EA026022B1 - Производные полипептиды il-2 с агонистической активностью для лечения рака - Google Patents

Производные полипептиды il-2 с агонистической активностью для лечения рака Download PDF

Info

Publication number
EA026022B1
EA026022B1 EA201390681A EA201390681A EA026022B1 EA 026022 B1 EA026022 B1 EA 026022B1 EA 201390681 A EA201390681 A EA 201390681A EA 201390681 A EA201390681 A EA 201390681A EA 026022 B1 EA026022 B1 EA 026022B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bie
tng
azp
zeg
cells
Prior art date
Application number
EA201390681A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390681A1 (ru
Inventor
Монсон Калет Леон
Портилла Таня Карменате
Родригес Саумель Перес
Эскалона Нерис Мичель Энаморадо
Давила Агустин Бьенвенидо Лахе
Original Assignee
Сентро Де Инмунологиа Молекулар
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45350376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA026022(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Сентро Де Инмунологиа Молекулар filed Critical Сентро Де Инмунологиа Молекулар
Publication of EA201390681A1 publication Critical patent/EA201390681A1/ru
Publication of EA026022B1 publication Critical patent/EA026022B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Abstract

Изобретение относится к полипептидам, которые имеют общую первичную последовательность с IL-2 человека, за исключением нескольких аминокислот, которые подверглись мутациям. Эти мутации приводят к существенному снижению способности данных полипептидов стимулировать in vitro и in vivo регуляторные Т-клетки (Т CD4+CD25+FoxP3+) и делают их более эффективными в лечении пригодных для трансплантации опухолей мышей. Кроме того, предложены терапевтические применения этих мутированных полипептидов для лечения рака. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим описанные полипептиды в качестве активной основы.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Оно относится, в частности, к терапевтической модуляции иммунной системы посредством аналогов натуральной молекулы, которые производят агонистическое действие на исходную молекулу, но неожиданно проявляют превосходную терапевтическую эффективность.
Уровень техники
Интерлейкин 2 (Ш-2) стал первым фактором роста, описанным для Т-клеток. После его открытия исследовали его способность активировать пролиферацию и жизнеспособность Т-клеток ίη νίΐτο (К.А. διηίΐΐι, §с1епсе, 1988 г., т. 240, с. 1169-76), а также усиливать иммунный ответ по отношению к Твирусным инфекциям (ΙΝ. В1айтап, и др., Ναΐ Меб., 2003 г., т. 9, с. 540-7) или вакцинам (М. р1кЬтап и др., 1. 1ттипо1йег., 2008 г., т. 31, с. 72-80; С. Кибо-8айо и др., Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1йег., 2007 г., т. 56, с. 1897-910; С.Т. Мп и др., 1ттипо1. Ьей., 2007 г., т. 114, с. 86-93). Однако эту классическую роль 1Ь-2 в качестве активатора Т-иммунного ответа поставили под вопрос многочисленные экспериментальные данные (А.К. А1те1ба и др., 1. 1ттипо1., 2002 г., т. 169, с. 4850-60; М. бе 1а Кока и др., Еиг. 1. 1ттипо1., 2004 г., т. 34, с. 2480-8; Т.К. Ма1ек и др., ΝηΙ. Рет. 1ттипо1., 2004 г., т. 4, с. 665-74), показывающие, что этот цитокин представляет собой гомеостатический фактор роста для натуральных регуляторных Тклеток СЭ4+СО25+РохР3+(Тгед). Кроме того, интерлейкин 2 предложен в качестве основного участника механизма, посредством которого регуляторные Т-клетки подавляют активность и размножение других эффекторных клеток, таких как хелперные Т-клетки СЭ4, цитотоксичные Т-клетки СЭ8 и натуральные киллерные клетки (ΝΚ). В частности, недавно сделано предположение, что регуляторные Т-клетки подавляют другие Т-клетки, вызывая местное снижение уровней 1Ь-2 (Р. Рапб1уап и др., ΝηΙ. 1ттипо1., 2007 г., т. 8, с. 1353-1362). Основу этого эффекта подавления представляют собой: а) их способность непосредственно ингибировать эффекторные Т-клеток в производстве нового 1Ь-2 (А.К. А1те1ба и др., 1. 1ттипо1., 2002 г., т. 169, с. 4850-60; Т. ТакаЬакЫ и др., 1пк 1ттипо1., 1998 г., т. 10, с. 1969-80; А.М. ТкогЩоп и др., 1. Ехр. Меб., 1998 г., т. 188, с. 287-96; М. \Уо1Г и др., Еиг. 1. 1ттипо1., 2001 г., т. 31, с. 1637-45); Ь) их способность быстро улавливать, интернализировать и разлагать 1Ь-2, присутствующий в их микросреде (Р. Рапб1уап и др., ΝηΙ. 1ттипо1., 2007 г., т. 8, с. 1353-62) и с) их способность к чрезмерной экспрессии альфа-цепи рецептора 1Ь-2 (Υ. Кишуаки и др., ЙН. 1ттипо1., 2000 г., т. 12, с. 1145-1155), что обеспечивает более эффективное использование 1Ь-2, когда его концентрации являются низкими.
Таким образом, 1Ь-2 представляет собой высокоплейотропный цитокин, который имеет очень большое значение в биологической активности различных клеточных популяций. Данное свойство превращает 1Ь-2 в важный центр регуляции иммунного ответа, делая его привлекательной целью для лечения и комплексной иммуномодуляции.
В течение ряда лет 1Ь-2 использовали в лечении рака. В частности, его использование в высоких дозах представляет собой разрешенное в нескольких странах лечение метастатической меланомы и карциномы клеток почек. Однако непосредственное использование 1Ь-2 пациентами серьезно ограничено его токсичным действием и низкой эффективностью. Поэтому только 20% соответствующих пациентов получают лечение на основе 1Ь-2, и только 17% из подвергнутых этому лечению пациентов показывают объективный ответ. Вероятное объяснение такой выраженной неудачи в клиническом исследовании заключается в том, что лечение нативным 1Ь-2 также стимулирует популяции регуляторных Т-клеток (М. АНтаб/абек и др., В1ооб, 2006 г., т. 107, с. 2409-14), что ослабляет желательную иммуностимуляцию. В настоящее время многочисленные данные доклинических исследований подтверждают эту идею. В частности, эксперименты на мышиных моделях показывают, что первичная активность введенного 1Ь-2 ш νί\Ό представляет собой гомеостатическое размножение натуральных регуляторных Т-клеток.
Разработано несколько стратегий для ослабления токсических эффектов лечения 1Ь-2. Некоторые из этих стратегий основаны на использовании мутированных вариантов 1Ь-2, предназначенных для увеличения способности этой молекулы передавать сигнал, главным образом, через имеющий высокое сродство рецептор (альфа-, бета-и гамма-цепи), а не через имеющий промежуточное сродство рецептор (бета- и гамма-цепи). Основная идея заключается в том, чтобы активировать передачу сигнала в Тклетках вместо передачи сигналов в ΝΚ-клетках, которые считаются ответственными за наблюдаемые токсические эффекты. Этому направлению работы соответствуют следующие изобретения: патенты США №№ 7186804, 7105653, 6955807, 5229109 и патентная заявка США № 20050142106. Важно отметить, что ни одно из данных изобретений не относится к мутеинам 1Ь-2, которые проявляют более высокую терапевтическую эффективность, чем нативный Ш-2 ш νίνΌ, на основании своей пониженной способности стимулировать натуральные регуляторные Т-клетки.
Другие мутированные варианты Ш-2 созданы с целью увеличения их фармакологической активности, например, путем улучшения укладки или увеличения продолжительности существования в крови. Помимо прочих этому направлению работы соответствуют следующие изобретения: патенты США №№ 4959314, 5116943 и 4853332. Снова ни одни из этих мутеинов не проявляет уменьшения способности активировать регуляторные Т-клетки и не проявляет более высокую терапевтическую эффективность.
Наконец, следует упомянуть, что в литературе опубликованы многочисленные предложения лекарственных средств (К.1. Кгейтап, Сигг. РЬагт. Эек., 2009 г., т. 15, с. 2652-64; М.Х. П1(хлпдег, К. Ретапбо,
- 1 026022
Т.Е Сште1, Т.Е СтокепЬаск, ί. §сЫот и С. Ра1епа, В1ооб, 2007 г., т. 110, с. 3192-201; М.А. Могке, А.С. НоЬе1ка, Т. Окаба, Ό. 8егга, Ό. №еб/\\'1ескк Н.К.Ьуег1у и Т.М. С1ау, Βίοοά, 2008 г., т. 112, с. 610-8; δ. Οιτί/ика, I. Та\\ага. 1. §Ыт1/и, δ. 8акадисЫ, Т. Ри_р1а и Е. Ыакауата, Сапсег Кек. 1999 г., т. 59, с. 3128-33; δ.Α. Оие/аба, Κ.δ. Реддк, М.А. Сштап и ЕР. ЛШкоп, 1. С1ш. 1пуекк, 2006 г., т. 116, с. 1935-45), которые должны модулировать или уменьшать активность регуляторных Т-клеток ш νί\Ό. Эти лекарственные средства были исследованы на подопытных животных или даже на пациентах в целях непосредственного лечения рака или усиления эффекта вакцин. Кроме того, опубликованы некоторые сообщения, в которых предложено модулировать активность 1Ь-2 в определенных моноклональных антителах (О. Воутап, М. Коуаг М.Р. КиЫп51е1п, С.Э. διιιΐι и 1. 8ргепф δ^ιτ^, 2006 г., т. 311, с. 1924-1927; О. Воутап и др., Ехрей Орш. Вю1. ТЬег., 2006 г., т. 6, с. 1323-31; Ό. Катшига и др., 1. 1ттипо1., 2006 г., т. 177, с. 306-14; М. Мигакатк Л. δакатοΐο, 1. Вепбег, 1. Карр1ег и Р. Маггаск, Ргос. ЫаЙ. Асаб. δ^. υδΛ., 2002 г., т. 99, с. 8832-7; ЕТ. Тота1а, Н. СЬте1оуа, Т. Мгкуап, В. РПюуа и М. Коуаг, 1. 1ттипо1., 2009 г., т. 183, с. 4904-4912), чтобы активировать лучшие или более эффективные иммунные ответы. Насколько известно авторам настоящего изобретения, однако, в литературе отсутствуют основанные на мутированных вариантах 1Ь-2 сообщения, показывающие возможность получения более высокой терапевтической эффективности за счет уменьшения способности стимулировать натуральные регуляторные Т-клетки.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к получению мутированных вариантов 1Ь-2, которые проявляют более высокую терапевтическую эффективность, чем нативный 1Ь-2, в моделях, пригодных для трансплантации мышиных опухолей.
Эти мутеины отличаются тем, что они являются частичными агонистами активности 1Ь-2 и выбраны вследствие своей особенно низкой способности стимулировать натуральные регуляторные Т-клетки (Т СГО4+СГО25+РохР3+) ш уПго и/или ш νί\Ό. Терапевтическая эффективность этих мутеинов ш νί\Ό обеспечивает практическое решение задачи улучшения лечения злокачественных опухолей с помощью 1Ь-2. В частности, эти мутеины открывают путь к преодолению ограничений, наблюдаемых в лечении нативным 1Ь-2, которые возникают в результате того, что они способствуют размножению натуральных регуляторных Т-клеток ш νί\Ό. Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые имеют общую первичную последовательность с 1Ь-2 человека, за исключением нескольких аминокислот, которые подверглись мутациям. Эти мутации приводят к существенному уменьшению способности данных полипептидов стимулировать ш уПго и ш νί\Ό регуляторные Т-клетки (Т СО4+СО25+РохР3+) и придают 1Ь-2 более высокую эффективность в лечении пригодных для трансплантации опухолей мышей. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутированных вариантов индивидуально или в сочетании с вакцинами для лечения заболеваний, таких как рак или инфекции, где имеет значение активность регуляторных Т-клеток (Тгед).
В частности, изобретение включает выделенный полипептид, являющийся агонистом по отношению к 1Ь-2, проявляющий повышенное иммуностимулирующее и противоопухолевое действие по сравнению с нативным 1Ь-2 и имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична на 95% последовательности нативного 1Ь-2 и которая выбрана из δΙΕ) ΙΌ ΝΟ. 1 (содержит мутации К38К, Ρ42Ι, Υ45Ν, Е62Ь и Е68У); δΕφ ΙΌ ΝΟ. 2 (содержит мутации К38К, Р42Ц, Υ45Ε и Е68У); δΙΕ) ΙΌ ΝΟ. 3 (содержит мутации К38А, Ρ42Ι, Υ45Ν, Е62Ь и Е68У); δΕ^ ΙΌ ΝΟ. 4 (содержит мутации К38К, Р42К, Υ45Κ, Е62Ь и Е68У); δΕ^ ГО ΝΟ. 5 (содержит мутации К38К, Ρ42Ι, Υ45Ε и Е68У); δΕ^ ГО ΝΟ. 6 (содержит мутации К38А, Р42А, Υ45Λ и Е62А).
Изобретение также относится к слитому белку, содержащему данный полипептид, соединенный с белком-носителем.
Предпочтительно белок-носитель представляет собой альбумин.
В другом варианте осуществления белок-носитель может представлять собой Рс-область иммуноглобулинов человека.
Далее, изобретение относится к фармацевтической композиции для применения для лечения рака, содержащей вышеприведенный полипептид в качестве активного ингредиента.
Дополнительно, изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей слитый белок по изобретению в качестве активной основы.
Кроме того, изобретение включает применение полипептида по изобретению для лечения рака.
Далее, изобретение включает применение слитого белка по изобретению для лечения рака.
Настоящее изобретение обеспечивает существенное улучшение современных стратегий иммуномодуляции на основе ГО-2, в том числе в непосредственном лечении рака и в сочетании с различными вакцинами. В частности, замена нативного ГО-2 мутированными вариантами, описанными в настоящем документе, предотвращает размножение регуляторных Т-клеток, которые заметно уменьшают желательные терапевтические эффекты.
Подробное описание изобретения
Получение полипептидных аналогов ГО-2.
- 2 026022
Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим в цепи от 100 до 500 аминокислотных остатков, предпочтительно 140 аминокислотных остатков, и их эффективная молекулярная масса составляет по меньшей мере 15000. Эти полипептиды сохраняют высокую степень идентичности последовательности с нативным 1Ь-2, которая составляет более чем 90%. В отношении своей последовательности они содержат от 3 до 6 мутаций по сравнению с нативным 1Ь-2. В данных положениях эти полипептиды являются мутированными, включая аминокислотные остатки, отличающиеся от аминокислотных остатков, занимающих соответствующие положения в нативном 1Ь-2. Аминокислоты, которые замещают исходные аминокислотные остатки, выбирают таким образом, что они имеют физикохимические свойства, значительно отличающиеся от свойств исходных аминокислот, заменяя полярные остатки неполярными, незаряженные остатки заряженными, большие остатки малыми, кислотные остатки основными, помимо других изменений.
Полипептиды согласно настоящему изобретению могут называться, помимо прочего, терминами иммуномодулирующие полипептиды, аналоги 1Ь-2 или мутеины 1Ь-2. Эти полипептиды построены на основе трехмерной структуры рецепторного комплекса 1Ь-2 (имеется в общественной базе данных ΡΌΒ), и содержат мутации, главным образом, в положениях 1Ь-2, соответствующих аминокислотам, на которые в значительной степени воздействует растворитель и которые являются в высокой степени устойчивыми в 1Ь-2 различных видов (последовательности получены из швейцарской базы данных белков δΜδδρτοί). Находящиеся под воздействием растворителя аминокислоты вышеупомянутого типа определяют, используя биоинформационное программное обеспечение для визуализации белковых структур, такое как РА8МОЬ, 8\У155РЭВ\ае\уег или другое. Сохраненные положения в последовательности 1Ь-2 определяли, используя биоинформационное программное обеспечение для множественной модификации последовательности, например Райа, СйтЛегХУ или другое.
Полипептиды согласно настоящему изобретению можно получать, используя разнообразные стратегии, в том числе путем синтеза белка. Их можно также получать, используя генно-инженерные технологии, например, путем их экспрессии в бактериях, таких как кишечные палочки (Е. сой) или другие бактерии, а также в клетках млекопитающих, таких как клетки N80 или другие клетки млекопитающих. Точечные мутации в определенных положениях можно также получать, используя методы точечнонаправленного мутагенеза посредством анализа с полимеразной цепной реакцией (РСР).
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили существенное преимущество этих мутеинов по сравнению с традиционным использованием нативного 1Ь-2. Данное преимущество представляет собой их повышенная эффективность в лечении опухолей, обусловленная их способностью препятствовать размножению регуляторных Т-клеток.
Выбор полипептидных аналогов 1Ь-2 с точки зрения биологической активности.
Полипептиды согласно настоящему изобретению выбирают, учитывая следующие свойства:
1) Агонистическое действие нативного 1Ь-2. Данное свойство можно оценивать непосредственно путем исследования ίη νίίτο пролиферации линий клеток, зависимых от 1Ь-2, таких как СТЬЬ2 или Κίΐΐ225, или путем исследования смесей Т-лимфоцитов мыши и/или человека. Эти мутеины должны обладать удельной стимулирующей активностью, являющейся в 5-50 раз меньше, чем активность нативного 1Ь-2 в данных исследованиях.
2) Потеря способности по сравнению с нативным 1Ь-2 стимулировать ίη νίίτο и/или ίη νίνο популяции регуляторных Т-клеток. Данное свойство можно оценивать, например, исследуя способность мутеинов согласно настоящему изобретению, по сравнению со способностью нативного 1Ь-2 непосредственно индуцировать размножение Т-клеток СЭ4+СЭ25+. выделенных у не подвергнутых экспериментам мышей, используя ίη νίίτο антитело анти-СПЗ. Его можно также исследовать, вводя мышам внутриперитонеально или подкожно эти мутеины или нативный 1Ь-2 в течение пяти суток и оценивая воздействие на размножение или увеличение скорости пролиферации популяций регуляторных Т-клеток (ΤίΠ4+ίΠ25+Ρο\Ρ3+). Активность мутированного 1Ь-2 по отношениям к клеткам Тгед должна быть по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем у нативного 1Ь-2 в этих исследованиях.
3) Увеличение терапевтического эффекта на подопытных животных по сравнению с нативным 1Ь2. Данное свойство можно оценивать, например, сравнивая противоопухолевый или противометастатический эффект мутеинов и нативного 1Ь-2 в качестве монотерапии на моделях пригодных для трансплантации опухолей (например, меланомы В16). Его можно также оценивать через потенцирующий эффект клеточного и/или гуморального ответа на исследуемую вакцину. Мутеины должны проявлять более высокую терапевтическую эффективность, чем нативный 1Ь-2, в дозах, содержащих равную суммарную массу белков 1Ь-2 и мутеина.
Настоящее изобретение относится, в частности, к мутеинам, представленным в табл. 1. Эти мутеины содержат множество замещений аминокислот, которые придают им вышеупомянутые свойства.
- 3 026022
Таблица 1
Модифицированные мутеины, имеющие три основных свойства, описанных в настоящем патенте.
Мутации представлены согласно нумерации 1Ь-2 человека
Настоящее изобретение также включает дополнительные модификации по отношению к классу вышеупомянутых мутеинов 1Ь-2 и, в частности, по отношению к тем, которые описаны в табл. 1. Они сделаны, чтобы усилить их сродство к определенным компонентам рецептора 1Ь-2, но без влияния или даже улучшения его агонистической природы, которая не стимулирует регуляторные Т-клетки, или чтобы улучшить их фармакодинамику ίη νίνο: увеличение периода полувыведения или уменьшение их интернализации Т-клетками. Эти дополнительные мутации можно получать путем рационального проектирования, используя биоинформационные средства или применяя комбинаторные молекулярные библиотеки различного характера (библиотеки фагов, библиотеки экспрессии генов в дрожжах или бактериях). В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему какие-либо из описанных выше иммуномодулирующих полипептидов в сочетании с белком-носителем. Белок-носитель может представлять собой альбумин или Рс-область иммуноглобулинов человека.
Терапевтическое применение полипептидного аналога 1Ь-2.
Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента мутеины 1Ь-2 и его аналоги, описанные средствами настоящего изобретения, и их потенциальные терапевтические применения для усиления натурального или индуцированного вакцинами иммунного ответа в случае заболеваний, таких как рак или хронические инфекции, где регуляторные Т-клетки имеют особое значение.
Для его терапевтического применения полипептид согласно настоящему изобретению следует вводить страдающему заболеванием пациенту независимо или в сочетании с другими полипептидами или другими веществами, которые способствуют его терапевтическому действию или усиливаю его. Способ данного введения может представлять собой любой способ введения, описанный на современном уровне техники для парентерального применения лекарственных средств. Предпочтительно введение следует осуществлять внутривенно, внутримышечно, подкожно или непосредственно в опухоль.
Полипептиды, описанные в настоящем документе, можно также вводить как часть фармацевтической композиции, которую используют для лечения рака и хронических инфекционных заболеваний или для усиления клеточного и/или гуморального ответа на вакцины, в качестве замены нативного 1Ь2. Полипептиды согласно настоящему изобретению можно использовать в сочетании с вакцинами для лечения рака или с вакцинами для профилактики инфекционных заболеваний, где имеют значение регуляторные Т-клетки.
Для получения желательного терапевтического эффекта полипептид согласно настоящему изобретению следует вводить в достаточно высоких дозах, чтобы обеспечивать его концентрацию в периферическом лимфатическом узле или в периферической области, имеющей отношение к исследуемому заболеванию в интервале концентраций, при которых мутеин проявляет иммуностимулирующий эффект. Таким образом, рассматриваемую дозу следует регулировать в зависимости от исследуемого типа заболевания и способа введения. Например, в случае лечения опухоли дозу следует устанавливать для создания концентрации мутеина внутри опухоли и/или в локорегионарном лимфатическом узле на таком уровне, чтобы обеспечивать стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа. Интервал доз для исследования может составлять от сотен микрограммов до сотен миллиграммов на дозу. Для применений, в которых мутеин заменяет традиционное лечение нативным 1Ь-2, используемая доза мутеина должна иметь меньшую или эквивалентную активность (определяемую в ходе анализа с использованием линии клеток СТРЬ2) по сравнению с активностью традиционно используемого нативного 1Ь-2.
Используемое число введений также следует устанавливать в соответствии с биологическим распределением исследуемого мутеина. Как правило, вышеупомянутые эффективные уровни следует поддерживать в течение от 2 до 30 суток подряд. Следует отметить, например, что если мутеин сочетается с белком-носителем, то частоту его введения необходимо устанавливать соответствующим образом. Для применений, в которых заменяют нативный 1Ь-2, схема введения мутеина может быть аналогичной схеме, которую используют в традиционном лечении.
- 4 026022
Терапевтическое действие следует понимать как полное или частичное прекращение симптомов заболевания. В случае рака критерий прекращения (ремиссии) заболевания представляет собой, помимо прочих, уменьшение объема опухоли или увеличение времени до рецидива.
Полипептиды согласно настоящему изобретению являются особенно полезными для лечения опухолей, таких как меланомы и почечные опухоли.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Получение мутеина.
a) Экспрессия мутеина в штамме ВЬ2ШЕ3 Е. сой, определяемая методом электрофореза в содержащем додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (δΌδ-РАОЕ): полоса 1 представляет сумму белков штамма ВЬ2ШЕ3, отрицательный контроль экспрессии; полосы 2 и 3 представляют два примера уровней экспрессии, достигаемых в данном штамме; стрелка показывает линию, соответствующую мутеину.
b) Обращенно-фазная хроматограмма, представляющая основную заключительную стадию очистки белка, стрелка показывает пик, соответствующий рассматриваемому белку.
c) Очистка мутеина, определяемая хроматографией в δΌδ-РЛОЕ: полоса 1 представляет результаты процесса выделения внутриклеточного тельца; полоса 2 представляет мутеин, полученный после очистки методом обращенно-фазной хроматографии.
Фиг. 2. Исследование агонистической природы мутеина 1Ь-2.
a) Измерение методом проточной цитометрии способности мутеина прикрепляться к поверхности клеток линии СТЬЬ2. Как 1Ь-2, так и мутеин определяли, используя антителомаскирующий иммуноферментный анализ с анти-бНтк.
b) График представляет способность мутеина индуцировать пролиферацию зависимой от 1Ь-2 линии Т-клеток СТЬЬ2 по сравнению с нативным 1Ь-2. Пролиферацию измеряли путем введения МТТ.
Фиг. 3. Мутеин не индуцирует ίη νίίτο пролиферацию регуляторных Т-клеток.
a) График проточной цитометрии, показывающий чистоту популяции клеток ί'.Ό3+ί'.Ό4+ί'.Ό25+. выделенной из лимфатических узлов мыши линии С57ВЬ/б.
b) Регуляторные Т-клетки стимулировали ίη νίίτο маскирующее антитело анти-СП3, и в них вводили нативный 1Ь-2 в концентрации 0,5 нг/мл или мутеин в концентрации 32 нг/мл в течение 72 ч; график представляет число живых клеток, обнаруженных после каждой обработки, по сравнению с контрольным исследованием, в котором цитокин не вводили. Выбранные концентрации соответствуют концентрации, в которой каждая молекула индуцирует одинаковую пролиферацию клеток линии СТЬЬ2.
Фиг. 4. Оценка эффекта лечения мутеином на пролиферацию клеточных популяций.
a) Количественное определение относительной массы селезенки мышей, которым вводили мутеин в течение пяти суток. Масса селезенки получавших лечение мышей статистически превышала массу селезенки мышей контрольной группы. Использовали непараметрический анализ Краскела-Уоллиса (Кти8ка1ХУаПй) и множественное сравнение Данна (Όιιηη).
b) Измерение популяции Т-клеток СЭ8+; график представляет процентные доли данной популяции.
Фиг. 5. Мутеин является более эффективным, чем нативный 1Ь-2, для сокращения метастаз в экспериментальной метастатической модели меланомы линии МВ16Р0.
a) Представительные фотографии легких для каждого вида лечения.
b) Количественное определение легочных метастаз в каждой группе.
Фиг. б. Лечение сочетанием мутеина и вакцины ОУА/У88Р потенцирует противоопухолевый эффект вакцины. Имеющим опухоли мышам вводили вакцину ОУА/У88Р индивидуально или в сочетании с мутеином. График представляет кривые роста опухолей, причем группа, которой вводили указанное сочетание, показывает статистически более значительное уменьшение опухолей по сравнению с контрольной группой.
Примеры
Пример 1. Проектирование мутеинов 1Ь-2.
Мутеины проектировали вычислительным путем, используя биоинформационные методы, на основе структуры 1Ь-2 человека, описанной в банке данных белков РЭВ (ΤΐΌΐοίη Эа1а Вапк), и аминокислотных последовательностей 1Ь-2 разнообразных видов, которые представлены в базе данных δ^ίδδρτοί. Некоторые мутеины проектировали, включая от 3 до б мутаций (вводя неконсервативные аминокислотные замещения) в открытых для растворителя высококонсервативных остатках. Эти мутеины подвергали экспрессии в Е. сой из конструкции на основе плазмидного вектора рЕТ28а, включающей целевую последовательность из шести гистидиновых остатков на аминном конце. Мутеины очищали обращеннофазной хроматографией (фиг. 1), и получали высокую чистоту (более 95%). Полученные мутеины выбирали согласно их свойствам в экспериментальных исследованиях ίη νίίτο и ίη νίνο, чтобы продемонстрировать три основных свойства, представленные в описании настоящего изобретения. Из всех спроектированных мутеинов табл. 1 описывает набор определенных мутаций, которые обеспечивают желательное свойство для агонистов активности 1Ь-2 без ощутимой стимуляции регуляторных Т-клеток и демонстрируют более высокую терапевтическую эффективность по сравнению с 1Ь-2 в лечении пригодных для трансплантации мышиных опухолей. Табл.2 представляет другие спроектированные мутеины, которые
- 5 026022 не проявляли желательных свойств.
Таблица 2
Спроектированные мутеины, не обладающие основными свойствами, описанными в настоящем патенте. Мутации представлены согласно нумерации !Ь-2 человека
Пример 2. Демонстрация агонистического характера спроектированных мутеинов 1Ь-2.
Фиг. 2 иллюстрирует, как представленные в табл. 1 мутеины прикрепляются к компонентам рецептора 1Ь-2 на поверхности клеток линии СТЬЬ2 (фиг. 2а). Спроектированные мутеины прикрепляются к клеткам линии СТЬЬ2, которые, как известно, содержат на своей поверхности имеющие как высокое сродство, так и промежуточное сродство рецепторы для 1Ь-2. Связывание, обнаруженное в данных исследованиях, оказывается аналогичным связыванию, полученному с нативным 1Ь-2. Фиг. 2Ь иллюстрирует способность представленных в табл.1 мутеинов стимулировать рост клеток линии СТЬЬ2 (фиг. 2Ь). Эти мутеины ведут себя как частичные агонисты активности 1Ь-2 в данном исследовании. Их удельная активность ниже от 5 до 50 раз, чем активность нативного 1Ь-2.
Пример 3. Воздействие мутеинов 1Ь-2 на регуляторные Т-клетки.
Описанные в табл.1 мутеины проявляют очень низкую способность стимулировать регуляторные Тклетки ίη νίίτο (фиг. 3). Как представлено на данном чертеже, нативный 1Ь-2 при этом способен индуцировать сильную пролиферацию регуляторных Т-клеток (Т СО4+СО25+РохР3+), стимулированных прикрепленным к чашке антителом анти-СО3. Описанные в табл.1 мутеины в массовых концентрациях, значительно превышающих концентрации нативного 1Ь-2, не стимулировали регуляторные Т-клетки. Кроме того, необходимо отметить, что описанные выше результаты являются действительными, даже если количество используемого мутеина увеличивают в такой степени, чтобы использовать количество, эквивалентное по активности нативному 1Ь-2, в исследовании пролиферации клеток линии СТЬЬ2. Описанные в табл.1 мутеины, как правило, проявляют способность стимулировать регуляторные Т-клетки, которая по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем способность нативного 1Ь-2.
Пример 4. Исследование иммуностимулирующей активности спроектированных мутеинов ίη νίνο.
Описанные в табл.1 мутеины проявляют повышенную иммуностимулирующую активность ίη νίνο. Фиг. 4а и Ь представляют, что мутеины индуцируют увеличение селезенки в большей степени, чем нативный 1Ь2, при исследовании не бывших в эксперименте мышей после внутриперитонеального введения двух доз в сутки, содержащих 20 мкг мутеина, в течение пяти суток. Эта стимуляция соответствует чистому увеличению популяции эффекторных клеток, таких как Т-лимфоциты СЭ8+. На основании данных наблюдений можно сделать вывод, что введение этих мутеинов не стимулирует размножение регуляторных Т-клеток (Т СО4+СО25+РохР3+) в отличие от стимуляции, наблюдаемой в случае нативного 1Ь2 (фиг. 4с и ά).
Пример 5. Измерение терапевтической эффективности мутеинов в случае мышиной модели пригодных для трансплантации опухолей.
Доказана повышенная терапевтическая эффективность спроектированных мутеинов в случае мышиной модели пригодных для трансплантации опухолей. Описанные в табл. 1 мутеины проявляют повышенную эффективность для лечения легочных метастаз меланомы МВ16 в мышиной модели. Фиг. 5 представляет, что после внутриперитонеального введения двух доз в сутки, содержащих 20 мкг описанных в табл.1 мутеинов, в течение пяти суток наблюдался сильный противометастатический эффект, который отсутствовал в группах, получавших эквивалентные дозы нативного 1Ь-2.
Пример 6. Измерение способности мутеина потенцировать действие противоопухолевой вакцины.
Доказана способность спроектированных мутеинов потенцировать действие противоопухолевой вакцины. Использовали модель первичной опухоли с клетками линии ЕО7, причем линия опухолевых клеток была генетически модифицирована для экспрессии антигена ОУА. Имеющих опухоли мышей иммунизировали антигеном ОУА, активированным У88Р, использованным индивидуально или в сочетании с мутеином. Фиг. 6 представляет, что уменьшение роста опухолей происходило в большей степени в случае мышей, которым вводили данное сочетание, чем в случае мышей, которым вводили только вакцину.
- 6 026022
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Центр молекулярной иммунологии <120> Производные полипептиды 1Ь-2 с агонистической активностью
для лечения рака и хронических инфекций.
<130> 4О2О1ОСиОО
<140> Си/Р/2010/216
<141> 2010-11-12
<160> 6
<170> РаРепЫп уегзаоп 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> РЕТ
<213> Е. соН
<400> 1
А1а Рго ТЬг Зег Зег Зег ТЬг Ьуз Ьуз ТЬг С1п Ьеи <31п Ьеи О1и Нхз
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Ьеи Азр Ьеи <31п Мер Не Ьеи Азп С1у Не Азп Азп Туг Ьуз
20 25 30
Азп Рго Ьуз Ьеи ТЬг Ьуз МеЬ Ьеи ТЬг Не Ьуз РЬе Азп МеР Рго Ьуз
35 40 45
Ьуз А1а ТЬг С1и Ьеи Ьуз Шз Ьеи Θΐη Суз Ьеи С1и С1и Ьеи Ьеи Ьуз
50 55 60
Рго Ьеи . С1и νηΐ \Га1 Ьеи Азп Ьеи А1а С1п Зег Ьуз Азп РЬе Шз Ьеи
65 70 75 80
Агд Рго Агд Азр Ьеи Не Зег Азп Не Азп Уа1 Не А/а1 Ьеи С1и Ьеи
85 90 95
Ьуз С1у Зег С1и ТЬг ТЬг РЬе Мер Суз (31и Туг А1а Азр С1и ТЬг А1а
100 105 110
ТЬг Не \7а1 <31и РЬе Ьеи Азп Агд Тгр Не ТЬг РЬе Зег С1п Зег Не
115 120 125
Не Зег ТЬг Ьеи ТЬг 130 <210> 2 <211> 133 <212> РЕТ <213> Е. соН <400> 2
А1а 1 Рго ТНг Зег Зег 5 Зег ТНг Ьуз Ьуз ТНг 10 С1п Ьеи С1п Ьеи С1и 15 Шз
Ьеи Ьеи Ьеи Азр Ьеи С1п МеН Не Ьеи Азп О1у Не Азп Азп Туг Ьуз
20 25 30
Азп Рго Ьуз Ьеи ТНг Ьуз МеС Ьеи ТНг С1п Ьуз РНе С1и МеН Рго Ьуз
35 40 45
Ьуз А1а ТНг С1и Ьеи Ьуз Шз Ьеи С1п Суз Ьеи С1и С1и О1и Ьеи Ьуз
50 55 60
Рго Ьеи О1и Уа1 Уа1 Ьеи Азп Ьеи А1а С1п Зег Ьуз Азп РНе Шз Ьеи
65 70 75 80
Агд Рго Агд Азр Ьеи Не Зег Азп Не Азп Уа1 Не Уа1 Ьеи С1и Ьеи
85 90 95
Ьуз С1у Зег С1и ТНг ТНг РНе МеН Суз С1и Туг А1а Азр 61и ТНг А1а
100 105 110
ТЬг Не Уа1 01и РНе Ьеи Азп Агд Тгр 11е ТНг РНе Зег О1п Зег Не
115 120 125
Не Зег ТНг Ьеи ТНг
130
<210> 3
<211> 133
<212> РЕТ
<213> : Е. соН
<400> 3
А1а Рго ТНг Зег Зег Зег ТНг Ьуз Ьуз ТНг О1п Ьеи О1п Ьеи С1и Шз
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Ьеи Азр Ьеи С1п МеЬ Не Ьеи Азп ОЯу Не Азп Азп Туг Ьуз
20 25 30
Азп Рго Ьуз Ьеи ТНг А1а МеН Ьеи ТНг 11е Ьуз РНе Азп МеН Рго Ьуз
35 40 45
Ьуз А1а ТНг С1и Ьеи Ьуз Шз Ьеи С1п Суз Ьеи 61и 61и Ьеи Ьеи Ьуз
50 55 60
Рго Ьеи С1и Уа1 Уа1 Ьеи Азп Ьеи А1а С1п Зег Ьуз Азп РНе Шз Ьеи
65 70 75 80
- 8 026022
Агд Рго Агд Азр Ьеи 85 Не Зег Азп Не Азп 90 Уа1 11е Уа1 Ьеи С1и 95 Ьеи
Ьуз О1у Зег С1и 100 ТЬг ТНг РНе МеС Суз 105 61и Туг А1а Азр О1и 110 ТНг А1а
ТНг Не Уа1 115 <31и РНе Ьеи Азп Агд 120 Тгр Не ТНг РНе Зег 125 С1п Зег Не
Не Зег ТНг Ьеи ТНг
130 <210> 4 <211> 133 <212> РКТ
<213> Е соН
<400> 4
А1а Рго ТНг Зег Зег Зег ТНг Ьуз Ьуз ТНг 61п Ьеи С1п Ьеи С1и Нхз
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Ьеи Азр Ьеи С1п МеС Не Ьеи Азп С1у 11е Азп Азп Туг Ьуз
20 25 30
Азп Рго Ьуз Ьеи ТНг Ьуз МеС Ьеи ТНг Ьуз Ьуз РНе Агд МеС Рго Ьуз
35 40 45
Ьуз А1а ТНг С1и Ьеи Ьуз Нхз Ьеи С1п Суз Ьеи С1и <31и Ьеи Ьеи Ьуз
50 55 60
Рго Ьеи С1и Уа1 Уа1 Ьеи Азп Ьеи А1а С1п Зег Ьуз Азп РНе Нхз Ьеи
65 70 75 80
Агд Рго Агд Азр Ьеи Не Зег Азп Не Азп Уа1 11е Уа1 Ьеи <31и Ьеи
85 90 95
Ьуз С1у Зег С1и ТНг ТНг РНе МеС Суз С1и Туг А1а Азр С1и ТНг А1а
100 105 110
ТНг Не Уа1 О1и РНе Ьеи Азп Агд Тгр Не ТНг РНе Зег С1п Зег 11е
115 120 125
Не Зег ТНг Ьеи ТНг
130 <210> 5 <211> 133 <212> РКТ <213> Е. соН <400> 5
А1а 1 Рго ТНг Зег Зег 5 Зег ТНг Ьуз Ьуз ТНг 10 С1п Ьеи О1п Ьеи <31и 15 Ηίβ
Ьеи Ьеи Ьеи Азр Ьеи С1п МеН 11е Ьеи Азп О1у Не Азп Азп Туг Ьуз
20 25 30
Азп Рго Ьуз Ьеи ТНг Ьуз МеН Ьеи ТНг 11е Ьуз РНе <31и МеН Рго Ьуз
35 40 45
Ьуз А1а ТНг <31и Ьеи Ьуз Ηίβ Ьеи О1п Суз Ьеи О1и <31и <31и Ьеи Ьуз
50 55 60
Рго Ьеи О1и Уа1 Уа1 Ьеи Азп Ьеи А1а С1п Зег Ьуз Азп РНе Нхз Ьеи
65 70 75 80
Агд Рго Агд Азр Ьеи 11е Зег Азп Х1е Азп Уа1 Не Уа1 Ьеи О1и Ьеи
85 90 95
Ьуз С1у Зег С1и ТНг ТНг РНе МеН Суз С1и Туг А1а Азр С1и ТНг А1а
100 105 110
ТНг Не Уа1 <31и РНе Ьеи Азп Агд Тгр Не ТНг РНе Зег С1п Зег Не
115 120 125
Не Зег ТНг Ьеи ТНг
130
<210> 6
<211> 133
<212> РЕТ
<213> : Е. οοΐί
<4 00 > 6
А1а Рго ТНг Зег Зег Зег ТНг Ьуз Ьуз ТНг Θΐη Ьеи 61п Ьеи (31и Шз
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Ьеи Азр Ьеи <31п МеЬ 11е Ьеи Азп С1у 11е Азп Азп Туг Ьуз
20 25 30
Азп Рго Ьуз Ьеи ТНг А1а МеЬ Ьеи ТНг А1а Ьуз РНе А1а МеН Рго Ьуз
35 40 45
Ьуз А1а ТНг О1и Ьеи Ьуз Нхз Ьеи <31п Суз Ьеи С1и С1и А1а Ьеи Ьуз
50 55 60
Рго Ьеи С1и <31и Уа1 Ьеи Азп Ьеи А1а С1п Зег Ьуз Азп РНе НЬз Ьеи
65 70 75 80
- 10 026022
Агд Рго Агд Азр Ьеи 85 11е Зег Азп 11е Азп УаЬ 90 11е УаЬ Ьеи СЬи 95 Ьеи
Ьуз СЬу Зег СЬи ТЬг ТЬг РЬе МеЬ Суз СЬи Туг АЬа Азр СЬи ТЬг АЬа
100 105 110
ТЬг 11е УаЬ СЬи РЬе Ьеи Азп Агд Тгр 11е ТЬг РЬе Зег СЬп Зег 1Ье
115 120 125
Не Зег ТЬг Ьеи ТЬг

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенный полипептид, являющийся агонистом по отношению к ΙΙ.-2. проявляющий повышенное иммуностимулирующее и противоопухолевое действие по сравнению с нативным 1Б-2 и имеющий аминокислотную последовательность. которая идентична на 95% последовательности нативного 1Б-2 и которая выбрана из
    81% ΙΌ N0. 1 (содержит мутации К38К. Ε42Ι. Υ45Ν. Е62Б и Е68У);
    81% ΙΌ N0. 2 (содержит мутации К38К. Е42р. Υ45Ε и Е68У);
    81% ΙΌ N0. 3 (содержит мутации Κ38Α. Ε42Ι. Υ45Ν, Е62Б и Е68У);
    81% ΙΌ N0. 4 (содержит мутации К38К. Е42К, Υ45Κ. Е62Б и Е68у);
    81 % ΙΌ N0. 5 (содержит мутации К38К. Ε42Ι, Υ45Ε и Е68У);
    81 % ΙΌ N0. 6 (содержит мутации Κ.38Α. Ε42Ά, Υ45Α и Е62А).
  2. 2. Слитый белок. содержащий полипептид по п.1, соединенный с белком-носителем.
  3. 3. Слитый белок по п.2. где белок-носитель представляет собой альбумин.
  4. 4. Слитый белок по п.2. где белок-носитель представляет собой Ее-область иммуноглобулинов человека.
  5. 5. Фармацевтическая композиция для лечения рака. содержащая полипептид по п.1 в качестве активного ингредиента.
  6. 6. Фармацевтическая композиция для лечения рака. содержащая слитый белок по любому из пп.2-4 в качестве активной основы.
  7. 7. Применение полипептида по п.1 для лечения рака.
  8. 8. Применение слитого белка по любому из пп.2-4 для лечения рака.
EA201390681A 2010-11-12 2011-11-10 Производные полипептиды il-2 с агонистической активностью для лечения рака EA026022B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2010000216A CU23923B1 (es) 2010-11-12 2010-11-12 Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
PCT/CU2011/000007 WO2012062228A2 (es) 2010-11-12 2011-11-10 Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista para la terapia del cáncer e infecciones crónicas.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390681A1 EA201390681A1 (ru) 2013-08-30
EA026022B1 true EA026022B1 (ru) 2017-02-28

Family

ID=45350376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390681A EA026022B1 (ru) 2010-11-12 2011-11-10 Производные полипептиды il-2 с агонистической активностью для лечения рака

Country Status (22)

Country Link
US (1) US9206243B2 (ru)
EP (1) EP2639241B1 (ru)
JP (1) JP5761831B2 (ru)
KR (1) KR101559330B1 (ru)
CN (1) CN103201284B (ru)
AR (1) AR083858A1 (ru)
AU (1) AU2011328688B2 (ru)
BR (1) BR112013010127B1 (ru)
CA (1) CA2814814C (ru)
CL (1) CL2013001107A1 (ru)
CO (1) CO6700862A2 (ru)
CU (1) CU23923B1 (ru)
EA (1) EA026022B1 (ru)
ES (1) ES2543915T3 (ru)
HK (1) HK1182403A1 (ru)
IL (1) IL226221B (ru)
MX (1) MX346222B (ru)
MY (1) MY171356A (ru)
PE (1) PE20140382A1 (ru)
TW (1) TWI488864B (ru)
UA (1) UA106318C2 (ru)
WO (1) WO2012062228A2 (ru)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
MA39250B1 (fr) 2014-02-06 2018-09-28 Hoffmann La Roche Protéines hybrides de l'interleukine-2 et leurs utilisations
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
MX2016013970A (es) * 2014-04-25 2017-04-06 Rinat Neuroscience Corp Conjugados anticuerpo-farmaco con carga alta de farmacos.
SG11201700629TA (en) 2014-08-11 2017-02-27 Delinia Inc Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US11077172B2 (en) 2016-11-08 2021-08-03 Delinia, Inc. IL-2 variants for the treatment of psoriasis
JP2019534308A (ja) * 2016-11-10 2019-11-28 ネクター セラピューティクス 免疫療法的腫瘍治療方法
CU24483B1 (es) * 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
CA3064435A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
US11542312B2 (en) * 2017-06-19 2023-01-03 Medicenna Therapeutics, Inc. IL-2 superagonists in combination with anti-PD-1 antibodies
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
JP2021506291A (ja) * 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
EP3762406A2 (en) 2018-03-09 2021-01-13 Askgene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs
CU24554B1 (es) * 2018-05-07 2021-11-04 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por una muteína de interleucina 2 e interferón tipo 1
JP2021523741A (ja) 2018-05-14 2021-09-09 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なインターロイキン１２ポリペプチド及びその使用方法
CA3100007A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
MX2020007072A (es) * 2018-09-17 2020-11-11 Gi Innovation Inc Proteina de fusion que comprende proteina il-2 y proteina cd80 y uso de la misma.
MX2021003543A (es) 2018-09-27 2021-06-23 Xilio Dev Inc Polipeptidos de citocinas enmascaradas.
CA3117853A1 (en) * 2018-10-29 2020-05-07 1Globe Biomedical Co., Ltd. Novel rationally designed protein compositions
TW202034945A (zh) 2018-12-21 2020-10-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種人白細胞介素２變體或其衍生物
CU20190021A7 (es) 2019-03-15 2020-10-20 Centre Hospitalier Univ Vaudois Método para la expansión y diferenciación de linfocitos t y células nk en terapias de transferencia adoptiva
SG11202112541RA (en) 2019-05-14 2021-12-30 Werewolf Therapeutics Inc Separation moieties and methods and use thereof
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
US20220305124A1 (en) * 2019-06-05 2022-09-29 Emory University Photolysis to Unlock Caged Protein Therapeutics
CN114341189A (zh) 2019-06-12 2022-04-12 奥美药业有限公司 全新il-15前药及其应用
CA3143034A1 (en) * 2019-06-14 2020-12-17 Cugene Inc. Novel interleukin-2 variants for the treatment of cancer
WO2021062406A1 (en) 2019-09-28 2021-04-01 AskGene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs and dual-prodrugs
MX2022007754A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Regeneron Pharma Nuevos agonistas de il2 y metodos de uso de estos.
US11633488B2 (en) 2020-01-10 2023-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
KR102653906B1 (ko) 2020-01-14 2024-04-03 신테카인, 인크. 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물
KR20230004682A (ko) 2020-04-22 2023-01-06 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 인터류킨-2 수용체 베타 감마c 이량체에 대해 편향되고 비펩티드성 수용성 중합체에 접합된 인간 인터류킨-2 접합체
JPWO2022059794A1 (ru) * 2020-09-18 2022-03-24
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
JP2023549191A (ja) 2020-11-13 2023-11-22 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 ヒトインターロイキン２の変異体又はその誘導体を含む医薬組成物及びその用途
CA3222359A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Ag Conjugates of checkpoint inhibitors with il-2, and uses thereof
KR20240041379A (ko) 2021-07-09 2024-03-29 브라이트 피크 테라퓨틱스 아게 Il-2에 접합된 체크포인트 억제제 및 이의 용도
US20230201365A1 (en) 2021-07-09 2023-06-29 Bright Peak Therapeutics Ag Modified cd20 antibodies and uses thereof
WO2023281481A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Antibody conjugates and manufacture thereof
AU2022320553A1 (en) 2021-07-30 2024-02-01 Yunquan Biotechnology (Beijing) Co., Ltd. Human interleukin-2 variant and use thereof
CU20210104A7 (es) 2021-12-21 2023-07-12 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteína agonista de interleucina 2
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023161857A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Bright Peak Therapeutics Ag Bifunctional cytokine compositions
WO2023180527A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Universität Zürich Adenoviral mediated targeting of activated immune cells
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040175357A1 (en) * 1998-05-15 2004-09-09 Shanafelt Armen B. IL-2 selective agonists and antagonists
WO2005007121A2 (en) * 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
WO2008003473A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
WO2009061853A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4853332A (en) 1982-10-19 1989-08-01 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
FR2624741B1 (fr) * 1987-12-21 1991-06-28 Pasteur Institut Compositions a base d'une combinaison de liposomes et de lymphokine presentant des proprietes immunostimulantes et leurs applications en medecine humaine et veterinaire
AU4525589A (en) * 1988-10-27 1990-05-14 Regents Of The University Of Minnesota Liposome immunoadjuvants containing il-2
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
DZ2788A1 (fr) * 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
PT1454138E (pt) 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
CN1609227A (zh) * 2003-10-24 2005-04-27 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种白介素－4突变基因il－4－13及其制备和应用
CN1964737B (zh) * 2004-06-04 2011-04-20 瑞泽恩制药公司 利用il-1拮抗剂治疗自身炎症性疾病的方法
DE102008023820A1 (de) * 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
CA2749539C (en) * 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040175357A1 (en) * 1998-05-15 2004-09-09 Shanafelt Armen B. IL-2 selective agonists and antagonists
WO2005007121A2 (en) * 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
WO2008003473A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
WO2009061853A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
PE20140382A1 (es) 2014-03-24
AU2011328688A1 (en) 2013-05-02
KR20130091346A (ko) 2013-08-16
CL2013001107A1 (es) 2014-01-10
EP2639241B1 (en) 2015-07-08
US20140314709A1 (en) 2014-10-23
WO2012062228A3 (es) 2012-07-05
JP2014500868A (ja) 2014-01-16
EP2639241A2 (en) 2013-09-18
JP5761831B2 (ja) 2015-08-12
AR083858A1 (es) 2013-03-27
HK1182403A1 (en) 2013-11-29
CO6700862A2 (es) 2013-06-28
KR101559330B1 (ko) 2015-10-12
BR112013010127B1 (pt) 2021-12-14
CU20100216A7 (es) 2012-06-21
ES2543915T3 (es) 2015-08-25
CN103201284A (zh) 2013-07-10
BR112013010127A2 (pt) 2016-08-30
UA106318C2 (ru) 2014-08-11
EA201390681A1 (ru) 2013-08-30
CN103201284B (zh) 2015-07-01
MX346222B (es) 2017-03-09
IL226221B (en) 2018-10-31
MY171356A (en) 2019-10-10
MX2013005250A (es) 2013-08-29
CU23923B1 (es) 2013-07-31
WO2012062228A2 (es) 2012-05-18
US9206243B2 (en) 2015-12-08
IL226221A0 (en) 2013-07-31
CA2814814C (en) 2015-12-22
TWI488864B (zh) 2015-06-21
TW201300409A (zh) 2013-01-01
CA2814814A1 (en) 2012-05-18
AU2011328688B2 (en) 2015-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA026022B1 (ru) Производные полипептиды il-2 с агонистической активностью для лечения рака
JP5680661B2 (ja) Ｉｌ−２に由来する免疫調節ポリペプチド並びに癌及び慢性感染症の治療におけるその使用
JP3825467B2 (ja) インターロイキン―７を用いた選定免疫療法
US11926654B2 (en) Fusion proteins composed of an interleukin-2 mutein and type I interferon
CN104231068A (zh) 人白细胞介素ii突变体及其应用
JPH10510147A (ja) 二次性免疫不全症の治療用薬剤の製造方法
KR101913333B1 (ko) 신규 ctl 에피토프 4 연결 펩타이드
Malkovský et al. Interleukin 2 and its receptor: structure, function and therapeutic potential
JP6077641B2 (ja) 新規ｃｔｌエピトープ５連結ペプチド
JP5227028B2 (ja) インターロイキン−２の中和能を有する免疫治療用製剤
CN117624379A (zh) 一种人工蛋白及其应用
Goey Interleukin-2 based systemic and locoregional immunology

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM