ES2643465T3

ES2643465T3 - Polipéptidos inmunomoduladores derivados de IL-2 y su uso terapéutico contra el cáncer e infecciones crónicas

Info

Publication number: ES2643465T3
Application number: ES10803437.2T
Authority: ES
Inventors: Kalet LEÓN MONZÓN; Tania Carmenate Portilla; Karina GARCÍA MATÍNEZ; Agustín Bienvenido LAGE DÁVILA; Saumel PÉREZ RODRIGUEZ; Diamile GONZÁLEZ ROCHE; Gabriel MÁRQUEZ PERERA
Original assignee: Centro de Immunologia Molecular
Current assignee: Centro de Immunologia Molecular
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2017-11-23
Anticipated expiration: 2030-11-26
Also published as: BR112012012025A2; CA2781173A1; EA021867B1; KR20120106728A; AR079197A1; CN102665754B; JP2013512200A; CO6501124A2; BR112012012025B8; HK1169961A1; AU2010324254B2; MY162324A; TN2012000182A1; EA201290395A1; BR112012012025B1; CN102665754A; NZ599792A; MX2012006077A; WO2011063770A2; SG181089A1

Abstract

La presente invención se relaciona en general con polipéptidos cuya secuencia primaria tiene una alta homología con la secuencia de la Interleucina 2humana(IL-2) con algunas mutaciones puntuales en la secuencia de la IL-2nativa.Los polipéptidos de la presente invención tienen un efecto inmunomodulador sobre el sistema inmune, que es selectivo/preferencial sobre célulasT reguladoras. La presente invención también se relaciona con polipéptidos específicos cuya secuencia de aminoácidos es divulgada en la presente invención. En otro aspecto la presente invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo los polipéptidos divulgados. Por último la presente invención se relaciona con el uso terapéutico de los polipéptidos y composiciones farmacéuticas divulgados dado su efecto modulador del sistema inmune sobre patologías como cáncer y enfermedades infecciosas crónicas.

Description

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DESCRIPCION

Polipeptidos inmunomoduladores derivados de IL-2 y su uso terapeutico contra el cancer e infecciones cronicas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la biotecnologfa y particularmente a la inmunologfa. La invencion se refiere a soluciones tecnicas con aplicaciones terapeuticas para la salud humana. Se refiere en particular a la modulacion terapeutica del sistema inmune utilizando analogos de moleculas naturales.

Estado de la tecnica

La interleuquina 2 (IL-2) fue el primer factor de crecimiento descrito para las celulas T. Desde su descubrimiento mostro una fuerte capacidad para promover la proliferacion y supervivencia de celulas T in vitro (Smith, KA (1988) Science 240, 1169-76) y para mejorar la respuesta inmune de las celulas T in vivo, en el contexto de infecciones vmales (Blattman, JN et al., (2003) Nat Med 9, 540-7) o vacunas (Fishman, M., et al., (2008) J Immunother. 31, 7280; Kudo-Saito, C, et al., (2007) Cancer Immunol Immunother 56, 1897-910; Lin, CT, et al., (2007) Immunol Lett., 114, 86-93). Sin embargo, este papel clasico de la IL-2 como promotor de la respuesta inmunitaria T ha sido cuestionado recientemente por numerosos datos experimentales (Almeida, AR, et al., (2002) J Immunol. 169, 485060; de la Rosa, M., et al., (2004) Eur J Immunol. 34, 2480-8; Malek, T.R. et al., (2004) Nat Rev. Immunol. 4, 665-74) que muestran que esta citoquina es un factor de crecimiento homeostatico para la regulacion natural de celulas T CD4+CD25+FoxP3+ (Tregs).

La interleuquina 2 es un actor principal en el mecanismo mediante el cual las celulas T reguladoras suprimen la actividad y la expansion de otras celulas efectoras tales como celulas T auxiliares CD4, celulas T citotoxicas CD8 y celulas nK. Espedficamente, se ha propuesto recientemente que las celulas T reguladoras suprimen a otras celulas T, induciendo la disminucion local en los niveles de IL-2 (Pandiyan, P., et al., (2007) Nat Immunol, 8, 1353-62). Este efecto supresor se basa en: a) su capacidad para inhibir directamente la produccion de IL-2 por las celulas T efectoras que suprimen: (Almeida, AR, et al., (2002) J Immunol 169, 485060; Takahashi, T et al., (1998) Int. Immunol., 10, 1969-80; Thornton, AM, et al., (1998) J Exp Med. 188, 287-96; Wolf, M., et al., (2001) Eur J Immunol., 31, 1637-45); b) la capacidad de consumir rapida y eficientemente la IL-2 en su microambiente (Pandiyan, P., et al., (2007) Nat Immunol., 8, 1353-62); y c) su capacidad para sobreexpresar el receptor de la cadena alfa de IL-2 (Kuniyasu, Y., et al., (2000) Int Immunol. 12, 1145-55), que les permite usar la IL-2 mas eficientemente cuando sus concentraciones son bajas.

Resumiendo, la IL-2 es una citoquina altamente pleiotropica que es muy significativa para la actividad biologica de diferentes poblaciones celulares. Esta propiedad hace que la IL-2 sea un nodo importante en la regulacion de la respuesta inmune, convirtiendola en un objetivo atractivo y complejo para las terapias de modulacion inmune. En particular, la naturaleza pleiotropica de la accion de esta citoquina, la hace muy significativa para el diseno de estrategias terapeuticas que modulan de manera selectiva /preferencial la actividad de esta citoquina en diferentes poblaciones celulares.

La IL-2 se ha utilizado durante varios anos en la terapia del cancer. En particular, su uso en dosis altas es un tratamiento aprobado en varios pafses para el tratamiento de melanoma y carcinoma de celulas renales. Sin embargo, el uso directo de IL-2 en pacientes esta severamente limitado por los efectos toxicos. Tanto es asf que solo el 20% de los pacientes elegibles recibieron terapia adicional y solo el 17% de los pacientes muestran una respuesta objetiva relevante. Una posible explicacion de este dramatico fracaso en la etapa clmica es que la terapia con IL-2 nativa tambien estimula las poblaciones de celulas T reguladoras (Ahmadzadeh, M., et al., (2006) Blood, 107, 2409-14), que obstaculizan la inmunoestimulacion perseguida con eso.

Se han desarrollado varias estrategias para mitigar los efectos toxicos de la terapia con IL-2. Algunas de estas estrategias se basan en el uso de variantes mutadas de IL-2, disenadas para aumentar la capacidad de senalizacion de esta molecula principalmente por medio del receptor de alta afinidad (cadenas alfa, beta y gamma) y no por medio del receptor intermedio de afinidad (cadenas beta y gamma). La idea basica es promover la senalizacion preferencial en celulas T frente a la senalizacion en celulas NK, que son las celulas que se cree que son responsables de los efectos toxicos observados. Las siguientes invenciones estan en la misma lmea de trabajo: las patentes estadounidenses Nos. 7,186,804, 7.105.653, 6.955.807, 5.229.109, la solicitud de patente estadounidense No. 20050142106. Es importante observar de todos modos que ninguna de estas invenciones esta relacionada con mutantes de IL-2 con la capacidad de modular diferencialmente la actividad de las celulas T reguladoras. Ademas, los mutantes en estas invenciones son agonistas de la IL-2 y no antagonistas/inhibidores tales como los descritos en esta solicitud.

Se han creado otras variantes mutadas de la IL-2 con el fin de aumentar su actividad farmacologica. Por ejemplo, mejorando su plegado o aumentando su vida util en sangre. Entre otras, las siguientes invenciones estan relacionadas con esta lmea de trabajo: las patentes estadounidenses Nos. 4.959.314, 5.116.943, 4.853.332. De nuevo, ninguno de estos mutantes ha demostrado capacidad para modular diferencialmente la actividad de las

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celulas T reguladoras.

Otras invenciones existentes se refieren a inhibidores de la actividad de IL-2, principalmente para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o para prevenir el rechazo de trasplante de organos. Entre estas invenciones se encuentran: las patentes estadounidenses Nos. 5.876.717, 5.635.597, 6.906.170, 6.168.785.

Por ultimo, debe hacerse referencia a que en la bibliograffa hay muchas propuestas de agentes terapeuticos (Kreitman, RJ (2009) Curr Pharm Des. 15, 2652-64; Litzinger, MT, Fernando, R., Curiel, TJ, Grosenbach, DW, Schlom, J. y Palena, C. (2007) Blood. 110, 3192-201; Morse, MA, Hobeika, AC, Osada, T., Serra, D., Niedzwiecki, D., Lyerly, Hk y Clay, tM (2008) Blood, 112, 610-8; Onizuka, S., Tawara, I., Shimizu, J., Sakaguchi, S., Fujita, T. y Nakayama, E. (1999) Cancer Res. 59, 312833; Quezada, SA, Peggs, KS, Curran, MA y Allison, JP (2006) J Clin Invest. 116, 1935-45) que proponen modular o reducir la actividad de celulas T reguladoras in vivo. Estos agentes terapeuticos han sido ensayados en modelos animales e incluso en pacientes para terapia directa del cancer o para mejorar el efecto de las vacunas. Tambien hay algunos informes que proponen modular la actividad de IL-2, particularmente con anticuerpos monoclonales (Boyman, O., Kovar, M., Rubinstein, MP, Surh, CD y Sprent, J. (2006) Science 311, 1924-1927; Boyman, O., et al., (2006) Expert Opin Biol Ther. 6, 1323-31; Kamimura, D. et al. (2006) J Immunol. 177, 306-14; Murakami, M., Sakamoto, A., Bender, J., Kappler, J. y Marrack, P. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 8832-7; Tomala, J., Chmelova, H., Mrkvan, T., Rihova, B. y Kovar, M. (2009) J Immunol. 183, 4904-4912), para promover respuestas inmunes mejores o mas eficaces. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay ningun informe en la bibliograffa sobre las variantes mutadas de la IL-2, que apoyan la posibilidad de su uso para modular, selectiva o preferentemente, la actividad de las celulas T reguladoras. En particular, las mutemas de IL2 capaces de antagonizar de forma selectiva/preferencial la actividad de IL2 en celulas T reguladoras, afectando asf su funcion y promoviendo en consecuencia una potenciacion terapeutica de respuestas inmunes.

Liu et al. 2009, J. Immunother. 32 (9), 887-894, divulgan variantes de IL-2 que comprenden varias mutaciones puntuales con respecto a la IL-2 nativa y tienen la propiedad de inhibir la actividad de IL-2 por antagonizacion del receptor de IL-2 in vitro, preferentemente en las celulas T reguladoras.

Breve descripcion de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones. La presente invencion se basa en el descubrimiento cientffico que demuestra que las variantes mutantes de IL-2 pueden ejercer una inhibicion preferencial sobre las celulas T reguladoras. Los inventores descubrieron por primera vez en experimentos in vitro que las variantes mutadas de IL-2 pueden inhibir sustancialmente la actividad de las celulas T reguladoras (T CD4+ CD25+ FoxP3+), mientras que apenas afectan la activacion y/o proliferacion de otros linfocitos con funciones efectoras. Este hallazgo proporciona la base para una nueva estrategia de inmunomodulacion de celulas T reguladoras en enfermedades tales como cancer o infecciones cronicas donde estas celulas son relevantes. La presente invencion se refiere a polipeptidos que comparten su secuencia primaria con IL-2 humana, excepto en el hecho de que se han mutado varios aminoacidos eliminando o reduciendo sustancialmente su capacidad de senalizacion a traves de las diferentes formas del receptor de IL-2

Estas variantes mutantes de IL-2 mantienen su capacidad para unirse a uno o mas componentes del receptor de IL- 2, y tienen una actividad inhibidora observada preferentemente en poblaciones de celulas T reguladoras, donde modulan negativamente su funcion. Se protegen diversas variantes espedficas de mutantes de IL-2 con propiedades inhibitorias preferenciales sobre celulas T reguladoras. La invencion tambien incluye los usos terapeuticos de estas variantes mutadas, utilizadas solas o en combinacion con vacunas para la terapia de enfermedades tales como cancer o infecciones cronicas donde es relevante la actividad de las celulas T reguladoras (Tregs).

La presente invencion propone una nueva estrategia para modular la actividad de celulas T reguladoras en enfermedades en las que la supresion por medio de estas celulas reduce la respuesta inmune protectora inducida naturalmente o por vacunacion. Las ventajas de esta nueva estrategia terapeutica frente a otras propuestas para modular la actividad de las Tregs son numerosas. Por ejemplo:

• Los mutantes de IL-2 son virtualmente protemas en sf mismos (salvo algunas mutaciones). Este hecho reduce el riesgo de toxicidades inesperadas (que son comunes en las estrategias basadas en inhibidores de pequeno tamano) o el riesgo de aumentar una respuesta inmune contra los farmacos inyectados (como sucedena en estrategias tales como Ontak, en la que IL-2 esta acoplada a una molecula foranea y toxica como la toxina de la difteria).

• Estas variantes mutantes de IL-2 mantendnan afinidades de union con el receptor de IL-2 al menos del orden de la afinidad de la IL-2 nativa (10 pM para el receptor de alta afinidad). Esta afinidad es diffcil de conseguir con estrategias de inhibicion del receptor o ligando, con anticuerpos monoclonales u otros farmacos.

• El pequeno tamano de estos mutantes (15 kD) podna permitirles tener una alta movilidad y penetrar facilmente en el microambiente del tumor. Algo que se sabe que es complejo para las moleculas mas grandes, tales como los anticuerpos y otros.

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Descripcion detallada de la invencion Obtencion de polipeptidos analogos de IL-2

La presente invencion se refiere a polipeptidos de 100 a 500 aminoacidos, preferiblemente aquellos cuyo tamano es de 140 aminoacidos y cuyo peso molecular aparente es de al menos 15 kD. Estos polipeptidos mantienen un alto nivel de identidad de secuencia con IL2 nativa, mas del 90% de identidad, en un area de su secuencia, incluyen 3 a 5 mutaciones con respecto a IL-2 nativa, y se indican aqu como M1-M4 (tabla 1).

En estas posiciones, estos polipeptidos se mutan insertando residuos de aminoacidos diferentes a aquellos aminoacidos colocados en la misma posicion en la IL-2 nativa. Los residuos que sustituyen a los residuos originales se seleccionan porque tienen propiedades fisicoqmmicas muy diferentes de las del aminoacido original, los residuos han cambiado de polar a apolar, de cargado a no cargado, de grande a pequeno, de acido a base, entre otros.

Los polipeptidos de la presente invencion tambien se pueden denominar polipeptidos inmunomoduladores indistintos, analogos de lL-2 o mutemas de IL-2, entre otros. Estos polipeptidos estan disenados a partir de la estructura tridimensional de la IL-2 (depositada en la base de datos PDB), introduciendo mutaciones solo en las posiciones de la IL2 que corresponden a aminoacidos expuestos significativamente al disolvente, que se identifican utilizando programas bioinformaticos de dominio publico como RASMOL, SwissPDBviewer y otros.

Los polipeptidos de esta invencion se pueden obtener de varias maneras, entre otros mediante smtesis de protemas. Tambien podnan obtenerse mediante tecnicas de ingeniena genetica, tales como su expresion en cuerpos de inclusion en bacterias tales como E. coli. Tambien se pueden obtener mutaciones puntuales en las posiciones espedficas mediante tecnicas de mutagenesis dirigida usando la reaccion en cadena de la polimerasa.

Seleccion de polipeptidos analogos de IL-2 por su actividad biologica

Los polipeptidos de la presente invencion se seleccionan realizando experimentos in vitro o in vivo para tener simultaneamente las siguientes propiedades

1) Estas variantes mutantes de IL-2 pierden o reducen sustancialmente su capacidad de senalizacion para las diferentes formas del receptor de IL-2. Esta propiedad se puede evaluar directamente en ensayos de proliferacion in vitro con lmeas celulares, que son dependientes de IL-2 como CTLL2 o Kitt225, o con linfocitos T o celulas NK de origen murino y/o humano. Estos mutantes deben tener una actividad estimuladora en estos ensayos al menos 100 veces menor que la de la IL-2 nativa.

2) Estas variantes mutadas de IL-2 (mutemas) mantienen su capacidad para unirse a uno o mas componentes moleculares del receptor de IL-2. Esta capacidad de union se puede evaluar directamente mediante ELISA frente a cadenas del receptor comercialmente disponibles tales como cadenas alfa y beta del receptor o indirectamente sobre poblaciones celulares positivas para el receptor. Las tasas de reconocimiento de las mutemas de IL-2 debenan ser comparables a las de la IL-2 nativa en estos ensayos.

3) Las variantes mutadas de IL-2 tienen una actividad inhibidora de la actividad nativa de IL-2 en linfocitos, que es preferente a poblaciones de celulas T reguladoras (al menos en celulas T CD4+ CD25+ FoxP3+). Las mutemas de IL-2 incluidas en esta invencion son capaces en un cierto intervalo de concentraciones de inhibir preferentemente o selectivamente la actividad o expansion de celulas T reguladoras, sin afectar o afectar solo mmimamente la actividad y/o expansion de otros linfocitos con funciones efectoras tales como celulas T auxiliares, celulas T citotoxicas o celulas NK. La actividad inhibidora preferencial o selectiva de estas mutemas puede evidenciarse en varios ensayos in vitro que examinan la respuesta a los estfmulos de mezclas de poblaciones efectoras y reguladoras en presencia de cantidades crecientes de las mutemas. En el intervalo apropiado de concentracion, las mutemas deben ser capaces de inhibir al menos tres veces mas el crecimiento o la actividad de las celulas T reguladoras que inhiben la actividad o expansion de las poblaciones efectoras usadas en el experimento, por ejemplo, celulas T auxiliares, celulas T citotoxicas o celulas Nk.

Esta invencion se refiere a diversas variantes espedficas de mutemas de IL-2 (mutaciones espedficas descritas en la Tabla 1), que han sido seleccionadas para tener las propiedades mencionadas anteriormente. Estas mutemas incluyen multiples sustituciones de aminoacidos que reducen significativamente su capacidad para estimular linfocitos murinos y humanos. Sin embargo, su capacidad para unirse a las cadenas alfa y beta del receptor permanece intacta, y adquieren capacidades inhibidoras (antagonistas) de la actividad nativa de IL-2. El aspecto mas significativo de estas mutemas es que presentan una capacidad marcada, en cierto intervalo de concentraciones, para inhibir preferentemente las celulas T reguladoras (CD4+ CD25+ FoxP3+), en un cultivo de linfocitos que contienen estas celulas y otras celulas T efectoras.

Tabla 1: Mutantes construidos, con referencia a la mutacion segun la numeracion de la IL2 humana.

Mutaciones: Nombre de referencia

Q22V, Q126A, 1129D, S130G: M1

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L18N, Q126Y, S130R: M2

Q13Y, Q126Y, 1129D, S130: M3

L18N, Q22V, T123A, 1129D, S130R: M4

La presente invencion tambien incluye modificaciones adicionales del tipo de mutantes de IL-2 mencionados anteriormente y en particular los descritos en la Tabla 1. O bien para aumentar su afinidad por componentes espedficos de IL-2, pero sin afectar o incluso mejorar sus propiedades inhibidoras preferenciales, o para mejorar su farmacodinamica in vivo: aumento de la esperanza de vida o reduccion de su internalizacion por celulas T. Estas mutaciones adicionales pueden obtenerse mediante diseno racional con herramientas bioinformaticas o utilizando bibliotecas moleculares combinatorias de diferente naturaleza (bibliotecas de presentacion en fagos, bibliotecas de expresion genica en levaduras o bacterias).

Aplicacion terapeutica de polipeptidos analogos a IL-2

Esta invencion tambien incluye composiciones farmaceuticas que comprenden como ingrediente activo mutemas de IL-2 y sus analogos, descritos en la presente invencion, asf como sus posibles aplicaciones terapeuticas con el objetivo de modular selectivamente la actividad de IL-2 en celulas T reguladoras. En particular, esta invencion protege el uso de estas mutemas para promover la respuesta inmune inducida naturalmente o por vacunas en enfermedades tales como cancer o infecciones cronicas donde las celulas T reguladoras son particularmente relevantes.

Para uso terapeutico, el polipeptido de la presente invencion se debe administrar a un sujeto portador de la enfermedad independientemente o en combinacion con otros polipeptidos u otras sustancias que facilitan o mejoran su accion terapeutica. La via de administracion puede ser cualquiera de las vfas de administracion descritas por la tecnica anterior para la administracion parenteral de farmacos. Se puede administrar preferiblemente por via intravenosa, intramuscular, subcutanea o intratumoral.

Los polipeptidos o protemas de fusion descritos por la presente invencion tambien pueden administrarse como parte de una composicion farmaceutica util en el tratamiento de cancer y enfermedades infecciosas cronicas.

Para obtener el efecto terapeutico deseado, el polipeptido de la presente invencion debe administrarse en dosis lo suficientemente altas como para asegurar una concentracion adecuada en el ganglio linfatico o en el sitio periferico relevante para la enfermedad estudiada, debe estar en el intervalo adecuado de concentraciones para que la mutema muestre un efecto inhibitorio preferencial sobre las celulas T reguladoras. Por lo tanto, la dosis referida debe ajustarse de acuerdo con el tipo de enfermedad y la via de administracion en el estudio. Por ejemplo, en el caso de la terapia tumoral, la dosis debe ajustarse hasta que las concentraciones del mutante dentro del tumor y/o del ganglio linfatico regional local sean adecuadas para asegurar un efecto inhibitorio preferencial sobre las celulas T reguladoras. Los intervalos de dosis a explorar pueden oscilar entre decenas de microgramos hasta unos pocos miligramos por dosis.

El numero de administraciones a aplicar tambien se ajustara de acuerdo con la biodistribucion de la mutema en cuestion. En general, las concentraciones efectivas antes mencionadas deben mantenerse durante un periodo que oscila entre 2 dfas y 30 dfas consecutivos. Observese, por ejemplo, que, si la mutema se acopla a una protema portadora, la frecuencia de administracion debe ajustarse en consecuencia. Se entiende por accion terapeutica la remision total o parcial de los smtomas de la enfermedad. Para el cancer, se considerara, entre otros, una disminucion del volumen del tumor o un aumento del tiempo hasta la recafda como criterios de remision. Por ultimo, cabe senalar que los beneficios de esta nueva estrategia terapeutica en comparacion con otras propuestas para modular la actividad de Tregs sena multiple. Por ejemplo:

• Los mutantes de IL-2 son virtualmente protemas en sf mismos (salvo para unas pocas mutaciones). Este hecho reduce el riesgo de toxicidades inesperadas (que son comunes en las estrategias basadas en inhibidores de pequeno tamano) o el riesgo de aumentar una respuesta inmune contra los farmacos inyectados (como sucedena en estrategias tales como Ontak, en la que IL-2 esta acoplada a una molecula foranea y toxica como la toxina de la difteria).

• Estas variantes mutantes de IL-2 mantendnan afinidades de union con el receptor de IL-2 al menos del orden de la afinidad de la IL-2 nativa (10 pM para el receptor de alta afinidad). Esta afinidad es difmil de conseguir con estrategias de inhibicion del receptor o ligando, con anticuerpos monoclonales u otros farmacos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Los mutantes se disenaron informaticamente a partir de tecnicas bioinformaticas, utilizando como base la estructura reportada del complejo cuaternario de IL-2 humana acoplada al receptor en lmea con lo reportado por

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Wang, X., Rickert, M. y Garcia, K.C. en Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gamma receptors. Science, 2005. 310 (5751): paginas 1159-63 y algoritmos de calculo de energfa para la interaccion protema-ligando en el dominio publico. Inicialmente se predijo que diferentes variantes de mutemas no afectaban la capacidad de union de las cadenas alfa y beta del receptor. Estas mutemas se expresaron en E. coli a partir de una construccion genetica en el vector pET28a que incluye una secuencia identificadora de 6 histidinas en el extremo terminal amino. Las mutemas se purificaron usando fase inversa (Figura1) obteniendose con alta pureza (> 95%). Las mutemas obtenidas se seleccionaron segun sus propiedades en ensayos experimentales in vitro. Entre las mutemas construidas en la Tabla 1 se describe un conjunto de mutaciones espedficas que tiene la propiedad de inhibir preferentemente la actividad de Tregs.

Ejemplo 2. Las mutemas seleccionadas conservan la capacidad de unirse a diferentes componentes del receptor de IL2, especialmente a las cadenas alfa y beta del receptor. La Figura 2 muestra que usando pruebas ELISA, varios de los mutantes especificados en la Tabla 1 mantienen practicamente intacta su capacidad para unirse a la cadena alfa (Figura 2) y la cadena beta (Figura 2b) del receptor humano de IL-2. La Figura 3 muestra una confirmacion adicional de que estos mutantes se unen al receptor en la superficie celular (Figura 3a) y que esta union se puede desplazar gradualmente mediante la adicion de IL-2 nativa (Figura 3b).

Ejemplo 3. Las mutemas seleccionadas reducen significativamente su capacidad de senalizacion por el receptor de lL-2. La Figura 3 ilustra este hecho midiendo su capacidad para estimular el crecimiento de la lmea celular CTLL2 (Figura 4a) o estimular la diferenciacion de celulas NK de los linfocitos totales del bazo (Figura 4b). Estas mutemas en altas concentraciones inhiben la actividad de IL-2 nativa, tanto en linfocitos T (Figura 5a) como en celulas NK (Figura 5b).

Ejemplo 4. Las mutemas seleccionadas inhiben preferentemente la expansion in vitro de celulas T reguladoras (CD4+ CD25+ FoxP3+). La Figura 6 ilustra esta propiedad para uno de los mutantes de la Tabla 1, particularmente se muestra que en un cultivo de celulas de linfocitos donde hay una mezcla de celulas T efectoras y reguladoras estimuladas con anticuerpos anti-CD3, la adicion de dosis intermedias de mutemas sustancialmente inhibe la proliferacion de CD4+FoxP3+ sin afectar significativamente a la expansion de las poblaciones efectoras de CD4+FoxP3-.

Ejemplo 5. Las mutemas seleccionadas son secuestradas preferentemente por las celulas T reguladoras en un cultivo, reduciendo su capacidad para afectar la actividad de las celulas T efectoras. Estas mutemas inhiben la senalizacion (estimulacion) mediada por la IL-2 producida endogenamente por las poblaciones de celulas T auxiliares CD4+CD25-FoxP3- purificadas y estimuladas con anticuerpos anti-CD3. Sin embargo, la adicion de cantidades crecientes de celulas T reguladoras CD4+CD25+FoxP3+ a estos cultivos, paradojicamente reduce la inhibicion mediada por el mutante en las poblaciones efectoras T (Figura 7). Este efecto se explica por la capacidad de las mutemas descritas para inhibir preferentemente la actividad de IL-2 en poblaciones T reguladoras. La presencia de celulas T reguladoras incluso en pequenas cantidades dirige la actividad de los mutantes a estas celulas, reduciendo asf la actividad supresora de la mutema en la poblacion efectora.

Ejemplo 6. Las mutemas seleccionadas muestran actividad antitumoral en un modelo murino de tumor trasplantable. La Figura 8 muestra la propiedad descrita para una de las mutemas de la Tabla 1. La mutema se evaluo en un modelo de tumor primario con una lmea celular de melanoma MB16F10, implantada subcutaneamente en el flanco derecho. La Figura 8 muestra la reduccion del volumen tumoral en ratones tratados con la mutema en comparacion con el grupo de control tratado con PBS. Ademas, se incluyo un grupo de control, tratado con el anticuerpo monoclonal anti CD25 (MAb), mostrando que el sistema experimental es sensible al agotamiento de celulas Tregs.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. Produccion y purificacion de variantes mutadas de IL-2 humana. a: Transferencia Western que muestra la expresion de algunas variantes mutadas e IL-2 nativa de control en cepas de E. coli transfectadas con la construccion genica realizada; b: Ejemplo de un perfil de purificacion tfpico obtenido usando purificacion de fase inversa.

Figura 2. Evaluacion por ELISA del reconocimiento de las cadenas alfa (a) y beta (b) del receptor de IL-2 por varias de las mutemas mencionadas en la tabla 1. La IL-2 nativa se usa como control positivo. Como puede verse, todas las mutemas analizadas mantienen tasas de reconocimiento comparables a las de la IL-2 nativa.

Figura 3. Evaluacion por citometna de flujo de la capacidad de varias de las mutemas mencionadas en la Tabla 1 para unirse al receptor de IL-2 en la superficie de las celulas. Especialmente a la lmea celular CTLL2 murina. Tanto las mutemas como el control de la IL-2 nativa en la superficie de las celulas se detectaron con un anticuerpo anti-6- His-PE que reconoce la cabeza de la histidina que esta incluida en la construccion genetica de estas moleculas. a): Histogramas que muestran los niveles de union directa detectados. b) Reduccion de la union de mutemas a las celulas, medida por la reduccion de la intensidad media de la fluorescencia detectada, causada por la adicion de cantidades crecientes de IL-2 nativa (una variante de esta molecula no tiene cabeza de histidina y no interfiere con la tincion).

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Figura 4. Evaluacion de la capacidad de senalizacion de varias de las mutemas mencionadas en la Tabla 1. a) Se evaluo la actividad de las mutemas en un ensayo de proliferacion de la lmea celular CTLL2 medida mediante un ensayo colorimetrico usando MTT. b): Las mutemas tambien se evaluaron en una prueba de diferenciacion de celulas NK1.1+ de esplenocitos totales de raton. En ambos casos se comparo la capacidad de estimulacion de las mutemas frente a un control de la IL-2 nativa que se produce exactamente en el mismo sistema experimental (la misma construccion genetica, cepa productora de E. coli, sistema de purificacion). Se obtienen resultados similares a los mostrados en la Figura3a con la lmea celular Kitt225, donde el sistema de receptores es humano.

Figura 5. Evaluacion de la capacidad de varias de las mutemas mencionadas en la Tabla 1 para inhibir la actividad in vitro de IL-2 nativa. a: Inhibicion de la proliferacion total de linfocitos de los ganglios estimulada con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (clon 2C11 a razon de 10 pg/mL) aumentando las concentraciones de mutemas. b. Inhibicion de la diferenciacion de celulas NK1.1+ de esplenocitos totales de raton estimulados con 500 UI/mL de IL-2 nativa, anadiendo cantidades crecientes de mutemas en el cultivo.

Figura 6. Evaluacion de la capacidad de las mutemas para inhibir preferentemente los linfocitos CD4+Foxp3+. Los linfocitos de los ganglios linfaticos de raton se estimularon in vitro con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (clon 2C11 a razon de 10 pg /mL) en presencia de las cantidades indicadas de la mutema M1 (como se hace referencia en la Tabla 1). Despues de 72 horas de cultivo se determino mediante citometna de flujo, usando perlas de referencia, el numero de linfocitos CD4+Foxp3+ reguladores y CD4+Foxp3 efectores. La grafica en a muestra la tincion basica en citometna de flujo utilizada para diferenciar las poblaciones de celulas reguladoras y efectoras. La grafica en b muestra los niveles de inhibicion de la proliferacion inducida por diferentes cantidades de la mutema anadida. Esta inhibicion se calcula con base en el numero de celulas vivas recuperadas en ausencia de la mutema. Como se muestra en b, existe un intervalo intermedio de concentraciones de mutema M1 en el que la inhibicion de la poblacion reguladora de CD4+FoxP3+ es mucho mas significativa que para las celulas T auxiliares o efectoras CD4+FoxP3-.

Figura 7. Evaluacion de la capacidad de las celulas T reguladoras para secuestrar preferentemente las mutemas de IL-2 disenadas, liberando celulas T efectoras con un efecto inhibidor sobre ellas. Las celulas T efectoras CD4+CD25- FoxP3- se purificaron usando perlas magneticas marcadas con CFSE y se colocaron en cultivo acopladas algunas en presencia y algunas en ausencia de mutemas (grafico de mutemas M1, dos concentraciones diferentes de 10 pg/mL y 5 pg/mL) y se estimularon con anticuerpos anti-CD3 (clon 2C11, 10 pg/mL) y anti-CD28 (clon 37.51, 10 pg/mL). A estos cultivos se les anadieron diferentes cantidades de celulas T reguladoras purificadas (CD4+CD25+FoxP3+). El grafico 6a muestra altos niveles de pureza (92% de Tregs y 97% de celulas T efectoras) logrados con separacion de perlas magneticas. La Figura 6b muestra los niveles de proliferacion en celulas efectoras medidos por dilucion de CFSE, para diferentes cantidades de celulas reguladoras en cultivo. Como se puede observar en ausencia de Tregs, la presencia de mutemas afecta sustancialmente la proliferacion de celulas efectoras (efecto inhibidor), pero a medida que se anaden Tregs, la proliferacion de celulas T efectoras se recupera, ya que las Tregs preferentemente secuestran las celulas efectoras liberadoras de mutema de su efecto inhibitorio.

Figura 8. Evaluacion del efecto antitumoral directo de las mutemas de IL-2 usando el modelo de tumor primario con lmea celular tumoral MB16F10 de melanoma. Se usaron 12 ratones C57BL6, distribuidos en tres grupos de cuatro ratones cada uno. Todos los tratamientos se administraron subcutaneamente desde el dfa -5 al dfa 0. El grupo 1 recibio 200 pL de PBS, el grupo 2 recibio 100 pg de MAb anti CD25 y el grupo 3 recibio 200 pg de mutema de IL-2. El dfa cero, todos los ratones recibieron 250.000 celulas en el flanco derecho. Se midio el volumen del tumor cada dos dfas hasta el dfa 30. Los datos se analizaron mediante la prueba de ANOVA y la prueba de Bonferroni de comparacion multiple. La mutema de IL-2 como MAb anti CD25 causo un retraso significativo en el crecimiento tumoral (p <0,001)

Claims

5

10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un polipeptido inmunomodulador derivado de la IL-2, que comprende varias mutaciones puntuales con respecto a la secuencia de la IL-2 humana nativa y tiene la propiedad de inhibir la actividad de lL-2 in vitro en celulas T reguladoras y tiene la propiedad de union al receptor de IL-2 murino y humano, en donde dichas mutaciones dentro de la secuencia de IL-2 humana nativa consisten en:

(i) Q22V, Q126A, S130G e I129D;

(ii) L18N, Q126Y y S130R;

(iii) Q13Y, Q126Y, I129D y S130R; o

(iv) L18N, Q22V, T123A, S130R e I129D.
2. El polipeptido de la reivindicacion 1, en el que dichas mutaciones dentro de la secuencia de la IL-2 humana nativa consisten en:

Q22V, Q126A, S130G e I129D.
3. El polipeptido de la reivindicacion 1, caracterizado por su capacidad para inhibir las celulas T reguladoras in vivo.
4. Una protema de fusion que comprende el polipeptido inmunomodulador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, acoplado a una protema portadora.
5. La protema de fusion de la reivindicacion 4, caracterizada porque la protema portadora es albumina.
6. La protema de fusion de la reivindicacion 4, caracterizada porque la protema portadora es la region Fc de la inmunoglobulina humana.
7. El polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en el tratamiento del cancer.
8. Una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de cancer, que comprende como ingrediente activo el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de cancer, caracterizada porque comprende como ingrediente activo la protema de fusion de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
10. La protema de fusion de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para uso en el tratamiento de cancer.