ES2543915T3 - Polipéptidos derivados de la IL-2 con actividad agonista para la terapia del cáncer e infecciones crónicas - Google Patents
Polipéptidos derivados de la IL-2 con actividad agonista para la terapia del cáncer e infecciones crónicas Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a polipéptidos que comparten secuencia primaria con la IL-2 humana, excepto porque varios aminoácidos han sido mutados. Las mutaciones introducidas reducen sustancialmente la capacidad de estos polipéptidos para estimular in vitro e in vivo a las células T reguladoras (T CD4+CD25+FoxP3+) y le confieren una mayor eficacia en la terapia de tumores trasplantables murinos. Además incluye, las aplicaciones terapéuticas de estas variantes, solas o en combinación con vacunas, para la terapia de enfermedades como el cáncer o infecciones donde la actividad de las células T reguladoras (Tregs) es relevante. En otro aspecto la presente invención se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo los polipéptidos divulgados. Por último, la presente invención se relaciona con el uso terapéutico de los polipéptidos y composiciones farmacéuticas divulgados dado su efecto modulador del sistema inmune sobre patologías como cáncer y enfermedades infecciosas crónicas.
Description
Polipéptidos derivados de la IL-2 con actividad agonista para la terapia del cáncer e infecciones crónicas.
Alcance de la Invención.
La presente invención se relaciona con la inmunología. Particularmente se relaciona con la aplicación terapéutica de la modulación del sistema inmune mediante análogos de moléculas naturales que tienen la acción agonista de la molécula original, pero de forma inesperada demostraron una eficacia terapéutica superior.
Antecedentes de la invención:
La interleucina 2 (IL-2) fue el primer factor de crecimiento descrito para las células T. Desde su descubrimiento se observó su capacidad de promover la proliferación y la supervivencia de las células T in vitro (Smith, K.A. (1988) Science. 240, 1169-76), así como su capacidad de potenciar la respuesta inmune T en el contexto de infecciones virales (Blattman, J.N., y otros (2003) Nat Med. 9, 540-7) o vacunas (Fishman, y otros (2008) J Immunother. 31, 72-80; Kudo-Saito, C, y otros (2007) Cancer Immunol Immunother. 56, 1897-910; Lin, C.T., y otros (2007) Immunol Lett. 114, 86-93). Sin embargo, este papel clásico de la IL-2 como promotor de la respuesta inmune T se ha cuestionado recientemente, por múltiples datos experimentales (Almeida, A.R., y otros (2002) J Immunol. 169, 4850-60; de la Rosa, M., y otros (2004) Eur J Immunol. 34, 2480-8; Malek, T.R., y otros (2004) Nat Rev Immunol. 4, 665-74) que muestran que esta citocina es un factor de crecimiento homeostático para las células T reguladoras naturales CD4+ CD25+ FoxP3+ (Tregs).
La interleucina 2 se ha propuesto además como un actor relevante en el mecanismo por el cual las células T reguladoras suprimen la actividad y expansión de otras células efectoras tales como células T auxiliadoras CD4,, células T citotóxicas CD8 y las células asesinas naturales NK. ParticularmenteParticularmente, se ha propuesto recientemente que células T reguladoras suprimen a otras células T, induciendo la disminución local de los niveles de IL-2 (Pandiyan, P., y otros (2007) Nat Immunol. 8, 1353-62). Este efecto supresor se sustenta en: a) su capacidad de inhibir directamente las células T efectoras que producen la nueva IL-2 por (Almeida, AR., y otros (2002) J Immunol. 169, 4850-60; Takahashi, T., y otros (1998) Int Immunol. 10, 1969-80; Thornton, AM., y otros (1998) J Exp Med. 188, 287-96; Wolf, M., y otros (2001) Eur J Immunol. 31 , 1637-45); b) su capacidad de secuestrar, internalizar y degradar rápidamente la IL-2 presente en su microambiente (Pandiyan, P. y otros (2007) Nat Immunol. 8, 1353-62); y c) su capacidad de sobre-expresar la cadena alfa del receptor de IL-2 (Kuniyasu, Y., y otros (2000) Int Immunol. 12, 1145-55), lo que le permite usar más eficientemente la IL-2 cuando sus concentraciones son bajas.
Resumiendo, la IL-2 es una citocina con propiedades altamente pleiotrópicas, siendo muy relevante en la actividad biológica de diferentes poblaciones celulares. Esta propiedad hace de la IL-2 un nodo importante en la regulación de la respuesta inmune, convirtiéndola en un objetivo atractivo para las terapias y modulación del complejo inmune.
La IL-2 se ha usado por varios años en la terapia del cáncer. Particularmente su uso en altas dosis es una terapia aprobada en varios países para el tratamiento del melanoma metastásico y carcinoma de la célula renal. Sin embargo, el uso directo de la IL-2 en pacientes está severamente limitado por sus efectos tóxicos y baja eficacia. Tanto es así que apenas el 20% de los pacientes elegibles reciben la terapia basada en IL-2 y solo el 17% de los pacientes tratados muestran una respuesta objetiva. Una explicación probable para este dramático fallo en la clínica es que la terapia con IL-2 nativa estimula también poblaciones de células T reguladoras (Ahmadzadeh, M., y otros (2006) Blood. 107, 240914) que reducen la inmuno-estimulación deseada. Actualmente numerosas evidencias preclínicas apoyan esta idea. Particularmente, experimentos en modelos murinos muestran que la actividad primaria de la IL-2 inyectada in vivo es la expansión homeostática de las células T reguladoras naturales.
Varias estrategias se han desarrollado con el objetivo de mitigar los efectos tóxicos de la terapia con IL-2. Algunas de estas estrategias se basan en el uso de variantes mutadas de IL-2, diseñadas para aumentar la capacidad de esta molécula de señalizar mayormente por el receptor de alta afinidad (cadenas alfa, beta y gamma) y no por el receptor de afinidad intermedia (cadenas beta y gamma). La idea básica es promover la señalización en células T en lugar de la señalización de células NK que se consideran responsables por los efectos tóxicos observados. En esta línea de trabajo se encuentran las invenciones siguientes: patente de los Estados Unidos núm. 7,186,804, patente de los Estados Unidos núm. 7,105,653, patente de los Estados Unidos núm. 6,955,807, patente de los Estados Unidos núm. 5,229,109, solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20050142106. Es importante notar que ninguna de estas invenciones se relaciona con muteínas de IL-2 que poseen mayor eficacia terapéutica que la IL-2 nativa in vivo, en base a su capacidad disminuida para estimular a las células T reguladoras naturales.
Otras variantes mutadas de la IL-2 se han creado con el objetivo de incrementar su actividad farmacológica, por ejemplo mejorando su plegamiento o incrementando su tiempo de vida en sangre. Entre otras las siguientes invenciones están en esa línea de trabajo: patente de los Estados Unidos núm. 4,959,314, patente de los Estados Unidos núm. 5,116,943, patente de los Estados Unidos núm. 4,853,332.
Nuevamente, ninguna de estas muteínas posee una capacidad disminuida para activar las células T reguladoras ni muestra una mayor eficacia terapéutica.
Finalmente, se debe mencionar que existen en la literatura numerosas propuestas de agentes terapéuticos (Kreitman,
R.J. (2009) Curr Pharm Des. 15, 2652-64; Litzinger, M.T., Fernando, R., Curiel, T.J., Grosenbach, D.W., Schlom, J. y Palena, C. (2007) Blood. 110, 3192-201; Morse, M.A., Hobeika, A.C., Osada, T., Serra, D., Niedzwiecki, D., Lyerly, H.K. y Clay, T.M. (2008) Blood. 112, 610-8; Onizuka, S., Tawara, I., Shimizu, J., Sakaguchi, S., Fujita, T. y Nakayama, E. (1999) Cancer Res. 59, 3128-33; Quezada, S.A., Peggs, K.S., Curran, M.A. y Allison, J.P. (2006) J Clin Invest. 116, 1935-45) que proponen modular o reducir la actividad de las células T reguladoras in vivo. Estos agentes terapéuticos se han probado en modelos animales o incluso en pacientes para la terapia directa de cáncer o para potenciar el efecto de vacunas. También hay algunos reportes que proponen modular la actividad de la IL-2, particularmente con anticuerpos monoclonales (Boyman, O., Kovar, M., Rubinstein, M.P., Surh, C.D. y Sprent, J. (2006) Science. 311, 19241927; Boyman, O., y otros (2006) Expert Opin Biol Ther. 6, 1323-31; Kamimura, D., y otros (2006) J Immunol. 177, 30614; Murakami, M., Sakamoto, A., Bender, J., Kappler, J. y Marrack, P. (2002) Proc Nati Acad Sci USA. 99, 8832-7; Tomala, J., Chmelova, H., Mrkvan, T., Rihova, B. y Kovar, M. (2009) J Immunol. 183, 4904-4912), para promover mejores o más efectivas respuestas inmunes. Sin embargo, para nuestro conocimiento no existe ningún reporte en la literatura, basado en variantes mutadas de la IL-2, que muestre la posibilidad de obtener mayor eficacia terapéutica basada en su capacidad disminuida para estimular a las células T reguladores naturales.
Breve descripción de la invención
La presente invención describe la producción de variantes mutadas de la IL-2, que muestran mayor eficacia terapéutica que la IL-2 nativa en modelos de tumores murinos transplantables. Estas muteínas se caracterizan por ser agonistas parciales de la actividad de la IL-2 y se seleccionan por su capacidad especialmente baja de estimular a las células T reguladores naturales (T CD4+CD25+FoxP3+) in vitro y/o in vivo. La eficacia terapéutica in vivo de estas muteínas, propone una solución práctica para mejorar las terapia con IL-2 en tumores malignos. Particularmente, estas muteínas proporcionarán una vía para superar las limitaciones observadas en la terapia con la IL-2 nativa que se derivan de su probada capacidad para expandir in vivo a las células T reguladoras naturales.
La presente invención se refiere a polipéptidos que comparten secuencia primaria con la IL-2 humana, excepto para varios aminoácidos que se han mutado. Las mutaciones introducidas reducen sustancialmente la capacidad de los polipéptidos para estimular in vitro e in vivo a las células T reguladoras (T CD4+CD25+FoxP3+) y conferir una mayor eficacia en la terapia de tumores murinos trasplantables. La presente invención describe además las aplicaciones terapéuticas de estas variantes mutadas, solas o en combinación con vacunas, para la terapia de enfermedades como el cáncer o infecciones donde la actividad de las células T reguladoras (Tregs) es relevante.
La presente invención permite un mejoramiento sustancial de las estrategias actuales de inmunomodulación basadas en la IL-2, tanto en la terapia directa del cáncer, como en su combinación con diferentes vacunas. Particularmente la sustitución de la IL-2 nativa por las variantes mutadas descritas en la presente invención, evitará la expansión de células T reguladoras que reducen marcadamente los efectos terapéuticos deseados.
Descripción Detallada de la invención.
Obtención de los polipéptidos análogos a IL-2.
La presente invención se relaciona con polipéptidos de 100 a 500 aminoácidos de longitud, preferentemente de tamaño de 140 residuos cuyo peso molecular aparente es de al menos 15 kD. Estos polipéptidos mantienen una alta identidad de secuencia con la IL-2 nativa, más de un 90% de identidad. En una región de su secuencia, incluyen mutaciones que se comparan con las de la IL-2 nativa como se indica en la reivindicación 1. En las posiciones, los polipéptidos se mutan introduciendo residuos de aminoácidos diferentes a los que existen en la misma posición en la IL-2 nativa. Los aminoácidos que sustituyen a los residuos originales se seleccionan que tengan propiedades fisicoquímicas bien distintas a las del aminoácido original, cambiando el residuo polar por apolar, no-cargado por cargado, grande por pequeño, acido por básico, entre otros cambios.
Los polipéptidos de la presente invención pueden denominarse indistintamente como polipéptidos inmunomoduladores, análogos a la IL-2 o muteínas de la IL-2, entre otros nombres. Estos polipéptidos se diseñan basado en la estructura 3D del complejo IL-2-receptor (disponible en la base de datos pública PDB), introduciendo mutaciones preferentemente en las posiciones de la IL-2 que corresponden a aminoácidos significativamente expuestos al solvente y que están altamente conservados en las IL-2 de diferentes especies (secuencias obtenidas de la base de datos Swissprot). Los aminoácidos expuestos al solvente del tipo antes mencionado se identifican usando programas bioinformáticos para la visualización de estructuras de proteínas tales como RASMOL, SwissPDBviewer u otros. Las posiciones conservadas en la secuencia de la IL-2 se identificaron usando programas bioinformáticos para el alineamiento múltiple de secuencias por ejemplo Fasta, ClusterW u otros.
Los polipéptidos de esta invención se pueden obtener por diferentes estrategias, incluyendo, por síntesis de proteínas. También pueden obtenerse por técnicas de ingeniería genética, por ejemplo expresándolos en bacterias tales como, E. coli u otras bacterias, y además en células de mamíferos tales como, células NSO u otras células de mamíferos. Las mutaciones puntuales en las posiciones específicas pueden obtenerse además por técnicas de mutagénesis dirigida
5 mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Sorprendentemente, los inventores encontraron una ventaja sustancial para estas muteínas con respecto al tradicional uso de la IL-2 nativa. Esta ventaja radica en su eficacia aumentada en la terapia antitumoral, derivada de su capacidad de evitar la expansión de las células T reguladoras.
Selección de los polipéptidos análogos a la IL-2 en función de su actividad biológica;
Los polipéptidos de la presente invención son seleccionados por las siguientes propiedades:
15 1) Acción agonista de la IL-2 nativa. Esta propiedad puede evaluarse directamente en ensayos de proliferación in-vitro con líneas celulares dependientes de IL-2 tales como CTLL2 o Kitt225, o con ensayos con mezclas de linfocitos T de ratón y/o humanos. Estas muteínas deben poseer una actividad estimuladora específica de 5 a 50 veces inferior a la de la IL-2 nativa en estos ensayos.
20 2) Pérdida de la capacidad, comparada con la IL-2 nativa, para estimular in vitro y/o in vivo las poblaciones de células T reguladoras. Esta propiedad puede evaluarse, por ejemplo, estudiando la capacidad de las muteínas de la presente invención en comparación con la IL-2 nativa para inducir directamente la expansión de células T CD4+CD25+, purificadas de ratones vírgenes y estimuladas in vitro con un anticuerpo anti-CD3. También puede evaluarse mediante la inyección intraperitonial o subcutánea, en ratones durante cinco días, de estas muteínas o la IL-2 nativa y evaluar su
25 efecto en la expansión o aumento de la tasa de proliferación de poblaciones de células T reguladoras (TCD4+CD25+FoxP3+). La actividad de la IL-2 mutada sobre las células T reguladoras debe ser al menos 1000 veces menor que la de la IL-2 nativa en estos ensayos.
3) Efecto terapéutico incrementado con respecto a la IL2 nativa en modelos animales. Esta propiedad puede evaluarse,
30 por ejemplo, comparando el efecto antitumoral o anti-metastásico de las muteínas y la IL-2 nativa como monoterapia en modelos de tumores trasplantables (por ejemplo Melanoma B16). También puede evaluarse a través del efecto potenciador de la respuesta celular y/o humoral a una vacuna de interés. Las muteínas deben mostrar mayor eficacia terapéutica que la IL-2 nativa en dosis que contengan una igual masa total de proteínas de la IL-2 y la muteína.
35 La presente invención se relaciona particularmente con las muteínas detalladas en la Tabla 1. Estas muteínas incluyen múltiples sustituciones de aminoácidos que de conjunto les confieren las propiedades antes mencionadas.
Tabla 1: Muteínas diseñadas que poseen las tres propiedades básicas descritas en esta patente. Las mutaciones se refieren según la numeración de la IL-2 humana.
La presente invención también comprende modificaciones adicionales de la clase de muteínas de IL-2 antes mencionadas y en especial las descritas en la Tabla 1. Ya sea para aumentar su afinidad por componentes específicos del receptor de IL-2, pero sin afectar o incluso mejorar su carácter de agonista que no estimula a las células T
55 reguladoras; o para mejorar su farmacodinámica in vivo: aumentar el tiempo de vida o reducir su internalización por las células T. Estas mutaciones adicionales se pudieran obtener mediante el diseño racional con herramientas bioinformáticas, o utilizando genotecas moleculares combinatorias de diferente naturaleza (genotecas de fagos, genotecas de expresión génica en levadura o en bacterias).
60 En otro aspecto la presente invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores antes descritos, acoplados a una proteína portadora. La proteína portadora puedes ser la Albúmina o la región Fc de las inmunoglobulinas humanas.
Aplicación terapéutica de los polipéptidos análogos a la IL-2;
Esta invención incluye además las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo las muteínas de IL-2 descritas por medio de la presente invención, y sus aplicaciones terapéuticas para potenciar la respuesta inmune natural o inducida por vacunas en enfermedades tales como el cáncer o infecciones crónicas donde las células T reguladoras son particularmente relevantes.
Para su uso terapéutico, el polipéptido de la presente invención debe administrarse a un sujeto portador de la enfermedad de forma independiente o combinado con otros polipéptidos u otras sustancias que faciliten o potencien su acción terapéutica. La ruta de administración puede ser cualquiera de las rutas de administración descritas por el estado del arte para la administración parenteral de fármacos. Debe administrarse preferentemente por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o intratumoral.
Los polipéptidos descritos en la presente invención también pueden administrarse formando parte de una composición farmacéutica que se usa en el tratamiento del cáncer y de enfermedades infecciosas crónicas o para potenciar la respuesta celular y/o humoral a vacunas en sustitución de la IL2 nativa. Los polipéptidos de la presente invención se pueden usar en combinación con vacunas terapéuticas para cáncer o con vacunas profilácticas en enfermedad infecciosa donde las células T reguladoras son relevantes.
Para obtener el efecto terapéutico deseado, el polipéptido de la presente invención debe administrarse a dosis suficientemente altas como para garantizar su concentración en el nodo linfático periférico o en el sitio periférico relevante para la enfermedad en estudio, y dentro del intervalo de concentraciones para el cual la muteína muestra un efecto immune-estimulador. La dosis en cuestión debe, por lo tanto, ajustarse de acuerdo con el tipo de enfermedad y vía de administración en estudio. Por ejemplo en el caso de terapia de tumores, la dosis debe ajustarse para lograr concentraciones de la muteína en el interior del tumor y/o en el nodo linfático loco-regional para garantizar la estimulación de una respuesta inmune antitumoral. Los intervalos de dosis a explorar pueden variar desde cientos de microgramos hasta cientos de miligramos por dosis. Para las aplicaciones en que la muteína sustituye una terapia tradicional con IL-2 nativa, la dosis de muteína a utilizar debe ser menor que o equivalente en actividad (determinada usando ensayo con la línea CTLL2) a la usada tradicionalmente para la IL-2 nativa.
El número de administraciones a aplicar debe ajustarse también de acuerdo con la biodistribución de la muteína en cuestión. Generalmente, se deben mantener las concentraciones eficaces antes mencionadas durante 2 a 30 días consecutivos. Debe notarse, por ejemplo, que si la muteína se acopla a una proteína portadora, como consecuencia deberá ajustarse la frecuencia de sus administraciones. Para aplicaciones donde se sustituya a la IL-2 nativa, el esquema de administración de la muteína puede ser similar al aplicado en la terapia tradicional.
Debe entenderse por acción terapéutica la remisión total o parcial de los síntomas de la enfermedad. En cáncer, la disminución del volumen tumoral o el incremento en el tiempo antes de la recaída será, entre otros, el criterio de remisión de la enfermedad.
Los polipéptidos de la invención son particularmente útiles en la terapia de tumores tales como melanomas y tumores renales.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Obtención de la muteína. a) Expresión de la muteína en la cepa de E. coli BL21DE3 evaluada por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), carril 1: Proteínas totales de la cepa BL21DE3, control negativo de la expresión;, carriles 2 y 3: Dos ejemplos de los niveles de expresión alcanzados en esta cepa, la flecha señala la banda correspondiente a la muteína. b) Cromatograma de la fase reversa que muestra la etapa fundamental y final de purificación de la proteína, la flecha señala el pico correspondiente a la proteína de interés, c) Purificación de la muteína evaluada por SDS-PAGE 1: Resultados del proceso de aislamiento del cuerpo de inclusión, 2: muteína obtenida después de la purificación por fase reversa. Figura 2. Evaluación del carácter agonista de la muteína de IL-2. a) Medición por citometría de flujo, de la capacidad de unión de la muteína a la superficie de la línea celular CTLL2. Tanto la IL-2 como la muteína se detectaron usando un AcM anti-etiqueta 6His. b) El gráfico muestra la capacidad de la muteína de inducir la proliferación de la línea celular T dependiente de IL-2 CTLL2, , en comparación con la IL-2 nativa. La proliferación se midió por incorporación de MTT. Figura 3. La muteína no induce proliferación in vitro de las células T reguladoras. a) Gráfico de citometría de flujo que muestra la pureza de la población CD3+CD4+CD25+ purificada a partir de los ganglios de un ratón C57BL/6. b) Las células Treg se estimularon in vitro con un AcM anti-CD3 y se administró IL-2 nativa en una concentración de 0.5 ng/mL
o muteína en una concentración de 32 ng/mL durante 72 horas, el gráfico muestra el número de células vivas recuperadas después de cada tratamiento en comparación con el control donde no se adicionó ninguna citocina. Las concentraciones seleccionadas corresponden con la concentración a la cual cada molécula induce la misma proliferación de la línea CTLL2. Figura 4. Evaluación del efecto del tratamiento con la muteína sobre la proliferación de las poblaciones celulares. a) Cuantificación de los pesos relativos de los bazos de los ratones tratados con la muteína durante cinco días. Los pesos de los bazos de los ratones tratados fueron estadísticamente superiores a los del grupo control. Prueba no paramétrica
de Kruskal-Wallis y prueba de comparación múltiple de Dunn. b) Medición de la población de células T CD8+, el gráfico muestra los porcentajes de esta población. Figura 5. La muteína es más eficiente que la IL-2 nativa en la disminución de metástasis en el modelo de metástasis experimental de la línea de melanoma MB16F0. a) Fotos representativas de los pulmones correspondientes a cada
5 tratamiento, b) Cuantificación de las metástasis pulmonares en cada grupo. Figura 6. El tratamiento con la combinación de la muteína y la vacuna OVA/VSSP potencia el efecto antitumoral de la vacuna. Los ratones portadores del tumor se trataron con la vacuna OVA/VSSP sola o en combinación con la muteína. El gráfico muestra el crecimiento tumoral, el grupo tratado con la combinación mostró una reducción mayor del tamaño tumoral siendo estadísticamente diferente del grupo control.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño de las muteínas de IL-2
15 Las muteínas se diseñaron computacionalmente, a partir de técnicas bioinformáticas, usando como base la estructura reportada de la IL-2 humana en la base de datos PDB (Protein Data Bank) y las secuencias aminoacídicas de la IL-2 en diversas especies que están disponibles en la base de datos Swissprot. Varias muteínas se diseñaron incluyendo de 3 a 6 mutaciones (introduciendo sustituciones de aminoácidos no conservativos) en residuos expuestos al solvente y altamente conservados. Estas muteínas se expresaron en E.coli a partir de una construcción plasmídica en el vector
20 pET28a incluyendo una secuencia objetivo de 6 histidinas en el amino terminal. Las muteínas se purificaron mediante fase reversa (Figura 1) y se obtuvo una elevada pureza (>95%). Las muteínas obtenidas se seleccionaron a partir de sus propiedades en ensayos experimentales in vitro e in vivo que muestran las 3 propiedades básicas descritas en el cuerpo de esta invención. De todas la muteínas construidas en la Tabla 1 se describe un conjunto de mutaciones específicas que tienen la propiedad deseada de ser agonistas de la actividad de la IL-2 sin estimular sensiblemente a
25 las células T reguladoras y que muestran una mayor eficacia terapéutica que la IL-2 nativa en el tratamiento de tumores murinos trasplantables. La Tabla 2 muestra otras de las muteínas construidas que no mostraron las propiedades deseadas.
Tabla 2: Muteínas construidas que no poseen las propiedades básicas descritas en esta patente. Las mutaciones se 30 refieren de acuerdo con la numeración de la IL-2 humana.
Ejemplo 2. Demostración de la naturaleza agonista de las muteínas de IL-2 diseñadas.
La Figura 2 ilustra cómo muteínas mencionadas en las Tabla 1 se unen a componentes del receptor de IL-2 sobre la superficie de la línea celular CTLL2 (Figura2a). Las muteínas construidas se unen a las células CTLL2, que se conocen
50 por poseer en su superficie tanto receptores de alta afinidad como de afinidad intermedia para la IL-2. La unión detectada en nuestros ensayos resulta ser similar a la obtenida con la IL-2 nativa. La Figura 2b ilustra la capacidad de las muteínas que se muestran en la Tabla 1 para estimular el crecimiento de la línea celular CTLL2 (Figura. 2b). Estas muteínas se comportan como agonistas parciales de la actividad de la IL-2 en este ensayo. Su actividad específica es entre 5 y 50 veces menor que la de la IL-2 nativa.
Ejemplo 3. Efecto de las muteínas de IL-2 sobre las células T reguladoras.
Las muteínas descritas en la Tabla 1 muestran una capacidad muy reducida de estimular in vitro las células T reguladoras (Figura 3). Como se muestra en esta Figura mientras que la IL-2 nativa es capaz de inducir proliferación 60 fuerte de las células T reguladoras (T CD4+CD25+FoxP3+) estimuladas con un anticuerpo anti-CD3 unido a la placa. Las muteínas descritas en la Tabla 1 en concentraciones de masa significativamente superiores a la de la IL-2 nativa no estimularon a las células T reguladoras. Debe acotarse que los resultados antes descritos son válidos incluso si la cantidad de muteína a usar se aumenta de modo que se utilice una cantidad equivalente en actividad a la IL-2 nativa en el ensayo de proliferación con la línea CTLL2. Las muteínas descritas en la Tabla 1 exhiben típicamente una capacidad
65 de estimular las células T reguladoras al menos 1000 veces menor que la de IL-2 nativa.
Ejemplo 4. Caracterización de la actividad inmunoestimuladora in vivo de las muteínas diseñadas.
Las muteínas descritas en la Tabla 1 muestran una capacidad immunoestimulatora in vivo aumentada. Las Figuras 4a, b muestran como las muteínas inducen una esplenomegalia mayor que la de la IL2 nativa en ratones vírgenes, después
5 del tratamiento durante cinco días con dos dosis diarias de 20 µg de la muteína administrado por vía intraperitoneal. Esta estimulación se correlaciona con un claro incremento de poblaciones efectoras, como los linfocitos T CD8+. Como observación relevante se expone que el tratamiento con estas muteínas no estimula la expansión de las células T reguladoras (TCD4+CD25+FoxP3+) a diferencia de lo que se observó para la IL2 nativa (Fig. 4c,d).
10 Ejemplo 5. Medición de la eficacia terapéutica de las muteínas en un modelo murino de tumores trasplantables.
Se demostró el incremento en la eficacia terapéutica de las muteínas diseñadas en un modelo murino de tumores trasplantables. Las muteínas descritas en la Tabla 1 muestran una eficacia aumentada para el tratamiento de metástasis pulmonares inducidas en un modelo de melanoma murino MB16. La Figura 5 muestra como el tratamiento durante 5
15 días con dos dosis diarias de 20 µg de las muteínas de la Tabla 1 administradas por vía intraperitoneal tiene un fuerte efecto antimetastásico, que no se observa en los grupos tratados con igual dosis de IL-2 nativa.
Ejemplo 6. Medición de la capacidad de las muteínas para potenciar el efecto de una vacuna antitumoral.
20 Se demostró la capacidad de la muteína diseñada para potenciar el efecto antitumoral de la vacuna. Se utilizó el modelo de tumor primario de la línea celular EG7, una línea de célula tumoral genéticamente modificada para expresar el antígeno OVA. Los ratones portadores del tumor se inmunizaron con el antígeno OVA adyuvado con VSSP sólo o en combinación con la muteína. La Figura 6 muestra que la disminución del crecimiento tumoral fue mayor para los ratones tratados con la combinación que para los ratones tratados solamente con la vacuna.
- LISTADO DE SECUENCIAS
- <110>
- Centro de Inmunología Molecular
- 5
- <120> POLIPÉPTIDOS DERIVADOS DE LA IL-2 CON ACTIVIDAD AGONISTA PARA
- LA TERAPIA DEL CÁNCER E INFECCIONES CRÓNICAS.
- <130>
- P101194EP00
- 10
- <140> EP 11797102.8
- <141>
- 2013-06-07
- <150>
- CU P/2010/216
- <151>
- 2010-11-12
- 15
- <150>
- PCT/CU2011/000007
- <151>
- 2011-11-10
- <160>
- 6
- 20
- <170>
- PatentIn versión 3.5
- <210>
- 1
- <211>
- 133
- 25
- <212> PRT
- <213>
- E. coli
- <400>
- 1
<210> 2 50 <211> 133
<212> PRT
<213> E. coli
<400> 2
<211> 117
<212> PRT
25 <400> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> E. coli
50 <400> 4
20 <210> 5
<211> 133
<212> PRT
25 <400> 5
<210> 6
<211> 133
<212> PRT 50 <213> E. coli
<400> 6
Claims (10)
- Reivindicaciones1. Un polipéptido agonista de la IL-2, en donde dicho polipéptido es una muteína de IL-2 que es al menos 1000veces menos eficaz para estimular in vitro y/o in vivo a las células T reguladoras y muestra una mayor eficacia 5 terapéutica in vivo que la IL-2 nativa, en donde dicho polipéptido comprende las mutaciones-R38K, F42I, Y45N, E62L, E68V; -R38A, F42I, Y45N, E62L, E68V; -R38K, F42k, Y45R, E62L, E68V;10 -R38A, F42A, Y45A, E62A,y en donde dichas mutaciones se refieren de acuerdo con la numeración de la IL-2 humana.
- 2. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido inmunomodulador de la reivindicación 1, acoplado a una 15 proteína portadora.
- 3. La proteína de fusión de la reivindicación 2 en donde la proteína portadora es albúmina, o la región Fc de las inmunoglobulinas humanas.20 4. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas, caracterizada por comprender como ingrediente activo el polipéptido de la reivindicación 1, o una combinación de diversos polipéptidos descritos en la reivindicación 1.
- 5. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas, que 25 comprende como principio activo la proteína de fusión descrita en la reivindicación 2 o 3.
- 6. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en el tratamiento directo de tumores malignos en sustitución de la IL-2 nativa.30 7. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en potenciar la respuesta celular y/o humoral a las vacunas usadas para sustituir a la IL-2 nativa.
- 8. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7 en donde dicha vacuna es una vacuna terapéutica para el cáncer o una vacuna para enfermedades infecciosas donde las células T reguladoras son relevantes.
- 9. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento de enfermedades crónicas, en la terapia de cáncer, o en la terapia de enfermedades crónicas infecciosas.
- 10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en la terapia de enfermedades crónicas, cáncer, o 40 para uso en la terapia de enfermedades crónicas infecciosas.
- 11. La proteína de fusión de la reivindicación 2 o 3 para uso en la terapia de enfermedades crónicas, o enfermedades crónicas infecciosas.45 12. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento que modula el sistema inmune.
- 13. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 y sus aplicaciones en donde se introducen nuevas mutaciones que aumentan su afinidad de unión a los diferentes componentes de IL-2.
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