TW202413398A

TW202413398A - 介白素-2變異體及其於治療癌症的用途

Info

Publication number: TW202413398A
Application number: TW112130710A
Authority: TW
Inventors: 藍耿立; 蔡政良; 黃彥華
Original assignee: 國立陽明交通大學
Priority date: 2022-08-16
Filing date: 2023-08-15
Publication date: 2024-04-01

Abstract

本揭示內容整體上是關於一種分離的介白素-2 (IL-2)變異體，其展現出對IL-2受體(IL-2R)的α-次單元的親和力降低，可以用作一種免疫治療劑。此外，本揭示內容亦涵蓋一種包含該分離的IL-2變異體的藥學組合物，以及該藥學組合物於治療一個體之癌症的用途。

Description

介白素-2變異體及其於治療癌症的用途

本揭示內容整體上是關於癌症治療的技術領域。更具體來說，本揭示內容是關於介白素-2 (interleukin-2，IL-2)變異體，以及其於治療癌症的用途。

癌症是一種有關於身體的某一部位有異常細胞不受控制地分裂，並有可能侵犯或擴散到身體其他部位的疾病。長久以來，癌症嚴重威脅到全人類的健康，並成為社會醫療衛生系統的沉重負擔。根據世界衛生組織所提供的統計數據，僅在2020年一年，男女各年齡段的所有癌症新增病例達19,292,789例，癌症死亡人數達9,958,133人，造成重大的人類生命和經濟損失。

因此，世界各地的科學家們致力於開發有效的癌症治療方法，藉以提高癌症治療的功效，迄今為止，現行的治療方法包括外科手術、化學療法、放射療法、荷爾蒙療法、溫熱療法、緩和療護(palliative care)等用於治療癌症的方法。然而，這類傳統方法經常伴隨著嚴重的副作用，例如，會對正常組織造成損傷或具有細胞毒性。有鑑於上述問題，近年來相應開發了具有較少副作用的治療方法，其中一些治療方法正處於研究或臨床前試驗的階段。在這些治療方法中，利用生物大分子(例如，多肽、核酸、碳水化合物等)的免疫療法被認為是最有前途的治療方法，因為它通過調節宿主免疫系統的功能來消除腫瘤，從而最大限度地減少可能對病患產生的副作用。

IL-2是一種有潛力的用於治療癌症的免疫治療劑。野生型IL-2 (亦稱為介白素原(proleukin)，一種T細胞生長因子(T cell growth factor，TCGF))，是一種15.5千道耳頓(kDa)的球狀糖蛋白，它參與在淋巴細胞的生成、存活，以及恆定。IL-2主要由活化的T細胞(特別是CD4 ⁺輔助型T細胞)來合成。它會刺激T細胞的增殖和分化，誘導胞毒型(cytotoxic) T淋巴細胞(CTL)的生成，誘導周邊血液淋巴細胞向胞毒型細胞和淋巴激素(lymphokine)活化殺手(lymphokine-activated killer，LAK)細胞的分化，促進T細胞表現細胞激素和細胞溶解(cytolytic)分子，促進B細胞的增殖和分化以及B細胞合成免疫球蛋白，並刺激自然殺手(natural killer，NK)細胞的生成、增殖，以及活化。由於IL-2能夠在體內擴大淋巴細胞群並增加該些細胞的效應器(effector)功能，從而產生抗腫瘤作用，因此IL-2被認為是一種有吸引力之用於治療癌症的治療選擇。

然而，IL-2在免疫反應中具有雙重功能，它不僅會介導效應細胞的擴增和活性，並且還關鍵性地參與在維持周邊免疫耐受性中。IL-2通過與IL-2受體(IL-2R)結合來介導其作用，而IL-2R由α-次單元(CD25)、β-次單元(CD122)，以及γ _c-次單元(γ _c，CD132)等次單元來組成二聚體形式(含有β/γ _c-次單元)或三聚體形式(含有α/β/γ _c-次單元)的受體。在上述次單元中，α-次單元是賦予與其受體結合的高度親和力，而β-次單元和γ _c-次單元則是對於訊息轉導至關重要。在免疫耐受性的部分，IL-2一部分通過結合至調控性T (regulatory T，T _reg)細胞所表現的IL-2R三聚體(即α/β/γ _c-次單元)來參與，結合後，活化T _reg細胞的活性，進而觸發周圍環境的免疫抑制性，從而損害宿主的抗腫瘤免疫力。據此，野生型IL-2對於抑制腫瘤生長來說並非最佳選擇，而優化IL-2，通過篩選一系列之IL-2變異體，以尋找出與IL-2R的α-次單元的親和力降低，且與IL-2R的β-次單元和γ _c-次單元的親和力不受影響的變異體，可有助於減輕T _reg細胞所引起的免疫抑制性，從而增強IL-2的整體抗腫瘤活性。

有鑑於此，相關領域亟需尋找出最佳的IL-2變異體來克服與IL-2免疫療法相關的問題，通過剪除IL-2蛋白中不想要的免疫耐受性活性，進而增強它在治療方面的應用性。

下文呈現出本揭示內容的簡單概要，以利讀者對於本揭示內容有基本的理解。本概要並非是對於本揭示內容的廣泛性概觀，也非是用以鑑別本揭示內容的關鍵性/決定性元件，或用以勾勒本揭示內容的範圍。它唯一的目的在於，以一種簡化的形式呈現出本揭示內容的某些概念，以作為後續呈現出更多詳細說明的序幕。

如在本文中所實施和廣泛描述的，本揭示內容的其中一態樣是關於一種分離的IL-2變異體，其表現出對IL-2R的α-次單元的親和力降低，而對IL-2R的β-次單元和γ _c-次單元的親和力不受影響的特性，該分離的IL-2變異體具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列，其中該分離的IL-2變異體在對應於序列編號：1中的第42、45、50、72或125個位置處包含一胺基酸置換(substitution)，其中：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的該胺基酸置換是將苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)、半胱胺酸(C)、麩胺酸(E)、組胺酸(H)、纈胺酸(V)，或色胺酸(W)；在對應於序列編號：1中的第45個位置處的該胺基酸置換是將酪胺酸(Y)置換為丙胺酸(A)、天門冬胺酸(D)、甘胺酸(G)、甲硫胺酸(M)、天門冬醯胺(N)、麩醯胺(Q)、精胺酸(R)、絲胺酸(S)，或蘇胺酸(T)；在對應於序列編號：1中的第50個位置處的該胺基酸置換是將丙胺酸(A)置換為異白胺酸(I)；在對應於序列編號：1中的第72個位置處的該胺基酸置換是將白胺酸(L)置換為天門冬胺酸(D)、異白胺酸(I)、離胺酸(K)、天門冬醯胺(N)，或纈胺酸(V)；以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的該胺基酸置換是將半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。

依據本揭示內容的某些實施方式，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為色胺酸(W)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為離胺酸(K)。

依據本揭示內容的其他實施方式，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為纈胺酸(V)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。

依據本揭示內容的再其他實施方式，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為麩胺酸(E)，以及在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為甘胺酸(G)。

可任選地，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為纈胺酸(V)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為絲胺酸(S)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。

或者或再者，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為組胺酸(H)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬胺酸(D)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為異白胺酸(I)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。

在本揭示內容的某些進一步的實施方式中，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為半胱胺酸(C)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為纈胺酸(V)。

或者是，在本揭示內容的一特定實施方式中，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第50個位置處的丙胺酸(A)置換為異白胺酸(I)。

依據本揭示內容的某些特定實施方式，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬胺酸(D)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬胺酸(D)。

又在本揭示內容的某些進一步的實施方式中，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為甲硫胺酸(M)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)。

再又在本揭示內容的某些進一步的實施方式中，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列和以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為精胺酸(R)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)。

依據本揭示內容的某些較佳的實施方式，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，該分離的IL-2變異體包含序列編號：1的胺基酸序列。

據此，本揭示內容亦涵蓋一種藥學組合物，包含上述之分離的IL-2變異體，以及一藥學上可接受的載體。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以治療一個體之癌症的方法，是借助於使用本揭示內容分離的IL-2變異體或包含該變異體的本揭示內容藥學組合物，該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容分離的IL-2變異體或本揭示內容藥學組合物的步驟。

依據本揭示內容的某些較佳的實施方式，本揭示內容分離的IL-2變異體或本揭示內容藥學組合物是以1-500微克/公斤體重的量投予至該個體。

適用於本揭示內容分離的IL-2變異體、本揭示內容藥學組合物，或本揭示內容方法來治療的癌症可以是膀胱癌、膽管癌、骨癌、腦瘤、乳癌細胞、子宮頸癌、大腸直腸癌、食道癌、上皮癌、胃癌、胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)、神經膠質瘤、類淋巴系造血組織腫瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、血癌、肺癌、淋巴瘤、腸癌、黑色素瘤、骨髓性白血病、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、卵巢癌、腎細胞癌、脾臟癌、鱗狀細胞癌、甲狀腺癌，或甲狀腺濾泡癌。

依據本揭示內容的某些進階的實施方式，本揭示內容方法更包含在投予本揭示內容分離的IL-2變異體或本揭示內容藥學組合物之前、同時，或之後，使該有需要治療之個體接受外科手術、放射療法、化學療法、免疫療法、荷爾蒙療法，或其組合療法的步驟。

在本揭示內容的某些較佳的實施方式中，本揭示內容方法中與本揭示內容分離的IL-2變異體或本揭示內容藥學組合物合併使用的是免疫療法，其中所述免疫療法包含對該個體投予一有效量之C-C模體趨化激素配體3 (C-C motif chemokine ligand 3，CCL3)、C-C模體趨化激素配體26 (CCL26)、C-X-C模體趨化激素配體7 (C-X-C motif chemokine ligand 7，CXCL7)；顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α (IFN-α)、干擾素-β (IFN-β)、干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)；介白素-4 (IL-4)、介白素-5 (IL-5)、介白素-7 (IL-7)、介白素-10 (IL-10)、介白素-12 (IL-12)、介白素-13 (IL-13)、介白素-15 (IL-15)；阿普司特(apremilast)、咪喹莫特(imiquimod)、來那度胺(lenalidomide)、柏馬度胺(pomalidomide)、西普魯塞-T (sipuleucel-T)、沙利度胺(thalidomide)；抗-CTLA-4抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體；抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD11a抗體、抗-CD20抗體、抗-CD25抗體、抗-CD52抗體、抗-EGFR抗體、抗-HER2抗體、抗-PCDP1抗體、抗-SLAMF7抗體，或抗-Trop-2抗體。依據本揭示內容的更佳實施方式，本揭示內容方法中與本揭示內容分離的IL-2變異體或本揭示內容藥學組合物合併使用的免疫療法，包含對該個體投予一有效量之IL-15。

可藉由本揭示內容分離的IL-2變異體、本揭示內容藥學組合物，或本揭示內容方法來治療的個體是一種哺乳動物，舉例來說，可以是人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、猴子、豬、狗、貓、馬、綿羊、山羊、乳牛，以及兔子。較佳地，該個體是人類。

在參閱以下的詳細說明和附隨圖式後，本揭示內容諸多伴隨的特徵和優點當可輕易瞭解。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

為方便起見，本說明書、實施例和所附申請專利範圍中所使用的特定專有名詞集中在此。除非本說明書另有定義，否則此處所使用的科學和技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解和慣用的意義相同。並且，在與上下文不相衝突的情形下，本說明書所使用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型，而所使用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，在本說明書與申請專利範圍中，單數形式「一」(a、an和the)包括複數參考值，但依據上下文而另有指示者除外。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」(at least one)與「一或多」(one or more)等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。除非另有說明，否則本揭示內容的實踐將會採用分子生物學、腫瘤生物學、微生物學，以及免疫學等領域的常規技術，該些技術均屬於本領域的技術範圍內。這類技術已在公開文獻中有詳細闡釋。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已經盡可能精確地呈現出具體實施例中的相關數值。然而，任何數值在本質上不可避免地會含有因個別測試方法所致的標準差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實施例以外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值，以及百分比(例如，用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例等)均經過「約」的修飾。據此，除非另有相反指示，否則本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，並且可視需求而更動。至少，應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

除非另有說明，否則本文所使用之「介白素-2」(interleukin-2)或「IL-2」一詞，是指來自任何脊椎動物來源的任何原生(native)的IL-2多肽，包括來自哺乳動物例如靈長類動物(例如，人類)和囓齒類動物(例如，小鼠和大鼠)的IL-2多肽。該詞彙涵蓋了未加工的IL-2以及任何由細胞內加工所產生的IL-2形式。該詞彙還涵蓋了天然存在的IL-2變異體，例如，剪接(splice)變異體或等位基因變異體。例示性之人類IL-2的胺基酸序列如序列編號：1所示。未加工的人IL-2還包含N端的20個胺基酸訊息肽，該訊息肽在成熟的IL-2分子中並不存在。

本文所使用之「IL-2變異體」(IL-2 variant)一詞旨在涵蓋各種形式的IL-2多肽的任何突變形式，包括全長IL-2、IL-2的截短形式(truncated form)，以及IL-2與另一分子通過融合或化學綴合(conjugation)而連接的形式。在指涉IL-2時，「全長」(full-length)意指成熟的、天然長度的IL-2分子。舉例來說，全長人類IL-2是指一種具有133個胺基酸(例如參見序列編號：1)的分子。各種形式的IL-2變異體的特徵在於，具有至少一個會影響IL-2與IL-2R的α-次單元(CD25)相互作用的胺基酸突變。該突變可能涉及置換、缺失、截短，或修飾在通常位於該位置的野生型胺基酸殘基。較佳是通過胺基酸置換來獲得突變體。除非另有說明，否則在本文中IL-2變異體可以稱為IL-2突變體、IL-2突變體肽序列、IL-2突變體多肽、IL-2突變體蛋白，或IL-2突變體類似物。本文中各種形式的IL-2的命名是相對於序列編號：1中的所示序列來進行。本文中可以使用各種命名方式來指稱相同的突變。舉例來說，第42個位置處的苯丙胺酸置換成丙胺酸的突變可以表示為42A、A42、F42A，或Phe42Ala。

如本文所使用者，「野生型」(wild-type) IL-2的形式是指一種在其他方面與IL-2變異體相同，但在每個IL-2變異體的突變胺基酸位置上，野生型形式具有野生型胺基酸的IL-2形式。舉例來說，如果IL-2變異體是全長IL-2(即未與任何其他分子融合或綴合的IL-2)，則該突變體的野生型形式是全長的原生IL-2。如果IL-2變異體是突變型IL-2與另一種位於IL-2下游的編碼多肽(例如，抗體鏈)之間的融合體，則該IL-2變異體的野生型形式是將野生型IL-2胺基酸序列融合到相同的下游多肽的融合體。此外，如果IL-2變異體是IL-2的截短形式(在非截短的部分具有突變或修飾序列)，則該IL-2變異體的野生型形式是一種同樣被截短的IL-2，但具有野生型序列的形式。為了比較各種形式的IL-2變異體相較於其相應的野生型IL-2形式，對於IL-2受體的結合親和力或生物學活性，「野生型」一詞還涵蓋了一種包含一或多個胺基酸突變的IL-2形式，其中與天然發生的原生IL-2相比，該突變不會影響到其與IL-2受體的結合，例如將人類IL-2的第125個位置處的半胱胺酸殘基置換為丙胺酸即屬此類。

本文所使用之「高度親和力IL-2R」(high-affinity IL-2R)一詞是指IL-2R的異源性三聚體形式(heterotrimeric form)，由受體α-次單元(又稱CD25或P55)、受體β-次單元(又稱CD122或P70)，以及受體γ _c-次單元(又稱共同細胞激素受體(common cytokine receptor) γ _c-次單元、γ _c，或CD132)所組成。相比之下，「中度親和力IL-2R」(intermediate-affinity IL-2R)一詞是指僅包括β-次單元和γ _c-次單元，而不包括α-次單元的IL-2受體。

本文所使用之「親和力」(affinity)一詞是指一種分子(例如，受體)的單一結合位點與其結合對象(例如，配體)之間的非共價相互作用的總強度。除非另有說明，否則本文所使用之「結合親和力」(binding affinity)一詞是指，一種反映出一組結合對(binding pair)的成員(例如，受體和配體)之間以1：1相互作用的內在(intrinsic)結合親和力。分子X與其對象Y的親和力通常可以用解離常數(K _D)來表示，該常數是解離速率常數(K _off)與結合速率常數(K _on)的比率。因此，「等效親和力」(equivalent affinity)可以包含不同的速率常數，只要該速率常數的比率保持不變即可。親和力可以通過本領域已知的任何已確立的方法來測量，例如通過表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)來進行分析，使用標準儀器例如BIAcore儀器，其中IL-2R的每個次單元可以通過表現重組蛋白來獲得。或者是，可以使用已知會表現出某種IL-2R形式的細胞株，來評估IL-2變異體對不同IL-2R形式的結合親和力。

本文所使用之「效應細胞」(effector cell)一詞，是指一種會介導IL-2之細胞毒性作用的淋巴細胞群。效應細胞包括效應T細胞，例如，CD8 ⁺胞毒性T細胞、NK細胞、LAK細胞，以及巨噬細胞/單核球。

本文所使用之「多肽」(polypeptide)一詞是指一種由單體(胺基酸)通過醯胺鍵(又稱肽鍵)進行線性連接所組成的分子。「多肽」一詞是指任何由兩個或更多個胺基酸所組成的鏈狀結構，並非指定特定的產物長度。因此，「肽」(peptide)、「二肽」(dipeptide)、「三肽」(tripeptide)、「寡肽」(oligopeptide)、「蛋白」(protein)、「胺基酸鏈」(amino acid chain)，或用於指稱任何兩個或更多個胺基酸鏈的其他詞彙，均包括在「多肽」的定義中，並且「多肽」一詞可以代替或與這些詞彙交替使用。「多肽」還意指多肽的表現後修飾產物，包括，但不限於，糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/封閉基團的衍生、蛋白水解切割，或通過非天然發生的胺基酸的修飾。多肽可以是來自天然的生物學來源，也可以通過重組技術來產生，但不一定是根據指定的核酸序列進行轉譯而來。它可以是通過任何方式來產生，包括通過化學合成來產生。本發明多肽的大小可能具有大約3個或更多個、5個或更多個、10個或更多個、20個或更多個、25個或更多個、50個或更多個、75個或更多個、100個或更多個、200個或更多個、500個或更多個、1,000個或更多個，或2,000個或更多個胺基酸。多肽可能具有確定的三維結構，儘管它們不一定具有這種結構。具有確定三維結構的多肽稱為折疊的，而該些沒有確定三維結構，但可以採用大量不同構型的多肽稱為未折疊的。

「分離的」(isolated)多肽或其變異體或衍生物是指一種不存在於其天然棲息地(milieu)中的多肽。並不需要特定程度的純化。舉例來說，可以將分離的多肽從其原生或天然(natural)環境中移出。為了本發明的目的，在宿主細胞中表現出以重組方式所製備的多肽和的蛋白視為是分離的，同理，已通過任何適當技術來進行分離、分餾(fractionated)，或部分或實質上純化的原生多肽或重組多肽也視為是分離的。

如本文所討論者，在本揭示內容IL-2變異體中的胺基酸序列發生些微變化仍被視為涵蓋在本揭示內容所披露和要求保護的發明概念中，只要該些變化是發生在對應於序列編號：1中的第42、45、50、72或125個位置處之外的位置上(即，在序列編號：1中的第1-41、43-44、46-49、51-71、73-124，或126-133個位置處發生變化)，並與序列編號：1保持至少85％之序列相似度(例如，與序列編號：1具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及100％的序列相似度)，且不會影響本揭示內容IL-2變異體對IL-2R的α-次單元的結合親和力即可。

「序列相似度百分比(％)」(percentage (%) sequence identity)定義為，在候選序列中的胺基酸殘基與在特定多肽序列中的胺基酸殘基的一致性百分比，是在比對序列並視需要來引入間隙(gap)，藉以達到最大的序列相似度百分比之後，並且不考慮任何保守性置換(conservative substitution)來作為序列相似度的一部分。可利用本領域技術人員所熟知的各種方法來比對，並確認序列相似度百分比，舉例來說，可利用例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等公開的電腦軟體來比對。本領域技術人員可以決定適當的測量比對參數，包括任何所需的演算法以利所比對的全長序列達到最大比對值。為達此目的，兩個胺基酸序列之間的序列比對是利用國家生物技術資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)於網路上所提供的電腦軟體Blastp (蛋白-蛋白BLAST)來進行分析。一個給定的胺基酸序列A與一個給定的胺基酸序列B之間的胺基酸序列相似度百分比(或說是，一個給定的胺基酸序列A具有與一個給定的胺基酸序列B之某％的序列相似度)是利用下列公式來計算：其中X是胺基酸殘基數，是藉由序列比對程式BLAST在比對A和B序列之後所得出的一致性匹配數，而Y則是A或B序列中的胺基酸殘基總數，取較短者。

「藥學組合物」(pharmaceutical composition)一詞是指一種它的形式可允許在其中所含的活性成分的生物學活性為有效的製劑，並且不包含對一待施用該組合物的個體具有不可接受之毒性的附加成分。

本文所使用之「藥學上可接受的載體」(pharmaceutically acceptable carrier)一詞是指藥學上可接受的材料、組合物，或載劑(vehicle)，例如，液體或固體填充劑、稀釋劑、載體、溶劑，或封裝材料，涉及從一個器官或身體的其中一部分攜帶或運輸主體藥劑(subject agent)到另一器官或身體的另一部分。每種載體在與該製劑中的其他成分相容的意義上，必須是「可接受的」。該藥學製劑含有本發明IL-2變異體以及一或多種藥學上可接受的成分。載體可以是固體(例如，膠囊)、半固體(例如，乳膏)，或液體(例如，稀釋劑)的形式。該些藥學製劑亦為本發明的進一步客體(object)。通常來說，活性成分的量約佔該製劑重量的0.1-95％，在胃腸外使用的製劑中較佳是約佔該製劑重量的0.2-20％，在口服給藥的製劑中較佳是約佔該製劑重量的1-50％。為了本揭示內容方法的臨床應用，可將本發明藥學組合物配製成適用於預定給藥途徑的製劑。

本文所使用之「治療」(treatment和treating)一詞可以是指一種治癒性或緩和性(palliative)措施。具體來說，本文所使用之「治療」一詞，是指對一個體施用(application)或投予(administration)本揭示內容IL-2變異體，或包含它們的藥學組合物，該個體罹患癌症，或罹患一種與癌症相關的症狀或疾病，或罹患一種繼發於癌症的次生性疾病或病症，以期部分地或完全地減輕(alleviate)、改善(ameliorate)、緩解(relieve)、延遲發作、抑制進展、降低嚴重性，及/或降低發生率在一或多種與癌症相關的症狀或病症上。

「投予」(administered、administering，或administration)一詞在本文中可交替使用，是指直接施用本揭示內容IL-2變異體，包含本揭示內容IL-2變異體的藥學組合物，及/或本發明方法。

本文所使用之「一有效量」(an effective amount)一詞是指一種有效的量，在必要的劑量和時間內，對癌症的治療可達到欲求的治療結果。為了治療的目的，有效量也可以是指一種其中成分的任一種毒性或有害作用被治療上有益作用所超過的量。具體的有效量或足量會因多種因素而有所差異，這類因素例如待治療的特定病症、病患的身體狀況(例如，病患的體重、年齡，或性別)、待治療的哺乳動物或動物的種類、治療的持續時間、並行療法的性質(若有的話)，以及所採用的具體製劑和化合物或其衍生物的結構等。一有效量可以表示成，舉例來說，活性成分的總質量(例如，以克、毫克或微克為單位)，或活性成分的質量與體重的比率(例如，以毫克/公斤(mg/kg)為單位)。或者是，有效量可以是以活性成分(例如，本揭示內容IL-2變異體)的濃度來表示，例如，體積莫耳濃度(molar concentration)、質量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、質量分率(mass fraction)，以及混合比率(mixing ratio)。本領域技術人員可以根據動物模式所確定的劑量來計算藥物(例如，本揭示內容IL-2變異體)的人體等效劑量(human equivalent dose，HED)。舉例來說，HED可以是按照美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)所發布的行業指南「估計成人健康志願者治療在初始臨床試驗中的最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算用於人類個體的最大安全劑量。

「個體」(subject)或「病患」(patient)一詞是指可用本揭示內容IL-2變異體、藥學組合物，及/或方法來治療的動物，包括人類物種。除非明確指出一種性別，否則「個體」或「病患」一詞意指男性和女性二者。據此，「個體」或「病患」一詞包含任何可能受益於癌症治療的哺乳動物。在一例示性的實施方式中，該個體是人類。

II. 發明詳述

本揭示內容至少一部分係基於一項發現，即本揭示內容IL-2變異體對IL-2R的α-次單元具有降低或消除(abolished)的親和力，使得本揭示內容IL-2變異體具有改善的免疫療法特性。如上所述，不同形式的IL-2R由不同的次單元所組成，並對IL-2表現出不同的親和力。中度親和力的IL-2R具有受體β/γ _c-次單元，並且在靜息的(resting)效應細胞(例如，自然殺手細胞和T細胞)中表現，且在與IL-2結合後足以進行IL-2訊息傳遞，從而誘發該些效應細胞的增殖和活化。相比之下，高度親和力的IL-2R還另外包含受體α-次單元，並且主要表現在T _reg細胞以及活化的效應細胞中，當在與IL-2結合時，能夠促進T _reg細胞所介導的免疫抑制作用或促進活化誘導的細胞死亡(activation-induced cell death，AICD)。因此，降低IL-2對IL-2R的α-次單元的親和力，可能會減少由IL-2所誘發的T _reg細胞對效應細胞功能的下調，同時抑制通過AICD過程所導致的腫瘤耐受性的發展。因此，本揭示內容的主要目的是提供一種對IL-2R的α-次單元具有較低親和力的IL-2變異體，以賦予IL-2所需的免疫療法特性。

1. IL-2 變異體

據此，本揭示內容的第一態樣涉及一種分離的IL-2變異體，其包含至少一個胺基酸突變，該突變會導致該IL-2變異體相較於野生型IL-2來說，與IL-2R的α-次單元的親和力降低或消除，同時保有與中度親和力的IL-2R的親和力。該分離的IL-2變異體對IL-2R的α-次單元具有降低的親和力，包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列，其中在該分離的IL-2變異體中的至少一個胺基酸置換發生在對應於序列編號：1中的第42、45、50、72或125個位置處，其中：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的該胺基酸置換是將苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)、半胱胺酸(C)、麩胺酸(E)、組胺酸(H)、纈胺酸(V)，或色胺酸(W)；在對應於序列編號：1中的第45個位置處的該胺基酸置換是將酪胺酸(Y)置換為丙胺酸(A)、天門冬胺酸(D)、甘胺酸(G)、甲硫胺酸(M)、天門冬醯胺(N)、麩醯胺(Q)、精胺酸(R)、絲胺酸(S)，或蘇胺酸(T)；在對應於序列編號：1中的第50個位置處的該胺基酸置換是將丙胺酸(A)置換為異白胺酸(I)；在對應於序列編號：1中的第72個位置處的該胺基酸置換是將白胺酸(L)置換為天門冬胺酸(D)、異白胺酸(I)、離胺酸(K)、天門冬醯胺(N)，或纈胺酸(V)；以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的該胺基酸置換是將半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)；該些變異體與野生型IL-2相比，對中度親和力的IL-2R展現出基本相似的結合親和力，並且對IL-2R的α-次單元或高度親和力的IL-2R具有實質上降低的親和力。

依據本揭示內容的實施方式，該分離的IL-2變異體可以具有：一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列，例如，與序列編號：1具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及100％之序列相似度；較佳地，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，該分離的IL-2變異體包含一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，該分離的IL-2變異體包含序列編號：1的胺基酸序列；其中該至少一個胺基酸置換發生在對應於序列編號：1中的第42、45、50、72或125個位置處，並且該胺基酸置換係選自由F42A、F42C、F42E、F42H、F42V和F42W；Y45A、Y45D、Y45G、Y45M、Y45N、Y45Q、Y45R、Y45S和Y45T；A50I；L72D、L72I、L72K、L72N和L72V；以及C125G所組成的群組。

依據本揭示內容的某些實施方式，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#2可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為色胺酸(W)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為離胺酸(K)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#2具有序列編號：3的胺基酸序列。

依據本揭示內容的其他實施方式，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#3可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為纈胺酸(V)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#3具有序列編號：4的胺基酸序列。

依據本揭示內容的再其他實施方式，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#7可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為麩胺酸(E)，以及在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為甘胺酸(G)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#7具有序列編號：8的胺基酸序列。

或是或除此之外，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#8可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為纈胺酸(V)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為絲胺酸(S)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#8具有序列編號：9的胺基酸序列。

可任選地，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#9可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為組胺酸(H)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬胺酸(D)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為異白胺酸(I)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#9具有序列編號：10的胺基酸序列。

在本揭示內容的一進一步實施方式中，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#12可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為半胱胺酸(C)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為纈胺酸(V)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#12具有序列編號：13的胺基酸序列。

在本揭示內容的再某些實施方式中，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#25可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第50個位置處的丙胺酸(A)置換為異白胺酸(I)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#25具有序列編號：21的胺基酸序列。

在本揭示內容的其他實施方式中，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#28可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬胺酸(D)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬胺酸(D)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#28具有序列編號：24的胺基酸序列。

有時，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#31可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為甲硫胺酸(M)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#31具有序列編號：27的胺基酸序列。

在本揭示內容的再其他實施方式中，本揭示內容IL-2變異體命名為IL-2_#31_Y45R可以是：具有一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列；較佳地，具有一與序列編號：1具有至少90％之序列相似度的胺基酸序列；更佳地，具有一與序列編號：1具有至少95％之序列相似度的胺基酸序列；再更佳地，具有序列編號：1的胺基酸序列；其中具有以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為精胺酸(R)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)。在一操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體IL-2_#31_Y45R具有序列編號：34的胺基酸序列。

本揭示內容IL-2變異體可以使用本領域所熟知的遺傳工程或化學合成方法，通過刪除、置換、插入，或修飾來製備。遺傳工程方法可以包括對編碼DNA序列進行定點誘變(site-specific mutagenesis)、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)、基因合成、CRISPR/cas9基因編輯等方法。正確的核苷酸變化可以通過例如定序等方法來驗證。在這方面，人類原生IL-2的核苷酸序列可以從公共資料庫，例如基因銀行(GenBank)中獲得(基因銀行登錄號：S77834.1)。人類原生IL-2的胺基酸序列如序列編號：1所示。置換或插入可涉及天然以及非天然的胺基酸殘基。胺基酸修飾包括本領域已知的化學修飾方法，例如添加糖基化位點或碳水化合物附加物等。

本揭示內容IL-2變異體可以通過例如固相肽合成或重組生產的方式來獲得。在重組生產的部分，會分離出一或多個編碼該IL-2變異體的多核苷酸，然後將其插入一或多個載體中，以進一步在宿主細胞中進行複製及/或表現。這類多核苷酸可以使用常規程序容易地進行分離和定序。可以使用本領域技術人員所熟知的方法來構建含有本揭示內容IL-2變異體的編碼序列以及適當的轉錄/轉譯控制訊息的表現載體。這些方法包括活體外重組DNA技術、合成技術，以及活體內重組/基因重組技術。表現載體可以是質體、病毒的一部分，或是可以是一段核酸片段。表現載體包括一個表現卡匣(expression cassette)，其中將用以編碼本揭示內容IL-2變異體的多核苷酸選殖到其中，並且與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作地連接。如果啟動子能夠影響核酸的轉錄，則可以將該啟動子可操作地與該用以編碼多肽的核酸連接。啟動子可以是細胞特異性的啟動子，僅會在預定的細胞中引導出大量的DNA轉錄。除了啟動子之外，其他轉錄控制元件(例如，增強子、操作子、抑制子，以及轉錄終止訊息等)可以與該多核苷酸可操作地連接，以引導出細胞特異性轉錄。

在某些實施方式中，IL-2變異體中存在的胺基酸突變可能會使該IL-2變異體降低對IL-2受體的α-次單元的親和力至少5倍，例如，降低至少10倍、降低至少25倍、降低至少30倍、降低至少50倍，甚至降低至少100倍。在一實施方式中，IL-2變異體中存在的胺基酸突變可能會使該IL-2變異體消除對IL-2受體的α-次單元的親和力。同時，當IL-2變異體呈現出，相較於野生型IL-2對中度親和力的IL-2R，超過約70％之親和力，例如，超過約80％之親和力，或超過約90％之親和力，則該IL-2變異體達到對該中度親和力的受體實質上類似的結合程度，即本揭示內容IL-2變異體保有對該受體的親和力。

在一特定的實施方式中，本揭示內容IL-2變異體可能會引起一或多種細胞反應，例如，促進活化的T淋巴細胞增殖，促進活化的T淋巴細胞分化，促進胞毒型T細胞(cytotoxic T cell，CTL)活性，促進活化的B細胞增殖，促進活化的B細胞分化，促進NK細胞增殖，促進NK細胞分化，促進活化的T細胞或NK細胞分泌細胞激素，或促進NK/LAK抗腫瘤細胞毒性。在一實施方式中，本揭示內容IL-2變異體相較於野生型IL-2，可能會降低T _reg細胞中的IL-2訊息傳遞，減少T細胞的活化誘導細胞死亡(AICD)，具有降低的活體內毒性分布(toxicity profile)，或擁有延長的血清半衰期。

本揭示內容IL-2變異體可以通過本領域已知的各種檢測方法來進行鑑定、篩選，或特性分析其物理/化學特性，及/或生物學活性。

舉例來說，可以測量物理/化學特性，例如，結合親和力測試。具體來說，本揭示內容IL-2變異體對IL-2受體的結合親和力可以通過以下的檢測方法來容易地確認：酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、表面電漿共振(SPR)、使用BIAcore儀器(GE Healthcare)，或使用已知會表現出某種IL-2受體形式的細胞株，並按照本領域已知且已確立的程序來進行測量。

在生物學活性測試的部分，可以通過檢測受體結合後，其下游所發生的免疫活化效應，來間接測量本揭示內容IL-2變異體的活性，其可以包括，舉例來說，誘發具有IL-2受體之T細胞及/或NK細胞增殖的能力，誘發具有IL-2受體之T細胞及/或NK細胞中的IL-2訊息傳遞的能力，誘發NK細胞產生IFN-γ的能力，降低誘發周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)表現IL-10或TNF-α的能力，降低誘發T細胞凋亡的能力，誘發腫瘤退化(regression)及/或改善存活率的能力，以及降低毒性分布(例如，降低活體內血管通透性)的能力，該些檢測方法為本領域所熟知。

或者是，可以通過檢測IL-2所觸發的下游訊息傳遞來實現活性測試，其中包括檢測雅努斯激酶(Janus kinase，JAK)和訊息傳遞子及轉錄活化子(signal transducer and activator of transcription，STAT)訊息傳遞分子。舉例來說，在IL-2與IL-2受體的β和γ _c-次單元交互作用後，可以評估JAK1和JAK3的磷酸化，以及STAT-5的磷酸化，來作為活化IL-2訊息傳遞作用的指標。該方法的細節揭示於實施例中。用本揭示內容IL-2變異體來處理T細胞，並通過流式細胞術來檢測磷酸化STAT-5的量。

2. 藥學組合物

本揭示內容亦涵蓋一種藥學組合物，包含上述的IL-2變異體，以用於治療癌症，及/或減輕或改善與癌症相關或由癌症所引起的症狀。具體來說，該藥學組合物包含一有效量之如本揭示內容的任何態樣或實施方式中所述的IL-2變異體；以及非必要性地，包含一藥學上可接受的載體。

本發明IL-2變異體的量約佔該藥學組合物總重量的0.1-99％ (重量％)。在某些實施方式中，本發明IL-2變異體的量約佔該藥學組合物總重量的至少1％ (重量％)。在特定實施方式中，本發明IL-2變異體的量約佔該藥學組合物總重量的至少5％ (重量％)。在其他實施方式中，本發明IL-2變異體的量約佔該藥學組合物總重量的至少10％ (重量％)。在再其他實施方式中，本發明IL-2變異體的量約佔該藥學組合物總重量的至少25％ (重量％)。

本揭示內容藥學組合物是按照本領域所熟知的製藥程序來製備，並可以配製成固體、半固體，或液體形式，例如，片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、懸浮劑，以及注射劑等，以適應於預定的給藥途徑。該些藥學製劑亦為本發明的進一步客體。本領域技術人員熟悉適用於每種給藥途徑的各種劑型。需要注意的是，在任何給定的情況下，最適當的給藥途徑會取決於待治療的疾病或病症的性質或嚴重程度。

藥學上可接受的載體是指，任何在其濃度符合該活性成分之有效活性能夠作用的情況下，對病患而言是相對無毒和無害的載體，使得該載體所引起的任何副作用都不會削弱該活性成分的有益功效。依據本發明的藥學上可接受的載體是例如，崩解劑、結合劑、潤滑劑、填充劑、塑化劑、界面活性劑和潤濕劑、成膜劑和包衣材料(coating material)，以及著色劑(例如，色素)。

崩解劑包括，但不限於，交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮、海藻酸、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、波拉克林鉀(polacrilin potassium)、交聯聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉、乙醇酸澱粉鈉(sodium starch glycolate)、部分水解澱粉、羧甲基澱粉鈉，以及澱粉。

結合劑包括，但不限於，羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素(hypromellose，hydroxypropyl methylcellulose (HPMC))、微晶纖維素、金合歡膠、海藻酸、羧甲基纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、壓縮糖、乙基纖維素、明膠、液體葡萄糖、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮，以及預糊化澱粉。

潤滑劑包括，但不限於，硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、硬脂酸、富馬酸、硬脂酸富馬酸鈉(sodium stearylfumarate)、硬脂酸鋅，以及聚乙二醇。

填充劑包括，但不限於，磷酸氫鈣(dibasic calcium phosphate)、高嶺土、乳糖、甘露醇、微晶纖維素、矽化(silicated)微晶纖維素、磷酸二鈣、磷酸三鈣、三矽酸鎂、麥芽糖醇、山梨醇、木糖醇、乳糖(例如，無水形式或水合物形式，例如單水合物形式)、右旋糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖或麥芽糊精、粉狀纖維素、沉澱碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈉，以及澱粉。

界面活性劑和潤濕劑包括，但不限於，十七乙烯氧基鯨蠟醇(heptadecaethylene oxycetanol)、卵磷脂、山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯、氯化苯甲烷銨、壬苯醇醚-10 (nonoxynol-10)、辛基酚聚醚-9 (octoxynol-9)、聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、40、60或80)、山梨醇單棕櫚酸酯、月桂基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、磺基琥珀酸二辛酯鈉、甘油單硬脂酸酯、山梨醇單月桂酸酯、聚乙二醇山梨醇單月桂酸酯、聚乙二醇山梨醇單硬脂酸酯、聚乙二醇山梨醇單油酸酯、環氧乙烷和環氧丙烷的共聚物(PLURONIC®)，以及乙氧基化三酸甘油酯。

成膜劑和包衣材料包括，但不限於，液體葡萄糖、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基纖維素、乙基纖維素、苯二甲酸醋酸纖維素(cellulose acetate phthalate)、蟲膠、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮和醋酸乙烯酯的共聚物(例如，KOLLIDON®)、二甲胺基甲基丙烯酸和中性甲基丙烯酸酯的共聚物、甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的聚合物、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，以及丙烯酸和丙烯酸甲酯的共聚物。

塑化劑包括，但不限於，聚乙二醇、鄰苯二甲酸二乙酯，以及甘油。

著色劑包括，但不限於，色素、無機色素、FD&C紅色3號、FD&C紅色20號、FD&C黃色6號、FD&C藍色2號、D&C綠色5號、D&C橙色5號、D&C紅色8號、焦糖、氧化鐵紅、氧化鐵黃，以及二氧化鈦。

其他可酌情用於配製用於預定給藥途徑之組合物的常用藥學載體，包括，但不限於，酸化劑(例如，醋酸、檸檬酸、富馬酸、鹽酸，以及硝酸)；鹼化劑(例如，氨水溶液、碳酸銨、二乙醇胺、單乙醇胺、氫氧化鉀、硼酸鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉，以及三乙醇胺)；吸附劑(例如，粉狀纖維素和活性炭)；穩定劑和抗氧化劑(例如，抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、次磷酸、單硫代甘油、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、甲醛次硫酸氫鈉，以及偏亞硫酸鈉)；其他結合材料(例如，塊狀聚合物、天然及合成橡膠、聚丙烯酸酯、聚胺酯、矽膠、聚矽氧烷，以及苯乙烯-丁二烯的共聚物)；緩衝劑(例如，偏磷酸鉀、磷酸二鉀、醋酸鈉、無水檸檬酸鈉，以及檸檬酸鈉水合物)；包封劑(例如，明膠、澱粉，以及纖維素衍生物)；調味劑、掩蔽劑(masking agent)，以及氣味劑(例如，茴香油、肉桂油、可可、薄荷醇、柑橘油、薄荷油，以及香草醛)；潤濕劑(例如，甘油、丙二醇，以及山梨醇)；甜味劑(例如，阿斯巴甜、右旋糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精鈉、山梨醇，以及蔗糖)；防黏劑(例如，硬脂酸鎂和滑石粉)；直接壓片賦形劑(例如，磷酸氫鈣、乳糖，以及微晶纖維素)；錠劑拋光劑(例如，棕櫚蠟和白蠟)。

本揭示內容藥學組合物可進一步包含其他已知的藥學活性劑(例如，化學治療劑、免疫治療劑，或荷爾蒙治療劑)，以治療由癌症所引起或與癌症相關的疾病和病症。

適用於本揭示內容藥學組合物的化學治療劑可以是以下的一或多種：放射菌素D(actinomycin D)、六甲蜜胺(altretamine)、胺麩精(aminoglutethimide)、胺苯吖啶(amsacrin)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽環黴素(anthracycline)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、苯達莫司汀(bendamustine)、貝沙羅汀(bexarotene)、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、布舍瑞林(buserelin)、硫酸布他卡因(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、氯甲烷(chlormethine)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、氯米芬(clomifene)、薑黃素(curcumin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine或cytosinarabinoside)、達卡巴仁(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地塞松(dexamethasone)、多西紫杉醇(docetaxel)、艾黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、雌莫司汀(estramustine)、雌酮(estrone)、雌二醇(estradiol)、雌三醇(estriol)、依託泊苷(etoposide)、依西美坦(exemestane)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、福美司坦(formestane)、氟尿苷(foxuridine)、吉西他濱(gemcitabine)、糖皮質素(glucocorticoid)、戈舍瑞林(goserelin)、癌康定(hycamtin)、羥基尿素(hydroxyurea)、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamid)、伊馬替尼(imatinib)、靛玉紅(indirubin)、伊立替康(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、利妥唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、洛莫司汀(lomustine)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、黴法蘭(melphalan)、巰嘌呤(mercaptopurine)、胺甲喋呤(methotrexate)、米替福辛(miltefosin)、絲裂黴素(mitomycine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼達尼布(nintedanib)、尼莫司汀(nimustine)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、噴司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、普賴松(prednisone)、甲苄肼(procarbazine)、黃體素(progesterone)、雷洛昔芬(raloxifene)、鏈佐菌素(streptozocin)、泰莫西芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾內酯(testolactone)、睾固酮(testosterone)、噻替哌(thiotepa)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、托普迪肯(topotecan)、蘇消安(treosulfan)、視網酸(tretinoin)、曲普瑞林(triptorelin)、曲磷醯胺(trofosfamide)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)，或長春瑞濱(vinorelbine)。

所述免疫治療劑是選自由CCL3、CCL26、CXCL7；G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α；IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15；阿普司特、咪喹莫特、來那度胺、柏馬度胺、西普魯塞-T、沙利度胺；抗-CTLA-4抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體；抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD11a抗體、抗-CD20抗體、抗-CD25抗體、抗-CD52抗體、抗-EGFR抗體、抗-HER2抗體、抗-PCDP1抗體、抗-SLAMF7抗體，以及抗-Trop-2抗體所組成的群組。依據本揭示內容的一較佳實施方式，用於本揭示內容藥學組合物中的附加免疫治療劑為IL-15。

荷爾蒙治療劑的實例包括，但不限於，雄性激素受體激動劑(例如，雄烯二醇二丙酸酯(androstenediol dipropionate)、寶丹酮十一烯酸酯(boldenone undecylenate)、氯司替勃(clostebol)，或醋酸環睾酮(cloxotestosterone acetate))；促性腺激素(例如，比卡魯胺(bicalutamide)、泰莫西芬(tamoxifen)、氯米芬(clomifene)、性腺釋素(gonadorelin)，或亮丙瑞林(leuprorelin))；雄性激素受體拮抗劑(例如，醋酸阿比特龍(abiraterone acetate)、坎利酮(canrenone)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)、醋酸環丙孕酮(cyproterone acetate)，或醋酸地馬地酮(delmadinone acetate))；類固醇生成抑制劑(例如，阿爾法雌二醇(alfatradiol)、度他雄胺(dutasteride)、愛普列胺(epristeride)、非那雄胺(finasteride)、氟他胺(flutamide)、酮康唑(ketoconazole)，或尼魯米特(nilutamide))；抗促性腺激素(antigonadotropins)(例如，多潘立酮(domperidone)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、利培酮(risperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、氯丙嗪(chlorpromazine)、舒必利(sulpiride)，或睾固酮(testosterone))；雌性激素受體激動劑(例如，阿爾法雌二醇、睾固酮、甲基睪固酮(methyltestosterone)、甲基雄烯酮(metandienone)，或雌二醇)；雌性激素受體拮抗劑(例如，阿科比芬(acolbifene)、雙炔失碳酯(anordrin)、巴多昔芬(bazedoxifene)、溴丙雌酚(broparestrol)、氯米芬，或環芬尼(cyclofenil))；芳香酶抑制劑(aromatase inhibitor)(例如，胺麩精、睾內酯、法屈唑(fadrozole)、福美司坦、安納柔、依西美坦，或來曲唑)；黃體素受體激動劑(例如，烯丙雌醇(allylestrenol)、地諾孕素(dienogest)、降雄甾炔酮(norethisterone)、黃體素、喹孕酮(quingestrone)、醋酸阿那孕酮(anagestone acetate)、醋酸氯地孕酮，或醋酸氯甲替尼酮(chlormethenmadinone acetate))；黃體素受體拮抗劑(例如，阿格司酮(aglepristone)，或美服培酮(mifepristone))。

3. 治療癌症的方法

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以治療一個體之癌症的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容IL-2變異體或包含該IL-2變異體的藥學組合物。

本揭示內容IL-2變異體或藥學組合物投予至該個體的有效劑量可以在約介於0.01微克/公斤個體體重至1,000毫克/公斤個體體重的範圍內，例如，在約介於0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000微克/公斤個體體重(= 1毫克/公斤個體體重)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950，或1,000毫克/公斤個體體重的範圍內；較佳地，在約介於0.1至1000微克/公斤個體體重的範圍內；更佳地，在約介於1至500微克/公斤個體體重的範圍內；再更佳地，在約介於10至200微克/公斤個體體重的範圍內。在某些操作實施例中，本揭示內容IL-2變異體或藥學組合物投予至該個體的有效劑量是15、50，或150微克/公斤個體體重。該劑量可以是以單個等分(aliquot)施用，或者以多於一個等分施用。本領域技術人員或臨床從業人員可以依據病患的身體狀況或疾病的嚴重程度來調整劑量或治療方案(regime)。

當可理解，在該個體罹患癌症的情況下，本揭示內容方法可以對該個體單獨施用，或與其他對癌症治療具有一定效益的附加療法(例如，外科手術、放射療法、化學療法、免疫療法、荷爾蒙療法，或其組合療法)合併施用。取決於預期的治療目的的不同，本揭示內容方法可以在對該個體施用該附加療法之前、同時，或之後投予至該個體。在上述附加療法中，化學療法、免疫療法，以及荷爾蒙療法是指對該個體施用有效量的化學治療劑、免疫治療劑，或荷爾蒙治療劑，如上所述；為求簡潔，在此省略了關於該些藥劑的詳細說明。

所述癌症可以是以下的任一種：膀胱癌、膽管癌、骨癌、腦瘤、乳癌細胞、子宮頸癌、大腸直腸癌、食道癌、上皮癌、胃癌、胃腸道間質瘤(GIST)、神經膠質瘤、類淋巴系造血組織腫瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、血癌、肺癌、淋巴瘤、腸癌、黑色素瘤、骨髓性白血病、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、卵巢癌、腎細胞癌、脾臟癌、鱗狀細胞癌、甲狀腺癌，或甲狀腺濾泡癌。

應當注意，在本揭示內容方法的治療期間內，可經由不同的途徑，以不同的劑量、時間間隔等，對該個體施用不同的療法或治療。劑量和時間間隔可能因如上文所述之因素而有所不同，並取決於從業人員的專業考慮；以及途徑可以是經由口服、腸內、口腔、鼻腔、經皮、經粘膜、靜脈內、腹膜內、動脈內、皮內、皮下，以及肌內等途徑。

基本上，適用於本揭示內容方法來治療的個體是一哺乳動物；較佳地，該個體為人類。

下文提出多個實施例來闡述本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實踐本發明，且不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。所有在此引用的公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料與方法

1. IL-2 變異體的設計和選殖

為了設計本研究所使用的IL-2變異體，首先從線上資料庫「蛋白資料庫」(Protein Data Bank，PDB)中獲取IL-2在與受體結合時的活性形式和非活性單體形式的結構，其中活性形式係使用PDB編號2B5I或2ERJ，而非活性形式係使用PDB編號1M4C或3INK。將IL-2的活性形式和非活性形式的結構用商業軟體PyMOL進行比對，並計算出螺旋A、C和D上的特定胺基酸的特定原子在活性形式和非活性形式中的空間位置之間的距離。因此，通過比較IL-2的活性形式和非活性形式的結構，確定了在空間位置上變化最大和最小的原子。據此，計算出有明顯移動與相對未移動的原子之間的距離，以創建出IL-2的活性形式和非活性形式之間的特徵。在本研究中，計算出在空間位置上變化最大的50個原子與在空間位置上變化最小的60個原子之間的距離，總計得到了3000 (50 × 60)個距離。在這些計算出的距離中，選取最大的距離作為IL-2從非活性形式轉變為活性形式的特徵。另一方面，人類IL-2在F42、Y45和L72位置上的全部變異體共有7,999 (20 × 20 × 20 – 1 (野生型))種。其中，每個IL-2變異體的結構是由線上軟體(AlphaFold Colab)進行預測。在已知IL-2活性形式和IL-2變異體的結構的基礎上，按之前在計算IL-2的活性和非活性形式之間所進行的計算方法，計算出這兩者之間的空間距離。選擇具有與IL-2活性形式距離＜10％之原子個數最多的IL-2變異體，作為本發明IL-2變異體(序列編號：1-29)，以用於進一步研究；然後對這些IL-2變異體序列進行人工合成再進行選殖。

2. IL-2 變異體的表現和驗證

將用於在原核細胞中表現上述每種IL-2變異體(帶有六組胺酸(hexahistidine，his6)標籤)的建構體(his6-IL-2，在pET中)轉化(transform)到大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中，並在OD ₆₀₀達到0.5-0.9時，將0.1毫體積莫耳濃度(mM)之IPTG添加到含有溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)/胺苄青黴素(ampicillin)(50微克/毫升)的培養物中，以誘發IL-2變異體的表現，然後在室溫(RT)下培養16小時。收穫細菌並用0.1毫升之裂解緩衝液(含20 mM之HEPES (pH 7.4)，250 mM之KCl，25微克/毫升之去氧核糖核酸酶(DNase)，25微克/毫升之溶菌酶(lysozyme)，10 mM之PMSF，以及10 mM之β-巰基乙醇)來裂解之，然後將所得混合物進行離心，以收集含有表現蛋白的上清液。將上清液中的可溶性his6-IL-2通過SDS-PAGE (含10％之聚丙烯醯胺)凝膠予以分離，並使用抗-his6抗體進行西方墨點法確認。然後，根據廠商的使用說明，使用鎳樹脂管柱(nickel-resin column)(Qiagen, Valencia, CA)來過濾和純化上清液。使用ELISA套組(人類IL-2 Quantikine，R&D Systems)來檢測純化後的IL-2變異體的量。

上述的IL-2變異體也在哺乳動物蛋白表現系統(ExpiCHO™ 表現系統套組；Thermo)中表現。將含有上述的IL-2變異體的建構體(在pcDNA3.4中)轉染(transfect)到ExpiCHO-S細胞中，並在轉染後第1天，將ExpiFectamine™ CHO增效劑添加到培養物中。第7天，通過離心去除ExpiCHO-S細胞，並收集含有IL-2變異體蛋白的上清液，以ELISA檢測其濃度。

3. 細胞培養

將CTLL-2細胞(小鼠胞毒型T淋巴細胞)和HH細胞(人類T淋巴母細胞)培養在羅斯威爾派克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI) 1640培養基中，並補充10％之胎牛血清和2 mM之麩醯胺；而KPC‐luc細胞(小鼠胰管腺癌細胞，並穩定轉染用以編碼殺稻瘟菌素-S (blasticidin‐S)去胺酶和螢火蟲螢光素酶的質體)則培養在上述培養基中，並進一步補充4奈米/毫升之殺稻瘟菌素-S。所有的細胞都培養在37°C下、含5％之CO ₂的加濕大氣中。

4. 測量受 IL-2 變異體刺激的細胞所生 pSTAT-5 的量

為了評估在受到本文中的IL-2變異體刺激後，CTLL-2細胞或HH細胞的活化程度，於是使用流式細胞術來檢測經刺激後的CTLL-2細胞和HH細胞(2×10 ⁵個細胞/孔)中的磷酸化STAT-5 (pSTAT-5)的量。取決於實驗目的的不同，將CTLL-2細胞和HH細胞培養在含有：濃度為30奈體積莫耳濃度(nM)的單一濃度或介於0-30 nM之間的一系列濃度之野生型IL-2 (介白素原(proleukin))、特定IL-2變異體，或突變型IL-2 (即IL-2v(AAG)，其中AAG是指具有F42A、Y45A和L72G置換的IL-2；F. Hoffmann-La Roche Ltd)的培養基中4小時。將處理後的CTLL-2細胞和HH細胞置於一個96孔微量盤上，其中每孔已預先種植了KPC-luc細胞(8×10 ³個細胞/孔)，然後反應30分鐘，之後用2％之甲醛(體積/體積)在室溫下固定15分鐘。將固定後的細胞進行通透，復水，用抗-磷酸化STAT5 (pSTAT-5)抗體在4°C下反應16小時，然後用FITC標記的抗-兔IgG抗體避光反應60分鐘。使用流式細胞儀(BD FACS Calibur流式細胞儀)來檢測螢光訊號，並使用軟體(CellQuest Pro和Cytexpert軟體；Beckman Coulter)進行數據分析。

5. 動物實驗

將雌性Balb/c小鼠(6週齡)飼養在溫度為23±1°C和相對濕度為45-70％的環境中，並提供12小時/12小時的光/暗循環。將小鼠隨機分為三組(每組n = 5)：PBS控制組、人類重組IL-2 (IL-2)控制組，以及IL-2_#7實驗組。對於PBS組，小鼠按照以下時程接受腹腔內給藥：每日一次，連續五天，然後休息兩天；此循環總共重複三次。對於IL-2組和IL-2_#7組，小鼠按照以下時程接受腹腔內給藥：(第1週) 每日一次，每隻小鼠接受3微克(約0.15毫克/公斤)的劑量，連續五天，然後休息兩天；(第2週) 每日一次，每隻小鼠接受10微克(約0.5毫克/公斤)的劑量，連續五天，然後休息兩天；以及(第3週) 每日一次，每隻小鼠接受30微克(約1.5毫克/公斤)的劑量，連續五天，然後休息兩天。在完成上述的給藥計劃後，將動物稱重並處死，並收穫它們的肺臟、肝臟，以及脾臟，以用於進一步分析。

6. 流式細胞術分析

將小鼠的脾臟進行裂解以萃取出其中的細胞。收集細胞，並用2％之甲醛(體積/體積)在室溫下固定15分鐘，然後進行流式細胞術分析。為了鑑定脾臟中的特定細胞群，使用了以下的抗體組合：(1) 鑑定活性CD8 ⁺T細胞：FITC標記的抗-CD45抗體(anti-CD45-FITC)，APC標記的抗-CD3抗體(anti-CD3-APC)，PE-cy7標記的抗-CD8抗體(anti-CD8-PE-cy7)，以及PE標記的抗-Tbet抗體(anti-Tbet-PE)；(2) 鑑定活性NK細胞：PE標記的抗-CD45抗體(anti-CD45-PE)，APC標記的抗-CD3抗體(anti-CD3-APC)，FITC標記的抗-KN1.1抗體(anti-KN1.1-FITC)，以及AlexaFluor 700標記的抗-顆粒酶B (GrB)抗體(anti-GrB-AlexaFluor 700)；以及(3) 鑑定T _reg細胞：APC-cy7標記的抗-CD45抗體(anti-CD45-APC-cy7)，FITC標記的抗-CD4抗體(anti-CD4-FITC)，APC標記的抗-CD25抗體(anti-CD25-APC)，以及PE標記的抗-Foxp3抗體(anti-Foxp3-PE)。使用流式細胞儀(BD FACS Calibur流式細胞儀)來檢測螢光訊號，並使用軟體(CellQuest Pro和Cytexpert軟體；Beckman Coulter)進行數據分析。

7. 統計分析

所有實驗均進行三重複。實驗數據係以平均值 ± 標準差(SD)來表示。使用學生氏t檢定來分析統計顯著性。對於所有的統計分析，雙尾p值≤ 0.05視為具有顯著性。使用軟體GraphPad Prims 6.01來生成計算結果和圖表。

實施例 1 製備和特性分析 IL-2 變異體

1.1 製備 IL-2 變異體

本實施例的目的在於鑑定出對中度親和力的IL-2R (而非對高度親和力的IL-2R)具有強烈結合能力的新型IL-2變異體，從而削減因與IL-2R的α-次單元結合所引發的不想要的免疫抑制效應。為達上述目的，根據「材料與方法」章節所述程序，設計並製備了幾種IL-2變異體。用以編碼每個IL-2變異體的核酸序列已通過定序確認(數據未顯示)，並且將每個IL-2變異體的胺基酸序列提供在序列表中。該些IL-2變異體進一步以下述方式來確認其生物學活性。

1.2 IL-2 變異體的生物學活性

首先，通過西方墨點法分析確認了實施例1.1中的IL-2變異體(命名為IL-2_#1至IL-2_#14)的表現，實驗結果顯示在第1A圖中，其中每個IL-2變異體(約15 kDa)都有成功表現。

接著，通過評估每個IL-2變異體於活化CTLL-2細胞或HH細胞的能力(在有KPC-luc細胞存在的情況下)，來評估每個IL-2變異體的生物學活性，並以細胞中所誘發的磷酸化STAT-5的量來表示CTLL-2細胞或HH細胞受到活化的程度。如第1B-1C圖所示，IL-2變異體可以活化CTLL-2細胞(第1B圖)或HH細胞(第1C圖)；其中，IL-2_#2、IL-2_#3、IL-2_#7、IL-2_#8、IL-2_#9，以及IL-2_#12在CTLL-2細胞和HH細胞兩者中一致表現出更高的活化能力(即pSTAT-5的量更高)，相比之下，IL-2_#1、IL-2_#4-6、IL-2_#10-11，以及IL-2_#13-14的活化能力較低。同樣地，IL-2變異體(命名為IL-2_#19至IL-2_#34)也有不同程度之活化HH細胞的能力。IL-2_#25、IL-2_#28，以及IL-2_#31相較於其他IL-2變異體，在HH細胞中表現出更高的活化能力(即pSTAT-5陽性細胞的百分比更高；第1D圖)。

另外，將IL-2_#31 (帶有F42A、Y45M，以及L72N置換的IL-2)選定為例示性之IL-2變異體，用於進一步研究IL-2在特定位置上的胺基酸置換對活化HH細胞的影響。需要說明的是，在以下與IL-2_#31相關的變異體(以下稱為「IL-2_#31相關變異體」)中，是將IL-2第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為丙胺酸(A)(Y45A)、天門冬胺酸(D)(Y45D)、甘胺酸(G)(Y45G)、麩醯胺(Q)(Y45Q)、精胺酸(R)(Y45R)、絲胺酸(S)(Y45S)，或蘇胺酸(T)(Y45T)，而在IL-2_#31中的F42A和L72N仍保留在上述IL-2_#31相關變異體(序列編號：30-36)中。實驗結果如第1E圖所示，與其他變異體相比，只有IL-2_#31相關變異體Y45R (即IL-2_#31_Y45R)在HH細胞中顯示出具有改善的活性。該些實驗結果表明，在特定IL-2變異體中，特定位點上的胺基酸變化可能會劇烈影響IL-2對於HH細胞的活化。將該些IL-2變異體(即具有活化細胞能力的變異體)隨後進行進一步分析。

1.3 IL-2 變異體的結合偏好性

本實施例的目的在於闡明實施例1.1的IL-2變異體對高度親和力的IL-2R或中度親和力的IL-2R的結合偏好性。為此目的，使用經刺激後的CTLL-2細胞和HH細胞(在處理一系列濃度之特定IL-2變異體後)中的pSTAT-5的量作為細胞活化的指標，其中CTLL-2細胞表現出高度親和力的IL-2R (含有IL-2R的α/β/γ _c-次單元)，而HH細胞則表現出中度親和力的IL-2R (包含IL-2R的β/γ _c-次單元)。IL-2_#2、IL-2_#3、IL-2_#7、IL-2_#8、IL-2_#9，以及IL-2_#12對CTLL-2細胞和HH細胞的活化結果分別提供在第2A-2B圖中。將實驗結果以校正後的MFI (％)表示，它是相對於IL-2 (指定為100％)進行校正；將上述IL-2變異體對於活化CTLL-2細胞和HH細胞的EC ₅₀值(分別為EC ₅₀(CTLL-2)和EC ₅₀(HH))進行相應計算，並總結在表1和表2中。IL-2變異體對於不同形式之IL-2R的結合偏好性以EC ₅₀(HH/CTLL-2)表示，並總結在表3中。

表1 IL-2_#2至IL-2_#12對於CTLL-2細胞的EC ₅₀

名稱	IL-2	IL-2_#2	IL-2_#3	IL-2_#7	IL-2_#8	IL-2_#9	IL-2_#12
EC ₅₀(nM)	0.1700	0.3416	44.11	11.50	120.2	10.01	2.323

表2 IL-2_#2至IL-2_#12對於HH細胞的EC ₅₀

名稱	IL-2	IL-2_#2	IL-2_#3	IL-2_#7	IL-2_#8	IL-2_#9	IL-2_#12
EC ₅₀(nM)	14.24	0.6122	9.600	1.356	90.18	17.91	0.5563

表3 IL-2_#2至IL-2_#12對於CTLL-2細胞和HH細胞的相對EC ₅₀

名稱	IL-2	IL-2_#2	IL-2_#3	IL-2_#7	IL-2_#8	IL-2_#9	IL-2_#12
EC ₅₀(HH)	14.24	0.6122	9.600	1.356	90.18	17.91	0.5563
EC ₅₀(CTLL-2)	0.1700	0.3416	44.11	11.50	120.2	10.01	2.323
EC ₅₀(HH/CTLL-2)	83.76	1.79	0.22	0.12	0.75	1.79	0.24

根據表3，IL-2的EC ₅₀(HH/CTLL-2)值為83.76，這表明IL-2傾向於結合至高度親和力的IL-2R，而非結合至中度親和力的IL-2R。相比之下，IL-2_#2到IL-2_#12的EC ₅₀(HH/CTLL-2)值小於IL-2的值，這表明該些IL-2變異體傾向於結合至中度親和力的IL-2R，而非結合至高度親和力的IL-2R。

第2C-2D圖展示出IL-2_#25、IL-2_#28，以及IL-2_#31各自對於CTLL-2細胞和HH細胞的活化能力；而結合偏好性結果總結在表4到表6中。

表4 IL-2_#25至IL-2_#31對於CTLL-2細胞的EC ₅₀

名稱	IL-2	IL-2_#25	IL-2_#28	IL-2_#31
EC ₅₀(nM)	0.2309	0.002908	9.562	2.018

表5 IL-2_#25至IL-2_#31對於HH細胞的EC ₅₀

名稱	IL-2	IL-2_#25	IL-2_#28	IL-2_#31
EC ₅₀(nM)	19.66	9.933	8.949	0.1099

表6 IL-2_#25至IL-2_#31對於CTLL-2細胞和HH細胞的相對EC ₅₀

名稱	IL-2	IL-2_#25	IL-2_#28	IL-2_#31
EC ₅₀(HH)	19.66	9.933	8.949	0.1099
EC ₅₀(CTLL-2)	0.2309	0.002908	9.562	2.018
EC ₅₀(HH/CTLL-2)	85.48	3424.14	0.94	0.05

根據表6，IL-2傾向於結合至高度親和力的IL-2R，而非結合至中度親和力的IL-2R。相反地，IL-2_#28和IL-2_#31均傾向於結合至中度親和力的IL-2R，而非結合至高度親和力的IL-2R，而IL-2_#28和IL-2_#31的EC ₅₀(HH/CTLL-2)值分別為0.94和0.05。儘管如此，IL-2_#25的EC ₅₀(HH/CTLL-2)值為3424.14，遠高於IL-2的相應值，這表明IL-2_#25更傾向於結合至高度親和力的IL-2R。

將IL-2_#7對於CTLL-2細胞和HH細胞的結合偏好性與市售的突變型IL-2 (IL-2v(AAG); F. Hoffmann-La Roche Ltd)進行了比較。實驗結果如第2E-2F圖所示，並總結在表7中。根據實驗結果，IL-2_#7 (EC ₅₀(HH/CTLL-2) = 0.027)在結合偏好性的表現優於野生型IL-2 (EC ₅₀(HH/CTLL-2) = 10.817)或IL-2v(AAG)(EC ₅₀(HH/CTLL-2) = 0.037)。這表明了與市售的IL-2v(AAG)相比，IL-2_#7在結合至中度親和力的IL-2R (而非結合至高度親和力的IL-2R)的性能上表現更為優越。

表7 IL-2_#7和IL-2v(AAG)的EC ₅₀和相對EC ₅₀

名稱	IL-2	IL-2_#7	IL-2v(AAG)
EC ₅₀(HH)	21.74	2.00	2.01
EC ₅₀(CTLL-2)	0.20	74.20	54.12
EC ₅₀(HH/CTLL-2)	108.7	0.027	0.037

實施例 2 IL-2 變異體的活體內毒性和免疫調節作用

2.1 IL-2 變異體的毒性

在本實施例中，研究了IL-2變異體的活體內毒性和免疫調節作用。按照「材料與方法」中所述的治療時程，對小鼠施用特定IL-2變異體。完成治療計劃後，處死小鼠。考慮到IL-2對內皮細胞會具有有害影響，會導致器官水腫，例如，造成肺臟、肝臟，以及脾臟水腫，進而導致體重發生變化，於是測量這些器官的重量，並將它們對個體體重進行校正(第3A-3C圖)。此外，在實驗過程中的體重變化呈現在第3D圖中。與用IL-2_#7治療的小鼠相比，用野生型IL-2治療的小鼠，其肝臟和脾臟的相對重量顯著增加，表明IL-2_#7對接受治療的小鼠具有較低的毒性效應。在本研究中，三個治療組的肺臟相對重量大致保持相同。此外，在整個研究過程中，該些治療組中的小鼠體重保持一致。總結上述，該些實驗數據表明，與野生型IL-2相比，IL-2_#7展現出更好的安全性。

2.2 IL-2 變異體的免疫調節作用

接下來，本研究評估了IL-2變異體的免疫調節能力，這可以通過周邊淋巴組織(例如，脾臟)中的免疫細胞數量變化來反映。為此目的，通過流式細胞術來測量活性CD8 ⁺T細胞、活性NK細胞，以及T _reg細胞的數量。基於第4A-4B圖的實驗結果，與PBS治療組和IL-2治療組相比，IL-2_#7治療組中的活性CD8 ⁺T細胞(標記為CD45 ⁺、CD3 ⁺、CD8 ⁺，以及T-bet ⁺)，以及活性NK細胞(標記為CD45 ⁺、GrB ⁺、NK1.1 ⁺，以及CD3 ^-)明顯增加。相比之下，IL-2_#7治療組並未顯示出T _reg細胞群(標記為CD45 ⁺、Foxp3 ⁺、CD4 ⁺，以及CD25 ⁺)有增加的現象。綜上，該些實驗數據表明，IL-2_#7可以通過刺激活性CD8 ⁺T細胞和NK細胞的生成來促進有益的免疫反應，而不會通過活化T _reg細胞的生成來引發不利的免疫反應。因此，IL-2_#7具有增強個體免疫系統的潛力，因而有望作為一種抗癌治療開發的潛在候選藥物。

總結上述，本發明提供了多種IL-2變異體，其中有許多變異體展現出對中度親和力的IL-2R的結合偏好性，進而觸發與之相關的生物學活性。因此，該些IL-2變異體不但可以消除不想要的免疫抑制特性，還可同時保有所需的生物學活性，因此，該些IL-2變異體對於開發用於治療與IL-2相關疾病的藥物上具有巨大的潛力。

當可理解，上文有關實施方式的敘述僅作為例示性的實施方式，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可對其進行各種更動與修飾。上文的說明書、實施例和實驗數據對本揭示內容作為例示性之實施方式中的結構和使用方式做出完整的描述。儘管上文已描述本揭示內容中各樣的實施方式有一定程度的特性，或參照一或多個個別的實施方式，本發明所屬領域技術具有通常知識者仍可在不悖離本揭示內容精神和範圍情形下，對已揭示的實施方式進行眾多修改。

無

在參閱以下的詳細說明、申請專利範圍和附隨圖式後，本揭示內容和其他特徵、態樣和優點將更明顯易懂，其中：

第1A-1E圖闡述依據本揭示內容的實施方式所製備之本揭示內容IL-2變異體的特性分析結果。第1A圖是西方墨點法的結果，闡述特定IL-2變異體的表現情況。第1B-1E圖是流式細胞術的結果，闡述在以特定IL-2變異體(在第1B和1D-1E圖中，分別使用30奈體積莫耳濃度(nM)；在第1C圖中，使用4 nM)處理細胞後，在CTLL-2細胞(表現出IL-2R的α/β/γ _c-次單元；第1B圖)或HH細胞(表現出IL-2R的β/γ _c-次單元；第1C-1E圖)中所誘發的磷酸化STAT-5 (pSTAT-5)表現量。MFI，平均螢光強度(mean fluorescence intensity)；pSTAT-5 ⁺細胞的百分比(％)，顯示出pSTAT-5-陽性細胞的百分比。

第2A-2F圖是流式細胞術的結果，闡述在以一系列濃度(0-30 nM)之特定IL-2變異體處理細胞後，在CTLL-2細胞(第2A、2C和2E圖)或HH細胞(第2B、2D和2F圖)中所誘發的pSTAT-5表現量。IL-2v(AAG)，一種突變IL-2 (AAG：IL-2具有F42A、Y45A，以及L72G的置換)。

第3A-3D圖是投予特定治療後的小鼠相對器官重量(第3A圖，肺臟；第3B圖，肝臟；第3C圖，脾臟；相對於體重)，以及其體重(第3D圖)。**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.005；****，p ＜ 0.0001。

第4A-4C圖是流式細胞術的結果，闡述在投予特定治療後的小鼠脾臟中的活性CD8 ⁺T細胞(第4A圖)、活性NK細胞(第4B圖)，以及T _reg細胞(第4C圖)的百分比。**，p ＜ 0.01；***，p ＜ 0.005；****，p ＜ 0.0001。

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Claims

一種分離的介白素-2 (interleukin-2，IL-2)變異體，包含一與序列編號：1具有至少85％之序列相似度的胺基酸序列，其中該分離的IL-2變異體在對應於序列編號：1中的第42、45、50、72或125個位置處包含一胺基酸置換(substitution)，其中：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的該胺基酸置換是將苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)、半胱胺酸(C)、麩胺酸(E)、組胺酸(H)、纈胺酸(V)，或色胺酸(W)；在對應於序列編號：1中的第45個位置處的該胺基酸置換是將酪胺酸(Y)置換為丙胺酸(A)、天門冬胺酸(D)、甘胺酸(G)、甲硫胺酸(M)、天門冬醯胺(N)、麩醯胺(Q)、精胺酸(R)、絲胺酸(S)，或蘇胺酸(T)；在對應於序列編號：1中的第50個位置處的該胺基酸置換是將丙胺酸(A)置換為異白胺酸(I)；在對應於序列編號：1中的第72個位置處的該胺基酸置換是將白胺酸(L)置換為天門冬胺酸(D)、異白胺酸(I)、離胺酸(K)、天門冬醯胺(N)，或纈胺酸(V)；以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的該胺基酸置換是將半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為色胺酸(W)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為離胺酸(K)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為纈胺酸(V)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為麩胺酸(E)，以及在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為甘胺酸(G)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為纈胺酸(V)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為絲胺酸(S)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為組胺酸(H)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬胺酸(D)，在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為異白胺酸(I)，以及在對應於序列編號：1中的第125個位置處的半胱胺酸(C)置換為甘胺酸(G)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為半胱胺酸(C)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬醯胺(N)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為纈胺酸(V)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第50個位置處的丙胺酸(A)置換為異白胺酸(I)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為天門冬胺酸(D)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬胺酸(D)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為甲硫胺酸(M)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含以下的胺基酸置換：在對應於序列編號：1中的第42個位置處的苯丙胺酸(F)置換為丙胺酸(A)，在對應於序列編號：1中的第45個位置處的酪胺酸(Y)置換為精胺酸(R)，以及在對應於序列編號：1中的第72個位置處的白胺酸(L)置換為天門冬醯胺(N)。
如請求項1所述之分離的IL-2變異體，其中該分離的IL-2變異體包含序列編號：1的胺基酸序列。
一種藥學組合物，包含如請求項1所述之分離的IL-2變異體，以及一藥學上可接受的載體。
一種用以治療一個體之癌症的方法，包含對該個體投予一有效量之如請求項13所述之藥學組合物。
如請求項14所述之方法，其中該藥學組合物包含該分離的IL-2變異體是以1-500微克/公斤體重的量投予至該個體。
如請求項14所述之方法，其中該癌症是以下的任一種：膀胱癌、膽管癌、骨癌、腦瘤、乳癌細胞、子宮頸癌、大腸直腸癌、食道癌、上皮癌、胃癌、胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)、神經膠質瘤、類淋巴系造血組織腫瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、血癌、肺癌、淋巴瘤、腸癌、黑色素瘤、骨髓性白血病、胰臟癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、卵巢癌、腎細胞癌、脾臟癌、鱗狀細胞癌、甲狀腺癌，或甲狀腺濾泡癌。
如請求項14所述之方法，更包含在投予如請求項13所述之藥學組合物之前、同時，或之後，使該個體接受外科手術、放射療法、化學療法、免疫療法、荷爾蒙療法，或其組合療法。
如請求項17所述之方法，其中該免疫療法包含對該個體投予一有效量之C-C模體趨化激素配體3 (C-C motif chemokine ligand 3，CCL3)、C-C模體趨化激素配體26 (CCL26)、C-X-C模體趨化激素配體7 (C-X-C motif chemokine ligand 7，CXCL7)；顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α (IFN-α)、干擾素-β (IFN-β)、干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)；介白素-4 (IL-4)、介白素-5 (IL-5)、介白素-7 (IL-7)、介白素-10 (IL-10)、介白素-12 (IL-12)、介白素-13 (IL-13)、介白素-15 (IL-15)；阿普司特(apremilast)、咪喹莫特(imiquimod)、來那度胺(lenalidomide)、柏馬度胺(pomalidomide)、西普魯塞-T (sipuleucel-T)、沙利度胺(thalidomide)；抗-CTLA-4抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體；抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD11a抗體、抗-CD20抗體、抗-CD25抗體、抗-CD52抗體、抗-EGFR抗體、抗-HER2抗體、抗-PCDP1抗體、抗-SLAMF7抗體，或抗-Trop-2抗體。
如請求項18所述之方法，其中該免疫療法包含對該個體投予一有效量之IL-15。
如請求項14所述之方法，其中該個體是人類。