ES2227553T3 - Quimiocina beta-13 humana. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN POLIPEPTIDOS DE QUIMIOCINA HUMANOS Y UN DNA (RNA) QUE CODIFICA TALES POLIPEPTIDOS DE QUIMIOCINA Y UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE TALES POLIPEPTIDOS MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA LA UTILIZACION DE TALES POLIPEPTIDOS DE QUIMIOCINA EN EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA, TUMORES, INFECCIONES CRONICAS, ENFERMEDADES AUTOINMUNES, TRASTORNOS FIBROTICOS, CICATRIZACION DE HERIDAS Y PSORIASIS. TAMBIEN SE PRESENTAN ANTAGONISTAS CONTRA TALES POLIPEPTIDOS DE QUIMIOCINA Y SU USO COMO AGENTES TERAPEUTICOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ARTRITIS REUMATOIDEA, ENFERMEDADES INFLAMATORIAS E INFECCIOSAS AUTOINMUNES Y CRONICAS Y AGUDAS, REACCIONES ALERGICAS, FIEBRE INDEPENDIENTE DE LA PROSTAGLANDINA Y FALLO DE LA MEDULA OSEA. TAMBIEN SE PRESENTAN ENSAYOS DE DIAGNOSTICO PARA LA DETECCION DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON MUTACIONES EN LAS SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS Y CONCENTRACIONES ALTERADAS DE LOS POLIPEPTIDOS. TAMBIEN SE PRESENTAN ENSAYOS DE DIAGNOSTICO PARA LADETECCION DE MUTACIONES EN LOS POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS POLIPEPTIDOS DE QUIMIOCINA Y PARA DETECTAR NIVELES ALTERADOS DEL POLIPEPTIDO EN UN HUESPED.

Description

Quimiocina beta-13 humana.

Esta invención se refiere a polinucleótidos recientemente identificados, a polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como a la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más en particular, el polipéptido de la presente invención ha sido identificado putativamente como polipéptido de quimiocina humana, a veces llamado en adelante en el presente texto como quimiocina beta-13 humana (Ck\beta-13). La invención se refiere también a la inhibición de la acción de tales polipéptidos.

Las quimiocinas, también denominadas citocinas de intercrina, son una subfamilia de citocinas relacionadas estructural y funcionalmente. Estas moléculas tienen un tamaño de 8-10 kD. En general, las quimiocinas muestran de un 20% a un 75% de homología en los aminoácidos, y se caracterizan por cuatro restos de cisteína conservados que forman dos puentes disulfuro. Basándose en la disposición de los dos primeros restos de cisteína, las quimiocinas han sido clasificadas en dos subfamilias, alfa y beta. En la subfamilia alfa, las dos primeras cisteínas están separadas por un aminoácido y por ello se las denomina como subfamilia "C-X-C". En la subfamilia beta, las dos cisteínas están en posiciones adyacentes y por ello se las denomina subfamila "C-C". Hasta ahora se han identificado en seres humanos al menos nueve miembros diferentes de esta familia.

Las citocinas de intercrina muestran una amplia variedad de funciones. Una característica típica es su capacidad para desencadenar la migración quimiotáctica de tipos de células diversos, incluyendo monocitos, neutrófilos, linfocitos T, basófilos y fibroblastos. Muchas quimiocinas tienen actividad proinflamatoria e intervienen en múltiples etapas durante una reacción inflamatoria. Estas actividades incluyen la estimulación de la liberación de histamina, liberación de enzima lisosómica y leucotrieno, el aumento de la adherencia de células inmunitarias diana a células endoteliales, el aumento de la unión de proteínas de complemento, la inducción de la expresión de moléculas de adhesión de granulocitos y receptores de complemento, y estallido respiratorio. Además de su implicación en la inflamación, se ha demostrado que ciertas quimiocinas muestran otras actividades. Por ejemplo, la proteína inflamatoria de macrófago (MIP-1) puede suprimir la proliferación de las células troncales hematopoiéticas, el factor plaquetario 4 (PF-4) es un potente inhibidor del crecimiento de las células endoteliales, la interleucina-8 (IL-8) favorece la proliferación de queratinocitos, y el GRO es un factor de crecimiento autocrino para células de melanoma.

En vista de las diversas actividades biológicas, no es sorprendente que las quimiocinas hayan sido implicadas en varias condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el tráfico de linfocitos, la cicatrización de las heridas, la regulación hematopoiética y trastornos inmunológicos tales como alergia, asma y artritis.

Los miembros de la rama "C-C" ejercen su efecto sobre las células siguientes: eosinófilos que destruyen parásitos para aminorar las infecciones parasitarias y causan inflamación crónica en las vías respiratorias; monocitos y macrófagos que suprimen la formación de tumores en los vertebrados; linfocitos T que atraen células T y basófilos que liberan histamina, que desempeña un papel en la inflamación alérgica.

Aunque los miembros de la rama C-C actúan de manera predominante sobre las células mononucleares y los miembros de la rama C-X-C actúan de manera predominante sobre los neutrófilos, no se puede asignar una propiedad quimioatrayente distinta a una quimiocina basándose en esta directriz. Algunas quimiocinas de una familia muestran características de la otra.

El polipéptido de la presente invención tiene la región "C-C" de cisteína conservada, y tiene homología de secuencia de aminoácidos respecto a quimiocinas conocidas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan nuevos polipéptidos así como fragmentos, análogos y derivados de los mismos, biológicamente activos y útiles en diagnóstico o en terapia.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican tales polipéptidos, incluyendo mRNAs, DNAs, cDNAs, DNA genómico, así como fragmentos, análogos y derivados de los mismos, biológicamente activos y útiles en diagnóstico o en terapia.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan sondas de ácidos nucleicos que comprenden moléculas de ácidos nucleicos de longitud suficiente para hibridarse específicamente con secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de la presente invención.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar tal polipéptido mediante técnicas recombinantes, que comprende cultivar células hospedadoras procariotas y/o eucariotas recombinantes, que contienen una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención, bajo condiciones que favorecen la expresión de dicha proteína y la subsiguiente recuperación de dicha proteína.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, para fines terapéuticos, por ejemplo para tratar tumores sólidos, infecciones crónicas, leucemia, enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T, infecciones parasitarias, soriasis, para regular la hematopoyesis, para estimular la actividad del factor de crecimiento, para inhibir la angiogénesis y para mejorar la cicatrización de las heridas.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan antagonistas para tales polipéptidos, que pueden ser usados para inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, en el tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunitarias, aterosclerosis, enfermedades inflamatorias e infecciosas crónicas, reacciones alérgicas mediadas por histamina e IgE, fiebre independiente de la prostaglandina, insuficiencia medular, silicosis, sarcoidosis, artritis reumatoide y síndrome hiper-eosinofílico.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o la susceptibilidad para una enfermedad relacionada con una mutación en las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención y a niveles alterados de la proteína codificada por tales secuencias de ácidos nucleicos.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, para aplicaciones in vitro relacionadas con la investigación científica, la síntesis de DNA y la elaboración de vectores de DNA.

Estos y otros aspectos de la presente invención han de resultar evidentes para un experto en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Los dibujos que siguen son ilustrativos de realizaciones de la invención y se entiende que no limitan el alcance de dicha invención, que queda comprendido por las reivindicaciones.

La figura 1 representa la secuencia de cDNA y la correspondiente secuencia de aminoácidos de Ck\beta-13 deducida. Los 28 aminoácidos iniciales representan la secuencia guía de forma que el polipéptido maduro putativo comprende 65 aminoácidos. Se usan las abreviaturas estándar de una letra para los aminoácidos. La secuenciación se llevó a cabo usando un secuenciador de DNA automático 373 (Applied Biosystems, Inc.).

La Figura 2 representa la homología de la secuencia de aminoácidos entre Ck\beta-13 (parte superior) y el polipéptido MIP-1\alpha humano (parte inferior).

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan ácidos nucleicos aislados (polinucleótidos) que codifican el polipéptido maduro que tiene la secuencia deducida de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 2) o el polipéptido maduro codificado por el cDNA del clon o los clones depositados como nº de depósito en la ATCC 97113 el 28 de abril de 1995.

Los polinucleótidos que codifican Ck\beta-13 han sido aislados de una genoteca de cDNA de monocitos activados. Ck\beta-13 es un miembro de la rama C-C de quimiocinas. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 93 restos de aminoácidos de los que aproximadamente los 28 primeros restos de aminoácidos son la secuencia guía putativa, de forma que la proteína madura comprende 65 aminoácidos. La proteína tiene homología estructural respecto a los polipéptidos de quimiocina, y la homología respecto al polipéptido MIP-1\alpha humano con 33% de identidad y 53% de similitud sobre la secuencia entera se usa solamente como ejemplo.

Los cuatro restos de cisteína conservados espacialmente en las quimiocinas se encuentran en el polipéptido de la presente invención, como puede verse en la Figura 1.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de RNA o en forma de DNA, el cual DNA incluye cDNA, DNA genómico y DNA sintético. El DNA puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la hebra codificadora o la hebra no codificadora (antisentido). La secuencia de codificación que codifica los polipéptidos maduros puede ser idéntica a la secuencia de codificación mostrada en las Figuras 1 (SEQ ID Nº: 1) o la del clon o clones depositados, o puede ser una secuencia codificadora diferente, la cual secuencia codificadora, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica los mismos polipéptidos maduros que el DNA de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 1) o el cDNA depositado.

Los polinucleótidos que codifican el polipéptido maduro de la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o el polipéptido maduro codificado por el cDNA depositado, pueden incluir solamente la secuencia de codificación para el polipéptido maduro; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y secuencia de codificación adicional tal como una secuencia guía o secretora o una secuencia pro-proteína; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro (y opcionalmente secuencia codificadora adicional) y secuencia no codificadora, tal como intrones o secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia codificadora para los polipéptidos maduros.

Así pues, la expresión "polinucléotido que codifica un polipéptido" abarca un polinucléotido que incluye solamente secuencia de codificación para el polipéptido así como un polinucléotido que incluye una secuencia adicional codificadora y/o no codificadora.

La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos anteriormente descritos, que codifican fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia deducida de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 2) o el polipéptido codificado por el cDNA del clon o clones depositados. Las variantes de los polinucleótidos pueden ser una variante alélica de origen natural de los polinucleótidos o una variante de los polinucleótidos que no es de origen natural.

Así pues, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro que se muestra en las Figuras 1 (SEQ ID Nº: 2) o el mismo polipéptido maduro codificado por el cDNA del clon o clones depositados, así como variantes de tales polinucleótidos, las cuales variantes codifican un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 2) o el polipéptido codificado por el cDNA del clon o clones depositados. Tales variantes de los nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción.

Como se ha indicado anteriormente en el presente texto, los polinucleótidos pueden tener una secuencia codificadora que es una variante alélica de origen natural de la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ ID Nº: 1) o la secuencia codificadora del clon o clones depositados. Como es sabido en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.

La presente invención incluye también polipéptidos en los que la secuencia codificadora para los polipéptidos maduros puede estar fusionada en el mismo marco de lectura con una secuencia de polinucleótidos que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula hospedadora, por ejemplo una secuencia guía que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia guía es una preproteína y puede tener la secuencia guía segmentada por la célula hospedadora para dar lugar a la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden también codificar una proproteína que es la proteína madura más restos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez segmentada la prosecuencia, queda una proteína activa madura.

Así, por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar una proteína madura, o una proteína que tiene una prosecuencia. o una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia guía).

Los polinucleótidos de la presente invención pueden también tener la secuencia codificadora fusionada en marco con una secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado con el marcador en el caso de un hospedador bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando se usa un hospedador de mamífero (p. ej. células COS-7). La etiqueta de HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson, I. et al., Cell, 37: 767 (1984)).

El término "gen" significa el segmento de DNA implicado en la producción de una cadena de polipéptido.; incluye regiones que preceden y que siguen a la región de codificación (guía y trailer) así como secuencias interpuestas (intrones) entre segmentos codificadores individuales (exones).

Pueden usarse fragmentos del gen Ck\beta-13 de longitud completa como sonda de hibridación para una genoteca de cDNA para aislar el gen de longitud completa y para aislar otros genes que tienen una elevada similitud de secuencia con el gen o una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo tienen preferentemente al menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 bases o más. La sonda puede usarse también para identificar un clon de cDNA correspondiente a un transcrito de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen Ck\beta-13 completo, incluyendo las regiones reguladora y promotora, exones, e intrones. Un ejemplo de un cribado comprende aislar la región codificadora del gen Ck\beta-13 usando la secuencia de DNA conocida, para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se usan para cribar una genoteca de cDNA humano, DNA genómico o mRNA, para determinar con qué miembros de la genoteca se hibrida la sonda.

La presente invención se refiere además a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias anteriormente descritas en el presente texto si hay al menos un 70%, preferentemente al menos un 90%, y más preferentemente al menos un 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se refiere en particular a polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones severas con los polinucleótidos anteriormente descritos en el presente texto. Como se usa en este texto, la expresión "condiciones severas" significa que la hibridación tendrá lugar solamente si hay al menos un 95% y preferentemente al menos un 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos anteriormente descritos, en una realización preferida codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido maduro codificado por el cDNA de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 1) o el cDNA o cDNAs depositados, es decir funcionan como un polipéptido de quimiocina.

Alternativamente, los polinucleótidos pueden ser polinucleótidos que tienen al menos 20 bases, preferentemente 30 bases y más preferentemente al menos 50 bases que se hibridan con un polinucleótido de la presente invención y que tienen una identidad con él, como se describió antes, y que pueden retener o no la actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden emplearse como sondas para el polinucleótido de la SEQ ID Nº: 1, o para variantes del mismo, por ejemplo, para la recuperación del polinucleótido o como sonda para diagnóstico o como cebador de la PCR.

Así, la presente invención se dirige a polinucleótidos que tienen al menos un 70% de identidad, preferentemente al menos un 90% y más preferentemente al menos un 95% de identidad respecto a un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº: 2 así como fragmentos del mismo, los cuales fragmentos tienen al menos 30 bases, preferentemente al menos 50 bases, y a los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos.

El depósito o depósitos mencionados en el presente texto serán mantenidos bajo los términos del Tratado de Budapest acerca del reconocimiento internacional del depósito de microorganismos, con fines relativos a procedimientos de patente. Estos depósitos se proporcionan meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no suponen admitir que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. párrafo 112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por ellos, se incorporan al presente texto como referencia y son reguladoras en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias del presente texto. Se puede requerir licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados y con el presente no se otorga tal licencia.

La presente invención se refiere además a polipéptidos que tienen la secuencia deducida de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 2) o que tienen la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA depositado, así como a fragmentos, análogos y derivados de tales polipéptidos.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando se refieren al polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 2) o al codificado por el cDNA depositado, significan un polipéptido que mantiene esencialmente la misma actividad o función biológica que tal polipéptido. Así, un análogo incluye una proproteína que puede activarse por segmentación de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo. Un derivado o fragmento puede incluir, por ejemplo, una variante de ayuste (corte y empalme) que tiene menos restos de aminoácidos que el polipéptido de la Figura 1 pero que todavía mantiene la característica de actividad biológica de los polipéptidos de quimiocina humana.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos, preferentemente polipéptidos recombinantes.

El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID Nº: 2) o el codificado por los cDNAs depositados puede ser (i) un fragmento, derivado o análogo en el que uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un resto de aminoácido conservado) y tal resto de aminoácido sustituido puede ser o no un resto codificado por el código genético, (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida mitad del polipéptido (por ejemplo polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados con el polipéptido maduro, tal como una secuencia guía o secretora o una secuencia que es empleada para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferentemente en forma aislada, y preferentemente se purifican hasta homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se retira de su entorno original (p. ej. el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado del algo o de la totalidad de los materiales que coexisten en el sistema natural, es aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y ser aún aislados, por cuanto tal vector o composición no es parte de su entorno natural.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de la SEQ ID Nº: 2 (en particular el polipéptido maduro) así como polipéptidos que tienen al menos un 70% de similitud (preferentemente al menos 70% de identidad) respecto del polipéptido de la SEQ ID Nº: 2 y más preferentemente al menos 90% de similitud (preferentemente al menos 90% de identidad) respecto al polipéptido de la SEQ ID Nº: 2, y aún más preferentemente al menos 95% de similitud (preferentemente al menos 95% de identidad) respecto al polipéptido de la SEQ ID Nº: 2, y también incluye porciones de tales polipéptidos que generalmente contienen al menos 30 aminoácidos y más preferentemente al menos 50 aminoácidos.

Como es sabido en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por consiguiente, los fragmentos pueden ser empleados como productos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden ser usados para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

La presente invención se refiere también a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células hospedadoras que se obtienen por ingeniería genética con vectores de la invención, y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Las células hospedadoras se obtienen por ingeniería genética (transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospedadoras obtenidas por ingeniería genética pueden ser cultivadas en un medio nutriente convencional modificado de la forma apropiada para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes Ck\beta-13. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y demás, son las usadas anteriormente con la célula hospedadora elegida para la expresión, y será evidente para un profesional con experiencia normal en la técnica.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en uno cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de DNA cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, p. ej. derivados de SV40, plásmidos bacterianos, DNA de fago, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y DNA de fago, DNA viral tal como viruela vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, y seudorabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre y cuando sea replicable y viable en el hospedador.

La secuencia de DNA apropiada puede ser insertada en el vector por una diversidad de procedimientos. En general, la secuencia de DNA se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales procedimientos y otros están al alcance de los expertos en la técnica.

La secuencia de DNA en el vector de expresión está operativamente ligada a una secuencia o secuencias de control de la expresión apropiada (promotor) para dirigir la síntesis de mRNA. Como ejemplos representativos de tales promotores, cabe mencionar: promotor de LTR o de SV40, el lac o trp de E. coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores conocidos que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión contiene también un sitio de unión con el ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector puede también incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferentemente uno o más genes marcadores seleccionables, para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas, tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a la neomicina para cultivo de células eucariotas, o tales como resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de DNA apropiada como se describió anteriormente en el presente texto, así como un promotor o una secuencia de control apropiados, puede emplearse para transformar un hospedador apropiado para permitir que el hospedador exprese la proteína.

Como ejemplo representativos de hospedadores apropiados, cabe mencionar: células bacterianas tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas tales como levaduras; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; cálulas animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales; etc. Se considera que la selección de un hospedador apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente texto.

Más en particular, la presente invención incluye además construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias ampliamente descritas antes. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral, en el que ha sido insertada una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras incluyendo, por ejemplo, un promotor, unidas de forma operativa a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y son disponibles comercialmente. A título de ejemplo, se proporcionan los vectores siguientes: Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre y cuando sean replicables y viables en el hospedador.

Las regiones de promotor pueden seleccionarse entre cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos citados en particular incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucarióticos incluyen CMV temprano inmediato, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados es propia del nivel de un experto normal en la técnica.

En otra realización más, la presente invención se refiere a las células hospedadoras que contienen las construcciones anteriormente descritas. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula procariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede realizarse mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, o electroporación (Davis, L., Dibner, N., Battey, I., Basic Methods in Molecular Bilogy, (1986)).

Las construcciones en células hospedadoras pueden usarse de una manera convencional para preparar los producto génicos codificados por las secuencias recombinantes. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden producirse por síntesis mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células, bajo el control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando RNAs derivados de las construcciones de DNA de la presente invención. Vectores de clonación y expresión apropiados para ser usados con hospedadores eucarióticos y procarióticos, son descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), cuya descripción se incorpora al presente texto como referencia.

La transcripción del DNA que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de DNA de acción cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación pb 100 a 270, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, p. ej. el gen de la resistencia a la ampicilina de los genes TRP1 de E. coli y S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para la transcripción directa de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican enzimas glucolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y, preferentemente, una secuencia guía capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que confiere las características deseadas, p. ej. la estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de DNA estructural que codifica una proteína deseada, junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si se desea, para proporcionar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procarióticos para transformación adecuados incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como cuestión de elección.

Como ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos disponibles comercialmente, que comprenden elementos genéticos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Estas secciones "esqueleto" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar.

Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y el crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados (p. ej. desplazamiento de la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional.

Las células se recolectan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se conserva para posterior purificación.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación y descongelación, tratamiento con ultrasonidos, rotura mecánica o el uso de agentes de lisis, y tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

También pueden emplearse varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), y otras líneas de células capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo las líneas de células C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado y también cualquier sitio necesario de unión con el ribosoma, sitio de poliadenilación, sitios de donador y aceptor de ayuste, secuencias de terminación de transcripcional y secuencias flanqueantes 5' no transcritas. Las secuencias de DNA derivadas del ayuste de SV40, y sitios de poliadenilación, pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no trascritos requeridos.

Los polipéptidos pueden ser recuperados y purificados de los cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina. Pueden usarse etapas de replegamiento de proteínas, si es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía de líquidos del alto rendimiento (HPLC) para las etapas finales de purificación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente o un producto de procedimientos de síntesis química, o ser producido por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, por células bacterianas, de levaduras, de vegetales superiores, de insectos y de mamíferos, en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glucosilados o pueden ser no glucosilados. Los polipéptidos de la presente invención pueden incluir también un resto de aminoácido metionina inicial.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados como reactivos y materiales para investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas.

El polipéptido de la presente invención puede emplearse para inhibir la formación de colonias de células troncales de la médula ósea como tratamiento protector coadyuvante durante la quimioterapia del cáncer. El polipéptido Ck\beta-13 puede inhibir la proliferación y diferenciación de células hematopoiéticas tales como las células troncales de la médula ósea. El efecto inhibidor sobre la población de células progenitoras comprometidas (por ejemplo granulocitos y macrófago/monocitos) puede emplearse terapéuticamente para inhibir la proliferación de células leucémicas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse también para inhibir la proliferación de queratinocitos epidérmicos para el tratamiento de la soriasis, que se caracteriza por la hiper-proliferación de queratinocitos, ya que se ha encontrado que las células de Langerhans de la piel producen quimiocinas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse también para tratar tumores sólidos, por ejemplo sarcoma de Karposi, estimulando la invasión y activación de las células de defensa del hospedador, p. ej. células T citotóxicas y macrófagos, mediante quimiotaxis, e inhibiendo la angiogénesis de tumores.

También pueden emplearse para mejorar las defensas del huésped contra las infecciones agudas y crónicas resistentes, por ejemplo las infecciones micobacterianas, a través de la atracción y la activación de leucocitos microbicidas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse también para inhibir la proliferación de células T mediante la inhibición de la biosíntesis de IL-2 para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T y leucemias linfocitarias.

El Ck\beta-13 puede emplearse también para estimular la cicatrización de heridas y prevenir la deformidad cicatricial durante la cicatrización de heridas, en ambos casos a través del reclutamiento de células inflamatorias de limpieza de residuos y promotoras de tejido conjuntivo y también a través de su control de la excesiva fibrosis mediada por TGF-\beta. De la misma forma, el Ck\beta-13 puede emplearse también para tratar otros trastornos fibróticos, incluyendo cirrosis hepática, osteoartritis y fibrosis pulmonar.

Los polipéptidos de la presente invención incrementan también la presencia de eosinófilos que tienen la función distintiva de destruir las larvas de parásitos que invaden los tejidos, como en la esquistosomiasis, la triquinosis y la ascariasis.

También pueden emplearse para regular la hematopoiesis, regulando la activación y diferenciación de varias células progenitoras hematopoiéticas, por ejemplo para liberar leucocitos maduros de la médula ósea después de la quimioterapia.

El polipéptido de la presente invención puede emplearse también para señalar como diana células no deseadas, tal como en el tratamiento del cáncer, para la apoptosis.

Los polinucleótidos y los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos pueden utilizarse también para propósitos in vitro relacionados con la investigación científica, la síntesis del DNA y la elaboración de vectores de DNA, y para diseñar terapéuticas y diagnósticos para el tratamiento de enfermedades humanas.

El polipéptido puede usarse también para movilizar células troncales de la médula ósea a la sangre periférica, lo cual permite un fácil aislamiento de dichas células troncales. Las células troncales aisladas pueden emplearse para la colonización de la médula ósea después de una quimioterapia de dosis alta.

Esta invención está también relacionada con el uso del gen Ck\beta-13 como parte de un ensayo diagnóstico para detectar enfermedades o la susceptibilidad hacia enfermedades relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la presente invención. Tales enfermedades están relacionadas con la sub-expresión de los polipéptidos de quimiocina humana, por ejemplo, tumores y cánceres.

Los individuos que llevan mutaciones en un gen de la presente invención pueden ser detectados a nivel del DNA por una diversidad de técnicas. Los ácidos nucleicos para diagnóstico pueden obtenerse de las células de un paciente, por ejemplo a partir de la sangre, orina, saliva, biopsia de tejidos y material de autopsia. El DNA genómico puede usarse directamente para la detección o puede ser amplificado enzimáticamente usando PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)) antes del análisis. El RNA o el cDNA pueden usarse también con el mismo propósito. Como ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios del ácido nucleico que codifica Ck\beta-13 para identificar y analizar mutaciones de Ck\beta-13. Por ejemplo, pueden detectarse deleciones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Pueden identificarse mutaciones puntuales hibridando DNA amplificado con RNA de Ck\beta-13 radiomarcado o, alternativamente, secuencias de DNA antisentido de Ck\beta-13 radiomarcadas. Las secuencias perfectamente coincidentes pueden distinguirse de los dúpleces no coincidentes por digestión con RNasa o por diferencias en las temperaturas de fusión.

Pueden realizarse pruebas genéticas basadas en diferencias de secuencia de DNA mediante la detección de la alteración de la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las pequeñas deleciones e inserciones de la secuencia pueden visualizarse mediante electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de DNA de secuencias diferentes pueden distinguirse en geles de gradiente de formamida desnaturalizante en los que las movilidades de fragmentos diferentes de DNA están retardadas en el gel en posiciones diferentes de acuerdo con sus temperaturas de fusión o fusión parcial específicas (véase, p. ej. , Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)).

Los cambios de secuencia en localizaciones específicas pueden también revelarse por ensayos de protección de nucleasa, tales como protección de RNasa y S1 o el método de segmentación química (p. ej. Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)).

Así, la detección de una secuencia de DNA específica puede conseguirse por métodos tales como hibridación, protección de RNasa, segmentación química, secuenciación directa de DNA o el uso de enzimas de restricción (p. ej. polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms)) y análisis de transferencia Southern de DNA genómico.

Además de electroforesis en gel y secuenciación de DNA más convencionales, las mutaciones pueden detectarse también mediante análisis in situ.

La presente invención se refiere también a un ensayo diagnóstico para detectar niveles alterados del polipéptido de la presente invención en varios tejidos, ya que una sobre-expresión del polipéptido en comparación con muestras de tejido testigo normales puede detectar la presencia de una enfermedad o la susceptibilidad para una enfermedad, por ejemplo un tumor. Los ensayos usados para detectar niveles de un polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de un hospedador son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western, ensayos ELISA y ensayos tipo sandwich. Un ensayo ELISA (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1 (2), capítulo 6 (1991)) comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para un antígeno Ck\beta-13, preferentemente un anticuerpo monoclonal. Además se prepara un anticuerpo informador ("reportero") contra el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo informador se le une un reactivo detectable tal como un reactivo radiactivo, fluorescente o, en este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano picante. Se saca una muestra del hospedador y se incuba en un soporte sólido, p. ej. un disco de poliestireno, que une las proteínas de la muestra. Cualquier sitio de unión libre de proteína en el disco es entonces cubierto incubando con una proteína no específica como BSA. A continuación, el anticuerpo monoclonal se incuba en el disco, tiempo durante el cual los anticuerpos monoclonales se unen a cualquier proteína Ck\beta-13 unida al disco de poliestireno. Todo el anticuerpo monoclonal no unido se elimina por lavado con tampón. El anticuerpo informador unido a la peroxidasa de rábano picante se pone ahora en el disco con el resultado de la unión del anticuerpo informador a cualquier anticuerpo monoclonal unido al polipéptido Ck\beta-13. El anticuerpo informador unido se separa entonces por lavado. Después se añaden al disco sustratos de peroxidasa y la cantidad de color desarrollada en un periodo de tiempo dado es una medida de la cantidad de proteína Ck\beta-13 presente en un volumen dado de muestra del paciente cuando se compara frente a una curva patrón.

Puede emplearse un ensayo de competición en el que anticuerpos específicos contra el polipéptido Ck\beta-13 se fijan a un soporte sólido y el polipéptido Ck\beta-13 marcado y una muestra derivada del hospedador se hacen pasar sobre el soporte sólido y la cantidad de marcador detectado, por ejemplo mediante cromatografía de centelleo de líquidos, puede correlacionarse con la cantidad de polipéptido Ck\beta-13 en la muestra.

Un ensayo sandwich es similar a un ensayo ELISA. En un ensayo sandwich el polipéptido Ck\beta-13 se hace pasar sobre un soporte sólido y se une al anticuerpo fijado a un soporte sólido. Después se une un segundo anticuerpo al polipéptido Ck\beta-13. Después se hace pasar sobre el soporte sólido un tercer anticuerpo que está marcado y es específico para el segundo anticuerpo, y se une al segundo anticuerpo en una cantidad que puede ser determinada cuantitativamente.

Esta invención proporciona un método para la identificación de receptores para el polipéptido de la presente invención. El gen que codifica el receptor puede ser identificado por numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo separación por adsorción de ligando y clasificación de FACS (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1 (2), capítulo 5 (1991)). Preferentemente se emplea clonación de expresión en donde el RNA poliadenilado se prepara a partir de una célula sensible a los polipéptidos, y una genoteca de cDNA creada a partir de este RNA es dividida en agrupaciones y usada para transfectar células COS u otras células que no son sensibles a los polipéptidos. Las células transfectadas que se desarrollan en portaobjetos de vidrio se exponen a los polipéptidos marcados. Los polipéptidos pueden marcarse por diversos medios entre los que se incluye yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica del sitio. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográfico. Los agrupamientos positivos se identifican y se preparan sub-agrupamientos y se re-transfectan usando un procedimiento iterativo de sub-agrupamiento y re-selección, dando eventualmente un clon o clones individuales que codifican el receptor putativo.

Como planteamiento alternativo para la identificación del receptor, los polipéptidos marcados pueden ser unidos por fotoafinidad con preparados de membrana o extracto celular que expresan la molécula de receptor. El material entrecruzado se resuelve mediante análisis por PAGE y se expone a película para rayos X. El complejo marcado conteniendo los receptores de los polipéptidos puede ser cortado, resuelto en fragmentos de péptido y sometido a microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida de la microsecuenciación sería usada para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótido degenerado para seleccionar una genoteca de cDNA para identificar los genes que codifican los receptores putativos.

Esta invención proporciona un método para cribar o seleccionar compuestos para identificar agonistas y antagonistas para el polipéptido de la presente invención. Un agonista es un compuesto que se une y activa a un receptor para el polipéptido de la presente invención, mientras que los antagonistas se unen e inhiben tales receptores o simplemente compiten con Ck\beta-13 por tales receptores. La quimiotaxis puede ensayarse poniendo células, que son quimioatraídas por el polipéptido de la presente invención, en la parte superior de un filtro con poros de diámetro suficiente para admitir las células (aproximadamente 5 \mum). Soluciones de agonistas potenciales se ponen en el fondo de la cámara con un medio de control apropiado en el compartimento superior, y así se mide un gradiente de concentración del agonista contando las células que migran a la membrana porosa, o a través de ella, a lo largo del tiempo.

Cuando se ensaya en relación con antagonistas, el polipéptido de la presente invención se pone en la cámara del fondo y se añade el antagonista potencial para determinar se si ha impedido la quimiotaxis de las células.

Alternativamente, se incubaría un preparado de células de mamífero o membranas que expresan los receptores de los polipéptido con un polipéptido marcado de la presente invención, p. ej. con radiactividad, en presencia del compuesto. Entonces podría medirse la capacidad del compuesto para bloquear esta interacción.

Los ejemplos de antagonistas potenciales para el polipéptido de la presente invención incluyen anticuerpos, o en algunos casos oligonucleótidos, que se unen a los polipéptidos. Otro ejemplo de un antagonista potencial es un mutante dominante negativo de los polipéptidos. Los mutantes dominantes negativos son polipéptidos que se unen al receptor del polipéptido de tipo silvestre, pero no consiguen conservar actividad biológica.

Las construcciones antisentido preparadas usando tecnología antisentido son también antagonistas potenciales. La tecnología antisentido puede ser usada para controlar la expresión génica mediante formación de triple hélice o DNA o RNA antisentido, y ambos métodos están basados en la unión de un polinucleótido a DNA o RNA. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia del polinucleótido, que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de RNA antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de DNA para que sea complementario de una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice, véanse Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); y Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), impidiendo así la transcripción y la producción del polipéptido de la presente invención. El oligonucleótido de RNA antisentido se hibrida con el mRNA in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mRNA a los polipéptidos (antisentido - Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresion (oligonucleótidos como inhibidores antisentido de la expresión génica), CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden también suministrarse a células de forma que el RNA o DNA antisentido pueden expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido de la presente invención.

Otro antagonista potencial es un derivado peptídico de los polipéptidos, que es un análogo modificado natural o sintéticamente del polipéptido que ha perdido la función biológica pero que aún reconoce y se une a los receptores del polipéptido para así bloquear eficazmente a los receptores. Los ejemplos de derivados de péptido incluyen, pero no se limitan a ellos, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos.

Los antagonistas pueden ser empleados para inhibir la quimiotaxis y la activación de macrófagos y sus precursores, y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subconjuntos de células T, p. ej. células T citotóxicas activadas y CD8 y células asesinas naturales, en ciertas enfermedades infecciosas e inflamatorias autoinmunitarias y crónicas. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen esclerosis múltiple y diabetes dependiente de la insulina.

Los antagonistas pueden también emplearse para tratar enfermedades infecciosas entre las que se incluye la silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, impidiendo el reclutamiento y la activación de fagocitos mononucleares. También pueden emplearse para tratar el síndrome hiper-eosinofílico idiopático impidiendo la producción y la migración de eosinófilos. El choque endotóxico puede también tratarse mediante los antagonistas, impidiendo la migración de macrófagos y su producción del polipéptido de la presente invención.

Los antagonistas pueden emplearse también para tratar la aterosclerosis, impidiendo la infiltración de monocitos en la pared de la arteria.

Los antagonistas pueden emplearse también para tratar reacciones alérgicas mediadas por histamina y trastornos inmunológicos, entre los que se incluyen reacciones alérgicas en fase tardía, urticaria crónica, y dermatitis atópica, inhibiendo la desgranulación mediada por quimiocina de células cebadas y basófilos y la liberación de histamina. También pueden tratarse reacciones alérgicas mediadas por IgE, tales como asma alérgica, rinitis y eczema.

Los antagonistas pueden emplearse también para tratar inflamaciones crónicas y agudas impidiendo la atracción de monocitos a la zona lesionada. También pueden emplearse para regular las poblaciones de macrófagos pulmonares normales, ya que las enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas y agudas están asociadas con el secuestro de fagocitos mononucleares en el pulmón.

Los antagonistas pueden emplearse también para tratar la artritis reumatoide evitando la atracción de los monocitos al líquido sinovial dentro de las articulaciones de los pacientes. El aflujo y la activación de los monocitos desempeña un papel importante en la patogénesis tanto de las artropatías degenerativas como de las inflamatorias.

Los antagonistas pueden emplearse para interferir con las cascadas nocivas atribuidas principalmente a la IL-1 y al TNF que evita la biosíntesis de otras citocinas inflamatorias. De esta manera, los antagonistas pueden emplearse para prevenir la inflamación. Los antagonistas pueden emplearse también para inhibir la fiebre independiente de la prostaglandina inducida por quimiocinas.

Los antagonistas pueden emplearse también para tratar casos de insuficiencia de la médula ósea, por ejemplo anemia aplásica y síndrome mielodisplásico.

Los antagonistas pueden emplearse también para tratar el asma y la alergia previniendo la acumulación de eosinófilos en el pulmón. Los antagonistas pueden emplearse también para tratar la fibrosis de la membrana basal subepitelial, que es una característica prominente del pulmón asmático.

Los antagonistas pueden emplearse en una composición con un vehículo aceptable farmacéuticamente, p. ej., como se describen más adelante.

El polipéptido de la presente invención y los agonistas y antagonistas pueden emplearse en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido, y un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente. Tal vehículo incluye, pero sin limitarse a ellos, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

La invención proporciona también un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen uno o más de los ingredientes de la composición farmacéutica de la invención. Junto con dichos recipientes puede acompañarse un prospecto en la forma prescrita por los organismos oficiales que regulan la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, el cual prospecto refleja la aprobación, por el organismo oficial, de la fabricación, uso o venta para administración a seres humanos. Además, los polipéptidos y agonistas y antagonistas pueden emplearse junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas de una manera conveniente tal como por las vías tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es efectiva para el tratamiento y/o la profilaxis de la indicación específica. En general, los polipéptidos serán administrados en una cantidad de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal y en la mayor parte de los casos será administrada en una cantidad no superior a aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal y por día. En la mayoría de los casos, la dosificación es de aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal al día, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc.

El polipéptido de la presente invención, y los agonistas y antagonistas que son polipéptidos, pueden emplearse de acuerdo con la presente invención mediante expresión de tales polipéptidos in vivo, lo que se denomina frecuentemente "terapia génica".

Así, por ejemplo, las células de un paciente pueden ser modificadas por ingeniería genética con un polinucleótido (DNA o RNA) que codifica un polipéptido ex vivo, siendo después proporcionadas las células modificadas por ingeniería genética a un paciente al que se ha de tratar con el polipéptido. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser modificadas por ingeniería genética por procedimientos conocidos en la técnica, usando una partícula retroviral que contiene RNA que codifica un polipéptido de la presente invención.

De un modo similar, las células pueden ser modificadas por ingeniería genética in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo, por ejemplo mediante procedimientos conocidos en la técnica. Como es sabido en la técnica, puede ser administrada a un paciente una célula productora para producir una partícula retroviral que contiene RNA que codifica el polipéptido de la presente invención para modificar por ingeniería genética células in vivo. Estos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención por tal método deben ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para modificar células por ingeniería química puede ser distinto de un retrovirus, por ejemplo un adenovirus que puede ser usado para modificar células por ingeniería química in vivo después de la combinación con un vehículo de suministro adecuado.

Los retrovirus a partir de los cuales pueden derivarse los vectores de plásmido retroviral antes mencionados incluyen, pero sin limitarse a ellos, el virus de la leucemia murina de Moloney, virus de la necrosis del bazo, retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia del mono gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus del sarcoma mieloproliferativo, y virus del tumor de mama. En una realización, el vector de plásmido retroviral se deriva del virus de la leucemia murina de Maloney.

El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero sin limitarse a ellos, el LTR retroviral; el promotor de SV40; y el promotor de citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller et al., Biotechniques, vol. 7, nº 9, 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (p. ej. promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los promotores histona, pol III y \beta-actina). Otros promotores virales que pueden emplearse incluyen, pero sin limitarse a ellos, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK) y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en el presente texto.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero sin limitarse a ellos, promotores adenovirales tales como el promotor tardío principal adenoviral; o promotores heterólogos tales como el promotor del citomegalovirus (CMV); el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores inducibles tales como el promotor MMT, el promotor de metalotioneína; promotores del choque térmico; el promotor de la albúmina; el promotor ApoAI; promotores de la globina humana; promotores virales de timidina quinasa tales como el promotor de la timidina quinasa del herpes simplex; LTRs retrovirales (incluyendo los LTRs retrovirales modificados descritos anteriormente); el promotor de \beta-actina; y promotores de la hormona del crecimiento humana. El promotor puede ser también el promotor nativo que controla los genes que codifican los polipéptidos.

El vector de plásmido retroviral se emplea para transducir las línes de células empaquetadoras (packaging cells) para formar líneas de células productoras. Los ejemplos de células empaquetadoras que pueden ser transfectadas incluyen, pero sin limitarse a ellas, las líneas de células PE501, PA317, \psi-2, \psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, \psi-CRE, \psi-CRIP, GP+E-86, GP+envAm12 y DAN, como se describe en Miller, Human Gene Therapy, vol. 1, p. 5-14 (1990).

El vector puede transducir las células empaquetadoras por cualquier medio conocido en la técnica. Entre estos medios se incluye, pero sin limitarse a ellos, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con CaPO_{4}. En una alternativa, el vector de plásmido retroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplado a un lípido, y después administrado a un hospedador.

La línea de células productoras genera partículas infecciosas de vector retroviral que incluyen la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Tales partículas de vector retroviral pueden emplearse entonces para transducir células eucariotas, bien sea in vitro o bien in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Las células eucariotas que pueden ser transducidas incluyen, pero sin limitarse a ellas, células troncales (células madre) embrionarias, células embrionarias de carcinoma, así como células troncales hematopoiéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células epiteliales bronquiales.

Las secuencias de la presente invención son también valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está especialmente dirigida a una posición particular de un cromosoma humano individual, y puede hibridarse con ella. Además, actualmente existe la necesidad de identificar sitios particulares en el cromosoma. Actualmente se dispone de pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos reales de secuencia (polimorfismos de repetición) para marcar la posición cromosómica. El cartografiado de DNAs a cromosomas de acuerdo con la presente invención es un importante primer paso en la correlación de esas secuencias con genes asociados con una enfermedad.

Brevemente, las secuencias pueden ser cartografiadas en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferentemente de 15-25 pb) a partir del cDNA. El análisis informático de la región no traducida 3' se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no abarquen más de un exón en el DNA genómico, complicando así el proceso de amplificación. Estos cebadores se usan después para la selección por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Solamente los híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador darán un fragmento amplificado.

El cartografiado por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un DNA particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores de oligonucleótido, puede conseguirse la sublocalización con paneles de fragmentos procedentes de cromosomas específicos o agrupamientos de grandes clones genómicos de una manera análoga. Otras estrategias de cartografiado que pueden usarse igualmente para cartografiar su cromosoma incluyen la hibridación in situ, la preselección con cromosomas marcados clasificados por flujo (flow sorted) y preselección por hibridación para construir genotecas de cDNA específicas del cromosoma.

La hibridación in situ fluorescente (FISH) de uno o más clones de cDNA con una diseminación cromosómica en metafase puede usarse para proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica puede usarse con cDNA tan corto como 500 o 600 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).

Una vez que una secuencia ha sido cartografiada a una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y enfermedades que han sido cartografiadas con la misma región cromosómica son entonces identificadas mediante análisis de unión (co-herencia de genes adyacentes físicamente).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en la secuencia de cDNA o genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en cualquier individuo normal, es entonces probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.

Con la actual resolución de las técnicas de cartografiado físico y cartografiado genético, un cDNA localizado precisamente en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno entre 50 y 500 genes causantes potenciales (esto supone una resolución de cartografiado de 1 megabase y un gen por cada 20 kb).

Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o células que los expresan, pueden ser usados como inmunógeno para producir anticuerpos contra ellos. Estos anticuerpo pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención incluye también anticuerpos quiméricos, de cadena simple y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una genoteca de expresión de Fab. Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención pueden ser obtenidos por inyección directa de los polipéptidos a un animal, o administrando los polipéptidos a un animal, preferentemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces él mismo a los polipéptidos. De esta manera, incluso una secuencia que codifica solamente un fragmento de los polipéptidos puede ser usada para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos completos. Tales anticuerpos pueden usarse entonces para aislar los polipéptidos del tejido que expresa ese polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Mildstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapie, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente de EE.UU. nº 4.946.778) puede adaptarse para producir anticuerpos de cadena simple contra productos de polipéptido inmunógenos de esta invención.

La presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos que siguen; sin embargo, se ha de entender que la presente invención no está limitada a tales ejemplos. Todas las partes y cantidades, a menos que se especifique otra cosa, son en peso.

Para facilitar la comprensión de los ejemplos que siguen, se describen ciertos métodos y/o términos que se presentan frecuentemente.

Los "plásmidos" se designan mediante un p minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida en el presente texto son disponibles comercialmente, o son disponibles públicamente sobre una base no restringida, o bien pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la técnica y serán evidentes para un profesional con una experiencia normal.

La "digestión" de DNA se refiere a la segmentación catalítica del DNA con una enzima de restricción que actúa solamente en determinadas secuencias del DNA. Las diversas enzimas de restricción usadas aquí son disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos fueron usados de forma conocida por un profesional con experiencia normal en la técnica. Para fines analíticos, típicamente se usa 1 \mug de plásmido o fragmento de DNA con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Con el fin de aislar fragmentos de DNA para la construcción de plásmidos, típicamente se digieren de 5 a 50 \mug de DNA con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones y cantidades de sustrato apropiadas para enzimas de restricción en particular vienen especificados por el fabricante. Normalmente se usan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del suministrador. Después de la digestión la mezcla de reacción se somete directamente a electroforesis en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaño de los fragmentos segmentados se lleva a cabo usando gel de poliacrilamida al 8% descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido de cadena simple o bien a dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótido que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen 5' fosfato y por tanto no se ligarán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no haya sido desfosforilado.

"Ligación" se refiere al proceso de formación de uniones fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (Maniatis, T., et al., Id. p. 146). A menos que se provea otra cosa, la ligación puede realizarse usando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades T4 DNA ligasa ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de DNA que se han de ligar.

A menos que se indique otra cosa, la transformación se realiza como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973).

Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de Ck\beta-13

La secuencia de DNA que codifica Ck\beta-13, ATCC nº 97113, se amplifica (se multiplica) inicialmente usando cebadores de oligonucleótido para PCR correspondientes a las secuencias terminales 5' y 3' de la secuencia de ácidos nucleicos de Ck\beta-13 procesada (menos la secuencia del péptido señal putativo). Se añaden nucleótidos adicionales correspondientes al gen Ck\beta- 13 a las secuencias terminales 5' y 3' respectivamente. El cebador de oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5' CCCGCATGCCCAACATGGAAGACAG 3' (SEQ ID Nº: 3) contiene un sitio para enzima de restricción SphI (en negrita) seguido por 16 nucleótidos de la secuencia codificadora de Ck\beta-13 partiendo del segundo nucleótido de la secuencia que codifica la proteína madura. El codón ATG está incluido en el sitio SphI. En el siguiente codón después del ATG, la primera base es a partir del sitio SphI y las dos bases restantes corresponden a la segunda y tercera bases del primer codón (resto 29) de la proteína madura putativa. La 3' secuencia 5' AAAGGATCCTTGGCTCAGCTTATTGAG 3' (SEQ ID Nº: 4) contiene secuencias complementarias respecto a un sitio BamH1 (en negrita) y está seguida por 18 nucleótidos de secuencias específicas del gen que preceden al codón de terminación. Los sitios para la enzima de restricción corresponden a los sitios para la enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). El vector pQE-9 codifica la resistencia al antibiótico (Amp'), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión con el ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios de enzima de restricción. El pQE-9 se digiere después con SphI y BamH1. Las secuencias amplificadas se ligan en pQE-9 y se insertan en marco con la secuencia que codifica la etiqueta de histamina y el RBS. La mezcla de ligación se usa después para transformar la cepa de E. coli M15/rep 4 (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito por Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a la kanamicina (Kan'). Los transformantes se identifican por su capacidad para desarrollarse en placas LB y se seleccionan las colonias resistentes a la ampicilina/kanamicina. El DNA del plásmido se aísla y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se desarrollan durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 ug/ml) como con Kan (25 ug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande a razón de 1:100 a 1:250. Las células se desarrollan hasta una densidad óptica a 600 nm (OD^{600}) entre 0,4 y 0,6. Después se añade IPTG ("isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido") hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG induce inactivando al represor lacI, aclarando el P/O dando lugar a una expresión génica incrementada. Las células se desarrollan otras 3 ó 4 horas más. Después se recolectan las células por centrifugación. El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar pH 5,0. Después de clarificar, la Ck\beta-13 solubilizada se purifica de esta solución mediante cromatografía en una columna de níquel-quelato bajo condiciones que permiten la unión estrecha mediante proteínas que contienen la etiqueta 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). La Ck\beta-13 (más del 98% de pureza) es eluida de la columna en guanidina HCl 6M. La renaturalización de la proteína fuera de GnHCl puede realizarse mediante varios protocolos (Jaenicke, R. y Rudolph, R., Protein Structure - A Practical Approach, IRL Press, Nueva York (1990)). Inicialmente, se utiliza diálisis en etapas para eliminar el GnHCl. Alternativamente la proteína purificada aislada de la columna de Ni-quelato puede unirse a una segunda columna sobre la que corre un gradiente lineal decreciente de GnHCl. La proteína se deja renaturalizar mientras está unida a la columna y subsiguientemente se eluye con un tampón que contiene imidazol 250 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 25 mM pH 7,5 y 10% de glicerol. Finalmente, la proteína soluble se dializa frente un tampón de almacenamiento que contiene bicarbonato amónico 5 mM.

Ejemplo 2 Expresión de Ck\beta-13 recombinante en células COS

La expresión del plásmido, Ck\beta-13 HA se deriva de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) origen de replicación de SV40, 2) gen de resistencia a la ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli, 4) promotor de CMV seguido por una región de polienlazador, un intrón de SV40 y sitio de poliadenilación. Un fragmento de DNA que codifica el precursor de Ck\beta-13 entero y una etiqueta HA fusionada en marco a su extremo 3', es clonado en la región de polienlazador del vector, y por tanto la expresión de la proteína recombinante es dirigida bajo el promotor de CMV. La etiqueta HA corresponde a un epítopo derivado a partir de la proteína hemaglutinina de la influenza como se ha descrito anteriormente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). La infusión de etiqueta HA a la proteína diana permite la fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítopo de HA.

La estrategia de construcción del plásmido se describe de la forma siguiente:

La secuencia de DNA que codifica Ck\beta-13, ATCC nº 97113, se construye mediante PCR usando
dos cebadores: el 5' cebador 5' AAAAAGCTTAACA
TAGGCTCGCCTACAGACT 3' (SEQ ID Nº: 5) con-
tiene un sitio HindIII seguido por 18 nucleótidos
de la secuencia codificadora de Ck\beta-13 partien-
do de la posición menos 3 relativa al codón de iniciación; la secuencia 3' 5'CGCTCTAGATTAAGCGTA
GTCTGGGACGTCGTATGGGTATTGGCTCAGCT
TATTGAGAAT 3' (SEQ ID Nº: 6) contiene secuencias complementarias a un sitio XbaI, codón de parada de la traducción (subrayado), etiqueta HA y los últimos 21 nucleótidos de la secuencia codificadora de Ck\beta-13 (no incluyendo el codón de parada). Por tanto, el producto de la PCR contiene un sitio HindIII, secuencia codificadora de Ck\beta-13 seguida por la etiqueta HA fusionada en marco, un codón de parada para terminación de la traducción a continuación de la etiqueta HA, y un sitio XbaI. El fragmento de DNA amplificado por PCR y el vector, pcDNA3/Amp, se digieren con enzima de restricción HindIII y XbaI y se ligan. La mezcla de ligación se transforma en la cepa de E. coli SURE (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), el cultivo transformado se cultiva en placas con medio de ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. El DNA de plásmido se aisla de los transformantes y se examina por análisis de restricción para ver la presencia del fragmento correcto. Para la expresión del polipéptido Ck\beta-13 recombinante, las células COS son transfectadas con el vector de expresión por el método DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína Ck\beta-13 HA se detecta por métodos de radiomarcaje e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988)). Las células se marcan durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después se recogen los medios de cultivo y las células se lisan con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, 0,5% de DOC, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I. et al., Id. 37: 767 (1984)). Tanto el lisado de células como el medio de cultivo se precipitan con anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizan mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 3 Clonación y expresión de Ck\beta-13 usando el sistema de expresión de baculovirus

La secuencia de DNA que codifica la proteína Ck\beta-13 de longitud completa, ATCC nº 97113, se amplifica usando cebadores de oligonucleótido para PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen:

El cebador 5' tiene la secuencia 5' AAAGGAT
CCGCCACCATGGCTCGCCTACAGACT 3' (SEQ
ID Nº: 7) y contiene un sitio para la enzima de restricción BamHI (en negrita) seguido por 6 nucleótidos que parecen una señal eficiente para la iniciación de la traducción en células eucarióticas (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196: 947-950 (1987)) y los 18 primeros nucleótidos del gen Ck\beta-13 (el codón de iniciación para la traducción "ATG" está subrayado).

El cebador 3' tiene la secuencia 5' AAAGGTACCTCATTGGCTCAGCTTATT 3' (SEQ ID Nº: 8) y contiene el sitio de segmentación para la endonucleasa de restricción Asp718 y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia no traducida 3' del gen Ck\beta-13. Las secuencias amplificadas se aíslan de un gel de 1% de agarosa usando un kit disponible comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digiere después con las endonucleasas BamHI y Asp718 y después se purifican otra vez en un gel de 1% de agarosa. Este fragmento se designa F2.

El vector pRG1 (modificación del vector pVL941, que se discute más adelante) se usa para la expresión de la proteína Ck\beta-13 usando el sistema de expresión de baculovirus (para una revisión véase: Summers, M. D. y Smith, G. E., 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin nº: 1555). Este vector de expresión contiene el promotor fuerte de polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear de la Autographa californica (AcMNPV) seguido por los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI y Asp718. El sitio de poliadenilación del virus de simio (SV)40 se usa para una poliadenilación eficiente. Para una fácil selección de virus recombinantes, el gen de la beta-galactosidasa de E. coli es insertado en la misma orientación que el promotor de polihedrina seguido por la señal para la poliadenilación del gen de la polihedrina. Las secuencias de la polihedrina están flanqueadas en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homóloga mediada por la célula de DNA viral de tipo silvestre co-transfectado. Podrían usarse otros muchos vectores de baculovirus en vez de pRG1, tales como pAc373, pVL941 y pACIM1 (Luckow, V. A, y Summers, M. D., Virology, 170: 31-39).

El plásmido es digerido con las enzimas de restricción BamHI y Asp718 y después es desfosforilado usando fosfatasa intestinal de ternera, por procedimientos conocidos en la técnica. Después se aísla el DNA de un gel de 1% de agarosa usando el kit disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este DNA vector se designa V2.

El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 son ligados con DNA ligasa de T4. Las células HB101 de E. coli son después transformadas y se identifican las bacterias que contenían el plásmido (pBac-Ck\beta-13) con el gen Ck\beta-13 usando las enzimas BamHI y Asp718. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante secuenciación del DNA.

Se co-transfectan 5 \mug del plásmido pBac-Ck\beta-13 con 1,0 \mug de un baculovirus linealizado disponible comercialmente ("BaculoGold™ baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) usando el método de lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)).

Se mezclan 1 \mug de DNA de baculovirus BaculoGold™ y 5 \mug del plásmido pBac-Ck\beta-13 en un pocillo estéril de una placa de microtítulo que contiene 50 \mul de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después se añaden 10 \mul de lipofectina más 90 \mul de medio de Grace, se mezcla y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, la mezcla de transfección se añade gota a gota a las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se bambolea hacia atrás y hacia delante para mezclar la solución recién añadida. Después se incuba la placa durante 5 horas a 27ºC. Al cabo de 5 horas la solución de transfección se retira de la placa y se añade 1 ml de medio de Grace para insectos suplementado con 10% de suero de ternera fetal. La placa se pone de nuevo en un incubador y el cultivo
continúa a 27ºC durante cuatro días.

Al cabo de cuatro días, se recoge el sobrenadante y se lleva a cabo un ensayo en placas similar al descrito por Summers y Smith (supra). Como modificación se usa un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) que permite un fácil aislamiento de las placas teñidas de azul. (Una descripción detallada de un "ensayo en placa" puede encontrarse también en la guía del usuario para cultivo de células de insectos y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9 y 10).

Cuatro días después de la dilución en serie, los virus se añaden a las células y las placas teñidas de azul se pican con la punta de una pipeta Eppendorf. El agar que contiene los virus recombinantes se resuspende después en un tubo Eppendorf que contiene 200 \mul de medio de Grace. El agar se elimina mediante una breve centrifugación y el sobrenadante conteniendo los baculovirus recombinantes se usa para infectar células Sf9 sembradas en discos de 35 mm. Cuatro días después los sobrenadantes de estos discos de cultivo se recolectan y se almacenan a 4ºC.

La células Sf9 se desarrollan en medio de Grace suplementado con 10% de FBS inactivado térmicamente. Las células se infectan con los baculovirus recombinantes V-Ck\beta13 a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas más tarde el medio se elimina y se reemplaza con medio SF900 II más metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas más tarde se añaden 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S-cisteína (Amersham). Las células se siguen incubando durante 16 horas antes de recolectarlas por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizan mediante SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 4 Expresión mediante terapia génica

Se obtienen fibroblastos de un sujeto mediante biopsia de la piel. El tejido resultante se pone en medio para cultivo de tejidos y se separa en porciones pequeñas. Se ponen trozos pequeños del tejido sobre la superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos; aproximadamente se ponen diez piezas en cada matraz. El matraz se voltea de arriba a abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los trozos de tejido quedan fijados al fondo del matraz y se añade medio fresco (p. ej. medio F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina). Después se incuba a 37ºC durante aproximadamente una semana. Al cabo de ese tiempo se añade medio fresco y se cambia posteriormente cada varios días. Después de otras dos semanas en cultivo, surge una monocapa de fibroblastos. La monocapa es tripsinada y se pasa en escamas a matraces más grandes.

El pMV-7 (Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de Moloney, se digiere con EcoRI y HindIII y subsiguientemente se trata con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica usando esferas de vidrio.

El cDNA que codifica un polipéptido de la presente invención es amplificado usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias terminales 5' y 3' respectivamente. El cebador 5' que contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye además un sitio HindIII. Se mezclan cantidades iguales del esqueleto lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento amplificado EcoRI y HindIII en presencia DNA ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usa para transformar bacterias HB101, que después se ponen en placa sobre agar con kanamicina con el fin de confirmar que el vector tenía el gen de interés apropiadamente insertado.

El pA317 anfotrópico o células empaquetadoras GP+am12 se desarrollan en cultivo de tejidos hasta densidad de confluencia en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera (CS), penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen se añade después al medio y las células empaquetadoras son transducidas con el vector. Las células empaquetadoras producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células empaquetadoras se denominan ahora células productoras).

Se añade medio fresco a las células productoras transducidas y subsiguientemente el medio se recolecta de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio usado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro millipore para eliminar las células productoras desprendidas y este medio se usa después para infectar células de fibroblasto. Se elimina el medio de una placa sub-confluente de fibroblastos y rápidamente se le reemplaza con el medio procedente de las células productoras. Este medio se elimina y se reemplaza con medio fresco. Si el título del virus es elevado, entonces prácticamente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requerirá selección. Si es título es muy bajo, es necesario entonces usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his.

Los fibroblastos construidos por ingeniería genética se inyectan entonces en el hospedador, bien sea solos o después de haber sido desarrollados hasta confluencia en esferas microportadoras cytodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto de proteína.

Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las anteriores enseñanzas y, por consiguiente, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede llevarse a la práctica de manera distinta a la descrita en particular.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: LI ET AL.

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(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: QUIMIOCINA HUMANA BETA 13

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(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv)

DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: HUMAN GENOME SCIENCES, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9410 KEY WEST AVENUE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: ROCKVILLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MD

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP: 20850

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco blando

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patent In Release 1.0, versión 1.30

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(vi)

DATOS SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NUMERO DE SOLICITUD: 95 92 3767.8-

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de junio de 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACION:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Vossius and Partner

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NUMERO DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: B2960 EPS3

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACION PARA TELECOMUNICACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELEFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 282 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGCATGCC CAACATGGAA GACAG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCT TGGCTCAGCT TATTGAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAGCTTA ACATAGGCTC GCCTACAGAC T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAT TGGCTCAGCT TATTGAGAAT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D):

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCG CCACCATGGC TCGCCTACAG ACT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGTACCTC ATTGGCTCAG CTTATT

\hfill

26

Claims (21)

1. Un polinucleótido elegido entre el grupo formado por:

(a)

polinucleótidos que codifican al menos la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en la SEQ ID Nº: 2;

(b)

polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora que se muestra en la SEQ ID Nº: 1, que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

(c)

polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el cDNA contenido en ATCC 97113;

(d)

polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora del cDNA contenido en ATCC 97113, que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

(e)

polinucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido según uno cualquiera de los apartados (a) a (d), en donde dicho fragmento tiene actividad quimiotáctica;

(f)

polinucleótidos que codifican un fragmento de polipéptido de al menos 30 o al menos 50 restos de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido según uno cualquiera de los apartados (a) a (d), en donde dicho fragmento tiene actividad quimiotáctica; y

(g)

polinucleótidos al menos un 70% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los apartados (a) a (f), y que codifica un polipéptido que tiene actividad quimiotáctica;

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1ª, que es DNA.

3. El DNA según la reivindicación 2ª, que es DNA genómico.

4. El polinucleótido según la reivindicación 1ª, que es RNA.

5. Un vector que contiene el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.

6. El vector según la reivindicación 5ª, en el que el polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células hospedadoras procarióticas o eucarióticas.

7. Una célula hospedadora construida mediante ingeniería genética con el vector según la reivindicación 5ª o 6ª.

8. Un procedimiento para preparar un polipéptido que tiene actividad quimiotáctica, que comprende cultivar la célula hospedadora según la reivindicación 7ª y recuperar del cultivo el polipéptido codificado por dicho polinucléotido.

9. Un procedimiento para preparar células capaces de expresar un polipéptido que tiene actividad quimiotáctica, que comprende construir por ingeniería genética células con el vector según las
reivindicaciones 5ª o 6ª.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, o que puede obtenerse mediante el procedimiento según la reivindicación 8ª.

11. Un anticuerpo contra el polipéptido según la reivindicación 10ª.

12. Una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente bajo condiciones severas con un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.

13. Un antagonista/inhibidor contra el polipéptido según la reivindicación 10ª, en el que dicho antagonista/inhibidor es un anticuerpo o una construcción antisentido que se híbrida bajo condiciones rigurosas con un material de transcripción de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.

14. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, el polipéptido según la reivindicación 10ª o un DNA que codifica dicho polipéptido y es capaz de expresarlo in vivo, o el antagonista según la reivindicación 13ª, y opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente.

15. Una composición para diagnóstico que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12ª, o el anticuerpo según la reivindicación 11ª.

16. El uso del polipéptido según la reivindicación 10ª o del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª para preparar una composición farmacéutica para tratar tumores sólidos, infecciones crónicas, leucemia, enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T, infecciones parasitarias, soriasis, para regular la hematopoiesis, para estimular la actividad del factor de crecimiento, para inhibir la angiogénesis o para favorecer la cicatrización de las heridas.

17. El uso del antagonista según la reivindicación 13ª para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, aterosclerosis, enfermedades crónicas inflamatorias o infecciosas, reacciones alérgicas mediadas por histamina o IgE, fiebre independiente de la prostaglandina, insuficiencia de la médula ósea, silicosis, sarcoidosis, artritis reumatoide o síndrome hiper-eosinofílico.

18. Un procedimiento in vitro para diagnosticar una enfermedad o la susceptibilidad para una enfermedad relacionada con una sobre-expresión del polipéptido según la reivindicación 10ª, que comprende determinar una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho polipéptido.

19. Un procedimiento de diagnóstico que comprende analizar la presencia del polipéptido según la reivindicación 10ª en una muestra derivada de un hospedador.

20. Un procedimiento para identificar un agonista para el polipéptido según la reivindicación 10ª, que comprende:

(a)

combinar un compuesto que se desea cribar y una mezcla de reacción que contiene células bajo condiciones en las que las células normalmente migran en respuesta al polipéptido según la reivindicación 10ª; y

(b)

determinar la magnitud de la migración de las células para identificar si el compuesto es eficaz como agonista.

21. El procedimiento según la reivindicación 20ª, en el que el polipéptido según la reivindicación 10ª es añadido a la combinación de la etapa (a), y la determinación de la magnitud de la migración identifica un compuesto eficaz como antagonista.