ES2251610T3 - Mutantes de interleuquina-18, su produccion y su uso. - Google Patents
Mutantes de interleuquina-18, su produccion y su uso.Info
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Abstract
Un polipéptido IL-18 mutante que comprende mutaciones en uno o más restos de aminoácido que están implicados en su interacción con la proteína ligante de IL- 18, en el que la mutación está en un resto seleccionado entre Glu-42 y Lys-89 del precursor de IL-18 humano codificado por el cDNA de la ID. SEC. nº 1 y en el que las mutaciones son sustituciones no conservativas.
Description
Mutantes de interleuquina-18, su
producción y su uso.
El presente invento se refiere a mutantes de
IL-18 que tienen una actividad biológica potenciada
con respecto a la proteína de tipo silvestre (WT; del inglés,
wild type).
En 1.989 se describió una actividad sérica
inducida por endotoxinas que inducía interferón \gamma
(IFN-\gamma), obtenida de células esplénicas de
ratón (Nakamura et al., 1.989). Esta actividad sérica
actuaba no como un inductor directo de IFN-\gamma
sino, más bien, como un coestimulante junto con
IL-2, IFN-/, factor de necrosis tumoral (TNF; del
inglés, tumor necrosis factor) o mitógenos. Un
intento para purificar la actividad a partir de suero de ratón
posendotoxínico reveló una proteína aparentemente homogénea de
50-55 kDa (Nakamura et al., 1.993). Puesto
que otras citoquinas pueden actuar como coestimulantes para la
producción de IFN-\gamma, el fallo de anticuerpos
neutralizantes hacia IL-1, IL-4,
IL-5, IL-6 o TNF a la hora de
neutralizar la actividad sérica sugería que era un factor distinto.
En 1.995, los mismos científicos demostraron que el coestimulante
para la producción de IFN-\gamma, inducido por
endotoxinas, estaba presente en extractos de hígados de ratones
preacondicionados con P. acnes (Okamura et al.,
1.995). En este modelo se amplía la población de macrófagos
hepáticos (células de Kupffer), y, en estos ratones, una pequeña
dosis de lipopolisacárido (LPS) bacteriano, que no es letal en
ratones no preacondicionados, resulta letal. El factor, llamado
factor inductor de IFN-\gamma, (IGIF; del inglés,
interferon gamma-inducing factor) y más
tarde denominado interleuquina 18 (IL-18), fue
purificado hasta homogeneidad a partir de 1.200 gramos de hígados
de ratones tratados con P. acnes. Oligonucleótidos
degenerados derivados de secuencias de aminoácidos de
IL-18 purificada fueron usados para clonar un cDNA
de IL-18 murino (Okamura et al., 1.995). En
macrófagos activados se detectan fácilmente RNAs mensajeros para
IL-18 e interleuquina 12 (IL-12). La
IL-18 no induce IFN-\gamma por sí
misma sino que actúa esencialmente como un coestimulante con
mitógenos o IL-12. La secuencia de cDNA humana para IL-18 fue presentada en 1.996 (Figura 1A, ID. SEC. nº 1).
mitógenos o IL-12. La secuencia de cDNA humana para IL-18 fue presentada en 1.996 (Figura 1A, ID. SEC. nº 1).
La interleuquina IL-18 comparte
rasgos estructurales con la familia IL-1 de
proteínas (Nakamura et al., 1.993; Okamura et al.,
1.995; Ushio et al., 1.996; Bazan et al., 1.996). A
diferencia de la mayoría de las otras citoquinas, que presentan una
estructura de haz de cuatro hélices, IL-18 e
IL-1\beta tienen una estructura todo \beta de
lámina plegada (Tsutsui et al., 1.996). Similarmente a
IL-1b, IL-18 es sintetizada como un
precursor biológicamente inactivo (proIL-18), que
carece de un péptido señal (Ushio et al., 1.996). Los
precursores de IL-1\beta e IL-18
son escindidos por caspasa 1 [enzima conversiva de
IL-1\beta o ICE (del inglés,
IL-1\beta-converting
enzyme)], que escinde los precursores por detrás de un resto
de ácido aspártico en la posición P1. Las citoquinas maduras
resultantes son rápidamente liberadas por la célula (Ghayur et
al., 1.997, y Gu et al., 1.997).
La IL-18 es un coestimulante para
la producción de citoquinas (IFN-\gamma,
IL-2 y factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos) por células T cooperadoras
de tipo I (Th1) (Kohno et al., 1.997) y también un
coestimulante para la citotoxicidad de clones murinos de células
asesinas naturales, mediada por el ligando de FAS (Tsutsui et
al., 1.996).
Los linfocitos Th1 están implicados en las
respuestas inmunes contra tumores (Seki et al., 2.000). Las
respuestas Th1 incluyen la secreción de las citoquinas
IL-2, IL-12, IL-18 e
IFN-\gamma, así como la generación de linfocitos
T citotóxicos específicos que reconocen antígenos tumorales
específicos. La respuesta Th1 es también un arma vital de la
defensa del huésped contra muchos microorganismos. Sin embargo, la
respuesta Th1 puede estar también asociada con efectos indeseables
tales como el desarrollo de diversas enfermedades autoinmunes, la
inflamación y el rechazo de órganos trasplantados.
Los intentos para que se expresara la forma
madura de IL-18 en E. coli usando un vector
que codificaba la proteína madura no proporcionaron una citoquina
totalmente activa. Se ha desarrollado un sistema de expresión
eficaz para la generación de la IL-18 humana total y
biológicamente activa para usos terapéuticos, por ejemplo, en
malignidades, o en cualquier estado en que se desee la inducción de
IFN-\gamma (Documento WO 00/61768). En este
sistema, el sitio de escisión de caspasa 1 para el precursor de
IL-18 ha sido cambiado a un sitio de factor Xa
(ICE/Xa), y se usó un vector que codificaba el precursor de
IL-18 ICE/Xa para la transformación de E.
coli. Después de la expresión de este precursor de
IL-18 en E. coli, se generó la
IL-18 madura por escisión con factor Xa in
vitro. Esta IL-18 madura generada por escisión
con factor Xa era totalmente activa.
Las proteínas ligantes de citoquinas (receptores
solubles de citoquinas) son normalmente los dominios
extracelulares, de unión a ligandos, de sus respectivos receptores
citoquínicos de la superficie celular. Se producen por corte y
empalme alternativo o por escisión proteolítica del receptor de la
superficie celular. Se han descritos con anterioridad estos
receptores solubles, tales como, por ejemplo, los receptores
solubles de IL-6 e IFN-\gamma
(Novick et al., 1.989), TNF (Engelmann et al., 1.989;
Engelmann et al., 1.990), IL-1 e
IL-4 (Maliszewski et al., 1.990), e
IFN-\alpha/\beta (Novick et al., 1.994;
Novick et al., 1.992). Parece que una proteína ligante de
citoquinas, denominada osteoprotegerina [OPG, también conocida como
factor inhibidor de osteoclastos (OCIF; del inglés,
osteoclast inhibitory factor)], un
miembro de la familia TNFR/Fas, es el primer ejemplo de un receptor
soluble que existe sólo como una proteína secretada (Anderson et
al., 1.997; Simonet et al., 1.997; Yasuda et al.,
1.998).
Una proteína ligante de IL-18
(IL-18BP; del inglés, IL-18
binding protein) fue purificada por afinidad en una
columna de IL-18, a partir de orina (Novick et
al., 1.999). IL-18BP anula la inducción de
IFN-\gamma y de IL-8 por
IL-18, la activación de NF-kB in
vitro y la inducción de IFN- in vivo.
IL-18BP es una proteína circulante soluble que es
constitutivamente expresada en el bazo y pertenece a la
superfamilia de las inmunoglobulinas. La isoforma de
IL-18BP más abundante, la isoforma variante por
corte y empalme, presenta una elevada afinidad por
IL-18 con una rápida velocidad de unión y una lenta
velocidad de desunión, y una constante de disociación (Kd) de
aproximadamente 400 pM (Kim et al., 1.999).
Los restos implicados en la interacción de
IL-18 con IL-18BP han sido descritos
por medio del uso del modelado informático (Kim et al.,
1.999) y basándose en la interacción de IL-1 con el
IL1R de tipo I (Vigers et al., 1.997). En el modelo para la
unión de IL-18 a la IL-18BP, se ha
propuesto que el resto Glu de la posición 42 y el resto Lys de la
posición 89 de IL-18 se unen respectivamente a Lys
130 y Glu-114 de IL-18BP (Kim et
al., 1.999).
La IL-18 está constitutivamente
presente en muchas células (Puren et al., 1.999) y circula
en seres humanos sanos (Urushihara et al., 2.000). La alta
afinidad de IL-1BP hacia IL-18 así
como la elevada concentración de IL-18BP hallada en
la circulación (un exceso molar de 20 veces con respecto a
IL-18) representan una situación única en la
biología de las citoquinas. Por lo tanto, la mayoría, si no todas,
las moléculas de IL-18 de la circulación están
unidas a la IL-18BP. La IL-18BP
circulante que compite por IL-18 con receptores de
la superficie celular puede actuar como un antiinflamatorio natural
y como una molécula inmunosupresora.
Agentes virales codifican proteínas similares a
IL-18BP; por ejemplo, las proteínas virales MC53 y
MC54 de M. contagiosum comparten una homología significativa
con la IL-18BP de mamífero (Novick et al.,
1.999). Las proteínas MC53 y MC54 de M. contagiosum poseen
la capacidad para unirse a, y neutralizar, IL-18
humana de una forma similar a la de IL-18BP (Xiang y
Moss, 1.999). La proteína p13 del poxvirus Ectromelia, que es
homóloga a IL-18BP, se une a IL-18
humana e inhibe su actividad in vitro. Ratones infectados
con un virus mutante por deleción de p13 presentaban unos niveles de
infectividad disminuidos (Born et al., 2.000). Por lo
tanto, parece que el grado de infectividad se correlaciona con la
presencia de IL-18BP.
Los elevados niveles de IL-18BP
circulante pueden representar una defensa natural contra una
respuesta Th1 de escape a una infección y el desarrollo de
enfermedades autoinmunes. Sin embargo, IL-18
contribuye a la respuesta Th1 que es importante en la defensa del
huésped contra tumores. Por lo tanto, la IL-18BP
puede ocasionar el fallo del huésped para desarrollar células T
citotóxicas dirigidas contra células tumorales. En realidad, hay
evidencia de que IL-18 provoca la defensa del
huésped contra tumores en ratones. Por ejemplo, en ratones
singénicos, células de carcinoma mamario murino que expresaban
IL-12 murino o IL-18 murino fueron
menos tumorigénicas y formaron tumores más lentamente que células
testigo que no expresaban (Coughlin et al., 1.998). Estudios
de neutralización con anticuerpos revelaron que los efectos
antitumorales requerían IFN-\gamma. En otro
estudio, la administración sistémica de IL-18 a
animales experimentales en combinación con el melanoma B16 que
expresa B7-1 (CD80) dio lugar a una drástica
supresión de la formación de melanomas y el desarrollo de tumores,
y a una mejora significativa de la supervivencia (Cho et
al., 2.000).
Se usan citoquinas como adyuvantes para aumentar
la eficacia de la inmunoterapia en el cáncer. Por ejemplo, se
administra IL-2 para el carcinoma de células renales
o el melanoma (Gollob et al., 2.000). A menudo, una
importante consecuencia del tratamiento con citoquinas es perfiles
de toxicidad sistémica grave. Usar citoquinas, expresadas por el
propio tumor o células dendríticas del paciente, es una solución
lógica al problema. No obstante, si se quisiera usar
IL-18 localmente como adyuvante en inmunoterapia
tumoral, los niveles constitutivos de IL-18BP aún
ejercerían su capacidad para neutralizar IL-18 en el
ambiente local, y, en consecuencia, su eficacia resultaría muy
disminuida.
El uso de trasplantes alogénicos no
mieloablativos, los llamados minitrasplantes, para tratar la
leucemia y tumores sólidos es cada vez más exitoso en cuanto a
inducir reacciones de injerto contra leucemia e injerto contra
tumor (S. Slavin, 2.000; Slavin et al., 2.000). Dos estudios
en que se usaban células pluripotenciales alogénicas de sangre
periférica (Childs et al., 2.000) o células dendríticas
(Kugler et al., 2.000) para tratar pacientes con carcinoma
metastásico de células renales alcanzaron un notable éxito. Aunque
es necesario que estos estudios sean ampliados y confirmados, va
ganando aceptación el concepto de que una progresiva reacción de
injerto contra tumor es explotable para la inmunoterapia del cáncer
(Slavin, 2.000). Puesto que parece que IL-18 está
implicada en estos exitosos planteamientos terapéuticos, podría
alcanzarse una mejora adicional si pudiera anularse el efecto
neutralizante de IL-18BP.
En el Documento EP0845530 se describen mutantes
de IL-18 (IFN-\gamma, factor
inductor). Los mutantes de IL-18 descritos son
moléculas en que 1, 2, 3 o los 4 restos de cisteína de
IL-18 (Figura 1B) estaban sustituidos por restos
de serina o alanina. Estos mutantes contenían una secuencia de
consenso intacta (Figura 1B). Todos los mutantes aislados
presentan un estabilidad mayor que la IL-18 de tipo
silvestre. El grado de estabilidad de los mutantes es directamente
proporcional al número de restos de Cys sustituidos en la molécula.
En el Documento EP0845530 se guarda silencio sobre la capacidad de
IL-18BP para neutralizar estos mutantes.
Por lo tanto, la generación y el uso terapéutico
de mutantes de IL-18 totalmente activos incapaces
de unirse, o que se unen con baja afinidad, a
IL-18BP son muy ventajosos.
El presente invento se refiere a un polipéptido
IL-18 mutante que comprende mutaciones en uno o más
restos de aminoácido que están implicados en su interacción con la
proteína ligante de IL-18, en el que las mutaciones
son sustituciones no conservativas. Los restos mutados en dicho
polipéptido son seleccionados entre Glu-42 y
Lys-89.
En una realización, Glu-42 o
Lys-89 o ambos, Glu-42 y
Lys-89, son sustituidos por un aminoácido apolar,
preferiblemente alanina.
Además, el invento proporciona un DNA que
codifica dicho polipéptido, que codifica preferiblemente un
polipéptido de la ID. SEC. nº 3, ID. SEC. nº 4, ID. SEC. nº 5, ID.
SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7 o ID. SEC. nº 8.
En una realización, el DNA que codifica la ID.
SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7, ID. SEC. nº 8, es fusionado a un péptido
señal, preferiblemente el de la hormona de crecimiento humana (hGH;
del inglés, human Growth Hormone). Además, el
invento también proporciona un vector que comprende dicho DNA,
capaz de expresar el polipéptido codificado por dicho DNA en una
célula huésped apropiada, por ejemplo, una célula huésped
procariótica o eucariótica.
Además, el presente invento proporciona
composiciones farmacéuticas que comprenden dicho polipéptido para
el tratamiento de enfermedades que son evitadas o aliviadas por
respuestas Th1, preferiblemente para el tratamiento de una
enfermedad vírica o el cáncer.
La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos
que codifica el precursor de IL-18 WT y la
situación de cebadores usados para construir las diferentes
proteínas IL-18 mutadas. La flecha ancha indica
donde comienza la secuencia que codifica la proteína
IL-18 madura.
La Figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos
de la IL-18 madura. Las secuencias de consenso
entre diferentes especies de IL-18 están encerradas
en los recuadros blancos. Las cisteínas están subrayadas. Los
recuadros oscuros muestran los restos mutados en
IL-18 de acuerdo con este invento.
La Figura 2 muestra la representación esquemática
de los mutantes de IL-18 de acuerdo con el invento.
His-6 indica la situación de las seis histidinas
fusionadas en el extremo N del proelemento precursor de
IL-18. La flecha indica el sitio de escisión para
ICE cuando es sustituido por el sitio de escisión para factor Xa
(x). WT indica la IL-18 madura de tipo silvestre.
E42A indica mutación de Glu-42 a Ala, K89A indica
mutación de Lys-89 a Ala, y E42A/K89A indica doble
mutación. Basándose en el precursor /x/ WT, se generaron tres
mutantes de IL-18 (E42A, K89A y E42A+K89A) mediante
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés,
polymerase chain reaction) de dos pasos.
La Figura 3A muestra la inducción de IFN- en
células NKO por IL-18 WT y proteína mutante en las
concentraciones mostradas en el eje X de la Figura 3B y en
presencia de IL-12 (0,5 ng/ml).
La Figura 3B muestra la inducción de IFN- en
células mononucleares de sangre periférica (PBMC; del inglés,
peripheral blood mononuclear cells) por
IL-18 WT y proteína mutante en las concentraciones
mostradas en el eje X y en presencia de IL-12 (1,0
ng/ml).
La Figura 4A muestra el efecto de
IL-18BP sobre la inducción de IFN- por
IL-18 WT humana y proteína mutante en células NKO.
Los mutantes y la IL-18 WT (30 ng/ml) fueron
preincubados con IL-18BP en las concentraciones
indicadas en el eje X (de la Figura 3B) durante 1 h a temperatura
ambiental y fueron añadidos a células NKO estimuladas con
IL-12 (0,5 mg/ml).
La Figura 4B muestra el efecto de
IL-18BP sobre la inducción de IFN- por
IL-18 WT humana y proteína mutante en células
PBMC. Los mutantes y la IL-18 WT (30 ng/ml) fueron
preincubados con IL-18BP en las concentraciones
indicadas en el eje X durante 1 h a temperatura ambiental y fueron
añadidos a células PBMC estimuladas con IL-12 (1,0
mg/ml).
La Figura 5 muestra la inducción de
IL-8 por IL-18 WT y proteína
mutante. Se incubaron PBMCs con IL-18 WT o mutante
(30 ng/ml). Se mezcló polimixina B (1 g/ml) con
IL-18 durante 30 min antes de añadirse a las
PBMCs. Después de 24 h, los sobrenadantes fueron separados y fueron
analizados en cuanto a la concentración de IL-18
por electroquimioluminiscencia (ECL; del inglés,
electrochemiluminescence) (Ejemplo 9). Se muestra uno de tres
experimentos.
El presente invento se refiere a un mutante de
IL-18 (IL-18M) que es menos
susceptible a la neutralización por IL-18BP en
comparación con el tipo silvestre (IL-18 WT).
Uno o dos aminoácidos de la IL-18
WT son sustituidos por otros aminoácidos con objeto de generar un
mutante de IL-18 activo que sea menos susceptible a
la neutralización por IL-18BP, sustituciones que
son sustituciones no conservativas de restos implicados en la unión
a IL-18BP y seleccionados entre
Glu-42 y/o Lys-89 (Kim et
al.,
1.999).
1.999).
La IL-18M puede ser producida, en
sistemas de expresión eucarióticos o procarióticos, intracelular o
periplásmicamente, o puede ser secretada al medio. La
IL-18M producida puede ser recuperada en forma
soluble o insoluble (cuerpos de inclusión).
Puede usarse un vector que comprenda el cDNA de
IL-18M precursora, para la expresión de la
IL-18M precursora ensamblada correcta en sistemas
procarióticos. La proteína madura totalmente activa puede ser
posteriormente generada después de escisión por ICE in
vitro. Una secuencia que codifique el sitio de escisión
específico para una proteasa, preferiblemente para el factor Xa,
puede sustituir a la secuencia de ICE en el precursor de
IL-18M.
IL-18M.
Puede utilizarse un vector de expresión que
codifique un péptido señal eficaz, preferiblemente el péptido
señal de la hormona de crecimiento humana, fusionado al cDNA de la
IL-18M madura, para expresión y secreción
eucarióticas.
El cDNA de IL-18 originario usado
para la construcción mutante puede ser seleccionado entre especies
de ratón y ser humano.
La IL-18M puede ser
epitópicamente marcada, preferiblemente con histidina, para una
conveniente purificación. La IL-18M recombinante
puede ser purificada mediante métodos convencionales o de afinidad.
La cantidad de IL-18M producida puede ser
comprobada mediante un ensayo de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked
immunosorption assay) específico.
La IL-18M puede ser usada en una
formulación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades que
son prevenidas o reducidas mediante respuestas Th1, más
específicamente mediante tratamiento con IL-18,
tales como, por ejemplo, infecciones por microorganismos y cáncer.
La ventaja de usar la versión mutante en lugar de la versión de
tipo silvestre de la proteína radica en su resistencia a la
neutralización por IL-18BP.
Más específicamente, la IL-18M
puede ser administrada sistémica o localmente en inmunoterapia de
tumores como un adyuvante para antígenos tumorales.
Células tumorales procedentes de un paciente
pueden ser aisladas, genéticamente modificadas para que secreten
IL-18M y reinjertadas al mismo paciente para
vacunación local (Coughlin et al., 1.998). La fusión de las
células tumorales modificadas que expresan IL-18M a
células dendríticas alogénicas (células presentadoras de antígeno)
puede ser llevada a cabo para aumentar más la antigenicidad tumoral
y, en consecuencia, la respuesta antitumoral.
La IL-18M puede ser administrada
como un adyuvante en vacunación con DNA (Tuting et al.,
1.998), de una manera similar a la indicada para el uso de las
citoquinas IL-12 e IFN-. En este caso, puede
llevarse a cabo una vacunación transdérmica con antígeno tumoral
usando una pistola de genes. Esto puede dar lugar a la transfección
de células dendríticas residentes de la piel con DNA que codifica
tanto el antígeno tumoral como IL-18M.
Alternativamente, pueden construirse las células dendríticas ex
vivo y luego realizarse una transferencia adoptiva.
La IL-18M puede ser usada como un
adyuvante en terapia de injerto contra tumor. Pueden usarse células
pluripotenciales alogénicas para trasplantar a pacientes
cancerosos. Para aumentar el rechazo del injerto contra tumor,
inducido por el trasplante de las células alogénicas, puede
administrarse IL-18M sistémica o localmente,
preferiblemente mediante la expresión de IL-18M en
células dendríticas singénicas genéticamente modificadas o en
células tumorales extraídas al paciente.
Ha de entenderse que, aunque el invento se ha
descrito conjuntamente con las realizaciones específicas preferidas
del mismo, la descripción precedente así como los ejemplos que
vienen a continuación están destinados a ilustrar y no a limitar
el alcance del invento. Otros aspectos, ventajas y modificaciones
del alcance del invento resultarán evidentes a los expertos en la
técnica a la que se refiere el invento.
Con objeto de generar la IL-18
ensamblada correcta en E. coli, el sitio de escisión para
ICE en el precursor de IL-18 fue sustituido por un
sitio de escisión para Xa. Por lo tanto, la escisión in
vitro del precursor de IL-18 por Xa genera
posteriormente la proteína activa (Documento WO 00/61768).
La secuencia de cDNA que codifica el precursor de
IL-18 humano (proIL-18, número de
acceso D49950 de la genoteca, Figura 1), usada para generar el
plásmido de expresión, fue aislada del modo descrito (Ghayur et
al., 1.997).
La sustitución del sitio de escisión para ICE por
un sitio de escisión para Xa fue llevada a cabo usando 2
reacciones PCR (véanse en la Figura 1 los cebadores usados).
Reacción PCR 1: se generó el proelemento de cDNA de
IL-18 utilizando el cebador sentido (Pr 1) que
contiene el sitio EcoRI situado cadena arriba del marco de lectura
abierto (ORF; del inglés, open reading
frame):
5'-ATATGAATTCATGGCTGCTGAACCAGTAG
(ID. SEC. nº 11), y un cebador inverso (Pr 2) creado para el sitio
ICE (33-LESD-36) en que se han
cambiado 6 nucleótidos para codificar el sitio para el factor Xa
(33-IEGR-36):
5'-AAAGTAACGTCCTTCGATGTTTTC (ID.
SEC. nº 12). El fragmento de DNA multiplicado que codifica la
IL-18 madura fue generado usando el cebador sentido
(Pr 3) que es complementario de Pr 2:
5'-GAAAACATCGAAGGACGTTACTTT (ID. SEC. nº 13) y el
cebador inverso (Pr 4) que contiene el sitio BamHI situado cadena
abajo de la secuencia de codificación de IL-18:
5'-ATATGGATCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGTG (ID. SEC. nº 14).
Los DNAs de la IL-18 madura, de 474 pares de bases
(bp; del inglés, base pairs), y del proelemento, de
108 bp, fueron resueltos por electroforesis en agarosa al 1% y
fueron eluidos mediante un sistema para extracción de gel
(GIBCO/BRL).
Reacción PCR 2: los dos fragmentos de DNA
obtenidos en la reacción PCR 1 fueron mezclados en una relación
1:1 y fueron usados junto con los cebadores Pr 1 y Pr 4 para generar
un cDNA de IL-18 humana completa en que el sitio
para ICE está sustituido por el sitio para el factor Xa
(ICE/Xa).
El cDNA de proIL-18 (ICE/Xa) fue
ligado en el plásmido BlueScript (Stratagene) por sitios de
restricción EcoRI y BamHI (GIBCO/BRL). Este plásmido sirvió para la
confirmación de secuencias. En ID. SEC. nº 2 se muestra la
prevista secuencia de aminoácidos codificada. Para expresión en
E. coli, el inserto de DNA de IL-18 fue
vuelto a ligar en el vector pPROEX HTa (GIBCO/BRL) con la
utilización de sitios EcoRI y XbaI (que se originaron en
BlueScript). En este vector, la proteína resultante está
N-terminalmente fusionada a un marcador de
histidina.
Se crearon mutaciones en IL-18,
en restos de los que se preveía que eran importantes para la unión
al inhibidor IL-18BP (Kim et al., 2.000). Se
generaron tres mutantes: E42A, K89A y F-42A/K89A.
Las mutaciones se llevaron a cabo mediante dos reacciones PCR, como
se describió en el Ejemplo 1, usando los cebadores y moldes
descritos más adelante (los cebadores se muestran en la Figura
2),
Reacción PCR 1 - La pareja de cebadores usados
para preparar el mutante E42A fueron: Par A - Pr 1 (Ejemplo
1) y el cebador inverso (Pr 5) 5'-TAA TTT AGA TGC
AAG CTT GCC (ID. SEC. nº 15) que codifica alanina en vez de ácido
glutámico (E 42), y Par B - el cebador sentido (Pr 6)
5'-GGC AAG CTT GCA TCT AAA TTA (ID. SEC. nº
16) que codifica alanina en intercambio por ácido glutámico (GAA a
GCA) y el cebador inverso Pr 4 (Ejemplo 1), usando
proIL-18 (ICE/Xa) como molde en la reacción
PCR.
Reacción PCR 2: los dos fragmentos de DNA
obtenidos en la reacción PCR 1 fueron usados como moldes para la
segunda reacción PCR usando los cebadores Pr 1 y Pr 4.
Reacción PCR 1 - La pareja de cebadores usados
para preparar el mutante K89A fueron: Par A - Pr 1 (Ejemplo
1) y el cebador inverso (Pr 7) 5'-CTG GCT ATC TGC
ATA CAT ACT (ID. SEC. nº 17) que codifica alanina en vez de lisina
(K 89), y Par B - el cebador sentido (Pr 8)
5'-AGT ATG TAT GCA GAT AGC CAG (ID. SEC. nº
18) que codifica alanina en lugar de lisina (AAA a GCA) con el
cebador inverso Pr 4 (Ejemplo 1), usando proIL-18
(ICE/Xa) como molde para la primera reacción PCR.
Reacción PCR 2: los dos fragmentos de DNA
obtenidos en la reacción PCR 1 fueron usados como moldes para la
segunda reacción PCR usando los cebadores Pr 1 y Pr 4.
Para la doble mutación E42A/K89A, el cebador
usado fue el mismo que para la preparación de la mutación
F-42A, y se usó el cDNA del mutante K89A como molde
en la reacción.
Cada uno de los tres genes mutados de
IL-18 fue ligado en el vector BlueScript para la
confirmación de secuencias. La prevista secuencia de aminoácidos
para los mutantes E42A, K89A y E42A/K89A de IL-18
precursora se muestran respectivamente en la ID. SEC. nº 3, la ID.
SEC. nº 4 y la ID. SEC. nº 5. Para expresión en E. coli,
cada uno de los tres insertos de DNA de IL-18 fue
vuelto a ligar en el vector pPROEX HTa (GIBCO/BRL) con el uso de
sitios EcoRI y XbaI. La proteína resultante está
N-terminalmente fusionada a histidina (Figura
1).
Los precursores mutantes de IL-18
fueron hechos expresar en E. coli y fueron purificados por
afinidad en virtud del marcador de histidina, y las respectivas
moléculas maduras fueron generadas por escisión proteolítica con
factor Xa.
Se introdujo cada uno de los cuatro plásmidos
pPROEX HTu/IL-18 (WT y los tres mutantes) en
células competentes de la cepa DHQ de E. coli (GIBCO/BRL) y
se hizo expresar del modo descrito (11). Un cultivo de 25 ml
realizado durante la noche sirvió como inóculo para 450 ml de
cultivo LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y fue
desarrollado hasta que alcanzó una densidad celular correspondiente
a una densidad óptica de 0,6-1 a 600 nm. Se indujo
la expresión proteica mediante tratamiento con
isopropiltiogalactosido (IPTG, 0,3 mM) y se continuó la incubación
a 37°C con sacudimiento durante 3 h. Las células bacterianas
cultivadas fueron recogidas por centrifugación (5.000 x g durante
15 minutos a 4°C), y el sedimento de centrifugación fue suspendido
en 30 ml de tampón Talon (NaH_{2}PO_{4} 50
mM/Tris-HCl 20 mM/NaCl 100 mM, pH de 8). Las
células fueron lisadas por sonicación (2 x impulsos de 30 s) sobre
hielo. La proteína soluble fue obtenida por centrifugación (4.000
x g durante 30 minutos a 4°C) y fue aplicada a una columna
mini-Talon de 3 ml de capacidad (CLONTECH). Luego
se lavó la columna Talon con 30 volúmenes de lecho de tampón Talon y
se realizó la elución con 6 ml de imidazol 100 mM en tampón Talon.
El producto de elución se dializó frente a tampón para factor Xa
(Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM/CsCl_{2} 2 mM) a 4°C
durante 20 h. Los 0,2 ml de proIL-18 de fusión con
His x 6 N-terminal, purificada por afinidad en
Talon, fueron incubados con 4 \mug de enzima factor Xa (New
England Biolabs) durante 4 h a temperatura ambiental en presencia
de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM (GIBCO/BRL). La cantidad de
IL-18 producida fue comprobada mediante un ELISA
específico (R&D Systems). Las secuencias de aminoácidos
previstas para la IL-18 WT madura y los mutantes
E42A, K89A y E42A/K89A se muestran respectivamente en las
secuencias ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 7 e ID. SEC. nº 8.
Los mutantes de IL-18 purificados
fueron sometidos a un análisis por transferencia Western con un
anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal específico para la
IL-18 madura.
Cantidades iguales de precursor y proteína madura
(después de escisión mediante factor Xa) purificados por afinidad
en Talon, las formas de IL-18 WT y mutante, fueron
resueltas por electroforesis en gel de
poliacrilamida/dodecilsulfato sódico (SDS/PAGE; del inglés,
sodium dodecyl
sulfate/polyacrylamide gel
electrophoresis) (acrilamida al 10%) bajo condiciones
reductoras. Las proteínas fueron transferidas a membranas de
nitrocelulosa y fueron luego incubadas con los anticuerpos
primarios [clon 8-31-4 de anticuerpo
monoclonal (IgG2a) o anticuerpo policlonal de conejo
anti-IL-18 humana que fueron
generados contra la forma madura recombinante de
IL-18 humana (Puren et al., 1.999) y que
también reconocen la IL-18 precursora]. Después de
24 h de incubación, se añadió el correspondiente segundo anticuerpo,
anti-IgG de ratón generada en cabra o
anti-IgG de conejo generada en burro y conjugadas
con peroxidasa (Jackson Immuno Research), y se realizó el
desarrollo por ECL (New England Nuclear Life Science Products).
La tinción de proIL-18 por
anti-IL-18 humana policlonal de
conejo fue de igual intensidad para la forma WT y para cada uno de
los tres mutantes. Similarmente, las señales obtenidas con las
formas maduras de WT e IL-18 y con cada uno de los
tres mutantes usando el antisuero policlonal fueron de igual
intensidad. El peso molecular aparente indicaba que las diferentes
formas de IL-18 tenían el tamaño correcto. Por
contraste, cuando se usa el anticuerpo monoclonal, parece que los
dos mutantes K89A y E42A/K89A se tiñen más intensamente que la
forma WT y que el mutante E42A, lo que sugiere que la afinidad del
anticuerpo monoclonal es mayor para esos mutantes. Estos
resultados sugieren que los mutantes K89A y E42A/K89A pueden tener
una conformación diferente que da lugar a una mayor afinidad.
Las formas maduras purificadas de
IL-18/ICE/Xa fueron analizadas en cuanto a la
coinducción de IFN-\gamma en células asesinas
naturales humanas (NKO, descritas en el Ejemplo 8) y en PBMCs
(descritas en el Ejemplo 7) y en cuanto a la inducción de
IL-8 en PBMCs.
IL-18 no induce
IFN-\gamma en estas células a menos que se utilice
IL-12 (o IL-15) como un
coestimulante. Bajas concentraciones de IL-12
[1-2 ng/ml (PreproTech Rocky Hill, New Jersey,
EE.UU.)] inducen una pequeña cantidad de
IFN-\gamma; sin embargo, el tratamiento con
IL-12 junto con IL-18 aumenta mucho
la producción de IFN-\gamma. La
IFN-\gamma producida fue comprobada en la célula
del modo descrito en el Ejemplo 9. Se halló que la inducción de
IFN-\gamma en células NKO por
IL-18 WT/ICE/Xa e IL-12 era
comparable a la inducción por IL-18 humana madura
recombinante, que resulta del procesamiento de
proIL-18 por ICE (Gu et al., 1.997), e
IL-12. Estos resultados indican que la
IL-18 era correctamente ensamblada en E. coli
y correctamente procesada por el factor Xa.
Para probar la actividad de la
IL-18 mutada, se evaluó en células NKO la inducción
de la producción de IFN-\gamma por estimulación
con la IL-18 mutante o WT junto con
IL-12 (en el Ejemplo 10 se describen análisis
estadísticos). Como se muestra en la Figura 3A,
IL-18 WT era activa como inductor de
IFN-\gamma, comenzando a 7,5 ng/ml y aumentando
progresivamente hasta 60 ng/ml (la mayor concentración probada).
Cada una de las tres formas mutadas de IL-18
presentaba mayor actividad biológica que la WT en estas células. Por
ejemplo, la mutación simple E42A era dos veces más activa que la
forma WT en cada una de las concentraciones probadas. La mutación
simple K89A era cuatro veces más activa que la forma WT en una
concentración de 7,5 ng/ml. La mutación doble E42A/K89A daba lugar
a la IL-18 más activa. Como se muestra en la Figura
3A, la IL-18 mutada E42A inducía 600 pg/ml de
IFN-\gamma, la máxima actividad observada por
pretratamiento con 60 ng/ml de IL-18 WT, en una
concentración de 30 ng/ml, el mutante K89A en una concentración de
15 ng/ml y el mutante doble en una concentración de 7,5 ng/ml. Por
lo tanto, los mutantes E42A y K89A y el mutante doble eran 2, 4 y 8
veces más potentes que la forma WT, respectivamente.
Se observaron resultados similares cuando se
probó la producción de IFN-\gamma en PBMCs
humanas recién aisladas (Ejemplo 7). En estas células, la
coestimulación de IL-12 e IL-18 daba
lugar a la producción de IFN-\gamma mientras que
ninguna de las dos citoquinas pudo inducir sola
IFN-\gamma. El mutante doble E42A/K89A fue el más
activo (Figura 3B).
Los resultados indican que la sustitución de los
dos aminoácidos cargados Glu 42 y/o Lys 89 por restos de Ala
ocasiona consecuentemente un aumento de la actividad biológica de
IL-18.
Se sabe que IL-18 induce
IL-8 en células CD14+ de preparaciones de PBMC
(descritas en el Ejemplo 7). Aunque IL-18 induce la
producción de IL-8 en estas células sin necesidad de
la coestimulación de IL-12, la inducción de
IL-8 requiere mayores concentraciones de
IL-18 que la inducción de
IFN-\gamma. Por lo tanto, se probó la inducción
de IL-8 por estimulación de PBMCs con
IL-18 WT y mutantes. La IL-8
producida fue comprobada en los medios celulares mediante el
ensayo específico descrito en el Ejemplo 9. La Figura 4 muestra
que, aunque las dos mutaciones simples eran comparables a la WT en
la inducción de IL-8, la IL-18
doblemente mutada inducía significativamente más
IL-8 (3,5 veces más) que la versión de tipo
silvestre.
Estos resultados indican que el doble mutante,
E42A/K89A, presenta la mayor actividad biológica.
Se crearon las mutaciones en restos de los que se
preveía que eran importantes para la unión de IL-18
al inhibidor IL-18BP. Por lo tanto, se evaluó
específicamente la capacidad de IL-18BP para
neutralizar la actividad biológica de IL-18, por
ejemplo, la producción de IFN-\gamma (Ejemplo
8).
Se preincubaron diferentes concentraciones de
IL-18BP [isoforma "a" de
IL-18BP humana recombinante marcada con
his-6, producida en células CHO (proporcionada por
Interpharm Laboratories, Ness Ziona, Israel Kim et al.,
2.000)] con IL-18 WT o sus formas mutadas
(concentración final de 30 ng/ml) y luego se añadieron a cultivos
celulares.
Como se muestra en la Figura 4A, la concentración
inhibidora al 50% de IL-18BP en cuanto a la
coinducción de IFN-\gamma por
IL-18 WT en células NKO era aproximadamente 15 ng/ml
(suponiendo que no tiene lugar inhibición a 3,7 ng/ml de
IL-18BP y que este valor representa 100% de
actividad). La mutación simple de E42A dio lugar a una similar
dosis-concentración inhibidora por
IL-18BP.
Sin embargo, cuando se incubó el mutante K89A con
IL-18BP, su capacidad para actuar como un
coinductor de IFN-\gamma en células NKO fue
neutralizada en menor grado (Figura 5A). Sólo en una concentración
de 120 ng/ml pudo observarse una reducción estadísticamente
significativa de actividad. Por contraste, IL-18BP
falló a la hora de neutralizar el doble mutante de
IL-18, E42A/K89A.
Como se muestra en la Figura 4B,
IL-18 es más sensible a la neutralización por
IL-18BP cuando se prueba en PBMCs que cuando se
prueba en células NKO. La cantidad de IL-18BP
necesaria para neutralizar IL-18 WT fue 3,7 ng/ml,
la menor concentración probada. La mutación simple E42A se comportó
similarmente a IL-18 WT, según se estableció por la
observación de que bajas concentraciones de IL-18BP
neutralizaban su actividad biológica en PBMCs. Por contraste, la
mutación simple K89A fue neutralizada a 120 ng/ml. Similarmente a
los resultados relativos a la neutralización de mutantes de
IL-18 por IL-18BP en células NKO,
el doble mutante E42A/K89A sólo resultó ligeramente afectado por
IL-18BP en PBMCs.
Estos resultados muestran que el mutante K89A y
el doble mutante E42A/K89A son menos afectados por el inhibidor
natural IL-18BP.
Leucocitos residuales procedentes de
plaquetaféresis de donantes humanos sanos fueron separados del tubo
de sangre por enjuague y fueron sometidos a centrifugación sobre
Histopaque. Las PBMCs fueron aspiradas de la interfase, lavadas
tres veces en disolución salina exenta de pirógenos (Baxter Health
Care, Mundelein, Illinois, EE.UU.) y resuspendidas en medio RPMI
1640 complementado con suero bovino fetal (FBS; del inglés,
fetal bovine serum) al 10% (GIBCO/BRL Grand
Island, New York, EE.UU.), en una concentración de 5 x 10^{6}
células por ml. Las células fueron cultivadas en placas de 96
pocillos de fondo plano (Becton Dickinson) con medio RPMI 1640
solo (testigo) o con IL-18 humana recombinante,
IL-18 WT (ICF/Xa) o los tres mutantes en
concentraciones variables, en presencia de 1 ng/ml de
IL-12. En algunos experimentos, las preparaciones
de IL-18 fueron mezcladas primero con polimixina B
(1 \mug/ml, obtenida de Sigma) antes de ser añadidas a las
células. Se incubaron las células durante 16-20 h a
37°C en aire humidificado con CO_{2} al 5% y luego se recogió el
sobrenadante del cultivo para la medición de
IFN-\gamma.
La línea celular NK92 materna original fue
obtenida de Hans Klingerman (Gong et al., 1.994). La línea
celular NKO humana usada en los estudios presentes era un subclón
de esta línea celular. Las células NKO fueron mantenidas en medio
RPMI 1640 complementado que contenía FBS al 10% y 50 pg/ml de
IL-2 (R&D Systems) y 200 pg/ml de
IL-15 (PeproTech). Para los ensayos, las células NKO
fueron suspendidas en medio RPMI 1640 en una concentración de 0,5
x 10^{6} células por ml y fueron estimuladas en volúmenes de 0,2
ml, en placas de 96 pocillos, con 0,5 ng/ml de
IL-12 (PreproTech Rocky Hill, New Jersey, EE.UU.) y
diferentes concentraciones de IL-18 WT humana
recombinante, IL-18 (ICE/Xa) o los mutantes E42A,
K89A y E42A/K89A de IL-18. Después de
16-20 h a 37°C en aire humidificado con CO_{2} al
5%, se recogió el sobrenadante del cultivo para la medición de
IFN-\gamma.
Se usó el método de electroquimioluminiscencia
(ECL) en fase líquida para medir IFN-\gamma (13)
e IL-8 (12) en los medios de cultivo celular. La
cantidad de ECL fue determinada con el uso de un analizador Origen
(Igen, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). Los límites de detección de
IFN-\gamma e IL-8 fueron 62 pg/ml
y 40 pg/ml, respectivamente.
Los datos se expresan como el valor medio ± error
estándar del valor medio. Los valores medios de los grupos se
compararon mediante un análisis ANOVA con el uso de la diferencia
menos significativa de Fisher. La significación estadística fue
aceptada dentro de límites de confianza de 95%. Los análisis ANOVA
y de correlación se llevaron a cabo con el programa estadístico
STATVIEW 512+ (Brain Power, Calabasas, California, EE.UU.).
Para la expresión y secreción de mutantes de
IL-18 madura en células CHO, se liga la secuencia
de DNA que codifica la proteína madura de tipo silvestre e
IL-18BP mutante a la secuencia de DNA del péptido
señal de la hormona de crecimiento humana (hGH) mediante dos
reacciones PCR similares a las reacciones descritas en el Ejemplo
1. El molde para la primera reacción PCR para la multiplicación de
cada mutante de IL-18 es la correspondiente
construcción del Ejemplo 2 con un cebador sentido (Pr 9) que
contiene secuencias solapantes de IL-18 y el
péptido señal de hGH y un cebador inverso (Pr 10) que codifica los
12 últimos nucleótidos de la IL-18, un codón de
terminación y un sitio para una enzima de restricción. Para la
multiplicación del péptido señal de la hormona de crecimiento, se
usa el plásmido pXGH como molde con un cebador sentido (Pr 11) que
contiene un sitio para una enzima de restricción, los 12 primeros
nucleótidos del péptido señal de hGH y el cebador inverso (Pr 12),
que contiene secuencias solapantes con el péptido señal de hGH y la
proteína IL-18 madura. Los moldes para la segunda
PCR llevada a cabo para la multiplicación del fragmento que
codifica el péptido señal de la hGH fusionado a la secuencia madura
de la IL-18 son los fragmentos multiplicados y
purificados procedentes de la primera reacción PCR y los cebadores
Pr 10 y Pr 11 que contienen los sitios de restricción. El
fragmento de fusión es purificado, sometido a digestión con las
enzimas de restricción apropiadas y clonado en un vector de
expresión de mamífero.
Los plásmidos se usan para transfectar células
CHO (DHFR-) junto con un plásmido que contiene el gen DHFR de
ratón como marcador genético. Las células resistentes son aisladas
en un medio selectivo y son analizadas en cuanto a la producción
de IL-18 mediante un ensayo ELISA.
Las células establemente transfectadas son
sometidas a varios ciclos de multiplicación génica con
concentraciones crecientes de MTX. Al final del proceso de
multiplicación génica, los clones son aislados por dilución
limitante. Tras una subclonación, el clon que muestra alta
productividad específica y mayor estabilidad de producción es
seleccionado para producción.
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<110> Ares Trading S.A
\hskip1,05cmDinarello, Charles
\hskip1,05cmKim, Soo Hyun
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<120> Mutantes de interleuquina 18, su
producción y su uso
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<130> 415
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<150> 60/274,327
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<151>
2001-03-08
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<160> 18
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 582
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\hfill21
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Claims (29)
1. Un polipéptido IL-18 mutante
que comprende mutaciones en uno o más restos de aminoácido que
están implicados en su interacción con la proteína ligante de
IL-18, en el que la mutación está en un resto
seleccionado entre Glu-42 y Lys-89
del precursor de IL-18 humano codificado por el cDNA
de la ID. SEC. nº 1 y en el que las mutaciones son sustituciones
no conservativas.
2. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que la mutación está en un resto
Glu-42.
3. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que la mutación está en un resto
Lys-89.
4. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que la mutación está en un resto
Glu-42 y un resto Lys-89.
5. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 2, en el que el resto Glu-42 está
sustituido por un aminoácido apolar.
6. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 5, en el que el Glu-42 está
sustituido por un resto de Ala.
7. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 3, en el que el resto Lys-89 está
sustituido por un aminoácido apolar.
8. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 7, en el que la Lys-89 está
sustituida por un resto de Ala.
9. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 4, en el que tanto el resto Glu-42
como el resto Lys-89 están sustituidos por un
aminoácido apolar.
10. Un polipéptido de acuerdo con la
Reivindicación 9, en el que tanto el resto Glu-42
como el resto Lys-89 están sustituidos por un resto
de Ala.
11. Una DNA aislado que codifica un polipéptido
de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones
1-10.
12. Un DNA de acuerdo con la Reivindicación 11,
en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de ID.
SEC. nº 3.
13. Un DNA de acuerdo con la Reivindicación 11,
en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de ID.
SEC. nº 4.
14. Un DNA de acuerdo con la Reivindicación 11,
en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de ID.
SEC. nº 5.
15. Un DNA de acuerdo con la Reivindicación 11,
en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de ID.
SEC. nº 6.
16. Un DNA de acuerdo con la Reivindicación 11,
en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de ID.
SEC. nº 7.
17. Un DNA de acuerdo con la Reivindicación 11,
en el que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de ID.
SEC. nº 8.
18. Un DNA de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 11, 15, 16 y 17, que comprende además una
secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal.
19. Un DNA de acuerdo con la Reivindicación 18,
en el que el péptido señal es el de una hormona de crecimiento.
20. Un vector que comprende un DNA de acuerdo con
cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 19, en el que dicho vector
es capaz de expresar el polipéptido codificado por dicho DNA en una
célula huésped apropiada.
21. Un vector de acuerdo con la Reivindicación
20, en el que la célula huésped es procariótica.
22. Un vector de acuerdo con la Reivindicación
21, en el que el DNA codifica un polipéptido seleccionado de un
grupo que consiste en la ID. SEC. nº 3, la ID. SEC. nº 4 y la ID.
SEC. nº 5.
23. Un vector de acuerdo con la Reivindicación
20, en el que la célula huésped es una célula eucariótica.
24. Un vector de acuerdo con la Reivindicación
23, en el que el DNA codifica un polipéptido seleccionado de un
grupo que consiste en la ID. SEC. nº 6, la ID. SEC. nº 7 y la ID.
SEC. nº 8.
25. Un vector de acuerdo con la Reivindicación
23, que comprende DNA de acuerdo con la Reivindicación 18 ó
19.
26. Un vector de acuerdo con la Reivindicación
24, en el que dicho DNA está ligado a la secuencia que codifica el
péptido señal de la hormona de crecimiento humana.
27. Una composición farmacéutica que comprende un
polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a
10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la Reivindicación 27, para el tratamiento del cáncer.
29. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la Reivindicación 27, para el tratamiento de enfermedades
víricas.
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