JP2013512200A - Ｉｌ−２に由来する免疫調節ポリペプチド並びに癌及び慢性感染症の治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、全般に、天然型ＩＬ−２の配列中にいくつかの正確な変異を有するヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）の配列と相同性が高い一次配列を有するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、免疫系に対する免疫調節効果を有し、その効果は制御性Ｔ細胞に対して選択的／優先的である。本発明はまた、アミノ酸配列が本明細書で開示されている特定のポリペプチドにも関する。本発明は更に、活性成分として開示されているそのポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。最後に本発明は、癌及び慢性感染症などの疾患に対するその免疫系調節効果に基づく、前記ポリペプチド及び医薬組成物の治療上の使用に関する。

Description

本発明は、生物工学、特に免疫学の分野に関する。本発明は、ヒトの健康に対する治療適用関する技術的解決策に関する。特に本発明は、天然分子の類似体を使用する免疫系の治療的調節に関する。

インターロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞に関して報告された最初の増殖因子であった。その発見以来、ＩＬ−２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞の増殖及び生存を促進し、（Ｓｍｉｔｈ，ＫＡ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４０、１１６９〜７６）ｉｎ ｖｉｖｏにおいてウイルス感染（Ｂｌａｔｔｍａｎ，ＪＮら（２００３）Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、５４０〜７）又はワクチン接種（Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｍ．ら（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１、７２〜８０、Ｋｕｄｏ−Ｓａｉｔｏ，Ｃ．ら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６、１８９７〜９１０；Ｌｉｎ，ＣＴら（２００７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．１１４、８６〜９３）に関連してＴ細胞の免疫応答を増強する強い能力を示した。しかし、このサイトカインが天然型制御性Ｔ細胞Ｔ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）に対する恒常性増殖因子であることを示す数多くの実験的データ（Ａｌｍｅｉｄａ，Ａ．Ｒ．ら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、４８５０〜６０；ｄｅ ｌａ Ｒｏｓａ，Ｍ．ら（２００４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４、２４８０〜８；Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．ら（２００４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４、６６５〜７４）により、近年、Ｔ免疫応答の促進物質としてのＩＬ−２の古典的役割が疑問視されている。

制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞など他のエフェクター細胞の活性及び増殖を抑制する機序において、インターロイキン−２は重要な役割を果たす。特に、制御性Ｔ細胞は他のＴ細胞を抑制し、ＩＬ−２レベルの局所的減少を誘導することが近年提唱されている（Ｐａｎｄｉｙａｎ，Ｐ．ら（２００７）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８、１３５３〜６２）。この抑制効果は、ａ）制御性Ｔ細胞が抑制するエフェクターＴ細胞によるＩＬ−２の産生を直接阻害する制御性Ｔ細胞の能力：（Ａｌｍｅｉｄａ，Ａ．Ｒ．ら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、４８５０６０；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．ら（１９９８）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０、１９６９〜８０；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ａ．Ｍ．ら（１９９８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８、２８７〜９６；Ｗｏｌｆ，Ｍ．ら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１、１６３７〜４５）、ｂ）その微環境において速く、効率的にＩＬ−２を消費する能力（Ｐａｎｄｉｙａｎ，Ｐ．ら（２００７）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８、１３５３〜６２）、及びｃ）ＩＬ−２濃度が低い場合でも制御性Ｔ細胞がより効率的にＩＬ−２を使用できるようになる、ＩＬ−２α鎖受容体を過剰発現させる制御性Ｔ細胞の能力（Ｋｕｎｉｙａｓｕ，Ｙ．ら（２０００）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、１１４５〜５５）に基づいている。

要約すると、ＩＬ−２は極めて多面的なサイトカインであり、このことは様々な細胞集団の生物活性に極めて重要である。この特性によりＩＬ−２は免疫応答の制御において重要な分岐点となり、免疫調節療法にとって魅力的で複雑な標的となる。具体的には、このサイトカインの作用の多面的な性質により、サイトカインは、様々な細胞集団の中で選択的／優先的にこのサイトカインの活性を調節する治療戦略を設計することに極めて重要になる。

ＩＬ−２は、数年間癌治療に使用されてきた。具体的には、高用量でのその使用は、黒色腫及び腎細胞癌の治療のための、数カ国で認可されている治療法である。しかし患者でのＩＬ−２の直接使用は、その毒作用により厳しく制限されている。そのため、適格患者の２０％しか更なる治療を受けず、患者の１７％しか妥当な目標の応答を示さないほどである。臨床段階におけるこの劇的な失敗について考えられる一つの解釈は、天然型ＩＬ−２を用いる治療は、その治療で求められる免疫刺激を妨げる制御性Ｔ細胞集団も刺激する（Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ，Ｍ．ら（２００６）Ｂｌｏｏｄ．１０７、２４０９〜１４）ことである。

ＩＬ−２治療の毒作用を緩和するためにいくつかの戦略が開発された。これらの戦略のいくつかは、主に高親和性受容体（α、β及びγ鎖）を利用し、中程度の親和性受容体（β及びγ鎖）を利用せずにこの分子のシグナル伝達能力を増強するように設計されているＩＬ−２の変異バリアントの使用に基づいている。基本的な着想は、観察された毒作用の原因と考えられる細胞であるＮＫ細胞におけるシグナル伝達に比べて、Ｔ細胞に対する優先的シグナル伝達を促進することである。以下の発明は、同種の業績である：米国特許第７，１８６，８０４号、米国特許第７，１０５，６５３号、米国特許第６，９５５，８０７号、米国特許第５,２２９,１０９号、米国特許出願公開第２００５０１４２１０６号。重要なことには、いずれにせよこれらの発明のいずれも制御性Ｔ細胞の活性を差別的に調節する能力を有するＩＬ−２変異体と関連付けられていないことに留意されたい。さらにこれらの発明における変異体は、ＩＬ−２の作動物質であり本出願に記述されるような拮抗物質／阻害物質ではない。

薬理活性を増加させる目的で、ＩＬ−２の別の変異バリアントが作製された。例えば、ＩＬ−２の折りたたみを改善すること又は血中の変異バリアントの寿命を増加させること。とりわけ以下の発明はこの種の業績に関する：米国特許第４，９５９，３１４号、米国特許第５，１１６，９４３号、米国特許第４，８５３，３３２号。また、これらの変異体のいずれも、制御性Ｔ細胞の活性を差別的に調節する能力を示さない。

その他の従来の発明は、主に自己免疫疾患の治療又は臓器移植拒否反応を予防するためのＩＬ−２の活性の阻害物質に関する。これらの発明のうちには以下のものがある：米国特許第５，８７６，７１７号、米国特許第５，６３５，５９７号、米国特許第６，９０６，１７０号、米国特許第６，１６８，７８５号。

最後に、文献には、ｉｎ ｖｉｖｏで制御性Ｔ細胞の活性を調節又は減弱させることを提唱する治療薬の提案が多数あることに言及しなければならない（Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００９）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｍ Ｄｅｓ．１５、２６５２〜６４；Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｔ．、Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｒ．、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｔ．Ｊ．、Ｇｒｏｓｅｎｂａｃｈ，Ｄ．Ｗ．、Ｓｃｈｌｏｍ，Ｊ．及びＰａｌｅｎａ，Ｃ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ．１１０、３１９２〜２０１；Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ａ．、Ｈｏｂｅｉｋａ，Ａ．Ｃ．、Ｏｓａｄａ，Ｔ．、Ｓｅｒｒａ，Ｄ．、Ｎｉｅｄｚｗｉｅｃｋｉ，Ｄ．、Ｌｙｅｒｌｙ，Ｈ．Ｋ．及びＣｌａｙ，Ｔ．Ｍ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ．１１２、６１０〜８；Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｓ．、Ｔａｗａｒａ，Ｉ．、Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．、Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．及びＮａｋａｙａｍａ，Ｅ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９、３１２８３３；Ｑｕｅｚａｄａ，Ｓ．Ａ．、Ｐｅｇｇｓ，Ｋ．Ｓ．、Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．及びＡｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（２００６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１６、１９３５〜４５）。これらの治療薬は、直接癌治療のため又はワクチンの効果を増強するために動物モデル及び患者においても試験されてきた。ＩＬ−２の活性を調節すること、具体的にはモノクローナル抗体を用いてより良好な又はより有効な免疫応答を促進することを提唱するいくつかの報告もある（Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．、Ｋｏｖａｒ，Ｍ．、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｕｒｈ，Ｃ．Ｄ．及びＳｐｒｅｎｔ，Ｊ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１１、１９２４〜１９２７；Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．、ら（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．６、１３２３〜３１；Ｋａｍｉｎｕｒａ，Ｄ．、ら（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７、３０６〜１４；Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．、Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ａ．、Ｂｅｎｄｅｒ，Ｊ．、Ｋａｐｐｌｅｒ，Ｊ．及びＭａｒｒａｃｋ，Ｐ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９９、８８３２〜７；Ｔｏｍａｌａ，Ｊ．、Ｃｈｍｅｌｏｖａ，Ｈ．、Ｍｒｋｖａｎ，Ｔ．、Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．及びＫｏｖａｒ，Ｍ．（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３、４９０４〜４９１２）。しかし、我々の知識の及ぶ限りではＩＬ−２の変異バリアントに関しては文献に報告されておらず、それにより制御性Ｔ細胞活性の選択的又は優先的な調節にこの変異バリアントを使用する可能性が支持される。具体的には、ＩＬ２変異タンパク質は、制御性Ｔ細胞に対してＩＬ２の活性と選択的／優先的に拮抗することができるので、その機能に影響を及ぼし、結果として免疫応答の治療的増強を促進することができる。

本発明は、ＩＬ−２の変異バリアントが制御性Ｔ細胞を優先的に阻害できるということを証明する科学的所見に基づいている。発明者らは、ＩＬ−２の変異バリアントは制御性Ｔ細胞（Ｔ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の活性を実質的に阻害できるが、エフェクター機能を有する他のリンパ球の活性化及び／又は増殖にはほとんど影響を及ぼさないことをｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で初めて発見した。この発見は、制御性Ｔ細胞が関連する癌又は慢性感染症などの疾患において、これらの細胞を免疫調節する新たな戦略の基礎を提供する。

本発明は、異なる形のＩＬ−２受容体を経由するシグナル伝達能力を除去又は実質的に減少させることによっていくつかのアミノ酸が変異を起こしているという事実を除いて、一次配列をヒトＩＬ−２と共有するポリペプチドに関する。

ＩＬ−２のこれらの変異バリアントは、ＩＬ−２受容体の１つ又は複数の構成要素に結合する能力を維持し、制御性Ｔ細胞集団に対して優先的に見られる阻害活性を有し、ここで、これらの変異バリアントは制御性Ｔ細胞集団の機能を負に調節する。制御性Ｔ細胞に対する優先的阻害特性を備えるＩＬ−２変異体のいくつか特定のバリアントを保護する。本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性と関連する癌又は慢性感染症などの疾患を治療するために、単独又はワクチンと組み合わせて使用されるこれらの変異バリアントの治療上の使用も含む。

本発明は、制御性Ｔ細胞による抑制が、天然に又はワクチン接種により誘導される防御免疫応答を減弱させる疾患において、制御性Ｔ細胞の活性を調節するための新たな戦略を提唱する。Ｔｒｅｇ活性を調節するための他の諸案に比べて、この新たな治療戦略には数多くの利点がある。例えば、
・ＩＬ−２変異体は、（いくつかの変異を除いて）実質的に自己タンパク質である。この事実は、予想外の毒性の危険性（小型阻害剤に基づく戦略において一般的である）又は注射した薬物に対して免疫応答が上昇する危険性（ＩＬ−２がジフテリア毒素のような外来性且つ有毒性の分子と結合しているオンタックなどの戦略において起こりうるような）を減少させる。
・ＩＬ−２のこれらの変異バリアントは、少なくとも天然型ＩＬ−２の親和性の程度（高親和性受容体に対して１０ｐＭ）であるＩＬ−２の受容体に対する結合親和性を維持しうる。この親和性は、モノクローナル抗体又は他の薬物を用いて受容体又はリガンドを阻害する戦略では達成が困難である。
・これらの変異体は小さい（１５ｋＤ）ため高い移動性を有し、容易に腫瘍微環境を透過できる可能性がある。抗体などのより大きな分子複合体になることが知られている何かである。

ＩＬ−２の類似体ポリペプチドの入手。
本発明は、１００〜５００アミノ酸のポリペプチド、好ましくはそのサイズが１４０アミノ酸でありその見かけの分子量が少なくとも１５ｋＤであるポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、天然型ＩＬ２との高レベルの配列同一性（９０％以上の同一性）を維持し、この配列のある領域中にポリペプチドは、天然型ＩＬ−２に対して２〜６個の変異を含む。

これらの位置には、天然型ＩＬ−２の同位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸残基を挿入することによって、これらのポリペプチドを変異させる。元の残基と置き換える残基は、元のアミノ酸残基のものとは大きく異なる物理化学的特性、特に有極性から無極性へ、荷電性から無荷電性へ、大きいものから小さいものへ、酸から塩基へ変化する物理化学的特性を有するという理由で選択される。

本発明のこれらのポリペプチドを、区別せずに、免疫調節ポリペプチド、ＩＬ−２の類似体又はＩＬ−２の変異タンパク質と呼ぶこともできる。これらのポリペプチドは、ＩＬ−２の３次元構造（ＰＤＢデータベースに蓄積されている）から設計し、溶媒に著しく露出しているアミノ酸に相当するＩＬ２の位置にのみ変異を導入する。これらの位置は、ＲＡＳＭＯＬ、ＳｗｉｓｓＰＤＢｖｉｅｗｅｒなどのパブリックドメインの生物情報科学プログラムを使用して特定する。

本発明のポリペプチドはいくつかの方法、とりわけタンパク質合成法によって得ることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など細菌の封入体中に発現させるなど遺伝子工学的技術によってこれらのポリペプチドを得ることも可能である。特定の位置における点変異は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して定方向突然変異誘発技術によって得ることもできる。

生物活性に基づくＩＬ−２の類似体ポリペプチドの選抜：
ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施することにより、次の特性を同時に有するように本発明のポリペプチドを選抜する
１）ＩＬ−２のこれらの変異バリアントは、異なる形のＩＬ−２受容体に対するシグナル伝達能力を緩める又は実質的に減少させる。ＣＴＬＬ２又はＫｉｔｔ２２５のようなＩＬ−２依存的細胞系を用いる、或いはマウス及び／又はヒト由来のＴリンパ球又はＮＫ細胞を用いるｉｎ−ｖｉｔｒｏ増殖アッセイで、この特性を直接評価することができる。このアッセイにおいて、これらの変異体は、天然型ＩＬ−２の刺激活性より少なくとも１００倍低い刺激活性を有するべきである。
２）ＩＬ−２のこれらの変異バリアント（変異タンパク質）は、ＩＬ−２受容体の１つ又は複数の分子成分に結合する能力を維持する。この結合能力は、受容体のα鎖及びβ鎖など市販の受容体の鎖に対するＥＬＩＳＡ法で直接的に、又は受容体に陽性の細胞集団で間接的に評価することができる。このアッセイにおいて、ＩＬ−２変異タンパク質の認識率は、天然型ＩＬ−２の認識率と同等であるべきである。
３）ＩＬ−２の変異バリアントは、リンパ球に対する天然型ＩＬ−２活性の阻害活性を有し、その活性は制御性Ｔ細胞集団（少なくともＴ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞において）に対して優先的である。本発明に含まれるＩＬ−２の変異タンパク質は、或る濃度範囲内でヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞などエフェクター機能を備える他のリンパ球の活性及び／又は増殖に影響を及ぼすことなく、或いはこれに対して最小限の影響のみで優先的に又は選択的に制御性Ｔ細胞の活性又は増殖を阻害することができる。いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験でこれらの変異タンパク質の優先的又は選択的阻害活性を証明することができ、この試験により増量させた変異タンパク質の存在下、エフェクター及び制御性集団の混合物の刺激に対する応答が分析される。適切な濃度範囲において、変異タンパク質は、この実験で使用したエフェクター集団、例えばヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの活性又は増殖を阻害するよりも少なくとも３倍以上制御性Ｔ細胞の増殖又は活性を阻害することが可能であるべきである。

本発明はまた、ＩＬ−２変異タンパク質のうちいくつか特定のバリアント（表１に開示されている特定の変異）を含み、それらは前述の特性を有するように選抜された。これらの変異タンパク質は、マウス及びヒトリンパ球を刺激する能力を著しく減弱させる複数のアミノ酸の置換を含む。しかし、変異タンパク質は、受容体のα鎖及びβ鎖に結合する能力を完全に維持したまま、天然型ＩＬ−２活性の阻害能力（拮抗物質）を獲得する。これらの変異タンパク質の最も重要な態様は、制御性Ｔ細胞及び他のエフェクターＴ細胞を含有するリンパ球の培養液中で、或る濃度範囲で、これらのタンパク質が制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を優先的に阻害する著しい能力を発揮することである。

本発明はまた、上記ＩＬ−２変異体の種類の追加の修飾、具体的には表１に開示するそれも含む。ＩＬ−２の優先的阻害特性に影響を及ぼすことなく又はいっそう強化しながら、ＩＬ−２の特定の構成要素に対するその親和性を増加させるために、或いはそれらのｉｎ−ｖｉｖｏ薬力学を改善する（寿命の増加）又はＴ細胞によるその内部移行を減少させるために。生物情報科学ツールを用いることによって又は異なる性格のコンビナトリアル分子ライブラリ（ファージディスプレイライブラリ、酵母又は細菌の遺伝子発現ライブラリ）を使用することによって、合理的な設計でこれらの追加の変異を得ることができる。

ＩＬ−２類似体ポリペプチドの治療適用；
本発明は、活性成分として本発明に開示されているＩＬ−２変異タンパク質及びその類似体を含む医薬組成物、並びに制御性Ｔ細胞に対するＩＬ−２の活性を選択的に調節するための潜在的な治療への応用も含む。具体的に本発明は、制御性Ｔ細胞が特に関連する癌又は慢性感染症などの疾患において、自然に又はワクチンによって誘導される免疫応答を促進するためにこれらの変異タンパク質を使用することを保護する。

治療に使用する際は、本発明のポリペプチドは、独立に或いはその治療効果を促し、又は増強する他のポリペプチド又は他の物質と組み合わせて疾患保因者に投与されるべきである。投与経路は、薬物の非経口投与に関する先行技術に記載されているいずれかの投与経路であってよい。ポリペプチドは、好ましくは静脈内、筋肉内、皮下又は腫瘍内経路によって投与することができる。

本発明に記載のポリペプチド又は融合タンパク質はまた、癌及び慢性感染症の治療に有用な医薬組成物の一部として投与されることもできる。

所望の治療効果を得るためには、本発明のポリペプチドは、試験中の疾患に対してリンパ節又は関連する周辺部位において適切な濃度を確保するために十分高い用量で投与されるべきであり、変異タンパク質が制御性Ｔ細胞に対して優先的阻害効果を示すのに適切な濃度範囲にあるべきである。したがって、適用する用量は、試験において疾患型及び投与経路に照らして調整されなければならない。例えば腫瘍治療の場合、腫瘍及び／又は局所限局リンパ節内の変異体の濃度が制御性Ｔ細胞に対して優先的阻害効果を確保するのに適切になるまで用量を調整するべきである。検討すべき用量範囲は、１用量につき数十マイクログラム〜数ミリグラムの範囲にあることができる。

適用される投与回数は、問題とする変異タンパク質の体内分布によっても調整されるべきである。一般に、上述した有効濃度は、２日間〜連続３０日間の範囲の期間にわたって維持されるべきである。例えば、変異タンパク質が担体タンパク質に結合している場合、投与頻度はそれに応じて調整されるべきであることに留意されたい。治療効果は、病徴の完全又は部分的寛解を意味する。癌については、腫瘍体積の減少又は再発までの時間の増加がとりわけ寛解基準として検討されることになる。最後に、Ｔｒｅｇの活性を調節するためのこの新たな治療戦略の利点は、他の諸案と比較すると複数ある点に留意されたい。例えば：
・ＩＬ−２変異体は、（いくつかの変異を除いて）実質的に自己タンパク質である。この事実は、予想外の毒性の危険性（小型阻害剤に基づく戦略において一般的である）又は注射した薬物に対して免疫応答が上昇する危険性（ＩＬ−２がジフテリア毒素のような外来性且つ有毒性の分子と結合しているオンタックなどの戦略において起こりうるような）を減少させる。
・ＩＬ−２のこれらの変異バリアントは、少なくとも天然型ＩＬ−２の親和性の程度（高親和性受容体に対して１０ｐＭ）であるＩＬ−２の受容体に対する結合親和性を維持しうる。この親和性は、モノクローナル抗体又は他の薬物を用いて受容体又はリガンドを阻害する戦略では達成が困難である。
・これらの変異体は小さい（１５ｋＤ）ため高い移動性を有し、容易に腫瘍微環境を透過できる可能性がある。抗体などのより大きな分子複合体になることが知られている何かである。

（例１）
Ｗａｎｇ，Ｘ．、Ｒｉｃｋｅｒｔ，Ｍ．及びＧａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．による報告書である「α、β、及びγ受容体とインターロイキン−２の四成分複合体構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ａｌｐｈａ、ｂｅｔａ、ａｎｄ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５、３１０（５７５１）：１１５９〜６３ページ中に報告されている受容体と結合したヒトＩＬ−２の四成分複合体の構造を基準として使用し、パブリックドメインのタンパク質−リガンド相互作用用のエネルギー算出アルゴリズムを使用して、変異体を生物情報科学技術より計算機的に設計した。最初に、受容体のα鎖及びβ鎖の結合能力に影響を及ぼさないように変異タンパク質の様々な変異体を予測した。これらの変異タンパク質を、アミノ末端に６個のヒスチジンから成る識別配列を含むｐＥＴ２８ａベクター中の遺伝的構築体から大腸菌で発現させた。逆相を使用してこれらの変異タンパク質を精製し（図１）、高純度（＞９５％）で得た。得られた変異タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験における特性に従って選抜した。表１の構築した変異タンパク質のうち、Ｔｒｅｇの活性を優先的に阻害する特性を有する一組の特定の変異について記述する。

（例２）
選抜した変異タンパク質は、ＩＬ２受容体の様々な構成要素、特に受容体のα鎖及びβ鎖へ結合する能力を保持する。図２は、表１に明記されている変異体のいくつかが、ヒトＩＬ−２受容体のα鎖（図２）及びβ鎖（図２ｂ）へ結合する能力を実質的に完全に維持することを、ＥＬＩＳＡ法を使用して示す。図３は、これらの変異体が細胞表面上で受容体に結合し（図３ａ）、天然型ＩＬ−２を添加することによってこの結合体が徐々に置き換えられ得ること（図３ｂ）の追加的な確認を示す。

（例３）
選抜した変異タンパク質は、ＩＬ−２受容体によるシグナル伝達能力を著しく減少させる。図３は、ＣＴＬＬ２細胞系の増殖を刺激する能力（図４ａ）又は総脾臓リンパ球由来ＮＫ細胞の分化を刺激する能力（図４ｂ）を測定することによって、この事実を例示する。これらの変異タンパク質は高濃度で、Ｔリンパ球（図５ａ）及びＮＫ細胞（図５ｂ）の両方に対する天然型ＩＬ−２の活性を阻害する。

（例４）
選抜した変異タンパク質は、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を優先的に阻害する。図６は、表１の変異体のうちの１つに関するこの特性を例示し、具体的には抗ＣＤ３抗体を用いて刺激したエフェクター細胞及び制御性Ｔ細胞の混合物が存在するリンパ球細胞培養液中に中間用量の変異タンパク質を添加すると、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−エフェクター集団の増殖に著しい影響を及ぼすことなくＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋の増殖は実質的に阻害されるということを示す。

（例５）
選抜した変異タンパク質を、培養液中の制御性Ｔ細胞によって優先的に分離して、エフェクターＴ細胞の活性に影響を及ぼすその能力を減少させる。精製し抗ＣＤ３抗体を用いて刺激したＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−ヘルパーＴ細胞集団によって内生的に産生させたＩＬ−２に媒介されるシグナル伝達（刺激）を、これらの変異タンパク質は阻害する。しかし、これらの培養液にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の量を増加させて添加すると、変異体によって媒介される、Ｔエフェクター集団に対する阻害が逆に減少する（図７）。この効果は、Ｔ制御性集団に対するＩＬ−２の活性を優先的に阻害することが報告されている変異タンパク質の能力で説明される。制御性Ｔ細胞は少量しか存在しなくても、変異体の活性をこの細胞に向かわせ、それによりエフェクター集団における変異タンパク質の抑制活性を減弱させる。

（例６）
選抜した変異タンパク質は、移植性腫瘍マウスモデルで抗腫瘍活性を示す。図８は、表１の変異タンパク質の１つについて記述された特性を示す。右側腹の皮下に移植した黒色腫ＭＢ１６Ｆ１０細胞系を用いる原発腫瘍モデルで、変異タンパク質を評価した。図８は、変異タンパク質で処理したマウスの腫瘍体積の減少を、ＰＢＳで処理した対照群と比較して示す。さらに、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で処理した対照群が含まれたので、この実験系がＴｒｅｇ細胞の枯渇を感知できることを示す。

ヒトＩＬ−２変異バリアントの産生及び精製を示す図である。ａ：遺伝子操作構築体を用いて形質導入した大腸菌株における、いくつかの変異バリアント及び対照の天然型ＩＬ−２の発現を示すウェスタンブロットの図である；ｂ：逆相精製を使用して得た典型的精製プロファイルの一例を示す図である。 表１に記載の変異タンパク質のいくつかによるＩＬ−２受容体α鎖（ａ）及びβ鎖（ｂ）の認識をＥＬＩＳＡ法で評価した図である。天然型ＩＬ−２を陽性対照として使用している。図に示すように、試験した全ての変異タンパク質が、天然型ＩＬ−２の認識率と同等の認識率を維持する。 表１に記載の変異タンパク質のいくつかの、細胞表面においてＩＬ−２受容体に結合する能力をフローサイトメトリーによって評価した図である。特にマウスＣＴＬＬ２細胞系に対する。これらの分子の遺伝的構築体に含まれるヒスチジンから成る頭部を認識する抗６−Ｈｉｓ−ＰＥ抗体を用いて、細胞表面上の変異タンパク質及び対照の天然型ＩＬ−２の両方を検出した。ａ）：検出された直接結合レベルを示すヒストグラムである。ｂ）：天然型ＩＬ−２の量を増加させて添加することに起因する細胞に結合している変異タンパク質の減少を、検出される蛍光の平均強度の減少によって測定した図である（この分子のバリアントにはヒスチジン頭部が無いので染色を妨げない）。 表１に記載の変異タンパク質のいくつかのシグナル伝達能力を評価した図である。ａ）：ＭＴＴを使用する比色分析アッセイによって測定するＣＴＬＬ２細胞系の増殖アッセイにおける、変異タンパク質の活性を評価した図である。ｂ）：変異タンパク質を、マウス総脾細胞由来のＮＫ１．１＋細胞の分化試験でも評価した図である。いずれの場合においても、全く同じ実験系（同じ遺伝的構築体、大腸菌産生株、精製系）で産生される対照の天然型ＩＬ−２に対して、変異タンパク質の刺激能力を比較する。図３ａで示した結果と同様の結果が、Ｋｉｔｔ２２５細胞系で得られ、ただし受容体系はヒトである。 表１に記載の変異タンパク質のいくつかの、天然型ＩＬ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を阻害する能力を評価した図である。ａ：変異タンパク質の濃度増加による、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（クローン２Ｃ１１、１０μｇ／ｍＬ）で刺激した総神経節リンパ球の増殖の阻害を示す図である。ｂ：培養液に変異タンパク質の量を増加させて添加することによる、５００ＩＵ／ｍＬの天然型ＩＬ−２で刺激したマウス総脾細胞由来ＮＫ１．１＋細胞の分化の阻害を示す図である。 ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋リンパ球を優先的に阻害する変異タンパク質の能力を評価した図である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、指示量のＭ１変異タンパク質（表１に参照される通り）の存在下にマウスリンパ節リンパ球を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（クローン２Ｃ１１、１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。培養７２時間後に、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋制御性リンパ球及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３エフェクターリンパ球の生存数を、参照ビーズを使用してフローサイトメトリーで定量した。ａでのグラフは、制御性細胞集団及びエフェクター細胞集団を区別するために使用したフローサイトメトリーにおける塩基性染色を示す。ｂでのグラフは、様々な量の変異タンパク質を添加することによって誘導される、増殖阻害レベルを示す。変異タンパク質の非存在下で回復した生細胞数に基づいて、この阻害率を算出する。ｂに示すように、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性集団の阻害率が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ヘルパーＴ細胞又はエフェクターＴ細胞の場合よりもさらに著しいＭ１変異タンパク質の中程度の濃度範囲がある。 設計したＩＬ−２変異タンパク質を優先的に分離して、エフェクターＴ細胞に対する阻害効果によってエフェクターＴ細胞を解放する制御性Ｔ細胞の能力の評価を示す図である。エフェクターＴ細胞ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−をＣＦＳＥで標識した磁気ビーズを使用して精製し、一部を変異タンパク質の存在下（Ｍ１変異タンパク質のグラフ、２種類の異なる濃度１０μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬ）で、及び一部を変異タンパク質の非存在下で培養液に入れ、抗ＣＤ３抗体（クローン２Ｃ１１、１０μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。様々な量の精製した制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を、これらの培養物に添加した。グラフ６ａは、磁気ビーズ分離法で得た高レベルの純度を示す（Ｔｒｅｇが９２％及びエフェクターＴ細胞が９７％）。図６ｂは、ＣＦＳＥ希釈法によって測定されるエフェクター細胞の増殖レベルを、培養液中の様々な量の制御性細胞に対して示す。Ｔｒｅｇの非存在下で見られるように、変異タンパク質が存在するとエフェクター細胞の増殖に実質的な影響（阻害効果）があるが、Ｔｒｅｇを添加するにつれてＴｒｅｇが変異タンパク質を優先的に分離してエフェクター細胞をその阻害効果から解放するので、エフェクターＴ細胞の増殖が回復する。 黒色腫ＭＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞系による原発腫瘍モデルを使用するＩＬ−２変異タンパク質の直接的な抗腫瘍効果を評価した図である。１２匹のＣ５７ＢＬ６マウスを使用し、マウスを各４匹の３群に分配した。−５日目〜０日目にすべての処理を皮下に行った。群１は２００・LのＰＢＳを受け、群２は１００μｇの抗ＣＤ２５ＭＡｂを受け、群３は２００μｇのＩＬ−２変異タンパク質を受けた。０日目に、全てのマウスは右側腹に２５００００個の細胞を受けた。３０日目まで２日毎に腫瘍体積を測定した。分散分析検定及び多重比較ボンフェローニー検定を使用してデータを分析した。ＩＬ−２変異タンパク質は抗ＣＤ２５ＭＡｂとして、腫瘍成長に著しい遅延をもたらした（ｐ＜０．００１）。

Claims (28)

1. 天然型ＩＬ−２の配列に関していくつかの点変異を含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏで制御性Ｔ細胞に対するＩＬ−２の活性を優先的に阻害する特性を有する、ＩＬ−２に由来する免疫調節ポリペプチド。
2. 天然型ＩＬ−２の配列内にいくつかの変異を含み、それにより天然型制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）に対するＩＬ−２の活性を選択的及び優先的に阻害できる、請求項１に記載のポリペプチド。
3. ｉｎ ｖｉｖｏで制御性Ｔ細胞を優先的に阻害する能力を特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 変異Ｑ２２Ｖ、Ｑ１２６Ａ、及びＳ１３０Ｇ Ｉ１２９Ｄを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 変異Ｌ１８Ｎ、Ｑ１２６Ｙ及びＳ１３０Ｒを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
6. 変異Ｑ１３Ｙ、Ｑ１２６Ｙ、Ｉ１２９Ｄ及びＳ１３０Ｒを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
7. 変異Ｌ１８Ｎ、Ｑ２２Ｖ、Ｔ１２３Ａ、及びＳ１３０Ｒ Ｉ１２９Ｄを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
8. 担体タンパク質と結合した請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫調節ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
9. 担体タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質。
10. 担体タンパク質が、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域であることを特徴とする、請求項９に記載の融合タンパク質。
11. 慢性疾患の治療に有用な医薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. 癌治療に有用な医薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. 慢性感染症の治療に有用な医薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
14. 活性成分として請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、癌及び慢性感染症の治療に有用な医薬組成物。
15. 活性成分として請求項４に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 活性成分として請求項５に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
17. 活性成分として請求項６に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
18. 活性成分として請求項７に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
19. 活性成分として請求項８〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むことを特徴とする、癌及び慢性感染症の治療に有用な医薬組成物。
20. 慢性疾患の治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
21. 癌治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
22. 慢性感染症の治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
23. 慢性疾患の治療のための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
24. 癌治療のための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
25. 慢性疾患の治療のための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
26. 免疫系を調節する医薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
27. ＩＬ−２受容体の様々な構成要素に対する結合親和性を増加させる新しい変異を導入する場合の、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド及びその適用。
28. ＩＬ−２受容体の異なる構成要素に対する結合親和性を増加させる新しい変異を導入する場合の、請求項４、５、６、７に記載のポリペプチド及びその適用。

Images