WO2022172944A1 - 新規ヒトインターロイキン－１８変異体及びその用途 - Google Patents

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WO2022172944A1
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csek
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義正 田中
俊 櫻庭
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国立大学法人 長崎大学
公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構
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    • C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)

Definitions

  • the present specification includes the contents described in the specification of Japanese Patent Application No. 2021-19418 (filed on February 10, 2021), which is the basis of priority of the present application.
  • the present invention relates to novel human interleukin-18 variants. More particularly, it relates to stable and highly active human interleukin-18 variants.
  • Interleukin-18 is a cytokine belonging to the IL-1 superfamily that was discovered as an interferon ⁇ (IFN ⁇ ) production inducer (Non-Patent Document 1).
  • IL-18 is produced as an inactive precursor containing a propeptide (pro-IL-18), cleaved by caspase 1, caspase 4, etc. and released outside the cell as active IL-18.
  • IL-18 is produced mainly by macrophage lineage cells in the immune system and binds to the IL-18 receptor expressed on the cell surface of cells in which IFN ⁇ production is induced in the presence of IL-12. , enhances the production of IFN ⁇ and enhances Th1-type immune responses.
  • IL-18 enhances Th2-type immune responses in the absence of IL-12. For example, in the presence of IL-2, it acts on NK cells to induce Th2-type immune responses, and in the presence of IL-3, it acts on eosinophils and mast cells to enhance Th2-type immune responses.
  • Non-Patent Document 2 Natural human IL-18 is unstable, and when recombinantly produced, it tends to aggregate and form oligomers, resulting in decreased activity. This is because cysteine residues exposed on the IL-18 molecule surface form disulfide bonds with cysteine residues of other IL-18 molecules, resulting in oligomerization (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 Yamamoto et al. reported that substitution of all four cysteines (positions 38, 68, 76, and 127) in the IL-18 molecule with serine enables production of stable human IL-18. have reported (Non-Patent Document 2).
  • Okamura et al. reported that substitution of cysteine (C) at positions 38, 76, or 127 with serine (S) or alanine (A) yields a polypeptide with significantly enhanced stability.
  • Patent Document 1 Bam et. (78th, 121st, and 157th positions) were substituted with cysteine (C) to generate a PEG-linked PEGylated IL-18 variant (Patent Document 2).
  • IL-18 exerts its physiological activity by binding to the IL-18 receptor on the cell membrane. Since an IL-18-specific IL-18 binding protein (IL-18BP) exists in vivo in excess, most of the secreted IL-18 binds to IL-18BP and quickly loses its activity.
  • IL-18BP IL-18-specific IL-18 binding protein
  • Non-Patent Document 3 Based on predictions from a computer model of the IL-18-IL-18BP complex, Kim et al. have reported that the activity of human IL-18 is remarkably improved by substituting it with an amino acid (alanine, etc.) that does not contain the amino acid (Non-Patent Document 3). Shirakawa et al. reported that substitution of aspartic acid at positions 17, 35, and 132 with alanine significantly inhibits receptor binding (Patent Document 3). Seatang et. It has been reported that substituting glutamine for methionine at the position reduces or abolishes activity (Non-Patent Document 4).
  • IL-18 activity is affected by aggregation (oligomerization), binding to IL-18BP, and affinity to IL-18R.
  • An object of the present invention is to provide novel human IL-18 mutants that are stable and highly active in consideration of all these effects.
  • the present invention is based on the above research results and relates to the following [1] to [22].
  • [1] A human IL-18 mutant, wherein cysteines at positions 38, 68, 76, and 127 in the amino acid sequence of wild-type human IL-18 are replaced with serine, and glutamic acid at position 6 and human IL-18 having an amino acid sequence in which at least one additional mutation is introduced to the amino acid sequence in which lysine at position 53 is replaced with alanine, and which has higher activity than wild-type human IL-18 Mutant.
  • the additional mutations are mutations at positions 3, 34, 38, 51, 72, 112, 119, and 145 of the wild-type human IL-18 amino acid sequence, and at positions 7 and 7;
  • the human IL-18 mutant according to any one of [1] to [3], whose activity is enhancement of interferon ⁇ production induction.
  • the human IL-18 mutants of the present invention when used at a concentration of 3 ng/ml, have higher interferon- ⁇ production-inducing enhancing activity than the wild-type.
  • a human IL-18 mutant wherein cysteines at positions 38, 68, 76, and 127 in the amino acid sequence of wild-type human IL-18 are substituted with serine, and glutamic acid at position 6 and a mutant in which lysine at position 53 is substituted with alanine has an amino acid sequence in which at least one additional mutation is introduced, wherein the additional mutation is G3Y, G3L, A6W, T34P, C38M, M51Y, A human IL-18 variant that is any one selected from S72Y, S72F, S72M, S72L, S72W, K112W, K119V, G145N, and S7/50C.
  • [6] The human IL of any one of [1] to [5], wherein the additional mutation is any one selected from G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F, S72M, S72L, and S72W -18 mutant.
  • a pharmaceutical composition comprising the human IL-18 variant of any one of [1] to [7].
  • the pharmaceutical composition of [8] which is for treating viral diseases, cancers, or immune diseases sensitive to IFN ⁇ .
  • a T-cell proliferation induction-enhancing agent comprising the human IL-18 mutant of any one of [1] to [7].
  • the T cell proliferation induction enhancing agent is used in combination with IL-2.
  • a method for producing genetically modified T cells wherein a cell population containing T cells is proliferated in the presence of IL-2 and the human IL-18 mutant according to any one of [1] to [7]
  • a method for producing genetically modified T cells comprising the step of inducing.
  • a peripheral blood mononuclear cell population containing T cells is isolated from the subject's peripheral blood, stimulated with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody, and then enhanced with IL-2 and human IL-18 mutants to induce proliferation. , expand T cells.
  • a gene for example, CAR (chimeric antigen receptor)
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a human IL-18 mutant wherein in the amino acid sequence of wild-type human IL-18, any one mutation selected from G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F, and S72M, preferably G3Y, A human IL-18 mutant having an amino acid sequence introduced with any one mutation selected from G3L and C38M, more preferably G3L or C38M mutation.
  • At least having an amino acid sequence introduced with one additional mutation wherein the additional mutation is any one selected from G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F, and S72M, preferably G3Y, G3L, and C38M
  • a human IL-18 variant which is any one selected from, more preferably G3L or C38M.
  • a pharmaceutical composition comprising the human IL-18 variant of any one of [13] to [17].
  • a T-cell proliferation induction-enhancing agent comprising the human IL-18 mutant according to any one of [13] to [17].
  • the human IL-18 mutant of the present invention has high stability, reduced binding to IL-18BP, and high activity (eg, ability to enhance induction of IFN ⁇ production). Therefore, it is useful for treating cancer and immune diseases based on IL-18 activity.
  • Figure 2 shows the organization of dimerized human caspase 4 (D315E) mutants. A histidine tag is added to the N-terminus.
  • Figure 3 shows the amino acid sequence of the human caspase 4 (D315E) mutant precursor. The first 104 underlined amino acids represent the propeptide. Two arrows indicate the position of autolysis. The portion indicated by [ ] is the amino acid sequence of mature human caspase-4 without propeptide. NdeI-Casp4-D315E-SalI with restriction enzyme recognition sequences added to both ends of the DNA sequence encoding the human caspase 4 (D315E) mutant optimized for E. coli.
  • the first catatg is an NdeI recognition sequence
  • the last gtcgc is a SalI recognition sequence
  • taa before the SalI recognition sequence is a stop codon.
  • the underlined gaa corresponds to the mutation introduction site (substitution site from aspartic acid to glutamic acid).
  • a vector for expressing human caspase 4 (D315E) is shown.
  • Fig. 2 shows an image of the electrophoresis results of human caspase 4 (D315E) by SDS-PAGE. Construction of human IL-18 precursor (wild-type) for recombinant expression.
  • a histidine tag is added to the N-terminus of the propeptide.
  • the C-terminal aspartic acid (D) of the propeptide undergoes caspase cleavage to generate mature human IL-18.
  • Amino acid sequence of human IL-18 precursor (wild type) is shown.
  • the first underlined 36 amino acids are the propeptide, the C-terminal LESD is the caspase-4 recognition sequence, and the arrow indicates the caspase-4 cleavage site.
  • NdeI-hProIL18-SalI with restriction enzyme recognition sequences added to both ends of the DNA sequence encoding human IL-18 precursor (wild type) optimized for E. coli.
  • the first catatg is an NdeI recognition sequence
  • the last gtcgac is a SalI recognition sequence
  • taa before the SalI recognition sequence is a stop codon.
  • the underlined portion corresponds to the propeptide
  • ctggaatctgac positions 100 to 111 in SEQ ID NO: 4
  • An image of the result of electrophoresis by SDS-PAGE of human IL-18 (wild type) is shown.
  • FIG. 2 shows enhanced induction of IFN ⁇ production by human IL-18 mutants.
  • ⁇ indicates IFN ⁇ production-inducing enhancing activity of the wild type
  • ⁇ indicates IFN ⁇ production-inducing enhancing activity of each mutant
  • FIG. 2 shows enhanced induction of IFN ⁇ production by human IL-18 mutants.
  • Each table corresponds to each graph in FIG.
  • IL-18CS variants containing the G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F and S72M mutations, and IL-18 variants containing the G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F and S72M mutations, IL-18WT (wild type), IL-18CS mutant, IL-18CSEK mutant IFN ⁇ production induction enhancing activity.
  • Interleukin 18 1.1 Structure and Function Interleukin 18 (IL-18) is a cytokine belonging to the IL-1 superfamily discovered as an IFN ⁇ production inducer. IL-18 is produced as an inactive precursor (pro-IL-18) containing a propeptide, and is released as an active form of IL-18 upon cleavage of the propeptide by caspase-1, caspase-4, or the like.
  • the human IL-18 precursor consists of 193 amino acids (24 KDa), and the mature human IL-18 without propeptide consists of 157 amino acids (18 KDa).
  • An exemplary amino acid sequence of human IL-18 precursor and human IL-18 is set forth in SEQ ID NO:2 (FIG. 7) and SEQ ID NO:3, respectively.
  • Human IL-18 precursors and human IL-18 having amino acid sequences with 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, or 99% or more sequence identity with these sequences also As long as they have the activity of human IL-18, they can be used as human IL-18 precursor and human IL-18, respectively.
  • IL-18 induces inflammation and tissue damage by inducing the production of inflammatory cytokines through the enhancement of IFN ⁇ production induction by IL-12.
  • the effect of IL-18 on Th1-type immune responses is synergistically enhanced by the presence of IL-2.
  • IL-18 enhances the induction of anti-inflammatory cytokines such as IL-4 and IL-13 under certain conditions and can also induce Th2-type immune responses.
  • IL-18 binding protein that specifically binds to IL-18 is constantly expressed. Since IL-18BP has a high affinity of 400 pM and exists in a large excess in vivo (molar concentration of 20 times or more relative to IL-18), most of the secreted IL-18 is IL-18BP. , resulting in inhibition of receptor binding and loss of activity. Thus, IL-18BP suppresses the immune response by regulating the activity of IL-18, so Zhou et al. describe IL-18BP as a secretory immune checkpoint (supra, Zhou et al. .).
  • IL-18 Receptor IL-18 receptor is expressed on various cells such as NK cells, NKT cells, helper T cells, B cells, neutrophils and macrophages.
  • the IL-18 receptor binding site consists of an ⁇ chain (IL-18R ⁇ ) and a ⁇ chain (IL-18R ⁇ ). It has been reported that the IL-18R ⁇ binding site of human IL-18 may be similar to that of IL-18BP (Kim et al., supra).
  • Human IL-18 variants of the present invention have cysteine serine substitutions at positions 38, 68, 76, and 127 in the amino acid sequence of wild-type human IL-18, and It is a human IL-18 mutant in which at least one additional mutation is introduced to the mutant in which glutamic acid at position 6 and lysine at position 53 are substituted with alanine.
  • amino acid mutations are abbreviated as C38S, depending on the amino acid residue and position before mutation and the amino acid residue after mutation, for example, if cysteine (C) at position 38 is mutated to serine (S) sometimes shown.
  • wild-type human IL-18 for example, one containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 can be used.
  • Wild-type human IL-18 has 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acids independently at one or both ends of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3. may be added.
  • wild-type human IL-18 has an amino acid sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • CS mutations In the molecule of human IL-18, there are four cysteines (C) at positions 38, 68, 76, and 127, but no disulfide bonds are formed. Both side chains of cysteine residues are present on the surface of the molecule. Therefore, human IL-18 is prone to oligomerization due to the formation of intermolecular disulfide bonds at free cysteine residues. This oligomerization inhibits binding to the receptor and leads to inactivation of human IL-18 (Yamamoto et al., supra).
  • the human IL-18 variants of the present invention have four cysteines mutated to serines, thus preventing oligomerization and consequent loss of activity.
  • the four cysteine to serine mutations (C38S, C68S, C76S, C127S) are referred to as "CS mutations.”
  • EK Mutation Glutamic acid (E) at position 6 and lysine (K) at position 53 of the human IL-18 molecule are important sites for interaction with IL-18BP (Kim et al. 2001 supra).
  • glutamic acid at position 6 and lysine at position 53 with uncharged amino acids (eg, alanine)
  • binding affinity to IL-18BP can be reduced.
  • mutations of glutamic acid at position 6 and lysine at position 53 to alanine (A) (E6A, K53A) are referred to as "EK mutations”.
  • CSEK Mutation Mutants containing both CS and EK mutations are expected to have enhanced activity due to the CS mutation preventing oligomerization and the EK mutation reducing binding to IL-18BP.
  • the inventors found that the activity of the CSEK mutant was lower than that of the CS mutant, and that the activity was not improved, but equal to or slightly lower than that of the wild type. This is thought to be because glutamic acid (E) at position 6 and lysine (K) at position 53 are also involved in binding to IL-18R ⁇ , and therefore mutations thereof affect expression of activity through receptor binding. be done.
  • a mutation containing both a CS mutation and an EK mutation is called a "CSEK mutation”
  • a human IL-18 mutant containing a CSEK mutation is called a "human IL-18CSEK mutant”.
  • the human IL-18 mutant of the present invention is based on the human IL-18CSEK mutant and further includes at least one “additional mutation”. "Additional mutations" improve the activity of human IL-18 CSEK mutants by altering binding to IL-18R ⁇ without impairing the effects of CS and EK mutations.
  • Additional mutations include mutations in: (a) mutation of glycine (G) at position 3: preferably mutation of glycine (G) at position 3 to tyrosine (Y) (G3Y) and mutation to leucine (L) (G3L); (b) mutation of alanine (A) at position 6 (glutamic acid (E) in the wild-type sequence) to an uncharged amino acid other than alanine: preferably tryptophan (W) at position 6 of alanine (glutamic acid in the wild-type sequence); ) (A6W, E6W based on the wild-type sequence); (c) mutation at position 34 (threonine): preferably mutation at position 34 (threonine) to proline (P) (T34P); (d) mutation of cysteine (C) at position 38: preferably mutation of cysteine (C) at position 38 to methionine (M) (C38M); (e) mutation of methionine (M) at position 51: preferably
  • the additional mutations are G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F, S72M, S72L, S72W, and S7/50C.
  • the additional mutations are G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F, S72M, S72L, and S72W.
  • mutants having G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F, and S72M exhibit relatively high activity even in the absence of EK mutations and CSEK. That is, human IL-18CS mutants or human IL-18 wild-type mutants in which position 3, 38, or 72 is substituted with an amino acid different from the wild-type amino acid, particularly G3Y, G3L, C38M, S72Y, A mutant introduced with any point mutation selected from S72F and S72M is also included in the scope of the present invention.
  • the amino acid sequences of preferred human IL-18 variants of the invention are: , 31, 33, 35, 37.
  • the above-described CS mutations C38S, C68S, C76S, C127S
  • EK mutations E6A, K53A
  • additional mutations e.g., G3Y, G3L, A6W, T34P, C38M, M51Y, S72Y, S72F, S72M, S72L, S72W, K112W, K119V, G145N, and S7/50C
  • variants containing minor modifications that do not alter the structural stability and activity of human IL-18 variants Included in the human IL-18 variants of the present invention.
  • Human IL-18 variants containing such minor modifications are SEQ ID NOs:9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45 , 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, and 67, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, % or greater, 97% or greater, 98% or greater, 99% or greater sequence identity.
  • DNA sequences encoding human IL-18 variants are optimized for the recombinant production described below, depending on the host used.
  • Examples of codon-optimized DNA sequences for expression in E. coli for human IL-18 variants having the above amino acid sequences are SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, respectively. 28, 30, 32, 34, 36, 38, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, and 68.
  • the DNA sequence is appropriately optimized according to the host to be used.
  • the human IL-18 variants of the invention combine stability with improved activity.
  • the activity of IL-18 includes enhancement of induction of IFN ⁇ production, CD8 positive killer ⁇ T cells, ⁇ T cells, NK cells, CD4CD8 negative killer ⁇ T cells (NKT cells), immune effector cells (especially NK cells). , preferably ⁇ type T cells, more preferably NK cells), enhanced expression of major histocompatibility antigens such as HLA-DR/HLA-DQ, enhanced expression of CD80/CD86, enhanced expression of CD25, ICOS and the like.
  • "having an activity higher than that of wild-type human IL-18” means that any of the aforementioned activities is higher than that of wild-type.
  • the human IL-18 mutant of the present invention has an enhanced ability (activity) to induce IFN ⁇ production as compared to wild-type human IL-18.
  • the human IL-18 mutant of the present invention has an enhanced ability (activity) to induce IFN ⁇ production as compared to the wild type.
  • human IL-18 variants of the present invention may be modified, for example, prenylation, acetylation, amidation, carboxylation, glycosylation, PEGylation, etc., depending on the purpose. 18 variants are also included in the scope of the present invention.
  • Codon Optimization The DNA sequence encoding human IL-18 (precursor) is preferably optimized according to the host used in order to maximize expression levels. . Codon optimization can be performed using commercially available software for codon optimization (GeneOptimizer (registered trademark), etc.).
  • a DNA encoding a human IL-18 mutant (precursor) containing a mutation of interest is incorporated into an appropriate expression vector and then introduced into host cells for expression.
  • the host cells to be used are not particularly limited as long as they can express human IL-18, and prokaryotic cells such as E. coli, eukaryotic cells such as yeast, insect cells and animal cells can be used.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can be expressed in the host.
  • Vectors that can be used in E. coli include pAT153, pACYC184, pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC system, pBluescript II, pMTL20, pBS, pGEM, pBEMEX, pUR222, pUCBM, pSP system, pEX system, pCAT system, pT3/ T7, pEUK, pMAM, pMSG, pEMBL, pSELECT, pBTrp2, pBTac1, pBTac2, pKK233-2, pSE280, pGEMEX-1, pQE-8, pGEX, pET, pME18SFL3 pGEX-4T-1, pACYC177, pKK338-1, pKC30 , pKT279, pFB series, p
  • vectors that can be used in yeast include YEP13, YEp24, YCp50, and the like.
  • Vectors that can be used in insect cells include, for example, pVL1392, pVL1393 and pBlueBacIII.
  • Vectors that can be used in plant cells include, for example, Ti plasmids and tobacco mosaic virus vectors.
  • human IL-18 does not have a sugar chain
  • the human IL-18 mutant (precursor) of the present invention can be easily recombinantly expressed using E. coli as a host.
  • Human IL-18 variants may be expressed fused to soluble tag sequences, such as histidine (His) and glutathione S-transferase (GST) tags, to facilitate later purification and detection.
  • His histidine
  • GST glutathione S-transferase
  • the human IL-18 mutant (precursor) is obtained by disrupting the cells with ultrasound or a cell wall lytic enzyme, and then separating the polypeptide from the cells or disrupted cells by filtration, centrifugation, or the like. , to refine. Purification includes, for example, salting out, dialysis, filtration, concentration, fractional precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, chromatofocusing, gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. Methods well known in the art can be employed.
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • GST tag selectively binds to glutathione resin under normal conditions
  • human IL-18 variants expressed as fusion proteins with the GST tag are readily purified using chromatography with glutathione resin. can do.
  • the molecular weight of the human IL-18 variant is 18 kDa.
  • the carrier to be used can be appropriately selected in consideration of the molecular weight of the target protein, scale, and operation time.
  • Gel filtration chromatography may be used in combination with the affinity chromatography described above.
  • Propeptide cleavage is required for the generation of mature human IL-18 variants from human IL-18 variant precursors.
  • caspase-1 or caspase-4 caspase-5 or the like can be used for propeptide cleavage.
  • the origin of the caspase to be used is not particularly limited, it is preferably human-derived caspase.
  • Caspases are proteases that play a central role in processes such as apoptosis and inflammation. Caspases 1-14 have been found in mammals, and caspases 1, 4, and 5 are all known as inflammatory caspases. Caspases 1, 4 and 5 are all expressed as inactive precursors (procaspases) and are processed by proteases into mature caspases consisting of heterotetramers composed of P20 and P10 subunits.
  • caspases 1, 4, and 5 may be used, and since the amino acid sequences and the DNA sequences encoding them are known, as described for IL-18 mutants, Therefore, it may be produced by recombinant production. In recombinant production, appropriate mutations may be introduced at susceptible sites to prevent autolysis of human caspases.
  • human caspase 4 (D315E) (SEQ ID NO: 40) was used in which aspartic acid at position 315 was mutated to glutamic acid in the amino acid sequence of wild-type human caspase 4 precursor (SEQ ID NO: 39).
  • This recombinant human caspase-4 variant is also within the scope of the invention.
  • factor Xa can also be used to cleave the propeptide of IL-18 (Yamamoto et al., Kim et al., supra).
  • Factor Xa is a 59 Da protease composed of two subunits.
  • Factor Xa derived from commercially available bovine plasma can be used as Factor Xa.
  • the amino acid sequence of Factor Xa and the DNA sequence encoding it are known (GenBank Accession No. NM — 001080213.2), they may be produced and used by conventional methods.
  • the activity of the human IL-18 mutant is determined by enhancing induction of IFN ⁇ production, enhancing induction of NK cell proliferation, enhancing HLA-DR/DQ expression, enhancing CD80/CD86 expression, or enhancing CD25 expression. It can be confirmed by comparison with the activity of wild-type IL-18.
  • the ability to enhance IFN ⁇ production induction is demonstrated by human IL
  • the -18 mutant is added to about 0.1 ng to 1 ⁇ g/ml, preferably about 1 to 100 ng/ml, cultured, and the amount of IFN ⁇ in the culture medium is measured by ELISA or the like to confirm. be able to.
  • the IL-18 mutant of the present invention has higher ability to induce IFN ⁇ production than the wild type.
  • NK cell proliferation induction enhancement is performed by adding an IL-2/IL-18 mutant to human peripheral blood mononuclear cells from which CD3-positive cells have been removed, and culturing them with NK cell-specific markers (e.g., CD56-positive, CD161-negative, CD3 negative) can be confirmed by counting the number of cells.
  • NK cell-specific markers e.g., CD56-positive, CD161-negative, CD3 negative
  • NK cells Changes in the molecules expressed on NK cells can be confirmed by measuring them using flow cytometry, etc. Specifically, HLA-DR/DQ and CD80/86 expressed on NK cells cultured with IL-2/IL-18 mutants as described above and NK cells cultured with IL-2 alone are compared. can be confirmed by
  • mice IL-18 precursor SEQ ID NO: 43, mature mouse IL-18: SEQ ID NO: 44
  • mice it is necessary to generate murine IL-18 variants that correspond to the human IL-18 variants of the present invention. Since there is some homology in the primary structure of human IL-18 and mouse IL-18, a CS mutation was introduced into wild-type mouse IL-18 according to the method described above, and further interaction with IL-18BP. The corresponding murine IL-18 mutants can be obtained by substituting the sites of interest and introducing additional mutations.
  • compositions The human IL-18 mutants of the present invention have high activities such as enhancement of induction of IFN ⁇ production, and therefore pharmaceutical compositions for treating or preventing viral diseases, cancers, and immune diseases sensitive to IFN ⁇ . is useful as
  • a pharmaceutical composition containing the human IL-18 variant of the present invention may contain pharmacologically acceptable carriers and additives.
  • carriers and additives include excipients, binders, lubricants, solvents, disintegrants, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, tonicity agents, stabilizers, soothing agents, agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, coloring agents, buffering agents, fluidity enhancers, etc., but not limited thereto, and other commonly used carriers and additives can be used as appropriate.
  • Excipients include sugars such as lactose, glucose, and D-mannitol, organic excipients such as starches and celluloses such as crystalline cellulose, and inorganic excipients such as calcium carbonate and kaolin.
  • Binders include pregelatinized starch, gelatin, gum arabic, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, D-mannitol, trehalose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and polyvinyl alcohol.
  • Lubricants include fatty acid salts such as stearic acid and stearates, talc, and silicates.
  • solvents examples include purified water, physiological saline, and phosphate buffer.
  • Disintegrants include low-substituted hydroxypropyl cellulose, chemically modified cellulose and starches.
  • Dissolution aids include polyethylene glycol, propylene glycol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, sodium carbonate, sodium citrate, sodium salicylate, sodium acetate, and the like.
  • Suspending or emulsifying agents include sodium lauryl sulfate, gum arabic, gelatin, lecithin, glyceryl monostearate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, celluloses such as sodium carboxymethylcellulose, polysorbates, and polyoxyethylene hydrogenated castor oil. mentioned.
  • tonicity agents examples include sodium chloride, potassium chloride, sugars, glycerin, and urea.
  • stabilizers examples include polyethylene glycol, sodium dextran sulfate, and other amino acids.
  • Analgesics include glucose, calcium gluconate, and procaine hydrochloride.
  • Preservatives include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid, and the like.
  • Antioxidants include water-soluble antioxidants ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite, fat-soluble antioxidants ascorbyl palmitate, and butylated hydroxyanisole (BHA). , butylated hydroxytoluene (BHT), lecithin, propyl gallate, ⁇ -tocopherol, and the metal chelating agents citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid.
  • BHA butylated hydroxyanisole
  • Flavoring agents include sweeteners and flavors commonly used in the pharmaceutical field, and coloring agents include coloring agents commonly used in the pharmaceutical field.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and may be oral or parenteral.
  • parenteral administration include injection administration, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • parenteral administration by injection include intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intramedullary injection, intrathecal injection and intradermal injection.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the patient's age and symptoms.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a subject in a therapeutically effective amount.
  • a "therapeutically effective amount” refers to that amount of therapeutic agent that is useful in alleviating the condition of choice.
  • a therapeutically effective amount is appropriately determined depending on the purpose of use, administration route, patient's age and symptoms, and the like.
  • at least 0.001 mg/kg, preferably 0.01 mg/kg, more preferably 0.1 mg/kg, and even more preferably 1 mg/kg as a human IL-18 variant per patient is at most 100 mg/kg, preferably 50 mg/kg, more preferably 20 mg/kg, even more preferably 10 mg/kg.
  • 0.001 to 100 mg/kg, preferably 0.01 to 50 mg/kg, more preferably 0.1 to 20 mg/kg, still more preferably 1 to 10 mg/kg as human IL-18 variant per patient is.
  • cancers to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied include leukemia such as acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, and chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, and non-Hodgkin's lymphoma.
  • leukemia such as acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, and chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, and non-Hodgkin's lymphoma.
  • malignant lymphoma multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, head and neck cancer, tongue cancer, pharyngeal cancer, oral cancer, esophageal cancer, esophageal adenocarcinoma, gastric cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder and Bile duct cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, lung cancer such as non-small cell lung cancer and small cell lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, endometrial cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, kidney Cancer, adenocarcinoma, urothelial cancer, prostate cancer, testicular tumor, bone/soft tissue sarcoma, uveal malignant melanoma, malignant melanoma, skin cancer such as Merkel cell carcinoma, neuroblastoma, glioblastoma, brain tumor, Includes, but is not limited to, pleural mesotheli
  • viral diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied include human immunodeficiency virus (HIV), human hepatitis A virus (HAV), human hepatitis B virus (HBV), and human hepatitis C virus. (HCV), herpes simplex virus (HSV), human papillomavirus (HPV) and the like, especially viral diseases associated with immunodeficiency.
  • HCV human immunodeficiency virus
  • HAV human hepatitis A virus
  • HBV human hepatitis B virus
  • HPV human papillomavirus
  • Immunological diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied include rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, nephritis, psoriasis, asthma, pernicious anemia, hyperthyroidism, and autoimmunity.
  • rheumatoid arthritis multiple sclerosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, nephritis, psoriasis, asthma, pernicious anemia, hyperthyroidism, and autoimmunity.
  • examples include, but are not limited to, hemolytic anemia, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, Addison's disease, Hodgkin's disease, AIDS, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with other drugs or therapeutic methods as long as the purpose of the present invention is not impaired.
  • molecularly targeted drugs such as monoclonal antibodies including immune checkpoint inhibitors (rituximab, trastuzumab, gemtuzumab, cetuximab, bevacizumab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab, brentuximab, pertuzumab, obinutuzumab, dinutuximab, nivolumab, pembrolizumab, blinatumomab, ramucirumab, necitumumab, elotuzumab, daratumumab, mogamulizumab, inotuzumab, olalatumab, durvalumab, avelumab, atezolizumab, alemtuzumab, ibritumomab), tyrosine kinase inhibitors (imatinib, gefitinib,
  • wild-type IL-18 and IL-2 (teseleukin), wild-type IL-18 and anti-PD-1 antibodies (nivolumab, pembrolizumab, semiplimab, spartalizumab), anti-PD-L1 antibodies (atezolizumab, avelumab, durvalumab) , Anti-CTLA-4 antibodies (ipilimumab, tremelimumab) and other immune checkpoint inhibitors have been reported to be effective in combination (JP 2004-315381, WO2016/021720), the human IL-18 variant of the present invention A combined effect can also be expected.
  • wild-type IL-18 and IL-2 teseleukin
  • wild-type IL-18 and anti-PD-1 antibodies nivolumab, pembrolizumab, semiplimab, spartalizumab
  • anti-PD-L1 antibodies atezolizumab, avelumab, durvalumab
  • nucleoside reverse transcriptase inhibitors zidovudine, lamivudine, abacavir, tenofovir, emtricitabine, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors nevirapine, efavirenz, etravine, rilpivirine, doravirine, protease inhibitors nelfinavir, ritonavir, lopinavir, atazanavir, darunavir, integrase inhibitors raltegravir, elbidegravir, dolutegravir, newcomer inhibitor maraviroc, or combination drugs containing one or more of these be able to.
  • NSAIDs such as celecoxib and loxoprofen sodium
  • DMARDs such as bucillamine, salazosulfapyridine, methotrexate, mizoribine, tacrolimus
  • human IL-18 variants may be conjugated with water-soluble polymers such as PEG (WO2004/091517).
  • ⁇ T cells stimulated with PTA/IL-2/IL-18 and cultured are more likely to grow than ⁇ T cells cultured after being stimulated with PTA/IL-2. It is known that the number after culture is larger.
  • immune effector cells and killer cells such as ⁇ -type T cells, ⁇ -type T cells, and NK cells
  • IL-18 inhibits major histocompatibility antigens such as HLA-DR and HLA-DQ, CD80, CD86 ( The expression of positive costimulatory molecules), CD25 (IL-2 receptor), ICOS (positive costimulatory molecules) is improved, and they become excellent immune effector cells endowed with antigen-presenting ability.
  • the human IL-18 mutant of the present invention has a high activity of activating such NK cells, CD8-positive killer ⁇ -type T cells, and ⁇ -type T cells, and inducing their proliferation. It can be used as an agent for inducing or stimulating proliferation of type T cells and ⁇ type T cells.
  • T cells can be expanded by adding the human IL-18 variants of the invention along with IL-2 to a cell population comprising T cells.
  • the human IL-18 variants of the invention can be used for expansion of T cells in genetically modified T cell therapies such as CAR-T therapy.
  • a peripheral blood mononuclear cell population containing T cells was isolated from the subject's peripheral blood, stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, and then proliferated with IL-2 and human IL-18 variants. Then, after expanding the T cells, introducing a gene, further inducing the proliferation of the T cells after the gene introduction with IL-2 and IL-18 mutants and expanding them, efficiently genetically modified T cells can be prepared.
  • peripheral blood mononuclear cells are stimulated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, and proliferation is induced with IL-2 to expand T cells.
  • IL-2 chimeric antigen receptor
  • the human IL-18 mutant of the present invention can also be used as a stimulant or proliferation agent in diagnostic and evaluation methods using the activation and proliferation of NK cells, CD8-positive killer ⁇ -type T cells, and ⁇ -type T cells as indicators. It can be used as an inducer.
  • Example 1 Preparation of Human Caspase-4 Mutant (hCasp4-D315E) For recombinant production of human IL-18, prepare human caspase-4 to cleave pro-IL-18 (IL-18 precursor) did.
  • Human caspase-4 is a heterodimer consisting of two subunits, P10 and P20.
  • a mutant hCasp4- D315E ( Figure 2, SEQ ID NO:40) was prepared.
  • Escherichia coli DH5a was transformed with the obtained plasmid, colonies were screened in LB medium containing ampicillin (LB/Amp), and pUCIDT-NdeI-hCasp4-D315E-SalI was extracted from the colonies.
  • NdeI-hCasp4-D315E-SalI excised from pUCID-Amp-NdeI-hCasp4-D315E-SalI was incorporated into the multicloning site of pCold TM II vector (Takara) (FIG. 4).
  • the pCold TM II vector is cooled to 15° C. to express the target protein as a His-tag-fused soluble protein.
  • Escherichia coli DH5a TOYOBO
  • TOYOBO was transformed with the obtained plasmid, colonies were screened on LB medium containing a selective agent, and a vector containing hCasp4-D315E was extracted from the colonies.
  • the E. coli suspension was incubated at 15°C for an additional 20 hours to induce expression of soluble hCasp4-D315E (His-tagged hCasp4-D315E). After the culture, the suspension was centrifuged (7,000 rpm, 10 minutes, 4°C), the supernatant was discarded, and the E. coli pellet was collected and stored frozen at -30°C.
  • the suspension was filtered through a 0.22 mM filter to obtain samples containing His-tagged hCasp4-D315E.
  • the resulting sample was subjected to TALON Superflow column chromatography (3 ml bed volume) to purify His-tagged hCasp4-D315E.
  • the purified His-tagged hCasp4-D315E was further purified using a Superdex 200pg HiLoad 26/600 column and confirmed by SDS-PAGE (Fig. 5).
  • Example 2 Preparation of native human IL-18 Native human IL-18 is expressed as a propeptide-containing precursor (SEQ ID NO: 2) and is subjected to the action of caspases to produce active mature hIL-18 (SEQ ID NO: 2). number 3) (FIGS. 6 and 7).
  • hProIL-18 was expressed in E. coli and treated with hCasp4-D315E prepared in Example 1 to produce hIL-18.
  • NdeI-hProIL18-SalI (FIG. 8, SEQ ID NO: 4).
  • NdeI-hProIL18-SalI was incorporated into the multicloning site of pUCIDT-Amp plasmid.
  • Escherichia coli DH5a (TOYOBO) was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened with LB/Amp, and pUCIDT-NdeI-hProIL18-SalI was extracted from the colonies.
  • NdeI-hProIL18-SalI excised from pUCIDT-NdeI-hProIL18-SalI was inserted into the multiple cloning site of pCold TM II vector.
  • Escherichia coli DH5a TOYOBO was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened on LB medium containing a selective agent, and a vector containing hProIL18 was extracted from the colonies.
  • the E. coli suspension was further incubated at 15°C for 40 hours and 30 minutes to induce expression of soluble hProIL18 (His-tagged hProIL18). After the culture, the suspension was centrifuged (7,000 rpm, 10 minutes, 4°C), the supernatant was discarded, and the E. coli pellet was collected and stored frozen at -30°C.
  • the resulting sample was applied to a TALON Superflow column (3 ml bed volume) to purify His-tagged hProIL18. Purified His-tagged hProIL18 was further purified over a Superdex 200pg HiLoad 26/600 column. Purified hProIL18 was treated with hCasp4-D315E and hIL18 was confirmed by SDS-PAGE (Fig. 9).
  • Example 3 Preparation of human IL-18-CS hIL-18-CS (SEQ ID NO: 5) was prepared by substituting alanine for all cysteine residues at positions 38, 68, 76 and 127 of human IL-18. did.
  • Escherichia coli DH5a (TOYOBO) was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened with LB/Amp, and pUCIDT-NdeI-hProIL18-CS-SalI was extracted from the colonies.
  • NdeI-hProIL18-CS-SalI excised from pUCIDT-NdeI-hProIL18-CS-SalI was inserted into the multiple cloning site of pCold TM GST vector.
  • the pCold TM GST vector (Takara) expresses the target protein as a soluble protein fused with a His-GST tag by cooling to 15°C.
  • Escherichia coli DH5a (TOYOBO) was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened on LB medium containing a selective agent, and a vector containing hProIL18-CS was extracted from the colonies.
  • the E. coli suspension was cultured at 15°C for an additional 40 hours to induce expression of soluble hProIL18-CS (His- and GST-tagged hProIL18-CS). After the culture, the suspension was centrifuged (7,000 rpm, 10 minutes, 4°C), the supernatant was discarded, and the E. coli pellet was collected and stored frozen at -30°C.
  • the suspension was filtered through a 0.22 mM filter to obtain a sample containing His- and GST-tagged hProIL18-CS.
  • the resulting sample was applied to a TALON Superflow column (3 ml bed volume) to purify His- and GST-tagged hProIL18-CS.
  • Purified His- and GST-tagged hProIL18-CS was further purified over a Superdex 200pg HiLoad 26/600 column.
  • Purified hProIL18-CS was treated with hCasp4-D315E and hIL18-CS was confirmed by SDS-PAGE.
  • Example 4 Preparation of human IL-18-CSEK
  • the glutamic acid residue at position 6 was further substituted with alanine (E6A), and the lysine residue at position 53 was replaced with alanine. (K53A) to create hIL-18-CSEK (SEQ ID NO: 7).
  • Glutamic acid residue at position 6 and lysine at position 53 of human IL-18 are important charged amino acids for interaction with IL-18BP. (Kim et al. 2001, supra).
  • Escherichia coli DH5a (TOYOBO) was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened with LB/Amp, and pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-SalI was extracted from the colonies.
  • NdeI-hProIL18-CSEK-SalI excised from pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-SalI was inserted into the multiple cloning site of pCold TM GST vector.
  • Escherichia coli DH5a TOYOBO was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened on LB medium containing a selective agent, and a vector containing hProIL18-CSEK was extracted from the colonies.
  • E. coli Rosetta (DE3) pLysS (Merck) was transformed with the above vector, and the resulting colonies were transferred to a tube containing 10 mL of LB medium containing a selective agent, Cultured at 37°C for 48 hours.
  • a medium (1 L, x 4) was inoculated with 10 ml of the culture solution and cultured overnight at 37°C.
  • a medium (1 L, x 4) was inoculated with 50 ml of the culture solution and cultured at 37°C for 11 hours. 1 ml of 1 M IPTG was added to the culture medium to a final concentration of 1 mM to prepare an E. coli suspension (OD600 nM: 1.894).
  • E. coli suspensions were incubated at 15°C for an additional 37 hours to induce expression of soluble hProIL18-CSEK (His- and GST-tagged hProIL18-CSEK). After the culture, the suspension was centrifuged (7,000 rpm, 10 minutes, 4°C), the supernatant was discarded, and the E. coli pellet was collected and stored frozen at -30°C.
  • the suspension was filtered through a 0.22 mM filter to obtain samples containing His-tagged hProIL18-CSEK.
  • the resulting sample was applied to a TALON Superflow column (3 ml bed volume) to purify His- and GST-tagged hProIL18-CSEK.
  • Purified His- and GST-tagged hProIL18-CSEK was further purified over a Superdex 200pg HiLoad 26/600 column.
  • Purified hProIL18-CSEK was treated with hCasp4-D315E and hIL18-CSEK was confirmed by SDS-PAGE.
  • Example 5 Generation of various mutants based on human IL-18-CSEKA. Preliminary Analysis 1. In silico point mutation scanning hIL-18CSEK activity is lower than wild-type hIL-18. This was thought to be because the introduced mutation impairs the structural stability of the protein itself. Therefore, we exhaustively introduced single-residue mutations to all amino acids on a computer, and calculated the relative stability of IL18 folding represented by the difference in Gibbs free energy change ( ⁇ G) using a supercomputer (H. Park et al. al. 2016). Since the value of ⁇ G is negative when the protein is predicted to be stabilized, quantitative evaluation becomes possible by using this value.
  • ⁇ G Gibbs free energy change
  • Escherichia coli DH5a (TOYOBO) was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened on LB/Amp medium, and pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI was extracted from the colonies.
  • NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI excised from pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI was inserted into the multiple cloning site of pCold TM II vector.
  • Escherichia coli DH5a TOYOBO was transformed with the resulting plasmid, colonies were screened on LB medium containing a selective agent, and a vector containing hProIL18-CSEK was extracted from the colonies.
  • the E. coli suspension (OD600 nM: 2.295). The E. coli suspension was cultured at 15°C for an additional 40 hours to induce expression of soluble hProIL18-CSEK-G3Y (His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y). After the culture, the suspension was centrifuged (7,000 rpm, 10 minutes, 4°C), the supernatant was discarded, and the E. coli pellet was collected and stored frozen at -30°C.
  • the suspension was filtered through a 0.22 mM filter to obtain samples containing His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y.
  • the resulting sample was applied to a TALON Superflow column (3 ml bed volume) to purify His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y.
  • Purified His- and GST-tagged hProIL18-CSEK-G3Y was further purified over a Superdex 200pg HiLoad 26/600 column.
  • Purified hProIL18-CSEK-G3Y was treated with hCasp4-D315E and hIL18-CSEK-G3Y was confirmed by SDS-PAGE.
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-G3L containing the propeptide was optimized for expression in E. coli.
  • Recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI were added to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively, to prepare NdeI-hProIL18-CSEK-G3L-SalI (SEQ ID NO: 12). and purified with TALON and Superdex 200pg columns, then treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-G3L.
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-A6W containing the propeptide was optimized for expression in E. coli.
  • Recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI were added to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively to prepare NdeI-hProIL18-CSEK-A6W-SalI (SEQ ID NO: 14). and purified with TALON and Superdex 200pg columns, then treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-A6W.
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-T34P containing the propeptide was optimized for expression in E. coli.
  • Recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI were added to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively, to prepare NdeI-hProIL18CSEK-T34P-SalI (SEQ ID NO: 16), and as a soluble protein using E. coli.
  • NdeI-hProIL18CSEK-T34P-SalI SEQ ID NO: 16
  • NdeI-hProIL18CSEK-C38M-SalI SEQ ID NO: 18
  • NdeI and SalI recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-M51Y containing the propeptide was optimized for expression in E. coli.
  • Recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI were added to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively, to prepare NdeI-hProIL18CSEK-M51Y-SalI (SEQ ID NO: 20), which was then expressed as a soluble protein using E. coli.
  • NdeI-hProIL18CSEK-M51Y-SalI SEQ ID NO: 20
  • a DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-S72Y containing a propeptide was generated in the same manner as B-1, except that the pCold TM GST vector (see Example 3) was used instead of the pCold TM II vector.
  • Optimized for expression in E. coli NdeI-hProIL18CSEK-S72Y-SalI (SEQ ID NO: 22) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively, and expressed as a soluble protein using E. coli. After purification with TALON column and Superdex 200pg column, it was treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-S72Y.
  • NdeI-hProIL18CSEK-S72F-SalI (SEQ ID NO: 24) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively, and expressed as a soluble protein using E. coli. and purified with TALON column and Superdex 200pg column, then treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-S72F.
  • Recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI were added to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively, to prepare NdeI-hProIL18CSEK-S72M-SalI (SEQ ID NO: 26), which was then expressed as a soluble protein using E. coli. , TALON column and Superdex 200pg column, followed by treatment with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-S72M.
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-S72L containing the propeptide was synthesized in the same manner as B-1, except that the pCold TM GST vector (see Example 3) was used instead of the pCold TM II vector.
  • Optimized for expression in E. coli A vector containing NdeI-hProIL18CSEK-S72L-SalI (SEQ ID NO: 28) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively. It was expressed as a protein, purified on a TALON column and a Superdex 200pg column, and treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-S72L.
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-S72W containing the propeptide was synthesized in the same manner as B-1, except that the pCold TM GST vector (see Example 3) was used instead of the pCold TM II vector.
  • Optimized for expression in E. coli A vector containing NdeI-hProIL18CSEK-S72W-SalI (SEQ ID NO: 30) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively. It was expressed as a protein, purified on a TALON column and a Superdex 200pg column, and treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-S72W.
  • a vector containing NdeI-hProIL18CSEK-K112W-SalI (SEQ ID NO: 32) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively. It was expressed as a protein, purified on a TALON column and a Superdex 200pg column, and treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-K112W.
  • a vector containing NdeI-hProIL18CSEK-K119V-SalI (SEQ ID NO: 34) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively. It was expressed as a protein, purified on a TALON column and a Superdex 200pg column, and treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-K119V.
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-G145N containing the propeptide was optimized for expression in E. coli.
  • a vector containing NdeI-hProIL18CSEK-G145N-SalI (SEQ ID NO: 36) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively. It was expressed as a protein, purified on a TALON column and a Superdex 200pg column, and treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-G145N.
  • the DNA sequence encoding human IL-18-CSEK-S7/50C containing the propeptide was optimized for expression in E. coli.
  • a vector containing NdeI-hProIL18CSEK-S7/50C-SalI (SEQ ID NO: 38) was prepared by adding recognition sequences for restriction enzymes NdeI and SalI to the N-terminus and C-terminus of the optimized sequence, respectively. was expressed as a soluble protein using TALON and Superdex 200pg columns, and treated with hCasp4-D315E to generate hIL18-CSEK-S7/50C.
  • KG-1 cell suspensions (100 ml each) were placed in wells of a 96-well plate.
  • a stock solution of 50 ⁇ g/ml was prepared by adding PBS to the IL-18 mutant. 988 ml of RPMI1640/10% FCS medium was added to 12 ml of this stock solution to make a dilution (600 ng/ml). As shown in the table below, this diluted solution was serially diluted with RPMI1640/10% FCS medium to prepare serially diluted samples (1) to (6). Serially diluted samples were added to each well of a 96-well plate.
  • Test Example 2 IFN- ⁇ production enhancing activity (1) A microcentrifuge tube containing 100 ⁇ l of capture antibody for human IFN- ⁇ (100 ⁇ g/ml) was thawed and diluted with 10 ml of PBS to 1 ⁇ g/ml. Diluted capture antibodies (100 ⁇ l each) were added to all wells of a 96-well ELISA plate (Nunc) and placed at 4°C.
  • the capture antibody was removed, and the wells were washed 4 times with PBS/0.05% Tween-20.
  • the PBS/0.05% Tween-20 was discarded and blocking buffer (PBS/1% BSA, 300 ml each) was added to the 96-well ELISA plates, sealed and left at room temperature for at least 1 hour. Blocking buffer was discarded and wells were washed four times with PBS/0.05% Tween-20.
  • 96-well plates containing KG-1 cell supernatants were thawed and supernatants (100 ml each) were added to ELISA plates.
  • standard human IFN ⁇ was serially diluted in PBS/0.05% Tween 80/0.1% BSA.
  • Serially diluted human IFN ⁇ standards (100 ⁇ l each) were placed in 96-well ELISA plates and left at room temperature for at least 2 hours.
  • an IL-18CS mutant in which all four cysteine residues were replaced with serine was significantly more active than wild-type IL-18.
  • an IL-18CSEK mutant that further introduced an EK substitution to attenuate binding to IL-18 binding proteins also had a reduced ability to bind to the IL-18 receptor, compared to the IL-18CS mutant. , resulting in significantly lower activity and higher activity than wild-type IL-18.
  • S119V showed higher activity than wild-type IL-18.
  • S7 with an artificially introduced SS bond and S7/50C mutant with C substituted for S50 also had higher activity than wild-type IL-18.
  • Test Example 3 IFN- ⁇ production enhancing activity (2) Among the mutations in which relatively high activity was observed in Test Example 2, G3Y, G3L, C38M, S72Y, S72F, and S72M were introduced into IL-18CS mutants and wild-type according to Example 5. to generate IL-18CS mutant-based and wild type-based mutants. According to Test Example 2, the IFN- ⁇ production-enhancing activity of each of the above mutants, IL-18 (wild type: WT), IL-18CS mutant, and IL-18CSEK mutant was measured. The results are shown in FIG.
  • IL-18CS mutants and IL-18 wild-type mutants with the above-mentioned point mutations all produce higher IFN- ⁇ than wild-type IL-18, IL-18CSEK mutants and IL-18CS mutants. showed induction-enhancing activity.
  • Each of the G3L and C38M mutations showed particularly good IFN- ⁇ production-enhancing activity.
  • Table 3 shows the amino acid sequences of the human IL-18 mutants (mutation introduction sites are underlined), and Table 4 shows the DNA sequences of the human IL-18 mutants optimized for recombinant expression in E. coli (framed parts is the mutation introduction site).
  • the human IL-18 mutants of the present invention are highly stable and highly active, and are therefore useful for the treatment of cancer, viral diseases, immune system diseases, and the like.
  • SEQ ID NO: 4 NdeI-hProIL18-SalI SEQ ID NO: 5: hIL-18-CS SEQ ID NO: 6: NdeI-hProIL18-CS-SalI SEQ ID NO: 7: hIL-18-CSEK SEQ ID NO: 8: NdeI-hProIL18-CSEK-SalI SEQ ID NO: 9: hIL-18-CSEK-G3Y SEQ ID NO: 10: NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI SEQ ID NO: 11: hIL-18-CSEK-G3L SEQ ID NO: 12: NdeI-hProIL18-CSEK-G3L-SalI SEQ ID NO: 13: hIL-18-CSEK-A6W SEQ ID NO: 14: NdeI-hProIL18-CSEK-A6W-SalI SEQ ID NO: 15: hIL-18-CSEK-T34P SEQ ID NO: 16:

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Abstract

本発明は、新規なＩＬ－１８変異体及びこれを利用した医薬組成物に関する。具体的には、野生型ヒトインターロイキン１８（ＩＬ－１８）のアミノ酸配列において、（i）３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの変異、及び（ii）６位のグルタミン酸及び５３位のリシンのアラニンへの変異を含む、ヒトＩＬ－１８変異体であって、（iii）さらに少なくとも１つの追加的変異を含む、ヒトＩＬ－１８変異体、及び前記ヒトＩＬ－１８変異体を含む医薬組成物等に関する。

Description

新規ヒトインターロイキン－１８変異体及びその用途
［関連出願］
　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０２１－１９４１８（２０２１年２月１０日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
［技術分野］
　本発明は、新規なヒトインターロイキン－１８変異体に関する。より詳細には、安定で活性が高いヒトインターロイキン－１８変異体に関する。
　インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生誘導因子として発見されたＩＬ－１スーパーファミリーに属するサイトカインである（非特許文献１）。ＩＬ－１８は、プロペプチドを含む不活性な前駆体（ｐｒｏ－ＩＬ－１８）として産生され、カスパーゼ１やカスパーゼ４などによる切断を受けて活性型ＩＬ－１８として細胞外に放出される。
　ＩＬ－１８は、免疫系において、主としてマクロファージ系細胞により産生され、ＩＬ－１２の存在下でＩＦＮγの産生が誘導されている細胞の細胞表面上に発現しているＩＬ－１８受容体に結合し、ＩＦＮγの産生を亢進し、Ｔｈ１型の免疫応答を増強する。一方、ＩＬ－１８は、ＩＬ－１２の不存在下では、Ｔｈ２型の免疫応答を増強する。例えば、ＩＬ－２の存在下でＮＫ細胞に作用してＴｈ２型の免疫応答を誘導し、ＩＬ－３の存在下で好酸球及びマスト細胞に作用してＴｈ２型の免疫応答を増強する。
　天然型のヒトＩＬ－１８は不安定で、組換え生産すると、凝集してオリゴマーを形成し、活性が低下する傾向がある。これは、ＩＬ－１８分子表面に露出しているシステイン残基が、他のＩＬ－１８分子のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することにより、オリゴマー化するためである（非特許文献２）。
　Ｙａｍａｍｏｔｏらは、ＩＬ－１８の分子内の４つのシステイン（３８位、６８位、７６位、１２７位）をすべてセリンに置換することで、安定なヒトＩＬ－１８の生産が可能になることを報告している（非特許文献２）。Ｏｋａｍｕｒａらは、３８位、７６位、又は１２７位のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）に置換することで、安定性を有意に高めたポリペプチドが得られることを報告している（特許文献１）。Ｂａｍらは、３８位及び６８位のシステイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）又はアスパラギン酸（Ｄ）に置換するとともに、ＩＬ－１８受容体との相互作用に関与しない柔軟な表面ループの先端残基（７８位、１２１位、１５７位）の１つをシステイン（Ｃ）に置換してＰＥＧを結合させたＰＥＧ化ＩＬ－１８変異体を作製している（特許文献２）。
　ＩＬ－１８は、細胞膜上のＩＬ－１８受容体に結合することで、生理活性を発揮する。生体内にはＩＬ－１８に特異的なＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）が過剰に存在するため、分泌されたＩＬ－１８の多くはＩＬ－１８ＢＰと結合してすみやかに活性を失う。
　Ｋｉｍらは、ＩＬ－１８とＩＬ－１８ＢＰの複合体コンピュータモデルからの予測に基づき、ＩＬ－１８ＢＰとの相互作用に重要な６位のグルタミン酸（Ｅ）と５３位のリシン（Ｋ）をチャージのないアミノ酸（アラニン等）に置換することで、ヒトＩＬ－１８の活性が顕著に向上することを報告している（非特許文献３）。Ｓｈｉｒａｋａｗａらは、１７位、３５位、１３２位のアスパラギン酸をアラニンに置換すると受容体との結合が顕著に抑制されることを報告している（特許文献３）。Ｓｅａｔａｎｇらは、６位のグルタミン酸（Ｅ）をリシン（Ｋ）に置換し、６３位のトレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）に置換することにより活性が顕著に増加すること、また３３位又は６０位のメチオニンをグルタミンに置換すると活性は低下又は喪失することを報告している（非特許文献４）。
　しかし、既報では、比較対象として使用される野生型ＩＬ－１８の活性が著しく低いものもあり、それゆえ、記載される野生型と比較した変異体の活性値には疑問があり、本来の活性を有する野生型と比較検証する必要がある。
　Ｚｈｏｕらは、ＩＬ－１８とＩＬ－１８ＢＰの複合体コンピュータモデルからの予測に基づき、野生型ヒトＩＬ－１８の１位のチロシン（Ｙ）、５位のロイシン（Ｌ）、８位のリシン（Ｋ）、５１位のメチオニン（Ｍ）、５３位のリシン（Ｋ）、５５位のセリン（Ｓ）、５６位のグルタミン（Ｑ）、５７位のプロリン（Ｐ）、５９位のグリシン（Ｇ）、６０位のメチオニン（Ｍ）、７７位のグルタミン酸（Ｅ）、１０３位のグルタミン（Ｑ）、１０５位のセリン（Ｓ）、１１０位のアスパラギン酸（Ｄ）、１１１位のアスパラギン（Ｎ）、１１３位のメチオニン（Ｍ），１５３位のバリン（Ｖ）、１５５位のアスパラギン（Ｎ）にランダムに置換を導入することで、ＩＬ－１８ＢＰとの相互作用が低減されたＩＬ－１８変異体を得ている（特許文献４、非特許文献５）。しかし、ＩＬ－１８ＢＰとの相互作用に重要な領域は、ＩＬ－１８Ｒαとの結合にも関与するため、上記部位の改変はＩＬ－１８の活性低下につながる可能性がある。
特開平１０－２６２６８６号 ＷＯ２００４／０９１５１７ 特開２００５－５２０２１号 ＷＯ２０１９／０５１０１５
Okamura et al., "Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells" Nature. 1995 Nov 2;378(6552):88-91 Yamamoto et al., "Generation of highly stable IL-18 based on a ligand-receptor complex structure" Biochem Biophys Res Commun. 2004 Apr 23;317(1):181-186 Kim et al., "Site-specific mutations in the mature form of human IL-18 with enhanced biological activity and decreased neutralization by IL-18 binding protein" Proc Natl Acad Sci. 2001 Mar 13;98(6):3304-3309 Saetang et al., "Immunologic Function and Molecular Insight of Recombinant Interleukin-18" PLoS One. 2016 Aug 2;11(8):e0160321 Zhou et al., "IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy" Nature. 2020 Jul;583(7817):609-614
　ＩＬ－１８の活性は、凝集（オリゴマー化）、ＩＬ－１８ＢＰとの結合、ＩＬ－１８Ｒへの親和性によって影響を受ける。本発明の目的は、これらの影響をすべて考慮し、安定で活性の高い新規なヒトＩＬ－１８変異体を提供することにある。
　発明者らは、ＩＬ－１８の凝集を防止するために４つのシステインをセリンに置換し、さらにＩＬ－１８ＢＰとの結合を低減させるために６位のグルタミン酸及び５３位のリシンをチャージのないアミノ酸に置換すると、ＩＬ－１８の活性が低下することを見出した。これは、ＩＬ－１８とその受容体であるＩＬ－１８Ｒα鎖との相互作用が６位のグルタミン酸及び５３位のリシンに依存するためと考えられた。そこで、発明者らは、４つのシステインをセリンに置換し、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンを置換したＣＳＥＫ変異体を基礎として、点変異を導入し、構造安定性が高く、かつ活性の高い変異体を網羅的に探索した。得られた変異体をもとに、より少ない変異で高活性な変異体も探索した。なお、本明細書においては、特記しない限り、各アミノ酸の位置はプロペプチドを含まない成熟型のヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列における位置を示す。
　本発明は、上記研究結果に基づくものであり、以下の［１］～［２２］に関する。
［１］ヒトＩＬ－１８変異体であって、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインがセリンに置換され、かつ、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列に対し、さらに少なくとも１つの追加的変異が導入された、アミノ酸配列を有し、野生型ヒトＩＬ－１８より高い活性を有する、ヒトＩＬ－１８変異体。
［２］前記追加的変異が、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列の３位、３４位、３８位、５１位、７２位、１１２位、１１９位、及び１４５位の変異、並びに７位と５０位の間へのジスルフィド結合の導入から選ばれる、［１］に記載のヒトＩＬ－１８変異体。
［３］前記追加的変異が、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ａ６Ｗ、Ｔ３４Ｐ、Ｃ３８Ｍ、Ｍ５１Ｙ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７２Ｗ、Ｋ１１２Ｗ、Ｋ１１９Ｖ、Ｇ１４５Ｎ、及びＳ７／５０Ｃから選ばれる、［１］に記載のヒトＩＬ－１８変異体。
［４］活性がインターフェロンγ産生誘導増強活性である、［１］～［３］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体。例えば、濃度３ｎｇ／ｍｌで使用したときに、本発明のヒトＩＬ－１８変異体は野生型よりも高いインターフェロンγ産生誘導増強活性を有する。
［５］ヒトＩＬ－１８変異体であって、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインがセリンに置換され、かつ、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンがアラニンに置換された変異体に対し、少なくとも１つの追加的変異が導入されたアミノ酸配列を有し、前記追加的変異が、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ａ６Ｗ、Ｔ３４Ｐ、Ｃ３８Ｍ、Ｍ５１Ｙ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７２Ｗ、Ｋ１１２Ｗ、Ｋ１１９Ｖ、Ｇ１４５Ｎ、及びＳ７／５０Ｃから選ばれるいずれか１つである、ヒトＩＬ－１８変異体。
［６］前記追加的変異が、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、及びＳ７２Ｗから選ばれるいずれか１つである、［１］～［５］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体。
［７］野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列が配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、［１］～［６］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体を含む、医薬組成物。
［９］ＩＦＮγに感受性を有するウイルス性疾患、がん、又は免疫疾患を治療するためのものである、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、及びＩＬ－２からなる群より選ばれる少なくとも１つと併用される、［８］又は［９］に記載の医薬組成物。
［１１］［１］～［７］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体を含む、Ｔ細胞増殖誘導増強剤。
　好ましくは、前記Ｔ細胞増殖誘導増強剤は、ＩＬ－２と組み合わせて使用される。
［１２］遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ＩＬ－２及び［１］～［７］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体の存在下で増殖誘導する工程を含む、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法。
　例えば、対象の末梢血からＴ細胞を含む末梢血単核球集団を単離し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した後、ＩＬ－２とヒトＩＬ－１８変異体で増殖誘導を増強して、Ｔ細胞を拡張する。その後、拡張したＴ細胞に遺伝子（例えば、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を導入し、さらに遺伝子導入後のＴ細胞をＩＬ－２とＩＬ－１８変異体で増殖誘導を増強して、拡張する。
［１３］ヒトＩＬ－１８変異体であって、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、３位置、３８位、及び７２位から選ばれるいずれか１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する、ヒトＩＬ－１８変異体。
［１４］ヒトＩＬ－１８変異体であって、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、及びＳ７２Ｍから選ばれるいずれか１つの変異、好ましくは、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、及びＣ３８Ｍから選ばれるいずれか１つの変異、より好ましくはＧ３Ｌ又はＣ３８Ｍの変異が導入されたアミノ酸配列を有する、ヒトＩＬ－１８変異体。
［１５］ヒトＩＬ－１８変異体であって、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインがセリンに置換された変異体に対し、少なくとも１つの追加的変異が導入されたアミノ酸配列を有し、前記追加的変異が、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、及びＳ７２Ｍから選ばれるいずれか１つ、好ましくは、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、及びＣ３８Ｍから選ばれるいずれか１つ、より好ましくはＧ３Ｌ又はＣ３８Ｍである、ヒトＩＬ－１８変異体。
［１６］野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、Ｇ３Ｌの変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体であって、所望により、以下の１）または２）の追加的変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体：
１）３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換
２）３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換と、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンのアラニンへの置換。
［１７］野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、Ｃ３８Ｍの変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体であって、所望により、以下の１）または２）の追加的変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体：
１）６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換
２）６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換と、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンのアラニンへの置換。
［１８］野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列が配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、［１３］～［１７］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体。
［１９］［１３］～［１７］のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体を含む、医薬組成物。
［２０］ＩＦＮγに感受性を有するウイルス性疾患、がん、又は免疫疾患を治療するためのものである、［１９］に記載の医薬組成物。
［２１］抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、及びＩＬ－２からなる群より選ばれる少なくとも１つと併用される、［１９］又は［２０］に記載の医薬組成物。
［２２］［１３］～［１７］のいずれかに記載のいずれかに記載のヒトＩＬ－１８変異体を含む、Ｔ細胞増殖誘導増強剤。
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、安定性が高く、ＩＬ－１８ＢＰとの結合が低減されていることに加えて、高い活性（例えば、ＩＦＮγ産生誘導増強能）を有する。したがって、ＩＬ－１８活性に基づくがんや免疫疾患の治療に有用である。
２量体を形成したヒトカスパーゼ４（Ｄ３１５Ｅ）変異体の構成を示す。Ｎ末端にはヒスチジンタグが付加されている。 ヒトカスパーゼ４（Ｄ３１５Ｅ）変異体前駆体のアミノ酸配列を示す。最初の下線を付した１０４アミノ酸はプロペプチドを示す。２つの矢印は自己消化の位置を示す。[ ]で示す部分が、プロペプチドを含まない成熟型のヒトカスパーゼ４のアミノ酸配列である。 大腸菌用に最適化されたヒトカスパーゼ４（Ｄ３１５Ｅ）変異体をコードするＤＮＡ配列の両端に制限酵素認識配列が付加されたNdeI-Casp4-D315E-SalIを示す。最初のｃａｔａｔｇはＮｄｅＩ認識配列、最後のｇｔｃｇｃはＳａｌＩの認識配列、ＳａｌＩ認識配列のまえのｔａａはストップコドン。下線を付したｇａａが変異導入部位（アスパラギン酸からグルタミン酸への置換部位）に該当する。 ヒトカスパーゼ４（Ｄ３１５Ｅ）を発現するためのベクターを示す。 ヒトカスパーゼ４（Ｄ３１５Ｅ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる泳動結果の画像を示す。 組換え発現のためのヒトＩＬ－１８前駆体（野生型）の構成を示す。プロペプチドのＮ末端にはヒスチジンタグが付加されている。プロペプチドのＣ末端側のアスパラギン酸（Ｄ）でカスパーゼによる切断を受け、成熟型ヒトＩＬ－１８が生成する。 ヒトＩＬ－１８前駆体（野生型）のアミノ酸配列を示す。最初の下線を付した３６アミノ酸がプロペプチドであり、そのＣ末端のＬＥＳＤがカスパーゼ４の認識配列であり、矢印はカスパーゼ４による切断部位を示す。 大腸菌用に最適化されたヒトＩＬ－１８前駆体（野生型）をコードするＤＮＡ配列の両端に制限酵素認識配列が付加されたNdeI-hProIL18-SalIを示す。最初のｃａｔａｔｇはＮｄｅＩ認識配列、最後のｇｔｃｇａｃはＳａｌＩの認識配列、ＳａｌＩ認識配列のまえのｔａａはストップコドン。下線部はプロペプチドに該当し、プロペプチドのＣ末端側のｃｔｇｇａａｔｃｔｇａｃ（配列番号４の１００～１１１位）はカスパーゼ４の認識配列に該当する。 ヒトＩＬ－１８（野生型）のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる泳動結果の画像を示す。１：分子量マーカー、２：Ｃａｓｐ４－Ｄ３１５ＥのＰ１０およびＰ２０断片、３：成熟型ヒトＩＬ－１８サンプル１、４：成熟型ヒトＩＬ－１８サンプル２(確認のため)、５：ヒトＩＬ－１８前駆体とＣａｓｐ４－Ｄ３１５Ｅを４℃で一昼夜処理したもの、６：ヒトＩＬ－１８前駆体 ヒトＩＬ－１８変異体によるＩＦＮγ産生誘導増強を示す。各グラフにおいて、〇は野生型のＩＦＮγ産生誘導増強活性、●は各変異体のＩＦＮγ産生誘導増強活性を示す。 ヒトＩＬ－１８変異体によるＩＦＮγ産生誘導増強を示す。各表は図１０の各グラフに対応する。 Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、及びＳ７２Ｍの各変異を含むＩＬ－１８ＣＳ変異体、及びＧ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、及びＳ７２Ｍの各変異を含むＩＬ－１８変異体、ＩＬ－１８ＷＴ（野生型）、ＩＬ－１８ＣＳ変異体、及びＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体のＩＦＮγ産生誘導増強活性を示す。
１．インターロイキン１８（ＩＬ－１８）
１．１　構造と機能
　インターロイキン１８（ＩＬ－１８）は、ＩＦＮγ産生誘導因子として発見されたＩＬ－１スーパーファミリーに属するサイトカインである。ＩＬ－１８は、プロペプチドを含む不活性な前駆体（ｐｒｏ－ＩＬ－１８）として産生され、カスパーゼ１やカスパーゼ４などによるプロペプチドの切断を受けて、活性型ＩＬ－１８として放出される。
　ヒトＩＬ－１８前駆体は１９３アミノ酸（２４ＫＤａ）からなり、プロペプチドを含まない成熟型のヒトＩＬ－１８は１５７アミノ酸（１８ＫＤａ）からなる。ヒトＩＬ－１８前駆体及びヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列の一例を、それぞれ配列番号２（図７）及び配列番号３に記載する。これらの配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－１８前駆体及びヒトＩＬ－１８もまた、ヒトＩＬ－１８の活性を有する限り、それぞれヒトＩＬ－１８前駆体の及びヒトＩＬ－１８として使用することができる。
　前述のとおり、ＩＬ－１８は、ＩＬ－１２によるＩＦＮγ産生誘導の増強を通じて、炎症性サイトカインの産生を誘導することで炎症や組織損傷を引き起こす。このＩＬ－１８のＴｈ１型免疫応答に対する作用はＩＬ－２の存在により、相乗的に高まる。一方で、ＩＬ－１８は、ある条件下では、ＩＬ－４やＩＬ－１３などの抗炎症性サイトカインの誘導を増強し、Ｔｈ２型免疫応答も誘導しうる。
１．２　ＩＬ－１８結合タンパク質
　生体内にはＩＬ－１８に対して特異的に結合するＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）が恒常的に発現している。ＩＬ－１８ＢＰは、４００ｐＭという高親和性で、しかも生体内に大過剰（ＩＬ－１８に対して２０倍以上のモル濃度）で存在するため、分泌されたＩＬ－１８の大部分はＩＬ－１８ＢＰと結合し、その結果受容体への結合が阻害され、活性を失う。このように、ＩＬ－１８ＢＰは、ＩＬ－１８の活性を制御することで、免疫応答を抑制するため、Ｚｈｏｕらは、ＩＬ－１８ＢＰを分泌免疫チェックポイントと表現している（前掲、Zhou et al.）。
１．３　ＩＬ－１８受容体
　ＩＬ－１８受容体は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、好中球、マクロファージなど、さまざまな細胞に発現している。ＩＬ－１８受容体結合部位は、α鎖（ＩＬ－１８Ｒα）及びβ鎖（ＩＬ－１８Ｒβ）からなる。ヒトＩＬ－１８のＩＬ－１８Ｒα結合部位は、ＩＬ－１８ＢＰとの結合部位と類似している可能性があるとの報告がある（前掲Kim et al.）。
２．ヒトＩＬ－１８変異体
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンに置換され、かつ、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンがアラニンに置換された変異体に、さらに少なくとも１つの追加的変異が導入された、ヒトＩＬ－１８変異体である。以下、アミノ酸変異は、変異前のアミノ酸残基と位置及び変異後のアミノ酸残基により、例えば、３８位のシステイン（Ｃ）のセリン（Ｓ）への変異であれば、Ｃ３８Ｓように簡略して示すこともある。野生型ヒトＩＬ－１８としては、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むものを使用することができる。野生型ヒトＩＬ－１８は、配列番号３に示されるアミノ酸配列の一方又は両方の末端に、それぞれ独立して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸が付加されていてもよい。好ましくは、野生型ヒトＩＬ－１８は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する。
（１）ＣＳ変異
　ヒトＩＬ－１８の分子内には、３８位、６８位、７６位、及び１２７位に４つのシステイン（Ｃ）が存在するが、ジスルフィド結合は形成しておらず、すべてのシステイン残基の側鎖はいずれも分子表面に存在する。そのため、ヒトＩＬ－１８は、フリーのシステイン残基が分子間でジスルフィド結合を形成することにより、オリゴマー化を生じやすい。このオリゴマー化は、受容体への結合を阻害し、ヒトＩＬ－１８の不活性化につながる（前掲Yamamoto et al.）。本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、４つのシステインがセリンに変異され、それゆえオリゴマー化とそれによる活性低下が防止される。前記４つのシステインのセリンへの変異（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ）を「ＣＳ変異」と呼ぶ。
（２）ＥＫ変異
　ヒトＩＬ－１８分子の６位のグルタミン酸（Ｅ）と５３位のリシン（Ｋ）は、ＩＬ－１８ＢＰとの相互作用に重要な部位である（前掲Kim et al. 2001）。６位のグルタミン酸と５３位のリシンを、電荷を持たないアミノ酸（アラニン等）に置換することで、ＩＬ－１８ＢＰとの結合親和性を低下させることができる。以下、６位のグルタミン酸と５３位のリシンのアラニン（Ａ）への変異（Ｅ６Ａ、Ｋ５３Ａ）を「ＥＫ変異」と呼ぶ。
（３）ＣＳＥＫ変異
　ＣＳ変異とＥＫ変異の両方を含む変異体には、ＣＳ変異によるオリゴマー化防止効果と、ＥＫ変異によるＩＬ－１８ＢＰとの結合低減効果により、活性の向上が期待される。しかし、発明者らは、ＣＳＥＫ変異体はＣＳ変異体よりも活性が低下し、野生型と比較しても活性は向上せず、同等あるいはやや低下することを見出した。これは、６位のグルタミン酸（Ｅ）と５３位のリシン（Ｋ）が、ＩＬ－１８Ｒαとの結合にも関与するため、その変異が受容体との結合を通じた活性発現に影響するためと考えられる。以下、ＣＳ変異とＥＫ変異の両方を含む変異を「ＣＳＥＫ変異」、ＣＳＥＫ変異を含むヒトＩＬ－１８変異体を「ヒトＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体」と呼ぶ。
（４）追加的変異
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、ヒトＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体をベースとして、さらに少なくとも１つの「追加的変異」を含む。「追加的変異」は、ヒトＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体における、ＣＳ変異及びＥＫ変異の効果を損なうことなく、ＩＬ－１８Ｒαへの結合性を変化させることで、ヒトＩＬ－１８変異体の活性を向上させる。
　追加的変異には、以下の変異が含まれる：
（a）３位のグリシン（Ｇ）の変異：好ましくは、３位のグリシン（Ｇ）のチロシン（Ｙ）への変異（Ｇ３Ｙ）、及びロイシン（Ｌ）への変異（Ｇ３Ｌ）；
（b）６位のアラニン（Ａ）（野生型配列ではグルタミン酸（Ｅ））のアラニン以外の電荷を有しないアミノ酸への変異：好ましくは６位のアラニン（野生型配列ではグルタミン酸）のトリプトファン（Ｗ）への変異（Ａ６Ｗ、野生型配列をベースにするとＥ６Ｗ）；
（c）３４位の（トレオニン）の変異：好ましくは、３４位の（トレオニン）のプロリン（Ｐ）への変異（Ｔ３４Ｐ）；
（d）３８位のシステイン（Ｃ）の変異：好ましくは、３８位のシステイン（Ｃ）のメチオニン（Ｍ）への変異（Ｃ３８Ｍ）；
（e）５１位のメチオニン（Ｍ）の変異：好ましくは、５１位のメチオニン（Ｍ）のチロシン（Ｙ）への変異（Ｍ５１Ｙ）；
（f）７２位のセリン（Ｓ）の変異：好ましくは、７２位のセリン（Ｓ）のチロシン（Ｙ）への変異（Ｓ７２Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）への変異（Ｓ７２Ｆ）、メチオニン（Ｍ）への変異（Ｓ７２Ｍ）、ロイシン（Ｌ）への変異（Ｓ７２Ｌ）、及びトリプトファン（Ｗ）への変異（Ｓ７２Ｗ）；
（g）１１２位のリシン（Ｋ）の変異：好ましくは、１１２位のリシン（Ｋ）のトリプトファン（Ｗ）への変異（Ｋ１１２Ｗ）；
（h）１１９位のリシン（Ｋ）の変異：好ましくは、１１９位のリシン（Ｋ）のバリン（Ｖ）への変異（Ｋ１１９Ｖ）；
（i）１４５位のグリシン（Ｇ）の変異：好ましくは、１４５位のグリシン（Ｇ）のアスパラギン（Ｎ）への（Ｇ１４５Ｎ）；
（j）７位と５０位の間へのジスルフィド結合の導入：すなわち、７位と５０位のセリン（Ｓ）のシステイン（Ｃ）への変異（Ｓ７／５０Ｃ）。
　より好ましくは、前記追加的変異は、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７２Ｗ、及びＳ７／５０Ｃである。
　さらに好ましくは、前記追加的変異は、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、及びＳ７２Ｗである。
　上記したヒトＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体のうち、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、及びＳ７２Ｍを有する変異体はＥＫ変異やＣＳＥＫがない場合でも比較的高い活性を示す。すなわち、ヒトＩＬ－１８ＣＳ変異体又はヒトＩＬ－１８野生型の３位、３８位、又は７２位を野生型のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換した変異体、とくに、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、及びＳ７２Ｍから選ばれるいずれの点変異を導入した変異体も本発明の範囲に包含される。
２．２　ヒトＩＬ－１８変異体のアミノ酸配列
　好ましい本発明のヒトＩＬ－１８変異体のアミノ酸配列は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９，２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７に示される。これらのアミノ酸配列において、上記したＣＳ変異（Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ）、ＥＫ変異（Ｅ６Ａ、Ｋ５３Ａ）、追加的変異（例えば、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ａ６Ｗ、Ｔ３４Ｐ、Ｃ３８Ｍ、Ｍ５１Ｙ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７２Ｗ、Ｋ１１２Ｗ、Ｋ１１９Ｖ、Ｇ１４５Ｎ、及びＳ７／５０Ｃ）の部位以外の部位において、ヒトＩＬ－１８変異体の構造安定性及び活性に変化を与えない微細な改変を含む変異体も、本発明のヒトＩＬ－１８変異体に包含される。そのような微細な改変を含むヒトＩＬ－１８変異体は、前記配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９，２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、及び６７に示されるアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有する。
２．３　ヒトＩＬ－１８変異体をコードするＤＮＡ配列
　ヒトＩＬ－１８変異体をコードするＤＮＡは、後述する組換え生産のために、使用する宿主に応じて配列を最適化する。上記アミノ酸配列を有するヒトＩＬ－１８変異体について、大腸菌での発現用にコドン最適化したＤＮＡ配列の一例は、それぞれ配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、及び６８に示される。ＤＮＡ配列は、使用する宿主に合わせて適宜最適化される。
２．４　ＩＬ－１８活性
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、安定性と改善された活性を併せ持つ。ＩＬ－１８の活性としては、ＩＦＮγ産生誘導の増強、ＣＤ８陽性キラー型αβＴ細胞、γδ型Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４ＣＤ８陰性キラーαβ型Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞）など、免疫エフェクター細胞（とくに、ＮＫ細胞、γδ型Ｔ細胞が好ましく、ＮＫ細胞がより好ましい）の増殖誘導の増強、ＨＬＡ－ＤＲ／ＨＬＡ－ＤＱなど主要組織適合性抗原の発現増強、ＣＤ８０／ＣＤ８６の発現増強、ＣＤ２５の発現増強、ＩＣＯＳの発現増強等を挙げることができる。本発明において、「野生型ヒトＩＬ－１８より高い活性を有する」とは、前述の活性のいずれかが野生型より高いことを意味する。
　好ましくは、本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、野生型ヒトＩＬ－１８よりもＩＦＮγ産生誘導増強能（活性）が向上している。例えば、本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、３ｎｇ／ｍｌ濃度において、野生型よりもＩＦＮγ産生誘導増強能（活性）が向上している。
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、目的に応じて、例えばプレニル化、アセチル化、アミド化、カルボキシル化、グリコシル化、ＰＥＧ化などの修飾をしてもよく、そのような修飾ヒトＩＬ－１８変異体も本発明の範囲に含まれる。
３．ヒトＩＬ－１８変異体の製造
３．１　コドン最適化
　ヒトＩＬ－１８（前駆体）をコードするＤＮＡ酸配列は、発現量を最大化するため、使用する宿主に応じて最適化することが好ましい。コドンの最適化は、市販のコドン最適化のためのソフトウェア（GeneOptimizer（登録商標）等）を用いて実施することができる。
３．２　変異の導入
　ヒトＩＬ－１８（前駆体）への変異の導入は、ＤＮＡの全合成により行うことができる。また、既報（前掲Yamamoto et al., Kim et al.）に従い、市販の部位特異的変異導入システムを用いて実施することができる。具体的には、目的とする変異導入部位を挟むプライマーペアを用意し、一方のプライマーに目的の変異を組み込み、前記プライマーペアを用いて鋳型配列を含むプラスミドを増幅することで、目的の変異を導入することができる。目的とする変異の導入は、増幅後の配列をライゲーションし、大腸菌等を用いてクローニングした後、配列決定することにより確認することができる。
３．３　変異体の発現
　目的の変異を含むヒトＩＬ－１８変異体（前駆体）をコードするＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み込んだ後、宿主細胞に導入して発現させる。
　使用する宿主細胞はヒトＩＬ－１８を発現可能な細胞である限り特に限定されず、大腸菌などの原核細胞、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの真核細胞を使用することができる。大腸菌としては、大腸菌XL1-Blue、大腸菌XL2-Blue、大腸菌DH1、大腸菌MC1000、大腸菌KY3276、大腸菌W1485、大腸菌JM109、大腸菌HB101、大腸菌No.49、大腸菌W3110、大腸菌NY49または大腸菌DH5α、大腸菌RosettaTM(DE3)pLysS、大腸菌RosettaTM2(DE3)pLysSなどがあげられる。
　発現ベクターは、宿主で発現可能なものであれば特に限定されない。大腸菌で使用可能なベクターとしては、pAT153、pACYC184、pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC系、pBluescript II、pMTL20、pBS、pGEM、pBEMEX、pUR222、pUCBM、pSP系、pEX系、pCAT系、pT3/T7、pEUK、pMAM、pMSG、pEMBL、pSELECT、pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pKK233-2、pSE280、pGEMEX-1、pQE-8、pGEX、pET系、pME18SFL3pGEX-4T-1、pACYC177、pKK338-1、pKC30、pKT279、pFB系、pNO1523、pSVL、pKSV10、pGA482、pNOS、pHSV106、pColdTMシリーズ等を挙げることができる。
　酵母で使用可能なベクターとしては、例えば、YEP13、YEp24、YCp50等を挙げることができる。昆虫細胞で使用可能なベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393およびpBlueBacIIIを挙げることができる。植物細胞で使用可能なベクターとしては、例えば、Tiプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。
　動物細胞で使用可能なベクターとしては、例えば、pcDNAI、pCDM8、pAGE107、pCDM8、pcDNAI/Amp、pcDNA3.1、pREP4、pAGE103、pAGE210、pME18SFL3、INPEP4等を挙げることができる。
　ヒトＩＬ－１８は糖鎖を有さないため、本発明のヒトＩＬ－１８変異体（前駆体）は大腸菌を宿主として簡便に組換え発現することができる。
　ヒトＩＬ－１８変異体は、後の精製や検出を容易にするため、可溶性のタグ配列、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグやグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ等と融合して発現させてもよい。
３．４　精製
　ヒトＩＬ－１８変異体（前駆体）は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動など、当該分野で周知の方法が採用できる。
　アフィニティークロマトグラフィー
　ヒトＩＬ－１８変異体（前駆体）に、予めＨｉｓタグやＧＳＴタグなどの可溶性タグを導入した場合には、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、簡便に精製することができる。
　Ｈｉｓタグは、特定の条件下でニッケル、コバルト、銅などの固定化金属イオンに結合するため、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質として発現されたヒトＩＬ－１８変異体は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を利用して容易に精製をすることができる。ＩＭＡＣとしては、例えば、ニッケルを利用したＩＭＡＣであるニッケルカラムや、コバルトを利用したＩＭＡＣであるＴａｌｏｎカラムを挙げることができる。
　ＧＳＴタグは、通常の条件でグルタチオン樹脂に選択的に結合するため、ＧＳＴタグとの融合タンパク質として発現されたヒトＩＬ－１８変異体は、グルタチオン樹脂を用いたクロマトグラフィーを利用して容易に精製することができる。
　ゲルろ過
　ヒトＩＬ－１８変異体の分子量は１８ｋＤａである。使用する担体は、目的タンパクの分子量、スケール、操作時間を考慮して、適宜選択することができる。ゲルろ過クロマトグフィーは、上記アフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて使用してもよい。
３．５　プロペプチドの切断
　ヒトＩＬ－１８変異体前駆体から、成熟型ヒトＩＬ－１８変異体の生成には、プロペプチドの切断が必要である。プロペプチドの切断には、カスパーゼ１又はカスパーゼ４のほか、カスパーゼ５等を使用することができる。使用するカスパーゼの由来は特に限定されないが、ヒト由来のカスパーゼであることが好ましい。
　カスパーゼは、アポトーシスや炎症などのプロセスで中心的な役割を果たすプロテアーゼである。哺乳動物では、カスパーゼ１～１４が発見されており、カスパーゼ１、４、及び５はいずれも炎症性のカスパーゼとして知られている。カスパーゼ１、４及び５は、いずれも不活性な前駆体（プロカスパーゼ）として発現し、プロテアーゼによるプロセシングを受けて、Ｐ２０及びＰ１０サブユニットからなるヘテロテトラマーからなる成熟カスパーゼとなる。
　カスパーゼ１、４、及び５は、市販のものを使用してもよいし、アミノ酸配列、及びこれをコードするＤＮＡ配列は公知であるため、ＩＬ－１８変異体について説明したように、常法にしたがい、組換え生産により製造してもよい。組換え生産においては、ヒトカスパーゼの自己消化を防止するため、作用をうけやすい部位に適当な変異を導入してもよい。
　後述する実施例では、野生型ヒトカスパーゼ４前駆体のアミノ酸配列（配列番号３９）において、３１５位のアスパラギン酸をグルタミン酸に変異させたヒトカスパーゼ４（Ｄ３１５Ｅ）（配列番号４０）を使用した。この組換えヒトカスパーゼ４変異体も本発明の範囲である。
　ＩＬ－１８のプロペプチドの切断には、カスパーゼの他にファクターＸａを使用することもできる（前掲Yamamoto et al., Kim et al.）。ファクターＸａは、２つのサブユニットからなる５９Ｄａのプロテアーゼである。ファクターＸａとしては、市販ウシ血漿由来のファクターＸａを使用することができる。また、ファクターＸａのアミノ酸配列、及びこれをコードするＤＮＡ配列は公知であるため（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１０８０２１３．２）、常法により製造して使用してもよい。
３．６　活性測定
　ヒトＩＬ－１８変異体の活性は、ＩＦＮγ産生誘導の増強、ＮＫ細胞増殖誘導の増強、ＨＬＡ－ＤＲ／ＤＱ発現増強、ＣＤ８０／ＣＤ８６発現増強、ＣＤ２５発現増強のいずれかを、野生型ＩＬ－１８の活性と比較することで確認することができる。
　ＩＦＮγ産生誘導増強能は、ＨＢＬ－３８細胞、Ｍｏ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ７８細胞、ＥＬ４細胞、Ｌ１２－Ｒ４細胞、ＫＧ－１細胞（ヒト急性骨髄性白血病株）などのＩＦＮγ産生細胞に、ヒトＩＬ－１８変異体を、約０．１ｎｇ～１μｇ／ｍｌ、好ましくは約１～１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して培養し、培養液中のＩＦＮγ量をＥＬＩＳＡ等により測定することで、確認することができる。本発明のＩＬ－１８変異体は、野生型よりも高いＩＦＮγ産生誘導増強能を有する。
　ＮＫ細胞増殖誘導増強は、ＣＤ３陽性細胞を除去したヒト末梢血単核球にＩＬ－２／ＩＬ－１８変異体を添加して培養し、ＮＫ細胞特異的マーカー（例えば、ＣＤ５６陽性、ＣＤ１６１陰性、ＣＤ３陰性）の増加を、細胞数を計数して確認することができる。
　ＮＫ細胞上の発現分子の変化は、フローサイトメトリー等を用いて測定することで、確認することができる。具体的には、上記のようにＩＬ－２／ＩＬ－１８変異体で培養したＮＫ細胞と、ＩＬ－２単独で培養したＮＫ細胞上に発現するＨＬＡ－ＤＲ／ＤＱやＣＤ８０／８６を比較することにより確認することができる。
　ヒトＩＬ－１８とマウスＩＬ－１８（マウスＩＬ－１８前駆体：配列番号４３、成熟マウスＩＬ－１８：配列番号４４）の間に交差反応性は認められないため、マウスを使用した実験のためには本発明のヒトＩＬ－１８変異体に対応するマウスＩＬ－１８変異体を作製する必要がある。ヒトＩＬ－１８とマウスＩＬ－１８の一次構造にはある程度の相同性が認められるため、上述した方法にしたがい、野生型マウスＩＬ－１８にＣＳ変異を導入し、さらにＩＬ－１８ＢＰとの相互作用に重要な部位を置換し、追加的変異を導入することにより、対応するマウスＩＬ－１８変異体を得ることができる。
４．医薬組成物
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、ＩＦＮγ産生誘導増強などの活性が高く、したがって、ＩＦＮγに感受性を有するウイルス性疾患、がん、免疫疾患を治療又は予防するための医薬組成物として有用である。
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体を含む医薬組成物は、薬理学上許容される担体や添加物を含むものであってもよい。そのような担体や添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味剤、着色剤、緩衝剤、流動性促進剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体や添加物が適宜使用できる。
　賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ－マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが挙げられる。
　結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ－マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。
　滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが挙げられる。
　溶剤としては、精製水、生理的食塩水、リン酸緩衝液などが挙げられる。
　崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが挙げられる。
　溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
　懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
　等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが挙げられる。
　安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが挙げられる。
　無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが挙げられる。
　防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
　抗酸化剤としては、水溶性抗酸化剤であるアスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、脂溶性抗酸化剤であるアスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ハイドロキシトルエン（BHT）、レシチン、プロピルガレート、α－トコフェロール、及び金属キレート剤であるクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸が挙げられる。
　矯味矯臭剤としては、医薬分野において通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬分野において通常に使用される着色料が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されず、経口でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、骨髄内注射、髄腔内注射、皮内注射が例示できる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物は、治療的有効量で対象に投与される。「治療的有効量」とは、選択された状態を緩和するのに有用である治療作用物質の量を指す。治療的有効量は、使用目的、投与経路、患者の年齢や症状等によって適宜決定される。ヒトに投与する場合は、例えば、患者あたり、ヒトＩＬ－１８変異体として、少なくとも０．００１ｍｇ/ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ/ｋｇ、さらに好ましくは１ｍｇ/ｋｇであり、多くとも１００ｍｇ/ｋｇ、好ましくは５０ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは２０ｍｇ/ｋｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ/ｋｇである。例えば、患者あたり、ヒトＩＬ－１８変異体として、０．００１～１００ｍｇ/ｋｇ、好ましくは０．０１～５０ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは０．１～２０ｍｇ/ｋｇ、さらに好ましくは１～１０ｍｇ/ｋｇである。
　本発明の医薬組成物の適用対象となるがんとしては、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、及び慢性リンパ性白血病などの白血病、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫などの悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、頭頸部癌、舌癌、咽頭癌、口腔癌、食道癌、食道腺癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、胆道癌、膵臓癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌などの肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部癌、腎癌、腺癌、尿路上皮癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、ブドウ膜悪性黒色腫、悪性黒色腫、メルケル細胞癌などの皮膚癌、神経芽腫、神経膠芽腫、脳腫瘍、胸膜中皮腫が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物の適用対象となるウイルス性疾患としては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などが関与するウイルス疾患、特に免疫不全を伴うウイルス疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物の適用対象となる免疫疾患としては、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、腎炎、乾癬、喘息、悪性貧血、甲状腺機能高進症、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、アジソン病、ホジキン病、ＡＩＤＳなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物は、本発明の目的を損なわない限り、他の薬剤や治療方法と併用してもよい。
　がんの治療の場合であれば、分子標的薬、例えば、免疫チェックポイント阻害剤を含むモノクローナル抗体（リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、オビヌツズマブ、ジヌツキシマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ブリナツモマブ、ラムシルマブ、ネシツムマブ、エロツズマブ、ダラツムマブ、モガムリズマブ、イノツズマブ、オララツマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ）、チロシンキナーゼ阻害剤（イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ボスチニブ、クリゾチニブ、アキシチニブ、ルキソリチニブ、レゴラフェニブ、ポナチニブ、カボザンチニブ、イブルチニブ、セリチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ）、ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤（テムシロリムス、エベロリムス）、その他キナーゼ阻害剤（ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、パルボシクリブ、コビメチニブ、ミドスタウリン、イデラリシブ）、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ）、レチノイン酸受容体作動薬（トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン、タミバロテン）、ＳＭＯ拮抗剤（ビスモデジブ）、ＶＥＧＦ阻害剤（アフリベルセプト）、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ、ニラパリブ）；ホルモンおよびホルモン拮抗薬（フルオキシメステロン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド、エチニルエストラジオール、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、プレドニゾン、オクトレオチド、メドロキシプロゲステロン）；免疫機能補助療法、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α２ｂ）、インターロイキン（アルデスロイキン、オプレルベキン、テセロイキン、デニロイキン、ディフチトクス）、コロニー刺激因子（フィルグラスチム、サルグラモスチム、レノグラスチム、ペグフィルグラスチム）、造血幹細胞動員促進剤（プレリキサフォル）、非特異的免疫調節剤（サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド）；アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、微小管高分子安定化剤（パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル）、分裂阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤等を適宜組み合わせることができる。
　とくに、野生型ＩＬ－１８とＩＬ－２（テセロイキン）、野生型ＩＬ－１８と抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、抗ＣＴＬＡ－４抗体（イピリムマブ、トレメリムマブ）などの免疫チェックポイント阻害剤との併用効果が報告されていることから（特開2004-315381、WO2016/021720）、本発明のヒトＩＬ－１８変異体との併用効果も期待できる。
　ウイルス性疾患の場合であれば、核酸系逆転写酵素阻害剤であるジドブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、エムトリシタビン、非核酸系逆転写酵素阻害剤であるネビラピン、エファビレンツ、エトラビン、リルピビリン、ドラビリン、プロテアーゼ阻害剤であるネルフィナビル、リトナビル、ロピナビル、アタザナビル、ダルナビル、インテグラーゼ阻害剤であるラルテグラビル、エルビデグラビル、ドルテグラビル、新入阻害剤であるマラビロク、またはこれらの１又は２以上を含む配合剤等と適宜組み合わせて使用することができる。
　免疫疾患の場合であれば、セレコキシブやロキソプロフェンナトリウムなどのＮＳＡＩＤ、ブシラミン、サラゾスルファピリジン、メトトレキセート、ミゾリビン、タクロリムスなどのＤＭＡＲＤ、生物学的製剤であるインフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、アバタセプト、トシリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブベゴル、レミケード、ヒト組換えＩＬ－１２、ステロイド薬であるプレドニゾロン、ＪＡＫ阻害剤であるトファシチニブ等と適宜組み合わせて使用することができる。
　製剤化のために、ヒトＩＬ－１８変異体は、ＰＥＧなどの水溶性のポリマーと複合化してもよい（ＷＯ２００４／０９１５１７）。
６．その他の利用
６．１　増殖誘導剤、刺激剤
　ＰＴＡ／ＩＬ－２で刺激して培養したγδ型Ｔ細胞よりも、ＰＴＡ／ＩＬ－２／ＩＬ－１８で刺激して培養したγδ型Ｔ細胞の方が培養後の数が多いことが知られている。また、αβ型Ｔ細胞、γδ型Ｔ細胞、ＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞やキラー細胞では、ＩＬ－１８を添加すると、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱなどの主要組織適合性抗原、ＣＤ８０、ＣＤ８６（正の副刺激分子）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体）、ＩＣＯＳ（正の副刺激分子）などの発現が向上し、抗原提示能が付与された、優れた免疫エフェクター細胞になる。
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、そのようなＮＫ細胞、ＣＤ８陽性キラーαβ型Ｔ細胞、γδ型Ｔ細胞を活性化し、増殖を誘導する活性が高く、それゆえＮＫ細胞、ＣＤ８陽性キラーαβ型Ｔ細胞、γδ型Ｔ細胞の増殖誘導剤あるいは刺激剤として使用することができる。例えば、本発明のヒトＩＬ－１８変異体を、ＩＬ－２とともに、Ｔ細胞を含む細胞集団に添加することで、Ｔ細胞を拡張することができる。
６．２　遺伝子改変Ｔ細胞の調製
　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、ＣＡＲ－Ｔ療法などの遺伝子改変Ｔ細胞療法において、Ｔ細胞の拡張のために使用することができる。具体的に言えば、対象の末梢血からＴ細胞を含む末梢血単核球集団を単離し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した後、ＩＬ－２とヒトＩＬ－１８変異体で増殖誘導して、Ｔ細胞を拡張した後、遺伝子を導入し、さらに遺伝子導入後のＴ細胞をＩＬ－２とＩＬ－１８変異体で増殖誘導して、拡張することで、効率的に遺伝子改変Ｔ細胞を調製することができる。
　例えば、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）発現Ｔ細胞を利用したＣＡＲ－Ｔ療法では、末梢血単核球を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、ＩＬ－２で増殖誘導してＴ細胞を拡張するが、その際にＩＬ－２に加えてＩＬ－１８を添加して増殖誘導することで、より効率よくＴ細胞を拡張することができる。
　上記のほか、本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、ＮＫ細胞、ＣＤ８陽性キラーαβ型Ｔ細胞、γδ型Ｔ細胞の活性化や増殖を指標とした診断や評価方法においても、刺激剤あるいは増殖誘導剤として使用することができる。
　以下、本発明について実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ヒトカスパーゼ4変異体（hCasp4-D315E）の調製
　ヒトIL-18の組換え生産のために、pro-IL-18（ＩＬ－１８前駆体）を切断するためのヒトカスパーゼ4を調製した。ヒトカスパーゼ4は、P10及びP20の2つのサブユニットからなるヘテロダイマーである。本実施例では、P10の自己消化を防ぐために、野生型ヒトカスパーゼ4前駆体のアミノ酸配列（配列番号３９）中315位のアスパラギン酸（D）をグルタミン酸（E）に置換した変異体（hCasp4-D315E（図２、配列番号４０）を調製した。
(1) His-tagged hCasp4-D315E発現ベクターの作製
　プロペプチドを含まないhCasp4-D315EをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に配列を最適化した（配列番号４１）。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hCasp4-D315E-SalI（図３、配列番号４２）を作製した。NdeI-hCasp4-D315E-SalIをpUCIDT-Amp plasmidのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、アンピシリンを含むLB培地（LB/Amp）でコロニーをスクリーニングし、pUCIDT-NdeI-hCasp4-D315E-SalIをコロニーから抽出した。
　pUCID-Amp-NdeI-hCasp4-D315E-SalIから切り出したNdeI-hCasp4-D315E-SalIを、pColdTMIIベクター（Takara）のマルチクローニングサイトに組み込んだ（図４）。pColdTMIIベクターは、15℃に冷却することで、目的タンパク質をHisタグと融合した可溶性タンパク質として発現する。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、選択用薬剤を含むLB培地でコロニーをスクリーニングし、hCasp4-D315Eを含むベクターをコロニーより抽出した。
(2) His-tagged hCasp4-D315Eの発現
　上記ベクターで大腸菌BL21(DE3) pLysSを形質転換し、生成したコロニーを選択用薬剤を含むLB培地 10 mlの入ったチューブに移し、37℃、10時間培養した。培養液10 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で一晩培養した。前記培養液50 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で8時間培養した（OD600 nM: 1.641）。培養液に終濃度1 mMとなるように1 M IPTG 1 mlを加え、大腸菌懸濁液を調製した。大腸菌懸濁液は、15℃でさらに20時間培養し、可溶性hCasp4-D315E（His-tagged hCasp4-D315E）の発現を誘導した。培養後の懸濁液を、遠心分離（7,000 rpm、10分、4℃）し、上清を捨て、大腸菌ペレットを回収し、-30℃で凍結保存した。
(3) His-tagged hCasp4-D315Eの精製
　凍結された大腸菌ペレットを、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4、300 mM NaCl含む）20 mlに再懸濁した。懸濁液を超音波処理（20 sec、5回）し、遠心分離（7,000rpm、30分、4℃）にかけ、上清を50 mlコニカルチューブに移した。チューブにDNAse1 100 μlを加え、遠心分離（10,000 rpm、30分、4℃）にかけ、上清を新しい50 mlコニカルチューブに移した。懸濁液を0.22 mMフィルターで濾過し、His-tagged hCasp4-D315Eを含むサンプルを得た。得られたサンプルをTALON Superflowカラムクロマトグラフィー(3 ml bed volume)にかけてHis-tagged hCasp4-D315Eを精製した。精製したHis-tagged hCasp4-D315Eは、さらにSuperdex 200pg HiLoad 26/600 カラムにかけて精製し、SDS-PAGEで確認した（図５）。
実施例２：ヒト天然型IL-18の調製
　ヒト天然型IL-18はプロペプチドを含む前駆体（配列番号２）として発現し、カスパーゼの作用を受けて、活性を有する成熟hIL-18（配列番号３）となる（図６、図７）。本実施例では、大腸菌でhProIL-18を発現させ、実施例１で調製したhCasp4-D315Eで処理することにより、hIL-18を生産した。
(1) His-tagged hProIL18発現ベクターの作製
　プロペプチドを含むヒトIL-18をコードするDNA配列（配列番号１、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC007461.1）を、大腸菌での発現用に配列を最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18-SalIを作製した（図８、配列番号４）。NdeI-hProIL18-SalIをpUCIDT-Amp plasmidのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、LB/Ampでコロニーをスクリーニングし、pUCIDT-NdeI-hProIL18-SalIをコロニーより抽出した。
　pUCIDT-NdeI-hProIL18-SalIから切り出したNdeI-hProIL18-SalIをpColdTMIIベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、選択用薬剤を含むLB培地でコロニーをスクリーニングし、hProIL18を含むベクターをコロニーより抽出した。
(2) His-tagged hProIL18の発現
　上記ベクターで大腸菌Rosetta(DE3)pLysS（Merck）を形質転換し、生成したコロニーを選択用薬剤を含むLB培地10mLの入ったチューブに移し、37℃で7時間培養した。培養液10 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で一晩培養した。前記培養液100 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で5時間30分培養した。培養液に終濃度1 mMとなるように1 M IPTG 1 mlを加え、大腸菌懸濁液を調製した（OD600 nM: 2.102）。大腸菌懸濁液は、15℃でさらに40時間30分培養し、可溶性hProIL18（His-tagged hProIL18）の発現を誘導した。培養後の懸濁液を、遠心分離（7,000 rpm、10分、4℃）し、上清を捨て、大腸菌ペレットを回収し、-30℃で凍結保存した。
(3) His-tagged hProIL18の精製
　凍結された大腸菌ペレットを、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4、300 mM NaCl含む）20 mlに再懸濁した。懸濁液を超音波処理（20 sec、5回）し、遠心分離（7,000rpm、30分、4℃）にかけ、上清を50 mlコニカルチューブに移した。チューブにDNAse1 200 μlを加え、遠心分離（33,000 rpm、30分、4℃）にかけ、上清を新しい50 mlコニカルチューブに移しに。懸濁液を0.22 mMフィルターで濾過し、His-tagged hProIL18を含むサンプルを得た。得られたサンプルをTALON Superflowカラム（3 ml bed volume）にかけてHis-tagged hProIL18を精製した。精製したHis-tagged hProIL18はさらにSuperdex 200pg HiLoad 26/600 カラムにかけて精製した。精製hProIL18はhCasp4-D315Eで処理し、SDS-PAGEでhIL18を確認した（図９）。
実施例３：ヒトIL-18-CSの調製
　ヒトIL-18の38位、68位、76位、127位のシステイン残基をすべてアラニンに置換したhIL-18-CS（配列番号５）を作製した。
(1) His- and GST-tagged hProIL18-CS発現ベクターの作製
　プロペプチドを含むヒトIL-18-CSをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18-CS-SalI（配列番号６）を作製した。NdeI-hProIL18-CS-SalIをpUCIDT-Amp plasmidのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、LB/Ampでコロニーをスクリーニングし、pUCIDT-NdeI-hProIL18-CS-SalIをコロニーより抽出した。
　pUCIDT-NdeI-hProIL18-CS-SalIから切り出したNdeI-hProIL18-CS-SalIを pColdTMGSTベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。pColdTMGSTベクター（Takara）は、15℃に冷却することで、目的タンパク質をHis-GSTタグと融合した可溶性タンパク質として発現する。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、選択用薬剤を含むLB培地でコロニーをスクリーニングし、hProIL18-CS を含むベクターをコロニーより抽出した。
(2) His- and GST-tagged hProIL18-CSの発現
　上記ベクターで大腸菌Rosetta(DE3)pLysS（Merck）を形質転換し、生成したコロニーを選択用薬剤を含むLB培地10mLの入ったチューブに移し、37℃で24時間培養した。培養液10 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で一晩培養した。前記培養液50 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で8時間培養した。培養液に終濃度1 mMとなるように1 M IPTG 1 mlを加え、大腸菌懸濁液を調製した（OD600 nM: 2.690）。大腸菌懸濁液は、15℃でさらに40時間培養し、可溶性hProIL18-CS（His- and GST-tagged hProIL18-CS）の発現を誘導した。培養後の懸濁液を、遠心分離（7,000 rpm、10分、4℃）し、上清を捨て、大腸菌ペレットを回収し、-30℃で凍結保存した。
(3) His- and GST-tagged hProIL18-CSの精製
　凍結された大腸菌ペレットを、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4、300 mM NaCl含む）20 mlに再懸濁した。懸濁液を超音波処理（20 sec、5回）し、遠心分離（7,000rpm、30分、4℃）にかけ、上清を50 mlコニカルチューブに移した。チューブにDNAse1 200 μlを加え、遠心分離（10,000 rpm、30分、4℃）にかけ、上清を新しい50 mlコニカルチューブに移した。懸濁液を0.22 mMフィルターで濾過し、His- and GST-tagged hProIL18-CSを含むサンプルを得た。得られたサンプルをTALON Superflowカラム（3 ml bed volume）にかけてHis- and GST-tagged hProIL18-CSを精製した。精製したHis- and GST-tagged hProIL18-CSはさらにSuperdex 200pg HiLoad 26/600 カラムにかけて精製した。精製hProIL18-CSはhCasp4-D315Eで処理し、SDS-PAGEでhIL18-CSを確認した。
実施例４：ヒトIL-18-CSEKの調製
　実施例３で調製したヒトIL-18-CSにおいて、さらに6位のグルタミン酸残基をアラニンに置換（E6A）、及び53位のリシン残基をアラニンに置換（K53A）したhIL-18-CSEK（配列番号７）を作製した。ヒトIL-18の6位のグルタミン酸残基、及び53位のリシンは、IL-18BPとの相互作用に重要な荷電アミノ酸であり、この部分の電荷を除くことにより、IL-18BPとの親和性を低下させることが知られている（前掲Kim et al. 2001）。
(1) His- and GST-tagged hProIL18-CSEK発現ベクターの作製の作製
　プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEKをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18-CSEK-SalIを作製した（配列番号８）。NdeI-hProIL18-CSEK-SalIをpUCIDT-Amp plasmidのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、LB/Ampでコロニーをスクリーニングし、pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-SalIをコロニーより抽出した。
　pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-SalIから切り出したNdeI-hProIL18-CSEK-SalIを pColdTMGSTベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、選択用薬剤を含むLB培地でコロニーをスクリーニングし、hProIL18-CSEKを含むベクターをコロニーより抽出した。
(2) His- and GST-tagged hProIL18-CSEKの発現
　上記ベクターで大腸菌Rosetta(DE3)pLysS（Merck）を形質転換し、生成したコロニーを選択用薬剤を含むLB培地10mLの入ったチューブに移し、37℃で48時間培養した。培養液10 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で一晩培養した。前記培養液50 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で11時間培養した。培養液に終濃度1 mMとなるように1 M IPTG 1 mlを加え、大腸菌懸濁液を調製した（OD600 nM: 1.894）。大腸菌懸濁液は、15℃でさらに37時間培養し、可溶性hProIL18-CSEK（His- and GST-tagged hProIL18-CSEK）の発現を誘導した。培養後の懸濁液を、遠心分離（7,000 rpm、10分、4℃）し、上清を捨て、大腸菌ペレットを回収し、-30℃で凍結保存した。
(3) His- and GST-tagged hProIL18-CSEKの精製
　凍結された大腸菌ペレットを、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4、300 mM NaCl含む）20 mlに再懸濁した。懸濁液を超音波処理（20 sec、5回）し、遠心分離（7,000rpm、30分、4℃）にかけ、上清を50 mlコニカルチューブに移した。チューブにDNAse1 200 μlを加え、遠心分離（10,000 rpm、30分、4℃）にかけ、上清を新しい50 mlコニカルチューブに移した。懸濁液を0.22 mMフィルターで濾過し、His-tagged hProIL18-CSEKを含むサンプルを得た。得られたサンプルをTALON Superflowカラム（3 ml bed volume）にかけてHis- and GST-tagged hProIL18-CSEKを精製した。精製したHis- and GST-tagged hProIL18-CSEKはさらにSuperdex 200pg HiLoad 26/600 カラムにかけて精製した。精製hProIL18-CSEKはhCasp4-D315Eで処理し、SDS-PAGEでhIL18-CSEKを確認した。
実施例５：ヒトIL-18-CSEKに基づく各種変異体の作製
Ａ．予備解析
１．インシリコ点変異スキャニング
　hIL-18CSEKの活性は、野生型hIL-18よりも低い。これは、導入された変異がタンパク質自体の構造安定性を損なっているためと考えられた。そこで、全アミノ酸に対し計算機上で1残基変異を網羅的に導入し、Gibbs自由エネルギー変化の差分（ΔΔG）で表されるIL18 folding の相対安定性をスーパーコンピューターで計算した（H. Park et al. 2016 ）。タンパク質が安定化すると予測される場合、ΔΔGの値は負となるため、この値を用いることで定量的に評価が可能となる。この時点でΔΔGの値が負と予想された候補と、配列解析により安定化が予想される変異候補について、さらに精度の高いΔΔGの予測を行った（L. Wang et al. 2013）。そのうえで、IL-18CSEKとIL-18Rα/βタンパク質との結合に影響を与えず、ΔΔGを減少させる点変異を探索した。
２．S-S結合の導入
　Dombkowski 2003 & Craig and Dombkowski 2013 に基づき、IL-18に新規なS-S結合を導入し、熱安定性を改善できるか検討を行った。構造情報（Tsutsumi et al. 2014;構造のProtein Data Bank ID:3W04）を元に、Cα-Cβ-Cβ-Cαの相対的位置からS－S結合を導入した際の構造安定性を予測し、構造ひずみエネルギーが低い、すなわち構造を大きく乱さずS-S結合が入る、残基ペアを探索した。構造ひずみエネルギーが基準となる2.20 kcal/molを下回る同一鎖内のS-S結同導入可能部位として、S7C-S50C（2.05 kcal/mol（chain A）、1.78 kcal/mol (chain B)）を特定した。
Ｂ．点変異の導入
　インシリコ点変異スキャニングで見つかった変異をヒトIL-18-CSEKに導入し、ヒトIL-18-CSEKに基づく各種変異体を調製した。
Ｂ－１．ヒトIL-18-CSEK-G3Yの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに3位のグリシン残基をチロシンに置換したhIL-18-CSEK-G3Y（配列番号９）を作製した。
(1) hProIL18-CSEK-G3Y発現ベクターの作製
　プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-C38MをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalIを作製した（配列番号１０）。NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalIをpUCIDT-Amp plasmidのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、LB/Amp培地でコロニーをスクリーニングし、pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalIをコロニーより抽出した。
　pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalIから切り出したNdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalIをpColdTMIIベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。得られたプラスミドで大腸菌DH5a（TOYOBO）を形質転換し、選択用薬剤を含むLB培地でコロニーをスクリーニングし、hProIL18-CSEKを含むベクターをコロニーより抽出した。
(2) His-tagged hProIL18-CSEK-G3Yの発現
　上記ベクターで大腸菌Rosetta(DE3)pLysS（Merck）を形質転換し、生成したコロニーを選択用薬剤を含むLB培地10mLの入ったチューブに移し、37℃で7時間30分培養した。培養液10 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で一晩培養した。前記培養液100 mlを培地（1L, x 4）に接種して37℃で7時間培養した。培養液に終濃度1 mMとなるように1 M IPTG 1 mlを加え、大腸菌懸濁液を調製した（OD600 nM: 2.295）。大腸菌懸濁液は、15℃でさらに40時間培養し、可溶性hProIL18-CSEK-G3Y（His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y）の発現を誘導した。培養後の懸濁液を、遠心分離（7,000 rpm、10分、4℃）し、上清を捨て、大腸菌ペレットを回収し、-30℃で凍結保存した。
(3) His-tagged hProIL18-CSEK-G3Yの精製
　凍結された大腸菌ペレットを、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4、300 mM NaCl含む）20 mlに再懸濁した。懸濁液を超音波処理（20 sec、5回）し、遠心分離（7,000rpm、30分、4℃）にかけ、上清を50 mlコニカルチューブに移した。チューブにDNAse1 200 μlを加え、遠心分離（10,000 rpm、1h、4℃）にかけ、上清を新しい50 mlコニカルチューブに移した。懸濁液を0.22 mMフィルターで濾過し、His-tagged hProIL18-CSEK-G3Yを含むサンプルを得た。得られたサンプルをTALON Superflowカラム（3 ml bed volume）にかけてHis-tagged hProIL18-CSEK-G3Yを精製した。精製したHis- and GST-tagged hProIL18-CSEK-G3YはさらにSuperdex 200pg HiLoad 26/600 カラムにかけて精製した。精製hProIL18-CSEK-G3YはhCasp4-D315Eで処理し、SDS-PAGEでhIL18-CSEK-G3Yを確認した。
Ｂ－２．ヒトIL-18-CSEK-G3Lの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに3位のグリシン残基をチロシンに置換したhIL-18-CSEK-G3L（配列番号１１）を作製した。
　Ｂ－１に従い、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-G3LをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18-CSEK-G3L-SalI（配列番号１２）を作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-G3Lを作製した。
Ｂ－３．ヒトIL-18-CSEK-A6Wの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに6位のグルタミン酸残基をトリプトファンに置換したhIL-18-CSEK-A6W（配列番号１３）を作製した。
　Ｂ－１に従い、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-A6WをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18-CSEK-A6W-SalI（配列番号１４）を作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-A6Wを作製した。
Ｂ－４．ヒトIL-18-CSEK-T34Pの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに34位のチミン残基をプロリンに置換したhIL-18-CSEK-T34P（配列番号１５）を作製した。
　Ｂ－１に従い、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-T34PをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-T34P-SalIを（配列番号１６）を作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-T34Pを作製した。
Ｂ－５．ヒトIL-18-CSEK-C38Mの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに38位のシステイン残基をメチオニンに置換したhIL-18-CSEK-C38M（配列番号１７）を作製した。
　Ｂ－１に従い、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-T38MをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-C38M-SalI（配列番号１８）を作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-C38Mを作製した。
Ｂ－６．ヒトIL-18-CSEK-M51Yの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに51位のメチオニン残基をチロシンに置換したhIL-18-CSEK-M51Y（配列番号１９）を作製した。
　Ｂ－１に従い、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-M51YをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-M51Y-SalI（配列番号２０）を作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-M51Yを作製した。
Ｂ－７．ヒトIL-18-CSEK-S72Yの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに72位のセリン残基をチロシンに置換したhIL-18-CSEK-S72Y（配列番号２１）を作製した。
　pColdTMIIベクターの代わりにpColdTMGSTベクター（実施例３参照）を使用する以外は、Ｂ－１と同様にして、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK- S72YをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-S72Y-SalI（配列番号２２）を作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK- S72Yを作製した。
Ｂ－８．ヒトIL-18-CSEK-S72Fの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに72位のセリン残基をフェニルアラニンに置換したhIL-18-CSEK-S72F（配列番号２３）を作製した。
　pColdTMIIベクターの代わりにpColdTMGSTベクター（実施例３参照）を使用する以外は、Ｂ－１と同様にして、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-S72FをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-S72F-SalI（配列番号２４）を作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-S72Fを作製した。
Ｂ－９．ヒトIL-18-CSEK-S72Mの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに72位のセリン残基をメチオニンに置換したhIL-18-CSEK-S72M（配列番号２５）を作製した。
　pColdTMIIベクターの代わりにpColdTMGSTベクター（実施例３参照）を使用する以外は、Ｂ－１と同様にして、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-S72MをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-S72M-SalI（配列番号２６）作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-S72Mを作製した。
Ｂ－１０．ヒトIL-18-CSEK-S72Lの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに72位のセリン残基をロイシンに置換したhIL-18-CSEK-S72L（配列番号２７）を作製した。
　pColdTMIIベクターの代わりにpColdTMGSTベクター（実施例３参照）を使用する以外は、Ｂ－１と同様にして、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-S72LをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-S72L-SalI（配列番号２８）を含むベクターを作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-S72Lを作製した。
Ｂ－１１．ヒトIL-18-CSEK-S72Wの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに72位のセリン残基をトリプトファンに置換したhIL-18-CSEK-S72W（配列番号２９）を作製した。
　pColdTMIIベクターの代わりにpColdTMGSTベクター（実施例３参照）を使用する以外は、Ｂ－１と同様にして、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-S72WをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-S72W-SalI（配列番号３０）を含むベクターを作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-S72Wを作製した。
Ｂ－１２．ヒトIL-18-CSEK-K112Wの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに112位のリシン残基をトリプトファンに置換したhIL-18-CSEK-K112W（配列番号３１）を作製した。
　pColdTMIIベクターの代わりにpColdTMGSTベクター（実施例３参照）を使用する以外は、Ｂ－１と同様にして、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-K112WをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-K112W-SalI（配列番号３２）を含むベクターを作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-K112Wを作製した。
Ｂ－１３．ヒトIL-18-CSEK-K119Vの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに119位のリシン残基をバリンに置換したhIL-18-CSEK-K119V（配列番号３３）を作製した。
　pColdTMIIベクターの代わりにpColdTMGSTベクター（実施例３参照）を使用する以外は、Ｂ－１と同様にして、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-K119VをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-K119V-SalI（配列番号３４）を含むベクターを作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-K119Vを作製した。
Ｂ－１４．ヒトIL-18-CSEK-G145Nの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに145位のグアニン残基をアスパラギンに置換したhIL-18-CSEK-G145N（配列番号３５）を作製した。
　Ｂ－１に従い、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-G145NをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-G145N-SalI（配列番号３６）を含むベクターを作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-G145Nを作製した。
Ｂ－１５．ヒトIL-18-CSEK-S7/50Cの調製
　実施例４で調製したヒトIL-18-CSEKにおいて、さらに7位及び50位のセリン残基をいずれもシステインに置換したhIL-18-CSEK-S7/50C（配列番号３７）を作製した。
　Ｂ－１に従い、プロペプチドを含むヒトIL-18-CSEK-S7/50CをコードするDNA配列を、大腸菌での発現用に最適化した。最適化された配列のN末端及びC末端に、それぞれ制限酵素NdeI及びSalIの認識配列を付加してNdeI-hProIL18CSEK-S7/50C-SalI（配列番号３８）を含むベクターを作製し、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として発現させ、TALONカラム及びSuperdex 200pgカラムで精製後、hCasp4-D315Eで処理してhIL18-CSEK-S7/50Cを作製した。
試験例１：変異体活性測定１－凝集活性
　凍結したKG-1細胞をRPMI1640/10％FCS培地12 ml中で解凍した。チューブを遠心分離（1,700 rpm、5分間、4℃）にかけ、上清を吸引後、細胞ペレットを分散させ、10 mlのRPMI1640/10％FCS培地に再懸濁した（細胞数：2.00 x 106細胞/ ml、合計10 ml）。チューブを再び遠心分離（1,700 rpm、5分間、4℃）にかけ、上清を吸引後、細胞ペレットを分散させ、10 mlのRPMI1640 / 10％FCS培地に再懸濁して、3 x 105/100 mlのKG-1細胞懸濁液を得た。KG-1細胞懸濁液（各100 ml）を96ウェルプレートのウェルに入れた。
　IL-18変異体にPBSを加え50 μg/mlのストック溶液を作製した。このストック溶液12 ml にRPMI1640/10% FCS培地988 mlを添加し、希釈液を作製した（600 ng/ml）。下表のように、この希釈液をRPMI1640/10% FCS培地で段階的に希釈し、段階希釈サンプル(1)～(6)を調製した。段階希釈サンプルを96ウェルプレートの各ウェルに添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
結果：
　培養開始後２４時間および４８時間時点において、細胞の顕微鏡観察を行った。その結果、活性のあるＩＬ－１８変異体は、濃度依存的に細胞の凝集がみられた。この凝集の濃度依存性は、ＥＬＩＳＡ測定によるＩＦＮγ産生の濃度依存性（試験例２）と一致した。
試験例２：IFN-γ産生増強活性（１）
　ヒトIFN-γ用捕捉抗体（100μg/ml）100μlを含むマイクロ遠心チューブを解凍し、10 mlのPBSで希釈して1 μg/mlにした。 希釈した捕捉抗体（各100 μl）を、96ウェルELISAプレート（Nunc）のすべてのウェルに入れ、4℃に置いた。
　捕捉抗体を除去し、ウェルをPBS/0.05％Tween-20で4回洗浄した。PBS/0.05％Tween-20を廃棄し、ブロッキング緩衝液（PBS / 1％BSA、各300 ml）を96ウェルELISAプレートに添加し、密封して、室温で少なくとも1時間置した。ブロッキング緩衝液を廃棄し、ウェルをPBS/0.05％Tween-20で4回洗浄した。KG-1細胞上清を含む96ウェルプレートを解凍し、上清（各100 ml）をELISAプレートに添加した。
　下表のとおり、標準ヒトIFNγをPBS/0.05% Tween 80/0.1％BSAの段階希釈溶液を調製した。段階希釈した標準ヒトIFNγ（各100μl）を96ウェルのELISAプレートに入れ、室温で少なくとも2時間置いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　サンプルを廃棄し、ウェルを300 mlのPBS/0.05％Tween-20で4回洗浄した。ヒトIFN-γ検出抗体（100μg/ml）100 mlを含むマイクロ遠心チューブを解凍し、10 mlの希釈液で希釈して1 μg/mlの濃度にした。希釈した検出抗体（各100 μl）を96ウェルELISAプレート（Nunc）に加え、プレートを室温で1時間置いた。検出抗体を吸引し、ウェルを300μlのPBS/0.05％Tween-20で4回洗浄した。5.5 μlのアビジン-HRPコンジュゲートを含むマイクロ遠心チューブを解凍し、アビジン-HRPコンジュゲートを11 mlの希釈剤で希釈した。アビジン-HRPコンジュゲート（各100 μl）を、室温で30分間置いた96ウェルELISAプレートに分注した。アビジン-HRPコンジュゲート溶液を廃棄し、ウェルをPBS/0.05％Tween-20で4回洗浄した。ABTS液体基質（各100 μl）をプレートに加え、室温で5分間インキュベートした。ABTS停止液（DWに1％SDS）をプレートに加え、発色を405 nmのプレートリーダーでモニターした。標準曲線に基づいて、ヒトIFN-γの量を計算した。結果を図１０及び１１に示す。
結果：
　４つのシステイン残基を全てセリンに置換したＩＬ－１８ＣＳ変異体は、野生型ＩＬ－１８と比較して、優位に活性が高くなった。一方で、ＩＬ－１８結合タンパク質との結合を減弱させるためにＥＫ置換をさらに導入したＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体は、ＩＬ－１８受容体との結合能も低下し、ＩＬ－１８ＣＳ変異体と比較して、優位に活性が低下し、野生型ＩＬ－１８よりも高い活性になった。このＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体に、さらに１つのアミノ酸置換を導入したＩＬ－１８変異体のうち、Ｃ３８Ｍ、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｓ７２Ｙ，Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、Ｅ６Ｗ、Ｓ７２Ｗ、Ｋ１１２Ｗ、Ｔ３４Ｐ、Ｇ１４５Ｎ、Ｍ５１Ｙ、Ｓ１１９Ｖが野生型ＩＬ－１８より高い活性を示した。また、人工的にＳ－Ｓ結合を導入したＳ７およびＳ５０をＣに置換したＳ７／５０Ｃ変異体も野生型ＩＬ－１８より高い活性を有していた。
試験例３：IFN-γ産生増強活性（２）
　試験例２において比較的高い活性が認められた変異のうち、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、及びＳ７２Ｍについて、実施例５にしたがい、前記各変異をＩＬ－１８ＣＳ変異体及び野生型に導入してＩＬ－１８ＣＳ変異体ベース及び野生型ベースの変異体を作製した。試験例２にしたがい、上記各変異体と、ＩＬ－１８（野生型：ＷＴ）、ＩＬ－１８ＣＳ変異体、及びＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体のIFN-γ産生増強活性を測定した。結果を図１２に示す。
　ＩＬ－１８ＣＳ変異体及びＩＬ－１８野生型に上記点変異を加えた変異体は、いずれも野生型ＩＬ－１８、ＩＬ－１８ＣＳＥＫ変異体及びＩＬ－１８ＣＳ変異体に比較して高いIFN-γ産生誘導増強活性を示した。Ｇ３Ｌ及びＣ３８Ｍの各変異は、とくに良好なIFN-γ産生増強活性を示した。
　以下、表３にヒトＩＬ－１８変異体のアミノ酸配列（下線は変異導入部位）を、表４に大腸菌での組換え発現用に最適化したヒトＩＬ－１８変異体のＤＮＡ配列（枠囲部分は変異導入部位）を記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
 
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　本発明のヒトＩＬ－１８変異体は、安定性が高く、高活性であるため、がん、ウイルス性疾患、免疫系疾患などの治療に有用である。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
配列番号4：NdeI-hProIL18-SalI
配列番号5：hIL-18-CS
配列番号6：NdeI-hProIL18-CS-SalI
配列番号7：hIL-18-CSEK
配列番号8：NdeI-hProIL18-CSEK-SalI
配列番号9：hIL-18-CSEK-G3Y
配列番号10：NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI
配列番号11：hIL-18-CSEK-G3L
配列番号12：NdeI-hProIL18-CSEK-G3L-SalI
配列番号13：hIL-18-CSEK-A6W
配列番号14：NdeI-hProIL18-CSEK-A6W-SalI
配列番号15：hIL-18-CSEK-T34P
配列番号16：NdeI-hProIL18CSEK-T34P-SalI
配列番号17：hIL-18-CSEK-C38M
配列番号18：NdeI-hProIL18CSEK-C38M-SalI
配列番号19：hIL-18-CSEK-M51Y
配列番号20：NdeI-hProIL18CSEK-M51Y-SalI
配列番号21：hIL-18-CSEK-S72Y
配列番号22：NdeI-hProIL18CSEK-S72Y-SalI
配列番号23：hIL-18-CSEK-S72F
配列番号24：NdeI-hProIL18CSEK-S72F-SalI
配列番号25：hIL-18-CSEK-S72M
配列番号26：NdeI-hProIL18CSEK-S72M-SalI
配列番号27：hIL-18-CSEK-S72L
配列番号28：NdeI-hProIL18CSEK-S72L-SalI
配列番号29：hIL-18-CSEK-S72W
配列番号30：NdeI-hProIL18CSEK-S72W-SalI
配列番号31：hIL-18-CSEK-K112W
配列番号32：NdeI-hProIL18CSEK-K112W-SalI
配列番号33：hIL-18-CSEK-K119V
配列番号34：NdeI-hProIL18CSEK-K119V-SalI
配列番号35：hIL-18-CSEK-G145N
配列番号36：NdeI-hProIL18CSEK-G145N-SalI
配列番号37：hIL-18-CSEK-S7/50C
配列番号38：NdeI-hProIL18CSEK-S7/50C-SalI
配列番号40：hCasp4-D315E
配列番号41：hCasp4-D315E DNA
配列番号42：NdeI-hCasp4-D315E-SalI
配列番号45：hIL-18-CS-G3Y
配列番号46：NdeI-hProIL18CS-G3Y-SalI
配列番号47：hIL-18-CS-G3L
配列番号48：NdeI-hProIL18CS-G3L-SalI
配列番号49：hIL-18-CS-C38M
配列番号50：NdeI-hProIL18CS-C38M-SalI
配列番号51：hIL-18-CS-S72Y
配列番号52：NdeI-hProIL18CS-S72Y-SalI
配列番号53：hIL-18-CS-S72F
配列番号54：NdeI-hProIL18CS-S72F-SalI
配列番号55：hIL-18-CS-S72M
配列番号56：NdeI-hProIL18CS-S72M-SalI
配列番号57：hIL-18-G3Y
配列番号58：NdeI-hProIL18-G3Y-SalI
配列番号59：hIL-18-G3L
配列番号60：NdeI-hProIL18-G3L-SalI
配列番号61：hIL-18-C38M
配列番号62：NdeI-hProIL18-C38M-SalI
配列番号63：hIL-18-S72Y
配列番号64：NdeI-hProIL18-S72Y-SalI
配列番号65：hIL-18-S72F
配列番号66：NdeI-hProIL18-S72F-SalI
配列番号67：hIL-18-S72M
配列番号68：NdeI-hProIL18-S72M-SalI
 

Claims (14)

  1. 　ヒトＩＬ－１８変異体であって、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインがセリンに置換され、かつ、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列に対し、さらに少なくとも１つの追加的変異が導入されたアミノ酸配列を有し、野生型ヒトＩＬ－１８よりも高い活性を有する、ヒトＩＬ－１８変異体。
  2. 　前記追加的変異が、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列の３位、３４位、３８位、５１位、７２位、１１２位、１１９位、及び１４５位の変異、並びに７位と５０位の間へのジスルフィド結合の導入から選ばれる、請求項１に記載のヒトＩＬ－１８変異体。
  3. 　前記追加的変異が、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ａ６Ｗ、Ｔ３４Ｐ、Ｃ３８Ｍ、Ｍ５１Ｙ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７２Ｗ、Ｋ１１２Ｗ、Ｋ１１９Ｖ、Ｇ１４５Ｎ、及びＳ７／５０Ｃから選ばれる、請求項１に記載のヒトＩＬ－１８変異体。
  4. 　活性がインターフェロンγ産生誘導増強能である、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－１８変異体。
  5. 　ヒトＩＬ－１８変異体であって、野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインがセリンに置換され、かつ、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンがアラニンに置換された変異体に対し、少なくとも１つの追加的変異が導入されたアミノ酸配列を有し、前記追加的変異が、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ａ６Ｗ、Ｔ３４Ｐ、Ｃ３８Ｍ、Ｍ５１Ｙ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、Ｓ７２Ｗ、Ｋ１１２Ｗ、Ｋ１１９Ｖ、Ｇ１４５Ｎ、及びＳ７／５０Ｃから選ばれるいずれか１つである、ヒトＩＬ－１８変異体。
  6. 　前記追加的変異が、Ｇ３Ｙ、Ｇ３Ｌ、Ｃ３８Ｍ、Ｓ７２Ｙ、Ｓ７２Ｆ、Ｓ７２Ｍ、Ｓ７２Ｌ、及びＳ７２Ｗから選ばれるいずれか１つである、請求項１～５のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－１８変異体。
  7. 　野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列が配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－１８変異体。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－１８変異体を含む、医薬組成物。
  9. 　ＩＦＮγに感受性を有するウイルス性疾患、がん、又は免疫疾患を治療するためのものである、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、及びＩＬ－２からなる群より選ばれる少なくとも１つと併用される、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
  11. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－１８変異体を含む、Ｔ細胞増殖誘導増強剤。
  12. 　遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、Ｔ細胞を含む細胞集団を、ＩＬ－２及び請求項１～７のいずれか１項に記載のヒトＩＬ－１８変異体の存在下で増殖誘導を増強する工程を含む、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法。
  13. 　野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、Ｇ３Ｌの変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体であって、所望により、以下の１）または２）の追加的変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体：
    １）３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換
    ２）３８位、６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換と、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンのアラニンへの置換。
  14. 　野生型ヒトＩＬ－１８のアミノ酸配列中、Ｃ３８Ｍの変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体であって、所望により、以下の１）または２）の追加的変異を有する、ヒトＩＬ－１８変異体：
    １）６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換
    ２）６８位、７６位、及び１２７位のシステインのセリンへの置換と、６位のグルタミン酸及び５３位のリシンのアラニンへの置換。
     
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