CN115315436A - 修饰的il-2多肽及其用途 - Google Patents

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罗伯托·亚科内
让-菲利普·卡拉洛特
马蒂尔德·阿雷瓦洛-鲁伊斯
杰弗里·威廉·博德
亚历山大·梅维格
弗兰齐·韦贝尔
安娜·海顿
雷吉斯·勃林格
戈尔克姆·库尔图尔杜沙辛
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Abstract

本公开内容涉及修饰的IL‑2多肽、包含修饰的IL‑2多肽的组合物、它们的制备方法以及使用修饰的IL‑2多肽用于治疗疾病的方法。在一方面，本公开内容涉及使用修饰的IL‑2多肽治疗癌症。在一些实施方案中，所公开的IL‑2多肽对IL‑2受体βγ复合物(IL‑2Rβ)表现出相比于对IL‑2受体αβγ复合物(IL‑2Rα)的优先结合特性。在一些实施方案中，修饰的IL‑2多肽的分子量分布是单分散的。

Description

修饰的IL-2多肽及其用途
交叉引用
本申请要求于2020年1月10日提交的美国临时申请第62/959,382号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用以其整体并入。于2021年1月6日创建的所述ASCII副本被命名为56146_702_601_SL.txt并且大小为36,537字节。
背景
免疫疗法利用受试者的免疫系统来帮助治疗疾病。免疫疗法可以根据被治疗的疾病的性质而设计为激活或抑制免疫系统。用于治疗癌症的各种免疫疗法的目标是刺激免疫系统，使得其识别和破坏肿瘤或其他癌组织。
激活受试者体内的免疫系统以攻击癌细胞的一种方法是细胞因子疗法。细胞因子是体内产生的在细胞信号传导中重要的蛋白。各种细胞因子在调节免疫系统中具有重要作用。一些细胞因子疗法利用这些分子的特性以便增强受试者的免疫系统来杀伤癌细胞。
白细胞介素-2(IL-2)是在调节免疫系统中重要的细胞因子信号传导分子。IL-2参与帮助免疫系统区分外来与内源细胞类型，从而防止免疫系统攻击受试者自己的细胞。IL-2通过与由淋巴细胞表达的IL-2受体(IL-2R)相互作用而实现其活性。通过这些结合相互作用，IL-2可以调节受试者的T-效应(Teff)细胞、自然杀伤(NK)细胞和调节性T细胞(TReg)的群体。
由于这些原因，IL-2已经单独的或与其他疗法组合地用于治疗某些癌症。然而，IL-2作为治疗的使用受到毒性(其包括危及生命以及有时致命的血管渗漏综合征)以及它的短半衰期(需要在八天内每天给药三次)的限制。对于对各种IL-2受体亚基(例如，IL-2受体αβγ(IL-2Rα)和IL-2受体βγ(IL-2Rβ))具有不同选择性以增强治疗潜力并使IL-2疗法的副作用风险最小化的改进的IL-2多肽存在需求。
概述
在一方面，本文提供了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含在残基F42Y处共价附接的第一聚合物，并且其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在另一方面，本文提供了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含：(i)残基42处的酪氨酸，和(ii)与所述修饰的IL-2多肽共价附接的第一聚合物和第二聚合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物中的至少一种具有高于5000道尔顿的重均分子量，并且其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在另一方面，本文提供了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与IL-2受体βγ复合物(IL-2Rβ)结合的半最大有效浓度(EC50)值相比于所述修饰的IL-2多肽与IL-2受体αβγ复合物(IL-2Rα)结合的EC50值的比例低于2:1，并且其中所述EC50值在激动剂测定中测量。在一些实施方案中，该比例由根据在小鼠模型中以0.1mg/kg剂量注射之后1小时测量的Treg和CD8+细胞水平的Treg/CD8+的比例确定。
在另一方面，本文提供了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽/IL-2受体βγ复合物(IL-2Rβ)的解离常数(KD)小于300nM，并且其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2受体αβγ复合物(IL-2Rα)表现出更大的亲和力，如通过Kd测量的。在一些实施例中，Kd根据表面等离子体共振实验中与IL-2R单体的结合测定来确定。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基F42Y处共价附接的第一聚合物，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，其中第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，第一聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约10,000道尔顿或至多约6,000道尔顿。在一些实施方案中，第一聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿或至少约500道尔顿。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含与修饰的IL-2多肽共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物在残基40至残基50的氨基酸残基区域处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物在残基Y45处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约10,000道尔顿或至多约6,000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿、至少约500道尔顿、至少约1000道尔顿、至少约2000道尔顿、至少约3000道尔顿、至少约4000道尔顿或至少约5000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物包括水溶性聚合物。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含第三聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。在一些实施方案中，第三聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约40,000道尔顿、至多约20,000道尔顿或至多约6000道尔顿。在一些实施方案中，第三聚合物具有以下的重均分子量：至少约500道尔顿、至少约1000道尔顿、至少约2000道尔顿、至少约3000道尔顿、至少约4000道尔顿或至少约5000道尔顿。
在一方面，本文提供了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含a)与残基F42Y共价附接的第一聚合物，所述第一聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量；和b)与Y45共价附接的第二聚合物，所述第二聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量；其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，第一聚合物具有约250道尔顿至约1000道尔顿的重均分子量，并且第二聚合物具有约5000道尔顿至约40,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有约250道尔顿至约1000道尔顿的重均分子量，并且第一聚合物具有约5000道尔顿至约40,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚乙二醇。在一些实施方案中，第三聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含约5个至约300个、约10个至约200个、约20个至约100个或约25个至约50个乙二醇单元。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含1个至5个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个至25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地是线性的或支链的。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是线性聚乙二醇。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基、烷基、烷氧基或氨基基团末端加帽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含2个至6个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有式(I)结构的一个或更多个PEG化酪氨酸
Figure BDA0003840274770000051
其中n是选自4至30的整数。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有式(I)结构的一个或更多个PEG化酪氨酸
Figure BDA0003840274770000052
其中n是选自4至30的整数，并且PEG基团是单分散的。
在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基35至残基45的氨基酸区域中。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基42、残基45或两者处。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含两个PEG化酪氨酸，每一个PEG化酪氨酸独立地具有式(I)的结构。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有式(II)结构的至少一种聚合物
Figure BDA0003840274770000053
Figure BDA0003840274770000061
其中每一个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，每一个m是约26。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代选自a)位于残基35-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基，b)位于残基61-81的任何一个中的高丝氨酸残基，和c)位于残基94-114的任何一个中的高丝氨酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71、Hse104或其组合。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含正亮氨酸(Nle)取代。在一些实施例中，Nle取代位于残基20-60的任何一个中。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含三个Nle取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Nle23、Nle39和Nle46。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:3。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少9个氨基酸取代。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2Rα表现出更大的功能活性，如在激动剂测定中通过半最大有效浓度(EC50)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于2:1、低于1.75:1、低于1.5:1、低于1.25:1、低于1:1、低于0.75:1或低于0.5:1。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2Rα表现出更大的亲和力，如通过解离常数(Kd)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的KD小于300nM、小于250nM、小于225nM、小于200nM、小于175nM或小于150nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少了至多0％、至多1％、至多2％、至多5％、至多10％、至多15％、至多20％、至多25％或至多30％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比增加了至少0.1％、至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:1至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽能够扩增CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞群体或其组合。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与调节性T细胞(Treg细胞)的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与调节性T细胞(Treg细胞)的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是约0.1至约15、约0.5至约10、约0.75至约5或约1至约2。在一些实施方案中，细胞群体是体外细胞群体、体内细胞群体或离体细胞群体。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是合成的。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与另外的多肽缀合。
在一方面，本文提供了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％、85％或90％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:3具有至少95％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3的多肽序列。
在一方面，本文提供了与SEQ ID NO:4-22的任何一个具有至少约80％、85％或90％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:4-22的任何一个具有至少95％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3-22的任何一个的多肽序列。
在一方面，本发明提供了多于一种修饰的IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的每一种包含在残基35至75的区域中共价附接的第一聚合物，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列，并且其中修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽的至少90％具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的多于一种修饰的IL-2多肽的峰值分子量的±500Da内的分子量。在一些实施方案中，其中修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至多1.5、至多1.2、至多1.1或至多1.05。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±200道尔顿内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20道尔顿内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％具有如通过质谱测量的相同的分子量。
在一些实施方案中，第一聚合物与氨基酸残基35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75附接，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一聚合物的重均分子量是至少约3000Da、至少约6000Da、至少约12,000Da或至少约24,000Da。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的每一种包含与其共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的每一种包含与其共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物与残基42或45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物与残基F42Y或Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物与残基42或45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物与残基F42Y或Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，群体包括至少100种、至少1000种或至少1000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，群体包括至少1μg、至少10μg或至少1mg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种修饰的IL-2多肽包含非典型氨基酸。在一些实施方案中，非典型氨基酸存在于选自以下的一个或更多个残基位置中：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74和75。
在一方面，本文提供了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体包括：多于一种聚合物，每一种聚合物共价附接至修饰的IL-2多肽的N末端处或残基35至75的区域中，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列，并且其中多于一种聚合物的至少95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。
在一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的修饰的IL-2多肽或修饰的IL-2多肽群体；和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于肠胃外或肠内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于静脉内或皮下施用。在一些实施方案中，药物组合物呈冻干形式。
在一方面，本文提供了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文提供的修饰的IL-2多肽、本文提供的修饰的IL-2多肽群体或本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，癌症是实体癌症或血液癌症。在一些实施方案中，实体癌症是肾癌、皮肤癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，实体癌症是转移性肾细胞癌(转移性RCC)或黑素瘤。在一些实施方案中，血液癌症是白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法包括重构修饰的IL-2多肽或药物组合物的冻干形式。
在一方面，本文提供了一种制备本文提供的修饰的IL-2多肽的方法，该方法包括a)合成修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段，b)连接片段，以及c)折叠所连接的片段。在一些实施方案中，该方法还包括将水溶性聚合物与折叠、连接的片段附接。
根据以下详细描述，本公开内容的另外的方面和优点对本领域技术人员而言将变得明显，详细描述中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将意识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。相应地，附图和描述应被认为本质上是说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被特别和单独地指明通过引用并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的情况，意图本说明书取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图简述
本公开内容的新颖特征特别地在所附权利要求书中阐述。通过参考以下详细描述和附图(本文中也称为“图(figure)”和“图(FIG.)”)将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了其中利用了本公开内容的原理的说明性实施方案，在附图中：
图1A示出了修饰的IL-2多肽(组合物A)的图解。
图1B示出了修饰的IL-2多肽(组合物B)的图解。
图1C示出了修饰的IL-2多肽(组合物C)的图解。
图1D示出了修饰的IL-2多肽(组合物D)的图解。
图1E示出了修饰的IL-2多肽(组合物C1)的图解。
图1F示出了修饰的IL-2多肽(组合物D1)的图解。
图1G示出了修饰的IL-2多肽(组合物A1)的图解。
图1H示出了修饰的IL-2多肽(组合物A2)的图解。
图1I示出了修饰的IL-2多肽(组合物Z)的图解。
图2A示出了纯化的修饰的IL-2多肽的HPLC迹线，其中x轴示出保留时间，并且y轴示出吸光度。该图中的样品是组合物A。
图2B示出了测量修饰的IL-2多肽的质量/电荷比的图，其中x轴是质量/电荷比，并且y轴是信号强度(上图——测量的谱，中图——放大的测量的谱，下图——计算的谱)。该图中示出的样品是本文提供的修饰的IL-2多肽组合物A。
图2C示出了测量修饰的IL-2多肽的偏振光吸光度的图，其中x轴是偏振光的波长，并且y轴是吸光度。该图中示出的样品是本文提供的修饰的IL-2多肽组合物A。
图2D示出了修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中Treg细胞诱导的生物活性的批次间可变性，其中该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度并且在x轴上示出了野生型IL-2或修饰的IL-2多肽的剂量。该图中示出的样品是本文提供的修饰的IL-2多肽组合物D。
图3示出了在表面等离子体共振实验中测量野生型IL-2和修饰的IL-2多肽与IL-2受体α和IL-2受体β的结合活性的图，其中x轴是时间，并且y轴是相对响应。在这些实验中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D。
图4示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中Teff和Treg细胞诱导的影响的图，其中该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度并且在x轴上示出了野生型IL-2或修饰的IL-2多肽的剂量。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D。
图5示出了测量修饰的IL-2多肽的PEG化对半衰期延长的影响的图，其中该图在y轴上示出了修饰的IL-2多肽的血浆浓度并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图6A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中Treg中IL-2信号传导诱导的影响的图，其中该图在y轴上示出了具有磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图6B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中CD8+Teff中IL-2信号传导诱导的影响的图，其中该图在y轴上示出了具有磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的CD8+Teff(CD3+、CD8+)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图7A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中Treg增殖诱导的影响的图，其中该图在y轴上示出了增殖标志物Ki67阳性的调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图7B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中CD8+Teff增殖的影响的图，其中该图在y轴上示出了对增殖标志物Ki67阳性的CD8+Teff(CD3+、CD8+)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图8A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中Treg扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)的调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图8B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+Teff(CD3+、CD8+)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图9示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环CD8+Teff与调节性CD4+T细胞的比例的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+Teff(CD3+、CD8+)与调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的频率的比值并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B和组合物C及组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图10A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环中央记忆性CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+中央记忆性T细胞(CD3+、CD8+、CD62L高、CD44高)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B和组合物C及组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图10B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环效应记忆性CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+效应记忆性T细胞(CD3+、CD8+、CD62L低、CD44高)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B和组合物C及组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图10C示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中幼稚CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+幼稚T细胞(CD3+、CD8+、CD62L高、CD44低)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B和组合物C及组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。
图11示出了用于制备本文提供的示例性修饰的IL-2多肽的一般合成方案。
图12A示出了纯化的PEG化组合物D的HPLC迹线，其中x轴是保留时间，并且y轴是吸光度。
图12B示出了纯化的PEG化组合物D的MALDI-TOF MS，其中x轴是质荷比，并且y轴是信号强度。
图12C示出了测量修饰的IL-2多肽的偏振光吸光度的图，其中x轴是偏振光的波长，并且y轴是吸光度。该图中示出的样品是本文提供的修饰的PEG化IL-2多肽组合物D。
图13示出了纯化的PEG化组合物A的HPLC迹线，其中x轴是保留时间，并且y轴是吸光度。
图14A示出了折叠的纯化的PEG化组合物H的HPLC迹线，其中x轴是保留时间，并且y轴是吸光度。
图14B示出了纯化的PEG化组合物H的MALDI-TOF质谱，其中x轴是质荷比，并且y轴表示相对丰度。
图15A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环自然杀伤细胞扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了白细胞区内的自然杀伤细胞(CD3-、CD49b+)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，以52纳摩尔/kg测试。
图15B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环CD4+T辅助细胞扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD4+T辅助细胞(CD3+、CD4+、CD25低)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，以52纳摩尔/kg测试。
图15C示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中嗜酸性粒细胞扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞白细胞中的嗜酸性粒细胞(SSC高、Siglec-F高)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，以52纳摩尔/kg测试。
图16A示出了测量抗PD1抗体和修饰的IL-2多肽在处理三周之后对BALB/c小鼠中CT26同系(syngeneic)结肠癌肿瘤尺寸的影响的柱状图。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，作为单一剂以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg(分别为18纳摩尔/kg、61纳摩尔/kg、184纳摩尔/kg和368纳摩尔/kg)测试。组合物D还以3mg/kg的剂量与10mg/kg的剂量的抗PD1抗体组合测试。(n＝9只动物；平均值±SEM)。
图16B示出了测量抗PD1抗体和修饰的IL-2多肽对植入了CT26同系结肠癌肿瘤细胞的BALB/c小鼠存活率的影响的图。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，作为单一剂以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg(分别为18纳摩尔/kg、61纳摩尔/kg、184纳摩尔/kg和368纳摩尔/kg)测试。组合物D还以3mg/kg的剂量与10mg/kg的剂量的抗PD1抗体组合测试。(n＝9只动物；CR＝完全消退)。
图17示出了测量抗PD1抗体和修饰的IL-2多肽预处理对CT26同系结肠癌肿瘤的植入和生长的影响的图，所述CT26同系结肠癌肿瘤接种在未经实验的
Figure BDA0003840274770000161
BALB/c小鼠与预处理的动物中。首次处理开始之后90天(处理结束之后69天)，10只未经实验的动物和9只显示完全肿瘤排斥的经预处理的(experienced)动物在对侧肋腹用3×105个CT26细胞皮下注射(s.c)再攻击。经预处理的动物如下：1只动物用3mg/kg的组合物D处理，5只动物用6mg/kg的组合物D处理，并且3只动物用3mg/kg的组合物D与10mg/kg的抗PD1抗体组合处理。图在y轴上示出了肿瘤体积(mm3)并且在x轴上示出了时间。(未经实验的组：n＝10只动物；平均值±SEM)。
图18描绘了以三种不同剂量静脉内注射至食蟹猴(cynomolgus monkey)的组合物D的药代动力学谱。以IL-2质量当量表示的组合物D在血浆中的浓度在y轴上指示，并且时间在x轴上指示。
图19示出了指示组合物D对食蟹猴中循环淋巴细胞细胞计数的影响的柱状图。血液淋巴细胞计数在y轴上指示，并且x轴按处理前(左图)与给药后1周(右图)以递增剂量排列。
图20A示出了用组合物D处理之后两个主要T细胞群体CD8+T效应细胞(CD3+、CD8+)和CD4+T辅助细胞(CD3+、CD4+)以及调节性T细胞(Treg；CD4+、FoxP3+、CD25高)的动态细胞计数谱，表示为y轴上的细胞数/微升血液和x轴上的时间。
图20B示出了用组合物D处理之后CD4+T和CD8+T两种细胞中的效应记忆性亚群(TEM，CD28-/CD95+)和中央记忆性亚群(TCM，CD28+/CD95+)的动态细胞计数谱，表示为y轴上的细胞数/微升血液和x轴上的时间。
图20C示出了用组合物D处理食蟹猴之后NK细胞和嗜酸性粒细胞的动态细胞计数谱。值表示为y轴上的细胞数/微升血液和x轴上的时间。
详细描述
本公开内容涉及可用作治疗剂的修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽。本文提供的修饰的IL-2多肽可以用作免疫疗法或作为其他免疫疗法方案的部分。这样的修饰的IL-2多肽可以显示出与野生型IL-2不同的对IL-2受体(IL-2R)的结合特性。在一方面，本文描述的修饰的IL-2多肽对IL-2Rαβγ复合物(IL-2Rα)具有的降低的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ(IL-2Rβ)复合物具有增加的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合亲和力与野生型IL-2与IL-2Rβ之间的结合亲和力相同或低于野生型IL-2与IL-2Rβ之间的结合亲和力。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含修饰的氨基酸残基。这样的修饰可以采取野生型IL-2多肽诸如SEQ ID NO:1的氨基酸序列的突变形式，从SEQ ID NO:1的序列添加或缺失氨基酸，或向氨基酸残基添加部分(moiety)。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含从SEQ ID NO:1序列的第一氨基酸的缺失。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含C125S突变，使用SEQ ID NO:1的序列作为参考序列。可以向氨基酸残基添加的部分包括但不限于聚合物、接头、间隔物及其组合。当添加至某些氨基酸残基时，这些部分可以调节修饰的IL-2多肽与野生型IL-2相比的活性或其他特性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸残基35-46范围内的两个修饰。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基40-43的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基42处。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基44-46的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基45处。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含一种或更多种聚合物。例如，向某些氨基酸残基添加聚合物可以具有破坏修饰的IL-2多肽与IL-2R(特别是αβγ复合物)的结合相互作用的效果。在一些实施方案中，添加聚合物以破坏这种相互作用的残基包括F42和Y45。在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)聚合物。F42残基可以突变为另一残基，以促进PEG聚合物的添加，例如向酪氨酸残基的添加。聚合物可以添加至残基F42和Y45或其突变体中的任一个或两个中。另外，聚合物可以添加至修饰的IL-2多肽，以便增加多肽的半衰期。这样的半衰期延长性聚合物可以添加至修饰的IL-2多肽的N末端。半衰期延长性聚合物可以具有任何尺寸，包括最多约6kDa、最多约25kDa或最多约50kDa。在一些实施方案中，半衰期延长性聚合物是PEG聚合物。在一些实施方案中，所描述的修饰的IL-2多肽的组合物示于图1A-图1D中。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含选自表1的一个或更多个氨基酸突变。
表1
Figure BDA0003840274770000181
*残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含选自表2的一个或更多个氨基酸突变。
表2
Figure BDA0003840274770000182
Figure BDA0003840274770000191
*残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含选自表3的一个或更多个聚合物。
表3
Figure BDA0003840274770000192
Figure BDA0003840274770000201
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含表4中提供的突变和聚合物。
表4
Figure BDA0003840274770000202
Figure BDA0003840274770000211
*残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列
本文描述的修饰的IL-2多肽也可以化学合成而不是以重组多肽表达。修饰的IL-2多肽可以通过合成全长的修饰的IL-2多肽的一种或更多种片段，将片段连接在一起，并折叠连接的全长多肽来制备。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸序列中的F42Y突变、与残基F42Y共价附接的约500Da的第一PEG聚合物、与残基Y45共价附接的约500Da的第二PEG聚合物、以及与修饰的IL-2多肽N末端共价附接的约6kDa的任选的第三PEG聚合物。修饰的IL-2多肽的实施方案可见于图1A-图1D中，它们分别示出了组合物A、组合物B、组合物C和组合物D。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在施用至受试者时增强T效应(Teff)细胞或自然杀伤(NK)细胞增殖。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在施用至受试者时增强Teff细胞或NK细胞增殖而不增强(spare)调节性T细胞(Treg)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在施用至受试者时增加CD8+T细胞和NK细胞而不增加CD4+调节T细胞。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在施用至受试者时产生接近1的Teff/Treg比值。
以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并因此可以变化。本领域的技术人员将认识到，本公开内容有许多变化和修改，这些都包括在本公开内容的范围内。
尽管本公开内容的各个特征可以在单个实施方案的上下文中被描述，但是这些特征也可以单独地或以任何合适的组合被提供。相反，尽管本公开内容可以为了清楚起见在单独的实施方案的上下文中在本文描述，但是本公开内容也可以以单个实施方案实施。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并不应被解释为限制所描述的主题。
所有术语意图按照本领域技术人员将理解的方式理解。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
以下定义补充了本领域的定义，并针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于实践对本公开内容的测试，但本文描述了优选的方法和材料。相应地，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的。
I.定义
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，并不意图是限制性的。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。
在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同物可以可互换使用。这些术语可以表示任何组合都被特别地设想。仅出于说明的目的，以下措辞“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可以意指“单独地A；单独地B；单独地C；A和B；B和C；A和C；以及A、B、C”。除非上下文特别指分开使用，否则术语“或”可以结合地或分开地使用。
术语“约”或“大约”可以意指在如由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围以内，其将部分地取决于值如何被测量或确定，即，测量系统的限制。例如，“约”可以根据本领域的实践意指1个或多于1个标准差以内。可选地，“约”可以意指特定值的最多20％、最多15％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或生物过程，该术语可以意指在值的数量级以内，5倍以内或2倍以内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外说明，否则应该假定术语“约”意指特定值的可接受的误差范围以内。
如本说明书和权利要求书中使用的，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(include)”和包括“(include)”)，或“含有(containing)”(和“含有(containing)”的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。设想了本说明书中讨论的任何实施方案可以参考本公开内容的任何方法或组合物来实现，并且反之亦然。此外，本公开内容的组合物可以用于实现本公开内容的方法。
说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不必包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开内容，一些术语和措辞定义如下。
术语“药学上可接受的”是指联邦或州政府的管理机构所批准的或可批准的或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的用于在动物包括人类中使用的。
“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与剂一起向受试者施用且不破坏其药理活性并且在以足以递送治疗量的剂的剂量施用时无毒性的赋形剂、载体或稀释剂。
适于本公开内容的“药学上可接受的盐”可以是本领域中通常认为适于与人类或动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激、过敏响应或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。这样的盐包括碱性残基诸如胺的矿物和有机酸盐，以及酸性残基诸如羧酸的碱或有机盐。特定的药物盐包括但不限于以下酸的盐：诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、帕莫酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、烷酸如诸乙酸、HOOC-(CH)2)n-COOH，其中n是0-4等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域普通技术人员将从本公开内容和本领域知识中认识到，其他的药学上可接受的盐包括Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，PA，第1418页(1985)列出的那些。通常，药学上可接受的酸盐或碱盐可以通过任何常规化学方法从包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。简言之，这样的盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在适当的溶剂中反应来制备。
本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自由以下组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及上述整数之间的所有中间小数数值，诸如，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围(nested sub-range)”被特别地设想。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或者在另一个方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。
术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅以示例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。
本文提供的某些式(例如，式A和式A’以及图1C-图1F)描绘了由叠氮-炔环加成反应产生的三唑反应产物。虽然这样的式通常仅描绘在反应中形成的所得三唑的单一位置异构体，但意图的是该式包括所得的两种位置异构体。因此，虽然式仅描绘了单一位置异构体(例如，
Figure BDA0003840274770000241
)，但意图的是另一位置异构体(例如，
Figure BDA0003840274770000242
)也被包括。
术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可以发生但不必须发生，并且表示该描述包括其中该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形没有发生的情况。
术语“部分”是指分子的特定区段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加至分子上的公认的化学实体。
如本文使用的，术语“数均分子量”(Mn)意指样品中所有个体单元的统计平均分子量，并且由式(1)定义：
Figure BDA0003840274770000251
其中Mi是单元的分子量并且Ni是该分子量的单元数。
如本文使用的，术语“重均分子量”(Mw)意指由式(2)定义的数：
Figure BDA0003840274770000252
其中Mi是单元的分子量并且Ni是该分子量的单元数。
如本文使用的，“峰值分子量”(Mp)意指在特定的分析方法(例如质谱、尺寸排阻色谱、动态光散射、分析型离心等)中最高峰值的分子量。
术语“烷基”是指具有1个至20个碳原子并且碳原子通过单键与分子的剩余部分附接的直链或支链的烃链基团。包含最多10个碳原子的烷基称为C1-C10烷基，同样，例如，包含最多6个碳原子的烷基是C1-C6烷基。包含其他数目碳原子的烷基(和本文定义的其他部分)类似地表示。烷基基团包括但不限于C1-C10烷基、C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C2-C8烷基、C3-C8烷基和C4-C8烷基。代表性烷基基团包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基丙基等。在一些实施方案中，烷基是甲基或乙基。在一些实施方案中，烷基是-CH(CH3)2或-C(CH3)3。除非说明书中另外特别说明，否则烷基基团可以任选地被取代。“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子剩余部分连接至基团的直链或支链的二价烃链。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2CH2-。除非说明书中另外特别说明，否则亚烷基基团可以任选地被取代。
术语“亚烯基”或“亚烯基链”是指将分子的剩余部分连接至基团的其中存在至少一个碳-碳双键的直链或支链的二价烃链。在一些实施方案中，亚烯基是–CH＝CH-、-CH2CH＝CH-或–CH＝CHCH2-。在一些实施方案中，亚烯基是–CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是–CH2CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是–CH＝CHCH2-。
术语“炔基”是指其中存在至少一个碳-碳三键的烃基基团类型。在一种实施方案中，炔基基团具有式-C≡C-Rx，其中RX是指炔基基团的剩余部分。在一些实施方案中，RX是H或烷基。在一些实施方案中，炔基选自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基基团的非限制性实例包括-C≡CH、-C≡CCH3、-C≡CCH2CH3和-CH2C≡CH。
术语“芳基”是指包含至少一个芳环(其中形成该环的每个原子都是碳原子)的基团。芳基基团可以任选地被取代。芳基基团的实例包括但不限于苯基和萘基。在一些实施方案中，芳基是苯基。根据结构，芳基基团可以是单基团的或双基团的(即，亚芳基基团)。除非说明书中另外特别说明，否则术语“芳基”或前缀“ar-”(诸如在“芳烷基”中)意指包括任选地被取代的芳基基团。在一些实施方案中，芳基基团包括本文定义的部分还原的环烃基基团(例如，1,2-二氢萘)。在一些实施方案中，芳基基团包括本文定义的完全还原的环烃基基团(例如，1,2,3,4-四氢萘)。当芳基包括环烃基基团时，芳基通过芳环碳原子与分子的剩余部分键合。芳基基团可以是单环或多环(例如，双环、三环或四环)环体系，其可以包括稠合环体系、螺环体系或桥接环体系。
术语“环烃基(cycloalkyl)”是指单环或多环的非芳香族基团，其中形成环的每个原子(即，骨架原子)是碳原子。在一些实施方案中，环烃基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烃基是螺环或桥接化合物。在一些实施方案中，环烃基与芳环稠合(在这种情况下，环烃基通过非芳环碳原子键合)。环烃基包括具有3个至10个环原子的基团。代表性环烃基包括但不限于具有三个至十个碳原子、三个至八个碳原子、三个至六个碳原子或三个至五个碳原子的环烃基。单环环烃基基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊烯基。多环基团包括，例如，金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢萘基、十氢萘基、3,4-二氢萘基-1(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片基(norbornyl)和双环[1.1.1]戊基。除非说明书中另外特别说明，否则环烃基可以任选地被取代。
术语“亚杂烷基”或“亚杂烷基链”是指将分子剩余部分连接至基团的直链或支链的二价杂烷基链。除非说明书中另外特别说明，否则杂烷基或亚杂烷基可以如下文描述任选地被取代。代表性亚杂烷基基团包括但不限于–CH2-O-CH2-、–CH2-N(烷基)-CH2-、–CH2-N(芳基)-CH2-、-OCH2CH2O-、–OCH2CH2OCH2CH2O-或–OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-。
术语“杂环烃基(heteocycloalkyl)”是指包含选自氮、氧和硫的至少一个杂原子的环烃基基团。除非说明书中另外特别说明，否则杂环烃基基团可以是单环或双环的环体系，其可以包括稠合(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烃基通过非芳环原子键合)或桥接的环体系。杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化。氮原子可以任选地被季铵化。杂环烃基基团是部分或完全饱和的。杂环烃基基团的实例包括，但不限于，二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基(piperidonyl)、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烃基还包括碳水化合物的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另外说明，否则杂环烃基在环中具有2个至12个碳。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至10个碳。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至10个碳和1个或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至10个碳和3个或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至12个碳、0-2个N原子、0-2个O原子、0-2个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至12个碳，1-3个N原子，0-1个O原子和0-1个S原子。应理解，当提及杂环烃基中的碳原子数时，杂环烃基中的碳原子数与构成杂环烃基的原子(包括杂原子)(即，杂环烃基环的骨架原子)总数不同。除非说明书中另外特别说明，否则杂环烃基基团可以任选地被取代。
术语“杂芳基”是指包含选自氮、氧和硫的一个或更多个环杂原子的芳基基团。在一些实施方案中，杂芳基是单环或双环的。杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。双环杂芳基的说明性实例包括吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含1-4个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基是C1-C9杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是C1-C5杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是5元或6元杂芳基。在一些实施方案中，双环杂芳基是C6-C9杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基基团包括本文定义的部分还原的环烃基或杂环烃基基团(例如，7,8-二氢喹啉)。在一些实施方案中，杂芳基基团包括本文定义的完全还原的环烃基或杂环烃基基团(例如，5,6,7,8-四氢喹啉)。在杂芳基包括环烃基或杂环烃基基团时，杂芳基通过杂芳环碳或杂原子与分子的剩余部分键合。杂芳基基团可以是单环或多环的(例如，双环、三环或四环)环体系，其可以包括稠合环体系、螺环体系或桥接环体系。
术语“任选地被取代”或“被取代”意指提及的基团任选地被单独和独立地选自以下的一个或更多个另外的基团取代：D、卤素、-CN、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-OH、-CO2H、-CO2烷基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(烷基)、-S(＝O)2N(烷基)2、烷基、环烃基、氟烷基、杂烷基、烷氧基、氟烷氧基、杂环烃基、芳基、杂芳基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基砜和芳基砜。在一些其他的实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH2、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-OH、-CO2H、-CO2(C1-C4烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(C1-C4烷基)、-C(＝O)N(C1-C4烷基)2、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(C1-C4烷基)、-S(＝O)2N(C1-C4烷基)2、C1-C4烷基、C3-C6环烃基、C1-C4氟烷基、C1-C4杂烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4氟烷氧基、-SC1-C4烷基、-S(＝O)C1-C4烷基和-S(＝O)2C1-C4烷基。在一些实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-NH(环丙基)、-CH3、-CH2CH3、-CF3、-OCH3和-OCF3。在一些实施方案中，被取代的基团被前述基团中的一个或两个取代。在一些实施方案中，脂族碳原子(无环或环状)上的任选的取代基包括氧代(＝O)。
II.描述
在一方面，本文描述了一种修饰的多肽，所述修饰的多肽包含修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽包含共价附接的第一聚合物。本文描述了一种修饰的多肽，所述修饰的多肽包含修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽包含在残基F42Y处共价附接的第一聚合物，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在另一方面，本文描述了一种修饰的多肽，所述修饰的多肽包含：修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽对IL-2R受体β(IL-2Rβ)比对IL-2R受体α(IL-2Rα)表现出更大的功能活性，如在激动剂测定中通过半最大有效浓度(EC50)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于2:1。在某些实施方案中，描述了一种修饰的多肽，所述修饰的多肽包含修饰的白细胞介素2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽对IL-2R受体β(IL-2Rβ)比对IL-2R受体α(IL-2Rα)表现出更大的功能活性，如在激动剂测定中通过半最大有效浓度(EC50)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于1:1。在某些实施方案中，描述了一种修饰的多肽，所述修饰的多肽包含修饰的白细胞介素2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽对IL-2R受体β(IL-2Rβ)比对IL-2R受体α(IL-2Rα)表现出更大的功能活性，如在激动剂测定中通过半最大有效浓度(EC50)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于1:5。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
结合亲和力
在一方面，本文描述了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽对IL-2R受体β(IL-2Rβ)比对IL-2R受体α(IL-2Rα)表现出更大的功能活性。在一些实施方案中，对IL-2Rβ、IL-2Rα或两者的亲和力通过解离常数(Kd)来测量。如本文使用的，措辞“修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd”意指修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ结合相互作用的解离常数。类似地，措辞“修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd”意指修饰的IL-2多肽与IL-2Rα结合相互作用的解离常数。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd小于300nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd小于1000nM、小于750nM、小于500nM、小于450nM、小于400nM、小于350nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于140nM、小于130nM、小于125nM、小于120nM、小于100nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd高于1000nM、高于500nM、高于450nM、高于450、高于400nM、高于350nM、高于300nM、高于250nM、高于200nM、高于150nM、高于140nM、高于130nM、高于125nM、高于120nM或高于100nM。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd与野生型IL-2大体上相同。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd与野生型IL-2/IL-2Rβ相比较低。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd比野生型IL-2/IL-2Rβ低。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd比野生型IL-2/IL-2Rβ低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少90％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd比野生型IL-2/IL-2Rβ低至少20％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd比野生型IL-2/IL-2Rβ低至少40％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd比野生型IL-2/IL-2Rβ低至少60％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd比野生型IL-2/IL-2Rβ低至少80％。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd比野生型IL-2/IL-2Rα高至多10％、至多20％、至多30％、至多40％或至多50％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd比野生型IL-2/IL-2Rα高至多10％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd比野生型IL-2/IL-2Rα高至多20％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd比野生型IL-2/IL-2Rα高至多30％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd比野生型IL-2/IL-2Rα高至多40％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd比野生型IL-2/IL-2Rα高至多50％。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd是至少500nM、至少1000nM、至少1500nM、至少2000nM、至少2500nM或至少5000nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd是至少500nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd是至少1000nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd是至少1500nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd是至少2500nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2Rα的Kd是至少5000nM。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽对IL-2受体β(IL-2Rβ)比对IL-2受体α(IL-2Rα)表现出更大的亲和力，如通过解离常数(Kd)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的KD小于300nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2受体β(IL-2Rβ)比对IL-2受体α(IL-2Rα)表现出更大的亲和力，如通过解离常数(Kd)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd小于500nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2受体β(IL-2Rβ)比对IL-2受体α(IL-2Rα)表现出更大的亲和力，如通过解离常数(Kd)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd小于200nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2受体β(IL-2Rβ)比对IL-2受体α(IL-2Rα)表现出更大的亲和力，如通过解离常数(Kd)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的Kd小于100nM。在一些实施方案中，Kd通过表面等离子体共振确定。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2Rα表现出更大的功能活性。在一些实施方案中，功能活性是通过修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ的相互作用刺激免疫细胞。在一些实施方案中，其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2Rα表现出更大的功能活性，如在激动剂测定中通过半最大有效浓度(EC50)测量的。在一些实施方案中，其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2Rα表现出更大的功能活性，如在激动剂测定中通过半最大有效浓度(EC50)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于2:1、低于1.75:1、低于1.5:1或低于1.25:1。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于2:1。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于1.75:1。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于1.5:1。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于1.25:1。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合被减少。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少70％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少80％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少90％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少95％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少99％。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合与野生型IL-2多肽和IL-2Rβ之间的结合相比被减少。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少了至多0％、至多1％、至多2％、至多5％、至多10％、至多15％、至多20％、至多25％或至多30％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少至多10％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少至多15％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少至多20％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少至多25％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少至多30％。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合被增加。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比增加了至少0.1％、至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比增加至少5％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比增加至少10％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比增加至少15％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比增加至少20％。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
生物活性
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽能够扩增CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞群体或其组合。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增调节性T细胞(Treg细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少30％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少40％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少200％。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽扩增调节性T细胞(Treg细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Treg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少30％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少40％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少200％。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多5％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多500％。
在一些实施方案中，由本文描述的修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是约0.1至约15、约0.5至约10、约0.75至约5或约1至约2。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是0.1至15。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是0.1至0.5、0.1至0.75、0.1至1、0.1至2、0.1至5、0.1至10、0.1至15、0.5至0.75、0.5至1、0.5至2、0.5至5、0.5至10、0.5至15、0.75至1、0.75至2、0.75至5、0.75至10、0.75至15、1至2、1至5、1至10、1至15、2至5、2至10、2至15、5至10、5至15、10至15或其间任何数字或范围。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是约0.1、0.5、0.75、1、2、5、10或15。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是至少0.1、0.5、0.75、1、2、5或10。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是至多0.5、0.75、1、2、5、10或15。
在一些实施方案中，由本文提供的修饰的IL-2多肽扩增的细胞群体是体外细胞群体、体内细胞群体或离体细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体外细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体内细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是离体细胞群体。细胞群体可以是CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或其组合的群体。
在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后1小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后2小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后4小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后30分钟测量细胞水平。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接的聚合物用于半衰期延长。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接的聚合物用于血浆或血清半衰期延长。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至2倍、1.5倍至4倍、1.5倍至6倍、1.5倍至8倍、1.5倍至10倍、2倍至4倍、2倍至6倍、2倍至8倍、2倍至10倍、4倍至6倍、4倍至8倍、4倍至10倍、6倍至8倍、6倍至10倍或8倍至10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍、2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期是至少1.5倍、2倍、4倍、6倍或8倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长至多2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至2倍、1.5倍至4倍、1.5倍至6倍、1.5倍至8倍、1.5倍至10倍、2倍至4倍、2倍至6倍、2倍至8倍、2倍至10倍、4倍至6倍、4倍至8倍、4倍至10倍、6倍至8倍、6倍至10倍或8倍至10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍、2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期是至少1.5倍、2倍、4倍、6倍或8倍。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长至多2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
位点特异性修饰
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在一个或更多个氨基酸残基处的一个或更多个修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号基于野生型人类IL-2多肽作为参考序列。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
本文描述的多肽的修饰包括突变、各种官能团的添加、氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或者蛋白或蛋白片段的野生型形式的任何其他改变。可以添加至多肽的官能团包括聚合物、接头、烷基基团、可检测的分子诸如生色团或荧光团、反应性官能团或其任何组合。在一些实施方案中，官能团被添加至多肽的个体氨基酸。在一些实施方案中，官能团被位点特异性地添加至多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在来自残基35-46区域的氨基酸残基处的修饰，其中残基编号基于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，修饰位于K35、L46、T37、R38、M39、L40、T41、F42、K43、F44、Y45或M46处。在一些实施方案中，修饰位于F42处。在一些实施方案中，修饰位于Y45处。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在N末端残基处的修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125S突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含A1缺失。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在残基35-46区域中的残基处共价附接的第一聚合物，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基39-43区域中的残基处共价附接的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基F42处共价附接的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基F42Y处共价附接的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基44-46区域中的残基处共价附接的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基Y45处共价附接的第一聚合物。
在一些实施方案中，本文描述的修饰IL-2多肽包含位于残基35至残基45区域中的氨基酸残基处的一个或更多个PEG化酪氨酸。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基42、残基45或两者处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基42处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基45处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基42和残基45两者处。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含两个PEG化酪氨酸，每个PEG化酪氨酸独立地具有式(I)的结构。
在一方面，本文公开了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含F42Y和Y45。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基35-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基61-81的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基94-114的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个、2个、3个或更多个Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71、Hse104或其组合。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代选自(a)位于残基35-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；(b)位于残基61-81的任何一个中的高丝氨酸残基；和(c)位于残基94-114的任何一个中的高丝氨酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个、2个、3个或更多个正亮氨酸(Nle)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基18-28的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基34-50的任何一个中的一个或更多个Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基20-60的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含三个Nle取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Nle23、Nle39和Nle46。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有A1缺失的SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含A1缺失。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有A1缺失的SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含表7中提供的SEQ ID NO:3-22的任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3-22的任何一个的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与ID NO NO:3的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与ID NO NO:4的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与ID NO NO:9的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个或4个氨基酸取代，3个至5个氨基酸取代、3个至6个氨基酸取代、3个至7个氨基酸取代、3个至9个氨基酸取代、4个或5个氨基酸取代、4个至6个氨基酸取代、4个至7个氨基酸取代、4个至9个氨基酸取代、5个或6个氨基酸取代、5个至7个氨基酸取代、5个至9个氨基酸取代、6个或7个氨基酸取代、6个至9个氨基酸取代或7个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个氨基酸取代、4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或更多个氨基酸取代选自表1。在一些实施方案中，一个或更多个氨基酸取代选自表2。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含第二修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含第三修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含第二修饰和第三修饰。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与另外的多肽连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽和另外的多肽形成融合多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽和另外的多肽缀合在一起。在一些实施方案中，另外的多肽是多肽复合物的一部分。在一些实施方案中，另外的多肽包含抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗体包括人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、其任何片段或其任何组合。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体或其任何片段。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与至少一种另外的多肽连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与多于一种另外的多肽连接。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整。
如本文描述的修饰的IL-2多肽可以包含一个或更多个非典型氨基酸。“非典型”氨基酸可以指不在通常掺入天然存在的蛋白中的20种典型氨基酸中的D形式或L形式的氨基酸残基。例如，在一些情况下，Tyr 45和/或Phe 42被非典型氨基酸取代。在一些实施方案中，位于表1和/或表2中提供的位置处的一个或更多个氨基酸被一个或更多个非典型氨基酸取代。非典型氨基酸包括但不限于N-α-(9-芴甲基氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)和N-α-(9-芴甲基氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH。示例性非典型氨基酸包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、对甲氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对硼苯丙氨酸、O-炔丙基酪氨酸、L-磷酸丝氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对溴苯丙氨酸、硒半胱氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、叠氮基-赖氨酸(AzK)、酪氨酸氨基酸的类似物；谷氨酰胺氨基酸的类似物；苯丙氨酸氨基酸的类似物；丝氨酸氨基酸的类似物；苏氨酸氨基酸的类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸、β-氨基酸；除了脯氨酸或组氨酸之外的环状氨基酸；除了苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸之外的芳族氨基酸；或其组合。在一些实施方案中，非典型氨基酸选自β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生化侧链的氨基酸。在一些实施方案中，非典型氨基酸包括β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、Nα-乙基甘氨酸、Nα-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、ω-甲基精氨酸、Nα-甲基甘氨酸、Nα-甲基异亮氨酸、Nα-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、Nα-乙酰丝氨酸、Nα-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和/或其他类似氨基酸。在一些实施方案中，Tyr 45和/或Phe 42被修饰的酪氨酸残基取代。在一些实施方案中，修饰的酪氨酸残基包含氨基、叠氮化物、炔烯丙基、酯和/或酰胺官能团。在一些实施方案中，位置42和/或45处的修饰的酪氨酸残基具有由前体结构1、结构2、结构3、结构4或结构5构建的结构，其中结构1是
Figure BDA0003840274770000441
结构2是
Figure BDA0003840274770000442
结构3是
Figure BDA0003840274770000443
结构4是
Figure BDA0003840274770000444
结构5是
Figure BDA0003840274770000451
聚合物
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接在其上的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，描述的修饰的IL-2多肽包含与修饰的IL-2多肽共价附接的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种聚合物。在一些实施方案中，描述的修饰的IL-2多肽包含第一聚合物。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是多糖。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含与IL-2多肽的N末端共价附接的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第二聚合物和第三聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物与残基42或45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物与残基F42Y或Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物与残基42和45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物与残基F42Y和Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含(i)残基42处的酪氨酸，和(ii)与其共价附接的第一聚合物和第二聚合物，其中第一聚合物和第二聚合物中的至少一种具有高于5000道尔顿的重均分子量，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物具有约6,000道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：约6,000道尔顿至约10,000道尔顿、约6,000道尔顿至约25,000道尔顿、约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、约10,000道尔顿至约25,000道尔顿、约10,000道尔顿至约50,000道尔顿或约25,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约6,000道尔顿、约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约6,000道尔顿、约10,000道尔顿或约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)，诸如聚乙二醇(即，聚环氧乙烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括改性聚(环氧烷)。在一些实施方案中，改性聚(环氧烷)包含一个或更多个接头基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括双官能接头，诸如酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团、羰基基团等。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括酰胺接头基团。在一些实施方案中，改性聚(环氧烷)包含一个或更多个间隔物基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括被取代或未被取代的C1-C6亚烷基基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，接头基团是双正交反应(例如，生物相容性和选择性反应)的产物。在一些实施方案中，生物正交反应是Cu(I)催化或“无铜”的炔-叠氮三唑形成反应、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学或金属介导的过程，诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。在一些实施方案中，第一聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含促进修饰的IL-2多肽与衍生化分子或部分(诸如抗体和聚合物)缀合的反应基团。在一些实施方案中，反应基团包括以下的一种或更多种：羧酸衍生的活性酯、混合酸酐、酰基卤化物、酰基叠氮化物、烷基卤化物、N-马来酰亚胺、亚氨基酯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在一些实施方案中，反应基团包括叠氮化物。在一些实施方案中，反应基团包括炔烃。在一些实施方案中，反应基团通过接头与修饰的IL-2多肽附接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个反应基团。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含多于一个反应基团。在一些实施方案中，反应基团在选自表1或表2所示残基的残基处附接。在一些实施方案中，反应基团在残基42或45处附接，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，反应基团与修饰的IL-2多肽的N末端残基附接。在一些实施方案中，反应基团与修饰的IL-2多肽的C末端残基附接。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含与残基共价附接的化学试剂。在一些实施方案中，化学试剂包括生物正交试剂。在一些实施方案中，化学试剂包括叠氮化物。在一些实施方案中，化学试剂包括炔烃。在一些实施方案中，化学试剂通过接头与残基共价附接。在一些实施方案中，化学试剂在残基35-46处附接，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂在残基39-43处附接，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂在残基42处附接，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂在残基F42Y处附接，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂在残基44-46处附接，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂在残基45处附接，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂在表1或表2所示的任何残基处附接。在一些实施方案中，化学试剂与修饰的IL-2多肽的N末端残基附接。
在一些实施方案中，水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链聚。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包括1个聚乙二醇链至2个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含至少1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含至多2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包括式(II)的结构
Figure BDA0003840274770000491
其中每个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物的至少一个聚乙二醇链包括式(III)的结构
Figure BDA0003840274770000492
其中每个m独立地是4-30的整数，并且每个n独立地是1-10的整数。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物的每个聚乙二醇链包括式(III)的结构。在式(III)的一些实施方案中，m是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在式(III)的一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽还包含与修饰的IL-2多肽共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物在残基40至残基50的氨基酸残基区域处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物在残基Y45处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。
在一些实施方案中，第二聚合物具有约6,000道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的重均分子量：约6,000道尔顿至约10,000道尔顿、约6,000道尔顿至约25,000道尔顿、约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、约10,000道尔顿至约25,000道尔顿、约10,000道尔顿至约50,000道尔顿或约25,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物具有约6,000道尔顿、约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至少约6,000道尔顿、约10,000道尔顿或约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至多约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第二聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。在一些实施方案中，第二聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。
在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链聚。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至2个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含至少1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含至多2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包括式(II)的结构
Figure BDA0003840274770000511
Figure BDA0003840274770000522
其中每个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物的至少一个聚乙二醇链包括式(III)的结构
Figure BDA0003840274770000521
其中每个m独立地是4-30的整数，并且每一个n独立地是1-10的整数。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物的每个聚乙二醇链包括式(III)的结构。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽还包含与修饰的IL-2多肽共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物在残基40至残基50的氨基酸残基区域处共价附接。在一些实施方案中，第三聚合物在残基Y45处共价附接。在一些实施方案中，第三聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。
在一些实施方案中，第三聚合物具有约6,000道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有以下的重均分子量：约6,000道尔顿至约10,000道尔顿、约6,000道尔顿至约25,000道尔顿、约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、约10,000道尔顿至约25,000道尔顿、约10,000道尔顿至约50,000道尔顿或约25,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一些实施方案中，第三聚合物具有约6,000道尔顿、约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至少约6,000道尔顿、约10,000道尔顿或约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至多约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第三聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，第三聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约500道尔顿至约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约1000道尔顿至约10,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第三聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，第三聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。
在另一方面，本文描述了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含：(a)与残基F42Y共价附接的第一聚合物，所述第一聚合物具有最多约6000道尔顿的重均分子量；(b)与Y45共价附接的第二聚合物，所述第二聚合物具有最多约6000道尔顿的重均分子量；并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一方面，本文描述了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含：(a)与残基F42Y共价附接的第一聚合物和(b)与Y45共价附接的第二聚合物，其中第一聚合物和第二聚合物中的一种具有在约200Da、300Da、或400Da至约600Da、1000Da或6000Da范围内的重均分子量，并且另一种聚合物具有在约5000Da、10,000Da或20,000Da至约30,000Da、40,000Da或50,000Da范围内的重均分子量，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在另一方面，本文描述了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽包含：a.与残基F42Y共价附接的第一聚合物，所述第一聚合物具有最多约6000道尔顿的重均分子量；b.与Y45共价附接的第二聚合物，所述第二聚合物具有最多约6000道尔顿的重均分子量；和c.共价附接的N末端第三聚合物，其具有最多约50,000道尔顿的重均分子量，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物中的每一种独立地包括水溶性聚合物。
在一些实施方案中，每种聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚乙二醇。
在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含1个至5个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含单个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个至25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个乙二醇单元至25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有以下的一个聚乙二醇链：3个乙二醇单元至5个乙二醇单元、3个乙二醇单元至7个乙二醇单元、3个乙二醇单元至10个乙二醇单元、3个乙二醇单元至15个乙二醇单元、3个乙二醇单元至25个乙二醇单元、5个乙二醇单元至7个乙二醇单元、5个乙二醇单元至10个乙二醇单元、5个乙二醇单元至15个乙二醇单元、5个乙二醇单元至25个乙二醇单元、7个乙二醇单元至10个乙二醇单元、7个乙二醇单元至15个乙二醇单元、7个乙二醇单元至25个乙二醇单元、10个乙二醇单元至15个乙二醇单元、10个乙二醇单元至25个乙二醇单元或15个乙二醇单元至25个乙二醇单元。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个乙二醇单元、5个乙二醇单元、7个乙二醇单元、10个乙二醇单元、15个乙二醇单元或25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有至少3个乙二醇单元、5个乙二醇单元、7个乙二醇单元、10个乙二醇单元或15个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有至多5个乙二醇单元、7个乙二醇单元、10个乙二醇单元、15个乙二醇单元或25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至2个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含至少1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含至多2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包括式(II)的结构
Figure BDA0003840274770000561
其中每个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物的每个聚乙二醇链包括式(III)的结构。
Figure BDA0003840274770000562
其中每个m独立地是4-30的整数，并且每个n独立地是1-10的整数。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含约5个至约300个、约10个至约200个、约20个至约100个或约25个至约50个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元至300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元至10个乙二醇单元、5个乙二醇单元至20个乙二醇单元、5个乙二醇单元至25个乙二醇单元、5个乙二醇单元至50个乙二醇单元、5个乙二醇单元至100个乙二醇单元、5个乙二醇单元至200个乙二醇单元、5个乙二醇单元至300个乙二醇单元、10个乙二醇单元至20个乙二醇单元、10个乙二醇单元至25个乙二醇单元、10个乙二醇单元至50个乙二醇单元、10个乙二醇单元至100个乙二醇单元、10个乙二醇单元至200个乙二醇单元、10个乙二醇单元至300个乙二醇单元、20个乙二醇单元至25个乙二醇单元、20个乙二醇单元至50个乙二醇单元、20个乙二醇单元至100个乙二醇单元、20个乙二醇单元至200个乙二醇单元、20个乙二醇单元至300个乙二醇单元、25个乙二醇单元至50个乙二醇单元、25个乙二醇单元至100个乙二醇单元、25个乙二醇单元至200个乙二醇单元、25个乙二醇单元至300个乙二醇单元、50个乙二醇单元至100个乙二醇单元、50个乙二醇单元至200个乙二醇单元、50个乙二醇单元至300个乙二醇单元、100个乙二醇单元至200个乙二醇单元、100个乙二醇单元至300个乙二醇单元或200个乙二醇单元至300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元、10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元、200个乙二醇单元或300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含至少5个乙二醇单元、10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元或200个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含至多10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元、200个乙二醇单元或300个乙二醇单元。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地是线性的或支链的。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是线性聚乙二醇。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是支链聚乙二醇。例如，在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种都包含线性聚乙二醇链。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基、烷基、烷氧基、酰胺基或氨基基团末端加帽。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用氨基基团末端加帽。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用酰胺基基团末端加帽。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烷氧基基团末端加帽。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烷基基团末端加帽。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基基团末端加帽。在一些实施方案中，一个或更多个聚乙二醇链独立地具有结构
Figure BDA0003840274770000581
其中n是4-30的整数。在一些实施方案中，一个或更多个聚乙二醇链独立地具有结构
Figure BDA0003840274770000582
其中m是4-30的整数。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个或2个共价附接的水溶性聚合物、1个至3个共价附接的水溶性聚合物、1个至4个共价附接的水溶性聚合物、1个至6个共价附接的水溶性聚合物、1个至8个共价附接的水溶性聚合物、1个至10个共价附接的水溶性聚合物、2个或3个共价附接的水溶性聚合物、2个至4个共价附接的水溶性聚合物、2个至6个共价附接的水溶性聚合物、2个至8个共价附接的水溶性聚合物、2个至10个共价附接的水溶性聚合物、3个或4个共价附接的水溶性聚合物、3个至6个共价附接的水溶性聚合物、3个至8个共价附接的水溶性聚合物、3个至10个共价附接的水溶性聚合物、4个至6个共价附接的水溶性聚合物、4个至8个共价附接的水溶性聚合物、4个至10个共价附接的水溶性聚合物、6个至8个共价附接的水溶性聚合物、6个至10个共价附接的水溶性聚合物或8个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个共价附接的水溶性聚合物、2个共价附接的水溶性聚合物、3个共价附接的水溶性聚合物、4个共价附接的水溶性聚合物、6个共价附接的水溶性聚合物、8个共价附接的水溶性聚合物或10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少1个共价附接的水溶性聚合物、2个共价附接的水溶性聚合物、3个共价附接的水溶性聚合物、4个共价附接的水溶性聚合物、6个共价附接的水溶性聚合物或8个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多2个共价附接的水溶性聚合物、3个共价附接的水溶性聚合物、4个共价附接的水溶性聚合物、6个共价附接的水溶性聚合物、8个共价附接的水溶性聚合物或10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含2个至6个共价附接的水溶性聚合物。
在一些实施方案中，一种或更多种共价附接的聚合物包含接头。在一些实施方案中，一种或更多种共价附接的聚合物，诸如第三聚合物，包含一个或更多个接头。在一些实施方案中，接头包含一个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含一个或更多个赖氨酸。在一些实施方案中，接头包含间隔物。在一些实施方案中，接头包含反应性官能团或官能团诸如酰胺。在一些实施方案中，接头具有式(IV)的结构
Figure BDA0003840274770000591
其中A、B、C和D各自独立地是聚合物。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有式(I)或式(I’)的结构的一个或更多个PEG化酪氨酸
Figure BDA0003840274770000592
其中n是选自4至30的整数。在一些实施方案中，n是4至6、4至8、4至10、4至15、4至20、4至25、4至30、6至8、6至10、6至15、6至20、6至25、6至30、8至10、8至15、8至20、8至25、8至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30或25至30。在一些实施方案中，n是4、6、8、10、15、20、25或30。在一些实施方案中，n是至少4、6、8、10、15、20或25。在一些实施方案中，n是至多6、8、10、15、20、25或30。在一方面，如本文描述的修饰的IL-2多肽包含在一个或两个氨基酸残基处共价附接的一种或两种水溶性聚合物。例如，在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有如表中所示的特征和附接位点的一种或两种水溶性聚合物。
表5.示例性多肽结构和水溶性聚合物特征
Figure BDA0003840274770000601
Figure BDA0003840274770000611
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包括式(A)的结构：
Figure BDA0003840274770000612
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包括式(A’)的结构：
Figure BDA0003840274770000613
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包括式(B)的结构：
Figure BDA0003840274770000621
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包括式(C)的结构：
Figure BDA0003840274770000622
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包括式(D)的结构：
Figure BDA0003840274770000623
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有如表中所示的结构和附接位点的一种或两种水溶性聚合物。
表6.示例性多肽结构和水溶性聚合物结构
Figure BDA0003840274770000624
Figure BDA0003840274770000631
在一些实施方案中，在残基45处附接的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，在残基45处附接的水溶性聚合物包括式(II)、式(III)、式(IV)或其组合的结构。在一些实施方案中，在残基45处附接的水溶性聚合物包括式(A)、式(A’)、式(B)、式(C)、式(D)或其组合的结构。在一些实施方案中，在残基45处附接的水溶性聚合物包括
Figure BDA0003840274770000632
的结构。在一些实施方案中，在残基42处附接的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，在残基42处附接的水溶性聚合物包括式(II)、式(III)、式(IV)或其组合的结构。在一些实施方案中，在残基42处附接的水溶性聚合物包括式(A)、式(A’)、式(B)、式(C)、式(D)或其组合的结构。在一些实施方案中，在残基42处附接的水溶性聚合物包括
Figure BDA0003840274770000633
的结构。
在一些实施方案中，聚合物由合适的前体材料合成。在一些实施方案中，聚合物由结构6、结构7、结构8或结构9的前体材料合成，其中结构6是
Figure BDA0003840274770000641
结构7是
Figure BDA0003840274770000642
结构8是
Figure BDA0003840274770000643
结构9是
Figure BDA0003840274770000644
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含将聚合物(例如，聚乙二醇)与IL-2多肽的氨基酸残基共价附接的接头。在一些实施方案中，氨基酸残基是35-46的残基，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，氨基酸残基是残基42。在一些实施方案中，氨基酸残基是残基45。在一些实施方案中，氨基酸残基是酪氨酸，诸如F42Y或Y45。在一些实施方案中，将聚合物(例如，聚乙二醇)与IL-2多肽共价附接的接头包括式(V)的结构，
Figure BDA0003840274770000645
其中L、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L8和L9的每一个独立地是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或被未取代的C1-C6亚杂烷基、被取代或被未取代的C2-C6亚烯基、被取代或未被取代的C2-C6亚炔基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在；
L7是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或被未取代的C1-C6亚杂烷基、被取代或被未取代的C2-C6亚烯基、被取代或未被取代的C2-C6亚炔基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-、点击化学残基或不存在；
每个RL独立地是氢、被取代或未被取代的C1-C4烷基、被取代或未被取代的C1-C4杂烷基、被取代或未被取代的C2-C6烯基、被取代或未被取代的C2-C5炔基、被取代或未被取代的C3-C8环烃基、被取代或未被取代的C2-C7杂环烃基、被取代或未被取代的芳基、或被取代或未被取代的杂芳基；
q是0、1、2、3、4、5或6；并且
qa、qb、qc和qd的每一个独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含一个或更多个接头，所述一个或更多个接头将第一聚合物、第二聚合物或两者与修饰的IL-2多肽的剩余片段共价附接，其中一个或更多个接头的每一个独立地具有式(V)的结构。在一些实施方案中，式(V)的接头通过L1末端与IL-2多肽的氨基酸残基附接。在一些实施方案中，式(V)的接头与聚合物的L末端附接。
在一些实施方案中，式(V)的接头具有式(V-1)的结构，
Figure BDA0003840274770000661
在一些实施方案中，式(V)的接头具有式(V-2)的结构，
Figure BDA0003840274770000662
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含式(V-1)的接头和式(V-2)的接头。
在一些实施方案中，L1是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L1是被取代或未被取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L1是被取代或未被取代的C1-C3亚烷基。在一些实施方案中，L1是-O-。在一些实施方案中，L1是-CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1不存在。
在一些实施方案中，L1是被取代或未被取代的C1-C3亚烷基。在一些实施方案中，L1是未被取代的C1-C3亚烷基。在一些实施方案中，L1是-CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L1不存在。
在一些实施方案中，L2是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L2是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-或-NRLC(＝S)NRL-。在一些实施方案中，L2是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NRL-或-NRLC(＝O)-。在一些实施方案中，L2是-C(＝O)NRL-。在一些实施方案中，L2是-NRLC(＝O)-。在一些实施方案中，L2是-NH-C(＝O)-。在一些实施方案中，L2是-C(＝O)NH-。在一些实施方案中，L2不存在。
在一些实施方案中，L2是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NRL-或-NRLC(＝O)-。在一些实施方案中，L2是-C(＝O)NRL-。在一些实施方案中，L2是-NRLC(＝O)-。在一些实施方案中，L2是-NH-C(＝O)-。在一些实施方案中，L2是-C(＝O)NH-。
在一些实施方案中，L3是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L3是被取代或未被取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L3是被取代或未被取代的C1-C3亚烷基。在一些实施方案中，L3是-O-。在一些实施方案中，L3是-CH2-。在一些实施方案中，L3是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L3是-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L3不存在。
在一些实施方案中，L3是被取代或未被取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L3是被取代或未被取代的C1-C3亚烷基。在一些实施方案中，L3是-CH2-。在一些实施方案中，L3是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L3是-CH2CH2CH2-。
在一些实施方案中，L4是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L4是被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-或-(O-CH(CH3)-CH2)qd-。在一些实施方案中，L4是被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-或-(O-CH2-CH2)qb-。在一些实施方案中，L4是-(CH2-CH2-O)qa-或-(O-CH2-CH2)qb-。在一些实施方案中，L4不存在。
在一些实施方案中，L5是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L5不存在。
在一些实施方案中，L6是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L6不存在。
在一些实施方案中，L8是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L8是被取代或未被取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L8是被取代或未被取代的C1-C4亚烷基。在一些实施方案中，L8是被取代或未被取代的C3-C4亚烷基。在一些实施方案中，L8是-O-。在一些实施方案中，L8是-CH2-。在一些实施方案中，L8是-CH2CH2-。在一些实施方案中，L8是-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L8是-CH2CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，L8不存在。
在一些实施方案中，L9是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或未被取代的C1-C6亚杂烷基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在。在一些实施方案中，L9是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-或-NRLC(＝S)NRL-。在一些实施方案中，L9是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NRL-或-NRLC(＝O)-。在一些实施方案中，L9是-C(＝O)NRL-。在一些实施方案中，L9是-NRLC(＝O)-。在一些实施方案中，L9是-NH-C(＝O)-。在一些实施方案中，L9是-C(＝O)NH-。在一些实施方案中，L9不存在。
在一些实施方案中，每个RL独立地是氢、被取代或未被取代的C1-C4烷基、被取代或未被取代的C1-C4杂烷基、或被取代或未被取代的C3-C8环烃基。在一些实施方案中，RL是氢。在一些实施方案中，RL是被取代或未被取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，RL是甲基。在一些实施方案中，RL是乙基。
在一些实施方案中，qa是1至20、5至20、5至15、8至20或8至12。在一些实施方案中，qa是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，qa是9、10、11或12。在一些实施方案中，qa是约10。
在一些实施方案中，qb是1至20、5至20、5至15、8至20或8至12。在一些实施方案中，qb是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，qb是9、10、11或12。在一些实施方案中，qb是约10。
在一些实施方案中，qc是1至20、5至20、5至15、8至20或8至12。在一些实施方案中，qc是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，qc是9、10、11或12。在一些实施方案中，qc是约10。
在一些实施方案中，qd是1至20、5至20、5至15、8至20或8至12。在一些实施方案中，qd是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，qd是9、10、11或12。在一些实施方案中，qd是约10。
在一些实施方案中，q是0。在一些实施方案中，q是1。在一些实施方案中，q是2。在一些实施方案中，q是3。在一些实施方案中，q是4。在一些实施方案中，q是5。在一些实施方案中，q是6。
在一些实施方案中，L7是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、点击化学残基或不存在。在一些实施方案中，L7是点击化学残基。在一些实施方案中，L7是无铜点击化学残基。在一些实施方案中，L7是硝酮偶极环加成的残基。在一些实施方案中，L7是四嗪连接的残基。在一些实施方案中，L7是四环烷连接的残基。点击化学残基的示例性基团示于Hein等人,“ClickChemistry,A Powerful Tool for Pharmaceutical Sciences,”PharmaceuticalResearch第25卷，第2216–2230页(2008)；Thirumurugan等人，“Click Chemistry for DrugDevelopment and Diverse Chemical–Biology Applications,”Chem.Rev.2013,113,7,4905–4979；US20160107999A1；US10266502B2；和US20190204330A1；其中每一项通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，L7是
Figure BDA0003840274770000701
Figure BDA0003840274770000711
在一些实施方案中，L7是
Figure BDA0003840274770000712
Figure BDA0003840274770000713
在一些实施方案中，本文提供了包含点击化学残基的接头。在一些实施方案中，接头包括式(V)的结构并且L7是点击化学残基。在一些实施方案中，点击化学残基是环辛炔叠氮化物残基。例如，在一些实施方案中，点击化学残基是
Figure BDA0003840274770000714
(DBCO-叠氮化物残基)。在一些实施方案中，点击化学残基是
Figure BDA0003840274770000715
Figure BDA0003840274770000716
在一些实施方案中，点击化学残基是DIBO-叠氮化物残基、BARAC-叠氮化物残基、DBCO-叠氮化物残基、DIFO-叠氮化物残基、COMBO-叠氮化物残基、BCN-叠氮化物残基或DIMAC-叠氮化物残基。在一些实施方案中，点击化学残基包括三唑。
在一些实施方案中，本文提供了包括以下结构的接头：
Figure BDA0003840274770000721
在一些实施方案中，接头包括以下结构：
Figure BDA0003840274770000722
Figure BDA0003840274770000723
在一些实施方案中，本文提供了包括以下结构的接头：
Figure BDA0003840274770000724
在一些实施方案中，接头包括以下结构：
Figure BDA0003840274770000725
Figure BDA0003840274770000726
在一些实施方案中，IL-2多肽通过叠氮化物侧与接头附接，并且聚合物通过环辛炔侧与接头附接。在一些实施方案中，IL-2多肽通过环辛炔侧与接头附接，并且聚合物通过叠氮化物侧与接头附接。
相应地，本文还描述了制备包含聚合物的修饰的IL-2多肽的方法，该方法包括将包含第一接头的IL-2多肽或其片段与包含第二接头的聚合物缀合。在一些实施方案中，第一接头和第二接头可以经由生物正交化学缀合，从而制备包含聚合物的修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，生物正交化学是点击化学。在一些实施方案中，第一接头包含叠氮化物部分，并且第二接头包含环辛炔部分。在一些实施方案中，第一接头包含环辛炔部分，并且第二接头包含叠氮化物部分。
本文还描述了一种修饰的IL-2多肽群体，所述修饰的IL-2多肽群体包含多于一种修饰的IL-2多肽，其中多于一种修饰的IL-2多肽包含(i)在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物，(ii)在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物，和/或(iii)在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物和在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物。在一些实施方案中，在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)确定的在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过MALDI-MS确定的在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱诸如凝胶渗透色谱(GPC)和高效液相色谱(HPLC)或质谱诸如MALDI-MS确定的。在一些实施方案中，在残基42处附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。在一些实施方案中，在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过MALDI-MS确定的在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过MALDI-MS确定的在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。在一些实施方案中，在残基45处附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。
单分散性
在一方面，本文描述了修饰的IL-2多肽群体。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽群体是单分散的。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体包含单分散聚合物。在一些实施方案中，单分散聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端、残基42和/或残基45附接。在一些实施方案中，单分散聚合物与修饰的IL-2多肽的如表1或表2中描述的残基位置附接。在一些情况下，修饰的IL-2多肽群体包含本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽群体包含与其共价附接的聚合物。在一些实施方案中，每种修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的聚合物。在一些实施方案中，聚合物是单分散聚合物。在一些实施方案中，聚合物与残基42或45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，聚合物与残基F42Y或Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽群体包含与其共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，每种修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物是单分散聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物与残基42或45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物与残基F42Y或Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽群体包含与其共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，每种修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物是单分散聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物与残基F42Y或Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物与残基F42Y和Y45共价附接，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽群体是单分散的。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至多1.5、至多1.2、至多1.1或至多1.05。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-2多肽群体，并且其中修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是1.05至1.5。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-2多肽群体，并且其中修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.4、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5或约1.2至约1.5。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-2多肽群体，并且其中修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.05、约1.1、约1.2或约1.5。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-2多肽群体，并且其中修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至少1.05、1.1或1.2。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-2多肽群体，并且其中修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至多1.1、1.2或1.5。在一些实施方案中，比值通过色谱诸如凝胶渗透色谱(GPC)和高效液相色谱(HPLC)确定。在一些实施方案中，比值通过质谱诸如MALDI-MS和ESI-HRMS确定。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，质谱是MALDI-质谱。在一些实施方案中，质谱是高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-MS或ESI-HRMS)。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。
在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20Da、±10Da或±5Da内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20Da、±10Da或±5Da内的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20Da、±10Da或±5Da内的分子量。在一些实施方案中，质谱是MALDI-质谱。在一些实施方案中，质谱是ESI-HRMS。
在本文描述的修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少85％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少90％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-2多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有如通过质谱测量的相同的分子量。
在一些实施方案中，当例如通过尺寸排阻色谱、动态光散射、ESI-MS、MALDI-MS或分析型超速离心评价时，本文描述的修饰的IL-2多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当例如通过尺寸排阻色谱、动态光散射、ESI-MS、MALDI-MS或分析型超速离心评价时，修饰的IL-2多肽群体的至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过尺寸排阻色谱评价时，修饰的IL-2多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过动态光散射评价时，修饰的IL-2多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过MALDI-MS或ESI-MS评价时，修饰的IL-2多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过分析型超速离心评价时，修饰的IL-2多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。
在一方面，本文描述了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体包含多于一种修饰的IL-2多肽，其中多于一种修饰的IL-2多肽包含多于一种聚合物(即，多于一种第一聚合物)，其中每种修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的多于一种聚合物的一种。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至少95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过MALDI-MS确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量，其中修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±0.5％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±0.1％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱诸如MALDI-MS确定的。在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。
在一些实施方案中，聚合物的重均分子量是至少约3000Da、至少约6000Da、至少约12,000Da或至少约24,000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量是至少约3000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量是至少约6000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量是至少约12,000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量是至少约24,000Da。
在一些实施方案中，本文描述的多于一种修饰的IL-2多肽包含多于一种第二聚合物，其中修饰的IL-2多肽的每一种包含与其共价附接的多于一种第二聚合物。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过质谱诸如MALDI-MS和ESI-MS确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过质谱确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱术诸如质谱确定的。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值是至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。
在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量是至少约3000Da、至少约6000Da、至少约12,000Da或至少约24,000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量是至少约3000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量是至少约6000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量是至少约12,000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量是至少约24,000Da。
在一些实施方案中，多于一种包括至少100种、至少1000种、至少10000种、至少100000种、至少1000000种、至少10000000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1000000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10000000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100000000种修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，多于一种包括约100种、约1000种、约10000种、约100000种、约1000000种、约10000000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1000000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10000000种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100000000种修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，多于一种包括至少1μg、至少10μg、至少100μg、至少1mg、至少10mg或至少100mg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1μg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10μg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100μg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1mg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10mg修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，多于一种包括约100mg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1μg、约10μg、约100μg、约1mg、约10mg或约100mg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1μg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10μg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100μg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1mg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10mg修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100mg修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽是线性多肽。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽被折叠。在一些实施方案中，修饰的多肽包含一个或更多个二硫键。
III.组合物
在一方面，本文描述了一种药物组合物，所述药物组合物包含：本文描述的修饰的IL-2多肽；和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含多于一种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，药物组合物还包含选自碳水化合物、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂或缓冲剂的一种或更多种赋形剂。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，药物组合物还包含碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物选自由以下组成的组：果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖山梨醇、肌肌醇、环糊精及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含无机盐。在某些实施方案中，无盐选自由以下组成的组：氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠或其组合。
在某些实施方案中，药物组合物包含抗氧化剂。在某些实施方案中，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、焦亚硫酸钾、没食子酸丙酯、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素E、3,4-二羟基苯甲酸及其组合。
在某些实施方案中，药物组合物包含表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、失水山梨醇酯、脂质、磷脂、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、EDTA、锌及其组合。
在某些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：柠檬酸、磷酸钠、磷酸钾、乙酸、乙醇胺、组氨酸、氨基酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、tris、HEPES或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于肠胃外或肠内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于静脉内或皮下施用。在一些实施方案中，药物组合物呈冻干形式。
在一方面，本文描述了一种液体或冻干组合物，所述液体或冻干组合物包含描述的修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是冻干粉末。在一些实施方案中，将冻干粉末重悬于缓冲溶液中。在一些实施方案中，缓冲溶液包含缓冲剂、糖、盐、表面活性剂或其任何组合。在一些实施方案中，缓冲溶液包含磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐是钠Na2HPO4。在一些实施方案中，盐是氯化钠。在一些实施方案中，缓冲溶液包括磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，缓冲溶液包含甘露醇。在一些实施方案中，将冻干粉末悬浮在包含10mM Na2HPO4缓冲液pH 7.5、0.022％SDS和50mg/mL甘露醇的溶液中。
剂型
本文描述的修饰的IL-2多肽可以是各种剂型。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为冻干粉末的形式给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为悬浮液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为溶液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为可注射溶液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为IV溶液给药。
IV.治疗方法
在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的如本文描述的修饰的IL-2多肽或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，实体癌症是癌或肉瘤。在一些实施方案中，实体癌症是肾癌、皮肤癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，实体癌症是转移性肾细胞癌(转移性RCC)或黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽以有效量的修饰的IL-2多肽的单剂量施用，包括另外的实施方案，其中(i)修饰的IL-2多肽被每天一次施用；或(ii)修饰的IL-2多肽在一天跨度内向试者施用多于一次。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每天一次、每隔一天一次、每周3次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周两次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每月一次、每月两次、每月3次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次或每6个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每隔一天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每隔一天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每周3次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每2周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每3周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每4周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每5周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每3天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每4天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每5天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每6天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每周两次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每周3次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每周4次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每周5次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每周6次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每月两次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每月3次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每两个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每3个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每4个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每5个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽被每6个月一次施用。
在一些实施方案中，受试者为5岁至75岁年龄。在一些实施方案中，受试者为5岁至10岁、5岁至15岁、5岁至18岁、5岁至25岁、5岁至35岁、5岁至45岁、5岁至55岁、5岁至65岁、5岁至75岁、10岁至15岁、10岁至18岁、10岁至25岁、10岁至35岁、10岁至45岁、10岁至55岁、10岁至65岁、10岁至75岁、15岁至18岁、15岁至25岁、15岁至35岁、15岁至45岁、15岁至55岁、15岁至65岁、15岁至75岁、18岁至25岁、18岁至35岁、18岁至45岁、18岁至55岁、18岁至65岁、18岁至75岁、25岁至35岁、25岁至45岁、25岁至55岁、25岁至65岁、25岁至75岁、35岁至45岁、35岁至55岁、35岁至65岁、35岁至75岁、45岁至55岁、45岁至65岁、45岁至75岁、55岁至65岁、55岁至75岁或65岁至75岁年龄。在一些实施方案中，受试者为至少5岁、10岁、15岁、18岁、25岁、35岁、45岁、55岁或65岁年龄。在一些实施方案中，受试者为至多10岁、15岁、18岁、25岁、35岁、45岁、55岁、65岁或75岁年龄。
V.制备方法
在一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-2多肽的方法。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-2多肽的方法，该方法包括合成修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段并连接所述片段。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-2多肽的方法，该方法包括a.合成修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段，b.连接所述片段；以及c.折叠所连接的片段。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表7或表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表1或表2中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段是化学合成的。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段通过固相肽合成来合成。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段在自动化肽合成仪上合成。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽连接自2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种肽片段。在一些实施方案中，修饰的肽连接自2种肽片段。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽连接自3种肽片段。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽连接自4种肽片段。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽连接自2种至10种肽片段。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段被连接在一起。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的三种或更多种片段以顺序方式连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的三种或更多种片段以一锅反应连接。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽连接自肽片段。在一些实施方案中，肽片段被连接，使得选自残基40/41、残基70/71或残基103/104的至少一对残基之间的键在连接反应中形成。在一些实施方案中，肽片段被连接，使得残基103与104之间的键在连接反应中形成。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽连接自包含修饰的IL-2多肽的残基104-135的片段。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基F42Y处共价附接的第一聚合物。
在一些实施方案中，连接的片段被折叠。在一些实施方案中，折叠包括在修饰的IL-2多肽内形成一个或更多个二硫键。在一些实施方案中，连接的片段经历折叠过程。在一些实施方案中，连接的片段使用本领域熟知的方法折叠。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过在其上附接一种或更多种聚合物被进一步修饰。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过PEG化被进一步修饰。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是合成的。
VI.SEQ ID
表7
Figure BDA0003840274770000881
Figure BDA0003840274770000891
Figure BDA0003840274770000901
在以上表7中，Nle是正亮氨酸残基，并且Hse是高丝氨酸残基。
尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但应当理解，本文可以进行各种变化、替代和改变，而不偏离如所附权利要求书中限定的本公开内容的精神和范围。
本公开内容在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅为了说明目的而提供，并不意图以任何方式限制本公开内容。
实施例
实施例1-修饰IL-2多肽的合成
具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的修饰的IL-2多肽通过连接使用固相肽合成(SPPS)合成的单独的肽来合成。单独的肽使用下文描述的方法在自动化肽合成仪上合成。
商业上可得的试剂从Sigma-Aldrich、Acros、Merck或TCI Europe购买，并且不经进一步纯化而使用。用于固相肽合成的具有合适侧链保护基团的Fmoc氨基酸从Novabiochem、Christof Senn Laboratories AG或PeptART购买，并将其按供应使用。用于肽合成的聚乙二醇衍生物由PolyPure购买。来自Sigma Aldrich的HPLC级CH3CN用于分析型和制备型HPLC纯化。
肽和蛋白的高分辨率质谱(FTMS)使用4-羟基-α-氰基肉桂酸(HCCA)作为基质在配有双ESI/MALDI-FTICR源的Bruker solariX(9.4T磁体)上测量。CD光谱用具有光程长为1.0mm的池的Jasco J-715光谱仪记录。在以下连续扫描模式在25℃收集光谱：标准灵敏度(100mdeg)，0.5nm数据间距(data pitch)，50nm/min扫描速度，1nm带宽和5次积累。
肽和蛋白片段通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析和纯化。肽分析和反应监测在具有双泵、混合器和在线脱气器(in-line degasser)、自动进样器、可变波长UV检测器(在220nm和254nm处同时监测洗脱液)和装有100μL注射环的注射器的分析型Jasco仪器上进行。肽片段的纯化在具有20mL注射环的Gilson制备型仪器上进行。在这两种情况下，流动相是含有0.1％TFA的MilliQ-H2O(缓冲液A)和含有0.1％TFA的HPLC级CH3CN(缓冲液B)。分析型HPLC在bioZenTMIntact C4柱(3.6μm,150×4.6mm)或Shiseido Capcell Pak MG III柱(5μm,150×4.6mm)上以1mL/min的流量进行。制备型HPLC在Shiseido Capcell Pak UG80C18柱(5μm,50mm I.D.×250mm)上以40mL/min的流量进行。
使用Fmoc SPPS化学在Syro I或CS Bio 136X肽合成仪上合成肽区段。使用以下具有侧链保护基团的Fmoc氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(1-Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。在必要时将Fmoc-假脯氨酸二肽掺入合成。Fmoc脱保护用DMF中的20％哌啶进行(2×8min)，并在304nm处通过UV以反馈回路监测以确保完全Fmoc去除。用Fmoc-氨基酸(3.0-5.0当量，相对于树脂取代)、作为偶联剂的HCTU或HATU(2.9-4.9当量)、以及在DMF中的DIPEA或NMM(6-10当量)在室温或50℃进行偶联。预活化3min之后，将溶液转移并允许与树脂上的肽反应30min或2h，取决于氨基酸。在一些情况下，需要双偶联。偶联之后，将树脂用DMF中的20％乙酸酐处理，用于对任何未反应的游离胺加帽。在需要时进行LiCl洗涤。烯丙基酯脱保护使用苯基硅烷(24当量)和四(三苯基膦)钯(0)(0.5当量)在无水二氯甲烷中进行。
通过SPPS进行的肽区段合成通过对相应树脂进行微裂解和分析来监测。使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O(在α酮酸树脂上合成的α酮酸区段)或95:2.5:2.5TFA:TIPS:H2O(在2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂上合成的肽)的混合物将肽从树脂裂解，持续2小时。滤去树脂，并将滤液蒸发，并用冷乙醚处理，研磨并离心。仔细地倾析乙醚层，并将剩余物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次。
1.1组合物D IL-2变体的合成
IL-2(1-39)-Leu-α-酮酸的合成
Figure BDA0003840274770000921
IL2(1-39)-Leu-α-酮酸(参见SEQ ID NO:3)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量(substitution capacity)的保护的Fmoc-α-Leu-酮酸的Rink-酰胺树脂上合成。为此，将Fmoc-Rink酰胺MBHA树脂(4g)在DMF中预溶胀15min，并进行Fmoc-脱保护。将Fmoc-亮氨酸-保护的-α-酮酸(795mg，1mmol，1.00当量)溶解在40mL DMF中，并用HATU(361mg，0.95mmol，0.95当量)和DIPEA(348μL，2mmol，2.00当量)预活化。允许偶联在室温进行6h。然后，对树脂加帽，随后进行Fmoc-脱保护。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS在0.250mmol规模上进行该区段的合成直到Ala1。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(1-39)的纯化：使用Shiseido capcellpak C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的30％至80％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集(pool)并冻干以获得650mg纯的IL2(1-39)-Leu-α-酮酸(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为69％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C204H346N56O61[M]，计算的m/z：4556.5694；测量的m/z：4556.5783。
组合物D的Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸的合成
Figure BDA0003840274770000931
Opr-IL2(42–69)(参见SEQ ID NO:3)光保护的-Leu-α-酮酸在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸的Rink酰胺MBHA树脂上制备。为此，将4g Fmoc-Rink酰胺MBHA树脂用DMF溶胀15min，并进行Fmoc-脱保护。将Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸(795mg，1mmol，1.00当量)溶解在40mL DMF中，并用HATU(361mg，0.95mmol，0.95当量)和DIPEA(348μL，2mmol，2.00当量)预活化。将反应在室温搅拌6h。然后，对树脂加帽，随后进行Fmoc-脱保护。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS在0.151mmol规模上进行该区段的合成直到Nle46。Cys(Acm)-OH(10当量，相对于树脂)用于使用DIC(5当量，相对于树脂)通过对称酸酐方法进行Cys58的偶联，在rt持续2h。预形成的氨基酸Fmoc-Tyr(Ac0.5kDaPEG)-OH(3当量)使用HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)通过单偶联在位置45中被偶联。Phe44和Lys43通过自动化SPPS偶联，随后在位置42和位置41中分别手动偶联Fmoc Tyr-烯丙基乙酸酯(结构5)和Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸。烯丙基酯脱保护遵循建立的标准条件使用苯基硅烷(449μL，3.6mmol，24当量)和Pd(Ph3)4(87mg，0.075mmol，0.5当量)在rt进行，持续30min。脱保护之后，O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)九乙二醇(结构7)(237mg，0.450mmol，3当量)在50℃偶联1.5h。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。使用冷醚:戊烷混合物(1:1)来处理和洗涤粗肽。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(42–69)的纯化：使用Shiseido capcell pak C18柱(50×250mm)，以两步骤梯度：首先，在5min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的10％至30％CH3CN，然后，在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至60％CH3CN。将纯的产物级分汇集并冻干以获得117.4mg纯的IL2(42–69)(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为16％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C230H376N46O74S[M]，计算的m/z：4998.6794；测量的m/z：4998.6749。
组合物D的Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-酮酸的合成
Figure BDA0003840274770000941
Fmoc-Opr IL2(72–102)-苯丙氨酸-α-酮酸在预先装载具有～0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink酰胺ChemMatrix树脂上合成。使用HCTU作为偶联试剂，通过自动化Fmoc SPPS在0.588mmol规模上进行合成直到Ala73。残基72(Fmoc-Leu)的偶联用HATU作为偶联试剂来进行。将偶联在45℃重复另外两次，以确保完全偶联。在rt使用HATU(2.95当量，相对于树脂)和NMM(6.00当量，相对于树脂)将Fmoc-5-氧杂脯氨酸(3.00当量，相对于树脂)手动偶联至游离胺，持续2h。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续2h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2.0h。通过以下制备型HPLC进行粗区段的纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的20％至75％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集并冻干以获得>98％纯度的Fmoc-Opr IL2(72–102)-Phe-α-酮酸(147.9mg，对于合成、裂解和纯化步骤，收率为6％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C184H285N47O53[M]，计算的m/z：4001.1051；测量的m/z：4001.1227。
OPR-IL2(105-133)的合成
Figure BDA0003840274770000942
Figure BDA0003840274770000951
Opr-IL2(105-133)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Thr-OH的2-氯三苯甲基-树脂上合成。加帽(二异丙基乙胺、甲醇)之后，通过自动化Fmoc SPPS在0.34mmol规模(1.5g树脂)上进行合成，直到Glu106。Cys(Acm)-OH(10当量，相对于树脂)用于使用DIC(5当量，相对于树脂)通过对称酸酐方法进行Cys105的偶联，在rt持续2h。然后，使用HATU(1.95当量)和NMM(4当量)将Boc-5-氧杂脯氨酸(2.00当量)偶联至树脂上的游离胺。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:TIPS:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。使用95:2.5:2.5TFA:TIPS:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2.0h。通过以下制备型HPLC进行粗Opr-IL2(105-133)的纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak C4柱(50×250mm)，以在10min内含有0.1％TFA的10％至65％CH3CN，然后在20min内含有0.1％TFA的65％至95％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集并冻干以获得>98％纯度的Opr-IL2(105-133)(108.5mg，对于合成、裂解和纯化步骤，收率为9％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C158H242N37O52S[M+H]，计算的m/z：3521.7145；测量的m/z：3521.7140。
通过KAHA连接合成组合物D的IL2-Seg12
Figure BDA0003840274770000952
KAHA连接：将Seg1(44mg，9.6μmol，1.2当量)和Seg2(40mg，8.0μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(400μL，20mM)，并允许在60℃反应20h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.6mm)，以含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内5％至95％CH3CN的梯度。
光-脱保护和纯化：连接完成之后，将混合物用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O(1:1)稀释～20倍(8mL)，并在365nm波长处辐照1h。光解反应的完成通过使用先前描述方法将样品注射到uHPLC上来确认。光脱保护的样品通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以2步骤梯度：含有0.1％TFA的在水中的CH3CN的双梯度(在5min内10％至35％，然后在35min内35％至65％)，以40mL/min的流量，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的Seg12(25.4mg，对于连接和纯化步骤，收率为40％)。对于C422H709N101O130S[M]，计算的m/z：9304.1694；测量的m/z：9304.1639。
用于通过KAHA连接制备组合物D的IL2-Seg34的KAHA连接
Figure BDA0003840274770000961
连接：将Seg3(136mg，34μmol，1.2当量)和Seg4(100mg，28.40μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)中(1.8mL，15mM)，并允许在60℃反应16h。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.56mm)，使用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内30％至70％CH3CN的梯度。
Fmoc脱保护和纯化：连接完成之后，将反应混合物用DMSO(6mL)稀释，添加5％二乙胺(300μL)并将反应混合物在室温振荡7min。为制备纯化样品，将其用含有TFA(300μL)的DMSO(4mL)稀释。
通过以下制备型HPLC纯化样品：保持在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)上，使用在35min内含有0.1％TFA的在水中的30％至70％CH3CN的梯度，以40mL/min的流量。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的BPT-143-Seg34(43.4mg，连接纯化之后，收率为21％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C326H516N84O101S[M]，计算的m/z：7255.7545；测量的m/z：7255.7653。
用于通过KAHA连接制备IL2线性蛋白组合物D的最终KAHA连接
连接：将Seg12(59.2mg，6.35μmol，1.2当量)和Seg34(38.5mg，5.3μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)(423μL，15mM)中，并允许连接在60℃进行24h。通过以下分析型HPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(250×4.6mm)，并且含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在14min内30％至95％CH3CN的梯度。
纯化：连接完成之后，将反应混合物用150μL DMSO稀释，随后用含有0.1％TFA的(1:1)CH3CN:H2O混合物(7mL)进一步稀释。样品通过注射到以下制备型HPLC上进行纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以2步骤梯度：在5min内10％至40％，以及在35min内40％至80％，流量：40mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的具有Acm的BPT-143线性蛋白(42.3mg，对于连接和纯化步骤，收率为48％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C747H1225N185O229S2[M]，计算的m/z：16515.9340；测量的m/z：16515.9008。
Acm脱保护：将具有Acm的肽IL2线性蛋白(35.4mg，2.14μmol)溶解在AcOH/H2O(1:1)中(8.6mL，0.25mM)，并向溶液中添加86mg AgOAc(1％m/v)。将混合物在50℃避光振荡2.5h。反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用含有0.1％TFA的CH3CN:H2O(1:1)稀释，并通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapCell Pak UG80 C18柱(20×250mm)。使用2步骤梯度进行纯化：在5min内10％至40％，以及在30min内40％至95％，流量：10mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的IL2线性蛋白(26.1mg，对于脱保护和纯化步骤，收率为74％)。对于C741H1215N183O227S2[M]，计算的m/z：16373.8597；测量的m/z：16373.8253。
折叠的IL-2组合物D的合成
Figure BDA0003840274770000981
线性蛋白的重排：将线性蛋白(20mg，1.221μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(81mL，15μM蛋白浓度)，将其用6M HCl水溶液调节至pH 8.0。将混合物在50℃温和地振荡2h，并通过以下分析型反相HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至95％CH3CN的梯度，流量：1.0mL/min。
线性重排蛋白的折叠：将先前的溶液冷却至室温，并用含有0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的第二缓冲溶液(240mL)稀释3倍。将混合物储存在室温，并通过以下分析型HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至～pH 3，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido ProteonaviC4柱(20×250mm)，以在60min内含有0.1％TFA的5％至40％至95％乙腈的两步骤梯度，流量：10.0mL/min。将包含折叠的IL2蛋白的级分汇集在一起并冻干。纯的折叠的蛋白(3.5mg，收率为18％)的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和高分辨率ESI质谱进一步确认。对于C741H1213N183O227S2[M]，计算的m/z：16371.8441；测量的m/z：16371.8107。
折叠的组合物D IL2变体的PEG化修饰
将折叠的蛋白IL2(3.5mg)通过与30kDa的DBCO-聚乙二醇聚合物反应进一步修饰。将折叠的蛋白IL2溶解在CH3CN:H2O溶液(1:1)中(50μM蛋白浓度)，并添加DBCO-PEG30k(20.1mg，3当量)。将反应物在25℃温和地混合20h，使用以下分析型HPLC监测进展：用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，使用在18min内含有0.1％TFA的在水中的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将反应混合物用(1:1)CH3CN/H2O+0.1％TFA稀释，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido Proteonavi C4柱(20×250mm)，以在60min内含有0.1％TFA的5％至40％至95％乙腈的两步骤梯度，流量：10.0mL/min。将包含聚乙二醇化IL2蛋白的级分汇集在一起并冻干过夜以获得5.2mg聚乙二醇化IL2蛋白(对于聚乙二醇化和纯化步骤，收率为53％)。纯的折叠的蛋白的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和MALDI-TOF进一步确认。最终的蛋白通过SEC-HPLC和CD进一步表征。观察到纯化的组合物D以单峰从RP-HPLC洗脱，保留时间为约8min。参见图12A，其在Y轴上示出了组合物D或未PEG化前体的吸光度并且在X轴上示出了保留时间。还通过MALDI-TOF观察到纯化的组合物D具有大约47600Da的分子量。参见图12B，其在Y轴上示出了纯化的PEG化组合物D的总离子计数并且在在X轴上示出了分子量。修饰的IL-2多肽还通过圆二色性光谱进行分析。所得的CD光谱显示出折叠良好的白细胞介素-2蛋白的特征峰，这指示组合物D以与野生型IL-2类似的方式折叠。参见图12C，其示出了偏振光波长(x轴)与组合物A的吸光度(y轴)。
1.2组合物A IL-2变体的合成
对于该变体，除了区段2之外，所有其他区段都与用于组合物A的Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸的组合物合成的区段相同
Figure BDA0003840274770000991
遵循合成组合物D的对应步骤中描述的程序，在位置42和位置45处具有修饰的Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸区段(参见SEQ ID NO:3)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸的Rink酰胺MBHA树脂上制备。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS在0.129mmol规模上进行该区段的合成直到Nle46。
携带O-烯丙基酯官能团(functionality)的修饰的Fmoc-酪氨酸衍生物(结构5)(3当量)使用HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)通过单偶联在位置45和位置42中被偶联。Phe44和Lys43通过自动化SPPS进行偶联，随后在位置41中手动偶联Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸。遵循合成组合物D的对应步骤中描述的建立的标准条件进行烯丙基酯脱保护。脱保护之后，O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(Boc-氨基)乙基]八乙二醇(结构6)(359mg，0.645mmol，5当量)在50℃偶联1.5h。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。
遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(42–69)的纯化：使用Shiseido capcell pak C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至65％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集并冻干以获得100.7mg纯的IL2(42–69)(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为16％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C228H374N44O73S[M]，计算的m/z：4928.6627；测量的m/z：4928.6781。
通过KAHA连接合成组合物A的IL2-Seg12
Figure BDA0003840274770001001
KAHA连接：将Seg1(64.4mg，14.1μmol，1.2当量)和在42和45处具有修饰的酪氨酸的Seg2(58.0mg，11.8μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(587μL，20mM)，并允许在60℃反应20h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.6mm)，以含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内20％至95％CH3CN的梯度。
光-脱保护和纯化：连接完成之后，将混合物用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O(1:1)稀释～20倍(8mL)，并在365nm波长处辐照1h。光解反应的完成通过使用先前描述方法将样品注射到uHPLC上来确认。通过以下制备型HPLC纯化光脱保护的样品：使用保持在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以在35min内含有0.1％TFA的在水中的30％至70％CH3CN的梯度，以40mL/min的流量，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到组合物A的纯的Seg12(57.4mg，对于连接和纯化步骤，收率为53％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C420H707N99O129S[M]，计算的m/z：9234.1527；测量的m/z：9234.1734。
用于制备IL2变体组合物A线性蛋白的最终KAHA连接
Figure BDA0003840274770001011
连接：将组合物A的Seg12(65.4mg，7.08μmol，1.2当量)和Seg34(42.8mg，5.89μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)中(364μL，16mM)，并允许连接在60℃进行24h。通过以下分析型HPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Shiseido Capcell PakUG80 C18柱(250×4.6mm)，并且含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在14min内30％至95％CH3CN的梯度。
纯化：连接完成之后，将反应混合物用300μL DMSO稀释，随后用含有0.1％TFA的(1:1)CH3CN:H2O混合物(9mL)进一步稀释。样品通过注射到以下制备型HPLC上进行纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至85％CH3CN的梯度，流量：40mL/min。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的具有Acm的线性蛋白(53.6mg，对于连接和纯化步骤，收率为55％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C745H1223N183O228S2[M]，计算的m/z：16454.9418；测量的m/z：16454.9604。
Acm脱保护：将具有Acm的组合物A的IL2线性蛋白(53.6mg，3.30μmol)溶解在AcOH/H2O(1:1)中(13mL，0.25mM)，并向溶液中添加130mg AgOAc(1％m/v)。将混合物在50℃避光振荡2.5h。反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用含有0.1％TFA的CH3CN:H2O(1:1)稀释，并通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapCell Pak UG80 C18柱(20×250mm)。使用2步骤梯度进行纯化：在5min内10％至30％，以及在20min内30％至85％，流量：10mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的IL2线性蛋白(22.8mg，对于脱保护和纯化步骤，收率为52％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C739H1213N181O226S2[M+1]，计算的m/z：16312.8676；测量的m/z：16312.6032。
折叠的IL2-变体组合物A的制备
Figure BDA0003840274770001021
线性蛋白的重排：将线性蛋白(22.8mg，1.39μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gnd·HCl水溶液中(93.2mL，15μM蛋白浓度)，将其用6M HCl水溶液调节至pH 8.0。将混合物在50℃温和地振荡3h，并通过以下分析型反相HPLC进行监测：使用在25℃的ProteonAvi C4柱(250×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至95％CH3CN的梯度，流量：1.0mL/min。
线性重排蛋白的折叠：将来自以上的折叠溶液冷却至室温，并用含有0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的第二缓冲溶液(186.4mL)稀释3倍。将混合物储存在室温，并通过以下分析型HPLC进行监测：使用在25℃的ProteonAvi C4柱(250×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至～pH 3，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido ProteonAviC4柱(20×250mm)，以在60min内含有0.1％TFA的5％至40％至95％乙腈的两步骤梯度，流量：10.0mL/min。将包含折叠的IL2蛋白的级分汇集并冻干。纯的折叠的蛋白(5.7mg，收率为25％)的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和高分辨率ESI质谱进一步确认。对于C739H1211N181O226S2，计算的m/z：16310.8519；测量的m/z：16310.8763。观察到纯化的组合物A以单峰从RP-HPLC洗脱，保留时间为约19min。参见图13，其在Y轴上示出了组合物D或未折叠的前体的吸光度并且在X轴上示出了保留时间。还通过ESI-HRMS观察到纯化的组合物A具有大约16300Da的分子量，具有紧密的分子量分布。参见图2B，其在Y轴上示出了纯化的折叠的组合物A的总离子计数并且在X轴上示出了分子量。
1.3组合物H IL-2变体的合成
对于该变体，除了区段1之外，所有其他区段都与用于组合物A的区段相同。
组合物H的IL2(1-39)-Leu-α-酮酸的合成
Figure BDA0003840274770001031
Figure BDA0003840274770001041
遵循用于组合物D的对应步骤中描述的程序，IL2(1-39)-Leu-α-酮酸(参见SEQ IDNO:3)在预先装载具有0.25mmol/g取代量的保护的Fmoc-α-Leu-酮酸的Rink酰胺树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS在0.270mmol规模上进行该区段的合成直到Ala1。
N末端通过顺序偶联2x Fmoc-氨基-3,6-二氧杂辛酸、3x Fmoc-Lys(Fmoc)和8xFmoc-NH-(PEG)27-COOH来延伸。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测偶联的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。
合成完成后，遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(1-39)的纯化：使用Shiseido capcell pak C18柱(50×250mm)，以在20min内含有0.1％TFA的20％至80％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集并冻干以获得369mg纯的IL2(1-39)-Leu-α-酮酸(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为9％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C714H1348N72O306，计算的m/z：15838.2412；测量的m/z：15838.2420。
通过KAHA连接合成组合物H的IL2-Seg12
KAHA连接：将组合物H的Seg1(55.2mg，3.48μmol，1.2当量)和Seg2(15.6mg，3.17μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(174μL，20mM)，并允许在60℃反应20h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.6mm)，以含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内20％至95％CH3CN的梯度。
光-脱保护和纯化：连接完成之后，将混合物用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O(1:1)稀释～20倍(8mL)，并在365nm波长处辐照1h。光解反应的完成通过使用先前描述方法将样品注射到uHPLC上来确认。通过以下制备型HPLC纯化光脱保护的样品：使用保持在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的在水中的30％至75％CH3CN的梯度，以40mL/min的流量，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到组合物H的纯的Seg12(16.8mg，对于连接和纯化步骤，收率为26％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C930H1709N115O374S，计算的m/z：20518.8328；测量的m/z：20518.8115。
用于制备IL2变体组合物H线性蛋白的最终KAHA连接
Figure BDA0003840274770001051
连接：将组合物H的Seg12(16.8mg，0.82μmol，1.2当量)和Seg34(5.4mg，0.74μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)中(54.6μL，15mM)，并允许连接在60℃进行24h。通过以下分析型HPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Shiseido Capcell PakUG80 C18柱(250×4.6mm)，并且含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在14min内30％至95％CH3CN的梯度。
Acm脱保护和纯化：连接完成之后，将反应混合物用55μL DMSO稀释，随后用(1:1)AcOH:H2O混合物(2mL)进一步稀释。向溶液添加20.5mg AgOAc(1％W/V)，并将混合物在50℃避光温和地振荡2.5h。反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用含有0.1％TFA的CH3CN:H2O(1:1)稀释，并通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapCell PakUG80 C18柱(20×250mm)，以在28min内30％至85％CH3CN的梯度，流量：10mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的还原的组合物H的IL2线性蛋白(3.5mg，对于连接、Acm脱保护和纯化步骤，收率为17％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和身份。对于C1249H2215N197O471S2，计算的m/z：27592.5341；测量的m/z：27592.2328。
折叠的组合物H IL-2变体的合成
Figure BDA0003840274770001061
线性蛋白的重排：将线性蛋白(3.5mg，0.13μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(8.4mL，15μM蛋白浓度)，将其用6M HCl水溶液调节至pH 8.0。将混合物在50℃温和地振荡2h，并通过以下分析型反相HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至95％CH3CN的梯度，流量：1.0mL/min。
线性重排蛋白的折叠：将来自以上的折叠溶液冷却至室温，并用含有0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的第二缓冲溶液(17mL)稀释3倍。将混合物储存在室温，并通过以下分析型HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至～pH 3，并在以下制备型HPLC上纯化：使用ShiseidoProteonAvi C4柱(20×250mm)，以在60min内含有0.1％TFA的5％至40％至95％乙腈的两步骤梯度，流量：10.0mL/min。将包含折叠的IL2组合物H变体的级分汇集在一起并冻干。纯的折叠的蛋白的纯度和身份(0.4mg，收率为11％)通过分析型RP-HPLC、MALDI-TOF质谱和CD光谱以及其他方法进一步确认。观察到纯化的组合物H以单峰从RP-HPLC洗脱，保留时间为约5.5min。参见图14A，其在Y轴上示出了组合物H或未折叠的前体的吸光度与在X轴上示出了保留时间。还通过MALDI-TOF观察到纯化的组合物H具有大约27650Da的分子量，具有紧密的分子量分布。参见图14B，其在Y轴上示出了纯化的折叠的组合物H的总离子计数与在X轴上示出了分子量。
1.4组合物M IL-2变体的合成
对于该变体，除了区段2之外，所有其他区段都与用于组合物D的区段相同。
Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸(组合物M的区段2)的合成
Figure BDA0003840274770001071
遵循合成组合物D的对应步骤中描述的程序，Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸区段(参见SEQ ID NO:3)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸的Rink酰胺MBHA树脂上制备。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化FmocSPPS在0.2mmol规模上进行该区段的合成直到Nle46。
携带O-烯丙基酯的Fmoc-酪氨酸衍生物(结构5)使用HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)通过单偶联在位置45中被偶联。Phe44和Lys43通过自动化SPPS进行偶联，随后在位置42和位置41中分别手动偶联携带期望的PEG8-氨基官能团和Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸的Fmoc-酪氨酸衍生物。遵循合成组合物D的对应步骤中描述的条件进行烯丙基酯脱保护。脱保护之后，O-[2-(烯丙氧羰基(alloc)-氨基)乙基]-O-[2-氨基-乙基]八乙二醇(结构8)(216.2mg,0.400mmol，2当量)在室温偶联2h。然后重复烯丙基酯脱保护，随后顺序偶联3x Fmoc-Lys(Fmoc)和4x Fmoc-NH-(PEG)27-COOH。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。在确认完全偶联后，进行Fmoc基团脱保护和乙酰化。
遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5 TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(42–69)的纯化：使用Shiseido Capcell Pak C18柱(50×250mm)，以两步骤梯度：以在10min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的10％至40％CH3CN开始，然后，在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的40％至60％CH3CN。将纯的产物级分汇集并冻干以获得110.6mg纯的IL2(42–69)(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为5.2％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C490H886N54O196S，计算的m/z：10702.0925；测量的m/z：10702.0844。
通过KAHA连接合成组合物M变体的IL2-Seg12
Figure BDA0003840274770001081
KAHA连接：将Seg1(11.6mg，2.55μmol，1.2当量)和组合物M的Seg2(22.7mg，2.12μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(128μL，20mM)，并允许在60℃反应22h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.6mm)，以含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内30％至70％CH3CN的梯度。
光-脱保护和纯化：连接完成之后，将混合物用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O(1:1)稀释(8mL)，并在365nm波长处辐照1h。光解反应的完成通过使用先前描述方法将样品注射到uHPLC上来确认。通过以下制备型HPLC纯化光脱保护的样品：使用保持在60℃的ShiseidoCapcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以两步骤梯度；首先，在10min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的10％至40％CH3CN，然后，在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的40％至70％CH3CN。将包含产物的级分汇集并冻干以得到组合物M的纯的Seg12(10.7mg，对于连接和纯化步骤，收率为34％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C682H1219N109O252S，计算的m/z：15009.5881；测量的m/z：15009.9979。
用于制备IL2变体组合物M线性蛋白的最终KAHA连接
连接：将组合物M的Seg12(12.5mg，0.83μmol，1.1当量)和Seg34(5.5mg，0.69μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)中(55.0μL，15mM)，并允许连接在60℃进行24h。通过以下分析型HPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Shiseido Capcell PakUG80 C18柱(250×4.6mm)，并且含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内30％至95％CH3CN的梯度。
Acm脱保护和纯化：连接完成之后，将反应混合物用55μL DMSO稀释，随后用(1:1)AcOH:H2O混合物(3.2mL)进一步稀释。向溶液添加33mg AgOAc(1％W/V)，并将混合物在50℃避光温和地振荡2.5h。反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用含有0.1％TFA的CH3CN:H2O(1:1)稀释，并通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapCell PakUG80 C18柱(20×250mm)，以在28min内30％至85％CH3CN的梯度，流量：10mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的组合物M的IL2线性蛋白(3.1mg，对于连接、脱保护和纯化步骤，收率为20％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C1001H1725N191O349S2，计算的m/z：22084.2921；测量的m/z：22084.9738。
折叠的IL2-变体组合物M的制备
Figure BDA0003840274770001091
Figure BDA0003840274770001101
线性蛋白的重排：将线性蛋白(3.1mg，0.14μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(9.4mL，15μM蛋白浓度)，将其用6M HCl水溶液调节至pH 8.0。将混合物在50℃温和地振荡2h，并通过以下分析型反相HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至95％CH3CN的梯度，流量：1.0mL/min。
线性重排蛋白的折叠：将折叠溶液冷却至室温，并用含有0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的第二缓冲溶液(18.7mL)稀释3倍。将混合物储存在室温，并通过以下分析型HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至～pH 3，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido ProteonaviC4柱(10×250mm)，以在40min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：5mL/min。将包含折叠的IL2蛋白的级分汇集在一起并冻干。纯的折叠的蛋白(0.87mg，收率为28％)的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和高分辨率ESI质谱进一步确认。对于C1001H1723N191O349S2[M]，计算的m/z：22082.2765；测量的m/z：22082.2618。3D结构使用CD光谱来确定。
1.5组合物N IL-2变体的合成
对于该变体，除了区段2之外，所有其他区段都与用于组合物D的区段相同。
组合物N的Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸的合成
Figure BDA0003840274770001102
Figure BDA0003840274770001111
遵循合成组合物D的对应部分中描述的程序，Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸区段(参见SEQ ID NO:3)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸的Rink酰胺MBHA树脂上制备。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化FmocSPPS在0.112mmol规模上进行该区段的合成直到Nle46。
携带期望的PEG8-氨基基团的Fmoc-酪氨酸衍生物(2当量)使用HATU(1.9当量)和DIPEA(4当量)通过单偶联在位置45中被偶联。Phe44和Lys43通过自动化SPPS进行偶联，随后在位置42和位置41中分别手动偶联携带O-烯丙基官能团的Fmoc Tyr衍生物(结构5)和Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸。遵循合成组合物D的对应步骤中描述的条件进行烯丙基酯脱保护。脱保护之后，O-[2-(烯丙氧羰基-氨基)乙基]-O-[2-氨基-乙基]八乙二醇(结构8)(182mg,0.336mmol，2当量)在室温偶联2h。然后重复烯丙基酯脱保护，随后顺序偶联3x Fmoc-Lys(Fmoc)和4x Fmoc-NH-(PEG)27-COOH。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。在确认完全偶联后，进行Fmoc基团脱保护和乙酰化。
遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(42–69)的纯化：使用Shiseido capcell pak C18柱(50×250mm)，以两步骤梯度：首先，在10min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的10％至40％CH3CN，然后，在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的40％至60％CH3CN。将纯的产物级分汇集并冻干以获得38.6mg纯的IL2(42–69)(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为3.2％)。使用分析型HPLC和MALDI-TOF确认产物的纯度和精确质量。对于C490H886N54O196S，计算的m/z：10702.7；测量的m/z：10702.8。
通过KAHA连接合成组合物N的IL2 Seg12
Figure BDA0003840274770001121
KAHA连接：将Seg1(21.3mg，4.70μmol，1.3当量)和组合物N的Seg2(38.6mg，3.61μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(235μL，20mM)，并允许在60℃反应22h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.6mm)，以含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内30％至70％CH3CN的梯度。
光-脱保护和纯化：连接完成之后，将混合物用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O(1:1)稀释～20倍(8mL)，并在365nm波长处辐照1h。光解反应的完成通过使用先前描述方法将样品注射到uHPLC上来确认。通过以下制备型HPLC纯化光脱保护的样品：使用保持在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以两步骤梯度；首先，在7min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的10％至40％CH3CN，然后，在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的40％至70％CH3CN。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的Seg12(13.4mg，对于连接和纯化步骤，收率为25％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C682H1219N109O252S，计算的m/z：15009.5881；测量的m/z：15009.5902。
用于制备IL2变体组合物N线性蛋白的最终KAHA连接
Figure BDA0003840274770001122
Figure BDA0003840274770001131
连接：将组合物N的Seg12(13.4mg，0.89μmol，1.1当量)和Seg34(5.9mg，0.81μmol，1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)中(59.3μL，15mM)，并允许连接在60℃进行24h。通过以下分析型HPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Shiseido Capcell PakUG80 C18柱(250×4.6mm)，并且含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内30％至95％CH3CN的梯度。
Acm脱保护和纯化：连接完成之后，将反应混合物用60μL DMSO稀释，随后用(1:1)AcOH:H2O混合物(3.1mL)进一步稀释。向溶液添加31mg AgOAc(1％W/V)，并在50℃振荡2.5h并且避光。反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用含有0.1％TFA的CH3CN:H2O(1:1)稀释，并通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapCell Pak UG80 C18柱(20×250mm)，以两步骤梯度：首先，在5min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的10％至40％CH3CN，然后，在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的40％至85％CH3CN，流量：10mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的IL2线性蛋白(4.4mg，对于连接、脱保护和纯化步骤，收率为25％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C1001H1725N191O349S2，计算的m/z：22084.2921；测量的m/z：22084.3234。
折叠的IL2-变体组合物N的制备
Figure BDA0003840274770001132
线性蛋白的重排：将线性蛋白(4.4mg，0.20μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(13.3mL，15μM蛋白浓度)，将其用6M HCl水溶液调节至pH 8.0。将混合物在50℃温和地振荡2h，并通过以下分析型反相HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至95％CH3CN的梯度，流量：1.0mL/min。
线性重排蛋白的折叠：将先前的溶液冷却至室温，并用含有0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的第二缓冲溶液(26.6mL)稀释3倍。将混合物储存在室温，并通过以下分析型HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至～pH 3，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido ProteonaviC4柱(10×250mm)，以在40min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：5mL/min。将包含折叠的IL2蛋白的级分汇集在一起并冻干。纯的折叠的蛋白(1.1mg，收率为25％)的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和高分辨率ESI质谱进一步确认。对于C1001H1723N191O349S2，计算的m/z：22082.2765；测量的m/z：22082.2603。
实施例2-组合物A、组合物B、组合物C和组合物D的结构
本文提供了修饰的IL-2多肽(组合物A)的图解。参见图1A。组合物A具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列。修饰的IL-2多肽的二级、三级和四级结构与野生型IL-2几乎相同。
与野生型IL-2相比，组合物A的修饰的IL-2多肽包含多于一种化学修饰。组合物A的一种修饰是与F42Y残基缀合的单分散PEG。在本实施例中，与F42Y残基缀合的PEG是具有～500Da分子量的单分散PEG。蛋白的第二种修饰是在Y45残基处缀合的单分散PEG。该PEG与Y42残基的PEG相同，也具有～500Da分子量。
本文还提供了另一种修饰的IL-2多肽(组合物B)的结构。参见图1B。与组合物A相比，组合物B还包含N末端处的修饰。该修饰包含附接在N末端处的具有式(IIa)结构的聚合物，并且该聚合物的Mw为约6kDa。如式(IIa)中示出的，所附接的聚合物包含四个线性PEG链，每个链包含约26个PEG单元。
Figure BDA0003840274770001151
本文还提供了修饰的IL-2多肽组合物C的结构。参见图1C。与组合物A相比，组合物C包含与残基45上的短PEG聚合物末端附接的30kDa PEG官能团。任选地，该30kDA PEG官能团通过无铜点击化学反应的方式与短PEG聚合物共价附接。本文还提供了修饰的IL-2，该修饰的IL-2具有将无铜点击化学试剂与PEG基团附接的替代接头基团，如图1E中示出的。本文还提供了修饰的IL-2多肽的结构，该修饰的IL-2多肽显示具有点击化学试剂的反向取向用于形成缀合物(例如，组合物C，具有PEG聚合物上的叠氮化物官能团和与IL-2多肽部分附接的炔烃部分)。本文还提供了修饰的IL-2，该修饰的IL-2在与残基Y45附接的PEG间隔物的末端处包含叠氮化物官能团，如图1G中示出的。
本文还提供了修饰的IL-2多肽组合物D的结构。参见图1D。与组合物A相比，组合物D包含与残基Y42上的短PEG聚合物末端附接的30kDa PEG官能团。任选地，该30kDA PEG官能团通过无铜点击化学反应的方式与短PEG聚合物共价附接。本文还提供了修饰的IL-2，该修饰的IL-2具有将无铜点击化学试剂与PEG基团附接的替代接头基团，如图1F中示出的。本文还提供了修饰的IL-2多肽的结构，该修饰的IL-2多肽显示具有点击化学试剂的反向取向用于形成缀合物(例如，组合物D，具有PEG聚合物上的叠氮化物官能团和与IL-2多肽部分附接的炔烃部分)。本文还提供了修饰的IL-2，该修饰的IL-2在与残基F42Y附接的PEG间隔物的末端处包含叠氮化物官能团，如图1H中示出的。
本文还提供了修饰的IL-2多肽组合物Z的结构。参见图1I。与组合物A相比，组合物Z还包含通过短接头与N末端残基连接的叠氮化物官能团。
实施例3-组合物A的表征
对组合物A进行一系列分析实验来表征它。这些实验的结果示于图2A、图2B和图2C中。这些实验的细节描述如下。
修饰的IL-2多肽通过HPLC进行分析。组合物A以单一狭窄的峰洗脱，指示样品中的高度均一性。所得的HPLC迹线如图2A中所示，图2A示出了吸光度(y轴)随柱上保留时间(x轴)的变化。
修饰的IL-2多肽还通过ESI-HRMS(电喷雾电离高分辨率质谱)进行分析。如图2B中示出的，计算的同位素分布模式和测量的高分辨率质谱密切匹配，证实了组合物A的高纯度和同质性。在图2B中，x轴表示分子量，并且y轴表示信号强度。
修饰的IL-2多肽还通过圆二色性进行分析。所得的CD光谱显示出折叠良好的白细胞介素-2蛋白的特征峰，这指示组合物A以与野生型IL-2类似的方式折叠。参见图2C，其示出了偏振光波长(x轴)与组合物A的吸光度(y轴)。
通过本文提供的方法产生的修饰的IL-2显示出IL-2多肽批次之间的显著一致性。图2D示出了三个不同批次的修饰的IL-2多肽的体外功效全都大体上相同。图2D示出了修饰的IL-2多肽对人类T细胞的体外样品中Treg细胞诱导的生物活性的批次间可变性，其中该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度并且在x轴上示出了野生型IL-2或修饰的IL-2多肽的剂量。该图中示出的样品是本文提供的修饰的IL-2多肽组合物D。
实施例4-修饰的IL-2多肽的配制
冻干的修饰的IL-2多肽使用实施例1中描述的方法制备。将冻干、折叠的组合物A溶解在含有1％SDS的0.05M Na2HPO4缓冲液(pH 7.5)中，通过温和地振荡以帮助完全溶解。如通过二喹啉甲酸(BCA)测定测量的靶浓度是大约0.4mg/mL。然后，将样品使用Slide-A-LyzerTM透析盒对含有0.1％SDS和50mg/mL甘露醇的0.05M Na2HPO4缓冲液(pH 7.5)进行透析。缓冲液在两个三小时的时间段之后交换两次，并且然后将样品留在缓冲液中过夜。然后将透析盒转移至含有最终制剂缓冲液(含有0.022％SDS和50mg/mL甘露醇的10mM Na2HPO4，pH 7.5)的容器中，并将样品用三次缓冲液交换(2×4小时，1×过夜)进行透析。然后将样品从透析盒中取出，并再次通过BCA测定进行评价。然后将样品分成等分试样并储存在-80℃。
实施例5-组合物A和其他IL-2多肽的IL-2受体结合活性
对野生型IL-2、阿地白介素(aldesleukin)(SEQ ID NO:2)、组合物A、组合物B和选择的其他修饰的IL-2多肽进行表面等离子体共振实验，以确定它们对IL-2R单体亚基的结合特性。IL-2多肽与人类IL-2受体亚基的相互作用以表面等离子体共振(SPR)技术在Crelux(无锡AppTec公司,Martinsried,GER)进行测量。对于这些研究，抗His抗体通过胺偶联结合到CM5芯片上，以捕获42nM的加His标签的人类IL2受体α(Abcam,Ab221397)或加His标签的人类IL2受体β(Abcam,Ab174003)。在其他设置中，将42nM的α和βIL2受体混合并预孵育30min，然后捕获α/β异二聚体IL2受体。
IL2分析物的动力学结合用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)以从2.5uM开始降至2.4nM的两倍系列稀释测量。在每一浓度的分析物之后，将表面再生回胺偶联的抗His抗体。为了测量蛋白与受体的缔合，将样品以50ul/min的流量注射30s，随后是180s仅缓冲液，以检测解离。所用的运行缓冲液是含有0.05％Tween20的1×PBS。将相对响应单位(RU，Y轴)与时间(s，X轴)作图，并且以用于单体受体结合的动力学1:1结合模型和用于α/β异二聚体结合的动力学异质性(heterogenous)配体拟合模型进行分析。
组合物A、组合物B、组合物C和组合物D未显示与IL-2Rα结合，各自具有观察到的>2500nM的Kd。参见图3，其示出了测量不同IL-2多肽与IL-2受体亚基的结合相互作用的表面等离子共振实验的相对响应(y轴)与时间(x轴)。相比之下，阿地白介素以23nM的Kd与IL-2Rα结合(表8)。因此，组合物A和组合物B显示出与IL-2受体的α亚基大幅减少的结合。
相反，组合物A和组合物B显示出增加的与IL-2受体β亚基的结合，分别为133nM和456nM的Kd(图3)。这标志着与阿地白介素(表9)或野生型IL-2(图3)(两者均显示出约900nM的Kd)相比，组合物A与β亚基的结合增加至大约7倍，并且组合物B与β亚基的结合增加至2倍。
以下表8示出了用另外的修饰的IL-2多肽进行的相同表面等离子体共振实验以测量与IL-2Rα(CD25)的结合的结果。所有测试的修饰的IL-2多肽都显示出与IL-2Rα的极小结合。NT指示IL-2多肽未被测试。
表8
Figure BDA0003840274770001181
Figure BDA0003840274770001191
表9示出了用另外的修饰的IL-2多肽进行的相同表面等离子体共振实验以测量与IL-2Rβ(CD122)的结合的结果。与阿地白介素相比，所有测试的修饰的IL-2多肽都显示出对IL-2Rβ相当的结合或更好的结合。NT指示IL-2多肽未被测试。
表9
Figure BDA0003840274770001192
进行了另外的表面等离子体共振实验，以确定修饰的IL-2多肽与IL-2Rα/β异二聚体的结合特性。实验按以上指示进行，但单体亚基被IL2R异二聚体替代。一级相互作用的结果示于以下表10中。值得注意的是，修饰的IL-2多肽都显示出一级相互作用大幅降低的亲和力。在以下表中，NT指示组合物未被测试。
表10
Figure BDA0003840274770001201
还测量了IL-2R异二聚体与修饰的IL-2多肽之间的二级相互作用。该实验的结果示于以下表11中。几乎所有修饰的IL-2多肽都保留了二级相互作用的至少一些亲和力。特别地，对于这种二级相互作用，组合物A显示的KD比阿地白介素大少于10倍。在以下表中，NT指示组合物未被测试。
表11
Figure BDA0003840274770001211
实施例6-组合物A的基于细胞的体外表征
进行实验以确定不同的IL-2多肽对人类T细胞群体的影响。原代泛T细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg T细胞)通过使用聚蔗糖梯度离心进行外周血单个核细胞(PBMC)纯化，随后用磁珠阴性选择，从健康供者血沉棕黄层(buffy coat)中获得，并且然后冷冻保存直至使用。将泛T细胞解冻，允许在T细胞培养基(RPMI 10％FCS、1％谷氨酰胺、1％NEAA、25μM bMeoH、1％丙酮酸钠(Napyrovate))中恢复过夜，并在用PBS的两个洗涤步骤之后，将细胞重悬于PBS中。然后，将细胞以每孔200,000个细胞/孔分配，并用以316nM的起始浓度降至3pM的3.16倍系列稀释的阿地白介素或修饰的IL-2多肽在37℃/5％CO2刺激20min至40min。孵育之后，将细胞使用转录因子磷酸缓冲液试剂盒固定并透化，随后对CD4、CD8、CD25、FoxP3、CD45RA和pStat5进行表面和细胞内免疫染色，以能够实现细胞亚群鉴定和测量Stat5(信号转导及转录激活因子5)磷酸化水平。FACS(荧光激活细胞分选)测量用来自Acea的NovoCyte或Quanteon流式细胞仪进行。
将表12中示出的T细胞亚群的pStat5 MFI(中位荧光强度)信号与阿地白介素或修饰的IL-2多肽的浓度作图。半最大有效浓度(EC50)使用GraphPad PRISM软件基于可变斜率四参数分析进行计算。
表12-T细胞亚群鉴定的门控策略
T-Reg CD4+、CD25<sup>高</sup>、FoxP3+
CD8 Teff CD8+
幼稚CD8 Teff CD8+、CD45RA+
CD4 conv CD4+、FoxP3-
Teff(CD8+)细胞和Treg细胞诱导的剂量响应曲线显示，阿地白介素在诱导Treg细胞方面比诱导Teff细胞实质上更有效。相反，组合物A-D各自在Teff细胞和Treg细胞的诱导方面表现出相当的效力。与阿地白介素或野生型IL-2相比，组合物A-D全都显示出相似的诱导Teff细胞的能力，但诱导Treg细胞的能力大幅减弱。代表性结果示于图4中，图4描绘了pStat5的平均荧光强度(MFI)(y轴)随野生型IL-2、组合物A、组合物B、组合物C或组合物D的剂量(x轴)的变化。
该实验的另外的结果示于以下表13中。值得注意的是，与阿地白介素相比，组合物A在诱导CD8+细胞方面显示出增加的效力，而组合物B仅显示出效力的微弱降低。与阿地白介素相比，组合物C和组合物D在诱导CD8+细胞的效力方面类似地仅显示出微弱的降低。另外，与阿地白介素相比，所有在残基42或残基45上携带聚合物基团的修饰的IL-2多肽都显示出CD8+/Treg半最大有效浓度(EC50)比值的大幅降低。在以下表中，NT指示组合物未被测试。
表13
Figure BDA0003840274770001221
Figure BDA0003840274770001231
实施例7-药代动力学/药效学研究
在小鼠中进行了单剂量药代动力学/药效学实验。未经实验的6-8周龄C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，中国上海)接收单次推注式(bolus)静脉内(i.v.)注射52nmol/kg野生型或修饰的IL-2多肽。研究包括14个时间点(5min、15min、1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、120h、168h、240h)，其中每个时间点对3只小鼠取样。在指定的时间点，在存在EDTA的情况下，经由尾静脉取样或经由心脏穿刺(终点)收集血液样品。
将血液样品立即通过离心进行处理。将血浆样品冷冻保存在-80℃，直至生物分析。
血浆样品的生物分析使用合格的人类IL-2LegendPlex珠测定(Biolegend，#740717、#740368、#740758)进行。来源于血浆的样品中的野生型和修饰的IL-2多肽及内标的浓度使用人类IL-2LegendPlex珠测定来确定。PK数据通过使用Phoenix WinNonlin软件(第6.3版，Pharsight,Mountain View,CA)进行非区室药代动力学分析。应用线性/对数梯形法则获得PK参数。
将细胞沉淀物用1×Lyse/Fix缓冲液(BD Bioscience,558050)在10min期间进行处理。洗涤之后，将细胞用抗CD3、抗CD335和抗CD25抗体在4℃染色30min。然后将细胞使用冷BD Perm缓冲液III进行透化，并用抗Ki67、Siglec-F、CD4、CD8、FoxP3、CD62L、CD44或pSTAT5的抗体染色。FACS(荧光激活细胞分选)测量用来自BD的Fortessa X-20流式细胞仪进行。
对于以下表14中示出的每个细胞亚群，确定pSTAT5阳性细胞的百分比、以及Ki67阳性细胞的百分比、细胞计数和细胞频率。
表14
Figure BDA0003840274770001241
给药后不同时间点的修饰的IL-2多肽的所得血浆浓度示于图5中。野生型IL-2和组合物D在同一研究中同时测试并监测14天，而组合物A、组合物B和组合物C在相同条件下进行的不同研究中跟踪10天。组合物C和组合物D显示出比其他测试组合物大幅延长的半衰期，指示大PEG基团的有益作用。以下表15示出了在该实验期间测量的另外的PK参数。PK参数使用R包“PK”通过非区室分析(NCA)的方式确定。血浆浓度-时间曲线下面积(AUC0-最后)是对不同时间点时的算术平均值使用线性梯形法则来计算，而AUC0-inf和AUMC 0-Inf所需的外推是假定在最后3个时间点上指数衰减来实现。
表15
Figure BDA0003840274770001251
除了各时间点的修饰的IL-2多肽的浓度之外，还测量了各时间点的不同免疫细胞类型增殖的诱导。野生型IL-2和组合物D在同一研究中同时测试并监测14天，而组合物A、组合物B和组合物C在相同条件下进行的不同研究中跟踪10天。图6A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对Treg中IL-2信号传导诱导的影响的图，其中该图在y轴上示出了具有磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的百分比并且在x轴上示出了时间。组合物D显示在最长的时间段内实现响应。类似地，图6B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中CD8+Teff中IL-2信号传导诱导的影响的图，其中该图在y轴上示出了具有磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的CD8+Teff(CD3+、CD8+)的百分比并且在x轴上示出了时间，其中组合物D显示出最高的响应持续时间。另外，测量了不同IL-2多肽的不同剂量水平的峰值水平(注射IL-2多肽后之后1h)的pSTAT5阳性细胞的百分比。结果示于以下表16中。
表16
Figure BDA0003840274770001261
另外，在这些时间点还测量了增殖标志物Ki67阳性的免疫细胞。野生型IL-2和组合物D在同一研究中同时测试并监测14天，而组合物A、组合物B和组合物C在相同条件下进行的不同研究中跟踪10天。图7A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中Treg增殖诱导的影响的图，其中该图在y轴上示出了增殖标志物Ki67阳性的调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的百分比并且在x轴上示出了时间。图7B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中CD8+Teff增殖的影响的图，其中该图在y轴上示出了对增殖标志物Ki67阳性的CD8+Teff(CD3+、CD8+)的百分比并且在x轴上示出了时间。图7A和图7B两者示出了，组合物C和组合物D显示出更大的随着时间的推移诱导Treg和CD8+细胞增殖的能力。表17示出了在研究中测试的不同的修饰的IL-2多肽的Ki67阳性细胞的峰值时间点的另外的药效学数据。
表17
Figure BDA0003840274770001271
图8A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中Treg扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的百分比并且在x轴上示出了时间。图8B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+Teff(CD3+、CD8+)的百分比并且在x轴上示出了时间。图9示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环CD8+Teff与调节性CD4+T细胞的比例的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+Teff(CD3+、CD8+)与调节性CD4+T细胞(CD4+、FoxP3+、CD25高)的频率的比值并且在x轴上示出了时间。在这些图中测试和描绘的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B、组合物C和组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。表18示出了在研究中测试的不同的修饰的IL-2多肽的淋巴细胞区阳性细胞内的细胞峰值时间点的另外的药效学数据。对于图8A、图8B和图9中的每一个，野生型IL-2和组合物D在同一研究中同时测试并监测14天，而组合物A、组合物B和组合物C在相同条件下进行的不同研究中跟踪10天。
表18
Figure BDA0003840274770001281
图10A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环中央记忆性CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+中央记忆性T细胞(CD3+、CD8+、CD62L高、CD44高)的百分比并且在x轴上示出了时间。图10B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环效应记忆性CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+效应记忆性T细胞(CD3+、CD8+、CD62L低、CD44高)的百分比并且在x轴上示出了时间。图10C示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中幼稚CD8+Teff扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD8+幼稚T细胞(CD3+、CD8+、CD62L高、CD44低)的百分比并且在x轴上示出了时间。在这些图中测试和描绘的修饰的IL-2多肽是组合物A、组合物B和组合物C及组合物D，全都以52纳摩尔/kg测试。对于图10A-图10C中的每一个，野生型IL-2和组合物D在同一研究中同时测试并监测14天，而组合物A、组合物B和组合物C在相同条件下进行的不同研究中跟踪10天。图15A示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环自然杀伤细胞扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了白细胞区内的自然杀伤细胞(CD3-、CD49b+)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，以52纳摩尔/kg测试。图15B示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中循环CD4+T辅助细胞扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞区(CD3+)内的CD4+T辅助细胞(CD3+、CD4+、CD25低)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，以52纳摩尔/kg测试。图15C示出了测量野生型和修饰的IL-2多肽对C57BL/6小鼠中嗜酸性粒细胞扩增的影响的图，其中该图在y轴上示出了淋巴细胞白细胞中的嗜酸性粒细胞(SSC高、Siglec-F高)的百分比并且在x轴上示出了时间。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，以52纳摩尔/kg测试。
实施例8-药代动力学/药效学研究
在小鼠中进行了体内效力研究。未经实验的6-8周龄BALB/c雌性小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，中国上海)在右下肋腹皮下接种0.1mL PBS中的CT26肿瘤细胞(3×105个)用于肿瘤发展。将动物随机化(使用基于Excel的随机化软件，根据肿瘤体积进行分层随机化)，并且当平均肿瘤体积达到大约65mm3时开始处理。用组合物D处理的动物接收2至3次10mL/kg推注式静脉内(i.v.)注射0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg(分别为18纳摩尔/kg、61纳摩尔/kg、184纳摩尔/kg和368纳摩尔/kg)修饰的IL-2多肽。用抗PD-1抗体处理的动物在三周内每周两次接收10mL/kg推注式腹膜内(i.p.)注射10mg/kg的InVivoMAb抗小鼠PD-1/CD279(Clone RMP1-14；BioXcell；目录号BE0146)。最后，用组合物D和抗PD-1抗体的组合处理的动物在第0天、第7天和第14天接收单次10mL/kg推注式静脉内(i.v.)注射3mg/kg(184纳摩尔/kg)修饰的IL-2多肽，并且在三周内每周两次接收10mL/kg推注式腹膜内(i.p.)注射10mg/kg的InVivoMAb抗小鼠PD-1/CD279(Clone RMP1-14；BioXcell；目录号BE0146)。接种之后，每天检查动物的发病率和死亡率。在那时，检查对动物的肿瘤生长和正常行为的影响，诸如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/损失(每周两次测量体重)、眼睛/毛发缠结(hair matting)和任何其他异常影响。主要终点是延迟的肿瘤生长或完全的肿瘤消退。每周两次使用卡尺以两个维度测量肿瘤尺寸，并且体积使用以下式以mm3表示：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。死亡和观察到的临床体征基于每个亚群内的动物数量进行记录。图16A示出了描述抗PD1抗体和修饰的IL-2多肽在处理三周之后对BALB/c小鼠中CT26同系结肠癌肿瘤尺寸的影响的柱状图。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，作为单一剂以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg(分别为18纳摩尔/kg、61纳摩尔/kg、184纳摩尔/kg和368纳摩尔/kg)测试。组合物D还以3mg/kg的剂量与10mg/kg的剂量的抗PD1抗体组合测试。(n＝9只动物；平均值±SEM)。图16B示出了描述抗PD1抗体和修饰的IL-2多肽对植入了CT26同系结肠癌肿瘤细胞的BALB/c小鼠存活率的影响的图。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物D，作为单一剂以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg(分别为18纳摩尔/kg、61纳摩尔/kg、184纳摩尔/kg和368纳摩尔/kg)测试。组合物D还以3mg/kg的剂量与10mg/kg的剂量的抗PD1抗体组合测试。(n＝9只动物；CR＝完全消退)。
对无肿瘤动物进行了再攻击研究。处理开始之后三个月，将显示完全肿瘤消退的动物纳入再攻击研究，以探索持久免疫记忆应答的建立。简言之，将10只未经实验的未处理的对照动物、1只先前用3mg/kg的组合物D处理的动物、5只先前用6mg/kg的组合物D处理的动物、和3只先前用3mg/kg的组合物D与10mg/kg的抗PD1抗体的组合处理的动物在左下肋腹皮下接种0.1mL PBS中的CT26肿瘤细胞(3×105个)。在常规监测时，检查对动物的肿瘤生长和正常行为的影响，诸如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/损失(每周两次测量体重)、眼睛/毛发缠结和任何其他异常影响。主要终点是延迟的肿瘤生长或肿瘤移植物排斥。每周两次使用卡尺在两个维度测量肿瘤尺寸，并且体积使用以下式以mm3表示：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。死亡和观察到的临床体征基于每个亚群内的动物数量进行记录。图17示出了描绘抗PD1抗体和修饰的IL-2多肽预处理对CT26同系结肠癌肿瘤的植入和生长的影响的图，所述CT26同系结肠癌肿瘤接种在未经实验的BALB/c小鼠与预处理的动物中。首次处理开始之后90天(处理结束之后69天)，10只未经实验的动物和9只显示完全肿瘤排斥的经预处理的动物在对侧肋腹用3×105个CT26细胞皮下注射(s.c)再攻击。经预处理的动物如下：1只动物用3mg/kg的组合物D处理，5只动物用6mg/kg的组合物D处理，并且3只动物用3mg/kg的组合物D与10mg/kg的抗PD1抗体组合处理。图17在y轴上示出了肿瘤体积(mm3)并且在x轴上示出了时间。(未经实验的组：n＝10只动物；平均值±SEM)。
实施例9-非人灵长类动物中的药代动力学/药效学研究
药代动力学/药效学实验在单次静脉内施用后的食蟹猴中进行。将毛里求斯(Mauritius)来源的至少24月龄的食蟹猴适应14天，并分为3组(每组1只雄性/1只雌性)，并且经由15分钟静脉内输注组合物D给药，该组合物D是在10mM乙酸钠缓冲液、8.4％w/v蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯80、pH 5.0中配制的0.01mg/kg、0.03mg/kg和0.1mg/kg剂量的修饰的IL-2(分别为0.61纳摩尔/kg、1.83纳摩尔/kg和6.1纳摩尔/kg)。动物在不同时间点采血用于药代动力学和免疫表型分析评价。用于药代动力学的血液样品(500μL)从适当的静脉(当可能时为股动脉/静脉)收集到含有K2EDTA的管内，并置于湿冰上等待离心(10min，3500rpm，+4℃)。将所得的血浆储存在-80℃直至生物分析。血浆样品的生物分析使用夹心Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光(ECL)测定来进行，该测定建立在分别作为捕获试剂和检测试剂的抗IL-2抗体(R&D Systems，目录号MAB201)和生物素化抗-PEG抗体(GenScript，目录号A01796-100)上。PK评价通过使用Phoenix软件(第8.2.0版，Certara)进行非区室药代动力学分析。应用线性/对数梯形法则获得PK参数。
收集用于免疫表型分析的血液样品(150μL)并转移到96孔V-底板中，然后用预冷的1×TFP Fix/Perm缓冲液(转录因子磷酸缓冲液组，BD Biosciences，#563239)在4℃固定和透化，持续50-60分钟。然后，将细胞用200μL的1×TFP Perm/Wash缓冲液(转录因子磷酸缓冲液组，BD Biosciences，#563239)在4℃洗涤两次。然后，将细胞使用在-20℃预冷的200μL BD Phosflow Perm缓冲液III(BD Biosciences，#558050)在冰上透化20-22分钟。透化之后，将细胞用200μL的1×Perm/Wash缓冲液在4℃洗涤3次，并且然后用抗体混合液在4℃染色，持续60-65min。最后，洗涤细胞(500g，5min，在4℃，两次)，重悬于250μL流式缓冲液中(如果需要，储存在5℃)，并在MACSquant流式细胞仪上分析，并用MACSQuantify软件(Miltenyi Biotec)进行分析。
对白细胞亚群进行了基于13种特异性标志物的组合的专用免疫表型分析组，并且标志物如表19所示：
表19
Figure BDA0003840274770001321
此外，血液学参数使用ADVIA120血液分析仪确定，包括红细胞、血小板和各种白细胞类型的计数以及其他。
组合物D的药代动力学谱示于图18中，以及估计的PK参数列于表20中。组合物D表现出持续的半衰期(t1/2)和平均滞留时间(MRT最后)。
表20
Figure BDA0003840274770001331
监测组合物D对血液中不同免疫细胞群体的影响。如图19中所示，组合物D在给药后1周对淋巴细胞的扩增具有明显且剂量依赖性的影响。图20A描绘了用组合物D处理后，两个主要T细胞群体CD8+T效应细胞(CD3+、CD8+)和CD4+T辅助细胞(CD3+、CD4+)以及调节性T细胞(Treg；CD4+、Foxp3+、CD25高)的动态细胞计数谱，显示T效应和T辅助的大量扩增，而对Treg的影响有限。图20B示出了处理对CD4+T细胞和CD8+T细胞两者的对应的效应记忆性亚群(TEM、CD20-、CD3+、CD159a-、CD28-、CD95+)和中央记忆性亚群(TCM、CD20-、CD3+、CD159a-、CD28+、CD95+)的影响。与基线相比，所有记忆性亚群都显示出显著的扩增。图20C示出了用组合物D处理如何还导致NK细胞的扩增，而对嗜酸性粒细胞的影响有限。
实施例10-用于合成修饰的IL-2多肽的一般方案
如本文描述的修饰的IL-2多肽，诸如具有例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4-22的任何一个的氨基酸序列的修饰的IL-2多肽或表4-6中描述的修饰的IL-2多肽，可以通过连接使用固相肽合成(SPPS)合成的单独的肽来合成。单独的肽使用下文描述的方法在自动化肽合成仪上合成。
商业上可得的试剂可以从Sigma-Aldrich、Acros、Merck或TCI Europe或任何其他合适的制造商购买，并且无需进一步纯化即可以使用。用于固相肽合成的具有合适侧链保护基团的Fmoc氨基酸可以从Novabiochem、Christof Senn Laboratories AG或PeptART购买，并且可以将其按供应使用。用于肽合成的聚乙二醇衍生物可以由PolyPure购买。来自Sigma Aldrich的HPLC级CH3CN可以用于分析型和制备型HPLC纯化。
肽和蛋白的高分辨率质谱(FTMS)使用4-羟基-α-氰基肉桂酸(HCCA)作为基质在配有双ESI/MALDI-FTICR源的Bruker solariX(9.4T磁体)上测量。CD光谱用具有光程长为1.0mm的池的Jasco J-715光谱仪记录。在以下连续扫描模式在25℃收集光谱：标准灵敏度(100mdeg)，0.5nm数据间距，50nm/min扫描速度，1nm带宽和5次积累。
肽和蛋白片段通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析和纯化。肽分析和反应监测在具有双泵、混合器和在线脱气器、自动进样器、可变波长UV检测器(在220nm和254nm处同时监测洗脱液)和装有100μL注射环的注射器的分析型Jasco仪器上进行。肽片段的纯化在具有20mL注射环的Gilson制备仪器上进行。在这两种情况下，流动相是含有0.1％TFA的MilliQ-H2O(缓冲液A)和含有0.1％TFA的HPLC级CH3CN(缓冲液B)。分析型HPLC在bioZenTMIntact C4柱(3.6μm,150×4.6mm)或Shiseido Capcell Pak MG III柱(5μm,150×4.6mm)上以1mL/min的流量进行。制备型HPLC在Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(5μm,50mmI.D.×250mm)上以40mL/min的流量进行。
使用Fmoc SPPS化学在Syro I或CS Bio 136X肽合成仪上合成肽区段。使用以下具有侧链保护基团的Fmoc氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(1-Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。在必要时将Fmoc-假脯氨酸二肽掺入合成。Fmoc脱保护用DMF中的20％哌啶进行(2×8min)，并在304nm处通过UV以反馈回路监测以确保完全Fmoc去除。用Fmoc-氨基酸(3.0-5.0当量，相对于树脂取代)、作为偶联剂的HCTU或HATU(2.9-4.9当量)、以及在DMF中的DIPEA或NMM(6-10当量)在室温或50℃进行偶联。预活化3min之后，将溶液转移并允许与树脂上的肽反应30min或2h，取决于氨基酸。在一些情况下，需要双偶联。偶联之后，将树脂用DMF中的20％乙酸酐处理，用于对任何未反应的游离胺加帽。在需要时进行LiCl洗涤。烯丙基酯脱保护使用苯基硅烷(24当量)和四(三苯基膦)钯(0)(0.5当量)在无水二氯甲烷中进行。
通过SPPS进行的肽区段合成通过对相应树脂进行微裂解和分析来监测。使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O(在α酮酸树脂上合成的α酮酸区段)或95:2.5:2.5TFA:TIPS:H2O(在2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂上合成的肽)的混合物将肽从树脂裂解，持续2小时。滤去树脂，并将滤液蒸发，并用冷乙醚处理，研磨并离心。仔细地倾析乙醚层，并将剩余物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次。
用于产生本文提供的修饰的IL-2多肽的一般合成方案(其也可以用于合成其他变体，诸如表7中提供的那些变体)示于图11中。特别地，SEQ ID NO:3-22的任何修饰的IL-2多肽可以使用本文提供的一般合成方案来合成，序列的任何变体也可以使用本文提供的一般合成方案来合成。简言之，线性肽片段(如图11中示出的区段1-4)使用SPPS制备，并在合成步骤期间掺入对野生型IL-2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的任何所期望的修饰。纯化单独的片段之后，分别将区段1和区段2连接在一起并将区段3和区段4连接在一起。然后，将所得的区段12和区段34连接在一起，并共同脱保护以提供粗合成IL-2多肽。
然后，将所得的合成的修饰的IL-2多肽重排和折叠。然后将线性多肽溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M盐酸胍水溶液中(最终多肽浓度为15μM，93.2mL)。使用6M HCl将pH调节至8.0。将溶液在50℃温和地振荡3小时，并通过以下分析型反相HPLC监测折叠：使用预热至60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(4.6×250mm)，以在22min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量为1.0mL/min。然后将溶液冷却至室温，并用含有0.2M Tris和2.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的缓冲液稀释3×(多肽的最终浓度为5μM)，持续30分钟。将所得的溶液储存在室温并振荡24h。通过以下分析型HPLC监测折叠进展：使用在室温的Shiseido Proteonavi C4柱(4.6×250mm)，以在22min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。折叠完成之后(～24小时)，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至～pH 3，并通过以下制备型HPLC纯化：使用Shiseido Proteonavi C4柱(10×250mm)，以在40min内含有0.1％TFA的40％-95％乙腈的梯度，流量：5.0mL/min。向包含修饰的IL-2多肽的汇集的级分中添加甘露醇(～3mg)，并将材料冷冻在液氮中并冻干。冻干之后，获得纯的修饰的IL-2多肽。将其通过圆二色性进行表征，以确认修饰的IL-2多肽显示与野生型IL-2相似的三级结构。然后，所得的折叠的修饰的IL-2多肽通过HPLC纯化。
9.1用于合成IL-2区段1(IL-2(1-39)-Leu-α-酮酸)的一般程序
Figure BDA0003840274770001361
IL2(1-39)-Leu-α-酮酸在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的保护的Fmoc-α-Leu-酮酸的Rink-酰胺树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化FmocSPPS进行合成直到Ala1。
区段1的变体：在一些情况下，N末端通过顺序偶联Fmoc-氨基-3,6-二氧杂辛酸、Fmoc-Lys(Fmoc)和Fmoc-NH-(PEG)27-COOH来延伸。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行肽基树脂的微裂解和分析持续1.5h来监测肽偶联的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。确认后，遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将较大批次从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(1-39)的纯化：使用Shiseido Capcell Pak C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的30％至80％CH3CN的梯度。N末端修饰的区段使用在30min内含有0.1％TFA的20％至80％CH3CN的梯度进行纯化。将纯的产物级分汇集并冻干以获得纯的IL2(1-39)(Seg1)(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为31％-69％)。使用分析型HPLC和HRMS确认产物的纯度和精确质量。
用于合成IL-2区段2[Opr-IL2(42-69)光保护的-Leu-α-酮酸]的一般程序
Figure BDA0003840274770001371
Opr-IL2(42–69)光保护的-Leu-α-酮酸区段在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸的Rink酰胺MBHA树脂上制备。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS进行合成直到Nle46。
从位置45至位置42，氨基酸残基是不同的，以制备不同的修饰的IL-2区段2。在所有情况下，Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸均手动偶联在区段的N末端。
区段2的变体.在一些情况下，Tyr 45或Phe 42被非典型氨基酸取代，所述非典型氨基酸由以下但不限于以下代表：N-α-(9-芴甲基氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)或N-α-(9-芴甲基氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH。在一些情况下，通过手动或自动化SPPS添加详细描述中描述的携带PEG基团或叠氮基基团的修饰的酪氨酸残基。在一些情况下，使用携带O-烯丙基酯官能团的修饰的酪氨酸残基(结构5)来偶联所期望的PEG基团。然后，在树脂上脱保护步骤期间去除O-烯丙基基团，并将所得的游离酸与对应的期望基团(例如PEG基团或携带叠氮化物或炔烃官能团的PEG基团)偶联。在一些情况下，携带PEG基团的胺通过手动SPPS偶联，随后以顺序偶联3x Fmoc-Lys(Fmoc)-OH和[Fmoc-NH-(PEG)27-COOH]进一步延伸。
通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽偶联的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。确认后，遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将整个批次从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(41–70)的纯化：使用Shiseido capcell pak C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的30％至40％或40％至60％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集并冻干以获得纯的修饰的IL2区段2(Seg2)(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为4％-18％)。使用分析型HPLC和HRMS确认产物的纯度和精确质量。
用于合成IL-2区段3[Fmoc-Opr IL2(72–102)-Phe-α-酮酸]的一般程序
Figure BDA0003840274770001381
Fmoc-Opr IL2(72–102)-苯丙氨酸-α-酮酸在预先装载具有～0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-Leu-酮酸的Rink酰胺ChemMatrix树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序来进行自动化Fmoc SPPS直到Leu72。将Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸手动偶联至该序列。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗Fmoc-Opr IL2(72-102)的纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak C18柱(50×250mm)，以在30min内含有0.1％TFA的20％至75％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集并冻干以获得>98％纯度的Fmoc-Opr IL2(72–102)-Phe-α-酮酸(Seg3)。
用于合成IL-2区段4[Opr-IL2(105-133)]的一般方法
Figure BDA0003840274770001382
Opr-IL2(105-133)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Thr-OH的2-氯三苯甲基-树脂上合成。加帽(二异丙基乙胺、甲醇)之后，通过自动化Fmoc SPPS进行合成，直到Cys(Acm)，残基105。然后，将Boc-5-氧杂脯氨酸(2.00当量，相对于树脂)偶联至树脂上的游离胺。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:TIPS:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。使用95:2.5:2.5TFA:TIPS:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2.0h。通过以下制备型HPLC进行粗Opr-IL2(105-133)的纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak C4柱(50×250mm)，以在10min内含有0.1％TFA的10％至65％CH3CN，然后在20min内含有0.1％TFA的65％至95％CH3CN的梯度。将纯的产物级分汇集并冻干以获得>98％纯度的Opr-IL2(105-133)(Seg4)。
IL2(1-69)-保护的-Leu-α-酮酸的合成
Figure BDA0003840274770001391
在一些情况下，包含残基(1-70)的IL2区段通过Fmoc-SPPS合成。IL2(1-69)-保护的Leu-α-酮酸(Seg12)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的保护的Fmoc-α-Leu-酮酸的Rink-酰胺树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS进行合成直到Ala1。在一些情况下，序列中的所有甲硫氨酸都被正亮氨酸(Nle)取代或在相应的位置处保留为甲硫氨酸。在一些情况下，将具有携带-O-C(＝O)NEt2和–(C＝O)-硝基苄酯保护基团的胺骨架的Fmoc-氨基酸偶联在位置45中。
用于合成IL2线性蛋白的KAHA连接
Figure BDA0003840274770001392
连接：将Seg1(1.2当量)和Seg2(1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(20mM肽浓度)，并允许在60℃反应22h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.6mm)，以含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内5％至95％CH3CN的梯度。
光脱保护和纯化：连接完成之后，将混合物用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O(1:1)稀释，并在365nm波长处辐照1h。光解反应的完成通过使用先前描述方法将样品注射到uHPLC上来确认。
光脱保护的样品通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapcellPak UG80 C18柱(50×250mm)，以2步骤梯度：含有0.1％TFA的在水中的CH3CN的双梯度：在5min内10％至35％，然后在35min内35％至65％，以40mL/min的流量，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的IL2-Seg12(对于连接和纯化步骤，收率为40％)。区段的纯度和身份通过HPLC和HRMS确认。
用于制备IL2-Seg34的KAHA连接(代表性方案)
Figure BDA0003840274770001401
连接：将IL2-Seg3(1.2当量)和IL2-Seg4(1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)或(9.8:0.2)中(15mM)，并允许在60℃反应16h。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.56mm)，使用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内30％至70％CH3CN的梯度。
Fmoc脱保护和纯化：连接完成之后，将反应混合物用DMSO(6mL)稀释，添加5％二乙胺(300μL)并将反应混合物在室温振荡7min。为了准备样品用于纯化，将其用含有TFA(300μL)的DMSO(4mL)稀释。
Fmoc脱保护和纯化：连接完成之后，将反应混合物用DMSO(6mL)稀释，添加5％二乙胺(300μL)并将反应混合物在室温振荡7min。为了准备样品用于纯化，将其用含有TFA(300μL)的DMSO(4mL)稀释。
通过以下制备型HPLC纯化样品：保持在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)上，使用在35min内含有0.1％TFA的在水中的30％至70％CH3CN的梯度，以40mL/min的流量。将包含产品的级分汇集并冻干以得到纯的IL2-Seg34。区段34的纯度和身份通过HPLC和HRMS确认。
用于制备IL2线性蛋白的最终KAHA连接(代表性方案)
连接：将IL2-Seg12(1.2当量)和IL2-Seg34(1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H2O(9:1)或(9.8:0.2)中(15mM肽浓度)，并允许连接在60℃进行24h。通过以下分析型HPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(250×4.6mm)，以及含有0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，以在14min内30％至95％CH3CN的梯度。
纯化：连接完成之后，将反应混合物用DMSO稀释，随后用含有0.1％TFA的(1:1)CH3CN:H2O混合物(7mL)进一步稀释。样品通过注射到以下制备型HPLC上进行纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(50×250mm)，以2步骤梯度：在5min内10％至40％，以及在35min内40％至80％，流量：40mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产品的级分汇集并冻干以得到纯的具有Acm的IL2线性蛋白。具有2x Acm的IL-2线性蛋白的纯度和身份通过HPLC和HRMS确认。
Acm脱保护：将具有2x Acm的IL2线性蛋白溶解在AcOH/H2O(1:1)中(0.25mM蛋白浓度)，并向溶液添加AgOAc(1％m/v)。将混合物在50℃避光振荡2.5h。反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用含有0.1％TFA的CH3CN:H2O(1:1)稀释，并通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapCell Pak UG80 C18柱(20×250mm)。使用2步骤梯度进行纯化：在5min内10％至40％，以及在30min内40％至95％，流量：10mL/min，以含有0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产品的级分汇集并冻干以得到纯的具有2x游离半胱氨酸的IL2线性蛋白。
IL-2线性蛋白的折叠(代表性方案)
线性蛋白的重排：将线性蛋白溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6MGu·HCl水溶液中(15μM蛋白浓度)，将其用6M HCl水溶液调节至pH 8.0。将混合物在50℃温和地振荡2h，并通过以下分析型反相HPLC监测重排：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm IntactC4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的在H2O中的30％至95％CH3CN的梯度，流量：1.0mL/min。
线性重排蛋白的折叠：将溶液冷却至室温，并用含有0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的第二缓冲溶液稀释3倍。将混合物储存在室温，并通过以下分析型HPLC监测进展：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，以在18min内含有0.1％TFA的在水中的30％至95％乙腈的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至pH 3-4，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido ProteonaviC4柱(20×250mm)，以在60min内含有0.1％TFA的在水中的5％至40％至95％乙腈的两步骤梯度，流量：10.0mL/min。将包含折叠的IL2蛋白的级分汇集在一起并冻干。纯的折叠的蛋白的纯度和身份通过分析型RP-HPLC、高分辨率ESI质谱和各种其他蛋白表征方法进一步确认。
折叠的IL2的进一步修饰
在一些情况下，折叠的蛋白IL2通过与DBCO-聚乙二醇聚合物反应进一步修饰。将折叠的IL2溶解在CH3CN:H2O溶液(1:1)中(50μM蛋白浓度)，并添加DBCO-PEG(3当量)。将反应物在25℃温和地混合20h，使用以下分析型HPLC监测进展：用在25℃的bioZenTM 3.6μmIntact C4柱(150×4.6mm)，使用在18min内含有0.1％TFA的在水中的30％至95％CH3CN的梯度，流量：1.0mL/min。20h之后，将反应混合物用(1:1)CH3CN/H2O+0.1％TFA稀释，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido Proteonavi C4柱(20×250mm)，以在60min内含有0.1％TFA的在水中的5％至40％至95％CH3CN的两步骤梯度，流量：10.0mL/min。将包含PEG化IL2蛋白的级分汇集在一起并冻干。纯的折叠的蛋白的纯度和身份通过分析型RP-HPLC、高分辨率ESI质谱和各种其他蛋白表征方法进一步确认。
IL2合成变异体的配制
在一些情况下，将冻干的折叠的蛋白直接重悬于含有0.022％SDS和50mg/mL甘露醇的(a)PBS或(b)10mM Na2HPO4缓冲溶液pH 7.5中。在一些情况下，将样品重悬于含有1％SDS和50mg/mL甘露醇的0.05M Na2HPO4缓冲溶液(pH 7.5)中，并顺序地对含有递减SDS浓度的溶液透析24-48h。最终配制的蛋白包含在10mM Na2HPO4缓冲液pH 7.5、0.022％SDS和50mg/mL甘露醇中。配制的蛋白直接用于进一步的研究或测定或储存在-80℃。
序列表
<110> 明峰治疗股份公司
<120> 修饰的IL-2多肽及其用途
<130> 56146-702.601
<140>
<141>
<150> 62/959,382
<151> 2020-01-10
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 2
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Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
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Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
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Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
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Ser Thr Leu Thr
130
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> Hse
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (71)..(71)
<223> Hse
<220>
<221> MOD_RES
<222> (104)..(104)
<223> Hse
<400> 3
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Ile Ser Thr Leu Thr
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<210> 4
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr
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<210> 5
<211> 133
<212> PRT
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<221> 来源
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<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
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<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> Hse
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
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<221> MOD_RES
<222> (71)..(71)
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50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Xaa Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Xaa Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Tyr Leu Gln Xaa Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Xaa Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Xaa Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Tyr Leu Lys
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Xaa Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Xaa Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130

Claims (114)

1.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：
修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含在残基F42Y处共价附接的第一聚合物，并且其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
2.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：
修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含：(i)残基42处的酪氨酸，和(ii)与所述修饰的IL-2多肽共价附接的第一聚合物和第二聚合物，
其中所述第一聚合物和所述第二聚合物中的至少一种具有高于5000道尔顿的重均分子量，并且
其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
3.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：
修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与IL-2受体βγ复合物(IL-2Rβ)结合的半最大有效浓度(EC50)值相比于所述修饰的IL-2多肽与IL-2受体αβγ复合物(IL-2Rα)结合的EC50值的比例低于2:1，并且其中所述EC50值在激动剂测定中测量。
4.根据权利要求3所述的修饰的IL-2多肽，其中所述比例由根据在小鼠模型中以0.1mg/kg剂量注射之后1小时测量的Treg和CD8+细胞水平的Treg/CD8+的比例确定。
5.一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含：
修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽/IL-2受体βγ复合物(IL-2Rβ)的解离常数(KD)小于300nM，并且其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2受体αβγ复合物(IL-2Rα)表现出更大的亲和力，如通过Kd测量的。
6.根据权利要求5所述的修饰的IL-2多肽，其中所述Kd根据表面等离子体共振实验中与IL-2R单体的结合测定来确定。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含在残基F42Y处共价附接的第一聚合物，并且其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
8.根据权利要求1或7所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第一聚合物包括水溶性聚合物。
9.根据权利要求1、7或8中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第一聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约10,000道尔顿或至多约6,000道尔顿。
10.根据权利要求1或7-9中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第一聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿或至少约500道尔顿。
11.根据权利要求1或7-10中任一项所述的修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽还包含与所述修饰的IL-2多肽共价附接的第二聚合物。
12.根据权利要求11所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第二聚合物在残基40至残基50的氨基酸残基区域处共价附接。
13.根据权利要求11所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第二聚合物在残基Y45处共价附接。
14.根据权利要求11所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第二聚合物与所述修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第二聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约10,000道尔顿或至多约6,000道尔顿。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第二聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿、至少约500道尔顿、至少约1000道尔顿、至少约2000道尔顿、至少约3000道尔顿、至少约4000道尔顿或至少约5000道尔顿。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第二聚合物包括水溶性聚合物。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽还包含第三聚合物。
19.根据权利要求17所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第三聚合物包括水溶性聚合物。
20.根据权利要求18或19所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第三聚合物与所述修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第三聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约40,000道尔顿、至多约20,000道尔顿或至多约6000道尔顿。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第三聚合物具有以下的重均分子量：至少约500道尔顿、至少约1000道尔顿、至少约2000道尔顿、至少约3000道尔顿、至少约4000道尔顿或至少约5000道尔顿。
23.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：
修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含：
a)与残基F42Y共价附接的第一聚合物，所述第一聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量；和
b)与Y45共价附接的第二聚合物，所述第二聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量；
其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
24.根据权利要求23所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。
25.根据权利要求23或24所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物的每一种独立地包括水溶性聚合物。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第一聚合物具有约250道尔顿至约1000道尔顿的重均分子量，并且所述第二聚合物具有约5000道尔顿至约40,000道尔顿的重均分子量。
27.根据权利要求23-25中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第二聚合物具有约250道尔顿至约1000道尔顿的重均分子量，并且所述第一聚合物具有约5000道尔顿至约40,000道尔顿的重均分子量。
28.根据权利要求8-22或25-27中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。
29.根据权利要求8-22或25-27中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚(环氧烷)。
30.根据权利要求8-22或25-27中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇。
31.根据权利要求18-22或24-30中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第三聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。
32.根据权利要求18-22或24-30中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第三聚合物包含4个聚乙二醇链。
33.根据权利要求31或32所述的修饰的IL-2多肽，其中所述每个聚乙二醇链独立地包含约5个至约300个、约10个至约200个、约20个至约100个或约25个至约50个乙二醇单元。
34.根据权利要求11-33中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物的每一种独立地包含1个至5个聚乙二醇链。
35.根据权利要求11-33中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物的每一种独立地包含具有3个至25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述每个聚乙二醇链独立地是线性的或支链的。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述每个聚乙二醇链是线性聚乙二醇。
38.根据权利要求32-37中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述每个聚乙二醇链独立地用羟基、烷基、烷氧基或氨基基团末端加帽。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含2个至6个共价附接的水溶性聚合物。
40.根据权利要求1-38中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含一个或更多个接头，所述一个或更多个接头将所述第一聚合物、所述第二聚合物或两者与所述修饰的IL-2多肽的剩余片段共价附接，其中所述一个或更多个接头的每一个独立地具有式(V)的结构，
Figure FDA0003840274760000051
其中L、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L8和L9的每一个独立地是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或被未取代的C1-C6亚杂烷基、被取代或被未取代的C2-C6亚烯基、被取代或未被取代的C2-C6亚炔基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-或不存在；
L7是-O-、–NRL-、–N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、
-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、
-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、被取代或未被取代的C1-C6亚烷基、被取代或被未取代的C1-C6亚杂烷基、被取代或被未取代的C2-C6亚烯基、被取代或未被取代的C2-C6亚炔基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-、点击化学残基或不存在；
每个RL独立地是氢、被取代或未被取代的C1-C4烷基、被取代或未被取代的C1-C4杂烷基、被取代或未被取代的C2-C6烯基、被取代或未被取代的C2-C5炔基、被取代或未被取代的C3-C8环烃基、被取代或未被取代的C2-C7杂环烃基、被取代或未被取代的芳基、或被取代或未被取代的杂芳基；
q是0、1、2、3、4、5或6；并且
qa、qb、qc和qd的每一个独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含具有式(I)结构的一个或更多个PEG化酪氨酸，
Figure FDA0003840274760000061
其中n是选自4至30的整数。
42.根据权利要求41所述的修饰的IL-2多肽，其中所述一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基35至残基45的氨基酸区域中。
43.根据权利要求41所述的修饰的IL-2多肽，其中所述一个或更多个PEG化酪氨酸位于残基42、残基45或两者处。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含两个PEG化酪氨酸，每一个PEG化酪氨酸独立地具有式(I)的结构。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含具有式(II)结构的至少一种聚合物
Figure FDA0003840274760000071
其中每一个m独立地是4-30的整数。
46.根据权利要求45所述的修饰的IL-2多肽，其中每一个m是约26。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代选自：
a)位于残基35-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；
b)位于残基61-81的任何一个中的高丝氨酸残基；和
c)位于残基94-114的任何一个中的高丝氨酸残基。
48.根据权利要求47所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71、Hse104或其组合。
49.根据权利要求47或48所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽还包含正亮氨酸(Nle)取代。
50.根据权利要求49所述的修饰的IL-2多肽，其中所述Nle取代位于残基20-60的任何一个中。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含三个Nle取代。
52.根据权利要求51所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含Nle23、Nle39和Nle46。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3。
54.根据权利要求47-53中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:4。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少9个氨基酸取代。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2Rα表现出更大的功能活性，如在激动剂测定中通过半最大有效浓度(EC50)测量的，并且其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比例低于2:1、低于1.75:1、低于1.5:1、低于1.25:1、低于1:1、低于0.75:1或低于0.5:1。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ比对IL-2Rα表现出更大的亲和力，如通过解离常数(Kd)测量的，并且其中所述修饰的IL-2多肽/IL-2Rβ的KD小于300nM、小于250nM、小于225nM、小于200nM、小于175nM或小于150nM。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与IL-2受体α(IL-2Rα)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rα之间的结合相比减少了至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比减少了至多0％、至多1％、至多2％、至多5％、至多10％、至多15％、至多20％、至多25％或至多30％。
60.根据权利要求1-58中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与IL-2受体β(IL-2Rβ)之间的结合与野生型IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合相比增加了至少0.1％、至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:1至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽能够扩增CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞群体或其组合。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中当所述修饰的IL-2多肽与调节性T细胞(Treg细胞)的细胞群体接触时，所述修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中当所述修饰的IL-2多肽与调节性T细胞(Treg细胞)的细胞群体接触时，所述修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中当所述修饰的IL-2多肽与效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体接触时，所述修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中当所述修饰的IL-2多肽与效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体接触时，所述修饰的IL-2多肽使所述群体扩增了至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中由所述修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比值是约0.1至约15、约0.5至约10、约0.75至约5或约1至约2。
68.根据权利要求62-67中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述细胞群体是体外细胞群体、体内细胞群体或离体细胞群体。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽是合成的。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与另外的多肽缀合。
72.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％、85％或90％序列同一性的多肽序列。
73.根据权利要求72所述的修饰的IL-2多肽，其中所述序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整。
74.根据权利要求72或73所述的修饰的IL-2多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:3具有至少95％、99％或100％的序列同一性。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3的多肽序列。
76.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含与SEQ ID NO:4-22的任何一个具有至少约80％、85％或90％序列同一性的多肽序列。
77.根据权利要求76所述的修饰的IL-2多肽，其中所述序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整。
78.根据权利要求76或77所述的修饰的IL-2多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:4-22的任何一个具有至少95％、99％或100％的序列同一性。
79.根据权利要求76-78中任一项所述的修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3-22的任何一个的多肽序列。
80.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体包括：
多于一种修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽的每一种包含在残基35至75的区域中共价附接的第一聚合物，其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列，并且其中
所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽的至少90％具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的所述多于一种修饰的IL-2多肽的峰值分子量的±500Da内的分子量。
81.根据权利要求80所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至多1.5、至多1.2、至多1.1或至多1.05。
82.根据权利要求80或81所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。
83.根据权利要求80或81所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。
84.根据权利要求80或81所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。
85.根据权利要求80-84中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±200道尔顿内的分子量。
86.根据权利要求80-85中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。
87.根据权利要求80-85中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20道尔顿内的分子量。
88.根据权利要求80-87中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％具有如通过质谱测量的相同的分子量。
89.根据权利要求80-88中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述第一聚合物与氨基酸残基35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75附接，并且其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
90.根据权利要求80-89中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述第一聚合物的重均分子量是至少约3000Da、至少约6000Da、至少约12,000Da或至少约24,000Da。
91.根据权利要求80-90中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽的每一种包含与其共价附接的第二聚合物。
92.根据权利要求91所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述修饰的IL-2多肽的每一种包含与其共价附接的第三聚合物。
93.根据权利要求91或92所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述第二聚合物与残基42或45共价附接，其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
94.根据权利要求91-93中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述第二聚合物与残基F42Y或Y45共价附接，其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
95.根据权利要求92所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述第二聚合物和所述第三聚合物与残基42和45共价附接，其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
96.根据权利要求92或95所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述第二聚合物和所述第三聚合物与残基F42Y和Y45共价附接，其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。
97.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽群体包括：
多于一种聚合物，每一种聚合物共价附接至修饰的IL-2多肽的N末端处或残基35至75的区域中，其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列，并且其中
所述多于一种聚合物的至少95％具有在如通过质谱确定的所述多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。
98.根据权利要求80-97中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述群体包括至少100种、至少1000种或至少1000种修饰的IL-2多肽。
99.根据权利要求80-98中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述群体包括至少1μg、至少10μg或至少1mg修饰的IL-2多肽。
100.根据权利要求80-99中任一项所述的修饰的IL-2多肽群，其中所述多于一种修饰的IL-2多肽包含非典型氨基酸。
101.根据权利要求100所述的修饰的IL-2多肽群体，其中所述非典型氨基酸存在于选自以下的一个或更多个残基位置中：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74和75。
102.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)权利要求1-79中任一项所述的修饰的IL-2多肽或权利要求80-101中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体；和
b)药学上可接受的载体或赋形剂。
103.根据权利要求102所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为用于肠胃外或肠内施用。
104.根据102或103所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为用于静脉内或皮下施用。
105.根据权利要求102-104中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈冻干形式。
106.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的权利要求1-79中任一项所述的修饰的IL-2多肽、权利要求80-101中任一项所述的修饰的IL-2多肽群体或权利要求102-105中任一项所述的药物组合物。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述癌症是实体癌症或血液癌症。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述实体癌症是癌或肉瘤。
109.根据权利要求107所述的方法，其中所述实体癌症是肾癌、皮肤癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。
110.根据权利要求107所述的方法，其中所述实体癌症是转移性肾细胞癌(转移性RCC)或黑素瘤。
111.根据权利要求107所述的方法，其中所述血液癌症是白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
112.根据权利要求106-111中任一项所述的方法，所述方法包括重构所述修饰的IL-2多肽或所述药物组合物的冻干形式。
113.一种制备权利要求1-79中任一项所述的修饰的IL-2多肽的方法，所述方法包括：
a)合成所述修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段，
b)连接所述片段；以及
c)折叠所连接的片段。
114.根据权利要求113所述的方法，所述方法还包括将水溶性聚合物与所折叠、连接的片段附接。
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