CN116848130A - 新型人白细胞介素-18突变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型的IL‑18突变体和利用其的药物组合物。具体而言，涉及人IL‑18突变体和包含上述人IL‑18突变体的药物组合物等，所述人IL‑18突变体包含在野生型人白细胞介素18(IL‑18)的氨基酸序列中(i)38位、68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的突变、和(ii)6位的谷氨酸和53位的赖氨酸向丙氨酸的突变，并且还包含(iii)至少1个追加突变。

Description

新型人白细胞介素-18突变体及其用途
技术领域
[关联申请]
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本特愿2021-19418(2021年2月10日申请)的说明书中记载的内容。
[技术领域]
本发明涉及新型的人白细胞介素-18突变体。更详细而言，涉及稳定且活性高的人白细胞介素-18突变体。
背景技术
白细胞介素-18(IL-18)是作为干扰素γ(IFNγ)产生诱导因子被发现的属于IL-1超级家族的细胞因子(非专利文献1)。关于IL-18，其以包含前肽的非活性前体(pro-IL-18)的形式产生，并在受到基于半胱天冬酶(Caspase)1、半胱天冬酶4等的切割后以活性型IL-18的形式释放到细胞外。
IL-18在免疫体系中主要由巨噬细胞系细胞产生，并与在IL-12的存在下诱导IFNγ的产生的细胞的细胞表面上发现的IL-18受体结合，增进IFNγ的产生，增强Th1型的免疫应答。另一方面，IL-18在不存在IL-12的情况下增强Th2型的免疫应答。例如，在IL-2的存在下作用于NK细胞而诱导Th2型的免疫应答，在IL-3的存在下作用于嗜酸细胞和肥大细胞而增强Th2型的免疫应答。
天然型的人IL-18不稳定，若进行重组生产，则存在凝聚而形成寡聚体、活性下降的倾向。这是因为：在IL-18分子表面露出的半胱氨酸残基与其他IL-18分子的半胱氨酸残基形成二硫键，由此发生寡聚化(非专利文献2)。
Yamamoto等报道了：通过将IL-18分子内的4个半胱氨酸(38位、68位、76位、127位)全部置换为丝氨酸，能够产生稳定的人IL-18(非专利文献2)。Okamura等报道了：通过将38位、76位、或127位的半胱氨酸(C)置换为丝氨酸(S)或丙氨酸(A)，可得到使稳定性显著地提高了的多肽(专利文献1)。Bam等将38位和68位的半胱氨酸(C)置换为丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)，并且将不参与与IL-18受体的相互作用的柔软的表面环的前端残基(78位、121位、157位)中的1个置换为半胱氨酸(C)后结合PEG，由此制作出PEG化IL-18突变体(专利文献2)。
IL-18通过与细胞膜上的IL-18受体结合而发挥生理活性。在生物体内由于过量存在对IL-18呈特异性的IL-18结合蛋白(IL-18BP)，因此被分泌出来的IL-18大部分与IL-18BP结合而迅速失去活性。
Kim等报道了：基于根据IL-18与IL-18BP的复合体计算机模型的预测，将对于与IL-18BP的相互作用而言重要的6位的谷氨酸(E)和53位的赖氨酸(K)置换为不带电荷的氨基酸(丙氨酸等)，由此使人IL-18的活性显著提高(非专利文献3)。Shirakawa等报道了：若将17位、35位、132位的天冬氨酸置换为丙氨酸，则与受体的结合显著受到抑制(专利文献3)。Seatang等报道了：通过将6位的谷氨酸(E)置换为赖氨酸(K)、并将63位的苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，由此活性显著增加，另外若将33位或60位的甲硫氨酸置换为谷氨酰胺，则活性下降或丧失(非专利文献4)。
但是，现有报道中，作为比较对象使用的野生型IL-18的活性明显地低，因此，在被记载的与野生型进行了比较的突变体的活性值方面存在疑问，需要与具有本来的活性的野生型进行比较验证。
Zhou等基于根据IL-18与IL-18BP的复合体计算机模型的预测，向野生型人IL-18的1位的酪氨酸(Y)、5位的亮氨酸(L)、8位的赖氨酸(K)、51位的甲硫氨酸(M)、53位的赖氨酸(K)、55位的丝氨酸(S)、56位的谷氨酰胺(Q)、57位的脯氨酸(P)、59位的甘氨酸(G)、60位的甲硫氨酸(M)、77位的谷氨酸(E)、103位的谷氨酰胺(Q)、105位的丝氨酸(S)、110位的天冬氨酸(D)、111位的天冬酰胺(N)、113位的甲硫氨酸(M)、153位的缬氨酸(V)、155位的天冬酰胺(N)随机地导入置换，由此得到了与IL-18BP的相互作用降低的IL-18突变体(专利文献4、非专利文献5)。但是，对于与IL-18BP的相互作用而言重要的区域也参与与IL-18Rα的结合，因此，上述位点的改造存在导致IL-18的活性下降的可能性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-262686号
专利文献2：WO2004/091517
专利文献3：日本特开2005-52021号
专利文献4：WO2019/051015
非专利文献
非专利文献1：Okamura et al.,“Cloning of a new cytokine that inducesIFN-gamma production by T cells”Nature.1995Nov 2；378(6552):88-91
非专利文献2：Yamamoto et al.,“Generation of highly stable IL-18basedon a ligand-receptor complex structure”Biochem Biophys Res Commun.2004Apr 23；317(1):181-186
非专利文献3：Kim et al.,“Site-specific mutations in the mature form ofhuman IL-18with enhanced biological activity and decreased neutralization byIL-18binding protein”Proc Natl Acad Sci.2001Mar 13；98(6):3304-3309
非专利文献4：Saetang et al.,“Immunologic Function and MolecularInsight of Recombinant Interleukin-18”PLoS One.2016Aug 2；11(8):e0160321
非专利文献5：Zhou et al.,“IL-18BP is a secreted immune checkpoint andbarrier to IL-18immunotherapy”Nature.2020Jul；583(7817):609-614
发明内容
发明所要解决的问题
IL-18的活性因凝聚(寡聚化)、与IL-18BP的结合、与IL-18R的亲和性而受到影响。本发明的目的在于考虑到全部这些影响，而提供稳定且活性高的新型的人IL-18突变体。
用于解决问题的方法
发明人发现：若为了防止IL-18的凝聚而将4个半胱氨酸置换为丝氨酸、并且为了降低与IL-18BP的结合而将6位的谷氨酸和53位的赖氨酸置换为不带电荷的氨基酸，则IL-18的活性下降。认为这是因为：IL-18与作为其受体的IL-18Rα链的相互作用依赖于6位的谷氨酸和53位的赖氨酸。因此，发明人以将4个半胱氨酸置换为丝氨酸、并置换了6位的谷氨酸和53位的赖氨酸的CSEK突变体为基础，导入点突变，网罗地探索了结构稳定性高、并且活性高的突变体。还以所得到的突变体为基础，探索了突变更少且高活性的突变体。需要说明的是，本说明书中，若无特别记载，则各氨基酸的位置表示不包含前肽的成熟型的人IL-18的氨基酸序列中的位置。
本发明基于上述研究结果，涉及以下的[1]～[22]。
[1]一种人IL-18突变体，其具有对于野生型人IL-18的氨基酸序列中38位、68位、76位和127位的半胱氨酸被置换为丝氨酸、并且6位的谷氨酸和53位的赖氨酸被置换为丙氨酸的氨基酸序列进一步导入了至少1个追加突变的氨基酸序列，并且具有高于野生型人IL-18的活性。
[2]根据[1]所述的人IL-18突变体，其中，上述追加突变选自野生型人IL-18的氨基酸序列的3位、34位、38位、51位、72位、112位、119位和145位的突变、以及向7位与50位之间的二硫键的导入。
[3]根据[1]所述的人IL-18突变体，其中，上述追加突变选自G3Y、G3L、A6W、T34P、C38M、M51Y、S72Y、S72F、S72M、S72L、S72W、K112W、K119V、G145N和S7/50C。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的人IL-18突变体，其中，活性为干扰素γ产生诱导增强活性。例如，在以3ng/ml的浓度使用时，本发明的人IL-18突变体具有高于野生型的干扰素γ产生诱导增强活性。
[5]一种人IL-18突变体，其具有对于野生型人IL-18的氨基酸序列中38位、68位、76位和127位的半胱氨酸被置换为丝氨酸、并且6位的谷氨酸和53位的赖氨酸被置换为丙氨酸的突变体导入了至少1个追加突变的氨基酸序列，上述追加突变为选自G3Y、G3L、A6W、T34P、C38M、M51Y、S72Y、S72F、S72M、S72L、S72W、K112W、K119V、G145N和S7/50C中的任意一个。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的人IL-18突变体，其中，上述追加突变为选自G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F、S72M、S72L和S72W中的任意一个。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的人IL-18突变体，其中，野生型人IL-18的氨基酸序列包含序列号3所示的氨基酸序列。
[8]一种药物组合物，其包含[1]～[7]中任一项所述的人IL-18突变体。
[9]根据[8]所述的药物组合物，其用于治疗对IFNγ具有敏感性的病毒性疾病、癌或免疫疾病。
[10]根据[8]或[9]所述的药物组合物，其与选自由抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和IL-2组成的组中的至少一种并用。
[11]一种T细胞增殖诱导增强剂，其包含[1]～[7]中任一项所述的人IL-18突变体。
优选上述T细胞增殖诱导增强剂与IL-2组合使用。
[12]一种基因改造T细胞的制造方法，其包括在IL-2和[1]～[7]中任一项所述的人IL-18突变体的存在下对包含T细胞的细胞群进行增殖诱导的步骤。
例如，从对象的外周血单离包含T细胞的外周血单核细胞群，用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激后，用IL-2和人IL-18突变体增强增殖诱导，扩增T细胞。之后，向扩增了的T细胞中导入基因(例如，CAR(嵌合抗原受体)，然后对于基因导入后的T细胞用IL-2和IL-18突变体增强增殖诱导，从而进行扩增。
[13]一种人IL-18突变体，其具有野生型人IL-18的氨基酸序列中选自3位、38位和72位中的任意1个氨基酸被置换为其他氨基酸的氨基酸序列。
[14]一种人IL-18突变体，其具有导入了野生型人IL-18的氨基酸序列中选自G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F和S72M中的任意1个突变、优选选自G3Y、G3L和C38M中的任意1个突变、更优选G3L或C38M的突变的氨基酸序列。
[15]一种人IL-18突变体，其具有对于野生型人IL-18的氨基酸序列中38位、68位、76位和127位的半胱氨酸被置换为丝氨酸的突变体导入了至少1个追加突变的氨基酸序列，上述追加突变为选自G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F和S72M中的任意一个，优选为选自G3Y、G3L和C38M中的任意一个，更优选为G3L或C38M。
[16]一种人IL-18突变体，其具有野生型人IL-18的氨基酸序列中G3L的突变，并且根据期望具有以下的1)或2)的追加突变：
1)38位、68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换；
2)38位、68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换、以及6位的谷氨酸和53位的赖氨酸向丙氨酸的置换。
[17]一种人IL-18突变体，其具有野生型人IL-18的氨基酸序列中C38M的突变，并且根据期望具有以下的1)或2)的追加突变：
1)68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换；
2)68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换、以及6位的谷氨酸和53位的赖氨酸向丙氨酸的置换。
[18]根据[13]～[17]中任一项所述的人IL-18突变体，其中，野生型人IL-18的氨基酸序列包含序列号3所示的氨基酸序列。
[19]一种药物组合物，其包含[13]～[17]中任一项所述的人IL-18突变体。
[20]根据[19]所述的药物组合物，其用于治疗对IFNγ具有敏感性的病毒性疾病、癌或免疫疾病。
[21]根据[19]或[20]所述的药物组合物，其与选自由抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和IL-2组成的组中的至少一种并用。
[22]一种T细胞增殖诱导增强剂，其包含[13]～[17]中任一项所述的人IL-18突变体。
发明效果
本发明的人IL-18突变体的稳定性高，与IL-18BP的结合得到了降低，除此以外还具有高活性(例如，IFNγ产生诱导增强能力)。因此，对于基于IL-18活性的癌、免疫疾病的治疗而言是有用的。
附图说明
图1示出形成了二聚体的人半胱天冬酶4(D315E)突变体的构成。在N末端附加有组氨酸标签。
图2示出人半胱天冬酶4(D315E)突变体前体的氨基酸序列。最先的带有下划线的104个氨基酸表示前肽。2个箭头表示自体消化的位置。[]所示的部分为不包含前肽的成熟型的人半胱天冬酶4的氨基酸序列。
图3示出在针对大肠杆菌用途进行了优化的编码人半胱天冬酶4(D315E)突变体的DNA序列的两端附加了限制酶识别序列的NdeI-Casp4-D315E-SalI。最先的catatg为NdeI识别序列，最后的gtcgc为SalI的识别序列，SalI识别序列之前的taa为终止密码子。带有下划线的gaa相当于突变导入位点(由天冬氨酸向谷氨酸的置换位点)。
图4示出用于表达人半胱天冬酶4(D315E)的载体。
图5示出人半胱天冬酶4(D315E)的基于SDS-PAGE的电泳结果的图像。
图6示出用于重组表达的人IL-18前体(野生型)的构成。在前肽的N末端附加有组氨酸标签。在前肽的C末端侧的天冬氨酸(D)处受到基于半胱天冬酶的切割，生成成熟型人IL-18。
图7示出人IL-18前体(野生型)的氨基酸序列。最先的带有下划线的36个氨基酸为前肽，其C末端的LESD为半胱天冬酶4的识别序列，箭头示出基于半胱天冬酶4的切割位点。
图8示出在针对大肠杆菌用途进行了优化的编码人IL-18前体(野生型)的DNA序列的两端附加了限制酶识别序列的NdeI-hProIL18-SalI。最先的catatg为NdeI识别序列，最后的gtcgac为SalI的识别序列，SalI识别序列之前的taa为终止密码子。下划线部相当于前肽，前肽的C末端侧的ctggaatctgac(序列号4的100～111位)相当于半胱天冬酶4的识别序列。
图9示出人IL-18(野生型)的基于SDS-PAGE的电泳结果的图像。1：分子量标记物；2：Casp4-D315E的P10和P20片段；3：成熟型人IL-18样品1；4：成熟型人IL-18样品2(用于确认)；5：将人IL-18前体和Casp4-D315E在4℃过夜处理后的样品；6：人IL-18前体。
图10示出基于人IL-18突变体的IFNγ产生诱导增强。各图中，〇表示野生型的IFNγ产生诱导增强活性；●表示各突变体的IFNγ产生诱导增强活性。
图11示出基于人IL-18突变体的IFNγ产生诱导增强。各表对应于图10的各图。
图12示出包含G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F和S72M的各突变的IL-18CS突变体、以及包含G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F和S72M的各突变的IL-18突变体、IL-18WT(野生型)、IL-18CS突变体和IL-18CSEK突变体的IFNγ产生诱导增强活性。
具体实施方式
1.白细胞介素18(IL-18)
1.1结构与功能
白细胞介素18(IL-18)是作为IFNγ产生诱导因子被发现的属于IL-1超级家族的细胞因子。IL-18以包含前肽的非活性前体(pro-IL-18)的形式产生，并在受到基于半胱天冬酶1、半胱天冬酶4等的前肽的切割后以活性型IL-18的形式被释放。
人IL-18前体由193个氨基酸(24KDa)构成，不包含前肽的成熟型的人IL-18由157个氨基酸(18KDa)构成。将人IL-18前体和人IL-18的氨基酸序列的一例分别记载于序列号2(图7)和序列号3。具有与这些序列具有80％、85％、90％、95％、96％、98％或99％以上的序列一致性的氨基酸序列的人IL-18前体和人IL-18只要还具有人IL-18的活性，则各自也可以作为人IL-18前体和人IL-18使用。
如前所述，IL-18经由基于IL-12的IFNγ产生诱导的增强，诱导炎症性细胞因子的产生，从而引起炎症、组织损伤。该IL-18的对Th1型免疫应答的作用通过IL-2的存在，协同地增高。另一方面，IL-18在某种条件下增强IL-4、IL-13等抗炎症性细胞因子的诱导，也可诱导Th2型免疫应答。
1.2IL-18结合蛋白
在生物体内，与IL-18特异性结合的IL-18结合蛋白(IL-18BP)恒定地表达。IL-18BP呈400pM这样的高亲和性，而且在生物体内大大过量(相对于IL-18为20倍以上的摩尔浓度)地存在，因此被分泌出来的IL-18的大部分与IL-18BP结合，其结果是，与受体的结合受到阻碍，失去活性。可见，IL-18BP通过控制IL-18的活性而抑制免疫应答，因此，Zhou等将IL-18BP表述为分泌免疫检查点(前述Zhou et al.)。
1.3IL-18受体
IL-18受体在NK细胞、NKT细胞、辅助T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等各种细胞中进行表达。IL-18受体结合位点由α链(IL-18Rα)和β链(IL-18Rβ)构成。关于人IL-18的IL-18Rα结合位点，有报道称存在同与IL-18BP的结合位点类似的可能性(前述Kim etal.)。
2.人IL-18突变体
本发明的人IL-18突变体是对于野生型人IL-18的氨基酸序列中38位、68位、76位和127位的半胱氨酸被置换为丝氨酸、并且6位的谷氨酸和53位的赖氨酸被置换为丙氨酸的突变体进一步导入了至少1个追加突变的人IL-18突变体。以下，对于氨基酸突变，也有时利用突变前的氨基酸残基和位置以及突变后的氨基酸残基，例如若为38位的半胱氨酸(C)向丝氨酸(S)的突变，则以C38S的形式简略地示出。作为野生型人IL-18，例如可以使用包含序列号3所示的氨基酸序列的野生型人IL-18。野生型人IL-18可以在序列号3所示的氨基酸序列的一个或两个末端各自独立地附加有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。优选野生型人IL-18具有由序列号3所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列。
(1)CS突变
在人IL-18的分子内，在38位、68位、76位和127位存在4个半胱氨酸(C)，但并未形成二硫键，所有的半胱氨酸残基的侧链均存在于分子表面。因此，人IL-18容易因游离的半胱氨酸残基在分子间形成二硫键而发生寡聚化。该寡聚化阻碍与受体的结合，导致人IL-18的非活性化(前述Yamamoto et al.)。本发明的人IL-18突变体中，4个半胱氨酸被突变为丝氨酸，因此，可防止寡聚化和基于寡聚化的活性下降。将上述4个半胱氨酸向丝氨酸的突变(C38S、C68S、C76S、C127S)称为“CS突变”。
(2)EK突变
人IL-18分子的6位的谷氨酸(E)和53位的赖氨酸(K)是对于与IL-18BP的相互作用而言重要的位点(前述Kim et al.2001)。通过将6位的谷氨酸和53位的赖氨酸置换为不带电荷的氨基酸(丙氨酸等)，由此能够使与IL-18BP的结合亲和性下降。以下，将6位的谷氨酸和53位的赖氨酸向丙氨酸(A)的突变(E6A、K53A)称为“EK突变”。
(3)CSEK突变
对于包含CS突变和EK突变这两者的突变体，利用基于CS突变的寡聚化防止效果、以及基于EK突变的与IL-18BP的结合降低效果，而期待活性的提高。但是，发明人发现：CSEK突变体与CS突变体相比活性下降，即使与野生型相比活性也并未提高，为同等或稍稍下降。认为这是因为：6位的谷氨酸(E)和53位的赖氨酸(K)也参与与IL-18Rα的结合，因此其突变对经由与受体的结合的活性表达带来影响。以下，将包含CS突变和EK突变这两者的突变称为“CSEK突变”，将包含CSEK突变的人IL-18突变体称为“人IL-18CSEK突变体”。
(4)追加突变
本发明的人IL-18突变体以人IL-18CSEK突变体为基础，进一步包含至少1个“追加突变”。“追加突变”在不损害人IL-18CSEK突变体中的CS突变和EK突变的效果的情况下，改变与IL-18Rα的结合性，从而提高人IL-18突变体的活性。
追加突变包含以下的突变：
(a)3位的甘氨酸(G)的突变：优选3位的甘氨酸(G)向酪氨酸(Y)的突变(G3Y)和向亮氨酸(L)的突变(G3L)；
(b)6位的丙氨酸(A)(野生型序列中为谷氨酸(E))向丙氨酸以外的不带电荷的氨基酸的突变：优选6位的丙氨酸(野生型序列中为谷氨酸)向色氨酸(W)的突变(A6W，若以野生型序列为基础则为E6W)；
(c)34位的(苏氨酸)的突变：优选34位的(苏氨酸)向脯氨酸(P)的突变(T34P)；
(d)38位的半胱氨酸(C)的突变：优选38位的半胱氨酸(C)向甲硫氨酸(M)的突变(C38M)；
(e)51位的甲硫氨酸(M)的突变：优选51位的甲硫氨酸(M)向酪氨酸(Y)的突变(M51Y)；
(f)72位的丝氨酸(S)的突变：优选72位的丝氨酸(S)向酪氨酸(Y)的突变(S72Y)、向苯丙氨酸(F)的突变(S72F)、向甲硫氨酸(M)的突变(S72M)、向亮氨酸(L)的突变(S72L)和向色氨酸(W)的突变(S72W)；
(g)112位的赖氨酸(K)的突变：优选112位的赖氨酸(K)向色氨酸(W)的突变(K112W)；
(h)119位的赖氨酸(K)的突变：优选119位的赖氨酸(K)向缬氨酸(V)的突变(K119V)；
(i)145位的甘氨酸(G)的突变：优选145位的甘氨酸(G)向天冬酰胺(N)的突变(G145N)；
(j)向7位与50位之间的二硫键的导入：即7位与50位的丝氨酸(S)向半胱氨酸(C)的突变(S7/50C)。
更优选上述追加突变为G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F、S72M、S72L、S72W和S7/50C。
进一步优选上述追加突变为G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F、S72M、S72L和S72W。
上述的人IL-18CSEK突变体中的具有G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F和S72M的突变体即使在无EK突变、CSEK的情况下，也显示出比较高的活性。即，人IL-18CS突变体、或将人IL-18野生型的3位、38位或72位置换为与野生型的氨基酸不同的氨基酸后的突变体、特别是导入了选自G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F和S72M中的任意的点突变的突变体也包含在本发明的范围中。
2.2人IL-18突变体的氨基酸序列
优选的本发明的人IL-18突变体的氨基酸序列示于序列号9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37。在这些氨基酸序列中，在上述的CS突变(C38S、C68S、C76S、C127S)、EK突变(E6A、K53A)、追加突变(例如，G3Y、G3L、A6W、T34P、C38M、M51Y、S72Y、S72F、S72M、S72L、S72W、K112W、K119V、G145N和S7/50C)的位点以外的位点中包含不对人IL-18突变体的结构稳定性和活性带来变化的微小改造的突变体也包含在本发明的人IL-18突变体中。这样的包含微小改造的人IL-18突变体相对于上述序列号9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65和67所示的氨基酸序列，具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列一致性。
2.3编码人IL-18突变体的DNA序列
对于编码人IL-18突变体的DNA，为了进行后述的重组生产，根据所使用的宿主对序列进行优化。关于具有上述氨基酸序列的人IL-18突变体，针对大肠杆菌中的表达用途进行了密码子优化的DNA序列的一例分别示于序列号10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66和68。DNA序列根据所使用的宿主适宜进行优化。
2.4IL-18活性
本发明的人IL-18突变体兼具稳定性和经改善的活性。作为IL-18的活性，可举出IFNγ产生诱导的增强、CD8阳性杀伤型αβT细胞、γδ型T细胞、NK细胞、CD4CD8阴性杀伤αβ型T细胞(NKT细胞)等免疫效应细胞(特别地，优选NK细胞、γδ型T细胞，更优选NK细胞)的增殖诱导的增强、HLA-DR/HLA-DQ等主要组织相容性抗原的表达增强、CD80/CD86的表达增强、CD25的表达增强、ICOS的表达增强等。本发明中，“具有高于野生型人IL-18的活性”是指上述活性中的任意一种高于野生型。
优选本发明的人IL-18突变体与野生型人IL-18相比IFNγ产生诱导增强能力(活性)得到提高。例如，本发明的人IL-18突变体在3ng/ml浓度下与野生型相比IFNγ产生诱导增强能力(活性)得到提高。
本发明的人IL-18突变体根据目的例如可以进行异戊二烯化、乙酰化、酰胺化、羧基化、糖基化、PEG化等修饰，这样的修饰人IL-18突变体也包含在本发明的范围中。
3.人IL-18突变体的制造
3.1密码子优化
对于编码人IL-18(前体)的DNA序列，为了使表达量最大化，优选根据所使用的宿主进行优化。密码子的优化可以使用市售的用于密码子优化的软件(GeneOptimizer(注册商标)等)来实施。
3.2突变的导入
向人IL-18(前体)中的突变的导入可以通过DNA的全合成来进行。另外，可以按照现有报道(前述Yamamoto et al.、Kim et al.)，使用市售的位点特异性突变导入系统来实施。具体而言，准备夹持目标突变导入位点的引物对，向一个引物中整合目标突变，使用上述引物对对包含模板序列的质粒进行扩增，由此可以导入目标突变。对于目标突变的导入，可以通过将扩增后的序列连接并使用大肠杆菌等克隆后进行序列测定来确认。
3.3突变体的表达
编码包含目标突变的人IL-18突变体(前体)的DNA被整合到适当的表达载体中后，导入到宿主细胞中，使其表达。
所使用的宿主细胞只要是能够表达人IL-18的细胞，则没有特别限定，可以使用大肠杆菌等原核细胞、酵母、昆虫细胞、动物细胞等真核细胞。作为大肠杆菌，可举出大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α、大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS、大肠杆菌RosettaTM2(DE3)pLysS等。
表达载体只要是能够在宿主中进行表达的载体，则没有特别限定。作为大肠杆菌中能够使用的载体，可举出pAT153、pACYC184、pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC系、pBluescript II、pMTL20、pBS、pGEM、pBEMEX、pUR222、pUCBM、pSP系、pEX系、pCAT系、pT3/T7、pEUK、pMAM、pMSG、pEMBL、pSELECT、pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pKK233-2、pSE280、pGEMEX-1、pQE-8、pGEX、pET系、pME18SFL3pGEX-4T-1、pACYC177、pKK338-1、pKC30、pKT279、pFB系、pNO1523、pSVL、pKSV10、pGA482、pNOS、pHSV106、pColdTM系列等。
作为酵母中能够使用的载体，例如可举出YEP13、YEp24、YCp50等。作为昆虫细胞中能够使用的载体，例如可举出pVL1392、pVL1393和pBlueBacIII。作为植物细胞中能够使用的载体，例如可举出Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。
作为动物细胞中能够使用的载体，例如可举出pcDNAI、pCDM8、pAGE107、pCDM8、pcDNAI/Amp、pcDNA3.1、pREP4、pAGE103、pAGE210、pME18SFL3、INPEP4等。
由于人IL-18不具有糖链，因此本发明的人IL-18突变体(前体)能够以大肠杆菌作为宿主来简便地进行重组表达。
为了使之后的纯化、检测变得容易，人IL-18突变体可以与可溶性的标签序列例如组氨酸(His)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签等融合地表达。
3.4纯化
对于人IL-18突变体(前体)，利用超声波、细胞壁溶解酶将菌体破碎后，利用过滤、离心分离等将该多肽从菌体或菌体破碎物中分离，并进行纯化。纯化可以采用例如盐析、透析、过滤、浓缩、分级沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、聚焦层析、凝胶电泳、等电点电泳等该领域中周知的方法。
亲和层析
在向人IL-18突变体(前体)中预先导入了His标签、GST标签等可溶性标签的情况下，可以使用亲和层析来简便地进行纯化。
由于His标签在特定的条件下与镍、钴、铜等固定化金属离子结合，因此，作为与His标签的融合蛋白表达的人IL-18突变体能够利用固定化金属亲和层析(IMAC)来容易地进行纯化。作为IMAC，例如可举出利用了镍的IMAC即镍柱、利用了钴的IMAC即Talon柱。
由于GST标签在通常的条件下与谷胱甘肽树脂选择性结合，因此，作为与GST标签的融合蛋白表达的人IL-18突变体能够利用使用了谷胱甘肽树脂的层析而容易地进行纯化。
凝胶过滤
人IL-18突变体的分子量为18kDa。对于所使用的载体，可以考虑目标蛋白的分子量、规模、操作时间而适宜选择。凝胶过滤层析也可以与上述亲和层析组合使用。
3.5前肽的切割
从人IL-18突变体前体生成成熟型人IL-18突变体需要前肽的切割。前肽的切割可以使用半胱天冬酶1或半胱天冬酶4、以及半胱天冬酶5等。所使用的半胱天冬酶的来源没有特别限定，但优选为人来源的半胱天冬酶。
半胱天冬酶是在细胞凋亡、炎症等过程中发挥核心作用的蛋白酶。哺乳动物中发现了半胱天冬酶1～14，半胱天冬酶1、4和5均已知为炎症性半胱天冬酶。半胱天冬酶1、4和5均以非活性前体(前半胱天冬酶)的形式表达，受到基于蛋白酶的加工后，成为由包含P20和P10亚基的异源四聚体构成的成熟半胱天冬酶。
半胱天冬酶1、4和5也可以使用市售品，由于氨基酸序列和编码其的DNA序列是公知的，因此，如对IL-18突变体所说明的，可以按照常法利用重组生产来制造。重组生产中，为了防止人半胱天冬酶的自体消化，可以向容易受到作用的位点导入适当的突变。
后述的实施例中，使用在野生型人半胱天冬酶4前体的氨基酸序列(序列号39)中315位的天冬氨酸被突变为谷氨酸的人半胱天冬酶4(D315E)(序列号40)。该重组人半胱天冬酶4突变体也在本发明的范围内。
IL-18的前肽的切割中，除了可以使用半胱天冬酶以外，还可以使用Xa因子(前述Yamamoto et al.、Kim et al.)。Xa因子为由2个亚基构成的59Da的蛋白酶。作为Xa因子，可以使用市售牛血浆来源的Xa因子。另外，由于Xa因子的氨基酸序列和编码其的DNA序列是公知的(GenBank Accession No.NM_001080213.2)，可以按照常法来制造、使用。
3.6活性测定
对于人IL-18突变体的活性，可以通过与野生型IL-18的活性进行比较来确认IFNγ产生诱导的增强、NK细胞增殖诱导的增强、HLA-DR/DQ表达增强、CD80/CD86表达增强、CD25表达增强中的任意一项。
对于IFNγ产生诱导增强能力，可以向HBL-38细胞、Mo细胞、Jurkat细胞、HuT78细胞、EL4细胞、L12-R4细胞、KG-1细胞(人急性骨髓性白血病株)等IFNγ产生细胞中添加人IL-18突变体以使其达到约0.1ng～1μg/ml、优选达到约1～100ng/ml，并进行培养，利用ELISA等测定培养液中的IFNγ量，由此进行确认。本发明的IL-18突变体具有高于野生型的IFNγ产生诱导增强能力。
对于NK细胞增殖诱导增强，可以向除去了CD3阳性细胞的人外周血单核细胞中添加IL-2/IL-18突变体并进行培养，对NK细胞特异性标记物(例如，CD56阳性、CD161阴性、CD3阴性)的增加计数细胞数，从而进行确认。
对于NK细胞上的表达分子的变化，可以通过使用流式细胞仪等进行测定而确认。具体而言，可以通过对如上所述地利用IL-2/IL-18突变体进行了培养的NK细胞与利用IL-2单独进行了培养的NK细胞上表达的HLA-DR/DQ、CD80/86进行比较而确认。
由于在人IL-18与小鼠IL-18(小鼠IL-18前体：序列号43；成熟小鼠IL-18：序列号44)之间未观察到交叉反应性，因此，为了进行使用小鼠的实验，需要制作与本发明的人IL-18突变体对应的小鼠IL-18突变体。由于在人IL-18与小鼠IL-18的一级结构方面观察到某种程度的同源性，因此，可以按照上述的方法向野生型小鼠IL-18中导入CS突变，进一步将对于与IL-18BP的相互作用而言重要的位点进行置换，导入追加突变，由此得到对应的小鼠IL-18突变体。
4.药物组合物
本发明的人IL-18突变体由于IFNγ产生诱导增强等的活性高，因此，作为用于治疗或预防对IFNγ具有敏感性的病毒性疾病、癌、免疫疾病的药物组合物是有用的。
包含本发明的人IL-18突变体的药物组合物可以包含药理学上允许的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，例如可举出赋形剂、结合剂、润滑剂、溶剂、崩解剂、溶解辅助剂、悬浊化剂、乳化剂、等渗剂、稳定化剂、无痛化剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、着色剂、缓冲剂、流动性促进剂等，但并不限定于这些，可以适宜使用其他常用的载体、添加物。
作为赋形剂，可举出乳糖、葡萄糖、D-甘露醇等糖类、淀粉类、结晶纤维素等纤维素类等有机系赋形剂、碳酸钙、高岭土等无机系赋形剂等。
作为结合剂，可举出α化淀粉、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、D-甘露醇、海藻糖、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇等。
作为润滑剂，可举出硬脂酸、硬脂酸盐等脂肪酸盐、滑石、硅酸盐类等。
作为溶剂，可举出纯化水、生理盐水、磷酸缓冲液等。
作为崩解剂，可举出低取代度羟丙基纤维素、经化学修饰的纤维素、淀粉类等。
作为溶解辅助剂，可举出聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、苯甲酸苄基酯、乙醇、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸钠等。
作为悬浊化剂或乳化剂，可举出月桂基硫酸钠、阿拉伯胶、明胶、卵磷脂、单硬脂酸甘油、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠等纤维素类、聚山梨酯类、聚氧乙烯氢化蓖麻油等。
作为等渗剂，可举出氯化钠、氯化钾、糖类、甘油、尿素等。
作为稳定化剂，可举出聚乙二醇、葡聚糖硫酸钠、其他氨基酸类等。
作为无痛化剂，可举出葡萄糖、葡萄糖酸钙、盐酸普鲁卡因等。
作为防腐剂，可举出对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
作为抗氧化剂，可举出作为水溶性抗氧化剂的抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、作为脂溶性抗氧化剂的抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、以及作为金属螯合剂的柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸。
作为矫味矫臭剂，可举出医药领域中通常使用的甜味料、香料等，作为着色剂，可举出医药领域中通常使用的着色料。
本发明的药物组合物的给药路径没有特别限定，可以是经口给药，也可以是非经口给药。作为非经口给药，具体而言，可举出注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药，可以例示静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、骨髓内注射、髓腔内注射、皮内注射。给药方法可以根据患者的年龄、症状来适宜选择。
本发明的药物组合物以治疗有效量给药于对象。“治疗有效量”是指对于缓和所选择的状态有用的治疗作用物质的量。治疗有效量根据使用目的、给药路径、患者的年龄、症状等来适宜确定。在对人给药的情况下，例如，对于每名患者，以人IL-18突变体计至少为0.001mg/kg、优选0.01mg/kg、更优选0.1mg/kg、进一步优选1mg/kg，且最多为100mg/kg、优选50mg/kg、更优选20mg/kg、进一步优选10mg/kg。例如，对于每名患者，以人IL-18突变体计为0.001～100mg/kg、优选0.01～50mg/kg、更优选0.1～20mg/kg、进一步优选1～10mg/kg。
作为成为本发明的药物组合物的适用对象的癌，例如可举出急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病和慢性淋巴性白血病等白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤等恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、头颈癌、舌癌、咽喉癌、口腔癌、食道癌、食道腺癌、胃癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆嚢/胆管癌、胆道癌、胰腺癌、甲状腺癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌等肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、肾癌、腺癌、尿路上皮癌、前列腺癌、精巢肿瘤、骨肉瘤/软骨肉瘤、葡萄膜恶性黑色素瘤、恶性黑色素瘤、默克尔细胞癌等皮肤癌、成神经细胞瘤、胶质母细胞瘤、脑肿瘤、胸膜间皮瘤，但并不限定于它们。
作为成为本发明的药物组合物的适用对象的病毒性疾病，例如可举出人免疫缺陷病毒(HIV)、人甲型肝炎病毒(HAV)、人乙型肝炎病毒(HBV)、人丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)等参与的病毒疾病、尤其是伴随免疫缺陷的病毒疾病，但并不限定于它们。
作为成为本发明的药物组合物的适用对象的免疫疾病，可举出类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩病、溃疡性大肠炎、肾炎、干癣、哮喘、恶性贫血、甲状腺功能亢进症、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力症、全身性红斑狼疮、艾迪森氏病、霍奇金病、AIDS等，但并不限定于它们。
只要在不损害本发明的目的，则本发明的药物组合物也可以与其他药剂、治疗方法并用。
若为治疗癌的情况，则可以适宜组合分子靶向药，例如包含免疫检查点抑制剂的单克隆抗体(利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、伊匹木单抗、本妥昔单抗、帕妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、地努妥昔单抗、纳武单抗、派姆单抗、博纳吐单抗、雷莫芦单抗、耐昔妥珠单抗、埃罗妥珠单抗、达雷妥尤单抗、莫格利珠单抗、奥英妥珠单抗、奥拉单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗、阿替利珠单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗)、酪氨酸激酶抑制剂(伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼、达沙替尼、拉帕替尼、尼罗替尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿法替尼、博舒替尼、克唑替尼、阿昔替尼、鲁索替尼、瑞戈非尼、普纳替尼、卡博替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、伦瓦替尼、尼达尼布、奥希替尼、阿来替尼、布加替尼)、mTOR激酶抑制剂(替西罗莫司、依维莫司)、其他激酶抑制剂(维莫非尼、达拉非尼、曲美替尼、帕布昔利布、考比替尼、米哚妥林、艾德拉尼),蛋白酶体抑制剂(硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米)、视黄酸受体激动剂(维甲酸、阿利维甲酸、贝沙罗汀、他米巴罗汀)、SMO拮抗剂(维莫德吉)、VEGF抑制剂(阿柏西普)、PARP抑制剂(奥拉帕尼、尼拉帕尼)；激素和激素拮抗药(氟甲睾酮、氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、恩杂鲁胺、炔雌醇、他莫昔芬、托瑞米芬、氟维司群、亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、泼尼松、奥曲肽、甲羟孕酮)；免疫功能辅助疗法，例如干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-α2b)、白细胞介素(阿地白介素、奥普瑞白介素、替西白介素、地尼白介素、diftitox)、集落刺激因子(非格司亭、沙格司亭、来格司亭、聚乙二醇非格司亭)、造血干细胞动员促进剂(普乐沙福)、非特异性免疫调节剂(沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)；烷基化剂、代谢拮抗剂、抗生素、微管聚合物稳定剂(紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)、分裂抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂等。
尤其是，由于已报道了野生型IL-18与IL-2(替西白介素)、野生型IL-18与抗PD-1抗体(纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗、斯巴达珠单抗)、抗PD-L1抗体(阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗)、抗CTLA-4抗体(伊匹木单抗、曲美木单抗)等免疫检查点抑制剂的并用效果(日本特开2004-315381、WO2016/021720)，因此也可以期待与本发明的人IL-18突变体的并用效果。
若为病毒性疾病的情况，则可以与作为核酸系逆转录酶抑制剂的齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、替诺福韦、恩曲他滨、作为非核酸逆转录酶抑制剂的奈韦拉平、依非韦伦、依曲韦林、利匹韦林、多拉韦林、作为蛋白酶抑制剂的奈非那韦、利托那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、达芦那韦、作为整合酶抑制剂的拉替拉韦、埃替拉韦、多替拉韦、作为进入抑制剂的马拉维若、或者包含它们的1种或2种以上的配合剂等适宜组合使用。
若为免疫疾病的情况，则可以与塞来昔布、洛索洛芬钠等NSAID、布西拉明、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、咪唑立宾、他克莫司等DMARD、作为生物学制剂的英夫利西单抗、阿达木单抗、依那西普、阿巴西普、托珠单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗、类克、人重组IL-12、作为类固醇药的泼尼松龙、作为JAK抑制剂的托法替尼等适宜组合使用。
为了进行制剂化，人IL-18突变体也可以与PEG等水溶性的聚合物复合化(WO2004/091517)。
6.其他利用
6.1增殖诱导剂、刺激剂
已知与通过PTA/IL-2刺激并培养得到的γδ型T细胞相比，通过PTA/IL-2/IL-18刺激并培养得到的γδ型T细胞在培养后的数目更多。另外，αβ型T细胞、γδ型T细胞、NK细胞等免疫效应细胞、杀伤细胞中，若添加IL-18，则HLA-DR、HLA-DQ等主要组织相容性抗原、CD80、CD86(正性共刺激分子)、CD25(IL-2受体)、ICOS(正性共刺激分子)等的表达提高，成为被赋予了抗原提呈能力的、优良的免疫效应细胞。
本发明的人IL-18突变体由于使这样的NK细胞、CD8阳性杀伤αβ型T细胞、γδ型T细胞活化、诱导增殖的活性高，因此可以作为NK细胞、CD8阳性杀伤αβ型T细胞、γδ型T细胞的增殖诱导剂或者刺激剂使用。例如，可以将本发明的人IL-18突变体与IL-2一起添加到包含T细胞的细胞群中，从而扩增T细胞。
6.2基因改造T细胞的制备
本发明的人IL-18突变体可以在CAR-T疗法等基因改造T细胞疗法中用于T细胞的扩增。具体而言，从对象的外周血中单离出包含T细胞的外周血单核细胞群，利用抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激后，利用IL-2和人IL-18突变体进行增殖诱导，从而扩增T细胞，然后导入基因，进一步将基因导入后的T细胞利用IL-2和IL-18突变体进行增殖诱导，从而进行扩增，由此可以高效地制备基因改造T细胞。
例如，利用CAR(嵌合抗原受体)表达T细胞的CAR-T疗法中，将外周血单核细胞利用抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激，并利用IL-2进行增殖诱导，从而扩增T细胞，但此时通过在IL-2的基础上还添加IL-18来进行增殖诱导，可以更高效地扩增T细胞。
除上述内容外，本发明的人IL-18突变体在以NK细胞、CD8阳性杀伤αβ型T细胞、γδ型T细胞的活化、增殖为指标的诊断、评价方法中，也可以作为刺激剂或增殖诱导剂使用。
实施例
以下，使用实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1：人半胱天冬酶4突变体(hCasp4-D315E)的制备
为了进行人IL-18的重组生产，制备了用于切割pro-IL-18(IL-18前体)的人半胱天冬酶4。人半胱天冬酶4为由P10和P20这2个亚基构成的异源二聚体。本实施例中，为了防止P10的自体消化，制备了将野生型人半胱天冬酶4前体的氨基酸序列(序列号39)中315位的天冬氨酸(D)置换为谷氨酸(E)的突变体(hCasp4-D315E(图2，序列号40)。
(1)His-tagged hCasp4-D315E(带有His标签的hCasp4-D315E)表达载体的制作
将编码不包含前肽的hCasp4-D315E的DNA序列进行序列优化以用于大肠杆菌中的表达(序列号41)。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列，制作出NdeI-hCasp4-D315E-SalI(图3，序列号42)。将NdeI-hCasp4-D315E-SalI整合到pUCIDT-Amp质粒的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在包含氨苄青霉素的LB培养基(LB/Amp)中筛选菌落，从菌落中提取pUCIDT-NdeI-hCasp4-D315E-SalI。
将从pUCID-Amp-NdeI-hCasp4-D315E-SalI中切出的NdeI-hCasp4-D315E-SalI整合到pColdTMII载体(Takara)的多克隆位点(图4)。pCold TMII载体通过冷却到15℃而使目标蛋白以与His标签融合的可溶性蛋白的形式表达。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在包含选择用药剂的LB培养基中筛选菌落，从菌落中提取包含hCasp4-D315E的载体。
(2)His-tagged hCasp4-D315E的表达
利用上述载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，将所生成的菌落转移至加入了包含选择用药剂的LB培养基10ml的管中，在37℃培养10小时。将培养液10ml接种至培养基(1L、x4)，在37℃培养过夜。将上述培养液50ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养8小时(OD600nM：1.641)。向培养液中加入1M IPTG 1ml以使终浓度达到1mM，制备大肠杆菌悬浮液。对于大肠杆菌悬浮液，在15℃进一步培养20小时，诱导可溶性hCasp4-D315E(His-tagged hCasp4-D315E)的表达。对培养后的悬浮液进行离心分离(7000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清，回收大肠杆菌颗粒，在-30℃冻结保存。
(3)His-tagged hCasp4-D315E的纯化
将冻结了的大肠杆菌颗粒重悬于20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4，包含300mM NaCl)20ml。对悬浮液进行超声波处理(20秒，5次)，进行离心分离(7000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至50ml锥形管。向管中加入DNAse1 100μl，进行离心分离(10000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至新的50ml锥形管。将悬浮液用0.22mM过滤器进行过滤，得到包含His-taggedhCasp4-D315E的样品。将所得到的样品施加于TALON Superflow柱层析(3ml柱床体积)，从而纯化His-tagged hCasp4-D315E。将纯化后的His-tagged hCasp4-D315E进一步施加于Superdex 200pg HiLoad 26/600柱，进行纯化，利用SDS-PAGE进行确认(图5)。
实施例2：人天然型IL-18的制备
人天然型IL-18以包含前肽的前体(序列号2)的形式表达，受到半胱天冬酶的作用后，成为具有活性的成熟hIL-18(序列号3)(图6、图7)。本实施例中，在大肠杆菌中表达hProIL-18，并利用实施例1中制备的hCasp4-D315E进行处理，由此生产hIL-18。
(1)His-tagged hProIL18表达载体的制作
将编码包含前肽的人IL-18的DNA序列(序列号1，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC007461.1)进行序列优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列，制作了NdeI-hProIL18-SalI(图8，序列号4)。将NdeI-hProIL18-SalI整合到pUCID T-Amp质粒的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYO BO)，在LB/Amp中筛选菌落，从菌落中提取pUCIDT-NdeI-hProIL18-SalI。
将从pUCIDT-NdeI-hProIL18-SalI中切出的NdeI-hProIL18-SalI整合到pColdTMII载体的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在包含选择用药剂的LB培养基中筛选菌落，从菌落中提取包含hProIL18的载体。
(2)His-tagged hProIL18的表达
利用上述载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS(Merck)，将所生成的菌落转移至加入了包含选择用药剂的LB培养基10mL的管中，在37℃培养7小时。将培养液10ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养过夜。将上述培养液100ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养5小时30分钟。向培养液中加入1M IPTG 1ml以使终浓度达到1mM，制备大肠杆菌悬浮液(OD600 nM：2.102)。对于大肠杆菌悬浮液，在15℃进一步培养40小时30分钟，诱导可溶性hProIL18(His-tagged hProIL18)的表达。对培养后的悬浮液进行离心分离(7000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清，回收大肠杆菌颗粒，在-30℃冻结保存。
(3)His-tagged hProIL18的纯化
将冻结了的大肠杆菌颗粒重悬于20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4，包含300mM NaCl)20ml。对悬浮液进行超声波处理(20秒，5次)，进行离心分离(7000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至50ml锥形管。向管中加入DNAse1 200μl，进行离心分离(33000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至新的50ml锥形管。将悬浮液用0.22mM过滤器进行过滤，得到包含His-taggedhProIL18的样品。将所得到的样品施加于TALON Superflow柱(3ml柱床体积)，从而纯化His-tagged hProIL18。将纯化后的His-tagged hProIL18进一步施加于Superdex 200pgHiLoad 26/600柱而进行纯化。对于纯化hProIL18，利用hCasp4-D315E进行处理，并利用SDS-PAGE确认hIL18(图9)。
实施例3：人IL-18-CS的制备
将人IL-18的38位、68位、76位、127位的半胱氨酸残基全部置换为丙氨酸，从而制作出hIL-18-CS(序列号5)。
(1)His-and GST-tagged hProIL18-CS表达载体的制作
将编码包含前肽的人IL-18-CS的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18-CS-SalI(序列号6)。将NdeI-hProIL18-CS-SalI整合到pUCIDT-Amp质粒的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在LB/Amp中筛选菌落，从菌落中提取pUCIDT-NdeI-hProIL18-CS-SalI。
将从pUCIDT-NdeI-hProIL18-CS-SalI中切出的NdeI-hProIL18-CS-SalI整合到pColdTMGST载体的多克隆位点。pColdTMGST载体(Takara)通过冷却到15℃而使目标蛋白以与His-GST标签融合的可溶性蛋白的形式表达。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在包含选择用药剂的LB培养基中筛选菌落，从菌落中提取包含hProIL18-CS的载体。
(2)His-and GST-tagged hProIL18-CS的表达
利用上述载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS(Merck)，将所生成的菌落转移至加入了包含选择用药剂的LB培养基10mL的管中，在37℃培养24小时。将培养液10ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养过夜。将上述培养液50ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养8小时。向培养液中加入1M IPTG 1ml以使终浓度达到1mM，制备大肠杆菌悬浮液(OD600 nM：2.690)。对于大肠杆菌悬浮液，在15℃进一步培养40小时，诱导可溶性hProIL18-CS(His-and GST-tagged hProIL18-CS)的表达。对培养后的悬浮液进行离心分离(7000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清，回收大肠杆菌颗粒，在-30℃冻结保存。
(3)His-and GST-tagged hProIL18-CS的纯化
将冻结了的大肠杆菌颗粒重悬于20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4，包含300mM NaCl)20ml。对悬浮液进行超声波处理(20秒，5次)，进行离心分离(7000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至50ml锥形管。向管中加入DNAse1 200μl，进行离心分离(10000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至新的50ml锥形管。将悬浮液用0.22mM过滤器进行过滤，得到包含His-and GST-tagged hProIL18-CS的样品。将所得到的样品施加于TALON Superflow柱(3ml柱床体积)，从而纯化His-and GST-tagged hProIL18-CS。将纯化后的His-and GST-tagged hProIL18-CS进一步施加于Superdex 200pg HiLoad 26/600柱而进行纯化。对于纯化hProIL18-CS，利用hCasp4-D315E进行处理，并利用SDS-PAGE确认hIL18-CS。
实施例4：人IL-18-CSEK的制备
在实施例3中制备的人IL-18-CS中，进一步将6位的谷氨酸残基置换为丙氨酸(E6A)、并且将53位的赖氨酸残基置换为丙氨酸(K53A)，而制作出hIL-18-CSEK(序列号7)。已知人IL-18的6位的谷氨酸残基和53位的赖氨酸为对于与IL-18BP的相互作用而言重要的带电氨基酸，通过除去该部分的电荷而使与IL-18BP的亲和性下降(前述Kim etal.2001)。
(1)His-and GST-tagged hProIL18-CSEK表达载体的制作
将编码包含前肽的人IL-18-CSEK的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18-CSEK-SalI(序列号8)。将NdeI-hProIL18-CSEK-SalI整合到pUCIDT-Amp质粒的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在LB/Amp中筛选菌落，从菌落中提取pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-SalI。
将pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-SalI中切出的NdeI-hProIL18-CSEK-SalI整合到pColdTMGST载体的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在包含选择用药剂的LB培养基中筛选菌落，从菌落中提取包含hProIL18-CSEK的载体。
(2)His-and GST-tagged hProIL18-CSEK的表达
利用上述载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS(Merck)，将所生成的菌落转移至加入了包含选择用药剂的LB培养基10mL的管中，在37℃培养48小时。将培养液10ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养过夜。将上述培养液50ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养11小时。向培养液中加入1M IPTG 1ml以使终浓度达到1mM，制备大肠杆菌悬浮液(OD600nM：1.894)。对于大肠杆菌悬浮液，在15℃进一步培养37小时，诱导可溶性hProIL18-CSEK(His-and GST-tagged hProIL18-CSEK)的表达。对培养后的悬浮液进行离心分离(7000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清，回收大肠杆菌颗粒，在-30℃冻结保存。
(3)His-and GST-tagged hProIL18-CSEK的纯化
将冻结了的大肠杆菌颗粒重悬于20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4，包含300mM NaCl)20ml。对悬浮液进行超声波处理(20秒，5次)，进行离心分离(7000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至50ml锥形管。向管中加入DNAse1 200μl，进行离心分离(10000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至新的50ml锥形管。将悬浮液用0.22mM过滤器进行过滤，得到包含His-taggedhProIL18-CSEK的样品。将所得到的样品施加于TALON Superflow柱(3ml柱床体积)，从而纯化His-and GST-tagged hProIL18-CSEK。将纯化后的His-and GST-tagged hProIL18-CSEK进一步施加于Superdex 200pg HiLoad 26/600柱而进行纯化。对于纯化hProIL18-CSEK，利用hCasp4-D315E进行处理，并利用SDS-PAGE确认hIL18-CSEK。
实施例5：基于人IL-18-CSEK的各种突变体的制作
A.预分析
1.In silico点突变扫描
hIL-18CSEK的活性低于野生型hIL-18。认为这是因为，被导入的突变会损害蛋白质自身的结构稳定性。因此，对于全部氨基酸，在计算机上网罗式地导入1个残基突变，利用超级计算机来计算出由Gibbs自由能量变化的差值(ΔΔG)表示的IL18折叠的相对稳定性(H.Park et al.2016)。在预测蛋白质稳定化的情况下，ΔΔG的值为负，因此，通过使用该值，能够定量地进行评价。对于在该时刻时ΔΔG的值预想为负的候补、和通过序列分析预想稳定化的突变候补，进一步进行精度高的ΔΔG的预测(L.Wang et al.2013)。进而，探索不对IL-18CSEK与IL-18Rα/β蛋白的结合带来影响地减少ΔΔG的点突变。
2.S-S键的导入
基于Dombkowski 2003&Craig and Dombkowski 2013，向IL-18中导入新的S-S键，研究是否能够改善热稳定性。基于结构信息(Tsutsumi et al.2014；结构的蛋白质数据库ID：3W04)，根据Cα-Cβ-Cβ-Cα的相对位置预测导入了S-S键时的结构稳定性，探索结构应变能低、即不显著扰乱结构地引入S-S键的残基对。作为结构应变能低于作为基准的2.20kcal/mol的同一链内的S-S键的可导入位点，确定出S7C-S50C(2.05kcal/mol(A链)、1.78kcal/mol(B链))。
B.点突变的导入
将In silico点突变扫描中发现的突变导入至人IL-18-CSEK，制备出基于人IL-18-CSEK的各种突变体。
B-1.人IL-18-CSEK-G3Y的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将3位的甘氨酸残基置换为酪氨酸，制作出hIL-18-CSEK-G3Y(序列号9)。
(1)hProIL18-CSEK-G3Y表达载体的制作
将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-C38M的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-Sa lI(序列号10)。将NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI整合到pUCIDT-Amp质粒的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在LB/Amp培养基中筛选菌落，从菌落中提取pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI。
将pUCIDT-NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI中切出的NdeI-hProIL 18-CSEK-G3Y-SalI整合到pColdTMII载体的多克隆位点。利用所得到的质粒转化大肠杆菌DH5a(TOYOBO)，在包含选择用药剂的LB培养基中筛选菌落，从菌落中提取包含hProIL18-CSEK的载体。
(2)His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y的表达
利用上述载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS(Merck)，将所生成的菌落转移至加入了包含选择用药剂的LB培养基10mL的管中，在37℃培养7小时30分钟。将培养液10ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养过夜。将上述培养液100ml接种至培养基(1L、x 4)，在37℃培养7小时。向培养液中加入1M IPTG 1ml以使终浓度达到1mM，制备大肠杆菌悬浮液(OD600 nM：2.295)。对于大肠杆菌悬浮液，在15℃进一步培养40小时，诱导可溶性hProIL18-CSEK-G3Y(His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y)的表达。对培养后的悬浮液进行离心分离(7000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清，回收大肠杆菌颗粒，在-30℃冻结保存。
(3)His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y的纯化
将冻结了的大肠杆菌颗粒重悬于20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4，包含300mM NaCl)20ml。对悬浮液进行超声波处理(20秒，5次)，进行离心分离(7000rpm，30分钟，4℃)，将上清转移至50ml锥形管。向管中加入DNAse1 200μl，进行离心分离(10000rpm，1小时，4℃)，将上清转移至新的50ml锥形管。将悬浮液用0.22mM过滤器进行过滤，得到包含His-taggedhProIL18-CSEK-G3Y的样品。将所得到的样品施加于TALON Superflow柱(3ml柱床体积)，从而纯化His-tagged hProIL18-CSEK-G3Y。将纯化后的His-and GST-tagged hProIL18-CSEK-G3Y进一步施加于Superdex 200pg HiLoad 26/600柱而进行纯化。对于纯化hProIL18-CSEK-G3Y，利用hCasp4-D315E进行处理，并利用SDS-PAGE确认hIL18-CSEK-G3Y。
B-2.人IL-18-CSEK-G3L的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将3位的甘氨酸残基置换为酪氨酸，制作出hIL-18-CSEK-G3L(序列号11)。
按照B-1，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-G3L的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18-CSEK-G3L-SalI(序列号12)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-G3L。
B-3.人IL-18-CSEK-A6W的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将6位的谷氨酸残基置换为色氨酸，制作出hIL-18-CSEK-A6W(序列号13)。
按照B-1，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-A6W的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18-CSEK-A6W-SalI(序列号14)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-A6W。
B-4.人IL-18-CSEK-T34P的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将34位的胸腺嘧啶残基置换为脯氨酸，制作出hIL-18-CSEK-T34P(序列号15)。
按照B-1，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-T34P的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18CSEK-T34P-SalI(序列号16)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-T34P。
B-5.人IL-18-CSEK-C38M的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将38位的半胱氨酸残基置换为甲硫氨酸，制作出hIL-18-CSEK-C38M(序列号17)。
按照B-1，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-T38M的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18CSEK-C38M-SalI(序列号18)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-C38M。
B-6.人IL-18-CSEK-M51Y的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将51位的甲硫氨酸残基置换为酪氨酸，制作出hIL-18-CSEK-M51Y(序列号19)。
按照B-1，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-M51Y的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18CSEK-M51Y-SalI(序列号20)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-M51Y。
B-7.人IL-18-CSEK-S72Y的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将72位的丝氨酸残基置换为酪氨酸，制作出hIL-18-CSEK-S72Y(序列号21)。
除了代替pColdTMII载体而使用pColdTMGST载体(参照实施例3)以外，与B-1同样地，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-S72Y的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18CSEK-S72Y-SalI(序列号22)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-S72Y。
B-8.人IL-18-CSEK-S72F的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将72位的丝氨酸残基置换为苯丙氨酸，制作出hIL-18-CSEK-S72F(序列号23)。
除了代替pColdTMII载体而使用pColdTMGST载体(参照实施例3)以外，与B-1同样地，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-S72F的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18CSEK-S72F-SalI(序列号24)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-S72F。
B-9.人IL-18-CSEK-S72M的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将72位的丝氨酸残基置换为甲硫氨酸，制作出hIL-18-CSEK-S72M(序列号25)。
除了代替pColdTMII载体而使用pColdTMGST载体(参照实施例3)以外，与B-1同样地，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-S72M的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出NdeI-hProIL18CSEK-S72M-SalI(序列号26)，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-S72M。
B-10.人IL-18-CSEK-S72L的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将72位的丝氨酸残基置换为亮氨酸，制作出hIL-18-CSEK-S72L(序列号27)。
除了代替pColdTMII载体而使用pColdTMGST载体(参照实施例3)以外，与B-1同样地，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-S72L的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出包含NdeI-hProIL18CSEK-S72L-SalI(序列号28)的载体，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-S72L。
B-11.人IL-18-CSEK-S72W的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将72位的丝氨酸残基置换为色氨酸，制作出hIL-18-CSEK-S72W(序列号29)。
除了代替pColdTMII载体而使用pColdTMGST载体(参照实施例3)以外，与B-1同样地，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-S72W的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出包含NdeI-hProIL18CSEK-S72W-SalI(序列号30)的载体，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-S72W。
B-12.人IL-18-CSEK-K112W的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将112位的赖氨酸残基置换为色氨酸，制作出hIL-18-CSEK-K112W(序列号31)。
除了代替pColdTMII载体而使用pColdTMGST载体(参照实施例3)以外，与B-1同样地，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-K112W的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出包含NdeI-hProIL18CSEK-K112W-SalI(序列号32)的载体，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-K112W。
B-13.人IL-18-CSEK-K119V的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将119位的赖氨酸残基置换为缬氨酸，制作出hIL-18-CSEK-K119V(序列号33)。
除了代替pColdTMII载体而使用pColdTMGST载体(参照实施例3)以外，与B-1同样地，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-K119V的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出包含NdeI-hProIL18CSEK-K119V-SalI(序列号34)的载体，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-K119V。
B-14.人IL-18-CSEK-G145N的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将145位的鸟嘌呤残基置换为天冬酰胺，制作出hIL-18-CSEK-G145N(序列号35)。
按照B-1，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-G145N的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出包含NdeI-hProIL18CSEK-G145N-SalI(序列号36)的载体，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-G145N。
B-15.人IL-18-CSEK-S7/50C的制备
在实施例4中制备的人IL-18-CSEK中，进一步将7位和50位的丝氨酸残基均置换为半胱氨酸，制作出hIL-18-CSEK-S7/50C(序列号37)。
按照B-1，将编码包含前肽的人IL-18-CSEK-S7/50C的DNA序列进行优化以用于大肠杆菌中的表达。在优化后的序列的N末端和C末端分别附加限制酶NdeI和SalI的识别序列而制作出包含NdeI-hProIL18CSEK-S7/50C-SalI(序列号38)的载体，使用大肠杆菌以可溶性蛋白的形式进行表达，利用TALON柱和Superdex 200pg柱纯化后，利用hCasp4-D315E处理而制作出hIL18-CSEK-S7/50C。
试验例1：突变体活性测定1-凝聚活性
将冻结了的KG-1细胞在RPMI1640/10％FCS培养基12ml中解冻。对管进行离心分离(1700rpm，5分钟，4℃)，吸出上清后，使细胞颗粒分散并重悬于10ml的RPMI1640/10％FCS培养基(细胞数：2.00x 106细胞/ml，合计10ml)。对管再次进行离心分离(1700rpm，5分钟，4℃)，吸出上清后，使细胞颗粒分散并重悬于10ml的RPMI1640/10％FCS培养基，得到3x 105/100ml的KG-1细胞悬浮液。将KG-1细胞悬浮液(各100ml)加入到96孔板的孔中。
向IL-18突变体中加入PBS，制作50μg/ml的储备液。向该储备液12ml中添加RPMI1640/10％ FCS培养基988ml，制作稀释液(600ng/ml)。如下表所示地，将该稀释液用RPMI1640/10％ FCS培养基逐步地进行稀释，制备出连续稀释样品(1)～(6)。将连续稀释样品添加到96孔板的各孔中。
[表1]
IL-18稀释液 RPMI1640/10％FCS培养基 浓度 最终浓度
400μl 800μl 200ng/ml 100ng/ml (1)
300μl 700μl 60ng/ml 30ng/ml (2)
400μl 800μl 20ng/ml 10ng/ml (3)
300μl 700μ1 6ng/ml 3ng/ml (4)
400μl 800μl 2ng/ml 1ng/ml (5)
- 2,000μl 0ng/ml 0ng/ml (6)
结果：
在培养开始后24小时和48小时的时刻，进行细胞的显微镜观察。其结果是，对于具有活性的IL-18突变体，呈浓度依赖性地观察到细胞的凝聚。该凝聚的浓度依赖性与基于ELISA测定的IFNγ产生的浓度依赖性(试验例2)一致。
试验例2：IFN-γ产生增强活性(1)
将包含人IFN-γ用捕捉抗体(100μg/ml)100μl的微量离心管解冻，用10ml的PBS稀释而使其为1μg/ml。将稀释后的捕捉抗体(各100μl)加入到96孔ELISA板(Nunc)的所有孔中，在4℃下放置。
除去捕捉抗体，将孔用PBS/0.05％Tween-20清洗4次。废弃PBS/0.05％Tween-20，将封闭缓冲液(PBS/1％BSA、各300ml)添加到96孔ELISA板中，进行密封，在室温放置至少1小时。废弃封闭缓冲液，将孔用PBS/0.05％Tween-20清洗4次。将包含KG-1细胞上清的96孔板解冻，将上清(各100ml)添加到ELISA板。
如下表所示，对于标准人IFNγ，制备PBS/0.05％Tween80/0.1％BSA的连续稀释溶液。将连续稀释后的标准人IFNγ(各100μl)加入到96孔的ELISA板，在室温放置至少2小时。
[表2]
IFN-γ稀释液 稀释剂(PBS/0.05％Tween 80/0.1％BSA) 最终浓度
2.4μl(1μg/ml) 797.6μl 3000pg/ml (1)
400μl(3000pg/ml) 400μl 1500pg/ml (2)
400μl(1500pg/ml) 400μl 750pg/ml (3)
400μl(750pg/ml) 400μl 375pg/ml (4)
400μl(375pg/ml) 400μl 187.5pg/ml (5)
400μl(187.5pg/m1) 400μl 93.75pg/ml (6)
400μl(93.75pg/ml) 400μl 46.875pg/ml (7)
- 400μl 0pg/ml (8)
废弃样品，将孔用300ml的PBS/0.05％Tween-20清洗4次。将包含人IFN-γ检测抗体(100μg/ml)100ml的微量离心管解冻，用10ml的稀释液稀释而使其为1μg/ml的浓度。将稀释后的检测抗体(各100μl)加入到96孔ELISA板(Nunc)，将板在室温放置1小时。吸出检测抗体，将孔用300μl的PBS/0.05％Tween-20清洗4次。将包含5.5μl的亲和素-HRP缀合物的微量离心管解冻，将亲和素-HRP缀合物用11ml的稀释剂稀释。将亲和素-HRP缀合物(各100μl)分注到在室温放置了30分钟的96孔ELISA板。废弃亲和素-HRP缀合物溶液，将孔用PBS/0.05％Tween-20清洗4次。将ABTS液体底物(各100μl)加入到板，在室温温育5分钟。将ABTS终止液(在DW中含1％SDS)加入到板，用405nm的读板器监测显色。基于标准曲线，计算出人IFN-γ的量。将结果示出于图10和11。
结果：
将4个半胱氨酸残基全部置换为丝氨酸而得的IL-18CS突变体与野生型IL-18相比，活性优势性地变高。另一方面，为了减弱与IL-18结合蛋白的结合而进一步导入了EK置换的IL-18CSEK突变体与IL-18受体的结合能力也下降，与IL-18CS突变体相比，活性优势性地下降，达到高于野生型IL-18的活性。向该IL-18CSEK突变体中进一步导入了1个氨基酸置换的IL-18突变体中的C38M、G3Y、G3L、S72Y、S72F、S72M、S72L、E6W、S72W、K112W、T34P、G145N、M51Y、S119V显示出高于野生型IL-18的活性。另外，人工导入了S-S键的S7和S50被置换为C的S7/50C突变体也具有高于野生型IL-18的活性。
试验例3：IFN-γ产生增强活性(2)
对于在试验例2中确认到较高活性的突变中的G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F和S72M，按照实施例5，将上述各突变导入到IL-18CS突变体和野生型中，制作出基于IL-18CS突变体的突变体、和基于野生型的突变体。按照试验例2，对上述各突变体以及IL-18(野生型：WT)、IL-18CS突变体和IL-18CSEK突变体的IFN-γ产生增强活性进行测定。将结果示出于图12。
向IL-18CS突变体和IL-18野生型中引入了上述点突变的突变体，均显示出与野生型IL-18、IL-18CSEK突变体和IL-18CS突变体相比更高的IFN-γ产生诱导增强活性。G3L和C38M的各突变显示出尤其良好的IFN-γ产生增强活性。
以下，在表3中记载人IL-18突变体的氨基酸序列(下划线为突变导入位点)，在表4中记载进行了优化以用于大肠杆菌中的重组表达的人IL-18突变体的DNA序列(方框部分为突变导入位点)。
[表3]
/>
/>
/>
[表4]
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
产业上的可利用性
本发明的人IL-18突变体的稳定性高，并且为高活性，因此，对于癌、病毒性疾病、免疫系统疾病等的治疗而言是有用的。
本说明书中引用的全部刊物、专利和专利申请均直接作为参考并入本说明书中。
序列表自由文本
序列号4：NdeI-hProIL18-SalI
序列号5：hIL-18-CS
序列号6：NdeI-hProIL18-CS-SalI
序列号7：hIL-18-CSEK
序列号8：NdeI-hProIL18-CSEK-SalI
序列号9：hIL-18-CSEK-G3Y
序列号10：NdeI-hProIL18-CSEK-G3Y-SalI
序列号11：hIL-18-CSEK-G3L
序列号12：NdeI-hProIL18-CSEK-G3L-SalI
序列号13：hIL-18-CSEK-A6W
序列号14：NdeI-hProIL18-CSEK-A6W-SalI
序列号15：hIL-18-CSEK-T34P
序列号16：NdeI-hProIL18CSEK-T34P-SalI
序列号17：hIL-18-CSEK-C38M
序列号18：NdeI-hProIL18CSEK-C38M-SalI
序列号19：hIL-18-CSEK-M51Y
序列号20：NdeI-hProIL18CSEK-M51Y-SalI
序列号21：hIL-18-CSEK-S72Y
序列号22：NdeI-hProIL18CSEK-S72Y-SalI
序列号23：hIL-18-CSEK-S72F
序列号24：NdeI-hProIL18CSEK-S72F-SalI
序列号25：hIL-18-CSEK-S72M
序列号26：NdeI-hProIL18CSEK-S72M-SalI
序列号27：hIL-18-CSEK-S72L
序列号28：NdeI-hProIL18CSEK-S72L-SalI
序列号29：hIL-18-CSEK-S72W
序列号30：NdeI-hProIL18CSEK-S72W-SalI
序列号31：hIL-18-CSEK-K112W
序列号32：NdeI-hProIL18CSEK-K112W-SalI
序列号33：hIL-18-CSEK-K119V
序列号34：NdeI-hProIL18CSEK-K119V-SalI
序列号35：hIL-18-CSEK-G145N
序列号36：NdeI-hProIL18CSEK-G145N-SalI
序列号37：hIL-18-CSEK-S7/50C
序列号38：NdeI-hProIL18CSEK-S7/50C-SalI
序列号40：hCasp4-D315E
序列号41：hCasp4-D315E DNA
序列号42：NdeI-hCasp4-D315E-SalI
序列号45：hIL-18-CS-G3Y
序列号46：NdeI-hProIL18CS-G3Y-SalI
序列号47：hIL-18-CS-G3L
序列号48：NdeI-hProIL18CS-G3L-SalI
序列号49：hIL-18-CS-C38M
序列号50：NdeI-hProIL18CS-C38M-SalI
序列号51：hIL-18-CS-S72Y
序列号52：NdeI-hProIL18CS-S72Y-SalI
序列号53：hIL-18-CS-S72F
序列号54：NdeI-hProIL18CS-S72F-SalI
序列号55：hIL-18-CS-S72M
序列号56：NdeI-hProIL18CS-S72M-SalI
序列号57：hIL-18-G3Y
序列号58：NdeI-hProIL18-G3Y-SalI
序列号59：hIL-18-G3L
序列号60：NdeI-hProIL18-G3L-SalI
序列号61：hIL-18-C38M
序列号62：NdeI-hProIL18-C38M-SalI
序列号63：hIL-18-S72Y
序列号64：NdeI-hProIL18-S72Y-SalI
序列号65：hIL-18-S72F
序列号66：NdeI-hProIL18-S72F-SalI
序列号67：hIL-18-S72M
序列号68：NdeI-hProIL18-S72M-SalI
序列表
<110> 国立大学法人长崎大学
公益财团法人神户医疗产业都市推进机构
国立研究开发法人量子科学技术研究开发机构
<120> 新型人白细胞介素-18突变体及其用途
<130> PN37-9001WO
<150> JP2021-19418
<151> 2021-02-10
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 973
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> CDS
<222> (221)..(802)
<400> 1
attctctccc cagcttgctg agccctttgc tcccctggcg actgcctgga cagtcagcaa 60
ggaattgtct cccagtgcat tttgccctcc tggctgccaa cgctggctgc taaagtggct 120
gccacctgct gcagtctaca cagcttcggg aagaggaaag gaacctcaga ccttccagat 180
cgcttcctct cgcaacaaac tatttgtcgc aggaataaag atg gct gct gaa cca 235
Met Ala Ala Glu Pro
1 5
gta gaa gac aat tgc atc aac ttt gtg gca atg aaa ttt att gac aat 283
Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met Lys Phe Ile Asp Asn
10 15 20
acg ctt tac ttt ata gct gaa gat gat gaa aac ctg gaa tcc gat tac 331
Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn Leu Glu Ser Asp Tyr
25 30 35
ttt ggc aag ctt gaa tct aaa tta tca gtc ata aga aat ttg aat gac 379
Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp
40 45 50
caa gtt ctc ttc att gac caa gga aat cgg cct cta ttt gaa gat atg 427
Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met
55 60 65
act gat tct gac tgt aga gat aat gca ccc cgg acc ata ttt att ata 475
Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile
70 75 80 85
agt atg tat aaa gat agc cag cct aga ggt atg gct gta act atc tct 523
Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser
90 95 100
gtg aag tgt gag aaa att tca act ctc tcc tgt gag aac aaa att att 571
Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile
105 110 115
tcc ttt aag gaa atg aat cct cct gat aac atc aag gat aca aaa agt 619
Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser
120 125 130
gac atc ata ttc ttt cag aga agt gtc cca gga cat gat aat aag atg 667
Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met
135 140 145
caa ttt gaa tct tca tca tac gaa gga tac ttt cta gct tgt gaa aaa 715
Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys
150 155 160 165
gag aga gac ctt ttt aaa ctc att ttg aaa aaa gag gat gaa ttg ggg 763
Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly
170 175 180
gat aga tct ata atg ttc act gtt caa aac gaa gac tag ctattaaaat 812
Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
185 190
ttcatgccgg gcgcagtggc tcacgcctgt aatcccagcc ctttgggagg ctgaggcggg 872
cagatcgcca gaggtcaggt gttcaagacc agcctgacca acatggtgaa acctcatctc 932
tactaaaaat acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 973
<210> 2
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met
1 5 10 15
Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn
20 25 30
Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile
35 40 45
Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro
50 55 60
Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg
65 70 75 80
Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met
85 90 95
Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile
115 120 125
Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly
130 135 140
His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe
145 150 155 160
Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys
165 170 175
Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu
180 185 190
Asp
<210> 3
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 4
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hProIL18-SalI
<400> 4
catatggctg ctgaaccggt tgaagacaac tgcatcaact tcgttgctat gaaattcatc 60
gacaacaccc tgtacttcat cgctgaagac gacgaaaacc tggaatctga ctacttcggt 120
aaactggaat ctaaactgtc tgttatccgt aacctgaacg accaggttct gttcatcgac 180
cagggtaacc gtccgctgtt cgaagacatg accgactctg actgccgtga caacgctccg 240
cgtaccatct tcatcatctc tatgtacaaa gactctcagc cgcgtggtat ggctgttacc 300
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gaagacgaac tgggtgaccg ttctatcatg ttcaccgttc agaacgaaga ctaagtcgac 480
<210> 27
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18-CSEK-S72L
<400> 27
Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Leu Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 28
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hProIL18CSEK-S72L-SalI
<400> 28
tacttcggta aactggcttc taaactgtct gttatccgta acctgaacga ccaggttctg 60
ttcatcgacc agggtaaccg tccgctgttc gaagacatga ccgactctga ctctcgtgac 120
aacgctccgc gtaccatctt catcatctct atgtacgctg actctcagcc gcgtggtatg 180
gctgttacca tctctgttaa atctgaaaaa atcctgaccc tgtcttctga aaacaaaatc 240
atctctttca aagaaatgaa cccgccggac aacatcaaag acaccaaatc tgacatcatc 300
ttcttccagc gttctgttcc gggtcacgac aacaaaatgc agttcgaatc ttcttcttac 360
gaaggttact tcctggcttc tgaaaaagaa cgtgacctgt tcaaactgat cctgaaaaaa 420
gaagacgaac tgggtgaccg ttctatcatg ttcaccgttc agaacgaaga ctaagtcgac 480
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18-CSEK-S72W
<400> 29
Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Trp Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 30
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hProIL18CSEK-S72W-SalI
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tacttcggta aactggcttc taaactgtct gttatccgta acctgaacga ccaggttctg 60
ttcatcgacc agggtaaccg tccgctgttc gaagacatga ccgactctga ctctcgtgac 120
aacgctccgc gtaccatctt catcatctct atgtacgctg actctcagcc gcgtggtatg 180
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atctctttca aagaaatgaa cccgccggac aacatcaaag acaccaaatc tgacatcatc 300
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gaaggttact tcctggcttc tgaaaaagaa cgtgacctgt tcaaactgat cctgaaaaaa 420
gaagacgaac tgggtgaccg ttctatcatg ttcaccgttc agaacgaaga ctaagtcgac 480
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18-CSEK-K112W
<400> 31
Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Trp
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 32
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hProIL18CSEK-K112W-SalI
<400> 32
tacttcggta aactggcttc taaactgtct gttatccgta acctgaacga ccaggttctg 60
ttcatcgacc agggtaaccg tccgctgttc gaagacatga ccgactctga ctctcgtgac 120
aacgctccgc gtaccatctt catcatctct atgtacgctg actctcagcc gcgtggtatg 180
gctgttacca tctctgttaa atctgaaaaa atctctaccc tgtcttctga aaacaaaatc 240
atctctttca aagaaatgaa cccgccggac aacatcaaag acaccaaatc tgacatcatc 300
ttcttccagc gttctgttcc gggtcacgac aactggatgc agttcgaatc ttcttcttac 360
gaaggttact tcctggcttc tgaaaaagaa cgtgacctgt tcaaactgat cctgaaaaaa 420
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<210> 33
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18-CSEK-K119V
<400> 33
Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Val Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 34
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hProIL18CSEK-K119V-SalI
<400> 34
tacttcggta aactggcttc taaactgtct gttatccgta acctgaacga ccaggttctg 60
ttcatcgacc agggtaaccg tccgctgttc gaagacatga ccgactctga ctctcgtgac 120
aacgctccgc gtaccatctt catcatctct atgtacgctg actctcagcc gcgtggtatg 180
gctgttacca tctctgttaa atctgaaaaa atctctaccc tgtcttctga aaacaaaatc 240
atctctttca aagaaatgaa cccgccggac aacatcaaag acaccaaatc tgacatcatc 300
ttcttccagc gttctgttcc gggtcacgac aacaaaatgc agttcgaatc ttctgtttac 360
gaaggttact tcctggcttc tgaaaaagaa cgtgacctgt tcaaactgat cctgaaaaaa 420
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<210> 35
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18-CSEK-G145N
<400> 35
Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Asn Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
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<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hProIL18CSEK-G145N-SalI
<400> 36
tacttcggta aactggcttc taaactgtct gttatccgta acctgaacga ccaggttctg 60
ttcatcgacc agggtaaccg tccgctgttc gaagacatga ccgactctga ctctcgtgac 120
aacgctccgc gtaccatctt catcatctct atgtacgctg actctcagcc gcgtggtatg 180
gctgttacca tctctgttaa atctgaaaaa atctctaccc tgtcttctga aaacaaaatc 240
atctctttca aagaaatgaa cccgccggac aacatcaaag acaccaaatc tgacatcatc 300
ttcttccagc gttctgttcc gggtcacgac aacaaaatgc agttcgaatc ttcttcttac 360
gaaggttact tcctggcttc tgaaaaagaa cgtgacctgt tcaaactgat cctgaaaaaa 420
gaagacgaac tgaacgaccg ttctatcatg ttcaccgttc agaacgaaga ctaagtcgac 480
<210> 37
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18-CSEK-S7/50C
<400> 37
Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Cys Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Cys Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 38
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hProIL18CSEK-S7/50C-SalI
<400> 38
tacttcggta aactggcttg caaactgtct gttatccgta acctgaacga ccaggttctg 60
ttcatcgacc agggtaaccg tccgctgttc gaagacatga ccgactctga ctctcgtgac 120
aacgctccgc gtaccatctt catcatctgc atgtacgctg actctcagcc gcgtggtatg 180
gctgttacca tctctgttaa atctgaaaaa atctctaccc tgtcttctga aaacaaaatc 240
atctctttca aagaaatgaa cccgccggac aacatcaaag acaccaaatc tgacatcatc 300
ttcttccagc gttctgttcc gggtcacgac aacaaaatgc agttcgaatc ttcttcttac 360
gaaggttact tcctggcttc tgaaaaagaa cgtgacctgt tcaaactgat cctgaaaaaa 420
gaagacgaac tgggtgaccg ttctatcatg ttcaccgttc agaacgaaga ctaagtcgac 480
<210> 39
<211> 273
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu
1 5 10 15
Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg
20 25 30
Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg
35 40 45
Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly
50 55 60
Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met
65 70 75 80
Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser
85 90 95
Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile
100 105 110
Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp
115 120 125
Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp
130 135 140
Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly
145 150 155 160
Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser
165 170 175
Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val
180 185 190
Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser
195 200 205
Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr
210 215 220
Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg
225 230 235 240
Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro
245 250 255
Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly
260 265 270
Asn
<210> 40
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCasp4-D315E
<400> 40
Met Ala Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Lys Asp Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln
20 25 30
Asn Val Leu Asn Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala
35 40 45
Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys
50 55 60
Gln Arg Met Ala Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp
65 70 75 80
Gln Ile Ser Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro
85 90 95
Pro Glu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu
100 105 110
Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile
115 120 125
Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr
130 135 140
Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr
145 150 155 160
Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu
165 170 175
Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala
180 185 190
Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met
195 200 205
Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys
210 215 220
Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn
225 230 235 240
Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln
245 250 255
Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro
260 265 270
Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu
275 280 285
Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys
290 295 300
Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Glu Ser Thr Met Gly Ser
305 310 315 320
Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys
325 330 335
Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr
340 345 350
Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr
355 360 365
Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn
370 375
<210> 41
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCasp4-D315E DNA
<400> 41
atggctctga aactgtgccc gcacgaagaa ttcctgcgtc tgtgcaaaga acgtgctgaa 60
gaaatctacc cgatcaaaga acgtaacaac cgtacccgtc tggctctgat catctgcaac 120
accgaattcg accacctgcc gccgcgtaac ggtgctgact tcgacatcac cggtatgaaa 180
gaactgctgg aaggtctgga ctactctgtt gacgttgaag aaaacctgac cgctcgtgac 240
atggaatctg ctctgcgtgc tttcgctacc cgtccggaac acaaatcttc tgactctacc 300
ttcctggttc tgatgtctca cggtatcctg gaaggtatct gcggtaccgt tcacgacgaa 360
aaaaaaccgg acgttctgct gtacgacacc atcttccaga tcttcaacaa ccgtaactgc 420
ctgtctctga aagacaaacc gaaagttatc atcgttcagg cttgccgtgg tgctaaccgt 480
ggtgaactgt gggttcgtga ctctccggct tctctggaag ttgcttcttc tcagtcttct 540
gaaaacctgg aagaagacgc tgtttacaaa acccacgttg aaaaagactt catcgctttc 600
tgctcttcta ccccgcacaa cgtttcttgg cgtgaatcta ccatgggttc tatcttcatc 660
acccagctga tcacctgctt ccagaaatac tcttggtgct gccacctgga agaagttttc 720
cgtaaagttc agcagtcttt cgaaaccccg cgtgctaaag ctcagatgcc gaccatcgaa 780
cgtctgtcta tgacccgtta cttctacctg ttcccgggta actaa 825
<210> 42
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NdeI-hCasp4-D315E-SalI
<400> 42
catatggctc tgaaactgtg cccgcacgaa gaattcctgc gtctgtgcaa agaacgtgct 60
gaagaaatct acccgatcaa agaacgtaac aaccgtaccc gtctggctct gatcatctgc 120
aacaccgaat tcgaccacct gccgccgcgt aacggtgctg acttcgacat caccggtatg 180
aaagaactgc tggaaggtct ggactactct gttgacgttg aagaaaacct gaccgctcgt 240
gacatggaat ctgctctgcg tgctttcgct acccgtccgg aacacaaatc ttctgactct 300
accttcctgg ttctgatgtc tcacggtatc ctggaaggta tctgcggtac cgttcacgac 360
gaaaaaaaac cggacgttct gctgtacgac accatcttcc agatcttcaa caaccgtaac 420
tgcctgtctc tgaaagacaa accgaaagtt atcatcgttc aggcttgccg tggtgctaac 480
cgtggtgaac tgtgggttcg tgactctccg gcttctctgg aagttgcttc ttctcagtct 540
tctgaaaacc tggaagaaga cgctgtttac aaaacccacg ttgaaaaaga cttcatcgct 600
ttctgctctt ctaccccgca caacgtttct tggcgtgaat ctaccatggg ttctatcttc 660
atcacccagc tgatcacctg cttccagaaa tactcttggt gctgccacct ggaagaagtt 720
ttccgtaaag ttcagcagtc tttcgaaacc ccgcgtgcta aagctcagat gccgaccatc 780
gaacgtctgt ctatgacccg ttacttctac ctgttcccgg gtaactaagt cgac 834
<210> 43
<211> 192
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 43
Met Ala Ala Met Ser Glu Asp Ser Cys Val Asn Phe Lys Glu Met Met
1 5 10 15
Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Pro Glu Glu Asn Gly Asp Leu
20 25 30
Glu Ser Asp Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg
35 40 45
Asn Ile Asn Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe
50 55 60
Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg
65 70 75 80
Leu Ile Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val
85 90 95
Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn
100 105 110
Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp
115 120 125
Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn
130 135 140
Lys Met Glu Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys
145 150 155 160
Gln Lys Glu Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu
165 170 175
Asn Gly Asp Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
180 185 190
<210> 44
<211> 157
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 44
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 45
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18-CS-G3Y
<400> 45
Tyr Phe Tyr Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 46
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgttacca tctctgttaa atgcgaaaaa atcatgaccc tgtcttgcga aaacaaaatc 240
atctctttca aagaaatgaa cccgccggac aacatcaaag acaccaaatc tgacatcatc 300
ttcttccagc gttctgttcc gggtcacgac aacaaaatgc agttcgaatc ttcttcttac 360
gaaggttact tcctggcttg cgaaaaagaa cgtgacctgt tcaaactgat cctgaaaaaa 420
gaagacgaac tgggtgaccg ttctatcatg ttcaccgttc agaacgaaga ctaagtcgac 480

Claims (14)

1.一种人IL-18突变体，其具有对于野生型人IL-18的氨基酸序列中38位、68位、76位和127位的半胱氨酸被置换为丝氨酸、并且6位的谷氨酸和53位的赖氨酸被置换为丙氨酸的氨基酸序列进一步导入了至少1个追加突变的氨基酸序列，并且具有高于野生型人IL-18的活性。
2.根据权利要求1所述的人IL-18突变体，其中，所述追加突变选自野生型人IL-18的氨基酸序列的3位、34位、38位、51位、72位、112位、119位和145位的突变、以及向7位与50位之间的二硫键的导入。
3.根据权利要求1所述的人IL-18突变体，其中，所述追加突变选自G3Y、G3L、A6W、T34P、C38M、M51Y、S72Y、S72F、S72M、S72L、S72W、K112W、K119V、G145N和S7/50C。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的人IL-18突变体，其中，活性为干扰素γ产生诱导增强能力。
5.一种人IL-18突变体，其具有对于野生型人IL-18的氨基酸序列中38位、68位、76位和127位的半胱氨酸被置换为丝氨酸、并且6位的谷氨酸和53位的赖氨酸被置换为丙氨酸的突变体导入了至少1个追加突变的氨基酸序列，
所述追加突变为选自G3Y、G3L、A6W、T34P、C38M、M51Y、S72Y、S72F、S72M、S72L、S72W、K112W、K119V、G145N和S7/50C中的任意一个。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的人IL-18突变体，其中，所述追加突变为选自G3Y、G3L、C38M、S72Y、S72F、S72M、S72L和S72W中的任意一个。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的人IL-18突变体，其中，野生型人IL-18的氨基酸序列包含序列号3所示的氨基酸序列。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1～7中任一项所述的人IL-18突变体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗对IFNγ具有敏感性的病毒性疾病、癌或免疫疾病。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其与选自由抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和IL-2组成的组中的至少一种并用。
11.一种T细胞增殖诱导增强剂，其包含权利要求1～7中任一项所述的人IL-18突变体。
12.一种基因改造T细胞的制造方法，其包括在IL-2和权利要求1～7中任一项所述的人IL-18突变体的存在下对包含T细胞的细胞群增强增殖诱导的步骤。
13.一种人IL-18突变体，其具有野生型人IL-18的氨基酸序列中G3L的突变，并且根据期望具有以下的1)或2)的追加突变：
1)38位、68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换；
2)38位、68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换、以及6位的谷氨酸和53位的赖氨酸向丙氨酸的置换。
14.一种人IL-18突变体，其具有野生型人IL-18的氨基酸序列中C38M的突变，并且根据期望具有以下的1)或2)的追加突变：
1)68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换；
2)68位、76位和127位的半胱氨酸向丝氨酸的置换、以及6位的谷氨酸和53位的赖氨酸向丙氨酸的置换。
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