KR20150092367A - 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 면역치료제로 사용하기 위한, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대해 감소된 친화성을 나타내는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 제조하는 방법, 그를 포함하는 약학 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드{MUTANT INTERLEUKIN-2 POLYPETIDES}
본 발명은 일반적으로 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 면역치료제로 사용하기 위한 개선된 성질을 나타내는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 제조 방법, 그를 포함하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
T 세포 성장 인자(TCGF)로도 알려진 인터루킨-2(IL-2)는 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중심 역할을 하는 15.5 kDa의 구형 당단백질이다. 상기 인터루킨-2는 133개 아미노산의 길이를 가지며, 그 기능에 필수적인 4차 구조를 형성하는 4개의 역평행, 양친매성 α-나선으로 이루어진다[Smith, Science 240, 1169-1176 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992)]. 상이한 종들로부터의 IL-2의 서열들은 NCBI 참조 서열 번호 NP000577(인간), NP032392(마우스), NP446288(래트) 또는 NP517425(침팬지) 하에 확인된다.
IL-2는, 그의 상이한 결합이 IL-2에 대한 친화성이 다른 수용체 형태들을 생성할 수 있는 3개 이하의 개별적 서브유니트(subunit)로 이루어진 IL-2 수용체(IL-2R)에 결합함으로써 그 작용을 매개한다. α(CD25), β(CD122) 및 γ(γC, CD132) 서브유니트의 결합은 IL-2에 대한 삼량체성 고-친화성 수용체를 제공한다. β 및 γ 서브유니트로 이루어진 이량체성 IL-2 수용체는 중간-친화성 IL-2R로 지칭된다. α 서브유니트는 단량체성 저-친화성 IL-2 수용체를 형성한다. 이량체성 중간-친화성 IL-2 수용체는 삼량체성 고-친화성 수용체보다 약 100배 더 낮은 친화성하에 IL-2에 결합하지만, 이량체성 및 삼량체성 IL-2 수용체 변이체는 둘 다 IL-2 결합시 신호를 전달할 수 있다[Minami et al., Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993)]. 따라서, α-서브유니트, CD25는 IL-2 신호전달에 필수적이 아니다. α-서브유니트는 그 수용체에 대한 고-친화성 결합을 제공하는 반면, β-서브유니트, CD122 및 γ-서브유니트는 신호 전달에 결정적이다[Krieg et al., Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11911 (2010)]. CD25를 포함하는 삼량체성 IL-2 수용체는 (휴지) CD4+ 포크헤드 박스(forkhead box) P3(FoxP3)+ 조절 T(Treg) 세포에 의해 발현된다. 이들은 또한 통상적인 활성화 T 세포 상에서 일시적으로 유도되는 반면, 휴지 상태에서 상기 세포들은 오직 이량체 IL-2 수용체만을 발현시킨다. Treg 세포는 생체내에서 지속적으로 최고 수준의 CD25를 발현시킨다[Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-1151 (2005)].
IL-2는 활성화 T-세포, 특히 CD4+ 헬퍼 T 세포에 의해 주로 합성된다. IL-2는 T 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구(CTL)의 생성 및 말초혈 림프구의 세포독성 세포 및 림포카인-활성화 킬러(LAK) 세포로의 분화를 유도하며, B-세포의 증식 및 분화 및 B-세포에 의한 면역글로불린의 합성을 촉진하고, 자연 살해(natural killer, NK) 세포의 생성, 증식 및 활성화를 자극한다(예를 들면, 문헌 [Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009); Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008); Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-479 (2008)]에 개관되어 있음).
생체내에서 림프구 개체군을 증대시키고 상기 세포의 작동인자 기능을 증대시키는 그의 능력은 IL-2에 항종양 효과를 부여하여 IL-2 면역치료가 특정 전이성 암에 대해 유력한 치료 선택안이 되게한다. 그 결과, 고용량 IL-2 치료가 전이성 신세포암 및 악성 흑색종을 갖는 환자에서의 사용에 승인되었다.
그러나, IL-2는, 작동인자 세포의 증대 및 활성을 매개할 뿐 아니라 말초 면역 관용(immune tolerance)을 유지하는데 중요하게 수반된다는 점에서 면역 반응에서 이중적 기능을 갖는다.
말초 자가-관용의 기초가 되는 주요 메카니즘은 T 세포에서 IL-2 유도된 활성화-유도성 세포 사멸(activation-induced cell death, AICD)이다. AICD는, 완전 활성화된 T 세포가 세포 표면-발현된 세포사멸 수용체(death receptor), 예를 들면, CD95(Fas로도 알려짐) 또는 TNF 수용체의 맞물림(engagement)을 통해 프로그램된 세포 사멸이 일어나게 되는 과정이다. 증식동안 고-친화성 IL-2 수용체를 발현하는(IL-2에 대한 사전 노출후) 항원-활성화된 T 세포가 T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체를 통해 항원으로 재-자극될 때, Fas 리간드(FasL) 및/또는 종양 괴사 인자(TNF)의 발현이 유도되어, 세포가 Fas-매개 세포자멸에 민감해지게 된다. 상기 과정은 IL-2 의존성이며[Lenardo, Nature 353, 858-861 (1991)], STAT5를 통해 매개된다. T 림프구에서 AICD의 과정에 의해, 관용은 자가-항원에 이루어질 뿐 아니라, 종양 항원과 같은 숙주의 구조물의 일부가 명백하게 아닌 지속성(persistent) 항원에 이루어질 수 있다.
게다가, IL-2는 또한 억제 T 세포로도 알려져 있는 말초 CD4+ CD25+ 조절 T(Treg) 세포[Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-1151 (2005); D'Cruz and Klein, Nature Immnol 6, 1152-1159 (2005); Maloy and Powrie, Nature Immnol 6, 1171-1172 (2005)]의 유지에도 관련된다. 이들은, T 세포 도움 및 활성화를 억제함으로써 세포-세포 접촉을 통해서 또는 IL-10 또는 TGF-β와 같은 면역억제 사이토카인의 방출을 통해서, 작동인자 T 세포가 그의 (자가-) 표적을 파괴하는 것을 억제한다. Treg 세포의 결핍은 IL-2 유도성 항-종양 면역성을 증대시키는 것으로 밝혀졌다[Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423 (2007)].
그러므로, IL-2는 종양 성장을 억제하는데 최적이 아닌데, 그 이유는 IL-2의 존재하에서, 생성된 CTL이 종양을 자신으로 인식해서 AICD가 일어날 수 있거나 또는 면역 반응이 IL-2 의존성 Treg 세포에 의해 억제될 수 있기 때문이다.
IL-2 면역치료에 관한 다른 관심사는 재조합 인간 IL-2 치료에 의해 발생되는 부작용이다. 고용량 IL-2 치료를 받은 환자는 흔히 심각한 심혈관, 폐, 신장, 간, 위장, 신경, 피부, 혈액 및 전신적인 부작용을 경험하며, 이것은 집중적인 모니터링 및 입원환자(in-patient) 관리를 요한다. 상기 부작용의 대부분은, 여러 장기에서 체액 혈관외유출(예를 들면, 폐 및 피부 부종 및 간세포 손상을 야기) 및 혈관내 체액 고갈(혈압 강하 및 심박수의 상호보완적 증가 야기)을 유발하는 혈관 투과도의 병리학적 증가인 소위 혈관(또는 모세관) 누출 증후군(VLS)의 발생에 의해 설명될 수 있다. IL-2의 투여중단 외에 다른 VLS의 치료법은 없다. 그러나, 차선의 치료 결과를 감수하고, VLS를 피하기 위해 저용량 IL-2 요법을 환자에서 시험하였다. VLS는 전염증성(proinflammatory) 사이토카인의 방출에 의해, 예를 들면, IL-2 활성화된 NK 세포로부터 종양 괴사 인자(TNF)-α의 방출에 의해 야기되는 것으로 생각되었으나, 최근에 IL-2 유도성 폐 부종은, 낮은 수준 내지 중간 수준의 기능성 αβγ IL-2 수용체를 발현한 폐 내피 세포에 대한 IL-2의 직접 결합으로부터 야기된 것으로 밝혀졌다[Krieg et al., Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11911 (2010)].
IL-2 면역치료와 관련된 상기 문제들을 해결하기 위해 여러가지 접근방법들이 취해졌다. 예를 들면, IL-2와 특정 항-IL-2 단클론성 항체와의 조합은 생체내에서 IL-2의 치료 효과를 증대시키는 것으로 밝혀졌다[Kamimura et al., J Immunol 177, 306-314 (2006); Boyman et al., Science 311, 1924-1927 (2006)]. 대안적인 접근방법에서는, 그의 독성을 감소시키고/시키거나 그의 효능을 증가시키기 위해 IL-2를 다양한 방법으로 돌연변이시켰다. 휴 등(Hu et al.)(문헌 [Blood 101, 4853-4861 (2003)], 미국 특허 공개공보 2003/0124678 호)은 IL-2의 위치 38에서의 아르기닌 잔기를 트립토판으로 치환시켜 IL-2의 혈관투과 활성을 제거하였다. 샤나펠트 등(Shanafelt et al.)(문헌 [Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)])은 아스파라긴 88을 아르기닌으로 돌연변이시켜 NK 세포에 비해 T 세포에 대한 선택성을 증대시켰다. 히튼 등(Heaton et al.)(문헌 [Cancer Res 53, 2597-2602 (1993)]; 미국 특허 제 5,229,109 호)은 2개의 돌연변이, Arg38Ala 및 Phe421Lys를 도입시켜 NK 세포로부터의 전염증성 사이토카인의 분비를 감소시켰다. 길리스 등(Gillies et al.)(미국 특허 공개공보 2007/0036752 호)은 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 친화성에 기여하는 IL-2의 3개의 잔기를 치환(Asp20Thr, Asn88Arg 및 Gln126Asp)시켜 VLS를 감소시켰다. 길리스 등(WO 2008/0034473 호)은 또한 IL-2와 CD25의 경계면을 아미노산 치환 Arg38Trp 및 Phe42Lys에 의해 돌연변이시켜 CD25와의 상호작용 및 효능을 증대시키기 위한 Treg 세포의 활성화를 감소시켰다. 동일한 목적으로, 위트럽 등(Wittrup et al.)(WO 2009/061853 호)은 CD25에 대해 증대된 친화성을 갖지만 수용체는 활성화시키지 않으므로 길항물질로 작용하는 IL-2 돌연변이체를 생성하였다. 도입된 돌연변이는 수용체의 β- 및/또는 γ-서브유니트와의 상호작용을 방해하는 것을 목적으로 하였다.
그러나, 공지된 IL-2 돌연변이체 중 어느 것도 IL-2 면역치료와 관련된 상기 언급한 문제들, 즉, VLS의 유도에 의해 야기된 독성, AICD의 유도에 의해 야기된 종양 내성, 및 Treg 세포의 활성화에 의해 야기된 면역억제 모두를 해결한 것으로 밝혀지지는 않았다. 따라서, 당해 분야에 IL-2 단백질의 치료적 유용성을 더 향상시킬 필요가 남아 있다.
본 발명은, 부분적으로, 삼량체성 고-친화성 IL-2 수용체의 α-서브유니트와 IL-2의 상호작용이 IL-2 면역치료와 관련된 문제들의 원인이 된다는 인식을 기초로 한다.
따라서, 첫번째 양태에서, 본 발명은, 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고, 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 제 1 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드를 제공한다. 한 태양에서, 상기 제 1 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 72에 상응하는 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 1 아미노산 돌연변이는 L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 특정한 태양에서, 상기 제 1 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 L72G이다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는, 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고, 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 제 2 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 35, 38, 42, 43 및 45에 상응하는 위치들로부터 선택된 위치에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42에 상응하는 위치에 존재한다. 보다 특정 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R 및 F42K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 F42A이다. 특정 태양에서, 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드는, 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고, 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 제 3의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 태양에서, 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드는, 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고, 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 3개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 이때 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42, 45 및 72에 상응하는 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 특정 태양에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G이다. 특정 태양에서, 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드는 또한 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 태양에서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 아미노산 돌연변이는 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 특정 태양에서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 돌연변이는 T3A이다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 필수적으로 전장(full-length) IL-2 분자, 특히 인간 전장 IL-2 분자이다.
본 발명은 또한 비-IL-2 잔기에 결합된 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드를 제공한다. 특정 태양에서, 상기 비-IL-2 잔기는 표적화 잔기이다. 특정 태양에서, 상기 비-IL-2 잔기는 항원 결합 잔기이다. 한 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 항체이다. 또 다른 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 항체 단편이다. 보다 특정한 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 Fab 분자 및 scFv 분자로부터 선택된다. 특정 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 Fab 분자이다. 또 다른 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 scFv 분자이다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 및 제 2 비-IL-2 잔기에 결합된다. 한 상기 태양에서, 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드는 상기 제 1 비-IL-2 잔기와 카복시-말단 펩티드 결합을, 및 상기 제 2 비-IL-2 잔기와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 면역글로불린 분자이다. 보다 특정한 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 IgG 부류, 특히 IgG1 서브클래스의 면역글로불린 분자이다. 특정 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경 중에 제공된 항원, 특히 섬유아세포 활성화 단백질(Fibroblast Activation Protein, FAP), 테나신-C의 A1 도메인(A1 domain of Tenascin-C, TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(Extra Domain B of Fibronectin, EDB), 암태아성 항원(Carcinoembryonic Antigen, CEA) 및 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(Melanoma-associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan, MCSP)의 군에서 선택된 항원에 대해 유도된다.
본 발명에 의하면 또한 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드, 및 항원 결합 잔기를 포함하는 면역접합체가 제공된다. 본 발명에 따른 면역접합체의 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 상기 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 특정 태양에서, 면역접합체는 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기를 포함한다. 한 상기 태양에서, 본 발명에 따른 면역접합체에 포함된 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 항원 결합 잔기는 i) 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 ii) 상기 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 태양에서, 본 발명에 따른 면역접합체에 포함된 항원 결합 잔기는 항체이고, 또 다른 태양에서 상기 항원 결합 잔기는 항체 단편이다. 특정 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 Fab 분자 및 scFv 분자로부터 선택된다. 특정 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 Fab 분자이다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 면역글로불린 분자이다. 보다 특정한 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 IgG 부류, 특히 IgG1 서브클래스의 면역글로불린 분자이다. 특정 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경중에 제공된 항원, 특히 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암태아성 항원(CEA) 및 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)의 군에서 선택된 항원에 대해 유도된다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 제조 방법, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물, 및 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 사용하는 방법도 제공된다.
특히, 본 발명은 질환 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 질환은 암이다. 특정 태양에서, 상기 개체는 인간이다.
본 발명에는 또한 질환 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 용도가 포함된다.
또한, 개체에게 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 질환은 바람직하게는 암이다.
또한, 개체에게 본원에 기술된 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 면역계를 자극하는 방법이 제공된다.
도 1은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는, Fab-IL-2-Fab(A) 및 IgG-IL-2(B) 면역접합체 구성형태를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 네이키드(naked) IL-2 야생형 구조물의 정제를 나타낸 것이다. (A) 야생형 네이키드 IL-2에 대한 His 표지 정제의 크로마토그램; (B) 정제된 단백질의 SDS PAGE(8 내지 12% 비스-트리스(Bis-Tris)(뉴페이지(NuPage), 인비트로겐(Invitrogen)), MES 분리 완충액(running buffer)).
도 3은 네이키드 IL-2 야생형 구조물의 정제를 나타낸 것이다. (A) 야생형 IL-2에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램; (B) 정제된 단백질의 SDS PAGE(8 내지 12% 비스-트리스(뉴페이지, 인비트로겐), MES 분리 완충액).
도 4는 슈퍼덱스(Superdex) 75, 10/300 GL 상에서 측정한 바와 같은 야생형 IL-2에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 나타낸 것이다. 풀(pool) 1은 74%의 23 kDa 종 및 26%의 20 kDa 종을 포함하고, 풀 2는 40%의 22 kDa 종 및 60%의 20 kDa 종을 포함한다.
도 5는 네이키드 IL-2 4중(quadruple) 돌연변이 구조물의 정제를 나타낸 것이다. (A) IL-2 4중 돌연변이체에 대한 His 표지 정제의 크로마토그램; (B) 정제된 단백질의 SDS PAGE(8 내지 12% 비스-트리스(뉴페이지, 인비트로겐), MES 분리 완충액).
도 6은 네이키드 IL-2 4중 돌연변이 구조물의 정제를 나타낸 것이다. (A) IL-2 4중 돌연변이체에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램; (B) 정제된 단백질의 SDS PAGE(8 내지 12% 비스-트리스(뉴페이지, 인비트로겐), MES 분리 완충액).
도 7은 슈퍼덱스 75, 10/300 GL 상에서 측정한 바와 같은 IL-2 4중 돌연변이체에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그래피(풀 2, 20 kDa)를 나타낸 것이다.
도 8은 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 29B11-기본 Fab-IL-2-Fab에 의한 IL-2R 및 인간 FAP에 대한 동시 결합을 나타낸 것이다. (A) SPR 분석의 구성; (B) SPR 센서그램(sensorgram).
도 9는 용액중에서, 프로루킨(Proleukin)과 비교한, 야생형 또는 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 4G8-기본 Fab-IL-2-Fab에 의한 NK92 세포에 의한 IFN-γ 방출의 유도를 나타낸 것이다.
도 10은 용액중에서, 프로루킨과 비교한, 야생형 또는 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 4G8-기본 Fab-IL-2-Fab에 의한 분리된 NK92 세포(맨 아래) 증식의 유도를 나타낸 것이다.
도 11은 용액중에서, 프로루킨과 비교한, 야생형 또는 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 4G8-기본 Fab-IL-2-Fab에 의한 활성화 CD3+ T 세포 증식의 유도를 나타낸 것이다.
도 12는 용액중에서, 프로루킨과 비교한, 야생형 또는 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 4G8-기본 Fab-IL-2-Fab에 의한 과-자극된 T 세포의 활성화 유도성 세포 사멸(AICD)의 유도를 나타낸 것이다.
도 13은 용액중에서, 프로루킨과 비교한, 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 4G8-기본 Fab-IL-2-Fab를 사용한, 용액중 포스포-STAT5 FACS 분석을 나타낸 것이다. (A) 조절 T 세포(CD4+CD25+FOXP3+); (B) CD8+ T 세포(CD3+CD8+); (C) CD4+ T 세포(CD4+CD25_CD127+); (D) NK 세포(CD3_CD56+).
도 14는 FAP-표적화 28H1-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 G 컬럼의 용출 프로필; (B) 슈퍼덱스 200 크기 배제 컬럼의 용출 프로필; (C) 비-환원 및 환원 샘플하에 최종-생성물의 노벡스(Novex) 트리스-글리신 4 내지 20% SDS-PAGE.
도 15는 4G8-기본 FAP-표적화 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 컬럼의 용출 프로필; (B) 슈퍼덱스 200 크기 배제 컬럼의 용출 프로필; (C) 비-환원 및 환원 샘플하에 최종-생성물의 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔(인비트로겐), MOPS 분리 완충액.
도 16은 MHLG1 KV9 MCSP-표적화 Fab-IL2QM-Fab 면역접합체의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 컬럼의 용출 프로필; (B) 슈퍼덱스 200 크기 배제 컬럼의 용출 프로필; (C) 비-환원 및 환원 샘플하에 최종-생성물의 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 분리 완충액.
도 17은 HEK 293-인간 FAP 세포 상에서 Fab-IL-2-Fab 구조물의 표적 결합을 나타낸 것이다.
도 18은 HEK 293-인간 FAP 세포 상에서 Fab-IL-2-Fab 구조물의 표적 결합을 나타낸 것이다.
도 19는 HEK 293-인간 DPPIV 및 HEK 293 모의(mock)-형질감염 세포 상에서 측정한 바와 같은 Fab-IL-2-Fab 구조물의 결합 특이성을 나타낸 것이다. 특이적 DPPIV (CD26) 항체의 결합은 우측에 나타나 있다.
도 20은 GM05389 섬유아세포 상에서 FAP에 대한 Fab-IL-2-Fab 구조물의 결합시 FAP 내재화의 분석을 나타낸 것이다.
도 21은 용액중에서 IL-2 유도된 NK92 세포에 의한 IFN-γ 방출을 나타낸 것이다.
도 22는 용액중에서 IL-2 유도된 NK92 세포에 의한 IFN-γ 방출을 나타낸 것이다.
도 23은 용액중에서 IL-2 유도된 NK92 세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 24는 용액중에서 PBMC를 사용한 STAT5 포스포릴화 분석에서 Fab-IL-2-Fab 클론 28H1 대 29B11 대 4G8의 평가를 나타낸 것이다. (A) NK 세포(CD3_CD56+); (B) CD8+ T 세포(CD3+CD8+); (C) CD4+ T 세포(CD3+CD4+CD25_CD127+); (D) 조절 T 세포(CD4+CD25+FOXP3+).
도 25는 인간 신세포 선암 세포주 ACHN에서 FAP-표적화 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 효능을 나타낸 것이다.
도 26은 마우스 루이스(Lewis) 폐암 세포주 LLC1에서 FAP-표적화 4G8 FAP-IL-2 qm-Fab 및 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 효능을 나타낸 것이다.
도 27은 마우스 루이스 폐암 세포주 LLC1에서 FAP-표적화 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 및 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 효능을 나타낸 것이다.
도 28은 비히클 대조군(A) 또는 9 ㎍/g wt IL-2(B) 또는 qm IL-2(C)로 처리된 마우스의 폐의 저배율(100x) 사진이다. 9 ㎍/g wt IL-2로 처리된 마우스의 폐는 폐포 공간내로 이동한 혈관중심부(vasocentric)의 단핵성 침윤물(infiltrate)을 보인다. 부종 및 출혈도 또한 존재한다. 주변부 침윤이 qm IL-2로 처리된 마우스에서 소수 혈관 주위에서 주목된다.
도 29는 도 28에 나타낸 폐의 고배율(200x) 사진이다. 혈관내 및 혈관 주위에 단핵성 세포의 주변화(margination) 및 침윤이 qm IL-2로 처리한 마우스(B 및 C)에서보다 wt IL-2로 처리한 마우스(A)에서 더 심하다.
도 30은 비히클 대조군(A) 또는 9 ㎍/g wt IL-2(B) 또는 qm IL-2(C)로 처리한 마우스의 간의 저배율(100x) 사진이다. 혈관중심부 침윤이 wt IL-2로 처리한 마우스에서 보여진다.
도 31은 상이한 IL-2 야생형(wt) 및 4중 돌연변이(qm) 제제와 함께 24 시간(A) 또는 48 시간(B) 동안 배양시 NK92 세포에 의한 IFN-γ 분비를 나타낸 것이다.
도 32는 상이한 IL-2 야생형(wt) 및 4중 돌연변이(qm) 제제와 함께 48 시간 배양시 NK92 세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 33은 상이한 IL-2 야생형(wt) 및 4중 돌연변이(qm) 제제와 함께 48 시간 배양시 NK92 세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 34는 상이한 FAP-표적화 28H1 IL-2 면역접합체 또는 프로루킨과 함께 4일(A), 5일(B) 또는 6일(C) 동안 배양시 NK 세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 35는 상이한 FAP-표적화 28H1 IL-2 면역접합체 또는 프로루킨과 함께 4일(A), 5일(B) 또는 6일(C) 동안 배양시 CD4 T-세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 36은 상이한 FAP-표적화 28H1 IL-2 면역접합체 또는 프로루킨과 함께 4일(A), 5일(B) 또는 6일(C) 동안 배양시 CD8 T-세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 37은 상이한 IL-2 면역접합체 또는 프로루킨과 함께 6 일동안 배양시 NK 세포(A), CD4 T-세포(B) 및 CD8 T-세포(C)의 증식을 나타낸 것이다.
도 38은 프로루킨, 자체(in-house) 수득된 야생형 IL-2 및 4중 돌연변이 IL-2와 함께 30분 배양후 NK 세포(A), CD8 T-세포(B), CD4 T-세포(C) 및 조절 T-세포(D)에서의 STAT 포스포릴화를 나타낸 것이다.
도 39는 프로루킨, 야생형 IL-2를 포함하는 IgG-IL-2, 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 IgG-IL-2와 함께 30분 배양후 NK 세포(A), CD8 T-세포(B), CD4 T-세포(C) 및 조절 T-세포(D)에서의 STAT 포스포릴화를 나타낸 것이다.
도 40은 상이한 용량의, 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 IL-2 면역접합체의 투여(7일동안 1일 1회)후 블랙 6 마우스의 생존을 나타낸 것이다.
도 41은 야생형(wt) 또는 4중 돌연변이(qm) IL-2를 포함하는 FAP-표적화(A) 및 비표적화(B) IgG-IL-2 구조물의 단일 정맥내 투여후 IL-2 면역접합체의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 42는 야생형(wt) 또는 4중 돌연변이(qm) IL-2를 포함하는 비표적화 Fab-IL-2-Fab 구조물의 단일 정맥내 투여후 IL-2 면역접합체의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 43은 4중 돌연변이 IL-2의 정제를 나타낸 것이다. (A) 고정화 금속 이온 크로마토그래피; (B) 크기 배제 크로마토그래피; (C) 비-환원 조건하에서의 SDS PAGE(뉴페이지 노벡스 비스-트리스 겔(인비트로겐), MES 분리 완충액); (D) 분석용 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 75 10/300 GL).
도 44는 상이한 IL-2 면역접합체와 함께 6일 배양후 예비-활성화된 CD8(A) 및 CD4(B) T 세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 45는 상이한 IL-2 면역접합체와 함께 6일 배양하고 항-Fas 항체로 밤새 처리후 CD3+ T 세포의 활성화 유도성 세포 사멸을 나타낸 것이다.
도 46은 FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 4중 돌연변이(qm) 면역접합체의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계의 용출 프로필; (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필; (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 분리 완충액); (D) 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서 최종 생성물의 크기 배제 크로마토그래피(97% 단량체 함량).
도 47은 FAP-표적화 28H1-기본 IgG-IL-2-qm 면역접합체의 정제를 나타낸 것이다. (A) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계의 용출 프로필; (B) 크기 배제 크로마토그래피 단계의 용출 프로필; (C) 최종 생성물의 분석용 SDS-PAGE(환원: 뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔, 인비트로겐, MOPS 분리 완충액; 비-환원: 뉴페이지 트리스-아세테이트, 인비트로겐, 트리스-아세테이트 분리 완충액); (D) 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서 최종 생성물의 분석용 크기 배제 크로마토그래피(100% 단량체 함량).
도 48은 상응하는 Fab-IL-2 qm-Fab 구조물과 비교한, FACS로 측정할 때 안정하게 형질감염된 HEK 293 세포 상에서 발현된 인간 FAP에 대한 FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체의 결합을 나타낸 것이다.
도 49는 28H1-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 구조물과 비교한, 용액중 FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체에 의해 유도된 NK92 세포 상에서의 인터페론(IFN)-γ 방출을 나타낸 것이다.
도 50은 28H1-기본 Fab-IL-2-Fab 및 Fab-IL-2 qm-Fab 구조물, 및 프로루킨과 비교한, 용액중 FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체로 20분 자극후 상이한 세포 유형에서 FACS에 의한 포스포릴화 STAT5의 검출을 나타낸 것이다. (A) NK 세포(CD3_CD56+); (B) CD8+ T 세포(CD3+CD8+); (C) CD4+ T 세포(CD3+CD4+CD25-CD127+); (D) 조절 T 세포(CD4+CD25+FOXP3+).
정의
용어들은 하기에서 달리 정의되지 않는 한, 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "인터루킨-2" 또는 "IL-2"는, 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 IL-2를 말한다. 상기 용어는 미처리된 IL-2, 및 세포에서의 처리로부터 수득된 IL-2의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 IL-2의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 IL-2의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 미처리된 인간 IL-2는 또한 천연 IL-2 분자에는 존재하지 않는, 서열번호 272의 서열을 갖는 N-말단 20개 아미노산 신호 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "IL-2 돌연변이체" 또는 "돌연변이 IL-2 폴리펩티드"는 전장 IL-2, IL-2의 절두형(truncated form), 및 IL-2가 융합 또는 화학적 접합에 의해서와 같이 또 다른 분자에 연결된 형태를 포함하여 IL-2 분자의 다양한 형태의 임의의 돌연변이 형태를 포함하는 것이다. "전장"은 IL-2와 관련하여 사용될 때 성숙한 천연 길이의 IL-2 분자를 의미하는 것이다. 예를 들면, 전장 인간 IL-2는 133개 아미노산을 갖는 분자를 말한다(예를 들면, 서열번호 1 참조). IL-2 돌연변이체의 다양한 형태는 IL-2와 CD25의 상호작용에 영향을 미치는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 돌연변이는 그 위치에 정상적으로 위치하는 야생형 아미노산 잔기의 치환, 결실, 절두 또는 변형을 포함할 수 있다. 아미노산 치환에 의해 수득된 돌연변이체가 바람직하다. 달리 언급하지 않는 한, IL-2 돌연변이체는 본원에서 IL-2 돌연변이 펩티드 서열, IL-2 돌연변이 폴리펩티드, IL-2 돌연변이 단백질 또는 IL-2 돌연변이 유사체로 언급될 수 있다.
다양한 형태의 IL-2의 호칭은 본원에서 서열번호 1에 나타낸 서열에 대해 이루어진다. 다양한 호칭들이 본원에서 동일한 돌연변이를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 위치 42에서 페닐알라닌으로부터 알라닌으로의 돌연변이는 42A, A42, A42, F42A 또는 Phe42Ala로 언급될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포함하는 것을 의미한다. 최종 구조물이 바람직한 특성, 예를 들면, CD25에 대한 감소된 결합을 갖는다면, 최종 구조물을 달성하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합도 이루어질 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 말단 결실의 한 예는 전장 인간 IL-2의 위치 1에서 알라닌 잔기의 결실이다. 바람직한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면, IL-2 폴리펩티드의 결합 특성을 변화시키기 위해, 비-보존적 아미노산 치환, 즉, 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 바람직한 아미노산 치환은 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 아미노산 치환은 비-천연 아미노산 또는 20개의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시라이신)에 의한 치환을 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에 공지된 유전자 또는 화학적 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 유전자 방법은 부위-지향 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 다른 방법, 예를 들면, 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변화시키는 방법도 또한 유용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, IL-2의 "야생" 형태는 야생 형태가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 각각의 아미노산 위치에서 야생형 아미노산을 갖는 것을 제외하고 그외에는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 동일한 IL-2의 형태이다. 예를 들면, IL-2 돌연변이체가 전장 IL-2(즉, 임의의 다른 분자에 융합되거나 접합되지 않은)인 경우, 상기 돌연변이체의 야생 형태는 전장 천연 IL-2이다. IL-2 돌연변이체가 IL-2와 IL-2의 하류에서 암호화된 또 다른 폴리펩티드(예, 항체 쇄) 사이의 융합체인 경우, 상기 IL-2 돌연변이체의 야생 형태는 동일한 하류 폴리펩티드에 융합된 야생형 아미노산 서열을 갖는 IL-2이다. 또한, IL-2 돌연변이체가 IL-2의 절두형(IL-2의 비-절두된 부분 내에서 돌연변이되거나 변형된 서열)인 경우, 상기 IL-2 돌연변이체의 야생 형태는 야생형 서열을 갖는 유사하게 절두된 IL-2이다. 다양한 형태의 IL-2 돌연변이체들의 IL-2 수용체 결합 친화성 또는 생물 활성을 상응하는 야생 형태의 IL-2와 비교하기 위해, 용어 야생형은, 천연 IL-2에 비해 IL-2 수용체 결합에 영향을 미치지 않는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에서 시스테인의 알라닌으로의 치환을 포함하는 IL-2의 형태를 포함한다. 일부 태양에서, 본 발명에 있어서 야생형 IL-2는 아미노산 치환 C125A를 포함한다(서열번호 3 참조). 본 발명에 따른 특정 태양에서, 그에 대해 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 비교되는 야생형 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 태양에서, 그에 대해 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 비교되는 야생형 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CD25" 또는 "IL-2 수용체의 α-서브유니트"는 달리 언급하지 않는 한 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하여, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD25를 말한다. 상기 용어는 "전장" 미처리 CD25 뿐 아니라, 세포에서의 처리로부터 생성된 CD25의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 CD25의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 형질대립 변이체를 포함한다. 특정 태양에서, CD25는 인간 CD25이다. 예시적인 인간 CD25의 아미노산 서열(신호 서열, Avi-표지 및 His-표지를 갖는)은 서열번호 278에 나타나 있다.
용어 "고-친화성 IL-2 수용체"는 본원에서 사용된 바와 같이 수용체 γ-서브유니트(공통 사이토카인 수용체 γ-서브유니트, γC 또는 CD132로도 알려져 있음), 수용체 β-서브유니트(CD122 또는 p70으로도 알려져 있음) 및 수용체 α-서브유니트(CD25 또는 p55로도 알려져 있음)로 이루어진, IL-2 수용체의 헤테로삼량체 형태를 말한다. 용어 "중간-친화성 IL-2 수용체"는 대조적으로 α-서브유니트 없이 γ-서브유니트 및 β-서브유니트 만을 포함하는 IL-2 수용체를 말한다(검토를 위해, 예를 들면, 문헌 [Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)] 참조).
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예, 수용체) 및 그의 결합 상대(예, 리간드) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 수용체 및 리간드) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 따라서, 등가의 친화도들은 속도 상수들의 비가 동일하게 유지되는 한 상이한 속도 상수들을 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 잘 확립되어 있는 방법들로 측정할 수 있다.
다양한 형태의 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 또는 야생형 IL-2 폴리펩티드의 친화도는 비아코어(BIAcore) 기기(지이 헬쓰케어(GE healthcare))와 같은 표준 기기장치 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 서브유니트를 이용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 나타낸 방법에 따라 측정할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)] 참조). 또는, 상이한 형태의 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 결합 친화도는 어느 하나의 상기 형태의 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가할 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 전형적인 태양을 하기에 기술한다.
"조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"란 다른 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 CD4+ T 세포의 분화된 유형을 의미한다. Treg 세포는 IL-2 수용체의 α-서브유니트(CD25) 및 전사 인자 포크헤드 박스 P3(FOXP3)의 발현을 특징으로 하며[Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-562 (2004)], 종양에 의해 발현된 것들을 포함하여 항원에 대한 말초 자가-내성의 유도 및 유지에 중요한 역할을 한다. Treg 세포는 그의 기능, 및 그의 억제 특성의 발생 및 유도에 IL-2를 필요로 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동인자 세포"는 IL-2의 세포독성 효과를 매개하는 림프구의 집단을 말한다. 작동인자 세포는 작동인자 T 세포, 예를 들면, CD8+ 세포독성 T 세포, NK 세포, 림포카인-활성화 킬러(LAK) 세포 및 대식세포/단핵구를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 잔기"는 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 말한다. 한 태양에서, 항원 결합 잔기는 결합되는 존재(예를 들면, 사이토카인 또는 제 2 항원 결합 잔기)를 표적 부위, 예를 들면, 항원 결정인자를 갖는 종양 세포 또는 종양 실질의 특정 유형으로 유도할 수 있다. 항원 결합 잔기는 본원에서 추가로 정의하는 바와 같은 항체 및 그의 단편을 포함한다. 바람직한 항원 결합 잔기는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 태양에서, 항원 결합 잔기는 본원에서 추가로 정의하고 당해 분야에 공지된 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5개의 이소형(isotype): α, δ, ε, γ 또는 μ 중 임의의 이소형을 포함한다. 유용한 경쇄 불변 영역은 2개의 이소형: κ 및 λ 중 임의의 이소형을 포함한다.
"특이적으로 결합한다"는 결합이 항원에 대해 선택적이며, 원치않거나 비-특이적인 상호작용과 식별될 수 있음을 의미한다. 특정 항원 결정인자에 결합하는 항원 결합 잔기의 능력은 효소-결합 면역흡수 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어 기기 상에서 분석)[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)] 및 종래의 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이며, 항원 결합 잔기가 결합되어 항원 결합 잔기-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들면, 아미노산의 연속 신장부 또는 비-연속 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체배좌 형태)를 말한다. 유용한 항원 결정인자는, 예를 들면, 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스-감염 세포의 표면 상에서, 다른 질환에 걸린 세포의 표면 상에서, 혈청내에서 유리하고/하거나 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 중에서 발견할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체들(아미노산)로 이루어진 분자를 말한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄를 말하며, 생성물의 특정 길이를 말하지 않는다. 따라서, 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 칭하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어들도 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 상기 용어들 대신에 또는 이들과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 제한하지 않고, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 또는 비-천연 아미노산에 의한 변형을 포함하여, 폴리펩티드의 발현후 변형의 산물을 말하는 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물 공급원으로부터 유도될 수 있거나 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있으나, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하여 임의의 방법으로 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 2,000개 이상의 아미노산의 크기를 가질 수 있다. 폴리펩티드는 규정된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 상기 구조를 갖는 것은 아니다. 규정된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩된 것으로 언급되며, 규정된 3차원 구조를 갖지 않는 폴리펩티드는 오히려 다수의 상이한 입체배좌를 취할 수 있으며 비폴딩된 것으로 언급된다.
"분리된" 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 그의 유도체는 그의 천연 환경에서가 아닌 폴리펩티드를 의도하는 것이다. 특정 수준의 정제는 필요하지 않다. 예를 들면, 분리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적합한 기술에 의해 분리되거나, 분별되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드가 그러하듯이, 본 발명에 있어서 분리된 것으로 간주된다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 창시되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함하여, 유닉스 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 하기 수학식 1과 같이 산출된다:
[수학식 1]
100 x 분수 X/Y
상기 식에서,
X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.
용어 "폴리펩티드"는 분리된 핵산 분자 또는 구조물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스-유도된 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 말한다.
"분리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 말하는 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 있어서 분리된 것으로 간주된다. 분리된 폴리뉴클레오티드의 다른 예는 이종 숙주 세포 중에 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체, 및 양성 및 음성 표준 형태, 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 또한 합성에 의해 생성된 상기 분자를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소일 수 있거나 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들면, 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일한 것을 의미하는 것이다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해, 참조 서열 중 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실되거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열중 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 수의 뉴클레오티드가 참조 서열중에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 상기 변형은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 참조 서열중 또는 참조 서열내 하나 이상의 인접 기중의 잔기들 사이에서 개별적으로 배치된, 상기 말단 위치들 사이 어디에서나 일어날 수 있다. 실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로, 폴리펩티드에 대해 상기 고찰한 것(예를 들면, ALIGN-2)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소를 갖는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편 내에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열들 중에서, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 태양에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구조물"과 동의어이며, 표적 세포에서 작용가능하게 결합되는 특정 유전자의 발현을 도입하고 유도하기 위해 사용되는 DNA 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입되는 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 일단 발현 벡터가 표적 세포 내부에 존재하면, 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 한 태양에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "인공적"은 합성, 또는 비-숙주 세포 유래 조성물, 예를 들면, 화학적으로-합성된 올리고뉴클레오티드를 말한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구조물을 포함한다.
용어 "전장 항체", "비손상(intact) 항체" 및 "전(whole) 항체"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
"항체 단편"은 비손상 항체가 결합하는 항원과 결합하는 비손상 항체의 일부를 포함하는 비손상 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자(예, scFv), 및 항체 단편으로부터 생성된 다중특이성 항체가 포함된다. 특정 항체 단편에 대한 검토는, 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토는, 예를 들면, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; 또한 WO 93/16185 호; 및 미국 특허 제 5,571,894 및 5,587,458 호를 참조한다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서는 미국 특허 제 5,869,046 호를 참조한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들면, EP 404,097 호; WO 1993/01161 호; 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조). 트리아바디(triabody) 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기술되어 있다. 항체 단편은 본원에 기술된 바와 같은, 비손상 항체의 단백질분해성 절단 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리치아 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 말한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는, α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)으로 불리는 5개 부류 중 하나로 지정될 수 있으며, 이들 중 일부는 서브클래스, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 면역글로불린은 필수적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 이루어진다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 그와 상보성인 영역을 포함하는 항체 부분을 말한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원 결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성을 가지고/가지거나 항원 인식에 수반된다. VH에서 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(HVR)은 또한 "상보성 결정 영역"(CDR)으로도 지칭되며, 상기 용어들은 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역 부분과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 특정 영역은 문헌 [Kagat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) and Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기술되었으며, 여기서 정의들은 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 언급하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 속해야 한다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 1에 나타내었다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당해 분야에 숙련된 자라면 통상적으로 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어느 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 결정할 수 있다.
[표 1]
CDR 정의1
Figure pat00001

카밧(Kabat) 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 번호 체계를 규정하였다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 서열 자체 이상의 임의의 실험 데이터를 의지하지 않고, 임의의 가변 영역 서열에 "카밧 "번호"의 상기 체계를 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카밧 번호"는 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 번호 체계를 말한다. 달리 명시하지 않는 한, 항체 가변 영역에 특정 아미노산 잔기 위치의 번호에 대한 언급은 카밧 번호 체계를 따른다.
서열표의 폴리펩티드 서열(즉, 서열번호 23, 25, 27, 29, 31, 33 등)은 카밧 번호 체계에 따라 번호를 붙이지 않는다. 그러나, 서열표의 서열의 번호를 카밧 번호로 전환시키는 것은 당해 분야에 통상의 기술에 속한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체의 "부류"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 연장되는 것으로 규정된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
"헤테로이량체화를 촉진하는 변형"은, 호모이량체를 형성하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드의 결합을 감소시키거나 방지하는, 폴리펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄의 펩티드 주쇄 또는 번역후 변형의 조작이다. 본원에서 사용된 바와 같은 헤테로이량체화를 촉진하는 변형은 특히 이량체를 형성하기에 바람직한 2개의 폴리펩티드 각각에 이루어진 별개의 변형을 포함하며, 이때 상기 변형은 2개의 폴리펩티드의 결합을 촉진하기 위해 서로에 상보성이다. 예를 들면, 헤테로이량체화를 촉진하는 변형은, 그의 결합을 입체적으로 또는 정전기적으로 각각 유리하게 만들기 위해 이량체를 형성하기에 바람직한 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 다의 구조 또는 전하를 변화시킬 수 있다. 헤테로이량체화는, 중쇄의 각각에 융합된 다른 면역접합체 성분(예를 들면, IL-2 폴리펩티드)이 동일하지 않은 2개의 면역글로불린 중쇄와 같은 2개의 비-동일 폴리펩티드 사이에서 일어난다. 본 발명의 면역접합체에서, 헤테로이량체화를 촉진하는 변형은 면역글로불린 분자의 특히 Fc 도메인 중 중쇄(들)에 존재한다. 일부 태양에서, 헤테로이량체화를 촉진하는 변형은 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다. 특정 태양에서, 헤테로이량체화를 촉진하는 변형은 2개의 면역글로불린 중쇄 각각에 별개의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "작동인자 기능"은 항체에 관해 사용될 때, 항체 이소형에 따라 달라지는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 작동인자 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 세포 표면 수용체(예, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 후속 맞물림이 작동인자 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 결과를 도출하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체로는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조작하다, 조작된, 조작"은 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 단편의 펩티드 주쇄 또는 번역후 변형의 임의의 조작을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴, 또는 개개 아미노산의 측쇄기의 변형, 및 이들 접근방법의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 하나 이상의 IL-2 잔기 및 하나 이상의 항원 결합 잔기를 포함하는 폴리펩티드 분자를 말한다. 특정 태양에서, 면역접합체는 하나 이상의 IL-2 잔기 및 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 본 발명에 따른 특정 면역접합체는 근본적으로 하나의 IL-2 잔기, 및 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된 2개의 항원 결합 잔기로 이루어진다. 항원 결합 잔기는 본원에 기술된 바와 같은 다양한 상호작용에 의해 다양한 형태로 IL-2 잔기에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대조 항원 결합 잔기"는 다른 항원 결합 잔기 및 작동인자 잔기가 없이 존재할 때의 항원 결합 잔기를 말한다. 예를 들면, 본 발명의 Fab-IL-2-Fab 면역접합체를 대조 항원 결합 잔기와 비교할 때, 대조 항원 결합 잔기는 유리 Fab이며, 이때 Fab-IL-2-Fab 면역접합체 및 유리 Fab 분자는 둘 다 동일 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 잔기 등과 관련하여 용어 "제 1" 및 "제 2"는 하나보다 많은 각 유형의 잔기가 존재하는 경우 구별의 편의를 위해 사용된다. 상기 용어의 사용은 명백히 언급하지 않는 한 면역접합체의 특정한 순서 또는 방향을 부여하려는 것이 아니다.
약제의 "효과량"은 약제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기하기 위해 필요한 양을 말한다.
약제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한 투여량에서 필요한 시간 기간동안 효과적인 양을 말한다. 약제의 치료 효과량은, 예를 들면, 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나 또는 방지한다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직하게, 개체 또는 대상은 인간이다.
용어 "약학 조성물"은, 그중에 함유된 약학 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하는 그런 형태이며, 조성물이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 조성물중 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 그의 문자적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 태양에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
본 발명은 면역치료에 개선된 성질을 갖는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 본 발명은 독성의 원인이 되지만 IL-2의 효능에 필수적이지 않은 IL-2의 약리학적 성질을 제거하는 것을 목적으로 한다. 상기 논의한 바와 같이, IL-2 수용체의 상이한 형태들은 상이한 서브유니트로 이루어지며 IL-2에 대한 상이한 친화성을 나타낸다. β 및 γ 수용체 서브유니트로 이루어지는 중간-친화성 IL-2 수용체는 휴지중인 작동인자 세포 상에서 발현되고 IL-2 신호전달에 충분하다. 수용체의 α-서브유니트를 추가로 포함하는 고-친화성 IL-2 수용체는 주로 조절 T(Treg) 세포 상에서, 및 IL-2에 의한 그의 맞물림이 Treg 세포-매개 면역억제 또는 활성화-유도된 세포 사멸(AICD)을 각각 촉진할 수 있는 활성화된 작동인자 세포 상에서 발현된다. 따라서, 이론에 결부되지 않고, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 IL-2의 친화성을 감소 또는 제거하는 것은 조절 T 세포에 의한 작동인자 세포 기능의 IL-2 유도된 하향조절 및 AICD의 과정에 의한 종양 내성의 발생을 감소시켜야 한다. 다른 한편으로, 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 친화성을 유지하는 것은 증식 유도 및 IL-2에 의한 NK 및 T 세포와 같은 작동인자 세포의 활성화를 유지해야 한다.
여러 IL-2 돌연변이체가 당해 분야에 이미 존재하지만, 본 발명자들은 IL-2에 면역치료에 바람직한 특성을 제공하기에 특히 적합한 IL-2 폴리펩티드의 새로운 아미노산 돌연변이 및 그의 조합을 찾아내었다.
첫번째 양태에서, 본 발명은, 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 유지시키는 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드를 제공한다. CD25에 대한 감소된 친화성을 갖는 인간 IL-2(hIL-2)는, 예를 들면, 아미노산 위치 35, 38, 42, 43, 45 또는 72에서의 아미노산 치환 또는 그의 조합에 의해 생성될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환으로는 K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K가 포함된다. 본 발명에 따른 특정 IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2의 잔기 42, 45 또는 72에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이 또는 그의 조합을 포함한다. 상기 돌연변이체들은 중간-친화성 IL-2 수용체에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타내며, IL-2 돌연변이체의 야생 형태에 비해 IL-2 수용체 및 고-친화성 IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대해 실질적으로 감소된 친화성을 갖는다.
유용한 돌연변이체의 다른 특성으로는 IL-2 수용체-함유 T 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 능력, IL-2 수용체-함유 T 및/또는 NK 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 능력, NK 세포에 의해 2차 사이토카인으로서 인터페론(IFN)-γ를 생성하는 능력, 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 의한 2차 사이토카인-특히 IL-10 및 TNF-α-의 합성(elaboration)을 유도하는 감소된 능력, 조절 T 세포를 활성화시키는 감소된 능력, T 세포에서 세포자멸을 유도하는 감소된 능력, 및 생체내 감소된 독성 프로필이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 한 태양에서, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 72에 상응하는 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E. L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된다. 보다 특정 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 L72G이다.
특정 양태에서, 본 발명은 IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 제 1 및 제 2 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 제공한다. 한 태양에서, 상기 제 1 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 72에 상응하는 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 1 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 특정 태양에서, 상기 제 1 아미노산 돌연변이는 L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E. L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 L72G이다. 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 상기 제 1 아미노산 돌연변이와 상이한 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 35, 38, 42, 43 및 45에 상응하는 위치에서 선택된 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 및 Y45K의 군에서 선택된다. 특정 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42 또는 45에 상응하는 위치에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 및 Y45K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 특정한 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 F42A 또는 Y45A이다. 보다 특정 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42에 상응하는 위치에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R 및 F42K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 F42A이다. 또 다른 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 45에 상응하는 위치에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 제 2 아미노산 돌연변이는 Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 및 Y45K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 Y45A이다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는, 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 유지시키는 제 3 아미노산 돌연변이를 포함한다. 상기 제 3 아미노산 돌연변이는 상기 제 1 및 제 2 아미노산 돌연변이와 상이한 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 3 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 35, 38, 42, 43 및 45에 상응하는 위치에서 선택된 위치에 존재한다. 바람직한 태양에서, 상기 제 3 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42 또는 45에 상응하는 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 3 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42에 상응하는 위치에 존재한다. 또 다른 태양에서, 상기 제 3 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 45에 상응하는 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 3 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 및 Y45K의 군에서 선택된다. 보다 특정 태양에서, 상기 아미노산 치환은 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 및 Y45K의 군에서 선택된다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 F42A 또는 Y45A이다. 한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 F42A이다. 또 다른 태양에서, 상기 아미노산 치환은 Y45A이다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 38에 상응하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 보다 더 특정한 양태에서, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 유지시키는 3개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 제공된다. 한 태양에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42, 45 및 72에 상응하는 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 태양에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 특정 태양에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 F42A, Y45A 및 L72G이다.
특정 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 5배 이상, 특히 10배 이상, 보다 특히 25배 이상 감소시킨다. IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 감소시키는 하나보다 많은 아미노산 돌연변이가 존재하는 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이의 조합은 IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 30배 이상, 50배 이상 또는 심지어 100배 이상 감소시킬 수 있다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이 또는 아미노산 돌연변이들의 조합은 IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거하여 본원 하기에 기술하는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결합이 검출되지 않는다.
중간-친화성 수용체에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성의 보존은 IL-2 돌연변이가 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 야생 형태의 친화성의 약 70%보다 큰 친화성을 나타낼 때 달성된다. 본 발명의 IL-2 돌연변이체는 상기 친화성의 약 80% 이상, 심지어 약 90% 이상을 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 IL-2의 O-글리코실화의 제거와 함께 IL-2의 α-서브유니트에 대한 IL-2의 친화성의 감소가 개선된 성질을 갖는 IL-2 단백질을 제공함을 밝혀내었다. 예를 들면, O-글리코실화 부위의 제거는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 CHO 또는 HEK 세포와 같은 포유동물 세포에서 발현될 때 보다 균질한 생성물을 제공한다.
따라서, 특정 태양에서, 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 추가의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 태양에서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예시적인 아미노산 치환으로는 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P가 포함된다. 특정 태양에서, 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 T3A이다.
특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 필수적으로 전장 IL-2 분자이다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2 분자이다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는, 돌연변이를 갖지 않는 서열번호 1을 포함하는 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 제거 또는 감소시키지만 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열번호 1의 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는, 돌연변이를 갖지 않는 서열번호 3을 포함하는 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 제거 또는 감소시키지만 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열번호 3의 서열을 포함한다.
특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 활성화 T 림프구 세포에서의 증식, 활성화 T 림프구 세포에서의 분화, 세포독성 T 세포(CTL) 활성, 활성화 B 세포에서의 증식, 활성화 B 세포에서의 분화, 자연 살해(NK) 세포에서의 증식, 활성화 T 세포 또는 NK 세포에 의한 사이토카인 분비, 및 NK/림프구 활성화 킬러(LAK) 항종양 세포독성으로 이루어진 군에서 선택된 세포 반응 중 하나 이상을 끌어낼 수 있다.
한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해, 조절 T 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 감소된 능력을 갖는다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해, T 세포에서 활성화-유도성 세포 사멸(AICD)을 덜 유도한다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해 감소된 생체내 독성 프로필을 갖는다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드에 비해 연장된 혈청 반감기를 갖는다.
본 발명에 따른 특정 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 3, 42, 45 및 72에 상응하는 위치에 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 아미노산 치환은 T3A, F42A, Y45A 및 L72G이다. 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 4중 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 CD25에 검출가능한 결합을 나타내지 않으며, T 세포에서 세포자멸을 유도하는 감소된 능력, TREG 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 감소된 능력, 및 감소된 생체내 독성 프로필을 나타낸다. 그러나, 상기 돌연변이체는 작동인자 세포에서 IL-2 신호전달을 활성화시키고, 작동인자 세포의 증식을 유도하고, NK 세포에 의해 2차 사이토카인으로서 IFN-γ를 생성하는 능력을 유지한다.
또한, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 실시예에 기술된 바와 같이, 감소된 표면 소수성, 우수한 안정성 및 우수한 발현 수율과 같은 추가의 유리한 성질을 갖는다. 예상치않게, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 또한 야생형 IL-2에 비해 연장된 혈청 반감기를 제공한다.
본 발명의 IL-2 돌연변이체는, CD25와 IL-2의 경계면 또는 글리코실화 부위를 형성하는 IL-2의 영역에 돌연변이를 갖는 것 이외에, 또한 상기 영역들 외의 아미노산 서열에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 인간 IL-2에서 상기 추가의 돌연변이는 증가된 발현 또는 안정성과 같은 추가의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 위치 125에서의 시스테인은, 미국 특허 제 4,518,584 호에 기술된 바와 같이, 세린, 알라닌, 트레오닌 또는 발린과 같은 중성 아미노산으로 치환되어, 각각 C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 또는 C125V IL-2를 제공할 수 있다. 상기 특허에 기술된 바와 같이, 또한 IL-2의 말단 알라닌 잔기를 결실시켜 des-A1 C125S 또는 des-A1 C125A와 같은 돌연변이체를 수득할 수 있다. 대안적으로 또는 결부적으로, IL-2 돌연변이체는 야생형 인간 IL-2의 위치 104에 정상적으로 존재하는 메티오닌이 알라닌과 같은 중성 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다(미국 특허 제 5,206,344 호 참조). 생성된 돌연변이체, 예를 들면, des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2 또는 M104A C125S IL-2(이들 및 다른 돌연변이체들은 미국 특허 제 5,116,943 호 및 문헌 [Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)]에서 찾을 수 있다)는 본 발명의 특정 IL-2 돌연변이와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 특정 태양에서, 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에 추가의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 태양에서, 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 C125A이다.
숙련된 자는 추가의 돌연변이가 본 발명에 추가의 이점을 제공할 수 있는 지를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 IL-2의 친화성을 감소시키거나 제거하는 IL-2 서열에서의 아미노산 돌연변이, 예를 들면, D20T, N88R 또는 Q126D(예를 들면, US 2007/0036752 호 참조)가 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드에 적합하지 않을 수 있음을 인지할 것이다.
한 태양에서, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15 및 서열번호 19의 군에서 선택된 서열을 포함한다. 특정 태양에서, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 15 또는 서열번호 19의 서열을 포함한다. 보다 더 특정한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 19의 서열을 포함한다.
본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 함유 면역접합체와 같은 IL-2 융합 단백질의 맥락에서 특히 유용하다. 상기 융합 단백질은 비-IL-2 잔기에 융합된 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 비-IL-2 잔기는 합성 또는 천연 단백질 또는 그의 일부 또는 변이체일 수 있다. 예시적인 비-IL-2 잔기로는 알부민, 또는 Fc 도메인 또는 면역글로불린의 항원 결합 도메인과 같은 항체 도메인이 포함된다.
IL-2 함유 면역접합체는 항원 결합 잔기 및 IL-2 잔기를 포함하는 융합 단백질이다. 이들은 IL-2를, 예를 들면, 종양 미세환경 중에 직접 표적화시킴으로써 IL-2의 효능을 상당히 증가시킨다. 본 발명에 따르면, 항원 결합 잔기는 전 항체 또는 면역글로불린, 또는 항원 특이적 결합 친화도와 같은 생물학적 기능을 갖는 그의 일부 또는 변이체일 수 있다.
면역접합체 치료의 이점은 용이하게 명백해진다. 예를 들면, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 종양-특이적 에피토프를 인지하고, 종양 부위로 면역접합체 분자의 표적화를 야기한다. 그러므로, 고농도의 IL-2가 종양 미세환경 중에 전달될 수 있으며, 이로써 비접합 IL-2에 필요한 것보다 훨씬 낮은 용량의 면역접합체를 사용하여 본원에 언급된 다양한 면역 작동인자 세포의 활성화 및 증식이 야기된다. 또한, 면역접합체 형태의 IL-2의 적용은 보다 저 용량의 사이토카인 자체를 허용하기 때문에, IL-2의 바람직하지 않는 부작용에 대한 가능성이 제한되고, 면역접합체에 의해 체내 특정 부위로의 IL-2의 표적화는 또한 전신 노출의 감소 및 따라서 비접합 IL-2에 의해 수득된 것 보다 적은 부작용을 야기할 수 있다. 또한, 비접합 IL-2에 비해 면역접합체의 증가된 순환 반감기는 면역접합체의 효능에 기여한다. 그러나, IL-2 면역접합체의 상기 특징은 IL-2 분자의 잠재적 부작용을 다시 심화시킬 수 있다. 비접합 IL-2에 비해 혈류중 IL-2 면역접합체의 훨씬 더 긴 순환 반감기로 인해, 융합 단백질 분자의 IL-2 또는 다른 부분들이 혈관계에 일반적으로 존재하는 성분들을 활성화시킬 가능성이 증가된다. 동일한 관심을 Fc 또는 알부민과 같은 또 다른 잔기에 융합된 IL-2를 함유하는 다른 융합 단백질에 적용하여, 순환시 IL-2의 연장된 반감기를 야기한다. 그러므로, IL-2의 야생 형태에 비해 감소된 독성을 갖는, 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체가 특히 유리하다.
따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 비-IL-2 잔기에 결합된, 전술한 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 제공한다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 비-IL-2 잔기는 융합 단백질을 형성한다, 즉, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 비-IL-2 잔기와 펩티드 결합을 공유한다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 및 제 2 비-IL-2 잔기에 결합된다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 항원 결합 잔기는 i) 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 ii) 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 상기 제 1 비-IL-2 잔기와 카복시-말단 펩티드 결합을, 및 상기 제 2 비-IL-2 잔기와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 태양에서, 상기 비-IL-2 잔기는 표적화 잔기이다. 특정 태양에서, 상기 비-IL-2 잔기는 항원 결합 잔기이다(따라서, 상기에서 보다 상세히 기술한 바와 같이 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 면역접합체를 형성한다). 특정 태양에서, 항원 결합 잔기는 항체 또는 항체 단편이다. 한 태양에서, 항원 결합 잔기는 전장 항체이다. 한 태양에서, 항원 결합 잔기는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 부류 면역글로불린 분자, 보다 특히 IgG1 서브클래스 면역글로불린 분자이다. 한 상기 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 중 하나와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또 다른 태양에서, 항원 결합 잔기는 항체 단편이다. 일부 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 보다 특정 태양에서, 항원 결합 잔기는 Fab 분자 또는 scFv 분자이다. 특정 태양에서, 항원 결합 잔기는 Fab 분자이다. 또 다른 태양에서, 항원 결합 잔기는 scFv 분자이다. 한 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경 중에 제공된 항원에 대해 유도된다. 바람직한 태양에서, 상기 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암태아성 항원(CEA) 및 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)의 군에서 선택된다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 하나보다 많은 결합 잔기, 예를 들면, 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기에 결합되는 경우, 각각의 항원 결합 잔기는 다양한 형태의 항체 및 항체 단편으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 제 1 항원 결합 잔기는 Fab 분자일 수 있고 제 2 항원 결합 잔기는 scFv 분자일 수 있다. 특정 태양에서, 상기 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기 각각은 scFv 분자이거나, 또는 상기 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기 각각은 Fab 분자이다. 특정 태양에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 항원 결합 잔기 각각은 Fab 분자이다. 마찬가지로, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 하나보다 많은 항원 결합 잔기, 예를 들면, 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기에 결합되는 경우, 각각의 항원 결합 잔기가 유도되는 항원은 독립적으로 선택될 수 있다. 한 태양에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 항원 결합 잔기는 상이한 항원들에 대해 유도된다. 또 다른 태양에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 항원 결합 잔기는 동일한 항원에 대해 유도된다. 전술한 바와 같이, 상기 항원은 특히 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경중에 제공된 항원, 보다 특히 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암태아성 항원(CEA) 및 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)의 군에서 선택된 항원이다. 항원 결합 영역은 또한 면역접합체의 항원 결합 도메인과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
면역접합체
특정 양태에서, 본 발명은 IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드, 및 하나 이상의 항원 결합 잔기를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명에 따른 한 태양에서, IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42, 45 및 72에 상응하는 위치에서 선택된 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환, 보다 특히는 F42A, Y45A 및 L72G의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42에 상응하는 위치에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R 및 F42K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 F42A이다. 또 다른 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 45에 상응하는 위치에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 및 Y45K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 Y45A이다. 또 다른 태양에서, 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 72에 상응하는 위치에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 보다 더 특정한 태양에서, 상기 아미노산 치환은 L72G이다. 특정 태양에서, 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 38에 상응하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다. 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체에 포함된 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체의 α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 제거 또는 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 적어도 제 1 및 제 2 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 태양에서, 상기 제 1 및 제 2 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42, 45 및 72에 상응하는 위치에서 선택된 2개의 위치에 존재한다. 한 태양에서, 상기 제 1 및 제 2 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 태양에서, 상기 제 1 및 제 2 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 특정 태양에서, 상기 제 1 및 제 2 아미노산 돌연변이는 F42A, Y45A 및 L72G의 군에서 선택된 아미노산 치환이다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 또한 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드에 관한 앞 단락에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 한 태양에서, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 면역접합체에 포함된 상기 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다, 즉, 면역접합체는 융합 단백질이다. 특정 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 항체 또는 항체 단편이다. 일부 태양에서, 상기 항원 결합 잔기는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 영역은 항원 결합 도메인에 관해 상기 또는 하기에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
면역접합체 구성형태
특히 적합한 면역접합체 구성형태는 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2011/020783 호에 기술되어 있다. 이들 면역접합체는 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 한 태양에서, 본 발명에 따른 면역접합체는 적어도 전술한 바와 같은 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드, 및 적어도 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기는 Fv 분자, 특히 scFv 분자, 및 Fab 분자로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 특정 태양에서, 상기 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 상기 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제 2 항원 결합 잔기는 i) 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 ii) 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 특정 태양에서, 면역접합체는 필수적으로, 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기로 이루어진다. 상기 구성형태는, 이들이 고친화도하에 표적 항원(예를 들면, 종양 항원)에 결합, 말하자면 IL-2 수용체에 대해 단량체 결합하므로, 표적 부위 이외의 다른 위치에서 IL-2 수용체 함유 면역 세포로 면역접합체를 표적화하는 것을 방지한다는 이점을 갖는다. 특정 태양에서, 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 항원 결합 잔기와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 항원 결합 잔기와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또다른 태양에서, 제 1 항원 결합 잔기는 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 항원 결합 잔기와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또 다른 태양에서, 제 1 항원 결합 잔기는 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 항원 결합 잔기와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 중쇄 가변 영역과 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또 다른 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 경쇄 가변 영역과 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또 다른 태양에서, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드에 대한 카복시-말단 펩티드 결합에 의해 연결되고, 또한 제 2 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대한 아미노-말단 펩티드 결합에 의해 연결된다. 또 다른 태양에서, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드에 대한 아미노-말단 펩티드 결합에 의해 연결되고, 또한 제 2 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대한 카복시-말단 펩티드 결합에 의해 연결된다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 Fab 중쇄 또는 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 Fab 중쇄 또는 경쇄와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또 다른 태양에서, 제 1 Fab 중쇄 또는 경쇄는 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 Fab 중쇄 또는 경쇄와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다. 다른 태양에서, 제 1 Fab 중쇄 또는 경쇄는 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유하고, 또한 제 2 Fab 중쇄 또는 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 태양에서, 면역접합체는 적어도, 하나 이상의 scFv 분자와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유하고 또한 하나 이상의 scFv 분자와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특히 적합한 면역접합체 구성형태는 항원 결합 잔기로서 면역글로불린 분자를 포함한다. 한 상기 태양에서, 면역접합체는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드, 및 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 보다 특히 IgG1 분자를 포함한다. 한 태양에서, 면역접합체는 1개 이하의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 한 태양에서, 면역글로불린 분자는 인간 면역글로불린이다. 한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 면역글로불린 분자와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 태양에서, 면역접합체는 필수적으로 하나 이상의 링커 서열에 의해 연결된, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 보다 특히 IgG1 분자로 이루어진다. 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 그의 아미노-말단 아미노산에서 면역글로불린 중쇄 중 하나의 카복시-말단 아미노산에 연결된다. 특정 태양에서, 면역글로불린 분자는 Fc 도메인에 2개의 비-동일 면역글로불린 중쇄의 헤테로이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 폴리펩티드 쇄 사이에 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 한 태양에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 특정 태양에서, 상기 변형은 면역글로불린 중쇄중 하나에 놉(knob) 변형 및 면역글로불린 중쇄 중 다른 하나에 홀(hole) 변형을 포함하는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변형이다. 놉-인투-홀 기술은, 예를 들면, US 5,731,168 호; US 7,695,936 호; 문헌 [Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996); and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 헤테로이량체 생성을 촉진하고 호모이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동(cavity)에 위치할 수 있도록 제 1 폴리펩티드의 계면에 돌출부("놉") 및 제 2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동("홀")을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상호보완적 공동이 제 2 폴리펩티드의 계면에 생성된다. 돌출부 및 공동은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 제조될 수 있다. 특정 태양에서, 놉 변형은 2개의 면역글로불린 중쇄 중 하나에서의 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 홀 변형은 2개의 면역글로불린 중쇄 중 다른 하나에서 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 다른 특정 태양에서, 놉 변형을 포함하는 면역글로불린 중쇄는 또한 아미노산 치환 S354C를 포함하고, 홀 변형을 포함하는 면역글로불린 중쇄는 또한 아미노산 치환 Y349C를 포함한다. 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 2개의 중쇄 사이에 다이설파이드 가교 형성을 야기하여 이량체를 더 안정화시킨다[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)].
특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 놉 변형을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 카복시-말단 아미노산에 연결된다.
대안적 태양에서, 2개의 비-동일 폴리펩티드 쇄의 헤테로이량체화를 촉진하는 변형은, 예를 들면, PCT 공개공보 WO 2009/089004 호에 기술된 바와 같이 정전기 스티어링(steering) 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 두 폴리펩티드 쇄의 경계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시켜 호모이량체 생성은 정전기적으로 불리하지만 헤테로이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 하는 것을 포함한다.
Fc 도메인은 표적 조직에서의 우수한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포 비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하여 유리한 약동학적 성질을 면역접합체에 제공한다. 그러나, 동시에 상기 Fc 도메인은 바람직한 항원-함유 세포보다 오히려 Fc 수용체 발현 세포로 면역접합체의 바람직하지 않은 표적화를 야기할 수도 있다. 또한, Fc 수용체 신호전달 경로의 동시-활성화는 사이토카인 방출을 야기할 수 있으며, 이것은 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체의 긴 반감기와 함께 사이토카인 수용체의 과잉 활성화 및 전신 투여시 심각한 부작용을 야기한다. 이에 따라, 통상적인 IgG-IL-2 면역접합체는 주입 반응과 관련되는 것으로 기술되었다(예를 들면, 문헌 [King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)] 참조).
따라서, 특정 태양에서, 본 발명에 따른 면역접합체에 포함된 면역글로불린 분자는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 한 상기 태양에서, 면역글로불린은 그의 Fc 도메인에 Fc 수용체에 대한 면역접합체의 결합 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 2개의 면역글로불린 중쇄 각각에 존재한다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 면역접합체의 결합 친화도를 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 면역접합체의 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이가 하나보다 많이 존재하는 태양에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상 감소시킬 수 있다. 한 태양에서, 조작된 면역글로불린 분자를 포함하는 면역접합체는, 비-조작된 면역글로불린 분자를 포함하는 면역접합체에 비해, 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 한 태양에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체, 보다 특히 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa 수용체이다. 바람직하게, 상기 수용체들 각각에 대한 결합은 감소된다. 일부 태양에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도도 또한 감소된다. 한 태양에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 면역글로불린의 결합 친화도의 유지는, 면역글로불린(또는 상기 면역글로불린을 포함하는 면역접합체)이 FcRn에 대한 면역글로불린의 비-조작 형태(또는 상기 면역글로불린의 비-조작된 형태를 포함하는 면역접합체)의 결합 친화도의 약 70% 이상을 나타낼 때 달성된다. 면역글로불린 또는 상기 면역글로불린을 포함하는 면역접합체는 상기 친화도의 약 80% 이상, 심지어 약 90% 이상을 나타낼 수 있다. 한 태양에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 태양에서, 면역글로불린은 면역글로불린 중쇄의 위치 P329에 아미노산 치환을 포함한다(카밧 번호). 보다 특정한 태양에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 태양에서, 면역글로불린은 면역글로불린 중쇄의 S228, E233, L234, N297 및 P331로부터 선택된 위치에 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 추가의 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 태양에서, 면역글로불린은 면역글로불린 중쇄의 위치 P329, L234 및 L235에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정 태양에서, 면역글로불린은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(LALA P329G)를 포함한다. 아미노산 치환의 상기 조합은 인간 IgG 분자의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 제거하므로, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 포함한 작동인자 기능을 감소시킨다.
특정 태양에서, 면역접합체는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 항원 결합 잔기 사이에 위치한 하나 이상의 단백질분해 절단 부위를 포함한다. 면역접합체의 성분들(예를 들면, 항원 결합 잔기 및/또는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드)은 직접 연결되거나, 또는 본원에 기술되거나 또는 당해 분야에 공지된 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 연결된다. 적합한 비-면역원성 링커 펩티드로는, 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 링커 펩티드가 포함되며, 여기서 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다.
항원 결합 잔기
본 발명의 면역접합체의 항원 결합 잔기는 일반적으로, 특이적 항원 결정인자에 결합하고 그것이 결합되는 존재(예, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 제 2 항원 결합 잔기)를 표적 부위로, 예를 들면, 항원 결정인자를 갖는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 실질로 유도할 수 있는 폴리펩티드이다. 면역접합체는, 예를 들면, 종양 세포의 표면상에, 바이러스-감염 세포의 표면상에, 다른 질환에 걸린 세포의 표면상에, 혈청내에서 유리하고/하거나 세포외 기질(ECM)중에서 발견되는 항원 결정인자에 결합할 수 있다.
종양 항원의 비-제한 예로는 다음이 포함된다: MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, 다이펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 아데노신 데아미나제-결합 단백질(ADAbp), 사이클로필린 b, 대장 결합 항원(CRC)-C017-1A/GA733, 암태아성 항원(CEA) 및 그의 면역원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이 항원(PSA) 및 그의 면역원성 에피토프 PSA-1, PSA-2 및 PSA-3, 전립선-특이성 막 항원(PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 쇄, 종양 항원의 MAGE-부류(예, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), 종양 항원의 GAGE-부류(예, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나제, p53, MUC 부류, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-태아단백질, E-카데린, α-카테닌, β-카테닌 및 γ-카테닌, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 용종증 콜라이(adenomatous polyposis coli) 단백질(APC), 포드린, 코넥신(Connexin) 37, Ig-이디오타입(idiotype), p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드, 인 유두종 바이러스 단백질과 같은 바이러스 산물, 종양 항원의 Smad 부류, lmp-1, P1A, EBV-암호화 핵 항원(EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2.
바이러스 항원의 비-제한 예로는 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 LMP-1, C형 간염 바이러스 E2 당단백질, HIV gp160 및 HIV gp120이 포함된다.
ECM 항원의 비-제한 예로는 신데칸, 헤파라나제, 인테그린, 오스테오폰틴, 링크, 카데린, 라미닌, 라미닌 유형 EGF, 렉틴, 피브로넥틴, 노치, 테나신 및 마트릭신이 포함된다.
본 발명의 면역접합체는 세포 표면 항원의 하기의 특이적 비-제한 예들에 결합할 수 있다: FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2(T-세포 표면 항원), CD3(TCR과 결합된 헤테로다량체), CD22(B-세포 수용체), CD23(저 친화성 IgE 수용체), CD30(사이토카인 수용체), CD33(골수 세포 표면 항원), CD40(종양 괴사 인자 수용체), IL-6R(IL6 수용체), CD20, MCSP 및 PDGFβR(β 혈소판-유래 성장 인자 수용체).
한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함하며, 이때 이들 항원 결합 잔기 각각은 동일 항원 결정인자에 특이적으로 결합한다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함하며, 이때 이들 항원 결합 잔기 각각은 상이한 항원 결정인자에 특이적으로 결합한다.
항원 결합 잔기는 항원 결정인자에 대한 특이적 결합을 유지하는 임의 유형의 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 항체 단편으로는 VH 단편, VL 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 미니바디(minibody), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다(예를 들면, 문헌 [Hudson and Souriau, Nature Med 9, 129-134 (2003)] 참조).
특히 적합한 항원 결합 잔기는 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2011/020783 호에 기술되어 있다.
한 태양에서, 면역접합체는 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB)에 특이적인 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 EDB의 에피토프와 결합하기 위해 단클론성 항체 L19와 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다(예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2007/128563 A1 호 참조). 또 다른 태양에서, 면역접합체는, L19 단클론성 항체로부터 유도된 제 1 Fab 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 L19 단클론성 항체로부터 유도된 제 2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, L19 단클론성 항체로부터 유도된 제 1 Fab 경쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 L19 단클론성 항체로부터 유도된 제 2 Fab 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 태양에서, 면역접합체는, L19 단클론성 항체로부터 유도된 제 1 scFv가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 L19 단클론성 항체로부터 유도된 제 2 scFv와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
보다 특정한 태양에서, 면역접합체는 서열번호 199의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 L19 단클론성 항체로부터 유도된 Fab 경쇄를 포함한다. 보다 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 201에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 서열번호 199 및 서열번호 201에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 폴리펩티드는, 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 테나신의 A1 도메인(TNC-A1)에 특이적인 하나 이상, 전형적으로는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 TNC-A1의 에피토프에 결합하기 위해 단클론성 항체 F16과 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다(예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2007/128563 A1 호 참조). 한 태양에서, 면역접합체는 테나신의 A1 및/또는 A4 도메인(TNC-A1 또는 TNC-A4 또는 TNC-A1/A4)에 특이적인 하나 이상, 전형적으로는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, 테나신의 A1 도메인에 특이적인 제 1 Fab 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 테나신의 A1 도메인에 특이적인 제 2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, 테나신의 A1 도메인에 특이적인 제 1 Fab 경쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 테나신의 A1 도메인에 특이적인 제 2 Fab 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 태양에서, 면역접합체는, 테나신의 A1 도메인에 특이적인 제 1 scFv가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 테나신의 A1 도메인에 특이적인 제 2 scFv와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 TNC-A1에 특이적인 면역글로불린 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 33 또는 서열번호 35에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 33 또는 서열번호 35에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 29 또는 서열번호 31에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 34 또는 서열번호 36에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 34 또는 서열번호 36의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 30 또는 서열번호 32에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 30 또는 서열번호 32의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 203에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 205 또는 서열번호 215에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 207 또는 서열번호 237에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 205 및 서열번호 207에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 215 및 서열번호 237에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 204에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 204의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 206 또는 서열번호 216에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 206 또는 서열번호 216의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 208 또는 서열번호 238에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 서열번호 208 또는 서열번호 238의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 태양에서, 면역접합체는 테나신의 A2 도메인(TNC-A2)에 특이적인 하나 이상, 전형적으로는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제 1 Fab 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제 2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제 1 Fab 경쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제 2 Fab 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 TNC-A2에 특이적인 면역글로불린 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 27, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 179, 서열번호 183 및 서열번호 187의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 157, 서열번호 161, 서열번호 165, 서열번호 169, 서열번호 173, 서열번호 177, 서열번호 181 및 서열번호 185의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 27, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 179, 서열번호 183 및 서열번호 187의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 157, 서열번호 161, 서열번호 165, 서열번호 169, 서열번호 173, 서열번호 177, 서열번호 181 및 서열번호 185의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 28, 서열번호 160, 서열번호 164, 서열번호 168, 서열번호 172, 서열번호 176, 서열번호 180, 서열번호 184 및 서열번호 188의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 28, 서열번호 160, 서열번호 164, 서열번호 168, 서열번호 172, 서열번호 176, 서열번호 180, 서열번호 184 및 서열번호 188의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 158, 서열번호 162, 서열번호 166, 서열번호 170, 서열번호 174, 서열번호 178, 서열번호 182 및 서열번호 186의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 158, 서열번호 162, 서열번호 166, 서열번호 170, 서열번호 174, 서열번호 178, 서열번호 182 및 서열번호 186의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 241, 서열번호 243 및 서열번호 245의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 247, 서열번호 249 및 서열번호 251의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 241, 서열번호 243 및 서열번호 245의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 247, 서열번호 249 및 서열번호 251의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 241 및 서열번호 249 또는 서열번호 251에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 243 및 서열번호 247 또는 서열번호 249에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 245 및 서열번호 247에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 242, 서열번호 244 및 서열번호 246의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 242, 서열번호 244 및 서열번호 246의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 248, 서열번호 250 및 서열번호 252의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 248, 서열번호 250 및 서열번호 252의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 태양에서, 면역접합체는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적인 하나 이상, 전형적으로는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, FAP에 특이적인 제 1 Fab 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 FAP에 특이적인 제 2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, FAP에 특이적인 제 1 Fab 경쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 FAP에 특이적인 제 2 Fab 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 FAP에 특이적인 면역글로불린 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87, 서열번호 91, 서열번호 95, 서열번호 99, 서열번호 103, 서열번호 107, 서열번호 111, 서열번호 115, 서열번호 119, 서열번호 123, 서열번호 127, 서열번호 131, 서열번호 135, 서열번호 139, 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 151 및 서열번호155로 이루어진 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 61, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85, 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 97, 서열번호 101, 서열번호 105, 서열번호 109, 서열번호 113, 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 129, 서열번호 133, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 145, 서열번호 149 및 서열번호153으로 이루어진 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 71, 서열번호 75, 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87, 서열번호 91, 서열번호 95, 서열번호 99, 서열번호 103, 서열번호 107, 서열번호 111, 서열번호 115, 서열번호 119, 서열번호 123, 서열번호 127, 서열번호 131, 서열번호 135, 서열번호 139, 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 151 및 서열번호155로 이루어진 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 61, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 73, 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85, 서열번호 89, 서열번호 93, 서열번호 97, 서열번호 101, 서열번호 105, 서열번호 109, 서열번호 113, 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 129, 서열번호 133, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 145, 서열번호 149 및 서열번호153으로 이루어진 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 41의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 39의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 51의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 49의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 111의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 109의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 143의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 141의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 151의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 149의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 42, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 52, 서열번호 56, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 68, 서열번호 72, 서열번호 76, 서열번호 80, 서열번호 84, 서열번호 88, 서열번호 92, 서열번호 96, 서열번호 100, 서열번호 104, 서열번호 108, 서열번호 112, 서열번호 116, 서열번호 120, 서열번호 124, 서열번호 128, 서열번호 132, 서열번호 136, 서열번호 140, 서열번호 144, 서열번호 148, 서열번호 152 및 서열번호 156으로 이루어진 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 42, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 52, 서열번호 56, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 68, 서열번호 72, 서열번호 76, 서열번호 80, 서열번호 84, 서열번호 88, 서열번호 92, 서열번호 96, 서열번호 100, 서열번호 104, 서열번호 108, 서열번호 112, 서열번호 116, 서열번호 120, 서열번호 124, 서열번호 128, 서열번호 132, 서열번호 136, 서열번호 140, 서열번호 144, 서열번호 148, 서열번호 152 및 서열번호 156으로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 44, 서열번호 50, 서열번호 54, 서열번호 58, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 74, 서열번호 78, 서열번호 82, 서열번호 86, 서열번호 90, 서열번호 94, 서열번호 98, 서열번호 102, 서열번호 106, 서열번호 110, 서열번호 114, 서열번호 118, 서열번호 122, 서열번호 126, 서열번호 130, 서열번호 134, 서열번호 138, 서열번호 142, 서열번호 146, 서열번호 150 및 서열번호 154로 이루어진 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 44, 서열번호 50, 서열번호 54, 서열번호 58, 서열번호 62, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 74, 서열번호 78, 서열번호 82, 서열번호 86, 서열번호 90, 서열번호 94, 서열번호 98, 서열번호 102, 서열번호 106, 서열번호 110, 서열번호 114, 서열번호 118, 서열번호 122, 서열번호 126, 서열번호 130, 서열번호 134, 서열번호 138, 서열번호 142, 서열번호 146, 서열번호 150 및 서열번호 154로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 209, 서열번호 211, 서열번호 213, 서열번호 217, 서열번호 219, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227 및 서열번호 229의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 231, 서열번호 233, 서열번호 235 및 서열번호 239의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 211 또는 서열번호 219에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 233에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 209, 서열번호 221, 서열번호 223, 서열번호 225, 서열번호 227 및 서열번호 229의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 231에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 213 및 서열번호 235에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 217 및 서열번호 239에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 219 및 서열번호 233에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 221 및 서열번호 231에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 223 및 서열번호 231에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 225 및 서열번호 231에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 227 및 서열번호 231에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 229 및 서열번호 231에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 211 및 서열번호 233에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 297, 서열번호 301 및 서열번호 315의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 299, 서열번호 303 및 서열번호 317의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 297에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 서열번호 299에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 233에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 301에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 서열번호 303에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 231에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 315에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 서열번호 317에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 233에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 210, 서열번호 212, 서열번호 214, 서열번호 218, 서열번호 220, 서열번호 222, 서열번호 224, 서열번호 226, 서열번호 228 및 서열번호 230의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 210, 서열번호 212, 서열번호 214, 서열번호 218, 서열번호 220, 서열번호 222, 서열번호 224, 서열번호 226, 서열번호 228 및 서열번호 230의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 232, 서열번호 234, 서열번호 236 및 서열번호 240의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 232, 서열번호 234, 서열번호 236 및 서열번호 240의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 298, 서열번호 302 및 서열번호 316의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 298, 서열번호 302 및 서열번호 316의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 300, 서열번호 304 및 서열번호 318의 군에서 선택된 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 300, 서열번호 304 및 서열번호 318의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 태양에서, 면역접합체는 흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)에 특이적인 하나 이상, 전형적으로는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, MCSP에 특이적인 제 1 Fab 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 MCSP에 특이적인 제 2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, MCSP에 특이적인 제 1 Fab 경쇄가 IL-2 분자와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 IL-2 분자는 MCSP에 특이적인 제 2 Fab 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는 MCSP에 특이적인 면역글로불린 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 189 또는 서열번호 193의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 191 또는 서열번호 197의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 189 또는 서열번호 193의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 191 또는 서열번호 197의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 189의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 191의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 193의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 191의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 190 또는 서열번호 194의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 190 또는 서열번호 194의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 192 또는 서열번호 198의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 192 또는 서열번호 198의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 253 또는 서열번호 257에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 255 또는 서열번호 261에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 253 또는 서열번호 257에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 255 및 서열번호 261에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 253에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 255에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 257에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 255에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 254 또는 서열번호 258의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 254 또는 서열번호 258의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 256 또는 서열번호 262의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 256 또는 서열번호 262의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 태양에서, 면역접합체는 암태아성 항원(CEA)에 특이적인 하나 이상, 전형적으로는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, CEA에 특이적인 제 1 Fab 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 CEA에 특이적인 제 2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 면역접합체는, CEA에 특이적인 제 1 Fab 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 CEA에 특이적인 제 2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 태양에서, 면역접합체는 CEA에 특이적인 면역글로불린 중쇄가 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 313의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 311의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기는 서열번호 313의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 311의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 314의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 314의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 312의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체의 항원 결합 잔기의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 312의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 319의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 321의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 323의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 본 발명의 면역접합체는 서열번호 319에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 서열번호 321에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체; 및 서열번호 323에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 유지하는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 320의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 320의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 322의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 322의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 324의 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 면역접합체는 서열번호 324의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 항원 결합 잔기는, 그의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하는, 서열번호 23 내지 261(홀수), 297 내지 303(홀수), 311 및 313에 나타낸 펩티드 서열들과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 것들을 포함한다. 본 발명은 또한 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 23 내지 261(홀수), 297 내지 303(홀수), 311 및 313의 서열을 포함하는 항원 결합 잔기를 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 그의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하여, 서열번호 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24 내지 262(짝수), 293 내지 296, 및 298 내지 324(짝수)에 나타낸 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 것들을 포함한다.
비-IL-2 잔기에 결합되지 않은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 전체 폴리펩티드를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현된다.
한 태양에서, 본 발명은 서열번호 7, 11, 15 또는 19의 돌연변이 IL-2 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 7, 11, 15 또는 19의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 293, 서열번호 294, 서열번호 295 및 서열번호 296의 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 293, 서열번호 294, 서열번호 295 및 서열번호 296의 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 293, 서열번호 294, 서열번호 295 및 서열번호 296의 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 293, 서열번호 294, 서열번호 295 및 서열번호 296의 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 면역접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 면역접합체를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 동시-발현되는 다중(예를 들면, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 동시-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합되어 기능성 면역접합체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 잔기의 중쇄 부분은 항원 결합 잔기의 경쇄 부분 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 동시-발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합되어 항원 결합 잔기를 형성할 것이다. 또는, 또 다른 예로, 항원 결합 잔기의 경쇄 부분은 항원 결합 잔기의 중쇄 부분 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 항원 결합 잔기를 포함하는 면역접합체의 단편을 암호화한다. 한 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 잔기 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 잔기의 경쇄 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다.
특정 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 항원 결합 잔기를 포함하는 면역접합체의 단편을 암호화하며, 이때 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 제 2 항원 결합 잔기는 제 1 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유한다. 한 태양에서, 항원 결합 잔기는 Fv 분자, 특히 scFv 분자 및 Fab 분자로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 또 다른 특정 태양에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 항원 결합 잔기의 중쇄 및 하나의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 특정 태양에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 항원 결합 잔기의 경쇄 및 하나의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 특정 태양에서, 폴리뉴클레오티드는 한 항원 결합 잔기의 하나의 경쇄, 제 2 항원 결합 잔기의 하나의 중쇄 및 하나의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다.
또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 면역접합체의 단편을 암호화하는데, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 2개의 Fab 분자의 중쇄 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 면역접합체의 단편을 암호화하는데, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 2개의 Fab 분자의 경쇄 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 특정 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 면역접합체의 단편을 암호화하는데, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 한 Fab 분자의 중쇄, 제 2 Fab 분자의 경쇄 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다.
한 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 그의 아미노- 및 카복시-말단 아미노산에서 하나 이상의 scFv 분자와 연결된, 하나 이상의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 암호화한다.
한 태양에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자, 보다 특히 IgG1 분자의 중쇄 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화한다. 보다 특정 태양에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 분자의 중쇄 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 암호화하며, 이때 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 또는 313에 나타낸 바와 같은 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 또는 323에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 서열번호 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 또는 324에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 또는 324에 나타낸 핵산을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 서열번호 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 또는 313의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 서열번호 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 또는 323의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 또는 313의 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명은 또한, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 또는 323의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 면역접합체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 태양에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 유전자 또는 화학적 방법을 사용하여 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전자 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들면, 서열분석에 의해 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 IL-2의 뉴클레오티드 서열은 문헌 [Taniguchi et al., Nature 302, 305-310 (1983)]에 기술되었으며, 인간 IL-2를 암호화하는 핵산은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, 메릴랜드주 록빌)과 같은 공공 기탁기관으로부터 입수할 수 있다. 천연 인간 IL-2의 서열은 서열번호 1에 나타나 있다. 치환 또는 삽입은 천연 및 비-천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 변형은 글리코실화 부위의 부가 또는 탄수화물 결합 등과 같은 공지된 화학적 변형 방법을 포함한다.
본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는, 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성의 경우, 예를 들어, 전술한 바와 같은 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 분리되고 서열화될 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법들로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다(예를 들면, 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel at al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기술된 기술 참조). 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작용가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재하는 경우 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 인접(flanking) 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 코돈 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구조물에, 예를 들면, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구조물들에, 예를 들면, 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 또는 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면, 본 발명의 벡터는 번역후 또는 번역과 동시에(post- or co-translationally) 단백질분해성 절단에 의해 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 다단백질을 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 제 1 또는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 제한하지 않고 분화된(specialized) 요소 또는 모티프, 예를 들면, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작용가능한 결합은 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조절하에 유전자 산물의 발현이 일어나게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들면, 폴리펩티드 암호화 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 사이의 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작용가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작용가능하게 결합되는 것이다. 프로모터는, 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 작동인자, 억제인자 및 전사 종료 신호가 폴리뉴클레오티드와 작용가능하게 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 영역, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(예, 인트론-A와 함께, 즉시 조기발현(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(예, 조기발현 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 단편(이로 한정되지는 않는다)을 포함한다. 다른 전자 조절 영역으로는 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것들, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서, 및 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)가 포함된다. 유사하게, 다양한 전사 조절 요소들이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 요소들(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat, LTR), 또는 아데노-결합 바이러스(AAV)의 역 말단 반복서열(ITR)과 같은 다른 특징들을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 결합될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 분비를 목적하는 경우, 신호서열을 암호화하는 DNA는 돌연변이 IL-2의 성숙 아미노산을 암호화하는 핵산의 상류에 위치할 수 있다. 본 발명의 면역접합체 또는 그의 단편에서 동일하게 적용된다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 확산이 개시되면 성숙 단백질로부터 분리되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 상기 신호 펩티드는 번역된 폴리펩티드로부터 분리되어 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 인지한다. 예를 들면, 인간 IL-2는 폴리펩티드의 N-말단에서 20개 아미노산 신호 서열하에 번역되고, 이어서 분리되어 성숙한 133개 아미노산의 인간 IL-2를 생성한다. 특정 태양에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, IL-2 신호 펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작용가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 또는, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 기능성 유도체도 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다. 분비 신호 펩티드의 예시적인 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 236 내지 273에 나타나 있다.
후속의 정제를 촉진하거나 또는 IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체의 표지화를 돕기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA(예를 들면, 히스티딘 표지)가 IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체 (단편) 암호화 폴리뉴클레오티드 내에 또는 그의 말단에 포함될 수 있다.
다른 태양에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 태양에서, 하나 이상의 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 한 상기 태양에서, 숙주 세포는 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염되었다). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체 또는 그의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 말한다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 세포는 특정 발현 벡터로 적절하게 형질감염 또는 형질도입될 수 있으며, 대규모 발효조에 접종하여 임상 용도로 충분한 양의 IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체를 수득하기 위해 대량의 벡터 함유 세포를 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예를 들면, 에스케리치아 콜라이, 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell, CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 세균에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 분리될 수 있으며, 더 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균류 및 효모 균주를 포함하여, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004); and Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조). (글리코실화) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, 유전자도입 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES, 등록상표) 기술을 기술하고 있는 미국 특허 제 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 호 참조). 척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액중에 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌 [Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌 [Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 dhfr_ CHO 세포[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0과 같은 흑색종 세포주가 포함된다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포로는 배양 세포, 몇가지만 예를 들면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 한 태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프종 세포(예, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
상기 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 항체와 같은 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 발현하는 세포는, 발현된 돌연변이 IL-2 융합 생성물이 중쇄 및 경쇄를 둘 다 갖는 항체이도록 항체 쇄 중 나머지 쇄를 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 발현에 적합한 조건하에서, 본원에 제공된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 제조 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 하나 이상의 비-IL-2 잔기에 연결된다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 단편이 하나 이상의 분자, 예를 들면, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 분자들의 조합인 분자(예, 당단백질, 당지질 등)에 연결된 IL-2 돌연변이체가 제조될 수 있다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 또한 유기 잔기, 무기 잔기 또는 약학적 약물에 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약학적 약물은 약 5,000 달톤 이하의 화합물을 함유하는 유기물이다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 또한 항-종양 약제, 항균제, 호르몬, 면역조절제, 소염제 등과 같은 치료 화합물을 포함하여 임의의 생물 약제에 연결될 수 있다. 영상화 및 치료에 유용한 것과 같은 방사성동위원소도 또한 포함된다.
돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 또한 동일 유형의 다중 분자들에 또는 하나보다 많은 유형의 분자에 연결될 수 있다. 특정 태양에서, IL-2에 연결되는 분자는 IL-2를 동물내 특정 조직 또는 세포로 표적화하는 능력을 제공할 수 있으며, 본원에서 "표적화 잔기"로 지칭된다. 상기 태양에서, 표적화 잔기는 표적 조직 또는 세포에서 리간드 또는 수용체에 대한 친화성을 가짐으로써 IL-2를 표적 조직 또는 세포로 유도할 수 있다. 특정 태양에서, 표적화 잔기는 IL-2를 종양으로 유도한다. 표적화 잔기로는, 예를 들면, 세포 표면 또는 세포내 단백질에 특이적인 항원 결합 잔기(예, 항체 및 그의 단편), 생물 수용체의 리간드 등이 포함된다. 상기 항원 결합 잔기는 본원에 기술된 바와 같은 종양 결합 항원에 특이적일 수 있다.
돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드, 예를 들면, 단일쇄 항체에 유전자적으로 융합될 수 있거나, 또는 항체 중쇄 또는 경쇄(의 일부)는 또 다른 분자에 화학적으로 접합될 수 있다. 항체 중쇄의 일부에 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 융합은 실시예에 기술되어 있다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 또 다른 폴리펩티드 사이의 융합체인 IL-2 돌연변이체는, IL-2 서열이 폴리펩티드에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있으며 효능에 대해 시험될 수 있다. IL-2와 항체 중쇄 사이의 링커 서열의 예는, 예를 들면, 서열번호 209, 211, 213 등에 나타낸 서열에 나와 있다. 바람직한 경우, 융합체의 개개 성분들을 분리하기 위한 절단 부위를 혼입시키기 위해 추가의 서열, 예를 들면, 엔도펩티다제 제한 서열도 또한 포함될 수 있다. 또한, IL-2 돌연변이체 또는 그의 융합 단백질은 또한 당해 분야에 공지된 바와 같은 폴리펩티드 합성 방법(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고상 합성)을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 공지된 화학 접합 방법을 이용하여, 다른 분자, 예를 들면, 또 다른 폴리펩티드에 화학적으로 접합될 수 있다. 당해 분야에 공지된 이작용성 가교결합 시약, 예를 들면, 호모작용성(homofunctional) 및 헤테로작용성(heterofunctional) 가교결합 시약을 상기 목적으로 사용할 수 있다. 사용하기 위한 가교결합 시약의 유형은 IL-2에 커플링될 분자의 성질에 따라 달라지며, 당해 분야에 숙련된 자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 대안적으로, 또는 그에 더해, 돌연변이 IL-2 및/또는 이것이 접합될 분자는 이 두개가 당해 분야에 또한 공지되어 있는 바와 같이 별도의 반응으로 접합될 수 있도록 화학적으로 유도체화될 수 있다.
특정 태양에서, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 적어도 항원 결정인자에 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 잔기(즉, 면역접합체의 일부인)에 연결된다. 가변 영역은 천연 또는 비-천연 항체 및 그의 단편의 일부를 형성할 수 있고, 이로부터 유도될 수 있다. 다클론성 항체 및 단클론성 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] 참조). 비-천연 항체는 고상-펩티드 합성을 이용하여 구성될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있거나(예를 들면, 미국 특허 제 4,186,567 호에 기술된 바와 같이), 또는 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 검색함으로써 수득할 수 있다(예를 들면, 맥카퍼티(McCafferty)의 미국 특허 제 5,969,108 호 참조). 면역접합체, 항원 결합 잔기 및 이들을 제조하는 방법은 또한 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2011/020783 호에 상세히 기술되어 있다.
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 돌연변이 IL-2 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 본 발명에 유용한 비-제한적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원을 가질 수 있다. 돌연변이 IL-2/항체 접합체 또는 융합체가 인간에 사용하기 위한 것인 경우, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유도된 항체의 키메라 형태를 사용할 수 있다. 항체의 인간화 또는 완전 인간 형태는 또한 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 윈터(Winter)의 미국 특허 제 5,565,332 호 참조). 인간화는, (a) 비-인간(예, 공여자 항체) CDR의 인간(예, 수용자 항체) 프레임워크 및 핵심(critical) 프레임워크 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들)를 갖거나 갖지 않는 불변 영역 상으로의 그라프팅, (b) 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)의 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 그라프팅, 또는 (c) 전체 비-인간 불변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 구획으로 이들을 "클로킹(cloaking)"하는 것을 포함하는(이로 한정되지는 않는다) 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 다음 문헌들에 더 기술되어 있다: 문헌 [Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409 호; 문헌 [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)(SDR(a-CDR) 그라프팅을 기술함); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)("표면처리"를 기술함); Dall' Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)("FR 셔플링"을 기술함); and Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "유도 선택"을 기술함)]. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-374 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 기술되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단클론성 항체의 일부를 형성할 수 있으며, 이로부터 유도될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 자극에 반응하여 비손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 비손상 항체를 생성하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 분리시킴으로써 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); and MaCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 파지 디스플레이에 의한 면역접합체에 대한 항원 결합 잔기의 제조에 대한 상세한 설명은 PCT 공개공보 WO 2011/020783 호에 첨부된 실시예에서 찾을 수 있다.
특정 태양에서, 본 발명에 유용한 항원 결합 잔기는, 예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2011/020783 호(친화성 증진(affinity maturation)에 관한 실시예 참조) 또는 미국 특허출원 공개 2004/0132066 호에 개시된 방법에 따라 증대된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 면역접합체의 능력은, 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA) 또는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어 T100 시스템 상에서 분석)[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)] 및 전통적인 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정할 수 있다. 경쟁 분석법을 사용하여 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB)에 대한 결합에 대해 L19 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 태양에서, 상기 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 동일 에피토프(예, 선형 또는 입체배좌 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하는 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris, "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66 (Human Press, Totowa, NJ) (1996)]에 제공되어 있다. 예시적인 경쟁 분석법에서는, 항원에 결합하는 제 1 표지화 항체(예, L19 항체) 및 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제 2의 비표지 항체를 포함하는 용액중에서 고정화된 항원(예, EDB)을 배양한다. 상기 제 2 항체는 하이브리도마 상등액중에 존재할 수 있다. 대조군으로, 제 1 표지화 항체는 포함하지만 제 2 비표지 항체는 포함하지 않는 용액중에서 고정화 항체를 배양한다. 제 1 항체의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과잉 미결합 항체를 제거하고, 고정화 항원과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화 항원과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제 2 항체가 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 것을 나타낸다(문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
본 발명의 돌연변이 IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체의 다른 화학적 변형이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 면역원성 및 짧은 반감기의 문제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)과 같은 실질적으로 직쇄 중합체에 대한 접합에 의해 개선될 수 있다(예를 들면, WO 87/00056 호 참조).
본원에 기술된 바와 같이 제조된 IL-2 돌연변이체 및 면역접합체는 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로, 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체가 사용될 수 있다. 본 발명의 면역접합체의 친화성 크로마토그래피를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스를 사용할 수 있다. 예를 들면, 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 기본적으로 실시예에 기술된 바와 같이 면역접합체를 분리할 수 있다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 그의 융합 단백질의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하여 다양한 공지된 임의의 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이 발현된 중쇄 융합 단백질은, 환원 SDS-PAGE에 의해 입증되듯이 비손상되고 적절히 구성된 것으로 나타났다(예를 들면, 도 14 참조). 면역접합체 경쇄 및 중쇄/IL-2 융합 단백질의 예측 분자량에 상응하는, 대략 Mr 25,000 및 Mr 60,000에서 2개의 밴드가 분리되었다.
분석
본원에 제공된 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 당해 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물 활성에 대해 확인되거나, 검사되거나, 또는 규명될 수 있다.
친화성 분석
다양한 형태의 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 또는 야생형 IL-2 폴리펩티드의 친화성은, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 서브유니트를 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 나타낸 방법에 따라 측정할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)] 참조). 재조합 IL-2 수용체 β/γ-서브유니트 헤테로이량체는, 적절한 수용체 서브유니트/Fc 융합 단백질(서열번호 102 및 103 참조)의 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 놉-인투-홀 기술(예를 들면, 미국 특허 제 5,731,168 호 참조)에 의해 변형된 항체 Fc 도메인 단량체에 각각의 서브유니트를 융합시켜 생성될 수 있다. 또는, 상이한 형태의 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 결합 친화도는 수용체의 어느 한 상기 형태를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가될 수 있다. 한 태양에 따르면, KD는, 25 ℃에서 CM5 칩 상에 고정화된 IL-2 수용체를 사용하여 비아코어(등록상표) T100 기기(지이 헬쓰케어)를 이용해 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정한다. 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 재조합 IL-2 수용체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.5)를 사용하여 10 ㎕/분의 유량에서 주입전에 0.5 내지 30 ㎍/ml로 희석하여 약 200 내지 1000(IL-2R α-서브유니트에 대해) 또는 500 내지 3000(IL-2R βγ 놉-인투-홀 헤테로이량체에 대해) 응답 단위(response unit, RU)의 커플링된 단백질을 수득한다. IL-2 수용체의 주입 후에, 1M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동적 측정을 위해, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 3배 연속 희석물(약 0.3 내지 300 nM의 범위)을 25 ℃에서 약 30 ㎕/분의 유량으로 HBS-EP+(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 서펙턴트 P20, pH 7.4)중에 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 산출한다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon로서 산출된다(예를 들면, 문헌 [Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)] 참조).
Fc 수용체에 대한 본 발명의 면역접합체의 결합은, 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기장치 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 Fc 수용체를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 또는, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인을 포함하는 Fc 도메인 또는 면역접합체의 결합 친화도는 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주, 예를 들면, FcγIIIa 수용체를 발현하는 NK 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 한 태양에 따라서, KD는, 25 ℃에서 CM5 칩 상에 고정화된 Fc 수용체를 사용하여 비아코어(등록상표) T100 기기(지이 헬쓰케어)를 이용해 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정한다. 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 재조합 Fc 수용체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.5)를 사용하여 10 ㎕/분의 유량에서 주입전에 0.5 내지 30 ㎍/ml로 희석하여 약 100 내지 5000 응답 단위(RU)의 커플링된 단백질을 수득한다. Fc 수용체의 주입 후에, 1M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동적 측정을 위해, 면역접합체의 3- 내지 5-배 연속 희석물(약 0.01 내지 300 nM의 범위)을 25 ℃에서 약 30 내지 50 ㎕/분의 유량으로 HBS-EP+(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 서펙턴트 P20, pH 7.4)중에 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랑뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 산출한다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon로서 산출된다(예를 들면, 문헌 [Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)] 참조).
활성 분석
IL-2 수용체에 결합하는 IL-2 돌연변이체의 능력은 수용체 결합의 하류에서 일어나는 면역 활성화 효과를 분석함으로써 간접적으로 측정할 수 있다.
한 양태에서, 생물 활성을 갖는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 생물 활성은, 예를 들면, IL-2 수용체-함유 T 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 능력, IL-2 수용체-함유 T 및/또는 NK 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 능력, NK 세포에 의한 2차 사이토카인으로서 인터페론(IFN)-γ를 생성하는 능력, 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 의한 2차 사이토카인, 특히 IL-10 및 TNF-α의 제거를 유도하는 감소된 능력, T 세포에서 세포자멸을 유도하는 감소된 능력, 종양 퇴축을 유도하고/하거나 생존을 개선하는 능력, 및 감소된 생체내 독성 프로필, 특히 감소된 혈관투과성을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드도 또한 제공된다.
특정 태양에서, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 상기 생물 활성에 대해 검사한다. IL-2의 생물 활성을 측정하기 위한 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있으며, 또한 많은 상기 방법들에 대한 세부사항은 본원에 첨부된 실시예에 개시되어 있다. 실시예는 NK 세포에 의한 IFN-γ를 생성하는 그의 능력에 대해 본 발명의 IL-2 돌연변이체를 검사하기 위한 적합한 분석법을 제공한다. 배양된 NK 세포를 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체와 함께 배양하고, 이어서 배양 배지 중의 IFN-γ 농도를 ELISA로 측정한다.
IL-2 유도된 신호전달은 여러 신호전달 경로를 유도하고, JAK(야누스(Janus) 키나제) 및 STAT(신호 전달인자 및 전사 활성화인자, signal transducer and activator of transcription) 신호전달 분자를 수반한다. IL-2와 수용체 β- 및 γ-서브유니트와의 상호작용은 수용체, 및 각각 β- 및 γ-서브유니트와 결합되는 JAK1 및 JAK3의 포스포릴화를 유도한다. 이어서, STAT5는 포스포릴화된 수용체와 결합하고, 핵심(crucial) 티로신 잔기 상에서 자체로 포스포릴화된다. 이것은 수용체로부터 STAT5의 해리, STAT5의 이량체화, 및 STAT5 이량체의 핵으로의 전좌를 야기하고, 상기 핵에서 상기 이량체는 표적 유전자의 전사를 촉진한다. 따라서, IL-2 수용체를 통해 신호전달을 유도하는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 능력은, 예를 들면, STAT5의 포스포릴화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 방법의 세부사항은 실시예에 개시되어 있다. PBMC는 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체로 처리하고, 포스포릴화 STAT5의 수준은 유세포분석기로 측정한다.
IL-2에 반응한 T 세포 또는 NK 세포의 증식은 혈액으로부터 분리된 T 세포 또는 NK 세포를 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체와 함께 배양한 후, 처리된 세포의 용해물 중 ATP 함량을 측정함으로써 측정할 수 있다. 처리하기 전에, T 세포는 피토헤마글루티닌(PHA-M)으로 예비-자극시킬 수 있다. 실시예에 기술된 상기 분석법은 생존 세포의 수의 민감한 정량화를 가능케 하지만, 당해 분야에 많은 적합한 대안 분석법들이 존재한다(예를 들면, [3H]-티미딘 혼입 분석법, 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) ATP 분석, 알라마르 불루(Alamar Blue) 분석, WST-1 분석, MTT 분석).
T 세포의 세포자멸 및 AICD의 측정을 위한 분석도 또한 실시예에 제공되어 있는데, 여기서는 T 세포를 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체와 함께 배양한 후 세포자멸-유도 항체로 처리하고 세포자멸 세포를 포스파티딜 세린/아넥신 노출의 유세포분석 검출로 정량화한다. 다른 분석법들도 당해 분야에 공지되어 있다.
종양 성장 및 생존에 대한 돌연변이 IL-2의 영향을 당해 분야에 공지된 다양한 동물 종양 모델에서 평가할 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이, 인간 암 세포주의 이종이식편을 면역결핍 마우스에 이식하고, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체로 처리할 수 있다.
생체내에서 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체의 독성은 사망률, 생존시(in-life) 관찰사항(부작용의 가시적 증상들, 예를 들면, 행동, 체중, 체온) 및 임상 및 해부 병리학(예를 들면, 혈액 화학적분석치의 측정 및/또는 조직병리학적 분석)을 근거로 측정할 수 있다.
IL-2에 의한 처리에 의해 유도된 혈관투과성은 전처리 혈관투과 동물 모델에서 검사할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체를 적당한 동물, 예를 들면, 마우스에 투여하고, 나중에, 혈관계로부터의 그의 확산이 혈관 투과성의 정도를 반영하는 혈관 누출 수용체 분자를 상기 동물에게 주입한다. 혈관 누출 수용체 분자는 바람직하게는 전처리에 사용된 야생 형태의 IL-2에 의한 투과성을 드러내기에 충분히 크다. 혈관 누출 수용체 분자의 한 예는 알부민 또는 면역글로불린과 같은 혈청 단백질일 수 있다. 혈관 누출 수용체 분자는 바람직하게는, 예를 들어, 분자의 조직 분포의 정량적 측정을 촉진하도록 방사성동위원소로 분리가능하게 표지화된다. 혈관 투과성은, 임의의 다양한 체내 장기, 예를 들면, 간, 폐 등, 및 이종이식된 종양을 포함하여, 종양에 존재하는 혈관에 대해 측정할 수 있다. 폐가 전장 IL-2 돌연변이체의 혈관투과성을 측정하기에 바람직한 장기이다.
조성물, 제형 및 투여 경로
다른 양태로, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 태양에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체, 및 예를 들면, 하기 기술하는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
또한, (a) 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 수득하고, (b) 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화시킴으로써 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 제제가 생체내 투여를 위해 제형화되는 것을 포함하는, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 분산된 하나 이상의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 치료 효과량으로 포함한다. "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉, 예를 들면, 인간과 같은 동물에 적절하게 투여될 때 해롭거나, 알레르기성이거나 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 말한다. 하나 이상의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체 및 선택적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)]에 예시된 바와 같이, 본 개시내용의 견지에서, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물(예, 인간) 투여의 경우, 제제들은 생물 표준에 대한 FDA 사무국 또는 다른 국가에서 상응하는 기관에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 함을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 예시적인 IL-2 조성물은 미국 특허 제 4,604,377 및 4,766,106 호에 기술되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 임의 및 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 방부제, 산화방지제, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 유사 물질 및 그의 조합들을 포함한다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, pp. 1289-1329 (1990)] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에 그의 사용이 고려된다.
조성물은, 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부, 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균되어야 하는지 여부에 따라서 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체(및 임의의 추가 치료제)는 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 늑막내, 기관지내, 비강내, 안내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 결막하, 소포내, 점막에, 심막내, 제대내, 안구내, 경구적으로, 국부적으로, 국소적으로, 흡입(예, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포의 직접적 국소 관류욕, 카테터를 통해, 세척에 의해, 크림으로, 지질 조성물(예, 리포솜)로, 또는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 상기 경로들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)] 참조). 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체와 같은 폴리펩티드 분자를 투여하기 위해 가장 일반적으로 사용된다.
비경구 조성물로는 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 기관지내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들이 포함된다. 주사의 경우, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예를 들어, 행크스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리적 식염수 완충액 중에서 제형화될 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 사용전에, 적당한 비히클, 예를 들면, 멸균 발열원-비함유수로 조성되기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 필요한 대로 하기에 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 필요량으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균성은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조 기술이다. 액체 매질은 필요한 경우 적절히 완충되어야 하며, 액체 희석제는 주사전에 충분한 식염수 또는 글루코스로 먼저 등장성이 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사용 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적당한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능케 하는 약제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절하게 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방산 오일, 예를 들면, 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어, 에틸 클리트 또는 트라이글리세리드 또는 리포솜이 포함된다.
활성 성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 거대유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 특정 태양에서, 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물중에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 그의 조합의 사용에 의해 이루어질 수 있다.
전술한 조성물 이외에, 면역접합체는 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 상기 지효성(long acting) 제형은 주입(예를 들면, 피하 또는 근육내에)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일중 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 염으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체를 포함하는 약학 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은, 단백질의 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물 중에 배합될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물 활성을 실질적으로 유지하는 염이다. 이들로는 산 부가염, 예를 들면, 단백성 조성물의 유리 아미노기에 의해 생성된 염, 또는 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산에 의해 생성된 염이 포함된다. 유리 카복실기에 의해 생성된 염도 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로케인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는, 예를 들면, 암 치료에 면역치료제로 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 우수한 의료 관행에 따른 방식으로 제형화되고 조제되고 투여된다. 이와 관련하여 고려될 요인으로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 조건, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다.
본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 숙주의 면역계의 자극이 유리한 질환 상태, 특히 증대된 세포 면역 반응이 바람직한 상태를 치료하는데 유용하다. 이들은 숙주 면역 반응이 불충분하거나 부족한 질환 상태를 포함할 수 있다. 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체가 투여될 수 있는 질환 상태는, 예를 들면, 세포 면역 반응이 특이 면역에 중요한 메카니즘인 종양 또는 감염을 포함한다. 본 발명의 IL-2 돌연변이체가 사용될 수 있는 특정 질환 상태로는 암, 예를 들면, 신세포 암 또는 흑색종; 면역 결핍, 특히 HIV-양성 환자, 면역억제 환자, 만성 감염 등에서의 면역 결핍이 포함된다. 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체는 그 자체로 또는 임의의 적합한 약학 조성물로 투여될 수 있다.
한 양태에서, 약제로 사용하기 위한 본 발명의 돌연변이 IL-폴리펩티드 및 면역접합체가 제공된다. 다른 양태에서, 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체가 제공된다. 특정 태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체가 제공된다. 한 태양에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 제공한다. 특정 태양에서, 본 발명은, 개체에게 치료 효과량의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 제공한다. 특정 태양에서, 치료될 질환은 증식성 질환이다. 바람직한 태양에서, 상기 질환은 암이다. 특정 태양에서, 상기 방법은 또한 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 암인 경우 항암제를 투여하는 것을 포함한다. 다른 태양에서, 본 발명은 면역계를 자극하는데 사용하기 위한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 제공한다. 특정 태양에서, 본 발명은 개체에게 효과량의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 투여하여 면역계를 자극하는 것을 포함하는, 개체에서 면역계를 자극하는 방법에 사용하기 위한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 제공한다. 임의의 상기 태양들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 임의의 상기 태양에 다른 "면역계의 자극"은 면역 기능의 일반적 증가, T 세포 기능의 증가, B 세포 기능의 증가, 림프구 기능의 회복, IL-2 수용체의 발현의 증가, T 세포 반응성의 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인-활성화 킬러(LAK) 세포 활성의 증가 등의 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제를 제조하는데 있어서 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 용도를 제공한다. 한 태양에서, 약제는 질환을 갖는 개체에게 치료 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 태양에서, 치료될 질환은 증식성 질환이다. 바람직한 태양에서, 상기 질환은 암이다. 한 상기 태양에서, 상기 방법은 또한 치료 효과량의 하나 이상의 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 암인 경우 항암제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 태양에서, 상기 약제는 면역계를 자극하기 위한 것이다. 또 다른 태양에서, 상기 약제는 개체에게 면역계를 자극하기에 효과적인 양의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역계를 자극하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 태양에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 임의의 상기 태양에 다른 "면역계의 자극"은 면역 기능의 일반적 증가, T 세포 기능의 증가, B 세포 기능의 증가, 림프구 기능의 회복, IL-2 수용체의 발현의 증가, T 세포 반응성의 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인-활성화 킬러(LAK) 세포 활성의 증가 등의 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료 효과량의 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 태양에서, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 태양에서, 치료될 질환은 증식성 질환이다. 바람직한 태양에서, 상기 질환은 암이다. 한 상기 태양에서, 상기 방법은 또한 치료 효과량의 하나 이상의 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 암인 경우 항암제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 면역계를 자극하기에 효과적인 양의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역계를 자극하는 방법을 제공한다. 임의의 상기 태양에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 임의의 상기 태양에 다른 "면역계의 자극"은 면역 기능의 일반적 증가, T 세포 기능의 증가, B 세포 기능의 증가, 림프구 기능의 회복, IL-2 수용체의 발현의 증가, T 세포 반응성의 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인-활성화 킬러(LAK) 세포 활성의 증가 등의 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.
임의의 상기 치료 방법은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
특정 태양에서, 치료될 질환은 증식성 질환, 바람직하게는 암이다. 암의 비-제한 예로는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암, 뼈암 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식성 질환으로는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 가슴 부위 및 비뇨생식계에 위치한 신생물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 전암성(pre-cancerous) 상태 또는 병변 및 암 전이물도 또한 포함된다. 특정 태양에서, 암은 신세포암, 피부암, 폐암, 대장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 이루어진 군에서 선택된다. 유사하게, 다른 세포 증식성 질환도 또한 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체로 치료될 수 있다. 상기 세포 증식성 질환의 예로는 고감마글로불린혈증, 림프증식성 질환, 파라단백혈증, 자반증, 유육종증, 세자리 증후군(Sezary Syndrome), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstron's Macroglobulinemia), 고셰병(Gaucher's Disease), 조직구증, 및 신생물 이외에, 상기 열거된 기관계에 위치한 임의의 다른 세포 증식성 질환이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 또 다른 태양에서, 상기 질환은 자가면역, 이식 거부, 외상후 면역 반응 및 감염성 질환(예, HIV)과 관련된다. 보다 특히, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는, 림프종, 자가면역, 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 허혈 및 뇌졸중을 포함하여 면역 세포-매개 질환에 수반되는 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. 숙련된 전문가라면 많은 경우에서 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체가 치유를 제공하지 않을 수도 있으며 단지 부분적 이점만을 제공할 수 있음을 인지한다. 일부 태양에서, 일부의 이점을 갖는 생리학적 변화도 또한 치료적으로 유리한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 태양에서, 생리학적 변화를 제공하는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 보다 특히는 인간이다.
본 발명의 면역접합체는 또한 진단 시약으로도 유용하다. 항원 결정인자에 대한 면역접합체의 결합은 IL-2 폴리펩티드에 특이적인 2차 항체를 사용하여 용이하게 검출될 수 있다. 한 태양에서, 2차 항체 및 면역접합체는 세포 또는 조직 표면 상에 위치한 항원 결정인자에 대한 면역접합체의 결합의 검출을 촉진한다.
일부 태양에서, 효과량의 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 세포에 투여한다. 다른 태양에서, 치료 효과량의 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 질환을 치료하기 위한 개체에게 투여한다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환, 투여 경로, 환자의 체중, 폴리펩티드의 유형(예를 들면, 비접합 IL-2 또는 면역접합체), 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 병행 치료 개입, 환자의 병력 및 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 책임지는 의사는 아무튼 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 개개 대상에 적절한 용량(들)을 결정할 것이다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 일시(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
비접합 IL-2의 단일 투여는 약 50,000 내지 약 1,000,000 IU/kg 이상, 보다 전형적으로는 약 600,000 IU/kg의 IL-2의 범위일 수 있다. 이것은 하루에 수회(예, 2 내지 3회), 수일(예, 연속 약 3 내지 5일)동안 반복될 수 있으며, 이어서 휴식 기간(예, 약 7 내지 14일) 후 1회 이상 반복될 수 있다. 따라서, 치료 효과량은 일정 기간동안 단지 단일 투여 또는 다중 투여(예를 들면, 약 10 내지 20 일의 기간동안 각각 주어진 IL-2 약 600,000 IU/kg의 약 20 내지 30회의 개별 투여)를 포함할 수 있다. 면역접합체의 형태로 투여되는 경우, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 치료 효과량은 비접합 돌연변이 IL-2 폴리펩티드보다 낮을 수 있다.
유사하게, 면역접합체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예, 0.1 내지 10 mg/kg)의 면역접합체가, 예를 들면, 하나 이상의 별개 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 한 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 조건에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 면역접합체의 예시적인 한 투여량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 다른 비-제한 예로서, 용량은 또한 투여당, 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중, 약 1000 mg/kg 체중 이상, 및 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 비-제한 예로, 전술한 숫자를 기준으로, 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주, 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 면역접합체를 투여받도록). 초기 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 저용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진전은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 일반적으로 의도한 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용된다. 질환 상태를 치료 또는 예방하기 위한 용도로, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체, 또는 그의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어, 당해 분야에 숙련된 자의 능력에 속한다.
전신 투여의 경우, 치료 효과적인 용량은 초기에 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석으로부터 평가될 수 있다. 이어서, 세포 배양물에서 측정할 때 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 용량을 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 상기 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, 예를 들면, 동물 모델에서 생체내 데이터로부터 평가될 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 동물 데이터를 기준으로 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여에 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위이다. 치료 효과적인 혈장 수준은 매일 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들면, HPLC로 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 면역접합체의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수도 있다. 당해 분야에 기술을 가진 자는 과도한 실험없이 치료 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 치료 효과적 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않고 치료 이점을 제공할 것이다. IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다(예를 들면, 실시예 8 및 9 참조). 세포 배양물 분석 및 동물 연구를 이용하여 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수로서, 비 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 IL-2 및 면역접합체가 바람직하다. 한 태양에서, 본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 수득된 데이터를 인간에 사용하기에 적합한 범위의 투여량을 제형화하는데 사용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 든다. 상기 투여량은 다양한 요인들, 예를 들면, 사용되는 투여 형태, 사용된 투여 경로, 대상의 상태 등에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 개개 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 문헌 [Fingle et al., In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1 (1975)] 참조).
본 발명의 IL-2 돌연변이체 또는 면역접합체로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능부전 등으로 인해 투여를 언제, 어떻게 종료하거나, 중단하거나 또는 조정할지를 알 것이다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해하는 독성), 더 높은 수준에 대한 치료를 조정하는 것을 알 것이다. 문제의 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료될 상태의 중증도에 따라, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 상태의 중증도는, 예를 들면, 부분적으로 표준 진단 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 용량 빈도도 또한 개개 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체의 최대 치료 용량은 야생형 IL-2 또는 야생형 IL-2를 포함하는 면역접합체 각각에 대해 사용되는 용량으로부터 증가될 수 있다.
다른 약제 및 치료
본 발명에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 치료에서 하나 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체는 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 동시-투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 상기 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 약제를 포함한다. 상기 추가의 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적 활성을 갖는 성분들을 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 추가의 치료제는 면역조절제, 세포정지제, 세포 부착 억제제, 세포독성제, 세포자멸 활성화제, 또는 세포자멸 유도인자에 대한 세포의 민감성을 증가시키는 약제이다. 특정 태양에서, 추가의 치료제는 항암제, 예를 들면, 미세소관 교란물질, 항대사물질, 토포이소머라제 억제제, DNA 인터칼레이터(intercalator), 알킬화제, 호르몬 치료제, 키나제 억제제, 수용체 길항물질, 종양 세포 자멸 활성화제 또는 항혈관신생제이다.
상기 다른 약제들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 조합으로 적절히 존재한다. 상기 다른 약제들의 효과량은 사용되는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역억제제의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의한 기타 요인들에 따라 달라진다. 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 측정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급한 상기 병용 치료는 복합 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별개의 조성물에 포함되는 경우) 및 별도의 투여를 포함하며, 별도의 투여의 경우, 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 이들의 투여와 동시에, 및/또는 이들의 투여 후에 일어날 수 있다. 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 면역접합체는 또한 방사선 치료와 함께 사용될 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 상기 용기 상에 또는 그에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택되는 상태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 달리 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 태양에서의 제품은 또한 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 또한 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다. 임의의 상기 제품은 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 태양들이 실행될 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
일반적 방법
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄에 관한 일반 정보는 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242 (1991)]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열은 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
유전자 합성
필요한 목적하는 유전자 절편을 적절한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성하거나 또는 제네아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르크)에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 자동 유전자 합성에 의한 PCR 산물로부터 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 가장 근사한 동족체로부터의 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 적절한 조직에서 유래한 RNA로부터 RT-PCR에 의해 유전자를 분리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 인접한 유전자 절편을 표준 클로닝/서열화 벡터 내에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터로의 서브-클로닝을 허용하기 위해 적당한 제한효소 부위를 갖는 유전자 절편을 설계하였다. 모든 구조물은 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계되었다. 서열번호 263 내지 273은 전형적인 리더 펩티드 및 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
IL-2R βγ 서브유니트 - Fc 융합체 및 IL-2R α 서브유니트 Fc 융합체의 제조
IL-2 수용체 결합 친화도를 연구하기 위해, 헤테로이량체 IL-2 수용체의 발현을 허용하는 도구를 제작하였다; IL-2 수용체의 β-서브유니트를 Fc 분자에 융합시키고, 이것을 "놉-인투-홀" 기술을 사용하여 헤테로이량체화(Fc(홀))(서열번호 274 및 275 참조)되도록 조작하였다[Merchant Et al., Nat. Biotech. 16, 677-681 (1998)]. 이어서, IL-2 수용체의 γ-서브유니트를 Fc(놉) 변이체(서열번호 276 및 277 참조)에 융합시키고, 이것을 Fc(홀)과 헤테로이량체화시켰다. 이어서, 상기 헤테로이량체 Fc-융합 단백질을 IL-2/IL-2 수용체 상호작용을 분석하기 위한 기질로 사용하였다. IL-2R α-서브유니트는 AcTev 절단 부위 및 Avi His 표지를 갖는 단량체 쇄로서 발현시켰다(서열번호 278 및 279). 각각의 IL-2R 서브유니트들을 IL-2R βγ 서브유니트 구조물에 대한 혈청의 존재하에 및 α-서브유니트 구조물에 대한 혈청의 부재하에 HEK EBNA 293에서 일시적으로 발현시켰다. IL-2R βγ 서브유니트 구조물은 단백질 A(지이 헬쓰케어) 상에서 정제한 후 크기 배제 크로마토그래피(지이 헬쓰케어, 슈퍼덱스 200)로 정제하였다. IL-2R α-서브유니트는 NiNTA 컬럼(키아겐(Qiagen)) 상에서 His 표지에 의해 정제한 후 크기 배제 크로마토그래피(지이 헬쓰케어, 슈퍼덱스 75)로 정제하였다.
면역접합체의 제조
항원 결합 잔기의 생성 및 친화성 증진을 포함하여, Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 제조 및 정제에 대한 세부사항은 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 공개공보 WO 2011/020783 호에 첨부된 실시예에서 찾을 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이, 하기 실시예에 사용된 4G8, 3F2, 28H1, 29B11, 14B3 및 4B9로 지칭된 것들을 포함하여, FAP에 대해 유도된 다양한 항원 결합 도메인들이 파지 디스플레이에 의해 제작되었다. 클론 28H1은 모 클론 4G8을 기초로 한 친화성 증진된 항체인 반면, 클론 29B11, 14B3 및 4B9는 모 클론 3F2를 기초로 한 친화성 증진된 항체이다. 본원에 사용된 MHLG1 KV9로 지칭된 항원 결합 도메인은 MCSP에 대해 유도된다.
하기 실시예에서 사용된 야생형 IL-2를 포함하는 면역접합체의 서열은 또한 PCT 공개공보 WO 2011/020783 호에서 찾을 수 있다. 하기 실시예에서 사용된 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 면역접합체에 상응하는 서열들은 4G8: 서열번호 211 및 233; 3F2: 서열번호 209 및 231; 28H1: 서열번호 219 및 233; 29B11: 서열번호 221 및 231; 14B3: 서열번호 229 및 231; 4B9: 서열번호 227 및 231; MHLG1-KV9: 서열번호 253 및 255이다. 상기 DNA 서열들은 유전자 합성 및/또는 전통적인 분자 생물 기술에 의해 생성하였으며, MPSV 프로모터의 조절하에 및 합성 폴리A 부위의 상류에서, 각각 EBV OriP 서열을 갖는 포유동물 발현 벡터(경쇄를 위한 하나 및 중쇄/IL-2 융합 단백질을 위한 하나) 내에 서브클로닝하였다. 하기에 실시예에서 적용된 바와 같은 면역접합체는, 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 인산칼륨-형질감염을 이용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 제조하였다. 또는 현탁액중에서 성장하는 HEK293 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 각각의 발현 벡터로 형질감염시켰다. 또는, 안정하게 형질감염된 CHO 세포 풀 또는 CHO 세포 클론을 무혈청 배지중에서의 제조를 위해 사용하였다. 야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는 4G8-기본 FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 구조물은 단백질 A 매트릭스를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있는 반면, 친화성 증진된 28H1-기본 FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 구조물은 소규모로 단백질 G 매트릭스 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
간략하게, 야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 28H1 Fab-IL-2-Fab를 하나의 친화도 단계(단백질 G)에 의해 세포 상등액으로부터 정제한 후, 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어)로 정제하였다. 단백질 G 컬럼을 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 평형화시키고, 상등액을 부하하고, 컬럼을 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 세척하였다. Fab-IL-2-Fab를 8.8 mM 폼산(pH 3)으로 용출시켰다. 용출된 분획을 취합하고 최종 제형화 완충액: 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 6.7) 중에서 크기 배제 크로마토그래피로 연마시켰다. 정제 및 분석으로부터의 대표적인 결과를 하기에 나타내었다.
야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 3F2 Fab-IL-2-Fab 또는 4G8 Fab-IL-2-Fab를 단백질 A를 사용한 하나의 친화도 단계로 이루어진 유사한 방법으로 정제한 후 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어)로 정제하였다. 단백질 A 컬럼을 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 평형화시키고, 상등액을 부하하고, 컬럼을 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 염화나트륨(pH 7.5)으로 세척한 후, 13.3 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 염화나트륨(pH 5.45)으로 세척하였다. 10 mM MES, 50 mM 염화나트륨(pH 5)을 사용한 세번째 세척을 선택적으로 수행하였다. Fab-IL-2-Fab를 10 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 3)으로 용출시켰다. 용출된 분획을 취합하고 최종 제형화 완충액: 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 6.7) 중에서 크기 배제 크로마토그래피로 연마시켰다. 예시적인 상세한 정제 절차 및 결과를 하기에 선택된 구조물에 대해 나타내었다.
FAP-항체 4G8, 4B9 및 28H1을 기초로 하여 FAP-표적화 IgG-IL-2 qm 융합 단백질을 생성하였는데, 이때 하나의 단일 IL-2 4중 돌연변이체(qm)를 도 1B에 나타낸 바와 같은 하나의 헤테로이량체 중쇄의 C-말단에 융합시켰다. FAP가 선택적으로 발현되는 종양 실질에 대한 표적화는 2가 항체 Fab 영역에 의해 달성된다(결합력 효과). 단일 IL-2 4중 돌연변이체의 존재를 제공하는 헤테로이량체화는 놉-인투-홀 기술을 적용하여 달성되었다. 호모이량체성 IgG-사이토카인 융합체의 생성을 최소화하기 위해, 사이토카인을 G4-(SG4)2- 또는 (G4S)3-링커를 통해 놉-함유 IgG 중쇄의 C-말단(C-말단 Lys 잔기의 결실 포함)에 융합시켰다. 항체-사이토카인 융합체는 IgG-유사 성질을 갖는다. FcγR 결합/작동인자 기능을 감소시키고 FcR 동시-활성화를 방지하기 위해, P329G, L234A, L235A(LALA) 돌연변이를 Fc 도메인에 도입하였다. 상기 면역접합체들의 서열은 서열번호 297, 299 및 233(28H1), 서열번호 301, 303 및 231(4B9) 및 서열번호 315, 317 및 233(4G8)에 나타내었다. 또한, CEA-표적화 IgG-IL-2 qm 융합 단백질, 및 IgG가 특정 표적에 결합하지 않은 대조군 DP47GS 비-표적화 IgG-IL-2 qm 융합 단백질을 제작하였다. 상기 면역접합체들의 서열은 서열번호 305, 307 및 309(DP47GS), 및 서열번호 319, 321 및 323(CH1A1A)에 나타내었다.
IgG-IL-2 구조물을 HEK293 EBNA 세포에서의 일시 발현에 의해 제조하고, 기본적으로 Fab-IL-2-Fab 구조물에 대해 전술한 바와 같이 정제하였다. 간략하게, IgG-IL-2 융합 단백질을, 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 평형화시킨 단백질 A(하이트랩(HiTrap) ProtA, 지이 헬쓰케어)를 사용하여 하나의 친화도 단계에 의해 정제하였다. 상등액을 부하한 후, 컬럼을 먼저 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 세척하고, 이어서 13.3 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 염화나트륨(pH 5.45)으로 세척하였다. IgG-사이토카인 융합 단백질을 20 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 3)으로 용출시켰다. 분획들을 중화시키고 취합한 다음 최종 제형화 완충액: 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 6.7) 중에서 크기 배지 크로마토그래피(하이로드(HiLoad) 16/60 슈퍼덱스 200, 지이 헬쓰케어)로 정제하였다. 예시적인 상세한 정제 절차 및 결과는 하기에 선택된 구조물에 대해 나타내었다. 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는, 아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 결정하였다. 면역접합체의 순도 및 분자량은 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에 SDS-PAGE로 분석하고, 쿠마시 블루(Coomassie blue)(심플블루(SimpleBlue, 등록상표) 세이프스테인(SafeStain), 인비트로겐)로 염색하였다. 뉴페이지(NuPAGE, 등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐)은 제조사의 지시에 따라 사용하였다(4 내지 20% 트리스-글리신 겔 또는 3 내지 12% 비스-트리스). 면역접합체 샘플의 응집체 함량은 25 ℃에서 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3(pH 7.3) 분리 완충액 중에서 슈퍼덱스 200 10/300GL 분석용 크기-배제 컬럼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 분석하였다.
FAP 결합 친화도
본 실시예에서 항원 결합 잔기로 사용된 절단된 Fab 단편의 FAP 결합 친화도는 비아코어 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 간략하게, 항-His 항체(펜타-His, 키아겐 34660)를 CM5 칩 상에 고정화시켜 10 nM 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스(cynomolus) FAP-His(20s)를 포획하였다. 온도는 25 ℃였으며, HBS-EP를 완충제로 사용하였다. Fab 분석물 농도는 50 ㎕/분의 유량에서 100 nM에서 0.41 nM로 감소되었다(이중실험)(결합: 300 s, 해리: 600 s(4B9, 14B3, 29B11, 3F2) 또는 1200 s(28H1, 4G8); 재생: 60 s 10 mM 글리신, pH 2). 1:1 결합 모델, RI = 0, Rmax=로컬(포획 구성형태로 인해)을 기준으로 피팅을 수행하였다. 표 2는 SPR로 측정된 바와 같은 1가 친화도를 나타낸 것이다.
[표 2]
SPR로 측정된 바와 같은 FAP에 대한 FAP-표적화 Fab 단편의 친화도(KD)
Figure pat00002

표적화 IL-2 면역접합체를 사용한 생물 활성 분석
야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는, FAP- 또는 MCSP-표적화 Fab-IL-2-Fab 면역접합체 및 FAP-표적화 IgG-IL-2 면역접합체의 생물 활성을, 상업적으로 시판하는 IL-2(프로루킨, 노바티스, 키론)와 비교하여 여러 세포 분석에서 조사하였다.
( 용액중에서 ) NK 세포에 의한 IFN -γ 방출
IL-2 결핍 NK92 세포(96-U-웰 플레이트에서 100000 세포/웰)를, 상이한 농도의, 야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는 IL-2 면역접합체와 함께 24 시간동안 NK 배지(10% FCS, 10% 말 혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 0.2 mM 이노시톨 및 0.02 mM 폴산이 보충된 인비트로겐의 MEM 알파(#22561-021))에서 배양하였다. 상등액을 수거하고, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)의 항-인간 IFN-γ ELISA 키트 II(#550612)를 사용하여 IFN-γ 방출을 분석하였다. 프로루킨(노바티스)은 세포의 IL-2 매개 활성화에 대해 양성 대조군으로 작용하였다.
NK 세포 증식
건강한 지원자로부터의 혈액을 헤파린-함유 주사기에 취하고, PBMC를 분리하였다. 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)의 인간 NK 세포 분리 키트 II(#130-091-152)를 사용하여 PBMC로부터 훼손되지 않은 인간 NK 세포를 분리하였다. 세포의 CD25 발현을 유세포분석기로 검사하였다. 증식 분석을 위해, 20000개의 분리된 인간 NK 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는 상이한 IL-2 면역접합체의 존재하에 2 일동안 배양하였다. 프로루킨(노바티스)은 대조군으로 작용하였다. 2 일 후에, 세포 용해물의 ATP 함량을 프로메가(Promega)의 셀타이터-글로 발광 세포 생존 분석법(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay)(#G7571/2/3)을 이용하여 측정하였다. 성장율 %는 최고 프로루킨 농도를 100% 증식으로 설정하고 IL-2 자극없이 미처리 세포를 0% 증식으로 설정하여 계산하였다.
STAT5 포스포릴화 분석
건강한 지원자로부터의 혈액을 헤파린-함유 주사기에 취하고, PBMC를 분리하였다. PBMC를 지시된 농도에서 야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는 IL-2 면역접합체로, 또는 대조군으로서 프로루킨(노바티스)으로 처리하였다. 37 ℃에서 20 분간 배양한 후, PBMC를 예열시킨 사이토픽스(Cytofix) 완충액(벡톤 디킨슨 #554655)으로 37 ℃에서 10 분간 고정시킨 다음, 4 ℃에서 30 분간 포스플로우 펌 (Phosflow Perm) 완충제 III(벡톤 디킨슨 #558050)으로 투과화시켰다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척한 후, 상이한 세포 개체군 및 STAT5의 포스포릴화의 검출을 위해 유세포분석 항체의 혼합물을 사용하여 FACS 염색을 수행하였다. 샘플을 벡톤 디킨슨의 HTS 하에 FACS칸토II(FACSCantoII)를 사용하여 분석하였다.
NK 세포는 CD3_CD56+으로 규정되었고, CD8 양성 T 세포는 CD3+CD8+로 규정되었으며, CD4 양성 T 세포는 CD4+CD25_CD127+로 규정되었고, Treg 세포는 CD4+CD25+FoxP3+으로 규정되었다.
T 세포의 증식 및 AICD
건강한 지원자로부터의 혈액을 헤파린-함유 주사기에 취하고, PBMC를 분리하였다. 밀테니 바이오텍의 팬(pan)-T 세포 분리 키트 II(#130-091-156)를 사용하여 훼손되지 않은 인간 NK 세포를 분리하였다. T 세포를 1 ㎍/ml PHA-M(시그마 앨드리치(Sigma Aldrich) #L8902)으로 16 시간동안 예비-자극시킨 후에, 야생형 또는 (4중) 돌연변이 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체를 세척된 세포에 5 일동안 더 첨가하였다. 5 일후에, 세포 용해물의 ATP 함량을 프로메가의 셀타이터-글로 발광 세포 생존 분석법(#G7571/2/3)을 이용하여 측정하였다. 상대 증식률은 최고 프로루킨 농도를 100% 증식으로 설정하여 산출하였다.
T 세포의 포스파티딜세린(PS) 노출 및 세포 사멸은 아넥신 V(아넥신-V-플루오스 염색 키트(Annexin-V-FLUOS Staining Kit), 로슈 어플라이드 사이언스) 및 프로피듐 요오다이드(PI)-염색된 세포의 유세포측정 분석(FACS칸토II, BD 바이오사이언시즈)에 의해 분석하였다. 활성화-유도성 세포 사멸(AICD)을 유도하기 위해, T 세포를, PHA-M으로 16 시간 및 Fab-IL-2-Fab 면역접합체로 5 일간 처리한 후, 세포자멸-유도 항-Fas 항체(밀리포어(Millipore) 클론 Ch11)로 16 시간동안 처리하였다. 아넥신 V 염색을 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 간략하게, 세포를 Ann-V 결합 완충액(1x 저장액: 0.01 M Hepes/NaOH pH 7.4, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl2)으로 세척하고 RT에서 어둡게 하여 아넥신 V FITC(로슈)로 15 분간 염색하였다. 세포를 다시 Ann-V-결합 완충액으로 세척한 후 PI(0.3 ㎍/ml)를 함유하는 200 ㎕/웰의 Ann-V-결합 완충액을 첨가하였다. 세포를 유세포분석기로 즉시 분석하였다.
FAP 발현 세포에 대한 결합
안정하게 형질감염된 HEK293 세포 상에서 발현된 인간 FAP에 대한 FAP-표적화 IgG-IL-2 qm 및 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 결합을 FACS로 측정하였다. 간략하게, 웰 당 250000 세포를, 4 ℃에서 30 분간 배양시킨 환저 96-웰 플레이트에서 지시된 농도의 면역접합체와 함께 배양하고, PBS/0.1% BSA로 1회 세척하였다. FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여, 4 ℃에서 FITC-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 F(ab')2 스페서픽(잭슨 임뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab) #109-096-097, 처리 용액: PBS/0.1% BSA에 1:20 희석, 새로 제조)과 함께 30 분간 배양한 후, 결합된 면역접합체를 검출하였다.
FACS 에 의한 결합시 FAP 내재화 분석
당해 분야에 공지된 여러 FAP 항체에 대해, 이들은 결합시 FAP 내재화를 유도하는 것으로 기술되어 있다(예를 들면, 문헌 [Baum et al., J Drug Target 15, 399-406 (2007); Bauer et al., Journal of Clinical Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition), vol. 28 (May 20 Supplement), abstract no. 13062 (2010); Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4584-4592 (2008)]에 기술되어 있다). 따라서, 본 발명의 Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 내재화 성질을 분석하였다. 간략하게, 15% FCS와 함께 EMEM 배지에서 배양한 GM05839 세포(인간 폐 섬유아세포)를 분리하고, 세척하고, 계수하고, 생존도에 대해 검사하고, 12-웰 플레이트에 2x105 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 다음 날, FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 면역접합체를 차가운 배지에 희석하고 얼음 위에서 30 분간 세포 표면에 결합시켰다. 과잉 미결합 항체를 차가운 PBS를 사용하여 세척하고, 세포를 37 ℃에서 0.5 ml 완전 예열 배지에서 지시된 시간동안 더 배양하였다. 상이한 시점에 이를 때, 세포를 얼음위로 옮기고, 차가운 PBS로 1회 세척하고, 2차 항체[FITC-접합 어피느퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 F(ab')2 스페서픽, 잭슨 임뮤노 리서치 랩 #109-096-097]와 함께 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS/0.1% BSA로 2회 세척하고, 96-웰 플레이트로 옮기고, 4 ℃, 400 x g에서 원심분리하고, 세포 펠릿을 볼텍싱하여 현탁시켰다. 세포를 100 ㎕의 2% PFA를 사용하여 고정시켰다. FACS 측정을 위해, 세포를 200 ㎕/샘플 PBS/0.1% BSA에 재현탁하고, FACS 칸토II(소프트웨어 FACS 디바)에서 플레이트 프로토콜로 측정하였다.
실시예 2
하나 이상의 하기 돌연변이(서열번호 1에 나타낸 야생형 IL-2 서열과 비교하여)를 포함하는 IL-2의 돌연변이된 버전들을 설계하였다:
1. T3A - 예측 O-글리코실화 부위의 유전자제거(knockout)
2. F42A - IL-2/IL-2R α 상호작용의 유전자제거
3. Y45A - IL-2/IL-2R α 상호작용의 유전자제거
4. L72G - IL-2/IL-2R α 상호작용의 유전자제거
5. C125A - 다이설파이드-가교된 IL-2 이량체를 배제하기 위한 전술한 돌연변이
돌연변이 1 내지 4를 모두 포함하는 돌연변이 IL-2 폴리펩티드는 본원에서 IL-2 4중 돌연변이체(qm)로 나타낸다. 상기 돌연변이체는 돌연변이 5를 추가로 포함할 수 있다(서열번호 19 참조).
CD25에 대한 결합을 방해하도록 설계된 3개의 돌연변이 F42A, Y45A 및 L72G 이외에, O-글리코실화 부위를 제거하고, IL-2 qm 폴리펩티드 또는 면역접합체가 CHO 또는 HEK293 세포와 같은 진핵 세포에서 발현될 때 보다 높은 균질성 및 순도를 갖는 단백질 생성물을 수득하기 위해 T3A 돌연변이를 선택하였다.
정제 목적으로, His6 표지를 VD 서열에 의해 결합된 C-말단에 도입하였다. 비교를 위해, 바람직하지 않은 분자간 다이설파이드 가교를 배제하기 위해 C145A 돌연변이만을 함유한 IL-2의 비-돌연변이 유사체 버전을 생성하였다(서열번호 3). 신호 서열의 부재하에 각각의 분자량은 네이키드 IL-2의 경우 16423 D였고, 네이키드 IL-2 qm의 경우 16169 D였다. 야생형 및 His 표지를 갖는 4중 돌연변이 IL-2를 무혈청 배지(F17 배지) 중에서 HEK EBNA에서 혈질감염시켰다. 여과시킨 상등액을 직교류(cross-flow) 상에서 완충액 교환시킨 다음, NiNTA 슈퍼플로우(Superflow) 카트리지(5 ml, 키아겐) 상에 부하시켰다. 컬럼을 세척 완충액: 20 mM 인산나트륨, 0.5 M 염화나트륨(pH 7.4)으로 세척하고, 용출 완충액: 20 mM 인산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, 0.5 M 이미다졸(pH 7.4)로 용출시켰다. 부하시킨 후, 컬럼을 8 컬럼 부피(CV)의 세척 완충액으로 세척하고, 10 CV 5% 용출 완충액(25 mM 이미다졸에 상응한다)으로 용출시킨 후, 0.5 M 이미다졸까지의 구배로 용출시켰다. 용출액을 취합해서, 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02% 나트륨 아지드(pH 7.3) 중에서 하이로드 16/60 슈퍼덱스75(지이 헬쓰케어) 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 연마시켰다. 도 2는 야생형 네이키드 IL-2에 대한 His 표지 정제의 크로마토그램을 나타낸다. 풀 1은 분획 78 내지 85로부터, 풀 2는 분획 86 내지 111로부터 제조되었다. 도 3은 야생형 IL-2에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것으로, 각각의 풀에 대해 분획 12 내지 14를 취합하였다. 도 4는 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02% 나트륨 아지드(pH 7.3) 중에서 슈퍼덱스 75, 10/300 GL(지이 헬쓰케어) 컬럼 상에서 측정한 바와 같은 야생형 IL-2에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 나타낸다. 풀 1은 대형 단백질이 더 많고, 풀 2는 소형 단백질이 더 많았는데, 추정하면 이 차이는 O-글리코실화의 차이에 기인한 것이다. 수율은 풀 1에 대해 약 0.5 mg/L 상등액이었고, 풀 2의 경우 약 1.6 mg/L 상등액이었다. 도 5는 4중 돌연변이 IL-2에 대한 His 표지 정제의 크로마토그램을 나타낸다. 풀 1은 분획 59 내지 91로부터, 풀 2는 분획 92 내지 111로부터 제조되었다. 도 6은 4중 돌연변이 IL-2에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것으로, 여기서 풀 2 분획 12 내지 14 만이 유지되었다. 도 7은 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02% 나트륨 아지드(pH 7.3) 중에서 슈퍼덱스 75, 10/300 GL(지이 헬쓰케어) 컬럼 상에서 측정한 바와 같은 4중 돌연변이 IL-2에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 나타낸다. 네이키드 4중 돌연변이 IL-2에 대한 제제는 20 kD의 한 단백질 만을 함유하였다. 상기 단백질은 유전자제거된 O-글리코실화 부위를 가졌다. 네이키드 IL-2 야생형 및 4중 돌연변이체의 분취량들을 -80 ℃에서 냉동 저장하였다. 수율은 약 0.9 mg/L 상등액이었다.
His-표지된 4중 돌연변이 IL-2의 두번째 배치를 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 전술한 바와 같이 정제한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하였다. IMAC에 사용된 완충액은, 컬럼 평형화 및 세척에 50 mM 트리스, 20 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl(pH 8), 및 용출에 50 mM 트리스, 0.5 M 이미다졸, 0.5 M NaCl(pH 8)이었다. SEC에 사용된 완충액 및 최종 제형화 완충액은 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6)이었다. 도 43은 상기 정제의 결과를 나타낸 것이다. 수율은 2.3 ml/L 상등액이었다.
이어서, IL-2R βγ 헤테로이량체 및 IL-2R α-서브유니트에 대한 친화성을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다. 간략하게, 리간드 - 인간 IL-2R α-서브유니트(Fc2) 또는 인간 IL-2 β 놉 γ 홀 헤테로이량체(Fc3) -를 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 이어서, 네이키드 야생형(풀 1 및 2) 또는 4중 돌연변이 IL-2, 및 프로루킨(노바티스/키론)을 300 nM으로부터 1.2 nM까지 범위(1:3 희석)의 농도로 HBS-EP 중에서 25 ℃에서 분석물로서 상기 칩에 적용하였다. 유량은 30 ㎕/분이었으며, 다음의 조건을 적용하였다: 결합: 180 s, 해리 300 s, 및 재생: IL-2R β 놉 γ 홀 헤테로이량체에 대해 2 x 30 s 3M MgCl2, IL-2R α-서브유니트에 대해 10 s 50 mM NaOH. 피팅을 위해 1:1 결합을 적용하였다(IL-2R βγ에 대해 1:1 결합 RI≠0, Rmax=로컬, IL-2R α에 대해 겉보기 KD, 1:1 결합 RI=0, Rmax=로컬). 표 3은 IL-2R βγ 및 IL-2R α-서브유니트에 대한 인간 야생형 및 4중 돌연변이 IL-2, 및 프로루킨의 결합에 대한 각각의 KD 값을 나타낸다.
[표 3]
중간 친화성 IL-2R 및 IL-2R α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화도
Figure pat00003

상기 데이터는 네이키드 IL-2 4중 돌여변이체가 바람직한 양태를 나타내고 IL-2R α-서브유니트에 대한 결합이 소실된 반면, IL-2R βγ에 대한 결합은 유지되고 야생형 IL-2 구조물 및 프로루킨 각각에 필적함을 보여준다. 야생형 IL-2의 풀 1 및 2 사이의 차이는 아마도 O-글리코실화의 차이에 기인할 수 있다. 상기 가변성 및 불균질성은 T23A 돌연변이의 도입에 의해 IL-2 4중 돌연변이체에서 해결되었다.
실시예 3
3개의 돌연변이 F42A, Y45A 및 L72G 및 돌연변이 T3A를, 도메인을 표적화는 모델로 항-FAP 항체 4G8을 사용하여, Fab-IL-2-Fab 구성형태(도 1A)에 단일 돌연변이체: 1) 4G8 IL-2 T3A, 2) 4G8 IL-2 F42A, 3) 4G8 IL-2 Y45A, 4) 4G8 IL-2 L72G로서 도입하거나, 또는 상기 돌연변이들을 또한 O-글리코실화 부위를 불활성화시키기 위해, 5) 3중 돌연변이체 F42A/Y45A/L72G로서, 또는 6) 4중 돌연변이체 T3A/F42A/Y45A/L72G로서 Fab-IL-2 mt-Fab 구조물에서 조합하였다. 4G8-기본 Fab-IL-2 wt-Fab를 비교에 사용하였다. 모든 구조물은 다이설파이드-가교된 IL-2 이량체를 배제하기 위해 C145A 돌연변이를 함유하였다. 상이한 Fab-IL-2-Fab 구조물을 HEK 293 세포에서 발현시키고 상기에서 언급한 바와 같은 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피로 전술한 바와 같이 정제하였다. 이어서, 인간 및 뮤린 IL-2R βγ 헤테로이량체, 및 인간 및 뮤린 IL-2R α-서브유니트에 대한 선택된 IL-2 변이체의 친화도를, 재조합 IL-2R βγ 헤테로이량체 및 단량체성 IL-2R α-서브유니트를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)(비아코어)에 의해 하기 조건하에서 측정하였다: IL-2R α-서브유니트를 2개의 밀도로 고정화시키고, 보다 높은 고정화율을 갖는 유동 세포를 CD25 결합이 소실된 돌연변이체에 사용하였다. 다음의 조건을 이용하였다: 화학적 고정화: 인간 IL-2R βγ 헤테로이량체 1675 RU; 마우스 IL-2R βγ 헤테로이량체 5094 RU; 인간 IL-2R α-서브유니트 1019 RU; 인간 IL-2R α-서브유니트 385 RU, 뮤린 IL-2R α-서브유니트 1182 RU; 뮤린 IL-2R α-서브유니트 378 RU, 온도: 25 ℃, 분석물: 4G8 Fab-IL-2 변이체-Fab 구조물 3.1 nM 내지 200 nM, 유량 40 ㎕/분, 결합: 180 s, 해리: 180 s, 재생: 10 mM 글리신 pH 1.5, 60 s, 40 ㎕/분. 피팅: 두 상태의 반응 모델(입체배좌 변화), RI=0, Rmax=로컬. 동적 분석의 결과는 표 4에 나타내었다.
[표 4]
중간 친화성 IL-2R 및 IL-2R α-서브유니트에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 FAP-표적화 면역접합체의 친화도(KD)
Figure pat00004

IL-2R βγ 헤테로이량체 및 FAP에 대한 동시 결합이 SPR에 의해 확인되었다. 간략하게, 인간 IL-2R βγ 놉-인투-홀 구조물을 CM5 칩 상에 화학적으로 고정화시키고, 10 nM Fab-IL-2-Fab 구조물을 90 s 동안 포획하였다. 인간 FAP를 200 nM로부터 0.2 nM 까지의 농도에서 분석물로 사용하였다. 조건은 다음과 같았다: 25 ℃, 완충액: HBS-EP, 유량: 30 ㎕/분, 결합: 90 s, 해리: 120 s. 재생은 10 mM 글리신(pH 2)을 사용하여 60 s 동안 수행하였다. 피팅은 1:1 결합 RI ≠ 0, Rmax = 글로벌에 대한 모델을 사용하여 수행하였다. SPR 가교 분석은 Fab-IL-2-Fab 구조물이 야생형으로 및 4중 돌연변이체로서 둘 다, 및 친화성 증진된 FAP 결합인자 28H1 또는 모 3F2 또는 4G8 항체가 10 nM의 농도에서, 칩 상에 고정화된 IL-2R βγ 헤테로이량체에 뿐 아니라, 분석물로 사용된 인간 FAP에 동시에 결합할 수 있음을 나타내었다(도 8). 측정된 친화도를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하고 중간 친화성 IL-2R에 결합된 FAP-표적화 면역접합체의 FAP에 대한 친화도(KD)
Figure pat00005

SPR 데이터를 취합한 결과, i) T3A 돌연변이는 CD25에 대한 결합에 영향을 미치지 않고; ii) 3개의 돌연변이 F42A, Y45A 및 L72G는 IL-2R βγ 헤테로이량체에 대한 친화성에 영향을 미치지 않지만, 다음 순서로 CD25에 대한 친화성을 감소시키며: wt = T3A > Y45A(약 5배 더 낮음) > L72G(약 10배 더 낮음) > F42A(약 33배 더 낮음); iii) O-글리코실화 부위 돌연변이 T3A의 존재 또는 부재하에 3개 돌연변이 F42A, Y45A 및 L72G의 조합은 SPR 조건하에서 측정할 때 CD25 결합의 완전한 소실을 야기하고; iv) 뮤린 IL-2R βγ 헤테로이량체 및 IL-2R α-서브유니트에 대한 인간 IL-2의 친화성은 인간 IL-2 수용체에 비해 대략 10배만큼 감소되지만, 선택된 돌연변이는 인간 IL-2R βγ 헤테로이량체에 대한 친화성에 영향을 미치지 않으나 따라서 뮤린 IL-2R α-서브유니트에 대한 결합은 제거하는 것으로 나타났다. 이것은, 전체 IL-2는 인간보다 설치류에서 독성을 덜 나타내긴 하지만, 마우스가 IL-2 돌연변이체의 약리학적 및 독성학적 효과 연구에 유용한 모델을 대표함을 시사한다.
O-글리코실화의 소실과는 별개로, 4개 돌연변이 T3A, F42A, Y45A, L72G의 조합의 한가지 추가 이점은 페닐알라닌, 티로신 또는 류신과 같은 표면 노출된 소수성 잔기의 알라닌으로의 교환으로 인한 IL-2 4중 돌연변이체의 더 낮은 표면 소수성이다. 동적 광 산란에 의한 응집 온도의 분석 결과, 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 면역접합체에 대한 응집 온도는 3F2 모 Fab-IL-2-Fab 및 친화성 증진된 29B11 3F2-유도체에 대해 약 57 내지 58 ℃의 동일한 범위, 및 4G8 모 Fab-IL-2-Fab 및 친화성 증진된 28H1, 4B9 및 14B3 4G8-유도체에 대해 62 내지 63 ℃의 범위로서, 4개의 돌연변이의 조합이 단백질 안정성에 불리한 영향을 갖지 않았음을 시사하는 것으로 나타났다. 선택된 IL-2 4중 돌연변이체의 유리한 성질을 뒷받침하여, 일시 발현 수율은 Fab-IL-2 qm-Fab 구성형태에서 4중 돌연변이체가 각각의 Fab-IL-2 wt-Fab 구조물에 대해 관찰된 것보다 높은 발현 수율을 제공할 수 있음을 보여주었다. 마지막으로, 약동학적 분석은 4G8-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 및 Fab-IL-2 wt-Fab 둘 다 필적할만한 PK 성질을 가짐을 보여준다(하기 실시예 9 참조). 상기 데이터 및 하기 실시예 4에 기술된 세포 데이터를 근거로, 4중 돌연변이체 T3A, F42A, Y45A, L72G가 표적화된 Fab-IL-2-Fab 면역접합체에서 IL-2의 CD25 결합을 제거하기 위한 돌연변이의 이상적인 조합으로 선택되었다.
실시예 4
야생형 IL-2 또는 단일 돌연변이체 4G8 IL-2 T3A, 4G8 IL-2 F42A, 4G8 IL-2 Y45A, 4G8 IL-2 L72G 또는 각각의 3중(F42A/Y45A/L72G) 또는 4중 돌연변이체(T3A/F42A/Y45A/L72G)를 포함하는 4G8-기본 FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 면역접합체를 계속해서 전술한 바와 같은 프로루킨과 비교하여 세포 분석에서 시험하였다.
NK 세포주 NK92를 구조물들과 함께 배양한 후 IL-2 유도된 IFN-γ 방출을 측정하였다(도 9). NK92 세포는 그 표면상에서 CD25를 발현한다. 결과는, IL-2R βγ 헤테로이량체에 대한 Fab-IL-2 wt-Fab의 약 10배 더 낮은 친화도로부터 예상할 수 있듯이, 야생형 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체가 프로루킨보다 IFN-γ 방출을 유도하는데 덜 효과적이었음을 보여준다. CD25 결합을 방해하는 단일 돌연변이의 도입, 및 IL-2 3중 돌연변이체에서 CD25 결합을 방해하는 3개 돌연변이의 조합은, 방법의 오차내에서 INF-γ 방출의 효력 및 확실한 유도의 견지에서, 야생형 IL-2 구조물에 필적하는 Fab-IL-2-Fab 구조물을 제공하였다.
[표 6]
돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체에 의한 NK 세포로부터 IFN-γ 방출의 유도
Figure pat00006

이어서, Fab-IL-2-Fab 면역접합체에 의한 분리된 NK 세포의 증식 유도를 증식 분석법(셀 타이터 글로, 프로메가)으로 평가하였다(도 10). NK92 세포와 대조적으로, 새로 분리된 NK 세포는 CD25를 발현하지 않는다(또는 단지 매우 소량만 발현). 상기 결과는, IL-2R βγ 헤테로이량체에 대한 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체의 약 10배 더 낮은 친화도로부터 예상할 수 있듯이, 야생형 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체가 프로루킨보다 NK 세포 증식을 유도하는데 약 10배 덜 효과적이었음을 보여준다. CD25 결합을 방해하는 단일 돌연변이의 도입, 및 IL-2 3중 돌연변이체에서 CD25 결합을 방해하는 3개 돌연변이의 조합은, 증식의 효력 및 확실한 유도의 견지에서, 야생형 IL-2 구조물에 필적하는 Fab-IL-2-Fab 구조물을 제공하였으며; Fab-IL-2-Fab 3중 돌연변이체에 대해 관찰된 효력에서 매우 작은 변화만 있었다. 두 번째 실험에서는, 상이한 양의 프로루킨 및 Fab-IL-2-Fab 면역접합체와 함께 배양한 후 PHA-활성화된 T 세포의 증식의 유도를 평가하였다(도 11). 활성화된 T 세포는 CD25를 발현하기 때문에, IL-2 단일 돌연변이체 F42A, L72G 또는 Y45A를 포함하는 면역접합체와 함께 배양시 T 세포 증식에 분명한 감소가 관찰될 수 있었으며; F42A의 경우 가장 강한 감소를 나타내었고, 이어서 L72G 및 Y45A가 감소를 나타낸 반면, Fba-IL-2 wt-Fab 또는 Fab-IL-2 (T3A)-Fab를 사용한 경우 활성화는 프로루킨과 비교해 거의 유지되었다. 상기 데이터는 SPR로 측정할 때(상기 실시예) CD25에 대힌 친화성의 감소를 반영한다. IL-2 3중 돌연변이체에서 CD25 결합을 방해하는 3개 돌연변의의 조합은 용액중에서 T 세포 증식의 상당히 감소된 유도를 매개한 면역접합체를 제공하였다. 이러한 결과에 따라서, 1 ㎍/ml PHA로 16 시간동안 1차 자극, 프로루킨 또는 각각의 Fab-IL-2-Fab 면역접합체로 5 일동안 2차 자극에 이어, 1 ㎍/ml PHA로 3차 자극에 의해 유도된 과-자극 후 아넥신 V/PI 염색에 의해 측정된 바와 같은 T 세포의 세포 사멸을 측정하였다. 상기 배경에서, 과-자극된 T 세포에서 활성화 유도된 세포 사멸(AICD)이, CD25 결합을 방해하는 IL-2 단일 돌연변이체 F42A, L72G 및 Y45A를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체에 의해 매우 감소되었으며, F42A 및 L72G가 가장 강한 감소를 나타내어, 이것은 IL-2 3중 돌연변이체를 포함하는 면역접합체에서 3개 돌연변이의 조합에 의해 달성된 감소와 유사한 것으로 관찰되었다(도 12). 마지막 실험 세트에서, 인간 PBMC로부터의 인간 NK 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 Treg 세포에 대한 Fab-IL-2 wt-Fab 및 프로루킨과 비교한 STAT5 포스포릴화 유도에 대한 Fab-IL-2 qm-Fab의 효과를 연구하였다(도 13). CD25 발현을 전혀 나타내지 않거나 매우 적게 나타낸(IL-2R 신호전달이 IL-2R βγ 헤테로이량체에 의해 매개됨을 의미) NK 세포 및 CD8+ T 세포의 경우, 상기 결과는 야생형 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 구성형태가 프로루킨보다 STAT5 포스포릴화를 유도하는데 있어 약 10배 덜 효과적이었으며, Fab-IL-2 qm-Fab는 Fab-IL-2 wt-Fab 구조물에 필적하였음을 보여준다. 자극시 CD25의 신속한 상향조절을 나타내는 CD4+ T 세포의 경우, Fab-IL-2 qm-Fab는 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체보다 덜 효과적이었으나, 포화 농도에서 IL-2R 신호전달의 필적하는 유도를 여전히 나타내었다. 이것은, Treg 세포상에서의 높은 CD25 발현 및 이어지는 Treg 세포 상에서 CD25에 대한 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체의 높은 결합 친화도로 인해 Fab-IL-2 qm-Fab의 효력이 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체에 비해 상당히 감소된 Treg 세포와 대조적이다. Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체에서 CD25 결합의 제거의 결과로서, Treg 세포에서의 IL-2 신호전달은 IL-2R 신호전달이 IL-2R βγ 헤테로이량체를 통한 CD25-음성 작동인자 세포 상에서 활성화되는 농도에서 IL-2R βγ에 의해서만 활성화된다. 통합하여 생각할 때, 본원에 기술된 IL-2 4중 돌연변이체는 IL-2R βγ 헤테로이량체를 통해 IL-2R 신호전달을 활성화시킬 수 있으나, AICD는 야기하지 못하며 다른 작동인자 세포에 비해 Treg 세포의 우선적인 자극도 야기하지 못한다.
실시예 5
실시예 2 및 3에 기술된 데이터를 근거로, 클론 28H1 또는 29B11을 기본으로 하는 친화성 증진된 FAP-표적화 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 제작하고 일반적 방법 부분에서 전술한 바와 같이 정제하였다. 보다 상세하게, FAP-표적화 28H1 표적화된 Fab-IL-2 qm-Fab를 하나의 친화도 단계(단백질 G)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200)로 정제하였다. 컬럼 평형화는 PBS 중에서 수행하였으며, 안정한 CHO 풀(CDCHO 배지)로부터의 상등액을 단백질 G 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하하고, 상기 컬럼을 PBS로 세척하고, 샘플을 2.5 mM HCl로 계속해서 용출하고, 분획들을 10x PBS로 즉시 중화시켰다. 크기 배제 크로마토그래피는 최종 제형화 완충액: 25 mM 인산나트륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 6.7) 중에서 슈퍼덱스 200 컬럼 상에서 수행하였다. 도 14는 정제로부터의 용출 프로필 및 SDS-PAGE(뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔 4 내지 20%, 인비트로겐, MOPS 분리 완충액, 환원 및 비-환원)에 의한 생성물의 분석 특성화로부터의 결과를 나타낸다. 단백질 G 및 단백질 A에 대한 28H1 Fab 단편의 낮은 결합 능력을 고려할 때, 포획 단계는 보다 높은 수율을 제공할 수 있다.
Fab-표적화 4G8, 3F2 및 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab 및 MCSP-표적화 MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 하나의 친화도 단계(단백질 A)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200)로 정제하였다. 컬럼 평형화는 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5) 중에서 수행하였으며, 상등액을 단백질 A 컬럼 상에 부하하였다. 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)에서 첫 번째 세척을 수행한 후, 13.3 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 염화나트륨(pH 5.45)에서 두 번째 세척을 수행하였다. Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 20 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 3)에서 용출시켰다. 크기 배제 크로마토그래피는 최종 제형화 완충액: 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신(pH 6.7) 중에서 수행하였다. 도 15는 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab에 대한 정제로부터의 용출 프로필 및 SDS-PAGE(뉴페이지 노벡스 비스-트리스 미니 겔 4 내지 20%, 인비트로겐, MOPS 분리 완충액, 환원 및 비-환원)에 의한 생성물의 분석 특성화로부터의 결과를 나타내고, 도 16은 MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체에 대한 상기 결과를 나타낸다.
FAP-항체 4G8, 4B9 및 28H1을 기본으로 하는 FAP-표적화 IgG-IL-2 qm 융합 단백질 및 대조군 DP47GS 비-표적화 IgG-IL-2 qm 융합 단백질을 일반 방법 부분에서 전술한 바와 같이 제작하였다. 도 46 및 47은 4G8- 및 28H1-기본 구조물에 대한, 정제의 각각의 크로마토그램 및 용출 프로필(A, B) 및 최종 정제된 구조물의 분석용 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피(C, D)를 나타낸 것이다. 일시 발현 수율은 4G8-기본 면역접합체의 경우 42 mg/L였고, 28H1-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체의 경우 20 mg/L였다.
4G8 및 28H1 항-FAP 항체를 기본으로 하는 IgG-IL-2 qm 면역접합체의 FAP 결합 활성을, 상응하는 비변형된 IgG 항체와 비교하여, 비아코어 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 간략하게, 항-His 항체(펜타-His, 키아겐 34660)를 CM5 칩상에 고정화시켜 10 nM His-표지된 인간 FAP(20 s)를 포획하였다. 온도는 25 ℃였으며, HBS-EP를 완충액으로 사용하였다. 분석물 농도는 50 ㎕/분의 유량에서 50 nm로부터 0.05 nM까지 였다(결합: 300 s, 해리: 900 s, 재생: 10 mM 글리신(pH 2)으로 60 s). 피팅은 1:1 결합 모델을 기준으로 수행하였다, RI=0, Rmax=로컬(포획 구성형태로 인함). 표 7은 1:1 결합 RI=0, Rmax=로컬에 따라 피팅된 SPR로 측정한 바와 같은, 평가된 겉보기 2가 친화도(pM 결합력)를 나타낸다.
[표 7]
Figure pat00007

데이터는, 상응하는 비변형 항체들과 비교할 때 방법의 오차내에서 인간 FAP에 대한 친화성이 28H1-기본 면역접합체에 대해 유지되거나, 또는 4G8-기본 면역접합체에 대해 단지 약간만 감소함을 보여준다.
실시예 6
각각 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화된 친화성 증진된 28H1 및 29B1-기본 Fab-IL-2-Fab 면역접합체, 및 3F2-기본 Fab-IL-2 wt-Fab의 친화도를, 하기의 조건하에서 재조합 IL-2R βγ 헤테로이량체를 사용하여 인간, 뮤린 및 사이노몰구스 IL-2R βγ 헤테로이량체에 대해 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다: 리간드: CM5 칩 상에 고정화된 인간, 뮤린 및 사이노몰구스 IL-2R β 놉 γ 홀 헤테로이량체, 분석물: 28H1 또는 29B11 Fab-IL-2-Fab(야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2 포함), 3F2 Fab-IL-2-Fab(야생형 IL-2 포함), 온도: 25 ℃ 또는 37 ℃, 완충액: HBS-EP, 분석물 농도: 200 nM에서 2.5 nM까지, 유량: 30 ㎕/분, 결합: 300 s, 해리: 300 s, 재생: 3 M MgCl2로 60 s, 피팅: 1:1 결합 RI≠0, Rmax=글로벌. 각각 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 함유하는 FAP-표적화된 친화성 증진된 28H1 및 29B1-기본 Fab-IL-2-Fab 면역접합체, 및 3F2-기본 Fab-IL-2 wt-Fab의 친화도를 하기의 조건하에서 재조합 단량체성 IL-2R α-서브유니트를 사용하여 인간, 뮤린 및 사이노몰구스 IL-2R α-서브유니트에 대해 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다: 리간드: CM5 칩 상에 고정화된 인간, 뮤린 및 사이노몰구스 IL-2R α-서브유니트, 분석물: 28H1 또는 29B11 Fab-IL-2-Fab(야생형 또는 돌연변이 IL-2 포함), 3F2 Fab-IL-2-Fab(야생형 IL-2 포함), 온도: 25 ℃ 또는 37 ℃, 완충액: HBS-EP, 분석물 농도: 25 nM에서 0.3 nM까지, 유량: 30 ㎕/분, 결합: 120 s, 해리: 600 s, 재생: 없음, 피팅: 1:1 결합, RI=0, Rmax=글로벌.
IL-2R βγ 헤테로이량체를 사용한 동적 분석의 결과를 표 8에 나타내었다.
[표 8]
친화성 증진된 Fab 및 돌연변이 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 IL-2R βγ 헤테로이량체에 대한 결합
Figure pat00008

인간 IL-2R βγ 헤테로이량체에 대한 인간 IL-2의 친화성은 약 1 nM인 것으로 기술된 반면, Fab-IL-2-Fab 면역접합체(야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2 포함)는 둘 다 6 내지 10 nM 사이의 감소된 친화성을 가지며, 상기에서 네이키드 IL-2에 대해 보여졌듯이, 뮤린 IL-2R에 대한 친화성은 인간 및 사이노몰구스 IL-2R에 대한 것보다 약 10배 더 약했다.
IL-2R α-서브유니트를 사용한 동적 분석의 결과는 표 9에 나타내었다. 선택된 조건하에서, IL-2 4중 돌연변이체를 포함하는 면역접합체의 인간, 뮤린 또는 사이노 IL-2R α-서브유니트에 대한 검출할 만한 결합은 없었다.
[표 9]
친화성 증진된 Fab 및 돌연변이 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 IL-2R α-서브유니트에 대한 결합
Figure pat00009

야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 MCSP-표적화된 MHLG1-KV9 Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 친화도를 하기의 조건하에서 재조합 IL-2R βγ 헤테로이량체를 사용하여 인간 IL-2R βγ 헤테로이량체에 대해 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다: 인간 IL-2R β 놉 γ 홀 헤테로이량체를 CM5 칩 상에 고정화시켰다(1600 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab 및 Fab-IL-2 qm-Fab를 25 ℃에서 HBS-P 완충액 중에서 분석물로서 사용하였다. 분석물 농도는 30 ㎕/분의 유량에서 IL-2R βγ에 대해 300 nM에서 0.4 nM까지(1:3 희석)였다(결합 시간 180 s, 해리 시간 300 s). 재생은 IL-2R βγ에 대해 3M MgCl2를 사용하여 2x30 s 동안 수행하였다. 데이터는 IL-2R βγ에 대해 1:1 결합, RI≠0, Rmax=로컬을 사용하여 피팅하였다.
야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 MCSP-표적화된 MHLG1-KV9 Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 친화도를 하기의 조건하에서 재조합 IL-2R α-서브유니트를 사용하여 인간 IL-2R α-서브유니트에 대해 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다: 인간 IL-2R α-서브유니트를 CM5 칩 상에 고정화시켰다(190 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab 및 Fab-IL-2 qm-Fab를 25 ℃에서 HBS-P 완충액 중에서 분석물로서 사용하였다. 분석물 농도는 30 ㎕/분의 유량에서 IL-2R α에 대해 33.3 nM에서 0.4 nM까지(1:3 희석)였다(결합 시간 180 s, 해리 시간 300 s). 재생은 IL-2R α에 대해 50 mM NaOH를 사용하여 10 s 동안 수행하였다. 데이터는 IL-2R α에 대해 1:1 결합, RI=0, Rmax=글로벌을 사용하여 피팅하였다.
IL-2R βγ 헤테로이량체를 사용한 동적 분석의 결과는 표 10에 나타내었다.
[표 10]
Figure pat00010

상기 데이터는 MCSP-표적화된 MHLG1-KV9 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체가 IL-2R βγ 수용체에 대한 친화성을 유지한 반면, CD25에 대한 결합은 야생형 IL-2를 포함하는 면역접합체에 비해 제거됨을 확인시켜 준다.
이어서, IL-2R βγ 헤테로이량체 및 IL-2R α-서브유니트에 대한 4G8- 및 28H1-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체의 친화도를 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체 구성형태와 직접 비교하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다. 간략하게, 리간드(인간 IL-2R α-서브유니트 또는 인간 IL-2R βγ 헤테로이량체)를 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 이어서, 4G8- 및 28H1-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체 또는 4G8- 및 28H1-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 25 ℃에서 HBS-EP 완충액중에 300 nM에서 1.2 nM까지(1:3 희석) 범위의 농도로 분석물로서 칩에 적용하였다. 유량은 30 ㎕/분이었으며, 하기의 조건을 적용하였다: 결합: 180 s, 해리: 300 s, 및 재생: IL-2R βγ 헤테로이량체에 대해 3M MgCl를 사용하여 2x30 s, IL-2R α-서브유니트에 대해 50 mM NaOH를 사용하여 10 s. 피팅에 1:1 결합을 적용하였다(IL-2R βγ에 대해 1:1 결합 RI≠0, Rmax=로컬, 겉보기 KD, IL-2R α에 대해 1:1 결합 RI=0, Rmax=로컬). 각각의 KD 값을 표 11에 나타내었다.
[표 11]
Figure pat00011

데이터는 4G8- 및 28H1-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체가 IL-2R βγ 헤테로이량체에 대해 적어도 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체만큼 우수하게 결합하는 반면, CD25 결합을 방해하는 돌연변이의 도입으로 인해 IL-2R α-서브유니트에는 결합하지 않음을 보여준다. 상응하는 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체와 비교하여, IgG-IL-2 qm 융합 단백질의 친화도는 방법의 오차 내에서 약간 증대된 것으로 보인다.
실시예 7
실험의 첫 번째 세트에서, 야생형 또는 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 면역접합체가 FACS에 의해 인간 FAP-발현 HEK 293-FAP 세포에 결합할 수 있고(도 17), IL-2 4중 돌연변이는 FAP-발현 세포에 대한 결합에 영향을 미치지 않았음(도 18)을 확인하였다.
[표 12]
FAP-발현 HEK 세포에 대한 Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 결합
Figure pat00012

특히, 상기 결합 실험들은 Fab-IL-2 qm-Fab로서 친화성 증진된 FAP 결합인자 28H1, 29B11, 14B3 및 4B9가, DPPIV로 형질감염된 HEK 293 세포, FAP의 유사한 동족체, 또는 HEK 293 모의-형질감염 세포에 대해 높은 특이성 및 비결합을 유지하면서, 모 FAP 결합인자 3F2(29B11, 14B3, 4B9) 및 4G8(28H1)을 기본으로 한 Fab-IL-2-Fab 면역접합체에 비해 HEK 293-FAP 표적 세포에 대한 월등한 확실한 결합을 나타내었음(도 17)을 보여주었다. 비교를 위해, 마우스 항-인간 CD26-PE DPPIV 항체 클론 M-A261(BD 바이오사이언시즈, #555437)을 양성 대조군으로 사용하였다(도 19). 내재화 성질의 분석 결과 Fab-IL-2-Fab 면역접합체의 결합은 FAP 내재화의 유도를 야기하지 않는 것으로 나타났다(도 20).
다른 실험에서, 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 상에서 발현된 인간 FAP 대한 FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 및 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 결합을 FACS로 측정하였다. 결과는 도 48에 나타내었다. 데이터는 IgG-IL-2 qm 면역접합체가, 상응하는 4G8-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 구조물(0.7 nM)에 필적하는, 0.9 nM의 EC50 값 하에, FAP-발현 세포에 결합함을 보여준다.
야생형 IL-2 또는 4중 돌연변이체를 포함하는 친화성 증진된 항-FAP Fab-IL-2-Fab 면역접합체를 계속해서 상기 실시예들에서 기술한 바와 같이 프로루킨과 비교하여 세포 분석에서 시험하였다.
NK 세포주 NK92를 상기 면역접합체들(도 21)과 함께 24 시간동안 배양한 후 상등액 중에서 IL-2 유도된 IFN-γ 방출을 ELISA로 측정하였다. NK92 세포는 그 표면상에서 CD25를 발현한다. 결과는, IL-2R βγ 헤테로이량체에 대한 Fab-IL-2 wt-Fab의 약 10배 더 낮은 친화도로부터 예상할 수 있듯이, 야생형 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체가 프로루킨보다 IFN-γ 방출을 유도하는데 덜 효과적이었음을 보여준다. Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체는, NK92 세포가 어느 정도의 CD25를 발현한다는 사실에도 불구하고 INF-γ 방출의 효력 및 확실한 유도의 견지에서 선택된 클론에 대한 각각의 야생형 구조물에 매우 필적하였다. 그러나, 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab가 29B11 Fab-IL-2 wt-Fab 뿐 아니라 28H1 및 4G8 구조물에 비해 사이토카인 방출을 덜 유도하였음을 관찰할 수 있었는데, 이로 인해 Fab-IL-2 wt-Fab에 비해 Fab-IL-2 qm-Fab에 대해 관찰된 효능에서 단지 약간의 변화만 있었다.
또한, MCSP-표적화 MHLG1-KV9-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 NK92 세포 상에서의 IFN-γ 방출 분석법에서 28H1 및 29B11 기본 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체와 비교하였다. 도 22는 MCSP-표적화 MHLG1-KV9-기본 Fab-IL-2 qm-Fab가 IFN-γ 방출을 유도하는데 있어서 FAP-표적화 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체와 매우 필적함을 보여준다.
이어서, 3 일의 기간동안 IL-2에 의한 NK92 세포의 증식 유도를 증식 분석법에서 셀타이터 글로(프로메가)를 사용하여 ATP 측정에 의해 평가하였다(도 23). NK92 세포가 소량의 CD25를 발현함을 고려할 때, 야생형 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체와 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 면역접합체 사이의 차이를 분석법으로 검출할 수 있었으나, 표준 조건하에서 둘 다 유사한 확실한 증식 유도를 달성하였다.
다른 실험에서, 인간 PBMC로부터의 인간 NK 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 Treg 세포 상에서 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 및 프로루킨과 비교한 STAT5 포스포릴화 유도에 대한 28H1 친화성 증진된 FAP-유도된 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 효과를 연구하였다(도 24). CD25 발현을 전혀 나타내지 않거나 매우 적게 나타낸(IL-2R 신호전달이 IL-2R βγ 헤테로이량체에 의해 매개됨을 의미) NK 세포 및 CD8+ T 세포의 경우, 상기 결과는 야생형 IL-2를 포함하는 Fab-IL-2-Fab 면역접합체가 프로루킨보다 IFN-γ 방출을 유도하는데 있어 약 10배 덜 효과적이었으며, Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체는 Fab-IL-2 wt-Fab 구조물보다 단지 매우 약간만 덜 효과적이었음을 나타내었다. 자극시 CD25의 신속한 상향조절을 나타내는 CD4+ T 세포의 경우, Fab-IL-2 qm-Fab는 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체보다 훨씬 덜 효과적이었으나, 포화 농도에서 IL-2R 신호전달의 필적하는 유도를 여전히 나타내었다. 이것은, Treg 세포상에서의 높은 CD25 발현 및 이어지는 Treg 세포 상에서 CD25에 대한 Fab-IL-2 wt-Fab 구조물의 높은 결합 친화도로 인해 Fab-IL-2 qm-Fab의 효력이 Fab-IL-2 wt-Fab 구조물에 비해 상당히 감소된 Treg 세포와 대조적이다. Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체에서 CD25 결합의 제거의 결과로서, Treg 세포에서의 IL-2 신호전달은 IL-2R 신호전달이 IL-2R βγ 헤테로이량체를 통한 CD25-음성 작동인자 세포 상에서 활성화되는 농도에서 IL-2R βγ에 의해서만 활성화된다. 각각의 pM EC50 값을 표 13에 나타내었다.
[표 13]
돌연변이 IL-2 폴리펩티드를 포함하는 28H1 FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 면역접합체에 의한 NK 세포로부터 IFN-γ 방출의 유도
Figure pat00013

또 다른 실험 세트에서, FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 및 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 생물 활성을 여러 세포 분석에서 조사하였다.
FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 및 28H1-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 IL-2R βγ 신호전달의 활성화에 의해 유도된 바와 같이 NK92 세포에 의한 IFN-γ 방출의 유도에 대해 연구하였다. 도 49는 FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체가 IFN-γ 방출을 유도하는데 있어 친화성 증진된 28H1-기본 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체와 동일하게 효과적이었음을 보여준다.
인간 PBMC로부터의 인간 NK 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 Treg 세포 상에서 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 및 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체 뿐 아니라 프로루킨과 비교한 STAT5 포스포릴화 유도에 대한 FAP-표적화 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체의 효과를 연구하였다. 상기 실험의 결과는 도 50에 나타내었다. NK 세포 및 CD8+ T 세포의 경우, 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 면역접합체가 프로루킨보다 STAT5 포스포릴화를 유도하는데 있어 10배 미만으로 덜 효과적이었으나, 28H1-기본 Fab-IL-2 wt-Fab 및 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체보다는 약간 더 효과적이었다. CD4+ T 세포의 경우, 4G8-기본 Fab-IL-2 qm 면역접합체는 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체보다 덜 효과적이었으나, 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체보다는 약간 더 효과적이었으며, 포화 농도에서 프로루킨 및 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab에 필적하는 IL-2R 신호전달의 유도를 여전히 나타내었다. 이것은, 4G8-기본 IgG-IL-2 qm 및 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 효력이 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체에 비해 상당히 감소된 Treg 세포와 대조적이다.
통합하여 생각할 때, 본원에 기술된 IL-2 4중 돌연변이체는 IL-2R βγ 헤테로이량체를 통해 IL-2R 신호전달을 야생형 IL-2와 유사하게 활성화시킬 수 있으나, 다른 작동인자 세포에 비해 Treg 세포의 우선적인 자극은 야기하지 못한다.
실시예 8
FAP-표적화 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체의 항-종양 효과를 ACHN 이종이식 및 LLC1 동계(syngeneic) 모델에서 FAP-표적화 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체와 비교하여 생체내 평가하였다. 모든 FAP-표적화 Fab-IL-2-Fab 면역접합체(야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2 포함)는 뮤린 FAP 및 뮤린 IL-2R을 인식한다. SCID-인간 FcγRIII 유전자도입 마우스에서 ACHN 이종이식 모델은 IHC 중 FAP에 대해 매우 양성이긴 하지만, 상기 모델은 면역약화(immunocompromised) 모델이며, NK 세포 및/또는 대식파지/단핵구에 의해 매개된 면역 작동인자 메카니즘을 단지 반영할 수 있으나, T 세포 매개된 면역성이 결여되어 Treg 세포를 통해 매개된 AICD 또는 효과는 반영하 수 없다. 대조적으로 완전 면역적격(immunocompetent) 마우스에서의 동계 LLC1 모델은 적응성 T 세포 매개된 면역 작동인자 메카니즘도 반영할 수 있으나, 뮤린 실질에서 FAP의 상당히 낮은 발현을 나타낸다. 따라서, 상기 모델들은 각각 인간 종양에서 접하게 되는 바와 같은 상황을 반영한다.
ACHN 신세포 암 이종이식 모델
SCID-인간 FcγRIII 유전자도입 마우스에 신장내 주입된 인간 신세포암 세포주 ACHN을 이용하여, FAP-표적화 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 시험하였다. ACHN 세포는 원래 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)에서 입수하였으며, 세포 증대후 글리카트(Glycart) 국내 세포 은행에 기탁되었다. ACHN 세포를 37 ℃에서 5% CO2 하에 수-포화 대기에서 10% FCS를 함유하는 DMEM 중에서 배양하였다. 시험관내에서 패시지(passage) 18을 98.4%의 생존도에서 신장내 주입에 사용하였다. 마취된 SCID 마우스의 우측 옆구리 및 복벽에 작은 절개부(2 cm)를 만들었다. 50 ㎕의 세포 현탁액(AimV 배지중 1x106 ACHN 세포)을 신장에 2 mm 피막하에 주입하였다. 피부 상처 및 복벽을 클램프를 사용하여 봉합하였다. 실험 초기에 8 내지 9 주된 암컷 SCID-FcγRIII 마우스(GLYCART-RCC)(RCC에서 사육, 스위스)를 관련 지침(GV-솔라스(Solas); 펠라사(Felasa); 티어슈게(TierschG))에 따라 12 h 밝음/12 h 어둠의 일일 주기하에 특정-병원균-비함유 조건에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P2008016). 도착한 후, 동물들을 새로운 환경에 익숙해지게 하기 위해서 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 연속적인 건강상태 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 연구 제 0 일에 1x106 ACHN 세포를 마우스에 신장내 주입하고, 무작위추출하여 계량하였다. 종양 세포 주입 1 주일후에, 마우스에 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab를 1주에 3회 3 주동안 정맥내 주입하였다. 모든 마우스에게 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주입하였다. 비히클 군의 마우스에게 PBS를 주입하고, 처리군에는 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 또는 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 주입하였다. 200 ㎕ 당 적절한 양의 면역접합체를 수득하기 위해, 필요한 경우 저장 용액을 PBS로 희석하였다. 도 25는 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 또는 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체가 둘 다, 효능의 견지에서 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체에 비해 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab에 대한 이점을 갖는 비히클 군에 비해 증대된 중앙 생존값의 견지에서 월등한 효능을 매개했음을 보여준다.
[표 14-A]
Figure pat00014

LLC1 루이스 폐암 동계 모델
블랙 6 마우스에 정맥내 주입된 마우스 루이스(Lewis) 폐암 세포주 LLC1을 사용하여 FAP-표적화 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 및 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 시험하였다. LLC1 루이스 폐암 세포는 원래 ATCC로부터 입수하여 증대시킨 후 글리카트 국내 세포 은행에 기탁하였다. 상기 종양 세포주는 37 ℃에서 5% CO2 하에 수-포화 대기에서 10% FCS를 함유하는 DMEM(깁코(Gibco)) 중에서 통상적으로 배양하였다. 패시지 10을 97.9%의 생존도에서 주입에 사용하였다. 동물 당 2x105 세포를 100 ㎕의 Aim V 세포 배양 배지(깁코) 중에서 꼬리 정맥내에 정맥내 주입하였다. 실험 개시때에 8 내지 9 주된 블랙 6 마우스(찰스 리버(Charles River), 독일)를 관련 지침(GV-솔라스; 펠라사; 티어슈게)에 따라 12 h 밝음/12 h 어둠의 일일 주기하에 특정-병원균-비함유 조건에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P2008016). 도착한 후, 동물들을 새로운 환경에 익숙해지게 하기 위해서 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 연속적인 건강상태 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 연구 제 0 일에 2x105 LLC1 세포를 마우스에 정맥내 주입하고, 무작위추출하여 계량하였다. 종양 세포 주입 1 주일후에, 마우스에 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 또는 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab를 1주에 3회 3 주동안 정맥내 주입하였다. 모든 마우스에게 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주입하였다. 비히클 군의 마우스에게 PBS를 주입하고, 처리군에는 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 또는 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 구조물을 주입하였다. 200 ㎕ 당 적절한 양의 면역접합체를 수득하기 위해, 필요한 경우 저장 용액을 PBS로 희석하였다. 도 26은 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 또는 친화성 증진된 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 구조물이 비히클 군에 비해 증대된 중앙 생존값의 견지에서 월등한 효능을 매개했음을 보여준다.
[표 14-B]
Figure pat00015

또 다른 실험에서, 블랙 6 마우스에 정맥내 주입된 마우스 루이스 폐암 세포주 LLC1을 사용하여 FAP-표적화 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 및 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체를 시험하였다. 패시지 9를 94.5%의 생존도에서 주입에 사용하였다. 동물 당 2x105 세포를 200 ㎕의 Aim V 세포 배양 배지(깁코) 중에서 꼬리 정맥내에 정맥내 주입하였다. 연구 제 0 일에 2x105 LLC1 세포를 마우스에 정맥내 주입하고, 무작위추출하여 계량하였다. 종양 세포 주입 1 주일후에, 마우스에 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 또는 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab를 1주에 3회 3 주동안 정맥내 주입하였다. 모든 마우스에게 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주입하였다. 비히클 군의 마우스에게 PBS를 주입하고, 처리군에는 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 또는 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 구조물을 주입하였다. 200 ㎕ 당 적절한 양의 면역접합체를 수득하기 위해, 필요한 경우 저장 용액을 PBS로 희석하였다. 도 27은 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab 및 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체가, 효능의 견지에서 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역접합체에 비해 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab에 대한 약간의 이점을 갖는 비히클 군에 비해 증대된 중앙 생존값의 견지에서 월등한 효능을 매개했음을 보여준다.
[표 14-C]
Figure pat00016

실시예 9
4G8 기본 FAP-표적화 Fab-IL-2 qm-Fab를 계속해서 블랙 6 마우스에서의 7일 정맥내 독성 및 독성동태학 연구에서 4G8 기본 FAP-표적화 Fab-IL-2 wt-Fab 면역접합체와 비교하였다. 표 15는 독성 및 독성동태학 연구의 연구 설계를 나타낸 것이다.
[표 15]
연구 설계
Figure pat00017

상기 연구의 목적은, 비-종양-함유 수컷 마우스에 7 일동안 1일 1회 정맥내 투여후에 FAP-표적화 4G8 Fab-IL2-Fab 야생형(wt) 인터루킨-2(IL-2) 및 FPA-표적화 G48 Fab-IL-2 4중 돌연변이 IL-2(qm)의 독성 및 독성동태학 프로필을 특성화하고 비교하기 위한 것이었다. 상기 연구에서, 5 마리 수컷 마우스/군의 5개 군에 0(비히클 대조군), 4.5 또는 9 ㎍/g/일의 wt IL-2, 또는 4.5 또는 9 ㎍/g/일의 qm IL-2를 정맥내 투여하였다. 독성동태학을 평가하기 위해, 6 마리 수컷 마우스/군의 또 다른 4개 군에 4.5 또는 9 ㎍/g/일의 wt IL-2, 또는 4.5 또는 9 ㎍/g/일의 qm IL-2를 투여하였다. 연구 기간은 4.5 및 9 ㎍/g/일의 wt IL-2를 투여받은 동물에서 관찰된 임상 징후로 인해 7 일에서 5 일로 변화되었다. 독성의 평가는 사망률, 생존시 관찰사항, 체중, 및 임상 및 해부 병리학을 기준으로 하였다. 독성동태학 분석을 위해 독성동태학 군의 동물로부터 혈액을 다양한 시점에서 수거하였다. 독성동태학 데이터는 wt IL-2 또는 qm IL-2로 처리된 마우스가 마지막 채혈 시점까지 측정가능한 혈장 수준을 가진 것을 나타내어, 마우스가 처리 기간 전체에 걸쳐 각각의 화합물에 노출되었음을 시사하였다. 제 1 일 AUC0-inf 값은 두 용량 수준 모두에서 wt IL-2 및 qm IL-2의 필적할 만한 노출을 시사한다. 산재 샘플들을 제 5 일에 취하였으며 제 1 일과 동등한 혈장 농도를 나타내어, 화합물 투여 5 일후에 축적이 발생하지 않았음을 시사하였다. 보다 상세하게는 하기의 결과들이 관찰되었다.
독성동태학
표 16은 윈놀린(WinNonLin) 버전 5.2.1 및 상업적인 카파-특이 ELISA[인간 카파 ELISA 정량화 세트(Human Kappa ELISA Qunatitation Set), 베틸 래버러토리즈(Bethyl Laboratories)]에 의해 측정할 때, FAP-표적화 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 및 FAP-표적화 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab에 대한 평균 혈장 독성동태학 파라미터를 요약한 것이다.
[표 16]
Figure pat00018

개개 혈청 농도는 하기에 나타내었다.
Figure pat00019

상기 데이터는 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab가 둘 다 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab에 대해 약간 더 높은 노출하에 필적할 만한 약동학적 성질을 나타냄을 보여준다.
사망률
9 ㎍/g FAP-표적화 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군에서, 제 5 일에 검시전에 한마리 동물에서 처리-관련 사망이 발생하였다. 사망 전에 활동저하, 차가운 피부 및 구부정한 자세가 주목되었다. 상기 동물은 부종 및 출혈이 동반된 폐에서의 세포 침윤과 현저한 골수 괴사의 복합으로 인해 죽은것 같았다. 사망률은 표 17에 요약하였다.
[표 17]
제 5 일 사망률
Figure pat00020

임상적 관찰
활동 저하, 차가운 피부 및 구부정한 자세가 4.5 및 9 ㎍/g/일 wt IL-2를 투여받은 동물에서 주목되었다. 임상적 관찰결과를 표 18에 요약하였다.
[표 18]
제 5 일 임상적 관찰
Figure pat00021

체중
4.5 및 9 ㎍/g/일 wt IL-2를 투여받은 동물에서 처리 5 일 후에 체중에서 중간정도의 감소(각각 9% 및 11%)가 관찰되었다. 4.5 또는 9 ㎍/g/일 qm IL-2를 투여받은 동물에서는 처리 5 일후 체중에 약간의 감소(각각 2% 및 1%)가 관찰되었다. 처리 5 일후 비히클 대조군에서도 체중에 중간정도(9%) 감소가 관찰되었다. 그러나, 가능한 이상치(outlier)(동물 #3)를 배제한 경우, 감소 퍼센트는 5%였다. 비히클 군에서 체중 손실은 스트레스에 기인할 수 있었다.
혈액학
4.5(약 4.5배) 및 9(약 11배) ㎍/g/일 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab를 투여받은 동물에서 감소된 혈소판 수가 관찰되었는데, 이것은 골수에서 감소된 거핵구, 및 상기 동물들의 비장 및 폐에서의 전신 소모성 효과(피브린)와 상관되었다(하기 조직병리학 부분 참조). 상기 소견은 감소된 혈소판이 소모 및 생성의 감소/IL-2의 직접 또는 간접 효과로서 림프구/골수 세포 생성의 증가로 인한 골수 밀집의 복합 효과에 기인하였을 것임을 나타내었다.
화합물 투여에 대한 불확실한 관계의 혈액학적 소견은 비히클 대조군의 평균 값에 비해, 4.5(약 5배) 및 9(약 3배) ㎍/g에서 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab에 따른 확실한 림프구 수 감소로 구성되었다. 상기 소견은 분명한 용량-의존성은 결여되었지만, 생존시 관찰 또는 화합물의 과장된 약리학(조직내로 이동하는 림프구)에서 언급된 스트레스와 관련된 효과에 대해 부차적인 것으로 간주될 수 있었다. 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab의 투여로 인한 처리-관련 혈액학적 변화는 없었다. 일부 유일한 혈액학적 소견은 그 각각의 대조군과 통계적으로 상이하였다. 그러나, 상기 소견은 병리학적 관련성을 시사하기에는 불충분한 규모였다.
육안 병리학 및 조직병리학
처리와 관련된 전체적 소견은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 각각의 5/5 및 4/5 마우스, 및 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 처리 군 둘 다의 1/5 마우스에서 발견된 커진 비장을 포함하였다.
처리와 관련된 조직병리학적 소견은, 하기에 기록된 바와 같이, 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab를 투여한 군에서, 발생률, 중증도 등급 또는 변화의 성질에는 차이가 있지만, 폐, 골수, 간, 비장 및 흉선에 존재하였다.
폐에서의 처리와 관련된 조직병리학적 소견은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 약한 정도에서 현저하게, 및 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군의 5/5 마우스에서 미미하게 발견된 단핵성 침윤으로 이루어졌다. 단핵성 침윤은 림프구(이들 중 일부는 세포질 과립을 갖는 것으로 주목되었다) 및 반응성 대식세포로 이루어졌다. 상기 세포들은, 종종 폐에 혈관내에서 주목된 주변화와 함께, 혈관중심 패턴을 갖는 것으로 매우 자주 주목되었다. 상기 세포들은 또한 혈관을 둘러싸는 것으로 주목되었으나, 보다 심한 경우에서는 상기 패턴은 보다 확산성이었다. 출혈은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 미미한 정도에서 약하게, 및 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군의 2/5 마우스에서 미미하게 나타났다. 출혈은 매우 자주 혈관주위에서 주목되었지만, 보다 심한 경우에서는 또한 폐포 공간에서도 주목되었다. 부종은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 약한 정도에서 중간정도로, 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군의 5/5 마우스에서 미미하게 나타났다. 부종은 매우 자주 혈관주위에서 주목되었지만, 보다 심한 경우에서는 또한 폐포 공간에서도 주목되었다. 미미한 세포 변성 및 핵붕괴가 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 각각의 2/5 및 5/5 마우스에서 주목되었으며, 침윤성 또는 반응성 백혈구의 변성으로 이루어졌다. MSB 염색으로 선택된 동물은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 둘 다에서 동물의 폐 내에서 발견된 피브린에 대해 양성이었으며, 이것은 부분적으로 상기 동물들에서 주목된 감소된 혈소판과 상관된다.
골수에서의 처리와 관련된 변화는 4.5 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군 둘 다의 5/5 마우스 및 2/5 마우스, 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군 둘 다의 2/5 마우스 각각에서 미미하게 내지 약하게 증가된 전체 골수 세포충실성을 포함하였다. 이것은, 부분적으로 골수 및 부비강 내의 CD3 양성 T 세포(특히, 선택된 동물에서 수행된 팬-T-세포 마커 CD3을 사용한 면역화학에 의해 확인된 T-림프구)의 증가된 수에 의해 지지된, 상기 군들에서 미미하게 내지 중간 정도로 증가된 림프구-골수세포 과형성을 특징으로 하였다. CD3 양성 T 세포 증가는 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 둘 다에서 중간정도였고, 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군 둘 다에서 미미한 정도 내지 약한 정도였다. 거핵구의 미미한 정도에서 약한 정도의 감소가 4.5 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 2/5 마우스, 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 관찰되었으며, 적혈구 전구체의 미미한 정도에서 중간 정도의 감소가 4.5 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 3/5 마우스, 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 주목되었다. 골수 괴사는 4.5 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 1/5 마우스(최소), 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서(약한 정도내지 현저하게) 주목되었다. 골수에서 거핵구의 감소된 수는 감소된 혈소판과 상관되었으며, 이것은 증가된 림프구/골수 전구체 및/또는 골수 괴사에 의한 골수의 직접적 밀집, 및/또는 다양한 조직(비장 및 폐 참조)에서 염증으로 인한 혈소판 소모에 기인할 수 있다. 골수에서 주목된 감소된 적혈구 전구체는 시간적 효과(말초혈 이전에 골수에서 보이는) 및 말초혈 적혈구세포의 더 긴 반감기(혈소판에 비해)에 기인하기 쉬운 말초혈 혈액학적 소견과 상관되지 않았다. 골수에서 골수 괴사의 메카니즘은, 골수강의 명백한 과밀집(림프구/골수 세포의 생성 및 성장으로 인한), 아마도 저산소증의 국소적 영향 또는 화합물의 다른 약리학적 효과와 관련된, 증식 세포 유형으로부터 사이토카인의 전신 또는 국소적 방출로 인해 부차적일 수 있다.
간에서의 처리 관련 소견은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 약한 정도에서 중간정도의 주로 혈관중심 단핵 세포 침윤물 및 미미하거나 약한 정도의 단일 세포 괴사로 이루어졌다. 미미한 단일 세포 괴사가 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 각각의 2/5 및 4/5 마우스에서 나타났다. 단핵성 침윤물은 주로 매우 자주 혈관중심부에서 뿐 아니라 중심 및 문형(portal) 혈관 내에서 주변부에서 주목되는 림프구(특히, 선택된 동물에서 수행된 팬-T 세포 마커 CD3을 사용하여 면역화학에 의해 확인된 T-림프구)로 이루어졌다. F4/80에 대한 면역조직화학 염색을 위해 선택된 동물은, 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군에서 간 동양혈관(sinusoid) 전체에 증가된 수 및 크기의(활성화) 대식세포/쿠퍼(Kupffer) 세포를 나타내었다.
비장에서의 처리 관련 소견은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 중간정도 내지 현저한 림프구양 증식증/침윤 및 약한정도에서 중간정도의 대힉세포 증식증/침윤, 및 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군의 5/5 마우스에서 미미한 정도 내지 약한 정도의 대식세포 증식증/침윤과 함께 약한정도 내지 중간정도의 림프구양 증식증/침윤으로 이루어졌다. 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab에 대한 면역조직화학은 팬-T 세포 마커 CD3, 및 대식세포 마커 F4/80을 사용하여 상이한 패턴을 나타내었다. 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab의 경우, 1차 난포의 구조가 림프구용해(lymphocytolysis) 및 괴사에 의해 변화되었기 때문에(하기에 기술), T-세포 및 대식세포 면역반응성의 패턴은 주로 적색 수질(red pulp) 영역 내에 유지되었다. 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab의 경우, 특정 염색은, T-세포 집단 및 보다 큰 팽창된 적색 수질 영역에 의해, 동맥주위 림프집(periarteriolar lymphoid sheath, PALS) 백색 수질(white pulp) 팽창하에, 비히클 군과 유사한 패턴을 나타내었다. T-세포 및 대식세포 명확성은 또한, 팽창된 것을 제외하고 비히클 대조군과 유사한 패턴하에 적색 수질 내에서 명백하였다. 상기 소견은 확장된 비장의 전체적 소견과 상관된다. 괴사는 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 각각의 3/5 마우스에서 미미하게, 및 5/5 마우스에서 미미한 정도 내지 약하게 주목되었다. 괴사는 통상적으로 1차 난포 영역 주위에 위치하였고, MSB 염색을 이용하여 선택된 동물은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 둘 다에서 피브린에 대해 양성이었으며, 이것은 부분적으로 상기 동물들에서 주목된 감소된 혈소판과 상관된다. 림프구용해는 4.5 ㎍/g(최소 내지 약하게) 및 9 ㎍/g(중간정도 내지 현저하게) 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군에서 나타났다.
흉선에서의 처리 관련 소견은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 둘 다에서 및 4.5 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군에서 림프구의 최소 내지 약한 증가를 포함하였다. 피질 및 수질은 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군에서 개별적으로 분명하지 않았으나, 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군에서 선택된 동물 상에 팬 T 세포 마커 (CD3)에 대한 면역조직화학은 흉선내 대부분의 세포에 대해 강한 명확성을 나타내었다. 흉선에서 증가된 림프구는, IL-2가 추가의 분화 및 클론 확대를 위해 골수로부터 흉선(T 세포)으로 이동하는 림프구의 증식을 유도한 두 화합물의 직접적인 약리학적 효과인 것으로 간주되었다. 상기 현상은 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab를 제외하고 모든 군에서 발생하였는데, 이것은 일시적 효과인 듯하다. 림프구용해는 4.5 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군에서는 약하였으며, 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군에서는 중간정도 내지 현저하였다. 중간정도의 림프 결핍이 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군 둘 다에서 주목되었다. 상기 결과는 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군에서 더 강한 것으로 보이지만, 상기 동물들은 제 5 일에 빈사상태로서 기술되었으며, 약한정도 내지 현저한 림프구용해 및 중간정도의 림프 결핍이 상기 생존시 관찰(불량한 신체 조건으로 인한 스트레스-관련 효과)과 관련될 수 있다.
간에서 화합물 투여에 대한 불확실한 관계의 조직병리학적 소견은 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군 둘 다의 5/5 마우스에서 간 전체에 불규칙하게 산란된 작은 병소/미세육아종으로 주목된 미미한 혼합 세포(림프구 및 대식세포) 침윤물/활성화로 이루어졌다. 상기 미미한 변화는 또한 비히클 군에서도 나타났으나, 발생률 및 중증도가 매우 낮았다. 선위 확장 및 위축이 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 5/5 마우스에서 미미하게 내지 약하게 나타났으며, 회장 융모 위축이 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군의 3/5 마우스에서 미미하게 나타났다. 상기 결과는 필시, 특히 생존시 관찰에서 주목된 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 군에서, 감소된 체중과 같은 상기 마우스에서 나타난 불량한 신체 조건에 기인한다.
주입 부위 소견은 비히클 군, 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군에서 동일하게 주목된 혼합 세포 침윤, 혈관주위 부종 및 근변성을 포함하였다. 한 동물은 상피 괴사를 가졌다. 상기 결과는 처리(들) 자체에 기인하는 것이 아니라, 매일의 정맥내 주사 및 꼬리 취급에 기인하였다. 또 다른 동물은 근변성과 관련된 골격근의 대식세포 침윤(폐 조직 조직학 부분에서 주목된)을 가졌으며, 만성 병변에 기인하기 쉬운 근변성은 처리에 기인하지 않았다. 미미한 림프 결핍이 4.5 및 9 ㎍/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab 군 각각의 3/5 및 4/5 마우스에서 주목되었으며, 필시 마우스가 나이가 듦에 따라 흉선에서 보여지는 정상적인 물리적 변화(유사한 발생률, 4/5 마우스에서 및 비히클 대조군 동물에서의 중증도에서도 보임)에 기인하였다.
결론적으로, 수컷 마우스에서 4.5 또는 9 ㎍/g/일의 용량으로 5 일이하 동안 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab 또는 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab의 매일 정맥내 투여는 두 화합물 모두에서 유사한 처리-관련 조직학적 결과를 제공하였다. 그러나, 상기 결과들은 인반적으로 폐(도 28 및 29)(림프구 및 반응성 대식세포로 이루어진 단핵성 침윤, 출혈 및 부종), 골수(림프-골수 증식증 및 감소된 세포충실성), 간(도 30)(단일 세포 괴사, 수 및 활성화에 있어 쿠퍼 세포/대식세포 증가), 비장(전체적 확장, 대식세포 및 림프구 침윤/증식증) 및 흉선(증가된 림프구)에서 FAP-표적화 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab에 있어서 더 우세하였고 보다 심하였다. 또한, 폐, 비장, 골수 및 흉선에서의 사망률, 림프구용해, 괴사 또는 세포 변성에 더하여, 골수에서의 감소된 거핵구 및 적혈구 및 말초혈에서의 감소된 혈소판이 wt IL-2를 투여한 동물에서만 나타났다. 임상적 및 해부 병리학적 소견, 및 임상적 관찰사항, 및 두 화합물의 필적하는 전신 노출을 근거로, 상기 연구의 조건하에서 qm IL-2는 wt IL-2보다 5회 투약후 현저히 적은 전신 독성을 나타내었다.
실시예 10
야생형 및 4중 돌연변이 IL-2에 의한 NK 세포 IFN -γ 분비의 유도
NK-92 세포를 96 웰-F-바닥 플레이트 내에 100000 세포/웰을 접종하기 2 시간전에 결핍시켰다. IL-2 구조물을 접종된 NK-92 세포 상에 적정하였다. 24 시간 또는 48 시간 후에, 플레이트를 원심분리한 후, 상등액을 수거하고 상업적 IFN-γ ELISA(BD #550612)를 사용하여 인간 IFN-γ의 양을 측정하였다. 야생형 IL-2의 2개의 상이한 자체제조된 제제(아마도 그의 O-글리코실화 프로필에서 약간 상이함, 실시예 2 참조), 상업적으로 시판하는 야생형 IL-2(프로루킨) 및 인-하우스 제조된 4중 돌연변이 IL-2(첫번째 배치)를 시험하였다. 도 31은 4중 돌연변이 IL-2가 24 시간(A) 또는 48 시간(B)동안 NK 세포에 의한 IFN-γ 분비를 유도하는데 있어 상업적으로 구입(프로루킨)하거나 자체 생성된 야생형 IL-2와 동일하게 효과적임을 보여준다.
실시예 11
야생형 및 4중 돌연변이 IL-2에 의한 NK 세포 증식의 유도
NK-92 세포를 96 웰-블랙-F-투명 바닥 플레이트 내에 100000 세포/웰을 접종하기 2 시간 전에 결핍시켰다. IL-2 구조물을 접종된 NK-92 세포 상에 적정하였다. 48 시간 후에, 프로메가의 "셀타이터-글로 발광 세포 생존도 분석" 키트를 제조사의 지시에 따라 사용하여 ATP 함량을 측정하여 생존 세포 수를 결정하였다. 실시예 10에서와 동일한 IL-2 제제를 시험하였다. 도 32는 모든 시험한 분자들이 NK 세포의 증식을 유도할 수 있었음을 보여준다. 저농도(<0.01 nM)에서, 4중 돌연변이 IL-2는 자체 생성된 야생형 IL-2보다 약간 덜 활성적이었으며, 모든 자체제조된 제제는 상업적으로 구입한 야생형 IL-2(프로루킨)보다 덜 활성적이었다. 두 번째 실험에서, 하기 IL-2 제제를 시험하였다: 야생형 IL-2(풀 2), 4중 돌연변이 IL-2(제 1 및 제 2 배치). 도 33은 모든 시험한 분자들이 NK 세포의 증식을 유도하는데 대략 유사하게 활성적이었으며, 이때 2개의 돌연변이 IL-2 제제는 최저 농도에서 야생형 IL-2 제제보다 단지 최소한으로 덜 활성적임을 보여준다.
실시예 12
야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 면역접합체에 의한 인간 PBMC 증식의 유도
말초혈 단핵 세포(PBMC)를 히스토팩(Histopaque)-1077(시그마 다이아그노스틱스 인코포레이티드(Sigma Diagnostics Inc.), 미국 미저리주 세인트루이스)을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 건강한 지원자로부터의 정맥혈을 헤파린화 주사기내에 채혈하였다. 혈액을 칼슘- 및 마그네슘-비함유 PBS로 2:1로 희석하고, 히스토팩-1077 위에 적층시켰다. 상기 구배를 실온(RT)에서 450 x g에서 30 분동안 쉬지않고 원심분리하였다. PBMC를 함유하는 중간상을 수거하고, PBS로 3회 세척하였다(실온에서 10 분동안 350 x g에 이어 300 x g). 이어서, PBMC를 37 ℃에서 15 분동안 40 nM CFSE(카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터)로 표지화시켰다. 세포를 20 ml 배지로 세척한 후 37 ℃에서 30 분동안 표지화된 PBMC를 회수하였다. 세포를 세척하고, 계수하고, 100000 세포를 96-웰-U-바닥 플레이트 내에 접종시켰다. 미리-희석된 프로루킨(상업적으로 시판하는 야생형 IL-2) 또는 IL-2 면역접합체를 접종 세포 상에 적정하고, 이것은 지시된 시간 동안 배양하였다. 4 내지 6 일후에, 세포를 세척하고, 적절한 세포 표면 마커에 대해 염색하고, BD FACS칸토II를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다. NK 세포는 CD3_/CD56+으로서, CD4 T 세포는 CD3+/CD8_로서, CD8 T 세포는 CD3_/CD8+로서 규정하였다. 도 34는 상이한 FAP-표적화 28H1 IL-2 면역접합체와 함께 4 일(A), 5 일(B) 또는 6 일(C) 동안 배양한 후 NK 세포의 증식을 나타낸 것이다. 모든 시험한 구조물은 농도-의존 방식으로 NK 세포 증식을 유도하였다. 프로루킨은 보다 저농도에서 면역접합체보다 효과적이었으나, 상기 차이는 고농도에서는 더이상 존재하지 않았다. 초기 시점(제 4 일)에서는, IgG-IL2 구조물이 Fab-IL2-Fab 구조물보다 약간 더 효과적인 것으로 보였다. 말기 시점(제 6 일)에서는, 모든 구조물이 필적하는 효능을 가졌으며, Fab-IL2 qm-Fab 구조물은 저농도에서 가장 덜 효과적이었다. 도 35는 상이한 FAP-표적화 28H1 IL-2 면역접합체와 함께 4 일(A), 5 일(B) 또는 6 일(C) 동안 배양한 후 CD4 T-세포의 증식을 나타낸 것이다. 모든 시험한 구조물은 농도-의존 방식으로 CD4 T 세포 증식을 유도하였다. 프로루킨이 면역접합체보다 더 높은 활성을 가졌으며, 야생형 IL-2를 포함하는 면역접합체는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 면역접합체보다 약간 더 효과적이었다. NK 세포의 경우에서와 같이, Fab-IL2 qm-Fab 구조물이 최저 활성을 가졌다. 아마도 증식 T 세포는 부분적으로, 적어도 야생형 IL-2 구조물에 대해 조절 T 세포이다. 도 36은 상이한 FAP-표적화 28H1 IL-2 면역접합체와 함께 4 일(A), 5 일(B) 또는 6 일(C) 동안 배양한 후 CD8 T-세포의 증식을 나타낸 것이다. 모든 시험한 구조물은 농도-의존 방식으로 CD8 T 세포 증식을 유도하였다. 프로루킨이 면역접합체보다 더 높은 활성을 가졌으며, 야생형 IL-2를 포함하는 면역접합체는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 면역접합체보다 약간 더 효과적이었다. NK 세포의 경우에서와 같이, Fab-IL2 qm-Fab 구조물이 최저 활성을 가졌다. 도 37은 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 28H1 IgG-IL-2 및 프로루킨을 비교한 또 다른 실험의 결과를 나타낸 것이다. 배양 시간은 6 일이었다. 도면에 나타난 바와 같이, 3개의 IL-2 구조물은 모두 NK(A) 및 CD8 T-세포(C) 증식을 유사한 효력하에 용량-의존성 방식으로 유도한다. CD4 T-세포(B)의 경우, IgG-IL2 qm 면역접합체가 특히 중간 농도에서 더 낮은 활성을 갖는데, 이것은 CD4 T 세포의 부분집합인 CD25-양성 (조절세포 포함) T 세포에 대한 활성의 결여에 기인할 수 있다.
실시예 13
야생형 및 4중 돌연변이 IL-2에 의한 작동인자 세포 활성화( pSTAT5 분석)
전술한 바와 같이 PBMC를 제조하였다. 500000 PBMC/웰을 96-웰-U-바닥 플레이트 내에 접종하고 37 ℃에서 10% FCS 및 1% 글루타맥스(깁코)를 함유하는 RPMI 배지중에서 45 분간 휴지시켰다. 그 후에, PBMC를 프로루킨, 자체 생성된 야생형 IL-2 또는 4중 돌연변이 IL-2와 함께 지시된 농도에서 37 ℃에서 20 분간 배양하여 STAT5의 포스포릴화를 유도하였다. 이어서, 세포를 37 ℃에서 10 분동안 즉시 고정(BD 사이토픽스 버퍼(Cytofix Buffer))시키고 1회 세척한 후, 4 ℃에서 30 분간 투과화 단계(BD 포스플로우 펌 버퍼 III)를 수행하였다. 그 다음에, 세포를 PBS/0.1% BSA로 세척하고, NK 세포(CD3_/CD56+), CD8+ T 세포(CD3+/CD8+), CD4+ T 세포(CD3+/CD4+/CD25_/CD127+) 또는 Treg 세포(CD4+/CD25+/CD127_/FoxP3+), 및 pSTAT5의 검출을 위해 RT에서 암실에서 30 분동안 FACS 항체들의 혼합물로 염색하였다. 유세포측정 분석(BD FACS칸토II) 전에 세포를 PBS/0.1% BSA로 2회 세척하고 2% PFA에 재현탁시켰다. 도 38은 프로루킨, 자체 생성된 야생형 IL-2(풀 2) 및 4중 돌연변이 IL-2(배치 1)와 함께 30 분 배양후, NK 세포(A), CD8 T 세포(B), CD4 T-세포(C) 및 조절 T-세포(D)의 STAT 포스포릴화를 나타낸 것이다. 3개의 IL-2 제제는 모두 NK 뿐 아니라 CD8 T-세포에서 STAT 포스포릴화를 유도하는데 동일하게 효과적이었다. CD4 T-세포에서 및 조절 T-세포에서 훨씬 더, 4중 돌연변이 IL-2가 야생형 IL-2 제제보다 낮은 활성을 가졌다.
실시예 14
야생형 및 4중 돌연변이 IgG -IL-2에 의한 작동인자 세포 활성화( pSTAT5 분석)
실험 조건은 전술한 바와 같았다(실시예 13 참조). 도 39는 프로루킨, 야생형 IL-2를 포함하는 IgG-IL-2 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 IgG-IL-2와 함께 30 분 배양후, NK 세포(A), CD8 T-세포(B), CD4 T-세포(C) 및 조절 T-세포(D)에서의 STAT 포스포릴화를 나타낸 것이다. 모든 세포 유형에 대해 프로루킨이 IgG-IL-2 면역접합체보다 STAT 포스포릴화를 유도하는데 더 효과적이었다. IgG-IL-2 야생형 및 4중 돌연변이 구조물은 NK 뿐 아니라 CD8 T-세포에서 동일하게 효과적이었다. CD4 T-세포에서 및 조절 T-세포에서 훨씬 더, IgG-IL-2 4중 돌연변이체가 IgG-IL-2 야생형 면역접합체보다 낮은 활성을 가졌다.
실시예 15
FAP - 표적화 Fab - IL2 wt- Fab 및 Fab - IL2 qm - Fab 면역접합체의 최대 허용 용량(MTD)
야생형(wt) 또는 4중 돌연변이(qm) IL-2를 포함하는 FAP-표적화 Fab-IL2-Fab 면역접합체의 상승 용량을 종양 비함유 면역적격 블랙 6 마우스에서 시험하였다. 실험 개시 때에, 8 내지 9 주된 암컷 블랙 6 마우스(찰스 리버, 독일)를 관련 지침(GV-솔라스; 펠라사; 티어슈게)에 따라 12 h 밝음/12 h 어둠의 일일 주기하에 특정-병원균-비함유 조건에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P2008016). 도착한 후, 동물들을 새로운 환경에 익숙해지게 하기 위해서 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 연속적인 건강상태 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 마우스에게 60, 80 및 100 ㎍/마우스의 용량으로 4G8 Fab-IL2 wt-Fab 또는 100, 200, 400, 600 및 1000 ㎍/마우스의 용량으로 4G8 Fab-IL2 qm-Fab를 7 일동안 하루에 1회 정맥내 주입하였다. 모든 마우스에게 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주입하였다. 200 ㎕ 당 적절한 양의 면역접합체를 수득하기 위해, 필요한 경우 저장 용액을 PBS로 희석하였다. 도 40은 Fab-IL-2 qm-Fab에 대한 MTD(최대 허용 용량)가 Fab-IL-2 wt-Fab에 대한 값보다 10배 더 높은 것, 즉, Fab-IL2 wt-Fab에 대해 7 일동안 하루에 60 ㎍/마우스에 비해 Fab-IL2 qm-Fab에 대해 7 일동안 하루에 600 ㎍/마우스임을 보여준다.
[표 19]
Figure pat00022

실시예 16
단일 용량의 FAP - 표적화 및 비표적화 IgG - IL2 wt 및 qm 의 약동학
단일 용량 약동학(PK) 연구를 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 FAP-표적화 IgG-IL2 면역접합체, 및 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 비표적화 IgG-IL2 면역접합체에 대해 무종양 면역적격 129 마우스에서 수행하였다. 실험 개시 때에, 8 내지 9 주된 수컷 129 마우스(할란(Harlan), 영국)를 관련 지침(GV-솔라스; 펠라사; 티어슈게)에 따라 12 h 밝음/12 h 어둠의 일일 주기하에 특정-병원균-비함유 조건에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P2008016). 도착한 후, 동물들을 새로운 환경에 익숙해지게 하기 위해서 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 연속적인 건강상태 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 마우스에게 FAP-표적화 28H1 IgG-IL2 wt(2.5 mg/kg) 또는 28H1 IgG-IL2 qm(5 mg/kg), 또는 비표적화 DP47GS IgG-IL2 wt(5 mg/kg) 또는 DP47GS IgG-IL2 qm(5 mg/kg)을 1회 정맥내 주입하였다. 모든 마우스에게 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주입하였다. 200 ㎕ 당 적절한 양의 면역접합체를 수득하기 위해, 필요한 경우 저장 용액을 PBS로 희석하였다. 마우스를 1, 8, 24, 48, 72, 96 시간; 및 그 후 3 주동안 2 일마다 출혈시켰다. 혈청을 추출하고 ELISA 분석까지 -20 ℃에서 저장하였다. 혈청내 면역접합체 농도를 IL2-면역접합체 항체의 정량화를 위한 ELISA(로슈-펜즈베르그)를 이용하여 측정하였다. 405 nm의 측정 파장 및 492 nm의 기준 파장을 이용하여 흡광도를 측정하였다(버사맥스(Versamax) 파장가변 마이크로플레이트 리더, 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)). 도 41은 상기 IL-2 면역접합체들의 약동학을 나타낸 것이다. FAP-표적화(A) 및 비표적화(B) IgG-IL2 qm 구조물이 둘 다(약 30 h) 상응하는 IgG-IL2 wt 구조물(약 15 h)보다 긴 혈청 반감기를 갖는다.
[표 20]
Figure pat00023

실시예 17
단일 용량의 비표적화 Fab - IL2 wt- Fab 및 Fab - IL2 qm - Fab 의 약동학
단일 용량 약동학(PK) 연구를 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 비표적화 IgG-IL2-Fab 면역접합체에 대해 무종양 면역적격 129 마우스에서 수행하였다. 실험 개시 때에, 8 내지 9 주된 수컷 129 마우스(할란, 영국)를 관련 지침(GV-솔라스; 펠라사; 티어슈게)에 따라 12 h 밝음/12 h 어둠의 일일 주기하에 특정-병원균-비함유 조건에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P2008016). 도착한 후, 동물들을 새로운 환경에 익숙해지게 하기 위해서 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 연속적인 건강상태 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 마우스에게 65 nM/kg 용량의 DP47GS Fab-IL2 wt-Fab 또는 65 nM/kg 용량의 DP47GS Fab-IL2 qm-Fab를 1회 정맥내 주입하였다. 모든 마우스에게 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내 주입하였다. 200 ㎕ 당 적절한 양의 면역접합체를 수득하기 위해, 필요한 경우 저장 용액을 PBS로 희석하였다. 마우스를 0.5, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 96 시간 및 그 후 3 주동안 2 일마다 출혈시켰다. 혈청을 추출하고 ELISA 분석까지 -20 ℃에서 저장하였다. 혈청내 면역접합체 농도를 IL2-면역접합체 항체의 정량화를 위한 ELISA(로슈-펜즈베르그)를 이용하여 측정하였다. 405 nm의 측정 파장 및 492 nm의 기준 파장을 이용하여 흡광도를 측정하였다(버사맥스 파장가변 마이크로플레이트 리더, 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)). 도 42는 상기 IL-2 면역접합체들의 약동학을 나타낸 것이다. Fab-IL2-Fab wt 및 qm 구조물은 약 3 내지 4 h의 혈청 반감기를 갖는다. 야생형 또는 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 구조물 사이의 혈청 반감기의 차이는, 자체로 더 긴 반감기를 갖는 IgG-유사 면역접합체보다 Fab-IL2-Fab 구조물들에서 덜 현저하였다.
[표 21]
Figure pat00024

실시예 18
IL-2 활성화 PBMC 의 활성화 유도성 세포 자멸
건강한 공여자로부터 새로 분리한 PBMC를 10% FCS 및 1% 글루타민을 함유한 RPMI1640 중에서 1 ㎍/ml의 PHA-M으로 밤새 예비-활성화시켰다. 예비-활성화 후에, PBMC를 회수하고, PBS 중 40 nM CFSE로 표지화하고, 96-웰 플레이트에 100,000 세포/웰로 접종하였다. 예비-활성화된 PBMC를 상이한 농도의 IL-2 면역접합체(4B9 IgG-IL-2 wt, 4B9 IgG-IL-2 qm, 4B9 IgG-IL-2 wt-Fab 및 4B9 IgG-IL-2 qm-Fab)로 자극하였다. IL-2 처리 6 일후에, PBMC를 0.5 ㎍/ml 활성화 항-Fas 항체로 밤새 처리하였다. 6 일후에 CD4(CD3+CD8_) 및 CD8(CD3+CD8+) T 세포의 증식을 CFSE 희석에 의해 분석하였다. 항-Fas 처리후 살아있는 T 세포의 비율을 CD3+ 아넥신 V 음성 생 세포 상에서 게이팅하여 측정하였다. 도 44에 나타낸 바와 같이, 모든 구조물은 예비-활성화된 T 세포의 증식을 유도하였다. 저농도에서 야생형 IL-2 wt를 포함하는 구조물이 IL-2 qm-포함 구조물보다 더 활성적이었다. IgG-IL-2 wt, Fab-IL-2 wt-Fab 및 프로루킨은 유사한 활성을 가졌다. Fab-IL-2 qm-Fab는 IgG-IL-2 qm보다 약간 덜 활성적이었다. 야생형 IL-2를 포함하는 구조물은, 아마도 조절 T 세포의 활성화로 인해, CD8 T 세포 상에서보다 CD4 T 세포 상에서 더 활성적이었다. 4중 돌연변이 IL-2를 포함하는 구조물은 CD8 및 CD4 T 세포 상에서 유사하게 활성적이었다. 도 45에 나타낸 바와 같이, 고농도의 야생형 IL-2로 자극된 T 세포가 4중 돌연변이 IL-2로 처리된 T 세포보다 항-Fas 유도된 세포자멸에 더 민감하다.
상기 본 발명을 명확한 이해를 위해 예시 및 실례로써 어느 정도 상세히 기술하였지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 전체로 참고로 인용된다.
<110> Roche Glycart AG <120> Mutant Interleukin-2 Polypeptides <130> 27307 <140> PCT/EP2012/051991 <141> 2012-02-07 <150> EP 11153964.9 <151> 2011-02-10 <150> EP 11164237.7 <151> 2011-04-29 <160> 324 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild-type human IL-2 <400> 2 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ttgcagtgta ttactgtcag cagggtaatc agattccccc tacgttcggt 300 caggggacca aagtggaaat caaa 324 <210> 75 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2D9; VH <400> 75 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2D9; VH <400> 76 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag 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ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399 <210> 293 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutant L72G (C125A) (4) <400> 293 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399 <210> 294 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 mutant L72G / F42A (C125A) (4) <400> 294 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acagccaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399 <210> 295 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 triple mutant F42A / Y45A / L72G (C125A) (4) <400> 295 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acagccaagt ttgccatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatggcgctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct ttgcccaaag catcatctca acactgact 399 <210> 296 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 quadruple mutant T3A / F42A /Y45A /L72G (C125A) (4) <400> 296 gcacctgcct caagttctac aaagaaaaca 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tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtgg cggcggaggc tccggaggcg gaggttctgg cggaggtggc 1380 tccgcacctg cctcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 1440 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 1500 ctcacagcca agtttgccat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 1560 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatggcg ctcaaagcaa aaactttcac 1620 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 1680 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 1740 agatggatta cctttgccca aagcatcatc tcaacactga ct 1782 <210> 303 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4B9 Fab heavy chain-Fc (hole) <400> 303 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 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Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 322 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1A1A Fab heavy chain-Fc (hole) <400> 322 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120 ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180 gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240 atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300 ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360 agcgctagca ccaagggccc aagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gagcacaagc 420 ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 480 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc acagtgccta gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga gctgctgggc 720 ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780 cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agccccggga ggaacagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagaaccc caggtgtgca ccctgccccc cagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtca agggcttcta ccccagcgat 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg gtgtccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aag 1353 <210> 323 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1A1A light chain <400> 323 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 324 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1A1A light chain <400> 324 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc 300 cagggcacca agctcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

Claims (36)

  1. 각각 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거하거나 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 제 1 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드로서, 상기 제 1 아미노산 돌연변이가 인간 IL-2의 잔기 72에 상응하는 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 인터루킨-2(IL-2) 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 아미노산 돌연변이가 L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환인 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    각각 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거하거나 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 제 2 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 제 2 아미노산 돌연변이가 인간 IL-2의 잔기 35, 38, 42, 43 및 45에 상응하는 위치들에서 선택된 위치에 존재하는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 제 2 아미노산 돌연변이가 인간 IL-2의 잔기 42에 상응하는 위치에 존재하는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 제 2 아미노산 돌연변이가 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R 및 F42K의 군에서 선택된 아미노산 치환인 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거하거나 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 제 3 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 고-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 제거하거나 감소시키고 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이 IL-2 폴리펩티드의 친화성은 유지시키는 3개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 3개의 아미노산 돌연변이가 인간 IL-2의 잔기 42, 45 및 72에 상응하는 위치에 존재하는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 3개의 아미노산 돌연변이가 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군에서 선택된 아미노산 치환인 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 비-IL-2 잔기에 결합되는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 제 1 및 제 2의 비-IL-2 잔기에 결합되는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 상기 제 1 비-IL-2 잔기와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제 2 비-IL-2 잔기와 아미노-말단 펩티드 결합을 공유하는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-IL-2 잔기가 항원 결합 잔기인 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드.
  15. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 및 항원 결합 잔기를 포함하는 면역접합체.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 상기 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 면역접합체.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    상기 면역접합체가 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기를 포함하는 면역접합체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드가 상기 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제 2 항원 결합 잔기가 i) 상기 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 ii) 상기 제 1 항원 결합 잔기와 아미노- 또는 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 면역접합체.
  19. 제 14 항 또는 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 잔기가 항체 또는 항체 단편인 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  20. 제 14 항 또는 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 잔기가 Fab 분자 및 scFv 분자로부터 선택되는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  21. 제 14 항 또는 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 잔기가 면역글로불린 분자, 특히 IgG 분자인 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  22. 제 14 항 또는 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 잔기가 종양 세포 상에 또는 종양 세포 환경 중에 제공된 항원에 대해 유도되는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암태아성 항원(CEA) 및 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)의 군에서 선택되는 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제 24 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  26. 제 24 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 25 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제 26 항의 숙주 세포를 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 그의 면역접합체의 제조 방법.
  28. 제 27 항의 방법에 의해 생성된 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  29. 제 1 항 내지 제 23 항 또는 제 28 항 중 어느 한 항의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  30. 질환 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 23 항 또는 제 28 항 중 어느 한 항의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 질환이 암인 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체.
  32. 질환 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 23 항 또는 제 28 항 중 어느 한 항의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체의 용도.
  33. 개체에게 제 1 항 내지 제 23 항 또는 제 28 항 중 어느 한 항의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물의 치료 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 질환이 암인 방법.
  35. 개체에게 제 1 항 내지 제 23 항 또는 제 28 항 중 어느 한 항의 돌연변이 IL-2 폴리펩티드 또는 면역접합체를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 면역계를 자극하는 방법.
  36. 전술한 바와 같은 본 발명.
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