EA033369B1 - Мутантные полипептиды интерлейкина-2 со сниженной аффинностью к высокоаффинному рецептору il-2 и неизменной аффинностью к рецептору il-2 с промежуточной аффинностью и их применение - Google Patents

Мутантные полипептиды интерлейкина-2 со сниженной аффинностью к высокоаффинному рецептору il-2 и неизменной аффинностью к рецептору il-2 с промежуточной аффинностью и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA033369B1
EA033369B1 EA201300896A EA201300896A EA033369B1 EA 033369 B1 EA033369 B1 EA 033369B1 EA 201300896 A EA201300896 A EA 201300896A EA 201300896 A EA201300896 A EA 201300896A EA 033369 B1 EA033369 B1 EA 033369B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
polypeptide
mutant
sequence
immunoconjugate
Prior art date
Application number
EA201300896A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300896A1 (ru
Inventor
Oliver Ast
Peter Bruenker
Anne Freimoser-Grundschober
Sylvia Herter
Thomas U Hofer
Ralf Hosse
Christian Klein
Ekkehard Moessner
Valeria G Nicolini
Pablo Umana
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of EA201300896A1 publication Critical patent/EA201300896A1/ru
Publication of EA033369B1 publication Critical patent/EA033369B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

В изобретении описывается мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2), содержащий три аминокислотные мутации, соответствующие аминокислотным заменам F42A, Y45A и L72G в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1), где указанные мутации аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа, или мутантный полипептид интерлейкина-2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 19, у которого снижена или отсутствует аффинность к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняется аффинность к рецептору с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Кроме того, описываюся выделенный полинуклеотид, кодирующий, указанный мутантный полипептид, экспрессионный вектор и клетки-хозяева, содержащие указанный выделенный полинуклеотид. В изобретении описывается также способ получения указанных мутантных полипептидов, фармацевтические композиции, содержащие указанные полипептиды, способы лечения рака и стимуляции иммунной системы, в которых применяются указанные композиции.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится в целом к мутантным полипептидам интерлейкина-2. Более конкретно, изобретение относится к мутантным полипептидам IL-2, которые обладают улучшенными свойствами при применении в качестве иммунотерапевтических агентов. Кроме того, изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим указанные мутантные полипептиды IL-2, к полинуклеотидным молекулам, кодирующим мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты, и векторам и клеткамхозяевам, содержащим указанные полипептидные молекулы. Изобретение относится также к способам получения мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, содержащим их фармацевтическим композициям и их применению.
Предпосылки создания изобретения
Интерлейкин-2 (IL-2), который называют также фактором роста T-клеток (TCGF), представляет собой глобулярный гликопротеин с молекулярной массой 15,5 кДа, который играет основную роль в образовании, выживании и гомеостазе лимфоцитов. Он включает 133 аминокислоты и состоит из четырех антипараллельных амфипатических α-спиралей, которые формируют четвертичную структуру, необходимую для его функционирования (Smith, Science, 240, 1988, p. 1169-1176; Bazan, Science 257, 1992, p. 410-413). Последовательности IL-2 из различных видов находятся в базе данных RefSeq NCBI под № NP000577 (человеческая), NP032392 (мышиная), NP446288 (крысиная) или NP517425 (шимпанзе).
IL-2 осуществляет свое действие посредством связывания с рецепторами IL-2 (IL-2R), которые содержат вплоть до трех индивидуальных субъединиц, различная ассоциация которых может приводить к образованию форм рецепторов, которые отличаются по их аффинности к IL-2. Ассоциация субъединиц α (CD25), β (CD122) и γ (yc, CD132) приводит к образованию тримерного высокоаффинного рецептора для IL-2. Димерный рецептор IL-2, состоящий из субъединиц β и γ, обозначают как IL-2R с промежуточной аффинностью. Субъединица α образует мономерный низкоаффинный рецептор IL-2. Хотя димерный рецептор IL-2 с промежуточной аффинностью связывается с IL-2 с более низкой примерно в 100 раз аффинностью по сравнению с тримерным высокоаффинным рецептором, как димерные, так и тримерные варианты рецептора IL-2 обладают способностью передавать сигналы после связывания с IL-2 (Minami et al., Annu Rev Immunol 11, 1993, p. 245-268). Поэтому α-субъединица, т.е. CD25, не имеет решающего значения для передачи сигналов IL-2. Она обеспечивает высокую аффинность связывания со своим рецептором, в то время как β-субъединица, т.е. CD 122, и γ-субъединица имеют решающее значение для трансдукции сигналов (Krieg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 2010, p. 11906-11911). Тримерные рецепторы IL-2, включающие CD25, экспрессируются (покоящимися) регуляторными CD4+, forkhead box P3 ((FoxP3)+-T-клетками (Treg). Они кратковременно индуцируются также на обычных активированных T-клетках, в то время как в покоящемся состоянии эти клетки экспрессируют только димерные рецепторы IL-2. Treg-клетки постоянно экспрессируют наиболее высокий уровень CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol. 6, 12005, p. 142-151).
IL-2 синтезируется главным образом активированными T-клетками, в частности CD4+-T-клеткамихелперами. Он стимулирует пролиферацию и дифференцировку T-клеток, индуцирует образование цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) и дифференцировку лимфоцитов периферической крови в цитотоксические клетки и лимфокин-активированные клетки-киллеры (LAK), усиливает экспрессию цитокинов и цитолитических молекул T-клетками, способствует пролиферации и дифференцировке B-клеток и синтезу иммуноглобулинов B-клетками и стимулирует образование, пролиферацию и активацию естественных клеток-киллеров (NK) (см., например, обзор у Waldmann, Nat. Rev. Immunol. 6, 2009, p. 595-601; Olejniczak и Kasprzak, Med. Sci. Monit. 14, 2008, RA179-89; Malek, Annu Rev. Immunol. 26, 2008, p. 453-479).
Способность IL-2 увеличивать популяции лимфоцитов in vivo и усиливать эффекторные функции этих клеток определяет противоопухолевые действия IL-2, что делает иммунотерапию на основе IL-2 привлекательным средством лечения определенных метастатических видов рака. По этой причине для пациентов с метастатической почечно-клеточной карциномой и злокачественной меланомой разрешено лечение высокими дозами IL-2.
Однако IL-2 обладает двойной функцией с позиций иммунного ответа, поскольку он не только опосредует размножение и активность эффекторных клеток, но также играет решающую роль в поддержании периферической иммунной толерантности.
Основным механизмом, лежащим в основе периферической самотолерантности, является индуцируемая IL-2 индуцированная активацией клеточная гибель (AICD) T-клеток. AICD представляет собой процесс, при котором полностью активированные T-клетки подвергаются запрограммированной клеточной гибели в результате взаимодействия с экспрессируемыми на клеточной поверхности рецепторами смерти, такими как CD95 (известный также как Fas) или TNF-рецептор. Когда активированные антигеном T-клетки, которые экспрессируют высокоаффинный IL-2-рецептор (после предварительного воздействия IL-2) в процессе пролиферации, повторно стимулируют антигеном с помощью комплекса T-клеточный рецептор (TCR)/CD3, то индуцируется экспрессия лиганда Fas (FasL) и/или фактора некроза опухолей (TNF), что делает клетки чувствительными к опосредуемому Fas апоптозу. Этот процесс зависит от IL-2 (Lenardo, Nature, 353, 1991, p. 858-861) и опосредуется STAT5. С помощью процесса AICD у T-лимфоцитов может создаваться толерантность не только к аутоантигенам, но также и к перси- 1 033369 стентным антигенам, таким как опухолевые антигены, которые, как очевидно, не являются созданным хозяином компонентом.
Кроме того, IL-2 участвует также в поддержании периферических регуляторных CD4+ CD25+-Tклеток (Treg) (Fontenot et al., Nature Immunol. 6, 2005, p. 1142-11451; D'Cruz и Klein, Nature Immunol. 6, 2005, p. 1152-1159; Maloy и Powrie, Nature Immunol. 6, 2005, p. 1171-1172), которые известны также как супрессорные T-клетки. Они подавляют разрушение эффекторными T-клетками их (собственной) мишени либо путем контакта типа клетка-клетка посредством ингибирования хелперной функции и активации T-клеток, либо посредством высвобождения иммуносупрессорных цитокинов, таких как IL-10 или TGF-β. Установлено, что истощение Treg-клеток повышает индуцируемый IL-2 противоопухолевый иммунитет (Imai et al., Cancer Sci. 98, 2007, p. 416-423).
Таким образом, IL-2 не является оптимальным агентом для ингибирования роста опухолей, поскольку в присутствии IL-2 либо образовавшиеся CTL могут распознавать опухоль как свою и подвергаться AICD, либо иммунный ответ может ингибироваться зависимыми от IL-2 Д^-клетками.
Другой проблемой, связанной с иммунотерапией на основе IL-2, являются побочные действия лечения рекомбинантным человеческим IL-2. У пациентов, получающих высокие дозы IL-2, часто обнаружены серьезные сердечно-сосудистые, легочные, почечные, печеночные, желудочно-кишечные, неврологические, кожные, гематологические и системные нежелательные явления, которые требуют интенсивного мониторинга и устранения в организме пациента. Большинство этих побочных действий можно объяснить развитием так называемого синдрома васкулярного (или капиллярного) просачивания (VLS), т.е. патологического повышения сосудистой проницаемости, приводящей к транссудации жидкости во многих органах (что вызывает, например, отек легких или кожи и поражение клеток печени) и внутрисосудистому истощению жидкости (что вызывает падение кровяного давления и компенсирующее увеличение частоты сердечных сокращений). Не существует другого лечения VLS, кроме отказа от IL-2. На пациентах изучали режимы, основанные на применении IL-2 в низких дозах с целью избегания VLS, однако полученные терапевтические результаты оказались ниже оптимальных. Предполагалось, что VLS вызывается высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей (TNF)-u из активированных IL-2 NK-клеток, однако в последние годы было установлено, что индуцированный IL-2 легочный отек возникает в результате непосредственного связывания IL-2 с эндотелиальными клетками легких, в которых происходит экспрессия от низкого до среднего уровня функциональных αβγ IL-2-рецепторов (Krieg et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 107, 2010, p. 11906-11911).
Для преодоления этих проблем, связанных с иммунотерапией на основе IL-2, применяли несколько подходов. Например, было установлено, что комбинация IL-2 с некоторыми моноклональными антителами к IL-2 повышает действия лечения IL-2 in vivo (Kamimura et al., J. Immunol. 177, 2006, p. 306-314; Boyman et al., Science, 311, 2006, p. 1924-1927). Согласно альтернативному подходу IL-2 подвергали мутации различными путями для снижения его токсичности и/или повышения его эффективности. Hu с соавторами (Blood, 101, 2003, p. 4853-4861, публикация патента США № 2003/0124678) заменяли остаток аргинина в положении 38 IL-2 на триптофан для элиминации активности IL-2 в отношении сосудистой проницаемости. Shanafelt с соавторами (Nature Biotechnol. 18, 2000, p. 1197-1202) заменяли посредством мутации аспарагин 88 на аргинин для повышения избирательности в отношении T-клеток относительно NK-клеток. Heaton с соавторами (Cancer Res. 53, 1993, p. 2597-2602; US № 5229109) интродуцировали две мутации, Arg38Ala и Phe42Lys, для снижения секреции провоспалительных цитокинов из NK-клеток. Gillies с соавторами (публикация патента США № 2007/0036752) заменяли три остатка IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg и Gln126Asp), с которыми связана аффинность к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, для снижения VLS. Gillies с соавторами (WO 2008/0034473) изменяли также путем мутации поверхность раздела IL-2 с CD25 путем аминокислотной замены Arg38Trp и Phe42Lys для снижения взаимодействия с CD25 и активации Tj-^-клеток с целью повышения эффективности. Для этой же цели Wittrup с соавторами (WO 2009/061853) получали мутанты IL-2 с повышенной аффинностью к CD25, но не активирующие рецептор, которые в результате действовали в качестве антагонистов. Мутации интродуцировали с целью нарушения взаимодействия с β- и/или γ-субъединицей рецептора.
Однако было установлено, что ни один из известных мутантов IL-2 не позволял преодолевать все вышеуказанные проблемы, связанные с иммунотерапией на основе IL-2, а именно, токсичность, которая обусловлена индукцией VLS, толерантность к опухолевым антигенам, вызываемую индукцией AICD, и иммуносупрессию, вызываемую активацией Н^-клеток. Таким образом, в данной области сохраняется потребность в дополнительном повышении терапевтической ценности белков IL-2.
- 2 033369
Краткое изложение сущности изобретения
В основу настоящего изобретения положены, в частности, данные о том, что проблемы, связанные с иммунотерапией на основе IL-2, определяются взаимодействием IL-2 с α-субъединицей тримерного высокоаффинного IL-2-рецептора.
Таким образом, первым объектом данного изобретения является мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2), содержащий три аминокислотные мутации, соответствующие аминокислотным заменам F42A, У45А и L72G в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1), где указанные мутации аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения мутантный полипептид интерлейкина-2 дополнительно содержит аминокислотную мутацию, соответствующую аминокислотной замене T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K или T3P в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1), где указанная мутация элиминирует сайт O-гликозилирования IL-2.
В наиболее предпочтительном варианте указанная аминокислотная мутация соответствует аминокислотной замене T3A.
Мутантный полипептид интерлейкина-2, являющийся объектом данного изобретения дополнительно содержит аминокислотную мутацию, соответствующую аминокислотной замене C125S, C125A, C125T или C125V в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1). Причем предпочтительно указанная аминокислотная мутация соответствует аминокислотной замене C125A.
Мутантный полипептид интерлейкина-2 в предпочтительном варианте осуществления изобретения представляет собой мутантную молекулу человеческого IL-2.
В наиболее предпочтительном варианте мутантный полипептид интерлейкина-2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 19, и у него снижена или отсутствует аффинность к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняется аффинность к рецептору с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
Мутантный полипептид интерлейкина-2 согласно изобретению может быть сцеплен по меньшей мере с одной антигенсвязывающей молекулой, в предпочтительном варианте с двумя антигенсвязывающими молекулами. Причем он может быть сцеплен карбоксиконцевой пептидной связью с первой антигенсвязывающей молекулой и аминоконцевой пептидной связью со второй антигенсвязывающей молекулой.
Предпочтительно указанная антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или фрагмент антитела или же указанная антигенсвязывающая молекула может быть выбрана из молекулы Fab и молекулы scFv или представляет собой молекулу иммуноглобулина, в частности молекулу IgG.
Вторым объектом данного изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий мутантный полипептид интерлейкина-2.
Третьим объектом является экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, и, наконец, клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или экспрессионный вектор.
Еще одним объектом данного изобретения является способ получения мутантного полипептида интерлейкина-2, который включает культивирование клетки-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии полинуклеотида, кодирующего мутантный полипептид интерлейкина-2, в результате чего продуцируется мутантный полипептид интерлейкина-2, и мутантный полипептид интерлейкина-2, полученный этим способом.
Наконец, изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащая мутантный полипептид интерлейкина-2 и фармацевтически приемлемый носитель, и применению мутантного полипептида интерлейкина-2 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.
Еще одним объектом данного изобретения являются способ лечения рака, который предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, и способ стимуляции иммунной системы, который тоже предусматривает введение эффективного количества этой композиции.
- 3 033369
Подробное описание изобретения
Определения.
Понятия, применяемые в настоящем описании, имеют значения, общепринятые в данной области, если ниже специально не указано иное.
В контексте настоящего описания понятие интерлейкин-2 или IL-2, если не указано иное, относится к любому нативному IL-2 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы). Под понятие подпадает непроцессированный IL-2, а также любая форма IL-2, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты IL-2, например сплайсинговые варианты или аллельные варианты. В качестве примера аминокислотная последовательность человеческого IL-2 представлена в SEQ ID NO: 1. Непроцессированный человеческий IL-2 дополнительно содержит расположенный на N-конце состоящий из 20 аминокислот сигнальный пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 272, который отсутствует в зрелой молекуле IL-2.
Подразумевается, что понятие мутант IL-2 или мутантный полипептид IL-2 в контексте настоящего описания относится к любым мутантным формам различных форм молекулы IL-2, включая полноразмерный IL-2, укороченные формы IL-2 и формы, в которых IL-2 сцеплен с другой молекулой, например, путем слияния или химической конъюгации. Подразумевается, что понятие полноразмерный при использовании касательно IL-2 означает зрелую молекулу IL-2, которая имеет встречающуюся в естественных условиях длину. Например, полноразмерный человеческий IL-2 относится к молекуле, которая содержит 133 аминокислоты (см., например, SEQ ID NO: 1). Различные формы мутантов IL-2 отличаются наличием по меньшей мере одной аминокислотной мутации, которая оказывает воздействие на взаимодействие IL-2 с CD25. Такая мутация может включать замену, делецию, укорочение или модификацию аминокислотного остатка дикого типа, локализованного в норме в этом положении. Предпочтительными являются мутации, полученные путем аминокислотной замены. Если не указано иное, то в настоящем описании мутант IL-2 может быть обозначен как мутантная пептидная последовательность IL-2, мутантный полипептид IL-2, мутантный белок IL-2 или мутантный аналог IL-2.
В контексте настоящего описания обозначение различных форм IL-2 сделано относительно последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. В контексте настоящего описания для одной и той же мутации можно применять различные обозначения. Например, мутацию, приводящую к замене фенилаланина в положении 42 на аланин, можно обозначать как 42A, A42, A42, F42A или Phe42Ala.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие аминокислотная мутация относится к аминокислотным заменам, делециям, инсерциям и модификациям. Можно применять любую комбинацию замены, делеции, инсерции и модификации для создания конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например пониженной способностью связываться с CD25. Аминокислотная последовательность с делециями и инсерциями включает амино- и/или карбоксиконцевые делеции и инсерции аминокислот. Примером концевой делеции является делеция остатка аланина в положении 1 полноразмерного человеческого IL-2. Аминокислотными мутациями являются аминокислотные замены. Для изменения, например, характеристик связывания полипептида IL-2 наиболее предпочтительными являются неконсервативные аминокислотные замены, т.е. замена одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую другие структурные и/или химические свойства. Аминокислотные замены включают замену гидрофобной аминокислоты на гидрофильную. Аминокислотные замены включают замену на не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты или на производные встречающихся в естественных условиях 20 стандартных аминокислот (например, на 4-гидроксипролин, 3-метилгистидин, орнитин, гомосерин, 5-гидроксилизин). Аминокислотные мутации можно создавать с помощью генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайт-направленный мутагенез, ПЦР, синтез генов и т.п. Подразумевается, что можно применять также методы изменения боковой группы аминокислоты, отличные от методов генетической инженерии, такие как химическая модификация.
В контексте настоящего описания форма дикого типа IL-2 представляет собой форму IL-2, которая является такой же, что и мутантный полипептид IL-2, за исключением того, что в форме дикого типа присутствует аминокислота дикого типа в каждом аминокислотном положении мутантного полипептида IL-2. Например, если мутант IL-2 представляет собой полноразмерный IL-2 (т.е. IL-2, не слитый или не конъюгированный с любой другой молекулой), то форма дикого типа этого мутанта представляет собой полноразмерный нативный IL-2. Если мутант IL-2 представляет собой слияние IL-2 и другого полипептида, кодируемого по ходу транскрипции относительно IL-2 (например, цепь антитела), то форма дикого типа этого мутанта IL-2 представляет собой IL-2 с аминокислотной последовательностью дикого типа, слитой с таким же кодируемым по ходу транскрипции полипептидом. Кроме того, если мутант IL-2 представляет собой укороченную форму IL-2 (мутантная или модифицированная последовательность в неукороченной части IL-2), то форма дикого типа этого мутанта IL-2 представляет собой аналогично укороченный IL-2, который имеет последовательность дикого типа. Для целей сравнения аффинности связывания IL-2-рецептора или биологической активности различных форм мутантов IL-2 и соответст
- 4 033369 вующей формы дикого типа IL-2 под понятие дикий тип подпадают формы IL-2, содержащие одну или несколько аминокислотных мутаций, которые не влияют на связывание IL-2-рецептора по сравнению со встречающимся в естественных условиях нативным IL-2, таких, например, как замена цистеина в положении, соответствующем остатку 125 человеческого IL-2, на аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения для целей настоящего изобретения форма дикого типа IL-2 содержит аминокислотную замену C125A (см. SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид IL-2 дикого типа, с которым сравнивают мутантный полипептид IL-2, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления изобретения полипептид IL-2 дикого типа, с которым сравнивают мутантный полипептид IL-2, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
В контексте настоящего описания понятие CD25 или α-субъединица рецептора IL-2, если не указано иное, относится к любой нативной CD25 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы). Под понятие подпадает полноразмерная непроцессированная CD25, а также любая форма CD25, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты CD25, например сплайсинговые варианты или аллельные варианты. CD25 может представлять собой человеческую CD25. В качестве примера аминокислотная последовательность человеческой CD25 (с сигнальной последовательностью, Avi-меткой и His-меткой) представлена в SEQ ID NO: 278.
В контексте настоящего описания понятие высокоаффинный рецептор IL-2 относится к гетеротримерной форме рецептора IL-2, состоящей из рецепторной γ-субъединицы (которая известна также как общая γ-субъединица цитокинового рецептора, γ0, или CD 132), рецепторной β-субъединицы (известной также как CD122 или p70) и рецепторной α-субъединицы (известной также как CD25 или p55). В противоположность этому, понятие рецептор IL-2 с промежуточной аффинностью относится к рецептору IL-2, который включает только γ-субъединицу и β-субъединицу, но не содержит α-субъединицы (см., например, обзор Olejniczak и Kasprzak, Med. Sci. Monit. 14, 2008, RA179-189). Понятие аффинность относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между индивидуальным сайтом связывания молекулы (например, рецептора) и его партнера по связыванию (например, лиганда). Если не указано иное, то в контексте настоящего описания понятие аффинность связывания относится к присущей компонентам связывающейся пары (например, рецептору и лиганду) аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1. Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно, как правило, характеризовать с помощью константы диссоциации (KD), которая представляет собой отношение констант скорости реакции диссоциации и ассоциации (koff и kon соответственно). Так, эквивалентные аффинности могут соответствовать различным константам скорости, если соотношение констант скорости остается таким же. Аффинность можно оценивать общепринятыми методами, известными в данной области, включая представленные в настоящем описании.
Аффинность полипептида IL-2 мутантного или дикого типа в отношении различных форм рецептора IL-2 можно определять с помощью изложенного в разделе Примеры метода резонанса поверхностного плазмона (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например устройство Biacore (фирма GE Healthcare), и рецепторные субъединицы, которые можно получать с помощью метода рекомбинантной экспрессии (см., например, Shanafelt et al., Nature Biotechnol. 18, 2000, p. 1197-1202). Альтернативно этому, аффинность связывания мутантов IL-2 с различными формами рецептора IL-2 можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известна способность к экспрессии одной или другой формы рецептора. Ниже описаны конкретные приведенные в качестве иллюстрации примеры вариантов измерения аффинности связывания.
Под регуляторной T-клеткой или Тгед-клеткой подразумевается специализированный тип CD4+-T-клетки, которая может подавлять ответы других Т-клеток. Тгед-клетки отличаются способностью экспрессировать α-субъединицу рецептора IL-2 (CD25) и фактор транскрипции forkhead box P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev. Immunol. 22, 2004, p. 531-562), и они играют решающую роль в индукции и поддержании периферической самотолерантности к антигенам, включая те, которые экспрессируются опухолями. Тгед-клеткам требуется IL-2 для их функционирования и развития и индукции их способности оказывать подавляющее действие.
В контексте настоящего описания понятие эффекторные клетки относится к популяции лимфоцитов, которые опосредуют цитотоксические действия IL-2. Эффекторные клетки представляют собой эффекторные Т-клетки, такие как цитотоксические CD8+-T-клетки, NK-клетки, лимфокин-активированные клетки-киллеры (LAK) и макрофаги/моноциты.
В контексте настоящего описания понятие антигенсвязывающий фрагмент относится к полипептидной молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминантой. Антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью направлять субстанцию, к которой он присоединен (например, цитокин или второй антигенсвязывающий фрагмент), к сайту-мишени, например к специфическому типу опухолевой клетки или стромы опухоли, несущей антигенную детерминанту. Антигенсвязывающие фрагменты включают антитела и их фрагменты, что будет дополнительно описано ниже. Антигенсвязы
- 5 033369 вающие фрагменты могут содержать антигенсвязывающий домен антитела, который содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. Антигенсвязывающие фрагменты могут включать константные области антитела, что будет дополнительно описано ниже и известно в данной области. Пригодные константные области тяжелых цепей включают любой из пяти изотипов: α, δ, ε, γ или μ. Пригодные константные области легких цепей включают любой из двух изотипов: κ и λ.
Понятие специфически связывается означает, что связывание является избирательным в отношении антигена и его можно отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающего фрагмента связываться со специфической антигенной детерминантой можно определять с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или других методик, известных специалисту в данной области, например с помощью методики на основе резонанса поверхностного плазмона (осуществляя анализ с помощью устройства Biacore) (Liljeblad et al., Glyco J. 17, 2000, p. 323-329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, p. 217-229).
В контексте настоящего описания понятие антигенная детерминанта является синонимом понятий антиген и эпитоп и относится к сайту (например, участку, состоящему из смежных аминокислот, или конформационной конфигурации, состоящей из различных областей несмежных аминокислот) на полипептидной макромолекуле, с которой связывается антигенсвязывающий фрагмент с образованием комплекса антигенсвязывающий фрагмент-антиген. Пригодные антигенные детерминанты можно обнаружить, например, на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхности других больных клеток, в свободном состоянии в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ECM).
В контексте настоящего описания понятие полипептид относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (которые обозначают также как пептидные связи). Понятие полипептид относится к любой цепи, состоящей из двух или большего количества аминокислот, и не подразумевает, что продукт имеет конкретную длину. Так, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любое иное общепринятое понятие, относящееся к цепи, состоящей из двух или большего количества аминокислот, все, подпадают под определение полипептид, и понятие полипептид можно применять вместо или взаимозаменяемо с любым из указанных понятий. Подразумевается также, что понятие полипептид относится к продуктам, которые несут постэкспрессионные модификации полипептида, включая (но не ограничиваясь только ими) гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление или модификацию с помощью не встречающихся в естественных условиях аминокислот. Полипептид можно получать из встречающегося в естественных условиях биологического источника или можно получать с помощью технологии рекомбинантной ДНК, и его необязательно транслировать с созданной нуклеотидной последовательности. Его можно создавать любым путем, включая химический синтез. Полипептид, предлагаемый в изобретении, может состоять примерно из 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь различную трехмерную структуру, хотя они необязательно должны иметь указанную структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой обозначают как полипептиды, имеющие укладку, а полипептиды, которые не обладают определенной трехмерной структурой, но которые легче могут адаптироваться к большому количеству различных конформаций, обозначают как полипептиды, не имеющие укладку.
Под выделенным полипептидом или его вариантом или производным подразумевают полипептид, который не находится в его естественном окружении. При этом не требуется какого-то конкретного уровня очистки. Например, выделенный полипептид можно удалять из его нативного или естественного окружения. Полученные путем рекомбинации полипептиды и белки, экспрессируемые в клеткаххозяевах, рассматриваются как выделенные, если они представляют собой нативные или рекомбинантные полипептиды, которые отделены, фракционированы или частично или полностью очищены с помощью любого приемлемого метода.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательностикандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референспоследовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции при необходимости брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом какиелибо консервативные замены не учитываются при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например с использованием публично доступных компьютерных программ, таких как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательно
- 6 033369 стей. Однако для целей настоящего изобретения величину процента идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием предназначенной для сравнения последовательностей компьютерной программы ALIGN-2. Предназначенная для сравнения последовательностей компьютерная программа ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., и исходный код помещен на хранение вместе с документацией для пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 представляет собой публично доступную программу фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния или ее можно компилировать из исходного кода. Программу ALIGN-2 можно компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую версию UNIX V4.0D. В программе ALIGN-2 все параметры для сравнения последовательностей являются заданными и не должны изменяться. В ситуациях, когда ALIGN-2 применяют для сравнения аминокислотных последовательностей % идентичности аминокислотных последовательностей данной аминокислотной последовательности А относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б (которую другими словами можно обозначать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или отличается определенным % идентичности аминокислотной последовательности относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б), рассчитывают следующим образом:
100 х X/Y, где X обозначает количество аминокислотных остатков, оцененных программой сравнительного анализа последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при сравнительном анализе последовательностей А и Б с помощью указанной программы;
Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в Б.
Должно быть очевидно, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, то % идентичности аминокислотной последовательности А относительно аминокислотной последовательности Б не должен быть равен % идентичности аминокислотной последовательности Б относительно аминокислотной последовательности А. Если специально не указано иное, то в контексте настоящего описания все величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают согласно процедуре, описанной в последнем из предшествующих параграфов, с помощью компьютерной программы ALIGN-2.
Понятие полинуклеотид относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкции, например матричной РНК (мРНК), РНК вирусного происхождения или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или не традиционную связь (например, амидную связь, такую, которая присутствует в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Понятие молекула нуклеиновой кислоты относится к любому одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.
Под выделенной нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, т.е. ДНК или РНК, которая отделена от ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий входящий в вектор терапевтический полипептид, рассматривается как выделенный. Другими примерами выделенного полинуклеотида являются рекомбинантные полинуклеотиды, присутствующие в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или полностью) полинуклеотиды, находящиеся в растворе. Выделенный полинуклеотид включает молекулу полинуклеотида, входящую в клетки, которые в норме содержат молекулу полинуклеотида, но молекула полинуклеотида присутствует вне хромосомы или имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в хромосоме в естественных условиях.
Выделенные молекулы РНК включают полученные in vivo или in vitro РНК-транскрипты, а также формы с позитивной и негативной цепью и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают также указанные молекулы, полученные с помощью синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или могут включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции. Под нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, имеющей/имеющим нуклеотидную последовательность, которая, например, на 95% идентична нуклеотидной референс-последовательности, подразумевается, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична референс-последовательности, за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для получения полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 95% нуклеотидной референс-последовательности, вплоть до 5% нуклеотидов в референспоследовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид или вплоть до 5% нуклеотидов от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место в положениях на 5'- или З'-конце нуклеотидной референс-последовательности или в ином положении между этими концевыми положениями, и их встраивают либо индивидуально между остатками в референспоследовательности, либо в референс-последовательность в виде одной или нескольких смежных групп. На практике вопрос о том, идентична ли конкретная полинуклеотидная последовательность по меньшей
- 7 033369 мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидной последовательности, можно решать, как правило, с использованием известных компьютерных программ, например, указанных выше для полипептидов (например, ALIGN-2).
Понятие кассета экспрессии относится к полинуклеотиду, полученному с помощью рекомбинации или синтеза, который содержит серии специфических нуклеотидных элементов, которые обеспечивают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантную кассету экспрессии можно встраивать в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, рекомбинантная кассета экспрессии, представляющая собой часть экспрессионного вектора, включает среди прочих последовательностей подлежащую транскрипции нуклеотидную последовательность и промотор. Кассета экспрессии может содержать полинуклеотидные последовательности, которые кодируют мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты.
Понятие вектор или экспрессионный вектор является синонимом понятия экспрессионная конструкция и относится к молекуле ДНК, которую применяют для интродукции и обеспечения экспрессии конкретного гена, с которой он функционально связан в клетке-мишени. Понятие включает вектор, представляющий собой самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Экспрессионный вектор содержит кассету экспрессии. Экспрессионные векторы позволяют осуществлять транскрипцию больших количеств стабильной мРНК. Когда экспрессионный вектор находится внутри клетки-мишени, то молекула рибонуклеиновой кислоты или белок, который кодируется геном, продуцируется в результате клеточного механизма транскрипции и/или трансляции. Экспрессионный вектор может содержать кассету экспрессии, которая включает полинуклеотидные последовательности, которые кодируют мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты.
Понятие искусственный относится к синтетической или не полученной из клетки-хозяина композиции, например к синтезированному химически олигонуклеотиду.
В контексте настоящего описания понятия клетка-хозяин, клеточная линия-хозяин и клеточная культура-хозяин используются взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. Трансформанты и трансформированные клетки клеток-хозяев включают первичные рассматриваемые клетки, а также культуры, выведенные из них, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть строго идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может нести мутации. Под данное понятие подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга или селекции исходная трансформированная клетка.
В контексте настоящего описания понятие антитело используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.
В контексте настоящего описания понятия полноразмерное антитело, интактное антитело и полное антитело используются взаимозаменяемо, и они относятся к антителу, имеющему строение, практически сходное со строением нативного антитела, или имеющему тяжелые цепи, которые содержат указанную в настоящем описании Fc-область.
Понятие фрагмент антитела относится к молекуле, отличной от интактного антитела, содержащей часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антител являются (но не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, димерные антитела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител. Обзор некоторых фрагментов антител см., например, у Hudson et al., Nat. Med. 9, 2003, p. 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, у Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, p. 269-315; см. также WO 93/16185 и US № 5571894 и 5587458. Обсуждение Fab- и F(ab')2-фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладающих удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US № 5869046. Димерные антитела (диабоди) представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9, 2003, p. 129-134 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 1993, p. 6444-6448. Тримерные (триабоди) и тетрамерные (тетрабоди) антитела описаны также у Hudson et al., Nat. Med. 9, 2003, p. 129-134. Фрагменты антител можно создавать с помощью различных методик, включая (но не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, E.coli или фага), как указано в настоящем описании.
Понятие молекула иммуноглобулина относится к белку, имеющему структуру встречающегося в естественных условиях антитела. Например, иммуноглобулины класса IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, связанные дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к C-концу
- 8 033369 каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (Vh), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой расположены три константных домена (Ch1, Ch2 и Ch3), которые называют также константной областью тяжелой цепи. Аналогично этому, в направлении от N-конца к С-концу каждая легкая цепь содержит вариабельную область (Vl), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой расположен константный домен легкой цепи (Cl), который называют также константной областью легкой цепи. Тяжелая цепь иммуноглобулина может относиться к одному из пяти классов, обозначенных как α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых дополнительно подразделяют на подклассы, например γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) и α2 (IgA2). Легкая цепь иммуноглобулина может относиться к одному из двух типов, обозначенных как каппа (к) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена. Иммуноглобулин, как правило, состоит из двух молекул Fab и Fc-домена, которые соединены через шарнирную область иммуноглобулина.
Понятие антигенсвязывающий домен относится к части антитела, которая содержит область, специфически связывающуюся и являющуюся комплементарной части антигена или полному антигену. Антигенсвязывающий домен может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела (которые называют также вариабельными областями антитела). Предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (Vl) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (Vh) антитела.
Понятие вариабельная область или вариабельный домен относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, которая/который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (Vh и Vl соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt et al., Kuby Immunology, 6-е изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, p. 91). Одного Vh- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена.
Понятие гипервариабельный участок или HVR в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательность которых является гипервариабельной и/или которые образуют структуры в виде петель (гипервариабельные петли). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в Vh (Hl, H2, H3) и три в Vl (LI, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из определяющих комплементарность участков (CDR), последние отличаются наиболее выраженной вариабельностью последовательности и/или участвуют в распознавании антигенов. Кроме CDR1, присутствующего в Vh, CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. Понятие гипервариабельные участки (HVR) относится также к определяющим комплементарность участкам (CDR), и в контексте настоящего описания эти понятия используются взаимозаменяемо касательно положений вариабельной области, которые формируют антигенсвязывающие области. Эта конкретная область описана у Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 1983 и у Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 1987, p. 901-917, причем эти определения относятся к перекрывающимся аминокислотным остаткам или поднаборам аминокислотных остатков при их сравнении друг с другом. Однако в контексте настоящего описания подразумевается возможность применения любого определения CDR антитела или его вариантов. Соответствующие аминокислотные остатки, из которых состоят CDR, как они определены в каждой из процитированных выше ссылок, представлены в сравнении в табл. 1. Точные номера остатков, которые образуют конкретный CDR, должны варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области на основе данных об аминокислотной последовательности вариабельной области антитела легко могут определить, какие остатки входят в конкретный CDR.
Таблица l
Определения CDR1
Кэб от Хотиа 9 AbM
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-32
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1Нумерация всех входящих в CDR остатков дана в соответствии с номенклатурой, предложенной Кэботом с соавторами (см. ниже). 2AbM относится к CDR, как они определены программой для моделирования антител AbM компании Oxford Molecular Group.
- 9 033369
Кэбот с соавторами предложили также систему нумерации (номенклатуру) последовательностей вариабельных областей, которую можно применять для любого антитела. Обычный специалист в данной области может однозначно применять эту систему нумерации по Кэботу к любой последовательности вариабельной области, не имея никаких экспериментальных данных, кроме сведений о самой последовательности. В контексте настоящего описания понятие нумерация по Кэботу относится к системе нумерации, описанной у Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, изд-во U.S. Dept. of Health and Human Services, 1983. Если не указано иное, то ссылки на нумерацию положений конкретных аминокислотных остатков в вариабельной области антитела даны в соответствии с системой нумерации по Кэботу.
Нумерация полипептидных последовательностей в Перечне последовательностей (т.е. SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33 и т.д.) не представляет собой нумерацию в соответствии с системой Кэбота. Однако в компетенции обычного специалиста в данной области является превращение нумерации последовательностей в Перечне последовательностей в нумерацию по Кэботу.
Каркасные участки или FR''-участки представляют собой участки вариабельных доменов, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR). FR вариабельного домена, как правило, представлены четырьмя FR-доменами: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Понятие класс антител относится к типу константного домена или константной области, характерному для тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.
В контексте настоящего описания понятие Fc-область относится к C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие относится к нативной последовательности Fc-областей и вариантам Fc-областей. Хотя пограничные последовательности Fc-области в тяжелой цепи IgG могут слегка варьироваться, как правило, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) Fc-области может либо присутствовать, либо не присутствовать.
Модификация, усиливающая гетеродимеризацию представляет собой манипуляцию с пептидным каркасом или посттрансляционные модификации полипептида, например тяжелой цепи иммуноглобулина, которая уменьшает или препятствует ассоциации полипептида с идентичным полипептидом с образованием гомодимера. В контексте настоящего описания модификация, усиливающая гетеродимеризацию, включает, прежде всего, различные модификации, осуществляемые с каждым из двух полипептидов, требуемые для образования димера, при этом модификации дополняют друг друга таким образом, чтобы усиливать ассоциацию двух полипептидов. Например, модификация, усиливающая гетеродимеризацию, может изменять структуру или заряд одного или обоих полипептидов, что требуется для образования димера, таким образом, чтобы улучшать их ассоциацию стерически или электростатически соответственно. Гетеродимеризация имеет место между двумя неидентичными полипептидами, такими как тяжелые цепи двух иммуноглобулинов, при этом дополнительные компоненты иммуноконъюгата слитых друг с другом тяжелых цепей (например, полипептида IL-2) не являются одинаковыми. В иммуноконъюгатах модификация, усиливающая гетеродимеризацию, затрагивает тяжелую(ые) цепь(и), в частности Fc-домен молекулы иммуноглобулина. Модификация, усиливающая гетеродимеризацию, может быть аминокислотной мутацией, в частности аминокислотной заменой. Модификация, усиливающая гетеродимеризацию, может представлять собой индивидуальную аминокислотную мутацию, в частности аминокислотную замену, в каждой из двух тяжелых цепей иммуноглобулина.
Понятие эффекторные функции при его использовании касательно антител относится к видам биологической активности, присущим Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: способность связываться с C1q и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), способность связываться с Fc-рецептором, антителообусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора) и активация B-клеток.
Активирующий Fc-рецептор представляет собой Fc-рецептор, который после взаимодействия с Fc-областью антитела осуществляет процесс передачи сигналов, которые стимулируют несущую рецептор клетку осуществлять эффекторные функции. Активирующие Fc-рецепторы включают Fc'/RIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FU/RIIa (CD32) и FcoRI (CD89).
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятия конструирование, сконструированный, инженерия включают любую манипуляцию с пептидным каркасом или посттрансляционные модификации встречающегося в естественных условиях или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Инженерия включает модификации аминокислотной последовательности, схемы гликозилирования или группы боковых цепей индивидуальных аминокислот, а также комбинации указанных под
- 10 033369 ходов.
В контексте настоящего описания понятие иммуноконъюгат относится к молекуле полипептида, которая включает по меньшей мере один фрагмент IL-2 и по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент. Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один фрагмент IL-2 и по меньшей мере два антигенсвязывающих фрагмента. Конкретные иммуноконъюгаты практически состоят из одного фрагмента IL-2 и двух антигенсвязывающих фрагментов, сцепленных с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. Антигенсвязывающий фрагмент может быть сцеплен с фрагментом IL-2 с помощью различных взаимодействий и в широком разнообразии конфигураций, указанных в настоящем описании.
В контексте настоящего описания понятие контрольный антигенсвязывающий фрагмент относится к антигенсвязывающему фрагменту, который должен быть свободен от других антигенсвязывающих фрагментов и эффекторных фрагментов. Например, при осуществлении сравнения иммуноконъюгата Fab-IL-2-Fab с контрольным антигенсвязывающим фрагментом контрольный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой свободный Fab, при этом иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab и свободная молекула Fab могут, оба, специфически связываться с одной и той же антигенной детерминантой.
В контексте настоящего описания понятия первый и второй касательно антигенсвязывающих фрагментов и др. применяют для удобства различия, когда присутствует более одного фрагмента каждого типа. Подразумевается, что применение этих понятий не определяет специфический порядок или ориентацию иммуноконъюгата, если специально не указано иное.
Понятие эффективное количество агента относится к количеству, необходимому для обеспечения физиологического изменения в клетке или ткани, в которую его вводят.
Понятие терапевтически эффективное количество агента, например фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному при применении в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество агента, например, элиминирует, снижает, замедляет, минимизирует или предупреждает нежелательные явления заболевания.
Индивидуум или субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающие представляют собой (но не ограничиваясь только ими) одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы, кроме человека, такие как мартышки), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). Предпочтительно индивидуум или субъект представляет собой человека.
Понятие фармацевтическая композиция относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, обладающих неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.
Фармацевтически приемлемый носитель относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
В контексте настоящего описания понятие лечение (и его грамматические вариации, такие как лечить или процесс лечения) относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.
Подробное описание изобретения
В основу настоящего изобретения положена задача создать мутантный полипептид IL-2, обладающий улучшенными свойствами для иммунотерапии. В частности, в основу изобретения положена задача элиминировать фармакологические свойства IL-2, которые участвуют в проявлении его токсичности, но не имеют решающего значения для эффективности IL-2. Как указано выше, различные формы рецептора IL-2 состоят из различных субъединиц и характеризуются различной аффинностью к IL-2. Рецептор IL-2 с умеренной аффинностью, состоящий из β- и γ-субъединиц рецептора, экспрессируется на покоящихся эффекторных клетках, и его присутствия достаточно для обеспечения передачи сигналов IL-2. Высокоаффинный рецептор IL-2, который дополнительно содержит α-субъединицу рецептора, экспрессируется главным образом на регуляторных T-клетках (Treg), а также на активированных эффекторных клетках, при этом их взаимодействие с IL-2 может усиливать опосредуемую Тгед-клетками иммуносупрессию или индуцированную активацией клеточную гибель (AICD) соответственно. Таким образом, не ограничиваясь какой-либо теорией, можно предположить, что снижение или аннулирование аффинности IL-2 к
- 11 033369 α-субъединице рецептора IL-2 может снижать индуцируемую IL-2 понижающую регуляцию функции эффекторных клеток посредством регуляторных T-клеток и развитие толерантности опухолей с помощью процесса AICD. С другой стороны, сохранение аффинности рецептора IL-2 с промежуточной аффинностью поддерживает индукцию пролиферации и активацию эффекторных клеток типа NK и
T-клеток с помощью IL-2.
В данной области уже известно несколько мутантов IL-2, однако при создании изобретения были обнаружены новые аминокислотные мутации полипептида IL-2, которые являются наиболее предпочтительными для придания IL-2 характеристик, требуемых для иммунотерапии.
Мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2) должен содержать аминокислотную мутацию, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
Мутанты человеческого IL-2 (hIL-2) с пониженной аффинностью к CD25 можно создавать, например, путем аминокислотной замены аминокислоты в положении 35, 38, 42, 43, 45 или 72 или их комбинации. Примерами аминокислотных замен являются K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. Конкретные мутанты IL-2, которые содержат мутацию в аминокислотном положении, соответствующем остатку 42, 45 или 72 человеческого IL-2 или их комбинации, характеризуются практически одинаковой аффинностью к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью и обладают пониженной в значительной степени аффинностью к α-субъединице рецептора IL-2 и высокоаффинному рецептору IL-2 по сравнению с формой дикого типа мутанта IL-2.
Другая характеристика перспективных мутантов может представлять собой способность индуцировать пролиферацию несущих рецептор IL-2 T-клеток и/или NK-клеток, способность индуцировать передачу сигналов IL-2 в несущих рецептор IL-2 T-клетках и/или NK-клетках, способность воздействовать на образование интерферона (IFN)-y в качестве вторичного цитокина NK-клетками, пониженную способность индуцировать выработку вторичных цитокинов, прежде всего IL-10 и TNF-α, мононуклеарными клетками периферической крови (PMBC), пониженную способность активировать регулярные T-клетки, пониженную способность индуцировать апоптоз T-клеток и пониженным профилем токсичности in vivo.
Аминокислотная мутация, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, находится в положении, соответствующем остатку 72 человеческого IL-2. Эта аминокислотная мутация может быть аминокислотной заменой, ее выбирают из группы, включающей L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K.
Итак, для решения поставленной задачи может быть получен мутантный полипептид IL-2, содержащий первую и вторую аминокислотную мутацию, которые аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. Причем первая аминокислотная мутация может находиться в положении, соответствующем остатку 72 человеческого IL-2. Указанная первая аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. Указанная вторая аминокислотная мутация может находиться в положении, отличном от положения первой аминокислотной мутации. Указанная вторая аминокислотная мутация может находиться в положении, выбранном из положений, соответствующих остаткам 35, 38, 42, 43 и 45 человеческого IL-2. Указанную аминокислотную замену выбирают из группы, включающей K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, К43Е, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. Мутантный полипептид IL-2 может содержать третью аминокислотную мутацию, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. Указанная третья аминокислотная мутация может находиться в положении, отличном от положений указанных первой и второй аминокислотных мутаций. Указанная третья аминокислотная мутация может находиться в положении, выбранном из положений, соответствующих остаткам 35, 38, 42, 43 и 45 человеческого IL-2. Указанную третью аминокислотную замену выбирают из группы, включающей K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R и Y45K. Мутантный полипептид IL-2 может содержать три аминокислотные мутации, которые аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, но сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. Указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены, выбранные из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K.
- 12 033369
Указанные аминокислотные мутации снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 по меньшей мере в 5 раз, в частности по меньшей мере в 10 раз, более конкретно по меньшей мере в 25 раз. У полипептидов, в которых присутствует более одной аминокислотной мутации, которая снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, комбинация указанных аминокислотных мутаций может снижать аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 50 раз или даже по меньшей мере в 100 раз. Указанная аминокислотная мутация или комбинация аминокислотных мутаций может аннулировать аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, в результате чего никакое связывание не удается обнаружить с помощью резонанса поверхностного плазмона, что будет описано ниже.
Считается, что достигается практически сходное связывание с рецептором с промежуточной аффинностью, т.е. сохранение аффинности мутантного полипептида IL-2 к указанному рецептору, когда для мутанта IL-2 характерна аффинность, составляющая более чем примерно 70% от аффинности формы дикого типа мутанта IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. Мутанты IL-2 могут характеризоваться аффинностью, составляющей более чем примерно 80% и даже более чем примерно 90% от указанной аффинности.
Уменьшение аффинности IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 в сочетании с элиминацией O-гликозилирования IL-2 позволяет получать белок IL-2 с улучшенными свойствами. Например, элиминация сайта O-гликозилирования позволяет получать более гомогенный продукт при экспрессии мутантного полипептида IL-2 в клетках млекопитающих, таких как клетки CHO или HEK.
Таким образом, мутантный полипептид IL-2 содержит дополнительную аминокислотную мутацию, которая элиминирует сайт O-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого IL-2. Указанная дополнительная аминокислотная мутация, которая элиминирует сайт O-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого IL-2, представляет собой аминокислотную замену. Примерами аминокислотных замен являются T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K и T3P. Мутантный полипептид IL-2 представляет собой практически полноразмерную молекулу человеческого IL-2. Мутантный полипептид IL-2 может содержать последовательность SEQ ID NO: 1 по меньшей мере с одной аминокислотной мутацией, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, но сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2, который содержит SEQ ID NO: 1 без указанной мутации. Мутантный полипептид IL-2 может содержать последовательность SEQ ID NO: 3 по меньшей мере с одной аминокислотной мутацией, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, но сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2, который содержит SEQ ID NO: 3 без указанной мутации.
Мутантный полипептид IL-2 может вызывать один или несколько клеточных ответов, выбранных из группы, включающей пролиферацию активированного T-лимфоцита, дифференцировку активированного T-лимфоцита, активность цитотоксической T-клетки (CTL), пролиферацию активированной B-клетки, дифференцировку активированной B-клетки, пролиферацию естественной клетки-киллера (NK), дифференцировку NK-клетки, секрецию активированной T-клетки или NK-клетки и противоопухолевую цитотоксичность NK/лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK).
Мутантный полипептид IL-2 обладает пониженной способностью индуцировать передачу сигналов IL-2 в регуляторных T-клетках по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа, индуцирует пониженную индуцированную активацией клеточную гибель (AICD) T-клеток по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа, обладает пониженным профилем токсичности in vivo по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа, обладает пролонгированным временем полужизни в плазме по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
Мутантный полипептид IL-2 может содержать четыре аминокислотные замены в положениях, соответствующих остаткам 3, 42, 45 и 72 человеческого IL-2. Конкретные аминокислотные замены представляют собой T3A, F42A, Y45A и L72G. Как продемонстрировано в приведенных ниже примерах, указанный несущий четыре мутации (четырехмутантный) полипепид IL-2 характеризуется не выявляемым уровнем связывания с CD25, пониженной способностью индуцировать апоптоз T-клеток, пониженной способностью индуцировать передачу сигналов IL-2 в T^-клетках и пониженным профилем токсичности in vivo. Однако он сохраняет способность активировать передачу сигналов IL-2 в эффекторных клетках, индуцировать пролиферацию эффекторных клеток и создание NK-клетками IFN-γ в качестве вторичного цитокина.
Кроме того, указанный мутантный полипептид IL-2 обладает дополнительными предпочтительными свойствами, такими как пониженная гидрофобность поверхности, хорошая стабильность и высокий выход экспрессии, что описано в примерах. Неожиданно было установлено, что указанный мутантный полипептид IL-2 обладает также пролонгированным временем полужизни в сыворотке по сравнению с IL-2 дикого типа.
- 13 033369
Мутанты IL-2, помимо наличия мутаций в области IL-2, которая образует поверхность раздела между IL-2 и CD25, или в сайте гликозилирования, могут иметь также одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности, расположенной вне указанных областей. Такие дополнительные мутации в человеческом IL-2 могут обеспечивать дополнительные преимущества, такие как повышенный уровень экспрессии или стабильности. Например, цистеин в положении 125 можно заменять на нейтральную аминокислоту, такую как серин, аланин, треонин или валин, получая C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 или C125V IL-2 соответственно, что описано в US № 4518584. Как описано в указанном документе, можно также изымать путем делеции N-концевой остаток аланина IL-2, получая такой мутант, как des-A1 C125S или des-A1 C125A. Альтернативно этому или в дополнение к этому, мутант IL-2 может включать мутацию, при которой метионин, присутствующий в норме в положении 104 человеческого IL-2 дикого типа, заменен на нейтральную аминокислоту, такую как аланин (см. US № 5206344). Образовавшиеся мутанты, например des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2 или M104A C125S IL-2 (эти и другие мутанты описаны в US № 5116943 и у Weiger et al., Eur. J. Biochem. 180, 1989, p. 295-300), можно применять в сочетании с конкретными мутациями IL-2 указанными мутациями.
Таким образом, мутантный полипептид IL-2 содержит дополнительную аминокислотную мутацию в положении, соответствующем остатку 125 человеческого IL-2. Указанная дополнительная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену C125A.
Специалисту в данной области очевидно определять, какие дополнительные мутации могут обеспечивать дополнительные преимущества для целей изобретения. Например, должно быть очевидно, что аминокислотные мутации в последовательности IL-2, которые снижают или аннулируют аффинность IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, такие как D20T, N88R или Q126D (см., например, US 2007/0036752), могут оказаться непригодными для включения в мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении.
Мутантный полипептид IL-2 может содержать последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 19.
Мутантные полипептиды IL-2 наиболее целесообразно применять в контексте слитых белков IL-2, таких как несущие IL-2 иммуноконъюгаты. Такие слитые белки содержат мутантный полипептид IL-2 слитый с не-ГЬ-2-фрагментом. Не-ГЬ-2-фрагмент может представлять собой синтетический или встречающийся в естественных условиях белок или его часть или вариант. Примерами не-ГЬ-2-фрагментов являются альбумин, домены антител, такие как Fc-домены или антигенсвязывающие домены иммуноглобулинов.
Несущие IL-2 иммуноконъюгаты представляют собой слитые белки, содержащие антигенсвязывающий фрагмент и фрагмент, представляющий собой IL-2. Они существенно повышают эффективность терапии на основе IL-2 в результате направленного переноса IL-2, например, в микроокружение опухоли. Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой полное антитело или иммуноглобулин или его часть или вариант, обладающий биологической функцией, такой как специфическая аффинность к связыванию антигена.
Преимущества терапии с использованием иммуноконъюгатов достаточно очевидны. Например, антигенсвязывающий фрагмент иммуноконъюгата распознает специфический для опухоли эпитоп, и это приводит к направленному переносу молекулы иммуноконъюгата к области опухоли. При этом можно обеспечивать высокие концентрации IL-2 в микроокружения опухоли, что позволяет достигать активации и пролиферации различных иммунных эффекторных клеток, указанных в настоящем описании, при использовании существенно более низкой дозы иммуноконъюгата по сравнению с требуемой для неконъюгированного IL-2. Кроме того, указанное применение IL-2 в форме иммуноконъюгатов позволяет снижать дозы самого цитокина, ограничивая, тем самым, потенциальное проявление нежелательных побочных действий IL-2, a направленный перенос IL-2 к специфической области в организме с помощью иммуноконъюгата может приводить также к снижению системной экспозиции и в результате к уменьшенным побочным воздействиям по сравнению с получаемыми при использовании неконъюгированного IL-2. Кроме того, удлинение времени полужизни иммуноконъюгата в циркуляторном русле по сравнению с неконъюгированным IL-2 важно для эффективности иммуноконъюгата. Однако эта характеристика содержащих IL-2 иммуноконъюгатов может вновь усугублять потенциальные побочные действия молекулы IL-2: поскольку при существенно удлиненном времени полужизни циркулирующего в кровотоке иммуноконъюгата, содержащего IL-2, относительно неконъюгированного IL-2 возрастает вероятность того, что IL-2 или другие компоненты молекулы слитого белка будут активировать компоненты, которые обычно присутствуют в сосудистой сети. Это относится также и к другим слитым белкам, которые содержат IL-2, слитый с другим фрагментом, таким как Fc или альбумин, приводящим к удлинению времени полужизни IL-2 в циркуляторном русле. Таким образом, мутантный полипептид IL-2 может быть сцеплен по меньшей мере с одним не-ГЬ-2-фрагментом с образованием слитого белка, т.е. мутантный полипептид IL-2 объединен пептидной связью с не-!Ь-2-фрагментом. Мутантный полипептид IL-2 может быть сцеплен с первым и вторым не-ГЬ-2-фрагментами. Мутантный полипептид IL-2 может быть объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим фрагментом,
- 14 033369 а второй антигенсвязывающий фрагмент объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью либо I) с мутантным полипептидом IL-2, либо II) с первым антигенсвязывающим фрагментом. Мутантный полипептид IL-2 может быть объединен карбоксиконцевой пептидной связью с указанным первым не-ГЕ-2-фрагментом и аминоконцевой пептидной связью с указанным вторым не-ГЕ-2-фрагментом. Указанный не-ГЕ-2-фрагмент может представлять собой обеспечивающий направленный перенос фрагмент, антигенсвязывающий фрагмент (образуя, тем самым, иммуноконъюгат с мутантным полипептидом IL-2, который описан более подробно ниже). Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой антитело или фрагмент антитела, например полноразмерное антитело. Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу иммуноглобулина, в частности молекулу иммуноглобулина класса IgG, более предпочтительно молекулу иммуноглобулина подкласса IgGi. Мутантный полипептид IL-2 может быть объединен аминоконцевой пептидной связью с одной из тяжелых цепей иммуноглобулина. Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой фрагмент антитела, который включает антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу Fab или молекулу scFv. Антигенсвязывающий фрагмент может быть направлен к антигену, присутствующему на опухолевой клетке или в окружении опухолевой клетки, который выбирается из группы, включающей белок активации фибробластов (FAP), А1-домен тенасцина-C (TNC A1), А2-домен тенасцина-C (TNC A2), экстра-домен B фибронектина (EDB), карциноэмбриональный антиген (CEA) и ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP). Если мутантный полипептид IL-2 сцеплен более чем с одним антигенсвязывающим фрагментом, например первым и вторым антигенсвязывающими фрагментами, то каждый антигенсвязывающий фрагмент можно независимо выбирать из различных форм антител или фрагментов антител. Например, первый антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу scFv. Каждый из указанных первого и второго антигенсвязывающих фрагментов может представлять собой молекулу scFv или молекулу Fab. Аналогично этому, если мутантный полипептид IL-2 сцеплен более чем с одним антигенсвязывающим фрагментом, например первым и вторым антигенсвязывающими фрагментами, то антиген, к которому направлен каждый антигенсвязывающий фрагмент, можно выбирать независимо друг от друга. Указанный первый и второй антигенсвязывающие фрагменты могут быть направлены к различным антигенам или к одному и тому же антигену. Как описано выше, антиген предпочтительно представляет собой антиген, присутствующий на опухолевой клетке или в окружении опухолевой клетки, более предпочтительно антиген выбран из группы, включающей белок активации фибробластов (FAP), A1-домен тенасцина-C (TNC A1), A2-домен тенасцина-C (TNC A2), экстра-домен B фибронектина (EDB), карциноэмбриональный антиген (CEA) и ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP). Антигенсвязывающая область может дополнительно включать любые особенности, индивидуально или в сочетании друг с другом, которые описаны касательно антигенсвязывающих доменов иммуноконъюгатов.
Иммуноконъюгаты.
Иммуноконъюгат содержит мутантный полипептид IL-2, который несет одну или несколько аминокислотных мутаций, аннулирующих или снижающих аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 и сохраняющих аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, и по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент. Аминокислотная мутация, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, находится в положении, выбранном из положения, соответствующего остатку 42, 45 и 72 человеческого IL-2. Указанная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. Аминокислотная мутация может находиться в положении, соответствующем остатку 72 человеческого IL-2. Указанная аминокислотная мутация может представлять собой аминокислотную замену, выбранную из группы, включающей L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. Мутантный полипептид IL-2 не содержит аминокислотную мутацию в положении, соответствующем остатку 38 человеческого IL-2. Мутантный полипептид IL-2, входящий в иммуноконъюгат, содержит, по меньшей мере, первую и вторую аминокислотные мутации, которые аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. Указанные первая и вторая аминокислотные мутации находятся в двух положениях, выбранных из положений, которые соответствуют остаткам 42, 45 и 72 человеческого IL-2. Они могут представлять собой аминокислотные замены, выбранные из группы, включающей F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. Мутантный полипептид IL-2 может также включать любые особенности, индивидуально или в сочетании, описанные в предыдущих разделах касательно мутантных полипептидов IL-2. Указанный мутантный полипептид IL-2 может быть
- 15 033369 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с указанным антигенсвязывающим фрагментом, который входит в иммуноконъюгат, т.е. иммуноконъюгат представляет собой слитый белок. Указанный антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой антитело или фрагмент антитела, включающий антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. Антигенсвязывающая область может дополнительно включать любые особенности, индивидуально или в сочетании друг с другом, которые описаны касательно антигенсвязывающих доменов.
Форматы иммуноконъюгатов.
Наиболее приемлемые форматы иммуноконъюгатов описаны в публикации PCT WO 2011/020783, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Такие иммуноконъюгаты содержат по меньшей мере два антигенсвязывающих домена. Таким образом, иммуноконъюгат содержит, по меньшей мере, первый мутантный полипептид IL-2 и, по меньшей мере, первый и второй антигенсвязывающие фрагменты. Указанные первый и второй антигенсвязывающие фрагменты независимо выбраны из группы, включающей молекулу Fv, в частности молекулу scFv, и молекулу Fab. Указанный первый мутантный полипептид IL-2 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим фрагментом, а второй антигенсвязывающий фрагмент объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью либо I) с мутантным полипептидом IL-2, либо II) с первым антигенсвязывающим фрагментом. Итак, иммуноконъюгат практически состоит из первого мутантного полипептида IL-2 и первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, сцепленных с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. Указанные форматы обладают преимуществом, заключающимся в том, что они связываются с высокой аффинностью с антигеном-мишенью (таким как опухолевый антиген), но характеризуются лишь мономерным связыванием с рецептором IL-2, что позволяет избегать направленного переноса иммуноконъюгата к несущим рецептор IL-2 иммунным клеткам, расположенным в областях, отличных от сайта-мишени. Первый мутантный полипептид IL-2 может быть объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим фрагментом и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со вторым антигенсвязывающим фрагментом. Первый антигенсвязывающий фрагмент может быть объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со вторым антигенсвязывающим фрагментом. Первый антигенсвязывающий фрагмент может быть объединен аминоконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно объединен карбоксиконцевой пептидной связью со вторым антигенсвязывающим фрагментом. Мутантный полипептид IL-2 может быть объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первой вариабельной областью тяжелой цепи и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со второй вариабельной областью тяжелой цепи. Мутантный полипептид IL-2 может быть объединен карбоксиконцевой пептидной связью с первой вариабельной областью легкой цепи и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью со второй вариабельной областью легкой цепи. Первая вариабельная область тяжелой или легкой цепи может быть сцеплена карбоксиконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно сцеплена аминоконцевой пептидной связью со второй вариабельной областью тяжелой или легкой цепи. Первая вариабельная область тяжелой или легкой цепи может быть сцеплена аминоконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно сцеплена карбоксиконцевой пептидной связью со второй вариабельной областью тяжелой или легкой цепи. Мутантный полипептид IL-2 может быть сцеплен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью первого Fab и дополнительно объединен аминоконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью второго Fab. Тяжелая или легкая цепь первого Fab может быть объединена карбоксиконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно объединена аминоконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью второго Fab. Тяжелая или легкая цепь первого Fab может быть объединена аминоконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно объединена карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью второго Fab. Иммуноконъюгат может содержать, по меньшей мере, первый мутантный полипептид IL-2, объединенный аминоконцевой пептидной связью с одной или несколькими молекулами scFv и дополнительно объединенный карбоксиконцевой пептидной связью с одной или несколькими молекулами scFv.
Другие наиболее приемлемые форматы иммуноконъюгатов содержат молекулу иммуноглобулина в качестве антигенсвязывающего фрагмента. В одном из таких вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2, представленный в настоящем описании, и молекулу иммуноглобулина, в частности молекулу IgG, более предпочтительно молекулу IgG1. Иммуноконъюгат может содержать не более одного мутантного полипептида IL-2. Молекула иммуноглобулина может представлять собой человеческий иммуноглобулин, где мутантный полипептид IL-2 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с молекулой иммуноглобулина. Иммуноконъюгат может практически состоять из мутантного полипептида IL-2 и молекулы иммуноглобулина, в частности молекулы IgG, более предпочтительно молекулы IgG1, которые сцеплены с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. Мутантный полипептид IL-2 может быть сцеплен на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой одной из тяжелых цепей имму
- 16 033369 ноглобулина. Молекула иммуноглобулина может содержать в Fc-домене модификацию, усиливающую гетеродимеризацию двух неидентичных тяжелых цепей иммуноглобулина. Сайт наиболее сильного белок-белкового взаимодействия двух полипептидных цепей Fc-домена человеческого IgG находится в Сн3-домене Fc-домена. Таким образом, указанная модификация находится в Сн3-домене Fc-домена. Указанная модификация представляет собой модификацию типа knob-in-hole (типа выступ-впадина), которая включает модификацию, приводящую к образованию выступа в одной из тяжелых цепей иммуноглобулина, и модификацию, приводящую к образованию впадины в другой одной из тяжелых цепей иммуноглобулина. Технология knob-into-hole описана, например, в US № 5731168; 7695936; у Ridgway et al., Prot. Eng. 9, 1996, p. 617-621 и Carter, J. Immunol. Meth. 248, 2001, p. 7-15). В целом метод включает интродукцию выпуклости (выступ) на поверхности раздела первого полипептида и соответствующей полости (впадина) на поверхности раздела второго полипептида, в результате выпуклость может помещаться в полость, усиливая таким образом образование гетеродимера и препятствуя образованию гомодимера. Выпуклости создают путем замены аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности раздела первого полипептида на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или сходного размера с выпуклостями создают на поверхности раздела второго полипептида путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с менее крупными боковыми цепями (например, аланин или треонин). Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза или посредством синтеза пептидов. Модификация, приводящая к получению выступа, представляет собой аминокислотную замену T366W в одной из двух тяжелых цепей иммуноглобулина, а модификация, приводящая к получению впадины, представляет собой аминокислотные замены T366S, L368A и Y407V в другой одной из двух тяжелых цепей иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая модификацию, приводящую к получению выступа, дополнительно содержит аминокислотную замену S354C, а тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая модификацию, приводящую к получению впадины, дополнительно содержит аминокислотную замену Y349C. Интродукция этих двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя тяжелыми цепями, дополнительно стабилизирующего димер (Carter, J. Immunol. Methods, 248, 2001, p. 7-15).
Мутантный полипептид IL-2 может быть сцеплен с карбоксиконцевой аминокислотой тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей модификацию, приводящую к получению выступа.
Модификация, усиливающая гетеродимеризацию двух неидентичных полипептидных цепей, представляет собой модификацию, опосредующую определяемые электростатическим действием воздействия, например, описанные в публикации PCT WO 2009/089004. В целом указанный метод включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков на поверхности раздела двух полипептидных цепей на заряженные аминокислотные остатки, в результате чего образование гомодимера становится электростатически невыгодным, а гетеродимеризация становится электростатически выгодной.
Fc-домен придает иммуноконъюгату предпочтительные фармакокинетически свойства, включая удлиненное время полужизни в сыворотке, что обусловливает достаточное накопление в ткани-мишени и предпочтительное соотношение распределения в ткани-крови. Однако в то же время это может приводить к нежелательному направленному переносу иммуноконъюгата к клеткам, экспрессирующим Fc-рецепторы, а не к предпочтительным несущим антиген клеткам. Кроме того, совместная активация путей передачи сигналов Fc-рецептора может приводить к высвобождению цитокинов, которые в сочетании с полипептидом IL-2 и имеющим продолжительное время полужизни иммуноконъюгатом приводят к избыточной активации рецепторов цитокинов и приводят к серьезным побочным действиям при системном введении. В соответствии с этим описано, что с иммуноконъюгатами, содержащими канонический IgG-IL-2, связаны реакции на инфузию (см., например, King et al., J. Clin. Oncol. 22, 2004, p. 44634473)).
Таким образом, молекулу иммуноглобулина, которая входит в иммуноконъюгат, можно создать так, чтобы она обладала пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором. Иммуноглобулин может содержать в его Fc-домене одну или несколько аминокислотных мутаций, которые снижают аффинность связывания иммуноконъюгата с Fc-рецептором. Как правило, одна или несколько одинаковых аминокислотных мутаций присутствуют в каждой из двух тяжелых цепей иммуноглобулина. Указанные аминокислотные мутации снижают аффинность связывания иммуноконъюгата с Fc-рецептором по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз.
В случае более одной аминокислотных мутаций, которые снижают аффинность связывания иммуноконъюгата с Fc-рецептором, комбинация указанных аминокислотных мутаций может снижать аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз или по меньшей мере в 50 раз. Иммуноконъюгат, содержащий сконструированную молекулу иммуноглобулина, характеризуется менее чем 20%, в частности менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 5% от аффинности связывания с Fc-рецептором, характерной для иммуноконъюгата, содержащего несконструированную молекулу иммуноглобулина. Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор, а именно Fcy-рецептор, более конкретно FcyRIIIa-, FcyRI- или FcyRIIa-рецептор. Предпочтительно
- 17 033369 уменьшается связывание с каждым из этих рецепторов, снижается также аффинность связывания с компонентом системы комплемента, в частности аффинность связывания с C1q, но не снижается аффинность связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Практически такое же связывание с FcRn, т.е. сохранение аффинности связывания иммуноглобулина с указанным рецептором, достигается, когда иммуноглобулин (или иммуноконъюгат, содержащий указанный иммуноглобулин) характеризуется аффинностью связывания с FcRn, составляющей более чем примерно 70% от аффинности связывания с FcRn несконструированной формы иммуноглобулина (или иммуноконъюгата, содержащего несконструированную форму иммуноглобулина). Иммуноглобулины или иммуноконъюгаты, содержащие указанные иммуноглобулины, могут характеризоваться аффинностью, составляющей более чем примерно 80% и даже более чем примерно 90% от указанной выше аффинности. Иммуноглобулин может содержать аминокислотную замену в положении P329 тяжелой цепи иммуноглобулина (нумерация по Кэботу). Эта аминокислотная замена может представлять собой P329A или P329G, в частности P329G. Иммуноглобулин может содержать дополнительную аминокислотную замену в положении, выбранном из S228, E233, L234, L235, N297 и P331 тяжелой цепи иммуноглобулина Дополнительная аминокислотная замена может представлять собой S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. Иммуноглобулин может также содержать аминокислотные замены в положениях P329, L234 и L235 тяжелой цепи иммуноглобулина, более конкретно аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G (LALA P329G).
Такая комбинация аминокислотных замен практически полностью аннулирует связывание с Fcy-рецептором молекулы человеческого IgG и в результате снижает эффекторную функцию, включая антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC).
Иммуноконъюгат может содержать один или несколько сайтов протеолитического расщепления, локализованных между мутантным полипептидом IL-2 и антигенсвязывающими фрагментами.
Компоненты иммуноконъюгата (например, антигенсвязывающие фрагменты и/или мутантный полипептид IL-2) могут быть сцеплены непосредственно или через различные линкеры, в частности пептидные линкеры, содержащие одну или несколько аминокислот, как правило, примерно 2-20 аминокислот. Приемлемыми неиммуногенными линкерными пептидами являются, например, линкерные пептиды (G4S)n, (SG4)n или G4(SG4)n, в которых n обозначает число, как правило, от 1 до 10, как правило, от 2 до 4.
Антигенсвязывающие фрагменты.
Антигенсвязывающий фрагмент иммуноконъюгата, как правило, представляет собой молекулу полипептида, которая связывается со специфической антигенной детерминантой и обладает способностью направлять субстанцию, с которой она соединена (например, мутантный полипептид IL-2 или второй антигенсвязывающий фрагмент), к сайту-мишени, например к конкретному типу опухолевой клетки или стромы опухоли, которая несет антигенную детерминанту. Иммуноконъюгат может связываться с антигенной детерминантой, например, присутствующей на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхности других больных клеток, находящейся в свободном состоянии в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ECM).
Примерами опухолевых антигенов являются (но не ограничиваясь только ими) MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, дипептидилпептидаза IV (DPPIV), белок, связывающий аденозиндеаминазу (ADAbp), циклофилин b, антиген, ассоциированный с колоректальным раком (CRC)-C017-1A/GA733, карциноэмбриональный антиген (CEA) и его иммуногенные эпитопы CAP-1 и CAP-2, etv6, aml1, простатический антиген (PSA) и его иммуногенные эпитопы PSA-1, PSA-2 и PSA-3, простатический специфический мембранный антиген (PSMA), T-клеточный рецептор/CD3-зета-цепь, семейство MAGE опухолевых антигенов (например, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGEA7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-АП, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), семейство GAGE опухолевых антигенов (например, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, тирозиназа, p53, семейство MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-фетопротеин, E-кадхерин, α-катенин, β-катенин и γ-катенин, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, белок аденоматозного полипоза coli (APC), фодрин, коннексин 37, Ig-идиотип, p15, gp75, ганглиозиды GM2 и GD2, вирусные продукты, такие как белки человеческого вируса папилломы, семейство Smad опухолевых антигенов, lmp-1, P1A, кодируемый EBV ядерный антиген (EBNA)-1, гликогенфосфолипаза головного мозга, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 и CT-7 и c-erbB-2.
Примерами вирусных антигенов являются (но не ограничиваясь только ими) гемагглютинин вируса гриппа, LMP-1 вируса Эпштейна-Барра, гликопротеин вируса гепатита C E2, gp160 ВИЧ, и gp120 ВИЧ.
Примерами антигенов ECM являются (но не ограничиваясь только ими) синдекан, гепараназа, интегрины, остеопонтин, белки семейства link, кадхерины, ламинин, ламинин типа EGF, лектин, фибронектин, белки семейства notch, тенасцин и матриксин.
Иммуноконъюгаты можно связывать со следующими специфическими антигенами клеточной поверхности, включающими (но не ограничиваясь только ими) FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2 (поверхностный антиген T-клеток), CD3 (гетеромультимер, ассоциированный с TCR), CD22 (B-клеточный рецептор), CD23 (низкоаффинный IgE-рецептор), CD30 (цитокиновый рецептор ), CD33 (поверхностный анти- 18 033369 ген клеток миелоидного ряда), CD40 (рецептор фактора некроза опухолей), IL-6R (ТЬб-рецептор), CD20,
MCSP и PDGFPR (рецептор тромбоцитарного фактора роста β).
Иммуноконъюгат содержит два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, где каждый из этих антигенсвязывающих фрагментов специфически связывается с одной и той же антигенной детерминантой. Иммуноконъюгат содержит два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, где каждый из этих антигенсвязывающих фрагментов специфически связывается с различными антигенными детерминантами.
Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой антитело любого типа или его фрагмент, который сохраняет специфичность связывания с антигенной детерминантой. Фрагменты антитела включают (но не ограничиваясь только ими) Ун-фрагменты, VL-фрагменты. Fab-фрагменты, F(ab')2фрагменты, scFv-фрагменты, Fv-фрагменты, мини-тела (мини-боди), димерные антитела, тримерные антитела и тетрамерные антитела (см., например, Hudson и Souriau, Nature Med. 9, 2003, p. 129-134).
Наиболее приемлемые антигенсвязывающие фрагменты описаны в публикации PCT WO 2011/020783, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими для экстра-домена B фибронектина (EDB), или по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые могут конкурировать с моноклональным антителом L19 за связывание с эпитопом EDB (см., например, публикацию PCT WO 2007/128563 A1, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, полученного из моноклонального антитела L19, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, полученного из моноклонального антитела L19. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, полученного из моноклонального антитела L19, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, полученного из моноклонального антитела L19. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой первый scFv, полученный из моноклонального антитела L19, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью со вторым scFv, полученным из моноклонального антитела L19.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность SEQ ID NO: 199 или ее вариант, который сохраняет функциональность. Иммуноконъюгат может содержать легкую цепь Fab, полученного из моноклонального антитела L19. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 201 или ее варианту, который сохраняет функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 201 или их вариантам, которые сохраняют функциональность. Полипептиды могут быть ковалентно связаны, например, дисульфидным мостиком.
Иммуноконъюгат также может содержать по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими в отношении A1-домена тенасцина (TNC-A1). Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые могут конкурировать с моноклональным антителом F16 за связывание с эпитопом TNC-A1 (см., например, публикацию PCT WO 2007/128563 A1, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими в отношении A1- и/или A4-домена тенасцина (TNC-A1 или TNC-A4, или TNC-A1/A4). Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении A1-домена тенасцина, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении A1-домена тенасцина. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении A1-домена тенасцина, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении A1-домена тенасцина. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой первый scFv, специфический в отношении A1-домена тенасцина, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью со вторым scFv, специфическим в отношении A1-домена тенасцина. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении TNC-A1, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
- 19 033369
Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 33, либо SEQ ID NO: 35 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 29, либо SEQ ID NO: 31 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 33, либо SEQ ID NO: 35 или их вариантам, сохраняющим функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 29, либо SEQ ID NO: 31 или их вариантам, сохраняющим функциональность.
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата может кодироваться полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо SEQ ID NO: 34, либо SEQ ID NO: 36. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата может кодироваться полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 34, либо SEQ ID NO: 36. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата может кодироваться полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 32. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата может кодироваться полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 30, либо SEQ ID NO: 32.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 203 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 205, либо SEQ ID NO: 215 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 207, либо SEQ ID NO: 237 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 205 и SEQ ID NO: 207 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 215 и SEQ ID NO: 237 или их вариантам, сохраняющим функциональность.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 204. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 204. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо SEQ ID NO: 206, либо SEQ ID NO: 216. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 206, либо SEQ ID NO: 216. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо SEQ ID NO: 208, либо SEQ ID NO: 238. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 208, либо SEQ ID NO: 238.
Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими в отношении A2-домена тенасцина (TNC-A2). Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении A2-домена тенасцина, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении A2-домена тенасцина. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении A2-домена тенасцина, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении A2-домена тенасцина. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении TNC-A2, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
- 20 033369
Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 и SEQ ID NO: 187 или их варианты, сохраняющие функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 и SEQ ID NO: 185 или их варианты, сохраняющие функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 и SEQ ID NO: 187 или их варианты, сохраняющие функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 и SEQ ID NO: 185 или их варианты, сохраняющие функциональность.
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 и SEQ ID NO: 188. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 и SEQ ID NO: 188. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 и SEQ ID NO: 186. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 и SEQ ID NO: 186.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 и SEQ ID NO: 245 или их варианты, сохраняющие функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 и SEQ ID NO: 251 или их варианты, сохраняющие функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 и SEQ ID NO: 245 или их варианты, сохраняющие функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 и SEQ ID NO: 251 или их варианты, сохраняющие функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 241 и либо SEQ ID NO: 249, либо SEQ ID NO: 251 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 243 и либо SEQ ID NO: 247, либо SEQ ID NO: 249 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 245 и SEQ ID NO: 247 или их вариантам, сохраняющим функциональность.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 и SEQ ID NO: 246. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 242,
- 21 033369
SEQ ID NO: 244 и SEQ ID NO: 246. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 и SEQ ID NO: 252. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 и SEQ ID NO: 252.
Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один, как правило, два или более количество антигенсвязывающих фрагментов, специфических в отношении фибробласт-активирующего белка (FAP). Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении FAP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении FAP. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении FAP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении FAP. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении FAP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63,
SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135,
SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 и SEQ ID NO: 155 или их варианты, сохраняющие функциональность.
Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61,
SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85,
SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133,
SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 и SEQ ID NO: 153 или их варианты, сохраняющие функциональность.
Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63,
SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135,
SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 и SEQ ID NO: 155 или их варианты, сохраняющие функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 и SEQ ID NO: 153 или их варианты, сохраняющие функциональность.
Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 41 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 39. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 51 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 49. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 111 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 109. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 143 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 141. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 151 и
- 22 033369 последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 149.
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 и SEQ ID NO: 156.
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 и SEQ ID NO: 156.
Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 и SEQ ID NO: 154.
Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 и SEQ ID NO: 154.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 и SEQ ID NO: 229 или их варианты, сохраняющие функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235 и SEQ ID NO: 239 или их варианты, сохраняющие функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 211 или SEQ ID NO: 219 или их вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 233 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 и SEQ ID NO: 229 или их варианты, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 231 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 213 и SEQ ID NO: 235 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 217 и SEQ ID NO: 239 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 233 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 221 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 223 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по
- 23 033369 меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 225 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 227 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 229 и SEQ ID NO: 231 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать две полипептидные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 211 и SEQ ID NO: 233 или их вариантам, сохраняющим функциональность.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301 и SEQ ID NO: 315 или их варианты, сохраняющие функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303 и SEQ ID NO: 317 или их варианты, сохраняющие функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 297 или ее варианту, сохраняющему функциональность, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 299 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 233 или ее варианту, сохраняющему функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 301 или ее варианту, сохраняющему функциональность, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 303 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 231 или ее варианту, сохраняющему функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 315 или ее варианту, сохраняющему функциональность, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 317 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 233 или ее варианту, сохраняющему функциональность.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 и SEQ ID NO: 230. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 и SEQ ID NO: 230. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 и SEQ ID NO: 240. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 и SEQ ID NO: 240.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 и SEQ ID NO: 316. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 и SEQ ID NO: 316. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 и SEQ ID NO: 318. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 и SEQ ID NO: 318.
Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, специфических в отношении ассоциированного с меланомой хонд
- 24 033369 роитинсульфат-протеогликана (MCSP). Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении MCSP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении MCSP. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении MCSP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении MCSP. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении MCSP, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2.
Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 189, либо последовательности SEQ ID NO: 193 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 191, либо последовательности SEQ ID NO: 197 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 189, либо последовательности SEQ ID NO: 193 или их вариантам, сохраняющим функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 191, либо последовательности SEQ ID NO: 197 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 189, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 191. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 193, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 191.
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 190, либо последовательности SEQ ID NO: 194. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 190, либо SEQ ID NO: 194. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 192, либо последовательности SEQ ID NO: 198. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 192, либо SEQ ID NO: 198.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 253, либо SEQ ID NO: 257 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 255, либо SEQ ID NO: 261 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 253, либо SEQ ID NO: 257 или их вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична либо SEQ ID NO: 255, либо SEQ ID NO: 261 или их вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 253 или ее вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 255 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 257 или ее вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 255 или ее вариантам, сохраняющим функциональность.
- 25 033369
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 254, либо последовательности SEQ ID NO: 258. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 254, либо SEQ ID NO: 258. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична либо последовательности SEQ ID NO: 256, либо последовательности SEQ ID NO: 262. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью либо SEQ ID NO: 256, либо SEQ ID NO: 262.
Иммуноконъюгат может содержать по меньшей мере один, как правило, два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, специфических в отношении карциноэмбрионального антигена (CEA).
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь первого Fab, специфического в отношении CEA, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой цепью второго Fab, специфического в отношении CEA. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой легкая цепь первого Fab, специфического в отношении CEA, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, который, в свою очередь, объединен карбоксиконцевой пептидной связью с легкой цепью второго Fab, специфического в отношении CEA. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, в которой тяжелая цепь иммуноглобулина, специфического в отношении CEA, объединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 313 или ее варианту, сохраняющему функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 311 или ее варианту, сохраняющему функциональность. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноконъюгата могут содержать последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 313 или ее варианту, сохраняющему функциональность, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 311 или ее варианту, сохраняющему функциональность.
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 314. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 314. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 312. Последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающих фрагментов иммуноконъюгата кодируется полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 312.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 319 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 321 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 323 или ее вариантам, сохраняющим функциональность. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 319 или ее вариантам, сохраняющим функциональность, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 319 или ее вариантам, сохраняющим функциональность, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 323 или ее вариантам, сохраняющим функциональность.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 320. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 320. Иммуно- 26 033369 конъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 322. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 322.
Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 324. Иммуноконъюгат может содержать полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 324.
Антигенсвязывающие фрагменты могут включать фрагменты, имеющие последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны пептидным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 23-261 (нечетные номера), 297-303 (нечетные номера), 311 и 313, включая их функциональные фрагменты или варианты. Антигенсвязывающие фрагменты могут содержать последовательности SEQ ID NO: 23-261 (нечетные номера), 297-303 (нечетные номера), 311 и313 с консервативными аминокислотными заменами.
Полинуклеотиды.
Изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, кодирующим мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2, которые представлены в настоящем описании.
Полинуклеотиды могут включать полинуклеотиды, которые по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2, 4-6, 810, 12-14, 16-18, 20-22, 24-262 (четные номера), 293-296 и 298-324 (четные номера), включая их функциональные фрагменты или варианты.
Полинуклеотиды, кодирующие мутантные полипептиды IL-2, не сцепленные с не-ГЕ-2-фрагментом, как правило, экспрессируются в виде индивидуального полинуклеотида, кодирующего полный полипептид.
Выделенный полинуклеотид, кодирующий мутантный полипептид IL-2, где полинуклеотид может содержать последовательность, которая кодирует последовательность SEQ ID NO: 7, 11, 15 или 19 мутантного IL-2. Выделенный полинуклеотид может кодировать мутантный полипептид IL-2, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует последовательность SEQ ID NO: 7, 11, 15 или 19 мутантного IL-2 с консервативными аминокислотными заменами.
Выделенный полинуклеотид может кодировать мутантный полипептид IL-2, где полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296. Выделенный полинуклеотид может также кодировать мутантный полипептид IL-2, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296. Он может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296. Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 и SEQ ID NO: 296.
Полинуклеотиды, кодирующие иммуноконъюгаты, могут экспрессироваться в виде индивидуального полинуклеотида, который кодирует полный иммуноконъюгат, или в виде нескольких (например, двух или нескольких) полинуклеотидов, которые экспрессируются совместно. Полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые совместно экспрессируются, могут быть связаны посредством, например, дисульфидных мостиков или других средств с образованием функционального иммуноконъюгата. Например, область тяжелой цепи антигенсвязывающего фрагмента может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, кодирующего часть иммуноконъюгата, содержащую область легкой цепи антигенсвязывающего фрагмента и мутантный полипептид IL-2. При совместной экспрессии полипептиды тяжелой цепи должны быть ассоциированы с полипептидами легкой цепи с образованием антигенсвязывающего фрагмента. Альтернативно этому, в другом примере область легкой цепи антигенсвязывающего фрагмента может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, кодирующего часть иммуноконъюгата, содержащую область тяжелой цепи антигенсвязывающего фрагмента и
- 27 033369 мутантный полипептид IL-2. Выделенный полинуклеотид может кодировать фрагмент иммуноконъюгата, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антигенсвязывающий фрагмент. Выделенный полинуклеотид может кодировать тяжелую цепь антигенсвязывающего фрагмента и мутантный полипептид IL-2.
Выделенный полинуклеотид может кодировать легкую цепь антигенсвязывающего фрагмента и мутантный полипептид IL-2.
Выделенный полинуклеотид может кодировать фрагмент иммуноконъюгата, содержащий по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2, и по меньшей мере один, предпочтительно два или большее количество антигенсвязывающих фрагментов, где первый мутантный полипептид IL-2 объединен аминоили карбоксиконцевой пептидной связью с первым антигенсвязывающим фрагментом, а второй антигенсвязывающий фрагмент объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью либо с первым мутантным полипептидом IL-2, либо с первым антигенсвязывающим фрагментом. Антигенсвязывающие фрагменты независимо друг от друга могут быть выбраны из группы, включающей молекулу Fv, в частности молекулу scFv, и молекулу Fab. Полинуклеотид может кодировать тяжелые цепи двух антигенсвязывающих фрагментов и один мутантный полипептид IL-2. Полинуклеотид может кодировать легкие цепи двух антигенсвязывающих фрагментов и один мутантный полипептид IL-2. Полинуклеотид может кодировать одну легкую цепь одного из антигенсвязывающих фрагментов, одну тяжелую цепь второго антигенсвязывающего фрагмента и один мутантный полипептид IL-2.
Выделенный полинуклеотид также может кодировать фрагмент иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид может кодировать тяжелые цепи двух молекул Fab и мутантный полипептид IL-2. Выделенный полинуклеотид может кодировать фрагмент иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид может кодировать легкие цепи двух молекул Fab и мутантный полипептид IL-2. Выделенный полинуклеотид может кодировать фрагмент иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид кодирует тяжелую цепь одной молекулы Fab, легкую цепь другой молекулы Fab и мутантный полипептид IL-2.
Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат, содержащий по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2, сцепленный с помощью его амино- и карбоксиконцевых аминокислот с одной или несколькими молекулами scFv.
Выделенный полинуклеотид может кодировать фрагмент иммуноконъюгата, при этом полинуклеотид может кодировать тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина, предпочтительно молекулы IgG, более предпочтительно молекулы IgGi и мутантный полипептид IL-2. Выделенный полинуклеотид может кодировать тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина и мутантный полипептид IL-2, где мутантный полипептид IL-2 объединен аминоконцевой пептидной связью с тяжелой цепью иммуноглобулина.
Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует последовательность вариабельной области, представленную в SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 или 313. Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует полипептидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 или 323. Выделенный полинуклеотид может также кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184,
186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228,
230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312,
314, 316, 318, 320, 322 или 324. Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124,
126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168,
170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212,
214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256,
258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 или 324. Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере примерно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139,
- 28 033369
141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 или 313. Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 или 323.
Выделенный полинуклеотид также может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует последовательности вариабельной области SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 или 313 с консервативными аминокислотными заменами. Выделенный полинуклеотид может кодировать иммуноконъюгат или его фрагмент, где полинуклеотид содержит последовательность, которая кодирует полипептидные последовательности SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 или 323 с консервативными аминокислотными заменами.
Полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой ДНК. Полинуклеотид может представлять собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
Методы рекомбинации.
Мутантные полипептиды IL-2 можно получать путем делеции, замены, инсерции или модификации с использованием генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайт-специфический мутагенез кодирующей последовательности ДНК, ПЦР, синтез генов и т.п. Правильность нуклеотидных изменений можно подтверждать, например, с помощью секвенирования. Для этой цели можно применять нуклеотидную последовательность нативного IL-2, описанную у Taniguchi et al. (Nature, 302, 1983, p. 305-310), и нуклеиновую кислоту человеческого IL-2, доступную из публичных депозитариев, таких как Американская коллекция типовых культур (Роквилл, шт. Мэриленд). Последовательность нативного человеческого IL-2 представлена в SEQ ID NO: 1. Замена или инсерция может включать встречающиеся в естественных условиях, а также не встречающиеся в естественных условиях аминокислотные остатки. Аминокислотная модификация включает хорошо известные методы химической модификации, такие как дополнительное введение сайтов гликозилирования или присоединения углеводов и т.п.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно получать, например, путем твердофазного пептидного синтеза или методом рекомбинации. Для рекомбинантного получения один или несколько полинуклеотидов, кодирующих мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат (фрагмент), например, описанный выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дополнительного клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанный полинуклеотид легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур. Вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, может содержать один или несколько полинуклеотидов. Методы, хорошо известные специалистам в данной области, можно применять для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата (фрагмента) наряду с приемлемыми контролирующими транскрипцию/трансляцию сигналами. Эти методы включают технологии рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и рекомбинации/генетической рекомбинации in vivo (см., например, методы, описанные у Maniatis et al., Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, изд-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). Экспрессионный вектор может представлять собой часть плазмиды, вируса или может представлять собой фрагмент нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор включает кассету экспрессии, в которой полинуклеотид, кодирующий мутантный IL-2 или иммуноконъюгат (фрагмент) (т.е. кодирующую область), клонируют с обеспечением функциональной связи с промотором и/или другими элементами, контролирующими транскрипцию или трансляцию. В контексте настоящего описания кодирующая область представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (TAG, TGA или TAA) не транслируется в аминокислоту, он, в случае его присутствия, может рассматриваться как часть кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или большее количество кодирующих областей может присутствовать в индивидуальной полинуклеотидной конструкции, например индивидуальном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, напримеротдельных (различных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или большее количество кодирующих областей, например вектор может кодировать один или несколько полипротеинов,
- 29 033369 которые пост- или котранляционно разделяются на конечные белки посредством протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут кодировать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо не слитые с первым или вторым полинуклеотидом, который кодирует полипептиды, их или варианты или производные. Гетерологичные кодирующие области включают (но не ограничиваясь только ими) специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Функциональная связь имеет место, когда кодирующая область генного продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта находилась под воздействием или контролем регуляторной(ых) последовательности(ей). Два ДНКфрагмента (таких как кодирующая область полипептида и ассоциированный с ней промотор) являются функционально связанными, если индукция промоторной функции приводит к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый генный продукт, и если природа связи между двумя ДНК-фрагментами не оказывает воздействия на способность регулирующих экспрессию последовательностей направлять экспрессию генного продукта или не оказывает воздействия на способность ДНК-матрицы к транскрипции. Таким образом, промоторная область должна быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор обладает способностью осуществлять транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой специфический для клетки промотор, который обеспечивает значительную транскрипцию ДНК только в предварительно отобранных клетках. Другие контролирующие транскрипцию элементы, помимо промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, можно функционально связывать с полинуклеотидом для обеспечения специфической для клетки транскрипции. Приемлемые промоторы и другие контролирующие транскрипцию области представлены в настоящем описании. Специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих транскрипцию областей. Они включают (но не ограничиваясь только ими) контролирующие транскрипцию области, которые функционируют в клетках позвоночных животных, такие как (но не ограничиваясь только ими) сегменты промоторов и энхансеров из цитомегаловирусов (например, немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном-A), обезьяньего вируса 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие контролирующие транскрипцию области включают области, выведенные из генов позвоночных животных, таких как ген актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и кроличьего β-глобина, а также другие последовательности, которые могут контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные приемлемые контролирующие транскрипцию области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклином). Аналогично этому, обычным специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих трансляцию элементов. Они включают (но не ограничиваясь только ими) сайты связывания рибосом, кодоны инициации трансляции и терминирующие кодоны и элементы, выведенные из вирусных систем (в частности внутренний сайт связывания (посадки) рибосом или IRES, который обозначают также как CITE-последовательность). Кассета экспрессии может включать также другие характерные структуры, такие как сайт инициации репликации и/или интегрированные в хромосому элементы, такие как длинные концевые повторы (LTR) ретровирусов, или инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).
Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты могут быть ассоциированы с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом, предлагаемым в настоящем изобретении. Например, если требуется секреция мутантного полипептида IL-2, то ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, можно помещать против хода транскрипции относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей зрелые аминокислоты мутантного IL-2. Этот же поход применим к иммуноконъюгатам или их фрагментам. Согласно гипотезе, касающейся сигналов, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, который/которая отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Обычным специалистам в данной области должно быть очевидно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных животных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида с образованием секретируемой или зрелой формы полипептида. Например, человеческий IL-2 транслируется с состоящей из 20 аминокислот сигнальной последовательностью на N-конце полипептида, которая затем отщепляется с образованием зрелого состоящего из 133 аминокислот человеческого IL-2. Нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид IL-2 или сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное указанной последовательности, которое сохраняет способность обеспечивать секрецию полипептида, можно функционально связать с ним. Альтернативно этому, можно применять гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменять на лидерную последовательность человеческого тканевого активатора плазминогена (TPA) или мышиной β-глюкуронидазы. Примеры аминокислотных и полинуклеотидных последовательностей сек- 30 033369 реторных сигнальных пептидов представлены в SEQ ID NO: 236-273.
ДНК, кодирующую короткую белковую последовательность, которую можно применять для облегчения дальнейшей очистки (например, гистидиновую метку), или предназначенную для мечения мутантного IL-2 или иммуноконъюгата, можно включать внутрь или на концы полинуклеотида, кодирующего мутантный IL-2 или иммуноконъюгат (фрагмент).
Клетка-хозяин может содержать один или несколько векторов. Полинуклеотиды и векторы могут обладать любыми особенностями, индивидуально или в сочетании. Клетка-хозяин может содержать (например, трансформирована или трансфектирована) вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, включающую мутантный полипептид IL-2. В контексте настоящего описания понятие клетка-хозяин относится к любому типу клеточной системы, которую можно конструировать для получения мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов и их фрагментов. Клетки-хозяева, пригодные для репликации и для поддержания экспрессии мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, хорошо известны в данной области. Такие клетки можно трансфектировать или трансдуцировать соответствующим образом конкретным экспрессионным вектором и можно выращивать большее количество содержащих вектор клеток с целью внесения в ферментеры для крупномасштабных процессов получения мутанта IL-2 или иммуноконъюгата в достаточных для клинических применений количествах. Приемлемыми клетками-хозяевами являются прокариотические микроорганизмы, такие как E.coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки насекомых или т.п. Например, полипептиды можно получать в бактериях, в частности, когда отсутствует потребность в гликозилировании. После экспрессии полипептид можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и можно дополнительно очищать. Помимо прокариот, в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют полипептид, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были гуманизированы, что позволяет получать полипептид с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, p. 1409-1414 и Li et al., Nat. Biotech. 24, 2006, p. 210-215). Клеткихозяева, которые можно использовать для экспрессии (гликозилированных) полипептидов, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US № 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES для получения антител в трансгенных растениях). В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных животных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (293 или клетки линии 293, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомяка (BHK); клетки Сертоли мыши (TM4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, p. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3A); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, p. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (CHO), включая DHFR--CHO-клетки (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства белка, см., например, у Yazaki и Wu, в Methods in Molecular Biology под ред. B.K.C. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, p. 255-268. Клеткихозяева включают культивируемые клетки, например культивируемые клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений (но не ограничиваясь только ими), а также клетки, находящиеся в организме трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани. Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомячка (CHO), клетку почки человеческого эмбриона (HEK) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20).
В данной области известны стандартные технологии для экспрессии чужеродных генов в этих системах. Клетки, экспрессирующие мутантный полипептид IL-2, слитый либо с тяжелой, либо с легкой цепями антигенсвязывающего домена, такого как антитело, можно конструировать таким образом, чтобы в них происходила экспрессия других цепей антитела, например, таким образом, чтобы экспрессируемый слитый продукт, содержащий мутантный IL-2, включал антитело, которое имеет как тяжелую, так и легкую цепи.
- 31 033369
Способ получения мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата заключается в том, что культивируют клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, который кодирует мутантный полипептид
IL-2 или иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, в условиях, пригодных для экспрессии мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, и необязательно выделяют мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
Мутантный полипептид IL-2 может быть сцеплен по меньшей мере с одним не-!Е-2-фрагментом. Можно получать мутантный IL-2, в котором сегмент мутантного полипептида IL-2 сцеплен с одной или несколькими молекулами, такими как полипептид, белок, углевод, липид, нуклеиновая кислота, полинуклеотид или молекула, которая содержит любые комбинации этих молекул (например, гликопротеины, гликолипиды и др.). Мутантный полипептид IL-2 можно соединять также с органическим фрагментом, неорганическим фрагментом или фармацевтическим лекарственным средством. В контексте настоящего описания фармацевтическое лекарственное средство представляет собой органическую субстанцию, содержащую соединение с молекулярной массой примерно 5000 Да или менее. Мутантный полипептид IL-2 можно соединять также с любым биологическим агентом, включая терапевтические соединения, такие как антинеопластические средства, антимикробные средства, гормоны, иммуномодуляторы, противовоспалительные средства и т.п. Можно применять также радиоизотопы, например, применяемые для визуализации, а также для терапии.
Мутантный полипептид IL-2 можно соединять также с множеством молекул одного и того типа или молекул нескольких типов. Молекула, которую соединяют с IL-2, может придавать способность обеспечивать направленность IL-2 к специфическим тканям или клеткам в организме животного, и их называют в контексте настоящего описания обеспечивающий направленный перенос фрагмент. Обеспечивающий направленный перенос фрагмент может обладать аффинностью к лиганду или рецептору в ткани- или клетке-мишени, направляя, тем самым, IL-2 к ткани- или клетке-мишени. Обеспечивающий направленный перенос фрагмент направляет IL-2 к опухоли. Обеспечивающие направленный перенос фрагменты включают, например, антигенсвязывающие фрагменты (например, антитела и их фрагменты), специфические в отношении находящихся на клеточной поверхности или внутриклеточных белков, лигандов биологических рецепторов и т.п. Указанные антигенсвязывающие фрагменты могут быть специфическими в отношении ассоциированных с опухолью антигенов, таких как описанные выше антигены.
Мутантный полипептид IL-2 можно генетически сливать с другим полипептидом, например одноцепочечным антителом или (частью) тяжелых или легких цепей антитела, или можно конъюгировать химически с другой молекулой. Слияние мутантного полипептида IL-2 с частью тяжелой цепи антитела описано в разделе Примеры. Мутантный IL-2, который является компонентом слияния мутантного полипептида IL-2 и другого полипептида, можно создавать таким образом, что последовательность IL-2 слита с полипептидом непосредственно или опосредовано через линкерную последовательность. Состав и длину линкера можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области, и можно оценивать его эффективность. Примеры линкерной последовательности между IL-2 и тяжелой цепью антитела представлены, например, в последовательностях SEQ ID NO: 209, 211, 213 и т.д. Дополнительные последовательности можно включать также в сайт расщепления для разделения при необходимости индивидуальных компонентов слияния, например распознаваемую эндопептидазой последовательность. Кроме того, мутантный IL-2 или содержащий его слитый белок можно также синтезировать химически с использованием методов полипептидного синтеза, хорошо известных в данной области (например, твердофазный синтез Меррифилда). Мутантные полипептиды IL-2 можно конъюгировать химически с другими молекулами, например другим полипептидом, используя хорошо известные методы химической конъюгации. Для этой цели можно применять бифункциональные перекрестно сшивающие реагенты, такие как гомофункциональные и гетерофункциональные перекрестно сшивающие реагенты, хорошо известные в данной области. Применяемый тип перекрестно сшивающего реагента зависит от природы молекулы, подлежащей сочетанию с IL-2, и его могут легко идентифицировать специалисты в данной области. В альтернативном или дополнительном варианте мутантный IL-2 и/или молекулу, с которой его предполагается конъюгировать, можно подвергать химической дериватизации таким образом, чтобы их обеих можно было конъюгироваться с помощью отдельной реакции, что также хорошо известно в данной области.
Мутантный полипептид IL-2 соединяют с одним или несколькими антигенсвязывающими фрагментами (т.е. в виде части иммуноконъюгата), которые содержат, по меньшей мере, вариабельную область антитела, обладающую способностью связываться с антигенной детерминантой. Вариабельные области могут образовывать часть встречающихся в естественных условиях или не встречающихся в естественных условиях антител или их фрагментов или могут быть выведены из них. Методы получения поликлональных антител и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Harlow и Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). He встречающиеся в естественных условиях антитела можно создавать с помощью твердофазного пептидного синтеза, можно получать с помощью методов рекомбинации (например, описанных в US № 4186567) или можно получать, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей (см., например, US № 5969108 на имя McCafferty). Им- 32 033369 муноконъюгаты, антигенсвязывающие фрагменты и методы их получения подробно описаны также в публикации PCT WO 2011/020783, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Любые виды антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов или вариабельных областей животного происхождения можно соединять с мутантным полипептидом IL-2. Примерами антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов или вариабельных областей, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются (но не ограничиваясь только ими) конструкции, полученные из организма мышей, приматов или человека. Если конъюгат или слияние мутантный IL-2/антитело предназначен/предназначено для применения на человеке, то можно применять химерную форму антитела, в которой константные области антитела получают из человеческого антитела. Гуманизированную или полностью человеческую форму антитела можно приготавливать также с помощью методов, хорошо известных в данной области (см., например, US № 5565332 на имя Winter). Для осуществления гуманизации можно применять различные методы, такие как (но не ограничиваясь только ими) (а) трансплантация нечеловеческих (например, из антитела-донора) CDR в человеческий (например, антитело-реципиент) каркасный участок и константные области, сохраняющие или не сохраняющие имеющие решающее значение остатки каркасного участка (например, остатки, важные для сохранения хорошей антигенсвязывающей аффинности или функций антитела); (б) трансплантация нечеловеческих определяющих специфичность участков (SDR или a-CDR; остатки имеют решающее значение для взаимодействия антитело-антиген) в человеческий каркасный участок и константные области или (в) трансплантация полностью нечеловеческих вариабельных доменов и их маскировка напоминающим человеческий сегментом путем замены поверхностных остатков. Обзор гуманизированных антител и методов их получения см., например, у Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 12008, p. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann et al., Nature, 332, 1988, p. 323-329; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, p. 10029-10033; US № 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Jones et al., Nature 321, 1986, p. 522-525; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1984, p. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv. Immunol. 44, 1988, p. 65-92; Verhoeyen et al., Science, 239, 1988, p. 1534-1536; Padlan, Molec. Immun. 31(3), 1994, p. 169217; Kashmiri et al., Methods, 36, 2005, p. 25-34) (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 1991, p. 489-498 (описание повторного покрытия); Dall'Acqua et al., Methods, 36, 2005, p. 43-60 (описание перестановки FR) и Osbourn et al., Methods, 36, 2005, p. 61-68 и Klimka et al., Br. J. Cancer. 83, 2000, p. 252-260 (описание подхода на основе целенаправленной селекции для перестановки FR). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать с помощью различных методик, известных в данной области. Человеческие антитела описаны в целом у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, p. 368-374 и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, p. 450-459). Человеческие вариабельные области могут образовывать часть человеческих моноклональных антител или могут быть получены из них с помощью метода гибридом (см., например, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, p. 51-63). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать также путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что может продуцировать интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном (см., например, Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, p. 1117-1125). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных областей Fv-клона, отобранных из человеческих фаговых дисплейных библиотек (см., например, Hoogenboom и др. в: Methods in Molecular Biology, под ред. O'Brien et al., изд-во Human Press, Totowa, NT, 178, 2001, p. 1-37) и McCafferty et al., Nature, 348, 552-554; Clackson et al., Nature, 352, 1991, p. 624-628). Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных ^-^^^фрагментов, либо в виде Fab-фрагментов. Подробное описание получения антигенсвязывающих фрагментов для иммуноконъюгатов с помощью фагового дисплея представлено в примерах, прилагаемых к публикации PCT WO 2011/020783.
Антигенсвязывающие фрагменты создают так, чтобы они обладали повышенной аффинностью связывания, например, с помощью методов, описанных в публикации PCT WO 2011/020783 (см. примеры, касающиеся созревания аффинности) или публикации заявки на патент США № 2004/0132066, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Способность иммуноконъюгата связываться со специфической антигенной детерминантой можно оценивать количественно либо с помощью твердофазного ферментного анализа (ELISA), либо другими методиками, известными специалисту в данной области, например, с помощью метода резонанса поверхностно плазмона (осуществляя анализ с использованием системы Biacore T100 system) (Liljeblad et al., Glyco J. 17, 2000, p. 323-329) и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr. Res. 28, 2002, p. 217-229). Анализы в конкурентных условиях можно применять для идентификации антитела, фрагмента антитела, антигенсвязывающего домена или вариабельного домена, конкурирующего с референс-антителом за связывание с конкретным антигеном, например, антитела, которое конкурирует с антителом L19 за связывание с экстра-доменом B фибронектина (EDB). Указанное конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается референс-антитело. Подробные
- 33 033369 приведенные в качестве примеров методы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены у Morris, Epitope Mapping Protocols, в Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996. При осуществлении приведенного в качестве примера анализа в конкурентных условиях иммобилизованный антиген (например, EDB) инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с антигеном (например, антитело L19), и вторым немеченным антителом, которое подлежит тестированию в отношении его способности конкурировать с первым антителом за связывание с антигеном. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченное антитело. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с антигеном, избыток несвязанного антитела удаляют и оценивают количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном, существенно снижено в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с антигеном (см. Harlow и Lane. Antibodies: A Laboratory Manual., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, гл. 14, 1988).
Может требоваться дополнительная модификация мутантного IL-2 или иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении. Например, проблемы, связанные с иммуногенностью и коротким временем полужизни, можно преодолевать путем конъюгации с практически прямоцепочечными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоль (ИНГ) (см., например, WO 87/00056).
Мутанты IL-2 и иммуноконъюгаты, полученные с помощью представленных в настоящем описании методов, можно очищать с использованием известных в данной области методик, таких как жидкостная хроматография высокого разрешения, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, гель-фильтрация и т.п. Фактические условия, применяемые для очистки конкретного белка, зависят, в частности, от таких факторов, как чистый заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и они должны быть очевидны специалисту в данной области. Для очистки антитела с помощью аффинной хроматографии можно использовать лиганд, рецептор или антиген, с которым связывается мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат. Например, можно использовать антитело, которое специфически связывается с мутантным полипептидом IL-2. Для очистки с помощью аффинной хроматографии иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, можно использовать матрикс с белком A или белком G. Например, последовательное применение аффинной хроматографии на белке A или G и гель-фильтрации можно применять для выделения иммуноконъюгата, практически согласно методу, описанному в разделе Примеры. Чистоту мутантных полипептидов IL-2 и содержание слитых белков можно определять с помощью любого из широкого разнообразия хорошо известных аналитических методов, включая гельэлектрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п. Например, установлено, что содержащие тяжелые цепи слитые белки, которые экспрессировали согласно описанным в разделе Примеры методам, являются интактными и правильно собранными, что продемонстрировано с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях (см., например, фиг. 14). Разделяли две полосы, соответствующие примерно Mr 25000 и Mr 60000, которые соответствовали предсказанным молекулярным массам слитого белка, содержащего легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина/ГЕ-2.
Анализы.
Представленные в настоящем описании мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно идентифицировать, подвергать скринингу или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различным анализов, известных в данной области.
Анализы аффинности.
Аффинность полипептида IL-2, мутантного или дикого типа, к различным формам рецептора IL-2 можно определять согласно методу, описанному в разделе Примеры с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например устройство Biacore (фирма GE Healthcare), и субъединицы рецептора, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии (см., например, Shanafelt et al., Nature Biotechnol. 18, 2000, p. 1197-1202). Гетеродимер β/γ-субъединиц рекомбинантного рецептора IL-2 можно создавать путем слияния каждой из субъединиц с мономером Fc-домена антитела, модифицированного с помощью технологии knobs-into-holes (см., например, US № 5731168) для усиления гетеродимеризации слитых белков, содержащих соответствующую рецепторную субъединицу/Fc (см. SEQ ID NO: 102 и 103). Альтернативно этому, аффинность связывания мутантных IL-2 с различными формами рецептора IL-2 можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известна способность экспрессировать одну или другую форму рецептора. Конкретный иллюстративный и приведенный в качестве примера вариант измерения аффинности связывания описан ниже в разделе Примеры. Величину KD можно измерять с помощью резонанса поверхностного плазмона с помощью устройства Biacore® T100 (фирма GE Healthcare) при 25°C с использованием рецепторов IL-2, иммобилизованных на CM5-чипах. В целом, метод состоял в следующем: биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (CM5, фирма GE Healthcare) активировали с помощью гидрохлорида №этил-И'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Рекомбинантный рецептор IL-2 раз
- 34 033369 водили 10 мМ ацетатом натрия, pH 5,5 до концентрации 0,5-30 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 10 мкл/мин для достижения примерно 200-1000 единиц ответа (RU) слитого белка (для α-субъединицы IL-2R) или 500-3000 RU (для гетеродимера IL-2R βγ, полученного технологией knobs-into-holes). После инъекции рецептора IL-2 инъецировали 1 М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецировали трехкратные серийные разведения мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата (диапазон от ~0,3 до 300 нМ) в буфере HBS-EP+ (фирма GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТК, 0,05% сурфактанта P20, pH 7,4) при 25°C со скоростью потока примерно 30 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (kon) и реакции диссоциации (koff) рассчитывали с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программа Biacore® T100 Evaluation Software, версия 1.1.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (KD) рассчитывали как соотношение koff/kot, (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293, 1999, p. 865-881).
Связывание иммуноконъюгатов с Fc-рецепторами можно легко определять, например, с помощью ELISA или с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например устройство Biacore (фирма GE Healthcare), и Fc-рецепторы, например, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии. Альтернативно этому, аффинность связывания Fc-доменов или иммуноконъюгатов, содержащих Fc-домен, с Fc-рецепторами можно оценивать, используя клеточные линии, которые, как известно, экспрессируют конкретные Fc-рецепторы, такие как NK-клетки, экспрессирующие FcyIIIa-рецептор. Величину KD можно измерять с помощью метода резонанса поверхностного плазмона с использованием устройства Biacore® T100 (фирма GE Healthcare) при 25°C с использованием Fc-рецепторов IL-2, иммобилизованных на СМ5-чипах. В целом, метод состоял в следующем: биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (CM5, фирма GE Healthcare) активировали с помощью гидрохлорида №этил-Ы'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Рекомбинантный Fc-рецептор разводили 10 мМ ацетатом натрия, pH 5,5 до концентрации 0,5-30 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 10 мкл/мин для достижения примерно 100-5000 единиц ответа (RU) слитого белка. После инъекции Fc-рецептора инъецировали 1 М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецировали 3-5-кратные серийные разведения иммуноконъюгата (диапазон от ~0,1 до 300 нМ) в буфере HBS-EP+ (фирма GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТК, 0,05% сурфактанта P20, pH 7,4) при 25°C со скоростью потока примерно 30-50 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (kon) и реакции диссоциации (koff) рассчитывали с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программа Biacore® T100 Evaluation Software, версия 1.1.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (KD) рассчитывали в виде соотношения koff/kon (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293, 1999, p. 865-881).
Анализы активности.
Способность мутантного IL-2 связываться с рецепторами IL-2 можно оценивать опосредовано путем анализа воздействий иммунной активации, которые происходили в прямой зависимости от связывания с рецептором. Виды биологической активности включают, например, способность индуцировать пролиферацию несущих рецептор IL-2 Т- и/или NK-клеток, способность индуцировать передачу сигналов IL-2 в несущих рецептор IL-2 T-и/или NK-клетках, способность воздействовать на образование интерферона (IFN)-y в качестве вторичного цитокина NK-клетками, пониженную способность индуцировать образование вторичных цитокинов, в частности IL-10 и TNF-α, мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС), пониженную способность индуцировать апоптоз T-клеток, способность индуцировать регресс опухолей и/или повышенную выживаемость и профиль пониженной токсичности, прежде всего пониженной проницаемости сосудов, in vivo. Предложены также мутантные полипептиды IL-2, обладающие указанной биологической активностью in vivo и/или in vitro.
Биологическую активность мутантного полипептида IL-2 можно оценить. В данной области широко известны различные методы определения биологической активности IL-2, и подробное описание многих из этих методов представлено в приведенном ниже разделе Примеры. В разделе Примеры представлен приемлемый анализ оценки мутантных IL-2 в отношении их способности воздействовать на образование IFN-γ NK-клетками. Культивируемые NK-клетки инкубировали с мутантным полипептидом IL-2 или иммуноконъюгатами и затем определяли концентрацию IFN-γ в культуральной среде с помощью ELISA.
Индуцируемая IL-2 передача сигналов индуцирует несколько путей передачи сигналов и включает сигнальные молекулы JAK (киназа Janus) и STAT (сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции). Взаимодействие IL-2 с β-и γ-субъединицами рецептора приводит к фосфорилированию рецептора и JAK1 и JAK3, которые ассоциированы с β- и γ-субъединицей соответственно. Затем происходит ассоциация STAT5 с фосфорилированным рецептором и его фосфорилирование на имеющем решающее значение остатке тирозина. Это приводит к диссоциации STAT5 от рецептора, димеризации STAT5 и транслокации димеров STAT5 в ядро, где они усиливают транскрипцию генов-мишеней. Таким образом, способность мутантных полипептидов IL-2 индуцировать передачу сигналов через рецептор IL-2 можно оценивать, например, измеряя фосфорилирование STAT5. Подробности этого метода описаны в разделе
- 35 033369
Примеры. PBMC обрабатывали мутантными плипептидами IL-2 или иммуноконъюгатами и уровни фосфорилированного STAT5 определяли с помощью проточной цитометрии.
Пролиферацию T-клеток или NK-клеток в ответ на воздействие IL-2 можно оценивать путем инкубации T-клеток или NK-клеток, выделенных из крови, с мутантными полипептидами IL-2 или иммуноконъюгатами с последующим определением содержания АТФ в лизате обработанных клеток. Перед обработкой T-клетки можно предварительно стимулировать фитогемагглютинином (ФГА-М). Этот анализ, описанный в разделе Примеры, является чувствительным и позволяет определять количество жизнеспособных клеток, хотя в данной области известны другие приемлемые альтернативные анализы (например, анализ включения [3Н]-тимидина, Cell Titer Glo-анализы АТФ, анализ, основанный на применении Alamar Blue, WST-1-анализ, MTT-анализ).
В разделе Примеры описан также анализ, предназначенный для оценки апоптоза T-клеток и AICD, при осуществлении которого T-клетки обрабатывают индуцирующим апоптоз антителом после инкубации с мутантными полипептидами IL-2 или иммуноконъюгатами и апоптозные клетки оценивают количественно на основе определения проточной цитометрией по отложению фосфатидилсерина/аннексина. В данной области известны и другие анализы.
Воздействие мутантного IL-2 на рост опухолей и выживание можно оценивать с использованием различных созданных на животных моделей опухолей, известных в данной области. Например, ксенотрансплантаты человеческих раковых линий клеток можно имплантировать мышам с иммунодефицитом и обрабатывать их мутантными полипептидами IL-2 или иммуноконъюгатами, как описано в разделе Примеры.
Токсичность мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов in vivo можно определять по смертности, с помощью прижизненных наблюдений (оценка видимых симптомов нежелательных явлений, таких, например, как поведение, вес тела, температура тела) и клинической и анатомической патологии (например, определение показателей химии крови и/или гистопатологические анализы).
Проницаемость сосудов, индуцированную обработкой IL-2, можно оценивать на предварительно обработанной созданной на животных модели проницаемости сосудов. В целом, мутантный IL-2 или иммуноконъюгат вводят соответствующему животному, например мыши, и позднее животному инъецируют репортерную молекулу сосудистого просачивания, распространение которой из сосудистой сети отражает степень проницаемости сосудов. Репортерная молекула сосудистого просачивания предпочтительно является достаточно крупной для того, чтобы обнаруживать проницаемость при использовании формы IL-2 дикого типа для предварительной обработки. Примером репортерной молекулы сосудистого просачивания может являться сывороточный белок, такой как альбумин или иммуноглобулин. Репортерную молекулу сосудистого просачивания предпочтительно метят с помощью выявляемой метки, такой как радиоизотоп, для облечения количественного определения распределения молекулы в ткани. Сосудистую проницаемость можно измерять для сосудов, присутствующих в любом из различных внутренних органов тела, таких как печень, легкое и т.п., а также в опухоли, включая ксенотрансплантированную опухоль. Легкое является предпочтительным органом для измерения сосудистой проницаемости при использовании полноразмерных мутантных IL-2.
Композиции, препаративные формы и пути введения.
Фармацевтическая композиция может содержать любой из мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может содержать любой из мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже.
Кроме того, представлен способ получения мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата в форме, пригодной для введения in vivo, может заключаться в том, что (а) получают мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат и (б) объединяют в препаративной форме мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, где приготовленный препарат мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, пригоден для применения in vivo.
Фармацевтические композиции могут содержать в эффективном количестве один или несколько мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, который(ые) растворен(ы) или диспергирован(ы) в фармацевтически приемлемом носителе. Понятия фармацевтически или фармакологически приемлемый относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые в целом нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, т.е. не вызывают вредные, аллергические или другие нежелательные реакции при введении при необходимости животному, такому, например, как человек. Приготовление фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат и необязательно дополнительное действующее вещество, должно быть очевидно специалистам в данной области в свете настоящего описания, например, из справочника Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, включенного в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, очевидно, что препараты, предназначенные для введения животному (например, человеку), должны удовлетворять требованиям стандартов стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, разработанных отделением биологических стандартов
- 36 033369 (Управление контроля пищевых продуктов и лекарственных средств) FDA или соответствующим уполномоченным органом других стран. Предпочтительными композициями являются лиофилизированные препаративные формы или водные растворы. Примеры композиций IL-2 приведены в US № 4604377 и 4766106. В контексте настоящего описания фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, буферы, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибные агенты), агенты для придания изотоничности, замедляющие абсорбцию агенты, соли, белки, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, полимеры, гели, связующие вещества, эксципиенты, разрыхлители, замасливатели, подслащивающие вещества, корригенты, красители и подобные материалы и их комбинации, которые должны быть известны обычному специалисту в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, p. 1289-1329, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Любой общепринятый носитель, если только он совместим с действующим веществом, можно применять в терапевтических или фармацевтических композициях.
Композиция может содержать различные типы носителей в зависимости от того, вводят ли ее в твердой, жидкой или аэрозольной форме, и от того, должна ли она быть стерильной, как в случае использования таких путей введений, как инъекция. Мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты (и дополнительное терапевтическое средство) можно вводить внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутрь повреждения, внутрь черепа, внутрь сустава, внутрь предстательной железы, внутрь селезенки, внутриренально, внутриплеврально, внутритрахеально, внутриназально, внутрь стекловидного тела, внутривагинально, внутриректально, внутрь опухоли, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, подконъюнкивально, интравезикулярно, в слизистую оболочку, интраперикардиально, внутрь пуповины, интраокулярно, орально, топикально, место, путем ингаляции (например, аэрозольной ингаляции), инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, локализованной перфузии, омывающей непосредственно клетки-мишени, через катетер, посредством лаважа, в виде кремов, в липидных композициях (например, липосомах), или с помощью любого другого метода или любой комбинации вышеуказанных путей, известных обычному специалисту в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Для введения молекул полипептидов, таких как мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, наиболее часто применяют парентеральное введение, в частности внутривенную инъекцию.
Парентеральные композиции включают композиции, созданные для введения путем инъекции, например подкожной, внутрикожной, внутрь повреждения, внутривенной, внутриартериальной, внутримышечной, подоболочечной или внутрибрюшинной инъекции. Для инъекции мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно включать в препаративные формы в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический соляной буфер. Раствор может содержать предназначенные для получения препаративной формы агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно этому, мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты могут находиться в порошкообразной форме, предназначенной для восстановления перед применением приемлемым наполнителем, например, стерильной не содержащей пирогенов водой. Стерильные инъецируемые растворы приготавливают путем включения полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости в сочетании с различными другими ингредиентами, перечисленными ниже. Стерильность можно легко достигать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных действующих веществ в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, суспензий или эмульсий предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка или сушка вымораживанием, которые позволяют получать порошок действующего вещества в сочетании с любым дополнительным требуемым ингредиентом из предварительно стерилизованной фильтрацией жидкой среды. При необходимости жидкая среда перед применением должна быть соответствующим образом забуферена и жидкому разбавителю сначала придана изотоничность с помощью достаточного количества соляного раствора или глюкозы. Композиция должны быть стабильной в условиях приготовления и хранения и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Принято поддерживать загрязнение эндотоксинами на минимальном безопасном уровне, например менее 0,5 нг/мг белка. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают (но не ограничиваясь только ими) буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид; бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол, резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и метакрезол); низкомолекулярные (содержащие менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гис
- 37 033369 тидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Водные суспензии для инъекций могут содержать соединения, которые повышают вязкость суспензии, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит, декстран или т.п. Необязательно суспензия может содержать также стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. Кроме того, суспензии действующих веществ можно получать в виде соответствующих масляных предназначенных для инъекции суспензий. Приемлемые липофильные растворители или наполнители включают жирные нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этиловые эфиры или триглицериды, или липосомы.
Действующие вещества можно заключать в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксипропилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980. Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие полипептид, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например пленки или микрокапсулы. Для достижения пролонгированной абсорбции инъецируемой композиции можно применять в композиции агенты, замедляющие абсорбцию, такие, например, как моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.
Помимо описанных выше композиций, иммуноконъюгаты можно приготавливать также в виде препарата в форме депо. Указанные препаративные формы длительного действия можно применять путем имплантации (например, подкожной или внутримышечной) или внутримышечной инъекции. Так, например, мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно включать в препаративные формы в сочетании с приемлемыми полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в виде умеренно растворимых производных, например умеренно растворимой соли.
Фармацевтические композиции, содержащие мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, можно приготавливать с помощью общепринятых процессов смешения, растворения, эмульгирования, капсулирования, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции можно включать в препаративные формы с помощью общепринятого метода с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ, которые облегчают процессирование белков, с получением препаратов, которые можно применять в фармацевтических целях. Соответствующая форма зависит от выбранного пути введения.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно включать в композиции в виде свободной кислоты или свободного основания, в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, которые практически сохраняют биологическую активность свободной кислоты или свободного основания. Они включают кислотно-аддитивные соли, например соли, образованные со свободными аминогруппами белковой композиции или образованные с неорганическими кислотами, такими, например, как соляная или фосфорная кислота, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные со свободной карбоксильной группой, можно получать также из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. Фармацевтические соли имеют тенденцию к более высокой растворимости в водных и других протонных растворителях по сравнению с соответствующими формами в виде свободных оснований.
Способы и композиции для терапевтического применения.
Любые мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, представленные в настоящем описании, можно применять в терапевтических методах. Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно применять в качестве иммунотерапевтических агентов, например, при лечении различных видов рака.
Для применения в терапевтических способах мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно включать в состав препаративных форм, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно применять для лечения болезненных состояний, на которые оказывает благоприятное воздействие стимуляция иммунной системы хозяина, в частности состояний, при которых является желательным повышенный клеточный иммунный ответ. Они
- 38 033369 могут включать болезненные состояния, при которых иммунный ответ хозяина является неудовлетворительным или недостаточным. Болезненные состояния, при которых можно вводить мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, представляют собой, например, опухоль или инфекцию, при которой клеточный иммунный ответ должен представлять собой имеющий решающее значение механизм специфического иммунитета. Конкретные болезненные состояния, при которых можно применять мутантные IL-2, включают рак, например почечноклеточную карциному или меланому; иммунодефицит, в частности, у ВИЧ-положительных пациентов, у пациентов с иммунодепрессией, хроническую инфекцию и т.п. Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно вводить индивидуально или в виде любой приемлемой фармацевтической композиции.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты предназначены для применения для лечения заболевания. Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты предназначены для применения в способе лечения. Мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, предназначен для применения при лечении заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. Мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат предназначен для применения в способе лечения индивидуума, который имеет заболевание, и заключается в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат. Заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. Заболевание может представлять собой рак. Способ заключается также в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например противораковое средство, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат предназначен для применения для стимуляции иммунной системы. Мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат также предназначен для применения в способе стимуляции иммунной системы у индивидуума, который заключается в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат для стимуляции иммунной системы. Индивидуум в контексте любого настоящего изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. Стимуляция иммунной системы в контексте настоящего изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение иммунной функции, повышение T-клеточной функции, повышение B-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение T-клеточной реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
Мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгата можно применять для производства или приготовления лекарственного средства, которое предназначено для лечения заболевания у индивидуума, нуждающегося в этом. Лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания, которое заключается в том, что вводят индивидууму, который имеет заболевание, в терапевтически эффективном количестве лекарственное средство. Подлежащее лечению заболевание представляет собой пролиферативное нарушение, например рак. Способ заключается также в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например противораковое средство, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Лекарственное средство может быть предназначено для стимуляции иммунной системы. Лекарственное средство может быть предназначено для применения в способе стимуляции иммунной системы у индивидуума, который заключается в том, что индивидууму вводят в эффективном количестве лекарственное средство для стимуляции иммунной системы. Индивидуум в контексте настоящего изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. Стимуляция иммунной системы в контексте настоящего изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение иммунной функции, повышение T-клеточной функции, повышение B-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение T-клеточной реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
Способ лечения заболевания у индивидуума заключается в том, что указанному индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат. Указанному индивидууму вводят композицию, которая содержит мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат в фармацевтически приемлемой форме. Заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. Заболевание представляет собой рак. Способ заключается также в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например противораковое средство, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Способ стимуляции иммунной системы у индивидуума заключается в том, что индивидууму в эффективном количестве вводят мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат для стимуляции иммунной системы. Индивидуум в контексте настоящего изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. Стимуляция иммунной системы в контексте настоящего изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение иммунной функции, повышение T-клеточной функции, повышение B-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение T-клеточной реак- 39 033369 тивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокинактивированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
Должно быть очевидно, что любой из вышеуказанных терапевтических способов можно осуществлять с использованием иммуноконъюгата вместо или в дополнение к мутантному полипептиду IL-2.
Заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение, предпочтительно рак. Примерами рака являются (но не ограничиваясь только ими) рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак ободочной кишки, колоректальный рак, ректальный рак, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, рак кожи, плоскоклеточная карцинома, рак кости и рак почки. Другие нарушения клеточной пролиферации, которые можно лечить с использованием мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, включают (но не ограничиваясь только ими) неоплазмы, локализованные в животе, кости, молочной железе, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, брюшине, эндокринных железах (надпочечник, паращитовидная, гипофиз, яички, яичник, тимус, щитовидная), глазу, голове и шеи, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, тазовой области, коже, мягкой ткани, селезенке, грудном отделе и мочеполовой системе. Также под объем изобретения подпадают предраковые состояния или повреждения и метастазы рака. Рак выбирают из группы, включающей почечноклеточный рак, рак кожи, рак легкого, колоректальный рак, рак молочной железы, рак головного мозга, рак головы и шеи. Аналогично этому, другие нарушения клеточной пролиферации можно также лечить с помощью мутантных полипептидов IL-2 и иммуноконъюгатов. Примерами таких нарушений клеточной пролиферации являются (но не ограничиваясь только ими) гипер-гамма-глобулинемия, лимфопролиферативные нарушения, парапротеинемия, пурпура, саркоидоз, синдром Сезари, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь Гаучера, гистоцитоз и любое другое заболевание, связанное с клеточной пролиферацией, помимо неоплазм, локализованных в указанных выше органах. Заболевание также может быть связано с аутоиммунитетом, отторжением трансплантата, посттравматическим иммунным ответом и инфекционными заболеваниями (например, ВИЧ). Более конкретно, мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно применять для элиминации клеток, участвующих в опосредованных иммунными клетками нарушениях, таких как лимфома; аутоиммунитет, отторжение трансплантата, заболевание трансплантат-противхозяина, ишемия и удар. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что во многих случаях мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты не могут обеспечивать исцеление, а могут только оказывать частичное благоприятное воздействие. Физиологические изменения, обладающие некоторым благоприятным действием, рассматриваются также как терапевтически ценные. Таким образом, количество мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, которое обеспечивает физиологическое изменение, рассматривается как эффективное количество или терапевтически эффективное количество. Субъект, пациент или индивидуум, нуждающийся в лечении, представляет собой, как правило, млекопитающее, более конкретно человека.
Иммуноконъюгаты можно применять также в качестве диагностических реагентов. Связывание иммуноконъюгата с антигенной детерминантой можно легко выявлять, используя вторичное антитело, специфическое в отношении полипептида IL-2. Вторичное антитело и иммуноконъюгат облегчают выявление связывания иммуноконъюгата с антигенной детерминантой, локализованной на поверхности клетки или ткани.
Мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты в эффективном количестве вводят в клетку. Мутантные полипептиды IL-2 или иммуноконъюгаты вводят в терапевтически эффективном количестве индивидууму для лечения заболевания.
Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата (при его применении индивидуально или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами) должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, пути введения, веса тела пациента, типа полипептида (например, неконъюгированный IL-2 или иммуноконъюгат), серьезности и течения заболевания и от того, вводят ли антитело в превентивных или терапевтических целях, предшествующих или осуществляемых одновременно терапевтических вмешательств, истории болезни пациента и ответа на мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат и предписания лечащего врача. Практикующий специалист, ответственный за введение, в любом случае должен определять концентрацию действующего(их) вещества(в) в композиции и соответствующую(ие) дозу(ы) для индивидуального пациента. Различные схемы введения доз включают (но не ограничиваясь только ими) однократное введение или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.
Однократное введение неконъюгированного IL-2 может включать от примерно 50000 до примерно 1000000 МЕ/кг или более, более конкретно примерно 600000 МЕ/кг IL-2. Его можно повторять несколько раз в день (например, 2-3 раза), в течение нескольких дней (например, в течение примерно 3-5 последовательных дней) и затем можно повторять один или несколько раз после периода отдыха (например, примерно 7-14 дней). Таким образом, терапевтически эффективное количество может включать только одно введение или несколько введений в течение некоторого периода времени (например, примерно 20- 40 033369 введений индивидууму примерно 600000 МЕ/кг IL-2 каждый раз, в течение примерно 10-20-дневного периода). При введении в форме иммуноконъюгата терапевтически эффективное количество мутантного полипептида IL-2 может быть ниже по сравнению с неконъюгированной формой мутантного полипептида IL-2.
Аналогично этому иммуноконъюгат можно вводить пациенту в виде одной обработки или серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг) иммуноконъюгата может представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например, с использованием одного или нескольких индивидуальных введений или с помощью непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может составлять от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от отмеченных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или более продолжительного периода в зависимости от состояния лечение, как правило, должно продолжаться до достижения требуемого подавления имеющихся симптомов заболевания. В качестве примера доза иммуноконъюгата может составлять от примерно 0,005 до примерно 10 мг/кг. В другом примере (но не ограничиваясь только указанным) доза на одно введение может составлять от примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500 мкг/кг веса тела, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500 до примерно 1000 мг/кг/веса тела или более и находиться в любом указанном диапазоне. В качестве примеров (но не ограничиваясь только ими) указанного диапазона значений, можно вводить от примерно 5 до примерно 100 мг/кг веса тела, от примерно 5 мкг/кг веса тела до примерно 500 мг/кг веса тела и т.д. с учетом указанных выше уровней доз. Так, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих примерно 0,5, 2,0, 5,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить прерывисто, например каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз иммуноконъюгата). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу, после которой применять одну или несколько более низких доз. Однако можно использовать другие схемы введения доз. Успех такой терапии легко оценивать с помощью общепринятых методик и анализов.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты, как правило, следует применять в количестве, эффективном для достижения поставленной цели. При применении для лечения или предупреждения болезненного состояния мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты или их фармацевтические композиции вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалистов в данной области.
Для системного введения терапевтически эффективную дозу можно сначала определять с помощью анализов in vitro, например анализов с использованием клеточных культур. Затем дозу можно включать в форму для изучения на животных моделях для достижения концентрации в кровотоке, находящейся в диапазоне, включающем значение IC50, определенное на клеточной культуре. Указанную информацию можно использовать для более точного определения доз, которые можно применять на людях.
Начальные дозы можно оценивать также, исходя из данных, полученных in vivo, например, на животных моделях, используя методики, хорошо известные в данной области. Обычный специалист в данной области легко может оптимизировать применение на людях на основе данных, полученных на животных.
Уровень доз и интервал можно регулировать индивидуально для получения уровней в плазме мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, которые являются достаточными для поддержания терапевтического действия.
Обычные дозы, предназначенные для введения пациенту путем инъекции, составляют от примерно 0,1 до 50 мг/кг/день, как правило, от примерно 0,5 до 1 мг/кг/день. Для достижения терапевтически эффективных уровней в плазме можно вводить несколько доз каждый день. Уровни в плазме можно оценивать, например, с помощью ЖХВР.
В случаях местного применения или избирательного поглощения эффективная местная концентрация иммуноконъюгатов может не соответствовать концентрации в плазме. Специалист в данной области может оптимизировать терапевтически эффективные местные дозы без чрезмерных экспериментов.
Применение в терапевтически эффективной дозе мутантных полипептидов IL-2 или иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, должно, как правило, обеспечивать терапевтическую пользу, не вызывая существенной токсичности. Токсичность и терапевтическую эффективность мутантного IL-2 или иммуноконъюгата можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных животных (см., например, примеры 8 и 9). Анализы на клеточных культурах или опыты на животных можно применять для определения значений LD50 (доза, смертельная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз, характеризующих токсические и терапевтические действия, обозначают как терапевтический индекс, который можно выражать в виде соотношения LD50/ED50 Мутантные IL-2 и иммуноконъюгаты, имеющие высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат характеризуется высоким терапевтическим индексом. Данные, полученные в анализах с использованием клеточных культур и в опытах на животных, можно применять для оп- 41 033369 ределения диапазона доз, которые можно применять на людях. Доза лежит предпочтительно в диапазоне концентраций в кровотоке, которые включают ED50, обладающих невысокой токсичностью или не обладающих токсичностью. Доза может варьироваться в зависимости от различных факторов, например от применяемой лекарственной формы, применяемого пути введения, состояния индивидуума и т.п. Точную препаративную форму, путь введения и дозу может выбирать индивидуально врач в зависимости от состояния пациента (см., например, Fingl et al., в The Pharmacological Basis of Therapeutics, гл. 1, 1975, с 1, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки).
Лечащему врачу пациентов, которым вводят мутантные IL-2 или иммуноконъюгаты, должно быть очевидно, как и когда заканчивать, прерывать или регулировать введение из-за токсичности, дисфункции органов и т.п. И наоборот, лечащему врачу должно быть очевидно, как регулировать лечение в сторону применения более высоких доз, если клинический ответ является неадекватным (предотвращая токсичность). Величина вводимой дозы при лечении представляющего интерес нарушения должна варьироваться в зависимости от серьезности состояния, подлежащего лечению, пути введения и т.п. Серьезность состояния можно, например, оценивать среди прочего с помощью стандартных прогностических методов оценки. Кроме того, доза и предполагаемая частота введения дозы должны также варьироваться в зависимости от возраста, веса тела и ответа индивидуального пациента.
Максимальную терапевтическую дозу мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, содержащего указанный полипептид, можно повышать по сравнению с дозами, в которых применяют IL-2 дикого типа или иммуноконъюгат, содержащий IL-2 дикого типа соответственно.
Другие агенты и варианты лечения.
Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты при лечении можно вводить в сочетании с одним или несколькими другими агентами. Например, мутантный полипептид IL-2 или иммуноконъюгат можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. Понятие терапевтическое средство включает любое средство, которое вводят для лечения симптома заболевания у индивидуума, который нуждается в таком лечении. Указанное дополнительное терапевтическое средство может представлять собой любое действующее вещество, которое можно применять при конкретном показании, подлежащем лечению, предпочтительно с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательное действие друг на друга. Дополнительное терапевтическое средство представляет собой иммуномодулятор, цитостатическое средство, ингибитор клеточной адгезии, цитотоксическое средство, активатор клеточного апоптоза или средство, повышающее чувствительность клеток к индукторам апоптоза.
Дополнительное терапевтическое средство представляет собой противораковое средство, например агент, разрушающий микротрубочки, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, интеркалятор ДНК, алкилирующий агент, средство гормональной терапии, ингибитор киназ, антагонист рецептора, активатор апоптоза опухолевых клеток или антиангиогенное средство.
Указанные другие средства могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для указанных целей. Эффективное количество указанных других средств зависит от количества применяемого мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата, типа нарушения, подлежащего лечению, и других указанных выше факторов. Мутантные полипептиды и иммуноконъюгаты, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием указанных в настоящем описании путей введения, или в дозах, составляющих примерно от 1 до 99% от указанных в настоящем описании доз, или в любой дозе и с использованием любого пути введения, которые согласно эмпирическим/клиническим данным рассматриваются как приемлемые.
Отмеченные выше комбинированные терапии предусматривают совместное введение (когда два или большее количество терапевтических средств включают в одну и ту же или в отдельные композиции) и раздельное введение, в этом случае введение мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта. Мутантные полипептиды IL-2 и иммуноконъюгаты можно применять также в сочетании с лучевой терапией.
Изделия.
Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или прилагаются к нему. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного (IV) раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой мутантный полипептид IL-2. На этикетке или листовкевкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит мутантный полипептид IL-2; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где
- 42 033369 композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковке, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Как должно быть очевидно, любое из указанных выше изделий может включать иммуноконъюгат вместо или в дополнение к мутантному полипептиду IL-2.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - схематическое изображение форматов иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab (А) и IgG-IL-2 (Б), содержащих мутантный полипептид IL-2;
на фиг. 2 - результаты очистки конструкции оголенного (неконъюгированного) IL-2 дикого типа. (А) Хроматограмма, полученная после очистки с использованием His-метки, оголенного IL-2 дикого типа; (Б) результаты ДСН-ПААГ-анализа очищенного белка (8-12% бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 3 - результаты очистки конструкции оголенного IL-2 дикого типа. (А) Хроматограмма IL-2 дикого типа, полученная методом гель-фильтрации; (Б) результаты ДСН-ПААГ-анализа очищенного белка (8-12% бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 4 - результаты, полученные методом аналитической гель-фильтрации IL-2 дикого типа, проведенной на колонке Супердекс 75, 10/300 GL.
Пул 1 содержит 74% видов с молекулярной массой 23 кДа и 26% видов с 20 кДа.
Пул 2 содержит 40% видов с 22 кДа и 60% видов с 20 кДа;
на фиг. 5 - результаты очистки конструкции оголенного четырехмутантного IL-2. (А) Хроматограмма, полученная после очистки с использованием His-метки, четырехмутантного IL-2; (Б) результаты ДСН-ПААГ-анализа, очищенного белка (8-12% бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 6 - результаты очистки конструкции оголенного четырехмутантного IL-2. (А) Хроматограмма, полученная методом гель-фильтрации, четырехмутантного IL-2; (Б) результаты ДСН-ПААГанализа очищенного белка (8-12% бис-Трис (NuPage, фирма Invitrogen), подвижный буфер MES);
на фиг. 7 - результаты, полученные методом аналитической гель-фильтрации четырехмутантного IL-2, проведенной на колонке Супердекс 75, 10/300 GL (пул 2, 20 кДа);
на фиг. 8 - результаты, демонстрирующие одновременное связывание с IL-2R и человеческим FAP конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 29B11, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP. (А) Результат SPR-анализа; (Б) SPR-сенсограмма;
на фиг. 9 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию высвобождения IFN-γ МН92-клетками, при воздействии конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 4G8, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнению с пролейкином;
на фиг. 10 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию пролиферации выделенных NK-клеток (внизу), при воздействии конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 4G8, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнению с пролейкином;
на фиг. 11 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию пролиферации активированных CD3+-T-клеток при воздействии конструкции Fab-IL-2-Fab на основе 4G8, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнению с пролейкином;
на фиг. 12 - результаты анализа в растворе, демонстрирующие индукцию индуцированной активацией клеточной гибели (AICD) избыточно стимулированных T-клеток при воздействии конструкции на основе 4G8 Fab-IL-2-Fab, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнению с пролейкином;
на фиг. 13 - результаты фосфо-STAT5 FACS-анализа в растворе с использованием конструкции на основе 4G8 Fab-IL-2-Fab, содержащей IL-2 дикого типа или четырехмутантный, мишенью которой является FAP, по сравнению с пролейкином. (А) регуляторные T-клетки (CD4+CD25+FOXP3+); (Б) CD8+-Tклетки (CD3+CD8+); (В) CD4+-T-клетки (CD4+CD25-CD127+); (Г) NK-клетки (CD3-CD56+);
на фиг. 14 - результаты очистки иммуноконъюгата на основе 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции на колонке с белком G. (Б) Профиль элюции на колонке для гель-фильтрации с Супердекс 200. (В) Результаты ДСН-ПААГ-анализа (Novex Трис-глицин 4-20%) конечного продукта с использованием образца в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях;
на фиг. 15 - результаты очистки иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции на колонке с белком А. (Б) Профиль элюции на колонке для гель-фильтрации с Супердекс 200. (В) Результаты электрофореза в NuPAGE Novex бис-Трис-мини-геле (фирма Invitrogen), подвижный MOPS-буфер, конечного продукта с использованием образца в невосста
- 43 033369 навливающих и восстанавливающих условиях;
на фиг. 16 - результаты очистки иммуноконъюгата Fab-IL-2QM-Fab на основе MHLG1 KV9, мишенью которого является MCSP. (А) Профиль элюции на колонке с белком А. (Б) Профиль элюции на колонке для гель-фильтрации с Супердекс 200. (В) Результаты электрофореза в мини-геле NuPAGE Novex бис-Трис (фирма Invitrogen), подвижный MOPS-буфер, конечного продукта с использованием образца в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях;
на фиг. 17 - результаты, демонстрирующие направленное связывание конструкций Fab-IL-2-Fab на экспрессирующих человеческий FAP HEK 293-клетках;
на фиг. 18 - результаты, демонстрирующие направленное связывание конструкций Fab-IL-2-Fab на экспрессирующих человеческий FAP HEK 293-клетках;
на фиг. 19 - результаты, демонстрирующие специфичность связывания конструкций Fab-IL-2-Fab, которую определяли на экспрессирующих человеческую DPPIV HEK 293-клетках и на HEK 293-клетках, трансфектированных имитатором. Справа представлены результаты, демонстрирующие связывание специфического в отношении DPPIV (CD26) антитела;
на фиг. 20 - результаты анализа интернализации FAP при связывании конструкций Fab-IL-2-Fab с FAP на фибробластах линии GM05389;
на фиг. 21 - результаты анализа индуцируемого IL-2 высвобождения IFN-γ КН92-клетками в растворе;
на фиг. 22 - результаты анализа индуцируемого IL-2 высвобождения IFN-γ КН92-клетками в растворе;
на фиг. 23 - результаты анализа индуцируемой IL-2 пролиферации М<92-клеток в растворе;
на фиг. 24 - результаты сравнительной оценки Fab-IL-2-Fab на основе клонов 28H1, 29B11 и 4G8 с помощью анализа в растворе фосфорилирования STAT5 с использованием PBMC. (А) NK-клетки (CD3 CD56+); (Б) CD8+-T-^tkh (CD3+CD8+); (В) CD4+-T-^tkh (CD3+CD4+CD25-CD127+); (Г) регуляторные T-клетки (CD4+CD25+FOXP3+);
на фиг. 25 - данные об эффективности иммуноконъюгатов 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qmFab, мишенью которых является FAP, на клеточной линии человеческой почечноклеточной аденокарциномы ACHN;
на фиг. 26 - данные об эффективности иммуноконъюгатов 4G8 FAP-IL-2 qm-Fab и 28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, на клеточной линии мышиной легочной карциномы Льюиса LLC1;
на фиг. 27 - данные об эффективности иммуноконъюгатов 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab и 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, на клеточной линии мышиной легочной карциномы Льюиса LLC1;
на фиг. 28 - изображения, полученные при небольшом увеличении (100х). легкнх мышей, обработанных наполнителем (контроль) (А) или взятыми в концентрации 9 мкг/г wt IL-2 (Б) или qm IL-2 (В). В легкнх мышей, обработанных 9 мкг/г wt IL-2, виден вазоцентрнческнй мононуклеарный инфильтрат, переместившийся в альвеолярные пространства. Имеют место отек и кровоизлияние. У мышей, обработанных qm IL-2, обнаружен маргинальный инфильтрат вокруг нескольких сосудов;
на фиг. 29 - изображения, полученные при большем увеличении (200х), легких, показанных на фиг. 28. Краевое скопление (маргинацня) и инфильтрация мононуклеарных клеток в кровеносных сосудах и вокруг них являются более серьезными у мышей, обработанных wt IL-2 (А), чем у мышей, обработанных qm IL-2 (Б и В);
на фиг. 30 - изображения, полученные при небольшом увеличении (100х), печени мышей, обработанных наполнителем (контроль) (А) или взятыми в концентрации 9 мкг/г wt IL-2 (Б) или qm IL-2 (В). У мышей, обработанных wt IL-2, обнаружена вазоцентрическая инфильтрация;
на фиг. 31 - результаты анализа секреции IFN-γ NK92-клетками после инкубации с различными препаратами IL-2 дикого типа (wt) и четырехмутантного IL-2 (qm) в течение 24 ч (А) или 48 ч (Б);
на фиг. 32 - результаты анализа пролиферации М<92-клеток после инкубации с различными препаратами IL-2 дикого типа (wt) и четырехмутантного IL-2 (qm) в течение 48 ч;
на фиг. 33 - результаты анализа пролиферации М<92-клеток после инкубации с различными препаратами IL-2 дикого типа (wt) и четырехмутантного IL-2 (qm) в течение 48 ч;
на фиг. 34 - результаты анализа пролиферации NK-клеток после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28H1 IL-2, мишенью которых является FAP, или с пролейкином в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней;
на фиг. 35 - результаты анализа пролиферации CD4-T-клеток после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28H1 IL-2, мишенью которых является FAP, или с пролейкином в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней;
на фиг. 36 - результаты анализа пролиферации CD8-T-клеток после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28H1 IL-2, мишенью которых является FAP, или с пролейкином в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней;
- 44 033369 на фиг. 37 - результаты анализа пролиферации NK-клеток (A), СП4-Т-клеток (Б) и CDS-T-клсток (В) при инкубации с различными иммуноконъюгатами IL-2 или с пролейкином в течение 6 дней;
на фиг. 38 - результаты анализа фосфорилирования STAT в NK-клетках (А), CD8-T-клетках (Б),
CD4-T-клетках (В) и регуляторных T-клетках (Г) после 30-минутной инкубации с пролейкином, полученным на фирме-заявителе IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2;
на фиг. 39 - результаты анализа фосфорилирования STAT в NK-клетках (А), CD8-T-клетках (Б), CD4-T-клетках (В) и регуляторных T-клетках (Г) после 30-минутной инкубации с пролейкином, IgG-IL-2, содержащим IL-2 дикого типа, или IgG-IL-2, содержащим четырехмутантный IL-2;
на фиг. 40 - данные о выживаемости мышей линии Black 6 после введения (один раз в день в течение семи дней) иммуноконъюгатов IL-2, содержащих IL-2 дикого типа или четырехмутантный IL-2, в различных дозах;
на фиг. 41 - данные о концентрации в сыворотке иммуноконъюгатов IL-2 после однократного i.v.введения конструкций IgG-IL-2, мишенью которых является FAP (А), и ненаправленных (не имеющих специфической мишени) (Б) конструкций IgG-IL-2, содержащих либо дикого типа (wt), либо четырехмутантный (qm) IL-2;
на фиг. 42 - данные о концентрации в сыворотке иммуноконъюгатов IL-2 после однократного i.v.введения ненаправленных конструкций Fab-IL-2-Fab, содержащих либо дикого типа (wt), либо четырехмутантный (qm) IL-2;
на фиг. 43 - результаты очистки четырехмутантного IL-2. (А) Хроматография с иммобилизованным ионом металла; (Б) гель-фильтрация; (В) ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (NuPAGE Novex бис-Трис-гель (фирма Invitrogen), подвижный буфер MES); (Г) аналитическая гель-фильтрация (Супердекс 75 10/300 GL);
на фиг. 44 - результаты анализа пролиферации предварительно активированных CD8- (А) и CD4(Б) T-клеток после шестидневной инкубации с различными иммуноконъюгатами IL-2;
на фиг. 45 - результаты анализа активации индуцированной клеточной гибели CD3+-T-клеток после шестидневной инкубации с различными иммуноконъюгатами IL-2 и обработки в течение ночи антителом к Fas;
на фиг. 46 - результаты очистки иммуноконъюгата IgG-IL-2 (четырехмутантный, (qm)) на основе 4G8, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции, полученный на стадии аффинной хроматографии с белком А. (Б) Профиль элюции, полученный на стадии гель-фильтрации. (В) Анализ конечного продукта с помощью аналитического ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex бис-Трис-мини-гель (фирма Invitrogen), подвижный буфер MOPS. Г) Аналитическая гель-фильтрация конечного продукта на колонке с Супердекс 200 (содержание мономера 97%);
на фиг. 47 - результаты очистки иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 28H1, мишенью которого является FAP. (А) Профиль элюции, полученный на стадии аффинной хроматографии с белком А. (Б) Профиль элюции, полученный на стадии гель-фильтрации. (В) Анализ конечного продукта с помощью аналитического ДСН-ПААГ (восстанавливающие условия: NuPAGE Novex бис-Tris-мини-гель (фирма Invitrogen), подвижный буфер MOPS; невосстанавливающие условия: NuPAGE Трис-ацетат (фирма Invitrogen), подвижный Трис-ацетатный буфер). Г) Аналитическая гель-фильтрация конечного продукта на колонке с Супердекс 200 (содержание мономера 100%):
фиг. 48 - результаты анализа связывания иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, с человеческим FAP, экспрессируемым в стабильно трансфектированных HEK 293-клетках, по данным FACS, в сравнении с соответствующей конструкцией Fab-IL-2 qm-Fab;
на фиг. 49 - результаты анализа высвобождения интерферона (IFN)-y на NK92-клетках в растворе, индуцированного иммуноконъюгатом IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, в сравнении с конструкцией Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1;
на фиг. 50 - результаты обнаружения фосфорилированного STAT5 с помощью FACS в различных типах клеток после 20-минутной стимуляции в растворе иммуноконъюгатом IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, в сравнении с конструкциями Fab-IL-2-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1, а также с пролейкином. А) NK-клетки (CD3-CD56+); Б) CD8'-T-kjctkh (CD3+CD8+); В) CD4+-Tклетки (CD3+CD4+CD25-CD127+); Г) регуляторные T-клетки (CD4+CD25+FOXP3+).
- 45 033369
Примеры
Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, можно осуществлять на практике различные другие варианты осуществления изобретения с учетом представленного выше описания изобретения в целом.
Пример 1.
Общие методы.
Методы рекомбинантной ДНК.
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяли согласно инструкциям производителей. Общую информацию, касающуюся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческих иммуноглобулинов, см. у: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во NIH, публикация No. 91-3242, 1991.
Секвенирование ДНК.
Последовательности ДНК определяли с помощью секвенирования двух цепей.
Синтез генов.
Требуемые сегменты генов либо создавали с помощью ПЦР с использованием соответствующих матриц, либо синтезировали на фирме Geneart AG (Регенсбург, Германия) из синтетических олигонуклеотидов и ПЦР-продуктов посредством автоматического синтеза генов. В случаях, когда точная генная последовательность не была доступна, создавали олигонуклеотидные праймеры на основе последовательностей ближайших гомологов и гены выделяли с помощью ОТ-ПЦР из РНК, полученной из соответствующей ткани. Сегменты генов, фланкированные единичными сайтами, распознаваемыми рестриктазами, клонировали в стандартных клонирующих/секвенирующих векторах. Плазмидную ДНК очищали из трансформированных бактерий и определяли концентрацию с помощью УФ-спектроскопии. Последовательность ДНК субклонированных фрагментов генов подтверждали ДНК-секвенированием. Создавали сегменты генов с требуемыми сайтами рестрикции, позволяющими субклонировать их в соответствующих экспрессионных векторах. Все конструкции создавали с 5'-концевой последовательностью ДНК, кодирующей лидерный пептид, который направляет секрецию белков в эукариотических клетках. В SEQ ID NO: 263-273 представлены примеры лидерных пептидов и кодирующих их полинуклеотидных последовательностей.
Получение слияний βγ-субъединица IL-2R-Fc и слияния α-субъединица IL-2R-Fc.
Для изучения аффинности связывания рецептора IL-2 создавали инструмент, который позволяет экспрессировать гетеродимерный рецептор IL-2; β-субъединицу рецептора IL-2 сливали с молекулой Fc, которую создавали таким образом, что она обладала способностью к гетеродимеризации ^(впадина)) (см. SEQ ID NO: 274 и 275), используя технологию knobs-into-holes (Merchant et al., Nat Biotech. 16, 1998, p. 677-68). Затем γ-субъединицу рецептора IL-2 сливали с Fc (выступ)-вариантом (см. SEQ ID NO: 276 и 277), гетеродимеризованным с Fc (впадина). Затем указанный гетеродимерный содержащий Fc-слияние белок применяли в качестве субстрата для анализа взаимодействия IL-2/IL-2рецептор. α-Субъединицу IL-2R экспрессировали в виде мономерной цепи, несущей сайт расщепления AcTev и Avi His-метку (SEQ ID NO: 278 и 279). Соответствующие субъединицы IL-2R кратковременно экспрессировали в клетках HEK EBNA 293 с сывороткой в случае конструкции βγ-субъединицы IL-2R и без сыворотки в случае конструкции α-субъединицы. Конструкцию βγ-субъединицы IL-2R очищали на белке A (фирма GE Healthcare) с последующей гель-фильтрацией (фирма GE Healthcare, Супердекс 200). α-Субъединицу IL-2R очищали с использованием His-метки на колонке NiNTA (фирма Qiagen) с последующей гель-фильтрацией (фирма GE Healthcare, Супердекс 75).
Получение иммуноконъюгатов.
Более подробное описание получения и очистки иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, включая создание и созревание аффинности антигенсвязывающих фрагментов, представлено в разделе Примеры, прилагаемом к публикации PCT WO 2011/020783, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Как описано в указанной публикации, различные антигенсвязывающие домены, мишенью которых является FAP, создавали с помощью метода фагового дисплея, включая клоны, обозначенные как 4G8, 3F2, 28H1, 29B11, 14B3 и 4B9, которые применяли в описанных ниже примерах. Клон 28H1 представлял собой антитело с созревшей аффинностью, основой которого является родительский клон 4G8, а клоны 29B11, 14B3 и 4B9 представляли собой антитела с созревшей аффинностью, основой которых являлся родительский клон 3F2. Антигенсвязывающий домен, мишенью которого является MCSP, обозначен в контексте настоящего описания как MHLG1 KV9.
Последовательности иммуноконъюгатов, содержащих IL-2 дикого типа, которые применяли в приведенных ниже примерах, представлены также в публикации PCT WO 2011/020783. Последовательности, соответствующие иммуноконъюгатам, которые содержали четырехмутантный IL-2, которые применяли в приведенных ниже примерах, представляли собой для 4G8: SEQ ID NO: 211 и 233; для 3F2: SEQ ID NO: 209 и 231; для 28H1: SEQ ID NO: 219 и 233; для 29B11: SEQ ID NO: 221 и 231; для 14B3: SEQ ID NO: 229 и 231; для 4B9: SEQ ID NO: 227 и 231; для MHLG1-KV9: SEQ ID NO: 253 и 255. После
- 46 033369 довательности ДНК создавали путем генного синтеза и/или классических методов молекулярной биологии и субклонировали в экспрессионных векторах млекопитающих (один для легкой цепи и один для тяжелой цепи слитого с IL-2 белка) под контролем промотора MPSV и против хода транскрипции относительно синтетического сайта поли A, каждый вектор нес последовательность EBV OriP. Иммуноконъюгаты, которые применяли в описанных ниже примерах, получали путем контрасфекции клеток линии HEK293-EBNA, находящихся на экспоненциальной фазе роста, экспрессионными векторами млекопитающих, используя опосредуемую фосфатом кальция трансфекцию. Альтернативно этому, HEK293клетки, растущие в суспензии, трансфектировали полиэтилеимином (ПЭИ) с использованием соответствующих экспрессионных векторов. Альтернативно этому, для получения в бессывороточной среде применяли пулы стабильно трансфектированных CHO-клеток или клоны CHO-клеток. В то время как конструкции на основе 4G8, мишенью которых является FAP, такие как Fab-IL-2-Fab, содержащие дикого типа или (четырех)мутантный IL-2, можно очищать с помощью аффинной хроматографии, используя в качестве матрикса белок A, конструкции с созревшей аффинностью на основе 28H1, мишенью которых является FAP, такие как Fab-IL-2-Fab, очищали с помощью аффинной хроматографии, используя в качестве матрицы белок G, при получении продукта в лабораторном масштабе.
В целом, метод состоял в следующем: конструкцию 28H1 Fab-IL-2-Fab, мишенью которой является FAP, содержащую дикого типа или (четырех)мутантный IL-2, очищали от супернатантов с помощью одной стадии аффинной хроматографии (белок G) с последующей гель-фильтрацией (Супердекс 200, фирма GE Healthcare). Колонку с белком G уравновешивали с использованием 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, pH 7,5, вносили супернатант и колонку промывали 20 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитратом натрия, pH 7,5. Fab-IL-2-Fab элюировали с помощью 8,8 мМ муравьиной кислоты, pH 3. Элюированные фракции объединяли и очищали с помощью гель-фильтрации в буфере для конечной препаративной формы следующего состава: 25 мМ фосфат калия, 125 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, pH 6,7. Ниже представлены примеры результатов очистки и аналитических исследований.
Конструкции, мишенью которых является FAP, такие как 3F2 Fab-IL-2-Fab или 4G8 Fab-IL-2-Fab, содержащие дикого типа или (четырех)мутантный IL-2, очищали аналогичным методом, включающим одну стадию очистки на белке A с последующей гель-фильтрацией (Супердекс 200, фирма GE Healthcare). Колонку с белком A уравновешивали с использованием 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, pH 7,5, вносили супернатант и колонку промывали 20 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитратом натрия, 500 мМ хлоридом натрия, pH 7,5, после чего промывали 13,3 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитратом натрия, 500 мМ хлоридом натрия, pH 5,45. Необязательно осуществляли третью промывку 10 мМ MES, 50 мМ хлоридом натрия, pH 5. Fab-IL-2-Fab элюировали 20 мМ цитратом натрия, 100 мМ хлоридом натрия, 100 мМ глицином, pH 3. Элюированные фракции объединяли и очищали с помощью гель-фильтрации в конечном буфере для препаративной формы следующего состава: 25 мМ фосфат калия, 125 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, pH 6,7. Ниже более подробно представлены примеры процедур очистки и результаты для отобранных указанных ниже конструкций.
Слитые белки IgG-IL-2 qm, мишенью которых является FAP, создавали на основе антител к FAP 4G8, 4B9 и 28H1, в них один индивидуальный четырехмутантный (qm) IL-2, сливали с С-концом одной гетеродимерной тяжелой цепи, как показано на фиг. 1Б. Для достижения направленного переноса к строме опухоли, в которой происходит избирательная экспрессия FAP, применяли Fab-область двухвалентного антитела (явление авидности). Для достижения гетеродимеризации в присутствии индивидуального четырехмутантного IL-2 применяли технологию knob-into-hole. Для того чтобы минимизировать создание гомодимерных слияний IgG-цитокин, цитокин сливали с C-концом (с делецией C-концевого остатка Lys) содержащей выступ тяжелой цепи IgG через G4-(SG4)2- или (G.-iSh-линкер. Слияние антитело-цитокин обладало IgG-подобными свойствами. Для снижения связывания FcyR/эффекторной функции и предупреждения коактивации FcR в Fc-домен интродуцировали мутации P329G L234A L235A (LALA). Последовательности этих иммуноконъюгатов представлены в SEQ ID NO: 297, 299 и 233 (28H1), SEQ ID NO: 301, 303 и 231 (4B9) и SEQ ID NO: 315, 317 и 233 (4G8). Кроме того, создавали слитый белок, мишенью которого является CEA, такой как IgG-IL-2 и контрольный на основе DP47GS ненаправленный слитый белок IgG-IL-2 qm, в котором IgG не связывается со специфической мишенью. Последовательности этих иммуноконъюгатов представлены в SEQ ID NO: 305, 307 и 309 (DP47GS) и SEQ ID NO: 319, 321 и 323 (CH1A1A).
Конструкции IgG-IL-2 создавали путем кратковременной экспрессии в клетках линии HEK293 EBNA и очищали в целом согласно методу, описанному выше для конструкций Fab-IL-2-Fab. В целом, метод состоял в следующем: слитые белки IgG-IL-2 очищали с использованием одной стадии аффинной хроматографии на белке A (HiTrap ProtA, фирма GE Healthcare), уравновешивали с использованием 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, pH 7,5. После внесения супернатанта колонку сначала промывали 20 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитрата натрия, pH 7,5, а затем промывали 13,3 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитратом натрия, 500 мМ хлоридом натрия, pH 5,45. Слитый белок IgG-цитокин элюировали с помощью 20 мМ цитрата натрия, 100 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, pH 3. Фракции нейтрализовали, объединяли и очищали гель-фильтрацией (HiLoad 16/60 Супердекс 200, фирма GE Healthcare) в конечном буфере для продукта, имеющем следующий состав: 25 мМ фосфат калия, 125 мМ
- 47 033369 хлорид натрия, 100 мМ глицин, pH 6,7. Ниже представлены примеры результатов процедур очистки и результаты для отобранных указанных ниже конструкций. Концентрацию белка в очищенных образцах белков определяли, измеряя оптическую плотность (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности.
Чистоту и молекулярную массу иммуноконъюгатов анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5 мМ 1,4-дитиотреитол) или без него и окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым (SimpleBlue™ SafeStain, фирма Invitrogen). Гелевую систему NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen) применяли согласно инструкциям производителя (4-20% Трис-глициновые гели или 3-12% бис-Трис). Содержание агрегатов в образцах иммуноконъюгатов анализировали с использованием колонки для аналитической гель-фильтрации с Супердекс 200 10/300GL (фирма GE Healthcare) в подвижном буфере, содержащем 2 мМ MOPS, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3, pH 7,3, при 25°C.
Аффинность связывания FAP
Способность связывать FAP расщепленных Fab-фрагментов, применяемых в указанных примерах в качестве антигенсвязывающих фрагментов, определяли на основе резонанса поверхностного плазмона (SPR) с использованием устройства Biacore. В целом, метод состоял в следующем: антитело к His (PentaHis, фирма Qiagen 34660) иммобилизовали на CM5-чипах для захвата 10 нМ человеческого, мышиного или обезьян циномолгус FAP-His (20 с). Температура составляла 25°C и применяли HBS-EP в качестве буфера. Концентрация анализируемого Fab составляла от 100 до 0,41 нМ (с дублированием), скорость потока составляла 50 мкл/мин (ассоциация: 300 с, диссоциация: 600 с (4B9, 14B3, 29B11, 3F2) или 1200 с (28H1, 4G8), регенерация: 60 с, 10 мМ глицин pH 2). Аппроксимацию осуществляли на основе модели связывания 1:1, RI=0, Rmax = локальное значение (поскольку применяли формат захвата). В табл. 2 представлены данные об аффинности одновалентных компонентов по данным SPR.
Таблица 2
Аффинность (KD) Fab-фрагментов, мишенью которых является FAP, к FAP по данным SPR
KD в нМ Человеческий FAP FAP обезьян циномолгус Мышиный FAP
4В9 Fab 0,3 0,23 5
0,31 0,24 5,2
14ВЗ Fab 0,47 0,61 4,7
0,47 0,59 4,7
29В11 Fab 0,19 0,21 1,3
0,19 0,2 1,2
3F2 Fab 6 4,7 8,9
6 5,3 9,5
28Н1 Fab 2,6 3,7 0,13
2,6 3,7 0,18
53 (48 стационарное 33 (33 стационарное
4G8 Fab состояние) состояние) 0,07
51 (48 стационарное 35 (34 стационарное 0,07
состояние) состояние)
Анализы биологической активности имеющих специфическую мишень (направленных) иммуноконъюгатов IL-2.
Биологическую активность иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP или MCSP, и иммуноконъюгатов IgG-IL-2, мишенью которых является FAP, содержащих дикого типа или (четырех)мутантный IL-2, исследовали с использованием нескольких клеточных анализов в сравнении с поступающим в продажу IL-2 (пролейкин, фирма Novartis, Хирон).
Высвобождение IFN-γ NK-клетками (в растворе).
NK92-клетки с недостаточной экспрессией IL-2 (100000 клетки/лунку в 96-луночный планшет с U-образным дном) инкубировали с иммуноконъюгатами IL-2 в различных концентрациях, которые содержали дикого типа или (четырех)мутантный IL-2, в течение 24 ч в NK-среде (среда MEM-альфа фирмы Invitrogen (№ 22561-021), дополненная 10% FCS, 10% лошадиной сыворотки, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанолом, 0,2 мМ инозитом и 0,02 мМ фолиевой кислотой). Супернатанты собирали и высвобождение IFN-γ анализировали с использованием набора II для ELISA, содержащего антитело к человеческому IFN-γ, фирма Becton Dickinson (№ 550612). Пролейкин (фирма Novartis) служил в качестве положительного контроля при оценке опосредуемой IL-2 активации клеток.
Пролиферация NK-клеток.
Получали образцы крови здоровых добровольцев в содержащие гепарин шприцы и выделяли PBMC. Неповрежденные человеческие NK-клетки выделяли из PBMC, используя набор II для выделения человеческих NK-клеток фирмы Miltenyi Biotec (№ 130-091-152). Экспрессирующие CD25 клетки оценивали с помощью проточной цитометрии. Для анализа пролиферации 20000 выделенных человеческих
- 48 033369
NK-клеток инкубировали в течение 2 дней во влажной камере при 37°C, 5% CO2 в присутствии различных иммуноконъюгатов IL-2, содержащих дикого типа или (четырех)мутантный IL-2. Пролейкин (фирма Novartis) служил в качестве контроля. Через 2 дня содержание АТФ в клеточных лизатах измеряли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Pro mega (№ G7571/2/3). Процент роста рассчитывали, принимая пролиферацию при наиболее высокой концентрации пролейкина за 100%, а пролиферацию необработанных нестимулированных IL-2 клеток - за 0%.
Анализ фосфорилирования STAT5.
Получали образцы крови здоровых добровольцев в содержащие гепарин шприцы и выделяли PBMC. PBMC обрабатывали иммуноконъюгатами IL-2, содержащими дикого типа или (четырех)мутантный IL-2 в указанных концентрациях или пролейкином (фирма Novartis) в качестве контроля. После 20-минутной инкубации при 37°C PBMC фиксировали предварительно нагретым Cytofix-буфером (фирма Becton Dickinson, № 554655) в течение 10 мин при 37°C, после чего повышали проницаемость клеток с помощью буфера III Phosflow Perm (фирма Becton Dickinson, № 558050) в течение 30 мин при 4°C. Клетки отмывали дважды ЗФР, содержащим 0,1% БСА, перед осуществлением FACS-окрашивания, для которого использовали смеси антител для проточной цитометрии для выявления различных клеточных популяций и фосфорилирования STAT5. Образцы анализировали с использованием устройства FACSCantoII с HTS фирмы Becton Dickinson.
NK-клетки определяли как CD3-CD56'. CD8-позитивные T-клетки определяли как CD3+CD8+, CD4-позитивные T-клетки определяли как CD4+CD25-CD127+ и Treg-клетки определяли как CD4+CD25+FoxP3+.
Пролиферация T-клеток и AICD.
Получали образцы крови здоровых добровольцев в содержащие гепарин шприцы и выделяли PBMC. Неповрежденные T-клетки выделяли с использованием набора для выделения T-клеток Pan T Cell Isolation Kit II фирмы Miltenyi Biotec (№ 130-091-156). T-клетки предварительно стимулировали 1 мкг/мл ФГА-М (фирма Sigma Aldrich, № L8902) в течение 16 ч перед добавлением пролейкина или иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, содержащих дикого типа или (четырех)мутантный IL-2, к промытым клеткам в течение еще 5 дней. Через 5 дней содержание АТФ в клеточных лизатах измеряли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega (№ G7571/2/3). Относительную пролиферацию рассчитывали, принимая пролиферацию при наиболее высокой концентрации пролейкина за 100%.
Экспозицию фосфатидилсерина (PS) и клеточную гибель T-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии (FACSCantoII, фирма BD Biosciences) с использованием клеток, окрашенных аннексином V (набор для окрашивания Annexin-V-FLUOS, фирма Roche Applied Science) и йодидом пропидиния (PI). Для индукции индуцированной активацией клеточной гибели (AICD) T-клетки обрабатывали индуцирующим апоптоз антителом к Fas (фирма Millipore, клон Ch11) в течение 16 ч после 16-часовой обработки ФГА-М и 5-дневной обработки иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab. Окрашивание аннексином V (Ann-V) осуществляли согласно инструкциям производителя. В целом, метод состоял в следующем: клетки отмывали Ann-V-связывающим буфером (1 х маточный раствор: 0,01 М Hepes/NaOH, pH 7,4, 0,14 М NaCl, 2,5 мМ CaCl2) и окрашивали в течение 15 мин при КТ с помощью комплекса аннексин V-ФИТЦ (фирма Roche). Клетки вновь отмывали Ann-V-связывающим буфером перед добавлением 200 мкл/лунку Ann-V-связывающего буфера, содержащего PI (0,3 мкг/мл). Клетки немедленно анализировали с помощью проточной цитометрии.
Связывание с экспрессирующими FAP клетками.
Связывание иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, с человеческим FAP, экспрессируемым на стабильно трансфектированных HEK293-клетках оценивали с помощью FACS. В целом, метод состоял в следующем: 250000 клеток/лунку инкубировали с взятыми в указанных концентрациях иммуноконъюгатами в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°C и однократно отмывали ЗФР/0,1% БСА. Связанные иммуноконъюгаты определяли после инкубации в течение 30 мин при 4°C с конъюгированным с ФИТЦ F(ab')2-фрагментом козьего антитела, специфического в отношении F(ab')2, AffiniPure (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-096-097, рабочий раствор: разведение 1:20 в ЗФР/0,1% БСА, свежеприготовленный), используя устройство FACS CantoII (программное обеспечение FACS Diva).
Анализ с помощью FACS интернализации FAP при связывании.
Для нескольких известных в данной области антител к FAP известно, что они индуцируют интернализацию FAP при связывании (описано, например, у Baum et al., J. Drug. Target. 15, 2007, p. 399-406; Bauer et al., Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings (издание после конференции), 28 мая 2010 г. (дополнение от 20 мая), реферат № 13062 (2010); Ostermann et al., Clin. Cancer Res. 14, 2008, p. 4584-4592). По этой причине при создании изобретения анализировали способность к интернализации предлагаемых в изобретении иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab. В целом, метод состоял в следующем: клетки линии GM05389 (фибробласты легкого человека), которые культивировали в среде EMEM, дополненной 15% FCS, отделяли, промывали, подсчитывали, анализировали их жизнеспособность и высевали с плотностью 2*105 клеток/лунку в 12-луночные планшеты. На следующий день имму
- 49 033369 ноконъюгаты Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, разводили холодной средой и давали связываться с клеточной поверхностью в течение 30 мин на льду. Избыток несвязанного антитела отмывали с помощью холодного ЗФР и клетки дополнительно инкубировали в 0,5 мл полной предварительно нагретой среды при 37°C в течение указанных периодов времени. Через различные моменты времени клетки переносили на лед, однократно отмывали холодным ЗФР и инкубировали с вторичным антителом (конъюгированное с ФИТЦ F(ab')2-фрагментом козьего антитела, специфического в отношении F(ab')2, AffiniPure (фирма Jackson Immuno Research Lab, № 109-096-097, разведение 1:20) в течение 30 мин при 4°C. Затем клетки промывали дважды ЗФР/0,1% БСА, переносили в 96-луночный планшет, центрифугировали (400xg) в течение 4 мин при 4°C и клеточный дебрис ресуспендировали путем интенсивного перемешивания. Клетки фиксировали, используя 100 мкл 2% PFA (параформальдегид). Для FACS-оценки клетки ресуспендировали, используя по 200 мкл ЗФР/0,1% БСА/образец, и осуществляли измерения с использованием протокола для планшетов для устройства FACS CantoII (программное обеспечение FACS Diva).
Пример 2.
При создании изобретения были разработаны мутантные версии IL-2, которые содержали одну или несколько следующих мутаций (по сравнению с последовательностью IL-2 дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1):
1) T3A - обеспечивает выключение предсказанного сайта O-гликозилирования,
2) F42A - обеспечивает выключение взаимодействия IL-2/IL-2R α,
3) Y45A - обеспечивает выключение взаимодействия IL-2/IL-2R α,
4) L72G - обеспечивает выключение взаимодействия IL-2/IL-2R α,
5) C125A - ранее описанная мутация, препятствующая связыванию посредством дисульфидного мостика димеров IL-2.
Мутантный полипептид IL-2, содержащий все мутации 1-4, обозначен в контексте настоящего описания как четырехмутантный (qm) IL-2. Он может содержать также мутацию 5 (см. SEQ ID NO: 19).
Помимо трех мутаций F42A, Y45A и L72G, созданных для воздействия на связывание с CD25, T3A-мутация выбрана для элиминации сайта O-гликозилирования и получения белкового продукта с более высокой гомогенностью и чистотой, когда полипептид или иммуноконъюгат IL-2 qm экспрессируется в эукариотических клетках, таких как CHO или НЕК293-клетки.
С целью очистки His6-метку интродуцировали на C-конец, соединяя через VD-последовательность. Для сравнения создавали немутантную аналогичную версию IL-2, включающую только мутацию C145A, препятствуя, тем самым, образованию нежелательных межмолекулярных дисульфидных мостиков (SEQ ID NO: 3). Соответствующие молекулярные массы без сигнальной последовательности составляли 16423 Да для оголенного IL-2 и 16169 Да для оголенного IL-2 qm. IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2 с His-меткой трансфектировали клетки линии НЕК EBNA в бессывороточной среде (среда F17). У профильтрованного супернатанта заменяли буфер посредством перекрестного потока перед его внесением в картридж NiNTA Superflow (5 мл, фирма Qiagen). Колонку промывали буфером для промывки: 20 мМ фосфат натрия, 0,5 М хлорид натрия, pH 7,4 и элюировали буфером для элюции 20 мМ фосфат натрия, 0,5 М хлорид натрия, 0,5 М имидазол, рН 7,4. После загрузки колонку отмывали 8 объемами колонки (CV) буфера для отмывки, 10 CV 5% буфера для элюции (что соответствовало 25 мМ имидазолу), затем элюировали с использованием градиента имидазола вплоть до 0,5 М. Объединенный элюат окончательно очищали с помощью гель-фильтрации на колонке HiLoad 16/60 с Супердекс75 (фирма GE Healthcare) в 2 мМ MOPS, 150 мМ хлорид натрия, 0,02% азида натрия, pH 7,3. На фиг. 2 представлена хроматограмма, полученная после очистки с использованием His-метки оголенного IL-2 дикого типа. Пул 1 получали из фракций 78-85, пул 2 - из фракций 86-111. На фиг. 3 представлена хроматограмма, полученная после гель-фильтрации IL-2 дикого типа, в каждом пуле объединены фракции 12-14. На фиг. 4 представлен результат аналитической гель-фильтрации IL-2 дикого типа на колонке с Супердекс 75, 10/300 GL (фирма GE Healthcare) в 2 мМ MOPS, 150 мМ хлорид натрия, 0,02% азида натрия, pH 7,3. В пул 1 и 2 входили два белка с молекулярной массой примерно 22 и 20 кДа. Пул 1 включал большее количество белка, имеющего больший размер, а пул 2 включал большее количество белка, имеющего меньший размер, предположительно такое различие является следствием различий в Oгликозилировании. Выходы составляли примерно 0,5 мг/л супернатанта на пул 1 и примерно 1,6 мг/л супернатанта на пул 2. На фиг. 5 представлена хроматограмма, полученная после очистки с использованием His-метки четырехмутантного IL-2. Пул 1 состоял из фракций 59-91, пул 2 из фракций 92-111. На фиг. 6 представлена хроматограмма, полученная после гель-фильтрации четырехмутантного IL-2, при этом сохраняли только пул 2, содержащий фракции 12-14. На фиг. 7 представлен результат аналитической гель-фильтрации четырехмутантного IL-2 на колонке с Супердекс 75, 10/300 GL (фирма GE Healthcare) в 2 мМ MOPS, 150 мМ хлорид натрия, 0,02% азида натрия, pH 7,3. Препарат оголенного четырехмутантного IL-2 включал только один белок 20 кДа. У этого белка был выключен сайт O-гликозилирования. Аликвоты оголенных IL-2 дикого типа и четырехмутантного хранили в замороженном состоянии при -80°C. Выходы составляли примерно 0,9 мг/л супернатанта.
- 50 033369
Вторую партию меченого с помощью His четырехмутантного IL-2 очищали согласно описанному выше методу с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (IMAC) и затем с помощью гель-фильтрации (SEC). Применяемые буферы для IMAC представляли собой буфер для уравновешивания и промывки колонки, содержащий 50 мМ Трис, 20 мМ имидазол, 0,5 М NaCl, pH 8, и буфер для элюции, содержащий 50 мМ Трис, 0,5 М имидазол, 0,5 М NaCl, pH 8. Применяемый для SEC и конечный буфер для продукта включал 20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, pH6. На фиг. 43 представлены результаты такой очистки. Выход составлял 2,3 мл/л супернатанта.
Затем определяли аффинность в отношении гетеродимера IL-2R βγ и α-субъединицы IL-2R с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR). В целом, метод состоял в следующем: лиганд - либо αсубъединицу человеческого IL-2R (Fc2), либо гетеродимер IL-2-R, включающий β в качестве выступа, γ в качестве впадины (Fc3) -иммобилизовали на CM5^u^. Затем оголенные IL-2 дикого типа (пул 1 и 2) или четырехмутантный IL-2 и пролейкин (фирма Novartis/Chiron) наносили на чип в качестве анализируемых веществ при 25°C в HBS-EP-буфере в концентрациях от 300 до 1,2 нМ (разведение 1:3). Скорость потока составляла 30 мкл/мин, и применяли следующие условия: ассоциация 180 с, диссоциация: 300 с и регенерация: 2*30с 3 М MgCl2 для гетеродимера IL-2-R β выступ, γ впадина, 10 с 50 мМ NaOH для α-субъединицы IL-2R. Применяли модель связывания 1:1 для аппроксимации (связывание 1:1, RI#0, Rmax = локальное значение для IL-2R βγ, кажущаяся величина KD, связывание 1:1, RI=0, Rmax = локальное значение для IL-2R α). В табл. 3 представлены соответствующие величины KD, характеризующие связывание человеческого IL-2R дикого типа и четырехмутантного IL-2, а также пролейкина с IL-2R βγ и α-субъединицей IL-2R.
Таблица 3
Аффинность мутантных полипептидов IL-2 к IL-2R с промежуточной аффинностью и α-субъединице IL-2R
К D в нМ Т = 25°С Hu IL-2R βγ (кинетика) Hu IL-2R а (кинетика) Hu IL-2R а (стационарное состояние)
«оголенный» IL-2 wt, 5,6 17,4 30,3
пул 1 5 16,6 23,9
«оголенный» IL-2 wt, 2,8 10,6 19,7
пул 2 1,8 10 17,6
«оголенный» IL-2 qm 2,7 2 нет связывания нет связывания
пролейкин 2,4 2,8 7.5 12.5 19 17,8
Полученные данные демонстрируют, что оголенный четырехмутантный IL-2 обладает требуемым поведением и утрачивает способность к связыванию с α-субъединицей IL-2R, в то время как связывание с IL-2R βγ сохраняется и является сопоставимым со связыванием соответствующей конструкции IL-2 дикого типа и пролейкина. Различия между пулами 1 и 2 IL-2 дикого типа, по-видимому, могут быть связаны с различиями в O-гликозилировании. Эту вариабельность и гетерогенность можно преодолевать у четырехмутантного IL-2R путем интродукции мутации T23A.
Пример 3.
Три мутации F42A, Y45A и L72G и мутацию T3A интродуцировали в формат Fab-IL-2-Fab (фиг. 1A), используя антитело к FAP 4G8 в качестве модели обеспечивающего направленный перенос домена либо в виде конструкции с одной мутацией: 1) 4G8 IL-2 T3A, 2) 4G8 IL-2 F42A, 3) 4G8 IL-2 Y45A, 4) 4G8 IL-2 L72G, либо их объединяли также в конструкциях Fab-IL-2 mt-Fab в виде: 5) трех мутаций F42A/Y45A/L72G или 6) четырех мутаций 2T3A/F42A/Y45A/L72G для инактивации сайта O-гликозилирования. Для сравнения использовали конструкцию Fab-IL-2 wt-Fab на основе 4G8. Все конструкции содержали мутацию C145A, препятствующую образованию связанных дисульфидными мостиками димеров IL-2. Различные конструкции Fab-IL-2-Fab экспрессировали в HEK 293-клетках и очищали согласно указанному выше методу с помощью белка A и гель-фильтрации, которые описаны выше. Затем аффинность отобранных вариантов IL 2 в отношении гетеродимера человеческого и мышиного IL-2R βγ и в отношении α-субъединицы человеческого и мышиного IL-2R определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) (фирма Biacore), используя рекомбинантный гетеродимер IL-2R βγ и мономерный содержащий α-субъединицу IL-2R, в следующих условиях: α-субъединицу IL-2R иммобилизовали, используя две плотности иммобилизации, проточную ячейку с более высокой иммобилизацией применяли для мутантов, у которых утрачена способность связываться с CD25. Использовали следующие условия: химическая иммобилизация: гетеродимер человеческого IL-2R βγ - 1675 RU; гетеродимер мышиного IL-2R βγ - 5094 RU; α-субъединица человеческого IL-2R - 1019 RU; α-субъединица человеческого IL-2R - 385 RU, α-субъединица мышиного IL-2R -1182 RU; α-субъединица мышиного IL-2R - 378 RU, температура: 25°C, анализируемые субстанции: варианты содержащих Fab конструкций Fab-IL-2 на основе 4G8 - от 3,1 до 200 нМ, скорость потока - 40 мкл/мин, ассоциация: 180 с, диссоциация: 180 с, регенерация: 10 мМ глицин, pH 1,5: 60 с, 40 мкл/мин. Аппроксимация: реакционная модель двух состояний (конформационное изменение), RI = 0 Rmax = локальное значение. Результаты кинетиче
- 51 033369 ского анализа представлены в табл. 4.
Таблица 4
Аффинность иммуноконъюгатов, мишенью которых является FAP, содержащих мутантные полипептиды IL-2, к IL-2R с промежуточной аффинностью и к α-субъединице IL-2R (KD)
Конструкция Fab-IL-2-Fab Hu IL-2R βγ Hu IL-2R а Mu IL-2R βγ Ми IL-2R а
4G8 IL-2 wt 3,8нМ 4,5нМ 45,6нМ 29нМ
4G8 IL-2 ТЗА 1,6нМ 4,9нМ 15,6нМ 15нМ
4G8 IL-2 F42A 4,7нМ 149нМ 57нМ ЗбЗнМ
4G8 IL-2 Y45A 3,9нМ 22,5нМ 41,8нМ 369нМ
4G8 IL-2 L72G ND 45,ЗнМ ND ND
4G8 IL-2 трехмутантный F42A/Y45A/L72G 5,6нМ нет связывания 68,8нМ ND
4G8 IL-2 четырехмутантный T3A/F42A/Y45A/L72G 5,2нМ нет связывания 56,2нМ нет связывания
Одновременное связывание с гетеродимером IL-2R βγ и FAP продемонстрировано с помощью SPR. В целом, метод состоял в следующем: конструкцию человеческого IL-2R βγ, созданную с помощью технологии knob-into-hole, иммобилизовали химически на СМ5-чипе и 10 нМ конструкцию Fab-IL-2-Fab захватывали в течение 90 с. Человеческий FAP служил в качестве анализируемой субстанции, и его использовали в концентрациях от 200 до 0,2 нМ. Использовали следующие условия: температура: 25°C, буфер: HBS-EP, скорость потока: 30 мкл/мин, ассоциация: 90 с, диссоциация: 120 с. Регенерацию осуществляли в течение 60 с, используя 10 мМ глицин, pH 2. Аппроксимацию осуществляли с использованием модели связывания 1:1, RI.-O, Rmax = глобальное значение. Анализ образования мостиков, проведенный с помощью SPR, продемонстрировал, что конструкции Fab-IL-2-Fab как дикого типа, так и четырехмутантный, а также полученный с помощью созревания аффинности к FAP связывающийся клон 28H1 или его родительские антитела 3F2 или 4G8 в концентрации 10 нМ обладали способностью связываться одновременно с гетеродимером IL 2R βγ, иммобилизованном на чипе, а также и с человеческим FAP, применяемым в качестве анализируемой субстанции (фиг. 8). Результаты определения аффинности представлены в табл. 5.
Таблица 5
Аффинность к FAP (KD) иммуноконъюгатов, мишенью которых является FAP, содержащих мутантные полипептиды IL-2 и связывающиеся с IL-2R с промежуточной аффинностью.
Конструкция Fab-IL-2-Fab KD
4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 5,0hM
4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 5,6hM
29В11 Fab-IL-2 wt-Fab 0,32hM
29В11 Fab-IL-2 qm-Fab 0,89hM
3F2 Fab-IL-2 wt-Fab 1,2hM
Взятые в совокупности, данные SPR-анализа демонстрируют, что I) мутация T3A не влияет на связывание с CD25; II) три мутации F42A, Y45A и L72G не влияют на аффинность к гетеродимеру IL-2R βγ, но они снижают аффинность к CD25 следующим образом: wt=T3A>Y45A (примерно в 5 раз ниже)>L72G (примерно в 10 раз ниже)>F42A (примерно в 33 раза ниже); III) комбинация трех мутаций F42A, Y45A и L72G в сочетании с воздействующей на сайт О-гликозилирования мутацией T3A или без указанной мутации приводит к полной потере способности связываться CD25 при определении в условиях SPR
IV) хотя аффинность человеческого IL-2 к мышиному гетеродимеру IL-2R βγ и α-субъединице IL-2R уменьшается примерно в 10 раз по сравнению с человеческими рецепторами IL-2R, отобранные мутации не влияют на аффинность к мышиному гетеродимеру IL-2R βγ, но аннулируют связывание с α-субъединицей мышиного IL-2R соответственно. Этот результат свидетельствует о том, что мыши представляют собой приемлемую модель для изучения фармакологических и токсикологических воздействий мутантных IL-2, хотя в целом IL-2 обладают меньшей токсичностью для грызунов, чем для чело века.
Помимо утраты сайта O-гликозилирования, одним из дополнительных преимуществ комбинации четырех мутаций T3A, F42A, Y45A, L72G является снижение поверхностной гидрофобности четырехмутантного IL-2 вследствие замены экспонируемых на поверхности гидрофобных остатков, таких как фенилаланин, тирозин или лейцин, на аланин. Анализ температуры агрегации методом динамического рассеяния света продемонстрировал, что температура агрегации иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, которые содержат дикого типа или четырехмутантный IL-2, находилась в одинаковом диапазоне: примерно 57-58°C для Fab-IL-2-Fab на основе родительского 3F2 и для производного 3F2 с созревшей аффинностью 29B11 и в диапазоне от 62-63°C для Fab-IL-2-Fab на основе родительского
- 52 033369
4G8 и производных 4G8 с созревшей аффинностью 28H1, 4B9 и 14B3 4G8, что свидетельствует о том, что комбинация четырех мутаций не оказывает отрицательного воздействия на стабильность белка. В подтверждение предпочтительных свойств отобранных четырех мутаций IL-2 установлено, что выход после кратковременной экспрессии иммуноконъюгата в формате четырехмутантного Fab-IL-2 qm-Fab может даже превышать уровни экспрессии, обнаруженные при применении соответствующих конструкций Fab-IL-2 wt-Fab. И, наконец, фармакокинетический анализ (ФК) продемонстрировал, что конструкции на основе 4G8 как Fab-IL-2 qm-Fab, так и Fab-IL-2 wt-Fab обладают сопоставимыми ФК-свойствами (см. пример 9, ниже). На основе этих данных и данных клеточных анализов, которые описаны ниже в примере 4, четыре мутации T3A, F42A, Y45A, L72G отобраны в качестве идеальной комбинации мутаций для того, что аннулировать связывание CD25 с IL-2 в обладающем направленным действием иммуноконъюгате Fab-IL-2-Fab.
Пример 4.
Иммуноконъюгаты Fab-IL 2-Fab на основе 4G8, мишенью которых является FAP, содержащие IL-2 дикого типа или имеющий одну мутацию 4G8 IL-2 T3A, 4G8 IL-2 F42A, 4G8 IL-2 Y45A, 4G8 IL-2 L72G или IL-2, имеющий соответственно три мутации (F42A/Y45A/L72G) или четыре мутации (T3A/F42A/Y45A/L72G), последовательно тестировали с использованием описанных выше клеточных анализов в сравнении с пролейкином.
Индуцируемое IL-2 высвобождение IFN-γ оценивали после инкубации NK-клеток линии NK92 с указанными конструкциями (фиг. 9). NK92-клетки экспрессируют на их поверхности CD25. Результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал меньшей эффективностью в отношении индукции высвобождения IFN-γ, чем пролейкин, что является ожидаемым с учетом примерно в 10 раз более низкой аффинности Fab-IL-2 wt-Fab к гетеродимеру IL-2R βγ. Интродукция индивидуальных мутаций, влияющих на связывание с CD25, а также комбинации трех мутаций, влияющих на связывание с CD25, в трехмутантный IL-2 привела к получению конструкций Fab-IL-2-Fab, которые оказались сопоставимыми в пределах ошибки метода с конструкцией, содержащей IL-2 дикого типа, с позиций эффективности и абсолютной индукции высвобождения IFN-γ.
Таблица 6
Индукция высвобождения IFN-γ NK-клетками иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab, содержащими мутантные полипептиды IL-2
Конструкция EC50 [nM]
пролейкин 4,1
4G8 Fab-IL 2 wt-Fab 23,0
4G8Fab-IL-2 (T3A)-Fab 16,2
4G8 Fab-IL-2 (F42A)-Fab 15,4
4G8 Fab-IL-2(Y45A)-Fab 20,9
4G8 Fab-IL-2 (L72G)-Fab 16,3
4G8 Fab-IL-2 (трехмутантный 42/45/72)-Fab 24,4
Затем индукцию пролиферации выделенных человеческих NK-клеток иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab оценивали на основе анализа пролиферации (Cell Titer Glo, фирма Promega) (фиг. 10). В отличие от NK92-клеток свежевыделенные NK-клетки не экспрессируют CD25 (или экспрессируют очень небольшие количества). Результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал примерно в 10 раз более низкой эффективностью в отношении индукции пролиферации NK-клеток, чем пролейкин, что является ожидаемым, учитывая примерно в 10 раз более низкую аффинность иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab к гетеродимеру IL-2R βγ. Интродукция индивидуальных мутаций, влияющих на связывание с CD25, а также комбинации трех мутаций, влияющих на связывание с CD25, в трехмутантный IL-2 привела к получению конструкций Fab-IL-2-Fab, которые оказались сопоставимыми в пределах ошибки метода с конструкцией, содержащей IL-2 дикого типа, с позиций эффективности и абсолютной индукции пролиферации; обнаружен лишь очень небольшой сдвиг эффективности у трехмутантного Fab-IL-2-Fab. Во втором эксперименте оценивали индукцию пролиферация активированных ФГА T-клеток после инкубации с взятыми в различных количествах пролейкином и иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab (фиг. 11). Поскольку активированные T-клетки экспрессируют CD25, выраженное снижение T-клеточной пролиферации удалось обнаружить при инкубации с иммуноконъюгатами, содержащими IL-2 с одной из мутаций F42A, L72G или Y45A; в случае F42A продемонстрировано наиболее выраженное снижение, далее в порядке убывания действия располагались мутации L72G и Y45A, в то время как при применении Fab-IL-2 wt-Fab или Fab-IL-2 (T3A)-Fab активация сохранялась практически на таком же уровне, что и при применении пролейкина. Эти данные свидетельствуют о снижении аффинности к CD25 при оценке с помощью SPR (см. описанный выше пример). Комбинация трех мутаций, влияющих на связывание с CD25, в трехмутантном IL-2 приводит к получе
- 53 033369 нию иммуноконъюгата, который опосредует значительное снижение индукции T-клеточной пролиферации в растворе. В контексте этих результатов при создании изобретения оценивали клеточную гибель T-клеток с использованием окрашивания аннексином V/PI с последующей сверхстимуляцией, индуцированной первой стимуляцией, которую осуществляли путем 16-часовой обработки 1 мкг/мл ФГА, второй стимуляцией путем обработки в течение 5 дней пролейкином или соответственно иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab с последующей третьей стимуляцией путем обработки 1 мкг/мл ФГА. С помощью такого процесса было обнаружено, что индуцированная активацией клеточная гибель (AICD) у сверхстимулированных Т-клеток существенно снижалась при использовании иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, содержащих IL-2 с индивидуальными мутациями F42A, L72G и Y45A, влияющими на связывание с CD25, при этом при применении F42A и L72G обнаружено наиболее сильное снижение, которое оказалось сходным со снижением достигаемом при применении трех мутаций в иммуноконъюгате, содержащем трехмутантный IL-2 (фиг. 12). В последней серии экспериментов изучали воздействия Fab-IL-2 qm-Fab на индукцию фосфорилирования STAT5 в сравнении с Fab-IL-2 wt-Fab и пролейкином в человеческих NKклетках, CD4+-T-клетках, CD8+-T-клетках и T^-клетках из человеческих PBMC (фиг. 13). Для NK-клеток и CD8+-T-клеток, для которых характерно отсутствие экспрессии или очень низкий уровень экспрессии CD25 (это означает, что передача сигналов IL-2R опосредуется гетеродимером IL-2R βγ), установлено, что формат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал примерно в 10 раз более низкой эффективностью в отношении индукции фосфорилирования STAT5, чем пролейкин, и что эффективность Fab-IL-2 qm-Fab оказалась сопоставимой с эффективностью конструкции Fab-IL-2 wt-Fab. В случае CD4+-T-клеток, для которых характерна быстрая повышающая регуляция CD25 при стимуляции, иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab оказался менее эффективным, чем Fab-IL-2 wt-Fab, но все еще обладал сопоставимой способностью индуцировать передачу сигналов IL-2R при применении в насыщающих концентрациях. Это противоположно данным, полученным для T^-клеток, для которых эффективность Fab-IL-2 qm-Fab была существенно более низкой по сравнению с эффективностью иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab, из-за высокого уровня экспрессии на CD25 T^-клетках и, как следствие, высокой аффинности связывания иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab с CD25 на T^-клетках. В результате аннулирования способности связываться с CD25 у иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab передача сигналов IL-2 в T^-клетках активируется только через гетеродимер IL-2R βγ при его применении в концентрациях, в которых передача сигналов IL-2R активирует CD25-негативные эффекторные клетки через гетеродимер IL-2R βγ. В целом, установлено, что четырехмутантный IL-2, указанный в настоящем описании, обладает способностью активировать передачу сигналов IL-2R через гетеродимер IL-2R βγ, но не приводит ни к AICD, ни к преимущественной стимуляции T^-клеток по сравнению с другими эффекторными клетками.
Пример 5.
Основываясь на данных, описанных в примерах 2 и 3, создавали иммуноконъюгаты с созревшей аффинностью (иммуноконъюгаты, содержащие Fab с созревшей аффинностью) Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, на основе клонов 28H1 или 29B11 и очищали их с использованием методов, описанных в разделе Общие методы, в целом созданный на основе 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является FAP, очищали с использованием одной стадии аффинной хроматографии (белок G) с последующей гель-фильтрацией (Супердекс 200). Для уравновешивания колонки использовали ЗФР и супернатант пула стабильных CHO-клеток (CDCHO среда) вносили на колонку с белком G (фирма GE Healthcare), колонку промывали ЗФР и затем образцы элюировали 2,5 мМ HCl и фракции немедленно нейтрализовали 10* ЗФР. Гель-фильтрацию осуществляли в конечном буфере для продукта, имеющем следующий состав: 25 мМ фосфат натрия, 125 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, pH 6,7 на колонке Супердекс 200. На фиг. 14 представлены профили элюции после очистки и результаты аналитической характеризации продукта с помощью ДСН-ПААГ (4-20% бис-Трис-мини-гель NuPAGE Novex, фирма Invitrogen, подвижный буфер MOPS, восстанавливающие и невосстанавливающие условия). С учетом низкой связывающей способности 28H1 Fab-фрагмента с белком G и белком A применение дополнительных стадий захвата может приводить к более высоким выходам продукта.
Иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab на основе клонов 4G8, 3F2 и 29B11, мишенью которых является FAP, и Fab-IL-2 qm-Fab на основе клона MHLG1 KV9, мишенью которых является MCSP, очищали с помощью одной стадии аффинной хроматографии (белок A) с последующей гель-фильтрацией (Супердекс 200). Для уравновешивания колонки использовали 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, pH 7,5 и супернатант вносили на колонку с белком A. Первую стадию промывки осуществляли с помощью 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, pH 7,5, после чего осуществляли вторую стадию промывки, используя: 13,3 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, 500 мМ хлорид натрия, pH 5,45. Иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab элюировали с помощью 20 мМ цитрата натрия, 100 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, pH 3. Гель-фильтрацию осуществляли в конечном буфере для продукта, имеющем следующий состав: 25 мМ фосфат калия, 125 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, pH 6.7. На фиг. 15 представлены профили элюции после очистки и результаты аналитической характеризации продукта с помощью ДСН-ПААГ (4-20% бис-Трис-мини-гель NuPAGE Novex, фирма Invitrogen, подвижный буфер MOPS, восстанавливающие и невосстанавливающие условия) иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, на
- 54 033369 фиг. 16 - иммуноконъюгата MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab.
Слитые белки IgG-IL-2 qm, мишенью которых является FAP, на основе антител к FAP 4G8, 4B9 и 28H1 и контрольный слитый ненаправленный белок на основе DP47GS IgG-IL-2 qm создавали согласно методам, описанным выше в разделе Общие методы. На фиг. 46 и 47 соответственно представлены хроматограммы и профили элюции, полученные при очистке (А, Б), а также результаты аналитического ДСН-ПААГ и гель-фильтрации конечных очищенных конструкций (В, Г) иммуноконъюгатов на основе 4G8 и 28H1. Выходы после кратковременной экспрессии составляли 42 мг/л для иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и 20 мг/л для иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 28H1.
Способность связывать FAP иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm на основе антител к FAP 4G8 и 28H1 определяли с помощью метода резонанса поверхностного плазмона (SPR) с использованием устройства Biacore в сравнении с соответствующими немодифицированными антителами типа IgG. В целом, метод состоял в следующем: антитело к His (Penta-His, фирма Qiagen, № 34660) иммобилизовали на CM5-чипах для захвата 10 нМ меченного с помощью His человеческого FAP (20 с). Температура составляла 25°C, и в качестве буфера применяли HBS-EP. Концентрации анализируемой субстанции находились в диапазоне от 50 до 0,05 нМ, скорость потока составляла 50 мкл/мин (ассоциация: 300 с, диссоциация: 900 с, регенерация: 60 с помощью 10 мМ глицина, pH 2). Аппроксимацию осуществляли на основе модели связывания 1:1, RI=0, Rmax = локальное значение (поскольку применяли формат захвата). В табл. 7 представленные оцененные кажущиеся величины аффинности (пМ, авидность), определенные с помощью SPR, аппроксимированные с использованием модели связывания 1:1, RI=0, Rmax = локальное значение.
Таблица 7
KD [ПМ] Hu FAP
4G8 IgG-IL-2 qm 100
4G8 IgG 50
28Н1 IgG-IL-2 qm 175
28H1 IgG 200
Полученные данные свидетельствуют о том, что в пределах ошибки метода аффинность к человеческому FAP сохраняется у иммуноконъюгата на основе 28H1 или слегка снижается у иммуноконъюгата на основе 4G8 по сравнению с соответствующими немодифицированными антителами.
Пример 6.
Аффинность иммуноконъюгатов с созревшей аффинностью Fab-IL-2-Fab на основе 28H1 и 29B11, мишенью которых является FAP, каждый из которых содержал дикого типа или четырехмутантный IL-2, и Fab-IL-2 wt-Fab на основе 3F2 определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) в отношении гетеродимера IL-2R βγ человека, мышей или обезьян циномолгус, используя рекомбинантный гетеродимер IL-2R βγ в следующих условиях: лиганд: гетеродимер IL-2R β выступ γ впадина человека, мышей и обезьян циномолгус, иммобилизованный на CM5-чипе, анализируемая субстанция: 28H1 или 29B11 Fab-IL-2-Fab (содержащий дикого типа или четырехмутантный IL-2), 3F2 Fab-IL-2-Fab (содержащий IL-2 дикого типа), температура: 25 или 37°C, буфер: HBS-EP, концентрации анализируемой субстанции: от 200 до 2,5 нМ, скорость потока: 30 мкл/мин, ассоциация: 300 с, диссоциация: 300 с, регенерация: 60 с, 3 М MgCl2, аппроксимация: модель связывания 1:1, RI/0, Rmax = глобальное значение. Аффинность иммуноконъюгатов на основе 28H1 и 29B11 с созревшей аффинностью Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, каждый из которых содержал дикого типа или четырехмутантный IL-2, и Fab-IL-2 wt-Fab на основе 3F2 определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) в отношении α-субъединицы IL-2R человека, мышей или обезьян циномолгус, используя рекомбинантную мономерную α-субъединицу IL-2R в следующих условиях: лиганд: α-субъединица IL-2R человека, мышей и обезьян циномолгус, иммобилизованная на CM5-чипе, анализируемая субстанция: 28H1 или 29B11 Fab-IL-2-Fab (содержащий дикого типа или мутантный IL-2), 3F2 Fab-IL-2-Fab (содержащий IL-2 дикого типа), температура: 25 или 37°C, буфер: HBS-EP, концентрации анализируемой субстанции: от 25 до 0,3 нМ, скорость потока: 30 мкл/мин, ассоциация: 120 с, диссоциация: 600 с, регенерация: отсутствует, аппроксимация: модель связывания 1:1, RI/0, Rmax = глобальное значение.
Результаты кинетического анализа с использованием гетеродимера IL-2R βγ представлены в табл. 8.
- 55 033369
Таблица 8
Связывание иммуноконъюгатов, содержащих Fab с созревшей аффинностью и мутантный IL-2, с гетеродимерами IL-2R βγ
KD в нМ Hu IL-2R βγ (25°C) Hu IL-2R βγ (37°C) Cyno IL-2R βγ (25°C) Cyno IL-2R βγ (37°C) Mu IL-2R βγ (25°C) Mu IL-2R βγ (37°C)
28Н1 Fab-IL-2 9,7 19 11,5 29,2 112 186
wt-Fab 9 22 11,6 30,4 79 219
28Н1 Fab-IL-2 7,5 14,3 8,9 21,3 66 142
qm-Fab 6,9 14,7 8,4 21,2 54 106
29В11 Fab-IL- 6,5 9,5 6,9 14 93 71
2 wt-Fab 5,7 12,4 6,7 19 74 74
29B11 Fab-IL- 7,2 13,1 7,8 16,7 60 44
2 qm-Fab 7,4 13 8,4 18,1 63 42
3F2 Fab-IL-2 5 ND 6,4 ND 40 ND
wt-Fab 4,8 6,1 40
Установлено, что в то время как аффинность человеческого IL-2 к человеческому димеру IL-2R βγ составляла примерно 1 нМ, иммуноконъюгаты Fab-IL-2-Fab (содержащие дикого типа или четырехмутантный IL-2), оба, обладали пониженной аффинностью (от 6 до 10 нМ), и, как описано выше, аффинность оголенного IL-2 к мышиному IL-2R была примерно в 10 слабее, чем к IL-2R человека и обезьян циномолгус.
Результаты кинетического анализа с использованием α-субъединицы IL-2R представлены в табл. 9. В выбранных условиях отсутствует выявляемое связывание иммуноконъюгатов, содержащих четырехмутантный IL-2R с α-субъединицей IL-2R человека, мышей или обезьян циномолгус.
Таблица 9 Связывание иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, содержащих Fab с созревшей аффинностью и мутантный IL-2, с α-субъединицей IL-2R
К q в нМ Hu IL-2R a (25°C) Hu IL-2R a (37°C) Cyno IL-2R a (25°C) Cyno IL-2R a (37°С) Mu IL-2R a (25°С) Mu IL-2R a (37°С)
28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 16 16,2 28,8 28,2 16 16,2 36.5 35.6 43,3 44 67,5 61,1
28H1 Fab-IL-2 qm-F ab нет связывания Нет связывания нет связывания нет связывания нет связывания нет связывания
29B11 Fab-IL-2 wt-Fab 5 4,6 7.6 7.7 4,8 4,3 7.3 7.4 11,4 9,6 13,3 13,8
29B11 Fab-IL-2 qm-F ab нет связывания Нет связывания нет связывания нет связывания нет связывания нет связывания
3F2 Fab-IL-2 wt-Fab 5,7 6,1 ND 5 5,4 ND 12,3 12,1 ND
Аффинность иммуноконъюгатов на основе MHLG1-KV9 Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является MCSP, содержащих дикого типа или четырехмутантный IL-2, определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) в отношении человеческого гетеродимера IL-2R βγ, используя рекомбинантный гетеродимер IL-2R βγ, в следующих условиях: человеческий гетеродимер IL-2R β выступ γ впадина, иммобилизованный на CM5-чипе (1600 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab применяли в качестве анализируемых субстанций при 25 °C в буфере HBS-P. Концентрации анализируемых субстанций при изучении в отношении IL-2R βγ составляли от 300 до 0,4 нМ (разведение 1:3), скорость протока 30 мкл/мин, (продолжительность ассоциации 180 с, продолжительность диссоциации 300 с). Регенерацию в случае IL-2R βγ осуществляли, используя 2x30 с 3 М MgCl2. Данные аппроксимировали на основе модели связывания 1:1, RI ,Ό, Rmax = локальное значение в случае IL-2R βγ.
Аффинность иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab на основе MHLG1-KV9, мишенью которых является MCSP, содержащих дикого типа или четырехмутантный IL-2, определяли с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR) в отношении человеческой α-субъединицы IL-2R, используя рекомбинантную мономерную α-субъединицу IL-2R в следующих условиях: человеческая α-субъединица IL-2R, иммобилизованная на CM5-чипе (190 RU).
MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab применяли в качестве анализируемых субстанций при 25°C в буфере HBS-P. Концентрации анализируемых субстанций при изучении в отношении IL-2R α составляли от 33,3 до 0,4 нМ (разведение 1:3), скорость протока 30 мкл/мин, (продолжительность ассоциации 180 с, продолжительность диссоциации 300 с). Регенерацию в случае IL-2R α осуществляли в течение 10 с с использованием 50 мМ NaOH. Данные аппроксимировали на основе модели связывания 1:1, RI^0, Rmax = глобальное значение в случае IL-2R α.
Результаты кинетического анализа с использованием гетеродимера IL-2R βγ представлены в табл. 10.
- 56 033369
Таблица 10
KD в нМ Т = 25°С Hu IL 2R βγ (кинетика) Hu IL 2R a (кинетика) Hu IL 2R a (стационарное состояние)
MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab 8,6 8,8 6,8
9,8 10,1 10,9
MHLG1-KV9 Fab-IL 2 qm-Fab 7,3 10,7 нет связывания нет связывания
Данные подтверждают, что иммуноконъюгат MHLG1-KV9 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является MCSP, сохранял аффинность к IL-2R βγ-рецептору, в то время как аффинность связывания с CD25 утрачивалась по сравнению с иммуноконъюгатом, содержащим IL-2 дикого типа.
Далее определяли аффинность иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и 28H1 к гетеродимеру IL-2R βγ и α-субъединице IL-2R с помощью резонанса поверхностного плазмона (SPR), осуществляя непосредственное сравнение с форматом Fab-IL-2 qm-Fab иммуноконъюгата. В целом, метод состоял в следующем: лиганды - либо α-субъединицу человеческого IL-2R, либо гетеродимер человеческого IL-2R βγ - иммобилизовали на СМ5-чипе. Затем на чип наносили иммуноконъюгаты IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и 28H1, либо иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8 и 28H1 в качестве анализируемых субстанций при 25°C в HBS-EP-буфере в концентрациях от 300 до 1,2 нМ (разведение 1:3). Скорость потока составляла 30 мкл/мин, и применяли следующие условия: ассоциация: 180 с, диссоциация: 300 с и регенерация: 2x30 с при использовании 3 М MgCl2 в случае гетеродимера IL-2R βγ, 10 с при использовании 50 мМ NaOH в случае α-субъединицы IL-2R. Для аппроксимации применяли модель связывания 1:1 (связывание 1:1, RI#0, Rmax = локальное значение для IL-2R βγ, кажущаяся величина KD, связывание RI=0, Rmax = локальное значение для IL-2R α). Соответствующие величины KD представлены в табл. 11.
Таблица 11
Кажущаяся величина KD [нМ] Hu IL-2R βγ Hu IL-2R a
4G8 IgG-IL-2 qm 5,9 нет связывания
4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 10,4 нет связывания
28H1 IgG-IL-2 qm 6,2 нет связывания
28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 11,4 нет связывания
Данные демонстрируют, что иммуноконъюгаты IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и 28H1 связывались, по меньшей мере, с такой же высокой аффинностью, что и иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab, с гетеродимером IL-2R βγ, в то время как они не связывались с α-субъединицей IL-2R из-за интродукции мутаций, которые оказывают воздействие на связывание с CD25. По сравнению с соответствующими иммуноконъюгатами Fab-IL-2 qm-Fab аффинность слитых белков IgG-IL-2 qm, вероятно, несколько повышается в пределах погрешности метода.
Пример 7.
При создании изобретения в первой серии экспериментов при оценке с помощью FACS было подтверждено, что иммуноконъюгаты Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, содержащие либо IL-2 дикого типа, либо мутантный IL-2, обладали способностью связываться с экспрессирующими человеческий FAP клетками линии HEK 293-FAP (фиг. 17) и что наличие в IL-2 четырех мутаций не влияло на связывание с экспрессирующими FAP клетками (фиг. 18).
Таблица 12
Связывание иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab с экспрессирующими FAP НЕК-клетками
Значения ЕС50 (нМ)
28Н1 Fab-IL-2-Fab 0,64
28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab 0,70
29В11 Fab-IL-2-Fab 0,66
29В11 Fab-IL-2 qm-Fab 0,85
4G8 Fab-IL-2-Fab 0,65
В частности, в этих экспериментах по оценке связывания установлено, что связывающие FAP агенты в виде Fab-IL-2 qm-Fab 28H1, 29B11, 14B3 и 4B9 с созревшей аффинностью обладали повышенной абсолютной способностью к связыванию с клетками-мишенями HEK 293-FAP по сравнению с иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab на основе родительских связывающих FAP агентов 3F2 (29B11, 14B3, 4B9) и 4G8 (28H1) (фиг. 17), сохраняя при этом высокую специфичность и отсутствие связывания с HEK 293клетками, трансфектированными DPPIV, близким гомологом FAP, или HEK 293-клетками, трансфектированными имитатором. В качестве положительного контроля применяли мышиное антитело к человеческому CD26-PE DPPIV, клон M-A261 (фирма BD Biosciences, № 555437) (фиг. 19). Анализ способности к интерализации продемонстрировал, что связывание иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab не приводит к
- 57 033369 индукции интернализации FAP (фиг. 20).
В другом эксперименте с помощью FACS оценивали связывание иммуноконъюгатов IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8, мишенью которых является FAP, с человеческим FAP, который экспрессируется на стабильно трансфектированных НЕК293-клетках. Результаты представлены на фиг. 48. Данные демонстрируют, что иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm связывается с экспрессирующими FAP клетками, что характеризуется значением EC50 составляющим 0,9 нМ, сопоставимым со значением, которое соответствует конструкции Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8 (0,7 нМ).
Затем иммуноконъюгаты с созревшей аффинностью Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, содержащие IL-2 дикого типа или четырехмутантный IL-2, тестировали с использованием клеточных анализов в сравнении с пролейкином согласно методам, описанным выше в примерах.
Оценивали с помощью ELISA индуцируемое IL-2 высвобождение IFN-γ в супернатанте после инкубации NK-клеток линии NK92 с указанными иммуноконъюгатами (фиг. 21) в течение 24 ч. NK92клетки экспрессируют на своей поверхности CD25. Результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, который содержал IL-2 дикого типа, обладал меньшей способностью индуцировать высвобождение IFN-γ по сравнению с пролейкином, что является ожидаемым с учетом примерно в 10 раз более низкой аффинности иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab к гетеродимеру IL-2R βγ. Иммуноконъюгаты Fab-IL-2 qm-Fab оказались практически сопоставимыми с соответствующей конструкцией дикого типа выбранного клона с позиций эффективности и абсолютной индукции высвобождения IFN-γ, несмотря на тот факт, что NK92-клетки экспрессируют в некотором количестве CD25. Однако было установлено, что конструкция 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab индуцировала меньший уровень высвобождения цитокина по сравнению с конструкциями 29B11 Fab-IL-2 wt-Fab, а также 28H1- и 4G8-конструкциями, для которых обнаружен лишь небольшой сдвиг эффективности Fab-IL-2 qm-Fab относительно Fab-IL-2 wt-Fab.
Кроме того, иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab на основе MHLG1-KV9, мишенью которого является MCSP, сравнивали с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1 и 29B11 с использованием анализа высвобождения IFN-γ на NK92-клетках. Как продемонстрировано на фиг. 22, иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab на основе MHLG1-KV9, мишенью которого является MCSP, практически сопоставим по способности индуцировать высвобождение IFN-γ с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP.
Затем оценивали индукцию пролиферации NK92-клеток с помощью IL-2 в течение 3 дней с использованием анализа пролиферации, основанного на измерении АТФ, с помощью CellTiter Glo (фирма Promega) (фиг. 23). С учетом того, что NK92-клетки экспрессируют низкие уровни CD25, различие между иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab, содержащими IL-2 дикого типа, и иммуноконъюгатами, содержащими четырехмутантный IL-2, можно выявлять с помощью анализа пролиферации, однако в условиях насыщения обоими для достижения сходной абсолютной индукции пролиферации.
В следующем эксперименте оценивали воздействие иммуноконъюгата на основе 28H1 с созревшей аффинностью Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является FAP, на индукцию фосфорилирования STAT5 в сравнении с 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab и пролейкином с использованием человеческих NK-клеток, CD4+-T-клеток, CD8+-T-клеток и T^-клеток из человеческих PBMC (фиг. 24). Для NK-клеток и CD8+-Tклеток, для которых характерно отсутствие или очень низкий уровень экспрессии CD25 (т.е. передача сигналов IL-2R происходит через гетеродимер IL-2R βγ), результаты продемонстрировали, что иммуноконъюгат Fab-IL-2-Fab, содержащий IL-2 дикого типа, обладал примерно >10 раз более низкой способностью индуцировать высвобождение IFN-γ по сравнению с пролейкином и что иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab был лишь немного более эффективным по сравнению с конструкцией Fab-IL-2 wt-Fab. На CD4+-T-клетках продемонстрирована быстрая повышающая регуляция CD25 при стимуляции, иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab оказался значительно менее эффективным, чем Fab-IL-2 wt-Fab, но все еще сохранял сопоставимую способность индуцировать передачу сигналов IL-2R при применении в насыщающих концентрациях. Это противоположно действию, обнаруженному при применении T^-клеток, для которых эффективность Fab-IL-2 qm-Fab оказалась существенно более низкой по сравнению с эффективностью конструкции Fab-IL-2 wt-Fab вследствие высокого уровня экспрессии CD25 на Tregклетках и в результате этого высокой аффинности связывания конструкции Fab-IL-2 wt-Fab с CD25 на T^-клетках. В результате утраты способности связываться с CD25 у иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab, передача сигналов IL-2 в T^-клетках активируется только через гетеродимер IL-2R βγ при применении в концентрациях, в которых передача сигналов IL-2R активируется в ОЭ25-негативных эффекторных клетках через гетеродимер IL-2R βγ. Соответствующие значения EC50 (в пМ) представлены в табл. 13.
- 58 033369
Таблица 13 Индукция высвобождения IFN-γ из NK-клеток иммуноконъюгатами Fab-IL-2-Fab на основе 28H1, мишенью которых является FAP, содержащими мутантные полипептиды IL-2
ЕС50 [пМ] NK- kлетки СО8+-Т-клетки СО4+-Т-клетки т - 1 reg клетки
пролейкин 222 1071 92 1
28Н1 Fab-IL-2 wt-Fab 3319 14458 3626 15
28Н1 Fab-IL-2 qm-Fab 3474 20583 70712 19719
В другой серии экспериментов изучали биологическую активность иммуноконъюгатов на основе 4G8 IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, с использованием нескольких клеточных анализов.
Иммуноконъюгаты на основе 4G8 IgG-IL-2 qm и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1, мишенью которых является FAP, исследовали в отношении индукции высвобождения IFN-γ NK92-клетками, что индуцируется активацией передачей сигналов IL-2R βγ. На фиг. 49 продемонстрировано, что иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, обладал такой же эффективностью в отношении индукции высвобождения IFN-γ, что и иммуноконъюгат с созревшей аффинностью Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1.
При создании изобретения изучали также воздействие иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8, мишенью которого является FAP, на индукцию фосфорилирования STAT5 в сравнении с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1, а также пролейкином с использованием человеческих NK-клеток, CD4+-T-клеток, CD8+-T-клеток и Д-^-клеток из человеческих PBMC. Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 50. Для NK-клеток и CD8 -T-клеток установлено, что иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm на основе 4G8 обладал примерно >10 раз более низкой способностью индуцировать фосфорилирование STAT5 по сравнению с пролейкином, но несколько более высокой эффективностью по сравнению с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1. Для CD4+-T-клеток иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm на основе 4G8 оказался менее эффективным, чем иммуноконъюгат Fab-IL-2 wt-Fab на основе 28H1, но не несколько более эффективным, чем иммуноконъюгат Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1, для этого иммуноконъюгата установлена также способность индуцировать передачу сигналов IL-2R при применении в насыщающих концентрациях, сопоставимая со способностью пролейкина и Fab-IL-2 wt-Fab на основе 28H1. Это противоположно действию, обнаруженному при использовании Д-^-клеток, для которых эффективность иммуноконъюгата IgG-IL-2 qm на основе 4G8 и иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab на основе 28H1 оказалась несколько более низкой по сравнению с иммуноконъюгатом Fab-IL-2 wt-Fab.
Взятые в совокупности, полученные данные демонстрируют, что четырехмутантный IL-2, представленный в настоящем описании, обладает способностью активировать передачу сигналов IL-2R через гетеродимер IL-2R βγ, аналогично способности IL-2 дикого типа, но не приводит к более преимущественной стимуляции Д-^-клеток по сравнению с другими эффекторными клетками.
Пример 8.
Противоопухолевое действие иммуноконъюгатов Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, оценивали in vivo в сравнении с иммуноконъюгатами Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которых является FAP, на моделях с использованием ксенотрансплантатов ACHN и сингенных моделей LLC1. Все иммуноконъюгаты Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP (содержащие дикого типа или четырехмутантный IL-2), распознавали мышиный FAP, а также мышиный IL-2R. Поскольку модели с использованием ксенотрансплантатов ACHN, созданные на SCID-мышах, трансгенных по человеческому FcyRIII, давали выраженную позитивную реакцию на FAP при оценке методом иммуногистохимии (ИГХ), то указанная модель представляет собой модель с нарушенной иммунологической реактивностью и может отражать только иммунные эффекторные механизмы, опосредуемые NK-клетками и/или макрофагами/моноцитами, но лишенную опосредуемого T-клетками иммунитета, и поэтому эта модель не может отражать AICD или действия, опосредуемые Д^-клетками. В отличие от вышеуказанной модели сингенная модель LLC1, созданная на полностью иммунокомпетентных мышах, может также отражать адаптивные опосредуемые Д-клетками иммунные эффекторные механизмы, но отличается очень низким уровнем экспрессии FAP в мышиной строме. Таким образом, каждая из указанных моделей частично отражает ситуацию, характерную для человеческих опухолей.
Модель, созданная с использованием ксенотрансплантата почечноклеточной карциномы линии ACHN.
Иммуноконъюгаты 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, тестировали с использованием клеток клеточной линии человеческой почечноклеточной аденокарциномы ACHN, которые инъецировали в почки SCID-мышей, трансгенных по человеческому FcyRIII. ACHNклетки исходно получали из ATCC (Американская коллекция типовых культур) и после размножения депонировали в собственном (внутреннем) банке клеток фирмы Glycart. ACHN-клетки культивировали в
- 59 033369 среде DMEM, содержащей 10% FCS, при 37°C в насыщенной водяными парами атмосфере с 5% CO2. Полученный in vitro пассаж 18 применяли для внутрипочечной инъекции, его жизнеспособность составляла 98,4%. Делали небольшой надрез (2 см) в правой боковой области и брюшной стенке анестезированных SCID-мышей. Подкапсулярно в почку инъецировали 50 мкл суспензии (1*106 ACHN-клеток в среде AimV) (2 мМ). Раны на коже и брюшную стенку закрывали с помощью скобок. Самок SCID-FcyRIII мышей (линия GLYCART-RCC), возраст которых в начале эксперимента составлял 8-9 недель (осемененные на фирме RCC, Швейцария), содержали в специфических условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (P 2008016). После доставки животных выдерживали одну неделю для акклиматизации к новому окружению и для обследования. Регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья. Мышам инъецировали в почку в день опыта 0 по 1*106 ACHN-клеток, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали i.v. 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab три раза в неделю в течение трех недель. Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Мышам из группы, обработанной наполнителем, инъецировали ЗФР, мышам из групп обработки - иммуноконъюгат 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab или 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы разводили при необходимости ЗФР. На фиг. 25 продемонстрирована опосредуемая иммуноконъюгатами как 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, так и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab высокая эффективность на основе таких критериев, как повышенная медианная выживаемость, по сравнению с обработанной наполнителем группой, при этом эффективность иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab оказалась более высокой, чем эффективность иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab.
Таблица 14А
Соединение Доза Состав буфера Концентрация (мг/мл)
4G8 Fab-IL-2-Fab дикого типа, т.е. FAP 4G8 wt 20 мкг 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, 100мМ глицин, pl 6,7 1,45
4G8 Fab-IL-2-Fab четырехмутантный, т.е. FAP 4G8 qm 20 мкг 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, 100мМ глицин, pl 6,7 4,25
Сингенная модель карциномы легкого Льюиса LLC1.
Иммуноконъюгаты 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab и 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, тестировали с использованием клеточной линии мышиной карциномы легкого Льюиса LLC1, для создания которой осуществляли i.v.-инъекцию мышам линии Black 6. Исходные клетки карциномы легкого Льюиса LLC1 получали из ATCC и после размножения депонировали во внутреннем банке клеток фирмы Glycart. Линию опухолевых клеток культивировали согласно общепринятым методам в среде DMEM, содержащей 10% FCS (фирма Gibco), при 37°C в насыщенной водяными парами атмосфере с 5% CO2. Пассаж 10 применяли для трансплантации, его жизнеспособность составляла 97,9%. По 2*105 клеток на животное инъецировали i.v. в хвостовую вену в 200 мкл среды для культуры клеток Aim V (фирма Gibco). Мышей линии Black 6 (фирма Charles River, Германия), возраст которых в начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специфических условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (P 2008016). После доставки животных выдерживали одну неделю для акклиматизации к новому окружению и для обследования. Регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья. Мышам инъецировали i.v. в день опыта 0 по 2*105 LLd-клеток, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали i.v. 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab или 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab три раза в неделю в течение трех недель. Всем мышам е инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Мышам из группы, обработанной наполнителем, инъецировали ЗФР, мышам из групп обработки -конструкцию 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab или 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы разводили при необходимости ЗФР. На фиг. 26 продемонстрировано, что конструкция 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab или конструкция с созревшей аффинностью 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab обладали более высокой эффективностью согласно таким критериям, как повышенная медианная выживаемость, при сравнении с обработанной наполнителем группой.
- 60 033369
Таблица 14Б
Соединение Доза Состав буфера Концентрация (мг/мл)
28Н1 Fab-IL-2-Fab четырехмутантны й, т.е. FAP 28Н1 qm 30 мкг 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, ЮОмМ глицин, pH 6,7 2,74
4G8 Fab-IL-2-Fab четырехмутантны й, т.е. FAP 4G8 qm 30 мкг 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, ЮОмМ глицин, pH 6,7 4,25
В другом эксперименте тестировали иммуноконъюгаты 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab и 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP, с использованием такой же модели мышиной карциномы легкого Льюиса, созданной с помощью клеточной линии LLC1, для получения которой осуществляли i.v.-инъекцию мышам линии Black 6. Пассаж 9 применяли для трансплантации, его жизнеспособность составляла 94,5%. По 2*105 клеток на животное инъецировали i.v. в хвостовую вену в 200 мкл среды для культуры клеток Aim V (фирма Gibco). Мышам инъецировали i.v. в день опыта 0 по 2*105 LLd-клеток, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали i.v. 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab или 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab три раза в неделю в течение трех недель. Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Мышам из группы, обработанной наполнителем, инъецировали ЗФР, мышам из групп обработки - конструкцию 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab или 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы разводили при необходимости ЗФР. На фиг. 27 продемонстрировано, что иммуноконъюгаты 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab и 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab обладали более высокой эффективностью согласно таким критериям, как повышенная медианная выживаемость, при сравнении с обработанной наполнителем группой, при этом эффективность иммуноконъюгата 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab была несколько более высокой, чем иммуноконъюгата 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab.
Таблица 14В
Соединение Доза Состав буфера Концентрация (мг/мл)
28Н1 Fab-IL-2-Fab четырехмутантный= FAP 28Н1 qm 45 мкг 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, ЮОмМ глицин, pH 6,7 2,74
28Н1 Fab-IL-2-Fab дикого типа= FAP 28Н1 wt 45 мкг 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, ЮОмМ глицин, pH 6,7 1,66
Пример 9.
Затем осуществляли семидневное сравнительное исследование иммуноконъюгата Fab-IL-2 qm-Fab на основе 4G8, мишенью которого является FAP, и иммуноконъюгата Fab-IL-2 wt-Fab на основе 4G8, мишенью которого является FAP, для оценки токсичности при внутривенном введении и токсикокинетического анализа с использованием мышей линии Black 6. В табл. 15 представлен план эксперимента по оценке токсичности и токсикокинетического анализа.
Таблица 15
План эксперимента
Групп Тип Доза [мкг/г] Назначение
1 D-ЗФР 0 контроль
2 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 4,5 титрометрический анализ токсичности
3 9,0
4 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 4,5
5 9,0
6 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 4,5 токсикокинетический анализ
7 9,0
8 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 4,5
9 9,0
Цель данного исследования заключалась в характеризации и сравнении профилей токсичности и проведении токсикокинетического анализа иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2-Fab, содержащего интерлейкин-2 (IL-2) дикого типа, мишенью которого является FAP, и иммуноконъюгата G48 Fab-IL-2-Fab, содержащего четырехмутантный IL-2 (qm), мишенью которого является FAP, после ежедневных внутривенных введений не имеющим опухоль самцам мышей в течение 7 дней. Для этого исследования пяти группам по 5 самцов мышей/группу вводили внутривенно по 0 (используя наполнитель в качестве контроля), 4,5 или 9 мкг/г/день wt IL-2 или 4,5 или 9 мкг/г/день qm IL-2. Еще четырем группам мышей по 6 самцов мышей/группу вводили 4,5 или 9 мкг/г/день wt IL-2 или 4,5 или 9 мкг/г/день qm IL-2 для осуществления токсикокинетических анализов. Продолжительность исследования варьировалась от 7 до 5 дней в зависимости от клинических признаков, обнаруженных у животных, которым вводили 4,5 и
- 61 033369 мкг/г/день wt IL-2. Оценка токсичности основывалась на смертности, прижизненных наблюдениях, весе тела и клинической и анатомической патологии. У животных в различные моменты времени отбирали образцы крови в группах, предназначенных для токсикокинетического анализа, для осуществления токсикокинетического анализа. Данные токсикокинетического анализа продемонстрировали, что у мышей, обработанных wt IL-2 или qm IL-2, обнаружены выявляемые уровни в плазме вплоть до момента последнего взятия образца крови, что свидетельствует о том, что мыши подвергаются воздействию соответствующими соединениями в процессе обработки. Значения AUC0-inf, полученные в день 1, позволяют предположить наличие сопоставимой экспозиции wt IL-2 и qm IL-2 при применении в обеих дозах. Несколько образцов отбирали в день 5 и в них обнаружены концентрации в плазме, эквивалентные концентрациям, обнаруженным в день 1, что позволяет предположить отсутствие накопления любого соединения после 5 дней дозирования. Более конкретно, были получены следующие данные.
Токсикокинетика (ТК).
В табл. 16 обобщены усредненные токсикокинетические параметры в плазме для 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которого является FAP, и 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которого является FAP, полученные с использованием программы WinNonLin, версия 5.2.1 и поступающего в продажу каппа-специфического ELISA (набор для ELISA для количественной оценки человеческой каппа-цепи, фирма Bethyl Laboratories).
Таблица 16
Параметр Единицы Группа 6, 4G8-FAP IL-2 дикого типа Группа 7, 4G8-FAP IL-2 дикого типа Группа 8, 4G8-FAP мутантный IL-2 Группа 9, 4G8-FAP мутантный IL-2
Стах нг/мл 47198 97986 60639 146416
Стах/дозу (нг/мл) (мкг/г) 0,011 0,011 0,0135 0,016
AUC нгхч/мл 331747 747499 355030 926683
AUC/дозу нгхч/мл(мкг/г) 0,074 0,083 0,079 0,103
Tl/2z ч 3,6 3,11 4, 3 3,12
исходная доза мкг/г 4,5 9 4,5 9
путь введения IV IV IV IV
ТК-параметры рассчитывали с помощью программы WinNonLin, версия 5.2.1, используя некомпартментальный анализ.
Индивидуальные концентрации в сыворотке представлены ниже.
- 62 033369
Группа (доза) День отбора крови Время (ч) Животные Конц, в сыворотке (нг/мл) Средняя конц. (нг/мл)
Группа 6 (4,5 1 1 26 64241 47198
мкг/г) 4G6 Fab- 27 30155
IL2-Fab WT 1 5,5 28 14693 15784
29 16875
1 24 30 318 419
31 520
5 5,5 29 13061 13335
30 13620
31 13325
Группа 7 (9 1 1 32 101208 97986
мкг/г) 4G6 Fab- 33 94764
IL2-Fab WT 1 5,5 34 35766 34062
35 32359
1 24 36 573 580
37 588
5 5,5 32 31779 37473
33 51143
35 53409
36 13562
Группа 8 (4,5 1 1 38 73326 60639
мкг/г) 4G6 Fab- 39 47953
IL2-Fab мутант 1 5,5 40 12168 13269
41 14371
1 24 42 494 490
43 487
5 5,5 40 6561 10957
41 15352
5 24 38 608 721
39 543
42 1298
43 437
Группа 6 (9 1 1 44 162970 146416
мкг/г) 4G6 Fab- 45 129862
IL2-Fab мутант 1 5,5 46 20475 24800
47 29125
1 24 48 478 493
49 509
5 5,5 46 20504 48031
47 75557
5 24 44 634 703
45 796
48 661
49 719
Эти данные демонстрируют, что как 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, так и 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab обладали сопоставимыми фармакокинетическими свойствами, но для 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab имела место несколько более высокая экспозиция.
Смертность.
В группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которого является FAP, в дозе 9 мкг/г, одно животное погибло в результате обработки, проведенной в день 5. Перед гибелью у него обнаружена пониженная активность, холодная кожа и сгорбленная поза. Указанное животное, вероятно, погибло в результате комбинации клеточной инфильтрации в легкое, которая сопровождалась отеком и кровоизлиянием, и заметного некроза костного мозга. Данные о смертности обобщены в табл. 17.
- 63 033369
Таблица 17
Смертность в день 5
Группа Тип Доза [мкг/г] Обнаруженная гибель Серьезная токсичность/ умерщвление * * Всего
1 D-ЗФР 0 0/5 0/5 0/5
2 4G8 Fab-IL-2 wt- 4,5 0/5 5/5 5/5
3 Fab 9 1/5* 4/5 4/5
4 4G8 Fab-IL-2 qm- 4,5 0/5 0/5 0/5
5 Fab 9 0/5 0/5 0/5
6 4G8 Fab-IL-2 wtFab 4,5 1/6 5/6 6/6
7 9 2/6 4/6 6/6
8 4G8 Fab-IL-2 qmFab 4,5 0/6 0/6 0/6
9 9 0/6 0/6 0/6
* тт
До аутопсии.
Исследование планировали осуществлять в течение 7 дней, но у всех мыши, обработанных иммуноконъюгатом, содержащим IL-2 дикого типа, обнаружены поражения ко дню 5 и их умерщвляли, поскольку отсутствовала вероятность их выживания.
Клинические обследования.
Такие признаки, как пониженная активность, холодная кожа и сгорбленная поза, обнаружены у животных, которых обрабатывали wt IL-2 в дозах 4,5 и 9 мкг/г/день. Данные клинических обследований обобщены в табл. 18.
Таблица 18 Клинические обследования в день 5
Группа Тип Доза [мкг/г] Сгорбленная поза Пониженная активность Холодное на ощупь тело
1 D-ЗФР 0 0/5 0/5 0/5
2 4G8 Fab-IL-2 wtFab 4.5 4/5 4/5 5/5
3 9 5/5 5/5 5/5
4 4G8 Fab-IL-2 qm- A CAM 4.5 0/5 0/5 0/5
5 О 0/5 0/5 0/5
6 4G8 Fab-IL-2 wtFab 4.5 6/6 2/6 2/6
7 9 6/6 5/6 6/6
8 4G8 Fab-IL-2 qmFab 4.5 0/6 0/6 0/6
9 9 0/6 0/6 0/6
Вес тела.
Умеренное снижение веса тела обнаружено после 5 дней обработки у животных, которым вводили wt IL-2 в дозе 4,5 или 9 мкг/г/день (составлявшее 9 и 11% соответственно). Небольшое снижение веса тела обнаружено после 5 дней обработки у животных, которым вводили qm IL-2 в дозе 4,5 или 9 мкг/г/день (составлявшее 2 и 1% соответственно). Умеренное (9%) снижение веса тела обнаружено также в контрольной группе животных, обработанных наполнителем, после 5 дней обработки. Однако процент снижения должен составлять 5%, если исключить погибшее животное (животное № 3). Снижение веса тела в обработанной наполнителем группе может быть связано со стрессом.
Гематология.
Пониженное содержание тромбоцитов обнаружено у животных, которым вводили в дозе 4,5 (~4,5кратное) и 9 мкг/г/день (~11-кратное) 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, что коррелировало со снижением количества мегакариоцитов в костном мозге, а также с системными истощающими действиями (фибрин) в селезенке и легком этих животных (см. раздел Гистопатология, ниже). Эти данные свидетельствуют о том, что пониженное содержание тромбоцитов, вероятно, обусловлено объединенными воздействиями поглощения и снижения производства/скученности в костном мозге из-за повышения производства лимфоцитов/миелоидных клеток вследствие непосредственного или косвенного воздействия IL-2.
Гематологические данные свидетельствуют о наличии нестрогой взаимосвязи с введением соединения, они демонстрируют абсолютное снижение количества лимфоцитов при обработке 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 (~5-кратное) и 9 мкг/г (~3 -кратное) по сравнению со средним количеством в обработанной наполнителем группе. Эти данные не свидетельствуют о четкой зависимости от до
- 64 033369 зы, но могут рассматриваться как вторичные, связанные с эффектами, которые ассоциированы со стрессом, обнаруженным при прижизненных исследованиях, или повышенным фармакологическим действием соединения (лимфоциты мигрируют в ткани). Не обнаружено связанных с обработкой гематологических изменений в ответ на введение 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Несколько отдельных гематологических данных статистически отличались от соответствующих данных для контролей. Однако этих данных недостаточно для предположения, что они свидетельствуют о патологических изменениях.
Макроскопическая патология и гистопатология.
Связанные с обработкой макроскопические признаки, включая увеличенную селезенку, обнаружены у 5/5 и 4/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г соответственно, и у 1/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/г.
Связанные с обработкой гистопатологические признаки обнаружены в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г в легком, костном мозге, печени, селезенке и тимусе, они отличались по частоте встречаемости, серьезности стадии или природе изменений, что будет описано ниже.
Связанные с обработкой гистопатологические признаки в легком включали инфильтрацию мононуклеарных клеток от слабой до выраженной, которая обнаружена у 5/5 мышей из групп, которых обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, и маргинальную инфильтрацию у 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г. Инфильтрация мононуклеарных клеток включает инфильтрацию лимфоцитов (некоторые из них, как установлено, имели цитоплазматические гранулы), а также реактивных макрофагов. Эти клетки, как установлено, часто имели вазоцентрическое распределение, часто их маргинация обнаруживалась внутри сосудов в легком. Установлено также, что эти клетки окружали также сосуд, но в более серьезных случаях их распределение было более диффузным. Кровоизлияние от маргинального до слабого обнаруженного у 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, и маргинальным у 2/5 мышей из группы, которую обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/г. Хотя кровоизлияние наиболее часто являлось периваскулярным, в более серьезных случаях оно было обнаружено в альвеолярном пространстве. Отек от слабого до умеренного обнаружен у 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г, и маргинальным у 5/5 мышей из группы, которую обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/г. Хотя отек часто являлся периваскулярным, в более серьезных случаях он обнаружен также в альвеолярном пространстве. Маргинальная дегенерация клеток и кариорексис обнаружены у 2/5 и 5/5 мышей из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/г соответственно, и они включали дегенерацию инфильтрующихся или реактивных лимфоцитов. Отобранные с помощью красителя MSB животные оказались позитивными по фибрину в легких животных из групп, которые обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/г, что коррелировало со снижением количества тромбоцитов, обнаруженных у этих животных.
Связанные с обработкой признаки в костном мозге, включая увеличение от маргинальной до слабой общей насыщенности клетками костного мозга, обнаружено у 5/5 мышей и 2/5 мышей из групп, обработанных как 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, так и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 4,5 мкг/г, и 5/5 мышей и 2/5 мышей из групп, обработанных каждой из указанной конструкций в дозе 9 мкг/г соответственно. Это характеризовалось повышением от маргинального до умеренного уровня лимфоцитарной-миелоцитарной гиперплазии в этих группах, что подтверждалось, в частности, повышением количества CD3-позитивных T-клеток в костном мозге и синусах (в частности, T-лимфоцитов, что подтверждено с помощью иммуногистохимии с использованием pan-T-клеточного маркера CD3 на отобранных животных). Увеличение CD3позитивных T-клеток было умеренным в обеих группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, и от маргинального до слабого в обеих группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Снижение от маргинального до слабого мегакариоцитов обнаружено у 2/5 мышей из группы, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 мкг/г, и 5/5 у мышей, обработанных этой же конструкцией в дозе 9 мкг/г, снижение от маргинального до умеренного эритроидных предшественников обнаружено у 3/5 мышей из группы, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 мкг/г, и у 5/5 мышей, обработанных этой же конструкцией в дозе 9 мкг/г. Некроз костного мозга обнаружен у 1/5 мышей в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 мкг/мг (минимальный), и у 5/5 мышей (от слабого до выраженного), обработанных этой же конструкцией в дозе 9 мкг/г. Пониженное количество мегакариоцитов в костном мозге коррелировало с пониженным содержанием тромбоцитов, что может являться прямым результатом переполнения костного мозга в результате увеличения лимфоцитов/миелоидных предшественников и/или некроза костного мозга, и/или истощения тромбоцитов из-за воспаления в различных тканях (см. данные для селезенки и легкого). Обнаруженное в костном мозге снижение содержания эритроидных предшественников не коррелировало с данными гематологического исследования периферической крови, вероятно, из-за связанных со временем факторов (исследования костного мозга проводили до оценки периферической крови) и более продолжительным временем полужизни периферических эритроцитов (по сравнению с тромбоцитами). Механизм некроза костного мозга в костном мозге может быть вторичным, являясь следствием выраженного сверхпереполнения полости мозга (из-за производства и роста лимфоцитов/миелоидных клеток), системного или локального высвобождения цитокинов из находящихся на стадии пролиферации
- 65 033369 типов клеток, фактора, связанного с локальными воздействиями гипоксии, или других фармакологических действий соединения.
Связанные с обработкой признаки в печени, включая наличие от слабой до умеренной первичной вазоцентрической инфильтрации мононуклеарных клеток и от маргинального до умеренного некроза индивидуальных клеток, обнаружено у 5/5 мышей, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг. Маргинальный некроз индивидуальных клеток обнаружен у 2/5 и 4/5 мышей, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг соответственно. Мононуклеарный инфильтрат состоял в основном из лимфоцитов (в частности, T-лимфоцитов, что подтверждено с помощью иммуногистохимии с использованием pan-T-клеточного маркера CD3, выполненной на отобранных животных), для него наиболее часто характерно вазоцентрическое расположение, а также очень редко расположение в центральных и портальных сосудах. Отобранных для иммуногистохимического исследования животных окрашивали F4/80, у них обнаружено повышенные количество и размер (активированных) макрофагов/клеток Купфера в гепатических синусоидах в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qmFab в дозе 9 мкг/мг.
Связанные с обработкой признаки в селезенке, включая наличие от умеренной до выраженной лимфоидной гиперплазии/инфильтрации и от слабой до умеренной гиперплазии/инфильтрации макрофагов, обнаружено в 5/5 мышей в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг, и от слабой до умеренной лимфоидной гиперплазии/инфильтрации и от маргинальной до слабой гиперплазии/инфильтрации макрофагов - у 5/5 мышей в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг.
Иммуногистохимическое исследование, проведенное с использованием мышей, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг, с использованием pan-T-клеточного маркера CD3, а также маркера макрофагов F4/80 продемонстрировало различные картины. При применении 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг картина иммунореактивности T-клеток и макрофагов сохранялась, прежде всего, в областях красной пульпы, поскольку архитектура первичных фолликулов была изменена лимфоцитолизом и некрозом (что описано ниже). При применении 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг специальное окрашивание продемонстрировало наличие картины, сходной с обнаруженной у обработанных наполнителем контрольных мышей, но с распространением в периартериальные лимфоцитарные оболочки (PALS) белой пульпы T-клеточной популяции и наличием более крупной расширенной области красной пульпы. Позитивное в отношении T-клеток и макрофагов окрашивание обнаружено также внутри красной пульпы, аналогичное по картине с окрашиванием в контрольной обработанной наполнителем группе, но расширенное. Эти результаты коррелируют с данными макроскопических исследований увеличенной селезенки. Маргинальный некроз обнаружен у 3/5 мышей и от маргинального до слабого у 5/5 мышей в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг соответственно. Некроз, как правило, был локализован вокруг области первичных фолликулов, и при окрашивании с помощью MSB отобранные животные давали положительную реакцию на фибрин в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/мг, что коррелировало, в частности, со сниженным содержанием тромбоцитов, обнаруженным у этих животных. Лимфоцитолиз обнаружен в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4,5 мкг/г (от минимального до слабого) и 9 мкг/г (от умеренного до выраженного).
Связанные с обработкой признаки в тимусе, включая увеличение от минимального до слабого содержания лимфоцитов в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab как в дозе 4,5, так и 9 мкг/мг и обработанной 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 4,5 мкг/мг. Кору и мозговое вещество тимуса не исследовали по отдельности в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, однако иммуногистохимическое исследование с использованием pan-T-клеточного маркера (CD3), проведенное на отобранных животных, которых обрабатывали 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг, продемонстрировало сильное позитивное окрашивание большинства клеток в тимусе. Повышенное содержание лимфоцитов в тимусе рассматривается как непосредственное фармакологическое действие обоих соединений, при котором IL-2 индуцировал пролиферацию лимфоцитов, мигрирующих в тимус (T-клетки) из костного мозга для дополнительной дифференцировки и клональной экспансии. Это имело место во всех группах, кроме группы, обработанной 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг, в которой, вероятно, имело место временное действие. Лимфоцитолиз оказался слабым в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 4 мкг/мг, и от умеренного до выраженного в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг. Умеренное истощение лимфоидных элементов обнаружено в группах, обработанных 4G8 Fab-IL2 wt-Fab в дозах как 4,5, так и 9 мкг/мл. Поскольку эти результаты являются более значительными в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг, эти животные были отнесены к агонирующим в день 5, и лимфоцитолиз от слабого до выраженного, а также умеренное лимфоидное истощение могут быть связаны с указанным прижизненным фактором (связанные со стрессом действия вследствие плохого физического состояния).
Гистопатологические признаки нестрогой взаимосвязи между введением соединения и проявлениями в печени включают маргинальную инфильтрацию/активацию смешанных клеток (лимфоцитов и макрофагов), обнаруженную в виде небольшого очага/микрогрануломатоза, произвольно расположенных в
- 66 033369 печени у 5/5 мышей из групп, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в обеих дозах 4,5 и 9 мкг/мг. Это маргинальное изменение обнаружено также в контрольной обработанной наполнителем группе, но реже и менее серьезное. Расширение и атрофия железистой области желудка от маргинального до слабого обнаружены у 5/5 мышей, а маргинальная атрофия ворсинок подвздошной кишки обнаружена у 3/5 мышей, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг. Этот факт наиболее вероятно связан с плохим физическим состоянием, обнаруженным при проведении прижизненных исследований на этих мышах, отражением которого был пониженный вес тела, прежде всего в группе, обработанной 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг.
Признаки в месте инъекции, включая инфильтрат смешанных клеток, периваскулярный отек и миодегенерацию, обнаружены как в обработанной наполнителем контрольной группе, так и в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 9 мкг/мг и 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 9 мкг/мг. У одного животного обнаружен эпидермальный некроз. Эти признаки не связаны с самой(ими) обработкой(ами), а с ежедневными i.v.-инъекциями и манипуляциями с хвостом. У другого животного обнаружена инфильтрация макрофагами скелетной мышцы (обнаружена на гистологическом срезе ткани легкого), ассоциированная с миодегенерацией и миорегенерацией, вероятно, вследствие хронического повреждения и не связанная с обработкой. Маргинальное лимфоидное истощение обнаружено у 3/5 и 4/5 мышей в группах, обработанных 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 и 9 мкг/мг соответственно, что наиболее вероятно связано с нормальными физиологическими изменениями, обнаруженными в тимусе мышей с увеличением их возраста (обнаружены также с аналогичной встречаемостью и серьезностью у 4/5 мышей из обработанной наполнителем контрольной группы животных).
В целом, ежедневное внутривенное введение 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab или 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 4,5 или 9 мкг/г/день в течение промежутка времени, составляющего вплоть до 5 дней, самцам мышей привело к сходным связанным с обработкой гистологическим признакам, характерным для обоих соединений.
Однако изменения были более значительными и более серьезными при применении иммуноконъюгата 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, мишенью которого является FAP, в легком (фиг. 28 и 29) (мононуклеарная инфильтрация лимфоцитами и реактивными макрофагами, кровоизлияние и отек), в костном мозге (лимфомиелогиперплазия и повышенная и повышенная насыщенность клетками), в печени (фиг. 30) (некроз индивидуальных клеток, увеличение количества и активация клеток Купфера/макрофагов), в селезенке (выраженное увеличение, инфильтрация/гиперплазия макрофагов и лимфоцитов) и в тимусе (повышенное содержание лимфоцитов). Кроме того, смертность, лимфоцитолиз, некроз или дегенерация клеток в легком, селезенке, костном мозге и тимусе, а также снижение количества мегакариоцитов и эритроцитов в костном мозге и пониженное содержание тромбоцитов в периферической крови обнаружены только у животных, которых обрабатывали wt IL-2. На основе клинических и анатомических признаков, а также на основе клинических наблюдений и сопоставимой системной экспозиции обоих соединений можно сделать заключение, что qm IL-2 в условиях данного исследования обладал существенно менее выраженной системной токсичностью после введения 5 доз, чем wt IL-2.
Пример 10.
Индукция IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2 секреции IFN-γ NK-клетками.
NK-92-клетки выдерживали в минимальной среде в течение 2 ч перед посевом из расчета 100000 клеток/лунку в 96-луночный плоскодонный планшет. Конструкции IL-2 добавляли титрометрически к высеянным NK-92-клеткам. Через 24 или 48 ч планшеты центрифугировали перед сбором супернатантов для определения количества человеческого IFN-γ, используя поступающий в продажу набор для IFN-γ ELISA (фирма BD, № 550612).
Тестировали два различных, полученных при создании настоящего изобретения препарата IL-2 дикого типа (вероятно, несколько отличающихся по профилям их O-гликозилирования см. пример 2), поступающий в продажу IL-2 дикого типа (пролейкин) и полученный при создании настоящего изобретения четырехмутантный IL-2 (первая партия).
На фиг. 31 продемонстрировано, что четырехмутантный IL-2 обладает такой же эффективностью, что поступающий в продажу (пролейкин) или полученный при создании изобретения IL-2 дикого типа в отношении индукции секреции IFN-γ NK-клетками в течение 24 ч (А) или 48 ч (Б).
Пример 11.
Индукция IL-2 дикого типа и четырехмутантным IL-2 пролиферации NK-клеток.
NK-92-клетки выдерживали в минимальной среде в течение 2 ч перед посевом из расчета 100000 клеток/лунку в 96-луночный плоскодонный планшет. Конструкции IL-2 добавляли титрометрически к высеянным NK-92-клеткам. Через 48 ч оценивали содержание АТФ для определения количества жизнеспособных клеток с использованием набора для анализа CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay фирмы Promega согласно инструкциям производителя.
Тестировали такие же препараты IL-2, что и в примере 10.
На фиг. 32 продемонстрировано, что все тестируемые молекулы обладали способностью индуцировать пролиферацию NK-клеток. При применении в низких концентрациях (<0,01 М) четырехмутантный IL-2 оказался несколько менее активным, чем полученный при создании изобретения IL-2 дикого типа, а
- 67 033369 все полученные при создании изобретения препараты оказались менее активными, чем поступающий в продажу IL-2 дикого типа (пролейкин).
Во втором эксперименте тестировали следующие препараты IL-2: IL-2 дикого типа (пул 2), четырехмутантный IL-2 (первая и вторая партии).
На фиг. 33 продемонстрировано, что все тестируемые молекулы обладали примерно одинаковой способностью индуцировать пролиферацию NK-клеток, при этом два препарата, содержащие мутантный IL-2, оказались лишь минимально менее активными, чем препараты IL-2 дикого типа, при применении в наиболее низких концентрациях.
Пример 12.
Индукция пролиферации человеческих PBMC иммуноконъюгатами, содержащими IL-2 дикого типа или четырехмутантный IL-2.
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) получали с помощью Histopaque-1077 (фирма Sigma Diagnostics Inc., Сент-Луис, шт. Миссури, США). В целом, метод состоял в следующем: образцы венозной крови здоровых добровольцев отбирали в гепаринизированные шприцы. Кровь разводили в соотношении 2:1 ЗФР, не содержащем кальций и магний, и наслаивали на Histopaque-1077. Градиент центрифугировали при 450*g в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ) без перерыва. Собирали содержащую PBMC интерфазу и отмывали трижды ЗФР (350*g, после чего центрифугировали при 300/g в течение 10 мин при КТ).
Затем PBMC метили с помощью 40 нМ CFSE (сложный сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина) в течение 15 мин при 37°C. Клетки отмывали 20 мл среды перед выделением меченых PBMC в течение 30 мин при 37°C. Клетки отмывали, подсчитывали и по 100000 клеток высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном. Предварительно разведенный пролейкин (поступающий в продажу IL-2 дикого типа) или IL-2-иммуноконъюгаты добавляли титрометрически к посеянным клеткам, которые инкубировали в течение указанных промежутков времени. Через 4-6 дней клетки отмывали, окрашивали для выявления соответствующих маркеров клеточной поверхности и анализировали с помощью FACS, используя устройство BD FACSCantoII. NK-клетки определяли как CD37CD56'. CD4-T-клетки как CD3+/CD8-, a CD8-T-клетки как CD3+/CD8+.
На фиг. 34 продемонстрированы данные о пролиферации NK-клеток после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28H1 IL-2, мишенью которых является FAP, в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней. Все тестируемые конструкции индуцировали пролиферацию NK-клеток в зависимости от концентрации. Пролейкин оказался более эффективным, чем иммуноконъюгаты при применении в более низких концентрациях, однако это различие не обнаружено при более высоких концентрациях. В более ранние моменты времени (день 4), конструкции IgG-IL-2 обладали несколько более высокой эффективностью, чем конструкции Fab-IL-2-Fab. В более поздние моменты времени (день 6) эффективность всех конструкций была сопоставимой, при этом конструкция Fab-IL-2 qm-Fab обладала слабой эффективностью при применении в низких концентрациях.
На фиг. 35 продемонстрированы данные о пролиферации CD4-T-клеток после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28H1 IL-2, мишенью которых является FAP, в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней. Все тестируемые конструкции индуцировали пролиферацию CD4-T-клеток в зависимости от концентрации. Пролейкин оказался более эффективным, чем иммуноконъюгаты, а иммуноконъюгаты, содержащие IL-2 дикого типа, обладали несколько более высокой эффективностью, чем содержащие четырехмутантный IL-2. Также как и в случае NK-клеток, конструкция Fab-IL-2 qm-Fab обладала наименьшей активностью. Наиболее вероятно, пролиферирующие CD4-T-клетки частично представляют собой регуляторные T-клетки, по меньшей мере, в случае конструкций, содержащих IL-2 дикого типа.
На фиг. 36 продемонстрированы данные о пролиферации CD8-T-клеток после инкубации с различными иммуноконъюгатами 28H1 IL-2, мишенью которых является FAP, в течение 4 (А), 5 (Б) или 6 (В) дней. Все тестируемые конструкции индуцировали пролиферацию CD8-T-клеток в зависимости от концентрации. Пролейкин оказался более эффективным, чем иммуноконъюгаты, а иммуноконъюгаты, содержащие IL-2 дикого типа, обладали несколько более высокой эффективностью, чем содержащие четырехмутантный IL-2. Также как и в случае NK-клеток и CD4-T-клеток, конструкция Fab-IL-2 qm-Fab обладала наименьшей активностью.
На фиг. 37 представлены результаты другого эксперимента, в котором осуществляли сравнение 28H1 IgG-IL-2, мишенью которого является FAP, содержащий либо IL-2 дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, и пролейкина. Продолжительность инкубации составляла 6 дней. Как продемонстрировано на чертеже, все три содержащие IL-2 конструкции индуцировали пролиферацию NK-клеток (А) и CD8-Tклеток (В) в зависимости от дозы с одинаковой эффективностью. В отношении CD4-T-клеток (Б) иммуноконъюгат IgG-IL-2 qm обладал более низкой активностью, особенно при применении в средних концентрациях, что может являться следствием отсутствия активности в отношении CD25-позитивных (включая регуляторные) T-клеток, которые представляют собой подпопуляцию CD4-T-клеток.
- 68 033369
Пример 13.
Активация эффекторных клеток IL-2 дикого типа и четырехмутантных IL-2 (рБТАТ5-анализ).
PBMC получали согласно описанному выше методу. 500000 PBMC/лунку высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном и выдерживали в течение 45 мин при 37°C в среде RPMI, содержащей 10% FCS и 1% глютамакса (фирма Gibco). Затем PBMC инкубировали с пролейкином, полученным при создании изобретения IL-2 дикого типа или четырехмутантным IL-2, в указанных концентрациях в течение 20 мин при 37°C для индукции фосфорилирования STAT5. Затем клетки немедленно фиксировали (фирма BD, Cytofix-буфер) в течение 10 мин при 37°C и однократно отмывали, затем осуществляли стадию повышения проницаемости (фирма BD, буфер III Phosflow Perm) в течение 30 мин при 4°C. Затем клетки отмывали ЗФР /0,1% БСА и окрашивали смесями, применяемыми для FACS антител для выявления NKклеток (CD3-/CD56+), CD8+-T-клеток (CD3+/CD8+), CD4+-T-клеток (CD3+/CD4+/CD25-/CD127+) или Tregклеток (CD4+/CD25+/CD127-/FoxP3+), а также pSTAT5 в течение 30 мин при КТ в темноте. Клетки отмывали дважды ЗФР/0,1% БСА и ресуспендировали в 2% PFA перед анализом методом проточной цитометрии (фирма BD, устройство FACSCantoII).
На фиг. 38 продемонстрированы данные о фосфорилировании STAT в NK-клетках (А), CD8-Tклетках (Б), CD4-T-клетках (В) и регуляторных T-клетках (Г) после 30-минутной инкубации с пролейкином, полученными при создании изобретения IL-2 дикого типа (пул 2) и четырехмутантным IL-2 (партия 1). Все три препарата IL-2 обладали одинаковой эффективностью в отношении индукции фосфорилирования STAT в NK-клетках, а также в CD8-T-клетках. В CD4-T-клетках и даже еще в большей степени в регуляторных T-клетках четырехмутантный IL-2 обладал более низкой активностью, чем препараты, содержащие IL-2 дикого типа.
Пример 14.
Активация эффекторных клеток иммуноконъюгатом IgG-IL-2, содержащим IL-2 дикого типа и четырехмутантный IL-2 (pSTAT5-анализ).
Условия эксперимента соответствовали описанным выше (см. пример 13).
На фиг. 39 продемонстрированы данные о фосфорилировании STAT в NK-клетках (А), CD8-Tклетках (Б), CD4-T-клетках (В) и регуляторных T-клетках (Г) после 30-минутной инкубации с пролейкином, IgG-IL-2, содержащим IL-2 дикого типа, или IgG-IL-2 содержащим четырехмутантный IL-2. В клетках всех типов пролейкин обладал более высокой эффективностью в отношении индукции фосфорилирования STAT, чем иммуноконъюгаты IgG-IL-2. Конструкции IgG-IL-2, содержащие IL-2 дикого типа и четырехмутантный IL-2, обладали одинаковой эффективностью в NK-клетках, а также CD8-T-клетках. В CD4-T-клетках и даже еще в большей степени в регуляторных T-клетках четырехмутантный IgG-IL-2 обладал более низкой активностью, чем иммуноконъюгат IgG-IL-2, содержащий IL-2 дикого типа.
Пример 15.
Максимальные переносимые дозы (MTD) иммуноконъюгатов Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab, мишенью которых является FAP.
Проводили оценку воздействия возрастающих доз иммуноконъюгатов Fab-IL-2-Fab, мишенью которых является FAP, содержащих либо IL-2 дикого типа (wt), либо четырехмутантный (qm) IL-2, на не имеющих опухоли иммунокомпетентных мышах линии Black 6.
Самок мышей линии Black 6 (фирма Charles River, Германия), возраст которых в начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специальных условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (P 2008016). После доставки животных выдерживали в течение одной недели для акклиматизации к новому окружению и для обследования. В течение всего периода времени регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
Мышам инъецировали i.v. один раз в день в течение 7 дней 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab в дозах 60, 80 и 100 мкг/мышь или 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab в дозах 100, 200, 400, 600 и 1000 мкг/мышь. Всем мышам инъецировали i.v. 200 мкл соответствующего раствора. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили ЗФР.
На фиг. 40 продемонстрировано, что MTD (максимальная переносимая доза) Fab-IL-2 qm-Fab оказалась в 10 раз выше, чем Fab-IL-2 wt-Fab, а именно, она составляла 600 мкг/мышь при ежедневном введении Fab-IL-2 qm-Fab в течение 7 дней по сравнению с 60 мкг/мышь при ежедневном введении Fab-IL-2 wt-Fab в течение 7 дней.
- 69 033369
Таблица 19
Соединение Доза Состав буфера Концентрация (мг/мл)
4G8 Fab-IL2 wt-Fab 60,80, 100 мкг 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, ЮОмМ глицин, pH 6,7 3,32 (маточный раствор)
4G8 Fab-IL2 qm-Fab 100,200, 400,600, 25мМ фосфат калия, 125мМ NaCl, 4,25 (маточный раствор)
1000 мкг ЮОмМ глицин, pH 6,7
Пример 16.
Фармакокинетические характеристики одноразовой дозы иммуноконъюгатов IgG-IL-2 wt и qm, мишенью которых является FAP, и ненаправленных иммуноконъюгатов IgG-IL-2 wt и qm.
Фармакокинетическое (ФК) исследование одноразовой дозы иммунокоъюгатов IgG-IL-2, мишенью которых является FAP, содержащих либо IL-2 дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, и ненаправленных иммуноконъюгатов IgG-IL-2, содержащих либо IL-2 дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, осуществляли на не имеющих опухоли иммунокомпетентных мышах линии 129.
Самок мышей линии 129 (фирма Harlan, Великобритания), возраст которых в начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специальных условиях без патогенов с суточными циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (P 2008016). После доставки животных выдерживали в течение одной недели для акклиматизации к новому окружению и для обследования. В течение всего периода времени регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
Мышам однократно инъецировали i.v. иммуноконъюгаты, мишенью которых является FAP, такие как 28H1 IgG-IL-2 wt (2,5 мг/кг) или 28H1 IgG-IL-2 qm (5 мг/кг), или ненаправленные иммуноконъюгаты DP47GS IgG-IL-2 wt (5 мкг/кг) или DP47GS IgG-IL-2 qm (5 мг/кг). Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили ЗФР.
У мышей брали образцы крови в следующие моменты времени: 1, 8, 24, 48, 72, 96 ч и после этого через каждые 2 дня в течение 3 недель. Сыворотку экстрагировали и хранили при -20°C до осуществления анализа ELISA. Концентрации иммуноконъюгатов в сыворотке определяли, применяя ELISA для количественной оценки антитела, входящего в содержащий IL-2 иммуноконъюгат (фирма Roche-Penzberg). Абсорбцию определяли, осуществляя измерения при длине волны 405 нм и длине референс-волны 492 нм (настраиваемый ридер для микропланшетов типа VersaMax, фирма Molecular Devices).
На фиг. 41 представлены результаты фармакокинетического исследования указанных иммуноконъюгатов IL-2. Как конструкции, мишенью которых является FAP (А), так и ненаправленные (Б) конструкции IgG-IL-2 qm, имели более продолжительное время полужизни в сыворотке (примерно 30 ч) по сравнению с соответствующими конструкциями IgG-IL-2 wt (примерно 15 ч).
Таблица 20
Соединение Доза Состав буфера Концентрация (мг/мл)
28Hl-IgG- IL2 wt 2,5 мг/кг 20мМ гистидин, 140мМ NaCl, pH 6,0 3,84 (маточный раствор)
28Hl-IgG- IL2 qm 5 мг/кг 20мМ гистидин, 140мМ NaCl, pH 6,0 2,42 (маточный раствор)
DP47GS- IgG-IL2wt 5 мг/кг 20мМ гистидин, 140мМ NaCl, pH 6,0 3,74 (маточный раствор)
DP47GS- IgG-IL2QM 5 мг/кг 20мМ гистидин, 140мМ NaCl, pH 6,0 5,87 (маточный раствор)
Пример 17.
Фармакокинетические характеристики одноразовой дозы ненаправленных иммуноконъюгатов Fab-IL-2 wt-Fab и Fab-IL-2 qm-Fab.
Фармакокинетическое (ФК) исследование одноразовой дозы ненаправленных иммунокоъюгатов Fab-IL-2-Fab, содержащих либо IL-2 дикого типа, либо четырехмутантный IL-2, осуществляли на не имеющих опухоли иммунокомпетентных мышах линии 129.
- 70 033369
Самок мышей линии 129 (фирма Harlan, Великобритания), возраст которых при начале эксперимента составлял 8-9 недель, содержали в специальных условиях без патогенов с суточным циклами 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (P 2008016). После доставки животных выдерживали в течение одной недели для акклиматизации к новому окружению и для обследования. В течение всего периода регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
Мышам однократно инъецировали i.v. иммуноконъюгаты DP47GS Fab-IL-2 wt-Fab в дозе 65 нмоль/кг или DP47GS Fab-IL-2 qm-Fab в дозе 65нМ/кг. Всем мышам инъецировали i.v. по 200 мкл соответствующего раствора. Для получения соответствующего количества иммуноконъюгата на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили ЗФР.
У мышей брали образцы крови в следующие моменты времени: 0,5, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 96 ч и после этого через каждые 2 дня в течение 3 недель. Сыворотку экстрагировали и хранили при -20°C до осуществления анализа ELISA. Концентрации иммуноконъюгатов в сыворотке определяли, применяя ELISA для количественной оценки антитела, входящего в содержащий IL-2 иммуноконъюгат (фирма RochePenzberg). Абсорбцию определяли, осуществляя измерения при длине волны 405 нм и длине референсволны 492 нм (настраиваемый ридер для микропланшетов типа VersaMax, фирма Molecular Devices).
На фиг. 42 представлены результаты фармакокинетического исследования указанных иммуноконъюгатов IL-2. Конструкции Fab-IL-2-Fab wt и qm имели время полужизни в сыворотке приблизительно 3-4 ч. Различие во времени полужизни в сыворотке между конструкциями, содержащими IL-2 дикого типа или четырехмутантный IL-2, оказалось менее выраженным для Fab-IL-2-Fab-конструкций, чем для IgG-подобных иммуноконъюгатов, которые сами имели более продолжительное время полужизни.
Таблица 21
Соединение Доза Состав буфера Концентрация (мг/мл)
DP47GS Fab-IL2 wt- Fab 6 5 нМ/кг ЮОмМ глицин, 125мМ NaCl, 25мМ КН2РО4, pH 6,7 3,84 (маточный раствор)
DP47GS Fab-IL2 qm- Fab 6 5 нМ/кг ЮОмМ глицин, 125мМ NaCl, 25мМ КН2РО4, pH 6,7 2,42 (маточный раствор)
Пример 18.
Активация индуцированной клеточной гибели активируемых IL-2 PBMC.
Свежевыделенные из организма здоровых доноров PBMC предварительно активировали в течение ночи с помощью ФГА-М в концентрации 1 мкг/мл в среде RPMI1640, содержащей 10% FCS и 1% глутамина. После предварительной активации PBMC собирали, метили с помощью 40 нМ CFSE в ЗФР и высевали в 96-луночные планшеты из расчета 100000 клеток/лунку. Предварительно активированные PBMC стимулировали, используя в различных концентрациях иммуноконъюгаты IL-2 (4B9 IgG-IL-2 wt, 4B9 IgG-IL-2 qm, 4B9 Fab-IL-2 wt-Fab и 4В9 Fab-IL-2 qm-Fab). Через 6 дней после обработки с помощью IL-2 PBMC обрабатывали в течение ночи активирующим антителом к Fas в концентрации 0,5 мкг/мл. Через 6 дней анализировали пролиферацию CD4-(CD3+CD8-) и CD8-(CD3+CD8+) T-клеток, используя разведения CFSE. Процент живых T-клеток после обработки антителом к Fas определяли путем установки дискриминационного окна на CD3+-, аннексин V-негативных живых клеток.
Как продемонстрировано на фиг. 44, все конструкции индуцировали пролиферацию предварительно активированных T-клеток. При применении в низких концентрациях конструкции, содержащие IL-2 дикого типа (wt), оказались более активными, чем содержащие IL-2 qm конструкции. IgG-IL-2 wt, Fab-IL-2 wt-Fab и пролейкин обладали сходной активностью. Конструкция Fab-IL-2 qm-Fab обладала несколько более низкой активностью, чем IgG-IL-2 qm. Конструкции, содержащие IL-2 дикого типа, обладали более высокой активностью в отношении CD4-T-клеток, чем в отношении CD8-T-клеток, наиболее вероятно из-за активации регуляторных T-клеток. Конструкции, содержащие четырехмутантный IL-2, обладали сходной активностью в отношении CD8- и CD4-T-клеток.
Как продемонстрировано на фиг. 45, T-клетки, стимулированные IL-2 дикого типа в высоких концентрациях, обладали большей чувствительностью к индуцируемому антителом к Fas апоптозу, чем T-клетки, обработанные четырехмутантным IL-2.
Хотя изобретение описано достаточно подробно с помощью иллюстраций и примеров, приведенных для целей лучшего понимания, описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Все процитированные в настоящем описании патентные и научные публикации полностью включены в него в качестве ссылки.
- 71 033369
Перечень последовательностей <110> Роше Гликарт АГ <120> Мутантные полипептиды интерлейкина-2 <130> 27307 <150> ЕР 11153964.9 <151> 2011-02-10 <150> ЕР 11164237.7 <151> 2011-04-29 <160>324 <170> Patentin. версия 3.5 <210>1 <211>133 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>1
Ala 1 Pro Thr Ser Ser 5 Ser Thr Lys Lys Thr 10 Gln Leu Gln Leu Glu 15 His
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 5 5 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
- 72 033369
Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Cys Gln Ser lie
115
120
125 lie Ser Thr Leu Thr
130 <210> 2 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа <40O>2 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga360 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact399 <210>3 <211>133 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа(С125А) <400> 3
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
- 73 033369
4045
Lys Ala 50 Thr Glu Leu Lys Hi s 5 5 Leu Gln Cys Leu Glu 60 Glu Glu Leu Lys
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
lie Ser Thr Leu Thr
130 <210>4 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа(С125А) (1) <400> 4
gctcctacat cct ccagcac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga t cctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt t ct асаtgcc caagaaggcc accgagctga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacctggccc agtccaagaa cttccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggct ccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca t cgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct t cgcccagt c catcatctcc accctgacc 399
<210> 5
- 74 033369 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческий IL-2 дикого типа (C125A)(2) <400>5
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgct c 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat ctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210>6 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий IL-2 дикого <400> 6 типа (C125A) (3)
gctcctacta gcagct ccac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacctggccc agagcaagaa cttccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca t cgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210>7 <211>133 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 75 033369 <220>
<223> Мутант IL-2 L72G (С125А) <400>7
Ala 1 Pro Thr Ser Ser 5 Ser Thr Lys Lys Thr 10 Gln Leu Gln Leu Glu 15 Hi s
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 5 5 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu
65 70 75 80
Pro Ser
J J.J_ 4-j J J.J_ 4-j J — S_. S_. V «-Я -1- -1--i_ S_ V «-Я -1- — —
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Al a Gln Ser Ile
115 120 125
lie Ser Thr Leu Thr
130 <210>8 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) (1) <400> 8 gctcctacat cctccagcac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct cctgctggat 60
- 76 033369
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agt ccaagaa ctt ccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggct ccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210>9 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) (2)
<400> 9
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat ctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210>10 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) ( 3)
<400> 10
gctcctacta gcagctccac caagaaaacc cagct ccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacat ctgca gtgcctggaa 180
- 77 033369
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa ctt ccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag a cagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210> 11 <211> 133 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант IL-2 L72G / F42A (C125A) <400> 11
Ala 1 Pro Thr Ser Ser 5 Ser Thr Lys Lys Thr 10 Gln Leu Gln Leu Glu 15 Hi s
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 5 5 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie
115 120 125
lie Ser Thr Leu Thr
- 78 033369
130 <210> 12 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант IL-2 F42A / L72G (С125А) (1) <400>12
gctcctacat cctccagcac caagaaaacc cagct ccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agt ccaagaa ctt ccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggct ccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210>13 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант IL-2 F42A / L72G (С125А) (2) <400> 13
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgt ctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat ctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 14
- 79 033369 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант IL-2 F42A / L72G (C125A) (3) <400>14 gctcctacta gcagctccac caagaaaacc cagctccagc tggaacatct gctgctggat60 ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg120 accgccaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa180 gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa cttccacctg240 aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag300 acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg360 tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca399 <210>15 <211>133 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) <400> 15
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met
Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
45
Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
80
- 80 033369
Arg Pro Arg Asp Leu 85 lie Ser Asn lie Asn 90 Val lie Val Leu Glu 95 Leu
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie
115 120 125
lie Ser Thr Leu Thr
130 <210> 16 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (1) <400>16
gctcctacat cctccagcac caagaaaacc cagct ccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccgga tgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgagctga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agt ccaagaa ctt ccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggct ccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210>17 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (2) <400> 17 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
- 81 033369
ttacagatga ttttgaatgg aattaat aat tacaagaatc ccaaactcac cagga tgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat ctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210>18 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (3)
<400> 18
gctcctacta gcagctccac caagaaaacc cagct ccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccgga tgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgaactga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa ctt ccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210>19 <211>133 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A) <400> 19
Ala 1 Pro Ala Ser Ser 5 Ser Thr Lys Lys Thr 10 Gln Leu Gln Leu Glu 15 Hi s
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys
- 82 033369
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 5 5 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie
115 120 125
lie Ser Thr Leu Thr
130 <210> 20 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A) (1) <400> 20
gctcctgcct cctccagcac caagaaaacc cagct ccagc tggaacatct cctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgagctga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agt ccaagaa ctt ccacctg 240
aggcctcggg acctgatctc caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggct ccgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
- 83 033369
tggatcacct tcgcccagtc catcatctcc accctgacc 399
<210> 21 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A) (2)
<400> 21 gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat ctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 22 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная i лоследовательность
<220> <223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A / Y45A / L72G (C125A) (3)
<400> 22 gctcctgcca gcagctccac caagaaaacc cagct ccagc tggaacatct gctgctggat 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 120
accgccaagt tcgccatgcc caagaaggcc accgaactga aacat ctgca gtgcctggaa 180
gaggaactga agcctctgga agaggtgctg aacggcgccc agagcaagaa ctt ccacctg 240
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagccacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcgcccagag catcatcagc accctgaca 399
<210> 23
- 84 033369 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10; VL <400> 23
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala <210> 24 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10; VL <400>24 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc60 atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca180
- 85 033369
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 25 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10(GS); VL <400>25
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Al a Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>26 <211>321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10(GS); VL
- 86 033369 <400> 26
gatatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g321 <210>27 <211>121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10; VH <400> 27
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Al a Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
- 87 033369
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115120 <210>28 <211>363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10; VH <400>28
caggtgcaat tggtgeagte tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte 60
teetgeaagg cct ccggagg cacattcagc agetaegeta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tea363 <210>29 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11; VL <400> 29
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
- 88 033369
5560
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 Ile Ser Arg Leu Glu 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>30 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11; VL <400>30
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcgtccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagt atact ccccc cacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210>31 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11 (VI ) ; VL
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
- 89 033369
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro <210> 32 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11(VI); VL <400>32 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagt atactccccc cacgttcggc300 caggggacca aagtggaaat caaa324 <210>33 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11; VH
- 90 033369 <400>33
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>34 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11; VH <400> 34
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
- 91 033369
- 92 033369 <220>
<223> 2F11(МТ); VH <400>36
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
пса cmcra arm □net π π a σ t cr σ σ t c t с а σ c t a 11 a π t σ σ t a at, cmΓ. cmΓ. a er cacatactac 1 80
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca att ccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaatggaga 300
tggatgatgt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtct egag t 351
<210>37 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2; VL <400> 37
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Tyr Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
- 93 033369
100105 <210>38 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2; VL <400>38
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt atccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210>39 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3F2(YS); VL
<400 > 39
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
- 94 033369
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2(YS); VL <400>40
gaaatcgtgt taacgcagt c tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ct cccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcat ccca 180
gacaggttca gtggcagtgg at ccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgctt ccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210>41 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2; VH <400> 41
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
- 95 033369
4045
Ser Ala 50 lie Ser Gly Ser Gly 5 5 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>42 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2; VH <400>42
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210>43 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9, VL
- 96 033369 <400>43
Glu 1 Не Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Не Туг Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Leu He Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105
<210>44 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9, VL <400> 44
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cage ttattccccc taegttegge 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
- 97 033369 <210> 45 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9, VH <400> 45
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100
105
110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 46 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9, VH <400> 46
- 98 033369
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attggtgtta gtactggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210> 47 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9(TA); VH <400> 47
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
J-C LA 0X11 1’1 C L, Л.О11 OCL J-C LA Arg α L7-L LA •П.О U J. 1 1 J_ j-i-L α v ax Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
- 99 033369
115 <210> 48 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9(TA); VH <400> 48
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggt ct cagct attggtgtta gtactggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca att ccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 49
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4G8; VL
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr G1 n Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Se r Cys Arg . Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr G1 n Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Th r Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Th r Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
- 100 033369
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>50 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<400> 50
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc cgcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcatt ggggcctcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggacg gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210>51 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8; VH <400> 51
Glu 1 Val Gln 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
- 101 033369
40
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly
55
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg
70
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe
100
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 52 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последоват ъность <220>
<223> 4G8; VH <400>52
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210>53 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B3; VL
- 102 033369 <400>53
Glu 1 Не Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Не Туг Gly Ala Tyr He Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val He Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105
<210>54 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4ВЗ; VL <400> 54
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcaattact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggcgcctaca t cagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
- 103 033369 <210> 55 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B3; VH <400>55
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>56 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B3; VH <400> 56
- 104 033369
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 57 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4D6; VL <400> 57
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro
5
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
40
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Gln Gly Ala Ser Ser Arg Ala
55
Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
70
Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
Cys Gln Gln Gly Gln Val Tie Pro
95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
Val Glu lie Lys
105 <210> 58
- 105 033369 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4D6; VL <400> 58
csscgcsgtc ILCCclCJCJCclCC ctgtctttgt ccccagggga clclCfclCJCCclCC 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatccag ggcgcctcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 59 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4D6; VH <400> 59
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
- 106 033369
Ala Lys
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp
Gly Gln Gly Thr Leu
100
105
110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 60 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4D6; VH <400>60
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210>61 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
<220 >
<223 > 2C6; VL
<400 > 61
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
- 107 033369
4045
He Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 5 5 Ala Thr Gly lie Pro 60 Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Gln lie Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210>62 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2С6; VL <400>62
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag caggctggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cage agatt ccccc taegttegge 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210>63 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2С6; VH <400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
- 108 033369
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Ala Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 64 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2C6; VH <400> 64
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtct cagct attagtggga gtgctggtta tacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca att ccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttgggaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
- 109 033369 <210> 65 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5H5; VL <400> 65
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Gln Ile Pro <210> 66 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5H5; VL <400>66 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa120
- 110 033369
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtaatc agatt ccccc tacgttcggt 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 67 <211> 116 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5H5; VH <400> 67
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 5 5 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Phe Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115 <210> 68
- 111 033369 <211> 348 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5H5; VH <400> 68
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatacca tgagctgggt ccgccggtct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggtg gtggtaggac atactacgca 180
gact ccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aggttggttt 300
acgccttttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagt 348
<210> 69
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2C4; VL
<400> 69
Glu lie Val Leu Thr G1 n Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Se r Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr G1 n Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Gly Ala Ser II e Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Th r Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Gln lie Pro
- 112 033369 <210> 70 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2С4; VL <400>70 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agtaactact tagcctggta ccagcagaaa120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcctcca ttagggccac tggcatccca180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtaatc agattccccc tacgttcggt300 caggggacca aagtggaaat caaa324 <210>71 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2C4; VH <400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
- 113 033369
5560
Lys 65 Gly Arg Phe Thr lie 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>72 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2C4; VH <400>72
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttacgcctt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgt ct cgag t 351
<210>73 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2D9; VL <400> 73
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
- 114 033369
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Gln Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 74 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2D9; VL <400>74
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtaatc agatt ccccc tacgttcggt 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210>75 <211>117 <212> БЕЛОК
- 115 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2D9; VH <400>75
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Al a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Al a Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Al a Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>76 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2D9; VH <400>76 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct120
- 116 033369
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttacgcctt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210> 77 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B8; VL <400>77
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val lie Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210>78 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 117 033369
<220>
<223> 4B8; : VL
<400> 78
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 79 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B8; VH <400> 79
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
- 118 033369
100 105110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>80 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B8; VH <400>80
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210>81 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223 > 7A1; VL
<400 > 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Se r Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
- 119 033369
5560
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 Ile Ser Arg Leu Glu 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Gln Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>82 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 7А1; VL <400>82
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cage agattccccc taegttegge 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210>83 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 7A1; VH
<400> 83
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
- 120 033369
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Al a Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 84 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 7A1; VH <400>84
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
tttgggaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210>85 <211>108 <212> БЕЛОК
- 121 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 13С2; VL <400>85
Glu 1 Не Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Не Туг Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Leu He Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>86 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 13С2; VL
<400> 86
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
- 122 033369 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagc ttattccccc tacgttcggc300 caggggacca aagtggaaat caaa324 <210>87 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 13C2; VH <400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
5
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly
55
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg
70
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe
100
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 88 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 123 033369 <220>
<223> 13С2; VH
<400> 88
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210> 89 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 13Е8; VL <400> 89
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Asn lie Pro
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
- 124 033369
100
105 <210> 90 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 13Е8; VL <400>90 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtctga atattccctc gacgttcggc300 caggggacca aagtggaaat caaa324 <210>91 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 13E8; VH <400> 91
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
- 125 033369
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 92 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 13E8; VH <400>92
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ttgggtccgt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210>93 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14C10; VL <400> 93
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
- 126 033369
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His lie lie Pro <210> 94 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14C10; VL <400>94 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcata ttattccccc gacgttcggc300 caggggacca aagtggaaat caaa324 <210>95 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14C10; VH
- 127 033369 <400>95
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Trp Met Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>96 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14C10; VH <400> 96
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
- 128 033369 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagcttgg atggggcctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t
300
351 <210> 97 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 17A11; VL <400> 97
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Pro <210> 98 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 17A11; VL <400> 98
- 129 033369
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtctga atattccctc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 99 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 17A11; VH <400> 99
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Al a Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Al a Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
- 130 033369
115 <210> 100 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 17А11; VH
<400> 100
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ttgggtccgt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag t 351
<210> 101 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 19G1; VL <400> 101
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
- 131 033369
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pr
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 102 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 19G1; VL
<400> 102
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcat ccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 103 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 19G1; VH <400> 103
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Al a Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
- 132 033369
4045
Ser Ala 50 Ile Ile Ser Ser Gly 5 5 Gly Leu Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>104 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 19G1; VH
<400> 104
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg attattagta gtggtggtct cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210> 105 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 20G8; VL
- 133 033369 <400>105
Glu 1 Не Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Al a Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Не Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly lie Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105
<210>106 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 20G8; VL
<400> 106
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact t agcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc t caccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta t gctt ccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 32 4
- 134 033369 <210> 107 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 20G8; VH <400>107
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Al a Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie lie Gly Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>108 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 20G8; VH <400> 108
- 135 033369
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcaa tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggga gtggtagtcg tacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 24 0
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210> 109 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B9; VL <400> 109
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Phe Met Pro
J—k-l- Ol V <—Ί -L -L _y J_ -L _y J_ _y ·— -1- X X _i_ x x _y -1--_ J_l
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 110
- 136 033369 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B9; VL <400>110
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgtt cggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa324 <210>111 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B9; VH <400> 111
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
- 137 033369
9095
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>112 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<400> 112
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggta gtggtgctag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210>113 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5B8; VL <400> 113
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Al a Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
- 138 033369
4045
He Asn 50 Val Gly Ser Arg Arg 5 5 Ala Thr Gly lie Pro 60 Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly lie Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210>114 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5В8; VL
<400> 114
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgtt acc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcat ccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgt cag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 115 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5В8; VH <400> 115
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
- 139 033369
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
4 0 4 5
Ser Ala Ile Trp Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
210>116
211>351
212> ДНК <220>
<223> 5B8; VH <400>116
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct atttggggtg gtggtcgtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
- 140 033369 <210> 117 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5F1; VL <400>117
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly lie Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210>118 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5F1; VL <400>118 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa120
- 141 033369
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgt cag cagggtatta tgcttccccc gacgtt cggc 300
cagggga cca aagtggaaat caaa 324
<210> 119 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5F1; VH <400> 119
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie lie Ser Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Phe Asn Thr
4_, _1_ J, 4_, _1_ J, 4_, _1_ J, -1· 4_, _1_ J, 4_, _1_ J,
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 120
- 142 033369 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5F1; VH <400> 120
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattagta gtggggctag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210> 121
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14B3 ; VL
<400> 121
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
- 143 033369
9095
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210>122 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14B3; VL
<400> 122
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cct cat caat gtgggctccc gtagggccac tggcat ccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 123 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14B3; VH <400> 123
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Leu Al a Ser Gly Ala Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
- 144
5560
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>124 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14B3; VH
<400> 124
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attttggcta gtggtgcgat cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaact actg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210> 125 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16F1; VL <400> 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
- 145 033369
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly lie Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 126 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16F1; VL
<400> 126
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 127 <211> 117 <212> БЕЛОК
- 146 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16F1; VH <400>127
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>128 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16F1; VH <400>128 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct120
- 147 033369
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attattggta gtggtggtat cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca att ccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgtc c 351
<210> 129 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16F8; VL <400>129
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Al a Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>130 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 148 033369 <220>
<223> 16F8; VL
<400> 130
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 131 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16F8; VH <400> 131
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Leu Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
- 149 033369
100 105110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>132 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16F8; VH
<400> 132
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attcttggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210> 133 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O3C9; VL <400> 133
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
- 150 033369
5560
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 Ile Ser Arg Leu Glu 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>134 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O3C9; VL
<400> 134
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 135 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O3C9; : VH
<400> 135
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
- 151 033369
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile lie Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
5 0 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 136 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O3C9; VH
<400> 136
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttttgcca tgagctgggt ccgtcagtct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggt ct cagct attattggta gtggtagtaa cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210> 137 <211> 108 <212> БЕЛОК
- 152 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O2D7; VL <400>137
Glu 1 Не Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Не Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Thr Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala lie Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 <210>138 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O2D7; VL <400> 138
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcacccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
- 153 033369
- 154 033369 <220>
<223> O2D7; VH
<400> 140
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
18 0
ССауууаауу ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgtc c 351
<210> 141 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28Н1; VL <400> 141
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
- 155
100
105 <210> 142 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28Н1; VL <400>142
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc cgcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcatt ggggcctcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat сааа324 <210>143 <211>116 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28Н1; VH <400> 143
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
5
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala lie Trp Ala Ser Gly Glu
55
Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
- 156 033369
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115 <210> 144 <211> 348 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28H1; VH
<400> 144
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agtcatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggt ct cagct atttgggcta gtggggagca atactacgca 180
gact ccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agggtggctg 300
ggtaattttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagt 348
<210> 145 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 22A3; : VL
<400> 145
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
- 157 033369
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
40
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala
55
Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
70
Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
Cys Gln Gln Gly lie Met Leu Pro
95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
Val Glu lie Lys
105 <210> 146 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 22A3; VL <400> 146 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcttgca gggccagtca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca
120
180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag
240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc
300 caggggacca aagtggaaat caaa324 <210>147 <211>117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 22A3; VH
- 158 033369 <400>147
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210>148 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 22A3; VH
<400> 148
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggta gtggtagtat cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca att ccaagaa cacgctgtat 240
- 159 033369 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg
300 tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t351 <210>149 <211>108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 29B11; VL <400>149
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly lie Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210>150 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 29B11; VL <400> 150
- 160 033369
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttacc agtagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcaat gtgggctccc gtagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtatta tgcttccccc gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 151 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 29B11; VH <400> 151
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ile Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
- 161 033369
115 <210> 152 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 29В11; VH
<400> 152
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attattggta gtggtggtat cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc t ccagagaca att ccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 153 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 23С10; VL <400> 153
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Al a Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
- 162 033369
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val lie Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 154 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 23C10; VL
<400> 154
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc cgcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcatt ggggcctcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 155 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 23C10; VH <400> 155
1 V xxx. 5 Ser XX x. _y XX x. _y 10 XX XX XX V XXX. XXX.XX Pro 15 XXX. _y
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
- 163 033369
40
Ser Ala lie Ser Thr Asn Gly Asn
55
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg
70
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe
100
Tyr Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
105 110
Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 156 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 23C10; VH
<400> 156
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagact c 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttctgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtacta atggtaatta tacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag t 351
<210> 157 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 C3B6; VL
- 164 033369 <400>157
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Туг Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>158 <211>321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B1C >_C3B6; VL
<400> 158
gatatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgt cccat ca 180
aggttcagcg gcagtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
- 165 033369 <210> 159 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_C3B6; VH <400>159
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Al a Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>160 <211>363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_C3B6; VH <400> 160
- 166 033369
caggtgcaat tggtgeagte tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte 60
teetgeaagg cct ccggagg cacattcagc agetaegeta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggagct at cat cccga teettggtat cgcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag at ctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tea363 <210>161 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_6A12; VL <400> 161
Asp 1 lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
- 167 033369 <210> 162 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_6A12; VL <400>162
gatatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgt cccat ca 180
aggttcagcg gcagtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210>163 <211>121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная поел' <220>
<223> 2B10 6A12; VH <400> 163
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
5
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
Gly Val lie lie Pro lie Leu Gly
55
Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala
70
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
80
- 168 033369
Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 164 <211> 363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_6A12; VH <400>164
caggtgcaat tggtgeagte tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte 60
teetgeaagg cct ccggagg cacattcagc agetatgeta taagctgggt gcgacaggcc 120
clt Cdt CCCtS 180
cc.ggacaag ggc.egagtg ga ^gggagtg .cc . .ggtac cgcaaac.ac
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag at ctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tea363 <210>165 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_C3A6; VL <400> 165
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Asn Val
- 169 033369
Leu Gly Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu lie
Tyr Asp Ser Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
100
Glu lie Lys
105 <210> 166 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 C3A6; VL <400> 166
gacatccaga tgacccagt c tccttcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcatt cgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat tcgtccagtt tgcagagtgg cgt cccat ca 180
aggttcagcg gcggtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g321 <210>167 <211>121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 C3A6; VH
- 170 033369 <400>167
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Al a Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>168 <211>363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B1C i_C3A6; VH
<400> 168
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cct ccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg at cat cccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
- 171 033369 atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300 ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360 tea 363 <210> 169 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_DlA2_wt; VL <400>169
Asp 1 lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie
35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210>170 <211>321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 D1A2 wt; VL
- 172 033369
<400> 170
gatatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca ggggatt cgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcttacagct tgcagagtgg cgt cccat ca 18 0
aggttcagcg gcggtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 171 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_DlA2_wt; VH <400> 171
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 4 5
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Al a Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
- 173 033369
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
210> 172
211> 363
212> ДНК
213> Искусственная последовательность
220>
223> 2B10_DlA2_wt; VH
400> 172
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg at cat cccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
210> 173
211> 107
212> БЕЛОК
213> Искусственная последовательность
220>
223> 2B1O_D1A2_VD; VL
400> 173
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
- 174 033369
Gly
Gly
Gly
Asp
Phe
Ala
Phe
Gly
Thr Lys
Lys
100
105
210>174
211>321
213
220
223> 2B10 D1A2 VD; VL
<400> 174
gacatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca ggggatt cgt aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcttacagct tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
210>175
211>121
212> БЕЛОК
213
220
223> 2B10 D1A2 VD;
VH
400> 175
- 175 033369
30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly
55
Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala
70
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr
100
Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115120
Ser <210>176 <211>363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 D1A2 VD; VH
<400> 176
caggtgcaat tggtgeagte tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agetaegeta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg at cat cccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tea 363
210> 177
- 176 033369 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_07D8; VL <400>177
Asp 1 lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie
35 40 45
Tyr Asp Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
С П П 1 П R
<210>178 <211>321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 _O7D8; VL
<400> 178
gatatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gagcatt cgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gtgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
- 177 033369
aggttcagcg gcggtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 179 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_07D8; VH <400>179
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Al a Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>180 <211>363 <212> ДНК
- 178 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_07D8; VH <400> 180
caggtgcaat tggtgeagt c tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agetaegeta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gget egagt g gatgggaggg at cat cccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggca g ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctga g atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtg c ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tea 363
<210> 181
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная по следовательность
<220>
<223> 2B10 _O1F7; VL
<400> 181
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
- 179
9095
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100105 <210>182 <211>321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B1C I_O1F7; VL
<400> 182
gatatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcatt cgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcctgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210>183 <211>121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_01F7; VH <400> 183
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Al a Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
- 180 033369
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 184 <211> 363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_01F7; VH <400>184
caggtgcaat tggtgeagte tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte 60
teetgeaagg cctccggagg cacattcagc agetaegeta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg at cat cccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tea363 <210>185 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_6H10; VL <400> 185
- 181 033369
Asp 1 lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie
35 40 45
Gln Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
10 0 10 5
<210> 186 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 6H10; VL <400> 186
gacatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcatt cgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatccaggct gctaccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggat c cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321 <210> 187
- 182 033369 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10_6H10; VH <400>187
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Al a Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>188 <211>363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 6H10; VH <400> 188 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc
- 183 033369
teetgeaagg cctccggagg cacattcagc agetaegeta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg at cat cccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aat ccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 3 60
tea363 <210>189 <211>122 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG1; VH <400> 189
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala
50 5 5 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Hi s Tyr Phe Asp Hi s Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
- 184
115120 <210>190 <211>366 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG1; VH
<400> 190
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa ctt cggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagt366 <210>191 <211>109 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV9; VL <400> 191
Asp 1 lie Gln Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ser Phe 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
- 185 033369
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gln Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105
<210> 192 <211> 327 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV9; VL <400>192
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca aggccagt ca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120
gggcaggcac ctaggcct ct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gtt cggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacg327 <210>193 <211>122 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG; VH <400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ту:
20 25 30
- 186 033369
Trp Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Al a Ala
50 5 5 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Hi s Tyr Phe Asp Hi s Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 194 <211> 366 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG; VH
<400> 194
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa ctt cggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagt366 <210>195 <211>109 <212> БЕЛОК
- 187 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV1; VL <400>195
Asp 1 lie Gln Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ser Phe 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr
100 105
<210>196 <211>330 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV1; VL <400>196 gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc60 atcacctgca gggccagtca gaatgtggat actaacttag cttggtacca gcagaagcca120 gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca180 aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct240
- 188 033369 gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gtt ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg <210> 197 <211> 109 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последоват <220>
<223> KV7; VL <400> 197
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
5
BHOCTB
Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
40
Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
55
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
70
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 <210> 198 <211> 330 <212> ДНК <213> Искусственная последоват <220>
<223> KV7; VL <400> 198
Glu Ile Lys Arg Thr
105
BHOCTB
- 189 033369
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120
gggaaagcac ctaagcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gtt cggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330
<210> 199
<211> 603
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> L19 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
<400> 199
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser lie Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu A_rg A_la Gin A.^tj Thr Ala. Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
- 190 033369
115 120 125
Pro Ser 130 Ser Lys Ser Thr Ser 135 Gly Gly Thr Ala Ala 140 Leu Gly Cys Leu
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp Leu
245 250 255
Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
260 265 270
Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
275 280 285
Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
290 295 300
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp Leu
305 310 315 320
lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
- 191 033369
325 330 335
Thr Phe Met Cys 340 Glu Tyr Ala Asp Glu 345 Thr Ala Thr lie Val 350 Glu Phe
Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu
370 375 380
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
385 390 395 400
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ser
405 410 415
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
420 425 430
Ser lie Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
435 440 445
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
450 455 460
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
465 470 475 480
Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
485 490 495
Val Ser Ser Al a Ser Thr Lvs Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Al a Pro
500 505 510
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Al a Ala Leu Gly Cys Leu Val
515 520 525
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
- 192 033369
530 535 540
Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Al a Val Leu Gln Ser Ser Gly
545 550 5 5 5 560
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
5 65 570 575
Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys
580 585 590
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600
<210> 200 <211> 1809 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> L19 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 200
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct etggatt cacctttagc agtttttcga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attt ccggta gttcgggtac cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac aeggeegtat attactgtgc gaaaccgttt 300
ccgtattttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tetegagtge tagcaccaag 360
ggcccat egg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggteaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca geggegtgea caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccct ccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gataagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
teeggeggag gagggagegg eggaggtgge teeggaggtg gcggagcacc tgcctcaagt 720
- 193 033369
tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca gatgattttg 780
aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacagc caagtttgcc 840
atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga act caaacct 900
ctggaggaag tgctaaatgg cgctcaaagc aaaaactttc acttaagacc cagggactta 960
atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac att catgtgt 1020
gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat tacctttgcc 1080
caaagcatca tctcaacact gactt ccggc ggaggaggat ccggcggagg tggct ctggc 1140
ggtggcggag aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 1200
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gtttttcgat gagctgggtc 1260
cgccaggct c cagggaaggg gctggagtgg gtctcatcta tttccggtag ttcgggtacc 1320
acatactacg cagact ccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 1380
acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 1440
aaaccgtttc cgtattttga ctact ggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagtgct 1500
agcaccaagg gcccat cggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 1560
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 1620
aact caggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 1680
ctctactccc tcagcagcgt ggtga ccgtg ccct ccagca gcttgggcac ccagacctac 1740
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa 1800
tcttgtgac1809 <210>201 <211>215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> L19, легкая цепь <400> 201
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
Gly
- 194 033369
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Al a 25 Ser Gln Ser Val Ser 30 Ser Ser
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
riu L7-L U Asp flit; Al ci V al Tyr Tyr Cys tc _L 11 Ij-LIl Thr Gly Arg 1 -LC r L U
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
- 195 033369 <210> 202 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> L19, легкая цепь <400>202
gaaattgtgt tgacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat tatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagacgggtc gtatt cct cc gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataactt c 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
Cayy ayay t Cj tCacsgsgca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag -ccc-c-
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210>203 <211>641 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> F16 scFv-IL2 qm-scFv <400> 203
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
- 196 033369
40 45
Ser Ala 50 Ile Ser Gly Ser Gly 5 5 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Al a Leu
130 135 140
Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
165 170 175
Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Al a Gln
195 200 205
Ala Glu Asp Glu Al a Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met
210 215 220
Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Al a Pro
- 197 033369
245 250 255
Ala Ser Ser Ser 260 Thr Lys Lys Thr Gln 265 Leu Gln Leu Glu Hi s 270 Leu Leu
Leu Asp Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro
275 280 285
Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala
290 295 300
Thr Glu Leu Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
305 310 315 320
Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro
325 330 335
Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly
340 345 350
Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Al a Asp Glu Thr Ala Thr Ile
355 360 365
Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser
370 375 380
Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Al a Leu
405 410 415
Gly Gln Thr Val Arg lie Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
420 425 430
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
435 440 445
lie Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
- 198
450 455 460
Gly 465 Ser Ser Ser Gly Asn 470 Thr Ala Ser Leu Thr 475 lie Thr Gly Al a Gln 480
Ala Glu Asp Glu Al a Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met
485 490 495
Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Val
515 520 525
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
530 535 540
Arg Leu Ser Cys Al a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met
545 550 5 5 5 560
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
5 65 570 575
lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
580 585 590
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
595 600 605
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Al a Val Tyr Tyr Cys Al a Lys
610 615 620
Al ci П1 11 Al ci flit; Asp Tyr Trp Gly kc-L 11 Gly Thr J_I U V al Th r V ell
625 630 635 640
Ser <210> 204
- 199 033369 <211> 1923 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> F16 scFv-IL2 qm-scFv <400> 204
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cggtatggta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca att ccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgt at attactgtgc gaaagcgcat 300
aatgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgt cgagagg tggaggcggt 360
tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg 420
tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc acatgccaag gagacagcct cagaagctat 480
tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa 540
aacaaccggc cctcagggat cccagaccga ttctctggct ccagctcagg aaacacagct 600
tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa gatgaggctg actattactg taactcctct 660
gtttatacta tgccgcccgt ggtattcggc ggagggacca agctgaccgt cctaggctct 720
tcctcatcgg gtagtagctc ttccggctca tcgtcctccg gagcacctgc ctcaagttct 780
acaaagaaaa cacagctaca actggagcat ttactgctgg atttacagat gattttgaat 840
ggaattaata attacaagaa tcccaaactc accaggatgc tcacagccaa gtttgccatg 900
cccaagaagg ccacagaact gaaacat ctt cagtgtctag aagaagaact caaacctctg 960
gaggaagtgc taaatggcgc tcaaagcaaa aactttcact taagacccag ggacttaatc 1020
agcaatatca acgtaatagt tctggaacta aagggat ctg aaacaacatt catgtgtgaa 1080
tatgctgatg agacagcaac cattgtagaa tttctgaaca gatggattac ctttgcccaa 1140
agcatcatct caacactgac tt ccggcgga ggagggagcg gcggaggtgg ctctggcggt 1200
ggcggat cgt ctgagctcac tcaggaccct gctgtgtctg tggccttggg acagacagtc 1260
aggatcacat gccaaggaga cagcctcaga agctattatg caagctggta ccagcagaag 1320
- 200 033369
ccaggacagg cccctgtact tgteatetat ggtaaaaaca accggccctc agggatccca 1380
gaccgattct ctggctccag ct caggaaac acagctt cct tgaccatcac tggggctcag 1440
geggaagatg aggctgacta ttactgtaac tcctctgttt atactatgcc gcccgtggta 1500
tteggeggag ggaccaagct taccgtacta ggctcaggag gcggttcagg eggaggtt ct 1560
ggcggcggta geggategga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt ggtacagcct 1620
ggggggtccc tgagact ct c ctgtgcagcc tetggattea cctttagccg gtatggtatg 1680
agctgggtcc gccaggct cc agggaagggg ctggagtggg tctcagctat tagtggtagt 1740
ggtggtagca catactacgc agact ccgtg aagggccggt tcaccatctc cagagacaat 1800
tccaagaaca egetgtatet gcaaatgaac ageetgagag ccgaggacac ggeegtatat 1860
taetgtgega aagcgcataa tgcttttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtg 1920
t eg192 3 <210>205 <211>603 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> F16 Fab-IL2 qm-Fab (слит.
<400> 205
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala я конструкция тяжелая цепь-цитокин)
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly
55
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg
70
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
80
- 201 033369
Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Al a Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Ser Ser Ser
210 215 220
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala Pro Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp Leu
245 250 255
Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
260 265 270
Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
275 280 285
- 202 033369
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
290 295
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
300
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn
305 310
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
315 320 lie Ser Asn lie Asn Val lie Val
325
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
330 335
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
340
Glu Thr Ala Thr lie Val Glu Phe
345 350
Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala
355 360
Gln Ser lie lie Ser Thr Leu Thr
365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu
380
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
385 390
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
395 400
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
405
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly
410 415
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
420
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
425 430
Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser
435 440
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
445
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp
450 455
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
460
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
465 470
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
475 480
Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr
485
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
490 495
- 203 033369
Val Ser Ser Ala 500 Ser Thr Lys Gly Pro 505 Ser Val Phe Pro Leu 510 Al a Pro
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Al a Ala Leu Gly Cys Leu Val
515 520 525
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
530 535 540
Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Al a Val Leu Gln Ser Ser Gly
545 550 5 5 5 560
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
5 65 570 575
Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys
580 585 590
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600
<210> 206 <211> 1809 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> F16 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 206
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct etggatt cacctttagc cggtatggta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac aeggeegtat attactgtgc gaaagcgcat 300
aatgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtcgagtgc tagcaccaag 360
ggcccat egg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
- 204 033369
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 54 0
ct cagcagcg tggtgaccgt gccct ccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gataagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
72 0
tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca gatgattttg 780
aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacagc caagtttgcc 84 0
atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga act caaacct 900
ctggaggaag tgctaaatgg cgctcaaagc aaaaactttc acttaagacc cagggactta 960
atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac attcatgtgt 1020
gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat tacctttgcc 1080
caaagcatca tctcaacact gactt ccggc ggaggaggga gcggcggagg tggct ctggc 114 0
ggtggcggag aggtgcaatt gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 1200
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagcc ggtatggtat gagctgggtc 1260
cgccaggct c cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtagc 1320
acatactacg cagact ccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 1380
acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 144 0
aaagcgcata atgcttttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt gtcgagtgct 1500
agcaccaagg gcccat cggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 1560
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 1620
aact caggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 1680
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccct ccagca gcttgggcac ccagacctac 174 0
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 1800
tcttgtgac1809 <210>207 <211>214 <212> БЕЛОК
- 205 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> F16, легкая цепь <400> 207
Ser 1 Ser Glu Leu Thr 5 Gln Asp Pro Ala Val 10 Ser Val Al a Leu Gly 15 Gln
Thr Val Arg lie Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Al a Pro Val Leu Val lie Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 5 5 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Al a Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Al a Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Al a Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser Hi s Arg Ser
- 206 033369
180 185190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 <210>208 <211>642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> F16, легкая цепь <400> 208
tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agt caggat c 60
acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagct cagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaggctg actattactg taactcctct gtttatacta tgccgcccgt ggtattcggc 300
ggagggacca agctgaccgt cctaggt caa cccaaggctg cccccagcgt gaccctgtt c 360
ccccccagca gcgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtctgcct gatcagcgac 420
ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480
gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540
agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 600
ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gc 642
<211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 209
- 207 033369
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
1 30 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
- 208 033369
Thr Lys 210 Val Asp Lys Lys Val 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Ser G1 у Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Al a Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
gyp g n 38 0
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Al a Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
- 209 033369
Ala Met Ser Trp 420 Val Arg Gln Ala Pro 425 Gly Lys Gly Leu Glu 430 Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 210 <211> 1815 <212> ДНК
- 210 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 210
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
tttggtggtt ttaactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaat c acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaat cttgt 660
gact ccggcg gaggagggag cggcggaggt ggct ccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaat ccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcct ccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caatt ccaag 1380
- 211 033369
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattactgt 1440
gcgaaagggt ggtttggtgg ttttaactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa t cacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<210> 211 <211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 211
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
- 212 033369
100
105
110
Val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys Gly Pro Ser Val 125 Phe Pro Leu
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Al a Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
- 213
305 310 315 320
Leu lie Ser Asn lie 325 Asn Val lie Val Leu 330 Glu Leu Lys Gly Ser 335 Glu
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
34 0 34 5 35 0
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Al a Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
- 214 033369
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 212 <211> 1815 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 212
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
- 215 033369
aacgtgaat с acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaat cttgt 660
gact ccggcg gaggagggag cggcggaggt ggct ccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaat ccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagtt ctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcct ccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caatt ccaag 1380
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattactgt 1440
gcgaaagggt ggctgggtaa ttttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa t cacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<210> 213 <211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 213
- 216 033369
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
- 217 033369
Thr Lys 210 Val Asp Lys Lys Val 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Ser Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
34 0 34 5 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
- 218 033369
Ala Met Ser Trp 420 Val Arg Gln Thr Pro 425 Gly Lys Gly Leu Glu 430 Trp Val
Ser Ala lie Gly Val Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Al a Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 214 <211> 1815 <212> ДНК
- 219 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 214
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcta tgagctgggt ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attggtgtta gtactggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggttgg 300
ctgggtcctt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaat c acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaat cttgt 660
gact ccggcg gaggagggag cggcggaggt ggct ccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaat ccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcct ccgga ttcaccttta gcagttatgc tatgagctgg 1260
gtccgccaga ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattggtgt tagtactggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caatt ccaag 1380
- 220 033369 acacggccgt
1440 agagccgagg gcgaaaggtt ggctgggt cc tggggccaag gaaccctggt
1500 agtgctagca
1560 cggccctggg ctgcctggtc ggtgacggtg
1620 gtgac cagcgtggtg aggtggataa gaaagttgag
1740
1800
1815
210> 215
211> 605
212> БЕЛОК
213
220
223> 2F11
Fab-IL2 qm-Fab конструкция
400> 215
Val
Gly
Gly
Gly
Gly
Gly
Arg
Ala
Gly
Phe
Ala
Met
Trp
Arg
Gly
Lys
Gly
Trp
Ala
Ala
Gly
Lys
Met
Trp
Arg
Thr
Trp
Met
Gly
5
Gly
Tyr
Asp
Thr
Arg
Asp
Met
Asp
Trp
Ala
Gly
Gly
- 221 033369
100
105
НО
Val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys Gly Pro Ser Val 125 Phe Pro Leu
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr He Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met He Leu Asn Gly He Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Al a Met Pro Lys Lys Al a Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
- 222
305
310
315
320
Leu lie Ser Asn lie 325 Asn Val lie Val Leu 330 Glu Leu Lys Gly Ser 335 Glu
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Al a Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
- 223 033369
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210>216 <211>1815 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400>216
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtat attactgtgc gaaatggaga 300
tggatgatgt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
- 224 033369
aacgtgaat с acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaat cttgt 660
gact ccggcg gaggagggag cggcggaggt ggct ccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaat ccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagtt ctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca tcatctcaac actgacttcc ggcggaggag gatccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tct cctgtgc agcct ccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caatt ccaag 1380
14 4 0
gcgaaatgga gatggatgat gtttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact t ccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct act ccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa t cacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaatctt gtgac 1815
<210> 217 <211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B3 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 217
- 225 033369
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
- 226
Thr Lys 210 Val Asp Lys Lys Val 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Ser Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
34 0 34 5 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
- 227
Ala Met Ser Trp 420 Val Arg Gln Ala Pro 425 Gly Lys Gly Leu Glu 430 Trp Val
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Al a Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 218 <211> 1815 <212> ДНК
- 228 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4ВЗ Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 218
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaa ccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaat c acaagcccag caacaccaag gtggataaga aagttgagcc caaat cttgt 660
gact ccggcg gaggagggag cggcggaggt ggct ccggag gtggcggagc acctgcctca 720
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 780
ttgaatggaa ttaataatta caagaat ccc aaactcacca ggatgctcac agccaagttt 840
gccatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 900
cctctggagg aagtgctaaa tggcgctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 960
ttaatcagca atatcaacgt aatagtt ctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 1020
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 1080
gcccaaagca t cat ct caac actgacttcc ggcggaggag gat ccggcgg aggtggctct 1140
ggcggtggcg gagaggtgca attgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 1200
tccctgagac tctcctgtgc agcct ccgga ttcaccttta gcagttatgc catgagctgg 1260
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcag ctattagtgg tagtggtggt 1320
agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctccagaga caatt ccaag 1380
- 229 033369
aacacgctgt atetgeagat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattaetgt 1440
gcgaaagggt ggctgggtaa ttttgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 1500
agtgctagca ccaagggccc ateggtette cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 1620
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa t cacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 1800
cccaaat ctt gtgac 1815
<211> 603 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28H1 Fab-IL2 qm-Fab (ели <400> 219
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
5 ая конструкция тяжелая цепь-цитокин)
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu
55
Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
70
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
- 230 033369
100
105
НО
Thr Val Ser 115 Ser Al a Ser Thr Lys 120 Gly Pro Ser Val Phe 125 Pro Leu Ala
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr He Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp Leu
245 250 255
Gln Met He Leu Asn Gly He Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
260 265 270
ZXi-nt Met Al a Lys Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr
XJ- 'rJ
275 280 285
Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
290 295 300
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp Leu
- 231 033369
305
310
315
320
Не Ser Asn He Asn 325 Val He Val Leu Glu 330 Leu Lys Gly Ser Glu 335 Thr
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr He Val Glu Phe
340 345 350
Leu Asn Arg Trp He Thr Phe Ala Gln Ser He He Ser Thr Leu Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu
370 375 380
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
385 390 395 400
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Hi s Ala
405 410 415
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
420 425 430
Ala He Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
435 440 445
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
450 455 460
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Al a Lys
465 470 475 480
·—1 -1- _y J. J_ — ·—1 -1- _y χ χ — J J.«_> J. _y J_ J. J_ ·—1 -1- _y —--XX ·—1 -1- _y X. X X J_ — —г V <_Л -1- X. X X x_
485 490 495
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
500 505 510
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
- 232 033369
515 520 525
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
530 535 540
Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Al a Val Leu Gln Ser Ser Gly
5 4 5 5 5 0 5 5 5 5 60
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
5 65 570 575
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys
580 585 590
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600
<210> 220 <211> 1809 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28H1 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 220
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc etggeggate tetgagaetg 60
tcctgcgccg cct ccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgt ccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gact ctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggaccct ccg tgttccccct ggccccctcc agcaagt eta cctctggcgg caccgccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480
gccctgacca gcggcgtcca cacctttcca gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540
ctgt cct ccg tcgtgaccgt gccct ccagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 600
- 233 033369
gtgaaccaca agccct ccaa caccaaggtg gacaagaagg tggaacccaa gtcctgcgac 660
agtggtgggg gaggatctgg tggcggaggt tctggcggag gtggcgct cc tgcctcctcc 720
agcaccaaga aaacccagct ccagctggaa catctcctgc tggatctgca gatgatcctg 780
aacggcatca acaactacaa gaaccccaag ctgacccgga tgctgaccgc caagttcgcc 840
900
a.gcccaaga aggccaccga gc.gaaaca. c_ gca gt g cc _ ggaa gagga ac.gaagcc.
ctggaagagg tgctgaacgg cgcccagtcc aagaacttcc acctgaggcc tcgggacctg 960
atctccaaca tcaacgtgat cgtgctggaa ctgaagggct ccgagacaac ctt catgtgc 1020
gagtacgccg acgagacagc taccatcgtg gaatttctga accggtggat caccttcgcc 1080
cagtccatca tctccaccct gacct ccggt ggtggcggat ccgggggagg gggtt ctggc 1140
ggaggcggag aagtgcagct gctggaatcc ggcggaggcc tggtgcagcc tggcggatct 1200
ctgagactgt cctgcgccgc ctccggcttc accttctcct cccacgccat gtcctgggtc 1260
cgacaggct c caggcaaggg cctggaatgg gtgt ccgcca tctgggcctc cggcgagcag 1320
tactacgccg act ctgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaactc caagaacacc 1380
ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgccaag 1440
ggctggctgg gcaacttcga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt gtcctccgcc 1500
tctaccaagg gcccct ccgt gttccctctg gccccctcca gcaagtctac ctctggcggc 1560
accgccgct c tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 1620
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gtcctccggc 1680
ctgtactccc tgt cct ccgt cgtgaccgtg ccct ccagct ctctgggcac ccagacctac 1740
atctgcaacg tgaaccacaa gccct ccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 1800
tcctgcgac1809 <210>221 <211>605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 29B11 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 221
- 234 033369
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie lie Gly Ser Gly Gly lie Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Al a Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Al a Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
Ί ц Ί ^7 /А 1 T Д
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
- 235
Thr Lys 210 Val Asp Lys Lys Val 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Ser Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
J. 1 1 J_ Arg 1’1 C l_ JjCU J. 1 1 J_ J-l-L d Lys rue J-l-L d 1'1 C l_ Г J_ L2 Lys Lys J-l-L d J. 1 1 J_ кЛ-L L4
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
- 236 033369
Ala Met Ser Trp 420 Val Arg Gln Ala Pro 425 Gly Lys Gly Leu Glu 430 Trp Val
Ser Ala lie lie Gly Ser Gly Gly lie Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 222 <211> 1815 <212> ДНК
- 237 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 29В11 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 222
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cct ccggctt caccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgt ccgcc atcatcggct ccggcggcat cacctactac 180
gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga act ccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc caagggctgg 300
ttcggaggct tcaactactg gggacagggc accctggt ca ccgtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccct ccgtgttccc cctggccccc tccagcaagt ctacctctgg cggcaccgcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgccctga ccagcggcgt ccacaccttt ccagccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540
tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccctcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagccct c caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc 660
gacagtggtg ggggaggatc tggtggcgga ggttctggcg gaggtggcgc tcctgcctcc 720
tccagcacca agaaaaccca gctccagctg gaacat ct cc tgctggatct gcagatgat c 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagtt c 840
gccatgccca agaaggccac cgagctgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag tccaagaact t ccacctgag gcctcgggac 960
ctgatctcca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gctccgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agctaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagt cca tcatctccac cctgacctcc ggtggtggcg gatccggggg agggggttct 1140
ggcggaggcg gagaagtgca gctgctggaa tccggcggag gcctggtgca gcctggcgga 1200
tctctgagac tgtcctgcgc cgcct ccggc ttcaccttct cctcctatgc catgtcctgg 1260
gtccgacagg ctccaggcaa gggcctggaa tgggtgtccg ccatcatcgg ctccggcggc 1320
atcacctact acgccgactc tgtgaagggc cggttcacca tctcccggga caactccaag 1380
- 238 033369
aacaccctgt acctgcagat gaact ccctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgt 1440
gccaagggct ggttcggagg cttcaactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 1500
tccgcctcta ccaagggccc ctccgtgttc cctctggccc cctccagcaa gtctacctct 1560
ggcggcaccg ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact t ccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaact ctggcgccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagtcc 1680
tccggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgccct ccagctctct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagt cct gcgac 1815
<210> 223 <211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 19G1 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 223
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Phe Ser
J—1 _y _y Arg □. X X J- U- -U >—' — J- Arg J—I·-? 1 1 J—1 _y J—I·-? 1 1 J- X X J- J—1 4— k-l -L _y J-
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
- 239 033369
100
105
НО
Val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys Gly Pro Ser Val 125 Phe Pro Leu
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr He Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met He Leu Asn Gly He Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Met Phe Met Pro
X. X X J_ X IX. 4-j x-x X. X X J_ X X-X. XX J—1 _y b-' X X->- XX J—1 _y b-' J—1 _y b-' X X->- XX X. X X x_ —' X-X
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
- 240
305
310
315
320
Leu lie Ser Asn lie 325 Asn Val lie Val Leu 330 Glu Leu Lys Gly Ser 335 Glu
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala lie lie Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
- 241 033369
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
5 4 5 5 5 0 5 5 5 5 60
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210>224 <211>1815 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 19G1 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400>224
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgt ccgcc atcatcagct ctggcggcct gacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggt ca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
- 242 033369
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gact ccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggct ccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgat c 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagtt c 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact t ccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcatcag ctctggcggc 1320
ctgacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca t cagccggga caacagcaag 1380
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaagactact t ccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac 1815
<210> 225 <211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 20G8 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 225
- 243 033369
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie lie Gly Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe i n IT lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn i n IT Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 14 0
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
- 244 033369
Thr Lys 210 Val Asp Lys Lys Val 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Ser Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Al a Met Pro Lys Lys Al a Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
34 0 34 5 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
- 245 033369
Ala Met Ser Trp 420 Val Arg Gln Ala Pro 425 Gly Lys Gly Leu Glu 430 Trp Val
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 226 <211> 1815 <212> ДНК
- 246 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 20G8 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 226
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgt ccgcc atcatcggct ctggcagccg gacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggt ca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gact ccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggct ccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgat c 780
ctgaacggca t caacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagttc 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact t ccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcatcgg ctctggcagc 1320
cggacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca t cagccggga caacagcaag 1380
- 247 033369
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaagactact t ccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac 1815
<210> 227 <211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовав <220>
<223> 4B9 Fab-IL2 qm-Fab (слит, <400> 227
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
5 ъность я конструкция тяжелая цепь-цитокин)
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala lie Ile Gly Ser Gly Ala
55
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
70
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
- 248 033369
100
105
110
Val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys Gly Pro Ser Val 125 Phe Pro Leu
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Al a Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Al a Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
- 249
305
310
315
320
Leu lie Ser Asn lie 325 Asn Val lie Val Leu 330 Glu Leu Lys Gly Ser 335 Glu
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
340 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
405 410 415
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
420 425 430
Ser Ala lie lie Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Phe
X X-X. — J—1 _/ —> 1 -1- _y J. J_ - χ χ — 1 -1- _y 1 -1- _y X X— X X J. _y J_ J. J_ 1 -1- _y —•--XX ·—1 -u _y X. X X x_ — —г
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
- 250 033369
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 228 <211> 1815 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B9 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 228
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgt ccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggt ca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
- 251 033369
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gact ccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggct ccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgat c 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagtt c 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact t ccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcatcgg ctctggcgcc 1320
agcacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca t cagccggga caacagcaag 1380
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaagactact t ccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac 1815
<210> 229 <211> 605 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14B3 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 229
- 252 033369
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Leu Al a Ser Gly Ala lie Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Gly
195
Cys
200
Asn
Asn
Lys
205
- 253
Thr Lys 210 Val Asp Lys Lys Val 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Ser Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Al a Ser
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
260 265 270
Thr Arg Met T ,A1 1 Thr Al a T AZ St Phe Al a Met Pro T AZ St T AZ St Al a Thr Glu
275 280 285
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
290 295 300
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
305 310 315 320
Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
325 330 335
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu
34 0 345 350
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
385 390 395 400
Arg
Ala
405
Gly
410
415
- 254 033369
Ala Met Ser Trp 420 Val Arg Gln Ala Pro 425 Gly Lys Gly Leu Glu 430 Trp Val
Ser Ala lie Leu Al a Ser Gly Ala lie Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
435 440 445
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
450 455 460
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
500 505 510
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
515 520 525
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
530 535 540
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
545 550 5 5 5 560
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
5 65 570 575
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
580 585 590
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
595 600 605
<210> 230 <211> 1815 <212> ДНК
- 255 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 14ВЗ Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 230
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgt ccgcc atcctggcct ctggcgccat cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggt ca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggaccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa agactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc tctagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gact ccggcg gaggcggatc tggcggtgga ggct ccggag gcggaggcgc tcctgccagc 720
agctccacca agaaaaccca gctccagctg gaacatctgc tgctggatct gcagatgat c 780
ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cgccaagtt c 840
gccatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga ggaactgaag 900
cctctggaag aggtgctgaa cggcgcccag agcaagaact t ccacctgag gcccagggac 960
ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaagg gcagcgagac aaccttcatg 1020
tgcgagtacg ccgacgagac agccaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc 1080
gcccagagca tcatcagcac cctgacaagc ggaggcggcg gatccggcgg aggcggatct 1140
ggcggaggag gcgaggtcca gctgctcgaa agcggcggag gactggtgca gcctggcggc 1200
agcctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgagctgg 1260
gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tgggtgtccg ccatcctggc ctctggcgcc 1320
atcacctact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca t cagccggga caacagcaag 1380
- 256 033369
aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg acaccgccgt gtactactgc 1440
gccaagggat ggttcggcgg cttcaactac tggggacagg gcaccctggt cacagtgtcc 1500
agcgccagca ccaagggccc cagcgtgtt c cccctggccc ccagcagcaa gagcacatct 1560
ggcggaa cag ccgccctggg ctgcctggt c aaagactact t ccccgagcc cgtgaccgtg 1620
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1680
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggt c accgtgccta gctctagcct gggcacccag 1740
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1800
cccaagagct gcgac1815 <210>231 <211>215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2, легкая цепь <400> 231
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly lie Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala
- 257 033369
100 105 НО
Ala Pro Ser 115 Val Phe He Phe Pro 120 Pro Ser Asp Glu Gln 125 Leu Lys Ser
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 232 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3F2, легкая цепь <400>232 gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc60 ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgacc tcctcctacc tcgcctggta tcagcagaag120 cccggccagg cccctcggct gctgatcaac gtgggcagtc ggagagccac cggcatccct180 gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggcatca tgctgccccc cacctttggc300 cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca360
- 258 033369
ccct ccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcct ccgt eg tgtgeetget gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaat ccg tcaccgagca ggact ccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg 540
accctgt cca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgt cca gccccgtgac caagtccttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 233 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8, легкая цепь <400> 233
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
- 259 033369
Gly Thr 130 Ala Ser Val Val Cys 135 Leu Leu Asn Asn Phe 140 Tyr Pro Arg Glu
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val
180 185 190
Al a Sci Sgi
-L _y J_ Чх. _y О ux u V QX J. X X J_ 1 1 J_ О ·_ -1_ X X VX у Xj LA J- J_ V QX J. X X J_ XJ _y О
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210215 <210>234 <211>645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8, легкая цепь <400>234 gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc60 ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc cggtcctacc tcgcctggta tcagcagaag120 cccggccagg cccctcggct gctgatcatc ggcgcctcta ccagagccac cggcatccct180 gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggccagg tcatccctcc cacctttggc300 cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca360 ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtcg tgtgcctgct gaacaacttc420 tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc480 caggaatccg tcaccgagca ggactccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg540
- 260 033369 accctgtcca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag600 ggcctgtcca gccccgtgac caagtccttc aaccggggcg agtgc645 <210>235 <211>215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9, легкая цепь <400> 235
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Leu Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
- 261 033369
145 150 155160
Gln Glu Ser Val Thr 165 Glu Gln Asp Ser Lys 170 Asp Ser Thr Tyr Ser 175 Leu
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val
180 185 190
Туг Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 <210>236 <211>645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 3D9, легкая цепь <400> 236
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cage ttattccccc taegttegge 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgeetget gaataaett c 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 237
- 262 033369 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11, легкая цепь <400> 237
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
- 263
Ser Ser Thr Leu 180 Thr Leu Ser Lys Ala 185 Asp Tyr Glu Lys Hi s 190 Lys Val
Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 238 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2F11, легкая цепь
<400> 238
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctccitctst 18 0
cc.ggccagg c_ c cca gg c_ ggagca_ cca gcagggccac -gg ca_ ccca
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagt atact ccccc cacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataactt c 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 239 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B3, легкая цепь
- 264 033369 <400> 239
Glu 1 lie Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Туг Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Gly Ala Tyr lie Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser
50 5 5 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val lie Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
- 265
195 200205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210215 <210>240 <211>645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B3, легкая цепь <400>240
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcaattact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggcgcctaca t cagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggt cagg ttattccccc tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataactt c 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210>241 <211>613 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10 Fab- -IL2 qm-Fab ( слитая конструкция тяжелая цепь -цитокин )
<400> 241
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
- 266 033369
Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Gly Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Al a Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Al a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
- 267 033369
Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
235 240
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys
245
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
250 255
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met lie
260
Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys
265 270
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
275280
Lys A.la Thr Glu Leu Lys His Leu
290295
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly
305310
Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
285
Gln Cys Lsu Glu Glu Glu Leu Lys
300
Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
315 320
Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn
325 lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu
330 335
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met
340
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
345 350
Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg
355 360
Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie
365 lie Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly
370 375
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
380
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu
385 390
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
395 400
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val
405
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
410 415
Phe Ser Ser Tyr Ala lie Ser Trp
420
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
425 430
- 268 033369
Leu Glu Trp 435 Met Gly Gly lie lie 440 Pro lie Phe Gly Thr 445 Ala Asn Tyr
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr
450 455 4 60
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Al a Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Al a Phe
485 490 495
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
500 505 510
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Al a Pro Ser Ser Lys Ser Th r Ser
515 520 525
Gly Gly Thr Ala Al a Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
530 535 540
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Al a Leu Thr Ser Gly Val His
545 550 5 5 5 560
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
5 65 570 575
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys
580 585 590
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
595 600 605
Pro Lys Ser Cys Asp
610 <210> 242 <211> 1839 <212> ДНК
- 269 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2В10 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 242
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte 60
tcctgcaagg cct ccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa t cacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgactccgg cggaggaggg agcggcggag gtggctccgg aggtggegga 720
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt aetgetggat 780
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgct c 840
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ett ca gtgtctagaa 900
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 960
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat etgaa 1020
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1080
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgactt ccggcggagg aggat ccggc 1140
ggaggtggct ctggcggtgg cggacaggtg caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag 1200
aagcctgggt cct cggtgaa ggtctcctgc aaggcctccg gaggcacatt cagcagctac 1260
gctataagct gggtgcgaca ggcccctgga caagggct eg agtggatggg agggat cat c 1320
cctatctttg gtacagcaaa ctacgcacag aagttccagg gcagggtcac cattactgca 1380
- 270 033369
gacaaat сса cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc 1440
gtgtattact gtgcgagact gtacggttac gcttactacg gtgcttttga ctactggggc 1500
caagggacca ccgtgaccgt ctcctcagct agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1560
gcaccct cct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1620
tacttccccg aaccggtgac ggtgt cgtgg aact caggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1680
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc t cagcagcgt ggtgaccgtg 1740
ccct ccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1800
accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa tcttgtgac 1839
<210> 243 <211> 613 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> C3B6 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 243
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala lie lie Pro lie Leu Gly lie Al a Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
- 271 033369
100 105 НО
Gln Gly Thr 115 Thr Val Thr Val Ser 120 Ser Al a Ser Thr Lys 125 Gly Pro Ser
Val Phe Pro Leu Al a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr He Cys Asn Val Asn Hi s
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met He Leu Asn Gly He Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Ala Met Pro Lys
275 280 285
Lys Ala Thr Glu Leu Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
290 295 300
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu
- 272 033369
305 310 315 320
Arg Pro Arg Asp Leu 325 Ile Ser Asn Ile Asn 330 Val Ile Val Leu Glu 335 Leu
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
340 345 350
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Al a Gln Ser Ile
355 360 365
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Al a Glu Val Lys
385 390 395 400
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
405 410 415
Phe Ser Ser Tyr Al a Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
420 425 430
Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr
435 440 445
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
450 455 460
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Al a Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe
485 490 495
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
500 505 510
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
- 273 033369
515 520 525
Gly Gly Thr Al a Al a Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
530 535 540
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Al a Leu Thr Ser Gly Val Hi s
545 550 5 5 5 560
Thr Phe Pro Al a Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
5 65 570 575
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
580 585 590
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
595 600 605
Pro Lys Ser Cys Asp
610 <210> 244 <211> 1839 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> C3B6 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 244
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cct ccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggagct atcatcccga tccttggtat cgcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
- 274 033369
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa t cacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgact ccgg cggaggaggg agcggcggag gtggctccgg aggtggegga 720
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt aetgetggat 780
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 840
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ett ca gtgtctagaa 900
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 960
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat etgaa 1020
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1080
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgactt ccggcggagg aggat ccggc 1140
ggaggtggct ctggcggtgg cggacaggtg caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag 1200
aagcctgggt cct cggtgaa ggtctcctgc aaggcct ccg gaggcacatt cagcagctac 1260
gctataagct gggtgcgaca ggcccctgga caagggct eg agtggatggg agctatcatc 1320
ccgatccttg gtatcgcaaa ctacgcacag aagttccagg gcagggtcac cattactgca 1380
gacaaat cca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc 1440
gtgtattact gtgcgagact gtacggttac gcttactacg gtgcttttga ctactggggc 1500
caagggacca ccgtgaccgt ctcctcagct agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1560
gcaccct cct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1620
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1680
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc t cagcagcgt ggtgaccgtg 1740
ccct ccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1800
accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa tcttgtgac 1839
<210> 245 <211> 613 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 275 033369 <220>
<223> 6А12 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 245
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val lie lie Pro lie Leu Gly Thr Al a Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 5 5 60
Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Al a Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Al a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
- 276 033369
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195 200
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210 215
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
220
Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
235 240
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys
245
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
250 255
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile
260
Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
265 270
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
275 280
Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
285
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
290 295
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
300
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly
305 310
Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
315 320
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn
325
Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
330 335
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met
340
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
345 350
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg
355 360
Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
365
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly
370 375
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
380
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu
385 390
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
395 400
- 277
Lys Pro Gly Ser Ser 405 Val Lys Val Ser Cys 410 Lys Ala Ser Gly Gly 415 Thr
Phe Ser Ser Tyr Al a Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
420 425 430
Leu u Trp Met Gly V al Ile Ile f L О Ile Leu Gly 1 III. .M.± cl FiiS fl Tyr
435 440 445
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
450 455 460
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Al a Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Al a Phe
485 490 495
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
500 505 510
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
515 520 525
Gly Gly Thr Ala Al a Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
530 535 540
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Al a Leu Thr Ser Gly Val Hi s
545 550 5 5 5 560
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
5 65 570 575
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
580 585 590
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
595 600 605
- 278 033369
Pro Lys Ser Cys Asp
610 <210> 246 <211> 1839 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 6A12 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 246
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cct ccggagg cacattcagc agctatgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggagtg atcatcccta tccttggtac cgcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300
ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggt c aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa t cacaagccc agcaacacca aggtggataa gaaagttgag 660
cccaaat ctt gtgact ccgg cggaggaggg agcggcggag gtggctccgg aggtggcgga 720
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 780
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgct c 840
Q О О
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga gtgtctagaa
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 960
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 1020
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1080
tggatta cct ttgcccaaag catcatctca acactgactt ccggcggagg aggat ccggc 1140
- 279 033369
ggaggtggct ctggcggtgg cggacaggtg caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag 1200
aagcctgggt cct cggtgaa ggtctcctgc aaggcctccg gaggcacatt cagcagctat 1260
gctataagct gggtgcgaca ggcccctgga caagggct eg agtggatggg agtgatcatc 1320
cctatccttg gtaccgcaaa ctacgcacag aagttccagg gcagggtcac cattactgca 1380
gacaaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc 1440
gtgtattact gtgcgagact gtacggttac gcttactacg gtgcttttga ctactggggc 1500
caagggacca ccgtgaccgt ctcctcagct agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1560
gcaccct cct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1620
tacttccccg aaccggtgac ggtgt cgtgg aact caggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1680
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc t cagcagcgt ggtgaccgtg 1740
ccct ccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1800
accaaggtgg ataagaaagt tgagcccaaa tcttgtgac 1839
<210> 247 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2B10, легкая цепь <400> 247
Asp 1 lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Al a Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
- 280 033369
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 248 <211> 642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 2В10, легкая цепь <400>248 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc60 atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca120
- 281 033369
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcat ccagtt tgcagagtgg cgt cccat ca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag ctt gcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtt tggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat ctt cccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taa ct cccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagct cgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 249 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> D1A2, легкая цепь <400> 249
Asp 1 lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie
35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
- 282 033369
Thr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 Al a Ala
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 250 <211> 642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> D1A2, легкая цепь
<400> 250
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca ggggatt cgt aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcttacagct tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
- 283 033369
ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat ctt cccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagact acga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagct cgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 251 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O7D8, легкая цепь <400> 251
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Val
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Al a Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
- 284 033369
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
14 5 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 252 <211> 642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> O7D8, легкая цепь
<400> 252
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagt ca gagcatt cgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gtgt ccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat ctt cccgcca 360
t ctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
- 285 033369
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagct cgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 253 <211> 615 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG1 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 253
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala
50 5 5 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Hi s Tyr Phe Asp Hi s Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
286 033369
Ala 145 Ala Leu Gly Cys Leu 150 Val Lys Asp Tyr Phe 155 Pro Glu Pro Val Thr 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
Hi s Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s
305 310 315 32 0
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
- 287 033369
Ala Thr Ile 355 Val Glu Phe Leu Asn 360 Arg Trp Ile Thr Phe 365 Ala Gln Ser
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
385 390 395 400
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
420 425 430
Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly
435 440 445
Arg Tyr Tyr Ala Al a Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
450 455 4 60
Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Hi s
4 85 4 90 4 95
Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
500 505 510
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Ly s Ser
515 520 525
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
530 535 540
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
545 550 5 5 5 560
- 288 033369
Val Hi s Thr Phe Pro 5 65 Ala Val Leu Gln Ser 570 Ser Gly Leu Tyr Ser 575 Leu
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
580 585 590
Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
595 600 605
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
610 615
<211> 1845 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG1 Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 254
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cct gcggct c 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacatttagc aactattgga t gaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa ctt cggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgt caccgt c 360
tccagtgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact a ctt ccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga act caggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgt cctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag ctt gggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga taagaaagtt 660
gagcccaaat cttgtgactc cggcggagga gggagcggcg gaggtggctc cggaggtggc 720
ggagcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 780
- 289 033369
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 840
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct teagtgteta 900
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 960
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1020
gaaacaacat tcatgtgtga atatgetgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1080
agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga cttccggcgg aggaggatcc 1140
ggcggaggtg get etggegg tggcggagaa gtgcagctgg tggagtctgg aggaggettg 1200
gtcaagcctg gcgggt ccct gcggctctcc tgtgcagcct ccggattcac atttagcaac 1260
tattggatga actgggtgcg gcaggct cct ggaaagggcc t cgagtgggt ggeegagat c 1320
agattgaaat ccaataactt eggaagatat taegetgeaa gegtgaaggg ccggttcacc 1380
atcagcagag atgatt ccaa gaacacgctg tacctgcaga tgaacagcct gaagaccgag 1440
gatacggccg tgtattactg taccacatac ggcaactacg ttgggcacta cttcgaccac 1500
tggggccaag ggaccaccgt caccgtctcc agtgetagea ccaagggccc ateggtette 1560
cccctggcac cct cct ccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggt c 1620
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 1680
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 1740
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 1800
agcaacacca aggtggataa gaaagttgag cccaaatctt gtgac 1845
<210> 255 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV9, легкая цепь <400> 255
Asp 1 lie Gln Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ser Phe 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
- 290 033369
25 30
Val Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Gln Ala Pro Arg 45 Pro Leu Ile
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Al a Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Al a Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
14. J_ cl Cys Val 1П Σ’ Hi s Gln Gly Leu Ser Ser tro Val 1ПГ Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 256
- 291 033369 <211> 642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV9, легкая цепь <400>256 gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc60 atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca120 gggcaggcac ctaggcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca180 aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct240 gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga300 ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt642 <210>257 <211>615 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 257
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
40
Gly
Lys Gly
Glu Trp Val
- 292 033369
Ala Glu 50 lie Arg Leu Lys Ser 5 5 Asn Asn Phe Gly Arg 60 Tyr Tyr Al a Ala
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Hi s Tyr Phe Asp Hi s Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
- 293 033369
Hi s Leu Leu Leu 260 Asp Leu Gln Met Ile 265 Leu Asn Gly Ile Asn 270 Asn Tyr
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s
305 310 315 320
7\ 7\ As7· Sci As n Asn
J—1 VA л... у J- J_ л... у J—1 VA J--L C J- -L V QX J--L C V Q± J—1 VA XJ-L LA
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
355 360 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
385 390 395 400
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
405 410 415
Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
420 425 430
Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly
435 440 445
Arg Tyr Tyr Ala Al a Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
450 455 460
- 294 033369
Asp 465 Ser Lys Asn Thr Leu 470 Tyr Leu Gln Met Asn 475 Ser Leu Lys Thr Glu 480
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Hi s
485 490 495
Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
500 505 510
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
515 520 525
Thr Ser Gly Gly Thr Al a Al a T,l=11 Gly Сия T,l=11 Val T , Asp Tyr Phe
530 535 540
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
545 550 5 5 5 560
Val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
5 65 570 575
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
580 585 590
lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
595 600 605
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
610615 <210>258 <211>1845 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> MHLG Fab-IL2 qm-Fab (слитая конструкция тяжелая цепь-цитокин) <400> 258 gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
- 295 033369
tcctgtgcag cct ccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccgag atcagattga aatccaataa ctt eggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggataegg ccgtgtatta ctgtaccaca 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagtgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga act caggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgt cctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga taagaaagtt 660
gagcccaaat cttgtgactc eggeggagga gggagcggcg gaggtggctc eggaggtgge 720
ggagcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 780
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 840
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct teagtgteta 900
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 960
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1020
gaaacaacat tcatgtgtga atatgetgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1080
agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga cttccggcgg aggaggatcc 1140
ggcggaggtg get etggegg tggcggagaa gtgcagctgg tggagtctgg aggaggettg 1200
gtccagcctg gcgggt ccct gcggctctcc tgtgcagcct ccggattcac atttagcaac 1260
tattggatga actgggtgcg gcaggct cct ggaaagggcc t cgagtgggt ggeegagat c 1320
agattgaaat ccaataactt eggaagatat taegetgeaa gegtgaaggg ccggttcacc 1380
atcagcagag atgatt ccaa gaacacgctg tacctgcaga tgaacagcct gaagaccgag 1440
gatacggccg tgtattactg taccacatac ggcaactacg ttgggcacta cttcgaccac 1500
tggggccaag ggaccaccgt caccgtctcc agtgetagea ccaagggccc ateggtette 1560
cccctggcac cct cct ccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggt c 1620
- 296 033369
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 1680
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 1740
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 1800
agcaacacca aggtggataa gaaagttgag cccaaatctt gtgac 1845
<210> 259 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV1, легкая цепь <400> 259
Asp 1 Ile Gln Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ser Phe 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
- 297
130 135140
Lys 145 Val Gln Trp Lys Val 150 Asp Asn Ala Leu Gln 155 Ser Gly Asn Ser Gln 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210>260 <211>642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV1, легкая цепь
<400> 260
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca gggccagt ca gaatgtggat actaacttag cttggtacca gcagaagcca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gtt cggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat ctt cccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
- 298 033369 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt642 <210>261 <211>214 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV7, легкая цепь <400> 261
Asp 1 Ile Gln Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ser Phe 10 Leu Ser Al a Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
- 299
Glu Ser Val Thr Glu 165 Gln Asp Ser Lys Asp 170 Ser Thr Tyr Ser Leu 175 Se:
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Ту:
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Se:
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 262 <211> 642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> KV7, легкая цепь <400>262
gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60
atcacctgca aggccagt ca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120
gggaaagcac ctaagcct ct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gtt cggcgga 300
ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat ctt cccgcca 360
t ctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gt ctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagct cgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210>263 <211>19 <212> БЕЛОК
- 300 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>263
Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1015
Ala His Ser <210>264 <211>57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>264 atggactgga cctggagaat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc57 <210>265 <211>57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>265 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc57 <210>266 <211>22 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400> 266
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
10 15
- 301 033369
Phe Pro Gly Ala Arg Cys <210> 267 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>267 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc60 aggtgt66 <210>268 <211>19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>268
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1015
Val His Ser <210>269 <211>57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>269 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcc57 <210>270 <211>57 <212> ДНК
- 302 033369 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>270 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcc57 <210>271 <211>57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>271 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtcgccacag ccaccggcgt gcactct57 <210>272 <211>20 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>272
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys lie Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1015
Val Thr Asn Ser <210>273 <211>60 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> лидерная последовательность <400>273 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt60 <210>274
- 303 033369 <211> 466 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-6eTa-Fc(«впадина») <400> 274
Met Asp Met Arg Val Fro Ala Gln
5
Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Ala Val
Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys
30
Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn lie
40
Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly
Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln
55
Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg
Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu
70
Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp
80
Ala Cys Asn Leu lie Leu Gly Ala
Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr
95
Val Asp lie Val Thr Leu Arg Val
Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp
Arg Val Met Ala lie Gln Asp Phe
115 120
Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu
125
Met Ala Pro lie Ser Leu Gln Val
130 135
Val His Val Glu Thr His Arg Cys
140
Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln
145 150
Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His
155 160
Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu
165
Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu
170 175
- 304 033369
Ala Pro Leu Leu 180 Thr Leu Lys Gln Lys 185 Gln Glu Trp lie Cys 190 Leu Glu
Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro
195 200 205
Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala
210 215 220
Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Gly Ala Gln Asp
225 230 235 24 0
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Al a Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 32 0
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Al a Leu Pro Ala Pro lie Glu
340 345 350
Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
- 305 033369
Ser 385 Cys Ala Val Lys Gly 390 Phe Tyr Pro Ser Asp 395 Ile Ala Val Glu Trp 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s
435 440 445
Glu Ala Leu Hi s Asn Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465 <210> 275 <211> 1401 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-6eia-Fc(«впадина»)
<400> 275
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60
aggtgtgcgg tgaatggcac ttcccagttc acatgcttct acaactcgag agccaacatc 120
tcctgtgtct ggagccaaga tggggctctg caggacactt cctgccaagt ccatgcctgg 180
ccggacagac ggcggtggaa ccaaacctgt gagetget cc ccgtgagt ca agcat cctgg 240
gcctgcaacc tgatcctcgg agccccagat tctcagaaac tgaccacagt tgacatcgtc 300
accctgaggg tgctgtgccg tgagggggtg cgatggaggg tgatggccat ccaggactt c 360
aagccctttg agaacctt eg cctgatggcc cccatctccc tccaagttgt ccacgtggag 420
acccacagat gcaacataag ctgggaaatc tcccaagcct cccactactt tgaaagacac 480
ctggagttcg aggcccggac getgt cccca ggccacacct gggaggaggc ccccctgctg 540
actctcaagc agaagcagga atggatctgc etggagaege t caccccaga cacccagtat 600
- 306 033369
gagtttcagg tgcgggtcaa gcctctgcaa ggcgagtt ca cgacctggag cccctggagc 660
cagcccctgg ccttcagaac aaageetgea gcccttggga aggacaccgg agctcaggac 720
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gteagtette 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840
900
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccc. gaggteaagt - caac_ggta cgtggacggc
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg egggaggage agtacaacag cacgtaccgt 960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc ategagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgaget gaccaagaac 1140
caggtcagcc tctcgtgcgc agteaaagge ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320
gtcttctcat get ccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcct c 1380
tccctgtctc cgggtaaatg a 1401
<210> 276 <211> 492 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-raMMa-Fc(«выступ») <400> 276
Met 1 Leu Lys Pro Ser 5 Leu Pro Phe Thr Ser 10 Leu Leu Phe Leu Gln 15 Leu
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp
35 40 45
Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 5 5 60
- 307 033369
Phe 65 Asn Val Glu Tyr Met 70 Asn Cys Thr Trp Asn 75 Ser Ser Ser Glu Pro 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile Hi s Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln
130 135 140
Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn
165 170 175
Arg Phe Leu Asn Hi s Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp
180 185 190
Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg Hi s Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Al a Gln Hi s Trp Ser Glu Trp
225 230 235 240
Ser Hi s Pro Ile Hi s Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Gly Ala Gln Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
260 265 270
- 308 033369
Pro Cys Pro 275 Ala Pro Glu Leu Leu 280 Gly Gly Pro Ser Val 285 Phe Leu Phe
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val
290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala
370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s Glu Ala Leu Hi s Asn Hi s
465 470 475 480
- 309 033369
Tyr Thr Gln Lys
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485490 <210>277 <211>1479 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок человеческий IL-2R-raMMa-Fc(«выступ») <400> 277
atgttgaagc catcattacc attcacatcc ctcttattcc tgcagctgcc cctgctggga 60
gtggggctga acacgacaat tctgacgccc aatgggaatg aagacaccac agctgattt c 120
ttcctgacca ctatgcccac tgactccctc agtgtttcca ctctgcccct cccagaggtt 180
cagtgttttg tgttcaatgt cgagtacatg aattgcactt ggaacagcag ctctgagccc 240
cagcctacca acctcactct gcattattgg tacaagaact cggataatga taaagtccag 300
aagtgcagcc actatctatt ctctgaagaa atcacttctg gctgt cagtt gcaaaaaaag 360
gagatccacc tctaccaaac atttgttgtt cagctccagg acccacggga acccaggaga 420
caggccacac agatgctaaa actgcagaat ctggtgat cc cctgggct cc agagaaccta 480
acacttcaca aactgagtga atcccagcta gaactgaact ggaacaacag attcttgaac 540
cactgtttgg agcacttggt gcagtaccgg actgactggg accacagctg gactgaacaa 600
tttcgtgttc ggagccgctt taacccactc tgtggaagtg ctcagcattg gagtgaatgg 720
agccacccaa tccactgggg gagcaatact tcaaaagaga atcctttcct gtttgcattg 780
gaagccggag ctcaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gat ct cccgg 900
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggt caagtt c 960
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccct cc cagcccccat cgagaaaacc 1140
- 310 033369
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 1200
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg t caaaggctt ctatcccagc 1260
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320
cccgtgctgg act ccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggct ct gcacaaccac 1440
tacacgcaga agagcctctc cctgt ct ccg ggtaaatga 1479
<210> 278 <211> 219 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Альфа-субъединица человеческого IL-2R + Avi-метка + His-метка <400> 278
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 lie lie Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly
Val Hi s Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu lie Pro Hi s Ala
20 25 30
Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu
35 40 45
Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu
50 5 5 60
Cys Thr Gly Asn Ser Ser Hi s Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Ser Ser Al a Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro
85 90 95
Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln
100 105 110
Pro Val Asp Gln Al a Ser Leu Pro Gly Hi s Cys Arg Glu Pro Pro Pro
- 311
115 120 125
Trp Glu Asn Glu Al a Thr Glu Arg Ile Tyr Hi s Phe Val Val Gly Gln
130 135 140
Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu Hi s Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr Hi s Gly Lys Thr Arg Trp Thr
165 170 175
Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
195 200 205
Hi s Glu Ala Arg Al a Hi s Hi s His His Hi s Hi s
210 215
<210> 279 <211> 660 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Альфа-субъединица человеческого IL-2R + Avi-метка + His-метка <400> 279
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcatt ccgag 60
ctctgtgacg atgacccgcc agagatccca cacgccacat t caaagccat ggcctacaag 120
gaaggaacca tgttgaactg tgaatgcaag agaggtttcc gcagaataaa aagcgggtca 180
ctctatatgc tctgtacagg aaactctagc cactcgtcct gggacaacca atgtcaatgc 240
acaagctctg ccactcggaa cacaacgaaa caagtgacac ctcaacctga agaacagaaa 300
gaaaggaaaa ccacagaaat gcaaagt cca atgcagccag tggaccaagc gagccttcca 360
ggtcactgca gggaacct cc accatgggaa aatgaagcca cagagagaat ttatcatttc 420
gtggtggggc agatggttta ttatcagtgc gt ccagggat acagggct ct acacagaggt 480
- 312 033369 cctgctgaga gcgtctgcaa aatgacccac gggaagacaa ggtggaccca gccccagctc 540 atatgcacag gtgtcgacga acagttatat tttcagggcg gctcaggcct gaacgacatc 600 ttcgaggccc agaagatcga gtggcacgag gctcgagctc accaccatca ccatcactga 660 <210> 280 <211> 473 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> <400> Слитый белок 280 МЫШИНЫЙ IL-2R-6eTa-Fc(«впадина»)
Gln Leu Leu 10 uly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Met 1 Asp Met Arg Val 5 fro Ala
Phe Pro Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ala Arg Cys Ala Val Lys
20 25 30
Asn Cys Ser Hi s Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser
35 40 45
Cys Met Trp Ser Hi s Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys Hi s Val
50 5 5 60
Hi s Ala Lys Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Val Arg Gln Al a Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe
85 90 95
Pro Glu Ser Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val
100 105 110
Val Cys Trp Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe
115 120 125
Hi s Pro Phe Asp Asn Leu Arg Leu Val Al a Pro Hi s Ser Leu Gln Val
130 135 140
- 313
Leu His lie Asp Thr Gln Arg Cys
145 150
Val Ser His Tyr lie Glu Pro Tyr
165
Leu Leu Gly His Ser Trp Glu Asp
180
Arg Gln Gln Trp Leu Phe Leu Glu
195 200
Glu Val Gln Val Arg Val Lys Ala
210 215
Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Thr
225 230
Met Lys Glu Gly Ala Gln Asp Lys
245
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340
Asn lie Ser 155 Trp Lys Val Ser Gln 160
Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg
170 175
Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln
185 190
Met Leu lie Pro Ser Thr Ser Tyr
205
Gln Arg As n As n Thr Gly Thr Trp
220
Phe Arg Thr Arg Pro Ala Asp Pro
235 240
Thr Hi s Thr Cys Pro Pro Cys Pro
250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
2 8 5
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu Hi s
330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
345 350
- 314 033369
Ala Leu Pro 355 Ala Pro Ile Glu Lys 360 Thr Ile Ser Lys Ala 365 Lys Gly Gln
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Al a Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Туг Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s Glu Ala Leu Hi s Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 281 <211> 1422 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок мышиный IL-2R-6eTa-Fc(«впадина») <400> 281
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt ccccctcctg 60
ctgctctggt tcccaggtgc caggtgtgca gtgaaaaact gttcccatct tgaatgcttc 120
tacaact caa gagccaatgt ctcttgcatg tggagccatg aagaggct ct gaatgt caca 180
acctgccacg tccatgccaa gtcgaacctg cgacactgga acaaaacctg tgagctaact 240
cttgtgaggc aggcatcctg ggcctgcaac ctgatcctcg ggtcgttccc agagtcccag 300
tcactgacct ccgtggacct ccttgacata aatgtggtgt gctgggaaga gaagggttgg 360
- 315 033369
cgtagggtaa agacctgcga cttccatccc tttgacaacc ttcgcctggt ggcccctcat 420
tccctccaag ttctgcacat tgatacccag agatgtaaca taagctggaa ggt ct cccag 480
gtctctcact acattgaacc atacttggaa tttgaggccc gtagacgtct tctgggccac 540
agctgggagg atgcat ccgt attaagcctc aagcagagac agcagtggct cttcttggag 600
atgctgatcc ctagtacctc atatgaggtc caggtgaggg t caaagct ca acgaaacaat 660
accgggacct ggagtccctg gagccagccc ctgacctttc ggacaaggcc agcagatccc 720
atgaaggagg gagctcagga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaact c 780
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggt caag 900
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg t cctgcacca ggactggctg 1020
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc t cccagcccc cat cgagaaa 1080
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtgcaccct gcccccatcc 1140
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctctcgtgcg cagtcaaagg cttctatccc 1200
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260
cctcccgtgc tggact ccga cggctccttc ttcctcgtga gcaagctcac cgtggacaag 1320
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422
<210> 282 <211> 500 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок мышиный IL-2R-raMMa-Fc(«выступ») <400> 282
Met 1 Asp Met Arg Val 5 Pro Ala Gln Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ala Arg Cys Trp Ser Ser
20 25 30
- 316
Lys Val Leu 35 Met Ser Ser Ala Asn 40 Glu Asp lie Lys Ala 45 Asp Leu lie
Leu Thr Ser Thr Al a Pro Glu His Leu Ser Ala Pro Thr Leu Pro Leu
50 5 5 60
Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn lie Glu Tyr Met Asn Cys Thr
65 70 75 80
Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Al a Thr Asn Leu Thr Leu Hi s Tyr
85 90 95
Arg Tyr Lys Val Ser Asp Asn Asn Thr Phe Gln Glu Cys Ser Hi s Tyr
100 105 110
Leu Phe Ser Lys Glu lie Thr Ser Gly Cys Gln lie Gln Lys Glu Asp
115 120 125
lie Gln Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Gln Lys
130 135 140
Pro Gln Arg Arg Al a Val Gln Lys Leu Asn Leu Gln Asn Leu Val lie
145 150 155 160
Pro Arg Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gln
165 170 175
Leu Glu Leu Arg Trp Lys Ser Arg His lie Lys Glu Arg Cys Leu Gln
180 185 190
Tyr Leu Val Gln Tyr Arg Ser Asn Arg Asp Arg Ser Trp Thr Glu Leu
195 200 205
lie Val Asn His Glu Pro Arg Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp Glu Leu
210 215 220
Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Tyr Asn Pro lie Cys Gly
225 230 235 240
- 317 033369
Ser Ser Gln Gln Trp 245 Ser Lys Trp Ser Gln 250 Pro Val His Trp Gly 255 Ser
Hi s Thr Val Glu Glu Asn Pro Ser Leu Phe Ala Leu Glu Ala Gly Ala
260 265 270
Gln Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
Hi s Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Hi s Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Al a Pro
370 375 380
lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Al a Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
- 318
Pro Val 450 Leu Asp Ser Asp Gly 455 Ser Phe Phe Leu Tyr 460 Ser Lys Leu Thr
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met Hi s Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Pro Gly Lys
500 <210> 283 <211> 1503 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок мышиный IL-2R-raMMa-Fc(«выступ») <400> 283
--—)—)----—) — gggtccccgc tcsgctcctg ggcctcctgc tgctctggtt ccccctcctg 60
ctgctctggt tcccaggtgc caggtgttgg agtt ccaagg tcctcatgtc cagtgcgaat 120
gaagacatca aagctgattt gatcctgact tctacagccc ctgaacacct cagtgctcct 180
actctgcccc ttccagaggt tcagtgcttt gtgttcaaca tagagtacat gaattgcact 240
tggaatagca gtt ctgagcc t caggcaacc aacctcacgc tgcactatag gtacaaggta 300
tctgataata atacattcca ggagtgcagt cactatttgt tctccaaaga gattacttct 360
ggctgtcaga tacaaaaaga agatatccag ct ctaccaga catttgttgt ccagct ccag 420
gacccccaga aaccccagag gcgagctgta cagaagctaa acctacagaa tcttgtgatc 480
ccacgggct c cagaaaat ct aacactcagc aatctgagtg aatcccagct agagctgaga 540
tggaaaagca gacatattaa agaacgctgt ttacaatact tggtgcagta ccggagcaac 600
agagatcgaa gctggacgga actaatagtg aatcatgaac ctagattctc cctgcctagt 660
gtggatgagc tgaaacggta cacatttcgg gttcggagcc gctataaccc aatctgtgga 720
agttctcaac agtggagtaa atggagccag cctgtccact gggggagtca tactgtagag 780
- 319 033369
gagaatcctt ccttgtttgc actggaagct ggagct cagg acaaaactca cacatgccca 840
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgt cagt ct tcctcttccc cccaaaaccc 900
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc 1260
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaagct ca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1500
tga1503 <210>284 <211>213 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Альфа-субъединица мышиного IL-2R + Avi-метка + His-метка <400> 284
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 Ile lie Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly
Val Hi s Ser Glu Leu Cys Leu Tyr Asp Pro Pro Glu Val Pro Asn Ala
20 25 30
Thr Phe Lys Ala Leu Ser Tyr Lys Asn Gly Thr Ile Leu Asn Cys Glu
35 40 45
Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Leu Lys Glu Leu Val Tyr Met Arg Cys
50 5 5 60
- 320
Leu 65 Gly Asn Ser Trp Ser 70 Ser Asn Cys Gln Cys 75 Thr Ser Asn Ser Hi s 80
Asp Lys Ser Arg Lys Gln Val Thr Ala Gln Leu Glu His Gln Lys Glu
85 90 95
Gln Gln Thr Thr Thr Asp Met Gln Lys Pro Thr Gln Ser Met Hi s Gln
100 105 110
Glu Asn Leu Thr Gly Hi s Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Lys Hi s Glu
115 120 125
Asp Lys a i-nt Hi s Hi s
XJ- 'rJ -1· _1_ J, -1·
130 135 140
Glu Cys He Pro Gly Tyr Lys Ala Leu Gln Arg Gly Pro Ala He Ser
145 150 155 160
lie Cys Lys Met Lys Cys Gly Lys Thr Gly Trp Thr Gln Pro Gln Leu
165 170 175
Thr Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu Asn
180 185 190
Asp lie Phe Glu Al a Gln Lys He Glu Trp Hi s Glu Ala Arg Al a Hi s
195 200 205
His His His His His
210 <210> 285 <211> 642 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Альфа-субъединица мышиного IL-2R + Avi-метка + His-метка <400> 285 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgaa 60
- 321 033369
ctgtgtctgt atgacccacc cgaggtcccc aatgccacat t caaagccct ctcctacaag 120
aacggcacca tcctaaactg tgaatgcaag agaggtttcc gaagactaaa ggaattggtc 180
tatatgcgtt gcttaggaaa ctcctggagc agcaactgcc agtgcaccag caactcccat 240
gacaaat cga gaaagcaagt tacagctcaa cttgaacacc agaaagagca acaaaccaca 300
360
gagccacct c cttggaaaca tgaagattcc aagagaat ct atcatttcgt ggaaggacag 420
agtgttcact acgagtgtat t ccgggatac aaggctctac agagaggt cc tgctattagc 480
atctgcaaga tgaagtgtgg gaaaacgggg tggactcagc cccagctcac atgtgtcgac 540
gaacagttat attttcaggg cggct caggc ctgaacgaca tcttcgaggc ccagaagat c 600
gagtggcacg aggctcgagc tcaccaccat caccatcact ga 642
<210> 286 <211> 480 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) IL-2R-6eTa-Fc(«выступ») + Avi метка <400> 286
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 lie lie Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Al a Thr 15 Gly
Val Hi s Ser Ala Val Asn Gly Thr Ser Arg Phe Thr Cys Phe Tyr Asn
20 25 30
Ser Arg Ala Asn lie Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln
35 40 45
Asp Thr S cl Cys G1 n V a Ί His ci T rp Pro Asp Arg Arg Arg T rp Asn
50 5 5 60
Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Al a Cys Asn
65 70 75 80
Leu Ile Leu Gly Thr Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Ala Val Asp lie
- 322 033369
Val Thr Leu Arg 100 Val Met Cys Arg Glu 105 Gly Val Arg Trp Arg 110 Met Met
Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Al a Pro
115 120 125
Ile Ser Leu Gln Val Val Hi s Val Glu Thr Hi s Arg Cys Asn Ile Ser
130 135 140
Trp Lys Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe
145 150 155 160
Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu
165 170 175
Met Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr
180 185 190
Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly
195 200 205
Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr
210 215 220
Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Gly Ala Gln Asp Lys Thr Hi s
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
- 323
290
295
300
Thr 305 Lys Pro Arg Glu Glu 310 Gln Tyr Asn Ser Thr 315 Tyr Arg Val Val Ser 320
Val Leu Thr Val Leu Hi s Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Al a Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Al a Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
Hi s Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser
450 455 460
Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Hi s Glu
465 470 475 480
<210> 287 <211> 1443 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 324 033369 <220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) IL-2R-6eTa-Fc(«выступ») + Avi метка
<400> 287
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcatt ccgcg 60
gtcaacggca ctt cccggtt cacatgcttc tacaactcga gagccaacat ctcctgtgtc 120
tggagccaag atggggct ct gcaggacact tcctgccaag t ccacgcctg gccggacaga 180
cggcggtgga accaaacctg tgagctgctc cctgtgagtc aagcatcctg ggcctgcaac 240
ctgatcctcg gaaccccaga 11 ct cagaaa ctgaccgcag t ggat at cgt caccctgagg 300
gtgatgtgcc gtgaaggggt gcgatggagg atgatggcca t ccaggactt caaacccttt 360
gagaacctt c gcctgatggc ccccatctcc ctccaagtcg tccacgtgga gacccacaga 420
tgcaacataa gctggaaaat ctcccaagcc tcccactact ttgaaagaca cctggagttt 480
gaggcccgga cgctgt cccc aggccacacc tgggaggagg cccccctgat gaccctcaag 540
cagaagcagg aatggatctg cctggagacg ctcaccccag acacccagta tgagtttcag 600
gtgcgggtca agcctctgca aggcgagttc acgacctgga gcccctggag ccagcccctg 660
gccttcagga caaagcctgc agcccttggg aaggacaccg gaget cagga caaaactcac 720
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac egteagtett cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggt cacatg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt aegtggaegg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacat eg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga egget cctt c 1260
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
tgct ccgtga tgcatgaggc t ctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ccggaggcct gaacgacatc ttcgaggccc agaagattga atggcacgag 1440
- 325 033369 tga1443 <210>288 <211>489 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) 11-2Е-гамма-Гс(«впадина») <400> 288
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 Ile Ile Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly
Val Hi s Ser Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp
20 25 30
Ala Thr Thr Asp Phe Phe Leu Thr Ser Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser
35 40 45
Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val
С ГХ ,- .-
Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr
65 70 75 80
Asn Leu Thr Leu Hi s Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val
85 90 95
Gln Lys Cys Ser Hi s Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys
100 105 110
Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln
115 120 125
Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys
130 135 140
Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu Arg
145 150 155 160
- 326 033369
Lys Leu Ser Glu Ser 165 Gln Leu Glu Leu Asn 170 Trp Asn Asn Arg Phe 175 Leu
Asn Hi s Cys Leu Glu Hi s Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp As p Hi s
180 185 190
Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg Hi s Lys Phe Ser Leu Pro
195 200 205
Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe
210 215 220
Pro Ser Ser Ser Pro
— -1- _y —--XX X X J. J_ Ч-.Х. J. J_ X X
225 230 235 240
lie Hi s Trp Gly Ser Asn Ser Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala
245 250 255
Leu Glu Ala Gly Al a Gln Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
275 280 285
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
n Ά’ Г1 LL
Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305 310 315 320
Val Asp Gly Val Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
325 330 335
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Hi s
340 345 350
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
355 360 365
- 327 033369
Ala Leu 370 Pro Al a Pro Ile Glu 375 Lys Thr Ile Ser Lys 380 Ala Lys Gly Gln
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
385 390 395 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Al a Val Lys Gly Phe Tyr Pro
405 410 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
420 425 430
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
435 440 445
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
450 455 460
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Hi s Asn His Tyr Thr Gln
465 470 475 480
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 289 <211> 1470 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок обезьяний (циномолгус) 1Н-2Р-гамма-Гс(«впадина») <400> 289
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gca11 ccct g 60
aacacgacaa ttctgacgcc caatgggaat gaagacgcca caactgattt ctt cctgacc 120
tctatgccca ctgact ccct cagtgtttcc actctgcccc t cccagaggt tcagtgtttt 180
gtgttcaatg tcgagtacat gaattgcact tggaacagca gctctgagcc ccagcctacc 240
aacctcactc tgcattattg gtacaagaat tcggataatg ataaagtcca gaagtgcagc 300
- 328 033369
cactatctat tctctgaaga aatcacttct ggctgtcagt tgcaaaaaaa ggagatccac 360
ctctaccaaa cgtttgttgt tcagctccag gacccacggg aacccaggag acaggccaca 420
cagatgctaa aactgcagaa tctggtgatc ccctgggctc cggagaacct aacacttcgc 480
aaactgagtg aat cccagct agaactgaac tggaacaaca gattcttgaa ccactgtttg 540
gagcacttgg tgcagtaccg gactgactgg gaccacagct ggactgaaca atcagtggat 600
tatagacata agttctcctt gcctagtgtg gatgggcaga aacgctacac gtttcgtgtc 660
cggagccgct ttaacccact ctgtggaagt gctcagcatt ggagtgaatg gagccaccca 720
atccactggg ggagcaatag ttcaaaagag aatcctttcc tgtttgcatt ggaagccgga 780
gctcaggaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 840
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 960
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac cat ct ccaaa 1140
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1200
accaagaacc aggtcagcct ctcgtgcgca gtcaaaggct t ctat cccag cgacatcgcc 1260
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320
gact ccgacg gctccttctt cctcgtgagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380
caggggaacg tcttctcatg ct ccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1470
<210> 290 <211> 217 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Альфа-субъединица обезьяньего (циномогус) IL-2R + Avi-метка + His метка <400> 290
- 329 033369
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu
1 5
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro
20
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr
35 40
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly
50 5 5
Ά.5 n His
— — — — — Дзр
65 70
Ala Ala Arg Asn Thr Thr Lys Gln
85
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met
100
Gln Val Ser Leu Pro Gly Hi s Cys
115 120
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His
130 1 35
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg
145 150
Ser Val Cys Lys Met Thr Hi s Gly
165
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Val Asp
180
Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
195 200
Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
15
Lys Ile Thr His Ala Thr Phe Lys
30
Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
Ser Pro Tyr Met Leu Cys Thr Gly
Ά.sn Gln Cys Gln Cys Thn Ssг Ssг
80
Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
95
Gln Ser Gln Met Gln Leu Ala Asp
105 110
Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
125
Phe Val Val Gly Gln Thr Val Tyr
140
Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
155 160
Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
170 175
Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly
185 190
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
205
- 330 033369
Ala Arg Ala His His His His His His
210215 <210>291 <211>654 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Альфа-субъединица обезьяньего (циномогус) IL-2R + Avi-метка + His метка <400>291
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtga gctctgtgac 60
gatgacccgc caaaaatcac acatgccaca ttcaaagcca tggcctacaa ggaaggaacc 120
atgttgaact gtgaatgcaa gagaggtttc cgcagaataa aaagcgggtc accctatatg 180
ctctgtacag gaaactctag ccactcgtcc tgggacaacc aatgt caatg cacaagctct 240
gctgctcgga acacaacaaa acaagtgaca cctcaacctg aagaacagaa agaaagaaaa 300
accacagaaa tgcaaagt ca aatgcagctg gcggaccaag tgagccttcc aggtcactgc 360
agggaacct c caccgtggga aaatgaagcc acagaaagaa tttatcattt cgtggtgggg 420
cagacggttt actaccagtg cgtccaggga tacagggctc tacacagagg tcctgctgag 480
agcgtctgca aaatgaccca cgggaagaca agatggaccc agccccagct catatgcaca 540
ggtgaagtcg acgaacagtt atattttcag ggcggctcag gcctgaacga catcttcgag 600
gcccagaaga tcgagtggca cgaggct cga gctcaccacc atcaccatca ctga 654
<210>292 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> IL-2 дикого типа(С125А) (4) <400> 292
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgct c 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
- 331 033369
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat ctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210> 293 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант IL-2 L72G (C125A) (4) <400>293
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaa ctaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210>294 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мутант IL-2 L72G / F42A (C125A) (4) <400> 294
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
- 332 033369
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210>295 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тройной мутант IL-2 F42A / Y45A / L72G (C125A) (4 )
<400> 295
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggat ctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
<210>296 <211>399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Четверной мутант IL-2 T3A / F42A /Y45A /L72G (C125A) (4) <400> 296
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399
- 333 033369 <210> 297 <211> 593 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 297
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Hi s
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Trp Al a Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 5 5 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Sgi Al a Sgt Sgi Phe Al a
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
- 334 033369
Ala Leu Thr Ser Gly 165 Val Hi s Thr Phe Pro 170 Ala Val Leu Gln Ser 175 Ser
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Al a Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu Hi s Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
- 335 033369
Lys Gly 370 Phe Tyr Pro Ser Asp 375 Ile Ala Val Glu Trp 380 Glu Ser Asn Gly
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s Glu Ala Leu Hi s
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln T i\7 St Ser T ,1=1 1 Ser T ,1=1 1 Ser Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Al a Ser
450 455 4 60
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp
465 470 475 480
Leu Gln Met lie Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
485 490 495
Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
500 505 510
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
515 520 525
Val Leu Asn Gly Al a Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp
530 535 540
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
545 550 5 5 5 560
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
5 65 570 575
- 336 033369
Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala Gln Ser lie lie
Ser Thr Leu
580
585
590 <210> 298 <211> 1779 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400>298
gaagtgcagc tgctggaat c eggeggagge etggtgeage etggeggate tetgagaetg 60
tcctgcgccg cct ccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgt ccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gact ctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccat egg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggteaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca geggegtgea caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccct ccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gteagtette 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
e t. cm t. cm t. cm acntnancca cnaanaccct п а π π t c a a σ t t c a a c t σ σ t a cntanacnnc! 84 0
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg egggaggage agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggq1020 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac1080
- 337 033369
caggt cagcc tgtggtgcct ggteaaagge ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat get ccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcct c 1320
tccctgtctc cgggtggcgg cggaggctcc ggaggeggag gttctggcgg aggtggctcc 1380
gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt aetgetggat 1440
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 1500
acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacat ctt ca gtgtctagaa 1560
gaagaactca aacctctgga ggaagtgeta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 1620
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 1680
acaacattca tgtgtgaata tgetgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 1740
tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 1779
<210> 299 <211> 446 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc <400> 299
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
5 («впадина»)
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala lie Trp Ala Ser Gly Glu
55
Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
- 338 033369
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ser Lys 75 Asn Thr Leu Tyr Leu 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Al a Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Lys Thr Thr Ala Ala
—' —' —' '
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Al a Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
- 339
Lys Phe Asn 275 Trp Tyr Val Asp Gly 280 Val Glu Val Hi s Asn 285 Ala Lys Thr
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
JjCU Till? V d-L reu ΓΊΧ S erj-ii Asp Trp J_iCU M.011 Gly Lys ед_ u Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Al a Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s Glu Ala Leu Hi s
420 425 430
Asn Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 300 <211> 1338 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 28H1 тяжелая цепь Fab-Fc («впадина»)
- 340 033369
<400> 300
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cct ccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgt ccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gact ctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccct ccg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480
gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc 540
ctgagcagcg tggtcaccgt gccttctagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgcgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggt cacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt t caactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
tccctgtctc cgggtaaa 1338
<210> 301 <211> 594 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 341 033369 <220>
<223> 4В9 тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 301
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
- 342 033369
Leu Gly Thr 195 Gln Thr Tyr lie Cys 200 Asn Val Asn Hi s Lys 205 Pro Ser Asn
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu V ci 1 Till? Cys V ci 1 V ci 1 V ci 1 Asp V ci 1 Ser Hl 5 Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Al a Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu Hi s Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Al a Pro lie Glu Lys Thr lie
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Al a Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
- 343
Asp Gly Ser Phe Phe 405 Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Thr Val Asp Lys Ser 415 Arg
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Al a Leu
420 425 430
Hi s Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala
450 455 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465 470 475 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485 490 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr
500 505 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515 520 525
Ά.5 n Al a T . \ 7 C Ά.5 n Hi s Arg Arg
— -- ' —' -- — — - * - ·— -----
530 535 540
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val He Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
545 550 5 5 5 560
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr He Val
5 65 570 575
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Al a Gln Ser He He Ser Thr
580 585 590
Leu Thr
- 344 <210> 302 <211> 1782 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B9 тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 302
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggt ca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaa ccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggct gt cc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaat c acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaat cttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacct gaag ctgcaggggg accgt cagt c 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ct catgat ct cccggacccc tgaggt caca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggt ca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcct cccgt gctggactcc 1200
gacggct cct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
- 345 033369
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtgg cggcggaggc tccggaggcg gaggttctgg cggaggtggc 1380
tccgcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 1440
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 1500
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 1560
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 1620
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1680
gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1740
agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga ct 1782
<210> 303 <211> 447 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B9 тяжелая цепь Fab-Fc («впадина») <400> 303
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
- 346 033369
Ala Lys Gly Trp 100 Phe Gly Gly Phe Asn 105 Tyr Trp Gly Gln Gly 110 Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Al a Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu ТП I? Ser Gly v His ТП I? Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Al a Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Al a Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
- 347
Val 305 Leu Thr Val Leu Hi s 310 Gln Asp Trp Leu Asn 315 Gly Lys Glu Tyr Lys 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Al a Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr ΕΊΓΟ Ser Asp Ile Al a Val Li± U Trp Li± U Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Al a Leu
420 425 430
Hi s Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445 <210> 304 <211> 1341 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4B9 тяжелая цепь Fab-Fc («впадина»)
<400> 304
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgt ccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
- 348 033369
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggt ca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cct ccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgt cagt c 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggt ca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcct cccgt gctggactcc 1200
gacggct cct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ct ccgggtaa a 1341
<210> 305 <211> 592 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> DP47GS тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 305
- 349 033369
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Al a Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Al a Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp As n Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Al a Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
- 350 033369
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
325
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
0
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
410 415
- 351 033369
Gln Gly Asn Val 420 Phe Ser Cys Ser Val 425 Met Hi s Glu Ala Leu 430 Hi s Asn
Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Arg Met Leu Thr Al a Lys Phe Al a Met Pro Lys Lys Al a Thr Glu Leu
500 505 510
Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 5 5 5 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
5 65 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 306 <211> 1776 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> DP47GS тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm
- 352 033369
<400> 306
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggt c cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac aeggeegtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct egagtgetag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat etgeaaegtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagetgeag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca aetggtaegt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaageegegg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaa ccag 1080
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc ageeggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatget ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact А ГА ГПТАГТАА -------- gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtggcggcgg aggctccgga ggcggaggtt etggeggagg tgget ccgca 1380
cctgcct caa gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact gctggattta 1440
cagatgattt tgaatggaat taataattac aagaat ccca aact caccag gatget caca 1500
gccaagtttg ccatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tetagaagaa 1560
- 353 033369
354 033369
Ser Ser 130 Lys Ser Thr Ser Gly 135 Gly Thr Al a Ala Leu 140 Gly Cys Leu Val
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Al a Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Al a Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Al a Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
- 355 033369
Ala Lys Gly Gln 340 Pro Arg Glu Pro Gln 345 Val Cys Thr Leu Pro 350 Pro Ser
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
4 05 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s Glu Ala Leu Hi s Asn
420 425 430
Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
210> 308
211> 1335
212> ДНК
213> Искусственная последовательность
220>
223> DP47GS тяжелая цепь Fab-Fc («впадина»)
400> 308
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccct ccgtgt tccccctggc ccccagcagc aagagcacca gcggcggcac agccgctctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa cagcggagcc 480
- 356 033369
ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcaga gttctggcct gtatagcctg 540
agcagcgtgg tcaccgtgcc ttctagcagc ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag ctgcgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgtg caccctgccc ccat cccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctct cgtgcgcagt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tcgtgagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgt c 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 309 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> DP47GS, легкая цепь <400> 309
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Al a Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
- 357 033369
He Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 5 5 Ala Thr Gly He Pro 60 Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Al a Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Al a T . \ 7 C
*- — — - -- — ----- - -- — ------ - -- — — — Ά.5 ]p ----- — —
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210215 <210>310 <211>645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 358 033369
<223> DP47GS, легкая цепь
<400> 310
gaaatcgtgt taacgcagtc t ccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagt ca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataactt c 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 311 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A; VL <400> 311
Asp 1 lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
- 359 033369
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
70 7580
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
9095
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
100105 lie Lys <210>
<211>
312
324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A; VL <400> 312 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc cagggcacca agctcgagat caag
120
180
240
300
324 <210>
<211>
<212>
313
121
БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A; VH <400> 313
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
Lys Lys Pro Gly Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
25
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
- 360 033369
Gly Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp Met
Gly Trp lie Asn Thr Lys Thr Gly Glu Al a Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 5 5 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 314 <211> 363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A; VH
<400> 314
caggtgcagc tggtgeagte tggcgccgaa gtgaagaaac etggagetag tgtgaaggtg 60
teetgeaagg ccagcggcta caccttcacc gagtteggea tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggageetgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt aegtggaage catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
age363 <210>315 <211>594 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 361 033369 <220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 315
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
- 362 033369
Leu Gly Thr 195 Gln Thr Tyr lie Cys 200 Asn Val Asn Hi s Lys 205 Pro Ser Asn
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Al a Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu Hi s Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Al a Pro lie Glu Lys Thr lie
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Al a Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
- 363 033369
Asp Gly Ser Phe Phe 405 Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Thr Val Asp Lys Ser 415 Arg
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Al a Leu
420 425 430
Hi s Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala
450 455 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465 470 475 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485 490 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Al a Met Pro Lys Lys Al a Thr
500 505 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515 520 525
Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe Hi s Leu Arg Pro Arg
530 535 540
Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
545 550 5 5 5 560
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
5 65 570 575
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Al a Gln Ser Ile Ile Ser Thr
580 585 590
Leu Thr
- 364 033369 <210> 316 <211> 1782 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 316
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cct ccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggt ct cagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggca cagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaat c acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaat cttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgt cagt c 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ct catgat ct cccggacccc tgaggt caca 7 8 0
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggt ca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagt acaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcct cccgt gctggactcc 1200
gacggct cct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
- 365 033369
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtgg cggcggaggc tccggaggcg gaggttctgg cggaggtggc 1380
tccgcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 1440
gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 1500
ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 1560
gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 1620
ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1680
gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1740
agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga ct 1782
<210> 317 <211> 447 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc («впадина») <400> 317
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 5 5 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
- 366 033369
Ala Lys Gly Trp 100 Leu Gly Asn Phe Asp 105 Tyr Trp Gly Gln Gly 110 Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Al a Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Al ci Leu Til IT Ser Gly V cil Hl 5 Til IT Phe Pro Al ci V ci 1 Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Al a Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Al a Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
- 367 033369
Val 305 Leu Thr Val Leu Hi s 310 Gln Asp Trp Leu Asn 315 Gly Lys Glu Tyr Lys 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Al a Pro lie Glu Lys Thr lie
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val T i\7 St Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Al a Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Al a Leu
420 425 430
Hi s Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 318 <211> 1341 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 4G8 тяжелая цепь Fab-Fc («впадина») <400>318 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180
- 368 033369
gcagact ccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagggtgg 300
ctgggtaatt ttgactactg gggccaagga accctggt ca ccgtctcgag tgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cct ccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgt cagt c 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggt ca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcct cccgt gctggactcc 1200
gacggct cct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ct ccgggtaa a 1341
<210> 319 <211> 600 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 319
- 369 033369
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Al a Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 5 5 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Al a Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Al a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s
195 200 205
- 370 033369
Lys Pro 210 Ser Asn Thr Lys Val 215 Asp Lys Lys Val Glu 220 Pro Lys Ser Cys
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie
325 330 335
Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
34 0 34 5 3 5 0
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
- 371
Asp Lys Ser Arg 420 Trp Gln Gln Gly Asn 425 Val Phe Ser Cys Ser 430 Val Met
Hi s Glu Ala Leu Hi s Asn Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
465 470 475 480
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met lie Leu Asn Gly lie Asn
485 490 495
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala
500 505 510
Met Pro Lys Lys Al a Thr Glu Leu Lys Hi s Leu Gln Cys Leu Glu Glu
515 520 525
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn
530 535 540
Phe Hi s Leu Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val
545 550 5 5 5 560
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Al a Asp
5 65 570 575
Glu Thr Ala Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Ala
580 585 590
Gln Ser lie lie Ser Thr Leu Thr
595 600
<210> 320 <211> 1800 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 372 033369 <220>
<223> СН1А1А тяжелая цепь Fab-Fc («выступ»)-IL-2 qm <400> 320
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agcgctagca ccaagggccc aagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gagcacaagc 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact t ccccgagcc cgtgacagtg 480
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc acagtgccta gcagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga gctgctgggc 720
ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagtt caat 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agccccggga ggaacagtac 900
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc cagagaaccc caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tact ccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aagt ccggag gcggaggctc cggcggcgga 1380
ggtt ctggcg gaggtggctc cgcacctgcc tcaagttcta caaagaaaac acagctacaa 1440
- 373 033369
ctggagcatt tactgctgga tttacagatg attttgaatg gaattaataa ttacaagaat 1500
cccaaactca ccaggatgct cacagccaag tttgccatgc ccaagaaggc cacagaactg 1560
aaacatcttc agtgtctaga agaagaactc aaacctctgg aggaagtgct aaatggcgct 1620
caaagcaaaa actttcactt aagacccagg gacttaatca gcaatatcaa cgtaatagtt 1680
ctggaactaa agggatctga aacaacattc atgtgtgaat atgctgatga gacagcaacc 1740
attgtagaat ttctgaacag atggattacc tttgcccaaa gcatcatctc aacactgact 1800
<210> 321 <211> 451 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A тяжелая цепь Fab-Fc («впадина») <400> 321
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr Lys Thr Gly Glu Al a Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 5 5 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Al a Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
- 374
Gln Gly Thr 115 Thr Val Thr Val Ser 120 Ser Al a Ser Thr Lys 125 Gly Pro Ser
Val Phe Pro Leu Al a Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Thr
J· J, J_
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi s
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Hi s Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
- 375 033369
Lys Glu Tyr Lys Cys 325 Lys Val Ser Asn Lys 330 Ala Leu Pro Al a Pro 335 lie
Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
Hi s Glu Ala Leu Hi s Asn Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450 <210> 322 <211> 1353 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A тяжелая цепь Fab-Fc («впадина») <400> 322
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
- 376 033369
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agcgctagca ccaagggccc aagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gagcacaagc 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact t ccccgagcc cgtgacagtg 480
tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc acagtgccta gcagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga gctgctgggc 720
ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agccccggga ggaacagtac 900
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc cagagaaccc caggtgtgca ccctgccccc cagcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgt ca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg gtgt ccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aag 1353
<210> 323 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A, легкая цепь <400> 323
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
- 377 033369
Asp Arg Val Thr 20 lie Thr Cys Lys Ala 25 Ser Ala Ala Val Gly 30 Thr Tyr
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ser Al a Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Al a Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Al a Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
- 378 033369 <210> 324 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CH1A1A, легкая цепь
<400> 324
gatatccaga tgacccagt c tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agt cccat ca 180
aggttcagtg gcagtggat c tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc 300
cagggcacca agct cgagat caagcgtacg gtggctgcac cat ct gtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa at ctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaact cc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
- 379 033369

Claims (22)

1. Мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2), содержащий три аминокислотные мутации, соответствующие аминокислотным заменам F42A, У45А и L72G в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1), где указанные мутации аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
2. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по п.1, дополнительно содержащий аминокислотную мутацию, соответствующую аминокислотной замене T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K или T3P в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1), где указанная мутация элиминирует сайт O-гликозилирования IL-2.
3. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по п.2, где указанная аминокислотная мутация соответствует аминокислотной замене T3A.
4. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по одному из пп.1-3, дополнительно содержащий аминокислотную мутацию, соответствующую аминокислотной замене C125S, C125A, C125T или C125V в последовательности человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1).
5. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по п.4, где указанная аминокислотная мутация соответствует аминокислотной замене C125A.
6. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по любому из пп.1-5, представляющий собой мутантную молекулу человеческого IL-2.
7. Мутантный полипептид интерлейкина-2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 19, у которого снижена или отсутствует аффинность к высокоаффинному рецептору IL-2 и сохраняется аффинность к рецептору с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
8. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по любому из пп.1-7, сцепленный по меньшей мере с одной антигенсвязывающей молекулой.
9. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по п.8, сцепленный с двумя антигенсвязывающими молекулами.
10. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по п.9, сцепленный карбоксиконцевой пептидной связью с первой антигенсвязывающей молекулой и аминоконцевой пептидной связью со второй антигенсвязывающей молекулой.
11. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по любому из пп.8-10, в котором указанная антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или фрагмент антитела.
12. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по любому из пп.8-11, в котором указанная антигенсвязывающая молекула выбрана из молекулы Fab и молекулы scFv.
13. Мутантный полипептид интерлейкина-2 по любому из пп.8-11, в котором указанная антигенсвязывающая молекула представляет собой молекулу иммуноглобулина, в частности молекулу IgG.
14. Выделенный полинуклеотид, кодирующий мутантный полипептид интерлейкина-2 по любому из пп.1-13.
15. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.14.
16. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п.14 или экспрессионный вектор по п.15.
17. Способ получения мутантного полипептида интерлейкина-2 по любому из пп.1-13, включающий культивирование клетки-хозяина по п.16 в условиях, пригодных для экспрессии полинуклеотида, кодирующего мутантный полипептид интерлейкина-2, в результате чего продуцируется мутантный полипептид интерлейкина-2.
18. Мутантный полипептид интерлейкина-2, полученный способом по п.17.
19. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая мутантный полипептид интерлейкина-2 по любому из пп.1-13 или 18 и фармацевтически приемлемый носитель.
20. Применение мутантного полипептида интерлейкина-2 по любому из пп.1-13 или 18 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.
21. Способ лечения рака, отличающийся тем, что вводят терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции по п.19.
22. Способ стимуляции иммунной системы, отличающийся тем, что вводят эффективное количество фармацевтической композиции по п.19.
EA201300896A 2011-02-10 2012-02-07 Мутантные полипептиды интерлейкина-2 со сниженной аффинностью к высокоаффинному рецептору il-2 и неизменной аффинностью к рецептору il-2 с промежуточной аффинностью и их применение EA033369B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11153964 2011-02-10
EP11164237 2011-04-29
PCT/EP2012/051991 WO2012107417A1 (en) 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300896A1 EA201300896A1 (ru) 2014-02-28
EA033369B1 true EA033369B1 (ru) 2019-10-31

Family

ID=45560919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300896A EA033369B1 (ru) 2011-02-10 2012-02-07 Мутантные полипептиды интерлейкина-2 со сниженной аффинностью к высокоаффинному рецептору il-2 и неизменной аффинностью к рецептору il-2 с промежуточной аффинностью и их применение

Country Status (36)

Country Link
US (5) US9266938B2 (ru)
EP (4) EP3489255B1 (ru)
JP (2) JP5878182B2 (ru)
KR (2) KR101667096B1 (ru)
CN (3) CN105440123B (ru)
AR (1) AR085335A1 (ru)
AU (2) AU2012215573B2 (ru)
BR (1) BR112013018932B1 (ru)
CA (1) CA2824253C (ru)
CL (1) CL2013001987A1 (ru)
CO (1) CO6741186A2 (ru)
CR (1) CR20130314A (ru)
CY (1) CY1117842T1 (ru)
DK (3) DK3075745T3 (ru)
EA (1) EA033369B1 (ru)
EC (1) ECSP13012815A (ru)
ES (3) ES2883371T3 (ru)
HK (1) HK1217020A1 (ru)
HR (3) HRP20160917T1 (ru)
HU (3) HUE029139T2 (ru)
IL (3) IL269687B (ru)
LT (2) LT3075745T (ru)
MA (1) MA35803B1 (ru)
MX (2) MX356675B (ru)
MY (1) MY190604A (ru)
PE (2) PE20140303A1 (ru)
PH (1) PH12017500954A1 (ru)
PL (3) PL3075745T3 (ru)
PT (3) PT3489255T (ru)
RS (3) RS54802B1 (ru)
SG (2) SG10201604160WA (ru)
SI (3) SI2673294T1 (ru)
TW (2) TWI577801B (ru)
UA (2) UA113729C2 (ru)
WO (1) WO2012107417A1 (ru)
ZA (1) ZA201305282B (ru)

Families Citing this family (232)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
US9011847B2 (en) 2010-08-13 2015-04-21 Roche Glycart, AG Anti-FAP antibodies and methods of use
SI2673294T1 (sl) 2011-02-10 2016-08-31 Roche Glycart Ag Mutirani polipeptidi interlevkina-2
UA115030C2 (uk) * 2011-03-02 2017-09-11 Рош Глікарт Аг Антитіло, яке зв'язується зі зв'язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (сеа)
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CA3136084A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Intrexon Actobiotics Nv Polycistronic expression system for bacteria
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
AU2013301582B2 (en) 2012-08-07 2018-09-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
CA2887486A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Roche Glycart Ag Removal of cancer cells by circulating virus-specific cytotoxic t-cells using cancer cell targeted mhc class i comprising multi-function proteins
JP6475167B2 (ja) 2012-12-21 2019-02-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィド結合した多価ｍｈｃクラスｉを含む多機能タンパク質
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2945969A1 (en) 2013-01-15 2015-11-25 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
MA38308B1 (fr) * 2013-02-26 2022-09-30 Hoffmann La Roche Molécules de liaison à l'antigène bispécifiques activant des lymphocytes t
EP3444278A1 (en) 2013-02-26 2019-02-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US9546203B2 (en) 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
JP2016531122A (ja) 2013-08-08 2016-10-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュートＴｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 非天然ヌクレオチドの取り込みによるインビトロの核酸の部位特異的な酵素標識のための方法
JP6306201B2 (ja) * 2014-02-06 2018-04-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ インターロイキン−２融合タンパク質及びその使用
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
UA119167C2 (uk) 2014-03-28 2019-05-10 Зенкор, Інк. Біспецифічне антитіло, яке зв'язується з cd38 та cd3
EP3129493B1 (en) 2014-04-09 2021-07-07 The Scripps Research Institute Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters
CN106604932A (zh) 2014-07-10 2017-04-26 诺华公司 人白细胞介素‑2的免疫刺激单克隆抗体
ES2763198T3 (es) * 2014-07-21 2020-05-27 Delinia Inc Moléculas que selectivamente activan las células T reguladoras para el tratamiento de enfermedades autoinmunes
FI3177643T5 (fi) 2014-08-04 2023-11-28 Hoffmann La Roche T-soluja aktivoivia bispesifisiä antigeeniä sitovia molekyylejä
NZ728175A (en) 2014-08-11 2023-03-31 Delinia Inc Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
CA2951604A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 Pablo Umana Combination therapy of tumor-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1
EP3489256B1 (en) 2014-11-14 2021-03-17 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
SI3789402T1 (sl) 2014-11-20 2022-10-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirano zdravljenje z bispecifičnimi molekulami, ki vežejo antigen in aktivirajo celice T, ter antagonisti za vezavo osi PD-1
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CN107406512A (zh) 2014-11-26 2017-11-28 Xencor公司 结合cd3和cd38的异二聚体抗体
DK3233192T3 (da) 2014-12-15 2021-07-19 Univ Washington Sammensætninger og fremgangsmåder til målrettet cytokinindgivelse
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
CN114751989A (zh) 2015-03-31 2022-07-15 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
MA43017A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf
EP3356411B1 (en) 2015-10-02 2021-06-30 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
WO2017077382A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
KR20210016479A (ko) 2015-12-04 2021-02-15 노파르티스 아게 항체 시토카인 그라프트된 조성물 및 면역조절을 위한 사용 방법
KR20180085800A (ko) 2015-12-07 2018-07-27 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체
BR112018003984A2 (pt) * 2015-12-09 2018-09-25 Hoffmann La Roche anticorpos
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
WO2017106767A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
IL259588B2 (en) 2016-01-08 2023-09-01 Hoffmann La Roche Methods for the treatment of cea-positive cancer using pd-1 spindle-binding antagonists and bispecific antibodies against anti-cea and anti-cd3
KR20180100224A (ko) 2016-01-11 2018-09-07 노바르티스 아게 인간 인터루킨-2에 대한 면역-자극 인간화 단일클론 항체, 및 이의 융합 단백질
JP7292877B2 (ja) 2016-01-14 2023-06-19 イントレクソン・アクトバイオテイクス・エヌブイ １型糖尿病を処置するための組成物および方法
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
US11053293B2 (en) 2016-02-05 2021-07-06 Washington University Compositions and methods for targeted cytokine delivery
CN117024599A (zh) 2016-02-05 2023-11-10 奥里尼斯生物科学私人有限公司 双特异性信号传导剂及其用途
EP3426278B1 (en) 2016-03-07 2024-01-03 Vib Vzw Cd20 binding single domain antibodies
UA127308C2 (uk) 2016-03-22 2023-07-19 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Активована протеазою біспецифічна молекула, яка зв'язує т-клітини
JP7105200B2 (ja) 2016-05-13 2022-07-22 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ 標的突然変異体インターフェロン－ベータおよびその使用
CA3023881A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Therapeutic targeting of non-cellular structures
MA45255A (fr) 2016-06-14 2019-04-17 Xencor Inc Anticorps inhibiteurs de points de contrôle bispécifiques
CN109475603B (zh) 2016-06-20 2023-06-13 科马布有限公司 抗pd-l1抗体
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
EP4163293A1 (en) 2016-06-24 2023-04-12 The Scripps Research Institute Novel nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
AU2017290086A1 (en) 2016-06-28 2019-01-24 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3518969A2 (en) 2016-09-28 2019-08-07 Xoma (Us) Llc Antibodies that bind interleukin-2 and uses thereof
JP7022123B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に対する二重特異性抗体
SG11201903302UA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Xencor Inc Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments
CN109952370B (zh) 2016-10-19 2023-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生免疫缀合物的方法
US11084859B2 (en) 2016-10-24 2021-08-10 Orionis Biosciences BV Targeted mutant interferon-gamma and uses thereof
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
AU2017359172A1 (en) * 2016-11-08 2019-05-16 Delinia, Inc. IL-2 variants for the treatment of autoimmune diseases
CU24483B1 (es) * 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
DK3558339T3 (da) * 2016-12-22 2024-02-26 Cue Biopharma Inc T-celle-modulerende multimere polypeptider og fremgangsmåder til anvendelse deraf
EP3576765A4 (en) 2017-02-06 2020-12-02 Orionis Biosciences, Inc. TARGETED ENGINEERING INTERFERON AND USES OF IT
KR102642385B1 (ko) 2017-02-06 2024-03-04 오리오니스 바이오사이언시스 엔브이 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도
US20200010528A1 (en) * 2017-03-15 2020-01-09 Cue Biopharma, Inc. Methods for modulating an immune response
EP3596108A4 (en) 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
EP3606947B1 (en) * 2017-04-03 2022-12-21 F. Hoffmann-La Roche AG Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
PT3606946T (pt) 2017-04-03 2022-10-17 Hoffmann La Roche Imunoconjugados de um anticorpo anti-pd-1 com uma il-2 mutante ou com il-15
AU2018247796A1 (en) * 2017-04-04 2019-08-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to CD40 and to FAP
CN110506059B (zh) 2017-04-05 2023-01-17 豪夫迈·罗氏有限公司 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体
EP3610006B1 (en) * 2017-04-11 2021-05-19 Roche Diagnostics GmbH Mutant reverse transcriptase with increased thermal stability as well as products, methods and uses involving the same
CA3058279A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 F.Hoffmann-La Roche Ag An interleukin-2 immunoconjugate, a cd40 agonist, and optionally a pd-1 axis binding antagonist for use in methods of treating cancer
JP2020521452A (ja) 2017-05-24 2020-07-27 パンディオン・セラピューティクス・インコーポレイテッド 標的化免疫寛容
WO2018215938A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
AU2018274216A1 (en) * 2017-05-24 2019-12-12 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
AU2018300069A1 (en) 2017-07-11 2020-02-27 Synthorx, Inc. Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
WO2019028425A1 (en) * 2017-08-03 2019-02-07 Synthorx, Inc. CONJUGATES OF CYTOKINE FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
WO2019125732A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
JP7336457B2 (ja) * 2017-12-26 2023-08-31 ナンジン、ジェンスクリプト、バイオテック、カンパニー、リミテッド 抗体Ｆｃ領域を主鎖として用いた融合タンパク質二量体及びその使用
AU2019215440A1 (en) 2018-02-05 2020-08-27 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
MA51793A (fr) 2018-02-08 2020-12-16 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène et procédés d'utilisation
CA3115461A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 AskGene Pharma, Inc. Novel cytokine prodrugs
EP3773680A1 (en) * 2018-03-28 2021-02-17 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 conjugates
CA3094112A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
EP3827014A1 (en) * 2018-07-24 2021-06-02 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Il2 agonists
CA3106324C (en) * 2018-08-01 2024-04-02 Nantkwest, Inc. A quadricistronic system comprising a homing receptor or a cytokine, and chimeric antigen receptor for stable genetic modification of cellular immunotherapies
PT3849614T (pt) * 2018-09-11 2024-02-28 Ambrx Inc Conjugados de polipeptídeos de interleucina-2 e suas utilizações
JP7085644B2 (ja) * 2018-09-17 2022-06-16 ジーアイ・イノベイション・インコーポレイテッド Ｉｌ－２タンパク質およびｃｄ８０タンパク質を含む融合タンパク質およびその使用
TW202023542A (zh) 2018-09-18 2020-07-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 組織蛋白酶(cathepsin)S抑制劑之對抗抗藥抗體形成之用途
CA3098930A1 (en) * 2018-09-21 2020-03-26 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Novel interleukin-2 and use thereof
EP3854805A4 (en) * 2018-09-21 2022-08-24 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. NOVEL INTERLEUKIN 2 AND ITS USE
WO2020069398A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Akrevia Therapeutics Inc. Masked cytokine polypeptides
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CA3117212A1 (en) * 2018-10-23 2020-04-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Heterodimeric fc-fused proteins
SG11202104297XA (en) * 2018-10-29 2021-05-28 1Globe Biomedical Co Ltd Novel rationally designed protein compositions
WO2020130300A1 (ko) * 2018-12-21 2020-06-25 한미약품 주식회사 신규 면역 억제 인터루킨 2
AU2019406453A1 (en) 2018-12-21 2021-07-22 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule directed against human PD-1
CN113383013B (zh) * 2018-12-21 2022-11-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素2变体或其衍生物
WO2020127618A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
CA3125529A1 (en) * 2019-01-07 2020-07-16 Inhibrx, Inc. Polypeptides comprising modified il-2 polypeptides and uses thereof
TW202038994A (zh) 2019-01-14 2020-11-01 美商醫格耐免疫治療公司 重組痘瘡病毒及其使用方法
MX2021009259A (es) 2019-02-06 2021-08-24 Synthorx Inc Conjugados de il-2 y metodos de uso del mismo.
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
CN111647068A (zh) * 2019-03-04 2020-09-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素2变体或其衍生物
CN111944008A (zh) * 2019-05-14 2020-11-17 上海盖浦生物科技有限公司 一种突变蛋白的方法以及得到的突变体蛋白
CN111944036A (zh) * 2019-05-14 2020-11-17 上海盖浦生物科技有限公司 一种增殖免疫细胞的突变体蛋白
WO2020234387A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Cytune Pharma IL-2/IL-15Rßy AGONIST DOSING REGIMENS FOR TREATING CANCER OR INFECTIOUS DISEASES
JP2022533702A (ja) 2019-05-20 2022-07-25 パンディオン・オペレーションズ・インコーポレイテッド ＭＡｄＣＡＭ標的化免疫寛容
EP3983432A1 (en) 2019-06-12 2022-04-20 Askgene Pharma, Inc. Novel il-15 prodrugs and methods of use thereof
AU2020292421A1 (en) * 2019-06-14 2022-01-27 Cugene, Inc. Novel interleukin-2 variants and bifunctional fusion molecules thereof
JP2022538784A (ja) 2019-06-14 2022-09-06 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 半合成生物における複製、転写および翻訳のための試薬ならびに方法
TW202115105A (zh) * 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
CN114051500A (zh) 2019-07-02 2022-02-15 豪夫迈·罗氏有限公司 包含白细胞介素-2突变体和抗cd8抗体的免疫缀合物
EP4013775A1 (en) * 2019-08-12 2022-06-22 Askgene Pharma, Inc. Il-2 fusion proteins that preferentially bind il-2ralpha
WO2021055568A1 (en) * 2019-09-19 2021-03-25 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof
US20220340621A1 (en) 2019-09-27 2022-10-27 Intrexon Actobiotics Nv D/B/A Precigen Actobio Treatment of celiac disease
CN114901807B (zh) 2019-11-20 2023-07-11 吉爱希公司 调节性t细胞培养组合物及其用途
CN117660331A (zh) 2019-11-20 2024-03-08 吉爱希公司 用于培养自然杀手细胞的组合物及使用其来生产自然杀手细胞的方法
KR20210061956A (ko) 2019-11-20 2021-05-28 주식회사 지아이셀 T 세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 t 세포의 배양 방법
BR112022010246A2 (pt) * 2019-11-27 2022-09-06 Gi Innovation Inc Composição farmacêutica para o tratamento de câncer compreendendo proteína de fusão compreendendo proteína il-2 e proteína cd80 e inibidor de checkpoint imunológico
BR112022010063A2 (pt) 2019-11-27 2022-09-06 Gi Cell Inc Composição para tratamento anticâncer, compreendendo células nk e proteína de fusão que compreende proteína il-2 e proteína cd80
CN114437198A (zh) 2019-12-17 2022-05-06 北京志道生物科技有限公司 白介素-2衍生物
JP2023507115A (ja) 2019-12-17 2023-02-21 アムジエン・インコーポレーテツド 治療における使用のためのデュアルインターロイキン－２／ｔｎｆ受容体アゴニスト
JP2023510115A (ja) 2019-12-20 2023-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ２アゴニストおよびそれらの使用方法
IL294475A (en) * 2020-01-09 2022-09-01 Pfizer Recombinant cowpox virus
JP2023514010A (ja) 2020-01-10 2023-04-05 ブライト ピーク セラピューティクス エージー 修飾ｉｌ－２ポリペプチドおよびその使用
IL294659A (en) 2020-01-14 2022-09-01 Synthekine Inc Methods and preparations of il2 skewed mutants
KR20220141299A (ko) 2020-01-14 2022-10-19 신테카인, 인크. Il2 오르토로그 및 사용 방법
US11230699B2 (en) 2020-01-28 2022-01-25 Immunitybio, Inc. Chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells targeting EGFR super-family receptors
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
KR102604984B1 (ko) 2020-03-18 2023-11-23 (주)지아이이노베이션 Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 제제
CN115989238A (zh) 2020-03-18 2023-04-18 Gi医诺微新 包含il-2蛋白和cd80蛋白片段或其变体的融合蛋白及其用途
CA3175457A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Gi Innovation, Inc. Pharmaceutical composition for treating cancer, comprising fusion protein comprising il-2 protein and cd80 protein and anticancer drug
AU2021237518A1 (en) 2020-03-19 2022-10-13 Innovent Biologics (Singapore) Pte. Ltd. Interleukin-2 mutant and use thereof
CA3175717A1 (en) * 2020-03-19 2021-09-23 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Interleukin-2 mutant and use thereof
WO2021202675A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 Xilio Development, Inc. Masked il-2 cytokines and their cleavage products
JP2023521238A (ja) 2020-04-15 2023-05-23 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫複合体
EP4139341A1 (en) * 2020-04-21 2023-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-2 variants with reduced binding to il-2 receptor alpha and uses thereof
AU2021259426B2 (en) 2020-04-22 2024-05-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Human interleukin-2 conjugates biased for the interleukin-2 receptor beta gammac dimer and conjugated to a nonpeptidic, water-soluble polymer
EP4149524A1 (en) 2020-05-11 2023-03-22 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy with modified pbmcs and an immunoconjugate
KR20230010251A (ko) 2020-05-13 2023-01-18 보넘 테라퓨틱스, 인크. 단백질 복합체의 조성물 및 그의 사용 방법
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
TW202210502A (zh) 2020-06-03 2022-03-16 丹麥商阿森迪斯腫瘤製藥有限公司 新穎il-2序列及其用途
KR102373965B1 (ko) 2020-06-05 2022-03-15 (주)지아이이노베이션 Ｉｌ-２ 단백질 및 ｃｄ８０ 단백질을 포함하는 융합단백질을 포함하는 방사선 치료 증진용 약학적 조성물
IL296225A (en) 2020-06-19 2022-11-01 Hoffmann La Roche Binding molecules in the fc domain that activate the immune system
PE20231080A1 (es) 2020-06-19 2023-07-17 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y cd19
JP2023531876A (ja) 2020-06-30 2023-07-26 ジーアイ イノベーション， インコーポレイテッド 抗ｌａｇ－３抗体とｉｌ－２とを含む融合タンパク質及びその使用
KR20220014531A (ko) * 2020-07-29 2022-02-07 (주)메디톡스 헤테로이량체 Ｆｃ 융합 단백질, 및 관련 조성물, 용도 및 방법
TW202221031A (zh) 2020-07-30 2022-06-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 血清半衰期延長之pd-l1抑制多肽
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
WO2022059794A1 (ja) * 2020-09-18 2022-03-24 地方独立行政法人 宮城県立病院機構 Ｉｌ－２変異体タンパク質及びこれを含む医薬
CN114380919A (zh) * 2020-10-18 2022-04-22 北京志道生物科技有限公司 经修饰的il-2分子及其用途
CN114369153A (zh) * 2020-10-18 2022-04-19 北京志道生物科技有限公司 一种白介素-2突变体
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
WO2022090202A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 Cytune Pharma IL-2/IL-15RBβү AGONIST FOR TREATING NON-MELANOMA SKIN CANCER
IL302321A (en) 2020-10-26 2023-06-01 Cytune Pharma IL-2/IL-15RBY agonist for the treatment of squamous cell carcinoma
WO2022094275A1 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Fusion proteins for the treatment of disease
CN114437228B (zh) * 2020-10-30 2024-02-06 中国科学院生物物理研究所 一种il-2与抗体亚单位构成的双功能融合蛋白
EP4245768A4 (en) 2020-11-13 2024-05-29 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A VARIANT OF HUMAN INTERLEUKIN 2 OR A DERIVATIVE THEREOF AND ITS USE
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
PE20232045A1 (es) 2020-12-04 2023-12-27 Hoffmann La Roche Polipeptidos de interleucina-2 mutante dependientes del ph
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
JP2024503703A (ja) * 2021-01-19 2024-01-26 セネカ セラピューティクス、インク． 武装型セネカバレーウイルス腫瘍溶解療法組成物およびその方法
CN117083084A (zh) 2021-03-09 2023-11-17 豪夫迈·罗氏有限公司 Pd-1靶向il-2变体免疫缀合物和fap/4-1bb结合分子的组合疗法
JP2024512382A (ja) 2021-03-09 2024-03-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－１標的化ｉｌ－２バリアント免疫コンジュゲートと抗ｔｙｒｐ１／抗ｃｄ３二重特異性抗体の併用療法
WO2022192403A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
CN117321087A (zh) 2021-03-26 2023-12-29 先天制药公司 包含与细胞因子融合用于nk细胞衔接的nkp46结合位点、癌抗原结合位点的多特异性蛋白质
JP2024512709A (ja) 2021-03-30 2024-03-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト プロテアーゼ活性化ポリペプチド
WO2022214653A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
CN116854802A (zh) * 2021-04-13 2023-10-10 苏州复融生物技术有限公司 白介素2突变体及其应用
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN117616050A (zh) 2021-06-09 2024-02-27 先天制药公司 与nkp46、细胞因子受体、肿瘤抗原和cd16a结合的多特异性蛋白质
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258673A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific antibodies binding to cd20, nkp46, cd16 and conjugated to il-2
WO2022266467A2 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Recombinant histone polypeptide and uses thereof
AU2022306145A1 (en) 2021-07-09 2024-02-01 Bright Peak Therapeutics Ag Antibody conjugates and manufacture thereof
US20230201365A1 (en) 2021-07-09 2023-06-29 Bright Peak Therapeutics Ag Modified cd20 antibodies and uses thereof
EP4366781A1 (en) 2021-07-09 2024-05-15 Bright Peak Therapeutics AG Checkpoint inhibitors conjugated to il-2, and uses thereof
US20230181754A1 (en) 2021-07-09 2023-06-15 Bright Peak Therapeutics Ag Modified checkpoint inhibitors and uses thereof
CA3225815A1 (en) 2021-08-13 2023-02-16 Cytune Pharma Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer
WO2023025194A1 (zh) 2021-08-24 2023-03-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 Fap/cd40结合分子及其医药用途
WO2023046156A1 (en) * 2021-09-26 2023-03-30 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Il-2 variants and fusion proteins thereof
CA3234731A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag New interleukin-7 immunoconjugates
WO2023062048A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Alternative pd1-il7v immunoconjugates for the treatment of cancer
CU20210104A7 (es) 2021-12-21 2023-07-12 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteína agonista de interleucina 2
KR20230095612A (ko) * 2021-12-22 2023-06-29 한미약품 주식회사 신규 면역 억제 인터루킨 2 (Interleukin 2) 아날로그
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
US20230303650A1 (en) * 2022-01-21 2023-09-28 Aetio Biotherapy, Inc. Immunoconjugates of Interlukin-2 Mutant Polypeptides with Antibodies
JP2024515912A (ja) * 2022-02-21 2024-04-11 シーティーセルズ、インコーポレイテッド 抗原結合ドメインおよびサイトカイン三量体ドメインを含む融合タンパク質
US20240132563A1 (en) 2022-02-23 2024-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Bifunctional cytokine compositions
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023245097A2 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Cephalon Llc Anti-pd-1 antibody-attenuated il-2 immunoconjugates and uses thereof
WO2024002363A1 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Beijing Neox Biotech Limited Il-2 polypeptides and methods of use
US11773160B1 (en) 2022-08-05 2023-10-03 Anaveon AG Immune-stimulating IL-2 fusion proteins
WO2024037572A1 (en) * 2022-08-16 2024-02-22 Kine Biotech Co., Ltd. Interleukin-2 variants and their uses in treating cancers
WO2024068705A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated polypeptides
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030124678A1 (en) * 2001-08-13 2003-07-03 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
US20030166163A1 (en) * 2001-12-04 2003-09-04 Emd Lexigen Research Center Corp. Immunocytokines with modulated selectivity
US20040175357A1 (en) * 1998-05-15 2004-09-09 Shanafelt Armen B. IL-2 selective agonists and antagonists
WO2005086798A2 (en) * 2004-03-05 2005-09-22 Chiron Corporation Improved interleukin-2 muteins
WO2008003473A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7802170A (nl) 1977-04-18 1978-10-20 Hitachi Metals Ltd Sierraad.
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4604377A (en) 1984-03-28 1986-08-05 Cetus Corporation Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19607751A1 (de) 1996-02-29 1997-09-04 Henkel Kgaa Neue Aminophenol-Derivate und deren Verwendung
CA2269204C (en) 1996-10-18 2012-01-24 Genentech, Inc. Anti-erbb2 antibodies
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
IL136544A0 (en) 1997-12-05 2001-06-14 Scripps Research Inst Humanization of murine antibody
ES2532910T3 (es) 1998-04-02 2015-04-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6455677B1 (en) 1998-04-30 2002-09-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPα-specific antibody with improved producibility
EP0953639A1 (en) 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
PT1156823E (pt) 1999-02-12 2009-01-08 Scripps Research Inst Métodos para tratamento de tumores e metástases utilizando uma combinação de terapias anti-angiogénicas e imunitárias
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU2001256325A1 (en) 2000-03-17 2001-09-24 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Human and humanized fap-alpha-specific antibodies
JP4936299B2 (ja) 2000-08-21 2012-05-23 メレクシス・テクノロジーズ・ナムローゼフェンノートシャップ 磁場方向検出センサ
US7396917B2 (en) 2000-12-05 2008-07-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Rationally designed antibodies
AU2002258778C1 (en) 2001-04-13 2008-12-04 Biogen Ma Inc. Antibodies to VLA-1
HUP0700103A3 (en) 2001-08-03 2012-09-28 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
US8367374B2 (en) 2003-01-22 2013-02-05 Roche Glycart Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
JP2007515185A (ja) 2003-12-22 2007-06-14 カイロン コーポレイション 免疫応答障害に対する処置ストラテジーのための診断法としてのＦｃレセプター多型の使用
CN1930300A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 希龙公司 预测患者治疗药物耐受性的体外试验系统
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
JP2008543278A (ja) 2005-05-11 2008-12-04 フィロゲン エスピーエー フィブロネクチンｅｄ−ｂに対する抗体ｌ１９とインターロイキン１２との融合タンパク質
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
WO2007128563A1 (en) 2006-05-08 2007-11-15 Philogen Spa Antibody-targeted cytokines for therapy
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
PT2066796E (pt) 2006-09-20 2011-10-11 Mt Biomethan Gmbh Procedimento e dispositivo para a separação do metano e do dióxido de carbono do biogás
JP2010510794A (ja) 2006-11-28 2010-04-08 ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途
US20090252729A1 (en) 2007-05-14 2009-10-08 Farrington Graham K Single-chain Fc (scFc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
AU2008278803A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to KDR and uses thereof - 035
EP2018877A1 (en) 2007-07-27 2009-01-28 The Procter and Gamble Company Absorbent article comprising water-absorbing polymeric particles and method for the production thereof
WO2009061853A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
ES2564523T3 (es) 2007-12-19 2016-03-23 Janssen Biotech, Inc. Diseño y generación de bibliotecas de presentación en fago por pIX de novo humanas mediante fusión con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y métodos
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
EP2085095B1 (en) 2008-01-17 2012-03-07 Philogen S.p.A. Combination of an anti-EDb fibronectin antibody-IL-2 fusion protein, and a molecule binding to B cells, B cell progenitors and/or their cancerous counterpart
CN102119175A (zh) 2008-04-10 2011-07-06 Ibc药品公司 采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法
AU2009248105B2 (en) 2008-05-13 2013-10-31 Molmed S.P.A. Conjugates for the treatment of mesothelioma
MX2011007647A (es) 2009-01-21 2011-09-01 Amgen Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
MX337590B (es) * 2009-01-29 2016-03-11 Medimmune Llc Anticuerpos anti il-6 humanos, con semivida in vivo prolongada y su uso en el tratamiento de oncologia, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias.
EP2411416A1 (en) 2009-03-24 2012-02-01 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Anti-mesothelin antibodies
WO2010117448A2 (en) 2009-04-05 2010-10-14 Provenance Biopharmaceuticals Corp. Chimeric immunocytokines and methods of use thereof
EP2448599A1 (en) 2009-06-30 2012-05-09 Philogen S.p.A. Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer
JP5764127B2 (ja) 2009-08-17 2015-08-12 ロシュ グリクアート アーゲー 標的化イムノコンジュゲート
EP2473532B1 (en) 2009-08-31 2017-06-21 Roche Glycart AG Affinity-matured humanized anti cea monoclonal antibodies
PL2483310T3 (pl) 2009-09-29 2015-01-30 Roche Glycart Ag Bispecyficzne przeciwciała agonistyczne dla receptora śmierci
US9011847B2 (en) 2010-08-13 2015-04-21 Roche Glycart, AG Anti-FAP antibodies and methods of use
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
SI2673294T1 (sl) 2011-02-10 2016-08-31 Roche Glycart Ag Mutirani polipeptidi interlevkina-2
UA115030C2 (uk) 2011-03-02 2017-09-11 Рош Глікарт Аг Антитіло, яке зв'язується зі зв'язаним з мембраною карциноембріональним антигеном (сеа)
ES2692268T3 (es) 2011-03-29 2018-12-03 Roche Glycart Ag Variantes de Fc de anticuerpo
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
AU2013301582B2 (en) 2012-08-07 2018-09-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
EA201500208A1 (ru) 2012-08-08 2015-07-30 Роше Гликарт Аг Слитые белки, содержащие интерлейкин-10, и их применения
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP2994487B1 (en) 2013-05-07 2019-10-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules
CA2951604A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Pablo Umana Combination therapy of tumor-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040175357A1 (en) * 1998-05-15 2004-09-09 Shanafelt Armen B. IL-2 selective agonists and antagonists
US20030124678A1 (en) * 2001-08-13 2003-07-03 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
US20030166163A1 (en) * 2001-12-04 2003-09-04 Emd Lexigen Research Center Corp. Immunocytokines with modulated selectivity
WO2005086798A2 (en) * 2004-03-05 2005-09-22 Chiron Corporation Improved interleukin-2 muteins
WO2008003473A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHANAFELT A B,ET AL: "A T-cell-selective interleukin 2 mutein exhibits potent antitumor activity and is well tolerated in vivo", NATURE BIOTECHNOLOGY, GALE GROUP INC., NEW YORK, vol. 18, no. 11, 1 November 2000 (2000-11-01), New York, pages 1197 - 1202, XP002307306, ISSN: 1087-0156, DOI: 10.1038/81199 *

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20211318T1 (hr) 2021-11-26
EP3075745A1 (en) 2016-10-05
IL252230B (en) 2019-10-31
ES2883371T3 (es) 2021-12-07
CA2824253A1 (en) 2012-08-16
PL3075745T3 (pl) 2019-07-31
PE20181077A1 (es) 2018-07-05
PE20140303A1 (es) 2014-03-22
DK3489255T3 (da) 2021-08-23
EP2673294B1 (en) 2016-04-27
MX2013009226A (es) 2013-12-06
RS57767B1 (sr) 2018-12-31
CN103492411B (zh) 2016-12-07
CO6741186A2 (es) 2013-08-30
US20120244112A1 (en) 2012-09-27
EP3075745B1 (en) 2018-09-05
CY1117842T1 (el) 2017-05-17
HUE040326T2 (hu) 2019-03-28
MX356675B (es) 2018-06-08
HRP20160917T1 (hr) 2016-09-23
SI3489255T1 (sl) 2021-11-30
BR112013018932A2 (pt) 2017-05-02
CN105440123A (zh) 2016-03-30
US20190077881A1 (en) 2019-03-14
JP2014506793A (ja) 2014-03-20
IL269687B (en) 2022-08-01
TW201718029A (zh) 2017-06-01
AU2015249085B2 (en) 2017-12-14
PL2673294T3 (pl) 2016-11-30
KR101852245B1 (ko) 2018-04-25
EP2673294A1 (en) 2013-12-18
US20180142037A1 (en) 2018-05-24
EP3489255A1 (en) 2019-05-29
US10323098B2 (en) 2019-06-18
HUE029139T2 (hu) 2017-02-28
MY190604A (en) 2022-04-27
PT3075745T (pt) 2018-11-14
EP3971206A1 (en) 2022-03-23
WO2012107417A1 (en) 2012-08-16
PH12017500954B1 (en) 2017-11-27
EA201300896A1 (ru) 2014-02-28
TWI577801B (zh) 2017-04-11
US11111312B2 (en) 2021-09-07
BR112013018932B1 (pt) 2020-11-17
CL2013001987A1 (es) 2014-01-31
DK3075745T3 (en) 2018-11-26
CA2824253C (en) 2019-09-17
HUE055284T2 (hu) 2021-11-29
JP5878182B2 (ja) 2016-03-08
UA117294C2 (uk) 2018-07-10
ES2579987T3 (es) 2016-08-18
HRP20181736T1 (hr) 2018-12-28
PT2673294T (pt) 2016-07-07
AR085335A1 (es) 2013-09-25
PL3489255T3 (pl) 2021-11-22
US20190322765A1 (en) 2019-10-24
MA35803B1 (fr) 2014-12-01
US10184009B2 (en) 2019-01-22
US9266938B2 (en) 2016-02-23
LT3489255T (lt) 2021-08-25
ECSP13012815A (es) 2013-10-31
ZA201305282B (en) 2016-07-27
SI3075745T1 (sl) 2018-12-31
SG192673A1 (en) 2013-09-30
UA113729C2 (xx) 2017-03-10
HK1217020A1 (zh) 2016-12-16
IL252230A0 (en) 2017-07-31
JP2015229676A (ja) 2015-12-21
RS62238B1 (sr) 2021-09-30
CN105440123B (zh) 2020-10-09
SI2673294T1 (sl) 2016-08-31
NZ611749A (en) 2015-08-28
RS54802B1 (sr) 2016-10-31
CN112210000A (zh) 2021-01-12
DK2673294T3 (en) 2016-05-30
TW201237165A (en) 2012-09-16
EP3489255B1 (en) 2021-06-16
US20160208017A1 (en) 2016-07-21
PH12017500954A1 (en) 2017-11-27
AU2012215573B2 (en) 2015-11-26
KR101667096B1 (ko) 2016-10-18
PT3489255T (pt) 2021-08-13
MX340671B (es) 2016-07-20
AU2015249085A1 (en) 2015-11-12
IL269687A (en) 2019-11-28
JP6155300B2 (ja) 2017-06-28
TWI666027B (zh) 2019-07-21
SG10201604160WA (en) 2016-07-28
CN103492411A (zh) 2014-01-01
NZ710742A (en) 2017-04-28
AU2012215573A1 (en) 2013-05-02
KR20150092367A (ko) 2015-08-12
IL227095B (en) 2018-06-28
LT3075745T (lt) 2018-11-26
ES2694564T3 (es) 2018-12-21
CR20130314A (es) 2013-08-09
KR20130118363A (ko) 2013-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017202437B2 (en) Novel immunoconjugates
DK3075745T3 (en) Mutated interleukin-2 polypeptides
KR102473028B1 (ko) 항-tim-3 항체 및 조성물
KR102042246B1 (ko) 인터류킨-2 융합 단백질 및 이의 용도
KR102648966B1 (ko) Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
KR20210134300A (ko) 항-sars-cov-2 스파이크 당단백질 항체 및 항원-결합 단편
KR102361237B1 (ko) 코일드 코일 면역글로불린 융합 단백질 및 이것의 조성물
KR101901458B1 (ko) Ｔｃｒ 복합체 면역치료제
KR20210013156A (ko) 항-cd33 항체, 항-cd33/항-cd3 이중특이성 항체, 및 이의 용도
KR20150041628A (ko) 인터루킨-2 융합 단백질 및 그의 용도
CN109311973A (zh) 含有c端融合的tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
CN110719920A (zh) 蛋白质异二聚体及其用途
KR20180054877A (ko) 공자극 tnf 수용체에 대해 4가를 갖는 이중특이적 항체
CN107206072A (zh) T细胞活化性双特异性抗原结合分子CD3 ABD叶酸受体1(FolR1)和PD‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
KR20100021601A (ko) 단일-쇄 Ｆｃ(ＳｃＦｃ) 부분, 이를 포함하는 결합 폴리펩타이드, 및 이에 관련된 방법
KR20150122203A (ko) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
KR20110043643A (ko) 인터루킨 6 면역치료제
KR20220040483A (ko) 칼리크레인 관련 펩티다제 2 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도
KR20230017815A (ko) 항-sars-cov-2 스파이크 당단백질 항체 및 항원-결합 단편
KR20230027300A (ko) Il-10 뮤테인 및 이의 융합 단백질
KR20230017841A (ko) Cd3 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도
RU2795232C2 (ru) Комбинированные лекарственные средства, нацеленные на pd-1, tim-3 и lag-3
KR20230165829A (ko) 이중특이적 분자 및 관련 조성물 및 방법
EA044746B1 (ru) АНТИТЕЛА И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ФРАГМЕНТЫ ПРОТИВ ГЛИКОПРОТЕИНА ШИПОВ SARS-CoV-2

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM