KR19990008322A

KR19990008322A - 사람 케모킨 베타-13

Info

Publication number: KR19990008322A
Application number: KR1019970707848A
Authority: KR
Inventors: 리하오동; 시벨조지
Original assignee: 벤슨 로버트 에이치; 휴먼게놈사이언시즈,인코포레이티드; 베네티아너 스티븐; 스미스클라인비참코포레이션
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1999-01-25
Also published as: WO1996039521A1; EP0832233A1; ES2227553T3; MX9708528A; PT832233E; DE69533627T2; DE69533627D1; AU713267B2; EP0832233A4; EP0832233B1; DK0832233T3; ATE278780T1; AU2820895A

Abstract

본 발명은 사람 케모킨 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(RNA) 및 상기 펩티드를 재조합 기술에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 백혈병, 종양, 만성 감염, 자가-면역 질환, 섬유상 장애, 상처 치유 및 건선의 치료에 상기 케모킨 폴리펩티드를 이용하는 방법을 기술한다. 또한 , 상기 케모킨 폴리펩티드에 대한 길항제, 및 류마티즘성 신경통, 자가-면역, 만성, 급소 염증 및 감염성 질병, 알레르기성 반응, 프로스타그란딘-의존성 열, 및 뼈 골수 이상을 치료하기 위한 치료제로서의 이들의 용도를 기술한다. 또한 본 발명은 핵산 서열의 돌연변이에 관련된 질병 및 폴리펩티드의 변형 농도를 검색하기 위한 진단 검정법을 기술한다. 또한 본 발명은 케모킨 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이와 숙주에서 폴리뉴클레오타이드의 변형 수준을 검색하기 위한 진단 검정법을 기술한다.

Description

사람 케모킨 베타-13

본 발명은 새롭게 동정된 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩티드의 용도, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 사람 케모킨 폴리펩티드[종종 사람 케모킨 베타-13(Ckβ-13)으로 후술됨]로서 추정상 동정되었다. 또한 본 발명은 이러한 폴리펩티드의 억제작용에 관한 것이다.

인터크린 사이토킨으로 지침되는 케모킨은 구조적으로 및 기능적으로 관련된 사이토킨의 아종이다. 이들의 분자 크기는 8-10 kd이다. 일반적으로, 케모킨은 아미노산 수준에서 20% 내지 75%의 상동성을 나타내고, 2 개의 디설파이드 결합을 형성하는 4개의 시스테인 잔기를 보유하는 것이 특징이다. 처음 두 잔기의 배열을 기초로, 케모킨은 2개의 아종, 알파 및 베타로 분류된다. 알파 아종에 있어서, 처음 2 개의 시스테인은 1 개의 아미노산에 의해 분리되고, 따라서 C-X-C 아종으로 지침2된다. 베타 아종에 있어서, 2 개의 시스테인은 근접한 위치에 있으므로 C-C 아종으로 지침된다. 이에 따라, 이 종의 9개 이상의 다른 원소가 사람에게서 동정되었다.

인터크린 사이토킨은 광범위한 다양한 기능을 나타낸다. 홀마크(hall mark) 특징은 단구, 호중구, T 림프구, 호염구 및 섬유아세포를 포함하는 명확한 세포 형태의 세포 유주성 이동을 유도하는 능력이다. 다수의 케모킨은 선염증 활성을 갖고, 염증 반응 동안 다수의 단계가 진행된다. 이러한 활성은 히스타민 방출, 리소솜성 효소 및 류코트리엔 방출의 촉진, 내피 세포에 대한 표적 면역 세포의 증가된 고착, 보체 단백질의 강화된 결합, 과립구 부착 분자 및 보체 수용체의 유도된 발현 및 호흡 격발을 포함한다. 염증 이외에도, 어떤 케모킨은 다른 활성을 나타낸다. 예를 들면, 마크로파지 염증 단백질 1(MIP-1)은 조혈성 스템 세포 증식을 억제할 수 있고, 혈소판 인자-4(PF-4)는 내피세포 성장의 강력한 억제제이고, 인터류킨-8(IL-8)은 각질구의 증식을 증진시키고, GRO는 흑색종 세포용 오토크린 성장 인자이다.

다양한 생물학적 활성의 견지에서, 케모킨이 림프구 트래피킹, 상처 치료, 조혈성 조절 및 면역학적 장애, 예를 들면 알레르기, 천식 및 관절염을 포함하는 다수의 생태학적 질병 상태와 관련되어 왔다는 사실은 놀라운 일이 아니다.

C-C 측쇄의 원소는 이러한 효과를 하기의 하기 세포에 발휘한다:

감소된 기생충 감염에서 기생충을 파괴하고, 호흡 시스템의 경로에 만성 염증을 일으키는 호산구; 척추동물에서 종양 형성을 억제하는 단구 및 마크로파지; T 세포를 유인하는 T 림프구; 알레르기성 염증에서 중요한 역할을 하는 히스타민을 방출하는 호염구.

C-C 측쇄의 구성 원소는 주로 단일핵 세포에 작용하고, C-X-C 측쇄의 구성 원소는 주로 호중구에 작용하는 반면, 명확한 세포 유주성은 이 가이드라인 기초의 케모킨에 할당될 수 없다. 한 종으로 부터의 일부 케모킨은 다른 특징을 보인다.

본 발명의 폴리펩티드는 시스테인을 보유한 C-C 부위를 갖고, 공지의 케모킨과 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 한 국면에 따라서, 신규의 폴리펩티드, 및 생물학적으로 활성이고 진단상 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 동족체 및 유도체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, mRNA, DNA, cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드, 및 생물학적으로 활성이고 진단상 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열과 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브(probe)도 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 상기 폴리펩티드를 상기 단백질의 발현 및 이에 후속되는 회수를 촉진시키는 조건하에, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 배양함을 포함하는 재조합 기술에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 상기 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 치료 목적, 예를 들어 충실성 종양, 만성 감염, 백혈병, T-세포 매개된 자가-면역 질환, 기생충 감염, 건선을 치료하고, 조혈증을 조절하고, 성장 인자 활성을 자극하며, 혈관 형성을 억제하고, 상처 치유를 증진하기 위해 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 국면에 따라, 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 국면에 따라, 상기 폴리펩티드의 작용을 억제하기 위하여, 예를 들면, 특정 자가-면역 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 만성 염증 및 감염 질환, 히스타민 및 IgE-매개된 알레르기성 반응, 프로스타글란딘-의존성 열, 골수 손상, 규폐증, 유육종증, 류마티스 관절염 및 고-호산성 증후군의 치료에 사용될 수 있는, 상기 폴리펩티드에 대한 길항제를 제공한다.

본 발명의 다른 국면에 따라, 본 발명의 핵산 서열의 돌연변이와 관련된 질병 또는 질환 또는 이러한 실천에 대한 감수성 및 상기 핵산 서열에 의해 암호화되는 단백질의 변형된 수준을 진단하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 추가의 국면에 따라, 과학적 연구 조사, DNA 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 시험관내 목적을 위하여, 상기 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 모든 국면은 본원의 교시로 부터 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백할 것이다.

하기 도면은 본 발명의 양태를 예시하지만 청구의 범위에 포함된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 Ckβ-13의 cDNA 서열 및 상응하는 추론된 아미노산 서열을 예시한다. 추정된 성숙한 폴리펩티드가 65개의 아미노산을 포함하도록 처음의 28개의 아미노산은 리더 서열을 나타낸다. 아미노산에 대해 표준 단일문자 약어를 사용한다. 서열분석은 373 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystem, Inc.)를 사용하여 수행한다.

도 2는 Ckβ-13(상단)과 사람 MIP-1α 폴리펩티드(하단)간의 아미노산 서열 상동성을 도시한 것이다.

본 발명의 한 국면에 따라, 도 1(서열 2)의 추론된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩티드 또는 1995년 4월 28일에 ATCC 기탁번호 제97113호로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)을 제공한다.

Ckβ-13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 활성화된 단구 cDNA 라이브러리로 부터 분리된다. Ckβ-13은 케모킨의 C-C 측쇄의 구성원이다. 이는 성숙한 단백질이 65개의 아미노산을 포함하도록 초기 약 28개의 아미노산 잔기가 추정상의 리더 서열인, 93개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame)을 함유한다. 단백질은 케모킨 폴리펩티드와 구조적 상동성과 실시예에서 단독으로 사용된 모든 서열에 대해 33%의 동일성과 53%의 유사성으로 사람 MIP-1α 폴리펩티드와 상동성을 갖는다.

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 공간적으로 4개의 보존된 시스테인 잔기를 갖는다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태이거나, 또는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. 이러한 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있고, 일본쇄일 경우 암호화쇄 또는 비-암호화(안티-센스)쇄일 수 있다. 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열은 도 1에 나타낸 암호화 서열(서열 1) 또는 기탁된 클론의 암호화 서열과 동일하거나, 또는 유전자 암호의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서 암호화 서열이 도 1의 DNA (서열 1)또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있다.

도 1의 성숙한 폴리펩티드(서열 2)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 단지 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열 및 리더 또는 분비성 서열 또는 프로단백질 서열과 같은 부가의 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열(및 임의의 부가적 암호화 서열) 및 인트론또는 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 비-암호화 서열 5' 및/또는 3'과 같은 비-암호화 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 용어 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단지 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 부가의 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.

또한 본 발명은 도 1의 추론된 아미노산 서열(서열 2)을 갖는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 상기 언급된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 대립유전자성 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-천연 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1(서열 2)에 나타낸 바와 동일한 성숙한 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 도 1의 폴리펩티드(서열 2) 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체로는 결실 변이체, 치환 변이체 및 첨가 또는 삽입 변이체가 있다.

앞서 지적한 바와 같이, 당해 폴리뉴클레오티드는 도 1에 나타낸 암호화 서열(서열 1) 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 천연 대립 유전자성 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립 유전자성 변이체는 암호화된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변형시키지 않으면서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 대체 형태이다.

또한 본 발명은 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열이 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 상기 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 수송을 조절하는 분비성 서열로서 작용하는 리더 서열과 동일한 판독 프레임에서 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리단백질이고, 숙주 세포에 의해 절단되어 폴리펩티드의 성숙한 형태를 형성시키는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙한 단백질 + 부가의 5' 아미노산 잔기인 프로단백질을 암호화할 수도 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질은 프로단백질이고 단백질의 불활성 형태이다. 프로서열이 절단되면, 활성을 지닌 성숙한 단백질이 남게 된다.

따라서, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질, 프로서열을 갖는 단백질, 또는 프로서열과 프리서열(리더 서열) 모두를 갖는 단백질을 암호화할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드를 정제하도록 하는 마커 서열에 대한 프레임 내에서 융합된 암호화 서열을 가질 수도 있다. 이러한 마커 서열은 세균성 숙주의 경우에는 상기 마커와 융합된 성숙한 폴리펩티드를 정제하기 위해 제공된, pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사히스티딘 태그(tag)일 수 있거나, 또는 예를 들어 COS-7 세포와 같은 포유류 숙주가 사용될 경우에는 혈구응집소(HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프(epitope)에 상응한다[참조: Wilson, I., et al., Cell, 37:767(1984)].

용어 유전자는 폴리펩티드 쇄를 생성시키는데 관여된 DNA의 세그먼트를 의미하고; 이는 암호화 영역의 전방 및 후방 영역(리더 및 테일러) 뿐만 아니라 개개의 암호화 세그먼트(엑손) 간의 삽입 서열(인트론)을 포함한다.

완전한 길이의 Ckβ-13 유전자의 단편을 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로서 사용하여 완전한 길이의 유전자를 분리하고, 유전자와의 유사성이 높은 서열을 가지거나 유사한 생물학적 활성을 지닌 기타 유전자를 분리할 수 있다. 이러한 유형의 프로브는, 바람직하게는 약 30개 이상의 염기를 가지며, 예를 들면, 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 상기 프로브를 사용하여 완전한 길이의 전사물에 상응하는 cDNA 클론, 및 조절 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 Ckβ-13 유전자를 함유하는 게놈성 클론 또는 클론(들)을 동정할 수 있다. 스크린의 한 예는 공지된 DNA 서열을 사용함으로써 Ckβ-13 유전자의 암호화 영역을 분리하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성함을 포함한다. 본 발명의 유전자 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 사람 cDNA, 게놈성 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하므로 프로브가 하이브리드화되는 라이브러리의 구성원을 결정한다.

또한 본 발명은 서열간에 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%의 동질성이 존재하는 경우, 상기 언급된 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 상기 언급된 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 엄격한 조건이란 서열간에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동질성이 존재하는 경우에만 하이브리드화가 발생하는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서 상기 언급된 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열 1)의 cDNA 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.

또 다르게는, 당해 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화되고 앞서 언급한 바와 같은 동질성을 가지며 활성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들면, 이러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 폴리뉴클레오티를 회수하기 위한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 변이체에 대한 프로브으로서 또는 진단 프로브로서 또는 PCR 프라이머로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열 2의 폴리펩티드 뿐만 아니라 이의 단편(이러한 단편은 30개 이상, 바람직하게는 50개 이상의 염기를 갖는다)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에서 언급된 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 협약하에 주장된다. 이들 기탁은 단지 당해 기술분야의 숙련인에게 편의를 제공하는 것이지 기탁이 35 U.S.C. §112 규정을 충족시켜야 하는 승인 요건은 아니다. 기탁된 물질에 함유된 폴리뉴클레오티드의 서열, 및 이에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본 명세서에서 참조로 인용되고 본 명세서내에 기술된 서열과 분쟁이 일어날 경우에 조정한다. 실시권은 기탁된 물질을 제조, 사용 또는 판매하는데 필요할 수 있는데, 어떠한 실시권도 본원에 의해 허여되지 않는다.

또한 본 발명은 도 1의 추론된 아미노산 서열(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 상기 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.

도 1의 폴리펩티드(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드에 관해 언급할 경우, 용어 단편, 유도체 및 동족체는 상기 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 동족체는 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성을 지닌 성숙한 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 프로단백질을 포함한다. 유도체 또는 단편은, 예를 들면 도 1의 폴리펩티드 보다 더 적은 아미노산 잔기를 가지나 사람 케모킨 폴리펩티드의 생물학적 활성 특성을 또한 유지하는 스플리스(splice) 변이체를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

도 1의 폴리펩티드(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체는 (ⅰ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 보존되지 않는 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 이와 같이 치환된 아미노산 잔기가 유전자 암호에 의해 암호화된 것이거나 아닐 수 있는 것, (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, (ⅲ) 성숙한 폴리펩티드가 또다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것, (ⅳ) 리더 또는 분비성 서열; 성숙한 폴리펩티드의 정제를 위해 사용되는 서열; 또는 프로단백질 서열과 같은 부가의 아미노산이 성숙한 폴리펩티드와 융합되는 것일 수 있다. 본 명세서의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인은 상기 단편, 유도체 및 동족체가 본 발명의 범주 내에 있다고 간주할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되고, 바람직하게는 동종성으로 정제된다.

용어 분리된이란 물질을 이의 본래 환경(예를 들면, 천연 물질인 경우에는 천연 환경)으로부터 제거함을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 동물 내에 존재하는 천연의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않으나, 천연 시스템 내에 공존하는 몇몇 또는 모든 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으므로, 상기 벡터 또는 조성물이 이의 천연 환경의 일부가 아닌 경우에 분리될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열 2의 폴리펩티드(특히 성숙한 폴리펩티드) 뿐만 아니라 서열 2의 폴리펩티드와 70% 이상의 상동성(바람직하게는 70% 이상의 동일성), 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 90% 이상의 상동성(보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성), 더욱 바람직하게는 서열 2의 폴리펩티드와 95% 이상의 상동성(보다 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성)을 지니는 폴리펩티드를 포함하며, 또한 일반적으로 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 상기 부분을 갖는 상기 폴리펩티드의 부분을 포함한다.

당해 분야에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 간의 상동성이란 제2 폴리펩티드에 대한 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 비교함으로써 결정한다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하는데 사용할 수 있으므로, 이러한 단편을 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분을 사용하여 본 발명의 완전한 길이의 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.

숙주 세포를, 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 사용하여 유전적으로 조작(형질도입, 형질전환 또는 형질감염)한다. 이러한 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 상기와 같이 조작된 숙주 세포를 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선별 또는 Ckβ-13 유전자의 증폭에 적합하도록 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이고, 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술에 의해 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 당해 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 각종 발현 벡터 중의 어느 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터로는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 파아지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파아지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 백시니아, 아데노바이러스, 가금류 폭스 바이러스 및 슈도라비스와 같은 바이스성 DNA를 포함한다. 그러나, 그 외의 어떠한 벡터라도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능한 경우에는 사용될 수 있다.

적당한 DNA 서열을 각종 방법에 의해 벡터내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 이러한 DNA 서열은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위 내로 삽입된다. 이러한 방법 및 기타 방법은 당해 기술 분야의 숙련인의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.

발현 벡터 내의 DNA 서열은 적당한 발현 조절(control) 서열(프로모터)에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 상기 프로모터의 대표적인 예로서, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이(E. coli) lac또는trp, 파아지 람다 P_L프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스 내에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 언급할 수 있다. 또한 발현 벡터는 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결인자를 함유한다. 상기 벡터는 발현을 증폭시키기에 적합한 서열을 포함할 수도 있다.

또한, 발현 벡터는 바람직하게는, 진핵 세포 배양의 경우에는 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는이. 콜라이내에서의 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선별성 마커 유전자를 함유한다.

상기 언급된 바와 같은 적당한 DNA 서열 뿐만 아니라 적당한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 적당한 숙주를 형질전환시킴으로써 상기 숙주가 단백질을 발현할 수 있도록 한다.

적합한 숙주의 대표적인 예로서는, 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)과 같은 세균성 세포; 효모와 같은 진균성 세포; 드로소필라 (Drosophila) S2및 스포도프테라(Spodoptera)Sf9와 같은 곤충류 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종과 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포 등을 언급할 수 있다. 적합한 숙주의 선별은 본 명세서의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인의 범주 내에 있다고 간주된다.

보다 특히, 본 발명은 또한 앞서 광범위하게 기술된 바와 같은 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 작제물도 포함한다. 이러한 작제물은 본 발명의 서열을 전진 또는 후진 방향으로 삽입시킨 플라스미드 또는 바이러스성 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 상기 양태의 바람직한 국면에서, 작제물은, 예를 들어 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지되어 있고, 시판되고 있다. 하기 벡터가 예로써 제공된다. 세균성: pQE70, pQE60, pQE-9(공급원: Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(공급원: Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(공급원: Pharmacia). 진핵성: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(공급원: Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(공급원: Pharmacia). 그러나, 그 외의 어떠한 플라스미드 또는 벡터도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용될 수 있다.

프로모터 영역은 CAT(Chloramphenicol transferase(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 기타 벡터를 선별성 마커와 함께 사용하여 바람직한 어떠한 유전자로부터도 선별할 수 있다. 두가지 적합한 벡터는 PKK232-8 및 PCM7이다. 특정하게 명명된 세균성 프로모터로는 lacⅠ, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P_R, P_L및 trp가 있다. 진핵성 프로모터로는 CMS 즉시 프로모터, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ이 있다. 적당한 벡터 및 프로모터의 선별은 충분히 당해 분야에서 통상적인 기술의 범주 내이다.

추가 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 저등 진핵 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 세균성 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 작제물의 숙주 세포로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 전기천공(electroporation)에 의해 수행할 수 있다[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Method in Molecular Biology, (1986)].

숙주 세포 내의 작제물은 통상적인 방법으로 사용되어 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 본 발명의 폴리펩티드를 통상적인 펩티드 합성기에 의해 합성적으로 제조될 수 있다.

성숙한 단백질은 적합한 프로모터의 조절하에 포유류 세포, 효모, 세균, 또는 기타 세포 내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하기 위해 무세포 해독 시스템을 사용할 수도 있다. 원핵성 및 진핵성 숙주와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있고, 본 발명의 명세서에 참조로 인용된다.

고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서(enhancer) 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 통상적으로 약 10 내지 300bp이고 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는, DNA의 cis-작용성 요소이다. 복제 기원 bp 100 내지 270의 말단측 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 말단측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 예로서 포함한다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기원; 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선별성 마커, 예를 들어 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)TRP1 유전자의 앰피실린 내성 유전자; 및 하부 구조 서열의 전사를 지시하는 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열 쇼크 단백질 등과 같은 해당촉진성 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종 구조 서열은 해독 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 해독된 단백질이 세포질 공간 또는 세포외 매질 내로 분비되도록 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 적당한 상에서 어셈블리된다. 임의로, 이러한 이종 구조 서열은 목적하는 특성, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간소화된 정제를 제공하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.

세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 목적하는 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 적합한 해독 개시 및 종결 시그날과 함께, 작용성 프로모터를 가진 작동성 판독 상 내로 삽입함으로써 작제한다. 상기 벡터는 하나 이상의 표현형 선별성 마커 및 복제 기원을 포함하여 벡터를 유지할 수 있고, 필요한 경우 숙주 내에서 증폭을 제공한다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주 세포로는 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살포넬라 티피무리움, 및 슈도모나스(Pseudomanas) 속, 스트렙토마이세스 속 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 내의 각종 종들이 있지만, 다른 것들을 선택하여 사용할 수도 있다.

대표적이나 이에 제한되지 않는 예로서, 세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 익히 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 시판용 플라스미드로부터 유도된 선별성 마커 및 세균성 복제 기원을 포함할 수 있다. 이러한 시판용 벡터로는, 예를 들어 pKK223-3(제조원: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 pGEM1(제조원: Promega Biotec, Madison, WI, USA)이 있다. 상기 pBR322 중축(backbone) 절편을 적당한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 결합한다.

적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 적당한 세포 밀도로 숙주 균주를 성장시킨 다음, 선별된 프로모터를 적합한 방법(예: 온도 변화 또는 화학적 유도)으로 유도시키고 세포들을 추가 기간 동안 배양한다.

세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단으로 파쇄한 다음, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 보유한다.

단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 당해 기술 분야의 숙련인에게 익히 공지된 방법들인 냉동-해동 순환, 초음파 분해처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 통상적인 방법에 의해 파쇄시킬 수 있다.

또한, 각종 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 적합성 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 기원, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플리스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열 및 5' 플랜킹 비전사 서열을 포함한다. SV40 스플리스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 필요로 하는 비-전사 유전적 요소를 제공할 수 있다.

폴리펩티드를 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그패피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계를, 필요한 경우 성숙한 단백질의 배열을 완성하는데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물이거나, 또는 화학적 합성 과정 또는 원핵 또는 진핵 세포 숙주(예를 들어, 배양물 중의 세균성, 효모, 고등 식물, 곤충류 및 포유류 세포에 의해)로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물일 수 있다. 재조합 제조 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 글리코실화 되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또는 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩티드는 사람 질병에 대한 치료 및 진단법을 발견하기 위한 연구 시약 및 물질로 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드는 암 화학치료를 하는 동안 보조의 보호 치료로서 골격 골수 스템 세포 콜로니 형성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. Ckβ-13 폴리 펩티드는 골격 골수 스템 세포와 같은 조혈성 세포의 증식 및 분화를 억제할 수 있다. 인정된 모 세포(예; 과립구 및 대식구/단구)의 증식을 억제하는 효과는 백혈병 세포의 증식을 치료적으로 억제하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 피부의 랑스한거 세포가 케모킨 생성에 발견되므로 각질구의 과대 증식을 특징으로 하는 건선 치료용 외피성 각질구 증식에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 숙주 방어 세포(예; 세포 유주성을 통한 세포증식억제 T 세포 및 대식구)의 침입과 활성을 촉진시킴으로, 종양의 혈관 형성을 억제하므로써 고체 종양, 예를 들면 칼포시(Karposi) 육종 치료에 사용 될 수 있다.

또한, 이들은 만성 및 급성 감염, 예를 들면 살균성 백혈병의 유인 및 활성을 통한 세균적 감염의 내성에 대한 숙주 방어를 강화하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 T-세포 조절된 자가-면역 질환 및 림프구의 백혈병 치료용 IL-2 생합성의 억제로 T세포 증식을 억제하기 위해 사용될 수 있다.

또한, Ckβ-13은 파편 제거 및 결합 조직 촉진 염증 세포의 회복과 과도한 TGFβ-조절 섬유증의 조절을 통해서 상처 치유를 촉진하고, 상처 치유 동안 상처 자국을 막기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이와 동일한 방법으로 Ckβ-13은 간경화증, 골 관절염 및 폐 섬유증을 포함하는 다른 섬유성 장애를 치료하기 위해 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 주혈흡충병, 선모충병 및 회충증에서 조직에 침입하는 기생충을 사멸시기는 확실한 기능을 갖는 호산구를 증가시킨다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 다양한 조혈성 모세포의 활성화 및 분화를 조절, 예를 들면 뼈 골수로 부터 성숙한 백혈구를 방충하고 후속적으로 화학치료하므로써 조혈 조절에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들면 암 치료시 세포소멸을 위해 불필요한 세포를 목적으로 적용될 수 있다.

또한, 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드로 암호화된 폴리펩티드는 과학적 연구, DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 목적으로, 사람 질병 치료용 치료제 및 진단제를 고안하기위해 시험관 내에서 사용될 수 있다.

또한 폴리펩티드는 골격 골수 스템 세포를 스템 세포의 분리에 용이하게 어용되는 말초 혈액으로 이동시키는데 사용될 수 있다. 분리된 스템 세포는 많은 양의 화학치료 후에 골격 골수 콜로니화를 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에서 돌연변이체의 존재에 관련된 질병 또는 질병에 민감도를 탐색하기 위한 진단 분석법의 한부분으로써 Ckβ-13 유전자의 용도에 관한 것이다. 상기 질병은 사람 케모킨의 저-발현, 예를 들면 종양 및 암에 관한 것이다.

본 발명의 유전자에서 돌연변이체를 수행하는 개체는 다양한 기술로 DNA 수준에서 검색될 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예를 들면 혈액, 뇨, 타액, 조직 생체검사 및 검시 물질로 부터 수득될 수 있다. 게놈성 DNA는 검색용으로 직접 사용될 수 있거나 분석하기 전에 PCR을 사용하여 효소적으로 증폭될 수 있다[문헌참조; Saiki et al., Nature, 324: 163-166(1986)]. 또한 RNA 및 cDNA도 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면 Ckβ-13을 암호화하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머는 Ckβ-13 돌연변이체를 동정하고 분석하기 위해 사용될 수 있다. 에를 들면 손실과 삽입은 정상 유전형과 비교한 증폭된 생성물의 크기의 변화로 검색될 수 있다. 점 돌연변이를, 방사표지된 Ckβ-13 RNA 또는 대안으로 방사표지된 Ckβ-13 앤티센스 DNA 서열에 증폭된 DNA를 하이브리드화시킴으로써 동정할 수 있다. 완전히 일치하는 서열은 RNase A 분해 또는 융해 온도의 차이로 일치하지 않는 이중선과 구별될 수 있다.

DNA 서열 차이에 기초한 유전적 시험은 젤상에서 변성 물질의 존재 또는 부재시 DNA 단편의 전기영동적 이동으로 변화를 검색하므로써 달성될 수 있다. 소형 서열 손실 및 삽입은 고 해상도 젤 전기영동으로 가시화할 수 있다. 다른 서열의 DNA 단편은 다른 DNA 단편의 이동이 특이적 융해 또는 부분적 융해 온도에 따라서 젤상의 다른 위치에서 지체되는 변성 포름아미드 구배 젤로 구별될 수 있다[참조; Myers et al., Science, 230: 1242(1985)].

또한 특이적 위치에서의 서열 변화는 뉴클레아제 보호 검정(예; RNase 및 S1 보호) 또는 화학 분열 방법으로 나타날 수 있다[예; Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401(1985)].

또한 특이적 DNA 서열의 탐색은 방법, 예를 들면 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 분열, 직접적 DNA 서열화 또는 제한 효소의 사용[예; Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)] 및 게놈성 DNA의 서던 블롯팅으로 달성될 수 있다.

더욱 일반적인 방법으로 젤-전기영동 및 DNA 서열화이외에도 돌연변이체는 또한 그 자체로 분석으로 검색될 수 있다.

또한 본 발명은 정상 조절 조직 샘플에 비해 과발현의 폴리펩티드는 질병, 예를 들면 종양의 존재 또는 민감성을 검시할 수 있으므로 다양한 방사능표지된 Ckβ-13 한 조직에서 본 발명의 폴리펩티드의 변화 수준을 검시하기 위한 진단 분석법에 관한 것이다. 숙주로 부터 추출한 샘플에서 본 발명의 폴리펩티드의 수준을 검시하기 위해 사용된 검정은 당해 기술분양의 숙련인에게는 공지되 있고, 방사면역검정, 경쟁적-결합 검정, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 검정 및 Sandwich 검정을 포함한다. ELISA 검정은 먼저 Ckβ-13 항원에 특이적인 항체의 제조, 바람직하게는 모노클로날 항체를 포함한다[Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), ghapter 6, (1991)]. 또한 리포터 항체가 모노클로날 항체에 대해 제조된다. 리포터 항체에 검시 가능한 시양, 예를 들면 방사 활성, 형광(예; 홀스래디쉬 퍼옥시다제 효소)을 부착시킨다. 샘플은 숙주로 부터 제거되고, 샘플의 단백질에 결합한 고체 지지체(예; 폴리스티렌 접시)에서 배양된다. 접시상 결합 부위의 유리 단백질은 BSA와 같은 비특이적 단백질과 배양하므로 포함된다. 그 후 모노클로날 항체는 모노클로날 항체가 폴리스티렌 접시에 부착된 어떤 Ckβ-13 단백질에 부착하는 시간 동안 접시에서 배양된다. 모든 비결합 모노클로날 항체는 완충용액으로 세척한다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 결합된 리포터 항체를 접시상에 놓은 결과 리포터 항체는 Ckβ-13 폴라펩티드에 결합한 어던 모노클로날 항체에 결합한다. 그후 비부착 리포터 항체를 세척한다. 그후 퍼옥시다제 기질을 접시에 가하고, 주어진 시간 동안 발전된 색의 양은 표준 곡선과 비교앴을 때 환자 샘플의 용적내에 존재하는 Ckβ-13 단백질의 양으로 측정된다.

경쟁적 검정 방법을 사용할 수 있는데, 여기서는 Ckβ-13에 특이적인 항체를 고체 지지체에 부착시키고, 표지된 Ckβ-13 폴리펩티드 및 숙주로부터 유도된 샘플을 상기 고체 지지체 위로 통과시키고 상기 고체 지지체에 부착되어 검출된 표지의 양을 샘플 내의 Ckβ-13의 양과 상관지울 수 있다.

샌드위치 검정은 ELISA 검정과 유사하다. 샌드위치 검정에 있어서, Ckβ-13 폴리펩티드를 고체 지지체 위로 통과시켜 이러한 고체 지지체에 부착된 항체와 결합시킨다. 이어서, 제2 항체를 Ckβ-13 폴리펩티드에 결합시킨다. 제2 항체에 특이적으로 표지시킨 제3 항체를 고체 지지체 위로 통과시키고 제2 항체에 결합시킨 후 정량화할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 수용체의 동정 방법을 제공한다. 이러한 수용체를 암호화하는 유전자를 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지된 다수의 방법, 예를 들어 리간드 패닝(panning) 및 FACS 분류에 의해 동정할 수 있다[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)]. 바람직하게는 폴리아데닐화 RNA를 Ckβ-13 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조하고, 이러한 RNA로부터 창출된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하고 Ckβ-13에 대해 반응성이 없는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는 발현 클로닝을 사용한다. 유리 슬라이드 상에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 Ckβ-13에 노출시킨다. Ckβ-13를 부위 특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 혼입을 포함하는 각종 방법으로 표지시킬 수 있다. 고정 및 배양한 다음, 슬라이드를 대상으로 자동 방사성 사진술을 이용하여 분석한다. 양성 풀을 동정하고 서브-풀을 제조하고 반복되는 서브-풀링 및 재스크리닝 방법을 사용하여 재형질감염시켜, 최종적으로 추정상의 수용체를 암호화하는 단일 클론을 수득한다.

수용체 동정에 대한 또 다른 접근법으로서, 표지된 폴리펩티드를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 제제와 광친화적으로 연결시킬 수 있다. 가교결합된 물질을 PAGE에 의해 분할하고 X-레이 필름에 노출시킨다. 폴리펩티드의 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단하고, 펩티드 단편으로 분할하고, 단백질 미소서열분석시킨다. 미소서열분석으로부터 수득된 아미노산 서열을 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 디자인하는데 사용하여 추정상의 수용체를 암호화하는 유전자를 동정할 수 있다.

본 발명은 본발명의 폴리펩티드에 대한 작용 물질 및 길항제를 동정하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. 효능제는 본 발명의 폴리펩티드와 결합하고, 수용체를 활성화 시키는 화합물인 반면, 길항제는 상기 수용체와 결합하고 억제하거나 단순히 상기 수용체에 대한 Ckβ-13과 경쟁한다. 물질주성은 본 발명의 폴리펩티드에 의해 화학적으로 유인되는 세포를 세포가 통과되기 충분한 지름, 약 5㎛의 구멍을 갖는 필터상에 놓으므로써 검정할 수 있다. 유효한 효능액을 적합한 상부의 조절 배지와 함께 채임버의 바닥에 놓고, 따라서 효능제의 농도 구배는 시간 경과에따라 다공성 막을 통해서 이동하는 세포를 계산하므로 측정된다.

길항제의 검정은 본 발명의 폴리펩티드를 채임버 바닥에 놓고, 세포의 물질주성이 억제될 경우, 결정하기 위해 유효한 길항제를 부가한다.

또한 폴리펩티드의 수용체가 발현되는 포유 동물 세포 또는 막제조는 화합물 존재시 표지된 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들면 방사활성과 배양된다. 이 상호 반응을 막기위한 화합물의 능력이 측정된다.

본 발명의 폴리펩티드에 대한 효능있는 길항제는 항체 또는 일부 경우, 폴리펩티드에 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 효능있는 길항제의 다른 예는 폴리펩티드의 음성 부위 돌연변이체이다 음성 부위 돌연변이체는 야생형 폴리펩티드의 수용체에 결합하는 폴리펩티드이나 생물학적 활성을 함유하지 않는다.

또 다른 효능있는 Ckβ-13 길항제는 안티센스(antisense) 기술을 사용하여 제조된 안티센스 작제물이다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중-나선 구조 형성을 통하여 유전자 발현을 조절하거나 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여 유전자 발현을 조절하는데, 이들 방법 모두는 폴리뉴클레오티드를 DNA 또는 RNA에 결합시키는 것을 기초로 한다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인한다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관계된 유전자 영역에 상보적이도록 디자인함으로써[삼중 나선 - 참조: Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney et al, Science, 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science, 251: 1360(1991)], 전사 및 Ckβ-13의 생성을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드가 생체 내에서 mRNA와 하이브리드화하고 mRNA 분자가 Ckβ-13 폴리펩티드로 해독되는 것을 차단한다[안티센스-참조: Okano, J. Neurochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)]. 또한 상기 언급된 올리고뉴클레오티드를 세포로 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 Ckβ-13의 생성을 억제할 수 있도록 한다.

다른 효능있는 길항제는 자연적으로 또는 합성적으로 변형된 생물학적 활성을 잃은 폴리펩티드의 유사물인 폴리펩티드의 펩티드 유도체이나 폴리펩티드의 수용체를 인식하고, 이에 결합하므로 효과적으로 수용체를 차단한다. 펩티드 유도체의 예는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자가 있지만 이에 제한되지는 않는다.

길항제는 어떤 자가 면역, 만성 염증 및 감염성 질병에 있어서, 생물주성, 대식구와 이의 전구체, 호중구, 호염구, B 림프구 및 일부의 T 세포 서브셋의 활성, 예를 들면 활성화되고 CD8 세포성장 억제성 T 세포 및 천연 사멸 세포의 활성을 억제하기 위해 사용된다. 자가 면역 질병은 다중성 경화증 및 인슐린 의존성 당뇨병을 포함한다.

또한 길항제는 단핵상 식세포의 회복 및 활성을 억제하는 규폐증, 유육종증, 특발성 폐 섬유증을 포함하는 감염성 질병의 치료에 적용될 수 있다. 또한 상기 길항제는 호산성 생성 및 이동을 억제하므로써 특발성 과호산성 증후군을 치료하기 위해 적용될 수 있다. 내독성 쇼크는 또한 대식구의 이동 및 본 발명의 폴리펩티드의 생성을 억제하므로써 길항제에 의해 치료될 수 있다.

길항제는 또한 동맥 벽에서 단구의 침입을 억제하므로써 동맥경화증을 치료하기 위해 적용될 수 있다.

또한 길항제는 케모킨-유발된 매스트 세포와 호염성 과립화를 억제하므로써 히스타민-매개된 알레르기성 반응 및 말기 알레르기성 반응, 만성 위궤양 및 국부성 피부염을 포함하는 면역성 장애 및 히스타민의 방출을 치료하기 위해 적용될 수 있다. 알레르기성 천식, 비염 및 습진과 같은 IgE-매개된 알레르기성 반응 또한 치료될 수 있다.

또한 길항제는 상처 부위에 단구의 침입을 억제하므로써 만성 및 국소 염증을 치료하기 위해 적용될 수 있다. 상기 길항제는 또한 폐에서 만성 및 급성 염증성 폐 질병이 중핵성 식세포의 부골형성과 관련되므로 정상 폐의 대식구 질병을 조절하기 위해 적용될 수 있다.

길항제는 또한 환자의 관절에서 단구가 관절 낭액으로 침투하는 것을 억제하므로써 류마티즘성 관절염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 단구의 흐름 및 활성은 퇴행성 및 염증성 관절증에 발명에 중요한 역할을 한다.

길항제는 주로 다른 염증성 사이토킨의 생합성을 억제하는 IL-1 및 TNF에 기인하는 악화성 케스케이드를 간섭하기 위해 적용될 수 있다. 다른 방법으로, 길항제는 염증을 억제하기 위해 적용될 수 있다. 길항제는 또한 케모킨에 의해 유도되는 프로스타그란딘-의존성 열을 억제하기 위해 적용될 수 있다.

길항제는 또한 골격 골수 장애, 예를 들면 재생불량성 빈혈 및 골수이형성 증후군을 치료하기 위해 적용될 수 있다.

길항제는 또한 폐에 호산성 축적을 억제하므로써 천식 및 알레르기를 치료하기 위해 적용될 수 있다. 길항제는 또한 천식성 폐의 주된 특징인 부상피 기저 막 섬유증을 치료하기 위해 적용될 수 있다.

상기 길항제를 다음에 언급된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물에 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드, 작용 물질, 길항제를 적합한 약제학적 담체와 배합하여 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 당해 폴리펩티드 또는 길항제 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 상기 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 배합물이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 제형물은 투여 형태에 적합해야 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 컨테이너와 관련된 사항은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지일 수 있고, 이러한 통지는 상기 정부 기관에 의한, 사람 투여용 제품에 대한 제조, 사용 또는 판매의 승인을 반영한다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 다른 치료학적 화합물과 함께 사용할 수 있다.

당해 약제학적 조성물은 통상적인 방법, 예를 들어 경구, 국부, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피내 경로로 투여할 수 있다. 약제학적 조성물은 특이적인 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여한다. 일반적으로, 이를 1일 약 10μg/체중 kg 이상의 양으로 투여하고 대부분의 경우에는 1일 약 8mg/체중 kg을 초과하지 않는 양으로 투여해야 한다. 대부분의 경우에, 투여량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 1일 약 10μg/체중 kg 내지 약 1mg/체중 kg이다.

본 발명의 폴리펩티드, 및 폴리펩티드인 및 길항제는 본 발명에 따라서, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현시킴으로써 사용할 수도 있는데, 이를 종종 유전자 치료(gene therapy)라고 부른다.

따라서, 예를 들어 환자의 세포를 생체 외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)로 유전적으로 조작한 다음, 이와 같이 유전적으로 조작된 세포를 상기 폴리펩티드로 치료하고자 하는 환자에게 제공할 수 있다. 상기 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 사용함으로써 당해 분야에 공지된 방법으로 조작할 수 있다.

유사하게 세포를, 예를 들어 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 폴리펩티드를 생체 내에서 발현시키기 위해 생체 내에서 조작할 수 있다. 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위한 생산자 세포를 생체 내에서 세포를 조작하고 생체 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 상기 과정에 의해 투여하는 방법 및 기타 방법은 본 발명의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백하여야 한다. 예를 들어, 세포를 조작하기 위한 발현 비히클(vehicle)은 레트로바이러스 이외의 것일 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스를 적합한 전달 비히클과 결합시킨 후에 생체 내에서 세포를 조작하는데 사용할 수 있다.

상기 언급된 레트로바이러스성 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 멍키 쥐과 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 로우스 육종 바이러스와 같은 레트로바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 기본 아페 백혈병 바이러스, 사람 면역결핍증 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 포유류 종양 바이러스가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 한 양태에 있어서, 레트로바이러스성 플라스미드 벡터는 멍키 쥐과 백혈병 바이러스로부터 유도된다.

이러한 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 레트로바이러스성 LTR; SV40 프로모터; 및 문헌[참조: Miller et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990(1989)]에 기재된 사람 사이토메갈로바이러스(CMV), 또는 기타 프로모터(예를 들면, 히스톤, pol Ⅲ 및 β-악틴 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 진핵성 세포내 프로모터와 같은 세포내 프로모터)가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이용될 수 있는 기타 바이러스성 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 B19 파르보바이러스 프로모터가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 프로모터의 선택은 본 명세서의 교시로부터 당해 분야의 숙련인에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 이용될 수 있는 적합한 프로모터로는 아데노바이러스성 주 후기 프로모터와 같은 아데노바이러스성 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV)와 같은 이종 프로모터; 호흡기 합포체성 바이러스(RSV) 프로모터; MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터와 같은 유도성 프로모터; 열 쇼크 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터와 같은 바이러스성 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스성 LTR(상기 언급된 바와 같은 변형된 레트로바이러스성 LTR을 포함함); β-액틴 프로모터; 및 사람 성장 호르몬 프로모터가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 프로모터는 또한 당해 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 본래의 프로모터일 수도 있다.

레트로바이러스성 플라스미드 벡터를 사용하여 패키징 세포주를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성할 수 있다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예로는 본원에 참조로 삽입된 문헌[참조: Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, p. 5-14(1990)]에 기술된 바와 같은 PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DNA 세포주가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 벡터는 당해 분야에 공지된 어떠한 수단을 통해서 패키징 유전자를 형질도입할 수 있다. 이러한 수단으로는 전기 영동, 리포좀의 사용 및 CaPO₄침전이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나의 또다른 양태에서는, 레트로바이러스성 플라스미드 벡터를 리포좀 내로 봉입하거나 지질에 커플링시킨 다음 숙주에 투여할 수 있다.

생산자 세포주는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스성 벡터 입자를 생성시킨다. 이러한 레트로바이러스성 입자를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 진핵성 세포를 형질도입할 수 있다. 이와 같이 형질도입된 진핵 세포는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포로는 배아 간세포, 배아 암종 세포, 및 조혈성 간 세포, 헤파토사이트, 섬유아세포, 근원세포, 각질세포, 내피 세포 및 기관지 상피 세포가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 서열은 또한, 염색체 동정에도 유용하다. 상기 서열은 개개의 사람 염색체 상의 특정한 위치에 대해 특이적으로 표적되고 이와 하이브리화할 수 있다. 더욱이, 현재 염색체 상의 특정 부위를 동정해야 할 필요가 있다. 염색체 위치를 표식하기 위한, 실제 서열 데이터(반복 다형성)를 기준으로 하는 염색체 표식화 시약을 현재 거의 입수할 수 없다. 본 발명에 따라 염색체에 대한 DNA의 유전자 위치를 나타내는 것(지도화)은 이들 서열을 질환과 관련된 유전자와 상호연관시키는데 있어서 중요한 제1 단계이다.

간략히 언급하면, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25bp)를 제조함으로써 서열을 염색체에 대해 지도화할 수 있다. 3' 비-해독된 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA 내에 하나 이상의 엑손을 걸치지 않는 프라이머를 신속하게 선별하여, 증폭 과정을 복잡하게 만든다. 다음, 상기 프라이머를 개개의 사람 염색체를 함유하는 체강 세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 생성시킬 수 있다.

체강 세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정 DNA를 특정 염색체로 분배하기 위한 신속한 방법이다. 본 발명에 있어서 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 서브-국재(sublocalization)를 특이적 염색체 또는 대형 게놈 클론의 풀로부터의 단편의 패널을 사용하여 유사한 방법으로 성취할 수 있다. 이의 염색체로 지도화하는데 유사하게 사용될 수 있는 다른 지도화 방법으로는 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 작제하기 위한, 동일계 내의 하이브리드화, 표지된 플로우(flow)-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝 및 하이브리드화에 의한 예비선별 방법이 있다.

cDNA 클론을 중기 염색체 확산배양물과 동일계 내에서 형광성 하이브리드화(FISH)시켜 1단계로 정확한 염색체의 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 50 또는 60개 염기정도로 짧은 cDNA를 사용할 수 있다. 상기 기술의 재고를 위해, 문헌[참조: Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조할 수 있다.

서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치를 유전자 지도 데이터와 상호연관시킬 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들어 문헌[참조: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man](Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통해 온 라인으로 구입할 수 있다)에서 발견된다. 다음, 동일한 염색체 영역에 지도화시킨 유전자와 질환간의 관계를 결합 분석(물리적으로 인접한 공동유전형질)을 통해 동정한다.

다음, 감염자 및 비감염자간의 cDNA 또는 게놈 서열 차이를 결정하는 것이 필요하다. 돌연변이가 몇몇 감염자 또는 모든 감염자에서 관찰되나 정상인에서는 관찰되지 않을 경우, 이러한 돌연변이가 아마도 상기 질환의 유발 원인제일 것이다.

통상적인 물리적 지도화의 분해 및 유전학적 지도화 기술을 이용하면, 상기 질환과 연관된 염색체 영역으로 정확하게 국재된 cDNA가 50 내지 500가지의 효능있는 유발 원인성 유전자 중의 하나일 수 있다(이는 1 메가염기 지도화 분해능 및 20kb당 하나의 유전자를 취한다).

당해 폴리펩티드, 이의 단편 또는 기타 유도체, 이의 동족체, 또는 이들을 발현시키는 세포를 면역원으로서 사용하여 이에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 이들 항체는, 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날항체일 수 있다. 또한 본 발명은 키메라성, 일본쇄, 및 사람적응화 항체 뿐만 아니라 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당해 기술 분야에 공지된 각종 방법을 상기 항체 및 단편을 제조하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는, 상기 폴리펩티드를 동물 내로 직접 주사하거나 상기 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 사람이 아닌 동물에게 투여함으로써 수득할 수 있다. 다음, 상기와 같이 수득된 항체는 상기 폴리펩티드 자체에 결합될 것이다. 이러한 방법으로, 당해 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열이라도 완전한 천연 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 이어서, 상기 항체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 발현시키는 조직으로부터 상기 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다.

모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속적인 세포주 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 어떠한 기술도 사용할 수 있다. 이의 예로는 하이브리도마(hybridoma) 기술[참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497], 트리오마(trioma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72], 및 사람 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Caner Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]이 있다.

일본쇄 항체의 제조를 위해 기술된 기술[미국 특허 제4,946,778호]을 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 일본쇄 항체를 제조하는데 적용할 수 있다. 또한, 유전자전환된 마우스를 사용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 사람적응화 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이나; 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는 다는 것을 인지해야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 부 또는 양은 중량 기준이다.

하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해, 종종 나타나는 특정 방법 및/또는 용어에 관해 기술한다.

플라스미드는 처음에는 소문자 p로 표기하고/거나 그 다음에는 대문자 및/또는 숫자로 표기한다. 본 발명에서 출발 플라스미드는 제한되지 않은 조건으로 공개적으로 구입할 수 있도록 시판중이거나, 또는 시판용 플라스미드로부터 공개된 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 것과 동등한 플라스미드는 당해 기술에 공지되어 있고 통상의 숙련인에게 명백할 것이다.

DNA의 분해(digestion)란 DNA의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적 절단하는 것을 지칭한다. 본 발명에 사용된 각종 제한 효소는 시판용이고 이의 반응조건, 보조인자 및 기타 필요조건은 통상의 숙련인에게 공지된 바와 같이 사용된다. 분석 목적을 위해서는, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 1μg을 약 20μl의 완충액에서 효소 약 2 유니트와 함께 사용한다. 플라스미드 작제를 위해 DNA 단편을 분리하고자 하는 경우에는, 전형적으로 DNA 5 내지 50μg을 효소 20 내지 250 유니트를 사용하여 보다 큰 용적으로 분해한다. 특정 제한 효소에 적합한 완충액 및 기질의 양은 제조업자에 의해 명시된다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되나, 공급자의 지시에 따라 변화될 수 있다. 분해 후에, 반응물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리시킨다.

절단된 단편의 크기 분리는 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057(1980)]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.

올리고뉴클레오티드란 화학적으로 합성할 수 있는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 두 개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 가지지 않으므로 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 첨가하지 않을 경우 또 다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않는다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 연결될 것이다.

연결(ligation)이란 두 개의 이본쇄 핵산 단편간의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 지칭한다[참조: Maniatis, T., et al., Id., p. 146]. 다른 방법으로 제공하지 않는 한, 공지된 완충액 및 조건을 이용하여, 거의 등몰량의 연결시키고자 하는 DNA 단편 0.5μg당 T4 DNA 리가제(리가제) 10 유니트를 사용하여 연결을 수행한다.

달리 언급되지 않는 한, 형질전환은 문헌[참조: Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457(1973)]에 기술된 방법과 같이 수행한다.

실시예 1

Ckβ-13의 세균성 발현 및 정제

Ckβ-13를 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 97113)을, 프로세싱된 Ckβ-13 핵산 서열의 5' 서열(- 추정 시그날 펩티드 서열) 및 3' 말단 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. Ckβ-13 유전자에 상응하는 부가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 말단 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 SphⅠ 제한 효소 부위(진하게 표시됨)를 함유하고, 후속적으로 성숙한 단백질에 대한 2차 뉴클레오티드의 서열 암호화로부터 출발하는 Ckβ-13 암호화 서열 16 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5' CCCGCATGCCCAACATGGAAGACAG 3'(서열 3)을 갖는다. ATG 코돈은 SphI 부위에 포함한다. ATG 다음의 코돈에 있어서, 처음 염기는 SphI 부위로 부터이고, 잔여의 2개의 추정된 성숙한 단백질의 처음 코돈(29 잔기)의 두 번째 및 세 번째 염기에 상응한다. 3' 서열 5' AAAGGATCCTTGGCTCAGCTTATTGAG 3'(서열 4)은 BamH1 부위(진하게 표시됨)에 상보적인 서열을 함유하고, 후속적으로 종결 코돈 에 선행하는 18 뉴클레오타니드의 유전자 특이적 서열을 함유한다. 상기 제한 효소 부위는 세균성 발현 벡터 pQE-9(공급원: Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 91311) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. pQE-9는 항생제 내성(Amp^r), 세균성 복제 기원(ori), IPTG-조절성 프로모터 작동인자(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 그 다음, pQE-9를 SphI및 BamHⅠ을 사용하여 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-9에 연결하고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열을 이용하여 동일한 프레임 내에 삽입한다. 그 다음, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 방법에 의해 이. 콜라이 균주 M15/rep 4(공급원: Qiagen, Inc.)를 형질전환시킨다. M15/rep 4는 lacⅠ 억제인자를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 복사물을 함유한다. LB 판 상에서 성장하는 이의 능력에 의해 형질전환체를 동정하고 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리시키고 제한 분석에 의해 확인한다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100ug/ml)와 Kan(25ug/ml) 모두가 보충된 LB 배지 중의 액체 배양물에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비로 대형 배양물에 접종시킨다. 세포를 0.4 내지 0.6의 광밀도 600(O.D⁶⁰⁰)으로 성장시킨다. 그 다음, IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드)를 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 한다. lacⅠ 억제인자를 불활성화시킴으로써 IPTG가 유도되는데, 이로써 P/O가 유전자 발현 증가를 유발시킨다는 것이 명백해졌다. 지수적 성장 배양이 되도록 세포를 3 내지 4시간 더 성장시킨다. 그 다음, 세포를 원심분리시켜 수거한다. 세포 펠렛을 카오트로픽제 6 몰랄 구아니딘 HCl pH 5.0에 용해시킨다. 액체를 정화한 후, 용해된 Ckβ-13을 6-His tag를 함유하는 단백질을 꽉 잡는 조건하의 닉켈-킬레이트 칼럼으로 크로마토그래피하여 용액을 정제한다[Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184(1984)]. Ckβ-13(순도 98%이상)을 6M 구아니딘 HCl로 컬럼으로 부터 용출시킨다. 몇가지 프로토콜로 GnHCl로 부터의 단백질을 재생시킨다[Jaenicke, R. and Rudolph, R., Protein Structure-A Practical Approach, IRL Press, New York (1990)]. 먼저 GnHCl을 제거하기 위해 투석 단계를 사용한다. 또한 , 니켈-킬레이트칼럼으로 부터 분리된 정제 단백질을 GnHCl 하향선 농도구배가 수행되는 2차 칼럼에 부하한다. 칼럼에 결합된 단백질을 재생하고, 연속적으로 250mM 이미다졸, 150mM NaCl, 25mM Tris-HCl pH 7.5 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충 용액으로 용출한다. 최종적으로 용해성 단백질은 5mM 중탄산암모늄을 함유하는 저장 완충액으로 투석한다.

실시예 2

COS 세포에서 재조합 Ckβ-13의 발현

플라스미드, Ckβ-13 HA의 발현은 1) 복제의 SV40 원형, 2) 암피실린 내성 유전자, 3) 이. 콜리 복제 원형, 4) 복합연결 부위, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위로 후속되는 CMV 프로모터를 함유하는 벡터 pcDNAI/Amp(Invitrogen)로 부터 유도된다. Ckβ-13 전구체와 프레임에서 이의 3' 말단으로 융합되는 HA 태그를 암호화하는 DNA 단편은 벡터의 복합연결 부위로 복제되므로 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터 하에서 직접된다. HA 태그는 상기 기술된 인플루엔자 헤마글루티닌으로 부터 유도된 에피토프에 상응한다(I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). 목적 단백질에 대한 HA 태그의 융합은 HA 에피토프를 인식하는 항체를 갖는 재조한 단백질로 쉽게 검시된다.

플라스미드 확립 전략은 하기와 같이 수행된다.

Ckβ-13 단백질을 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 97113)을 2개의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한다. 이러한 프라이머는 시작 코돈과 관련된 - 3 위치로 부터 시작하는 18 뉴클레오타이드의 Ckβ-13 암호화 서열로 후속되는 HindⅢ 부위를 함유하는 5' AAAAAGCTTAACATAGGCTCGCCTACAGACT 3'(서열 5)이고, XbaⅠ부위, 번역 종결 코돈(밑줄), HA 태그 및 Ckβ-13 암호화 서열의 마지막 21 뉴클레오타이드(종결 코돈을 포함하지 않음)에 상응하는 서열을 함유하는 5' CGCTCTAGA TTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTGGCTCAGCTTATTGAGAAT 3'(서열 6)이다. 그러므로 PCR 생성물은 HindⅢ 부위, 프레임에서 융합된 HA 태그로 후속되는 Ckβ-13 암호화 서열, 번역 종결 코돈 다음의 HA 태그, 및 XbaⅠ 부위를 함유한다. PCR로 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNA3/Amp는 HindⅢ 및 XbaⅠ 제한효소로 분해되고, 연결된다. 연결 혼합물은 이. 콜리 균주로 SURE(Stratagene Cloning System, La Jolla, CA)로 형질전환되고, 형질전환된 배양액을 앰피실린 함유 평판배지에 평판배양한다. 플리스미드 DNA는 형질전환체로 부터 분리되고, 수정 단편의 존재에 대한 제한 분석으로 검정된다. 재조합 Ckβ-13 폴리펩티드의 발현을 위해, COS 세포는 DEAE-DEXTRAN 방법으로 발현 벡터를 형질감염시킨다[J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]. 세포는 8시간 동안³⁵S-시스테인으로 표지되고, 2일 후에 형질감염된다. 그 후 배양액을 회수하고, 세포를 계면 활성제로 용율시킨다[RIPA 완충용액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM Tris, pH 7.5), Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984)]. 세포 용융물과 배양배지는 HA 특이적 모노클로날 항체로 침전된다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한다.

실시예 3

바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용한 Ckβ-13의 클로닝 및 발현

완전한 길이의 Ckβ-13 단백질을 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 97113)을 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머 서열은 5'AAAGGATCCGCCACCATGGCTCGCCTACAGACT 3'(서열 7)이고, 이들은 진핵세포에서 번역을 시작하기 위한 유효 신호를 재조합하는 6 뉴클레오티드[Kozak, M., J. Mpl. Biol., 196: 947-950(1987)]로 후속되는 BamHI 제한효소 부위(진하게) 및 Ckβ-13 유전자의 시작 18 뉴클레오타이드(번역 ATG에 대한 시작 코돈은 및줄침)를 함유한다.

3' 프라이머 서열은 5'AAAGGTACCTCATTGGCTCAGCTTATT3'(서열 8)이고, 이들은 제한 엔도뉴클레아제 Asp718에 대한 분열부위 및 Ckβ-13 유전자의 3' 비번역 서열에 상보적인 18 뉴클레오타이드를 함유한다. 증폭된 서열은 시판되는 키트(상표: Geneclean, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)를 사용하여 1% 아가로스 젤로부터 분리한다. 그후 단편을 엔도뉴클레아제BamHⅠ 및 Asp718로 분해시키고, 다시 1% 아가로스 젤로 정제한다. 이 단편을 F2로 명명한다.

벡터 pRG1(하기에 기술한 pVL941 벡터의 변형)을 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하는 Ckβ-13 단백질의 발현에 사용한다[참조: Summers, M.D. and Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555]. 이러한 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 강력한 폴리헤드린 프로모터에 이어 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 XbaⅠ에 대한 인식 부위를 함유한다. 원숭이 바이러스(SV) 40의 폴리아데닐화 부위를 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선별을 위해, 이. 콜라이로 부터의 베타-갈락토시다제를 폴리헤드린 프로모터에 이어 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날과 동일한 방향으로 삽입한다. 폴리헤드린 서열을 공동형질감염된 야생형 바이러스성 DNA의 세포-매개된 동종 재조합을 위한 바이러스성 서열에 의해 양측에 플랭킬할 수 있다. pA2 대신해서 수 많은 기타 바쿨로바이러스 벡터, 예를 들면 pRG1, pAc373, pVL941 및 pAcIM1을 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170: 31-39].

플라스미드를 제한 효소 BamHⅠ 및 XbaⅠ를 사용하여 분해한 다음, 송아지 장의 포스파타제를 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 탈포스포릴화한다. 그 다음, DNA를 시판용 키트(상표: Geneclean, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 이러한 벡터 DNA를 V2로 명명한다.

단편 F2와 탈포스포릴화 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 그 다음, 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시키고, 효소 BamHⅠ 및 Asp718을 사용하여 Ckβ-13 유전자를 갖는 플라스미드(pBac-Ckβ-13)에 함유된 세균을 동정하였다. 이와 같이 클론된 단편의 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인한다.

플라스미드 pBac Ckβ-13 5μg을 리포펙션(lipofection) 방법[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)]을 사용하여 시판용의 선형화된 바쿨로바이러스[상표: 바쿨로골드(BaculoGold^TM)바쿨로바이러스 DNA, 공급원: Pharmingen, San Diego, CA.] 1.0μg으로 공동형질감염시킨다.

바쿨로골드^TM바이러스 DNA 1μg 및 플라스미드 pBac Ckβ-13 5μg을 무혈청 그레이스 배지(공급원: Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) 50μl를 함유하는 미세역가 플레이트의 멸균 웰에서 혼합한다. 리포펙틴 10μl와 그레이스 배지 90μl를 가한 후에, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양한다. 그 다음, 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지와 함께 35mm 조직 배양 플레이트에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 상기 플레이트를 전후로 진탕하여 새로이 추가된 용액을 혼합한다. 그 다음, 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 배양한다. 5시간 후에 형질감염 용액을 상기 플레이트로부터 제거하고 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1ml을 가한다. 상기 플레이트를 배양기 내에 넣고 4일 동안 27℃에서 계속 배양한다.

4일 후에 상등액을 수집하고 플라크 분석을 상기 섬머즈(Summers)와 스미스(Smith)에 의해 기술된 바와 유사하게 수행한다. 한 변형으로서, 블루 염색된 플라크를 용이하게 분리시키도록 하는 블루 갈(Blue Gal)[Life Technologies Inc., Gaithersburg]이 수반된 아가로스 겔을 사용한다. (플라크 분석의 상세한 설명은 공급자(Life Technologies Inc., Gaithersburg)에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로바이러스학에 관한 사용자 지침서 제9면 내지 제10면에서 참조할 수 있다).

일련의 희석을 수행한지 4일 후에, 바이러스를 세포에 가하고, 블루 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫 팁으로 골라낸다. 그 다음, 재조합 바이러스를 함유하는 한천을 그레이스 배지 200μl를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시킨다. 상기 한천을 단시간의 원심분리에 의해 제거하고 재조합 바쿨로바이러스를 함유하는 상등액을 사용하여 35mm 디쉬에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후에 상기 배양 디쉬의 상등액을 수거한 다음 4℃에서 저장한다.

Sf9 세포를 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 그레이스 배지 내에서 성장시킨다. 상기 세포를 감염 다중도(multiplicity of infection(MOI)) 2에서 재조합 바쿨로바이러스 V-Ckβ-13로 감염시킨다. 6시간 후에 배지를 제거하고 메티오닌 및 시스테인 부재의 SF900 Ⅱ 배지[Life Technologies Inc., Gaithersburg]로 대체한다. 42시간 후에³⁵S-메티오닌 5μCi 및³⁵S 시스테인 5μCi(공급원: Amersham)를 가한다. 세포를 원심분리에 의해 수거하기 전에 16시간 동안 추가로 배양하고 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자가방사성사진에 의해 가시화시킨다.

실시예 4

유전자 치료를 통한 발현

피부 검시에 의해 특정 대상체로부터 섬유아세포를 수득한다. 생성된 조직을 조직 배양 배지에 놓아 두고 작은 조각으로 분리시킨다. 이러한 작은 조각을 조직 배양 플라스크의 젖은 표면 위에 놓아두는데, 약 10조각을 각 플라스크에 놓아둔다. 이 플라스크를 거꾸로 하고, 단단하게 밀봉시킨 다음 실온에 밤새 방치시켜 둔다. 실온에서 24시간 후, 플라스크를 전위시키고 조직 조각을 플라스크의 바닥에 고정시킨 채로 두며 신선한 배지(예: 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 햄의 F12 배지)를 가한다. 이어서, 이를 37℃에서 약 1주 동안 배양한다. 이때, 신선한 배지를 가하고 매 수일마다 계속해서 교체한다. 2주간 더 배양한 후, 섬유아세포의 단층이 나타난다. 이러한 단층을 트립신으로 처리하고 보다 큰 플라스크로 늘린다.

몰로니 쥐의 육종 바이러스의 긴 말단 반복에 의해 플랭킹된 pMV-7[참조: Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)]을 EcoRⅠ 및 HindⅢ로 분해하고 연속적으로 송아지 장내 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로즈 겔 상에서 분획화하고 유리 비드를 사용하여 정제한다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 5' 및 3' 말단 서열에 각각 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 5' 프라이머는 EcoRⅠ 부위를 함유하고 3' 프라이머는 HindⅢ 부위를 또한 함유한다. 몰로니 쥐의 육종 바이러스 선형 중축과 증폭된 EcoRⅠ 및 HindⅢ 단편의 등량을 T4 DNA 리가제의 존재하에서 함께 가한다. 생성된 혼합물을 두 단편을 연결시키기에 적당한 조건하에서 유지시킨다. 연결 혼합물을 사용하여 세균 HB101을 형질전환시키고, 이를 벡터가 적절하게 삽입된 문제의 유전자를 함유하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여 한천을 함유하는 카나마이신 위로 도말한다.

앰포트로픽 pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 조직 배양액에서 성장시켜 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 둘벡코 변형된 이글즈 배지(DMEM)에서 밀도를 합류시킨다. 상기 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 가하고 패키징 세포를 상기 벡터로 형질도입한다. 이때 패키징 세포는 유전자를 함유하는 감염성 바이러스성 입자를 생산한다(패키징 세포는 본원에서 생산자 세포로서 지칭됨).

신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 가하고 연속적으로 합류된 생산자 세포의 10cm 플레이트로부터 배지를 수거한다. 감염성 바이러스성 입자를 함유하는 소모된 배지를 미소기공 여과기를 통하여 여과시켜 분리된 생산자 세포를 제거하고 이 배지를 사용하여 섬유아세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 아-합류된 플레이트로부터 제거하고 생산자 세포로부터의 배지로 신속히 교체한다. 이 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한다. 바이러스의 역가가 높으면, 실질적으로 모든 섬유아세포가 감염될 것이도 어떠한 선별도 필요치 않는다. 역가가 극히 낮을 경우에는,neo또는his와 같은 선별성 마커를 갖는 레트로바이러스성 벡터를 사용하는 것이 필요하다.

이어서, 유전자처리시킨 섬유아세포를 단독으로 또는 사이토덱스 3 미소담체 비드 상에서 합류까지 성장시킨 후에 숙주에 주입한다. 이때 섬유아세포는 단백질 생성물을 생성시킨다.

본 발명의 수 많은 변형 및 변이가 상기 교시에 비추어 볼 때 가능하므로, 첨부된 청구의 범위내에서 본 발명은 구체적으로 기술된 것 이외의 양태로 실시할 수 있다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(ⅰ) 출원인: 리 등

(ⅱ) 발명의 명칭: 사람 케모킨 베타-13

(ⅲ) 서열수: 8

(ⅳ) 서신 주소:

(A) 수신인: 카렐라, 바이른, 바인, 길필란, 체치, 스튜워트 올 슈타인

(B) 거리: 벡커 팜 로드 6

(C) 시: 로즈랜드

(D) 주: 뉴 저지

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 07068

(ⅴ) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체 유형: 3.5in 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PS/2

(C) 운영 시스템: MS-DOS

(D) 소프트웨어: 워드 퍼펙트 5.1

(ⅵ) 현 출원 데이터:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일: 본원과 함께 제출

(C) 분류:

(ⅶ) 이전의 출원 데이터

(A) 출원 번호:

(B) 출원 날짜:

(ⅷ) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 페라로 그레고리 디

(B) 등록 번호: 36,134

(C) 참조/소송 번호: 325800-

(ⅸ) 전자통신 정보:

(A) 전화: 201-994-1700

(B) 팩시밀리: 201-994-1744

(2) 서열 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 282개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: cDNA

(Xi) 서열 기술:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 93개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄:

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(Xi) 서열 기술:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 25개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(Xi) 서열 기술:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 27개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(Xi) 서열 기술:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 31개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(Xi) 서열 기술:

(2) 서열 6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 60개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(Xi) 서열 기술:

(2) 서열 7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 33개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(Xi) 서열 기술:

(2) 서열 8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 26개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 올리고뉴클레오티드

(Xi) 서열 기술:

Claims

(a) 서열 2에서 제시한 -23번 아미노산에서 65번 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열 2에서 제시된 1번 아미노산에서 65번 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드와 70% 이상의 동질성을 나타내는 폴리뉴클레오티드; 및

(d) (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 한 구성원(member)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열 2의 -28번 아미노산에서 65번 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열 2의 1번 아미노산에서 65번 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
(a) ATCC 기탁번호 제97113호에 함유된 DNA에 의해 발현된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(b) (a)의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드와 70% 이상의 동질성을 나타내는 폴리뉴클레오티드; 및

(c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 한 구성원을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제2항에 따른 DNA를 함유하는 벡터.
제6항에 따른 벡터를 사용하여 유전적으로 조작시킨 숙주 세포.
제7항에 따른 숙주 세포로부터 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현시킴을 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법.
제6항에 따른 벡터를 사용하여 세포를 유전적으로 조작함을 포함하는, 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 세포의 제조 방법.
(ⅰ) 서열 2의 추론된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체; 및 (ⅱ) ATCC 기탁번호 제97113호의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 폴리펩티드.
제10항의 폴리펩티드의 활성을 모방하는 화합물.
제10항의 폴리펩티드의 활성을 길항하는 화합물.
모노클로날 및 폴리클로날 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 구성원을 포함하는 제10항의 폴리펩티드에 대한 항체.
제10항의 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, Ckβ-13을 필요로하는 환자를 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 폴리펩티드의 치료학적 유효량을, 폴리펩티드를 암호화하고 생체에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 DNA를 환자에게 제공함으로써 투여하는 방법.
제12항의 화합물의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, Ckβ-13 폴리펩티드의 억제를 필요로하는 환자를 치료하는 방법.
폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에서 돌연변이를 결정함을 포함하여, 제10항의 폴리펩티드의 저발현에 관련된 질환 또는 이러한 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법.
숙주로부터 유도된 샘플에서 제10항의 폴리펩티드의 존재에 대한 분석을 포함하는 진단 방법.
(a) 스크린될 화합물을 일반적으로 세포가 제13항의 폴리펩티드에 대한 반응으로 이동하는 조건하에서 상기 세포를 함유하는 반응 혼합물과 혼합시키는 단계; 및

작용제로서 효과적인 화합물을 분리하기 위하여 세포의 이동정도를 결정함을 포함하여, 제10항의 폴리펩티드에대해 작용제로서 활성인 화합물을 동정하는 방법.
제18항에 있어서, Ckβ-13 폴리펩티드를 단계(a)의 혼합물에 가하고, 이동 정도의 결정이 작용제로서 효과적인 화합물을 동정하는 방법.