CN117999085A - 用于治疗或预防冠状病毒感染的干扰素相关的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过施用肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂和干扰素(IFN)(例如IFN相关的抗原结合蛋白诸如IFN‑融合抗体)的组合、或者编码肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂和干扰素(IFN)的核酸和表达载体的组合来治疗或预防受试者中的冠状病毒感染的方法。本发明还涉及用于治疗冠状病毒感染的相应药物组合物的用途。

Description

用于治疗或预防冠状病毒感染的干扰素相关的抗原结合蛋白
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防受试者中的冠状病毒感染的方法。本发明还涉及用于治疗、更特别是用于治疗或预防冠状病毒感染的新的干扰素相关的抗原结合蛋白以及编码这种干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸和表达载体。这包括干扰素融合抗体或其干扰素融合抗原结合片段，在本文中也称为“IFA”。本发明还涉及用于治疗、更特别是用于治疗冠状病毒感染的包含这种干扰素相关的抗原结合蛋白或核酸或表达载体的药物组合物。本发明进一步提供了使用这种干扰素相关的抗原结合蛋白或核酸或表达载体或药物组合物的治疗方法。所述新的干扰素相关的抗原结合蛋白提供了对现有技术的有益改进，例如它们可以有效地从冠状病毒诱导的细胞凋亡和/或从冠状病毒诱导的细胞病变效应中挽救细胞。
背景技术
正在进行的2019冠状病毒病(COVID-19)全球大流行是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2；也称为2019-nCoV或HCoV-19)引起的。SARS-CoV-2与SARS-CoV-1(2003年鉴定)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV，2012年鉴定)一起都属于冠状病毒科的β-冠状病毒属(Zhu et al.,N Engl J Med 382(8):727-733(2020)；Jiang et al.,Emerg.Microbes Infect.9,275-277(2020)；Jiang et al.,Lancet 395,949(2020)；Zhouet al.,Nature 579,270-273(2020)；Zhu et al.,N.Engl.J.Med.382,727-733(2020))。SARS-CoV-2是一种包膜病毒，含有约30kb的正义单链RNA基因组，它编码16种非结构蛋白(nsp1-16)、4种结构蛋白[刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)]和8种辅助蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b、和ORF10)。nsp负责病毒复制，是病毒粒子形成的结构蛋白，而辅助蛋白促进病毒感染，但对病毒复制不是必需的(Yoshimoto,The Protein Journal 39,198-216(2020))。
SARS-CoV-2的快速国际传播与许多改变病毒适应度的突变有关。病毒基因组编码的所有4种结构蛋白都有突变记录。最显著的突变是在刺突蛋白中，刺突蛋白通过与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体接合来介导病毒进入细胞(Cai et al.,Science 369:1586-92(2020)；Walls et al.,Cell 181:281-92.(2020)；Lan et al.,Nature 581:215-20(2020)；Benton et al.,Nature 588:327-30(2020))。刺突蛋白受体结合结构域(RBD)中出现的突变尤其令人感兴趣，因为它们具有改变病毒与靶细胞相互作用的动力学和强度的很高潜力。这些突变也可能影响能够结合并阻断病毒与ACE2接合的抗体的结合。2020年12月，英国(SARS-CoV-2VOC202012/01)和南非(501Y.V2)记录了携带刺突蛋白中多个突变的SARS-CoV-2的新变体(世界卫生组织。日内瓦：世界卫生组织；(2020)；Lauring et al.,JAMA 325(6):529-31.(2021))。早期流行病学和临床发现表明，这些变体在人群中的传播性增加(Davies et al.,Estimated transmissibility and severity of novel SARS-CoV-2 Variant of Concern 202012/01 in England.medRxiv.2021Feb 7)。
干扰素是病毒感染细胞中首先被上调的细胞因子之一，并且代表负责在感染早期消灭病毒的宿主先天免疫系统的关键组分。SARS-CoV-2已经进化出多种策略来防止干扰素释放，从而逃避先天免疫反应，并且促进病毒复制、传播和发病(Xia and Shi,Journal ofInterferon&Cytokine Research Volume 40,Number 12(2020))。几种SARS-CoV-2非结构蛋白显示出阻断干扰素通路，包括nsp1、nsp3、nsp6、nsp13、nsp14和nsp15。不同的小组已经报道了SARS-Cov-2 nsp1是一种有效的IFN-I拮抗剂，其显著降低IFN-I和ISG的>95％的表达(Lei et al.,Nat Commun 11(1)(2020):3810；Xia et al.Cell Rep 33(1):108234.(2020)；Yuen et al.,Emerg Microbes Infect 9(1):1418-1428.(2020))。
SARS-CoV-2Nsp3(称为木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro))通过直接切割IRF3或通过切割泛素样蛋白ISG15和减少磷酸化IRF3来限制IFN-I产生，导致IRF3激活和IFN-I产生减少(Shin et al.,Nature 587(7835):657-662(2020)；Moustaqil et al.,Emerg MicrobesInfect 10(1):178-195(2021))。
Nsp6在IFN-I信号传导期间减少STAT1和STAT2的磷酸化。值得注意的是，与SARS-CoV和MERS-CoV的nsp6相比，SARS-CoV-2nsp6表现出更有效地抑制RIG-I诱导的IFN-I产生和IFN-I刺激的ISG产生，这在IFN-I刺激的瞬时复制子系统中赋予了更高的病毒复制(Xiaet al.,Cell Rep 33(1):108234.(2020))。
解旋酶nsp13对IFN-I的产生和信号传导具有强烈的抑制作用。Nsp13与TBK1结合，导致TBK1磷酸化减少和IRF3失活。此外，nsp13通过抑制STAT1和STAT2激活而被鉴定为IFN-I信号传导的有效拮抗剂，导致STAT1保留在细胞质中并损害ISRE启动子的刺激(Lei etal.,Nat Commun11(1):3810.(2020)；Xia et al.Cell Rep 33(1):108234(2020)；Yuen etal.,Emerg Microbes Infect 9(1):1418-1428(2020))。
最初感染SARS-CoV-2的最常见症状包括发烧、干咳和疲劳。更严重的下呼吸道感染会导致更严重的症状，诸如呼吸困难或呼吸短促以及胸痛或压力。此时，患者可能需要住院治疗，如果血氧饱和度降低，他们将需要补充氧气或呼吸机支持来缓解症状。全身性炎症和严重的发病率或死亡可能随之而来。
需要治疗和预防冠状病毒感染，特别是SARS-CoV-2感染的新方法。特别地，需要从冠状病毒诱导的细胞凋亡和从冠状病毒诱导的细胞病变效应中挽救细胞的方法，特别是从SARS-CoV-2诱导的细胞凋亡和SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救细胞。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防冠状病毒感染的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段，其中TNFRSF激动剂或其功能片段与干扰素(IFN)或其功能片段组合施用。
在另一个方面，本发明进一步涉及一种用于治疗或预防冠状病毒感染的干扰素(IFN)或其功能片段，其中IFN或其功能片段与肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段组合施用。
在另一个方面，本发明还涉及一种用于治疗或预防冠状病毒感染的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段以及干扰素(IFN)或其功能片段的组合。
在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防冠状病毒感染的干扰素相关的抗原结合蛋白，包含(I)激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段以及(II)干扰素(IFN)或其功能片段。
根据本发明的任何方面，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段可以包括(a)重链或其片段，包含与SEQ ID NO 56具有至少90％同一性的互补性决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少90％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少90％同一性的CDRH3；以及(b)轻链或其片段，包含与SEQ ID NO 52具有至少90％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少90％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少90％同一性的CDRL3。替代地，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段可以包含(a)重链或其片段，包含与SEQID NO 56相同的互补性决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57相同的CDRH2和与SEQ ID NO58相同的CDRH3；以及(b)轻链或其片段，包含与SEQ ID NO 52相同的CDRL1、与SEQ ID NO53相同的CDRL2和与SEQ ID NO 54相同的CDRL3。
根据一个实施方式，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，VL包含SEQ ID NO 51所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链可变区VH，VH包含SEQ ID NO 55所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
根据另一个实施方式，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，LC包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链(HC)，HC包含选自由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的组的序列或与它们具有至少90％同一性的序列。
根据进一步的实施方式，IFN或其功能片段可以选自由以下组成的组：I型IFN、II型IFN和III型IFN、或它们的功能片段。优选地，I型IFN或其功能片段是IFNα或IFNβ、或它们的功能片段。
根据另一个实施方式，IFN或其功能片段是IFNα2a、或其功能片段。根据优选实施方式，IFNα2a包含SEQ ID NO 17所示的序列、或与其具有至少90％同一性的序列。
根据另一个实施方式，IFN或其功能片段是IFNβ或其功能片段。在优选的实施方式中，IFNβ包含SEQ ID NO 14所示的序列、或与其具有至少90％同一性的序列。
根据另一个实施方式，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合，优选与C末端融合。
根据进一步的实施方式，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合，优选与C末端融合。
根据另一个实施方式，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段与IFN或其功能片段通过接头彼此融合。在优选的实施方式中，接头包含SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26所示的序列。
根据另一个实施方式，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，它们包含表9(特别是表9A或表9B，更特别是表9A)中公开的序列组合之一。
根据另一个实施方式，用途包括通过用编码干扰素相关的抗原结合蛋白的RNA或DNA序列或编码干扰素相关的抗体结合蛋白的载体或载体系统进行基因递送，将干扰素相关的抗原结合蛋白施用到有此需要的受试者。
根据又一个实施方式，干扰素相关的抗原结合蛋白包含在药物组合物中。
附图说明
图1：该示意图描绘了示例性干扰素相关的抗原结合蛋白格式。干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段。IFN通过接头与抗体或其抗原结合片段上的不同位置相关联：轻链(LC)或重链(HC)的N-末端或C-末端部分。特别地，IFN选自I型、II型和III型干扰素家族。
图2A描绘了在pCMV启动子控制下编码SEQ ID NO 32的pcDNA3.1质粒的示例性图谱。编码SEQ ID NO 32(＝SEQ ID NO 78)的核酸序列也在底部示出。斜体：信号肽序列；黑色：CP870,893重链编码序列；下划线：HL接头编码序列；粗体：IFNβ编码序列。
图2B示出了在一些IFA的还原条件下的SDS PAGE的实例，其中IFNα或IFNβ在重链或轻链处融合。左侧还示出了亲本CP870,893的迁移。
图3A-3B图示了具有IFNβ融合的许多IFA分子对HEK-BlueTMCD40L细胞中激活CD40介导的NFκB通路报告基因测定的剂量依赖性效应。图3A示出了IFNβ融合到重链(HC)的C末端部分的IFA的抗CD40活性的实例。图3B示出了具有IFNβ融合到LC(IFA34)或HC(IFA36)的N-末端部分和C末端部分上的相应融合(IFA35和IFA37)的IFA的抗CD40活性的实例。后一组IFA的纯化产率非常低，因此为了测试它们的活性，使用HEK转染细胞的上清液并且连续稀释以评估对HEK-BlueTMCD40L细胞的抗CD40活性。
图3C-3D图示了具有IFNβ融合的许多IFA分子对报告基因HEK-Blue-IFN-α/β细胞中激活I型IFN-通路的剂量依赖性效应。图3C示出了具有IFNβ融合到HC的C末端部分的IFA的IFN活性的实例。图3D示出了具有IFNβ融合到LC(IFA34)或HC(IFA36)的N-末端部分和C末端部分上的相应融合(IFA35和IFA37)的IFA的IFN活性的实例。如图3B所示，使用来自HEK转染细胞的相同上清液并连续稀释以评估IFN活性。使用亲本抗体CP870,893作为阴性对照，并且用重组人IFNβ作为阳性对照。NS：未刺激的。
图4A图示了具有IFNα融合的许多IFA分子对HEK-BlueTMCD40L细胞中激活CD40介导的NFκB通路报告基因测定的剂量效应。
图4B图示了具有IFNα融合的许多IFA分子对报告基因HEK-Blue-IFN-α/β细胞中激活I型IFN-介导的通路的剂量效应。Pegasys的活性显示在右下角的插图中。
图4C图示了在HC(IFA38)或LC(IFA39)上具有IFNα融合和HL接头的IFA分子对HEK-BlueTMCD40L细胞中激活CD40介导的NFκB通路报告基因测定的影响。
图4D图示了IFA38和IFA39对激活报告基因HEK-Blue-IFNα/β细胞中I型IFN通路的影响。
图5A图示了感染SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020)后S309抗体对Vero E6细胞活力的影响。对于中和实验，将病毒与剂量范围的S309抗体在37℃下预孵育1小时，随后将病毒/抗体添加到细胞上，并在37℃下孵育3天。在感染后72小时通过CellTiter Glo(CTG)测定法评估细胞活力。
图5B图示了感染SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020)后瑞德西韦对Vero E6细胞活力的影响。对于瑞德西韦的评估，细胞用SARS-CoV-2(MOI(感染复数(multiplicity ofinfection))：0.05)感染。一小时后，清除病毒，并以一定剂量范围添加瑞德西韦。在感染后72小时通过CellTiter Glo评估细胞活力。
图5C图示了通过流式细胞术评估的CD40在Vero E6细胞上的表达。
图5D-G图示了在感染SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020)后，与瑞德西韦(RDV)相比，IFA27对Vero E6细胞活力的影响。图5D图示了感染后IFA27治疗的效果(治疗后)。图5E图示了感染后瑞德西韦(RDV)治疗的效果(治疗后)。图5F图示了感染前IFA27治疗的效果(治疗前)。图5G图示了感染前瑞德西韦(RDV)治疗的效果(治疗前)。细胞用SARS-CoV-2(MOI0.05)感染。在治疗后设置中，感染1小时后，清除病毒，洗涤细胞，并在72小时持续时间内以指定浓度添加IFA27或瑞德西韦。在治疗前设置中，Vero E6细胞用IFA27或瑞德西韦治疗1小时。然后洗涤细胞，并用SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020)感染72小时的持续时间。在两个实验中，通过CellTiter-Glo评估感染后3天的细胞活力。
图5D之二-图5G之二图示了在感染SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020)后，与瑞德西韦(RDV)相比，IFA25对Vero E6细胞活力的影响。图5D之二(Fig.5D.bis)图示了感染后IFA25治疗的效果(治疗后)。图5E之二图示了感染后瑞德西韦(RDV)治疗的效果(治疗后)。图5F之二图示了感染前IFA25治疗的效果(治疗前)。图5G之二图示了感染前瑞德西韦(RDV)治疗的效果(治疗前)。细胞用SARS-CoV-2(MOI 0.05)感染。在治疗后设置中，感染1小时后，清除病毒，洗涤细胞，并在72小时持续时间内以指定浓度添加IFA25或瑞德西韦。在治疗前设置中，Vero E6细胞用IFA25或瑞德西韦治疗1小时。然后洗涤细胞并用SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020，MOI 0.05)感染并保持72小时的持续时间。在两个实验中，通过CellTiter-Glo评估感染后3天的细胞活力。
图5H图示了在治疗后设置中，IFA27与亲本抗体(CP870,893)或对照IFA201(没有抗CD40激动活性)相比的效果。Vero E6细胞用SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020；MOI0.05)感染。感染一小时后，清除病毒，洗涤细胞，并在指定治疗的剂量范围存在下加入新鲜培养基，达到72小时持续时间。通过CTG测定法评估细胞活力。
图5I图示了在治疗后设置中，IFA25与或对照IFA202(没有抗CD40激动活性)相比的效果。Vero E6细胞用SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020；MOI 0.05)感染。感染一小时后，清除病毒，洗涤细胞，并在指定治疗剂量范围存在下加入新鲜培养基，达到72小时持续时间。通过CTG测定法评估细胞活力。
图5I之二图示了在治疗后设置中，与CP870,893或对照IFA202(没有抗CD40激动活性，单独的或组合的)相比，单独IFA25或与同种型EVI5的组合(具有与CP870,893和IFA202组合相同的抗体负载)的效果。Vero E6细胞用SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020；MOI0.05)感染。感染一小时后，清除病毒，洗涤细胞，并在指定治疗剂量范围存在下加入新鲜培养基，达到72小时持续时间。通过CTG测定法评估细胞活力。
图5J-R图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA25对Vero E6细胞活力的影响。图5J示出了用分离株USA-WA1/2020感染后的效果。图5K示出了用分离株德国/BavPat1/2020感染后的效果。图5J示出了用分离株USA-CA_CDC_5574-2020感染后的效果。图5M示出了用分离株hCoV-19_英格兰_204820464_2020感染后的效果。图5N示出了用分离株南非/KRISP-EC-K005321/2020感染后的效果。图5O示出了用分离株南非/KRISP-EC-K005325/2020感染后的效果。图5P示出了用分离株hCoV-19/日本/TY7-503/2021(γ变体)感染后的效果。图5Q示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体)感染后的效果。图5R示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体)感染后的效果。细胞以MOI 0.05用SARS-CoV-2感染(除γ和奥密克戎变体外，分别以MOI 0.5和0.1感染)。一小时后，清除病毒，洗涤细胞，并以一定剂量范围加入IFA25。在感染后3天通过CTG测定法评估细胞活力。
图5S-U图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA126对Vero E6细胞活力的影响。图5S示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图5T示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图5U示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)感染后的效果。
图6A-C图示了用SARS-CoV-2感染Vero E6细胞时关于使用xCELLigence系统设置实时细胞分析的结果。Vero E6细胞用SARS-CoV-2(分离株USA-WA1/2020)感染。感染一小时后，清除病毒，洗涤细胞，并在指定治疗存在下加入新鲜培养基。图6A示出了用阴性对照(未感染)或不同数量的SARS-CoV-2空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)接种75小时的E板孔的归一化细胞指数(CI)。水平线表示CI已降至其初始值的50％的点。达到这一点所需的时间称为CIT50。图6B示出了S309抗体对Vero E6细胞中SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应的影响。用阴性对照(未感染)、MOI为0.025的感染对照、或病毒(MOI 0.025)与1μg/mL的S309抗体在37℃下预孵育1小时的混合物来接种细胞。图6C描绘了瑞德西韦(RDV)对VeroE6细胞中的SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应的影响。用阴性对照(NI)、MOI为0.01的感染对照、或递增浓度的瑞德西韦(RDV)来接种细胞。
图6D-6I图示了用SARS-CoV-2(USA-WA1/2020)感染后的IFA25、和对照IFA202对Vero E6细胞活力的影响。细胞用SARS-CoV-2(MOI 0.05)感染。一小时后，清除病毒，并以一定剂量范围加入IFA25。使用xCELLigence实时细胞分析(RTCA)技术测量细胞活力。
图7描绘了人全血细胞(WBC)的体外细胞因子释放测定的结果：刺激来自4名健康志愿者供体的WBC后获得的数据的实例。WBC不受刺激(NS)，用LPS(10ng/mL)或IFA1(1μg/mL)处理24小时。收集上清液，并使用用于人类细胞因子的MSD u-Plex试剂盒进行细胞因子释放定量。结果代表了来自每个供体的两个独立刺激的平均值。示出了CXCL10(IP10)、IL6、IL1β和TNFα的分布。
表11a-b：这些表格总结了在进行从健康志愿者中获得的全血细胞(WBC)体外刺激后获得的数据。每个IFA在来自四个不同供体的WBC上进行测试。WBC不处理(NT)，用LPS(10ng/mL)或IFA(1μg/mL)处理24小时。收集上清液，并使用用于人类细胞因子的MSD u-Plex试剂盒进行细胞因子释放定量。结果表示来自每个供体的两个独立刺激的平均值，并以pg/mL表示(nd：未检测到)。
图8：向小鼠静脉推注0.5mg/kg(IFA)或0.3mg/kg pegasys后IFA25、IFA26、IFA27、IFA28、IFA29和IFA30的药代动力学特征。以半对数标度的平均值+/-SD表示的数据。在施用后至多10天内采集样品。对于IFA27、IFA29和IFA30(图8A)以及对于IFA25、IFA26和IFA28(图8B)，使用抗IFNα作为二抗进行ELISA测定的定量方法。对于IFA25和IFA27(图8C)，使用抗IgG2作为二抗进行ELISA测定的定量方法。图8D：Pegasys定量是使用人类IFNα匹配的抗体对进行的。标记线(LLOQ)表示Pegasys测定的检测极限。
表12A：PK报告总结：对雄性CD1瑞士小鼠单次静脉施用0.5mg/kg的CP870,893、IFA27、IFA29和IFA30后的PK参数。在7天实验中探索了CP870,893的PK参数，并在10天实验中探索了IFA27、IFA29和IFA30的PK参数(使用2种不同的ELISA方法进行IFA27的定量)。
表12B：PK报告总结：对雄性CD1瑞士小鼠单次静脉推注施用0.5mg/kg的CP870,893、Pegasys和三种不同IFA(IFA25、IFA26和IFA28)后的PK参数。在21天实验中探索了CP870,893和IFA25、IFA26、IFA28和Pegasys的PK参数(使用2种不同的ELISA方法进行IFA25的定量)。
图9A描绘了与报告基因HEK-BlueTMCD40L细胞中的亲本抗CD40抗体相比，以没有Fc区的IFA50和IFA51的剂量依赖性方式的CD40激动活性。图9B描绘了报告基因HEK-BlueTMhIFN-α/β中的以IFA50和IFA51的剂量依赖性方式的IFNα活性。
图10A描绘了在HEK-BlueTMCD40L报告细胞中，与亲本抗CD40抗体相比，以基于IFNε的IFA49的剂量依赖性方式的CD40激动活性。IFA49对应于通过肽接头的IFNε与HC的融合。图10B描绘了在由I型干扰素激活的报告基因HEK-BlueTMhIFN-α/β报告细胞上以剂量依赖性方式的IFA49的IFN活性。
图10C-10E图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA49对Vero E6细胞活力的影响。图10C示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图10D示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图10E示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)感染后的效果。
图11A描绘了在HEK-BlueTMCD40L报告细胞中，与亲本抗CD40抗体相比，以基于IFNω的IFA46的剂量依赖性方式的CD40激动活性。IFA46对应于通过肽接头的IFNω与LC的融合。图11B描绘了在由I型干扰素激活的报告基因HEK-BlueTMhIFN-α/β报告细胞上以IFA46的剂量依赖性方式的IFN活性。
图11C-11E图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA46对Vero E6细胞活力的影响。图11C示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图11D示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图11E示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)感染后的效果。
图12A描绘了在HEK-BlueTMCD40L报告细胞中，与亲本抗CD40抗体相比，以基于IFNγ的IFA(IFA42和IFA43)的剂量依赖性方式的CD40激动活性。IFA42对应于通过肽接头的IFNγ与LC的融合，并且IFA43对应于通过肽接头的IFNγ与HC的融合。图12B描绘了在报告基因HEK-Blue-hIFNγ细胞中，以IFA42和IFA43的剂量依赖性方式的IFN活性。
图12C-12E图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA42对Vero E6细胞活力的影响。图12C示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图12D示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图12E示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)感染后的效果。
图12F-12H图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA43对Vero E6细胞活力的影响。图12F示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图12G示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图12H示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)感染后的效果。
图13A描绘了在HEK-BlueTMCD40L报告细胞中，与亲本抗CD40抗体相比，以基于IFNλ的IFA(IFA44和IFA45)的剂量依赖性方式的CD40激动活性。IFA44对应于通过肽接头的IFNλ与LC的融合，并且IFA45对应于通过肽接头的IFNλ与HC的融合。图13B描绘了在报告基因HEK-Blue-hIFNλ细胞中，以IFA44和IFA45的剂量依赖性方式的IFN活性。
图13C-13E图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA44对Vero E6细胞活力的影响。图13C示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图13D示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图13E示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)感染后的效果。
图13F-13H图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA45对Vero E6细胞活力的影响。图13F示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图13G示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图13H示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎菌株，MOI 0.1)感染后的效果。
图14示出了在一些IFA的还原条件下的SDS PAGE的实例，其中IFNα或IFNβ融合在3G5抗CD40抗体的重链上。左侧还示出了亲本3G5抗CD40抗体的迁移。
图15A-B图示了在HEK-BlueTMCD40L细胞中，具有IFNβ融合的许多基于3G5的IFA分子对激活CD40介导的NFκB通路报告基因测定的剂量依赖性效应。同样示出了与亲本抗体3G5(在该图中指定为CDX-3G5)的比较。图15A示出了具有IFNβ融合到重链(HC)的C末端部分的IFA的抗CD40活性的实例。具有在轻链上融合IFNβ的IFA的纯化产率非常低，因此为了测试其活性，使用来自HEK转染细胞的上清液并连续稀释以评估对HEK-BlueTMCD40L细胞的抗CD40活性；活性的实例如图15B所示，并且将含有3G5的上清液用作对照。
图15C-D图示了在报告基因HEK-Blue-IFN-α/β细胞中，具有IFNβ融合的许多IFA分子对激活I型IFN-通路的剂量依赖性效应。图15C示出了IFNβ融合到HC的C末端部分的IFN活性的实例。图15D示出了具有IFNβ融合在轻链上的IFA的IFN活性；这些蛋白的产生水平非常低，因此两种IFA的活性的实例如图15D所示，使用与图15B中相同的上清液。
图16A图示了在HEK-BlueTMCD40L细胞中，具有IFNα融合的四种IFA分子对激活CD40介导的NFκB通路报告基因测定的剂量效应。同样示出了与亲本抗体3G5(在该图中指定为CDX-3G5)的比较。
图16B图示了在报告基因HEK-Blue-IFN-α/β细胞中，具有IFNα融合的许多IFA分子对激活I型IFN-介导的通路的剂量效应。
图16C-E图示了用各种SARS-CoV-2分离株感染后IFA125(IFN融合)对Vero E6细胞活力的影响。图16C示出了用分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)感染后的效果。图16D示出了用分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(δ变体，MOI 0.05)感染后的效果。图16E示出了用分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)感染后的效果。
图17：人全血细胞(WBC)的体外细胞因子释放测定：刺激来自4名健康志愿者供体的WBC后获得的数据的实例。WBC不处理(NT)，用LPS(10ng/mL)或用IFA109(1μg/mL)处理24小时。收集上清液，并使用用于人类细胞因子的MSD u-Plex试剂盒进行细胞因子释放定量。结果代表了来自每个供体的两个独立刺激的平均值。示出了CXCL10(IP10)、IL6、IL1β和TNFα的分布。
表13：该表总结了从健康志愿者获得的全血细胞的体外刺激后获得的数据。IFA109在来自四个不同供体的WBC上进行测试。WBC不处理(NT)，用LPS(10ng/mL)或用IFA109(1μg/mL)处理24小时。收集上清液，并使用用于人类细胞因子的MSD u-Plex试剂盒进行细胞因子释放定量。结果表示来自每个供体的两个独立刺激的平均值，并以pg/mL表示(nd：未检测到)。
表14：该表报告了针对每种SARS-CoV-2分离株评估的IFA25和瑞德西韦的Log绝对EC50值。在图5J至5R所示的评估IFA25对Vero E6细胞活力影响的实验中，对瑞德西韦在相同条件下进行了测试。绝对EC50是根据准确EC50/IC50评估的指南定义的(Sebaugh J.L.；Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.Pharmaceut.Statist.2010；DOI:10.1002/pst.426.)，作为给出50％响应的浓度，定义为0％(未感染CTR条件)和100％(感染CTR情况)的平均值。因此，Log绝对EC50是通过PRISM，使用4-PL模型，通过反向预测设置Y等于50％响应(50％对照平均值)来评估的。
图18图示了在未感染和SARS-CoV-2感染条件下的原代人类鼻腔和支气管细胞中CD40、IFNAR1和IFNAR2的表达。通过RT-qPCR分析评估CD40、IFNAR1和IFNAR2的RNA表达。对于该评估，按照实施例VIII中详述的制造商说明(cat#11754050)，首先使用从原代人类鼻腔和支气管细胞(未感染的或感染的)提取的500ng的全RNA作为cDNA合成的模板。然后，进行TLDA受体阵列卡(TLDAreceptor arrays card)(Thermofisher Scientific-详述于方法部分)，以同时量化特定受体的mRNA水平。管家基因mRNA表达(GAPDH、GUSB、TBP和RPLP0)也包括在TLDA测定中，以评估在所有4种测试条件下的潜在mRNA变化。4个管家基因中的每一个在鼻腔和支气管细胞中以及在有或没有感染的情况下都具有相似的表达水平，从而能够进行直接的Ct比较。(图18A)CD40和IFNAR靶向表达通过血细胞计数分析在未感染细胞中的蛋白水平上得到证实。将原代人类鼻腔和支气管细胞与抗hCD40-APC、抗hIFNAR1-APC和抗hIFNAR2-APC或匹配的同种型对照一起孵育。在MACSQuant16流式细胞仪上采集细胞。同种型对照用虚线直方图表示，并且感兴趣的标志物用全灰色直方图表示(图18B)。
图19图示了IFA27治疗(在168小时的动力学中在1小时、48小时和96小时施加后处理)对在气-液界面(ALI)系统(批次，MD0713)中培养和用分离株USA-WA1/2020感染的原代人类鼻细胞中的SARS-CoV-2病毒载量的影响。细胞从接收起就在MucilAirTM培养基中培养，并在实验的第0天用0.1MOI的分离株USA-WA1/2020感染。在1小时后，洗涤感染，并施加含有IFA27或EVI5同种型对照或瑞德西韦治疗的新鲜培养基，并在感染后2天和4天更新。进行了额外的未感染的和感染的未治疗的条件。在感染后7天进行最后的洗涤和组织收集。在感染后7天的最终终点，通过RT-qPCR评估病毒载量(通过测量在实施例VIII中描述的RNA提取后的鼻组织(图19A)和鼻腔尖部(nasal apical)冲洗液(图19B)中的SARS-CoV-2RNA拷贝数)。使用实施例VIII中描述的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定在感染后7天的最终终点处在尖部(apical)冲洗液中评估感染病毒(图19C)。
图20图示了IFA27治疗(在168小时的动力学中在1小时、48小时和96小时施加后处理)在气-液界面(ALI)系统(批次，MD0713)中培养和用分离株USA-WA1/2020感染的原代人类支气管细胞中的SARS-CoV-2病毒载量的影响。细胞从接收起就在MucilAirTM培养基中培养，并在实验的第0天用0.1MOI的分离株USA-WA1/2020感染。在1小时后，洗涤感染，并施加含有IFA27或EVI5同种型对照或瑞德西韦治疗的新鲜培养基，并在感染后2天和4天更新。进行了额外的未感染的和感染的未治疗条件。在感染后7天进行最后的洗涤和组织收集。在感染后7天的最终终点处通过RT-qPCR评估病毒载量(通过测量在实施例VIII中描述的RNA提取后支气管组织(图20A)和支气管尖部冲洗液(图20B)中的SARS-CoV-2RNA拷贝数)。
图21图示了IFA25治疗(在96小时的动力学中在1小时和48小时施加后处理)在气液界面(ALI)系统(批次，MD0853)中培养和用分离株USA-WA1/2020感染的原代人类鼻细胞中的SARS-CoV-2病毒载量的影响。细胞从接收起就在MucilAirTM培养基中培养，并在实验的第0天用0.1MOI的分离株USA-WA1/2020感染。在1小时后，洗涤感染，并施加含有IFA25或EVI5同种型对照或瑞德西韦治疗的新鲜培养基，并在感染后2天更新。进行了额外的未感染的和感染的未治疗条件。在感染后4天的最终终点处通过RT-qPCR评估病毒载量(通过在实施例VIII中描述的RNA提取后测量鼻组织(图21A)和的鼻腔尖部冲洗液(图21B)中的SARS-CoV-2RNA拷贝数)。使用实施例VIII中描述的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定在感染后4天的最终终点处在尖部冲洗液中评估感染病毒(图21C)。
图22图示了IFA25预治疗在气-液界面(ALI)系统(批次，MD0853)中培养和用分离株USA-WA1/2020菌株感染的原代人类鼻细胞中的SARS-CoV-2病毒载量的影响。细胞从接收起就在MucilAirTM培养基中培养，并在感染前3小时用IFA25或EVI5同种型对照或瑞德西韦处理。进行了额外的未感染的和感染的未治疗条件。去除治疗，并用0.1MOI的分离株USA-WA1/2020菌株进行1小时的感染。在感染1小时后，洗涤尖部隔室并加入新鲜培养基。在感染后2天进行最后的洗涤和组织收集。在感染后2天的最终终点处通过RT-qPCR评估病毒载量(通过测量在实施例VIII中描述的RNA提取后鼻组织(图22A)和鼻腔尖部冲洗液(图22B)中的SARS-CoV-2RNA拷贝数)。使用实施例VIII中描述的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定在感染后2天的最终终点处在尖部冲洗液中评估感染病毒(图22C)。
图23图示了IFA25治疗(在96小时的动力学中在1小时和48小时施加后处理)在气-液界面(ALI)系统(批次，MD0868)中培养和用分离株USA-WA1/2020感染的原代人类支气管细胞中的SARS-CoV-2病毒载量的影响。细胞从接收起就在MucilAirTM培养基中培养，并在实验的第0天用0.1MOI的分离株USA-WA1/2020感染。在1小时后，洗涤感染，并施加含有IFA25或EVI5同种型对照或瑞德西韦治疗的新鲜培养基，并在感染后2天更新。进行了额外的未感染的和感染的未治疗条件。在感染后4天的最终终点处通过RT-qPCR评估病毒载量(通过测量实施例VIII中描述的RNA提取后支气管组织(图23A)和支气管尖部冲洗液(图23B)中的SARS-CoV-2RNA拷贝数)。使用实施例VIII中描述的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定在感染后4天的最终终点处在尖部冲洗液中评估感染病毒(图23C)。
图24图示了IFA25预治疗在气-液界面(ALI)系统(批次，MD0868)中培养和用分离株USA-WA1/2020感染的原代人类支气管细胞中的SARS-CoV-2病毒载量的影响。细胞从接收起就在MucilAirTM培养基中培养，并在感染前3小时用IFA25或EVI5同种型对照或瑞德西韦处理。进行了额外的未感染的和感染的未治疗条件。去除治疗，并用0.1MOI的分离株USA-WA1/2020进行1小时的感染。在感染1小时后，洗涤尖部隔室并加入新鲜培养基。在感染后2天进行最后的洗涤和组织收集。在感染后2天的最终终点处通过RT-qPCR通过评估病毒载量(通过测量在实施例VIII中描述的RNA提取后的支气管组织(图24A)和支气管尖部冲洗液(图24B)中的SARS-CoV-2RNA拷贝数)。
“细胞活力(％)”和“活力(％)”在整个文件中可互换使用。
通过以下结合附图对说明性实施方式的详细描述，将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点。
具体实施方式
应当理解，本文所描述和/或要求保护的任何定义和实施方式旨在是适用于本发明的所有方面、实施方式、条款和事项的定义和实施方式。例如，应当理解，本文提供了关于以下的合适方式或实施方式的教导和解释：制备、配制和施用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或者对其进行编码或表达的核酸，以及它们的施用途径、合适的剂量和施用方案，经过适当修改也适用于本文所描述或要求保护的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段、干扰素(IFN)或其功能片段、或对其进行编码或表达的核酸、或它们的组合。
本发明部分基于一种基于包含(I)激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段和(II)干扰素(IFN)或其功能片段的“干扰素相关的抗原结合蛋白”、其变体或衍生物在冠状病毒疗法中的用途的疗法的发现。所述干扰素相关的抗原结合蛋白从冠状病毒诱导的细胞凋亡和从冠状病毒诱导的细胞病变效应中挽救细胞，并且增强未感染和感染的细胞中的IFN通路，甚至可以以协同的方式起作用。提供了包括向冠状病毒感染的细胞或感染冠状病毒的受试者施用干扰素相关的抗原结合蛋白的冠状病毒疗法。
根据下面定义的选定术语可以更容易地理解本发明。
如本文使用的，肿瘤坏死因子(配体)超家族成员(或TNFSF)是指属于共享特征性细胞外TNF同源结构域(THD)的蛋白配体的超家族的蛋白(Bremer ISRN Oncology(2013)，文章ID 371854，第25页，在线访问：dx.doi.org/10.1155/2013/371854)。THD触发非共价同源三聚体的形成。TNF配体通常以II型跨膜蛋白的形式表达，但大多数可以经过蛋白酶解加工成可溶性配体。TNF配体通过结合和激活TNFRSF的成员来发挥其生物学功能。TNFRSF通常以三聚体I型跨膜蛋白的形式表达，并且在其细胞外结构域中含有一至六个富含半胱氨酸的结构域(CRD)。TNF超家族的一个重要功能是在免疫反应的不同阶段提供共刺激信号。一些配体具有结合和激活不同受体的能力(例如，结合并激活TNFRSFlA、TNFRSFlB和TNFRSF14的LTa3以及结合并激活TNFRSF3和TNFRSF14的LIGHT(TNFSF14))。示例性TNFSF基因家族成员如下表A所示，其来源于HUGO基因命名委员会(HGNC)(参见，Gray et al.Nucleic AcidsRes.43:D1079-1085(2015)；HGNC数据库、HUGO基因命名委员会(HGNC)、EMBL分站-Hinxton、欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)、Wellcome Trust GenomeCampus,Hinxton,Cambridgeshire,CBl0lSD,UK www.genenames.org)。认证符号表示适用于特定基因的HGNC符号，并且认证名称对应于该基因的完整拼写。先前符号表示HGNC使用的任何先前符号或指代特定基因。同义词是指特定基因的替代、同义名称。
表A.示例性TNFSF基因家族成员
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表B.示例性TNFRSF基因家族成员
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如本文使用的，“TNFRSF激动剂”是指激活TNFRSF(例如，表B中列出的TNFRSF)的化合物(例如，蛋白、融合蛋白、多肽、抗体、抗体的抗原结合片段等)。表B来源于HGNC，如上表A所示。例如，TNFRSF激动剂可以是针对TNFRSF成员的激动性抗体、可溶性TNFRSF激动剂，包括但不限于其天然配体或其功能片段。
在某些示例性实施方式中，TNFRSF激动剂包括但不限于LTa3受体(TNFRSFlA、TNFRSFlB、或TNFRSF14)激动剂、LTβ受体(TNFRSF3)激动剂(例如LIGHT或LTβ)、疱疹病毒侵入介体(HVEM或TNFRSF14)激动剂(LIGHT)、肿瘤坏死因子样受体弱凋亡诱导剂(TNFRSF12A)激动剂(例如，TWEAK也称为TNFSF12)、分化因子40(CD40，TNFRSF5)激动剂簇(CD40L)、CD27(TNFRSF7)激动剂(CD70)、CD30(TNFRSF8)激动剂、4-lBB(CD137，TNFRSF9)激动剂、核因子KB的受体激活剂(RANK，TNFRSF 1lA)激动剂和Troy(TNFRSF 19)激动剂以及OX40受体(TNFRSF4)激动剂。
如本文使用的，术语“功能片段”是指保留原始物质的一种或多种功能活性，优选保留所有功能活性的物质片段。例如，TNFRSF激动剂的功能片段是指保留本文所描述和/或要求保护的TNFRSF激动剂的功能(例如，它激活靶TNFRSF)的TNFRSF激动剂的片段。
如本文使用的，术语“配体”是指能够结合或被结合到另一种物质的任何物质。配体可以是肽、多肽、蛋白、适体、多糖、糖分子、碳水化合物、脂质、寡核苷酸、多核苷酸、合成分子、无机分子、有机分子以及它们的任何组合。优选地，配体是多肽。
如本文使用的，术语“CD40”是指“分化簇40”，肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。CD40是在抗原呈递细胞(例如，B细胞、树突状细胞、单核细胞)、造血前体、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞以及大多数人类肿瘤上发现的共刺激蛋白(Grewal&Flavell,Ann.Rev.lmmunol.,1996,16:111-35；Toes&Schoenberger,Seminars in Immunology,1998,10(6):443-8)。TH细胞上的天然配体CD154(CD40L)与CD40的结合激活抗原呈递细胞并诱导多种下游效应。TNF受体相关因子衔接蛋白TRAF1、TRAF2、TRAF6和TRAF5与CD40相互作用，并充当信号传导的介体。最终，CD40信号传导激活了经典和非经典NF-κB通路。
激动性抗CD40抗体及其抗原结合片段
如本文使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，包括通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)，以及它们的多聚体(例如IgM)。每个重链包括重链可变区(缩写为VH或VH)和重链恒定区(CH或CH)。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(缩写为VL或VL)和轻链恒定区(CL或CL)。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为“互补决定区(CDR)”，穿插有更保守的区，称为“框架区”(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区可以帮助维持CDR的适当构象，以促进抗原结合区和抗原之间的结合。
治疗应用中最常用的免疫球蛋白是免疫球蛋白G(或IgG)(一种四聚体糖蛋白)。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条轻链(约25kDa)和一条重链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定一个主要负责效应子功能的恒定区。免疫球蛋白可以根据其重链恒定结构域的氨基酸序列分为不同的类别。
重链分类为谬(μ)、德尔塔(δ)、伽马(γ)、阿尔法(α)和艾普西隆(ε)，并将抗体的同种型分别限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。其中一些可以进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的同种型具有不同的效应子功能；例如IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)活性。在优选的实施方式中，包含在根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白中的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段属于IgG类。在更优选的实施方式中，包含在根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白中的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段属于IgG1或IgG3亚类。在特别优选的实施方式中，包含在根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白中的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段属于IgG1亚类。在其他更优选的实施方式中，包含在根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白中的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段属于IgG2或IgG4亚类。在特别优选的实施方式中，包含在根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白中的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段属于IgG2亚类。
人轻链分类为卡帕(κ)和拉姆达(λ)轻链。因此，在一些实施方式中，包含在根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白中的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包括κ类的轻链。在其他实施方式中，包含在根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白中的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包括λ类的轻链。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链另外包括约10个以上氨基酸的“D”区。通常参见，基础免疫学(Fundamental Immunology)，第7章(Paul,W.,ed.,2nd ed.RavenPress,N.Y.(1989))。
术语“抗体”进一步分别包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体以及它们的片段。除非另有说明，否则术语“抗体”除了包括两个全长重链和两个全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、抗原结合片段和突变蛋白，它们的实例如下文所述。
如本文使用的，术语“激动性CD40抗体”或“激动性抗CD40抗体”是指与CD40结合并介导CD40信号传导的抗体。在优选的实施方式中，它与人CD40结合。如下文所述，与CD40的结合可以使用表面等离子体共振来确定(优选使用系统)。当添加到表达CD40的细胞、组织或生物体中时，激动性抗CD40抗体可使一种或多种CD40活性增加了至少约20％。在一些实施方式中，抗体使CD40活性激活了至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少85％。激动性抗CD40抗体的CD40活性可以使用全血表面分子上调测定法或使用体外报告细胞测定法来测量，例如使用HEK-BlueTMCD40L细胞(InvivoGen Cat.#:hkb-cd40)，如实施例I中更详细地描述的。这些报告细胞是通过用人CD40基因和NFκB诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)构建体进行HEK293细胞的稳定转染来产生的，以测量CD40激动剂的活性。CD40的刺激导致NFκB的激活，从而产生SEAP，SEAP可以使用显色底物(诸如QUANTI-BlueTM)在上清液中检测到。
在本发明的上下文中，干扰素相关的抗原结合蛋白激活CD40和IFN通路。在某些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白以小于400ng/mL、300ng/mL、200ng/mL、150ng/mL、100ng/mL、70ng/mL、60ng/mL、50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、25ng/mL、20ng/mL、或15ng/mL的EC50激活CD40通路，其中CD40活性优选使用体外报告细胞测定法测定，任选使用HEK-BlueTMCD40L细胞，例如实施例I中所述的。
在更具体的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白激活CD40通路，EC50范围为10ng/mL至200ng/mL。在甚至更具体的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白激活CD40通路，EC50范围为10ng/mL至50ng/mL，优选为10ng/mL至30ng/mL。
合适的激动性抗-CD40抗体的实例包括但不限于CP870,893(Pfizer/Roche)、SGN-40(Seattle Genetics)、ADC-1013(Janssen/Alligator BioSciences)、Chi Lob 7/4(南安普顿大学)、达西木单抗(dacetumumab)(Seattle Genetics)、APX005M(Apexigen,Inc.)、3G5(Celldex)和CDX-1140(Celldex)。激动性抗CD40抗体CP870,893的示例性轻链和重链序列如表7所示。激动性抗CD40抗体3G5的示例性轻链和重链序列如表8所示。
如本文使用的，激动性抗CD40抗体的术语“激动性抗原结合片段”是指激动性抗-CD40抗体的片段，该片段保留原始抗体的一种或多种功能活性，诸如与细胞中CD40信号传导的激动剂结合并且充当CD40信号传导的激动剂的能力，例如它介导CD40通路信号传导。这种片段可以与完整的抗体竞争结合CD40。
激动性抗CD40抗体的激动性抗原结合片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过酶促或化学切割抗CD40的抗体产生。激动性抗原结合片段包括但不限于Fab片段、双体抗体(与轻链可变结构域在同一多肽上的重链可变结构域(通过短肽接头连接)，该接头太短而不能使同一链上的两个结构域之间配对)、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、结构域抗体和单链抗体，并且可以来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包括重链中约120至130个氨基-末端的氨基酸和轻链中约100至110个氨基末端的氨基酸。不同抗体的可变区在氨基酸序列上有很大差异，甚至在来源于同一物种或同一类别的抗体之间也是如此。激动性抗CD40抗体CP870,893的示例性VL和VH结构域序列在表1中示出。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性，因为它含有CDR。表1还示出了激动性抗CD40抗体CP870,893的示例性CDR序列。
表1.抗CD40抗体重链/轻链可变区和激动性抗CD40抗体CP870,893的CDR。粗体斜体序列对应于根据Kabat定义的CDR区。
CDR的描绘和包含抗体结合位点的残基的鉴定可以通过解决抗体的结构和/或解决抗体-配体复合物的结构来完成。这可以通过本领域技术人员已知的各种技术中的任何一种来实现，诸如X射线晶体学。可以采用各种分析方法来鉴定或模拟CDR区。这种方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和接触定义。
Kabat定义是对抗体中的残基进行编号的标准，并且通常用于鉴定CDR区。例如参见Johnson&Wu,Nucleic Acids Res.,28:214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构回路区域的位置。例如参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901-17(1986)；Chothia et al.,Nature,342:877-83(1989)。AbM定义使用了牛津分子集团(Oxford Molecular Group)制作的集成的计算机程序套件来对抗体结构建模。例如参见Martin et al.,Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272(1989)；“AbMTM，一种抗体可变区建模的计算机程序”，牛津，英国；Oxford Molecular,Ltd.。AbM定义使用知识数据库和从头开始的方法的组合对来自一级序列的抗体的三级结构进行建模，诸如通过Samudrala etal.,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach,”in PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198(1999)中描述的那些。接触定义是基于对可用的复杂晶体结构的分析。例如参见MacCallum etal.,J.Mol.Biol.,5:732-45(1996)。
在某些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链和重链可变区的互补决定区(CDR)可以移植到来自同一或另一物种的框架区(FR)。在某些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链和重链可变区的CDR可以移植到共有人类FR。为了产生共有人类FR，在某些实施方式中，对来自几种人重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对以鉴定共有氨基酸序列。在某些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链或轻链的FR被来自不同重链或重链的FR替换。在某些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链和轻链的FR中的稀有氨基酸不被替换，而FR的其余氨基酸被替换。稀有氨基酸是指在FR中通常不存在的位置上的特定氨基酸。在某些实施方式中，来自激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的移植的可变区可以与不同于激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的恒定区的恒定区一起使用。在某些实施方式中，移植的可变区是单链Fv抗体的一部分。CDR移植描述于例如美国专利号6,180,370、6,054,297、5,693,762、5,859,205、5,693,761、5,565,332、5,585,089和5,530,101以及Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988),Winter,FEBS Letts.,430:92-94(1998)中，它们出于任何目的通过引用并入本文。
“Fc”区通常包含两个重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或多个二硫键和CH3结构域的疏水相互作用结合在一起。
“Fab片段”包括一条全长轻链以及一条重链的CH1和可变区(VH和CH1区的组合，在本文中称为“fab区重链”)。
“Fab’片段”包括一条轻链和一条重链的一部分，该部分含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域，使得两个Fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链，该重链含有在CH1和CH2结构域之间的一部分恒定区，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由两个Fab’片段组成，它们通过两个重链之间的二硫键结合在一起。
“Fv区”包括重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。
“单链抗体”是Fv分子，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接以形成单个多肽链，这形成了抗原结合区。在国际专利申请公开号WO88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了单链抗体，其公开内容通过引用并入。
“结构域抗体”是一种免疫功能性免疫球蛋白片段，仅含有重链可变区或轻链可变区。在一些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
抗体或抗原结合蛋白，诸如根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白，优选以≤10-7M的解离常数(Kd)与其靶抗原结合。当Kd≤5x10-9M时，抗体或抗原结合蛋白以“高亲和力”结合其抗原，并且当Kd≤5x10-10M时，以“非常高的亲和力”结合其抗原。更优选地，抗体或抗原结合蛋白的Kd≤10-9M。在一些实施方式中，解离速率<1x10-5。在其他实施方式中，抗体或抗原结合蛋白以Kd为约10-9M至10-13M与人CD40结合，并且在又一个实施方式中，抗体或抗原结合蛋白以Kd≤5x10-10结合。如本领域技术人员将理解的，在一些实施方式中，任何或所有抗原结合片段可以结合CD40。优选地，使用表面等离子体共振来确定所述常数，更优选地使用系统。
术语“表面等离子体共振”是指一种光学现象，该光学现象可以通过检测生物传感器基质中蛋白浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用系统(BIAcore International AB，GE Healthcare公司,Uppsala,Sweden和Piscataway,N.J.)。有关进一步的描述，参见/>et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26。术语“Kon”是指结合蛋白(例如抗体或抗原结合蛋白)与抗原结合以形成例如抗原结合蛋白/抗原复合物的结合速率常数。术语“Kon”或“结合速率”也表示“结合速率常数”或“ka”在本文中可互换使用。该值指示结合蛋白与其靶抗原的结合速率或者在结合蛋白(例如抗体或抗原结合蛋白)和抗原之间的复合物形成速率，也由以下方程式示出：
抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag
术语“Koff”或“解离速率”是指本领域已知的结合蛋白(例如抗体或抗原结合蛋白)从例如抗原结合蛋白/抗原复合物解离的解离速率常数(off rate constant)(或“解离速率常数(dissociation rate constant)”)。该值指示结合蛋白(例如抗体或抗原结合蛋白)从其靶抗原的解离速率，或Ab-Ag复合物随时间分离为游离抗体和抗原的解离速率，如以下方程式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag
术语“Kd”和“平衡解离常数”是指在平衡条件下的滴定测量中获得的值，或通过解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)获得的值。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示结合蛋白(例如抗体或抗原结合蛋白)对抗原的结合亲和力。测定结合速率常数和解离速率常数的方法在本领域是众所周知的。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度和在平衡时检查生理缓冲液中的样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器，诸如(生物分子相互作用分析)测定法(例如，可从BIAcore International AB，GEHealthcare公司，Uppsala，Sweden获得的仪器)。此外，还可以使用可从SapidyneInstruments(Boise,Id.)获得的/>(动力学排除测定)测定法。
根据本发明的抗原结合蛋白可以以比第二靶标高至少一个数量级(优选至少两个数量级)的亲和力与一个靶标结合。
术语“靶标”是指能够被抗原结合蛋白结合的分子或分子的一部分。在某些实施方式中，靶标可以具有一个或多个表位。因此可以理解，靶标可以充当本发明的“抗原结合蛋白”的“抗原”。
术语“表位”包括能够被抗原结合蛋白结合的任何决定簇，诸如抗体。表位是抗原的一个区域，该区域被靶向该抗原的抗原结合蛋白结合，并且当抗原是蛋白时，包括直接接触抗原结合蛋白的特定氨基酸。最常见的是，表位位于蛋白上，但在某些情况下也可以位于其他种类的分子上，诸如核酸上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原具有特异性的抗体将优先/特异性地识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中靶抗原上的表位。
在示例性实施方式中，形成本发明干扰素相关的抗原结合蛋白的部分(I)的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)，其与SEQ ID NO 3内的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少90％同一性；和三个重链CDR，其与SEQ ID NO 6内的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少90％同一性。激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段还可以包含三个轻链互补决定区(CDR)，其与SEQ ID NO 3内的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列相同；和三个重链CDR，其与SEQ ID NO 6内的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列相同。在这种实施方式中，根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义来定义每个CDR；优选地，其中根据Kabat的CDR定义或Chothia的CDR定义来定义每个CDR。在特定的实施方式中，根据Kabat定义来定义每个CDR。在其他特定的实施方式中，根据Chothia定义来定义每个CDR。
替代地，形成本发明干扰素相关的抗原结合蛋白的部分(I)的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段可以包含(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1，与SEQ ID NO 57具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的CDRH2，和与SEQ ID NO 58具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的CDRH3；和(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的CDRL1，与SEQ IDNO 53具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的CDRL2，和与SEQ ID NO 54具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的CDRL3。
在一些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56相同的互补性决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57相同的CDRH2和与SEQ ID NO 58相同的CDRH3；和(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52相同的CDRL1、与SEQ ID NO 53相同的CDRL2和与SEQ ID NO 54相同的CDRL3。
更具体地，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，VL包含SEQ ID NO 51所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链可变区VH，VH包含SEQ ID NO 55所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白还可包含激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段，其包含Fab区重链，该重链包含SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在一些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 50或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 6所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 9所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在其他更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 49所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在其他更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 12所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在其他更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 50所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在一些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 59所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO61、SEQ ID NO 63和SEQ ID NO 65或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 59所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 61所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在其他更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 59所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 63所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
在其他更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 59所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含SEQ ID NO 65所示的序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性的序列。
干扰素相关的抗原结合蛋白或其组分的变体和衍生物
多肽的“变体”(例如干扰素相关的抗原结合蛋白、干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段、抗体、抗原结合蛋白、或IFN、或其组分)包括氨基酸序列，其中一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸残基相对于另一个多肽序列插入到氨基酸序列、从氨基酸序列中缺失、和/或替换到氨基酸序列。优选地，变体包括至多十个插入、缺失和/或替换，更优选至多八个插入、缺失和/或替换。更具体地，变体可以包括至多十个，更优选至多八个插入。变体还可以包括至多十个，更优选至多八个缺失。在甚至更优选的实施方式中，变体包括至多十个替换，最优选至多八个替换。在一些实施方式中，这些替换是如下所述的保守氨基酸替换。
多核苷酸序列(例如，RNA或DNA)的“变体”包括多核苷酸序列内相对于另一个多核苷酸序列的一个或多个突变，其中一个、两个、三个、四个、五个或更多个核酸残基插入到核酸序列、从核酸序列缺失和/或替换到核酸序列。优选地，变体包括至多十个插入、缺失和/或替换，更优选至多八个插入、缺失和/或替换。更具体地，变体可以包括至多十个，更优选至多八个插入。变体还可以包括至多十个，更优选至多八个缺失。在甚至更优选的实施方式中，变体包括至多十个替换，最优选至多八个替换。与另一个氨基酸序列(即“非沉默突变”)相比，所述一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变可以在变体编码的氨基酸序列内引起一个、二个、三个、四个、五个或更多个氨基酸交换。变体还包括核酸序列，其中一个、两个、三个、四个、五个或更多个密码子被它们的同义词替代，这不会引起氨基酸交换，因此被称为“沉默突变”。
在多肽或核苷酸序列变体的上下文中，术语“同一性”或“同源性”是指通过比对和比较序列确定的两个或多个多肽分子或者两个或多个核酸分子的序列之间的关系。“同一性百分比”是指被比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并根据被比较的分子的最小尺寸计算。优选地，在序列的全长上确定同一性。应当理解，表述“至少80％同一性”包括其中所描述或所要求保护的序列与参考序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％、或还更优选至少99％同一性的实施方式。表述“至少90％同一性”包括其中所描述或所要求保护的序列与参考序列具有至少90％、优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、或还更优选至少99％同一性的实施方式。
对于同一性百分比的计算，比对中的空位(若有)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:OxfordUniversity Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo et al.,1988,SIAM J.Applied Math.48:1073中描述的那些。
在计算同一性百分比时，被比较的序列通常以在序列之间给出最大匹配的方式比对。可用于确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereuxet al.,1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,WI)。计算机算法GAP用于比对要确定其序列同一性百分比的两种多肽或多核苷酸。对序列进行比对，以实现其各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，由算法确定)。结合算法使用的空位开放罚分(其计算为3x平均对角线，其中“平均对角线”是所用比较矩阵的对角线平均值；“对角线”是特定比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的分数或数字)和空位扩展罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及诸如PAM 250或BLOSum62的比较矩阵。在某些实施方式中，标准比较矩阵(参见，Dayhoff et al.,1978,Atlas ofProtein Sequence and Structure 5:345-352(对于PAM 250比较矩阵)；Henikoff etal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919(对于BLOSum 62比较矩阵))也被算法使用。
可用于使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的参数的实例如下：
算法：Needleman et al.,1970,J.Mol.Biol.48:443-453
比较矩阵：BLOSum 62，来自Henikoff et al.,1992，同上
空位罚分：12(但末端空位没有罚分)
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可能导致两个序列中仅一个短区域的匹配，并且即使两个全长序列之间没有显著关系，该小的比对区域也可能具有非常高的序列同一性。因此，若需要，可以调整所选择的比对方法(GAP程序)，以产生跨越靶多肽的连续氨基酸的至少50个或至少100个(优选整个长度)的比对。
保守氨基酸替换可以包括非天然存在的氨基酸残基，这些残基通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来并入。这些包括模拟肽和其他反向或倒置形式的氨基酸部分。
天然存在的残基可以根据常见的侧链性质分为几类：
1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
3)酸性：Asp、Glu；
4)碱性：His、Lys、Arg；
5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守替换可能涉及将这些类中的一类的成员交换为另一类的成员。例如，这种替换的残基可以引入到与非人抗体同源的人抗体的区域中，或引入到分子的非同源区域中。
根据某些实施方式，在对干扰素相关的抗原结合蛋白进行改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。每个氨基酸都根据其疏水性和电荷特性被指定了亲水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
氨基酸亲水性指数在赋予蛋白相互作用的生物功能方面的重要性是本领域所理解的。Kyte et al.,J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可以替换具有相似亲水性指数或分数的其他氨基酸，并且仍然保持相似的生物活性。在基于亲水性指数进行改变时，在某些实施方式中，包括亲水性指数在±2内的氨基酸的替换。在某些实施方式中，包括在±1内的那些氨基酸的替换，并且在某些实施方式中，包括±0.5内的那些氨基酸的替换。
本领域还应当理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。在某些实施方式中，由其相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白的生物学特性相关。
这些氨基酸残基可被分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，在某些实施方式中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的替换，在某些实施方式中包括在±1内的那些氨基酸的替换，并且在某些实施方式中，包括在±0.5内的那些氨基酸的替换。
表2中示出了示例性的氨基酸替换。
表2.氨基酸替换
根据本发明，本领域技术人员将能够使用众所周知的技术来确定本文所示的干扰素相关的抗原结合蛋白的合适变体。在某些实施方式中，本领域技术人员可以通过靶向被认为对活性不重要的区域来鉴定分子的合适区域，该区域可以在不破坏活性的情况下进行改变。在某些实施方式中，可以鉴定在类似多肽中保守的分子的残基和部分。在某些实施方式中，甚至对生物活性或对结构可能重要的区域也可以进行保守的氨基酸替换，而不破坏生物活性或没有对多肽结构的不利影响。
此外，本领域技术人员可以回顾鉴定类似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这种比较，可以预测蛋白中氨基酸残基的重要性，这些氨基酸残基对应于对类似蛋白中的活性或结构重要的氨基酸残基。本领域技术人员可以选择对这种预测的重要氨基酸残基进行化学相似的氨基酸替换。
本领域技术人员还可以分析类似蛋白或蛋白结构域中的三维结构和与该结构相关的氨基酸序列。鉴于这些信息，本领域技术人员可以预测如本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段、或干扰素或其功能片段的氨基酸残基相对于其三维结构的比对。在某些实施方式中，本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白表面上的氨基酸残基进行根本性改变，因为这些残基可以参与与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生在每个所需氨基酸残基处含有单个氨基酸替换的测试变体。然后可以使用本领域技术人员已知的活性测定法来筛选变体。这种变体可以用于收集关于合适变体的信息。例如，如果发现特定氨基酸残基的变化导致破坏、不期望地降低或不合适的活性，则可以避免具有这种变化的变体。换言之，基于从这样的实验中收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定应当避免的单独或与其他突变组合的进一步替换的氨基酸。
根据某些实施方式，氨基酸替换是那些：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和/或(5)赋予或修饰这种多肽上的其他物理化学或功能性质。根据某些实施方式，可以在天然存在的序列中(在某些实施方式中，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸替换(在某些实施方式中，保守氨基酸替换)。在某些实施方式中，保守氨基酸替换通常不会显著改变亲本序列的结构特征(例如，替换氨基酸不应倾向于破坏亲本序列中出现的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于蛋白、结构和分子原理(Proteins,Structures and Molecular Principles)(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；蛋白结构简介(Introduction to Protein Structure)(C.Branden&J.Tooze,eds.,GarlandPublishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton et al.,Nature,354:105(1991)，它们各自通过引用并入本文。
术语“衍生物”是指包括氨基酸(或核酸)的插入、缺失或替换以外的化学修饰的分子。在某些实施方式中，衍生物包括共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施方式中，化学修饰的干扰素相关的抗原结合蛋白可以比未经化学修饰的干扰素相关的抗原结合蛋白具有更大的循环半衰期。在某些实施方式中，化学修饰的干扰素相关的抗原结合蛋白可以对所需细胞、组织和/或器官具有改进的靶向能力。在一些实施方式中，衍生物干扰素相关的抗原结合蛋白被共价修饰以包括一种或多种水溶性聚合物附件(attachment)，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如，美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337。在某些实施方式中，衍生物干扰素相关的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他基于碳水化合物的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇、以及这些聚合物的混合物。
在某些实施方式中，本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白的衍生物用聚乙二醇(PEG)亚基共价修饰。在某些实施方式中，一种或多种水溶性聚合物结合在衍生物的一个或多个特定位置，例如氨基末端。在某些实施方式中，一种或多种水溶性聚合物随机附接到衍生物的一个或多个侧链上。在某些实施方式中，PEG用于提高干扰素相关的抗原结合蛋白的治疗能力。某些这样的方法在例如美国专利号6,133,426中进行讨论，该专利出于任何目的通过引用并入本文。
在某些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白变体包括糖基化变体，其中与亲本多肽的氨基酸序列相比，糖基化位点的数量和/或类型已经改变。在某些实施方式中，蛋白变体包含比天然蛋白更多数量的N-连接糖基化位点。在其他实施方式中，蛋白变体包含比天然蛋白更少数量的N-连接糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征在于序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。氨基酸残基的替换产生该序列为添加N-连接的碳水化合物链提供了潜在的新位点。替代地，消除该序列的替换将去除现有的N-连接的碳水化合物链。还提供了N-连接的碳水化合物链的重排，其中一个、两个、三个、四个、五个或多个N-连接的糖基化位点(通常是天然存在的那些)被消除，并且产生一个或多个新的N-连接的位点。另外优选的变体包括半胱氨酸变体，其中与亲本氨基酸序列相比，一个或多个半胱氨酸残基从另一个氨基酸(例如丝氨酸)缺失或替换。当抗体必须重折叠成生物活性构象时(诸如在分离不溶性包涵体后)，半胱氨酸变体可能是有用的。半胱氨酸变体通常比天然蛋白具有更少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数以最小化由不成对的半胱氨酸引起的相互作用。
冠状病毒感染
本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白、核酸、载体、载体系统、方法和组合物可用于治疗冠状病毒感染，特别是SARS-CoV-2感染。如本文使用的，“治疗冠状病毒感染”和“冠状病毒感染的治疗”是指以下的一种或多种：(i)从冠状病毒诱导的细胞凋亡中挽救细胞；(ii)从冠状病毒诱导的细胞病变效应中挽救细胞；(iii)减少一种或多种冠状病毒相关病症；和(iv)减少受试者的一种或多种冠状病毒相关症状。
术语“病毒载量”和“病毒滴度”是指细胞、器官或体液(诸如血液或血清)中病毒颗粒的数量。根据检测类型，病毒载量或病毒滴度通常表示为病毒颗粒，或每毫升的感染性颗粒。现今，病毒载量通常使用国际单位/毫升(IU/mL)来测量。病毒载量或病毒滴度也可以替代地被确定为所谓的病毒基因组当量。较高的病毒负荷、滴度或病毒载量通常与活性病毒感染的严重程度相关。因此，病毒载量或病毒滴度的降低与例如血清中感染性病毒颗粒数量的减少相关。病毒载量通常使用基于核酸扩增的测试(NAT或NAAT)来确定。NAT/NAAT测试利用例如PCR、(定量)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR或qRT-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或基于探针的测定。由于使用基于核酸扩增的测试容易检测病毒核酸，因此病毒载量在临床环境中可用于监测治疗期间的成功率。
术语“患者”和“受试者”可互换使用，并且包括人类和非人类动物受试者(优选是人类受试者)，以及那些有正式诊断病症的人类受试者、那些没有正式识别的病症的人类受试者、那些接受医疗护理的人类受试者、有患病症风险的人类受试者等。
如本文使用的，“冠状病毒相关病症”，特别是与SARS-CoV-2感染相关的病症，是指由受试者感染冠状病毒引起的病症。冠状病毒相关病症包括但不限于Covid-19、呼吸道疾病、肺炎以及任何这些病症引起的症状和/或并发症。
如本文使用的，“冠状病毒相关症状”、“冠状病毒感染症状”或“冠状病毒相关并发症”包括与冠状病毒感染相关的一种或多种身体功能障碍，特别是与SARS-CoV-2感染相关的身体功能障碍。冠状病毒症状和并发症包括但不限于发热、干咳、疲劳、呼吸困难或呼吸短促、胸痛或压力、味觉丧失、味觉异常、味觉减退、失嗅、嗅觉倒错、嗅觉减退等。
干扰素
如本文使用的，“干扰素”或“IFN”是指细胞因子或其衍生物，其通常由细胞响应病原体或肿瘤细胞的存在而产生和释放。IFN包括I型IFN(例如，IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ、IFNτ、IFNζ和IFNω)、II型IFN(例如，IFNγ)和III型IFN(例如，IFNλ1、IFNλ2和IFNλ3)。术语“干扰素”或“IFN”包括但不限于全长IFN、其变体或衍生物(例如，化学(例如聚乙二醇化)修饰的衍生物或突变蛋白)或其功能活性片段，这保留全长IFN的一种或多种信号传导活性。
如本文使用的，术语“功能片段”是指保留原始物质的一种或多种功能活性的物质片段。例如，干扰素的功能片段是指保留如本文所述的IFN功能的干扰素片段，例如，它介导IFN通路信号传导。
当IFN被添加到表达同源IFN受体(用于IFNα的IFNAR，用于IFNβ的IFNBR等)的细胞、组织或生物体中时，IFN可使一种或多种IFN受体活性增加了至少约20％。在一些实施方式中，干扰素使IFN受体活性激活了至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少85％。IFN的活性(即“IFN活性”)可以例如使用体外报告细胞测定法来测量，例如使用HEK-BlueTMIFN-α/β细胞(InvivoGen,Cat.#:hkb-ifnαβ)、HEK-BlueTMIFN-λ(InvivoGen,Cat.#:hkb-ifnl)或HEK-BlueTM双重IFN-γ细胞(InvivoGen,Cat.#:hkb-ifng)，如实施例I中更详细地描述的。这些报告细胞是通过用人IFN受体基因和IFN刺激的应答元件控制的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)构建体稳定转染HEK293细胞而产生的，以测量IFN的活性。HEK-BlueTMIFN-细胞被设计为监测由I型、II型或III型干扰素诱导的JAK/STAT/ISGF3通路的激活。这些通路的激活诱导SEAP的产生和释放。
在本发明的上下文中，干扰素相关的抗原结合蛋白激活CD40和IFN通路。在某些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白以以下的EC50激活IFN通路：小于100ng/mL、60ng/mL、50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL或1ng/mL，优选地EC50小于11ng/mL，更优选地EC50小于6ng/mL，其中IFN活性优选地使用体外报告细胞测定法测定，任选地使用HEK-BlueTM IFN-细胞，如实施例I中描述的。
在这些实施方式中的一些中，IFN通路是IFNα(干扰素α)、IFNβ(干扰素β)、IFNε(干扰素ε)、IFNω(干扰素ω)、IFNγ(干扰素γ)或IFNλ(干扰素λ)通路。
根据某些示例性实施方式，本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白包含全长IFN、其变体或衍生物(例如，化学(例如聚乙二醇化)修饰的衍生物或突变蛋白)或其功能活性片段，这保留全长IFN的一种或多种信号传导活性。在某些实施方式中，IFN是人类IFN。
在某些实施方式中，本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白包含选自由I型IFN、II型IFN和III型IFN或其功能片段组成的组的IFN或其功能片段。
在特定实施方式中，IFN或其功能片段是I型IFN或其功能片段。在特定实施方式中，I型IFN或其功能片段为IFNα、IFNβ、IFNω或IFNε或其功能片段。在更具体的实施方式中，I型IFN或其功能片段是IFNα或IFNβ或其功能片段。在其他更具体的实施方式中，I型IFN或其功能片段是IFNα或其功能片段。在其他更具体的实施方式中，I型IFN或其功能片段是IFNβ或其功能片段。在其他更具体的实施方式中，I型IFN或其功能片段是IFNω或其功能片段。在其他更具体的实施方式中，I型IFN或其功能片段是IFNε或其功能片段。
在特定实施方式中，IFN或其功能片段是IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNε、或IFNω、或它们功能片段。在特定实施方式中，IFN或其功能片段是IFNα、或IFNβ、或它们功能片段。
在一些实施方式中，IFN或其功能片段是IFNα或其功能片段。在更具体的实施方式中，IFN或其功能片段是IFNα2a或其功能片段。IFNα2a可以包含SEQ ID NO 17中所示的序列或者与其具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方式中，IFN或其功能片段是IFNβ或其功能片段。IFNβ可以包含SEQ IDNO 14中所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。IFNβ或其功能片段可以包含相对于SEQ ID NO 14的一个或两个选自C17S和N80Q的氨基酸替换。在一些实施方式中，IFNβ或其功能片段包含相对于SEQ ID NO 14的氨基酸替换C17S。在一些实施方式中，IFNβ包含SEQID NO 15中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，IFNβ包含相对于SEQ ID NO 14的氨基酸替换C17S和N80Q。在其他实施方式中，IFNβ包含SEQ ID NO 16中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，IFN或其功能片段是IFNγ、或IFNλ、或它们功能片段。在特定实施方式中，IFN或其功能片段是IFNγ或其功能片段。在更具体的实施方式中，IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。在其他具体实施方式中，IFN或其功能片段是IFNλ或其功能片段。在更具体的实施方式中，IFNλ或其功能片段是IFNλ2或其功能片段。IFNλ2可以包含SEQ ID NO 18中所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方式中，IFN或其功能片段是IFNε或其功能片段。IFNε可以包含SEQ IDNO 80中所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方式中，IFN或其功能片段是IFNω或其功能片段。IFNω可以包含SEQID NO 79中所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。
在某些实施方式中，在用本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗的冠状病毒感染的细胞中，一种或多种IFN信号传导通路生物标志物的表达水平改变，即上调或下调。根据某些示例性实施方式，一种或多种IFN通路生物标志物的表达水平在用本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗的冠状病毒感染的细胞中上调。在这种情况下，“生物标志物”应被理解为一种客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指标。
根据某些实施方式，本文所述的合适的IFN通路生物标志物是趋化因子，例如C-X-C趋化因子，选自由以下组成的组：CXCL9、CXCL10和CXCL11。在某些示例性实施方式中，由IFN通路诱导的合适的生物标志物是CXCL9、CXCL10和/或CXCL11，以及干扰素刺激的基因ISG20。细胞因子诱导或释放可以使用本领域已知的技术诸如ELISA来定量。替代地，诱导也可以使用基于RNA的测定法(诸如RNAseq或qRT-PCR)来确定。在某些实施方式中，上调可以指这些细胞因子的表达或分泌增加了至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
在这些或其他示例性实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，促炎细胞因子如IL10、IL1β和/或IL2的表达水平在人全血细胞中没有显著上调。在一些实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，IL10的表达水平在人全血细胞中没有显著上调。在一些实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，IL1β的表达水平在人全血细胞中没有显著上调。在一些实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，IL2的表达水平在冠状病毒感染的细胞中没有显著上调。在一些实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，IL10和IL1β的表达水平在冠状病毒感染的细胞中没有显著上调。在一些实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，IL10和IL2的表达水平在冠状病毒感染的细胞中没有显著上调。在一些实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，IL1β和IL2的表达水平在冠状病毒感染的细胞中没有显著上调。在一些实施方式中，当用本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白治疗时，IL10、IL1β和IL2的表达水平在冠状病毒感染的细胞中没有显著上调。
干扰素相关的抗原结合蛋白
如本文中使用的，术语“结合”通常指两个(或多个)分子的共价或非共价连接。相关蛋白是通过连接两种或多种不同的肽或蛋白而产生的，从而产生具有衍生自每种原始蛋白的一种或多种功能特性的蛋白。在本发明的上下文中，干扰素相关的抗原结合蛋白激活CD40和IFN通路。相关蛋白包括单体和多聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体等，不同相关或融合蛋白的复合物。在本上下文中，非共价连接是由两个蛋白表面区域之间的强相互作用产生的，通常通过离子、范德华力和/或氢键相互作用。另一方面，共价键需要存在实际的化学键，诸如肽键、二硫桥(disulphide bridge)等。如本文中使用的，术语“融合”通常指两种或多种不同的肽或蛋白通过肽键以共价方式连接。因此，“融合蛋白”是指通过肽键连接两种或多种不同的肽或蛋白而产生的单个蛋白，其具有衍生自每种原始蛋白的一种或多种功能特性。在某些实施方式中，两种或多种不同的肽或蛋白可以通过一种或多种肽接头(“L”)彼此融合。
在本发明的某些方面中，干扰素相关的抗原结合蛋白是包含激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段以及IFN或其功能片段的蛋白。
在一些实施方式中，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段非共价结合。在更具体的实施方式中，IFN或其功能片段通过离子、范德华力和/或氢键相互作用与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段非共价结合。
在其他实施方式中，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段共价结合。在优选的实施方式中，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合。IFN或其功能片段可以与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合。在一些实施方式中，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的N末端融合。在其他实施方式中，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的C末端融合。IFN或其功能片段还可以与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合。在一些实施方式中，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的N末端融合。在其他实施方式中，IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的C末端融合。在这些实施方式中的任一个中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段与IFN或其功能片段可以通过接头彼此融合。
如本文使用的，术语“接头”或“L”是指将一种或多种激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段共价连接到一种或多种干扰素或其功能片段的任何部分。在示例性实施方式中，接头是肽接头。如本文中使用的，术语“肽接头”是指适于连接两个或多个部分的肽。本文提及的肽接头可以具有以下概述的一种或多种性质。根据某些示例性实施方式的肽接头的序列示于表7中。
肽接头可以具有任何长度，即包括任何数量的氨基酸残基。在示例性实施方式中，接头包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸。接头可以包含至少4个氨基酸。接头可以包含至少11个氨基酸。接头可以包含至少12个氨基酸。接头可以包含至少13个氨基酸。接头可以包含至少15个氨基酸。接头可以包含至少20个氨基酸。接头可以包含至少21个氨基酸。接头可以包含至少24个氨基酸。
接头通常足够长以提供足够程度的灵活性，以防止连接的部分干扰彼此的活性，例如部分与受体结合的能力。在示例性实施方式中，接头包含至多10个、至多20个、至多30个、至多40个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、或至多100个氨基酸。接头可以包含至多80个氨基酸。接头可以包含至多40个氨基酸。接头可以包含至多24个氨基酸。接头可以包含至多21个氨基酸。接头可以包含至多20个氨基酸。接头可以包含至多15个氨基酸。接头可以包含至多13个氨基酸。接头可以包含至多12个氨基酸。接头可以包含至多11个氨基酸。接头可以包含至多4个氨基酸。
在一些实施方式中，接头选自包括刚性、柔性和/或形成螺旋的接头的组。应当理解，形成螺旋的接头也可以是刚性接头，因为α-螺旋的自由度比假设更随机的螺旋构象的肽小。在一些实施方式中，接头是刚性接头。示例性刚性接头包括如SEQ ID NO 20中所示的序列。进一步的示例性刚性接头包括SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。在相关的实施方式中，接头是形成螺旋的接头。示例性的形成螺旋的接头包括SEQ ID NO 22或SEQID NO 23中所示的序列。在其他实施方式中，接头是柔性接头。示例性柔性接头包含SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
接头也可以具有不同的化学性质。接头可以选自酸性、碱性或中性接头。通常，酸性接头含有一种或多种酸性氨基酸，例如Asp或Glu。碱性接头通常含有一种或多种碱性氨基酸，例如Arg、His和Lys。两种类型的氨基酸都具有很强的亲水性。在一些实施方式中，接头是酸性接头。示例性酸性接头包含SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。在其他实施方式中，接头是碱性接头。在又一些其他实施方式中，接头是中性接头。示例性中性接头包含SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
在优选实施方式中，接头是由多个甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基(如适用)组成的Gly-Ser或Gly-Ser-Thr接头。在这些实施方式中的一些中，接头包括氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在更具体的实施方式中，接头包含SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ IDNO 26中所示的序列。在一些实施方式中，接头进一步包含氨基酸苏氨酸。在更具体的实施方式中，接头包含SEQ ID NO 21中所示的序列。
在本发明的示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含接头，该接头包含以下序列：选自SEQ ID NO 20至26中所示的序列，优选选自SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。在优选实施方式中，接头包含SEQ ID NO 24中所示的序列。在另一个优选实施方式中，接头包含SEQ ID NO 25中所示的序列。在另一个优选实施方式中，接头包含SEQ ID NO 26中所示的序列。
在本发明任一方面的各种实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白不包含除了形成(I)所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段和(II)所述IFN或其功能片段之外的氨基酸。在相关实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白不包含除了形成(I)所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段、(II)所述IFN或其功能片段和(III)所述接头的氨基酸之外的氨基酸。
代表(I)激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段、(II)干扰素(IFN)或其功能片段和(III)接头的各种不同构型的示例性实施方式概述如下。
在某些优选的实施方式中，如表3A或表3B所示，IFN或其功能片段通过接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的C末端融合。在这些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链可以包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO12、SEQ ID NO 48或SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 61或SEQ ID NO 63中所示的序列。IFNα2a可以包含如SEQ ID NO 17中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQID NO 16中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQ ID NO 14中所示的序列。IFNβ_C17S可以包含如SEQ ID NO 15中所示的序列。IFNβ_C17S,N80Q可以包含如SEQ ID NO 16中所示的序列。IFNγ可以包含如SEQ ID NO 19中所示的序列。IFNλ2可以包含如SEQ ID NO 18中所示的序列。IFNε可以包含如SEQ ID NO 80中所示的序列。IFNω可以包含如SEQ ID NO 79中所示的序列。所提及的接头是表7中列出的那些。
在IFN与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的C末端融合的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白进一步包含激动性抗-CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链。在更具体的实施方式中，重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO12、SEQ ID NO 48或SEQ ID NO 49中所示的序列，以及轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。在其他更具体的实施方式中，重链包含SEQ ID NO 61或SEQ ID NO 63中所示的序列，以及轻链包含SEQ ID NO 59中所示的序列。
表3.与抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的C末端融合的干扰素或其功能片段。
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在某些优选的实施方式中，如表4A或表4B所示，IFN或其功能片段通过接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的N末端融合。在这些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链可以包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO12、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 63或SEQ IDNO 65中所示的序列。IFNα2a可以包含如SEQ ID NO 17中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQ ID NO 14中所示的序列。IFNβ_C17S可以包含如SEQ ID NO 15中所示的序列。IFNβ_C17S,N80Q可以包含如SEQ ID NO 16中所示的序列。IFNγ可以包含如SEQ ID NO 19中所示的序列。IFNλ2可以包含如SEQ ID NO 18中所示的序列。IFNε可以包含如SEQ ID NO 80中所示的序列。IFNω可以包含如SEQ ID NO 79中所示的序列。所提及的接头是表7中列出的那些。
在IFN与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的N末端融合的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白进一步包含激动性抗-CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链。在更具体的实施方式中，重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO12、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49或SEQ ID NO 50中所示的序列，以及轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。在其他更具体的实施方式中，重链包含SEQ ID 61、SEQ ID 63或SEQ ID 65中所示的序列，以及轻链包含SEQ ID 59中所示的序列。
表4.与抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的N末端融合的干扰素或其功能片段。
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在某些优选的实施方式中，如表5A或表5B所示，IFN通过接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的C末端融合。在这些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链可以包含SEQ ID NO 3中所示的序列。在其他实施方式中，轻链可以包含SEQ ID NO 59中所示的序列。IFNα2a可以包含如SEQ ID NO 17中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQ ID NO 14中所示的序列。IFNβ_C17S可以包含如SEQ ID NO 15中所示的序列。IFNβ_C17S,N80Q可以包含如SEQ ID NO 16中所示的序列。IFNγ可以包含如SEQ ID NO 19中所示的序列。IFNλ2可以包含如SEQ ID NO 18中所示的序列。IFNε可以包含如SEQ ID NO 80中所示的序列。IFNω可以包含如SEQ ID NO 79中所示的序列。所提及的接头是表7中列出的那些。
在IFN与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的C末端融合的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白进一步包含激动性抗-CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链。在更具体的实施方式中，轻链包含如SEQ ID NO 3中所示的序列，以及重链包含如SEQID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQID NO 48、SEQ ID NO 50或SEQ ID NO12中所示的序列。在其他更具体的实施方式中，轻链包含SEQ ID NO 59中所示的序列，以及重链包含SEQ IDNO 61、SEQ ID NO 63或SEQ ID NO 65中所示的序列。
表5.与抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的C末端融合的干扰素或其功能片段。
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在某些优选实施方式中，如表6A或表6B所示，IFN通过接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的N末端融合。在这些实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链可以包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 59中所示的序列。IFNα2a可以包含如SEQ ID NO 17中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQID NO 16中所示的序列。IFNβ可以包含如SEQ ID NO 14中所示的序列。IFNβ_C17S可以包含如SEQ ID NO 15中所示的序列。IFNβ_C17S,N80Q可以包含如SEQ ID NO 16中所示的序列。IFNγ可以包含如SEQ ID NO 19中所示的序列。IFNλ2可以包含如SEQ ID NO 18中所示的序列。IFNε可以包含如SEQ ID NO 80中所示的序列。IFNω可以包含如SEQ ID NO 79中所示的序列。所提及的接头是表7中列出的那些。
在IFN与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的N末端融合的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白进一步包含激动性抗-CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链。在更具体的实施方式中，轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列，以及重链包含SEQID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQID NO 48、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 50中所示的序列。在其他更具体的实施方式中，轻链包含SEQ ID NO 59中所示的序列，以及重链包含SEQ IDNO 61、SEQ ID NO 63或SEQ ID NO 65中所示的序列。
表6.与抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的N末端融合的干扰素或其功能片段。
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表7列出了本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或其前体中包含的示例性序列。
在示例性优选实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 28-47或SEQID NO 66-75的序列。在其他示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO81-88的序列。在示例性优选实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 28-47或SEQID NO 66-75的序列。在其他示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 81-88的序列。在其他示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 93-94的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 93中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 93中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 94中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 94中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 81中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 81中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 82中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 82中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 83中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 83中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 84中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 84中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 85中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 85中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 86中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 86中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 87中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 87中所示的序列。
在某些示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 88中所示的序列。在另一个示例性实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 88中所示的序列。
在更优选实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 38、SEQ ID NO39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42或SEQ ID NO 43的序列。在更优选实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO 42或SEQ ID NO 43的序列。在其他更优选实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74和SEQ ID NO 75的序列。在其他更优选实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74和SEQID NO 75的序列。
在甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 38中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 38中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 39中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 39中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 40中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 40中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 41中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 41中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 42中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 42中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 43中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 43中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 72中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 72中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 73中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 73中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 74中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 74中所示的序列。
在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 75中所示的序列。在另一种甚至更优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性结合片段，其包含SEQ ID NO 75中所示的序列。
表7.示例性干扰素相关的抗原结合蛋白及其基于抗CD40抗体CP870,893的组分的序列。斜体序列对应于信号肽。SEQ ID NO 3和6中的粗斜体序列对应于CDR区。粗体非斜体序列对应于接头。突变的氨基酸带下划线。
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表8.示例性干扰素相关的抗原结合蛋白及其基于抗CD40抗体3G5的组分的序列。斜体序列对应于信号肽。粗体非斜体序列对应于接头。突变的氨基酸带下划线。
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在优选的实施方式中，本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合抗原结合蛋白，其包含衍生自表9(特别是表9A或表9B，更特别是下表9A)中所述的那些的多肽，并且尤其是衍生自上述SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQID NO 42或SEQ ID NO 43的多肽。在优选的实施方式中，本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合抗原结合蛋白，其由衍生自表9(特别是表9A或表9B，更特别是下表9A)中所述的那些的多肽，并且尤其是衍生自上述SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42或SEQ ID NO 43的多肽组成。在更优选的实施方式中，干扰素融合的抗体包含SEQ ID NO 38和SEQ ID NO 3中所示的序列。在其他更优选的实施方式中，干扰素融合的抗体包含SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 3中所示的序列。在其他更优选的实施方式中，干扰素融合的抗体包含SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 3中所示的序列。在其他更优选的实施方式中，干扰素融合的抗体包含SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 9中所示的序列。在其他更优选的实施方式中，干扰素融合的抗体包含SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 9中所示的序列。在其他更优选的实施方式中，干扰素融合的抗体包含SEQ ID NO 43和SEQ ID NO 9中所示的序列。
表9.基于抗CD40抗体CP870,893的本发明的优选干扰素融合抗原结合蛋白中发现的多肽组合，它们关于CD40和IFN通路的激活的平均值以及它们的生产率(即每升培养物的产量)。所指示的每个序列组合在各自的IFA中被包括两次。SN：上清液。
A
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B
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在其他优选的实施方式中，本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合抗原结合蛋白，其包含衍生自下表10中所述的那些的多肽。在优选的实施方式中，本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合抗原结合蛋白，其由衍生自下表10中所述的那些的多肽组成。
表10.基于抗CD40抗体3G5的本发明的优选干扰素融合抗原结合蛋白中发现的多肽组合，它们关于CD40和IFN通路的激活的平均EC50值。所指示的每个序列组合在各自的IFA中被包括两次。SN：上清液。
A
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B
核酸与表达载体
在一个方面，提供了编码干扰素相关的抗原结合蛋白的多核苷酸的组合。还提供了制备干扰素相关的抗原结合蛋白的方法，包括表达这些多核苷酸。
在一些实施方式中，提供了编码与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合的IFN或其功能片段的核酸，如本文所公开的。在某些示例性实施方式中，核酸编码与根据SEQ ID NO 93至94中所示序列中的任一个的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合的IFN或其功能片段，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在某些示例性实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 93至94中任一个的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。在某些示例性实施方式中，核酸编码与根据SEQ ID NO 81至88中所示序列中的任一个的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合的IFN或其功能片段，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在某些示例性实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 81至88中任一个的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。在优选的实施方式中，核酸编码与根据SEQ ID NO 28至47中所示序列中的任一个的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合的IFN或其功能片段，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在甚至更具体的实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 28至47中任一个的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。在其他优选的实施方式中，核酸编码与根据SEQ ID NO 66至75中所示序列中的任一个的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合的IFN或其功能片段，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在甚至更具体的实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 66至75中任一个的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。
在其中核酸编码与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合的IFN或其功能片段的那些实施方式中，核酸可以进一步编码激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链。在更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、或SEQ ID NO 50中所示的序列，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在甚至更具体的实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、或SEQ ID NO 50的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。在其他更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ IDNO 64或SEQ ID NO 65中所示的序列，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在这种其他甚至更具体的实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ IDNO 64或SEQ ID NO 65的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。
在其中核酸编码与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合的IFN或其功能片段的那些实施方式中，核酸可以进一步编码激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链。在更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5中所示的序列，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在甚至更具体的实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。在其他更具体的实施方式中，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO 59或SEQ ID NO60中所示的序列，或与编码这些序列中任一个的核酸具有至少至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在甚至更具体的实施方式中，所述核酸与编码SEQ ID NO 59或SEQ ID NO 60的核酸具有至少95％、至少98％或至少99％同一性。
在某些实施方式中，本文所述的核酸可以包含编码用于提高产量(例如，可溶性标签)或促进所表达蛋白的纯化(即，纯化标签)的序列的序列。纯化标签是本领域技术人员已知的，并且可以选自谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、钙调蛋白结合肽(CBP)标签、内含肽-几丁质结合结构域(内含肽-CBD)标签、链霉亲和素/生物素基标签(例如生物素化信号肽(BCCP)标签、链霉亲和素结合肽(SBP)标签、His斑块硫代融合标签(His-patch ThioFusion tag)、串联亲和纯化(TAP)标签、小泛素样修饰物(SUMO)标签、(Promega)、Profinity eXactTM系统(Bio-Rad)。在一些实施方式中，纯化标签可以是多组氨酸标签(例如His6-、His7-、His8-、His9-或His10-标签)。在其他实施方式中，纯化标签可以是Strep标签(例如Strep-/>或Strep-tag/>IBA Life Sciences)。在其他实施方式中，纯化标签可以是麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。
在一些实施方式中，核酸序列可以进一步包含编码用于去除纯化标签的切割位点的序列。这种切割序列是本领域技术人员已知的，并且可以选自由内切蛋白酶或外切蛋白酶识别和切割的序列。在一些实施方式中，用于去除纯化标签的内切蛋白酶可以选自：肠肽酶、凝血酶、因子Xa、TEV蛋白酶或鼻病毒3C蛋白酶。在一些实施方式中，用于去除纯化标签的外切蛋白酶可以选自：羧肽酶A、羧肽酶B或DAP酶。在优选的实施方式中，用于去除纯化标签的蛋白酶是TEV蛋白酶。在更具体的优选实施方式中，核酸包含编码His6标签和TEV切割位点的序列。在甚至更具体的优选实施方式中，所述核酸包含编码SEQ ID NO 27中所示的序列的序列。
本发明的核酸分子还可以包括编码信号肽的序列。本领域技术人员知道可用于将表达的蛋白引导到所需的折叠、组装和/或成熟位点以及影响最终蛋白分泌到培养基中以促进下游加工的各种信号肽。因此，在一些实施方式中，信号肽是分泌型信号肽。编码的信号肽可以包括SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2中所示的序列。在一些实施方式中，信号肽包含SEQ ID NO:1中所示的序列。在其他实施方式中，信号肽包含SEQ ID NO:2中所示的序列。
信号肽1(SEQ ID NO 1)用于合成如SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO50、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ IDNO70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74和SEQ ID NO 75中所示的多肽序列。最初存在于相应的多肽序列的N末端的这种信号肽在合成过程中被切割。
信号肽2(SEQ ID NO 2)用于合成如SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 43中所示的多肽序列。最初存在于相应的多肽序列的N末端的这种信号肽在合成过程中被切割。
为了合成如SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ IDNO 85、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87和SEQ ID NO 88中所示的多肽序列，使用信号肽MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO 1)。最初存在于相应的多肽序列的N末端的这种信号肽在合成过程中被切割。
为了合成如SEQ ID NO 93和SEQ ID NO 94中所示的多肽序列，使用信号肽1(SEQID NO 1)。最初存在于相应的多肽序列的N末端的这种信号肽在合成过程中被切割。
编码与本文所公开的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合的IFN或其功能片段的多核苷酸通常插入表达载体中以引入宿主细胞中，该宿主细胞可用于产生所需量的所描述或要求保护的干扰素相关的抗原结合蛋白。因此，在某些方面，本发明提供了包含本文公开的多核苷酸的表达载体和包含这些载体和多核苷酸的宿主细胞。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于说明书和权利要求的目的，是指根据本发明用作在细胞中引入和表达所需基因的溶媒(vehicle)的载体。如本领域技术人员所知，这种载体可以容易地选自由以下组成的组：质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体包含选择标志物、促进所需基因克隆的适当限制酶切位点以及进入真核细胞或原核细胞和/或在真核细胞或原核细胞中复制的能力。
许多表达载体系统可以用于本发明的目的。例如，一类载体利用衍生自动物病毒的DNA元件，该动物病毒诸如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其他涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，可以通过引入一种或多种标志物来选择已将DNA整合到其染色体中的细胞，该标志物允许选择转染的宿主细胞。该标志物可以对营养缺陷型宿主提供原养型(prototrophy)、杀生体抗性(例如抗生素)或对重金属(如铜)的抗性。选择性标记物基因可以直接连接到要表达的DNA序列，或者通过共转化引入到同一细胞。还可能需要额外的元件来优化mRNA的合成。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一些实施方式中，将克隆的可变区基因(其中一个与编码IFN或其功能片段的基因融合)与如上所述合成的重链和轻链恒定区基因(诸如人类基因)一起插入表达载体中。
在其他实施方式中，本发明的载体系统可以包括多于一个载体。在一些实施方式中，载体系统可以包含用于表达与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合的IFN或其功能片段的第一载体，和用于表达激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的第二载体。替代地，这种载体系统可以包含用于表达与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合的IFN或其功能片段的第一载体，和用于表达激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的第二载体。
在其他实施方式中，如本文所述的干扰素相关的抗原结合蛋白可以使用多顺反子构建体表达。在这种表达系统中，多个感兴趣的基因产物(诸如编码与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合的IFN或其功能片段以及编码所述抗体的轻链的那些，或者编码与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合的IFN或其功能片段以及编码所述抗体或其激动性抗原结合片段的重链的那些)可由单个多顺反子构建体产生。有利地，这些系统使用内部核糖体进入位点(IRES)在真核宿主细胞中提供相对高水平的多肽。相容的IRES序列公开于美国专利号6,193,980中，该专利通过引用并入本文。本领域技术人员将理解，这种表达系统可用于有效地产生本申请中公开的全范围多肽。
更通常地，一旦制备编码本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白的载体或DNA序列，就可以将表达载体引入合适的宿主细胞。也就是说，宿主细胞可以被转化。将质粒引入宿主细胞可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来完成。这些包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜DNA的细胞融合、显微注射和用完整病毒感染。参见，例如，Ridgway,A.A.G.“Mammalian Expression Vectors”Chapter24.2,pp.470-472Vectors,Rodriguez and Denhardt,Eds.(Butterworths,Boston,MA 1988)。转化的细胞在适合生产轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学等。
如本文使用的，术语“转化”应在广义上用于指将DNA引入受体宿主细胞，这改变了基因型并且进而导致受体细胞的变化。
同样，“宿主细胞”是指用重组DNA技术构建并编码至少一种异源基因的载体转化的细胞。在从重组宿主分离多肽的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换地用于表示干扰素相关的抗原结合蛋白的来源，除非另有明确规定。换言之，从“细胞”中回收多肽可能意味着从离心沉降的全细胞中，或者从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收多肽。
在一个实施方式中，用于表达干扰素相关的抗原结合蛋白的宿主细胞系是真核或原核来源的。如本文使用的，术语“表达”可以包括多于一个多肽链(诸如干扰素相关的抗原结合蛋白的抗体部分的重链和轻链)的转录和翻译，它们结合形成最终的干扰素相关的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，用于表达干扰素相关的抗原结合蛋白的宿主细胞系是细菌来源的。在一个实施方式中，用于表达干扰素相关的抗原结合蛋白的宿主细胞系是哺乳动物来源的；本领域技术人员可以确定最适合在其中表达的所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于来自Horizon、DG44和DUXB11的CHO K1 GS敲除(中国仓鼠卵巢系，DHFR-(DHFR minus))、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、HEK 293(人肾脏)。在优选的实施方式中，可以使用HEK FS S11/254细胞。在另一个优选实施方式中，可以使用来自Horizon的CHO K1 GS。在一个实施方式中，细胞系提供由其表达的抗体的改变的糖基化(例如，无岩藻糖基化(afucosylation))(例如PER.(Crucell)或FUT8敲除的CHO细胞系(POTELLIGENTTM细胞)(Biowa,Princeton,NJ))。在一个实施方式中，可以使用NS0细胞。宿主细胞系通常可从商业服务、美国组织培养物保藏中心或已发表的文献中获得。
在一个实施方式中，用于表达干扰素相关的抗原结合蛋白的宿主是非人转基因动物或转基因植物。
本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白也可以通过产生对感兴趣序列进行转基因的非人动物(例如哺乳动物)或植物而转基因地生产，并从中生产以可回收形式的干扰素相关的抗原结合蛋白。与哺乳动物的转基因生产有关，干扰素相关的抗原结合蛋白可以在山羊、奶牛或其他哺乳动物的乳汁中生产并从其中回收。参见例如，美国专利号5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。示例性的植物宿主是烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。在植物中表达抗体的方法，包括启动子和载体的描述，以及植物的转化是本领域已知的。参见例如美国专利6,517,529，该专利通过引用并入本文。在一些实施方式中，非人转基因动物或植物是通过标准转基因技术将编码本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白的一种或多种核酸分子引入动物或植物中而产生的。参见Hogan和美国专利6,417,429。用于制造转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞。转基因非人类生物体可以是嵌合的、非嵌合杂合子和非嵌合纯合子。参见例如，Hogan et al.,Manipulating the MouseEmbryo:A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson etal.,Mouse Genetics and Transgenics:A Practical Approach,Oxford UniversityPress(2000)；和Pinkert,Transgenic Animal Technology:ALaboratory Handbook,Academic Press(1999)。在一些实施方式中，转基因非人动物具有靶向断裂并被编码感兴趣序列的靶向构建体替换。干扰素相关的抗原结合蛋白可以在任何转基因动物中制备。在优选的实施方式中，非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人转基因动物在血液、乳汁、尿液、唾液、泪液、粘液和其他体液中表达所述干扰素相关的抗原结合蛋白。
体外生产允许放大以产生大量所需的干扰素相关的抗原结合蛋白。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，并且包括均匀悬浮培养(例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或固定化或包埋的细胞培养(例如在中空纤维、微胶囊、琼脂糖微珠或陶瓷盒上)。若需要和/或所需，干扰素相关的抗原结合蛋白的溶液可以通过常规色谱方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE纤维素色谱法和/或(免疫-)亲和色谱法。
编码干扰素相关的抗原结合蛋白的一个或多个基因也可以在非哺乳动物细胞(诸如细菌或酵母)或植物细胞中表达。在这方面，将理解各种单细胞非哺乳动物微生物(诸如细菌)也可以被转化；即能够在培养物或发酵中生长的那些。易转化的细菌包括肠杆菌科的成员，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的菌株。将进一步理解，当在细菌中表达时，根据本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或其组分(即激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段，以及IFN或IFN的功能片段)可以成为包涵体的一部分。然后可能需要分离(任选地还需要重折叠和纯化)所需的干扰素相关的抗原结合蛋白。
除了原核生物外，还可以使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常见的面包酵母，是真核微生物中最常用的，尽管许多其他菌株也常用。为了在酵母(Saccharomyces)中表达，质粒YRp7，例如(Stinchcomb et al.,Nature,282:39(1979)；Kingsman et al.,Gene,7:141(1979)；Tschemper et al.,Gene,10:157(1980))是常用的。该质粒已经含有TRP1基因，该基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母的突变菌株提供了选择标志物，例如ATCC号44076或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))。trp1损伤的存在作为酵母宿主细胞基因组的特征，从而为检测在不存在色氨酸的情况下的生长转化提供了有效的环境。
治疗载体
编码干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸序列可以插入载体中并用作治疗载体，例如表达本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白的载体。合适的功能性表达构建体和治疗性表达载体的构建是本领域普通技术人员已知的。因此，在某些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白可以通过用RNA或DNA序列、编码干扰素相关的抗原结合蛋白的载体或载体系统的基因递送来施用到受试者。
治疗载体可以通过例如静脉注射、局部施用(参见美国专利号5,328,470)或通过立体定向注射(参见例如Chen et al.,PNAS 91:3054-3057(1994))递送到受试者。治疗载体的药物制剂可以将载体包含在可接受的稀释剂中。
编码一种或多种核酸的干扰素相关的抗原结合蛋白可以结合到基因构建体中，以作为治疗方案的一部分用于递送编码干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸。提供了用于体内转染和表达干扰素相关的抗原结合蛋白的表达载体。
这些组分的表达构建体可以在任何生物有效载体中施用，例如本领域普通技术人员已知的能够有效地将组分核酸序列递送到体内细胞的任何制剂或组合物。方法包括但不限于将受试者核酸序列插入病毒载体中，该病毒载体包括但不局限于重组逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒-1、重组细菌或真核质粒等。
逆转录病毒载体和腺相关病毒载体可以用作重组递送系统，用于在体内转移外源核酸序列，特别是转移到人类中。这种载体提供了基因有效递送到细胞中，并且转移的核酸可以稳定地整合到宿主的染色体DNA中。
仅产生复制缺陷的逆转录病毒的特异性细胞系(称为“包装细胞”)的发展增加了逆转录病毒用于基因疗法的效用，并且缺陷型逆转录病毒被表征用于基因疗法目的的基因转移(综述参见，例如Miller,Blood76:271-78(1990))。复制缺陷型逆转录病毒可以被包装成病毒粒子，病毒粒子可以通过标准技术使用辅助病毒感染靶细胞。用于产生重组逆转录病毒和用这种病毒在体外或体内感染细胞的方案可以在分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel,et al.,(eds.)Greene PublishingAssociates,(1989),Sections 9.10-9.14)，以及其他标准实验室手册中找到。合适的逆转录病毒的非限制性实例包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它们是本领域普通技术人员已知的。合适的包装病毒系的实例包括*Crip、*Cre、*2和*Am。(参见例如，Eglitis,et al.,Science230:1395-1398(1985)；Danos and Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464(1988)；Wilson,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018(1988)；Armentano,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145(1990)；Huber,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039-8043(1991)；Ferry,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381(1991)；Chowdhury,et al.,Science 254:1802-1805(1991)；vanBeusechem,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644(1992)；Kay,et al.,HumanGene Therapy 3:641-647(1992)；Dai,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895(1992)；Hwu,et al.,J.Immunol.150:4104-4115(1993)；美国专利号4,868,116；美国专利号4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；和PCT申请WO 92/07573)。
在另一个实施方式中，提供了腺病毒衍生的递送载体。腺病毒的基因组可以被操纵，使其编码和表达感兴趣的基因产物，但就其在正常裂解病毒生命周期中复制的能力而言是失活的。参见例如Berkner,et al.,BioTechniques 6:616(1988)；Rosenfeld,et al.,Science 252:431-434(1991)；和Rosenfeld,et al.,Cell 68:143-155(1992)。衍生自腺病毒菌株Ad 5型d1324或其他腺病毒菌株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合适腺病毒载体是本领域普通技术人员已知的。重组腺病毒在某些情况下是有利的，因为它们不能感染非分裂细胞并且可以用于感染多种细胞类型，包括上皮细胞(Rosenfeld,et al.(1992)，同上)。此外，病毒颗粒相对稳定，并且易于纯化和浓缩，并且如上所述，它们可以进行修饰以影响传染性谱。此外，引入的腺病毒DNA(以及其中包含的外来DNA)没有整合到宿主细胞的基因组，而是保持游离型，从而避免了在引入的DNA整合到宿主基因组(例如逆转录病毒DNA)的情况下由于原位插入诱变而可能发生的潜在问题。此外，腺病毒基因组对外来DNA的携带能力相对于其他递送载体是大的(高达8千碱基)(Berkner,et al.(1998)，同上；Haj-Ahmand andGraham,J.Virol.57:267(1986))。
另一种可用于递送编码干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸序列的病毒载体系统是腺相关病毒(AAV)。AAV是一种天然存在的缺陷型病毒，该病毒需要另一种病毒诸如腺病毒或疱疹病毒作为有效复制和生产生命周期的辅助病毒。(综述参见Muzyczka,et al.,Curr.Topics in Micro.and Immunol.158:97-129(1992))。它也是少数可以将其DNA整合到非分裂细胞中并表现出高频率稳定整合的病毒之一(参见例如Flotte,et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356(1992)；Samulski,et al.,J.Virol.63:3822-3828(1989)；和McLaughlin,et al.,J.Virol.62:1963-1973(1989))。含有仅仅300个碱基对的AAV的载体可以被包装并整合。外源DNA的空间被限制在约4.5kb。AAV载体(诸如Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)中描述的AAV载体)可以用于将DNA引入细胞中。已经使用AAV载体将多种核酸引入不同的细胞类型中(参见例如，Hermonat,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470(1984)；Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1985)；Wondisford,et al.,Mol.Endocrinol.2:32-39(1988)；Tratschin,et al.,J.Virol.51:611-619(1984)；和Flotte,et al.,J.Biol.Chem.268:3781-3790(1993)。
除了病毒转移方法外，还可以采用非病毒方法在受试者的组织中引起编码干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸序列的表达。大多数非病毒基因转移方法依赖于哺乳动物细胞摄取和细胞内运输大分子所用的正常机制。在一些实施方式中，非病毒递送系统依赖于靶细胞摄取受试者基因的内吞途径。这种类型的示例性递送系统包括脂质体衍生的系统、聚赖氨酸缀合物和人工病毒包膜。其他实施方式包括质粒注射系统，诸如在Meuli,et al.,J.Invest.Dermatol.116(1):131-135(2001)；Cohen,et al.,Gene Ther 7(22):1896-905(2000)；或Tam,et al.,Gene Ther.7(21):1867-74(2000)中描述的。
在临床环境中，可以通过多种方法中的任一种将递送系统引入受试者，每种方法在本领域中都是熟悉的。例如，可以系统地引入递送系统的药物制剂，例如通过静脉注射。蛋白在靶细胞中的特异性转导主要发生于由于控制受体基因表达的转录调控序列而引起的递送溶媒、细胞类型或组织类型表达提供的转染的特异性，或它们的组合。在其他实施方式中，重组基因的初始递送受到更大的限制，将其引入动物中是完全局限性的。例如，递送载体可以通过导管引入(参见美国专利号5,328,470)或通过立体定向注射(例如Chen,etal.,PNAS 91:3054-3057(1994))。
治疗构建体的药物制剂可以基本上由在可接受的稀释剂中的递送系统组成，或者可以包括递送溶媒嵌入其中的缓释基质。替代地，在完全递送系统可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产生的情况下，药物制剂可以包括一个或多个产生递送系统的细胞。
治疗方法及相应用途
在一个方面，本发明提供了治疗有此需要的患者(例如，感染冠状病毒，特别是SARS-CoV-2的患者)的方法，包括施用有效量的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸序列(例如，mRNA)，如本文所公开的。本发明还提供了如本文所公开的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸序列(例如，mRNA)在制备用于治疗冠状病毒感染的药物中的用途。在某些实施方式中，本发明提供了用于在需要这种治疗的哺乳动物受试者中治疗病症和/或症状(例如冠状病毒相关病症和/或冠状病毒相关症状)的试剂盒和方法。在某些示例性实施方式中，受试者是人。
本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码它们的核酸序列可用于多种不同的应用。例如，在一个实施方式中，受试者干扰素相关的抗原结合蛋白或编码它们的核酸序列可用于挽救冠状病毒感染的细胞免于细胞凋亡和/或免于冠状病毒诱导的细胞病变效应。
在另一个实施方式中，受试者干扰素相关的抗原结合蛋白或编码它们的核酸序列可用于减少与冠状病毒感染相关的一种或多种症状和/或并发症，如本文所述(下文)。
因此，本发明还涉及一种通过向这种人或动物施用有效、无毒量的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码其的核酸序列来治疗与人或其他动物中冠状病毒感染相关的一种或多种病症、症状和/或并发症的方法。本领域技术人员能够通过常规实验来确定用于治疗冠状病毒感染的目的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码其的核酸序列的有效、无毒量。
例如，本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白的“治疗活性量”可根据诸如受试者的疾病分期(例如，急性与慢性)、年龄、性别、医疗并发症(例如，HIV合并感染、免疫抑制病况或疾病)和体重的因素，以及干扰素相关的抗原结合蛋白在受试者中引发所需反应的能力而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每天施用几个分剂量，或者可以根据治疗情况的紧急状态的指示按比例减少剂量。
通常，本发明提供的组合物可用于预防性治疗未感染的细胞或治疗性治疗任何冠状病毒感染的细胞(包含允许干扰素相关的抗原结合蛋白靶向冠状病毒感染的细胞的抗原标志物)。
根据本文所描述和要求保护的方法和用途治疗或预防冠状病毒感染可能需要施用TNFRSF激动剂或其功能片段(例如，与IFN或其功能片段“组合”，反之亦然。如果TNFRSF激动剂或其功能片段和IFN或其功能片段存在于不同的药物组合物中，则可以通过同时施用进行这种组合施用。替代地，在这种情况下可以通过顺序施用来实现联合施用。例如，TNFRSF激动剂或其功能片段可以在IFN或其功能片段之前施用。替代地，IFN或其功能片段可以在TNFRSF激动剂或其功能片段之前施用。在顺序施用的情况下，施用将以这样的方式进行，即优选与单独施用IFN或其功能片段相比，联合施用将增强治疗对例如从冠状病毒诱导的细胞凋亡和/或从冠状病毒诱导的细胞病变效应中挽救细胞的有益效果。本领域技术人员将能够容易地确定合适的施用方案、相关剂量、施用间隔，以及在选择不同药物组合物的顺序施用的情况下，在实现这种增强的情况下所述不同药物组合物施用之间的间隔。
药物组合物及其施用
在某些实施方式中，本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码它们的核酸序列(包括载体或载体系统)包含在药物组合物中。制备本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码它们的核酸序列并将其施用到受试者的方法是本领域技术人员众所周知的，或者他们可以通过使用本说明书和本领域知识作为指南来容易地确定。本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码它们的核酸序列的施用途径可以是口服、肠胃外、通过吸入或局部施用。如本文中使用的，术语“肠胃外”包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。虽然所有这些施用形式都清楚地被认为在本发明的范围内，但施用形式将是用于注射的溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可以包括缓冲剂(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。在一些实施方式中，缓冲剂是乙酸盐。在另一个实施方式中，缓冲剂是甲酸盐。在又一个实施方式中，缓冲剂是柠檬酸盐。在相关的实施方式中，表面活性剂可以选自包括以下的列表：普朗尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇和泰洛沙泊。在优选的实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯。在更优选的实施方式中，表面活性剂为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、或聚山梨醇酯100，优选为聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白或编码它们的核酸序列可以直接递送到不良细胞群的位点(例如，肝脏)，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明的组合物和方法中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M，例如0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常见的肠胃外溶媒包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液、或固定油。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如，基于林格氏葡萄糖的那些)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，诸如例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更特别地，适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在这种情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是达到易于注射程度的流体。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且通常会被保存以防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
可以通过各种抗菌和抗真菌剂来实现预防微生物的作用，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，等渗剂将包括在组合物中，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在任何情况下，制备无菌可注射溶液可以根据需要通过在含有本文列举的一种成分或多种成分的组合的合适溶剂中掺入单独的或与所需量的其他活性剂组合的活性化合物(诸如本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白或编码所述干扰素相关的抗原结合蛋白的核酸序列)，然后过滤灭菌来进行。通常，通过将活性化合物掺入无菌溶媒中来制备分散体，该无菌溶媒含有碱性分散介质和上文列举的那些所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这产生了从其先前无菌过滤的溶液中活性成分加上任何额外所需成分的粉末。根据本领域已知的方法，对用于注射的制剂进行处理，将其填充到诸如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶的容器中，并在无菌条件下密封。此外，制剂可以以试剂盒的形式进行包装和销售。这种制品通常具有标签或药品说明书(指示相关组合物可用于治疗患有冠状病毒感染的受试者)。
用于治疗上述冠状病毒感染相关病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但包括转基因哺乳动物在内的非人哺乳动物，特别是非人灵长类动物，也可以接受治疗。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以优化安全性和有效性。
对于用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗，剂量范围例如可以为宿主体重的约0.0001mg/kg至约100mg/kg，更通常为约0.01mg/kg至约5mg/kg(例如，约0.02mg/kg、约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约0.75mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg等)。例如，剂量可以为约1mg/kg体重或约10mg/kg体重，或在约1mg/kg至约10mg/kg，例如至少约1mg/kg的范围内。上述范围内的剂量中间值也预期在本发明的范围内。受试者可以每天、每隔一天、每周或根据经验分析确定的任何其他时间表施用这种剂量。示例性治疗需要在延长的时间内(例如至少六个月)以多剂量施用。附加的示例性治疗方案需要约每两周施用一次或约每月施用一次或约每3至6个月施用一次。示例性的给药方案包括连续几天约1mg/kg至约10mg/kg或约15mg/kg、每隔一天约30mg/kg、或每周约60mg/kg。
干扰素相关的抗原结合蛋白、或表达任何这些的核酸序列可以在多种情况下施用。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者体内干扰素相关的抗原结合蛋白及其组分的血液水平所指示的。替代地，干扰素相关的抗原结合蛋白或表达任何这些的核酸序列可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较少的施用频率。剂量和频率因患者体内干扰素相关的抗原结合蛋白的半衰期而异。
如本文所提及的，术语“半衰期”或“t1/2”涉及化合物(诸如本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白)的稳定性和/或排泄率。在实践中，化合物的半衰期通常在血清中测量，并表示施用后血清浓度为施用时间时血清浓度的50％的时间。本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白的特征在于在小鼠中具有长的血清半衰期。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的半衰期为至少50小时、至少60小时、至少70小时、至少80小时、至少90小时或至少100小时。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的半衰期为至少100小时。在优选的实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白在小鼠体内的半衰期为116小时至158小时。
蛋白的半衰期与其清除率有关。如本文中使用的，术语“清除率(clearance)”或“清除率(clearance rate)”是指每单位时间清除蛋白的血浆体积。本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率低。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率低于10mL/h/kg、低于5mL/h/kg、低于2.5mL/h/kg、低于1mL/h/kg、或低于0.5mL/h/kg。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率低于5mL/h/kg。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率低于1mL/h/kg。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白在小鼠体内的清除率在0.28mL/h/kg至0.49mL/h/kg的范围内。
如本文使用的，术语“分布容积”、“VD”、“VSS”或“表观分布容积”，是指在与血浆中观察到的浓度相同的浓度下，含有施用的化合物(如本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白)总量所需的理论体积，并且涉及所述化合物在口服或肠胃外给药后在血浆和身体其他部分之间的分布。在某些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的分布容积(Vss)低于500mL/kg、低于400mL/kg、低于300mL/kg、低于200mL/kg、或低于100mL/kg。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的分布容积(Vss)低于100mL/kg。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白在小鼠体内的分布容积(Vss)在50mL/kg至98mL/kg的范围内。
另一个相关的药代动力学参数是全身暴露量。如本文使用的，术语“全身暴露量”、“AUC”或“曲线下面积”是指浓度-时间曲线的积分。全身暴露量可通过血浆(血清或血液)浓度或母体化合物和/或代谢产物的AUC来表示。本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白以比其亲本抗体更高的全身暴露量(AUC(0-inf))在血液中循环。在一些实施方式中，亲本抗体是CP870,893。在其他实施方式中，亲本抗体是3G5。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白的全身暴露量为至少600μg*h/mL、至少700μg*h/mL、至少800μg*h/mL、至少900μg*h/mL、或至少1000μg*h/mL，优选为至少1000μg*h/mL。在一些实施方式中，干扰素相关的抗原结合蛋白在小鼠体内的全身暴露量在1033μg*h/mL至1793μg*h/mL的范围内。
如前所述，本发明的干扰素相关的抗原结合蛋白可以以药学上有效量施用，用于哺乳动物病症的体内治疗。在这方面，应当理解，如所公开的，干扰素相关的抗原结合蛋白将被配制成便于施用并促进活性剂的稳定性。
根据本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的无毒无菌载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。干扰素相关的抗原结合蛋白的药学上有效量通常是足以介导以下一种或多种的量：减少冠状病毒诱导的细胞凋亡，特别是SARS-CoV-2诱导的细胞凋亡；以及在受感染的细胞中刺激IFN信号传导通路。当然，本发明的药物组合物可以以单剂量或多剂量施用，以提供药学上有效量的干扰素相关的抗原结合蛋白。
根据本发明的范围，干扰素相关的抗原结合蛋白或表达它们中任一种的核酸序列可以根据上述治疗方法以足以产生治疗效果的量施用到人或其他动物。干扰素相关的抗原结合蛋白或表达它们中任一种的核酸序列可以以常规剂型施用到这种人或其他动物，该常规剂型是根据已知技术通过将干扰素相关的抗原结合蛋白或表达它们中任一种的核酸序列与常规的药学上可接受的载体或稀释剂组合而制备的。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由其将与之结合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量决定。本领域技术人员将进一步理解，本发明中描述的包含一种或多种干扰素相关的抗原结合蛋白或表达它们中任一种的核酸序列的混合物可能被证明是有效的。
应当理解，本发明中描述的方法不限于本文公开的特定方法和实验条件，因为这种方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在进行限制。
此外，除非另有说明，否则本文描述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。这些技术对于技术工人来说是众所周知的，并且在文献中有充分的解释。参见例如，Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)(包括所有副刊)，MR Green的MolecularCloning:A Laboratory Manual(第四版)和J.Sambrook and Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor(2013，第二版)。
除非另有定义，否则本文中使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何词典或外在定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，以及复数术语应包括单数。除非另有说明，否则使用“或”是指“和/或”。术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”的使用应包括术语“由...组成(“consisting of)”。
通常，结合本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法是本领域众所周知的和通常使用的。除非另有说明，否则本文提供的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法执行，并且如在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的那样。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域中通常完成的或如本文描述的。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及药物和药学化学相关的命名法以及它们的实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者治疗。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。本文提及或引用的文章、专利和专利申请的内容，以及所有其他文件和电子可用信息，均通过引用以其全部内容并入本文，其程度与每一份单独的出版物被明确和单独地表示通过引用并入相同。申请人保留将任何这种文章、专利、专利申请或其他实体和电子文件中的任何和所有材料和信息实际并入本申请的权利。
虽然已经参照本发明的具体实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下，可以使用本公开作为指南来进行各种改变并且可以替换等价物。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参考以下实施例将更清楚地理解这些实施方式，这些实施方式仅出于说明的目的而被包括，并且不旨在是限制性的。
实施例
实施例I
基于激动性抗CD40抗体CP870,893的干扰素融合的抗体(IFA)的产生及其在报告 细胞上的表征
I.a-IFA设计
表7和表9中列出了用CP870,893激动性抗CD40抗体作为骨架抗体设计的示例性IFA的序列组合、IFN的定位和接头的性质。如表7所示，IFN通过接头在轻链(LC)或重链(HC)的N-或C-末端部分处融合。用优化的哺乳动物表达密码子合成编码HC、LC或融合体的核酸，并将其克隆到真核表达载体如pcDNA3.1(Invitrogen)中。图2A描绘了在pCMV启动子控制下编码Seq ID NO 32的pcDNA3.1质粒的示例性图谱。
I.b-IFA生产
将Freestyle 293-F细胞(Invitrogen)与以4/6的HC/LC比率编码HC和LC的质粒瞬时共转染。转染后6天，收集上清液，离心并通过0.22μm过滤器过滤。纯化过程在AktaExpress色谱系统(GE Healthcare)上使用蛋白A MabSelect Sure 5mL 1.6/2.5cm柱(GE Healthcare)以流速为5mL/min在两个纯化步骤中进行。样品结合在D-PBS1X pH 7.5缓冲液中进行，并用甘氨酸/HCl 0.1M pH 3.0缓冲液洗脱。将洗脱峰储存在回路中，然后在D-PBS1XpH 7.5缓冲液中以10mL/min的流速注入HiTrap脱盐26/10柱(GE Healthcare)上。在96孔微孔板(2mL级分)上收集洗脱峰。根据UV峰曲线进行池化。在0.22μm过滤器(SartoriusMiniSart)上过滤后，进行质量控制，包括细菌内毒素测试(Bacterial Endotoxins)(使用nexgen-PTSTM(Charles River))、尺寸排阻色谱法(使用SEC 200Increase 10/300柱(GE Healthcare)在还原和非还原条件下在MESSDS运行缓冲液中的NuPAGE凝胶系统(Invitrogen)上测定纯度和低聚物以及SDS-PAGE)。生产产率如表9所示。对于一些IFA，生产产率非常低。在这种情况下，使用含有IFA的上清液直接评估激动性CD40活性和IFN活性，而无需任何进一步纯化。
纯化的IFA的还原SDS-PAGE分析表明存在对应于HC和LC的两个主要条带。当IFN(无论IFN家族成员如何)与HC融合时，观察到其分子量的变化，并且对于与任何IFN融合的LC也观察到相同的现象(图2B)。
I.c-报告细胞的IFA表征
HEK-BlueTMCD40L细胞(InvivoGen Cat.#：hkb-cd40)或HEK-BlueTM IFN-α/β细胞(InvivoGen,Cat.#:hkb-ifnαβ)分别用于监测CD40激动剂对NFκB通路的激活或I型-IFN诱导的IFN通路的激活。
HEK-BlueTMCD40L细胞通过用人CD40基因和NFκB诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)构建体(Invivogen)稳定转染HEK293细胞来产生HEK-BlueTMCD40L细胞以测量CD40激动剂的生物活性。CD40的刺激导致NFκB诱导，然后产生SEAP，该SEAP使用QUANTI-BlueTM(Invivogen,Cat.#rep-qbs2)在上清液中检测到。
HEK-BlueTMIFN-细胞被设计为监测由I型-IFN诱导的JAK/STAT/ISGF3通路的激活。该通路的激活诱导SEAP的产生和释放。使用QUANTI-BlueTM可以很容易地评估上清液中SEAP的水平。
HEK-BlueTMIFN-α/β用于监测人IFN-α或IFN-β的活性。
将细胞接种在96孔板中(每个孔50,000个细胞)，并且对于每个IFA或对照用指示浓度刺激，以及在37℃下孵育24小时。然后收集上清液，并且在用QuantiBlueTM孵育上清液约30分钟以及在Ensight酶标仪或PheraStar(Lab Biotech)上在620nm处的光密度(O.D.)评估后对SEAP水平进行定量。
HEK-BlueTM双重IFN-γ细胞(InvivoGen,Cat.#:hkb-ifng)、HEK-BlueTM IFN-λ(InvivoGen,Cat.#:hkb-ifnl)可用于分别监测II型和III型IFN的活性。HEK-BlueTMIFN-λ细胞被设计用于监测IFNλ的活性。HEK-BlueTM双重IFN-γ细胞允许检测生物活性人IFNγ。
I.d-基于IFNα/β的IFA对报告细胞的功能活性
图3示出了IFA的剂量反应的实例，其中表7中规定的IFNβ或其突变体与表7中所示的HC融合，在HEK-BlueTMCD40L细胞上(图3A-3B)和在HEK-BlueTMIFN-α/β细胞上(图3C-3D)。IFA的激动性抗CD40活性总结在表9中，实例如图3A和图3B所示。结果表明，所有测试的IFA都能以剂量依赖性方式激活CD40通路和IFN-α/β通路。对于融合到HC或LC的C末端，激动性CD40的EC50值在11.1ng/mL至192ng/mL的范围内(表9)。在图3所示的实验中，亲本抗体的平均EC50值为48ng/mL和57ng/mL。与HC或LC的N末端融合的IFN的IFA也能够激活CD40通路，但这些IFA的精确EC50值无法确定，因为活性是从上清液中直接测定的，而不是使用纯化的蛋白(图3B)。
表9中总结了各种IFA的IFN活性，并且图3C至3D示出了实例。对于将IFNβ或突变的IFNβ(如表7所示)融合到HC或LC的C末端，IFN活性根据接头序列而变化，EC50值范围为0.14ng/mL至4.5ng/mL(图3C和表9)。图3D示出了IFNβ与N-末端部分融合的IFA表现出高IFN活性。用作阴性对照的亲本抗体没有显示出任何活性，而重组IFNβ确实显示出强烈的剂量依赖性反应。总之，这些结果表明，表7中指出的IFNβ或其突变体与抗体的融合，无论定位如何，都保持了两种生物功能，尽管在效力方面存在差异。
图4示出了在IFNα与如表7指示的HC或LC融合的情况下IFA剂量反应的实例，在HEK-BlueTMCD40L细胞上(图4A和图4C)和HEK-BlueTMIFN-α/β细胞上(图4B和图4D)。结果表明，所有测试的IFA都能以剂量依赖性方式激活CD40通路和IFNα/β通路。令人惊讶的是，对于所有基于IFNα的IFA，它们在CD40通路上的效力可再现地高于亲本抗体的效力。基于IFNα的IFA的EC50值在11.1ng/mL至22.7ng/mL的范围内，CP870,893的EC50在30ng/mL至80ng/mL的范围内(平均EC50值：48ng/mL)。
IFA的IFN活性根据接头序列而变化，其中EC50值在1.6ng/mL至5.1ng/mL的范围内。在相同的测定中，聚乙二醇化的IFNα2a也具有剂量依赖性活性，EC50值为约1ng/mL。
I.e–不含Fc区的IFA的产生和表征
根据本发明的合适构建体也可以是不具有Fc区的干扰素相关的抗原结合蛋白。设计了编码与TEV-His标签融合的CP870,893的fab片段的重链的构建体(SEQ ID NO 50)，并将其克隆到表达质粒pcDNA3.1中。如前面所述，该构建体在HEK细胞中共转染，其中LC通过不同的接头融合到不同的IFN，例如SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 34、SEQ IDNO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42、或SEQ ID NO 43。在报告细胞中评估蛋白和/或上清液。本领域技术人员将理解，用于疗法的构建体将不再含有TEV-His标签。这些构建体同样是本发明的实施方式。没有Fc部分的干扰素相关的抗原结合蛋白将对冠状病毒感染具有活性。然后制备两种IFA，并且它们的功能表征在实施例V中描述：IFA50：(SEQ ID NO 41)+(SEQ ID NO 50)和IFA51：(SEQ ID NO 42)+(SEQ ID NO 50)。
实施例II
IFA对SARS-CoV-2感染细胞的影响
II.a–细胞培养
从非洲绿猴肾(African green monkey kidney)-来源的细胞系CCL81中提取的Vero E6细胞获得自ElabScience(cat#EP-CL-0491)。将贴壁细胞系维持在补充有10％胎牛血清(FBS；Gibco,Carlsbad,CA,USA)的杜氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)(DMEM；Gibco cat#21885-025,Carlsbad,CA,USA)中。将细胞在含5％CO2的潮湿气氛中于37℃下培养。
II.b–病毒分离株
实验中使用的以下SARS-CoV-2菌株来自BEI资源：
分离株USA-WA1/2020(NR-52281)
分离株德国/BavPat1/2020(NR-52370)
分离株hCoV-19/南非/KRISP-EC-K005325/2020(NR-54009)
分离株USA/CA_CDC_5574/2020(NR-54011)
分离株hCoV-19/英国/204820464/2020(NR-54000)
分离株hCoV-19/南非/KRISP-EC-K005321/2020(NR-54008)
分离株hCoV-19/日本/TY7-503/2021(NR-57982)
分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(NR-55611)
分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(NR-56461)
II.c–对照IFA的序列
表C.基于同种型对照Evi5的对照干扰素相关的抗原结合蛋白的序列。
斜体序列对应于信号肽。粗体非斜体序列对应于接头。
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表D.在基于同种型对照Evi5的对照干扰素融合的抗原结合蛋白中发现的多肽组合(＝(SEQ ID NO 89)+(SEQ ID NO 90)；包括两次的序列组合)。所指示的每个序列组合在各自的IFA中被包括两次。
II.d-血细胞计数分析：CD40染色
在FcR阻断抗体(Miltenyi 130-059-901)存在下，将Vero E6细胞(1.106个细胞/孔)在4℃下重悬在PEB缓冲液中15分钟。在4℃下以1500rpm离心2分钟后，将细胞单独或在同种型抗体(Miltenyi 130-113-438)或抗-CD40-APCVio770抗体(Miltenyi,130-123-395)存在下重悬于100μl缓冲液中，并在4℃下孵育30分钟。然后，将细胞离心、洗涤，在4℃下用4％的PFA固定10分钟。离心和洗涤后，将孔重悬于PEB缓冲液中，并在MACSQuant16细胞计数器上进行分析。
II.e-细胞活力测定CellTiter-Glo
根据制造商的说明(Promega，目录号：G7570)，对每个样品进行CellTiter-Glo发光细胞活力测定(CTG)。简言之，将细胞一式三份在96孔板中铺板，并在37℃、5％CO2下孵育。接种后24小时，将细胞以0.05的感染复数(MOI)(伽马和奥密克戎变体除外，MOI分别为0.5和0.1)感染1小时，用PBS洗涤一次，然后用瑞德西韦(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA；Wang(2020)Cell Res.30:2-71)治疗或用指示浓度的测试物(test item)治疗。对于治疗前程序(图5F和5G，图5F之二和图5G之二)，细胞用瑞德西韦或用指定浓度的测试物在37℃下治疗1小时，用PBS洗涤一次，并在37℃、5％CO2下以0.05的MOI感染72小时。对于中和测定，将病毒以0.05的MOI与指定浓度的S309(Pinto(2020)Nature Jul；583(7815):290-295)在37℃下混合1小时，以使抗体与病毒的刺突蛋白结合。然后用混合病毒/抗体感染细胞，并在37℃、5％CO2下孵育72小时。对于上述所有程序，在感染后72小时，细胞用PBS洗涤一次，并用CellTiter-Glo试剂孵育10分钟，并且使用96孔酶标仪(GloMax-96微孔板光度计；Promega)在微孔板读取器(Perkin Elmer Ensight)中以每孔0.1秒的积分时间测量发光。在没有细胞的培养基中测量背景发光，并从实验值中减去。
II.f-SARS-CoV-2感染模型验证(利用CTG测定)
为了验证感染模型，使用中和抗体和聚合酶抑制剂瑞德西韦进行了两个实验。对于中和测定，在细胞感染前将中和抗体S309和病毒(分离株USA-WA1/2020)预孵育1小时，并在感染后3天评估细胞活力。图5A示出了S309以858ng/mL的EC50有效中和了SARS-CoV-2。
瑞德西韦的效果也通过在感染后一小时内用增加剂量范围的测试产品处理细胞72小时的时间来评估。结果表明，瑞德西韦能够以剂量-反应方式抑制病毒复制和病毒诱导的细胞病变效应，EC50为1.341μM(图5B)。
II.g.1-IFA 27对SARS-CoV-2感染的影响(利用CTG测定)
我们发现Vero E6细胞在其细胞表面上表达CD40(图5C)。因此，在两个实验设计中，与瑞德西韦相比，评估了IFA27对SARS-CoV-2感染的影响。在用SARS-CoV-2感染后1小时，用剂量范围的IFA27或瑞德西韦处理细胞(图5D和5E)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。结果表明，IFA27以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2-诱导的细胞病变效应中挽救Vero E6，EC50为8.10-5μM(图5D)。在同一实验中，瑞德西韦的EC50大于1μM(图5E)。在第二实验环境中，细胞用IFA27或瑞德西韦预孵育1小时，用PBS洗涤，并在37℃下以0.05的MOI感染72小时。通过CTG方法评估细胞活力。结果表明，用IFA27的短期治疗(图5F)能够从SARS-CoV-2诱导的细胞凋亡中挽救Vero E6细胞，而用瑞德西韦不行(图5G)。尽管治疗持续时间较短，但EC50为3.45.10-4μM(图5F)。
II.g.2.-IFA 25对SARS-CoV-2感染的影响(利用CTG测定)
在两个实验设计中，与瑞德西韦相比，评估了IFA25对SARS-CoV-2感染的影响。在用SARS-CoV-2感染后1小时，用剂量范围的IFA25或瑞德西韦处理细胞(图5D之二和5E之二)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。结果表明，IFA25以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2-诱导的细胞病变效应中挽救Vero E6，EC50为2.231x10-5μM(图5D之二)。在同一实验中，瑞德西韦的EC50为1.756μM(图5E之二)。在第二实验环境中，细胞用IFA25或瑞德西韦预孵育1小时，用PBS洗涤，并在37℃下以0.05的MOI感染72小时。通过CTG方法评估细胞活力。结果表明，用IFA25的短期治疗(图5F之二)能够从SARS-CoV-2诱导的细胞凋亡中挽救Vero E6细胞，而瑞德西韦不行(图5G之二)。尽管治疗持续时间较短，但IFA25的EC50为4.813x 10-5μM。当在感染步骤之前或之后应用IFA25时，IFA25的这种抗病毒作用表明，在临床情况下，它可以保护感染细胞和存在于感染部位周围的未感染细胞。因此，这些结果支持了本发明的构建体不仅治疗而且预防冠状病毒感染的能力。对周围未感染细胞的保护作用进一步使治疗特别有效。
II.h-与对照IFA、CP870,893和Pegasys)相比，IFA25、IFA27对SARS-CoV-2感染的影响(利用CTG测定法)
然后，我们评估了IFA27与亲本抗体(CP870,893)或与对照IFA(IFA201)相比的效果，其中IFNA2A通过相同的(G4S)4接头与对照抗体(没有CD40激动活性)融合。细胞在感染后1小时治疗，并且3天后通过CTG评估细胞活力。结果表明，CP870,893本身对SARS-CoV-2-诱导的细胞凋亡没有任何作用。由于IFNA2A的存在，对照IFA表现出剂量效应活性，但在从SARS-CoV-2-诱导的细胞凋亡中挽救Vero E6方面，IFA27的效力比对照IFA高100多倍(图5H)。
与IFA27相比，IFA25表现出非常相似的活性，并且与其对照IFA(IFA202)或相比具有高效力(图5I)。
然后，我们评估了IFA25与亲本抗体(CP870,893)或与对照IFA(IFA202)相比的效果，其中IFNA2A通过相同的(G4S)2接头与对照抗体(EVI5，没有CD40激动活性)融合。细胞在感染后1小时治疗，并且3天后通过CTG评估细胞活力。结果表明，CP870,893本身对保护SARS-CoV-2-诱导的细胞凋亡没有强效作用。由于IFNA2A的存在，对照IFA202表现出剂量效应活性，但在从SARS-CoV-2-诱导的细胞凋亡中挽救Vero E6细胞方面，IFA25的效力比对照IFA高。有趣的是，与CP870,893和IFA202组合相比，单独或与同种型EVI5组合的IFA25(具有与CP870,893和IFA202组合相同的抗体载量)也更有效，从而证明了在同一分子内同时具有CD40和IFN功能的益处(图5I之二)。
II.i-IFA25对SARS-CoV-2分离株的影响(利用CTG测定)
用不同的分离株感染Vero E6细胞，并用IFA25治疗3天。结果表明，不考虑分离株，IFA25在防止细胞在SARS-CoV-2感染后死亡方面是非常有效的，EC50为约10-6μM，这表明它在任何SARS-CoV-2变体或在甚至任何冠状病毒上都有潜在的广泛用途(图5J-5O)。
在图5P至5R中，对其他分离株的额外结果表明，同样采用这些分离株，IFA25在防止细胞在SARS-CoV-2感染后死亡方面非常有效，EC50为约10-5μM。
在所有这些实验中(图5J-5R)，应用相同的方案，并将包括用于治疗COVID19的直接作用抗病毒药物瑞德西韦(RDV)作为比较物。为了比较IFA25和瑞德西韦的疗效，评估Log10绝对EC50(Log绝对EC50)，并在表14中报告。在所有测试条件下，IFA25保护VeroE6细胞免于死亡的效力优于RDV。此外，使用在SARS-CoV-2谱系上的配对的治疗比较的Log绝对EC50进行配对t检验，IFA25被发现与RDV显著不同(表14)，p值为p<0.001。这表明IFA25在任何SARS-CoV-2变体或甚至在任何冠状病毒上都有潜在的广泛用途。
II.j-IFA126对SARS-CoV-2分离株的影响(利用CTG测定)
IFA126对SARS-CoV-2感染的影响是在剂量范围内，在治疗后设计实验中，针对3种主要变体进行评估的：分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)、分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(德尔塔变体，MOI 0.05)和分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI0.1)(图5S至5U)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。
IFA126以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救VeroE6细胞，对USA-WA1/2020分离株的EC50为9.5x 10-6μM(图5S)，对德尔塔变体的EC50为1.445x10-5μM(图5T)，以及对奥密克戎变体的EC50为2.72x 10-5μM(图5U)。
II.k-实时细胞分析系统(RTCA x CELLigence；Nat Med.2020 Sep；26(9):1422-1427)
RTCA仪器使用的微孔板包含集成在每个孔底部的金生物传感器。金生物传感器上贴壁细胞的存在阻碍了电流流动，并且阻抗的大小取决于细胞数量、细胞尺寸、细胞-基质附着质量和细胞-细胞粘附(屏障功能)。当用病毒感染时，宿主细胞通常表现出显微镜下可见的变化，统称为细胞病变效应(CPE)。CPE可以包括细胞收缩或增大、退化/裂解、细胞融合和/或包涵体的形成。通过细胞病变效应(CPE)的连续体进行的感染细胞在阻碍电流流动方面变得越来越不有效。通过连续测量这些变化，RTCA详细跟踪病毒CPE并产生定量动力学。根据制造商的说明，研究中使用的设备和软件分别为xCELLigence RTCA SP(Agilent)和RTCA软件2.0(Agilent)。对每个样品进行RTCA，如下所述。简言之，将细胞一式三份接种在96孔E板(Agilent,cat#5232368001)中，并在37℃、5％ CO2下孵育。接种后24小时，将板放入位于37℃、5％CO2孵化器中的xCELLigence站，并且按如下方式记录每个孔中的电流：每隔1分钟连续读61次，每隔15分钟连续读100次和每隔1小时连续读200次。电阻抗(称为细胞指数(CI)，图6)监测1小时以评估细胞单层的背景。然后将细胞以0.05的MOI感染1小时，用PBS洗涤一次，然后用或用指示浓度的测试物治疗。连续监测细胞指数55小时。使用软件GraphPad Prism 8对数据进行分析。对于图6D、图6F和图6H，CI归一化为如下：100％对应于非感染病况(NI)记录的最高CI(在25小时)，并且0％对应于所有细胞凋亡时在55小时获得的CI。为了确定图6E、图6G和图6I中的EC50，使用4PL非线性回归分析绘制了45小时时间点下测试物的每个浓度的数据。
II.l-使用实时细胞分析系统验证感染模型
xCELLigence系统用于实时评估IFA对用SARS-CoV-2感染Vero E6细胞后细胞凋亡的影响。我们首先评估了病毒浓度对病毒诱导的细胞病变效应(在此表示为细胞指数)的影响。细胞保持未感染或用不同数量的SARS-CoV-2噬菌斑形成单位(PFU)感染75小时。结果表明，细胞指数和PFU数量之间具有良好的相关性(图6A)。然后，我们证实中和抗体S309能够预防由SARS-CoV-2诱导的细胞凋亡(图6B)，并且瑞德西韦也能够以剂量依赖性的方式预防Vero E6细胞中的SARS-CoV-2-诱导的细胞病变效应(图6C)。
II.m-使用实时细胞分析系统监测IFA25对SARS-CoV-2感染的影响
在用SARS-CoV-2感染的Vero-E6细胞上监测IFA25与和与相关对照IFA相比的实时作用。结果表明，IFA25与/>或与对照IFA(IFA202)相比的强效作用，从而确认了先前使用CTG测定的结果，EC50为4.4.10-7μM(图6D-E)。
实施例III
细胞因子释放
III.a-人全血细胞的细胞因子释放评估(CRA)
全血细胞(WBC)离体刺激测定用于研究IFA刺激后细胞因子的释放。从四名健康供体中收集WBC，在RPMI1640(72400-021，Gibco)中稀释1/3，并分布在无菌反应管(300μl)中。使细胞不受刺激，用10ng/mL的LPS(LipoPolySaccharide)K12(tlrl-eklps，Invivogen)作为阳性对照或用1μg/mL的IFA刺激，并在37℃下孵育24小时。然后收集上清液并在-20℃下冷冻直至分析当天。
使用多重MSD测定法(K15067L-4)分析人促炎细胞因子，该多重MSD测定法测量肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12/IL-23p40和IFNγ。在1300MESO QuickPlex SQ120仪器(MSD)上分析MSD板。
图7描绘了未刺激、用LPS或用IFA1治疗的人WBC的体外细胞因子释放评估的示例性结果。
表11a和11b总结了来自测试基于IFNβ-/基于突变的IFNβ-和基于IFNα的IFA的进一步结果。结果表明，对于所有供体，LPS诱导非常高水平的炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12p40和IFNγ)。它还诱导了作为IFN通路的生物标志物的IP10(CXCL10)和中等水平的IL-10。测试了两种基于IFNβ-(表11a)和六种基于IFNα-(表11b)的IFA。所有这些都诱导了生物标志物IP10。然而，它们没有诱导IL-10、IL-1β和IL-2，并且它们仅诱导非常低到中等水平的IFNγ、IL-6和TNF-α，因此表明在诱导炎性细胞因子方面具有良好的安全性能。
实施例IV
药代动力学研究
IV.a-用于IFA定量的ELISA测定法的开发
对于ELISA定量，96孔板(板96孔Maxisorp，THERMO Scientifique；442404)在4C下用100μl重组人CD40/TNFRSF5 Fc嵌合体蛋白包被过夜，该蛋白由以0.5μg/mL融合到人IgG1的Fc部分的人CD40的胞外结构域(CD40-Fc；R&D Systems；1493-CDB-050)(在碳酸钠中(0.05M，pH 9.6，C-3041，Sigma))组成。翻转排空后，然后将平板在37C下用PBS-0.05％吐温20-1％牛奶(SIGMA；70166-500g)孵育1小时，然后用PBS-0.05％吐温20洗涤。然后将样品和对照(100μl的1/2连续稀释液)在37C下孵育90分钟，然后洗涤三次(PBS-0.05％吐温20)，并且在PBS-0.05％吐温20-1％牛奶中与二级抗IgG2缀合物HRP(1/5000，ab99779，Abcam)抗体或抗IFNα缀合物HRP(1/1000，eBIOSCIENCE/Invitrogen；BMS216MST)一起孵育。用PBS洗涤三次后，加入0.05％吐温2、TMB(四甲基联苯胺，Tebu Bio；TMBW-1000-01)，并将板在黑暗中孵育20分钟。通过加入1M HCl来停止反应。用Ensight酶标仪(Perkin Elmer)在450-650nm下读取平板。使用类似的方案步骤但使用来自eBioscience/Invitrogen的人IFNα匹配的抗体对Pegasys的定量进行评估。使用以1μg/mL的100μL的人抗IFNα抗体(eBioscience/Invitrogen；BMS216MST)(在碳酸钠中(0.05M，pH 9.6，C-3041，Sigma))进行捕获。为了检测，应用PBS-0.05％吐温20-1％牛奶中的二级抗IFNα缀合物HRP抗体(1/1000，AffymetrixeBioscience/BMS216MST；15501707)。
IV.b-小鼠体内生物利用度
为了测定PK参数，将0.5mg/kg的CP870,893、IFA25、IFA26、IFA27、IFA28、IFA29和IFA30和0.3mg/kg的Pegasys静脉推注给雄性CD1瑞士小鼠，并在不同时间点采集血样。使用上述ELISA方法并用抗-IFNα缀合的HRP揭示的循环分子定量的实例如图8A和图8B所示，而用抗-IgG2缀合的HRP揭示的定量的实例如图8C所示；Pegasys定量如图8D所示。在表12A中总结的一组实验中，在7天实验中探索了CP870,893的PK参数，并在10天实验中探索了IFA27、IFA29和IFA30的PK参数(使用2种不同的ELISA方法进行IFA27定量)。在表12B中总结的另一组实验中，在21天实验中探索了CP870,893和IFA25、IFA26、IFA28和Pegasys的PK参数(使用2种不同的ELISA方法进行IFA25定量)。
在短暂的分布阶段后，IFA的药代动力学曲线的特征是血清半衰期长达116小时至218小时(表12A和表12B)。即使在单剂量施用10天后，6种循环水平高的测试IFA也获得了非常相似的PK曲线。表12A/B中总结的药代动力学参数表明，这些IFA在血液中的循环令人惊奇地具有对于IFA的更高全身暴露量(AUC(0-inf))，范围为1033μg.h/mL至2552μg.h/mL，这与对于亲本抗体CP870,893相比(高达3.2倍)(分别为590μg.h/mL或797μg.h/mL)，这也反映出IFA的清除值较低。分布容积Vss较低，并且排名为50mL/kg至105mL/kg，这略高于该物种的血浆血管容积(50mL/kg)。对于所有IFA，清除率都排名很低(0.28mL/h/kg至0.49mL/h/kg)。有趣的是，Pegasys(1.4mL/hr/kg)比IFA的清除率(例如，IFA27为0.2mL/hr/kg)高至多7倍，表明IFA的全身暴露量更高。
实施例V
V.a-报告细胞上不含Fc区的IFA的功能活性
为了确定IFA的Fc部分对于活性是否需要，设计并生产了IFNα与LC的C末端部分(该部分与HC的Fab片段结合)的融合。用(G4S)2(IFA50)或(G4S)3(IFA51)接头将IFNα与LC部分连接。
对HEK-BlueTMCD40L细胞的评估表明，这种IFA仍然表现出激动性CD40活性(图9A)，并激活CD40通路，EC50值分别为约128ng/ml(IFA 50)和123ng/ml(IFA51)。
对HEK-BlueTMIFN-α/β细胞上的IFN活性评估显示两种测试的IFA都表现出IFN活性(图9B)。表9B中报告了EC50值，并且IFA50为约1.36ng/ml，IFA51为约1.43ng/ml。
V.b-基于IFNε的IFA对报告细胞和SARS-CoV-2感染的细胞的功能活性
也已设计和生产了CP870,893与第三种I型干扰素(IFN艾普西隆；IFNε)的融合。这些IFA在HEK-BlueTMCD40L细胞上进行了测试，并且可以证明它们维持了激动性CD40活性。一个这种IFA(IFA49)的结果如图10A所示。对HEK-BlueTMhIFN-α/β细胞(它们实际上被任何I型干扰素激活)的评估表明IFA49也能够激活IFN-I通路(图10B)。EC50值在表9B中报告。
这些结果表明，具有IFNε的IFA维持了IFN和激动性CD40活性(即，是双功能的)。
IFA49对SARS-CoV-2感染的影响是在剂量范围内，在治疗后设计实验中，针对3种主要变体进行评估的：分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)、分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(德尔塔变体，MOI 0.05)和分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0,1)(图10C至10E)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。
IFA49以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救VeroE6细胞，对USA-WA1/2020分离株的EC50为6.565x10-4μM(图10C)，对德尔塔变体的EC50为5.45x10-4μM(图10D)，和对奥密克戎变体的EC50为1.517x10-3(图10E)。
V.c-基于IFNω的IFA对报告细胞和SARS-CoV-2感染的细胞的功能活性
也已设计和生产了CP870,893与第四种I型干扰素(IFN欧米茄；IFNω)的融合。这些IFA在HEK-BlueTMCD40L细胞上进行了测试，并且结果可以表明它们维持了激动性CD40活性。一个这种IFA(IFA46)的结果如图11A所示。对HEK-BlueTMhIFN-α/β细胞(它们实际上被任何I型干扰素激活)的评估表明IFA46也能够激活IFN-I通路(图11B)。EC50值在表9B中报告。
这些结果表明，具有IFNω的IFA维持了IFN和激动性CD40活性(即，是双功能的)。
IFA46对SARS-CoV-2感染的影响是在剂量范围内，在治疗后设计实验中，针对3种主要变体进行评估的：分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)、分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(德尔塔变体，MOI 0.05)和分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0,1)(图11C至11E)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。
IFA46以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救VeroE6细胞，在最高浓度下实现了100％挽救USA-WA1/2020分离株感染的Vero E6细胞(图11C)，对德尔塔菌株的EC50为8.395x10-4μM(图11D)并且对奥密克戎菌株的EC50为2.111x10-5μM(图11E)。
V.d-基于IFNγ的IFA对报告细胞和SARS-CoV-2感染的细胞的功能活性
也已设计和生产了CP870,893与II型干扰素(IFN伽马；IFNγ)的融合。在HEK-BlueTMCD40L细胞上对这些IFA的评估表明，无论IFNγ是否与LC(IFA42)或HC(IFA43)的C末端部分连接，它们都保持了激动性CD40活性(图12A)。在HEK-BlueTM-IFNγ细胞上对这些IFA的评估(图12B)显示它们也能够激活IFNγ-通路。IFNγ活性在IFA42(EC50：15ng/ml)和IFA43(EC50：<0.01ng/ml)之间有一定差异。EC50值在表9B中报告。
总体来看，这些结果表明，具有IFNγ的IFA维持了IFN和激动性CD40活性(即，是双功能的)。
IFA42和IFA43对SARS-CoV-2感染的影响是在剂量范围内，在治疗后设计实验中，针对3种主要变体进行评估的：分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)、分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(德尔塔变体，MOI 0.05)和分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0.1)(图12C至12H)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。
结果表明，IFA42以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救Vero E6细胞，对USA-WA1/2020分离株的EC50为1.195x10-3μM(图12C)，对德尔塔变体的EC50为0.9971x10-3μM(图12D)并且对奥密克戎变体的EC50为0.6351x10-3μM(图12E)。IFA43以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救Vero E6细胞，对USA-WA1/2020分离株的EC50为1.063x10-3μM(图12F)，对德尔塔变体的EC50为1.812x10-4μM(图12G)并且对奥密克戎变体的EC50为7.575x10-5μM(图12H)。
V.e-基于IFNλ的IFA对报告细胞和SARS-CoV-2感染的细胞的功能活性
也已设计和生产了CP870,893与III型干扰素(IFN拉姆达；IFNλ)的融合。在HEK-BlueTMCD40L细胞上对这些IFA进行测试，结果表明无论IFNλ是否与LC(IFA44)或HC(IFA45)的C末端部分连接，它们也保持了激动性CD40活性(图13A)。在HEK-BlueTM-IFNλ细胞上对这些IFA的评估显示它们也能够激活IFNλ-通路(图13B)。EC50值在表9B中报告。这些结果还表明，具有IFNλ的IFA维持了IFN和激动性CD40活性(即，是双功能的)。
IFA44和IFA45对SARS-CoV-2感染的影响是在剂量范围内，在治疗后设计实验中，针对3种主要变体进行评估的：分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)、分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(德尔塔变体，MOI 0.05)和分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI 0,1)(图13C至13H)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。
IFA44以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救VeroE6细胞，在10-1μM浓度下实现大于60％挽救了USA-WA1/2020分离株感染的Vero E6细胞(图13C)，对德尔塔菌株的EC50为1.628x10-2μM(图13D)，并且对奥密克戎变体的EC50为2.132x10-2μM(图13E)。IFA45以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救Vero E6细胞，对USA-WA1/2020分离株的EC50为1.458x10-2μM(图13F)，对德尔塔变体的EC50为6.789x10-3μM(图13G)并且对奥密克戎变体的EC50为2.329x10-2μM(图13H)。
实施例VI
基于抗CD40抗体3G5的干扰素融合抗体(IFA)的产生以及在报告细胞上的表征
VI.a-IFA设计
表8和表10中列出了用3G5抗CD40抗体(Celldex)作为骨架抗体设计的示例性IFA的序列组合、IFN的定位和接头的性质。如表8所示，IFN通过接头在轻链(LC)或重链(HC)的C-末端部分处融合。用优化的哺乳动物表达密码子合成编码HC、LC或融合体的核酸，并将其克隆到真核表达载体如pcDNA3.1(Invitrogen)中。
VI.b-IFA生产
如前面所述进行IFA生产，并且生产产率如表10所示。对于一些IFA，生产产率非常低，主要是IFNβ融合到LC的C末端部分。对于这些IFA，使用含有IFA的上清液直接评估激动性CD40活性和IFN活性，而无需任何进一步纯化。纯化的IFA的还原SDS-PAGE分析表明存在对应于HC和LC的两个主要条带。当IFN与HC融合时，观察到其分子量的变化(图14)。
VI.c-基于IFNα/β的IFA对报告细胞的功能活性
在HEK-BlueTMCD40L(图15A-B和图16A)和HEK-BlueTMIFN-α/β细胞(图15C-D和图16B)上对报告细胞上的3G5 IFA进行表征，如前所述(参见I.c)。
VI.c.1.基于IFNβ的IFA
图15示出了IFA的剂量反应的实例，其中IFNβ与HEK-BlueTMCD40L和HEK-BlueTMIFN-α/β细胞上的3G5的HC或LC融合(图15)。表10中总结的结果表明，所有测试的基于IFNβ的IFA都是功能性的并且能够以剂量依赖性方式激活CD40通路和IFNα/β通路。
CD40活性的实例如图15A和图15B所示。IFNβ与HC的C末端部分的融合显示出高可变的抗CD40活性，并且在所有情况下都低于亲本抗体(EC50值范围为30ng/mL至190.5ng/mL)(图15A和表10)。亲本3G5抗体的平均EC50值为9.3ng/mL。
对于在C末端部分LC上的融合，生产产率非常低，并且在HEK细胞中过表达后使用含有IFA的上清液来评估活性。对HEK-BlueTMCD40L上的这些上清液的评估(图15B)表明这些IFA在CD40通路上具有活性。对于3G5，当上清液稀释300倍时，仍然检测到激动性抗CD40活性。相反，含有IFA的上清液需要1/10的稀释度才能观察到活性(图15B)。
在HEK-BlueTMIFN-α/β细胞上测试IFA的IFN活性并且结果总结在表10中。实例如图15C-D所示。对于在HC的C末端部分的IFNβ的融合，IFN活性是可变的，这取决于接头序列，EC50值范围为0.45ng/mL至10,3ng/mL(图15C)。对于在含有LC的上清液的C末端部分具有IFNβ融合的IFA，即使在上清液稀释10000倍后，仍然检测到IFN活性(图15D)。
VI.c.2.基于IFNα的IFA
图16A-B示出了IFA的剂量反应的实例，其中IFNα与HEK-BlueTM CD40L细胞(图16A)和HEK-BlueTMIFNα/β细胞(图16B)上的3G5的HC融合。
结果表明，所有IFA都以剂量依赖性方式显示CD40通路和IFNα/β通路的功能激活(表10中报告了平均EC50值)。
对于所有基于IFNα的IFA，CD40通路上的效力与亲本抗体相似，平均EC50值范围为11.74ng/mL至14.2ng/mL(图16A和表10)。亲本3G5抗体的平均EC50值为9.3ng/mL。
在HEK-BlueTMIFN-α/β细胞上测试了基于IFNα的IFA的IFN活性，并且表现出非常高的活性。这些IFA的IFN活性的平均EC50值在0.04ng/mL至0.12ng/mL的范围内(图16B和表10)。
VI.c.3.基于IFNγ的IFA
如前所述，对HEK-BlueTMCD40L和HEK-BlueTM-IFNγ细胞上的IFA125的评估(参见I.c)显示IFA 125是功能性的，并且能够激活CD40通路和IFNγ通路(表10B)。
IFA125对SARS-CoV-2感染的影响是在剂量范围内，在治疗后设计实验中，针对3种主要变体进行评估的：分离株USA-WA1/2020(MOI 0.05)、分离株hCoV-19/USA/PHC658/2021(德尔塔变体，MOI 0.05)和分离株hCoV-19/USA/MD-HP20874/2021(奥密克戎变体，MOI0.1)(图16C至16E)。3天后使用CTG测定法评估细胞活力。
IFA125以剂量依赖性方式有效地从SARS-CoV-2诱导的细胞病变效应中挽救VeroE6细胞，以10-4μM浓度100％挽救了USA-WA1/2020分离株感染的Vero E6细胞(图16C)，针对德尔塔变体的EC50为4.283x10-6μM(图16D)，以及针对奥密克戎变体的EC50为7.482x10-6μM(图16E)。
VI.d–不含Fc区的IFA的产生和表征
根据本发明的合适构建体也可以是不具有Fc区的干扰素相关的抗原结合蛋白。设计了编码与TEV-His标签融合的3G5的Fab片段的重链的构建体(SEQ ID NO 65)，并将其克隆到表达质粒pcDNA3.1中。如前所述，该构建体在HEK细胞中共转染，其中LC通过不同的接头与IFN如SEQ ID NO 70或SEQ ID NO 71融合。在报告细胞中评估蛋白和/或上清液和/或它们对冠状病毒感染的细胞的影响。本领域技术人员将理解，用于疗法的构建体将不再含有TEV-His标签。这些构建体同样是本发明的实施方式。没有Fc部分的干扰素相关的抗原结合蛋白将对冠状病毒感染具有活性。
实施例VII
人全血细胞的细胞因子释放测定(CRA)
WBC离体刺激测定法用于研究IFA刺激后细胞因子的释放，如前所述(参见III.a)。IFA109的实例如图17和表13所示。结果表明，所有IFA均诱导CXCL10释放。它们没有诱导IL-10、IL-1β和IL-2，并且它们仅诱导非常低到中等水平的IFNγ、IL-6和TNF-α，因此表明在诱导炎性细胞因子方面具有良好的安全性能。
实施例VIII
IFA对SARS-CoV-2感染的人鼻腔和支气管人气道上皮的影响
VIII.a-人鼻腔和支气管细胞中的CD40和IFNAR RNA表达及血细胞计数分析
通过RT-qPCR分析评估CD40和IFNAR在感染和未感染病况下在气-液界面系统中培养的原代人鼻腔和支气管细胞中的表达。按照制造商建议(SV96全RNA分离系统，cat#Z3505)，从原代人鼻腔和支气管细胞(未感染或感染)中提取全RNA。简言之，SV 96全RNA分离系统结合了硫氰酸胍(GTC)和β-巯基乙醇的破坏性和保护性特性，用于破坏核蛋白复合物并且灭活细胞提取物中存在的核糖核酸酶。
然后将细胞裂解物应用到结合板以将全RNA结合到柱上。将无RNase的DNase I直接应用于二氧化硅膜以消化污染的基因组DNA。通过简单的洗涤步骤从污染盐、蛋白和细胞杂质中进一步纯化结合的全RNA。最后，通过添加无核酸酶的水从膜洗脱全RNA。洗脱后，按照制造商说明(cat#11754050)，首先使用500ng的RNA作为cDNA合成的模板。然后，执行TLDA受体阵列卡(Thermofisher Scientific)以同时量化特异性受体的mRNA水平，包括CD40(Taqman测定Hs00374176)、IFNAR1(Taqman测定Hs01066116)和IFNAR2(Taqman测定Hs00174198)。管家基因的mRNA表达，包括GAPDH(Taqman测定Hs99999905)、GUSB(Taqman测定Hs99999908)、TBP(Taqman测定99999910)和RPLP0(Taqman测定Hs99999902)也包括在测定中，以评估在所有4种测试条件下的潜在mRNA变化，每种受体的Ct值均低于25(图18A)。
CD40和IFNAR的表达也在气-液界面系统中培养的未感染的鼻腔和支气管细胞中通过血细胞计数分析在蛋白水平上得到证实(图18B)。在4℃下在活力标志物Aqua LIVE/DEAD(Invitrogen L34957)存在下，将原代人鼻腔和支气管细胞(0.2x106个细胞/孔)重悬在PBS 1X+2mM EDTA+0.5％BSA+(PEB)缓冲液中30分钟。在4℃下以1300rpm离心3分钟后，在抗-CD40-APC抗体(Miltenyi，130-110-947)或匹配的对照同种型APC(Miltenyi 130-113-434)的存在下，在抗-IFNAR1-APC抗体(Bio-techne SAS，FAB245A)或匹配的对照同种型APC(Bio-techne SAS，IC002A)的存在下，以及在抗-IFNAR2-APC抗体(Miltenyi，130-099-558)或匹配的对照同种型-APC(Miltenyi，130-113-434)的存在下，将细胞重悬于100μl的PEB中。细胞在4℃下孵育30分钟。然后，将细胞离心、洗涤，在4℃下用4％的PFA固定10分钟。离心和洗涤后，将细胞重悬于PEB缓冲液中，在MACSQuant16细胞计数器上采集，并使用Flowjo软件进行分析。
VIII.b-气液界面系统中原代人细胞中的SARS-CoV-2感染模型。
MucilAirTM(Epithelix)是在气液界面培养的人气道上皮的体外细胞模型。在37℃、95％湿度和5％ CO2的专用孵化器中，将即用上皮细胞保存在MucilAirTM培养基(cat#EP05MM)中。在这种MucilAirTM系统中，治疗可以在感染步骤之前、期间或之后进行。对于IFA评估，开发了两种治疗设计，分别命名为治疗后和治疗前，如下所示。
治疗后设计(2次或3次治疗)：在感染当天，用Opti-MEM(cat#31985-062)在尖部面冲洗上皮细胞两次，然后用0.1MOI的SARS-CoV-2分离株USA-WA1/2020感染1小时。然后，细胞用Opti-MEM洗涤两次以去除残留的病毒接种体，并在基底隔室添加补充有感兴趣的治疗物的新鲜MucilAirTM培养基。对于96小时的动力学，在培养基更新期间的48小时施加第二次治疗。对于168小时的动力学，在培养基更新期间的48小时和96小时进行第二次和第三次治疗。根据动力学，在Opti-MEM中收集48小时、96小时和168小时处的尖部冲洗液，用于以下所述的SARS-CoV-2RT-qPCR(nucleospin 96病毒，cat#740691)和TCID50评估。在动力学(96小时或168小时)结束时，用RNA裂解试剂盒(cat#Z3505)裂解上皮细胞，用于细胞内SARS-CoV-2RT-qPCR定量，如下所述。
治疗前设计：感染当天，在感染前3小时，在基底隔室添加补充有感兴趣的治疗物的新鲜MucilAirTM培养基。随后，用Opti-MEM(cat#31985-062)在尖部面冲洗上皮细胞两次，然后用0.1MOI的SARS-CoV-2分离株USA-WA1/2020感染1小时。然后，细胞用Opti-MEM洗涤两次以去除残留的病毒接种体，并且在基底隔室添加没有治疗物的新鲜MucilAirTM培养基48小时。在动力学结束时，在Opti-MEM中收集尖部冲洗液，用于SARS-CoV-2RT-qPCR和TCID50评估，如下文所述。然后，按照制造商关于细胞内SARS-CoV-2RT-qPCR定量的说明，用RNA裂解试剂盒(cat#Z3505)裂解上皮细胞，如下所述。
SARS-CoV-2病毒RNA定量：对于尖部冲洗液中的病毒RNA定量，简言之，按照制造商的说明，用病毒特异性核酸提取试剂盒(nucleospin 96病毒，cat#74061，来自Macherey-Nagel)提取每种病况下100μl的冲洗液。然后，在100μl的无核酸酶的水中洗脱病毒RNA，然后通过RT-qPCR进行定量。对于RT-qPCR定量，将5μl的病毒RNA添加到以下的反应混合物中：TaqMan Fast病毒1步法预混液(TaqMan Fast Virus 1-step Master mix)(#4444434，Thermo Fisher)、SARS-CoV-2 20X Taqman测定液(#4332078，正向引物5’-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3’；反向引物5’-TCTGGTTA CTGCCAGTTGAATCTG-3；探针FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGA CC-MGB-NFQ)和无核酸酶水。在50℃下进行5分钟的初始逆转录步骤以产生cDNA后，在95℃下进行20秒的酶失活步骤。在40个PCR循环中立即扩增PCR产物(在95℃下进行3秒变性步骤，然后在60℃下退火和延伸30秒)。使用在相同条件下扩增的内部参考基因组SARS-CoV-2RNA标准品的10倍连续稀释度计算SARS-CoV-2拷贝数。
对于MucilAirTM组织中的病毒RNA定量，首先使用如上所述的RNA裂解试剂盒(Cat#Z3505)提取RNA。然后，将全RNA在100μl的无核酸酶的水中洗脱以进行RT-qPCR扩增和定量，如上所述。
SARS-CoV-2病毒滴度测定：简言之，对于每种治疗病况，对来自生物复制体的相同体积的尖部冲洗液进行池化，因此代表每组的一个样品。然后，制备这些样品的连续10倍稀释液，并将其应用于铺板的Vero E6细胞1天。CPE在3天后通过CellTiter-Glo测定法进行评估，并用于确定感染终点。使用五个复制体来计算每毫升尖部冲洗液的50％的细胞组织培养感染剂量(TCID/mL)。
VIII.c-IFA25和IFA27对原代人细胞系统中SARS-CoV-2感染的影响
根据实施例VIII.b，我们评估了IFA25和IFA27在气液界面系统中培养并用0.1MOISARS-CoV-2分离株USA-WA1/2020感染的原代人鼻腔和支气管细胞中的影响。首先，在0.1nM和1nM下测试的IFA27显示出减少鼻腔组织(图19A)和鼻腔尖部冲洗液(图19B)中病毒RNA的剂量依赖性作用。此外，最高剂量的IFA27治疗消除了感染性病毒的从头产生，如尖部洗涤液中的TCID50滴度所示(图19C)。在支气管细胞中也观察到抗病毒作用，如组织病毒RNA载量(图20A)和尖部洗涤液病毒RNA载量(图20B)所示。在相同的实验中测试时，直接作用的抗病毒药物瑞德西韦在比IFA27高得多的浓度(1.25μM和5μM)下对病毒RNA载量和感染性病毒滴度显示出剂量依赖性影响。
此外，IFA25在RNA和感染性病毒水平上都表现出抗病毒活性，如鼻腔组织(图21)和支气管组织(图23)中的病毒抑制所示。IFA25的抗病毒作用在1nM的最低测试剂量下实现，而瑞德西韦治疗表现出剂量范围效应，并在远高于IFA25的浓度下实现抑制。此外，IFA25和瑞德西韦在如上所述的治疗前设计中进行了测试。在治疗前设计中，IFA25在鼻腔(图22)和支气管(图24)细胞中对SARS-CoV-2感染保持很高的效力。观察到细胞内隔室中(图22A和图24A)和尖部冲洗液中(图22B和图24B)的病毒RNA载量减少以及鼻腔细胞尖部冲洗液的感染性病毒滴度的降低(图22C)。也观察到瑞德西韦在治疗前设计中对细胞内隔室中(图22A和图24A)和尖部洗涤液中(图22B和图24B)病毒RNA载量的影响，但与治疗后设计相比没有达到相同的水平。此外，治疗前设计中的瑞德西韦对鼻腔细胞尖部冲洗液中的感染性病毒滴度没有产生任何影响(图22C)。
等效物
在不偏离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式来实施。因此，前述实施方式在所有方面都被认为是对本发明的说明而非限制。因此，所要求保护的发明的范围由所附的权利要求而不是由前述描述来指示，并且因此在权利要求的等同含义和范围内的所有变化都旨在包含在本文中。
条款
鉴于以上内容，应当理解，本发明还涉及以下条款：
1.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，包括：
(I)激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段，和
(II)干扰素(IFN)或其功能片段，
用于治疗或预防冠状病毒感染。
2.根据条款1的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)，其与SEQ ID NO 3内的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少90％同一性；和三个重链CDR，其与SEQ ID NO 6内的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少90％同一性；
优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)，其与SEQ ID NO 3内的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少95％同一性；和三个重链CDR，其与SEQ ID NO 6内的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少95％同一性；
更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)，其与SEQ ID NO 3内的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少98％同一性；和三个重链CDR，其与SEQ ID NO 6内的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少98％同一性；
或还更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)，其与SEQ ID NO 3内的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少99％同一性；和三个重链CDR，其与SEQ ID NO 6内的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少99％同一性。
3.根据条款1或2的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)，其与SEQ ID NO 3内的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列相同；和三个重链CDR，其与SEQ ID NO 6内的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列相同。
4.根据条款2或3的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义来定义每个CDR；优选地，其中根据Kabat的CDR定义或Chothia的CDR定义来定义每个CDR。
5.根据条款1的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含：
(I)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少90％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少90％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少90％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少90％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少90％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少90％同一性的CDRL3；
优选地(II)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少95％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少95％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少95％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少95％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少95％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少95％同一性的CDRL3；
更优选地(III)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少98％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少98％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少98％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少98％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少98％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少98％同一性的CDRL3；或
还更优选地(IV)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少99％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少99％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少99％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少99％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少99％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少99％同一性的CDRL3。
6.根据条款1的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含：
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56相同的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQID NO 57相同的CDRH2和与SEQ ID NO 58相同的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52相同的CDRL1、与SEQ ID NO 53相同的CDRL2和与SEQ ID NO 54相同的CDRL3。
7.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO 51所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含SEQ ID NO 55所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；
优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与SEQ ID NO 51中所示的序列具有至少95％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含与SEQ ID NO 55中所示的序列具有至少95％同一性的序列；
更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与SEQ ID NO 51中所示的序列具有至少98％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含与SEQ ID NO 55中所示的序列具有至少98％同一性的序列；
还更优选地，激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与SEQ ID NO 51中所示的序列具有至少99％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含与SEQ ID NO 55中所示的序列具有至少99％同一性的序列；或
最优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO 51中所示的序列；和重链可变区VH，其包含SEQ ID NO 55中所示的序列。
8.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含Fab区重链，该Fab区重链包含SEQ ID NO12中所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
9.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含选自由SEQ ID NO 6、SEQID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的组的序列或与它们具有至少90％同一性的序列；
优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含与SEQ ID NO 3中所示的序列具有至少95％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含与由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的序列组中所示的序列具有至少95％同一性的序列；
更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含与SEQ ID NO 3中所示的序列具有至少98％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含与由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的序列组中所示的序列具有至少98％同一性的序列；
还更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含与SEQ ID NO 3中所示的序列具有至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含与由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的序列组中所示的序列具有至少99％同一性的序列；或
最优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列；和重链(HC)，该重链包含选自由SEQ ID NO 6、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的组的序列。
10.根据条款9的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中HC包含SEQ ID NO6中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
11.根据条款9的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中HC包含SEQ ID NO9中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
12.根据条款9的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中HC包含SEQ ID NO49中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
13.根据条款9的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中HC包含SEQ ID NO48中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
14.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段是人干扰素。
15.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段选自由I型IFN、II型IFN和III型IFN、或其功能片段组成的组。
16.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段是I型IFN或其功能片段。
17.根据条款16的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中I型IFN或其功能片段为IFNα、IFNβ、IFNω、或IFNε、或它们的功能片段。
18.根据条款16的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中I型IFN或其功能片段为IFNα、或IFNβ、或它们的功能片段。
19.根据条款16的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中I型IFN或其功能片段为IFNω或其功能片段。
20.根据条款16的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中I型IFN或其功能片段为IFNε或其功能片段。
21.根据条款1至14中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNω、或IFNε、或它们的功能片段。
22.根据条款21的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNα、或IFNβ、或它们的功能片段。
23.根据条款22的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNα或其功能片段。
24.根据条款23的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNα2a或其功能片段。
25.根据条款24的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNα2a包含SEQID NO 17中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
26.根据条款22的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNβ或其功能片段。
27.根据条款26的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ IDNO 14中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
28.根据条款26的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中相对于SEQ ID NO14，IFNβ或其功能片段包含选自C17S和N80Q的一个或两个氨基酸替换。
29.根据条款28的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中相对于SEQ ID NO14，IFNβ或其功能片段包含氨基酸替换C17S。
30.根据条款29的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ IDNO 15中所示的氨基酸序列。
31.根据条款28的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中相对于SEQ ID NO14，IFNβ或其功能片段包含氨基酸替换C17S和N80Q。
32.根据条款31的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ IDNO 16中所示的氨基酸序列。
33.根据条款21的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNγ、或IFNλ、或它们的功能片段。
34.根据条款33的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNγ或其功能片段。
35.根据条款34的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNγ包含SEQ IDNO 19中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
36.根据条款33的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段为IFNλ或其功能片段。
37.根据条款36的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ或其功能片段为IFNλ2或其功能片段。
38.根据条款37的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ2包含SEQ IDNO 18中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
39.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段非共价结合。
40.根据条款39的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段通过离子、范德华力和/或氢键相互作用与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段非共价结合。
41.根据条款1至38中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段共价结合。
42.根据条款41的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段融合。
43.根据条款42的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合。
44.根据条款43的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的N末端融合。
45.根据条款43的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的C末端融合。
46.根据条款42的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合。
47.根据条款46的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的N末端融合。
48.根据条款46的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的C末端融合。
49.根据条款42至48中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段与IFN或其功能片段通过接头相互融合。
50.根据条款49的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白不包含除形成(I)所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段、(II)所述IFN或其功能片段和(III)所述接头的氨基酸之外的氨基酸。
51.根据条款1至49中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白不包含除形成(I)所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段和(II)所述IFN或其功能片段的氨基酸之外的氨基酸。
52.根据条款49至50中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头是肽接头。
53.根据条款52的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸。
54.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少4个氨基酸。
55.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少11个氨基酸。
56.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少12个氨基酸。
57.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少13个氨基酸。
58.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少15个氨基酸。
59.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少20个氨基酸。
60.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少21个氨基酸。
61.根据条款53的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至少24个氨基酸。
62.根据条款52的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多10个、至多20个、至多30个、至多40个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、或至多100个氨基酸。
63.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多80个氨基酸。
64.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多40个氨基酸。
65.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多24个氨基酸。
66.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多21个氨基酸。
67.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多20个氨基酸。
68.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多15个氨基酸。
69.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多13个氨基酸。
70.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多12个氨基酸。
71.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多11个氨基酸。
72.根据条款62的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含至多4个氨基酸。
73.根据条款52至72中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头选自包括酸性接头、碱性接头和中性接头的组。
74.根据条款73的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头是酸性接头。
75.根据条款73或74的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。
76.根据条款73的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头是碱性接头。
77.根据条款73的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头是中性接头。
78.根据条款73或77的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
79.根据条款52至78中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头选自包括刚性接头、柔性接头和形成螺旋的接头的组。
80.根据条款79的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头是刚性接头。
81.根据条款79或80的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQID NO 20、SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。
82.根据条款79的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头是柔性接头。
83.根据条款79或82的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
84.根据条款79的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头是形成螺旋的接头。
85.根据条款79或84的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。
86.根据条款52至74、76、77、79、80、82或84的任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包括氨基酸甘氨酸和丝氨酸。
87.根据条款86的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
88.根据条款86的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头还包含氨基酸苏氨酸。
89.根据条款88的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQ IDNO 21中所示的序列。
90.根据条款52的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含以下序列：选自SEQ ID NO 20至26中所示的序列。
91.根据条款90的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含以下序列：选自SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 26中所示的序列。
92.根据条款91的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQ IDNO 24中所示的序列。
93.根据条款91的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQ IDNO 25中所示的序列。
94.根据条款91的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中接头包含SEQ IDNO 26中所示的序列。
95.根据条款49、50或52至94任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段通过表3(特别是表3A或表3B，更特别是表3A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的C末端融合。
96.根据条款95的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 12、SEQ IDNO 48或SEQ ID NO 49中所示的序列。
97.根据条款95或96的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
98.根据条款95或96的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
99.根据条款98的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ IDNO 14中所示的序列。
100.根据条款98的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ IDNO 15中所示的序列。
101.根据条款98的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ IDNO 16中所示的序列。
102.根据条款95或96的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
103.根据条款95或96的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
104.根据条款95至103任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白还包含激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链。
105.根据条款104的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中轻链包含SEQID NO 3中所示的序列。
106.根据条款49、50或52至94任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段通过表4(特别是表4A或表4B，更特别是表4A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的N末端融合。
107.根据条款106的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQID NO 48或SEQ ID NO 12中所示的序列。
108.根据条款106或107的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
109.根据条款106或107的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
110.根据条款109的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 14中所示的序列。
111.根据条款109的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 15中所示的序列。
112.根据条款109的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 16中所示的序列。
113.根据条款106或107的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
114.根据条款106或107的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
115.根据条款106至114任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白还包含激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链。
116.根据条款115的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中轻链包含SEQID NO 3中所示的序列。
117.根据条款49、50或52至94任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段通过表5(特别是表5A或表5B，更特别是表5A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的C末端融合。
118.根据条款117的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。
119.根据条款117或118的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
120.根据条款117或118的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
121.根据条款120的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 14中所示的序列。
122.根据条款120的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 15中所示的序列。
123.根据条款120的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 16中所示的序列。
124.根据条款117或118的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
125.根据条款117或118的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
126.根据条款117至125任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白还包含激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链。
127.根据条款126的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体的重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 48或SEQ ID NO 12中所示的序列。
128.根据条款49、50或52至94任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通过表6(特别是表6A或表6B，更特别是表6A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的N末端融合。
129.根据条款128的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。
130.根据条款128或129的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
131.根据条款128或129的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
132.根据条款131的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 14中所示的序列。
133.根据条款131的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 15中所示的序列。
134.根据条款131的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ包含SEQID NO 16中所示的序列。
135.根据条款128或129的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
136.根据条款128或129的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
137.根据条款128至136中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白还包含抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链。
138.根据条款137的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体的重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 48或SEQ ID NO 12中所示的序列。
139.根据条款1至138中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ IDNO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ IDNO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 81、SEQ IDNO 82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、SEQ IDNO 88和SEQ ID NO 94的序列。
140.根据条款139的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQID NO 42或SEQ ID NO 43的序列。
141.根据条款139或140的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含表9(特别是表9A或表9B，更特别是表9A)中公开的序列组合之一。
142.根据条款141的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 38和SEQ ID NO 3中所示的序列。
143.根据条款141的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 3中所示的序列。
144.根据条款141的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 3中所示的序列。
145.根据条款141的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 9中所示的序列。
146.根据条款141的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 9中所示的序列。
147.根据条款141的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 43和SEQ ID NO 9中所示的序列。
148.根据条款1至147中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白激活CD40和IFN通路。
149.根据条款148的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中CD40活性使用全血表面分子上调测定法或体外报告细胞测定法测定。
150.根据条款149的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中CD40活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTM CD40L细胞测定。
151.根据条款148至150中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以小于400ng/mL、300ng/mL、200ng/mL、150ng/mL、100ng/mL、70ng/mL、60ng/mL、50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、25ng/mL、20ng/mL、或15ng/mL的EC50激活CD40通路。
152.根据条款151的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以在10ng/mL至200ng/mL范围内的EC50激活CD40通路。
153.根据条款152的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以在10ng/mL至50ng/mL，优选10ng/mL至30ng/mL范围内的EC50激活CD40通路。
154.根据条款148至153中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以小于100ng/mL、60ng/mL、50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、或1ng/mL的EC50激活IFN通路。
155.根据条款148至154中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以小于11ng/mL，优选小于6ng/mL的EC50激活IFN通路。
156.根据条款148至155中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路是IFNα、IFNβ、IFNε、IFNγ、IFNω、或IFNλ通路。
157.根据条款156的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTMIFN-α/β细胞测定。
158.根据条款156的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNα活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTMIFN-α/β细胞测定。
159.根据条款156的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNγ活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTM双重IFN-γ细胞测定。
160.根据条款156的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTMIFN-λ细胞测定。
161.根据前述条款特别是条款148至160中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中与未用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗的冠状病毒感染细胞中生物标志物的表达水平相比，一种或多种IFN通路生物标志物的表达水平在用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗后在所述冠状病毒感染的细胞中上调，优选上调至少1.5倍，更优选至少2倍，最优选至少3倍。
162.根据条款161的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物是趋化因子。
163.根据条款162的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物是干扰素刺激的基因ISG20。
164.根据条款162的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物是选自CXCL9、CXCL10和CXCL11的C-X-C趋化因子。
165.根据条款164的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物是CXCL10。
166.根据前述条款特别是条款148至165中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中与未用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗的冠状病毒感染细胞中白细胞介素的表达水平相比，IL10、IL1β和IL2中的一种或多种的表达水平在用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗后在所述冠状病毒感染的细胞中未显著上调。
167.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中与抗体CP870,893相比，干扰素相关的抗原结合蛋白的全身暴露量增加，优选增加至少10％，更优选至少15％，最优选至少25％。
168.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的全身暴露量为至少1000μg*h/mL。
169.根据条款168的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的全身暴露量在1033μg*h/mL至1793μg*h/mL的范围内。
170.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的半衰期为至少100小时。
171.根据条款170的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的半衰期在116小时至158小时的范围内。
172.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率低于0.5mL/h/kg。
173.根据条款172的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率在0.28mL/h/kg至0.49mL/h/kg的范围内。
174.根据条款1至173中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的分布容积Vss低于100mL/kg。
175.根据条款174的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的分布容积Vss在50mL/kg至98mL/kg的范围内。
176.根据前述条款中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中用途包括通过用编码干扰素相关的抗原结合蛋白的RNA或DNA序列或编码干扰素相关抗体结合蛋白的载体或载体系统进行基因递送，将干扰素相关的抗原结合蛋白施用到有此需要的受试者。
177.根据条款1至176中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白包含在药物组合物中。
178.根据条款177的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合口服施用、肠胃外施用或局部施用或通过吸入施用。
179.根据条款178的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合口服施用。
180.根据条款178的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合局部施用。
181.根据条款178的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合通过吸入施用。
182.根据条款178的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合肠胃外施用。
183.根据条款182的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。
184.根据条款183的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合注射，优选适合静脉内或动脉内注射或滴注。
185.根据条款177至184中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物包含至少一种缓冲剂。
186.根据条款185的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是乙酸盐、甲酸盐或柠檬酸盐。
187.根据条款186的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是乙酸盐。
188.根据条款186的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是甲酸盐。
189.根据条款186的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是柠檬酸盐。
190.根据条款177至189中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物包含表面活性剂。
191.根据条款190的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂选自包括普朗尼克、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇和泰洛沙泊的列表。
192.根据条款191的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯。
193.根据条款192的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、或聚山梨醇酯100。
194.根据条款193的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯20。
195.根据条款193的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯80。
196.根据条款177至195中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物包含稳定剂，任选地其中稳定剂为白蛋白。
197.根据条款1至196中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少90％同一性；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，它们与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少90％同一性。
198.根据条款1至197中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列相同；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，它们与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列相同。
199.根据条款197或条款198的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义来定义每个CDR；优选地，其中根据Kabat的CDR定义或Chothia的CDR定义来定义每个CDR。
200.根据条款2至199中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中在激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链和轻链可变区的互补决定区内不存在氨基酸替换、插入或缺失。
201.根据条款2至199中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中在激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链和轻链可变区的互补决定区的每一个内不单独存在一个或两个氨基酸替换、插入或缺失。
202.在治疗或预防有此需要的受试者中的冠状病毒感染中用于使用的根据前述条款中任一项所定义的编码干扰素相关的抗原结合蛋白的一种或多种多核苷酸，其中治疗包括在所述受试者中，从施用到所述受试者的一种或多种多核苷酸表达所述干扰素相关的抗原结合蛋白。
203.根据前述条款中任一项的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白或一种或多种多核苷酸，其中冠状病毒选自由严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组成的组。
204.根据前述条款中任一项的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白或一种或多种多核苷酸，其中冠状病毒是SARS-CoV-2或其变体。
205.根据条款204的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白或一种或多种多核苷酸，其中冠状病毒是可从https://outbreak.info/situation-reports或https://cov-lineages.org/global_report.html获得的谱系报告中鉴定的SARS-CoV-2的变体。
206.根据条款204或205的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白或一种或多种多核苷酸，其中SARS-CoV-2变体选自由以下组成的组：A.23.1、B.1.1.7、B.1.351、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.526.1、B.1.526.2、B.1.617、B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3、P.1或P.2。
事项
鉴于以上内容，将进一步理解，本发明还涉及以下事项：
1.一种治疗或预防冠状病毒感染中用于使用的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段，其中TNFRSF激动剂或其功能片段与干扰素(IFN)或其功能片段联合施用。
2.一种治疗或预防冠状病毒感染中用于使用的干扰素(IFN)或其功能片段，其中IFN或其功能片段与肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段联合施用。
3.一种治疗或预防冠状病毒感染中用于使用的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段与干扰素(IFN)或其功能片段的组合。
4.根据事项1至3中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中TNFRSF激动剂或其功能片段选自由以下组成的组：CD27激动剂、CD30激动剂、分化因子40(CD40)激动剂簇、HVEM激动剂、OX40激动剂、TNFRSF12A激动剂和4-1BB激动剂、或它们的功能片段。
5.根据前述事项中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中TNFRSF激动剂或其功能片段是多肽或其功能片段、或者抗体或其功能片段。
6.根据事项1至5中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中TNFRSF激动剂或其功能片段选自CD70、CD30L(TNFSF8)、CD40L、LIGHT、OX40L、TWEAK和4-1BBL、或它们的功能片段；优选地，其中TNFRSF激动剂或其功能片段选自CD40L、LIGHT和TWEAK或它们的功能片段。
7.根据事项1至5中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中TNFRSF激动剂或其功能片段是激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段。
8.根据事项7用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少90％同一性；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，其与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少90％同一性；
优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少95％同一性；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，其与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少95％同一性；
更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少98％同一性；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，其与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少98％同一性；
或还更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少99％同一性；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，其与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少99％同一性。
9.根据事项8用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列相同；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，其与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列相同。
10.根据事项8或事项9用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义来定义每个CDR；优选地，其中根据Kabat的CDR定义或Chothia的CDR定义来定义每个CDR。
11.根据事项7用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含
(I)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少90％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少90％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少90％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少90％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少90％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少90％同一性的CDRL3；
优选地(II)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少95％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少95％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少95％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少95％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少95％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少95％同一性的CDRL3；
更优选地(III)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少98％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少98％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少98％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少98％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少98％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少98％同一性的CDRL3；或
还更优选地(IV)
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少99％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少99％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少99％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少99％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少99％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少99％同一性的CDRL3。
12.根据事项11用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含：
a.重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56相同的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQID NO 57相同的CDRH2和与SEQ ID NO 58相同的CDRH3；和
b.轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52相同的CDRL1、与SEQ ID NO 53相同的CDRL2和与SEQ ID NO 54相同的CDRL3。
13.根据事项7至12中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO 51所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含SEQ ID NO 55所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；
优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与SEQ ID NO 51所示的序列具有至少95％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含与SEQ ID NO 55所示的序列具有至少95％同一性的序列；
更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与SEQ ID NO 51所示的序列具有至少98％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含与SEQ ID NO 55所示的序列具有至少98％同一性的序列；
还更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与SEQ ID NO 51所示的序列具有至少99％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含与SEQ ID NO 55所示的序列具有至少99％同一性的序列；或
最优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO 51中所示的序列；和重链可变区VH，其包含SEQ ID NO 55中所示的序列。
14.根据事项7至13中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含Fab区重链，该Fab区重链包含SEQ ID NO 12中所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
15.根据事项7至14中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含选自由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的组的序列或与它们具有至少90％同一性的序列；
优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含与SEQ ID NO 3中所示的序列具有至少95％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含与由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的序列组中所示的序列具有至少95％同一性的序列；
更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含与SEQ ID NO 3中所示的序列具有至少98％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含与由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的序列组中所示的序列具有至少98％同一性的序列；
还更优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含与SEQ ID NO 3中所示的序列具有至少99％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含与由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的序列组中所示的序列具有至少99％同一性的序列；或
最优选地，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列；和重链(HC)，该重链包含选自由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的组的序列。
16.根据事项15用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中HC包含SEQ ID NO 6中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
17.根据事项15用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中HC包含SEQ ID NO 9中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
18.根据事项15用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中HC包含SEQ ID NO 49中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
19.根据事项15用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中HC包含SEQ ID NO 48中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
20.根据事项13至19中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中在激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链和轻链可变区的互补决定区内不存在氨基酸替换、插入或缺失。
21.根据事项8至19中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中在激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链和轻链可变区的互补决定区的每一个内不单独存在一个或两个氨基酸替换、插入或缺失。
22.根据前述事项中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中所述IFN或其功能片段是人干扰素。
23.根据前述事项中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段选自由以下组成的组：I型IFN、II型IFN和III型IFN、或它们的功能片段。
24.根据前述事项中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为I型IFN或其功能片段。
25.根据事项24用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中I型IFN或其功能片段为IFNα、IFNβ、IFNω或IFNε、或它们的功能片段。
26.根据事项24用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中I型IFN或其功能片段为IFNα或IFNβ或它们的功能片段。
27.根据事项24用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中I型IFN或其功能片段为IFNω或其功能片段。
28.根据事项24用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中I型IFN或其功能片段为IFNε或其功能片段。
29.根据事项1至23中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNω或IFNε或它们的功能片段。
30.根据事项29用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNα或IFNβ或它们的功能片段。
31.根据事项30用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNα或其功能片段。
32.根据事项31用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNα2a或其功能片段。
33.根据事项32用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
34.根据事项30用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNβ或其功能片段。
35.根据事项34用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
36.根据事项34用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中相对于SEQ ID NO 14，IFNβ或其功能化片段包含选自C17S和N80Q的一个或两个氨基酸替换。
37.根据事项36用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中相对于SEQ ID NO 14，IFNβ或其功能化片段包含氨基酸替换C17S。
38.根据事项37用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 15中所示的氨基酸序列。
39.根据事项36用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中相对于SEQ ID NO 14，IFNβ或其功能化片段包含氨基酸替换C17S和N80Q。
40.根据事项39用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 16中所示的氨基酸序列。
41.根据事项29用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNγ或IFNλ或它们的功能片段。
42.根据事项41用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNγ或其功能片段。
43.根据事项42用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
44.根据事项41用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段为IFNλ或其功能片段。
45.根据事项44用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNλ或其功能片段为IFNλ2或其功能片段。
46.根据事项45用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列，或与其具有至少90％、优选95％、更优选98％、或还更优选99％同一性的序列。
47.根据事项1至46中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与TNFRSF激动剂或其功能片段非共价结合。
48.根据事项47用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段通过离子、范德华力和/或氢键相互作用与TNFRSF激动剂或其功能片段非共价结合。
49.根据事项1至46中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与TNFRSF激动剂或其功能片段共价结合。
50.根据事项1至46或49中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与TNFRSF激动剂或其功能片段融合，优选地，其中IFN或其功能片段与TNFRSF激动剂或其功能片段通过接头相互融合。
51.根据事项50用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与选自CD70、CD30L(TNFSF8)、CD40L、LIGHT、OX40L、TWEAK和4-1BBL或它们的功能片段的TNFRSF激动剂或其功能片段融合；优选地，其中IFN或其功能片段与选自CD40L、LIGHT和TWEAK或它们的功能片段的TNFRSF激动剂或其功能片段融合。
52.根据事项50用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中TNFRSF激动剂或其功能片段和IFN或其功能片段作为干扰素相关的抗原结合蛋白提供，其中TNFRSF激动剂或其功能片段是抗体或其抗原结合片段，优选为激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段、更优选为包含以下的激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段：
a.重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56相同的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQID NO 57相同的CDRH2和与SEQ ID NO 58相同的CDRH3；和
b.轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52相同的CDRL1、与SEQ ID NO 53相同的CDRL2和与SEQ ID NO 54相同的CDRL3；
并且其中IFN或其功能片段与所述抗体或其抗原结合片段融合。
53.根据事项52用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与抗体或其抗原结合片段的轻链融合。
54.根据事项53用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与抗体或其抗原结合片段的轻链的N末端融合。
55.根据事项53用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与抗体或其抗原结合片段的轻链的C末端融合。
56.根据事项52用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与抗体或其抗原结合片段的重链融合。
57.根据事项56用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与抗体或其抗原结合片段的重链的N末端融合。
58.根据事项56用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段与抗体或其抗原结合片段的重链的C末端融合。
59.根据事项50至58中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头是肽接头。
60.根据事项59用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少21个或至少24个氨基酸。
61.根据事项59用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含至多4个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多15个、至多20个、至多21个、至多24个、至多30个、至多40个、至多50个、至多60个、至多70个、至多80个、至多90个、或至多100个氨基酸。
62.根据事项59至61中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头选自包括酸性接头、碱性接头和中性接头的组。
63.根据事项62用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头是酸性接头。
64.根据事项62或事项63用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。
65.根据事项62用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头是碱性接头。
66.根据事项62用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头是中性接头。
67.根据事项62或事项66用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
68.根据事项59至67中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头选自包括刚性接头、柔性接头和形成螺旋的接头的组。
69.根据事项68用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头是刚性接头。
70.根据事项68或事项69用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。
71.根据事项68用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头是柔性接头。
72.根据事项68或事项71用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO26中所示的序列。
73.根据事项68用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头是形成螺旋的接头。
74.根据事项68或事项73用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 23中所示的序列。
75.根据事项59至63、65、66、68、69、71或73中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。
76.根据事项75用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
77.根据事项75用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头进一步包含氨基酸苏氨酸。
78.根据事项77用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 21中所示的序列。
79.根据事项59用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含以下序列：选自SEQ ID NO 20至26中所示的序列。
80.根据事项79用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含以下序列：选自SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
81.根据事项80用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 24中所示的序列。
82.根据事项80用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 25中所示的序列。
83.根据事项80用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中接头包含SEQ ID NO 26中所示的序列。
84.根据事项59至83中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段通过表3(特别是表3A或表3B，更特别是表3A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的C末端融合。
85.根据事项84用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO 6、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 48或SEQ ID NO 49中所示的序列。
86.根据事项84或事项85用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
87.根据事项84或事项85用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
88.根据事项87用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14中所示的序列。
89.根据事项87用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 15中所示的序列。
90.根据事项87用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 16中所示的序列。
91.根据事项84或事项85用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
92.根据事项84或事项85用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
93.根据事项84至92中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链，优选其中轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。
94.根据事项59至83中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段通过表4(特别是表4A或表4B，更特别是表4A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链的N末端融合。
95.根据事项94用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO 6、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 48或SEQ ID NO 12中所示的序列。
96.根据事项94或事项95用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
97.根据事项94或事项95用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
98.根据事项97用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14中所示的序列。
99.根据事项97用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 15中所示的序列。
100.根据事项97用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 16中所示的序列。
101.根据事项94或事项95用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
102.根据事项94或事项95用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
103.根据事项94至102中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链、优选其中轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。
104.根据事项59至83中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段通过表5(特别是表5A或表5B，更特别是表5A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的C末端融合。
105.根据事项104用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。
106.根据事项104或105用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
107.根据事项104或105用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
108.根据事项107用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14中所示的序列。
109.根据事项107用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 15中所示的序列。
110.根据事项107用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 16中所示的序列。
111.根据事项104或105用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
112.根据事项104或105用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
113.根据事项104至112中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含重链、优选其中重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 48、或SEQ ID NO12中所示的序列。
114.根据事项59至83中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFN或其功能片段通过表6(特别是表6A或表6B，更特别是表6A)中所示的接头与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链的N末端融合。
115.根据事项114用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列。
116.根据事项114或事项115用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列。
117.根据事项114或事项115用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16中所示的序列。
118.根据事项117用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 14中所示的序列。
119.根据事项117用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 15中所示的序列。
120.根据事项117用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNβ包含SEQ ID NO 16中所示的序列。
121.根据事项114或事项115用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNγ包含SEQ ID NO 19中所示的序列。
122.根据事项114或事项115用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中IFNλ2包含SEQ ID NO 18中所示的序列。
123.根据事项114至122中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含重链、优选其中重链包含SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 48、或SEQ ID NO12中所示的序列。
124.根据事项52至123中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白包含选自以下的序列：SEQ ID NO28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO85、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、SEQ ID NO 88和SEQ ID NO 94。
125.根据事项124用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42或SEQ ID NO 43的序列。
126.根据事项124或事项125用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含表9(特别是表9A或表9B，更特别是表9A)中公开的序列组合之一。
127.根据事项126用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 38和SEQ ID NO 3中所示的序列。
128.根据事项126用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 3中所示的序列。
129.根据事项126用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 3中所示的序列。
130.根据事项126用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 9中所示的序列。
131.根据事项126用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 9中所示的序列。
132.根据事项126用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含SEQ ID NO 43和SEQ ID NO 9中所示的序列。
133.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，包括：
(I)激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段，和
(II)干扰素(IFN)或其功能片段，
用于治疗或预防冠状病毒感染。
134.根据事项133的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含：
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56具有至少90％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少90％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少90％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52具有至少90％同一性的CDRL1、与SEQID NO 53具有至少90％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少90％同一性的CDRL3。
135.根据事项133的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含：
(a)重链或其片段，其包含与SEQ ID NO 56相同的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQID NO 57相同的CDRH2和与SEQ ID NO 58相同的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，其包含与SEQ ID NO 52相同的CDRL1、与SEQ ID NO 53相同的CDRL2和与SEQ ID NO 54相同的CDRL3。
136.根据事项133至135中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO 51所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链可变区VH，其包含SEQ ID NO 55所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
137.根据事项133至136中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)，该轻链包含SEQ ID NO 3所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列；和/或重链(HC)，该重链包含选自由SEQ ID NO6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的组的序列或与它们具有至少90％同一性的序列。
138.根据事项133至137中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段选自由以下组成的组：I型IFN、II型IFN和III型IFN、或它们的功能片段。
139.根据事项138的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中I型IFN或其功能片段为IFNα或IFNβ或它们的功能片段。
140.根据事项133至139中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段是IFNα2a或其功能片段，并且其中优选IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
141.根据事项133至139中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段是IFNβ或其功能片段，并且其中优选IFNβ包含SEQ ID NO 14中所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
142.根据事项133至141中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合，优选地与C末端融合。
143.根据事项133至141中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合，优选地与C末端融合。
144.根据事项133至143中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段和IFN或其功能片段通过接头相互融合,并且其中优选接头包含SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ IDNO 26中所示的序列。
145.根据事项133至144中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，其包含表9(特别是表9A或表9B，更特别是表9A)中公开的序列组合之一。
146.根据事项133至145中任一项的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中该使用包括通过用编码干扰素相关的抗原结合蛋白的RNA或DNA序列或编码干扰素相关抗体结合蛋白的载体或载体系统进行基因递送，将干扰素相关的抗原结合蛋白施用到有此需要的受试者。
147.以下的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白：
(a)事项133至145的任一项，其中干扰素相关的抗原结合蛋白包含在药物组合物中；或
(b)事项146，其中编码所述干扰素相关的抗原结合蛋白的RNA或DNA序列或者编码所述干扰素相关的抗原结合蛋白的载体或载体系统包含在药物组合物中。
148.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，其包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段(包含SEQ ID NO 38和SEQ ID NO 3中所示的氨基酸序列)，用于治疗或预防冠状病毒感染。
149.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，其包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段(包含SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 3中所示的氨基酸序列)，用于治疗或预防冠状病毒感染。
150.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，其包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段(包含SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 3中所示的氨基酸序列)，用于治疗或预防冠状病毒感染。
151.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，其包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段(包含SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 9中所示的氨基酸序列)，用于治疗或预防冠状病毒感染。
152.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，其包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段(包含SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 9中所示的氨基酸序列)，用于治疗或预防冠状病毒感染。
153.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，其包含干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段(包含SEQ ID NO 43和SEQ ID NO 9中所示的氨基酸序列)，用于治疗或预防冠状病毒感染。
154.根据事项1至132中任一项用于使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合，或根据事项133至153中任一项用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白激活CD40和IFN通路。
155.根据事项154用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中CD40活性使用全血表面分子上调测定法或体外报告细胞测定法测定。
156.根据事项155用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中CD40活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTM CD40L细胞测定。
157.根据事项154至156中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以小于400ng/mL、300ng/mL、200ng/mL、150ng/mL、100ng/mL、70ng/mL、60ng/mL、50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、25ng/mL、20ng/mL、或15ng/mL的EC50激活CD40通路。
158.根据事项157用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以范围为10ng/mL至200ng/mL的EC50激活CD40通路。
159.根据事项158用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以范围为10ng/mL至50ng/mL、优选10ng/mL至30ng/mL的EC50激活CD40通路。
160.根据事项154至159中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以小于100ng/mL、60ng/mL、50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL或1ng/mL的EC50激活IFN通路。
161.根据事项154至160中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白以小于11ng/mL、优选小于6ng/mL的EC50激活IFN通路。
162.根据事项154至161中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路为IFNα、IFNβ、IFNε、IFNγ、IFNω或IFNλ通路。
163.根据事项162用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNβ活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTMIFN-α/β细胞测定。
164.根据事项162用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNα活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTMIFN-α/β细胞测定。
165.根据事项162用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNγ活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTM双重IFN-γ细胞测定。
166.根据事项162用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFNλ活性使用体外报告细胞测定法，任选使用HEK-BlueTMIFN-λ细胞测定。
167.根据事项1至166中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中与未用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗的冠状病毒感染细胞中生物标志物的表达水平相比，一种或多种IFN通路的所述生物标志物的表达水平在用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗后在所述冠状病毒感染的细胞中上调，优选上调至少1.5倍，更优选至少2倍，最优选至少3倍。
168.根据事项167用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物是趋化因子。
169.根据事项168用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物为干扰素刺激基因ISG20。
170.根据事项168用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物是选自由CXCL9、CXCL10和CXCL11组成的组的C-X-C趋化因子。
171.根据事项170用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN通路生物标志物为CXCL10。
172.根据事项1至171中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中与未用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗的冠状病毒感染细胞中白细胞介素的表达水平相比，IL10、IL1β和IL2中的一种或多种的表达水平在用干扰素相关的抗原结合蛋白治疗后在所述冠状病毒感染的细胞中未显著上调。
173.根据事项1至172中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中与抗体CP870,893相比，干扰素相关的抗原结合蛋白的全身暴露量增加，优选增加至少10％，更优选增加至少15％，最优选增加至少25％。
174.根据事项52至173中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的全身暴露量为至少1000μg*h/mL。
175.根据事项174用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的全身暴露量在1033μg*h/mL至1793μg*h/mL的范围内。
176.根据事项52至175中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的半衰期为至少100小时。
177.根据事项176用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的半衰期在116小时至158小时的范围内。
178.根据事项52至177中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率低于0.5mL/h/kg。
179.根据事项178用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的清除率在0.28mL/h/kg至0.49mL/h/kg的范围内。
180.根据事项1至179中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的分布容积Vss低于100mL/kg。
181.根据事项180用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白的分布容积Vss在50mL/kg至98mL/kg的范围内。
182.根据前述事项中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中该使用包括将所述TNFRSF激动剂或其功能片段、所述IFN或其功能片段、所述组合、或所述干扰素相关的抗原结合蛋白施用到有此需要的受试者，通过以下方式：
a.编码所述TNFRSF激动剂或其功能片段、所述IFN或其功能片段、所述组合、或所述干扰素相关的抗原结合蛋白的RNA或DNA序列的基因递送；或
b.编码所述TNFRSF激动剂或其功能片段、所述IFN或其功能片段、所述组合、或所述干扰素相关的抗原结合蛋白的载体或载体系统。
183.根据事项182用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述干扰素相关的抗原结合蛋白在所述受试者中从施用到所述受试者的一种或多种多核苷酸表达。
184.根据事项1至183中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中干扰素相关的抗原结合蛋白包含在药物组合物中。
185.根据事项1至184中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、或组合，其中TNFRSF激动剂或其功能片段和IFN或其功能片段包含在同一药物组合物中或不同药物组合物中。
186.根据事项184或事项185用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合口服施用、肠胃外施用、或局部施用、或通过吸入施用。
187.根据事项186用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合口服施用。
188.根据事项186用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合局部施用。
189.根据事项186用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合通过吸入施用。
190.根据事项186用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合肠胃外施用。
191.根据事项184或事项185用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。
192.根据事项184或事项185用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物适合注射，优选适合静脉内或动脉内注射或滴注。
193.根据事项184至192中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物包含至少一种缓冲剂。
194.根据事项193用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是乙酸盐、甲酸盐或柠檬酸盐。
195.根据事项194用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是乙酸盐。
196.根据事项194用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是甲酸盐。
197.根据事项194用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中缓冲剂是柠檬酸盐。
198.根据事项184至197中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物包含表面活性剂。
199.根据事项198用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂选自包括以下的列表普朗尼克、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇和泰洛沙泊。
200.根据事项199用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯。
201.根据事项200用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、或聚山梨醇酯100。
202.根据事项201用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯20。
203.根据事项201用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中表面活性剂是聚山梨醇酯80。
204.根据事项184至203中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、或干扰素相关的抗原结合蛋白，其中药物组合物包含稳定剂，任选其中稳定剂为白蛋白。
205.根据事项133至204中任一项的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列具有至少90％同一性；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，其与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列具有至少90％同一性。
206.根据事项133至205中任一项的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与SEQ ID NO 3内的相应CDRL1、CDRL2和CDRL3序列相同；和三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，其与SEQ ID NO 6内的相应CDRH1、CDRH2和CDRH3序列相同。
207.根据事项205或事项206的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、AbM定义或接触定义来定义每个CDR；优选地，其中根据Kabat的CDR定义或Chothia的CDR定义来定义每个CDR。
208.根据事项133至207中任一项的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中在激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链和轻链可变区的互补决定区内不存在氨基酸替换、插入或缺失。
209.根据事项133至207中任一项的用于它们使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中在激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链和轻链可变区的互补决定区的每一个内不单独存在一个或两个氨基酸替换、插入或缺失。
210.根据前述事项中任一项所定义的编码TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段或干扰素相关的抗原结合蛋白的一种或多种多核苷酸，用于治疗或预防有此需要的受试者中的冠状病毒感染，其中治疗包括在所述受试者中表达所述TNFRSF激动剂或其功能片段和所述IFN或其功能片段，或在所述受试者中从施用到所述受试者的一种或多种多核苷酸表达所述干扰素相关的抗原结合蛋白。
211.根据前述事项中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、干扰素相关的抗原结合蛋白、或一种或多种多核苷酸，其中冠状病毒选自由以下组成的组：严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。
212.根据前述事项中任一项用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、干扰素相关的抗原结合蛋白、或一种或多种多核苷酸，其中冠状病毒是SARS-CoV-2或其变体。
213.根据事项212用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、干扰素相关的抗原结合蛋白、或一种或多种多核苷酸，其中冠状病毒是可以从https://outbreak.info/situation-reports或https://cov-lineages.org/global_report.html获得的谱系报告中鉴定的SARS-CoV-2的变体。
214.根据事项212或213用于它们使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、组合、干扰素相关的抗原结合蛋白、或一种或多种多核苷酸，其中SARS-CoV-2变体选自由以下组成的组：A.23.1、B.1.1.7、B.1.351、B.1.427、B.1.429、B.1.525、B.1.526、B.1.526.1、B.1.526.2、B.1.617、B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3、P.1和P.2。
本领域技术人员将理解，本发明还涉及根据本文所鉴定的事项或条款中任一项用于使用的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、两者的组合、干扰素相关的抗原结合蛋白、或一种或多种多核苷酸，其中TNFRSF激动剂包含表8中公开的SEQ ID NO 59、SEQID NO 61或SEQ ID NO 63，和/或其中干扰素相关结合蛋白是包含表10中公开的序列组合之一的干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段。
此外，本领域技术人员将理解，本发明还涉及用于治疗或预防受试者中的冠状病毒感染的方法，特别是事项211至214中鉴定的冠状病毒感染，其中治疗有效量的本文所鉴定的方面、实施方式、事项或条款中任一项或前述段落中所提及的TNFRSF激动剂或其功能片段、IFN或其功能片段、两者的组合、干扰素相关的抗原结合蛋白、或一种或多种多核苷酸施用到所述受试者。
应当理解，根据本文所描述和要求保护的所有方面、实施方式、条款和事项，待治疗的受试者优选为哺乳动物，以及最优选为人类受试者。
最后，应当理解，本文所描述的所有方面、实施方式、条款和事项都可以成为进一步的权利要求(除了以下提供的权利要求之外)的主题。
序列表
<110> 埃沃特克国际有限责任公司（Evotec International GmbH）
<120>用于治疗或预防冠状病毒感染的干扰素相关的抗原结合蛋白
<130> EVO25837PCT
<150> EP21305786.2
<151> 2021-06-09
<160> 94
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽1
<400> 1
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽2
<400> 2
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体轻链
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 4
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽1的抗CD40抗体轻链
<400> 4
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile
35 40 45
Tyr Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile
100 105 110
Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 5
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽2的抗CD40抗体轻链
<400> 5
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Tyr Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ala Asn Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 6
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体重链hIgG2 dK
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 7
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽1的抗CD40抗体重链hIgG2 dK
<400> 7
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val
115 120 125
Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
145 150 155 160
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
305 310 315 320
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 8
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽2的抗CD40抗体重链hIgG2 dK
<400> 8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
85 90 95
Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr
115 120 125
Asn Gly Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
145 150 155 160
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
165 170 175
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
195 200 205
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
210 215 220
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
225 230 235 240
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 9
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体重链hIgG2
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 10
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽1的抗CD40抗体重链hIgG2
<400> 10
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val
115 120 125
Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
145 150 155 160
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
305 310 315 320
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 11
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽2的抗CD40抗体重链hIgG2
<400> 11
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
85 90 95
Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr
115 120 125
Asn Gly Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
145 150 155 160
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
165 170 175
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
195 200 205
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
210 215 220
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
225 230 235 240
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 12
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 hIgG2 Fab区重链
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
225 230
<210> 13
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽1的抗CD40抗体 hIgG2 Fab区重链
<400> 13
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val
115 120 125
Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
145 150 155 160
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
165 170 175
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
180 185 190
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
195 200 205
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln
210 215 220
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
225 230 235 240
Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
245 250
<210> 14
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IFNβ
<400> 14
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 15
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNβ C17S
<400> 15
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 16
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNβ C17S,N80Q
<400> 16
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Gln
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 17
<211> 165
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IFNα2a
<400> 17
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 18
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IFNλ2
<400> 18
Val Pro Val Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys
1 5 10 15
His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe
20 25 30
Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys
35 40 45
Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu
50 55 60
Gln Val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr
65 70 75 80
Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp
85 90 95
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Phe
100 105 110
Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly
115 120 125
Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
130 135 140
Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
145 150 155 160
Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val
165 170 175
<210> 19
<211> 143
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IFNγ
<400> 19
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln
130 135 140
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RL接头
<400> 20
Pro Ala Pro Ala
1
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GST接头
<400> 21
Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HL接头
<400> 22
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HL2接头
<400> 23
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
20
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)3接头
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)4接头
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TEV-6His标签
<400> 27
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser His His His His His His
1 5 10
<210> 28
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_LC--HL--IFNβ
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
210 215 220
Lys Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn
225 230 235 240
Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr
245 250 255
Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln
260 265 270
Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met
275 280 285
Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly
290 295 300
Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln
305 310 315 320
Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp
325 330 335
Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr
340 345 350
Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala
355 360 365
Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn
370 375 380
Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
385 390
<210> 29
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_LC--HL--IFNβ_C17S
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
210 215 220
Lys Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn
225 230 235 240
Phe Gln Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr
245 250 255
Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln
260 265 270
Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met
275 280 285
Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly
290 295 300
Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln
305 310 315 320
Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp
325 330 335
Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr
340 345 350
Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala
355 360 365
Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn
370 375 380
Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
385 390
<210> 30
<211> 621
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_hIgG2_dK_HC--RL--IFNβ
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu
225 230 235 240
Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp
245 250 255
Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe
260 265 270
Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNβ--(G4S)3--抗CD40_HC_IgG1_NNAS_dK
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Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
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65 70 75 80
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100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
180 185 190
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
195 200 205
Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
210 215 220
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn
225 230 235 240
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
245 250 255
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
260 265 270
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn
275 280 285
Gly Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
290 295 300
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
305 310 315 320
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
325 330 335
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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<220>
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr Asn Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 hIgG1重链NNAS
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Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
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Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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355 360 365
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 hIgG1重链-NNAS-dK
<400> 49
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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195 200 205
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 hIgG2 Fab区重链--TEV--6His标签
<400> 50
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
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Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 VL结构域
<400> 51
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 CDRL1
<400> 52
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<210> 54
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<220>
<223> 抗CD40抗体 CDRL3
<400> 54
Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 VH结构域
<400> 55
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Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 CDRH1
<400> 56
Thr Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 CDRH2
<400> 57
Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 CDRH3
<400> 58
Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 59
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体_轻链
<400> 59
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
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130 135 140
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165 170 175
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 60
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽1的抗CD40抗体_轻链
<400> 60
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
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Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 61
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体_重链hIgG2 dK
<400> 61
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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435 440 445
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<213> 人工序列
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<223>具有信号肽1的抗CD40抗体_重链hIgG2 dK
<400> 62
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<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 63
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<210> 64
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<213> 人工序列
<220>
<223>具有信号肽1的抗CD40抗体 Fab区重链hIgG2
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245
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40抗体 Fab区区重链hIgG2--TEV--6His标签
<400> 65
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<212> PRT
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<400> 66
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<400> 69
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50 55 60
Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu
65 70 75 80
Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His
85 90 95
Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg
100 105 110
Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile
115 120 125
Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile
130 135 140
Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr
145 150 155 160
Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 77
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNβ dM C17S
<400> 77
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1 5 10 15
Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys
20 25 30
Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln
35 40 45
Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn
50 55 60
Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu
65 70 75 80
Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His
85 90 95
Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg
100 105 110
Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile
115 120 125
Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile
130 135 140
Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr
145 150 155 160
Gly Tyr Leu Arg Asn
165
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>编码SEQ ID NO 32的核酸
<400> 78
atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccacaggcgt gcactctcag 60
gttcaactgg ttcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgtaaagcca gcggctacac ctttaccggc tactacatgc actgggtccg acaggctcca 180
ggacagggac ttgagtggat gggctggatc aatcctgaca gcggcggcac caactacgcc 240
cagaaattcc agggcagagt gaccatgacc agagacacca gcatcagcac cgcctacatg 300
gaactgaacc ggctgagatc cgacgacacc gccgtgtact attgcgccag agatcagcct 360
ctgggctact gcacaaatgg cgtgtgcagc tacttcgact actggggcca gggcacactg 420
gttacagtgt ctagcgcctc tacaaagggc ccctccgttt ttcctctggc tccttgttct 480
agaagcacca gcgagtctac agccgctctg ggctgtctgg tcaaggacta ctttcctgag 540
cctgtgaccg tgtcctggaa标签cggagca ctgacatccg gcgtgcacac atttccagct 600
gtgctgcaga gcagcggcct gtactctctg tctagcgtgg tcaccgtgcc标签cagcaat 660
ttcggcaccc agacctacac ctgtaacgtg gaccacaagc ctagcaacac caaggtggac 720
aagaccgtgg aacggaagtg ctgcgtggaa tgccctcctt gtcctgctcc tccagtggcc 780
ggaccttccg tgtttctgtt ccctccaaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 840
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tctcacgagg atcccgaggt gcagttcaat 900
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aacagcacct tcagagtggt gtccgtgctg accgtggtgc atcaggactg gctgaacggc 1020
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgcctg ctcctatcga gaaaaccatc 1080
agcaagacca aaggccagcc tcgcgagcct caggtttaca cactgcctcc aagccgggaa 1140
gagatgacca agaatcaggt gtccctgacc tgcctcgtga agggcttcta cccttccgat 1200
atcgccgtgg aatgggagag caatggccag cctgagaaca actacaagac cacacctcct 1260
atgctggaca gcgacggctc attcttcctg tacagcaagc tgacagtgga caagtccaga 1320
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acccagaagt ctctgtctct gagccctggc gctgaagccg ctgctaaaga agctgccgcc 1440
aaggccatga gctacaacct gctgggcttt ctgcagcgga gcagcaactt ccagtgccag 1500
aaactgctgt ggcagctgaa tggccggctg gaatactgcc tgaaggaccg gatgaacttc 1560
gacatccccg aggaaatcaa gcagctgcag cagttccaga aagaggacgc cgctctgacc 1620
atctacgaga tgctgcagaa catcttcgcc atcttccggc aggatagcag cagcaccgga 1680
tggaacgaga caatcgtgga aaatctgctg gccaacgtgt accaccagat caaccacctg 1740
aaaaccgtgc tggaagagaa gctggaaaaa gaggacttca cccggggcaa gctgatgagc 1800
agcctgcacc tgaagcggta ctacggcaga atcctgcact acctcaaggc caaagagtat 1860
agccactgcg cctggaccat cgtgcgcgtg gaaatcctgc ggaacttcta cttcatcaac 1920
agactgaccg gctacctgcg caactga 1947
<210> 79
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN Ω
<400> 79
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65 70 75 80
Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Gln
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Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly
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Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu
130 135 140
Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met
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Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser
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<210> 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNε
<400> 80
Leu Asp Leu Lys Leu Ile Ile Phe Gln Gln Arg Gln Val Asn Gln Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Leu Asn Lys Leu Gln Thr Leu Ser Ile Gln Gln Cys
20 25 30
Leu Pro His Arg Lys Asn Phe Leu Leu Pro Gln Lys Ser Leu Ser Pro
35 40 45
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50 55 60
Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe Arg Ala Asn Ile Ser Leu Asp Gly Trp
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Arg Ile His Asp Tyr Leu Glu Asn Gln Asp Tyr Ser Thr Cys Ala Trp
130 135 140
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_hIgG2 dK_HC--HL--IFNα2A
<400> 81
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
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260 265 270
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275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
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305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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435 440 445
Ser Pro Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Cys
450 455 460
Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu
465 470 475 480
Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg
485 490 495
His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys
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515 520 525
Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu
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Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu
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Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala
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Arg Ser Lys Glu
625
<210> 82
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_LC-衍生物--HL--IFNα2A
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Glu Ala
210 215 220
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Cys Asp Leu Pro Gln Thr His
225 230 235 240
Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys
245 250 255
Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro
260 265 270
Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val
275 280 285
Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp
290 295 300
Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu
305 310 315 320
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325 330 335
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Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe
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<210> 83
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_LC--(G4S)4--IFNγ
<400> 83
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Pro Tyr Val Lys
225 230 235 240
Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
245 250 255
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu
260 265 270
Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe
275 280 285
Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val
290 295 300
Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys
305 310 315 320
Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp
325 330 335
Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala
340 345 350
Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met
355 360 365
Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln
370 375
<210> 84
<211> 614
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_hIgG2 dK_HC--(G4S)4--IFNγ
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
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Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
465 470 475 480
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
485 490 495
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp
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Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
515 520 525
Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
530 535 540
Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg
545 550 555 560
Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val
565 570 575
Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser
580 585 590
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595 600 605
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Val Ala Arg Leu
225 230 235 240
His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala
260 265 270
Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu
275 280 285
Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro
290 295 300
Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala
305 310 315 320
Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu
325 330 335
His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Phe Arg Ala Cys Ile Gln Pro
340 345 350
Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu
355 360 365
Tyr Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu
370 375 380
Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn
385 390 395 400
Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val
405
<210> 86
<211> 646
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_hIgG2 dK_HC--(G4S)4--IFNλ2
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys
465 470 475 480
Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe
485 490 495
Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met
500 505 510
Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys
515 520 525
Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met
530 535 540
Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu
545 550 555 560
Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala
565 570 575
Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys
580 585 590
Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala
595 600 605
Ser Gln
610
<210> 94
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD40_LC--(G4S)3--IFNβ_C17S
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
225 230 235 240
Ser Ser Asn Phe Gln Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
245 250 255
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
260 265 270
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
275 280 285
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
290 295 300
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
305 310 315 320
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
325 330 335
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
340 345 350
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
355 360 365
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
370 375 380
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
385 390 395

Claims (16)

1.一种肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂或其功能片段和干扰素(IFN)或其功能片段的组合，用于在治疗或预防冠状病毒感染中使用。
2.一种干扰素相关的抗原结合蛋白，包括：
(I)激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段，和
(II)干扰素(IFN)或其功能片段，
用于在治疗或预防冠状病毒感染中使用。
3.根据权利要求2所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含：
(a)重链或其片段，所述重链或其片段包含与SEQ ID NO 56具有至少90％同一性的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57具有至少90％同一性的CDRH2和与SEQ ID NO 58具有至少90％同一性的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，所述轻链或其片段包含与SEQ ID NO 52具有至少90％同一性的CDRL1、与SEQ ID NO 53具有至少90％同一性的CDRL2和与SEQ ID NO 54具有至少90％同一性的CDRL3。
4.根据权利要求2或3所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含：
(a)重链或其片段，所述重链或其片段包含与SEQ ID NO 56相同的互补决定区(CDR)CDRH1、与SEQ ID NO 57相同的CDRH2和与SEQ ID NO 58相同的CDRH3；和
(b)轻链或其片段，所述轻链或其片段包含与SEQ ID NO 52相同的CDRL1、与SEQ ID NO53相同的CDRL2和与SEQ ID NO 54相同的CDRL3。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链可变区VL和/或重链可变区VH，VL包含SEQ ID NO 51中所示的序列或与SEQ ID NO 51中所示的序列具有至少90％同一性的序列；VH包含SEQ ID NO 55中所示的序列或与SEQ ID NO 55中所示的序列具有至少90％同一性的序列。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段包含轻链(LC)和/或重链(HC)，所述轻链包含SEQ ID NO 3中所示的序列或与SEQ ID NO 3中所示的序列具有至少90％同一性的序列；所述重链包含选自由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 48组成的组的序列或与它们具有至少90％同一性的序列。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段选自由I型IFN、II型IFN和III型IFN组成的组或它们的功能片段。
8.根据权利要求7所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述I型IFN或其功能片段是IFNα或IFNβ、或它们的功能片段。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段是IFNα2a或其功能片段，并且其中优选所述IFNα2a包含SEQ ID NO 17中所示的序列或与SEQ ID NO 17中所示的序列具有至少90％同一性的序列。
10.根据权利要求2至8中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段是IFNβ或其功能片段，并且其中优选所述IFNβ包含SEQ ID NO 14中所示的序列或与SEQ ID NO 14中所示的序列具有至少90％同一性的序列。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的轻链融合，优选与C末端融合。
12.根据权利要求2至10中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中IFN或其功能片段与所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段的重链融合，优选与C末端融合。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述激动性抗CD40抗体或其激动性抗原结合片段与IFN或其功能片段通过接头相互融合，并且其中优选所述接头包含SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26中所示的序列。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述干扰素相关的抗原结合蛋白是干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段，所述干扰素融合的激动性抗CD40抗体或其干扰素融合的激动性抗原结合片段包含表9、特别是表9A或表9B、更特别是表9A中公开的序列组合之一。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述使用包括通过用编码所述干扰素相关的抗原结合蛋白的RNA或DNA序列或者编码所述干扰素相关的抗原结合蛋白的载体或载体系统进行基因递送，将所述干扰素相关的抗原结合蛋白施用到有此需要的受试者。
16.根据权利要求2至15中任一项所述的用于使用的干扰素相关的抗原结合蛋白，其中所述干扰素相关的抗原结合蛋白包含在药物组合物中。
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