KR20180054877A - 공자극 tnf 수용체에 대해 4가를 갖는 이중특이적 항체 - Google Patents

공자극 tnf 수용체에 대해 4가를 갖는 이중특이적 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 신규한 이중특이적 항원 결합 분자, 이들 분자의 생산 방법, 및 이들 분자의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

공자극 TNF 수용체에 대해 4가를 갖는 이중특이적 항체
본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 상위계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 신규한 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 분자의 생산 방법 및 이들 분자의 사용 방법에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상위계열의 여러 구성원은 초기 T 세포 활성화 후에 작용하여 T 세포 반응을 지속시키므로 면역계의 구성 및 기능에서 핵심 역할을 한다. CD27, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), HVEM, CD30 및 GITR은 T 세포에 공자극 효과를 가질 수 있다, 즉, 이들은 초기 T 세포 활성화 후에 T-세포 반응을 지속시킨다(문헌[Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68]). 이들 공자극 TNFR 상위계열 구성원(본원에서 TNFR 계열 구성원으로도 지칭됨)의 효과는 종종 CD28의 효과와 및 서로와 기능적으로, 시간적으로 또는 공간적으로 구분될 수 있다. 상이한 공자극인자에 의한 T 세포 활성화/생존 신호의 순차적 및 일시적 조절은 T 세포 생존의 엄격한 조절을 유지하면서 반응의 장기지속을 가능하게 하도록 작용할 수 있다. 질환 상태에 따라서, 공자극 TNF 상위계열 구성원을 통한 자극은 질환을 악화시키거나 개선시킬 수 있다. 이러한 복잡함에도 불구하고, TNFR 계열 공자극인자의 자극 또는 차단은, 암, 감염성 질환, 이식 및 자가면역을 포함한 여러 치료 용도에 대한 전망을 나타낸다.
여러 공자극 분자 중에서, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 상위계열 구성원 OX40(CD134)은 효과기 및 기억 T 세포의 생존 및 항상성에서 핵심 역할을 한다(문헌[Croft M. et al. (2009), Immunological Reviews 229, 173-191].) OX40(CD134)은 여러 유형의 세포에서 발현되고 감염, 종양 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 조절하며, 그 발현은 T-세포, NKT-세포 및 NK-세포뿐 아니라 호중구의 표면에서 입증되었고(문헌[Baumann R. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 2268-2275]) 다양한 자극 신호에 반응하여 엄격하게 유도가능하거나 강하게 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 상기 분자의 기능 활성은 모든 OX40-발현 세포 유형에서 입증되어, 생체내 OX40-매개된 활성의 복잡한 조절을 시사하였다. T-세포 수용체 촉발과 함께, T-세포 상에서 그 천연 리간드 또는 작용성 항체에 의한 OX40 결합은 PI3K 및 NFκB 신호전달 경로의 상승적 활성화를 유도한다(문헌[Song J. et al. (2008) J. Immunology 180(11), 7240-7248]). 결과적으로, 이것은 활성화된 T-세포의 증대된 증식, 증가된 사이토카인 수용체 및 사이토카인 생성, 및 더 우수한 생존을 야기한다. 효과기 CD4+ 또는 CD8+ T-세포에서 그의 공자극 활성 이외에, OX40 촉발은 최근에 T 조절 세포의 발달 및 면역억제 기능을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 상기 효과는, 적어도 부분적으로, 항-종양 또는 항-미생물 면역 반응에 대한 OX40의 증대하는 활성의 원인이 되기 쉽다. OX40 결합이 T-세포 집단을 증식시키고 사이토카인 분비를 촉진시키고 T-세포 기억을 지원할 수 있음을 고려할 때, 리간드 OX40L의 항체 및 가용성 형태를 포함한 작용물질이 다양한 임상전 종양 모델에서 성공적으로 사용되어 왔다(문헌[Weinberg et al. (2000), J. Immunol. 164, 2160-2169]).
TNF 수용체 상위계열의 또 다른 수용체인 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체-관련된 유전자(GITR; TNFRSF18)는 Tregs 및 활성화된 효과기 T 세포에 대한 마커로서 간주된다(문헌[Petrillo et al. (2015), Autoimmun. Rev. 14, 117-26]). GITR 촉발은 프로- 및 항-세포 사멸 효과를 유도하고 Treg 세포의 억제 활성을 무효화하고 응답 T 세포를 공자극하며, 후자의 활성은 면역계를 과자극한다(문헌[Nocentini et al. (2005), Eur. J. Immunol. 35, 1016-1022]). 뮤린 GITR에 대한 작용성 단일클론 항체는 효과적으로 종양-특이적 면역을 유도하고 마우스 동질유전자적 종양 모델에서 생성된 종양을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Ko et al. (2005), J. Exp. Med. 202, 885-891]). 그러나, 뮤린 GITR과 인간 GITR 사이에 구조적 차이가 있다. 뮤린 GITR은 이량체인 반면에, 인간 GITR을 삼량체이다. 이러한 구조적 복잡성을 기반으로, 항-GITR 항체 그 자체가 불량한 GITR 작용물질이며, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 위해 증가된 FcR 효과기 기능이 필요함이 제기됐다. 따라서, 증가된 FcR 효과기 기능으로부터 독립적이면서도 삼량체성 인간 GITR을 활성화시킬 수 있는 신규한 포맷의 항-GITR 항체의 제공이 필요하다.
TNF 수용체 상위계열의 구성원인 4-1BB(CD137)는 그 발현이 T-세포 활성화에 의해 유도되는 분자로서 처음 확인되었다(문헌[Kwon Y.H. and Weissman S.M. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967]). 후속 연구는 T- 및 B-림프구(문헌[Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217] 또는 [Zhang X.et al. (2010), J. Immunol. 184, 787-795]), NK-세포(문헌[Lin W. et al. (2008), Blood 112, 699-707]), NKT-세포(문헌[Kim D.H. et al. (2008), J. Immunol. 180]), 단핵구(문헌[Kienzle G. and von Kempis J. (2000), Int. Immunol. 12, 73-82] 또는 [Schwarz H. et al. (1995), Blood 85, 1043-1052]), 호중구(문헌[Heinisch I.V. et al. (2000), Eur. J. Immunol. 30, 3441-3446]), 비만세포(문헌[Nishimoto H. et al. (2005), Blood 106, 4241-4248]), 및 수지상 세포뿐 아니라, 내피 및 평활근 세포와 같은 비-조혈 기원을 갖는 세포(문헌[Broll K. et al. (2001), Am. J. Clin. Pathol. 115, 543-549] 또는 [Olofsson P.S. et al. (2008), Circulation 117, 1292-1301])에서 4-1BB의 발현을 입증하였다. 상이한 세포 유형에서 4-1BB의 발현은 주로 유도성이며, 다양한 자극 신호, 예를 들어, T-세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체 촉발뿐 아니라, 전-염증성 사이토카인의 공자극 분자 또는 수용체를 통해 유도된 신호전달에 의해 주도된다(문헌[Diehl L. et al. (2002), J. Immunol. 168, 3755-3762]; [von Kempis J. et al. (1997), Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406]; [Zhang X.et al. (2010), J. Immunol. 184, 787-795]).
CD137 신호전달은 NK 세포의 IFNγ 분비 및 증식을 자극할뿐 아니라(문헌[Buechele C. et al. (2012), Eur. J. Immunol. 42, 737-748]; [Lin W. et al. (2008), Blood 112, 699-707]; [Melero I. et al. (1998), Cell Immunol. 190, 167-172]), 그의 증가된 생존 및 사이토카인을 분비하고 공자극 분자를 상향조절하는 능력으로 나타나듯이 DC 활성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다(문헌[Choi B. K. et al. (2009), J. Immunol. 182, 4107-4115]; [Futagawa T. et al. (2002), Int. Immunol. 14, 275-286]; [Wilcox R. A. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4262-4267]). 그러나, CD137은 T-세포의 CD4+ 및 CD8+ 아집단 둘 다에서 TCR-유도된 활성화를 조절하는 공자극 분자로서 가장 잘 규정된다. TCR 촉발과 함께, 작용성 4-1BB-특이적 항체는 T-세포의 증식을 증대시키고, 림포카인 분비를 자극하고, 활성화-유도된 세포 사멸에 대한 T-림프구의 민감성을 감소시킨다(문헌[Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217]). 시험관내에서 T-세포에 대한 4-1BB 항체의 상기 공자극 효과에 따라, 많은 실험 종양 모델에서 종양이 있는 마우스에게 상기 항체를 투여하면 강력한 항-종양 효과를 이끌어낸다(문헌[Melero I. et al. (1997), Nat. Med. 3, 682-685]; [Narazaki H. et al. (2010), Blood 115, 1941-1948]). 생체내 고갈 실험은 CD8+ T-세포가 4-1BB-특이적 항체의 항-종양 효과에서 가장 결정적인 역할을 하는 것을 입증하였다. 그러나, 항-4-1BB를 포함하는 종양 모델 또는 병용 치료에 따라서, DC, NK-세포 또는 CD4+ T-세포와 같은 다른 유형의 세포의 기여도 보고된 바 있다(문헌[Murillo O. et al. (2009), Eur. J. Immunol. 39, 2424-2436]; [Stagg J. et al. (2011), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 7142-7147]).
또한, 상이한 림프구 아집단에 대한 그의 직접적인 효과 이외에, 4-1BB 작용물질은 종양 혈관 내피 상에서의 세포간 부착 분자 1(ICAM1) 및 혈관 세포 부착 분자 1(VCAM1)의 4-1BB-매개된 상향조절을 통해, 종양내 활성화된 T-세포의 침윤 및 체류를 유도할 수 있다(문헌[Palazon A. et al. (2011), Cancer Res. 71, 801-811]). 또한, 4-1BB 촉발은 종양 미세환경에서 또는 만성 감염시에 면역 내성의 파괴에 기여할 수 있는 가용성 항원에 노출됨으로써 유도된 T-세포 무반응(anergy) 상태를 역전시킬 수 있다(문헌[Wilcox R.A. et al. (2004), Blood 103, 177-184]).
생체내에서 4-1BB 작용성 항체의 면역조절 특성은 항체 분자상에 야생형 Fc-부분의 존재를 필요로 함으로써, TNFR-상위계열의 다른 세포자살-유도 또는 면역조절 구성원에 특이적인 작용성 항체에 대해 기술되었듯이 Fc-수용체 결합이 상기 시약의 약리학적 활성에 필요한 중요한 사건임을 시사하는 것으로 보인다(문헌[Li F. and Ravetch J.V. (2011), Science 333, 1030-1034]; [Teng M.W. et al. (2009), J. Immunol. 183, 1911-1920]). 그러나, 기능적으로 활성인 Fc 도메인을 갖는 4-1BB-특이적 작용성 항체의 전신 투여는 또한, 마우스에서 기능성 Fc-수용체의 부재하에서 감소되거나 상당히 개선되는 간 독성과 연관된 CD8+ T-세포의 증식을 유도한다(문헌[Dubrot J. et al. (2010), Cancer Immunol. Immunother. 59, 1223-1233]). 인간 임상 시험(ClinicalTrials.gov, NCT00309023)에서, 12주 동안 3주에 1회씩 투여된 Fc-반응능(Fc-competent) 4-1BB 작용성 항체(BMS-663513)는 흑색종, 난소 또는 신장 세포 암종을 갖는 환자에서 질환의 안정화를 유도하였다. 그러나, 또 다른 시험(NCT00612664)에서 제공된 동일 항체는 4급 간염을 유발하여 시험 종료를 초래하였다(문헌[Simeone E. and Ascierto P.A. (2012), J. Immunotoxicology 9, 241-247]). 따라서, 조혈세포 및 내피 세포의 표면상에 4-1BB를 효과적으로 결합시켜야 할 뿐 아니라 통제불가능한 부작용을 방지하기 위해 Fc-수용체에 대한 결합 이외의 다른 메카니즘을 통해 상기 결합을 달성할 수 있는 신세대 작용물질이 필요하다.
이용가능한 전임상 및 임상 데이터는, 암에 대해 효과적인 내인성 면역 반응을 유도하고 증대시킬 수 있는 Ox40 및 4-1BB와 같은 공자극 TNFR 계열 구성원의 효과적인 작용물질이 임상적으로 매우 필요함을 명백하게 입증한다. 그러나, 단일 세포 유형으로 제한되거나 단일 메카니즘을 통해 작용하는 효과는 거의 없으며, 세포내 및 세포간 신호전달 메카니즘을 밝히기 위해 설계된 연구는 증가하는 수준의 복잡성을 나타내었다. 따라서, 단일 세포 유형에 우선적으로 작용하는 "표적화된" 작용물질이 필요하다. 본 발명의 항원 결합 분자는 종양-특이적 또는 종양-결합된 표적에 우선적으로 결합할 수 있는 모이어티를 공자극 TNF 수용체에 작용적으로 결합할 수 있는 모이어티와 결합시킨다. 본 발명의 항원 결합 분자는 TNF 수용체를 목적 부위에서 효과적으로뿐 아니라 매우 선택적으로 촉발시킴으로써 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, 즉, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원을 표적화하는 4개의 항원 결합 부위를 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티(즉, 표적 세포 항원을 표적화하는 하나 이상의 항원 결합 부위)와 결합시키는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 이들 이중특이적 항원 결합 분자는, 이들이 바람직하게는 표적 세포 항원에 대한 이의 결합 능력에 기인하여 공자극 TNF 수용체를 표적 세포 항원가 발현되는 부위에서 활성화시킬 수 있기 때문에 유리하다.
하나의 양태에서, 본 발명은
(a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 임의적으로, 이들은 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 특히, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 융합되고 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 임의적으로 이들은 펩티드 링커를 통해 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명은, 분자가 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 중쇄가 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티의 가변 도메인 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티의 가변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티(이때, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 OX40, 4-1BB 및 GITR로 이루어진 군으로부터 선택됨), (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다.
하나의 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 OX40이다. 따라서, 특정 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
추가 양태에서, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티는
(i) 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이
(i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(v) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(vi) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
(vii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티(이때, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택됨), 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다. 보다 특히, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다.
특정 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(i) 서열번호 39 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은
(i) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 또는 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 4-1BB이다. 따라서, 특정 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 서열번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
특정 양태에서, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티 각각이
(i) 서열번호 249 및 서열번호 250으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 251 및 서열번호 252로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 253, 서열번호 254, 서열번호 255, 서열번호 256 및 서열번호 257로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 258 및 서열번호 259로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 260 및 서열번호 261로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 262, 서열번호 263, 서열번호 264, 서열번호 265 및 서열번호 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
추가 양태에서, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 267, 서열번호 269, 서열번호 271, 서열번호 273 및 서열번호 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 268, 서열번호 270, 서열번호 272, 서열번호 274 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이
(i) 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ii) 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iii) 서열번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iv) 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
(v) 서열번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은
(i) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 267, 서열번호 269, 서열번호 271, 서열번호 273 및 서열번호 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 268, 서열번호 270, 서열번호 272, 서열번호 274 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원이 GITR인, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 따라서, 특정 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
하나의 양태에서, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티 각각은 서열번호 371의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 373의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 374의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 375의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 376의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
추가 양태에서, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 384의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은
(i) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 384의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편, 교차-Fab 단편, 단일쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항원 결합 도메인, 및 단일도메인 항체(예를 들어 aVH)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편인, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편이고, 이들 중 각각의 2개가 서로 연결되는, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편의 VH 도메인에 융합되고, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제4 Fab 단편의 VH 도메인에, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 융합되는, 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 불변 도메인 CH1에서, 위치 147 및 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 1가인 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 VH 및 VL 도메인을 포함하고, VH 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, VL 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에에 연결되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, Fc 도메인이 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특히, 놉-인투-홀 방법에 따라, Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛은 홀을 포함한다. 보다 특히, Fc 도메인의 제1 서브유닛이 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), Fc 도메인의 제2 서브유닛이 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V를 포함한다(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링).
또 다른 양태에서, (i) 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또한, 본 발명은 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 2가인 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편인, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편 각각이 VH 또는 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 VH-VL 크로스오버 Fab 단편이고 각각 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
보다 특히, (i) 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 서열번호 226의 제1 경쇄 및 서열번호 228의 제2 경쇄, 또는 (ii) 서열번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 서열번호 226의 제1 경쇄 및 서열번호 225의 제2 경쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, Fc 도메인이 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링) 인간 IgG1 서브클래스의 것인, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또 다른 양태에서, (i) 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (ii) 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 이중특이적 항원 결합 분자, OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체를 포괄한다.
또한, 본 발명은 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 포괄한다.
하나의 양태에서, (i) T 세포 반응을 자극하거나,
(ii) 활성화된 T 세포의 생존을 지원하거나,
(iii) 감염을 치료하거나,
(iv) 암을 치료하거나,
(v) 암의 진행을 지연시키거나,
(vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존을 연장시키는 데
사용하기 위한 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다.
구체적 실시양태에서, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다. 또 다른 구체적 양태에서, 본 발명은, 이중특이적 항원 결합 분자가 화학치료제, 방사선 및/또는 암 면역치료에 사용하기 위한 다른 제제와 조합으로 투여되는, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은, 개체에게 효과량의 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 종양 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 개체의 종양 세포 성장의 억제 방법을 제공한다.
또한, 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료를 위한 약제의 생산, 특히 암의 치료를 위한 약제의 생산을 위한 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자의 용도, 및 개체에게 치료적 효과량의 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 약학적으로 허용되는 형태로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 질병의 치료 방법이 제공된다. 구체적 양태에서, 질병은 암이다. 임의의 상기 양태에서, 개체는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1A는 TNF 수용체 항체의 생산에 사용된 Fc-결합된 TNF 수용체 항원의 단량체 형태를 나타낸다. 도 1B는 TNF 리간드의 존재하에 TNF 수용체 항체의 결합을 시험하기 위해(리간드 차단 특성) 사용된 C-말단 Ha 태그를 갖는 이량체성 인간 TNF 수용체 항원 Fc 융합 분자를 나타낸다. 실시예 2.4에 기술된 실험의 도식적인 구성이 도 1C에 도시되어 있다.
도 2A 내지 2D는 활성화된 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 항-OX40 항체의 결합을 나타낸다. OX40은 휴지중인 인간 PBMC 상에서는 발현되지 않는다(도 2A 및 2C). 인간 PBMC의 활성화 후에, OX40은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 상향조절된다(도 2B 및 2D). 인간 CD8+ T 세포 상에서의 OX40 발현은 CD4+ T 세포상에서의 발현보다 낮다. 나타낸 클론은 OX40 양성 세포에 대한 그 결합 강도(EC50 값 및 신호 강도)가 달랐다. 이차 검출 항체로 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(median of fluorescence intensity, MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였으며, 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. 모든 OX40 클론은 활성화된 OX40 발현 인간 CD4+ T 세포에 결합하며, 활성화된 인간 CD8+ T 세포에는 더 낮은 정도로 결합한다.
도 3A 내지 3D는 활성화된 마우스 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 항-OX40 항체의 결합을 나타낸다. OX40은 휴지중인 마우스 비장세포 상에서는 검출되지 않았다(도 3A 및 3C). 활성화 후에, OX40은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 상향조절된다(도 3B 및 3D). 마우스 비장세포를, 6 내지 8주령 암컷 C57BL/6 마우스로부터 수득된 기계적으로 균질화된 비장의 ACK 용해 완충액을 사용한 용혈에 의해 단리하였다. 세포 표면 단백질에 대한 항-OX40 항체의 결합을, FACS 분석을 사용하여 FITC에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 이차 항체를 사용하여 검출하였다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였으며 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. 클론 20B7만이 활성화된 OX40 발현 마우스 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 결합하며, 휴지중인 T 세포에는 결합하지 않는다.
도 4A 및 4B는 각각 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus) 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 항-OX40의 결합을 나타낸다. 나타낸 클론은 OX40 양성 활성화된 사이노몰구스 CD4+ T 세포에 대한 그 결합 강도(EC50 값 및 신호 강도)가 달랐다. 활성화된 CD8+ T 세포 상에서의 OX40 발현은 상기 조건하에서 낮으며 선택된 클론의 결합은 거의 확인되지 않았다. 세포 표면 단백질에 대한 항-OX40 항체의 결합은 FACS 분석을 사용하여 FITC에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 이차 항체를 사용하여 검출하였다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였으며 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. 모든 OX40 클론이 활성화된 OX40 발현 사이노몰구스 CD4+ T 세포에 결합하며, 활성화된 사이노몰구스 CD8+ T 세포에는 더 낮은 정도로 결합한다.
도 5A 및 5B는 OX40 음성 종양 세포에 대한 결합의 결여를 나타낸다. 나타낸 클론은 OX40 음성 U-78 MG(도 5A) 및 WM266-4 종양 세포(도 5B)에 대한 결합을 나타내지 않았다. 이차 검출 항체로 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타내었다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였으며 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. IgG 포맷의 모든 클론은 OX40 음성 종양 세포에 결합하지 않는다. 결합은 활성화된 백혈구 상의 OX40에 특이적이다.
도 6A 내지 6F는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 항-Ox40 항체 8H9(도 6A), 20B7(도 6B), 1G4(도 6C), 49B4(도 6D), CLC-563(도 6E) 및 CLC-564(도 6F)와 사전형성된 복합체 huOx40 리간드/huOx40-Fc 사이의 상호작용을 나타낸다.
도 7A 및 7B는 인간 OX40 및 리포터 유전자 NF-κB-루시퍼라제를 발현하는 HeLa 세포에 대한 본 발명의 항-인간 OX40 항체의 효과를 나타낸다. 이차-항체에 의해 가교결합되거나(도 7B) 가교결합되지 않는(도 7A) P329GLALA huIgG1 포맷의 다양한 항-OX40 결합자에 의한 리포터 세포주에서의 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 나타냈다. 리포터 세포를 1:2 비의 이차 다중클론 항-huIgG1 Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab)2 단편의 가교결합의 존재 또는 부재하에 지시된 농도에서 항-OX40 구축물의 존재하에 6시간 동안 배양하였다. 활성은 0.5초 동안 측정된 발광 단위(URL) 대 시험된 항-Ox40 구축물의 농도(nM)를 블롯팅함으로써 특성규명된다. URL은 루시페린의 옥시루시페린으로의 루시퍼라제-매개된 산화로 인해 방사된다. 모든 클론은 OX40 축이 인간 OX40+ 리포터 세포주에서 촉발될 때 NFκB 활성화를 유도할 수 있다. 따라서, 모든 클론은 작용성(agonistic)이며 용량 의존성 방식으로 활성화된다. 이차 Fc 부분 특이적 Ab에 의한 가교결합은 상기 작용성을 강하게 증가시킨다.
도 8A 내지 8F는 사전활성화된 인간 CD4 T 세포에서 항-인간 OX40 항체의 생체활성을 나타낸다. 플레이트-고정화된 항-OX40 결합자(huIgG1 P329GLALA 포맷)에 의한 공자극은 최적이하로 재자극된 인간 CD4 T 세포의 세포 증식 및 성숙을 촉진하였으며 증대된 활성화된 표현형을 유도하였다. PHA-L 사전활성화된 CFSE-표지된 인간 CD4 T 세포를 마우스 IgG Fcγ 특이적 항체, 인간 IgG Fcγ 특이적 항체(둘 다 2 ㎍/mL), 마우스 항-인간 CD3 항체(클론 OKT3, [3 ng/mL]) 및 적정된 항-Ox40 결합자(huIgG1 P329GLALA 포맷)로 예비코팅된 플레이트 상에서 4일 동안 배양하였다. 제4일에 이벤트 수, 증식(저-CFSE) 세포의 백분율, 효과기 T 세포의 백분율(CD127 저발현/CD45RA 저발현), 및 CD62L 저발현, OX40 양성 또는 Tim-3 양성 세포의 백분율을 나타내었다. 플레이트-고정화된 항-인간 CD3만을 함유하는 샘플의 기준선 값을 감하였다. 따라서, 여기서 OX40 자극의 증대하는 효과는 뚜렷하지만 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 뚜렷하지 않다. 모든 클론은 플레이트에 코팅될 때 Ox40 양성 사전활성화된 CD4 T 세포에서 최적이하 TCR 자극을 촉진할 수 있다. 세포는 더 잘 생존하고 더 많이 증식한다. 종양 미세환경에서, 상기 사실은 T 세포의 증가된 항-종양 활성을 야기할 수 있다.
도 9는 각각의 클론의 작용물질 능력에 대한 마커로서 EC50 값(모든 바이오마커에 대해)을 요약한 것이다(값은 도 8A 내지 8F에 나타낸 곡선으로부터 산출됨). 효능은 왼쪽으로부터 오른쪽으로 증가한다. 제4일에 이벤트 수, 증식(저-CFSE) 세포의 백분율, 및 CD62L 저발현, CD45RA 저발현 또는 Tim-3 양성 세포의 백분율을 항-Ox40 항체 농도에 대해 도표화하였고, 프리즘4(Prism4)(그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국)에서 고유의 S자형 용량 반응 견적을 이용하여 EC50 값을 산출하였다.
도 10A 내지 10F는 용액 중 사전활성화된 인간 CD4 T 세포에서 항-인간 OX40 항체의 생체활성을 나타낸다. 최적이하로 재자극된 인간 CD4 T 세포의 세포 증식, 성숙 또는 활성화 상태에 대한 효과는 항-Ox40 결합자(hu IgG1 P329GLALA 포맷)의 플레이트-고정화의 부재하에서는 검출되지 않았다. PHA-L 사전활성화된 CFSE-표지된 인간 CD4 T 세포를 마우스 IgG Fcγ 특이적 항체 및 마우스 항-인간 CD3 항체(클론 OKT3, [3 ng/mL])로 예비코팅된 플레이트 상에서 4일 동안 배양하였다. 적정된 항-Ox40 결합자(hu IgG1 P329GLALA 포맷)를 배지에 첨가하였고, 실험내내 용액 중에 존재하였다. 제4일에 이벤트 수, 증식(저-CFSE) 세포의 백분율, 효과기 T 세포(CD127 저발현 CD45RA 저발현)의 백분율, 및 CD62L 저발현, OX40 양성 또는 Tim-3 양성 세포의 백분율을 나타내었다. 플레이트-고정화된 항-인간 CD3만을 함유하는 샘플의 기준선 값을 감하였다. 따라서, 여기서 OX40 자극의 증대하는 효과는 뚜렷하지만 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 뚜렷하지 않다. 강한 가교결합의 부재(용액 중 P329GLALA 포맷)하에서는 TCR 자극이 개선되지 않는다. 따라서, 가교결합은 2가 aOx40 포맷이 T 세포에 작용성이 되는 데 필수적이다. 상기 가교결합은 표적화된 포맷으로 종양 또는 종양-기질 세포의 세포 표면에서 발현된 FAP에 의해 제공될 것이다.
도 11은 상이한 항-OX40 클론의 결합 강도와 작용물질 능력 사이의 상관성을 나타낸다. 활성화된 CD4 T 세포상에서의 항-OX40 클론(huIgG1 P329GLALA 포맷)의 결합을 실시예 2.1.2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 평탄역(plateau) 값을 클론 8H9(huIgG1 P329GLALA 포맷)를 사용하여 수득된 값으로 표준화하였다. 항-Ox40 클론(huIgG1 P329GLALA 포맷)의 생체활성 시험을 실시예 3.2에 기술된 바와 같이 수행하였으며, PD-1 발현의 평탄역 값을 클론 8H9(huIgG1 P329GLALA 포맷)를 사용하여 수득된 값으로 표준화하였다. 결합 강도와 작용물질 능력 사이의 상관성에 대해 시험하기 위해, 표준화된 결합을 표준화된 생체활성에 대해 도표화하였다. 대부분의 클론에서, 직접적인 상관성이 있었다(선형 회귀가 나타남, p값 0.96; 기울기 0.91). 그러나, 2개의 클론(49B4, 1G4)은, 그의 결합 강도로부터 예측될 수 있는 훨씬 더 강한 생체활성을 나타내었다. 낮은 결합 능력에도 불구하고 예기치 않게 높은 작용물질 효능을 나타내는 클론의 상기 아군(subgroup)은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자에 특히 유리하다.
도 12A는 예시적인 본 발명의 이중특이적 2가 항원 결합 분자(2+2 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다. 도 12B는 예시적인 본 발명의 이중특이적 1가 항원 결합 분자(1+1 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다. 도 12C는 고정화된 인간 OX40 및 인간 FAP에 대한 동시 결합을 보여주는 SPR 실험에 대한 구성을 나타낸다.
도 13A 내지 13D는 고정화된 인간 OX40 및 인간 FAP(분석물 2)에 대한 이중특이적 2가 2+2 구축물(분석물 1)의 동시 결합의 SPR 다이어그램을 나타낸다. SPR 다이어그램은 OX40 클론 8H9(도 13A), 49B4(도 13B), 1G4(도 13C) 및 20B7(도 13D)을 갖는 2+2 구축물에 대한 것이다. 도 13E 내지 13H에서, 고정화된 인간 Ox40 및 인간 FAP(분석물 2)에 대한 이중특이적 1가 1+1 구축물(분석물 1)의 동시 결합을 나타냈다. SPR 다이어그램은 OX40 클론 8H9(도 13E), 49B4(도 13F), 1G4(도 13G) 및 20B7(도 13H)을 갖는 1+1 구축물에 대한 것이다.
도 14A 내지 14H는 휴지중인 인간 PBMC및 활성화된 인간 PBMC에 대한 FAP 표적화된 1가 또는 2가 포맷의 선택된 항-OX40 결합자(클론 8H9, 1G4)의 결합을 나타낸다. OX40 양성 T 세포에 대한 결합 특성(도 14B, 14D, 14E 및 14F)은 통상적인 2가 hu IgG 포맷(빈 사각형) 및 FAP-표적화된 2가 포맷(채워진 사각형)의 클론에 필적하였다. FAP-표적화된 1가 포맷(채워진 삼각형)의 동일 클론의 결합은 결합활성 결합의 소실로 인해 명백하게 더 약했다. 인간 OX40 발현 세포의 부재하에서는 결합이 관찰될 수 없다(휴지중인 세포, 도 14A, 14C, 14G 및 14H). 이차 검출 항체로 사용되는, FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타내었다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였으며 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. 도 14D에서, 클론 1G4는 활성화된 OX40 발현 인간 CD4 T 세포에 결합하고 활성화된 인간 CD8+ T 세포에는 보다 낮은 정도로 결합함을 볼 수 있다( 도 14B). 2가 구축물은 1가 구축물보다 더 강하게 결합한다. 구축물은 OX40 음성 휴지중인 T 세포에는 결합하지 않는다. 도 14E는 클론 8H9가 활성화된 OX40-발현 인간 CD4 T 세포에 결합하고 활성화된 인간 CD8+ T 세포에는 더 낮은 정도로 결합함을 나타낸다(도 14F). 2가 구축물은 1가 구축물보다 더 강하게 결합한다. 구축물은 Ox40 음성 휴지중인 T 세포에는 결합하지 않는다.
도 15A 및 15B는 FAP 양성 종양 세포에 대한 FAP 표적화된 1가 또는 2가 포맷의 선택된 항-OX40 결합자(클론 8H9, 1G4)의 결합을 나타낸다. 유전자전이 변형된 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3-huFAP 클론 39 또는 WM266-4 세포는 높은 수준의 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP)을 발현한다. FAP-표적화된 1가 및 2가 항-Ox40 구축물(채워진 사각형 및 삼각형)만이 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포(도 15A) 및 WM266-4 세포(도 15B) 각각에 결합하고, 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 동일 클론(빈 사각형)은 결합하지 않는다. 이차 검출 항체로 사용된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타내었다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. 2가 FAP 구축물이 1가 구축물보다 더 강하게 결합한다.
도 16A는 표적 세포 항원에 대해 1가를 갖는 예시적인 본 발명의 이중특이적 4가 항원 결합 분자(4+1 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다. 도 16B는 표적 세포 항원에 대해 2가를 갖는 예시적인 본 발명의 이중특이적 4가 항원 결합 분자(4+2 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다.
도 17A 및 17B는 인간 FAP 양성 WM266-4 세포에 대한 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자(클론 49B4)의 결합을 보여준다. WM266-4 세포는 높은 수준의 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP)을 발현한다. FAP-표적화된 1가 및 2가 이중특이적 49B4 구축물(채원진 원, 사각형 및 삼각형)만이 WM266-4 세포에 결합하고 표적화되지 않은 49B4 구축물(빈 원, 사각형 및 삼각형)은 결합하지 않았다. 이차 검출 항체로서 사용된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI를 유세포분석으로 측정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 18A 내지 18D는 휴지중인 인간 CD4 T 세포 및 활성화된 인간 CD4 T 세포에 대한 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자 49B4의 결합을 나타낸다. OX40은 휴지중인 인간 CD4 T 세포 상에서 발현되지 않는다(도 18A 및 18C). 인간 OX40 발현 세포의 부재하에서는, 결합이 관찰되지 않았다. 인간 PBMC의 활성화 후에, OX40은 CD4+ T 세포 상에서 상향조절된다(도 18B 및 18D). 결합자 49B4를 함유하는 모든 구출물은 Ox40+ 활성화된 CD4+ T 세포에 결합하였다. 4가 OX40 결합(원 및 사각형)은 OX40에 대한 결합활성을 강하게 증가시킨 반면에, FAP 결합 모이어티의 존재는 영향이 없었다(빈 기호와 채워진 기호 비교). 비교해 볼 때, 둘 다의 2가 구축물(삼각형)은 CD4+ T 세포에 대한 보다 약한 결합을 나타냈다. 2가 이중특이적 구축물에서 클론 49B4의 결합은 명백하게 통상적 IgG 포맷의 것보다 강했다. 이차 검출 항체로서 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI를 유세포분석으로 측정하고, 기준선은 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 19A 내지 19D는 휴지중인 인간 CD8 T 세포 및 활성화된 인간 CD8 T 세포에 대한 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자의 결합을 나타낸다. OX40은 휴지중인 인간 CD8 T 세포 상에서 발현되지 않는다(도 19A 및 19C). 인간 OX40 발현 세포의 부재하에서는, 결합이 관찰되지 않았다. 인간 PBMC의 활성화 후에, OX40은 CD8+ T 세포 상에서 상향조절된다(도 19B 및 19D). 인간 CD8+ T 세포 상의 OX40 발현은 CD4+ T 세포 상에서 보다 낮고, 공여체 및 시점 사이에 변한다. OX40의 발현은 도식된 CD8 T 세포 상에서 낮았다. 결합자 49B4를 함유하는 모든 구축물은 OX40+ 활성화된 CD8+ T 세포에 결합하였다. 4가 OX40 결합(원 및 사각형)은 OX40에 대한 결합활성을 강하게 증가시킨 반면에, FAP 결합 모이어티의 존재는 영향이 없었다(빈 기호와 채워진 기호 비교). 비교해 볼 때, 둘 다의 2가 구축물(삼각형)은 CD8+ T 세포에 대한 보다 약한 결합을 나타냈다. 2가 이중특이적 구축물에서 클론 49B4의 결합은 명백하게 통상적 IgG 포맷에서 보다 강했다. 이차 검출 항체로서 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI를 유세포분석으로 측정하고, 기준선은 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 20A 내지 20D는 활성화된 사이노몰구스 T 세포에 대한 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-Ox40 결합자 49B4의 결합을 나타낸다. 도식된 구축물은 OX40 양성 활성화된 사이노몰구스 CD4+ T 세포에 대한 결합 강도(EC50 값)에 있어서 달랐다. 4가 OX40 결합 모이어티를 갖는 구축물은 2가 구축물보다 OX40+ T 세포에 대한 강한 결합을 나타냈다. OX40에 대한 4가 결합과 2가 결합 사이의 결합활성의 증가는 인간 OX40에 대해 관찰된 것보다 덜 강했다. 활성화된 CD8+ T 세포 상의 발현은 이러한 조건하에 낮았고, 단지 약한 결합만이 발견되었다. 세포 표면 단백질에 대한 항-OX40 항체의 결합을, FACS 분석을 사용하여 FITC에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 이차 항체를 사용하여 검출하였다. MFI를 유세포분석으로 측정하고, 기준선은 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 21A는 세포-기반 FRET 분석에서 인간 OX40 경쟁 결합의 결과를 나타낸다. 도 21B는 고정화된 인간 OX40 및 인간 FAP에 대한 동시 결합을 보여주는 SPR 실험에 대한 구성을 나타낸다.
도 22A, 22B 및 22C는 고정화된 인간 OX40 및 인간 FAP(분석물 2)에 대한 이중특이적 4가 4+1 구축물(분석물 1)의 동시 결합의 SPR 다이어그램을 나타낸다. 구축물 4+1(49B4/28H1)(도 22A) 및 4+1(49B4/4B9)(도 22B)은 동시 결합을 나타낸 반면에, 구축물 4+1(49B4/DP47)은 OX40에 대한 결합만을 나타냈다. 도 22D에서, 고정화된 인간 Ox40 및 인간 FAP(분석물 2)에 대한 이중특이적 4가 4+2 구축물(49B4/28H1)(분석물 1)의 동시 결합을 나타냈다. 구축물 4+2(49B4/DP47)는 동시 결합을 나타내지 않았다(도 22E).
도 23A 내지 23D는 인간 FAP 인간 OX40 음성 A549 세포에 대한 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자(클론 49B4)의 결합에 관한 것이다. 도식된 구축물은 OX40 음성 FAP 음성 A549 종양 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다. 이차 검출 항체로서 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI를 유세포분석으로 측정하고, 기준선은 블랭크 대조군의 MFI를 감하여서 보정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다. 비교를 위해, 인간 FAP 양성 WM266-4 세포에 대한 결합의 그래프를 오른편 컬럼에 나타냈다. WM266-4 세포는 높은 수준의 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP)을 발현한다. 이차 검출 항체로서 사용된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타냈다. MFI를 유세포분석으로 측정하였다. x-축은 항체 구축물의 농도를 나타낸다.
도 24A 내지 24D는 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 리포터 세포에서 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자(클론 49B4)에 의한 NFκB 활성화를 나타낸다. 이차 항체에 의한 가교결합이 존재하거나(도 24B 및 24D) 부재하는(도 24A 및 24D) 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자 49B9를 갖는 리포터 세포주에서 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 나타낸다. 리포터 세포를 1:2 비의 이차 다중클론 항-huIgG1 Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab)2 단편의 가교결합의 존재 또는 부재하에 지시된 농도에서 항-OX40 구축물의 존재하에 6시간 동안 배양하였다. NF-κB-매개된 루시퍼라제 활성은 0.5초 동안 측정된 발광 단위(URL) 대 시험된 화합물의 농도(nM)를 블롯팅함으로써 특성규명된다. URL은 루시페린의 옥시루시페린으로의 루시퍼라제-매개된 산화로 인해 방사된다. 4가 구축물은 2가 구축물보다 약간 양호하게 수행하였다.
FAP 양성 세포의 존재하에 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 리포터 세포에서 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자 49B4에 의한 NFκB의 활성화를 도 25A 내지 25F 및 26A 내지 26C에 나타냈다. FAP 저발현 WM266-4 세포(도 25A 내지 25C), FAP 중간발현 NIH-3T3 인간 FAP 세포(도 25D 내지 25F) 및 FAP 고발현 NIH-3T3 마우스 FAP 세포(도 26A 내지 26C)의 존재하에 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 항-OX40 결합자 49B4에 의한 리포터 세포에서 NFκB 신호전달 경로의 활성화를 나타냈다(4개의 FAP+ 종양 세포 대 1개의 리포터 세포의 비). NFκB-매개된 루시퍼라제 활성은 0.5초 동안 측정된 발광 단위(URL) 대 시험된 화합물의 농도(nM)를 블롯팅함으로써 특성규명된다. URL은 루시페린의 옥시루시페린으로의 루시퍼라제-매개된 산화로 인해 방사된다. 값은 블랭크 대조군의 URL를 감하여서 기준선 보정된다. 모든 포맷의 보다 양호한 비교를 위해, 각각의 블롯팅된 용량-반응 곡선의 곡선 아래의 면적을 각각의 구축물의 작용물질 능력에 대한 마커로서 정량화하였다. 면적을 그래프패드프리즘을 사용하여 산출하였다. 값은 블랭크 대조군의 값을 감하여서 기준선 보정된다. 모든 구축물은 Ox40+ HeLa 리포터 세포에서 NFκB 활성화를 유도할 수 있었다. 그러나, FAP 양성 세포의 첨가에 의한 가교결합은 FAP 표적화된 분자의 작용성 잠재력만을 증가시키고, 비-표적화된 대조군 분자의 것은 증가시키지 않았다. 4가 구축물은 2가 구축물보다 양호하게 수행하였다. 보다 높은 FAP 발현은 보다 양호한 가교결합을 제공하여 추가적으로 OX40 작용성을 추가로 증가시켰다.
플레이트-고정화된 FAP 표적화된 1가 및 2가 항-OX40(49B4) 구축물에 의해 사전활성화된 CD4 T 세포의 최적이하 TCR 재자극의 해제가 도 27A 내지 27H에 나타나 있다. 플레이트-고정화된 항-Ox40 구축물에 의한 공자극은 최적이하로 재자극된 인간 CD4 T 세포의 세포 증식 및 성숙을 촉진하였고 증대된 활성화된 표현형을 유도하였다. PHA-L 사전활성화된 CFSE-표지된 인간 CD4 T 세포를 마우스 IgG Fcγ 특이적 항체, 인간 IgG Fcγ 특이적 항체(둘 다 2 ㎍/mL), 마우스 항-인간 CD3 항체(클론 OKT3, [3 ng/mL]) 및 적정된 항-OX40 구축물로 예비코팅된 플레이트 상에서 4일 동안 배양하였다. 제4일에서의 이벤트 수, 증식(저-CFSE) 세포의 백분율, 효과기 T 세포(CD127 저발현 CD45RA 저발현)의 백분율, 및 CD62L 저발현, OX40 양성 또는 Tim-3 양성 세포의 백분율을 나타내었다. 플레이트-고정화된 항-인간 CD3만을 함유하는 샘플의 기준선 값을 감하였다. 따라서, 여기서 OX40 자극의 증대하는 효과는 뚜렷하지만 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 뚜렷하지 않다. 도 27A 내지 27H에서는, 모든 구축물이, 플레이트에 코팅되었을 때, 사전활성화된 Ox40+ CD4 T 세포의 최적이하 TCR 자극을 해제시킬 수 있었음을 볼 수 있다. 세포는 생존하였고, 증식이 보다 양호하였다. 모든 4가 구축물은 플레이트에 코팅되었을 때 서로 비슷하게 수행하였고 2가 구축물보다 양호하였다.
도 28A 내지 28D에서, 용액 중 항-OX40 구축물이 사전활성화된 CD4 T 세포의 최적이하 TCR 재자극를 변화시키지 않았음을 보여준다. 최적이하로 재자극된 인간 CD4 T 세포의 세포 증식 및 성숙에 대한 효과 없음은 항-OX40 구축물(huIgG1 P329GLALA 포맷)의 플레이트 고정화의 부재하에 검출되었다. PHA-L 사전활성화된 CFSE-표지된 인간 CD4 T 세포를 마우스 IgG Fcγ 특이적 항체 및 마우스 항-인간 CD3 항체(클론 OKT3, [3 ng/mL])로 예비코팅된 플레이트 상에서 4일 동알 배양하였다. 적정된 항-OX40 구축물(huIgG1 P329GLALA 포맷)을 배지에 첨가하였고 이는 실험 내내 용액에 존재하였다. 제4일에서의 이벤트 수 및 효과기 T 세포(CD127lowCD45RAlow)의 백분율을 나타냈다. 플레이트-고정화된 항-인간 CD3만을 함유하는 샘플의 기준선 값을 감하였다. 따라서, 여기서 OX40 자극의 증대하는 효과는 뚜렷하지만 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 뚜렷하지 않다.
도 29A 내지 29D는 최적이하로 TCR 촉발된 휴지중인 인간 PBMC의 OX40 매개된 공자극 및 세포 표면 FAP에 의한 초가교결합에 관한 것이다. 비-표적화된 4가 항-Ox40(49B4) huIgG1 P329GLALA 4+1 및 4+2에 의한 공자극은 최적이하로 TCR 자극된 CD4 및 CD8 T 세포를 거의 해제시키지 않았다. 존재하는 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포에 의한 FAP 표적화된 2가 및 4가 항-Ox40 구축물의 초가교결합은 인간 CD4 및 CD8 T 세포에서 생존 및 증식을 강하게 촉진하였다. 필수적인 CD4+(도 29A 및 29B) 및 CD8+(도 29C 및 29D) T 세포의 이벤트 수를 나타냈다. 항-인간 CD3(클론 V9, huIgG1), 휴지중인 인간 PBMC 및 NIH/3T3-huFAP 클론 39만을 함유하는 샘플의 기준선 값을 감하였다. 따라서, 여기서 OX40 공자극의 증대하는 효과는 뚜렷하지만 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 뚜렷하지 않다. 표적화된 4가 구축물은 2가 구축물보다 우수하였다. FAP 양성 종양 미세환경에서, 상기 사실은 전체 OX40 활성화의 부재하에 T 세포의 증가된 항-종양 활성을 야기할 수 있다.
도 30A 내지 30D는 증식 단계에서 세포 표면 고정화된 FAP 표적화된 4가 항-Ox40(49B4) 구축물에 의한 휴지중인 인간 PBMC의 최적이하 TCR 자극의 해제에 관한 것이다. 비-표적화된 4가 항-Ox40(49B4) huIgG1 P329GLALA 4+1 및 4+2에 의한 공자극은 최적이하로 TCR 자극된 CD4 및 CD8 T 세포를 거의 해제시키지 않았다. 존재하는 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포에 의한 FAP 표적화된 2가 및 4가 항-Ox40 구축물의 초가교결합은 인간 CD4 및 CD8 T 세포에서 생존 및 증식을 강하게 촉진하였다. 저-CFSE 필수 CD4+(도 30A 및 30B) 및 CD8+(도 30C 및 30D) T 세포의 백분율을 나타냈다. 항-인간 CD3(클론 V9, huIgG1), 휴지중인 인간 PBMC 및 NIH/3T3-huFAP 클론 39만을 함유하는 샘플의 기준선 값을 감하였다. 따라서, 여기서 OX40 공자극의 증대하는 효과는 뚜렷하였으나 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 뚜렷하지 않았다. 표적화된 4가 구축물이 2가 구축물보다 우수하였다.
도 31A 내지 31D는 활성화된 표현형 CD25를 증대시킴으로써 세포 표면 고정화된 FAP 표적화된 4가 항-Ox40(49B4) 구축물에 의한 휴지중인 인간 PBMC의 최적이하 TCR 자극의 해제를 나타낸다. 비-표적화된 4가 항-Ox40(49B4) huIgG1 P329GLALA 4+1 및 4+2에 의한 공자극은 최적이하로 TCR 자극된 CD4 및 CD8 T 세포를 거의 해제시키지 않았다. 존재하는 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포에 의한 FAP 표적화된 2가 및 4가 항-Ox40 구축물의 초가교결합은 인간 CD4 및 CD8 T 세포에서 활성화된 표현형을 강하게 증대시켰다. CD25 양성, 필수 CD4+(도 31A 및 31B) 및 CD8+(도 31C 및 31D) T 세포의 백분율을 나타냈다. 항-인간 CD3(클론 V9, huIgG1), 휴지중인 인간 PBMC 및 NIH/3T3-huFAP 클론 39만을 함유하는 샘플의 기준선 값을 감하였다. 따라서, OX40 공자극의 증대시키는 효과는 뚜렷하였으나 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 뚜렷하지 않았다. 표적화된 4가 구축물이 2가 구축물보다 양호하게 수행하였다.
도 32A 내지 32C에 요약을 나타냈다. 존재하는 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포에 의한 FAP 표적화된 2가 및 4가 항-OX40 구축물의 초가교결합은 인간 CD4 및 CD8 T 세포에서 활성화된 표현형을 강하게 증대시켰고 생존 및 증식을 지속시켰다. 모든 포맷의 보다 양호한 비교를 위해, 도 29A 내지 29D, 도 30A 내지 30D 및 도 31A 내지 31D의 각각의 블롯팅된 용량-반응 곡선의 곡선 아래 면적을 각각의 구축물의 작용물질 능력에 대한 마커로서 정량화하였다. 면적을 그래프패드프리즘을 사용하여 산출하였다. 값은 블랭크 대조군의 값을 감하여서 기준선 보정한다. FAP 결합 모이어티를 함유하는 구축물만이, 가교결합이 FAP 양성 세포(NIH)에 의해 제공될 때, 휴지중인 CD4 및 CD8 T 세포의 최적이하 TCR 자극을 해제할 수 있었다. 세포는 보다 강한 증식, 확장 및 활성화(CD25)를 나타냈다. 표적화된 4가 구축물은 2가 구축물보다 우수하였다. FAP 양성 종양 미세환경에서, 상기 사실은 전체 OX40 활성화의 부재하에 T 세포의 증가된 항-종양 활성을 야기할 수 있다.
EC50 값의 비교를 도 33에 나타냈다. 모든 포맷의 보다 양호한 비교를 위해, 도 29A 내지 29D, 도 30A 내지 30D 및 도 31A 내지 31D의 각각의 블롯팅된 용량-반응 곡선의 EC50 값을 각각의 구축물 작용물질 능력에 대한 마커로서 정량화하였다. EC50 값을 그래프패드프리즘을 사용하여 산출하였다. 표적화된 4+1 및 4+2 구축물이 2+2 구축물보다 양호하게 수행하였음을 용이하게 알 수 있다.
도 34A 내지 34D는 huIgG1 P329G LALA 포맷으로 전이된 4개의 항-인간 4-1BB-특이적 클론(채워진 다이아몬드: 클론 25G7, 채워진 사각형: 클론 12B3, 채워진 별: 클론 11D5, 위를 가리키는 삼각형: 클론 9B11) 및 huIgG1P329G LALA 포맷으로 전이된 1개의 항-마우스 4-1BB 특이적 클론 20G2(아래를 가리키는 삼각형)의 휴지중인 인간 T 세포 및 활성화된 인간 T 세포에 대한 결합을 나타낸다. 음성 대조군으로서 비-4-1BB-특이적 클론 DP47 huIgG1 P329G LALA 항체를 사용하였다(빈 회색 원). 위쪽 패널은 휴지중인 CD4+ T 세포(도 34A) 및 활성화된 CD4+ T 세포(도 34B)에 대한 결합을 나타낸 것인 반면, 아래쪽 패널은 휴지중인 CD8+ T 세포(도 34C) 및 활성화된 CD8+ T 세포(도 34D)에 대한 결합을 나타낸다. 결합은 이차 검출 항체로 사용된 FITC-표지되거나 PE-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)를, 시험한 1차 항-4-1BB-결합 huIgG1 P329G LALA 항체의 농도(nM)에 대해 도표화하여 특성규명하였다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였고 블랭크 대조군(1차 항체 미함유)의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다.
도 35A 내지 35D는 4-1BB 발현 마우스 T 세포에 대한 결합을 나타낸다. 4개의 항-인간 4-1BB-결합 huIgG1 P329G LALA 항체 클론(채워진 다이아몬드: 클론 25G7, 채워진 사각형: 클론 12B3, 채워진 별: 클론 11D5, 위를 가리키는 삼각형: 클론 9B11) 및 1개의 항-마우스 4-1BB 결합 huIgG1 P329G LALA 항체 클론 20G2(아래를 가리키는 삼각형)의 휴지중인 마우스 T 세포 및 활성화된 마우스 T 세포에 대한 결합을 나타내었다. 음성 대조군으로서 비-4-1BB 결합 DP47 huIgG1 P329G LALA 항체를 사용하였다(빈 회색 원). 위쪽 패널은 휴지중인 마우스 CD4+ T 세포(도 35A) 및 활성화된 CD4+ T 세포(도 35B)에 대한 결합을 나타낸 것인 반면, 아래쪽 패널은 휴지중인 마우스 CD8+ T 세포(도 35C) 및 활성화된 CD8+ T 세포(도 35D)에 대한 결합을 나타낸다. 결합은, 이차 검출 항체로 사용된 FITC-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 MFI를, 시험한 1차 항-4-1BB-결합 huIgG1 P329G LALA 항체의 농도(nM)에 대해 도표화하여 특성규명되었다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였고 블랭크 대조군(1차 항체 미함유)의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다.
도 36A 내지 36D는 4-1BB 발현 마우스 T 세포에 대한 마우스 IgG의 결합을 나타낸다. 마우스 IgG1 DAPG 포맷 및 마우스 IgG1 야생형(wt)으로 전이된 항-마우스 4-1BB 결합 클론 20G2의 휴지중인 마우스 T 세포 및 활성화된 마우스 T 세포에 대한 결합을 나타내었다. 음성 대조군으로서 상업적인 비-4-1BB 결합 마우스 IgG1 wt 이소타입 대조군을 사용하였다(빈 회색 원, 바이오레전드(BioLegend), 카탈로그 번호 400153). 위쪽 패널에는 휴지중인 CD4+ T 세포(도 36A) 및 활성화된 CD4+ T 세포(도 36B)에 대한 결합을 나타낸 반면, 아래쪽 패널에는 휴지중인 CD8+ T 세포(도 36C) 및 활성화된 CD8+ T 세포(도 36D)에 대한 결합을 나타내었다. 결합은, 이차 검출 항체로 사용된 FITC-표지된 항-마우스 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)를, 시험한 1차 항-4-1BB-결합 moIgC 항체의 농도(nM)에 대해 도표화하여 특성규명되었다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였고 블랭크 대조군(1차 항체 미함유)의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다.
도 37A 및 37B는 4-1BB 발현 사이노몰구스 T 세포에 대한 결합을 나타낸다. 4개의 항-인간 4-1BB-결합 huIgG1 P329G LALA 항체 클론(채워진 다이아몬드: 클론 25G7, 채워진 사각형: 클론 12B3, 채워진 별: 클론 11D5, 위를 가리키는 삼각형: 클론 9B11)의 활성화된 사이노몰구스 T 세포에 대한 결합을 나타내었다. 음성 대조군으로서 비-4-1BB 결합 DP47 huIgG1 P329G LALA 항체를 사용하였다(빈 회색 원). 활성화된 CD4+ T 세포(도 37A) 및 활성화된 CD8+ T 세포(도 37B) 각각에 대한 결합을 나타내었다. 결합은, 이차 검출 항체로 사용된 FITC-표지화 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 중간 형광 강도(MFI)를, 시험한 1차 항-4-1BB-결합 huIgG1 P329G LALA 항체의 농도(nM)에 대해 도표화하여 특성규명되었다. MFI를 유세포분석에 의해 측정하였고 블랭크 대조군(1차 항체 미함유)의 MFI를 감하여서 기준선을 보정하였다.
도 38A 내지 38E는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 본 발명의 항-4-1BB 항체의 리간드 결합 특성을 나타낸다. 인간 항-4-1BB IgG 25G7, 11D5, 9B11 및 12B3과 사전형성된 복합체 hu4-1BB 리간드/hu4-1BB 사이의 상호작용뿐 아니라 마우스 항-4-1BB 클론 20G2 및 사전형성된 복합체 mu4-1BB 리간드/mu4-1BB의 상호작용을 나타내었다.
도 39A 내지 39D는 시험관내에서 상이한 항-인간 4-1BB 클론의 기능적 특성을 나타낸다. 사전활성화된 인간 CD8+ T 세포를 항-인간 CD3 항체의 부재하에서(도 39A 및 39C) 또는 최적이하 농도의 표면 고정화된 항-인간 CD3 항체의 존재하에서(도 39B 및 39D) 상이한 농도의 표면 고정화된 항-인간-4-1BB-특이적 huIgG1 P329G LALA 항체로 활성화시켰다. 전체 CD8+ T 세포 집단중 IFNγ+(A 및 B) 및 TNFα+(C 및 D) CD8+ T 세포의 빈도 대 표면 고정화된 4-1BB-결합 huIgG1 P329G LALA의 농도(pM)를 나타내었다. CD3-자극의 존재하에서 4-1BB-공자극은 IFNγ(도 39B) 및 TNFα(도 39D) 분비를 농도 의존 방식으로 증가시켰다. CD-3 자극의 부재하에서는, 4-1BB의 활성화는 IFNγ(도 39A) 및 TNFα(도 39C) 분비에 영향을 미치지 않았다.
도 40A는 2개의 항-4-1BB Fab 단편 및 2개의 항-FAP Fab 단편을 포함하는 본 발명의 예시적 이중특이적 2가 항원 결합 분자(2+2 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다. 도 40B는 하나의 항-4-1BB Fab 단편 및 하나의 항-FAP Fab 단편을 포함하는 본 발명의 예시적 이중특이적 1가 항원 결합 분자(1+1 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다. 도 40C는 2개의 항-4-1BB Fab 단편 및 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인을 포함하는 본 발명의 예시적 이중특이적 2가 항원 결합 분자(2+1 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다. 채워진 원은 놉-인투-홀 돌연변이를 상징한다. 도 40C에 나타낸 구축물에서 FAP 항체의 VH 도메인은 Fc 놉 중쇄의 C-말단에 융합되는 반면에, 도 40D에 구축물에서 FAP 항체의 VH 도메인은 Fc 홀 쇄의 C-말단에 결합된다. 도 40E 및 40F는 FAP에 대해 1가를 갖는 본 발명의 예시적 이중특이적 4가 항원 결합 분자(4+1 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다.
도 41A 내지 41D는 이중특이적 항-4-1BB x 항-FAP 항원 결합 분자(4+1 구축물)의 동시 결합을 설명한다. 도 41A는 분석의 구성을 나타낸다. 도 41B 내지 41D는 고정화된 인간 4-1BB 및 인간 FAP(분석물 2)에 대한 이중특이적 구축물(분석물 1)의 동시 결합을 나타낸다. 도 41B는 이중특이적 4+1 구축물과 클론 12B3의 결합을 나타내고, 도 41C는 구축물과 클론 25G7의 결합을 나타내고, 도 41D는 구축물과 클론 11D5의 결합을 나타낸다.
도 42는 세포막 결합된 4-1BB에 대한 2가(IgG) 및 4가 (4+1) 4-1BB x FAP 구축물의 결합을 분석하는 FRET 기반 경쟁 분석을 나타낸다. 항-4-1BB 결합자 12B3의 경우, 4가 4+1 포맷은 각각의 2가 IgG 항체보다 결합에 대해 양호하게 경쟁한다.
도 43A 내지 43D는 휴지중인 인간 T 세포 및 활성화된 인간 T 세포에 대한 결합을 나타낸다. 4-1BB-결합 분자의 농도를 PE-접합된 이차 검출 항체의 형광 강도의 기하 평균(MFI)에 대해 블롯팅한다. 모든 값은 블랭크 대조군(예를 들어 일차 검출 항체는 미함유하며 이차 검출 항체만 함유)의 기준선 값을 감하여서 기준선 보정한다. 도 43A는 휴지중인 CD4 T 세포에 대한 결합을 나타내고, 도 43B는 CD4+ T 활성화된 세포에 대한 결합을 나타낸다. 도 43C는 휴지중인 CD8 T 세포에 대한 결합을 나타내고, 도 43D는 활성화된 CD8+ T 세포에 대한 결합을 나타낸다. 단지 4-1BB-결합-도메인-함유 구축물, 예컨대 12B3 huIgG1 P329G LALA(채워진 흑색 사각형), 12B3 x FAP(28H1) 2+2 항원 결합 분자(채워진 흑색 삼각형), 12B3 x FAP(28H1) 1+1 항원 결합 분자(절반만 채워진 회색 원) 또는 12B3 x FAP(4B9) 4+1 항원 결합 분자(절반만 채워진 회색 사각형)가 4-1BB-발현 세포에 효율적으로 결합한다. 생식계열 대조군 분자 DP47 huIgG1 P329G LALA(빈 흑색 원, 점선)를 사용한 경우 결합이 검출되지 않았다.
도 44는 활성화된 인간 CD8+ T 세포에 대한 결합을 요약하여 나타낸다. 상이한 4-1BB-특이적 분자에 대한 4-1BB-고발현 활성화된 CD8+ T 세포에 대한 결합의 곡선 아래 면적(AUC)을 나타냈다. 포맷 및 각각의 FAP-특이적 클론(28H1 또는 4B9)을 그래프 아래에 픽소그램으로 나타냈다. 4-1BB-결합 클론 12B3을 회색 기둥으로 나타낸 반면에, 이소타입 대조군 DP47 huIgG1 P329G LALA를 백색 기둥으로 나타냈다(단지 IgG, 왼편 기둥).
도 45A 및 45B는 인간 FAP-발현 세포에 대한 결합에 관한 것이다. 4-1BB-결합 분자의 농도를 PE-접합된 이차 검출 항체의 형광 강도의 기하 평균(MFI)에 대해 블롯팅한다. 모든 값은 블랭크 대조군(예를 들어 일차 검출 항체는 미함유하며 이차 검출 항체만 함유)의 기준선 값을 감하여 기준선 보정하였다. 도 45A는 FAP-중간발현 인간 흑색종 세포주 WM-266-4에 대한 결합을 나타내고, 도 45B는 FAP-고발현 NIH/3T3-huFAP 클론 19 세포에 대한 결합을 나타낸다. 단지 FAP-결합-도메인-함유 구축물, 예컨대 12B3 x FAP(28H1) 2+2 항원 결합 분자(채워진 흑색 삼각형), 12B3 x FAP(28H1) 1+1 항원 결합 분자(절반만 채워진 회색 원) 또는 12B3 x FAP(4B9) 4+1 항원 결합 분자(절반만 채워진 회색 사각형)가 FAP-발현 세포에 효율적으로 결합한다. FAP-비표적화된 분자 12B3 huIgG1 P329G LALA(채워진 흑색 사각형) 및 대조군 분자 DP47 huIgG1 P329G LALA(빈 흑색 원, 점선)를 사용시 결합은 관찰되지 않았다.
도 46은 인간 FAP-발현 NIH/3T3-huFAP 세포에 대한 결합을 요약하여 나타낸다. 상이한 4-1BB-특이적 분자에 대해 블롯팅된 FAP-고발현 NIH/3T3-huFAP 세포에 대한 결합의 곡선 아래 면적(AUC)을 나타냈다. 포맷 및 각각의 FAP-특이적 클론(28H1 또는 4B9)을 그래프 아래에 픽토그램으로 나타냈다. 4-1BB-결합 클론을 기둥 색으로 나타낸 반면에, 이소타입 대조군 DP47은 백색으로 나타내고, 4-1BB-특이적 클론 12B3을 함유하는 분자는 회색으로 나타냈다.
도 47A 내지 47I는 4-1BB 발현 리포터 세포주에서 NFκB-제어된 루시퍼라제 발현에 관한 것이다(실시예 10). 4-1BB-결합 분자의 농도를 6시간의 항온처리 후에 측정된 발광 단위(URL)에 대해 블롯팅하였다. 모든 값을 블랭크 대조군(예를 들어 항체가 첨가되지 않음)의 기준선 값을 감하여서 기준선 보정하였다. 도 47A, D 및 G는, 4-1BB-결합이 임의의 FAP-매개된 가교결합 없이 리포터 세포주에서 NFκB-제어된 루시퍼라제 발현을 유도하는, FAP-표적-독립적 4-1BB 활성화를 나타냈다. 구축물은 FAP-표적화된-독립적 활성화를 유도할 수 없었다. 도 47B, 47E 및 47H에서는 FAP-중간발현 인간 흑색종 세포주 WM-266-4가, 도 47C, 47F 및 47I에서는 FAP-고발현 세포주 NIH/3T3-huFAP 클론 19가 5:1의 비로 리포터 세포주에 첨가된다. FAP-발현 세포는 FAP-표적화된 4-1BB-결합 분자의 가교결합을 야기하고 4-1BB-발현 리포터 세포주에서 NFkB/루시퍼라제 활성화를 유도하는 이의 잠재력을 증가시킨다. 4가 4-1BB FAP-표적화된 4+1 분자는 FAP-발현 세포가 존재하자 곧 가장 강한 활성화를 나타냈다. 이는 클론 12B3(절반만 채워진 회색 사각형, 절반 점선, 도 47B 및 C), 클론 11D5(회색 별, 점선, 도 47E 및 F) 및 클론 25G7(절반만 채워진 삼각형, 점선, 도 47H 및 I)에 대해 적용된다.
도 48은 NIH/3T3-huFAP 세포의 존재하에 4-1BB-발현 리포터 세포주에서 NFκB-매개된 루시퍼라제 활성을 요약하여 나타낸다. NIH/3T3-huFAP 세포의 존재하에 활성화 곡선의 곡선 아래 면적(AUC)을 나타냈다(도 47C, F 및 I에 나타냄). 사용된 항체 포맷 및 항-FAP 클론(28H1 또는 4B9)을 그래프 아래에 픽토그램으로서 나타내고, 상이한 작용성 4-1BB 클론을 상이한 기둥 색으로 나타냈다. 이소타입 대조군 DP47은 백색(기준선)으로 나타내고, 4-1BB-특이적 클론 12B3은 회색으로 나타내고, 4-1BB-특이적 클론 25G7은 흑색으로 나타내고, 4-1BB-특이적 클론 11D5는 백색-흑색-체크로 나타냈다. 그래프는, FAP-표적화된 분자만이 백그라운드보다 높은 강한 활성화를 유도할 수 있고, FAP(4B9)-표적화된 4+1 구축물은 모든 다른 시험된 분자보다 우수함을 나타낸다.
도 49A 내지 49D는 실시예 11.4.1.1에 기술된 항-GITR 항체 8A06에 대한 교차-특이성의 측정에 관한 것이다. 도 49A는 종 교차-반응성의 결정을 위한 분석 구성의 개략적인 도식이다. 도 49B는 인간 GITR에 대한 항체 8A06의 특이성을 나타낸다. 도 49C는 사이노몰구스 GITR에 대한 특이성을 나타내고, 도 49D는 8A06이 뮤린 GITR에 결합하지 않음을 나타낸다.
인간 및 사이노몰구스 GITR에 대한 GITR 특이적 항체 8A06의 친화도를 결정하기 위한 분석 구성을 도 50A에 나타냈다. 도 50B는 인간 GITR에 대한 결과를 나타낸 반면에, 도 50C는 사이노몰구스 GITR에 대한 결과를 나타낸다.
도 51A 내지 51C는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 항-GITR 클론 8A06의 리간드 차단 특성을 나타낸다. 실험 설정(실시예 11.4.1.2 참조)을 도 51A에 나타냈고, 항-GITR IgG 8A06과 사전형성된 복합 huGITR/huGITR 리간드 사이의 관찰된 상호작용은 도 51B에서 찾아볼 수 있다. 도 51C는 항-GITR IgG 6C8과 사전형성된 복합 huGITR/huGITR 리간드 사이의 상호작용을 나타낸다.
도 52A 내지 52C는 실시예 11.4.1.3에 기술된 에피토프 비닝(binning)에 관한 것이다. GITR과 복합화된 사전형성된 항체에 대한 항-GITR 항체의 결합을 측정하였다. 도 52A는 분석 구성을 나타내고, 도 52B는 항-GITR 8A06 IgG와 클론 6C8/huGITR의 사전형성된 복합체 사이의 상호작용을 나타내고, 도 52C에는 항-GITR 6C8 IgG와 클론 8A06/huGITR의 사전형성된 복합체 사이의 상호작용이 제시된다.
도 53A는 FAP에 대해 1가를 갖는 예시적인 본 발명의 이중특이적 4가 항-GITR 항원 결합 분자(4+1 포맷)의 개략적인 도식을 나타낸다. 흑색 점은 2개의 상이한 중쇄의 보다 양호한 쌍형성을 가능하게 하는 놉-인투-홀 변형을 상징한다. 도 53B는 FAP에 대해 2가를 갖는 예시적인 본 발명의 이중특이적 4가 항원 결합 분자(4+2 포맷)의 개략적인 도식이다. 항-GITR Fab 단편의 불변 영역은 경쇄와의 보다 양호한 쌍형성을 가능하게 하기 위해 변형(하전된 잔기)을 함유할 수 있다.
도 54A 내지 54C는 이중특이적 4+1 및 4+2 항-GITR x 항-FAP 구축물의 동시 결합을 나타낸다. 실험 설정을 도 54A에 나타냈다. 고정화된 인간 GITR 및 인간 FAP(분석물 2)에 대한 항-GITR 클론 8A06(분석물 1)을 함유하는 이중특이적 4+1 구축물의 동시 결합을 도 54B에 나타냈다. 고정화된 인간 GITR 및 인간 FAP(분석물 2)에 대한 항-GITR 클론 8A06을 함유하는 이중특이적 4+2 구축물(분석물 1)의 동시 결합을 도 54C에 나타냈다.
도 55A 및 55B는 GITR-발현 HEK 세포에 대한 결합에 관한 것이다. 도 55A에 나타낸 바와 같이, 모든 시험된 이중특이적 항-GITR 구축물은 인간 GITR 발현 HEK 세포에 효율적으로 결합하였으나 GITR 음성 대조군 HEK 세포에는 결합하지 않거나 무시해도 될 정도의 비로 결합하였다(도 55B). 따라서, 항-GITR 클론의 GITR 특이성은 4가 이중특이적 FAP 표적화된 포맷에서도 유지된다. 모든 구축물은 항-GITR 클론 8A06 및 항-FAP 클론 28H1, 또는 표적화되지 않은 버전으로 생식계열 대조군 DP47GS로 생산된다. 4+2는 본원에 개시된 바와 같이 4개의 항-GITR 모이어티 및 2개의 항-FAP 모이어티를 갖는 4가 이중특이적 항원 결합 분자를 의미하는 반면에, 4+2 CR은 본원에 기술된 바와 같이 추가적 하전된 잔기를 갖는 분자를 의미한다.
도 56A 및 56B는 FAP-발현 3T3 세포에 대한 결합에 관한 것이다. 도 56A에 나타낸 바와 같이, 시험된 이중특이적 항-GITR x 항-FAP 구축물은 인간 FAP 발현 3T3 세포에 결합할 수 있었으나, FAP-음성 대조군 3T3 세포에는 결합하지 않거나 무시해도 될 정도의 비로 결합하였다(도 56B). 따라서, 항-FAP 클론의 FAP 특이성은 C-말단에서 1가 또는 2가 FAP 표적화 모이어티를 갖는 4가 이중특이적 포맷에서 유지된다.
도 57A 및 57B는 최적이하 자극된 TCR의 GITR-매개된 공자극을 나타낸다. 비-표적화된 4가 항-GITR 항원 결합 분자(GITR 8A06 DP47GS 4+1 sf w(1a))에 의한 공자극(삼각형)은 최적이하로 TCR 자극된 CD4(도 57A) 및 CD8 T 세포(도 57B)의 증식 증력에 대해 효과를 가지지 않은 반면에, 존재하는 NIH/3T3-huFAP 세포에 의한FAP-표적화된 항-GITR 구축물(GITR 8A06 28H1 4+1 sf W(1))(원)의 초가교결합은 T 세포 공자극에 필요하고 명백하게 증식을 촉진시킨다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원을 설명하기 위해, 하기의 정의가 적용될 것이고, 적절하다면, 단수형으로 사용된 용어는 또한 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자"는 그의 가장 일반적인 의미에서 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 항원 결합 분자의 예는 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 말한다. 하나의 양태에서, 항원 결합 모이어티는 그의 표적 세포 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 특정 양태에서, 항원 결합 모이어티는 그것이 부착되는 물질(예를 들어, TNF 계열 리간드 삼량체)을 표적 부위로, 예를 들어, 항원 결정기를 갖는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 기질로 유도할 수 있다. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 본원에서 더 정의되는 바와 같은 항체 및 그의 단편을 포함한다. 또한, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 본원에서 추가로 정의되는 바와 같은 스캐폴드 항원 결합 단백질, 예를 들어, 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인을 기반으로 하는 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, WO 2002/020565 참조).
항체 또는 그의 단편과 관련하여, 용어 "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 상기 항원의 일부 또는 전체에 상보적인 영역을 포함하는 분자의 부분을 말한다. 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는, 예를 들어, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 하나의 양태에서, "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 Fab 단편 또는 교차-Fab 단편이다.
용어 "공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 공자극 TNF 수용체 상위계열 구성원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 말한다. 한 양태에서, 상기 항원 결합 모이어티는 공자극 TNF 수용체 계열 구성원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 본원에서 더 정의되는 바와 같은 항체 및 그의 단편을 포함한다. 또한, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 본원에서 추가로 정의되는 바와 같은 스캐폴드 항원 결합 단백질, 예를 들어, 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인을 기반으로 하는 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, WO 2002/020565 참조). 특히, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 특정 양태에서, "공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 항체 단편이다. 하나의 양태에서, "공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 단일쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 이중 가변 도메인(DVD) 및 단일도메인 항체, Fab 단편 및 교차-Fab 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 특히, "공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 Fab 단편 또는 교차-Fab 단편이다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 일반적인 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구조물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 구성하는 개개 항체는 동일하고/하거나, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 생산시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미미한 양으로 존재한다)를 제외하고, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일특이적" 항체는 그 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다. 용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 별개의 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 상기 부위 각각은 상이한 항원 결정기에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정기, 특히 2개의 별개의 세포 상에서 발현된 2개의 항원 결정기에 동시에 결합할 수 있다.
본원 내에서 사용된 바와 같은 용어 "결합가(valent)"는 1개의 별개의 항원 결정기에 특이적인 항원 결합 분자에 1개의 별개의 항원 결정기에 특이적인 특정 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항원 결합 분자에 각각 특정 항원 결정기에 특이적인 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 의미한다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는 특정 항원 결정기에 대해 1가일 수 있거나, 즉, 상기 항원 결합 분자는 상기 항원 결정기에 대해 1개의 결합 부위만을 가지거나, 상기 항원 결합 분자는 특정 항원 결정기에 대해 2가일 수 있다, 즉, 상기 항원 결합 분자는 상기 항원 결정기에 대해 2개의 결합 부위를 갖는다. 본 발명의 특정 분자는 공자극 TNF 수용체에 대해 4가이며, 이는 이들이 공자극 TNF 수용체에 대해 4개의 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. "천연(native) 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 천연 IgG-클래스 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 경쇄 불변 도메인(CL)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)로 불리는 5가지 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 상기 유형 중 일부는 아형(subtype), 예를 들어, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 분류될 수 있다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체가 아닌 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 교차-Fab 단편; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예, scFv), 이중 가변 도메인(DVD) 및 단일 도메인 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해서는, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다; 또한 WO 93/16185; 및 US 5,571,894 및 5,587,458를 참조한다. 재생 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해서는, US 5,869,046을 참조한다. 다이아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조). 트라이아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기술되어 있다. 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc., 미국 매사추세츠주 월탐 소재)); 예를 들어, US 6,248,516 B1 참조)이다. 항체 단편은, 본원에 기술된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해성 절단뿐 아니라, 재조합 숙주 세포(예를 들어, 이콜라이(Escherichia coli; E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다.
온전한 항체의 파파인 절단은, 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인을 함유하는 "Fab" 단편으로 불리는, 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fab 단편"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 말한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 수개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올 기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부분을 갖는 F(ab')2 단편을 제공한다. 본 발명에 따라서, 용어 "Fab 단편"은 또한 "교차-Fab 단편" 또는 하기에서 정의되는 바와 같은 "크로스오버 Fab 단편"을 포함한다.
용어 "교차-Fab 단편", "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"은, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 단편을 말한다. 크로스오버 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 조성이 가능하며 본 발명의 이중특이적 항체에 포함된다. 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 교환된다, 즉, 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 분자는 또한 크로스Fab(VLVH)로도 지칭된다. 다른 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 교환되는 경우, 크로스오버 Fab 분자는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 분자는 또한 크로스Fab(CLCH1)으로 지칭된다.
"단일쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이고, 이때 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 가지고; 상기 링커는 30개 이상의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일쇄 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 상기 단일쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기의 삽입(예를 들어, 카바트 넘버링에 따라 가변 중쇄 중 위치 44 및 가변 경쇄 중 위치 100)에 의한 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 더 안정화될 수 있다.
"크로스오버 단일쇄 Fab 단편" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이며, 이때 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서: a) VH-CL-링커-VL-CH1 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 가지고; VH 및 VL은 함께, 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 상기 링커는 30개 이상의 아미노산의 폴리펩티드이다. 또한, 상기 x-scFab 분자는 시스테인 잔기의 삽입(예를 들어, 카바트 넘버링에 따라 가변 중쇄 중 위치 44 및 가변 경쇄 중 위치 100)에 의한 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 더 안정화될 수 있다.
"단일쇄 가변 단편(scFv)"은 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드에 의해 연결된, 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 통상적으로 유연성을 위해 글리신이 풍부할 뿐 아니라 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결시킬 수 있거나 그 반대도 가능하다. 상기 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는, 예를 들어, 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기술되어 있다. 또한, 항체 단편은, VL 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위로 조립될 수 있는 VH 도메인의 특성을 갖거나, VH 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위로 조립될 수 있는 VL 도메인의 특성을 가짐으로써, 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "이중 가변 도메인" 또는 "DVD"는 2개의 가변 도메인을 갖는 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 가변 도메인을 갖는 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자를 나타낸다. DVD 항체("DVD-Ig")에서, 각각의 절반은 2개의 표적 결합 부위를 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 각각의 결합 부위는 표적 결합에 수반되는 총 6개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. DVD-Ig 단백질에서 각각의 가변 도메인(VD)은 하나 이상의 목적하는 항원 또는 에피토프에 결합하는 하나 이상의 "모" 단일클론 항체(mAbs)로부터 수득될 수 있다. 생산된 DVD-Ig 분자는 모mAbs의 둘 다의 활성을 보유한다. 상세한 내용을 예를 들어 WO 2008/024188을 참조한다.
"스캐폴드 항원 결합 단백질"은 당해 분야에 공지되어 있다, 예를 들어, 피브로넥틴 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)이 항원-결합 도메인에 대한 대체 스캐폴드로서 사용되었다(예를 들어, 문헌[Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)] 및 [Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discov Today 13: 695-701 (2008)] 참조). 본 발명의 한 양태에서, 스캐폴드 항원 결합 단백질은 CTLA-4(에비바디(Evibody)), 리포칼린(Lipocalin)(안티칼린(Anticalin)), 단백질 A-유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디(Affibody)), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)), 혈청 트랜스페린(트랜스-바디); 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인(단일-도메인 항체, sdAb), 항체 중쇄의 가변 도메인(나노바디, aVH), VNAR 단편, 피브로넥틴(어드넥틴(AdNectin)), C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 새로운 항원 수용체 베타-락타마제의 가변 도메인(VNAR 단편), 인간 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴(어필린(Affilin) 분자); 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠(kunitz) 유형 도메인, 크노틴(knottin) 계열로부터의 단백질과 같은 미소체(microbody), 펩티드 압타머 및 피브로넥틴(어드넥틴)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. CTLA-4(세포독성 T 림프구-결합 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포 상에서 발현되는 CD28-계열 수용체이다. 그의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 접힘(fold)을 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 특성을 부여하는 이종 서열로 치환될 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로도 알려져 있다(예를 들어, US 7,166,697 B1). 에비바디는 항체(예를 들어, 도메인 항체)의 단리된 가변 영역과 대략 동일한 크기이다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조한다. 리포칼린은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 소형 소수성 분자를 운반하는 세포외 단백질의 한 계열이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 말단에서 다수의 루프를 갖는 견고한 베타-시트 이차 구조를 갖는다. 안티칼린은 160 내지 180개 아미노산의 크기이며, 리포칼린으로부터 유도된다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US 7,250,297 B1 및 US 2007/0224633을 참조한다. 어피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는, 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유도된 스캐폴드이다. 상기 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선형 다발로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위선정에 의해 제작되었다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462] 및 EP 1641818A1을 참조한다. 아비머는 A-도메인 스캐폴드 계열로부터 유도된 다중도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 천연 도메인은 한정된 다이설파이드 결합 구조를 취한다. A-도메인의 계열에 의해 나타난 자연적 변이의 셔플링에 의해 다양성이 발생된다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)] 및 [Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조한다. 트랜스페린은 단량체성 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 허용 표면 루프 내에 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예로는 트랜스-바디(Trans-body)가 포함된다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조한다. 설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPin)은 세포골격에 대한 내재성 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 한 계열인 안키린으로부터 유도된다. 단일 안키린 반복서열은 2개의 알파-나선 및 베타-회전으로 이루어지는 33개 잔기 모티프이다. 이들은 각 반복서열의 제1 알파-나선 및 베타-회전에서 잔기를 무작위선정함으로써 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 그의 결합 계면은 모듈의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다(친화도 증진 방법). 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)] 및 [J. MoI. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US 2004/0132028A1을 참조한다. 단일-도메인 항체는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 제1 단일 도메인은 카멜리드(camelid)로부터의 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유도되었다(나노바디 또는 VHH 단편). 또한, 용어 단일-도메인 항체는 상어로부터 유도된 자율적 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 VNAR 단편을 포함한다. 피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 어드넥틴은 제3형 인간 피브로넥틴(FN3)의 15개 반복 단위의 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 주쇄로 이루어진다. 베타-샌드위치의 한 말단에서 3개의 루프가, 어드넥틴이 해당 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], US 2008/0139791, WO 2005/056764 및 US 6,818,418 B1을 참조한다. 펩티드 압타머(peptide aptamer)는 불변 스캐폴드 단백질, 전형적으로는 활성 부위에 삽입된 제한적 가변 펩티드 루프를 함유하는 티오레독신(TrxA)으로 이루어지는 조합적 인식 분자이다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조한다. 미소체(microbody)는 3 내지 4개의 시스테인 가교를 함유하는, 25 내지 50개 아미노산 길이를 갖는 천연 미소단백질(microprotein)로부터 유도되며, 미소단백질의 예로는 칼라타BI(KalataBI) 및 코노톡신 및 크노틴이 포함된다. 미소단백질은 미소단백질의 전체 접힘에 영향을 미치지 않고 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 WO 2008/098796을 참조한다.
기준 분자와 "동일 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 분석에서 그 항원에 대한 기준 분자의 결합을 50% 이상 차단하는 항원 결합 분자를 말하며, 반대로, 기준 분자는 경쟁 분석에서 그 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 50% 이상 차단한다.
용어 "항원 결합 도메인" 또는 "항원-결합 부위"는 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 그와 상보적인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 부분을 말한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 단지 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 상기 부분은 에피토프로 지칭된다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 하나 이상의 가변 도메인(가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결정기"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이며, 항원 결합 모이어티가 결합되어 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들어, 아미노산의 연속 신장부 또는 비-연속 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태 구조)를 말한다. 유용한 항원 결정기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면상에서, 다른 질병에 걸린 세포의 표면상에서, 면역 세포의 표면상에서, 혈청내에서 유리하는 상태로, 및/또는, 세포외 기질(ECM) 중에서 발견할 수 있다. 본원에서 항원으로 유용한 단백질은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질을 언급할 때, 상기 용어는 "전장"의 비처리된 단백질뿐 아니라 세포내 처리로부터 비롯되는 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이며 원치않거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 또는 당해 분야에 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(비아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석됨)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석법(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 비관련 단백질에 대한 항원 결합 분자의 결합 정도는, 예를 들어, SPR로 측정시, 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 분자는 ≤1μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
"친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 따라서, 등가의 친화도는 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 한, 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
"친화도 증진된" 항체는, 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변이를 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서 하나 이상의 상기 변이를 갖는 항체를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들어, 암세포 또는 종양 기질의 세포와 같은 종양내 세포의 표면상에 존재하는 항원 결정기를 말한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원은 종양 세포의 표면상의 항원이다. 한 실시양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 암배아 항원(CEA), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다.
프롤릴 엔도펩티다제 FAP 또는 세프라제(Seprase)(EC 3.4.21)로도 알려진, 용어 "섬유아세포 활성화 단백질(FAP)"은 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FAP를 말한다. 상기 용어는 "전장"의 비처리된 FAP 뿐 아니라 세포내 처리로부터 비롯되는 임의의 형태의 FAP를 포함한다. 상기 용어는 또한, FAP의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스 FAP에 특이적으로 결합할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯(UniProt)(www.uniprot.org) 등록번호 Q12884(버전 149, 서열번호 55), 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에 나타나 있다. 인간 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 760까지 이른다. His-태그된 인간 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 서열번호 56 및 57에 각각 나타나 있다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P97321(버전 126, 서열번호 58), 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에 나타나 있다. 마우스 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 761에 이른다. 서열번호 59 및 60은 His-태그된 마우스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 서열번호 61 및 62는 His-태그된 사이노몰구스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 바람직하게, 본 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다.
암배아 항원-관련 세포 부착 분자 5(CEACAM5)로도 알려진, 용어 "암배아 항원(CEA)"은 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 CEA를 말한다. 인간 CEA의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P06731(버전 151, 서열번호 63)에 나타나 있다. 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4)로도 알려진, 용어 "흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)"은 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 MCSP를 말한다. 인간 MCSP의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 Q6UVK1(버전 103, 서열번호 64)에 나타나 있다. 원발암유전자 c-ErbB-1 또는 수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-1로도 알려진, 용어 "상피 성장 인자 수용체(EGFR)"는 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 EGFR을 말한다. 인간 EGFR의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P00533(버전 211, 서열번호 65)에 나타나 있다. 용어 "CD19"는 B-림프구 표면 항원 B4 또는 T-세포 표면 항원 Leu-12로도 알려진 B-림프구 항원 CD19를 말하고, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 CD19를 포함한다. 인간 CD19의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P15391(버전 160, 서열번호 66)에 나타나 있다. "CD20"은 막을 가로지르는(membrane-spanning) 4-도메인 하위계열 A 구성원 1(MS4A1), B-림프구 표면 항원 B1 또는 백혈구 표면 항원 Leu-16으로도 알려진 B-림프구 항원 CD20을 말하고, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 CD20을 포함한다. 인간 CD20의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P11836(버전 149, 서열번호 67)에 나타나 있다. "CD33"은 SIGLEC3 또는 gp67로도 알려진 골수 세포 표면 항원 CD33을 말하고, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD33을 포함한다. 인간 CD33의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P20138(버전 157, 서열번호 68)에 나타나 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원 결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성을 가지고/가지거나 항원 인식에 수반된다. 대표적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재한다(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)]). 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에 존재한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 초가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로도 지칭되며, 상기 용어는 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역 부분과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 특정 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기술되었으며, 여기서 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 아집단을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 언급하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 속해야 한다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 A에 나타내었다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당해 분야에 숙련된 자라면 통상적으로 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어느 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 결정할 수 있다.
[표 A]
Figure pct00001
카바트 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 번호 체계를 정의하였다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 서열 자체 이상의 임의의 실험 데이터를 의지하지 않고, 임의의 가변 영역 서열에 "카바트 번호"의 상기 체계를 명백하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카바트 번호"는 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 번호 체계를 말한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호에 대한 언급은 카바트 번호 체계를 따른다.
VH에서의 CDR1은 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, CDR은 항원과 접촉하는 잔기인 "특이적 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에 존재한다(문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인내 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 카바트 등의 상기 문헌에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 실시양태에서, 인간화된 항체는 1개 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들어, CDR)의 전체 또는 거의 전체가 비-인간 항체의 HVR에 상응하고, FR의 전체 또는 거의 전체가 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다. 본 발명에 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관해 본 발명에 따른 특성을 제공하기 위해 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되거나 변화된 항체이다.
"인간" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리(repertory) 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 명확하게 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 제외한다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로 대략 위치 231의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 340의 아미노산 잔기까지 이른다. 한 실시양태에서, 탄수화물 쇄가 CH2 도메인에 결합된다. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인까지 C-말단 잔기의 신장부(즉, IgG의 대략적 위치 341의 아미노산 잔기로부터 대략적 위치 447의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인(예를 들어, 그의 한 쇄에 도입된 "돌출부"("놉") 및 그의 다른 쇄에 상응하는 도입된 "공동(cavity)"("홀")을 갖는 CH3 도메인; 특별히 본원에 참고로 인용된 US 5,821,333 참조)일 수 있다. 상기 변이체 CH3 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 2개의 비-동일 항체 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys 226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이른다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
"놉-인투-홀" 기술은, 예를 들어, US 5,731,168; US 7,695,936; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 [Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 생산을 촉진하고 동종이량체 생산을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록, 제1 폴리펩티드의 계면에 돌출부("놉") 및 제2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동("홀")을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상호보완적 공동이 제2 폴리펩티드의 계면에 생성된다. 돌출부 및 공동은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 생산할 수 있다. 특정 실시양태에서, 놉 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 홀 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 추가로 아미노산 치환 S354C를 포함하고, 홀 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 추가로 아미노산 치환 Y349C를 포함한다. 상기 2개 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여 이량체를 더 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)]).
"면역글로불린의 Fc 영역과 등가의 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 대립유전자 변이체 뿐 아니라, 치환, 부가 또는 결실을 야기하지만 효과기 기능(예를 들어, 항체 의존성 세포성 세포독성)을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변이를 갖는 변이체를 포함하는 것이다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 상기 변이체는 활성에 최소의 영향을 미치기 위해 당해 분야에 공지된 일반적인 규칙에 따라 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990)] 참조).
용어 "효과기 기능"은 항체 이소타입에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 효과기 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
Fc 수용체 결합 의존성 효과기 기능은 항체의 Fc-영역과, 조혈 세포 상의 분화된 세포 표면 수용체인 Fc 수용체(FcR)과의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 상위계열에 속하며, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 통해, 면역 복합체의 식균작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 적혈구 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 다른 세포 표적(예를 들어, 종양 세포)의 용해 둘 다를 매개하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 문헌[Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524] 참조). FcR은 면역글로불린 이소타입에 대한 그의 특이성에 의해 정의된다: IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR로 지칭된다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어, 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]; [Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34]; [de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341]; 및 [Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248]에 기술되어 있다.
IgG 항체의 Fc-영역에 대한 수용체(FcγR)의 가교결합은 식균작용, 항체 의존성 세포성 세포독성 및 염증 매개인자의 방출뿐 아니라, 면역 복합체 제거 및 항체 생산 조절을 포함한 매우 다양한 효과기 기능을 촉발한다. 인간에서, 다음의 3개 클래스의 FcγR이 규정되었다:
- FcγRI(CD64)은 고친화도하에 단량체성 IgG와 결합하고, 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구 상에서 발현된다. 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329(카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서의 Fc-영역 IgG에서의 변형은 FcγRI에 대한 결합을 감소시킨다. 위치 233-236에서의 IgG2는 IgG1 및 IgG4로 치환되었고, FcγRI에 대한 결합을 103배 만큼 감소시켰으며, 항체-감작된 적혈구 세포에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다(문헌[Armour, K.L., et al., Eur.J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624]).
- FcγRII(CD32)는 중간 내지 낮은 친화도하에 복합체화 IgG에 결합하고 광범위하게 발현된다. 상기 수용체는 2개의 아형, FcγRIIA 및 FcγRIIB로 분류될 수 있다. FcγRIIA는 사멸에 수반되는 많은 세포(예를 들어, 대식세포, 단핵구, 호중구) 상에서 발견되며 사멸 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB는 억제 과정에서 역할을 하는 것으로 보이며 B 세포, 대식세포 상에서 및 비만세포 및 호산구 상에서 발견된다. B-세포 상에서 상기 FcγRIIB는 추가의 면역글로불린 생산 및 예를 들어, IgE 클래스로의 이소타입 전환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식세포 상에서, FcγRIIB는 FcγRIIA를 통해 매개되는 바와 같은 식균작용을 억제하도록 작용한다. 호산구 및 비만세포 상에서, B-형태는 그의 별개의 수용체에 대한 IgE 결합을 통한 상기 세포의 활성화를 억제하는 것을 촉진할 수 있다. FcγRIIA에 대해 감소된 결합은, 예를 들어, 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414(카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체의 경우에서 확인된다.
- FcγRIII(CD16)은 낮은 친화도하에 IgG와 결합하고 2개 유형으로 존재한다. FcγRIIIA는 NK 세포, 대식세포, 호산구 및 일부 단핵구 및 T 세포 상에서 발견되고 ADCC를 매개한다. FcγRIIIB는 호중구 상에서 고도로 발현된다. FcγRIIIA에 대한 감소된 결합은, 예를 들어, 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376(카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체의 경우에서 확인된다.
Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위, 상기 언급한 돌연변이 부위의 지도화, 및 FcγRI 및 FcγRIIA에 대한 결합을 측정하는 방법은 문헌[Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]에 기술되어 있다.
용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포성 세포독성"은 Fc 수용체 결합에 의해 매개된 기능이며, 효과기 세포의 존재하에 본원에서 보고된 바와 같은 항체에 의한 표적 세포의 용해를 말한다. ADCC를 매개하는 초기 단계를 유도하는 항체의 능력은, Fcγ 수용체 발현 세포, 예를 들어, FcγRI 및/또는 FcγRIIA 또는 NK 세포(근본적으로 FcγRIIIA를 발현시킴)를 재조합적으로 발현하는 세포에 대한 그의 결합을 측정함으로써 조사된다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 후속 결합이 효과기 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 이벤트를 유도하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체로는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)이 포함된다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa(유니프롯 등록번호 P08637, 버전 141 참조)이다.
"종양 괴사 인자 수용체 상위계열" 또는 "TNF 수용체 상위계열"은 현재 27개 수용체로 이루어진다. 이것은 세포외 시스테인-풍부 도메인(CRD)을 통해 종양 괴사 인자(TNF)와 결합하는 능력을 특징으로 하는 사이토카인 수용체의 군이다. 상기 유사반복서열(pseudorepeat)은 수용체 쇄 내에 고도로 보존된 시스테인 잔기에 의해 생성된 쇄내 다이설파이드에 의해 정의된다. 신경 성장 인자(NGF)는 제외하고, 모든 TNF는 원형적 TNF-알파에 상동적이다. 그의 활성 형태에서, TNF 수용체의 대부분은 원형질막에서 삼량체성 복합체를 형성한다. 따라서, 대부분의 TNF 수용체는 막관통 도메인(TMD)을 함유한다. 상기 수용체 중 여러개는 또한 카스파제 활성화의 외인성 경로를 개시하는 리간드 결합 후에 카스파제-상호작용 단백질을 동원하는 세포내 사멸 도메인(DD)을 함유한다. 사멸 도메인이 결여된 다른 TNF 상위계열 수용체는 TNF 수용체-연관 인자와 결합하고 증식 또는 분화를 유도할 수 있는 세포내 신호전달 경로를 활성화시킨다. 이들 수용체는 또한 세포자살을 개시할 수 있지만, 간접적 메카니즘을 통해 세포자살을 유도한다. 세포자살을 조절하는 것 이외에, 여러 TNF 상위계열 수용체는 B 세포 항상성 및 활성화, 자연 살해세포 활성화 및 T 세포 공자극과 같은 면역 세포 기능을 조절하는 데 수반된다. 여러 다른 수용체는 모공 발달 및 파골세포 발달과 같은 세포 유형-특이적 반응을 조절한다. TNF 수용체 상위계열의 구성원은 다음을 포함한다: 종양 괴사 인자 수용체 1(1A)(TNFRSF1A, CD120a), 종양 괴사 인자 수용체 2(1B)(TNFRSF1B, CD120b), 림프독소 베타 수용체(LTBR, CD18), OX40(TNFRSF4, CD134), CD40(Bp50), Fas 수용체(Apo-1, CD95, FAS), 디코이(Decoy) 수용체 3(TR6, M68, TNFRSF6B), CD27(S152, Tp55), CD30(Ki-1, TNFRSF8), 4-1BB(CD137, TNFRSF9), DR4(TRAILR1, Apo-2, CD261, TNFRSF10A), DR5(TRAILR2, CD262, TNFRSF10B), 디코이 수용체 1(TRAILR3, CD263, TNFRSF10C), 디코이 수용체 2(TRAILR4, CD264, TNFRSF10D), RANK(CD265, TNFRSF11A), 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin)(OCIF, TR1, TNFRSF11B), TWEAK 수용체(Fn14, CD266, TNFRSF12A), TACI(CD267, TNFRSF13B), BAFF 수용체(CD268, TNFRSF13C), 헤르페스바이러스 유입 매개체(HVEM, TR2, CD270, TNFRSF14), 신경 성장 인자 수용체(p75NTR, CD271, NGFR), B-세포 성숙화 항원(CD269, TNFRSF17), 글루코코르티코이드-유도성 TNFR-관련 분자(GITR, AITR, CD357, TNFRSF18), TROY(TNFRSF19), DR6(CD358, TNFRSF21), DR3(Apo-3, TRAMP, WS-1, TNFRSF25) 및 엑토디스플라신(Ectodysplasin) A2 수용체(XEDAR, EDA2R).
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 계열의 여러 구성원은 초기 T 세포 활성화후에 T 세포 반응을 지속하도록 작용한다. 용어 "공자극 TNF 수용체 계열 구성원", "공자극 TNF 수용체 상위계열 구성원" 또는 "공자극 TNF 상위계열 수용체"는 T-세포의 증식 및 사이토카인 생성을 공자극할 수 있는 TNF 수용체 상위계열 구성원의 아군(subgroup)을 말한다. 상기 용어는 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간), 비-인간 영장류(예, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 TNF 계열 수용체를 말한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 공자극 TNF 수용체 상위계열 구성원은 OX40(CD134), 4-1BB(CD137), CD27, HVEM(CD270), CD30 및 GITR로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들 모두는 T 세포에 공자극 효과를 가질 수 있다. 보다 특히, 공자극 TNF 수용체 상위계열 구성원은 OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.
TNF 수용체 상위계열 구성원의 추가의 정보, 특히 서열은 유니프롯(www.uniprot.org)과 같은 대중적으로 접근가능한 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 공자극 TNF 수용체는 하기의 아미노산 서열을 갖는다: 인간 OX40(유니프롯 등록번호 P43489, 서열번호 69), 인간 4-1BB(유니프롯 등록번호 Q07011, 서열번호 70), 인간 CD27(유니프롯 등록번호 P26842, 서열번호 71), 인간 HVEM(유니프롯 등록번호 Q92956, 서열번호 72), 인간 CD30(유니프롯 등록번호 P28908, 서열번호 73) 및 인간 GITR(유니프롯 등록번호 Q9Y5U5, 서열번호 74).
용어 "OX40"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 OX40을 말한다. 상기 용어는 "전장"의 비처리된 OX40 뿐 아니라 세포내 처리로부터 비롯되는 임의의 형태의 OX40을 포함한다. 예시적인 인간 OX40의 아미노산 서열은 서열번호 69(유니프롯 P43489, 버전 112)에 나타나 있고, 예시적인 뮤린 OX40의 아미노산 서열은 서열번호 75(유니프롯 P47741, 버전 101)에 나타나 있다.
용어 "항-OX40 항체", "항-OX40", "OX40 항체" 및 "OX40에 특이적으로 결합하는 항체"는 항체가 OX40을 표적화함에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도하에 OX40에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 한 실시양태에서, 비관련, 비-OX40 단백질에 대한 항-OX40 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사선면역분석(RIA) 또는 유세포분석(FACS)에 의해 측정시 OX40에 대한 항체 결합의 약 10%보다 적다. 특정 실시양태에서, OX40에 결합하는 항체는 ≤1μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들어, 10-6 M 이하, 예를 들어, 10-68 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-8 내지 10-10 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
용어 "4-1BB"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 4-1BB를 말한다. 상기 용어는 "전장" 비처리 4-1BB 뿐 아니라 세포내 처리로부터 비롯되는 임의의 형태의 4-1BB를 포함한다. 상기 용어는 또한 4-1BB의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 4-1BB의 아미노산 서열은 서열번호 70(유니프롯 등록번호 Q07011)에 나타나 있고, 예시적인 뮤린 4-1BB의 아미노산 서열은 서열번호 76(유니프롯 등록번호 P20334)에 나타나 있고, 예시적인 사이노몰구스 4-1BB(히말라야 원숭이(Macaca mulatta)로부터)의 아미노산 서열은 서열번호 77(유니프롯 등록번호 F6W5G6)에 나타나 있다.
용어 "항-4-1BB 항체", "항-4-1BB", "4-1BB 항체" 및 "4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체"는 항체가 4-1BB를 표적화함에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도하에 4-1BB에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 한 실시양태에서, 비관련, 비-4-1BB 단백질에 대한 항-4-1BB 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사선면역분석(RIA) 또는 유세포분석(FACS)에 의해 측정시 4-1BB에 대한 항체 결합의 약 10%보다 적다. 특정 실시양태에서, 4-1BB에 결합하는 항체는 ≤1μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들어, 10-6 M 이하, 예를 들어, 10-68 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-8 내지 10-10 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
용어 "GITR"은, 본원에 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 토끼)를 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득된 임의의 천연 GITR을 말한다. 상기 용어는 "전장" 비처리 GITR뿐만 아니라 세포내 처리로부터 비롯되는 임의의 형태의 GITR을 포함한다. 또한, 상기 용어는 자연적으로 발생한 GITR의 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적 인간 GITR의 아미노산 서열은 서열번호 74(유니프롯 P43489, 버전 112)에 나타나 있다.
용어 "항-GITR 항체", "항-GITR", "GITR 항체 및 "GITR에 특이적으로 결합하는 항체"는, GITR을 표적화함에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도하에 GITR에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 하나의 양태에서, 비관련 비-GITR 단백질에 대한 항-GITR 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사선면역분석(RIA) 또는 유세포분석(FACS)에 의해 측정시 GITR에 대한 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 특정 실시양태에서, GITR에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어 10-6 M 이하, 예를 들어 10-68 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-8 M 내지 10-10 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
용어 "펩티드 링커"는 1개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 말한다. 펩티드 링커는 당해 분야에 공지되어 있거나, 본원에 기술되어 있다. 적합한 비-면역원성 링커 펩티드는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커(여기서, "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수, 특히 2이다), 즉, GGGGS(서열번호 78) GGGGSGGGGS(서열번호 79), SGGGGSGGGG(서열번호 80) 및 GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 81)로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이지만, 또한 서열 GSPGSSSSGS(서열번호 82), (G4S)3(서열번호 83), (G4S)4(서열번호 84), GSGSGSGS(서열번호 85), GSGSGNGS(서열번호 86), GGSGSGSG(서열번호 87), GGSGSG(서열번호 88), GGSG(서열번호 89), GGSGNGSG(서열번호 90), GGNGSGSG(서열번호 91) 및 GGNGSG(서열번호 92)도 포함한다. 특히 주목되는 펩티드 링커는 (G4S)(서열번호 78), (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS(서열번호 79) 및 (G4S)4(서열번호 84)이다.
용어 "아미노산"은 본 출원내에서 사용될 때, 알라닌(3-문자 코드: ala, 1-문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
"융합된" 또는 "연결된"은 구성성분(예를 들어, 항체의 중쇄 및 Fab 단편)이 펩티드 결합에 의해 직접적으로, 또는 1개 이상의 펩티드 링커에 의해 결합된 것을 의미한다.
기준 폴리펩티드(단백질) 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN.SAWI 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었으며, 소스 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office, 미국 워싱턴 디씨 20559)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 대중적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함하여, 유닉스 작업 시스템상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다:
100 x 분수 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체를, 상기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다. 상기 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구축물을 수득할 수 있으나, 단, 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들어, 항원-결합 특성을 가져야 한다. 치환적 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 프레임워크(FR)를 포함한다. 보존적 치환을 "바람직한 치환"이란 제목하에 표 B에 나타내었으며, 아미노산 측쇄 클래스 (1) 내지 (6)과 관련하여 하기에서 더 기술된다. 아미노산 치환은 해당 분자 내에 도입될 수 있으며, 생성물은 목적하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.
[표 B]
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Gln;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 클래스중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 것이다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 모 항원 결합 분자(예를 들어, 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기에 아미노산 치환이 존재하는 실질적인 변이체를 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 수득된 변이체는 모 항원 결합 분자에 비해 특정 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 변화(예를 들어, 개선)를 가질 것이고/것이거나, 모 항원 결합 분자의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 증진된 항체로서, 이것은, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 증진 기술을 이용하여 편리하게 생산될 수 있다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항원 결합 분자를 파지상에 디스플레이시키고 특정 생물 활성(예를 들어, 결합 친화도)을 스크리닝한다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 상기 변이가 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에서 이루어질 수 있다. 돌연변이유발에 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 표적 잔기(예를 들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항원 결합 분자 복합체의 결정 구조로 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인한다. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 그들이 목적하는 특성을 보유하는지를 측정하기 위해 변이체를 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1개 잔기로부터 백개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 뿐 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 포함된다. 상기 분자의 다른 삽입 변이체는 상기 이중특이적 항원 결합 분자의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
특정 양태에서, 본원에서 제공된 이중특이적 항원 결합 분자는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변이된다. 상기 분자의 글리코실화 변이체는, 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변이시킴으로써 편리하게 수득될 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물이 변이될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 결합된, 분지된 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐 아니라, 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정한 개선된 특성을 갖는 변이체를 생산하기 위해 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자중 상기 올리고사카라이드의 변형이 수행될 수 있다. 한 양태에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 변이체가 제공된다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들어, US 2003/0157108(프레스타(Presta, L.)) 또는 US 2004/0093621(쿄와 하꼬 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)) 참조). 또 다른 양태에서, 예를 들어, Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 변이체가 제공된다. 상기 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들어, WO 2003/011878(진-메이렛(Jean-Mairet) 등); US 6,602,684(우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546(우마나 등) 참조). Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 1개 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 변이체도 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있으며, 예를 들어, WO 1997/30087(파텔(Patel) 등); WO 1998/58964(라주(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764(라주)에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 분자의 1개 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 시스테인 조작된 변이체, 예를 들어, "티오MAb"를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양태에서, 치환된 잔기는 분자의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치되고, 항체를 다른 모이어티, 예를 들어, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카바트 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항원 결합 분자는, 예를 들어, US 7,521,541에 기술된 바와 같이 생산될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스-유래 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1개 이상의 핵산 분절, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 말한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경으로부터 분리된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하는 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 있어서 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 또 다른 예는 이종 숙주 세포들내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체 뿐 아니라, 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생산된 상기 분자를 또한 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어, 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미하는 것이다. 즉, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열중 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열중 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 일부의 뉴클레오티드가 기준 서열중에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 상기 변이는, 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열중의 잔기 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 기중의 잔기 가운데 개별적으로 배치된, 상기 말단 위치 사이 어디에서나 일어날 수 있다. 실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로, 폴리펩티드에 대해 상기 논의한 것(예를 들어, ALIGN-2)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소를 사용하여 재조합적으로 또는 합성적으로 생산된 폴리뉴클레오티드를 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편내에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열 중에서, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중 특이적 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구축물"과 동의어이며, 표적 세포에서 작동가능하게 결합되는 특정 유전자를 도입하고 상기 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용되는 DNA 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터 뿐 아니라, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 일단 발현 벡터가 표적 세포 내부에 있으면, 상기 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질은 세포 전사 및/또는 번역 절차에 의해 생산된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계 없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들어, 배양된 포유동물 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
약제의 "효과량"은 약제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기하기 위해 필요한 양을 말한다.
약제, 예를 들어, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 필요한 시간 기간 동안 효과적인 양을 말한다. 약제의 치료 효과량은, 예를 들어, 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나 방지한다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특히, 개체 또는 대상은 인간이다.
용어 "약학 조성물"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하는 그런 형태이면서, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 부형제"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 조성물내 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 부형제로는 완충액, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병용 치료, 금기 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 그의 문자적 변형, 예를 들어, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 분자는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "암"은, 예를 들어, 그의 난치성 형태를 포함하여, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 복부암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨(Hodgkin)병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계(CNS) 종양, 척추 종양, 뇌간교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평세포암, 뇌하수체 선종 및 유잉(Ewing) 육종, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합과 같은 증식성 질환을 말한다.
본 발명의 이중특이적 항체
본 발명은 생산성, 안정성, 결합 친화도, 생물 활성, 표적화 효율 및 감소된 독성과 같은 특히 유리한 특성을 갖는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
예시적 이중특이적 항원 결합 분자
하나의 양태에서, 본 발명은
(a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양태에서, 이들 이중특이적 항원 결합 분자는 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대한 작용성 결합을 특징으로 한다. 특히, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 OX40, 4-1BB 및 GITR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 특히, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 OX40 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택된다.
OX40에 결합하는 이중특이적 4가 항원 결합 분자
하나의 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 OX40이다. 특히, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양태에서, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티는 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인, 및;
(iv) 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인.
특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티는 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(c) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(d) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(f) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(v) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(vi) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
(vii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명은, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 28의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
보다 특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또한, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 이중특이적 항원 결합 분자는 이들이 전형적으로 암 세포인 표적 세포에서 공자극 T 세포 반응을 선택적으로 유도한다는 유리점을 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 통상적 항체에 비해 갖는다. 하나의 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. FAP 결합 모이어티는 그 전체가 본원에 참고로 포함된 WO 2012/02006에 기술되어 있다. 특히 관심있는 FAP 결합 모이어티가 하기에 기술된다.
하나의 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(i) 서열번호 39 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, (i) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 또는 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되,
(a) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(b) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(c) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(d) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(e) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(f) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(g) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(h) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(i) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(j) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(k) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(l) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(m) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(n) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
보다 특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나; OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 임의적으로, 이들은 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 임의적으로 이들이 펩티드 링커를 통해 이의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명은 2개의 중쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 각각의 중쇄는 OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티의 가변 도메인 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티의 가변 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편이고, 이 중 각각의 2개가 서로 연결되는, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가 양태에서, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
4- 1BB에 결합하는 이중특이적 4가 항원 결합 분자
하나의 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 4-1BB(CD137)이다. 특히, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양태에서, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티는 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 249 및 서열번호 250으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 251 및 서열번호 252로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 253, 서열번호 254, 서열번호 255, 서열번호 256 및 서열번호 257로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 258 및 서열번호 259로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 260 및 서열번호 261로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 262, 서열번호 263, 서열번호 264, 서열번호 265 및 서열번호 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인.
특히, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티는 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(b) 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 255의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 264의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(c) 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 265의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인,
(d) 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 266의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 263의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 267, 서열번호 269, 서열번호 271, 서열번호 273 및 서열번호 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 268, 서열번호 270, 서열번호 272, 서열번호 274 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(i) 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ii) 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iii) 서열번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iv) 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
(v) 서열번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명은, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 267의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 보다 특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 269의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 270의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 보다 특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 이중특이적 항원 결합 분자는 이들이 전형적으로 암 세포인 표적 세포에서 공자극 T 세포 반응을 선택적으로 유도한다는 유리점을 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 통상적 항체에 비해 갖는다. 하나의 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. FAP 결합 모이어티는 그 전체가 본원에 참고로 포함된 WO 2012/02006에 기술되어 있다. 특히 관심있는 FAP 결합 모이어티가 하기에 기술된다.
하나의 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(i) 서열번호 39 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, (i) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 267, 서열번호 269, 서열번호 271, 서열번호 273 및 서열번호 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 268, 서열번호 270, 서열번호 272, 서열번호 274 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되,
(a) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(b) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(c) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(d) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(e) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(f) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(g) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(h) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(i) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(j) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 임의적으로, 이들은 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 특히, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 연결되고, 임의적으로 이들은 이의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 펩티드 링커를 통해 연결되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 분자는 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 중쇄는 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티의 가변 도메인 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티의 가변 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편이고, 이들 중 각각의 2개가 서로 연결되는, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가 양태에서, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
GITR에 결합하는 이중특이적 4가 항원 결합 분자
하나의 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원은 GITR이다. 특히, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
하나의 양태에서, GITR에 특이적으로 결합할수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티는 서열번호 371의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 373의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 374의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 375의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 376의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 384의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 상기 모이어티는 서열번호 377의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 378의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 379의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 380의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 381의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 381의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 385의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 386의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 385의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 386의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또한, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 이중특이적 항원 결합 분자는 이들이 전형적으로 암 세포인 표적 세포에서 공자극 T 세포 반응을 선택적으로 유도한다는 유리점을 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 통상적 항체에 비해 갖는다. 하나의 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. FAP 결합 모이어티는 그 전체가 본원에 참고로 포함된 WO 2012/02006에 기술되어 있다. 특히 관심있는 FAP 결합 모이어티가 하기에 기술된다.
하나의 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(i) 서열번호 39 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, (i) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, (a) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(b) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, (i) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 385의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 386의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, (a) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 385의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 386의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
(b) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 385의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 386의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
하나의 양태에서, 본 발명은, GITR에 특이적으로 결합할수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 임의적으로, 이들은 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개는 서로 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 임의적으로 이들은 이의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 펩티드 링커를 통해 연결된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 분자는 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 중쇄는 GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이이어티의 가변 도메인 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티의 가변 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, GITR에 특이적으로 결합할수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편이고, 이들 중 각각의 2개가 서로 연결되는, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가 양태에서, OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가 서로 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 임의적으로, 이들은 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 특히, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되되, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개는 추가로 이의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 임의적으로 이들은 이의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 펩티드 링커를 통해 연결된다.
특정 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 분자는 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 중쇄는 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티의 가변 도메인 및 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티의 가변 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편이고, 이들 중 각각의 2개가 서로 연결되는, 본원 상기에 정의된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
추가 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편의 VH 도메인에 융합되고, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제4 Fab 단편의 VH 도메인에, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 융합되는, 본원 상기에 기술된 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
표적 세포 항원에 대해 1가를 갖는 4가 이중특이적 항원 결합 분자(4+1 포맷)
하나의 양태에서, 본 발명은 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 1가인 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
특정 양태에서, (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
하나의 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 VH 및 VL 도메인을 포함하되, VH 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, VL 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에 연결되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 양태에서, 펩티드 링커는 (G4S)4이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이되, 놉-인투-홀 방법에 따라 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 홀을 포함하고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 놉을 포함하는 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 홀을 포함하는 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에 연결된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이되, 놉-인투-홀 방법에 따라 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 홀을 포함하고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VL 도메인은 펩티드 링커를 통해 놉을 포함하는 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 도메인은 펩티드 링커를 통해 홀을 포함하는 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에 연결된다.
하나의 양태에서, (a) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편,
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
구체적 양태에서, (i) 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 구체적 양태에서, 서열번호 233의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 234의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 구체적 양태에서, 서열번호 237의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 238의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, (a) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편,
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
구체적 양태에서, (i) 서열번호 327의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 328의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
(ii) 서열번호 331의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 332의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
(iii) 서열번호 335의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 336의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
(iv) 서열번호 339의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 340의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 301의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 구체적 양태에서, (i) 서열번호 343의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
(ii) 서열번호 347의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 348의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
(iii) 서열번호 351의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 352의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
(iv) 서열번호 355의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 356의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 301의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, (a) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편,
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
구체적 양태에서, 서열번호 401의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 402의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 393의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 서열번호 405의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 406의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 397의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
표적 세포 항원에 대해 2가를 갖는 4가 이중특이적 항원 결합 분자(4+2 포맷)
또 다른 양태에서, 본 발명은
(a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 2가인 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편인, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
추가 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편 각각이 VH 또는 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 양태에서, 펩티드 링커는 (G4S)4이다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 VH-VL 크로스오버 Fab 단편이고 각각 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 CH-CL 크로스오버 Fab 단편이고 각각 VH 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
구체적 양태에서, 본 발명은
(a) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편,
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
보다 특히, (i) 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 서열번호 226의 제1 경쇄 및 서열번호 228의 제2 경쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
구체적 양태에서, 본 발명은
(a) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편,
(b) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
보다 특히, (i) 서열번호 409의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 서열번호 393의 제1 경쇄 및 서열번호 410의 제2 경쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, (i) 서열번호 412의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 서열번호 397의 제1 경쇄 및 서열번호 410의 제2 경쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
또한, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다.
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc-영역내에 도입됨으로써 Fc 영역 변이체를 생산할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
Fc 도메인은, 표적 조직에서의 양호한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 유리한 조직-혈액 분포비를 포함하는 유리한 약동학적 특성을 본 발명의 이중특이적 항체에 제공한다. 그러나, 동시에, Fc 도메인은, 본 발명의 이중특이적 항체의 바람직하지 않은 표적화를 바람직한 항원-함유 세포가 아니라 Fc 수용체를 발현하는 세포로 유도할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체의 Fc 도메인은, 천연 IgG Fc 도메인, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 보다 특히, Fc 도메인은 IgG1 FC 도메인이다.
한 상기 양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)은, 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 한 양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히는 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특히는 인간 FcγRIIIa이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 억제 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 억제 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히는 인간 FcγRIIB이다. 한 양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비 중 하나 이상이다. 특정 양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 한 양태에서, Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교시, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합은, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화도의 약 70%보다 크고, 특히 약 80%보다 크고, 보다 특히 약 90%보다 큰 결합 친화도를 나타낼 때 달성된다.
특정 양태에서, Fc 도메인은, 비-조작된 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 한 양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 또 다른 양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 감소시킨다. 한 양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는, 비-조작된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자에 비해, 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 다른 양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 억제 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 억제 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히는 인간 FcγRIIB이다. 일부 양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특히는 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게, 상기 수용체 각각에 대한 결합은 감소된다. 일부 양태에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도도 또한 감소된다. 한 양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 유지는, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 Fc 도메인의 비-조작된 형태(또는 Fc 도메인의 상기 비-조작된 형태를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화도의 약 70%보다 더 큰 결합 친화도를 나타낼 때 달성된다. Fc 도메인 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 친화도의 약 80%보다 크고, 심지어 약 90%보다 큰 친화도를 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 비-조작된 Fc 도메인에 비해, 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능으로는 다음 중 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다: 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC), 감소된 항체 의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수의 감소, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵구에 대한 감소된 결합, 다형핵 세포에 대한 감소된 결합, 세포자살을 유도하는 직접 신호전달의 감소, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍.
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다(US 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(US 7,332,581)를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다. FcR에 대한 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기술되어 있다(예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]).
본 발명의 한 양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A("LALA")를 포함한다. 한 상기 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329의 아미노산 치환, 및 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은, WO 2012/130831 A1에 기술된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 제거한다. 상기 특허출원은 또한 상기 돌연변이 Fc 도메인을 생산하는 방법, 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 특성을 측정하는 방법을 기술하고 있다. 상기 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A를 가지거나 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 IgG1이다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]의 EU 인덱스에 따른 넘버링).
하나의 양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(카바트 넘버링)에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔(arm) 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참조).
증가된 반감기, 및 모체 IgG의 태아로의 전이를 담당하는(문헌[Guyer,R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593], 및 [Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434]) 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US 2005/0014934에 기술되어 있다. 상기 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체로는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(US 7,371,826)을 갖는 변이체가 포함된다. 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 문헌[Duncan,A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740]; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
Fc 수용체에 대한 결합은, 예를 들어, ELISA에 의해, 또는 비아코어 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))와 같은 표준 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있으며, Fc 수용체는 예를 들어 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 상기 결합 분석법은 본원에서 기술된다. 또는, Fc 수용체에 대한, Fc 도메인의 결합 친화도 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화도는, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포와 같이 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가할 수 있다. Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체의 효과기 기능은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석법은 본원에서 기술된다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 다른 예는 US 5,500,362; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; US 5,821,337; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수 있다(예를 들어, 유세포분석을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨) 참조). 상기 분석에 유용한 효과기 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
하기 단락은 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 바람직한 양태를 기술한다. 한 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로, 이때 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로, 이때 상기 Fc 도메인은 효과기 기능을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 Fc 도메인이다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원 결합 부위를 포함하므로, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 2개의 비-동일 폴리펩티드 쇄에 포함될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 재조합 공-발현 및 후속 이량체화는 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유도한다. 따라서, 재조합체 생산에서 본 발명의 이중특이적 항체의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 모이어티 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로, 이때 상기 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 한 양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
특정 양태에서, 상기 변형은, Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나에 "놉" 변형을 포함하고 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 나머지 하나에 "홀" 변형을 포함하는소위 "놉-인투-홀" 변형이다. 따라서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 놉-인투-홀 방법에 따라 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브 유닛은 홀을 포함한다. 특정 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고(EU 넘버링), Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V를 포함한다(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링).
놉-인투-홀 기술은, 예를 들어, US 5,731,168; US 7,695,936; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 [Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은, 이종이량체 생산을 촉진하고 동종이량체 생산을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록 제1 폴리펩티드의 계면에 돌출부("놉") 및 제2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동("홀")을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 보상적인 공동이 제2 폴리펩티드의 계면에 생성된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 돌출부가 생성되고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서는, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다. 돌출부 및 공동은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 생산될 수 있다. 특정 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서, 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서, 위치 407에서의 티로신 잔기가 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 한 양태에서, Fc 도메인의 제2 서브유닛에서, 추가로 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 세린 잔기로 치환되고(T366S), 위치 368에서의 류신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된다(L368A).
또 다른 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서, 추가로 위치 354에서의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서는, 위치 349에서의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여, 이량체를 더 안정화시킨다(문헌[Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15]). 특정 양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(EU 넘버링)를 포함하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 포함한다.
대안적 양태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형은, 예를 들어, WO 2009/089004에 기술된 바와 같이 정전기 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은, 동종이량체 생산은 정전기적으로 불리하지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 것을 포함한다.
Fab 도메인에서의 변형
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이되, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편에서 또는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편에서 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 교환된다. 이중특이적 항체는 크로스맙(Crossmab) 기술에 따라 생산된다.
하나의 결합 팔에서 도메인 치환/교환을 갖는 다중특이적 항체(크로스Mab VH-CL 또는 크로스Mab CH-CL)는 WO 2009/080252 및 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191]에 상세하게 기술되어 있다. 이들은 명백하게 (상기 도메인 교환을 갖지 않는 접근방법에 비해) 제1 항원에 대한 경쇄와 제2 항원에 대한 부적절한 중쇄와의 미스매치에 의해 야기된 부산물을 감소시킨다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이되, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편에서 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되어 VH 도메인이 경쇄의 일부이고, VL 도메인이 중쇄의 일부이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이되, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 Fab 단편에서 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되어 CH1 도메인이 경쇄의 일부이고 CL 도메인이 중쇄의 일부이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 4개의 경쇄 및 2개의 중쇄의 항체, 및 (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 추가적 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이되, 상기 추가적 Fab 단편은 각각 펩티드 링커, 특히 (G4S)4를 통해 (a)의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 특정 양태에서, 추가적 Fab 단편은 교차-Fab 단편이되, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되어 VH 도메인이 경쇄의 일부이고 VL 도메인이 중쇄의 일부이거나, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되어 CH1 도메인이 경쇄의 일부이고 CL 도메인이 중쇄의 일부이다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 4개의 경쇄 및 2개의 중쇄의 항체, 및 (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 추가적 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하되, 상기 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 추가적 Fab 단편은 크로스오버 Fab 단편이고, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되고, VL-CH 쇄는 서로 펩티드 링커를 통해 (a)의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 특정 양태에서, 펩티드 링커는 (G4S)4이다.
또 다른 양태에서, 상이한 중쇄 및 경쇄의 정확한 쌍형성을 보다 개선하기 위해, (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 4개의 경쇄 및 2개의 중쇄의 항체, 및 (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 추가적 Fab 단편을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 하전된 아미노산 치환(소위 "하전된 잔기")을 함유할 수 있다. 이들 변형은 교차되거나 비-교차된 CH1 및 CL 도메인에 도입된다. 하나의 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편의 CL 도메인 중 하나의 불변 도메인 CL에서, 위치 123의 아미노산이 R로 치환되고 위치 124의 아미노산이 K로 치환된다(카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링). 추가 양태에서, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편의 CH1 도메인 중 하나의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147 및 213의 아미노산은 E로 치환된다(카바트의 EU 인덱스에 따른 넘버링).
특정 양태에서, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편의 CL 도메인 중 하나에서, 위치 123의 아미노산(EU 넘버링)이 아르기닌(R)으로 대체되고, 위치 124의 아미노산(EU 넘버링)이 라이신(K)으로 대체되고, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 Fab 단편의 CH1 도메인 중 하나에서, 위치 147의 아미노산(EU 넘버링) 및 위치 213의 아미노산(EU 넘버링)이 글루탐산(E)으로 치환된, 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 도메인에 인접한 CL 도메인에서, 위치 123의 아미노산(EU 넘버링)이 아르기닌(R)으로 대체되고 위치 124의 아미노산(EU 넘버링)이 라이신(K)으로 치환되고, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CH1 도메인에서, 위치 147의 아미노산(EU 넘버링) 및 위치 213의 아미노산(EU 넘버링)이 글루탐산(E)으로 치환된, Fab 단편을 포함하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명의 예시적 항체
하나의 양태에서, 본 발명은 GITR에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이의 단편을 제공한다. 특히, GITR에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되되, 상기 항체는 (a) 서열번호 371의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 373의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 374의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 375의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 376의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
하나의 양태에서, GITR에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되되, 상기 항체는 서열번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
추가 양태에서, 결합에 대해 GITR에 특이적으로 결합하는 항체와 경쟁하는 항체가 제공되되, 상기 항체는 서열번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
또한, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 전체 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현되거나 공-발현되는 다중(예를 들어, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 예를 들어, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합되어 기능성 항원 결합 분자를 생산할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린의 경쇄 부분은 면역글로불린의 중쇄 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공-발현되는 경우, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 면역글로불린을 생산할 것이다.
일부 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 이중특이적 분자에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
하나의 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 151, 서열번호 155, 서열번호 159, 서열번호 163, 서열번호 167, 서열번호 171, 서열번호 175, 서열번호 184, 서열번호 211, 서열번호 212, 서열번호 215, 서열번호 216, 서열번호 223, 서열번호 224, 서열번호 225, 서열번호 235 및 서열번호 236으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특히, 서열번호 155, 서열번호 211 및 서열번호 212의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 155, 서열번호 215 및 서열번호 216을 포함하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 287, 서열번호 291, 서열번호 295, 서열번호 299, 서열번호 303, 서열번호 325, 서열번호 326, 서열번호 329, 서열번호 330, 서열번호 333, 서열번호 334, 서열번호 337, 서열번호 338, 서열번호 341, 서열번호 342, 서열번호 345, 서열번호 346, 서열번호 349, 서열번호 350, 서열번호 353 및 서열번호 354로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 391, 서열번호 399, 서열번호 400, 서열번호 407 및 서열번호 408로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 (a) GITR에 특이적으로 결합할수 있는 4개의 모이어티, (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및 (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
특정 실시양태에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 이중특이적 항체는, 예를 들어, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들어, 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생산의 경우, 예를 들어, 전술한 바와 같은 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. 예를 들어, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기술되어 있는 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편(즉, 암호화 영역)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재하는 경우, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 측면인접(flanking) 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 미번역된 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어, 본 발명의 벡터는 번역후 또는 번역과 동시에 단백질분해성 절단에 의해 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은, 제한하지 않고, 특수 요소 또는 모티프, 예를 들어, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동가능한 결합은, 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절하에 유전자 산물의 발현이 일어나게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어, 폴리펩티드 암호화 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 사이의 결합의 특성이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 결합"된 것이다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 결합되는 것이다. 프로모터는, 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들어, 인핸서, 작동유전자, 억제유전자 및 전사 종결 신호가 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다.
적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 영역, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(예, 인트론-A와 함께, 급속 초기발현(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(예, 초기발현 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들어, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 분절(이로 한정되지는 않는다)이 포함된다. 다른 전사 조절 영역으로는 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것 뿐 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서 뿐 아니라, 유도성 프로모터(예를 들어, 테트라사이클린 유도성 프로모터)가 포함된다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소가 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat, LTR), 또는 아데노-연관 바이러스(AAV) 역 말단 반복서열(ITR)과 같은 다른 특징도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 결합될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편의 분비를 목적하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 위치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 확산이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 상기 신호 펩티드는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어, 분비된 형태 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생산함을 인지할 것이다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작동가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 또는, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 기능성 유도체가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
후속의 정제를 용이하게 하거나(예를 들어, 히스티딘 태그) 또는 융합 단백질의 표지화를 돕기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA가 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 그의 말단에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 한 양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어, 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 단편을 생산하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 말한다. 항원 결합 분자를 복제하고 그의 발현을 촉진하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 세포는 특정 발현 벡터로 적절하게 형질감염되거나 형질도입될 수 있으며, 대규모 발효조에 접종하여 임상 용도로 충분한 양의 항원 결합 분자를 수득하기 위해 대량의 벡터 함유 세포를 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예를 들어, 이콜라이, 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 세균에서 생산될 수 있다. 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며, 더 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩티드의 생산을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 [Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조).
(글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양균도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, (유전자전이 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES, 상표) 기술을 기술하고 있는) US 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429를 참조한다. 척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 dhfr_ CHO 세포[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 단백질 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포로는 배양 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프구 세포(예, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 상기 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 둘 다 갖는 면역글로불린이도록 면역글로불린 쇄 중 나머지 쇄를 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편의 발현에 적합한 조건하에서, 본원에서 제공된 바와 같은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편의 생산 방법이 제공된다.
본원에 기술된 바와 같이 생산된 본 발명의 이중특이적 분자는 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로, 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인에 따라 달라질 것이며, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스를 사용할 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 근본적으로 실시예에 기술된 바와 같이 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. 이중특이적 항원 결합 분자 또는 그의 단편의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하여 다양한 공지된 임의의 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 실시예에서 기술된 바와 같이 발현된 이중특이적 항원 결합 분자는 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에 의해 입증되는 바와 같이 온전하고 적절히 구성된 것으로 나타났다.
분석
본원에 제공된 항원 결합 분자는, 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나 특성규명될 수 있다.
1. 친화도 분석
상응하는 TNF 수용체에 대한 본원에 제공된 이중특이적 항원 결합 분자의 친화도는, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 나타낸 방법에 따라 측정될 수 있다. 표적 세포 항원에 대한 이중특이적 항원 결합 분자의 친화도도 또한, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예증적이고 예시적인 실시양태는 실시예 2에서 기술된다. 한 양태에 따라서, KD는 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다.
2. 결합 분석 및 기타 분석
상응하는 수용체 발현 세포에 대한 본원에 제공된 이중특이적 항원 결합 분자의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여, 예를 들어, 유세포분석(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 한 양태에서, TNF 수용체를 발현하는 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 결합 분석에 사용된다. 상기 세포는 단리 후에(미감작(naive) PBMC) 또는 자극 후에(활성화된 PBMC) 바로 사용된다. 또 다른 양태에서, 상응하는 TNF 수용체 발현 세포에 대한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 결합을 입증하기 위해 활성화된 마우스 비장세포(TNF 수용체 분자를 발현하는)를 사용하였다. 또 다른 양태에서, 건강한 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)의 헤파린첨가 혈액으로부터 단리된 PBMC를 사용하여 상응하는 사이노몰구스 TNF 수용체 발현 세포에 대한 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 결합을 밝혔다.
추가 양태에서, 표적 세포 항원, 예를 들어, FAP를 발현하는 암 세포주를 사용하여 표적 세포 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 입증하였다.
또 다른 양태에서, 경쟁 분석을 이용하여 표적 또는 TNF 수용체 각각에 결합하기 위해 특이적 항체 또는 항원 결합 분자와 경쟁하는 항원 결합 분자를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항원 결합 분자는 특이적 항-표적 항체 또는 특이적 항-TNF 수용체 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 그에 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
3. 활성 분석
한 양태에서, 특이적 표적 세포 항원에 및 생물 활성을 갖는 특이적 TNF 수용체에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물 활성은, 예를 들어, 표적 세포 항원을 발현하는 세포 상에서 TNF 수용체를 통한 작용물질 신호전달을 포함할 수 있다. 상기 분석에 의해 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 것으로 확인된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자도 또한 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 생물 활성에 대해 시험된다. 또한, 세포 용해(예를 들어, LDH 방출을 측정함으로써), 유도된 세포자살 동역학(예를 들어, 카스파제 3/7 활성을 측정함으로써) 또는 세포자살(예를 들어, TUNEL 분석을 이용하여)을 검출하기 위한 분석은 당해 분야에 공지되어 있다. 또한, 상기 복합체의 생물 활성은, NK 세포, NKT-세포 또는 γδ T-세포와 같은 다양한 림프구 아집단의 생존, 증식 및 림포카인 분비에 대한 그의 영향을 평가하거나, 수지상 세포, 단핵구/대식세포 또는 B-세포와 같은 항원 제공 세포의 표현형 및 기능을 조절하는 그의 능력을 평가함으로써 평가될 수 있다.
약학 조성물, 제형 및 투여 경로
추가 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 하기 치료 방법 중 임의의 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자 및 1개 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자 및 1개 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 치료제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제에 용해되거나 분산된 하나 이상의 이중특이적 결합 분자를 치료 효과량으로 포함한다. "약학적 또는 약리학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉, 예를 들어, 인간과 같은 동물에게 적절하게 투여될 때, 해롭거나, 알레르기성이거나 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 말한다. 본 발명에 따른 하나 이상의 이중특이적 결합 분자 또는 항체 및 임의적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는, 본원에 참고로 도입된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시된 바와 같이, 본 개시내용을 고려하여, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있을 것이다. 특히, 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 임의 및 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예, 항균제, 항진균제), 등장화제, 염, 안정화제 및 그의 혼합물을 포함한다.
비경구 조성물로는 주사, 예를 들어, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 기관지내 또는 복강내 주사에 의해 투여하도록 설계된 것이 포함된다. 주사의 경우, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충액, 예를 들어, 행크(Hank) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리적 식염수 완충액 중에 제형화될 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 사용전에, 적당한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원-미함유수로 조성되기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사액은, 본 발명의 항원 결합 분자를, 필요에 따라, 하기에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요량으로 혼입시킴으로써 생산된다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 생산된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 생산을 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 생산 방법은 사전에 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조 기술이다. 액체 매질은 필요한 경우 적절히 완충되어야 하며, 액체 희석제는 주사전에 충분한 식염수 또는 글루코스로 먼저 등장성이 되어야 한다. 조성물은 생산 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들어, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 부형제로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체(예, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사용 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한 적당한 안정화제, 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 생산을 가능케 하는 약제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 생산될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들어, 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어, 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세리드 또는 리포좀이 포함된다.
활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 생산된 미세캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 거대유화액중에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 생산할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 특정 실시양태에서, 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물중에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 그의 혼합물을 사용하여 이루어질 수 있다.
본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 부형제로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rhuPH20을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 2006/0104968에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 혼합된다.
예시적인 동결건조 항체 제형이 US 6,267,958에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908에 기술된 것이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
전술한 조성물 이외에, 항원 결합 분자는 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 상기 지효성(long acting) 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내에)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 융합 단백질은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 약학 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정에 의해 생산될 수 있다. 약학 조성물은, 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
이중특이적 항원 결합 분자는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물내에 배합될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물 활성을 실질적으로 유지하는 염이다. 이들로는 산 부가염, 예를 들어, 단백성 조성의 유리 아미노 기에 의해 생성된 염, 또는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산에 의해 생성된 염이 포함된다. 유리 카복실 기에 의해 생성된 염도 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기로부터; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다.
본 발명의 조성물은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나 초과의 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로에 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적인 활성을 갖는 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분은 의도한 목적에 효과적인 양으로 적절히 함께 존재한다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균 물질이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 올바른 의료 행위에 따른 방식으로 제형화되고 조제되고 투여된다. 이와 관련하여 고려될 요인으로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지되어 있는 기타 요인이 포함된다.
하나의 양태에서, 약제로 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다.
또 다른 양태에서, (i) T 세포 반응을 자극하거나 증대시키는 데 사용하거나, (ii) 활성화된 T 세포의 생존을 촉진하는 데 사용하거나, (iii) 감염의 치료에 사용하거나, (iv) 암의 치료에 사용하거나, (v) 암의 진행을 지연시키는 데 사용하거나, (vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존을 연장시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 특정 양태에서, 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다.
특정 양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 한 양태에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은, 치료 효과량의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 치료될 질환은 암이다. 치료를 필요로 하는 대상, 환자 또는 "개체"는 전형적으로 포유동물, 보다 특히는 인간이다.
하나의 양태에서, 치료 효과량의 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 그를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, (i) T 세포 반응을 자극하거나 증대시키거나, (ii) 활성화된 T 세포의 생존을 촉진하거나, (iii) 감염을 치료하거나, (iv) 암을 치료하거나, (v) 암의 진행을 지연시키거나, (vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존을 연장시키는 방법이 제공된다.
추가 양태에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제를 생산하는 데 있어서 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 상기 약제는 질환을 갖는 개체에게 치료 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 양태에서, 치료될 질환은 증식성 질환, 특히 암이다. 암의 예로는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 뼈암, 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 질환으로는 복부, 뼈, 유방, 소화기관, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 및 비뇨생식계에 위치한 종양이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 전암성 병태 또는 병변 및 암 전이도 또한 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신세포암, 피부암, 폐암, 대장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 숙련된 전문가라면 많은 경우에서 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체가 치유를 제공할 수는 없지만 이익을 제공할 수 있음을 용이하게 인지한다. 따라서, 일부 양태에서, 생리적 변화를 제공하는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로 간주된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 특정 분자, 질환의 중증도 및 과정, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 병행 치료 개입, 환자의 병력 및 융합 단백질에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 담당하는 의사는 아무튼 조성물 중 활성 성분의 농도 및 개개 대상에 적절한 용량을 결정할 것이다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예, 0.1 내지 10 mg/kg)의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가, 예를 들어, 하나 이상의 별개 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 한 일일 투여량은 상기 언급한 요인에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 다른 예로, 용량은 또한 투여당, 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중, 약 1000 mg/kg 체중 이상, 및 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 예로, 전술한 숫자에 준하여, 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주, 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들어, 약 6개 용량의 융합 단백질을 투여받도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진전은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 일반적으로 의도한 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하기 위한 용도로, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체, 또는 그의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용을 고려하여, 당해 분야에 숙련된 자의 능력에 속한다.
전신 투여의 경우, 치료 효과적인 용량은 초기에 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석으로부터 평가될 수 있다. 이어서, 세포 배양물에서 측정시 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 용량을 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 상기 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, 생체내 데이터, 예를 들어, 동물 모델로부터 평가될 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 동물 데이터에 근거하여 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여에 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위이다. 치료 효과적인 혈장 수준은 매일 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들어, HPLC로 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 섭취의 경우, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수도 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 과도한 실험 없이 치료 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 치료 효과적 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않고 치료 이점을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구를 이용하여 LD50(한 집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(한 집단의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수로서, 비 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 한 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 수득된 데이터를, 인간에 사용하기에 적합한 범위의 투여량을 제형화하는 데 이용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 든다. 상기 투여량은 다양한 요인, 예를 들어, 사용되는 투여 형태, 사용되는 투여 경로, 대상의 병태 등에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 병태를 고려하여 개개 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, 본원에 전체로 참고로 도입된 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 융합 단백질로 치료되는 환자의 주치의는 독성, 장기 기능부전 등으로 인해 투여를 어떻게 및 언제 종료하거나, 중단하거나 조정할지를 알 것이다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해하는 독성), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알 것이다. 해당 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료될 병태의 중증도에 따라, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 병태의 중증도는, 예를 들어, 부분적으로, 표준 진단 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 용량 빈도도 또한 개개 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 약제 및 치료
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 치료에서 하나 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 동시-투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 상기 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 상기 추가의 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적 활성을 갖는 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가적 치료제는 또 다른 항암제이다.
상기 다른 약제는 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다. 상기 다른 약제의 효과량은 사용되는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의한 기타 요인에 따라 달라진다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체는 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급한 상기 병용 치료는 복합 투여(2개 이상의 치료제가 동일 조성물 또는 별개의 조성물에 포함되는 경우) 및 별도의 투여를 포함하며, 별도 투여의 경우, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 상기 용기 상의 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 생산될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 항체이다.
표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 아니면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 상기 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
[표 C]
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모든 뉴클레오티드 서열은 각각의 정지 코돈 서열 없이 제시된다.
하기에 본 발명의 구체적 실시양태가 열거된다:
1. (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티,
(b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자.
2. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원이 OX40 및 4-1BB로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제1항의 이중특이적 항원 결합 분자.
3. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원이 OX40인, 제1항 또는 제2항의 이중특이적 항원 결합 분자.
4. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
5. OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자로서, 각각의 상기 모이어티가
(i) 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
6. OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
7. OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이
(i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(iv) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(v) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
(vi) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
(vii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL
을 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
8. 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
9. 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)인, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
10. FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
(i) 서열번호 68 및 서열번호 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) 서열번호 70 및 서열번호 71로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) 서열번호 72 및 서열번호 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(iv) 서열번호 74 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
(v) 서열번호 76 및 서열번호 77로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
(vi) 서열번호 78 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
11. (i) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 또는 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 또는 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 80 또는 서열번호 82의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 81 또는 서열번호 83의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
12. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편이고, 이들 중 각각의 2개가 서로 연결되는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
13. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편의 VH 도메인에 융합되고, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제4 Fab 단편의 VH 도메인에, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 융합되는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
14. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 불변 도메인 CH1에서 위치 147 및 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
15. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 1가인 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
16. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 VH 및 VL 도메인을 포함하고, VH 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, VL 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에 연결되는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
17. Fc 도메인이 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
18. 놉-인투-홀 방법에 따라 Fc 도메인의 제1 서브유닛이 놉을 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛 이 홀을 포함하는, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
19. Fc 도메인의 제1 서브유닛이 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), Fc 도메인의 제2 서브유닛이 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V를 포함하는(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
20. (i) 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
21. 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 2가인, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
22. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편인, 제1항 내지 제14항 및 제21항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
23. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편 각각이 VH 또는 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 제1항 내지 제14항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
24. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 VH-VL 크로스오버 Fab 단편이고 각각 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 제1항 내지 제14항 및 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
25. (i) 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 서열번호 226의 제1 경쇄 및 서열번호 228의 제2 경쇄
를 포함하는, 제1항 내지 제14항 및 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
26. Fc 도메인이 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 것인(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
29. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제28항의 약학 조성물.
30. (i) T 세포 반응을 자극하거나,
(ii) 활성화된 T 세포의 생존을 지원하거나,
(iii) 감염을 치료하거나,
(iv) 암을 치료하거나,
(v) 암의 진행을 지연시키거나,
(vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존을 연장시키는 데
사용하기 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제28항의 약학 조성물.
31. 암을 치료하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제28항의 약학 조성물.
32. 이중특이적 항원 결합 분자를 화학치료제, 방사선 및/또는 암 면역치료에 사용하기 위한 다른 제제와 조합으로 투여하는, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제28항의 약학 조성물.
33. 개체에게 효과량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제28항의 약학 조성물을 투여하여 종양 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 개체의 종양 세포 성장의 억제 방법.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 실시양태가 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 생산사의 지시에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH PublicationNo 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열은 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
유전자 합성
목적하는 유전자 분절을 적절한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생산하거나 자동 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 진아트 아게(Geneart AG, 독일 레겐스부르크)에 의해 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 가장 근사한 동족체로부터의 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 적절한 조직에서 유래한 RNA로부터 RT-PCR에 의해 유전자를 분리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 측면에 위치한 유전자 분절을 표준 클로닝/서열화 벡터 내에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터내에 서브클로닝시키기 위해 적절한 제한효소 부위를 갖는 유전자 분절을 설계하였다. 모든 구축물은 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계되었다.
단백질 정제
표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 간략하게, 항체를 단백질 A 세파로스 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하고 PBS로 세척하였다. pH 2.8에서 항체를 용출시킨 후 샘플을 즉시 중화시켰다. 응집된 단백질을 PBS 중에서 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(pH 6.0) 중에서 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200, 지이 헬쓰케어)에 의해 단량체성 항체로부터 분리하였다. 단량체성 항체 분획을 모으고, (필요한 경우) 예를 들어, 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고, 냉동시키고 -20℃ 또는 -80℃에서 저장하였다. 예를 들어, SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량 분석법에 의한 후속 단백질 분석 및 분석적 특성규명을 위해 샘플의 일부를 제공하였다.
SES-PAGE
뉴페이지(NuPAGE, 등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐 (Invitrogen))을 생산사의 지시에 따라 사용하였다. 특히, 10% 또는 4 내지 12% 뉴페이지(등록상표) 노벡스(Novex, 등록상표) 비스-트리스(Bis-TRIS) 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 뉴페이지(등록상표) MES(환원 겔, 뉴페이지(등록상표) 산화방지제 러닝 완충액(running buffer)첨가제 사용) 또는 MOPS(비-환원 겔) 러닝 완충액을 사용하였다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태를 측정하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 HPLC 크로마토그래피로 수행하였다. 간략하게, 단백질 A 정제된 항체를 에이질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7.5) 중에서 토소(Tosoh) TSK겔 G3000SW 컬럼에 적용하거나, 디오넥스 HPLC-시스템상에서 2 x PBS 중에서 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적 적분에 의해 정량화하였다. 바이오래드 겔 여과 표준물(BioRad Gel Filtration Standard) 151-1901이 표준물로 사용되었다.
질량 분석법
본 단락은 그의 정확한 구성을 강조하여 VH/VL 교환(크로스Mab)을 갖는 다중특이적 항체의 특성규명을 기술한다. 예상된 1차 구조는 탈글리코실화된 온전한 크로스Mab 및 탈글리코실화된/플라스민 절단되거나 양자택일적으로 탈글리코실화된/제한 LysC 절단된 크로스Mab의 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
37℃에서 1 mg/ml의 단백질 농도에서 포스페이트 또는 트리스 완충액 중에서 N-글리코시다제 F를 사용하여 17시간 이하 동안 상기 크로스Mab를 탈글리코실화시켰다. 플라스민 또는 제한된 LysC(로슈) 절단은 각각 실온에서 120시간 동안 및 37℃에서 40분 동안, 트리스 완충액(pH 8) 중에서 100 ㎍ 탈글리코실화 VH/VL 크로스Mab를 사용하여 수행하였다. 질량 분석 전에, 샘플을 세파덱스 G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에서 HPLC에 의해 탈염시켰다. 총 질량은 트라이버사 나노메이트(TriVersa NanoMate) 광원(애드비온(Advion))이 장착된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브루커 달토닉(Bruker Daltonik)) 상에서 ESI-MS에 의해 측정하였다.
실시예 1: Ox40 항체 및 도구 결합자의 생산
1.1 파지 디스플레이에 의한 새로운 OX40 결합자의 생산을 위한 항원 및 스크리닝 도구의 생산, 정제 및 특성규명
인간, 마우스 또는 사이노몰구스 OX40의 엑토도메인을 암호화하는 DNA 서열(표 1)을 놉 상에 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다(Merchant et al., 1998). AcTEV 프로테아제 절단 부위를 인간 IgG1의 항원 엑토도메인과 Fc 사이에 도입하였다. 유도된 비오틴화를 위한 Avi 태그를 항원-Fc 놉의 C-말단에 도입시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항원-Fc 놉 쇄와 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 Fc 홀 쇄의 결합은 OX40 엑토도메인 함유 쇄의 단일 카피를 포함하는 이종이량체의 생산을 가능하게 하여, Fc-결합 항원의 단량체 형태를 생산하였다(도 1A). 표 1은 다양한 OX40 엑토도메인의 아미노산 서열을 나타낸다. 표 2는 도 1에 도시된 바와 같은 단량체성 항원 Fc(kih) 융합 분자의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
모든 OX40-Fc-융합체 암호화 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 신호 서열을 함유하는 플라스미드 벡터 내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유하였다.
비오틴화된 단량체성 항원/Fc 융합 분자의 생산을 위해, 지수적으로 성장하는 현탁 HEK293 EBNA 세포를 융합 단백질의 2개 성분(놉 쇄 및 홀 쇄) 뿐 아니라, 비오틴화 반응에 필수적인 효소인 BirA를 암호화하는 3개의 벡터로 동시-형질감염시켰다. 상응하는 벡터를 2:1:0.05 비("항원 ECD-AcTEV-Fc 놉":"Fc 홀":"BirA")로 사용하였다.
500 ml 진탕 플라스크에서의 단백질 생산을 위해, 4억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열시킨 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍의 벡터 DNA를 함유하는 20 mL의 CD CHO 배지에 재현탁시켰다. 540 ㎕의 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드(Feed)를 배양물에 첨가하였다. 배양 7일 후에, 세포를 210 g에서 15분 동안 스핀다운시켜 세포 상등액을 수거하였다. 용액을 멸균 여과시키고(0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01%(v/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지시켰다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 친화성 크로마토그래피를 위해, 상등액을, 40 mL 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 평형화된 하이트랩 프로테인A(HiTrap ProteinA) HP 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다. 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨 및 0.5 M 염화 나트륨(pH 7.5)을 함유하는 완충액 적어도 10 컬럼 부피로 세척하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은 20 컬럼 부피의 20 mM 시트르산 나트륨, 0.01%(v/v) 트윈-20(트윈-20)(pH 3.0)에 걸쳐 생성된 염화 나트륨(0 mM으로부터 500 mM 까지)의 선형 pH-구배를 이용하여 용출시켰다. 이어서, 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 염화 나트륨 및 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 3.0)을 함유하는 용액 10 컬럼 부피로 컬럼을 세척하였다.
수거된 분획의 pH를 1/40(v/v)의 2 M 트리스(pH 8.0)를 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시키고 여과시킨 후 pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화 나트륨, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200(HiLoad Superdex 200) 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
1.2 포괄적 Fab 및 공통 경쇄 라이브러리로부터 Ox40 -특이적 8H9 , 20B7 , 49B4, 1G4, CLC-563, CLC-564 및 17A9 항체의 선별
항-OX40 항체를 3개의 상이한 포괄적 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별하였다: DP88-4(클론 20B7, 8H9, 1G4 및 49B4), 공통 경쇄 라이브러리 Vk3_20/VH3_23(클론 CLC-563 및 CLC-564) 및 람다-DP47(클론 17A9).
DP88-4 라이브러리를, 경쇄의 CDR3(L3, 3가지 상이한 길이) 및 중쇄의 CDR3(H3, 3가지 상이한 길이)에서 무작위 서열 스페이스를 포함하는 V-도메인 쌍 Vk1_5(카파 경쇄) 및 VH1_69(중쇄)를 사용하여 인간 생식계열 유전자를 기반으로 구축하였다. 라이브러리 제작을 중복 연장 스플라이싱(SOE) PCR을 적용하여 3개의 PCR-증폭된 단편의 조립에 의해 수행하였다. 단편 1은 무작위 L3을 포함하는 항체 유전자의 5' 말단을 포함하고, 단편 2는 L3으로부터 H3까지 걸쳐있는 중심 불변 단편인 반면, 단편 3은 무작위 H3 및 항체 유전자의 3' 부분을 포함한다. 하기의 프라이머 조합을 이용하여 DP88-4 라이브러리를 위한 상기 라이브러리 단편을 생산하였다: 각각 단편 1(역방향 프라이머 Vk1_5_L3r_S 또는 Vk1_5_L3r_SY 또는 Vk1_5_L3r_SPY와 함께 정방향 프라이머 LMB3), 단편 2(역방향 프라이머 RJH32와 함께 정방향 프라이머 RJH31) 및 단편 3(역방향 프라이머 fdseqlong와 함께 정방향 프라이머 DP88-v4-4 또는 DP88-v4-6 또는 DP88-v4-8). 라이브러리 단편의 생산을 위한 PCR 파라미터는 94℃에서 5분 초기 변성, 25주기의 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 및 72℃에서 10분 동안의 말단 신장이었다. 조립 PCR의 경우, 동몰비의 겔-정제된 단일 단편을 주형으로 사용하여, 파라미터는 94℃에서 3분 초기 변성, 및 5주기의 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 2분이었다. 이 단계에서, 외부 프라이머(LMB3 및 fdseqlong)를 가하고 20주기를 더 수행한 후 72℃에서 10분 동안 말단 신장을 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위 Fab 구축물의 조립 후, 이들을 NcoI/NheI로 절단하고 유사하게 처리된 수용체(acceptor) 파지미드 벡터내에 접합시켰다. 정제된 접합물을 전기천공적격 이콜라이 TG1 내로의 ~60 형질전환에 사용하였다. Fab 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 회수하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다. 상기 라이브러리 구축 단계를 3회 반복하여 4.4 x 109의 최종 라이브러리 크기를 수득하였다. 점 블롯으로 C-말단 태그 검출에 의해 측정시, 기능성 클론의 백분율은 각각 경쇄의 경우 92.6% 및 중쇄의 경우 93.7%이었다.
중쇄의 CDR3(H3, 3가지 상이한 길이)에 불변 비-무작위 공통 경쇄 Vk3_20 및 무작위 서열 스페이스를 포함하는 V-도메인 쌍 Vk3_20(카파 경쇄) 및 VH3_23(중쇄)을 사용하여 인간 생식계열 유전자를 기반으로 공통 경쇄 라이브러리 Vk3_20/VH3_23을 구축하였다. 라이브러리 제작은 중복 연장 스플라이싱(SOE) PCR을 적용하여 2개 PCR-증폭된 단편의 조립에 의해 수행하였다. 단편 1은 L3으로부터 H3까지 걸쳐 있는 불변 단편인 반면, 단편 2는 무작위 H3 및 항체 유전자의 3' 부분을 포함한다. 하기의 프라이머 조합을 사용하여 Vk3_20/VH3_23 공통 경쇄 라이브러리를 위한 상기 라이브러리 단편을 생산하였다: 각각 단편 1(역방향 프라이머 DP47CDR3_ba(변형)와 함께 정방향 프라이머 MS64) 및 단편 2(역방향 프라이머 fdseqlong와 함께 정방향 프라이머 DP47-v4-4, DP47-v4-6, DP47-v4-8). 라이브러리 단편의 생산을 위한 PCR 파라미터는 94℃에서 5분 초기 변성, 25주기의 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 및 72℃에서 10분 동안의 말단 신장이었다. 조립 PCR의 경우, 동몰비의 겔-정제된 단일 단편을 주형으로 사용하여, 파라미터는 94℃에서 3분 초기 변성, 및 5주기의 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 2분이었다. 이 단계에서, 외부 프라이머(MS64 및 fdseqlong)를 가하고 18주기를 더 수행한 후 72℃에서 10분 동안 말단 신장을 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위 VH 구축물의 조립 후, 이들을 MunI/NotI로 절단하고 유사하게 처리된 수용체 파지미드 벡터내에 접합시켰다. 정제된 접합물을 전기천공적격 이콜라이 TG1 내로의 ~60 형질전환에 사용하였다. Fab 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 회수하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다. 3.75 x 109의 최종 라이브러리 크기를 수득하였다. 점 블롯으로 C-말단 태그 검출에 의해 측정시, 기능성 클론의 백분율은 각각 경쇄의 경우 98.9% 및 중쇄의 경우 89.5%이었다.
람다-DP47 라이브러리를, 하기의 V-도메인 쌍: Vl3_19 람다 경쇄 및 VH3_23 중쇄를 사용하여 인간 생식계열 유전자를 기반으로 구축하였다. 상기 라이브러리는 경쇄의 CDR3(L3) 및 중쇄의 CDR3(H3)에서 무작위선정되고 3개 단편으로부터 "중복 연장 스플라이싱"(SOE) PCR에 의해 조립되었다. 단편 1은 무작위 L3을 포함하는 항체 유전자의 5' 말단을 포함하고, 단편 2는 L3의 말단으로부터 H3의 개시서열까지 걸쳐 있는 중심 불변 단편인 반면, 단편 3은 무작위 H3 및 Fab 단편의 3' 부분을 포함한다. 하기의 프라이머 조합을 사용하여 라이브러리를 위한 라이브러리 단편을 생산하였다: 단편 1((LMB3 - Vl_3_19_L3r_V/Vl_3_19_L3r_HV/ Vl_3_19_L3r_HLV), 단편 2(RJH80 - DP47CDR3_ba(변형)) 및 단편 3(DP47-v4-4/DP47-v4-6/DP47-v4-8 - fdseqlong). 라이브러리 단편의 생산을 위한 PCR 파라미터는 94℃에서 5분 초기 변성, 25주기의 94℃ 60초, 55℃ 60초, 72℃ 60초, 및 72℃에서 10분 동안의 말단 신장이었다. 조립 PCR의 경우, 동몰비의 3개 단편을 주형으로 사용하여, 파라미터는 94℃에서 3분 초기 변성, 및 5주기의 94℃ 60초, 55℃ 60초, 72℃ 120초였다. 이 단계에서, 외부 프라이머를 가하고 20주기를 더 수행한 후 72℃에서 10분 동안 말단 신장을 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위 Fab 단편의 조립 후, 이들을 유사하게 처리된 수용체 파지미드 벡터와 함께 NcoI/NheI로 절단하였다. 15 ㎍의 Fab 라이브러리 삽입물을 13.3 ㎍의 파지미드 벡터와 접합시켰다. 정제된 접합물을 60 형질전환에 사용하여 1.5 x 109 형질전환체를 수득하였다. Fab 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 회수하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다.
파지 디스플레이 선별을 위한 항원으로서 인간 OX40(CD134)을 HEK EBNA 세포에서 N-말단 단량체 Fc-융합체로서 일시적으로 발현시키고, 수용체 쇄(Fc 놉 쇄)를 갖는 Fc 부분의 C-말단에 위치한 avi-태그 인식 서열에서 BirA 비오틴 리가제의 공-발현을 통해 생체내에서 부위-특이적으로 비오틴화시켰다.
선별 라운드(바이오패닝(biopanning))를 하기 패턴에 따라서 용액 중에서 수행하였다:
1. 항원의 Fc-부분을 인식하는 항체의 라이브러리를 고갈시키기 위해 10 ㎍/ml의 비관련 인간 IgG로 코팅된 맥시소프(maxisorp) 플레이트 상에서 약 1012개 파지미드 입자의 예비-제거(pre-clearing),
2. 1 ml의 총부피의 Fc-결합자의 추가 고갈을 위한 100 nM 비관련 비-비오틴화된 Fc 놉-인투-홀 구축물의 존재하에서 0.5시간 동안 100 nM 비오틴화된 인간 OX40과 함께 비-결합 파지미드 입자의 배양,
3. 10분 동안 뉴트라비딘 예비-코팅된 미세적정 플레이트의 4개 웰로의 전이에 의해 비오틴화된 huOX40 및 부착된 특이적 결합 파지의 포획(라운드 1 및 3에서),
4. 5x PBS/트윈20 및 5x PBS를 사용하여 각 웰의 세척,
5. 10분 동안 웰 당 250 ㎕ 100 mM TEA(트라이에틸아민)의 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 4개 웰로부터 모인 용출물에 500 ㎕ 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)의 첨가에 의한 중화,
6. Fc-결합자의 최종 제거를 위한, 100 nM 비오틴-포획된 Fc 놉-인투-홀 구축물과 함께 뉴트라비딘 예비-코팅된 미세적정 플레이트 상에서의 배양에 의한 중화된 용출물의 후-제거,
7. 용출된 파지 입자의 상등액에 의한 대수기(log-phase) 이콜라이 TG1 세포의 재감염, 헬퍼파지 VCSM13에 의한 감염, 30℃에서 진탕기상에서 밤새 배양, 및 다음 선별 라운드에서 사용되도록 파지미드 입자의 후속 PEG/NaCl 침전.
선별은 100 nM의 일정한 항원 농도를 사용하여 3 또는 4 라운드에 걸쳐 수행되었다. 사이노몰구스 OX40에 대해서뿐 아니라 뮤린 OX40에 대해서도 교차-반응성인 결합자에 대한 가능성을 증가시키기 위해, 일부 선별 라운드에서 인간 OX40 대신 뮤린 표적을 사용하였다. 라운드 2 및 4에서, 뉴트라비딘에 대한 결합자의 풍부화를 방지하기 위해, 5.4 x 107 스트렙타비딘-코팅된 자석 비드를 첨가하여 항원:파지 복합체의 포획을 수행하였다. 특이적 결합자는 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: 100 ㎕의 25 nM 비오틴화된 인간 OX40 및 10 ㎍/ml의 인간 IgG를 뉴트라비딘 플레이트 및 맥시소프 플레이트 상에 각각 코팅하였다. Fab-함유 세균 상등액을 첨가하고, 항-Flag/HRP 이차 항체를 사용하여 그의 Flag-태그를 통해 결합 Fab를 검출하였다. 인간 OX40 상에서 신호를 나타내고 인간 IgG에 대해 음성인 클론을 추가의 분석을 위해 최종 후보명단에 올려놓고 또한 사이노몰구스 및 뮤린 OX40에 대해 유사한 방식으로 시험하였다. 이들을 0.5 리터 배양 부피로 세균에서 발현시키고, 친화도 정제하고, 바이오래드(BioRad)의 프로테온(ProteOn) XPR36 바이오센서를 사용하여 SPR-분석에 의해 더 특성규명하였다.
표 3은 포괄적 파지-디스플레이 항체 라이브러리(DP88-4)의 서열을 나타내고, 표 4는 라이브러리 DP88-4 생식계열 주형의 cDNA 및 아미노산 서열을 제공하고 표 5는 DP88-4 생식계열 주형의 제작에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
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Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
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표 6은 포괄적 파지-디스플레이 항체 공통 경쇄 라이브러리(Vk3_20/VH3_23)의 서열을 나타낸다. 표 7은 공통 경쇄 라이브리러(Vk3_20/VH3_23) 생식계열 주형의 cDNA 및 아미노산 서열을 제공하고, 표 8은 공통 경쇄 라이브러리(Vk3_20/VH3_23)의 제작에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
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Figure pct00058
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표 9는 PCR에 사용된 포괄적 파지-디스플레이 람다-DP47 라이브러리(Vl3_19/VH3_23) 주형의 서열을 나타낸다. 표 10은 람다-DP47 라이브러리(Vl3_19/VH3_23) 생식계열 주형의 cDNA 및 아미노산 서열을 제공하고, 표 11은 람다-DP47 라이브러리(Vl3_19/VH3_23)의 제작에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
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Figure pct00063
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클론 8H9, 20B7, 49B4, 1G4, CLC-563, CLC-564 및 17A9는 전술한 절차를 통해 인간 Ox40-특이적 결합자로서 확인되었다. 이의 가변 영역의 cDNA 서열을 하기 표 12에 나타내었으며, 상응하는 아미노산 서열을 표 C에서 확인할 수 있다.
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1.3 항- Ox40 IgG1 P329G LALA 항체의 생산, 정제 및 특성규명
선택된 항-Ox40 결합자의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 인간 IgG1의 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라서 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
항-Ox40 클론의 cDNA 및 아미노산 서열을 표 13에 나타내었다. 모든 항-Ox40-Fc-융합체 암호화 서열은, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3'말단에 위치한 합성 폴리A 신호 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
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항-Ox40 항체를, 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 생산하였다. 세포를 1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생산을 위해, 4억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 보충물과 함께 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
항원 Fc 융합체의 정제에 대해 전술한 바와 같이 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 항체 분자의 정제를 수행하였다.
단백질을 농축하고 여과시킨 후, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 이용하여, 280 nm에서 OD를 측정함으로써, 정제된 항체의 단백질 농도를 측정하였다. 항체의 순도 및 분자량을, 환원제(인비트로겐, 미국)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(LabChipGXII)(캘리퍼(Caliper))를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 항체 샘플의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 14는 항-Ox40 P329G LALA IgG1 항체의 수율 및 최종 함량을 요약한 것이다.
Figure pct00087
실시예 2: 항-OX40 항체의 특성규명
2.1 인간 OX40 상에서의 결합
2.1. 1 표면 플라즈몬 공명(결합활성 + 친화도)
재조합 OX40 Fc(kih)에 대한 파지-유도된 OX40-특이적 항체의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 러닝 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
동일한 실험에서, 파지 디스플레이 유도된 항-OX40 클론 8H9, 49B4, 1G4, 20B7, CLC-563, CLC-564 및 17A9(모두 인간 IgG1 P329GLALA)와, 재조합 OX40(인간, 사이노몰구스 및 뮤린) 사이의 종 선택성 및 상호작용의 결합활성을 측정하였다. 비오틴화된 인간, 사이노몰구스 및 뮤린 OX40 Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 상이한 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 600 공명 단위(RU) 이하의 고정화 수준을 사용하였다.
파지 디스플레이 유도된 항-OX40 인간 IgG1 P329GLALA 항체를 30 ㎕/분의 흐름하에 2 내지 500 nM(3배 희석)의 농도 범위에서 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 복합체 해리는 210초 동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하고 결합활성을 정성적으로 평가하기 위해 이용하였다(표 16).
동일한 실험에서, 파지 디스플레이 유도된 항체 8H9, 49B4, 1G4, 20B7, CLC-563 및 CLC-564(인간 IgG1 P329GLALA) 대 재조합 OX40 사이의 상호작용의 친화도를 측정하였다. 이를 위해, 인간 또는 뮤린 Ox40의 엑토도메인을 또한 avi(GLNDIFEAQKIEWHE) 및 헥사히스티딘 태그(서열에 대해 표 15 참조)를 갖는 프레임 내에 서브클로닝하거나, AcTEV 프로테아제로 절단하고 크로마토그래피 방법으로 Fc를 제거하여 수득하였다.
Figure pct00088
단백질 생산은 Fc-융합 단백질에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 분비된 단백질은 킬레이트화 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.
제1 크로마토그래피 단계를 20 mM 인산 나트륨, 500 nM 염화 나트륨(pH 7.4)에서 평형화된 NiNTA 슈퍼플로우 카트리지(NiNTA Superflow Cartridge)(5 ml, 키아겐(Qiagen)) 상에서 수행하였다. 용출은 5%로부터 45%까지의 용출 완충액(20 mM 인산 나트륨, 500 nM 염화 나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4) 12 컬럼 부피에 걸쳐 구배를 적용하여 수행하였다.
단백질을 농축하고 여과한 후 pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화 나트륨, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 75 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
친화도 측정은 2가지 구성을 이용하여 수행하였다.
구성 1) 항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 9000 RU이었다. OX40에 대한 파지 디스플레이 유도된 항체를 25 내지 50 nM의 농도에서 60초 동안 포획하였다. 재조합 인간 OX40 Fc(kih)를 4 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포상에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항원을, 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖지만, 항체가 아닌 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다.
구성 2) 항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 8000 RU이었다. Ox40에 대한 파지 디스플레이 유도된 항체를 20 nM의 농도에서 60초 동안 포획하였다. 재조합 인간 Ox40 avi His를 2.3 내지 600 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포상에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항원을, 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖지만, 항체가 아닌 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하였다.
클론 49B4, 1G4 및 CLC-564는 클론 8H9, 20B7 및 CLC-563보다 낮은 친화도하에 인간 Ox40 Fc(kih)에 결합한다.
항-OX40 P329GLALA IgG1과 인간 OX40 Fc(kih) 사이의 상호작용에 대한 친화도 상수는 1:1 랭뮤어 결합에 정합시켜 측정하였다.
Figure pct00089
2.1.2 인간 Ox40 발현 세포: 미감작 인간 말초혈 단핵 백혈구( PBMC ) 및 활성화된 인간 말초혈 단핵 백혈구에 대한 결합
취리히 헌혈 센터에서 버피 코트(buffy coat)를 수득하였다. 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 버피 코트를 동일 부피의 DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스(Gibco by Life Technologies), 카탈로그 번호 14190 326)로 희석하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관(TPP, 카탈로그 번호 91050)에 15 mL 히스토파크(Histopaque) 1077(시그마 라이프 사이언스(SIGMA Life Science), 카탈로그 번호 10771, 폴리슈크로스 및 나트륨 다이아트라이조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정)을 보충하고, 버피 코트 용액을 히스토파크 1077 위에 적층시켰다. 상기 관을 400 x g에서 실온에서 낮은 가속하에 휴지 없이 30분 동안 원심분리하였다. 그 후에, PBMC를 계면으로부터 수거하고, DPBS로 3회 세척하고, 10% 태아 소 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 16000-044, Lot 941273, 감마선-조사되고, 마이코플라스마가 없고 56℃에서 35분 동안 열 불활성화됨), 1%(v/v) 글루타맥스(GlutaMAX) I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038), 1 mM 나트륨-피루베이트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)로 보충된 RPMI 1640 배지(깁코 바이 라이프 테코놀로지, 카탈로그 번호 42401-042)로 이루어진 T 세포 배지에 재현탁시켰다.
PBMC를 단리한 후에 바로 사용하거나(미감작 인간 PBMC 상의 결합), 또는 T 세포의 세포 표면상에서 강한 인간 Ox40 발현을 수용하도록 자극하였다(활성화된 인간 PBMC 상의 결합). 따라서, 미감작 PBMC를, 37℃ 및 5% CO2에서, 6-웰 조직 배양 플레이트에서 200　U/mL 프로류킨(프로류킨) 및 2 ㎍/mL PHA-L로 보충된 T 세포 배지에서 5일 동안 배양한 다음 200　U/mL 프로류킨으로 보충된 T 세포 배지 중에서 예비-코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트[2 ㎍/mL 항-인간 CD3(클론 OKT3) 및 2 ㎍/mL 항-인간 CD28(클론 CD28.2)]에서 1일 동안 배양하였다.
Ox40의 검출을 위해 미감작 인간 PBMC와 활성화된 인간 PBMC를 혼합하였다. 활성화된 인간 PBMC로부터 미감작 세포의 구별을 가능하게 하기 위해, 휴지중인 세포를 결합 분석 전에 이플루오르670(eFluor670) 세포 증식 지시염료(이바이오사이언스(eBioscience), 카탈로그 번호 65-0840-85)를 사용하여 표지하였다.
표지화를 위해 세포를 수거하고, 예열된(37℃) DPBS로 세척하고, DPBS 중에 1 x 107 세포/mL의 세포 밀도로 조정하였다. 이플루오르670 세포 증식 지시염료(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0840-85)를 2.5 mM의 최종 농도 및 DPBS 중 0.5 x 107 세포/mL의 최종 세포 밀도에서 미감작 인간 PBMC의 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 실온에서 어두운 상태에서 10분 동안 배양하였다. 표지화 반응을 중단하기 위해 2 mL FBS를 첨가하고, 세포를 T 세포 배지로 3회 세척하였다. 이어서, 1 x 105 미감작, 이플루오르670 표지된 인간 PBMC 및 비표지된 활성화된 인간 PBMC의 1:1 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one), 셀스타(Cellstar), 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하였다.
플레이트를 400 x g로 및 4℃에서 4분 동안 원심분리하고, 상등액을 털어버렸다. 세포를 200 ㎕의 4℃ 냉각 FACS 완충액(2% FBS, 5 mM EDTA pH 8(암레스코(Amresco), 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) S2002)로 보충된 DPBS)으로 1회 세척하였다. 세포를 4℃에서 적정된 항-Ox40 항체 구축물을 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 50 ㎕/웰 중에서 120분 동안 배양하였다. 플레이트를 200 ㎕/웰의 4℃ FACS 완충액으로 4회 세척하여 미결합된 구축물을 제거하였다.
4℃에서 어두운 상태에서, 형광 표지된 항-인간 CD4(클론 RPA-T4, 마우스 IgG1 k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532), 항-인간 CD8(클론 RPa-T8, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 3010441), 항-인간 CD45(클론 HI30, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 304028), 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098)을 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 25 ㎕/웰 중에서 30분 동안 세포를 염색시켰다.
플레이트를 200 ㎕/웰의 4℃ FACS 완충액으로 2회 세척하고, 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍(Santa Cruz Biotec), 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁시키고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(Fortessa)(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어(BD Bioscience with DIVA software))를 사용하여 획득하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Ox40에 특이적인 항체 구축물은 Ox40을 발현하지 않는 휴지중인 인간 CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포에 결합하지 않았다. 대조적으로, 모든 구축물이 OX40을 발현하는 활성화된 CD8+ 또는 CD4+ T-세포에 결합하였다. CD4+ T-세포에 대한 결합은 CD8+ T 세포에 대한 결합보다 훨씬 더 강하였다. 활성화된 인간 CD8+ T 세포는 활성화된 CD4+ T 세포 상에서 검출된 OX40 수준의 일부분만을 발현한다. 상기 차이는 공여체 뿐 아니라 시간 의존성이다. 분석된 항-OX40 클론은 그 결합 강도가 달랐다. EC50 값은 표 17에 나타내었다. 2가 및 1가 FAP 표적화 구축물의 추가의 평가를 위해 높고(8H9) 낮은(49B4/1G4) 결합 능력을 갖는 클론을 선택하였다.
Figure pct00090
2.2 뮤린 OX40 상에서의 결합
2.2. 1 표면 플라즈몬 공명(결합활성 + 친화도)
재조합 뮤린 OX40 Fc(kih)에 대한 파지-유도된 OX40-특이적 항체 20B7의 결합을 인간 OX40 Fc(kih)에 대해 전술한 바와 같이(실시예 2.1.1 참조) 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하고 결합활성을 정성적으로 평가하기 위해 이용하였다(표 18).
친화도 측정을 위해, 기준 유동 세포에 대한 Fc 융합 단백질의 비특이적 상호작용으로 인해, AcTEV로 절단된 뮤린 Ox40 His(실시예 2.1.2 참조) 또는 Ox40 Fc(kih)를 사용하였다. 항-인간 Fc 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 8000 RU이었다. OX40에 대한 파지 디스플레이 유도된 항체를 25 nM의 농도에서 60초 동안 포획하였다. 재조합 뮤린 OX40(배급자 지시에 따라서 AcTEV 절단에 의해 절단된)을 4.1 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포상에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항원을, 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖지만, 항체가 아닌 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하였다. 클론 20B7이 뮤린 OX40에 결합하는 것으로 나타났다(표 18).
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 항-OX40 P329GLALA IgG1 분자와 뮤린 OX40 사이의 상호작용의 친화도 상수를 유도하였다.
Figure pct00091
2.2.2 마우스 OX40 발현 세포: 미감작 및 활성화된 마우스 비장세포(선별된 클론)에 대한 결합
마우스 비장을 3 mL PBS 중에 수거하고, 적당한 MACS 튜브(밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec) 카탈로그 번호 130-096-334) 및 적당한 MACS 옥토 해리장치(Octo Dissociator)(밀테나이 바이오텍)를 사용하여 단일 세포 현탁액을 생산하였다. 그 후에, 비장세포를 30 ㎛ 예비-분리 필터(밀테나이 바이오텍 카탈로그 번호 130-041-407)를 통해 여과시키고, 350 x g 및 4℃에서 7분 동안 원심분리하였다. 상등액을 흡인시키고, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨-피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산, 50 μM β-머캅토에탄올 및 10% 페니실린-스트렙토마이신(시그마, 카탈로그 번호 P4333)으로 보충된 RPMI 1640 배지에 세포를 재현탁시켰다. 106 세포/mL를, 10 ㎍/mL 항-마우스 CD3ε 아르메니아 햄스터 IgG(클론 145-2C11, 바이오레전드, 카탈로그 번호 100331) 및 2 ㎍/mL 항-마우스 CD28 시리아 햄스터 IgG(클론 37.51, 바이오레전드, 카탈로그 번호 102102)로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 3일 동안 배양하였다. 활성화된 마우스 비장세포 또는 새 마우스 비장세포를 수거하고, DPBS에 세척하고, 계수하고, 0.1 x 106 세포를 96 U-바닥 비-조직 배양물 처리된 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 세포를 DPBS로 세척하고, 상이한 농도의 항-OX40 인간 IgG1 P329GLALA 항체(선택된 결합자만)를 함유하는 50 ㎕ FACS 완충액에서 염색시켰다. 세포를 4℃에서 120분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 4℃에서, 항-마우스 CD8b 래트 IgG2bκ-APC-Cy7(바이오레전드, 카탈로그 번호 100714, 클론 53-6.7), 항-마우스 CD4 래트 IgG2bk-PE-Cy7(바이오레전드, 카탈로그 번호 100422, 클론 GK1.5) 및 FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098)을 함유하는 FACS 완충액 25 ㎕/웰 중에서 30분 동안 염색시켰다. 플레이트를 200 ㎕/웰의 4℃ FACS 완충액으로 2회 세척하고, 세포를 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁시키고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 클론 20B7 및 잘 특성규명된 마우스 특이적 벤치마크 항체 OX86 만이 활성화된 마우스 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 결합을 나타내었다. 휴지중인 마우스 비장세포 상에서는 결합이 관찰되지 않았다.
2.3 사이노몰구스 OX40 상에서의 결합
선택된 항-OX40 결합자와 사이노몰구스 세포의 반응성을 시험하기 위해, 건강한 필리핀 원숭이의 PBMC를 약간의 변형하에 인간 세포에 대해 전술한 바와 같은 밀도 구배 원심분리를 이용하여 헤파린첨가 혈액으로부터 단리하였다. 사이노몰구스 PBMC를 DPBS로 희석된 림포프레프(lymphoprep) 배지(90% v/v, 액손 랩(Axon Lab), 카탈로그 번호 1114545)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 헤파린첨가된 새 혈액으로부터 단리하였다. 원심분리는 실온에서 520 x g에서 휴지 없이 30분 동안 수행하였다. 연이은 원심분리를 실온에서 150 x g에서 15분 동안 수행하여 혈소판 수를 감소시킨 후, 실온에서 400 x g에서 10분 동안 수회 원심분리 단계를 수행하여 멸균 DPBS로 PBMC를 세척하였다. PBMC는 T 세포의 세포 표면상에서 강한 Ox40 발현을 수용하도록 자극하였다(활성화된 사이노몰구스 PBMC 상의 결합). 따라서, 미감작 PBMC를, 37℃ 및 5% CO2에서, 200　U/mL 프로류킨으로 보충된 T 세포 배지에서 예비-코팅된 12-웰 조직 배양 플레이트[10 ㎍/mL 사이노몰구스 교차-반응성 항-인간 CD3(클론 SP34) 및 2 ㎍/mL 사이노몰구스 교차-반응성 항-인간 CD28(클론 CD28.2)] 상에서 72시간 동안 배양하였다.
이어서, 0.5 x 105 활성화된 사이노몰구스 PBMC를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하였다. 세포를 200 ㎕의 4℃ 냉각 FACS 완충액으로 1회 세척하고, 4℃에서 적정된 항-Ox40 항체 구축물을 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 50 ㎕/웰 중에서 120분 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 200 ㎕/웰의 4℃ FACS 완충액으로 4회 세척하였다. 세포를, 형광 표지된 사이노몰구스 교차-반응성 항-인간 CD4(클론 OKT-4, 마우스 IgG1 k, BD, 카탈로그 번호 317428), 항-인간 CD8(클론 HIT8a, 마우스 IgG1k, BD, 카탈로그 번호 555369) 및 FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) 카탈로그 번호 109-096-098)을 함유하는 25 μL/웰의 4℃ 냉각 FACS 완충액으로 재현탁시키고 30분 동안 4℃에서 어두운 상태에서 배양하였다. 플레이트를 200 ㎕/웰의 4℃ 냉각 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 세포를 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁시키고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 대부분의 구축물이 활성화된 CD4+ 사이노몰구스 T-세포에 결합하였다. CD4+ T-세포에 대한 결합이 CD8+ T 세포에 대한 결합보다 훨씬 더 강하였다. OX40에 대한 발현 수준은 자극의 동역학 및 강도에 따라 달라지며, CD4+ 사이노몰구스 T 세포에 대해서는 최적화되었으나 CD8+ 사이노몰구스 T 세포에 대해서는 최적화되지 않으므로, CD8+ T 세포 상에서는 미미한 OX40 발현만이 유도되었다. 분석된 항-OX40 클론은 그 결합 강도가 달랐다. EC50 값을 표 19에 나타내었다. 비전형적인 곡선 정합으로 인해, 클론 8H9, 49B4, 21H4에 대해서는 EC50 값을 산출할 수 없었다.
Figure pct00092
2.3. 1 표면 플라즈몬 공명(결합활성 + 친화도)
재조합 사이노몰구스 OX40 Fc(kih)에 대한 파지-유도된 OX40-특이적 항체(모두 인간 IgG1 P329GLALA)의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 러닝 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
비오틴화된 사이노몰구스 OX40 Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 상이한 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 800 공명 단위(RU) 이하의 고정화 수준을 사용하였다.
파지 디스플레이 유도된 항-OX40 인간 IgG1 P329GLALA 항체를 30 ㎕/분의 흐름하에 2 내지 500 nM(3배 희석)의 농도 범위에서 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 복합체 해리를 210초 동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하였다(표 20).
동일한 실험에서, 파지 디스플레이 유도된 항체(인간 IgG1 P329GLALA) 대 재조합 사이노몰구스 OX40 Fc(kih) 사이의 상호작용의 친화도를 측정하였다. 항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 9000 RU이었다. OX40에 대한 파지 디스플레이 유도된 항체를 25 내지 50 nM의 농도에서 60초 동안 포획하였다. 재조합 사이노몰구스 Ox40 Fc(kih)를 4 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포상에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항원을, 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖지만, 항체가 아닌 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하였다(표 20).
클론 49B4, 1G4 및 CLC-564는 클론 8H9, 20B7 및 CLC-563보다 낮은 친화도하에 사이노몰구스 OX40 Fc(kih)에 결합한다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T100 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 항-OX40 P329GLALA IgG1과 사이노몰구스 OX40 Fc(kih) 사이의 상호작용의 친화도 상수를 유도하였다.
Figure pct00093
2.3.2 사이노몰구스 OX40 발현 세포: 활성화된 사이노몰구스 말초혈 단핵 백혈구(PBMC) 상에서의 결합
Ox40 음성 종양 세포에 대한 결합
OX40 음성 종양 세포에 대한 결합의 결여를, WM266-4 세포(ATCC CRL-1676) 및 U-87 MG(ATCC HTB-14) 종양 세포를 사용하여 시험하였다. 두 종양 세포 모두의 분리를 가능하게 하기 위해, WM266-4 세포를 PKH-26 레드 형광 세포 링커 키트(시그마, 카탈로그 번호 PKH26GL)로 예비표지하였다. 세포를 수거하고, RPMI 1640 배지로 3회 세척하였다. 펠릿을 실온에서 어두운 상태에서 새로 생산된 PKH26-레드-염색 용액(제공된 희석제 C 중에 최종 농도 [1 nM]) 중에서 1 x 107 세포의 최종 세포 밀도에서 5분 동안 염색시켰다. 과량의 FBS를 첨가하여 표지화 반응을 중단시키고 세포를 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 RPMI 1640 배지로 4회 세척하여 과량의 염료를 제거하였다.
DPBS 중 5 x 104 PKH26 표지된 WM266-4 세포와 비표지된 U-87 MG 세포의 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 400 x g 및 4℃에서 4분 동안 원심분리하고, 상등액을 털어버렸다. 세포를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고 펠릿을 짧고 약한 볼텍스에 의해 재현탁시켰다. 모든 샘플을, 4℃에서 적정된 농도의 항-Ox40 인간 IgG1 P329GLALA 항체 구축물을 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 50 ㎕/웰 중에 120분 동안 재현탁시켰다. 플레이트를 200 ㎕/웰의 4℃ FACS 완충액으로 4회 세척하였다. FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098)을 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 25 ㎕/웰 중에 세포를 재현탁시키고 어두운 상태에서 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 200 ㎕/웰의 4℃ 냉각 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁시키고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, OX40에 특이적인 항체 구축물은 OX40 음성 인간 종양 세포 WM266-4 및 U-78 MG에 결합하지 않았다.
2.4 리간드 차단 특성
OX40/OX40-리간드 상호작용을 방해하는 OX40-특이적 인간 IgG1 P329GLALA 항체 분자의 능력을 측정하기 위해, 인간 OX40 리간드(알앤디 시스템즈)를 사용하였다. OX40과 OX40 리간드 사이의 상호작용의 낮은 친화도로 인해, C-말단 Ha 태그를 갖는 이량체성 인간 OX40 Fc 융합체를 생산하였다(도 1B). 상기 이량체성 인간 Ox40 Fc 융합 분자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표 21에 나타내었다. 생산 및 정제를 실시예 1.1에서 단량체성 OX40 Fc(kih)에 대해 기술한 바와 같이 수행하였다.
Figure pct00094
Figure pct00095
인간 OX40 리간드(알앤디 시스템즈)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 pH 5.0까지 약 2500 RU에서 CM5 칩의 2개 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 재조합 인간 Ox40 Fc를 30 ㎕/분의 흐름하에 200 nM의 농도에서 90초 동안 제2 유동 세포 상에 통과시켰다. 해리를 생략하고, 파지 유도된 항-Ox40 인간 IgG1P329LALA를 30 ㎕/분의 흐름하에 500 nM의 농도에서 90초 동안 2개 유동 세포 모두 위로 통과시켰다. 해리를 60초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포 상에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항체를, 고정화된 인간 OX40 리간드를 갖지만 재조합 인간 OX40 Fc 대신 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다. 도 1C는 실험의 설계를 나타낸다.
파지-유도된 클론 20B7은 인간 OX40과 그의 OX40 리간드의 복합체에 결합하였다(표 22, 도 6). 따라서, 상기 항체는 인간 OX40에 대한 결합을 두고 리간드와 경쟁하지 않으므로, "비-리간드 차단"으로 지칭된다. 대조적으로, 클론 8H9, 1G4, 49B4, CLC-563 및 CLC-564는 그의 리간드와의 복합체로 인간 OX40에 결합하지 않으므로, "리간드 차단"으로 지칭된다.
Figure pct00096
실시예 3: 항-인간 OX40 결합 클론의 기능적 특성
3.1 인간 OX40 및 리포터 유전자 NF - κB - 루시퍼라제를 발현하는 HeLa 세포
OX40의 그 리간드에 대한 작용성 결합은 핵 인자 카파 B(NFκB)의 활성화를 통해 하류 신호전달을 유도한다(문헌[A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972]). 재조합 리포터 유전자 세포주 HeLa_hOx40_NFκB_Luc1을 그 표면상에서 인간 Ox40을 발현하도록 생산하였다. 또한, 상기 세포주는 NFκB-민감성 인핸서 분절의 조절하에 루시퍼라제 유전자를 함유하는 리포터 플라스미드를 갖는다. Ox40 촉발은 NFκB의 용량 의존성 활성화를 유도하여 NFκB가 핵에서 전위되며, 이때 OX40은 리포터 플라스미드의 NFκB 민감성 인핸서 상에서 결합하여 루시퍼라제 단백질의 발현을 증가시킨다. 루시퍼라제는 루시페린-산화를 촉진하여 발광하는 옥시루시페린을 생산한다. 이것은 루미노미터(luminometer)로 정량화할 수 있다. 한 실험의 목적은 P329GLALA huIgG1 포맷의 다양한 항-Ox40 결합자가 HeLa_hOx40_NFκB_Luc1 리포터 세포에서 NFκB 활성화를 유도하는 능력을 시험하는 것이었다.
부착성 HeLa_hOx40_NFκB_Luc1 세포를 37℃에서 세포 해리 완충액(인비트로겐, 카탈로그 번호 13151-014)을 사용하여 10분 동안 수거하였다. 세포를 DPBS로 1회 세척하고, MEM(인비트로겐, 카탈로그 번호 22561-021), 10%(v/v) 열-불활성화 FBS, 1 mM 나트륨-피루베이트 및 1%(v/v) 비필수 아미노산을 포함하는 분석 배지 중에서 2x105의 세포 밀도로 조정하였다. 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)에서 웰 당 0.3x105 세포의 밀도에서 세포를 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 셀(Hera Cell) 150)에서 밤새 유지시켰다.
다음 날, HeLa_hOX40_NFκB_Luc1을 P329GLALA huIgG1 포맷으로 다양한 적정된 항-OX40 결합자를 함유하는 분석 배지를 첨가하여 6시간 동안 자극하였다. 항-OX40 항체에 대한 초가교결합의 효과를 시험하기 위해, 이차 항체 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서티, 109-006-098)을 함유하는 배지 50 ㎕/웰을 1:2 비로 가하였다(1차 단일 항-OX40 P329GLALA huIgG1에 비해 2배인 이차 항체). 배양 후에, 상등액을 흡인시키고 플레이트를 DPBS로 2회 세척하였다. 발광의 정량를,는 루시퍼라제 1000 분석 시스템 및 리포터 용해 완충액(둘 다 프로메가(Promega), 카탈로그 번호 E4550 및 카탈로그 번호 E3971)을 생산사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 간략하게, -20℃에서 웰 당 30 ㎕의 1x 용해 완충액을 첨가하여 10분 동안 세포를 용해시켰다. 세포를 37℃에서 20분 동안 해동한 후 웰 당 90 ㎕의 제공된 루시퍼라제 분석 시약을 첨가하였다. 발광을, 모든 파장을 수집하기 위한 임의의 필터 없이, 500밀리초의 적분 시간을 이용하여 스펙트라맥스(SpectraMax) M5/M5e 미세플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 미국)로 즉시 정량화하였다. 상대 발광 단위(URL)는 HeLa_hOX40_NFκB_Luc1 세포의 기저 발광에 의해 보정되었으며, 프리즘4(그래프패드 소프트웨어, 미국)를 사용하여 로그 1차 항체 농도에 대해 블롯팅하였다. 곡선을 고유의 S자형 용량 반응을 이용하여 정합시켰다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 제한된 용량 의존성 NFκB 활성화는 리포터 세포주에 항-OX40 P329GLALA huIgG1 항체(왼쪽)의 첨가에 의해 이미 유도되었다. 항-인간 IgG 특이적 이차 항체에 의한 항-OX40 항체의 초가교결합은 NFκB-매개된 루시퍼라제-활성화 유도를 농도 의존성 방식으로 강하게 증가시켰다(오른편). 활성화의 EC50 값은 표 23에 요약되어 있다.
Figure pct00097
3.2 최적이하로 TCR 촉발된 사전활성화된 인간 CD4 T 세포의 OX40 매개된 공자극
OX40의 접합은 최적이하 T-세포 수용체(TCR) 자극 후에 T-세포의 분열 및 생존을 촉진하는 상승적 공자극 신호를 제공한다(문헌[M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191]). 또한, 여러 사이토카인의 생성 및 T-세포 활성화 마커의 표면 발현도 증가된다(문헌[I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517]; [S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532]).
다양한 항-OX40 결합자의 작용물질 특성을 시험하기 위해, 사전활성화된 Ox40 양성 CD4 T-세포를, 용액 중의 또는 플레이트 표면상에 고정화된 항-OX40 항체의 존재하에서 최적이하 농도의 플레이트-고정화된 항-CD3 항체로 72시간 동안 자극하였다. T-세포 생존 및 증식에 대한 효과는 살아있는 세포에서 유세포분석에 의해 전체 세포수 및 CFSE 희석의 모니터링을 통해 분석하였다. 또한, 세포는 T-세포 활성화 및 분화 마커, 예를 들어, CD127, CD45RA, Tim-3, CD62L 및 OX40 자체에 대한 형광-표지된 항체로 동시-염색시켰다.
인간 PBMC를 피콜 밀도 원심분리에 의해 단리하고 실시예 2.1.2에 기술된 바와 같이 PHA-L[2 ㎍/mL] 및 프로류킨[200 U/mL]으로 3일 동안 자극하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 10분 동안 [50 nM]의 최종 농도에서 CFDA-SE(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 2188)를 사용하여 1x106 세포/mL의 세포 밀도에서 CFSE로 표지하였다. 그 후에, 세포를 FBS(10% v/v)를 함유하는 과량의 DPBS로 2회 세척하였다. 표지된 세포를 37℃에서 30분 동안 T-세포 배지 중에서 휴지시켰다. 그 후에, 비-전환된 CFDA-SE를 DPBS를 사용한 추가의 2회 세척 단계에 의해 제거하였다. MACS 음성 CD4 T-세포 단리 키트(밀테나이 바이오텍)를 생산사의 지시에 따라 사용하여 사전활성화된 CFSE-표지된 인간 PBMC로부터 CD4 T-세포 단리를 수행하였다.
모리스(Morris) 등은 통상적인 항-Ox40 항체에 의한 작용성 공자극이 표면 고정화에 의존하였음을 보여주었다(문헌[N. P. Morris et al., Mol. Immunol. 2007, 44(12), 3112-3121]). 따라서, 염소 항-마우스 Fcγ-특이적 항체(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 111-500-5008)를 4℃에서 염소 항-인간 Fcγ-특이적 항체(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-006-098)의 존재(표면 고정화된 항-OX40) 또는 부재(용액 중의 항-OX40)하에서 PBS 중 [2 ㎍/mL]의 농도에서 96 웰 U-바닥 세포 배양 플레이트(그레이너 바이오 원)의 표면에 밤새 코팅시켰다. 그 후에, 플레이트 표면을 BSA(1% v/w)를 함유하는 DPBS로 차단하였다. 모든 후속 배양 단계는 37℃에서 BSA(1% v/w)를 함유하는 PBS중에서 90분 동안 수행하였다. 배양 단계 사이에, 플레이트를 DPBS로 세척하였다.
마우스 항-인간 CD3 항체(클론 OKT3, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호 16-0037-85, 고정 농도[3 ng/mL])를 후속 배양 단계에서 표면 코팅된 항-마우스 Fcγ-특이적 항체를 통해 포획하였다. 이어서, 한 실험에서, 적정된 인간 항-OX40 항체(인간IgG1 P329G LALA)를 DPBS 중에서의 추가 배양 단계에 의해 플레이트 상에 고정화시켰다. 제2 실험에서는, 활성화 분석 동안 항-OX40 항체를 배지에 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 예비코팅되지 않은 플레이트로 직접 가하였다.
CFSE-표지된 사전활성화된 CD4+ T 세포를 200 ㎕ T-세포 배지 중에 웰 당 0.6x105 세포의 세포 밀도에서 예비코팅된 플레이트에 가하고 96시간 동안 배양하였다. 4℃에서 어두운 상태에서, 플루오로크롬-표지된 마우스 항-인간 Ox40(클론 BerACT35, 바이오레전드, 카탈로그 번호 35008), TIM-3(클론 F38-2E2, 바이오레전드, 카탈로그 번호345008), CD127(클론 A019D5, 바이오레전드, 카탈로그 번호351234), CD62L(클론 DREG 56, 바이오레전드, 카탈로그 번호304834) 및 CD45RA(클론 HI100, 비디 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호555489)의 혼합물로 20분 동안 세포를 염색시켰다. 플레이트를 200 ㎕/웰 4℃ FACS 완충액으로 2회 세척하고, 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS-완충액 중에 최종적으로 재현탁시키고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
DAPI 음성인 살아있는 세포를 증식에 대한 마커로서 중간 CFSE 형광의 감소에 대해 분석하였다. OX40 양성, CD62L 저발현 및 TIM-3 양성 T 세포의 백분율을 T-세포 활성화에 대한 마커로서 모니터링하였다. CD45RA 및 CD127의 발현을 분석하여 T 세포의 성숙 상태의 변화를 측정하였으며, 이때 CD45RA 저발현 CD127 저발현 세포는 효과기 T 세포로 분류되었다.
플레이트-고정화된 항체에 의한 공자극은 플레이트-고정화된 항-인간 CD3으로 사전활성화된 인간 CD4 T 세포의 최적이하 자극을 용량 의존 방식으로 강하게 증대시켰다(도 8). T-세포는 더 강하게 증식하였고, 더 높은 효과기 T 세포의 백분율하에 더 성숙한 표현형을 나타내었으며, 더 높은 백분율의 CD62L 저발현, Tim-3 양성 및 OX40 양성 활성화 세포를 가졌다. 일부 클론(8H9, 20B7)은 세포성 OX40에 대한 결합에 있어서 상업적으로 시판하는 검출 항체보다 훨씬 우수하였다. 상기 클론의 경우, EC50 값 산출이 가능하지 않았으며 따라서 OX40 유도에 대한 모든 EC50 값은 전체 EC50 값 산출로부터 배제되었다. T-세포 활성화의 모든 다른 파라미터에서 반-최대 변화는 3 내지 700 pM 범위의 농도에서 달성되었으며, 도 9 및 표 24에 요약되어 있다. 항-Ox40 항체가 표면 고정화의 부재하에 용액 중에서 첨가되었을 때 최적이하 TCR 자극의 증대는 나타나지 않았다(도 10). 이것은 OX40 수용체의 초가교결합에 대한 Ox40 축 활성화의 강한 의존성을 다시 입증하였다.
항-OX40 항체(hu IgG1 P329GLALA 포맷)의 결합 강도와 작용물질 활성(생체활성) 사이의 상관성을 도 11에 나타내었다. 대부분의 클론의 경우, 직접적인 상관성이 있었으나, 놀랍게도 2개의 클론(49B4, 1G4)은 훨씬 더 강한 생체활성을 나타내었고, 이것은 그의 결합 강도로부터 예측되었다.
Figure pct00098
실시예 4: Ox40 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 구축물의 생산
4.1 Ox40 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 2가 항원 결합 분자(2+2 포맷)의 생산(비교용 실시예)
Ox40 및 FAP에 대해 2가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 Ox40 항체를 생산하였다. WO 2010/145792 A1에 따른 크로스맙 기술을 적용하여 부적절하게 쌍을 이룬 경쇄의 형성을 감소시켰다.
FAP 결합자의 생성 및 생산은 본원에 참고로 도입된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다.
본 실시예에서는, FAP 결합자 28H1의 교차된 Fab 유닛(VHCL)을 (G4S)4 연결자 서열을 사용하여 항-OX40 huIgG1의 중쇄에 C-말단에 융합시켰다. 상기 중쇄 융합체를 항-OX40의 경쇄 및 상응하는 FAP 교차된 경쇄(VLCH1)로 공-발현시켰다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다. 예비표지된 이중특이적 2가 구축물은 도 12A에 도시되어 있다.
표 25는 성숙한 이중특이적 2가 항-OX40/항-FAP 인간 IgG1 P329GLALA 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
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Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
모든 유전자를, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 조절하에 일시적으로 발현시켰다. 발현 벡터는 또한 EBNA(엡스타인 바 바이러스 핵 항원(Epstein Barr Virus Nuclear Antigen)) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 항-Ox40, 항-FAP 구축물을 생산하였다. 상기 세포를 1:1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄1":"벡터 경쇄2")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생산을 위해, 4억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍ DNA의 최종량으로 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상등액을 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
항원-Fc 융합체 및 항체의 정제에 대해 전술한 바와 같이 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 이중특이적 구축물의 정제를 수행하였다.
단백질을 농축하고 여과시킨 후, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 OD를 측정함으로써 정제된 이중특이적 구축물의 단백질 농도를 측정하였다. 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을, 환원제(인비트로겐, 미국)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 이중특이적 구축물의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 러닝 완충액에서 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다(표 26).
Figure pct00117
4.2 Ox40 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 1가 항원 결합 분자(1+1 포맷)의 생산(비교용 실시예 )
부적절하게 쌍을 이룬 경쇄의 형성을 감소시키기 위해 WO 2010/145792 A1에 따른 크로스맙 기술을 적용하여 Ox40 및 FAP에 대한 1가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 Ox40 항체를 생산하였다.
본 실시예에서는, FAP 결합자 28H1의 교차된 Fab 유닛(VHCL)을 huIgG1의 홀 중쇄에 융합시켰다. 항-Ox40에 대한 Fab를 놉 중쇄에 융합시켰다. 표적화된 항-FAP-Fc 홀 쇄와 항-Ox40-Fc 놉 쇄의 결합은, FAP 결합 Fab 및 Ox40 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생산을 가능하게 한다(도 12B).
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
생산된 이중특이적 1가 구축물은 도 12B에 도시되어 있고, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 27에서 확인할 수 있다.
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
모든 유전자를, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 조절하에 일시적으로 발현시켰다. 발현 벡터는 또한 EBNA(엡스타인 바 바이러스 핵 항원) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 항-Ox40, 항-FAP 구축물을 생산하였다. 상기 세포를 1:1:1:1 비("벡터 중쇄 홀":"벡터 중쇄 놉":"벡터 경쇄1":"벡터 경쇄2")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생산을 위해, 4억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍ DNA의 최종량으로 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상등액을 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
항원 Fc 융합체 및 항체의 정제에 대해 전술한 바와 같이 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 이중특이적 항원 결합 분자의 정제를 수행하였다.
단백질을 농축하고 여과시킨 후, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 OD를 측정함으로써, 정제된 이중특이적 구축물의 단백질 농도를 측정하였다. 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을, 환원제(인비트로겐, 미국)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 이중특이적 구축물의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 28은 이중특이적 1가 항-Ox40/항-FAP IgG1 P329G LALA kih 항원 결합 분자의 생화학적 분석을 요약한 것이다.
Figure pct00131
4.3 Ox40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 2가 구축물의 특성규명
4.3. 1 표면 플라즈몬 공명(동시 결합)
인간 Ox40 Fc(kih)와 인간 FAP에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다. 비오틴화된 인간 Ox40 Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 1000 공명 단위(RU)까지의 고정화 수준을 사용하였다.
Ox40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 구축물을 250 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90초 동안 유동 세포에 통과시키고 해리는 0(제로)초로 설정하였다. 인간 FAP를 제2의 분석물로서 250 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90초 동안 유동 세포를 통해 주입하였다(도 12C). 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
도 13A 내지 13D(2+2 구축물) 및 도 13E 내지 13H의 그래프에서 볼 수 있듯이, 모든 이중특이적 구축물은 인간 Ox40 및 인간 FAP에 동시에 결합할 수 있었다.
4.3.2 세포상에서의 결합
4.3.2.1 FAP - 표적화된 항- Ox40 항체의 미감작 인간 PBMC 대 활성화된 인간 PBMC에 대한 결합
인간 PBMC를 실시예 2.1.2에 기술된 바와 같이 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. PBMC를 단리한 후에 바로 사용하거나(휴지중인 인간 PBMC 상의 결합), 또는 T 세포의 세포 표면상에서 강한 인간 Ox40 발현을 수용하도록 자극하였다(활성화된 인간 PBMC 상의 결합). 따라서, 미감작 PBMC를, 37℃ 및 5% CO2에서, 6-웰 조직 배양 플레이트에서 200 U/mL 프로류킨 및 2 ㎍/mL PHA-L로 보충된 T 세포 배지에서 4 내지 7일 동안 배양한 다음, 200 U/mL 프로류킨으로 보충된 T 세포 배지 중에서 예비-코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트[10 ㎍/mL 항-인간 CD3(클론 OKT3) 및 2 ㎍/mL 항-인간 CD28(클론 CD28.2)]에서 1일 동안 배양하였다.
Ox40의 검출을 위해 미감작 인간 PBMC와 활성화된 인간 PBMC를 혼합하였다. 활성화된 인간 PBMC로부터 미감작 세포의 구별을 가능하게 하기 위해, 미감작 세포를 결합 분석 전에 이플루오르670 세포 증식 지시염료(이바이오사이언스, 카탈로그 번호65-0840-85)를 사용하여 표지하였다. 이어서, 1 x 105 미감작, 이플루오르670 표지된 인간 PBMC 및 비표지된 활성화된 인간 PBMC의 1:1 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하고, 실시예 2.1.2에서 기술된 바와 같이 결합 분석을 수행하였다. 이어서, 1 x 105 미감작 이플루오르670 표지된 인간 PBMC 및 비표지된 활성화된 인간 PBMC의 1:1 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하고, 단락 2.1.2에서 기술된 바와 같이 결합 분석을 수행하였다.
1차 항체는 4℃에서 120분 동안 배양된, 적정된 항-Ox40 항체 구축물이었다. 이차 항체 용액은, 4℃에서 어두운 상태에서 30분 동안 배양된, 형광 표지된 항-인간 CD4(클론 RPA-T4, 마우스 IgG1 k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532), 항-인간 CD8(클론 RPa-T8, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 3010441) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098)의 혼합물이었다. 플레이트를, 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁시키고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 14A 및 14B에 나타낸 바와 같이, Ox40에 대해 특이적인 항원 결합 분자는 휴지중인 인간 CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포에 결합하지 않았다. 대조적으로, 모든 항원 결합 분자는 활성화된 CD8+ 또는 CD4+ T-세포에 결합하였다. CD4+ T-세포에 대한 결합은 실시예 1.4.1.2에서 이미 기술된 바와 유사하게 CD8+ T 세포에 대한 결합보다 훨씬 더 강하였다. 도 14A 및 14B에 나타낸 바와 같이, 2가 FAP 표적화 Ox40 구축물은 Ox40 양성 및 음성 세포에 대해 통상적인 IgG 항체 포맷의 각각의 클론과 유사한 결합 특성을 나타낸 반면, 1가 항체는 결합활성의 손실로 인해 Ox40 양성 세포에 결합하는 능력이 명백하게 감소되었다.
4.3.2.2 인간 FAP -발현 종양 세포에 대한 결합
인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP) 발현 세포 NIH/3T3-huFAP 클론 39 또는 WM266-4 세포(ATCC CRL-1676)를 사용하여 세포 표면 FAP에 대한 결합을 시험하였다. NIH/3T3-huFAP 클론 39는, 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3 세포주(ATCC CRL-1658)를 1.5 ㎍/mL 퓨로마이신(Puromycin) 선별하에서 huFAP를 발현하기 위한 발현 벡터 pETR4921로 형질감염시켜 생산하였다. 일부 분석에서는, WM266-4 세포를 실시예 2.3.2에서 기술된 바와 같이 PKH-26 레드 형광 세포 링커 키트(시그마, 카탈로그 번호 PKH26GL)로 예비표지하여 존재하는 다른 세포(예를 들어, 인간 PBMC)로부터 이들 종양 세포의 분리를 가능하게 하였다.
이어서, 0.5 x 105 NIH/3T3-huFAP 클론 39 또는 WM266-4 세포를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하고, 실시예 2.3.2에서 기술된 바와 유사한 방식으로 결합 분석을 수행하였다. 플레이트를 400 x g 및 4℃에서 4분 동안 원심분리하고, 상등액을 털어버렸다. 세포를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고 펠릿을 짧고 약한 볼텍스에 의해 재현탁시켰다. 모든 샘플을 지시된 농도(적정됨) 범위에서 이중특이적 항원 결합 분자(1차 항체)를 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 50 ㎕/웰 중에 재현탁시키고, 4℃에서 120분 동안 배양하였다. 그 후에 세포를 200 ㎕/웰의 4℃ FACS 완충액으로 4회 세척하고 짧은 볼텍스에 의해 재현탁시켰다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098)을 함유하는 4℃ 냉각 이차 항체 용액 25 ㎕/웰로 세포를 더 염색시키고, 어두운 상태에서 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트를, 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁시키고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 15A에 나타낸 바와 같이, FAP-표적화된 1가 및 2가 항-Ox40 항원 결합 분자는 인간 FAP-발현 표적 세포에 효과적으로 결합하였으나, huIgG1 P329GLALA 포맷의 동일 클론은 그렇지 않았다. 따라서, FAP-표적화된 1가 및 2가 항-Ox40 항원 결합 분자만이 직접적인 종양-표적화 특성을 나타낸다. 2가 구축물(채워진 사각형)은 1가 구축물보다 FAP에 대해 더 강한 결합을 나타내었으며, 이것은 1가 포맷에 비해 2가에서의 결합활성의 증가로 설명된다. 이것은 FAP 저-발현 WM266-4 세포에서보다 FAP 고-발현 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포(왼편 그래프)에서 더 두드러졌다. WM266-4 세포 상의 표면 FAP의 더 낮은 밀도는 항상 항-OX40 구축물의 2가 결합을 가능하게 하는 FAP 분자의 근접을 제공하지 않을 수도 있다. 활성화된 인간 CD4 T 세포 및 FAP 양성 종양 세포에 대한 결합의 EC50 값이 표 29에 요약되어 있다.
Figure pct00132
4.4 Ox40 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 4가 항원 결합 분자(4+1 포맷)의 생산
2개의 상이한 중쇄의 조립을 가능하게 하는 놉-인투-홀 기술을 적용하여, Ox40에 대해 4가 결합 및 FAP에 대해 1가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 Ox40 항체를 생산하였다.
본 실시예에서, 제1 중쇄(HC 1)는 항-OX40 결합자 49B4의 2개의 Fab 유닛(VHCH1_VHCH1)에 이어 (G4S) 링커에 의해 항-FAP 결합자 28H1 또는 4B9의 VH-도메인에 융합된 Fc 놉 쇄로 이루어졌다. 상기 구축물의 제2 중쇄(HC 2)는 항-OX40 결합자 49B4의 2개의 Fab 유닛(VHCH1_VHCH1)에 이어 (G4S) 링커에 의해 항-FAP 결합자 28H1 또는 4B9의 VL 도메인에 융합된 Fc 홀 쇄로 이루어졌다.
FAP 결합자의 생성 및 생산은 본원에 참고로 도입된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다.
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다. 상기 중쇄 융합 단백질은 항-OX40 결합자 49B4의 경쇄(CLVL)와 공-발현되었다. 생산된 이중특이적 4가 구축물은 도 16A에 도시되어 있고, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 30에서 확인할 수 있다.
또한, 항-FAP 결합자의 VH 및 VL 도메인이, 항원에 결합하지 않는, DP47로 지칭되는 생식계열 대조군으로 대체된 "비표적화된" 4+1 구축물을 생산하였다.
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
추가적 예에서, 제1 중쇄(HC 1)는, 항-OX40 결합자 49B4의 2개의 Fab 유닛(VHCH1_VHCH1)에 이어 (G4S) 링커에 의해 항-FAP 결합자 4B9의 VL 도메인에 융합된 Fc 놉 쇄로 이루어졌다. 구축물의 제2 중쇄(HC 2)는 항-OX40 결합자 49B4의 2개의 Fab 유닛(VHCH1_VHCH1)에 이어 (G4S) 링커에 의해 항-FAP 결합자 4B9의 VH 도메인에 융합된 Fc 홀 쇄로 이루어졌다.
놉에 융합된 a-FAP VL 및 홀 쇄에 융합된 VH를 갖는 4+1 항-Ox40, 항-FAP 구축물에 대한 아미노산 서열을 각각 표 31에서 확인할 수 있다.
Figure pct00151
Figure pct00152
또한, P329G LALA 돌연변이를 함유하지 않는 4+1 항-OX40, 항-FAP 구축물에 대한 염기쌍 및 아미노산 서열을 각각 표 32에서 확인할 수 있다.
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
모든 유전자를, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 조절하에 일시적으로 발현시켰다. 발현 벡터는 또한 EBNA(엡스타인 바 바이러스 핵 항원) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI; 폴리사이언시즈 인코포레이티드(Polysciences Inc.))을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 항-Ox40/항-FAP 4+1 구축물을 생산하였다. 상기 세포를 1:1:4 비("벡터 HC1":"벡터 HC2":"벡터 LC")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 200 mL 생산을 위해, 2억5천만개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 보충물 함유 엑셀(Excell) 배지(시그마)에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지(깁코)로 교체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍ DNA의 최종량으로 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI(1 mg/mL)(폴리사이언시즈 인코포레이티드)를 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기 및 165 rpm에서의 진탕하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 보충물(1 mM 발프로산, 5 g/l 펩소이(PepSoy), 6 mM L-글루타민)를 함유하는 엑셀 배지 160 mL를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 24시간 후에 세포에 12% 최종 부피(24 mL)의 아미노산 및 글루코스 공급물 및 3 g/L 글루코스(500 g/L 저장액으로부터 1.2 mL)를 보충하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상등액을 2000 내지 3000 x g에서 45분 동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
MabSelectSure를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 이중특이적 구축물의 정제를 수행하였다. 단백질을 농축하고 여과시킨 후, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈-20 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
친화성 크로마토그래피를 위해, 30 mL 20 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 인산 나트륨(pH 7.5)으로 평형화된 ProtA MabSelectSure 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 상등액을 부하시켰다. 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)을 함유하는 완충액 6 내지 10 컬럼 부피로 세척하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 미결합된 단백질을, 15 CV(0%로부터 100%까지)의 20 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화 나트륨, 100 mM 글리신, 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 3.0)의 단계 또는 선형 pH-구배를 이용하여 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 20 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화 나트륨, 100 mM 글리신, 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 3.0)을 함유하는 용액 10 컬럼 부피로 세척한 후 재평형화 단계를 수행하였다.
수거된 분획의 pH는 1/10(v/v)의 0.5 M 인산 나트륨(pH 8.0)을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과시킨 후, 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화 나트륨, (pH 6.0), 0.01% 트윈-20으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 OD를 측정함으로써, 정제된 이중특이적 구축물의 단백질 농도를 측정하였다. 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을, 환원제(인비트로겐)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 이중특이적 구축물의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM 인산 칼륨, 125 mM 염화 나트륨, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다(표 31).
Figure pct00160
4.5 OX40 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 4가 항원 결합 분자(4+2 포맷)의 생산
OX40에 대한 4가 결합 및 FAP에 대한 2가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 OX40 항체를 생산하였다. WO 2010/145792 A1에 따른 크로스맙 기술을 적용하여 부적절하게 쌍을 이룬 경쇄의 형성을 감소시켰다.
FAP 결합자의 생성 및 생산은 본원에 참고로 포함된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다.
본 실시예에서, FAP 결합자 28H1의 교차된 Fab 유닛(VLCH)은 둘 다의 중쇄의 Fc 일부의 C-말단에 융합되었다. OX40에 대한 2개의 Fab가 실시예 4.3에 기술된 바와 같이 각각의 중쇄의 N-말단에 융합되었다. 항-OX40 Fab의 CH 및 CL은 벤스 존스(Bence Jones) 단백질의 생산을 방지하고 경쇄의 정확한 쌍형성을 추가로 안정화시키기 위해 항-OX40 결합자 49B4의 CH1 도메인(K147E, K213E, 카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링) 및 CL(E123R 및 Q124K, 카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링)에서 아미노산 돌연변이(소위 하전된 잔기)를 함유하였다. 이러한 경우, 놉-인투-홀의 도입은 둘 다의 중쇄가 동일한 도메인을 함유하였기 때문에 필요하지 않았다.
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다. 생산된 이중특이적 4가 구축물을 도 16B에 도시하였다.
표 34는 각각 성숙한 이중특이적 4가 항-OX40/항-FAP 인간 IgG1 P329GLALA 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
또한, Fab 도메인을 항원에 대해 결합하지 않는 DP47로 지칭되는 생식계열 대조군의 Fab 도메인으로 대체한, "비표적화된" 4+2 구축물을 생산하였다.
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
모든 유전자를, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 조절하에 일시적으로 발현시켰다. 또한, 발현 벡터는 EBNA(엡스타딘 바 바이러스 핵 항원) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI; 폴리사이언시즈 인코포레이티드)를 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 항-Ox40/항-FAP 구축물을 생산하였다. 세포를 1:2:1 비("벡터 중쇄" : "벡터 경쇄 1 " : "벡터 경쇄 2 ")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 200 mL 생산을 위해, 2억5천만개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 보충물 함유 엑셀(시그마) 배지에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD-CHO 배지(깁코)로 교체하였다. 발현 벡터를 20 mL CD-CHO 배지(깁코)에 200 μg DNA의 최종량으로 혼합하였다. 540 μL PEI(1 mg/mL)(폴리사이언시즈 인코포레이티드)의 첨가 후에, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 10분 동안 실온에서 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 mL 진탕 플라스크에 옮기고 3시간 동안 37℃에서 165 rpm에서의 진탕하에 5% CO2 대기를 갖는 배양기에서 배양하였다. 배양 후에, 보충물(1 mM 발프로산, 5 g/l 펩소이, 6 mM L-글루타민)를 함유하는 160 mL 엑셀 배지(시그마)를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 24시간 후에, 세포를 12% 최종 부피(24 mL)의 아미노산 및 글루코스 공급물 및 3 g/L 글루코스(500 g/L 저장액으로부터 1.2 mL)로 보충하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상등액을 45분 동안 2000 내지 3000 x g에서 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과시키고(0.22 μm 필터) 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고 4℃에서 유지하였다.
친화성 크로마토그래피를 위해, 상등액을 30 mL 20 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 인산 나트륨(pH 7.5)으로 평형화된 ProtA MabSelect Sure 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다. 미결합된 단백질을, 6 내지 10 컬럼 부피의 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)을 함유하는 완충액으로 세척하여 제거하였다. 결합된 단백질을 8 CV의 20 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화 나트륨, 100 mM 글리신(pH 3.0)으로 단계 용출을 사용하여 용출시켰다.
수거된 분획의 pH를 1/10(v/v)의 0.5 M 인산 나트륨(pH 8.0)을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과시킨 후에, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, 0.01% 트윈20(pH 6.0)으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
정제된 이중특이적 4가 4+2 구축물의 단백질 농도를, 아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여 280 nm에서 OD를 측정함으로써 측정하였다. 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을 CE-SDS 환원제(인비트로겐)의 존재 및 부재하에 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 분석하였다. 이중특이적 구축물의 응집물 함량을 25℃에서 25 mM 인산 칼륨, 125 mM 염화 나트륨, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다(표 35).
Figure pct00170
4.6 이중특이적 4가 4+1 및 4+ 2 항 -OX40 항원 결합 분자의 응집 온도의 측정
모든 포맷의 직접 비교를 위해, 열적 안정성을 정적 광 산란법(SLS)에 의해 및 적용된 온도 응력에 응한 내재 단백질 형광을 측정함으로써 모니터링하였다. 1 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 30 μg의 여과된 단백질 샘플을 2회 옵팀(Optim) 2 기기(아박타 어낼리티컬 리미티드(Avacta Analytical Ltd))에 적용하였다. 온도를0.1℃/분으로 25℃에서 85℃로 증가시켰고, 반지름 및 총 산란 강도를 수거하였다. 내재 단백질 형광을 측정하기 위해, 샘플을 266 nm에서 여기시키고, 방출을 275 내지 460 nm에서 수거하였다.
모든 구축물에 대하여, 응집 온도는 결합자 조합 및 포맷에 따라 49℃ 내지 67℃였다.
4.7 Ox40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 4가 구축물의 특성규명
4.7.1 인간 FAP -발현 종양 세포에 대한 결합
세포 표면 FAP에 대한 결합을 WM266-4 세포(ATCC CRL-1676)를 사용하여 시험하였다. 0.5 x 105 WM266-4 세포를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 120분 동안 4℃에서 어두운 상태에서 적정된 항-OX40 항체 구축물을 함유하는 BSA(0.1% v/w, 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 A9418) 함유 50 μL/웰 4℃ 냉각 FACS 완충액(DPBS (깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190 326)에서 염색시켰다. 과량의 FACS 완충액으로 3회 세척한 후에, 세포를 45분 동안 4℃에서 어두운 상태에서 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098)을 함유하는 25 μL/웰 4℃ 냉각 FACS 완충액에서 염색시켰다.
플레이트를 최종적으로 0.2 μg/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 85 μL/웰 FACS-완충액에 재현탁시키고 같은 날에 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스, 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 비표적화된 OX40 구축물이 아닌 FAP-표적화된 이중특이적 4가 OX40 구축물이 인간 FAP-발현 표적 세포에 효율적으로 결합하였다. 따라서, FAP-표적화된 항-OX40 구축물만이 직접 종양-표적화 특성을 나타낸다. 4+1 포맷의 경우, FAP 클론 4B9는 FAP 클론 28H1보다 인간 FAP에 대한 훨씬 더 강한 결합을 가졌고, 여기서 사용된 세척 조건하에 유세포 분석에 의해 결합이 거의 관찰되지 않았다. 클론 28H1의 경우, 2+2 및 4+2 구축물(채워진 원 및 삼각형)은 4+1 구축물(사각형)보다 강한 FAP에 대한 결합을 나타냈고, 이는 1가 포맷에 비해 2가 포맷에서의 결합활성의 증가에 의해 설명된다. 동일한 2가 FAP 결합 모이어티를 함유하는 4가와 2가 49B4 구축물(채워진 삼각형 대 원) 사이의 FAP 결합의 차이는, 아마 4가 구축물의 보다 큰 크기에 기인한 FAP 결합에서의 입체 장애가 이미 존재함을 암시한다. 활성화된 인간 및 사이노몰구스 CD4 T 세포 및 FAP 양성 종양 세포에 대한 결합의 EC50 값(실시예 4.3.2.1 및 4.3.2.2에 기술된 바와 같이 측정됨)을 표 36에 요약하여 나타냈다.
Figure pct00171
4.7. 2 표면 플라즈몬 공명
인간, 뮤린 및 사이노몰구스 FAP와 결합하는 이중특이적 구축물의 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 러닝 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200(비아코어) 상에서 수행하였다.
His-태그된 인간, 뮤린 또는 사이노몰구스 원숭이 이량체성 FAP를, 500 nM huFAP를 10 ㎕/분의 유량에서 60초 동안, 10 nM 뮤린 FAP를 20 ㎕/분의 유량에서 20초 동안 및 10 nM 사이노몰구스 FAP를 20 Ll/분의 유량에서 20초 동안 주입시켜 항-His 항체(키아겐 카탈로그 번호 34660)로 고정화된 CM5 칩(지이 헬쓰케어) 상에 포획하였다. 18000 공명 단위(RU) 이하의 항-His 항체에 대한 고정화 수준을 사용하였다.
포획 단계 후에, 이중특이적 구축물 및 대조군 분자를 0.006 내지 100 nM 범위의 농도에서 30 ㎕/분의 유량하에 280초 동안 칩 표면위로 즉시 통과시키고 180초의 해리 단계를 수행하였다. FAP가 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 친화도는 랭뮤어 1:1 곡선 정합을 사용하여 측정하였다. 2가 결합의 경우, 동일한 1:1 정합을 사용하여 겉보기 KD 값을 수득하였다.
Figure pct00172
4.7.3 OX40에 대한 결합
4.7.3 인간 OX40 발현 세포 : 미감작 및 활성화된 인간 말초혈 단핵 백혈구(PBMC)에 대한 결합
취리히 헌혈 센터에서 버피 코트를 수득하였다. 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 버피 코트를 동일 부피의 DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190 326)로 희석하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관(TPP, 카탈로그 번호 91050)에 15 mL 히스토파크 1077(시그마 라이프 사이언스, 카탈로그 번호 10771, 폴리슈크로스 및 나트륨 다이아트라이조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정)을 보충하고, 버피 코트 용액을 히스토파크 1077 위에 적층시켰다. 관을 30분 동안 400 x g에서 실온에서 낮은 가속하에 휴지 없이 원심분리하였다. 그 후에, PBMC를 계면으로부터 수거하고 DPBS로 3회 세척하고 10% 태아 소 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 16000-044, Lot 941273, 감마선-조사되고 마이코플라스마가 없고 56℃에서 35분 동안 열 불활성화됨), 1%(v/v) 글루타맥스 I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038), 1 mM 나트륨-피루베이트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1% (v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)로 보충된 RPMI 1640 배지(깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 42401-042)로 이루어진 T 세포 배지에 재현탁시켰다.
PBMC를 단리 후에 바로 사용하거나(휴지중인 인간 PBMC 상의 결합) 이들을 T 세포의 세포 표면 상에서 강한 인간 Ox40 발현을 수용하도록 자극하였다(활성화된 인간 PBMC 상의 결합). 따라서, 미감작 PBMC를 4일 동안 6-웰 조직 배양 플레이트에서 200 U/mL 프로류킨(노바티스(Novartis)) 및 2 ug/mL PHA-L(시그마-알드리치, L2769-10)로 보충된 T 세포 배지에서 배앙한 후에, 37℃에서 5% CO2에서 200 U/mL 프로류킨으로 보충된 T 세포 배지에서 1일 동안 예비코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트 상에서 [4 ug/mL] 항-인간 CD3(클론 OKT3, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호 16-0037-85) 및 [2 ug/mL] 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호16-0289-85]을 배양하였다.
OX40의 검출을 위해, 미감작 인간 PBMC 및 활성화된 인간 PBMC를 혼합하였다. 활성화된 인간 PBMC로부터 미감작 세포의 구별을 가능하게 하기 위해, 미감작 세포를 이플루오르670 세포 증식 지시염료(이바이오사이언스, 카탈로그 번호65-0840-85)를 사용하여 분석 전에 표지하였다.
표지화를 위해, 세포를 수거하고 예열된(37℃) DPBS로 세척하고 DPBS 중에 1 x 107 세포/mL의 세포 밀도로 조정하였다. 이플루오르670 세포 증식 지시염료(이바이오사이언스, 카탈로그 번호65-0840-85 )를 2.5 mM의 최종 농도 및 DPBS 중의 0.5 x 107 세포/mL의 최종 세포 밀도로 미감작 인간 PBMC의 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 10분 동안 실온에서 어두운 상태에서 배양하였다. 표지화 반응을 중단하기 위해, 4 mL 열 불활성화된 FBS를 첨가하고, 세포를 3회 T 세포 배지로 세척하였다. 이어서, 1 x 105 휴지중인 이플루오르670 표지된 인간 PBMC 및 0.5 x 105 비표지된 활성화된 인간 PBMC의 2:1 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다.
세포를 120분 동안 4℃에서 어두운 상태에서 적정된 항-Ox40 항체 구축물을 함유하는 50 μL/웰 4℃ 냉각 FACS 완충액 중에서 염색시켰다. 과량의 FACS 완충액으로 3회 세척한 후에, 세포를 45분 동안 4℃에서 어두운 상태에서 형광 표지된 항-인간 CD4(클론 RPA-T4, 마우스 IgG1 k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532), 항-인간 CD8(클론 RPa-T8, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 3010441) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 096 098)의 혼합물을 함유하는 25 μL/웰 4℃ 냉각 FACS 완충액 중에서 염색시켰다.
플레이트를 최종적으로 0.2 μg/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 85 μL/웰 FACS-완충액에 재현탁시키고 같은 날에 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스, 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, OX40에 특이적인 항체 구축물은 휴지중인 인간 CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포에 결합하지 않았고, 이는 OX40에 대해 음성이다. 대조적으로, 모든 구축물은 활성화된 CD8+ 또는 CD4+ T-세포에 결합하였고, 이는 OX40을 발현한다. CD4+ T-세포에 대한 결합은 CD8+ T 세포에 대한 것보다 훨씬 더 강했다. 활성화된 인간 CD8+ T 세포는 활성화된 CD4+ T 세포 상에 검출된 OX40 수준의 일부분만을 발현한다. OX40에 대한 발현 수준은 자극의 동역학 및 강도 및 조건에 의존적이고, 조건은 CD8+ T 세포에 대해서 최적화되지 않았으나 CD4+ T 세포 상의 OX40 발현에 대해서는 최적화되었다. 따라서, 미미한 Ox40 발현만이 CD8 T 세포 상에 유도되었다. 분석된 이중특이적 항-OX40 구축물은 그의 결합 강도에 있어서 달랐다(EC50 값, 표 34 참조). 4가 OX40 결합(원 및 사각형)은 OX40에 대한 결합활성을 강하게 증가시켰다. 비교해보면, 둘 다의 2가 구축물(삼각형)은 CD4+ T 세포에 대한 보다 약한 결합을 나타냈다. FAP 결합 모이어티의 존재는 (예를 들어 입체 장애에 의해) 4가 OX40 결합자에 대한 OX40 결합에 영향을 미치지 않았다(빈 기호 대 채워진 기호 비교). 그러나, 2가 이중특이적 구축물에서 클론 49B9의 결합은 통상적 IgG 포맷에서의 것보다 분명히 강하였다.
4.7.3.2 사이노몰구스 OX40 발현 세포 : 활성화된 사이노몰구스 말초혈 단 핵 백혈구(PBMC)에 대한 결합
항-OX40 구축물과 사이노몰구스 세포의 반응성을 시험하기 위해, 건강한 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)의 PBMC를 약간의 변형하에 4.7.3.1에서 인간 세포에 대해 기술된 바와 같이 밀도 구배 원심분리를 사용하여 헤파린첨가 혈액으로부터 단리하였다. 사이노몰구스 PBMC를 DPBS(90% v/v)로 희석된 히스토파크 1077(시그마 라이프 사이언스, 카탈로그 번호 10771, 폴리슈크로스 및 나트륨 다이아트라이조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정)을 사용하여 신선한 헤파린첨가 혈액으로부터 밀도 구배 원심분리로 단리하였다. 원심분리를 520 x g에서 휴지 없이 실온에서 30분 동안 수행하였다. PBMC를 자극하여 T 세포의 세포 표면 상에 강한 OX40 발현을 수용하도록 자극하였다(활성화된 사이노몰구스 PBMC 상의 결합). 따라서, 미감작 PBMC를 37℃에서 및 5% CO2에서 200 U/mL 프로류킨으로 보충된 T 세포 배지에서 예비-코팅된 12-웰 조직 배양 플레이트 상에 [10 ug/mL] 사이노몰구스 교차-반응성 항-인간 CD3(클론 SP34-2, 비디바이오사이언스, 카탈로그 번호 551916) 및 [2 ug/mL] 사이노몰구스 교차-반응성 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호16-0289-85]을 72시간 동안 배양하였다.
이어서, 0.5 x 105 활성화된 사이노몰구스 PBMC를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 1회 200 μL 4℃ 냉각 FACS 완충액으로 세척하고, 적정된 항-Ox40 항체 구축물을 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 냉각 FACS 중에서 120분 동안 4℃에서 배양하였다. 이어서, 플레이트를 4회 200 μL/웰 4℃ FACS 완충액으로 세척하였다. 세포를 형광 표지된 사이노몰구스 교차-반응성 항-인간 CD4(클론 OKT-4, 마우스 IgG1 k, BD, 카탈로그 번호 317428), 항-인간 CD8(클론 HIT8a, 마우스 IgG1k, BD, 카탈로그 번호 555369) 및 FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 096 098)을 함유하는 25 μL/웰 4℃ 냉각 FACS 완충액 중에 재현탁시키고 60분 동안 4℃에서 어두운 상태에서 배양하였다. 플레이트를 2회 200 μL/웰 4℃ FACS 완충액으로 세척하고, 최종적으로 0.2 μg/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 μL/웰 FACS-완충액 중에 재현탁시키고, 같은 날에 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스, 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 모든 49B4 구축물은 활성화된 CD4+ 사이노몰구스 T-세포에 결합하였다. 분석된 항-OX40 항체 구축물은 그의 결합 강도에 있어서 달랐다(표 34에 요약하여 나타낸 (EC50 값). 4가 OX40 결합 모이어티를 갖는 구축물은 2가 구축물보다 Ox40+ T 세포에 대한 보다 강한 결합을 나타냈다. OX40에 대한 4가 결합과 2가 결합 사이의 결합활성의 증가는 인간 OX40에 대해 관찰된 것보다 덜 강했다(약 5x 증가 대 약 50x 증가, 표 34의 값 비교). CD4+ T-세포에 대한 결합은 CD8+ T 세포에 대한 결합보다 훨씬 더 강했다. OX40에 대한 발현 수준은 자극의 동역학 및 강도에 의존적이고, CD8+ 사이노몰구스 T 세포에 대해 최적화되지 않으나 CD4+ 사이노몰구스 T 세포에 대해서는 최적화되었고, 미미한 OX40 발현만이 CD8+ T 세포 상에 유도되었다.
4.7.3.3 인간 OX40에 대한 결합 - 2가 Ox40 결합 대 4가 Ox40 결합의 경쟁 결합
huOX40에 결합하는 4개의 항-OX40 Fab 도메인 모두의 능력을 확인하기 위해, 세포-기반 FRET 분석(태그라이트(TagLite))을 적용하였다. 따라서, huOX40-SNAP 융합체로 형질감염되고 FRET 공여체 터븀(Terbium)(시스바이오(Cisbio))으로 표지된 900개 Hek293 EBNA 세포/웰을 FRET 수용체 d2(시스바이오)로 표지된 1.56 nM (49B4) IgG와 혼합하였다. 또한, (49B4) IgG 또는 이중특이적 구축물 49B4/28H1(4+1)로부터의 0.01 내지 750 nM 범위의 농도 희석물을 첨가하고 실온에서 2 내지 4시간 동안 배양하였다. 형광 신호를, 형광 공여체(터븀)에 대해서는 620 nm에서 및 형광 수용체 염료(M100 Pro, 테칸(Tecan))에 대해서는 665 nm에서 측정하였다. 665/620*1000의 비를 산출하고, 기준(세포만)을 감하였다(도 21A). EC50 측정을 위해, 결과를 그래프 패드 프리즘5에서 분석하였다. 관찰된 EC50 값을 표 38에 나타내었다.
Figure pct00173
4.7.4 OX40 및 FAP에 대한 동시 결합
인간 Ox40 Fc(kih)와 인간 FAP에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
비오틴화된 인간 Ox40 Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 1000 공명 단위(RU) 이하의 고정화 수준을 사용하였다.
OX40 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 항체를 250 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 유량하에 90초 동안 칩 표면 위로 이동시키고 해리는 0(제로)초로 설정하였다. 인간 FAP를 제2의 분석물로서 250 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 유량하에 90초 동안 주입하였다(도 21B 참조). 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
모든 이중특이적 구축물은 DP47 대조군 분자를 제외하고 인간 OX40 및 인간 FAP에 동시에 결합할 수 있었다(도 22).
4.7.5 OX40 및 FAP 음성 종양 세포에 대한 결합
비표지된 인간 FAP 양성 WM266-4 세포로부터의 분리를 가능하게 하기 위해 핵으로 제한된 누크라이트 레드(NucLight Red) 형광 단백질을 발현하는 A549 누크라이트(상표) 레드 세포(에센바이오사이언스(Essenbioscience, 카탈로그 번호 4491)를 사용하여, OX40 음성 FAP 음성 종양 세포에 대한 결합의 결여를 시험하였다. 표준 에센(Essen) 프로토콜에 따라서 8 ㎍/ml 폴리브렌의 존재하에 3(TU/세포)의 MOI에서 에센 셀플레이어(Essen CellPlayer) 누크라이트 레드 렌티바이러스(에센바이오사이언스, 카탈로그 번호 4476; EF1α, 퓨로마이신)로 모 A549(ATCC CCL-185)를 형질도입시켰다. 이에 의해 ≥70%의 형질도입 효율이 야기되었다.
FACS 완충액 중의 5 x 104 비표지된 WM266-4 세포 및 비표지된 A549 누크라이트(상표) 레드 세포의 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 결합 분석을 4.7.1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 49B4 항체 구축물은 Ox40 음성 FAP 음성 인간 종양 세포에 결합하지 않았다.
실시예 5: 이중특이적 항-인간 OX40 결합 분자의 기능적 특성
5.1 인간 OX40 및 리포터 유전자 NFκB - 루시퍼라제를 발현하는 HeLa 세포
Ox40의 그 리간드에 대한 작용성 결합은 핵 인자 카파 B(NFκB)의 활성화를 통해 하류 신호전달을 유도한다(문헌[A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972]). 재조합 리포터 세포주 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1을 인간 OX40을 그 표면 상에서 발현하도록 생산하였다. 또한, 이는 NFκB-민감성 인핸서 분절의 제어하에 루시퍼라제 유전자를 함유하는 리포터 플라스미드를 갖는다. OX40 촉발은 NFκB의 용량 의존성 활성화를 유도하고, 이는 핵에서 전위하고, 여기서 이는 리포터 플라스미드의 NFκB 민감성 인핸서 상에서 결합하여 루시퍼라제 단백질의 발현을 증가시킨다. 루시퍼라제는 루시페린-산화를 촉진하여 발광하는 옥시루시페린을 생성한다. 이는 루미노미터로 정량화될 수 있다. 따라서, HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 리포터 세포에서 NFκB 활성화를 유도하는 다양한 항-OX40 항원 결합 분자의 능력은 생체활성에 대한 척도로서 분석되었다.
부착성 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 세포를, 세포 해리 완충액(인비트로겐, 카탈로그 번호 13151-014)을 사용하여 10분 동안 37℃에서 수거하였다. 세포를 1회 DPBS로 세척하고 MEM(인비트로겐, 카탈로그 번호 22561-021), 10%(v/v) 열 불활성화된 FBS, 1 mM 나트륨-피루베이트 및 1%(v/v) 비필수 아미노산을 포함하는 분석 배지 중에 0.64*105의 세포 밀도로 조정하였다. 세포를 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)에 웰 당 0.1*105 세포의 밀도로 접종하고 밤새 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 셀 150)에서 유지시켰다.
다음 날 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1을, P329GLALA huIgG1 포맷으로 다양한 적정된 이중특이적 항-OX40(클론 49B4) 항체 구축물을 함유하는 분석 배지를 첨가함으로써 6시간 동안 자극하였다. 항-Ox40 항체의 초가교결합의 효과를 시험하기 위해, 이차 항체 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 109-006-098)을 함유하는 25 μL/웰의 배지를 1:2 비(1차 항-Ox40 P329GLALA huIgG1에 비해 2배인 이차 항체)로 첨가하였다. 배양 후에, 상등액을 흡인시키고 플레이트를 2회 DPBS로 세척하였다. 발광의 정량화를 생산사의 지시에 따라 루시퍼라제 100 분석 시스템 및 리포터 용해 완충액(둘 다 프로메가, 카탈로그 번호 E4550, 및 카탈로그 번호 E3971)을 사용하여 수득하였다. 간략하게, 세포를 웰 당 30 uL의 1x 용해 완충액을 첨가하여 10분 동안 -20℃에서 용해시켰다. 세포를 20분 동안 37℃에서 해동한 후에, 웰 당 90 uL의 제공된 루시퍼라제 분석 시약을 첨가하였다. 모든 파장을 수집하기 위한 임의의 필터 없이 500밀리초의 적분 시간을 사용하여 스펙트라맥스 M5/M5e 미세플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈, 미국)로 발광을 즉시 정량화하였다. 상대 발광 단위(URL)는 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 세포의 기저 발광에 의해 보정되었고 프리즘4(그래프패드 소프트웨어, 미국)를 사용하여 로그 1차 항체 농도에 대해 블롯팅되었다. 곡선을 고유의 S자형 용량 반응을 사용하여 정합시켰다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 제한된 용량 의존성 NFκB 활성화가 항-OX40 P329GLALA huIgG1 항체(왼편)를 리포터 세포주에 첨가함으로써 이미 유도되었다. 4가 OX40 결합 모이어티를 갖는 구축물은 2가 OX40 결합 모이어티를 갖는 구축물보다 강한 NFkB 활성화를 유도하였다. 이는, OX40 수용체의 최소 신호전달 단위가 삼량체라는 사실에 부합한다(문헌[M. Croft, Nat rev Immunol. 2009, 9, 271- 285]). 항-인간 IgG 특이적 이차 항체에 의한 항-OX40 항체의 초가교결합은 농도 의존성 방식으로 NFκB-매개된 루시퍼라제-활성화의 유도를 강하게 증가시켰다(오른편). 증가는 구축물의 4가 및 2가 기 내에 존재하였다.
결과적으로, FAP+ 종양 세포주에 의한 구축물의 초가교결합을 사용하여 상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷의 aOx40 결합자 49B9의 NFkB 활성화 능력을 시험하였다.
시험된 종양 세포주는 WM266-4 세포(ATCC CRL-1676), NIH/3T3-moFAP 클론 26 및 NIH/3T3-huFAP 클론 39였다. NIH/3T3-huFAP 클론 39 및 NIH/3T3-moFAP 클론 26을, 모두 1.5 μg/mL 퓨로마이신 선별하에서 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3 세포주(ATCC CRL-1658)를 huFAP를 발현하는 발현 벡터 pETR4921로 및 moFAP를 발현하는 발현 벡터 pETR4906로 형질감염시켜 생산하였다. FAP의 표면 발현을 생산사의 지시에 따라 Quifikit(다코(Dako) 카탈로그 번호 K0078)를 사용하여 정량화하였다. 세포 표면 FAP 발현을 검출하는 데 사용된 1차 항체는 인간/마우스 교차-반응성 클론 F11-24(마우스 IgG1, 칼바이오켐(Calbiochem), 카탈로그 번호 OP188)였다. WM266-4 세포 상의 표면 발현은 평균으로 세포 당 약 40000 huFAP이었고(저발현, FAP+/-)이었고, NIH/3T3-huFAP 클론 39의 경우 세포 당 약 90000 huFAP이었고(중간발현, FAP+), NIH/3T3-moFAP 클론 26의 경우 세포 당 약 160000 moFAP이었다(고발현, FAP++) .
본원 상기에 기술된 바와 같이, 부착성 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 세포를 밤새 웰 당 0.1*105 세포의 세포 밀도로 배양하고, 적정된 항-OX40 구축물을 함유하는 분석 배지로 5 내지 6시간 동안 자극하였다. 세포 표면 FAP 결합에 의한 초가교결합의 효과를 시험하기 위해, FAP+ 종양 세포(WM266-4, NIH/3T3-huFAP 클론 39, NIH/3T3-moFAP cl 26)를 함유하는 25 μL/웰의 배지를 4:1 비(웰 당 리포터 세포에 비해 4배인 FAP+ 종양 세포)로 동시-배양하였다. 활성화된 NFκB를 전술된 바와 같이 루시퍼라제 100 분석 시스템 및 리포터 용해 완충액(둘 다 프로메가, 카탈로그 번호 E4550, 및 카탈로그 번호 E3971)을 사용하여 발광을 측정함으로써 정량화하였다.
도 25 및 도 26에 나타낸 바와 같이, 모든 항-OX40 구축물의 존재는 제한된 NFκB 활성화를 유도하였다. FAP-발현 종양 세포는, FAP 표적화된 분자(채워진 원, 사각형 및 삼각형)가 첨가됐을 때 NFκB-매개된 루시퍼라제-활성화의 유도를 강하게 증가시켰으나 비표적화된 이중특이적 구축물(각각 빈 원, 사각형 및 삼각형과 비교)이 첨가됐을 때는 증가시키지 않았다.
모든 포맷의 보다 양호한 비교를 위해, 각각 블롯팅된 용량-반응 곡선의 곡선 아래 면적을 각각의 구축물의 작용물질 능력에 대한 마커로서 정량화하였다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 4가 FAP-표적화된 구축물은 2가 FAP-표적화된 분자보다 우수하였다. FAP의 고발현은 보다 많은 가교결합을 보장하여 FAP-표적화된 구축물의 보다 양호한 작용성 효과를 보장하였다(FAP 저발현 WM266-4 세포와 FAP 중간발현 NIH-3T3 인간 FAP 세포 및 FAP 고발현 NIH-3T3 마우스 FAP 세포 비교).
5.2 최적이하로 TCR 촉발된 사전활성화된 인간 CD4 T 세포의 OX40 매개된 공자극
OX40의 접합물은 최적이하 T-세포 수용체(TCR) 자극 후 T-세포의 분열 및 생존을 촉진하는 상승적 공자극 신호를 제공한다(문헌[M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191]). 또한, 여러 사이토카인의 생성 및 T-세포 활성화 마커의 표면 발현이 증가된다(문헌[I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517]; [S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532]).
상이한 이중특이적 인간 IgG1 P329GLALA 포맷으로 클론 49B9의 작용물질 특성을 시험하기 위해, 사전활성화된 OX40 양성 CD4 T-세포를 용액 상태이거나 플레이트 표면 상에 고정화된 항-Ox40 항체의 존재하에 최적이하 농도의 플레이트-고정화된 항-CD3 항체로 72시간 동안 자극하였다. T-세포 생존 및 증식에 대한 효과를 유세포분석에 의해 살아있는 세포에서 전체 세포수 및 CFSE 희석의 모니터링을 통해 분석하였다. 또한, 세포를 T-세포 활성화 및 분화 마커, 예를 들어 CD127, CD45RA, Tim-3, CD62L 및 OX40 자체에 대해 형광 표지된 항체로 동시-염색시켰다.
인간 PBMC를 피콜 밀도 원심분리를 통해 단리하고 실시예 4.7.3.1에 기술된 바와 같이 3일 동안 PHA-L[2 μg/mL] 및 프로류킨[200 U/mL]으로 자극하였다. 이어서, 세포를 10분 동안 37℃에서 50 nM의 최종 농도에서 CFDA-SE(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 2188) 1x106 세포/ mL의 세포 밀도로 CFSE를 사용하여 표지하였다. 그 후에, 세포를 FBS(10% v/v)를 함유하는 과량의 DPBS로 2회 세척하였다. 표지된 세포를 T-세포 배지에서 37℃에서 30분 동안 휴지시켰다. 그 후에, 비-전환된 CFDA-SE를 DPBS를 사용한 2개의 추가적 세척 단계에 의해 제거하였다. 사전활성화된 CFSE-표지된 인간 PBMC로부터 CD4 T-세포의 단리를 생산사의 지시에 따라 MACS 음성 CD4 T-세포 단리 키트(밀테나이 바이오텍, 카탈로그 번호 130-096.533)를 사용하여 수행하였다.
모리스 등은 통상적 항-Ox40 항체에 의한 작용성 공자극이 표면 고정화에 의존적임을 보여주었다(문헌[N. P. Morris et al., Mol. Immunol. 2007, 44(12), 3112-3121]). 따라서, 염소 항-마우스 Fcγ-특이적 항체(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 111-500-5008)를 96 웰 U-바닥 세포 배양 플레이트(그레이너 바이오 원)의 표면에 2 μg/mL 농도로 PBS 중에서 밤새 4℃에서 염소 항-인간 Fcγ-특이적 항체(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-006-098)의 존재(표면 고정화된 항-OX40) 또는 부재(용액 중의 항-OX40)하에 코팅하였다. 그 후에, 플레이트 표면을 BSA(1% v/w)를 함유하는 DPBS로 차단하였다. 모든 하기 배양 단계를 37℃에서 90분 동안 BSA(1% v/w)를 함유하는 PBS 중에서 수행하였다. 배양 단계 사이에, 플레이트를 DPBS로 세척하였다.
마우스 항-인간 CD3 항체(클론 OKT3, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호 16-0037-85, 3 ng/mL의 고정된 농도)를 표면 코팅된 항-마우스 Fcγ- 특이적 항체를 통한 후속 배양 단계에서 포획하였다. 이어서, 하나의 실험에서, 적정된 인간 항-OX40 항원 결합 분자를 DPBS 중에서 추가적 배양 단계에 의해 플레이트 상에 고정화시켰다. 제2 실험에서, 항-OX40 항원 결합 분자를 활성화 분석 동안 배지에 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 예비코팅되지 않은 플레이트에 직접 첨가하였다.
CFSE-표지된 사전활성화된 CD4+ T 세포를 예비코팅된 플레이트에 웰 당 0.5*105 세포의 세포 밀도로 200 μL T-세포 배지 중에서 첨가하고 96시간 동안 배양하였다. 세포를 플루오로크롬-표지된 마우스 항-인간 Ox40(클론 BerACT35, 바이오레전드, 카탈로그 번호 35008), TIM-3(클론 F38-2E2, 바이오레전드, 카탈로그 번호345008), CD127(클론 A019D5, 바이오레전드, 카탈로그 번호351234), CD25(클론 M-AQ251, 바이오레전드, 카탈로그 번호 356112) 및 CD45RA(클론 HI100, 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 카탈로그 번호555489)의 조합으로 20분 동안 4℃에서 어두운 상태에서 염색시켰다. 플레이트를 2회 200 μL/웰 4℃ FACS 완충액으로 세척하고 최종적으로 0.2 μg/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 85 μL/웰 FACS-완충액에 재현탁시키고 같은 날에 5-레이저 LSR-포르테사(BD 바이오사이언스, 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
DAPI-음성인 살아있는 세포를 증식에 대한 마커로서 중간 CFSE 형광의 감소에 대해 분석하였다. OX40 양성, CD25 고발현 및 TIM-3 양성 T 세포의 백분율을 T-세포 활성화에 대한 마커로서 모니터링하였다. CD45RA 및 CD127의 발현을 분석하여 T 세포의 성숙 상태의 변화를 측정하여 CD45RA 저발현 및 CD127 저발현 세포를 효과기 T 세포로 분류하였다.
플레이트-고정화된 항체에 의한 공자극은 플레이트-고정화된 항-인간 CD3에 의한 사전활성화된 인간 CD4 T 세포의 최적이하 자극을 용량 의존성 방식으로 강하게 증대시켰다(도 27). T-세포는 보다 강하게 증식하였고, 보다 높은 백분율의 효과기 T 세포하에 보다 성숙한 표현형을 나타냈으며, 보다 높은 백분율의 Ox40 양성 활성화된 세포를 가졌다. 4가 OX40 결합 모이어티를 갖는 분자는 OX40에 대한 단지 2가 결합을 갖는 분자보다 강한 작용성을 나타냈다. 모든 5개의 4가 분자 및 2개의 2가 분자는 TCR 자극을 비슷한 정도로 증대시킬 수 있었다. 따라서, 이들 2개의 군 내에 FAP+ 종양 세포의 존재하에 활성화 잠재력의 차이는 상이한 FAP 결합 능력 및 가교결합에 의해 매개되고 OX40을 어드레스하는 상이한 능력에 기인한 것은 아니였다. 최적이하 TCR 자극의 증대는, 항-OX40 항원 결합 분자가 용액에 표면 고정화의 부재하에 첨가될 때 발견되지 않았다(도 28). 이는 OX40 수용체의 초가교결합에 대한 OX40 축 활성화의 강한 의존성을 다시 입증하였다.
5.3 최적이하로 TCR 촉발된 휴지중인 인간 PBMC의 Ox40 매개된 공자극 및 세포 표면 FAP에 의한 초가교결합
실시예 5.1에서는 FAP+ 종양 세포의 첨가가, OX40 수용체의 강한 올리고머화를 제공함으로써 인간 OX40 양성 리포터 세포주에서 FAP 표적화된 4가 항-OX40 구축물에 의해 유도된 NFκB 활성을 강하게 증가시킬 수 있음을 보여주었다. 유사하게, NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포의 존재하에서 휴지중인 인간 PBMC 세포의 최적이하 TCR 자극을 해제하는 그의 능력에 대해 FAP 표적화된 4가 항-OX40 구축물을 시험하였다.
인간 PBMC 제제는 (1) 휴지중인 OX40 음성 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 (2) 그 세포 표면상에 다양한 Fc-γ 수용체 분자를 갖는 항원 제공 세포, 예를 들어, B 세포 및 단핵구를 함유한다. 인간 IgG1 이소타입의 항-인간 CD3 항체는 그의 Fc 부분과 함께 본 발명의 Fc-γ 수용체 분자에 결합할 수 있고 휴지중인 Ox40 음성 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 연장된 TCR 활성화를 매개할 수 있다. 이어서, 이들 세포는 수시간 내에 OX40을 발현하기 시작한다. OX40에 대한 기능적 작용성 화합물은 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에 존재하는 OX40 수용체를 통해 신호를 전달하고 TCR-매개된 자극을 촉진할 수 있다.
휴지중인 CFSE-표지된 인간 PBMC를, 방사선조사된 FAP+ NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포 및 적정된 항-Ox40 구축물의 존재하에서 최적이하 농도의 항-CD3 항체로 4 내지 5일 동안 자극하였다. T-세포 생존 및 증식에 대한 효과는 총세포수의 모니터링 및 유세포분석에 의한 살아있는 세포에서의 CFSE 희석을 통해 분석하였다. 또한, T-세포 활성화 및 성숙화 마커 CD25에 대한 형광-표지된 항체로 세포를 동시-염색시켰다.
마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포(실시예 4.3.2.2 참조)를 37℃에서 세포 해리 완충액(인비트로겐, 카탈로그 번호 13151-014)을 사용하여 10분 동안 수거하였다. 세포를 DPBS로 1회 세척하였다. NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포를, 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 셀 150)에서 멸균 96-웰 환저 부착 조직 배양 플레이트(TPP, 카탈로그 번호 92097)에서 T 세포 배지 중에 웰 당 0.2*105 세포의 밀도에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 종양 세포주에 의한 인간 PBMC의 후속 과성장을 방지하기 위해 4500 RAD의 선량을 이용하여 x선 조사장치에서 상기 세포를 방사선조사하였다.
인간 PBMC를 실시예 4.3.2.1에서 기술된 바와 같이 피콜 밀도 원심분리에 의해 단리하고 CFSE로 표지하였다. 세포를 웰 당 0.5*105 세포의 밀도로 각각의 웰에 첨가하였다. 10 nM의 최종 농도의 항-인간 CD3 항체(클론 V9, 인간 IgG1, 문헌[Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)] 및 US 6,054,297에 기술됨) 및 항-Ox40 구축물을 지시된 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 셀 150)에서 5일 동안 활성화시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 20분 동안 형광 염료-접합된 항체 항-인간 CD4(클론 RPA-T4, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532), CD8(클론 RPa-T8, 바이오레전드, 카탈로그 번호 3010441) 및 CD25(클론 M-A251, 바이오레전드, 카탈로그 번호 356112)로 표면-염색시켰다. 세포 막을 투과하기 위해, 세포 펠릿을 FACS 완충액으로 2회 세척한 다음, 실온에서 어두운 상태에서 50 ㎕/웰의 새로 생산된 FoxP3 Fix/Perm 완충액(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 00-5123 및 00-5223) 중에 45분 동안 재현탁시켰다. Perm-세척 완충액(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 00-8333-56)으로 3회 세척한 후, 세포를 실온에서 어두운 상태에서 1시간 동안, 항-인간 그랜자임 B 항체(클론 GB-11, 비디 바이오사이언스, 카탈로그 번호 561142)를 함유하는 25 ㎕/웰 Perm-세척 완충액으로 세포내 염색시켰다. 세포를 85 ㎕/웰의 FACS 완충액에 재현탁시키고, 5-레이저 포르테사 유세포분석기(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 29, 30 및 31에 나타낸 바와 같이, 비표적화된 4가 항-OX40(49B4) 4+1 구축물(빈 사각형) 및 OX40(49B4) 4+2(빈 원)에 의한 공자극은 최적이하로 TCR 자극된 CD4 및 CD8 T 세포를 약간만 해제시켰다. 존재하는 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포에 의한 FAP 표적화된 4+1(채워진 사각형 및 반만 채워진 사각형) 및 4+2(채워진 원) 항-OX40 구축물의 초가교결합은 인간 CD4 및 CD8 T 세포에서 증식(도 29) 및 생존(도 30)을 강하게 촉진시켰고 증대된 활성화된 표현형(도 31)을 유도하였다. FAP-표적화된 4가 OX40 결합자는 명백히 FAP-표적화된 2가 OX40 결합자보다 우수하였다(도 29 및 30: 채워진 삼각형, 비교를 위해 도 32 및 33 참조). 그러나, 2가 OX40 작용물질의 세포 표면 고정화는 비표적화된 4가 OX40 작용물질의 첨가보다 활성화를 지원하는 데 보다 효과적이었다(도 32 및 33에서, 2+2 (28H1) 대 4+1 (DP47)/ 4+2 (DP47) 비교). 1차 세포 환경에서 상기 사실은 NFκB 리포터 분석에서의 관찰 내용과 약간 상이하였다(도 26). 여기서, OX40에 대한 4가는 2가에 비해 표면-고정화되지 않은 때에도 보다 강한 NFκB 활성화를 야기하였다. 따라서, T 세포에 대한 최적의 OX40 작용성을 수득하기 위해, OX40 수용체의 충분한 올리고머화뿐만 아니라, 추가적으로 OX40 수용체 올리고머의 세포 표면 고정화가 달성될 필요가 있다. FAP에 대한 2가 결합은 FAP에 대한 1가 결합에 비해 4가 OX40 분자의 작용물질 능력을 감소시켰다(도 31에서, 4+1 (28H1) 대 4+2 (28H1) 비교). 이는 FAP 양성 세포 마다 결합할 수 있는 FAP 표적화된 OX40 분자의 감소된 수에 기인한 것일 수 있다. 1가 FAP 결합자의 경우 FAP에 대한 보다 높은 친화도는 아마도 OX40 수용체 올리고머의 최적화된 초가교결합에 의해 4가 OX40 작용물질의 작용물질 능력을 추가적으로 증가시켰다(도 31에서, 4+1 (28H1) 대 4+1 (4B9) 비교).
실시예 6: 4 - 1BB 항체 및 도구 결합자의 생산
6.1 파지 디스플레이에 의한 새로운 4- 1BB 결합자의 생산을 위한 항원 및 스크리닝 도구의 생산, 정제 및 특성규명
인간, 마우스 또는 사이노몰구스 4-1BB의 엑토도메인을 암호화하는 DNA 서열(표 39)을 놉 상에 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다(Merchant et al., 1998). AcTEV 프로테아제 절단 부위를 항원 엑토도메인과 인간 IgG1의 Fc 사이에 도입하였다. 유도된 비오틴화를 위한 Avi 태그를 항원-Fc 놉의 C-말단에 도입하였다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항원-Fc 놉 쇄와 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 Fc 홀 쇄의 결합은 4-1BB 엑토도메인 함유 쇄의 단일 카피를 포함하는 이종이량체의 생산을 가능하게 하여, Fc-결합된 항원의 단량체성 형태를 생산한다(도 1A). 표 40은 항원 Fc-융합 구축물의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00174
Figure pct00175
Figure pct00176
Figure pct00177
Figure pct00178
Figure pct00179
모든 4-1BB-Fc-융합 분자 암호화 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 신호 서열을 함유하는 플라스미드 벡터 내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
비오틴화된 단량체성 항원/Fc 융합 분자의 생산을 위해, 지수적으로 성장하는 현탁 HEK293 EBNA 세포를 융합 단백질의 2개 성분(놉 쇄 및 홀 쇄) 뿐 아니라, 비오틴화 반응에 필수적인 효소인 BirA를 암호화하는 3개 벡터로 동시-형질감염시켰다. 상응하는 벡터를 2:1:0.05 비("항원 ECD-AcTEV-Fc 놉":"Fc 홀":"BirA")로 사용하였다.
500 ml 진탕 플라스크에서의 단백질 생산을 위해, 4억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열시킨 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍의 벡터 DNA를 함유하는 20 mL의 CD CHO 배지에 재현탁시켰다. 540 ㎕의 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고 세포를 24시간 동안 배양하였다. 생성 배지는 5 μM 키푸넨신으로 보충되었다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 배양물에 첨가하였다. 배양 7일 후에, 세포를 210 g에서 15분 동안 스핀다운시켜 세포 상등액을 수거하였다. 용액을 멸균 여과시키고(0.22 ㎛ 필터), 나트륨 아지드를 0.01%(v/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지시켰다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 친화성 크로마토그래피를 위해, 상등액을, 40 mL 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 평형화된 하이트랩 프로테인A HP 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다. 적어도 10 컬럼 부피의, 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨 및 0.5 M 염화 나트륨 함유 완충액(pH 7.5)으로 세척하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은 20 컬럼 부피의 20 mM 시트르산 나트륨, 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 3.0)에 걸쳐 생성된 염화 나트륨의 선형 pH-구배(0 mM으로부터 500 mM까지)를 이용하여 용출시켰다. 이어서, 10 컬럼 부피의, 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 염화 나트륨, 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 3.0)으로 컬럼을 세척하였다. 수거된 분획의 pH는 1/40(v/v)의 2M 트리스(pH 8.0)를 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시키고 여과시킨 후 pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화 나트륨, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
6.2 포괄적 F(ab) 라이브러리로부터 4- 1BB -특이적 12B3 , 25G7, 11D5 , 9B11 및 20G2 항체의 선별
인간 및 사이노몰구스 4-1BB에 대한 특이성을 갖는 항체 11D5, 9B11 및 12B3을 Fab 포맷의 포괄적 파지-디스플레이 항체 라이브러리(DP88-4)로부터 선별하였다. 동일한 라이브러리로부터, 뮤린 4-1BB에 대한 반응성을 갖는 추가의 항체, 클론 20G2도 선별하였다. 상기 라이브러리는, 경쇄의 CDR3(L3, 3가지 상이한 길이) 및 중쇄의 CDR3(H3, 3가지 상이한 길이)에서 무작위 서열 스페이스를 포함하는 V-도메인 쌍 Vk1_5(카파 경쇄) 및 VH1_69(중쇄)를 사용하여 인간 생식계열 유전자를 기반으로 구성하였다. 라이브러리 제작은 중복 연장 스플라이싱(SOE) PCR을 적용하여 3개의 PCR-증폭된 단편의 조립에 의해 수행하였다. 단편 1은 무작위 L3을 포함하는 항체 유전자의 5' 말단을 포함하고, 단편 2는 L3으로부터 H3까지 걸쳐있는 중심 불변 단편인 반면, 단편 3은 무작위 H3 및 항체 유전자의 3' 부분을 포함한다. 하기의 프라이머 조합을 이용하여 DP88-4 라이브러리를 위한 상기 라이브러리 단편을 생산하였다: 각각 단편 1(역방향 프라이머 Vk1_5_L3r_S 또는 Vk1_5_L3r_SY 또는 Vk1_5_L3r_SPY와 함께 정방향 프라이머 LMB3), 단편 2(역방향 프라이머 RJH32와 함께 정방향 프라이머 RJH31) 및 단편 3(역방향 프라이머 fdseqlong와 함께 정방향 프라이머 DP88-v4-4 또는 DP88-v4-6 또는 DP88-v4-8). 라이브러리 단편의 생산을 위한 PCR 파라미터는 94℃에서 5분 초기 변성, 25주기의 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 및 72℃에서 10분 동안의 말단 신장이었다. 조립 PCR의 경우, 동몰비의 겔-정제된 단일 단편을 주형으로 사용하여, 파라미터는 94℃에서 3분 초기 변성, 및 5주기의 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 2분이었다. 이 단계에서, 외부 프라이머(LMB3 및 fdseqlong)를 가하고 20주기를 더 수행한 후 72℃에서 10분 동안 말단 신장을 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위 Fab 구축물의 조립 후, 이들을 NcoI/NheI로 절단하고 유사하게 처리된 수용체 파지미드 벡터내에 접합시켰다. 정제된 접합물을 전기천공적격 이콜라이 TG1 내로의 약 60 형질전환에 사용하였다. Fab 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 회수하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다. 상기 라이브러리 구성 단계를 3회 반복하여 4.4 x 109의 최종 라이브러리 크기를 수득하였다. 점 블롯으로 C-말단 태그 검출에 의해 측정시, 기능성 클론의 백분율은 각각 경쇄의 경우 92.6% 및 중쇄의 경우 93.7%이었다.
인간 및 사이노몰구스 4-1BB에 대한 특이성을 갖는 항체 25G7을 Fab 포맷의 포괄적 파지-디스플레이 항체 라이브러리(λ-DP47)로부터 선별하였다. 상기 라이브러리는, 경쇄의 CDR3(L3, 3가지 상이한 길이) 및 중쇄의 CDR3(H3, 3가지 상이한 길이)에서 무작위 서열 스페이스를 포함하는 V-도메인 쌍 V13_19(람다 경쇄) 및 VH3_23(중쇄)를 사용하여 인간 생식계열 유전자를 기반으로 구성하였다. 라이브러리 제작은 중복 연장 스플라이싱(SOE) PCR을 적용하여 3개의 PCR-증폭된 단편의 조립에 의해 수행하였다. 단편 1은 무작위 L3을 포함하는 항체 유전자의 5' 말단을 포함하고, 단편 2는 L3으로부터 H3까지 걸쳐 있는 중심 불변 단편인 반면, 단편 3은 무작위 H3 및 항체 유전자의 3' 부분을 포함한다. 하기의 프라이머 조합을 사용하여 λ-DP47 라이브러리를 위한 상기 라이브러리 단편을 생산하였다: 각각 단편 1(역방향 프라이머 Vl_3_19_L3r_V 또는 Vl_3_19_L3r_HV 또는 Vl_3_19_L3r_HLV와 함께 정방향 프라이머 LMB3), 단편 2(역방향 프라이머 MS63과 함께 정방향 프라이머 RJH80) 및 단편 3(역방향 프라이머 fdseqlong와 함께 정방향 프라이머 DP47-v4-4, DP47-v4-6, DP47-v4-8). 라이브러리 단편의 생산을 위한 PCR 파라미터는 94℃에서 5분 초기 변성, 25주기의 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 및 72℃에서 10분 동안의 말단 신장이었다. 조립 PCR의 경우, 동몰비의 겔-정제된 단일 단편을 주형으로 사용하여, 파라미터는 94℃에서 3분 초기 변성, 및 5주기의 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 2분이었다. 이 단계에서, 외부 프라이머(LMB3 및 fdseqlong)를 가하고 20주기를 더 수행한 후 72℃에서 10분 동안 말단 신장을 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위 Fab 구축물의 조립 후, 이들을 NcoI/NheI로 절단하고 유사하게 처리된 수용체 파지미드 벡터내에 접합시켰다. 정제된 접합물을 전기천공적격 이콜라이 TG1 내로의 약 60 형질전환에 사용하였다. Fab 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 회수하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다. 9.5 x 109의 최종 라이브러리 크기를 수득하였다. 점 블롯으로 C-말단 태그 검출에 의해 측정시, 기능성 클론의 백분율은 각각 경쇄의 경우 81.1% 및 중쇄의 경우 83.2%이었다.
표 41은 포괄적 파지-디스플레이 항체 라이브러리(DP88-4)의 서열을 나타내고, 표 42는 라이브러리 DP88-4 생식계열 주형의 cDNA 및 아미노산 서열을 제공하고, 표 43은 DP88-4 생식계열 주형의 생산에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure pct00180
Figure pct00181
Figure pct00182
Figure pct00183
Figure pct00184
표 44는 PCR에 사용된 포괄적 파지-디스플레이 람다-DP47 라이브러리(Vl3_19/VH3_23) 주형의 서열을 나타낸다. 표 45는 람다-DP47 라이브러리(Vl3_19/VH3_23) 생식계열 주형의 cDNA 및 아미노산 서열을 제공하고, 표 46은 람다-DP47 라이브러리(Vl3_19/VH3_23)의 제작에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure pct00185
Figure pct00186
Figure pct00187
Figure pct00188
Figure pct00189
파지 디스플레이 선별 및 ELISA- 및 SPR-기반 스크리닝을 위한 항원으로서 인간, 뮤린 및 사이노몰구스 4-1BB(CD137)를 HEK EBNA 세포에서 N-말단 단량체성 Fc-융합체로서 일시적으로 발현시키고, 수용체 쇄(Fc 놉 쇄)를 갖는 Fc 부분의 C-말단에 위치한 avi-태그 인식 서열에서의 BirA 비오틴 리가제의 공-발현을 통해 생체내에서 부위-특이적으로 비오틴화시켰다.
선별 라운드(바이오패닝)는 하기 절차에 따라서 용액 중에서 수행하였다: 제1 단계, 항원의 Fc-부분을 인식하는 항체의 라이브러리를 고갈시키기 위한 10 ㎍/ml의 비관련 인간 IgG로 코팅된 맥시소프 플레이트 상에서 약 1012개 파지미드 입자의 예비-제거; 제2 단계, 1 ml의 총부피의 Fc-결합자의 추가 고갈을 위한 100 nM 비관련 비-비오틴화된 Fc 놉-인투-홀 구축물의 존재하에서 0.5시간 동안 100 nM 비오틴화된 인간 또는 뮤린 4-1BB와 함께 비-결합 파지미드 입자의 배양; 제3 단계, 10분당 뉴트라비딘 예비-코팅된 미세적정 플레이트의 4개 웰로의 전이에 의한 비오틴화된 hu4-1BB 및 부착된 특이적 결합 파지의 포획(라운드 1 및 3에서); 제4 단계, 5x PBS/트윈20 및 5x PBS를 사용한 각 웰의 세척; 제5 단계, 10분 동안 웰 당 250 ㎕ 100 mM TEA(트라이에틸아민)의 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 4개 웰로부터 모인 용출물에 500 ㎕ 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)의 첨가에 의한 중화; 제6 단계, Fc-결합자의 최종 제거를 위한, 100 nM 비오틴-포획된 Fc 놉-인투-홀 구축물과 함께 뉴트라비딘 예비-코팅된 미세적정 플레이트 상에서의 배양에 의한 중화된 용출물의 후-제거; 제7 단계, 용출된 파지 입자의 상등액에 의한 대수기 이콜라이 TG1 세포의 재감염, 헬퍼파지 VCSM13에 의한 감염, 30℃에서 진탕기상에서 밤새 배양, 및 다음 선별 라운드에서 사용되도록 파지미드 입자의 후속 PEG/NaCl 침전. 선별은 100 nM의 일정한 항원 농도를 사용하여 3 또는 4 라운드에 걸쳐 수행되었다. 라운드 2 및 4에서, 뉴트라비딘에 대한 결합자의 풍부화를 방지하기 위해, 5.4 x 107 스트렙타비딘-코팅된 자석 비드를 첨가하여 항원:파지 복합체의 포획을 수행하였다. 특이적 결합자는 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: 100 ㎕의 25 nM 비오틴화된 인간 또는 뮤린 4-1BB 및 10 ㎍/ml의 인간 IgG를 뉴트라비딘 플레이트 및 맥시소프 플레이트 상에 각각 코팅하였다. Fab-함유 세균 상등액을 첨가하고, 항-Flag/HRP 이차 항체를 사용하여 그의 Flag-태그를 통해 결합 Fab를 검출하였다. 인간 또는 뮤린 4-1BB 상에서 신호를 나타내고 인간 IgG상에서 음성인 클론을 추가의 분석을 위해 최종 후보명단에 올려놓고 또한 남은 2개 종의 4-1BB에 대해 유사한 방식으로 시험하였다. 이들을 0.5 리터 배양 부피로 세균에서 발현시키고, 친화도 정제하고, 바이오래드의 프로테온 XPR36 바이오센서를 사용하여 SPR-분석에 의해 특성규명하였다.
클론 12B3, 25G7, 11D5 및 9B11은 전술한 절차를 통해 인간 4-1BB-특이적 결합자로서 확인되었다. 클론 20G2는 전술한 절차를 통해 뮤린 4-1BB-특이적 결합자로서 확인되었다. 이의 가변 영역의 cDNA 서열을 하기 표 47에 나타내었고, 상응하는 아미노산 서열을 표 C에서 확인할 수 있다.
Figure pct00190
Figure pct00191
Figure pct00192
6.3 항-4- 1BB IgG1 P329G LALA 항체의 생산, 정제 및 특성규명
선별된 항-4-1BB 결합자의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 인간 IgG1의 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라서 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
항-4-1BB 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표 48에 나타내었다. 모든 항-4-1BB-Fc-융합체 암호화 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3'말단에 위치한 합성 폴리A 신호 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
Figure pct00193
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항-4-1BB 항체를, 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 생산하였다. 세포를 1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생산을 위해, 4억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 보충물과 함께 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
항원 Fc 융합체의 정제에 대해 전술한 바와 같이 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 항체 분자의 정제를 수행하였다.
단백질을 농축하고 여과시킨 후, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 이용하여, 280 nm에서 OD를 측정함으로써, 정제된 항체의 단백질 농도를 측정하였다. 항체의 순도 및 분자량을, 환원제(인비트로겐, 미국)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 항체 샘플의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 49는 항-4-1BB P329G LALA IgG1 항체의 수율 및 최종 함량을 요약한 것이다.
Figure pct00205
실시예 7: 항-4- 1BB 항체의 특성규명
7.1 인간 4- 1BB 상에서의 결합
7.1. 1 표면 플라즈몬 공명(결합활성 + 친화도)
재조합 4-1BB Fc(kih)에 대한 파지-유도된 4-1BB-특이적 항체의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 러닝 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
동일한 실험에서, 파지 디스플레이 유도된 항-4-1BB 클론 12B3, 25G7, 11D5, 9B11 및 20G2(모두 인간 IgG1 P329GLALA)와, 재조합 4-1BB(인간, 사이노몰구스 및 뮤린) 사이의 종 선택성 및 상호작용의 결합활성을 측정하였다. 비오틴화된 인간, 사이노몰구스 및 뮤린 4-1BB Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 상이한 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 100 공명 단위(RU) 이하의 고정화 수준을 사용하였다. 파지 디스플레이 유도된 항-4-1BB 인간 IgG1 P329GLALA 항체를 30 ㎕/분의 흐름하에 4 내지 450 nM(3배 희석)의 농도 범위에서 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 복합체 해리를 220초 동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하고 결합활성을 정성적으로 평가하기 위해 이용하였다(표 50).
동일한 실험에서, 파지 디스플레이 유도된 항체(인간 IgG1 P329GLALA) 대 재조합 4-1BB(인간, 사이노몰구스 및 뮤린) 사이의 상호작용의 친화도를 측정하였다. 항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 7500 RU이었다. 4-1BB에 대한 파지 디스플레이 유도된 항체를 25 nM 범위의 농도에서 60초 동안 포획하였다. 재조합 인간 4-1BB Fc(kih)를 4.1 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포로부터 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항원을, 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖지만, 항체가 아닌 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하였다.
클론 25G7 및 9B11은 클론 12B3 및 11D5보다 낮은 친화도하에 인간 4-1BB Fc(kih)에 결합한다. 클론 20G2 는 인간 4-1BB에 결합하지 않는다. 항-4-1BB P329GLALA IgG1과 인간 4-1BB Fc(kih) 사이의 상호작용에 대한 친화도 상수는 1:1 랭뮤어 결합에 정합시켜 측정하였다.
Figure pct00206
7.1.2 인간 4- 1BB 발현 세포: 휴지중인 인간 말초혈 단핵 백혈구( PBMC ) 및 활성화된 인간 말초혈 단핵 백혈구에 대한 결합
인간 4-1BB의 발현은 휴지중인 인간 T 세포 및 미감작 인간 T 세포상에서는 부재한다(문헌[Kienzle G. and von Kempis Int. Immunol. 12(1):, 73-82], [Wen T. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4897-4906]). 고정화된 항-인간 CD3 작용성 항체로 활성화시킨 후, 4-1BB는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 상향조절된다. 활성화된 인간 NK 세포 상에서(문헌[Baessler T. et. al. (2010) Blood 115(15), 3058-3069]), 활성화된 인간 NKT 세포 상에서(문헌[Cole S.L. et al. (2014) J. Immunol. 192(8), 3898-3907]), 활성화된 인간 B 세포 상에서(문헌[Zhang et al. (2010) J. Immunol. 184(2), 787-795]), 활성화된 인간 호산구 상에서(문헌[Heinisch et al. 2001]), 인간 호중구 상에서 구성적으로(문헌[Heinisch I.V. (2000) J Allergy Clin Immunol. 108(1), 21-28]), 활성화된 인간 단핵구 상에서(문헌[Langstein J.et al. (1998) J Immunol. 160(5), 2488-2494], [Kwajah M. and Schwarz H. (2010) Eur J Immunol. 40(7), 1938-1949]), 인간 조절 T 세포상에서 구성적으로(문헌[Bacher P. et al. (2014) Mucosal Immunol. 7(4), 916-928]), 인간 여포성 수지상 세포 상에서(문헌[Pauly S. et al. (2002) J Leukoc Biol. 72(1), 35-42]), 활성화된 인간 수지상 세포 상에서(문헌[Zhang L. et al. (2004) Cell Mol Immunol. 1(1), 71-76]), 및 악성 인간 종양의 혈관 상에서(악성[Broll K. et al. (2001) Am J Clin Pathol. 115(4), 543-549]) 4-1BB 발현이 또한 보고되었다.
천연 세포-발현된 인간 4-1BB에 대한 본 발명의 항-4-1BB 클론의 결합을 시험하기 위해, 새로 단리된 휴지중인 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 PHA-L/프로류킨 사전활성화 및 CD3/CD28-재활성화 PBMC를 사용하였다. 취리히 헌혈 센터에서 수득된 버피 코트으로부터의 PBMC를 히스토파크 1077(시그마 라이프 사이언스, 카탈로그 번호 10771, 폴리슈클로스 및 나트륨 디아트리조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정됨)을 사용하여 피콜 밀도 원심분리에 의해 단리하고, 10% 소 태아 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 16000-044, Lot 941273, 감마선-조사되고, 마이코플라스마를 함유하지 않고 56℃에서 35분 동안 열 불활성화됨), 1%(v/v) 글루타맥스-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038), 1 mM 나트륨 피루베이트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)로 보충된 RPMI 1640 배지(깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 42401-042)로 이루어진 T 세포 배지에 재현탁시켰다. PBMC를 단리한 후에 바로 사용하거나(휴지중인 세포), 또는 37℃ 및 5% CO2에서, 6-웰 조직 배양 플레이트에서 200　U/mL 프로류킨(노바티스 파마 슈바이츠 아게(Novartis Pharma Schweiz AG), CHCLB-P-476-700-10340) 및 2 ㎍/mL PHA-L(시그마 카탈로그 번호 L2769)로 보충된 T 세포 배지에서 3 내지 5일 동안 배양한 다음 T 세포 배지에서 10 ㎍/mL 항-인간 CD3(클론 OKT3, 바이오레전드, 카탈로그 번호 317315) 및 2 ㎍/mL 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302928)로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 2일 동안 배양함으로써 T 세포의 세포 표면에서 4-1BB 발현을 유도하도록 자극하였다.
인간 PBMC에 의해 발현된 인간 4-1BB에 대한 결합을 측정하기 위해, 0.1 내지 0.2 x 106의 새로 단리되거나 활성화된 PBMC를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 4℃에서 400 x g하에 4분 동안 원심분리하고, 상등액을 폐기하였다. 세포를 200 ㎕/웰 DPBS로 세척한 다음, 4℃에서 1:5000 희석된 정착성 생존도 지시염료(Fixable Viability Dye) 이플루오르 450(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 64-0863-18) 또는 정착성 생존도 지시염료 이플루오르 660(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 DPBS 100 ㎕/mL와 함께 30분 동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 200 ㎕/웰 냉각 FACS 완충액(2%(v/v) FBS, 5 mM EDTA pH 8(암레스코, 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치 S2002)로 보충된 DPBS)으로 1회 세척하였다. 이어서, 적정된 항-인간 4-1BB 결합자를 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 50 ㎕/웰을 가하고, 세포를 4℃에서 120분 동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕/웰 4℃ FACS 완충액으로 4회 세척하여 미결합된 분자를 제거하였다. 그 후에, 2.5 ㎍/mL PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-116-098) 또는 30 ㎍/mL FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 096 098), 항-인간 CD45 AF488(클론 HI30, 바이오레전드, 카탈로그 번호 304019), 0.67 ㎍/mL APC/Cy7-접합된 항-인간 CD3 moIgG1k(클론 UCH1, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300426) 또는 0.125 ㎍/mL PE-접합된 항-인간 CD3 마우스 IgG1k(클론 SK7, 바이오레전드 카탈로그 번호 344806) 또는 0.67 ㎍/mL PerCP/Cy5.5-접합된 항-인간 CD3 마우스 IgG1 k(클론 UCHT1, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300430), 0.125 ㎍/mL BV421-접합된 항-인간 CD4 moIgG1k(클론 RPA-T4, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532) 또는 0.23 ㎍/mL BV421-접합된 항-인간 CD4 마우스 IgG2b k(클론 OKT4, 바이오레전드, 카탈로그 번호 317434) 또는 0.08 ㎍/mL PE/Cy7-접합된 항-인간 CD4 마우스 IgG1k(클론 SK3, 바이오레전드 카탈로그 번호 344612), 0.17 ㎍/mL APC/Cy7-접합된 항-인간 CD8(마우스 IgG1k, 클론 RPA-T8, 바이오레전드 카탈로그 번호 301016) 또는 0.125 ㎍/mL PE/Cy7-접합된 항-인간 CD8a(moIgG1k, 클론 RPA-T8, 바이오레전드, 카탈로그 번호 301012) 또는 0.33 ㎍/mL 항-인간 CD8 BV510(moIgG1k, 클론 SK1, 바이오레전드, 카탈로그 번호 344732) 및 0.25 ㎍/mL APC-접합된 항-인간 CD56(마우스 IgG1k, 클론 HCD56, 바이오레전드, 카탈로그 번호 318310) 또는 1 ㎕ AF488-접합된 항-인간 CD56(moIgG1k, 클론 B159, 비디 파밍겐(BD Pharmingen), 카탈로그 번호 557699) 및 0.67 ㎍/mL 항-인간 CD19-PE/Cy7(moIgG1k, 클론 HIB19, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302216)을 함유하는 4℃ 냉각 FACS 완충액 50 ㎕/웰과 함께 세포를 더 배양하고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다.
세포를 200 ㎕ FACS 완충액/웰로 2회 세척하고, 1% 포름알데하이드(시그마, HT501320-9.5L)를 함유하는 50 ㎕/웰 DPBS 중에 재현탁시켜 정착시켰다. 같은 날 또는 다음 날 3-레이저 칸토(Canto) II(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어) 또는 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어) 또는 3-레이저 맥스퀀트(MACSQuant) 분석기 10(밀테나이 바이오텍)을 사용하여 세포를 획득하였다. 게이트를 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에 설정하고, 이차 검출 항체의 중간 형광 강도(MFI) 또는 기하 평균 형광 강도를 이용하여 1차 항체의 결합을 분석하였다. 그래프 패드 프리즘(그래프 패드 소프트웨어 인코포레이티드)을 사용하여 블랭크 값(1차 항체가 첨가되지 않음)을 감함으로써 데이터의 기준선을 설정하고, 비-선형 회귀 곡선 정합(로버스트 정합)을 이용하여 EC50 값을 산출하였다.
인간 T 세포는 휴지중인 상태에서 4-1BB 발현이 결여되지만, 활성화 후에는 4-1BB를 상향조절시킨다. 인간 CD8+ T 세포는 CD4+ T보다 더 강한 상향조절을 나타낸다. 생산된 항-인간 4-1BB-특이적 항체는 도 34A 내지 34D에 나타낸 바와 같이 활성화된 인간 T 세포에 의해 발현된 인간 4-1BB 클론에 결합할 수 있다. 나타낸 항-인간 4-1BB 클론은 강한 결합자(클론 12B3 및 11D5) 및 약한 결합자(클론 25G7 및 9B11)로 분류될 수 있다. 차이는 EC50 값에 의해서 뿐 아니라 MFI에 의해서도 보여진다. 활성화된 CD8 T 세포에 대한 결합의 EC50 값을 표 51에 나타내었다. 항-마우스 4-1BB-특이적 클론 20G2는 인간 4-1BB에 결합하지 않았으므로 인간-교차-반응성이 아니다.
Figure pct00207
7.2 뮤린 4- 1BB 상에서의 결합
7.2. 1 표면 플라즈몬 공명(결합활성 + 친화도)
재조합 뮤린 4-1BB Fc(kih)에 대한 파지-유도된 4-1BB 특이적 항체 20G2의 결합을 인간 4-1BB Fc(kih)에 대해 전술한 바와 같이(실시예 7.1.1 참조) 표면 플라즈몬 공명으로 평가하였다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하고 결합활성을 정성적으로 평가하기 위해 이용하였다(표 52).
친화도 측정을 위해, 기준 유동 세포에 대한 Fc 융합 단백질의 비특이적 상호작용으로 인해, 뮤린 4-1BB Fc(kih)를 AcTEV 프로테아제로 절단하고 Fc 부분을 크로마토그래피 방법에 의해 제거하였다. 항-인간 Fc 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 7500 RU이었다. 4-1BB에 대한 파지 디스플레이 유도된 항체를 25 nM 범위의 농도에서 60초 동안 포획하였다. 재조합 뮤린 4-1BB AcTEV를 4.1 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포상에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항원을, 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖지만, 항체가 아닌 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하였다. 클론 20G2는 뮤린 4-1BB에 결합하는 것으로 나타났다(표 52).
1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 항-4-1BB P329GLALA IgG1 분자와 뮤린 4-1BB 사이의 상호작용의 친화도 상수를 유도하였다.
Figure pct00208
7.2.2 마우스 4- 1BB 발현 세포: 휴지중인 및 활성화된 마우스 비장세포(선 별된 클론)에 대한 결합
인간과 유사하게, 새로 단리된 휴지중인 마우스 T 세포는 4-1BB를 발현하지 않지만, 발현은 펩티드-펄스된 APC(문헌[Cannons J.et al. (2001) J. Immunol. 167(3): 1313-1324]) 또는 고정화된 항-마우스 CD3 또는 항-마우스 CD3과 항-마우스 CD28 항체의 조합(문헌[Pollok K. et al. (1995), European J. Immunol. 25(2), 488-494])을 통한 TCR 활성화에 의해 유도될 수 있다. 표면 고정화된 항-CD3 항체를 통한 활성화 후에, 4-1BB 발현은 CD8+ T 세포상에서 더 높은 것으로 보고되어(문헌[Shuford W, et al. (1997) J. of Experimental Med. 186(1), 47-55] )있지만, 이것은 활성화 프로토콜에 따라 달라질 수 있다. 활성화된 마우스 NK 세포상에서(문헌[Melero et al. (1998) Cell Immunol. 190(2), 167-172]), 활성화된 마우스 NKT 세포상에서(문헌[Vinay D, et al. (2004) J Immunol. 173(6), 4218-4229]), 활성화된 마우스 B 세포상에서(문헌[Vinay, Kwon (2011) Cell Mol Immunol. 8(4), 281-284]), 마우스 호중구상에서 구성적으로(문헌[Lee S. et al. (2005) Infect Immun. 73(8), 5144-5151]) 및 마우스 조절 T 세포상에서(문헌[Gavin et al. (2002) Nat Immunol. 3(1), 33-41]), 마우스 IgE-자극된 비만세포상에서(문헌[Nishimoto et al. (2005) Blood 106(13): 4241-4248]), 마우스 골수-계통 세포상에서(문헌[Lee et al. (2008) Nat Immunol. 9(8), 917-926]), 마우스 여포성 수지상 세포상에서(문헌[Middendorp et al. (2009) Blood 114(11), 2280-2289]) 및 활성화된 마우스 수지상 세포상에서(문헌[Wilcox, Chapoval et al. (2002) J Immunol. 168(9),4262-4267]) 또 다른 4-1BB 발현도 또한 보고되었다.
건강한 암컷 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포 단리 직후에 뿐 아니라 표면 고정화된 작용성 항-마우스 CD3 및 항-마우스 CD28 항체에 의한 72시간 동안의 시험관내 활성화 후에 항-4-1BB 특이적 항체 결합을 시험하였다. 암컷 C57BL/6 마우스(7 내지 9주령)를 프랑스 찰스 리버(Charles River)에서 구입하였다. 도착 후, 동물을 새로운 환경에 적응되도록 및 관찰을 위해 1주일 동안 유지시켰다. 마우스는 사료 및 물을 자유식으로 공급하면서 특정-병원체가 없는 조건하에서 및 전용 지침[GV-Solas; Felasa; TierschG]에 따라서 12시간 밝음/12시간 어둠의 일일 주기하에 유지시켰다. 정기적으로 지속적인 건강 모니터링을 수행하였다. 마우스를 경추 탈골에 의해 희생시켰다. 비장을 해부하고 얼음 위에서 10%(v/v) 열-불활성화된 FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 RPMI 1640 중에 저장하였다. 단일 세포 용액을 수득하기 위해, 비장을 70 μm 세포 스트레이너(비디 팔콘(BD Falcon); 독일)를 통해 균질화시키고 37℃에서 ACK 용해 완충액(ddH2O, pH 7.2 중 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) 중에서 10분 동안 용혈시켰다. 멸균 DPBS를 사용한 2회 세척 단계 후에, 비장세포를 T 세포 배지 중에서 복원시켰다. 세포를 신선하게 사용하거나(휴지), 또는 106 세포/mL 비장세포를, 1 ㎍/mL 항-마우스 CD3 항체(래트 IgG2b, 클론 17A2, 바이오레전드, 카탈로그 번호 100223) 및 2 ㎍/mL 항-마우스 CD28 항체(시리아 햄스터, 클론 37.51, 바이오레전드 카탈로그 번호 102112)로 코팅된 6-웰 세포 배양 플레이트 상에서, 10% FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨 피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산 및 50 μM β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지로 이루어진 T 세포 배지 중에서 72시간 동안 더 자극하였다.
마우스 4-1BB에 대한 결합을 시험하기 위해, 새로 단리되거나 활성화된 마우스 비장세포를 DPBS에 재현탁시키고, 0.1 x 106/웰의 비장세포를 환저 96-현탁 세포 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)로 옮겼다. 세포를 4℃ 및 400 x g에서 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 1:5000 희석된 정착성 생존도 지시염료 이플루오르 450(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 64-0863-18) 또는 정착성 생존도 지시염료 이플루오르 660(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 DPBS 100 ㎕/웰에 재현탁시킨 후에 세포를 4℃에서 30분 동안 배양하였다. FACS 완충액, 및 적정된 농도의 항-인간 4-1BB huIgG1 P329G LALA 항체-클론 12B3, 25G7, 11D5, 9B11 및 항-마우스 4-1BB-특이적 클론 20G2를 huIgG1 P329G LALA 또는 마우스 IgG1 또는 마우스 IgG1 DAPG로서 함유하는 50 ㎕/웰 FACS 완충액으로 세포를 세척하였다. 4℃에서 1시간 동안 배양한 후, 세포를 4회 세척하여 과량의 항체를 제거하였다. 마우스 IgG1 및 마우스 IgG1 DAPG 포맷으로서 항-마우스 20G2의 결합을 시험한 경우, 4℃에서 30 ㎍/mL FITC-접합된 항-마우스 IgG Fcγ-단편-특이적 어피니퓨어 염소 IgG F(ab')2 단편을 함유하는 FACS 완충액 50 ㎕/웰 중에서 30분 동안 세포를 배양하고, FACS-완충액으로 2회 세척하였다. 인간 IgG1 P329G LALA Fc-단편을 함유하는 항-4-1BB 결합자의 결합을 시험한 경우, 상기 단계는 생략되었다. 그 후에, 0.67 ㎍/mL PE-접합된 항-마우스 CD3(래트 IgG2bk, 클론 17A2, 비디 파밍겐, 카탈로그 번호 555275) 또는 APC-Cy7-접합된 항-마우스 CD3(래트 IgG2ak, 클론 53-6.7, 바이오레전드, 카탈로그 번호 100708), 0.67 ㎍/mL PE/Cy7-접합된 항-마우스 CD4(래트 IgG2bk, 클론 GK1.5, 바이오레전드, 카탈로그 번호 100422), 0.67 ㎍/mL APC/Cy7-접합된 항-마우스 CD8(래트 IgG2ak, 클론 53-6.7, 바이오레전드, 카탈로그 번호 1007141) 또는 PE-접합된 항-마우스 CD8(래트 IgG2ak, 클론 53-6.7, 바이오레전드, 카탈로그 번호 100708), 2 ㎍/mL APC-접합된 항-마우스 NK1.1(마우스 IgG2a, k, 클론 PK136, 바이오레전드, 카탈로그 번호 108710) 또는 PerCP/Cy5.5-접합된 항-마우스 NK1.1(마우스 IgG2a, k, 클론 PK136, 바이오레전드, 카탈로그 번호 108728) 및 10 ㎍/mL 항-마우스 CD16/CD32(마우스 Fc-블록, 래트 IgG2b k, 클론 2.4G2, 비디 바이오사이언스, 카탈로그 번호 553142)를 함유하는 50 ㎕ FACS 완충액/웰 중에서 세포를 배양하였다. 인간 IgG1 P329G LALA Fc-단편을 함유하는 항-4-1BB 결합자의 결합을 시험한 경우, 30 ㎍/mL FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 096 098)도 또한 첨가하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 배양하고, 200 ㎕/웰 FACS-완충액으로 2회 세척하고, 정착을 위해 1%(v/v) 포름알데하이드를 함유하는 50 ㎕/웰 DPBS로 재현탁시켰다. 다음 날, 세포를 200 ㎕/웰 FACS 완충액에 재현탁시키고, 2-레이저 칸토II(비디 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어) 또는 5-레이저 포르테사(비디 바이오사이언스 위디 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다. 게이트를 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에 설정하고, 이차 검출 항체의 중간 형광 강도(MFI)를 이용하여 1차 항체의 결합을 분석하였다. 그래프 패드 프리즘(그래프 패드 소프트웨어 인코포레이티드)을 사용하여 블랭크 값(1차 항체가 첨가되지 않음)을 감함으로써 데이터의 기준선을 설정하고, 비-선형 회귀 곡선 정합(로버스트 정합)을 이용하여 EC50 값을 산출하였다.
도 35B 및 35D에 나타낸 바와 같이, 항-마우스 4-1BB 결합 클론 20G2만 활성화된 마우스 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 결합한 반면, 항-인간 4-1BB 결합 클론 9B11, 11D5, 12B3 및 25G7은 마우스-4-1BB에 결합하지 않았으므로 마우스-교차-반응성이 아니다. 시험한 클론 중에서 클론 20G2만이 마우스 대체물로 사용될 수 있다. 예상된 바와 같이, 항-4-1BB 결합 클론 중 어느 것도 새로 단리된 휴지중인 마우스 T 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다(도 35A 및 35C). 활성화된 인간 CD4+ T 세포와 유사하게, 활성화된 마우스 CD4+ T 세포도 또한 활성화된 마우스 CD8+ T 세포보다 4-1BB를 더 적게 발현한다. 그러나, 상기 차이는 인간 T 세포의 경우에서만큼 강하지 않으며, 이것은 또한 상이한 활성화 프로토콜과 관련될 수 있다. EC50 값을 표 53에 나타내었다.
Figure pct00209
도 36B 및 36D에 나타낸 바와 같이, 항-마우스-4-1BB 결합 클론 20G2는 moIgG1 야생형(wt) 또는 moIgG1 DAPG 포맷으로 활성화된 마우스 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 유사한 방식으로 결합한다. 상기 결합은 도 35B 및 35D에 나타낸 결합과 유사하므로; 포맷의 변화는 결합 특성에 영향을 미치지 않는다. 면역 반응능 마우스에서 항-약물-항체(ADA)의 촉발을 방지하기 위해 클론 20G2를 moIgG로 전이시켰다. DAPG 돌연변이는 인간 IgG1 구축물에서의 P329G LALA 돌연변이와 동등하다, 예를 들어, 상기 돌연변이는 FcR+ 면역 세포를 통한 가교결합을 방지한다. EC50 값을 표 54에 나타내었다.
Figure pct00210
7.3 사이노몰구스 4- 1BB 상에서의 결합
7.3. 1 표면 플라즈몬 공명(결합활성 + 친화도)
재조합 사이노몰구스 4-1BB Fc(kih)에 대한 파지-유도된 4-1BB 특이적 항체 12B3, 25G7, 11D5 및 9B11의 결합을 인간 4-1BB Fc(kih)에 대해 전술한 바와 같이(실시예 7.1.1 참조) 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 러닝 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200 상에서 수행하였다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수를 유도하고 결합활성을 정성적으로 평가하기 위해 이용하였다(표 55).
동일한 실험에서, 파지 디스플레이 유도된 항체(인간 IgG1 P329GLALA) 대 재조합 사이노몰구스 4-1BB Fc(kih) 사이의 상호작용의 친화도를 측정하였다. 항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 9000 RU이었다. 4-1BB에 대한 파지 디스플레이 유도된 항체를 25 내지 100 nM의 농도를 사용하여 포획하였다. 실험을 인간 4-1BB Fc(kih)(실시예 7.1.1)에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다.
클론 12B3, 25G7, 11D5 및 9B11은 유사한 친화도하에 사이노몰구스 4-1BB Fc(kih)에 결합하였으나(표 55), 12B3 및 11D5는 더 높은 결합활성하에 사이노몰구스 4-1BB를 발현하는 세포에 결합하였다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 수치 적분에 의해 정합시키기 위해, 비아코어 T100 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 항-4-1BB P329GLALA IgG1과 사이노몰구스 4-1BB Fc(kih) 사이의 상호작용의 친화도 상수를 유도하였다.
Figure pct00211
7.3.2 사이노몰구스 4- 1BB 발현 세포: 활성화된 사이노몰구스 말초혈 단핵 백혈구(PBMC) 상에서의 결합
사이노몰구스 세포에 대한 항-인간 4-1BB 결합 클론의 교차-반응성을 시험하기 위해, 건강한 사이노몰구스 파시큘라리스(cynomolgus fascicularis)의 PBMC를 헤파린첨가 혈액으로부터 미미한 차이하에 인간 PBMC(7.1.2)에 대해 기술한 바와 같이 밀도 구배 원심분리를 이용하여 단리하였다. 단리된 PBMC를, 10 ㎍/mL 항-사이노-교차-반응성 CD3(mo IgG3 λ, 항-인간 CD3, 클론 SP34, 비디 파밍겐, 카탈로그 번호 556610) 및 2 ㎍/mL 항-사이노-교차-반응성 CD28(moIgG1κ, 항-인간 CD28, 클론 CD28.2, 바이오레전드, 카탈로그 번호 140786) 항체로 코팅된 6-웰 세포 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 독일) 상에서, 10% FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨 피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산 및 50 μM β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지로 이루어진 T 세포 배지 중에서 1.5*106 세포/mL의 세포 밀도에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 동안 자극한 후, 세포를 수거하고 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)에 0.1 x 106 세포/웰의 농도로 접종하였다. 세포를 4℃에서 상이한 농도의 1차 항-인간 4-1BB-특이적 huIgG P32G LALA 항체를 함유하는 50 ㎕/웰 FACS 완충액 중에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 200 ㎕/웰 FACS 완충액으로 4회 세척하고, 4℃에서, 2 ㎕ PE-접합된 항-사이노-교차-반응성 CD4(moIgG2aλ, 항-인간 CD4, 클론 M-T477, 비디 파밍겐, 카탈로그 번호 556616), 1 ㎍/mL PerCP/Cy5.5-접합된 항-사이노-교차-반응성 CD8(moIgG1λ, 항-인간 CD8, 클론 RPA-T8, 바이오레전드, 카탈로그 번호 301032) 및 30 ㎍/mL FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 096 098)을 함유하는 50 ㎕/웰 FACS 완충액과 함께 30분 동안 더 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 0.2 ㎍/mL DAPI로 보충된 100 ㎕/웰 FACS 완충액에 재현탁시켜 살아있는 세포로부터 사멸 세포를 식별하였다. 5-레이저 포르테사(비디 바이오사이언스 위디 디바 소프트웨어)를 사용하여 세포를 즉시 획득하였다. 게이트를 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에 설정하고, 이차 검출 항체의 중간 형광 강도(MFI)를 이용하여 1차 항체의 결합을 분석하였다. 그래프 패드 프리즘(그래프 패드 소프트웨어 인코포레이티드)을 사용하여 블랭크 값(1차 항체가 첨가되지 않음)을 감함으로써 데이터의 기준선을 설정하고, 비-선형 회귀 곡선 정합(로버스트 정합)을 이용하여 EC50 값을 산출하였다.
도 37A 및 37B에 나타낸 바와 같이, 항-인간 4-1BB 클론 중 적어도 3개, 즉, 12B3, 11D5 및 25G7은 또한 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 발현된 사이노몰구스 4-1BB에 대해 교차-반응성이다. 흥미롭게, 결합 곡선은 인간 4-1BB와 유사하게 보인다, 예를 들어, 12B3 및 11D5는 모든 시험한 구축물중 최고 MFI 및 최저 EC50 값을 나타내는 반면, 25G7은 더 낮은 MFI 및 더 높은 EC50 값을 갖는 더 약한 결합자이다(표 56). 클론 9B11은 100 nM의 최고 농도에서만 결합한다. 이것은 클론 9B11이 클론 25G7에 비해 우수한 인간 4-1BB에 대한 결합과 대조적이다. 활성화된 사이노몰구스 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 4-1BB 발현 수준의 추가의 차이는 활성화된 인간 T 세포와 유사하다, 예를 들어, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포보다 4-1BB를 훨씬 적게 발현한다.
Figure pct00212
7.4 리간드 차단 특성
4-1BB/4-1BB-리간드 상호작용을 방해하는 4-1BB-특이적 인간 IgG1 P329GLALA 항체 분자의 능력을 측정하기 위해, 인간 4-1BB 리간드(알앤디 시스템즈)를 사용하였다. 유사하게, 뮤린 4-1BB 리간드(알앤디 시스템즈)를 사용하여 항-뮤린 4-1BB 특이적 IgG1 P329GLALA 항체 20G2의 리간드 차단 특성을 평가하였다.
인간 또는 뮤린 4-1BB 리간드를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 pH 5.0까지 약 1500 RU에서 CM5 칩의 2개 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 재조합 인간 또는 뮤린 4-1BB Fc(kih)를 30 ㎕/분의 흐름하에 500 nM의 농도에서 90초 동안 제2 유동 세포 상에 통과시켰다. 해리를 생략하고 파지 유도된 항-4-1BB 인간 IgG1 P329LALA를 30 ㎕/분의 흐름하에 200 nM의 농도에서 90초 동안 2개 유동 세포 모두 위로 통과시켰다. 해리를 60초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 세포 상에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 이때, 항체를, 고정화된 인간 또는 뮤린 4-1BB 리간드를 갖지만, 재조합 인간 4-1BB Fc(kih) 대신 HBS-EP가 주입된 표면위로 유동시켰다.
파지-유도된 클론 25G7은 인간 4-1BB와 그의 4-1BB 리간드와의 복합체에 결합하였다(표 57, 도 38A). 따라서, 상기 항체는 인간 4-1BB에 대한 결합을 두고 리간드와 경쟁하지 않으므로, "비-리간드 차단"으로 지칭된다. 대조적으로, 클론 12B3, 11D5 및 9B11은 그의 리간드와 결합된 인간 4-1BB에 결합하지 않았으므로, "리간드 차단"으로 지칭된다. 뮤린 대체물 20G2는 그의 리간드와 결합된 뮤린 4-1BB에 결합하지 않았으므로, "리간드 차단"으로 지칭된다.
Figure pct00213
실시예 8: 항 4- 1BB 결합 클론의 기능적 특성
4-1BB는 공자극 수용체로서 작용하며, TCR 의존성 방식으로 T 세포의 증식, 사이토카인 생성 및 기능적 특성을 개선시킨다. 표면 고정화된 항-CD3 항체 또는 펩티드-펄스된 항원 제공 세포를 통한 TCR-활성화는 T 세포상에서 4-1BB의 상향조절을 유도하고(문헌[Pollok et al. (1993) J. Immunol. 150(3): 771-781]), 결합 후에 증식 및 사이토카인 방출을 촉진함으로써 면역 반응을 조장한다(문헌[Hurtado et al. (1995) J Immunology 155(7), 3360-3367]). 생산된 항-인간 4-1BB 항체의 촉진 능력을 시험하기 위해, 환저 현탁 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)를, 2 ㎍/mL의 Fcγ-단편-특이적인 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-008) 및 2 ㎍/mL의 Fcγ-단편-특이적인 어피니퓨어 염소 항-마우스 IgG(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 115-005-008)를 함유하는 DPBS로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 DPBS로 세척하여 과량의 분자를 제거하고, 37℃에서 1%(w/v) BSA(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 A3059-100G)를 함유하는 DPBS로 90분 동안 차단하였다. 상등액을 제거하고, 플레이트를 37℃에서 10 ng/mL 항-인간 CD3 항체(바이오레전드, 카탈로그 번호 317315, 클론 OKT3)의 존재 또는 부재하에 1%(w/v) BSA로 보충된 DPBS와 함께 90분 동안 배양하였다. 플레이트를 DPBS로 세척하고, 1%(w/v) BSA로 보충된 DPBS 및 상이한 농도의 적정된 항-인간 4-1BB IgG1 P329 G LALA 항체와 함께 배양하였다. 플레이트를 DPBS로 세척하고 상등액을 흡인시켰다.
인간 PBMC를 전술한 바와 같이(7.1.2) 단리하고, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 2 ug/mL PHA-L 및 200 U/mL 프로류킨을 함유하는 RPMI 1640에서 5일 동안 활성화시켰다. 세포를, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I 및 200 U/mL 프로류킨을 함유하는 RPMI 1640 중에서 1 내지 2 x 106 세포/mL의 밀도에서 추가로 21일 동안 더 배양하였다. 장시간 배양된 PBMC를 수거하고, 세척하고, CD8 T 세포를 인간 CD8+ T 세포 단리 키트(밀테나이 바이오텍, 카탈로그 번호 130-096-495)를 사용하여 생산사 프로토콜에 따라서 단리하였다. 사전활성화되고 분류된 CD8+ T 세포를, 10% FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨 피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산 및 50 μM β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지로 이루어진 T 세포 배지 200 ㎕/웰 중에서 7 x 104 세포/웰로 접종하였다. 세포를 72시간 동안 배양하는데, 마지막 4시간은 골지-스탑(Golgi-Stop)(비디 바이오사이언스, 카탈로그 번호 554724)의 존재하에서 배양하였다. 세포를 DPBS로 세척하고, 4℃에서 1:5000 희석된 생존/사멸 정착성 녹색 사멸 세포 염색제(LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain)(몰레큘라 프로브즈, 라이프 테크롤로지스(Molecular Probes, Life Technologies), 카탈로그 번호 L-23101)를 함유하는 100 ㎕/웰 DPBS 중에서 30분 동안 배양하였다. 그 후에 세포를 세척하고, 4℃에서, 0.5 ㎍/mL PerCP/Cy5.5-접합된 항-인간 CD8(마우스 IgG1 k, 클론 RPA-T8, 바이오레전드, 카탈로그 번호 301032), 0.5 ㎍/mL PE/Cy7-접합된 항-인간 CD25(마우스 IgG1 k, 클론 BC96, 바이오레전드 카탈로그 번호 302612) 및 1 ㎍/mL APC/Cy7-접합된 항-인간 PD-1(마우스 IgG1 k, 클론 EH12.2H7, 바이오레전드, 카탈로그 번호 329922)을 함유하는 50 ㎕/웰 FACS 완충액 중에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 새로 생산된 정착/투과 용액(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 00-5523-00) 50 ㎕/웰에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 새로 생산된 투과 완충액(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 00-5523-00)으로 세척하고, 4℃에서, 2 ㎍/mL APC-표지된 항-인간-IFNγ(mo IgG1 k, 클론 B27, 비디 파밍겐, 카탈로그 번호 554702) 및 2 ㎍/mL PE-접합된 항-인간-TNFα(mo IgG1 k, 클론 MAb11, 비디 파밍겐, 카탈로그 번호 554513)를 함유하는 50 ㎕/웰 Perm-완충액과 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 1% 포름알데하이드를 함유하는 DPBS로 고정시켰다. 다음 날 2-레이저 칸토 II(BD, 디바 소프트웨어)를 사용하여 세포를 획득하였다. 게이트를 CD8+ T 세포 상에 설정하고, TNFα 및 IFNγ 분비 CD8+ T 세포의 빈도를 측정하였다. 그래프 패드 프리즘(그래프 패드 소프트웨어 인코포레이티드)을 사용하여 데이터를 블롯팅하고 비-선형 회귀 곡선 정합(로버스트 정합)을 이용하여 곡선을 산출하였다.
전술한 바와 같이 TCR- 또는 CD3-자극의 부재하에서 4-1BB 결합은 CD8+ T 세포 기능에 영향을 미치지 않는(Pollok 1995) 반면, 최적이하 CD3-활성화의 존재하에서 4-1BB의 공자극은 사이토카인 분비를 증가시킨다(도 39A 또는 39C). CD3-항체를 통한 최적이하 활성화는 전체 CD8+ T 세포 집단중 30%의 CD8+ T 세포에서 IFNγ-분비를 유도한다. 4-1BB-공자극의 부가는 IFNγ+ CD8 T 세포 집단을 농도 의존 방식으로 55%까지 증가시킨다(도 39B). 표 59는 상응하는 EC50 값을 나타낸다. TNFα 분비는 전체 CD8+ T 세포 집단의 23%에서 39%로 증가될 수 있었다(도 39D). 그 결합 특성과 유사하게, 클론 12B3 및 11D5는 빈도 및 EC50에 있어서 25G7 및 9B11보다 INFγ 발현을 우수하게 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 생산된 클론은 기능성이며, TCR-매개된 T 세포 활성화 및 기능을 개선시킬 수 있다. 항-4-1BB-특이적 항체가 표면 고정화되지 않은 경우, 이들은 CD8+ T 세포 활성화를 개선시키지 않았다(나타내지 않음).
Figure pct00214
실시예 9: 4 - 1BB 및 종양 결합 항원( TAA )을 표적화하는 이중특이적 2가 항체의 생산, 정제 및 특성규명
9.1 4 - 1BB 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 2가 항체(2+2 포맷)의 생산(비교용 실시예)
4-1BB 및 FAP에 대해 2가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 4-1BB 항체를 생산하였다. WO 2010/145792 A1에 기술된 바와 같이 크로스맙 기술을 적용하여 부적절하게 쌍을 이룬 경쇄의 형성을 감소시켰다.
FAP 결합자의 생성 및 생산은 본원에 참고로 도입된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다.
본 실시예에서는, FAP 결합자 28H1의 교차된 Fab 유닛(VHCL)을 (G4S)4 연결자 서열을 사용하여 항-4-1BB hu IgG1의 중쇄에 C-말단에 융합시켰다. 상기 중쇄 융합체를 항-4-1BB의 경쇄 및 상응하는 FAP 교차된 경쇄(VLCH1)로 공-발현시켰다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다. 생산된 이중특이적 2가 구축물은 도 40A에 도시된 것과 유사하다.
표 59는 성숙한 이중특이적 2가 항-4-1BB/항-FAP 인간 IgG1 P329GLALA 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
Figure pct00215
Figure pct00216
Figure pct00217
Figure pct00218
Figure pct00219
Figure pct00220
Figure pct00221
Figure pct00222
Figure pct00223
모든 유전자를, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 조절하에 일시적으로 발현시켰다. 또한, 발현 벡터는 EBNA(엡스타딘 바 바이러스 핵 항원) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 항-4-1BB/항-FAP 구축물을 생산하였다. 상기 세포를 1:1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄1":"벡터 경쇄2")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생산을 위해, 4억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍ DNA의 최종량으로 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상등액을 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과시키고(0.22 μm 필터) 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고 4℃에서 유지하였다.
항원 Fc 융합체 및 항체의 정제에 대해 전술한 바와 같이 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 이중특이적 구축물의 정제를 수행하였다.
단백질을 농축하고 여과시킨 후, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 OD를 측정함으로써, 정제된 이중특이적 구축물의 단백질 농도를 측정하였다. 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을, 환원제(인비트로겐, 미국)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 이중특이적 구축물의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다(표 60).
Figure pct00224
9.2 1가 포맷의 4- 1BB 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이 중특이적 항체(1+1 포맷)의 생산(비교용 실시예 )
4-1BB 및 FAP에 대해 1가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 4-1BB 항체를 생산하였다. WO 2010/145792 A1에 기술된 바와 같이 크로스맙 기술을 적용하여 부적절하게 쌍을 이룬 경쇄의 형성을 감소시켰다.
FAP 결합자의 생성 및 생산은 본원에 참고로 도입된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다.
이중특이적 구축물은 4-1BB 및 FAP에 1가로 결합한다(도 40B). 이는 항-4-1BB huIgG1의 놉 중쇄(S354C/T366W 돌연변이 함유)에 융합된 FAP 결합자의 교차된 Fab 유닛(VHCL)을 함유한다. Fc 홀 중쇄(Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이 함유)는 항-4-1BB에 대한 Fab에 융합된다. 표적화된 항-FAP-Fc 놉 쇄와 항-4-1BB-Fc 홀 쇄의 조합은, FAP에 특이적으로 결합하는 Fab 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 Fab를 포함하는 이종이량체의 생산을 가능하게 한다.
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 1가 항-4-1BB 및 항-FAP huIgG1 P329GLALA를 생산하였다. 세포를 1:1:1:1 비("벡터 놉 중쇄":"벡터 경쇄1":"벡터 홀 중쇄";"벡터 경쇄2")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
생산된 이중특이적 1가 구축물을 이중특이적 2가 항-4-1BB 및 항-FAP huIgG1 P329GLALA에 대해 기술된 바와 같이(실시예 9.1 참조) 생산하고 정제하였다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표 61에서 확인할 수 있다.
Figure pct00225
Figure pct00226
Figure pct00227
Figure pct00228
Figure pct00229
Figure pct00230
모든 유전자를, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 조절하에 일시적으로 발현시켰다. 또한, 발현 벡터는 EBNA(엡스타딘 바 바이러스 핵 항원) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 항-4-1BB/ 항-FAP 구축물을 생산하였다. 세포를 1:1:1:1 비("벡터 놉 중쇄" : "벡터 홀 중쇄 " : "벡터 경쇄1" : "벡터 경쇄2")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생산을 위해, 4억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 접종하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 20 mL CD CHO 배지에 200 μg DNA의 최종량으로 혼합하였다. 540 μL PEI의 첨가 후에, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 10분 동안 실온에서 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 mL 진탕 플라스크에 옮기고 3시간 동안 37℃에서 5% CO2 대기를 갖는 배양기에서 배양하였다. 배양 후에, 160 mL F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상등액을 15분 동안 210 x g에서 원심분리함으로써 수거하였다. 용액을 멸균 여과시키고(0.22 μm 필터) 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고 4℃에서 유지하였다.
항원/Fc 융합 분자 또는 항체의 정제에 대해 상기에 기술된 바와 같이 세포 배양 상등액으로부터의 이중특이적 구축물의 정제를 단백질 A를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 정제된 이중특이적 구축물의 단백질 농도를 아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여 280 nm에서 OD를 측정함으로써 측정하였다. 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을 환원제(인비트로겐, 미국)의 존재 및 부재하에 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 이중특이적 구축물의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
Figure pct00231
9.3 4 - 1BB에 대한 2가 결합 및 종양 결합된 항원( TAA )에 대한 1가 결합을 갖는 이중특이적 항체(2+1 포맷)의 생산(비교용 실시예)
2+1로도 지칭되는, 4-1BB에 대해 2가 결합 및 FAP에 대해 1가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 4-1BB 항체를 도 40C 및 40D에 도시된 바와 같이 생산하였다.
본 실시예에서, 구축물의 제1 중쇄 HC1은 다음 구성성분으로 이루어졌다: 항-4-1BB 결합자의 VHCH1에 이어서, C-말단에 항-FAP 결합자의 VL 또는 VH가 융합된 Fc 놉. 제2 중쇄 HC2는 항-4-1BB의 VHCH1에 이어서, C-말단에 항-FAP 결합자(클론 4B9)의 VH 또는 VL이 각각 융합된 Fc 홀로 이루어졌다. FAP 결합자 4B9의 생성 및 생산은 본원에 참고로 도입된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다. 4-1BB에 대한 결합자(12B3, 9B11, 11D5 및 25G7)를 실시예 6에서 기술된 바와 같이 생산하였다. 표적화된 항-FAP-Fc 놉 쇄와 항-4-1BB-Fc 홀 쇄의 조합은 FAP 결합 모이어티 및 2개의 4-1BB 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생산을 가능하게 한다(도 40C 및 40D).
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 2+1 항-4-1BB 항-FAP huIgG1 P329GLALA 항체를 생산하였다. 세포를 1:1:1 비("벡터 놉 중쇄":"벡터 경쇄":"벡터 홀 중쇄")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 구축물을, 이중특이적 2가 항-4-1BB 및 항-FAP huIgG1 P329GLALA 항체에 대해 기술한 바와 같이 생산하고 정제하였다(실시예 9.1 참조).
놉 쇄에 융합된 a-FAP VH 및 홀 쇄에 융합된 a-FAP VL을 갖는 2+1 항-4-1BB, 항-FAP 구축물의 염기쌍 및 아미노산 서열을 각각 표 63에서 확인할 수 있다.
Figure pct00232
Figure pct00233
Figure pct00234
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Figure pct00239
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9.4 스크리닝 도구로서 FAP 항원의 생산, 정제 및 특성규명
FAP에 대한 결합을 시험하기 위해, C-말단 His 태그에 융합된 인간, 마우스 또는 사이노몰구스 FAP의 엑토도메인을 암호화하는 DNA 서열을, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터를 함유하는 발현 벡터에 클로닝하였다. 또한, 발현 벡터는 EBNA(엡스타딘 바 바이러스 핵 항원) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다. His-태그된 인간 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 서열번호 85 및 86에 나타내었다. 서열번호 88 및 89는 His-태그된 마우스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 서열번호 90 및 91은 His-태그된 사이노몰구스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다.
폴리에틸렌이민(PEI; 폴리사이언시즈 인코포레이티드)을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 FAP 항원을 생산하였다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 200 mL 생산을 위해, 3억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 100% F17 + 6 mM 글루타민에 접종하였다. 형질감염을 위해, 4억개의 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 20 mL의 예열된 CD-CHO 배지(깁코)로 교체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍ DNA의 최종량으로 20 mL CD-CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI(1 mg/mL)(폴리사이언시즈 인코포레이티드)의 첨가 후에, 용액을 15초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 재현탁된 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 3시간 동안 37℃에서 165 rpm에서의 진탕하에 5% CO2 대기를 갖는 배양기에서 배양하였다. 배양 후에, 160 mL F17 배지 및 보충물(1 mM 발프로산, 5 g/l 펩소이 및 6 mM L-글루타민)을 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 24시간 후에, 세포를 12% 최종 부피(24 mL)의 아미노산 및 글루코스 공급물로 보충하였다. 7일 동안 배양한 후에, 세포 상등액을 45분 동안 2000 내지 3000 x g에서 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과시키고(0.22 μm 필터) 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고 4℃에서 유지하였다.
세포 배양 상등액으로부터의 항원의 정제를, 먼저 5 ml IMAC 컬럼(로슈) 또는 5 ml NiNTA 컬럼(키아겐)을 사용한 친화성 크로마토그래피 단계에 이어, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0) 또는 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3(pH 7.3) 각각으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의한 2-단계 정제로 수행하였다.
친화성 크로마토그래피를 위해, IMAC 컬럼(로슈)을 사용하여, 8 CV에 대해 25 mM 트리스-HCl, 500 mM 염화 나트륨, 20 mM 이미다졸(pH 8.0)로 평형화를 수행하였다. 상등액을 부하시키고, 10 CV의 25 mM 트리스-HCl, 500 mM 염화 나트륨, 20 mM 이미다졸(pH 8.0)로 세척함으로써 미결합된 단백질을 세척하였다. 결합된 단백질은 20 CV(0에서 100%까지)의 25 mM 트리스-HCl, 500 mM 염화 나트륨, 500 mM 이미다졸(pH 8.0)의 선형 구배에 이어 8 CV에 대한 100%의 단계를 이용하여 용출시켰다.
친화성 크로마토그래피를 위해, NiNTA 컬럼(키아겐)을 사용하여, 8 CV에 대해 50 mM 인산나트륨, 300 mM 염화 나트륨(pH 8.0)으로 평형화를 수행하였다. 상등액을 부하시키고, 10 컬럼 부피의 50 mM 인산나트륨, 300 mM 염화 나트륨(pH 8.0)으로 세척함으로써 미결합된 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은 20 CV(0에서 100%까지)의 50 mM 인산나트륨, 300 mM 염화 나트륨, 500 mM 이미다졸(pH 7.4)의 선형 구배에 이어 5 CV의 50 mM 인산나트륨, 300 mM 염화 나트륨, 500 mM 이미다졸(pH 7.4)의 단계를 이용하여 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 8 CV의 50 mM 인산나트륨, 300 mM 염화 나트륨(pH 8.0)으로 재평형화시켰다.
이어서, 수거된 분획에 1/10(v/v)의 0.5 M EDTA(pH 8.0)를 보충하였다. 단백질을 비바스핀(Vivaspin) 컬럼(30 kD 컷오프, 사토리우스(Sartorius))에서 농축하고 여과시킨 후, 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3(pH 7.3) 또는 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
정제된 항원의 단백질 농도를, 아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여 280 nm에서 OD를 측정함으로써 측정하였다. 항원의 순도 및 분자량을, 환원제(인비트로겐, 미국)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 항원의 응집물 함량을, 25℃에서 25 mM 인산 칼륨, 125 mM 염화 나트륨, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
9.5 4 - 1BB 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 4가 항원 결합 분자(4+1 포맷)의 생산
4-1BB에 대해 4가 결합 및 FAP에 대해 1가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 4-1BB 항체(4+1 이중특이적 항원 결합 분자로도 지칭됨)를 도 40E 및 40F에 도시한 바와 같이 생산하였다.
본 실시예에서, 구축물의 HC1은 하기 구성성분으로 이루어졌다: 항-4-1BB의 VHCH1_VHCH1에 이어, C-말단에서 각각 항-FAP 결합자(클론 4B9)의 VL 또는 VH가 융합된 Fc 홀. HC2는 하기로 이루어졌다: 항-4-1BB의 VHCH1_VHCH1에 이어, C-말단에서 항-FAP 결합자의 각각 VH 또는 VL이 융합된 Fc 놉.
4-1BB, 12B3, 9B11, 11D5 및 25G7에 대한 결합자를 실시예 6에 기술된 바와 같이 생산하였다. FAP 결합자의 생성 및 생산은 본원에 참고도 도입된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다.
표적화된 항-FAP-Fc 놉 쇄와 항-4-1BB-Fc 홀 쇄의 조합은 FAP 결합 모이어티 및 4개의 4-1BB 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생산을 가능하게 한다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이는 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입되어 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다. 중쇄 융합 단백질은 항-4-1BB 결합자의 경쇄(CLVL)와 동시-발현되었다. 생산된 이중특이적 4가 구축물은 도 40E 및 40F에 도시되어 있고, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 표 65에서 확인할 수 있다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이적 4+1 항-4-1BB 항-FAP huIgG1 P329GLALA를 생산하였다. 세포를 1:1:1 비("벡터 놉 중쇄" : "벡터 경쇄" : "벡터 홀 중쇄")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 4+1 이중특이적 항원 결합 분자를 이중특이적 2가 항-4-1BB 및 항-FAP huIgG1 P329GLALA에 대해 기술된 바와 같이 생산하고 정제하였다(실시예 9.1 참조).
또한, "비표적화된" 4+1 구축물을, 항-FAP 결합자의 VH 및 VL 도메인이 항원에 결합하지 않는 생식계열 대조군(DP47로 지칭됨)으로 대체하여 생산하였다.
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Figure pct00267
놉 쇄에 융합된 a-FAP VL 및 홀 쇄에 융합된 a-FAP VH를 갖는 4+1 항-4-1BB, 항-FAP 구축물의 염기쌍 및 아미노산 서열을 각각 표 66에서 확인할 수 있다.
Figure pct00268
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9.6 4 - 1BB 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 4가 항체의 특성규명
9.6. 1 표면 플라즈몬 공명(동시 결합)
인간 4-1BB Fc(kih)와 인간 FAP에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
비오틴화된 인간 4-1BB Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 400 공명 단위(RU) 이하의 고정화 수준을 사용하였다. 4-1BB 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 항체를 200 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90초 동안 유동 세포에 통과시키고 해리는 0(제로)초로 설정하였다. 인간 FAP를 제2의 분석물로서 500 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90초 동안 유동 세포를 통해 주입하였다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
모든 이중특이적 구축물은 도 41B 내지 41D에 나타낸 바와 같이 인간 4-1BB 및 인간 FAP에 동시에 결합할 수 있었다.
9.6.2 인간 4- 1BB에 대한 결합 - 2가 4- 1BB 항체 대 4가 항-4- 1BB 항원 결합 분자의 경쟁 분석
인간 4-1BB에 결합하는 모든 4개의 항-4-1BB Fab 도메인의 능력을 확인하기 위해, 세포-기반 FRET 분석(태그라이트)을 적용하였다. 따라서, hu4-1BB-SNAP 융합 단백질로 형질감염시키고 FRET 공여체 터븀(시스바이오)으로 표지시킨 2500 Hek293 EBNA 세포/웰을 0.6 nM 항-4-1BB 우렐루맙(Urelumab) 또는 FRET 수용체 d2(시스바이오)로 표지된 0.39 nM 항-4-1BB 12B3과 혼합하였다. 또한, 0.006 내지 1000 nM의 농도 희석 범위의 비표지된 IgG(12B3) 또는 4가(12B3/4B9 4+1) 이중특이적 항체를 첨가하고 2 내지 4시간 동안 실온에서 배양하였다. 형광 신호를 형광 공여체(터븀)의 경우 620 nm에서 측정하고 형광 수용체 염료(M100 Pro, 테칸)의 경우 665 nm에서 측정하였다. 665/620*1000의 비를 산출하고, 기준(세포만 함유)을 감하였다. EC50 측정을 위해, 결과를 그래프 패드 프리즘6으로 분석하였다. 4시간의 배양 후에 관찰된 EC50 값을 표 68에 나타냈다. 상응하는 곡선을 도 42에 나타냈다.
Figure pct00294
9.6.3 세포 상에 결합
9.6.3.1 인간 4- 1BB 발현 세포 상에 결합: 휴지중인 인간 말초혈 단핵 백혈구(PBMC) 및 활성화된 인간 말초혈 단핵 백혈구
인간 4-1BB의 발현은 휴지중인 (미감작) 인간 T 세포 상에서 부재한다(문헌[Kienzle G. and von Kempis J (2000), Int. Immunol. 12(1):, 73-82], [Wen T. et al. (2002), J. Immunol. 168, 4897-4906]). 고정화된 항-인간 CD3 작용성 항체로 활성화시킨 후에, 4-1BB는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 상향조절된다. 또한, 활성화된 인간 NK 세포(문헌[Baessler T. et. al. (2010) Blood 115(15), 3058-3069]), 활성화된 인간 NKT 세포(문헌[Cole S.L. et al. (2014) J. Immunol. 192(8), 3898-3907]), 활성화된 인간 B 세포([Zhang et al. (2010) J. Immunol. 184(2), 787-795]), 활성화된 인간 호산구(문헌[Heinisch et al. 2001]), 구성적으로 인간 호중구(문헌[Heinisch I.V. (2000) J Allergy Clin Immunol. 108(1), 21-28]), 활성화된 인간 단핵구(문헌[Langstein J.et al. (1998) J Immunol. 160(5), 2488-2494], [Kwajah M. and Schwarz H. (2010) Eur J Immunol. 40(7), 1938-1949]), 구성적으로 인간 조절 T 세포(문헌[Bacher P. et al. (2014) Mucosal Immunol. 7(4), 916-928]), 인간 여포성 수지상 세포(문헌[Pauly S. et al. (2002) J Leukoc Biol. 72(1), 35-42]), 활성화된 인간 수지상 세포(문헌[Zhang L. et al. (2004) Cell Mol Immunol. 1(1), 71-76]) 및 인간 악성 종양의 혈관(문헌[Broll K. et al. (2001) Am J Clin Pathol. 115(4), 543-549]) 상에서 4-1BB 발현이 보고되었다.
천연 세포-발현된 인간 4-1BB에 대한 항-4-1BB 클론의 결합을 시험하기 위해, 휴지중인 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 PHA-L/프로류킨 사전활성화된 PBMC 및 CD3/CD28-재활성화된 PBMC를 사용하였다. 취리히 헌혈 센터의 버피 코트로부터 수득된 PBMC를 히스토파크 1077(시그마 라이프 사이언스, 카탈로그 번호 10771, 폴리슈크로스 및 나트륨 다이아트라이조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정)을 사용하여 피콜 밀도 원심분리에 의해 단리하고 10% 태아 소 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 16000-044, Lot 941273, 감마선-조사되고 마이코플라스마가 없고 56℃에서 35분 동안 열 불활성화됨), 1%(v/v) 글루타맥스-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038), 1 mM 나트륨 피루베이트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)로 보충된 RPMI 1640 배지(깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 42401-042)로 이루어진 T 세포 배지에 재현탁시켰다. PBMC를 단리 후에 바로 사용하거나(휴지중인 세포), 3 내지 5일 동안 6-웰 조직 배양 플레이트에서 200 U/mL 프로류킨(노바티스 파마 슈바이츠 아게, CHCLB-P-476-700-10340) 및 2 μg/mL PHA-L(시그마 카탈로그 번호 L2769)로 보충된 T 세포 배지에서 배앙한 후에 10 μg/mL 항-인간 CD3(클론 OKT3, 바이오레전드, 카탈로그 번호 317315) 및 2 μg/mL 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302928)으로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 T 세포 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양함으로써 자극하여 T 세포의 세포 표면에서 4-1BB 발현을 유도하였다.
인간 PBMC에 의해 별현된 인간 4-1BB에 대한 결합을 측정하기 위해, 0.1 내지 0.2 x 106개의 새로 단리된, 예를 들어 휴지중인 PBMC 또는 활성화된 PBMC를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4분 동안 400 x g에서 4℃에서 원심분리하고, 상등액을 폐기하였다. 세포를 200 μL/웰 DPBS로 세척한 후에, 30분 동안 4℃에서 1:5000 희석된 정착성 생존도 지시 염료 이플루오르 660(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 100 μL/mL DPBS와 함께 배양하였다. 그 후에, 세포를 1회 200 μL/웰 냉각 FACS 완충액(2%(v/v) FBS, 5 mM EDTA pH 8(암레스코, 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치 S2002)로 보충된 DPBS)으로 세척하였다. 이어서, 적정된 항-인간 4-1BB 결합자를 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 냉각 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 120분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 4회 200 μL/웰 4℃ FACS 완충액으로 세척하여 미결합된 분자를 제거하였다. 그 후에, 세포를 2.5 μg/mL PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-116-098), 항-인간 CD45 AF488(클론 HI30, 바이오레전드, 카탈로그 번호 304019), 0.67 μg/mL PerCP/Cy5.5-접합된 항-인간 CD3 마우스 IgG1 κ(클론 UCHT1, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300430), 0.125 μg/mL BV421-접합된 항-인간 CD4 moIgG1κ(클론 RPA-T4, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532) 또는 0.23 μg/mL BV421-접합된 항-인간 CD4 마우스 IgG2b κ(클론 OKT4, 바이오레전드, 카탈로그 번호 317434), 0.33 μg/mL 항-인간 CD8-BV510 (moIgG1κ, 클론 SK1, 바이오레전드, 카탈로그 번호 344732) 및 0.67 μg/mL 항-인간 CD19-PE/Cy7(moIgG1κ, 클론 HIB19, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302216)을 함유하는50 μL/웰의 4℃ 냉각 FACS 완충액과 함께 추가로 배양하고 30분 동안 4℃에서 배양하였다.
세포를 2회 200 μL FACS 완충액/웰로 세척하고 1% 포름알데하이드(시그마, HT501320-9.5L)를 함유하는 50 μL/웰 DPBS 중에 재현탁시켜 정착시켰다. 세포를 3-레이저 맥스퀀트 분석기 10(밀테나이 바이오텍)을 사용하여 같은 날 또는 다음 날 획득하였다. 게이트를 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에 설정하고, 이차 검출 항체의 형광 강도의 기하 평균(MFI)을 사용하여 1차 항체의 결합을 분석하였다. 그래프 패드 프리즘(그래프 패드 소프트웨어 인코포레이티드) 데이터를 사용하여 블랭크 값(1차 항체가 첨가되지 않음)을 감함으로써 기준선을 설정하고, EC50 값을 비-선형 회귀 곡선 정합(로버트 정합)을 사용하여 산출하였다.
인간 T 세포는 휴지중인 상태에서 4-1BB 발현이 결여되나, 활성화 후에 4-1BB를 상향조절한다. 인간 CD8+ T 세포는 CD4+ T 세포보다 강한 상항조절을 나타낸다. 생산된 항-인간 4-1BB-특이적 항체는 도 43B 및 43D에 나타낸 바와 같이 활성화된 인간 T 세포에 의해 발현된 인간 4-1BB에 결합할 수 있는 반면에, 휴지중인 CD4 및 CD8 T 세포 상에 유의미한 결합은 검출되지 않는다(도 43A 및 43C). 결합은 세포의 4-1BB 발현 수준에 의해 영향을 받고, 예를 들어 4-1BB-특이적 분자는 활성화된 CD4+ T 세포(도 43B)보다 활성화된 CD8+ T 세포에 대해 보다 강하게 결합한다(도 43D). 또한, 분자의 포맷에 의해 관찰된 차이가 존재하며, 예를 들어 1가 4-1BB-결합자는 2가 또는 4가 4-1BB 항원 결합 분자에 비해 상이하게 결합한다. 1가 4-1BB-결합은 보다 낮은 결합 친화도 때문에 EC50 값의 증가 및 MFI의 감소를 야기하고, 4가 4-1BB-결합자는 보다 강한 친화도 및 4-1BB-특이적 에피토프에 대한 내부 경쟁 때문에 상이한 결합 곡선을 나타낼 수 있다. Fc-융합된 FAP-표적화 도메인을 함유하는 분자(예를 들어 FAP-표적화된 2+2 또는 4+1 포맷, 1+1 포맷은 아님)는 다중클론 이차 검출 항체의 에피토프를 마스킹할 수 있고, 이는 MFI 및 EC50 값에 영향을 미칠 수 있다. 활성화된 CD8+ T 세포에 대한 결합의 EC50 값을 표 69에 나타냈다. 도 44에서, 도 43에 나타낸 결합 곡선의 곡선 아래 면적(AUC)을 요약하여 나타냈다.
Figure pct00295
9.6.3.2 인간 FAP -발현 종양 세포에 대한 결합
세포-표면-발현된 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 대한 결합을 위해, NIH/3T3-huFAP 클론 19 세포 또는 인간 흑색종 세포주 WM-266-4(ATCC CRL-1676)를 사용하였다. NIH/3T3-huFAP 클론 19를 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 인간 FAP를 암호화하는 발현 pETR4921 플라스미드로 CMV 프로모터하에 형질감염시켜 생산하였다. 세포를 1.5 μg/mL 퓨로마이신(인비보겐(InvivoGen), 카탈로그 번호 ant-pr-5)의 존재하에 유지하였다. 2 x 105의 FAP 발현 종양 세포를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 1회 200 μL DPBS로 세척하고, 펠릿을 1:5000 희석된 정착성 생존도 지시 염료 이플루오르 450(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65 0863 18) 또는 정착성 생존도 지시 염료 이플루오르 660(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 100 μL/웰의 4℃ 냉각 DPBS 완충액에 재현탁시켰다. 플레이트를 30분 동안 4℃에서 배앙하고 1회 200 μL 4℃ 냉각 DPBS 완충액으로 세척하였다. 그 후에, 세포를 상이한 적정된 농도의 4-1BB-특이적 FAP-표적화된 항체 및 비표적화된 항체를 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 냉각 FACS 완충액에 재현탁시킨 후에, 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 4회 200 μL/웰로 세척한 후에, 세포를 30분 동안 4℃에서 2.5 μg/mL PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-116-098) 또는 30 μg/mL FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 096 098)을 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 냉각 FACS 완충액으로 염색시켰다. 세포를 2회 200 μL 4℃ FACS 완충액으로 세척한 후에, 정착을 위해 1% 포름알데하이드를 함유하는 50 μL/웰 DPBS 중에 재현탁시켰다. 같은 날 또는 다음 날 세포를 100 μL FACS-완충액 중에 재현탁시키고 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스, 디바 소프트웨어) 또는 맥스퀀트 분석기 10(밀테나이 바이오텍)을 사용하여 획득하였다.
도 45A 및 45B에 나타낸 바와 같이, (DP47-표적화되거나 모 huIgG1 P293G LALA 클론 12B3이 아닌) FAP-표적화된 분자가 인간 FAP-발현 WM-266-4(A) 및 NIH/3T3-huFAP 클론 19 세포(B)에 효율적으로 결합하였다. 따라서, FAP-결합 부위를 포함하는 것은 인간 FAP-발현 세포에 대한 효과적 표적화 효과를 유도한다. FAP-결합 부위의 모이어티(예를 들어 1+1, 2+2 또는 4+1) 및 FAP-결합 클론(28H1 또는 4B9)은 FAP-발현 세포에 대한 결합의 EC50(표 70) 및 AUC(도 46)에서 역할을 맡고 영향을 미친다. 4-1BB(12B3) x FAP(28H1) 2+2(채워진 흑색 삼각형), 4-1BB(12B3) x FAP(28H1) 1+1(절반만 채워진 회색 원) 및 4-1BB(12B3) x FAP(4B9) 4+1(절반만 채워진 회색 사각형)은 결합의 차이를 나타냈고(도 45B), 이는 이의 가교결합 및 활성화 잠재력에 영향을 미칠 수 있다(도 47A 내지 47K에 나타냈고 실시예 10에서 논의됨).
Figure pct00296
실시예 10: 이중특이적 항-인간 4- 1BB 결합 분자의 기능적 특성
10.1 NFκB 활성화
10.1.1 HeLa 세포 발현 인간 4- 1BB 및 NF - κB - 루시퍼라제의 생산
자궁경부암종 세포주 HeLa(ATCC CCL-2)를, CMV-프로모터의 조절하에 인간 4-1BB(유니프롯 등록번호 Q07011)의 서열 및 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 발현 벡터 pETR10829를 기반으로 하는 플라스미드로 형질도입시켰다. 세포를, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I 및 3 ㎍/mL 퓨로마이신으로 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다.
4-1BB-형질도입된 HeLa 세포를 유세포분석에 의해 4-1BB 발현에 대해 시험하였다: 0.2x106의 살아있는 세포를 0.1 ㎍ PerCP/Cy5.5 접합된 항-인간 4-1BB 마우스 IgG1k 클론 4B4-1(바이오레전드 카탈로그 번호309814) 또는 그의 이소타입 대조군(PerCP/Cy5.5 접합된 마우스 IgG1k 이소타입 대조군 항체 클론 MOPC 21, 바이오레전드 카탈로그 번호400150)을 함유하는 100 ㎕ FACS 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 0.06 ㎍ DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 300 ㎕ FACS 완충액에 재현탁시키고, 5-레이저 LSR-포르테사(비디 바이오사이언스, 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다. 기술된 바와 같이 제한된 희석을 수행하여 단일 클론을 생산하였다: 인간-4-1BB-형질도입된 HeLa 세포를 배지 중에 10, 5 및 2.5 세포/ml의 밀도로 재현탁시키고, 200 ㎕의 세포 현탁액을 환저 조직-배양 처리된 96-웰 플레이트(6개 플레이트/세포 농도, TPP 카탈로그 번호 92697)로 옮겼다. 단일 클론을 수거하고, 증식시키고, 전술한 바와 같이 4-1BB 발현에 대해 시험하였다. 4-1BB의 최고 발현을 갖는 클론(클론 5)을 NF-κB-루시퍼라제 발현-벡터 5495p 트랜루센트(Tranlucent) HygB에 의한 후속 형질감염을 위해 선택하였다. 상기 벡터는 하이그로마이신 B에.대한 내성 및 NF-κB-반응 요소(파노믹스(Panomics), 카탈로그 번호 LR0051)의 조절하에 루시퍼라제를 발현하는 능력 둘 다를 갖는 형질감염 세포를 제공한다. 형질감염을 위해, 인간-4-1BB HeLa 클론 5 세포를 70% 밀집도(confluence)로 배양하였다. 50 ㎍(40 ㎕)의 선형화된 (제한 효소 AseI 및 SalI) 5495p 트랜루센트 HygB 발현 벡터를 멸균 0.4 cm 진 펄서/마이크로펄서 큐벳(Gene Pulser/MicroPulser Cuvette)(바이오래드, 카탈로그 번호 165-2081)에 가하였다. 400 ㎕의 무보충물 DMEM 배지 중의 2.5x106 인간-4-1BB HeLa 클론 5 세포를 첨가하고 플라스미드 용액과 조심스럽게 혼합하였다. 세포의 형질감염은 하기의 설정하에 진 펄서 엑셀(Gene Pulser Xcell) 토탈 시스템(바이오래드, 카탈로그 번호 165 2660)을 사용하여 수행하였다: 지수적 펄스, 전기용량 500 μF, 전압 160 V, 저항 ∞. 상기 펄스 직후에, 형질감염된 세포를 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스 I로 보충된 37℃ 따뜻한 DMEM 배지15 mL를 함유한 75 cm2 조직 배양 플라스크(TPP, 카탈로그 번호 90075)로 옮겼다. 다음 날, 3 ㎍/mL 퓨로마이신 및 200 ㎍/mL 하이그로마이신 B(로슈, 카탈로그 번호 10843555001)를 함유하는 배양 배지를 첨가하였다. 생존 세포를 증식시키고 전술한 바와 같이 제한된 희석을 수행하여 단일 클론을 생산하였다.
클론을 전술한 바와 같이 4-1BB 발현에 대해서 및 하기와 같이 NF-κB-루시퍼라제 활성에 대해 시험하였다: 클론을 선택 배지 중에 수거하고 세포 계수기(Cell Counter) 바이-셀(Vi-cell) xr 2.03(벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 카탈로그 번호 731050)을 사용하여 계수하였다. 세포를 0.33x106 세포/mL의 세포 밀도로 맞추고, 150 ㎕의 상기 세포 현탁액을 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오 원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮겼다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 세포 배양기(헤라 셀)에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 상이한 농도의 재조합 인간 종양 괴사 인자 알파(rhTNFa, 페프로테크(PeproTech), 카탈로그 번호 300 01A)를 함유하는 배지 50 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 0 ng/웰의 rhTNFa의 최종 농도를 야기하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 배양한 다음, 200 ㎕/웰 DPBS로 3회 세척하였다. 리포터 용해 완충액(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고(40 ㎕) 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 냉동된 세포 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온으로 해동시켰다. 100 ㎕의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, 스펙트라맥스 M5/M5e 마이크로플레이트 판독기 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(SoftMax Pro Software)(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 가능한 한 빨리 플레이트를 측정하였다. 대조군(rhTNFa 무첨가)보다 500밀리초/웰 높은 경우 측정된 발광 단위(URL)를 루시퍼라제 활성으로 취하였다. 최고 루시퍼라제 활성 및 상당한 수준의 4-1BB-발현을 나타내는 HeLa-hu4-1BB-NF-kB-luc 클론 26을 추후 사용을 위해 선택하였다.
10.1.2 FAP -발현 종양 세포와 공배양된 인간 4- 1BB를 발현하는 HeLa 세포에서 NFκB 활성화
HeLa-hu4-1BB-NF-kB-luc 클론 26 세포를 수거하고 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 0.2 x 106 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 100 ㎕(2 x 104 세포)의 상기 세포 현탁액을 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오 원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮기고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 적정된 FAP-표적화 항-인간 4-1BB 구축물 또는 그의 모 huIgG1 P329G LALA 항체를 함유하는 배지 50 ㎕를 첨가하였다. FAP-발현 NIH/3T3-huFAP 클론 19 또는 WM-266-4를 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 2 x 106 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다.
FAP-발현 종양 세포의 현탁액(50 ㎕) 또는 음성 대조군으로서 배지를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 세포 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕/웰 DPBS로 2회 세척하였다. 40 ㎕의 새로 생산된 리포터 용해 완충액(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 냉동된 세포 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온으로 해동시켰다. 100 ㎕의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, 스펙트라맥스 M5/M5e 마이크로플레이트 판독기 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 가능한 한 빨리 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 47A 내지 47K에, 상이한 FAP-표적화된 4-1BB-특이적 구축물의 활성화 특성을 나타냈다. 상부 패널에, FAP의 부재하에 활성화 특성을 나타냈다(도 47A, D 및 G). FAP의 부재하에, 활성화는 4-1BB-결합 클론에 독립적인 것으로 검출되지 않았다. 중부 패널에, FAP-중간발현 인간 WM-266-4의 존재하에 활성화를 나타냈다. 4+1 및 2+1 FAP(4B9)-표적화된 구축물의 존재하에만 NFκB-매개된 루시퍼라제 활성화가 관찰될 수 있었다; 즉, 4-1BB(12B3) x FAP(4B9) 4+1(절반만 채워진 회색 사각형, 절반의 점선)(도 47B), 4-1BB(11D5) x FAP(4B9) 4+1(회색 별, 점선) 및 4-1BB(11D5) x FAP(4B9) 2+1(흑색 엑스표, 점선)(도 47E) 및 4-1BB(25G7) x FAP(4B9) 4+1(절반만 채워진 위를 가리키는 흑색 삼각형, 점선) 및 4-1BB(25G7) x FAP(4B9) 2+1(절반만 채워진 아래를 가리키는 흑색 삼각형)(도 47I). 하부 패널에, FAP-고발현 NIH/3T3-huFAP 클론 19의 존재하에 활성화를 나타냈다. 여기서, 4+1 및 2+1 FAP(4B9)-표적화된 구축물뿐만 아니라 2+2 및 1+1 FAP(28H1)-표적화된 구축물도 리포터 세포주에서 NFκB-매개된 루시퍼라제 활성화를 유도할 수 있다. 또한, 이러한 결과를 활성화 곡선의 곡선 아래 면적(AUC)으로서 도 48A 및 B에 요약하여 나타냈다. 사용된 포맷 및 FAP-결합 클론을 그래프 아래에 픽토그램으로서 나타냈고, 사용된 클론을 기둥 패턴으로 나타냈다. 명백히, 4가 4-1BB x FAP 4+1 분자는 4-1BB 발현 리포터 세포주에서 가장 강한 NFkB/루시퍼라제-활성화를 유도하였다.
Figure pct00297
Figure pct00298
실시예 11: GITR 항체 및 도구 결합자의 생산
11.1 파지 디스플레이에 의한 신규한 GITR 결합자의 생산을 위한 스크리닝 도구로서 항원 Fc 융합체의 생산, 정제 및 특성규명
인간, 마우스 또는 사이노몰구스 GITR의 엑토도메인을 암호화하는 DNA 서열(표 72)을 Fc-놉 상에 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 융합시켰다(Merchant et al., 1998). IgAse 프로제아제 절단 부위를 항원 엑토도메인과 인간 IgG1의 Fc 사이에 도입하였다. 유도된 비오틴화를 위한 Avi 태그를 항원-Fc-놉 융합체의 C-말단에 도입하였다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항원-Fc 놉 쇄와 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 Fc-홀 쇄의 조합은 하나의 GITR 엑토도메인 쇄를 갖는 이종이량체의 생산을 가능하게 하여 Fc-결합된 항원의 단량체성 형태를 생산한다(도 1A). 표 73은 항원 Fc-융합 구축물의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00299
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Figure pct00302
Figure pct00303
Figure pct00304
Figure pct00305
서열을 암호화하는 모든 GITR-Fc-융합 분자를, 키메라 MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3'에 위치된 합성 폴리A 서열을 함유하는 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 또한, 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV oriP 서열을 함유한다.
비오틴화된 단량체성 항원/Fc 융합 분자의 생산을 위해, 기하급수적으로 성장하는 현탁액 HEK293 EBNA 세포를 융합 단백질의 2개의 성분(놉 쇄 및 홀 쇄) 및 BirA(비오틴화 반응에 필수적인 효소)를 암호화하는 3개의 벡터와 함께 동시-형질감염시켰다. 상응하는 벡터를 2:1:0.05 비("항원 ECD-IgAse- Fc 놉":"Fc 홀":"BirA")로 사용하였다.
항원 생산 및 정제를 실시예 1.1.1에 기술한 절차와 유사하게 수행하였다. 상이한 GITR-Fc 융합 단백질의 수율, 농도 및 품질을 표 74에 요약하여 나타냈다.
Figure pct00306
11.2 포괄적 F(ab) 라이브러리로부터 항- GITR 항체의 선별
항-GITR 항체 8A06을 Fab-포맷에서 포괄적 파지 디스플레이 라이브러리 λ-DP88로부터 선별하였다.
라이브러리 구축
λ-DP88 라이브러리를, 경쇄의 CDR3(L3, 3가지 상이한 길이) 및 중쇄의 CDR3(H3, 3가지 상이한 길이)에서 무작위 서열 스페이스를 포함하는 V-도메인 쌍형성 Vl3_19(람다 경쇄) 및 VH1_69(중쇄)를 사용하여 인간 생식계열 유전자를 기반으로 구축하였다. 라이브러리 제작을, 중복 연장 스플라이싱(SOE) PCR을 적용하여 3개의 PCR-증폭된 단편의 조립에 의해 수행하였다. 단편 1은 무작위 L3을 포함하는 항체 유전자의 5' 말달을 포함하고, 단편 2는 L3에서 H3까지 걸쳐 있는 중심 불변 단편인 반면에, 단편 3은 무작위 H3 및 항체 유전자의 3' 말단을 포함한다. 하기 프라이머 조합을 λ-DP88 라이브러리를 위한 이들 라이브러리 단편을 생산하는 데 사용하였다: 각각 단편 1(역방향 프라이머 Vl_3_19_L3r_V, Vl_3_19_L3r_HV 또는 Vl_3_19_L3r_HLV와 조합된 정방향 프라이머 LMB3), 단편 2(역방향 프라이머 RJH32와 조합된 정방향 프라이머 RJH80) 및 단편 3(역방향 프라이머 fdseqlong와 조합된 정방향 프라이머 DP88-v4-4, DP88-v4-6 또는 DP88-v4-8). 라이브러리 단편을 생산하기 위한 PCR 파라미터는 94℃에서 5분 초기 변성, 25주기의 1분 94℃, 1분 58℃, 1분 72℃ 및 10분 동안 72℃에서 말단 신장이었다. 조립 PCR의 경우, 주형으로서 동몰비의 겔-정제된 단일 단편을 사용하여, 파라미터는 94℃에서 3분 초기 변형 및 5주기의 30초 94℃, 1분 58℃, 2분 72℃이었다. 이 단계에서, 외부 프라이머(LMB3 및 fdseqlong)를 첨가하고, 10분 동안 72℃에서 말단 신장 전에 추가적 20주기를 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위 Fab 구축물의 조립 후에, 이들을 NcoI/NheI로 절단하고 유사하게 처리된 수용체 파지미드 벡터 내에 접합시켰다. 정제된 접합물을 전기천공적격 이콜라이 TG1 내로의 약 60 형질전환에 사용하였다. 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 회수하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다. 9.0 × 109의 최종 라이브러리 크기를 수득하였다. 점 블롯으로 C-말단 태그 검출에 의해 측정시 기능성 클론의 백분율은 각각 경쇄의 경우 73.7%이었고 중쇄의 경우 80.0%이었다.
파지 디스플레이 선별 및 ELISA 스크리닝
파지 디스플레이 선별을 위한 항원으로서 인간 GITR을 HEK EBNA 세포에서 N-말단 단량체성 Fc-융합체(Fc의 놉-인투-홀 이종이량체화)로서 일시적으로 발현시키고, 수용체 쇄(Fc 놉 쇄)를 갖는 Fc 부분의 C-말단에 위치된 avi-태그 인식 서열에서 BirA 비오틴 리가제의 공-발현을 통해 생체내 부위-특이적으로 비오틴화시켰다.
선별 라운드(바이오패닝)를 하기 패턴에 따라 용액 중에서 수행하였다: 1. 항원의 Fc-부분을 인식하는 항체의 라이브러리를 고갈시키기 위해 10 ㎍/ml의 코팅된 NUNC 맥시소프 플레이트 상에 코팅된 인간 IgG로 약 1012개 파지미드 입자의 예비-제거; 2. 1 ml의 총 부피로 0.5시간 동안 100 nM 비오틴화된 인간 GITR을 갖는 상등액 중에서 사전-승인된 파지미드 입자의 배양; 3. 10분 동안 뉴트라비딘 예비-코팅된 미세적정 플레이트의 4개 웰로의 전이에 의해 비오틴화된 인간 GITR 및 특이적 결합 파지의 포획(라운드 1 및 3에서); 4. 5x PBS/트윈20 및 5x PBS를 사용하여 각 웰 세척; 5. 10분 동안 웰 당 250 ㎕ 100 mM TEA(트라이에틸아민)의 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 4개 웰로부터 모인 용출물에 500 ㎕ 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)의 첨가에 의한 중화; 6. 대수기 이콜라이 TG1 세포를 용출된 파지 입자의 상등액으로 재배양, 헬퍼파지 VCSM13으로 감염, 진탕기 상에서 30℃에서 밤새 배양, 및 후속 선별 라운드에 사용하기 위해 파지미드 입자의 후속 PEG/NaCl 침전. 선별을 100 nM의 일정한 항원 농도를 사용하여 4개의 라운드에 걸쳐 수행하였다. 라운드 2 및 4에서, 뉴트라비딘에 대한 결합자의 풍부화를 방지하기 위해, 5.4 x 107 스트렙타비딘-코팅된 자석 비드를 첨가하여 항원:파지 복합체의 포획을 수행하였다. 특이적 결합자를 라운드 4 후에 다음과 같이 ELISA로 확인하였다: 100 ㎕의 100 nM 비오틴화된 인간 GITR을 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 세균 상등액을 첨가하고, 항-Flag/HRP 이차 항체를 사용하여 그의 Flag-태그를 통해 결합 Fab를 검출하였다. 인간 GITR에 대해 신호를 나타내고 인간 Fc에 대해 음성인 클론을 추가의 분석을 위해 최종 후보명단에 올려놓았다. 이들을 0.5 리터 배양 부피로 세균 발현시키고, 친화도 정제하고, 바이오래드의 프로테온 XPR36 바이오센서를 사용하여 SPR-분석에 의해 결합 동역학을 측정하고 사이노몰구스 및 뮤린 GITR에 대한 교차-반응성을 시험하여 추가로 특성규명하였다.
바이오래드의 프로테온 XPR36 바이오센서를 사용한 SPR -분석
인간, 사이노몰구스 및 뮤린 GITR에 대한 클론 8A06의 친화도(KD)를 25℃에서 프로테온 XPR36 기구(바이오래드)를 사용하여 뉴트라비딘 포획에 의해 NLC 칩 상에 고정화된 비오틴화된 인간, 사이노몰구스 및 뮤린 GITR 항원을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 항원(리간드)의 고정화: 재조합 항원을 PBST(10 mM 포스페이트, 150 mM 염화 나트륨 pH 7.4, 0.005% 트윈 20)으로 10 μg/ml로 희석한 후에, 30 μl/분으로 수직 방향으로 주입하였다. 분석물의 주입: '원-샷(one-shot) 동역학' 측정을 위해, 주입 방향을 수평 방향으로 바꾸고, 정제된 Fab의 2-배 희석 시리즈를 각각 200초의 결합 시간 및 240초의 해리 시간을 사용하여 개별 채널 1 내지 5를 따라 동시 주입하였다. 완충액(PBST)을 제6 채널을 따라 주입하여 기준 표시를 위한 "인-라인" 블랭크를 제공하였다. 결합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 정합시킴으로써 프로테온 매니저 소프트웨어로 간단한 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 산출하였다. 평형 해리 상수(KD)를 koff/kon의 비로서 산출하였다. 클론 8A06은 각각 4.4 및 67 nM 친화도로 갖는 인간 및 사이노몰구스 단량체성 GITR-Fc 융합체에 결합하였다. 뮤린 단량체성 GITR-Fc 융합체에 대해서는 결합이 검출되지 않았다.
pRJH52 라이브러리 주형 λ-DP88 라이브러리는 경쇄에 대해 PelB 리더 서열 + Vl3_19 람다 V-도메인 + CL 불변 도메인 및 태그를 포함하는 중쇄에 대해 pelB + VH1_69 V-도메인 + CH1 불변 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 완전 Fab를 기반으로 하였다. 표 75는 PCR에 대해 사용된 포괄적 파지-디스플레이 λ-DP88 라이브러리(Vl3_19/VH1_69) 주형의 서열을 나타내고, 표 76은 λ-DP88 라이브러리 주형의 생산에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure pct00307
Figure pct00308
Figure pct00309
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Figure pct00311
Figure pct00312
클론 8A06은 상기에 기술된 절차에 따라 인간 GITR-특이적 결합자로서 확인되었다. 이의 가변 영역의 cDNA 서열을 하기 표 77에 나타냈고, 상응하는 아미노산 서열을 표 C에서 확인할 수 있다. 또한, 벤치마크 항체 6C8(WO 2006/105021에 따라 생산함)의 가변 영역의 cDNA 서열을 표 77에 나타냈다.
Figure pct00313
Figure pct00314
11. 3 항 - GITR IgG1 P329G LALA 항체의 생산, 정제 및 특성규명
선별된 항-GITR 결합자의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 인간 IgG1의 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 놉 중쇄 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여. WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
항-GITR 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표 78에 나타냈다. 항-GITR 항체를, 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 생산하였다. 세포를 1:1 비("벡터 중쇄": "벡터 경쇄")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. GITR 특이적 항체 8A06의 생산 및 정제를 실시예 1.3에 기술된 바와 유사하게 수행하였다. 표 79는 파지 디스플레이에 의해 선별된 클론 8A06의 생산 및 정제의 결과를 요약하여 나타낸다.
Figure pct00315
Figure pct00316
Figure pct00317
Figure pct00318
Figure pct00319
Figure pct00320
Figure pct00321
11.4 GITR 클론 8A06의 특성규명
11.4.1 표면 플라즈몬 공명(결합활성 + 친화도)
11.4.1.1 클론 8A06 및 6C8의 종 교차-반응성 및 친화도
재조합 GITR Fc(kih)에 대한 GITR-특이적 항체(클론 8A06 및 6C8)의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험을 25℃에서 비아코어 T200 상에서 러닝 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 수행하였다. 동일한 실험에서, GITR 결합자(인간 IgG1 P329GLALA)와 재조합 GITR(인간, 사이노 및 뮤린) 사이의 종 선택성 및 상호작용의 결합활성을 측정하였다. 비오틴화된 인간, 사이노몰구스 및 뮤린 GITR Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 상이한 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 100 공명 단위(RU) 이하의 고정화 수준을 사용하였다.
항-GITR 인간 IgG1 P329GLALA 항체를 0.2 내지 200 nM(4-배 희석) 범위의 농도로 30 μL/분의 흐름하에 120초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 복합체 해리를 180초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이를 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득한 반응을 감함으로써 보정하였다. 동적 상수를 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 유도하여 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식에 정합시키고 결합활성을 정성적으로 평가하는 데 사용하였다(도 49A 내지 49D).
동일한 실험에서, GITR 항체(인간 IgG1 P329GLALA)와 재조합 GITR(인간 및 사이노) 사이의 상호작용의 친화도를 측정하였다. 항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이브루크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링하였다. 고정화 수준은 약 7000 RU였다. GITR 항체를 90초 동안 5 nM에서 포획하였다. 재조합 인간 및 사이노몰구스 GITR Fc(kih)를 2.7 내지 2000 nM 범위에서 30 μL/분의 흐름하에 180초 동안 유동 세포에 통과시켰다. 해리를 180초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이를 기준 유동 세포에 대해 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 이때, 항원을 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖는 표면 위에 유동시켰으나, 이 위에 HBS-EP를 항체 대신에 주입하였다(도 50A). 동적 상수를 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 유도하여 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식에 정합시켰다. 항-GITR P329GLALA IgG1(클론 8A06)과 GITR Fc(kih) 사이의 상호작용에 대한 친화도 상수를 1:1 랭뮤어 결합에 정합시킴으로써 측정하였다(표 80).
클론 8A06 및 6C8운 인간 및 사이노몰구스 GITR Fc(kih)에 결합하나 뮤린 GITR에 대한 교차 반응성은 가지지 않는다.
Figure pct00322
11.4.1.2 리간드 차단 특성
GITR/GITR-리간드 상호작용을 방해하는 GITR-특이적 인간 IgG1 P329GLALA 항체 8A06의 능력을 측정하기 위해 인간 GITR 리간드(알앤디 시스템즈)를 사용하였다.
인간 GITR 리간드를 약 2000 RU로 pH 5.0까지 표준 아민 커플링 키트 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 CM5 칩의 2개의 유동 세포에 직접 커플링하였다. 재조합 인간 GITR Fc(kih)를 100 nM의 농도에서 30 μL/분의 흐름하에 90초 동안 제2 유동 세포 상에 통과시켰다. 해리를 생략하고, 항-GITR 인간 IgG1P329LALA를 500 nM의 농도로 30 uL/분의 흐름하에 90초 동안 둘 다의 유동 세포 상에 통과시켰다. 해리를 60초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이를 기준 유동 세포에 대해 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 이때, 항체를 고정화된 인간 GITR 리간드를 갖는 표면 상에 유동시켰으나, 이 위에 HBS-EP를 재조합 인간 GITR Fc(kih) 대신에 주입하였다.
GITR 클론 8A06은 인간 GITR과 이의 GITR 리간드의 복합체에 결합하였다(도 51). 따라서, 이러한 항체는 인간 GITR에 대한 결합을 위한 리간드와 경쟁하지 않아 "비-리간드 차단"으로 지칭된다.
Figure pct00323
11.4.1.3 에피토프 비닝
항-GITR 항체에 의해 인식되는 에피토프를 표면 플라즈몬 공명에 의해 특성규명하였다. 먼저, 인간 GITR에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체의 능력을 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 이들 실험의 목적은 "에피토프 빈(bin)"을 정의하는 것이다. 유사하거나 중첩하는 에피토프에 대해 경쟁하는 항체는 GITR에 동시에 결합할 수 없고 "에피토프 빈"에 속한다. GITR에 동시에 결합할 수 있는 항-GITR 항체는 에피토프 또는 이의 일부를 공유하지 않아 상이한 에피토프 빈으로 분류된다.
항-GITR 인간 IgG1 P329GLALA의 인간 또는 뮤린 수용체에 대한 경쟁 결합을 분석하기 위해, 파지 유도된 항-GITR 클론 8A06 및 벤치마크 항체 6C8을 약 1000 RU로 pH 5.5까지 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 CM5 칩에 직접 커플링시켰다. 재조합 인간 GITR Fc(kih)를 200 nM의 농도로 30 μL/분의 흐름하에 180초 동안 주입하였다. 해리를 생략하고, 제2 항-GITR 인간 IgG1 P329GLALA 항체를 200 nM의 농도로 30 μL/분의 흐름하에 90초 동안 통과시켰다. 해리를 90초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차리를 기준 유동 세포에 대해 수득한 반응을 감함으로써 보정하였다.
SPR 실험을 비아코어 T200 상에서 25℃에서 러닝 완충액으로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 수행하였다.
경쟁 결합 실험은, 2개의 항체가 동시에 인간 GITR Fc(kih)에 결합할 수 있기 때문에 항-GITR 클론 8A06 및 6C8 상이한 공간적 에피토프에 결합함을 보여준다(표 82, 도 52B 및 52C).
Figure pct00324
실시예 12: GITR 및 종양 결합된 항원(TAA)를 표적화하는 이중특이적 2가 항체의 생산, 정제 및 특성규명
12.1 GITR 및 섬유아세포 활성화 단백질( FAP )을 표적화하는 이중특이적 4가 구축물(4+1 및 4+2 포맷)의 생산
GITR에 대해 4가 결합 및 FAP에 대해 1가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 GITR 항체(4+1 이중특이적 항원 결합 분자로도 지칭됨)를 도 53A에 도시된 바와 같이 생산하였다.
구축물의 하나의 중쇄 HC1은 하기 구성성분으로 이루어진다: 항-GITR의 VHCH1_VHCH1에 이어, C-말단에서 항-FAP 결합자(클론 28H1)의 VL 또는 VH가 각각 융합된 Fc 홀. 중쇄 HC2는 하기로 이루어진다: 항-GITRdml VHCH1_VHCH1에 이어, C-말단에서 항-FAP 결합자의 VH 또는 VL가 융합된 Fc 놉.
GITR에 대한 결합자를 실시예 11에 기술된 바와 같이 생산하였다. FAP 결합자의 생산 및 생산은 본원에 참고로 도입된 WO 2012/020006 A2에 기술되어 있다.
둘 다의 중쇄의 조합은 FAP 결합 모이어티 및 4개의 GITR 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생산을 가능하게 한다. Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다 중쇄 융합 단백질을 항-GITR 결합자의 경쇄(CLVL)와 함께 공-발현시켰다. 생산된 이중특이적 4가 구축물의뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표 83에서 확인할 수 있다.
Figure pct00325
Figure pct00326
Figure pct00327
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Figure pct00335
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Figure pct00337
Figure pct00338
또한, GITR에 대해 4가 결합 및 FAP에 대해 2가 결합을 갖는 이중특이적 작용성 GITR 항체(4+2 구축물)를 생산하였다. WO 2010/145792 A1에 따른 크로스맙 기술을 적용하여 부적절하게 쌍을 이룬 경쇄의 형성을 감소시켰다. 본 실시예에서, FAP 결합자 28H1의 교차된 Fab 유닛(VHCL)을 둘 다의 중쇄의 Fc 일부의 C-말단에 융합시켰다. GITR에 대한 2개의 Fab를 실시예 4.2에 기술된 바와 같이 각각의 중쇄의 N-말단에 융합시켰다. 이 경우, 놉-인투-홀의 도입은 둘 다의 중쇄가 동일한 도메인을 함유하지 않았기 때문에 필요하지 않았다.
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 WO 2012/130831 A1에 기술된 방법에 따라 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 제거하였다. 생산된 이중특이적 4가 구축물을 도 53B에 도시하였다. 표 84는 각각 성숙한 이중특이적 4가 항-OX40/항-FAP 인간 IgG1 P329GLALA 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00339
Figure pct00340
Figure pct00341
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Figure pct00343
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Figure pct00345
Figure pct00346
모든 유전자를, CMV 프로모터 인핸서 단편과 결합된 MPSV 코어 프로모터로 이루어진 키메라 MPSV 프로모터의 조절하에 일시적으로 발현시켰다. 또한, 발현 벡터는 EBNA(엡스타딘 바 바이러스 핵 항원) 함유 숙주 세포에서의 에피솜 복제를 위한 oriP 영역을 함유한다. 이중특이적 항-GITR/ 항-FAP 구축물을, 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 생산하였다. 세포를 1:1:1 비("벡터 중쇄 1" : "벡터 중쇄 2" : "벡터 경쇄" 또는 "벡터 중쇄" : "벡터 경쇄1" : "벡터 경쇄2")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
생산 및 정제를 Ox40 이중특이적 분자의 생산에 대해 실시예 4.5에 사용된 프로토콜에 따라 수행하였다.
Figure pct00347
12.2 이중특이적 GITR / FAP 구축물의 동시 결합
인간 GITR Fc(kih) 및 인간 FAP에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험을, 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
비오틴화된 인간 GITR Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 1000 공명 단위(RU) 이하의 고정화 수준을 사용하였다. GITR 및 FAP를 표적화하는 이중특이적 구축물을 200 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90초 동안 유동 세포에 통과시키고 해리는 0(제로)초로 설정하였다. 인간 FAP를 제2의 분석물로서 500 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90초 동안 유동 세포를 통해 주입하였다. 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
모든 이중특이적 구축물은 인간 GITR 및 인간 FAP에 동시에 결합할 수 있었다(도 54B 및 54C).
12.3 GITR -발현 HEK 세포 및 FAP -발현 3T3 세포에 대한 결합
세포 표면 GITR에 대한 결합을 세포 표면 상에 인간 GITR 단백질(HEK-GITR)을 과발현하도록 조작된 인간 배아 신장 293(HEK) 세포을 사용하여 4-1BB에 대해 실시예 9.6.2에 기술된 방법과 유사한 방법으로 시험하였다. 대조군으로서 HEK-GITR 세포 또는 모 GITR 음성 HEK 세포(HEK WT)를 10% FBS(깁코 카탈로그 번호 16140-071), 50 U/mL 페니실린-스트렙토마이신(깁코 카탈로그 번호 15070-063) 및 글루타맥스(깁코 카탈로그 번호 35050-061)로 보충된, HEK-GITR 세포의 경우에는 1 μg/mL 퓨로마이신(깁코 카탈로그 번호 A11138-03)도 함께 보충된 DMEM 배지(깁코 카탈로그 번호 42430-025)에서 성장시켰다. 세포 표면 FAP에 대한 결합을 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP)을 발현시키도록 형질감염된 3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 사용하여 시험하였다(실시예 9.6.3.2 참조). 모 3T3 세포를 10% CS(시그마 카탈로그 번호 C8056)로 보충된 DMEM 배지에서 성장시켰다. 3T3-huFAP 세포를 DMEM + 10% CS 및 1.5 μg/mL 퓨로마이신에서 성장시켰다.
세포를 수거하고 PBS(깁코 카탈로그 번호 20012-019)로 세척하고 PBS 중에 1 x 107 세포/mL의 세포 밀도로 조정하였다. 대조군 세포(HEK WT 및 3T3 WT)를 PBS 중에 7분 동안 37℃에서 2.5 μM의 세포 증식 지시염료 이플루오르 670(이바이오사이언스 카탈로그 번호 65-0840-85)으로 표지시켰다. 세포를 2회 완전 배지로 1회 PBS + 2% FBS로 세척한 후에, PBS + 2% FBS 중에 1 x 107 세포/mL의 세포 밀도로 조정하였다. 2 x 105 세포(105 HEK WT + 105 HEK GITR 또는 105 3T3 WT + 105 3T3-huFAP)를 환저 96-웰 플레이트(TPP, 카탈로그 번호 92097)의 웰 마다 접종시켰다.
플레이트를 4℃에서 3분 동안 600 x g에서 원심분리하고, 상등액을 털어버렸다. 세포를 120분 동안 4℃에서 적정된 항-GITR 항체 구축물을 함유하는 50 μL/웰의 4℃ 냉각 PBS + 2% FBS 중에 재현탁시켰다. 플레이트를 2회 200 μL/웰 4℃ PBS + 2% FBS로 세척하고 미결합된 구축물을 제거하였다. 세포를 PBS 중에서 30분 동안 4℃에서 좀비 아쿠아 플렉서블 바이어빌리티 키트(Zombie Aqua Fixable Viability Kit, 바이오레전드 카탈로그 번호 423102) 및 이차 항체(잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 번호 109-116-098)로 염색시켰다. 플레이트를 4℃에서 3분 동안 600 x g에서 원심분리하고 2회 PBS + 2% FBS로 세척하였다. 세포를 20분 동안 실온에서 PBS + 2% 포름알데하이드(폴리사이언시즈 카탈로그 번호04018)로 고정시켰다. 플레이트를 4℃에서 3분 동안 600 x g에서 원심분리하고, 상등액을 털어버렸다. 세포를 200 μL/웰 FACS 완충액(이바이오사이언스 카탈로그 번호 00-4222-26)으로 세척하고 최종적으로 다음 날 획득을 위해 100 μL/웰 FACS 완충액 중에 4-레이저 LSR II(비디 바이오사이언스, 디바 소프트웨어)를 사용하여 재현탁시켰다.
도 55A에 나타낸 바와 같이, 모든 시험된 이중특이적 항-GITR 구축물은 인간 GITR 발현 표적 세포에 효율적으로 결합하였고 GITR 음성 대조군 세포에는 결합하지 않거나 무시해도 될 정도로 결합하였다(도 55B). 따라서, 항-GITR 항체는 이중특이적 FAP 표적화된 포맷으로서 발현될 때도 이의 GITR 특이성을 유지하였다.
Figure pct00348
도 56A에 나타낸 바와 같이, 모든 이중특이적 항-GITR 구축물은 인간 FAP-발현 표적 세포에 효율적으로 결합하였고 모 3T3 세포(음성 대조군, 도 56B)에는 결합하지 않거나 무시해도 될 정도로 결합하였다. 따라서, 이중특이적 항-GITR/항-GITR 항체는 이중특이적 포맷에서 이의 FAP 특이성을 유지하였다.
실시예 13: 이중특이적 항-인간 GITR 결합 분자의 기능적 특성
13.1 최적이하 TCR 자극의 존재하에 인간 CD4 및 CD8 T 세포의 GITR 매개된 공자극
GITR의 접합물은 최적이하 T-세포 수용체(TCR) 자극 후 T-세포의 분열 및 생존을 촉진하는 상승적 공자극 신호를 제공한다(문헌[Clouthier et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2014 Apr;25(2):91-106]).
이중특이적 항-인간 GITR 결합 분자의 작용물질 특성을 분석하기 위해, FAP 표적화된 1가 포맷의 선별된 결합자(클론 8A06) 또는 이의 상응하는 비-표적화된 버전을 대조군으로서 표면 고정화시 T 세포를 공-활성화시키는 이의 능력에 대해 시험하였다. 이를 위해, 휴지중인 ef450-표지된 인간 PBMC를 최적이하 농도의 항-CD3 항체로 조사된 FAP+ NIH/3T3-huFAP 클론 19 세포 및 적정된 항-GITR 구축물의 존재하에 6일 동안 자극하였다. T-세포 증식에 대한 효과를 유세포분석에 의해 총 세포 수 및 살아있는 세포 중의 ef450 희석의 모니터링을 통해 분석하였다.
취리히 헌혈 센터에서 버피 코트를 수득하였다. 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 버피 코트를 동부피의 PBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 20012-019)로 희석하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관(TPP, 카탈로그 번호 91050)을 15 mL 림포프렙(Lymphoprep, 스팀셀, 카탈로그 번호 07851)으로 보충하고, 버피 코트 용액을 림포프렙 위에 적층하였다. 관을 실온에서 가속화 없이 휴지 없이 30분 동안 400 x g에서 원심분리하였다. 그 후에, PBMC를 계면으로부터 수거하고 3회 PBS로 세척하고, 10% 태아 소 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 16140-071), 1%(v/v) 1 mM 나트륨-피루베이트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)로 보충된 글루타맥스(깁코 바이 라이프 테크놀로지, 카탈로그 번호 72400-021)로 사전보충된 RPMI 1640 배지로 이루어진 T 세포 배지 중에 재현탁시켰다. PBMC를 단리 후에 바로 사용하였다.
PBMC를 8분 동안 37℃에서 1x106 세포/ mL의 세포 밀도로 ef450(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0842-85)으로 PBS 중에 희석된 2.5 μM의 최종 농도로 표지하였다. 그 후에, 세포를 2회 T 세포 배지로 세척하였다. 표지된 세포를 T-세포 배지 중에 37℃에서 30분 동안 휴지시켰다.
마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3-huFAP 클론 19 세포(실시예 4.3.2.2)를 세포 해리 완충액(인비트로겐, 카탈로그 번호 13151-014)을 사용하여 10분 동안 37℃에서 수거하였다. 세포를 1회 PBS로 세척하였다. 세포를 PBS 중에 107/ml로 재현탁시키고 선량 ao 5000 RAD까지 x-선 조사기로 조사하여 종양 세포주에 의한 인간 PBMC의 후기 과성장을 방지하였다. NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포를 밤새 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 셀 150)에서 웰 당 0.25*105 세포의 밀도로 96-웰 평저 부착 조직 배양 플레이트(TPP, 카탈로그 번호 92096)에서 T 세포 배지에 접종하였다.
16시간 후에, 인간 ef450 표지된 PBMC를 웰 당 0.75*105 세포의 밀도로 각각의 웰에 첨가하였다. 0.12 ng/ml의 최종 농도의 항-인간 CD3 항체(이바이오사이언스, 클론 OKT3, Ref: 16-0037-85) 및 FAP 표적화된 1가 및 2가 항-GITR 항원 결합 분자를 지시된 농도로 첨가하였다. 세포를 6일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 셀 150)에서 배양하였다. 이어서, 세포를 살아있는 것과 죽은 것의 차별을 위해 형광 지시 염료-접합된 항체 항-인간 CD4(클론 L200, 비디 파밍겐, 카탈로그 번호 550631), CD8(클론 RPa-T8, 바이오레전드, 카탈로그 번호 301044), CD25 (BC96, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302632) 및 좀비 아쿠아(바이오레전드, 카탈로그 번호 423102)로 표면-염색시키고 PBS 중에 희석시키고 30분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포를 140 μL/웰 FACS 완충액 + 10 μL/웰의 절대 계수 비드(카운트브라이트(CountBright), 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), C36950) 중에 재현탁시키고 5-레이저 포르테사 유세포 계수기(비디 바이오사이언스, 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
좀비 아쿠아 음성 살아있는 세포를 증식에 대한 마커로서 ef450의 중간 형광의 감소에 대해 분석하였다.
도 57A 및 57B에 나타낸 바와 같디, 비-표적화된 항-GITR(GITR 8A06 DP47GS 4+1 sf w(1a))(삼각형)에 의한 공자극은 최적이하로 TCR 자극된 CD4 CD8 T 세포의 증식 능력에 대한 영향을 갖지 않았다. 존재하는 NIH/3T3-huFAP 세포에 의한 FAP 표적화된 항-GITR 구축물(GITR 8A06 28H1 4+1 sf W(1))(원)의 초가교결합은 T 세포 공자극을 위해 필요하였고 명백히 증식을 촉진시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory TNF receptor <130> P33117-WO <140> PCT/EP2016/073198 <141> 2016-09-29 <150> EP15188809.6 <151> 2015-10-07 <160> 412 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His 1 5 10 15 Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln 20 25 30 Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val 35 40 45 Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly 50 55 60 Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg 65 70 75 80 Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp 85 90 95 Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala 100 105 110 Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln 115 120 125 Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro 130 135 140 Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro 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atgtgtccca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 840 gtggaagtgc acaatgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaactc cacctaccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gggagccccc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020 cagcctcgcg agcctcaggt gtacaccctg ccccctagca gagatgagct gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct cgtgaaaggc ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac 1200 ggctcattct tcctgtactc taagctgaca gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tccctgtctc ccgggggagg cggaggatct ggcggaggcg gatccggtgg tggcggatct 1380 gggggcggtg gatctgaggt gcagctgctg gaatctgggg gaggactggt gcagccaggc 1440 ggatctctga ggctgtcctg cgctgcttcc ggctttacct tctccagcca cgccatgagt 1500 tgggtgcgcc aggcacccgg aaaaggactg gaatgggtgt cagccatctg ggcctccggc 1560 gagcagtact acgccgatag cgtgaagggc cggttcacca tctctcggga taacagcaag 1620 aatactctgt acctgcagat gaactccctg cgcgctgaag ataccgctgt gtattactgc 1680 gccaagggct ggctgggcaa cttcgattac tggggccagg gaaccctcgt gactgtctcg 1740 agcgcttctg tggccgctcc ctccgtgttc atcttcccac cttccgacga gcagctgaag 1800 tccggcactg cctctgtcgt gtgcctgctg aacaacttct accctcggga agccaaggtg 1860 cagtggaaag tggataacgc cctgcagtcc ggcaactccc aggaatccgt gaccgagcag 1920 gactccaagg acagcaccta ctccctgagc agcaccctga ccctgtccaa ggccgactac 1980 gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaagtg acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc 2040 aagtccttca accggggcga gtgc 2064 <210> 194 <211> 688 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> (CLC-563) VHCH1-Heavy chain-(28H1) VHCL <400> 194 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu 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gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 1680 ctgggagccc ccatcgagaa aaccatcagc aaggccaagg gccagccccg cgaacctcag 1740 gtgtacaccc tgcccccaag cagggacgag ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1800 ctcgtgaagg gcttctaccc ctccgatatc gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc 1860 gagaacaact acaagaccac cccccctgtg ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac 1920 tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg 1980 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacaca cagaagtctc tgagcctgag ccctggcgga 2040 gggggaggat ctgggggagg cggaagtggg ggagggggtt ccggaggcgg cggatcagaa 2100 attgtgctga cccagtcccc cggcaccctg tcactgtctc caggcgaaag agccaccctg 2160 agctgtaggg cctcccagag cgtgtccaga agctatctgg cctggtatca gcagaagccc 2220 ggacaggccc ccagactgct gatcattggc gcctctacca gagccaccgg catccccgat 2280 agattcagcg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag actggaaccc 2340 gaggactttg ccgtgtacta ttgccagcag ggccaagtga tcccccccac ctttggccag 2400 ggaacaaagg tggaaatcaa gtccagcgct tccaccaagg gcccctcagt gttcccactg 2460 gcaccatcca gcaagtccac aagcggagga accgccgctc tgggctgtct cgtgaaagac 2520 tactttccag agccagtgac cgtgtcctgg aatagtggcg ctctgacttc tggcgtgcac 2580 actttccccg cagtgctgca gagttctggc ctgtactccc tgagtagcgt cgtgacagtg 2640 ccctcctcta gcctgggcac tcagacttac atctgcaatg tgaatcataa gccttccaac 2700 acaaaagtgg acaaaaaagt ggaacccaaa tcttgc 2736 <210> 225 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> (28H1) VHCL- light chain DNA <400> 225 gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180 gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240 cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300 ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcgtggcc 360 gctccctccg tgttcatctt cccaccttcc gacgagcagc tgaagtccgg caccgcttct 420 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 480 aacgccctgc agtccggcaa cagccaggaa tccgtgaccg agcaggactc caaggacagc 540 acctactccc tgtcctccac cctgaccctg tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 600 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagtc tttcaaccgg 660 ggcgagtgc 669 <210> 226 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> (49B4) VLCL*-light chain <400> 226 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Gln Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 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ccccctagca gagatgagct gaccaagaac caggtgtccc tgacctgtct cgtgaaaggc 1800 ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1860 aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac ggctcattct tcctgtactc taagctgaca 1920 gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc 1980 ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg tccctgtctc ccgggggagg cggaggatct 2040 ggcggaggcg gatccggtgg tggcggatct gggggcggtg gatctgaggt gcagctgctg 2100 gaatctgggg gaggactggt gcagccaggc ggatctctga ggctgtcctg cgctgcttcc 2160 ggctttacct tctccagcca cgccatgagt tgggtgcgcc aggcacccgg aaaaggactg 2220 gaatgggtgt cagccatctg ggcctccggc gagcagtact acgccgatag cgtgaagggc 2280 cggttcacca tctctcggga taacagcaag aatactctgt acctgcagat gaactccctg 2340 cgcgctgaag ataccgctgt gtattactgc gccaagggct ggctgggcaa cttcgattac 2400 tggggccagg gaaccctcgt gactgtctcg agcgcttctg tggccgctcc ctccgtgttc 2460 atcttcccac cttccgacga gcagctgaag tccggcactg cctctgtcgt gtgcctgctg 2520 aacaacttct accctcggga agccaaggtg cagtggaaag tggataacgc cctgcagtcc 2580 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caagcccagc 600 aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgt 639 <210> 409 <211> 918 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (8A06) VHCH1_VHCH1Fc VHCL (28H1) <400> 409 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 225 230 235 240 Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 245 250 255 Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 260 265 270 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 275 280 285 Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys 290 295 300 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 305 310 315 320 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Ala Ile Asp Tyr Trp 325 330 335 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 340 345 350 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 355 360 365 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 370 375 380 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 385 390 395 400 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 405 410 415 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 420 425 430 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 435 440 445 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 450 455 460 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 465 470 475 480 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 485 490 495 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 500 505 510 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 515 520 525 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 530 535 540 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 545 550 555 560 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 565 570 575 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 580 585 590 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 595 600 605 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 610 615 620 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 625 630 635 640 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 645 650 655 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 660 665 670 Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 675 680 685 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 690 695 700 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 705 710 715 720 Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 725 730 735 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln 740 745 750 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 755 760 765 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 770 775 780 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr 785 790 795 800 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala 805 810 815 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 820 825 830 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 835 840 845 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 850 855 860 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 865 870 875 880 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 885 890 895 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 900 905 910 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 915 <210> 410 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (28H1) VLCH1- light chain <400> 410 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 115 120 125 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 180 185 190 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 195 200 205 Glu Pro Lys Ser Cys 210 <210> 411 <211> 2772 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA (6C8) VHCH1_VHCH1Fc VHCL (28H1) <400> 411 caggtcacac tgagagagtc cggccctgcc ctggtcaagc ccacccagac cctgaccctg 60 acatgcacct tctccggctt ctccctgtcc acctccggca tgggcgtggg ctggatcaga 120 cagcctcctg gcaaggccct ggaatggctg gcccacattt ggtgggacga cgacaagtac 180 taccagccct ccctgaagtc ccggctgacc atctccaagg acacctccaa gaaccaggtg 240 gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgcccggacc 300 cggcggtact tcccctttgc ttattggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcgagcgct 360 tctaccaagg gccccagcgt gttccctctg gcccctagca gcaagagcac atctggcgga 420 acagccgccc tgggctgcct cgtgaaggac tactttcccg agcccgtgac agtgtcctgg 480 aactctggcg ccctgacaag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctcca gagcagcggc 540 ctgtactctc tgagcagcgt cgtgactgtg cccagcagca gcctgggaac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 660 agctgcgacg gcggaggcgg atctggcggc ggaggatccc aggtcacact gagagagtcc 720 ggccctgccc tggtcaagcc cacccagacc ctgaccctga catgcacctt ctccggcttc 780 tccctgtcca cctccggcat gggcgtgggc tggatcagac agcctcctgg caaggccctg 840 gaatggctgg cccacatttg gtgggacgac gacaagtact accagccctc cctgaagtcc 900 cggctgacca tctccaagga cacctccaag aaccaggtgg tgctgaccat gaccaacatg 960 gaccccgtgg acaccgccac ctactactgc gcccggaccc ggcggtactt cccctttgct 1020 tattggggcc agggcaccct ggtcaccgtc tcgagtgcta gcaccaaggg cccatccgtg 1080 ttccctctgg ccccttccag caagtctacc tctggcggca cagccgctct gggctgcctc 1140 gtgaaggact acttccccga gcctgtgaca gtgtcctgga actctggcgc cctgacatcc 1200 ggcgtgcaca cctttccagc tgtgctgcag tcctccggcc tgtactccct gtcctccgtc 1260 gtgacagtgc cctccagctc tctgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag 1320 ccctccaaca ccaaggtgga caagaaggtg gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc 1380 tgtccccctt gtcctgcccc tgaagctgct ggcggcccta gcgtgttcct gttcccccca 1440 aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 1500 gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 1560 aatgccaaga ccaagcctag agaggaacag tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg 1620 ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac 1680 aaggccctgg gagcccccat cgaaaagacc atctccaagg ccaagggcca gcctcgcgag 1740 cctcaggtgt acaccctgcc ccctagcaga gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg 1800 acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc 1860 cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc 1920 ctgtactcta agctgacagt ggacaagtcc cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc 1980 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgtctccc 2040 gggggaggcg gaggatctgg cggaggcgga tccggtggtg gcggatctgg gggcggtgga 2100 tctgaggtgc agctgctgga atctggggga ggactggtgc agccaggcgg atctctgagg 2160 ctgtcctgcg ctgcttccgg ctttaccttc tccagccacg ccatgagttg ggtgcgccag 2220 gcacccggaa aaggactgga atgggtgtca gccatctggg cctccggcga gcagtactac 2280 gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc tctcgggata acagcaagaa tactctgtac 2340 ctgcagatga actccctgcg cgctgaagat accgctgtgt attactgcgc caagggctgg 2400 ctgggcaact tcgattactg gggccaggga accctcgtga ctgtctcgag cgcttctgtg 2460 gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct tccgacgagc agctgaagtc cggcactgcc 2520 tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaagtg 2580 gataacgccc tgcagtccgg caactcccag gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac 2640 agcacctact ccctgagcag caccctgacc ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag 2700 gtgtacgcct gtgaagtgac ccaccagggc ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac 2760 cggggcgagt gc 2772 <210> 412 <211> 924 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (6C8) VHCH1_VHCH1Fc VHCL (28H1) <400> 412 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Gln Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser 225 230 235 240 Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr 245 250 255 Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile 260 265 270 Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp 275 280 285 Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Gln Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile 290 295 300 Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met 305 310 315 320 Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Arg Arg Tyr 325 330 335 Phe Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 340 345 350 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 355 360 365 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 370 375 380 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 385 390 395 400 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 405 410 415 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 420 425 430 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 435 440 445 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 450 455 460 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 465 470 475 480 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 485 490 495 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 500 505 510 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 515 520 525 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 530 535 540 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 545 550 555 560 Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 565 570 575 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 580 585 590 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 595 600 605 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 610 615 620 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 625 630 635 640 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 645 650 655 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 660 665 670 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 675 680 685 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 690 695 700 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 705 710 715 720 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala Met Ser 725 730 735 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile 740 745 750 Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 755 760 765 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 770 775 780 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp 785 790 795 800 Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 805 810 815 Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 820 825 830 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 835 840 845 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 850 855 860 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 865 870 875 880 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 885 890 895 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 900 905 910 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 915 920

Claims (41)

  1. (a) 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티,
    (b) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 모이어티, 및
    (c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인
    을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티 중 각각의 2개가, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 서로 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원이 OX40, 4-1BB 및 GITR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원이 OX40인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 모이어티 각각이
    (i) 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 VH 도메인; 및
    (iv) 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이
    (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (iii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (iv) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (v) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (vi) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
    (vii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 43 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 VH 도메인; 및
    (iv) 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 49 및 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) OX40에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원이 4-1BB인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 모이어티 각각이
    (i) 서열번호 249 및 서열번호 250으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) 서열번호 251 및 서열번호 252로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) 서열번호 253, 서열번호 254, 서열번호 255, 서열번호 256 및 서열번호 257로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 VH 도메인; 및
    (iv) 서열번호 258 및 서열번호 259로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (v) 서열번호 260 및 서열번호 261로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    (vi) 서열번호 262, 서열번호 263, 서열번호 264, 서열번호 265 및 서열번호 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 267, 서열번호 269, 서열번호 271, 서열번호 273 및 서열번호 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 268, 서열번호 270, 서열번호 272, 서열번호 274 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이
    (i) 서열번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (ii) 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (iii) 서열번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL,
    (iv) 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL, 또는
    (v) 서열번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL
    을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 267, 서열번호 269, 서열번호 271, 서열번호 273 및 서열번호 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 268, 서열번호 270, 서열번호 272, 서열번호 274 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    이중특이적 항원 결합 분자.
  19. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원이 GITR인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 모이어티 각각이 서열번호 371의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 373의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열번호 374의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 375의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 376의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 384의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH 및 서열번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제3항, 제9항 내지 제11항 및 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) GITR에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 각각이 서열번호 383의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 384의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    (ii) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 서열번호 51 또는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 VH, 및 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    이중특이적 항원 결합 분자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 4개의 모이어티가 Fab 단편이고, 이들 중 각각의 2개가, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 서로 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 Fab 단편의 VH 도메인에 융합되고, 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 Fab 단편이 CH1 도메인의 C-말단에서 공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 제4 Fab 단편의 VH 도메인에, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 불변 도메인 CH1에서 위치 147 및 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링), 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 1가인 이중특이적 항원 결합 분자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티가 VH 및 VL 도메인을 포함하고, VH 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 C-말단에 연결되고, VL 도메인이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 C-말단에 연결되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    공자극 TNF 수용체 계열 구성원에 대해 4가이고 표적 세포 항원에 대해 2가인 이중특이적 항원 결합 분자.
  31. 제1항 내지 제27항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  32. 제1항 내지 제27항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편 또는 크로스오버 Fab 단편 각각이 VH 또는 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  33. 제1항 내지 제27항 및 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모이어티가 VH-VL 크로스오버 Fab 단편이고 각각 VL 도메인의 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 C-말단에 융합되는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 것인, 이중특이적 항원 결합 분자.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  37. 제1항 내지 제34항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  38. 제1항 내지 제34항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) T 세포 반응을 자극하거나,
    (ii) 활성화된 T 세포의 생존을 지원하거나,
    (iii) 감염을 치료하거나,
    (iv) 암을 치료하거나,
    (v) 암의 진행을 지연시키거나,
    (vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존을 연장시키는 데
    사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  39. 제1항 내지 제34항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    암을 치료하는 데 사용하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  40. 제1항 내지 제34항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항원 결합 분자가 화학치료제, 방사선 및/또는 암 면역치료에 사용하기 위한 다른 제제와 조합으로 투여되는, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  41. 개체에게 효과량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제36항의 약학 조성물을 투여하여 종양 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 개체의 종양 세포 성장의 억제 방법.
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