项所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体；

所述方法包括向所述细胞中引入编码所述受体以及(i)和(ii)中的一者或两者的一种或多种核酸或表达载体。

203.如权利要求200所述的方法，其中第一免疫细胞群体表达包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体，并且第二免疫细胞群体表达所述变体G-CSF。

204.如权利要求203所述的方法，其中所述第一免疫细胞群体和所述第二免疫细胞群体中的一者或两者还表达以下中的一者或两者：

(b)至少一种抗原结合信号传导受体。

205.一种增强有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用权利要求192所述的免疫细胞。

206.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括：

向所述受试者施用权利要求192所述的免疫细胞。

207.如权利要求204所述的方法，其还包括向所述受试者施用或提供至少一种变体G-CSF。

208.如权利要求204至207所述的方法，其中所述方法用于治疗癌症。

209.如权利要求204至207所述的方法，其中所述方法用于治疗炎症性病症。

210.如权利要求204至207所述的方法，其中所述方法用于治疗自身免疫性疾病或病症。

211.如权利要求204至207所述的方法，其中所述方法用于治疗退行性疾病。

212.如权利要求204至207所述的方法，其中所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。

213.如权利要求204至207所述的方法，其中所述方法用于预防或治疗移植排斥。

214.如权利要求204至207所述的方法，其中所述方法用于治疗传染性疾病。

215.如权利要求204至207所述的方法，其还包括施用或提供至少一种额外的活性剂；任选地，其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

216.一种治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括:

(i)分离含免疫细胞的样品；

(ii)将一种或多种核酸序列引入所述免疫细胞中，所述一种或多种核酸序列编码包含权利要求155至188中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的一种或多种受体；和以下中的一或两者：

(a)至少一种额外的活性剂；任选地，其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括权利要求155至188中任一项所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和任选地，

(b)权利要求155至188中任一项所述的系统的一种或多种抗原结合信号传导受体；

(iii)向所述受试者施用来自(ii)的所述免疫细胞；和

(iv)使所述免疫细胞与特异性结合包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体的变体G-CSF接触。

217.如权利要求216所述的方法，其中在向所述受试者施用或输注所述免疫细胞之前所述受试者已经历免疫耗竭治疗。

218.如权利要求216所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从施用所述细胞的所述受试者分离的。

219.如权利要求216所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从不同于施用所述细胞的所述受试者的受试者分离的。

220.如权利要求216至219中任一项所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从来源于施用所述细胞的所述受试者或来源于不同于施用所述细胞的所述受试者的受试者的来源细胞产生的，并且任选地，其中所述来源细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。

221.如权利要求216所述的方法，其中在向所述受试者施用所述免疫细胞之前，使所述免疫细胞在体外与所述变体G-CSF或额外的细胞因子或趋化因子接触。

222.如权利要求216至220中任一项所述的方法，其中使所述免疫细胞与所述变体G-CSF接触足够长的时间以活化来自包含如权利要求1至32中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体的信号传导。

223.一种试剂盒，其包括编码以下的细胞：

包含权利要求155至188中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一或两者：

(a)权利要求155至188中任一项所述的系统的至少一种额外的细胞因子和趋化因子；以及，

(b)权利要求155至188中任一项所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体；

以及使用说明书；并且任选地，其中所述细胞是免疫细胞。

224.一种试剂盒，其包括：

(i)一种或多种核酸序列或表达载体，所述一种或多种核酸序列或表达载体编码包含权利要求155至188中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一或两者：

(a)至少一种额外的活性剂；任选地，其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括权利要求155至188中任一项所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；以及，

(b)权利要求155至188中任一项所述的系统的至少一种抗原结合信号传导受体；和

(ii)至少一种变体G-CSF；以及

(iii)使用说明书；

其中所述受体以及(a)和(b)中的一者或两者位于相同或单独的核酸序列或表达载体上。

225.一种试剂盒，其包括：

(i)包含一种或多种核酸序列或表达载体的细胞，所述一种或多种核酸序列或表达载体编码包含权利要求155至188中任一项所述的系统的G-CSFR的变体ECD的受体；和以下中的一或两者：

(a)至少一种额外的活性剂；任选地，其中所述至少一种额外的活性剂包括至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括权利要求155至188中任一项所述的系统的一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂；和

(ii)使用说明书；

并且任选地，其中所述试剂盒包括特异性结合包含G-CSFR的所述变体ECD的所述受体的变体G-CSF。

226.一种嵌合受体，其包含：

(i)白介素受体α(IL-7Rα)的胞外结构域(ECD)；

(ii)跨膜结构域(TMD)；和

(iii)细胞因子受体的胞内结构域(ICD)，其不同于SEQ ID NO:109中所示的野生型人IL-7Rα细胞内信号传导结构域；其中所述ECD和所述TMD各自可操作地连接至所述ICD。

227.如权利要求226所述的嵌合受体，其中所述ECD的羧基末端(C末端)连接至所述TMD的氨基末端(N末端)，并且所述TMD的C末端连接至所述ICD的N末端。

228.如权利要求226或227所述的嵌合受体，其中所述ECD是天然人IL-7Rα的ECD。

229.如权利要求226至228中任一项所述的嵌合受体，其中所述TMD是IL-7Rα的TMD。

230.如权利要求229所述的嵌合受体，其中所述TMD是天然人IL-7Rα的TMD。

231.如权利要求226至230中任一项所述的嵌合受体，其中所述ICD包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点，并且任选地，

所述至少一个信号传导分子结合位点包括：

(a)IL-2Rβ、IL-4Rα、IL-7Ra、IL-21R或gp130的Jak 1结合位点(框1区和2区)；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ或IL-7Ra的STAT5结合位点；

(d)IL-21R或gp130的STAT3结合位点；

(e)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；

(f)IL-4Rα的STAT6结合位点；

(g)IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点；和

(h)gp130的SHP-2结合位点；

(i)IL-7Rα的PI3K结合位点；

或它们的组合。

232.如权利要求226至231中任一项所述的嵌合受体，其中所述ICD包括通过与共同γ链(gc)的异二聚化而被活化的受体的至少一个细胞内信号传导结构域。

233.如权利要求226至231中任一项所述的嵌合受体，其中所述ICD包括细胞因子受体的至少一个细胞内信号传导结构域，所述细胞因子受体选自由以下组成的组：IL-2Rβ(白介素-2受体β)、IL-4Rα(白介素-4受体α)、IL-9Rα(白介素-9受体α)、IL-12R(白介素-12受体)、IL-21R(白介素-21受体)和糖蛋白130(gp130)及它们的组合。

234.一种嵌合受体，其包含IL-7Rα的ECD和可操作地连接至ICD的TMD，所述ICD包含：

(i)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；和

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；或者

(ii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；和

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；或者

(iii)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；或者

(iv)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和

(d)IL-12Rβ2的STAT4结合位点；或者

(v)

(a)IL-21R的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(vi)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；和

(b)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(vii)

(a)IL-21R的框1区和框2区；

(b)IL-21R的STAT3结合位点；和

(c)IL-7Rα的STAT5和PI3激酶结合位点；

(viii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-21R的STAT3结合位点；和(c)IL-7Rα的STAT5和PI3激酶结合位点；(ix)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和(d)IL-21R的STAT3结合位点；或者(x)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；和(d)IL-21R的STAT3结合位点；或者(xi)

(a)IL-2Rβ的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；

(d)IL12Rβ2的STAT4结合位点；和(e)IL-21R的STAT3结合位点；或者(xii)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-2Rβ的SHC结合位点；

(c)IL-2Rβ的STAT5结合位点；

(d)IL12Rβ2的STAT4结合位点；和

(e)IL-21R的STAT3结合位点；或者

(xiii)

(a)IL-4Rα的框1区和框2区；

(b)IL-4Rα的IRS-1或IRS-2结合位点；和

(c)IL-4Rα的STAT6结合位点；或者

(xiv)

(a)IL-7Rα的框1区和框2区；

(b)IL-4α的IRS-1或IRS-2结合位点；和

(c)IL-4α的STAT6结合位点；或者

(xv)

(a)gp130的框1区和框2区；

(b)gp130的SHP-2结合位点；和

(c)gp130的STAT3结合位点；或者

(xvi)

(a)IL-7α的框1区和框2区；

(b)gp130的SHP-2结合位点；和

(c)gp130的STAT3结合位点。

235.如权利要求234所述的嵌合受体，其中

(b)在(c)的N末端；或其中

(c)在(b)的N末端；或其中

(c)在(d)的N末端；或其中

(d)在(c)的N末端；或其中

(d)在(e)的N末端；或其中

(e)在(d)的N末端。

236.如上述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述ICD包含与SEQ ID NO:85-107中的至少一个中所示的序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。

237.如上述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体的活化形式形成异二聚体，并且任选地，所述嵌合受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达所述嵌合受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种，并且任选地，

所述嵌合受体在与白介素(IL)-7接触时被活化。

238.如权利要求237所述的嵌合受体，其中所述IL-7为野生型人IL-7。

239.如权利要求237所述的嵌合受体，其中与野生型IL-7相比，所述IL-7含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个突变。

240.如权利要求237所述的嵌合受体，其中所述IL-7包含一种或多种化学修饰。

241.如权利要求240所述的嵌合受体，其中所述IL-7通过聚乙二醇化来修饰。

242.如权利要求241所述的嵌合受体，其中所述IL-7是通过将聚乙二醇(PEG)化学添加到所述IL-7蛋白质的N末端或C末端而被聚乙二醇化的。

243.如上述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中

所述嵌合受体在细胞上表达。

244.如权利要求243所述的嵌合受体，其中所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

245.如权利要求244所述的嵌合受体，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

246.如上述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中

IL-7对所述受体的活化引起细胞反应，所述细胞反应包括表达所述受体的细胞的增殖、活力、持久性、细胞毒性、细胞因子分泌、记忆和增强的活性中的至少一种。

247.一种或多种核酸序列，其编码上述权利要求中任一项所述的受体。

248.一种或多种表达载体，其包含权利要求20所述的核酸序列。

249.一种细胞，其包含权利要求247所述的核酸序列或权利要求248所述的表达载体。

250.如权利要求249所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

251.如权利要求250所述的细胞，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

252.一种用于活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：

(a)权利要求226至245中任一项所述的嵌合受体；和

(b)IL-7。

253.一种用于活化免疫细胞的系统，所述系统包含：

(a)权利要求226至245所述的嵌合受体；

(b)IL-7；和

(c)抗原结合信号传导受体。

254.一种用于活化免疫细胞的系统，所述系统包含：

(a)如权利要求226至245所述的嵌合受体；

(b)IL-7；和

(c)至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

255.如权利要求254所述的系统，其还包含至少一种抗原结合信号传导受体。

256.如权利要求253或255所述的系统，其中所述至少一种抗原结合信号传导受体包括选自由以下组成的组的至少一种受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

257.如权利要求256所述的系统，其中所述至少一种抗原结合信号传导受体是CAR。

258.如权利要求254所述的系统，其中所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL19、NKG2D及它们的组合。

259.如权利要求258所述的系统，其中所述细胞因子是IL-18。

260.如权利要求258或259所述的系统，其中所述细胞因子是人的。

261.一种活化在细胞表面上表达的嵌合受体的方法，其包括：

使所述嵌合受体与IL-7接触以活化所述嵌合受体；其中所述嵌合受体包含：

(i)IL-7Rα的胞外结构域(ECD)；

(ii)跨膜结构域(TMD)；和

262.如权利要求253所述的方法，其中所述嵌合受体是如权利要求227至245中任一项所述的嵌合受体。

263.一种在细胞中产生嵌合受体的方法，所述方法包括：向所述细胞中引入权利要求247所述的核酸序列或权利要求262所述的表达载体。

264.如权利要求262所述的方法，其还包括将所述载体的一种或多种序列编辑到所述细胞的基因组中。

265.如权利要求262或263所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞；并且任选地，所述免疫细胞是：

T细胞，并且任选地，

NK细胞，并且任选地，

NKT细胞，并且任选地，

B细胞，并且任选地，

浆细胞，并且任选地，

巨噬细胞，并且任选地，

树突细胞，并且任选地，

所述细胞是干细胞，并且任选地，

所述细胞是原代细胞，并且任选地，

所述细胞是人细胞。

266.如权利要求265所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8⁺T细胞、细胞毒性CD8⁺T细胞、原初CD4⁺T细胞、原初CD8⁺T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞和γδT细胞。

267.一种增强有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括：

向所述受试者施用表达权利要求226至245中任一项所述的嵌合受体的细胞，并且向所述受试者施用或提供IL-7。

268.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括：

269.如权利要求267或268所述的方法，其中所述方法用于治疗癌症。

270.如权利要求267或268所述的方法，其中所述方法用于治疗自身免疫性疾病。

271.如权利要求267或268所述的方法，其中所述方法用于治疗炎症性病症。

272.如权利要求267或268所述的方法，其中所述方法用于治疗退行性疾病。

273.如权利要求267或268所述的方法，其中所述方法用于产生用于移植的天然或工程化细胞、组织或器官。

274.如权利要求267或268所述的方法，其中所述方法用于预防或治疗移植排斥。

275.如权利要求267或268所述的方法，其中所述方法用于治疗传染性疾病。

276.如权利要求267或268所述的方法；其还包括施用或提供至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

277.如权利要求267或268所述的方法，其中向所述受试者施用表达至少一种额外的不同嵌合受体的细胞。

278.如权利要求277所述的方法，其中所述至少一种额外的不同嵌合受体是包含粒细胞刺激因子受体(G-CSFR)的变体ECD的嵌合受体。

279.如权利要求278所述的方法，其中使表达包含G-CSFR的变体ECD的所述至少一种额外的不同嵌合受体的所述细胞与一种或多种变体G-CSF接触，并且任选地，向所述受试者施用一种或多种变体G-CSF。

280.如权利要求276至279中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用编码所述嵌合细胞因子受体的核酸序列转导或转染所述免疫细胞；(iii)向所述受试者施用来自(ii)的所述免疫细胞；和(iv)使所述免疫细胞与IL-7接触。

281.如权利要求277所述的方法，其还包括向所述免疫细胞引入编码至少一种额外的激动或拮抗信号传导蛋白的核酸序列；并且任选地，所述一种或多种额外的激动或拮抗信号传导蛋白包括一种或多种细胞因子、趋化因子、激素、抗体或其衍生物，或其他亲和试剂。

282.如权利要求281所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL19、NKG2D及它们的组合。

283.如权利要求280所述的方法，其还包括向所述免疫细胞引入编码至少一种抗原结合信号传导受体的核酸序列。

284.如权利要求283所述的方法，其中所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

285.如权利要求280所述的方法，其中在向所述受试者施用所述细胞之前所述受试者已经历免疫耗竭治疗。

286.如权利要求280中的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从施用所述细胞的所述受试者中分离的。

287.如权利要求280所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从不同于将施用所述细胞的所述受试者的受试者分离的。

288.如权利要求280所述的方法，其中所述含免疫细胞的样品是从来源于施用所述细胞的所述受试者或来源于不同于施用所述细胞的所述受试者的受试者的细胞产生的，并且任选地，其中所述细胞是干细胞，并且任选地，是多能干细胞。

289.如权利要求280所述的方法，其中在向所述受试者施用所述细胞之前，使所述免疫细胞在体外与IL-7或变体G-CSF中的一者或两者接触。

290.如权利要求280所述的方法，其中使所述免疫细胞与IL-7或变体G-CSF中的一者或两者接触足够的时间以活化来自如权利要求226至246中任一项所述的嵌合受体的信号传导。

291.如权利要求267至290中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述细胞还表达选自由以下组成的组的至少一种抗原结合信号传导受体：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

292.如权利要求267至291中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述细胞还表达包含G-CSFR的变体ECD的受体。

293.如权利要求292所述的方法，其中G-CSFR的所述变体ECD包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或它们的组合。

294.如权利要求267至291中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述细胞还表达IL-18。

295.一种试剂盒，其包括：

编码权利要求226至245中任一项所述的嵌合受体的细胞，并且任选地，所述细胞是免疫细胞；以及使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括IL-7，并且任选地，并且任选地，所述试剂盒包括变体G-CSF。

296.一种试剂盒，其包括：

一种或多种表达载体，其包含编码权利要求226至245中任一项所述的嵌合受体的核酸序列；和使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括IL-7，并且任选地，所述试剂盒包括变体G-CSF。

297.如权利要求296所述的试剂盒，其还包括编码细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL19、NKG2D及它们的组合。

298.如权利要求296所述的试剂盒，其还包括编码至少一种受体的一种或多种表达载体，所述受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

299.如权利要求298所述的试剂盒，其还包括编码嵌合抗原受体的表达载体。

300.如权利要求295所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种细胞因子或趋化因子的一种或多种表达载体，所述细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-18、IL-21、干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、IL-17、IL-21、TNF-a、CXCL13、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL19、NKG2D及它们的组合。

301.如权利要求295所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种抗原结合信号传导受体的一种或多种表达载体。

302.如权利要求301所述的试剂盒，其中所述至少一种抗原结合信号传导受体选自由以下组成的组：天然T细胞受体、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、天然B细胞受体、工程化B细胞受体(BCR)、应激配体受体、模式识别受体及它们的组合。

303.如权利要求302所述的试剂盒，其中所述细胞还包含编码至少一种CAR的一种或多种表达载体。