TW202037606A - 針對cll1之單域抗體及其構築體 - Google Patents

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劉昀蕾
涂孝潔
束陳宇
詹泰嵐
張贇
唐安
張亞峰
武術
張清
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Abstract

本申請案提供靶向CLL1之單域抗體及其構築體，該等構築體包括嵌合受體、免疫效應細胞銜接子及免疫結合物。還提供經工程改造免疫效應細胞(諸如T細胞)，其包含抗CLL1嵌合受體及視情況存在之靶向第二抗原或抗原決定基之第二嵌合受體。亦提供治療癌症之醫藥組成物、套組及方法。

Description

針對CLL1之單域抗體及其構築體
本發明係關於靶向CLL1之單域抗體、嵌合受體及經工程改造免疫細胞，及其使用方法。
隨著腫瘤免疫療法及臨床技術之發展，嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)免疫療法現已成為最有前途之腫瘤免疫療法之一。通常，嵌合抗原受體(CAR)包含細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域。細胞外域可包含靶向已鑑別腫瘤抗原之單鏈可變片段(scFv)。可以使用基因轉染技術使CAR在T細胞表面上表現。結合標靶腫瘤抗原後，CAR可以抗原依賴性方式活化T細胞以啟動特定抗腫瘤反應，而不受特異於標靶腫瘤抗原之主要組織相容性複合物(MHC)之可用性限制。
單域抗體(sdAb)與常規4鏈抗體之不同之處在於具有單個單體抗體可變域。舉例而言，駱駝科動物及鯊魚產生稱為僅重鏈抗體(HcAb)之sdAb，該等sdAb天然缺乏輕鏈。駱駝科僅重鏈抗體之各臂中的抗原結合片段具有單個重鏈可變域(VHH)，其無需輕鏈幫助即可對抗原具有高親和力。駱駝VHH被認為是最小之功能性抗原結合片段，其分子量為約15kD。
急性骨髓性白血病(AML)為一種血細胞骨髓系癌症，其特徵為不成熟血細胞(「胚細胞」)迅速生長，該等不成熟血細胞在骨髓及血液中積累並干擾正常血細胞。AML可擴散至其他器官，諸如肝臟、脾臟及腦。AML之臨床症狀包括感覺疲倦、呼吸急促、容易瘀傷及出血及感染風險增加。若不治療，AML 會迅速進展，且通常在數週或數月內致命。AML具有數種亞型，針對該等亞型之治療及結果可不同。典型地，最初以化學療法治療AML，有時與靶向療法藥物一起。隨後，患者可繼續接受幹細胞移植、其他化學療法、手術或放射療法。AML最常見於老年人，其中一些不夠健康，無法接受密集化學療法，因此具有不良臨床結果。儘管當前針對AML之療法通常會使疾病緩解，但幾乎所有患者最終均會復發。需要有效免疫治療劑來治療AML。
本文提及之所有公開案、專利、專利申請案及公開之專利申請案之揭露內容在此以全文引用之方式併入本文中。
本申請案提供抗CLL1單域抗體(sdAb)及其構築體，該等構築體包括嵌合受體、免疫效應細胞銜接子及免疫結合物；經工程改造免疫細胞；及其在癌症免疫療法中之使用方法。
本申請案之一態樣提供一種包含特異性結合CLL1之單域抗體(「sdAb」)部分的抗CLL1構築體，其中sdAb部分(例如VHH)包含有包含SEQ ID NO：4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158及165中之任一者之胺基酸序列的CDR1或其在該CDR1中包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160及167中之任一者之胺基酸序列的CDR2或其在該CDR2中包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162及169中之任一者之胺基酸序列的CDR3或其在該CDR3中包含至多約3個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之 胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體； (12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。
在一些實施方案中，提供一種包含特異性結合CLL1之sdAb部分的抗CLL1構築體，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列的sdAb的CDR1、CDR2及CDR3。
在根據本文所述抗CLL1構築體中之任一者之在一些實施方案中，sdAb部分包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%(例如約96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列。
還提供上述抗CLL1 sdAb部分中之任一者特異性結合的CLL1抗原決定基，及與上述抗CLL1 sdAb部分中之任一者競爭的抗CLL1抗體(諸如抗CLL1 sdAb)。
在根據上述抗CLL1構築體中之任一者的在一些實施方案中，sdAb部分為駱駝科抗體。在一些實施方案中，sdAb部分為嵌合抗體。在一些實施方案中，sdAb部分為人類化部分。在一些實施方案中，sdAb部分為VHH片段。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為嵌合受體(本文中亦稱為「抗CLL1嵌合受體」)，其包含有包含sdAb部分(例如VHH)之細胞外域、跨膜域及包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列為CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域還包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，抗CLL1構築體之細胞外域還包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分。在一些實施方案中，第二結合部分為sdAb(例如VHH)或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為受體之細胞外域。在一些實施方案中，第二結合部分特異性結合CD33、CD123或NKG2D配體。在一些實施方案中，第二結合部分為抗CD33 sdAb或抗CD123 sdAb。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之細胞外域(ECD)。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為嵌合受體(本文中亦稱為「抗CLL1嵌合受體」)，其包含有包含sdAb部分(例如VHH)之細胞外域、跨膜域及 包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，抗CLL1構築體之細胞外域還包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分。在一些實施方案中，第二結合部分為sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為受體之細胞外域。在一些實施方案中，第二結合部分特異性結合CD33、CD123或NKG2D配體。在一些實施方案中，第二結合部分為特異性結合CD33或CD123之sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之ECD。
本申請案之一態樣提供一種抗CLL1嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb部分之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中抗CLL1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列為CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域還包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、 TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。
本申請案之一態樣提供一種多特異性嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb部分及抗CD33 sdAb部分之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中抗CLL1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3，且其中抗CD33 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列為CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域還包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。
本申請案之一態樣提供一種抗CLL1嵌合受體，其包含SEQ ID NO：120-132、177-179、181、184-195及229-230中之任一者的胺基酸序列。
本申請案之一態樣提供一種包含上述抗CLL1嵌合受體或多特異性嵌合受體中之任一者的經工程改造免疫細胞，或一種編碼該抗CLL1嵌合受體或該多特異性嵌合受體之核酸。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞還包含 第二嵌合受體。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分的細胞外域、跨膜域及包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列為CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域還包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分的細胞外域、跨膜域及包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，第二結合部分為受體之細胞外域。在一些實施方案中，第二結合部分特異性結合CD33、CD123或NKG2D配體。在一些實施方案中，第二結合部分為特異性結合CD33或CD123之sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之ECD。
本申請案之一態樣提供一種包含以下之雙重嵌合受體系統：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中抗CLL1 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3；或(2)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導 域，其中抗CD33 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列的CDR3；或(3)包含SEQ ID NO：219之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：221之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：223之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體之細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列為CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體之細胞內信號傳導域還包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，第一嵌合受體之細胞內共刺激序列包含來源於CD28之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第二嵌合受體之細胞內共刺激序列包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列。
還提供一種雙重嵌合受體構築體，其包含SEQ ID NO：234-236中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種經工程改造免疫細胞，其包含上述雙重嵌合受體系統或雙重嵌合受體構築體中之任一者。
在根據上述經工程改造免疫細胞中之任一者的在一些實施方案中，免疫細胞為T細胞、NK細胞、外周血單核細胞(PBMC)、造血幹細胞、多能幹細胞或胚胎幹細胞。在一些實施方案中，免疫細胞為T細胞，諸如細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、自然殺傷T細胞或γδT細胞。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR、CD20或其抗原決定基。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為單特異性分子。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為多特異性分子，諸如雙特異性分子。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為分泌型分子。在一些實施方案中，抗CLL1構築體包含與特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分連接的sdAb部分(例如VHH)。在一些實施方案中，第二結合部分為sdAb或scFv。在一些實施方案中，sdAb部分與第二結合部分經由肽連接子連接。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為免疫效應細胞銜接子，其中第二結合部分特異性結合免疫細胞表面上之抗原。在一些實施方案中，抗CLL1構築體包含特異性結合T細胞表面上之抗原的第二結合部分。在一些實施方案中，第二結合部分特異性結合選自由以下組成之群之抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、4-1BB、CD27、CD40L及HVEM。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為包含sdAb部分及效應分子之免疫結合物。在一些實施方案中，效應分子為選自由以下組成之群之治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。在一些實施方案中，效應分子為藥物或毒素。在一些實施方案中，效應分子為標記。
本申請案之一態樣提供一種經分離核酸，其包含編碼上述抗CLL1構築體(包括抗CLL1 sdAb、抗CLL1嵌合受體、多特異性嵌合受體、雙重嵌合受體系統、免疫效應細胞銜接子及抗CLL1免疫結合物)中之任一者的核酸序 列。在一些實施方案中，核酸序列選自由SEQ ID NO：107-119及174-176組成之群。
在一些實施方案中，提供一種經分離核酸，其包含編碼上述抗CLL1嵌合受體中之任一者的核酸序列。在一些實施方案中，經分離核酸包含編碼抗CLL1嵌合受體之第一核酸序列及編碼第二嵌合受體(例如抗CD33、抗CD123或NKG2D嵌合受體)之第二核酸序列，其中第二核酸序列與第一核酸序列經由編碼自切割肽(諸如T2A、P2A或F2A肽)之第三核酸序列可操作地連接。在一些實施方案中，經分離核酸還包含編碼安全性開關抗原或抗原決定基(諸如CD52、CD20、EGFR或其抗原決定基)之核酸序列。
本申請案之一態樣提供一種載體，其包含上述經分離核酸中之任一者。在一些實施方案中，載體為表現載體。在一些實施方案中，載體為病毒載體，諸如慢病毒載體。在一些實施方案中，載體為非病毒載體。
本申請案之一態樣提供一種醫藥組成物，其包含上述抗CLL1嵌合受體中之任一者或上述經工程改造免疫細胞中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。還提供一種治療個體之疾病(諸如癌症)的方法，該方法包括向個體投與有效量之上述醫藥組成物中之任一者。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞為自體免疫細胞。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞為同種異體免疫細胞。在一些實施方案中，疾病為癌症。在一些實施方案中，癌症為液體癌症。在一些實施方案中，癌症為急性骨髓性白血病(AML)。在一些實施方案中，癌症為慢性骨髓性白血病(CML)。在一些實施方案中，癌症為骨髓化生不良症候群(MDS)。在一些實施方案中，其中免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，方法還包含隨後投與有效量之特異性結合安全性開關抗原或抗原決定基之抗體。
本申請案之一態樣提供一種醫藥組成物，其包含上述抗CLL1構築體中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施方案中，提供一種治療個體之疾病(諸如癌症)的方法，該方法包括向個體投與有效量之醫藥組成物。在一些實施方案中，提供一種治療個體之癌症的方法，該方法包括向個體投與有效量之根據上述抗CLL1構築體中之任一者的抗CLL1構築體。在一些實施方案中，癌症為急性骨髓性白血病(AML)。在一些實施方案中，癌症為慢性骨髓性白血病(CML)。在一些實施方案中，癌症為骨髓化生不良症候群(MDS)。
還提供使用方法、套組及包含上述抗CLL1 sdAb、嵌合受體、免疫效應細胞銜接子、免疫結合物、經工程改造免疫細胞、經分離核酸或載體中之任一者的製品。
圖1描繪免疫前血清及針對人類CLL1最終加強免疫後之免疫後血清的免疫反應。
圖2描繪了針對人類CLL1加強免疫後之免疫後血清中的4鏈抗體(IgG1)及僅重鏈抗體(IgG2及IgG3)之免疫反應。將自免疫前血清分離之相應免疫球蛋白片段用作對照。
圖3描繪用於篩選之嵌合抗原受體(CAR)構築體之示意圖。
圖4描繪代表性活體外細胞毒性測定之結果，該測定展示來源於針對急性骨髓性白血病細胞系THP-1之各種sdAb的CAR-T細胞的溶細胞活性。將未轉導T細胞(UnT)用作陰性對照，且將CLL1 BM CAR-T細胞用作陽性對照。
圖5A-5D描繪活體外細胞毒性測定中之細胞因子釋放。圖5A展示由抗CLL1 CAR-T細胞與THP-1細胞之共培養物分泌之IFN-γ的水準。圖5B展示由單獨培育之抗CLL1 CAR-T細胞分泌之IFN-γ的水準。圖5C展示由抗CLL1 CAR-T細胞與THP-1細胞之共培養物分泌之TNF-α的水準。圖5D展示由單獨培育之抗CLL1 CAR-T細胞分泌之TNF-α的水準。
圖6A-6C描繪抗CLL1 CAR-T細胞與THP-1細胞之長期共培養物中的T細胞群。圖6A展示藉由FACS分析獲得之代表性結果。圖6B展示計算之T細胞增殖率。圖6C展示同一共培養物中之總T細胞計數。
圖7描繪代表性活體內功效測定之結果，該測定展示所選CAR-T細胞在U937-Luc異種移植小鼠模型中之抗腫瘤能力。將未轉導T細胞(「UnT」)用作陰性對照，且將CLL1 BM CAR-T細胞用作陽性對照。
圖8A-8E描繪CAR構築體之示意圖，該等CAR構築體包括常規CAR(圖8A)、串聯CAR(圖8B)、雙重CAR(圖8C)及分割CAR(圖8D-8E)。
圖8A展示例示性抗CLL1 CAR，其包含CLL1結合域、跨膜域、CD28或4-1BB細胞內共刺激序列及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。
圖8B展示例示性串聯CAR，其包含有包含CLL1結合域及第二抗原結合域之細胞外域、跨膜域及包含CD28或4-1BB細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。
圖8C展示雙重CAR系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含CLL1結合域、跨膜域、CD28或4-1BB細胞內共刺激序列及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含CD33結合域或NKG2D之細胞外域(ECD)(「NKG2D ECD」)、跨膜域及包含CD28或4-1BB細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。
圖8D展示分割CAR系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含CLL1結合域、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域；及(b) 第二嵌合受體，其包含CD33結合域或NKG2D ECD、跨膜域及包含CD28或4-1BB細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。
圖8E展示分割CAR系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含CD33結合域(或CD123結合域，或NKG2D ECD)、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含CLL1結合域、跨膜域及包含CD28或4-1BB細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。
在圖8A-8E中，CLL1結合域可為本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者。第二抗原結合域可為NKG2D ECD或CD33結合域(例如抗CD33 sdAb)，或CD123結合域(例如抗CD123 sdAb)。
圖9A-9B描繪代表性活體外細胞毒性測定之結果，該測定展示針對急性骨髓性白血病細胞系THP-1(圖9A)及MOLM-13(圖9B)之AS82658-28z CAR-T細胞的溶細胞活性。將未轉導T細胞(UnT)用作陰性對照，且將CLL1 BM CAR-T細胞用作陽性對照。
圖10A-10B描繪AS82658-28z CAR-T細胞在抑制與U937細胞之長期共培養物中的腫瘤細胞生長方面的效力。圖10A展示藉由FACS分析確定之CAR-T細胞在不同時間點(共培養後3、5、7、10、12、14、17、19及21天)之細胞毒性。圖10B展示在不同時間點(共培養後3、5、7、10及12天)之T細胞增殖率。
圖11A-11B描繪長期共培養物測定中之細胞因子釋放。圖11A展示在不同時間點(共培養後3、5、7、10及12天)由AS82658-28z CAR-T細胞分泌之GM-CSF的水準。圖11B展示在不同時間點(共培養後3、5、7、10及12天)由AS82658-28z CAR-T細胞釋放之IFN-γ的水準。
圖12A-12B描繪通過CFU測定確定之AS82658-28z CAR-T細胞針對造血幹細胞(HSC)之活體外毒性。將UnT細胞用作陰性對照，且將CLL1 BM CAR-T細胞用作陽性對照。
圖13描繪AS82658-28z CAR-T細胞在U937-Luc異種移植小鼠模型中之活體內功效。將UnT細胞用作陰性對照，且將CLL1 BM CAR-T細胞用作陽性對照。
圖14描繪CLL1/CD33串聯CAR-T細胞針對急性骨髓性白血病細胞系THP-1之活體外細胞毒性。使用UnT細胞作為陰性對照，且使用AS82658-28z及AS49264 CAR-T細胞(抗CD33 CAR)作為陽性對照。
圖15A-15B描繪CLL1/CD33串聯CAR-T細胞在抑制與U937細胞之長期共培養物中的腫瘤細胞生長方面的效力。圖15A展示藉由FACS分析確定之CAR-T細胞在不同時間點(共培養後2、5、7、9及12天)之細胞毒性。圖15B展示在不同時間點(共培養後2、5、7及9天)之T細胞增殖率。
圖16A-16B描繪長期共培養物測定中之細胞因子釋放。圖16A展示在不同時間點(共培養後3、6及9天)由CLL1/CD33串聯CAR-T細胞分泌之GM-CSF的水準。圖16B展示在不同時間點(共培養後2、5、7及9天)由CLL1/CD33串聯CAR-T細胞釋放之IFN-γ的水準。
圖17A-17C描繪CLL1/CD33雙重CAR-T細胞針對急性骨髓性白血病細胞系THP-1之活體外細胞毒性。使用UnT細胞作為陰性對照。
圖18A-18D描繪CLL1/CD33雙重CAR-T及單標靶CAR-T細胞在HL-60-Luc異種移植模型中之活體內功效。圖18A及18C展示活體內功效研究之示意圖。圖18B及18D展示CAR-T細胞處理後HL-60-Luc異種移植小鼠模型中之腫瘤生長曲線。使用UnT細胞作為陰性對照。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2018年9月10日申請之國際專利申請案第PCT/CN2018/104883號及2018年9月10日申請之國際專利申請案第PCT/CN2018/104882號之優先權，該等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
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本申請案提供抗CLL1單域抗體(sdAb)及其構築體，該等構築體諸如嵌合受體、免疫效應細胞銜接子及免疫結合物。亦提供多價及多特異性嵌合受體、雙重嵌合受體系統及分割嵌合受體系統。本文所述之抗CLL1 sdAb、嵌合受體及表現嵌合受體之經工程改造免疫細胞為用於癌症治療之有用藥劑。
因此，本申請案之一態樣提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1(例如CLL1之細胞外域)之單域抗體(「sdAb」)部分。
在另一態樣中，提供一種抗CLL1嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(例如VHH)之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域(例如細胞內共刺激序列及/或免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列，例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)。
在另一態樣中，提供一種多特異性嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(例如VHH)之細胞外域及特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二抗原結合域(例如抗CD33 sdAb、抗CD123 sdAb或NKG2D之細胞外域)、跨膜域及包含細胞內共刺激序列及免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)的細胞內信號傳導域。
在另一態樣中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：第一嵌合受體，其包含抗CLL1 sdAb(例如VHH)、跨膜域及包含免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)的細胞內信號傳導域；及第二嵌合受體，其包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二抗原結合域(例如抗CD33 sdAb、抗CD123 sdAb或NKG2D之細胞外域)、跨膜域及包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。
在另一態樣中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：第一嵌合受體，其包含抗CLL1 sdAb(例如VHH)、跨膜域及細胞內共刺激序列；及第二嵌合受體，其包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二抗原結合域(例如抗CD33 sdAb、抗CD123 sdAb或NKG2D之細胞外域)、跨膜域及包含免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)的細胞內信號傳導域。
本文亦描述編碼抗CLL1構築體之核酸、包含嵌合受體或嵌合受體系統之經工程改造免疫細胞(諸如T細胞)、醫藥組成物、套組、製品及治療方法。
I. 定義
術語「抗原」係指能夠在宿主細胞中誘導免疫反應之任何分子，或能夠結合抗原特異性受體之任何分子。
術語「抗體」或「抗體部分」包括單株抗體(其包括全長4鏈抗體或具有免疫球蛋白Fc區之僅全長重鏈抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組成物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體及單鏈分子)以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2及Fv)。在本文中，術語「免疫球蛋白」(Ig)可與「抗體」互換使用。本文涵蓋之抗體包括單域抗體，諸如僅重鏈抗體。
基本4鏈抗體單元為由兩條一致輕(L)鏈及兩條一致重(H)鏈組成之異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個基本異四聚體單元以及稱為J鏈之另一多肽組 成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包含2-5個可聚合形成多價集合體之基本4鏈單元與J鏈之組合。在IgG之情況下，4鏈單元通常為約150,000道爾頓(Dalton)。各L鏈由一共價二硫鍵與H鏈連接，而兩條H鏈視H鏈同型而定由一或多個二硫鍵彼此連接。各H及L鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫鍵。各H鏈在N端具有一可變域(VH)，接著為三個恆定域(CH)(對於α及γ鏈中之每一者)及四個CH域(對於μ及ε同型)。各L鏈在N端具有一可變域(VL)，接著在其另一端具有一恆定域。VL與VH對準，且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對準。據信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH及VL之配對一起形成單個抗原結合位點。對於不同類別抗體之結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties,Abba I.Terr及Tristram G.Parsolw(編)，Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71頁及第6章。可將來自任何脊椎動物物種之L鏈基於其恆定域之胺基酸序列歸於稱為κ及λ之兩種明顯不同類型之一。視重鏈恆定域(CH)之胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白歸於不同類別或同型。存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其分別具有稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。基於CH序列之相對較小差異及功能，將γ及α類別進一步分成亞類，例如人類表現以下亞類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
術語「僅重鏈抗體」或「HCAb」係指功能性抗體，其包含重鏈，但缺乏在4鏈抗體中通常發現之輕鏈。已知駱駝科動物(諸如駱駝、美洲駝或羊駝)會產生HCAb。
術語「單域抗體」、「單域抗體部分」、「sdAb」或「sdAb部分」係指具有三個互補決定區(CDR)之單一抗原結合多肽，其包括全長抗體(例如HCAb)及其抗原結合片段(例如VHH)。單獨之sdAb能夠在不與相應含CDR多肽配對之情況下結合抗原。在一些情況下，單域抗體由駱駝科HCAb工程改造而 成，且其重鏈可變域在本文中稱為「VHH」。一些VHH還可稱為奈米抗體。駱駝科sdAb為最小已知抗原結合抗體片段之一(參見例如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-8(1993)；Greenberg等人，Nature 374：168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine(Lond),8：1013-26(2013))。基本VHH自N端至C端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分別指構架區1至4，且其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。
「經分離」抗體為已自其產生環境(例如天然或重組)之組分中鑑別、分離及/或回收之抗體。較佳地，經分離多肽不與其產生環境中之所有其他組分結合。其產生環境中之污染物組分(諸如由重組轉染細胞產生之污染物組分)為通常會干擾抗體之研究、診斷性或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施方案中，將多肽純化至：(1)大於95重量%之抗體，如藉由例如勞瑞法(Lowry method)所測定，且在一些實施方案中，純化至大於99重量%；(1)足以藉由使用旋杯式測序儀獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或(3)藉由在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染進行SDS-PAGE證實具有均一性。經分離抗體包括原位處於重組細胞內之抗體，因為抗體天然環境之至少一種組分將不存在。然而，通常，藉由至少一純化步驟製備經分離多肽或抗體。
抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈之胺基端域。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH」及「VL」。此等域通常為抗體中變化最大之部分(相對於相同類別之其他抗體)，且含有抗原結合位點。來自駱駝科物種之僅重鏈抗體具有單一重鏈可變區，其稱為「VHH」。因此VHH為VH之特定類型。
術語「可變」係指在抗體之間，可變域之某些區段的序列差異很大。V域介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性並非 在可變域之整個範圍內均勻分佈。而是，其集中在輕鏈可變域與重鏈可變域兩者中稱為高變區(HVR)之三個區段中。可變域中更高度保守之部分稱為構架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含主要採用β折疊構型之四個FR區，該四個FR區由三個HVR連接，從而形成連接且在一些情況下形成β折疊結構之一部分的環。各鏈中之HVR由FR區緊密結合在一起，且與另一鏈中之HVR緊密結合在一起，從而有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第十五版，National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自基本上均一抗體之群體獲得的抗體，亦即構成群體之個別抗體除可少量存在之可能天然發生之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)外為一致的。單株抗體針對單一抗原位點具有高度特異性。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。除特異性外，單株抗體之有利之處在於其藉由融合瘤培養物合成或以重組方式合成，不會污染其他免疫球蛋白。修飾語「單株」表明抗體之特徵為自基本上均一之抗體群體獲得，且不應視為要求藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本申請案使用之單株抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括例如融合瘤法(例如Kohler及Milstein.,Nature,256：495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma,14(3)：253-260(1995),Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA法(參見例如美國專利第4,816,567號)、噬菌體呈現技術(參見例如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)； Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))及用於在具有編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的動物中產生人類或人類樣抗體之技術(參見例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號；Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison,Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14：826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「整個抗體」可互換用於指與抗體片段相對之基本上完整形式之抗體。特定而言，全長4鏈抗體包括具有重鏈及輕鏈之抗體，其包括Fc區。僅全長重鏈抗體包括重鏈(諸如VHH)及Fc區。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳完整抗體之抗原結合及/或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利第5,641,870號實例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；單鏈抗體分子；單域抗體(諸如VHH)及由抗體片段形成之多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩種一致抗原結合片段，該等片段稱為「Fab」片段及殘餘「Fc」片段，「Fc」片段之名稱反映容易結晶之能力。Fab片段由完整L鏈以及H鏈之可變區域(VH)及一條重鏈之第一恆定域(CH1)組成。 各Fab片段在抗原結合方面為單價的，亦即，其具有單一抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生單一大F(ab')2片段，該片段大致對應於兩個具有不同抗原結合活性之由二硫鍵連接之Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，其在CH1域之羧基端具有數個額外殘基，該等殘基包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab'-SH為本文中如下Fab'之名稱，其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基。F(ab')2抗體片段最初以Fab'片段對之形式產生，該等Fab'片段對在其間具有鉸鏈半胱胺酸。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
Fc片段包含由二硫鍵保持在一起之兩條H鏈之羧基端部分。抗體之效應功能由Fc區中之序列決定，該區亦由某些類型之細胞上發現的Fc受體(FcR)識別。
「Fv」為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由緊密非共價結合之一重鏈可變區域及一輕鏈可變區域之二聚體組成。由此兩個域之折疊產生六個高變環(3個環各自來自H鏈及L鏈)，此等環提供用於抗原結合之胺基酸殘基，且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或Fv之一半，其僅包含三個特異於抗原之HVR)亦具有識別且結合抗原之能力，但親和力低於完整結合位點。
「單鏈Fv」，亦縮寫為「sFv」或「scFv」，為包含連接成單一多肽鏈之VH及VL抗體域的抗體片段。較佳地，sFv多肽還在VH與VL域之間包含多肽連接子，從而使sFv能夠形成用於抗原結合之所要結構。關於sFv之回顧，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
本文所述抗體之「功能片段」包含完整抗體之一部分，該部分通常包括完整抗體之抗原結合或可變區，或保留或具有改變FcR結合能力之抗體之 Fc區。抗體片段之實例包括線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「雙功能抗體」係指藉由如下方法製備之小抗體片段：在VH與VL域之間用短連接子(約5-10個)殘基構築sFv片段(參見前段)，使得實現V域之鏈間配對而非鏈內配對，從而產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙功能抗體為兩種「交叉」sFv片段之異二聚體，其中兩種抗體之VH及VL域存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更詳細地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)中。
本文之單株抗體尤其包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，而鏈其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體以及此類抗體之片段中的相應序列一致或同源，只要其展現所要生物學活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本文之目標嵌合抗體包括PRIMATTZFD®抗體，其中抗體之抗原結合區來源於藉由例如用目標抗原免疫獼猴產生之抗體。如本文所用，所使用之「人類化抗體」為「嵌合抗體」之亞組。
非人類(例如駱駝科)抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在一些實施方案中，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受體之HVR(下文定義)的殘基經具有所要特異性、親和力及/或能力之來自非人類物種(供者抗體)(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之HVR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架(「FR」)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。可以進行此等修飾以進一步改善抗體性能，諸如結合親和力。 通常，人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變域中之基本上全部，其中高變環中之全部或基本上全部對應於非人類免疫球蛋白序列之高變環，且FR區中之全部或基本上全部為人類免疫球蛋白序列之FR區，但該等FR區可包括一或多個改良抗體性能(諸如結合親和力、異構化、免疫原性等)之個別FR殘基取代。FR中此等胺基酸取代之數量在H鏈中通常不超過6，且在L鏈中不超過3。人類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分(Fc)，通常人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分(Fc)。對於其他細節，參見例如Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。亦參見例如Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。
「人類抗體」為如下抗體，其具有對應於人類所產生抗體之胺基酸序列，及/或使用本文所揭示之用於製備人類抗體之任何技術製備。人類抗體之此定義尤其排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術製備，該等技術包括噬菌體呈現文庫。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581(1991)。以下文獻中所述之方法亦可用於製備人類單株抗體：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1)：86-95(1991)。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5：368-74(2001)。人類抗體可藉由向轉殖基因動物投與抗原來製備，該轉殖基因動物已經修飾以響應於抗原攻擊產生此類抗體，但其內源基因座已失能，例如經免疫之異種小鼠(關於XENOMOUSETM技術，參見例如美國專利第 6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體，亦參見例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)。
當在本文中使用時，術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變域中序列高變及/或形成結構上定義之環的區域。通常，sdAb包含三個HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)及HVR3(或CDR3)。HVR3在三個HVR中呈現最大多樣性，且認為在賦予抗體優良特異性方面起獨特作用。參見例如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
術語「互補決定區」或「CDR」用於指由Kabat系統定義之高變區。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
多種HVR描繪可供使用且涵蓋於本文中。Kabat互補決定區(CDR)基於序列可變性且最常用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。或者，Chothia提及結構環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體使用。「contact」HVR基於對可用複雜晶體結構之分析。來自此等HVR中每一者之殘基示於下表1中。
Figure 108132631-A0202-12-0025-155
Figure 108132631-A0202-12-0026-156
HVR可包含如下「擴展HVR」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)及89-97或89-96(L3)，及VH中之26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。對於此等定義中之每一者，根據以上Kabat等人對可變域殘基進行編號。
sdAb(諸如VHH)之胺基酸殘基根據Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.，出版號91)提供之用於VH域之通用編號進行編號，該編號適用於Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000年6月23日；240(1-2)：185-195之文章中的來自駱駝科之VHH域。根據此編號，VHH之FR1包含1-30位之胺基酸殘基，VHH之CDR1包含31-35位之胺基酸殘基，VHH之FR2包含36-49位之胺基酸，VHH之CDR2包含50-65位之胺基酸殘基，VHH之FR3包含66-94位之胺基酸殘基，VHH之CDR3包含95-102位之胺基酸殘基，且VHH之FR4包含103-113位之胺基酸殘基。在此方面，應注意，如此項技術中對於VH域及VHH域所熟知，各CDR中胺基酸殘基之總數可變化，且可不對應於Kabat編號所表明之胺基酸殘基總數(亦即，根據Kabat編號之一或多個位置可不由實際序列佔據，或實際序列可含有比Kabat編號允許之數量多之胺基酸殘基)。
表述「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指以上Kabat等人中用於抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有較少胺基酸或其他胺基酸，此對應於可變域之FR或HVR的縮短或在該FR或HVR中之插入。舉例而言，重鏈可變域可在H2之殘基52後包括單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)，且在重鏈FR殘基82後包括插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、 82b及82c等)。可藉由將抗體序列中具有同源性之區域與「標準」Kabat編號之序列比對來確定給定抗體中殘基之Kabat編號。
除非本文另外表明，否則免疫球蛋白重鏈中殘基之編號為如以上Kabat等人中之EU索引的編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「構架」或「FR」殘基為除本文所定義之HVR殘基以外的彼等可變域殘基。
「人類一致構架」或「受體人類構架」為代表人類免疫球蛋白VL或VH構架序列選擇中最常見胺基酸殘基之構架。通常，自可變域序列之亞組選擇人類免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列之亞組為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中之亞組。對於VL，實例包括如下亞組，其可為如以上Kabat等人中之亞組κI、κII、κIII或κIV。此外，對於VH，亞組可為如Kabat等人中之亞組I、亞組II或亞組III。或者，人類一致構架可來源於上述亞組，其中藉由將供者構架序列與各種人類構架序列之集合比對基於與供者構架之同源性來選擇特定殘基，諸如人類構架殘基。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類一致構架之受體人類構架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有預先存在之胺基酸序列變化。在一些實施方案中，預先存在之胺基酸變化之數量為10或少於10、9或少於9、8或少於8、7或少於7、6或少於6、5或少於5、4或少於4、3或少於3或2或少於2。
指定位置(例如Fc區)之「胺基酸修飾」係指指定殘基之取代或缺失，或與在指定殘基相鄰位置插入至少一胺基酸殘基。在指定殘基「相鄰位置」插入意指在其一至兩個殘基內插入。插入可在指定殘基之N端或C端。本文之較佳胺基酸修飾為取代。
「親和力成熟」抗體為在一或多個HVR中具有一或多種改變之抗體，與不具有彼等改變之母抗體相比，該等改變使抗體對抗原之親和力改良。在一些實施方案中，親和力成熟抗體對標靶抗原具有奈莫耳或甚至微微莫耳親和力。藉由此項技術中已知之程序產生親和力成熟抗體。舉例而言，Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述藉由VH及VL域改組進行之親和力成熟。以下參考文獻描述HVR及/或構架殘基之隨機突變誘發，例如：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性識別」或「特異於」係指可量測且可再現之相互作用，諸如標靶與抗原結合蛋白(諸如嵌合受體或sdAb)之間的結合，其在包括生物分子之異質分子群存在下確定標靶之存在。舉例而言，特異性結合標靶(其可為抗原決定基)之抗原結合蛋白為相對於其與其他標靶結合，與此標靶以更大親和力、親合力、更容易及/或以更長持續時間結合之抗原結合蛋白。在一些實施方案中，如例如藉由放射免疫測定法(RIA)所量測，抗原結合蛋白與不相關標靶之結合程度小於抗原結合蛋白與標靶之結合的約10%。在一些實施方案中，特異性結合標靶之抗原結合蛋白的解離常數(Kd)為
Figure 108132631-A0202-12-0028-52
1μM，
Figure 108132631-A0202-12-0028-53
100nM，，
Figure 108132631-A0202-12-0028-54
10nM，
Figure 108132631-A0202-12-0028-55
1nM或
Figure 108132631-A0202-12-0028-56
0.1nM。在一些實施方案中，抗原結合蛋白特異性結合蛋白質上之抗原決定基，該抗原決定基在來自不同物種之蛋白質之間為保守的。在一些實施方案中，特異性結合可包括但不需要排他性結合。
術語「特異性」係指抗原結合蛋白(諸如嵌合受體或抗體構築體)對於抗原之特定抗原決定基的選擇性識別。天然抗體例如具有單特異性。如本文所用，術語「多特異性」表示抗原結合蛋白具有兩個或更多個抗原結合位點，其中至少兩個結合不同抗原或抗原決定基。如本文所用，「雙特異性」表示抗原 結合蛋白具有兩種不同抗原結合特異性。如本文所用，術語「單特異性」表示抗原結合蛋白具有一或多個結合位點，該等結合位點各自結合相同抗原或抗原決定基。
如本文所用，術語「價」表示抗原結合蛋白中存在指定數量之結合位點。舉例而言，天然抗體或全長抗體具有兩個結合位點且為二價的。因此，術語「三價」、「四價」、「五價」及「六價」分別表示抗原結合蛋白中存在兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點、五個結合位點及六個結合位點。
「抗體效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)且隨抗體同型而變化之彼等生物學活性。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下調細胞表面受體(例如B細胞受體)；及B細胞活化。「降低或最小化」之抗體效應功能意指自野生型或未修飾抗體降低至少50%(或者60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)之抗體效應功能。一般技術者之一可容易測定且量測抗體效應功能。在一較佳實施方案中，影響補體結合、補體依賴性細胞毒性及抗體依賴性細胞毒性之抗體效應功能。在一些實施方案中，經由消除糖基化之恆定區突變(例如「無效應子突變」)來消除效應功能。在一態樣中，無效應子突變為CH2區域中之N297A或DANA突變(D265A+N297A)。Shields等人，J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604(2001)。或者，引起效應功能降低或消除之其他突變包括：K322A及L234A/L235A(LALA)。或者，可經由製備技術來降低或消除效應功能，諸如在不糖基化之宿主細胞(例如大腸桿菌)或產生不能有效或不太有效地促進效應功能之改變糖基化模式的宿主細胞中表現(例如Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473(2003))。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或ADCC係指細胞毒性之一種形式，其中結合於某些細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使此等細胞毒性效應細胞特異性結合於帶有抗原之標靶細胞，隨後以細胞毒素殺滅標靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞，且為藉由此機制殺滅標靶細胞所必需。介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上之Fc表現。為評估目標分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC測定，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述之測定。用於此類測定之有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如Clynes等人，PNAS USA 95：652-656(1998)中揭露之動物模型)中評估目標分子之ADCC活性。
本文中之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區域，其包括天然序列Fc區及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區之邊界可變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區定義為Cys226位之胺基酸殘基或Pro230至其羧基端之片段。Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可例如在抗體之產生或純化期間，或藉由重組工程改造編碼抗體重鏈之核酸而去除。因此，完整抗體之組成物可包含去除所有K447殘基之抗體群體、未去除K447殘基之抗體群體及具有含及不含K447殘基之抗體的混合物的抗體群體。用於本文所述抗體之合適天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3及IgG4。
「結合親和力」通常指分子(例如抗體或CAR)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外表明，否則如本文所用，「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對之成員(例如抗體與抗原，或CAR與抗原)之間的1：1相互作用。分子X對其搭配物Y之親 和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之通用方法來量測，該等方法包括本文所述之方法。低親和力抗體通常緩慢結合抗原，且往往易於解離，而高親和力的抗體通常更快地結合抗原且往往較長久地保持結合。此項技術中已知量測結合親和力之多種方法，該等方法中之任一者均可用於本申請案之目的。下文描述用於量測結合親和力之特定說明性且例示性實施方案。
「阻斷性」抗體或「拮抗劑」抗體為抑制或降低其所結合之抗原的生物學活性的抗體。在一些實施方案中，阻斷性抗體或拮抗劑抗體基本上或完全抑制抗原之生物學活性。
關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」定義為在比對候選序列及特定肽或胺基酸序列且必要時引入間隙以實現最大序列一致性百分比，且不考慮任何保守取代作為序列一致性之一部分後，候選序列中與特定肽或胺基酸序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以此項技術技能範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，該等參數包括在所比較序列之全長上實現最大比對所要的任何算法。
如本文所用，「嵌合受體」、「嵌合抗原受體」或「CAR」係指經遺傳工程改造受體，其可用於將一或多種抗原特異性移植於免疫細胞，諸如T細胞上。一些嵌合受體亦稱為「人工T細胞受體」、「嵌合T細胞受體」或「嵌合免疫受體」。在一些實施方案中，嵌合受體包含特異於一或多種抗原(諸如腫瘤抗原)或抗原決定基之細胞外域、跨膜域及T細胞及/或共刺激受體之細胞內信號傳導域。「CAR-T」係指表現CAR之T細胞。「抗CLL1 CAR」係指具有特異於CLL1之細胞外結合域的CAR。
編碼本文所述嵌合受體或抗CLL1構築體之「經分離」核酸分子為經鑑別且與至少一種污染物核酸分子分離之核酸分子，該核酸分子在其產生環境中通常與該至少一種污染物核酸分子結合。較佳地，經分離核酸不與產生環境相關之所有組分結合。編碼本文之多肽及抗體的經分離核酸分子的形式不同於其天然存在之形式或環境。因此，經分離核酸分子與天然存在於細胞中之編碼本文之多肽及抗體的核酸不同。
術語「控制序列」係指在特定宿主生物中表現可操作連接之編碼序列所必需的DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況存在之操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
當核酸與另一核酸序列處於功能關係時，該核酸為「可操作連接」的。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該DNA與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經安置而有利於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。通常，「可操作地連接」意指所連接之DNA序列為連續的，且在分泌前導序列之情況下，為連續的且處於閱讀階段。然而，增強子不必為連續的。藉由在方便限制性位點連接來完成連接。若此類位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸銜接子或連接子。
如本文所用，術語「載體」係指如下核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一核酸。該術語包括自複製核酸結構形式之載體，以及併入宿主細胞基因組中之載體，其中已在該宿主細胞中引入該載體。某些載體能夠指導與其可操作連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用，術語「自體」意指來源於同一個體之任何物質，之後將該物質再引入該個體中。
「同種異體」係指來源於相同物種之不同個體的移植物。
如本文所用，術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中之過程。經「轉染」或「轉型」或「轉導」細胞為已用外源核酸轉染、轉型或轉導之細胞。該細胞包括原代標的細胞及其子代。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有此類名稱均包括子代。因此，詞語「轉染子」及「經轉染細胞」包括原代標的細胞及來源於其之培養物，與轉移次數無關。還應理解，由於故意或無意突變，所有子代之DNA含量可不完全一致。包括具有與原始轉型細胞中所篩選相同之功能或生物學活性的變體子代。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用，且指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「經轉型細胞」，其包括原代轉型細胞及來源於其之子代，而與傳代次數無關。子代之核酸含量可與母細胞不完全一致，而是可含有突變。本文包括具有與原始轉型細胞中所篩選或選擇相同之功能或生物學活性的突變體子代。
如本文所用，「治療」為用於獲得有益或所要結果，包括臨床結果之方法。出於本發明之目的，有益或所要之臨床結果包括但不限於以下中之一或多者：減輕由疾病引起之一或多種症狀，減輕疾病之程度，穩定疾病(例如預防或延緩疾病之惡化)，預防或延緩疾病之擴散(例如轉移)，預防或延緩疾病之復發，延緩或減緩疾病之進展，改善疾病狀態，使疾病緩解(部分或全部)，減少治療疾病所要之一或多種其他藥物之劑量，延緩疾病之進展，提高生活品質及/或延長生存期。「治療」亦涵蓋減少癌症之病理結果。本申請案之方法涵蓋治療之此等態樣中之任何一或多者。
如本文所用，「個體」或「受試者」係指哺乳動物，其包括但不限於人類、牛、馬、貓、犬、齧齒動物或靈長類動物。在一些實施方案中，個體為人類。
本文所用之術語「有效量」係指藥劑(諸如抗CLL1構築體、經工程改造免疫細胞或其醫藥組成物)足以治療指定病症、病狀或疾病(諸如改善、緩和、減輕及/或延緩其症狀中之一或多者)之量。關於癌症，有效量包含足以使腫瘤縮小及/或降低腫瘤生長速率(以抑制腫瘤生長)或預防或延緩其他不所要之細胞增殖的量。在一些實施方案中，有效量為足以延緩產生之量。在一些實施方案中，有效量為足以預防或延緩復發之量。有效量可在一或多次投與中投與。有效量之藥物或組成物可：(i)減少癌細胞之數量；(ii)縮小腫瘤大小；(iii)在某種程度上抑制、延遲、減緩且較佳終止癌細胞浸潤至外周器官中；(iv)抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳終止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延緩腫瘤之發生及/或復發；及/或(vii)在某種程度上緩解癌症相關症狀中之一或多者。
「輔助方案」係指個體具有癌症史且通常(但不一定)對療法起反應之臨床方案，其包括但不限於手術(例如手術切除)、放射療法及化學療法。然而，由於其癌症史，認為此等個體具有產生該疾病之風險。「輔助方案」中之治療或投與係指後續治療模式。風險程度(例如當認為輔助方案中之個體為「高風險」或「低風險」時)取決於數種因素，最通常為首次治療時之疾病程度。
「新輔助方案」係指如下臨床方案，其中在原始/確定療法之前進行該方法。
如本文所用，「延緩」癌症之產生意指遲延、阻礙、減緩、延遲、穩定及/或推遲疾病之產生。此延緩可視病史及/或所治療個體而定具有不同時間長度。如熟習此項技術者顯而易見，足夠或顯著延緩在個體不會產生該疾病之情況下實際上可涵蓋預防。「延緩」癌症產生之方法為如下方法，在與不使用 該方法相比時，其在給定時間範圍內降低疾病產生之可能性及/或在給定時間範圍內降低疾病之程度。此類比較通常基於使用統計學上顯著數量之個體進行的臨床研究。癌症產生可使用標準方法偵測，該等方法包括但不限於電腦軸向斷層掃描(CAT掃描)、磁共振成像(MRI)、腹部超聲、凝血測試、動脈造影或生檢。產生亦可指最初可能無法偵測到之癌症進展，且包括發生、復發及發作。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑，其為使活性成分之生物學活性有效之形式，且不含對調配物所投與之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。此類調配物為無菌的。「無菌」調配物為無菌的或不含所有活微生物及其孢子。
應理解，本文所述之本申請案之實施方案包括「由實施方案組成」及/或「基本上由實施方案組成」。
本文提及「約」一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之變化。舉例而言，提及「約X」之描述包括對「X」之描述。
如本文所用，提及「不為」一值或參數通常意指且描述「非」一值或參數。例如，該方法不用於治療X型癌症意指該方法用於治療非X型癌症。
本文所用之術語「約X-Y」具有與「約X至約Y」相同之含義。
除非上下文另外明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。
II. 抗CLL1構築體
在一態樣中，本申請案提供一種抗CLL1構築體，其包含抗CLL1 sdAb部分。本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者或其抗原結合片段(例如VHH)可用於抗CLL1構築體。抗CLL1 sdAb描述於以下部分「A.抗CLL1單域抗體」中。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的 CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：94之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：95之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：96之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：97之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的 CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：98之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：99之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：100之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：101之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的 CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：102之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：103之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：104之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：105之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的 CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：106之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：171之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：174之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：175之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1構築體，其包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO：173之胺基酸序列，或其包含與SEQ ID NO：176之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為跨膜分子。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為分泌型分子。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為包含本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者的單株抗體，其包括駱駝科、嵌合、人類化或人類抗體。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為抗體片段，例如VHH片段。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為僅全長重鏈抗體，其包含任何抗體類別或同型(諸如IgG1或IgG4)之Fc區。在一些實施方案中，Fc區具有降低或最小化之效應功能。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為嵌合受體，其包含有本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者、跨膜域及細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫細胞(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫細胞之主要細胞內信號傳導序列(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)與細胞內共刺激序列兩者。抗CLL1嵌合受體及嵌合受體系統進一步描述於部分「B.嵌合受體」中。包含抗CLL1嵌合受體或嵌合受體系統之經工程改造免疫細胞描述於部分IV中。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為單特異性分子。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為多特異性分子。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為雙特異性分子。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為多特異性抗原結合蛋白，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分。在一些實施方案中，第二結合部分為sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分特異性結合CLL1上之不同抗原決定基。在一些實施方案中，第二結合部分特異性結合第二抗原，諸如腫瘤抗原，或免疫細胞表面上之抗原。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb與第二結合部分經由肽連接子連接。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為免疫效應細胞銜接子，其包含本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者及特異性結合免疫細胞(諸如T細胞)表面上之抗原的第二結合部分。在一些實施方案中，第二結合部分特異性結合選自由以下組成之群之抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、4-1BB、CD27、CD40L及HVEM。免疫效應細胞銜接子進一步描述於以下部分「C.免疫效應細胞銜接子」中。
在一些實施方案中，抗CLL1構築體為免疫結合物，其包含本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者及效應分子。在一些實施方案中，效應分子為選自由以下組成之群之治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。在一些實施方案中，效應分子為藥物或毒素。在一些實施方案中，效應分子為標記。免疫結合物如部分「D.免疫結合物」中進一步描述。
A. 抗CLL1單域抗體
本申請案之一態樣提供特異性結合CLL1之經分離單域抗體(本文中稱為「抗CLL1 sdAb」)。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb調節CLL1活性。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb為拮抗劑抗體。還提供來源於本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者的抗原結合片段(例如VHH)及包含本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者的構築體。例示性抗CLL1 sdAb列於下表2中。本文所述之抗CLL1構築體包含一或多種抗CLL1 sdAb部分。
Figure 108132631-A0202-12-0041-157
Figure 108132631-A0202-12-0042-158
Figure 108132631-A0202-12-0043-159
SEQ ID NO：94(AS82472 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0043-160
SEQ ID NO：95(AS82480 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0043-161
SEQ ID NO：96(AS82494 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0043-162
SEQ ID NO：97(AS82505 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0043-163
SEQ ID NO：98(AS82544 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0044-164
SEQ ID NO：99(AS82658 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0044-165
SEQ ID NO：100(AS82718 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0044-166
SEQ ID NO：101(AS83180 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0044-167
SEQ ID NO：102(AS83183 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0044-168
SEQ ID NO：103(AS83309 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0044-169
SEQ ID NO：104(AS83431 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0045-170
SEQ ID NO：105(AS83478 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0045-171
SEQ ID NO：106(AS83591 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0045-172
SEQ ID NO：171(AS83010 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0045-173
SEQ ID NO：172(AS83457 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0045-174
SEQ ID NO：173(AS83591 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0045-175
SEQ ID NO：107(AS82472 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0046-176
SEQ ID NO：108(AS82480 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0046-177
SEQ ID NO：109(AS82494 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0046-178
Figure 108132631-A0202-12-0047-179
SEQ ID NO：110(AS82505 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0047-180
SEQ ID NO：111(AS82544 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0047-181
SEQ ID NO：112(AS82658 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0047-182
Figure 108132631-A0202-12-0048-183
SEQ ID NO：113(AS82718 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0048-184
SEQ ID NO：114(AS83180 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0048-185
SEQ ID NO：115(AS83183 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0049-186
SEQ ID NO：116(AS83309 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0049-187
SEQ ID NO：117(AS83431 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0049-188
Figure 108132631-A0202-12-0050-189
SEQ ID NO：118(AS83478 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0050-190
SEQ ID NO：119(AS83791 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0050-191
SEQ ID NO：174(AS83010 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0050-192
Figure 108132631-A0202-12-0051-193
SEQ ID NO：175(AS83457 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0051-194
SEQ ID NO：176(AS83591 sdAb核酸序列)
Figure 108132631-A0202-12-0051-195
C型凝集素樣分子-1(CLL1)，亦稱為CLEC12A、C型凝集素域家族12之成員A、DCAL-2、MICL和CD371為一種II型跨膜糖蛋白，其用作抑制性受體。CLL1之表現限於骨髓譜系細胞以及大多數AML胚細胞中。詳言之，CLL1選擇性存在於急性骨髓性白血病(AML)中之白血病幹細胞中，但不存在於正常造 血幹細胞中。CLL1可為針對AML之免疫治療劑的合適腫瘤抗原標靶。參見例如Wang J.等人，(2018)J.Hematol.Oncol.,11：7；Zhao X.等人，(2010),Haematologica,95(1)：71-78；及Lu H.等人，(2014)Angew Chem.Int.Ed.Engl.53(37)：9841-9845。
在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb特異性結合人類CLL1。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb特異性結合食蟹猴CLL1。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb特異性結合CLL1之細胞外域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb特異性結合SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb特異性識別人類CLL1內之抗原決定基。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb與來自非人類物種之CLL1交叉反應。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb完全特異於人類CLL1，且不展現物種或其他類型非人類交叉反應性。
在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb與CLL1蛋白(或其片段)之至少一種等位基因變體交叉反應。在一些實施方案中，在與天然存在之CLL1(或其片段)比較時，等位基因變體具有至多約30個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個)胺基酸取代(諸如保守取代)。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb不與CLL1蛋白(或其片段)之任何等位基因變體交叉反應。
在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列中之一 個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：171之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，提供包含SEQ ID NO：173之胺基酸序列中之一個、兩個或全部三個CDR的抗CLL1 sdAb。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之CDR：(a)包含SEQ ID NO：4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158及165中之任一者之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160及167中之任一者之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162及169中之任一者之胺基酸序列的CDR3。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)與SEQ ID NO：4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158及165 中之任一者之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的CDR1；(b)與SEQ ID NO：6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160及167中之任一者之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的CDR2；及(c)與SEQ ID NO：8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162及169中之任一者之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的CDR3。在一些實施方案中，具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性中之任一者的CDR相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗CLL1 sdAb保留結合CLL1之能力。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)相對於SEQ ID NO：4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158及165中之任一者之胺基酸序列具有約1、2或3個胺基酸取代(例如保守取代)、插入或缺失中之任一者的CDR1；(b)相對於SEQ ID NO：6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160及167中之任一者之胺基酸序列具有約1、2或3個胺基酸取代(例如保守取代)、插入或缺失中之任一者的CDR2；及(c)相對於SEQ ID NO：8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162及169中之任一者之胺基酸序列具有約1、2或3個胺基酸取代(例如保守取代)、插入或缺失中之任一者的CDR3。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2 中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：4、6及8之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：11、13及15之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：18、20及22之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO： 29之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：25、27及29之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：32、34及36之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方 案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：39、41及43之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：46、48及50之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：55之胺基酸 序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：53、55及57之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：60、62及64之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3 個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：67、69及71之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：74、76及78之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2或其在 CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：81、83及85之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：88、90及92之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：151、153及155之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：158、160及162之胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；(b)包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體；及(c)包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含至多約3個(例如1、2或3個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2；及(c)包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：165、167及169之胺基酸序列。
在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb，包括上述實施方案中之任一者(亦即包含特定CDR1、CDR2及/或CDR3之抗CLL1 sdAb)，包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的VHH域。在一些實施方案中，具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性中之任一者之VHH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗CLL1 sdAb保留結合CLL1之能力。在一些實施方案中，在SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列中，總共1 至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在一些實施方案中，取代、插入或缺失發生在CDR外之區域中(亦即，在FR中)。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列，視情況包括該序列之轉譯後修飾。
在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：94。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：95。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：96。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：97。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：98。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：99。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：100。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：101。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：102。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO： 103。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：104。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：105。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種經分離抗CLL1 sdAb，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：106。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：171之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：172之胺基酸序列。在一些實施方案中，提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：173之胺基酸序列。
在一些實施方案中，可藉由組合丙胺酸掃描來定位功能性抗原決定基。在此過程中，可使用組合丙胺酸掃描策略來鑑別CLL1蛋白中與抗CLL1 sdAb相互作用所必需之胺基酸。在一些實施方案中，抗原決定基為構形抗原決定基，且可使用結合CLL1之抗CLL1 sdAb之晶體結構來鑑別抗原決定基。
在一些實施方案中，本申請案提供與本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者競爭結合CLL1的抗體(例如sdAb)。在一些實施方案中，本申請案提供與本文所提供抗CLL1 sdAb中之任一者競爭結合CLL1上之抗原決定基的抗體(例如sdAb)。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1抗體(例如sdAb)，其與包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列的抗CLL1 sdAb結合相同抗原決定基。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1抗體(例如sdAb)，其與包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列的抗CLL1 sdAb競爭特異性結合CLL1。
在一些實施方案中，可使用競爭測定鑑別與本文所述抗CLL1 sdAb競爭結合CLL1之單株抗體。可使用競爭測定藉由識別一致或空間重疊之抗原決定基來判定兩種抗體是否結合相同抗原決定基，或判定一種抗體是否競爭性抑制另一抗體與抗原之結合。在某些實施方案中，此種競爭性抗體結合本文所述抗體所結合之相同抗原決定基。例示性競爭測定包括但不限於常規測定，諸如Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)中所提供之測定。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,N.J.)中提供用於定位抗體所結合之抗原決定基的詳細例示性方法。在一些實施方案中，若各抗體將另一抗體之結合阻斷50%或更多，則認為該兩種抗體結合相同抗原決定基。在一些實施方案中，與本文所述抗CLL1 sdAb競爭之抗體為駱駝科、嵌合、人類化或人類抗體。在一些實施方案中，本申請案提供與本文所述駱駝科、嵌合、人類化或人類抗CLL1 sdAb競爭之抗體。
B. 嵌合受體及嵌合受體系統
本申請案之一態樣提供一種嵌合受體，其包含有包含一或多種抗CLL1 sdAb(例如VHH)之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域。亦提供一種嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(例如VHH)之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之結合部分的細胞外域。部分A中所述抗CLL1 sdAb中之任一者可用於本文所述之嵌合受體或嵌合受體系統。嵌合受體及嵌合受體系統之例示性結構展示於圖8A-8E中。
在一些實施方案中，提供一種靶向CLL1之嵌合受體(本文中亦稱為「抗CLL1嵌合受體」或「抗CLL1 CAR」)，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號 傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分為駱駝科、嵌合、人類或人類化部分。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(諸如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ(亦即「CD3ζ細胞內 信號傳導序列」)。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含主要細胞內信號傳導序列(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)與細胞內共刺激序列兩者。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含主要細胞內信號傳導序列，但不包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列，但不包含主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(例如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種抗CLL1嵌合受體，其包含與SEQ ID NO：120-132、177-179、181及229-230中之任一者之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的多肽。在一些實施方案中，提供一種抗CLL1嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：120-132、177-179、181及229-230中之任一者之胺基酸序列的多肽。亦提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：120-132、177-179、181及229-230中之任一者之胺基酸序列。
例示性抗CLL1嵌合受體展示於下表3中。
Figure 108132631-A0202-12-0070-196
在一些實施方案中，提供一種靶向CLL1之嵌合受體，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb之細胞外域，該抗CLL1 sdAb包含有包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：99之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些 實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(例如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含如下多肽，其包含SEQ ID NO：125或181之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：125或181之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種靶向CLL1之嵌合受體，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb之細胞外域，該抗CLL1 sdAb包含有包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(例如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中， 抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含如下多肽，其包含SEQ ID NO：120或229之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：120或229之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
在一些實施方案中，提供一種靶向CLL1之嵌合受體，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb之細胞外域，該抗CLL1 sdAb包含有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：96之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(例如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及 CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含如下多肽，其包含SEQ ID NO：122或230之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：122或230之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。
多價嵌合受體
本申請案亦提供多價抗CLL1嵌合受體，其具有兩個或更多個(諸如約2、3、4、5、6個或更多個中之任一者)特異性結合CLL1之結合部分。在一些實施方案中，結合部分中之一或多者為抗原結合片段。在一些實施方案中，結合部分中之一或多者包含sdAb。在一些實施方案中，結合部分中之一或多者衍生自駱駝科抗體。在一些實施方案中，結合部分中之一或多者來源於四鏈抗體。在一些實施方案中，結合部分中之一或多者為scFv。在一些實施方案中，結合部分中之一或多者來源於人類抗體。在一些實施方案中，結合部分中之一或多者為特異性結合CLL1之受體、多肽配體或其他非抗體多肽之細胞外域。在一些實施方案中，多價嵌合受體為單特異性的，亦即該多價嵌合受體僅靶向CLL1，且包含兩個或更多個針對CLL1之結合位點。在一些實施方案中，多價嵌合受體為多特異性的，亦即該多價嵌合受體靶向超過一種抗原或抗原決定基。特異於相同抗原之結合部分可結合抗原之相同抗原決定基(亦即「單抗原決定基嵌合受體」)或結合抗原之不同抗原決定基(亦即「多抗原決定基嵌合受體」，諸如雙抗原決定基嵌合受體或三抗原決定基嵌合受體)。特異於相同抗原之結合位點可包含相同或不同sdAb。
在一些實施方案中，本申請案提供一種多價(諸如二價、三價或更高原子價數)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含複數個(諸如至少約2、3、4、5、6個或更多個中之任一者)特異性結合CLL1之結合部分；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，本申請案提供一種多價(諸如二價、三價或更高原子價數)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含複數個(諸如至少約2、3、4、5、6個或更多個中之任一者)抗CLL1 sdAb部分；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，本申請案提供一種多價(諸如二價、三價或更高原子價數)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含特異性結合CLL1之第一抗原決定基的sdAb部分，及特異性結合CLL1之第二抗原決定基的第二結合部分(例如sdAb或scFv)；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域，其中第一抗原決定基與第二抗原決定基不同。在一些實施方案中，第一抗CLL1 sdAb位於第二CLL1結合部分(例如第二抗CLL1 sdAb)之N端。在一些實施方案中，第一抗CLL1 sdAb位於第二CLL1結合部分(例如第二抗CLL1 sdAb)之C端。在一些實施方案中，多價嵌合受體特異性結合CLL1上之兩種不同抗原決定基。在一些實施方案中，多價嵌合受體特異性結合CLL1上之三個或更多個不同抗原決定基。
在一些實施方案中，結合部分，諸如sdAb(包括複數個sdAb或第一sdAb及/或第二sdAb)為駱駝科、嵌合、人類或人類化部分。在一些實施方案中，結合部分或sdAb經由肽鍵或肽連接子彼此融合。在一些實施方案中，各肽連接子之長度不超過約50個(諸如不超過約35、25、20、15、10或5個中之任一者)胺基酸。在一些實施方案中，跨膜域選自由以下組成之群：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152及PD1。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(諸如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之 共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，多價嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(諸如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，多價嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，多價嵌合受體為單特異性嵌合受體。在一些實施方案中，多價嵌合受體為多特異性嵌合受體，諸如雙特異性嵌合受體。
本文所述之多價嵌合受體可尤其適用於經由不同抗原結合位點協同結合來靶向多聚體抗原，或適用於提高與抗原之結合親和力或親合力。本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者可用於本文所述多價嵌合受體之細胞外域。
多特異性嵌合受體
本申請案還提供多特異性嵌合受體，其靶向兩種或更多種(諸如約2、3、4、5、6種或更多種中之任一者)不同抗原。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體對各抗原具有一抗原結合位點。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體對至少一種抗原具有超過兩個結合位點。各抗原結合位點可包含一種sdAb。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體為雙特異性嵌合受體。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體為三特異性嵌合受體。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(諸如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一 者)及特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合域；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(諸如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及特異性結合第二抗原之第二sdAb；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。
(a)細胞外域，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及特異性結合第二抗原之scFv；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(諸如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及特異性結合第二抗原之受體的細胞外域；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，第二抗原選自由以下組成之群：NKG2D配體、CD33、WT1、CS1、CD123、葉酸受體β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27及CD70。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb及/或第二結合部分(包括第二sdAb或scFv)為駱駝科、嵌合、人類或人類化之抗CLL1 sdAb及/或第二結合部分。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb及第二結合部分(包括第二sdAb、scFv或受體之細胞外域)經由肽鍵或肽連接子彼此融合。在一些實施方案中，肽連接子之長度不超過約50個(諸如不超過約35、25、20、15、10或5個中之任一者)胺基酸。在一些實施方案中，跨膜域選自由以下組成之群：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152及PD1。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(諸如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞 內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(諸如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及抗CD33 sdAb或scFv；(b)跨膜域，及(c)包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內域。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb及抗CD33 sdAb之細胞外域；(b)跨膜域(例如CD28跨膜域)，及(c)細胞內域(例如包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；且其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在 一些實施方案中，抗CLL1 sdAb在抗CD33 sdAb之N端。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb在抗CD33 sdAb之C端。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb與抗CD33 sdAb經由肽連接子融合。在一些實施方案中，肽連接子包含SEQ ID NO：142-147及182-183中之任一者之胺基酸序列。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：99之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：225之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：225之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb及抗CD33 sdAb之細胞外域，其中抗CLL1 sdAb之C端經由肽連接子與抗CD33 sdAb之N端融合；(b)跨膜域(例如CD28跨膜域)，及(c)細胞內域(例如包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3；且其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，肽連接子包含SEQ ID NO：147之胺基酸序列。在一些實施方案中，肽連接子包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列。在一些實施方案中，肽連接子包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：99 之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：99之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：225之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：225之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含與SEQ ID NO：184之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的胺基酸序列。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含與SEQ ID NO：185之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的胺基酸序列。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含與SEQ ID NO：188之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，其包含與SEQ ID NO：184-195中之任一者之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的多肽。在一些實施方案中，提供一種多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：184-195中之任一者之胺基酸序列的多肽。亦提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：184-195中之任一者之胺基酸序列。
例示性抗CLL1串聯嵌合受體展示於下表4中。
Figure 108132631-A0202-12-0080-197
任何合適抗CD33 sdAb或scFv均可用於本文所述之靶向CLL1及CD33之多特異性嵌合受體。已描述例示性抗CD33 sdAb，例如參見PCT/CN2018/104882。例示性抗CD33 sdAb之序列展示於下表5中。
Figure 108132631-A0202-12-0080-198
SEQ ID NO：225(AS49264 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0081-199
SEQ ID NO：226(AS49814 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0081-200
SEQ ID NO：227(AS50073 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0081-201
SEQ ID NO：228(AS67190 sdAb胺基酸序列；CDR加有下劃線)
Figure 108132631-A0202-12-0081-202
在一些實施方案中，提供一種多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及抗CD123 sdAb或scFv；(b)跨膜域及(c)包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內域。
在一些實施方案中，提供一種多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，其包含：(a)細胞外域，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及NKG2D之細胞外域；(b)跨膜域及(c)包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內域。
嵌合受體系統
本申請案還提供包含兩種或更多種嵌合受體之嵌合受體系統，其包括雙重嵌合受體系統及分割嵌合受體。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列及細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列及細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二抗原選自由以下組成之群：NKG2D配體、CD33、WT1、CS1、CD123、葉酸受體β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27及CD70。在一些實施方案中，跨膜域選自由以下組成之群：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152及PD1。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(諸如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中， 第一嵌合受體及第二嵌合受體各自包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAB(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域，其中視情況細胞內信號傳導域不包含細胞內共刺激序列；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域，其中視情況細胞內信號傳導域不包含主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，第二抗原選自由以下組成之群：NKG2D配體、CD33、WT1、CS1、CD123、葉酸受體β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27及CD70。在一些實施方案中，跨膜域選自由以下組成之群：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152及PD1。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(諸如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或 第二嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、第二結合域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含有包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域的細胞內域，其中視情況細胞內信號傳導域不包含主要細胞內信號傳導序列；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域，其中視情況細胞內信號傳導域不包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第二抗原選自由以下組成之群：NKG2D配體、CD33、WT1、CS1、CD123、葉酸受體β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27及CD70。在一些實施方案中，跨膜域選自由以下組成之群：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152及PD1。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83 之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(諸如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、抗CLL1 sdAb、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、第二結合域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb或scFv之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域(例如包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)。在一些實施方案中，跨膜域選自由以下組成之群：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152及PD1。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(諸如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，第一嵌合受體及/或第二嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。
任何合適抗CD33 sdAb或scFv均可用於本文所述之靶向CLL1及CD33之雙重嵌合受體系統。已描述例示性抗CD33 sdAb，例如參見PCT/CN2018/104882。例示性抗CD33 sdAb之序列展示於下表5中。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD28跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)，其中抗CLL1 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(2)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD8跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)，其中抗CD33 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(3)包含SEQ ID NO：219之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：221之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：223之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94之胺基酸序列具有至少約95%序列 一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：96之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：226之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：226之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：227之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：228之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：228之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD28跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD8跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導 域)，其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：226之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：226之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD28跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD8跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)，其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：227之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD28跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb之細胞外域、跨膜域(例如CD8跨膜域)及細胞內信號傳導域(例如包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域)，其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO：219之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：221之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：96之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：228之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：228之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域及包含來源於CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二嵌合受體包含自N端至C端包含以下之多肽：CD8信號肽、細胞外域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及包含來源於4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含與SEQ ID NO：229或230之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的多肽；及(b)第二嵌合受體，其包含與SEQ ID NO：231、232或233之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的多肽。在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：229或230之胺基酸序列的多肽；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：231、232或233之胺基酸序列的多肽。在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：229之胺基酸序列的多肽；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列的多肽。在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：229之胺基酸序列的多肽；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：232之胺基酸序列的多肽。在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：230之胺基酸序列 的多肽；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含SEQ ID NO：233之胺基酸序列的多肽。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體構築體，其包含有包含本文所述抗CLL1嵌合受體中之任一者的第一多肽及包含本文所述抗CD33嵌合受體中之任一者的第二多肽，其中第一多肽及第二多肽彼此經由自切割肽(例如P2A肽)融合。在一些實施方案中，雙重嵌合受體構築體包含與SEQ ID NO：234之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的胺基酸序列。在一些實施方案中，雙重嵌合受體構築體包含與SEQ ID NO：235之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的胺基酸序列。在一些實施方案中，雙重嵌合受體構築體包含與SEQ ID NO：236之胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的胺基酸序列。在一些實施方案中，雙重嵌合受體構築體包含SEQ ID NO：234、235或236之胺基酸序列。還提供編碼本文所述雙重嵌合受體構築體中之任一者的核酸。亦提供一種多肽，其包含SEQ ID NO：234-236中之任一者之胺基酸序列。
例示性抗CLL1雙重嵌合受體系統展示於下表6中。
Figure 108132631-A0202-12-0091-203
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者) 之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD123 sdAb或scFv之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種雙重嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含NKG2D之細胞外域的細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb或scFv之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD123 sdAb或scFv之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域；及 (b)第二嵌合受體，其包含有包含NKG2D之細胞外域的細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb或scFv之細胞外域、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD123 sdAb或scFv之細胞外域、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。
在一些實施方案中，提供一種分割嵌合受體系統，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含來源於4-1BB或CD28之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含NKG2D之細胞外域的細胞外域、跨膜域及包含CD3ζ細胞內信號傳導序列之細胞內信號傳導域。
細胞外域
本文所述嵌合受體之細胞外域包含一或多個(諸如1、2、3、4、5、6個或更多個中之任一者)結合部分，諸如sdAb。在一些實施方案中，一或多個結合部分為抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，一或多個結合部分來源於四鏈抗體。在一些實施方案中，一或多個結合部分來源於駱駝科抗體。在一些實施方案中，一或多個結合部分來源於人類抗體。在一些實施方案中，一或 多個結合部分為非抗體結合蛋白，諸如結合抗原之受體細胞外域、多肽配體或經工程改造蛋白。結合部分可直接經由肽鍵或經由肽連接子彼此融合。
在一些實施方案中，細胞外域包含第二結合部分。第二結合部分特異性結合細胞表面分子。第二結合部分可經選擇以識別用作與特殊疾病狀態相關之標靶細胞上細胞表面標誌物的抗原。第二結合部分靶向之抗原可直接或間接參與疾病。在一些實施方案中，抗原為腫瘤抗原。在一些實施方案中，腫瘤抗原與急性骨髓性白血病(AML)相關。在一些實施方案中，腫瘤抗原與慢性骨髓性白血病(CML)相關。在一些實施方案中，腫瘤抗原與骨髓化生不良症候群(MDS)相關。
腫瘤抗原為由腫瘤細胞產生之可引發免疫反應，尤其T細胞介導之免疫反應的蛋白質。本發明之靶向抗原之選擇將取決於待治療癌症之特定類型。例示性腫瘤抗原包括例如神經膠質瘤相關之抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人類絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、生存素及端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、蝶素B2、CD22、胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受體及間皮素。
在一些實施方案中，腫瘤抗原為腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關抗原(TAA)。TSA為腫瘤細胞所獨有，且不存在於體內其他細胞上。TAA相關抗原並非腫瘤細胞所獨有，而是在不能誘導對該抗原之免疫耐受狀態之條件下亦在正常細胞上表現。該抗原在腫瘤上之表現可在使免疫系統對抗原作出反應之條件下發生。TAA可為在胎兒發育期間在免疫系統不成熟且不能反應時在正常細 胞上表現之抗原，或其可為通常在正常細胞上以極低水準存在，但在腫瘤細胞上以高得多之水準表現的抗原。
TSA或TAA抗原之非限制性實例包括以下：分化抗原，諸如MART-1/MelanA(MART-1)、gp 100(Pmel 17)、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2，及腫瘤特異性多譜系抗原，諸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；過度表現之胚胎抗原，諸如CEA；過度表現之致癌基因及突變之腫瘤抑制基因，諸如p53、Ras、HER2/neu；因染色體易位產生之獨特腫瘤抗原，諸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；及病毒抗原，諸如愛巴病毒(Epstein Barr virus)抗原EBVA及人類乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6及E7。其他基於蛋白質之大型抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環素、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白\親環蛋白C相關蛋白、TAAL6、TAG72、TLP及TPS。
第二結合部分可具有任何合適形式。在一些實施方案中，第二結合部分來源於抗體，諸如四鏈抗體，或單域抗體，諸如僅重鏈抗體。在一些實施方案中，第二結合部分為抗體片段諸如Fab、Fv、scFv或VHH。在一些實施方案中，第二結合部分為特異性結合選自由以下組成之群之抗原的抗體片段：NKG2D配體、CD33、WT1、CS1、CD123、葉酸受體β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27及CD70。
在一些實施方案中，第二結合部分為CD33結合域。在一些實施方案中，CD33結合域為抗CD33抗體之抗體片段(例如scFv或VHH)。在一些實施方案中，CD33結合域為來源於hp67.6之scfv。在一些實施方案中，CD33結合域為抗CD33 sdAb。
CD33，亦稱為Siglec-3(結合唾液酸之Ig樣凝集素3)、gp67或p67，為在骨髓譜系細胞上表現之跨膜受體。CD33為吉妥珠單抗(gemtuzumab)刺孢黴素(ozogamicin)(MYLOTARG®)之標靶，MYLOTARG®為一種抗體-藥物結合物，其已經批准用於治療患有急性骨髓性白血病之患者。
在一些實施方案中，第二結合部分為CD123結合域。在一些實施方案中，CD123結合域為抗CD123抗體之抗體片段(例如scFv或VHH)。在一些實施方案中，CD123結合域為CD123之配體或IL-3域。在一些實施方案中，IL-3域來源於人類IL-3，諸如人類IL-3之全長或功能片段。
IL-3(介白素-3)基因定位於染色體5上，該基因編碼長度為152個胺基酸之蛋白質。IL-3為能夠支持大量細胞活性(諸如細胞生長、分化及凋亡)之細胞因子。IL-13藉由結合介白素-3受體(IL-3R)(亦稱為CD123抗原)而起作用。IL-3R為一種異二聚體受體，其包含配體特異性α亞基及IL-3、群落刺激因子2(CSF2/GM-CSF)及介白素5(IL5)之受體所共有之信號轉導β亞基。IL-3R之活化引起βc鏈之磷酸化，含SH2銜接分子(諸如Vav1)之募集及經由Jak2/STAT5及Ras/MAPK路徑進行之下游信號轉導。
IL-3R為一種75kD糖蛋白，且在經N-糖苷酶水解時變為43kD。IL-3R具有三個負責特異性結合IL-3之細胞外域、跨膜域及對於細胞內信號傳導必不可少之短細胞間域(Sato等人，1993)。IL-3R為對IL-3具有低親和力及高特異性之異二聚體受體。結合IL-3後，IL-3R經活化且促進細胞增殖及存活(Liu等人，2015)。
CD123過度表現於AML胚細胞(亦即骨髓胚細胞)上。AML患者之75至89%中的AML胚細胞及白血病幹細胞(LSC)表現CD123。鮮明對比地，正常造血幹細胞(HSC)上存在CD123之低或不可偵測之表現(Frankel等人，2014；Jordan等人，2000)。除AML外，CD123亦過度表現於多種血液惡性腫瘤中，包括B細胞譜系急性淋巴胚細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、漿細胞樣樹突狀細胞瘤及毛細胞白血病(Munoz等人，2001)。此表現譜使CD123成為該等疾病之臨床診斷、預後及干預中之有價值生物標誌物。目前，早期臨床試驗已展現CD123靶向療法安全且對造血作用無嚴重副作用。CD123靶向療法在人類中之抗白血病活性仍在研究中。
在一些實施方案中，第二結合部分為配體，或受體之配體結合域，諸如受體之細胞外域。在一些實施方案中，第二結合部分為來源於選自由以下組成之群之分子的配體或配體結合域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1及NKp80。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之細胞外域。在一些實施方案中，第二結合部分包含SEQ ID NO：149之胺基酸序列。
SEQ ID NO：149 NKG2D-L結合域
Figure 108132631-A0202-12-0097-204
NKG2D為NKG2家族之獨特成員，該家族為刺激或抑制NK細胞之細胞毒性活性的C型凝集素受體。NKG2D為一種II型跨膜錨定糖蛋白，其主要在NK細胞及CD8+ T細胞(例如αβ T細胞及γδ T細胞)之表面上表現。其在多個物種中高度保守，其中在人類與鼠類受體之間具有70%序列一致性。不同於與CD94異二聚且結合I類非經典MHC糖蛋白之其他NKG2受體，NKG2D形成同 二聚體且結合細胞應激誘導分子。越來越多證據表明，NKG2D在針對應激或異常細胞(諸如自體腫瘤細胞及感染病毒之細胞)之免疫監視中起至關重要之作用。
已在人類中鑑別出多種NKG2D配體，其包括由MHC家族中之基因編碼的MIC分子(MHC I類鏈相關蛋白A及B，或MICA及MICB)，及聚集在人類染色體6上之ULBP分子(UL16結合蛋白，亦稱為RAET1蛋白)(Bahram等人，2005)。所有NKG2D配體均與MHC I類分子同源，且展現相當大之等位基因變化。儘管NKG2D配體RNA在身體所有組織及器官中廣泛表現，但正常成人細胞之表面通常不存在NKG2D配體(Le Bert及Gasser,2014)。然而，NKG2D配體之表現主要在上皮來源之組織中響應於細胞應激(包括熱休克、DNA損傷及停滯之DNA複製)誘導或上調。細胞上NKG2D配體之存在標誌著該細胞進行NK細胞靶向及潛在消除(Le Bert及Gasser,2014)。有趣地，多種血液及實體腫瘤中轉型細胞之DNA修復路徑的高活性引起NKG2D配體之表現，從而使此等細胞易於進行NK介導之裂解(Sentman等人，2006)。
NKG2D由KLRK1基因編碼。NKG2D為一種跨膜受體蛋白，其包含三個域：細胞質域(人類NKG2D之殘基1-51)、跨膜域(人類NKG2D之殘基52-72)及細胞外域(人類NKG2D之殘基73-216)。NKG2D之細胞外域含有C型凝集素域(人類NKG2D之殘基98-213)。
跨膜域
本申請案之嵌合受體包含可直接或間接與細胞外域融合之跨膜域。跨膜域可來源於天然來源或來源於合成來源。如本文所用，「跨膜域」係指在細胞膜，較佳真核細胞膜中熱力學穩定之任何蛋白質結構。適用於本文所述嵌合受體之跨膜域可獲自天然存在之蛋白質。或者，其可為非天然存在之合成蛋白質區段，例如在細胞膜中熱力學穩定之疏水性蛋白質區段。
基於跨膜域之三維結構對跨膜域進行分類。舉例而言，跨膜域可形成α螺旋、超過一個α螺旋之複合物、β桶或能夠跨越細胞之磷脂雙層的任何其他穩定結構。此外，亦可或替代地基於跨膜域拓撲結構對跨膜域進行分類，該拓撲結構包括跨膜域跨膜之穿過次數及蛋白質之定向。舉例而言，單次穿膜蛋白跨越細胞膜一次，而多次穿膜蛋白跨越細胞膜至少兩次(例如2、3、4、5、6、7次或更多次)。膜蛋白可視其末端及穿膜區段相對於細胞內部及外部之拓撲結構定義為I型、II型或III型。I型膜蛋白具有單一跨膜區，且經定向以使得蛋白質之N端存在於細胞脂質雙層之細胞外側，且蛋白質之C端存在於細胞質側。II型膜蛋白亦具有單一跨膜區，但經定向以使得蛋白質之C端存在於細胞脂質雙層之細胞外側，且蛋白質之N端存在於細胞質側。III型膜蛋白具有多個跨膜區段，且可基於跨膜區段之數量及N端及C端之位置進一步細分。
在一些實施方案中，本文所述之CAR的跨膜域來源於I型單次穿膜蛋白。在一些實施方案中，來自多次穿膜蛋白之跨膜域亦可適用於本文所述之CAR。多次穿膜蛋白可包含複合(至少2、3、4、5、6、7個或更多個)α螺旋或β折疊結構。較佳地，多次穿膜蛋白之N端及C端存在於脂質雙層之相對側，例如蛋白質之N端存在於脂質雙層之細胞質側，且蛋白質之C端存在於細胞外側。
在一些實施方案中，嵌合受體之跨膜域包含選自以下之α、β或ξ鏈之跨膜域的跨膜域：T細胞受體、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CLL1、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(4-1BB)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL-2R β、IL-2R γ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、 CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D及/或NKG2C。在一些實施方案中，跨膜域來源於選自由以下組成之群之分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152及PD1。
在一些實施方案中，跨膜域來源於CD8。在一些實施方案中，跨膜域為CD8α之跨膜域，其包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：133)之胺基酸序列。在一些實施方案中，跨膜域來源於CD8。在一些實施方案中，跨膜域為CD28之跨膜域，其包含FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：134)之胺基酸序列。
用於本文所述嵌合受體之跨膜域亦可包含非天然存在之合成蛋白質區段的至少一部分。在一些實施方案中，跨膜域為非天然存在之合成α螺旋或β折疊。在一些實施方案中，蛋白質區段為至少約20個胺基酸，例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸。合成跨膜域之實例為此項技術中，例如在美國專利第7,052,906 B1號及PCT公開案第WO 2000/032776 A2號中所已知，其相關揭露內容以引用之方式併入本文中。
跨膜域可包含跨膜區及位於跨膜域C端側之細胞質區。跨膜域之細胞質區可包含三個或更多個胺基酸，且在一些實施方案中，有助於使脂質雙層中之跨膜域定向。在一些實施方案中，一或多個半胱胺酸殘基存在於跨膜域之跨膜區中。在一些實施方案中，一或多個半胱胺酸殘基存在於跨膜域之細胞質區中。在一些實施方案中，跨膜域之細胞質區包含帶正電之胺基酸。在一些實施方案中，跨膜域之細胞質區包含胺基酸精胺酸、絲胺酸及離胺酸。
在一些實施方案中，跨膜域之跨膜區包含疏水性胺基酸殘基。在一些實施方案中，嵌合受體之跨膜域包含人工疏水性序列。舉例而言，在跨膜域之C端可存在苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。在一些實施方案中，跨膜區主要包含疏水性胺基酸殘基，諸如丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸或纈胺酸。在一些實施方案中，跨膜區為疏水性的。在一些實施方案中，跨膜區包含聚白胺酸-丙胺酸序列。蛋白質或蛋白質區段之喜水性或疏水性或親水性特徵可藉由此項技術中之任何已知方法來評估，例如Kyte及Doolittle喜水性分析。
細胞內信號傳導域
本申請案之嵌合受體包含細胞內信號傳導域。嵌合受體系統中單一嵌合受體之細胞內信號傳導域或兩種嵌合受體之細胞內信號傳導域負責活化表現嵌合受體之免疫效應細胞的至少一種正常效應功能。術語「效應功能」係指細胞之專門功能。T細胞之效應功能例如可為細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因子之分泌。因此，術語「細胞質信號傳導域」係指蛋白質之一部分，其轉導效應功能信號且引導細胞執行專門功能。儘管通常可以使用完整細胞質信號傳導域，但在多數情況下，不必使用完整鏈。在使用細胞質信號傳導域之截短部分的情況下，只要此種截短部分轉導效應功能信號，其即可用於替代完整鏈。因此，術語細胞質信號傳導域意欲包括細胞質信號傳導域中足以轉導效應功能信號之任何截短部分。
在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，嵌合受體包基本上由免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列組成的細胞內信號傳導域。「主要細胞內信號傳導序列」係指以刺激方式起作用以誘導免疫效應功能之細胞質信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化 基序或ITAM的信號傳導基序。如本文所用，「ITAM」為一種保守蛋白質基序，其通常存在於多種免疫細胞中表現之信號傳導分子的尾部。該基序可包含由6-8個胺基酸分隔之胺基酸序列YxxL/I的兩個重複序列，其中各x獨立地為任何胺基酸，從而產生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信號傳導分子內之ITAM對於細胞內之信號轉導很重要，該信號轉導至少部分由信號傳導分子活化後ITAM中酪胺酸殘基之磷酸化介導。ITAM亦可用作信號傳導路徑中涉及之其他蛋白質之對接位點。例示性含ITAM之主要細胞質信號傳導序列包括來源於CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(Fcε Rib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之序列。
在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ，亦即主要細胞內信號傳導序列為CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域由CD3ζ之細胞質信號傳導域組成。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列為野生型CD3ζ之細胞質信號傳導域。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列為CD3ζ之細胞質信號傳導域之功能突變體，其含有一或多種突變，諸如Q65K。在一些實施方案中，CD3ζ細胞內信號傳導序列包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列。
SEQ ID NO：135 CD3ζ細胞內信號傳導序列
Figure 108132631-A0202-12-0102-205
在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域由細胞內共刺激序列組成。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域不包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(例如T細胞) 之主要細胞內信號傳導序列及細胞內共刺激序列兩者。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域不包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含有包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域，且第二嵌合受體包含有包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第一嵌合受體包含有包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域，且第二嵌合受體包含有包含免疫效應細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
除刺激抗原特異性信號外，多種免疫效應細胞還需要共刺激，以促進細胞增殖、分化及存活，以及活化細胞之效應功能。在一些實施方案中，嵌合受體包含至少一種細胞內共刺激序列。如本文所用，術語「細胞內共刺激序列」係指蛋白質中介導細胞內之信號轉導以誘導免疫反應(諸如效應功能)之至少一部分。本文所述嵌合受體之細胞內共刺激序列可為來自共刺激蛋白之細胞質信號傳導域，其轉導信號且調節由免疫細胞(諸如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞或嗜酸性粒細胞)介導之反應。「細胞內共刺激序列」可為共刺激分子之細胞質部分。術語「共刺激分子」係指免疫細胞(諸如T細胞)上特異性結合共刺激配體，從而由免疫細胞介導共刺激反應(諸如但不限於增殖及存活)之同源結合搭配物。
在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含單一細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含兩種或更多種(諸如約2、3、4種或更多種中之任一者)細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含兩種或更多種相同細胞內共刺激序列，例如CD28之細胞內共刺激序列中之兩種複本。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含來自不同共刺激蛋白(諸如任何兩種或更多種本文所述之共刺激蛋白)的兩種或更多種細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含主要細胞內信號傳導序列(諸 如CD3ζ之細胞質信號傳導域)及一或多種細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，一或多種細胞內共刺激序列及主要細胞內信號傳導序列(諸如CD3ζ之細胞質信號傳導域)經由任選肽連接子彼此融合。主要細胞內信號傳導序列及一或多種細胞內共刺激序列可以任何合適次序排列。在一些實施方案中，一或多種細胞內共刺激序列位於跨膜域與主要細胞內信號傳導序列(諸如CD3ζ之細胞質信號傳導域)之間。多種細胞內共刺激序列可提供加和或協同刺激作用。
宿主細胞(例如免疫細胞)中細胞內共刺激序列之活化可誘導細胞增加或減少細胞因子之產生及分泌、吞噬細胞特性、增殖、分化、存活及/或細胞毒性。任何共刺激分子之細胞內共刺激序列可適用於本文所述之嵌合受體中。基於諸如表現效應分子之免疫效應細胞之類型(例如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞或嗜酸性粒細胞)及所要免疫效應功能(例如ADCC作用)的因素選擇細胞內共刺激序列之類型。用於嵌合受體之細胞內共刺激序列之實例可為如下共刺激蛋白之細胞質信號傳導域，其包括但不限於B7/CD28家族之成員(例如B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC及PDCD6)；TNF超家族之成員(例如4-1BB/TNFSF9/4-1BB、4-1BB配體/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配體/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配體/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配體/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配體/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配體/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α及TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族之成員(例如2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、 CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6及SLAM/CD150)；及任何其他共刺激分子，諸如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I類、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)及NKG2C。
在一些實施方案中，一或多種細胞內共刺激序列選自由以下組成之群：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特別地結合CD83之配體。
在一些實施方案中，本申請案嵌合受體中之細胞內信號傳導域包含來源於CD28之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含CD3ζ之細胞質信號傳導域及CD28之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含CD28之細胞內共刺激序列，該序列包含RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRS(SEQ ID NO：136)之胺基酸序列。
在一些實施方案中，本申請案CAR中之細胞內信號傳導域包含來源於4-1BB(亦即CD137)之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含CD3ζ之細胞質信號傳導域及4-1BB之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含4-1BB之細胞內共刺激序列，該序列包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEE EEGGCEL(SEQ ID NO：137)之胺基酸序列。
在一些實施方案中，本申請案CAR中之細胞內信號傳導域包含來源於ICOS之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含CD3ζ之細胞質信號傳導域及ICOS之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含ICOS之細胞內共刺激序列，該序列包含CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSR LTDVTL(SEQ ID NO：138)之胺基酸序列。
在一些實施方案中，本申請案CAR中之細胞內信號傳導域包含CD28之細胞內共刺激序列及4-1BB之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含CD3ζ之細胞質信號傳導域、CD28之細胞內共刺激序列及4-1BB之細胞內共刺激序列。
在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含有包含CD3ζ之細胞質信號傳導域的多肽。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含有包含CD28之細胞內共刺激序列的多肽。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含有包含4-1BB之細胞內共刺激序列的多肽。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含自N端至C端包含以下之多肽：4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ之細胞質信號傳導域。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含自N端至C端包含以下之多肽：CD28之細胞內共刺激序列、4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ之細胞質信號傳導域。
本揭露範圍內亦包括本文所述任何細胞內共刺激序列之變體，使得該細胞內共刺激序列能夠調節免疫細胞之免疫反應。在一些實施方案中，與野生型對應物相比，細胞內共刺激序列包含至多10個胺基酸殘基變化(例如1、2、3、4、5或8個)。包含一或多個胺基酸變化之此類細胞內共刺激序列可稱為變體。相對於不包含突變之細胞內共刺激序列，細胞內共刺激序列之胺基酸殘基突變可產生增加之信號轉導及提高之免疫反應刺激。相對於不包含突變之細胞 內共刺激序列，細胞內共刺激序列之胺基酸殘基突變可產生減少之信號轉導及降低之免疫反應刺激。
鉸鏈區
本申請案之嵌合受體可包含位於細胞外域與跨膜域之間的鉸鏈域。鉸鏈域為如下胺基酸區段，其通常在蛋白質之兩個域之間發現，且可使蛋白質具有可撓性及使該等域中之一者或兩者相對於彼此移動。可使用提供細胞外域相對於效應分子之跨膜域的此種可撓性及移動的任何胺基酸序列。
鉸鏈域可含有約10-100個胺基酸，例如約15-75個胺基酸、20-50個胺基酸或30-60個胺基酸中之任一者。在一些實施方案中，鉸鏈域可為長度為至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75個胺基酸中之任一者。
在一些實施方案中，鉸鏈域為天然存在蛋白質之鉸鏈域。此項技術中已知包含鉸鏈域之任何蛋白質的鉸鏈域均適用於本文所述之嵌合受體。在一些實施方案中，鉸鏈域為天然存在蛋白質之鉸鏈域的至少一部分，且賦予嵌合受體可撓性。在一些實施方案中，鉸鏈域來源於CD8，諸如CD8α。在一些實施方案中，鉸鏈域為CD8α之鉸鏈域的一部分，例如含有CD8α之鉸鏈域的至少15(例如20、25、30、35或40)個連續胺基酸的片段。在一些實施方案中，CD8α之鉸鏈域包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：139)之胺基酸序列。在一些實施方案中，鉸鏈域來源於CD28。在一些實施方案中，CD28之鉸鏈域包含IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO：140)之胺基酸序列。
抗體(諸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗體)之鉸鏈域亦適用於本文所述之嵌合受體系統。在一些實施方案中，鉸鏈域為連接抗體之恆定域CH1及CH2的鉸鏈域。在一些實施方案中，鉸鏈域為抗體之鉸鏈域，且包含抗體之鉸鏈域及抗體之一或多個恆定區。在一些實施方案中，鉸鏈域包含抗體之鉸鏈域及抗體之CH3恆定區。在一些實施方案中，鉸鏈域包含抗體之鉸鏈域及抗體之CH2及CH3恆定區。在一些實施方案中，抗體為IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗體。在一些實施方案中，抗體為IgG抗體。在一些實施方案中，抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施方案中，絞鏈區包含IgG1抗體之絞鏈區及CH2及CH3恆定區。在一些實施方案中，絞鏈區包含IgG1抗體之絞鏈區及CH3恆定區。
非天然存在之肽亦可用作本文所述嵌合受體之鉸鏈域。在一些實施方案中，Fc受體之細胞外配體結合域的C端與跨膜域之N端之間的鉸鏈域為肽連接子，諸如(GxS)n連接子，其中x及n可獨立地為3至12之整數，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。在一些實施方案中，肽連接子包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：141)之胺基酸序列。
信號肽
本申請案之嵌合受體可在多肽之N端包含信號肽(亦稱為信號序列)。通常，信號肽為將多肽靶向至細胞中所要位點之肽序列。在一些實施方案中，信號肽將效應分子靶向至細胞之分泌路徑，且將使效應分子可整合且錨定至脂質雙層中。包括天然存在蛋白質之信號序列或非天然存在之合成信號序列的信號肽可適用於本文所述之嵌合受體。在一些實施方案中，信號肽來源於選自由CD8、GM-CSF受體α及IgG1重鏈組成之群之分子。在一些實施方案中，信號肽來源於CD8，諸如CD8α。在一些實施方案中，CD8α之信號肽包含MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：142)之胺基酸序列。
C. 免疫效應細胞銜接子
本申請案之一態樣提供一種免疫效應細胞銜接子，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之標靶細胞結合域，及(b)包含特異性結合免疫效應細胞上之抗原之抗原結合片段的免疫效應細胞結合域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺 基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域中之抗原結合片段為Fab、scFv或sdAb。 在一些實施方案中，標靶細胞結合域與免疫效應細胞結構域之N端融合。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與免疫效應細胞結構域之C端融合。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與免疫效應細胞結合域經由肽連接子融合。在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域特異性結合選自由以下組成之群之抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。
在一些實施方案中，提供一種T細胞銜接子，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之標靶細胞結合域，及(b)包含特異性結合T細胞上之抗原的抗原結合片段的T細胞結合域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之 變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該 等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，T細胞結合域中之抗原結合片段為Fab、scFv或sdAb。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與T細胞結構域之N端融合。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與T細胞結構域之C端融合。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與T細胞結合域經由肽連接子融合。在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域特異性結合選自由以下組成之群之抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域包含特異性結合CD3(諸如CD3ε)之抗原結合片段。
標靶細胞結合域
本文所述之免疫效應細胞銜接子包含有包含抗CLL1 sdAb之標靶細胞結合域。在一些實施方案中，標靶細胞結合域由抗CLL1 sdAb組成。在一些實施方案中，標靶細胞結合域包含抗CLL1 sdAb及來源於特異性結合標靶細胞上之抗原的一或多種單域抗體或四鏈抗體的抗原結合片段。在一些實施方案中，標靶細胞為腫瘤細胞或骨髓細胞。
在一些實施方案中，標靶細胞結合域具有兩種或更多種(諸如約2、3、4、5、6種或更多種中之任一者)抗原結合片段，諸如單域抗體。在一些實施方案中，多價標靶細胞結合域僅靶向CLL1，且包含針對CLL1之兩種或更多種抗原結合片段。在一些實施方案中，多價標靶細胞結合域靶向超過一種抗原，且多價標靶細胞結合域包含針對至少一種抗原之兩種或更多種抗原結合片段。特異於相同抗原之抗原結合片段可結合抗原之相同抗原決定基或結合抗原之不同抗原決定基。特異於相同抗原之抗原結合片段可包含相同或不同單域抗體。
在一些實施方案中，標靶細胞結合域包含複數種抗CLL1 sdAb。在一些實施方案中，複數種抗CLL1 sdAb經由肽鍵或肽連接子彼此融合。在一些實施方案中，各肽連接子之長度不超過約50個(諸如不超過約35、25、20、15、10或5個中之任一者)胺基酸。
在一些實施方案中，標靶細胞結合域可特異性結合兩種或更多種(諸如約2、3、4、5、6種或更多種中之任一者)不同抗原。在一些實施方案中，多特異性標靶細胞結合域對各抗原具有一種抗原結合片段。在一些實施方案中，多特異性標靶細胞結合域對至少一種抗原具有超過兩種抗原結合片段。各抗原結合片段可包含單域抗體。
視待靶向之所要抗原而定，可將標靶細胞結合域工程改造以包括特異於所要抗原之適當單域抗體。在一些實施方案中，標靶細胞結合域包含抗CLL1 sdAb及抗CD33 sdAb。抗原結合片段(諸如sdAb)可以任何合適次序排列。舉例而言，使第一sdAb與第二sdAb之N端或C端融合。可將合適肽連接子置於不同sdAb之間以避免sdAb之間的位阻。
免疫效應細胞結合域
本文所述之免疫效應細胞銜接子包含免疫效應細胞結合域。免疫效應細胞結合域包含特異性結合免疫效應細胞上之抗原的抗原結合片段。免疫效應細胞包括但不限於T細胞及NK細胞。
在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域特異性結合CD3，諸如人類CD3。「CD3」在此項技術中稱為六鏈多蛋白複合物(參見Abbas及Lichtman,2003；Janeway等人，第172頁及第178頁，1999)。在哺乳動物中，複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩條CD3ε鏈及CD3ζ鏈之同二聚體。如本文所用之CD3可來自各種動物物種，包括人類、靈長類動物、小鼠、大鼠或其他哺乳動物。在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域包含特異性結合個別CD3鏈(諸如CD3γ 鏈、CD3δ鏈或CD3ε鏈)之抗原結合片段。在一些實施方案中，抗原結合片段特異性結合由兩條或更多條個別CD3鏈形成之複合物(例如，超過一條CD3ε鏈之複合物、CD3γ與CD3ε鏈之複合物、CD3δ與CD3ε鏈之複合物)在一些實施方案中，抗原結合片段特異性結合CD3ε鏈。
靶向CD3之抗原結合片段可為任何合適抗原結合片段，其包括但不限於Fab、scFv及sdAb(例如VHH)。在一些實施方案中，抗原結合片段為鼠類、駱駝科、嵌合、人類或人類化抗原結合片段。可基於此項技術中之任何已知CD3抗體設計抗原結合片段，該等CD3抗體包括但不限於SP34小鼠單株抗體(參見例如Pressano,S.The EMBO J.4：337-344,1985；Alarcon,B.EMBO J.10：903-912,1991；Salmeron A.等人，J.Immunol.147：3047-52,1991；Yoshino N.等人，Exp.Anim 49：97-110,2000；Conrad M L.等人，Cytometry 71A：925-33,2007；及Yang等人，J.Immunol.137：1097-1100：1986)、Cris-7單株抗體(Reinherz,E.L.等人(編)，Leukocyte typing II,Springer Verlag,New York,(1986))、BC3單株抗體(Anasetti等人(1990)J.Exp.Med.172：1691)、OKT3(Ortho multicenter Transplant Study Group(1985)N.Engl.J.Med.313：337)及其衍生物(諸如OKT3 ala-ala(Herold等人(2003)J.Clin.Invest.11：409))、維西珠單抗(visilizumab)(Carpenter等人(2002)Blood 99：2712)、145-2C11單株抗體(Hirsch等人(1988)J.Immunol.140：3766)、UCHT-1(Beverley,P C及Callard,R.E.(1981)Eur.J.Immunol.11：329-334)、WO2016180982中所述之抗CD3 sdAb(諸如60E11及117G03)及WO2004/106380；WO2004/106381；WO2010/037838；WO2008/119567；WO2007/042261；WO2010/0150918中所述之CD3結合分子；各參考文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施方案中，抗CD3抗原結合片段來源於OKT3、L2K、UCHT1、60E11或117G03。在一些實施方案中，抗CD3抗原結合片段為來源於OKT3、L2K或UCHT之scFv。在一些實施方案中，抗CD3 抗原結合片段為來源於60E11或117G03之VHH。在一些實施方案中，抗CD3抗原結合片段來源於與OKT3、L2K、UCHT1、60E11或117G03結合相同抗原決定基之抗體。在一些實施方案中，抗CD3抗原結合片段來源於與OKT3、L2K、UCHT1、60E11或117G03競爭特異性結合CD3之抗體。
信號肽
本申請案之免疫效應細胞銜接子可在多肽之N端包含信號肽(亦稱為信號序列)。通常，信號肽為將多肽靶向至細胞中所要位點之肽序列。在一些實施方案中，信號肽將免疫效應細胞銜接子靶向至細胞之分泌路徑，且將使免疫效應細胞銜接子可分泌至細胞培養基中。包括天然存在蛋白質之信號序列或非天然存在之合成信號序列的信號肽。在一些實施方案中，信號肽來源於人類白蛋白信號肽。在一些實施方案中，信號肽來源於人類天青殺素(azurocidin)分泌信號。
肽連接子
標靶細胞結合域與免疫效應細胞結合域可經由肽連接子彼此融合。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與免疫效應細胞結合域可在無任何肽連接子下直接彼此融合。
在一些實施方案中，多特異性或多價標靶細胞結合域中之各種抗原結合片段(諸如sdAb)經由肽連接子彼此融合。在一些實施方案中，抗原結合片段(諸如sdAb)在無任何肽連接子下直接彼此融合。連接不同抗原結合片段(諸如sdAb)之肽連接子可相同或不同。
免疫效應細胞銜接子中之各肽連接子可視抗原結合片段(諸如sdAb)及/或各種域之結構及/或功能特徵而定具有相同或不同長度及/或序列。可獨立地選擇且最佳化各肽連接子。免疫效應細胞銜接子中使用之肽連接子的長度、撓度及/或其他特性可對包括但不限於對一或多種特定抗原或抗原決定基之親和 力、特異性或親合力的特性具有一些影響。例如，可選擇較長肽連接子以確保兩個相鄰域在空間上不會彼此干擾。例如，在包含針對多聚體抗原之sdAb的多價或多特異性標靶細胞結合域中，肽連接子之長度及可撓性較佳使得其允許各抗原結合片段(諸如sdAb)結合多聚體各亞基上之抗原決定簇。
在一些實施方案中，肽連接子包含可撓性殘基(諸如甘胺酸及絲胺酸)，使得相鄰域相對於彼此自由移動。舉例而言，(GGGGS)3連接子(SEQ ID NO：141)可為標靶細胞結合域與免疫效應細胞結合域之間的合適肽連接子。在一些實施方案中，肽連接子之長度不超過約50個(諸如不超過約35、25、20、15、10或5個中之任一者)胺基酸。
肽連接子可具有任何合適長度。在一些實施方案中，肽連接子之長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100個或更多個胺基酸中之任一者。在一些實施方案中，肽連接子之長度不超過約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5個或更少胺基酸中之任一者。在一些實施方案中，肽連接子之長度為約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸或約1個胺基酸至約100個胺基酸中之任一者。
肽連接子可具有天然存在之序列或非天然存在之序列。例如，來源於僅重鏈抗體之鉸鏈區的序列可用作連接子。參見例如WO1996/34103。在一些實施方案中，肽連接子為可撓性連接子。例示性可撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n及(GGGGS)n，其中n為至少一個整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚 合物及此項技術中已知之其他可撓性連接子。在一些實施方案中，肽連接子包含胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：143)、(GGGGS)2(SEQ ID NO：144)、(GGGGS)3(SEQ ID NO：141)、(GGGGS)4(SEQ ID NO：182)、(GGGGS)5(SEQ ID NO：183)、(GGGS)2(SEQ ID NO：145)、(GGGS)4(SEQ ID NO：146)或GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：147)。
D. 免疫結合物
在一態樣中，本申請案提供免疫結合物，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及效應分子。例示性效應分子包括但不限於藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽、核酸及標記。
在一些實施方案中，提供一種免疫結合物，其包含與一或多種細胞毒性劑(諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素結合之抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)。
在一些實施方案中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗CLL1 sdAb與一或多種藥物結合，該等藥物包括但不限於美登醇(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；澳瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基澳瑞他汀藥物部分DE及DF(MMAE和MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環，諸如道諾黴素(daunomycin)或阿黴素(doxorubicin)(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj. Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；甲胺蝶呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，諸如多西他賽(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉羅他賽(larotaxel)、替塞他賽(tesetaxel)及奧他他賽(ortataxel)；單端孢黴烯(trichothecene)；及CC1065。
在一些實施方案中，免疫結合物包含與如下酶活性毒素或其片段結合之本文所述抗CLL1 sdAb，其包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮素A鏈、α-帚麯黴素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、薑黃素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、米托格林(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯。
在一些實施方案中，免疫結合物包含與放射性原子結合以形成放射性結合物之本文所述抗CLL1 sdAb。多種放射性同位素可用於生產放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當將放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍顯像研究之放射性原子(例如tc99m或I123)，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，「MRI」)之自旋標記(諸如碘123、碘131、銦111、氟19、碳13、氮15、氧17、釓、錳或鐵)。
可以使用如下多種雙功能蛋白偶合劑來製備抗體與細胞毒性劑之結合物，諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙(對重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述製備蓖麻毒素免疫毒素。碳14標記之1-異硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有利於釋放細胞中之細胞毒性藥物的「可切割連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋但不限於用如下交聯劑製備之此類結合物，其包括但不限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯劑可購得(例如來自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
在一些實施方案中，本文提供之抗CLL1 sdAb中之任一者可用於偵測生物樣品中CLL1之存在。如本文所用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施方案中，生物樣品為生物來源之血液、血清或其他液體樣品。在一些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。
在一些實施方案中，本申請案提供免疫結合物，其包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及標記。在一些實施方案中，標記與抗CLL1 sdAb結合。在一些實施方案中，提供一種偵測細胞中之CLL1的方法，其 包括使細胞與免疫結合物接觸。在一些實施方案中，提供一種偵測生物樣品中CLL1之存在的方法。在一些實施方案中，方法包括偵測生物樣品中CLL1蛋白之存在。在一些實施方案中，CLL1為人類CLL1。在一些實施方案中，該方法包括在允許抗CLL1 sdAb與CLL1結合之條件下使生物樣品與免疫結合物接觸，及偵測來自標記之信號。此種方法可為活體外或活體內方法。在一些實施方案中，提供一種診斷個體之與CLL1表現相關之疾病(例如急性骨髓性白血病)的方法，其包括向個體投與免疫結合物及偵測個體中之標記。在一些實施方案中，使用免疫結合物來選擇適合用本文所述之任何抗CLL1治療劑(例如抗CLL1 sdAb、嵌合受體、免疫效應細胞銜接子及經工程改造免疫細胞)治療之受試者，其中CLL1為用於選擇患者之生物標誌物。
在一些實施方案中，提供經標記抗CLL1 sdAb。標記包括但不限於直接檢測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子密集標記、化學發光標記及放射性標記)，以及間接(例如經由酶促反應或分子間相互作用)偵測之部分，諸如酶或配體。例示性標記包括但不限於放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團(諸如稀土金屬螯合物)或螢光素(fluorescein)及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹磺醯基；傘形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素(luciferin)；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化物酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫氧化染料前體之酶(諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基；及其類似物。
E. 抗體部分之特徵
在一些實施方案中，本文所述抗CLL1構築體中之任何抗體部分可單獨或以組合形式並有以下部分1-7中所述之任何特徵。
1. 抗體親和力
在一些實施方案中，本文提供之抗體部分的解離常數(Kd)為
Figure 108132631-A0202-12-0122-148
1μM、
Figure 108132631-A0202-12-0122-149
100nM、
Figure 108132631-A0202-12-0122-150
10nM、
Figure 108132631-A0202-12-0122-151
1nM、
Figure 108132631-A0202-12-0122-152
0.1nM、
Figure 108132631-A0202-12-0122-153
0.01nM或
Figure 108132631-A0202-12-0122-154
0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一些實施方案中，藉由放射性標記之抗原結合測定(RIA)來量測Kd，該放射性標記之抗原結合測定用以下測定所述之目標抗體之Fab形式或VHH片段及其抗原進行。舉例而言，藉由以下方法量測Fab對抗原之溶液結合親和力：在未標記抗原之滴定系列存在下，以最小濃度之(125I)標記抗原平衡Fab，隨後以塗有抗Fab抗體之盤捕獲結合之抗原(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。
在一些實施方案中，在25℃下，以約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，使用表面電漿子共振測定來量測Kd。簡言之，根據供應商之說明，以N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化之葡聚糖生物傳感器晶片(CM5，BIACORE,Inc.)。以10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)，隨後以5μl/min之流速注射，以實現約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。為進行動力學量測，在25℃下以約25μl/min之流速將目標抗體之Fab或VHH之兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)注射於含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中。藉由同時擬合締合及解離傳感圖，使用簡單一對一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIACORE®評價軟體版本3.2)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。以比率koff/kon計算平衡解離常數 (Kd)。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由以上表面電漿子共振測定測得之締合速率超過106M-1 s-1，則可藉由使用螢光猝滅技術來測定締合速率，該技術量測在25℃下，在增加濃度之抗原存在下，含20nM抗抗原抗體部分之PBS(pH 7.2)的螢光發射強度的增加或減少(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)，該量測在光譜儀(諸如配備有停流裝置之分光光度計(Aviv Instruments)或帶有之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中以攪拌比色皿量測。
2. 抗體片段
在一些實施方案中，本文提供之抗體部分為抗體片段。抗體片段包括但不限於Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段(VHH)及下述其他片段。關於特定抗體片段之回顧，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之回顧，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期的Fab及F(ab')2片段的討論，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
抗體片段可藉由各種技術製備，該等技術包括但不限於如本文所述之蛋白水解消化完整抗體以及由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。
3. 嵌合及人類化抗體
在一些實施方案中，本文提供之抗體部分為嵌合抗體。特定嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中。在一實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於駱駝科物種(諸如美洲駝)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為一種「類別轉換」抗體，其中類別或亞類已自母抗體之類別或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施方案中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留非人類母抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施方案中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法例如回顧於Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於以下中，例如：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「再表面化」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「指導選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括但不限於：使用「最佳擬合」法選擇之構架區(參見例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區特定亞組之人類抗體的一致序列的構架區(參見例如Carter等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
在一些實施方案中，對sdAb進行修飾(諸如人類化)，而不降低該域對抗原之天然親和力，同時降低其對異源物種之免疫原性。舉例而言，可確定美洲駝抗體之抗體可變域(VHH)的胺基酸殘基，且例如將構架區中之一或多個駱駝科胺基酸以人類一致序列中發現之其人類對應物置換，未使該多肽喪失其典型特徵，亦即人類化不會顯著影響所得多肽之抗原結合能力。人類化駱駝科sdAb需要在單一多肽鏈中引入且突變誘發有限量之胺基酸。此與scFv、Fab'、(Fab')2及IgG之人類化形成對比，後者需要在兩條鏈(輕鏈及重鏈)中引入胺基酸變化，且保留兩條鏈之裝配。
可人類化包含VHH域之單域抗體以具有人類樣序列。在一些實施方案中，本文所用VHH域之FR區與人類VH構架區具有至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大胺基酸序列同源性中之任一者。一種例示性類別之人類化VHH域的特徵在於，根據Kabat編號，VHH在位置45(諸如L45)處攜帶來自由以下組成之群的胺基酸：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺或谷胺醯胺，且在位置103處攜帶色胺酸。因此，屬於此類別之多肽展示出與人類VH構架區之高胺基酸序列同源性，且該等多肽可直接投與人類而預期不會由此產生不需要之免疫反應，且無進一步人類化之負擔。
WO 03/035694中描述另一種例示性類別之人類化駱駝科sdAb，其含有通常在人類來源或來自其他物種之習知抗體中發現的疏水性FR2殘基，但藉 由位置103上之帶電精胺酸殘基補償此親水性損失，該帶電精胺酸殘基取代來自雙鏈抗體之VH中存在的保守色胺酸殘基。因此，屬於此兩種類別之肽展示出與人類VH構架區之高胺基酸序列同源性，且該等肽可直接投與人類而預期不會由此產生不需要之免疫反應，且無進一步人類化之負擔。
4. 人類抗體
在一些實施方案中，本文提供之抗體部分為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術製備。人類抗體通常描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。能夠產生完全人類sdAb之轉殖基因小鼠或大鼠為此項技術中所已知。參見例如US20090307787A1、美國專利第8,754,287號、US20150289489A1、US20100122358A1及WO2004049794。
人類抗體可藉由向已經修飾以響應於抗原攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物投與免疫原來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合於動物之染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，通常已使內源性免疫球蛋白基因座滅活。關於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的回顧，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號；描述K-MMOUSE®技術之美國專利第7,041,870號及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。來自此類動物產生之完整抗體的人類可變區可進一步修飾，例如藉由與不同人類恆定區組合。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系(參見例如Kozbor J. Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)中所述之方法(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
亦可藉由分離選自來源於人類之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變域序列來產生人類抗體。隨後可以將此類可變域序列與所要之人類恆定域組合。用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術如下所述。
用於獲得針對特定抗原或標靶之VHH序列的一種技術涉及使能夠表現重鏈抗體之轉殖基因哺乳動物適當免疫(亦即以增加針對該抗原或標靶之免疫反應及/或重鏈抗體)，自含有該等VHH序列(編碼該等VHH序列之核酸序列)之該轉殖基因哺乳動物獲得合適生物樣品(諸如血液樣品、血清樣品或B細胞樣品)，隨後由該樣品開始，使用本身已知之任何合適技術(諸如本文所述方法或融合瘤技術中之任一者)產生針對該抗原或標靶之VHH序列。舉例而言，出於此目的，可使用表現重鏈抗體之小鼠及WO 02/085945、WO 04/049794及WO 06/008548及Janssens等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41)：15130-5中描述之其他方法及技術。舉例而言，此類表現重鏈抗體之小鼠可表現具有任何合適(單一)可變域之重鏈抗體，該可變域諸如來自天然來源之 (單一)可變域(例如人類(單一)可變域、駱駝科(單一)可變域或鯊魚(單一)可變域)以及例如合成或半合成(單一)可變域。
5. 來源於文庫之抗體
本申請案之抗體部分可藉由篩選組合文庫中具有所要活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知用於產生噬菌體呈現文庫且篩選此類文庫中具有所要結合特徵之抗體的多種方法。此類方法例如回顧於Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且進一步描述於以下中，例如：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。已描述了構築sdAb文庫之方法，例如，參見美國專利第7371849號。
如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述，在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖VH及VL基因庫，且在噬菌體文庫中隨機再組合，隨後可篩選該等噬菌體文庫中之抗原結合噬菌體。噬菌體通常呈現單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式之抗體片段。來自免疫來源之文庫提供針對免疫原之高親和力抗體，而無需構築融合瘤。或者，可如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述，在不經任何免疫之情況下選殖初始庫(例如自人類)以提供針對多種非自身抗原以及自身抗原之抗體的單一來源。最後，亦可如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述，藉由如下方法來合成製備初始文庫：自幹細胞選殖未重排之V基因區段，且使用含有隨 機序列之PCR引子來編碼高度可變之CDR3區且在活體外完成重排。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
在本文中，認為自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段係人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在一些實施方案中，本文提供之抗體部分為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。可製備全長抗體或抗體片段形式之雙特異性抗體。用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983)、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「把手-孔洞」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由如下方法製備：工程改造靜電操縱作用來製備抗體Fc-異二聚體分子(WO 2009/089004A1)；交聯兩種或更多種抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述製備三特異性抗體；及產生包含串聯單域抗體之多肽(參見例如美國專利申請案第20110028695號；及Conrath等人，J.Biol.Chem.,2001；276(10)：7346-50)。本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之經工程改造抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576A1)。
7. 抗體變體
在一些實施方案中，涵蓋本文提供之抗體部分的胺基酸序列變體。例如，可能需要改良抗體部分之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體部分之胺基酸序列變體可藉由將適當修飾引入編碼抗體部分之核酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體部分之胺基酸序列內殘基之缺失，及/或該等殘基中之插入及/或該等殘基之取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變體
在一些實施方案中，提供具有一或多種胺基酸取代之抗體變體。取代突變誘發之目標位點包括HVR及FR。保守取代展示於表7之「較佳取代」標題下。更實質性變化提供於表7之「例示性取代」標題下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步描述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，且篩選具有所要活性之產物，例如保留/改善之抗原結合，降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。
Figure 108132631-A0202-12-0130-52
Figure 108132631-A0202-12-0131-53
胺基酸可根據共有側鏈特性分組：
(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)鹼性：His、Lys、Arg；
(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要將此等類別之一的成員交換為另一類別。
一種類型之取代變體涉及取代母抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，選用於進一步研究之所得變體將相對於母抗體在某些生物學特性(例如增加之親和力、降低之免疫原性)方面具有改變(例如改良)及/或將基本上保留母抗體之某些生物學特性。例示性取代變體為親和力成熟抗體，其可方便地產生，例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術，諸如本文所述之技術。簡言之，使一或多個HVR殘基突變，使變體抗體呈現在噬菌體上且針對特定生物學活性(例如結合親和力)進行篩選。
可在HVR中進行改變(例如取代)，例如以改良抗體親和力。可在HVR「熱點」，亦即由在體細胞成熟過程中經歷高頻突變之密碼子編碼的殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行此類改變，且測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由構築及自二級文庫再選擇進行之親和力成熟已例如描述於Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001).)中。在親和力成熟之在一些實 施方案中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一者將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。隨後產生二級文庫。隨後篩選該文庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體變體。引入多樣性之另一種方法涉及HVR定向方法，其中使數個HVR殘基(例如一次4-6個殘基)進行隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或建模來特異性鑑別參與抗原結合之HVR殘基。通常尤其靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些實施方案中，可在一或多個HVR內進行取代、插入或缺失，只要此類改變基本上不降低抗體部分結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行基本上不降低結合親和力之保守改變(例如，本文提供之保守取代)。此類改變可在HVR「熱點」或CDR外。在上文提供之變體VHH序列的在一些實施方案中，各HVR未改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述，將用於鑑別可經靶向以進行突變誘發之抗體部分之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」。在此方法中，鑑別殘基或標靶殘基之組(例如，帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)，且以中性或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換，以判定抗體部分與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，可確定抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可經靶向或消除以作為取代之候選者。可篩選變體以判定其是否含有所要特性。
胺基酸序列插入包括在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽之長度範圍內的胺基及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括使抗體之N端或C端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體之血清半衰期的多肽融合。
b)糖基化變體
在一些實施方案中，本文提供之抗體部分經改變以增加或減少抗體部分糖基化之程度。向抗體部分添加或使抗體部分缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個糖基化位點來方便地實現。
若抗體部分包含Fc區，則與其連接之碳水化合物可改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支雙觸角寡醣，該寡醣通常由N鍵連接於Fc區CH2域之Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及連接於雙觸角寡醣結構之「莖」中之GlcNAc的岩藻醣。在一些實施方案中，可對本申請案之抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改良特性之抗體變體。
在一些實施方案中，提供具有如下碳水化合物結構之抗體變體，該碳水化合物結構無岩藻醣(直接或間接)連接於Fc區。舉例而言，此種抗體中岩藻醣之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻醣之量藉由如例如WO 2008/077546中所述，如藉由MALDI-TOF質譜所量測，計算糖鏈中Asn297處岩藻醣相對於連接於Asn 297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來確定。Asn297係指位於Fc區中約297位(Fc區殘基之EU編號)之天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸，亦即在位置294與300之間。此類岩藻醣基化變體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去岩藻醣基化」或「岩藻醣缺陷型」抗體變體之公開案實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞系的實例包括蛋白質岩藻糖基化缺陷型Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其實例11)，及基因敲除細胞系，例如敲除α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8之CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
抗體變體還具有二等分之寡醣，例如，其中連接於抗體Fc區之雙觸角寡醣由GlcNAc二等分。此類抗體變體可具有減少之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在寡糖中具有至少一個連接於Fc區之半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可具有改良之CDC功能。此類抗體變體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變體
在一些實施方案中，可將一或多種胺基酸修飾引入本文提供之抗體的Fc區中，從而產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一些實施方案中，本申請案涵蓋一種抗體變體，其具有一些但非全部效應功能，從而使其成為如下應用之適宜候選者，其中抗體之活體內半衰 期很重要，但某些效應功能(諸如補體及ADCC)為非必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性測定，以證實CDC及/或ADCC活性之降低/清除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁表3總結了造血細胞上之FcR表現。評估目標分子之ADCC活性之活體外測定的非限制性實例描述於以下中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可使用非放射性測定法(參見例如用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CYTOTOX 96®非放射性細胞毒性測定(Promega,Madison,WI))。用於此類測定之有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭露之動物模型)中評估目標分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合測定，以證實抗體不能結合C1q，因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC測定(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327和329中的一或多者經取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包 括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
描述了具有改良或減少之FcR結合的某些抗體變體(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在一些實施方案中，抗體變體包含具有一或多個胺基酸取代之Fc區，該等胺基酸取代改良ADCC，例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代。
在一些實施方案中，在Fc區中進行改變，從而產生改變(亦即改良或減少之)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
具有延長之半衰期及改良之新生兒Fc受體(FcRn)結合的抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中，其中新生兒Fc受體(FcRn)負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn之結合。此類Fc變體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之Fc變體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變體之其他實例，亦參見Duncan & Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造之抗體變體
在一些實施方案中，可能需要產生半胱胺酸工程改造之抗體(例如「thioMAb」)，其中抗體部分之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施方案中，經取代殘基存在於抗體部分之可達位點處。如本文進一步描述，藉由以半胱胺酸取代彼等殘基，從而使反應性硫醇基定位於抗體部分之可達位點，且該等反應性硫醇基可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合，以產生免疫結合物。在一些實施方案中，以下殘基中之任何一或多個可經半胱胺酸取代：重鏈之A118(EU編號)；重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸工程改造之抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生。
e)抗體衍生物
在一些實施方案中，本文提供之抗體部分可進一步經修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白性部分。適用於衍生抗體部分之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)及葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而可在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可具有分支或無分支。連接於抗體部分之聚合物的數量可改變，且若連接超過一個聚合物，則其可為相同或不同分子。通常，用於衍生化之聚合物的數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，其包括但不限於待改良抗體部分之特定特性或功能，抗體部分衍生物是否將在指定條件下用於療法中等。
III. 製備抗CLL1構築體之方法
如本文所述之抗CLL1構築體，包括抗CLL1 sdAb、免疫效應細胞銜接子及免疫結合物之抗體部分，可使用此項技術中已知或如本文所述之任何方法製備。組成物及製備抗CLL1嵌合受體及嵌合受體系統之方法描述於部分IV中。
已描述製備sdAb之方法。參見例如Els Pardon等人，Nature Protocol,2014；9(3)：674。可使用此項技術中已知之方法獲得單域抗體(例如VHH)，諸如藉由使駱駝科物種(諸如駱駝或美洲駝)免疫且由其獲得融合瘤，或藉由使用此項技術中已知之分子生物學技術選殖sdAb之文庫，隨後藉由ELISA對未選文庫之個別純系進行選擇或藉由使用噬菌體呈現進行選擇。
為重組產生sdAb，分離編碼sdAb之核酸且將其插入可複製載體中以進一步選殖(擴增DNA)或表現。編碼sdAb之DNA可使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離且測序。可使用多種載體。載體之選擇部分取決於待使用之宿主細胞。通常，較佳宿主細胞為原核或真核(通常為哺乳動物)來源。
核酸及載體
提供包含編碼本文所述抗CLL1構築體中之任一者的一或多條鏈的多核苷酸的核酸分子。
在一些實施方案中，提供一種經分離核酸，其編碼本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者。在一些實施方案中，提供一種編碼抗CLL1 sdAb之經分離核酸，其中該核酸包含與SEQ ID NO：107-119及174-176中之任一者之核酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性中之任一者的序列。在一些實施方案中，提供一種經分離核酸，其包含選自由SEQ ID NO：107-119及174-176組成之群之核酸序列。
可使用此項技術中習知之重組DNA技術構築核酸分子。在一些實施方案中，核酸分子為適用於在所選宿主細胞中表現之表現載體。
提供包含編碼本文所述抗CLL1構築體中之任一者的多核苷酸的載體。此類載體包括但不限於DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體等。在一些實施方案中，載體為表現載體。
宿主細胞
在一些實施方案中，抗CLL1構築體可表現於原核細胞(諸如細菌細胞)中；或真核細胞(諸如真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞)中。此種表現可例如根據此項技術中已知之程序進行。可用於表現多肽之示例性真核細胞包括但不限於COS細胞，其包括COS 7細胞；293細胞，其包括293-6E細胞；CHO細胞，其包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO細胞及FUT8 CHO細胞；PER.C6®細胞(Crucell)；及NSO細胞。在一些實施方案中，抗CLL1構築體可表現於酵母中。參見例如美國公開案第US 2006/0270045 A1號。在一些實施方案中，特定真核宿主細胞基於其對抗CLL1構築體進行所要之轉譯後修飾之能力來選擇。舉例而言，在一些實施方案中，CHO細胞產生之多肽的唾液酸化程度高於293細胞中產生之相同多肽。
可藉由任何方法完成將一或多種核酸引入所要宿主細胞中，該方法包括但不限於磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電穿孔、轉導、感染等。非限制性方法描述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。可根據任何合適方法將核酸瞬時或穩定轉染於所要宿主細胞中。
本發明亦提供包含本文所述多核苷酸或載體中之任一者的宿主細胞。在一些實施方案中，本發明提供一種包含抗CLL1構築體之宿主細胞。能夠過度表現異源DNA之任何宿主細胞均可以用於分離編碼目標抗體、多肽或蛋白 質之基因的目的。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括但不限於COS、HeLa及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。合適非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(B.subtillis))及酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克魯維酵母(K.lactis))。
表現及純化
在一些實施方案中，提供一種製備抗CLL1構築體之方法，其中該方法包括在適用於表現抗CLL1構築體之條件下培養包含編碼抗CLL1構築體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗CLL1構築體。
抗CLL1構築體可藉由任何合適方法純化。此類方法包括但不限於使用親和基質或疏水相互作用層析。合適親和配體包括ROR1 ECD及結合抗體恆定區之配體。舉例而言，可使用蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗體親和管柱來結合恆定區及純化包含恆定區之抗CLL1構築體。疏水相互作用層析(例如丁基或苯基管柱)亦可適用於純化一些多肽，諸如抗體。離子交換層析(例如陰離子交換層析及/或陽離子交換色譜)亦可適合於純化一些多肽，諸如抗體。混合模式層析(例如逆相/陰離子交換、逆相/陽離子交換、親水相互作用/陰離子交換、親水相互作用/陽離子交換等)亦可適合於純化一些多肽，諸如抗體。此項技術中已知純化多肽之多種方法。
在一些實施方案中，在無細胞系統中產生抗CLL1構築體。非限制性例示性無細胞系統描述於例如以下文獻中：Sitaraman等人，Methods Mol.Biol.498：229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22：538-45(2004)；Endo等人，Biotechnol.Adv.21：695-713(2003)。
亦提供藉由本文所述方法中之任一者製備之抗CLL1構築體。在一些實施方案中，在宿主細胞中製備抗CLL1構築體。在一些實施方案中，在無細胞系統中製備抗CLL1構築體。在一些實施方案中，抗CLL1構築體經純化。在 一些實施方案中，本申請案提供包含抗CLL1構築體之細胞培養基。在一些實施方案中，本申請案提供包含抗CLL1構築體之宿主細胞培養液。
IV. 經工程改造免疫細胞
本申請案之一態樣提供包含如本文所述之抗CLL1嵌合受體或嵌合受體系統中之任一者的宿主細胞(諸如免疫細胞)。
因此，在一些實施方案中，提供一種包含抗CLL1嵌合受體之經工程改造免疫細胞(諸如T細胞)，該抗CLL1嵌合受體包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(諸如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。
在一些實施方案中，提供一種包含抗CLL1嵌合受體之經工程改造免疫細胞(諸如T細胞)，該抗CLL1嵌合受體包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域；(b)跨膜域；及(c)包含CD3ζ細胞內信號傳導序列及來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列的細胞內信號 傳導域。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。
在一些實施方案中，提供一種經工程改造免疫細胞(諸如T細胞)，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列及細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列及細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第一嵌合受體及第二嵌合受體各自之細胞內信號傳導域包含CD3ζ細胞內信號傳導序列及來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第二結合部分為抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之細胞外域。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。
在一些實施方案中，提供一種經工程改造免疫細胞(諸如T細胞)，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第一嵌合受體之細胞內信號傳導域包含CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，第二嵌合受體之細胞內信號傳導域包含來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第二結合部分為抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之細胞外域。在一 些實施方案中，經工程改造免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。
在一些實施方案中，提供一種經工程改造免疫細胞(諸如T細胞)，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含有包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域的細胞內域；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞(例如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第一嵌合受體之細胞內信號傳導域包含來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第二嵌合受體之細胞內信號傳導域包含CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，第二結合部分為抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之細胞外域。在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。
在根據上述經工程改造免疫細胞中之任一者的在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包 含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153 之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，嵌合受體還包含位於細胞外域C端與跨膜域N端之間的鉸鏈域(例如CD8鉸鏈域)。在一些實施方案中，嵌合受體還包含信號肽(諸如CD8信號肽)。
經工程改造免疫細胞還可表現一或多種治療性蛋白及/或免疫調節劑，諸如免疫檢查點抑制劑。參見例如國際專利申請案第PCT/CN2016/073489號及第PCT/CN2016/087855號，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。
核酸及載體
在一些實施方案中，提供一種經分離核酸，其編碼本文提供之抗CLL1嵌合受體或嵌合受體系統中之任一者。在一些實施方案中，提供一種核酸，其包含編碼第一嵌合受體之第一多核苷酸，該第一嵌合受體包含：包含抗CLL1 sdAb之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域；及編碼第二嵌合受體之第二多核苷酸，該第二嵌合受體包含：包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第一多核苷酸可操作地連接於第一啟動子，且第二多核苷酸可操作地連接於第二啟動子。在一些實施方案中，第一多核苷酸及第二多核苷酸連接於相同啟動 子。在一些實施方案中，第一多核苷酸及第二多核苷酸經由編碼自切割肽(諸如T2A、P2A或F2A)之第三多核苷酸彼此可操作地連接。在一些實施方案中，自切割肽為P2A。在一些實施方案中，自切割肽包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：148)之胺基酸序列。在一些實施方案中，經分離核酸為DNA。在一些實施方案中，經分離核酸為RNA。
在一些實施方案中，本申請案提供用於選殖及表現本文所述之任何抗CLL1嵌合受體或嵌合受體系統中之任一者的載體。在一些實施方案中，載體適合在真核細胞(諸如哺乳動物細胞)中複製及整合。在一些實施方案中，載體為病毒載體。病毒載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、牛痘載體、單純性皰疹病毒載體及其衍生物。病毒載體技術為此項技術中所熟知，且描述於例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中及其他病毒學和分子生物學手冊中。
已開發多種基於病毒之系統用於基因轉移至哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供方便之平台。可使用此項技術中已知之技術將異源核酸插入載體中且包裝在逆轉錄病毒粒子中。隨後可分離重組病毒，且在活體外或離體遞送至經工程改造哺乳動物細胞。此項技術中已知多種逆轉錄病毒系統。在一些實施方案中，使用腺病毒載體。此項技術中已知多種腺病毒載體。在一些實施方案中，使用慢病毒載體。在一些實施方案中，使用自滅活慢病毒載體。舉例而言，可用此項技術中已知之方案包裝攜帶嵌合受體之自滅活慢病毒載體。可使用此項技術中已知之方法，使用所得慢病毒載體轉導哺乳動物細胞(諸如原代人類T細胞)。來源於逆轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為實現長期基因轉移之合適工具，因為該等載體使得轉殖基因可長期穩定地整合且其可在子代細胞中繁殖。慢病毒載體亦具有低免疫原性，且可轉導非增殖細胞。
在一些實施方案中，載體為非病毒載體。在一些實施方案中，載體為轉位子，諸如Sleeping Beauty(SB)轉位子系統或PiggyBac轉位子系統。在一些實施方案中，載體為基於聚合物之非病毒載體，其包括例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)及聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亞胺)(PEI)及樹枝狀聚合物。在一些實施方案中，載體為基於陽離子脂質之非病毒載體，諸如陽離子脂質體、脂質奈米乳劑及固體脂質奈米粒子(SLN)。在一些實施方案中，載體為基於肽之基因非病毒載體，諸如聚-L-離胺酸。適用於基因組編輯之任何已知非病毒載體均可用於將編碼嵌合受體之核酸引入經工程改造免疫細胞中。參見例如Yin H.等人，Nature Rev.Genetics(2014)15：521-555；Aronovich EL等人，“The Sleeping Beauty transposon system：a non-viral vector for gene therapy.”Hum.Mol.Genet.(2011)R1：R14-20；及Zhao S.等人，“PiggyBac transposon vectors：the tools of the human gene editing.”Transl.Lung Cancer Res.(2016)5(1)：120-125，該等參考文獻以引用之方式併入本文中。在一些實施方案中，藉由物理方法將編碼嵌合受體或嵌合受體系統之核酸中之任何一或多者引入經工程改造免疫細胞中，該物理方法包括但不限於電穿孔、聲穿孔、光穿孔、磁轉染、水穿孔。
在一些實施方案中，載體包含編碼本文所述抗CLL1構築體之核酸中之任一者。可使用此項技術中任何已知分子選殖方法將核酸選殖至載體中，該等方法包括例如使用限制性核酸內切酶位點及一或多種可選標誌物。在一些實施方案中，核酸可操作地連接於啟動子。已探索各種啟動子在哺乳動物細胞中之基因表現，且本發明中可使用此項技術中已知啟動子中之任一者。啟動子可大致分為組成型啟動子或調節型啟動子，諸如誘導型啟動子。
在一些實施方案中，編碼嵌合受體之核酸可操作地連接於組成型啟動子。組成型啟動子使得異源基因(亦稱為轉殖基因)可在宿主細胞中組成型表現。本文涵蓋之例示性組成型啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)啟動子、 人類延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C啟動子(UbiC)、磷酸甘油激酶啟動子(PGK)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)及雞β-肌動蛋白啟動子與CMV早期增強子之偶合物(CAGG)。已在大量研究中廣泛比較了此類組成型啟動子對驅動轉殖基因表現之效率。舉例而言，Michael C.Milone等人比較了CMV、hEF1α、UbiC及PGK在原代人類T細胞中驅動嵌合受體表現之效率，且得出結論，hEF1α啟動子不僅誘導最高水準之轉殖基因表現，而且最佳地維持在CD4及CD8人類T細胞中(Molecular Therapy,17(8)：1453-1464(2009))。在一些實施方案中，編碼嵌合受體之核酸可操作地連接於hEF1α啟動子。
在一些實施方案中，編碼嵌合受體之核酸可操作地連接於誘導型啟動子。誘導型啟動子屬於調節型啟動子。誘導型啟動子可藉由一或多種條件(諸如物理條件)、經工程改造免疫細胞之微環境或經工程改造免疫細胞之生理狀態、誘導物(亦即誘導劑)或其組合來誘導。在一些實施方案中，誘導條件不誘導經工程改造哺乳動物細胞中及/或接受醫藥組成物之受試者中內源基因之表現。在一些實施方案中，誘導條件選自：誘導物、照射(諸如電離輻射、光)、溫度(諸如熱)、氧化還原狀態、腫瘤環境及經工程改造哺乳動物細胞之活化狀態。
在一些實施方案中，載體亦含有可選標誌基因或報道基因，以自經由慢病毒載體轉染之宿主細胞群中選擇表現嵌合受體之細胞。可選標誌物及報道基因均可側接適當調節序列以使其可在宿主細胞中表現。舉例而言，載體可含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及用於調節核酸序列表現之啟動子。
在一些實施方案中，載體包含一或多個編碼嵌合受體之核酸。在一些實施方案中，載體包含如下核酸，其包含編碼第一嵌合受體之第一核酸序列及編碼第二嵌合受體之第二核酸序列，其中第一核酸經由編碼自切割肽之第三核酸可操作地連接於第二核酸。在一些實施方案中，自切割肽選自由T2A、P2A及F2A組成之群。在一些實施方案中，自切割肽為P2A。在一些實施方案中， 自切割肽包含SEQ ID NO：148之胺基酸序列。在一些實施方案中，載體還包含編碼安全性開關抗原或抗原決定基之核酸。在一些實施方案中，安全性開關抗原或抗原決定基來源於CD52、EGFR或CD20。
免疫細胞
在一些實施方案中，經工程改造免疫細胞為免疫效應細胞。「免疫效應細胞」為可執行免疫效應功能之免疫細胞。在一些實施方案中，免疫效應細胞表現至少FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之免疫效應細胞之實例包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞、嗜中性粒細胞及嗜酸性粒細胞。
在一些實施方案中，免疫細胞為T細胞，諸如細胞毒性T細胞及/或輔助性T細胞。在一些實施方案中，T細胞為CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或其組合。在一些實施方案中，T細胞在表現CAR且結合標靶細胞(諸如CLL1+腫瘤細胞)後產生IL-2、TFN及/或TNF。在一些實施方案中，CD8+ T細胞在表達CAR且結合標靶細胞後裂解抗原特異性標靶細胞。在一些實施方案中，免疫細胞為γδ T細胞。
在一些實施方案中，免疫細胞為NK細胞。在其他實施方案中，免疫細胞可來源於所建立之細胞系，例如NK-92細胞。
在一些實施方案中，免疫細胞為自然殺傷T細胞。
在一些實施方案中，免疫細胞自幹細胞(諸如造血幹細胞、多能幹細胞、iPS或胚胎幹細胞)分化。
藉由將CAR引入免疫細胞(諸如T細胞)中來製備經工程改造免疫細胞。在一些實施方案中，藉由轉染部分III中所述之經分離核酸中之任一者或載體中之任一者將CAR引入免疫細胞中。在一些實施方案中，藉由將蛋白質插入 細胞膜中，同時使細胞通過微流體系統(諸如CELL SQUEEZE®)來將CAR引入免疫細胞(參見例如美國專利申請公開案第20140287509號)。
將載體或經分離核酸引入哺乳動物細胞中之方法為此項技術中所已知。所述載體可藉由物理、化學或生物學方法轉移至免疫細胞中。
將載體引入免疫細胞中之物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。產生包含載體及/或外源核酸之細胞的方法為此項技術中所熟知。參見例如Sambrook等人，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。在一些實施方案中，藉由電穿孔將載體引入細胞中。
將載體引入免疫細胞中之生物學方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體已成為將基因插入哺乳動物(例如人類)細胞中最廣泛使用之方法。
用於將載體引入免疫細胞中之化學方法包括膠體分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。用作活體外遞送媒劑之例示性膠體系統為脂質體(例如人工膜囊)。
在一些實施方案中，可藉由習知方法(例如活體外轉錄)製備編碼本文所述嵌合受體或嵌合受體系統中之任一者的RNA分子，隨後經由已知方法(諸如mRNA電穿孔)將引入免疫細胞中。參見例如Rabinovich等人，Human Gene Therapy 17：1027-1035。
在一些實施方案中，在引入載體或經分離核酸後，使經轉導或轉染免疫細胞離體繁殖。在一些實施方案中，將經轉導或轉染免疫細胞培養以繁殖至少約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中之任一者。在一些實施方案中，進一步評價或篩選經轉導或轉染免疫細胞以選擇經工程改造哺乳動物細胞。
報道基因可用於鑑別潛在轉染細胞及評價調節序列之功能。通常，報道基因為如下基因，其不存在於受者生物體或組織中或不由受者生物體或組織表現，且編碼表現藉由一些易於偵測之特性(例如酶活性)顯現之多肽。在將DNA引入受者細胞後之合適時間測定報道基因之表現。合適報道基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因之基因(例如Ui-Tei等人，FEBS Letters 479：79-82(2000))。合適表現系統為吾人所熟知，且可使用已知技術製備或自商業上獲得。
證實經工程改造免疫細胞中編碼嵌合受體或嵌合受體系統之核酸之存在的其他方法包括例如熟習此項技術者熟知之分子生物學測定，諸如Southern及Northern墨點法、RT-PCR及PCR；生物化學測定，諸如例如藉由免疫學方法(諸如ELISA及Western墨點法)偵測特定肽之存在或不存在。
1. 免疫細胞之來源
在免疫細胞擴增及遺傳修飾之前，從個體獲得免疫細胞(例如T細胞)之來源。免疫細胞(例如T細胞)可自多種來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸腔積液、脾臟組織及腫瘤。在一些實施方案中，可使用此項技術中可獲得之任何數量之免疫細胞(例如T細胞)系。在一些實施方案中，可使用熟習此項技術者已知之任何數量之技術(諸如FICOLLTM分離)自由受試者收集之血液單位獲得免疫細胞(例如T細胞)。在一些實施方案中，藉由單采血液分離術獲得來自個體之循環血液的細胞。單采血液分離術產品通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白細胞、紅細胞及血小板。在一些實施方案中，可洗滌藉由單采血液分離術收集之細胞以移除血漿級分且將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施方案中，以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些實施方案中，洗滌溶液缺乏鈣且可缺乏鎂或可缺乏多種(若非全部) 二價陽離子。再次令人驚訝地，在鈣不存在下之初始活化步驟產生放大之活化。如一般技術者所容易理解的，洗滌步驟可藉由此項技術者已知之方法完成，諸如藉由使用半自動化「流通式」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根據製造商之說明完成。洗滌後，可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液中，諸如無Ca2+無Mg2+之PBS、PlasmaLyte A或具有或不具有緩衝液之其他鹽水溶液。或者，可移除單采血液分離術樣品之非所要組分，且將細胞直接再懸浮於培養基中。
在一些實施方案中，例如藉由經由PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析來溶解紅細胞且清除單核細胞，從而自外周血淋巴細胞分離T細胞。可藉由正或負選擇技術進一步分離T細胞之特定亞群，諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+T細胞。舉例而言，在一些實施方案中，T細胞藉由與抗CD3/抗CD28結合之珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以正選擇所要T細胞之時間段來分離。在一些實施方案中，時間段為約30分鐘。在另一實施方案中，該時間段在30分鐘至36小時或更久及其間所有整數值範圍內。在另一實施方案中，時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在一些實施方案中，時間段為10至24小時。在一些實施方案中，培育時間段為24小時。為自白血病患者分離T細胞，使用更久培育時間(諸如24小時)可提高細胞產量。在與其他細胞類型相比存在較少T細胞之任何情形下，諸如在自腫瘤組織或自免疫受損個體分離腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)時，可使用更久培育時間分離T細胞。此外，使用更久培育時間可提高捕獲CD8+ T細胞之效率。因此，可藉由簡單地縮短或延長使T細胞結合於CD3/CD28珠粒之時間及/或藉由提高或降低珠粒與T細胞之比率(如本文進一步所述)，在培養起始時或在處理過程中之其他時間點優先選擇或不選擇T細胞之亞群。另外，可藉由增加或減少珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，在培養起始時或在其他 所要時間點優先選擇或不選擇T細胞之亞群。熟練技術者將認識到亦可使用多輪選擇。在一些實施方案中，可能需要執行選擇程序且在活化及擴增過程中使用「未選擇」之細胞。「未選擇」之細胞亦可進行其他輪次之選擇。
藉由陰性選擇富集免疫細胞(例如T細胞)群可以針對陰性選擇細胞獨有之表面標誌物之抗體的組合完成。一種方法為經由負磁性免疫黏附或流式細胞術進行細胞分選及/或選擇，該方法使用針對負選擇細胞上存在之細胞表面標誌物之單株抗體之混合物。舉例而言，為藉由負選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些實施方案中，可能需要富集或正選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+之調節型T細胞。或者，在某些實施方案中，由抗C25結合之珠粒或其他類似選擇方法來清除T調節型細胞。
為藉由正選擇或負選擇分離所要細胞群，可改變細胞及表面(例如粒子，諸如珠粒)之濃度。在某些實施方案中，可能需要顯著減小珠粒與細胞混合在一起之體積(亦即提高細胞之濃度)，來確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，在一實施方案中，使用20億個細胞/毫升之濃度。在一實施方案中，使用10億個細胞/毫升之濃度。在另一實施方案中，使用大於1億個細胞/毫升。在另一實施方案中，使用0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5億個細胞/毫升之細胞濃度。在另一實施方案中，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1億個細胞/毫升之細胞濃度。在其他實施方案中，可使用1.25或1.5億個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可產生增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度使得可更有效地捕獲可弱表現目標標靶抗原之細胞(諸如CD28-陰性T細胞)，或來自存在多種腫瘤細胞之樣品(亦即白血病血液、腫瘤組織等)的細胞。此類細胞群可具有治療價值，且需要獲得。舉例而言，使用高濃度細胞使得可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一些實施方案中，可能需要使用較低濃度之細胞。藉由顯著稀釋T細胞與表面(例如粒子，諸如珠粒)之混合物，使粒子與細胞之間的相互作用達最小化。此舉可選擇表現大量所要抗原之細胞與粒子結合。舉例而言，在稀濃度下，與CD8+ T細胞相比，CD4+ T細胞表現更高水準之CD28，且更有效地經捕獲。在一些實施方案中，所用細胞之濃度為5×106個/毫升。在一些實施方案中，所用濃度可為約1×105個/毫升至1×106個/毫升及其間任何整數值。
在一些實施方案中，可使細胞在2-10℃下或在室溫下在旋轉器上以不同速度培育不同時間長度。
亦可在洗滌步驟後冷凍用於刺激之免疫細胞(例如T細胞)。在不受理論限制下，冷凍及後續解凍步驟藉由移除細胞群中之粒細胞及在某種程度上移除單核細胞而提供更均勻產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟之後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管多種冷凍溶液及參數為此項技術中已知且可用於本發明之上下文中，但一種方法涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO或31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基，或含有例如Hespan及PlasmaLyte A之其他合適細胞冷凍培養基，隨後使細胞以每分鐘1°之速率冷凍至-80℃，且儲存在液氮儲罐之氣相中。除在-20℃下或在液氮中立即進行不受控冷凍之外，亦可使用其他控制冷凍方法。
在一些實施方案中，如本文所述將凍存之細胞解凍且洗滌，且在活化之前使其在室溫下靜置一小時。
本申請案中亦涵蓋在可能需要如本文所述之擴增細胞之前的時間段自受試者收集血液樣品或單采血液分離術產物。因此，可在任何必需時間點收集待擴增細胞之來源，且將所要細胞(諸如T細胞)分離且冷凍以供後期用於任何 數量之將受益於免疫療法之疾病或病狀(諸如本文所述之疾病或病狀)的免疫療法中。在一實施方案中，血液樣品或單采血液分離術樣品係自一般健康受試者獲得的。在某些實施方案中，血液樣品或單采血液分離術樣品係自具有產生疾病之風險，但尚未產生疾病之一般健康受試者獲得的，且將目標細胞分離且冷凍以供後期使用。在某些實施方案中，可將免疫細胞(例如T細胞)擴增、冷凍且在後續時間使用。在某些實施方案中，在診斷如本文所述之特定疾病之後不久但在任何治療之前自患者收集樣品。在一些實施方案中，分離患者之細胞且冷凍以供後期結合骨髓或幹細胞移植，使用化學治療劑(諸如氟達拉濱(fludarabine))之T細胞消融療法、外束輻射療法(XRT)、環磷醯胺或抗體(諸如OKT3或CAMPATH)(例如在其之前、同時或之後)使用。在另一實施方案中，將細胞在B細胞消融療法(諸如與CD20反應之藥劑，例如Rituxan)後之治療之前分離，且可冷凍以供後期用於該治療。
在一些實施方案中，在治療後直接自患者獲得免疫細胞(例如T細胞)。在此方面，已觀察到，在某些癌症治療，尤其以損傷免疫系統之藥物治療之後，在治療後不久在患者通常會自治療恢復之時間段期間，所得免疫細胞(例如T細胞)在其離體擴增能力方面之品質可為最佳或改良的。同樣，在使用本文所述方法離體操作之後，此等細胞可呈較佳狀態以供增強之植入及活體內擴增。因此，在本發明上下文中預期在此恢復階段期間收集血細胞，包括T細胞、樹突狀細胞或造血譜系之其他細胞。此外，在某些實施方案中，可使用動員(例如以GM-CSF動員)及調節方案在受試者中產生如下狀態，其中特定細胞類型之再增殖、再循環、再生及/或擴增為有利的，尤其在治療後指定時間窗期間。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
2. 免疫細胞之活化及擴增
無論在以本文所述之嵌合受體或嵌合受體系統遺傳修飾免疫細胞(例如T細胞)之前抑或之後，通常均可使用如以下所述之方法活化及擴增免疫細胞(例如T細胞)，例如：美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國專利申請公開案第20060121005號。
通常，T細胞可藉由與連接有刺激CD3/TCR複合物相關信號之試劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子的配體的表面接觸而擴增。詳言之，可如本文所述刺激T細胞群，諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段或固定在表面上之抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚抑素)以及鈣離子載體接觸。為共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配體。舉例而言，可在適合於刺激T細胞增殖之條件下使T細胞群與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。為刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，其可如此項技術中通常已知之其他方法使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63,1999)。
在一些實施方案中，可藉由不同方案提供T細胞之主要刺激信號及共刺激信號。舉例而言，提供各信號之試劑可為溶液形式或與表面偶合。當與表面偶合時，該試劑可與相同表面(亦即，以「順式」形式)偶合或與各別表面(亦即，以「反式」形式)偶合。或者，一種試劑可與表面偶合，且另一試劑可為溶液形式。在一實施方案中，提供共刺激信號之試劑與細胞表面結合，且提供主要活化信號之試劑為溶液形式或與表面偶合。在某些實施方案中，兩種藥劑均 可為溶液形式。在另一實施方案中，試劑可為可溶形式，隨後與表面交聯，該表面諸如表現Fc受體之細胞或將結合該等試劑之抗體或其他結合劑。在此方面，參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號中之人工抗原呈遞細胞(aAPC)，在本發明中預期該等細胞可用於活化及擴增T細胞。
在一些實施方案中，將T細胞與塗有試劑之珠粒組合，隨後分離珠粒與細胞，接著培養細胞。在一替代性實施方案中，在培養之前，未分離塗有試劑之珠粒與細胞，而是在一起培養。在另一實施方案中，首先藉由施加力(諸如磁力)濃縮珠粒及細胞以使細胞表面標誌物之連接增加，從而誘導細胞刺激。
舉例而言，可藉由使連接有抗CD3及抗CD28之順磁珠粒接觸T細胞來連接細胞表面蛋白。在一實施方案中，將細胞(例如104至109個T細胞)與珠粒(例如1：1比率之DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁珠粒)在緩衝液，較佳PBS(無二價陽離子，諸如鈣及鎂)中組合。再次，一般技術者可容易地理解可使用任何細胞濃度。舉例而言，標靶細胞在樣品中可能非常稀少且僅佔樣品之0.01%，或整個樣品(亦即100%)可包含目標標靶細胞。因此，任何細胞數量均屬於本發明之上下文中。在某些實施方案中，可能需要顯著減小粒子與細胞混合在一起之體積(亦即提高細胞之濃度)，來確保細胞與粒子之最大接觸。舉例而言，在一個實施方案中，使用約20億個細胞/毫升之濃度。在另一實施方案中，使用大於1億個細胞/毫升。在另一實施方案中，使用0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5億個細胞/毫升之細胞濃度。在另一實施方案中，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1億個細胞/毫升之細胞濃度。在其他實施方案中，可使用1.25或1.5億個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可產生增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度使得可更有效地捕獲可能弱表現標靶抗原之細胞，諸如CD28陰性T細胞。此類細胞群可具有治療價值，且 在某些實施方案中需要獲得。舉例而言，使用高濃度細胞使得可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一些實施方案中，可將混合物培養數小時(約3小時)至約14天或其間任何小時整數值。在另一實施方案中，可培養混合物21天。在本發明之一實施方案中，將珠粒及免疫細胞(例如T細胞)一起培養約八天。在另一實施方案中，將珠粒及免疫細胞(例如T細胞)一起培養2-3天。亦可能需要數個刺激週期以使得免疫細胞(例如T細胞)之培養時間可為60天或更久。適用於免疫細胞(例如T細胞)培養之條件包括適當培養基(例如最低必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可含有增殖及存活所要之因子，包括血清(例如胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟練技術者已知用於細胞生長之任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括但不限於界面活性劑、血漿製品及還原劑，諸如N-乙醯基半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640；AIM-V；DMEM；MEM；α-MEM；F-12；X-Vivo 15及X-Vivo 20；Optimizer，其添加有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，不含血清或補充有適量血清(或血漿)或指定激素組，及/或添加有足以使免疫細胞(例如T細胞)生長及擴增之量的細胞因子。僅在實驗培養物中包括抗生素(例如青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin))，而不在待輸注入受試者之細胞的培養物中包括。將標靶細胞維持在支持生長所必需之條件(例如適當溫度(例如37℃)及氛圍(例如空氣加5% CO2))下。暴露於不同刺激時間之免疫細胞(例如T細胞)可展現不同特徵。舉例而言，典型血液或單采血液分離術獲得之外周血單核細胞產物的輔助性T細胞群(TH，CD4+)多於細胞毒性或抑制性T細胞群(TC，CD8)。藉由刺激CD3及CD28受體離體擴增T細胞產生T細胞群，該細胞群在約8-9天之前主要由TH細胞組成，而在約8-9天之後，該T細胞群包含愈來愈大之TC細胞群。因此，視治療目的而定，向受試者輸注主要 包含TH細胞之T細胞群可為有利的。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性亞組，則在更大程度上擴增此亞組可為有益的。
此外，除CD4及CD8標誌物外，其他表型標誌物在細胞擴增過程中亦顯著變化，但大部分為可再現地。因此，此種再現性使得能夠針對特定目的定製經活化T細胞產物。
V. 醫藥組成物
本申請案進一步提供醫藥組成物，其包含抗CLL1構築體(包括抗CLL1 sdAb、嵌合受體、免疫效應細胞銜接子及免疫結合物)中之任一者，或包含如本文所述之抗CLL1嵌合受體或嵌合受體系統中之任一者的經工程改造免疫細胞中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。醫藥組成物可藉由將具有所要純度之抗CLL1構築體或複數個經工程改造免疫細胞與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.版(1980))以凍乾調配物或水溶液形式混合來製備。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在使用劑量及濃度下對受者無毒，且包括緩衝劑；抗氧化劑，其包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉；防腐劑；等張劑；穩定劑；金屬錯合物(例如鋅-蛋白錯合物)；螯合劑，諸如EDTA及/或非離子界面活性劑。
為將醫藥組成物用於活體內投與，其必須為無菌的。可藉由經無菌濾膜過濾來使醫藥組成物無菌。通常將本文之醫藥組成物置於具有無菌進入口之容器(例如，靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞的小瓶)中。
投藥途徑根據已知且可接受之方法，諸如藉由以合適方式長時間單次或多次推注或輸注，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑注射或輸注；局部投與；吸入；或藉由持續釋放或延長釋放方式。
本文所述之醫藥組成物亦可含有超過一種所治療特定適應症所必需之活性化合物或藥劑，較佳為具有不會不利地彼此影響之互補活性的活性化合物或藥劑。或者或另外，組成物可包含細胞毒性劑、化學治療劑、細胞因子、免疫抑制劑或生長抑制劑。此類分子適合以對預期目的有效之量組合存在。
活性成分亦可截留在以下中：微膠囊，其例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備，該等微膠囊分別例如羥基甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)；或大乳液。此類技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版中。
VI. 治療方法
本申請案之一態樣提供治療個體之疾病(諸如癌症)之方法，其包括向個體投與有效量之本文所述抗CLL1構築體中之任一者。在一些實施方案中，本申請案提供用於細胞免疫療法中之方法及組成物。在一些實施方案中，細胞免疫療法係用於治療癌症，包括但不限於血液惡性腫瘤及實體腫瘤。本文所述之抗CLL1 sdAb、免疫效應細胞銜接子、嵌合受體、免疫結合物及經工程改造免疫細胞(諸如CAR-T細胞)中之任一者均可用於治療癌症之方法中。例示性癌症類型包括但不限於急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及骨髓化生不良症候群(MDS)。在一些實施方案中，本文所述之方法及組成物可用於治療與CLL1相關之其他疾病。
在一些實施方案中，提供一種治療個體(諸如人類個體)之疾病(諸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向個體投與有效量之包含抗CLL1構築體之醫藥組成物，該抗CLL1構築體包含特異性結合CLL1之sdAb部分，其中sdAb部分(例如VHH)包含：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基 酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包 含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為僅重鏈抗體。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為多特異性抗體，諸如雙特異性抗體。在一些實施方案中，抗CLL1構築體為免疫結合物。
在一些實施方案中，提供一種治療個體(諸如人類個體)之疾病(諸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向個體投與有效量之包含免疫效應細胞銜接子之醫藥組成物，該免疫效應細胞銜接子包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之標靶細胞結合域，及(b)包含特異性結合免疫效應細胞上之抗原之抗原結合片段的免疫效應細胞結合域。在一 些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺 基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域中之抗原結合片段為Fab、scFv或sdAb。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與免疫效應細胞結合域之N端融合。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與免疫效應細胞結構域之C端融合。在一些實施方案中，標靶細胞結合域與免疫效應細胞結合域經由肽連接子融合。在一些實施方案中，免疫效應細胞為T細胞。在一些實施方案中，免疫效應細胞結合域特異性結合選自由以下 組成之群之抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L及HVEM。
在一些實施方案中，提供一種治療個體(諸如人類個體)之疾病(諸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向個體投與有效量之包含經工程改造免疫細胞(例如T細胞)之醫藥組成物，該經工程改造免疫細胞包含：抗CLL1嵌合受體，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含免疫效應細胞(諸如T細胞)之主要細胞內信號傳導序列。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方案中，主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。在一些實施方案中，細胞內共刺激序列來源於CD28或4-1BB。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域；(b)跨膜域；及(c)包含CD3ζ細胞內信號傳導序列及來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列的細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸 序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含SEQ ID NO：120-132、177-179、181及229-230中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：120-132、177-179及181及229-230中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，抗CLL1嵌合受體包含SEQ ID NO：125或181之胺基酸序列。在一些實施方案中，經工程改造免疫效應細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。在一些實施方案中，該方法進一步包含隨後投與有效量之特異性結合安全性開關抗原或抗原決定基的治療性抗體。
在一些實施方案中，提供一種治療個體(諸如人類個體)之疾病(諸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向個體投與有效量之包含經工 程改造免疫細胞(例如T細胞)之醫藥組成物，該經工程改造免疫細胞包含多特異性(例如雙特異性)嵌合受體，該多特異性嵌合受體包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)及特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二sdAb(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域；(b)跨膜域；及(c)細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，細胞內信號傳導域包含CD3ζ細胞內信號傳導序列及來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列。在一些實施方案中，第二結合部分為抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之細胞外域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包 含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含 如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含如下多肽，該多肽包含SEQ ID NO：184-195中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：184-195中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，多特異性嵌合受體包含SEQ ID NO：184、185或188之胺基酸序列。在一些實施方案中，經工程改造免疫效應細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。在一些實施方案中，該方法進一步包含隨後投與有效量之特異性結合安全性開關抗原或抗原決定基的治療性抗體。
在一些實施方案中，提供一種治療個體(諸如人類個體)之疾病(諸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向個體投與有效量之包含經工程改造免疫細胞(例如T細胞)之醫藥組成物，該經工程改造免疫細胞包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞之主要細胞內信號傳導序列(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)的細胞內信號傳導域；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含細胞內共刺激序列(例如來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列)之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，提供一種治療個體(諸如人類個體)之疾病(諸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向個體投與有效量之包含經工程改造免疫細胞(例如T細胞)之醫藥組成物，該經工程改造免疫細胞包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb(諸如本文所述抗CLL1 sdAb中之任一者)之細胞外域、跨膜域及包含有包含細胞內共刺激序列(例如來源於CD28或4-1BB之細胞內共刺激序列)之細胞內信號傳 導域的細胞內域；(b)第二嵌合受體，其包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分(例如sdAb、scFv或受體之細胞外域)的細胞外域、跨膜域及包含免疫細胞之主要細胞內信號傳導序列(例如CD3ζ細胞內信號傳導序列)之細胞內信號傳導域。在一些實施方案中，第二結合部分為抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些實施方案中，第二結合部分為NKG2D之細胞外域。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中之任一者：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或(16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。在一些實施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下VHH域，其包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，經工程改 造免疫細胞包含雙重嵌合受體構築體，該雙重嵌合受體構築體包含經由自切割肽(例如P2A肽)與第二嵌合受體融合之第一嵌合受體。在一些實施方案中，雙重嵌合受體構築體包含SEQ ID NO：234-236中之任一者之胺基酸序列或其包含與SEQ ID NO：234-236中之任一者之胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列的變體。在一些實施方案中，經工程改造免疫效應細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基，諸如CD52、EGFR或CD20。在一些實施方案中，該方法進一步包含隨後投與有效量之特異性結合安全性開關抗原或抗原決定基的治療性抗體。
本文所述之方法適用於治療各種癌症，包括實體癌症及液體癌症。該等方法適用於所有階段之癌症，包括早期、晚期及轉移性癌症。本文所述方法可在輔助療法或新輔助療法中用作第一療法、第二療法、第三療法或與此項技術中已知之其他類型癌症療法用作組合療法，該等癌症療法諸如化學療法、手術、輻射、基因療法、免疫療法、骨髓移植、幹細胞移植、靶向療法、冷凍療法、超聲療法、光動力療法、射頻消融等。在一些實施方案中，癌症為急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)或骨髓化生不良症候群(MDS)。
抗CLL1構築體或其醫藥組成物之投與可以任何方便方式進行，包括藉由注射、攝入、輸液、植入或移植。可將醫藥組成物經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內或腹膜內投與患者。在一些實施方案中，全身投與藥物組成物。在一些實施方案中，藉由輸注(諸如靜脈內輸注)向個體投與醫藥組成物。用於免疫療法之輸注技術為此項技術中所已知(參見例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676(1988))。在一些實施方案中，藉由皮內或皮下注射向個體投與醫藥組成物。在一些實施方案中，藉由靜脈內注射投與組成物。在一些實施方案中，將組成物直接注射至腫瘤或淋巴結中。在一 些實施方案中，將醫藥組成物局部投至腫瘤位點，諸如直接投至腫瘤細胞中，或具有腫瘤細胞之組織。
本申請案之醫藥組成物的劑量及所要藥物濃度可視預期之特定用途而變化。適當劑量或投藥途徑之確定完全在普通技術人員之技能範圍內。動物實驗為確定人類療法之有效劑量提供可靠指導。可遵循Mordenti,J.及Chappell,W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,”Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等人編，Pergamon Press,New York 1989，第42-46頁提出之原理執行有效劑量之種間標定。在本申請案之範圍內，不同調配物對於不同治療及不同病症將為有效的，且旨在治療特定器官或組織之投藥可能需要以與向另一器官或組織不同之方式遞送。
在醫藥組成物包含本文所述抗CLL1構築體中之任一者的在一些實施方案中，視投藥途徑而定，以每天每千克個體體重約10ng至約100mg或更高(例如以約1毫克/千克/天至10毫克/千克/天)之劑量投與醫藥組成物。
在醫藥組成物包含本文所述經工程改造免疫細胞中之任一者的在一些實施方案中，以每千克個體體重至少約104、105、106、107、108或109個細胞中之任一者之劑量投與醫藥組成物。在一些實施方案中，以每千克個體體重約104至約105、約105至約106、約106至約107、約107至約108、約108至約109、約104至約109、約104至約106、約106至約108或約105至約107個細胞中之任一者之劑量投與醫藥組成物。在一些實施方案中，以至少約1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107個細胞/千克或更多中之任一者之劑量投與醫藥組成物。
在一些實施方案中，單次投與醫藥組成物。在一些實施方案中，多次(諸如2、3、4、5、6次或更多次中之任一者)投與醫藥組成物。在一些實施方 案中，每週一次至每年一次投與醫藥組成物。在一些實施方案中，投藥之間的時間間隔為約1週至一年。熟習醫學技術者可藉由監測患者之病徵且相應地調節治療容易地確定針對特定患者之最佳劑量及治療方案。
此外，可藉由一或多次各別投與或藉由連續輸注來投與劑量。在一些實施方案中，以分割劑量(諸如約2、3、4、5次或更多次劑量中之任一者)投與醫藥組成物。在一些實施方案中，經約一週投與分割劑量。在一些實施方案中，將劑量等分。在一些實施方案中，分割劑量為總劑量之約20%、約30%及約50%。在一些實施方案中，連續分割劑量之間的時間間隔為約1天、2天、3天或更長時間。對於經數天或更久重複投與，視病狀而定，持續治療直至出現所要之疾病症狀抑制。然而，其他劑量方案亦可為有用的。可藉由習知技術及測定容易地監測此療法之進展。
在一些實施方案中，醫藥組成物之量有效引起個體之客觀臨床反應。在一些實施方案中，醫藥組成物之量有效引起個體之疾病緩解(部分或完全)。在一些實施方案中，醫藥組成物之量有效預防個體之癌症的復發或疾病進展。在一些實施方案中，醫藥組成物之量有效延長個體之生存期(諸如無疾病生存期)。在一些實施方案中，醫藥組成物有效改良個體之生活品質。
在一些實施方案中，醫藥組成物之量有效抑制實體或淋巴腫瘤之生長或減小實體或淋巴腫瘤之尺寸。在一些實施方案中，實體或淋巴腫瘤之尺寸減小至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中之任一者)。在一些實施方案中，提供一種抑制個體之實體或淋巴腫瘤之生長或減小實體或淋巴腫瘤之尺寸的方法。
在一些實施方案中，醫藥組成物之量有效抑制個體之腫瘤轉移。在一些實施方案中，抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中之任一者)轉移。在一些實施方案中，提供一種抑制 向淋巴結轉移之方法。在一些實施方案中，提供一種抑制向肺轉移之方法。在一些實施方案中，提供一種抑制向肝臟轉移之方法。可藉由此項技術中之任何已知方法評估轉移，諸如藉由血液測試、骨掃描、X射線掃描、CT掃描、PET掃描及生檢。
VII. 套組及製品
還提供包含本文所述之抗CLL1 sdAb、抗CLL1構築體(諸如嵌合受體、免疫效應細胞銜接子及免疫結合物)或經工程改造免疫細胞的套組、單位劑量及製品。在一些實施方案中，提供一種套組，其含有本文所述醫藥組成物中之任一者。在一些實施方案中，套組還包含其使用說明。
本申請案之套組在合適包裝中。合適包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、可撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。套組可視情況提供其他組分，諸如緩衝液及解釋性資訊。因此，本申請亦提供製品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶、可撓性包裝及其類似物。
製品可包含容器及在容器上或與容器相結合之標籤或包裝插頁。合適容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。通常，容器容納有效治療本文所述疾病或病症(諸如癌症)之組成物，且可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞的小瓶)。標籤或包裝插頁表明該組成物用於治療個體之特定疾病或病狀。標籤或包裝插頁還包含用於向個體投與組成物之說明。標籤可表明復原及/或使用之指南。容納醫藥組成物之容器可為多次使用之小瓶，其允許重複投與(例如2-6次投與)復原調配物。包裝插頁係指通常包括在治療性產品之商業包裝中的說明，其含有關於使用此類治療性產品之適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或警告之資訊。另外，該製品還可包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其還可包括出於商業及使用者觀點適宜之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
套組或製品可包括藥物組成物之多次單位劑量及使用說明書，其包裝數量足以在藥房(例如醫院藥房及混配藥房)中儲存及使用。
實例
以下實例僅欲作為本發明之示例，因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳細描述以說明方式而非限制方式提供。
實例1：抗CLL1 sdAb之產生 CLL1蛋白之重組細胞外域的製備
來自人類或食蟹猴之CLL1蛋白的細胞外蛋白域(ECD)藉由在轉染有編碼表8中之對應胺基酸序列之質體的人類胚腎HEK293細胞中瞬時表現製備。
將各表現質體與293FECTINTM(Life Technologies)複合，且添加至懸浮培養之293-F細胞(源自HEK293細胞)中。轉染後八天，收集培養上清液，且藉由IMAC(GE Healthcare)純化相應可溶性蛋白，得到蛋白質批料。
Figure 108132631-A0202-12-0177-54
免疫
根據所有現行動物福利法規，以CLL1之各重組ECD使駱駝免疫。為進行免疫，以CFA(完全弗氏佐劑(Complete Freund's adjuvant)；初次免疫)或 IFA(不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant)；加強免疫)將抗原調配為乳液。在頸部皮下投與抗原。各動物以兩週時間間隔接受6次乳液注射，該乳液在CFA乳液中含有200μg CLL1-His蛋白，隨後接受5次含CLL1-His蛋白之IFA乳液的注射。在免疫期間之不同時間點，自動物收集10ml血液樣品且製備血清。使用血清樣品，使用基於ELISA之測定以固定之CLL1-His蛋白驗證抗原特異性體液免疫反應之誘導。如圖1-2所示，免疫後血清及免疫球蛋白(包括4鏈抗體及僅重鏈抗體兩者)以濃度依賴性方式特異性結合CLL1-His蛋白。上次免疫後四天，收集180ml血液樣品。使用Ficoll-Paque梯度(Amersham Biosciences)自血液樣品分離外周血淋巴細胞(PBL)作為駱駝HCAb之遺傳來源，得到2.5×108個PBL。
文庫構築
使用自PBL提取之RNA作為RT-PCR之起始材料來擴增編碼sdAb之基因片段。將此等片段選殖至內部噬菌粒載體中。該載體編碼與各sdAb編碼序列同框之C端His標籤。文庫尺寸為約3×109個。根據標準方案製備噬菌體文庫，且在過濾滅菌後儲存在4℃下以供進一步使用。
選擇及高通量篩選
通過固體淘選以及基於細胞之淘選來篩選噬菌體文庫。對於兩種淘選條件中之每一者，僅執行單輪選擇。基於ELISA結果，分析各選擇輸出以確定富集因子(亦即相對於對照，洗脫液中存在之噬菌體數量)、多樣性及CLL1陽性純系之百分比。基於此等參數，選擇最佳純系以用於進一步分析。為此，將各選擇之輸出作為庫再選殖至可溶性表現載體中以進行高通量篩選。該表現載體編碼與各sdAb編碼序列同框之C端His標籤。挑取群落且在96深孔盤(1mL體積/孔)中生長，且藉由添加IPTG及0.1% Triton誘導以在上清液中表現sdAb。
首先使用ELISA測定篩選上清液結合相應CLL1蛋白之能力。對陽性結合物進行測序，且選擇獨特純系以進行進一步表徵。
使獨特純系在2YT培養基中生長，且藉由IPTG誘導以在上清液中表現sdAb。使用FACS測定分析獨特結合物上清液結合表現CLL1之HKE293/huCLL-1細胞系及癌細胞系AML193之能力。藉由BIACORE® T200儀器上之表面電漿子共振(SPR)測定上清液中所選結合物對重組人類及食蟹猴CLL1蛋白之親和力。使用解離相計算各sdAb之kd值。所選抗CLL1 sdAb之結合數據如表9所示。
Figure 108132631-A0202-12-0179-55
實例2：抗CLL1 CAR-T之產生及篩選 CAR構築體之產生
如圖3及表3所示，將各經分離sdAb(SEQ ID NO：94-106及171-173)與4-1BB之細胞內共刺激序列及CD3ζ之細胞內域一起選殖至慢病毒表現載體中。亦構築具有抗CLL1 scFv域之陽性對照CAR(CLL1 BM CAR)。將CAR構 築體(SEQ ID NO：120-132及180)與EF1α啟動子一起選殖至表現載體中以進行表現。CAR構築體之序列如下所示。
SEQ ID NO：120(AS82472 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0180-56
SEQ ID NO：121(AS82480 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0180-57
SEQ ID NO：122(AS82494 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0180-58
Figure 108132631-A0202-12-0181-59
SEQ ID NO：123(AS82505 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0181-60
SEQ ID NO：124(AS82544 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0181-61
SEQ ID NO：125(AS82658 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0181-62
Figure 108132631-A0202-12-0182-63
SEQ ID NO：126(AS82718 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0182-64
SEQ ID NO：127(AS83180 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0182-65
SEQ ID NO：128(AS83183 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0183-66
SEQ ID NO：129(AS83309 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0183-67
SEQ ID NO：130(AS83431 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0183-68
Figure 108132631-A0202-12-0184-69
SEQ ID NO：131(AS83478 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0184-70
SEQ ID NO：132(AS83791 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0184-71
SEQ ID NO：177(AS83010 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0184-72
Figure 108132631-A0202-12-0185-73
SEQ ID NO：178(AS83457 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0185-74
SEQ ID NO：179(AS83591 CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0185-75
SEQ ID NO：180(CLL1 BM CAR)
Figure 108132631-A0202-12-0185-76
Figure 108132631-A0202-12-0186-77
慢病毒之製備
將包括pCMV-△R-8.47及pMD2.G(Addgene，Cat # 12259)之慢病毒包裝質體混合物與包含CAR構築體之各載體PLLV-hEF1α-CLL1以與聚乙烯亞胺之預最佳化比率預混合。隨後將混合物添加至HEK293細胞中。隔夜培育之後收集細胞上清液。使含病毒之上清液通過0.45μm PES過濾器過濾，繼而超速離心以使慢病毒成粒。以預冷之PBS沖洗病毒丸粒。將病毒等分且立即儲存在-80℃中。藉由使用流式細胞術測定量測對supT1細胞系之轉導效率來確定病毒效價。
T淋巴細胞之收集及轉導
藉由單采血液分離術自健康供體收集白血球。使用FICOLL-PAQUETM PLUS培養基(GE Healthcare，目錄號17-5442-02)根據製造商之方案分離外周血單核細胞(PBMC)。按照製造商之方案，使用泛T細胞分離套組(Miltenyi，目錄號130-096-535)自PMBC純化人類T細胞。隨後根據製造商之方案以人類T細胞活化/擴增套組(Miltenyi，目錄號130-091-441)預活化經純化T細胞48小時，其中以1：2之珠粒與細胞比率添加抗CD3/CD28 MACSi珠粒粒子。在7μg/ml聚凝胺存在下，以各慢病毒儲液轉導經預活化之T細胞。隨後將經轉導細胞轉移至細胞培養培育箱以在合適條件下進行轉殖基因表現。
活體外細胞毒性測定
為在活體外快速評價CAR-T細胞之抗腫瘤活性，進行LDH(乳酸脫氫酶)細胞毒性測定。轉導後第6天或第11天，收穫經轉導T細胞，且與標靶細胞(CLL1+ AML細胞系THP-1)以5：1或1：1之E/T比率(效應子：CAR-T/標靶：THP-1)共培育20小時。使用來自相同批料之未轉導T細胞(「UnT」)作為陰性對照。按照製造商之手冊(Roche，11644793001)進行測定。藉由以下等式計算細胞毒性([LDH]E+T：自E/T共培育釋放之LDH，[LDH]E：僅自效應子釋放之LDH，[LDH]max：自以Triton X-100處理之標靶細胞釋放之LDH，[LDH]min：自未處理之標靶細胞釋放之LDH)：
Figure 108132631-A0202-12-0187-79
如圖4所示，相對於CLL1 BM CAR-T細胞，所有抗CLL1 CAR-T細胞均展示針對THP-1細胞之更強細胞毒性。
藉由HTRF偵測之IFN-γ及TNF-α分泌
效應T細胞活化及增殖之另一量度為效應細胞因子(諸如IFN-γ及TNF-α)之產生。收集來自活體外細胞毒性測定之上清液以評估CAR誘導之細胞因子釋放。根據製造商之手冊，針對IFN-γ(Cisbio，目錄號62HIFNGPEH)及TNFα(Cisbio，目錄號62HTNFAPEH)進行HTRF測定。
相應細胞因子釋放結果如圖5A-5D所示。所有抗CLL1 CAR-T細胞均展現針對THP-1細胞之有效殺滅活性，且響應於THP-1細胞釋放出IFN-γ和TNF-α。
長期共培養測定
為評價CAR-T細胞之長期殺滅功效，執行長期共培養測定，該等測定模擬活體內之動態殺滅過程。以CFSE(SIGMA-ALDRICH，目錄號21888-25MG-F)標記腫瘤細胞系(例如THP-1)。在外源細胞因子(IL-2)不存在下， 將經轉導或未轉導之T細胞(2×105個/孔)與腫瘤細胞系(例如CFSE-THP-1細胞，2×105或4×105個/孔)以1：1或1：2之E：T比率在24孔盤中共培養。共培養2或3天后，收穫細胞之一部分且進行CD3染色。藉由CFSE+信號鑑別腫瘤細胞。為進行連續共培養測定，隨後以相同E：T比率以新鮮CFSE-THP-1細胞再攻擊剩餘T細胞。繼續進行共培養直至腫瘤細胞生長。各時間點之T細胞增殖率藉由將該時間點之T細胞數除以前一時間點之T細胞數來計算。
藉由FACS偵測進行長期共培養測定之代表性結果如圖6A所示。來自同一實驗之計算T細胞增殖率及總T細胞計數分別如圖6B及圖6C中所示。數據表明，來源於sdAb AS83478之CAR-T的增殖及持久性優於CLL1 BM CAR及所測試之其餘純系。
群落形成單位(CFU)測定
藉由CFU測定評估抗CLL1 CAR-T細胞在活體外對正常白血病祖細胞之潛在細胞毒性。將自臍帶血(CB)免疫磁分離之CD34+細胞(HemaCare，目錄號：CB34C-2)與測試CAR-T細胞、unT細胞或單獨之培養基(未處理)以10：1之E：T(T細胞：CB細胞)比率共培養6小時。隨後將每孔總數5,000個混合細胞塗於MethoCult H4034 Optimum培養基(STEMCELL Technologies)中，且培養5-7天，隨後計數群落形成單位。使用BCMA及未轉導之T細胞作為陰性對照。數據表示為各樣品在三個皮氏培養皿中之群落數量的平均值±SEM。
小鼠異種移植模型中之活體內功效評價
培養U937-Luc，再懸浮於HBSS-/-中，且以每只小鼠2x 106個細胞靜脈內注射。腫瘤接種後每週或每兩週進行一次生物發光成像(BLI)，以監測模型之產生。基於BLI光子數及動物體重將動物隨機分組。隨機分組後，靜脈內輸注單次劑量之CAR-T細胞(AS82494 CAR-T、AS82658 CAR-T、AS83183 CAR-T、AS83431 CAR-T、AS83478 CAR-T及陽性對照CLL1 BM CAR-T)或UnT細胞。每週進行BLI成像以記錄腫瘤生長。
如圖7所示，在輸注後2-3週後，以AS83183、AS83431或AS82658 CAR-T細胞處理之小鼠無腫瘤(BLI為約106個)，而以UnT或媒劑處理之小鼠展現快速腫瘤進展，且必須在實驗結束前安樂死。然而，以AS83183及AS83431 CAR-T細胞處理之小鼠在變得無腫瘤後由於不受控之CAR-T細胞擴增死亡。此等結果展示吾等抗CLL1 sdAb CAR-T細胞比CLL1 BM CAR有效。
進行外周血樣品之FACS分析以確定CAR-T細胞之持久性。在研究之終點，進行外周血、脾臟及骨髓樣品等之FACS分析。
具有人類化免疫系統之小鼠模型中的活體內毒性評價
為在小鼠中重構人類免疫系統(HIS)，向NCG小鼠輸注來源於臍帶血之CD34+細胞(HemaCare，目錄號：CB34C-2)。藉由流式細胞術分析來自各種人類免疫亞組之外周血樣品證實重構。為製備CAR-T細胞，均如上所述，自HIS小鼠之脾臟分離人類T細胞，擴增且以表現CAR之候選慢病毒轉導。為研究CAR-T細胞之毒性，向HIS小鼠輸注2×106個來源於同一CD34+細胞供者之CAR-T細胞。一週兩次監測動物健康狀態及體重，且每週藉由流式細胞術偵測小鼠外周血中之人類免疫細胞亞組。在指定時間點及研究結束時，對動物進行安樂死，收穫諸如脾臟及骨髓之器官，且使用FACS分析人類免疫細胞及造血幹細胞之存在。
非人類靈長類動物(NHP)模型中之活體內毒性評價
為製備CAR-T細胞，分離來源於食蟹獼猴之T細胞，擴增且以表現CAR之候選慢病毒轉導。為研究CAR-T之短期毒性，以環磷醯胺及氟達拉濱對動物進行預處理，隨後輸注自體CAR-T細胞。輸注後，每天監測受者動物之細胞因子釋放症候群(CRS)及神經毒性之臨床病徵及症狀。藉由外周血樣品之流式 細胞術分析評估CAR-T細胞中之持久性及數目變化。藉由ELISA或Meso Scale Discovery測定評估CRS相關之細胞因子水平。在指定時間點及研究結束時，對動物進行安樂死，收穫諸如脾臟及骨髓之器官且使用FACS分析。
實例3：其他抗CLL1 CAR構築體之產生及評價 CAR構築體之產生
使用來自實例2之前沿抗CLL1 sdAb作為CLL1結合域來構築其他CAR及CAR系統，如圖8A-8E所示。
舉例而言，如圖8A所示之具有單特異性細胞外域及包含細胞內共刺激序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列兩者之細胞內信號傳導域的「常規CAR」可反應且殺滅表現CLL1之細胞。如圖8B所示之「串聯CAR」藉由經由肽連接子融合特異性識別不同標靶之兩個結合域以在單一CAR分子中形成細胞外域來構築。串聯CAR可對表現兩種標靶分子(諸如CLL1、CD33及NKG2D配體)中之任一者的細胞起反應。串聯CAR預期同時以較高親和力及特異性結合表現兩種標靶分子之標靶細胞，從而以低劑量產生改良之反應。如圖8C所示，「雙重CAR」藉由表現針對不同標靶之兩種全功能CAR構築。雙重CAR可對表現CLL1或CD33、CD123或NKG2D配體中之任一者的細胞作出反應。如圖8D-8E所示之「分割CAR」對表現CLL1及CD33、CD123或NKG2D配體中之任一者兩者的細胞具有完全反應，但對僅表現CLL1、CD33、CD123或NKG2D配體中之一者的細胞僅具有邊緣反應，此可產生較佳安全性概況。
安全性開關
為限制CAR-T細胞之潛在毒性，可在CAR構築體中包括某些安全性開關。舉例而言，將CAR-T細胞經工程改造以進一步表現CD20、EGFR或CD52之全長抗原或某些肽抗原決定基序列。為清除CAR-T細胞，可投與針對 經工程改造抗原或抗原決定基之抗體，從而經由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性消除CAR-T細胞。
活體內抗體介導之CAR-T細胞消除
為評估完成情況且鑑別抗體介導之CAR-T細胞消除的最佳時機，在指定時間點向植入HL-60、MV4-11、THP-1或U937之小鼠(每個群組n=5至8只小鼠；時間點=第0週)靜脈內投與1次劑量之鹽水、未轉導T細胞(unT)或1.0×106個CAR-T細胞。隨後，在投與CAR-T後之指定時間點，藉由腹膜內注射(i.p.)1次劑量之1或5mg/kg阿侖單抗(人類化抗CD52抗體)來向動物投藥。如上所述，每週藉由BLI及FACS定量人類AML及CAR-T細胞來評估動物。收穫鼠類骨髓及脾臟，以藉由FACS定量人類AML及T細胞。在一些研究中進行鼠類組織之組織病理學及免疫組織化學分析，以評估以阿侖單抗進行T細胞消融之完成情況。
如上所述，以鹽水、unT或CAR-T-CD20細胞(每只小鼠1.0×106個細胞)處理植入HL-60、MV4-11、THP-1或U937之其他小鼠群組(每個處理n=5)。隨後在CAR-T-CD20後4週，以1mg/kg之劑量的抗CD20抗體利妥昔單抗(rituximab)(Roche)腹膜內處理動物來消除T細胞。藉由BLI及FACS評估動物以定量白血病負荷及CAR-T細胞。
對於西妥昔單抗(cetuximab)介導之T細胞清除，如上所述，以鹽水、unT或CAR-T-EGFR細胞(每只小鼠1.0×106個細胞)處理植入HL-60、MV4-11、THP-1或U937之其他小鼠群組(每個處理n=5)。隨後在CAR-T-CD20後4週，以1mg/kg之劑量的抗EGFR抗體西妥昔單抗(Bristol-Myers Squibb)腹膜內處理動物來消除T細胞。藉由BLI及FACS評估動物以定量白血病負荷及CAR-T細胞。
CAR構築體之評價
測試具有或不具有安全性開關之CAR構築體在活體外對AML細胞系之細胞毒性，測試該等CAR構築體在異種移植AML動物模型中之活體內功效，藉由CFU測定測試該等CAR構築體之活體外造血毒性，測試該等CAR構築體在活體內經相應抗體之消除情況及藉由HIS小鼠及NHP研究測試該等CAR構築體之活體內毒性。
實例4：AS82658-28z CAR構築體之產生及評價 CAR構築體之產生
如圖8A所示，將AS82658 sdAb與CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ之細胞內域一起選殖至慢病毒表現載體中。將CAR構築體(AS82658-28z)與EF1α啟動子一起選殖至表現載體中以進行表現。AS82658-28z之序列如下所示。
SEQ ID NO：181(AS82658-28z CAR)：
Figure 108132631-A0202-12-0192-80
CAR-T細胞之製備
如實例2中所述製備編碼AS82658-28z CAR及CLL1 BM CAR(陽性對照)之慢病毒。根據實例2中之方案，收集T淋巴細胞且以慢病毒轉導。
活體外細胞毒性測定
如實例2中所述，使用活體外LDH(乳酸脫氫酶)測定評估AS82658-28z CAR-T細胞之抗腫瘤活性。如圖9A-9B所示，AS82658-28z對THP-1(具有CLL1之中等表現)及MOLM-13細胞(具有CLL1之低表現)之活體外細胞毒性與CLL1 BM CAR相當。
長期共培養測定
使用長期共培養測定評估CAR-T細胞對腫瘤細胞之長期殺滅功效。以CFSE(SIGMA-ALDRICH，目錄號21888-25MG-F)標記AML腫瘤細胞系(例如U937)。在外源細胞因子(例如IL-2)不存在下，將經轉導或未轉導之T細胞(1×105個/孔)與腫瘤細胞系(例如CFSE-U937細胞，4×105個/孔)以1：4之E：T比率在24孔盤中共培養。共培養2或3天後，收穫細胞之級分且進行CD3染色。藉由CFSE+信號鑑別腫瘤細胞。為進行連續共培養測定，隨後以相同E：T比率以新鮮CFSE-U937細胞再攻擊剩餘T細胞。進行共培養直至腫瘤細胞在共培養物中佔主導地位。各時間點之T細胞增殖率藉由將該時間點之T細胞數除以前一時間點之T細胞數來計算。
在重複腫瘤刺激測定中，CAR-T細胞之殺滅功效如圖10A中所示。陽性對照CLL1 BM CAR-T細胞在5輪腫瘤刺激後耗盡，而AS82658-28z CAR-T細胞直至9輪腫瘤刺激為止仍持續存在。此外，AS8265-28z CAR-T細胞在活體外之增殖快於CLL1 BM CAR(圖10B)。此等結果表明，AS82658-28z CAR-T細胞在活體外具有比CLL1 BM CAR-T細胞有效之抗腫瘤活性。
藉由HTRF偵測之IFN-γ及GM-CSF分泌
效應T細胞活化及增殖之另一量度為效應細胞因子(諸如IFN-γ及GM-CSF)之產生。收集來自長期共培養測定之上清液以評估CAR誘導之細胞因子釋放。根據製造商之手冊，針對IFN-γ(Cisbio，目錄號62HIFNGPEH)及GM-CSF(Cisbio，目錄號62HGMCSFPEG)進行HTRF測定。
代表性細胞因子釋放測定之結果如圖11A-11B中所示。在較晚時間點(共培養開始後之5、7、10及12天)，在與U937細胞之共培養物中，AS82658-28z CAR-T細胞分泌之IFN-γ及GM-CSF之水準高於CLL1 BM CAR-T細胞。
群落形成單位(CFU)測定
藉由活體外CFU測定評估抗CLL1 CAR-T細胞對正常造血幹細胞(HSC)之潛在毒性。將自臍帶血(CB)免疫磁分離之CD34+細胞(HemaCare，目錄號：CB34C-2)與測試CAR-T細胞、unT細胞或單獨之培養基(未處理)以10：1之E：T(T細胞：CB細胞)比率共培養6小時。隨後將每孔總數5,000個混合細胞塗於MethoCult H4034 Optimum培養基(STEMCELL Technologies)中，且培養5-7天，隨後計數群落形成單位。使用未轉導之T細胞作為陰性對照。使用CLL1 BM CAR-T細胞作為陽性對照。數據表示為各樣品在三個皮氏培養皿中之群落數量的平均值±SEM。
如圖12A所示，與媒劑對照相比，與UnT細胞一起預培育之HSC未展現異常發育，因為UnT組之群落數量與培養基組之群落數量相同。與UnT相比，與AS82658-28z CAR-T細胞或CLL1 BM CAR-T細胞一起預培育之HSC的發育均受抑制，因為與UnT組中相比，此等組中形成之群落較少(圖12B)。AS82658-28z CAR組與CLL1 BM CAR組之間無顯著差異。此等數據表明抗CLL1 CAR-T治療可影響造血功能，且AML治療可能需要HSC移植。
小鼠異種移植模型中之活體內功效評價
如實例2中所述，在U937-Luc異種移植小鼠模型中評價AS82658-28z CAR-T細胞之活體內功效。
如圖13所示，在注射後2-3週後，以AS82658-28z CAR-T細胞或CLL1 BM CAR-T細胞處理之小鼠無腫瘤(BLI為約106個)，而以UnT或媒劑處 理之小鼠展現快速腫瘤進展，且必須在實驗結束前安樂死。AS82658-28z CAR-T細胞在活體內之抗腫瘤活性與CLL1 BM相當。
實例5：抗CLL1/CD33串聯CAR構築體之產生及評價 CAR構築體之產生
如圖8B所示之例示性串聯CAR藉由經由肽連接子融合特異性識別不同標靶(CLL1及CD33)之兩個結合域以在單一CAR分子中形成細胞外域來構築。如圖8B及表4所示，將抗CLL1/CD33串聯CAR與CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ之細胞內域一起選殖至慢病毒表現載體中。亦構築AS49264 CAR，其包含抗CD33 sdAb域作為細胞外域，及CD28之細胞內共刺激序列及CD3ζ之細胞內域。將CAR構築體與EF1α啟動子一起選殖至表現載體中以進行表現。例示性串聯CAR之序列如下所示。
SEQ ID NO：184(Tan1)：
Figure 108132631-A0202-12-0195-81
SEQ ID NO：185(Tan2)：
Figure 108132631-A0202-12-0196-82
SEQ ID NO：186(Tan3)：
Figure 108132631-A0202-12-0196-83
SEQ ID NO：187(Tan4)：
Figure 108132631-A0202-12-0196-84
Figure 108132631-A0202-12-0197-85
SEQ ID NO：188(Tan5)：
Figure 108132631-A0202-12-0197-86
SEQ ID NO：189(Tan6)：
Figure 108132631-A0202-12-0197-87
Figure 108132631-A0202-12-0198-88
SEQ ID NO：190(Tan7)：
Figure 108132631-A0202-12-0198-89
SEQ ID NO：191(Tan8)：
Figure 108132631-A0202-12-0198-90
Figure 108132631-A0202-12-0199-91
SEQ ID NO：192(Tan9)：
Figure 108132631-A0202-12-0199-92
SEQ ID NO：193(Tan10)：
Figure 108132631-A0202-12-0199-93
Figure 108132631-A0202-12-0200-94
SEQ ID NO：194(Tan11)：
Figure 108132631-A0202-12-0200-95
SEQ ID NO：195(Tan12)：
Figure 108132631-A0202-12-0200-96
SEQ ID NO：196(AS49264 CAR)：
Figure 108132631-A0202-12-0201-97
CAR-T細胞之製備
如實例2中所述製備編碼串聯CAR(Tan 1-Tan 12)、AS82658-28z CAR及AS49264 CAR(陽性對照)之慢病毒。根據實例2中之方案，收集T淋巴細胞且以慢病毒轉導。
活體外細胞毒性測定
如實例2中所述，使用活體外LDH(乳酸脫氫酶)測定評估串聯CAR-T細胞之抗腫瘤活性。
如圖14所示，串聯CAR對THP-1之活體外細胞毒性高於兩種單一標靶CAR-T細胞(AS82658-28z或AS49264 CAR-T)，此表明針對兩種標靶(例如CLL1及CD33)之串聯CAR比單一標靶CAR更有效地消除腫瘤。
長期共培養測定
如實例2中所述，使用長期共培養測定評估CAR-T細胞對腫瘤細胞之長期殺滅功效。
在重複腫瘤刺激測定中，各種串聯CAR-T細胞之殺滅功效如圖15A中所示。抗CLL1單一標靶CAR-T細胞(AS82658-28z CAR-T)及抗CD33單一標 靶CAR-T細胞(AS49264 CAR-T)在3輪腫瘤刺激後耗盡，而大多數串聯CAR-T細胞直至4或5輪腫瘤刺激為止仍持續存在。此外，串聯CAR-T細胞在活體外之增殖快於AS82658-28z或AS49264 CAR-T細胞(圖15B)。此等結果還展現，CLL1/CD33串聯CAR-T細胞在活體外具有比兩種單一標靶CAR-T細胞有效之抗腫瘤活性。
藉由HTRF偵測之IFN-γ及GM-CSF分泌
如實例3中所述評估在與腫瘤細胞之長期共培養物中，串聯CAR-T細胞之細胞因子釋放(IFN-γ及GM-CSF)。
代表性細胞因子釋放測定之結果如圖16A-16B中所示。串聯CAR-T細胞與單一標靶CAR-T細胞(AS82658-28z及AS49264 CAR-T)在活體外響應於U937細胞釋放相當水平之細胞因子。
實例6：抗CLL1/CD33雙重CAR構築體之產生及評價 CAR構築體之產生
如圖8C所示，例示性雙重CAR藉由分別表現針對CLL1及CD33之兩種全功能CAR構築。將表6所示之雙重CAR構築體與EF1α啟動子一起選殖至表現載體中以進行表現。抗CD33 sdAb、AS49814、AS50073及AS67190之序列如表5中所示。例示性雙重CAR構築體及個別CAR之序列如下所示。
SEQ ID NO：234(雙重1)：
Figure 108132631-A0202-12-0202-98
Figure 108132631-A0202-12-0203-99
SEQ ID NO：235(雙重2)：
Figure 108132631-A0202-12-0203-100
Figure 108132631-A0202-12-0204-101
SEQ ID NO：236(雙重3)：
Figure 108132631-A0202-12-0204-102
SEQ ID NO：229(AS82472-28z CAR)：
Figure 108132631-A0202-12-0204-103
Figure 108132631-A0202-12-0205-104
SEQ ID NO：230(AS82494-28z CAR)：
Figure 108132631-A0202-12-0205-105
SEQ ID NO：231(AS49814 CAR)：
Figure 108132631-A0202-12-0205-106
SEQ ID NO：232(AS50073 CAR)：
Figure 108132631-A0202-12-0205-107
Figure 108132631-A0202-12-0206-108
SEQ ID NO：233(AS67190 CAR)：
Figure 108132631-A0202-12-0206-109
CAR-T細胞之製備
如實例2中所述製備編碼雙重CAR構築體(雙重1-雙重3)以及其中所含之個別CAR之慢病毒。根據實例2中之方案，收集T淋巴細胞且以慢病毒轉導。
活體外細胞毒性測定
如實例2中所述，使用活體外LDH(乳酸脫氫酶)測定評估雙重CAR-T細胞之抗腫瘤活性。
如圖17A-17C所示，雙重CAR-T細胞對THP-1之活體外細胞毒性強於抗CLL1 CAR-T細胞，且與抗CD33 CAR-T細胞相當。此等數據表明，針對兩種不同標靶(例如CLL1及CD33)之雙重CAR-T細胞比單一標靶抗CLL1 CAR-T細胞更有效地消除腫瘤。
小鼠異種移植模型中之活體內功效評價
培養HL-60-Luc(人類白血病細胞系)，再懸浮於HBSS-/-中，且以每只小鼠1x 107個細胞靜脈內注射。腫瘤接種後每週或每兩週進行一次生物發光成像(BLI)，以監測模型之產生。基於BLI光子數及動物體重將動物隨機分組。隨機分組後，靜脈內輸注單次劑量之CAR-T細胞或UnT細胞。每週進行BLI成像以記錄腫瘤生長。
如圖18B及18D所示，在注射後3-4週後，以雙重CAR-T細胞(雙重1、雙重2及雙重3)處理之小鼠無腫瘤(BLI為約106個)，而以UnT或媒劑處理之小鼠展現快速腫瘤進展，且必須在實驗結束前安樂死。以雙重CAR-T細胞處理之小鼠的腫瘤生長顯著慢於以單一標靶CAR T細胞(AS82472 CAR、AS49814 CAR及AS67190 CAR)處理之小鼠。與實例5之結果組合，此等數據展現雙重標靶CAR-T細胞(串聯CAR或雙重CAR)比單一標靶CAR-T細胞更有效地作為腫瘤療法。 
<110> 大陸商南京傳奇生物科技有限公司(NANJING LEGEND BIOTECH CO.,Ltd.)
				<120> 針對CLL1之單域抗體及其構築體
				<130> 76142-28011.00
				<140> TW 108132631  
				<141> 2019-09-10            
				<150> PCT/CN2018/104883; PCT/CN2018/104882
				<151> 2018-09-10; 2018-09-10
				<160> 236
				<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
				<210> 1
				<211> 201
				<212> PRT
				<213> 智人(Homo sapiens)
				<400> 1
				His Val Thr Leu Lys Ile Glu Met Lys Lys Met Asn Lys Leu Gln Asn
				 1               5                  10                  15      
				Ile Ser Glu Glu Leu Gln Arg Asn Ile Ser Leu Gln Leu Met Ser Asn
				            20                  25                  30          
				Met Asn Ile Ser Asn Lys Ile Arg Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr
				        35                  40                  45              
				Ile Ala Thr Lys Leu Cys Arg Glu Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Glu His
				    50                  55                  60                  
				Lys Cys Lys Pro Cys Pro Arg Arg Trp Ile Trp His Lys Asp Ser Cys
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Phe Leu Ser Asp Asp Val Gln Thr Trp Gln Glu Ser Lys Met Ala
				                85                  90                  95      
				Cys Ala Ala Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Ile Asn Asn Lys Asn Ala
				            100                 105                 110         
				Leu Glu Phe Ile Lys Ser Gln Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Trp Leu Gly
				        115                 120                 125             
				Leu Ser Pro Glu Glu Asp Ser Thr Arg Gly Met Arg Val Asp Asn Ile
				    130                 135                 140                 
				Ile Asn Ser Ser Ala Trp Val Ile Arg Asn Ala Pro Asp Leu Asn Asn
				145                 150                 155                 160 
				Met Tyr Cys Gly Tyr Ile Asn Arg Leu Tyr Val Gln Tyr Tyr His Cys
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				Thr Tyr Lys Lys Arg Met Ile Cys Glu Lys Met Ala Asn Pro Val Gln
				            180                 185                 190         
				Leu Gly Ser Thr Tyr Phe Arg Glu Ala
				        195                 200     
				<210> 2
				<211> 201
				<212> PRT
				<213> 食蟹獼猴(Macaca fascicularis)
				<400> 2
				His Ile Thr Leu Lys Thr Ala Met Lys Lys Met Asn Lys Leu Gln Asn
				 1               5                  10                  15      
				Ile Asn Glu Glu Leu Gln Arg Asn Val Ser Leu Gln Leu Met Ser Asn
				            20                  25                  30          
				Met Asn Ser Ser Asn Lys Ile Arg Asn Leu Ser Thr Thr Leu Gln Thr
				        35                  40                  45              
				Ile Ala Thr Arg Leu Cys Arg Glu Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Glu His
				    50                  55                  60                  
				Lys Cys Lys Pro Cys Pro Arg Arg Trp Ile Trp His Lys Asp Ser Cys
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Phe Leu Ser Asp Asp Val Arg Thr Trp Gln Glu Ser Arg Met Ala
				                85                  90                  95      
				Cys Ala Ala Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Ile Asn Asn Lys Asn Ala
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				Leu Glu Phe Ile Lys Ser Gln Ser Thr Ser Tyr Pro Tyr Trp Leu Gly
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				Leu Ser Pro Glu Lys Asp Tyr Ser Tyr Gly Thr Ser Val Asp Asp Ile
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				Ile Asn Ser Ser Ala Trp Val Thr Arg Asn Ala Ser Asp Leu Asn Asn
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				Met Phe Cys Gly Tyr Ile Asn Arg Ile Tyr Val His Tyr Asp Tyr Cys
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				Ile Tyr Arg Lys Lys Met Ile Cys Glu Lys Met Ala Asn Pro Val Gln
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				Leu Gly Phe Ile His Phe Arg Glu Ala
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				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 3
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 4
				Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn
				 1               5                  10  
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 5
				Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 6
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 6
				Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 7
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 7
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg
				            20                  25                  30          
				<210> 8
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 8
				Asp Ala Glu Arg Trp Asp Glu Asn Asp Leu Arg Arg
				 1               5                  10          
				<210> 9
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 9
				Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 10
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
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				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
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				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 11
				Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 12
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 12
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 13
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 13
				Val Leu Tyr Ala Gly Gly Ser Thr Thr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Glu
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 14
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
				            20                  25                  30          
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
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				Ala Leu Gly Asp Arg Ser Ser Cys Glu Trp Arg Tyr
				 1               5                  10          
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				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 16
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
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				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 17
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
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				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
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				Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Asp Met Asn
				 1               5                  10  
				<210> 19
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 19
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
				 1               5                  10                  
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				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 20
				Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 21
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 21
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys
				            20                  25                  30          
				<210> 22
				<211> 3
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 22
				Glu Thr Asn
				 1          
				<210> 23
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 23
				Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 24
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 24
				Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 25
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 25
				Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser
				 1               5                  10  
				<210> 26
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 26
				Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 27
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 27
				Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Ala Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 28
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 28
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Lys
				            20                  25                  30          
				<210> 29
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 29
				Gly Phe Pro Asp Asp Asp Gly Pro Gly Glu Leu Ser Arg Glu Tyr Asn
				 1               5                  10                  15      
				Tyr
				<210> 30
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 30
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 31
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 31
				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 32
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 32
				Gly Phe Leu Phe Arg Val Tyr Asp Met Asn
				 1               5                  10  
				<210> 33
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 33
				Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Ile Val
				 1               5                  10                  
				<210> 34
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 34
				Gly Ile Thr Asn Asn Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 35
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 35
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Glu Asn Thr Leu Phe Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Thr
				            20                  25                  30          
				<210> 36
				<211> 5
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 36
				Asp Asn Gly Arg Val
				 1               5  
				<210> 37
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 37
				Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 38
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 38
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 39
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 39
				Gly Tyr Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 40
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 40
				Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Arg Glu Pro Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 41
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 41
				Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly
				 1               5                  10                  15      
				<210> 42
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 42
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
				            20                  25                  30          
				<210> 43
				<211> 8
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 43
				Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr
				 1               5              
				<210> 44
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 44
				Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 45
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 45
				Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 46
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 46
				Gly Leu Asn Phe Gly Leu Tyr Ala Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 47
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 47
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 48
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 48
				Cys Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ser Asp Phe Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Ser
				<210> 49
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 49
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala
				            20                  25                  30          
				<210> 50
				<211> 27
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 50
				Asp Arg Ser Pro Phe Gly Ser Cys Ser Ser Asp Trp Ser Arg Ser Ser
				 1               5                  10                  15      
				Asp Trp Ser Arg Met Ala Glu Lys Phe Gly Tyr
				            20                  25          
				<210> 51
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 51
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 52
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 52
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser
				            20                  25  
				<210> 53
				<211> 9
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 53
				Ala Ala Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Ala
				 1               5                  
				<210> 54
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 54
				Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Phe Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 55
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 55
				Thr Leu Gly Ser Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
				 1               5                  10                  15      
				<210> 56
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 56
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ile Lys Asn Met Ala Tyr Leu Glu
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Gly Thr
				            20                  25                  30          
				<210> 57
				<211> 12
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 57
				Arg Cys Gln Ile Gly Asp Asp Trp Arg Ser Ser Asp
				 1               5                  10          
				<210> 58
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 58
				Trp Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 59
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 59
				Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 60
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 60
				Gly Tyr Ala Tyr Arg Ser Tyr Cys Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 61
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 61
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Gly Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 62
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 62
				Ala Ile Glu Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Met Gly
				 1               5                  10                  15      
				<210> 63
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 63
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys Ala Ala
				            20                  25                  30          
				<210> 64
				<211> 15
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 64
				Val Lys Gly Ser Cys Asp Ser Ala Ser Ser Asp Thr Pro Ser Tyr
				 1               5                  10                  15  
				<210> 65
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 65
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 66
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 66
				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 67
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 67
				Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn
				 1               5                  10  
				<210> 68
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 68
				Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 69
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 69
				Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 70
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 70
				Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg
				            20                  25                  30          
				<210> 71
				<211> 12
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 71
				Gly Gly Glu Lys Trp Asp Glu Asn Asp Leu Arg Arg
				 1               5                  10          
				<210> 72
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 72
				Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 73
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 73
				Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 74
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 74
				Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Thr Cys Leu Gly
				 1               5                  10  
				<210> 75
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 75
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Val Glu Gly Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 76
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 76
				Ile Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
				 1               5                  10                  15      
				<210> 77
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 77
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu His
				 1               5                  10                  15      
				Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
				            20                  25                  30          
				<210> 78
				<211> 18
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 78
				Val Glu Gly Gly Cys Glu Val Ser Glu Gly Thr Gly Glu Gln Gln Leu
				 1               5                  10                  15      
				Ala Tyr
				<210> 79
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 79
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 80
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 80
				Gln Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 81
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 81
				Gly Phe Ile Phe Ala Asn Tyr Glu Met Ser
				 1               5                  10  
				<210> 82
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 82
				Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Trp Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 83
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 83
				Gly Ile Asn Ser Arg Gly Asn Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 84
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 84
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu His Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys Val Val
				            20                  25                  30          
				<210> 85
				<211> 13
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 85
				Gly Gly Met Thr Thr Asp Gln Gly Ser Pro Asp Phe Tyr
				 1               5                  10              
				<210> 86
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 86
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 87
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 87
				Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 88
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 88
				Gly Phe Ala Phe Ser Ser Ala Asp Met Ser
				 1               5                  10  
				<210> 89
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 89
				Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Ala Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 90
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 90
				Val Ile Asn Arg Asp Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 91
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 91
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys Ala Val
				            20                  25                  30          
				<210> 92
				<211> 13
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 92
				Val Pro Glu Asn Glu Tyr Glu Ser Gly Ser Tyr Asn Tyr
				 1               5                  10              
				<210> 93
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 93
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 94
				<211> 121
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 94
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
				        35                  40                  45              
				Ala Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Val Arg Asp Ala Glu Arg Trp Asp Glu Asn Asp Leu Arg Arg Lys Gly
				            100                 105                 110         
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120     
				<210> 95
				<211> 121
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 95
				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala
				            20                  25                  30          
				Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Val Val
				        35                  40                  45              
				Ala Val Leu Tyr Ala Gly Gly Ser Thr Thr His Tyr Ala Ser Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Glu Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Ala Ala Ala Leu Gly Asp Arg Ser Ser Cys Glu Trp Arg Tyr Trp Gly
				            100                 105                 110         
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120     
				<210> 96
				<211> 112
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 96
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
				        35                  40                  45              
				Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Ala Lys Glu Thr Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				            100                 105                 110         
				<210> 97
				<211> 126
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 97
				Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
				        35                  40                  45              
				Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Ala
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Val Lys Gly Phe Pro Asp Asp Asp Gly Pro Gly Glu Leu Ser Arg Glu
				            100                 105                 110         
				Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120                 125     
				<210> 98
				<211> 114
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 98
				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Leu Phe Arg Val Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Ile
				        35                  40                  45              
				Val Gly Ile Thr Asn Asn Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Glu Asn Thr Leu Phe
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Gln Thr Asp Asn Gly Arg Val Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
				            100                 105                 110         
				Ser Ser
				<210> 99
				<211> 116
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 99
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Arg Ile Asp
				            20                  25                  30          
				Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Arg Glu Pro Val
				        35                  40                  45              
				Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Glu
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr Leu
				65                  70                  75                  80  
				Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
				                85                  90                  95      
				Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val
				            100                 105                 110         
				Thr Val Ser Ser
				        115     
				<210> 100
				<211> 136
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 100
				Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Asn Phe Gly Leu Tyr
				            20                  25                  30          
				Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
				        35                  40                  45              
				Ser Cys Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ser Asp Phe Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Ala Ala Asp Arg Ser Pro Phe Gly Ser Cys Ser Ser Asp Trp Ser Arg
				            100                 105                 110         
				Ser Ser Asp Trp Ser Arg Met Ala Glu Lys Phe Gly Tyr Trp Gly Gln
				        115                 120                 125             
				Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				    130                 135     
				<210> 101
				<211> 119
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 101
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Ala Ala Thr Asn Cys Arg Tyr
				            20                  25                  30          
				Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Phe Val Ser
				        35                  40                  45              
				Thr Leu Gly Ser Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
				    50                  55                  60                  
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ile Lys Asn Met Ala Tyr Leu Glu
				65                  70                  75                  80  
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Gly Thr
				                85                  90                  95      
				Arg Cys Gln Ile Gly Asp Asp Trp Arg Ser Ser Asp Trp Ala Gln Gly
				            100                 105                 110         
				Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 
				<210> 102
				<211> 123
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 102
				Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Arg Ser Tyr
				            20                  25                  30          
				Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Gly Val
				        35                  40                  45              
				Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Met
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu
				65                  70                  75                  80  
				Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys Ala
				                85                  90                  95      
				Ala Val Lys Gly Ser Cys Asp Ser Ala Ser Ser Asp Thr Pro Ser Tyr
				            100                 105                 110         
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120             
				<210> 103
				<211> 121
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 103
				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
				        35                  40                  45              
				Ala Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Val Arg Gly Gly Glu Lys Trp Asp Glu Asn Asp Leu Arg Arg Lys Gly
				            100                 105                 110         
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120     
				<210> 104
				<211> 126
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 104
				Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Thr
				            20                  25                  30          
				Cys Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Val Glu Gly Val
				        35                  40                  45              
				Ala Ile Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
				65                  70                  75                  80  
				His Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
				                85                  90                  95      
				Ala Val Glu Gly Gly Cys Glu Val Ser Glu Gly Thr Gly Glu Gln Gln
				            100                 105                 110         
				Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120                 125     
				<210> 105
				<211> 122
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 105
				Gln Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ala Asn Tyr
				            20                  25                  30          
				Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Trp Val
				        35                  40                  45              
				Ser Gly Ile Asn Ser Arg Gly Asn Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu His Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys
				                85                  90                  95      
				Val Val Gly Gly Met Thr Thr Asp Gln Gly Ser Pro Asp Phe Tyr Trp
				            100                 105                 110         
				Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120         
				<210> 106
				<211> 122
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 106
				Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Ala
				            20                  25                  30          
				Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Ala Val
				        35                  40                  45              
				Ser Val Ile Asn Arg Asp Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys
				                85                  90                  95      
				Ala Val Val Pro Glu Asn Glu Tyr Glu Ser Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp
				            100                 105                 110         
				Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120         
				<210> 107
				<211> 363
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 107
				caggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtgcggc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt atctatgaca tgaactgggt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gactcgagtg ggtcgcaggt attagtggta atggttacag tacaagctat 180
				gcagagtccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240
				ctacaattga gcagcctgaa atttgaagac acggccatgt attactgtgt aagagatgcg 300
				gagaggtggg acgagaatga cctgcgacgg aagggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
				tca                                                               363
				<210> 108
				<211> 363
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 108
				gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggcgt cacgtacagt agtgcctgca tgggctggtt ccgccaggct 120
				ccaggaaagg ggcgcgaggt ggtcgcggtt ctttatgcag gtggtagtac cacacactat 180
				gccagctccg tgaaggagcg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cacggtatat 240
				ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac actgccgttt actactgtgc ggcagctttg 300
				ggtgatcgtt caagttgcga gtggagatac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
				tca                                                               363
				<210> 109
				<211> 336
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 109
				caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gtgtatgaca tgaactggtt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gactcgagtg ggtctcaggt attactggga atggttatac aacatcctac 180
				gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
				ctgcaattga acagcctgaa aagtgaggac acggccatgt attactgtgc aaaggagact 300
				aataggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca                           336
				<210> 110
				<211> 378
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 110
				caggtgcagc tggcggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt agctatgaca tgagctgggt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gagtcgagtg ggtctcaact attaatagtg gtggtggtag tacatactat 180
				gcagagtccg cgaagggccg atttaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
				ctgcaattga acagcctgaa aactgaggac acggccatgt attactgtgt aaaagggttt 300
				ccggacgacg atggaccggg ggagttaagt agagagtata attactgggg ccaggggacc 360
				caggtcaccg tctcctca                                               378
				<210> 111
				<211> 342
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 111
				gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagcc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtacag cctctggatt tttattccgt gtgtacgaca tgaactgggt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gcgtcgagtg gattgtaggt atcacaaata atggttatac cacagcctat 180
				gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acaccgaaaa caccctgttt 240
				ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatgt attactgtca gacagataac 300
				ggtcgtgtgc ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct ca                    342
				<210> 112
				<211> 348
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 112
				caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggaggggc tctgagcctc 60
				tcctgcgcag cctctggata caccgtcaga atcgactaca tgggctggta ccgccagact 120
				ccagggaagg gccgcgagcc ggtcgcaact attgcctcta atggtggaac agcctatgcc 180
				gactccgtgg agggccgatt taccatctcc caagacaacg ccaagaactc ggtgtatctg 240
				caaatgaata ccctgaaacc tggggacact gccatgtact actgtgcggc gggtacctgg 300
				cctaccttga cttacttcgg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca              348
				<210> 113
				<211> 408
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 113
				caggtgcagc tggcggagtc tgggggaggc ttggtgcaga caggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtacag cctctggatt gaattttggt ctttatgcca tgggctggtt ccgccaggcc 120
				ccagggaagg agcgcgaggg ggtctcatgt attaacgggg gtggtggtat tacagtctac 180
				tcagactttg tgaagagccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cactctgtat 240
				ctgcaaatga acagcctgaa acctgacgac acggccacgt attactgtgc ggcagacaga 300
				agtccgtttg gctcatgctc aagcgattgg tcgcgctcaa gcgattggtc gcgaatggcg 360
				gagaagtttg gttattgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca              408
				<210> 114
				<211> 357
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 114
				caggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
				tcctgtgtag tctctgcagc caccaactgt agatacattg cctggtaccg ccaggctcca 120
				gggaaggccc gcgagttcgt ctcaactctt ggtagtgatg gtaacacaaa ctacgcagac 180
				tccgtgaagg gccgattcac tatctcccaa ggtaatatca agaacatggc gtatctggag 240
				atgaacagcc tgaaacctga ggacacgggc atgtactact gcggcacaag gtgtcaaatt 300
				ggggatgact ggcgatcgag cgactgggcc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca    357
				<210> 115
				<211> 369
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 115
				caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagt ctggagggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggata cgcctaccgt agctactgta tgggctggtt ccgccaggct 120
				ccagggaagg tcctcgaggg ggtcgcagct attgagagtg atggtactac aacctacgca 180
				gactccgtga tgggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaatgc gctctatctg 240
				caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccatgtatc actgtgcggc tgtcaaaggg 300
				tcgtgcgatt cagcgtcttc cgacacccct agttactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
				gtctcctca                                                         369
				<210> 116
				<211> 363
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 116
				gaggtgcaac tggtggagtc tgggggagac ttggtgcggc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt atttatgaca tgaactgggt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gactcgagtg ggtcgcaggt attagtggta atggttacag tacaagctat 180
				gcagagtccg tgaagggccg attcaccatc tccaaagaca acgccaagaa cacagtgtat 240
				ctacaattga gcagcctgaa atttgaagac acggccatgt attactgtgt aagaggtggg 300
				gagaagtggg acgaaaatga cctgcgacgg aagggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
				tca                                                               363
				<210> 117
				<211> 378
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 117
				caggtgaggt tagtggagtc tgggggaggc tcggtgcagt ctggagggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggata tgcccgcagt agtacttgtt tgggatggtt ccgccaggct 120
				ccagggaagg aggtcgaggg ggtcgcaatt attggtaggg atggcagtac ggggtatgca 180
				gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaacac gctgtatcta 240
				catatggaca gcctgaaacc tgaggacacg gctatgtatt actgtgcggc agttgagggc 300
				ggttgtgagg tgtcagaagg tacgggggaa cagcagcttg cttactgggg ccaggggacc 360
				caggtcaccg tctcctca                                               378
				<210> 118
				<211> 366
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 118
				caggtgcacc tgatggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggagtc tctgagactc 60
				tcctgtgccg cctctggatt catattcgct aactacgaga tgagctgggt ccgccaggct 120
				ccagggaagg tgctcgagtg ggtctcagga attaatagca gaggtaatgc gacatactat 180
				gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagca cacgctgtac 240
				ctccaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatgt atcactgtgt ggtagggggt 300
				atgaccactg atcagggctc gccagatttc tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
				tcctca                                                            366
				<210> 119
				<211> 366
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 119
				caggtgaagt tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgtag cctctggatt cgcattcagt agtgccgaca tgagctgggt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gggtcgaagc ggtctcagtt attaatcgtg atggtgcgag cacatactat 180
				gcggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag cacgctgtat 240
				ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatgt atcactgtgc ggtagtcccg 300
				gaaaacgaat atgaaagtgg atcgtataac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
				tcctca                                                            366
				<210> 120
				<211> 365
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 120
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu
				            20                  25                  30          
				Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Ala Glu Arg Trp Asp Glu Asn Asp
				        115                 120                 125             
				Leu Arg Arg Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
				    130                 135                 140                 
				Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
				145                 150                 155                 160 
				Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
				                165                 170                 175     
				Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
				            180                 185                 190         
				Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
				        195                 200                 205             
				Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
				    210                 215                 220                 
				Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
				225                 230                 235                 240 
				Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
				                245                 250                 255     
				Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
				            260                 265                 270         
				Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
				        275                 280                 285             
				Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
				    290                 295                 300                 
				Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
				305                 310                 315                 320 
				Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
				                325                 330                 335     
				Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
				            340                 345                 350         
				Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360                 365 
				<210> 121
				<211> 365
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 121
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val
				        35                  40                  45              
				Thr Tyr Ser Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Val Val Ala Val Leu Tyr Ala Gly Gly Ser Thr Thr His
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Ser Ser Val Lys Glu Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Leu Gly Asp Arg Ser Ser Cys Glu
				        115                 120                 125             
				Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
				    130                 135                 140                 
				Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
				145                 150                 155                 160 
				Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
				                165                 170                 175     
				Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
				            180                 185                 190         
				Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
				        195                 200                 205             
				Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
				    210                 215                 220                 
				Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
				225                 230                 235                 240 
				Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
				                245                 250                 255     
				Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
				            260                 265                 270         
				Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
				        275                 280                 285             
				Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
				    290                 295                 300                 
				Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
				305                 310                 315                 320 
				Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
				                325                 330                 335     
				Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
				            340                 345                 350         
				Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360                 365 
				<210> 122
				<211> 356
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 122
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Val Tyr Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ser
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Thr Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln
				        115                 120                 125             
				Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
				    130                 135                 140                 
				Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
				145                 150                 155                 160 
				Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
				                165                 170                 175     
				Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
				            180                 185                 190         
				Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
				        195                 200                 205             
				Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
				    210                 215                 220                 
				Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
				225                 230                 235                 240 
				Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
				                245                 250                 255     
				Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
				            260                 265                 270         
				Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
				        275                 280                 285             
				Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
				    290                 295                 300                 
				Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
				305                 310                 315                 320 
				Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
				                325                 330                 335     
				Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
				            340                 345                 350         
				Leu Pro Pro Arg
				        355     
				<210> 123
				<211> 370
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 123
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Val Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Glu Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Val Lys Gly Phe Pro Asp Asp Asp Gly Pro Gly
				        115                 120                 125             
				Glu Leu Ser Arg Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
				    130                 135                 140                 
				Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
				145                 150                 155                 160 
				Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
				                165                 170                 175     
				Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
				            180                 185                 190         
				Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
				        195                 200                 205             
				Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
				    210                 215                 220                 
				Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
				225                 230                 235                 240 
				Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
				                245                 250                 255     
				Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
				            260                 265                 270         
				Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
				        275                 280                 285             
				Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
				    290                 295                 300                 
				Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
				305                 310                 315                 320 
				Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
				                325                 330                 335     
				Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
				            340                 345                 350         
				Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
				        355                 360                 365             
				Pro Arg
				    370 
				<210> 124
				<211> 358
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 124
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Leu Phe Arg Val Tyr Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Val Glu Trp Ile Val Gly Ile Thr Asn Asn Gly Tyr Thr Thr Ala
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr
				                85                  90                  95      
				Glu Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Thr Asp Asn Gly Arg Val Arg Gly Gln Gly
				        115                 120                 125             
				Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
				    130                 135                 140                 
				Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
				145                 150                 155                 160 
				Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
				                165                 170                 175     
				Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
				            180                 185                 190         
				Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
				        195                 200                 205             
				Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
				    210                 215                 220                 
				Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
				225                 230                 235                 240 
				Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
				                245                 250                 255     
				Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
				            260                 265                 270         
				Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
				        275                 280                 285             
				Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
				    290                 295                 300                 
				Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
				305                 310                 315                 320 
				Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
				                325                 330                 335     
				Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
				            340                 345                 350         
				Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355             
				<210> 125
				<211> 360
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 125
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly
				        115                 120                 125             
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
				    130                 135                 140                 
				Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
				145                 150                 155                 160 
				Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
				                165                 170                 175     
				Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
				            180                 185                 190         
				Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
				        195                 200                 205             
				Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
				    210                 215                 220                 
				Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
				225                 230                 235                 240 
				Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
				                245                 250                 255     
				Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
				            260                 265                 270         
				Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
				        275                 280                 285             
				Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
				    290                 295                 300                 
				Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
				305                 310                 315                 320 
				Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
				                325                 330                 335     
				Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
				            340                 345                 350         
				His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360 
				<210> 126
				<211> 380
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 126
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu
				        35                  40                  45              
				Asn Phe Gly Leu Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ile Thr Val
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ser Asp Phe Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Ser Pro Phe Gly Ser Cys Ser
				        115                 120                 125             
				Ser Asp Trp Ser Arg Ser Ser Asp Trp Ser Arg Met Ala Glu Lys Phe
				    130                 135                 140                 
				Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
				145                 150                 155                 160 
				Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
				                165                 170                 175     
				Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
				            180                 185                 190         
				His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
				        195                 200                 205             
				Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
				    210                 215                 220                 
				Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
				225                 230                 235                 240 
				Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
				                245                 250                 255     
				Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
				            260                 265                 270         
				Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
				        275                 280                 285             
				Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
				    290                 295                 300                 
				Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
				305                 310                 315                 320 
				Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
				                325                 330                 335     
				Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
				            340                 345                 350         
				Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
				        355                 360                 365             
				Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				    370                 375                 380 
				<210> 127
				<211> 363
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 127
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Ala Ala
				        35                  40                  45              
				Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala
				    50                  55                  60                  
				Arg Glu Phe Val Ser Thr Leu Gly Ser Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Ala
				65                  70                  75                  80  
				Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gly Asn Ile Lys Asn
				                85                  90                  95      
				Met Ala Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met
				            100                 105                 110         
				Tyr Tyr Cys Gly Thr Arg Cys Gln Ile Gly Asp Asp Trp Arg Ser Ser
				        115                 120                 125             
				Asp Trp Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
				    130                 135                 140                 
				Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
				145                 150                 155                 160 
				Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
				                165                 170                 175     
				Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
				            180                 185                 190         
				Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
				        195                 200                 205             
				Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
				    210                 215                 220                 
				Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
				225                 230                 235                 240 
				Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
				                245                 250                 255     
				Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
				            260                 265                 270         
				Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
				        275                 280                 285             
				Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
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				Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
				305                 310                 315                 320 
				Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
				                325                 330                 335     
				His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
				            340                 345                 350         
				Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360             
				<210> 128
				<211> 367
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 128
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Ala Tyr Arg Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Val Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr His Cys Ala Ala Val Lys Gly Ser Cys Asp Ser Ala Ser Ser
				        115                 120                 125             
				Asp Thr Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				    130                 135                 140                 
				Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
				145                 150                 155                 160 
				Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
				                165                 170                 175     
				Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
				            180                 185                 190         
				Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
				        195                 200                 205             
				Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
				    210                 215                 220                 
				Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
				225                 230                 235                 240 
				Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
				                245                 250                 255     
				Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln
				            260                 265                 270         
				Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
				        275                 280                 285             
				Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
				    290                 295                 300                 
				Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
				305                 310                 315                 320 
				Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
				                325                 330                 335     
				Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
				            340                 345                 350         
				Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360                 365         
				<210> 129
				<211> 365
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 129
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu
				            20                  25                  30          
				Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Gly Glu Lys Trp Asp Glu Asn Asp
				        115                 120                 125             
				Leu Arg Arg Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
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				Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
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				Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
				                165                 170                 175     
				Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
				            180                 185                 190         
				Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
				        195                 200                 205             
				Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
				    210                 215                 220                 
				Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
				225                 230                 235                 240 
				Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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				Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
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				Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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				Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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				Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
				305                 310                 315                 320 
				Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
				                325                 330                 335     
				Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
				            340                 345                 350         
				Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360                 365 
				<210> 130
				<211> 370
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 130
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
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				Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
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				Ala Arg Ser Ser Thr Cys Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Glu Val Glu Gly Val Ala Ile Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Gly Tyr
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				Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
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				Asn Thr Leu Tyr Leu His Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Glu Gly Gly Cys Glu Val Ser Glu Gly
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				Thr Gly Glu Gln Gln Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
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				Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
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				Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
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				Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
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				Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
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				Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
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				Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
				                245                 250                 255     
				Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
				            260                 265                 270         
				Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
				        275                 280                 285             
				Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
				    290                 295                 300                 
				Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
				305                 310                 315                 320 
				Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
				                325                 330                 335     
				Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
				            340                 345                 350         
				Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
				        355                 360                 365             
				Pro Arg
				    370 
				<210> 131
				<211> 366
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 131
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Ile Phe Ala Asn Tyr Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Val Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Ser Arg Gly Asn Ala Thr Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Glu His Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr His Cys Val Val Gly Gly Met Thr Thr Asp Gln Gly Ser
				        115                 120                 125             
				Pro Asp Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr
				    130                 135                 140                 
				Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
				145                 150                 155                 160 
				Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
				                165                 170                 175     
				Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
				            180                 185                 190         
				Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
				        195                 200                 205             
				Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
				    210                 215                 220                 
				Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
				225                 230                 235                 240 
				Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
				                245                 250                 255     
				Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn
				            260                 265                 270         
				Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
				        275                 280                 285             
				Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
				    290                 295                 300                 
				Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
				305                 310                 315                 320 
				Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
				                325                 330                 335     
				Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
				            340                 345                 350         
				Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360                 365     
				<210> 132
				<211> 366
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 132
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Ala Phe Ser Ser Ala Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Val Glu Ala Val Ser Val Ile Asn Arg Asp Gly Ala Ser Thr Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr His Cys Ala Val Val Pro Glu Asn Glu Tyr Glu Ser Gly
				        115                 120                 125             
				Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr
				    130                 135                 140                 
				Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
				145                 150                 155                 160 
				Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
				                165                 170                 175     
				Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
				            180                 185                 190         
				Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
				        195                 200                 205             
				Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
				    210                 215                 220                 
				Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
				225                 230                 235                 240 
				Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
				                245                 250                 255     
				Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn
				            260                 265                 270         
				Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
				        275                 280                 285             
				Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
				    290                 295                 300                 
				Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
				305                 310                 315                 320 
				Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
				                325                 330                 335     
				Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
				            340                 345                 350         
				Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360                 365     
				<210> 133
				<211> 24
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 133
				Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
				            20                  
				<210> 134
				<211> 27
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 134
				Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
				 1               5                  10                  15      
				Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
				            20                  25          
				<210> 135
				<211> 112
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 135
				Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
				 1               5                  10                  15      
				Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
				        35                  40                  45              
				Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
				    50                  55                  60                  
				Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
				65                  70                  75                  80  
				Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
				                85                  90                  95      
				Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				            100                 105                 110         
				<210> 136
				<211> 41
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 136
				Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
				 1               5                  10                  15      
				Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
				            20                  25                  30          
				Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
				        35                  40      
				<210> 137
				<211> 42
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 137
				Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
				 1               5                  10                  15      
				Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
				            20                  25                  30          
				Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
				        35                  40          
				<210> 138
				<211> 38
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 138
				Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
				 1               5                  10                  15      
				Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
				            20                  25                  30          
				Leu Thr Asp Val Thr Leu
				        35              
				<210> 139
				<211> 45
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 139
				Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
				 1               5                  10                  15      
				Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
				            20                  25                  30          
				Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
				        35                  40                  45  
				<210> 140
				<211> 39
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 140
				Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
				 1               5                  10                  15      
				Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
				            20                  25                  30          
				Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
				        35                  
				<210> 141
				<211> 15
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 141
				Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
				 1               5                  10                  15  
				<210> 142
				<211> 21
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 142
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro
				            20      
				<210> 143
				<211> 5
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 143
				Gly Gly Gly Gly Ser
				 1               5  
				<210> 144
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 144
				Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
				 1               5                  10  
				<210> 145
				<211> 8
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 145
				Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
				 1               5              
				<210> 146
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 146
				Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
				 1               5                  10                  15      
				<210> 147
				<211> 18
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 147
				Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
				 1               5                  10                  15      
				Lys Gly
				<210> 148
				<211> 22
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 148
				Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
				 1               5                  10                  15      
				Glu Glu Asn Pro Gly Pro
				            20          
				<210> 149
				<211> 134
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 149
				Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro
				 1               5                  10                  15      
				Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe
				            20                  25                  30          
				Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln
				        35                  40                  45              
				Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu
				    50                  55                  60                  
				Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr
				65                  70                  75                  80  
				Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu
				                85                  90                  95      
				Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser
				            100                 105                 110         
				Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile
				        115                 120                 125             
				Cys Met Gln Arg Thr Val
				    130                 
				<210> 150
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 150
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 151
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 151
				Gly Phe Phe Phe Ser Ala Tyr Asp Met Asn
				 1               5                  10  
				<210> 152
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 152
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 153
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 153
				Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 154
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 154
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Glu
				            20                  25                  30          
				<210> 155
				<211> 3
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 155
				Gly Asp Asn
				 1          
				<210> 156
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 156
				Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 157
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 157
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 158
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 158
				Gly Phe Phe Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn
				 1               5                  10  
				<210> 159
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 159
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 160
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 160
				Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 161
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 161
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gln
				            20                  25                  30          
				<210> 162
				<211> 3
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 162
				Gly Ser Asn
				 1          
				<210> 163
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 163
				Arg Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 164
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 164
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 165
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 165
				Gly Phe Leu Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn
				 1               5                  10  
				<210> 166
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 166
				Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Ile Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 167
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 167
				Gly Ile Thr Asn Asn Glu His Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 168
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 168
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Arg
				            20                  25                  30          
				<210> 169
				<211> 5
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 169
				Asp Asp Gly Gln Val
				 1               5  
				<210> 170
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 170
				Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 171
				<211> 112
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 171
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Phe Phe Ser Ala Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
				        35                  40                  45              
				Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Thr Glu Gly Asp Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				            100                 105                 110         
				<210> 172
				<211> 112
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 172
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Phe Ser Ile Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
				        35                  40                  45              
				Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Ala Gln Gly Ser Asn Arg Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				            100                 105                 110         
				<210> 173
				<211> 114
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 173
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Leu Phe Ser Ile Tyr
				            20                  25                  30          
				Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Ile
				        35                  40                  45              
				Ala Gly Ile Thr Asn Asn Glu His Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Phe
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Gln Arg Asp Asp Gly Gln Val Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
				            100                 105                 110         
				Ser Ser
				<210> 174
				<211> 336
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 174
				caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgtag cctctggatt cttcttcagt gcgtatgaca tgaactggtt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gactcgagtg ggtctcaggt attactggga atggttatac gaccgcctac 180
				gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
				ctgcaattga acagcctgaa aagtgaggac acggccatgt attactgtac agagggagat 300
				aataggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca                           336
				<210> 175
				<211> 336
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 175
				caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggatt ctttttcagt atttatgaca tgaactggtt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gactcgagtg ggtctcaggt attactggga atggttatac gaccgcctac 180
				gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
				ctgcaattga acagcctgaa aagtgaggac acggccatgt attactgtgc acagggatct 300
				aataggggcc gggggaccca ggtcaccgtc tcctca                           336
				<210> 176
				<211> 342
				<212> DNA
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 176
				caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
				tcctgtgcag cctctggatt tttattcagt atttacgaca tgaattgggt ccgccaggct 120
				ccagggaagg gcgtcgagtg gatcgcaggt attacaaata atgagcatac cacagcctat 180
				gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acaccaaaaa caccctgttt 240
				ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatgt attactgtca gagagatgac 300
				ggacaagtgc ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct ca                    342
				<210> 177
				<211> 356
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 177
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Phe Phe Ser Ala Tyr Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ala
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Glu Gly Asp Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln
				        115                 120                 125             
				Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
				    130                 135                 140                 
				Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
				145                 150                 155                 160 
				Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
				                165                 170                 175     
				Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
				            180                 185                 190         
				Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
				        195                 200                 205             
				Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
				    210                 215                 220                 
				Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
				225                 230                 235                 240 
				Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
				                245                 250                 255     
				Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
				            260                 265                 270         
				Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
				        275                 280                 285             
				Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
				    290                 295                 300                 
				Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
				305                 310                 315                 320 
				Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
				                325                 330                 335     
				Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
				            340                 345                 350         
				Leu Pro Pro Arg
				        355     
				<210> 178
				<211> 356
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 178
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Phe Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ala
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ser Asn Arg Gly Arg Gly Thr Gln
				        115                 120                 125             
				Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
				    130                 135                 140                 
				Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
				145                 150                 155                 160 
				Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
				                165                 170                 175     
				Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
				            180                 185                 190         
				Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
				        195                 200                 205             
				Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
				    210                 215                 220                 
				Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
				225                 230                 235                 240 
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				Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
				            260                 265                 270         
				Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
				        275                 280                 285             
				Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
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				Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
				305                 310                 315                 320 
				Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
				                325                 330                 335     
				Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
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				Leu Pro Pro Arg
				        355     
				<210> 179
				<211> 358
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 179
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Leu Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Val Glu Trp Ile Ala Gly Ile Thr Asn Asn Glu His Thr Thr Ala
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Arg Asp Asp Gly Gln Val Arg Gly Gln Gly
				        115                 120                 125             
				Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
				    130                 135                 140                 
				Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
				145                 150                 155                 160 
				Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
				                165                 170                 175     
				Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
				            180                 185                 190         
				Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
				        195                 200                 205             
				Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
				    210                 215                 220                 
				Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
				225                 230                 235                 240 
				Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
				                245                 250                 255     
				Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
				            260                 265                 270         
				Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
				        275                 280                 285             
				Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
				    290                 295                 300                 
				Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
				305                 310                 315                 320 
				Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
				                325                 330                 335     
				Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
				            340                 345                 350         
				Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355             
				<210> 180
				<211> 479
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 180
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
				            20                  25                  30          
				Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln
				        35                  40                  45              
				Asp Ile Asn Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
				    50                  55                  60                  
				Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro
				65                  70                  75                  80  
				Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
				                85                  90                  95      
				Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
				            100                 105                 110         
				Gly Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
				        115                 120                 125             
				Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
				    130                 135                 140                 
				Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
				145                 150                 155                 160 
				Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
				                165                 170                 175     
				Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
				            180                 185                 190         
				Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
				        195                 200                 205             
				Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
				    210                 215                 220                 
				Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
				225                 230                 235                 240 
				Ser Leu Val Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Gly Phe Asp Tyr Trp
				                245                 250                 255     
				Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Leu Asp Asn
				            260                 265                 270         
				Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
				        275                 280                 285             
				Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
				    290                 295                 300                 
				Val Trp Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
				305                 310                 315                 320 
				Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
				                325                 330                 335     
				Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
				            340                 345                 350         
				Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
				        355                 360                 365             
				Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
				    370                 375                 380                 
				Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
				385                 390                 395                 400 
				Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
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				Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
				            420                 425                 430         
				Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
				        435                 440                 445             
				Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
				    450                 455                 460                 
				Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				465                 470                 475                 
				<210> 181
				<211> 356
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 181
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly
				        115                 120                 125             
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro
				    130                 135                 140                 
				Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys
				145                 150                 155                 160 
				Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
				                165                 170                 175     
				Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
				            180                 185                 190         
				Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
				        195                 200                 205             
				Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
				    210                 215                 220                 
				Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
				225                 230                 235                 240 
				Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
				                245                 250                 255     
				Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
				            260                 265                 270         
				Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
				        275                 280                 285             
				Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
				    290                 295                 300                 
				Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
				305                 310                 315                 320 
				Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
				                325                 330                 335     
				Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
				            340                 345                 350         
				Leu Pro Pro Arg
				        355     
				<210> 182
				<211> 20
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 182
				Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
				 1               5                  10                  15      
				Gly Gly Gly Ser
				            20  
				<210> 183
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 183
				Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
				 1               5                  10                  15      
				Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
				            20                  25  
				<210> 184
				<211> 488
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 184
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly
				        115                 120                 125             
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
				    130                 135                 140                 
				Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
				145                 150                 155                 160 
				Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met
				                165                 170                 175     
				Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Val
				            180                 185                 190         
				Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly
				        195                 200                 205             
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
				    210                 215                 220                 
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly
				225                 230                 235                 240 
				Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys Gly Leu Gly Arg Ser Ala Tyr
				                245                 250                 255     
				Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val
				            260                 265                 270         
				Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile
				        275                 280                 285             
				Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
				    290                 295                 300                 
				Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
				305                 310                 315                 320 
				Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
				                325                 330                 335     
				Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
				            340                 345                 350         
				Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
				        355                 360                 365             
				Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
				    370                 375                 380                 
				Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
				385                 390                 395                 400 
				Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
				                405                 410                 415     
				Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
				            420                 425                 430         
				Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
				        435                 440                 445             
				Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
				    450                 455                 460                 
				Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
				465                 470                 475                 480 
				His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				                485             
				<210> 185
				<211> 493
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 185
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly
				        115                 120                 125             
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
				    130                 135                 140                 
				Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln
				145                 150                 155                 160 
				Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr
				                165                 170                 175     
				Ser Ile Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
				            180                 185                 190         
				Glu Gly Val Ala Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Arg
				        195                 200                 205             
				Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn
				    210                 215                 220                 
				Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met
				225                 230                 235                 240 
				Tyr Tyr Cys Ala Gly Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys Gly Leu
				                245                 250                 255     
				Gly Arg Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
				            260                 265                 270         
				Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys
				        275                 280                 285             
				Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
				    290                 295                 300                 
				Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
				305                 310                 315                 320 
				Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
				                325                 330                 335     
				Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
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				Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
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				Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
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				Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
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				Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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				Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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				Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
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				Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
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				Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
				465                 470                 475                 480 
				Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				                485                 490             
				<210> 186
				<211> 498
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 186
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly
				        115                 120                 125             
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
				    130                 135                 140                 
				Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
				145                 150                 155                 160 
				Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
				                165                 170                 175     
				Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
				            180                 185                 190         
				Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly
				        195                 200                 205             
				Arg Thr Asp Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln
				    210                 215                 220                 
				Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
				225                 230                 235                 240 
				Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Lys Thr Thr Tyr Pro Gly
				                245                 250                 255     
				Tyr Gly Cys Gly Leu Gly Arg Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
				            260                 265                 270         
				Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
				        275                 280                 285             
				Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys
				    290                 295                 300                 
				His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp
				305                 310                 315                 320 
				Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
				                325                 330                 335     
				Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
				            340                 345                 350         
				Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
				        355                 360                 365             
				Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
				    370                 375                 380                 
				Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
				385                 390                 395                 400 
				Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
				                405                 410                 415     
				Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
				            420                 425                 430         
				Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
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				Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
				    450                 455                 460                 
				Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
				465                 470                 475                 480 
				Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
				                485                 490                 495     
				Pro Arg
				<210> 187
				<211> 503
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 187
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly
				        115                 120                 125             
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
				    130                 135                 140                 
				Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
				145                 150                 155                 160 
				Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
				                165                 170                 175     
				Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met Gly
				            180                 185                 190         
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ile
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				Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg
				    210                 215                 220                 
				Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
				225                 230                 235                 240 
				Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Lys
				                245                 250                 255     
				Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys Gly Leu Gly Arg Ser Ala Tyr Asn
				            260                 265                 270         
				Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met
				        275                 280                 285             
				Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile
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				His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
				305                 310                 315                 320 
				Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
				                325                 330                 335     
				Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
				            340                 345                 350         
				Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
				        355                 360                 365             
				Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
				    370                 375                 380                 
				Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
				385                 390                 395                 400 
				Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
				                405                 410                 415     
				Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
				            420                 425                 430         
				Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
				        435                 440                 445             
				Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
				    450                 455                 460                 
				Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
				465                 470                 475                 480 
				Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
				                485                 490                 495     
				Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				            500             
				<210> 188
				<211> 508
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 188
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
				                85                  90                  95      
				Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe Gly
				        115                 120                 125             
				Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
				    130                 135                 140                 
				Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
				145                 150                 155                 160 
				Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
				                165                 170                 175     
				Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser
				            180                 185                 190         
				Ile Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
				        195                 200                 205             
				Gly Val Ala Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Arg Asp
				    210                 215                 220                 
				Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr
				225                 230                 235                 240 
				Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
				                245                 250                 255     
				Tyr Cys Ala Gly Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys Gly Leu Gly
				            260                 265                 270         
				Arg Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
				        275                 280                 285             
				Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
				    290                 295                 300                 
				Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
				305                 310                 315                 320 
				Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
				                325                 330                 335     
				Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
				            340                 345                 350         
				Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
				        355                 360                 365             
				Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
				    370                 375                 380                 
				Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
				385                 390                 395                 400 
				Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
				                405                 410                 415     
				Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
				            420                 425                 430         
				Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
				        435                 440                 445             
				Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
				    450                 455                 460                 
				Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
				465                 470                 475                 480 
				Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
				                485                 490                 495     
				Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				            500                 505             
				<210> 189
				<211> 501
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 189
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
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				Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr
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				Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
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				Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
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				Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
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				Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
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				Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
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				Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
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				<210> 190
				<211> 488
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 190
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
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				Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
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				Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
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				Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
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				Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
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				Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
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				<210> 191
				<211> 493
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 191
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
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				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
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				Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr
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				Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys
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				Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
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				Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
				        435                 440                 445             
				Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
				    450                 455                 460                 
				Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
				465                 470                 475                 480 
				Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				                485                 490             
				<210> 192
				<211> 498
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 192
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
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				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
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				Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp
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				Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
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				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys
				        115                 120                 125             
				Gly Leu Gly Arg Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
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				Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
				145                 150                 155                 160 
				Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln
				                165                 170                 175     
				Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val
				            180                 185                 190         
				Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Arg
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				Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Asp
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				Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser
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				Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
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				Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
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				Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
				385                 390                 395                 400 
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				Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
				            420                 425                 430         
				Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
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				Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
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				Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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				Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
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				Pro Arg
				<210> 193
				<211> 503
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 193
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
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				Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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				His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
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				Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
				                325                 330                 335     
				Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
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				Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
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				Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
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				Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
				385                 390                 395                 400 
				Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
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				Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
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				Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
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				Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
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				Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
				465                 470                 475                 480 
				Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
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				<210> 194
				<211> 508
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 194
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
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				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
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				Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
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				Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
				385                 390                 395                 400 
				Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
				                405                 410                 415     
				Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
				            420                 425                 430         
				Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
				        435                 440                 445             
				Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
				    450                 455                 460                 
				Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
				465                 470                 475                 480 
				Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
				                485                 490                 495     
				Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				            500                 505             
				<210> 195
				<211> 501
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 195
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys
				        115                 120                 125             
				Gly Leu Gly Arg Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
				    130                 135                 140                 
				Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
				145                 150                 155                 160 
				Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
				                165                 170                 175     
				Ser Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
				            180                 185                 190         
				Tyr Thr Val Arg Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly
				        195                 200                 205             
				Lys Gly Arg Glu Pro Val Ala Thr Ile Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala
				    210                 215                 220                 
				Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
				225                 230                 235                 240 
				Lys Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Gly Asp Thr
				                245                 250                 255     
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Trp Pro Thr Leu Thr Tyr Phe
				            260                 265                 270         
				Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro
				        275                 280                 285             
				Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
				    290                 295                 300                 
				Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
				305                 310                 315                 320 
				Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
				                325                 330                 335     
				Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
				            340                 345                 350         
				Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
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				Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
				    370                 375                 380                 
				Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
				385                 390                 395                 400 
				Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
				                405                 410                 415     
				Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
				            420                 425                 430         
				Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
				        435                 440                 445             
				Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
				    450                 455                 460                 
				Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
				465                 470                 475                 480 
				Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
				                485                 490                 495     
				Ala Leu Pro Pro Arg
				            500     
				<210> 196
				<211> 371
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 196
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys
				        115                 120                 125             
				Gly Leu Gly Arg Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
				    130                 135                 140                 
				Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
				145                 150                 155                 160 
				Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
				                165                 170                 175     
				Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
				            180                 185                 190         
				Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
				        195                 200                 205             
				Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
				    210                 215                 220                 
				Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
				225                 230                 235                 240 
				Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
				                245                 250                 255     
				Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
				            260                 265                 270         
				Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
				        275                 280                 285             
				Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
				    290                 295                 300                 
				Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
				305                 310                 315                 320 
				Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
				                325                 330                 335     
				Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
				            340                 345                 350         
				Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
				        355                 360                 365             
				Pro Pro Arg
				    370     
				<210> 197
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 197
				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 198
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 198
				Gly Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn Cys Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 199
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 199
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 200
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 200
				Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Arg Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 201
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 201
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly
				            20                  25                  30          
				<210> 202
				<211> 18
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 202
				Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys Gly Leu Gly Arg Ser Ala Tyr
				 1               5                  10                  15      
				Asn Tyr
				<210> 203
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 203
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 204
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 204
				Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 205
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 205
				Gly Tyr Ile Gly Gly His Tyr Tyr Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 206
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 206
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 207
				<211> 18
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 207
				Ala Ile Asp Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Gly Ser Val
				 1               5                  10                  15      
				Gln Gly
				<210> 208
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 208
				Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Val
				            20                  25                  30          
				<210> 209
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 209
				Gly Val Gly Trp Val Pro Ala Arg Leu Thr Pro Gln Ala Val Ser Tyr
				 1               5                  10                  15      
				<210> 210
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 210
				Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 211
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 211
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 212
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 212
				Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr Val Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 213
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 213
				Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
				 1               5                  10                  
				<210> 214
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 214
				Cys Ile Gly Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
				 1               5                  10                  15      
				Gly
				<210> 215
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 215
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
				            20                  25                  30          
				<210> 216
				<211> 17
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 216
				Asp Gln Gly Lys Cys Ser Leu Gly Ser Ala Gly Ala Asp Asp Met Asp
				 1               5                  10                  15      
				Tyr
				<210> 217
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 217
				Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 218
				<211> 25
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 218
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
				            20                  25  
				<210> 219
				<211> 10
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 219
				Gly Asn Val Phe Arg Phe Asn Ile Met Gly
				 1               5                  10  
				<210> 220
				<211> 14
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 220
				Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val Ala
				 1               5                  10                  
				<210> 221
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 221
				Ser Ile Asp Asp Gly Gly Asp Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly
				 1               5                  10                  15      
				<210> 222
				<211> 32
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 222
				Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Gly Lys Lys Ile Met Tyr Leu Gln
				 1               5                  10                  15      
				Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
				            20                  25                  30          
				<210> 223
				<211> 16
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 223
				Gly Leu Gly Thr Tyr Leu Asn Gly Arg Val Ser Met Ala Thr Asn Tyr
				 1               5                  10                  15      
				<210> 224
				<211> 11
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 224
				Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				 1               5                  10      
				<210> 225
				<211> 127
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 225
				Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ile Asn
				            20                  25                  30          
				Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
				        35                  40                  45              
				Ala Val Ile Ser Thr Gly Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Arg Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Ala Gly Lys Thr Thr Tyr Pro Gly Tyr Gly Cys Gly Leu Gly Arg Ser
				            100                 105                 110         
				Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120                 125         
				<210> 226
				<211> 126
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 226
				Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ile Gly Gly His Tyr
				            20                  25                  30          
				Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
				        35                  40                  45              
				Ala Ala Ile Asp Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Gly Ser
				    50                  55                  60                  
				Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
				65                  70                  75                  80  
				His Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr
				                85                  90                  95      
				Cys Ala Val Gly Val Gly Trp Val Pro Ala Arg Leu Thr Pro Gln Ala
				            100                 105                 110         
				Val Ser Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120                 125     
				<210> 227
				<211> 126
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 227
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
				            20                  25                  30          
				Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
				        35                  40                  45              
				Ser Cys Ile Gly Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
				    50                  55                  60                  
				Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
				                85                  90                  95      
				Ala Ala Asp Gln Gly Lys Cys Ser Leu Gly Ser Ala Gly Ala Asp Asp
				            100                 105                 110         
				Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120                 125     
				<210> 228
				<211> 124
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 228
				Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
				 1               5                  10                  15      
				Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Val Phe Arg Phe Asn
				            20                  25                  30          
				Ile Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val
				        35                  40                  45              
				Ala Ser Ile Asp Asp Gly Gly Asp Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val Glu
				    50                  55                  60                  
				Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Gly Lys Lys Ile Met Tyr Leu
				65                  70                  75                  80  
				Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
				                85                  90                  95      
				Ala Gly Leu Gly Thr Tyr Leu Asn Gly Arg Val Ser Met Ala Thr Asn
				            100                 105                 110         
				Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
				        115                 120                 
				<210> 229
				<211> 361
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 229
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu
				            20                  25                  30          
				Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Ala Glu Arg Trp Asp Glu Asn Asp
				        115                 120                 125             
				Leu Arg Arg Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu
				    130                 135                 140                 
				Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
				145                 150                 155                 160 
				Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
				                165                 170                 175     
				Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
				            180                 185                 190         
				Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
				        195                 200                 205             
				Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
				    210                 215                 220                 
				Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
				225                 230                 235                 240 
				Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
				                245                 250                 255     
				Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
				            260                 265                 270         
				Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
				        275                 280                 285             
				Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
				    290                 295                 300                 
				Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
				305                 310                 315                 320 
				Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
				                325                 330                 335     
				Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
				            340                 345                 350         
				Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360     
				<210> 230
				<211> 352
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 230
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Val Tyr Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ser
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Thr Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln
				        115                 120                 125             
				Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp
				    130                 135                 140                 
				Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu
				145                 150                 155                 160 
				Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu
				                165                 170                 175     
				Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
				            180                 185                 190         
				Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
				        195                 200                 205             
				Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
				    210                 215                 220                 
				His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
				225                 230                 235                 240 
				Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
				                245                 250                 255     
				Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
				            260                 265                 270         
				Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
				        275                 280                 285             
				Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
				    290                 295                 300                 
				Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
				305                 310                 315                 320 
				Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
				                325                 330                 335     
				Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				            340                 345                 350         
				<210> 231
				<211> 370
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 231
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr
				        35                  40                  45              
				Ile Gly Gly His Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr
				65                  70                  75                  80  
				Arg Tyr Ala Gly Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
				                85                  90                  95      
				Ala Lys Asn Thr Leu His Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp
				            100                 105                 110         
				Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Val Gly Val Gly Trp Val Pro Ala Arg
				        115                 120                 125             
				Leu Thr Pro Gln Ala Val Ser Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr
				    130                 135                 140                 
				Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
				145                 150                 155                 160 
				Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
				                165                 170                 175     
				Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
				            180                 185                 190         
				Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
				        195                 200                 205             
				Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
				    210                 215                 220                 
				Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
				225                 230                 235                 240 
				Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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				Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
				            260                 265                 270         
				Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
				        275                 280                 285             
				Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
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				Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
				305                 310                 315                 320 
				Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
				                325                 330                 335     
				Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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				Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
				        355                 360                 365             
				Pro Arg
				    370 
				<210> 232
				<211> 370
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 232
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Asp Asn Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Gly Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Gln Gly Lys Cys Ser Leu Gly Ser
				        115                 120                 125             
				Ala Gly Ala Asp Asp Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
				    130                 135                 140                 
				Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
				145                 150                 155                 160 
				Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
				                165                 170                 175     
				Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
				            180                 185                 190         
				Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
				        195                 200                 205             
				Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
				    210                 215                 220                 
				Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
				225                 230                 235                 240 
				Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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				Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
				            260                 265                 270         
				Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
				        275                 280                 285             
				Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
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				Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
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				Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
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				Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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				Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
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				Pro Arg
				    370 
				<210> 233
				<211> 368
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 233
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn
				        35                  40                  45              
				Val Phe Arg Phe Asn Ile Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn
				    50                  55                  60                  
				Gln Arg Glu Leu Val Ala Ser Ile Asp Asp Gly Gly Asp Arg Ser Tyr
				65                  70                  75                  80  
				Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Gly Lys
				                85                  90                  95      
				Lys Ile Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
				            100                 105                 110         
				Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gly Thr Tyr Leu Asn Gly Arg Val
				        115                 120                 125             
				Ser Met Ala Thr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
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				Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
				145                 150                 155                 160 
				Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
				                165                 170                 175     
				Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
				            180                 185                 190         
				Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
				        195                 200                 205             
				Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
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				Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
				225                 230                 235                 240 
				Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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				Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
				            260                 265                 270         
				Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
				        275                 280                 285             
				Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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				Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
				305                 310                 315                 320 
				Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
				                325                 330                 335     
				Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
				            340                 345                 350         
				Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				        355                 360                 365             
				<210> 234
				<211> 753
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 234
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu
				            20                  25                  30          
				Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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				Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser
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				Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Ala Glu Arg Trp Asp Glu Asn Asp
				        115                 120                 125             
				Leu Arg Arg Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu
				    130                 135                 140                 
				Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
				145                 150                 155                 160 
				Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
				                165                 170                 175     
				Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
				            180                 185                 190         
				Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
				        195                 200                 205             
				Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
				    210                 215                 220                 
				Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
				225                 230                 235                 240 
				Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
				                245                 250                 255     
				Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
				            260                 265                 270         
				Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
				        275                 280                 285             
				Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
				    290                 295                 300                 
				Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
				305                 310                 315                 320 
				Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
				                325                 330                 335     
				Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
				            340                 345                 350         
				Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
				        355                 360                 365             
				Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
				    370                 375                 380                 
				Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
				385                 390                 395                 400 
				Ala Ala Arg Pro Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
				                405                 410                 415     
				Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ile
				            420                 425                 430         
				Gly Gly His Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
				        435                 440                 445             
				Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg
				    450                 455                 460                 
				Tyr Ala Gly Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
				465                 470                 475                 480 
				Lys Asn Thr Leu His Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
				                485                 490                 495     
				Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Val Gly Val Gly Trp Val Pro Ala Arg Leu
				            500                 505                 510         
				Thr Pro Gln Ala Val Ser Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val
				        515                 520                 525             
				Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
				    530                 535                 540                 
				Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
				545                 550                 555                 560 
				Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
				                565                 570                 575     
				Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
				            580                 585                 590         
				Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
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				Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
				    610                 615                 620                 
				Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
				625                 630                 635                 640 
				Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
				                645                 650                 655     
				Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
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				Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
				        675                 680                 685             
				Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
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				Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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				Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
				                725                 730                 735     
				Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
				            740                 745                 750         
				Arg
				<210> 235
				<211> 753
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 235
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu
				            20                  25                  30          
				Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Thr Ser
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Ala Glu Arg Trp Asp Glu Asn Asp
				        115                 120                 125             
				Leu Arg Arg Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ile Glu
				    130                 135                 140                 
				Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
				145                 150                 155                 160 
				Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
				                165                 170                 175     
				Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
				            180                 185                 190         
				Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
				        195                 200                 205             
				Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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				Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
				225                 230                 235                 240 
				Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
				                245                 250                 255     
				Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
				            260                 265                 270         
				Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
				        275                 280                 285             
				Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
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				Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
				305                 310                 315                 320 
				Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
				                325                 330                 335     
				Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
				            340                 345                 350         
				Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
				        355                 360                 365             
				Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
				    370                 375                 380                 
				Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
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				Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
				                405                 410                 415     
				Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr
				            420                 425                 430         
				Phe Asp Asn Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
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				Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Gly Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
				    450                 455                 460                 
				Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
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				Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
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				Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Gln Gly Lys Cys Ser Leu Gly Ser Ala
				            500                 505                 510         
				Gly Ala Asp Asp Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
				        515                 520                 525             
				Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
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				Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
				545                 550                 555                 560 
				Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
				                565                 570                 575     
				Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
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				Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
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				Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
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				Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
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				Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
				                645                 650                 655     
				Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
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				Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
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				Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
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				Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
				705                 710                 715                 720 
				Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
				                725                 730                 735     
				Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
				            740                 745                 750         
				Arg
				<210> 236
				<211> 742
				<212> PRT
				<213> 人工序列(Artificial Sequence)
				<220> 
				<223> 合成構築體
				<400> 236
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
				 1               5                  10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
				            20                  25                  30          
				Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
				        35                  40                  45              
				Thr Phe Ser Val Tyr Asp Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
				    50                  55                  60                  
				Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Ser
				65                  70                  75                  80  
				Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
				                85                  90                  95      
				Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
				            100                 105                 110         
				Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Thr Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln
				        115                 120                 125             
				Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp
				    130                 135                 140                 
				Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu
				145                 150                 155                 160 
				Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu
				                165                 170                 175     
				Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
				            180                 185                 190         
				Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
				        195                 200                 205             
				Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
				    210                 215                 220                 
				His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
				225                 230                 235                 240 
				Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
				                245                 250                 255     
				Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
				            260                 265                 270         
				Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
				        275                 280                 285             
				Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
				    290                 295                 300                 
				Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
				305                 310                 315                 320 
				Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
				                325                 330                 335     
				Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				            340                 345                 350         
				Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
				        355                 360                 365             
				Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu
				    370                 375                 380                 
				Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val
				385                 390                 395                 400 
				Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
				                405                 410                 415     
				Cys Ala Ala Ser Gly Asn Val Phe Arg Phe Asn Ile Met Gly Trp Tyr
				            420                 425                 430         
				Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val Ala Ser Ile Asp Asp
				        435                 440                 445             
				Gly Gly Asp Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile
				    450                 455                 460                 
				Ser Arg Glu Asn Gly Lys Lys Ile Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
				465                 470                 475                 480 
				Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gly Thr
				                485                 490                 495     
				Tyr Leu Asn Gly Arg Val Ser Met Ala Thr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
				            500                 505                 510         
				Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
				        515                 520                 525             
				Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
				    530                 535                 540                 
				Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
				545                 550                 555                 560 
				Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
				                565                 570                 575     
				Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
				            580                 585                 590         
				Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
				        595                 600                 605             
				Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
				    610                 615                 620                 
				Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
				625                 630                 635                 640 
				Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
				                645                 650                 655     
				Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
				            660                 665                 670         
				Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
				        675                 680                 685             
				Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
				    690                 695                 700                 
				Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
				705                 710                 715                 720 
				Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
				                725                 730                 735     
				Gln Ala Leu Pro Pro Arg
				            740

Claims (47)

  1. 一種包含特異性結合CLL1之單域抗體(「sdAb」)部分的抗CLL1構築體，其中該sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158及165中之任一者之胺基酸序列的CDR1或其在該CDR1中包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160及167中之任一者之胺基酸序列的CDR2或其在該CDR2中包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162及169中之任一者之胺基酸序列的CDR3或其在該CDR3中包含至多約3個胺基酸取代之變體。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗CLL1構築體，其中該sdAb部分包含：
    (1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；
    (15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體；或
    (16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3或其在該等CDR中包含至多約5個胺基酸取代之變體。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗CLL1構築體，其中該sdAb部分包含：
    (1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3；
    (2)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的CDR3；
    (3)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3；
    (4)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR3；
    (5)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR3；
    (6)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3；
    (7)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR3；
    (8)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR3；
    (9)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR3；
    (10)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的CDR3；
    (11)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的CDR3；
    (12)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的CDR3；
    (13)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的CDR3；
    (14)包含SEQ ID NO：151之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：153之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：155之胺基酸序列的CDR3；
    (15)包含SEQ ID NO：158之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：162之胺基酸序列的CDR3；或
    (16)包含SEQ ID NO：165之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：167之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列的CDR3。
  4. 一種包含特異性結合CLL1之sdAb部分的抗CLL1構築體，其中該sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之胺基酸序列的sdAb的CDR1、CDR2及CDR3。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗CLL1構築體，其中該sdAb部分包含與SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之該胺基酸序列具有至少約95%序列一致性的胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗CLL1構築體，其中該sdAb部分包含SEQ ID NO：94-106及171-173中之任一者之該胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗CLL1構築體，其中該抗CLL1構築體包含有包含該sdAb部分之細胞外域、跨膜域及包含免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
  8. 如申請專利範圍第7項之抗CLL1構築體，其中該主要細胞內信號傳導序列來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。
  9. 如申請專利範圍第7項或第8項之抗CLL1構築體，其中該細胞內信號傳導域還包含細胞內共刺激序列。
  10. 如申請專利範圍第7項或第8項之抗CLL1構築體，其中該細胞內信號傳導域不包含細胞內共刺激序列。
  11. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗CLL1構築體，其中該抗CLL1構築體包含有包含該sdAb部分之細胞外域、跨膜域及包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。
  12. 如申請專利範圍第9項或第11項之抗CLL1構築體，其中該細胞內共刺激序列來源於選自由以下組成之群之共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、 B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83之配體及其組合。
  13. 一種抗CLL1構築體，其包含有包含抗CLL1 sdAb部分之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中該抗CLL1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3。
  14. 如申請專利範圍第7項至第13項中任一項之抗CLL1構築體，其中該抗CLL1構築體之該細胞外域還包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗CLL1構築體，其中該第二結合部分為sdAb、scFv或受體之細胞外域。
  16. 如申請專利範圍第15項之抗CLL1構築體，其中該第二結合部分為特異性結合CD33或CD123之sdAb或scFv。
  17. 如申請專利範圍第15項之抗CLL1構築體，其中該第二結合部分為NKG2D之細胞外域。
  18. 一種抗CLL1構築體，其包含有包含抗CLL1 sdAb部分及抗CD33 sdAb部分之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中該抗CLL1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR3，且其中該抗CD33 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列的CDR3。
  19. 一種抗CLL1構築體，其包含SEQ ID NO：120-132、177-179、181、184-195、229-230及234-236中之任一者之胺基酸序列。
  20. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之抗CLL1構築體。
  21. 一種經工程改造免疫細胞，其包含如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之抗CLL1構築體或如申請專利範圍第20項之核酸。
  22. 如申請專利範圍第21項之經工程改造免疫細胞，其還包含第二嵌合受體。
  23. 如申請專利範圍第22項之經工程改造免疫細胞，其中該第二嵌合受體包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分的細胞外域、跨膜域及包含免疫效應細胞之主要細胞內信號傳導序列的細胞內信號傳導域。
  24. 如申請專利範圍第23項之經工程改造免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域還包含細胞內共刺激序列。
  25. 如申請專利範圍第22項之經工程改造免疫細胞，其中該第二嵌合受體包含有包含特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分的細胞外域、跨膜域及包含細胞內共刺激序列之細胞內信號傳導域。
  26. 如申請專利範圍第23項至第25項中任一項之經工程改造免疫細胞，其中該第二結合部分為sdAb、scFv或受體之細胞外域。
  27. 如申請專利範圍第26項之經工程改造免疫細胞，其中該第二結合部分為特異性結合CD33或CD123之sdAb或scFv。
  28. 如申請專利範圍第26項之經工程改造免疫細胞，其中該第二結合部分為NKG2D之細胞外域。
  29. 一種經工程改造免疫細胞，其包含：(a)第一嵌合受體，其包含有包含抗CLL1 sdAb之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中該抗CLL1 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR3；或(2)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的CDR3；及(b)第二嵌合受體，其包含有包含抗CD33 sdAb之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中該抗CD33 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列的CDR3；或(3)包含SEQ ID NO：219之胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：221之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO：223之胺基酸序列的CDR3。
  30. 如申請專利範圍第21項至第29項中任一項之經工程改造免疫細胞，其中該免疫細胞為T細胞。
  31. 如申請專利範圍第30項之經工程改造免疫細胞，其中該免疫細胞係選自由以下組成之群：細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、自然殺傷T細胞或γδT細胞。
  32. 如申請專利範圍第21項至第31項中任一項之經工程改造免疫細胞，其中該經工程改造免疫細胞表現安全性開關抗原或抗原決定基。
  33. 如申請專利範圍第32項之經工程改造免疫細胞，其中該安全性開關抗原或抗原決定基來源於CD52、EGFR或CD20。
  34. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗CLL1構築體，其中該抗CLL1構築體為單特異性分子。
  35. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗CLL1構築體，其中該抗CLL1構築體為多特異性分子。
  36. 如申請專利範圍第35項之抗CLL1構築體，其中該抗CLL1構築體包含與特異性結合第二抗原或抗原決定基之第二結合部分連接的該sdAb部分。
  37. 如申請專利範圍第36項之抗CLL1構築體，其中該第二結合部分為sdAb或scFv。
  38. 如申請專利範圍第36項或第37項之抗CLL1構築體，其中該sdAb部分與該第二結合部分經由肽連接子連接。
  39. 如申請專利範圍第36項至第38項中任一項之抗CLL1構築體，其中該第二結合部分特異性結合T細胞表面上之抗原。
  40. 如申請專利範圍第39項之抗CLL1構築體，其中該第二結合部分特異性結合選自由以下組成之群之抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、4-1BB、CD27、CD40L及HVEM。
  41. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗CLL1構築體，其中該抗CLL1構築體為包含該sdAb部分及效應分子之免疫結合物。
  42. 如申請專利範圍第41項之抗CLL1構築體，其中該效應分子為選自由以下組成之群之治療劑：藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸。
  43. 如申請專利範圍第41項之抗CLL1構築體，其中該效應分子為藥物或毒素。
  44. 如申請專利範圍第41項之抗CLL1構築體，其中該效應分子為標記。
  45. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第19項及第34項至第44項中任一項之抗CLL1構築體或如申請專利範圍第21項至第33項中任一項之經工程改造免疫細胞。
  46. 一種治療患有癌症之個體的方法，該方法包括向該個體投與有效量之如申請專利範圍第1項至第19項及第34項至第44項中任一項之抗CLL1構築體或如申請專利範圍第21項至第33項中任一項之經工程改造免疫細胞。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及骨髓化生不良症候群(MDS)。
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