UA79235C2 - Il-18 mutant polypeptide, extracted dna coded il-18 mutant polypeptide, vector and pharmaceutical composition - Google Patents

Description

тково включає послідовність нуклеїнової кислоти, 24. Вектор за п.23, де вказана ДНК кодує поліпеп- що кодує сигнальний пептид. тид, вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ 19. ДНК за п.18, де вказаним сигнальним пепти- МО:6, 5ЕО ІЮ МО:7 і 5ЕО ІЮ МО:8. дом є сигнальний пептид гормону росту. 25. Вектор за п.23, що включає ДНК за п.18 або 19. 20. Вектор, що включає ДНК за будь-яким з пп.11- 26. Вектор за п.24, де вказана ДНК лігована з пос- 19, де вказаний вектор здатний експресувати лідовністю, що кодує сигнальний пептид людсько- поліпептид, що кодується вказаною ДНК у го гормону росту людини. відповідній клітині-хазяїні. 27. Фармацевтична композиція, що містить 21. Вектор за п.20, де вказаною клітиною-хазяїном поліпептид за будь-яким з пп.1-10 і фармацевтич- є прокаріотична клітина. но прийнятний носій. 22. Вектор за п.21, де вказана ДНК кодує поліпеп- 28. Фармацевтична композиція за п.27, призначе- тид, вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ на для лікування раку.

МО:3, 5ЕО 10 МО:4 і БЕО ІЮ МО:5. 29. Фармацевтична композиція за п.27, призначе- 23. Вектор за п.20, де вказаною клітиною-хазяїном на для лікування вірусних захворювань. є еукаріотична клітина.

Даний винахід відноситься до мутантів 1-18, мають р-складчасту структуру (Темцівиі еї а!., 1996). що мають підвищену біологічну активність в порів- Аналогічно 1-18, 1-18 синтезується як біологічно нянні з білком дикого типу. неактивний попередник (про-1Ї-18), в якого відсут-

У 1989р. була описана стимульована ендоток- ній сигнальний пептид (Ов5піо еї а!., 1996). Попере- сином сироваткова активність, яка індукувала ін- дники 1-18 ї І-18 розщеплюються каспазою 1 (ІІ - терферон-у (ІЕМ-у), одержаний з клітин мишачої ІВ-конвертуючим ферментом або ІСЕ), який роз- селезінки (Макатига еї а!., 1989). Ця сироваткова щеплює ці попередники за залишком аспарагінової активність діяла не як прямий індуктор ІЕМ-у, а як кислоти в положенні РІ. Зрілі цитокіни, що утво- ко-стимулятор спільно с І/-2, ІЕМ-а/В, ТМЕ або з рюються в результаті, легко вивільняються з клі- мітогенами. В спробі виділити активність з миша- тини (Спауиг еї а!., 1997 5 Си еї аі., 1997). чої сироватки, після її стимуляції ендотоксином, І--18 є ко-стимулятором для продукування ци- був виявлений явно гомогенний білок розміром 50- токінів (ІЕМ-у, І -2 і гранулоцитарного- 55кДа (МаКатига еї аї., 1993). Оскільки інші цитокі- макрофагального колонієстимулюючого фактора) ни можуть діяти як ко-стимулятори для продуку- Т-клітинами-хелперами типу І! (ТН1) (Конповї еї аї., вання ІЕМ-у, то було припущено, що відсутність 1997), а також ко-стимулятором опосередкованої нейтралізуючих антитіл проти 1-1, 11 -4, 1-5, 11 -6 лігандом РАБ цитотоксичності клітинних клонів або ТМЕ, направлених на нейтралізацію сироват- мишачих клітин-кілерів (Т5Мйівиї еї аї!., 1996). кової активності, може слугувати відмітним факто- Тп1-лімфоцити беруть участь в імунних відпо- ром. У 1995р. ті самі вчені продемонстрували, що відях проти пухлин (зекі еї аі!., 2000). ТН1-відповіді індукований ендотоксином ко-стимулятор продуку- включають секрецію цитокінів 1-2, 1-12, 1-18 і вання ІЕМ-у присутній в екстрактах печінки, одер- ІРМ-у, а також генерування специфічних цитоток- жаних від мишей, підданих передтрансплантацій- сичних Т-лімфоцитів, що розпізнають специфічні ній обробці Р.аспе5 (ОКатига еї аї., 1995). У пухлинні антигени. Тп1-відповідь також є життєво вказаній моделі, популяція макрофагів в печінці важливим фактором захисту хазяїна від багатьох (клітини Купфера) збільшувалася, і у цих мишей, мікроорганізмів. Однак, ТН1-відповідь може бути низька доза бактеріального ліпополісахариду також асоційована з небажаними ефектами, таки- (ЛПС), яка була не летальною для мишей, не під- ми як розвиток деяких аутоїмунних захворювань, даних передтрансплантаційній обробці, ставала запалення і відторгнення трансплантованого орга- летальною. Фактор, названий ІЕМ-у-індукуючим ну. фактором (ІСІ), а пізніше названий інтерлейкі- Спроби експресувати зрілу форму 1-18 в ном-18 (ІПІ/-18), був очищений до гомогенності із Е.соїї з використанням вектора, що кодує зрілий 1200 грамів мишачої печінки, обробленої Р. аспев. білок, не привели до одержання повністю активно-

Для клонування мишачої кДНК ІІ -18 були викорис- го цитокіну. Ефективна експресійна система для тані вироджені олігонуклеотиди, одержані виходя- генерування повністю біологічно активного людсь- чи з амінокислотних послідовностей очищеного ІЇ - кого І/-18 була розроблена для терапевтичних 18, |(Окатига е! а/!., 1995). Матричні РНК для 1І--18 і цілей, наприклад, для лікування злоякісних пухлин інтерлейкіну-12 (І/-12) легко детектувалися в акти- або будь-яких станів, при яких бажано індукування вованих макрофагах. Сам 1І-18 не індукує ІЕМ-у, а ІЕМ-у (МО 00/61768). У цій системі, сайт розщеп- діє головним чином як ко-стимулятор разом з міто- лення попередника 1-18 каспазою-1 був заміне- генами або ІІ -12. Людська кКДНК-послідовність для ний на сайт фактора Ха (ІСЕ/Ха), і вектор, що ко-

І/-18 була описана у 1996 (Фіг1А, 5ЕО І МО 1). дує попередник ІСЕ/Ха-ІІ.-18, був використаний

Інтерлейкін ІІ-18 і білки сімейства І/-1 мають для трансформації Е.соїї. Після експресії цього спільні структурні елементи (Макатига еї а!., 1993; попередника 1І-18 в Е.соїї, зрілий ІІ/-18 був гене-

Окатига еї а/., 1995; Овпіо еї а!., 1996; Валап в! аї|., рований шляхом відщеплення фактора Ха іп міго. 1996). На відміну від більшості інших цитокінів, які Цей зрілий 1/-18, генерований шляхом розщеп- мають структуру, що складається з чотирьох спі- лення фактором Ха, був повністю активним. ральних ділянок, сполучених тяжами, 1-18 і 11-18 Білки, що зв'язуються з цитокінами (розчинні цитокінові рецептори), звичайно являють собою позаклітинні ліганд-зв'язуючі домени їх відповідних Високі рівні циркулюючого ІІ -18ВР можуть за- цитокінових рецепторів клітинної поверхні. Вони безпечувати природний захист проти неконтро- продукуються або за допомогою альтернативного льованої ТН1-відповіді на інфекцію і розвитку ауто- сплайсингу, або за допомогою протеолітичного імунних захворювань. Однак, ІЇ-18 стимулює ТН1- розщеплення рецептора клітинної поверхні. Ці відповідь, яка є важливим фактором захисту хазя- розчинні рецептори були описані раніше, напри- Тна проти пухлин. Тому, І/-18В8Р може викликати у клад, розчинні рецептори 1І-6 і ТЕМ-у |Моміск еї аї., хазяїна нездатність продукувати цитотоксичні Т- 19891, ТМЕ (Епде!тапп еї аї., 1989; Епдеїтапп єї клітини, спрямовані проти пухлинних клітин. Дійс- а!., 19901, 1-1 ї 11-4 |Маїївгемувкі еї аї., 1990), ТЕМ- но, очевидно, що у мишей ІІ-18 стимулює захист а/В І(мМоміск еї аї., 1994; МоміскК еї аї!., 1992). Один хазяїна проти пухлин. Так, наприклад, у сингенних білок, що зв'язується з цитокіном, названий остео- мишей, клітини мишачої карциноми молочної за- протегерином (ОРа, також відомий як фактор інгі- лози, експресуючі мишачий ІІ -12 або мишачий І - бування остеокластів, ОСІР), член сімейства 18, були менш онкогенними і утворювали пухлини

ТМЕВ/Раз5, є, очевидно, першим прикладом роз- більш повільно, ніж контрольні неекспресуючі клі- чинного рецептора, який існує тільки як секретова- тини (Соцдпіїп еї а!., 1998). Дослідження по нейт- ний білок (Апаєїхоп еї аї., 1997; бітопеї єї аї., ралізації антитілами виявили, що для досягнення 1997; Мавцаа еї а!., 1998). протипухлинного ефекту необхідна присутність

Білок, що зв'язується з І/-18 (/-188Р), був ІЕМ-у. В іншому дослідженні, системне введення афінно очищений з сечі на колонці з ІІ -18 |Моміск І--18 експериментальною твариною з меланомою еї аї., 1999). І.-18вР запобігає І/-18- В16, експресуючою В7-1 (СО80), приводило до стимульованому індукуванню ІЕМ-у і ІІ -8, активації різкого інгібування утворення меланоми, пухлин-

МЕ-КВ іп міо і індукуванню ІЕМ іп мімо. І/-18ВвР ного зростання і до значного підвищення рівня являє собою розчинний циркулюючий білок, який виживаності |Спо еї а!ї., 20001. конститутивно експресується в селезінці і нале- Цитокіни були використані як ад'юванти для жить до суперсімейства імуноглобулінів. ІЗОформа підвищення ефективності імунотерапії раку. Так,

І--18ВР, що найчастіше зустрічається, ізоформа наприклад, ІІ-2 вводили в нирково-клітинну карци- сплайсованого варіанту, має високу афінність по ному або меланому |Соїоб еї аї., 2000). У більшос- відношенню до 1ІІ/-18 з високою швидкістю асоціа- ті випадків, одними з важливих наслідків лікування ції і низькою швидкістю дисоціації, і константу ди- цитокінами є їх важкі системні токсикологічні про- соціації (Ка), що дорівнює приблизно 400пМ (Кіт філі. Використання цитокінів, які експресуються еїа)ї., 1999). самими пухлинними або дендритними клітинами

Залишки, що беруть участь у взаємодії ІІ -18 з пацієнта, є логічним розв'язанням цієї проблеми.

І--188Р, були описані з використанням комп'ютер- Однак, навіть при місцевому використанні ІІ -18 як ного моделювання |Кіт еї аї., 1999) і на основі ад'юванту в імунотерапії пухлин ще зберігається взаємодії І/-1 з 1-1А типу 1 |Мідегв еї аї., 1997). здатність конститутивних рівнів ІЇ-18ВР нейтралі-

Було передбачено, що в моделі для ІІ-18, що зв'я- зувати ІЇ/-18 в локальному оточенні, а отже, його зується з ПІ -18ВР, залишок СІ в положенні 42 і ефективність значно знижується. залишок Гуз в положенні 89 зв'язуються з І уз-ІЗО і Використання не-мієлоабляційних алогенних (Іи-114 в ІІ -188Р, відповідно (Кіт еї аї., 19991. трансплантатів, так званих мінітрансплантатів для

І/-18 постійно присутній в багатьох клітинах лікування лейкозу і солідних пухлин є значно

ІРигеп єї аї., 1999| і в кровотоці здорових людей більш успішним для посилення реакцій "транспла-

ІШпвепінага еї аї., 2000). Високий ступінь афінності нтат проти лейкозу" і "трансплантат проти пухли-

І/-18ВР. по відношенню до 1І-18, а також висока ни" ІбіІаміп 5., 2000; біаміп єї аї., 20001. Два дослі- концентрація ІІ-18ВР, що виявляється в кровотоці дження, в яких були використані алогенні (у 20-кратному надлишку в порівнянні з ЇЇ -18), яв- стовбурові клітини периферичної крові (Спій5 єї ляє собою унікальну ситуацію в біології цитокінів. а!., 20001) або дендритні клітини (Кидіеєг еї а!., 2000)

Тому, більшість, якщо не всі, молекули ІІ-18, при- для лікування пацієнтів з метастазами нирково- сутні в кровотоці, зв'язуються з ІІ -18ВР. Циркулю- клітинної карциноми, мали помітний успіх. Хоча ючий Ш-18ВР, який конкурує з клітинно- необхідно продовжити і підтвердити ці досліджен- поверхневими рецепторами для ІІ-18, може діяти ня, однак, ідея про використання реакції "транс- як природна протизапальна і імуносупресорна плантат проти пухлини" для протиракової імуноте- молекула. рапії знаходить все більше визнання |біаміп, 2000).

Вірусні агенти, що кодують ІІ-18ВР-подібні бі- Оскільки, очевидно, що в успішній терапії певну лки, наприклад, вірусні білки МО53 і МОо54 роль грає 1-18, то ще більший успіх може бути

М.сопіадіовит володіють значною гомологією з ЇЇ - досягнутий шляхом запобігання нейтралізуючій дії 18вР ссавців |Моміск еї аї., 1999). Білки МО53 і І.-188Р.

МО54 М.сопіадіозит володіють здатністю зв'язу- Мутанти 1-18 (ІЕМ-у, індикаційний фактор) ватися з людським ІІ -18 і нейтралізувати його зда- (описані в ЕРО845530)|. Описані мутанти 1-18 яв- тність, аналогічно механізму дії І/-188 |Хіапд 5 ляють собою молекули, в яких 1, 2, З або всі 4 ци-

Моз5, 1999). Білок р!3 поксвірусу Есіготеїїа, який стеїнових залишки в 1-18 (Фіг.18) були замінені є гомологічним ІІ -188Р, зв'язується з людським ЇЇ - сериновими або аланіновими залишками. Ці мута- 18 ї інгібує його активність іп міго. У мишей, інфі- нти містили інтактну консенсусну послідовність кованих р!З-делеційним вірусним мутантом, вияв- (Фіг.18). Всі виділені мутанти володіли більш висо- лялися знижені рівні інфекційності (Вогп еї аї., кою стабільністю, ніж ІЇ/-18 дикого типу. Міра ста- 2000Ї. Тому, очевидно, що ступінь інфекційності більності мутантів прямо пропорційна числу замі- корелює з присутністю ІІ -18ВР. нених залишків Суз в даній молекулі. ТУ

ЕРОВ8В45530І| нічого не вказується про здатність ІІ - ного білка в концентраціях, представлених по осі х 188Р до нейтралізації цих мутантів. на Фіг.ЗВ, і в присутності 1-12 (0,5нг/мл).

Тому, генерування і терапевтичне використан- На Ффіг.3В показано індукування ІЕМ-у в кліти- ня повністю активних мутантів ІЇ-18, що не зв'язу- нах МКПК за допомогою ІІ -18 дикого типу і мутан- ються з І/-18В8Р або, що зв'язуються з ІІ/-188Р з тного білка в концентраціях, представлених по осі низькою афінністю, може дати дуже хороший х і в присутності ІІ -12 (1,Онг/мл). ефект. На Фіг.4А показаний вплив ІІ-188Р на індуку-

Даний винахід відноситься до мутантного по- вання ІЕМ-у людським 1-18 дикого типу і мутант- ліпептиду ІІ-18, що включає мутації в одному або ним білком в клітинах МКО. Мутанти і І/-18 дикого декількох амінокислотних залишках, які беруть типу (ЗОнг/мл) були заздалегідь інкубовані з І - участь в його взаємодії з білком, що зв'язується з 18ВР при концентраціях, показаних по осі х (на

І/-18. Більш конкретно, такими мутаціями є заміни, Фіг.3В), протягом год. при кімнатній температурі, і переважно, неконсервативні заміни, додатки або додані до клітин МКО, стимульованих 11-12 делеції. Залишки, мутовані у вказаному поліпеп- (0,5мг/мл). тиді, можуть бути вибрані з с11и-42, Пе-85, Ме!ї-87, На Фіг.4В показаний вплив ІІ-188ВР на індуку-

ІГув-89, Меї-96, Авр-130, Гуз-132, Рго-143, Меї-149 і вання ІЕМ людським ІЇ -18 дикого типу і мутантним

Ї еи-189, а переважно, Спи-42 і І ув-89. білком в клітинах МКПК. Мутанти і 11-18 дикого

В одному з варіантів здійснення винаходу, С1и- типу (ЗОнг/мл) були заздалегідь інкубовані з ІІ- 42 або І уз-89, або обидва сіи-42 і І уз-89 замінені 18ВР при концентраціях, показаних по осі х, протя- неполярною амінокислотою, переважно, аланіном. гом МТгод. при кімнатній температурі і додані до

Крім того, даний винахід відноситься до ДНК, клітин МКПК, стимульованих 1! --12 (1,0мг/мл). що кодує вказаний поліпептид, а переважно, до На Фіг.5 показано індукування 1-8 під дією ЇЇ -

ДНК, що кодує поліпептид, вибраний з ЗЕО ІО МО: 18 дикого типу і мутантного білка. МКПК інкубува-

З, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО І МО: 6, 5ЗЕО ли з І/-18 дикого типу або з мутантом (Збонг/мл).

ІО МО: 7 або БЕО ІЮ МО: 8. Поліміксин В (г/мл) змішували з ІІ-18 протягом 30

В одному з варіантів здійснення даного вина- хвилин, а потім додавали до МКПК. Через 24 го- ходу, ДНК, що кодує поліпептиди 5ЕО ІЮ МО: 6, дини, супернатанти видаляли і аналізували конце-

ЗЕОО МО: 7 ї БЕО ІЮ МО: 8, приєднують до сиг- нтрацію 1-18 з допомогою ЕХЛ (приклад 9). Проі- нального пептиду, переважно, до сигнального пеп- люстрований один з трьох експериментів. тиду людського гормону росту (лГР). Крім того, Даний винахід відноситься до мутанта 11-18 даний винахід також відноситься до вектора, що або до його активного фрагмента або мутеїну, або включає вказану ДНК, здатного експресувати полі- до будь-якого іншого білка або його пептидного пептид, що кодується вказаною ДНК, у відповідній похідного (ІІ-18М), яке, в порівнянні з білком дико- клітині-хазяїні, наприклад, в прокаріотичній або в го типу (ПІ.-18МУ/Т), є менш чутливим до нейтралі- еукаріотичній клітині-хазяїні. зації під дією ІІ-18ВР. Більш конкретно, для гене-

Крім того, даний винахід відноситься до фар- рування активного мутанта ІЇ/-18, який є менш мацевтичних композицій, що містить вказаний по- чутливим до нейтралізації під дією ІІ-18ВР, одна ліпептид і призначеним для лікування захворю- або декілька амінокислот, переважно, не більше вань, які можуть попереджатися або ніж 30, а більш переважно, до 10 амінокислот ІІ -18 послаблюватися ТПп1-відповідями, а переважно, дикого типу можуть бути замінені іншими аміноки- для лікування вірусного захворювання або раку. слотами або еліміновані, або може бути додана

На Фіг.1А показана нуклеотидна послідовність, одна або декілька амінокислот, переважно, не бі- що кодує попередник ІЇ--18 дикого типу, і локаліза- льше ніж 30, а більш переважно, до 10 амінокис- ція праймерів, що використовуються для констру- лот. Амінокислоти можуть бути замінені іншими ювання різних мутантних білків ІІ-18. Широка стрі- амінокислотами; причому, переважними замінами лка вказує на початок послідовності, що кодує є неконсервативні заміни. Більш конкретно, вказані зрілий білок ІІ -18. мутації можуть бути націлені на залишки, які, як

На Фіг1В показана амінокислотна послідов- передбачається, беруть участь в скріпленні з ІЇ- ність зрілого 1-18. Консенсусна послідовність різ- 188Р, такі як С1и-42, Пе-85, Меї-87, І ує-89, Ме!ї-96, них видів ІЇ--18 взята в білі рамки. Цистидини підк- Авр-130, Гув-132, Рго-143, Меї-149 і І еи-189, а реслені. Темними рамками окреслені залишки, переважно, Сіи-42 і/або І уз-89 ІКіт еї а!., 19991. мутовані в ІІ--18 даного винаходу. І--18М може бути продукований в еукаріотич-

На Фіг.2 схематично показані мутанти 1-18 них або прокаріотичних експресійних системах, даного винаходу. Нівз-6 вказує на присутність шес- всередині клітини або в периплазматичному прос- ти гістидинів, приєднаних в М-кінці про-фрагмента торі, або він може бути секретований в середови- попередника І/-18. Стрілка вказує на сайт ІСЕ- ще. Продукований 1ІІ-18М може бути виділений в розщеплення, замінений сайтом розщеплення розчинній або нерозчинній формі (в формі тілець фактора Ха (х). М/Т означає зрілий 1-18 дикого включення). типу. Е42А означає мутацію із заміною Спи 42 на Вектор, що містить КДНК попередника ІІ -18М,

Аа, КВЗА означає мутацію із заміною Гуз 89 на може бути використаний для експресії "правильно"

Аа, а Е42А/К89А означає подвійну мутацію. Вихо- зібраного попередника І/-18М в прокаріотичних дячи з попередника/х/УТ були генеровані три му- системах. Потім, після ІСЕ-розщеплення іп міо, танти 11-18 (Е42А, К8В9А їі Е42А-І-КВ9А) за допомо- може бути генерований зрілий повністю активний гою двостадійної ПЛР. білок. Послідовність ІСЕ в попередникові 1І/-18М

На Фіг.ЗА показано індукування ІЕМ-у в кліти- може бути замінена послідовністю, що кодує сайт нах МКО за допомогою ІІ -18 дикого типу і мутант- специфічного розщеплення протеазою, переваж-

но, фактором Ха. жують об'єму винаходу. Для кожного фахівця оче-

Для еукаріотичної експресії і секреції може бу- видно, що даний винахід може включати і інші ас- ти використаний експресуючий вектор, що кодує пекти, переваги і модифікації, що не виходять за ефективний сигнальний пептид, а переважно, сиг- рамки об'єму даного винаходу. нальний пептид лЛГР, приєднаний до кДНК зрілого Приклади

І/-18М. Приклад 1

Батьківська кДНК 1 -18М, що використовується Конструювання векторів для експресії гібрид- для конструювання мутантів, може бути вибрана з ного білка "рго1Ї! -18УМ/ Т-гістидинова мітка", що ро-

КДНК миші або людини. зщеплюється фактором Ха. Для генерування "пра-

Для полегшення очищення, ІЇ-18М може бути вильно" зібраного 1І-18 в Е.соїї, сайт розщеплення помічений в епітопі, переважно, гістидином. Реко- ферментом ІСЕ в попередникові ІІ -18 замінювали мбінантний І/-18М може бути очищений стандарт- на сайт розщеплення фактором Ха. Внаслідок цьо- ними або афінними методами. Моніторинг кількос- го, розщеплення попередника 1-18 фактором Ха ті продукованого ІЇ/-18М може бути здійснений з їп міго приводило до генерування активного білка допомогою специфічного ЕГІ5А. ІМО 00/617681.

І--18М може бути використаний в фармацев- КДНК-послідовність, що кодує попередник тичній композиції для лікування захворювань, які людського ІІ--18 (ргої!І 18, банк генів, реєстраційний можуть попереджатися або послаблюватися шля- номер 049950, Фіг.1) і що використовується для хом індукування Тп1-відповідей, а більш конкрет- генерування експресійної плазміди, виділяли як но, шляхом обробки 1-18, наприклад, для ліку- описано в літературі (Спауиг єї аї., 1997). вання інфекцій, що викликаються Заміну сайту розщеплення для ІСЕ сайтом ро- мікрооРганізмами, або раку. Перевага використан- зщеплення для Ха здійснювали з використанням 2 ня цього мутанта замість варіанту білка дикого ПЛР-реакцій (див. праймери, що використовують- типу, полягає в його стійкості або резистентності ся на Фіг.1). ПЛР; -реакція 1: про-фрагмент кДНК 1Ї-- до нейтралізації під дією ІІ -188Р. 18 генерували з використанням смислового прай-

Більш конкретно, І/-18М може бути введений мера (РІ!), що містить ЕсоВі-сайт, розташований системно або місцево як ад'ювант при протипух- вище (в положенні оапстрім) за ОРС, 5- линній імунотерапії, спрямованій проти пухлинних АТАТаААТТСАТОССТаСТаААССАСТАС 0 (5ЕО антигенів. ІО МО: 11), і зворотного праймера (Ріг), сконстру-

Пухлинні клітини пацієнта можуть бути виділе- йованого для введення ІСЕ-сайгу (33-ІЕ5О-36), в ні і генетично модифіковані для секреції ІІ -18М, якому 6 нуклеотидів були замінені так, щоб вони після чого вони можуть бути знов трансплантовані кодували сайт фактора Ха (33-ІЕС2В-36), 5- тому самому пацієнту з метою місцевої вакцинації АААСТААСаТтоСсТтСсАТОТТТТО (5БО ІЮО МО:

ІСоцоднпіїп еї аї., 1998). Злиття модифікованих пух- 12). Ампліфікований ДНК-фрагмент, що кодує зрі- линних клітин, експресуючих ІІ -18М, з алогенними лий 1-18, генерували з використанням смислового дендритними клітинами (антигенпрезентуючими праймера (РІЗ), комплементарного Ріг, 5- клітинами) може бути здійснено для додаткового СААААСАТСС,ААСИАСОаТтТТАСТТТ (5БО І МО: підвищення пухлинної антигенності, а отже, і про- 13), і зворотного праймера (Рг4), що містить Ват- типухлинної відповіді. Ні-сайт, розташований нижче (в положенні да-

І/-18М може бути введений як ад'ювант при унстрім) кодуючої послідовності 1-18, (5-

ДНК-вакцинації (Типу еї аї!., 1998). Цей спосіб АТАТаСАТССТАСТСТТСатТттаААСАСТа (5ЕО аналогічний описаному раніше способу викорис- ІО МО: 14). Про-фрагмент розміром 108п.н. і ДНК тання цитокінів І/-12 і ІЕМ. У цьому випадку, зрілого 1-18 розміром 474п.н., виділяли шляхом чрезшкірна вакцинація пухлинним антигеном може електрофорезу в 195 агарозі і елюювали за допо- бути здійснена з використанням "пістолета" для могою системи гель-екстракції (4ІВСО/ВА. вистрілювання генів. Таким чином трансфекція ПЛР-реакція 2: два ДНК-фрагменти, одержані дендритних клітин, присутніх в шкірі, може бути в ПЛР-реакції 1, змішували у відношенні 11 і вико- здійснена з використанням ДНК, що кодує як пух- ристовували разом з праймерами Р'і і Рг4 для ге- линний антиген, так і І/-18М. Альтернативно, ден- нерування кКДНК повнорозмірного людського ЇЇ -18, дритні клітини можуть бути сконструйовані ех мімо в якій сайт ІСЕ замінений сайтом фактора Ха з подальшим адоптивним перенесенням. (ІСЕ/Ха).

І--18М може бути використаний як ад'ювант в КДНК про-1Ї-18 (ІСЕ/Ха) лігували в плазміду протипухлинній терапії, що проводиться за допо- Вінебеспрі (Зігаїадепе) за допомогою рестрикцій- могою трансплантації. У цих цілях, раковим паціє- них ЕсоВі- і ВатнНі-сайтів (4ІВСО/ВВАІ). Ця плаз- нтам можуть бути трансплантовані алогенні стов- міда служила для підтвердження послідовності. бурові клітини. Для посилення реакції Передбачена кодована амінокислотна послідов- "трансплантат проти пухлини", індукованої шляхом ність представлена в 5ЕО ІЮ МО: 2. Для експресії трансплантації алогенних клітин, ІІ -18М може бути в Е.соїї, ДНК-вставку, що кодує ІІ -18, знов лігували введений системно або місцево, а переважно, у вектор РРАОЕХ НтТа (СІВСО/ВН|) з використан- шляхом експресії І -18М в генетично модифікова- ням ЕсоВІ- і Хбаї!-сайтів (присутніх в Вінебсгір). У них сингенних дендритних клітинах або в пухлин- цьому векторі, одержаний білок був приєднаний них клітинах, взятих у пацієнта. своїм М-кінцем до гістидинової мітки.

При цьому, потрібно зазначити, що хоча даний Приклад 2 винахід описаний на конкретних переважних варі- Конструювання мутантів Е42А. КВ9А і антах його здійснення, однак, приведений вище Е42А/К89А-мутантів. Мутації в ІІ -18 були створені опис, а також ілюструючі його приклади не обме- в залишках, які, як передбачається, мають важли-

ве значення для зв'язування з інгібітором ІІ-188ВР тозидом (ІРТа 0,3мММ), і інкубування продовжували

ЇКіт еї аїІ., 2000). Були генеровані три мутанти: при 37"С протягом Згод. при струшуванні. Культи-

Е42А, КВЗА і Е42А/КЗ89А. Ці мутації були створені вовані бактерійні клітини збирали центрифугуван- за допомогою двох ПЛР-реакцій, як описано в при- ням (5000х9 протягом 15 хвилин при 4"С), і осад кладі 1, з використанням праймерів і матриць, суспендували в ЗОмл буферу Талона (50мММ описаних нижче (праймери показані на Фіг.2). МангРОг/20мМ Трис-НСІЛО0мМ Масі, рнН8в). Кліти-

Мутант Е42А ни лізу вали шляхом обробки ультразвуком (імпу-

ПЛР-реакція 1: Для одержання мутанта Е42А льси 2х3З0с) на льоду. Розчинний білок одержува- була використана пара праймерів: пара А - прай- ли центрифугуванням (4000х9 протягом 30 хвилин мер Рі! (приклад 1) і зворотний праймер (Ріг) 5'- при 42С) і наносили на Змл мініколонку Талона

ТАА ТТ АСА ТИС ААС Ст Со (БО ОО МО: (Сіопіесп). Потім колонку Талона промивали 30 15), кодуючий аланін замість глутамінової кислоти об'ємами шару і елюювали бмл 100мМ імідазолу в (Е42), і пара В - смисловий праймер (Ргб) 5-60С буфері Талона. Елюент діалізували проти буфера,

АдДО СТТ ОСА ТСТ ААА ТТА (ЗЕО ІО МО: 16), ко- що містить фактор Ха (20мМ Трис-НСІ/150ММ дуючий аланін замість глутамінової кислоти (САА МмасСі/2ммМ Се5Сб) при 4"С протягом 20год. 0,2мл

СА), і зворотний праймер Рг4 (приклад 1), з ви- афінно очищеного на колонці Талона гібрида про- користанням про-1Ї--18 (ІСЕ/Ха) як матриця в ПЛР- І--18 з міткою Нівєхб на М-кінці інкубували з 4мкг реакції. | І ферменту фактора Ха (Меж Епдіапа Віоїарв) про-

ПЛР-реакція 2: Два фрагменти, одержані в тягом 4год. при кімнатній температурі в присутнос-

ПЛР-реакціях 1, використали як матриці для другої ті 2ММ фенілметилсульфонілфториду

ПЛР:реакції, здійснюваної з допомогою праймерів (БІВСО/ВВІ). Моніторинг кількості продукованого

Рі Рга. -18 здійснювали за допомогою специфічного

Мутант КВЗА ЕПБА (820 БЗувіетв). Амінокислотні послідовнос-

ПЛР-реакція 1: Для одержання мутанта КВ9ЗА ті, передбачені для зрілого ІЇ-18 дикого типу і му- була використана пара праймерів: пара А - прай- тантів Е42А, КВОА і Е42А/К89А, показані в послі- мер Ргі (приклад 1) і зворотний праймер (Рі7) 5- довностях 5ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО І МО: 7 і ЕС ІЮ

Ста ОСТ АТС ТОС АТА САТ АСТ (5БО ІЮ МО: МО: 8, відповідно. 17), кодуючий аланін замість лізину (К89), і пара В Приклад 4 - смисловий праймер (Рі8) 5-АСТ АТС ТАТ ССА Оцінка мутантів білка І/-18: Е42А, КВОА і

САТ АОС САС (БЕО ІО МО: 18), кодуючий аланін Е42А/КВЗА за допомогою Вестерн-блот-аналізу. замість лізину (ААА-ССА), і зворотний праймер Очищені мутанти 1ІІ/-18 піддавали Вестерн-блот-

Рг4 (приклад 1), з використанням про-1Ї-18 аналізу з використанням поліклонального антитіла (ІСЕ/Ха) як матриці для першої ПЛР-реакції. і моноклонального антитіла проти зрілого ІЇ-18.

ПЛР-реакція 2: Два фрагменти, одержані в Рівні кількості афінно-очищеного на колонці

ПЛР-реакції 1, служили як матриці для другої ПЛР- Талона (після розщеплення фактором Ха) попере- реакції, здійснюваної з використанням праймерів дника 1/-18 дикого типу і його мутантних форм,

Рі Рга. піддавали електрофорезу в ПАГ з ДСН (1095 акри-

Мутант Е42А/КВЗА ламід) у відновлювальних умовах. Білки перено-

Для одержання подвійної мутації Е42А/КВ9А сили на нітроцелюлозні мембрани, а потім інкубу- використали такий самий праймер, як і для одер- вали з "першими" антитілами (кролячим жання мутації Е42А, а кКДНК мутанта К89 викорис- поліклональним антитілом проти людського ІІ-18 тали як матрицю в цій реакції. або клоном моноклонального антитіла 8-31-4

Кожний з трьох мутованих генів ІІ -18 лігували (да), яке було продуковане проти рекомбінант- у вектор Вісезсгірі для підтвердження послідовно- ної зрілої форми людського І/-18 |Ригеп еї аї., сті. Передбачені амінокислотні послідовності для 1999) і яке також розпізнавало попередник ІЇ-18). мутантів попередника 11-18: Е42А, КВ9А і Після 24-годинного інкубування додавали відпо-

Е42А/К89А показані в ХЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 4 відне "друге" антитіло, козячий антимишачий або і ЗЕО Ю МО: 5, відповідно. Для експресії в Б.сої, ослячий антикролячий імуноглобулін ІДС, кон'юго- кожну з трьох ДНК-вставок для 1І--18 знов лігували ваний з пероксидазою (дасквоп Ійтипо Везеагсп), і у вектор РРАОЕХ НтТа (СІВСО/ВНІ) з використан- візуалізували за допомогою ЕХЛ (Мем Епдіапа ням ЕсоВІ- і ХвраїЇ-сайтів. Одержаний білок був Мисіваг І їе Зсієпсе Ргодисів). приєднаний своїм М-кінцем до гістидину (Фіг.1). Фарбування про-ІЇ.-18 поліклональним кроля-

Приклад З. | чим антитілом проти людського ІІ -18 було однако-

Експресія і очищення білка. Попередники му- во інтенсивним для 1І--18 дикого типу і для кожного тантів І/-18 були експресовані в Е.соїї і піддані з його трьох мутантів. Аналогічним чином, сигнали, афінному очищенню за допомогою гістидинової одержані з використанням зрілих форм ІІ-18 дико- мітки, і відповідні зрілі молекули генерували шля- го типу, І/-18 і кожного з його трьох мутантів з ви- хом протеолітичного розщеплення фактором Ха. користанням поліклональної антисироватки, мали

Кожну з чотирьох плазмід РРАОЕХ НТи/І-18 однакову інтенсивність. Уявна молекулярна маса (дикого типу і три мутанти) вводили в компетентні вказувала на те, що різні форми ІІ-18 мали очіку- клітини Е.соїї штаму СНО) (СІВСО/ВА) і експресу- ваний розмір. У протилежність цьому, при викори- вали як описано в літературі (11). Нічна культура, станні моноклонального антитіла, два мутанти 25мл, служила як інокулят для 450мл культури І.В, КВОА і Е42А/К89А мали більш інтенсивне забарв- що містить 100мкг/мл ампіциліну, і її культивували лення, ніж білок дикого типу і мутант Е42А, внаслі- до клітинної щільності ОЮвоо--0,6-1. Експресію біл- док чого було зроблене припущення, що афінність ка індукували шляхом обробки ізопропілтіогалак- моноклонального антитіла по відношенню до цих мутантів є більш високою. Ці результати дають в цих клітинах, 1-18 індукує продукування ІІ -8 без основу передбачити, що мутанти КВОА і допомоги ко-стимулятора ІІ -12, однак, для індуку-

Е42А/КВ9А можуть мати іншу конформацію, що вання ІІ -8 потрібні більш високі концентрації ІІ -18, приводить до більш високої афінності. ніж для індукування ІЕМ-у. Тому був проведений

Приклад 5 тест на індукування ІІ -8 під дією ІІ -18 дикого типу і

Оцінка біологічної активності мутантів білка ІІ - мутантну стимуляцію МКПК. Моніторинг продуку- 18: Е42А. К8В9А і Е42А/К89А. Очищені зрілі форми вання І/-8 проводили в клітинних середовищах

І/18ЛоЕ/Ха аналізували на ко-індукування ІЕМ-у в шляхом специфічного аналізу, описаного в прик- людських природних клітинах-кілерах (МКО, опи- ладі 9. На Ффіг.4 показано, що хоча дія двох одино- саних в прикладі 8), в МКПК (описаних в прикладі чних мутацій на індукування ІІ -3 була порівнянною 7) і на індукування ІІ -8 в МКПК. з дією білка дикого типу, однак, подвійний мутант

ІС--18 не індукує ІЕМ-у в цих клітинах, на відміну І/-18 виявляв набагато більш високий рівень інду- від /-12 (або 1/-15), і використовувався як ко- кування ІІ -8 (в 3,5 разів), ніж форма дикого типу. стимулятор. Низькі концентрації 1-12 (1-2нг/мл ЇЇ - Ці результати показали, що подвійний мутант, 12 (РгергоТесіп РоскКу НІЇЇ, М))) індукують невелику Е42А/КВ9А володіє найвищою біологічною актив- кількість ІЕМ-у, однак, обробка 1-12 разом з 1/-18 ністю. приводила до значного збільшення продукування Приклад 6

ІЕМ-у. Моніторинг продукування ІЕМ-у в клітині Нейтралізація мутантів 1І--18 під дією 1І-198Р. проводили як описано в прикладі 9. Було виявле- Мутації були створені в залишках, які, як передба- но, що індукування ІЕМ-у в клітинах МКО під дією чається, грають важливу роль в зв'язуванні І/-18 з

П/-18 дикого типу (ІСЕ/Ха) і ІІ -12 було порівнянне з інгібітором ІІ-18ВР. Тому був проведений специ- індукуванням ІЕМ-у рекомбінантним зрілим людсь- фічний аналіз на здатність І--188Р нейтралізувати ким 11-18, утвореним внаслідок ІСЕ-процесингу біологічну активність ІЇ/-18, наприклад, продуку- про-І/.-18 Си єї ай, 19971 і 11-12. Ці результати вання ІРМ-у (приклад 8). показали, що ІЇ-18 має "правильне" збирання в Різні концентрації ІІ-18ВР (ізоформа га" клітин

Е.соїї і "правильно" процесується фактором Ха. сно, продукувала рекомбінантний піз б-мічений

Для тесту на активність мутованого І! -18, інду- людський І -18вР (що поставляється з Іпсегрпагт кцію продукування ІЕМ-у шляхом стимуляції мутан- Іарогаюгев, Мев55 опа, Ізгає! Кіт еї аї., 2000)) тним ІІ-18 або ІІ -18 дикого типу разом з 1І-12 ана- заздалегідь інкубували з ІІ-18 дикого типу або з лізували в клітинах МКО (статистичні аналізи його мутантними формами (кінцева концентрація описані в прикладі 10). Як показано на Ффіг.ЗА, 1-18 Зонг/мл), а потім додавали до клітинних культур. дикого типу є активним як індуктор ІЕМ-у, при його Як показано на Фіг.4А, 5095 інгібуюча концент. використанні, починаючи з концентрації 7,5нг/мл з рація ІІ-188Р для ко-індукування ІРМ-у під дією 1Ї-- поступовим її збільшенням до бонг/мл (найвищої 18 дикого типу, з клітин МКО, становила приблиз- тестованої концентрації). Кожна з трьох мутованих но І5нг/мл (що дозволяє передбачити, що при форм 11-18 володіла біологічною активністю, яка концентрації І/-18ВР З,7нг/мл інгібування не від- була вище ніж активність ІЇ-18 дикого типу в цих бувається, і ця величина представляє 10095 акти- клітинах. Так, наприклад, білок з однією мутацією вність). Одиночна мутація Е42А приводить до

Е42А був в два рази більш активним, ніж форма аналогічної залежності доза - інгібуюча концент- дикого типу при кожній тестованій концентрації. рація П-Т8ВРУ С

Білок з однією мутацією КВОА був в чотири рази Однак, при інкубуванні мутанта КВЗА з 11- більш активним, ніж форма дикого тину при конце- 188Р, його здатність діяти як ко-індуктор ІРМ-у в нтрації 7,5нг/мл. 1-18 з подвійною мутацією клітинах МКО нейтралізувалася в меншій мірі

Е42А/КВ9А був найбільш активним. Як показано на (Фіг.5А). Статистично значуще зниження активнос-

Фіг.ЗА, мутований І/-18, Е42А, індукував боООпг/мл ті могло спостерігатися ТІЛЬКИ при концентрації

ІЕМ-у, при цьому, максимальна активність спосте- 12Онг/мл. У протилежність цьому, ІІ-188Р був не- рігалася при попередній обробці бонг/мл 1І--18 ди- здатний нейтралізувати подвійний мутант ІІ-18, кого тину в концентрації ЗОнг/мл, мутанта К8ВОА в Е42гА/КВЗА. й й й концентрації 15нг/мл і подвійного мутанта, в кон- Як показано на Фіг.4В, при тестуванні в кліти- центрації 7,5нг/мл. Таким чином, мутанти Е42А, нах МКПК, замість клітин МКО, 1-18 виявився

К89А і подвійний мутант були в 2, 4 і 8 разів більш більш чутливим до нейтралізації під дією ІІ-188Р. активними, ніж білок дикого тину, відповідно. Кількість І/-18ВР, необхідна для нейтралізації І -

Аналогічні результати спостерігалися при тес- 18 дикого типу, становила 3,7нг/мл, тобто, найме- туванні продукування ІЕМ-у в свіжовиділених люд- ншу з концентрацій, що тестуються. ІІ-18 з однією ських МКК (приклад 7). У цих клітинах, ко- мутацією Е42А поводиться аналогічно до 11-18 стимуляція 1-12 ії П-18 приводила до продуку- дикого тину, Ї як було встановлено з спостере- вання ІРМ-у, але жоден з двох цитокінів, взятих жень, низькі концентраці! П.-188Р нейтралізували окремо, не міг індукувати ІЕМ-у. Подвійний мутант його біологічну активність в МКПК. У протилеж-

ЕАОД/КВОА був найактивнішим (Фіг. ЗВ). ність цьому, мутант з однією мутацією КВ9А був

Ці результати показали, що заміна двох заря- нейтралізований при концентрації 120нг/мл. Ана- й : логічно до результатів, одержаних для ІІ-18вР- джених амінокислот С1іш42 і/або І уз89 залишками нейтралізації мутантів 1-18 в клітинах МКО, 1Ї- цс: відповідно, приводить до збільшення біопогіч- 18ВР здійснював лише незначний вплив на по- й ши , двійний мутант Е42А/К89А в клітинах МКПК.

Відомо, що 1-18 індукує ІІ -8 в СО14"-клітинах Ці результати показали, що мутант ЕВ89А і по- в препаратах МКПК (описаних в прикладі 7). Хоча двійний мутант Е42А/К89А був менше схильний до впливу природного інгібітору ІІ. -188Р. СНО. Для експресії і секреції мутантів 11-18 в клі-

Приклад 7 тинах СНО, ДНК-послідовність, що кодує зрілий

Виділення і культивування мононуклеарних білок дикого типу і мутантний ІІ-188Р, лігували з клітин периферичної крові (МКПК) і індукування послідовністю ДНК сигнального пептиду лГР за

ІЕМ-у. Залишкові лейкоцити після тромбоферезу допомогою двох ПЛР-реакцій, аналогічних реакці- здорових людей-донорів, вимивали з пробірок для ям, описаним в прикладі 1. Матриця для першої взяття крові і піддавали центрифугуванню на апа- ПЛР-реакції ампліфікації кожного мутанта 11-18 раті Нізюрадиє. МКПК відсмоктували з внутрішньої являла собою відповідну конструкцію, описану в поверхні судин, три рази промивали в апірогенно- прикладі 2 і одержану з використанням смислового му фізіологічному розчині (Вахіег Неаїй Саге, праймера (РІ9), який містить послідовності, що

Мипавеїеєїп, І) ії ресуспендували при щільності перекриваються, ІІ--18 і сигнального пептиду лгГР, і 5х105 клітин на мл в середовищі ВРМІ 1640, в яке зворотних праймерів (Рг10), що кодують останні 12 було додано 1095 ЕВ5 (СІВСО/ВВІ. Стапа Івіапа, нуклеотидів 1-18, стоп-кодон і сайт для рестрик-

МУ). Клітини культивували в плоскодонних 96- туючого ферменту. Для ампліфікації сигнального ямкових планшетах (Весіюп біскіпзоп), що містять пептиду гормону росту, плазміду РХОН використа- тільки середовище АРМІ 1640 (контроль), різні ли як матрицю зі смисловим праймером (Р/І11), що концентрації рекомбінантного людського ІІ -18 і ПІ - містить сайт для рестриктуючого ферменту і пер- 18 дикого типу (ІСЕ/Ха) або три мутанти, в присут- ших 12 нуклеотидів сигнального пептиду лгГР, | із ності 1нг/мл ІЇ-12. У деяких експериментах, пре- зворотним праймером (Рг12), що містить послідо- парати 1-18 спочатку були змішані з поліміксином вності сигнального пептиду, що перекриваються, і

В (1мкг/мл, бідта), а потім додані до клітин. Кліти- зрілого білка 1-18. Матриці для другої ПЛР- ни інкубували протягом 16-20год. при 37"С в атмо- реакції, здійснюваної з метою ампліфікації фраг- сфері повітря з підвищеною вологістю і з 595 СО», мента, що кодує сигнальний пептид лГР, приєдна- а потім супернатант культури збирали для оцінки ний до зрілої послідовності І/-18, являли собою рівня ТЕМ-у. очищені ампліфіковані фрагменти, одержані в пе-

Приклад 8 ршій ПЛР-реакції, і праймери Рі10 і Р/11, що міс-

Індукування ІЕМ-у в клітинній лінії МКО. Почат- тять рестрикційні сайти. Цей гібридний фрагмент кову батьківську клітинну лінію МКО2 одержували очищали, підролізували відповідними рестриктую- від Напе Кіїпдептап |Сопд еї аї., 19941. Людська чими ферментами і клонували в експресуючий клітинна лінія МКО, що використовується в даних вектор ссавця, . дослідженнях, являла собою субклон цієї клітинної / Вказані плазміди використали для трансфекції лінії. Клітини МКО підтримували в середовищі клітин СНО (ОНЕН-) разом з плазмідою, що міс-

ВРМІ 1640, в яке були додані 1095 ЕВ5, 5Опг/мл ІІ - тить мишачий ген ОНЕНА як генний маркер. Резис- 2 (820 бувіетв) і 200пг/мл ІІ-15 (Рерго Тесп). Для тентні клітини виділяли на селективному середо- аналізів, клітини МКО суспендували при концент- вищі і аналізували на продукування 11-18 за рації 0,5х105 клітин на мл в середовищі АРМ 1640 допомогоюаналізу БІІЗА. і стимулювали (в 0,2мл-об'ємах в 96-ямкових // Стабільно трансфіковані клітини піддавали де- планшетах) 0,5нг/мл 1-12 (Ргерго Тесп Воску НІЇ, кільком циклам генної ампліфікації із зростаючими

М.) ії різними концентраціями рекомбінантного концентраціями МТХ. Після закінченні процесу людського 11-18 дикого типу, І -18 (ІСЕ/Ха) або ампліфікації генів, клони виділяли за допомогою мутантів ІІ-18, Е42А, КВОА і Е42А/КВОА. Після ви- лімітуючого розведення. Після субклонування, тримування протягом 16-20год. при 37"С в атмос- клон, який виявляв високу специфічну продуктив- фері повітря з підвищеною вологістю і з 595 СО», ність і більш високу стабільність продукування, супернатант культури збирали для оцінки рівнів відбирали для подальшого продукування.

ІЄМ-у. Бібліографія: Щі

Приклад 9 1. Ападеггоп, Р.М., МагазКоузку, Е., ВіїПпдвзієу,

Аналіз цитокінів. Для вимірювання ІЕМ-у (13) і т Сова, М дотеївко, Ме. сих Е.В.

І/-8 (12) в середовищі для культивування клітин сере, | бо ГлавБове, В.Г, мозтап, б. запрегь н. використали метод електрохемілюмінесценції в (1997) ГА Ппотоіодне ої Ше ТМЕ гесеріог апа йв По- рідкій фазі (ЕХЛ). Рівень ЕХЛ визначали з викори- вла вало апа адепагійс-сеї! топо- станням аналізатора Огідеп Апаїулег (деп, І й У о-- І .

Сайпегериго, МО). Межа детекції ІЕМ-у і ІІ--8 стано- 2. Вагап, 4). В, Тітапе, у. б. апа Казеїіевіп, А. А. вила вопг/мл ! 4Опг/мл, відповідно. но "А пемлу аеїїпей іпіепецйкіп-1? "Майшге 379,

Приклад 10 І .

Статистичний аналіз. Дані виражали як серед- а У Вот не Мото: сим Гврерать 0. а ні х стандартна помилка середньої. Значення для епвов, го перева, слль еп, з зрПуув, Мо, груп порівнювали за допомогою аналізу АМОМА з Зітв, У.Е., ВиШег, А.М. (2000) "А рохмігив ргоївїп в й 7, . ща ріпа ю апа іпасіїмасге5 1-18, апа іпнірів МК використанням найменшої значущої різниці по сеїЇ гезропзе." 9. Іттипої. 164, 3246-54. аку о ОМ елннйния вас, А. Село А. Сопютіт, М. аналіз здійснювали з використанням пакетів ста- валової, Б поршт, п рейтал. б. неас, а" тистичних програм ЗТАТМІЕМУ 512 -- (Вгаїіп Ромег, ва, ав, хе плпраг п пепап, мум., Тоипоу, М.о.,

Саїаравав, СА). агтей, А). (2000) "Недгезвіоп ої тегазіаїййс тепа!-

Приклад 11 сеї сагсіпота апег поптуевіоаріайме аподепеїс ре-

Продукування зрілих мутантів І/--18 в клітинах пріега!-рбіоой віет-сеї! (гапзріапіайоп." М. Епаї. 9.

Меад. 343, 750-8.

5. Спо, 0., Кіт, Т.С2., І еє, МУ., Нмапо, У.І., Спо, 16. Макатига, К., Окатига, Н., У/ада, М., Ма-

Н.І., Нап, Н., Кмоп, О., Кіт, 0., Рак, Н., Ноишй, 0. дага, К. апа Татига, Т. (1989). "Епаоюхіп-іпдисей (2000) "ІптепПеикіп-18 апа (пе созійтшаюгу тоїесше вегпит Тасіог Шаї 5ійтшціагез датта іпіепегоп рго-

В7-1 паме а зупегдівійс апі-штог ейесі оп тигіпе дисіоп." Іптесі. Іттип., 57,590-5 іввп: 0019-9567. теїапота; ітріїсайоп ої сотбріпед іттипоїпегару 17. Макатига, К., Окатига, Н., Мадаїйа, К., Ко- тог роопу іттиподепіс таїїдпапсу" У Іпле5і Оегта- таїзи, Т. апа Татига, Т. (1993) "Рипйісайоп ої а

Ії, 114, 928-34. Тасіог улпісп ргомідез а созіїтшіагу зідпа! юг дат- 6. Соцдпійп, СМ., ЗаІнапу, К.Е., УУузосКа, М, та іпФіепегоп ргодисійоп." Іптесі. Іттип. 61, 64-70.

Агида, Е., Кигламжа, Н., Спапо, А.Е., Нипіег, С.А., 18. Моміск, О., ЕпдеІтапп, Н., У/аІМаси, 0. апа

Еох, 9У.С., Тпіпспієгі, С. апа Геє, М.М. (1998) "Іпіег- Вибіпвієїп, М. (1989) "БоЇШбіє суїокіпе гесеріог: аге

ІеиКіп-12 апа іпепеикКіп-18 зупегдізісанйу іпдисе ргезепі іп поппа! пПитап цигіпе." у). Ехр. Меадй., 170, тигіпе шШтог гедгевзвіоп м/пісн іпмоїме5 іппірйоп ої 1409-14. апдіодепевів." У.Сііп.Іпмеві., 101, 1441-52. 19. Моміск, О., Сопеп, В. апа Вибіпвієїп, М. 7. ЕпдеІтапп, Н., Адеїка, О., Вибіпвієїп, М., (1992) "БоЇШріє Іпіепегоп-аї|рна Весеріог Моїесшев

Воїтап, 0. апа УУаїїаси. 0. (1989) "А шШтог песговів Аге Ргевзепі іп Воду Рішіаз." РЕВ5 Гей, 314, 445-8.

Ттасюог-ріпаїпуд ргоївїп ригпєй юю Ппотодепейу їот 20. Моміск, О., Сопеп, В. апа Аибіпвієїп, М.

Ппитап игіпе ргоїесів сеї їот Штог песговів Тасіюог (1994) "пе Нитап Іпіепегоп аірпа/беїа Несеріог - юхісйу" у. ВіоІ. Спет. 264, 11974-11980. Спагасієгігайоп апа МоїІесшаг Сіопіпд." Сеї! 77, 8. ЕпдеіІтапп, Н, Моміск, О. апа Уайнйасн. 0. 391-400. (1990) То ЩШштог песговів Гасіог-ріпаїпу ргоїеїп5 21. Моміск, О., Кіт, 5., Бапіцалгі, с., Вегпіком, рипйеа їот питап игіпе. Емідепсе (ог іттипоіоді- Г.М., Оіпагеїюо, С.А. апа Вибіпгієїп, М. (1999) "Іптег- са! сго55-геасіїміу мій сеїЇ зипйасе Штог песговів ІеиКіп-18 Віпаїпуд Ргоїєїп: А Моме! Моашацйог ої (пе

Тасіог гесеріогв.".). Віої. Спет. 265, 1531-1536. ТІ Суїюкіпе Незропзе. Іттипіу 10, 127,36. 9. сСпаушг, Т., Вапегієє, 5., Нидипіп, М., Вийег, 22. ОКатига, Н., Тецівицї, Н., Котаїви, Т.,

О., Нег2од, І., Сапег, А., Опціпіа!, Г., бекиї, І., Та- Уцївидо, М., НаКига, А., Тапітоїю, Т., Тогідоє, К.,

Іапіап, А., Равкіпа, М., Ууопо, МУ., Катеп, УВ., ОкКига, Т., МиКкада, У., Найогі, К., АКіга, К., Матбва,

Тгасеу, 0., апа Аїеп, Н. (1997) "Сазразе-1 ргосезв- М., Тапабре, РЕ., Копівні, К., Рикида, 5., апа Кигіто- ев ІЕМ-датта-іпаисіпд Тасіог апа гедшагез І РБ- ю, М. (1995) "Сіопіпуд ої а пем/ суїоКіпе (паї іпдисез іпдисей ІЕМ-датта ргодисіп." Майте 386, 619- ЕЕМ-датта ргодисійоп ру Т сеїІв." Майте, 378, 88- 623. 91. 10. (опор, 9.А., Міег, 9У.МУ., Меепвіга, К., 23. Ригеп, А.уУ., ЕБапшалі, Сс., Оіпагенпо, С.А.

МеОегтоїї, О.Р., Сіапсу, О., Сіапсу, М., Аіїкіп5, МВ. (1999) "Сепе ехргеззіоп, зупіпевів, апа зесгейоп ої (2000) "Рпавзе І паї ої місе-муеекіу іпігамепоцз іпіег- іпсепеиКт 18 апа іпіепеицКіп 1 реа аге аїйбегепіапну

ІешКіп 12 іп рабйепів м/п тегавіаїйс гепаї! сеїЇ сапсег гедшатеа іп питап Бріоо4 топописієаг сеїЇІ5 апа ог таїїдпапі теїапота: арійу їо таїпіаійп ІЕМ- тоиве зрієєп сеїЇв." Ргос Май Асай 5сі ИШ5А, датта іпдисіоп ів аввосіагей умій сіїпіса! ге- 962256-61. зропзе-." Сіїп Сапсег Нез, 5, 1678-92. 24. Зекі, 5, Нари, У., Каматига, Т., Такеда, К., 11. Сопд, 9У.Н., Макі, С., Кіпдетапп, Н. а. Бобавнпї, Н., Онкама, Т., Нігаїіде, Н. (2000)3" Тне ЇІїмег (1994) "Спагасієї2айоп ої а питап сеї! пе (МК-92) аз а списіа! огдап іп Ре йгві Іїпе ої пові аеїгепзе: ШТе мКпрпепоїуріса! апа ЯТпсіопа! спагасіегівісв5 ої гоїез ої Киріег сеї, пайшга! юйег (МК) сеїїв апа асіїматейд пашгтаї кіПег сеїІв." Генкетіа 8:652. МКІ1.1 Ад-- Т сеї5 іп Т Неїрег 1 іттипе гезропзев." 12. Си, МУ., Киїда, К., Тецївиї, Н., Ки, С., Нвіао, Іттипої Аем, 174, 35-46.

К., Нетіпод, М.А., Науазнпї, М., Нідавзнпіпо, К., ОКа- 25. Бітопеї, МУ.5., Гасєу, О.Г., Юипвіап, С.В., тига, Н., МаКапівзні, К., Киптою, М., Тапітою, Т., Кеїеу, М., Снапо, М.5., І шу, А., Моцуєп, Н.О,

НіамеїІ, А. А., Заю, М., Нагаїпд, М. МУ., Пміпузюп, Моодеп, 5., Веппеїйї, Г., Воопе, Т., ЗпПітатоїй, С.5 0.9У., апа Би, М. 5. (1997) "Асіїмайоп ої іпіепегоп- ОеНозе, М., ЕШой, ЯН, Соіотбрего, А., Тап, Н..., датта іпаисіпд Тасіог тедіаїей Бу іпіепецкіп-1 реїа Тгаї!ї, сх., З!цімап, 9., Оаму, Е., Висау, М., Вепепам/- сопмепіпд епгуте." Зсіепсе 275, 206-209. Седа, Г., Нидпез, Т.М., НІЇІ, О., Ранізоп, МУ., Сатр- 13. Кіт, 5.Н., Еізепвієїп, М., НВегпіком, І., ЕБап- реїї, Р., Воуїе, " Овіеоргоїєдеїгіп: а поме! зесгеїєйд

Шалі, с, Моміск, О., Вибіпеівїп, М. апа біпагеїо, ргоїєїп іпмоїмей іп (Ше гедшіайоп ої ропе депзйу."

С.АД2000)" Бігисішга! гедцігетепів ої віх пашгаїїу Сеї, 89, 309-19. оссигпіпу ізоїоптв ої Пе 1-18 ріпаїпу ргоїеїп ю іп- 26. Зіаміп, 5. (2000) "ІттипоїНегару ої сапсег

ПІБ -18." Ргос Маї! Асад 5сі О5А, 97, 1190-5. міт аїПогеасіїме Іутрпосуїевз." М. Епа)ї. У. Меад., 343, 14. Коппо, К., у. Каїаока, Т. Опізикі, У. Зцето- 802-3.

Юю, І. Окатою, М. Овиї, М. Ікседа, апа М. Киїтою. 27. Зіаміп, 5., Ог, В., Рідполіпа, Т., (зигеміїси, (1997) "І"ЕМ-датта-іпаисіпуд Тасіог (ІСІ) ів а сові- О., АКег, М., Рапідпагі, 5. ЗПпаріга, М., Мадіє, А. ітшіаюгу Тасіог оп Ше асіїмайоп ої ТА! Бшиї пої Тп2 (2000) "Іттипоїпегару ої пПетайоіодіс таїїдпапсієв сеї апа ехепв їїз емпесі іпаерепдепіу ої 11-12." у. апа теїавіаййс зоїїйй штогз іп ехрептепіа! апіта!в

Іттипої. 158: 1541-1550. апа тап" Вопе Маїтом Тгапзріапі Зиррі, 2: 554-7. 15. Кидієг, А., ЗШніег, О., УМаїдеп, Р., 2оПег, а., 28. Тецівиі, Н., К. МаКапівпі, К. Маївиї, К. Ні- 7орумаївкі, А., Вгоззай, Р., Тгеїгег, О., ОПиісн, 5., дазпіпо, Н. Окатига, У. Міуагама, апа К. Капеда.

Миїпег, С.А., Вескег, М., Сго55, А)., Неттегїеїп, В., (1996) "І"ЕМ-датта-іпдисіпд Тасіог ир-гедиіасез Еаз

Капаг, І., МиПег, а.А., Віпдеп, А.Н.(2000) "Недгев- Ідапа-теаіатеа сушюїохіс асімйу ої тигппе пашгаї! віоп ої пПитап тегїазіаїййс гепаї! сеї! сагсіпота апег Кійег сеї! сіопев." 9). Іттипої., 157,3967-73 іввп: массіпайоп мій штог сеїІ-депапіс сеї! нургіав." Маї. ро22-1767.

Меа. 3, 332-6. 29. Тийпу, Т., УМівоп, С.б., Мапіп, О.М.,

Казатоп, У.Ї., Воуез, 9., Ма, О.І., Біїпдішт, С.ї., Вгапапибег, В.. (1997) "Стувіа! вігисштге ої Те їуре-

Мадпег, 5. М., мап дег Вгиддеп, Р., Вааг, »., І ої26, Ї іптепПеиКіп-1 гесеріог сотріехей мій іпепеишкіп-

М.Т., ої кив, УМО. (1998) "Ашоодоив питап топо- Іреїта." Маїшге, 386, 190-4. суїе-депмей аепагйіс сеї5 депеїйїсаПйу тоайіваЙ 33. Хіапо, У. апа Мозз, В.(19993" 1-18 ріпаїпд ехрге55 теЇапота апіїдепз еїїсії рітагу суююхіс Т апа іппірйоп ої іпіепегоп датта іпаисіоп бу пи- сеїЇ тгезропзев іп міго: еппапсетепі ру соїгапвіес- тап рохмігпиз-епсодеай ргоїеїп5." Ргос Маї! Асай 5сі

Моп ої депе5 епсодіпд Ше ТН1-Бріазіпд суюКтез ІІ - О5А, 96, 1537-42. 12 апа темМ-аІрпа." У. Іттипої!., 160, 1139-47. 34. Мавзида, Н., ЗПіта, М., МаКадамжа, М., Мо- 30. Огизпіпага, М., мадакі, Н., Маді, Т., КонКа, спігикі, 5.І., Мапо, К., Еціїве, М., За, У., (ою, М.,

Н., Ковазвнпі, К., Могітоїйю, У., ХовПпіпо, Т., Тапітою, Хатадисні, К., Кипуата, М., Каппо, Т., Мигакаті,

Т., Кигітоїо, М., ТапаКа, М. (2000) "ЕІемайоп ої 5е- А., Твцуда, Е., Могіпада, Т., Нідазпіо, К. (1998)" пит іпіепеикКіп-18 Іемеі5 апа асіїмайоп ої Кирмег Ідепійу ої озієосіазіодепезів іппіріюгу Гасіюог (ОСІРЕ) сеїв іп ріїагу айгевіа." У. Редіаїг. бига., 35, 446-9. апа овієоргоїедегіп (ОРОС): а теспапізт ру м/пісп 31. Овпіо, 5., Матбра, М., Окига, Т., Нацоїї, К., ОРС/ОСІЕ іппіріїє озієосіазіодепевів іп міо. "Еп-

Микада, У., АкКкіїа, К., Тапабе, РЕ., Копівні, К., Мі- досііпоіоду. 139, 1329-37. саеї, М., Еціїї, М., Тогідоє, К., Тапітою, Т., Рикида, Роботи, що цитуються вище і по всьому опису 5., ІКеда, М., ОКатига, Н., апа Киптоїйю, М. (1996) винаходу у всій своїй повноті вводяться в даний

У. Іттипо)., 156, 4274-9. опис за допомогою посилання. 32. Мідег5, (.Р., Апаегзоп, І.9У., СамНев, Р., кі лік жопа нір фенйорчісетитттттькеок тину

АТООСТОСТОААССАСТАОААВАСААТТОСАТСААСТТТОТООСААТОАААТТАТТОАС гі фінан істот нрав нтів іні іі функ настінне

ААТАСОСТТТАСТТТАТАОСТОААОАТОАТОААААССТОВААТСАСАТТАСТТТООСААЄ пафосносповловоснновтотсннт катет ст тет ответ жир фсттьеттет оно попе ота питною овють фі

СТТОААТСТАААТТАТСАОТСАТААОАААТТТОААТСАССААСТІСТИТТСАТТОАССАА, подолана платні во то, ве

ОЗАААТООВЗССТОТА ТТ ААЗАТАТОАСТЧАТЕСТОАСТОТАСАСАТААТОСАССССОЯ рей фотон кютінрітоосввввввввввсввоїне песваанттін фі

АССАТАТТТАТТАТААСТАТОТАТАААВАТАОССАИССТАСАОСТАТОВСТОТААСТАТС пефуннннтнн кнюніжнінііоостенотнко тг7

ТСТОТОЛАОТИТОАОААААТТТСААСТИТСТОСТОТаАОЛАСАЛААТТАТІТОСТІТААО

ОАЛАТЗААТОСТОСТОАТААСАТСЛАОЗАТАСААЛААОТОАСАТСАТАТІСТІТСАСАСХ

АСТОТОССАОЧЗАСАТОАТААТААЙВАТОСААТТТОААТСТІСАТСАТАОСААОСАТАСТТЕ

СОООАТАОАТСТАТААТОТТСАСТОИТТСААЛАСОЛАЧВАСТАЄ Бош нО

Ре

ФА

Тук Впе сіу Буз ци Ваг буз цен ах чуаї її6 Ак Ашп їм Авп їі СИ " : (хв БІВ УВІ ТЕ. РВЕ) тів Мар бі 01У Ап Ах РКО Це з 4

ВЕС Хо) сех дер Суз зго лвр Авп Аіа Рго Аго ТВх Ії Ве ців 7 У 2 же тів сей Має щх ШЕ хе гра рко Ак бі нах Аа чаї тво хів ваг Уві уж Стя 031» Туз 116 бек ТВвх Гвои й Суз.біз Ази Бук Ше 70 В тів Зак Ра був віх Мес деп ро йко сво яп Іі щує АвО тТОх уз 8 4 ча бву Вжо се тів ре Ріє іп Ак Баг Чаї Рго біж дів ер Кай бує

Зо .: й . ;

Має віп вва Фіз Зех Вех бах тук біш с1У Тук тва т Але тв біз ук бів Ас Авр го бе Бує зем їі їні мМуе Був ЯМ Асі бім їі 130 135 380 сі Авшр Ахо бек Ії Має Ра їТвж Уві бів ав бій ер, 145 159 198

ЗВО мо

Фіг. ІВ

КЕ сеочф нн ЕЯВАеКИУЙ а і Я а А там кача са 1 лякийти ново пжовагь ; заб . світе вх ГИ я он с є. ВЕ «ва У ше ні йо Я КВБА ї «во " Ж ! , , сл ; - (дні бе 1 баз АКВОА 200 Я-я о !

Б

Фіг. 2 тво Е. -- за

Шон ШИ и

А тич Е 506 су о яке - ч мой зоовф нив А Ї «о і кг ОХ певне ДИКИЙ ' у ч

ГИ твп Ж мо Їх 1 речі | й М зи

В б0о 4 "Ж, ві че - Я Жх у й кт тя 15 50 120 - чо рей я? й ї- ОХ ж пера (нг/мл) «00 й

Кк т, о Фіг. З

В І ї ТА 5.

Н вва Ки В.

Е «во ї Х ; в 4 ит а оо ит, Я з са рони й й ! й аж ожт 78 156 зо БВ сел кет садеков т-18 (нг/мл) я -1В

Фіг. 4 Фіг, 5

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Ате5 Ітайіпо 5.А

РіпатеНо, Снагієя Кіт, Боб Пуйй «120» Мутанти інтерлейкічу 18, їх продукування і застосування «1302475 «1502 60/274,327 «1512:2001-03-08 «160518 «1702 Раси усівіоп 3.1 «0» 1 «12 587 «2122 ДНК «213» Ното харівте «до» 1 зсачсечесЯ зассачсаца адасааєсос ахсзасксто гоодсаасова асетасеоас 59 засасуссстї ассссасачес сузаззаєссає чазаавсскоу забсачаєса сессдусваа 120 ссесуазесса заєссацсацчи сагазузват ссузасоасс зацессьсехї саседассва ї8о удазаєсоус сксбаєссоа здасаєдасо дасссгоасє усасавакєва сосассосаФ 240 ассатасєсса єсасСавосат усзбавацає ауссвоссса чачухсактууе сосавосасе 309 кессусуааце усочвоааваєх сссаассссе ссссуєдача асзаааєтає стсссгскаао 360 чЧчазактчаасс ссеоссуасва сассзацуає асавазаціц всаксасаєсє себссадача 420 аскуссссау дасабсоазсаа таазакосаа сСссоааєсьс сассвбасуа восдатаське 460 ствдссстУусу завааузучац вуассссЕЕ ааасссабсс Єдаввазауа чада ко 540

Чеддасасає стасзатасє сассціссга ззсузачаст ау 8 -0 2

«11» 157 «212» РЕ «213» Ното варієпь «4005 2

Тут Рне 51у Був ви біз Зеї був йец бек Уа1ї Іі Ака Депо Ге) за к 5 то 15

Аяр біп Уаї Бе Ре їі йвр сіп біу дп Аку Рго їеа Ре бій Авр

Меє ТВх Азр бек Авр Сув Аху Ар Ап Віа Рго Ага тах їі Ре Це 15

Ії бЗех Мех Тух Пуз Авр Зех бі Ро Аго біу Меї діа Уаї ТЬБую її6 60 бек Чаї Пуз Суз бі) цуз Т1іе 5ех Тпх Пео беїх Суз біц Авзп Був ї1е 65 70 75 во

ІТїе бех Рпбе Пув бі) Меб Авп оРхо Рго Авр Азп їі уз Авр ТВ Був 85 50 95 бех Азр 116 Іі Рпе Рре біл Аху Зег Маї Рко бБіу Нія Ар Двп Був 109 105 110

Мес біп Рпе біз бек бек бек Туг бійш біу Туг Рпе їв діа Сув бій 115 120 125

Бпуз біз АкЯ Ар опе ве уз Бе Т1Є Пей Був буя бій Азр бій цей 130 135 140

Стіу Ар Аку Бех бі Меє Рпе тТвх Уаї бій Авп сій Авр 145 150 155 -025 3 «1» 193 «-212з РЕТ «213» Синтезована послідовність «20» «282 Синтезована послідовність РК «А» З

Мес Аіїа Аза біш Рхо Уа1 6320 Авзр Ав Суз 116 Азп Риє Ма) Аза Меє 1 5 10 15

Гуз Ріе І1е Ахр Ал ТВг Пе) Тук Ре І)їє діа бій Дар Дер 01 деп

Тіе бі сіу Ак Тук Ре біуУу уз цец Діаз бег Буз Пец бек Уаї ї1є ака Ав бе Азй Авр бій Маї Без ббе Тіє Авр Сіп біу Авп Аку Ре 60 цей Ре бій Авр Меб Тпх Азр бек Азр о Суз Аку Авр Азл о Аїа Рго Аг 55 70 15 во

ТВх Тіе Ріє Іі Її бет Меб Тух Буз Вр бек біп БРко дго біу Меб 85 зо 95

Віз Уаї ТВг Ії Бек Уаї уз Суя бій Пуз Іїе бек ТБЕ цей Бех Суб

Т00 505 110 бій Авп Буз Ті Тіє бех Рпе йуз біц Мей деп Рко Рго Авр Ап о Т1е 115 120 125

Був вро Твк о Бруя Зег Авр Її18 ї11ї6 Ріє РБе біп Ага бек Уа) Рто біу 136 135 140

Ні Ар Азпобув Меї біп Рпе біз бЗех бек Вех Тук 51 біу Тук Вре 145 150 155 160

Бей Аїа Сув сіш Буз сію Вс Авр Гей Рпе уз Пец Ї16е без Буз Був 165 170 175 січ Азвр ої пе біу Авр дхо бек Т1е Мек Ре ТпЕ Маї бій Взп 0195 180 185 90

Авр «210» 4 «15 193 «2172 РЕТ «2132 Сиктезована послідовність «зах «923» Синтезована послідовність РЕТ «00» 4

Мес Аіа Аза бій Рхо Уаї біз Азр Авп Су Ії АДвп Рає Уаї Аіа Мес 1 5 10 15 був Рпе І1є Азр Азп Тих Пец Тук Рпе 116 Аза 030 Дзр Ар бід дей

Тіє бій шіу Ака4 Тук Рпе біу Був їец суд бЗес ув беч бек уді Ще 49 45

Ака Аза цей Азп Азробіп Узі Бей Рпе їі Азр бій біу деп ака Вге бо

Темп Рпе сій Авр Меб Тнх Азр бек дзр Сув Ахо Авр о Авполіа Ртго Аго 65 70 75 80 їв Ї1е Рпе Їїе Ії Бех Меє Тух Аїа АДвр бек біп Рго Агу бу Мех 85 зо 55

Аїа Маї ТБх І1е бек Маї Пуз Суз біз Ббуа Її16є Бек ТЕ Бей бех Сув 100 1905 110 сій А5п Був 16 Т1е Бех Ре Суз 03) Межб дДяп Рго Рго Вер деп о ї1е 115 126 125

Був Азр ТЕ буз бек Авр її Ї16 впе Ре сій Ак Бек уаї Ро біу 130 135 140

Віз Авр Аяп йуз Ме біб Ре сій бЗег бек бех Тук біо біу Тук РвВе 145 159 155 169 їм Аїа Су бі був 010 Аку Авр Пе РвЄ Шуз це Т1е цей Був Був 165 170 175 бій Азр біз пей біу Азр Ага бег Іі Ме Ре ТІ Уаї біп д5п С 180 185 180 двр «-40х 5 «Мі» 193 «122 РЕ -213» Синтезована послідовність «ЗД «да» Синтезована послідовність РКТ «00» 5

Мек Аїа А1їа біс Рко Уа! біш Азо АвпоСув Т1е Авб РБе Узі діа Меї 1 5 10 15 пуз Ре Ії Азр Азп ТВх Пец Тух Ре І16 Аза бій Дер Азр сто Аза

ТІв би о1у Ака Тух Рпе біу уз Бей Дія беї Буз ївеи бек Узі ї18

Аса Аза без Азп дер біп Уаї Бей Ре І1е Азр біп біу Авп Ага ВКго 60

Пец Ре Зі) Авр Меє ТЛІ Дер бех Ар Суз Вху Авр дп дів Рхо Ага 55 70 75 80

ТВж Се Ре Ї16 Тїе бек Мес Тух Віз Авр бек Сіп бто Ага біу Меб 85 0 35

А1з Узі ТЕ І1є Зех Чаї Пуз Сув 019 уз І16є бек Ту Бей бек Суб 100 105 110 бій Азп Буз Т1є 116 бах Рпе цуз біш Меб Авп о Рко Рго Авр Ази Ї116 115 120 125 уз Авр Твг пу бек Вр І16 Т1е Рце Рпе б1іп Аху Бек уаії ро Сіу 130 135 140

Ніз Ар дп цу Мек о біп Рбе бію беї бех бех Тук 515 б1у Тук Рне 145 150 155 169 їеай Аза Суз бій Був бі» Ахо Дер Гей Бе дув Без Ї1і6 лей уз Гуз 165 170 ї75 сій Авр біб пец б1іу Вр Аго Зеє І1З1е Меб Ре Твах Уа) біп Аза 01 180 185 190

Ар «0» в «2115 157 «12 РЕ «2132 Синтезована послідовність «220» «223» Синтезована послідовність РАТ -О0» 6

Тук Рпе біу Пуз без Віа Бех йуз Пец бех Уві Іїє Аг Азп Бей Авп 1 5 10 15

Азр біп Узі цей Рпе І1їє Дер Сіп сСіу Авп Ак Рко Бей Ре б)іх Ар 26 за

Ме: ТНк Азр Зег Азр Сув Ак Авр о Авп Аза Рго Ак Так І18 Рпє 116 їі Зеї Меї Тух Ду Вар бек біп о Рко Аку біу Меб Віа Уаї тТвпг тів 60

Бек УМаї Буя«є Сув бій Буб5 Т1е бЗег Тах Пец бех Суз біц Авп Буз І16 65 70 75 Бо

Т1е Бек Рре Буз біз Меїб Авп о рго Рго Ар Авп І118 Був Авр ТВЕ Був 85 90 55

Бек Азр Г1є І16 Ре Ріє бій Аху бЗехг Чаї Рко біу Ніз Авр Двп Буз 100 105 110

Мебс бій Ре біо бек бек бек Тук бу; біу Тут Ре Печ Аза Су 51 115 120 125

Був бі Аг Азр Бей Рпе був ей ї1їе Бен Буз Буз бій Авр бій Пец 130 135 140 б1у Авр Ага бек І1е Меб Ре Тпк Чаї бій Авп бій Авр 145 150 155 «05 7 «і» 7 «2» ЕТ «215» Синцтезована послідовність «220 «22У» Синтезована послідовність РЕТ «00» 7

Тук бе біу уз цез бій. Зек пуб цей бЗег Уаї Ті Ако Авп без Авп 1 5 10 І5

Азр біл Уаї Ген Ре 1 Авр о біп біу А5п Ах Рхо пец Ре бін Авр; 29 25 30

Мес Тих Азр Бех Авю» Сув Ака АвробДяп Аїа Рко Ахо ТвВт Ї1є Бе її8 35 чо 45

Іїе бБетх Меб Тук Аїа Азвр Зех біп Рго Аху біу Меб Діа чаї Твг їїе

ЕсТ6) бек Уаїі цу Сув бій Був Її Бех ТВг реч бех Сув Бі Авп о Був ії 5. 70 15 85

Іїе Бек Рпе пу бі Ме Азп о РХО Рго Азр Абзп Ії1іє Пуз Авр Тптх Був 85 90 95

Бак Авр Іі І11єЄє Рі Рне біп Ак бет Уаії Рко біу Ні Азр и Взп о був 100 105 110

Меє біп Ріе бій бех бек Бех Тух бій Сіу Туг Ріє ем діа Сув 01 115 120 125

Гуз біз Аку Авр теп Ве Був бео Ї16е во Ббуз Був біо Авр бів пей 130 135 140 біу Абр Ака Бех І1є Меє Рне Тпс Узі сів Ап бі Авр 145 150 155 «0» 8 -2112 157 2122 РЕТ «213» Синтезована послідовність «Ра» «223» «ФСинтезована послідовність РЕТ «А В

Тук Ріе біу уз без Аза бет БПуз Тез Зех Уаії 118 Бго Аза рем Ав 1 5 19 15 дер сіп Уаї Без Ре Її Авр біз б1у Азп Ахо Бро беюб РБе бій Авр за

Меб Тпх Дер бек Азр Су Ак Азр о Азп Аза Ро Аку ТВ Ті Ре тів їі бЗех Меї Тух діа Авр бах біп Рео Ах біу Ме Аза Уа) ТВЕ ї1е 60 ек Узі уз Сув зії Пу5 Її Зех Тк Пез бек Суз бій Авп о був ТЇ1ї8 65 70 75 80 ї1їє 5ек пе Пух бій Мей дяп го Рко Авр Ап о Т1і6є Був Двр Твжх Був 85 50 95

Заг Алр Пе Кіе Рие Рбе біп Ако бег Уаді Ро б1у Ні Авр Авп Гу 100 105 110

Месє біп Рпе бій Бег бек бехг Ту біз біу Тух Ріє без Аїа Су 01) 115 120. 125

Бу біз Агу Азвр обеп Ре був Бей Т1е Бей уз йуз 510 Авр о бім Бей 130 135 140 біу Ар Аку Зег І1є Меб Рпе Так Уаї біп Азп бій дар 145 150 155 «10 595 «211» 193 «212» РЕТ «213» Синтезована послідовність «220» «203» Євннтезована послідовність РЕ «НОМ о мес Аза Аїа сій Рго Уві біц Дер Азп Сув Іт1)е Азп Ре Уаї діа Мех 1 5 10 15 буз Рпе Т1е Авр Аноп о Твйх Без Тух Рпе 118 А1іа біч Авр Авр бій дей 20 28 30

Іїе біш б1у Аг Тух Рпе біу Був Бей Був бех Був певи бек Ууді Іїе 35 40 45

АкЧ Авп без Ази Авр о біп Уаї Пе) Ре І16 Авр сів біу Авп Аку рРЕгб бо

Брец Рце Сбій Вер Меб Тих Ар Зек Авр Суз Аху Авр о дап о АтТа РКО Ако 55 70 75 80

ТВх їі Ріє Ії ІЗ бек Меб Тух Буз Двр Бек біп Рго Ахо 01у Мех 65 20 35

Аїа Уаї ТК І1е бек Уві Бйуз Сує Сіз Ббуз Ї1є бек Тк Пей Зек Сув 100 105 116 сіб Аза Пуз Ті 716 бек Рпе буз бід Меб АБп о Рко Рго Авр Авп Це 115 120 125 уз Азр тпж бує бек Ар Її1Ме Із Рне Бе б51іп Ага бежх Уаї Рхо біу 130 135 140

Ні Авр Азп о пуз Меї біп Ре біз беї Бек Зех Тук бій б1у Тут Рпе 145 150 155 150 бе Аза Сув 5)ч БПув бій Аг Ар о їеи бе йув їецш Ї16є Бей пуз Гуз

І65 170 175 біз Азр бід без біу Авр Агу Зег ІТ Меб Ре Твх Уаї бів Аєп бій 180 185 190

Азр «0» 10 «Її» 157 «12» РЕТ «913» Синтезована послідовність «220 «2732 Синтезована послідовність РЕТ «005 10

Тук Рпе біу бу бен» був бах Був Пец бе Уа) І1є Ага А5п Бе дви 1 5 16 15

Азр о біп Уві Бео Ебе Ті Авр о біп біу Авп Асу Рго Бей Ре біз Азр 20 25 30

Меї ТпЕ Авр бег Абр о Суз Ах Авр Авп Аза Рго Аку Тнх ї1іе ВБе Іїє

Ії Зек Мек Тух Був Авр о Зег бів Ркго Агу біу Меб Аїа Уаї Тнх І3е 58 о

Заг Уві йузв Суз бій Був І1е бет ТЕ бен бех Суб бій Авп о Був т16 65 70 75 80

Іїе беж Різ Пуз бій Мебє Аеп Рко Рго Дер деп їі уз Авр Тв Був 85 50 55

Зек Авр 16 ї1еє Ре Рре біп Агу бек Уаї Рхо б1іу Ніз Азр Де Був 100 105 110

Меє біп Рпе бій бехї бех бех Тук бін біу Туг Рпе Пей діа Суз 03 115 129 125 уз сі Агу Авр цеч пе був ем 116 йез бує Бук бі) Дар Сій Бей 130 І35 140 біу Азр Агу бек Іі Меб Ріе Тит уаї бій яп бі дер 145 150 155 «210511 «1» 29 «212» ДНК «313» Синтезована послідовність «220» «а» Синтезована ДНЕ-послідоВність «00211 аіаїсване вітостосір, зассаріар 29 «10515 -2115 24 -3122 ДНК «213» Синтезована послідовність

«220» «2102516 «2232» Синтезована ДИК-послідовність «іі «4005 12 «12» ДНК азасавсві сепбсеаі ще. ; ; й я в Баві «2132 Синтезована послідовність «21013 «11» 24 «205 ее д «23: Синтезована ДНК-послідовність -213» Синтезована послідовність Я «АЮ» 16 «223» Синтезована ДИК-послідовність «10517 хА005 13 «211221 вазаасвіся варсасвйа сій «2122 ДНК 24 «мо 14 «13» Синтезована послідовність «1» Зі «122 ДК «205 213» Синтезована послідовність «2232 ЄСинтезована ДИК-послідовністе «00517 «20» сіресівіст рсагасяатасії «223» Синтезована ДНК-послідовність п «40014 «І» 18 аівіревісстарісйнсрі Шіразсарі -211221 31 «2105 15 сло» ДНК зії» «213» Синтезована посліловність -2122 ДНК «213» Синтезовена послідовність «20 «Щ23» Синтезована ДИК-послідовність чх «400» 18 «223» Синтезована ДНК-послідовність астакуєаєч сасаєсвасся 4 «4005 15 71

Тазійарає рсавройес с

Комп'ютерна верстка Н. Лисенко Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601