MXPA97008528A

MXPA97008528A - Quimiosina bata-13 humana

Info

Publication number: MXPA97008528A
Application number: MXPA/A/1997/008528A
Authority: MX
Inventors: Li Haodong; Seibel George
Original assignee: Human Genome Sciences Inc; Li Haodong; Seibel George; Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1997-11-05
Publication date: 1998-02-01

Abstract

Se describen polipéptidos de quimiosina humana y ADN que codifica para tales polipéptidos de quimiosina, y un procedimiento para producir tales polipéptidos por técnicas recombinantes. También se describen métodos pare utilizar tales polipéptidos de quimiosina para el tratamiento de leucemia, tumores fibróticos, sanado de heridas y psoriasis. También se describen antagonistas contra tales polipéptidos de quimiosina y su uso como una sustancia terapéutica para tratar artritis reumatoide, enfermedades autoimunes y enfermedades inflamatorias e infecciosas crónicas y aguadas, reacciones alérgicas, fiebre independiente de prostaglandina y fallo de médulaósea. También se describen ensayos de diagnostico para detectar enfermedades relacionadas con mutaciones en las secuencias deácido nucleico y concentraciones alteradas de los polipéptidos. También se describen ensayos de diagnóstico para detectar mutaciones en los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de quimiosina y para detectar concentraciones alteradas del polipéptido en un huésped.

Description

OUIMIOSINA BETA-13 HUMANA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con polinucleótidos recién identificados, polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos así como la producción de polinucleótidos y polipéptidos. De manera más particular, el polipéptido de la presente invención ha sido identificado de manera putativa como polipéptidos de quimiosina humana, algunas veces mencionado en lo siguiente como quimiosina beta-13 humana (Ckß-13) . La invención se relaciona con la inhibición de la acción de tales polipéptidos. Las quimiosinas, también conocidas como intercrina citosinas, son una subfamilia de citosinas relacionadas estructural y funcionalmente. Estas moléculas son de un tamaño de 8-10 kd. En general, las quimiosinas muestran 20% a 75% de homología a nivel de aminoácidos y están caracterizadas por cuatro residuos cisteína conservados que forman dos enlaces disulfuro. Basados en la disposición de los primeros residuos cisteína, las quimiosinas se han clasificado en dos subfamilias, alfa y beta. En la subfamilia alfa, las primeras dos cisteínas están separadas por un aminoácido y por lo tanto se conocen REF: 25846 como la subfamilia "C-X-C". En la subfamilia beta, las dos cisteínas están en posiciones adyacentes y por lo tanto se mencionan como la subfamilia "C-C" . Hasta ahora, se han identificado en los humanos por lo menos nueve miembros diferentes de estas familias. Las intercrina citosinas muestran una amplia variedad de funciones . Una característica común es su capacidad para inducir migración quimiotáctica de distintos tipos de células, que incluyen a monocitos, neutrófilos, linfocitos T, basófilos y fibroblastos. Muchas quimiosinas tienen actividad proinflamatoria y están involucradas en etapas múltiples durante una reducción inflamatoria. Estas actividades incluyen estimulación de liberación de histamina, liberación de enzimas lisosómicas y de leucotrieno, adherencia aumentada de las células inmune dirigidas a células endoteliales, unión aumentadas de proteínas de complemento, expresión inducida de moléculas de adhesión de granulocitos y receptores de complemento, y descarga respiratoria. Además de su relación en la inflamación, se ha demostrado que ciertas quimiosinas muestran otras actividades. Por ejemplo, la proteína 1 inflamatoria de macrófagos (MIP-1) es capaz de suprimir la proliferación de células pluripotenciales hematopoyéticas, el factor 4 plaquetario (PF-4) es un potente inhibidor del crecimiento de células endoteliales, la interleucina-8 (IL-8) promueve la proliferación de queratinocitos y GRO es un factor de crecimiento autóctono para células de melanoma. A la luz de las diversas actividades biológicas, no es sorprendente que las quimiosinas estén implicadas en muchos trastornos fisiológicos y mórbidos, que incluyen tráfico de linfocitos, sanado de heridas, regulación hematopoyética y trastornos inmunológicos tales como alergia, asma y artritis. Los miembros de la rama "C-C" ejercen sus efectos sobre las siguientes células: eosinófilos los cuales destruyen parásitos en una infección parasitaria menor y provocan inflamación crónica en las vías aéreas del sistema respiratorio; monocitos y macrófagos, los cuales suprimen la formación de tumores invertebrados; linfocitos T los cuales atraen a células T y basófilos, los cuales liberan histamina que juega un papel en una inflamación alérgica. Aunque los miembros de la rama C-C actual principalmente sobre células mononucleares y los miembros de la rama C-X-C actúan predominantemente sobre neutrófilos, no se puede asignar una propiedad quimioatrayente diferente a la quimiosina basado en estos lineamientos. Algunas quimiosinas de una familia muestran características de la otra.

El polipéptido de la presente invención tiene una región "C-C" cisteína conservada y una homología de secuencia de aminoácidos con las quimiosinas conocidas . De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan polipéptidos novedosos así como fragmentos, análogos y derivados del mismo biológicamente activos y útiles diagnóstica y terapéuticamente. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para tales polipéptidos, que incluyen ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico, así como fragmentos, análogos y derivados de los mismos biológicamente activos y diagnóstica o terapéuticamente útiles. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporcionan sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de longitud suficiente para hibridizar específicamente con secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido de la presente invención. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para producir tal polipéptido por técnicas recombinantes las cuales comprenden cultivar células huésped procarióticas y/o eucarióticas recombinantes, que contengan una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la presente invención, bajo condiciones que promuevan la expresión de la proteína y la posterior recuperación de la proteína. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales polipéptidos o polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos para propósitos terapéuticos, por ejemplo, para tratar tumores sólidos, infecciones crónicas, leucemia, enfermedades autoinmunes mediadas por células T, infecciones parasitarias, psoriasis, para regular la hematopoyesis, para estimular la actividad del factor de crecimiento, para inhibir la angiogénesis y para promover el sanado de heridas . De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos. De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan antagonistas para tales polipéptidos los cuales pueden ser utilizados para inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, en el tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunes, aterosclerosis, enfermedades inflamatorias e infecciosas crónicas, reacciones alérgicas mediadas por histamina y por IgE, fiebre independiente de prostaglandina, fallo de médula ósea, silicosis, sarcoidosis, artritis reumatoide y síndrome hipereosinofílico. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad relacionada con una mutación en las secuencias de ácido nucleico de la presente invención y con concentraciones alteradas de la proteína codifica por tales secuencias de ácido nucleico. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, para propósitos in vi tro relacionados con investigación científica, síntesis de ADN y fabricación de vectores de ADN. Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes para aquéllos familiarizados con la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Los siguientes dibujos son modalidades ilustrativas de la invención y no significa que limiten el alcance de la invención como es abarcada por las reivindicaciones . La figura 1 muestra la secuencia de ADNc y la secuencia deducida de aminoácidos correspondiente de Ck/ß-13. Los 28 aminoácidos iniciales representan la secuencia líder de manera que el polipéptido maduro putativo comprende 65 aminoácidos. Se utilizan las abreviaturas estándar de una letra para los aminoácidos. El secuenciado se realiza utilizando un secuenciador de ADN automatizado 373 (Applied Biosystems, Inc.). La figura 2 muestra la homología en la secuencia de aminoácidos entre Ck/3-13 (parte superior) y en polipéptido MlP-la humano (parte inferior) . De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan ácidos nucleicos aislados "polinucleótidos" los cuales codifican para el polipéptido maduro que tiene la secuencia deducida de aminoácidos de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc de las clonas depositadas como ATCC, depósito No. 97113 el 28 de abril de 1995. Los polinucleótidos que codifican para Ck?-l3 han sido aislados de una biblioteca de ADNc de monocitos activados. Ck3-13 es un miembro de la rama C-C de quimiosinas. Contiene un marco de lectura abierta que codifica para una proteína de 93 residuos aminoácidos de los cuales aproximadamente los primeros 28 residuos aminoácidos son la secuencia líder putativa de manera que la proteína madura comprende 65 aminoácidos. La proteína tiene homología estructural con polipéptidos de quimiosina y la homología con el polipéptido MIP-la, con 33% de identidad y 53% de similitud con respecto a la totalidad de la secuencia, se utiliza únicamente como un ejemplo. Los cuatro residuos cisteína conservados espacialmente en las quimiosinas se encuentran en el polipéptido de la presente invención, como se puede observar en la figura 1. Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, ADN el cual incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hebra o de hebra sencilla, y si es de hebra sencilla puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido) . La secuencia codificante la cual codifica para los polipéptidos maduros puede ser idéntica a la secuencia codificante que se muestra en las figuras 1 (SEC. DE IDENT. NO:l) o a la de las clonas depositadas, o puede ser una secuencia codificante diferente, secuencia codificante la cual, como resultado de la redundancia o regeneración del código genético, codifica para los mismos polipéptidos maduros que el ADN de la figura 1 (SEC. DE IDENT. N0:1) o el ADNc depositado. Los polinucleótidos los cuales codifican para el polipéptido maduro de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc depositado pueden incluir: únicamente la secuencia codificante para el polipéptido maduro,- la secuencia codificante para el polipéptido maduro y una secuencia codificante adicional tal como una secuencia líder o secretora, o una secuencia de proproteína; la secuencia codificante para el polipéptido maduro (y opcionalmente una secuencia codificante adicional) y la secuencia no codificante, tales como intrones o secuencias no codificantes 5' y/o 3' con respecto a la secuencia codificante para los polipéptidos maduros. Por lo tanto, el término "polinucleótido que codifica para un polipéptido" abarca a un polinucleótido el cual incluye únicamente la secuencia codificante para el polipéptido así como un polinucleótido el cual incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales. La presente invención se relaciona adicionalmente con variantes de los polinucléotidos descritos en lo anterior, los cuales codifican para fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos reducida de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) o para el polipéptido codificado por el ADNc de las clonas depositadas. Las variantes de los polinucleótidos pueden ser una variante alélica que se presenta de manera natural de los polinucleótidos o una variante que se presenta de manera no natural de los polinucleótidos. Por lo tanto, la presente invención incluye polinucléotidos que codifican para el mismo polipéptido maduro, como se muestra en las figuras l (SEC. DE IDENT. NO: 2) o para el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de las clonas depositadas así como variantes de tales polinucleótidos, variantes las cuales codifican para un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) o el polipéptido codificado por el ADNc de las clonas depositadas. Tales variantes de nucleótido incluyen variantes por supresión, variantes por sustitución y variantes por adición o inserción. Como se indica en lo anterior, los polinucleótidos pueden seguir una secuencia codificante la cual es una variante alénica que se presenta de manera natural de la secuencia codificante que se muestra en la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO:l) o de la secuencia codificante de las clonas depositadas. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos la cual puede tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos, lo cual no altera sustancialmente la función del polipéptido codificante. La presente invención también incluye polinucleótidos, en los que la secuencia codificante para el polipéptido maduro puede fusionarse en el mismo marco de lectura con una secuencia para polinucleótido lo cual ayuda a la dispersión y secreción de un polipéptido desde la célula huésped, por ejemplo, una secuencia líder la cual funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder separada por la célula huésped para producir la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar para una proproteína la cual es la proteína madura más los residuos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se separa la prosecuencia permanece la proteína madura activa. Así, por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar para una proteína madura, o para una proteína que tiene una prosecuencia o para una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder) . Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener una secuencia codificante fusionada al marco con una secuencia marcadora lo cual permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una marca o etiqueta de hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación de polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano, o bien, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) cuando se utilizan células de mamífero, por ejemplo células COS-7. La marca HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza ( ilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984) ) . El término "gen" significa un segmento de ADN involucrado en producir una cadena polipeptídica; incluye regiones precedentes y posteriores a la región codificante (delanteras y traseras) así como secuencias intercaladas (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones) . Los fragmentos del gen para Ck-130 de longitud completa se pueden utilizar como una sola hibridización para una biblioteca de ADNc para aislar el gen de longitud completa y para aislar otros genes los cuales tengan una elevada similitud en la secuencia para el gen o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo de manera preferible tienen por lo menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 o más bases. La sonda también se puede utilizar para identificar una clona de ADNc que corresponda con el transcrito de longitud completa y con una clona o clonas genómicas que contengan al gen para Ck3-13 completo, que incluyan regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de un examen o tamizado comprende aislar la región codificante del gen para Ck/3-13 mediante la utilización de una secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos marcados tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención y se utilizan para examinar una biblioteca de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar con cuáles miembros de la biblioteca hibridiza la sonda. La presente invención se relaciona adicionalmente con polinucleótidos los cuales hibridizan con las secuencias descritas en lo anterior si existe por lo menos 70%, de manera preferible por lo menos 90%, y de manera más preferible por lo menos 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se relaciona particularmente con polinucleótidos los cuales hibridizan bajo condiciones de restricción con los polinucleótidos descritos en lo anterior. Como se utiliza en la presente, el término "condiciones de restricción" significa que la hibridización ocurrirá únicamente si existe por lo menos 95%, y de manera preferible por lo menos 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos los cuales hibridizan con los polinucleótidos descritos en lo anterior, en una modalidad preferida, codifican para polipéptidos los cuales retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la figura 1 (SEC. DE IDENT. N0:1) o con los ADNc depositados, es decir, funciona como un polipéptido de quimiosina. De manera alternativa, los polinucleótidos pueden tener polinucleótidos los cuales tienen por lo menos 20 bases, de manera preferible 30 bases y de manera más preferible por lo menos 50 bases, los cuales hibridizan con un polinucleótido de la presente invención y el cual tiene una identidad con el mismo, como se describe en lo siguiente, y el cual puede o no retener actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden ser utilizados como sondas para el polinucleótido de la SEC. DE IDENT. NO:l: o para variantes de la misma, por ejemplo, para recuperación del polinucleótido o como una sonda de diagnóstico o como un iniciador o sebador para PCR. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que tienen por lo menos 70% de identidad, de manera preferible por lo menos 90% y de manera más preferible por lo menos 95% de identidad con un polinucleótido el cual codifica para el polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO : 2 así como para fragmentos del mismo, fragmentos los cuales tienen 30 bases y de manera preferible por lo menos 50 bases, con polipéptidos que codifican para tales polinucleótidos.

Los depósitos a los que se hace referencia en la presente se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest respecto al reconocimiento Internacional de el depósito de Microorganismos para propósitos de procedimiento para patente. Estos depósitos se proporcionan únicamente para conveniencia de aquéllos familiarizados con la técnica y no son un reconocimiento de que se requiere un depósito bajo 35 U.S.C. §112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por la misma se incorporan en la presente como referencia y están controlados en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias en la presente. Se puede requerir un permiso para producir, utilizar, o vender los materiales depositados, y por la presente no se proporciona tal permiso. La presente invención se relaciona adicionalmente con polipéptidos los cuales tienen la secuencia reducida de aminoácidos de la figura l (SEC. DE IDENT. NO: 2) o la cual tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado, así como con fragmentos, análogos o derivados de tales polipéptidos. Los términos "fragmentos", "derivados" y "análogos", cuando se refieren al polipéptido de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) o al codificado por el ADNc depositado, significa un polipéptido el cual retiene esencialmente la misma función biológica o actividad como tal polipéptido. Por lo tanto, un análogo incluye una proproteína la cual puede ser activada por separación o desprendimiento de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo. Un derivado o fragmento puede incluir, por ejemplo, una variante por empalme la cual tiene menos residuos aminoácidos que el polipéptido de la figura 1, pero que aún retiene la actividad biológica característica de los polipéptidos de quimiosina humana. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos, de manera preferible polipéptidos recombinantes . El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la figura 1 (SEC. DE IDENT. NO: 2) o el codificado por los ADNc depositados puede ser: (i) uno en el cual uno o más residuos aminoácidos están sustituidos con un residuo aminoácido conservado o no conservado (de manera preferible un residuo aminoácido conservado) y tal residuo aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) , uno en el cual el polipéptido maduro esté fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) , o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionen con el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora, o una secuencia la cual es utilizada para purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se considera que se encuentran dentro del alcance por aquéllos familiarizados con la técnica a partir de las enseñanzas en la presente. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención de manera preferible se proporcionan en forma aislada, y de manera preferible se purifican hasta homogeneidad. El término "aislado" significa que el material se ha separado de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si se presenta de manera natural) . Por ejemplo, el polinucleótido o polipéptido que se presenta de manera natural, presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de la totalidad de los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos pueden ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos pueden ser parte de una composición, y aún estar aislados de manera que tal vector o composición no sea parte de su ambiente natural .

Los polipéptidos de la presente invención incluyen al polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO: 2 (en particular al polipéptido maduro) así como polipéptidos los cuales tienen por lo menos 70% de similitud (preferiblemente, por lo menos 70% de identidad) con el polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO : 2 y de manera más preferible con por lo menos 90% de similitud (de manera más preferible por lo menos 90% de identidad) con el polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO: 2 y de manera aún más preferible por lo menos 95% de similitud (de manera aún más preferible por lo menos 95% de identidad) con el polipéptido de la SEC. DE IDENT. NO: 2 y que también incluye porciones de tales polipéptidos las cuales generalmente contendrán por lo menos 30 aminoácidos, y de manera más preferible por lo menos 50 aminoácidos. Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos está determinada al comparar la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados para producir el polipéptido correspondiente de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, los fragmentos pueden ser utilizados como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención. La presente invención también se relaciona con vectores los cuales incluyen polinucleótidos de la presente invención, células huésped las cuales son sometidas a ingeniería genética con vectores de la invención, y la producción del polipéptido de la invención por técnicas recombinantes . Las células huésped son sometidas a ingeniería genética (transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención los cuales pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped sometidas a ingeniería se pueden cultivar en medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para activación de promotores, selección de transformantes o amplificación de los genes para Ck/3-13. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y similares son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para una persona familiarizada con la técnica.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede incluirse en cualquiera de diversos vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y de ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de viruela y pseudorrabia. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector en la medida en que sea replicable y viable en el huésped. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el vector por diversos procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en sitios de endonucleasa de restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos y otros se consideran que están dentro del alcance de aquéllos familiarizados con la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está unido de manera operable a secuencias de control de expresión apropiadas (promotores) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores se pueden mencionar: promotor LTR o SV40, los promotores de E. coli, lac o trp. el fago lambda PL y otros promotores conocidos que se sabe controlan la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas, o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión de ribosoma para inicio de traducción y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificación de la expresión. Además, los vectores de expresión de manera preferible contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para selección de células huésped transformadas tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se describe en lo anterior, así como un promotor apropiado o secuencia de control, puede ser utilizado para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la proteína. Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados se pueden mencionar: células bacterianas tales como E. coli. Streptomyces, Salmonella typhimurium; células micóticas tales como levadura; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes ; adenovirus; células vegetales, etc. La selección de un huésped apropiado se considera que está dentro del alcance de aquéllos familiarizados con la técnica a partir de las enseñanzas en la presente. De manera más particular, la presente invención también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias como se describen de manera amplia en lo anterior. Los constructos comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación hacia adelante o en reversa. En un aspecto preferido de esta modalidad, el constructo comprende de manera adicional secuencias reguladoras que incluyen, por ejemplo, un promotor, unido de manera operable a la secuencia. Se conocen por aquéllos familiarizados con la técnica grandes cantidades de vectores y promotores adecuados, los cuales están disponibles comercialmente. A modo de ejemplo se proporcionan los siguientes vectores. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pBS, pDlO, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK-233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) . Eucariótico: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3 , pBPV, pMSG, pSLV (Pharmacia) . Sin embaergo, se puede utilizar cualquier otro plásmido o vector en la medida en que sea replicable y viable en el huésped. Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado utilizando vectores CAT (cloramfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos mencionados de manera particular incluyen lacl, lacZ, T3 , T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucarióticos incluyen SMV temprano inmediato, HSV de timidina cinasa, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados se encuentra dentro del nivel de una persona familiarizada con la técnica. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con células huésped que contienen los constructos descritos en lo anterior. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped se puede llevar a cabo por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Los constructos en las células huésped se pueden utilizar de manera convencional para producir los productos de genes codificados por las secuencias recombinantes . De manera alternativa, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos de manera sintética por sintetizadores de péptidos convencionales. Las proteínas maduras se pueden expresar en células de mamífero, levadura, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. También se pueden utilizar sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas utilizando ARN derivados de constructos de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con los huéspedes procarióticos y eucarióticos se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY., (1989), la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia. La transcripción del ADN que codifica para los polipéptidos de la presente invención por eucariotes superiores se incrementa al insertar una secuencia alargadora en el vector. Los alargadores son elementos que actúan cis de ADN, de manera habitual, desde aproximadamente 10 hasta 300 pb que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el alargador SV40 en el lado tardío del origen de replicación de las pb 100 a 270, el alargador del promotor temprano de citomegalovirus, y el alargador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los alargadores de adenovirus . Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae. y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores se pueden derivar de operones que codifican para enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor a, fosfatasa acida o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructura heteróloga se ensambla en fase apropiada con secuencias de inicio y de terminación de traducción, y de manera preferible, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico u otro medio extracelular. De manera opcional, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N terminal que imparta las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen al insertar una secuencia de ADN estructural que codifique para una proteína deseada junto con las señales de inicio y de terminación de traducción adecuadas en fase de lectura operable con un promotor funcional . El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, para proporcionar amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque se pueden utilizar otros según se decida. Como un ejemplo representativo aunque no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprende elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017) . Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wl, EUA) . Estas secciones de "estructura principal" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a expresar. Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce por medios apropiados (por ejemplo desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un período adicional . Las células típicamente se pueden recolectar por centrifugación, se pueden romper por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante se puede retener para purificación adicional. Las células microbianas utilizadas en la expresión de proteínas se puede romper por cualquier método conveniente, que incluye ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes Usantes de células, tales métodos son bien conocidos por aquéllos familiarizados con la técnica. También se pueden utilizar diversos sistemas de cultivos de células de mamífero para expresar proteínas recombinantes. Los ejemplos de sistemas de expresión en mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritos por Gluzman, Cell, 23:175 (1981) y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo las líneas de células C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor y alargador adecuados, y también sitios de unión de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores de sectores de empalme, frecuencias de terminación de transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes 5' . Las secuencias de ADN derivadas del empalme SV40, y los sitios de poliadenilación pueden ser utilizados para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. Los polipéptidos se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes por métodos que incluyen sulfato de amonio o precipitación con etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Se pueden utilizar etapas de renaturalización de proteína según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, se puede utilizar cromatografía líquida de alta resolución (CLAP) para las etapas de purificación finales. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o bien se puede producir por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucarió ico (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamífero en cultivo) . En base al huésped utilizado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados . Los polipéptidos de la invención también incluyen un residuo aminoácido metionina inicial . Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y para diagnóstico de enfermedades humanas . El polipéptido de la presente invención puede ser utilizado para inhibir la formación de colonias de células pluripotenciales de médula ósea como tratamiento protector adyuvante durante la quimioterapia del cáncer. El polipéptido Ck/3-13 puede inhibir la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas tales como células pluripotenciales de médula ósea. El efecto inhibidor sobre la población de células progenitoras reclutadas (por ejemplo, granulocitos y macrófagos/monocitos) se puede utilizar terapéuticamente para inhibir la proliferación de células leucénicas.

Los polipéptidos de la presente invención, también se pueden utilizar para inhibir la proliferación de queratinocitos epidérmicos para el tratamiento de psoriasis, el cual está caracterizado porque por hiperproliferación de queratinocitos, puesto que se ha encontrado que las células de Langerhans en la piel producen quimiosinas. Los polipéptidos de la presente invención también se pueden utilizar para tratar tumores sólidos, por ejemplo sarcoma de Karposi, al estimular la invasión y activación de las células de defensa del huésped, por ejemplo, células T citotóxicas y macrófagos por medio de quimiotaxis, y por inhibición de la angiogénesis de tumores. También pueden ser utilizados para incrementar la defensas del huésped contra infecciones crónicas y agudas resistentes, por ejemplo, infecciones micobacterianas por medio de la atracción y activación de leucocitos microbicidas . Los polipéptidos de la presente invención también se pueden utilizar para inhibir proliferación de células T por la inhibición de biosíntesis de IL-2 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes mediadas por células T y leucemias linfocíticas . La CKjS-13 también se puede utilizar para estimular el sanado de heridas y evitar la cicatrización durante el sanado de heridas, tanto vía reclutamiento y aclaramiento de residuos y de tejido conectivo que promueva células inflamatorias, y también por medio de su control de fibrosis excesiva mediada por TGF/3. De esta manera, Ck/3-13 también se puede utilizar para tratar otros trastornos fibróticos que incluyen cirrosis hepática osteoartritis y fibrosis pulmonar. Los polipéptidos de la presente invención también incrementan la presencia de eosinófilos los cuales tienen la función distintiva de destruir las larvas de parásitos que invaden los tejidos como en la esquisomiasis, triquinosis y ascariasis. También se pueden utilizar para regular la hematopoyesis, al regular la activación y diferenciación de diversas células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, para liberar leucocitos maduros de la médula ósea posterior a quimioterapia. El polipéptido de la presente invención también puede ser utilizado para dirigirse a células no deseadas, tales como en el tratamiento de cáncer, para apoptosis. Los polinucléotidos y polipéptidos codificados por tales polinucleótidos también se pueden utilizar para propósitos in vi tro relacionados con la investigación científica, síntesis de ADN y fabricación de vectores de ADN y para el diseño de sustancias terapéuticas y de diagnóstico para el tratamiento de enfermedades humanas. El polipéptido también se puede utilizar para movilizar células pluripotenciales de médula ósea hacia sangre periférica, lo cual permite el aislamiento fácil de células pluripotenciales. Las células pluripotenciales aisladas pueden ser utilizadas para colonización de médula ósea después de quimioterapia a altas dosis . Esta invención también se relaciona con el uso del gen para Ck/3-13 como parte de un ensayo diagnóstico para detectar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de la presente invención. Tales enfermedades se relacionan con la subexpresión de polipéptidos de quimiosina humana, por ejemplo, tumores y cánceres. Los individuos que presentan mutaciones en un gen de la presente invención se pueden detectar a nivel de ADN por diversas técnicas. Los ácidos nucleicos para diagnóstico se pueden obtener a partir de células del paciente, tales como sangre, orina, saliva, tejido de biopsia y material de autopsia. El ADN genómico puede ser utilizado directamente para detección o se puede amplificar enzimáticamente utilizando PCR (Saiki et al . , Nature, 324:163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o ADNc también se puede utilizar para el mismo propósito. Como un ejemplo, los iniciadores de PCR complementarios al ácido nucleico que codifica para Ck/3-13 se pueden utilizar para identificar y analizar mutaciones de Ckjß-13. Por ejemplo, se pueden detectar supresiones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Se pueden identificar mutaciones de punto al hibridizar ADN amplificado a ARN para Ck/3-13 radiomarcado, o, alternativamente, secuencias de ADN antisentido para Ck/3-13 radiomarcadas. Las secuencias que coincidan perfectamente se pueden diferenciar de hebras dúplex mal pareadas por digestión con RNasa A o por diferencias en las temperaturas de desnaturalización. Las pruebas genéticas basadas en diferencias en las secuencias de ADN se pueden obtener por detección de alteración en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Se pueden visualizar pequeñas supresiones e inserciones en la secuencia por electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de secuencias diferentes se pueden diferenciar en base a geles de gradiente de formamida desnaturalizante en los cuales se retarda la movilidad de diferentes fragmentos de ADN en gel, en posiciones diferentes de acuerdo con sus temperaturas específicas de fusión (desnaturalización) o de fusión parcial (véase, por ejemplo, Myers et al . , Science, 230:1242 (1985)). También se pueden hacer evidentes los cambios de secuencias en posiciones específicas mediante ensayo de protección con nucleasa, tales como RNasa y protección SI o el método de ruptura química (por ejemplo Cotton et al., PNAS, EUA, 85:4397-4401 (1985)). Por lo tanto, la detección de una secuencia de ADN específica se puede obtener por métodos tales como hibridización, protección por RNasa, ruptura química, secuenciado directo de ADN o el uso de enzimas de restricción (por ejemplo, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) ) y transferencia Southern del ADN genómico. Además de la electroforesis en gel y secuenciado de ADN, más convencionales, también se pueden detectar mutaciones mediante análisis in si tu . La presente invención también se relaciona con un ensayo diagnóstico para detectar concentraciones alteradas del polípéptido de la presente invención a diversos tejidos puesto que una sobreexpresión del polipéptido comparada con muestras de tejido de control normal puede detectar la presencia de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo, un tumor. Los ensayos utilizados para detectar niveles de un polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de un huésped son bien conocidas por aquéllos con habilidades en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western, ensayos ELISA y ensayos "de interposición". Un ensayo ELISA (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Capítulo 6, (1991)) inicialmente comprende preparar un anticuerpo específico para un antígeno Ck/3-13, de manera preferible un anticuerpo monoclonal. Además, se prepara un anticuerpo indicador contra el anticuerpo monoclonal . Al anticuerpo indicador se le une un reactivo detectable tal como radioactividad, fluorescencia o, en este ejemplo, enzima de peroxidasa de rábano. Se extrae una muestra de un huésped y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo, un recipiente de poliestireno, que une a las proteínas en la muestra. Cualquiera de los sitios de unión de la proteína libres sobre el recipiente posteriormente se cubren al incubar con una proteína no específica como BSA. Después, el anticuerpo monoclonal se incuba en el recipiente durante un tiempo en el cual los anticuerpos monoclonales se unen a cualquier proteína Ck/3-13 unida al recipiente de poliestireno. Todo el anticuerpo monoclonal no unido se elimina por clavado con amortiguador. Después se coloca el anticuerpo indicador unido a peroxidasa de rábano en el recipiente lo que resulta en la unión del anticuerpo indicador a cualquier anticuerpo monoclonal unido al polipéptido Ckjß-13. Posteriormente se elimina por lavado el anticuerpo indicador que no se ha unido. Después se agregan los sustratos de peroxidasa al recipiente y la cantidad de color desarrollado en un período de tiempo dado es una medida de la cantidad de la proteína Ckjß-13 presente en un volumen dado de una muestra de paciente cuando se compara contra una curva estándar. Se puede utilizar un ensayo de competencia en el que los anticuerpos específicos para el polipéptido Ck/3-13 se unen a un soporte sólido y un polipéptido Ck/3-13 marcado y una muestra derivada del huésped se hacen pasar sobre soporte sólido y la cantidad de nivel detectada, por ejemplo por centelleo líquido o cromatografía, puede correlacionarse con una cantidad de polipéptido Ckjß-13 en la muestra. Un ensayo "de interposición" es similar a un ensayo ELISA. En un ensayo "de interposición", el polipéptido Ckjß-13 se hace pasar sobre un soporte sólido y se une al anticuerpo unido a un soporte sólido. Después se une a un segundo anticuerpo al polipéptido Ck/3-13. Después se hace pasar a un tercer anticuerpo, el cual está marcado y es específico para el segundo anticuerpo, sobre el soporte sólido y se une al segundo anticuerpo en una cantidad que puede ser cuantificada posteriormente.

Esta invención proporciona un método para la identificación de receptores para el polipéptido de la presente invención. El gen que codifica para el receptor puede ser identificado por numerosos métodos conocidos por aquéllos familiarizados con la técnica, por ejemplo, una panorámica de ligando y clasificación FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Capítulo 5, (1991) ) . De manera preferible, se utiliza la clonación de expresión en la que se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula sensible a los polipéptidos, y la biblioteca de ADNc producida a partir de este ARN se divide en acumulados y se utilizan para transfectar células COS u otras células que no sean sensibles a los polipéptidos. Las células transfectadas las cuales se hacen crecer en placas de vidrio se exponen a los polipéptidos marcados. Los polipéptidos pueden ser marcados por diversos medios que incluyen yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica para sitio. Después de la fijación e incubación, las placas se someten a análisis autorradiográfico. Se identifican acumulados positivos y subacumulados se preparan y se transfectan utilizando un subacumulamiento interactivo y proceso de preexaminación, lo que finalmente proporcionan clonas únicas que codifican para el receptor putativo.

Como un enfoque alternativo para la identificación del receptor, los polipéptidos marcados pueden ser unidos por fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones de extracto que expresen la molécula receptora. El material reticulado se separa por análisis en PAGE y se expone a película de rayos X. El complejo marcado que contiene los receptores de los polipéptidos puede ser cortado, separado en fragmentos peptídicos y sometido a microsecuenciado de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir del microsecuenciamiento puede ser utilizada para diseñar un conjunto de sondas degeneradas de oligonucleótidos para examinar una biblioteca de ADNc para identificar los genes que codifican para los receptores putativos . Esta invención proporciona un método para examinar compuestos para identificar agonistas y antagonistas al polipéptido de la presente invención. Un agonista es un compuesto el cual se une a, y activa un receptor al polipéptido de la presente invención, mientras que los antagonistas se unen e inhiben a los receptores o simplemente compiten con Ckjß-13 para tales receptores. La quimiotaxis puede ser ensayada al colocar células, las cuales son quimiotraídas por el polipéptido de la presente invención, en la parte superior de un filtro con poros de diámetro suficiente para que pasen las células (aproximadamente 5 µm) . Las soluciones de agonistas potenciales se colocan en el fondo de la cámara con un medio de control apropiado en el compartimiento superior y de esta manera se mide un gradiente de concentración del agonista al contar las células que emigran hacia o a través de la membrana porosa con respecto al tiempo. Cuando se realizan ensayos para los antagonistas, el polipéptido de la presente invención se coloca en la cámara inferior y el antagonista potencial se agrega para determinar si se evita la quimiotaxis de las células. De manera alternativa, células de mamífero o preparación de membrana que exprese los receptores de los polipéptidos se puede incubar con un polipéptido marcado de la presente invención, por ejemplo, por radioactividad, en presencia del compuesto. La capacidad del compuesto para bloquear esta interacción después se puede determinar. Los ejemplos de antagonistas potenciales para el polipéptido de la presente invención incluyen anticuerpos o, en algunos casos, oligonucleótidos, los cuales se unen a los polipéptidos. Otro ejemplo de un antagonista potencial es un mutante dominante negativo de los polipéptidos. Los mutantes dominantes negativos son polipéptidos los cuales se unen al receptor del polipéptido de tipo silvestre, pero que no retienen actividad biológica.

Los constructos antisentido preparados utilizando tecnología antisentido también • son antagonistas potenciales. La tecnología antisentido puede ser utilizada para controlar la expresión de genes a través de la formación de triples hélices de ADN antisentido o de ARN, ambos métodos los cuales se basan en la unión de un polinucleótido a ADN o a ARN. Por ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia de polinucleótidos la cual codifica para los polipéptidos maduros de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario con una región del gen involucrado en la transcripción (triple hélice, véase Lee et al., Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al , Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), por lo que se evita la transcripción y la producción de polipéptido de la presente invención. El oligonucleótido ARN antisentido hibridiza con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en polipéptidos (antisentido - Okano, J. Neurochem. , 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos antes también pueden ser suministrados a células de manera que el ARN o ADN antisentido se puede expresar in vivo para inhibir la producción del polipéptido de la presente invención. Otro antagonista potencial es un péptido derivado de los polipéptidos el cual es un análogo modificado de manera natural o sintética del polipéptido que tiene la función biológica perdida pero que aún reconoce y se une a los receptores del polipéptido para de esta manera bloquear efectivamente a los receptores. Los ejemplos de derivados peptídicos incluyen, pero no se limitan a péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos. Los antagonistas pueden ser utilizados para inhibir la quimiotaxis y activación de macrófagos y sus precursores y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subgrupos de células T, por ejemplo, las células T activadas y citotóxicas CD8 y las células asesinas o destructoras naturales (natural killer) , en ciertas enfermedades autoinmunes crónicas e inflamatorias e infecciosas. Los ejemplos de tales enfermedades autoinmunes incluyen esclerosis múltiple y diabetes dependiente de insulina. Los antagonistas también pueden ser utilizados para tratar enfermedades infecciosas que incluyen silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática al evitar el reclutamiento y activación de fagocitos mononucleares. También se pueden utilizar para tratar el síndrome hipereosinofílico idiopático al evitar la producción y migración de eosinófilos. También se puede tratar el choque endotóxico por los antagonistas al evitar la migración de macrófagos y su producción del polipéptido de la presente invención. Los antagonistas también se pueden utilizar para tratar la aterosclerosis al evitar la infiltración de monocitos en las paredes arteriales. Los antagonistas también se pueden utilizar para tratar reacciones alérgicas mediadas por histamina y trastornos inmunológicos que incluyen reacciones alérgicas de fase tardía, urticaria crónica y dermatitis atópica al inhibir células cebadas inducidas por quimiosina y desgranulación de basófilos y liberación de histamina, fracciones alérgicas mediadas por IgE tales como asma alérgica, rinitis y eczema también pueden ser tratadas. Los antagonistas también pueden ser utilizados para tratar inflamación crónica y aguda al evitar la atracción de monocitos al área de la herida. También se pueden utilizar para regular poblaciones normales de macrófagos pulmonares, puesto que las enfermedades pulmonares e inflamatorias crónicas y agudas están asociadas con el secuestro de fagocitos mononucleares en el pulmón.

Los antagonistas también se pueden utilizar para tratar artritis reumatoide y para evitar la atracción de monocitos al fluido sinovial en las articulaciones de pacientes. El flujo de entrada de monocitos y la activación juega un papel significativo en la patogénesis de artropatías tanto degenerativas como inflamatorias . Los antagonistas pueden ser utilizados para interferir con las cascadas dañinas atribuidas principalmente a IL-1 y TNF lo que evita la biosíntesis de otras citosinas inflamatorias. De esta manera, se pueden utilizar los antagonistas para evitar la inflamación. Los antagonistas también pueden ser utilizados para inhibir la fiebre independiente de prostaglandinas inducida por quimiosinas . Los antagonistas también pueden ser utilizados para tratar casos de fallo de médula ósea, por ejemplo, anemia aplástica y síndrome mielodisplástico. Los antagonistas también pueden ser utilizados para tratar asma y alergia al evitar la acumulación de eosinófilos en el pulmón. Los antagonistas también pueden ser utilizados para tratar fibrosis de membrana vasometal subepitelial lo cual es una característica prominente del pulmón asmático.

Los antagonistas pueden ser utilizados en una composición con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe en lo siguiente. El polipéptido de la presente invención y los agonistas y antagonistas pueden ser utilizados en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal portador incluye, pero no se limita a solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos . La formulación debe de adaptarse al modo de administración. La invención también proporciona un paquete o equipo (kit) farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado con tales recipientes puede haber una nota en forma prescrita por una agencia reguladora gubernamental respecto a la fabricación, uso o venta de sustancias farmacéuticas o productos biológicos, nota la cual refleja la aprobación por la agencia para la fabricación, uso o venta para administración en humanos. Además, los polipéptidos y agonistas y antagonistas pueden ser utilizados junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de una manera conveniente por ejemplo por vía tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad la cual es efectiva para tratar y/o para profilaxis de la indicación específica. En general, los polipéptidos se administrarán en una cantidad de por lo menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal y, en la mayor parte de los casos, se administrarán en una cantidad que no exceda de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. En la mayor parte de los casos, la dosificación es desde aproximadamente 10 µg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diario, tomando en consideración las vías de administración, síntomas, etc. El polipéptido de la presente invención, y los agonistas o antagonistas los cuales son polipéptidos, se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención por expresión de tales polipéptidos in vivo, lo cual con frecuencia se menciona como "terapia de genes". Así, por ejemplo, las células de un paciente se pueden someter a ingeniería con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica para un polipéptido ex vivo, con las células sometidas a ingeniería posteriormente proporcionadas a un paciente para ser tratado con el polipéptido. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden someter a ingeniería por procedimientos conocidos en la técnica mediante el uso de una partícula retroviral que contenga ARN que codifique para un polipéptido de la presente invención. De manera similar, las células se pueden someter a ingeniería in vivo para expresión de un polipéptido in vivo mediante, por ejemplo, procedimientos conocidos en la técnica. Como se sabe en la técnica, una célula productora para producir una partícula retroviral que contenga ARN que codifique para el polipéptido de la presente invención se puede administrar a un paciente para células sometidas a ingeniería in vivo y la expresión del polipéptido in vivo . Este y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención por tal método pueden ser evidentes para aquéllos familiarizados con la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para células sometidas a ingeniería puede ser diferente a un retrovirus, por ejemplo, se puede utilizar un adenovirus para someter a ingeniería a las células in vivo después de la combinación con un vehículo de suministro adecuado. Los retrovirus a partir de los cuales se pueden derivar los vectores plásmidos retrovirales mencionados en lo anterior incluyen, pero no se limitan a, virus de leucemia de ratón Moloney, virus de necrosis del bazo, retrovirus tales como el virus de sarcoma de Rous, el virus de sarcoma de Harvey, virus de leucosis avian, virus de leucemia del mono gibón, virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus de sarcoma mieloproliferativo y virus de tumor mamario. En una modalidad, el vector plásmido retroviral se deriva de virus de leucemia de ratón Moloney. El vector incluye uno o más promotores . Los promotores adecuados los cuales pueden ser utilizados incluyen, pero no se limitan a LTR retroviral; el promotor SV40; y el promotor de citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller, et al., Biotechniques . Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989) , o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero que no se limitan a los promotores de histona, pol III, y /3-actina) . Otros promotores virales los cuales pueden ser utilizados incluyen, pero no se limitan a promotores de adenovirus, promotores de tímidina cinasa (TK) , y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para aquéllos familiarizados con la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en la presente. La secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados los cuales pueden ser utilizados incluyen, pero no se limitan a promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral; o promotores heterólogos tales como el promotor de citomegalovirus (CMV) ; el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV) ; promotores inducibles tales como el promotor MMT, el promotor de metalotioneína,-promotores de choque térmico; el promotor de albúmina,- el promotor ApoAI ; promotores de globina humana,- promotores de timidina cinasa viral, tales como el promotor de timidina cinasa de Herpes Siplex; LTR retrovirales (que incluyen los LTR retrovirales modificados descritos en lo anterior) ; el promotor de 3-actina,- y promotores de la hormona del crecimento humana. El promotor también puede ser un promotor nativo el cual controle los genes que codifican para los polipéptidos. El vector plásmido retroviral es utilizado para transducir líneas de células empacadas para formar líneas de células productoras. Los ejemplos de células empacadas las cuales pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, las líneas celulares PE501, PA317, ?- 2 , 1--AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, l'CRE, ?/<CRIP, GP+E+86, GP+envAml2, y DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy., Vol. 1, páginas 5-14 (1990), la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células empacadas a través de cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a electroporación, el uso de liposomas y precipitación con CaP04. En una alternativa, el vector plásmido retroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o se puede acoplar a un lípido, y después se puede administrar a un huésped. La línea de células productoras genera partículas de vector retroviral infeccioso los cuales incluyen las secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos. Tales partículas de vector retroviral pueden ser utilizadas posteriormente para transducir células eucarióticas, ya sea in vi tro o in vivo . Las células eucarióticas transducidas expresarán las secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido. Las células eucarióticas las cuales pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan a células pluripotenciales embriónicas, células de carcinoma embriónico, así como células pluripotenciales hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales. Las secuencias de la presente invención también son valiosas para identificación de cromosomas. La secuencia tiene como objetivo específicamente y puede hibridizar con una posición particular en un cromosoma humano individual. Además, actualmente hay necesidad para identificación de sitios particulares en el cromosoma. Algunos reactivos marcadores de cromosoma basados en datos de secuencia real (polimorfismos de repetición) actualmente está disponible para marcar posiciones cromosómicas. El mapeo o elaboración de mapas de ADN para cromosomas de acuerdo con la presente invención es un primer paso importante para correlacionar estas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. Brevemente, las secuencias pueden ser mapeadas para cromosomas mediante la preparación de iniciadores o sebadores para PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir de ADNc. Se utiliza el análisis por computadora de la región 3' no traducida para seleccionar rápidamente iniciadores que no abaten más de un exón en el ADN genómico, lo que podría complicar el proceso de amplificación. Estos iniciadores después se utilizan para examen por PCR de híbridos de células somáticas que contengan cromosomas humanos individuales . Únicamente aquéllos híbridos que contengan el gen humano que corresponde al iniciador proporcionarán un fragmento amplificado. El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Utilizando la presente invención con los mismos iniciadores de oligonucleótido, se puede obtener la sublocalización con paneles de fragmentos a partir de cromosomas o acumulados específicos de clonas genómicas grandes de una manera análoga. De manera similar, se pueden utilizar otras estrategias de mapeo para realizar mapas de sus cromosomas que incluyen la hibridización in si tu, preexamen con cromosoma clasificado por flujo marcado y preselección por hibridización para construir bibliotecas de ADNc específicas para cromosomas. La fluorescencia por hibridización in si tu (FISH) de una clona o clonas de ADNc a una dispersión cromosómica en metafase puede ser utilizada para proporcionar una posición cromosómica precisa en una sola etapa. Esta técnica puede ser utilizada con ADNc tan pequeño como 500 o 600 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988) . Una vez que se ha mapeado una secuencia hasta una posición cromosómica precisa, se puede correlacionar la posición física de la secuencia en el cromosoma con datos de un mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de la biblioteca médica en Johns Hopkins University Welch Medical Library) . La relación entre los genes de enfermedades que han sido mapeados en la misma región cromosómica después se identifica mediante análisis de enlace (coherencia de genes físicamente adyacentes) . Después, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o la secuencia genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en la totalidad de individuos afectados pero no en individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causal de la enfermedad. Con la resolución actual del mapeo físico y las técnicas de mapeo genético, un ADNc puede localizarse con precisión en una región cromosómica asociada con la enfermedad que puede ser uno de 50 y 500 genes causales potenciales. (Esto establece la suposición de una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb) . Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados o análogos de los mismos, o células que los expresen pueden ser utilizadas como un inmunógeno para producir anticuerpos para el mismo. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena única y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión Fab. Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención se pueden obtener por inyección directa de los polipéptidos en un animal o por administración de los polipéptidos a un animal, de manera preferible un no humano. El anticuerpo obtenido de esta manera después se unirá a los polipéptidos mismos, de este modo, incluso una secuencia que codifique únicamente para un fragmento de los polipéptidos puede ser utilizada para generar anticuerpos que se unan a la totalidad de los polipéptidos nativos. Posteriormente, tales anticuerpos pueden ser utilizados para aislar los polipéptidos del tejido que expresa a tal polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica la cual proporcione anticuerpos producidos por cultivos en línea celular continua. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé, et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) .

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (patente norteamericana No. 4.946,778) se puede adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla para productos de polipéptido inmunogénicos de esta invención. Además, pueden utilizarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para productos de polipéptido inmunogénico de esta invención. La presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos,-sin embargo debe entenderse que la presente invención no está limitada a tales ejemplos. A menos que se indique de otra manera, todas las partes o cantidades son en peso. Con el fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que se presentan con frecuencia. El término "plásmidos" están designados por una p inferior preceda y/o seguida por y/o números . Los plásmidos iniciales en la presente están disponibles comercialmente, están disponibles públicamente en una base no restringida o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la técnica y serán evidentes para una persona familiarizada con la técnica.

El término "digestión" de ADN se refiere a la ruptura catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa únicamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción utilizadas en la presente están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se utilizan como se conocen por aquéllos habitualmente familiarizados con la técnica. Para propósitos analíticos, típicamente se utiliza 1 µg de plásmido o de fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de solución amortiguadora. Con el propósito de aislar fragmentos de ADN para construcción de plásmidos, típicamente se digieren 5 a 50 µg de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen más grande. Los amortiguadores apropiados y las cantidades de sustrato para las enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. Habitualmente se utilizan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37°C, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado. La separación por tamaño de los fragmentos separados se lleva a cabo utilizando un gel de poliacrilamida el 8% descrito por Goeddel, D. et al . , Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980). El término "oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido de hebra sencilla o a dos hebras de polidesoxinucleótido complementarias las cuales pueden ser sintetizadas químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen un fosfato 5' y por lo tanto no se ligan a otro oligonucleótido sin agregar un fosfato con un 'ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará un fragmento que no ha sido desfosforilado . El término "ligación" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre los fragmentos de ácido nucleico de doble hebra (Maniatis, T., et al., Id., p. 146) . A menos que se indique de otra manera, la ligación puede llevarse a cabo utilizando amortiguadores y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") con 0.5 µg de cantidades aproximadamente equimolares de fragmentos de ADN que se van a ligar. A menos que se indique de otra manera, la transformación se realiza como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

E emplo 1 Expresión bacteriana y purificación de Ck/3-13 La secuencia de ADN que codifica para Ck|ß-13, ATCC, # 97113, inicialmente se amplifica utilizando iniciadores de oligonucleótido de PCR que corresponden a las secuencias de extremo 5' y 3' de la secuencia de ácido nucleico para Ckjß-13 (menos la secuencia de péptido señal putativa) . Se agregan nucleótidos adicionales que corresponden al gen Ckjß-13 en las secuencias de extremo 5' y 3', respectivamente. El iniciador oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5' CCCGCATGCCCAACATGGAAGACAG 3' (SEC. DE IDENT. NO: 3) que contiene un sitio de enzima de restricción Sphl (negrillas) seguido por 16 nucleótidos de la secuencia codificante para Ckjß-13 comenzando desde el segundo nucleótido de la secuencia que codifica para la proteína madura. Se incluye el codón ATG en el sitio Sphl. En el siguiente codón posterior a ATG, la primera base es del sitio Sphl y las dos bases restantes corresponden a la segunda y tercera base del primer codón (residuo 29) de la proteína madura putativa. La secuencia 3', 5' AAAGGATCCTTGGCTCAGCTTATTGAG 3' (SEC. DE IDENT. NO: 4) contiene secuencias complementarias al sitio BamHl (negrillas) y es seguido por 18 nucleótidos de las secuencias específicas del gen precedentes al codón de terminación. Los sitios de la enzima de restricción corresponden a los sitios de enzima de restricción del vector de expresión bacteriana pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA) . El vector pQE-9 codifica para resistencia a antibióticos (Ampr) , un origen bacteriano de replicación (ori) , un operador promotor regulable por IPTG (P/0) , un sitio de unión de ribosoma (RBS) , una marca o etiqueta 6-His y sitios de enzima de restricción. Después se digiere el vector pQE-9 con Sphl y BamHl. Las secuencias amplificadas se ligan en pQE-9 y se insertan en marco con la secuencia que codifica para la marca histidina y para RBS. La mezcla de ligación después se utiliza para transformar E. coli cepa Ml5/rep 4 (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989) . La cepa M15/rep4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, el cual expresa al represor lacl y también confiere resistencia a canamicina (Kanr) . Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/canamicina. El ADN plásmido se aisla y se confirma por análisis de restricción. Las clonas que contienen los constructos deseados se hacen crecer durante la noche (O/N) en un cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 µg/ml) como con Kan (25 µg/ml) . El cultivo O/N se utiliza para inocular un cultivo grande en una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se hacen crecer hasta una densidad óptica de 600 (D.O.600) de entre 0.4 y 0.6. Después se agrega IPTG ("Isopropyl-B-D-tiogalactopiranósido") a una concentración final de 1 mM. La IPTG se induce por inactivación del represor lacl, aclarando a P/0 lo que deja la expresión del gen aumentada . Las células se hacen crecer 3 a 4 horas adicionales. Las células se recolectan por centrifugación. El sedimento celular se solubiliza en un agente caotrófico clorhidrato de guanidina 6 molar, pH 5.0. Después de la clarificación, la Ckjß-13 solubilizada se purifica de esta solución por cromatografía en una columna Nickel-Chelate bajo condiciones que permiten la unión firme por proteínas que contienen la etiqueta 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). Se eluye Ck/3-13 (>98% puro) de la columna en clorhidrato de guanidina 6M. La renaturalización de la proteína fuera de GnHCl se puede llevar a cabo por varios protocolos (Jaenicke, R. y Rudolph, R., Protein Structure - A Practical Approach, IRL Press, New York (1990) ) . Inicialmente, se utiliza una etapa de diálisis para eliminar GnHCl. De manera alternativa, la proteína purificada aislada de la columna Ni-Chelate se puede unir a una segunda columna sobre la cual se corre un gradiente de GnHCl lineal decreciente. Se permite que la proteína se renaturalice mientras que se une a la columna y posteriormente se eluye con un amortiguador que contiene imidazol 250 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7.5 y glicerol al 10%. Finalmente, una proteína soluble es dializada contra el amortiguador de almacenamiento que contiene bicarbonato de amonio 5 mM.

Ejemplo 2 Expresión de Ck/3-13 recombinante en células COS La expresión del plásmido Ck/3-13 HA se deriva de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) un origen de replicación SV40, 2) gen de resistencia a ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli. 4) promotor CMV seguido por una región polienlazadora, un intrón SV40 y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica para el precursor completo de Ck3-13 y una marca HA se fusionan en marco a su extremo 3' y se clonan en la región polienlazadora del vector, por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante se dirige bajo el promotor CMV. La marca HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner 1984, Cell 37, 767) . La infusión de la marca HA a la proteína objetivo permite la fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconozca al epitopo HA. Se describe a continuación la estrategia de construcción del plásmido: La secuencia de ADN que codifica para Ckjß-13, ATCC # 97113, se construye por PCR utilizando dos iniciadores o cebadores: el iniciador 5', 5' AAA AAGCTTAACATAGGCTCGCCTACAGACT 3' (SEC. DE IDENT. NO: 5) que contiene un sitio HindIII seguido por 18 nucleótidos de la secuencia codificante de Ck/3-13 a partir de la posición 3 menos en relación al codón de inicio,- la secuencia 3' 5 ' CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTGGCTCAGCTTATT GAGAAT 3' (SEC. DE IDENT. NO: 6) contiene secuencias complementarias a un sitio Hbal, un codón de detención de traducción (subrayado) , la marca HA y los últimos 21 nucleótidos de la secuencia que codifica para Ckjß-13 (que no incluye al codón de detención) . Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio HindIII, una secuencia codificante para Ckjß-13 seguida por una marca HA fusionada en marco, un codón de detención de terminación de traducción cercano a la marca HA, y un sitio Xbal. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector pcDNA3/Amp, se digieren con enzimas de restricción HindIII y Xbal y se ligan. La mezcla de ligación se transforma en E. coli cepa SURE (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) el cultivo transformado se siembra en placas, en unas placas de medio de ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes . El ADN plásmido se aisla de transformantes y se examina por análisis de restricción para la presencia del fragmento correcto. Para la expresión del polipéptido Ck/3-13 recombinante, se transfectan células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína Ck/3-13 HA se detecta por el método de radiomarcado e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)) . Las células se marcan durante 8 horas con 35S-cisteína dos días post-transfección. Los medios de cultivo después se recolectan y las células se lisan con detergente (amortiguador RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0.1% de SDS, 1% de NP-40, 0.5% de DOC, Tris 50 mM, pH 7.5) (Wilson, I. et al . , Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitan con anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizan por SDS-PAGE.

Ejemplo 3 Clonación y expresión de Ck/3-13 utilizando el sistema de expresión de baculovirus La secuencia de ADN que codifica para la proteína Ckjß-13 de longitud completa, ATCC # 97113, se amplifica utilizando iniciadores de oligonucleótido para PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' del gen: El iniciador 5' tiene la secuencia 5' AAAGGATCCGCCACCATGGTCGCCTACAGACT 3' (SEC. DE IDENT. NO: 7) y contiene un sitio de enzima de restricción BamHl (en negrillas) seguido por seis nucleótidos que recuerdan una señal eficiente para el inicio de traducción en células eucarióticas (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987) y los primeros 18 nucleótidos del gen para Ck/3-13 (el codón de inicio de traducción "ATG" está subrayado) . El iniciador 3' tiene la secuencia 5' AAAGGTACCTCATTGGCTCAGCTTATT 3' (SEC. DE IDENT. NO: 8) y contiene el sitio de ruptura o de separación para la endonucleasa de restricción Asp718 y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia 3' no traducida del gen para Ckjß-13. Las secuencias amplificadas se aisla de un gen de agarosa al 1% utilizando un equipo disponible comercialmente ( "Geneclean, " BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.).

El fragmento después se digiere con la endonucleasa BamHl y Asp718 y después se purifica nuevamente en un gel de agarosa al 1% . Este fragmento se denomina F2. El vector pRGl (modificación del vector pVL941 descrito abajo) se utiliza para la expresión de la proteína Ck/3-13 utilizando el sistema de expresión de baculovirus (para una revisión véase: Summers, M.D. y Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin NO:1555). Este vector de expresión contiene el promotor de polihedriona fuerte del virus de polihedrosis nuclear de Autographa califonica (AcMNPV) seguido por los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHl y Asp718. El sitio de poliadenilación del virus de simio (SV)40 se utiliza para poliadenilación eficiente. Para una selección fácil de los virus recombinantes, el gen para beta-galactosidasa de E. coli se inserta en la misma orientación que el promotor de polihedrina seguido por la señal de poliadenilación del gen para polihedrina. Las secuencias de polihedrina están flanqueadas en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homologa mediada por células del ADN viral de tipo silvestre cotransfectado. Se pueden utilizar muchos otros vectores de baculovirus en lugar de pRGl tales como pAc373, pVL941 y pAcIMl (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology, 170:31-39). El plásmido se digiere con enzimas de restricción BamHl y Asp718 y después se desfosforila utilizando fosfatasa intestinal bovina por procedimientos conocidos en la técnica. Después se aisla el ADN a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando un equipo disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.).

Este ADN vector se denomina V2. El fragmento F2 del plásmido V2 desfosforilado se liga con ADN ligasa T4. Después se transforman células mediadas E. coli HB101 y se identifican las bacterias que contienen al plásmido (pBac-Ck/3-13) con el gen para Ck/3-13 utilizando las enzimas BamHl y Asp7l8. La secuencia del fragmento se contiene por secuenciado de ADN. Se cotransfectan 5 µg del plásmido pBac-Ckjß-13 con 1.0 µg de un baculovirus linearizado disponible comercialmente ("BaculoGoldMR baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) utilizando el método de lipofección (Felgner et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987) ) . Se mezclan 1 µg de ADN de virus BaculoGoldMR y µg del plásmido en un recipiente estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 µl de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) .

Posteriormente se agregan 10 µl de lipofectina más 90 µl de medio de Grace, se mezcla y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla de transfección se agrega a gotas a las células de injerto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejido de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se hace oscilar hacia atrás y hacia adelante para mezclar la solución recién agregada. Posteriormente la placa se incuba durante 5 horas a 27 °C. Después de 5 horas, la selección de transfección se retira de la placa y se agregan 1 ml de medio de insectos de Grace suplementados con 10% de suero bovino fetal . La placa se regresa nuevamente a un incubador y se continúa el cultivo a 27 °C durante 4 días. Después de 4 días, el sobrenadante se recolecta y se realiza un ensayo similar al descrito por Summers y Smith (supra) . Como una modificación, se utiliza un gel de agarosa ("Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) lo cual permite un enfriamiento fácil de las placas teñidas de azul. (Una descripción detallada del "ensayo en placa "también se puede encontrar en la guía del usuario para cultivo de células de insecto y baculovirus se ha distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, página 9-10) . Cuatro días después de la dilución seriada, se agregan los virus a las células y se toman las capas teñidas de azul con la punta de una pipeta Eppendorf . El agar que contiene los virus recombinantes después se resuspende en un tubo Eppendorf que contiene 200 µl de medio de Grace. El agar se separa por centrifugación breve y el sobrenadante que contiene el baculovirus recombinante se utiliza para infectar células Sf9 sembradas en placas de 25 m. Cuatro días después, los sobrenadantes de estos recipientes de cultivo se recolectan y después se almacena a 4°C. Las células Sf9 se hacen crecer en medio de Grace suplementado con FBS al 10% inactivado con calor. Las células se infectan con el baculovirus recombinante V-Ck/3-13 a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas después, el medio se retira y se sustituye con medio SF900 II y menos metionina y cisteína (Life Technnologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después se agregan 5 µCi de 35S-metionina y 5 µCi de 35s-cisteína (Amersham) . Las células se incuban adicionalmente durante 16 horas antes de que sean recolectadas por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizan por SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 4 Expresión por medio de terapia de genes Se obtienen fibroblastos de un sujeto mediante biopsia cutánea. El tejido resultante se coloca en medio del cultivo de tejido y se separa en piezas pequeñas. Los cortes pequeños del tejido se colocan en una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejido, se colocan en cada matraz aproximadamente 10 piezas. El matraz se hace girar golpeándolo de arriba hacia abajo, cerrado herméticamente se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los trozos de tejido permanecen fijos en el fondo del matraz y se agrega medio fresco (por ejemplo, medio F12 de Ham con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina) . Esto después se incuba a 37 °C durante aproximadamente una semana. En este momento, se agrega medio fresco y posteriormente se cambia cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, se produce una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se siembra a escala en matraces más grandes. El plásmido pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al, DNA, 7:219-25 (1988)) flanqueado por las dos secuencias repetidas terminales largas del virus de sarcoma de ratón Moloney, se digiere con EcoRI y HindIII y posteriormente se trata con fosfatasa intestinal bovina. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica utilizando esferas de vidrio.

Se amplifica el ADNc que codifica para un polipéptido de la presente invención utilizando iniciadores de PCR los cuales corresponden a las secuencias de los extremos 5' y 3', respectivamente. El iniciador 5' que contiene un sitio EcoRI y el iniciador 3' incluyen además un sitio HindIII. Se agregan juntas cantidades iguales de la estructura principal lineal del virus de sarcoma de ratón de Moloney y el fragmento amplificado EcoRI y HindIII, en presencia de ADN ligasa T4. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se utiliza para transformar bacterias HB101, las cuales después se colocan en agar que contiene canamicina con el propósito de confirmar que el vector tenga el gen de interés insertado apropiadamente. Se hacen crecer las células empacadas anfotróficas pA317 o GP+aml2 en cultivo de tejido hasta densidad confluente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino al 10% (CS) , penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene gen después se agrega al medio y las células empacadas se transducen con el vector. Las células empacadas ahora producen partículas virales infecciosas que contienen el gen (la células empacadas ahora se mencionarán como las células productoras) .

Se agrega medio fresco a las células productoras transducidas y posteriormente el medio se recolecta a partir de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio gastado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de filtro millipore para eliminar las células productoras desmedidas, y este medio se utiliza posteriormente para infectar células de fibroblastos. Se separa el medio de la placa subconfluente de fibroblastos y sustituye rápidamente con el medio de las células productoras . Este medio se retira y se sustituye con medio fresco. Si el título de virus es elevado, entonces virtualmente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario utilizar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his . Los fibroblastos sometidos a ingeniería genética después se inyectan en el huésped, ya sea solos después de haber crecido a confluencia en esferas de microportador cytodex 3. Los fibroblastos ahora producen el producto proteínico.

Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, de otra manera, la invención puede llevarse a la práctica como se describe de manera particular.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Ll, ET AL. (Ü) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Quimiosina Beta- 13 humana (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART & OLSTEIN (B) CALLE: 6 BECKER FARM ROAD (C) CIUDAD: ROSELAND (D) ESTADO: NEW JERSEY (E) PAÍS: EUA (F) ZONA POSTAL: 07068 (v) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: DISQUETE DE 3.5 PULGADAS (B) COMPUTADORA: IBM PS/2 (C) SISTEMA OPERANTE: MS-DOS (D) SOFTWARE O PROGRAMA: WORD PERFECT 5.1 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Actualmente (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (viíi) ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN: (A) NOMBRE: FERRARO, GREGORY D. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 36,134 (C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 325800- (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: 201-994-1700 (B) TELEFAX: 201-994-1744 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 282 PARES DE BASES (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO:l: ATGGCTCGCC TACAGACTGC ACTCCTGGTT GTCCTCGTCC TCCTTGCTGT GGCGCTTCAA 60 GCAACTGAGG CAGGCCCCTA CGGCGCCAAC ATGGAAGACA GCGTCTGCTG CCGTGATTAC 120 GTCCGTCACC GTCTGCCCCT GCGCGTGGTG AAACACTTCT ACTGGACCTC AGACTCCTGC 180 CCGAGGCCTG GCGTGGTGTT GCTAACCTTC AGGGATAAGG AGATCTGTGC CGATCCCAGA 240 GTGCCCTGGG TGAAGATGAT TCTCAATAAG CTGAGCCAAT GA 282 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 93 AMINOÁCIDOS (B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 2 Met Ala Arg Leu Gln Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu -25 -20 -15 Ala Val Ala Leu Gln Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Asn -10 -5 1 Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu 5 10 15 Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr Ser Asp Ser Cys 20 25 30 Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Glu lie 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met lie Leu Asn Lys 50 55 60 Leu Ser Gln 65 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 25 PARES DE BASES (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO : 3 CCCGCATGCC CAACATGGAA GACAG 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 27 PARES DE BASES (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : AAAGGATCCT TGGCTCAGCT TATTGAG 27 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 31 PARES DE BASES (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 5 AAAAAGCTTA ACATAGGCTC GCCTACAGAC T 31 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 6 : (í) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 60 PARES DE BASES (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : Oligonucleótido (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC . DE IDENT . NO : 6 CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAT TGGCTCAGCT TATTGAGAAT 60 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 33 PARES DE BASES (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO : 7 : AAAGGATCCG CCACCATGGC TCGCCTACAG ACT 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 26 PARES DE BASES (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 8 AAAGGTACCTC ATTGGCTCAG CTTATT 26 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende desde el aminoácido -28 hasta el aminoácido 65, de conformidad con la SEC. DE IDENT. NO: 2; (b) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 65, de conformidad con la SEC. DE IDENT. N0:2; (c) un polinucleótido capaz de hibridizar con, y el cual es por lo menos 70% idéntico al polinucleótido de (a) o (b) ,- y (d) un fragmento de polinucleótido del polinucleótido de (a) , (b) o (c) .

2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ADN.

3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque codifica para el polipéptido que comprende los aminoácidos -28 a 65 de la SEC. DE IDENT. NO : 2.

4. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque codifica para el polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 65 de la SEC. DE IDENT . NO : 2.

5. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido el cual codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expresada por el ADN contenido en ATCC, depósito No. 97113; (b) un polinucleótido capaz de hibridizar con, y el cual es por lo menos 70% idéntico al polinucleótido de (a) ,- y (c) un fragmento de polinucleótido del polinucleótido de (a) o (b) .

6. Un vector, caracterizado porque contiene el ADN de conformidad con la reivindicación 2.

7. Una célula huésped, caracterizada porque ha sido sometida a ingeniería genética con el vector de conformidad con la reivindicación 6.

8. Un proceso para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: expresar a partir de la célula huésped de conformidad con la reivindicación 7, el polipéptido codificado por el ADN.

9. Un proceso para producir células capaces de expresar un polipéptido, caracterizado porque comprende someter a ingeniería genética células con el vector de conformidad con la reivindicación 6.

10. Un polipéptido, caracterizado porque se selecciona del grupo de: (i) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la SEC. DE IDENT. NO: 2 y fragmentos, análogos y derivados del mismo,- y (ii) un polipéptido codificado por el ADNc de ATCC, depósito No. 97113, y fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido.

11. Un compuesto, caracterizado porque imita la actividad del polipéptido de conformidad con la reivindicación 10.

12. Un compuesto, caracterizado porque antagoniza la actividad del polipéptido de conformidad con la reivindicación 10.

13. Un anticuerpo contra el polipéptido de la reivindicación 10, caracterizado porque comprende un miembro que se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales y policlonales.

14. Un proceso para identificar un compuesto activo como un agonista para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende: (a) combinar un compuesto que va a ser examinado y una mezcla de reacción que contiene células bajo condiciones en las que las células normalmente migran en respuesta al polipéptido de conformidad con la reivindicación 13 ; y determinar el grado de migración de las células para identificar si el compuesto es efectivo como un agonista.

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido Ckjß-13 se agrega a la combinación de la etapa (a) , y la determinación del grado de migración identifica un compuesto efectivo como un antagonista.