WO2023095913A1 - ヒトｔｎｆｒ２アゴニストとして利用可能なポリペプチド - Google Patents

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WO2023095913A1
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polypeptide
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human
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慎一 角田
雅己 井上
康弘 阿部
大介 安藤
春彦 鎌田
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学校法人神戸学院
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to polypeptides that can be used as human TNFR2 agonists.
  • Treg Regulatory T cells
  • CTL cytotoxic T cells
  • TNF controls immune responses through TNF receptors (TNFR). TNF induces apoptosis and inflammation induction when bound to the type 1 TNF receptor (TNFR1), whereas TNF induces Treg proliferation and activation when bound to the type 2 TNF receptor (TNFR2). In humans, Tregs have multiple subtypes, among which effector Tregs are more activated forms.
  • Non-Patent Document 1 reports that a TNFR2 agonist was obtained by mutating human TNF- ⁇ .
  • Non-Patent Document 2 reports that a TNFR1 antagonist is fused with an antibody Fc region, and a complex is used via the Fc region. However, although the fusion of the Fc region increased stability, no improvement in activity was observed.
  • An object of the present invention is to provide a technique for further improving the agonistic activity of human TNFR2 agonists.
  • a further object of the present invention is to provide a technique for selectively increasing effector Tregs.
  • the present inventors have discovered a polypeptide comprising a human TNFR2 agonist domain and a multimerization domain, wherein the human TNFR2 agonist domain is linked to the multimerization domain. It has been found that the above problem can be solved if there is. Based on this finding, the inventors have further studied and completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Section 1 A polypeptide comprising a human TNFR2 agonist domain and a multimerization domain, wherein the human TNFR2 agonist domain is linked to the multimerization domain.
  • the human TNF- ⁇ mutant comprises an amino acid sequence B obtained by mutating the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence B is L29, A145, E146, and S147 in the amino acid sequence A.
  • Item 3 The polypeptide according to item 2, comprising an amino acid substitution mutation of at least one amino acid selected from the group consisting of:
  • Item 4 wherein the amino acid after mutation of L29 is valine or alanine, and the amino acid after mutation of A145, E146 and S147 is aspartic acid or glutamic acid.
  • Item 5 Item 5. Item 3 or 4, wherein the human TNFR2 agonist domain comprises a domain structure consisting of amino acid sequence B-linker-amino acid sequence B-linker amino acid sequence B from the N-terminal side.
  • Item 6 Items 1 to 5, wherein the multimerization domain comprises an antibody Fc region.
  • Item 7 Items 1 to 6, wherein the human TNFR2 agonist domain is linked to the multimerization domain via an antibody hinge region and/or a linker.
  • Item 8 A polynucleotide comprising a coding sequence for the polypeptide according to any one of Items 1 to 7.
  • Item 9 A cell comprising the polynucleotide according to Item 8.
  • Item 10 A complex in which a plurality of polypeptides according to any one of Items 1 to 7 are linked via the multimerization domains.
  • a human TNFR2 agonist comprising the conjugate according to item 10.
  • Item 12 At least one selected from the group consisting of the polypeptide according to any one of Items 1 to 7, the polynucleotide according to Item 8, the cell according to Item 9, and the complex according to Item 10, Medicine.
  • Item 13 which is an immunosuppressant, a prophylactic or therapeutic agent for autoimmune diseases, a suppressor for organ transplant rejection, or a prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases.
  • the agonist activity of human TNFR2 agonists can be further improved, and effector Tregs can be selectively increased.
  • FIG. 2 shows the results of the WST-8 assay of Example 2.
  • FIG. The vertical axis indicates the cell viability, and the horizontal axis indicates the final concentration of the test substance in the medium.
  • 2 shows a flow cytometry scattergram of Example 3.
  • FIG. 4 shows the ratio of each cell group measured in Example 3.
  • FIG. Fr.II indicates effector Tregs.
  • identity refers to the extent to which two or more comparable amino acid sequences match each other. Therefore, the higher the identity or similarity between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using the sequence analysis tool FASTA, using default parameters. or Algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Karlin S, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc Natl Acad Sci USA.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitutions between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine correspond to conservative substitutions.
  • amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues with uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine. Substitutions between amino acid residues are also conservative substitutions.
  • nucleotides such as DNA and RNA may be subjected to known chemical modifications as exemplified below.
  • Substitution of the phosphate residue of each nucleotide with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. to prevent degradation by hydrolases such as nucleases can be done.
  • the hydroxyl group at the 2nd position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.).
  • R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • phosphate moiety or hydroxyl moiety has been modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like.
  • BNA LNA
  • the conformation of the sugar portion is fixed to the N-type by bridging the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar portion of a nucleotide, can also be preferably used.
  • amino acid mutation is specifically amino acid deletion, substitution, insertion, or addition.
  • the position of an amino acid in an amino acid sequence may be indicated by the amino acid one-letter notation + the amino acid number counted from the N-terminal amino acid.
  • “L29” indicates the 29th amino acid from the N-terminus, leucine.
  • Amino acid substitution mutations are sometimes indicated by the one-letter amino acid code before mutation + the amino acid number counted from the N-terminal amino acid + the one-letter amino acid code after mutation.
  • “L29V” indicates a substitution mutation of leucine, which is the 29th amino acid from the N-terminus, to valine.
  • polypeptide of the present invention a polypeptide comprising a human TNFR2 agonist domain and a multimerization domain, wherein the human TNFR2 agonist domain is linked to the multimerization domain. This will be explained below.
  • the human TNFR2 agonist domain is a polypeptide consisting of a specific amino acid sequence that has agonistic activity against human TNFR2, and is not particularly limited as long as it can be linked to the multimerization domain to form a single polypeptide chain. .
  • Human TNFR2 which exerts agonist activity, is a known protein.
  • the amino acid sequence of human TNFR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 (NCBI Reference Sequence: NP_001057.1), and the mRNA sequence of human TNFR2 includes the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13. (NCBI Reference Sequence: NM_001066.3).
  • Human TNFR2 may also include various splicing variants.
  • Human TNFR2 has amino acid mutations such as substitutions, deletions, additions, and insertions as long as it has its original activity, that is, the activity of proliferating and/or activating Treg depending on the binding of a ligand (human TNF). You may have Mutations include preferably substitutions, more preferably conservative substitutions, from the viewpoint that activity is less likely to be impaired.
  • human TNFR2 include the protein described in (a) below and the protein described in (b) below: (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and (b) consisting of an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and proliferating and/or activating Treg At least one selected from the group consisting of proteins having an activity to induce
  • the identity is more preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, and even more preferably 98% or higher.
  • An example of the protein described in (b) above is, for example, (b') from an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • a protein having the activity of proliferating and/or activating Tregs in the above (b') is, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, more preferably 2 or 3.
  • a human TNFR2 agonist domain usually contains a variant of human TNF- ⁇ .
  • Human TNF- ⁇ is preferably of the secretory type and consists of the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO:1, for example.
  • the human TNF- ⁇ mutant is not particularly limited as long as it is a mutant obtained by introducing an amino acid mutation into human TNF- ⁇ and has agonistic activity against human TNFR2.
  • Variants of human TNF- ⁇ do not include TNF- ⁇ of other organisms (eg, mice) and variants thereof.
  • the human TNF- ⁇ variant preferably comprises an amino acid sequence B obtained by mutating the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence B comprises L29, A145, E146, and It can contain at least one amino acid substitution mutation selected from the group consisting of S147.
  • it preferably contains amino acid substitution mutations of A145 and S147, more preferably contains amino acid substitution mutations of A145, E146, and S147, and amino acid substitution mutations of L29, A145, E146, and S147. It is further preferred to contain
  • the amino acid after mutation of L29 is preferably an aliphatic amino acid with a lower molecular weight of the side chain.
  • Preferred amino acids after mutation of L29 include valine, alanine, and the like, and particularly preferred is valine.
  • Amino acids after mutation of A145 include, for example, aspartic acid, glutamic acid, histidine, arginine, threonine, glutamine, and the like.
  • a particularly preferred amino acid after mutation of A145 is aspartic acid.
  • amino acids after mutation of E146 include aspartic acid, serine, glycine, and the like.
  • Preferred amino acids after mutation of E146 include aspartic acid, glutamic acid and the like, and particularly preferred is aspartic acid.
  • amino acids after mutation of S147 include aspartic acid and glutamic acid.
  • a particularly preferred amino acid after mutation of S147 is aspartic acid.
  • amino acid sequence B lysine in amino acid sequence A is mutated to another amino acid so as not to interfere with future molecular modification (to prevent random modification of side chain amino groups).
  • amino acid sequence B is at least one selected from the group consisting of K11, K65, K90, K98, K112, and K128 in the amino acid sequence A (preferably two or more, more preferably three or more, and further preferably 4 or more, more preferably 5 or more, most preferably all 6) amino acid substitution mutations.
  • Amino acids after mutation are not particularly limited.
  • the amino acid substitution mutation of K11 is preferably K11M
  • the amino acid substitution mutation of K65 is preferably K65S
  • the amino acid substitution mutation of K90 is preferably K90P
  • the amino acid substitution of K98 Preferably, the mutation is K98R
  • the K112 amino acid substitution mutation is preferably K112N
  • the K128 amino acid substitution mutation is preferably K128P.
  • Amino acid sequence B can contain other amino acid mutations (eg, substitutions, conservative substitutions) in addition to the above, as long as the agonist activity for human TNFR2 is not significantly impaired.
  • the number of other amino acid mutations is, for example, 1-20, 1-10, 1-5, or 1-2.
  • Amino acid sequence B is preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or 85% or more (more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more) identity.
  • the human TNFR2 agonist domain preferably contains multiple human TNF- ⁇ variants.
  • a human TNFR2 agonist domain can comprise, for example, 2-6, preferably 2-5, more preferably 2-4, even more preferably 3 variants of human TNF- ⁇ .
  • the human TNF- ⁇ variants are preferably linked via a linker (peptide linker).
  • the linker is preferably an amino acid sequence that does not form a secondary structure such as an ⁇ -helix structure or a ⁇ -sheet structure and that can freely bend.
  • the linker is preferably an amino acid sequence in which units consisting of several amino acid residues are linked.
  • the peptide linker is preferably a linker composed of glycine and serine (GS linker).
  • the linker preferably consists of one or more structural units of one or more types selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14-18.
  • the number of amino acid residues in the linker is not particularly limited, but is, for example, 3 or more, preferably 3-20, more preferably 4-10.
  • the human TNFR2 agonist domain preferably contains a domain structure consisting of amino acid sequence B-linker-amino acid sequence B-linker amino acid sequence B from the N-terminal side.
  • "-" indicates a peptide bond, or an arbitrary amino acid sequence (eg, an amino acid sequence consisting of 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 2 amino acids) linked to the sequences on both sides thereof via peptide bonds.
  • the multimerization domain is not particularly limited as long as it is a domain that can bind to each other to form multimers and can be linked to multiple human TNFR2 agonist domains to form a single polypeptide chain.
  • Examples of such domains include antibody Fc regions, cartilage oligomer matrix protein domains, leucine zipper domains, collagen-like domains, cholera toxin B subunit domains, tetrabrachion coiled core domains, reovirus ⁇ 1 protein domains, hepatitis delta antigen domains, and the like.
  • the domain may be part of a human dimeric protein, eg Liprin-b2 Coil2, RP_P2 domain.
  • Antibody Fc regions are particularly preferred as multimerization domains.
  • An antibody Fc region is a region containing the CH2 domain and CH3 domain of an antibody heavy chain, and is not particularly limited in this respect.
  • the antibody Fc region is preferably the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7, or 85% or more (more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more) identity.
  • the human TNFR2 agonist domain is linked to the multimerization domain via an antibody hinge region and/or linker.
  • the antibody hinge region is not particularly limited, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or one or more (preferably 3 or less, more preferably 2 or less) relative to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 It can be an amino acid sequence in which the amino acids of are mutated. Linkers are as described above.
  • polypeptide of the present invention may contain amino acid sequences other than the above, such as secretory signal sequence, protein tag, fluorescent protein, luminescent protein, protease recognition sequence (TEV protease recognition sequence), as long as the agonist activity against human TNFR2 is not significantly impaired. etc.) may be added with a protein or peptide such as a signal sequence.
  • protein tags include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag and the like.
  • polypeptide of the present invention may be chemically modified as long as the agonist activity against human TNFR2 is not significantly impaired.
  • the polypeptide of the present invention may have a carboxyl group (--COOH), carboxylate ( --COO- ), amide (--CONH 2 ) or ester (--COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester includes, for example, C 1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and n-butyl; C 3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as , ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl 14 Aralkyl group; pivaloyloxymethyl group and the like are used.
  • C 1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and n-butyl
  • C 3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl
  • carboxyl groups (or carboxylates) other than the C-terminus may be amidated or esterified.
  • ester in this case, for example, the above-described C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the amino acid residue at the N-terminus is protected with a protective group (for example, a formyl group, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as an acetyl group, etc.).
  • a protective group for example, a formyl group, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as an acetyl group, etc.
  • -OH, -SH, amino group, imidazole group , indole group, guanidino group, etc. is protected with an appropriate protecting group (e.g., C1-6 acyl group such as formyl group, C1-6 alkanoyl group such as acetyl group, etc.), or the sugar chain is Also included are conjugated proteins such as so-called glycoproteins.
  • an appropriate protecting group e.g., C1-6 acyl group such as formyl group, C1-6 alkanoyl group such as acetyl group, etc.
  • conjugated proteins such as so-called glycoproteins.
  • the polypeptides of the present invention may be in the form of salts with acids or bases.
  • Salts are not particularly limited, and both acid salts and basic salts can be employed.
  • acid salts include mineral salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, apple organic acid salts such as acid salts, citrates, methanesulfonates, and paratoluenesulfonates; and amino acid salts such as aspartates and glutamates.
  • Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; and alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
  • the polypeptide of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the polypeptide of the present invention can be easily produced according to known genetic engineering techniques, depending on its amino acid sequence. For example, it can be produced using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription/translation technology, recombinant protein production technology, and the like.
  • the polypeptide of the present invention may be purified after synthesis.
  • the protein molecule of the present invention is extracted from the cells collected from the culture by centrifugation, filtration, or the like.
  • digestion by enzymes, breakage by osmotic pressure, sudden pressurization and pressure reduction, ultrasonic waves, various homogenizers, and the like can be used.
  • Physicochemical electrophoresis, column chromatography, supports, dialysis, salting out, etc. can be used in combination. In applying these means, physicochemical conditions such as temperature, pressure, pH, and ionic strength can be appropriately set.
  • polynucleotides of the present invention comprising coding sequences of the polypeptides of the present invention. It relates to a cell (herein sometimes referred to as “the cell of the present invention”) containing a polynucleotide.
  • the coding sequence of the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide consisting of a base sequence encoding the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention contains an expression cassette of the polypeptide of the present invention.
  • the expression cassette of the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide capable of expressing the polypeptide of the present invention in cells.
  • a typical example of an expression cassette for a polypeptide of the invention includes a promoter and a polynucleotide comprising a coding sequence for a polypeptide of the invention placed under the control of the promoter.
  • the promoter contained in the expression cassette of the polypeptide of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected according to the target cell.
  • various pol II promoters can be used.
  • pol II promoters include, but are not limited to, CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter and the like.
  • Other promoters include tryptophan promoters such as trc and tac, lac promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, SP6 promoter, arabinose-inducible promoter, cold shock promoter, tetracycline-inducible promoter, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention may optionally contain other elements (e.g., multiple cloning site (MCS), drug resistance gene, replication origin, enhancer sequence, repressor sequence, insulator sequence, reporter protein (e.g., fluorescent protein). etc.) coding sequences, drug resistance gene coding sequences, guide RNA expression cassettes, etc.).
  • MCS multiple cloning site
  • drug resistance gene e.g., replication origin, enhancer sequence, repressor sequence, insulator sequence, reporter protein (e.g., fluorescent protein).
  • reporter protein e.g., fluorescent protein
  • the polynucleotide of the present invention can be in the form of a vector.
  • a suitable vector is selected depending on the purpose of use (cloning, expression of protein) and in consideration of the type of host cell.
  • E. coli host vectors include M13 phage or variants thereof, ⁇ phage or variants thereof, pBR322 or variants thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.), and yeast hosts include pYepSec1, pMFa, pYES2. , pPIC3.5K and the like, pAc, pVL and the like for insect cell hosts, and pcDNA, pCDM8, pMT2PC and the like for mammalian cell hosts.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention.
  • Cells include, for example, Escherichia coli K12 and other Escherichia coli, Bacillus subtilis MI114 and other Bacillus bacteria, Saccharomyces cerevisiae AH22 and other yeasts, Spodoptera frugiperda-derived Sf cell lines or Trichoplusia ni-derived HighFive cell lines, and olfactory neurons.
  • Animal cells such as insect cells and COS7 cells can be used.
  • Animal cells are preferably cultured cells derived from mammals, specifically COS7 cells, CHO cells, HEK293 cells, HEK293FT cells, Hela cells, PC12 cells, N1E-115 cells, SH-SY5Y cells and the like. be done.
  • the cells of the present invention express the polypeptide of the present invention.
  • complex of the present invention a complex comprising a plurality of polypeptides of the present invention linked via the multimerization domain (herein referred to as the "complex of the present invention")
  • complex of the present invention There are also things.), related to. This will be explained below.
  • the complex of the present invention is composed of a single polypeptide chain of the polypeptide of the present invention, which forms a secondary structure and a tertiary structure, and which are linked together via multimerization domains. be.
  • the complexes of the present invention can be obtained by associating and linking via the multimerization domains.
  • the complex of the present invention contains multiple human TNFR2 agonist domains, depending on the number of linked polypeptides of the present invention.
  • the conjugate of the present invention can be suitably used as a human TNFR2 agonist.
  • the conjugates of the invention can selectively increase effector Tregs.
  • a medicament (the present In the specification, it may be indicated as “medicine of the present invention”). This will be explained below.
  • the medicament of the present invention is based on the polypeptide of the present invention, the agonistic activity of the complex of the present invention against human TNFR2, or the polynucleotide of the present invention, the polypeptide of the present invention expressed from the cell of the present invention, the Based on the agonistic activity of the complex to human TNFR2, it can be used as an immunosuppressive agent, a prophylactic or therapeutic agent for autoimmune diseases, an agent for suppressing organ transplant rejection, or a prophylactic or therapeutic agent for allergic diseases. can.
  • autoimmune diseases include, but are not limited to, systemic lupus erythematosus (SLE), CREST syndrome (calcinosis, Raynaud's syndrome, esophageal motility disorder, sclerodactyly and telangiectasia), opsoclonus, inflammatory myopathy (e.g., polymyositis, dermatomyositis and inclusion body myositis), systemic sclerosis, primary biliary cirrhosis, celiac disease (e.g., gluten-sensitive enteropathy), dermatitis herpetiformis, Miller-Fischer syndrome, acute exercise axonal neuropathy (AMAN), multifocal motor neuropathy with conduction block, autoimmune hepatitis, antiphospholipid antibody syndrome, Wegener's granulomatosis, microscopic polyangiitis, Churg-Strauss syndrome, rheumatoid arthritis, chronic Autoimmune hepatitis,
  • autoimmune disorders include pernicious anemia, Addison's disease, psoriasis, inflammatory bowel disease, psoriatic arthritis, Sjogren's syndrome, lupus erythematosus (e.g., discoid lupus erythematosus, drug-induced lupus erythematosus and neonatal lupus erythematosus). lupus erythematosus), multiple sclerosis reactive arthritis, and the like.
  • allergic diseases include, but are not limited to, asthma, respiratory allergies (e.g., pollen allergy), insect bite allergies, allergic rhinitis (hay fever), food allergies, drug allergies, latex allergies, atopic dermatitis (eczema). ), contact dermatitis, and the like.
  • the content of the active ingredient in the medicament of the present invention can be appropriately set in consideration of the type of target disease, desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age of the patient, body weight of the patient, and the like. can.
  • the content of the active ingredient in the medicament of the present invention can be about 0.0001 to 100 parts by weight based on 100 parts by weight of the entire medicament of the present invention.
  • the dosage form of the medicament of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained. It can be administered to mammals including humans by any route of administration. A preferred mode of administration is parenteral administration. Dosage forms for oral administration and parenteral administration and production methods thereof are well known to those skilled in the art, and can be produced according to conventional methods by, for example, mixing an active ingredient with a pharmaceutically acceptable carrier. can.
  • Dosage forms for parenteral administration include preparations for injection (e.g., drip injection, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection), external preparations (e.g., ointments, poultices, lotions). formulations, creams, gels), suppositories, inhalants, eye drops, eye ointments, nose drops, ear drops, liposomes and the like.
  • an injectable preparation is prepared by dissolving the oligopeptide of the present invention in distilled water for injection, and if necessary, adding a solubilizing agent, a buffer, a pH adjuster, a tonicity agent, an analgesic, and a preservative. , and stabilizers can be added.
  • the medicament of the present invention can also be made into a freeze-dried preparation for extemporaneous preparation.
  • the medicament of the present invention may further contain other drugs effective in treating or preventing diseases.
  • the medicament of the present invention can also contain ingredients such as bactericides, antiphlogistic agents, cell activators, vitamins, and amino acids, if necessary.
  • the carrier used for formulating the medicament of the present invention includes excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, flavoring agents and, if necessary, stabilizers, emulsifiers, emulsifiers, Absorption enhancers, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, bulking agents, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc. are used. be able to.
  • the dosage of the medicament of the present invention is determined, for example, by route of administration, type of disease, degree of symptoms, patient age, sex, body weight, severity of disease, pharmacological findings such as pharmacokinetics and toxicological characteristics, Decisions can be made based on a variety of factors, such as whether a drug delivery system is utilized and whether it is administered as part of a combination of other drugs.
  • the dosage of the drug of the present invention can be, for example, about 1 ⁇ g/kg (body weight) to 10 g/kg (body weight) per day.
  • the administration schedule of the medicament of the present invention can also be determined in consideration of factors similar to the dosage. For example, the above daily dosage can be administered 1 to 5 times a day to 1 month.
  • Example 1 Preparation of scR2-7-Fc protein From the N-terminal side, (1) mouse IgG heavy chain-derived secretory signal sequence (SEQ ID NO: 3), (2) Mutant sequence of human TNF- ⁇ (SEQ ID NO: 2: Human TNFR2 binding region mutations (L29V, A145D, E146D, and S147D) in human TNF- ⁇ wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) In addition, mutation of lysine to other amino acids (K11M, K65S, K90P, K98R, K11M, K65S, K90P, K98R, K112N and K128P) introduced amino acid sequence), (3) a linker sequence (SEQ ID NO: 4), (4) a variant sequence of human TNF- ⁇ (SEQ ID NO: 2); (5) a linker sequence (SEQ ID NO: 4), (6) a variant sequence of human TNF- ⁇ (SEQ ID NO: 2); (7) a linker-spacer sequence (SEQ ID
  • Expi293F cells (Thermo) were used to express the scR2-7-Fc protein.
  • Expi293F cells were cultured using serum-free Expi293 Expression Medium (Thermo Scientific).
  • a lipofection reagent (ExpiFectamine 293 reagent)
  • the pCAG-scR2-7-Fc plasmid was transfected into Expi293F cells, followed by shaking culture at 37°C, 8% CO 2 for 7 days.
  • Example 2 Measurement of agonist activity using TNFR2-expressing cells TNFR2/Fas-forced expression cells (mouse TNFR2/Fas-preadipocyte) fused with TNFR2 (extracellular) and cell death-inducing receptor Fas (intracellular) were used to induce cell death.
  • TNFR2-mediated agonist activity was examined as an index. Specifically, it was investigated as follows.
  • Mouse TNFR2/Fas-preadipocytes were cultured at 37°C in D-MEM (Wako) containing 10% fetal bovine serum, 1% antibiotic cocktail (Wako) and 5 ⁇ g/mL blasticidin S (Wako). bottom. Cells were seeded at 3 ⁇ 10 4 cells/well in a 96-well plate, and serially diluted scR2-7-Fc complexes were added.
  • trimer TNFR2 agonist (R2-7)
  • R2-7 TNFR2 agonist
  • SEQ ID NO: 1 wild-type sequence
  • WST-8 assay Dojindo
  • absorbance 450 nm
  • Example 3 In vitro human PBMC assay After seeding human peripheral blood mononuclear cells (Precision for Medicine) in a 96-well plate (5*10E4 cells/well), add scR2-7-Fc complex (100 ng/mL) , and cultured at 37°C for 72 hours. In addition, IL-2 (10 U/mL) was added as a control. After collecting the cells, anti-human CD4 antibody-APC, anti-human CD25 antibody-PE, and anti-human CD45RA antibody-FITC were added to perform fluorescent immunostaining.

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Abstract

ヒトTNFR2アゴニストのアゴニスト活性を向上させる技術を提供すること、エフェクターTregを選択的に増加させる技術を提供すること。 ヒトTNFR2アゴニストドメイン、及び多量体化ドメインを含み、前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが前記多量体化ドメインに連結している、ポリペプチド。

Description

ヒトＴＮＦＲ２アゴニストとして利用可能なポリペプチド
　本発明は、ヒトTNFR2アゴニストとして利用可能なポリペプチド等に関する。
　制御性T細胞（Treg）は、免疫を抑制に調節する細胞であり、種々の生体免疫反応に関与している。例えば、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、アレルギー疾患等は、細胞障害性T細胞（CTL）がTregよりも優位になることを一因として発症する。このため、Tregの量を増やすことにより、免疫抑制バランスを清書し、上記疾患や反応を改善することができる。
　TNFは、TNF受容体（TNFR）を介して、免疫反応を制御している。TNFは、1型TNF受容体（TNFR1）に結合した場合はアポトーシスや炎症誘導を惹起する一方、2型TNF受容体（TNFR2）に結合した場合はTregの増殖や活性化を惹起する。また、ヒトにおいては、Tregには複数のサブタイプが存在し、それらの中でもエフェクターTregはより活性化した形態である。
　TNFRを介した免疫反応の制御技術として、非特許文献１には、ヒトTNF－αを変異させることによりTNFR2アゴニストが得られたことが報告されている。また、非特許文献２には、TNFR1アンタゴニストと抗体Fc領域とを融合させて、当該Fc領域を介して複合体化したものを使用することが報告されている。しかし、当該Fc領域の融合により安定性は高まるものの、活性の向上は見られなかった。
Biomaterials. 2011 Aug;32(23):5498-504. J Biol Chem. 2020 Jul 10;295(28):9379-9391.
　本発明は、ヒトTNFR2アゴニストのアゴニスト活性をより向上させる技術を提供することを課題とする。さらに、本発明は、エフェクターTregを選択的に増加させる技術を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、ヒトTNFR2アゴニストドメイン、及び多量体化ドメインを含み、前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが前記多量体化ドメインに連結している、ポリペプチド、であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　ヒトTNFR2アゴニストドメイン、及び多量体化ドメインを含み、前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが前記多量体化ドメインに連結している、ポリペプチド。
　項２．　前記ヒトTNFR2アゴニストドメインがヒトTNF－αの変異体を含む、項１に記載のポリペプチド。
　項３．　前記ヒトTNF－αの変異体が、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aが変異してなるアミノ酸配列Bを含み、且つ前記アミノ酸配列Bが、前記アミノ酸配列AにおけるL29、A145、E146、及びS147からなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、項２に記載のポリペプチド。
　項４．　L29の変異後のアミノ酸がバリン又はアラニンであり、且つA145、E146、及びS147の変異後のアミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である、項３に記載のポリペプチド。
　項５．　前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが、N末端側から、アミノ酸配列B－リンカー－アミノ酸配列B－リンカーアミノ酸配列B　からなるドメイン構造を含む、項３又は４に記載のポリペプチド。
　項６．　前記多量体化ドメインが抗体Fc領域を含む、項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
　項７．　前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが、抗体ヒンジ領域及び／又はリンカーを介して前記多量体化ドメインに連結している、項１～６のいずれかに記載のポリペプチド。
　項８．　項１～７のいずれかに記載のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
　項９．　項８に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
　項１０．　項１～７のいずれかに記載のポリペプチド複数個が、前記多量体化ドメインを介して連結してなる、複合体。
　項１１．　項１０に記載の複合体を含む、ヒトTNFR2アゴニスト。
　項１２．　項１～７のいずれかに記載のポリペプチド、項８に記載のポリヌクレオチド、項９に記載の細胞、及び項１０に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬。
　項１３．　免疫抑制剤、自己免疫疾患の予防又は治療剤、臓器移植の拒絶反応の抑制剤、又はアレルギー疾患の予防又は治療剤である、項１２に記載の医薬。
　本発明によれば、ヒトTNFR2アゴニストのアゴニスト活性をより向上させることができ、さらにエフェクターTregを選択的に増加させることが可能である。
scR2-7-Fcタンパク質のドメイン構造の模式図を示す。 実施例2のWST-8アッセイの結果を示す。縦軸は細胞生存率を示し、横軸は被験物質の培地中終濃度を示す。 実施例3のフローサイトメトリーのスキャッタグラムを示す。 実施例3で測定された各細胞群の割合を示す。Fr.IIがエフェクターTregを示す。
　1．定義等
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」とは、2つ以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（Karlin S， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；トレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書において、DNA、RNAなどのヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
　本明細書において、アミノ酸の変異は、具体的には、アミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加である。
　本明細書において、アミノ酸配列中のアミノ酸の位置は、アミノ酸一文字表記＋N末端アミノ酸から数えた場合のアミノ酸番号で示すことがある。例えば、「L29」は、N末端から29番目のアミノ酸であるロイシンを示す。また、アミノ酸置換変異は、変異前のアミノ酸一文字表記＋N末端アミノ酸から数えた場合のアミノ酸番号＋変異後のアミノ酸一文字表記で示すことがある。例えば、「L29V」は、N末端から29番目のアミノ酸であるロイシンのバリンへの置換変異を示す。
　2．ポリペプチド
　本発明は、その一態様において、ヒトTNFR2アゴニストドメイン、及び多量体化ドメインを含み、前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが前記多量体化ドメインに連結している、ポリペプチド（本明細書において、「本発明のポリペプチド」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　ヒトTNFR2アゴニストドメインは、ヒトTNFR2に対するアゴニスト活性を有する特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、多量体化ドメインと連結して一本のポリペプチド鎖を形成可能なものである限り、特に制限されない。
　アゴニスト活性の発揮対象であるヒトTNFR2は、公知のタンパク質である。具体的には、ヒトTNFR2のアミノ酸配列としては、配列番号12に示されるアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_001057.1）が挙げられ、ヒトTNFR2のmRNA配列としては、配列番号13に示される塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_001066.3）が挙げられる。また、ヒトTNFR2としては、各種スプライシングバリアントも包含され得る。
　ヒトTNFR2は、その本来の活性、すなわちリガンド（ヒトTNF）の結合に依拠してTregを増殖及び／又は活性化させる活性を有する限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　ヒトTNFR2の好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
　（a）配列番号12に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
　（b）配列番号12に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つTregを増殖及び／又は活性化させる活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（b）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号12に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つTregを増殖及び／又は活性化させる活性を有するタンパク質
　上記（b’）において、複数個とは、例えば2～20個であり、好ましくは2～10個であり、より好ましくは2～5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
　ヒトTNFR2アゴニストドメインは、通常、ヒトTNF－αの変異体を含む。ヒトTNF－αは、分泌型であることが好ましく、例えば配列番号1に示されるアミノ酸配列Aからなる。ヒトTNF－αの変異体は、ヒトTNF－αにアミノ酸変異が導入されてなる変異体であって、ヒトTNFR2に対してアゴニスト活性を有するものである限り、特に制限されない。なお、ヒトTNF－αの変異体には、他の生物（例えばマウス）のTNF－α及びその変異体は包含されない。
　ヒトTNF－αの変異体において導入されるアミノ酸変異については、例えば非特許文献１で報告されているような公知の変異を採用することができる。ヒトTNF－αの変異体は、好ましくは配列番号1に示されるアミノ酸配列Aが変異してなるアミノ酸配列Bを含み、且つ前記アミノ酸配列Bが、前記アミノ酸配列AにおけるL29、A145、E146、及びS147からなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含むことができる。本発明の好ましい態様においては、A145及びS147のアミノ酸置換変異を含むことが好ましく、A145、E146、及びS147のアミノ酸置換変異を含むことがより好ましく、L29、A145、E146、及びS147のアミノ酸置換変異を含むことがさらに好ましい。
　L29の変異後のアミノ酸は、側鎖の分子量がより低い脂肪族アミノ酸が好ましい。L29の変異後のアミノ酸としては、好ましくはバリン、アラニン等が挙げられ、特に好ましくはバリンが挙げられる。
　A145の変異後のアミノ酸としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、トレオニン、グルタミン等が挙げられる。A145の変異後のアミノ酸としては、特に好ましくはアスパラギン酸が挙げられる。
　E146の変異後のアミノ酸としては、例えばアスパラギン酸、セリン、グリシン等が挙げられる。E146の変異後のアミノ酸としては、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられ、特に好ましくはアスパラギン酸が挙げられる。
　S147の変異後のアミノ酸としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。S147の変異後のアミノ酸としては、特に好ましくはアスパラギン酸が挙げられる。
　アミノ酸配列Bにおいては、将来的な分子修飾時の障害にならないように（側鎖のアミノ基がランダムに修飾されることを防ぐために）、アミノ酸配列Aにおけるリシンが他のアミノ酸へ変異していることが好ましい。この観点から、アミノ酸配列Bは、アミノ酸配列AにおけるK11、K65、K90、K98、K112、及びK128からなる群より選択される少なくとも1種（好ましくは2種以上、より好ましくは3種以上、さらに好ましくは4種以上、よりさらに好ましくは5種以上、とりわけ好ましくは6種全て）のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含むことが好ましい。変異後のアミノ酸は特に制限されない。本発明の一態様において、K11のアミノ酸置換変異はK11Mであることが好ましく、K65のアミノ酸置換変異はK65Sであることが好ましく、K90のアミノ酸置換変異はK90Pであることが好ましく、K98のアミノ酸置換変異はK98Rであることが好ましく、K112のアミノ酸置換変異はK112Nであることが好ましく、K128のアミノ酸置換変異はK128Pであることが好ましい。
　アミノ酸配列Bは、ヒトTNFR2に対するアゴニスト活性が著しく損なわれない限りにおいて、上記以外にも他のアミノ酸変異（例えば置換、保存的置換）を含むことができる。他のアミノ酸変異の数は、例えば1～20個、1～10個、1～5個、又は1～2個である。
　アミノ酸配列Bは、好ましくは配列番号2で示されるアミノ酸配列、又は配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して85％以上（より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上）の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
　ヒトTNFR2アゴニストドメインは、複数個のヒトTNF－αの変異体を含むことが好ましい。ヒトTNFR2アゴニストドメインは、例えば2～6、好ましくは2～5、より好ましくは2～4、さらに好ましくは3個のヒトTNF－αの変異体を含むことができる。この場合、ヒトTNF－αの変異体間は、リンカー（ペプチドリンカー）を介して連結していることが好ましい。リンカーは、αヘリックス構造やβシート構造などの2次構造を作らず、且つ自由に折り曲がるアミノ酸配列であることが好ましい。リンカーは、数アミノ酸残基からなる単位が連結してなるアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチドリンカーはグリシン及びセリンから構成されるリンカー（GSリンカー）が好ましく、具体的に、その構成単位としては、例えばGGGGS（配列番号14）、GSG（配列番号15）、SAGG（配列番号16）、GGGS（配列番号17）、GGSG（配列番号18）、GGG（配列番号19）等が挙げられる。リンカーは、好ましくは配列番号14～18からなる群より選択される1種以上の構成単位1つ以上からなる。リンカーのアミノ酸残基数は、特に制限されるものではないが、例えば3以上、好ましくは3～20、より好ましくは4～10である。
　ヒトTNFR2アゴニストドメインは、N末端側から、アミノ酸配列B－リンカー－アミノ酸配列B－リンカーアミノ酸配列B　からなるドメイン構造を含むことが好ましい。当該ドメイン構造において、「－」はペプチド結合、又はその両側の配列とペプチド結合で連結された任意のアミノ酸配列（例えば1～10、1～5、又は1～2アミノ酸からなるアミノ酸配列）を示す。
　多量体化ドメインは、互いに結合して多量体を形成可能なドメインであり、多ヒトTNFR2アゴニストドメインと連結して一本のポリペプチド鎖を形成可能なものである限り、特に制限されない。当該ドメインとしては、例えば抗体Fc領域、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ドメイン、ロイシンジッパードメイン、コラーゲン様ドメイン、コレラトキシンBサブユニットドメイン、テトラブラキオンコイルドコアドメイン、レオウイルスσ1タンパク質ドメイン、ヘパチチスデルタ抗原ドメイン等が挙げられる。当該ドメインは、例えばLiprin-b2 Coil2、RP_P2ドメイン等、ヒトのダイマータンパク質の一部であってもよい。
　多量体化ドメインとして、特に好ましくは抗体Fc領域が挙げられる。抗体Fc領域は、抗体重鎖のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む領域であり、この限りにおいて特に制限されない。抗体Fc領域は、好ましくは配列番号7で示されるアミノ酸配列、又は配列番号7で示されるアミノ酸配列に対して85％以上（より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上）の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
　本発明の好ましい一態様においては、ヒトTNFR2アゴニストドメインが、抗体ヒンジ領域及び／又はリンカーを介して多量体化ドメインに連結している。抗体ヒンジ領域は、特に制限されず、例えば配列番号6で示されるアミノ酸配列、又は配列番号6で示されるアミノ酸配列に対して1又は複数個（好ましくは3個以下、より好ましくは2個以下）のアミノ酸が変異してなるアミノ酸配列であることができる。リンカーについては上記で説明したとおりである。
　本発明のポリペプチドは、ヒトTNFR2に対するアゴニスト活性が著しく損なわれない限りにおいて、上記以外の他のアミノ酸配列、例えば分泌シグナル配列、タンパク質タグ、蛍光タンパク質、発光タンパク質、プロテアーゼ認識配列（TEVプロテアーゼ認識配列等）等のシグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、ヒトTNFR2に対するアゴニスト活性が著しく損なわれない限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
　本発明のポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　本発明のポリペプチドは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
　さらに、本発明のポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
　本発明のポリペプチドは、酸または塩基との塩の形態であってもよい。塩は、特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して作製することができる。
　本発明のポリペプチドは、合成後、精製してもよい。例えば、培養物から遠心、濾過等により集菌し採取した菌体から本発明のタンパク質分子を抽出する。先ず、抽出第一段階としての菌体の破砕には、酵素による消化、浸透圧による破壊、急激な加圧減圧、超音波、種々のホモジナイザー等々を用いることができる。次いで、菌体破砕物を分別するための手段として、物理的な低速遠心、超遠心、濾過、分子ふるい、膜濃縮等、化学的な沈殿剤、可溶化剤、吸脱着剤、分散剤等、物理化学的な電気泳動、カラムクロマトグラフィー、支持体、透析、塩析等を、それぞれ組合せて用いることができる。また、これ等の手段の適用においては、温度、圧力、pH、イオン強度等の物理化学的条件を適宜、設定できる。
　3．ポリヌクレオチド、細胞
　本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明のポリヌクレオチド」と示すこともある。）、本発明のポリヌクレオチドを含む、細胞（本明細書において、「本発明の細胞」と示すこともある。）に関する。以下に、これらについて説明する。
　本発明のポリペプチドのコード配列は、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである限り、特に制限されない。
　本発明のポリヌクレオチドは、その一態様において、本発明のポリペプチドの発現カセットを含む。
　本発明のポリペプチドの発現カセットは、細胞内で本発明のポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチドである限り特に制限されない。本発明のポリペプチドの発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された本発明のポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明のポリペプチドの発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、対象細胞に応じて適宜選択することができる。プロモーターとしては、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる。pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター等が挙げられる。その他にも、プロモーターとして、例えばtrcやtac等のトリプトファンプロモーター、lacプロモーター、T7プロモーター、T5プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等が挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS）、薬剤耐性遺伝子、複製起点、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質等）コード配列、薬剤耐性遺伝子コード配列、ガイドRNA発現カセットなどが挙げられる。）を含んでいてもよい。
　本発明のポリヌクレオチドは、ベクターの形態であることができる。使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpcDNA、pCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
　本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含む限り特に制限されない。細胞としては、例えば、Escherichia coli K12等の大腸菌、Bacillus subtilis MI114等のバチルス属細菌、Saccharomyces cerevisiae AH22等の酵母、Spodoptera frugiperda 由来の Sf細胞系もしくはTrichoplusia ni由来のHighFive細胞系、嗅神経細胞等の昆虫細胞、COS7細胞等の動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、COS7細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293FT細胞、Hela細胞、PC12細胞、N1E-115細胞、SH-SY5Y細胞等が挙げられる。
　本発明の細胞は、その一態様において、本発明のポリペプチドを発現している。
　4．複合体
　本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチド複数個が、前記多量体化ドメインを介して連結してなる、複合体（本明細書において、「本発明の複合体」と示すこともある。）、に関する。以下に、これについて説明する。
　本発明の複合体は、1本のポリペプチド鎖である本発明のポリペプチドが、2次構造、3次構造を形成し、多量体化ドメインを介して複数個連結して構成されるものである。本発明のポリペプチドを、本発明のポリペプチド同士が接触可能な条件に置くことによって、多量体化ドメインを介して会合・連結し、本発明の複合体を得ることができる。
　本発明の複合体においては、連結した本発明のポリペプチドの数に応じて、複数のヒトTNFR2アゴニストドメインを含む。
　本発明の複合体は、ヒトTNFR2アゴニストとして好適に使用することができる。本発明の複合体は、エフェクターTregを選択的に増加させることができる。
　5．医薬
　本発明は、その一態様において、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の細胞、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬（本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。）、に関する。以下に、これについて説明する。
　本発明の医薬は、本発明のポリペプチド、本発明の複合体のヒトTNFR2に対するアゴニスト活性に基づいて、或いは本発明のポリヌクレオチド、本発明の細胞から発現する本発明のポリペプチド、本発明の複合体のヒトTNFR2に対するアゴニスト活性に基づいて、各種用途、例えば免疫抑制剤、自己免疫疾患の予防又は治療剤、臓器移植の拒絶反応の抑制剤、又はアレルギー疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
　自己免疫疾患としては、特に制限されないが、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー症候群、食道運動障害、強指症及び毛細血管拡張症）、オプソクローヌス、炎症性ミオパチー（例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎及び封入体筋炎）、全身性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病（例えば、グルテン過敏性腸疾患）、疱疹状皮膚炎、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、自己免疫性肝炎、抗リン脂質抗体症候群、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチ、慢性自己免疫性肝炎、硬化性筋炎、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、傍腫瘍性小脳変性症、スティッフパーソン症候群、辺縁系脳炎、アイザックス症候群、シデナム舞踏病、小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、脳炎、１型真性糖尿病並びに視神経脊髄炎が挙げられる。他の自己免疫性障害としては、悪性貧血、アジソン病、乾癬、炎症性腸疾患、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡（例えば、円板状紅斑性狼瘡、薬物誘発性紅斑性狼瘡及び新生児紅斑性狼瘡）、多発性硬化症反応性関節炎等が挙げられる。
　アレルギー疾患としては、特に制限されないが、例えば喘息、呼吸器アレルギー（例えば花粉アレルギー）、虫刺されによるアレルギー、アレルギー性鼻炎（花粉症）、食物アレルギー、薬物アレルギー、ラテックスアレルギー、アトピー性皮膚炎（湿疹）、接触性皮膚炎等が挙げられる。
　本発明の医薬中の有効成分の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重などを考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の医薬中の有効成分の含量は、本発明の医薬全体を100重量部として0.0001重量部～100重量部程度をすることができる。
　本発明の医薬の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体などと混合などすることにより、常法に従って製造することができる。
　非経口投与のための剤形は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤、クリーム、ゲル剤）、坐剤、吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤などが挙げられる。例えば、注射用製剤は、本発明のオリゴペプチドを注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤などを添加することができる。本発明の医薬は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
　本発明の医薬は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の医薬は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸などの成分を配合することもできる。
　本発明の医薬の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤などを用いることができる。
　本発明の医薬の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴などの薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、決定することができる。本発明の医薬の投与量は、例えば、一日当たりで、1μg/kg（体重）～10g/kg（体重）程度とすることができる。本発明の医薬の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日～1月に1～5回投与することができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　実施例1．scR2-7-Fcタンパク質の作製
　N末端側から、
（1）マウスIgG重鎖由来分泌シグナル配列（配列番号3）、
（2）ヒトTNF－αの変異体配列（配列番号2：ヒトTNF－α野生型アミノ酸配列（配列番号1）に対して、ヒトTNFR2結合領域の変異（L29V、A145D、E146D、及びS147D）を導入し、さらに将来的な分子修飾時の障害にならないように（側鎖のアミノ基がランダムに修飾されることを防ぐために）リシンの他のアミノ酸への変異（K11M、K65S、K90P、K98R、K112N、及びK128P）を導入してなるアミノ酸配列）、
（3）リンカー配列（配列番号4）、
（4）ヒトTNF－αの変異体配列（配列番号2）、
（5）リンカー配列（配列番号4）、
（6）ヒトTNF－αの変異体配列（配列番号2）、
（7）リンカー・スペーサー配列（配列番号5）、
（8）抗体ヒンジ配列（配列番号6）、
（9）抗体Fc配列（配列番号7：ヒトIgG CH2配列（配列番号8）＋ヒトIgG CH3配列（配列番号9））、
の順に配置されてなるアミノ酸配列（配列番号10：図１）からなるscR2-7-Fcタンパク質のコード配列（配列番号11）が哺乳類発現用ヒトIgG1-Fc 融合プラスミドベクター（pCAG-Hyg hIgG-Fc）のマルチクローニングサイト内に配置されてなるscR2-7-Fc発現用プラスミド（pCAG-scR2-7-Fc）を作製した。
　Expi293F細胞（Thermo）を用いてscR2-7-Fcタンパク質を発現させた。Expi293F 細胞は、無血清培地 Expi293 Expression Medium（Thermo scientific社）を用いて培養した。リポフェクション試薬（ExpiFectamine 293 reagent）を用いて、pCAG-scR2-7-FcプラスミドをExpi293F細胞に遺伝子導入した後、37℃, 8% CO2下で7日間振とう培養した。培養上清を回収した後、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー（Wako）及びゲルろ過クロマトグラフィー（Hiload 16/600 Superdex 200 pg column, GE Healthcare）の2段階精製を行い、目的物（scR2-7-Fc複合体：2つのscR2-7-Fcタンパク質が抗体Fc領域を介して連結してなる複合体）を回収した。
　実施例2．TNFR2 発現細胞を用いたアゴニスト活性の測定
　TNFR2（細胞外）と細胞死誘導受容体Fas（細胞内）を融合したTNFR2/Fas強制発現細胞（mouse TNFR2/Fas-preadipocyte）を用いて、細胞死を指標にしてTNFR2を介したアゴニスト活性を調べた。具体的には以下のようにして調べた。
　mouse TNFR2/Fas-preadipocyteは、10% ウシ胎児血清、1% 抗生物質カクテル（Wako）及び5 μg/mLブラストサイジンS（Wako）を含むD-MEM（Wako）を用いて、37℃で培養した。96ウェルプレートに 3×104 cells/well の細胞を播種し、段階希釈した scR2-7-Fc複合体を添加した。また、コントロールとして、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が3つ会合してなる3量体（TNFR2アゴニスト（R2-7））、及び配列番号2に代えて野生型配列（配列番号1）を採用する以外はR2-7と同じ構成のタンパク質（ヒト野生型TNF（humanwtTNF））についても、段階希釈して添加した。37℃で48 時間培養した後、WST-8アッセイ（Dojindo）を行い、吸光度（450 nm）を測定した。scR2-7-Fc添加群の吸光度値を非添加群の吸光度値で除して、細胞生存率を算出し、アゴニスト活性を比較した。
　結果を図２に示す。ヒト野生型TNFやR2-7（TNFR2アゴニスト）に比べて、scR2-7-Fc複合体は低濃度で効果を示し、約100倍活性が高いことが分かった。
　実施例3．In vitroヒトPBMCアッセイ
　ヒト末梢血単核球（Precision for Medicine社）を96ウェルプレートに播種（5*10E4 cells/well）した後、scR2-7-Fc複合体（100 ng/mL）を加えて、37℃で72時間培養した。また、コントロールとしてIL-2（10 U/mL）を添加した。細胞を回収した後、抗ヒトCD4抗体-APC、抗ヒトCD25抗体-PE、抗ヒトCD45RA抗体-FITCを加えて、蛍光免疫染色を行った。フローサイトメトリーを用いて、分画I（CD4+CD45RA+CD25low細胞）、分画II（CD4+CD45RA-CD25high細胞）、分画III（CD4+CD45RA-CD25low細胞）におけるTregの割合（％）を測定した（N=5）。
　結果を図３及び図４に示す。scR2-7-Fc複合体により、エフェクターTregが選択的に増殖したことが分かった。

Claims (13)

  1. ヒトTNFR2アゴニストドメイン、及び多量体化ドメインを含み、前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが前記多量体化ドメインに連結している、ポリペプチド。
  2. 前記ヒトTNFR2アゴニストドメインがヒトTNF－αの変異体を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記ヒトTNF－αの変異体が、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aが変異してなるアミノ酸配列Bを含み、且つ前記アミノ酸配列Bが、前記アミノ酸配列AにおけるL29、A145、E146、及びS147からなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. L29の変異後のアミノ酸がバリン又はアラニンであり、且つA145、E146、及びS147の変異後のアミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが、N末端側から、アミノ酸配列B－リンカー－アミノ酸配列B－リンカーアミノ酸配列B　からなるドメイン構造を含む、請求項３又は４に記載のポリペプチド。
  6. 前記多量体化ドメインが抗体Fc領域を含む、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
  7. 前記ヒトTNFR2アゴニストドメインが、抗体ヒンジ領域及び／又はリンカーを介して前記多量体化ドメインに連結している、請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチド。
  8. 請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
  9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  10. 請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチド複数個が、前記多量体化ドメインを介して連結してなる、複合体。
  11. 請求項１０に記載の複合体を含む、ヒトTNFR2アゴニスト。
  12. 請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載の細胞、及び請求項１０に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬。
  13. 免疫抑制剤、自己免疫疾患の予防又は治療剤、臓器移植の拒絶反応の抑制剤、又はアレルギー疾患の予防又は治療剤である、請求項１２に記載の医薬。
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