ES2307313T3 - Nuevos polipeptidos, adn que codifican y utilizan estos polpeptidos. - Google Patents

Abstract

Una forma sustancialmente purificada de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Ala en la posición 392 que se muestra en la SEC ID Nº 4, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Leu en la posición 398 que se muestra en la SEC ID Nº 8 o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95% con las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº 1 ó 5.

Description

Nuevos polipétidos, ADN que codifican y utilizan estos polipéptidos.

Campo técnico

La invención se refiere a nuevos polipéptidos producidos por una determinada línea de células estromales humanas y a ADN que codifican dichos polipéptidos.

Más particularmente, la invención se refiere a nuevos polipéptidos denominados OAF065\alpha y OAF065\beta (en lo sucesivo denominados OAF065), a un proceso para su preparación, a ADN que codifican dichos polipéptidos, a un vector que contiene el polipéptido, a una célula hospedadora transformada con el vector, a un anticuerpo de dicho polipéptido y a una composición farmacéutica que contiene el polipéptido o anticuerpo.

Antecedentes técnicos

Se sabe que las células estromales de la médula ósea constituyen el microambiente del sistema inmunológico, hematopoyético, etc. en la médula ósea y producen y secretan factores esenciales para inducir la proliferación y la diferenciación de células madre, por ejemplo, IL-7, SCF, IL-11, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-6, TGF-\beta, LIF, etc. También se hace evidente que determinadas células estromales de la médula ósea están relacionadas con el metabolismo óseo (Kenneth Dorshkind Annu. Rev. Immunol. 8, 111-137, 1990). Sin embargo, los papeles de las células estromales no se reconstituyen completamente únicamente a partir de los factores aislados. Esto puede sugerir la existencia de factores que no se han aislado todavía.

JAYAKUMAR ARUMUGAN ET AL: "Cloning and expressing of the multifunctional human fatty acid synthase and its subdomains in Escherichia coli" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, vol. 93, nº 25, 1996, páginas 14509-14514, describen que han caracterizado previamente un ADNc de longitud completa (8,3 kb) que codifica la ácido graso sintasa (FAS; EC 2.3.1.85) a partir de los clones de ADNc de FAS de cerebro humano. En el proceso de llevar a cabo esta tarea desarrollan un nuevo procedimiento de PCR, la PCR recombinante, que es muy útil para unir dos fragmentos de ADN solapantes que no tengan un sitio de restricción común o único. El ADNc de longitud completa se clonó en pMAL-c2 para la expresión heteróloga en Escherichia coli como una fusión con proteína de unión a maltosa. La proteína recombinante se purificó usando la afinidad por resina de amilosa y una cromatografía de hidroxilapatita. Como se esperaba de la capacidad codificante del ADNc expresado, la proteína quimérica recombinante tiene un peso molecular de 310.000 y reacciona con anticuerpos tanto contra la FAS humana como contra la proteína de unión a maltosa. La proteína de unión a maltosa-FAS humana (MBP-hFAS) catalizaba la síntesis de palmitato a partir de acetil-CoA, malonil-CoA y NADPH y presentaba todas las actividades parciales de FAS a niveles comparables con los de la enzima humana nativa purificada a partir de células HepG2. Al igual que la FAS de HepG2 nativa, los productos de MBP-hFAS son principalmente ácido palmítico (>90%) y cantidades minoritarias de los ácidos esteárico y araquídico. De forma similar, se clonó un ADNc de FAS humana que codificaba el dominio I (\beta-cetoacil sintasa, acetil-CoA y malonil-CoA transacilasas y \beta-hidroxiacil deshidratasa) y se expresó en E. coli usando pMAL-c2. La proteína de fusión expresada, MBP-dominio I de hFAS, se purificó hasta una homogeneidad aparente (M_{r} 190.000) y presentaba las actividades de las acetil/malonil transacilasas y de la \beta-hidroxiacil deshidratasa. Además, se clonó un ADNc de FAS humana que codificaba los dominios II y III (enoil y \beta-cetoacil reductasas, proteína transportadora de acilo y tioesterasa) en pET-32b (+) y se expresó en E. coli como una proteína de fusión con tiorredoxina y seis restos histidina en la fase de lectura abierta. La proteína de fusión recombinante, tiorredoxina-dominios II y III de FAS humana, que se purificó a partir de E. coli, tenía un peso molecular de 159.000 y presentaba las actividades de las enoil y \beta-cetoacil reductasas y de la tioesterasa. Tanto la MBP como la tiorredoxina-marcadores de His no parecen interferir con la actividad catalítica de la FAS humana ni con sus actividades parciales.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han dirigido su atención a este punto y se ha llevado a cabo una investigación activa para descubrir nuevos factores (polipéptidos), especialmente secretores, y proteínas de membrana que se generan por determinadas células estromales.

Hasta ahora, cuando un especialista en la técnica pretendía obtener un polipéptido particular o un ADN que lo codifica, utilizaba generalmente métodos por confirmación de una actividad biológica deseada en un tejido o en un medio celular, aislamiento y purificación del polipéptido y, posteriormente, clonación de un gen o métodos de "clonación y expresión" bajo la dirección de la actividad biológica.

Sin embargo, los polipéptidos fisiológicamente activos en cuerpos vivos tienen con frecuencia muchas clases de actividades. Por lo tanto, cada vez es más frecuente que, después de clonarse un gen, se descubra que el gen es idéntico al que codifica un polipéptido ya conocido. Generalmente, las células estromales de la médula ósea generan sólo una cantidad muy pequeña de un factor y esto hace difícil aislar y purificar el factor y confirmar su actividad biológica.

Los rápidos avances recientes en técnicas para generar ADNc y técnicas de secuenciación han hecho posible secuenciar rápidamente una gran cantidad de ADNc. Mediante la utilización de estas técnicas, actualmente se está desarrollando un proceso que comprende la generación aleatoria de ADNc, la identificación de las secuencias de nucleótidos de los mismos y la expresión de nuevos polipéptidos codificados por los mismos. Aunque este proceso es ventajoso por el hecho de que se puede clonar un gen y se puede obtener información con respecto a su secuencia de nucleótidos sin ningún análisis bioquímico o genético, en muchos casos el gen diana sólo puede descubrirse de este modo accidentalmente.

Los presentes inventores han estudiado un método de clonación de genes que codifican factores de proliferación y/o diferenciación que funcionan en los sistemas hematopoyéticos y en los sistemas inmunes. Centrando su atención en el hecho de que la mayoría de las proteínas secretoras, tales como factores de proliferación y/o diferenciación (por ejemplo, diversas citocinas), y proteínas de membrana, tales como receptores de las mismas (en lo sucesivo estas proteínas se denominarán en general como proteínas secretoras y similares), tienen secuencias denominadas péptidos señal en los extremos N-terminales, los inventores realizaron estudios exhaustivos sobre un proceso para clonar eficaz y selectivamente un gen que codifica un péptido señal. Por último, se ha inventado con éxito un método de exploración para ADNc que tienen secuencias que codifican péptidos señal y se ha denominado el método como captura de secuencias señal (SST) (véase la Solicitud de Patente Japonesa Nº 6-13951). También se desarrolló un método de SST en levaduras basado en la misma idea. Mediante el método que usa levaduras, pueden identificarse genes que incluyen secuencias que codifican péptidos señal más fácil y eficazmente (véase el documento USP Nº 5.536.637).

Mediante el uso del método de SST, los presentes inventores consiguieron descubrir nuevas proteínas de membrana producidas por células estromales de la médula ósea y ADN que las codifican y entonces se llevó a cabo la invención. Los polipéptidos OAF065 de la invención no son conocidos, cuando las secuencias de aminoácidos del polipéptido se compararon mediante un ordenador con todas las secuencias conocidas en la base de datos de Swiss Prot Release 33. Se descubrió que los polipéptidos de la invención son proteínas de membrana de tipo I y que tienen una región extracelular rica en Cys que existe habitualmente en la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véase la Figura 1). Así que se sugirió que los polipéptidos de la invención son nuevas proteínas de membrana que pertenecen a la familia de receptores de TNF.

La presente invención proporciona una forma sustancialmente purificada de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, un ADNc de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de replicación o de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8, un método para producir el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, un anticuerpo monoclonal o policlonal de acuerdo con la reivindicación 10 y una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de la invención y de las de la familia de receptores de TNF. hTNFR1 representa el receptor 1 del factor de necrosis humano, hTNFR2 representa el receptor 2 del factor de necrosis humano, hNGFR representa el receptor del factor de crecimiento nervioso humano y hFas representa la Fas humana en esta figura.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona:

1) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 o Nº 5,

2) un ADN que codifica los polipéptidos descritos anteriormente (1),

3) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 o Nº 6.

Más particularmente, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5 en una forma sustancialmente purificada, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Ala en la posición 392 que se muestra en la SEC ID Nº 4, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Leu en la posición 398 que se muestra en la SEC ID Nº 8 o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95% con las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº 1 ó 5.

Además, la invención se refiere a ADN que codifican los péptidos anteriores. Más particularmente, la invención proporciona ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 2, 3, 6 ó 7.

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5 en una forma sustancialmente purificada comprenderá generalmente el polipéptido en una preparación en la que más del 90%, por ejemplo, el 95%, 98% o 99% del polipéptido en la preparación sea el de la SEC ID Nº 1 ó 5. Un homólogo del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5 tendrá generalmente una homología de al menos el 95% con el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5. Se hará referencia a dicho homólogo del polipéptido como un polipéptido de la invención.

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Una realización adicional de la invención proporciona vectores de replicación y de expresión que llevan un ADN de la invención. Los vectores pueden, por ejemplo, vectores plasmídicos, virales o fagos provistos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho ADN y, opcionalmente, un regulador del promotor. El vector puede contener uno o más genes marcadores de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina. El vector puede usarse in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN que se corresponde con el ADNc, o usarse para transfectar o transfectar una célula hospedadora.

Una realización adicional de la invención proporciona células hospedadoras transformadas con los vectores para la replicación y la expresión del ADN de la invención, incluyendo las SEC ID de ADN Nº 2, 3, 6 ó 7 o la fase de lectura abierta de las mismas. Las células se seleccionarán para que sean compatibles con el vector y pueden ser, por ejemplo, de bacterias, levaduras, insectos o mamíferos.

Una realización adicional de la invención proporciona un método de producción de un polipéptido que comprende cultivar células hospedadoras de la invención en condiciones eficaces para expresar un polipéptido de la invención. Preferiblemente, además, dicho método se lleva a cabo en condiciones en la que el polipéptido de la invención se expresa y después se produce a partir de las células hospedadoras.

También puede insertarse un ADN de la invención en los vectores descritos anteriormente en una orientación antisentido para servir para la producción de ARN antisentido. Dicho ARN antisentido puede usarse en un método para controlar los niveles de un polipéptido de la invención en una célula.

La invención también proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales contra un polipéptido de la invención. La invención proporciona además un proceso para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales contra los polipéptidos de la invención. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales mediante la tecnología de hibridomas habitual, usando polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos como inmunógenos. También puede prepararse anticuerpos policlonales por medios comunes que comprenden inocular animales hospedadores, por ejemplo, una rata o un conejo, con polipéptidos de la invención, y recuperar el suero inmune.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de la invención, o un anticuerpo del mismo, junto con un diluyente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los polipéptidos de la invención incluyen los que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5.

Es bien conocido que existen de uno a seis tipos de codones que codifican un aminoácido (por ejemplo, se conoce un tipo de codón para metionina (Met) y seis tipos de codones para leucina (Leu)). Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos de ADN puede modificarse para codificar el polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos.

El ADN de la invención, especificado en (2) incluye un grupo de todas las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos (1) que se muestran en la SEC ID Nº 1 ó 5. Existe una probabilidad de que el rendimiento de un polipéptido se mejore modificando una secuencia de nucleótidos.

El ADN especificado en (3) es la realización del ADN que se muestra en (2) e indica la secuencia de la forma natural.

El ADN que se muestra en (4) indica la secuencia del ADN especificado en (3) con una región natural no traducida.

El ADNc que lleva la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 3 se prepara por el método siguiente:

Una breve descripción del método de SST en levaduras (véase el documento USP Nº 5.536.637) es la siguiente.

Levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae tienen que secretar invertasa al medio para captar sacarosa o rafinosa como fuente de energía o de carbono (la invertasa es una enzima para escindir la rafinosa en sacarosa y melibiosa y la sacarosa en fructosa y glucosa). Se sabe que muchas secuencias señal de mamíferos conocidas hacen que las levaduras secreten su invertasa. Partiendo de este conocimiento, se desarrolló el método de SST como un método de exploración para descubrir nuevas secuencias señal que hagan posible que se pueda secretar invertasa de levaduras a partir de una genoteca de ADNc de mamíferos. El método de SST usa levaduras cultivadas en medio con rafinosa como marcador. Se insertó el gen de la invertasa de tipo no secretor SUC2 (Nº de acceso de GENBANK V 01311) que carecía del codón de inicio ATG en un vector de expresión de levaduras para preparar el vector de SST en levaduras pSUC2. En este vector de expresión, se insertaron un promotor de ADH, un terminador de ADH (ambos procedentes del plásmido AAH5 (Gammerer, Methods in Enzymol., 101, 192-201, 1983)), 2 \mu ori (como un origen de replicación en levaduras), TRP1 (como un marcador de selección en levaduras), ColE1 ori (como un origen de replicación en E. coli) y un gen de resistencia a ampicilina (como un fármaco marcador de resistencia). Se insertó un ADNc de mamífero cadena arriba del gen SUC2 para preparar una genoteca de ADNc de SST en levaduras. Se transformaron con esta genoteca levaduras que carecían de la invertasa de tipo secretor. Si el ADNc de mamífero insertado codifica un péptido señal, la levadura sobrevivirá en medio con rafinosa como resultado de la restitución de la secreción de invertasa. Sólo cultivando colonias de levaduras, preparando plásmidos y determinando la secuencia de nucleótidos de los ADNc insertados es posible identificar nuevos péptidos señal rápida y fácilmente.

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La preparación de la genoteca de ADNc de SST en levaduras es de la forma siguiente:

(1) se aísla ARNm de las células diana, se realiza una síntesis de la segunda cadena usando un cebador aleatorio con un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción (enzima I) determinada,

(2) el ADNc bicatenario se liga con un adaptador que contiene un sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción (enzima II) determinada, distinta de la enzima I, se digiere con la enzima I y se fracciona en un tamaño apropiado,

(3) el fragmento de ADNc obtenido se inserta en un vector de expresión de levaduras en la región cadena arriba del gen de la invertasa cuyo péptido señal está delecionado y se transforma la genoteca.

La descripción detallada de cada etapa es la siguiente:

(1) Se aísla ARNm de órganos y líneas celulares de mamíferos (estimuladas con un estimulador apropiado si es necesario) por métodos conocidos (Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o Current Protocol in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc.), si no se hacen observaciones especiales.

Se seleccionaron como fuente de tejido HAS303 (línea de células estromales de la médula ósea humana: proporcionadas por el catedrático Keisuke Sotoyama, Dr. Makoto Aizawa del Tokyo Medical College, 1º de Medicina; véase J. Cell. Physiol., 148, 245-251, 1991 y Experimental Hematol., 22, 482-487, 1994) y HUVEC (células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano: ATCC Nº CRL-1730). Se realiza síntesis de ADNc bicatenario usando un cebador aleatorio por métodos conocidos.

Puede usarse cualquier sitio como sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción I que esté ligado a un adaptador y al sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción II que se usa en la etapa (2), si ambos sitios son diferentes entre sí. Preferiblemente, se usa EcoRI como enzima I y XhoI como enzima II.

En la etapa (2), se generan extremos romos en el ADNc con la ADN polimerasa T4, se liga al adaptador de la enzima II y se digiere con la enzima I. El fragmento de ADNc se analiza con electroforesis en gel de agarosa (AGE) y se selecciona una fracción de ADNc que varía en tamaño de 300 a 800 pb. Como se ha mencionado anteriormente, puede usarse cualquier enzima como enzima II si no es la misma que la enzima I.

En la etapa (3), el fragmento de ADNc obtenido en la etapa (2) se insertan en un vector de expresión de levaduras en la región cadena arriba del gen de la invertasa cuyo péptido señal está delecionado. Se transforman E. coli con el vector de expresión. Se conocen muchos vectores como vectores plasmídicos de expresión en levaduras. Por ejemplo, YEp24 también funciona en E. coli. Preferiblemente, se usa pSUC2, como se ha descrito anteriormente.

Se conocen muchas cepas hospedadoras de E. coli para la transformación, y preferiblemente se usan células competentes DH10B. Está disponible cualquier método de transformación conocido, preferiblemente, se realiza mediante el método de electroporación. Los transformantes se cultivan por métodos convencionales para obtener una genoteca de ADNc para el método de SST en levaduras.

Sin embargo, no todos los clones contienen un fragmento de ADNc. Además, no todos los fragmentos génicos codifican péptidos señal desconocidos. Por lo tanto, es necesario seleccionar a partir de la genoteca un fragmento génico que codifique un péptido señal desconocido.

Por lo tanto, se realiza la selección de los fragmentos que contienen una secuencia que codifica un péptido señal apropiado mediante la transformación de la genoteca de ADNc en Saccharomyces cerevisiae (por ejemplo, cepa YT455) que carece de invertasa (puede prepararse por métodos conocidos). La transformación de las levaduras se realiza por métodos conocidos, por ejemplo, el método de acetato de litio. Los transformantes se cultivan en un medio selectivo y después se transfieren a un medio que contiene rafinosa como fuente de carbono. Se seleccionan las colonias supervivientes y después se prepara el plásmido. La supervivencia de las colonias en un medio con rafinosa indica que se ha insertado en este clon algún péptido señal de proteína secretora.

Se determina la secuencia de nucleótidos de los clones positivos aislados. En lo que se refiere a un ADNc que codifica una proteína desconocida, puede aislarse el clon de longitud completa usando un fragmento de ADNc como una sonda y determinarse después para obtener la secuencia de nucleótidos de longitud completa. Esta manipulación se realiza por métodos conocidos.

Una vez que las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEC ID Nº 2, 3, 6 ó 7 se determinan parcialmente o, preferiblemente, completamente, es posible obtener el ADN que codifica la propia proteína de mamífero, un homólogo o subconjunto. Se exploró una genoteca de ADNc o ARNm procedente de mamíferos mediante PCR con cualquier cebador oligonucleotídico sintetizado o mediante hibridación con cualquier fragmento como sonda. Es posible obtener un ADN que codifica otra proteína homóloga de mamíferos a partir de otra genoteca de ADNc o genoma de mamíferos.

Si un ADNc obtenido anteriormente contiene una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADNc obtenido por SST (o una secuencia consenso del mismo), se pensará que el ADNc codifica un péptido señal. Así que es evidente que el ADNc será de longitud completa o casi completa. (Todas las secuencias señal se encuentran en el extremo N-terminal de una proteína y están codificadas en el extremo 5' de la fase de lectura abierta de un ADNc).

La confirmación puede llevarse a cabo mediante análisis de Northern con dicho ADNc como sonda. Se piensa que el ADNc es casi de longitud completa si la longitud del ADNc es casi la misma longitud del ARNm obtenido en la banda de hibridación.

Una vez que se determinan las secuencias de nucleótidos en la SEC ID Nº 2, 3, 6 ó 7, los ADN de la invención se obtienen mediante síntesis química o mediante hibridación haciendo uso de los fragmentos de nucleótidos que se sintetizan químicamente como una sonda. Además, se obtienen ADN de la invención en la cantidad deseada mediante la transformación de un vector que contiene el ADN en un hospedador apropiado y el cultivo del transformante.

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse mediante:

(1) aislamiento y purificación a partir de un organismo o de una célula cultivada,

(2) síntesis química, o

(3) uso de la tecnología de ADN recombinante,

preferiblemente, mediante el método descrito en (3) en una producción industrial.

Son ejemplos de sistemas de expresión (sistema vector-hospedador) para producir un polipéptido, mediante el uso de tecnología de ADN recombinante, los sistemas de expresión de células de bacterias, levaduras e insectos y células de mamíferos).

En la expresión del polipéptido, por ejemplo, en E. coli, el vector de expresión se prepara por adición del codón de inicio (ATG) al extremo 5' de un ADN que codifica un péptido maduro, ligando el ADN obtenido de este modo cadena abajo de un promotor adecuado (por ejemplo, promotor trp, promotor lac, promotor \lambda PL, promotor T7, etc.) e insertándolo después en un vector (por ejemplo, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) que funcione en una cepa de E. coli.

Después, una cepa de E. coli (por ejemplo, cepa DH1 de E. coli, cepa JM109 de E. coli, cepa HB101 de E. coli, etc.) que está transformada con el vector de expresión descrito anteriormente puede cultivarse en un medio apropiado para obtener el polipéptido deseado. Cuando se utiliza un péptido señal de bacterias (por ejemplo, péptido señal de pel B), el polipéptido deseado también puede liberarse en el periplasma. Además, también puede producirse fácilmente una proteína de fusión con otro polipéptido.

En la expresión del polipéptido, por ejemplo, en células de mamífero, por ejemplo, el vector de expresión se prepara mediante la inserción de los nucleótidos de ADN codificante que se muestran en la SEC ID Nº 3 ó 7 cadena abajo de un promotor adecuado (por ejemplo, promotor SV40, promotor LTR, promotor de metalotioneína, etc.) en un vector apropiado (por ejemplo, vector de retrovirus, vector de papilomavirus, vector de virus vaccinia, vector de SV40, etc.). Una célula de mamíferos apropiada (por ejemplo, célula de mono COS-7, célula de hámster chino CHO, célula de ratón L, etc.) se transforma con el vector de expresión obtenido de este modo y, después, el transformante se cultiva en un medio apropiado para obtener un polipéptido deseado en la membrana celular. En un vector descrito anteriormente puede insertarse un ADN mutante de deleción que codifique una secuencia, que tiene delecionada la región transmembrana de la SEC ID Nº 3 ó 7 y el vector de expresión puede usarse para transfectar una célula de mamífero apropiada. La proteína soluble objetivo puede secretarse en el medio de cultivo. El polipéptido disponible de este modo descrito anteriormente puede aislarse y purificarse mediante métodos bioquímicos convencionales.

Aplicabilidad industrial

Los polipéptidos OAF065 de la invención muestran una homología significativa con una serie de proteínas que pertenecen a la familia de receptores de TNF. Las proteínas, que pertenecen a la familia de receptores de TNF, son proteínas de membrana de tipo I que tienen de 3 a 6 estructuras repetidas que contienen 6 restos Cys en el dominio extracelular. Se ha demostrado que las proteínas están relacionadas con la proliferación, diferenciación y muerte celular de diversas células mediante la interacción con ligandos de las mismas (Craig A. Smith et al., Cell 76, 959-962, 1994). Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento neuronal (NGF) y NGF son esenciales para mantener la supervivencia de varias clases de células neuronales, permitiendo la extensión de tubos neuronales y promoviendo la síntesis de neurotransmisores (Chao M. V., J. Neurobiol., 25, 1373-1385, 1994). Fas y FasL son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis in vivo, tal como la destrucción de células cancerosas y la eliminación de linfocitos autorreactivos a través de su actividad inductora de la apoptosis y también se relaciona con la reducción de células T CD4 positivas en el SIDA, la hepatitis fulminante, la enfermedad injerto contra huésped (GVHD) después de un trasplante y el comienzo de diversas enfermedades autoinmunes (Nagata S. et al., Science, 267, 1449-1456, 1995). CD40 y CD40L son esenciales para la activación de células B (aceleración del desarrollo y de la producción de anticuerpos) a través de la interacción de células T y B (Banchereau J. et. al., Annu. Rev. Immunol., 12, 881-922, 1994). El receptor de TNF y TNF y el receptor de linfotoxina (LT) y LT tienen actividades tales como la inducción del desarrollo, la activación y la diferenciación de diversas células inmunes y hematopoyéticas, la inhibición de la citotoxicidad y del desarrollo de células tumorales, el desarrollo y la activación de diversos tejidos conectivos (por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, osteoblastos, etc.) e inhibición del desarrollo viral, y también son esenciales para la morfología o la formación de órganos del tejido linfoide (Ware, C. F. et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 198, 175-218, 1995).

Puesto que existen estructuras repetitivas de Cys en tres puntos en el dominio extracelular del polipéptido de la invención, es evidente que ésta es una nueva proteína que pertenece a la familia de receptores de TNF y ejerce su actividad a través de un ligando que pertenece a una familia de TNF conocida o desconocida. Por consiguiente, se considera que el polipéptido de la invención y una molécula de ADNc que codifica el polipéptido mostrarán uno o más de los efectos o actividades biológicas (incluyendo las que se relacionan con los ensayos que se citan a continuación) en lo que se refiere a la diferenciación, proliferación, crecimiento, supervivencia o muerte celular de células del sistema hematopoyético, inmune y nervioso, funciones del sistema inmune, proliferación y desarrollo de tumores, inflamaciones, metabolismo óseo, etc. Los efectos o actividades biológicas descritas en relación con el polipéptido de la invención se proporcionan mediante la administración o el uso del polipéptido o mediante la administración o el uso de una molécula de ADNc que codifica el polipéptido (por ejemplo, un vector adecuado para terapia génica o introducción de ADNc).

1) Actividad de citocina y actividad de proliferación y diferenciación celular

El polipéptido de la invención puede presentar actividad de citocina, de proliferación celular (induciéndola o inhibiéndola) o de diferenciación celular (induciéndola o inhibiéndola) o puede inducir la producción de otras citocinas en determinadas poblaciones celulares. Muchos factores proteicos descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citocinas conocidas, han presentado actividad en uno o más ensayos de proliferación celular dependiente de factores y, por lo tanto, los ensayos sirven como una confirmación adecuada de la actividad de citocina. La actividad de un polipéptido de la invención se demuestra por uno cualquiera de varios ensayos de proliferación celular dependiente de factores para líneas celulares.

2) Actividad estimuladora o supresora inmune

El polipéptido de la invención también puede presentar actividad estimulante del sistema inmune o supresora del sistema inmune. El polipéptido de la invención puede ser útil en el tratamiento de diversas deficiencias y trastornos inmunes (incluyendo la inmunodeficiencia combinada grave (SCID)), por ejemplo, en la regulación (positiva o negativa) del desarrollo y de la proliferación de linfocitos T y/o B, así como llevar a cabo la actividad citolítica de células NK y otras poblaciones celulares. Estas inmunodeficiencias pueden ser genéticas o estar causadas por infecciones víricas (por ejemplo, VIH), así como bacterianas o fúngicas, o pueden ser el resultado de trastornos autoinmunes. Más en concreto, las enfermedades infecciosas causadas por infecciones víricas, bacterianas, fúngicas u otras pueden tratarse usando el polipéptido de la invención, incluyendo infecciones por VIH, virus de la hepatitis, herpesvirus, micobacterias, leishmania, malaria y diversas infecciones fúngicas tales como candidiasis. Por supuesto, a este respecto, un polipéptido de la invención también puede ser útil cuando esté indicado un refuerzo del sistema inmune en general, es decir, en el tratamiento del cáncer.

Dicho polipéptido de la invención también puede ser útil en el tratamiento de reacciones y afecciones alérgicas, tales como asma y otros problemas respiratorios.

El polipéptido de la invención también puede suprimir una inflamación crónica o aguda, tal como, por ejemplo, la asociada con infección (tal como choque séptico o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o resultante de la sobreproducción de citocinas tales como TNF o IL-1 (tal como el efecto demostrado por IL-11).

3) Actividad reguladora de la hematopoyesis

El polipéptido de la invención puede ser útil en la regulación de la hematopoyesis y, por consiguiente, en el tratamiento de deficiencias de células mieloides o linfoides. Incluso una actividad biológica marginal a favor de células formadoras de colonias o de líneas celulares dependientes de factores indica una implicación en la regulación de la hematopoyesis.

Dichas actividades biológicas están relacionadas con todos o con algunos de los siguientes ejemplos. Por ejemplo, en el mantenimiento del desarrollo y de la proliferación de células progenitoras eritroides, solo o junto con otras citocinas, indicando de este modo su utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de diversas anemias o para el uso junto con irradiación o quimioterapia para estimular la producción de precursores eritroides y/o células eritroides; en el mantenimiento del desarrollo y de la proliferación de células mieloides, tales como granulocitos y monocitos o macrófagos (es decir, actividad CSF tradicional) útil, por ejemplo, junto con la quimioterapia para prevenir o tratar la mielosupresión consiguiente; en el mantenimiento del desarrollo y de la proliferación de megacariocitos y, por consiguiente, de plaquetas, permitiendo de este modo la prevención o tratamiento de diversos trastornos plaquetarios tales como trombocitopenia y, en general, para su uso en lugar de o complementario a transfusiones de plaquetas; y/o en el mantenimiento del desarrollo y de la proliferación de células madre hematopoyéticas que son capaces de madurar hasta cualquiera y todas las células hematopoyéticas mencionadas anteriormente y que, por lo tanto, tienen utilidad terapéutica en diversos trastornos de células madre (tales como los tratados habitualmente con trasplantes, incluyendo, sin limitación, anemia aplásica y hemoglobinuria nocturna paroxística), así como en la repoblación del compartimento de células madre posteriormente a la irradiación o quimioterapia, in vivo o ex vivo (es decir, junto con el trasplante de médula ósea) como células normales o manipuladas genéticamente para terapia génica.

La actividad del polipéptido de la invención puede medirse, entre otros medios, mediante los métodos siguientes:

4) Actividad de generación o regeneración tisular

El polipéptido de la invención también puede tener utilidad en composiciones usadas para el desarrollo o la regeneración tisular de hueso, cartílago, tendones, ligamentos y/o nervios, así como para la cicatrización de heridas y la reparación tisular, y en el tratamiento de quemaduras, incisiones y úlceras. El polipéptido de la invención, que induce el desarrollo de cartílago y/o hueso en circunstancias en las que normalmente no se forma hueso, tiene aplicación en la cicatrización de fracturas óseas y de lesiones o defectos de cartílago en seres humanos y otros animales. Dicha preparación que emplea el polipéptido de la invención puede tener un uso profiláctico en la reducción de fracturas tanto cerradas como abiertas y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación de hueso de novo inducida por un agente osteogénico contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismos o inducidos por resecciones oncológicas y también es útil en la cirugía plástica cosmética.

El polipéptido de esta invención también puede usarse en el tratamiento de enfermedad periodontal y en otros procesos de reparación de dientes. Dichos agentes pueden proporcionar un entorno para atraer células formadoras de hueso, estimular el desarrollo de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. El polipéptido de la invención también puede ser útil en el tratamiento de la osteoporosis u osteoartritis, tal como mediante la estimulación de la reparación ósea y/o cartilaginosa, o mediante el bloqueo de la inflamación o de los procesos de destrucción tisular (actividad colagenasa, actividad de osteoclastos, etc.) mediados por procesos inflamatorios.

Otra categoría de actividad de regeneración tisular que puede atribuirse al polipéptido de la invención es la formación de tendones y ligamentos. Un polipéptido de la invención, que induce tejidos de tipo tendón o ligamento u otra formación de tejido en circunstancias en las que dicho tejido no se forma normalmente, tiene aplicación en la cicatrización de roturas de tendones o ligamentos, deformidades y otros defectos de tendones o ligamentos en seres humanos y otros animales. Dicha preparación que emplea un polipéptido inductor de tejido de tipo tendón o ligamento puede tener un uso profiláctico en la prevención de lesiones del tejido de tendones o ligamentos, así como un uso en la fijación mejorada de tendones o ligamentos al hueso o a otros tejidos, y en la reparación de defectos en el tejido de tendones o ligamentos. La formación de tejido de tipo tendón o ligamento de novo inducida por una composición de la invención contribuye a la reparación de defectos de tendones o ligamentos congénitos, inducidos por traumatismos o de otro origen y también es útil en la cirugía plástica cosmética para la unión o reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones de la invención pueden proporcionar un entorno para atraer células formadoras de tendones o de ligamentos, estimular el desarrollo de células formadoras de tendones o ligamentos, inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de tendones o ligamentos o inducir el desarrollo de células de tendones o ligamentos o progenitores ex vivo, para devolverlos in vivo para efectuar la reparación tisular. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de la tendinitis, del síndrome del túnel carpiano y otros defectos de tendones o ligamentos. Las composiciones también pueden incluir una matriz apropiada y/o un agente secuestrante como un vehículo, como es bien conocido en la técnica.

El polipéptido de la invención también puede ser útil para la proliferación de células nerviosas y para la regeneración de tejido nervioso y cerebral, es decir, para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central y periférico y neuropatías, así como trastornos mecánicos y traumáticos que implican degeneración, muerte o traumatismo para células nerviosas o tejido nervioso. Más en concreto, el polipéptido de la invención puede usarse en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso periférico, tales como lesiones nerviosas periféricas, neuropatías periféricas y neuropatías localizadas y enfermedades del sistema nervioso central, tales como Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager. Afecciones adicionales que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen trastornos mecánicos y traumáticos, tales como trastornos de la médula espinal, traumatismos craneales y enfermedades cerebrovasculares tales como apoplejía. Las neuropatías periféricas que son el resultado de la quimioterapia o de otras terapias médicas también pueden tratarse usando el polipéptido de la invención.

Se espera que el polipéptido de la invención también pueda presentar actividad para la generación de otros tejidos, tales como órganos (incluyendo, por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel y endotelio), músculo (liso, esquelético y cardiaco) y tejido vascular, (incluyendo endotelio vascular) o para promover la proliferación de las células que comprenden dichos tejidos. Parte de los efectos deseados pueden ser por inhibición de la cicatrización fibrótica para permitir que se regenere el tejido normal.

Un polipéptido de la invención también puede ser útil para la protección o regeneración intestinal y para el tratamiento de fibrosis pulmonar o hepática, lesiones de reperfusión en diversos tejidos y afecciones que son el resultado de daños sistémicos por citocinas.

5) Actividad de activina o inhibina

El polipéptido de la invención también puede presentar actividades relacionadas con activina o inhibina. Las inhibinas se caracterizan por su capacidad para inhibir la liberación de la hormona folículo estimulante (FSH), mientras que las activinas se caracterizan por su capacidad para estimular la liberación de la hormona folículo estimulante (FSH). Por lo tanto, un polipéptido de la invención, solo o en heterodímeros con un miembro de la familia de la inhibina \alpha, puede ser útil como un anticonceptivo basado en la capacidad de las inhibinas para disminuir la fertilidad en mamíferos hembra y disminuir la espermatogénesis en mamíferos macho. La administración de cantidades suficientes de otras inhibinas puede inducir la infertilidad en estos mamíferos. Como alternativa, el polipéptido de la invención, como un homodímero o como un heterodímero con otras subunidades proteicas del grupo de la inhibina \beta, puede ser útil como un agente terapéutico inductor de la fertilidad, basado en la capacidad de las moléculas de activina de estimular la liberación de FSH desde las células de la pituitaria anterior. Véase, por ejemplo, el documento USP 4.798.885. El polipéptido de la invención también puede ser útil para el adelanto del comienzo de la fertilidad en mamíferos sexualmente inmaduros, de tal modo que se aumente el rendimiento de la vida reproductiva de los animales domésticos, tales como vacas, ovejas y cerdos.

6) Actividad quimiotáxica o quimiocinética

Un polipéptido de la invención puede tener actividad quimiotáxica o quimiocinética (por ejemplo, actúa como una quimiocina) para células de mamíferos, incluyendo, por ejemplo, monocitos, neutrófilos, células T, mastocitos, eosinófilos y/o células endoteliales. Pueden usarse proteínas quimiotáxicas y quimiocinéticas para movilizar o atraer una población celular deseada hasta un lugar de acción deseado. Las proteínas quimiotáxicas o quimiocinéticas proporcionan ventajas particulares en el tratamiento de heridas y otros traumatismos en tejidos, así como en el tratamiento de infecciones localizadas. Por ejemplo, la atracción de linfocitos, monocitos o neutrófilos a tumores o lugares de infección puede dar como resultado respuestas inmunes mejoradas contra el tumor o el agente infeccioso.

Una proteína o péptido tiene actividad quimiotáxica para una población celular en particular si puede estimular, directa o indirectamente, la orientación o el movimiento dirigido de dicha población celular. Preferiblemente, la proteína o péptido tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento dirigido de las células. Puede determinarse fácilmente si una proteína en particular tiene actividad quimiotáxica para una población de células mediante el empleo de dicha proteína o péptido en un ensayo conocido para quimiotaxis celular.

7) Actividad hemostática y trombolítica

El polipéptido de la invención también puede presentar actividad hemostática o trombolítica. Como resultado, se espera que dicha proteína sea útil en el tratamiento de diversos trastornos de la coagulación (incluyendo trastornos hereditarios, tales como hemofilias) o para mejorar la coagulación y otros acontecimientos hemostáticos en el tratamiento de heridas que son el resultado de traumatismos, cirugías u otras causas. Una proteína de la invención también puede ser útil para disolver o inhibir la formación de trombos y para el tratamiento y la prevención de afecciones que son el resultado de los mismos (tales como, por ejemplo, infartos o apoplejías).

8) Actividad de receptor o ligando

Los polipéptidos de la invención también puede demostrar actividad como receptores, ligandos de receptores o inhibidores o agonistas de interacciones receptor/ligando. Los ejemplos de dichos receptores y ligandos incluyen, sin limitación, receptores de citocinas y sus ligandos, receptores de quinasas y sus ligandos, receptores de fosfatasas y sus ligandos, receptores implicados en las interacciones célula-célula y sus ligandos (incluyendo moléculas de adhesión celular (tales como selectinas, integrinas y sus ligandos) y parejas receptor/ligando implicadas en la presentación de antígenos, en el reconocimiento de antígenos y en el desarrollo de respuestas inmunes celulares y humorales). Los receptores y ligandos también son útiles para la exploración de potenciales péptidos o pequeñas moléculas inhibidoras de la interacción receptor/ligando pertinente. Un polipéptido de la invención (incluyendo, sin limitación, fragmentos de receptores y ligandos) puede ser por sí mismo útil como inhibidor de interacciones receptor/ligando.

9) Otras actividades

El polipéptido de la invención también puede presentar una o más de las siguientes actividades o efectos adicionales: inhibición del desarrollo, de la infección o de la función de, o destrucción, de agentes infecciosos, incluyendo bacterias, virus, hongos y otros parásitos; afectar (suprimiendo o mejorando) características corporales, incluyendo altura, peso, color del pelo, color de los ojos, piel, proporción de grasa con respecto a magro u otra pigmentación tisular, o forma o tamaño de un órgano o parte corporal (tal como, por ejemplo, aumento o disminución del tamaño de las mamas); afectar a la eliminación de la grasa, proteínas e hidratos de carbono de la dieta; afectar a las características conductuales, incluyendo apetito, libido, estrés, conocimiento (incluyendo trastornos cognitivos), depresión y comportamientos violentos; proporcionar efectos analgésicos u otros efectos reductores del dolor; estimular la diferenciación y el desarrollo de células madre embrionarias en linajes distintos de linajes hematopoyéticos; en el caso de enzimas, corregir las deficiencias de la enzima y tratar enfermedades relacionadas con deficiencias.

El polipéptido con las actividades anteriores, se sospecha que tiene las siguientes funciones por sí mismo o por interacción con sus ligandos o receptores o por asociación con otras moléculas. Por ejemplo, proliferación o muerte celular de células B, células T y/o mastocitos o inducción específica de clase de células B por estimulación de cambio de clase de genes de inmunoglobulina; diferenciación de células B en células formadoras de anticuerpos; proliferación, diferenciación o muerte celular de precursores de granulocitos; proliferación, diferenciación o muerte celular de precursores de monocitos-macrófagos; proliferación o sobrerregulación o muerte celular de neutrófilos, monocitos-macrófagos, eosinófilos y/o basófilos; proliferación o muerte celular de precursores de megacariocitos; proliferación, diferenciación o muerte celular de precursores de neutrófilos; proliferación, diferenciación o muerte celular de precursores de células T y células B; estimulación de la producción de eritrocitos; mantenimiento de la proliferación de eritrocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos-macrófagos, mastocitos, precursores de megacariocitos; estimulación de la migración de neutrófilos, monocitos-macrófagos, células B y/o células T; proliferación o muerte celular de timocitos; supresión de la diferenciación de adipocitos; proliferación o muerte celular de células asesinas naturales; proliferación o muerte celular de células madre hematopoyéticas; supresión de la proliferación de células madre y de cada célula precursora hematopoyética; estimulación de la diferenciación de células madre mesenquimales en osteoblastos o condrocitos, proliferación o muerte celular de células madre mesenquimales, osteoblastos o condrocitos y estimulación de la absorción ósea por activación de osteoclastos y estimulación de la diferenciación de monocitos en osteoclastos.

Se sospecha que este péptido también funciona en el sistema nervioso, donde se espera que tenga las funciones siguientes; diferenciación en clases de neuronas sensibles a neurotransmisores, supervivencia o muerte celular de estas células; estimulación de la proliferación o muerte celular de células gliales; extensión de dendritas neuronales; supervivencia o muerte celular de gangliocitos; proliferación, estimulación de la diferenciación o muerte celular de astrocitos; proliferación o supervivencia de neuronas periféricas; proliferación o muerte celular de células de Schwann; proliferación, supervivencia o muerte celular de motoneuronas.

Además, en el proceso del desarrollo embrionario temprano, se espera que este polipéptido estimule o inhiba la organogénesis de epidermis, cerebro, esqueleto y sistema nervioso por inducción del ectodermo, la de los tejidos conectivos de la notocorda (hueso, músculo y tendones), hemocitos, corazón, riñón y órganos genitales por inducción del mesodermo, y la del aparato digestivo (estómago, intestino, hígado y páncreas) y aparato respiratorio (pulmón y tráquea) por inducción del endodermo. En adultos, además, se piensa que este polipéptido contribuye a la proliferación o inhibición de los órganos anteriores.

Por lo tanto, se espera que este polipéptido se use por sí mismo como un agente para la prevención o tratamiento de enfermedades del desarrollo o de supresión de la función inmune, nerviosa o metabólica ósea, hipoplasia o sobrecrecimiento de células hematopoyéticas: enfermedades inflamatorias (reumatismo, colitis ulcerativa, etc.), disminución de células madre hematopoyéticas después de un trasplante de médula ósea, disminución de leucocitos, plaquetas, células B o células T después de una exposición a radicación o de una dosificación de quimioterapia contra cáncer o leucemia, anemia, enfermedades infecciosas, cáncer, leucemia, SIDA, enfermedad metabólica ósea (osteoporosis, etc.), diversas enfermedades degenerativas (enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, etc.) o lesiones nerviosas.

Además, puesto que se piensa que este polipéptido induce la diferenciación o el desarrollo de órganos procedentes del ectodermo, mesodermo y endodermo, se espera que este polipéptido sea un agente para la reparación tisular (de epidermis, hueso, músculo, tendones, corazón, riñón, estómago, intestino, hígado, páncreas, pulmón y tráquea, etc.).

Puede realizarse la cuantificación del polipéptido de la invención en el cuerpo usando anticuerpos policlonales o monoclonales contra el polipéptido de la invención. Puede usarse el estudio de la relación entre este polipéptido y enfermedad o diagnóstico de enfermedad, y así sucesivamente. Pueden prepararse anticuerpos policlonales y monoclonales usando este polipéptido como un antígeno por métodos convencionales.

La identificación, purificación o clonación molecular de proteínas conocidas o desconocidas que se unen al polipéptido de la invención (preferiblemente, polipéptido del dominio extracelular) puede realizarse usando el polipéptido de la invención mediante, por ejemplo, la preparación de una columna de afinidad.

Puede realizarse la identificación de las moléculas de transmisión de señales corriente abajo que interaccionan con el polipéptido de la invención en el citoplasma y la clonación molecular del gen: mediante el método de west-western, usando el polipéptido de la invención (preferiblemente polipéptido de la región transmembrana o dominio intracelular) o mediante un sistema de doble híbrido en levaduras usando el ADNc (preferiblemente ADNc que codifica la región transmembrana o el dominio citoplasmático del polipéptido).

Pueden seleccionarse agonistas y antagonistas de este polipéptido receptor e inhibidores entre el receptor y las moléculas de transducción de señal usando el polipéptido de la invención.

Los ADNc de la invención son útiles, no sólo como molde importante y esencial para la producción del polipéptido de la invención que se espera que sea útil en gran medida, sino también son útiles para el diagnóstico o la terapia (por ejemplo, en el tratamiento de una deficiencia de un gen o en el tratamiento para detener la expresión del polipéptido mediante un ADN antisentido (ARN)). Puede aislarse ADN genómico con el ADNc de la invención como una sonda. De la misma forma, también puede aislarse un gen humano codificante que puede tener una elevada homología con el ADNc de la invención, es decir, que codifique un polipéptido que tenga una elevada homología con el polipéptido de la invención y un gen de animales, excluyendo ratones, que puede tener una elevada homología con el ADNc de la invención.

Aplicación a medicamentos

El polipéptido de la invención o el anticuerpo específico para el polipéptido de la invención se administra por vía sistémica o por vía tópica y, en general, por vía oral o parenteral para prevenir o tratar enfermedades relacionadas con el desarrollo incompleto o con el desarrollo anormal de células del sistema hematopoyético, la aceleración o la reducción de las funciones del sistema nervioso o la aceleración o la reducción de las funciones del sistema inmune, tales como enfermedades inflamatorias (por ejemplo, reumatoides, colitis ulcerativa, etc.), citopenia de células madre hematopoyéticas después de un trasplante de médula ósea, citopenia de leucocitos, plaquetas, células B o células T después de un tratamiento con radiación o después de la administración de un agente quimioterápico, anemia, enfermedades infecciosas, cáncer, leucemia, SIDA y diversas enfermedades degenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, etc.) o lesiones nerviosas, para prevenir o tratar trastornos metabólicos óseos (por ejemplo, osteoporosis, etc.), o para la reparación de tejidos. Se prefiere la administración por vía oral, por inyección intravenosa y la administración intraventricular.

Las dosis que se van a administrar dependen de la edad, del peso corporal, de los síntomas, del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento, etc. En adultos humanos, una dosis por persona está generalmente entre 100 \mug y 100 mg, por administración oral hasta varias veces al día, y entre 10 \mug y 100 mg, por administración parenteral hasta varias veces al día.

Como se ha mencionado anteriormente, las dosis que se van a usar dependen de diversas condiciones. Por ejemplo, hay casos en los que pueden usarse dosis inferiores o superiores a los intervalos especificados anteriormente.

Los compuestos de la invención pueden administrarse como composiciones sólidas, composiciones líquidas u otras composiciones para la administración oral, o como inyecciones, linimentos o supositorios, etc. para la administración parenteral.

Las composiciones sólidas para la administración oral incluyen comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos dispersables y gránulos. Las cápsulas incluyen cápsulas duras o blandas.

En dichas composiciones, se mezclan uno o más compuestos activos con al menos un diluyente inerte (tal como lactosa, manitol, glucosa, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcristalina, almidón, polivinilpirrolidona, metasilicato aluminato de magnesio, etc.). Las composiciones también pueden comprender, como en la práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes: por ejemplo, agentes lubricantes (tal como estearato de magnesio, etc.), agentes disgregantes (tales como glicolato cálcico de celulosa, etc.), agentes estabilizantes (tales como albúmina de suero humano, lactosa, etc.) y agentes coadyuvantes para la disolución (tales como arginina, ácido asparagínico, etc.).

Los comprimidos o píldoras, si se desea, pueden recubrirse con una película de materiales gástricos o entéricos (tales como azúcar, gelatina, hidroxipropilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, etc.) o recubrirse con más de dos películas. Y después, el recubrimiento puede incluir la inclusión en el interior de cápsulas de materiales absorbibles tales como gelatina.

Las composiciones líquidas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. En dichas composiciones, uno o más compuestos activos están contenidos en un diluyente o diluyentes inertes usados habitualmente (agua purificada, etanol, etc.). Aparte de diluyentes inertes, dichas composiciones también pueden comprender adyuvantes (tales como agentes humectantes, agentes de suspensión, etc.), agentes edulcorantes, agente aromatizantes, agentes perfumantes y agentes conservantes.

Otras composiciones para la administración oral incluyen composiciones para pulverización que pueden prepararse por métodos conocidos y que comprende uno o más compuestos activos. Las composiciones para pulverización pueden comprender sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes: por ejemplo, agentes estabilizantes (sulfito sódico, etc.), tampones isotónicos (cloruro sódico, citrato sódico, ácido cítrico, etc.). Para la preparación de dichas composiciones para pulverización, por ejemplo, puede usarse el método descrito en las Patentes de Estados Unidos Nº 2.868.691 o 3.095.355 (incorporadas en la presente memoria en su totalidad como referencia).

Las inyecciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. En dichas composiciones, se mezclan uno o más compuestos activos con al menos un diluyente inerte acuoso (agua destilada para inyección, solución salina fisiológica, etc.) o diluyente inerte no acuoso (propilenglicol, polietilenglicol, aceite de oliva, etanol, POLISORBATO 80 TM, etc.).

Las inyecciones pueden comprender compuestos adicionales distintos de diluyentes inertes: por ejemplo, agentes conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes, agentes estabilizantes (tales como albúmina de suero humano, lactosa, etc.) y agentes coadyuvantes tales como agentes coadyuvantes para la disolución (arginina, ácido asparagínico, etc.).

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, pero sin limitar la invención.

Ejemplo

Se preparó el ARN total de una línea de células estromales de la médula ósea humana HAS303 (proporcionada por el catedrático Keisuke Sotoyoma, Dr. Makoto Aizawa, primero de Medicina, Tokyo Medical College; véase J. Cell. Physiol., 148: 245-251 (1991) y Experimental Hematol., 22: 482-487 (1994)) mediante reactivo TRIzol (marca comercial, GIBCOBRL). Se purificó ARN poli(A) a partir del ARN total mediante el mRNA purification kit (nombre comercial, Pharmacia).

Se sintetizó ADNc bicatenario mediante el SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (nombre de marca, GIBCOBRL) con el anterior ARN poli(A) como molde y 9 nucleótidos aleatorios como cebador, que contenían un sitio XhoI:

SEC ID Nº 9

\quad

5'-CGA TTG AAT TCT AGA CCT GCC TCG AGN NNN NNN NN-3'

El ADNc se ligó con un adaptador de EcoRI mediante el DNA ligation kit ver.2 (nombre comercial, Takara Shuzo; se usó este kit en todas las etapas de ligación sucesivas) y se digirió con XhoI. Los ADNc se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Se aislaron ADNc de 300-800 pb y se ligaron en los sitios EcoRI/NotI de pSUC2 (véase el documento US 5.536.637). Se transformó la cepa DH10B de E. coli mediante electroporación con pSUC2 para obtener una genoteca de ADNc de SST en levaduras.

Se prepararon los plásmidos de la genoteca de ADNc. Se transformó la cepa YTK12 de levaduras con los plásmidos mediante el método de acetato de litio (Current Protocols in Molecular Biology 13.7.1). Las levaduras transformadas se sembraron en placas de medio sin triptófano (CMD-Try medium) para la selección. La placa se incubó durante 48 horas a 30ºC. Réplicas de la colonia que se obtuvieron mediante Accutran Replica Plater (nombre comercial, Schleicher & Schuell) se colocaron en placas YPR que contenían rafinosa como fuente de carbono, y la placa se incubó durante 14 días a 30ºC. Después de 3 días, cada colonia surgida se sembró en estrías, de nuevo en una placa YPR. Las placas se incubaron durante 48 horas a 30ºC. Se inoculó una colonia individual en medio YPR y se incubó durante 48 horas a 30ºC. Después se prepararon los plásmidos. Se amplificó el inserto de ADNc mediante PCR con dos clases de cebadores que se encuentran en el extremo del sitio de clonación en pSUC2 (se biotinilaron los cebadores de la cadena directa). Se purificaron las cadenas sencillas biotiniladas de los ADNc con Dynabeads (nombre comercial, DYNAL) y se determinaron las secuencias de nucleótidos. Se realizó la secuenciación mediante el kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction with DNA Sequencing (nombre comercial, Applied Biosystems Inc.) y se determinó la secuencia mediante un secuenciador de ADN 373 (Applied Biosystems Inc.). Todas las secuenciaciones sucesivas se realizaron con este método.

El clon denominado OAF065 no está registrado en las bases de datos por búsqueda de homología de secuencias de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos deducida y, por lo tanto, es evidente que se trata de una nueva secuencia. Se confirmó que OAF065 contiene un péptido señal en vista de su función y estructura, por comparación con péptidos conocidos que tienen un péptido señal y sus secuencias de aminoácidos deducidas. Se aisló el ADNc de longitud completa de OAF065 mediante 3'-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Se usó el Marathon cDNA Amplification Kit (nombre comercial, Clontech) en el 3'-RACE. Se preparó ADNc bicatenario ligado a un adaptador a partir de ARN poli(A) de HAS303 conforme al método del kit. Cebador específico de OAF065 F3
(28 nucleótidos):

SEC ID Nº 10

\quad

5'-AGA AAG ATG GCT TTA AAA GTG CTA CTA G-3'

que incluía una región de codón de inicio ATG deducida basada en la información de la secuencia de nucleótidos que se preparó mediante SST. Se realizó una PCR con dicho cebador y con un cebador adaptador unido en el kit. Se amplificaron dos clases de ADNc (de 4,0 kb y 1,5 kb) y el ADNc de 4,0 kb se denominó OAF065\alpha y el ADNc de 1,5 kb se denominó OAF065\beta.

Se separaron dos clases de ADNc con electroforesis en gel de agarosa y se ligaron en un pT7-Blue-2T-Vector (nombre comercial, Novagen) y se usaron para transformar E. coli DH5\alpha y, después, se prepararon los plásmidos. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los extremos 5' y se confirmó la existencia de la secuencia de nucleótidos del cebador específico OAF065 en ambas secuencias de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del extremo 5' (de aproximadamente 1,7 kb) de OAF065\alpha y la secuencia de nucleótidos de longitud completa de OAF065\beta se determinaron y después se obtuvieron las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 3 y 7. Se buscó la fase de lectura abierta y se obtuvieron las secuencias de aminoácidos deducidas que se muestran en las SEC ID Nº 1 y 5.

En comparación con las secuencias de nucleótidos de OAF065\alpha y OAF065\beta, las secuencias de nucleótidos desde las bases 1 hasta 1290 eran completamente iguales, pero las secuencias cadena abajo desde la base 1291 no tenían homología entre sí. En comparación con las secuencias de aminoácidos de OAF065\alpha y OAF065\beta, los aminoácidos de 1 a 415 en el extremo N-terminal eran completamente iguales, sólo dos aminoácidos en el extremo C-terminal de OAF065\alpha estaban reemplazados por 8 aminoácidos (Val Arg Gln Arg Leu Gly Ser Leu) en la secuencia de OAF065\beta. Se reveló que OAF065\alpha y OAF065\beta eran nuevas proteínas de membrana tipo I mediante análisis de hidrofobicidad, y que la región extracelular y la región transmembrana de ambas secuencias eran concordantes.

Los polipéptidos OAF065\alpha y OAF065\beta de la invención no son conocidos, cuando las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos se compararon mediante un ordenador con todas las secuencias conocidas en la base de datos de Swiss Prot Release 33. Se identificó en el polipéptido de la invención una región extracelular rica en Cys que existe habitualmente en la familia de receptores de TNF.

Es decir, en la comparación de la Figura 1 de las secuencias de aminoácidos del polipéptido de la invención (OAF065) y otros miembros de la familia de receptores de TNF, es decir, del receptor 1 del factor de necrosis tumoral humano (hTNFR1), del receptor 2 del factor de necrosis tumoral humano (hTNFR2), del receptor del factor de crecimiento nervioso humano (hNGFR) y de la Fas humana (hFas), se reveló que los polipéptidos (OAF065) de la invención son proteínas de membrana de tipo I y que tienen región extracelular rica en Cys que existe habitualmente en la familia de receptores TNF (factor de necrosis tumoral).

Por lo tanto, se confirmó que los polipéptidos OAF065\alpha y OAF065\beta de la invención son nuevas proteínas de membrana que pertenecen a la familia de receptores de TNF.

SEC ID Nº: 1

Longitud: 417 aminoácidos

Tipo: aminoácido

Topología: lineal

Tipo de molécula: proteína

Secuencia

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº: 2

Longitud: 1269 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Tipo de cadena: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADNc para ARNm

Secuencia

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\newpage

SEC ID Nº: 3

Longitud: 1704 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Tipo de cadena: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADNc para ARNm

Secuencia

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº: 4
Longitud: 1704 pares de bases
Tipo: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencilla
Topología: lineal
Tipo de molécula: ADNc para ARNm

\vskip1.000000\baselineskip

Fuente original:

\hskip1cm Organismo: Homo sapiens

\hskip1cm Línea celular: HAS303

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

\hskip1cm Nombre/clave: CDS

\hskip1cm Localización: 45..1295

\hskip1cm Método de identificación: P

\hskip1cm Nombre/clave: sig peptide

\hskip1cm Localización: 45..119

\hskip1cm Método de identificación: S

\hskip1cm Nombre/clave: mat peptide

\hskip1cm Localización: 120..1295

\hskip1cm Método de identificación: S

\newpage

Secuencia

8

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº: 5

Longitud: 423 aminoácidos

Tipo: aminoácido

Topología: lineal

Tipo de molécula: proteína

Secuencia

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\newpage

SEC ID Nº: 6

Longitud: 1269 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Tipo de cadena: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADNc para ARNm

Secuencia

15

\newpage

SEC ID Nº: 7

Longitud: 1496 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Tipo de cadena: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADNc para ARNm

Secuencia

17

\newpage

SEC ID Nº: 8

Longitud: 1496 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Tipo de cadena: sencilla

Topología: lineal

Tipo de molécula: ADNc para ARNm

\vskip1.000000\baselineskip

Fuente original:
\hskip1cm Organismo: Homo sapiens
\hskip1cm Línea celular: HAS303

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

\hskip1cm Nombre/clave: CDS

\hskip1cm Localización: 45..1313

\hskip1cm Método de identificación: P

\hskip1cm Nombre/clave: sig peptide

\hskip1cm Localización: 45..119

\hskip1cm Método de identificación: S

\hskip1cm Nombre/clave: mat peptide

\hskip1cm Localización: 120..1313

\hskip1cm Método de identificación: S

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

22

23

SEC ID Nº: 9

Longitud: 35 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Tipo de cadena: sencilla

Topología: lineal

Secuencia

\hskip1cm

24

SEC ID Nº: 10

Longitud: 28 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Tipo de cadena: sencilla

Topología: lineal

Secuencia

\hskip1cm

25

Claims (11)

1. Una forma sustancialmente purificada de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Ala en la posición 392 que se muestra en la SEC ID Nº 4, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Leu en la posición 398 que se muestra en la SEC ID Nº 8 o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 95% con las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº 1 ó 5.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Ala en la posición 392 que se muestra en la SEC ID Nº 4 o el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Leu en la posición 398 que se muestra en la SEC ID Nº 8.

3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 ó 5, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Ala en la posición 392 que se muestra en la SEC ID Nº 4 o el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos desde la Lys en la posición 1 hasta la Leu en la posición 398 que se muestra en la SEC ID Nº 8.

4. Un ADNc que codifica el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un ADNc de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 ó 6.

6. Un ADNc de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 3 ó 7.

7. Un vector de replicación o de expresión que lleva el ADNc de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Una célula hospedadora transformada con el vector de replicación o de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un método para producir el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8 en una condición eficaz para expresar el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. Un anticuerpo monoclonal o policlonal contra el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3.

11. Una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, junto con un diluyente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.