JP7213180B2 - 免疫コンジュゲートを製造するための方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ポリペプチド製造方法および発酵方法の分野に属する。免疫コンジュゲートを製造するための新規な方法が、本明細書において報告される。
発明の背景
癌は、世界で最も多い死亡原因のうちの1つである。2012年には、820万件の死亡が記録され、大部分は肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、および乳癌に起因した。保存的癌療法は、次の治療、すなわち外科手術、放射線療法、および化学療法のうちの1つまたは組み合わせからなる(WHO 2014)。癌治療の別の実行可能な手段は、癌に対する身体自体の免疫応答を促進する免疫療法である。サイトカインは、免疫系の調節に関与するシグナル伝達分子である。癌療法で使用される場合、サイトカインは、抗腫瘍作用を有しており、かついくつかのタイプの腫瘍の免疫原性を高めることができる免疫調節剤として作用することができる。この治療領域において、インターロイキン-2(IL-2)は、ヒト癌に対して有効である最初の薬物であった。
IL-2は、癌療法において強力な分子である。IL-2はサイトカインであり、免疫応答において非常に重要な役割を果たす。これは、Tヘルパー(Th、CD4+)細胞において産生され、CD8+T細胞を含む免疫系の他の細胞では、それより少ない量が産生される。しかし、IL-2の市販されている形態であるProleukin(登録商標)(アルデスロイキン)の臨床応用は、治療中のこの分子の高い毒性が原因で、限定的である。IL-2免疫コンジュゲートが、現在のIL-2療法の欠点を回避するために開発されている。これらの分子は、腫瘍マーカー(TM)を標的としてよく、それゆえ、TMを有する腫瘍組織においてIL-2の局所的作用を実現させるか、またはIL-2が非標的化IgG分子に結合されて、例えば半減期の延長をもたらしてもよい。さらに、IL-2それ自体およびFc領域を、分子の毒性を低下させるために改変することもできる(IL-2変異体)。それでもなお、CHO細胞においてIL-2免疫コンジュゲートを製造する間に、製品に関係する、および工程に関係する様々な不純物が観察されている。これらは、例えば、断片化したサイトカイン(IL-2)部分を有する分子、凝集した分子(高分子量種;HMW)、またはクラスタリンもしくはホスホリパーゼB様2(PLBL2/PLB2)のような宿主細胞タンパク質である。断片化は、IL-2分子でのみ起こり、一方、抗体では切り取りは観察されない。FDA規制によれば、製品は、凝集、変性、および断片化を含むいかなる異種性も含むべきではない(Zoon, K.C. 1997 「Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」, U. S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration（非特許文献1）)。バイオ医薬剤のヒトへの安全性を確実にするためには、製造工程中に蓄積する副産物は除去されなければならず、これらの不純物の形成および蓄積を最初から防止することが望ましい。
WO2008/131374（特許文献1）では、低温および/または低pHで細胞培養物を増殖させることによって細胞培養物中のタンパク質のミスフォールディングおよび凝集を減らすための方法が説明されている。
Cruz et al. (Biotechnology Letters, pages 677 - 682, (2000))（非特許文献2）は、無タンパク質培地中で育て固定した仔ハムスター腎臓細胞において発現させた組換え融合タンパク質の製品品質について報告している。
WO2012/146628（特許文献2）では、細胞活動に影響するエフェクター部分を選択的に送達するための抗原特異的免疫コンジュゲートが報告されている。
Trummer et al. (Biotechnol Bioeng, 2006, 94(6): 1045 -1052)（非特許文献3）は、Epo-Fc発現CHO細胞を用いるバッチ工程の容積生産性を高めるための手段として二相培養を説明している。
改良された細胞培養方法が、WO2011/134919（特許文献3）で報告されている。
WO2008/131374 WO2012/146628 WO2011/134919
Zoon, K.C. 1997 「Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」, U. S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Cruz et al. (Biotechnology Letters, pages 677 - 682, (2000)) Trummer et al. (Biotechnol Bioeng, 2006, 94(6): 1045 -1052)
製品に関係する不純物および工程に関係する不純物のレベルを低下させた免疫コンジュゲートを製造するための方法が、本明細書において報告される。より詳細には、培地中の免疫コンジュゲートの断片(例えば、断片化した、IL-2のようなサイトカイン)、宿主細胞タンパク質(例えば、PLBL2またはクラスタリン)、および凝集体の発生は、第1の期間の間、第1の(高めの)温度および第1の(低めの)pHで細胞培養物を増殖させ/細胞を培養し、次いで培養終了時まで、温度を低い値に、かつpHを高い値に変えることによって減らすことができることが見出されている。
したがって、本明細書において報告される1つの局面は、関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養培地中で培養することによって、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物を減少させた免疫コンジュゲートを製造するための方法であり、ここでそれら1つまたは複数の核酸は細胞培養条件下で発現され、この方法は以下の段階を含む：
第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する段階、
細胞培養培地の第1の温度を第2の温度に下げ、かつ細胞培養培地の第1のpHを第2のpHに高める段階、
細胞または細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
それによって免疫コンジュゲートを製造する段階。
1つの態様において、方法はさらに、1つまたは複数の精製段階を用いて免疫コンジュゲートを精製する段階を含む。
1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、13～14日の合計培養期間の2～9日目である(に行われる)。1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、13～14日の合計培養期間の約8日目である(に行われる)。
1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、ほぼ同じ時間である(に行われる)。
1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、第2の温度は28℃～34℃の範囲である(すなわち、第1の温度は3℃～9℃下げられる)。1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、第2の温度は29℃～30℃の範囲である(すなわち、7℃～8℃下げられる)。1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、29℃±0.5℃の第2の温度に下げられる。
1つの態様において、第2のpH値は、7.25またはそれより高い。
1つの態様において、播種細胞密度は、約600000(6×105)～約1000000(1×106)細胞/mlである。1つの態様において、播種細胞密度は、約600000(6×105)細胞/mlまたは約1000000(1×106)細胞/mlである。
1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、300mOsmol/kg±15mOsmol/kgまたはそれより高い。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、350mOsmol/kg±15mOsmol/kgまたはそれより高い。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、350mOsmol/kg±15mOsmol/kg～800mOsmol/kg±15mOsmol/kgである。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、約400mOsmol/kgである。
1つの態様において、免疫コンジュゲートは、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである。
本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートである。
本明細書において報告される1つの局面は、免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片(例えば断片化IL-2)、凝集体、および宿主細胞タンパク質を含む組成物である。
1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができるか、または本明細書において報告される組成物中の免疫コンジュゲートは、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、細胞培養は、大規模細胞培養である。
1つの態様において、細胞培養の体積は、約100リットル～約15000リットルである。
1つの態様において、細胞培養は、バッチ細胞培養である。
1つの態様において、細胞培養は、フェドバッチ細胞培養である。
1つの態様において、培地は、無血清培地である。
1つの態様において、培地は、無タンパク質培地である。
1つの態様において、培地は、既知組成培地である。
1つの態様において、培地は、無タンパク質既知組成培地である。
1つの態様において、哺乳動物細胞はCHO細胞である。
[本発明1001]
関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養培地中で培養することによって、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物を減少させた免疫コンジュゲートを製造するための方法であって、
ここで該1つまたは複数の核酸が細胞培養条件下で発現され、
該方法が、
第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する段階、
該細胞培養培地の該第1の温度を第2の温度に下げ、かつ該細胞培養培地の該第1のpHを第2のpHに高める段階、
該細胞または該細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
それによって該免疫コンジュゲートを製造する段階
を含む、方法。
[本発明1002]
1つまたは複数の精製段階により免疫コンジュゲートを精製する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第2の温度への低下および第2のpHへの上昇が、13～14日の合計培養期間の2～9日目である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
第2の温度への低下および第2のpHへの上昇が、ほぼ同じ時点である、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
第1の温度が37℃±0.5℃であり、第2の温度が28℃～34℃の範囲内である、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
第1の温度が37℃±0.5℃であり、29℃±0.5℃の第2の温度に下げられる、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
第2のpHが7.25またはそれより高い、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
第1のpH値がpH7±0.05pH単位であり、第1のpH値が0.25～0.4pH単位高められて第2のpHとされる、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
播種細胞密度が、約600000(6×10 5 )～約1000000(1×10 6 )細胞/mlである、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
細胞培養培地の重量オスモル濃度が、350mOsmol/kg±15mOsmol/kg～800mOsmol/kg±15mOsmol/kgである、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
免疫コンジュゲートが、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
細胞培養がフェドバッチ細胞培養である、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1013]
哺乳動物細胞がCHO細胞である、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
本発明1001～1013のいずれかの方法によって得ることができる、免疫コンジュゲート、ならびに低レベルの断片、凝集体、および宿主細胞タンパク質
を含む、組成物。
[本発明1015]
免疫コンジュゲートが、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである、本発明1014の組成物。
発明の詳細な説明
用語
本明細書において使用される場合、用語「免疫コンジュゲート」は、少なくとも1つのエフェクター部分および少なくとも1つの免疫グロブリン部分を含む融合ポリペプチド分子を意味する。特定の態様において、免疫コンジュゲートは、1つのエフェクター部分および1つの免疫グロブリン部分を含む。特定の態様において、免疫コンジュゲートは、1つのエフェクター部分および1つのIgG免疫グロブリン部分を含む。特定の態様において、免疫コンジュゲートは、2つのエフェクター部分および1つの免疫グロブリン部分を含む。本明細書において言及される免疫コンジュゲートは、融合タンパク質である、すなわち、免疫コンジュゲートの構成要素は、直接的または1つもしくは複数のリンカーペプチドを介して、ペプチド結合によって互いに連結されている。本発明による具体的な免疫コンジュゲートは、1つまたは複数のリンカー配列によって結合された、少なくとも1つのエフェクター部分および1つの免疫グロブリン部分から本質的になる。
用語「免疫グロブリン部分」は、天然に存在する抗体の構造を有しているタンパク質を意味する。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、互いにジスルフィド結合されている2つの軽鎖および2つの重鎖から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)と、それに続く、重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有しており、その際、第1の定常ドメインと第2の定常ドメインの間にはヒンジ領域が位置している。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)と、それに続く、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常(CL)ドメインを有している。免疫グロブリンの重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、またはμ(IgM)と呼ばれる5つのタイプのうちの1つに割り当てることができ、これらのうちのいくつかは、サブタイプ、例えば、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)、およびα2(IgA2)にさらに分類することができる。免疫グロブリンの軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。免疫グロブリン部分は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子であってよい。1つの態様において、免疫グロブリン部分は、それが結合している実体を標的部位に、例えば、抗原決定基を有している特定のタイプの腫瘍細胞または腫瘍間質に導くことができる。免疫グロブリン部分には、抗体および抗体断片が含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「抗原決定基」は、「抗原」および「エピトープ」と同義語であり、免疫グロブリン部分が結合するポリペプチド高分子上の部位(例えば、連続した一続きのアミノ酸、または非連続アミノ酸からなる異なる領域で構成された立体配置的構造)を意味する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の罹病細胞の表面に、血清中に遊離して、かつ/または細胞外基質(ECM)中に見出すことができる。特定の態様において、抗原決定基はヒト抗原である。
特定の態様において、腫瘍抗原の非限定的な例には、MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質(ADAbp)、シクロフィリンb、結腸直腸関連抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胎児性抗原(CEA)ならびにその免疫原性エピトープCAP-1およびCAP-2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原(PSA)ならびにその免疫原性エピトープPSA-1、PSA-2、およびPSA-3、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、T細胞受容体/CD3-ζ鎖、MAGEファミリーの腫瘍抗原(例えば、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGEファミリーの腫瘍抗原(例えば、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-フェトプロテイン、E-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、およびγ-カテニン、p120ctn、gp100 Pmel117 PRAME、NY-ESO-1、cdc27、結腸腺腫性ポリポーシスタンパク質(APC)、ホドリン、コネキシン37、Igイディオタイプ、p15、gp75、GM2ガングリオシドおよびGD2ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物、Smadファミリーの腫瘍抗原、lmp-1、P1A、EBVにコードされた核抗原(EBNA)-1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1、およびCT-7、ならびにc-erbB-2が含まれる。
特定の態様において、ウイルス抗原の非限定的な例には、インフルエンザウイルス血球凝集素、エプスタイン・バーウイルスLMP-1、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、HIV gp160、およびHIV gp120が含まれる。
特定の態様において、ECM抗原の非限定的な例には、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、リンク、カドヘリン、ラミニン、ラミニン型EGF、レクチン、フィブロネクチン、ノッチ、テネイシン、およびマトリキシンが含まれる。
特定の態様において、本明細書において説明する免疫コンジュゲートは、以下の具体的な細胞表面抗原の非限定的例に結合することができる:FAP(Fibroblast Activation Protein)、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(TCRと結合するヘテロ多量体)、CD22(B細胞受容体)、CD23(低親和性IgE受容体)、CD30(サイトカイン受容体)、CD33(骨髄細胞表面抗原)、CD40(腫瘍壊死因子受容体)、IL-6R(IL6受容体)、CD20、MCSP、およびPDGFβR(β血小板由来増殖因子受容体)。
本発明は、特定の抗原(例えば腫瘍抗原)を標的とする免疫コンジュゲートだけでなく、いかなる抗原にも特異的に結合しない、特にいかなるヒト抗原にも結合しない1つまたは複数の免疫グロブリン部分を含む非標的化コンジュゲートも提供する。任意の抗原へのこれらのコンジュゲートの特異的結合がないこと(すなわち、非特異的相互作用と区別することができる任意の結合がないこと)は、例えば、本明細書において説明するELISAまたは表面プラズモン共鳴によって測定することができる。このようなコンジュゲートは、例えば、特定の組織への標的化が望まれていない場合に、コンジュゲートしていないエフェクター部分の血清半減期と比べて、それらが含むエフェクター部分の血清半減期を延ばすために特に有用である。非標的化免疫コンジュゲートの例は、IgG-IL-2である。本発明による方法によって製造される標的化免疫コンジュゲートとは、標的(抗原)に特異的に結合する抗体およびエフェクター部分、例えばサイトカインのコンジュゲートを指す。したがって、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートとは、IL-2にコンジュゲートされた、FAPに結合する抗体を指す。
本明細書において使用される場合、用語「エフェクター部分」は、例えばシグナル伝達経路または他の細胞経路を介して細胞活動に影響を与えるポリペプチド、例えばタンパク質または糖タンパク質を意味する。したがって、本発明のエフェクター部分は、細胞膜の外側からのシグナルを伝達してエフェクター部分に対する1つまたは複数の受容体を有している細胞における応答を調整する受容体媒介シグナル伝達に関連付けることができる。1つの態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する1つまたは複数の受容体を有している細胞において細胞障害性応答を誘発することができる。別の態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する1つまたは複数の受容体を有している細胞において増殖性応答を誘発することができる。別の態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する受容体を有している細胞において分化を誘発することができる。別の態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する受容体を有している細胞において内在性細胞タンパク質の発現を変更(すなわち、上方調節または下方調節)することができる。エフェクター部分の非限定的な例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、酵素、基質、および補因子が含まれる。1つの態様において、エフェクター部分はサイトカインである。1つの態様において、エフェクター部分はインターロイキンである。1つの態様において、エフェクター部分はインターロイキン2(IL-2)である。1つの態様において、エフェクター部分は4-1BB-リガンド(4-1BBL)である。
本明細書において使用される場合、用語「サイトカイン」は、生物学的または細胞の機能またはプロセス(例えば、免疫、炎症、および造血)を媒介および/または調節する分子を意味する。本明細書において使用される用語「サイトカイン」は、「リンフォカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」、および「インターロイキン」を含む。特定の態様において、有用なサイトカインの例には、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、4-1BB-リガンド(4-1BBL)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、およびTNF-βが含まれるがそれらに限定されるわけではない。具体的なサイトカインは、IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α、およびIFN-γである。特定の態様において、サイトカインはヒトサイトカインである。本明細書において使用される用語「サイトカイン」はまた、例えば、Sauve et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991); Hu et al., Blood 101, 4853-4861 (2003)および米国特許出願公開第2003/0124678号; Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000); Heaton et al., Cancer Res 53, 2597-602 (1993)、ならびに米国特許第5,229,109号;米国特許出願公開第2007/0036752号;WO 2008/0034473;WO 2009/061853;またはWO2012/107417に説明されているIL-2変異体のような、対応する野生型サイトカインのアミノ酸配列中に1つまたは複数のアミノ酸変異を含むサイトカイン変異体も含むことを意図している。
本明細書において使用される場合、用語「単鎖」は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を意味する。1つの態様において、エフェクター部分は、単鎖エフェクター部分である。単鎖エフェクター部分の非限定的な例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、酵素、基質、および補因子が含まれる。エフェクター部分がサイトカインであり、関心対象のサイトカインが普通は自然界に多量体として存在している場合、その多量体サイトカインの各サブユニットは、エフェクター部分の単鎖によって順番にコードされている。したがって、有用な単鎖エフェクター部分の非限定的な例には、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、4-1BB-リガンド(4-1BBL)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、およびTNF-βが含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「エフェクター部分受容体」は、エフェクター部分に特異的に結合することができるポリペプチド分子を意味する。例えば、IL-2がエフェクター部分である場合、IL-2分子(例えば、IL-2を含む免疫コンジュゲート)に結合するエフェクター部分受容体は、IL-2受容体である。エフェクター部分が複数の受容体に特異的に結合する場合、そのエフェクター部分に特異的に結合する受容体はすべて、そのエフェクター部分に対する「エフェクター部分受容体」である。
本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において説明されているKabat番号付与方式に基づいて番号を付けられ、本明細書において「Kabatに基づく番号付与」と呼ばれる。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のKabat番号付与方式(647～660頁を参照されたい)が、κアイソタイプおよびλアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLに対して使用される。具体的には、KabatのEU指標番号付与方式(661～723頁を参照されたい)が、定常重鎖ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3。この場合、「KabatのEU指標に基づく番号付与」を参照することにより、本明細書においてさらに明らかにされる)に対して使用される。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞(a cell)」への言及は、複数のそのような細胞および当業者に公知であるその等価物を含み、以下同様である。同様に、「1つの（a）」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」といった用語も、本明細書において同義的に使用され得る。「含む(comprising)」、「含む(including)」、および「有する(having)」といった用語が同義的に使用され得ることにも留意すべきである。
当業者にとって、例えばあるポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順および方法は周知である。したがって、ある核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴付けられ、同様に、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によっても特徴付けられる。
用語「約」は、その後に続く数値の±20％の範囲を意味する。1つの態様において、「約」という用語は、その後に続く数値の±10％の範囲を意味する。1つの態様において、「約」という用語は、その後に続く数値の±5％の範囲を意味する。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む、様々な抗体構造体を包含する。
用語「抗体依存性細胞障害(ADCC)」は、Fc受容体結合によってもたらされる機能であり、エフェクター細胞の存在下での本明細書において報告される抗体による標的細胞の溶解を意味する。1つの態様において、ADCCは、エフェクター細胞、例えば、新しく単離されたPBMC (peripheral blood mononuclear cell)または単球もしくはNK(natural killer)細胞のようにバフィコートから精製されたエフェクター細胞の存在下で、CD19を発現する赤血球細胞(例えば、組換えヒトCD19を発現するK562細胞)の調製物を本明細書において報告される抗体で処理することによって測定される。標的細胞は、Cr-51で標識され、続いて抗体と共にインキュベートされる。標識された細胞は、エフェクター細胞と共にインキュベートされ、放出されたCr-51について上清が解析される。対照は、エフェクター細胞を伴うが抗体は伴わずに行う標的内皮細胞のインキュベーションを含む。ADCCをもたらす初期段階を誘導する抗体の能力は、組換えによってFcγRIおよび/もしくはFcγRIIAを発現する細胞または(本質的にFcγRIIIAを発現する)NK細胞などのFcγ受容体発現細胞へのそれらの結合を測定することによって、調査される。1つの好ましい態様において、NK細胞上のFcγRへの結合が測定される。
「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合する、インタクト抗体の一部分を含むインタクト抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;直鎖状抗体;単鎖抗体分子(例えばscFv);および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有している定常ドメインまたは定常領域のタイプを意味する。抗体には5つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
用語「補体依存性細胞障害(CDC)」は、補体の存在下での本明細書において報告される抗体によって誘導される細胞溶解を意味する。1つの態様において、CDCは、補体の存在下で、CD19を発現するヒト内皮細胞を本明細書において報告される抗体で処理することによって測定される。1つの態様において、これらの細胞は、カルセインで標識される。抗体が濃度30μg/mlで標的細胞の20％以上の溶解を誘導する場合、CDCが存在する。補体因子C1qへの結合は、ELISAで測定することができる。
このようなアッセイ法では、原則として、ELISAプレートが、いくつかの濃度範囲の抗体でコーティングされ、そこに、精製されたヒトC1qまたはヒト血清が添加される。C1q結合は、C1qに対する抗体の後にペルオキシダーゼ標識コンジュゲートを用いて検出される。結合の検出(最大結合Bmax)は、ペルオキシダーゼ基質ABTS(登録商標)(2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホナート])の405nmでの光学濃度(OD405)として測定される。
「エフェクター機能」とは、抗体クラスによって異なる、抗体のFc領域に帰すことができる生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞障害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えばB細胞受容体)の下方調節;ならびにB細胞活性化が含まれる。
Fc受容体結合に依存するエフェクター機能は、抗体のFc領域と、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるFc受容体(FcR)との相互作用によってもたらされ得る。Fc受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による、抗体で被覆された病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)を介した、対応する抗体で被覆された赤血球および他の様々な細胞標的(例えば腫瘍細胞)の溶解との両方をもたらすことが示されている(例えば、Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524を参照されたい)。FcRは、免疫グロブリンのアイソタイプに対する特異性に基づいて定義されている:IgG抗体に対するFc受容体は、FcγRと呼ばれている。Fc受容体結合は、例えば、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341;およびGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に説明されている。
IgG抗体のFc領域に対する受容体(FcγR)の架橋により、食作用、抗体依存性細胞障害、および炎症メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランス、および抗体産生の調節を含む、多種多様のエフェクター機能が引き起こされる。ヒトでは、以下の3つのクラスのFcγRが特徴を明らかにされている:
・FcγRI(CD64)は、高い親和性で単量体IgGに結合し、マクロファージ、単球、好中球、および好酸球において発現されている。IgGのFc領域中のアミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、およびP329(KabatのEU指標に基づく番号付与)のうちの少なくとも1つの改変により、FcγRIへの結合が減少する。IgG2残基の233～236位をIgG1およびIgG4中に入れて置き換えると、FcγRIへの結合が103分の1に減少し、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答がなくなった(Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。
・FcγRII(CD32)は、複合IgGに中度～低度の親和性で結合し、広範に発現されている。この受容体は、2つのサブタイプ、すなわちFcγRIIAおよびFcγRIIBに分けることができる。FcγRIIAは、死滅に関与している多くの細胞(例えば、マクロファージ、単球、好中球)の表面に存在しており、死滅プロセスを活性化することができるようである。FcγRIIBは、阻害プロセスにおいて役割を果たしていると思われ、B細胞、マクロファージの表面、ならびに肥満細胞および好酸球の表面に存在している。B細胞において、FcγRIIBは、それ以上の免疫グロブリン産生、および例えばIgEクラスへのアイソタイプスイッチを抑制する働きをすると思われる。マクロファージにおいて、FcγRIIBは、FcγRIIAによって媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞において、B型は、別々の受容体へのIgE結合を介して、これらの細胞の活性化を抑制するのを助け得る。例えば、アミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292、およびK414(KabatのEU指標に基づく番号付与)のうちの少なくとも1つに変異を有しているIgG Fc領域を含む抗体について、FcγRIIAに対する結合が減少していることが判明している。
・FcγRIII(CD16)は、IgGに中度～低度の親和性で結合し、2つのタイプとして存在している。FcγRIIIAは、NK細胞、マクロファージ、好酸球、ならびに一部の単球およびT細胞の表面に存在し、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは、好中球の表面で高度に発現されている。例えば、アミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338、およびD376(KabatのEU指標に基づく番号付与)のうちの少なくとも1つに変異を有しているIgG Fc領域を含む抗体について、FcγRIIIAへの結合が減少していることが判明している。
Fc受容体に対するヒトIgG1上の結合部位のマッピング、前述の変異部位、ならびにFcγRIおよびFcγRIIAへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604において説明されている。
本明細書において使用される用語「Fc 受容体」は、受容体と結合する細胞質ITAM配列の存在を特徴とする活性化受容体を意味する(例えば、Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290を参照されたい)。このような受容体は、FcγRI、FcγRIIA、およびFcγRIIIAである。用語「FcγRに結合しない」とは、10μg/mlの抗体濃度で、本明細書において報告される抗体のNK細胞への結合が、WO2006/029879に報告されている抗OX40L抗体LC.001について認められている結合の10％以下であることを意味する。
IgG4は、少ないFcR結合を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかし、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (Fc炭水化物の減少)、Pro329、ならびに234、235、236、および237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、およびHis435は、変更された場合には、少ないFcR結合を同様にもたらす残基である(Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324;およびEP0307434)。
本明細書における用語「Fc領域」は、定常領域についての少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域および変異Fc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230またはAla231からカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在してもしなくてもよい。
1つの態様において、本明細書において報告されるコンジュゲートの抗体分子は、ヒトに由来するFc領域をFc領域として含む。1つの態様において、Fc領域は、ヒト定常領域のすべての部分を含む。抗体のFc領域は、補体活性化、C1q結合、C3活性化、およびFc受容体結合に直接的に関与している。補体系に対する抗体の影響はいくつかの条件に左右されるが、C1qへの結合は、Fc領域中の定められた結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、最新技術において公知であり、例えば、Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324;およびEP0307434によって説明されている。このような結合部位は、例えば、L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329である(KabatのEU指標に基づく番号付与)。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3の抗体は、通常、補体活性化、C1q結合、およびC3活性化を示すが、IgG4は補体系を活性化せず、C1qに結合せず、かつC3を活性化しない。「抗体のFc領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。1つの態様において、Fc領域はヒトFc領域である。1つの態様において、Fc領域は、変異S228Pおよび/またはL235Eおよび/またはP329G(KabatのEU指標に基づく番号付与)を含むヒトIgG4サブクラスのものである。1つの態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235Aならびに任意でP329G(KabatのEU指標に基づく番号付与)を含むヒトIgG1サブクラスのものである。
用語「野生型Fc領域」は、自然界に存在するFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。野生型ヒトFc領域には、天然ヒトIgG1 Fc領域(A以外のアロタイプおよびAアロタイプ)、天然ヒトIgG2 Fc領域、天然ヒトIgG3 Fc領域、および天然ヒトIgG4 Fc領域、ならびに天然に存在するそれらの変異体が含まれる。野生型Fc領域は、SEQ ID NO: 26(IgG1、コーカサス人アロタイプ)、SEQ ID NO: 27(IgG1、アフリカ系アメリカ人アロタイプ)、SEQ ID NO: 28(IgG2)、SEQ ID NO: 29(IgG3)、およびSEQ ID NO: 30(IgG4)に示されている。
変異(ヒト)Fc領域は、含まれるアミノ酸変異に基づいて定義される。したがって、例えば、用語P329Gは、親(野生型)Fc領域と比べてアミノ酸329位がプロリンからグリシンに変異した変異Fc領域を意味する(KabatのEU指標に基づく番号付与)。野生型アミノ酸のアイデンティティが明記されない場合があり、その場合、前述の変異体は329Gと呼ばれる。
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」、および「全長抗体」は、本明細書において同義的に使用されて、天然抗体の構造に実質的に同様の構造を有するか、または本明細書において定義するFc領域を含む重鎖を有する、抗体を意味する。
用語「ヒンジ領域」は、野生型抗体重鎖においてCH1ドメインおよびCH2ドメインを連結する抗体重鎖ポリペプチドの部分、例えば、KabatのEU番号方式に基づいて216位あたり～230位あたり、またはKabatのEU番号方式に基づいて226位あたり～230位あたりの部分を意味する。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と位置合わせすることによって決定することができる。
通常、ヒンジ領域は、アミノ酸配列が同一である2つのポリペプチドからなる二量体分子である。一般に、ヒンジ領域は約25個のアミノ酸残基を含み、可動性であるため、結び付いている標的結合領域が独立に動くことが可能である。ヒンジ領域は、3つのドメイン:上部ヒンジドメイン、中央部ヒンジドメイン、下部ヒンジドメインに細分することができる(例えば、Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083を参照されたい)。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基およびヒトFRに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。特定の態様において、ヒト化抗体は、HVR(例えばCDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに相当し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに相当する、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域についての少なくとも1つの部分を任意で含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。
本明細書において使用される用語「超可変領域」または「HVR」は、配列が超可変性であり(「相補性決定領域」もしくは「CDR」)、かつ/または構造が明らかにされたループ(「超可変ループ」)を形成し、かつ/または抗原接触残基(「抗原接触部分」)を含むアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインの各領域を意味する。一般に、抗体は6個のHVRを含む。3個はVH中にあり(H1、H2、H3)、3個はVL中にある(L1、L2、L3)。
HVRには、
（a）アミノ酸残基26～32(L1)、50～52(L2)、91～96(L3)、26～32(H1)、53～55(H2)、および96～101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
（b）アミノ酸残基24～34(L1)、50～56(L2)、89～97(L3)、31～35b(H1)、50～65(H2)、および95～102(H3)に存在するCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
（c）アミノ酸残基27c～36(L1)、46～55(L2)、89～96(L3)、30～35b(H1)、47～58(H2)、および93～101(H3)に存在する抗原接触部分(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに
（d）アミノ酸残基46～56(L2)、47～56(L2)、48～56(L2)、49～56(L2)、26～35(H1)、26～35b(H1)、49～65(H2)、93～102(H3)、および94～102(H3)を含む、（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ
が含まれる。
別段の定めが無い限り、本明細書において、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えばFR残基)は、前記のKabatらに従って番号を付与する。
「単離された」抗体とは、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換もしくは逆相HPLC)によって測定した場合に95％または99％を超える純度まで精製される。抗体純度を評価するための方法を再確認するには、例えばFlatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
用語「軽鎖」は、天然IgG抗体の短い方のポリペプチド鎖を意味する。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を意味する。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、存在し得る変異抗体(例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物を製造する間に発生し、このような変異体は通常、少量で存在する)を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)を対象とする異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用するためのモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書において説明される。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合させるのに関与している抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを意味する。一般に、天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれVHおよびVL)は、類似した構造を有しており、各ドメインは、4つの保存されているフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む。(例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照されたい)。単一のVHドメインまたはVLドメインが、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを用いて、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングして、単離することができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい。
抗体および免疫コンジュゲートの精製
本出願内で使用される用語「アフィニティークロマトグラフィー」は、「アフィニティークロマトグラフィー材料」を使用するクロマトグラフィー方法を意味する。アフィニティークロマトグラフィーでは、クロマトグラフィー材料のクロマトグラフィー官能基に対する静電的相互作用、疎水結合、および/または水素結合の形成に応じて変わる生物活性または化学構造に基づいて、抗体が分離される。特異的に結合した抗体をアフィニティークロマトグラフィー材料から回収するには、競合リガンドを添加してもよく、または緩衝液のpH値、極性、またはイオン強度などのクロマトグラフィー条件を変更してもよい。例示的な「アフィニティークロマトグラフィー材料」は、Ni(II)-NTAもしくはCu(II)-NTAなどの金属キレートクロマトグラフィー材料、またはそれに共有結合的に連結されたプロテインAもしくはプロテインGを含むクロマトグラフィー材料のような抗体アフィニティークロマトグラフィー材料、またはそれに共有結合された酵素基質類似体、酵素補因子、もしくは酵素阻害剤をクロマトグラフィー官能基として含むクロマトグラフィー材料のような酵素結合アフィニティークロマトグラフィー材料、またはそれに共有結合的に連結された多糖類、細胞表面受容体、糖タンパク質、もしくは完全な細胞をクロマトグラフィー官能基として含むクロマトグラフィー材料のようなレクチン結合クロマトグラフィー材料である。
1つの態様において、抗体軽鎖親和性リガンドは、κ軽鎖またはλ軽鎖が抗体中に含まれるかどうかに応じて、例えばκ定常軽鎖またはλ定常軽鎖に特異的である、軽鎖定常ドメインに特異的な捕捉試薬を使用する。このような軽鎖定常ドメイン特異的捕捉試薬の例は、例えば、KappaSelect(商標)およびLambdaFabSelect(商標)(GE Healthcare/BACから入手可能)であり、これらは、大規模での速い流速および低い背圧を可能にする剛性の高いアガロースベースマトリックスに基づいている。これらの材料は、κ軽鎖またはλ軽鎖の定常領域にそれぞれ結合するリガンドを含む(軽鎖の定常領域を欠く抗体またはその断片は結合しないと考えられる)。したがって、両方とも、軽鎖の定常領域を含む他の標的分子、例えば、IgG、IgA、およびIgMに結合することができる。これらのリガンドは、標的分子に結合するために容易に利用できるようにするために、長い親水性スペーサーアームを介してマトリックスに結合されている。それらは、ヒトIgのκまたはλのいずれかについてスクリーニングされた単鎖抗体断片に基づいている。
本出願内で使用される用語「～に添加する」およびその文法的同義語は、関心対象の物質を含む溶液を固定相と接触させる精製段階の部分的段階を意味する。精製しようとする関心対象の物質を含む溶液は、固定相を通過して、固定相と溶液中の物質との相互作用をもたらす。例えば、pH、導電率、塩濃度、温度、および/または流速などの条件によって、溶液に含まれる一部の物質が固定相に結合し、それによって溶液から除去される。他の物質は、溶解したままである。溶解したままの物質は、通過画分中に見出すことができる。「通過画分」とは、クロマトグラフィー装置を通過した後に得られる溶液を意味し、関心対象の物質を含む添加された溶液または緩衝液のいずれかであってよく、この緩衝液は、カラムを洗い流す目的または固定相に結合した1種もしくは複数種の物質を溶出させる目的で使用される。関心対象の物質は、実質的に均一な形態で物質を得るための、例えば、沈降、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、または溶媒体積減少などの当業者によく知られている方法による精製段階の後に、溶液から回収することができる。
抗体もしくは抗体断片または免疫コンジュゲートは、組換え手段によって製造することができる。組換え製造のための方法は、最新技術において広く知られており、真核細胞におけるタンパク質発現と、それに伴うその後の抗体もしくは抗体断片または免疫コンジュゲートの単離および薬学的に許容される純度までの精製とを含む。抗体もしくは抗体断片または免疫コンジュゲートを発現させるために、抗体または抗体断片をコードする1つまたは複数の核酸が導入されたハイブリドーマ細胞または真核細胞のいずれかが使用される。1つの態様において、真核細胞は、CHO細胞(例えばCHO K1、CHO DG44)、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、BHK細胞、ウサギ細胞、またはヒツジ細胞より選択される。別の態様において、真核細胞は、CHO細胞、HEK細胞、またはウサギ細胞より選択される。発現後、抗体もしくは抗体断片または免疫コンジュゲートは、細胞から(上清からまたは溶解後の細胞から)回収される。抗体を組換えによって製造するための一般的方法は最新技術において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880といった総説論文で報告されている。
抗体または免疫コンジュゲートの精製は、アルカリ/SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技術(例えばAusubel, F.M, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005)を参照されたい)を含む標準技術によって、細胞構成要素または他の混在物、例えば、他の細胞核酸または細胞タンパク質を除去するために実施され得る。タンパク質精製のために様々な方法が十分に確立され、広く普及して使用されており、例えば、微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換(カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換(アミノエチル樹脂)、および混合モードの交換)、硫黄親和性吸着(例えば、β-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを使用)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニルセファロース、アザアレーン親和性樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を使用)、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Ni(II)親和性材料およびCu(II)親和性材料を使用)、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法(例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動)など、ならびにそれらの組み合わせ、例えば、微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーである(例えばVijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102を参照されたい)。一般的なクロマトグラフィー方法およびそれらの使用は、当業者に公知である。例えば、Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C. F., and Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989);またはAusubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005)を参照されたい。
例えば細胞培養方法によって製造された抗体もしくは抗体断片または免疫コンジュゲートを精製する場合、通常、様々なクロマトグラフィー段階の組み合わせが使用され得る。普通は、(プロテインA)アフィニティークロマトグラフィーの後に、1つまたは2つの追加の分離段階が続けられる。1つの態様において、追加のクロマトグラフィー段階は、陽イオン交換クロマトグラフィー段階および陰イオン交換クロマトグラフィー段階であり、逆もまた同様である。最終精製段階は、凝集した免疫グロブリン、残留HCP(host cell protein)、DNA(宿主細胞核酸)、ウイルス、またはエンドトキシンのような微量の不純物および混入物を除去するためのいわゆる「ポリッシング段階」である。
本明細書において報告される方法によって製造される分子/免疫コンジュゲートおよびそれらの分子/免疫コンジュゲートを含む組成物は、精製、ろ過などのような後続の処理の対象となってよく、これにより、さらに品質が向上し、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物が減少することが理解される。
細胞の培養
本明細書において使用される「バイオマス」とは、培地中の培養細胞の量または重量を意味する。バイオマスは、生細胞密度、総細胞密度、(生細胞密度および総細胞密度についての)細胞時間積分、(生細胞密度および総細胞密度についての)細胞容積時間積分、血中血球容積、乾燥重量、または湿重量を明らかにすることにより、直接的にまたは間接的に測定され得る。
本明細書において使用される「バイオリアクター」とは、哺乳動物細胞培養物の増殖に使用される任意の容器を意味する。バイオリアクターの容積は、わずか数ミリリットルから12,000リットルまたはそれより多くまで、非常に多様であってよい。典型的には、pH、溶存酸素、および温度を非限定的に含むバイオリアクターの内部条件は、培養期間中、管理される。バイオリアクターは、培地中に懸濁された哺乳動物細胞培養物を本発明の培養条件下で維持するのに適している、ガラス、プラスチック、または金属を含む任意の材料で構成されてよい。
用語「細胞株」、「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は同義的に使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて意味する。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫が継代の回数に関わらず含まれる。子孫の核酸内容は親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有している変異子孫は、本明細書に含まれる。用語「細胞」は、核酸の発現のために使用される細胞を含む。1つの態様において、宿主細胞は、CHO細胞(例えば、CHO K1、CHO DG44)、またはBHK細胞、またはNS0細胞、またはSP2/0細胞、またはHEK 293細胞、またはHEK 293 EBNA細胞、またはPER.C6(登録商標)細胞、またはCOS細胞である。別の態様において、細胞は、CHO細胞、またはBHK細胞、またはPER.C6(登録商標)細胞である。本明細書において使用される場合、「細胞」という表現は、対象の細胞およびその子孫を含む。
本明細書において使用される「細胞密度」とは、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を意味する。
本明細書において使用される「播種細胞密度」または「播種密度」とは、培養工程の最初に存在する細胞密度を意味する。
本明細書において使用される「細胞生存能力」とは、培養中の細胞が所与の一連の培養条件または実験変動のもとで生き延びる能力を意味する。本明細書において使用されるこの用語はまた、ある特定の時点で培養状態にある生細胞または死細胞の総数に対する、その時点で生きている細胞の割合も意味する。
本明細書において使用される「培養物」または「細胞培養物」とは、細胞集団の生存および/または増殖に適した条件下で培地中に懸濁されている細胞集団を意味する。これらの用語は、培地およびその中に懸濁されている細胞集団の組み合わせにも使用される。
細胞を「培養すること」とは、細胞の生存能力ならびに/または増殖および/もしくは分裂増殖に適した条件下で細胞を細胞培養培地と接触させることを意味する。
「培養条件(culture condition)」、「培養条件(cultivation condition)」、および「発酵条件」は、本明細書において同義的に使用され、上首尾な細胞培養を実現するために満たされなければならない条件である。典型的には、これらの条件には、適切な培地の供給、ならびに例えば温度(約37℃であることが望ましいが、培養期間中の温度変更(例えば37℃から29℃)を含んでもよい)およびpH(典型的には6.8～7.2の間である)の管理、ならびに酸素および二酸化炭素の供給が含まれる。このような条件には、細胞が培養される様式、例えば振盪機培養またはロボット培養も含まれる。
用語「培地」および「細胞培養培地」とは、細胞を増殖させるか、または維持するために使用される栄養物供給源を意味する。当業者によって理解されるように、栄養物供給源は、細胞が増殖および/もしくは生存ならびに/または産生物産生のために必要とする成分を含んでよく、あるいは細胞の増殖および/もしくは生存ならびに/または産生物産生を助ける成分を含んでよい。ビタミン、必須アミノ酸または非必須アミノ酸、微量元素、および界面活性剤(例えばポロキサマー)は、培地成分の例である。典型的には、栄養物を含むこのような溶液は、最低限の増殖および/または生存のために細胞が必要とする必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および微量元素を供給する。このような溶液はまた、最低限の速度を上回るように増殖および/または生存を促進する補助的成分も含んでよく、これらには、限定されるわけではないが、ホルモンおよび/もしくは他の増殖因子、特定のイオン、例えば、ナトリウム、クロライド、カルシウム、マグネシウム、およびホスファート、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素、アミノ酸、脂質、および/もしくはグルコース、または他のエネルギー源が含まれる。有利には、培地は、細胞の生存および分裂増殖にとって最適なpHおよび塩濃度になるように調製される。培地は、低血清培地または無血清培地、すなわち、それぞれ、培地が約1～5％の血清を含むもの、または培地がいかなる哺乳動物血清(例えばウシ胎児血清)も本質的に含まないもの、であってよい。本質的に含まないとは、培地が0～5％の間の血清、好ましくは約0～1％の間の血清、および最も好ましくは約0～0.1％の血清を含むことを意味する。培地の各成分のアイデンティティおよび濃度が公知である無血清既知組成培地が使用されてよい。培地は無タンパク質培地であってよく、すなわち、これはタンパク質を含まないが、例えば植物加水分解物に由来する不明確なペプチドを含むと考えられる。培地は、ヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリン、しかし場合によっては動物由来のインスリンおよび脂質を含んでよく、またはヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、および既知組成の脂質を含むゼノフリー培地が含まれてよい。あるいは、培地は、全物質が明確であり所定の濃度で存在する培地である、既知組成培地であってもよい。これらの培地は、組換えタンパク質および/もしくはホルモンのみを含んでよく、または無タンパク質既知組成培地、すなわち必要に応じて低分子量構成成分および合成ペプチド/ホルモンのみを含む培地を含んでよい。既知組成培地はまた、いかなるタンパク質もまったく含まなくてもよい。1つの態様において、培地は、無血清培地である。1つの態様において、培地は、無タンパク質培地である。1つの態様において、培地は、既知組成培地である。1つの態様において、培地は、無タンパク質既知組成培地である。
例えば、「既知組成の細胞培養培地」または「CDM」とは、動物血清およびペプトンなどの動物由来産物を含まない、特定の組成を有する培地を意味する。この用語はまた、不明確または十分に明確ではない成分、例えば、動物血清、動物ペプトン(加水分解物)、植物ペプトン(加水分解物)、および酵母ペプトン(加水分解物)などの成分を含まない、特定の組成を有する培地を包含する。当業者によって理解されるであろうように、CDMは、ポリペプチド製造工程において使用されてよく、その際、細胞はCDMに接触し、その中にポリペプチドを分泌する。したがって、組成はCDMおよびポリペプチド産物を含んでよいこと、ならびにポリペプチド産物の存在によってCDMが化学的に不明確にはならないことが理解される。
「化学的に不明確な細胞培養培地」とは、その化学組成を特定することができず、1種または複数種の動物由来産物、例えば血清およびペプトンを含み得る培地を意味する。当業者によって理解されるであろうように、化学的に不明確な細胞培養培地は、栄養物供給源のような動物由来産物を含んでよい。この用語はまた、不明確または十分に明確ではない成分、例えば、動物血清、動物ペプトン(加水分解物)、植物ペプトン(加水分解物)、または酵母ペプトン(加水分解物)などの成分を含む、細胞培養培地も包含し得る。
本明細書において使用される場合、「基本培地」または「ベース培地」とは、培養工程の開始時に培養容器に供給される細胞培養栄養物を含む細胞培養培地を意味する。基本培地は、細胞培養サイクルの前に細胞が播種される培地であることができる。基本細胞培養培地は、バッチ細胞培養またはフェドバッチ細胞培養のための細胞培養サイクルより前に供給されてよい。基本細胞培養培地はまた、培養終了前の細胞および/または産生物の定期的な採取を伴うまたは伴わない(すなわちフェドバッチ細胞培養)培養工程の間の細胞培養物に、連続的または慎重に増量しながらフィード培地として供給されてもよい。
本明細書において使用される場合、「フィード培地」とは、培養終了前の細胞および/または産生物の定期的な採取を伴うまたは伴わない(すなわちフェドバッチ細胞培養)培養工程の間の細胞培養物に、連続的または慎重に増量しながらフィード培地として培養容器に供給される、細胞培養栄養物を含む細胞培養培地を意味する。
本明細書において使用される「バッチ培養」とは、培養工程の始まり後の一時点または複数の時点に追加成分を培養物にまったく与えない、すなわち、細胞培養のための全成分(細胞ならびにすべての培養栄養物および成分を含む)が培養工程の開始時に培養容器に供給される、細胞培養方法を意味する。
本明細書において使用される「フェドバッチ培養」とは、培養工程の始まり後の一時点または複数の時点に追加成分を培養物に与える、細胞培養方法を意味する。したがって、これは、細胞および培地が最初に培養容器に供給され、かつ追加の培養栄養物が、培養終了前の細胞および/または産生物の定期的な採取を伴うまたは伴わない培養工程の間に培養物に補給される、バッチ培養である。補給が連続的である場合、この工程は「連続フェドバッチ」と呼ばれ、または補給が慎重に増量して行われる場合、この工程は「フェドバッチボーラス」と呼ばれる。工程は、独特の設定またはアルゴリズムを用いて、付加的な「代理」マーカー(例えば、細胞数、特定の代謝産物または基質、オンライン解析シグナル)によって管理することができる。典型的には、フェドバッチ培養は、ある時点に停止され、かつ培地中の細胞および/または成分が採取され、任意で精製される。
本明細書において使用される用語「力価」とは、所与の量の培地体積で割った、細胞培養物によって産生された発現タンパク質産物の総量を意味する。力価は、様々な培養条件下でタンパク質産物を得て比較した力価の増加率のような相対的測定値の見地から、表現または評価することができる。
本明細書において報告される方法
免疫コンジュゲートをコードする核酸を内に含む細胞を培養する特定の方法によって免疫コンジュゲートを製造するための方法が、本明細書において報告される。
製品に関係する不純物および工程に関係する不純物のレベルを低下させた関心対象の免疫コンジュゲートを製造することが可能であることが、本発明者らによって見出された。
様々な例示的培養工程が調査され比較された。
Figure 0007213180000001
より詳細には、培養中に温度およびpH値の変更を行った場合、培養期間/発酵の間および最後におけるある種の不純物のレベルを下げられることが見出された。具体的には、温度が下げられ、pH値が高められる。減少させることができる不純物は、例えば、宿主細胞タンパク質(例えばホスホリパーゼB様2もしくはクラスタリン)のような工程に関係する不純物、または例えば免疫コンジュゲートの凝集体もしくは断片などの製品に関係する不純物である。例えば、免疫コンジュゲートが、IL-2のようなインターロイキンをエフェクター部分として含む場合、IL-2は切断を起こしやすく、したがって免疫コンジュゲートの断片が蓄積する。不純物のレベルが高いと、例えば、汚染された製品が生じ、かつ/または不純物除去のために困難かつ複雑な作業が生じる。培養条件の変更は、他の重大な不都合をもたらさない。培養条件の変更の結果、同程度のレベルの生細胞密度および細胞生存率が得られることが、示されることができた。
したがって、本明細書において報告される1つの局面は、関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養培地中で培養し、それら1つまたは複数の核酸を細胞培養条件下で発現させることによって、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物を減少させた免疫コンジュゲートを製造するための方法であり、この方法は以下の段階を含む：
第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する段階、
細胞培養培地の第1の温度を第2の温度に下げ、かつ細胞培養培地の第1のpHを第2のpHに高める段階、
細胞または細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
それによって免疫コンジュゲートを製造する段階。
必要な場合には、製造された免疫コンジュゲートを標準的な精製方法によってさらに精製することができる。
1つの態様において、方法はさらに、1つまたは複数の精製段階を用いて免疫コンジュゲートを精製する段階を含む。
1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、13～14日の合計培養期間の2～9日目である(に行われる)。1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、13～14日の合計培養期間の7～9日目である(に行われる)。1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、培養時間のほぼ半分の後である(に行われる)(すなわち、変更は、増殖期から産生期への移行時に行われる)。1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、13～14日の合計培養期間の約8日目である(に行われる)。
1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、同じ時間である(に行われる)。1つの態様において、第2の温度への低下および第2のpHへの上昇は、約6時間の期間中の異なる時点である(に行われる)。1つの態様において、最初に第2の温度への低下が行われ、続いて、第2のpHへの上昇が行われる。
温度を特定の温度範囲まで低下させた場合、不純物減少の効果が顕著であることが見出されている。これは、例えば、製品力価の顕著な低下を招くことはない。反対に、正味の製品力価は、同程度のレベルで保たれる。
1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、第2の温度は28℃～34℃の範囲である(すなわち、第1の温度は3℃～9℃下げられる)。1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、第2の温度は、33℃～34℃の範囲である(すなわち、3℃～4℃下げられる)。1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、第2の温度は29℃～30℃の範囲である(すなわち、7℃～8℃下げられる)。1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、約34℃±0.5℃の第2の温度に下げられる。1つの態様において、第1の温度は37℃±0.5℃であり、約29℃±0.5℃の第2の温度に下げられる。
温度を低下させることに加えて、最適な結果のためにはpH値も特定の値に上昇させることが見出されている。
1つの態様において、第2のpH値は、7.25またはそれより高い。1つの態様において、第1のpHはpH7±0.05pH単位であり、第1のpH値が0.25～0.4pH単位高められて第2のpHとされる。1つの態様において、第1のpHは7±0.05pH単位であり、0.3pH単位高められて第2のpHとされる。1つの態様において、第1のpHは7±0.05pH単位であり、約7.3±0.05pH単位である第2のpHまで高められる。1つの態様において、第1のpHはpH7±0.1pH単位であり、第1のpHが0.25～0.4pH単位高められて第2のpHとされる。1つの態様において、第1のpHは7±0.1pH単位であり、0.3pH単位高められて第2のpHとされる。1つの態様において、第1のpHは7±0.1pH単位であり、約7.3±0.1pH単位である第2のpHまで高められる。
また、播種細胞密度の調整によって、製品力価を維持しつつ、低い不純物レベルという所望の結果をさらに良くすることもできる。
1つの態様において、播種細胞密度は、約600000(6×105)～約1000000(1×106)細胞/mlである。1つの態様において、播種細胞密度は、約600000(6×105)細胞/mlまたは約1000000(1×106)細胞/mlである。1つの態様において、播種細胞密度は、約650000(6.5×105)である。1つの態様において、播種細胞密度は、約900000(9×105)である。1つの態様において、播種細胞密度は、温度およびpHの変更を伴わない培養と比べて、2～4倍、好ましくは約3倍に増やされる。
1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、300mOsmol/kg±15mOsmol/kgまたはそれより高い。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、350mOsmol/kg±15mOsmol/kgまたはそれより高い。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、400mOsmol/kg±15mOsmol/kgまたはそれより高い。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、約250mOsmol/kg～約800mOsmol/kgである。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、約300mOsmol/kg～約600mOsmol/kgである。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、約400mOsmol/kgである。1つの態様において、細胞培養培地の重量オスモル濃度は、350mOsmol/kg±15mOsmol/kg～800mOsmol/kg±15mOsmol/kgである。
1つの態様において、免疫コンジュゲートは、IL-2またはその変異体を含む(すなわち、免疫コンジュゲートは、IL-2ベースの免疫コンジュゲートである)。1つの態様において、免疫コンジュゲートは標的化免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートもしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、免疫コンジュゲートは、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 01～SEQ ID NO: 03のアミノ酸配列を含む、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 04～SEQ ID NO: 06のアミノ酸配列を含む、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、免疫コンジュゲートは、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 07、SEQ ID NO: 08、およびSEQ ID NO: 03のアミノ酸配列を含む、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 09～SEQ ID NO: 11のアミノ酸配列を含む、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、免疫コンジュゲートは、IgG-IL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 12～SEQ ID NO: 14のアミノ酸配列を含むIgG-IL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 15～SEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を含むIgG-IL-2免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、免疫コンジュゲートは、(WO 2016/075278に説明されている)FAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物は、宿主細胞タンパク質、クラスタリン、PLBL2、免疫コンジュゲートの凝集体または断片を含む群より選択される。
1つの態様において、製品に関係する不純物は、免疫コンジュゲートの凝集体または断片を含む群より選択される。1つの態様において、製品に関係する不純物は、免疫コンジュゲートの断片である。1つの態様において、製品に関係する不純物は、断片化IL-2である。
1つの態様において、工程に関係する不純物は、宿主細胞タンパク質、クラスタリン、またはPLBL2を含む群より選択される。
本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 01～SEQ ID NO: 03のアミノ酸配列を含む、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 04～SEQ ID NO: 06のアミノ酸配列を含む、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 07、SEQ ID NO: 08、およびSEQ ID NO: 03のアミノ酸配列を含む、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 09～SEQ ID NO: 11のアミノ酸配列を含む、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、IgG-IL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 12～SEQ ID NO: 14のアミノ酸配列を含むIgG-IL-2免疫コンジュゲートである。1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、SEQ ID NO: 15～SEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を含むIgG-IL-2免疫コンジュゲートである。
1つの態様において、本明細書において報告される方法を用いて得ることができる免疫コンジュゲートは、(WO 2016/075278に説明されている)FAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである。
本発明はまた、不純物のレベルを低下させた免疫コンジュゲートを含む組成物も提供する。例えば、これらの組成物は、断片化IL-2、すなわち遺伝学的に予想される完全長タンパク質配列の一部のみを有する分子を低レベルだけ含む。断片化エフェクター部分/IL-2を有するこのような分子は、例えば、分子量が低めのIL-2を含む重鎖として検出され得る。
本明細書において報告される1つの局面は、免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片/断片化エフェクター部分(例えばIL-2)、凝集体、および宿主細胞タンパク質を含む組成物である。
本明細書において報告される1つの局面は、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化IL-2、凝集体、および宿主細胞タンパク質を含む組成物である。
本明細書において報告される1つの局面は、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化IL-2、凝集体、および宿主細胞タンパク質である。
本明細書において報告される1つの局面は、IgG-IL-2免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化IL-2、凝集体、および宿主細胞タンパク質である。
本明細書において報告される1つの局面は、FAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化4-1-BBL、凝集体、および宿主細胞タンパク質である。
本明細書において報告される1つの局面は、請求項1記載の方法によって得ることができる、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化IL-2、凝集体、および宿主細胞タンパク質を含む組成物である。
本明細書において報告される1つの局面は、請求項1記載の方法によって得ることができる、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化IL-2、凝集体、および宿主細胞タンパク質を含む組成物である。
本明細書において報告される1つの局面は、請求項1記載の方法によって得ることができる、IgG-IL-2免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化IL-2、凝集体、および宿主細胞タンパク質を含む組成物である。
本明細書において報告される1つの局面は、請求項1記載の方法によって得ることができる、FAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートならびに低レベルの断片化4-1-BBL、凝集体、および宿主細胞タンパク質を含む組成物である。
1つの態様において、断片化IL-2の(相対)量は、10％またはそれ未満である。1つの態様において、断片化IL-2の(相対)量は、9％またはそれ未満である。1つの態様において、断片化IL-2の(相対)量は、8％またはそれ未満である。1つの態様において、断片化IL-2の(相対)量は、7％またはそれ未満である。1つの態様において、断片化IL-2の(相対)量は、6％またはそれ未満である。1つの態様において、断片化IL-2の(相対)量は、5％またはそれ未満である。1つの態様において、断片化IL-2の(相対)量は、4％またはそれ未満である。
1つの態様において、凝集体の(相対)量は、5％またはそれ未満である。1つの態様において、凝集体の(相対)量は、4％またはそれ未満である。1つの態様において、凝集体の(相対)量は、3％またはそれ未満である。1つの態様において、凝集体の(相対)量は、2％またはそれ未満である。1つの態様において、凝集体の(相対)量は、1％またはそれ未満である。
1つの態様において、クラスタリンの(相対)量は、30000ng/mlまたはそれ未満である。1つの態様において、クラスタリンの(相対)量は、25000ng/mlまたはそれ未満である。1つの態様において、クラスタリンの(相対)量は、20000ng/mlまたはそれ未満である。1つの態様において、クラスタリンの(相対)量は、15000ng/mlまたはそれ未満である。
1つの態様において、製品力価に対するクラスタリンの比率は、15ng/μgまたはそれ未満である。1つの態様において、製品力価に対するクラスタリンの比率は、13ng/μgまたはそれ未満である。1つの態様において、製品力価に対するクラスタリンの比率は、10ng/μgまたはそれ未満である。
1つの態様において、PLBL2の(相対)量は、2000ng/mlまたはそれ未満である。1つの態様において、PLBL2の(相対)量は、1500ng/mlまたはそれ未満である。1つの態様において、PLBL2の(相対)量は、1200ng/mlまたはそれ未満である。1つの態様において、PLBL2の(相対)量は、1000ng/mlまたはそれ未満である。
1つの態様において、製品力価に対するPLBL2の比率は、1.5ng/μgまたはそれ未満である。1つの態様において、製品力価に対するPLBL2の比率は、1.2ng/μgまたはそれ未満である。1つの態様において、製品力価に対するPLBL2の比率は、1ng/μgまたはそれ未満である。
1つの態様において、宿主細胞タンパク質全体の(相対)量は、500000～2500000ng/mlの間である。
1つの態様において、製品力価に対する宿主細胞タンパク質全体の比率は、1200ng/μgまたはそれ未満である。1つの態様において、製品力価に対する宿主細胞タンパク質全体の比率は、1000ng/μgまたはそれ未満である。1つの態様において、製品力価に対する宿主細胞タンパク質全体の比率は、800ng/μgまたはそれ未満である。
1つの態様において、細胞培養は、大規模細胞培養である。1つの態様において、細胞培養の体積は、約100リットル～約15000リットルである。1つの態様において、細胞培養の体積は、約1000リットル～約15000リットルである。
1つの態様において、細胞培養は、バッチ細胞培養である。
1つの態様において、細胞培養は、フェドバッチ細胞培養である。
1つの態様において、細胞培養は、ボーラス補給を伴うフェドバッチ細胞培養である。
1つの態様において、細胞培養は、連続的補給を伴うフェドバッチ細胞培養である。
1つの態様において、培地は、無血清培地である。1つの態様において、培地は、無タンパク質培地である。1つの態様において、培地は、既知組成培地である。1つの態様において、培地は、無タンパク質既知組成培地である。
1つの態様において、哺乳動物細胞はCHO細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞はCHO K1細胞である。
本明細書において報告される方法1つの局面は、関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含むCHO細胞を細胞培養培地中で培養し、それら1つまたは複数の核酸を細胞培養条件下で発現させることによって、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物を減少させた、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはFAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートを製造するための方法であり、この方法は以下の段階を含む：
第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する段階、
細胞培養培地の第1の温度を第2の温度に下げ、かつ細胞培養培地の第1のpHを第2のpHに高める段階、
細胞または細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
それによって免疫コンジュゲートを製造する段階。
本明細書において報告される1つの局面は、関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含むCHO細胞を細胞培養培地中で培養し、それら1つまたは複数の核酸を細胞培養条件下で発現させることによって、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物を減少させたIL-2免疫コンジュゲートを製造するための方法であり、この方法は以下の段階を含む：
第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する段階、
細胞培養培地の第1の温度を第2の温度に下げ、かつ細胞培養培地の第1のpHを第2のpHに高める段階、
細胞または細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
それによって免疫コンジュゲートを製造する段階。
本明細書において報告される1つの局面は、関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含むCHO細胞を細胞培養培地中で培養し、それら1つまたは複数の核酸を細胞培養条件下で発現させることによって、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物を減少させた、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートまたはIgG-IL-2免疫コンジュゲートを製造するための方法であり、この方法は以下の段階を含む：
第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する段階、
細胞培養培地の第1の温度を第2の温度に下げ、かつ細胞培養培地の第1のpHを第2のpHに高める段階、
細胞または細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
それによって免疫コンジュゲートを製造する段階。
本明細書において報告される1つの局面は、関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含む哺乳動物細胞を細胞培養培地中で培養し、それら1つまたは複数の核酸を細胞培養条件下で発現させることによって、(免疫コンジュゲートの)断片(および/)または凝集体のレベルを低下させた、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートまたはIgG-IL-2免疫コンジュゲートを製造するための方法であり、この方法は以下の段階を含む：
第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する段階、
細胞培養培地の第1の温度を第2の温度に下げ、かつ細胞培養培地の第1のpHを第2のpHに高める段階、
細胞または細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
それによって免疫コンジュゲートを製造する段階。
以下の実施例、図面、および配列は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明される手順に修正を加えてよいことが理解される。
試験した異なる工程形式。播種細胞密度、pH変更、温度変更、および工程の長さについての異なる主要パラメーターを、工程1(基準/標準工程)、工程2、および工程3に関して示している。 工程形式2および3により、cM1を発現するクローンの採取時の上清クラスタリン濃度が低下する。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM1=CEA-IL-2免疫コンジュゲート)を発現する組換えCHO細胞株を用いる2Lガラス製バイオリアクター中での13日(工程2)および14日(工程3)続く3種のフェドバッチ工程の無細胞試料を、(A)クラスタリン、(B)正味の力価、および(C)正味の力価あたりのクラスタリンの比率について解析した。ひげは、それぞれの標準偏差を表している(n=3)。 工程形式2および3により、cM2を発現する2種のクローンの採取時の上清クラスタリン濃度が低下する。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM2=IgG-IL-2免疫コンジュゲート)を発現する2種の組換えCHO細胞株(クローン1およびクローン2)を用いる2Lガラス製バイオリアクター中での13日(工程2)および14日(工程3)続くフェドバッチ工程の無細胞試料を、(A)クラスタリン、(B)力価、および(C)力価あたりのクラスタリンの比率について解析した。 工程形式2および3により、cM2を発現する2種のクローンの採取時の上清CHO宿主細胞タンパク質(HCP)濃度が低下する。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM2=IgG-IL2免疫コンジュゲート)を発現する2種の組換えCHO細胞株(クローン1およびクローン2)を用いる2Lガラス製バイオリアクター中での13日(工程2)および14日(工程3)続くフェドバッチ工程の無細胞試料を、(A)CHO宿主細胞タンパク質および(B)力価あたりのCHO HCPの比率について解析した。 工程形式2および3により、cM2を発現する2種のクローンの採取時の上清PLBL2濃度が低下する。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM2=IgG-IL2免疫コンジュゲート)を発現する2種の組換えCHO細胞株(クローン1およびクローン2)を用いる2Lガラス製バイオリアクター中での13日(工程2)および14日(工程3)続くフェドバッチ工程の無細胞試料を、(A)PLBL2および(B)力価あたりのPLBL2の比率について解析した。 工程形式3により、製造規模/大規模での採取時の上清クラスタリン濃度が低下する。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM2=IgG-IL-2免疫コンジュゲート)を発現する組換えCHO細胞株を用いる250L単回使用バイオリアクター中での13日(工程2)および14日(工程3)のフェドバッチ工程の無細胞試料を、クラスタリンについて解析した。 工程3によるcM2断片および凝集体の減少。(A)CE-SDSによって測定した断片、すなわち重鎖断片＋非グリコシル化重鎖および(B)SECによって測定した凝集体(HMW種)を、cM2を発現するクローン1およびクローン2について示している。実験はすべて、2Lガラス製バイオリアクター中で実施した。 工程のpHによる上清クラスタリンレベルの調整。複合IgG融合タンパク質(cM3=FAP-4-1-BBL免疫コンジュゲート)を発現する2種の組換えCHO細胞株、すなわちクローン6およびクローン7を用いる、2Lガラス製バイオリアクター中での、8日目の6.8、7.0、7.2、または7.4へのpH変更を伴う14日のフェドバッチ工程(工程1)の無細胞試料を、クラスタリンについて解析した。 工程の温度による上清クラスタリンレベルの調整。複合IgG融合タンパク質(cM3=FAP-4-1-BBL免疫コンジュゲート)を発現する2種の組換えCHO細胞株、すなわちクローン6およびクローン7を用いる、振盪フラスコ中での、8日目の33℃への温度変更を伴うまたは温度変更を伴わない(37℃)14日のフェドバッチ工程(工程1)の無細胞試料を、(A)クラスタリンおよび(B)製品力価について解析した。ひげは、それぞれの標準偏差を表している。 工程の重量オスモル濃度による上清クラスタリンレベルの調整。複合IgG融合タンパク質(cM3=FAP-4-1-BBL免疫コンジュゲート)を発現する組換えCHO細胞株クローン6を用いる、振盪フラスコ中での、異なるベース培地重量オスモル濃度(300mOsmol/kgおよび400mOsmol/kg)での14日のフェドバッチ工程(工程1)の無細胞試料を、(A)クラスタリン、(B)製品力価、および(C)力価当たりのクラスタリン比率について解析した。ひげは、それぞれの標準偏差を表している。 cM1(=CEA-IL-2免疫コンジュゲート)断片および凝集体の減少。(A)CE-SDSによって測定した断片、すなわち重鎖断片＋非グリコシル化重鎖および(B)SECによって測定した凝集体(HMW種)を、cM1を発現するクローンについて示している。実験はすべて、2Lガラス製バイオリアクター中で実施した。 工程1、2および3の正味の力価。異なる工程の正味の力価は、合計製品力価から断片化製品の量を引くことによって決定した。すべての工程が、同程度のレベルの正味の力価を示している。 生細胞密度(A)および細胞生存率(B)を示している。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM2=IgG-IL-2免疫コンジュゲート)を発現する2種の組換えCHO細胞株(クローン1:丸いマーカーおよびクローン2:四角いマーカー)を用いる、2Lガラス製バイオリアクター中での13日(工程2、灰色のマーカーおよび線)および14日(工程3、黒色のマーカーおよび線)続くフェドバッチ工程を、(A)生細胞密度および(B)細胞生存率について解析した。 生細胞密度(A)を示している。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM1=CEA-IL-2免疫コンジュゲート)を発現する1種の組換えCHO細胞株を用いる、2Lガラス製バイオリアクター中での14日続くフェドバッチ工程(n=3)(工程形式1、黒;工程形式2、薄い灰色;工程形式3、濃い灰色)を、(A)生細胞密度について解析した。すべての工程が、同程度の細胞生存率および生細胞密度を示している。 細胞生存率(B)を示している。複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM1=CEA-IL-2免疫コンジュゲート)を発現する1種の組換えCHO細胞株を用いる、2Lガラス製バイオリアクター中での14日続くフェドバッチ工程(n=3)(工程形式1、黒;工程形式2、薄い灰色;工程形式3、濃い灰色)を、(B)細胞生存率について解析した。すべての工程が、同程度の細胞生存率および生細胞密度を示している。
配列表の説明
SEQ ID NO: 01 CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる抗CEA IgGの可変重鎖ドメインVH
SEQ ID NO: 02 CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる抗CEA IgGの可変軽鎖ドメインVL
SEQ ID NO: 03 CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートおよびFAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれるインターロイキン2変異体(IL-2)
SEQ ID NO: 04 CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる、IL-2を伴う全重鎖(ノブ)
SEQ ID NO: 05 CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる全重鎖(ホール)
SEQ ID NO: 06 CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる全軽鎖
SEQ ID NO: 07 FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる抗FAP IgGの可変重鎖ドメインVH
SEQ ID NO: 08 FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる抗FAP IgGの可変軽鎖ドメインVL
SEQ ID NO: 09 FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる、IL-2を伴う全重鎖(ノブ)
SEQ ID NO: 10 FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる全重鎖(ホール)
SEQ ID NO: 11 FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲートに含まれる全軽鎖
SEQ ID NO: 12 IgG-IL-2免疫コンジュゲートに含まれる非標的化IgGの可変重鎖ドメインVH
SEQ ID NO: 13 IgG-IL-2免疫コンジュゲートに含まれる非標的化IgGの可変軽鎖ドメインVL
SEQ ID NO: 14 IgG-IL-2免疫コンジュゲートに含まれるインターロイキン2変異体(IL-2)
SEQ ID NO: 15 IgG-IL-2免疫コンジュゲートに含まれる、IL-2を伴う全重鎖
SEQ ID NO: 16 IgG-IL-2免疫コンジュゲートに含まれる全軽鎖
実施例1
一般的な方法および材料
細胞株
この研究においては、トランスフェクトしたCHO(Chinese hamster ovary)K1細胞株を使用した。
免疫コンジュゲート
WO 2012/146628もしくはSEQ ID NO: 01～SEQ ID NO: 06に記載されているCEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート(IL-2にコンジュゲートされた抗CEA抗体);またはWO 2012/107417もしくはSEQ ID NO: 07～SEQ ID NO: 11 およびSEQ ID NO: 03に記載されているFAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート;またはWO 2015/118016もしくはSEQ ID NO: 12～SEQ ID NO: 16に報告されている非標的化IgG-IL-2免疫コンジュゲート;またはWO 2016/075278に記載されているFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートなどのいくつかの例示的免疫コンジュゲートを用いて、本発明を例示する。
細胞培養方法
細胞培養に必要とされる培地およびフィードを準備し、pH値、グルコース濃度、および重量オスモル濃度といったパラメーターを供給業者(Gibco/Life Technologies Inc.)の操作説明書に従って調整した。培地およびフィードを暗所、4℃で保管し、それぞれ4週間(前培養培地、発酵培地)、3週間(フィード1)、および2週間(フィード2)以内に使い切った。補正剤を室温で保管し、3ヶ月(グルコース溶液;50％)、6ヶ月(炭酸ナトリウム溶液;1M)、および12ヶ月(消泡剤溶液;Dow Corning(登録商標)Antifoam C乳濁液、食品グレード、10％)以内に消費した。
以下の部分で説明する方法は、標準プロトコール(Lindl, T. Zell- und Gewebekultur: Einfuhrung in die Grundlagen sowie ausgewahlte Methoden und Anwendungen. Heidelberg/Berlin, Spektrum Akademischer Verlage GmbH 2002)および各供給業者の操作説明書を目的に合わせて改変している。
前培養
細胞を解凍し、振盪フラスコに入れて前培養培地中で2～3週間、前培養した。インキュベーションパラメーターは次の通りであった:温度37℃、湿度80％、CO2 7％、振盪頻度210rpm、振幅5cm。3～4日毎に細胞を継代し、播種に必要とされる体積になるまで、前培養培地中、選択圧(メトトレキサート)下で増殖させた。
標準的な細胞培養工程(工程1)
3.5×105細胞/mlの出発細胞密度で、フィード1、フィード2、およびグルコースを用いる1つまたは14日のフェドバッチ工程で、細胞を培養した。フィードは発酵の3日目および6日目に開始し、発酵の残りの日数の間は、出発体積を基準として2％(v/v)の比率で連続的に添加した。別段の記載が無い限り、pH値は、CO2および1M Na2CO3を用いて、0.05pH単位のデットバンド範囲内に調整した。必要な場合には、泡消し溶液および抗生物質を添加した。工程の間、温度、pH値、およびpO2といったパラメーターをモニターし、管理した。14日後に発酵工程を停止した。培養液を採取し、滅菌ろ過した。バイオリアクターを分解し、清掃した。
改変した工程(工程2および3)については、下記を参照されたい。
Quadシステムにおける発酵装置
2L容の二重壁ガラス製バイオリアクターは、スチール製の蓋で閉じられ、撹拌機、プローブ、フィード口などの内蔵部品が中に組み込まれる。4つの容器が1つのBIOSTAT(登録商標)DCU3/4 (Sartorius Stedim Biotech AG)コントロールシステムによって管理され、それゆえ、Quadシステムと呼ばれている。
バイオリアクターを組み立て、KH2PO4溶液(1.4g/l)で満たした。pHプローブを較正し、pO2プローブと一緒にバイオリアクター中に組み入れた。続いて、システムの気密性を試験した。バイオリアクターを高圧滅菌し(ウェットプログラム:121℃、大気圧より高い1.2バール、30分間)、供給タワー(それぞれDCU3および4)に連結した。播種の前日に、KH2PO4を発酵培地900mlに交換した。さらに、pHプローブを較正し、ベース入りフラスコおよびグルコース入りフラスコをバイオリアクターに連結し、管理段階(撹拌機、pO2較正のためのガス供給、温度、および圧力)を開始した。播種前に、pHプローブを再び較正し、pO2プローブを較正し、パラメーターを発酵条件に設定した(温度37℃、pO2 35％、pH7、圧力100mbar)。pO2のフィードバック制御システムは、次のカスケード、すなわちN2/空気、空気/O2、および撹拌機を介して調節された。
細胞増殖の測定
培養工程時の生細胞密度および生存率を、Cedex HiRes (Roche Diagnostics GmbH)装置によるトリパンブルー染色を用いて評価した。
プロテインA精製
供給業者のプロトコールに従って、精製およびCEを実施した。通常、タンパク質を含む凍結試料を4℃で慎重に解凍し、可能な場合は氷上で保存した。凍結と解凍の繰り返しは避けた。発酵試料を遠心分離し(4000×g、体積に応じて10～30分)、精製し、かつ/または直ちに解析するか、または液体窒素中で急速冷凍し、80℃で保管した。
抗体精製のためにアフィニティークロマトグラフィーを使用した。小体積(150μl～3ml)のプロテインA精製を、PureSpeedチップ(Mettler Toledo)を用いて実施した。
より大きな体積(2L～3L)の場合、プロテインA MabSelectSureカラムを平衡化した。続いて、捕捉段階のために発酵上清を載せた。カラムは、タンパク質を溶出させる前に洗浄した。最後に、中和緩衝液を用いて、溶出液のpHを5.0に調整した。
キャピラリー電気泳動(CE-SDS)
チップ上でのCEを、製造業者の取扱い説明書に従ってAgilent Bioanalyzer 2100またはPerkinElmer LabChip GXおよび各々のタンパク質キットを用いて実施した。
還元状態でCEを用いて、断片化を解析した。標準的なCE図は、異なるマーカーピークおよび3つの生成物ピークを示している:軽鎖ピークは、サイズ約28kDaの位置で認識でき、重鎖ホール(HCホール、HC1)ピークは約58kDaの位置で認識でき、結合したIL-2分子を伴う重鎖ノブ(HCノブ、HC2)のピークは約74kDaの位置で認識できる。IL-2部分の断片化が起こる場合、HC1ピークとHC2ピークの間に追加のピークを認識できる。
正味の製品力価
製品力価は、Bioprofile 100 Plusを用いて測定した。しかし、この装置は、断片化抗体と非断片化抗体を区別することができない。こういう訳で、断片の少ない正味の力価を下記に示すように算出した。
Tnet=(1-F)×T
上式で、Tnet=正味の製品力価(少ない断片)(mg/l)
T=合計力価(mg/l)
F=断片比率(％)
実施例2
pHおよび温度の調整は、CHOフェドバッチ工程におけるクラスタリンレベルに影響を与える(cM1/cM2を用いて例示)
CHOフェドバッチ工程における上清クラスタリンレベルに対するpHおよび温度の影響を明らかにするために、3種の工程形式、すなわち工程1、工程2、および工程3を3つ1組で比較した。
表：試験の際に使用された工程パラメーター
Figure 0007213180000002
工程2および工程3は、工程1と異なり、両方の形式で播種細胞密度の増加および8日目の追加の温度変更を行い、工程2では13日目に採取し、工程3ではpH変更を追加している(図1)。所与の設定において、複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM1=CEA-IL-2免疫コンジュゲート)を安定に発現するクローンを、2Lガラス製バイオリアクター中でのフェドバッチ工程に使用した。工程2および工程3はどちらも、ベースラインの工程形式1と比べて、採取時に低レベルの上清クラスタリンを示した(図2A)。工程2および工程3は、正味の製品力価に基づいて算出したところ、基準工程1と同じ生産性に達した(図2B)。それにより、製品濃度当たりの上清クラスタリン濃度の比率は、上清クラスタリンレベル単独と同じ傾向をたどった:工程形式2および3は、生成分子に対して減少したクラスタリン「量」を誘導する(図2C)。
生細胞密度および細胞生存率を評価し、3種すべての工程において同程度であることを見出した(図11および12)。
CHOフェドバッチ工程においてpHおよび温度を調整することがクラスタリンレベルに与える一般的効果を解析するために、別の複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM2=IgG-IL-2免疫コンジュゲート)を安定に発現する2種のクローン(クローン1およびクローン2)ならびに工程形式2および3を2Lバイオリアクターの稼働において使用した。以前に観察されたように、工程形式3はまた、クローン1およびクローン2について、低レベルの上清クラスタリンおよび製品当たりのクラスタリン比率を示したが、全体的製品力価は同じままである(図3a、(A))。工程形式3を用いた場合のクローン1およびクローン2において、CHO宿主細胞タンパク質(図3b、(A)～(C))およびPLPL2(図3c、(A)～(C))について同じ減少傾向を観察することができた。
典型的な生産規模として250Lの単回使用バイオリアクター(SUB)を用いるフェドバッチ工程において工程形式2および3を比較することにより、工程形式の規模を拡張できることが証明された。この場合もやはり、工程形式3は、工程2と比べて低レベルの上清クラスタリンを示した(図4)。
採取時のcM2製品に関係する不純物(断片化および凝集)の最終レベルをそれぞれCE-SDSおよびSECによって測定した。試験した両方のクローン、すなわちクローン1およびクローン2とも、工程形式3を使用した場合に、低レベルのcM2断片化および凝集を示した(図5)。
実施例3
クラスタリンレベルは、pH、温度、および培地重量オスモル濃度によって調整することができる(cM3を用いて例示)
2Lガラス製バイオリアクターまたは振盪フラスコのいずれかを用いるフェドバッチ実験において、工程ならびに培地パラメーターであるpH、温度、および重量オスモル濃度を、CHOフェドバッチ培養の上清クラスタリンレベルに与える影響について試験した。そのために、同じ複合IgG融合タンパク質(cM3=FAP-4-1-BBL免疫コンジュゲート)をいずれも発現する2種のクローン、すなわちクローン6およびクローン7ならびに工程形式1を使用した。温度変更およびpH変更を8日目に開始し、14日目に採取するまで保った。様々な培地重量オスモル濃度を培養開始以降使用した。
両方のクローンについて、pH6.8からpH7.2までは、上清クラスタリンレベルが上がった(図6)。pH7.4で、クラスタリンレベルは、クローン6およびクローン7において、それぞれ最低レベルまたは6.8と同程度のレベルを示した。
8日目に33℃まで温度を下げると、クラスタリンレベルが約50％低下したが、培養の生産性は、同程度のレベルのままであった(図7)。
CHO細胞に対する工程の重量オスモル濃度の調整を用いて、細胞の比生産性を変えることができる。その後の実験で、上清クラスタリンに対する培地重量オスモル濃度の影響を解析した。より高い培地重量オスモル濃度を用いることにより、工程は、低い培地重量オスモル濃度レベルと比べて、少し低減した最終力価をもたらした(図8B)。しかし、上清クラスタリンレベルおよび製品力価当たりのクラスタリンの比率は、約50％減少した(図8A、C)。
実施例4
断片化レベルおよび凝集レベルの調整(cM1を用いて例示)
実施例2で説明したように、CHO細胞中の組換えによって製造された分子の断片化レベルおよび凝集レベルに基づいてpHおよび温度のような様々なパラメーターを解析した。この場合もやはり、3種の異なるフェドバッチ工程形式、すなわち工程1、工程2、および工程3(実施例2を参照されたい)を比較した。ここでは、複合サイトカイン-IgG融合タンパク質(cM1=CEA-IL-2免疫コンジュゲート)を安定に発現するクローンをフェドバッチ工程に使用した。
採取時のcM1製品に関係する不純物(断片化および凝集)の最終レベルをそれぞれCE-SDSおよびSECによって測定した。
工程2および特に工程3は、レベルが著しく低下した断片化を示している(14日目の工程1の11％に対して工程3の4％;図9A)。凝集体レベルは、工程3において著しく低下していた(図9B)。
重要なことは、14日目の正味の力価は、3種の工程すべてについてほぼ同じであった(図10)。したがって、生産性を高いレベルで保つことができ、同時に断片化および凝集を減少させることができる。生細胞密度および細胞生存率も評価し、3種すべての工程において同程度であることを見出した(図12)。
実施例5
免疫コンジュゲートの精製
生じた免疫コンジュゲートを採取した後に、さらなる精製を実施してもよい。簡単に説明すると、20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウムpH7.5中で平衡化したプロテインA(HiTrap ProtA、GE Healthcare)を用いる1回のアフィニティー段階によって、免疫コンジュゲートを精製した。上清を載せた後、カラムを最初に20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、pH7.5で洗い、続いて13.3mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH5.45で洗った。20mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、100mMグリシン、pH3を用いて免疫コンジュゲートを溶出させた。画分を中和し、集め、最終的な調合緩衝液:25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、100mMグリシンpH6.7中でのサイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad 16/60 Superdex 200、GE Healthcare)によって精製した。280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、精製タンパク質試料のタンパク質濃度を決定した。還元剤(5mM 1,4-ジチオトレイトール)の存在下および非存在下でのSDS-PAGEによって免疫コンジュゲートの純度および分子量を解析し、クーマシーブルー(SimpleBlue(商標)SafeStain、Invitrogen)で染色した。

Claims (10)

  1. 関心対象の免疫コンジュゲートをコードする1つまたは複数の核酸を含むCHO細胞を細胞培養培地中で培養することによって、製品に関係する不純物および工程に関係する不純物を減少させた免疫コンジュゲートを製造するための方法であって、
    ここで該1つまたは複数の核酸が細胞培養条件下で発現され、
    該方法が、
    第1の温度および第1のpHの細胞培養培地中でCHO細胞を培養する段階、
    該細胞培養培地の該第1の温度を第2の温度に下げ、かつ該細胞培養培地の該第1のpHを第2のpHに高める段階、
    該細胞または該細胞培養培地から免疫コンジュゲートを回収する段階、ならびに
    それによって該免疫コンジュゲートを製造する段階
    を含み、
    該第1の温度が37℃±0.5℃であり、該第2の温度が28℃～34℃の範囲内であり、
    該第1のpH値がpH7±0.05pH単位であり、該第1のpH値が0.25～0.4pH単位高められて第2のpHとされる、
    方法。
  2. 1つまたは複数の精製段階により免疫コンジュゲートを精製する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 第2の温度への低下および第2のpHへの上昇が、13～14日の合計培養期間の2～9日目である、請求項1または2記載の方法。
  4. 第2の温度への低下および第2のpHへの上昇が、ほぼ同じ時点である、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 第1の温度が37℃±0.5℃であり、29℃±0.5℃の第2の温度に下げられる、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. 第2のpHが7.25またはそれより高い、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 播種細胞密度が、600000(6×105)～1000000(1×106)細胞/mlである、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  8. 細胞培養培地の重量オスモル濃度が、350mOsmol/kg±15mOsmol/kg～800mOsmol/kg±15mOsmol/kgである、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 免疫コンジュゲートが、CEAを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、FAPを標的とするIL-2免疫コンジュゲート、もしくはIgG-IL-2免疫コンジュゲート、またはFAPを標的とする4-1-BBL免疫コンジュゲートである、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
  10. 細胞培養がフェドバッチ細胞培養である、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
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