CN109952370A - 用于产生免疫缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中报道了一种通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的哺乳动物细胞、产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的免疫缀合物的方法，其中在细胞培养的条件下表达该一个或多个核酸，所述方法包括步骤：在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；降低细胞培养基的第一温度至第二温度，并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，由此产生免疫缀合物。

Description

用于产生免疫缀合物的方法
技术领域
本发明属于多肽生产和发酵工艺领域。本文中报道了用于产生免疫缀合物的新方法。
背景技术
癌症是全球最重大的死因。2012年，登记了820万死亡例；大部分由肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌引起。保守的癌疗法由以下治疗之一或其组合组成：手术、放疗和化疗(WHO 2014)。治疗癌症的另一种可能性是免疫疗法，刺激身体自身对癌症的免疫应答。细胞因子是参与免疫系统调节的细胞信号传导分子。在癌疗法中使用时，细胞因子可以充当具有抗肿瘤作用和可增加对某些类型肿瘤的免疫原性的免疫调节剂。在这个治疗领域，白介素-2(IL-2)是有效对抗人体癌症的首个药物。
IL-2是癌疗法中的强力分子。IL-2是在免疫应答中发挥关键作用的细胞因子。它在辅助T细胞(Th，CD4+)细胞中产生并且在其他免疫系统细胞(包括CD8+T细胞)中以较少的量产生。然而，(阿地白介素,aldesleukin)(IL-2市售形式)的临床应用有限，原因在于治疗期间分子的毒性高。已经开发了避免当前IL-2治疗之缺点的IL-2免疫缀合物。这些分子可以靶向肿瘤标记(TM)，并且因此在携带TM的肿瘤组织中实现IL-2的局部作用，或IL-2可以接合至无靶向作用的IgG分子，例如导致半寿期延长。此外，可以修饰IL-2本身和Fc区以降低分子的毒性(IL-2变体)。然而，在CHO细胞中产生IL-2免疫缀合物期间，观察到不同的产物相关和工艺相关杂质。这些杂质例如是具有碎片化细胞因子(IL-2)部分的分子、聚集的分子(高分子量种类；HMW)或宿主细胞蛋白如凝聚素(Clusterin)或磷脂酶B样2(PLBL2/PLB2)。在抗体中未观察到剪切，碎片化仅发生在IL-2分子中。根据FDA法规，产品必须避免任何异质性，包括聚集、变性和碎片化(Zoon,K.C.1997“Points to Consider inthe Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”，美国卫生和公众服务部，美国食品药品监督管理局)。为了确保生物药剂对人体的安全性，必须移除生产过程期间累积的副产物并且需要从一开始就防止这些杂质的形成和积累。
在WO2008/131374中，描述了一种用于通过在降低的温度和/或降低的pH培育细胞培养物，减少细胞培养物中蛋白质错误折叠和聚集的方法。
Cruz等人(Biotechnology Letters,第677–682页,(2000))报道了固定化幼仓鼠肾细胞中表达的重组融合蛋白的产品质量，所述细胞在无蛋白质的培养基中培育。
在WO 2012/146628中，报道了选择性递送影响细胞活性的效应子部分的抗原特异性免疫缀合物。
Trummer等人(Biotechnol Bioeng,2006,94(6):1045-1052)描述了双相培养作为增强分批工艺的体积生产率的工具，所述分批工艺使用表达Epo-Fc的CHO细胞。
WO 2011/134919中报道了改进的细胞培养工艺。
发明简述
本文中报道了一种用于产生产物相关杂质水平和工艺相关杂质水平降低的免疫缀合物的方法。更详细地，已经发现，可以通过在第一时间段期间在第一(较高)温度和第一(较低)pH生长细胞培养物/培养细胞、随后转变温度至较低值并转变pH至较高值直至培养结束，来减少培养基中免疫缀合物的片段(例如，碎片化细胞因子如IL-2)、宿主细胞蛋白(例如，PLBL2或凝聚素)和聚集物的出现。
因此，如本文中报告的一个方面是，一种通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的哺乳动物细胞、产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的免疫缀合物的方法，其中在细胞培养的条件下表达该一种或多种核酸，所述方法包括步骤：
-在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；
-降低细胞培养基的第一温度至第二温度；并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；
-从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，
并且由此产生免疫缀合物。
在一个实施方案中，该方法还包括用一个或多个纯化步骤纯化免疫缀合物。
在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在13至14天的总培养时间的2至9天后(进行)。在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在13至14天的总培养时间的约8天后(进行)。
在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在约相同的时间(进行)。
在一个实施方案中，第一温度是37℃+/-0.5℃并且第二温度处于28℃至34℃范围内(即第一温度降低3℃至9℃)。在一个实施方案中，第一温度是37℃+/-0.5℃并且第二温度处于29℃至30℃范围内(即，降低7℃至8℃)。在一个实施方案中，其中第一温度是37℃+/-0.5℃并且降低至29℃+/-0.5℃的第二温度。
在一个实施方案中，第二pH是7.25或更高。
在一个实施方案中，接种细胞密度是从约600000(6x 105)至约1000000(1x 106)个细胞/ml。在一个实施方案中，接种细胞密度是约600000(6x 105)或约1000000(1x 106)个细胞/ml。
在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是300mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg或更大。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是350mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg或更大。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是从350mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg至800mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是约400mOsmol/kg。
在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物、靶向FAP的IL-2免疫缀合物、或IgG-IL-2免疫缀合物、或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。
如本文中报告的一个方面是采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物。
如本文中报告的一个方面是一种组合物，其包含免疫缀合物和水平降低的碎片(如碎片化IL-2)、聚集物和宿主细胞蛋白。
在一个实施方案中，采用如本文报告的方法可获得的或在如本文报告的组合物中的免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物，靶向FAP的IL-2免疫缀合物、或IgG-IL-2免疫缀合物、或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。
在一个实施方案中，细胞培养物是大规模细胞培养物。
在一个实施方案中，细胞培养物具有约100升至约15000升的体积。
在一个实施方案中，细胞培养物是分批细胞培养物。
在一个实施方案中，细胞培养物是补料分批细胞培养物。
在一个实施方案中，培养基是无血清培养基。
在一个实施方案中，培养基是无蛋白质的培养基。
在一个实施方案中，培养基是化学成分确知培养基。
在一个实施方案中，培养基是无蛋白质的化学成分确知培养基。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
发明详述
术语
如本文所用，术语“免疫缀合物”指包含至少一个效应子部分和至少一个免疫球蛋白部分的融合多肽分子。在某些实施方案中，免疫缀合物包含一个效应子部分和一个免疫球蛋白部分。在某些实施方案中，免疫缀合物包含一个效应子部分和一个IgG免疫球蛋白部分。在某些实施方案中，免疫缀合物包含二个效应子部分和一个免疫球蛋白部分。如本文提到的免疫缀合物是融合蛋白，即免疫缀合物的组分直接或借助一个或多个接头肽由肽键彼此连接。本发明的特定免疫缀合物基本上由借助一个或多个接头序列连接的至少一个效应子部分和一个免疫球蛋白部分组成。
术语“免疫球蛋白部分”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键彼此结合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称作重链恒定区，从而铰链区位于第一和第二恒定结构域之间。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域，也称作轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以归属5个类型之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类型可以划分成亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。免疫球蛋白部分可以是与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施方案中，免疫球蛋白部分能够将与之连接的实体引向靶部位，例如引向携带抗原决定簇的特定类型肿瘤细胞或肿瘤基质。免疫球蛋白部分包括抗体和抗体片段。
如本文所用，术语“抗原决定簇”同义于“抗原”和“表位”并且指多肽大分子上与免疫球蛋白部分结合的位点(例如一段连续氨基酸或由不同区域的不连续氨基酸构成的构象构型)。可用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上、病毒感染的细胞的表面上、其他患病细胞的表面上存在、游离于血清中存在，和/或在胞外基质(ECM)中存在。在一个具体实施方案中，抗原决定簇是人抗原。
在某些实施方案中，肿瘤抗原的非限制性例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)和其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)和其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、MAGE家族肿瘤抗原(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE家族肿瘤抗原(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙黏着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白和γ-联蛋白、p120ctn、gp100Pmel117PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白质(APC)、胞衬蛋白(fodrin)、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人乳头瘤病毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7及c-erbB-2。
在某些实施方案中，病毒性抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、Epstein-Barr病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160和HIV gp120。
在某些实施方案中，ECM抗原的非限制性例子包括多配体聚糖(syndecan)、类肝素酶(heparanase)、整联蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)、连接蛋白(Link)、钙黏着蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、刻痕蛋白(Notch)、腱糖蛋白(tenascin)和基质素(matrixin)。
在某些实施方案中，本文所述的免疫缀合物可以与以下具体非限制的细胞表面抗原例子结合：FAP(成纤维细胞活化蛋白)、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR缔合的异源多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(髓样细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R(IL6受体)、CD20、MCSP、和PDGFβR(β血小板衍生生长因子受体)。
本发明不仅提供靶向特定抗原(例如，肿瘤抗原)的免疫缀合物，还提供无靶向作用的缀合物，其包含一个或多个不与任何抗原特异性结合、尤其不与任何人体抗原结合的免疫球蛋白部分。可以例如通过如本文所述的ELISA或表面等离子体共振法测量不存在这些缀合物与任何抗原的特异性结合(即不存在可以与非特异性相互作用区别的任何结合)。当不想要靶向特定组织时，这类缀合物例如特别有用，可以例如用于与未缀合的效应子部分的血清半寿期相比，增强这些缀合物中包含的效应子部分的血清半寿期。无靶向作用的免疫缀合物的例子是IgG-IL-2。通过本发明方法产生的有靶向作用的免疫缀合物指，与靶(抗原)特异性结合的抗体和效应子部分(例如，细胞因子)的缀合物。因此，靶向FAP的IL-2免疫缀合物指与IL-2缀合的FAP结合性抗体。
如本文所用，术语“效应子部分”指影响细胞活性(例如通过信号转导或其他细胞的途径)的多肽，例如蛋白质或糖蛋白。因此，本发明的效应子部分可以与受体介导的信号传导过程相关，其中所述信号传导过程传输来自细胞膜外部的信号，以调节携带该效应子部分的一种或多种受体的细胞中的应答。在一个实施方案中，效应子部分可以在携带该效应子部分的一种或多种受体的细胞中激发细胞毒反应。在另一个实施方案中，效应子部分可以在携带该效应子部分的一种或多种受体的细胞中激发增殖反应。在另一个实施方案中，效应子部分可以在携带该效应子部分的受体的细胞中激发分化。在另一个实施方案中，效应子部分可以在携带该效应子部分的受体的细胞中改变(即上调或下调)内源细胞蛋白的表达。效应子部分的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。在一个实施方案中，效应子部分是细胞因子。在一个实施方案中，效应子部分是白介素。在一个实施方案中，效应子部分是白介素2(IL-2)。在一个实施方案中，效应子部分是4-1BB-配体(4-1BBL)。
如本文所用，术语“细胞因子”指介导和/或调节生物学功能或过程或细胞功能或过程(例如免疫力、炎症和造血)的分子。如本文所用的术语“细胞因子”包括淋巴因子、趋化因子、单核因子和白介素。在某些实施方案中，有用细胞因子的例子包括但不限于、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、4-1BB-配体(4-1BBL)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、和TNF-β。尤其是，细胞因子是IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α和IFN-γ。在一些具体的实施方案中，细胞因子是人细胞因子。如本文所用的术语“细胞因子”意在还包括，在相应野生型细胞因子的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变的细胞因子变体，例如在Sauvé等人,Proc Natl Acad SciUSA 88,4636-40(1991)；Hu等人,Blood 101,4853-4861(2003)和美国专利公开号2003/0124678；Shanafelt等人,Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000)；Heaton等人,CancerRes 53,2597-602(1993)和美国专利号5,229,109；美国专利公开号2007/0036752；WO2008/0034473；WO 2009/061853；或WO/2012/107417中描述的IL-2变体。
如本文所用，术语“单链”指包含由肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一个实施方案中，效应子部分是单链效应子部分。单链效应子部分的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。当效应子部分是细胞因子并且目的细胞因子正常情况下作为多聚体在自然界中存在时，则多聚体细胞因子的每个亚基由效应子部分单链依次编码。因此，可用单链效应子部分的非限制性例子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、4-1BB-配体(4-1BBL)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。
如本文所用，术语“效应子部分受体”指能够与效应子部分特异性结合的多肽分子。例如，在IL-2是效应子部分的情况下，与IL-2分子(例如，包含IL-2的免疫缀合物)结合的效应子部分受体是IL-2受体。在效应子部分与多于一种受体特异性结合的情况下，与效应子部分特异性结合的全部受体均是该效应子部分的“效应子部分受体”。
如本文所用，重链和轻链的全部恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号并且在本文中称作“根据(Kabat)编号”。具体而言，Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号体系(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL。具体而言，Kabat EU index编号体系(参见第661-723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链区，CH2和CH3，这在本文中通过提到“根据Kabat EU索引编号”来进一步澄清)。
必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(an)”包括复数称谓。因此，例如，对“某细胞”的提及包括复数个此类细胞及本领域技术人员已知的其等同物等。同样，术语“a”(或“an”)、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文互换使用。还应指出，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
本领域技术人员熟知将氨基酸序列(例如，多肽)转化成编码这种氨基酸序列的相应核酸序列的程序和方法。因此，核酸可以通过由核苷酸组成的核酸序列来表征并且同样地可以由其编码的多肽的氨基酸序列来表征。
术语“约”指后随数值的+/-20％范围。在一个实施方案中，术语“约”指后随数值的+/-10％范围。在一个实施方案中，术语“约”指后随数值的+/-5％范围。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
术语“抗体依赖的细胞毒性(ADCC)”是由Fc受体结合作用介导的功能并且指在效应细胞存在下，通过如本文中报道的抗体引起的对靶细胞的溶胞作用。在一个实施方案中，通过在效应细胞(如新鲜分离的PBMC(外周血单个核细胞)或从血沉棕黄层纯化的效应细胞如单核细胞或NK(天然杀伤)细胞)存在下，用如本文中报道的抗体处理表达CD19的红细胞样细胞的制备物(例如，表达重组人CD19的K562细胞)，测量ADCC。靶细胞用Cr-51标记并随后与抗体温育。标记的细胞与效应细胞温育并对上清液分析释放的Cr-51。对照包括靶内皮细胞与效应细胞在无抗体情况下的温育。通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞)或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA)的结合，研究抗体诱导介导ADCC的起始步骤的能力。在一个优选的实施方案中，测量与NK细胞上的FcγR的结合。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类别”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”指在补体存在下，如本文报告的抗体诱导的细胞溶胞作用。在一个实施方案中，通过在补体存在下，用如本文中报道的抗体处理表达CD19的人内皮细胞，测量CDC。在一个实施方案中，用钙黄绿素(calcein)标记细胞。如果抗体在30μg/ml浓度诱导20％或更多的靶细胞发生溶胞，则存在CDC。可以在ELISA中测量与补体因子C1q的结合。在这种测定法中，原则上用一系列浓度的抗体包被ELISA板，其中向所述平板添加纯化的人C1q或人血清。通过针对C1q的抗体，随后借助过氧化物酶-标记的缀合物，检测C1q结合作用。对于过氧化物酶底(2,2'-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯])，将结合作用的检测(最大结合Bmax)测量为405nm处光密度(OD405)。
“效应子功能”指随抗体类别变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
Fc受体结合作用依赖性效应子功能可以由抗体Fc区与作为造血细胞上特化细胞表面受体的Fc受体(FcRs)的相互作用介导。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已经证实其介导抗体包覆的病原体经由免疫复合物的吞噬作用而移除、以及被相应抗体包覆的红细胞和多种其他细胞靶(例如，肿瘤细胞)经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)而溶胞(参见，例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR依据其对免疫球蛋白同种型的特异性定义：IgG抗体的Fc受体称作FcγR。例如在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner,J.E.等人,Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述了Fc受体结合。
IgG抗体Fc区的受体(FcγR)交联可以触发多种类型的效应子功能，包括吞噬、抗体依赖的细胞毒性、和炎症介质的释放，以及免疫复合物清除和对抗体产生的调节。在人类中，已经表征三个类别的FcγR，它们是：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG并且表达在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上。IgG的Fc区中至少在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329之一处(根据Kabat的EU索引编号)的修饰可以减少与FcγRI的结合。位置233–236处的IgG2残基向IgG1和IgG4中置换，可以使FcγRI结合降低103倍并且消除人单核细胞对抗体致敏的红细胞的应答(Armour,K.L.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合型IgG并且广泛表达。这种受体可以分成二个亚型：FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于参与杀伤过程的许多细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上并且似乎能够激活杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制性过程中发挥作用并存在于B细胞、巨噬细胞上以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上。在B细胞上，它似乎发挥作用以抑制免疫球蛋白进一步产生及例如向IgE类别的同种型转换。在巨噬细胞上，FcγRIIB发挥作用以抑制FcγRIIA介导的吞噬。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，该B形式可以帮助抑制这些细胞通过IgE与其独立受体结合引起的活化。例如发现，包含至少在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414之一处(根据Kabat的EU索引编号)具有突变的IgG Fc区的抗体，对FcγRIIA的结合减少。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG并且作为二个类型存在。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和某些单核细胞及T细胞上并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上高度表达。例如发现，包含至少在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376之一处(根据Kabat的EU索引编号)具有突变的IgG Fc区的抗体，对FcγRIIIA的结合减少。
Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604中描述了将结合位点定位到针对Fc受体的人IgG1上、上文提到的突变位点、和用于测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
如本文所用的术语“Fc受体”指以存在与受体缔合的胞质ITAM序列为特征的激活作用受体(参见，例如Ravetch,J.V.和Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。这类受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。术语“不结合FcγR”指，在抗体浓度10μg/ml，如本文中报道的抗体与NK细胞的结合是，对如WO 2006/029879中所报道的抗OX40L抗体LC.001观察到的结合作用的10％或更小。
尽管IgG4显示FcR结合作用减少，但其他IgG亚类的抗体显示强力结合。但是Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(丢失Fc糖)、Pro329和234、235、236和237Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435是如若改变则也减少FcR结合作用的残基(Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307434)。
术语“Fc区”在本文中用来限定免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226、或从Pro230、或从Ala 231延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。
如本文报告的缀合物的抗体分子可以包含Fc区，在一个实施方案中衍生自人源的Fc区。在一个实施方案中，该Fc区包含人类恒定区的全部部分。抗体Fc区直接参与补体激活、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响依赖于某些条件，但与C1q结合由Fc区中确定的结合位点引起。这类结合位点是现有技术已知的，并且例如由Lukas,T.J.等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434描述。这类结合位点例如是L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)。IgG1、IgG2和IgG3亚类抗体通常显示激活补体、结合C1q和激活C3，而IgG4不激活补体系统、不结合C1q并且不激活C3。“抗体的Fc区”是技术人员熟知的术语并且基于木瓜蛋白酶对抗体的剪切而限定。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在一个实施方案中，Fc区属于包含突变S228P和/或L235E和/或P329G的人IgG4亚类(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，Fc区属于包含突变L234A和L235A及任选地P329G的人IgG1亚类(根据Kabat的EU索引编号)。
术语“野生型Fc区”指与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc区包含天然人IgG1Fc区(非A同种异型和A同种异型)，天然人IgG2Fc区、天然人IgG3Fc区和天然人IgG4Fc区及其天然存在的变体。在SEQ ID NO:26(IgG1，高加索人同种异型)、SEQ ID NO:27(IgG1，非洲裔美国人同种异型)、SEQ ID NO:28(IgG2)、SEQ ID NO:29(IgG3)和SEQ ID NO:30(IgG4)中显示了野生型Fc区。
变异(人)Fc区由所含的氨基酸突变定义。因此，例如，术语P329G指相对于亲本(野生型)Fc区在氨基酸位置329处具有脯氨酸至甘氨酸突变的变异Fc区(根据Kabat的EU索引编号)。可以不指定野生型氨基酸的身份，在这种情况下前述变体称作329G。
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构、或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“铰链区”指抗体重链多肽的部分，所述部分在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域，例如根据Kabat的EU编号体系从约位置216至约位置230，或根据Kabat的EU编号体系从约位置226至约位置230。可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基对齐，确定其他IgG亚类的铰链区。
铰链区正常情况下是由具有相同氨基酸序列的两条多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基并且是柔性的，允许相关的靶结合位点独立移动。铰链区可以再划分成三个结构域：上部、中部和下部铰链结构域(参见例如Roux等人，J.Immunol.161(1998)4083)。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个和一般两个可变结构域的基本上全部，其中这些HVR(例如，CDR)的全部或基本上全部与非人抗体的对应；并且FR的全部或基本上全部与人抗体的对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”，指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的下述每个区域，所述区域包含在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)、和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)的氨基酸残基段。通常，抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。
HVR包括
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人引文编号。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞内的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“轻链”指天然IgG抗体的较短多肽链。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生根据本发明待使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人,KubyImmunology，第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库而进行分离。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。
抗体和免疫缀合物的纯化
如本申请中使用的术语“亲和色谱”指利用“亲和色谱材料”的色谱方法。在亲和色谱中，取决于与色谱材料的色谱官能团形成静电相互作用、疏水键和/或氢键，将抗体基于其生物学活性或化学结构分离。为了从亲和色谱材料回收特异性结合的抗体，可以添加竞争性配体或可以改变色谱条件，如缓冲液的pH值、极性或离子强度。示例性“亲和色谱材料”是金属螯合色谱材料，如Ni(II)-NTA或Cu(II)-NTA，或抗体亲和色谱材料，如包含与其共价连接的蛋白A或蛋白G的色谱材料，或酶结合亲和力色谱材料，如包含与其共价结合的酶底物类似物、酶辅因子、或酶抑制剂作为色谱官能团的色谱材料，或结合凝集素的色谱材料，如包含与其共价连接的多糖、细胞表面受体、糖蛋白或完整细胞作为色谱官能团的色谱材料。
在一个实施方案中，抗体轻链亲和配体使用轻链恒定结构域特异性捕获试剂，所述试剂例如对κ或λ恒定轻链特异，这取决于κ或λ轻链是否含于该抗体中。这类轻链恒定结构域特异性捕获试剂的例子例如是KappaSelectTM和LambdaFabSelectTM(从GEHealthcare/BAC可获得)，其基于高度刚性的琼脂糖基-基质，所述基质允许大规模时的高流速和低回压。这些材料含有分别与κ轻链或λ轻链的恒定区结合的配体(缺少轻链恒定区的抗体或其片段将不结)。因此二者均能够结合含有轻链恒定区的其他靶分子，例如，IgG、IgA和IgM。配体借助亲水性长间隔臂与基质连接以使它们容易地可用于与靶分子结合。它们基于针对人Igκ或λ而筛选的单链抗体片段。
如本申请中使用的术语“施加至”和其语法等同物指纯化方法的部分步骤，其中使得含有目的物质的溶液与固定相接触。含有待纯化目的物质的溶液穿过固定相，在固定相和溶液中物质之间提供相互作用。取决于条件，例如，pH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，溶液的一些物质与固定相结合并且随之从溶液移除。其他物质留在溶液中。可以在穿流液中找到留在溶液中的物质。“穿流液”指在通过色谱装置后获得的溶液，其可以是含有目的物质的施加溶液、或用来冲洗柱或引起一种或多种与固定相结合的物质洗脱的缓冲液。目的物质可以在纯化步骤后，通过本领域技术人员熟悉的方法(例如，沉淀、盐析、超滤、渗滤、冻干、亲和色谱或溶剂体积缩减法)从溶液回收，以获得形式基本上同质的物质。
可以通过重组手段产生抗体或抗体片段或免疫缀合物。用于重组生产的方法是本领域广泛已知的，并且包括在真核细胞中表达蛋白质，以及后续分离抗体或抗体片段或免疫缀合物和纯化至可药用的纯度。为了表达抗体或抗体片段或免疫缀合物，可以使用杂交瘤细胞或其中已经引入一种或多种编码抗体或抗体片段的核酸的真核细胞。在一个实施方案中，真核细胞选自CHO细胞(例如，CHO K1、CHO DG44)、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、BHK细胞、兔细胞或羊细胞。在另一个实施方案中，真核细胞选自CHO细胞、HEK细胞、或兔细胞。在表达后，从细胞(从上清液或从溶胞后的细胞)回收抗体或抗体片段或免疫缀合物。用于重组产生抗体的一般方法是现有技术中熟知的并且例如在以下综述文章中报道：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
可以通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl区带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳)和本领域熟知的其他技术进行抗体纯化，目的在于消除其它细胞组分或其他杂质(例如，其他细胞核酸或蛋白质)(参见例如Ausubel,F.M等人(编著),Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(2005))。充分建立了不同的方法并且它们广泛用于蛋白质纯化，如使用微生物蛋白的亲和色谱(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱)、离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附作用(例如采用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附色谱(例如采用苯基-琼脂糖凝胶、亲氮杂-芳烃树脂(aza-arenophilic resin)或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和色谱(例如采用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻色谱和电泳法(如凝胶电泳法、毛细管电泳法)，以及其组合，如采用微生物蛋白的亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱(参见，例如，Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。本领域技术人员已知一般色谱方法及其用途。参见例如，Heftmann,E.(编著),Chromatography,第5版,第A部分:Fundamentals and Techniques,Elsevier SciencePublishing Company,New York(1992)；Deyl,Z.(编著),Advanced Chromatographic andElectromigration Methods in Biosciences,Elsevier Science BV,Amsterdam,TheNetherlands(1998)；Poole,C.F.,and Poole,S.K.,Chromatography Today,ElsevierScience Publishing Company,New York(1991)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(1982)；Sambrook,J.等人,(编著),Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989)；或Ausubel,F.M.等人,(编著),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(2005)。
为了纯化例如已经通过细胞培养方法产生的抗体或抗体片段或免疫缀合物，通常可以使用不同色谱步骤的组合。通常，(蛋白A)亲和色谱后是一个或两个附加的分离步骤。在一个实施方案中，附加的色谱步骤是阳离子和阴离子交换色谱步骤或反之亦然。最终的纯化步骤是所谓“精制步骤”以移除痕量杂质和污染物，如聚集的免疫球蛋白、残余HCP(宿主细胞蛋白)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒或内毒素。
可以理解，通过如本文中报道的方法产生的分子/免疫缀合物和包含分子/免疫缀合物的组合物可以接受后续处理，如纯化、过滤等，导致进一步改善品质及减少产物相关和工艺相关杂质。
细胞的培养
如本文所用的“生物量”指培养基中培养的细胞的量或重量。可以通过测定活细胞密度、总细胞密度、细胞-时间积分(对于活细胞密度和总细胞密度)、细胞体积-时间积分(对于活细胞密度和总细胞密度)、细胞压积(Packed cell volume)、干重或湿重，直接或间接地测量生物量。
如本文所用的“生物反应器”指任何用于培养哺乳动物细胞培养物的容器。生物反应器的容积可以大幅度变动，从仅几毫升至12,000升或更大。生物反应器的内部条件包括但不限于pH、溶解氧和温度，一般在培养期间受到控制。生物反应器可以由适于容纳在本发明培养条件下悬浮于培养基中的哺乳动物细胞培养物的任何材料组成，所述材料包括玻璃、塑料或金属。
术语“细胞系”、“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可以互换使用，并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和由其衍生的子代，而无论传代次数是多少。子代可以在核酸内容方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性。术语“细胞”包括用于表达核酸的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞(例如，CHO K1、CHO DG44)、或BHK细胞、或NS0细胞、或SP2/0细胞、或HEK 293细胞、或HEK293EBNA细胞、或细胞或COS细胞。在另一个实施方案中，细胞是CHO细胞、或BHK细胞、或细胞。如本文所用，表述“细胞”包括主题细胞及其后代。
如本文所用的“细胞密度”指给定培养基体积中存在的细胞的数目。
如本文所用的“接种细胞密度”或“接种密度”指培养过程伊始时存在的细胞密度。
如本文所用的“细胞活力”指，培养细胞在给定的一组培养条件或实验变量下存活的能力。如本文所用，该术语还指，在特定时间存活的细胞与在该时间培养物中(活或死)总细胞数相关的比率。
如本文所用的“培养物”或“细胞培养物”指在适于细胞群体存活和/或生长的条件下悬浮于培养基中的细胞群体。这些术语也将适用于培养基和悬浮于其中的细胞群体的组合。
“培养”细胞指使细胞与细胞培养基在适于细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下接触。
“培养条件”、“生长条件”和“发酵条件”在本文中可互换地使用，并且是必须满足以实现成功细胞培养的那些条件。一般，这些条件包括：提供适宜的培养基；提供控制，例如控制温度，所述温度应当是约37℃，但也可以包括培养期间的温度变动(例如，37℃至29℃)，和控制pH，其一般在6.8和7.2之间；以及提供氧和二氧化碳。这类条件还包括培养细胞的方式，例如，摇床或机器人培养。
术语“培养基”和“细胞培养基”指用于生长或维持细胞的养分源。如本领域技术人员理解，养分源可以含有为细胞生长和/或存活和/或产物生成所需要的组分，或可以含有辅助细胞生长和/或存活和/或产物生成的组分。维生素、必需或非必需氨基酸、微量元素和表面活性剂(例如，泊洛沙姆)是培养基组分的例子。一般，这类含有养分的溶液提供为细胞最低生长和/或存活所要求的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。这种溶液还可以含有增强生长和/或存活使之高于最小程度的补充性组分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子，如钠、氯、钙、镁和磷酸根、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能量源。培养基有利地配制成对细胞存活和增殖为最佳的pH和盐浓度。培养基可以是血清减少的或无血清的培养基，即分别地，其中培养基含有约1-5％血清或此时培养基基本上不含任何哺乳动物血清(例如，胎牛血清)。“基本上不含”意指，培养基包含0-5％之间的血清、优选地约0-1％之间的血清和最优选地约0-0.1％血清。可以使用无血清确定成分培养基，其中已知培养基的每种组分的身份和浓度。培养基可以是无蛋白质的培养基，即这种培养基将不含蛋白质，但是可以含有不确知的肽，例如，来自植物水解物的肽。培养基可以包含人血清白蛋白和人转铁蛋白、但是潜在动物源性的胰岛素和脂质，或含有人血清白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素和化学成分确知脂质的无外源物质培养基(xeno-free medium)。备选地，培养基可以是化学成分确知培养基，即，其中全部物质均确定并按确定的浓度存在的培养基。这些培养基可以仅含有重组蛋白和/或激素，或无蛋白质的化学成分确知培养基，即仅含有低分子量组分和(如果需要)合成性肽/激素。化学成分确知培养基也可以完全不含任何蛋白质。在一个实施方案中，培养基是无血清培养基。在一个实施方案中，培养基是无蛋白质的培养基。在一个实施方案中，培养基是化学成分确知培养基。在一个实施方案中，培养基是无蛋白质的化学成分确知培养基。
例如，“化学成分确知的细胞培养基”或“CDM”指，具有确定组成的、不含动物衍生产物，如动物血清和蛋白胨的培养基。本术语也涵盖，这样的具有确定组成的培养基，其不含不确知的或部分确知的组分，例如，诸如动物血清、动物蛋白胨(水解物)、植物蛋白胨(水解物)和酵母蛋白胨(水解物)的组分。如本领域技术人员将理解，CDM可以用于多肽生产过程中，由此细胞与CDM接触并将多肽分泌至其中。因此，可以理解，组合物可以含有CDM和多肽产物，并且多肽产物的存在不使得CDM在化学上不确知。
“化学成分不确知的细胞培养基”指化学组成不能被确定的培养基，其可以含有一种或多种动物衍生产物，如血清和蛋白胨。如本领域技术人员将理解，化学不确知的细胞培养基可以含有动物衍生产物作为养分源。本术语还可以涵盖细胞培养基，其包含不确知的或部分确知的组分，例如，诸如动物血清、动物蛋白胨(水解物)、植物蛋白胨(水解物)或酵母蛋白胨(水解物)的组分。
如本文所用，“基础培养基”或“基本培养基”指这样的细胞培养基，其含有在培养过程伊始时供应给培养容器的细胞培养用养分。基础培养基可以是在细胞培养周期之前细胞接种入其中的培养基。可以在细胞培养周期之前供应基础细胞培养基用于分批或补料分批细胞培养。基础细胞培养基也可以在培养过程期间作为补料培养基连续或按离散增量供应给细胞培养物，同时培养终止之前定期收获或不收获细胞或产物(即，补料分批细胞培养)。
如本文所用，“补料培养基”指含有细胞培养用养分的细胞培养基，其在培养过程期间作为补料连续或按离散增量供应给培养容器，且培养终止之前定期收获或不收获细胞和/或产物(即，补料分批细胞培养)。
如本文所用的“分批培养”指一种细胞培养的方法，其中培养过程开始后，不向培养物一次性或多次提供额外组分，即用于细胞培养的全部组分(包括细胞和全部培养用养分和组分)在培养过程伊始就供应给培养容器。
如本文所用的“补料分批培养”指一种细胞培养的方法，其中培养过程开始后，向培养物一次或多次提供额外组分。因此，它是一种分批培养，其中细胞和培养基在开始时供应给培养容器，并且额外的培养用养分在培养期间被加入培养物中，且在终止培养之前存在或不存在细胞和/或产物的定期收获。如果加料是连续的，则该过程称作“连续补料分批法”，或如果加料按离散的增量进行，则该过程称作“批式补料分批法”(fed batch bolus)。可以使用不同设置或算法，通过附加“替代”标志物(例如，细胞数目、特定代谢产物或底物、在线分析信号)引导该过程。一般在某个时点停止补料分批培养并且收获培养基中的细胞和/或组分并任选地纯化。
如本文所用的术语“滴度”指细胞培养物产生的已表达蛋白质产物的总量除以给定的培养基体积量。滴度可以以相对量度来表述或评估，如与不同培养条件下获得的蛋白质产物相比，滴度增加的百分数。
如本文中报道的方法
本文中报道了通过特定方式培养包含编码免疫缀合物的核酸的细胞，生产免疫缀合物的方法。
本发明人已经发现，可以产生产物相关杂质以及工艺相关杂质水平降低的目的免疫缀合物。
已经研究和比较了不同的示例性培养工艺。
更详细地，已经发现,如果在培养期间变动温度和pH值，可以在培养/发酵期间及其结束时降低某些杂质的水平。具体而言，降低温度并增加pH值。可以减少的杂质为，例如工艺相关杂质如宿主细胞蛋白(例如，磷脂酶B样2或凝聚素)、或产物相关杂质，例如，聚集物或免疫缀合物的片段。例如，如果免疫缀合物包含白介素如IL-2作为效应子部分，则IL-2易遭受剪切作用并且免疫缀合物的片段因此积累。较高水平的杂质可以例如导致产物受污染和/或繁琐和复杂的杂质移除工作。培养条件变动不导致其他严重缺点。可以显示，培养条件的变化导致相当水平的活细胞密度和细胞活力。
因此，如本文中报告的一个方面是一种通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的哺乳动物细胞、产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的免疫缀合物的方法，其中该一个或多个核酸在细胞培养的条件下表达，所述方法包括步骤：
-在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；
-降低细胞培养基的第一温度至第二温度；并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；
-从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，
并且由此产生免疫缀合物。
如果需要，产生的免疫缀合物可以由标准纯化方法进一步纯化。
在一个实施方案中，该方法还包括用一个或多个纯化步骤纯化免疫缀合物。
在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在13至14天的总培养时间的2至9天后(进行)。在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在13至14天的总培养时间的7至9天后(进行)。在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在约培养时间一半后(进行)(即，在从生长期过渡至生产期时进行转变)。在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在13至14天的总培养时间的约8天后(进行)。
在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是同时(进行)。在一个实施方案中，降低至第二温度和升高至第二pH是在约6小时的时间期间的不同时间点(进行)。在一个实施方案中，首先进行降低至第二温度并且随后进行升高至第二pH。
已经发现，如果降低温度至某个温度范围，则杂质减少的效应是明显的。这不导致例如产物滴度显著降低。相反，产物净滴度保持在可比水平。
在一个实施方案中，第一温度是37℃+/-0.5℃并且第二温度处于28℃至34℃范围内(即第一温度降低3℃至9℃)。在一个实施方案中，第一温度是37℃+/-0.5℃并且第二温度处于33℃至34℃范围内(即降低3℃至4℃)。在一个实施方案中，第一温度是37℃+/-0.5℃并且第二温度处于29℃至30℃范围内(即降低7℃至8℃)。在一个实施方案中，第一温度是37℃+/-0.5℃并且降低至约34℃+/-0.5℃的第二温度。在一个实施方案中，第一温度是37℃+/-0.5℃并且降低至约29℃+/-0.5℃的第二温度。
已经发现，除降低温度之外，为了最佳结果，还可以增加pH值至某些值。
在一个实施方案中，第二pH是7.25或更高。在一个实施方案中，第一pH是pH 7+/-0.05pH单位并且第一pH升高0.25至0.4pH单位至第二pH。在一个实施方案中，第一pH是7+/-0.05pH单位并且升高0.3pH单位至第二pH。在一个实施方案中，第一pH是7+/-0.05pH单位并且升高至约7.3+/-0.05pH单位的第二pH。在一个实施方案中，第一pH是pH 7+/-0.1pH单位并且第一pH升高0.25至0.4pH单位至第二pH。在一个实施方案中，第一pH是7+/-0.1pH单位并且升高0.3pH单位至第二pH。在一个实施方案中，第一pH是7+/-0.1pH单位并且升高至约7.3+/-0.1pH单位的第二pH。
另外，调整细胞接种密度可以进一步改进所需的低杂质水平结果，同时维持产物滴度。
在一个实施方案中，接种细胞密度是从约600000(6x 105)至约1000000(1x 106)个细胞/ml。在一个实施方案中，接种细胞密度是约600000(6x 105)或约1000000(1x 106)个细胞/ml。在一个实施方案中，接种细胞密度是约650000(6.5x 105)。在一个实施方案中，接种细胞密度是约900000(9x 105)。在一个实施方案中，与温度和pH不变动情况下的培养相比，接种细胞密度增加2至4倍、优选地约3倍。
在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是300mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg或更大。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是350mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg或更大。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是400mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg或更大。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是从约250mOsmol/kg至约800mOsmol/kg。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是从约300mOsmol/kg至约600mOsmol/kg。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是约400mOsmol/kg。在一个实施方案中，细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是从350mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg至800mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含IL-2或其变体(即免疫缀合物是基于IL-2的免疫缀合物)。在一个实施方案中，免疫缀合物是有靶向作用的免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物、靶向FAP的IL-2免疫缀合物或IgG-IL-2免疫缀合物或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物或IgG-IL-2免疫缀合物或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:03的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:04至SEQ ID NO:06的氨基酸序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向FAP的IL-2免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向FAP的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08和SEQID NO:03.的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向FAP的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:09至SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物是IgG-IL-2免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物是IgG-IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物是IgG-IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一个实施方案中，免疫缀合物是靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物(如WO 2016/075278中所述)。
在一个实施方案中，产物相关杂质和工艺相关杂质选自宿主细胞蛋白、凝聚素、PLBL2、聚集物或免疫缀合物的片段。
在一个实施方案中，产品相关杂质选自聚集物或免疫缀合物的片段。在一个实施方案中，产物相关杂质是免疫缀合物的片段。在一个实施方案中，产物相关杂质是碎片化IL-2。
在一个实施方案中，工艺相关杂质选自宿主细胞蛋白、凝聚素或PLBL2。
如本文中报告的一个方面是采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物。
在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物、靶向FAP的IL-2免疫缀合物或IgG-IL-2免疫缀合物或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。
在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物。在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:03的氨基酸序列。在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:04至SEQ ID NO:06的氨基酸序列。
在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向FAP的IL-2免疫缀合物。在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向FAP的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:03氨基酸序列。在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向FAP的IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:09至SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是IgG-IL-2免疫缀合物。在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是IgG-IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是IgG-IL-2免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一个实施方案中，采用如本文中报道的方法可获得的免疫缀合物是靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物(如WO 2016/075278中所述)。
本发明也提供包含杂质水平降低的免疫缀合物的组合物。例如，组合物仅包含低水平的碎片化IL-2，即仅具有遗传上预期的完整蛋白质序列的一部分的分子。这类具有碎片化效应子部分/IL-2的分子可以例如作为含有较低分子量的IL-2的重链而检测到。
如本文中报告的一个方面是一种组合物，其包含免疫缀合物和水平降低的碎片/碎片化效应子部分(例如，IL-2)、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是一种组合物，其包含靶向CEA的IL-2免疫缀合物和水平降低的碎片化IL-2、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是靶向FAP的IL-2免疫缀合物和水平降低的碎片化IL-2、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是IgG-IL-2免疫缀合物和水平降低的碎片化IL-2、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物和水平降低的碎片化4-1-BBL、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是一种组合物，其包含通过根据权利要求1的方法可获得的靶向CEA的IL-2免疫缀合物和水平降低的碎片化IL-2、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是一种组合物，其包含通过根据权利要求1的方法可获得的靶向FAP的IL-2免疫缀合物和水平降低的碎片化IL-2、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是一种组合物，其包含通过根据权利要求1的方法可获得的IgG-IL-2免疫缀合物和水平降低的碎片化IL-2、聚集物和宿主细胞蛋白。
如本文中报告的一个方面是一种组合物，其包含通过根据权利要求1的方法可获得的靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物和水平降低的碎片化4-1-BBL、聚集物和宿主细胞蛋白。
在一个实施方案中，碎片化IL-2的(相对)量是10％或更小。在一个实施方案中，碎片化IL-2的(相对)量是9％或更小。在一个实施方案中，碎片化IL-2的(相对)量是8％或更小。在一个实施方案中，碎片化IL-2的(相对)量是7％或更小。在一个实施方案中，碎片化IL-2的(相对)量是6％或更小。在一个实施方案中，碎片化IL-2的(相对)量是5％或更小。在一个实施方案中，碎片化IL-2的(相对)量是4％或更小。
在一个实施方案中，聚集物的(相对)量是5％或更小。在一个实施方案中，聚集物的(相对)量是4％或更小。在一个实施方案中，聚集物的(相对)量是3％或更小。在一个实施方案中，聚集物的(相对)量是2％或更小。在一个实施方案中，聚集物的(相对)量是1％或更小。
在一个实施方案中，凝聚素的(相对)量是30000ng/ml或更小。在一个实施方案中，凝聚素的(相对)量是25000ng/ml或更小。在一个实施方案中，凝聚素的(相对)量是20000ng/ml或更小。在一个实施方案中，凝聚素的(相对)量是15000ng/ml或更小。
在一个实施方案中，凝聚素/产物滴度的比率是15ng/μg或更小。在一个实施方案中，凝聚素/产物滴度的比率是13ng/μg或更小。在一个实施方案中，凝聚素/产物滴度的比率是10ng/μg或更小。
在一个实施方案中，PLBL2的(相对)量是2000ng/ml或更小。在一个实施方案中，PLBL2的(相对)量是1500ng/ml或更小。在一个实施方案中，PLBL2的(相对)量是1200ng/ml或更小。在一个实施方案中，PLBL2的(相对)量是1000ng/ml或更小。
在一个实施方案中，PLBL2/产物滴度的比率是1.5ng/μg或更小。在一个实施方案中，PLBL2/产物滴度的比率是1.2ng/μg或更小。在一个实施方案中，PLBL2/产物滴度的比率是1ng/μg或更小。
在一个实施方案中总宿主细胞蛋白的(相对)量在500000和2500000ng/ml之间。
在一个实施方案中，总宿主细胞蛋白/产物滴度的比率是1200ng/μg或更小。在一个实施方案中，总宿主细胞蛋白/产物滴度的比率是1000ng/μg或更小。在一个实施方案中，总宿主细胞蛋白/产物滴度的比率是800ng/μg或更小。
在一个实施方案中，细胞培养是大规模细胞培养。在一个实施方案中，细胞培养具有约100升至约15000升的体积。在一个实施方案中，细胞培养具有约1000升至约15000升的体积。
在一个实施方案中，细胞培养是分批细胞培养。
在一个实施方案中，细胞培养是补料分批细胞培养。
在一个实施方案中，细胞培养是采用批式补料(bolus feeding)的补料分批细胞培养。
在一个实施方案中，细胞培养是采用连续补料的补料分批细胞培养。
在一个实施方案中，培养基是无血清培养基。在一个实施方案中，培养基是无蛋白质的培养基。在一个实施方案中，培养基是化学成分确知培养基。在一个实施方案中，培养基是无蛋白质的化学成分确知培养基。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO K1细胞。
如本文中报告的一个方面是一种通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的CHO细胞、产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的靶向CEA的IL-2免疫缀合物、或靶向FAP的IL-2免疫缀合物或IgG-IL-2免疫缀合物或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物的方法，其中该一个或多个核酸在细胞培养条件下表达，所述方法包括步骤：
-在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；
-降低细胞培养基的第一温度至第二温度；并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；
-从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，
并且由此产生免疫缀合物。
如本文中报告的一个方面是一种通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的CHO细胞、产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的IL-2免疫缀合物的方法，其中该一个或多个核酸在细胞培养条件下表达，所述方法包括步骤：
-在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；
-降低细胞培养基的第一温度至第二温度；并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；
-从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，
并且由此产生免疫缀合物。
如本文中报告的一个方面是一种通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的CHO细胞，产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的靶向CEA的IL-2免疫缀合物或IgG-IL-2免疫缀合物的方法，其中该一个或多个核酸在细胞培养条件下表达，所述方法包括步骤：
-在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；
-降低细胞培养基的第一温度至第二温度；并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；
-从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，
并且由此产生免疫缀合物。
如本文中报告的一个方面是一种通过在细胞培养基中培养一个或多个含有编码目的免疫缀合物的核酸的哺乳动物细胞，产生(免疫缀合物)碎片水平(和/)或聚集物水平降低的靶向CEA的IL-2免疫缀合物或IgG-IL-2免疫缀合物的方法，其中该一个或多个核酸在细胞培养条件下表达，所述方法包括步骤：
-在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；
-降低细胞培养基的第一温度至第二温度；并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；
-从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，
并且由此产生免疫缀合物。
提供以下实施例、附图和序列以辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解，可以对本发明方法作出修改而不脱离本发明的精神。
附图简述
图1：测试的不同工艺变型。对工艺1(参比/标准工艺)、工艺2和工艺3，显示细胞接种密度、pH变动、温度变动和工艺时长的不同关键参数。
图2：工艺变型2和3降低表达cM1的克隆在收获时上清液的凝聚素浓度。对三个补料分批工艺的无细胞样品，分析了(A)凝聚素、(B)净滴度和(C)凝聚素/净滴度的比率，其中工艺使用表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM1＝CEA-IL-2免疫缀合物)的重组CHO细胞系在2L玻璃生物反应器中持续13天(工艺2)和14天(工艺3)。箱须代表相应的标准差(n＝3)
图3a：工艺变型2和3降低表达cM2的两个克隆在收获时上清液的凝聚素浓度。对补料分批工艺的无细胞样品,分析了(A)凝聚素、(B)滴度和(C)凝聚素/滴度的比率，其中工艺使用两个表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM2＝IgG-IL-2免疫缀合物)的重组CHO细胞系(克隆1和克隆2)在2L玻璃生物反应器中持续13天(工艺2)和14天(工艺3)。
图3b：工艺变型2和3降低表达cM2的两个克隆在收获时上清液的CHO宿主细胞蛋白(HCP)浓度。对补料分批工艺的无细胞样品，分析了(A)CHO宿主细胞蛋白和(B)CHO HCP/滴度的比率，其中工艺使用两个表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM2＝IgG-IL2免疫缀合物)的重组CHO细胞系(克隆1和克隆2)在2L玻璃生物反应器中持续13天(工艺2)和14天(工艺3)。
图3c：工艺变型2和3降低表达cM2的两个克隆在收获时上清液的PLBL2浓度。对补料分批工艺的无细胞样品，分析了(A)PLBL2和(B)PLBL2/滴度的比率，其中工艺使用两个表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM2＝IgG-IL2免疫缀合物)的重组CHO细胞系(克隆1和克隆2)在2L玻璃生物反应器中持续13天(工艺2)和14天(工艺3)。
图4:工艺变型3减少在生产规模/大规模下收获时上清液的凝聚素浓度。对250L一次性使用生物反应器中13天(工艺2)和14天(工艺3)补料分批工艺的无细胞样品，分析了凝聚素，其中所述工艺使用表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM2＝IgG-IL-2免疫缀合物)的重组CHO细胞系。
图5：工艺3减少cM2碎片和聚集物。对表达cM2的克隆1和克隆2，显示(A)片段：重链片段+非糖基化重链(通过CE-SDS测量)，和(B)聚集物(HMW种类)(通过SEC测量)。全部实验均在2L玻璃生物反应器中进行。
图6：通过工艺pH调节上清液的凝聚素水平。对2L玻璃生物反应器中第8天pH变动至6.8、7.0、7.2或7.4的14天补料分批工艺(工艺1)的无细胞样品，分析了凝聚素，其中所述工艺使用二个表达复合IgG融合蛋白(cM3＝FAP-4-1-BBL免疫缀合物)的重组CHO细胞系克隆6和克隆7。
图7：通过工艺温度调节上清液的凝聚素水平。对摇瓶中第8天温度变动至33℃或无温度变动(37℃)的14天补料分批工艺(工艺1)的无细胞样品，分析了(A)凝聚素和(B)产物滴度，其中所述工艺使用二个表达复合IgG融合蛋白(cM3＝FAP-4-1-BBL免疫缀合物)的重组CHO细胞系，克隆6和克隆7。箱须代表相应的标准差。
图8：通过工艺重量摩尔渗透压浓度调节上清液的凝聚素水平。对摇瓶中基础培养基重量摩尔渗透压浓度不同(300和400mOsmol/kg)的14天补料分批工艺(工艺1)的无细胞样品，分析了(A)凝聚素、(B)产物滴度和(C)凝聚素/滴度的比率，其中所述工艺使用表达复合IgG融合蛋白(cM3＝FAP-4-1-BBL免疫缀合物)的重组CHO细胞系克隆6。箱须代表相应的标准差。
图9：cM1(＝CEA-IL-2免疫缀合物)片段和聚集物减少。对表达cM1的克隆，显示(A)片段：重链片段+非糖基化重链(通过CE-SDS测量)，和(B)聚集物(HMW种类)(通过SEC测量)。全部实验均在2L玻璃生物反应器中进行。
图10：工艺1、2和3的净滴度。通过从总产物滴度扣减碎片化产物的量，确定不同工艺的净滴度。全部工艺均显示可比的净滴度水平。
图11：显示活细胞密度(A)和细胞活力(B)。对补料分批工艺，分析了(A)活细胞密度和(B)细胞活力，其中所述工艺使用两个表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM2＝IgG-IL2免疫缀合物)的重组CHO细胞系(克隆1，圆形标记，和克隆2，正方形标记)在2L玻璃生物反应器中持续13天(工艺2，灰色标记和线条)和14天(工艺3，黑色标记和线条)。
图12：显示活细胞密度(A)和细胞活力(B)。对补料分批工艺(n＝3)，分析了(A)活细胞密度和(B)细胞活力，其中所述工艺使用表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM1＝CEA-IL-2免疫缀合物)的一个重组CHO细胞系在2L玻璃生物反应器中持续14天(工艺变型1，黑色；工艺变型2，浅灰色；工艺变型3，深灰色)。全部工艺均显示可比的细胞活力和活细胞密度。
序列表说明
SEQ ID NO:01包含于靶向CEA的IL-2免疫缀合物中的抗CEA IgG的重链可变结构域VH
SEQ ID NO:02包含于靶向CEA的IL-2免疫缀合物中的抗CEA IgG的轻链可变结构域VL
SEQ ID NO:03包含于靶向CEA的IL-2免疫缀合物和靶向FAP的IL-2免疫缀合物中的白介素2变体(IL-2)
SEQ ID NO:04包含于靶向CEA的IL-2免疫缀合物中的完整重链(结,knob)连同IL-2
SEQ ID NO:05包含于靶向CEA的IL-2免疫缀合物中的完整重链(扣,hole)
SEQ ID NO:06包含于靶向CEA的IL-2免疫缀合物中的完整轻链
SEQ ID NO:07包含于靶向FAP的IL-2免疫缀合物中的抗FAP IgG的重链可变结构域VH
SEQ ID NO:08包含于靶向FAP的IL-2免疫缀合物中的抗FAP IgG的轻链可变结构域VL
SEQ ID NO:09包含于靶向FAP的IL-2免疫缀合物中的完整重链(结)连同IL-2
SEQ ID NO:10包含于靶向FAP的IL-2免疫缀合物中的完整重链(扣)
SEQ ID NO:11包含于靶向FAP的IL-2免疫缀合物中的完整轻链
SEQ ID NO:12包含于IgG-IL-2免疫缀合物中的无靶向作用的IgG的重链可变结构域VH
SEQ ID NO:13包含于IgG-IL-2免疫缀合物中的无靶向作用的IgG的轻链可变结构域VL
SEQ ID NO:14包含于IgG-IL-2免疫缀合物中的白介素2变体(IL-2)
SEQ ID NO:15包含于IgG-IL-2免疫缀合物中的完整重链连同IL-2
SEQ ID NO:16包含于IgG-IL-2免疫缀合物中的完整轻链
实施例1
一般方法和材料
细胞系
在本研究中，使用转染的CHO(中国仓鼠卵巢)K1细胞系。
免疫缀合物
使用以下的多个示例性免疫缀合物，举例说明本发明，例如，WO 2012/146628中或SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:06中描述的靶向CEA的IL-2免疫缀合物(与IL-2缀合的抗CEA抗体)；或WO 2012/107417中或SEQ ID NO:07至SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:03中描述的靶向FAP的IL-2免疫缀合物；或WO 2015/118016中或SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:16中描述的无靶向作用的IgG-IL-2免疫缀合物；或WO 2016/075278中描述的靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。
细胞培养方法
制备细胞培养所需要的培养基和补料，并且根据供应商(Gibco/LifeTechnologies Inc.)的操作说明调节参数pH值、葡萄糖浓度和重量摩尔渗透压浓度。培养基和补料储存在4℃黑暗下并且分别在四周(预培养培养基、发酵培养基)、三周(补料1)和两周(补料2)内耗尽。纠正剂在室温贮存并且在3个月(葡萄糖溶液；50％)、6个月(碳酸钠溶液；1M)和12个月(消泡剂溶液；Dow消泡C乳液，食品级，10％)内用尽。
以下部分中描述的方法适应性修改自标准方案(Lindl,T.Zell-undGewebekultur:Einführung in die Grundlagen sowieMethoden undAnwendungen.Heidelberg/Berlin,Spektrum Akademischer Verlage GmbH2002)和相应供应商的操作说明书。
预培养
将细胞解冻和在摇瓶的预培养培养基中预培养2至3周。温育参数是：温度37℃，湿度80％，CO2 7％，摇动频率210转/分钟，振幅5cm。将细胞每三至四天传代并且在预培养基中选择压力(甲氨蝶呤)下扩增至接种所需的体积。
标准细胞培养过程(工艺1)
在采用补料1、补料2和葡萄糖的14天补料分批工艺中培养细胞，细胞起始密度为3.5·x 10E5个细胞/ml。补料在发酵第三天和第六天开始，并且在剩余天数的发酵期间，按照基于初始体积的2％(v/v)的比率，连续添加。如果不另外说明，用CO2和1M Na2CO3调节pH值在0.05pH单位的死区(dead band)中。酌情添加消泡溶液和抗生素。在工艺期间，监测并控制参数,温度、pH值和pO2。在14天后停止发酵工艺。收获培养液并无菌过滤。拆卸生物反应器并清洁。
对于采用的工艺(工艺2和3)，参见下文。
Quad系统中的发酵设置
用钢盖封闭2L双层壁玻璃生物反应器，其中集成了内置组件如搅拌器、探头、进料口等。四个容器用一个DCU3/4(Sartorius Stedim Biotech AG)控制系统控制并且因此称作Quad系统。
装配生物反应器并灌装KH2PO4溶液(1.4g/l)。校准pH探头并与pO2探头一起集成入生物反应器。随后，测试系统的压力密闭性。对生物反应器进行高压灭菌(湿式程序：121℃和高于常压1.2巴持续30分钟)并将其连接至补给塔(分别是DCU3和4)。在接种前当日，将KH2PO4替换为900ml发酵培养基。此外，校准pH探头，将碱瓶和葡萄糖瓶与生物反应器连接，并且启动控制(搅拌器、用于pO2校准的通气、温度和压力)。在接种之前，再次校准pH探头，校准pO2探头并将参数设定成发酵条件(温度37℃，pO2 35％，pH 7，压力100毫巴)。按以下级联调节pO2的反馈控制系统：N2/空气、空气/O2和搅拌器。
细胞生长测量
在培养过程期间用台盼蓝染色法，通过Cedex HiRes(Roche Diagnostics GmbH)装置，评估活细胞密度和细胞活力。
蛋白A纯化
根据供应商的方案实施纯化和CE。通常，将含有蛋白质的冷冻样品在4℃小心解冻并尽可能保存在冰上。避免冻融循环。将发酵样品离心(4000x g，10–30分钟，取决于体积)，立即纯化和/或分析或在液氮中急冻(shock frozen)并储存在80℃。
亲和色谱用于纯化抗体。使用PureSpeed吸头(Mettler Toledo)进行小体积(150μl–3ml)的蛋白A纯化。
对较大体积(2L–3L)，将蛋白A MabSelectSure柱平衡。随后，加载发酵上清液用于捕获步骤。洗脱蛋白质之前洗涤该柱。最后，用中和缓冲液调节洗脱物pH至5.0。
毛细管电泳法(CE-SDS)
根据生产商的说明，用Agilent Bioanalyzer 2100或PerkinElmer LabChip GX和相应的蛋白质试剂盒进行芯片上CE。
用还原型CE分析碎片化。标准CE图显示不同的标记物峰和三个产物峰：轻链峰在大约28kDa的大小处可见，重链扣(HC扣，HC1)峰在约58kDa可见并且重链结(HC结，HC2)连同所连接IL-2分子的峰在大约74kDa处可见。当IL-2部分的碎片化发生时，在HC1峰和HC2峰之间可见附加峰。
产物净滴度
用Bioprofile 100Plus测量产物滴度。但是，该装置不能区分碎片化和非碎片化的抗体。出于这个原因，如下文所示，计算扣减碎片的净滴度。
Tnet＝(1-F)·T
其中：Tnet＝产物净滴度(扣减碎片)[mg/l]
T＝总滴度[mg/l]
F＝碎片[％]
实施例2
调节pH和温度影响CHO补料分批工艺中的凝聚素水平(用cM1/cM2举例说明)
为了阐明pH和温度对CHO补料分批工艺中上清液凝聚素水平的影响，一式三份比较三个工艺变型：工艺1、工艺2和工艺3。
表：使用的受试工艺参数
工艺2和工艺3不同于工艺1之处在于：细胞接种密度升高；对于两种变型，在第8天有额外温度变动；对于工艺2，在第13天收获；对于工艺3，有额外的pH变动(图1)。在给定的设置中，稳定表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM1＝CEA-IL-2免疫缀合物)的克隆用于2L玻璃生物反应器中的补料分批工艺。工艺2和工艺3均显示，与基线工艺变型1相比时，收获时上清液凝聚素水平降低(图2A)。依据产物净滴度计算，工艺2和工艺3达到与参比工艺1相同的生产率(图2B)。由此，上清液凝聚素浓度/产物浓度的比率，与单独上清液凝聚素水平，具有相同的趋势：工艺变型2和3引起凝聚素“载量”相对于产生的分子而减少(图2C)。
评估活细胞密度和细胞活力并且发现对于全部三个工艺，它们相当(图11和图12)。
为了分析在CHO补料分批工艺中调节pH和温度对凝聚素水平的一般影响，将两个稳定表达另一种复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM2＝IgG-IL-2免疫缀合物)的克隆(克隆1和克隆2)和工艺变型2与3，用于2L生物反应器试验中。如先前所观测，工艺变型3也显示对于克隆1和克隆2，上清液凝聚素水平和凝聚素/产物比率降低，而产物总体滴度保持相同(图3a，(A))。使用工艺变型3，可以对克隆1和克隆2观察到相同的CHO宿主细胞蛋白(图3b，(A)-(C))和PLPL2(图3c，(A)-(C))减少趋势。
在使用250L一次性使用生物反应器(SUB)作为代表性生产规模的补料分批工艺中，通过比较工艺变型2和3，证明了该工艺变型的可放大性。再次，工艺3显示与工艺2相比，上清液凝聚素水平降低(图4)。
分别通过CE-SDS和SEC测量收获时cM2产物相关杂质(碎片化和聚集物)的最终水平。当使用工艺变型3时，测试的两个克隆(克隆1和克隆2)显示cM2碎片化和聚集物的水平降低(图5)。
实施例3
可以通过pH、温度和培养基重量摩尔渗透压浓度调节凝聚素水平(用cM3例举)
在使用2L玻璃生物反应器或摇瓶的补料分批实验中，测试工艺参数和培养基参数——pH、温度和重量摩尔渗透压浓度，以影响CHO补料分批培养的上清液凝聚素水平。为此，使用均表达相同复合IgG融合蛋白(cM3＝FAP-4-1-BBL免疫缀合物)的两个克隆——克隆6和克隆7，和工艺变型1。在第8天启动温度变动和pH变动并保持直至在第14天收获。从培养伊始起使用不同的培养基重量摩尔渗透压浓度。
对于两个克隆，从pH 6.8至pH 7.2，上清液凝聚素水平升高(图6)。在pH 7.4，对于克隆6和克隆7，凝聚素水平分别显示最低水平或相对于6.8的相当水平。
在第8天温度降至33℃降低了凝聚素水平大约50％，然而培养过程的生产率保持在可比水平上(图7)。
工艺重量摩尔渗透压浓度对CHO细胞的调节作用可以用来改变细胞比生产率。在后续实验中，分析培养基重量摩尔渗透压浓度对上清液凝聚素的影响。通过使用更高的培养基重量摩尔渗透压浓度，与低的培养基重量摩尔渗透压浓度水平相比，该工艺产生了略微降低的最终滴度(图8B)。但是，上清液凝聚素水平和凝聚素/产物滴度的比率降低大约50％(图8A、C)。
实施例4
调节碎片化水平和聚集物水平(用cM1例举)
如实施例2中所述，在CHO细胞中，在重组产生的分子的碎片化水平和聚集物水平上，分析不同参数如pH和温度。再次比较了三个不同补料分批工艺变型：工艺1、工艺2和工艺3(参见实施例2)。此处，稳定表达复合细胞因子-IgG融合蛋白(cM1＝CEA-IL-2免疫缀合物)的克隆用于补料分批工艺。
分别通过CE-SDS和SEC测量收获时cM1产物相关杂质(碎片化和聚集)的最终水平。
工艺2和尤其工艺3显示显著降低的碎片化水平(在第14天，工艺1为11％，而工艺3为4％；图9A)。工艺3的聚集物水平显著降低(图9B)。
重要地，全部三个工艺的净滴度在第14天大致相同(图10)。因此，生产率可以保持在高水平上，同时可以降低碎片化和聚集物。另外，评估活细胞密度和细胞活力并且发现对于全部三个工艺，它们相当(图12)。
实施例5
免疫缀合物的纯化
在收获产生的免疫缀合物后，可以进行进一步纯化。简而言之，通过一个亲和步骤，用20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠pH 7.5中平衡的蛋白A柱(HiTrap ProtA，GEHealthcare)，纯化免疫缀合物。在装载上清液后，将该柱首先用20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5洗涤并随后用13.3mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，500mM氯化钠，pH 5.45洗涤。将免疫缀合物用20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH 3洗脱。将级分中和并汇集，通过大小排阻层析(HiLoad 16/60Superdex 200，GE Healthcare)纯化在最终配制缓冲液(25mM磷酸钾，125mM氯化钠，100mM甘氨酸pH6.7)中。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)，确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯蓝(SimpleBlueTM SafeStain，Invitrogen)染色，分析免疫缀合物的纯度和分子量。

Claims (15)

1.通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的哺乳动物细胞、产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的免疫缀合物的方法，其中在细胞培养的条件下表达该一个或多个核酸，所述方法包括步骤：
-在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；
-降低细胞培养基的第一温度至第二温度；并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；
-从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，
并且由此产生免疫缀合物。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中方法还包括用一个或多个纯化步骤纯化免疫缀合物。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中降低至第二温度和升高至第二pH是在13至14天的总培养时间的2至9天后。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中降低至第二温度和升高至第二pH是在大约相同的时间。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中第一温度是37℃+/-0.5℃并且第二温度处于28℃至34℃范围内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中第一温度是37℃+/-0.5℃并且降低至29℃+/-0.5℃的第二温度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中第二pH是7.25或更高。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中第一pH是pH7+/-0.05pH单位并且第一pH升高0.25至0.4pH单位至第二pH。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中接种细胞密度是从约600000(6 x 105)至约1000000(1 x 106)个细胞/ml。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中细胞培养基的重量摩尔渗透压浓度是从350mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg至800mOsmol/kg+/-15mOsmol/kg。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物、靶向FAP的IL-2免疫缀合物、或IgG-IL-2免疫缀合物、或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中细胞培养物是补料分批细胞培养物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
14.组合物，其包含通过根据权利要求1至13中任一项的方法可获得的免疫缀合物和降低水平的片段、聚集物和宿主细胞蛋白。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中免疫缀合物是靶向CEA的IL-2免疫缀合物、靶向FAP的IL-2免疫缀合物、或IgG-IL-2免疫缀合物、或靶向FAP的4-1-BBL免疫缀合物。
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