CN109963871A - 具有激动活性的多价及多表位抗体以及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了对细胞表面受体具有激动剂活性的四价抗原结合复合物。在一些实施方案中,复合物包含相同细胞表面受体的多个表位的结合特异性。本文进一步提供了核酸、载体、宿主细胞、药物组合物和与其相关的产生方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月5日提交的美国临时申请系列号62/371,671号的优先权,其全部内容在此引入作为参考。
提交ASCII文本文件的序列表
以下提交的ASCII文本文件的内容以全文引用的方式并入本文中:序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名:146392037740SEQLIST.txt,记录日期:2017年8月4日,大小:353KB)。
技术领域
本发明涉及具有激动活性的多价及多表位抗原结合复合物以及其使用方法。
背景技术
功能性抗体和抗原结合复合物是治疗多种疾病的重要治疗选择。本领域需要从候选分子库中鉴定功能性抗体和抗原结合复合物,特别是那些具有激动活性的复合物的更好的方法。本领域还需要具有更强效激动活性的抗体和抗原结合复合物。本发明涉及这些需求和其他需求。
本文引用的所有专利和科学文献的公开内容以全文引用的方式并入本文。
发明内容
本发明提供具有激动活性的抗原结合复合物(例如多价及多表位抗体/抗原结合复合物)及其使用方法。
在一个方面中,本文提供具有激动活性的四价抗原结合复合物,该复合物包含:第一亚单位及第二亚单位,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一条包含:(i)第一半抗体(half-antibody),该第一半抗体包含第一抗体重链可变结构域(VH1)及第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该第一半抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位;及(ii)第二半抗体,该第二半抗体包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中该第二半抗体特异性结合该细胞表面受体的第二表位;其中该第一亚单位与该第二亚单位偶联,且其中该复合物对与该复合物结合的该细胞表面受体具有激动活性。在一些实施方案中,本公开的抗原结合复合物显示体外激动活性。在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位中的每一条包含:(i)该第一半抗体,其中该第一半抗体包含:(a)第一抗体重链,该第一抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、第一抗体重链CH2结构域及第一抗体重链CH3结构域;及(b)第一抗体轻链,该第一抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);以及(i)该第二半抗体,其中该第二半抗体包含:(a)第二抗体重链,该第二抗体重链从N端至C端包含该第二抗体重链可变结构域(VH2)、第二抗体重链CH1结构域、第二抗体重链CH2结构域及第二抗体重链CH3结构域;及(b)第二抗体轻链,该第二抗体轻链从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中,该第一亚单位与该第二亚单位化学偶联。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位中的每一条包含双特异性抗体,该双特异性抗体包含两个具有两个CH3结构域的抗体Fc区,这两个CH3结构域中的每一条包含杵(protuberance)或臼(cavity),且这两个CH3结构域中的第一个中的该杵或臼可分别放置在这两个CH3结构域中的第二个中的该臼或杵中。在一些实施方案中,这两个亚单位是通过接头化学偶联。在一些实施方案中,这两个亚单位中的每一条包含两条重链及两条轻链,且各亚单位的重链之一包含选自以下的重链半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。在一些实施方案中,这两个亚单位各自包含两条重链及两条轻链,且各亚单位的轻链之一包含选自以下的轻链半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。在一些实施方案中,这两个亚单位是通过点击化学反应而化学偶联。在一些实施方案中,这两个亚单位是通过四嗪反式环辛烯(TCO)点击反应(substantive examination)而偶联。在一些实施方案中,该接头的长度介于约与约之间。在一些实施方案中,该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。在一些实施方案中,该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。在一些实施方案中,这些亚单位中的每一个具有包含用于降低(attenuate)效应子功能的修饰的Fc区。在一些实施方案中,这些亚单位中的每一条包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的297;(b)人IgG1的Fc区中的234及235;(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;(d)人IgG2的Fc区中的234及237;(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;(f)人IgG4的Fc区中的228及236;(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及(l)人IgG1的Fc区中的267及328。在一些实施方案中,这些亚单位中的每一个具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的N297A;(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。在一些实施方案中,这些亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。在一些实施方案中,这些亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。在一些实施方案中,该细胞表面受体为选自以下的受体家族的成员:肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族及G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。在一些实施方案中,该细胞表面受体选自OX40、DR5、GITR、CD27、CD137及Tie2。在一些实施方案中,该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH2包含:(a)VH结构域,其包含(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在另一个方面中,本文提供一种具有激动活性的四价抗原结合复合物,其中该复合物包含:(a)抗体,该抗体包含两条抗体重链,各抗体重链包含第一抗体重链可变结构域(VH1);及两条抗体轻链,各抗体轻链包含第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位;及(b)与该抗体偶联的两条抗体Fab片段,其中这两条抗体Fab片段中的每一条包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中这两条抗体Fab片段中的每一个特异性结合该细胞表面受体的第二表位;其中该复合物对与该复合物结合的该细胞表面受体具有激动活性。在一些实施方案中,本发明的抗原结合复合物显示体外激动活性。在一些实施方案中,各抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、第一抗体重链CH2结构域及第一抗体重链CH3结构域;各抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);这两条抗体Fab片段中的每一条包含重链Fab片段,该重链Fab片段从N端至C端包含该第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体重链CH1结构域;且这两条抗体Fab片段中的每一条包含轻链Fab片段,该轻链Fab片段从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中,这两条抗体Fab片段的第一个与这两条抗体轻链的第一个或这两条抗体重链的第一个化学偶联,且这两条抗体Fab片段的第二个与这两条抗体轻链的第二个或这两条抗体重链的第二个化学偶联。在一些实施方案中,这两个Fab片段中的每一个通过接头与该抗体化学偶联。在一些实施方案中,该复合物包含:(i)第一接头,其接合该抗体的第一改造游离半胱氨酸与这两个Fab片段的第一个的经改造游离半胱氨酸;及(ii)第二接头,其接合该抗体的第二改造游离半胱氨酸与这两个Fab片段的第二个的经改造游离半胱氨酸。在一些实施方案中,该抗体的这两条抗体重链中的每一条包含独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。在一些实施方案中,该抗体的这两条抗体轻链中的每一条包含独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。在一些实施方案中,这两条抗体Fab片段中的每一条包含C端半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中,该抗体与这两条抗体Fab片段均通过点击化学反应而偶联。在一些实施方案中,该抗体与这两条抗体Fab片段均通过四嗪反式环辛烯(TCO)点击反应而偶联。在一些实施方案中,该接头的长度介于约与约之间。在一些实施方案中,该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。在一些实施方案中,该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。在一些实施方案中,这两条抗体Fab片段与该抗体遗传偶联;各抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、该第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域、抗体重链CH2结构域及抗体重链CH3结构域;且该复合物包含:第一抗体轻链,该第一抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);及第二抗体轻链,该第二抗体轻链从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中,该第一抗体轻链包含用于与该抗体重链的该第一抗体重链可变结构域(VH1)和/或该第一抗体重链CH1结构域的修饰正交配对(orthogonal pairing)的修饰,且该第二抗体轻链包含用于与该抗体重链的该第二重链可变结构域(VH2)及/或该第二重链CH1结构域的修饰正交配对的修饰。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代:(a)人IgG1的Fc区中的297;(b)人IgG1的Fc区中的234及235;(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;(d)人IgG2的Fc区中的234及237;(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;(f)人IgG4的Fc区中的228及236;(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及(l)人IgG1的Fc区中的267及328。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代:(a)人IgG1的Fc区中的N297A;(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一条包含用于降低效应子功能的修饰,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。在一些实施方案中,该细胞表面受体为选自以下的受体家族的成员:肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族及G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。在一些实施方案中,该细胞表面受体选自:OX40、DR5、GITR、CD27、CD137及Tie2。在一些实施方案中,该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在另一方面中,本文提供编码根据任意以上实施方案中的复合物的核酸。在一些实施方案中,该核酸包含编码该第一抗体重链的第一聚核苷酸、编码该第一抗体轻链的第二聚核苷酸、编码该第二抗体重链的第三聚核苷酸及编码该第二抗体轻链的第四聚核苷酸。在一些实施方案中,该核酸包含编码该抗体重链的第一聚核苷酸、编码该抗体轻链的第二聚核苷酸、编码该重链Fab片段的第三聚核苷酸及编码该轻链Fab片段的第四聚核苷酸。在一些实施方案中,该核酸包含第一聚核苷酸,其编码抗体重链,该抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、该第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域、抗体重链CH2结构域及抗体重链CH3结构域;第二聚核苷酸,其编码抗体轻链,该抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);及第三聚核苷酸,其编码抗体轻链,该抗体轻链从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。本文中进一步提供一种载体,其包含根据任意以上实施方案的核酸。在一些实施方案中,该载体为表达载体。本文中进一步提供一种宿主细胞,其包含根据任意以上实施方案的载体及/或根据任意以上实施方案的核酸。在一些实施方案中,该宿主细胞为原核细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞为真核细胞。本文中进一步提供一种产生四价抗原结合复合物的方法,该方法包括培养根据任意以上实施方案的宿主细胞,从而产生该复合物。在一些实施方案中,该方法进一步包括自该宿主细胞回收该复合物。
在另一方面中,本文提供一种药物组合物,该药物组合物包含根据任意以上实施方案的复合物及可药用载体。
在另一方面中,本文提供一种产生四价抗原结合复合物的方法,该四价抗原结合复合物对与该复合物结合的细胞表面受体具有激动活性,该方法包括:(a)提供:(i)第一半抗体,该第一半抗体包含第一抗体重链可变结构域(VH1)及第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该第一半抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位,且其中该第一半抗体包含第一改造游离半胱氨酸;及(ii)第二半抗体,该第二半抗体包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中该第二半抗体特异性结合该细胞表面受体的第二表位,其中该第一半抗体及该第二半抗体中的每一条包含具有CH3结构域的抗体Fc区,其中这两个CH3结构域中的每一条包含杵或臼,其中这两个CH3结构域中的第一个中的该杵或臼可分别放置在这两个CH3结构域中的第二个中的臼或杵中;(b)在体外组装该第一半抗体及该第二半抗体以形成第一亚单位;(c)提供:(iii)第三半抗体,该第三半抗体包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)及该第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该第三半抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位,且其中该第三半抗体包含第二改造游离半胱氨酸;及(iv)第四半抗体,该第四半抗体包含该第二抗体重链可变结构域(VH2)及该第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中该第四半抗体特异性结合该细胞表面受体的该第二表位,其中该第三半抗体及该第四半抗体中的每一条包含具有CH3结构域的抗体Fc区,其中这两个CH3结构域中的每一条包含杵或臼,其中这两个CH3结构域中的第一个中的该杵或臼可分别放置在这两个CH3结构域中的第二个中的臼或杵中;(d)在体外组装该第三半抗体及该第四半抗体以形成第二亚单位;及(e)使用该第一游离改造半胱氨酸及该第二游离改造半胱氨酸,使该第一亚单位与该第二亚单位通过接头偶联,从而产生该复合物。在一些实施方案中,本发明的抗原结合复合物显示体外激动活性。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。在一些实施方案中,该第一改造游离半胱氨酸及该第二改造游离半胱氨酸中的每一个为独立地选自以下的重链半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。在一些实施方案中,该第一改造游离半胱氨酸及该第二改造游离半胱氨酸中的每一个为独立地选自以下的轻链半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。在一些实施方案中,该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。在一些实施方案中,步骤(e)包括:(1)使这两个亚单位与该双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头反应;及(2)纯化该复合物。在一些实施方案中,纯化该复合物包括对该复合物进行大小排阻层析及/或阴离子交换层析。在一些实施方案中,该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的297;(b)人IgG1的Fc区中的234及235;(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;(d)人IgG2的Fc区中的234及237;(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;(f)人IgG4的Fc区中的228及236;(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及(l)人IgG1的Fc区中的267及328。在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的N297A;(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
在另一方面中,本文提供一种产生四价抗原结合复合物的方法,该四价抗原结合复合物对与该复合物结合的细胞表面受体具有激动活性,该方法包括:(a)提供抗体,该抗体包含两个半抗体,其中各半抗体具有包含第一抗体重链可变结构域(VH1)的抗体重链及包含第一抗体轻链可变结构域(VL1)的抗体轻链,其中该抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位,且其中这两个半抗体中的每一个包含第一改造游离半胱氨酸;(b)提供两条抗体Fab片段,其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中这两条抗体Fab片段中的每一个特异性结合该细胞表面受体的第二表位,且其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含第二改造游离半胱氨酸;及(c)使这些抗体Fab片段之一与这两个半抗体中的每一个通过接头偶联,从而产生该复合物。在一些实施方案中,本发明的抗原结合复合物显示体外激动活性。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。在一些实施方案中,该第一改造游离半胱氨酸为独立地选自以下各项的重链半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。在一些实施方案中,该第一改造游离半胱氨酸为独立地选自以下各项的轻链半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。在一些实施方案中,该第二改造游离半胱氨酸为C端半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中,该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。在一些实施方案中,步骤(c)包括:(i)使这两条抗体Fab片段中的每一个与双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头反应,以形成两个双马来酰亚氨基缀合的抗体Fab片段;(ii)移除过量双马来酰亚氨基PEG接头;(iii)使这两个双马来酰亚氨基缀合的抗体Fab片段中的每一个与该抗体反应,以形成该复合物;及(iv)纯化该复合物。在一些实施方案中,纯化该复合物包括对该复合物进行大小排阻层析及/或阴离子交换层析。在一些实施方案中,该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。在一些实施方案中,该抗体具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。在一些实施方案中,该抗体包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的297;(b)人IgG1的Fc区中的234及235;(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;(d)人IgG2的Fc区中的234及237;(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;(f)人IgG4的Fc区中的228及236;(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及(l)人IgG1的Fc区中的267及328。在一些实施方案中,该抗体具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的N297A;(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。在一些实施方案中,该抗体具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。在一些实施方案中,该抗体具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
在另一方面中,本文提供一种产生四价抗原结合复合物的方法,该四价抗原结合复合物对与该复合物结合的细胞表面受体具有激动活性,该方法包括:(a)在宿主细胞中表达两条抗体重链,其中各抗体重链从N端至C端包含第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域(CH11)、第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域(CH12)、抗体重链CH2结构域及抗体重链CH3结构域,其中各VH1及/或各CH11包含用于正交配对的第一修饰,其中各VH2及/或各CH12包含用于正交配对的第二修饰,且其中该第一修饰与该第二修饰不同;(b)在该宿主细胞中表达两个第一抗体轻链,其中这两个第一抗体轻链中的每一个从N端至C端包含第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL1),且其中该VL1及/或该CL1包含用于与该抗体重链的该第一修饰进行正交配对的修饰;及(c)在该宿主细胞中表达两个第二抗体轻链,其中这两个第二抗体轻链中的每一个从N端至C端包含第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL2),且其中该VL2及/或该CL2包含用于与该抗体重链的该第二修饰进行正交配对的修饰;其中该VH1及该VL1特异性结合该细胞表面受体的第一表位;其中该VH2及该VL2特异性结合该细胞表面受体的第二表位;且其中在该宿主细胞中表达后,这两条抗体重链结合,该两条重链中的每一个与第一抗体轻链通过正交配对而偶联,且该两条重链中的每一个与第二抗体轻链通过正交配对而偶联,从而产生该复合物。在一些实施方案中,该抗体重链的该第一修饰及该第二修饰中的每一个独立地选自VH-Q39K、VH-Q39E、CH1-S183E、CH1-S183K、CH1-A141I、CH1-F170S、CH1-S181M、CH1-S183A及CH1-V185A(EU编号)。在一些实施方案中,该第一抗体轻链及该第二抗体轻链的这些修饰中的每一个独立地选自VL-Q38E、VL-Q38K、CL-V133K、CL-V133E、CL-F116A、CL-L135V、CL-S174A、CL-S176F及CL-T178V(EU编号)。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。在一些实施方案中,该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。在一些实施方案中,各抗体重链具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。在一些实施方案中,各抗体重链包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的297;(b)人IgG1的Fc区中的234及235;(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;(d)人IgG2的Fc区中的234及237;(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;(f)人IgG4的Fc区中的228及236;(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及(l)人IgG1的Fc区中的267及328。在一些实施方案中,各抗体重链具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:(a)人IgG1的Fc区中的N297A;(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。在一些实施方案中,各抗体重链具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。在一些实施方案中,各抗体重链具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
在任意以上实施方案的一些实施方案中,该细胞表面受体为选自以下的受体家族的成员:肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族及G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。在任意以上实施方案的一些实施方案中,该细胞表面受体选自:OX40、DR5、GITR、CD27、CD137及Tie2。在任意以上实施方案的一些实施方案中,该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在任意以上实施方案的一些实施方案中,该VH2包含:(a)VH结构域,其包含(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在任意以上实施方案的一些实施方案中,该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在任意以上实施方案的一些实施方案中,该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明的抗原结合复合物在体外显示激动活性。
本文中也提供结合OX40且对OX40具有一种或多种本文所述的激动活性的抗原结合复合物(例如,四价及双表位抗原结合复合物)。
在一个方面中,本文提供一种对OX40具有激动活性的四价抗原结合复合物,该复合物包含四个结合OX40的抗原结合结构域,其中该四个抗原结合结构域中的每一个包含抗体重链可变(VH)结构域及抗体轻链可变(VL)结构域,其中该复合物包含一个或多个结合OX40的第一表位的抗原结合结构域及一个或多个结合OX40的第二表位的抗原结合结构域,且OX40的该第一表位与该第二表位不同。在一些实施方案中,该结合该第一表位的抗原结合结构域不与该结合该第二表位的抗原结合结构域交叉竞争结合OX40。
在一个方面中,本文提供一种对OX40具有激动活性的四价抗原结合复合物,该复合物包含四个结合OX40的抗原结合结构域,其中该四个抗原结合结构域中的每一个包含抗体重链可变(VH)结构域及抗体轻链可变(VL)结构域,其中该复合物包含一个或多个结合OX40的第一表位的抗原结合结构域及一个或多个结合OX40的第二表位的抗原结合结构域,且该结合该第一表位的抗原结合结构域不与该结合该第二表位的抗原结合结构域交叉竞争结合OX40。在一些实施方案中,该复合物包含两个结合该第一表位的抗原结合结构域及两个结合该第二表位的抗原结合结构域。
在一些实施方案中,该第一表位包含选自以下的一个或多个氨基酸残基:SEQ ID NO:281的114-119、124、126、127、129、130、132、140及142。在一些实施方案中,该第一表位包含SEQ ID NO:281的氨基酸残基114-119、124、126、127、129、130、132、140及142。在一些实施方案中,该结合OX40的第一表位的抗原结合结构域包含:(a)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQID NO:4的HVR-H3;及(b)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,结合OX40的该抗原结合结构域中该第一表位的该VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且结合OX40的该抗原结合结构域中该第一表位的该VL结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:57。在一些实施方案中,该第二表位包含选自以下的一个或多个氨基酸残基:SEQ IDNO:281的68-71、83-90、95及98。在一些实施方案中,该第二表位包含SEQ ID NO:281的氨基酸残基68-71、83-90、95及98。在一些实施方案中,该结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域包含:(a)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;及(b)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3。在一些实施方案中,结合OX40的该抗原结合结构域中该第二表位的该VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,且结合OX40的该抗原结合结构域中该第二表位的该VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:129。在一些实施方案中,该结合OX40的第一表位的抗原结合结构域包含:(a)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;及(b)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3;且该结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域包含:(c)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;及(d)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3。在一些实施方案中,结合OX40的该抗原结合结构域中该第一表位的该VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,结合OX40的该抗原结合结构域中该第一表位的该VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:57;结合OX40的该抗原结合结构域中该第二表位的该VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,且结合OX40的该抗原结合结构域中该第二表位的该VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:129。
在一些实施方案中,该复合物包含两条抗体重链多肽及两条抗体轻链多肽;其中这些抗体重链多肽中的每一个包含:VH1-L1-VH2-L2-CH1-铰链-CH2-CH3[I];其中这些抗体轻链多肽中的每一个包含:VL1-L3-VL2-L4-CL[II];其中这些抗体重链多肽中的每一个与一个抗体轻链多肽结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域且VH2与VL2形成抗原结合结构域;VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,CH3为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2、L3及L4为氨基酸接头。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,L2及L4的长度为0个氨基酸。在一些实施方案中,L1的长度介于0与20个氨基酸之间。在一些实施方案中,L1的这些氨基酸中有至少90%为甘氨酸及/或丝氨酸氨基酸。在一些实施方案中,L1包含选自以下的氨基酸序列:GGGGSG(SEQ ID NO:270)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:272)及GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:273)。在一些实施方案中,L3包含选自以下的氨基酸序列:GGSGG(SEQ ID NO:271)、GGGGSGGGGS(SEQID NO:272)及GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:274)。在一些实施方案中,L1包含氨基酸序列GGGGSG(SEQ ID NO:270),且L3包含氨基酸序列GGSGG(SEQ ID NO:271)。在一些实施方案中,L1及L3均包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:272)。在一些实施方案中,L1包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:273),且L3包含氨基酸序列GGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:274)。在一些实施方案中,L1包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列。在一些实施方案中,L1包含氨基酸序列ASTKGP(SEQ ID NO:275)或ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:277)。在一些实施方案中,L3包含氨基酸序列RTVAAP(SEQ ID NO:276)或RTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:278)。在一些实施方案中,L1包含氨基酸序列ASTKGP(SEQ ID NO:275),且L3包含氨基酸序列RTVAAP(SEQ ID NO:276)。在一些实施方案中,L1包含氨基酸序列ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:277),且L3包含氨基酸序列RTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:278)。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,VL1包含氨基酸序列SEQ IDNO:129,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128或290,VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56、284或285,且VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或287。在上述任意复合物中的,VH1、VH2、VL1及/或VL2具有包含表4及表5中所列出的序列中的一个或多个的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:240,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:241;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:242,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:243;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ IDNO:250,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:251;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:252,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:253;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:254,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:255;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:256,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:257;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:258,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:259;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:260,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:261;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:262,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:263;这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQID NO:264,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:265;或这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:266,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ IDNO:267。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:240,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:241;或这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:242,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:243。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,重链多肽的C端赖氨酸可能不存在或已移除。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:242或291,且这两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:243。
在一些实施方案中,该复合物包含两条抗体重链多肽及四个抗体轻链多肽;其中这些抗体重链多肽中的每一个包含:VH1-L1-(CH1)x-L2-VH2-L3-(CH1)y-铰链-CH2-CH3[III];其中该四个抗体轻链多肽中有两个包含:VL1-(CL)x[IV];且其中该四个抗体轻链多肽中有两个包含:VL2-(CL)y[V];其中这些抗体重链多肽中的每一个与一个包含式[IV]的轻链多肽结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域且与一个包含式[V]的轻链多肽结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;且VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,(CL)x及(CL)y为抗体轻链恒定结构域,(CH1)x及(CH1)y为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,CH3为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2及L3为氨基酸接头。在一些实施方案中,该复合物在VH1、VL1、(CH1)x或(CL)x中包含一个或多个促进VH1与VL1形成抗原结合结构域的氨基酸取代;及/或在VH2、VL2、(CH1)y或(CL)y中包含一个或多个促进VH2与VL2形成抗原结合结构域的氨基酸取代。在一些实施方案中,该复合物包含以下氨基酸取代对中的一个或多个:VH1中的Q39K取代及VL1中的Q38E取代,根据Kabat进行编号;VH2中的Q39K取代及VL2中的Q38E取代,根据Kabat进行编号;VH1中的Q39E取代及VL1中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;VH2中的Q39E取代及VL2中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;(CH1)x中的S183E取代及(CL)x中的V133K取代,根据EU指数进行编号;(CH1)x中的S183K取代及(CL)x中的V133E取代,根据EU指数进行编号;(CH1)y中的S183E取代及(CL)y中的V133K取代,根据EU指数进行编号;以及(CH1)y中的S183K取代及(CL)y中的V133E取代,根据EU指数进行编号。在一些实施方案中,该复合物包含以下各组氨基酸取代中的一个或多个:VH1中的Q39K取代及VL1中的Q38E取代,以及VH2中的Q39E取代及VL2中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;VH2中的Q39K取代及VL2中的Q38E取代,以及VH1中的Q39E取代及VL1中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;(CH1)x中的S183E取代及(CL)x中的V133K取代,以及(CH1)y中的S183K取代及(CL)y中的V133E取代,根据EU指数进行编号;或(CH1)y中的S183E取代及(CL)y中的V133K取代,以及(CH1)x中的S183K取代及(CL)x中的V133E取代,根据EU指数进行编号。在一些实施方案中,该复合物包含:VH1中的Q39K取代及VL1中的Q38E取代,以及VH2中的Q39E取代及VL2中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;以及(CH1)x中的S183E取代及(CL)x中的V133K取代,以及(CH1)y中的S183K取代及(CL)y中的V133E取代,根据EU指数进行编号;或VH2中的Q39K取代及VL2中的Q38E取代,以及VH1中的Q39E取代及VL1中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;及或(CH1)y中的S183E取代及(CL)y中的V133K取代,以及(CH1)x中的S183K取代及(CL)x中的V133E取代,根据EU指数进行编号。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,L2包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列。在一些实施方案中,L2包含氨基酸序列DKTHT(SEQ ID NO:268)或DKTHTGGGGSGG(SEQID NO:269)。在一些实施方案中,L1及L3的长度为0个氨基酸。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQID NO:42的HVR-L3;VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128或290,VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH1包含氨基酸序列SEQ IDNO:56、284或285,且VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或287。在上述任意复合物中的,VH1、VH2、VL1及/或VL2具有包含表4及表5中所列出的序列中的一个或多个的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:244或292,这两个包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ IDNO:245,且这两个包含式[V]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:246;或这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:247或293,这两个包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:248,且这两个包含式[V]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:249。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,重链多肽的C端赖氨酸可能不存在或已移除。
在一些实施方案中,该复合物包含:第一抗体重链多肽,其包含:VH1-L1-CH1-L2-VH1-L3-CH1-铰链-CH2-(CH3)x[VI];两个第一抗体轻链多肽,其各自包含:VL1-CL[VII];第二抗体重链多肽,其包含:VH2-L7-CH1-L8-VH2-L9-CH1-铰链-CH2-(CH3)y[VIII];及两个第二抗体轻链多肽,其各自包含:VL2-CL[IX];其中该第一抗体重链多肽与两个包含式[VII]的第一抗体轻链多肽结合,以便各VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中该第二抗体重链多肽与两个包含式[IX]的第二抗体轻链多肽结合,以便各VH2与VL2形成抗原结合结构域;且VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,(CH3)x及(CH3)y为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2、L3、L7、L8及L9为氨基酸接头。在一些实施方案中,(CH3)x包含杵或臼,(CH3)y包含杵或臼,且(CH3)x的杵或臼可位于(CH3)y的杵或臼中。在一些实施方案中,(CH3)x包含T366Y取代且(CH3)y包含Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含T366W取代且(CH3)y包含Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含F405A取代且(CH3)y包含T394W取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含Y407T取代且(CH3)y包含T366Y取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含T366Y及F405A取代且(CH3)y包含T394W及Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含T366W及F405W取代且(CH3)y包含T394S及Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含F405W及Y407A取代且(CH3)y包含T366W及T394S取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含F405W取代且(CH3)y包含T394S取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366Y取代且(CH3)x包含Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366W取代且(CH3)x包含Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含F405A取代且(CH3)x包含T394W取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含Y407T取代且(CH3)x包含T366Y取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366Y及F405A取代且(CH3)x包含T394W及Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366W及F405W取代且(CH3)x包含T394S及Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含F405W及Y407A取代且(CH3)x包含T366W及T394S取代,根据EU指数进行编号;或(CH3)y包含F405W取代且(CH3)x包含T394S取代,根据EU指数进行编号。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,L2及L8均包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列。在一些实施方案中,L2及L8均包含选自以下的相同氨基酸序列:DKTHT(SEQ ID NO:268)及DKTHTGGGGSGG(SEQ ID NO:269)。在一些实施方案中,L1、L3、L7及L9的长度为0个氨基酸。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQID NO:42的HVR-L3;VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL2包含氨基酸序列SEQID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128或290,VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56、284或285,且VL1包含氨基酸序列SEQID NO:57或287。在上述任意复合物中的,VH1、VH2、VL1及/或VL2具有包含表4及表5中所列出的序列中的一个或多个的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3。
在一些实施方案中,该复合物具有包含与两条抗体轻链结合的两条抗体重链的抗体,及两条抗体Fab片段;其中该抗体的这些抗体重链中的每一个包含:VH1-CH1-铰链-CH2-CH3[X];其中该抗体的这些抗体轻链中的每一个包含:VL1-CL[VII];其中这些抗体Fab片段中的每一个包含:重链片段,其包含:VH2-CH1[XI];及轻链,其包含:VL2-CL[IX];其中这些抗体重链中的每一个与这些抗体轻链之一结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中这些抗体Fab片段中的每一个包含与一个包含式[IX]的轻链片段结合的一个包含式[XI]的重链片段,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;这些抗体Fab片段中的每一个通过接头L1与该抗体的这些抗体重链之一或这些抗体轻链之一偶联;且VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且CH3为抗体第三重链恒定结构域。在一些实施方案中,这些L1接头中的每一个为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。在一些实施方案中,该PEG接头包含介于一个与十一个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含一个、两个或三个PEG亚单位。在一些实施方案中,这些L1接头中的每一个使这些抗体重链之一或这些抗体轻链之一的第一经改造游离半胱氨酸与这些抗体Fab片段之一的第二经改造游离半胱氨酸偶联。在一些实施方案中,该第一经改造游离半胱氨酸为该抗体重链中独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。在一些实施方案中,该第一经改造游离半胱氨酸为该抗体轻链中独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。在一些实施方案中,该第二经改造游离半胱氨酸为C端半胱氨酸残基。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ IDNO:33的HVR-H3;VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH2具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,VL1包含氨基酸序列SEQID NO:129,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128或290,VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56、284或285,且VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或287。在上述任意复合物中的,VH1、VH2、VL1及/或VL2具有包含表4及表5中所列出的序列中的一个或多个的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:232,该抗体的这些抗体轻链中的每一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:237,这些抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:239的重链片段,且这些抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:231的轻链片段。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:230或294,该抗体的这些抗体轻链中的每一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:236,这些抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:238的重链片段,且这些抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:233的轻链片段。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,重链多肽的C端赖氨酸可能不存在或已移除。
在一些实施方案中,该复合物包含两条抗体,其中这些抗体中的每一个包含:第一抗体重链,其包含:VH1-CH1-铰链-CH2-(CH3)x[X];第一抗体轻链,其包含:VL1-CL[VII];第二抗体重链,其包含:VH2-CH1-铰链-CH2-(CH3)y[XII];及第二抗体轻链,其包含:VL2-CL[IX];其中该第一抗体重链与该第一抗体轻链结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中该第二抗体重链与该第二抗体轻链结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中这两条抗体是通过接头L1偶联;且VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且(CH3)x及(CH3)y为抗体第三重链恒定结构域。在一些实施方案中,(CH3)x包含杵或臼,(CH3)y包含杵或臼,且(CH3)x的杵或臼可位于(CH3)y的杵或臼中。在一些实施方案中,(CH3)x包含T366Y取代且(CH3)y包含Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含T366W取代且(CH3)y包含Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含F405A取代且(CH3)y包含T394W取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含Y407T取代且(CH3)y包含T366Y取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含T366Y及F405A取代且(CH3)y包含T394W及Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含T366W及F405W取代且(CH3)y包含T394S及Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含F405W及Y407A取代且t(CH3)y包含T366W及T394S取代,根据EU指数进行编号;(CH3)x包含F405W取代且(CH3)y包含T394S取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366Y取代且(CH3)x包含Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366W取代且(CH3)x包含Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含F405A取代且(CH3)x包含T394W取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含Y407T取代且(CH3)x包含T366Y取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366Y及F405A取代且(CH3)x包含T394W及Y407T取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含T366W及F405W取代且(CH3)x包含T394S及Y407A取代,根据EU指数进行编号;(CH3)y包含F405W及Y407A取代且(CH3)x包含T366W及T394S取代,根据EU指数进行编号;或(CH3)y包含F405W取代且(CH3)x包含T394S取代,根据EU指数进行编号。在一些实施方案中,该L1接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。在一些实施方案中,该PEG接头包含介于一个与十一个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含一个、两个或三个PEG亚单位。在一些实施方案中,该L1接头使这两条抗体中第一个的第一经改造游离半胱氨酸与这两条抗体中第二个的第二经改造游离半胱氨酸偶联。在一些实施方案中,该第一经改造游离半胱氨酸或该第二经改造游离半胱氨酸中的至少一个为独立地选自以下的重链半胱氨酸残基:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。在一些实施方案中,该第一经改造游离半胱氨酸或该第二经改造游离半胱氨酸中的至少一个为独立地选自以下的轻链半胱氨酸残基:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQID NO:42的HVR-L3;VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL2包含氨基酸序列SEQID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128或290,VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56、284或285,且VL1包含氨基酸序列SEQID NO:57或287。在上述任意复合物中的,VH1、VH2、VL1及/或VL2具有包含表4及表5中所列出的序列中的一个或多个的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3。
在一些实施方案中,该复合物包含第一抗体,该第一抗体包含两条抗体重链及两条抗体轻链,该第一抗体的这两条抗体重链中的每一个包含:VH1-CH1-铰链-CH2-CH3[X];且该第一抗体的这两条抗体轻链中的每一个包含:VL1-CL[VII];及第二抗体,该第二抗体包含两条抗体重链及两条抗体轻链,该第二抗体的这两条抗体重链中的每一个包含:VH2-CH1-铰链-CH2-CH3[XII];且该第二抗体的这两条抗体轻链中的每一个包含:VL2-CL[IX];该第一抗体的这些抗体重链中的每一个与该第一抗体的这些抗体轻链之一结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中该第二抗体的这些抗体重链中的每一个与该第二抗体的这些抗体轻链之一结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;该第一抗体及该第二抗体是通过接头L1偶联;且VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且CH3为抗体第三重链恒定结构域。在一些实施方案中,该L1接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。在一些实施方案中,该PEG接头包含介于一个与十一个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含一个、两个或三个PEG亚单位。在一些实施方案中,该L1接头使这两条抗体中第一个的第一经改造游离半胱氨酸与这两条抗体中第二个的第二经改造游离半胱氨酸偶联。在一些实施方案中,该第一经改造游离半胱氨酸或该第二经改造游离半胱氨酸中的至少一个为独立地选自以下的重链半胱氨酸残基:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。在一些实施方案中,该第一经改造游离半胱氨酸或该第二经改造游离半胱氨酸中的至少一个为独立地选自以下的轻链半胱氨酸残基:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中,VH1与VL1形成结合OX40的该第二表位的抗原结合结构域,且VH2与VL2形成结合OX40的该第一表位的抗原结合结构域。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或288的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或289的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或282的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或283的HVR-H3;且VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或286的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128或290,VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56、284或285,且VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或287。在上述任意复合物中的,VH1、VH2、VL1及/或VL2具有包含表4及表5中所列出的序列中的一个或多个的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3。
在任意以上实施方案中的一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQID NO:128,VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且VL1包含氨基酸序列SEQID NO:57。
在任意以上实施方案中的一些实施方案中,该复合物包含一个或多个包含选自SEQ IDNO:279及295-297的序列的CL结构域。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,该复合物包含一个或多个包含选自SEQ ID NO:298-303的序列的CH1-铰链-CH2-CH3区。在任意以上实施方案中的一些实施方案中,本文所述的任意复合物中的CL、CH1、铰链、CH2或CH3结构域中的一个或多个可包括一个或多个氨基酸取代。
在任意以上实施方案中的一些实施方案中,该复合物具有包含用于降低效应子功能的修饰的抗体Fc区。在一些实施方案中,该复合物包含在选自以下的一个或多个氨基酸位置(EU编号)上包含氨基酸取代的抗体Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的297;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328。
在一些实施方案中,该复合物具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的抗体Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
在一些实施方案中,该复合物具有包含用于降低效应子功能的修饰的抗体Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。在一些实施方案中,该复合物具有包含用于降低效应子功能的修饰的抗体Fc区,该修饰不会消除该Fc区的糖基化。
本文中进一步提供一种或多种聚核苷酸,其编码任意以上实施方案中的复合物的一种或多种多肽。本文中进一步提供一种或多种载体,其包含任意以上实施方案中的一种或多种聚核苷酸。本文中进一步提供一种或多种宿主细胞,其包含任意以上实施方案中的一种或多种聚核苷酸或任意以上实施方案中的一种或多种载体。本文中进一步提供一种药物制剂,其包含任意以上实施方案中的复合物及可药用载体。
本文中进一步提供一种治疗患有癌症的个体的方法,其包括对该个体施用有效量的任意以上实施方案中的复合物。在一些实施方案中,该方法进一步包括对该个体施用其他治疗剂。在一些实施方案中,该其他治疗剂包含化学治疗剂。在一些实施方案中,该其他治疗剂包含PD-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中,该癌症为卵巢上皮癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌(包括铂敏感性及铂抗性卵巢癌)、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、输卵管癌、腹膜癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌及各种类型的头颈癌,以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞性NHL、高级小无核裂细胞NHL、大体积疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤;及沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病;移植后淋巴增生性障碍(PTLD),或与斑痣性错构瘤相关的异常血管增殖、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)及梅格斯综合征(Meigs’syndrome),包括其他癌症的转移性形式。在一些实施方案中,该癌症为膀胱上皮癌(uBC)、黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肾癌或膀胱癌。
应理解,可组合本文所述的各种实施方案的一种、一些或所有性质,以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些及其他方面对本领域技术人员是显而易见的。通过以下详细描述来进一步描述本发明的这些及其他实施方案。
图1显示分析型大小排阻层析(aSEC)层析谱,其显示相对于单表位抗体,双表位1A7/3C8抗OX40抗体能够在靶抗原存在下促进高阶复合物。
图2说明可用于构建本文所述的新颖抗体形式的抗体元件。
图3A及图3B显示本发明的例示性抗体形式。提供针对以下各项的示意性说明:偶联IgG-IgG(c:IgG-IgG),其中两个全长IgG偶联(例如化学偶联);偶联Fab-IgG(c:Fab-IgG),其中两个Fab偶联(例如化学偶联)至全长IgG;重组Fab-IgG(r:Fab-IgG),其中额外一组Fab臂重组融合至IgG;及重组Fv-IgG(r:Fv-IgG),其中额外一组Fv区重组融合至IgG。针对各形式说明单表位形式(上列),其中所有四个可变区结合靶抗原上的相同表位,及双表位形式(下列),其中两个可变区结合一个表位且其他可变区结合靶抗原上的不同的表位。抗体之间或抗体与Fab片段之间的线表示接头,且星形表示接头化学偶联(例如在抗体或Fab片段的经改造半胱氨酸处)的连接点。
图4描绘根据一些实施方案的双表位c:IgG-IgG形式的第一种形式。
图5描绘根据一些实施方案的双表位c:IgG-IgG形式的第二种形式。
图6描绘根据一些实施方案的双表位c:Fab-IgG形式。
图7描绘根据一些实施方案的双表位r:Fv-IgG形式。
图8描绘根据一些实施方案的双表位r:Fab-IgG形式的第一种形式。
图9描绘根据一些实施方案的双表位r:Fab-IgG形式的第二种形式。
图10显示抗OX40或对照抗体在抗CD3抗体及CD80+FcγRIIa+L细胞存在下共刺激CD4+记忆T细胞增殖。通过(Promega)来监测T细胞增殖。所有组均包括抗CD3。偶联IgG包括单表位1A7_hIgG1(N297G)-BM(PEG)2-1A7_hIgG1(N297G)及双表位1A7/3C8_hIgG1(N297G)-BM(PEG)3-1A7/3C8_hIgG1(N297G)。
图11显示抗OX40或对照抗体在抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞存在下共刺激CD4+记忆T细胞增殖。通过(Promega)来监测T细胞增殖。偶联IgG包括单表位1A7_hIgG1(N297G)-BM(PEG)3-1A7_hIgG1(N297G)、单表位3C8_hIgG1(N297G)-BM(PEG)3-3C8_hIgG1(N297G)及双表位1A7/3C8_hIgG1(N297G)-BM(PEG)3-1A7/3C8_hIgG1(N297G)。此分析中的L细胞为FcγRII+但缺少CD80。四种对照为L细胞、L细胞+抗CD3、L细胞+T细胞及L细胞+T细胞+抗CD3。除非指出,否则所有测试抗体均包括抗CD3("-αCD3)。
图12显示关于偶联Fab-IgG 1A7/3C8及1A7(N297G)/3C8的SEC-MALS数据。
图13显示抗OX40或对照抗体在抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞存在下共刺激CD4+记忆T细胞增殖。通过(Promega)来监测T细胞增殖。此分析中的L细胞为FcγRII+但缺少CD80。四种对照为L细胞、L细胞+抗CD3、L细胞+T细胞及L细胞+T细胞+抗CD3。所有测试抗体均包括抗CD3。偶联Fab-IgG形式为两个3C8Fab通过BM(PEG)3接头与1A7_hIgG1(K149C)偶联。
图14显示抗OX40或对照抗体在抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞存在下共刺激CD4+记忆T细胞增殖。通过(Promega)来监测T细胞增殖。此分析中的L细胞为FcγRII+但缺少CD80。四种对照为L细胞、L细胞+抗CD3、L细胞+T细胞及L细胞+T细胞+抗CD3。所有测试抗体均包括抗CD3。偶联Fab-IgG形式为两个3C8Fab通过BM(PEG)3接头与1A7_hIgG1(K149C/N297G)偶联。
图15显示使用具有荧光素酶报道基因的表达OX40的Jurkat细胞时,抗OX40天然(1A7)及重组Fv-IgG单表位(1A7-1A7及3C8-3C8)及双表位(1A7-3C8及3C8-1A7)抗体的激动活性。
图16显示抗OX40天然(1A7)或r:Fv-IgG抗体在抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞存在下共刺激CD4+记忆T细胞增殖。通过CellTiter-(Promega)来监测T细胞增殖。此分析中的L细胞为FcγRII+但缺少CD80。四种对照为L细胞、L细胞+抗CD3、L细胞+T细胞及L细胞+T细胞+抗CD3。所有测试抗体均包括抗CD3。
图17显示r:Fab-IgG 3C8-1A7抗OX40抗体与天然IgG1抗体相比的SEC-MALS数据,如所标记。
图18显示r:Fab-IgG 1A7-3C8抗OX40抗体与天然IgG1抗体相比的SEC-MALS数据,如所标记。
图19显示使用具有荧光素酶报道基因的表达OX40的Jurkat细胞时,抗OX40天然重组Fab-IgG单表位(1A7-1A7及3C8-3C8)及双表位(1A7-3C8及3C8-1A7)抗体的激动活性。
图20显示抗OX40天然(1A7)或r:Fab-IgG抗体在抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞存在下共刺激CD4+记忆T细胞增殖。通过 (Promega)来监测T细胞增殖。此分析中的L细胞为FcγRII+但缺少CD80。四种对照为L细胞、L细胞+抗CD3、L细胞+T细胞及L细胞+T细胞+抗CD3。所有测试抗体均包括抗CD3。
图21显示抗OX40抗体在抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞存在下共刺激CD4+记忆T细胞增殖。左图显示r:Fv-IgG的IgG1形式的结果,而右图显示r:Fv-IgG的IgG1LALAPG形式的结果。所包括的r:Fv-IgG为3C8-1A7、1A7-3C8、3C8-3C8及1A7-1A7。该图的左图及右图上的IgG11A7是指1A7抗体的人IgG1形式。
图22显示抗OX40对照以及r:Fab-IgG及r:Fv-IgG抗体在表达OX40的Jurkat细胞荧光素酶报道基因分析中的激动活性。r:Fab-IgG(左图)及r:Fv-IgG(右图)包括双表位(1A7-3C8及3C8-1A7)形式以及单表位1A7-1A7形式。二价IgG1对照包括1A7、3C8及二价双表位抗体1A7/3C8。在这些分析中,所有重链恒定区均为人IgG1。
图23显示抗OX40对照以及cIgG-IgG及c:Fab-IgG抗体在表达OX40的Jurkat细胞荧光素酶报道基因分析中的激动活性。c:IgG-IgG(左图)及c:Fab-IgG(右图)包括双表位形式(c:IgG-IgG 1A7/3C8-1A7/3C8及c:Fab-IgG 1A7-3C8)以及单表位1A7-1A7形式。二价IgG1对照包括1A7、3C8及二价双表位抗体1A7/3C8。在这些分析中,所有重链恒定区均为人IgG1。
图24显示对照及四价双表位抗OX40抗体在表达OX40的Jurkat细胞荧光素酶报道基因分析中的激动活性。在这些分析中,所有重链恒定区均为人IgG1。
图25显示双表位r:Fv-IgG 1A7-3C8(黑色)及单表位r:Fv-IgG 1A7-1A7(灰色)在单独(实线)及与标靶OX40的复合物形式时(虚线)的大小排阻层析(SEC)层析谱。洗脱时间愈早,蛋白质尺寸愈大。
图26显示SEC柱洗脱后多角度光散射(MALS)数据的结果。Y轴体现抗体/OX40复合物的尺寸(KDa)。单表位形式显示为灰色柱条,双表位形式显示为空心白色柱条。
图27显示抗OX40r:Fv-IgG及r:Fab-IgG抗体形式在C.B-17SCID小鼠中的药物动力学(PK)。包括IgG1 1A7及IgG1抗gD作为对照。
图28显示抗OX40c:Fab-IgG及c:IgG-IgG抗体形式在C.B-17SCID小鼠中的PK。包括IgG11A7及IgG1抗gD作为对照。
图29显示抗OX40r:Fv-IgG、r:Fab-IgG、c:Fab-IgG及c:IgG-IgG抗体形式在C57BL-6小鼠中的PK。包括IgG1 1A7作为对照。
图30显示在人OX40敲入(hOX40ki)小鼠中比较r:Fv-IgG 1A7-3C8与1A7及3C8的IgG1形式的KLH免疫PD实验的结果。左图显示所检测的抗KLH IgG的水平,且右图显示CD4T细胞扩增百分比。显示比较r:Fv-IgG与IgG1 1A7的p值。
图31显示在hOX40ki小鼠中比较r:Fv-IgG 1A7-3C8与1A7及3C8的IgG1形式的KLH免疫PD实验的结果。左图显示引流淋巴结中的CD8+T细胞的总数,且右图显示细胞总数。显示比较r:Fv-IgG与IgG1 1A7的p值。
图32显示在hOX40ki小鼠中比较r:Fv-IgG 1A7-3C8与1A7及3C8的IgG1形式的KLH免疫PD实验的结果。该图显示用KLH对经纯化的CD4+T细胞进行离体再刺激之后的干扰素γ(IFN-γ)释放。显示比较r:Fv-IgG与IgG1 1A7的p值。
图33显示在hOX40ki小鼠中比较抗OX40双表位r:Fv-IgG、r:Fab-IgG及c:Fab-IgG抗体形式以及1A7及3C8的IgG1形式的KLH免疫PD实验的结果。左图显示引流淋巴结中的CD4T细胞的总数,且右图显示CD8T细胞总数。显示如所指示来比较四价双表位形式与IgG1 3C8(“相对于3C8”)、IgG1 1A7(“相对于1A7”)及对照IgG1抗gD(“相对于对照”)的三个p值。星号数目表示p值如下:*<0.05,**<0.005,***<0.0005,*<0.00005。
图34显示抗体在雌性hOX40ki C57BL/6小鼠的同基因(syngeneic)E.G7-OVA(表达EL4的鸡卵清蛋白(OVA))淋巴瘤肿瘤模型中的抗肿瘤活性。测试物品包括四价双表位r:Fv-IgG3C8-1A7、IgG1 1A7及同种型对照IgG1抗gD。
图35显示OX40与1A7及3C8Fab之间的三元复合物的结晶结构。突出显示OX40受体的160位上的N连接型糖基化。
图36显示基于三元复合物结构的人OX40序列,其突出显示1A7的结合表位(灰色方框)及3C8的结合表位(黑色轮廓方框)。显示SEQ ID NO:281的残基29-214。
图37显示所测试的IgG及r:Fv-IgG抗体在OX40+Jurkat细胞荧光素酶报道基因分析中的激动活性。在这些分析中,所有重链恒定区均为人IgG1。
图38显示r:Fv-IgG的经改造接头变体及1A7人IgG1(1A7)对照抗体在原代人T细胞分析(左图)及OX40+Jurkat细胞荧光素酶报道基因分析(右图)中的OX40激动活性。原代细胞分析包括CD4+记忆T细胞、抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞。GS(长)、GS(中)、GS(短)、肘弯(长)及肘弯(短)是指如实施例16中所描述的r:Fv-IgG 3C8-1A7的接头变体。
图39显示IgG1及r:Fv-IgG形式的高及低亲和力变体形式的亲和力的图。H对应于高(较低KD、较强亲和力),且L对应于低(较高KD、较弱亲和力)变体。括号指出3C8Fv及/或1A7Fv在亲和力方面是增高或是降低。例如,3C8(H)/1A7(L)对应于r:Fv-IgG 3C8-1A7,其中3C8Fv具有较强亲和力(N31I/K64L变体)且其中1A7Fv具有较弱亲和力(P96A变体),相对于r:Fv-IgG3C8-1A7亲本。
图40显示r:Fv-IgG的经改造亲和力变体以及1A7人IgG1(1A7)及3C8人IgG1(3C8)对照抗体在原代人T细胞分析(左图)及OX40+Jurkat细胞荧光素酶报道基因分析(右图)中的OX40激动活性。原代细胞分析包括CD4+记忆T细胞、抗CD3抗体及FcγRIIa+L细胞。高对应于较强亲和力(较低KD)且低对应于较弱亲和力(较高KD)变体,相对于r:Fv-IgG 3C8-1A7亲本。括号指出3C8Fv及/或1A7Fv在亲和力方面是增高或是降低。例如,3C8(高)-1A7(低)对应于r:Fv-IgG 3C8-1A7,其中3C8Fv具有较强亲和力(N31I/K64L变体)且其中1A7Fv具有较弱亲和力(P96A变体),相对于r:Fv-IgG 3C8-1A7亲本。
图41显示抗DR5抗体的IgG1、双表位IgG1及双表位r:Fab-IgG形式对HT-29细胞的胱冬酶8活性。在50nM浓度下测试抗体。drozitumab(Drozitumab)缩写为Droz。IgG1抗体包括drozitumab、13E3、3H3、4D9及11H12。二价双表位IgG1抗体包括IgG1Droz-4D9、IgG113E3-3H3及IgG1 11H12-4D9。r:Fab-IgG包括四价单表位r:Fab-IgG 4D9-4D9及r:Fab-IgG Droz-Droz以及四价双表位r:Fab-IgG Droz-4D9、r:Fab-IgG 13E3-3H3及r:Fab-IgG 11H12-4D9。
图42显示抗DR5抗体的IgG1、双表位IgG1及双表位r:Fab-IgG形式对HT-29细胞的剂量-反应胱冬酶8活性。drozitumab缩写为Droz。IgG1抗体包括IgG1Droz及IgG1 4D9。二价双表位IgG1抗体包括IgG1Droz-4D9。r:Fab-IgG包括四价单表位r:Fab-IgG 4D9-4D9及r:Fab-IgG Droz-Droz以及四价双表位r:Fab-IgG Droz-4D9。
图43显示抗DR5抗体的IgG1、双表位IgG1及双表位r:Fab-IgG形式对HT-29细胞的剂量-反应抗增殖活性。drozitumab缩写为Droz。IgG1抗体包括IgG1Droz及IgG1 4D9。二价双表位IgG1抗体包括IgG1Droz-4D9。r:Fab-IgG包括四价单表位r:Fab-IgG 4D9-4D9及r:Fab-IgGDroz-Droz以及四价双表位r:Fab-IgG Droz-4D9。
图44显示抗DR5抗体的IgG1、双表位IgG1及双表位r:Fab-IgG形式对Colo205细胞的剂量-反应胱冬酶8活性。drozitumab缩写为Droz。IgG1抗体包括IgG1Droz及IgG1 4D9。二价双表位IgG1抗体包括IgG1Droz-4D9。r:Fab-IgG包括四价单表位r:Fab-IgG 4D9-4D9及r:Fab-IgG Droz-Droz以及四价双表位r:Fab-IgG Droz-4D9。
图45显示抗DR5抗体的IgG1、双表位IgG1及双表位r:Fab-IgG形式对Colo205细胞的剂量-反应抗增殖活性。drozitumab缩写为Droz。IgG1抗体包括IgG1Droz及IgG1 4D9。二价双表位IgG1抗体包括IgG1Droz-4D9。r:Fab-IgG包括四价单表位r:Fab-IgG 4D9-4D9及r:Fab-IgG Droz-Droz以及四价双表位r:Fab-IgG Droz-4D9。
I.定义
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换用于指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可为线性或分枝的,其可包含经修饰的氨基酸,且其可能间杂非氨基酸。该术语也涵盖经天然或通过干预加以修饰的氨基酸聚合物;该干预为例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他处理或修饰,例如与标记组分或毒素结合。该定义也包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。如本文所用的术语“多肽”及“蛋白质”明确涵盖抗体。
术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段,只要其展现期望的抗原结合活性即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)与抗体在本文中可互换使用。
抗体为具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子,所有结构均基于免疫球蛋白折叠。例如,IgG抗体具有经二硫键结合以形成功能性抗体的两个“重”链及两个“轻”链。各重链及轻链本身包含“恒定”(C)区及“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性,而C区在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中提供结构支持及功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性为抗体特异性结合特定抗原的能力。
术语“可变”是指可变结构域的某些部分在抗体之间的序列差异很大,并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并非均匀分布在抗体的结构域中。其集中于轻链及重链可变结构域两者中称为高变区的三个区段中。可变结构域中更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR,主要采用β-片层构型,通过三个高变区连接,其形成连接β-折叠结构的环,并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区由FR紧密地保持在一起,并且来自另一条链的高变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但表现出多种效应子功能,例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列具有高变性(“互补性决定区”或“CDR”)及/或形成结构确定的环(“高变环”)及/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)的各区域。通常,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3),且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的例示性HVR包括:
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)处的高变环(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991));
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));及
(d)(a)、(b)及/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的结构域残基。结构域的FR一般由4个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3及FR4。因此,HVR及FR序列一般按以下顺序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其“抗原结合区”。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段;双抗体;串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如美国专利第5,641,870号实施例2;Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995));单臂抗体、单可变结构域抗体、微抗体、单链抗体分子;由抗体片段形成的多特异性抗体(例如,包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、二-scFv、双-scFv或串联(二,三)-scFv);及双特异性T细胞衔接子(engager)(BiTE)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,各自具有单一抗原结合位点,及一个残余“Fc”片段,其名称体现其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”为最小抗体片段,其含有完整抗原识别及结合位点。此区域由一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域紧密非共价结合的二聚体组成。在此构型中,各可变结构域的三个高变区相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之,该六个高变区赋予该抗体抗原结合特异性。然而,即使单一可变结构域(或仅包含三个抗原特异性高变区的半Fv)也具有识别并结合抗原的能力,但亲和力低于整个结合位点。
该Fab片段也含有该轻链的恒定结构域及该重链的第一恒定结构域(CHI)。Fab’片段与Fab片段的不同的处在于,在重链CHI结构域的羧基端处加入数个残基,包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH为本文中用于恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段起初产生为成对Fab’片段,在其之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也为已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定结构域的氨基酸序列而分配为称为κ(kappa)及λ(lambda)的两种截然不同的类型的一。
视其重链恒定结构域的氨基酸序列而定,抗体可分配至不同的类别。有五种主要完整抗体类别:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且这些中的若干种可进一步分成亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构及三维构型众所周知。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH及VL结构域,其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中,Fv多肽进一步包含位于VH与VL结构域之间的多肽接头,其使得该scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述,参见Pliickthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编著,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,这些片段包含与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用因过短而不允许在相同链上的两个结构域之间进行配对的接头,这些结构域被迫与另一链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双抗体更充分描述于例如以下文献中:EP 404,097;WO 93/11161;及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Set USA 90:6444-6448(1993)。
术语“多特异性抗体”以最广泛意义使用,且明确涵盖具有多表位特异性的抗体。这种多特异性抗体包括但不限于包含重链可变结构域(VH)及轻链可变结构域(VL)的抗体,其中VHVL亚单位具有多表位特异性;具有两个或多个VL及VH结构域的抗体,其中各VHVL亚单位结合不同的表位的情况下;具有两个或多个单一结构域的抗体,其中各单一结构域结合不同的表位;全长抗体;抗体片段,例如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、三重功能性抗体、已共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同标靶上的两个或多个不同的表位的能力。“单特异性”是指仅结合一个表位的能力。根据一个实施方案,该多特异性抗体为以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合各表位的IgG抗体。
表述“单可变结构域抗体”(sdAb)或“单结构域(SVD)抗体”一般是指单一可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换言之,该单结构域不需要与另一结构域相互作用以便识别靶抗原。单可变结构域抗体的实例包括来源于骆驼(羊驼及骆驼)及软骨鱼(例如须鲨)的单可变结构域抗体及由重组方法来源于人及小鼠抗体的单可变结构域抗体(Nature(1989)341:544-546;Dev Comp Immunol(2006)30:43-56;Trend Biochem Sci(2001)26:230-235;Trends Biotechnol(2003):21:484-490;WO 2005/035572;WO 03/035694;FebsLett(1994)339:285-290;WO 00/29004;WO 02/051870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即,构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位,除了产生单克隆抗体期间可能出现的可能变体除外,这种变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外,单克隆抗体的优点还在于它们不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的,并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如,根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人,Nature 256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备,或者可以通过重组DNA方法(参见,例如,美国专利No.4,816,567)制备。例如,也可使用Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)及Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而该链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们表现出所需的生物活性(美国专利号4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体,其包含衍生自非人灵长类动物(例如,旧世界猴,例如狒狒,恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
用于本文目的的“受体人框架”是包含衍生自如下文所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与其相同的氨基酸序列,或其可含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中,氨基酸改变的数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中,VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”是代表选择的人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列是来自于结构域序列的亚组。通常,序列亚组为如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中,对于VL,该亚组为如Kabat等人,同上中的亚组κI。在一个实施方案中,对于VH,该亚组为如Kabat等人,同上中的亚组III。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下,人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自于受体高变区的残基由具有期望的特异性、亲和力及容量(caapacity)的来自于例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的高变区的残基取代。在一些情况下,人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应非人残基取代。此外,人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常,人源化抗体将包含基本上所有至少一个且通常两个可变结构域,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白序列的高变环,且所有或基本上所有FR为人免疫球蛋白序列的FR,但如以上所指出的FR取代除外。人源化抗体任选地包含免疫球蛋白恒定区,通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步细节,参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的抗体相对应的氨基酸序列,或源自利用人抗体库(repertoires)或其他人抗体编码序列的非人源的氨基酸序列的人抗体。人抗体的这种定义特异性地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
在一些实施方案中,抗体“效应子功能(effector function)”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性,并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC);Fc受体结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用;下调细胞表面受体。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞)识别靶细胞上所结合的抗体且随后引起靶细胞裂解。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中。为了评定目的分子的ADCC活性,可进行体外ADCC分析,例如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中所描述。适用于这些分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及天然杀伤(NK)细胞。或者,或另外,可在体内,例如在例如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Set(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中评定目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”为表达一种或多种FcR且执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中,这些细胞至少表达FcγRIII且进行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞及嗜中性粒细胞;其中优选PBMC及NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下裂解标靶的能力。补体活化途径由补体系统的第一组分(Clq)与分子(例如多肽(例如抗体))跟同源抗原的复合物结合而引发。为了评定补体活化,可进行CDC分析,例如,如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施方案中,FcR为天然序列人FcR。
此外,优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR,包括FcγRI,FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(活化受体)和FcγRIIB(抑制受体),其具有主要在其细胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于以下文献中:Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994);以及deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR,包括有待将来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn,其负责将亲本IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976);及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
如本文所用的术语“Fc区”通常是指包含免疫球蛋白重链的C-端多肽序列的二聚体复合物,其中C-端多肽序列是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体获得的序列。Fc区可包含天然或变体Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可能不同,但人IgG重链Fc序列通常被定义为从大约Cys226位置的氨基酸残基或从大约位置Pro230延伸到Fc序列的羧基端。除非本文另有说明,否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述的EU编号系统,也称为EU指数来进行。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两个恒定结构域,CH2结构域和CH3结构域,并且任选包含CH4结构域。本文中的“Fc多肽”是指组成Fc区的多肽之一,例如单体Fc。Fc区可以从任何合适的免疫球蛋白获得,例如IgG1IgG2,IgG3或IgG4亚型,IgA,IgE,IgD或IgM。Fc区包含通过二硫键维持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定;该区域也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。在一些实施方案中,Fc多肽包含野生型铰链序列的一部分或全部(通常在其N端)。在一些实施方案中,Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。
“修饰的Fc区”或“Fc变体”包含通过至少一个氨基酸修饰,优选一个或多个氨基酸取代而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地,与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比,修饰的Fc区在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代,例如,约1-10个氨基酸取代,优选约1-5个氨基酸取代。本文中的修饰的Fc区优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80%的同源性,最优选与其具有至少约90%的同源性,更优选与其具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同源性。
如本文所用的术语“激动剂”、“激动作用”或“促效”一般是指结合细胞表面上的受体且能够引发/模拟/刺激与该受体的天然配体所引发模拟/刺激的反应或活性类似或相同的反应或活性的结合分子(例如抗原结合多肽或抗原结合复合物)。在例示性实施方案中,如本文所述的激动剂能够诱导/加强/增强/刺激与该受体相关的信号转导途径的活化。
除非另外指示,否则如本文所用的术语“细胞表面受体”是指来自于任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,例如灵长类(例如人)及囓齿动物(例如小鼠及大鼠)的任何天然细胞表面受体。该术语涵盖“全长”未处理细胞表面受体以及由在细胞中进行处理而产生的任何形式的细胞表面受体。该术语也涵盖天然存在的细胞表面受体变体,例如剪接变体或等位基因变体。
术语“癌症”及“癌”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性及恶性癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。这些癌症的更特定实例包括卵巢上皮癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌(包括铂敏感性及铂抗性卵巢癌)、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、输卵管癌、腹膜癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌及各种类型的头颈癌,以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、大体积疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤及沃尔登斯特伦巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病及移植后淋巴增生性障碍(PTLD),以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增殖、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)及梅格斯综合征。
“亲和力成熟”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个变化的抗体,与不具有这些改变的亲本抗体相比,这些改变引起该抗体对抗原的亲和力的提高。
药剂,例如药物制剂的“有效量”是指在必需的剂量及时间段下有效达到期望的治疗或预防结果的量。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“整抗体”在本文中可互换用于指结构基本上类似于天然抗体结构或重链含有如本文中所定义的Fc区的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”及“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指已引入外源核酸的细胞,包括这些细胞之后代。宿主细胞包括“转形株”及“转化细胞”,其包括原代转化细胞及由其衍生的子代,不考虑继代次数。子代在核酸内容方面可能与亲本细胞不完全一致,而是可能含有突变。本文中包括具有与针对原始转化细胞所筛选或选择者相同的功能或生物活性的突变子代。
在本文中,除非另外指示,否则结构域中的HVR残基及其他残基(例如,FR残基)是根据Kabat等人,同上进行编号。
“个人”或“个体”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如,牛、绵羊、猫、狗及马)、灵长类动物(例如,人及非人灵长类动物,例如猴)、兔及囓齿动物(例如,小鼠及大鼠)。在某些实施方案中,该个人或个体为人。
“经分离的”抗体为已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95%或99%纯度,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或逆相HPLC)所测定。关于用于评定抗体纯度的方法的综述,参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“经分离的”核酸是指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。经分离的核酸包括一般含有该核酸分子但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置的细胞中所含有的核酸分子。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体为由经二硫键键合的两个一致轻链及两个一致重链构成的约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白。从N端至C端,各重链具有可变区(VH,也称为可变重链可变结构域或重链可变结构域),然后以三个恒定结构域(CH1、CH2及CH3)。类似地,从N端至C端,各轻链具有可变区(VL,也称为可变轻链可变结构域或轻链可变结构域),然后以恒定轻链(CL)结构域。抗体轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列而分配为称为κ(kappa)及λ(lambda)的两种类型的一。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定义为在将序列对准并且在必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比,且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后,候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行的比对可用在本领域技术人员能力范围内的多种方式,例如使用公开可获得的计算机软件,例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来达到。本领域技术人员可确定适用于比对序列的参数,包括在所比较的序列的全长上达到最大程度的对准所需的任何算法。然而,用于本文目的的使用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生氨基酸序列同一性%值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写,且原始码已与用户文件一起提交至美国著作权局(WashingtonD.C.,20559),登记在美国著作权登记号TXU510087的下。ALIGN-2程序公开可得自Genentech,Inc.(South San Francisco,California),或可由原始码编译。应对ALIGN-2程序进行编译以用于UNIX操作系统,包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不做变化。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下,如下计算给定氨基酸序列A针对、与或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性%(其可替代地表述为给定氨基酸序列A针对、与或相对于给定氨基酸序列B具有或包含某一氨基酸序列同一性%):100×分数X/Y其中X为由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A与B比对中评分为一致匹配的氨基酸残基数,且其中Y为B中的氨基酸残基总数。应了解,若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等,则A相对于B的氨基酸序列同一性%将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性%。除非另外明确陈述,否则本文中所使用的所有氨基酸序列同一性%值均如前一段中所描述,使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指呈允许其中所含有的活性成分的生物活性有效的形式且不含对将施用该制剂的个体具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。
“可药用载体”是指药物制剂中除活性成分以外对个体无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用的术语“载体”是指能够使其所连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括呈自复制核酸结构以及并入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体形式的载体。某些载体能够指导与其有效连接的核酸的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。
II.具有激动活性的抗原结合复合物
本文提供具有激动活性的抗原结合复合物,例如四价抗原结合复合物。本文中描述并说明本发明的抗原结合复合物的各种构型,其中不同的形式包括单表位及双或多表位形式(参见例如图3A及图3B)。如本文中所说明,用对细胞表面受体具有激动活性的四价抗原结合复合物靶向该细胞表面受体引起强受体活化。此外,本发明的一个令人惊讶的发现为用对细胞表面受体具有激动活性的抗原结合复合物(例如四价抗原结合复合物)靶向该细胞表面受体的多个表位引起受体介导的信号传导的协同增加(例如,与用相等数目的抗原结合部分仅靶向单一表位相比)。重要的是,本发明显示抗体中在呈单价形式时已显示激动活性的抗原结合区(例如抗体CDR及/或结构域)在用于本文所述的多价双表位形式中时,显示更强的激动活性。例示性抗原结合复合物形式如下文所描述。
在一些实施方案中,本发明的抗原结合复合物(例如四价抗原结合复合物)包含两个亚单位。在一些实施方案中,各亚单位包含抗体。在一些实施方案中,该抗体为双特异性抗体。例如,在一些实施方案中,各亚单位包含第一半抗体,该第一半抗体包含第一抗体重链可变结构域(VH1)及第一抗体轻链可变结构域(VL1),及第二半抗体,该第二半抗体包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2)。如本文中所使用,“半抗体”可指与单一抗体重链配对的单一抗体轻链。
在一些实施方案中,该第一半抗体包含第一抗体重链,该第一抗体重链从N端至C端包含偶联的该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、第一抗体重链CH2结构域及第一抗体重链CH3结构域;及第一抗体轻链,该第一抗体轻链从N端至C端包含偶联的该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中,该第二半抗体包含第二抗体重链,该第二抗体重链从N端至C端包含偶联的该第二抗体重链可变结构域(VH2)、第二抗体重链CH1结构域、第二抗体重链CH2结构域及第二抗体重链CH3结构域;及第二抗体轻链,该第二抗体轻链从N端至C端包含偶联的该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。
在一些实施方案中,复合物包含第一抗体,该第一抗体包含两条抗体重链及两条抗体轻链,其中该第一抗体的这两条抗体重链中的每一个包含:VH1-CH1-铰链-CH2-CH3[X];且其中该第一抗体的这两条抗体轻链中的每一个包含:VL1-CL[VII];及第二抗体,该第二抗体包含两条抗体重链及两条抗体轻链,其中该第二抗体的这两条抗体重链中的每一个包含:VH2-CH1-铰链-CH2-CH3[XII];且其中该第二抗体的这两条抗体轻链中的每一个包含:VL2-CL[IX];其中该第一抗体的这些抗体重链中的每一个与该第一抗体的这些抗体轻链之一结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中该第二抗体的这些抗体重链中的每一个与该第二抗体的这些抗体轻链之一结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中该第一抗体及该第二抗体是通过接头L1偶联;且其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且CH3为抗体第三重链恒定结构域。
在一些实施方案中,这些亚单位的一个或两个均包含特异性结合(例如,细胞表面受体的)一个表位的第一半抗体(例如VH1及VL1)及特异性结合(例如,相同细胞表面受体的)不同的表位的第二半抗体(例如VH2及VL2)。在一些实施方案中,这些亚单位的一个或两个均包含特异性结合(例如,细胞表面受体的)一个表位的第一半抗体(例如VH1及VL1)及特异性结合相同表位的第二半抗体(例如VH2及VL2)。在一些实施方案中,该第一半抗体与该第二半抗体偶联,例如,如本文所述(包括但不限于化学或遗传偶联,例如利用本发明的接头偶联)。如本文中所使用,“不同的”表位可指与另一表位部分或完全不重叠的表位。本文中将该抗原结合复合物的一种例示性构型描述并说明为“c:IgG-IgG”形式(参见例如图3A及图3B)。
在一些实施方案中,复合物包含两条抗体,其中这些抗体中的每一个包含:第一抗体重链,其包含:VH1-CH1-铰链-CH2-(CH3)x[X];该第一抗体重链与第一抗体轻链结合,该第一抗体轻链包含:VL1-CL[VII];及第二抗体重链,其包含:VH2-CH1-铰链-CH2-(CH3)y[XII];该第二抗体重链与第二抗体轻链结合,该第二抗体轻链包含:VL2-CL[IX];其中这些第一抗体重链中的每一个与这些第一抗体轻链之一结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中这些第二抗体重链中的每一个与这些第二抗体轻链之一结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中这两条抗体是通过接头L1偶联;且其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且(CH3)x及(CH3)y为抗体第三重链恒定结构域。
在一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH结构域包含与SEQ ID NO:56或128具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL结构域包含与SEQ ID NO:57或129具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争分析法中阻断参考抗体与其抗原结合达50%以上的抗体,且相反,参考抗体在竞争分析法中阻断该抗体与其抗原结合达50%以上。本文提供例示性竞争分析法。
在一些实施方案中,本发明的抗原结合复合物(例如四价抗原结合复合物)包含抗体及与该抗体偶联的两个或多个抗体Fab片段。在一些实施方案中,该抗体包含两条抗体重链及两条抗体轻链。在一些实施方案中,该复合物包括两条抗体Fab片段(参见例如图3A及图3B)。在一些实施方案中,这些抗体重链的一个或两个均包含第一抗体重链可变结构域(VH1)。在一些实施方案中,这些抗体轻链的一个或两个均包含第一抗体轻链可变结构域(VL1)。
在一些实施方案中,各抗体重链从N端至C端包含偶联的该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、第一抗体重链CH2结构域及第一抗体重链CH3结构域。在一些实施方案中,各抗体轻链从N端至C端包含偶联的该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中,这两条抗体Fab片段中的每一个包含重链Fab片段,该重链Fab片段从N端至C端包含偶联的该第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体重链CH1结构域。在一些实施方案中,这两条抗体Fab片段中的每一个包含轻链Fab片段,该轻链Fab片段从N端至C端包含偶联的该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。
在一些实施方案中,该抗体特异性结合本发明的细胞表面受体的表位。在一些实施方案中,这些抗体Fab片段之一个或两个均包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2)。在一些实施方案中,这些抗体Fab片段之一个或两个均特异性结合相同细胞表面受体中与该抗体所结合的不同的表位。在一些实施方案中,这些抗体Fab片段之一个或两个均特异性结合该细胞表面受体中与该抗体所结合者相同的表位。在一些实施方案中,该复合物对与该复合物结合的该细胞表面受体具有激动活性。
在一些实施方案中,这两个Fab片段与该抗体化学偶联,例如,利用本发明的接头。在一些实施方案中,这两个Fab片段与该抗体遗传偶联,例如,利用本发明的多肽接头。
在一些实施方案中,这两个Fab片段中的每一个与该抗体的不同的重链或轻链偶联。本文中将该抗原结合复合物的一种例示性构型描述并说明为“c:Fab-IgG”形式(参见例如图3A及图3B)。本文描述了Fab片段可以与抗体重链或轻链偶联的多种构型,包括遗传或化学偶联,以及使用本公开的多种接头。在一些实施方案中,超过两个Fab片段与该抗体偶联。
在一些实施方案中,这两个Fab片段例如通过产生分别包含超过一个VH或VL结构域的抗体重链及/或轻链而与该抗体遗传偶联。
在一些实施方案中,复合物具有包含与两条抗体轻链结合的两条抗体重链的抗体,及两条抗体Fab片段;其中该抗体的这些抗体重链中的每一个包含:VH1-(CH1)x-铰链-CH2-CH3[X];其中该抗体的这些抗体轻链中的每一个包含:VL1-(CL)x[VII];其中这些抗体Fab片段中的每一个包含:重链片段,其包含:VH2-(CH1)y[XI];及轻链,其包含:VL2-(CL)y[IX];其中这些抗体重链中的每一个与这些抗体轻链之一结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中这些抗体Fab片段中的每一个包含与一个包含式[IX]的轻链片段结合的一个包含式[XI]的重链片段,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中这些抗体Fab片段中的每一个通过接头L1与该抗体的这些抗体重链的一或这些抗体轻链的一偶联;且其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,(CL)x及(CL)y为抗体轻链恒定结构域,(CH1)x及(CH1)y为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且CH3为抗体第三重链恒定结构域。
在一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH结构域包含与SEQ ID NO:56或128具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL结构域包含与SEQ ID NO:57或129具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个包含与SEQ ID NO:232具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,该抗体的这些抗体轻链中的每一个包含与SEQ ID NO:237具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,这些抗体Fab片段中的每一个具有包含与SEQ ID NO:239具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列的重链片段,且这些抗体Fab片段中的每一个具有包含与SEQ ID NO:231具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列的轻链片段。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个包含与SEQ ID NO:230具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,该抗体的这些抗体轻链中的每一个包含与SEQ ID NO:236具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,这些抗体Fab片段中的每一个具有包含与SEQ ID NO:238具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列的重链片段,且这些抗体Fab片段中的每一个具有包含与SEQ IDNO:233具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列的轻链片段。在一些实施方案中,该抗体的这些抗体重链中的每一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:230或294,该抗体的这些抗体轻链中的每一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:236,这些抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:238的重链片段,且这些抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:233的轻链片段。
本文中将该抗原结合复合物的一种例示性构型描述并说明为“r:Fab-IgG”形式(参见例如图3A及图3B)。涵盖各种构型,包括单表位及双或多表位形式。例如,在一些实施方案中,该抗体重链从N端至C端包含第一重链可变结构域(VH1)、第一重链CH1结构域、第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域、重链CH2结构域、重链CH3结构域及任选的(例如,对于IgM或IgE抗体)重链CH4结构域。在一些实施方案中,该抗体轻链从N端至C端包含第一轻链可变结构域(VL1)、第一轻链恒定结构域(例如VK或VL)、第二轻链可变结构域(VL2)及第二轻链恒定结构域(例如VK或VL)。在一些实施方案中,该第一重链可变结构域(VH1)及该第一轻链可变结构域(VL1)识别细胞表面受体的第一表位,且该第二重链可变结构域(VH2)及该第二轻链可变结构域(VL2)识别该细胞表面受体的相同表位。在一些实施方案中,该第一重链可变结构域(VH1)及该第一轻链可变结构域(VL1)识别细胞表面受体的第一表位,且该第二重链可变结构域(VH2)及该第二轻链可变结构域(VL2)识别相同细胞表面受体的不同的表位。在一些实施方案中,这两个Fab片段通过表达从N端至C端包含第一重链可变结构域(VH1)、第一重链CH1结构域、第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域、重链CH2结构域、重链CH3结构域及任选的(例如,对于IgM或IgE抗体)、重链CH4结构域的抗体重链且与该抗体一起共表达(或在体外组装)从N端至C端包含第一轻链可变结构域(VL1)及第一轻链恒定结构域(CL)的第一轻链(例如,VK或VL)及从N端至C端包含第二轻链可变结构域(VL2)及第二轻链恒定结构域(CL)的第二轻链(例如VK或VL)而与该抗体偶联。因而,该抗原结合复合物包含两个修饰重链,每一个具有两个与其偶联的独特轻链。
对适合产生r:Fab-IgG抗原结合复合物的技术的描述可见于例如国际专利公开第WO/2010/145792号中。本发明的一个令人惊讶的发现为多表位r:Fab-IgG抗原结合复合物在Jurkat T细胞及原代T细胞系统中均显示优良激动活性(参见图19及图20)。
在一些实施方案中,该第一抗体轻链包含用于与该抗体重链的第一修饰正交配对的修饰,且该第二抗体轻链包含用于与该抗体重链的第二修饰正交配对的修饰。例如,VH1及VL1中的每一个及/或CH1及CL中的每一个可包括正交变体对的同源修饰,使得该抗体的VH1及VH2结构域各自与其各自轻链VL结构域偶联。在一些实施方案中,该第一抗体轻链的VL1结构域包含用于与该抗体重链的VH1结构域的修饰正交配对的修饰。在一些实施方案中,该第一抗体轻链的CL结构域包含用于与该抗体重链的第一CH1结构域的修饰正交配对的修饰。在一些实施方案中,该第二抗体轻链的VL2结构域包含用于与该抗体重链的VH2结构域的修饰正交配对的修饰。在一些实施方案中,该第二抗体轻链的CL结构域包含用于与该抗体重链的第二CH1结构域的修饰正交配对的修饰。用于促进这种配对的例示性正交变体对描述于PCT/US2016/028850中,并且可包括但不限于具有变体对VH-Q39K/VL-Q38E或VH Q39E/VLQ38K的VH/VL区(Kabat编号);具有变体对CH1-S183E/CL-V133K或CH1-S183K/CL-V133E的CH1/CL区(EU编号);或选自CH1A141I、F170S、S181M、S183A、V185A以及CL F116A、L135V、S174A、S176F及T178V的变体(EU编号)。
在一些实施方案中,本发明的复合物包含两条抗体重链多肽及四个抗体轻链多肽;其中这些抗体重链多肽中的每一个包含:VH1-L1-(CH1)x-L2-VH2-L3-(CH1)y-铰链-CH2-CH3[III];其中该四个抗体轻链多肽中有两个包含:VL1-(CL)x[IV];且其中该四个抗体轻链多肽中有两个包含:VL2-(CL)y[V];其中这些抗体重链多肽中的每一个与一个包含式[IV]的轻链多肽结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域且与一个包含式[V]的轻链多肽结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;且其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,(CL)x及(CL)y为抗体轻链恒定结构域,(CH1)x及(CH1)y为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,CH3为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2及L3为氨基酸接头。在一些实施方案中,该复合物在VH1、VL1、(CH1)x或(CL)x中包含一个或多个促进VH1与VL1形成抗原结合结构域的氨基酸取代;及/或在VH2、VL2、(CH1)y或(CL)y中包含一个或多个促进VH2与VL2形成抗原结合结构域的氨基酸取代。参见例如国际公开第WO2016172485号及实施例6。例如,例示性取代包括但不限于VH-Q39K/VL-Q38E或VH Q39E/VL Q38K(Kabat编号)、CH1-S183E/CL-V133K或CH1-S183K/CL-V133E(EU编号);CH1A141I、F170S、S181M、S183A、V185A;及CL F116A、L135V、S174A、S176F及T178V(EU编号)。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含与SEQ ID NO:244具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,这两个包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含与SEQ ID NO:245具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,且这两个包含式[V]的抗体轻链多肽均包含与SEQ ID NO:246具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:244或292,这两个包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQID NO:245,且这两个包含式[V]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:246。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含与SEQ ID NO:247具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,这两个包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含与SEQ ID NO:248具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列,且这两个包含式[V]的抗体轻链多肽均包含与SEQID NO:249具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:247或293,这两个包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:249,且这两个包含式[V]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:248。
在一些实施方案中,复合物包含:第一抗体重链多肽,其包含:VH1-L1-CH1-L2-VH1-L3-CH1-铰链-CH2-(CH3)x[VI];两个第一抗体轻链多肽,其各自包含:VL1-CL[VII];第二抗体重链多肽,其包含:VH2-L7-CH1-L8-VH2-L9-CH1-铰链-CH2-(CH3)y[VIII];及两个第二抗体轻链多肽,其各自包含:VL2-CL[IX];其中该第一抗体重链多肽与两个包含式[VII]的第一抗体轻链多肽结合,以便各VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中该第二抗体重链多肽与两个包含式[IX]的第二抗体轻链多肽结合,以便各VH2与VL2形成抗原结合结构域;且其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,(CH3)x及(CH3)y为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2、L3、L7、L8及L9为氨基酸接头。在一些实施方案中,(CH3)x包含杵或臼,其中(CH3)y包含杵或臼,且其中(CH3)x的杵或臼可位于(CH3)y的杵或臼中。参见例如表C。
在一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH结构域包含与SEQ ID NO:56或128具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL结构域包含与SEQ ID NO:57或129具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。
本文中将该抗原结合复合物的另一种例示性构型描述并说明为“r:Fv-IgG”形式(参见例如图3A及图3B)。涵盖各种构型,包括单表位及双或多表位形式。例如,在一些实施方案中,该抗体重链从N端至C端包含第一重链可变结构域(VH1)、第二重链可变结构域(VH2)、重链CH1结构域、重链CH2结构域、重链CH3结构域及任选的重链CH4结构域。在一些实施方案中,该抗体轻链从N端至C端包含第一轻链可变结构域(VL1)、第二轻链可变结构域(VL2)及轻链恒定结构域(例如VK或VL)。在一些实施方案中,该第一重链可变结构域(VH1)及该第一轻链可变结构域(VL1)识别细胞表面受体的第一表位,且该第二重链可变结构域(VH2)及该第二轻链可变结构域(VL2)识别该细胞表面受体的相同表位。在一些实施方案中,该第一重链可变结构域(VH1)及该第一轻链可变结构域(VL1)识别细胞表面受体的第一表位,且该第二重链可变结构域(VH2)及该第二轻链可变结构域(VL2)识别相同细胞表面受体的不同的表位。
在一些实施方案中,本发明的抗原结合复合物(例如四价抗原结合复合物)包含两个或多个抗体重链及/或两个或多个抗体轻链。在一些实施方案中,各重链包含重链可变结构域(VH)及一组重链恒定结构域,例如CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域及任选的(例如,对于IgM或IgE抗体)CH4结构域。在一些实施方案中,各轻链包含轻链可变结构域(VL)及恒定轻链(CL)结构域(例如κ或λ)。在一些实施方案中,各亚单位的重链包含一个或多个降低效应子功能的修饰,例如,如本文所述。
在任意以上形式的某些实施方案中,该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列;及/或该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH1包含选自以下的一个、两个或三个抗体HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;及/或该VL1包含选自以下的一个、两个或三个抗体HVR序列:(iv)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(v)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(vi)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列,及/或该VL1包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在任意以上形式的某些实施方案中,该VH2包含:(a)VH结构域,其包含(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;及/或该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH2包含选自以下的一、二或三个抗体HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;及/或该VL2包含选自以下的一、二或三个抗体HVR序列:(iv)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(v)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(vi)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH2包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列,及/或该VL2包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在任意以上形式的某些实施方案中,该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列;该VH2包含:(a)VH结构域,其包含(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在某些实施方案中,该VH1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列,该VL1包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列,该VH2包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列,且该VL2包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
在任意以上形式的某些实施方案中,该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列;及/或该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH2包含选自以下的一、二或三个抗体HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;及/或该VL2包含选自以下的一、二或三个抗体HVR序列:(iv)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(v)HVR-L2,其包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列;及(vi)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列,及/或该VL2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在任意以上形式的某些实施方案中,该VH1包含:(a)VH结构域,其包含(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;及/或该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH1包含选自以下的一个、两个或三个抗体HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;及/或该VL1包含选自以下的一个、两个或三个抗体HVR序列:(iv)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(v)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(vi)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列,及/或该VL1包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在任意以上形式的某些实施方案中,该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列;该VH1包含:(a)VH结构域,其包含(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在某些实施方案中,该VH1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列,该VL1包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列,该VH2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列,且该VL2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在一些实施方案中,复合物包含两条抗体重链多肽及两条抗体轻链多肽;其中这些抗体重链多肽中的每一个包含:VH1-L1-VH2-L3-CH1-铰链-CH2-CH3[I];其中这些抗体轻链多肽中的每一个包含:VL1-L3-VL2-L4-CL[II];其中这些抗体重链多肽中的每一个与一个抗体轻链多肽结合,使得VH1与VL1形成抗原结合结构域且VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,CH3为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2、L3及L4为氨基酸接头。
在一些实施方案中,VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。在一些实施方案中,VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施方案中,VH结构域包含与SEQ ID NO:56或128具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL结构域包含与SEQ ID NO:57或129具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,根据式[I]的抗体重链多肽包含与SEQ ID NO:240、242、250、252、254、256、258、260、262、264或266具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,根据式[I]的抗体重链多肽包含与SEQ ID NO:240或242具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,根据式[I]的抗体重链多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:242或291。
在上述任意复合物中的,VH1、VH2、VL1及/或VL2具有包含表4及表5中所列出的序列中的一个或多个的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3。
本发明的复合物可具有以下描述的激动活性中的一种或多种。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物以小于或等于约0.45nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物以小于或等于约1nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,该OX40复合物以小于或等于约0.4nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,该OX40复合物以小于或等于约0.5nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,使用放射免疫分析法来测定结合亲和力。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物结合人OX40及食蟹猴OX40。在一些实施方案中,使用FACS分析法来测定结合。在一些实施方案中,与人OX40的结合具有约0.2μg/ml的EC50。在一些实施方案中,与人OX40的结合具有约0.3μg/ml以下的EC50。在一些实施方案中,与食蟹猴OX40的结合具有约1.5μg/ml的EC50。在一些实施方案中,与食蟹猴OX40的结合具有约1.4μg/ml的EC50。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物不结合大鼠OX40或小鼠OX40。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物在表达OX40的细胞(例如Treg)中不诱导细胞凋亡。在一些实施方案中,使用30μg/ml的抗体浓度,例如通过使用经膜联蛋白V及碘化丙啶染色的Treg确定是否已发生细胞凋亡来分析细胞凋亡。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物增加记忆T细胞增殖及/或增加该记忆细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中,该细胞因子为IFN-γ。在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物增强记忆T细胞功能,例如通过增加记忆T细胞增殖及/或增加该记忆细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中,该细胞因子为γ干扰素。
在一些实施方案中,与用该OX40激动剂复合物进行治疗之前的增殖及/或细胞因子产生相比,该OX40激动剂复合物增加CD4+效应T细胞增殖及/或增加该CD4+效应T细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中,该细胞因子为IFN-γ。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂复合物增强CD4+效应T细胞功能,例如通过增加CD4+效应T细胞增殖及/或增加该CD4+效应T细胞的γ干扰素产生(例如,与用抗人OX40激动剂复合物进行治疗之前的增殖及/或细胞因子产生相比)。在一些实施方案中,该细胞因子为γ干扰素。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂复合物增加肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如CD4+效应T细胞的总数目,或例如CD4+细胞占CD45+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂复合物进行治疗之前的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞的数目相比。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂复合物增加表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如总表达γ干扰素的CD4+细胞,或例如表达γ干扰素的CD4+细胞占总CD4+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂复合物进行治疗之前的表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞的数目相比。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,CD4+效应T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,CD4+效应T细胞细胞因子分泌有所升高。在任意这些方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,个体中的CD8+效应T细胞具有增强的增殖、细胞因子分泌及/或溶细胞活性。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,CD8+效应T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,CD8+效应T细胞细胞因子分泌有所升高。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂复合物增加肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如CD8+效应T细胞的总数目,或例如CD8+占CD45+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂复合物进行治疗之前的肿瘤内(浸润)CD8+T效应细胞的数目相比。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂复合物增加表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如表达γ干扰素的CD8+细胞占总CD8+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂复合物进行治疗之前的表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+T细胞的数目相比。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如CD8+效应T细胞的总数目,或例如CD8+占CD45+细胞的百分比)有所升高。在任意本发明方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如表达γ干扰素的CD8+细胞占总CD8+细胞的百分比)有所增加。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,个体中的记忆T细胞具有增强的增殖及/或细胞因子分泌。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,记忆T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,记忆T细胞细胞因子分泌(水平)有所升高。在任意这些方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,个体中的Treg对效应T细胞功能(例如增殖及/或细胞因子分泌)的抑制有所减弱。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,效应T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,效应T细胞细胞因子分泌(水平)有所升高。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物抑制Treg对效应T细胞功能的抑制。在一些实施方案中,效应T细胞功能为效应T细胞增殖及/或细胞因子产生。在一些实施方案中,该效应T细胞为CD4+效应T细胞。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物抑制Treg功能,例如通过减弱Treg对效应T细胞功能(例如效应T细胞增殖及/或效应T细胞细胞因子分泌)的抑制。在一些实施方案中,该效应T细胞为CD4+效应T细胞。在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物减少肿瘤内(浸润)Treg的数目(例如,Treg的总数目,或例如Fox3p+细胞占CD4+细胞的百分比)。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,肿瘤内(浸润)Treg的数目(例如,Treg的总数目,或例如Fox3p+细胞占CD4+细胞的百分比)有所减少。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如CD4+效应T细胞的总数目,或例如CD4+细胞占CD45+细胞的百分比)有所升高。在任意本发明方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂复合物之前,表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如总表达γ干扰素的CD4+细胞,或例如表达γ干扰素的CD4+细胞占总CD4+细胞的百分比)有所升高。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物增加表达OX40的靶细胞中的OX40信号转导。在一些实施方案中,通过监测NFkB下游信号传导来检测OX40信号转导。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物在40℃下处理两周之后为稳定的。
在一些实施方案中,该OX40激动剂复合物与OX40L竞争同人OX40的结合。在一些实施方案中,加入OX40L不增强体外分析中的OX40复合物功能。
根据另一实施方案,该OX40激动剂复合物包括以下任意性质、任何组合或所有:(1)以小于或等于约0.45nM的亲和力结合人OX40,在一些实施方案中以小于或等于约0.4nM的亲和力结合人OX40,在一些实施方案中以小于或等于约0.5nM的亲和力结合人OX40,在一些实施方案中使用放射免疫分析法来测定结合亲和力;(2)结合人OX40及食蟹猴OX40,在一些实施方案中使用FACS分析法来测定结合;(3)以约0.2μg/ml的EC50结合人OX40,在一些实施方案中以约0.3μg/ml以下的EC50结合人OX40,在一些实施方案中以约1.5μg/ml的EC50结合食蟹猴OX40,在一些实施方案中以约1.4μg/ml的EC50结合食蟹猴OX40;(4)基本上不结合大鼠OX40或小鼠OX40;(5)增强CD4+效应T细胞功能,例如,通过增加CD4+效应T细胞增殖及/或增加该CD4+效应T细胞的γ干扰素产生(例如,与用抗人OX40激动剂复合物进行治疗之前的增殖及/或细胞因子产生相比);(6)增强记忆T细胞功能,例如通过增加记忆T细胞增殖及/或增加该记忆细胞的细胞因子产生;(7)抑制Treg功能,例如通过减弱Treg对效应T细胞功能(例如效应T细胞增殖及/或效应T细胞细胞因子分泌)的抑制。在一些实施方案中,该效应T细胞为CD4+效应T细胞;(8)增加表达OX40的靶细胞中的OX40信号转导(在一些实施方案中,通过监测NFkB下游信号传导来检测OX40信号转导);及(9)在40℃下处理两周之后为稳定的。
本文中进一步涵盖双特异性或多特异性抗体,其中双特异性或多特异性抗体的各臂结合相同的细胞表面受体,例如OX40。在一些实施方案中,双特异性或多特异性抗体的各臂结合相同细胞表面受体(例如OX40)的不同的表位。例如,在某些实施方案中,双特异性抗体可包含两个臂,其中各臂结合OX40的不同的表位。应理解,结合OX40的例示性抗体、抗原结合结构域及/或抗体片段中的任意个(例如,本文所述的任意OX40激动剂抗体中的HVR、VH及/或VL结构域)均可呈任何组合的形式组合于双特异性或多特异性抗体中。
本文所述的其他抗体HVR序列、VH/VL序列及/或结合特异性中的任一个均可连同或替代上述序列中的一个或多个使用。
抗原结合多肽
适合于形成本文所述的复合物的抗原结合多肽或亚单位包含至少一个针对细胞表面受体的抗原结合区。本文所述的抗原结合多肽可包含抗体、与Fc区融合的抗体抗原结合区(例如抗体片段)或与Fc区融合的非抗体抗原结合区蛋白。在例示性实施方案中,该抗原结合多肽为结合细胞表面受体且具有经修饰的Fc区的抗体。
在一些实施方案中,本文所述的抗体或亚单位含有至少两个多肽。在一些实施方案中,这两个多肽为半抗体,例如单一重链(包含重链可变区、CH1结构域及Fc结构域)及单一轻链(包含轻链可变区及CL结构域)。具体而言,各抗体的Fc区为两个多肽之间形成的二聚体(如以下进一步描述的同源二聚体或异源二聚体)。类似地,与Fc区多肽之一连接的抗原结合区可含有两个多肽,例如,当抗原结合区为抗体片段时,其可含有重链可变区及轻链可变区。
抗体
在某些实施方案中,本文中所提供的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实施例中,嵌合抗体包含非人可变区(例如,来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人灵长类动物的可变区)及人恒定区。在另一实施例中,嵌合抗体为“类别转换”抗体,其中类别或亚类相对于亲本抗体的类别或亚类已发生变化。
在某些实施方案中,嵌合抗体为人源化抗体。通常,非人抗体经人源化以降低对人的免疫原性,而保留亲本非人抗体的特异性及亲和力。通常,人源化抗体包含一个或多个可变结构域,其中HVR,例如CDR(或其部分)来源于非人抗体,而FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体视情况也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中,人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如,HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代,例如,以恢复或改良抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中,且进一步描述于例如以下文献中:Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号;Kashmiri等人,Methods36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)接枝);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重整(resurfacing)”);Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”);以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合”法选择的框架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993));来源于特定轻链或重链可变区亚组的人抗体共有序列的框架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993));人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施方案中,本文中所提供的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位为人抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术来产生。人抗体大体上描述于以下文献中:van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001);及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
人抗体可通过向经修饰以响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。这些动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座,这些基因座取代内源性免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在这些转基因小鼠中,内源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述,参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利第6,075,181号及第6,150,584号;描述技术的美国专利第5,770,429号;描述 技术的美国专利第7,041,870号;及描述技术的美国专利申请公开第US 2007/0061900号。可进一步修饰来自由这些动物产生的完整抗体的人可变区,例如,通过与不同的人恒定区组合。
也可通过基于杂交瘤的方法来产生人抗体。已描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如以下文献中所描述者:美国专利第7,189,826号(描述由杂交瘤细胞系产生单株人IgM抗体);及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)也描述于以下文献中:Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005);以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可通过从来源于人的噬菌体展示文库分离Fv克隆结构域序列来产生人抗体。接着可将这些可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。以下描述用于自抗体库选择人抗体的技术。
可通过筛选组合库中具有期望的活性的多肽来分离适合作为如本文所述的抗原结合多肽或亚单位的抗体。例如,本领域中已知用于产生噬菌体展示文库及筛选这些库中具有期望的结合特征的抗体的各种方法。这些方法综述于例如以下文献中:Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001),且进一步描述于例如以下文献中:McCafferty等人,Nature 348:552-554;Clackson等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中,通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆VH及VL基因谱系且随机重组于噬菌体库中,接着可筛选抗原结合噬菌体,如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述。噬菌体通常呈现呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自于经免疫来源的文库在不需要构建杂交瘤的情况下提供对免疫原具有高亲和力的抗体。或者,可克隆(例如,自人)天然谱系以便在不进行任何免疫的情况下提供单一抗体来源至大范围非自体以及自体抗原,如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后,也可通过克隆来自干细胞的非重排V基因区段及使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区且在体外实现重排而合成产生天然库,如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人抗体噬菌体库的专利公开包括例如:美国专利第5,750,373号及美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号及第2009/0002360号。在本文中,自人抗体库分离的抗体或抗体片段被视为人抗体或人抗体片段。
抗体的抗原结合区
在某些实施方案中,本文所述的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位包含结合细胞表面受体的抗原结合区及Fc区。在一例示性实施方案中,本文所述的抗原结合多肽、抗体或亚单位包含结合细胞表面受体的抗体抗原结合区与Fc区的融合物。在一些实施方案中,本发明的抗原结合区是指包含重链可变结构域(VH)及轻链可变结构域(VL)的抗原结合结构域。在例示性实施方案中,抗体的抗原结合区是指抗体片段,例如,例如Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段以及以下所描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编著,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994);也参见WO93/16185,以及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。关于包含救助受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab及F(ab’)2片段的论述,参见美国专利第5,869,046号。
双抗体为具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可能为二价或双特异性的。参见例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体及四功能性抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单域抗体为包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或者全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体为人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利第6,248,516B1号)。
抗体片段可通过各种技术来产生,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生,如本文所述。可由本文所述的任何抗体来产生抗体片段,包括例如单株、嵌合、人源化、人、双特异性、多特异性、DAF等抗体形式。
本文所述的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位可包含一个或多个多肽。在某些实施方案中,抗原结合区包含一个多肽,例如,例如单链Fv(scFv),其中抗体的重链可变区及轻链可变区通过接头连接。在其他实施方案中,抗原结合区包含两个多肽,例如,例如Fab抗体片段,其中重链可变区及轻链可变区为在天然情况下结合以形成具有6个CDR的抗原结合区的单独多肽链。
在一些实施方案中,该复合物在VH1、VL1、(CH1)x或(CL)x中包含一个或多个促进VH1与VL1形成抗原结合结构域的氨基酸取代;及/或在VH2、VL2、(CH1)y或(CL)y中包含一个或多个促进VH2与VL2形成抗原结合结构域的氨基酸取代。参见例如国际公开第WO2016172485号及实施例6。例如,例示性取代包括但不限于VH-Q39K/VL-Q38E或VH Q39E/VL Q38K(Kabat编号)、CH1-S183E/CL-V133K或CH1-S183K/CL-V133E(EU编号);CH1A141I、F170S、S181M、S183A、V185A;及CLF116A、L135V、S174A、S176F及T178V(EU编号)。
在某些实施方案中,多特异性抗原结合蛋白质具有包含以下各项(包括由其组成及基本上由其组成)的H1的CH1结构域:A141I、F170S、S181M、S183A及V185A突变(EU编号);及包含以下各项(包括由其组成或基本上由其组成)的L1的CL结构域:F116A、L135V、S174A、S176F及T178V突变(EU编号)。
在某些实施方案中,该多特异性抗原结合蛋白质的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号),该多特异性抗原结合蛋白质的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号),该多特异性抗原结合蛋白质的H2的CH1结构域包含(例如由其组成或基本上由其组成)S183E取代突变(EU编号),且该多特异性抗原结合蛋白质的L2的CL结构域包含(例如由其组成或基本上由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中,该多特异性抗原结合蛋白质的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号),该多特异性抗原结合蛋白质的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号),该多特异性抗原结合蛋白质的H2的CH1结构域包含(例如由其组成或基本上由其组成)S183E取代突变(EU编号),且该多特异性抗原结合蛋白质的L2的CL结构域包含(例如由其组成或基本上由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
非抗体抗原结合区
在某些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽包含结合细胞表面受体的抗原结合区及Fc区。在一例示性实施方案中,本文所述的抗原结合多肽包含结合细胞表面受体的非抗体抗原结合区与Fc区的融合物。非抗体抗原结合区的实例包括例如结合细胞表面受体的配体、配体片段或其多聚体。以下描述结合OX40的非抗体抗原结合区的实例。结合Tie2的非抗体结合区的实例描述于WO 2008/049227中。
抗原结合区与Fc区的连接
本文所述的抗原结合区(来源于抗原结合区及非抗体抗原结合区域两者的抗体)可与如本文所述的变体Fc区融合。用于共价连接两个多肽的任何方法均可用于使抗原结合区与Fc结构域融合在一起,包括例如表达为单一多肽(有或无插入多肽接头)、化学键联或通过聚合基团(例如,例如单一或分枝聚乙二醇(PEG)接头)连接。在某些实施方案中,该接头可为可裂解接头。
在某些实施方案中,接头可为多肽接头。在一个实施方案中,该多肽接头为来自于抗体的铰链序列或其变体。例如,铰链序列可包含抗体,例如,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的氨基酸残基216-238(EU编号)或者其片段或衍生物。在一例示性实施方案中,基于铰链的接头包含序列CDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:219)或者其片段或衍生物。在某些实施方案中,该多肽接头可为具有不同长度(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个以上氨基酸)的柔性接头。适合的接头为本领域中已知的,参见例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996。例示性肽接头包括例如:
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:220)
Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:221)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:222)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:223)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:224)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:225)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:226)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:227)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:228)及
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SEQ ID NO:229)
其中n为不小于1的整数。在某些实施方案中,n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。
在一些实施方案中,接头的长度介于0与20个氨基酸之间(包括端点),例如,长度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
在一些实施方案中,接头的氨基酸中有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%为甘氨酸及/或丝氨酸氨基酸。例如,在一些实施方案中,本发明的接头包含序列GGGGSG(SEQ ID NO:270)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:272)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:273)、GGSGG(SEQ ID NO:271)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:272)或GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:274)。
在一些实施方案中,接头包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列(例如CH1结构域或铰链区序列)。在一些实施方案中,本发明的接头包含序列ASTKGP(SEQ ID NO:275)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:277)、RTVAAP(SEQ ID NO:276)或RTVAAPSVFIFPP(SEQ IDNO:278)。在一些实施方案中,接头包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列(例如CH1结构域或铰链区序列)及具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%甘氨酸及/或丝氨酸氨基酸的序列。
在某些实施方案中,接头可为化学接头。适合的化学接头为本领域中已知的且市售的。例示性化学接头包括例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚氨基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰氧基)乙基]砜(BSOCOES)及双[2-(磺基琥珀酰亚氨基氧基羰氧基)乙基]砜(sulfo-BSOCOES)。
在某些实施方案中,抗体的抗原结合区表达为具有Fc结构域的单一多肽。在Fc结构域为二聚体时,Fc二聚体中所含有的各多肽可与抗体的抗原结合区融合,或Fc二聚体中所含有的多肽中仅一个可与抗体的抗原结合区融合。
在某些实施方案中,非抗体抗原结合区表达为具有Fc结构域的单一多肽。在Fc结构域为二聚体时,Fc二聚体中所含有的各多肽可与非抗体抗原结合区融合,或Fc二聚体中所含有的多肽中仅一个可与非抗体抗原结合区融合。
包含OX40激动剂的抗原结合区
在一个实施方案中,本文所述的抗原结合多肽或复合物包含结合并激动人OX40的抗原结合区。在某些实施方案中,该抗原结合多肽包含抗人OX40激动剂抗体的抗原结合区。在某些实施方案中,该抗原结合多肽包含作为非抗体OX40激动剂的抗原结合区。下文所描述的任意例示性OX40激动剂抗体的任何可变结构域均可用于本发明的复合物中。
OX40激动剂抗体
本发明的某些方面是关于结合OX40的抗原结合复合物。在一些实施方案中,该复合物为对OX40(例如人OX40)具有激动活性的四价抗原结合复合物。下文描述例示性抗体亚单位及其例示性特征。不希望受理论束缚,认为激动性抗原结合复合物(例如四价激动性抗原结合复合物)可能尤其有利于以下方案:效应细胞所致的抗体交联对激动活性非常重要(例如通过诱导标靶的簇集及后续信号传导),但在作用位点处,效应细胞未必足够(例如在具有低水平效应细胞的肿瘤中)。在这些情境下,激动性抗原结合复合物,例如四价激动性抗原结合复合物,可在不存在足够效应细胞的情况下允许及/或增强激动活性。
在一些实施方案中,该抗原结合复合物具有包含如表A中所列出的相同抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或所有六个HVR的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段。例如,在某些实施方案中,该复合物中所包括的OX40抗体或Fab片段含有来自如表A中所列出的相同抗体的所有六个HVR。在其他实施方案中,该复合物具有包含如以下表A中所列出的相同抗体的重链可变区(VH)及/或轻链可变区(VL)的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段。然而,应了解,如表A中关于特定抗体所列出的HVR、VH及/或VL序列不限于这些特定抗体;或者,这些序列可由本领域技术人员适当地组合于表A中未明确列出的多种构型中。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQID NO:4的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQID NO:4的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:4的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQID NO:4的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ IDNO:4、15或19的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2、8或9的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-L1,其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列:及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2、8或9的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:2、8或9的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3、10、11、12、13或14的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4、15或19的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQID NO:173的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在一些实施方案中,HVR-H2不为DMYPDAAAASYNQKFRE(SEQ ID NO:216)。在一些实施方案中,HVR-H3不为APRWAAAA(SEQ IDNO:217)。在一些实施方案中,HVR-L3不为QAAAAAAAT(SEQ ID NO:218)。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。在一些实施方案中,HVR-H2不为DMYPDAAAASYNQKFRE(SEQ ID NO:216)。在一些实施方案中,HVR-H3不为APRWAAAA(SEQ ID NO:217)。在一些实施方案中,HVR-L3不为QAAAAAAAT(SEQ ID NO:218)。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含(a)HVR-L1,其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在一些实施方案中,HVR-L3不为QAAAAAAAT(SEQ ID NO:218)。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:174的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:172的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在一些实施方案中,HVR-H2不为DMYPDAAAASYNQKFRE(SEQ ID NO:216)。在一些实施方案中,HVR-H3不为APRWAAAA(SEQ ID NO:217)。在一些实施方案中,HVR-L3不为QAAAAAAAT(SEQID NO:218)。
SEQ ID NO:172、173、174及175的共有序列涵盖以上取代的所有可能组合。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQID NO:30的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQID NO:30的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一、二、三、四、五或六个HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQID NO:30、31或32的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30、31或32的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39、40或41的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;及HVR-L3,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;HVR-L3,其包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列;及HVR-H2,其包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列。在另一实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)VH结构域,该VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列:(i)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列;以及(b)VL结构域,该VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含:(a)HVR-H1,其包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列;(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;(d)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(e)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列;及(f)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:178的氨基酸序列。
在任意以上实施方案中,抗OX40激动剂抗体或Fab片段经人源化。在一个实施方案中,抗OX40抗体或Fab片段包含如以上任意实施方案中的HVR,且进一步包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、108、114、116、183或184的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗入类OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、108、114、116、183或184中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、108、114、116、183或184中的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQID NO:3的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、109、115或117的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、109、115或117中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,这些取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、109、115或117中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-L1,其包含SEQID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:56中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:56中的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:57中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,这些取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:57中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:180的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:180中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:180中的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:179的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:179中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,这些取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:179中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:94中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:94中的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:95的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:95中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,这些取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:95中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:96中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:96中的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:97中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,这些取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:97中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQ ID NO:118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ IDNO:SEQ ID NO:118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的VH序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(b)HVR-H2,其包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列;及(c)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在另一实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含与SEQ ID NO:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147或149的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中,相对于参考序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失,但包含该序列的抗人OX40激动剂抗体或Fab片段保留结合OX40的能力。在某些实施方案中,SEQID NO:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147或149中已取代、插入及/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中,这些取代、插入或缺失出现在HVR以外的区域中(也即,FR中)。可选地,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含SEQ ID NO:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147或149中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中,该VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR:(a)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(b)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(c)HVR-L3,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在某些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:56及SEQID NO:57中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQID NO:60及SEQ ID NO:61中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:62及SEQ ID NO:63中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:66及SEQID NO:67中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQID NO:70及SEQ ID NO:71中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:72及SEQ ID NO:73中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:76及SEQID NO:77中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQID NO:80及SEQ ID NO:81中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:82及SEQ ID NO:83中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:86及SEQID NO:87中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:88及SEQ ID NO:89中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQID NO:90及SEQ ID NO:91中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:96及SEQID NO:97中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:98及SEQ ID NO:99中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQID NO:100及SEQ ID NO:101中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:108及SEQ ID NO:109中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:114及SEQ ID NO:115中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:116及SEQ ID NO:117中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:65中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:184及SEQ IDNO:69中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:118及SEQ ID NO:119中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:121中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:122及SEQ ID NO:123中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:124及SEQ ID NO:125中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:126及SEQ ID NO:127中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ IDNO:128及SEQ ID NO:129中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:130及SEQ ID NO:131中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:132及SEQ ID NO:133中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:134及SEQ ID NO:135中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:136及SEQ ID NO:137中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:138及SEQ ID NO:139中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:140及SEQ ID NO:141中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:143中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ IDNO:144及SEQ ID NO:145中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。在一个实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体或Fab片段包含分别于SEQ ID NO:146及SEQ ID NO:147中的VH及VL序列,包括其他序列的翻译后修饰。
如上所述,本发明的某些方面是关于复合物。应理解,结合OX40的任何示例性抗体,抗原结合结构域和/或抗体Fab片段(例如,本文所述的任何OX40激动剂抗体的HVR,VH和/或VL结构域)可以以任何组合或构型组合在本公开的复合物中。在一些实施方案中,复合物可包含结合OX40的相同表位的两种或多种不同的OX40激动剂抗体或抗原结合多肽。在一些实施方案中,复合物可包含结合OX40的不同的表位(例如,例如人OX40的OX40多肽的部分不重叠或完全不重叠表位)的两种或多种不同的OX40激动剂抗体或抗原结合多肽。
在一些实施方案中,本发明的复合物包含四个结合OX40的抗原结合结构域,其中该四个抗原结合结构域中的每一个包含抗体重链可变(VH)结构域及抗体轻链可变(VL)结构域,其中该复合物包含一个或多个结合OX40的第一表位的抗原结合结构域及一个或多个结合OX40的第二表位的抗原结合结构域,且其中OX40的第一表位与第二表位不同。在一些实施方案中,结合该第一表位的抗原结合结构域不与结合该第二表位的抗原结合结构域交叉竞争结合OX40。
在一些实施方案中,本发明的复合物包含四个结合OX40的抗原结合结构域,该四个抗原结合结构域中的每一个包含抗体重链可变(VH)结构域及抗体轻链可变(VL)结构域。在一些实施方案中,该复合物包含一个或多个结合OX40的第一表位的抗原结合结构域及一个或多个结合OX40的第二表位的抗原结合结构域,其中结合该第一表位的抗原结合结构域不与结合该第二表位的抗原结合结构域交叉竞争结合OX40。在一些实施方案中,通过测试作为单独抗体或其片段之一部分的各抗原结合结构域,而不是测试作为共享复合物的一部分的两个结构域来进行两个抗原结合结构域之间的竞争。下文提供例示性竞争分析法。在一些实施方案中,不与第二抗原结合结构域交叉竞争同OX40结合的第一抗原结合结构域在竞争分析中阻断该第二抗原结合结构域与OX40的结合50%或更少。
在一些实施方案中,本发明的抗原结合结构域结合OX40(例如人OX40)的包含选自以下的一个或多个氨基酸残基(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个残基)的表位:SEQ ID NO:281的残基114-119、124、126、127、129、130、132、140及142。在一些实施方案中,本发明的抗原结合结构域结合OX40(例如人OX40)的包含选自以下的一个或多个氨基酸残基(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个残基)的表位:SEQ ID NO:281的残基68-71、83-90、95及98。
具有信号肽的人OX40的全长序列(信号肽加下划线):
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体以小于或等于约0.45nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体以小于或等于约1nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,该OX40抗体以小于或等于约0.4nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,该OX40抗体以小于或等于约0.5nM的亲和力结合人OX40。在一些实施方案中,使用放射免疫分析法来测定结合亲和力。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体结合人OX40及食蟹猴OX40。在一些实施方案中,结合是使用FACS分析法来测定。在一些实施方案中,与人OX40的结合具有约0.2μg/ml的EC50。在一些实施方案中,与人OX40的结合具有约0.3μg/ml以下的EC50。在一些实施方案中,与食蟹猴OX40的结合具有约1.5μg/ml的EC50。在一些实施方案中,与食蟹猴OX40的结合具有约1.4μg/ml的EC50。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体不结合大鼠OX40或小鼠OX40。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体在表达OX40的细胞(例如Treg)中不诱导细胞凋亡。在一些实施方案中,使用30μg/ml的抗体浓度测定细胞凋亡,例如通过使用膜联蛋白V和碘化丙啶(proprodium iodide)染色的Treg确定细胞凋亡是否已经发生。
在一些实施方案中,OX40激动剂抗体在表达OX40的细胞(例如Treg)中不诱导细胞凋亡。在一些实施方案中,使用30ug/ml的抗体浓度测定细胞凋亡,例如通过使用膜联蛋白V和碘化丙锭染色的Treg确定细胞凋亡是否已经发生。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体增加记忆T细胞增殖及/或增加该记忆细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中,该细胞因子为IFN-γ。在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体增强记忆T细胞功能,例如通过增加记忆T细胞增殖及/或增加该记忆细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中,该细胞因子为γ干扰素。
在一些实施方案中,与用该OX40激动剂抗体进行治疗之前的增殖及/或细胞因子产生相比,该OX40激动剂抗体增加CD4+效应T细胞增殖及/或增加该CD4+效应T细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中,该细胞因子为IFN-γ。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体增强CD4+效应T细胞功能,例如通过增加CD4+效应T细胞增殖及/或增加该CD4+效应T细胞的γ干扰素产生(例如,与用抗人OX40激动剂抗体进行治疗之前的增殖及/或细胞因子产生相比)。在一些实施方案中,该细胞因子为γ干扰素。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体增加肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如CD4+效应T细胞的总数目,或例如CD4+细胞占CD45+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂抗体进行治疗之前的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞的数目相比。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体增加表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如总表达γ干扰素的CD4+细胞,或例如表达γ干扰素的CD4+细胞占总CD4+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂抗体进行治疗之前的表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞的数目相比。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,CD4+效应T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,CD4+效应T细胞细胞因子分泌有所升高。在任意这些方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,个体中的CD8+效应T细胞具有增强的增殖、细胞因子分泌及/或溶细胞活性。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,CD8+效应T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,CD8+效应T细胞细胞因子分泌有所升高。
在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体增加肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如CD8+效应T细胞的总数目,或例如CD8+占CD45+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂抗体进行治疗之前的肿瘤内(浸润)CD8+T效应细胞的数目相比。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体增加表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如表达γ干扰素的CD8+细胞占总CD8+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂抗体进行治疗之前的表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+T细胞的数目相比。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如CD8+效应T细胞的总数目,或例如CD8+占CD45+细胞的百分比)有所升高。在任意本发明方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如表达γ干扰素的CD8+细胞占总CD8+细胞的百分比)有所增加。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,个体中的记忆T细胞具有增强的增殖及/或细胞因子分泌。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,记忆T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,记忆T细胞细胞因子分泌(水平)有所升高。在任意这些方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,个体中的Treg对效应T细胞功能(例如增殖及/或细胞因子分泌)的抑制有所减弱。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,效应T细胞的数目有所升高。在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,效应T细胞细胞因子分泌(水平)有所升高。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体抑制Treg对效应T细胞功能的抑制。在一些实施方案中,效应T细胞功能为效应T细胞增殖及/或细胞因子产生。在一些实施方案中,该效应T细胞为CD4+效应T细胞。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体抑制Treg功能,例如通过减弱Treg对效应T细胞功能(例如效应T细胞增殖及/或效应T细胞细胞因子分泌)的抑制。在一些实施方案中,该效应T细胞为CD4+效应T细胞。在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体减少肿瘤内(浸润)Treg的数目(例如,Treg的总数目,或例如Fox3p+细胞占CD4+细胞的百分比)。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,肿瘤内(浸润)Treg的数目(例如,Treg的总数目,或例如Fox3p+细胞占CD4+细胞的百分比)有所减少。
在一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如CD4+效应T细胞的总数目,或例如CD4+细胞占CD45+细胞的百分比)有所升高。在任意本发明方法的一些实施方案中,相对于施用该OX40激动剂抗体之前,表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如总表达γ干扰素的CD4+细胞,或例如表达γ干扰素的CD4+细胞占总CD4+细胞的百分比)有所升高。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体增加表达OX40的靶细胞中的OX40信号转导。在一些实施方案中,通过监测NFkB下游信号传导来检测OX40信号转导。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体在40℃下处理两周之后为稳定的。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体与OX40L竞争与人OX40的结合。在一些实施方案中,加入OX40L不增强体外分析中的OX40抗体功能。
根据另一实施方案,该OX40激动剂抗体包括以下任意性质、任何组合或全部:(1)以小于或等于约0.45nM的亲和力结合人OX40,在一些实施方案中以小于或等于约0.4nM的亲和力结合人OX40,在一些实施方案中以小于或等于约0.5nM的亲和力结合人OX40,在一些实施方案中使用放射免疫分析法来测定结合亲和力;(2)结合人OX40及食蟹猴OX40,在一些实施方案中使用FACS分析法来测定结合;(3)以约0.2μg/ml的EC50结合人OX40,在一些实施方案中以约0.3μg/ml或以下的EC50结合人OX40,在一些实施方案中以约1.5μg/ml的EC50结合食蟹猴OX40,在一些实施方案中以约1.4μg/ml的EC50结合食蟹猴OX40;(4)基本上不结合大鼠OX40或小鼠OX40;(5)增强CD4+效应T细胞功能,例如,通过增加CD4+效应T细胞增殖及/或增加该CD4+效应T细胞的γ干扰素产生(例如,与用抗人OX40激动剂抗体进行治疗之前的增殖及/或细胞因子产生相比);(6)增强记忆T细胞功能,例如通过增加记忆T细胞增殖及/或增加该记忆细胞的细胞因子产生;(7)抑制Treg功能,例如通过减弱Treg对效应T细胞功能(例如效应T细胞增殖及/或效应T细胞细胞因子分泌)的抑制。在一些实施方案中,该效应T细胞为CD4+效应T细胞;(8)增加表达OX40的靶细胞中的OX40信号转导(在一些实施方案中,通过监测NFkB下游信号传导来检测OX40信号转导);及(9)在40℃下处理两周之后为稳定的。
适用于任意本文所述的抗体及/或Fab片段的例示性抗OX40HVR、VH及VL序列以本发明的任何适合的组合提供于表A中。
表A.OX40抗体序列
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为美国专利第7,550,140号中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链:
(SEQ ID NO:185);及/或包含以下序列的轻链:
在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,550,140号中所描述的抗体008的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,550,140号中所描述的抗体008的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为美国专利第7,550,140号中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体包含序列
在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,550,140号中所描述的抗体SC02008的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,550,140号中所描述的抗体SC02008的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为美国专利第7,550,140号中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链:
(SEQ ID NO:188);及/或包含以下序列的轻链:
在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,550,140号中所描述的抗体023的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,550,140号中所描述的抗体023的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为美国专利第7,960,515号中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,960,515号中所描述的抗体11D4的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,960,515号中所描述的抗体11D4的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为美国专利第7,960,515号中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,960,515号中所描述的抗体18D8的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如美国专利第7,960,515号中所描述的抗体18D8的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2012/027328中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2012/027328中所描述的抗体hu106-222的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2012/027328中所描述的抗体hu106-222的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2012/027328中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2012/027328中所描述的抗体Hu119-122的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2012/027328中所描述的抗体Hu119-122的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2013/028231中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链:
及/或包含以下序列的轻链:
C(SEQ ID NO:199)。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2013/028231中所描述的抗体Mab CH 119-43-1的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2013/028231中所描述的抗体Mab CH 119-43-1的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2013/038191中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2013/038191中所描述的抗体克隆20E5的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2013/038191中所描述的抗体克隆20E5的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2013/038191中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2013/038191中所描述的抗体克隆12H3的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2013/038191中所描述的抗体克隆12H3的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆20E5的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为WO 2014/148895A1中所描述的抗人OX40激动剂抗体。在一些实施方案中,该抗人OX40激动剂抗体具有包含以下序列的重链可变区:
及/或包含以下序列的轻链可变区:
在一些实施方案中,该抗体包含如WO 2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含如WO2014/148895A1中所描述的抗体克隆12H3的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该激动剂抗人OX40抗体为L106BD(Pharmingen,产品编号340420)。在一些实施方案中,该抗体包含抗体L106(BD Pharmingen,产品编号340420)的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含抗体L106(BDPharmingen,产品编号340420)的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该激动剂抗人OX40抗体为ACT35(Santa Cruz Biotechnology,目录号20073)。在一些实施方案中,该抗体包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology,目录号20073)的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology,目录号20073)的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为MEDI6469。在一些实施方案中,该抗体包含抗体MEDI6469的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含抗体MEDI6469的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该OX40激动剂抗体为MEDI0562。在一些实施方案中,该抗体包含抗体MEDI0562的至少一、二、三、四、五或六个高变区(HVR)序列。在一些实施方案中,该抗体包含抗体MEDI0562的重链可变区序列及/或轻链可变区序列。
非抗体OX40激动剂
在某些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽具有包含非抗体OX40激动剂的抗原结合区。非抗体OX40激动剂在本领域中为众所周知的。
OX40L(也称为CD134L)充当OX40的配体。因而,呈现部分或整个OX40L的激动剂可充当OX40激动剂。在一些实施方案中,OX40激动剂可包括OX40L的一个或多个细胞外域。OX40L的细胞外域的实例可包括OX40结合域。在一些实施方案中,OX40激动剂可为包括OX40L的一个或多个细胞外域但缺少该蛋白质的其他不可溶结构域(例如跨膜域)的OX40L可溶形式。在一些实施方案中,OX40激动剂为包括OX40L的一个或多个能够结合OX40L的细胞外域的可溶蛋白质。
在一些实施方案中,OX40激动剂可为美国专利第7,696,175号或欧洲专利第EP0672141B1号中所描述的OX40激动剂中的任一种。在一些实施方案中,OX40激动剂可为国际公开第WO2006/121810号中所描述的OX40激动剂中的任一种,例如OX40免疫黏着素。在一些实施方案中,该OX40激动剂为MEDI6383。
降低(reduce)效应子功能的Fc修饰
在某些实施方案中,本文所述的抗体、亚单位或抗原结合多肽包含一个或多个用于降低效应子功能(例如CDC及/或ADCC)的氨基酸修饰。在例示性实施方案中,用于降低效应子功能的修饰为改变Fc区的糖基化模式的修饰,例如,产生无糖基化Fc区的修饰。在例示性实施方案中,用于降低效应子功能的修饰为不改变Fc区的糖基化模式的修饰。在某些实施方案中,用于降低效应子功能的修饰减少或消除与人效应细胞的结合、与一种或多种Fc受体的结合及/或与表达Fc受体的细胞的结合。在一例示性实施方案中,本文所述的Fc变体包含人IgG1的Fc区中的N297G或N297A修饰。在一例示性实施方案中,本文所述的Fc变体包含以下修饰:人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G,这些修饰引起减弱的效应子功能。
在各种实施方案中,具有减弱的效应子功能的Fc变体是指与由野生型Fc区(例如不具有可降低效应子功能的突变的Fc区,但其可具有其他突变)所达到的效应子功能相比,效应子功能(例如CDC、ADCC及/或与FcR结合等活性)减弱至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%以上的Fc变体。在某些实施方案中,具有减弱的效应子功能的Fc变体是指与野生型Fc区相比消除所有可检测效应子功能的Fc变体。用于测量效应子功能的分析法在本领域中为已知的且描述于下文。
可进行体外及/或体内细胞毒性分析以证实CDC及/或ADCC活性的减弱/除去(depletion)。例如,可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)中。用于评定目的分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实例描述于以下文献中:美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);第5,821,337号(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者,可采用非放射性分析法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析法(CellTechnology,Inc.,Mountain View,CA;及CytoTox非放射性细胞毒性分析法(Promega,Madison,WI)。适用于这些分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及天然杀伤(NK)细胞。或者,或另外,可在体内,例如在例如Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)中公开的动物模型的动物模型中评定目的分子的ADCC活性。也可进行C1q结合分析以证实抗体不能够结合C1q且因此缺少CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为了评定补体活化,可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003);以及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。
具有减弱的效应子功能的Fc变体包括在一个或多个以下氨基酸残基处具有氨基酸取代的Fc变体:238、265、269、270、297、327及329(美国专利第6,737,056号)。这些Fc变体包括在氨基酸位置265、269、270、297及327中的两个或多个上具有取代的Fc变体,包括残基265及297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc变体(美国专利第7,332,581号)。
描述与FcR的结合得到改良或削弱的某些抗体变体(参见例如美国专利第6,737,056号;WO 2004/056312;及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中,本发明涵盖具有一些但不是所有效应子功能,由此使其成为复合物体内半衰期重要但某些效应子功能(例如补体及ADCC)不必要或不利的应用的理想候选物的抗原结合复合物变体。可进行体外及/或体内细胞毒性分析以证实CDC及/或ADCC活性的减弱/除去。例如,可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性),但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII,而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页的表3中。用于评定目的分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实例描述于以下文献中:美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);第5,821,337号(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者,可采用非放射性分析法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析法(CellTechnology,Inc.,Mountain View,CA;及CytoTox非放射性细胞毒性分析法(Promega,Madison,WI)。适用于这些分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及天然杀伤(NK)细胞。或者,或另外,可在体内,例如在例如Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中评定目的分子的ADCC活性。也可进行C1q结合分析以证实抗体不能够结合C1q且因此缺少CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为了评定补体活化,可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003);以及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法来进行FcRn结合及体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
在某些实施方案中,本文所述的Fc变体可在Fc区中包含一个或多个引起C1q结合及/或补体依赖性细胞毒性(CDC)削弱的修饰,例如,如以下文献中所描述:美国专利第6,194,551号;WO 99/51642;及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。在例示性实施方案中,本文所述的Fc变体在人IgG1的Fc区中的赖氨酸322处包含修饰(残基的EU编号)。在一些实施方案中,该修饰导致C1q结合及/或CDC削弱,例如,与无修饰的Fc区相比。例如,在某些实施方案中,本文所述的Fc变体在人IgG1的Fc区中包含K322A修饰(残基的EU编号),例如,如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。其他这种例示性修饰(在人IgG1的Fc区中,且根据残基的EU编号)包括但不限于D270K、D270V、P329A及P331A。
在某些实施方案中,本文所述的Fc变体包含如Strohl,Current Opinion inBiotechnology,20;685-691(2009)中所描述的降低效应子功能的对Fc区的修饰。在例示性实施方案中,本文所述的Fc变体在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰(残基的EU编号):
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328,
其中这些修饰减弱Fc结构域的效应子功能。
在其他例示性实施方案中,本文所述的Fc变体包含选自以下的降低效应子功能的修饰(残基的EU编号):
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
在某些实施方案中,本文所述的Fc变体不包含降低效应子功能的N297A修饰。
在一例示性实施方案中,本文中所提供的激动性抗原结合复合物在不存在FcR结合的情况下结合并激动OX40。在一例示性实施方案中,本文中所提供的激动性抗原结合复合物结合并激动OX40,同时与在Fc区中不含有降低效应子功能的突变的等效抗原结合复合物相比,具有减弱的FcR结合。在各种实施方案中,本文中所提供的激动性抗原结合复合物结合并激动OX40,同时与Fc区中不含有降低效应子功能的突变的等效抗原结合复合物相比,FcR结合减少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上。在某些实施方案中,本文中所提供的激动性抗原结合复合物结合并激动OX40,同时与Fc区中不含有降低效应子功能的突变的等效抗原结合复合物相比,FcR结合减少至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%以上。
III.具有激动活性的抗原结合复合物的产生
本发明的某些方面是关于产生对细胞表面受体具有激动活性的抗原结合复合物(例如四价抗原结合复合物)的方法。
在一些实施方案中,这些方法包括组装第一亚单位及第二亚单位,以及通过接头使该第一亚单位与该第二亚单位偶联。在一些实施方案中,该第一亚单位及/或该第二亚单位为双特异性抗体。用于组装双或多特异性抗体的多种技术为本领域中已知的且描述于本文中(例如参见下文)。例如,在一些实施方案中,这些方法包括提供第一半抗体及第二半抗体,接着在体外组装该第一半抗体及该第二半抗体以形成第一亚单位或双特异性抗体。在一些实施方案中,该第一半抗体包含第一抗体重链可变结构域(VH1)及第一抗体轻链可变结构域(VL1)。在一些实施方案中,该第二半抗体包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2)。在一些实施方案中,这些方法进一步包括提供第三半抗体及第四半抗体,接着在体外组装该第三半抗体及该第四半抗体以形成第二亚单位或双特异性抗体。在一些实施方案中,该第三半抗体包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)及该第一抗体轻链可变结构域(VL1)。在一些实施方案中,该第四半抗体包含该第二抗体重链可变结构域(VH2)及该第二抗体轻链可变结构域(VL2)。在一些实施方案中,这些亚单位的一个或两个均包含特异性结合(例如,细胞表面受体的)一个表位的第一半抗体(例如VH1及VL1)及特异性结合(例如,相同细胞表面受体的)不同的表位的第二半抗体(例如VH2及VL2)。在一些实施方案中,这些亚单位的一个或两个均包含特异性结合(例如,细胞表面受体的)一个表位的第一半抗体(例如VH1及VL1)及特异性结合相同表位的第二半抗体(例如VH2及VL2)。尽管此代表用于产生抗原结合复合物(例如,如图3A及图3B中所说明的“c:IgG-IgG”形式)的例示性方法,但本发明涵盖使用本领域中已知的技术,包括用于产生双特异性抗体的其他技术、不同的接头、不同的偶联策略等的其他适合的产生方法。
在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位通过接头化学偶联。多种化学偶联技术为本领域中已知的且描述于本文中(例如,参见下文)。例如,在一些实施方案中,来自各亚单位的一个半抗体包括经改造的游离半胱氨酸,且使用本领域中已知及本文所述的技术来偶联该经改造的游离半胱氨酸(例如,参见下文)。因而,此不对称性允许该复合物的一致构型,因为仅一种配对为可能的。例示性游离半胱氨酸描述于本文中且包括但不限于选自根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C的重链半胱氨酸氨基酸;及选自根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C的轻链半胱氨酸氨基酸。
在一些实施方案中,该第一亚单位及该第二亚单位通过本发明的双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头发生化学偶联。例如,在一些实施方案中,偶联这些亚单位偶联包括使这两个亚单位与本发明的双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头反应,及纯化该复合物。可使用本领域中已知的多种纯化技术。在一些实施方案中,该纯化包括大小排阻层析及/或阴离子交换层析。
在一些实施方案中,这些方法包括提供抗体及两条抗体Fab片段,接着通过接头使这些抗体Fab片段之一与这两个半抗体中的每一个偶联。在一些实施方案中,该抗体包含两个半抗体。在一些实施方案中,各半抗体具有包含第一抗体重链可变结构域(VH1)的抗体重链及包含第一抗体轻链可变结构域(VL1)的抗体轻链。在一些实施方案中,各抗体Fab片段包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2)。在一些实施方案中,该复合物包含两个半抗体,各自具有特异性结合(例如,细胞表面受体的)一个表位的VH1及VL1;及两个Fab片段,各自具有特异性结合(例如,相同细胞表面受体的)不同的表位的VH2及VL2。在一些实施方案中,该复合物包含两个半抗体,各自具有特异性结合(例如,细胞表面受体的)一个表位的VH1及VL1;及两个Fab片段,各自具有特异性结合该细胞表面受体的相同表位的VH2及VL2。尽管此代表用于产生抗原结合复合物(例如,如图3A及图3B中所说明的“c:Fab-IgG”形式)的例示性方法,但本发明涵盖使用本领域中已知的技术,包括不同的接头(例如多肽接头)、不同的偶联策略(例如,使用与Fab片段连接的单链抗体或半抗体的遗传偶联)等的其他适合的产生方法。
在一些实施方案中,这两个Fab片段各自通过接头与该抗体化学偶联。多种化学偶联技术为本领域中已知的且描述于本文中(例如,参见下文)。例如,在一些实施方案中,各半抗体及Fab片段包括经改造的游离半胱氨酸,各Fab片段通过该经改造的游离半胱氨酸与一个半抗体偶联,且使用本领域中已知的及本文所述的技术来偶联该经改造的游离半胱氨酸(例如,参见下文)。例示性游离半胱氨酸描述于本文中且包括但不限于选自根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C的重链半胱氨酸氨基酸;及选自根据Kabat编号的C端半胱氨酸I106C、R108C、R142C、K149C及V205C的轻链半胱氨酸氨基酸。例如,在某些实施方案中(例如,如参考图6及图7所描述),各Fab片段通过接头,使用Fab片段上的C端经改造的游离半胱氨酸及抗体轻链上的K149C经改造的游离半胱氨酸与抗体轻链发生化学偶联。
在一些实施方案中,该抗体及这两个Fab片段通过本发明的双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头发生化学偶联。例如,在一些实施方案中,偶联这些亚单位包括使这两条抗体Fab片段中的每一个与双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头反应以形成两个双马来酰亚氨基缀合的抗体Fab片段,移除过量双马来酰亚氨基PEG接头,使这两个双马来酰亚氨基缀合的抗体Fab片段中的每一个与该抗体反应以形成该复合物,及纯化该复合物。可使用本领域中已知的多种纯化技术。在一些实施方案中,该纯化包括大小排阻层析及/或阴离子交换层析。
在一些实施方案中,这些方法包括在宿主细胞中表达两条抗体重链。在一些实施方案中,各抗体重链从N端至C端包含第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域(CH11)、第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域(CH12)、抗体重链CH2结构域及抗体重链CH3结构域。在一些实施方案中,各VH1及/或各CH11包含用于正交配对的第一修饰,且各VH2及/或各CH12包含不同的(例如与该VH1及/或CH11的修饰相比)用于正交配对的第二修饰。在一些实施方案中,这些方法进一步包括在宿主细胞中表达两个第一抗体轻链。在一些实施方案中,这两个第一抗体轻链中的每一个从N端至C端包含第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL1)。在一些实施方案中,该VL1及/或该CL1包含用于与该抗体重链的第一修饰正交配对的修饰。在一些实施方案中,这些方法进一步包括在宿主细胞中表达两个第二抗体轻链。在一些实施方案中,这两个第二抗体轻链中的每一个从N端至C端包含第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL2)。在一些实施方案中,该VL2及/或该CL2包含用于与该抗体重链的第二修饰正交配对的修饰。在该宿主细胞中表达后,这两条抗体重链结合,该两条重链中的每一个与第一抗体轻链通过正交配对而偶联,且该两条重链中的每一个与第二抗体轻链通过正交配对而偶联。在一些实施方案中,该抗原结合复合物为双表位的。尽管此代表用于产生抗原结合复合物(例如,如图3A及图3B中所说明的“r:Fab-IgG”形式)的例示性方法,但本发明涵盖使用本领域中已知的技术,包括不同的接头(例如多肽接头)、不同的偶联策略(例如,使用与Fab片段连接的单链抗体或半抗体的遗传偶联)等的其他适合的产生方法。
例示性正交变体对描述于本文中;关于进一步描述,参见例如PCT/US2016/028850。例如,在一些实施方案中,该抗体重链的该第一修饰及/或该第二修饰选自VH-Q39K、VH-Q39E、CH1-S183E、CH1-S183K、CH1-A141I、CH1-F170S、CH1-S181M、CH1-S183A及CH1-V185A(EU编号)。在一些实施方案中,该第一抗体轻链及/或该第二抗体轻链的这些修饰选自VL-Q38E、VL-Q38K、CL-V133K、CL-V133E、CL-F116A、CL-L135V、CL-S174A、CL-S176F及CL-T178V(EU编号)。
双特异性抗体
在某些实施方案中,本文中所提供的抗原结合多肽、亚单位或抗体为多特异性的,例如双特异性的。多特异性抗体为对至少两个不同的位点或表位具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中,双特异性抗体、亚单位或抗原结合多肽对相同标靶,例如细胞表面受体的至少两个不同的表位具有结合特异性。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein及Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))及“杵入臼”改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备:对静电牵引效应进行改造以制备抗体Fc异源二聚分子(WO 2009/089004A1);使两个或多个抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号及Brennan等人,Science,229:81(1985));使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992));使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994));及制备三特异性抗体,例如,如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所描述。
在一些实施方案中,例如,如下文所例示,通过“杵入臼”改造来产生双特异性抗体。例如,两个半抗体可以体外组装成双特异性抗体,其中第一半抗体在其CH3结构域中包含形成杵的氨基酸修饰,而第二半抗体在其CH3结构域中包含形成臼的氨基酸修饰。该杵可置于该臼中,从而在组装后形成双特异性抗体。
在此方法中,两个免疫球蛋白多肽(例如重链多肽)各自包含界面。一个免疫球蛋白多肽的界面与另一免疫球蛋白多肽的相应界面相互作用,从而允许这两个免疫球蛋白多肽结合。这些界面可经改造以使得位于一个免疫球蛋白多肽的界面中的“杵状结构”或“杵”(这些术语在本文中可互换使用)对应于位于另一免疫球蛋白多肽的界面中的“臼状结构”或“臼”(这些术语在本文中可互换使用)。在一些实施方案中,该臼与该杵具有相同或相似的尺寸,且适当地定位,以使得当这两个界面相互作用时,一个界面的杵可位于另一界面的相应臼中。不希望受理论束缚,认为此可稳定异源多聚体且有利于形成异源多聚体而非其他物质,例如同源多聚体。在一些实施方案中,此方法可用于促进两个不同的免疫球蛋白多肽的异源多聚,从而产生对不同的表位具有结合特异性的包含两个免疫球蛋白多肽的双特异性抗体。
在一些实施方案中,可通过用较大侧链取代小氨基酸侧链来构建杵状结构。在一些实施方案中,可通过用较小侧链取代大氨基酸侧链来构建臼状结构。杵或臼可存在于原始界面中,或其可合成引入。例如,杵或臼可通过改变编码界面的核酸序列以便用至少一个“输入”氨基酸残基取代至少一个“原始”氨基酸残基而合成引入。用于改变核酸序列的方法可包括本领域中众所周知的标准分子生物学技术。各种氨基酸残基的侧链体积示于下表中。在一些实施方案中,原始残基具有小侧链体积(例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸),而用于形成杵状结构的输入残基为天然存在的氨基酸且可包括精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸。在一些实施方案中,原始残基具有大侧链体积(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸),而用于形成臼的输入残基为天然存在的氨基酸且可包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及缬氨酸。
表B.氨基酸残基的性质
a氨基酸的分子量减水的分子量。来自于Handbook of Chemistry and Physics第43版,Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961的值。b来自于A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972的值。c来自于C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975的值。可及表面积定义于此参考文献的图6至图20中。
在一些实施方案中,基于异源多聚体的三维结构来鉴定用于形成杵或臼的原始残基。本领域中已知的用于获得三维结构的技术可包括X射线结晶及NMR。在一些实施方案中,该界面为免疫球蛋白恒定结构域的CH3结构域。在这些实施方案中,人IgG1的CH3/CH3界面涉及各结构域的位于四个反平行β股上的十六个残基。不希望受理论束缚,突变残基优选位于两个中心反平行β股上,以便将杵状结构可容纳于周围溶剂而非配偶体CH3结构域中的互补臼状结构中的风险减至最小。在一些实施方案中,形成两个免疫球蛋白多肽中的相应杵状结构及臼状结构的突变对应于下表中所提供的一个或多个配对。
表C.杵状结构及臼状结构形成突变的示例性组
第一免疫球蛋白的CH3 | 第二免疫球蛋白的CH3 |
T366Y | Y407T |
T366W | Y407A |
F405A | T394W |
Y407T | T366Y |
T366Y:F405A | T394W:Y407T |
T366W:F405W | T394S:Y407A |
F405W:Y407A | T366W:T394S |
F405W | T394S |
突变由原始残基,然后以使用Kabat编号系统的位置,接着为输入残基来表示(所有残基均以单字母氨基酸代码给出)。多个突变由冒号分开。
在一些实施方案中,免疫球蛋白多肽具有包含以上表C中所列出的一个或多个氨基酸取代的CH3结构域。在一些实施方案中,双特异性抗体包含第一免疫球蛋白多肽,该第一免疫球蛋白多肽具有包含表C的左侧行中所列出的一个或多个氨基酸取代的CH3结构域;及第二免疫球蛋白多肽,该第二免疫球蛋白多肽具有包含表C的右侧行中所列出的一个或多个相应氨基酸取代的CH3结构域。
在如以上所论述的DNA突变后,可使用本领域中已知的标准重组技术及细胞系统来表达并纯化编码具有一个或多个相应杵形成突变或臼形成突变的经修饰免疫球蛋白多肽的聚核苷酸。参见例如美国专利第5,731,168号、第5,807,706号、第5,821,333号、第7,642,228号、第7,695,936号、第8,216,805号;美国公开第2013/0089553号;及Spiess等人,Nature Biotechnology 31:753-758,2013。经修饰免疫球蛋白多肽可使用例如大肠杆菌的原核宿主细胞或例如CHO细胞的真核宿主细胞来产生。携带相应杵及臼的免疫球蛋白多肽可在宿主细胞中表达于共同培养物中且共同纯化为异源多聚体,或其可表达于单一培养物中,单独纯化,并且在体外组装。在一些实施方案中,使用本领域中已知的标准细菌培养技术共同培养两个细菌宿主细胞菌株(一个表达具有杵状结构的免疫球蛋白多肽,而另一个表达具有臼状结构的免疫球蛋白多肽)。在一些实施方案中,可将这两个菌株以特定比率混合,例如,以便在培养物中达到相等表达水平。在一些实施方案中,可将这两个菌株以50:50、60:40或70:30比率混合。在多肽表达之后,可使这些细胞共同溶解,并且可提取蛋白质。本领域中已知的允许测量同源多聚物质相对于异源多聚物质的丰度的标准技术可包括大小排阻层析。在一些实施方案中,使用标准重组技术单独表达各经修饰的免疫球蛋白多肽,并且可在体外将其组装在一起。组装可例如通过纯化各经修饰免疫球蛋白多肽、将其以相等质量混合在一起并培育、还原二硫键(例如通过用二硫苏糖醇处理)、浓缩并且使多肽再氧化来达到。可使用标准技术(包括阳离子交换层析)纯化并且使用标准技术(包括大小排阻层析)测量所形成的双特异性抗体。关于这些方法的更详细描述,参见Speiss等人,NatBiotechnol 31:753-8,2013。在一些实施方案中,可在CHO细胞中单独表达经修饰的免疫球蛋白多肽,并且使用以上描述的方法在体外进行组装。
根据一种不同的方法,使具有期望的结合特异性的抗体结构域(抗体-抗原结合部位)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。该融合优选与免疫球蛋白重链恒定结构域(包含铰链区、CH2区及CH3区的至少一部分)进行。具有含有至少一种融合物中所存在的轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)为典型的。将编码免疫球蛋白重链融合物及需要时免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中,且共转染至适合的宿主生物体中。由此,在诸多实施方案中,当用于构建的三个多肽链的不相等比率提供最佳产率时,在调节三个多肽片段的相互比例方面提供较大灵活性。然而,当至少两个多肽链以相等比率表达导致高产率时或当这些比率不具有特定显著性时,有可能在一个表达载体中插入两个或全部三个多肽链的编码序列。
在此方法的一个实施方案中,双特异性抗体由一个臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链及另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。据发现,此不对称结构促进期望的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合分离,因为仅一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供一种易行的分离方式。此方法公开于WO94/04690中。关于产生双特异性抗体的进一步细节,参见例如Suresh等人,Methods inEnzymology,121:210(1986)。
根据WO96/27011中所描述的另一种方法,一对抗体分子之间的界面可经改造以使自重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比最大化。一个界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在此方法中,用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上产生具有与大侧链相同或相似尺寸的互补“臼”。由此提供一种用于使异源二聚体的产率增加,从而超过其他不需要的最终产物(例如同源二聚体)的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。例如,异源缀合物中的抗体中一个可与抗生物素蛋白偶联,而另一个与生物素偶联。例如,已提出这种抗体使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利第4,676,980号),且用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源缀合物(heteroconjugate)抗体。适合的交联剂为本领域中众所周知的,且连同许多交联技术一起公开于美国专利第4,676,980号中。
用于由抗体片段产生双特异性抗体的技术也描述于文献中。例如,可使用化学键来制备双特异性抗体。Brennan等人,Science,229:81(1985)描述了一种程序,其中使完整抗体发生蛋白水解裂解以产生F(ab’)2片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下经还原以稳定邻位二硫醇且防止分子间二硫键形成。接着将所产生的Fab’片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原而将Fab’-TNB衍生物的一再转化成Fab’-硫醇,并且与等摩尔量的另一Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作用于对酶进行选择性固定的试剂。
最新进展已有助于自大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段,其可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。各Fab’片段单独自大肠杆菌分泌且在体外经历直接化学偶联以形成双特异性抗体。
也已描述用于由重组细胞培养物直接制备及分离双特异性抗体片段的各种技术。例如,已使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos及Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两个不同的抗体的Fab’部分。抗体同源二聚体在铰链区经还原以形成单体,接着再氧化以形成抗体异源二聚体。此方法也可用于产生抗体同源二聚体。Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)所描述的“双抗体”技术已提供用于制备双特异性抗体片段的替代机制。这些片段包含通过因过短而不允许相同链上的两个结构域之间发生配对的接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。因此,促使一个片段的VH及VL结构域与另一片段的互补VL及VH结构域配对,从而形成两个抗原结合位点。也已报导通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等人,J.Immunol,152:5368(1994)。
用于制备双特异性抗体片段的另一技术为“双特异性T细胞衔接子(engagor)”或方法(参见例如WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567)。此方法利用排列在单一多肽上的两条抗体结构域。例如,单一多肽链包括两个单链Fv(scFv)片段,各scFv片段具有可变重链(VH)及可变轻链(VL)结构域,这两个结构域由长度足以允许这两个结构域之间发生分子内结合的多肽接头隔开。此单一多肽进一步包括介于这两个scFv片段之间的多肽间隔区序列。各scFv识别不同的表位,且这些表位可对不同的细胞类型具有特异性,使得当各scFv与其同源表位接合时,属于两个不同的细胞类型的细胞紧密邻近或拴住。此方法的一个特定实施方案包括将识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原,例如T细胞上的CD3多肽的scFv与识别由靶细胞(例如恶性或肿瘤细胞)表达的细胞表面抗原的另一scFv连接。
由于其为单一多肽,故可使用本领域中已知的任何原核或真核细胞表达系统,例如CHO细胞系来表达双特异性T细胞衔接子。然而,可能必需特定纯化技术(参见例如EP1691833)来分离单体双特异性T细胞衔接子与可能具有除预定单体活性以外的生物学活性的其他多聚物质。在一个例示性纯化流程中,首先对含有分泌多肽的溶液进行金属亲和层析,且用咪唑浓度梯度来洗脱多肽。使用阴离子交换层析进一步纯化此洗脱液,且使用氯化钠浓度梯度来洗脱多肽。最后,对此洗脱液进行大小排阻层析以分离单体与多聚物质。
对用于制备多特异性抗体的方法的其他描述可见于Spiess,C.等人,(2015)Mol.Immunol.67:95-106中(参见例如表2)。这些包括但不限于以下技术(其中第一重链及第二重链中的例示性突变包括):杵入臼(第一重链中的T366W;第二重链中的T366S、L368A及Y407V)、(第一重链中的F405L;第二重链中的K409R)、AzymetricTM(第一重链中的T350V、L351Y、F405A及Y407V;第二重链中的T350V、T366L、K392L及T394W)、Amgen电荷对(第一重链中的K409D及K392D;第二重链中的D399K及E356K)、Rinat-Pfizer电荷对(第一重链中的D221E、P228E及L368E;第二重链中的D221R、P228R及K409R)、HA-TF(第一重链中的S364H及F405A;第二重链中的Y349T及T394F)、SEEDBody(第一重链及第二重链中的IgA/G嵌合体)及差异性蛋白A亲和力(第一重链中的H435R)。
偶联(coupling)
在一些实施方案中,两个抗原结合多肽、抗体或亚单位偶联。在一些实施方案中,抗体与一个或多个Fab片段偶联。如本文中所使用,偶联及其语法变化形式可能指两个或多个大分子由一种或多种化学键或力(例如非共价键、共价键、离子键或电荷-电荷相互作用、氢键、芳族堆积相互作用或范德华相互作用)连接或接合的状态。
在一些实施方案中,这些大分子可作为单独实体提供及化学偶联在一起,例如,通过化学反应。作为非限制性实例,本文所述及说明的c:IgG-IgG及c:Fab-IgG形式(参见图3A及图3B)分别可通过化学偶联两条抗体(例如双特异性抗体)或抗体与两个或多个Fab片段而产生。在一些实施方案中,化学偶联两个大分子可包括用本发明的接头接合这些大分子。
在一些实施方案中,这些大分子可包括可分辨亚单位或模块,但基因或重组产生为单一实体(例如单一多肽链)。作为非限制性实例,本文中描述及说明的r:Fab-IgG及r:Fv-IgG形式(参见图3A及图3B)可通过偶联Fab片段或Fv来产生。在一些实施方案中,偶联两个大分子可包括遗传偶联,藉此将这两个大分子改造(例如使用重组技术)以便由单一聚核苷酸或开放阅读框编码并且表达为单一多肽链。在一些实施方案中,遗传偶联两个大分子可包括用本发明的接头对这些大分子进行改造。
在一些实施方案中,两个抗原结合多肽或亚单位通过接头偶联。在一些实施方案中,抗体与两个或多个Fab片段通过接头偶联。例如,两条抗体(例如两个双特异性抗体)或抗体与两个或多个Fab片段可通过接头偶联。
在一些实施方案中,本发明的接头的长度介于约与约之间。例如,本发明的接头可具有在具有 及的上限以及 及的独立选择的下限的长度范围内的任何长度,其中该上限大于该下限。
多种接头为本领域中已知的。在一些实施方案中,接头可为化学接头。适合的化学接头为本领域中已知的且市售的。例示性化学接头包括例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚氨基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰氧基)乙基]砜(BSOCOES)及双[2-(磺基琥珀酰亚氨基氧基羰氧基)乙基]砜(sulfo-BSOCOES)。
在某些实施方案中,该接头可为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。该PEG接头可由许多PEG亚单位或单体构成,例如,以达到期望的长度。预期可利用各种PEG长度。例如,在一些实施方案中,该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。在一些实施方案中,该PEG接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个PEG亚单位。在某些实施方案中,该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。
在一些实施方案中,接头可为多肽接头。在一个实施方案中,该多肽接头为来自于抗体的铰链序列或其变体。例如,铰链序列可包含抗体,例如,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的氨基酸残基216-238(EU编号)或者其片段或衍生物。在一例示性实施方案中,基于铰链的接头包含序列CDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:219)或者其片段或衍生物。在某些实施方案中,该多肽接头可为具有不同长度(例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个以上氨基酸)的柔性接头。适合的接头为本领域中已知的,参见例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996。例示性肽接头包括例如:Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:220)
Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:221)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:222)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:223)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:224)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:225)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:226)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:227)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:228)和
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SEQ ID NO:229)
其中n为不小于1的整数。在某些实施方案中,n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。
在一些实施方案中,两个抗原结合多肽或亚单位通过点击化学反应而偶联。在一些实施方案中,抗体与两个或多个Fab片段通过点击化学反应而偶联。例如,两条抗体(例如两个双特异性抗体)或抗体与两个或多个Fab片段可通过点击化学反应而偶联。如本领域中已知,点击化学反应可能指各种化学反应,通常本质上为双正交的且用于接合两个或多个模块化学亚单位,易于形成、广泛适用、高产率、立体特异性及/或区位特异性、对氧及水不敏感、使用容易获得的试剂及/或产生可通过非层析移除的无害副产物。例示性点击反应类别包括但不限于环加成(例如,1,3-偶极环加成)、非丁醇醛羰基化学反应、亲核性开环及碳-碳多重键加成。点击化学反应及例示性点击反应的其他描述可见于例如Thirumurugan,P.等人,(2013)Chem.Rev.113:4905-4979中。
在一些实施方案中,两个抗原结合多肽通过四嗪-反式环辛烯(TCO)点击反应而偶联。例如,一个抗原结合多肽可与四嗪偶联,而另一个抗原结合多肽可与TCO偶联;在点击反应后,这两个抗原结合多肽偶联。四嗪-TCO点击反应的例示性描述可见于例如Blackman,M.L.等人,(2008)J.Am.Chem.Soc.130:13518-9中。
经改造的半胱氨酸
在一些实施方案中,两个抗原结合多肽、抗体或亚单位通过经改造的游离半胱氨酸而偶联。在一些实施方案中,抗体与一个或多个Fab片段通过经改造的游离半胱氨酸而偶联。例如,在一些实施方案中,两个抗原结合多肽或亚单位或抗体与一个或多个Fab片段通过THIOMABTM(Genentech)抗体技术而偶联。对THIOMABTM抗体技术的例示性描述可见于例如美国专利第7,521,541号、第7,855,275号、第8,309,300号及第9,000,130号以及美国专利公开第20160130358号中。在一些实施方案中,THIOMABTM抗体技术用于通过接头来偶联抗原结合多肽、亚单位、抗体或Fab片段。
与大部分胺在接近pH 7时发生质子化且具有较低亲核性不同,半胱氨酸硫醇在中性pH值下具有反应性。因为游离硫醇(RSH,巯基)基团相对具有反应性,故具有半胱氨酸残基的蛋白质通常以其氧化形式作为二硫键连接的寡聚物存在或具有内部桥接二硫基。与抗体胺或羟基相比,抗体半胱氨酸硫醇基一般对亲电子性结合试剂更具反应性,即,更具亲核性。通过使蛋白质的各种氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸而在半胱氨酸硫醇基中进行改造可能产生问题,尤其在未配对(游离Cys)残基或相对易于反应或氧化的残基的情况下。在蛋白质的浓溶液中,不论是在大肠杆菌的周质、培养物上清液或是经部分或完全纯化的蛋白质中,蛋白质表面上的未配对Cys残基均可配对并氧化,以形成分子间二硫键,且由此形成蛋白质二聚体或多聚体。二硫键二聚体形成致使新Cys在与药物、配体或其他标记结合时不具反应性。此外,若蛋白氧化形成介于新改造的Cys与现存Cys残基之间的分子内二硫键,则两个Cys基团均不可用于活性位点参与和相互作用。此外,可通过错折叠或损失三级结构而致使蛋白质无活性或无特异性(Zhang等人,(2002)Anal.Biochem.311:1-9)。
在改造半胱氨酸可用于结合但不干扰免疫球蛋白折叠及组装或改变抗原结合及效应子功能的位点具有半胱氨酸取代的抗体/亚单位/Fab片段(THIOMABTM抗体)(Junutula等人,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932;Dornan等人,(2009)Blood 114(13):2721-2729;US 7521541;US 7723485;WO2009/052249)。
在一些实施方案中,半胱氨酸改造抗体/亚单位/Fab片段是指其中抗体的一个或多个残基经半胱氨酸残基取代的抗体。半胱氨酸改造抗体的硫醇基可通过接头结合。在特定实施方案中,经取代的残基存在于该抗体的可及位点上。通过用半胱氨酸取代其他残基,反应性硫醇基从而位于抗体的可及位点上,并且可用于结合抗体或Fab片段与其他部分。例如,THIOMABTM抗体可为非半胱氨酸天然残基至半胱氨酸的单一突变处于轻链中(例如根据Kabat编号的G64C、I106C、R108C、K149C或R142C)或处于重链中(例如根据Kabat编号的HC-D101C、HC-V184C或HC-T205C,或者根据EU编号的HC-T114C、HC-A140C、HC-L174C、HC-L179C、HC-T187C、HC-T209C、HC-V262C、HC-G371C、HC-Y373C、HC-E382C、HC-S424C、HC-N434C及HC-Q438C(也即,根据Kabat编号的HC-A136C为根据EU编号的HC-A140C)的抗体。
在一些实施方案中,游离半胱氨酸氨基酸是指已改造至亲本抗体中、具有硫醇官能基(-SH)且未配对为分子内或分子间二硫桥的半胱氨酸氨基酸残基。
例示性游离改造半胱氨酸氨基酸为本领域中已知的且描述于本文中。在一些实施方案中,重链包含选自根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C的重链半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中,轻链包含选自根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C的轻链半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中,Fab片段包含C端半胱氨酸氨基酸。
应注意,在ThioFab中,单一位点突变产生单一改造半胱氨酸残基,而在THIOMABTM抗体中,单一位点突变产生两个改造半胱氨酸残基,这是由于IgG抗体的二聚特性所致。评估具有改造半胱氨酸(Cys)残基的突变体中新引入的经改造半胱氨酸硫醇基的反应性。硫醇反应性值为介于0至1.0范围内的相对数值项,且可针对任何半胱氨酸改造抗体进行测量。本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.0至1.0的范围内。具体而言,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.1至1.0的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.0至0.1、0.1至0.5、0.1至0.6、0.1至0.7、0.1至0.8、0.1至0.9或0.1至1.0的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.2至1.0、0.3至1.0、0.4至1.0、0.5至1.0、0.6至1.0、0.7至1.0或0.8至1.0的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.6至1.0的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.7至1.0的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.8至10的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.5至0.8的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.5至0.9的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.5至0.7的范围内。在某些实施方案中,本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值介于0.5至1.0的范围内。
本发明的设计、选择及制备方法能够获得与亲电子性官能基(functionality)具有反应性的半胱氨酸改造抗体。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基允许通过例如马来酰亚胺或卤基乙酰基的硫醇反应基团而偶联。Cys残基的硫醇官能基对马来酰亚氨基团的亲核反应性与蛋白质中的任何其他氨基酸官能基,例如赖氨酸残基的氨基或N端氨基相比高出约1000倍。碘基乙酰基及马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能基可与氨基反应,但需要更高pH值(>9.0)及更长反应时间(Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:APracticalApproach,Academic Press,London)。
本发明的半胱氨酸改造抗体/亚单位/Fab片段优选保留其野生型亲本对应物的抗原结合能力。因而,半胱氨酸改造抗体能够结合、优选特异性结合抗原,例如细胞表面受体的表位。
本发明的半胱氨酸改造抗体/亚单位/Fab片段可位点特异性地且有效地与硫醇反应性试剂偶联。硫醇反应性试剂的一个实例为N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一例示性实施方案中,THIOMABTM抗体与生物素-接头试剂的反应提供生物素化THIOMABTM抗体,藉此可检测及测量改造半胱氨酸残基的存在及反应性。THIOMABTM抗体与多官能接头试剂的反应提供具有官能化接头的THIOMABTM抗体,其可与抗体或Fab片段进一步反应。在某些实施方案中,该THIOMABTM抗体为ThioFab。
通常,在此描述的例示性方法可应用于抗体的鉴定及产生,且更通常,通过应用本文所述的设计及筛选步骤而应用于其他蛋白质。
这种方法可应用于结合其他硫醇反应剂,其中反应基团为例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其他硫醇反应性结合配偶体(Haugland,2003,Molecular ProbesHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.;Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2;Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:APractical Approach,Academic Press,London;Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2;Hermanson,G.,Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press,San Diego,第40-55页、第643-671页)。
载体、宿主细胞及重组方法
为了重组产生本文中所提供的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位,分离编码其的核酸并且插入可复制载体中以用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。使用常规方案容易地分离编码抗原结合多肽的DNA并且进行测序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分视欲使用的宿主细胞而定。通常,优选宿主细胞具有原核或真核(一般为哺乳动物,但也包括真菌(例如酵母)、昆虫、植物及来自其他多细胞生物体的有核细胞)起源。在一些实施方案中,该宿主细胞为经分离的宿主细胞,例如生长为经分离的细胞的来源于多细胞生物体的宿主细胞,例如在细胞培养物中生长的来源于无脊椎动物(例如昆虫)或脊椎动物(例如小鼠、人、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等)生物体的细胞系。在抗原结合多肽为抗体的情况下,应了解,任何同种型的恒定区均可用于此目的,包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恒定区,且这些恒定区可获自任何人或动物物种。
a.使用原核宿主细胞产生抗原结合多肽
i.载体构建
编码本文中所提供的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位的多肽组分的聚核苷酸序列可使用标准重组技术获得。例如,可自例如杂交瘤细胞的抗体产生细胞分离期望的多核苷酸序列并且测序。或者,可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成聚核苷酸。在获得后,将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源聚核苷酸的重组载体中。本领域中可利用且已知的许多载体可用于本发明的目的。适当载体的选择将主要基于待插入载体中的核酸的尺寸及欲用该载体转化的特定宿主细胞而定。每个载体包含不同的组分,取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达,或两者)及其与其所在的特定宿主细胞的相容性。载体组分一般包括但不限于:复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物及转录终止序列。
在一些实施方案中,本发明的聚核苷酸序列包括突变,例如编码本文所述的氨基酸取代的突变,例如改造游离半胱氨酸或用于减弱Fc区效应子功能的修饰。通过本领域中已知的多种方法来制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于通过对先前制备的编码该多肽的DNA进行定点(或寡核苷酸介导的)突变、PCR突变及盒式突变来制备。也可通过限制片段操纵或通过用合成寡核苷酸进行重叠延伸PCR来构建重组抗体变体。突变引物编码半胱氨酸密码子取代。可采用标准突变技术来产生编码这些突变半胱氨酸改造抗体的DNA。一般性指导可见于以下文献中:Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York,N.Y.,1993。
定点突变为一种用于制备取代变体,也即突变蛋白质的方法。此技术为本领域中公知(参见例如Carter等人,(1985)Nucleic Acids Res.13:4431-4443;Ho等人,(1989)Gene(Amst.)77:51-59;及Kunkel等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488)。简言之,在进行DNA的定点突变时,通过首先使编码期望的突变的寡核苷酸与该起始DNA的单链杂交来改变起始DNA。在杂交之后,使用经杂交的寡核苷酸作为引物且使用该起始DNA的该单链作为模板,使用DNA聚合酶来合成整个第二股。因而,将编码期望的突变的寡核苷酸并入所得双链DNA中。可在待表达质粒中进行突变的表达蛋白质的基因内进行定点突变,并且可对所得质粒进行测序以证实期望的半胱氨酸取代突变的引入(Liu等人,(1998)J.Biol.Chem.273:20252-20260)。定点方案及形式包括市售的其他方案及形式,例如多点突变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)。
PCR突变也适合于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi(1990),PCRProtocols,第177-183页,Academic Press;Ito等人,(1991)Gene 102:67-70;Bernhard等人,(1994)Bioconjugate Chem.5:126-132;及Vallette等人,(1989)Nuc.Acids Res.17:723-733。简言之,当使用少量模板DNA作为PCR中的起始物质时,在序列上与模板DNA中的相应区域稍微不同的引物可用于产生相对大量的仅在引物与模板不同的位置上与模板序列不同的特定DNA片段。
用于制备变体的另一方法盒式突变是基于Wells等人,(1985)Gene34:315-323所描述的技术。起始物质为包含待突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定待突变的起始DNA中的密码子。所鉴定的突变位点的每一侧上必定存在独特的限制酶位点。若不存在这些限制位点,则其可使用以上描述的寡核苷酸介导的突变法将其引入在起始多肽DNA中的适当位置上来产生。在这些位点上切割质粒DNA以使其线性化。使用标准程序合成编码介于限制位点之间但含有期望的突变的DNA序列的双链寡核苷酸,其中单独合成该寡核苷酸的两条链,接着使用标准技术杂交在一起。通过亚磷酰胺合成法来制备寡核苷酸(US 4415732;US 4458066;Beaucage,S.及Iyer,R.(1992)“Advances in the synthesis ofoligonucleotides by the phosphoramidite approach”,Tetrahedron 48:2223-2311)。此双链寡核苷酸称为盒。此盒经设计以具有与线性化质粒末端兼容的5’及3’端,使其可直接与质粒连结。此质粒现含有突变的DNA序列。可通过DNA测序来证实含有编码半胱氨酸取代的突变DNA。
也通过寡核苷酸定点突变,使用双链质粒DNA作为模板,通过基于PCR的突变来产生单一突变(Sambrook及Russel,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版;Zoller等人,(1983)Methods Enzymol.100:468-500;Zoller,M.J.及Smith,M.(1982)Nucl.Acids Res.10:6487-6500)。
通常,含有来源于与宿主细胞兼容的物种的复制子及控制序列的质粒载体与这些宿主联合使用。载体一般携带复制位点,以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如,通常使用来源于大肠杆菌属的质粒pBR322对大肠杆菌进行转化。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)及四环素(Tet)抗性的基因,且因而提供容易鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可含有或经修饰而含有可由微生物体用于表达内源蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等人,美国专利第5,648,237号中。
另外,含有与宿主微生物兼容的复制子及控制序列的噬菌体载体可作为转化载体与这些宿主联合使用。例如,例如λGEM.TM.-11的噬菌体可用于制备可用于转化例如大肠杆菌LE392的易感宿主细胞的重组载体。
本发明的表达载体可包含两个或多个编码各多肽组分的启动子-顺反子配对。启动子为位于顺反子上游(5’)的非翻译调节序列,其调节顺反子的表达。原核启动子通常属于诱导型及组成型两种类别。诱导型启动子为响应于培养条件的变化(例如存在或不存在营养物质或者温度变化)而引发受其控制的顺反子的转录水平增高的启动子。
由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是公知的。可通过限制酶消化从来源DNA中移除启动子并且将分离的启动子序列插入本发明的载体中,而将所选启动子有效连接至编码例如轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列及许多异源启动子均可用于直接扩增及/或表达靶基因。在一些实施方案中,利用异源启动子,因为与天然靶多肽启动子相比,其一般允许所表达的靶基因的更大程度转录及更高产率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-半乳糖苷酶及乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统及杂合启动子,例如tac或trc启动子。然而,在细菌中具有功能的其他启动子(例如其他已知细菌或噬菌体启动子)也为适合的。它们的核苷酸序列已经公开,从而使得本领域技术人员能够使用接头或衔接子提供任何所需的限制位点,将它们有效链接至编码抗原结合多肽蛋白(例如靶轻链及重链)基因的顺反子(Siebenlist等人,(1980)Cell 20:269)。
在一个实施方案中,重组载体内的各顺反子包含指导所表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列组分。通常,该信号序列可为载体的组分,或其可为插入载体中的靶多肽DNA的一部分。所选信号序列应为由宿主细胞识别并处理(也即,由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别及处理异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞,以例如选自以下的原核信号序列来取代该信号序列:碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本发明的一个实施方案中,表达系统的两个顺反子中所使用的信号序列为STII信号序列或其变体。
在另一实施方案中,免疫球蛋白的产生可发生在宿主细胞的细胞质中,且因此各顺反子内不需要存在分泌信号序列。就此而言,在细胞质内表达、折叠及组装免疫球蛋白轻链及重链以形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件,从而允许所表达的蛋白质亚单位的适当折叠及组装。参见Proba及Pluckthun Gene,159:203(1995)。
适合于表达本发明的抗原结合多肽(例如抗体)的原核宿主细胞包括古细菌及真细菌,例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。适用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas species)(例如绿脓杆菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏杆菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中,使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中,将大肠杆菌细胞用作本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.,美国微生物学学会,1987),第1190-1219页;ATCC保藏号27,325)及其衍生物,包括具有基因型W3110AfhuA(AtonA)ptr3lac Iq lacL8AompTA(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利第5,639,635号)。其他菌株及其衍生物,例如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)及大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是适合的。在一个实施方案中,特别使用大肠菌Alpp。这些实例为说明性的而非限制性的。用于构建具有限定基因型的任何上述细菌衍生物的方法为本领域中已知,且描述于例如Bass等人,Proteins,8:309-314(1990)中。一般必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如,当使用例如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410的熟知质粒来供应复制子时,大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属可能适合用作宿主。通常,宿主细胞将分泌极少量的蛋白水解酶,并且可能需要在细胞培养物中并入其他蛋白酶抑制剂。
ii.多肽产生
用上述表达载体对宿主细胞进行转化,并且在视情况经改良的常规培养基中培养以便诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望的序列的基因。
转化意指将DNA引入原核宿主中,使得DNA可作为染色体外元件或由染色体成分进行复制。视所使用的宿主细胞而定,使用适用于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理一般用于含有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。所用另一种技术为电穿孔。
用于产生本发明多肽的原核细胞在本领域中已知且适于培养所选宿主细胞的培养基中生长。适合的培养基的实例包括LB培养基(Luria broth,LB)加必需营养补充剂。在一些实施方案中,培养基也含有基于表达载体的构建而选择的选择剂,以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如,向用于生长表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中加入氨苄青霉素。
除碳、氮及无机磷酸盐来源以外,也可以适当浓度包括单独引入或作为与另一补充剂或培养基的混合物的任何必需补充剂,例如复合氮源。可选地,培养基可含有一种或多种选自以下的还原剂:谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸酯、二硫赤藓糖醇及二硫苏糖醇。
在适合的温度下培养原核宿主细胞。例如,对于大肠杆菌生长,优选温度介于约20℃至约39℃的范围内,更优选为约25℃至约37℃,甚至更优选为约30℃。培养基的pH值可为介于约5至约9的范围内的任何pH值,主要视宿主生物体而定。对于大肠杆菌,pH值优选为约6.8至约7.4,且更优选为约7.0。
若本发明的表达载体使用诱导型启动子,则在适合于活化该启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个实施方案中,使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此,在磷酸盐限制培养基中培养经转化的宿主细胞以进行诱导。优选地,磷酸盐限制培养基为C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。如本领域中已知,可根据所采用的载体构建体使用多种其他诱导剂。
在本发明的一个实施方案中,通过发酵方法大量进行抗原结合多肽(例如,例如抗体)产生。多种大规模补料-分批发酵程序可用于产生重组蛋白质。大规模发酵具有至少1000升的容量,优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧及营养物质,尤其是葡萄糖(优选碳源/能源)。小规模发酵一般是指在体积容量不超过约100升,并且可以介于约1升至约100升的范围内的发酵罐中进行的发酵。
在发酵过程中,通常在细胞已在适合条件下生长至期望的密度(例如约180-220的OD550,在此阶段细胞处于早期稳定期)之后起始蛋白质表达的诱导。如本领域中已知及以上所描述,可根据所采用的载体构建体使用多种诱导剂。可在诱导前使细胞生长较短时段。通常将细胞诱导约12-50小时,但可使用更长或更短的诱导时间。
为了将所表达的抗原结合多肽(尤其是对蛋白水解敏感的抗原结合多肽)的蛋白水解减至最少,可将缺少蛋白水解酶的某些宿主菌株用于本发明。例如,可修饰宿主细胞菌株,以便在编码已知细菌蛋白酶,例如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中实现基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺少菌株可利用且描述于例如以下文献中:Joly等人,(1998),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2773-2777;Georgiou等人,美国专利第5,264,365号;Georgiou等人,美国专利第5,508,192号;Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)。
在一个实施方案中,将缺少蛋白水解酶且用过度表达一种或多种蛋白侣伴的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞用于本发明的表达系统中。在第二实施方案中,大肠杆菌菌株缺少外膜脂蛋白(ΔIρρ)。
iii.抗原结合多肽纯化
在一个实施方案中,进一步纯化本文中所产生的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位以获得基本上同源的制剂用于进一步分析及使用。可采用本领域中已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序为例示性适合纯化程序:在免疫亲和力或离子交换柱上进行分馏、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅上或在例如DEAE的阳离子交换树脂上进行层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀及使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个实施方案中,将固定于固相上的蛋白A用于对例如本发明的抗原结合多肽进行免疫亲和力纯化。蛋白A为来自金黄色葡萄球菌的41kD细胞壁蛋白,其以高亲和力结合抗原结合多肽的Fc区。Lindmark等人,(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定蛋白A的固相优选为包含玻璃或二氧化硅表面的柱,更优选为受控孔隙玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中,柱已涂布有例如甘油的试剂,以试图防止污染物的非特异性黏附。
作为纯化的第一步骤,将来源于如上所述的细胞培养物的制剂施加至蛋白A固定化固相上,以允许相关抗原结合多肽与蛋白A的特异性结合。接着洗涤固相以移除与固相非特异性结合的污染物。通过洗脱自固相回收抗原结合多肽(例如,例如抗体)。
b.使用真核宿主细胞产生抗原结合多肽
载体组分一般包括但不限于以下各项中的一或多项:信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子及转录终止序列。
i.信号序列组分
用于真核宿主细胞中的载体也可含有信号序列或者在相关成熟蛋白质或多肽的N端具有特定裂解位点的其他多肽。所选异源信号序列优选为由宿主细胞识别并处理(也即,由信号肽酶裂解)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中,可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列,例如单纯疱疹gD信号。将这种前体区的DNA连接至编码期望的抗原结合多肽(例如抗体)的DNA的阅读框中。
ii.复制起点
通常,哺乳动物表达载体不需要复制起点组分。例如,通常可使用SV40起点,但仅因为其含有早期启动子。
iii.选择基因组分
表达及克隆载体可含有选择基因,也称为选择标记物。典型的选择标记基因编码如下蛋白质:(a)赋予针对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素)的抗性;(b)补充相关营养缺少;或(c)提供不可得自复合培养基的重要营养物质。
选择流程的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的其他细胞产生赋予药物抗性的蛋白质,且因而通过选择方案。这种显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸及潮霉素。
适合哺乳动物细胞的选择标记物的另一实例为使得能够鉴定胜任摄取抗体核酸的细胞的选择标记物,例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I及II,优选为灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱胺酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如,首先通过在含有DHFR的竞争拮抗剂即氨甲喋呤(Mtx)的培养基中培养所有转化体来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时,适当的宿主细胞为缺少DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者,可通过在含有针对选择标记物的选择剂,例如氨基糖苷抗生素,例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中进行细胞生长来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白及另一选择标记物(例如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(具体而言,含有内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利第4,965,199号。
iv.启动子组分
表达及克隆载体通常包含由宿主生物体识别的启动子,并且有效连接至期望的含Fc的多肽(例如抗体)核酸。已知真核细胞的启动子序列。实际上,所有真核基因均具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的AT富含区。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一个序列为CNCAAT区,其中N可为任何核苷酸。在大部分真核基因的3’端为AATAAA序列,其可能为用于加入poly A尾至编码序列的3’端的信号。所有这些序列均适合插入真核表达载体中。
为了产生含Fc的多肽(例如,例如抗体),例如通过获自病毒(例如,例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒及猴病毒40(SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)或热休克启动子的启动子在哺乳动物宿主细胞中控制从载体转录,其限制条件为这些启动子与宿主细胞系统兼容。
便利地获得呈SV40限制片段形式的SV40病毒早期及晚期启动子,该片段也含有SV40病毒复制起点。便利地获得呈Hind 111E限制片段形式的人巨细胞病毒立即早期启动子。美国专利第4,419,446号中揭示使用牛乳头状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。此系统的改良描述于美国专利第4,601,978号中。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA,也参见Reyes等人,Nature 297:598-601(1982)。或者,可使用劳氏肉瘤病毒长端重复序列作为启动子。
v.增强子元件组分
可通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核细胞对编码抗原结合多肽(例如,例如抗体)的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、a-胎蛋白及胰岛素基因)的许多增强子序列。也可使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧(late side)增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多形瘤复制起点晚期侧增强子及腺病毒增强子。关于用于增强真核启动子活化的元件的描述,也参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接至载体中,位于抗体多肽编码序列的5’或3’位置,条件为达到增强,但一般位于启动子的5’位点。
vi.转录终止组分
用于真核宿主细胞中的表达载体通常也将含有终止转录及稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可得自真核或病毒DNA或cDNA5’非翻译区,偶尔为3’非翻译区。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种适用的转录终止组分为牛生长激素聚腺苷酸化区。参见W094/11026及其中公开的表达载体。
vii.宿主细胞的选择及转化
适于克隆或表达本文中的载体中的DNA的宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞,包括脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规程序。适用哺乳动物宿主细胞系的实例为经SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651);人胚胎肾细胞系(293或经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的293细胞,Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));小鼠赛特利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1,ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳房肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI细胞(Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC 5细胞;FS4细胞;及人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以产生所需的抗原结合多肽(例如抗体),并在适当修饰的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
viii.培养宿主细胞
可在多种培养基中培养用于产生本发明的期望的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位的宿主细胞。市售培养基,例如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基((MEM),(Sigma)、转/分钟I-1640(Sigma)及Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM),Sigma),适合于培养这些宿主细胞。另外,可使用以下文献中所描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基:Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号;WO 90/03430;WO 87/00195;或美国专利复审30,985。任意这些培养基均可根据需要补充激素及/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲剂(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷及胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必需的补充剂。培养条件,例如温度,pH等,是先前与选择用于表达宿主细胞一起使用的那些,并且对于本领域技术人员是显而易见的
ix.纯化抗原结合多肽
当使用重组技术时,本发明的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位可在细胞内产生,或者直接分泌至培养基中。若在细胞内产生多肽,则作为第一步骤,通过例如离心或超滤移除颗粒状碎片,其或为宿主细胞或为裂解片段。在多肽分泌到培养基中的情况下,通常首先使用市售的蛋白质浓缩滤器,例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂如PMSF可以包括在任何前述步骤中,以抑制蛋白水解,并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析,凝胶电泳,透析及亲和层析来纯化由细胞制备的多肽组合物,亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1,γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3,推荐蛋白G(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所连接的基质通常是琼脂糖,但也可以使用其他基质。机械稳定的基质,例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯,与琼脂糖相比,可以实现更快的流速和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域时,Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体,也可利用其他蛋白质纯化技术,如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)色谱,色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后,可以使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含目标多肽和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱,优选在低盐浓度(例如约0至0.25M盐)下进行。抗原结合多肽的产生可替代地或另外(除上述特定方法中的任一种以外)包括对包含多肽混合物的溶液进行透析。
x.使用杆状病毒的抗原结合多肽产生
可通过使用例如脂质转染(试剂)(可购自GIBCO-BRL)将编码抗原结合多肽的质粒及BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共转染至例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如Sf9细胞;ATCC CRL 1711)或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞的昆虫细胞中来产生重组杆状病毒。在特定实例中,抗原结合多肽序列融合在杆状病毒表达载体内所含有的表位标签上游。这些表位标签包括聚His标签。可采用多种质粒,包括来源于市售质粒的质粒,例如pVL1393(Novagen)或pAcGP67B(Pharmingen)。简言之,可通过利用与5’及3’区互补的引物进行PCR来扩增编码抗原结合多肽的序列。5’引物可并入侧接(所选)限制酶位点。接着可用所选限制酶来消化产物,并且亚克隆至表达载体中。
用表达载体转染之后,在28℃下将宿主细胞(例如Sf9细胞)培育4至5天且收集所释放的病毒并用于进一步扩增。可如例如O’Reilley等人(Baculovirus expression vectors:ALaboratory Manual.Oxford:Oxford University Press(1994))所描述来进行病毒感染及蛋白质表达。
接着可例如通过如下的Ni2+螯合亲和层析来纯化所表达的聚His标签化抗原结合多肽。可如Rupert等人(Nature 362:175-179(1993))所描述,由经重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简言之,洗涤Sf9细胞,重悬于超音处理缓冲液(25mL HEPES pH 7.9;12.5mMMgCL2;0.1mM EDTA;10%甘油;0.1%NP-40;0.4M KCl)中,并且在冰上进行超音处理两次20秒。通过离心使超音处理物澄清,且将上清液50倍稀释在上样缓冲液(50mM磷酸盐;300mMNaCl;10%甘油pH 7.8)中,并且通过0.45μm过滤器进行过滤。以5mL柱床体积制备Ni2+-NTA琼脂糖柱(可购自Qiagen),用25mL水洗涤,且用25mL上样缓冲液进行平衡。以每分钟0.5mL将经过滤的细胞提取物上样至柱上。用上样缓冲液洗涤柱至基线A280,此时开始收集级分。接下来,用第二洗涤缓冲液(50mM磷酸盐;300mM Nal;10%甘油pH 6.0)洗涤柱,由此洗脱非特异性结合的蛋白质。再次达到A280基线之后,用含0至500mM咪唑梯度的第二洗涤缓冲液使柱显色。收集1mL级分,并且用与碱性磷酸酶结合的Ni2+-NTA(Qiagen)通过SDS-PAGE及银染色或Western印记加以分析。汇集含有洗脱的His10标签化抗原结合多肽的级分并且相对于上样缓冲液进行透析。
或者,可使用已知层析技术,包括例如蛋白A或蛋白G柱层析,进行抗原结合多肽的纯化。在一个实施方案中,通过洗脱至含有离液剂或温和清洁剂的溶液中而自柱的固相回收相关抗原结合多肽。例示性离液剂及温和清洁剂包括但不限于盐酸胍、尿素、过氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton及NP-40,所有各项均市售。
THIOMABTM抗体是全长抗体,其包括在抗体内形成二硫键的天然半胱氨酸残基。因此,这些天然半胱氨酸残基不具有任何反应性硫醇基团以与药物-马来酰亚胺缀合(除非用还原剂处理)。因此,新设计的Cys残基可以保持不配对,并且能够与亲电子接头试剂或药物-接头中间体(例如药物-马来酰亚胺)反应,即缀合。
硫醇反应性也可普及至抗体的某些结构域,例如轻链恒定结构域(CL)及重链恒定结构域CH1、CH2及CH3。产生约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及0.95以上的硫醇反应性值的半胱氨酸取代可分别在以下完整抗体的重链恒定结构域α、δ、ε、γ及μ中进行:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,包括IgG亚类:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。
靶分子及使用方法
本发明的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位可用于与标靶相互作用以活化信号转导途径。在某些实施方案中,该标靶可为活化、引发、调节及/或调控信号转导途径的任何标靶。可由如本文所述的抗原结合多肽或抗原结合复合物靶向的分子的实例包括但不限于细胞表面受体。在某些实施方案中,该细胞表面受体可为通过与配体组合而寡聚,例如二聚(同源二聚或异源二聚)且从而将信号转导至细胞中的受体。
在某些实施方案中,该标靶可为例如在与其配体相互作用后寡聚以活化信号转导途径的任何标靶。在某些实施方案中,该标靶可为多聚受体。如本文所用的术语“多聚受体”是指需要例如属于相同类型及/或来自相同家族的两个以上、三个以上、四个以上、五个以上或六个以上受体寡聚以获得信号传导活性的受体。参见例如Heidin(1995)Cell 80:213-223。
在某些实施方案中,靶受体可为“二聚的”且需要两个受体寡聚以获得活性。二聚受体的非限制性实例包括神经营养受体、神经生长因子、生长因子、丝氨酸/苏氨酸激酶受体及受体酪氨酸激酶(RTK)。参见例如Li及Hristova(2010)Cell Adhesion and Migration 4(2):249-254。
在某些实施方案中,靶受体可为“三聚的”且需要三个受体寡聚以获得活性。三聚受体的非限制性实例包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)。参见例如Brazil(2006)Nature ReviewsDrug Discovery 5:20。
在某些实施方案中,该标靶可为当与本发明的抗原结合多肽或抗原结合复合物相互作用时引起如以上所定义的“激动作用”的任何标靶,其中该激动作用相对于单体亲本抗体有所增强。
细胞表面受体包括例如属于例如造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族、TNF受体家族、G蛋白偶联受体(GPCR)家族、GPI锚定受体家族、酪氨酸磷酸酶受体家族、黏附因子家族及激素受体家族的受体家族的受体。可获得关于属于这些受体家族的受体及其特征的各种参考文献,且包括例如Cooke B A.,King R J B.,van der Molen H J.编著,New Comprehensive Biochemistry第18B卷,“Hormones and their Actions Part II”第1-46页(1988)Elsevier Science PublishersBV.,New York,USA;Patthy L.(1990)Cell,61:13-14;Ullrich A.等人,(1990)Cell,61:203-212;Massagul J.(1992)Cell,69:1067-1070;Miyajima A.等人,(1992)Annu.Rev.Immunol.,10:295-331;Taga T.及Kishimoto T.(1992)FASEB J.,7:3387-3396;Fantl W I.等人,(1993)Annu.Rev.Biochem.,62:453-481;Smith C A.等人,(1994)Cell,76:959-962;Flower D R.(1999)Biochim.Biophys.Acta,1422:207-234;及M.Miyasaka编著,Cell Technology,补充卷,Handbook series,“Handbook for Adhesion Factors”(1994)(Shujunsha,Tokyo,Japan)。
在某些实施方案中,细胞表面受体包括例如激素受体及细胞因子受体。例示性激素受体包括例如雌激素受体。例示性细胞因子受体包括例如造血因子受体、淋巴因子受体、生长因子受体、分化控制因子受体及其类似物。细胞因子受体的实例为红血球生成素(EPO)受体、促血小板生成素(TPO)受体、颗粒球集落刺激因子(G-CSF)受体、巨噬球集落刺激因子(M-CSF)受体、粒状巨噬球集落刺激因子(GM-CSF)受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体、白介素-1(IL-1)受体、白介素-2(IL-2)受体、白介素-3(IL-3)受体、白介素-4(IL-4)受体、白介素-5(IL-5)受体、白介素-6(IL-6)受体、白介素-7(IL-7)受体、白介素-9(IL-9)受体、白介素-10(IL-10)受体、白介素-11(IL-11)受体、白介素-12(IL-12)受体、白介素-13(IL-13)受体、白介素-15(IL-15)受体、干扰素-α(IFN-α)受体、干扰素-β(IFN-β)受体、干扰素-γ(IFN-γ)受体、生长激素(GH)受体、胰岛素受体、血液干细胞增殖因子(SCF)受体、血管表皮生长因子(VEGF)受体、表皮细胞生长因子(EGF)受体、神经生长因子(NGF)受体、纤维母细胞生长因子(FGF)受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、转化生长因子-β(TGF-β)受体、白细胞迁移抑制因子(LIF)受体、睫状神经营养性因子(CNTF)受体、抑癌素M(OSM)受体及Notch家庭受体。细胞因子受体的其他非限制性实例公开于Wang等人,(2009)Ann.Rev.Immunol.27:29-60中。
在某些实施方案中,该标靶可包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的成员。TNFR的非限制性实例包括TNFR1、TNFR2、淋巴细胞毒素β受体、OX40、CD40、Fas、诱杀受体3、CD27、CD70、CD226、CD137、ICOS、2B4、CD30、4-1BB、死亡受体3(DR3)、死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、死亡受体6(DR6)、诱杀受体1、诱杀受体2、NFκB受体活化因子(RANK)、骨保护素(OPG)、TWEAK受体、TACI、BAFF受体(BAFF-R)、HVEM(疱疹病毒进入介体、神经生长因子受体、B细胞成熟抗原(BCMA)、糖皮质激素诱导型TNF受体(GITR)、毒性及JNK诱导因子(TAJ)、RELT、TNFRSF22、TNFRSF23、外胚叶发育不全A2同种型异构受体及止汗受体外胚叶发育不全1。TNFR的其他非限制性实例公开于Naismith及Sprang(1998)Trends in Biochemical Sciences 23(2):74-79中。
在某些实施方案中,该标靶可包括低密度脂蛋白受体(LDLR)家族的成员。LDLR的非限制性实例包括LDLR、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)1、LRP10、LRP1B、LRP2、LRP4、LRP5、LRP5L、LRP6、LRP8、巢蛋白(Nidogen)(NID)-1、NID2、分拣蛋白(Sortilin)相关受体、L(SORL1)及极低密度脂蛋白受体(VLDLR)。
在某些实施方案中,该标靶可包括受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员。RTK的非限制性实例包括白细胞受体酪氨酸激酶(LTK)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)、Ephrin受体(Eph)、Trk受体、胰岛素受体(IR)及Tie2。RTK的其他非限制性实例公开于以下文献中:Alexander等人,(2013)The Concise Guide to Pharmacology 2013/14:Enzymes.Br.J.Pharmacol.170:1797-1867;Li及Hristova(2010);以及Lemrmon及Schlessinger(2010)Cell 141(7):1117-1134。
在其他实施方案中,该细胞表面受体可为生长激素受体、胰岛素受体、瘦激素受体、Flt-3配体受体或胰岛素样生长因子(IGF)-I受体。例示性受体包括例如hEPOR(Simon,S.等人,(1990)Blood 76,31-3);mEPOR(D’Andrea,AD.等人,(1989)Cell 57,277-285);hG-CSFR(Fukunaga,R.等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,8702-8706);mG-CSFR(Fukunaga,R.等人,(1990)Cell 61,341-350);hTPOR(Vigon,I.等人,(1992)89,5640-5644);mTPOR(Skoda,RC.等人,(1993)12,2645-2653);hInsR(Ullrich,A.等人,(1985)Nature 313,756-761);hFlt-3(Small,D.等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91,459-463);hPDGFR(Gronwald,R GK.等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85,3435-3439);hIFNa/b R(Uze,G.等人,(1990)Cell 60,225-234;及Novick,D.等人,(1994)Cell 77,391-400)。
在某些实施方案中,该标靶可包括神经生长因子受体家族及/或神经营养因子受体家族的成员。神经生长因子受体及神经营养因子受体的非限制性实例包括p75(也称为低亲和力神经生长因子受体(LNGFR))、TrkA、TrkB及TrkC。神经生长因子受体及神经营养因子受体的其他非限制性实例公开于Lotz等人,(1996)J.of Leukocyte Biology 60(1):1-7中。
在某些实施方案中,该标靶可包括生长因子受体家族的成员。例如且不具限制性,生长因子受体可为通过JAK/STAT、MAP激酶及PI3激酶途径进行信号传导的受体。生长因子受体的非限制性实例包括纤维母细胞生长因子受体(FGFR)、ErbB家族受体(例如表皮生长因子受体(EGFR))、血管内皮生长因子受体(VEGFR)及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)。
在某些实施方案中,该标靶可包括形成异源二聚体或异源三聚体以诱导细胞信号的受体。例如,但不作为限制,该标靶可为丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族的成员。丝氨酸/苏氨酸激酶受体的非限制性实例包括II型样活化素A受体I(ALK1)、I型活化素A受体(ALK2)、IA型骨形态发生蛋白受体(BMPR1A)、IB型活化素A受体(ALK4)、IC型活化素A受体(ALK7)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、IB型骨形态发生蛋白受体(BMPR1B)、转化生长因子β受体II(TGFBR2)、II型骨形态发生蛋白受体(BMPR2)、II型抗Mullerian激素受体(MISR2)、IIA型活化素A受体(ActR2)、IIB型活化素A受体(ActR2B)及转化生长因子β受体III(TGFBR3)。
在某些实施方案中,潜在标靶不包括以下各项:5T4;ADAM-10;ADAM-12;ADAM 17;AFP;AXL;ANGPT2炭疽抗原;BSG;CAIX;CAXII;CA 72-4;癌相关抗原CTAA16.88;CCL11;CCL2;CCR4;CCR5;CCR6;CD2;CD3E;CD4;CD5;CD6;CD15;CD18;CD19;CD20;CD22;CD24;CD25;CD29;CD30;CD32B;CD33;CD37;CD38;CD40;CD40LG;CD44;CD47;CD52;CD56;CD66E;CD72;CD74;CD79a;CD79b;CD80;CD86;CD98;CD137;CD147;CD138;CD168;CD200;CD248;CD254;CD257;CDH3;CEA;CEACAM5;CEACAM6;CEACAM8;Claudin4;CS-1;CSF2RA;CSPG-4;CTLA4;Cripto;DLL4;ED-B;EFNA2;EGFR;内皮素B受体;ENPP3;EPCAM;ERBB2;ERBB3;FAPα;FcγRI;FCER2;FGFR3;纤维蛋白IIβ链;FLT1;FOLH1;FOLR1;FRP-1;GD3神经节苷脂;GDF2;GLP1R;磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3;GPNM B;HBV(乙肝病毒);HCMV(人巨细胞病毒);热休克蛋白90同是物[白色念珠菌];单纯疱疹病毒gD糖蛋白;HGF;HIV-1;HIV-1IIIB gp120V3环;HLA-DRB(HLA-DRβ);人呼吸道合胞病毒糖蛋白F;ICAM1;IFNA1;IFNA1;双特异性IFNB1;IgE Fc;IGF1R;IGHE连接区;IL12B;IL13;IL15;IL17A;ILIA;IL1B;IL2RA;IL4;IL5;IL5RA;IL6;IL6R;IL9;白介素-2受体β亚单位;ITGA2;ITGA2B;ITGB3;ITGA4ITGB7;ITGA5;ITGAL;ITGAV_ITGB3;ITGB2;KDR;L1CAM;Lewis-y;脂聚糖LPS的结构域脂质A;LTA;MET;MMP14;MMpl5;MST1R;MSTN;MUC1;MUC4;MUC16;MUC5AC;NCA-90颗粒球细胞抗原;Nectin 4;NGF;NRP;NY-ESO-1;OX40L;PLAC-1;PLGF;PDGFRA;PD1;PDL1;PSCA;磷脂丝氨酸;PTK-7;绿脓杆菌血清型IATS Oil;RSV(人呼吸道合胞病毒糖蛋白F);ROR1;RTN4;SELL;SELP;STEAP1;志贺样毒素II B亚单位[大肠杆菌];SLAM7;SLC44A4;SOST;表皮葡萄球菌脂壁酸;T细胞受体α_β;TF;TGFB1;TGFB2;TMEFF2;TNC;TNF;TNFRSF10A;TNFRSF10B;TNFRSF12A;TNFSF13;TNFSF14;TNFSF2;TNFSF7;TRAILR2;TROP2;TYRP1;VAP-1;及波形蛋白。
在例示性实施方案中,该细胞表面受体为OX40。
在另一例示性实施方案中,该细胞表面受体为DR5。
在另一例示性实施方案中,该细胞表面受体为GITR。
在另一例示性实施方案中,该细胞表面受体为CD27。
在另一例示性实施方案中,该细胞表面受体为CD137。
在另一例示性实施方案中,该细胞表面受体为Tie2。
在某些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽或抗原结合复合物可用于激动个体的细胞表面受体,包括向该个体施用本文所述的复合物或抗原结合多肽。
在某些实施方案中,本文中所提供的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位可用于治疗或预防将受益于受体激动作用的各种疾病或病症,包括例如肿瘤,包括癌前肿瘤、非转移性肿瘤、转移性肿瘤及癌性肿瘤(例如早期癌症);癌症、过敏性或炎症性病症、自体免疫疾病、激素病症,或用于治疗处于发展癌症(例如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤或卵巢癌)、过敏性或炎症性病症或自体免疫疾病的风险下的个体。在一些实施方案中,该癌症为膀胱上皮癌(uBC)、黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肾癌或膀胱癌。
在某些实施方案中,该标靶可包括眼中所表达的细胞表面受体。不希望受理论束缚,认为本文所述的抗原结合复合物可有益于眼部治疗,此是由于例如其增强的对细胞表面受体的激动作用及/或其增加的尺寸(例如,与典型单克隆抗体相比),由此引起更长效的治疗。例示性眼标靶包括但不限于上皮生长因子(EGF)受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体、Tie2及纤维母细胞生长因子受体。眼标靶更详细论述于Rodrigues,E.B.等人,(2009)Prog.Retin.Eye Res.28:117-44中。
在某些实施方案中,该标靶可包括癌症或其他恶性细胞上所表达的用于靶向抗体-药物缀合物(ADC)的细胞表面受体。不希望受理论束缚,认为本文所述的抗原结合复合物可通过靶向受体及促进细胞内化,从而递送相关治疗化合物而有益于作为ADC的用途。通常,ADC靶向由癌症细胞或癌症治疗标靶表达的细胞表面抗原。这些抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白及其他细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调控因子、细胞增殖调控因子、与(因例如已知或疑似在功能上促成)组织发育或分化相关的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调控的分子、涉及血管发生的分子及与(因例如已知或疑似在功能上促成)血管生成相关的分子。肿瘤相关抗原可为群落分化因子(也即,CD蛋白)。抗原结合复合物能够结合的抗原可为以上提及的类别的一的子集的成员,其中该类别的其他子集包含具有不同的特征(相对于该相关抗原)的其他分子/抗原。ADC的例示性标靶包括但不限于HER2、MUC16、STEAP1、NAPI2B、LY6E、B7H4、CD79B及CD22。
抗体-药物缀合物(ADC)化合物的一例示性实施方案包含抗原结合复合物(Ab)及药物部分(D),其中该复合物由接头部分(L)连接至D;该组合物具有式I:
Ab-(L-D)p I
其中p为1、2、3或4。可例如使用具有游离改造半胱氨酸的半胱氨酸改造抗体将药物部分连接至本发明的复合物。
本发明的ADC化合物包括对于抗癌活性而言具有效用的ADC化合物。具体而言,这些化合物包括通过接头与药物部分(也即,毒素)结合(也即,共价连接)的复合物。当药物未与抗体结合时,该药物具有细胞毒性或细胞抑制效应。因而通过与抗原结合复合物结合来调节药物部分的生物活性。本发明的抗体-药物缀合物(ADC)选择性地递送有效剂量的细胞毒性剂至肿瘤组织,藉此可达到较大选择性,也即,较低有效剂量。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物部分(D)包括具有细胞毒性或细胞抑制效应的任何化合物、部分或基团。药物部分包括:(i)化学治疗剂,其可充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA插入剂;(ii)蛋白质毒素,其可具有酶功能;及(iii)放射性同位素。
例示性药物部分包括但不限于类美登素(maytansinoid)、奥里斯他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、单端孢霉素、CC1065、卡奇霉素及其他烯二炔抗生素、紫杉烷、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体、CBI-PBD异源二聚体、蒽环类及其立体异构体、等构物、类似物或衍生物。
适合用作类美登素药物部分的美登素化合物在本领域中为众所周知的,并且可根据已知方法自天然来源分离,使用基因改造技术产生(参见Yu等人,(2002)PROC.NAT.ACAD.SCI.(USA)99:7968-7973),或者根据已知方法合成制备美登醇及美登醇类似物。
例示性类美登素药物部分包括具有经修饰的芳环的类美登素药物部分,例如:C-19-脱氯(美国专利第4256746号)(通过氢化锂铝还原安丝菌素P2来制备);C-20-羟基(或C-20-脱甲基+/-C-19-脱氯(美国专利第4361650号及第4307016号)(通过使用链霉菌或放线菌进行脱甲基或使用LAH进行脱氯来制备);及C-20-脱甲氧基C-20-酰氧基(-OCOR)+/-脱氯(美国专利第4,294,757号)(通过使用酰基氯进行酰化来制备),以及在其他位置具有修饰的类美登素药物部分。
例示性类美登素药物部分也包括具有以下修饰的类美登素药物部分,例如:C-9-SH(US4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备);C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(US 4331598);C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(US 4450254)(由奴卡菌属制备);C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(通过以链霉菌转化美登醇来制备);C-15-甲氧基(美国专利第4313946号及第4315929号)(自滑桃树(Trewia nudlflora)分离);C-18-N-脱甲基(美国专利第4362663号及第4322348号)(通过以链霉菌对美登醇进行脱甲基来制备);及4,5-脱氧(US 4371533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。已知美登素化合物上的许多位置适用作连接位置,视连接类型而定。例如,对于形成酯键而言,具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置及具有羟基的C-20位置均为适合的。
药物部分包括卡奇霉素以及其类似物及衍生物。卡奇霉素家族抗生素能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。关于卡奇霉素家族的缀合物的制备,参见US 5712374、US5714586、US 5739116、US 5767285、US 5770701、US 5770710、US 5773001、US 5877296。可使用的卡奇霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG及θI1(Hinman等人,Cancer Research 53:3336-3342(1993);Lode等人,Cancer Research 58:2925-2928(1998)。
在一些实施方案中,ADC包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些实施方案中,PDB二聚体识别并结合特定DNA序列。1965年首次报导天然产物安曲霉素PBD(Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795;Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。自此,已报导许多天然存在的PBD及类似物(Thurston等人,(1994)Chem.Rev.1994,433-465),包括三环PBD支架的二聚体(US 6884799;US 7049311;US 7067511;US 7265105;US 7511032;US 7528126;US 7557099)。不受任何特定理论的束缚,据信二聚体结构赋予与B型DNA的小沟等同性(isohelicity)的适当三维形状,导致在结合位点的紧密配合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975);Hurley及Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19:230-237)。带有C2芳基取代基的二聚PBD化合物已显示适用作细胞毒性剂(Hartley等人,(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858;Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941;Howard等人,(2009)Bioorganic andMed.Chem.Letters 19(22):6463-6466)。
在一些实施方案中,PBD化合物可通过在N10位置上用体内可移除的氮保护基对其进行保护而用作前药(WO 00/12507;WO 2005/023814)。
在一些实施方案中,该免疫缀合物包含与一个或多个卡奇霉素分子结合的抗原结合复合物。卡奇霉素家族抗生素及其类似物能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂(Hinman等人,(1993)Cancer Research 53:3336-3342;Lode等人,(1998)Cancer Research 58:2925-2928)。卡奇霉素具有细胞内作用位点,但在某些情况下不容易越过胞质膜。因此,在一些实施方案中,通过抗体介导的内化对这些药剂进行细胞摄取可大幅增强其细胞毒性效应。用卡奇霉素药物部分制备抗体-药物缀合物的非限制性例示性方法描述于例如US 5712374、US 5714586、US 5739116及US 5767285中。
在一些实施方案中,ADC包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些实施方案中,PDB二聚体识别并结合特定DNA序列。1965年首次报导天然产物安曲霉素PBD(Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795;Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。自此,已报导许多天然存在的PBD及类似物(Thurston等人,(1994)Chem.Rev.1994,433-465),包括三环PBD支架的二聚体(US 6884799;US 7049311;US 7067511;US 7265105;US 7511032;US 7528126;US 7557099)。不受任何特定理论的束缚,据信二聚体结构赋予与B型DNA的小沟等同性的适当三维形状,导致在结合位点的紧密配合(Kohn,AntibioticsIII.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975);Hurley及Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19:230-237)。带有C2芳基取代基的二聚PBD化合物已显示适用作细胞毒性剂(Hartley等人,(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858;Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941;Howard等人,(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters19(22):6463-6466)。
在一些实施方案中,ADC包含蒽环类。蒽环类为展现细胞毒性活性的抗生素化合物。尽管不受任何特定理论束缚,但研究指示蒽环类可用于通过许多不同的机制杀死细胞,包括:1)将药物分子插入细胞的DNA中,从而抑制DNA依赖性核酸合成;2)由药物产生自由基,接着与细胞大分子反应以便对细胞造成损伤;及/或3)药物分子与细胞膜的相互作用(参见例如C.Peterson等人,“Transport And Storage Of Anthracycline In ExperimentalSystems And Human Leukemia”,Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy;N.R.Bachur,“Free Radical Damage”同上第97-102页)。由于其细胞毒性潜力,蒽环类已用于治疗许多癌症,例如白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(参见例如P.H-Wiernik,Anthracycline:Current Status And New Developments第11页)。
非限制性例示性蒽环类包括多柔比星、表柔比星、伊达比星、柔红霉素、奈莫柔比星及其衍生物。已制备并研究柔红霉素及多柔比星的免疫缀合物及前药(Kratz等人,(2006)Current Med.Chem.13:477-523;Jeffrey等人,(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362;Torgov等人,(2005)Bioconj.Chem.16:717-721;Nagy等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834;Dubowchik等人,(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532;King等人,(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343;EP0328147;US 6630579)。抗体-药物缀合物BR96-多柔比星特异性地与肿瘤相关抗原Lewis-Y反应且已在I期及II期研究中加以评估(Saleh等人,(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292;Ajani等人,(2000)Cancer Jour.6:78-81;Tolcher等人,(1999)J.Clin.Oncology17:478-484)。
在一些实施方案中,该免疫缀合物包含与一个或多个鹅膏毒素分子结合的抗原结合复合物。鹅膏毒素为由8个氨基酸组成的环肽。其可自毒鹅膏蕈菌分离或合成制备。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶II,且从而也抑制受影响细胞的转录及蛋白质生物合成。对细胞中的转录的抑制导致生长及增殖停止。参见例如Moldenhauer等人,JNCI 104:1-13(2012);WO2010115629、WO2012041504、WO2012119787、WO2014043403、WO2014135282及WO2012119787,这些文献以全文引用的方式并入在此。在一些实施方案中,该一个或多个鹅膏毒素分子为一个或多个α-毒鹅膏菌素分子。
其他药物部分包括蛋白质毒素,例如:白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌)、篦麻毒素A链(Vitetta等人,(1987)Science,238:1098)、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素(enomycin)及单端孢菌素(WO 93/21232)。
在某些实施方案中,该抗原结合复合物为双特异性的,且这些标靶可包括癌症或其他恶性细胞上所表达的细胞表面受体及例如T细胞的免疫细胞所表达的细胞表面受体(例如T细胞依赖性双特异性复合物或TDB)。不希望受理论束缚,认为本文所述的抗原结合复合物可能有益于作为TDB的用途,例如,由于其改良的亲合力,由此可获得更大细胞选择性及/或治疗指数。
例示性T细胞表达的标靶包括但不限于CD3。CD3(分化簇3)T细胞共受体为蛋白质复合物且由四条不同的链组成。在哺乳动物中,该复合物含有CD3γ链、CD3δ链及两个CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)及ζ链结合,以便在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ链及CD3分子共同形成TCR复合物。如本文所用的术语“CD3”是指来自任何人来源的任何天然CD3。该术语涵盖“全长”及未处理蛋白质以及由在细胞中处理产生的蛋白质或者一个或多个CD3链(多肽)的任何形式(例如成熟多肽)。该术语也涵盖CD3的天然存在的变体及同功异形体,例如剪接变体或等位基因变体。例如,CD3γ链、CD3δ链及CD3ε链及序列的描述提供于www.uniprot.org/uniprot/P04234、www.uniprot.org/uniprot/P07766及www.uniprot.org/uniprot/P09693。
在一些实施方案中,该双特异性复合物结合人CD3ε多肽。在一些实施方案中,该双特异性复合物结合与其他TCR亚单位缔合的天然T细胞受体(TCR)复合物中的人CD3ε多肽。在一些实施方案中,该双特异性复合物结合人CD3γ多肽。在一些实施方案中,该双特异性复合物结合与其他TCR亚单位缔合的天然T细胞受体(TCR)复合物中的人CD3γ多肽。
已知用于鉴别其具有生物活性的抗CD3抗体的分析法。生物活性可包括例如在体内、体外或离体与CD3多肽(例如T细胞表面上的CD3)或其肽片段的结合。在本发明的多特异性(例如双特异性)抗原结合复合物(例如具有一个抗癌抗原臂及另一CD3多肽识别臂的TDB抗体)的情况下,生物活性也可包括例如效应细胞活化(例如T细胞(例如CD8+及/或CD4+T细胞)活化)、效应细胞群扩增(也即,T细胞计数增加)、靶细胞群减少(也即,在其细胞表面上表达HER2的细胞群减少)及/或靶细胞杀死。提供在体内及/或体外具有这种生物活性的抗体。在某些实施方案中,测试本发明复合物的这种生物活性。
在某些实施方案中,该标靶可包括血脑屏障(BBB)细胞上所表达的细胞表面受体。不希望受理论束缚,认为本文所述的抗原结合复合物可能有益于输送治疗剂(例如治疗化合物或对相关标靶及BBB组分具有特异性的双特异性抗原结合复合物)越过BBB,例如,以便治疗由于其可能发生受体介导的吸收而致的脑部病症或疾病。BBB细胞表达的例示性标靶包括但不限于转铁蛋白受体、胰岛素样生长因子受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白1及2以及白喉毒素受体。BBB靶向治疗剂的进一步描述可见于例如Jones,A.R.and Shusta,E.V.(2007)Pharm.Res.24:1759-71。
OX40激动剂的用途
在某些实施方案中,如本文所述的结合OX40的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)可用于在个体中增强免疫反应、治疗癌症、预防癌症、增强其他癌症疗法的效力、增强疫苗效力、治疗病毒性或细菌性疾病或病症或者调节T细胞反应。
在一个方面中,提供一种用于在患有癌症的个体中增强免疫功能(例如通过上调细胞介导的免疫反应)的方法,该方法包括向该个体施用有效量的如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)。在一个方面中,提供一种用于在患有癌症的个体中增强T细胞功能的方法,该方法包括向该个体施用有效量的如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)。
在一些实施方案中,“增强T细胞功能”包括诱导、引起或刺激效应或记忆T细胞以具有更新、持续或扩增的生物功能。增强T细胞功能的实例包括:相对于干预前的水平,CD8+效应T细胞的γ-干扰素分泌增加、CD4+记忆及/或效应T细胞的γ-干扰素分泌增加、CD4+效应及/或记忆T细胞的增殖增加、CD8+效应T细胞的增殖增加、抗原反应性(例如清除率)增加。在一个实施方案中,增强程度为至少50%,或者60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%。测量此增强的方式为本领域技术人员已知的。
在一个方面中,提供一种用于在患有癌症的个体中增强免疫功能(例如通过减少免疫功能障碍及/或功能障碍免疫反应或免疫细胞)的方法,该方法包括向该个体施用有效量的如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)。在一些实施方案中,在免疫功能障碍的情形下,“功能障碍”是指对抗原刺激的免疫反应性降低的状态。在一些实施方案中,“功能障碍”也包括对抗原识别无感受性或无反应,具体而言,将抗原识别翻译成例如增殖、细胞因子产生(例如γ干扰素)及/或靶细胞杀死的下游T细胞效应子功能的能力受损。
在一个方面中,提供一种用于在患有癌症的个体中治疗肿瘤免疫及/或增强肿瘤免疫原性的方法,该方法包括向该个体施用有效量的如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)。在一些实施方案中,“肿瘤免疫”是指肿瘤逃避免疫识别及清除的过程。因而,在一些实施方案中,作为治疗原理,当这种逃避减弱时,肿瘤免疫得以“治疗”,且肿瘤被免疫系统识别并受到攻击。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤收缩及肿瘤清除。在一些实施方案中,“免疫原性”是指特定物质激起免疫反应的能力。肿瘤具有免疫原性且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫反应清除肿瘤细胞。
在一些实施方案中,如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)增强CD4+效应T细胞功能,例如,通过增加CD4+效应T细胞增殖及/或增加CD4+效应T细胞的γ干扰素产生(例如,与用结合OX40的激动性抗原结合复合物进行治疗之前的增殖及/或细胞因子产生相比)。在一些实施方案中,该细胞因子为γ干扰素。在一些实施方案中,如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)增加肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如,CD4+效应T细胞的总数目,或例如CD4+细胞占CD45+细胞的百分比),例如,与用结合OX40的激动性抗原结合复合物进行治疗之前的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞数目相比。在一些实施方案中,如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)增加表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如,总表达γ干扰素的CD4+细胞,或例如表达γ干扰素的CD4+细胞占总CD4+细胞的百分比),例如,与用结合OX40的激动性抗原结合复合物进行治疗之前表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞数目相比。
在一些实施方案中,如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)增加肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如,CD8+效应T细胞的总数目,或例如CD8+占CD45+细胞的百分比),例如,与用抗人OX40激动剂抗体进行治疗之前的肿瘤内(浸润)CD8+T效应细胞数目相比。在一些实施方案中,如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)增加表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如,表达γ干扰素的CD8+细胞占总CD8+细胞的百分比),例如,与用结合OX40的激动性抗原结合复合物进行治疗之前表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+T细胞数目相比。
在一些实施方案中,如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如,具有激动活性的四价抗原结合复合物)增强记忆T细胞功能,例如,通过增加记忆T细胞增殖及/或增加该记忆细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中,该细胞因子为γ干扰素。
在一些实施方案中,如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如,具有激动活性的四价抗原结合复合物)抑制Treg功能,例如,通过降低对效应T细胞功能(例如效应T细胞增殖及/或效应T细胞细胞因子分泌)的Treg抑制。在一些实施方案中,该效应T细胞为CD4+效应T细胞。在一些实施方案中,该抗人OX40激动性抗原结合复合物减少肿瘤内(浸润)Treg的数目(例如,Treg的总数目,或例如Fox3p+细胞占CD4+细胞的百分比)。
在一个实施方案中,本发明提供用于增强哺乳动物的免疫反应的方法,这些方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的结合OX40的抗原结合复合物(例如,具有激动活性的四价抗原结合复合物)。在某些实施方案中,这些方法包括刺激、激起、增加、改良或加强哺乳动物免疫系统的任何反应。该免疫反应可为细胞反应(也即,细胞介导的反应,例如细胞毒性T淋巴细胞介导的反应)或体液反应(也即,抗体介导的反应),且可为原发性或继发性免疫反应。免疫反应增强的实例包括CD4+辅助T细胞活性增加及产生溶细胞性T细胞。可使用本领域技术人员已知的众多体外或体内测量来评定免疫反应增强,包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞分析、细胞因子释放(例如IL-2产生)、肿瘤消退、携带肿瘤的动物的存活时间、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标记物的表达及细胞毒性。通常,当与未治疗哺乳动物或未使用所主张的方法加以治疗的动物的免疫反应相比时,本发明的方法增强哺乳动物的免疫反应。在一个实施方案中,该方法增强细胞免疫反应,尤其是细胞毒性T细胞反应。在另一实施方案中,该细胞免疫反应为T辅助细胞反应。在再另一个实施方案中,该免疫反应为细胞因子产生,尤其是IL-2产生。
在另一实施方案中,本发明提供治疗哺乳动物的癌症的方法,该方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)。在某些实施方案中,该方法包括在诊断患有癌症的哺乳动物中引起理想或有益的效应。该理想或有益效应可包括抑制癌细胞进一步生长或扩散、癌细胞死亡、抑制癌症复发、减轻与癌症相关的疼痛或提高动物的存活率。抑制癌症复发涵盖先前已通过辐射、化学疗法、手术或其他技术加以治疗的癌症位点及周围组织。该效应可为主观的或客观的。例如,若该动物为人,则该人可指出活力或生命力得到改良或疼痛有所减轻,作为主观症状改善或对治疗的反应。或者,临床医生可基于身体检查、实验室参数、肿瘤标记物或射线照相发现而注意到肿瘤大小或肿瘤负荷的减小。临床医生可针对治疗反应观测的一些实验室指标包括规范化测试,例如白细胞计数、红细球计数、血小板计数、红血球沉淀率及各种酶水平。另外,临床医生可观测可检测肿瘤标记物的减少。或者,可使用其他测试来评估客观改良,例如超声图、核磁共振测试及正电子发射测试。
在一个实施方案中,本发明提供用于预防哺乳动物的癌症的方法,这些方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的结合OX40的抗原结合复合物(例如,具有激动活性的四价抗原结合复合物)。在某些实施方案中,该方法包括在未证明瘤形成或肿瘤发生但鉴别到癌症素因(无论是通过基因筛选或是其他方式确定)的哺乳动物中延迟、抑制或预防癌症发作。该术语还包括治疗具有癌前病症的哺乳动物,以阻止癌前病症恶化的进展或使其恶化。癌前病症的实例包括增生、发育异常及组织变形。
在某些实施方案中,顺应如本文所述的结合OX40的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)治疗的癌症包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤及多发性骨髓瘤。在一些实施方案中,该癌症选自:非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌(CRC)及肝细胞癌。又,在一些实施方案中,该癌症选自:非小细胞肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤及乳腺癌(例如三阴性乳腺癌),包括其他癌症的转移形式。在一些实施方案中,该癌症为膀胱上皮癌(uBC)、黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肾癌或膀胱癌。
在一些实施方案中,癌症的实例进一步包括但不限于B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴细胞(SL)NHL;中级/滤泡性NHL;中级弥漫性NHL;高级免疫母细胞NHL;高级淋巴母细胞NHL;高级小无核裂细胞NHL;大体积疾病NHL;套细胞淋巴瘤;AIDS相关淋巴瘤;及瓦登斯特隆氏巨球蛋白血症);慢性淋巴细胞性白血病(CLL);急性淋巴母细胞性白血病(ALL);毛细胞白血病;慢性髓性白血病;及移植后淋巴组织增生性病症(PTLD),以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增殖、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)、B细胞增殖病症及梅格斯氏综合征。更特定实例包括但不限于复发性或难治性NHL、第一线低级NHL、第III/IV阶段NHL、化学疗法抗性NHL、前体B淋巴母细胞性白血病及/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病及/或前淋巴细胞性白血病及/或小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤及/或淋巴浆细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、结节外边缘区-MALT淋巴瘤、结节性边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤及/或浆细胞骨髓瘤、低级/滤泡性淋巴瘤、中级/滤泡性NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心性淋巴瘤(滤泡性)、中级弥漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、侵袭性NHL(包括侵袭性前线NHL及侵袭性复发性NHL)、自体干细胞移植后或难治性NHL复发、原代纵隔大B细胞淋巴瘤、原代渗出性淋巴瘤、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、大体积疾病NHL、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、前体(外周)大颗粒状淋巴细胞性白血病、蕈样真菌病及/或塞扎莱综合征、皮肤淋巴瘤、退行性大细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤。
在一些实施方案中,癌症的实例进一步包括但不限于B细胞增殖病症,其进一步包括但不限于淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))及淋巴细胞性白血病。这些淋巴瘤及淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤;b)小无核裂细胞淋巴瘤/伯基特氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤、偶发性伯基特氏淋巴瘤及非伯基特氏淋巴瘤);c)边缘区淋巴瘤(包括结节外边缘区B细胞淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织淋巴瘤,MALT)、结节性边缘区B细胞淋巴瘤及脾边缘区淋巴瘤);d)套细胞淋巴瘤(MCL);e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合型细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、原代纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤);f)毛细胞白血病;g)淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯托姆氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia);h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病;i)浆细胞肿瘤、浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤;及/或j)霍奇金病(Hodgkin’s disease)。
在任意这些方法的一些实施方案中,该癌症为B细胞增殖性病症。在一些实施方案中,该B细胞增殖性病症为淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性无痛性NHL、难治性NHL、难治性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)或套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中,该B细胞增殖性病症为NHL,例如无痛性NHL及/或侵袭性NHL。在一些实施方案中,该B细胞增殖性病症为无痛性滤泡性淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在任一本发明方法的一些实施方案中,该癌症呈现人效应细胞(例如受人效应细胞浸润)。用于检测人效应细胞的方法为本领域中众所周知的,包括例如通过IHC。在一些实施方案中,该癌症呈现高水平的人效应细胞。在一些实施方案中,人效应细胞为NK细胞、巨噬细胞、单核细胞中的一种或多种。在一些实施方案中,该癌症为本文所述的任何癌症。在一些实施方案中,该癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌(CRC)或肝细胞癌。
本文所述的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)可单独或与其他试剂组合用于疗法中。例如,本文所述的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)可与至少一种其他治疗剂共同施用。
以上所指出的这些组合疗法涵盖组合施用(其中两种以上治疗剂包括在相同或单独制剂中)及单独施用(在此情况下,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物的施用可在施用该其他治疗剂之前、同时及/或之后发生)。在一个实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物的施用及其他治疗剂的施用在彼此相距约一个月内或在约一、二或三周内或在约一、二、三、四、五或六天内。本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物也可与辐射疗法组合使用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与化学疗法或化学治疗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与辐射疗法或放射治疗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向疗法或靶向治疗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与免疫疗法或免疫治疗剂(例如单克隆抗体)联合施用。
“化学治疗剂”包括适用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括埃罗替尼(erlotinib)(Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(bortezomib)(Millennium Pharm.)、二硫龙(disulfiram)、没食子酸表儿茶素、盐孢菌酰胺A、卡非佐米(carfilzomib)、17-AAG(格尔德霉素(geldanamycin))、根赤壳菌素、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群(fulvestrant)(AstraZeneca)、舒尼替尼(sunitib)(Pfizer/Sugen)、来曲唑(letrozole)(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Novartis)、非那舒特(finasunate)(Novartis)、奥沙利铂(oxaliplatin)(Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(Rapamycin)(Sirolimus,Wyeth)、拉帕替尼(Lapatinib)(GSK572016,Glaxo Smith Kline)、氯那法尼(Lonafamib)(SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)(Bayer Labs)、吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca)、AG1478、烷基化剂,例如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺;烷基磺酸酯,例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶,例如苯佐替派(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及乌瑞替派(uredopa);乙烯亚胺及甲基蜜胺,包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺及三甲基蜜胺;聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(包括拓扑替康(topotecan)及伊立替康(irinotecan));苔藓抑素;海绵抑素;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物);念珠藻素(尤其念珠藻素1及念珠藻素8);肾上腺类固醇(包括强体松(prednisone)及培尼皮质醇(prednisolone));醋酸环妊酮;5α-还原酶,包括菲那雄胺(finasteride)及度他雄胺(dutasteride);伏立诺他(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、丙戊酸(valproicacid)、莫西司他(mocetinostat)、多拉司他汀;阿地白介素、滑石倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189及CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);水鬼蕉碱(pancratistatin);匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海绵抑素(spongistatin);氮芥类,例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧甲氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝基脲,例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine);抗生素,例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素,尤其卡奇霉素γ1I及卡奇霉素ω1I(AngewChem.Intl.Ed.Engl.199433:183-186);达内霉素(dynemicin),包括达内霉素A;双膦酸盐,例如氯膦酸盐;埃斯培拉霉素(esperamicin);以及新制癌菌素发色团及相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(anthramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-侧氧基-L-正亮氨酸、(多柔比星)、吗啉基多柔比星、氰基吗啉基多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星及脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星;抗代谢物,例如氨甲蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶酰蝶呤、三甲曲沙;嘌呤类似物,例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物,例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素,例如卡鲁睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯(testolactone);抗肾上腺剂,例如胺鲁米特、米托坦、曲洛司坦;叶酸补充剂,例如亚叶酸;醋葡内酯;醛磷酰胺糖苷;氨基乙酰丙酸;恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶;贝斯尿嘧啶(bestrabucil);比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);依氟鸟氨酸(elfomithine);依利醋铵;埃博霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟基脲;蘑菇多糖(lentinan);洛尼达宁(lonidainine);类美登素类(maytansinoids),例如美登素(maytansine)及安丝菌素类(ansamitocins);丙脒腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamnol);二胺硝吖啶(nitraerine);喷司他丁(pentostatin);蛋胺氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(1osoxantrone);足叶草酸;2-乙基酰肼;丙卡巴肼(procarbazine);聚糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofuran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2’,2"-三氯三乙胺;单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其T-2毒素、疣孢霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达喀尔巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;加西托辛;阿拉伯糖苷(“Ara-C”);环磷酰胺;噻替派;类紫杉醇,例如TAXOL(紫杉醇;Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、(无Cremophor)、白蛋白改造紫杉醇纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)及(多烯紫杉醇、多西他塞;Sanofi-Aventis);苯丁酸氮芥;(吉西他滨);6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;氨甲喋呤;铂类似物,例如顺铂及卡铂;长春花碱;伊妥普赛(VP-16);依弗酰胺;米托蒽醌;长春新碱;(长春瑞滨);能灭瘤;替尼泊苷;依达曲沙;柔红霉素;氨基蝶呤;卡培他滨伊班膦酸盐;CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄醇,例如视黄酸;以及以上任意个的可药用盐、酸及衍生物。
化学治疗剂也包括(i)用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂,例如抗雌激素及选择性雌激素受体调节剂(SERM),包括例如他莫西芬(tamoxifen)(包括柠檬酸他莫西芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、爱多昔芬(iodoxyfene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)及(柠檬酸托瑞米芬(toremifine));(ii)抑制可调节肾上腺中的雌激素产生的酶芳香酶的芳香酶抑制剂,例如例如4(5)-咪唑、胺鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦(exemestane);Pfizer)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、(伏氯唑(vorozole))、(来曲唑;Novartis)及(阿那曲唑(anastrozole);AstraZeneca);(iii)抗雄激素药物,例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin);布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(tripterelin)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、普雷马林(premarin)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸、芬维a胺(fenretinide)以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物);(iv)蛋白激酶抑制剂;(v)脂质激酶抑制剂;(vi)反义寡核苷酸,尤其是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途径中的基因,例如,例如PKC-α、Ralf及H-Ras的表达的反义寡核苷酸;(vii)核糖酶,例如VEGF表达抑制剂(例如)及HER2表达抑制剂;(viii)疫苗,例如基因疗法疫苗,例如及 rIL-2;拓扑异构酶1抑制剂,例如 及(ix)以及以上任意个的可药用盐、酸及衍生物。
化学治疗剂也包括抗体,例如阿仑单抗(alemtuzumab)(Campath)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(Genentech);西妥昔单抗(cetuximab)(Imclone);帕尼单抗(panitumumab)(Amgen)、利妥昔单抗(rituximab)(Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(2C4,Genentech)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech)、托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar,Corixia)及抗体药物缀合物吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Wyeth)。可作为与本发明化合物组合的药剂的具有治疗潜力的其他人源化单克隆抗体包括:阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿特珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、贝伐珠单抗DM1细胞毒(bivatuzumab mertansine)、坎妥珠单抗DM1细胞毒(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西福妥珠单抗(cidfusituzumab)、西妥珠单抗(cidtuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星、伊妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(1abetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫托珠单抗(motovizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼洛珠单抗(nolovizumab)、奴马珠单抗(numavizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥玛珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、培福妥珠单抗(pecfusituzumab)、培妥珠单抗(pectuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、雷利珠单抗(ralivizumab)、雷尼珠单抗(ranibizumab)、瑞西珠单抗(reslivizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、瑞维珠单抗(resyvizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、他卡珠单抗替塞坦(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非珠单抗(tefibazumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、图妥珠单抗西莫白介素(tucotuzumabcelmoleukin)、图库珠单抗(tucusituzumab)、乌马珠单抗(umavizumab)、乌托珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)及抗白介素-12(ABT-874/J695,Wyeth Research及Abbott Laboratories),其为重组专用人序列,经基因修饰以识别白介素-12p40蛋白的全长IgG1λ抗体。
化学治疗剂也包括“EGFR抑制剂”,其是指可结合或以其他方式直接与EGFR相互作用且防止或降低其信号传导活性的化合物,且替代地称为“EGFR拮抗剂”。这些药剂的实例包括结合EGFR的抗体及小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见Mendelsohn等人的美国专利第4,943,533号)及其变体,例如嵌合225(C225或西妥昔单抗;)及重整人225(H225)(参见Imclone Systems Inc.的WO 96/40210);完全人EGFR靶向抗体IMC-11F8(Imclone);结合II型突变EGFR的抗体(美国专利第5,212,290号);如美国专利第5,891,996号中所描述的结合EGFR的人源化及嵌合抗体;及结合EGFR的人抗体,例如ABX-EGF或帕尼单抗(参见WO98/50433,Abgenix/Amgen);EMD 55900(Stragliotto等人,Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996));EMD7200(马妥珠单抗),其为与EGF及TGF-α两者竞争EGFR结合的针对EGFR的人源化EGFR抗体(EMD/Merck);人EGFR抗体HuMax-EGFR(GenMab);称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3及E7.6.3且描述于US6,235,883中的完全人抗体;MDX-447(Medarex Inc);及mAb 806或人源化mAb 806(Johns等人,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可与细胞毒性剂结合,因而产生免疫缀合物(参见例如EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子,例如美国专利第5,616,582号、第5,457,105号、第5,475,001号、第5,654,307号、第5,679,683号、第6,084,095号、第6,265,410号、第6,455,534号、第6,521,620号、第6,596,726号、第6,713,484号、第5,770,599号、第6,140,332号、第5,866,572号、第6,399,602号、第6,344,459号、第6,602,863号、第6,391,874号、第6,344,455号、第5,760,041号、第6,002,008号及第5,747,498号以及以下PCT公开WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016及WO99/24037中所描述的化合物。特定小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774、埃罗替尼、(Genentech/OSI Pharmaceuticals);PD 183805(CI 1033、2-丙酰胺、N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-二盐酸盐,Pfizer Inc.);ZD1839、吉非替尼4-(3’-氯-4’-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉,AstraZeneca);ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉,Zeneca);BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺,Boehringer Ingelheim);PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚);(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶);CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺);EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth);AG1478(Pfizer);AG1571(SU 5271;Pfizer);双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂,例如拉帕替尼(GSK572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2-甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化学治疗剂也包括“酪氨酸激酶抑制剂”,包括前一段落中所指出的EGFR靶向药物;小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂,例如可得自Takeda的TAK165;ErbB2受体酪氨酸激酶的经口选择性抑制剂CP-724,714(Pfizer及OSI);双重HER抑制剂,例如EKB-569(可得自Wyeth),其优先结合EGFR但抑制过度表达HER2及EGFR的细胞;经口HER2及EGFR酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼(GSK572016;可得自Glaxo-SmithKline);PKI-166(可得自Novartis);泛-HER抑制剂,例如卡奈替尼(canertinib)(CI-1033;Pharmacia);Raf-1抑制剂,例如可得自ISISPharmaceuticals的反义药剂ISIS-5132,其抑制Raf-1信号传递;非HER靶向TK抑制剂,例如甲磺酸伊马替尼(可得自Glaxo SmithKline);多靶向酪氨酸激酶抑制剂,例如舒尼替尼(可得自Pfizer);VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂,例如瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584,可得自Novartis/Schering AG);MAPK细胞外调节激酶I抑制剂CI-1040(可得自Pharmacia);喹唑啉,例如PD 153035,4-(3-氯苯氨基)喹唑啉;吡啶并嘧啶;嘧啶并嘧啶;吡咯并嘧啶,例如CGP 59326、CGP 60261及CGP 62706;吡唑并嘧啶、4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶;姜黄素(二阿魏酰基甲烷、4,5-双(4-氟苯氨基)酞酰亚胺);含硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制剂;PD-0183805(Warner-Lamber);反义分子(例如结合HER编码核酸的其他反义分子);喹喏啉(美国专利第5,804,396号);酪氨酸磷酸化抑制剂(美国专利第5,804,396号);ZD6474(Astra Zeneca);PTK-787(Novartis/Schering AG);泛-HER抑制剂,例如CI-1033(Pfizer);Affinitac(ISIS3521;Isis/Lilly);甲磺酸伊马替尼PKI 166(Novartis);GW2016(Glaxo SmithKline);CI-1033(Pfizer);EKB-569(Wyeth);司马沙尼(Semaxinib)(Pfizer);ZD6474(AstraZeneca);PTK-787(Novartis/Schering AG);INC-1C11(Imclone)、雷帕霉素(西罗莫司,);或如任何以下专利公开中的任意个中所描述:美国专利第5,804,396号;WO 1999/09016(American Cyanamid);WO 1998/43960(American Cyanamid);WO 1997/38983(Warner Lambert);WO 1999/06378(Warner Lambert);WO 1999/06396(WarnerLambert);WO 1996/30347(Pfizer,Inc);WO 1996/33978(Zeneca);WO 1996/3397(Zeneca);及WO 1996/33980(Zeneca)。
化学治疗剂也包括地塞米松(dexamethasone)、干扰素、秋水仙碱、氯苯胺啶(metoprine)、环孢霉素、两性霉素(amphotericin)、甲硝哒唑(metronidazole)、阿仑单抗、阿利维A酸(alitretinoin)、别嘌呤醇(allopurinol)、阿米福汀(amifostine)、三氧化二砷、天冬酰胺酶、活BCG、癌思停(bevacuzimab)、贝沙罗汀(bexarotene)、克拉屈滨、克罗拉滨(clofarabine)、达贝泊汀α(darbepoetin alfa)、地尼白介素、右雷佐生、依伯汀(epoetin alfa)、埃罗替尼、非格司亭(filgrastim)、醋酸组胺瑞林(histrelin acetate)、替伊莫单抗(ibritumomab)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、来那度胺、左旋咪唑(levamisole)、美司钠(mesna)、甲氧沙林(methoxsalen)、南诺龙(nandrolone)、奈拉滨(nelarabine)、诺菲莫单抗(nofetumomab)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、帕利夫明(palifermin)、帕米膦酸盐、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)、普卡霉素(plicamycin)、卜吩姆钠(porfimer sodium)、奎吖因(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、沙格司亭(sargramostim)、替莫唑胺(temozolomide)、VM-26、6-TG、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星(valrubicin)、唑来膦酸盐及唑来膦酸以及其可药用盐。
化学治疗剂也包括氢化可体松(hydrocortisone)、醋酸氢化可体松、醋酸可体松、新戊酸替可体松(tixocortol pivalate)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、氟羟泼尼松龙醇(triamcinolone alcohol)、莫美他松(mometasone)、安西奈德(amcinonide)、布地奈德(budesonide)、地奈德(desonide)、氟欣诺能(fluocinonide)、丙酮化氟新龙(fluocinolone acetonide)、倍他米松(betamethasone)、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟考龙(fluocortolone)、氢化可体松-17-丁酸酯、氢化可体松-17-戊酸酯、双丙酸阿氯米松(aclometasone dipropionate)、戊酸倍他米松、双丙酸倍他米松、泼尼卡酯(prednicarbate)、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他松-17-丙酸酯、氟考龙己酸酯、氟考龙新戊酸酯及氟泼尼定醋酸酯(fluprednidene acetate);免疫选择性消炎肽(ImSAID),例如苯丙氨酸-麸胺酰胺-甘氨酸(FEG)及其D异构形式(feG)(IMULAN BioTherapeutics,LLC);抗风湿病药物,例如咪唑硫嘌呤(azathioprine)、环孢灵(ciclosporin)(环孢霉素A)、D青霉胺、金盐、羟氯奎、来氟米特(leflunomide)、米诺环素(minocycline)、柳氮磺胺吡啶;肿瘤坏死因子α(TNFα)阻断剂,例如依那西普(Enbrel)、英利昔单抗(infliximab)(Remicade)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(golimumab)(Simponi);白介素1(IL-1)阻断剂,例如阿那白滞素(anakinra)(Kineret);T细胞共刺激阻断剂,例如阿巴西普(abatacept)(Orencia);白介素6(IL-6)阻断剂,例如托西珠单抗白介素13(IL-13)阻断剂,例如来金珠单抗(lebrikizumab);干扰素α(IFN)阻断剂,例如隆塔珠单抗(Rontalizumab);β7整合素阻断剂,例如rhuMAbβ7;IgE途径阻断剂,例如抗M1初次免疫单抗;分泌同源三聚LTa3及膜结合异源三聚体LTa1/β2阻断剂,例如抗淋巴细胞毒素α(LTa);放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu放射性同位素);众多研究药剂,例如硫铂(thioplatin)、PS-341、丁酸苯酯、ET-18-OCH3或法呢基转移酶抑制剂(L-739749、L-744832);多元酚,例如槲皮素(quercetin)、白藜芦素(resveratrol)、白皮杉醇(piceatannol)、没食子酸表儿茶素、茶黄素类(theaflavins)、黄烷醇类(flavanols)、原花青素类(procyanidins)、桦木酸(betulinic acid)及其衍生物;自噬抑制剂,例如氯喹;δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol),);β-拉帕酮;拉帕醇;秋水仙碱;桦木酸;乙酰基喜树碱、东莨菪素及9-氨基喜树碱);鬼臼毒素;替加氟(tegafur)贝沙罗汀双膦酸盐,例如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、艾提膦酸盐(etidronate)NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)阿伦膦酸盐帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)及表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗,例如疫苗;哌立福新(perifosine)、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib)或依托考昔(etoricoxib))、蛋白酶体抑制剂(例如PS341);CCI-779;替吡法尼(tipifarnib)(R11577);奥拉非尼(orafenib)、ABT510;Bcl-2抑制剂,例如奥利默森钠(oblimersen sodium)匹杉琼;法尼基转移酶抑制剂,例如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636,SARASARTM);以及以上任意个的可药用盐、酸或衍生物;以及以上两者以上的组合,例如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱及泼尼松龙组合疗法的缩写CHOP及奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU及甲酰四氢叶酸组合的治疗方案的缩写FOLFOX。
化学治疗剂也包括具有止痛、退热及消炎效应的非类固醇消炎药。NSAID包括酶环加氧酶的非选择性抑制剂。NSAID的特定实例包括阿司匹灵(aspirin);丙酸衍生物,例如布洛芬(ibuprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、奥沙普嗪(oxaprozin)及萘普生(naproxen);乙酸衍生物,例如吲哚美辛(indomethacin)、舒林达酸(sulindac)、依托度酸(etodolac)、双氯芬酸(diclofenac);烯醇酸衍生物,例如吡罗昔康、美罗昔康、替诺昔康(tenoxicam)、曲恶昔康(droxicam)、氯诺昔康(lornoxicam)及伊索昔康(isoxicam);灭酸(fenamic acid)衍生物,例如甲灭酸、甲氯灭酸、氟灭酸、托灭酸(tolfenamic acid);及COX-2抑制剂,例如塞来昔布、依托昔布、鲁米昔布(lumiracoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、罗非昔布及伐地昔布(valdecoxib)。NSAID可经指示用于例如变形性关节炎、骨关节炎、炎性关节病、强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、莱特尔氏综合征(Reiter’s syndrome)、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛及偏头痛、手术后疼痛、由于炎症所致的轻度至中度疼痛以及组织损伤、发热、肠梗阻及肾绞痛的病状的症状缓解。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与PARP抑制剂(例如奥拉帕尼(Olaparanib)、瑞卡帕布(Rucaparib)、尼拉帕尼(Niraparib)、西地尼布(Cediranib)、BMN673、维利帕尼(Veliparib))、曲贝替定(Trabectedin)、nab-紫杉醇(nab-paclitaxel)(蛋白结合紫杉醇,ABRAXANE)、曲班尼布(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布、帕博西尼、依维莫司(everolimus)、氟嘧啶(例如FOLFOX、FOLFIRI)、IFL、瑞格非尼(regorafenib)、溶瘤病毒(Reolysin)、爱宁达(Alimta)、立克癌(Zykadia)、索坦(Sutent)、特癌适(Torisel)(替西罗莫司(temsirolimus))、Inlyta(阿西替尼,Pfizer)、癌伏妥(Afinitor)(依维莫司,Novartis)、蕾莎瓦(Nexavar)(索拉非尼,Onyx/Bayer)、福退癌(Votrient)、帕唑帕尼、阿西替尼(axitinib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂(例如阿帕妥新(apatorsin))、Ad-GM-CSF(CT-0070)、替莫唑胺、IL-2、IFNa、长春花碱、Thalomid、达喀尔巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、氮胞苷、来那度胺、硼替佐米(bortezomid)(VELCADE)、胺柔比星(amrubicine)、卡非佐米、普拉曲沙(pralatrexate)及/或恩扎妥林(enzastaurin)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与PD-1轴结合拮抗剂联合施用。PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂及PD-L2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279及SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274及B7-H。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc及CD273。在一些实施方案中,PD-1、PD-L1及PD-L2为人PD-1、PD-L1及PD-L2。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合的分子。在一特定方面中,该PD-1配体结合配偶体为PD-L1及/或PD-L2。在另一实施方案中,PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在一特定方面中,PD-L1结合配偶体为PD-1及/或B7-1。在另一实施方案中,该PD-L2结合拮抗剂为抑制PD-L2与其结合配偶体的结合的分子。在一特定方面中,PD-L2结合配偶体为PD-1。该拮抗剂可为抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白质或寡肽。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中,该抗PD-1抗体选自:MDX-1106(尼鲁单抗(nivolumab),OPDIVO)、Merck 3475(MK-3475、喷罗珠单抗(pembrolizumab),KEYTRUDA)、CT-011(皮地珠单抗(Pidilizumab))、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、BGB-108及BGB-A317。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂为免疫黏附素(例如,包含与恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂为AMP-224。在一些实施方案中,该PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。在一些实施方案中,该抗PD-L1结合拮抗剂选自:YW243.55.S70、MPDL3280A(阿替珠单抗(atezolizumab))、MEDI4736(度伐鲁单抗(durvalumab))、MDX-1105及MSB0010718C(阿维鲁单抗(avelumab))。MDX-1105,也称为BMS-936559,为WO2007/005874中所描述的抗PD-L1抗体。抗体YW243.55.S70(重链及轻链可变区序列分别示于SEQ ID No.20及21中)为WO 2010/077634A1中所描述的抗PD-L1。MDX-1106,也称为MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或尼鲁单抗,为WO2006/121168中所描述的抗PD-1抗体。Merck 3475,也称为MK-3475、SCH-900475或喷罗珠单抗,为WO2009/114335中所描述的抗PD-1抗体。CT-011,也称为hBAT、hBAT-1或皮地珠单抗,为WO2009/101611中所描述的抗PD-1抗体。AMP-224,也称为B7-DCIg,为WO2010/027827及WO2011/066342中所描述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。在一些实施方案中,该抗PD-1抗体为MDX-1106。“MDX-1106”的替代名称包括MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或尼鲁单抗。在一些实施方案中,该抗PD-1抗体为尼鲁单抗(CAS登录号:946414-94-4)。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对活化共刺激分子的激动剂联合施用。在一些实施方案中,活化共刺激分子可包括CD40、CD226、CD28、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127。在一些实施方案中,该针对活化共刺激分子的激动剂为结合CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127的激动剂抗体。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对抑制性共刺激分子的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,抑制性共刺激分子可包括CTLA-4(也称为CD152)、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精氨酸酶。在一些实施方案中,针对抑制性共刺激分子的拮抗剂为结合CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3(例如LAG-3-IgG融合蛋白质(IMP321))、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精氨酸酶的拮抗性抗体。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CTLA-4(也称为CD152)的拮抗剂,例如阻断抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与伊匹木单抗(也称为MDX-010、MDX-101或)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与曲美木单抗(tremelimumab)(也称为替西木单抗(ticilimumab)或CP-675,206)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对B7-H3(也称为CD276)的拮抗剂,例如阻断抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与MGA271联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对TGFβ的拮抗剂,例如美替木单抗(metelimumab)(也称为CAT-192)、夫苏木单抗(fresolimumab)(也称为GC1008)或LY2157299联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与包括对表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL)进行过继转移的治疗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与UCART19联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与WT128z联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与KTE-C19(Kite)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与CTL019(Novartis)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与包括对包含显性阴性TGFβ受体,例如II型显性阴性TGFβ受体的T细胞进行过继转移的治疗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与包括HERCREEM方案(参见例如ClinicalTrials.gov标识符NCT00889954)的治疗联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD19的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与MOR00208联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD38的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与达雷木单抗(daratumumab)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD137(也称为TNFRSF9、4-1BB或ILA)的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与乌瑞鲁单抗(urelumab)(也称为BMS-663513)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD40的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与CP-870893联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对OX40(也称为CD134)的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与不同的抗OX40抗体(例如AgonOX)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD27的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与CDX-1127联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,其中该IDO拮抗剂为1-甲基-D-色氨酸(也称为1-D-MT)。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD137(也称为TNFRSF9、4-1BB或ILA)的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD40的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与CP-870893或RO7009789联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对OX40(也称为CD134)的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对CD27的激动剂,例如活化抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与CDX-1127(也称为伐利鲁单抗(varlilumab))联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,其中该IDO拮抗剂为1-甲基-D-色氨酸(也称为1-D-MT)。在一些实施方案中,该IDO拮抗剂为WO2010/005958(其内容以记录的方式明确并入本文中)中所示的IDO拮抗剂。在一些实施方案中,该IDO拮抗剂为4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N’-羟基-1,2,5-恶二唑-3-甲脒(例如,如WO2010/005958的实施例23中所描述)。在一些实施方案中,该IDO拮抗剂为:
在一些实施方案中,该IDO拮抗剂为INCB24360。在一些实施方案中,该IDO拮抗剂为Indoximod(1-甲基-色氨酸的D异构体)。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与抗体-药物缀合物联合施用。在一些实施方案中,该抗体-药物缀合物包含DM1细胞毒或单甲基奥里斯他汀E(MMAE)。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与抗NaPi2b抗体-MMAE缀合物(也称为DNIB0600A、RG7599或利法珠单抗维多汀(lifastuzumab vedotin))联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与曲妥珠单抗安坦辛(也称为T-DM1、ado-曲妥珠单抗安坦辛或Genentech)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与抗MUC16抗体-MMAE缀合物DMUC5754A联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与抗MUC16抗体-MMAE缀合物DMUC4064A联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向内皮素B受体(EDNBR)的抗体-药物缀合物,例如针对EDNBR的抗体与MMAE的缀合物联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向淋巴细胞抗原6复合物基因座E(Ly6E)的抗体-药物缀合物,例如针对Ly6E的抗体与MMAE的缀合物(也称为DLYE5953A)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与普拉土珠单抗维多汀(polatuzumab vedotin)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CD30的抗体-药物缀合物联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与ADCETRIS(也称为贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin))联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与普拉土珠单抗维多汀联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与血管生成抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对VEGF,例如VEGF-A的抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗(也称为Genentech)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对血管生成素2(也称为Ang2)的抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与MEDI3617联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对VEGFR2的抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与雷莫芦单抗(ramucirumab)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与VEGF受体融合蛋白质联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与阿柏西普(aflibercept)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与ziv-阿柏西普(也称为VEGF Trap或)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与针对VEGF及Ang2的双特异性抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与RG7221(也称为伐努西珠单抗(vanucizumab))联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与血管生成抑制剂联合及与PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂,例如抗PD-1抗体;PD-L1结合拮抗剂,例如抗PD-L1抗体;及PD-L2结合拮抗剂,例如抗PD-L2抗体)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂,例如抗PD-1抗体;PD-L1结合拮抗剂,例如抗PD-L1抗体;及PD-L2结合拮抗剂,例如抗PD-L2抗体)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及MDX-1106(尼鲁单抗,OPDIVO)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及Merck 3475(MK-3475、喷罗珠单抗、KEYTRUDA)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及CT-011(皮地珠单抗)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及MEDI-0680(AMP-514)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及PDR001联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及REGN2810联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及BGB-108联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及BGB-A317联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及YW243.55.S70联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及MPDL3280A联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及MEDI4736联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及MDX-1105联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与贝伐珠单抗及MSB0010718C(阿维鲁单抗)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与抗肿瘤药联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CSF-1R(也称为M-CSFR或CD115)的药剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与抗CSF-1R抗体(也称为IMC-CS4或LY3022855)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与抗CSF-1R抗体RG7155(也称为RO5509554或伊玛妥珠单抗(emactuzumab))联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与干扰素(例如干扰素α或干扰素γ)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与Roferon-A(也称为重组干扰素α-2a)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与GM-CSF(也称为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、rhu GM-CSF、沙格司亭或)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-2(也称为阿地白介素或)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-12联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL27联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-15联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与ALT-803联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CD20的抗体联合施用。在一些实施方案中,该靶向CD20的抗体为奥妥珠单抗(obinutuzumab,也称为GA101或)或利妥昔单抗。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向GITR的抗体联合施用。在一些实施方案中,该靶向GITR的抗体为TRX518。在一些实施方案中,该靶向GITR的抗体为MK04166(Merck)。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与依鲁替尼联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)及/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)的抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与AG-120(Agios)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与奥妥珠单抗及PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂,例如抗PD-1抗体;PD-L1结合拮抗剂,例如抗PD-L1抗体;及PD-L2结合拮抗剂,例如抗PD-L2抗体)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与癌症疫苗联合施用。在一些实施方案中,该癌症疫苗为肽癌症疫苗,在一些实施方案中为个人源化肽疫苗。在一些实施方案中,该肽癌症疫苗为多价长肽、多肽、肽混合液、杂合肽或肽脉冲树突细胞疫苗(参见例如Yamada等人,CancerSci,104:14-21,2013)。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与佐剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与包含TLR激动剂,例如聚ICLC(也称为)、LPS、MPL或CpG ODN的治疗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与肿瘤坏死因子(TNF)α联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-1联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与HMGB1联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-10拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-4拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-13拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL-17拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与HVEM拮抗剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与ICOS激动剂联合施用,例如通过施用ICOS-L或针对ICOS的激动剂抗体。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CX3CL1的治疗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CXCL9的治疗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CXCL10的治疗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CCL5的治疗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与LFA-1或ICAM1激动剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与选择蛋白激动剂联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与B-Raf抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与维罗非尼(vemurafenib)(也称为)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与达拉非尼(dabrafenib)(也称为)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与恩可非尼(encorafenib)(LGX818)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与EGFR抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与埃罗替尼(也称为)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与EGFR-T790M抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与吉非替尼联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与阿法替尼联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与西妥昔单抗(也称为)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与帕尼单抗(也称为)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与罗西替尼(rociletinib)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与AZD9291联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与MEK,例如MEK1(也称为MAP2K1)及/或MEK2(也称为MAP2K2)的抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与考比替尼(cobimetinib)(也称为GDC-0973或XL-518)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与曲美替尼(trametinib)(也称为)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与比尼替尼(binimetinib)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与B-Raf抑制剂(例如维罗非尼或达拉非尼)及MEK(例如MEK1及/或MEK2)抑制剂(考比替尼或曲美替尼)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与ERK(例如ERK1/2)抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与GDC-0994联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与B-Raf抑制剂、MEK抑制剂及ERK1/2抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与EGFR抑制剂、MEK抑制剂及ERK1/2抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与一种或多种MAP激酶途径抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与CK127联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与K-Ras抑制剂联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与c-Met抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与奥那土珠单抗(onartuzumab)(也称为MetMAb)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与未分化(anaplatic)淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与AF802(也称为CH5424802或艾乐替尼(alectinib))联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与克唑替尼联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与色瑞替尼(ceritinib)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与布帕西布(buparlisib)(BKM-120)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与皮克西布(pictilisib)(也称为GDC-0941)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与布帕西布(也称为BKM-120)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与哌立福新(也称为KRX-0401)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的δ-选择性抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与艾代拉利司(idelalisib)(也称为GS-1101或CAL-101)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与他塞利西(taselisib)(也称为GDC-0032)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与BYL-719联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与Akt抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与MK2206联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与GSK690693联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与伊帕他塞(ipatasertib)(也称为GDC-0068)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与mTOR抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与斥消灵(sirolimus)(也称为雷帕霉素)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与替西罗莫司(也称为CCI-779或)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与依维莫司(也称为RAD001)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与利达福莫司(ridaforolimus)(也称为AP-23573、MK-8669或地福莫司(deforolimus))联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与OSI-027联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与AZD8055联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与INK128联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与双重PI3K/mTOR抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与XL765联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与GDC-0980联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与BEZ235(也称为NVP-BEZ235)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与BGT226联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与GSK2126458联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与PF-04691502联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与PF-05212384(也称为PKI-587)联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与选择性地降解雌激素受体的药剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与GDC-0927联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与HER3抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与度利戈珠单抗(duligotuzumab)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与LSD1抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与MDM2抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与BCL2抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与维奈托克(venetoclax)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与CHK1抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与GDC-0575联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与活化hedgehog信号传导途径抑制剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与ERIVEDGE联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与放射疗法联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与吉西他滨联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与nab-紫杉醇(ABRAXANE)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与曲妥珠单抗联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与TVEC联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与IL27联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与环磷酰胺联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与招募T细胞至肿瘤的药剂联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与利瑞鲁单抗(lirilumab)(IPH2102/BMS-986015)联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与艾代拉利司联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CD3及CD20的抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与REGN1979联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与靶向CD3及CD19的抗体联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与布利莫单抗联合施用。
在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与溶瘤病毒联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与卡铂及nab-紫杉醇联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与卡铂及紫杉醇联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与顺铂及培美曲塞联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与顺铂及吉西他滨联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与FOLFOX联合施用。在一些实施方案中,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物可与FOLFIRI联合施用。
以上所指出的这些组合疗法涵盖组合施用(其中两种以上治疗剂包括在相同或单独制剂中)及单独施用(在此情况下,本文所述的抗原结合多肽(例如抗体)或复合物的施用可在施用该其他治疗剂及/或佐剂之前、同时及/或之后发生)。本发明的抗体或复合物也可与放射疗法组合使用。
本发明的抗体或复合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用,包括肠胃外,肺内和鼻内,并且如果需要局部治疗,病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。给药可以通过任何合适的途径,例如,通过注射,例如静脉内或皮下注射,部分取决于给药是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案,包括但不限于在各种时间点上的单次或多次施用,浓注施用和脉冲输注。
本发明的抗体或复合物可以以符合良好医学实践的方式配制,给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的原因、药剂的递送部位、给药方法、给药方案以及医生所知的其他因素。抗体或复合物不必是,但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制。这些其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型,以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和给药途径使用,或者以本文所述剂量的约1%至99%,或以任何剂量和经验/临床确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病,本发明的抗体或复合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是否是用于预防或治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应,以及主治医师的判断。抗体或复合物适合一次性或在一系列治疗中给予患者。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至40mg/kg的抗体或复合物可以是用于给予患者的初始候选剂量,例如,通过一次或多次单独给药,或通过持续输注。取决于上述因素,一种典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复给药,取决于病症,通常持续治疗直至发生所需的疾病症状抑制。这些剂量可以间歇给药,例如,每周或每三周(例如,使患者接受约2至约20,或例如约6个剂量的抗体)。可施用初始较高负荷剂量,然后施用一种或多种较低剂量。然而,其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
使用Tie2激动剂
在某些实施方案中,本发明提供用于治疗或预防哺乳动物的疾病或病症的方法,这些方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的结合Tie2的抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)。在某些实施方案中,如本文所述的Tie2激动剂可用于刺激血管生成,且可用于需要促进血管生成的多种临床情形。这些适应症的非限制性实例包括再生组织血管生成、局部缺血性肢体病、大脑局部缺血、血管炎症病状(包括动脉硬化)、无血管形成性坏死、刺激毛发生长及勃起功能障碍。在某些实施方案中,如本文所述的Tie2激动剂可用于降低血管渗透率,例如,在渗漏血管位点。这种方法可用于多种临床情形,其非限制性实例包括中风、黄斑变性、黄斑水肿、淋巴水肿、血液-视网膜屏障破环、血脑屏障破环(例如在化学治疗性治疗期间)及肿瘤血管系统正常化以促进药物递送及增加放射敏感性。在某些实施方案中,如本文所述的Tie2激动剂可用于抑制内皮细胞的凋亡。这种方法可用于多种临床情形,其非限制性实例包括肾脏纤维化、中风、黄斑变性及糖尿病并发症(例如肾、眼、皮肤及/或肢体中)。在其他实施方案中,如本文所述的Tie2激动剂可用于刺激创伤愈合。
筛选分析
本文还提供了鉴定具有激动剂活性的多肽的方法。特别地,当作为单个多肽(例如,单个抗体,抗体片段,配体等)表达时,抗原结合多肽可能不具有激动剂活性,然而,当相同多肽存在于如本文所述的四价复合物的情形下时,复合物可以表现出激动剂活性。因此,通过筛选单个多肽的激动剂活性,可能存在许多作为假阴性被丢弃的候选物,例如,当包含于复合物中时能够充当激动剂但当以孤立形式存在时不展现这种活性的多肽。因此,如本文所述的抗原结合复合物可用于候选多肽的初始筛选中,以鉴定具有激动剂活性的其他多肽。
因此,在某些实施方案中,本公开提供了用于鉴定具有激动剂活性的抗原结合复合物(例如,四价抗原结合复合物)的新方法。该方法包括提供如本文所述的多种抗原结合复合物(例如,具有激动剂活性的四价抗原结合复合物),针对细胞表面受体筛选抗原结合复合物,以及选择对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合复合物。在某些实施方案中,抗原结合复合物可以作为抗原结合复合物的文库提供,其氨基酸序列彼此不同。这些文库提供了非常有用的资源,用于鉴定与细胞表面受体结合并对细胞表面受体具有激动剂活性的抗原结合复合物。
在某些实施方案中,可用于这种筛选测定的抗原结合复合物可以是其中每个抗原结合复合物是四价的文库。在一些实施方案中,复合物是单特异性或单表位的,其中给定复合物中的每个抗原结合多肽结合相同的表位,并且每个四价复合物含有结合相同靶标的不同抗体,例如,基本上针对给定细胞表面标靶产生的单特异性抗体的复合物库。在一些实施方案中,所述复合物是双表位的,其中每个复合物包含两个或更多个结合不同表位(例如,相同靶标)的抗原结合多肽,并且每个四价复合物靶向表位的不同组合,例如,基本上针对给定细胞表面标靶产生的单特异性抗体的复合物文库。这些文库可用于例如鉴定结合细胞表面受体并激动受体的抗体(或抗原结合复合物)。
可通过本领域中已知的各种分析法来表征本文所述的抗原结合复合物或抗原结合多肽的物理/化学性质及生物功能。例如,如本文中所例示,可例如使用大小排阻层析(SEC)监测复合物形成及/或纯度来分析复合物形成。
在某些实施方案中,可通过一系列分析法来表征抗原结合复合物或抗原结合多肽,包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析及木瓜蛋白酶消化。
在某些实施方案中,可分析抗原结合复合物或抗原结合多肽的生物活性,例如,例如抗原结合活性。抗原结合分析法为本领域中已知的,且可用于本文中,包括例如使用例如Western印记、放射免疫分析法、ELJSA(酶联免疫吸附分析法)、“夹心”免疫分析法、免疫沉淀分析法、荧光免疫分析法及蛋白A免疫分析法的技术的任何直接或竞争性结合分析法。
在另一方面中,可使用竞争分析法来鉴别与参考抗体竞争同标靶结合的抗体。在某些实施方案中,这种竞争抗体结合与参考抗体所结合的表位相同的表位(例如,线性或构型表位)。用于对抗体所结合的表位进行作图的详细例示性方法提供于Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols”,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一例示性竞争分析中,在包含结合靶多肽(例如OX40)的第一标记抗体及正测试其与该第一抗体竞争同该靶多肽结合的能力的第二未标记抗体的溶液中培育固定的靶多肽。该第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含该第一标记抗体但不含该第二未标记抗体的溶液中培育固定的靶多肽。在允许该第一抗体与靶多肽结合的条件下培育之后,移除过量未结合抗体,并且测量与固定的靶多肽结合的标记的量。若测试样品中与固定的靶多肽结合的标记的量相对于对照样品有所减少,则表明该第二抗体与该第一抗体竞争同靶多肽结合。参见Harlow及Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
在其他实施方案中,可分析本文所述的抗原结合复合物或抗原结合多肽的激动活性。在一些实施方案中,在体外测试该激动活性(例如,在无细胞或基于细胞的分析法中,与在完整哺乳动物中进行的体内分析相反)。在某些实施方案中,可通过分析依赖配体生长的细胞当在细胞培养期间加入抗原结合复合物或多肽时与当加入配体时相比是否将以相同方式生长,来测定本文所述的抗原结合复合物或抗原结合多肽的激动活性。若细胞以相同或相似方式生长,则确定该抗原结合复合物或多肽具有激动活性。在某些实施方案中,可通过分析具有固有配体依赖性活性(不限于生长)的细胞系当在细胞培养期间加入抗原结合复合物或多肽时与当加入配体时相比是否显示相同反应,来测定本文所述的抗原结合复合物或抗原结合多肽的激动活性。若该细胞系显示与配体相同或相似的反应,则确定该抗原结合复合物或多肽具有激动活性。
在某些实施方案中,能够转导以上提及的细胞生长信号的细胞表达对细胞表面上的配体具有反应性的受体。当配体(或激动性抗原结合复合物或多肽)结合该受体时,这些细胞转导细胞生长信号。在某些实施方案中,适用于筛选激动活性的细胞在配体与细胞上的细胞表面受体结合后增殖或转导信号。在其他实施方案中,当细胞表面受体为不转导信号至细胞中的细胞表面受体时,则通过使非转导受体的细胞外域(例如配体结合域)与转导信号至细胞中的受体的细胞内结构域融合来制备嵌合受体。适合于通过与配体结合受体融合来构建嵌合受体的受体包括转导信号的任何受体,包括例如G-CSF受体、mpl、neu、GM-CSF受体、EPO受体、c-Kit及FLT-3受体。用于表达这些受体的细胞包括例如BaF3、NFS60、FDCP-1、FDCP-2、CTLL-2、DA-1及KT-3。
在某些实施方案中,激动活性是指由在细胞中诱导特异性反应,例如,例如通过传输信号至细胞中而诱导某一生理活性变化的配体(或抗原结合复合物或多肽)结合引起的任何活性。这些生理活性包括例如生长活性、生长诱导活性、存活活性、分化活性、分化诱导活性、转录活性、膜转运活性、结合活性、蛋白水解活性、磷酸化/脱磷酸活性、氧化还原活性、转移活性、核溶解活性、脱水活性、细胞死亡诱导活性及细胞凋亡诱导活性。
本文所述的激动活性可通过本领域技术人员已知的方法来测定。例如,可通过使用细胞生长作为指标的方法来评估激动活性。更具体而言,将欲测定其激动活性的抗原结合复合物或多肽加入至显示激动剂依赖性生长的细胞,并且培养这些细胞。接下来,加入在特定波长下视活细胞计数而显示颜色反应的试剂,例如WST-8,并且测量吸光度。可使用所测量的吸光度作为指标来测定激动活性。
在某些实施方案中,使用可监测暴露于配体(或抗原结合复合物或多肽)后细胞中的定量及/或定性变化的指标来测定激动活性。例如,有可能使用无细胞分析指标、基于细胞的分析指标、基于组织的分析指标及体内分析指标。可用于无细胞分析的指标包括蛋白质、DNA或RNA中的酶促反应、定量及/或定性变化。这些酶促反应包括例如氨基酸转移、糖转移、脱水、脱氢及底物裂解。或者,蛋白质磷酸化、脱磷酸、二聚、多聚、水解及解离;DNA或RNA扩增、裂解及延伸可用作无细胞分析中的指标。例如,信号转导途径下游的蛋白质磷酸化可用作检测指标。细胞表型变化,例如产物的定量及/或定性变化、生长活性变化、细胞数目变化、形态变化或细胞性质变化,可用作基于细胞的分析中的指标。这些产物包括例如分泌蛋白质、表面抗原、细胞内蛋白质及mRNA。形态变化包括例如树枝状细胞形成及/或树枝状细胞数目变化、细胞平坦度变化、细胞伸长/轴比率变化、细胞尺寸变化、细胞内结构变化、细胞群体异质性/均质性及细胞密度变化。可在显微镜下观测这些形态变化。用作指标的细胞性质包括锚定依赖性、细胞因子依赖性反应、激素依赖性、抗药性、细胞活动性、细胞迁移活性、脉动活性及细胞内物质变化。细胞活动性包括细胞浸润活性及细胞迁移活性。细胞内物质变化包括例如酶活性、mRNA水平、细胞内信号传导分子(例如Ca2+及cAMP)水平及细胞内蛋白质水平的变化。当使用细胞膜受体时,由受体刺激诱导的细胞增殖活性变化可用作指标。欲用于基于组织的分析的指标包括适合个体组织的功能变化。在体内分析中,组织重量变化、血液系统变化(例如血球计数、蛋白质含量或酶活性的变化)、电解液水平变化及循环系统变化(例如血压或心率变化)。
任何适合的用于测量这些检测指标的方法均可与本文所述的方法联合使用。例如,可使用吸光度、发光、显色、荧光、放射性、荧光偏振、表面等离振子共振信号、时间解析荧光、质量、吸收光谱、光散射及荧光共振能量转移。这些测量方法为本领域技术人员已知的,且可视目的而适当地选择。例如,可通过使用常规亮度计、酶标仪等来获得吸收光谱;可利用亮度计等来测量发光;且可利用荧光计等来测量荧光。可用质谱仪来测定质量。视辐射类型而定,可利用例如γ粒子计数器的装置来测定放射性。可利用BEACON(TaKaRa)来测量荧光偏振。可利用BIACORE来获得表面等离振子共振信号。时间解析荧光、荧光共振能量转移等可利用ARVO等进行测量。此外,也可使用流式细胞仪进行测量。有可能使用以上方法之一来测量两种以上不同类型的检测指标。也可通过使用两种以上测量方法同时及/或依次研究更多数目的检测指标。例如,可用荧光计同时测量荧光及荧光共振能量转移。
OX40分析
如上所述,本发明的某些方面是关于对细胞表面受体的激动活性。如本领域技术人员将认识到,用于测定对细胞表面受体的激动活性的特定分析可视特定细胞表面受体而定。以下提供与测定OX40活性有关的例示性分析。基于此指导及本领域中的常识,本领域技术人员可适当地鉴别用于本文所述的其他细胞表面受体的分析法。
在一个方面中,提供用于鉴别具有生物活性的结合OX40的激动性抗原结合复合物的分析法。生物活性可包括例如结合OX40(例如结合人及/或食蟹猴OX40);增加OX40介导的信号转导(例如增加NFkB介导的转录);除去表达人OX40的细胞(例如T细胞);通过ADCC及/或吞噬作用来除去表达人OX40的细胞;增强T效应细胞功能(例如CD4+效应T细胞),例如,通过增加效应T细胞增殖及/或增加效应T细胞的细胞因子产生(例如γ干扰素);增强记忆T细胞功能(例如CD4+记忆T细胞),例如,通过增加记忆T细胞增殖及/或增加记忆T细胞的细胞因子产生(例如γ干扰素);或抑制调节T细胞功能(例如,通过降低对效应T细胞功能(例如CD4+效应T细胞功能)的Treg抑制。在某些实施方案中,结合OX40的激动性抗原结合复合物在不存在与人效应细胞结合的情况下具有所列出的生物活性中的一种或多种。在某些实施方案中,结合OX40的激动性抗原结合复合物具有所列出的生物活性中的一种或多种且不结合人效应细胞。也提供在体内及/或体外具有这种生物活性的抗体。
在某些实施方案中,测试本发明抗体的这种生物活性。
可使用本领域中已知的方法来分析T细胞共刺激且例示性方法公开于本文中。例如,T细胞(例如记忆或效应T细胞)可获自外周白细胞(例如使用Ficoll梯度离心自人全血分离)。可使用本领域中已知的方法自PBMC中分离记忆T细胞(例如CD4+记忆T细胞)或效应T细胞(例如CD4+Teff细胞)。例如,可使用Miltenyi CD4+记忆T细胞分离试剂盒或Miltenyi天然CD4+T细胞分离试剂盒。在存在抗原呈递细胞(例如表达CD32及CD80的经照射的L细胞)的情况下培养分离的T细胞,且通过在存在或不存在结合OX40的激动性抗原结合复合物的情况下加入抗CD3抗体将其活化。可使用本领域中众所周知的方法来测量结合OX40抗体的激动性抗原结合复合物对T细胞增殖的效应。例如,可使用试剂盒(Promega),且在Multilabel读数器(Perkin Elmer)上读取结果。也可通过分析由T细胞产生的细胞因子来测定结合OX40的激动性抗原结合复合物对T细胞功能的效应。在一个实施方案中,例如,通过测量细胞培养物上清液中的干扰素γ来测定CD4+T细胞的干扰素γ产生。用于测量干扰素γ的方法为本领域中众所周知的。
可使用本领域中已知的方法来分析Treg细胞功能且例示性方法公开于本文中。在一个实例中,分析Treg抑制效应T细胞增殖的能力。使用本领域中已知的方法自人全血分离T细胞(例如分离记忆T细胞或天然T细胞)。标记(例如用CFSE)经纯化的CD4+天然T细胞,且用不同的试剂标记经纯化的Treg细胞。将经照射的抗原呈递细胞(例如表达CD32及CD80的L细胞)与标记的经纯化天然CD4+T细胞及经纯化Treg一起共培养。在存在或不存在结合OX40的激动性抗原结合复合物的情况下使用抗CD3抗体活化共培养物并且进行测试。在适合的时间(例如共培养6天)后,使用FACS分析,通过减少的标记染色(例如减少的CFSE标记染色)中的染料稀释度来追踪CD4+天然T细胞增殖水平。
可使用本领域中众所周知的方法来分析OX40信号传导且例示性方法公开于本文中。在一个实施方案中,产生表达人OX40及报道基因(包含与报道基因(例如β荧光素酶)融合的NFkB启动子)的转基因细胞。向细胞加入结合OX40的激动性抗原结合复合物引起NFkB转录增加,此结果可使用针对报道基因的分析法加以检测。
可例如通过使用单核细胞衍生的巨噬细胞或U937细胞(一种具有成熟巨噬细胞的形态及特征的人组织细胞淋巴瘤细胞系)来分析吞噬作用。在存在或不存在结合OX40的激动性抗原结合复合物的情况下将OX40表达细胞加入至单核细胞衍生的巨噬细胞或U937细胞。将细胞培养适合的时段后,通过检查针对1)巨噬细胞或U937细胞及2)OX40表达细胞的标记物双重染色的细胞的百分比,并且将此百分比除以显示OX40表达细胞的标记物(例如GFP)的细胞的总数目来测定吞噬百分比。可通过流式细胞术进行分析。在另一实施方案中,可通过荧光显微术分析法来进行分析。
用于以上体外分析中的任一种的细胞包括天然地表达OX40或已经改造以表达OX40的细胞或细胞系。这些细胞包括天然地表达OX40的活化T细胞、Treg细胞及活化记忆T细胞。这些细胞也包括表达OX40的细胞系及正常情况下不表达OX40但已用编码OX40的核酸转染的细胞系。本文中所提供的用于以上体外分析中的任一种的例示性细胞系包括表达人OX40的转基因BT474细胞(人乳腺癌细胞系)。
IV.药物组合物
如本文所述的本发明抗原结合复合物(例如具有激动活性的四价抗原结合复合物)或其亚单位可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、各个个体的临床状况、疾病的原因、药剂的递送部位、给药方法、给药方案以及医生所知的其他因素。待施用的复合物或蛋白质的“治疗有效量”将视这些考虑因素而定,并且是预防、改善或治疗特定病症(例如,癌症、过敏性或炎性病症,或自身免疫性疾病)的最低必需量。在某些实施方案中,本文所述的复合物和蛋白质可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗该病症的药剂一起配制。这些其他药剂的有效量取决于制剂中存在的复合物或蛋白质的量、病症或治疗的类型,以及上面讨论的其他因素。
使用本领域中已知的标准方法,通过混合具有期望的纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂来制备治疗制剂(Remington’s PharmaceuticalSciences(第20版),A.Gennaro编著,2000,Lippincott,Williams及Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括生理盐水或缓冲液,例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如聚乙烯吡咯啶酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖及其他糖类,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,例如EDTA;糖醇,例如甘露醇或山梨醇;成盐返核离子,例如钠;及/或非离子表面活性剂,例如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
在某些实施方案中,制剂含有可药用盐,优选氯化钠,并且优选在约生理浓度下。任选地,本发明的制剂可含有可药用防腐剂。在一些实施方案中,该防腐剂浓度介于0.1至2.0%范围内,通常v/v。适合的防腐剂包括医药领域中已知的防腐剂。苯甲醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯为优选防腐剂。可选地,本发明的制剂可0.005%至0.02%浓度的包括可药用表面活性剂。
本文的制剂还可以含有一种以上的活性化合物,这是所治疗的具体适应症所必需的,优选那些具有互补活性但不会相互产生不利影响的活性化合物。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可捕获在例如通过团聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊,分别呈胶体药物递送系统形式(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或呈巨乳液形式。这些技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences,同上中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗原结合复合物或抗原结合多肽的固体疏水性聚合物半透性基质,这些基质呈成形物品形式,例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解乙烯乙酸乙烯酯、例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)的可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管例如乙烯乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸的聚合物使得能够释放分子超过100天,但某些水凝胶在较短时段内释放蛋白质。当经包封的抗原结合复合物或抗原结合多肽长时间保留在体内时,其可能由于在37℃下暴露于水分而变性或聚集,从而导致生物活性损失及可能的免疫原性变化。可设计合理策略以进行稳定,视所涉及的机制而定。例如,若发现聚集机制为通过硫-二硫键互换的分子间S-S键形成,则可通过修饰巯基残基、自酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当加入剂及开发特定聚合物基质组合物来达到稳定。
本文所述的复合物可根据已知方法施用人个体,例如经静脉内浓注施用或通过在一定时段内连续输注、通过肌肉内、腹膜内、大脑脊髄内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或吸入途径。若过度副作用或毒性与对蛋白质所识别的靶分子的拮抗作用相关,则可能尤其需要局部施用。离体策略也可用于治疗应用。离体策略涉及用编码本发明的蛋白质或复合物的聚核苷酸转染或转导获自个体的细胞。接着将经转染或转导的细胞归还至该个体。这些细胞可属于许多类型中的任一种,包括但不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、纤维母细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质细胞或肌细胞。
V.制品
本发明的另一个实施方案是含有一种或多种如本文所述的抗原结合复合物(例如,具有激动剂活性的四价抗原结合复合物)的制品,以及用于治疗或诊断病症的材料(例如,自身免疫性疾病或癌症)。制品包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料形成,例如玻璃或塑料。容器容纳有效治疗病症的组合物,并且可具有无菌进入口(例如,容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的抗原结合复合物或多肽。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗特定病症。标签或包装说明书还包括将抗原结合复合物或多肽组合物施用给受试者的说明书。还考虑了包含本文所述的组合疗法的制品和试剂盒。
包装说明书是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书,其包含关于使用这些治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
另外,制品还可包含第二容器,其包含可药用缓冲液,例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其还可以包括从商业和用户角度考虑的其他材料,包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器
例示性复合物、方法、核酸、载体、宿主细胞及组合物列于以下各项中:
【第1项】一种具有激动活性的四价抗原结合复合物,该复合物包含:
第一亚单位及第二亚单位,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个包含:
(i)第一半抗体,该第一半抗体包含第一抗体重链可变结构域(VH1)及第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该第一半抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位;及
(ii)第二半抗体,该第二半抗体包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中该第二半抗体特异性结合该细胞表面受体的第二表位;
其中该第一亚单位与该第二亚单位偶联,且其中该复合物对与该复合物结合的该细胞表面受体具有激动活性。
【第2项】如第1项的复合物,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个包含:
(i)该第一半抗体,其中该第一半抗体包含:
(a)第一抗体重链,该第一抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、第一抗体重链CH2结构域及第一抗体重链CH3结构域;及
(b)第一抗体轻链,该第一抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);以及
(i)该第二半抗体,其中该第二半抗体包含:
(a)第二抗体重链,该第二抗体重链从N端至C端包含该第二抗体重链可变结构域(VH2)、第二抗体重链CH1结构域、第二抗体重链CH2结构域及第二抗体重链CH3结构域;及
(b)第二抗体轻链,该第二抗体轻链从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。
【第3项】如第2项的复合物,其中该第一亚单位与该第二亚单位化学偶联。
【第4项】如第1项至第3项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。
【第5项】如第1项至第3项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。
【第6项】如第5项的复合物,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个包含双特异性抗体,其中该双特异性抗体包含两个具有两个CH3结构域的抗体Fc区,其中这两个CH3结构域中的每一个包含杵或臼,且其中这两个CH3结构域中的第一个中的该杵或臼可分别放置在这两个CH3结构域中的第二个中的该臼或杵中。
【第7项】如第1项至第6项中任一项的复合物,其中这两个亚单位是通过接头化学偶联。
【第8项】如第7项的复合物,其中该接头接合该第一亚单位的第一改造游离半胱氨酸与该第二亚单位的第二改造游离半胱氨酸。
【第9项】如第8项的复合物,其中这两个亚单位中的每一个包含两条重链及两条轻链,且其中各亚单位的重链之一包含选自以下的重链半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。
【第10项】如第8项的复合物,其中这两个亚单位中的每一个包含两条重链及两条轻链,且其中各亚单位的轻链之一包含选自以下的轻链半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。
【第11项】如第7项的复合物,其中这两个亚单位是通过点击化学反应而化学偶联。
【第12项】如第11项的复合物,其中这两个亚单位是通过四嗪反式环辛烯(TCO)点击反应而偶联。
【第13项】如第11或12项的复合物,其中该接头的长度介于约与约之间。
【第14项】如第7项的复合物,其中该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。
【第15项】如第13项的复合物,其中该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。
【第16项】如第15项的复合物,其中该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。
【第17项】如第2项至第16项中任一项的复合物,其中这些亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。
【第18项】如第17项的复合物,其中这些亚单位中的每一个包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Ec区:
(a)人IgG1的Fc区中的297;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328。
【第19项】如第17或18项的复合物,其中这些亚单位中的每一个具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
【第20项】如第17项至第19项中任一项的复合物,其中这些亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。
【第21项】如第17项至第19项中任一项的复合物,其中这些亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
【第22项】如第1项至第21项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体为选自以下的受体家族的成员:肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族及G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。
【第23项】如第1项至第22项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体选自:OX40、DR5、GITR、CD27、CD137及Tie2。
【第24项】如第23项的复合物,其中该VH1包含:
(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;
(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;
(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL1包含:
(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;
(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及
(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
【第25项】如第23或24项的复合物,其中该VH2包含:
(a)VH结构域,其包含
(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;
(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及
(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL2包含:
(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;
(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及
(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
【第26项】一种具有激动活性的四价抗原结合复合物,其中该复合物包含:
(a)抗体,该抗体包含两条抗体重链,各抗体重链包含第一抗体重链可变结构域(VH1);及两条抗体轻链,各抗体轻链包含第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位;及
(b)与该抗体偶联的两条抗体Fab片段,其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中这两条抗体Fab片段中的每一个特异性结合该细胞表面受体的第二表位;其中该复合物对与该复合物结合的该细胞表面受体具有激动活性。
【第27项】如第26项的复合物,其中各抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、第一抗体重链CH2结构域及第一抗体重链CH3结构域;其中各抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含重链Fab片段,该重链Fab片段从N端至C端包含该第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体重链CH1结构域;且其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含轻链Fab片段,该轻链Fab片段从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。
【第28项】如第27项的复合物,其中这两条抗体Fab片段的第一个与这两条抗体轻链的第一个或这两条抗体重链的第一个化学偶联,且其中这两条抗体Fab片段的第二个与这两条抗体轻链的第二个或这两条抗体重链的第二个化学偶联。
【第29项】如第26项至第28项中任一项的复合物,这两个Fab片段中的每一个通过接头与该抗体化学偶联。
【第30项】如第29项的复合物,其包含:
(i)第一接头,其接合该抗体的第一改造游离半胱氨酸与这两个Fab片段的第一个的经改造游离半胱氨酸;及
(ii)第二接头,其接合该抗体的第二改造游离半胱氨酸与这两个Fab片段的第二个的经改造游离半胱氨酸。
【第31项】如第30项的复合物,其中该抗体的这两条抗体重链中的每一个包含独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。
【第32项】如第30项的复合物,其中该抗体的这两条抗体轻链中的每一个包含独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。
【第33项】如第30项至第32项中任一项的复合物,其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含C端半胱氨酸氨基酸。
【第34项】如第29项的复合物,其中该抗体与这两条抗体Fab片段均通过点击化学反应而偶联。
【第35项】如第34项的复合物,其中该抗体与这两条抗体Fab片段均通过四嗪反式环辛烯(TCO)点击反应而偶联。
【第36项】如第34或35项的复合物,其中该接头的长度介于约与约之间。
【第37项】如第29项的复合物,其中该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。
【第38项】如第37项的复合物,其中该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。
【第39项】如第38项的复合物,其中该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。
【第40项】如第26项的复合物,其中这两条抗体Fab片段与该抗体遗传偶联;其中各抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、该第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域、抗体重链CH2结构域及抗体重链CH3结构域;且其中该复合物包含:第一抗体轻链,该第一抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);及第二抗体轻链,该第二抗体轻链从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。
【第41项】如第40项的复合物,其中该第一抗体轻链包含用于与该抗体重链的该第一抗体重链可变结构域(VH1)和/或该第一抗体重链CH1结构域的修饰正交配对的修饰,且其中该第二抗体轻链包含用于与该抗体重链的该第二重链可变结构域(VH2)及/或该第二重链CH1结构域的修饰正交配对的修饰。
【第42项】如第26项至第41项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。
【第43项】如第26项至第41项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。
【第44项】如第26项至第43项中任一项的复合物,其中该抗体的这些抗体重链中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。
【第45项】如第44项的复合物,其中该抗体的这些抗体重链中的每一个在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代:
(a)人IgG1的Fc区中的297;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328。
【第46项】如第44或45项的复合物,其中该抗体的这些抗体重链中的每一个在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代:
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
【第47项】如第44项至第46项中任一项的复合物,其中该抗体的这些抗体重链中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。
【第48项】如第44项至第46项中任一项的复合物,其中该抗体的这些抗体重链中的每一个包含用于降低效应子功能的修饰,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
【第49项】如第26项至第48项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体为选自以下的受体家族的成员:肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族及G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。
【第50项】如第26项至第49项中任一项的复合物,其中该细胞表面受体选自:OX40、DR5、GITR、CD27、CD137及Tie2。
【第51项】如第50项的复合物,其中该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
【第52项】如第50或51项的复合物,其中该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ IDNO:42的氨基酸序列。
【第53项】如第50项的复合物,其中该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
【第54项】如第50或53项的复合物,其中该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ IDNO:42的氨基酸序列。
【第55项】一种核酸,其编码如第1项至第25项中任一项的复合物。
【第56项】如第55项的核酸,其中该核酸包含编码该第一抗体重链的第一聚核苷酸、编码该第一抗体轻链的第二聚核苷酸、编码该第二抗体重链的第三聚核苷酸及编码该第二抗体轻链的第四聚核苷酸。
【第57项】一种核酸,其编码如第26项至第54项中任一项的复合物。
【第58项】如第57项的核酸,其中该核酸包含编码该抗体重链的第一聚核苷酸、编码该抗体轻链的第二聚核苷酸、编码该重链Fab片段的第三聚核苷酸及编码该轻链Fab片段的第四聚核苷酸。
【第59项】如第57项的核酸,其中该核酸包含第一聚核苷酸,其编码抗体重链,该抗体重链从N端至C端包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域、该第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域、抗体重链CH2结构域及抗体重链CH3结构域;第二聚核苷酸,其编码抗体轻链,该抗体轻链从N端至C端包含该第一抗体轻链可变结构域(VL1)及第一抗体轻链恒定结构域(CL);及第三聚核苷酸,其编码抗体轻链,该抗体轻链从N端至C端包含该第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL)。
【第60项】一种载体,其包含如第55项至第59项中任一项的核酸。
【第61项】如第60项的载体,其中该载体为表达载体。
【第62项】一种宿主细胞,其包含如第60或61项的载体。
【第63项】如第62项的宿主细胞,其中该宿主细胞为原核细胞。
【第64项】如第62项的宿主细胞,其中该宿主细胞为真核细胞。
【第65项】一种产生四价抗原结合复合物的方法,其包括培养如第62项的宿主细胞,从而产生该复合物。
【第66项】如第65项的方法,其进一步包括自该宿主细胞回收该复合物。
【第67项】一种药物组合物,其包含如第1项至第54项中任一项的复合物及可药用载体。
【第68项】一种产生四价抗原结合复合物的方法,该四价抗原结合复合物对与该复合物结合的细胞表面受体具有激动活性,该方法包括:
(a)提供:
(i)第一半抗体,该第一半抗体包含第一抗体重链可变结构域(VH1)及第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该第一半抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位,且其中该第一半抗体包含第一改造游离半胱氨酸;及
(ii)第二半抗体,该第二半抗体包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中该第二半抗体特异性结合该细胞表面受体的第二表位,其中该第一半抗体及该第二半抗体中的每一个包含具有CH3结构域的抗体Fc区,其中这两个CH3结构域中的每一个包含杵或臼,其中这两个CH3结构域中的第一个中的该杵或臼可分别放置在这两个CH3结构域中的第二个中的臼或杵中;
(b)在体外组装该第一半抗体及该第二半抗体以形成第一亚单位;
(c)提供:
(iii)第三半抗体,该第三半抗体包含该第一抗体重链可变结构域(VH1)及该第一抗体轻链可变结构域(VL1),其中该第三半抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位,且其中该第三半抗体包含第二改造游离半胱氨酸;及(iv)第四半抗体,该第四半抗体包含该第二抗体重链可变结构域(VH2)及该第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中该第四半抗体特异性结合该细胞表面受体的该第二表位,其中该第三半抗体及该第四半抗体中的每一个包含具有CH3结构域的抗体Fc区,其中这两个CH3结构域中的每一个包含杵或臼,其中这两个CH3结构域中的第一个中的该杵或臼可分别放置在这两个CH3结构域中的第二个中的臼或杵中;
(d)在体外组装该第三半抗体及该第四半抗体以形成第二亚单位;及
(e)使用该第一游离改造半胱氨酸及该第二游离改造半胱氨酸,使该第一亚单位与该第二亚单位通过接头偶联,从而产生该复合物。
【第69项】如第68项的方法,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。
【第70项】如第68项的方法,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。
【第71项】如第68项至第71项中任一项的方法,其中该第一改造游离半胱氨酸及该第二改造游离半胱氨酸中的每一个为独立地选自以下的重链半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。
【第72项】如第68项至第71项中任一项的方法,其中该第一改造游离半胱氨酸及该第二改造游离半胱氨酸中的每一个为独立地选自以下的轻链半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。
【第73项】如第68项至第72项中任一项的方法,其中该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。
【第74项】如第73项的方法,其中步骤(e)包括:
(1)使这两个亚单位与该双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头反应;及(2)纯化该复合物。
【第75项】如第74项的方法,其中纯化该复合物包括对该复合物进行大小排阻层析及/或阴离子交换层析。
【第76项】如第73项至第75项中任一项的方法,其中该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。
【第77项】如第73项至第76项中任一项的方法,其中该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。
【第78项】如第68项至第77项中任一项的方法,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。
【第79项】如第78项的方法,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的297;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328。
【第80项】如第78或79项的方法,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
【第81项】如第78项至第80项中任一项的方法,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。
【第82项】如第78项至第80项中任一项的方法,其中该第一亚单位及该第二亚单位中的每一个具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
【第83项】一种产生四价抗原结合复合物的方法,该四价抗原结合复合物对与该复合物结合的细胞表面受体具有激动活性,该方法包括:
(a)提供抗体,该抗体包含两个半抗体,其中各半抗体具有包含第一抗体重链可变结构域(VH1)的抗体重链及包含第一抗体轻链可变结构域(VL1)的抗体轻链,其中该抗体特异性结合细胞表面受体的第一表位,且其中这两个半抗体中的每一个包含第一改造游离半胱氨酸;
(b)提供两条抗体Fab片段,其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含第二抗体重链可变结构域(VH2)及第二抗体轻链可变结构域(VL2),其中这两条抗体Fab片段中的每一个特异性结合该细胞表面受体的第二表位,且其中这两条抗体Fab片段中的每一个包含第二改造游离半胱氨酸;及
(c)使这些抗体Fab片段之一与这两个半抗体中的每一个通过接头偶联,从而产生该复合物。
【第84项】如第83项的方法,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。
【第85项】如第83项的方法,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。
【第86项】如第83项至第85项中任一项的方法,其中该第一改造游离半胱氨酸为独立地选自以下的重链半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。
【第87项】如第83项至第85项中任一项的方法,其中该第一改造游离半胱氨酸为独立地选自以下的轻链半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。
【第88项】如第83项至第87项中任一项的方法,其中该第二改造游离半胱氨酸为C端半胱氨酸氨基酸。
【第89项】如第83项至第88项中任一项的方法,其中该接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。
【第90项】如第89项的方法,其中步骤(c)包括:
(i)使这两条抗体Fab片段中的每一个与双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头反应,以形成两个双马来酰亚氨基缀合的抗体Fab片段;
(ii)移除过量双马来酰亚氨基PEG接头;
(iii)使这两个双马来酰亚氨基缀合的抗体Fab片段中的每一个与该抗体反应,以形成该复合物;及
(iv)纯化该复合物。
【第91项】如第90项的方法,其中纯化该复合物包括对该复合物进行大小排阻层析及/或阴离子交换层析。
【第92项】如第89项至第91项中任一项的方法,其中该PEG接头包含1-11个之间的PEG亚单位。
【第93项】如第89项至第92项中任一项的方法,其中该PEG接头包含1、2或3个PEG亚单位。
【第94项】如第83项至第93项中任一项的方法,其中该抗体具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。
【第95项】如第94项的方法,其中该抗体包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的297;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328。
【第96项】如第94或95项的方法,其中该抗体具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
【第97项】如第94项至第96项中任一项的方法,其中该抗体具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。
【第98项】如第94项至第96项中任一项的方法,其中该抗体具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
【第99项】一种产生四价抗原结合复合物的方法,该四价抗原结合复合物对与该复合物结合的细胞表面受体具有激动活性,该方法包括:
(a)在宿主细胞中表达两条抗体重链,其中各抗体重链从N端至C端包含第一抗体重链可变结构域(VH1)、第一抗体重链CH1结构域(CH11)、第二重链可变结构域(VH2)、第二重链CH1结构域(CH12)、抗体重链CH2结构域及抗体重链CH3结构域,其中各VH1及/或各CH11包含用于正交配对的第一修饰,其中各VH2及/或各CH12包含用于正交配对的第二修饰,且其中该第一修饰与该第二修饰不同;
(b)在该宿主细胞中表达两个第一抗体轻链,其中这两个第一抗体轻链中的每者从N端至C端包含第抗体轻链可变结构域(VL1)及第抗体轻链恒定结构域(CL1),且其中该VL1及/或该CL1包含用于与该抗体重链的该第一修饰进行正交配对的修饰;及
(c)在该宿主细胞中表达两个第二抗体轻链,其中这两个第二抗体轻链中的每一个从N端至C端包含第二抗体轻链可变结构域(VL2)及第二抗体轻链恒定结构域(CL2),且其中该VL2及/或该CL2包含用于与该抗体重链的该第二修饰进行正交配对的修饰;
其中该VH1及该VL1特异性结合该细胞表面受体的第一表位;
其中该VH2及该VL2特异性结合该细胞表面受体的第二表位;且
其中在该宿主细胞中表达后,这两条抗体重链结合,该两条重链中的每一个与第一抗体轻链通过正交配对而偶联,且该两条重链中的每一个与第二抗体轻链通过正交配对而偶联,从而产生该复合物。
【第100项】如第99项的方法,其中该抗体重链的该第一修饰及该第二修饰中的每一个独立地选自:VH-Q39K、VH-Q39E、CH1-S183E、CH1-S183K、CH1-A141I、CH1-F170S、CH1-S181M、CH1-S183A及CH1-V185A(EU编号)。
【第101项】如第99或100项的方法,其中该第一抗体轻链及该第二抗体轻链的这些修饰中的每一个独立地选自:VL-Q38E、VL-Q38K、CL-V133K、CL-V133E、CL-F116A、CL-L135V、CL-S174A、CL-S176F及CL-T178V(EU编号)。
【第102项】如第99项至第101项中任一项的方法,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位相同。
【第103项】如第99项至第101项中任一项的方法,其中该细胞表面受体的该第一表位与该第二表位不同。
【第104项】如第99项至第103项中任一项的方法,其中各抗体重链具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区。
【第105项】如第104项的方法,其中各抗体重链包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基(EU编号)处包含氨基酸取代的Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的297;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328。
【第106项】如第104或105项的方法,其中各抗体重链具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
【第107项】如第104项至第106项中任一项的方法,其中各抗体重链具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰产生无糖基化Fc区。
【第108项】如第104项至第106项中任一项的方法,其中各抗体重链具有包含用于降低效应子功能的修饰的Fc区,该修饰不会引起对该Fc区的糖基化模式的修饰。
【第109项】如第68项至第108项中任一项的方法,其中该细胞表面受体为选自以下的受体家族的成员:肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族及G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。
【第110项】如第68项至第109项中任一项的方法,其中该细胞表面受体选自:OX40、DR5、GITR、CD27、CD137及Tie2。
【第111项】如第110项的方法,其中该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
【第112项】如第110或111项的方法,其中该VH2包含:(a)VH结构域,其包含(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
【第113项】如第110项的方法,其中该VH2包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;且其中该VL2包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
【第114项】如第110或113项的方法,其中该VH1包含:(i)HVR-H1,其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列;(ii)HVR-H2,其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列;及(iii)HVR-H3,其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列;且其中该VL1包含:(i)HVR-L1,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(ii)HVR-L2,其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列;及(iii)HVR-L3,其包含选自SEQ IDNO:42的氨基酸序列。
前述书面描述被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。提供以下实施例仅用于说明目的,并不意图以任何方式限制本发明的范围。实际上,除了本文所示和所述的那些之外,本发明的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描述将变得显而易见并且落入所附权利要求的范围内。
实施例
实施例1.探索双表位抗体以增强激动活性
人们越来越关注发现介导针对靶受体的激动活性的抗体。激动剂抗体以对信号传导有效的方式与受体结合,实际上充当替代配体。对于一些靶标,利用IgG的同源二聚体性质,通过受体的二价结合可以实现抗体介导的激动。然而,一些受体系统需要多价交联以引发活性,从而将受体一起拉入集落(cluster)中以引发最佳信号传导。对于这些受体,体内抗体交联通常通过抗体Fc与Fc受体的结合来实现(Wilson等人,2011,Cancer Cell 19:101-13;Kim及Ashkenazi,2013,J Exp Med 210:1647-51;Stewart等人,2014Journal forImmunoTherapy of Cancer 2:1-10)。
探索了OX40的双表位参与增强抗体介导的受体激动的潜力。OX40是在抗原经历的效应T(Teff)和调节性T(Treg)细胞(包括小鼠和人肿瘤中的浸润细胞)上表达的TNFRSF成员共刺激分子。已显示通过激动剂抗体激活OX40通过增强Teff激活和抑制Treg介导的抑制来促进抗肿瘤免疫(Voo等人,2013,J.Immunol,191:3641-50)。抗OX40抗体的激动作用已被证明可提供与天然配体OX40L类似的共刺激活性,但需要在体外或通过Fc/FcγR介导的体内交联进行交联(Voo等人,2013,J.Immunol,191:3641-50)。
材料及方法
通过构建由两个单独可变区构成的双特异性抗体来产生双表位抗OX40抗体。一个可变区包含抗OX40人源化抗体(VH及VL序列分别如SEQ ID NO:56及57中所阐述)。尽管包含这些结构域的可变区更完整地描述为1A7.gr.1,但在本文中,此可变区将缩写为1A7。换言之,1A7在本文中是指如由SEQ ID NO:56及57所定义的人源化1A7.gr.1可变区。一个可变区包含抗OX40人源化抗体(VH及VL序列分别如SEQ ID NO:126及129中所阐述)。尽管包含这些结构域的可变区更完整地描述为3C8.gr.5.SG,但在本文中,此可变区将缩写为3C8。换言之,3C8在本文中是指如由SEQ ID NO:126及129所定义的人源化3C8.gr.5.SG可变区。
使用杵入臼变体及体外组装单独半抗体来产生双特异性抗体(Spiess等人,2013,NatBiotechnol 31(8):753-8)。使用标准分子生物学技术在pRK哺乳动物表达载体中构建编码抗体重链及轻链的DNA(Eaton等人,1986,Biochemistry 25:8343-8347)。通过基因合成(Genewiz)或通过使用QuikChange Lightning多点突变试剂盒(Agilent,目录号210514)及Q5定点突变试剂盒(New England BioLab,目录号E0554S)进行突变来构建编码具有突变的抗体重链及轻链的质粒,以进行expi293或CHO细胞表达。将编码1A7VH区的DNA亚克隆至包含“杵”突变T366W(EU编号)、C端6His标签及有或无N297G(EU编号)突变的变体人IgG1(hIgG1)中。将编码3C8VH区的DNA亚克隆至包含“臼”突变T366S/L368A/Y407V(EU编号)、C端Flag标签及有或无N297G突变的变体人IgG1(hIgG1)中。
已描述用于减弱单克隆抗体的效应子功能性质的各种突变策略(Strohl,2009,CurrOpin in Biotech 20:685-691)。使用两种方法对本发明抗体的效应减弱形式进行改造。首先,在无糖基化Fc区的情形下,通过将其与可移除Fc区297位上的保守N连接糖基化位点的取代N297G组合来构建抗体。第二种方法利用取代L234A、L235A及P329G(EU编号)(L234A/L235A/P329G三重变体称为LALAPG),其先前已显示减少与Fc受体及补体的结合(参见例如美国专利公开第2012/0251531号)。利用人Cκ(hCk)恒定链来构建编码两种抗体的VL区的DNA。
编码1A7及3C8轻链及重链(天然抗体及半抗体)的pRK载体DNA共转染至HEK293细胞中以供表达,并且纯化所得蛋白质。表达之后,在重力下使Expi293细胞沉淀。使用FreedomEVO 200液体处理工作站(Tecan,Morrisville,NC)将上清液转移至含有0.2mL(50%浆液)MabSelect Sure树脂(GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh,PA)的50mL Falcon管(Corning,Corning,New York)中。在Innova 2000平台振荡器(New BrunswickScientific,Enfield,CT)上以270转/分钟将上清液/树脂混合物培育过夜。沉淀之后,将树脂转移至具有25μm膜的96孔2ml过滤平板(Thompson Instruments,Oceanside,CA)中,且用1mL PBS缓冲液pH 7.4洗涤两次,以通过使用Sorvall HT6离心机(Thermo Scientific,Waltham,MA)在2,000转/分钟下离心5分钟来移除任何未结合的蛋白质及培养基组分。将含有树脂的平板堆积在0.2μm 96孔过滤平板(Orochem,Naperville,IL,USA)及96孔洗脱捕获平板(Orochem,Naperville,IL)的顶部。在2个连续洗脱步骤(总洗脱体积0.668mL)中通过在2,000转/分钟下离心5分钟用洗脱缓冲液(50mM磷酸pH 2.9)自树脂洗脱已结合的半抗体,且通过加入1/12体积的中和缓冲液(1M精氨酸、0.685M琥珀酸盐,pH 5.0)使洗脱液的pH值升高。在使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,DE)测量280nm吸光度之后,计算半抗体制剂的浓度。
将半抗体组装成双表位抗体。将如上所述纯化的半抗体归一化至相同浓度且使用Hamilton Star液体处理工作站(Hamilton Robotics,Reno,NV)以1:1比率混合。通过加入1M精氨酸pH 9.5溶液使半抗体混合物的pH值上升至8.0。加入含还原L-谷胱甘肽0.5M贮存液的1M精氨酸pH 9.5(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),使得最终L-谷胱甘肽浓度相对于溶液中蛋白质的量为200倍过量。在32℃下将此混合物培育24小时,以允许半抗体组装成双表位抗体。
通过2步法来纯化组装期间产生的期望的双表位抗体(由杵状半抗体及臼状半抗体构成的异源二聚体),除去其他物质(未组装的半抗体及杵-杵或臼-臼同源二聚体),包括第一步骤中的His标签纯化,然后以第二步骤中的Flag标签纯化。第一步骤涉及使用定制包装(Glygen Corp,Columbia,MD)的含0.1mL Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen,Valencia,CA)的1.2mL液体处理端部(Dynamic Devices LLC,Wilmington,DE)。使用Lynx LM1200液体处理工作站,通过吸除15个循环将所有His标签化物质(包括未组装的杵状半抗体、杵-杵同源二聚体及杵-臼异源二聚体)捕获至树脂端部上。用1mL PBS pH 7.4洗涤树脂端部且在2个连续洗脱步骤(总洗脱体积=0.6mL)中用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠、500mM氯化钠、300mM咪唑pH 7.5)自端部洗脱His标签化物质。用试剂级水对所洗脱的样品进行1:1稀释来对其进行制备,以供用于下一步骤。
使用Freedom EVO 200液体处理工作站向第一组装后步骤纯化之后所获得的溶液中加入0.4mL 50%抗FLAG抗体树脂浆液,并且在Forma Orbital振荡器(Thermo ElectronCorporation,Madison,WI)上在4℃下以250转/分钟将所得混合物培育3小时。通过在2,000转/分钟下离心5分钟来分离树脂与上清液,并且转移至过滤平板以便用1mL PBS pH 7.4洗涤,以移除任何未结合的蛋白质。将平板堆积在0.2μm 96孔过滤平板及96孔洗脱捕获平板的顶部上。在3次连续洗脱中使用总计1.57mL洗脱缓冲液(50mM磷酸,pH 2.9)通过在2,000转/分钟下离心5分钟自树脂洗脱出已结合的双表位抗体(异源二聚体),并且用0.11mL 20×PBS pH 11.0进行中和以便将经纯化的双表位抗体溶液的pH值调节至6.0。在使用NanoDrop 2000分光光度计测量280nm吸光度之后,计算双表位抗体的浓度。
使用分析型SEC HPLC及质谱评定最终经纯化双表位抗体的质量。通过将0.03mL注入至与Dionex UltiMate 3000HPLC系统(Thermo Scientific,Waltham,MA)连接的TSKGelSuperSW3000柱(Tosoh Bioscience,King of Prussia,PA)上来进行SEC。利用等度梯度(200mM磷酸钾、250mM氯化钾,pH 7.2)进行分析。UV检测设定在280nM下。使用Agilent6224TOF LC-MS系统(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)来获得质谱数据。在37℃下用100mM二硫苏糖醇(G-Biosciences,St.Louis,MO)将双表位抗体样品还原20分钟。利用PLRP-S逆相柱(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)来分离多肽链。通过最大熵反褶积,使用MassHunter软件(定性分析B.03.01)来获得经还原轻链及重链的完整质量。
结果
使用aSEC研究双表位1A7/3C8抗体在存在OX40的情况下形成高阶复合物的能力。将1A7或1A7/3C8双表位抗体与人OX40(G&P Biosciences FCL2479)以2:1比率混合,在室温下培育2小时,在TSKGel SuperSW3000柱上对混合物进行运作。数据示于图1中。在2:1抗体:OX40比率下,单表位1A7IgG1抗体形成三种物质:游离抗体、有一个臂被结合的抗体及有2个臂被结合的抗体。相反,1A7/3C8形成大于1:2抗体:OX40化学计量的物质。结果指明相对于单表位抗体,双表位抗OX40抗体能够促进在存在靶抗原的情况下的高阶复合物。
实施例2.设计多价单表位及双表位抗体形式
探索多价及多表位靶向的组合,以试图改造具有增强的激动活性的抗体形式。图2描绘IgG抗体的结构,其说明用于对新颖多价及多表位抗体形式进行改造的元件。IgG包含重链及轻链。重链包含可变重链可变结构域(VH)、恒定重链可变结构域1(CH1)、铰链、恒定重链可变结构域2(CH2)及恒定重链可变结构域3(CH3)。轻链包含可变轻链可变结构域(VL)及恒定轻链可变结构域(CL)。CL可为恒定κ(Ck)或恒定λ(Cl)。对标靶具有特异性的Fv区包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)结构域。对标靶具有特异性的Fab区包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)结构域以及恒定重链可变结构域1(CH1)及恒定轻链(CL)。Fab区不包括的IgG区为重链铰链-CH2-CH3。图3A及图3B显示经改造及表征的一系列多价及多表位抗体形式。除了二价天然IgG以外,也对四种四价(原子价(valency)=4)形式进行改造:偶联IgG-IgG(c:IgG-IgG),其中两个全长IgG化学偶联;偶联Fab-IgG(c:Fab-IgG),其中两个Fab化学偶联至全长IgG;重组Fab-IgG(r:Fab-IgG),其中两个额外Fab臂遗传偶联至IgG;及重组Fv-IgG(r:Fv-IgG),其中两个额外Fv区遗传偶联至IgG。对于这些形式中的每一种,探索如下构建体:其中所有四个可变区结合靶抗原上的相同表位(在本文中称为单表位),或其中两个可变区结合一个表位且其他可变区结合靶抗原上的不同的表位(在本文中称为双表位)。
所有四个可变区均可结合靶抗原上的相同表位,这种情况在本文中称为单表位。例如,所有四个可变区均可为抗OX40 1A7可变区,或所有四个可变区均可为抗OX40 3C8可变区。或者,两个可变区可结合一个表位且另两个可变区可结合靶抗原上不同的表位,这种情况在本文中称为双表位。例如,两个可变区可为1A7可变区,且另两个可变区可为3C8可变区。
本文中描述偶联IgG-IgG(c:IgG-IgG)形式,其中两个全长IgG化学偶联。图4说明双表位c:IgG-IgG的一种形式的组分。在此形式中,c:IgG-IgG包含对表位1具有特异性的IgGEp1与对表位2具有特异性的IgGEp2化学偶联。IgGEp2通过化学接头L与IgGEp1连接。可使用多种接头来连接IgGEp1与IgGEp2。IgGEp1与IgGEp2的连接位点可变化。所描述的c:IgG-IgG形式包含四个单独蛋白质链:由VH1-铰链-CH2-CH3构成的IgGEp1重链(HC)、由VL1-CL构成的IgGEp1轻链(LC)、由VH2-CH1-铰链-CH2-CH3构成的IgGEp2HC及由VL2-CL构成的IgGEp2LC。图5说明双表位c:IgG-IgG的另一种形式的组分。在此形式中,c:IgG-IgG包含对与其自身化学偶联的表位1及表位2均具有特异性的双表位IgGEp1&2。IgGEp1&2通过化学接头L偶联。可使用多种接头来偶联IgGEp1&2。IgGEp1&2的连接位点可变化。所描述的c:IgG-IgG形式包含四个单独蛋白质链:由VH1-铰链-CH2-CH3构成的IgGEp1重链(HC)、由VL1-CL构成的IgGEp1轻链(LC)、由VH2-CH1-铰链-CH2-CH3构成的IgGEp2HC及由VL2-CL构成的IgGEp2LC。在本文所述的实施例中,构建并测试包含1A7及3C8抗体的可变区的c:IgG-IgG。在一优选实施方案中,IgGEp1&2包含1A7可变区及3C8可变区,称为c:IgG-IgG 1A7/3C8-1A7/3C8。
本文中描述偶联Fab-IgG(c:Fab-IgG)形式,其中两个Fab与全长IgG化学偶联。图6说明c:Fab-IgG形式的组分。c:Fab-IgG包含对表位1具有特异性的IgGEp1与对表位2具有特异性的FabEp2化学偶联。FabEp2通过化学接头L与IgGEp1连接。可使用多种接头来连接IgGEp1与FabEp2。IgGEp1与FabEp2的连接位点可变化。c:Fab-IgG形式包含四个单独蛋白质链:由VH1-铰链-CH2-CH3构成的IgGEp1重链(HC)、由VL1-CL构成的IgGEp1轻链(LC)、由VH2-CH1构成的FabEp2HC及由VL2-CL构成的FabEp2LC。
在本文所述的实施例中,构建并测试包含1A7及3C8抗体的可变区的c:Fab-IgG。在一些实施方案中,IgGEp1包含1A7可变区,且FabEp2包含3C8可变区,称为c:Fab-IgG 3C8-1A7。在一些实施方案中,IgGEp1包含3C8可变区,且FabEp2包含1A7可变区,称为c:Fab-IgG 1A7-3C8。
本文中描述重组Fv-IgG(r:Fv-IgG),其中两个附加可变区与IgG遗传偶联。图7说明r:Fv-IgG形式的组分。r:Fv-IgG包含单一重链及单一轻链。r:Fv-IgG包含对表位2具有特异性的IgGEp2在N端连接至对表位1具有特异性的FvEp1。FvEp1通过重链接头LH及轻链接头LL连接至IgGEp2。可使用多种接头来连接FvEp2与FvEp1。重链包含区域VH1-LH-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3。轻链包含区域VL1-LL-VL2-CL。在此形式中,对表位2具有特异性的FvEp2包含VH2及VL2结构域,且对表位1具有特异性的FvEp1包含VH1及VL1结构域。
在本文所述的实施例中,构建并测试包含1A7及3C8抗体的可变区的r:Fv-IgG。在一些实施方案中,FvEp1包含3C8可变区,且FvEp2包含1A7可变区,称为r:Fv-IgG 3C8-1A7。在一些实施方案中,FvEp1包含1A7可变区,且FvEp2包含3C8可变区,称为r:Fv-IgG 1A7-3C8。在SEQ ID 240-243中列出例示性r:Fv-IgG的重链及轻链的序列。在SEQ ID 270-278中提供且在以下实施例16中描述例示性接头LH及LL。在SEQ ID 250-257中列出如以下实施例16中所描述的具有不同的接头LH及LL的替代例示性r:Fv-IgG。在SEQ ID 258-267中列出如以下实施例17中所描述的包含具有不同的OX40亲和力的Fv的替代例示性r:Fv-IgG。
本文中描述重组Fab-IgG(r:Fab-IgG),其中两个附加Fab臂与IgG基因连接。图8说明包含一个同源二聚HC及两个LC的r:Fab-IgG形式的一种形式的组分。此r:Fab-IgG形式(在本文中称为r:Fab-IgG V1)包含对表位2具有特异性的IgGEp2在N端连接至对表位1具有特异性的FabEp1。FabEp1通过重链接头LH与IgGEp2连接。可使用多种接头来连接FabEp1与IgGEp2。r:Fab-IgG V1中的HC包含VH1-CH1-LH-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3。一个LC包含VL1-CL,且另一个LC包含VH2-CL。在VH、CH1、VL及/或CL结构域中,可使用经改造变体来控制重链与轻链之间的正确配对,如本文中的实施例中所描述。在此形式中,对表位2具有特异性的FvEp2包含VH2及VL2结构域,且对表位1具有特异性的FvEp1包含VH1及VL1结构域。
在本文所述的实施例中,构建并测试包含1A7及3C8抗体的可变区的r:Fab-IgG V1抗体。在一些实施方案中,FvEp1包含3C8可变区,且FvEp2包含1A7可变区,称为r:Fab-IgG3C8-1A7。在一些实施方案中,FvEp1包含1A7可变区,且FvEp2包含3C8可变区,称为r:Fab-IgG 1A7-3C8。在SEQ ID 244-249中列出例示性抗OX40r:Fab-IgG的重链及轻链的序列。
图9说明包含异源二聚HC及两个LC的r:Fab-IgG形式的替代形式的组分。此r:Fab-IgG形式(在本文中称为r:Fab-IgG V2)包含FabEp2通过重链接头LH与IgGEp1&2的一个臂连接,且FabEp1通过重链接头LH与IgGEp1&2的另一个臂连接。可使用多种接头来连接FabEp1与IgGEp1 &2及FabEp2与IgGEp1&2。此形式的一个HC包含VH2-CH1-LH-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3,且此形式的另一个HC包含VH1-CH1-LH-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3。此形式的一个LC包含VL2-CL,且另一个LC包含VH1-CL。对表位2具有特异性的FvEp2包含VH2及VL2结构域。对表位1具有特异性的FvEp1包含VH1及VL1结构域。可使用经改造的变体来促进重链的异源二聚体形成。
可使用多种接头来连接FabEp1与IgGEp2。接头可包含基本上包含丝氨酸、甘氨酸或丝氨酸及甘氨酸的序列。这种Gly-Ser接头可包含超过50%甘氨酸及/或丝氨酸、超过70%甘氨酸及/或丝氨酸、超过90%甘氨酸及/或丝氨酸或100%甘氨酸及/或丝氨酸。丝氨酸及甘氨酸由于其柔性及良好溶液性质而常用作接头。接头可另外或也包含基本上包含天然抗体序列的序列。在这些接头中,将构成抗体序列的天然序列用作接头。尤其适用于r:Fab-IgG的天然抗体序列为存在于天然抗体的介于重链恒定区CH1与CH2之间的铰链区中的重链序列。天然抗体序列接头的效用为其可用于减少四价抗体形式内的一些非天然序列。给定接头的长度可自1个残基至20个以上残基变化。通常,长度愈大,所连接的免疫球蛋白结构域之间的柔性愈大。在SEQ ID NO:268及269中描述用于本发明的r:Fab-IgG中的例示性重组接头。
SEQ ID NO:268.用于r:Fab-IgG的LH接头:DKTHT
SEQ ID NO:269.用于r:Fab-IgG的LH接头:DKTHTGGGGSGG
尽管本文中描述Fab通过单一重链接头(LH)与IgG连接的r:Fab-IgG形式,但预期r:Fab-IgG也可在轻链之间包含接头。针对r:Fab-IgG形式探索实际连接的轻链构建体,但在表达及纯化后获得较大聚集物质群体(数据未显示)且因此未进一步表征。
以下提供抗OX40IgG及本文所述的四价形式的重链及轻链的例示性序列。适当时给接头加下划线。
r:Fv-IgG形式
SEQ ID NO:240.r:Fv-IgG 1A7-3C8重链。
SEQ ID NO:241.r:Fv-IgG 1A7-3C8轻链。
SEQ ID NO:242.r:Fv-IgG 3C8-1A7重链。
SEQ ID NO:243.r:Fv-IgG 3C8-1A7轻链
SEQ ID NO:250.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS短接头重链。
SEQ ID NO:251.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS短接头轻链。
SEQ ID NO:252.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS长接头重链。
SEQ ID NO:253.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS长接头轻链。
SEQ ID NO:254.r:Fv-IgG 3C8-1A7ES短肘弯接头重链。
SEQ ID NO:255.r:Fv-IgG 3C8-1A7ES短肘弯接头轻链。
SEQ ID NO:256.r:Fv-IgG 3C8-1A7EL长肘弯接头重链。
SEQ ID NO:257.r:Fv-IgG 3C8-1A7EL长肘弯接头轻链。
SEQ ID NO:258.r:Fv-IgG 3C8-1A7(高)重链。
SEQ ID NO:259.r:Fv-IgG 3C8-1A7(高)轻链。
SEQ ID NO:260.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7重链。
SEQ ID NO:261.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7轻链
SEQ ID NO:262.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(高)重链
SEQ ID NO:263.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(高)轻链
SEQ ID NO:264.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(低)重链
SEQ ID NO:265.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(低)轻链
SEQ ID NO:266.r:Fv-IgG 3C8-1A7(低)重链
SEQ ID NO:267.r:Fv-IgG 3C8-1A7(低)轻链
r:Fab-IgG形式
SEQ ID NO:244.r:Fab-IgG 1A7-3C8重链。
SEQ ID NO:245.r:Fab-IgG 1A7-3C8轻链1。
SEQ ID NO:246.r:Fab-IgG 1A7-3C8轻链2。
SEQ ID NO:247.r:Fab-IgG 3C8-1A7重链。
SEQ ID NO:248.r:Fab-IgG 3C8-1A7轻链1。
SEQ ID NO:249.r:Fab-IgG 3C8-1A7轻链2。
c:Fab-IgG形式
SEQ ID NO:232.3C8_IgG1(全长重链)。
SEQ ID NO:237.3C8_Cκ(K149C)(轻链)。
SEQ ID NO:239.1A7_CH1-SPPC(Fab重链)。
SEQ ID NO:231.1A7_Cκ(轻链)。
SEQ ID NO:230.1A7_IgG1(全长重链)。
SEQ ID NO:236.1A7_Cκ(K149C)(轻链)。
SEQ ID NO:238.3C8_CH1-SPPC(Fab重链)。
SEQ ID NO:233.3C8_Cκ(轻链)。
序列
SEQ ID NO:230.1A7_IgG1(全长重链)。
SEQ ID NO:231.1A7_Cκ(轻链)。
SEQ ID NO:232.3C8_IgG1(全长重链)。
SEQ ID NO:233.3C8_Cκ(轻链)。
SEQ ID NO:234.1A7_CH1(Fab重链)。
SEQ ID NO:235.3C8_CH1(Fab重链)。
SEQ ID NO:236.1A7_Cκ(K149C)(轻链)。
SEQ ID NO:237.3C8_Cκ(K149C)(轻链)。
SEQ ID NO:238.3C8_CH1-SPPC(Fab重链)。
SEQ ID NO:239.1A7_CH1-SPPC(Fab重链)。
SEQ ID NO:240.r:Fv-IgG 1A7-3C8重链。
SEQ ID NO:241.r:Fv-IgG 1A7-3C8轻链。
SEQ ID NO:242.r:Fv-IgG 3C8-1A7重链。
SEQ ID NO:243.r:Fv-IgG 3C8-1A7轻链。
SEQ ID NO:244.r:Fab-IgG 1A7-3C8重链。
SEQ ID NO:245.r:Fab-IgG 1A7-3C8轻链1。
SEQ ID NO:246.r:Fab-IgG 1A7-3C8轻链2。
SEQ ID NO:247.r:Fab-IgG 3C8-1A7重链。
SEQ ID NO:248.r:Fab-IgG 3C8-1A7轻链1。
SEQ ID NO:249.r:Fab-IgG 3C8-1A7轻链2。
SEQ ID NO:250.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS短接头重链,如实施例16中所描述。
SEQ ID NO:251.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS短接头轻链,如实施例16中所描述。
SEQ ID NO:252.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS长接头重链,如实施例16中所描述。
SEQ ID NO:253.r:Fv-IgG 3C8-1A7GS长接头轻链,如实施例16中所描述。
SEQ ID NO:254.r:Fv-IgG 3C8-1A7ES短肘弯接头重链,如实施例16中所描述。
SEQ ID NO:255.r:Fv-IgG 3C8-1A7ES短肘弯接头轻链,如实施例16中所描述。
SEQ ID NO:256.r:Fv-IgG 3C8-1A7EL长肘弯接头重链,如实施例16中所描述。
SEQ ID NO:257.r:Fv-IgG 3C8-1A7EL长肘弯接头轻链,如实施例16中所描述。
SEQ ID 258及259描述实施例17中所描述的包含1A7VH突变M34I及VL突变R53Y的r:Fv-IgG 3C8-1A7(高)的重链及轻链序列。
SEQ ID NO:258.r:Fv-IgG 3C8-1A7(高)重链。
SEQ ID NO:259.r:Fv-IgG 3C8-1A7(高)轻链。
SEQ ID 260及261描述如实施例17中所描述的包含3C8VH突变M31I及K64L的r:Fv-IgG3C8(高)的重链及轻链序列。
SEQ ID NO:260.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7重链。
SEQ ID NO:261.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7轻链
SEQ ID 262及263描述实施例17中所描述的包含3C8VH突变M31I及K64L、1A7VH突变M34I以及1A7VL突变R53Y的r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(高)的重链及轻链序列。
SEQ ID NO:262.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(高)重链
SEQ ID NO:263.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(高)轻链
SEQ ID 264及265描述实施例17中所描述的包含3C8VH突变M31I及K64L以及1A7VH突变P96A的r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(低)的重链及轻链序列。
SEQ ID NO:264.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(低)重链
SEQ ID NO:265.r:Fv-IgG 3C8(高)-1A7(低)轻链
SEQ ID 266及267描述实施例17中所描述的包含1A7VH突变P96A的r:Fv-IgG 3C8-1A7(低)的重链及轻链序列。
SEQ ID NO:266.r:Fv-IgG 3C8-1A7(低)重链
SEQ ID NO:267.r:Fv-IgG 3C8-1A7(低)轻链
SEQ ID NO:279-288中提供可用于本发明的例示性重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)及轻链恒定区(CL)。如本领域中众所周知,人恒定链存在多晶型、异型及单体型变体,且这些变体可用于本发明。
SEQ ID NO:279.人IgG1重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)
SEQ ID NO:295.人IgG2重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)
SEQ ID NO:296.人IgG3重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)
RWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:297.人IgG4重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)
SEQ ID NO:298.人Cκ轻链恒定区(CL-κ)。
SEQ ID NO:299.人Cλ1轻链恒定区(CL-λ1)。
SEQ ID NO:300.人Cλ2轻链恒定区(CL-λ2)。
SEQ ID NO:301.人Cλ3轻链恒定区(CL-λ3)。
TVAPTECS
SEQ ID NO:302.人Cλ6轻链恒定区(CL-λ6)。
SEQ ID NO:303.人Cλ7轻链恒定区(CL-λ7)。
实施例3.偶联IgG-IgG抗体的改造及表征
材料及方法
使用1A7及3C8可变区产生单表位及双表位偶联IgG-IgG(c:IgG-IgG)抗OX40抗体。通过改造不对称硫代单抗(thiomab)来构建c:IgG-IgG抗体,该不对称硫代单抗为双特异性抗体,其中仅一个半抗体具有游离半胱氨酸。在本发明实验中,使用人Cκ恒定区上的取代K149C,但本发明涵盖使用任何抗体残基处的经改造半胱氨酸。如上所述,使用杵入臼变体(参考物)及体外组装半抗体来产生在K149C处包含单一游离半胱氨酸的双特异性抗体(Spiess等人,2013,Nat Biotechnol 31(8):753-8)。在pRK载体中构建抗体,且所有抗体重链均含有N297G突变以移除糖基化且减少与Fc受体的结合。1A7及3C8半抗体含有杵/His或臼/Flag重链及天然或K149C轻链,视期望的构建体而定。将编码各抗体的重链及轻链的pRK载体DNA共转染至HEK293细胞中以供表达,自上清液中纯化出所得蛋白质,且组装双特异性抗体并且如上所述加以纯化。
通过使用双马来酰亚氨基聚乙二醇接头(双马来酰亚氨基(PEG)化学偶联不对称硫代单抗双特异性抗体来产生c:IgG-IgG抗体。使用如以上所提及的杵入臼技术,利用杵或臼的轻链上的K149C突变来产生不对称硫代单抗双特异性抗体。对于本发明实验,通过含有2或3个PEG亚单位的接头,通过杵或臼上的K149C位点来制备IgG-IgG抗体,但预期可利用各种PEG长度。
结果
测试c:IgG-IgG抗体激动OX40受体的能力。自暗黄覆盖层分选CD4+记忆T细胞(CD4+CD45RO+),且使用表达CD80(B7-1)及CD32a(FcγRIIa)或仅CD32a(FcγRIIa)的经照射L细胞作为替代抗原呈递细胞(APC)。培育CD4+记忆T细胞与L细胞,用可溶性抗CD3抗体(小鼠抗人CD3克隆SP34)及增加浓度的抗OX40抗体或抗Her2抗体对照进行刺激。将细胞培养7天,收集,且通过(Promega)分析T细胞增殖并且通过ELISA分析细胞因子释放。
T细胞增殖数据示于图10中。这些结果显示尽管四价单表位1A7(N297G)-1A7(N297G)及二价双表位1A7/3C8(N297G)在不存在FcR介导的交联的情况下提供适度激动活性水平,但四价双表位1A7/3C8(N297G)-1A7/3C8(N297G)促进强激动活性水平。
重复该分析,其中测试设定中包括四价单表位3C8(N297G)-3C8(N297G)。这些数据示于图11中。这些结果再次显示1A7/3C8四价形式在不存在交联(N297G)的情况下的有效激动作用,且说明在四价接合的情形下靶向1A7及3C8表位的协同组合。重要的是,数据也显示1A7/3C8c:IgG-IgG形式在不存在CD3刺激的情况下无活性,从而指明尽管其具有有效活性,但仍需要TCR接合。
实施例4.偶联FAb-IgG抗体的改造及表征
材料及方法
产生基于1A7及3C8可变区的单表位及双表位偶联Fab-IgG(c:Fab-IgG)抗OX40抗体。通过使在K149C处包含游离半胱氨酸的1A7全长人IgG1与经改造而具有C端游离半胱氨酸的3C8Fab偶联来构建c:Fab-IgG抗体。在本发明实验中,使用人Cκ恒定区上的取代K149C,但本发明涵盖使用任何抗体残基处的经改造半胱氨酸。
通过使用双马来酰亚氨基聚乙二醇接头(双马来酰亚氨基(PEG)化学偶联Fab及IgG抗体来产生c:IgG-IgG抗体。对于本发明实验,接头含有2或3个PEG亚单位。预期可利用各种PEG长度。使3C8Fab与双马来酰亚氨基BMPEG3反应,接着移除过量BMPEG3。接着使缀合的3C8Fab与1A7 IgG1 K149C反应,并且使用常规层析法,使用S200SEC柱,然后以Mono-Q柱来纯化偶联的Fab-IgG。使用分析型大小排阻层析联合多角度光散射(SEC-MALS)以及质谱来评定最终经纯化的c:Fab-IgG抗体的质量。使用Xbridge BEH柱在PBS中在08.ml/min下运作SEC-MALS。
结果
结果示于图12中。数据拟合产生如下最终半径及分子量:c:Fab-IgG 1A7/3C8具有7.3nm+/-4.6%的Rh(Q)z(nm)及248.6+/-15%KDa的MW;c:Fab-IgG 1A7(N297G)/3C8具有7.3nm+/-4.3%的Rh(Q)z及238.2KDa+/-16.7%的MW。质谱证实(数据未显示)经纯化的c:Fab-IgG具有预测MW。
如上所述,利用表达CD32a的L细胞作为替代抗原呈递细胞(APC),使用原代T细胞分析法来测试c:IgG-IgG抗体激动OX40受体的能力。人IgG1及人IgG1(N297G)形式的T细胞增殖数据分别示于图13及图14中。结果显示1A7/3C8 c:Fab-IgG形式促进强水平的激动活性,与由二价1A7IgG、二价3C8 IgG、双表位1A7/3C8 IgG介导的弱活性相反。这些结果与关于(相同分析中所包括的)c:IgG-IgG形式的数据一起显示在四价的情形下靶向两个表位(在此实施例中,1A7及3C8 OX40表位)的益处。
实施例5.重组Fv-IgG抗体的改造及表征
材料及方法
产生基于1A7及3C8可变区的单表位及双表位重组Fv-IgG(r:Fv-IgG)抗OX40抗体。通过基因改造天然VL区N端的另一VL区及天然VH区N端的另一VH区来构建r:Fv-IgG抗体。所构建的r:Fv-IgG产生四价单表位(1A7-1A7及3C8-3C8)形式或四价双表位(1A7-3C8及3C8-1A7)形式。这些实施例中所使用的r:Fv-IgG 1A7-3C8的重链及轻链氨基酸序列分别提供于SEQID NO:240-241中,且这些实施例中所使用的r:Fv-IgG 3C8-1A7的重链及轻链氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO:242-243中。使用常规分子生物学方法在pRK载体中构建抗体。所有抗体均包含天然IgG1恒定区。将编码各r:Fv-IgG的重链及轻链的pRK载体DNA共转染至HEK293细胞中以供表达,且使用MabSelect Sure树脂自上清液中纯化出所得蛋白质。
使用具有荧光素酶报道基因的表达OX40的Jurkat细胞(克隆2A4Jurkat-OX40-luc)来测试r:Fv-IgG抗体激动OX40受体的能力。将细胞以2×105个细胞/孔接种在Corning 96孔平板(目录号3603)中,于50μL AIM-V培养基(Thermo Fischer Scientific,目录号12055-091)中接种在96孔组织培养板(Corning Inc.,目录号3603)中。将抗OX40抗体以2X浓度连续稀释于AIM-V培养基中,且向各孔中加入50μL经稀释的抗体并且在37℃下在5%CO2下培育16至18小时。加入100μL Bright Glo(Promega,目录号E2610)并且在室温下混合10分钟。在Infinite M1000Pro酶标仪(Tecan)上检测发光。与上述原代T细胞分析相反,此Jurkat报道基因分析不包括与FcR+L细胞一起共培育。此分析中的激动活性因而仅体现由抗体在不存在任何人工交联的情况下介导的交联。
结果
数据示于图15中。在不存在任何交联的情况下,1A7 IgG1抗体不介导OX40受体激动作用。四价单表位构建体(r:Fv-IgG 1A7-1A7及r:Fv-IgG 3C8-3C8)介导中度水平的交联非依赖性活性。四价双表位构建体(r:Fv-IgG 3C8-1A7及r:Fv-IgG 1A7-3C8)介导最强水平的激动活性。
如上所述,利用表达CD32a的L细胞,使用原代T细胞分析法来测试r:Fv-IgG抗体激动OX40受体的能力。人IgG1形式的T细胞增殖数据示于图16中。与Jurkat荧光素酶报道基因分析一致,双表位形式(1A7-3C8及3C8-1A7)促进受体活化,基本上超过单表位形式(1A7-1A7及3C8-3C8)的活性。r:FAb-IgG结果与关于c:IgG-IgG形式及c:Fab-IgG形式的数据一起进一步支持在四价的情形下靶向两个表位(在此实施例中,1A7及3C8 OX40表位)的益处。
实施例6.重组Fab-IgG抗体的改造及表征
材料及方法
产生包含1A7及3C8可变区的单表位及双表位重组Fab-IgG(r:Fab-IgG)抗OX40抗体。通过基因改造天然重链Fab(VH-CH1)区N端的另一重链Fab区(VH-CH1)来构建r:Fab-IgG抗体。通过分别构建串联1A7或3C8Fab(也即,1A7-1A7或3C8-3C8)且共表达1A7或3C8轻链(VL-Cκ)来改造r:Fab-IgG的四价单表位形式。四价单表位r:Fab-IgG为与天然IgG相同的“双链系统”,也即,存在单一重链及单一轻链。r:Fab-IgG的四价双表位形式需要额外改造以控制重链/轻链配对。通过针对1A7及3C8共表达串联重链(例如1A7-3C8或3C8-1A7)与轻链,从而产生“三链系统”(用于1A7-3C8方向的SEQ ID NO:244-246或用于3C8-1A7方向的247-249)来制备双表位形式。可变区自身不能确保适当配对,且因此如国际公开第WO2016172485号中所描述将正交变体并入VH/VL及CH1/CL区中。VH/VL区利用变体对VH-Q39K/VL-Q38E或VHQ39E/VL Q38K(Kabat编号),且CH1/CL区利用变体对CH1-S183E/CL-V133K或CH1-S183K/CL-V133E(EU编号)。决定适当重链/轻链配对的其他预期变体包括CH1A141I、F170S、S181M、S183A、V185A以及CL F116A、L135V、S174A、S176F及T178V(EU编号)。使用常规分子生物学方法在pRK载体中构建抗体。将编码各r:Fab-IgG的重链及轻链(对于单表位,一个轻链[1A7或3C8];且对于双表位,两条轻链[1A7及3C8])的pRK载体DNA共转染至HEK293细胞中以供表达。使用MabSelect Sure树脂自上清液中纯化出所得蛋白质。
使用分析型大小排阻层析联合多角度光散射(SEC-MALS)以及质谱来评定最终经纯化r:Fab-IgG抗体的质量。如上所述,使用Xbridge BEH柱在PBS中运作SEC-MALS。
结果
对于双表位r:Fab-IgG形式3C8-1A7及1A7-3C8,结果分别示于图17及图18中。数据拟合产生最终半径及分子量如下:r:Fab-IgG 3C8-1A7具有7.6nm的Rh(Q)z(nm)及约236KDa的MW,且r:Fab-IgG 1A7-3C8具有7.2nm的Rh(Q)z及约233.3KDa的MW。
如上所述,使用具有荧光素酶报道基因的表达OX40的Jurkat细胞(2A4Jurkat-OX40-luc)来测试r:Fab-IgG抗体激动OX40受体的能力。数据示于图19中。四价单表位构建体(r:Fab-IgG 1A7-1A7及r:Fab-IgG 3C8-3C8)不介导交联非依赖性活性。相反,四价双表位构建体(r:Fab-IgG 3C8-1A7及r:Fab-IgG 1A7-3C8)介导强激动活性。
如上所述,利用表达CD32a的L细胞,使用原代T细胞分析法来测试r:Fab-IgG抗体激动OX40受体的能力。人IgG1形式的T细胞增殖数据示于图20中。四价单表位形式显示无活性(1A7-1A7)或适度活性(3C8-3C8)。相反且与Jurkat荧光素酶报道基因分析一致,双表位形式(1A7-3C8及3C8-1A7)促进强受体活化。r:FAb-IgG结果与关于c:IgG-IgG、c:Fab-IgG及r:Fv-IgG形式的数据一起进一步支持在四价的情形下靶向两个表位(在此实施例中,1A7及3C8OX40表位)的益处。
实施例7.四价形式的大规模产生
大规模表达并纯化四价形式以进行更深层次的体外及体内表征。通过如上所述的基因合成或突变在pRK哺乳动物表达载体中构建以下所描述的所有新变体的DNA。将重链及轻链DNA共转染至293或CHO细胞中以便如上所述进行表达。在大肠杆菌中表达编码Fab的DNA。
r:Fab-IgG及r:Fv-IgG抗OX40抗体的纯化
将所收集的CHO培养基上样至5mL MabSelect SuRe柱(GE Hcalthcare,编号17-5438-01)上。在上样样品之后,用10倍柱体积(CV)的Tris缓冲液(25mM Tris pH 7.0、150mMNaCl、5mM EDTA、2mM叠氮化钠(NaN3))、5倍CV的Triton X-114缓冲液(25mM Tris pH 7.0、150mM NaCl、5mM EDTA、0.1%Triton X-114、2mM NaN3)、10倍CV的Tris缓冲液、2倍CV的KP洗涤缓冲液(0.4M磷酸钾pH 7.0、5mM EDTA、0.02%聚山梨醇酯Tween 20)及最终10倍CV的Tris缓冲液洗涤柱。用5倍CV的洗脱缓冲液(50mM柠檬酸钠pH 3.0、150mM NaCl)洗脱蛋白质,并且立即用1M Tris pH 8.0缓冲液中和。浓缩已中和的洗脱液,并且在HiLoad 16/600Superdex 200大小排阻层析(SEC)柱(GE Healthcare,编号28-983-36)上以精氨酸缓冲液(200mM精氨酸、137mM琥珀酸、1mM NaN3)作为移动相进行纯化。以1mL增量收集所洗脱的级分,并且通过SDS-PAGE加以分析。浓缩最终洗脱液汇集物,并且配制成20mM组氨酸乙酸盐(HisOAc)pH 5.5、240mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯Tween 20中。
c:Fab-IgG的产生
在大肠杆菌中表达铰链-半胱氨酸-Fab(Fab-SPPC),并且如先前所描述进行纯化(Scheer,J.M.等人,Reorienting the Fab domains of trastuzumab results in potentHER2activators.PLoS One 2012,7,e51817)。在CHO细胞中重组表达THIOMAB抗体,并且如先前所描述进行纯化(Sadowsky,J.D.等人,Development of efficient chemistry togenerate site-specific disulfide-linked protein-and peptide-payloadconjugates:Application to THIOMABTM antibody-drugconjugates.Bioconjug.Chem.2017)。
用双马来酰亚胺交联剂对铰链-半胱氨酸-Fab进行官能化。在N,N-二甲基乙酰胺(Sigma Aldrich,D5511)中将新鲜双马来酰亚胺交联剂(BMPEG)(ThermoFisherScientific,22337)复原至50mM的终浓度。接着使经纯化的Fab-SPPC与10摩尔当量的BMPEG在pH 5.0下在室温下反应2小时,并且通过质谱监测反应进展。在培育2小时之后,反应完毕且通过利用10,000MWCO Amicon Ultra-15离心过滤器亚单位(UFC901096,Millipore)简单缓冲液交换成结合缓冲液(25mM乙酸钠(NaOAc)pH 5.0,2mM NaN3)来移除过量交联剂。在缓冲液交换后,利用质谱来分析最终官能化Fab(Fab-BMPEG)。
缀合c:Fab-IgG并加以纯化。使经纯化的THIOMAB抗体(5mg/mL)与五倍摩尔过量的Fab-BMPEG(5mg/mL)反应。用缀合缓冲液将反应混合物处理至最终pH 5.0,并且在室温下培育21小时。利用质谱监测反应进展。培育21小时之后,反应完毕且利用疏水性相互作用层析(HIC)纯化反应混合物。简言之,用1.5M硫酸铵处理样品并且上样至ProPacTM HIC-10柱(5μm,7.8mm×75mm)(Thermo Scientific,063665)上。在样品上样之后,用5倍CV的HIC-缓冲液A(50mM磷酸钾pH 7.0、1M硫酸铵)洗涤柱并且用60倍CV的HIC-缓冲液B(50mM磷酸钾pH 7.0、20%异丙醇)的0%至80%线性梯度进行洗脱。收集所洗脱的级分,并且在配制之前通过LC/MS加以分析。将最终缀合物配制成20mM HisOAc pH 5.5、150mM NaCl缓冲液中,并且利用LC/MS、SDS-PAGE及SEC评定最终缀合物的质量。
c:IgG-IgG的产生
表达ThioMab_KiH(杵入臼)抗体并加以纯化。如先前所描述对半抗体进行表达、纯化及退火(Atwell,S.,Ridgway,J.B.,Wells,J.a及Carter,P.Stable heterodimers fromremodeling the domain interface of a homodimer using a phage displaylibrary.J.Mol.Biol.1997,270,26-35),以形成杵入臼式THIOMAB抗体(ThioMab_KiH)。由于退火过程,ThioMab_KiH抗体上经改造的半胱氨酸被阻断且因而对马来酰亚胺交联剂不具反应性。为了移除加合物,如先前所描述对ThioMab_KiH抗体进行还原及再氧化(Sadowsky,J.D.等人,Development of efficient chemistry to generate site-specific disulfide-linked protein-and peptide-payload conjugates:Applicationto THIOMABTM antibody-drug conjugates.Bioconjug.Chem.2017)。将最终去保护的ThioMab_KiH抗体配制成结合缓冲液中并且储存在4℃下。
使ThioMab_KiH抗体偶联。接着使去保护的ThioMab_KiH抗体与10摩尔当量的新制BMPEG(参见上文)在pH 5.0下在室温下反应2小时,并且通过质谱监测反应进展。在反应完毕之后,通过离子交换层析(IEX)移除过量交联剂。简言之,用IEX-缓冲液A(25mM NaOAc pH5.0、2mM NaN3)将反应混合物稀释10倍,并且上样至预平衡Hi-Trap SPHP(GE Healthcare,17115201)柱上。在样品上样之后,用5倍CV的IEX-缓冲液A洗涤柱并且用1倍CV的IEX-缓冲液B(25mM NaOAc pH 5.0、1000mM NaCl、2mM NaN3)的0%至100%阶梯梯度进行洗脱。收集级分并且通过质谱加以分析。将最终样品(ThioMab_KiH_BMPEG)浓缩至5mg/mL,并且配制成缀合缓冲液中。
接着将经纯化的ThioMab_KiH_BMPEG加入至含1.5倍摩尔过量的ThioMab_KiH的相同缓冲液中,以形成偶联IgG。在室温下将反应混合物培育48小时,并且通过LC/MS分析监测反应进展。在48小时之后,反应完毕且如早先所描述利用HIC纯化混合物。将最终经纯化的CIgG配制成20mM HisOAc pH 5.5、150mM NaCl中。
实施例8.四价双表位抗体形式的固有激动活性
测试r:Fv-IgG抗体在不存在交联的情况下活化T细胞的能力。如上所述利用LALAPG效应物减弱变体,改造并产生r:Fv-IgG双表位形式3C8-1A7及1A7-3C8以及单表位形式1A7-1A7及3C8-3C8。如上所述在原代人T细胞分析中使用FcγRIIa+L细胞(L细胞不表达B7-1)来测试r:Fv-IgG。
T细胞增殖数据示于图21中。双表位r:Fv-IgG的3C8-1A7及1A7-3C8显示最高活性水平且不显示依赖于Fc介导的交联:无论r:Fv-IgG是IgG1或是LALAPG,这些曲线看起来实际上相同。单表位r:Fv-IgG形式1A7-1A7及3C8-3C8显示活性相对于IgG1 1A7有所增强,但活性相对于双表位r:Fv-IgG形式而言较弱。此外,在不存在Fc介导的交联的情况下(右图中的LALAPG形式),单表位r:Fv-IgG显示无活性。由r:Fab-IgG抗OX40抗体的人IgG1及人IgG1LALAPG形式获得类似结果(数据未显示)。
实施例9.单表位及双表位四价形式的活性比较
如上所述在Jurkat报道基因分析中测试所有四种四价形式。如所描述,此分析中的激动活性体现抗体在不存在任何非固有交联的情况下的固有活性。图22及图23中的数据显示四价双表位形式相对于单表位形式的明显优异性。此外,此分析中所测试的二价双表位1A7/3C8抗体说明仅靶向两个表位的二价IgG就激动活性而言不充分。在四价的情况下靶向两个表位提供最佳活性。
在Jurkat报道基因分析中直接测试所有四价双表位形式。图24中的数据显示相对于生物缀合双表位c:Fab-IgG及c:IgG-IgG形式,重组双表位形式r:Fv-IgG及r:Fab-IgG提供更大活性。在此分析中,r:Fv-IgG 3C8-1A7抗体显示相对于其他r:Fv-IgG及r:Fab-IgG形式的轻微优异性。
实施例10.抗体:OX40复合物形成的测量
使用与多角度光散射串联连接的大小排阻层析(SEC-MALS)来测试四价单表位及双表位抗体形式在与标靶OX40结合后形成高阶(免疫)复合物的能力。将经纯化的抗体及人OX40(G&P Biosciences FCL2479)以不同的摩尔比混合在PBS中。使混合物在Waters xBrdigeBEH200A SEC 3.5μm(7.8×300mm)柱上运行,且通过与Wyatt Technology检测器DAWNHELEOS-II多角度雷射光散射亮度计及Optilab T-rEX差示折射率检测器连接的Agilent1200HPLC加以分析。
图25显示r:Fv-IgG的SEC层析谱。相对于单表位r:Fv-IgG 1A7-1A7,针对双表位r:Fv-IgG 1A7-3C8之间形成的复合物观察到在洗脱时间方面存在大得多的早期位移,此与尺寸成正比。对r:Fab-IgG及c:Fab-IgG形式获得类似结果(数据未显示),表明与四价单表位形式相比,四价双表位形式能够与标靶蛋白质形成更大的免疫复合物。
图26显示由得自这些实验的MALS数据得到的抗体/OX40复合物的计算尺寸。该数据进一步支持通过标靶结合四价双表位形式形成的免疫复合物相对于四价单表位及二价双表位形式二者而言均更大。这些数据与在原子价大于2的情况下自靶向两个表位观察到优异激动活性一致。
实施例11.四价抗OX40抗体在小鼠中的药物动力学(PK)
在C57BL-6或C.B-17SCID(严重复合型免疫缺陷)小鼠中测试四价抗体形式的PK。此节中所描述的小鼠PK研究经Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准。所有测试抗体均包含天然人IgG1重链恒定及Cκ轻链恒定链。在免疫缺陷C.B-17SCID小鼠中评估IgG1 1A7、r:Fv-IgG 1A7-1A7、r:Fv-IgG 1A7-3C8、r:Fab-IgG 1A7-1A7、r:Fab-IgG1A7-3C8、c:Fab-IgG 1A7-1A7、c:Fab-IgG 3C8-1A7及cIgG-cIgG 3C8-3C8抗体的PK。另外,在免疫活性C57BL-6小鼠中评估1A7IgG1、r:Fv-IgG 1A7-3C8、r:Fab-IgG 1A7-3C8、cIgG-IgG 1A7-3C8及c:Fab-IgG 1A7-3C8抗体的PK。包括抗gD IgG1抗体作为同种型对照。利用10mg/kg抗OX40抗体的单次静脉内(i.v)剂量进行小鼠PK研究,且在不同的时间点收集血清样品(n=3/时间点/组)以进行PK分析,直至剂量后第21天。
使用具有比色检测系统的夹心ELISA对C57BL-6或C.B-17SCID小鼠血清中的抗OX40huIgG1抗体(IgG1、r:Fv-IgG、r:Fab-IgG、c:Fab-IgG或c:IgG-IgG)及同种型对照抗gDhuIgG1抗体进行定量。用绵羊抗人IgG涂布微量滴定板以捕获抗OX40。将经稀释的样品、标准物及对照加入至该平板并且培育。随后,加入山羊抗人IgG-HRP以用于检测,并且培育。加入过氧化物酶底物(四甲基联苯胺)以显色,并且通过加入1M磷酸来终止反应。在450nm处读取板以检测吸光度,并且在620nm处读取板以检测参考吸光度。通过将数据输入四参数对数曲线拟合程序中来确定样品浓度。该分析的报告范围为0.156-20ng/mL抗OX40。对于C57BL-6小鼠血清或C.B-17SCID小鼠血清,最低样品稀释度为1/100,从而获得15.6ng/mL的最低可定量浓度。
如图27及图28中所示,抗OX40抗体形式,包括IgG1、r:Fv-IgG、r:Fab-IgG、c:Fab-IgG1及cIgG1,在C.B-17SCID小鼠中显示类似的PK性质,与对照抗gD IgG1抗体相当。所有抗体形式在静脉注射后均显示双指数降低与短分布阶段及长终末消除阶段。在C57BL-6小鼠中,IgG1、r:Fv-IgG、r:Fab-IgG及c:Fab-IgG的PK大体上与抗gD对照相当,直至第10天(图29)。r:Fv-IgG、r:Fab-IgG及c:Fab-IgG1在第14天及第21天的较高PK变异性可能或许由于抗药物抗体出现。c:IgG-IgG暴露与IgG1相比稍低直至第3天,但自第7天起观察到暴露快速降低,此或许由于抗药物抗体出现。
实施例12.在人OX40敲入(hOX40ki)小鼠中的药效学(PD)研究
测试抗OX40抗体形式的体内PD响应于用匙孔血蓝蛋白(KLH)抗原免疫的刺激T细胞活化的能力。在第0天,将人OX40敲入小鼠(Genentech,Inc.)皮下(尾根部)注射PBS或于CFAH37Ra(BD Difco;目录号231131)中乳化的50μg Imject mcKLH Subunits(ThermoFisherScientific;目录号77649),比率为1:1,每只小鼠注射的总体积为100μL。在第+1天,将动物分组且经静脉内施用10mg/kg抗人OX40抗体(所有人IgG1重链恒定区)或作为对照的抗gD人IgG1。为了定量抗KLH IgG抗体反应,在第+14天对来自不同的组的小鼠进行抽血,并且通过ELISA试剂盒,根据制备商的说明书(Life Diagnostics,Inc;目录号KLHG-1)来测量血清抗KLH IgG水平。
为了评定记忆反应,在第+16天利用50μg可溶性KLH对小鼠进行腹膜内再攻击,并且在再攻击后4天(第+20天)剖析引流淋巴结。在一些实验中,在第+20天自引流淋巴结纯化出CD4+T细胞,并且在得自WT小鼠的经纯化CD11c+脾脏DC存在下用10μg/mL可溶性KLH进行体外刺激。2天后,收集上清液并且使用Luminex分析IFN-γ产生。通过学生t检验来分析统计显著性。除非另外指示,否则数据表示平均值±SEM,其中p<0.05被视为统计上显著。
图30、图31及图32显示得自比较r:Fv-IgG 1A7-3C8与1A7及3C8的IgG1形式的KLH免疫PD实验的结果。四价双表位抗体形式优异CD4T细胞扩增及抗KLH IgG反应(图30),以及在引流淋巴结(dLN)中的CD8T细胞扩增及总细胞扩增(图31)。在利用KLH离体再刺激经纯化的CD4+T细胞之后,四价双表位形式也刺激更大程度的干扰素γ(IFN-γ)(图32)。
重复研究直接比较r:Fv-IgG、c:Fab-IgG及r:Fab-IgG四价双表位形式,以及1A7及3C8抗体的IgG1形式。图33显示得自此实验的数据。r:Fv-IgG及c:Fab-IgG显示在CD4及CD8T细胞扩增方面的明显优异性,其中r:Fab-IgG显示较适中的T细胞活化水平。总而言的,这些结果突出显示四价双表位抗体的优异体外激动活性转化成更大程度的体内T细胞活化。
实施例13.四价抗体的抗肿瘤活性
在Genentech产生的雌性人OX40(TNFRSF4)敲入C57BL/6N小鼠(huOX40.tnfrsf4.ki.B6N)的同基因E.G7-OVA(表达EL4的鸡卵清蛋白(OVA))淋巴瘤肿瘤模型中测试四价抗体的抗肿瘤活性。将小鼠经皮下接种处于100微升HBSS+基质胶中的300万个E.G7-OVA肿瘤细胞至右侧单侧胁中。允许小鼠生长肿瘤,直至其达到~250mm3的平均肿瘤体积(接种之后5天)。此时(第0天),招募小鼠至3个组中,对于所有组,n=10。抗gD结合单纯疱疹病毒的糖蛋白D且充当阴性对照。将抗体稀释在无菌PBS中且剂量体积为100μl。在第1天经静脉内给与所有组单次10mg/kg剂量。所有测试抗体均包含人IgG1重链恒定区。给药后24小时自5只小鼠/组/时间点收集血液。给药后6天自另5只小鼠/组收集血液。通过在异氟醚诱导的麻醉(吸入以生效)下进行眼窝取血来收集血液(收集体积不超过100μl)。自血液收集血清以进行PK分析。每周2次收集测量值和重量。每日对展现>15%的体重损失的动物进行称重,且在其损失>20%体重时施以安乐死。更频繁地观察显示不良临床问题的动物,多达每日一次,视严重程度而定,且在濒死时施以安乐死。然而,此研究中无小鼠显示不良临床征象。若肿瘤体积超过2,000mm3,则对小鼠施以安乐死。测量其余肿瘤并且每周称重2次。
图34显示得自该实验的肿瘤体积数据。相对于天然IgG1 1A7的较适中活性,四价双表位r:Fv-IgG 3C8-1A7提供优异抗肿瘤活性。这些结果与此抗体形式的优异体外及体内PD活性一致,且证明r:Fv-IgG及其他四价双表位形式作为治疗剂的效用。
实施例14.结构确定及表位作图
抗OX40配体Fab及OX40配体ECD的表达及纯化
用与以下相同的方式表达并纯化抗OX40配体的两个Fab片段。在大肠杆菌中表达这些Fab。分两个步骤纯化蛋白质。首先,将细胞裂解物上清液上样至G琼脂糖柱上并且用0.6%乙酸洗脱。其次,汇集含Fab的级分且使用SP琼脂糖柱(GE Healthcare)进行纯化。上样缓冲液含有2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)pH 5.5,且按NaCl梯度洗脱蛋白质。
在SF9昆虫细胞中共表达人OX40配体细胞外域(ECD,残基L29-D170)与内切糖苷酶H。通过离心分离含OX40配体的培养基与细胞碎片。通过首先使用10mL Ni-NTA Superflow(Qiagen)柱来纯化蛋白质。用含有20mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)pH 8.0、300mM NaCl及300mM咪唑的缓冲液洗脱OX40配体。汇集含有OX40配体的级分,且通过在已于20mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪甲磺酸(Hepes)pH 7.2及200mM NaCl中平衡的S-75柱(Pharmacia)上进行大小排阻层析(SEC)加以纯化。通过与凝血酶(Sigma)一起在4℃下培育过夜使N端his标签裂解。将已裂解的OX40配体蛋白收集在1.0mL Ni-NTA Sepharose(Qiagen)柱的流过级分中,并且通过在已于以上提及的相同S-75缓冲液中平衡的S-75柱(Pharmacia)上进行SEC而进一步纯化。
抗OX40配体Fab及抗原复合物的产生及结晶
将当量摩尔量的OX40ECD(PUR#124725)、1A7抗OX40配体Fab(PUR#115810)及3C8抗OX40配体Fab(PUR#109639)混合在一起并且在4℃下培育过夜。接着通过在已于25mM Tris pH7.5及0.15M NaCl中平衡的S200 16/60柱(GE Healthcare)上进行SEC来纯化三元复合物。通过SDS PAGE及液相层析质谱(LC-MS)来分析经纯化的复合物,由此揭示最终SEC步骤的高分子量(HMW)峰级分中的所有三种组分。使用截留分子量为10,000的Vivaspin浓缩器将HMW峰级分浓缩至10mg/mL。
结晶试验使用坐滴蒸气扩散方法和96孔格式的市售稀疏矩阵筛进行。主要在高盐条件下观察到初步中选晶体。在高盐条件下观察到初始晶体命中。进行加入剂筛选(HamptonResearch)以改善晶体衍射质量。最终结晶条件包含0.1M Tris pH 8.5、1.5M D-L苹果酸pH7.0和0.15mM二甲基乙基丙基铵磺酸铵盐(dimethylethylammonium propane sulfonate,也称为NDSB-195)。通过短暂浸泡在低温保护缓冲液(25%甘油加入至储存溶液)中,继而突然浸入液氮中来保存晶体用于数据收集。
X射线衍射数据收集及结构确定
使用Pilatus-6M检测器,在高级光源(ALS)光束线5.0.2下使用单色X射线来收集三元复合物晶体的衍射数据集。将旋转法应用于单一晶体以获得完整数据集。使用程序XDS(Kabsch W.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2010,66:125-132)进行数据简化且下的最终统计数据示于表1中。通过分子取代(MR)法,使用程序Phaser(McCoy A.J.,Grosse-Kunstleve R.W.,Adams P.D.,MWinn.D.,Storoni L.C.,Read R.J.,Journal ofapplied crystallography 2007,40,658-674)解出结构。通过利用介于+90°至-10°范围内的不同肘角以5°间隔对一系列Fab结构模型(基于PDB进入点1FVD而产生)进行旋转搜寻来测定两个Fab片段肘角。+70°及0°下的肘角模型得到最高信噪比(3倍)。接着使用两个最佳基于1FVD的模型(+70°、0°肘角)及先前确定的已移除Fab的恒定结构域(CH1及CL)的OX40ECD-3C8抗OX40fab复合物结构(CRY#21829)(Compaan D.M.,Hymowitz S.G.,TheCrystal Structure of the costimulatory OX40-OX40L complex,Structure,2006,14(8):1321-30)来进行完整MR搜寻。此MR搜寻得到三元复合物的解。对电子密度的观察表明具有0°肘角的Fab模型提供最佳解且对应于1A7的Fab。需要将肘角进一步调节至3C8fab以拟合CH1及CL结构域。使用图形建模程序COOT(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,
W.G.&Cowtan,K.Features and development of Coot.Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 66,486-501(2010)),我们将正确1A7Fab序列嵌入初始基于1FVD的MR解中。使用程序Phenix(Adams,P.D.等人,PHENIX:a comprehensive Python-based system formacromolecular structure solution.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,213-221(2010))及BUSTER(Dsafa Bricogne G.,Blanc E.,Brandl M.,Flensburg C.,KellerP.,Paciorek W.,Roversi P,Sharff A.,Smart O.S.,Vonrhein C.,Womack T.O.(2016);BUSTER第2.11.5版.Cambridge,United Kingdom:Global Phasing Ltd)与COOT中的手动建模(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,W.G.&Cowtan,K.Features and development ofCoot.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,486-501(2010))的组合以叠代方式对结构进行进一步细化。计算机细化方案包括最大似然目标函数最小化、各向异性的个别B因子细化及TLS细化法。最终细化统计数据示于表1中。
表1数据收集和细化统计
*最高分辨率壳层示于括号中。
图35显示两个Fab 1A7及3C8与OX40结合的三元复合物的结构。1A7及3C8结合在OX40受体的径向相对区域上。该结构中1A7与3C8Fab的C端之间的计算距离为约相反,抗体铰链约束两个IgG Fab臂的C端至约的最大距离。此分析表明该结构中的OX40结合表位及因此两个Fab的取向不允许IgG内OX40结合。此进一步提出单一OX40受体由两个单独r:Fv-IgG分子啮合的模型,这两个分子各有三个其他Fv结合其他OX40受体。理论上,结果将为免疫复合。此模型与实施例10中所描述的SEC-MALS数据及四价双表位抗体的固有激动活性一致。
通过直观检查三元复合物结构来确定被1A7及3C8抗体结合的OX40表位。图36显示人OX40的序列,其突出显示1A7的结合表位(灰色方框)及3C8的结合表位(黑色轮廓方框)。位置编号根据UniProt中所列出的编号(The UniProt Consortium,UniProt:the universalprotein knowledgebase,Nucleic Acids Res.45:D158-D169(2017))。1A7抗体结合OX40残基114-119、124、126-127、129-130、132、140及142。3C8抗体结合OX40残基68-71、83-90、95及98。本发明提供数据及结构/序列分析,表明结合这些或重叠表位的抗体可能为用于产生四价双表位形式从而激动OX40受体的良好配对。
实施例15.抗OX40抗体集及OX40表位空间的扩增
执行抗体发现活动以增加四价双表位靶向OX40的抗体集及扩增对其他OX40表位的覆盖率。
材料及方法
ClonaCell-HY培养基A(目录号03801)、培养基B(目录号03802)、培养基C(目录号03803)及培养基E(目录号03805)得自StemCell Technologies。用于电融合的Cytofusion培养基C(目录号LCM-C)得自Cyto Pulse Sciences。表达表面IgG的SP2ab融合伙伴得自Enzo Life Science((ENZ-70008-0001),山羊抗大鼠IgG Fc-HRP结合的抗体来自于Bethyl(A110-236P)。TMB单组分HRP微孔底物(目录号TMBW-1000-01)及TMB终止试剂(目录号BSTP-1000-01)得自BioFx Laboratories。
用50μg人及食蟹猴OX40抗原对Sprague Dawley大鼠进行一次初免,继而使用CFA/IFA佐剂对各大鼠进行25μg注射,以一周间隔进行加强,总计6次。在最终融合前加强之后三天,从已免疫大鼠收集淋巴细胞。
通过使用Cyto Pulse CEEF-50装置(Cyto Pulse Sciences)将分离的大鼠淋巴细胞与SP2ab骨髓瘤细胞融合。简言之,在B细胞富集及IgM+大鼠B细胞耗竭之后,将分离的IgM-大鼠B细胞及SP2ab细胞以1:1比率混合,接着以1000万个细胞/ml重悬于Cytofusion培养基C中,根据制备商的指导进行电融合。在37℃下,在7%CO2培育器中,在ClonaCell-HY培养基C中在HAT选择下培养已融合的细胞。在6天培养之后,用山羊抗大鼠IgG-Alexa 647(Jackson 112-606-071)将已融合的细胞染色30分钟,接着用FACS缓冲液洗涤两次,此后,通过FACSAria淘选单一大鼠IgG+杂交瘤细胞至含200μL/孔ClonaCell-HY培养基E的96孔细胞培养板(#353075,Becton Dickinson)中。培养7天之后,通过ELISA筛选杂交瘤上清液,并且将针对人及食蟹猴OX40两者的所有ELISA阳性杂交瘤克隆拣选至新的96孔细胞培养板。
如下进行ELISA分析。在4℃下用100μL/孔的以1□g/ml处于0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的人/食蟹猴OX40涂布96孔微量滴定ELISA平板(Greiner,Germany)过夜。在用洗涤缓冲液(0.05%Tween 20/PBS,Sigma)洗涤三次之后,用200μL ELISA分析稀释剂与BSA阻断各平板。加入100μL经培养的上清液或经稀释纯化的mAb且在室温下培育1小时。将各平板洗涤三次且与HRP结合的山羊抗大鼠IgG Fc一起培育1小时。在洗涤三次之后,通过加入100μL/孔的TMB底物(BioFX Laboratories,MD,USA)后持续5分钟来检测已结合的酶。通过加入100μL/孔的终止试剂(BioFX Laboratories,MD,USA)来终止反应且在A630nm下检测颜色。
用含有1%胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)将过度表达huOX40的Jurkat细胞洗涤两次,接着重悬于FACS缓冲液(含1%FBS的PBS)中,达至5×106个细胞/ml的终浓度。将100μl细胞加入至U形底96孔组织培养板(#353077,Becton Dickinson)的各孔,加入经纯化的mAb,在冰上进行30分钟培育之后,用FACS缓冲液将细胞洗涤两次,随后用山羊抗大鼠IgG-Alexa647(Jackson Lab,112-606-071)以1:400稀释度处理30分钟。用FACS缓冲液洗涤两次之后,使用FACS Calibur(BD Biosciences)分析经染色的细胞,使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)分析流式细胞术数据。
通过蛋白A亲和层析纯化杂交瘤上清液,接着进行无菌过滤(0.2μm孔径,Nalge NuncInternational,NY,USA)且储存在4℃PBS中。通过ELISA证实经纯化的mAb,随后在功能分析中进行进一步测试。
通过基于96×96距阵的SPR成像系统(Carterra USA)如下确定表位区间(bin)。将经纯化的大鼠抗OX40抗体以10μg/ml稀释于10mM乙酸钠缓冲液pH 4.5(WasatchMicrofluidics,CBNaOAc-pH 4.5-0.1L)中。使用胺偶联,使用连续流式微型点样器(Carterra,USA)将抗体直接固定至SPR传感器prism CMD 200M芯片(XanTecBioanalytics,Germany)上,以产生96个抗体的距阵。
为了进行抗体分区,将印刷芯片上样至IBIS MX96SPRi(Carterra USA)上,并在25℃下将在HBS-P缓冲液中稀释至50nM的人OX40蛋白注射至芯片上,持续4分钟,继而第二次注射以10μg/ml稀释于HBS-P缓冲液(GE,BR-1006-71)中的经纯化抗体,持续4分钟。使用Wasatch分区软件工具来处理表位分区数据。
对于抗体动力学,如上所述来固定抗体,将处于HBS-P缓冲液中的自300nM、100nM、33.3nM、11.1nM至3.7nM的连续稀释人或食蟹猴OX40蛋白注射在芯片上,且在25℃下允许结合3分钟及解离10分钟。使用Scrubber软件(BioLogic Software)处理动力学数据。
结果
表征318个由杂交瘤产生的大鼠抗OX40抗体的表位区间、在溶液中对OX40的亲和力、与细胞表面OX40的结合以及单独及在与抗Fc抗体交联时的功能活性。尽管许多抗体在非固有交联时促进OX40的激动作用,但318个抗体均不介导固有激动作用(数据未显示)。基于分区、亲和力及结合以及活性数据,将抗体从杂交瘤克隆至具有人IgG1重链及人Cκ轻链的嵌合大鼠VH及VL结构域中。在HEK293细胞中表达抗体且如上所述加以纯化。
表2汇总如上所述使用基于距阵的SPR成像系统(Carterra USA,WasatchMicrofluidics)测量的这些嵌合IgG1抗OX40抗体中的34个的表位区间及平衡解离常数(KD)。表2也显示使用BiacoreTM T200仪器(GE Healthcare)通过捕获抗体并测试与分析物OX40的结合而测量的对1A7及3C8IgG1抗体的亲和力。
表2.呈IgG和r:Fv-IgG的扩增的抗OX40抗体的特性
自非1A7表位区间选出27个主要抗体(也即,不阻断1A7与OX40结合的抗体)且构建为与1A7可变区对的r:Fv-IgG。如上所述来构建r:Fv-IgG DNA且表达蛋白质并加以纯化。如上所述,通过表面等离振子共振(SPR)技术使用BiacoreTM T200仪器(GE Healthcare)来测量前8个r:Fv-IgG的结合亲和力。表2显示r:Fv-IgG的OX40结合亲和力(KD)。测试这些抗体中前8个的IgG及r:Fv-IgG形式在OX40+Jurkat细胞荧光素酶分析中激动OX40受体的能力(图37)。正如所料,新抗体在不存在非固有交联的情况下均不介导作为IgG的激动活性(左图)。相反,当在r:Fv-IgG形式下与1A7可变区配对时,抗体可变区除一个以外全部促进OX40激动作用(右图)。例外情况为2B4抗体,其在r:Fv-IgG的情况下在与1A7配对时不介导活性。r:Fv-IgG的最大活性提供于表2中。
实施例16.r:Fv-IgG的经改造接头变体
本发明的抗体形式的关键要素为使用接头来连接免疫球蛋白结构域。设计一系列具有变体接头的r:Fv-IgG。第一组接头包含基本上包含丝氨酸、甘氨酸或丝氨酸及甘氨酸的序列。丝氨酸及甘氨酸由于其柔性及良好溶液性质而常用作接头。第二组接头包含基本上包含天然抗体序列的序列。在这些接头中,组成抗体序列的天然序列用作接头。两种尤其适用的天然抗体序列为存在于VH1与CH1结构域之间的肘弯处的重链序列及存在于VL与CL结构域之间的肘弯处的轻链序列。天然抗体序列接头的效用是它们可用于减少四价抗体形式内的一些非天然序列。给定接头的长度可以变化,从1个残基到20个或更多个残基。通常,长度愈大,所连接的免疫球蛋白结构域之间的柔性愈大。表3描述改造至r:Fv-IgG 3C8-1A7四价双表位形式的接头。
表3.接头的描述
如上所述来构建编码r:Fv-IgG 3C8/1A7的变体接头的DNA,并且如上所述在HEK293细胞中表达蛋白质并加以纯化。如上所述来测试r:Fv-IgG在原代人T细胞及Jurkat报道基因分析中的OX40激动活性。图38中的数据显示尽管相对于天然抗体肘弯接头,甘氨酸-丝氨酸接头在Jurkat报道基因分析中提供略微增强的OX40激动作用,但该数据突出显示所有经改造的接头均在r:Fv-IgG的Fv与IgG部分之间提供有效连接,从而能够实现对OX40受体的激动作用。
实施例17.四价形式的亲和力改造
对1A7及3C8可变区两者的变体进行改造,以便探索四价双表位形式的激动活性对个别OX40结合组分的亲和力的依赖性。亲和力改造方法利用NNK走查文库产生连同噬菌体展示及下一代测序(NGS)(更充分描述于Koenig等人,J Biol Chem 2015,290(36):21773-21786中)。
设计并构建1A7及3C8的可变结构域NNK走查文库。将1A7及3C8Fab亚克隆至噬菌粒构建体中。多样化1A7VH残基为28-35、49-65、93-102且VL残基为28-34、50-56、91-96。多样化3C8VH残基为28-35、50-65、95-97且VL残基为28-34、50-56、89-96。通过NNK走查对噬菌粒构建体中的多样化残基进行随机分组,各自在一个目标随机分组位置上有一个NNK密码子。NNK编码所有20个氨基酸(n=G、A、T及C;K=G及T,比例相等)。通过在各反应中的所有目标随机分组位置上引入终止密码子(TAA)来产生各突变反应的模板。通过对自突变反应汇集至大肠杆菌XL1细胞中的DNA产物进行电穿孔,从而产生约109个转化体来单独产生VH及VL库。
针对重组OX40蛋白淘选编码1A7及3C8文库的噬菌体。使用96孔ELISA平板选择OX40结合克隆。噬菌体展示文库与5μg/ml平板结合的OX40一起培育作为第1轮,继而在50、10、2、0.5、0.1nM及0.1nM生物素化+100nM非生物素化链霉抗生物素蛋白涂布的平板上进行数轮溶液结合OX40选择。对每轮次的已结合噬菌体进行洗涤且在100mM HCl中洗脱20分钟,接着用1/10体积的1M Tris pH 11.0中和,并且用于感染大肠杆菌以便进行扩增及下一轮次选择。在每次轮次时监测噬菌体效价。在未观测到富集的轮次时终止淘选。自来自于前一次轮次的细菌团粒提取DNA。
对淘选后经富集的NNK走查文库进行深度测序。从得自于未经选择及经选择的1A7及3C8NNK文库的大肠杆菌XL1细胞分离噬菌粒DNA,并且用于使用Phusion聚合酶(NewEngland BioLabs)对VL及VH区进行PCR扩增。使用TruSeq Nano DNA文库制备试剂盒(Illumina)纯化PCR产物以产生文库。在用于300bp成对端测序的Illumina MiSeq测序系统上对具有独特条形码的多路衔接子连结文库进行测序。用于富集分析的序列来自于分别在0.1nM及0.5nM生物素化人OX40下对1A7及3C8进行淘选。
为了分析NGS结果,若扩增子大小大于300bp,则将测序读数分成R1/R2读数。在该情况下,使用FLASH程序[T.和Salzberg,S.L.Bioinformatics 2011]进行合并步骤以重构完整扩增子。对于各重构完整扩增子,使用侧接突变区域的核苷酸序列(各自9bp长)来定位并提取突变部分序列。针对已知模板长度检查所提取的序列以筛选不需要的插入缺失(indel)序列。将其余序列翻译至氨基酸,并且可视研究人员的需要进行进一步过滤(也即,仅保留仅具有1个突变的提取序列,或丢弃已知非突变位置上具有突变的提取序列)。在筛选并保留满足该准则(也即,以上所列出者)的其他氨基酸序列之后,基于这些序列的独特氨基酸序列对其进行计数。接着,仅超过某些截止值(也即,标准物>2个计数或Vivian>20个计数)的氨基酸序列可用于进一步丢弃不需要的氨基酸序列。这些“净化”氨基酸序列接着将用于计算突变部分中的氨基酸频率的Log2比率。具体而言,由淘选前及淘选后文库的“净化”氨基酸序列确定各位置上的20个残基中的每一个的频率。鉴于最初文库的主要取样不足问题,淘选前文库有时为第一轮淘选文库。此后,对淘选后文库相对于淘选前文库的频率比率取log2。至少4至5的Log2比率(也即,16倍至32倍富集)被视为真富集。
基于NNK走查噬菌体淘选NGS结果,选择取代以增加及降低1A7及3C8可变区的亲和力。如上所述来构建编码重链(人IgG1恒定区)及轻链(Cκ恒定区)变体的DNA,且在HEK293细胞中表达抗体并且如上所述进行纯化。如上所述使用Biacore来测试变体与OX40的结合。表4及表5呈现所产生及测试的所有变体的变体名称、取代及OX40亲和力(KD)。所有取代的位置均根据Kabat惯例进行编号。
表4. 1A7亲和力变体
表5. 3C8亲和力变体
选择变体以并入r:Fv-IgG 3C8-1A7中。以上表4及表5中将所选变体给定为高或低。具有增加的亲和力(较低KD)的1A7及3C8变体分别称为1A7(高)及3C8(高)。具有降低的亲和力(较高KD)的1A7及3C8变体分别称为1A7(低)及3C8(低)。
如上所述来构建编码r:Fv-IgG 3C8-1A7的高及低亲和力变体的DNA。所有构建体均包含人IgG1重恒定区及人Cκ轻恒定区。在HEK293细胞中表达变体且如上所述加以纯化。如上所述使用Biacore来测试变体与OX40的结合。图39显示IgG1及r:Fv-IgG形式的高及低亲和力变体形式的亲和力的图。IgG1形式中高达2倍对数的亲和力差异翻译成r:Fv-IgG形式中的更适中亲和力差异。
在原代人CD4+记忆T细胞分析及OX40+Jurkat细胞荧光素酶报道基因分析中测试亲和力变体r:Fv-IgG的OX40激动活性。数据示于图40中。1A7及3C8Fv的亲和力增高及/或降低在OX40激动活性方面引起适度差异,且总体而言,独立结合亚单位的亲和力范围允许四价双表位形式能够具有固有激动活性。
实施例18.使用四价双表位抗体时死亡受体5的激动作用
探索多价双表位方法以设计针对TNFRSF成员死亡受体5(DR5)的抗体的激动活性,DR5也称为TNF相关凋亡诱导配体受体2(TRAILR2)和TNFRSF10B。DR5由于其在介导癌细胞凋亡中的作用而成为治疗目的的靶标(Ashkenazi 2015,J Clin Invest 125(2):487-489)。已确定针对DR5的抗体依赖于体内FcγR介导的交联活性(Wilson等人,2011,Cancer Cell19:101-13;Kim及Ashkenazi,2013,J Exp Med 210:1647-51)。
由经典基于杂交瘤的技术产生一组16个小鼠抗DR5单克隆抗体。从杂交瘤克隆编码重链及轻链的DNA且亚克隆至如上所述的具有小鼠IgG2a重恒定链及小鼠Cκ恒定链的pRK载体中。也产生先前已进行临床前及临床表征的人源化抗DR5人IgG1抗体drozitumab(Kang等人,2011,Clin Cancer Res 17(10):3181-3192)作为比较物。使用促细胞凋亡因子Bax及Bak双重敲除的CHO细胞(Bax-/Bak-)来表达抗体(Macaraeg NF等人,2013,BiotechnolProg 29:1050-8)且在蛋白A柱上进行纯化。需要时,通过利用大小排阻柱、SP阳离子交换柱或疏水性相互作用柱的层析进一步纯化大部分活性抗体以移除聚集物质。
利用基于距阵的表面等离振子共振成像(SPRi)技术(Carterra USA,WasatchMicrofluidics)将抗DR5抗体分类至不同的表位组中。表位分区分析,类似于“经典”夹心分析,利用微流体技术将抗DR5抗体固定于无标签生物传感器上,用经纯化的重组flag标签化DR5细胞外域(ECD)使所有表面结合的抗体饱和,继而加入各抗体以竞争同DR5结合。使用EDC/NHS化学反应将抗体固定至金表面生物传感器上的预定位置。利用DR5抗原的细胞外域使已固定的抗体饱和,继而进行抗体/DR5复合物与该组中第二抗体的竞争。阻断溶液抗体对已固定抗体/抗原复合物的结合指示抗体属于相同表位组。重复移除抗原及溶液抗体、用DR5抗原使已固定的抗体再饱和及加入不同的抗体,直至已测试所有抗体。一旦已测试所有抗体且置于表位组中后,便产生网状图以鉴别该16个小鼠抗体所识别的不同的表位。该16个小鼠抗体分布在针对表示为网状图的DR5抗原鉴别的三个不同的表位组之间。在进一步检查SPR传感图后,3个小鼠抗体显示低结合亲和力与基线SPR反应。移除这些抗体,将其余13个抗体限定至其个别表位组中。鼠类抗体及drozitumab的表位组提供于表6中。
表6.表位区间和DR5特异性小鼠单克隆抗体亲和力的总结
表位组 | 抗体 | KD(nM) | Stdev(+/-) |
1 | 12A1 | 20.43 | 3.57 |
1 | 13E11 | 52.23 | 2.35 |
1 | 13E3 | 12.23 | 1.33 |
2 | 11H12 | 0.72 | 0.18 |
2 | 3F11 | 1.03 | 0.17 |
2 | 3H3 | 0.97 | 0.24 |
2 | 5C7 | 6.43 | 0.75 |
2 | 7G4 | 52.37 | 4.48 |
3 | 1B10 | 8.71 | 0.17 |
3 | 14G8 | 4.46 | 1.99 |
3 | 3C9 | ND | |
3 | 3D5 | 2.63 | 0.16 |
3 | 3H1 | ND | |
3 | 4D9 | 0.33 | 0.12 |
3 | 4H10 | 0.41 | 0.1 |
3 | 6A5 | 57.83 | 1.51 |
drozitumab | drozitumab | 3.35 | 0.7 |
使用表面等离振子共振(SPR)来测量抗体与可溶性DR5抗原的结合亲和力。在25℃下,在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上使用SPR测量进行结合实验。将测试蛋白质以1μg/mL固定在经蛋白A涂布的传感器芯片上。将分析物DR5-flag的五倍连续稀释(100至0.16nM)以30μL/min的流速注入操作缓冲液(HBS-P+缓冲液1×;0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.05%(v/v)表面活性剂-20pH 7.4)中,并且记录结合及解离阶段的传感图。注射分析物持续180s且允许解离持续600s。对与1:1Langmuir结合模型拟合的数据进行非线性回归分析,获得结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)及平衡解离常数(KD)。对于具有快速结合及解离速率常数的抗体,也获得稳态亲和力分析。小鼠抗体及drozitumab的亲和力示于表6中。第2组及第3组表位的抗体的KD介于0.1至100nM的范围内,而来自第1组的抗体呈现KD>10nM。
对所选抗DR5抗体的二价双表位以及四价单表位及双表位形式进行改造。将编码所选鼠类抗体13E3、3H3、4D9及11H12的VH及VL结构域的DNA插入如上所述的包含人IgG1重恒定区及人Cκ轻恒定区的pRK载体中,以产生小鼠Fv-人IgG1/Cκ嵌合IgG。通过将VH区插入具有“杵”或“臼”变体的适当重链构建体中来对13E3、3H3、4D9、11H12及drozitumab抗体的所选组合的双表位形式进行改造(Ridgway JBB等人,1996,Protein Eng 9:617-21)。将编码VH区的DNA亚克隆至包含杵突变T366W(EU编号)且具有C端6His标签的变体人IgG1中,或亚克隆至包含臼突变T366S/L368A/Y407V(EU编号)且具有C端Flag标签的变体人IgG1中。使用如实施例2中所描述且如图9中所说明的r:Fab-IgG形式2(V2)形式对13E3、3H3、4D9、11H12及drozitumab抗体的所选组合的四价双表位形式进行改造。此形式使用上述杵/臼变体来促进异源二聚体形成。将编码VH区的DNA亚克隆至包含杵突变T366W(EU编号)的变体人IgG1中,或亚克隆至包含臼突变T366S/L368A/Y407V(EU编号)的变体人IgG1中。
在Bax-/Bak-CHO细胞系中表达IgG、双表位IgG及r:Fab-IgG并且如上所述加以纯化。使用基于体外组装个别半抗体的方法来产生双表位IgG及r:Fab-IgG(Spiess等人,2013,NatBiotechnol 31(8):753-8)。将杵/臼变体半抗体表达为半抗体,在体外组装,并且如上所述进行纯化。
测试IgG、双表位IgG及r:Fab-IgG抗DR5抗体促进胱冬酶8活性的能力。HT-29及Colo205细胞系获自美国典型菌种保藏中心。在37℃/5%CO2下,将细胞维持在补充有L-谷氨酰胺(L-glut)及10%胎牛血清(FBS)的转/分钟I培养基(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA,USA)中。在50nM下测试抗体,或在生长培养基中制备抗体稀释液。将100μL各抗体样品加入至96孔白壁板(Thermo Scientific)的各孔。对贴壁细胞进行胰蛋白酶处理并且自组织培养烧瓶剥落。将50μL 1.0×106个细胞/mL细胞悬浮液加入至96孔白壁板中的100μL Ab。在37℃、5%CO2下将细胞培育4小时(对于胱冬酶8)及24小时(对于细胞活力)。使用Promega的Caspase-Glo 8及CellTiter-Glo(细胞活力)荧光分析来评定胱冬酶活性及细胞活力。以一式三份进行实验且使用Envision(PerkinElmer)读取荧光。通过对单独细胞进行归一化来计算胱冬酶8活性倍数及细胞活力%。
图41显示抗DR5抗体的IgG1、双表位IgG1及双表位r:Fab-IgG形式在50nM抗体浓度下对人结肠直肠腺癌HT-29细胞的胱冬酶8活性。二价单表位IgG1或二价双表位IgG1抗体自身均不介导胱冬酶8活性,与需要进行非固有交联来达到活性一致。drozitumabIgG1在此实验中可能已展现一定程度的适中活性水平。相反,使drozitumab与4D9(Droz-4D9)及11H12与4D9(11H12-4D9)配对的四价双表位r:Fab-IgG形式介导针对DR5的固有激动活性,从而促进胱冬酶8信号传导。令人感兴趣的是,四价单表位r:Fab-IgGdrozitumab-drozitumab形式也介导固有激动活性,其中r:Fv-IgG中的所有4个Fv均为drozitumabFv。四价双表位r:Fab-IgG13E3-3H3及四价单表位r:Fab-IgG 4D9-4D9介导临界至无DR5激动活性。
选择drozitumab-4D9组合用于进一步表征。测试IgG、双表位IgG及r:Fab-IgG抗体对HT-29细胞及人结肠直肠腺癌Colo205细胞系的胱冬酶8活性及抗增殖活性。图42至图43显示测量针对HT-29细胞的胱冬酶8活性(图42)及抗增殖活性(图43)的剂量反应曲线。图44至图45显示测量针对Colo205细胞的胱冬酶8活性(图44)及抗增殖活性(图45)的剂量反应曲线。4D9的IgG1形式、4D9的四价单表位r:Fab-IgG形式或drozitumab与4D9的二价双表位组合均不介导胱冬酶8活性或对任一细胞系的细胞活力产生任何影响。IgG1drozitumab在较高浓度下介导针对两个细胞系的适度胱冬酶8活性及针对Colo205细胞的抗增殖活性。四价单表位r:Fab-IgGdrozitumab-drozitumab促进优于IgG1形式的对两种细胞系的胱冬酶8活性,且介导针对Colo205细胞的有效抗增殖活性。相对于其他抗体,就效力及最大活性而言,drozitumab与4D9的四价双表位组合r:Fab-IgGdrozitumab-4D9介导最强激动活性水平。r:Fab-IgGdrozitumab-4D9促进两个细胞系中的显著胱冬酶8活性及针对Colo205细胞的抗增殖活性。尽管具有强的胱天蛋白酶8活性,但这些试剂对HT-29细胞活力的影响不足表明该细胞系对通过外在死亡受体介导的途径的信号传导不敏感或弱敏感。这与Colo205细胞系形成对比,其中r:Fab-IgGdrozitumab-4D9、r:Fab-IgGdrozitumab-drozitumab以及较小程度的IgG1drozitumab的DR5激动和胱冬酶8活化导致细胞增殖的抑制。尽管如此,总的来说,数据支持多价抗体形式的多个表位的最佳靶向,以激发靶受体用于治疗目的。
Claims (107)
1.一种对OX40具有激动活性的四价抗原结合复合物,所述复合物包含四个结合OX40的抗原结合结构域,其中所述四个抗原结合结构域中的每一个包含抗体重链可变(VH)结构域及抗体轻链可变(VL)结构域,其中所述复合物包含一个或多个结合OX40的第一表位的抗原结合结构域及一个或多个结合OX40的第二表位的抗原结合结构域,且其中OX40的所述第一表位与所述第二表位不同。
2.如权利要求1的复合物,其中结合所述第一表位的抗原结合结构域不与结合所述第二表位的抗原结合结构域交叉竞争结合OX40。
3.一种对OX40具有激动活性的四价抗原结合复合物,所述复合物包含四个结合OX40的抗原结合结构域,其中所述四个抗原结合结构域中的每一个包含抗体重链可变(VH)结构域及抗体轻链可变(VL)结构域,其中所述复合物包含一个或多个结合OX40的第一表位的抗原结合结构域及一个或多个结合OX40的第二表位的抗原结合结构域,且其中结合所述第一表位的抗原结合结构域不与结合所述第二表位的抗原结合结构域交叉竞争结合OX40。
4.如权利要求1至3中任一项的复合物,其中所述复合物包含两个结合所述第一表位的抗原结合结构域及两个结合所述第二表位的抗原结合结构域。
5.如权利要求1至4中任一项的复合物,其中所述第一表位包含选自以下的一个或多个氨基酸残基:SEQ ID NO:281的114-119、124、126、127、129、130、132、140及142。
6.如权利要求1至5中任一项的复合物,其中所述第二表位包含选自以下的一个或多个氨基酸残基:SEQ ID NO:281的68-71、83-90、95及98。
7.如权利要求1至6中任一项的复合物,其中所述结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域包含:(a)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;及(b)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
8.如权利要求7的复合物,其中结合OX40的第一表位的抗原结合结构域的VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中结合OX40的第一表位的抗原结合结构域的VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
9.如权利要求1至8中任一项的复合物,其中所述结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域包含:(a)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;及(b)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3。
10.如权利要求9的复合物,其中结合OX40的第二表位的抗原结合结构域的VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,且其中结合OX40的第二表位的抗原结合结构域的VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:129。
11.如权利要求1至10中任一项的复合物,其中所述结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域包含:(a)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;及(b)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3;且其中所述结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域包含:(c)VH结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;及(d)VL结构域,其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3。
12.如权利要求11的复合物,其中结合OX40的第一表位的抗原结合结构域的VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中结合OX40的第一表位的抗原结合结构域的VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:57;其中结合OX40的第二表位的抗原结合结构域的VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,且其中结合OX40的第二表位的抗原结合结构域的VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:129。
13.如权利要求1至6中任一项的复合物,其中所述复合物包含两条抗体重链多肽及两条抗体轻链多肽;
其中抗体重链多肽中的每一条包含:
VH1-L1-VH2-L2-CH1-铰链-CH2-CH3 [I];
其中抗体轻链多肽中的每一条包含:
VL1-L3-VL2-L4-CL [II];
其中抗体重链多肽中的每一个与一个抗体轻链多肽结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域且VH2与VL2形成抗原结合结构域;
其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,CH3为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2、L3及L4为氨基酸接头。
14.如权利要求13的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域。
15.如权利要求13的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域。
16.如权利要求13至15中任一项的复合物,其中L2及L4的长度为0个氨基酸。
17.如权利要求13至16中任一项的复合物,其中L1的长度介于0与20个氨基酸之间。
18.如权利要求17的复合物,其中L1的氨基酸中有至少90%为甘氨酸及/或丝氨酸氨基酸。
19.如权利要求18的复合物,其中L1包含选自以下的氨基酸序列:GGGGSG(SEQ ID NO:270)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:272)及GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:273)。
20.如权利要求13至19中任一项的复合物,其中L3包含选自以下的氨基酸序列:GGSGG(SEQ ID NO:271)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:272)及GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:274)。
21.如权利要求13至20中任一项的复合物,其中L1包含氨基酸序列GGGGSG(SEQ ID NO:270),且其中L3包含氨基酸序列GGSGG(SEQ ID NO:271)。
22.如权利要求13至20中任一项的复合物,其中L1及L3均包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:272)。
23.如权利要求13至20中任一项的复合物,其中L1包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGG(SEQID NO:273),且其中L3包含氨基酸序列GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:274)。
24.如权利要求13至16中任一项的复合物,其中L1包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列。
25.如权利要求24的复合物,其中L1包含氨基酸序列ASTKGP(SEQ ID NO:275)或ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:277)。
26.如权利要求13至16及24中任一项的复合物,其中L3包含氨基酸序列RTVAAP(SEQ IDNO:276)或RTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:278)。
27.如权利要求13至16、24及26中任一项的复合物,其中L1包含氨基酸序列ASTKGP(SEQID NO:275),且其中L3包含氨基酸序列RTVAAP(SEQ ID NO:276)。
28.如权利要求13至16、24及26中任一项的复合物,其中L1包含氨基酸序列ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:277),且其中L3包含氨基酸序列RTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:278)。
29.如权利要求13至28中任一项的复合物,其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
30.如权利要求13至28中任一项的复合物,其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
31.如权利要求13至28中任一项的复合物,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
32.如权利要求13至28中任一项的复合物,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
33.如权利要求13的复合物,其中:
(a)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:240,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:241;
(b)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:242,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:243;
(c)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:250,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:251;
(d)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:252,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:253;
(e)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:254,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:255;
(f)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:256,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:257;
(g)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:258,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:259;
(h)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:260,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:261;
(i)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:262,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:263;
(j)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:264,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:265;或
(k)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:266,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:267。
34.如权利要求33的复合物,其中:
(a)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:240,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:241;或
(b)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:242,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:243。
35.如权利要求34的复合物,其中这两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:242,且两条抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:243。
36.如权利要求1至6中任一项的复合物,其中所述复合物包含两条抗体重链多肽及四个抗体轻链多肽;
其中抗体重链多肽中的每一条包含:
VH1-L1-(CH1)x-L2-VH2-L3-(CH1)y-铰链-CH2-CH3 [III];
其中所述四个抗体轻链多肽中有两个包含:
VL1-(CL)x [IV];且
其中所述四个抗体轻链多肽中有两个包含:
VL2-(CL)y [V];
其中抗体重链多肽中的每一个与一个包含式[IV]的轻链多肽结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域,且与一个包含式[V]的轻链多肽结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;且
其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,(CL)x及(CL)y为抗体轻链恒定结构域,(CH1)x及(CH1)y为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,CH3为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2及L3为氨基酸接头。
37.如权利要求36的复合物,其中所述复合物在VH1、VL1、(CH1)x或(CL)x中包含一个或多个促进VH1与VL1形成抗原结合结构域的氨基酸取代;及/或在VH2、VL2、(CH1)y或(CL)y中包含一个或多个促进VH2与VL2形成抗原结合结构域的氨基酸取代。
38.如权利要求37的复合物,其中所述复合物包含以下各组氨基酸取代中的一个或多个:
(a)VH1中的Q39K取代及VL1中的Q38E取代,以及VH2中的Q39E取代及VL2中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;
(b)VH2中的Q39K取代及VL2中的Q38E取代,以及VH1中的Q39E取代及VL1中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;
(c)(CH1)x中的S183E取代及(CL)x中的V133K取代以及(CH1)y中的S183K取代及(CL)y中的V133E取代,根据EU指数进行编号;或
(d)(CH1)y中的S183E取代及(CL)y中的V133K取代,以及(CH1)x中的S183K取代及(CL)x中的V133E取代,根据EU指数进行编号。
39.如权利要求38的复合物,其中所述复合物包含:
(a)VH1中的Q39K取代及VL1中的Q38E取代,以及VH2中的Q39E取代及VL2中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;以及(CH1)x中的S183E取代及(CL)x中的V133K取代,以及(CH1)y中的S183K取代及(CL)y中的V133E取代,根据EU指数进行编号;或
(b)VH2中的Q39K取代及VL2中的Q38E取代,以及VH1中的Q39E取代及VL1中的Q38K取代,根据Kabat进行编号;及或(CH1)y中的S183E取代及(CL)y中的V133K取代,以及(CH1)x中的S183K取代及(CL)x中的V133E取代,根据EU指数进行编号。
40.如权利要求36至39中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域。
41.如权利要求36至39中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域。
42.如权利要求36至41中任一项的复合物,其中L2包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列。
43.如权利要求42的复合物,其中L2包含氨基酸序列DKTHT(SEQ ID NO:268)或DKTHTGGGGSGG(SEQ ID NO:269)。
44.如权利要求36至43中任一项的复合物,其中L1及L3的长度为0个氨基酸。
45.如权利要求36至44中任一项的复合物,其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
46.如权利要求36至44中任一项的复合物,其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
47.如权利要求36至44中任一项的复合物,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
48.如权利要求36至44中任一项的复合物,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
49.如权利要求36的复合物,其中:
(a)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:244,两条包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:245,且两条包含式[V]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:246;或
(b)两条抗体重链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:247,两条包含式[IV]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:248,且两条包含式[V]的抗体轻链多肽均包含氨基酸序列SEQ ID NO:249。
50.如权利要求1至6中任一项的复合物,其中所述复合物包含:
第一抗体重链多肽,其包含:
VH1-L1-CH1-L2-VH1-L3-CH1-铰链-CH2-(CH3)x [VI];
两条第一抗体轻链多肽,其各自包含:
VL1-CL [VII];
第二抗体重链多肽,其包含:
VH2-L7-CH1-L8-VH2-L9-CH1-铰链-CH2-(CH3)y [VIII];及
两条第二抗体轻链多肽,其各自包含:
VL2-CL [IX];
其中所述第一抗体重链多肽与两条包含式[VII]的第一抗体轻链多肽结合,以便各VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中所述第二抗体重链多肽与两条包含式[IX]的第二抗体轻链多肽结合,以便各VH2与VL2形成抗原结合结构域;且
其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,(CH3)x及(CH3)y为抗体第三重链恒定结构域,且L1、L2、L3、L7、L8及L9为氨基酸接头。
51.如权利要求50的复合物,其中(CH3)x包含杵或臼,其中(CH3)y包含杵或臼,且其中(CH3)x的杵或臼可位于(CH3)y的杵或臼中。
52.如权利要求51的复合物,其中:
(a)(CH3)x包含T366Y取代且(CH3)y包含Y407T取代,根据EU指数进行编号;
(b)(CH3)x包含T366W取代且(CH3)y包含Y407A取代,根据EU指数进行编号;
(c)(CH3)x包含F405A取代且(CH3)y包含T394W取代,根据EU指数进行编号;
(d)(CH3)x包含Y407T取代且(CH3)y包含T366Y取代,根据EU指数进行编号;
(e)(CH3)x包含T366Y及F405A取代且(CH3)y包含T394W及Y407T取代,根据EU指数进行编号;
(f)(CH3)x包含T366W及F405W取代且(CH3)y包含T394S及Y407A取代,根据EU指数进行编号;
(g)(CH3)x包含F405W及Y407A取代且(CH3)y包含T366W及T394S取代,根据EU指数进行编号;或
(h)(CH3)x包含F405W取代且(CH3)y包含T394S取代,根据EU指数进行编号。
53.如权利要求50至52中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域。
54.如权利要求50至52中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域。
55.如权利要求50至54中任一项的复合物,其中L2及L8均包含在人抗体恒定结构域序列内发现的氨基酸序列。
56.如权利要求55的复合物,其中L2及L8均包含选自以下的相同氨基酸序列:DKTHT(SEQID NO:268)及DKTHTGGGGSGG(SEQ ID NO:269)。
57.如权利要求50至56中任一项的复合物,其中L1、L3、L7及L9的长度为0个氨基酸。
58.如权利要求50至57中任一项的复合物,其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
59.如权利要求50至57中任一项的复合物,其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
60.如权利要求50至57中任一项的复合物,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
61.如权利要求50至57中任一项的复合物,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
62.如权利要求1至6中任一项的复合物,其中所述复合物包含:包含与两条抗体轻链结合的两条抗体重链的抗体,及两条抗体Fab片段;
其中所述抗体的抗体重链中的每一条包含:
VH1-CH1-铰链-CH2-CH3 [X];
其中所述抗体的抗体轻链中的每一条包含:
VL1-CL [VII];
其中抗体Fab片段中的每一条包含:
重链片段,其包含:
VH2-CH1 [XI];及
轻链,其包含:
VL2-CL [IX];
其中抗体重链中的每一条与抗体轻链之一结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中抗体Fab片段中的每一条包含与一个包含式[IX]的轻链片段结合的一个包含式[XI]的重链片段,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中抗体Fab片段中的每一个通过接头L1与所述抗体的抗体重链之一或抗体轻链之一偶联;且
其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且CH3为抗体第三重链恒定结构域。
63.如权利要求62的复合物,其中L1接头中的每一个为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。
64.如权利要求63的复合物,其中所述PEG接头包含介于一个与十一个之间的PEG亚单位。
65.如权利要求64的复合物,其中所述PEG接头包含一个、两个或三个PEG亚单位。
66.如权利要求62至65中任一项的复合物,其中L1接头中的每一个使抗体重链之一或抗体轻链之一的第一经改造游离半胱氨酸与抗体Fab片段之一的第二经改造游离半胱氨酸偶联。
67.如权利要求66的复合物,其中所述第一经改造游离半胱氨酸为所述抗体重链中独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。
68.如权利要求66的复合物,其中所述第一经改造游离半胱氨酸为所述抗体轻链中独立地选自以下的半胱氨酸氨基酸:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。
69.如权利要求66至68中任一项的复合物,其中所述第二经改造游离半胱氨酸为C端半胱氨酸残基。
70.如权利要求62至69中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域。
71.如权利要求62至69中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域。
72.如权利要求62至69中任一项的复合物,其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
73.如权利要求62至69中任一项的复合物,其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
74.如权利要求62至69中任一项的复合物,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
75.如权利要求62至69中任一项的复合物,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
76.如权利要求62的复合物,其中所述抗体的抗体重链中的每一条包含氨基酸序列SEQID NO:232,所述抗体的抗体轻链中的每一条包含氨基酸序列SEQ ID NO:237,抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:239的重链片段,且抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:231的轻链片段。
77.如权利要求62的复合物,其中所述抗体的抗体重链中的每一条包含氨基酸序列SEQID NO:230,所述抗体的抗体轻链中的每一条包含氨基酸序列SEQ ID NO:236,抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:238的重链片段,且抗体Fab片段中的每一个具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:233的轻链片段。
78.如权利要求1至6中任一项的复合物,其中所述复合物包含两条抗体,其中抗体中的每一条包含:
第一抗体重链,其包含:
VH1-CH1-铰链-CH2-(CH3)x [X];
第一抗体轻链,其包含:
VL1-CL [VII];
第二抗体重链,其包含:
VH2-CH1-铰链-CH2-(CH3)y [XII];及
第二抗体轻链,其包含:
VL2-CL [IX];
其中所述第一抗体重链与所述第一抗体轻链结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中所述第二抗体重链与所述第二抗体轻链结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中这两条抗体是通过接头L1偶联;且
其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且(CH3)x及(CH3)y为抗体第三重链恒定结构域。
79.如权利要求78的复合物,其中(CH3)x包含杵或臼,其中(CH3)y包含杵或臼,且其中(CH3)x的杵或臼可位于(CH3)y的杵或臼中。
80.如权利要求79的复合物,其中:
(a)(CH3)x包含T366Y取代且(CH3)y包含Y407T取代,根据EU指数进行编号;
(b)(CH3)x包含T366W取代且(CH3)y包含Y407A取代,根据EU指数进行编号;
(c)(CH3)x包含F405A取代且(CH3)y包含T394W取代,根据EU指数进行编号;
(d)(CH3)x包含Y407T取代且(CH3)y包含T366Y取代,根据EU指数进行编号;
(e)(CH3)x包含T366Y及F405A取代,且(CH3)y包含T394W及Y407T取代,根据EU指数进行编号;
(f)(CH3)x包含T366W及F405W取代,且(CH3)y包含T394S及Y407A取代,根据EU指数进行编号;
(g)(CH3)x包含F405W及Y407A取代,且t(CH3)y包含T366W及T394S取代,根据EU指数进行编号;或
(h)(CH3)x包含F405W取代,且(CH3)y包含T394S取代,根据EU指数进行编号。
81.如权利要求1至6中任一项的复合物,其中所述复合物包含:
第一抗体,其包含两条抗体重链及两条抗体轻链,其中所述第一抗体的两条抗体重链中的每一条包含:
VH1-CH1-铰链-CH2-CH3 [X];
且其中所述第一抗体的两条抗体轻链中的每一条包含:
VL1-CL [VII];及
第二抗体,其包含两条抗体重链及两条抗体轻链,其中所述第二抗体的两条抗体重链中的每一条包含:
VH2-CH1-铰链-CH2-CH3 [XII];
且其中所述第二抗体的两条抗体轻链中的每一条包含:
VL2-CL [IX];
其中所述第一抗体的抗体重链中的每一个与所述第一抗体的抗体轻链之一结合,以便VH1与VL1形成抗原结合结构域;其中所述第二抗体的抗体重链中的每一个与所述第二抗体的抗体轻链之一结合,以便VH2与VL2形成抗原结合结构域;其中所述第一抗体及所述第二抗体是通过接头L1偶联;且
其中VH1为第一抗体重链可变结构域,VH2为第二抗体重链可变结构域,VL1为第一抗体轻链可变结构域,VL2为第二抗体轻链可变结构域,CL为抗体轻链恒定结构域,CH1为抗体第一重链恒定结构域,铰链为抗体铰链区,CH2为抗体第二重链恒定结构域,且CH3为抗体第三重链恒定结构域。
82.如权利要求78至81中任一项的复合物,其中所述L1接头为双马来酰亚氨基聚乙二醇(PEG)接头。
83.如权利要求82的复合物,其中所述PEG接头包含介于一个与十一个之间的PEG亚单位。
84.如权利要求83的复合物,其中所述PEG接头包含一个、两个或三个PEG亚单位。
85.如权利要求78至84中任一项的复合物,其中所述L1接头使所述两条抗体中第一个的第一经改造游离半胱氨酸与所述两条抗体中第二个的第二经改造游离半胱氨酸偶联。
86.如权利要求85的复合物,其中所述第一经改造游离半胱氨酸或所述第二经改造游离半胱氨酸中的至少一个为独立地选自以下的重链半胱氨酸残基:根据EU编号的T114C、A118C、A140C、L174C、L179C、T187C、T209C、V262C、G371C、Y373C、E382C、S400C、S424C、N434C及Q438C。
87.如权利要求85或86的复合物,其中所述第一经改造游离半胱氨酸或所述第二经改造游离半胱氨酸中的至少一个为独立地选自以下的轻链半胱氨酸残基:根据Kabat编号的I106C、R108C、R142C、K149C及V205C。
88.如权利要求78至87中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域。
89.如权利要求78至87中任一项的复合物,其中VH1与VL1形成结合OX40的所述第二表位的抗原结合结构域,且其中VH2与VL2形成结合OX40的所述第一表位的抗原结合结构域。
90.如权利要求78至87中任一项的复合物,其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
91.如权利要求78至87中任一项的复合物,其中VH2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HVR-H3;其中VL2具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HVR-L3;其中VH1具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-H2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-H3;且其中VL1具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2及包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L3。
92.如权利要求78至87中任一项的复合物,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
93.如权利要求78至87中任一项的复合物,其中VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:128,其中VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:129,其中VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:56,且其中VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
94.如权利要求1至93中任一项的复合物,其中所述复合物具有包含用于降低效应子功能的修饰的抗体Fc区。
95.如权利要求94的复合物,其中所述复合物包含在选自以下的一个或多个氨基酸位置(EU编号)上包含氨基酸取代的抗体Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的297;
(b)人IgG1的Fc区中的234及235;
(c)人IgG1的Fc区中的234、235及329;
(d)人IgG2的Fc区中的234及237;
(e)人IgG4的Fc区中的235、237及318;
(f)人IgG4的Fc区中的228及236;
(g)人IgG2的Fc区中的268、309、330及331;
(h)人IgG1的Fc区中的220、226、229及238;
(i)人IgG1的Fc区中的226、229、233、234及235;
(j)人IgG1的Fc区中的234、235及331;
(k)人IgG1的Fc区中的226及230;以及
(l)人IgG1的Fc区中的267及328。
96.如权利要求94或95的复合物,其中所述复合物具有包含选自以下的一个或多个氨基酸取代(EU编号)的抗体Fc区:
(a)人IgG1的Fc区中的N297A;
(b)人IgG1的Fc区中的L234A及L235A;
(c)人IgG1的Fc区中的L234A、L235A及P329G;
(d)人IgG2的Fc区中的V234A及G237A;
(e)人IgG4的Fc区中的L235A、G237A及E318A;
(f)人IgG4的Fc区中的S228P及L236E;
(g)跨越人IgG2的Fc区中的氨基酸残基118至260的区域中或跨越人IgG4的Fc区中的氨基酸261至447的区域中的一个或多个取代;
(h)人IgG2的Fc区中的H268Q、V309L、A330S及A331S;
(i)人IgG1的Fc区中的C220S、C226S、C229S及P238S;
(j)人IgG1的Fc区中的C226S、C229S、E233P、L234V及L235A;
(k)人IgG1的Fc区中的L234F、L235E及P331S;
(l)人IgG1的Fc区中的C226S及P230S;以及
(m)人IgG1的Fc区中的S267E及L328F。
97.如权利要求94至96中任一项的复合物,其中所述复合物具有包含用于降低效应子功能的修饰的抗体Fc区,所述修饰产生无糖基化Fc区。
98.如权利要求94至96中任一项的复合物,其中所述复合物具有包含用于降低效应子功能的修饰的抗体Fc区,所述修饰不会消除所述Fc区的糖基化。
99.一种或多种聚核苷酸,其编码如权利要求1至98中任一项的复合物的一种或多种多肽。
100.一种或多种载体,其包含如权利要求99的一种或多种聚核苷酸。
101.一种或多种宿主细胞,其包含如权利要求99的一种或多种聚核苷酸或如权利要求100的一种或多种载体。
102.一种药物制剂,其包含如权利要求1至98中任一项的复合物及可药用载体。
103.一种治疗患有癌症的个体的方法,其包括对所述个体施用有效量的如权利要求1至98中任一项的复合物。
104.如权利要求103的方法,其进一步包括对所述个体施用其他治疗剂。
105.如权利要求104的方法,其中所述其他治疗剂包含化学治疗剂。
106.如权利要求104的方法,其中所述其他治疗剂包含PD-1轴结合拮抗剂。
107.如权利要求103至106中任一项的方法,其中所述癌症为膀胱上皮癌(uBC)、黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肾癌或膀胱癌。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112210005A (zh) * | 2019-07-11 | 2021-01-12 | 京天成生物技术(北京)有限公司 | 低免疫原性低adcc/cdc功能的抗c5人源化单抗及其应用 |
CN113509558A (zh) * | 2020-04-11 | 2021-10-19 | 百力司康生物医药(杭州)有限公司 | 四价抗体药物偶联物及其应用 |
WO2022233320A1 (zh) * | 2021-05-07 | 2022-11-10 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 与Fc受体结合改变的Fc突变体 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106132439A (zh) | 2014-03-31 | 2016-11-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 包含抗血管发生剂和ox40结合激动剂的组合疗法 |
EP3356403A2 (en) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor |
US11505616B2 (en) | 2016-03-25 | 2022-11-22 | Biomunex Pharmaceuticals | Binding molecules to CD38 and PD-L1 |
SG11201907288RA (en) | 2017-02-28 | 2019-09-27 | Seattle Genetics Inc | Cysteine mutated antibodies for conjugation |
IL269559B1 (en) | 2017-03-27 | 2024-02-01 | Biomunex Pharmaceuticals | Stable multispecific antibodies |
AU2019240247A1 (en) * | 2018-03-21 | 2020-10-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Fc variant compositions and methods of use thereof |
WO2019199945A1 (en) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Dna-barcoded antigen multimers and methods of use thereof |
EP3831854A4 (en) | 2018-08-03 | 2022-05-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH TWO LINKED ANTIGEN-BINDING DOMAINS |
CN109627339B (zh) * | 2019-01-25 | 2022-03-15 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 抗人pdl1抗体及其用途 |
CN110172090B (zh) * | 2019-06-03 | 2020-04-03 | 中山标佳生物科技有限公司 | Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用 |
RU2731516C1 (ru) * | 2019-08-01 | 2020-09-03 | Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства | Антитела против анафилатоксина C5a человека |
BR112022012317A2 (pt) | 2020-02-05 | 2022-09-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Métodos para a produção e/ou enriquecimento de moléculas de ligação a antígeno recombinantes |
JP7085666B2 (ja) | 2020-03-31 | 2022-06-16 | 中外製薬株式会社 | Dll3標的多重特異性抗原結合分子およびその使用 |
IL297292A (en) * | 2020-04-17 | 2022-12-01 | Hutchison Medipharma Ltd | Anti-ox40 antibody and uses thereof |
IL297566B1 (en) * | 2020-06-01 | 2024-03-01 | Mustbio Co Ltd | A bispecific antibody or an antigen-binding fragment thereof and a method for its preparation |
US20230287143A1 (en) * | 2020-06-30 | 2023-09-14 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | Binding protein in fab-hcab structure |
WO2023228082A1 (en) * | 2022-05-26 | 2023-11-30 | Pfizer Inc. | Anti-tnfr2 antibodies and methods of use thereof |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102924600A (zh) * | 2012-11-14 | 2013-02-13 | 河南大学 | 死亡受体5激动性多价抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用 |
WO2015017822A1 (en) * | 2013-08-02 | 2015-02-05 | Jn Biosciences Llc | Antibodies or fusion proteins multimerized via homomultimerizing peptide |
US20150307620A1 (en) * | 2014-04-16 | 2015-10-29 | University Of Connecticut | Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways |
US20160130358A1 (en) * | 2014-09-12 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
WO2017123673A2 (en) * | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Inhibrx Lp | Multivalent and multispecific ox40-binding fusion proteins |
Family Cites Families (198)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
CU22545A1 (es) | 1994-11-18 | 1999-03-31 | Centro Inmunologia Molecular | Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico |
USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
FR2413974A1 (fr) | 1978-01-06 | 1979-08-03 | David Bernard | Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie |
US4307016A (en) | 1978-03-24 | 1981-12-22 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Demethyl maytansinoids |
US4256746A (en) | 1978-11-14 | 1981-03-17 | Takeda Chemical Industries | Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use |
JPS55102583A (en) | 1979-01-31 | 1980-08-05 | Takeda Chem Ind Ltd | 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound |
JPS55162791A (en) | 1979-06-05 | 1980-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Antibiotic c-15003pnd and its preparation |
JPS5645483A (en) | 1979-09-19 | 1981-04-25 | Takeda Chem Ind Ltd | C-15003phm and its preparation |
EP0028683A1 (en) | 1979-09-21 | 1981-05-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibiotic C-15003 PHO and production thereof |
JPS5645485A (en) | 1979-09-21 | 1981-04-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Production of c-15003pnd |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
WO1982001188A1 (en) | 1980-10-08 | 1982-04-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same |
US4450254A (en) | 1980-11-03 | 1984-05-22 | Standard Oil Company | Impact improvement of high nitrile resins |
US4419446A (en) | 1980-12-31 | 1983-12-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector |
US4315929A (en) | 1981-01-27 | 1982-02-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method of controlling the European corn borer with trewiasine |
US4313946A (en) | 1981-01-27 | 1982-02-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora |
US4415732A (en) | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
JPS57192389A (en) | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Takeda Chem Ind Ltd | Novel maytansinoid |
US4601978A (en) | 1982-11-24 | 1986-07-22 | The Regents Of The University Of California | Mammalian metallothionein promoter system |
US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
US4943533A (en) | 1984-03-01 | 1990-07-24 | The Regents Of The University Of California | Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
US4965199A (en) | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
CA1338518C (en) | 1987-09-23 | 1996-08-13 | Joyce M. Zarling | Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells |
US5770701A (en) | 1987-10-30 | 1998-06-23 | American Cyanamid Company | Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents |
US5606040A (en) | 1987-10-30 | 1997-02-25 | American Cyanamid Company | Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group |
FI102355B1 (fi) | 1988-02-11 | 1998-11-30 | Bristol Myers Squibb Co | Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjugaattien valmistamiseksi |
EP0435911B1 (en) | 1988-09-23 | 1996-03-13 | Cetus Oncology Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression |
EP0368684B2 (en) | 1988-11-11 | 2004-09-29 | Medical Research Council | Cloning immunoglobulin variable domain sequences. |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
ES2096590T3 (es) | 1989-06-29 | 1997-03-16 | Medarex Inc | Reactivos biespecificos para la terapia del sida. |
CA2066428C (en) | 1989-09-08 | 2000-11-28 | Bert Vogelstein | Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
US5508192A (en) | 1990-11-09 | 1996-04-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides |
US5264365A (en) | 1990-11-09 | 1993-11-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides |
DK0564531T3 (da) | 1990-12-03 | 1998-09-28 | Genentech Inc | Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
EP0586505A1 (en) | 1991-05-14 | 1994-03-16 | Repligen Corporation | Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection |
LU91067I2 (fr) | 1991-06-14 | 2004-04-02 | Genentech Inc | Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines |
GB9114948D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Process for preparing sertraline intermediates |
MX9204374A (es) | 1991-07-25 | 1993-03-01 | Idec Pharma Corp | Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion. |
CA2116774C (en) | 1991-09-19 | 2003-11-11 | Paul J. Carter | Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
DE69233528T2 (de) | 1991-11-25 | 2006-03-16 | Enzon, Inc. | Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen |
GB9300059D0 (en) | 1992-01-20 | 1993-03-03 | Zeneca Ltd | Quinazoline derivatives |
CA2372813A1 (en) | 1992-02-06 | 1993-08-19 | L.L. Houston | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
ZA932522B (en) | 1992-04-10 | 1993-12-20 | Res Dev Foundation | Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens |
DE69308573T2 (de) | 1992-08-17 | 1997-08-07 | Genentech Inc | Bispezifische immunoadhesine |
NZ257942A (en) | 1992-10-23 | 1996-04-26 | Immunex Corp | Preparing a mammalian protein by expression of a fusion protein containing a leucine zipper domain |
JP3095175B2 (ja) | 1992-11-13 | 2000-10-03 | アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション | B細胞リンパ腫の治療のためのヒトbリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用 |
GB9314893D0 (en) | 1993-07-19 | 1993-09-01 | Zeneca Ltd | Quinazoline derivatives |
US5821332A (en) | 1993-11-03 | 1998-10-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4 |
ATE207366T1 (de) | 1993-12-24 | 2001-11-15 | Merck Patent Gmbh | Immunokonjugate |
US5654307A (en) | 1994-01-25 | 1997-08-05 | Warner-Lambert Company | Bicyclic compounds capable of inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family |
IL112248A0 (en) | 1994-01-25 | 1995-03-30 | Warner Lambert Co | Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them |
IL112249A (en) | 1994-01-25 | 2001-11-25 | Warner Lambert Co | Pharmaceutical compositions containing di and tricyclic pyrimidine derivatives for inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family and some new such compounds |
US5773001A (en) | 1994-06-03 | 1998-06-30 | American Cyanamid Company | Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis |
EP0772609B1 (en) | 1994-07-21 | 1999-02-24 | Akzo Nobel N.V. | Cyclic ketone peroxide formulations |
US5804396A (en) | 1994-10-12 | 1998-09-08 | Sugen, Inc. | Assay for agents active in proliferative disorders |
US5639635A (en) | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
WO1996030347A1 (en) | 1995-03-30 | 1996-10-03 | Pfizer Inc. | Quinazoline derivatives |
US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
GB9508538D0 (en) | 1995-04-27 | 1995-06-14 | Zeneca Ltd | Quinazoline derivatives |
GB9508565D0 (en) | 1995-04-27 | 1995-06-14 | Zeneca Ltd | Quiazoline derivative |
US5747498A (en) | 1996-05-28 | 1998-05-05 | Pfizer Inc. | Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines |
US5712374A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-27 | American Cyanamid Company | Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
US5714586A (en) | 1995-06-07 | 1998-02-03 | American Cyanamid Company | Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
EP0831880A4 (en) | 1995-06-07 | 2004-12-01 | Imclone Systems Inc | ANTIBODIES AND FRAGMENTS OF ANTIBODIES INHIBITING TUMOR GROWTH |
US6140332A (en) | 1995-07-06 | 2000-10-31 | Novartis Ag | Pyrrolopyrimidines and processes for the preparation thereof |
US5760041A (en) | 1996-02-05 | 1998-06-02 | American Cyanamid Company | 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors |
GB9603095D0 (en) | 1996-02-14 | 1996-04-10 | Zeneca Ltd | Quinazoline derivatives |
PL190489B1 (pl) | 1996-04-12 | 2005-12-30 | Warner Lambert Co | Nieodwracalne inhibitory kinaz tyrozyny, kompozycja farmaceutyczna je zawierająca i ich zastosowanie |
EP0912559B1 (en) | 1996-07-13 | 2002-11-06 | Glaxo Group Limited | Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors |
ID18494A (id) | 1996-10-02 | 1998-04-16 | Novartis Ag | Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya |
US6002008A (en) | 1997-04-03 | 1999-12-14 | American Cyanamid Company | Substituted 3-cyano quinolines |
UA73073C2 (uk) | 1997-04-03 | 2005-06-15 | Уайт Холдінгз Корпорейшн | Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
CA2288705C (en) | 1997-05-06 | 2008-03-18 | American Cyanamid Company | Use of quinazoline compounds for the treatment of polycystic kidney disease |
ZA986732B (en) | 1997-07-29 | 1999-02-02 | Warner Lambert Co | Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases |
ZA986729B (en) | 1997-07-29 | 1999-02-02 | Warner Lambert Co | Irreversible inhibitors of tyrosine kinases |
TW436485B (en) | 1997-08-01 | 2001-05-28 | American Cyanamid Co | Substituted quinazoline derivatives |
HUP0004286A3 (en) | 1997-11-06 | 2002-01-28 | American Cyanamid Co Madison | Use of quinazoline derivatives for producing pharmaceutical compositions for treating colonic polyps |
US6610833B1 (en) | 1997-11-24 | 2003-08-26 | The Institute For Human Genetics And Biochemistry | Monoclonal human natural antibodies |
IL136544A0 (en) | 1997-12-05 | 2001-06-14 | Scripps Research Inst | Humanization of murine antibody |
PT1060247E (pt) | 1998-02-24 | 2008-12-22 | Sisters Of Providence In Orego | Composições que contêm um agente de ligação ao receptor ox-40 ou um ácido nucleico que codifica para o mesmo e métodos para melhorar a resposta imunitária específica do antigénio |
CA2323757C (en) | 1998-04-02 | 2011-08-02 | Genentech, Inc. | Antibody variants and fragments thereof |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
AU757510C (en) | 1998-08-27 | 2003-09-11 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines |
GB9818731D0 (en) | 1998-08-27 | 1998-10-21 | Univ Portsmouth | Compounds |
IL127127A0 (en) | 1998-11-18 | 1999-09-22 | Peptor Ltd | Small functional units of antibody heavy chain variable regions |
EA003786B1 (ru) | 1998-11-19 | 2003-10-30 | Варнер Ламберт Компани | N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид - необратимый ингибитор тирозинкиназ |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
EP1240319A1 (en) | 1999-12-15 | 2002-09-18 | Genentech, Inc. | Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes |
CA2395660A1 (en) | 1999-12-29 | 2001-07-12 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
DE60131456T2 (de) | 2000-11-30 | 2008-07-10 | Medarex, Inc., Milpitas | Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern |
CA2447832C (en) | 2000-12-22 | 2012-09-25 | Jamshid Tanha | Phage display libraries of human vh fragments |
JP2005289809A (ja) | 2001-10-24 | 2005-10-20 | Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) | 突然変異重鎖抗体 |
NZ556507A (en) | 2002-06-03 | 2010-03-26 | Genentech Inc | Synthetic antibody phage libraries |
DE60317677T2 (de) | 2002-06-13 | 2008-10-30 | Crucell Holland B.V. | Ox40 (=cd134) rezeptor agonisten und therapeutische verwendung |
ES2347241T3 (es) | 2002-12-16 | 2010-10-27 | Genentech, Inc. | Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones. |
AU2004205631A1 (en) | 2003-01-16 | 2004-08-05 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
AU2003215821B2 (en) | 2003-03-31 | 2009-04-23 | Council Of Scientific And Industrial Research | Non-cross-linking pyrrolo(2,1-c)(1,4)benzodiazepines as potential antitumour agents and process thereof |
EP1629012B1 (en) | 2003-05-31 | 2018-11-28 | Amgen Research (Munich) GmbH | Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders |
PT1639011E (pt) | 2003-06-30 | 2009-01-20 | Domantis Ltd | Anticorpos (dab) de domínio único peguilados |
GB0321295D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Spirogen Ltd | Synthesis of protected pyrrolobenzodiazepines |
ATE516288T1 (de) | 2003-10-22 | 2011-07-15 | Us Gov Health & Human Serv | Pyrrolobenzodiazepinderivate, zusammensetzungen, die diese enthalten, und damit in zusammenhang stehende verfahren |
EP2186527A1 (en) | 2003-11-28 | 2010-05-19 | Micromet AG | Compositions comprising polypeptides |
US7235641B2 (en) | 2003-12-22 | 2007-06-26 | Micromet Ag | Bispecific antibodies |
GB0404577D0 (en) | 2004-03-01 | 2004-04-07 | Spirogen Ltd | Pyrrolobenzodiazepines |
US7528126B2 (en) | 2004-03-09 | 2009-05-05 | Spirogen Limited | Pyrrolobenzodiazepines |
CN1961003B (zh) | 2004-03-31 | 2013-03-27 | 健泰科生物技术公司 | 人源化抗TGF-β抗体 |
US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
SG172616A1 (en) | 2004-04-13 | 2011-07-28 | Hoffmann La Roche | Anti-p-selectin antibodies |
TWI380996B (zh) | 2004-09-17 | 2013-01-01 | Hoffmann La Roche | 抗ox40l抗體 |
JP4948413B2 (ja) | 2004-09-23 | 2012-06-06 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | システイン操作抗体および結合体 |
JO3000B1 (ar) | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
US7696175B2 (en) | 2004-10-29 | 2010-04-13 | University Of Southern California | Combination cancer immunotherapy with co-stimulatory molecules |
WO2006121810A2 (en) | 2005-05-06 | 2006-11-16 | Providence Health System | Trimeric ox40-immunoglobulin fusion protein and methods of use |
KR101498834B1 (ko) | 2005-05-09 | 2015-03-05 | 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 | 예정 사멸 인자 1(pd-1)에 대한 인간 모노클로날 항체, 및 항-pd-1 항체를 단독 사용하거나 기타 면역 요법제와 병용한 암 치료 방법 |
HUE026039T2 (en) | 2005-07-01 | 2016-05-30 | Squibb & Sons Llc | Human monoclonal antibodies programmed for death ligand 1 (PD-L1) |
US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
EP1940881B1 (en) | 2005-10-11 | 2016-11-30 | Amgen Research (Munich) GmbH | Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof |
EP2465870A1 (en) | 2005-11-07 | 2012-06-20 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences |
TWI461436B (zh) | 2005-11-25 | 2014-11-21 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | 人類cd134(ox40)之人類單株抗體及其製造及使用方法 |
EP1973951A2 (en) | 2005-12-02 | 2008-10-01 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
EP2016101A2 (en) | 2006-05-09 | 2009-01-21 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with optimized scaffolds |
EP2076290B1 (en) | 2006-10-27 | 2016-12-14 | Sunnybrook Health Sciences Center | Multimeric tie 2 agonists and uses thereof in stimulating angiogenesis |
CN101687915B8 (zh) | 2007-04-03 | 2018-08-03 | 安进研发(慕尼黑)股份有限公司 | 跨物种特异性CD3-ε结合结构域 |
CL2008001334A1 (es) | 2007-05-08 | 2008-09-22 | Genentech Inc | Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer. |
CN100592373C (zh) | 2007-05-25 | 2010-02-24 | 群康科技(深圳)有限公司 | 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法 |
CN101835803B (zh) | 2007-10-19 | 2016-05-25 | 健泰科生物技术公司 | 半胱氨酸改造的抗tenb2抗体和抗体药物偶联物 |
EP2594590B1 (en) | 2007-12-14 | 2014-11-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Method of producing binding molecules for the human OX40 receptor |
DK2235064T3 (en) | 2008-01-07 | 2016-01-11 | Amgen Inc | A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects |
ES2639857T3 (es) | 2008-02-11 | 2017-10-30 | Cure Tech Ltd. | Anticuerpos monoclonales para el tratamiento del tumor |
WO2009114335A2 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-17 | Merck & Co., Inc. | Pd-1 binding proteins |
PL2315756T3 (pl) | 2008-07-08 | 2015-02-27 | Incyte Holdings Corp | 1,2,5-oksadiazole jako inhibitory 2,3-dioksygenazy indoloaminy |
WO2010098788A2 (en) | 2008-08-25 | 2010-09-02 | Amplimmune, Inc. | Pd-i antagonists and methods for treating infectious disease |
TWI686405B (zh) | 2008-12-09 | 2020-03-01 | 建南德克公司 | 抗pd-l1抗體及其於增進t細胞功能之用途 |
PL2398498T3 (pl) | 2009-02-17 | 2019-03-29 | Ucb Biopharma Sprl | Cząsteczki przeciwciał swoiste wobec ludzkiego OX40 |
PL3192529T3 (pl) | 2009-04-08 | 2020-08-24 | Heinz Faulstich | Zawierające amatoksynę terapeutyczne komponenty wiążące powierzchnię komórki zaprojektowane do terapii guza nowotworowego |
US9676845B2 (en) | 2009-06-16 | 2017-06-13 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
US20130017199A1 (en) | 2009-11-24 | 2013-01-17 | AMPLIMMUNE ,Inc. a corporation | Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2 |
EP2509627B1 (en) | 2009-12-07 | 2017-01-25 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Methods for enhancing anti-tumor antibody therapy |
RU2626537C2 (ru) | 2010-06-08 | 2017-07-28 | Дженентек, Инк. | Полученные с помощью генной инженерии антитела с цистеиновыми заменами и их конъюгаты |
WO2013028231A1 (en) | 2011-08-23 | 2013-02-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anti-ox40 antibodies and methods of using the same |
PE20131403A1 (es) | 2010-08-23 | 2014-01-10 | Univ Texas | Anticuerpos anti-ox40 y metodos de uso de los mismos |
ES2402254T3 (es) | 2010-09-30 | 2013-04-30 | Heidelberg Pharma Ag | Conjugados de amatoxinas con ligadores mejorados |
EP2497499A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-12 | Heidelberg Pharma GmbH | Amatoxin-conjugates with improved linkages |
AU2012234335B2 (en) | 2011-03-29 | 2016-09-01 | Roche Glycart Ag | Antibody Fc variants |
CA2840460C (en) | 2011-07-11 | 2022-08-16 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Antibodies that bind to ox40 and their uses |
GB201116092D0 (en) | 2011-09-16 | 2011-11-02 | Bioceros B V | Antibodies and uses thereof |
EP2812022B1 (en) | 2012-02-06 | 2019-06-26 | Providence Health & Services - Oregon | Method of monitoring cancer treatment using ox40 agonists |
CN112587658A (zh) | 2012-07-18 | 2021-04-02 | 博笛生物科技有限公司 | 癌症的靶向免疫治疗 |
WO2014043403A1 (en) | 2012-09-12 | 2014-03-20 | Agensys, Inc. | Amatoxin derivatives and cell-permeable conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase |
PT2925350T (pt) | 2012-12-03 | 2019-03-25 | Bristol Myers Squibb Co | Melhoria da atividade anticancerosa de proteínas de fusão de fc imunomoduladoras |
EP2774624A1 (en) | 2013-03-04 | 2014-09-10 | Heidelberg Pharma GmbH | Amatoxin derivatives |
PL2976361T3 (pl) | 2013-03-18 | 2018-12-31 | Biocerox Products B.V. | Humanizowane przeciwciała anty-CD134 (OX40) i ich zastosowania |
CA2934028A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Genentech, Inc. | Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists |
MX2016007972A (es) | 2013-12-17 | 2016-10-28 | Genentech Inc | Metodos para tratar canceres con antagonistas de union al eje pd-1 y taxanos. |
JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
US11213583B2 (en) | 2014-02-05 | 2022-01-04 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods and compositions for treating cancer and infectious diseases |
ES2754239T3 (es) | 2014-03-12 | 2020-04-16 | Curevac Ag | Combinación de vacunación y agonistas de OX40 |
MA40682B1 (fr) | 2014-03-31 | 2020-01-31 | Hoffmann La Roche | Anticorps anti-ox40 et procédés d'utilisation correspondants |
CN106132439A (zh) | 2014-03-31 | 2016-11-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 包含抗血管发生剂和ox40结合激动剂的组合疗法 |
ES2774381T3 (es) | 2014-04-03 | 2020-07-20 | Univ Res Inst Inc Augusta | Métodos para mejorar la eficacia de la respuesta inmune dirigida a tumores |
AU2015286043B2 (en) | 2014-07-09 | 2020-08-20 | Birdie Biopharmaceuticals Inc. | Anti-PD-L1 combinations for treating tumors |
CN105440135A (zh) | 2014-09-01 | 2016-03-30 | 博笛生物科技有限公司 | 用于治疗肿瘤的抗-pd-l1结合物 |
CN105233291A (zh) | 2014-07-09 | 2016-01-13 | 博笛生物科技有限公司 | 用于治疗癌症的联合治疗组合物和联合治疗方法 |
WO2016040880A1 (en) | 2014-09-13 | 2016-03-17 | Novartis Ag | Combination therapies of alk inhibitors |
BR112017006664A2 (pt) | 2014-10-03 | 2017-12-26 | Novartis Ag | terapias de combinação |
MA41044A (fr) | 2014-10-08 | 2017-08-15 | Novartis Ag | Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer |
TW201619200A (zh) | 2014-10-10 | 2016-06-01 | 麥迪紐有限責任公司 | 人類化抗-ox40抗體及其用途 |
TN2017000129A1 (en) | 2014-10-14 | 2018-10-19 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof |
MX2017005751A (es) | 2014-11-03 | 2018-04-10 | Genentech Inc | Métodos y biomarcadores para predecir la eficacia y evaluación de un tratamiento con agonista de ox40. |
WO2016073378A1 (en) | 2014-11-03 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Assays for detecting t cell immune subsets and methods of use thereof |
AU2015343494A1 (en) | 2014-11-06 | 2017-04-27 | Genentech, Inc. | Combination therapy comprising OX40 binding agonists and TIGIT inhibitors |
WO2016081384A1 (en) | 2014-11-17 | 2016-05-26 | Genentech, Inc. | Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists |
CA2981183A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Greg Lazar | Antigen binding complex having agonistic activity and methods of use |
AU2016252773B2 (en) | 2015-04-24 | 2022-06-02 | Genentech, Inc. | Multispecific antigen-binding proteins |
US20170000885A1 (en) | 2015-06-08 | 2017-01-05 | Genentech, Inc. | Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists |
CN107810011A (zh) | 2015-06-08 | 2018-03-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用抗ox40抗体治疗癌症的方法 |
US10428131B2 (en) | 2015-08-12 | 2019-10-01 | Medimmune Limited | GITRL fusion proteins comprising a human coronin 1a derived trimerization domain |
EP3356403A2 (en) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor |
MX2018004157A (es) | 2015-10-07 | 2019-04-01 | F Hoffmann La Roche Ag | Anticuerpos biespecificos con tetravalencia para un receptor de fnt coestimulador. |
-
2017
- 2017-08-04 JP JP2019506082A patent/JP2019530434A/ja active Pending
- 2017-08-04 EP EP17754895.5A patent/EP3494139B1/en active Active
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- 2017-08-04 CN CN201780061217.5A patent/CN109963871A/zh active Pending
- 2017-08-07 TW TW106126614A patent/TW201808991A/zh unknown
- 2017-08-07 AR ARP170102215A patent/AR109298A1/es unknown
-
2021
- 2021-05-17 US US17/322,671 patent/US20220064315A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102924600A (zh) * | 2012-11-14 | 2013-02-13 | 河南大学 | 死亡受体5激动性多价抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用 |
WO2015017822A1 (en) * | 2013-08-02 | 2015-02-05 | Jn Biosciences Llc | Antibodies or fusion proteins multimerized via homomultimerizing peptide |
US20150307620A1 (en) * | 2014-04-16 | 2015-10-29 | University Of Connecticut | Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways |
US20160130358A1 (en) * | 2014-09-12 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
WO2017123673A2 (en) * | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Inhibrx Lp | Multivalent and multispecific ox40-binding fusion proteins |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
SANDRINE ASPESLAGH等: "Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy", 《EUROPEAN JOURNAL OF CANCER》 * |
王勤等: "鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定", 《中华微生物学和免疫学杂志》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112210005A (zh) * | 2019-07-11 | 2021-01-12 | 京天成生物技术(北京)有限公司 | 低免疫原性低adcc/cdc功能的抗c5人源化单抗及其应用 |
CN112210005B (zh) * | 2019-07-11 | 2024-03-26 | 京天成生物技术(北京)有限公司 | 低免疫原性低adcc/cdc功能的抗c5人源化单抗及其应用 |
CN113509558A (zh) * | 2020-04-11 | 2021-10-19 | 百力司康生物医药(杭州)有限公司 | 四价抗体药物偶联物及其应用 |
WO2022233320A1 (zh) * | 2021-05-07 | 2022-11-10 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 与Fc受体结合改变的Fc突变体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3494139A1 (en) | 2019-06-12 |
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US20180057598A1 (en) | 2018-03-01 |
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