JP6038816B2 - 新規な超活性ｉｌ−３３断片およびその使用 - Google Patents

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Description

発明の背景
緒論
インターロイキン１ファミリー（ＩＬ−１）のサイトカインは、多数の自己免疫疾患、感染性疾患および炎症性疾患において主要な役割を果たす(Sims JE and Smith DE, Nature Rev Immunology 2010)。当初ＮＦ−ＨＥＶと命名されたインターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、２７０のアミノ酸（図１、ＮＰ＿２５４２７４、配列番号１）を含んでなるＩＬ−１ファミリーの新規なサイトカインである。ＩＬ−３３は、立方内皮細胞で強く発現される核因子である(Bakkevold E et al., American Journal Pathology 2003)。ＩＬ−３３は、そのカルボキシ末端部分に、インターロイキン１との構造的相同性（１２のβシートを有する構造）を有し(Lingel et al., Structure 2009)、オーファン受容体ＳＴ２（ＩＬ１−Ｒ４）と結合する(Chackerian AA et al., Journal of Immunology 2007)。ＩＬ−３３は、クロマチンと会合した核タンパク質である(Carriere V et al., PNAS 2007)。ＩＬ−３３は、ほとんどの組織の血管の内皮細胞、ならびに皮膚、胃、唾液腺または肺などの外部環境に曝されている組織の上皮細胞で構成的に発現される(Moussion et al., PLoS ONE 2008)。
ＩＬ−３３は細胞の傷害または壊死の場合に生物学的に活性な完全型（ＩＬ−３３ａａ１−２７０）で放出されることが知られている。完全なＩＬ−３３は実際にＳＴ２受容体と結合することができ(Cayrol and Girard, PNAS 2009)、標的細胞、特に、免疫系の細胞、すなわち、Ｔｈ２リンパ球、肥満細胞、ＮＫおよびｉＮＫＴキラー細胞、好塩基球および好酸球を活性化することができる（総説としては、Liew et al., Nature Rev Immunology 2010参照）。標的細胞上のＳＴ２受容体の活性化は、細胞に応じて、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）および／または炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ）の分泌を誘発する。さらに、いくつかの最近の研究では、炎症部位または感染部位に好中球などの免疫系細胞を動員するＩＬ−３３の能力を示している(Alves-Filho et al., Nature Medicine 2010)。従って、これらの結果によれば、ＩＬ−３３は、内皮細胞または上皮細胞の感染または外傷後に免疫系に警告を発する危険シグナルとして働く可能性がある(Moussion et al., PLoS ONE 2008; Cayrol and Girard, PNAS 2009)。
ＩＬ−３３は、ある種の病態には保護効果を持つが、他の病態には悪化因子となる。例えば、ＩＬ−３３は、敗血症(Alves-Filho et al., Nature Medicine 2010)、シュードモナス角膜炎(Hazlett et al., Invest Ophtalmol Vis Sci. 2010)または線虫感染(Humphreys et al., Journal of Immunology 2008)などの感染性疾患で保護的役割を持つ。この保護的役割はまた、アテローム性動脈硬化症(Miller et al., J. Exp. Med 2008)、心筋梗塞(Seki et al., Circ Heart Fail 2009)、肥満における脂肪組織炎症(Miller et al., Circ Res 2010)および癌（ＷＯ２００５／０７９８４４）でも示されている。このデータは、ＩＬ−３３がこれらの病態の治療薬として使用可能であることを示唆する。対照的に、ＩＬ−３３は、関節リウマチ(Xu et al., Journal of Immunology 2010)、喘息などの気道のアレルギー性炎症(Stolarski et al., Journal of Immunology 2010)、皮膚線維症(Rankin et al., J. Immunol. 2010)またはアナフィラキシーショック(Pushparaj et al., PNAS 2008)などの他の種の疾患では生理病理学的効果を悪化させることが示され、ＩＬ−３３はこれらの病態の潜在的治療標的となる。
よって、これらの研究は、ヒトおよび動物モデルの双方で、ＩＬ−３３のin vivo投与は多くの疾患、特に、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、心血管疾患、感染性疾患、癌およびアルツハイマー病からの回復を増進することができることを示している（総説としては、Liew et al., Nature Rev Immunology 2010を参照）。
上述の種々の研究の著者らは、彼らのin vivo研究に、ＩＬ−３３の「サイトカインＩＬ−１」ドメイン（アミノ酸１１２〜２７０）を含有し、かつ、完全タンパク質のＮ末端ドメイン（アミノ酸１〜１１１）を欠くＩＬ−３３の人工的末端切断型（ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０）を用いたことを述べておかなければならない（図１Ａ参照）。科学界では、この末端切断型(truncated form)ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０がin vivoで生成可能であると長年考えられてきた。実際に、「サイトカインＩＬ−１」型Ｃ末端ドメインに相当するＩＬ−３３ａａ１１２−２７０型は、カスパーゼ１によるＩＬ−３３の残基Ｓｅｒ１１１の後での切断後に生じ得ることが示唆されており(Schmitz et al., Immunity 2005)、以降、おそらくカスパーゼ１によるＩＬ−３３の成熟が活性のある末端切断型（ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０）を生成していると考えられていた。しかしながら、最近、カスパーゼによる切断は、タンパク質の活性化をもたらすのではなく、不活性化をもたらすことが確認されたが、これはこれらのプロテアーゼがＩＬ−３３タンパク質のサイトカインＩＬ−１ドメイン中の、ＤＧＶＤ配列レベル（ａａ１７５−１７８）で４番目のシートと５番目のシートの間を切断するためである。アポトーシスカスパーゼによるＩＬ−３３の切断は、アポトーシスの際にＩＬ−３３の炎症性活性を排除するように選択される機構、すなわち、in vivo炎症をもたらさないプロセスである可能性がある。さらにより重要な結果は、多くの研究に用いられた成熟型のＩＬ−３３ａａ１１２−２７０は、in vitroで、ましてやin vivoで、カスパーゼ１の作用によっては生じないことが示されたということである。よって、この末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０はin vivoには存在せず(Cayrol and Girard, PNAS 2009, Luthi et al., Immunity 2009; Talabot-Ayer et al., J. Biol. Chem. 2009; Ali et al., Biochem Biophys Res Commun 2010)、従って、ヒト免疫系がこれに出くわすことは決してなかった。従って、ヒトの療法におけるその使用には大きな問題、特に、免疫原性の問題があると思われる。ヒトの療法に適用するには天然型のＩＬ−３３を使用することが好ましい。しかしながら、これまでには、完全なＩＬ−３３タンパク質をin vivo試験の実施に適合した量で発現させることはできず、生物治療薬の工業生産の場合にはなおさらそうであった。
従って、ｉ）完全型と少なくとも同等の活性かまたはより活性が高く、ｉｉ）天然に生成され（従って、先験的に免疫原性がほとんどないかまたは全くない）、かつ、ｉｉｉ）組換え型で大規模に（ミリグラム、またはさらにはグラム単位で）生産することができ、従って、ヒトにおける中期および長期処置として使用することができる、活性型のヒトＩＬ−３３を特定することが必要であった。
しかしながら、完全型よりも活性の高い形態で、天然に、ヒトＩＬ−３３の成熟を誘発し得るプロテアーゼはこれまでに確認されていない。
本発明者らは、完全なＩＬ−３３が３つの好中球プロテアーゼ、すなわち、ヒトカテプシンＧ、エラスターゼおよびプロテイナーゼ３によって天然に切断されることを証明することによってこの必要に応えた。これらのプロテアーゼは、人工的末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０よりも大きなサイズのカルボキシ末端断片を遊離し、前記断片は、in vitroでもin vivoでも等しく、完全型ＩＬ−３３ａａ１−２７０よりも優れた生物活性を有する。ＩＬ−３３ａａ１−２７０型とは異なり、これらのＩＬ−３３の新規な断片は、大腸菌などの細菌細胞で容易に発現される。それらは天然に得られるという利点を持ち、これまでに用いられている人工的末端切断型のＩＬ−３３（ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０）よりもin vivoにおいて活性が高い（下記の例ｄを参照）。
それらの特性のために、これらのＩＬ−３３の新規な断片は、バイオテクノロジー産業において、特に、ヒトの保健（ＩＬ−３３が保護効果を有するヒト疾患の治療）においてまたは科学的研究のために使用するために、生産することができる。
図１Ａは、完全ヒトタンパク質ＩＬ−３３の基本構造を記載する。機能的ドメイン（クロマチン結合、サイトカインＩＬ−１）を示す。図１Ｂは、「サイトカインＩＬ−１」型Ｃ末端ドメインの上流にある、好中球プロテアーゼ、すなわち、カテプシンＧ（Ｃａｔ Ｇ）、エラスターゼ２（エラスターゼ）およびプロテアーゼ３（ｐＲ３）による切断部位、ならびにこれらのプロテアーゼの作用によって遊離される断片（ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０断片）を示す。 図２Ａは、完全ヒトインターロイキンＩＬ−３３がin vitroにおいて組換えプロテアーゼ、すなわち、カテプシンＧ（Ｃａｔ Ｇ）、エラスターゼ２（エラスターゼ）およびプロテアーゼ３（ＰＲ３）により切断されることを示すウエスタンブロット結果を、これらのプロテアーゼの存在下で完全な状態で留まっている末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０と対比して示している（図２Ｂ）。図２Ｃは、ヒトＩＬ−３３がヒト好中球から直接抽出された、これらの同じヒトプロテアーゼの基質であることをex vivoで示す結果を示している。図２Ｄは、ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０断片が、相当する切断部位が突然変異を受けた場合には、前記好中球プロテアーゼによって遊離されないことを示している。 図３Ａは、ウエスタンブロットによる組換えタンパク質ＩＬ−３３ａａ１−２７０、ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０の定量分析を示し、図３Ｂは、in vitroにおける、ＭＣ／９肥満細胞によるＩＬ−６分泌に対するこれらの種々のタンパク質の活性を示す。 図４は、細菌細胞において組換え手段（使用ベクターはベクターｐＥＴ１５ｂであり、大腸菌株はＢＬ２１株である。詳細については、以下のｃを参照）により得られた本発明の３つのポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０の発現プロフィールを示す。１リットルの大腸菌培養から数ミリグラムの精製組換えタンパク質が得られた（表参照）。 図５は、in vivoにおいて本発明のポリペプチド断片を用いて得られた結果を示す。これらの断片の注射を７日間、毎日受けたマウスの脾臓を採取し（Ａ）、空腸をＰＡＳ−アルシアンブルー染色により分析した（Ｂ）。血中の顆粒球の数を７日後に測定した（Ｃ）。
発明の具体的説明
本発明の説明
本発明の目的は、天然型に相当し（従って、先験的に免疫原性がほとんどないかまたは全くない）、かつ、組換え型で大規模に（ミリグラムまたはグラム程度で）生産することができ、従って、保健適用（ヒトにおける中期および長期治療）に、また、バイオテクノロジー（科学的研究）で使用することができる、ヒトＩＬ−３３の活性断片（完全型と少なくとも同等かまたはそれを超える、好ましくは、ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０と少なくとも同等）を特定することである。
好中球は、炎症部位に移動し、病原体に対して第１の防御線をはる第１の循環白血球である。食細胞としての役割の他、好中球は細胞外環境に顆粒タンパク質、特に、プロテアーゼであるカテプシンＧ、エラスターゼ２またはプロテイナーゼ３を放出することによって生得的防御を提供することができる。
本発明者らは、白血球のカテプシンＧまたはプロテイナーゼ３の作用がヒトＩＬ−３３のＮ末端ドメインのポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０を遊離するということを初めて実証することができた。好中球エラスターゼ２またはプロテアーゼ３の作用は、ヒトＩＬ−３３のＮ末端ドメインのポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９９−２７０を遊離する。これらのプロテアーゼの切断部位は極めて正確に決定されているので、これまでには確認されていない３つの新規なＩＬ−３３断片、すなわち、ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０が示される（図１Ｂおよび２参照）。これまでに用いられていたＩＬ−３３ａａ１１２−２７０断片とは対照的に、これらの断片は、ヒトにおいて好中球プロテアーゼによる完全ＩＬ−３３の天然切断から生じ、従って、生理学的なものである。
驚くことに、ＩＬ−３３のこれらの断片（ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０）は、in vitroおよびin vivoにおいて、完全型ヒトＩＬ−３３および／またはこれまでに用いられていた末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０よりも優れた生物活性を有し、実際に、これらの３つの新規なＩＬ−３３断片は、in vitroにおいて、ネズミＭＣ／９肥満細胞株で完全型ＩＬ−３３の４倍のＩＬ−６分泌を誘発し（図３Ｂ）、また、７日間毎日マウスにペプチドを注射すると、末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０に比べて、７日後に、脾臓重の倍増、およびマウス血中の顆粒球（主として好中球）の数の有意な増加を含む炎症反応がもたらされる（以下の例ｄを参照）。
最後に、完全型ヒトＩＬ−３３とは対照的に、ＩＬ−３３のこれらのポリペプチド断片（ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０）は、組換えタンパク質の生産に従来から用いられている細胞（例えば、大腸菌細胞）によって容易に発現され、細胞培養物１リットル当たり９ｍｇのレベルが得られる（以下の例ｃ参照）。
よって、第１の側面において、本発明は、配列として、ヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ−３３）のアミノ酸９５〜２７０（配列番号２）、９９〜２７０（配列番号３）または１０９〜２７０（配列番号４）を有する断片から選択される生物学的に活性な、ヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ−３３）の単離されたポリペプチド断片に関し、前記断片は、ヒト好中球の少なくとも１つのプロテアーゼによるｈＩＬ−３３切断の天然産物である。
本発明の特定の態様では、ヒト好中球の前記プロテアーゼは、カテプシンＧ、白血球プロテイナーゼ３、および好中球エラスターゼ２からなる群から選択される。
より具体的には、本発明は、カテプシンＧおよび白血球プロテイナーゼ３によるｈＩＬ−３３切断の天然産物である、配列番号２の配列を有するポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、白血球プロテイナーゼ３および好中球エラスターゼ２によるｈＩＬ−３３切断の天然産物である、配列番号３の配列を有するポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９９−２７０、および最後にカテプシンＧおよび白血球プロテイナーゼ３によるｈＩＬ−３３切断の天然産物である、配列番号４の配列を有するポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ１０９−２７０に関する。
従って、これら３つの断片は、ヒトに天然に存在するプロテアーゼによる完全ヒトＩＬ−３３の切断から生じるので、天然のものである。前記断片はヒトにおいて天然に生じることができ、従って、先験的に免疫原性がない。言い換えれば、これらの断片はヒト免疫系によって自己抗原であると認識され得るので、それらをヒトに注射しても、それら自体の拒絶に向けられた免疫反応を誘発しない。従って、前記断片はそれらが注射された個体によって、短期、中期および長期（一般に、患者の生涯）にわたって許容される。ここで、本発明のポリペプチド断片の非免疫原性は、完全インターロイキンＩＬ−３３と同様に、それが注射された個体の免疫系細胞（Ｔｈ２リンパ球、肥満細胞、ＮＫおよびｉＮＫＴ、好塩基球および好酸球）の刺激能および動員能を何ら弱めないことが想到される。
本発明において「カテプシンＧ」は、Ｓ１プロテアーゼ（またはＳ１ペプチダーゼ）のファミリーに属す酵素を意味する。その酵素活性は好ましくは、ＥＣ３．４．２１．２０番を特徴とする。カテプシンＧは特にＣＸＣＬ５などのケモカイン(Nufer O et al., Biochemistry 1999)またはＰＡＲ４などの膜受容体(Sambrano GR et al., J. Biol. Chem. 2000)を切断することができる。それは、哺乳類セリンプロテアーゼに特徴的な触媒トリアッド（セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸）を有する。様々なデータを編集することで、優先的切断部位を定義することが可能となった(Burster T et al. Molecular Immunology 2010)。特徴的には、芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ）または荷電残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）がＰ１の位置（切断された結合のすぐ上流にあるアミノ酸位）に多く見られる(Korkmaz B et al., Pharmacological Reviews 2010)。この酵素は好ましくは多形核好中球白血球のアズール顆粒に見られる。前記酵素は結合組織中または炎症部位に存在する病原体の破壊および消化に関与する(Kargi HA et al., J. Histochem. Cytochem 1990)。ヒトにおいて、前記酵素はＣＴＳＧ遺伝子によりコードされている。この酵素は好ましくは、受託番号ＨＵＭＣＡＰＧ Ｊ０４９９０．１として記載されている配列を有する。いっそうより好ましくは、この酵素は配列番号６の配列を有する。本発明者らは、配列番号６の配列のカテプシンＧの作用が、ヒトＩＬ−３３のＮ末端ドメインのポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０を遊離することを初めて実証することができた。
本発明に関して「白血球プロテイナーゼ３」は、ミエロブラスチン、好中球プロテイナーゼ４、アズール顆粒タンパク質７またはウェゲナー肉芽腫症自己抗原を意味する。これは本願に関しては「プロテイナーゼ３」（ＰＲＴＮ３）と呼ばれる。その酵素活性は好ましくはＥＣ３．４．２１．７６番を特徴とする。この酵素は、Ｓ１プロテアーゼファミリーにも属し、タンパク質、特に、エラスチンを加水分解することができる(Rao NV et al., PNAS 1991)。ＰＲ３の優先的基質は、Ｐ１の位置に、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ）(Korkmaz et al., Pharmacological Reviews 2010)または極性アミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）(Hajjar E et al., FEBS Letters 2007)を有する。好ましくは、本発明に用いられるプロテイナーゼ３は、例えば受託番号ＮＣＢＩ＿ＮＰ００２７６８．３として参照されるヒト酵素である。いっそうより好ましくは、本発明に用いられるプロテイナーゼ３は、配列番号７の配列を有する。本発明者らは、ヒトＩＬ−３３に対する配列番号７の配列のプロテアーゼ３の作用が、ポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ１０９−２７０およびＩＬ−３３ａａ９９−２７０を遊離することを実証することができた。
本発明に関して「好中球エラスターゼ２」は、ＥＬＡＮＥ遺伝子によりコードされるメダラシンまたはさらには白血球エラスターゼを意味する。これは本願に関しては「エラスターゼ２」と呼ばれる。その酵素活性は好ましくはＥＣ３．４．２１．３７番を特徴とする。この酵素は、エラスチンを切断することができる(Bieth JG, J. Soc. Biol. 2001)。これらの特異的切断部位に関しては、Ｐ１の位置に小型の疎水性残基が優先されることが示されている（Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ）(Korkmaz et al., 2010; Hajjar E et al., 2007)。好ましくは、本発明に用いられるエラスターゼ２は、ヒト酵素、例えば、受託番号ＮＣＢＩ ＮＰ＿００１９６３．１として参照されるタンパク質である。いっそうより好ましくは、本発明のエラスターゼ２は配列番号８の配列を有する。本発明者らは、ヒトＩＬ−３３に対する好中球エラスターゼ２の作用が、ポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９９−２７０を遊離することを初めて実証することができた。
これらの３つのプロテアーゼ（カテプシンＧ、プロテイナーゼ３およびエラスターゼ２）は、「好中球セリンプロテアーゼ」ファミリーの一部を成している。特定の態様では、上述のカテプシンＧは配列番号６の配列を有し、プロテイナーゼ３は配列番号７の配列を有し、エラスターゼ２は配列番号８の配列を有する。また、これらのプロテアーゼの相同体も対象とすることができる。ここで「相同体」は、配列番号６、配列番号７および配列番号８の少なくとも８０％、好ましくは８５％、好ましくは８７％、好ましくは９０％、好ましくは９２％、好ましくは９５％、好ましくは９８％、いっそうより好ましくは９９％と同一な配列を有し、かつ、上記に定義されるように、対応するエラスターゼ２プロテアーゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧの酵素活性を保存しているプロテアーゼを意味する。
本発明の意味において、用語「ヒトインターロイキン３３」（ＩＬ−３３）は、ＩＬ−１ファミリーのサイトカインを意味する。ヒトにおいてはＩＬ−３３の３つのアイソフォームが確認されており、これらはアイソフォーム１（ＮＰ＿２５４２７４）、アイソフォーム２（ＮＰ＿００１１８６５６９）、およびアイソフォーム３（ＮＰ＿００１１８６５７０）である。本発明で定義されるＩＬ−３３は、受託番号ＮＰ＿２５４２７４として識別される、２７０のアミノ酸を含んでなる、ＩＬ−３３のアイソフォーム１である。より特定の態様では、本発明のＩＬ−３３は配列番号１の配列を有する。
用語「ポリペプチド断片」は、本発明において、少なくとも５０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００のアミノ酸で２５０以下のアミノ酸、好ましくは１５０前後〜１８０の間のアミノ酸、いっそうより好ましくは１６０〜１７５の間のアミノ酸を含んでなる、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸鎖を意味する。
以下で用いられる「ポリペプチド断片」は、上記で定義されるような３つのポリペプチド断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０のそれぞれを意味する。
本発明のポリペプチド断片は生物学的に活性であり、すなわち、それらはin vitroおよび／またはin vivoにおいて、例えば、免疫系細胞の活性化および／または動員に対して生物活性を有する。
好ましくは、本発明のポリペプチド断片は、完全型ＩＬ−３３に比べて、かつ／または配列番号５の配列を有する既知の末端切断型ＩＬ−３３（ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０）に比べて少なくとも１つ（または２以上）の改善された生物活性を有する。この改良された生物活性は、例えば、免疫系細胞の活性化および／または動員であり得る。よって、特定の態様では、本発明のポリペプチド断片はそれぞれ、完全型ヒトＩＬ−３３に比べて、免疫系細胞に対する刺激活性が増強されている。別の特定の態様によれば、本発明のポリペプチド断片はそれぞれ、配列番号５の配列を有する末端切断型ヒトＩＬ−３３（ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０）に比べて、免疫系細胞に対する動員活性が増強されている。好ましくは、前記免疫系細胞は、Ｔｈ２リンパ球、肥満細胞、ＮＫおよびｉＮＫＴキラー細胞、好塩基球および好酸球である。
免疫系細胞の刺激の特性は、特に、in vitroで、例えば、前記断片の１つを免疫系細胞と接触させ、それらの刺激状態を測定することによって評価することができる。この試験では、免疫系細胞は好ましくは、その刺激状態が、例えば、それらが分泌するＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３またはＧＭ−ＣＳＦなどの炎症性サイトカインの量を測定することによって評価され得る好塩基球または肥満細胞である(Reen DJ, Methods Mol Biol. 1994)。分泌されるサイトカインの量の測定は、当業者に周知の多くの技術によって、特には、ＥＬＩＳＡ技術によって行うことができる。このような試験の一例を下記に示す（例ｂ参照）。
好ましい態様では、本発明のポリペプチド断片は、天然ヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ−３３）に比べて、免疫系細胞に対してより良好なin vitro刺激活性を有し、かつ、配列番号１の完全型ヒトＩＬ−３３に比べて、これらのサイトカインのうち少なくとも１つの、ある割合（例えば、本発明の断片の存在下で前記細胞により分泌されるサイトカインの量／完全型のＩＬ−３３の存在下で同じ細胞により分泌されるサイトカインの量として定義される）での分泌、好ましくは、少なくとも２つ、いっそうより好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つの分泌を刺激することができる。
また、これらのポリペプチド断片のＳＴ２受容体に対する結合をin vitroにおいて評価し、後者が実際にこれらの断片によって刺激されるかどうかを確かめることも可能となる。
さらに、免疫系細胞の動員の特性を、in vivoにおいて、ＩＬ−３３のペプチド断片の１つを６〜７日間腹腔に注射することによって、また、脾臓または血清の細胞充実度（好酸球、好中球、顆粒球）を分析することによって評価することができる。また、病的変化は肺（粘液の存在）、消化管（上皮細胞および杯状細胞の過形成）または血漿（ＩＬ−４、ＩＬ−５などのサイトカインの濃度の上昇）にも見て取ることができる(Schmitz J et al., Immunity 2005; Luthi A. et al., Immunity 2009)。このような例の１つを以下に記載する（例ｄ参照）。
好ましい態様では、本発明の断片は、配列として、アミノ酸１１２〜２７０（配列番号５）を有する末端切断型ＩＬ−３３より良好なin vivo免疫系細胞動員活性を有する。より具体的には、本発明の断片は、好ましくは、対照ビヒクル（ＰＢＳ）を注射した場合の少なくとも１．８倍、いっそうより好ましくは２倍、そして配列番号５の配列の末端切断型ＩＬ−３３（ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０）を注射した場合の少なくとも１．２倍、いっそうより好ましくは少なくとも１．３倍、最も好ましくは少なくとも１．４倍、脾臓の重量増および／またはマウス血液の顆粒球細胞充実度の増大を誘発することができる。
本発明の意味において、生物学的プロセスは、それが動物またはヒト生物体の外部で、例えば、実験器具（パイプ、試験管、エッペンドルフなど）内で、従って人工的に起こる場合に「in vitro」で起こるという。好ましくは、このプロセスは動物またはヒト細胞を含まない。これに対して、本発明の意味において、生物学的プロセスは、それがヒトまたは動物生物体内で起こる場合に「in vivo」で起こるという。本発明の意味において、生物学的プロセスは、ヒトまたは動物の生細胞であって、それらが得られた生物体の外部で培養されたもの（実験器具内で培養された細胞株または初代細胞）を含む場合に「ex vivo」と限定される。
この第１の側面において、本発明はまた、配列として、ヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ−３３）のアミノ酸９５〜２７０（配列番号２）、９９〜２７０（配列番号３）または１０９〜２７０（配列番号４）を有する断片の相同体に関する。
上述の「相同体」は、配列として、配列番号２、配列番号３および配列番号４を有するものと「相同」なポリペプチド断片である。用語「相同体」は、本明細書では、配列番号２、配列番号３および配列番号４の少なくとも８０％、好ましくは８５％、好ましくは８７％、好ましくは９０％、好ましくは９２％、好ましくは９５％、好ましくは９７％、好ましくは９８％、いっそうより好ましくは９９％と同一な配列を有し、かつ、対応するポリペプチド断片と同じ１または複数の生物活性を本質的に有するポリペプチドを意味する。
好ましくは、本発明において言及される「相同体」は、ヒトＩＬ−３３の既知の断片、すなわち、それぞれ配列番号１５および配列番号１６の配列のＩＬ−３３１−１７８およびＩＬ−３３１７９−２７０ではなく、これらの断片はin vitroおよびin vivo活性を持たない（ＷＯ２００８／１３２７０９、Cayrol and Girard, PNAS 2009, Luthi et al., Immunity 2009参照）。もちろん、「相同体」は、配列番号１を有する完全型ＩＬ−３３でも人工型ＩＬ−３３である配列番号５を有するＩＬ−３３１１２−２７０でもあり得ない。
「本質的に同じ１または複数の生物活性を有する」または「本質的に同じ１または複数の生物活性を保存する」とは、本明細書では、少なくとも８０％、好ましくは８５％、いっそうより好ましくは９０％と同一な列を有する断片に関して、配列番号２、配列番号３または配列番号４のポリペプチド断片の生物活性のうち少なくとも１つの少なくとも９０％、またはさらには少なくとも９５％が保存されていることを意味する。有利には、この生物活性は免疫系細胞の活性化であり、例えば上記のようにin vitroで測定することができる。あるいは、この生物活性は免疫系細胞の動員であり、例えば上記のようにin vivoで測定することができる。いっそうより好ましくは、配列番号２、配列番号３および配列番号４の少なくとも８０％、好ましくは８５％、いっそうより好ましくは９０％と同一な配列を有するポリペプチド断片は、対応するポリペプチド断片の場合と同じ免疫系細胞の活性化能および動員能を有する。
本発明に関して２つのアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、最良なアライメント（最適なアライメント）の後に得られる、比較する２配列間で同一のアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、２配列間の違いはランダムに、それらの全長にわたって分布している。２つのアミノ酸配列間の配列の比較は、それらが最適にアラインされた後にこれらの配列を比較することによって、慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「比較ウインドウ」により行われる。比較のための配列の最適なアライメントは、手作業の他、ある種ローカルホモロジーアルゴリズム(Smith-Waterman algorithm, Needleman-Wunsch algorithm or Lipman-Pearson algorithm)によるか、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴ ＮもしくはＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウエアプログラムによる）を用いたコンピューターソフトウエアプログラムによって行うことができる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、これら２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定されるが、この場合、比較するアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適アライメントのための参照配列に対して付加または欠失を含むことができる。同一性パーセンテージは、２配列間でアミノ酸残基が同一である同一の位置の数を求め、この同一の位置の数を比較ウインドウの位置の総数で割り、得られた商に１００を掛けて、これらの２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２シーケンシズ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999)を使用することができ、用いるパラメーターはデフォルトにより与えられているものであり（特に、「オープンギャップペナルティー」パラメーター：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２；選択マトリックスは、例えば、このプログラムにより提示されているマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ ６２」である）、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムにより直接計算される。
「参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、好ましくは８７％、好ましくは９０％、好ましくは９２％、好ましくは９５％、好ましくは９７％、好ましくは９８％、いっそうより好ましくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列」という句は、参照配列に対してある種の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または伸長を有し、かつ、対応するペプチドの活性と同じ１まはた複数の生物活性を本質的に保存しているものをむしろ指し、そのようなものが好ましい。有利には、免疫系細胞の活性化および／または動員の活動が本質的に保存されている。
１以上の連続するまたは不連続のアミノ酸の置換の場合、被置換アミノ酸が等価なアミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。「等価なアミノ酸」という句は、対応するポリペプチド断片の１または複数の生物活性を本質的に改変することなく、塩基構造のアミノ酸の１つと置き換わることができる任意のアミノ酸を意味する。有利には、免疫系細胞の活性もしくは活性化および／または動員が保存される。これらの等価なアミノ酸は、置換されるアミノ酸との構造的相同性に基づくか、または異なる断片間で行うことができる比較生物活性試験の結果に基づいて決定することができる。このポリペプチド配列の類似性に関する研究は、非荷電側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、およびチロシンなど）、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リシン、アルギニン、およびヒスチジンなど）、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸など）；極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびシステインなど）の置換などの同じクラスのアミノ酸の置換である保存的置換を考慮に入れる(Hausman RE et al. (2004). D.C: ASM Press)。当業者ならば、当技術分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することにより、変化を許容し得るペプチド断片の領域を容易に決定することができる。
本発明の特定の態様では、ポリペプチド断片を、それらの安定性、それらのバイオアベイラビリティおよび／またはそれらの活性を改善するために化学的にまたは酵素的に改変することもできる。有利には、免疫系細胞の活性化および／または動員の活動が改善される。当業者ならば、アミノ酸を化学的にまたは酵素的に改変するための多くの技術を知っている（David L. Nelson and Michael M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd edition, 2000もまた参照)。
非限定的な方法において、例えば、１以上のリシン（Ｋ）アミノ酸を下記により改変することができる：
・アミド化：この改変は実施が簡単であり、リシンの正電荷が疎水基（例えば、アセチルまたはフェニルアセチル）で置換される；
・アミノ化：第一級アミンＲ＝（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋からの第二級アミドの形成、例えば、Ｎ−メチル、Ｎ−アリルまたはＮ−ベンジル基の形成による；
・またはＮ−オキシド、Ｎ−ニトロソ、Ｎ−ジアルキルホスホリル、Ｎ−スルフェニル、またはＮ−グリコシド基の形成による。
さらに、それに加え、またはその代わりに、ペプチドの１以上のトレオニン（Ｔ）および／またはセリン（Ｓ）アミノ酸を、特に、トレオニンおよび／またはセリンの側鎖のＯＨ基にエステル基またはエーテル基を導入することによって改変することもできる。簡単な操作であるエステル化は、無水物のカルボン酸を用い、架橋などを行って、例えば、アセテートまたはベンゾエートを形成することによって行うことができる。より安定な化合物を生成するエーテル化は、アルコール、ハロゲン化物などを用いて、例えば、メチルエーテルまたはＯ−グリコシドを形成することにより行うことができる。さらに、それに加えて、またはその代わりに、１以上のグルタミン（Ｑ）アミノ酸を、例えば、アミノ化により、特に、メチル基、エチル基、官能基含有基または官能基不含基を有する第二級または第三級アミンを形成することによって改変することができる。さらに、それに加えて、またはその代わりに、１以上のグルタミン酸（Ｅ）および／またはアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸を、例えば、以下により改変することができる：
・エステル化による、置換または非置換メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、チオール（活性化エステル）などの形成、
・アミド化による、特に、Ｎ，Ｎジメチル、ニトロアニリド、ピロリジニル基などの形成。
しかしながら、アミノ酸Ｇ、ＡおよびＭが一般に、明らかに有益となる改変の可能性を与えないことを考えても、ペプチドの二次構造に関与するプロリンアミノ酸を改変することが好ましくない。
ヒト好中球プロテアーゼにより生成される天然型に相当する、本発明者らが確認したＩＬ−３３の断片（ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０、および／またはそれらの相同体）は、原核生物または真核生物組換えタンパク質生産系を用いた遺伝子工学により、特に、ｉ）ＩＬ−３３のこれらの異なる断片をコードするヌクレオチド配列により形質転換された微生物または真核細胞を培養すること、およびｉｉ）前記微生物または前記真核細胞により生産されたＩＬ−３３の断片を単離することによって得ることができる。この技術は当業者に周知である。これに関してさらに詳しくは、以下の研究を参照することができる：Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 646, 1991。本発明のＩＬ−３３のペプチド断片は好ましくは、それらが発現され、かつ／または分泌された細胞溶解液および／または細胞上清から精製／単離される。この精製は、当業者に公知のいずれの手段によって行ってもよい。多くの精製技術がVoet D and Voet JG, Techniques de purification des proteines et des acides nucleiques [Protein and nucleic acid purification techniques], Chapter 6, Biochimie, 2nd editionに記載されている。
組換えタンパク質生産系では、合成されるポリペプチドをコードする核酸を含んでなるヌクレオチドベクターを使用し、これを前記ポリペプチドを生産する宿主細胞に導入する（さらに詳しくは、"Recombinant DNA Technology I", Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 646, 1991を参照）。
第２の側面において、本発明は、本発明によるポリペプチド断片の少なくとも１つをコードする、すなわち、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４、またはそれらの相同体からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。用語「相同体」は、この場合にもまた、配列番号２、配列番号３または配列番号４の配列の１つの少なくとも８０％、好ましくは８５％、好ましくは８７％、好ましくは９０％、好ましくは９２％、好ましくは９５％、好ましくは９７％、好ましくは９８％、いっそうより好ましくは９９％と同一な配列を有するポリペプチドを意味する。
好ましい態様では、本発明による核酸は４８６〜５２８塩基対の間を有する。より好ましくは、本発明の核酸は、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１からなる群から選択される配列を含んでなる。
第３の側面において、本発明はまた、本発明による少なくとも１つの核酸を含んでなるベクターに関する。このベクターは、本発明のポリペプチド断片を生産する働きをし得るか（本発明による核酸を含有するクローニングベクターおよび／または発現ベクター）または遺伝子療法の目的で前記断片をin vivoに輸送する働きをし得る。
真核生物または原核生物宿主細胞に導入してその細胞内でそれを維持するために、対象とする核酸分子を挿入することができる多くのベクターが知られており、好適なベクターの選択は、このベクターに対して企図される使用（例えば、対象とする配列の複製、前記配列の発現、前記配列の染色体外形態での維持または宿主の染色体質への組込み）、ならびに宿主細胞の性質（例えば、プラスミドは好ましくは細菌細胞に導入され、一方、ＹＡＣは好ましくは酵母で使用される）によって異なる。これらの発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶに基づくエピソーム、および当業者が前記の鎖の発現に適当であると考え得るあらゆるベクターであり得る。本発明の好ましい態様では、本発明のポリペプチド断片をコードするために用いるベクターは、in vitro研究向けには配列番号１４のベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および細菌での大規模生産向けにはｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
本発明によるベクターは、本発明のポリペプチド断片の少なくとも１つ、または類似の配列をコードする核酸、ならびにその発現に必要な手段を含んでなる。「ペプチドの発現に必要な手段」という句は（ペプチドという用語は、タンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチドなど、いずれのペプチド分子にも用いられる）、特に、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点および好ましくは選択マーカーなど、ペプチドの取得を可能とする任意の手段を意味する。ペプチドの発現に必要な手段は、本発明のポリペプチド断片をコードする核酸配列に機能的に連結される。「機能的に連結される」とは、本発明のポリペプチド断片をコードする遺伝子の発現に必要な前記要素の並置を意味し、これらはそれらを予測される様式で働かせ得る関係にある。例えば、それらの機能的関係が保存される限り、プロモーターと本発明のポリペプチド断片をコードする遺伝子との間に付加的塩基が存在してもよい。ペプチドの発現に必要な手段は、同種手段、すなわち、使用するベクターのゲノムに本来含まれるものであってもよいし、あるいは異種手段、すなわち、別のベクターおよび／または生物体から人工的に付加されたものであってもよい。後者の場合、前記手段を、発現させるポリペプチド断片とともにクローニングする。異種プロモーターの例としては、（ｉ）ウイルスプロモーター、例えば、プロモーターＳＶ４０（シミアンウイルス４０）、単純ヘルペスウイルスのチミジン−キナーゼ遺伝子のプロモーター（ＴＫ−ＨＳＶ−１）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター(first immediate promoter)およびアデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、ならびに（ｉｉ）高等真核生物においてペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する任意の細胞プロモーター、例えば、構成的ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子プロモーター(Adra et al., Gene 1987)、肝臓α抗トリプシンに特異的な遺伝子のプロモーター、ならびに平滑筋細胞に特異的なＦＩＸおよびＳＭ２２プロモーター(Moessler et al., Development 1996)が含まれる。発現ベクターにおけるＤＮＡ配列の抑制および挿入の方法は当業者に十分に知られており、特に、酵素的消化およびライゲーション工程からなる。本発明のベクターはまた、特定の細胞コンパートメントにペプチドを標的化するために必要な配列も含み得る。１つの標的化例は、アデノウイルスのＥ３タンパク質に由来するリーダー配列タイプのアドレッシング配列を用いることにより得られる小胞体への標的化であり得る(Ciernik IF, et al., The Journal of Immunology, 1999)。
本明細書において用語「転写ターミネーター」は、遺伝子またはオペロンの、メッセンジャーＲＮＡとしての転写の終了をマークするゲノムの配列を意味する。転写終結機構は、原核生物と真核生物で異なる。当業者であれば、種々の細胞種に応じて使用されるシグナルを知っている。例えば、ベクターが導入される細胞が細菌である場合、Ｒｈｏ非依存性ターミネーター（逆方向反復配列とその後に続くＴシリーズ（転写されたＲＮＡ上のウラシル）またはＲｈｏ依存性ターミネーター（Ｒｈｏタンパク質により認識されるコンセンサス配列からなる）が使用される。
用語「複製起点」（ｏｒｉとも呼ばれる）は、複製の開始を可能とする単一のＤＮＡ配列である。一方向複製または双方向複製が始まるのはこの配列からである。当業者ならば、複製起点の構造が種ごとに異なることを知っており、従って、複製起点は、それらが総てある特定の特徴を持っているとしても特異的である。タンパク質複合体はこの配列において形成され、ＤＮＡの開環および複製の開始を可能とする。
選択マーカーは当業者に周知である。好ましくは、選択マーカーは、抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子である。
本発明の対象核酸を含んでなる本発明のベクターは、当業者により慣例の方法で作製される。得られたクローンは、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するために当業者に知られている標準的な方法によって好適な宿主に導入することができる。このような方法としては、デキストランを用いた形質転換、リン酸カルシウムによる沈殿形成、ポリブレンを用いたトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル封入、微粒子銃注入およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。また、前記配列（単離されたものまたはプラスミドベクターに挿入されたもの）を、ナノ輸送体もしくはリポソーム製剤などの輸送体、または陽イオンポリマーといった、それが宿主細胞の膜を通過することを可能とする物質と会合させることもできる。さらに、有利には、例えば、リポソームと組み合わせたエレクトロポレーションを使用することによるなど、これらの方法を組み合わせることも可能である。
第４の側面では、本発明は、本発明の核酸の少なくとも１つまたは本発明のベクターの１つによる、またはそれを含んでなる一時的または安定的な様式で形質転換された微生物または真核宿主細胞に関する。
本発明の目的に好適な微生物の例としては、酵母(Buckholz RG, Current Opinion in Biotechnology 1993)および細菌(Olins and Lee, Current Opinion in Biotechnology 1993)が挙げられる。真核細胞の例としては、哺乳類(Edwards CP and Aruffo A, Current Opinion in Biotechnology 1993)、爬虫類などに由来する細胞が挙げられる。また、植物細胞を使用することもできる。哺乳類細胞としては、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞）、ドワーフハムスター腎細胞（ＢＨＫ細胞）、ブタ腎細胞（ＰＫ１５細胞）およびウサギ腎細胞（ＲＫ１３細胞）、ヒト骨肉腫細胞株（１４３Ｂ細胞）、ヒトＨｅＬａ細胞株およびヒト肝細胞腫細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２細胞種のもの）を使用することができる。また、例えばバキュロウイルス実装プロセスを実行することができる昆虫細胞を使用することもできる(Luckow VA, Journal of Virology 1993)。本発明の好ましい態様では、本発明の断片を生産するために用いられる宿主細胞は、細菌、好ましくは、ＢＬ２１細菌である。
当業者ならば、これらの細胞を培養するための条件、ならびにこれらの細胞によるポリペプチド断片の発現に必要な実験条件を知っている。
別の側面において、本発明はまた、本発明による組換えポリペプチド断片の生産方法であって、以下の工程：
ａ）本発明による宿主細胞を、好適な培養培地中、好適な培養条件下で培養する工程、および
ｂ）工程ａで生産された本発明によるポリペプチド断片を単離する工程
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
前記断片は、前記断片を発現する細胞から単離（精製）することができる。この場合には、前記細胞を溶解する予備工程が必要となる可能性がある。
組換えタンパク質の生産に用いる各細胞種に関連する培養培地および条件は当業者に周知である。
本発明のポリペプチド断片の単離（または精製）は、当業者に公知のいずれの手段によって実施してもよい。例えば、示差沈殿または超遠心分離が挙げられる。また、目的断片をイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分子篩または等電点泳動によって精製することも有利であり得る。これらの技術は総て、Voet D and Voet JG, Techniques de purification des proteines et des acides nucleiques [Nucleic acid and protein purification techniques], Chapter 6, Biochimie, 2nd editionに記載されている。
より具体的には、最初の工程において、タンパク質が抽出される材料（動物組織、植物の一部、細菌など）が一般に摩砕される。この目的で種々の器具（「Ｗａｒｉｎｇブレンダー」、「Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｖｅｌｊｈｅｍ装置」、「Ｐｏｌｙｔｒｏｎ」など）が使用可能である。このホモジナイゼーションは、当業者に周知の、好適な組成のバッファー中で行う。このようにして得られたホモジネートを次に、通常には遠心分離により明澄化し、摩砕の不十分な大粒子を除去するか、または目的タンパク質を含有する細胞画分を得る。タンパク質が細胞コンパートメント内に存在していれば、一般に、弱い洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎなど、場合によってはデオキシコール酸塩）を用いて、前記コンパートメントの膜を溶解させることによってそれを放出させる。洗剤の使用は、多くの場合、制御された様式で行わなければならず、これは洗剤がリソソームを壊し、それにより、加水分解酵素（プロテアーゼ、ヌクレアーゼなど）が放出され、これらが単離するタンパク質またはその他の分子を攻撃し、破壊するおそれがあるからである。分解を受けやすい、または少数のタンパク質を扱う場合には、特に注意を払わなければならない。この問題の一般的な対策は、生理学的プロテアーゼ阻害剤（トリプシン阻害剤であるアンチパイン、ロイペプチンなど）または人工的プロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４、ＰＭＳＦなど）をそれらの溶液に含めることである。また、目的タンパク質を単離するためには種々の技術がある。大容量に最適な方法の１つは、硫酸アンモニウムによる示唆沈殿である。大きなサンプル容量に適用可能であるが、比較的良好な分離力を有するイオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーは、良好な中間法である。精製の仕上げには、分子篩または等電点泳動が用いられる場合が多い。これらの技術では、純度を極めることができるが、極めて少容量の高濃度タンパク質を必要とする。これらの工程と工程の間に、これらのクロマトグラフィー操作に用いられた塩または生成物を除去することが有利である場合が多い。これは透析または限外濾過により行うことができる。
本発明のポリペプチド断片の同定を可能とする配列を有する、本発明によるベクターを使用することが有利であり得る。さらに、原核生物系または真核生物系において分泌を促進することも有利であり得る。実際に、この場合、目的の組換え断片は、宿主細胞内よりもむしろ細胞培養の上清中に存在する。
このように、これらの技術の１つまたはその他を用いることにより、完全型ヒトＩＬ−３３とは対照的に、本発明者らが確認したＩＬ−３３のポリペプチド断片（ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０）は、本発明の組換え細胞により大量に生産することができる（上記の例ｃ）参照）。より具体的には、本発明の断片は、少なくとも１ｍｇ／リットル、好ましくは、２ｍｇ／リットル、いっそうより好ましくは、５ｍｇ／リットル細胞培養物に達するレベルで生産することができる。
あるいは、本発明によるポリペプチド断片は化学合成によって製造することもできる。このような製造方法もまた本発明の目的である。当業者ならば、化学合成法、例えば、固相実装技術、または部分的固相を用いるか、断片の縮合によるか、もしくは従来の溶液中での合成による技術を知っている。本発明の断片は、例えば、純度、抗原特異性、所望でない二次生成物の不在、および製造の容易さという理由で有利なメリフィールド(Merrifield)型合成などの合成化学法によって合成することができる。この化学合成は、当業者に周知であり、かつ、例えば、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989に記載されている技術を用いた単独の遺伝子工学的アプローチまたは遺伝子工学と組み合わせることができる。試薬および出発生成物は市販されているか、または周知の従来技術の（例えば、ＷＯ００／１２５０８、ＷＯ２００５／０８５２６０参照）によって合成することができる。
本発明者らが確認した新規なＩＬ−３３断片は、in vitroおよびin vivoにおいて、完全型ヒトＩＬ−３３および／またはこれまでに用いられている末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０よりも優れた生物活性を有する。
これらの断片は有利には、ＳＴ２受容体の、またはヒトＩＬ−３３と結合する他の任意の受容体のin vitro作動薬として使用することができる。別の側面において、本発明はまた、ＳＴ２受容体の、またはヒトＩＬ−３３と結合する他の任意の受容体のin vivo作動薬としてのそれらの使用のための本発明の断片に関する。「ＳＴ２受容体」は好ましくは、配列番号１２（アイソフォーム１、ＮＰ＿０５７３１６．３）または配列番号１３（アイソフォーム２、ＮＰ＿００３８４７．２）の配列のタンパク質を意味し、「Ｔ１」、「ＤＥＲ４」、「ＩＬ１Ｒ１」、「ＦＩＴ−１」、「ＭＧＣ３２６２３」または「ＩＬ３３Ｒ」とも呼ばれる。
本発明の断片は、in vitroでは肥満細胞によるＩＬ−６の分泌を効果的に刺激することができ、in vivoでは免疫系細胞を動員することができる（マウスの脾臓重および血中顆粒球数の増加）。従って、それらはin vivoにおいて、特に、天然ヒトＩＬ−３３の投与に対して正の反応を示す疾患に対して有意な治療活性を持ち得る。
従って、別の側面において、本発明は、本発明の単離されたポリペプチド断片の少なくとも１つ、または本発明のポリペプチド断片をコードする核酸の少なくとも１つを含んでなる医薬組成物に関する。前記組成物が本発明のポリペプチド断片を含んでなる場合、前記断片は組換え手段または化学合成手段によって得ることができる。
好ましくは、前記組成物に薬学上許容される賦形剤および／またはビヒクルを加える。本明細書において、「薬学上許容されるビヒクル」とは、二次反応を引き起こさず、かつ、例えば、有効化合物の投与の助長、生物体内でのその寿命および／または有効性の増大、溶液中でのその溶解度の増大、またはその保存性の向上を可能とする、医薬組成物中の化合物または関連化合物の組合せを意味する。これらの薬学上許容されるビヒクルは周知であり、当業者ならば、選択された有効化合物の性質および投与様式に従って適合させることができる。
好ましくは、これらの化合物は全身投与され、特に、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下、経口または局所経路（ゲル、エアゾール、滴剤などによる）により投与される。より好ましくは、本発明の医薬組成物は、時間的に分散させて数回投与される。その投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、治療耐性および見られる副作用など、患者に好適な治療を確立する上で一般に考慮される基準に従って決定することができる。
別の側面において、本発明はまた、薬剤としてのそれらの使用のための本発明のポリペプチド断片に関する。
より具体的には、本発明は、天然ヒトＩＬ−３３の投与に正の反応を示す疾患、例えば、敗血症、シュードモナス角膜炎、結核、または線虫もしくはインフルエンザウイルスによる感染などの感染性疾患、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞などの心血管疾患、癌、あるいは肥満における脂肪組織炎症、の治療を可能とする薬剤としてのそれらの使用のための、本発明の各ポリペプチド断片に関する。言い換えれば、本発明は、敗血症、シュードモナス角膜炎、結核、または線虫もしくはインフルエンザウイルスによる感染などの感染性疾患、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞などの心血管疾患、癌、あるいは肥満における脂肪組織炎症の治療を意図する薬剤の製造のための、本発明のポリペプチド断片の少なくとも１つの使用に関する。
本発明に関連する心血管疾患は、例えば、冠動脈疾患、心筋疾患、心臓弁疾患、心膜疾患、心臓律動または伝導疾患、血管疾患、またはその他である。関連する冠動脈疾患は、例えば、狭心症または心筋梗塞である。本発明に関連する心筋疾患は、例えば、心筋症または心不全である。関連する心臓弁疾患は、例えば、心内膜炎または心臓弁疾患である。「心膜疾患」は一般に、心膜炎である。心臓律動または伝導疾患は、例えば、心血管性失神、心臓伝導障害または心臓律動障害である。関連する血管疾患は、例えば、動脈瘤、閉塞性下肢動脈症、急性大動脈解離、肺動脈性高血圧症、または血栓塞栓性疾患である。本発明に関連するその他の疾患は、例えば、心臓循環器停止、先天性心臓障害、動脈性高血圧症、動脈性低血圧症、またはアダム−ストーク症候群である。
本発明のポリペプチド断片によって予防および／または治療可能な癌としては、特に、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫または卵巣癌、膵臓癌、黒色腫または他の任意の癌がある。
本発明はまた、有効量の、本発明のポリペプチド断片の１つまたはそれをコードする本発明の核酸の１つを含んでなる医薬組成物を患者に投与することを含んでなる治療方法に向けられる。好ましくは、この治療方法は、敗血症、シュードモナス角膜炎、結核、または線虫もしくはインフルエンザウイルスのよる感染などの感染性疾患、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、癌、あるいは肥満における脂肪組織炎症に罹患している患者において、それらの予防および／または治療を可能とする。
よって、本発明は、特に、本発明の核酸または本発明のヌクレオチドベクターを含んでなる医薬組成物に関する。従って、この医薬組成物は、遺伝子療法の目的で使用することができる。
この目的のため、本発明はまた、本発明のベクターの１つまたは核酸の１つを含んでなる哺乳類細胞（ヒト細胞、好ましくは、非胚性のものを含む）に関する。本発明において、遺伝子療法の原理は、本発明の目的ポリペプチド断片をコードする核酸を、それらがその核酸が導入された患者の細胞によってin vivoで発現されるような条件下で患者に投与することである。
このような核酸は特に、ＤＮＡベクター、例えば、プラスミドベクターの形態であり得る。１以上のベクターを投与することが可能であり、各ベクターは、少なくとも１つの目的ポリペプチド断片をコードする１以上の配列を有することができる。前記ＤＮＡベクターは、当業者に公知のいずれの技術によってin vivoに導入してもよい。特に、ＤＮＡベクターは、裸の形態で、すなわち、ベクターの細胞へのトランスフェクションを促進するビヒクルまたは系の助けなくin vivoに導入することができる（ＥＰ４６５５２９）。また、例えば、「金」粒子の表面にＤＮＡを付着させ、それらをそのＤＮＡが患者の皮膚を透過するように発射することによる「遺伝子銃」を使用することもできる。液体ゲルによる注射も、皮膚、筋肉、脂肪組織および乳房組織を同時にトランスフェクトするために使用可能である(Furth et al., Anal Biochem 1992)。マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムによる沈殿形成、ナノカプセルまたはリポソームを用いた製剤の技術が他の利用可能な技術である。生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が特に有利である。リポソームの場合、陽イオン脂質を使用すれば、負電荷を有する核酸のカプセル封入が促進され、負電荷を有する細胞膜との融合が助長される。あるいは、ベクターは、そのゲノムに挿入された、前記ペプチドをコードする核酸配列を含んでなる組換えウイルスの形態であってもよい。ウイルスベクターは好ましくは、アデノウイルス、レトロウイルス、特に、レンチウイルス、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクチンウイルス(vaccine virus)などであり得る。有利には、組換えウイルスは、欠陥型ウイルスである。
用語「欠陥型ウイルス」は、標的細胞内で複製することができないウイルスを意味する。一般に、欠陥型ウイルスのゲノムは、少なくとも、感染細胞での前記ウイルスの複製に必要な配列を欠いている。これらの領域は、削除するか、非機能性とするか、または他の配列により、特に、目的のポリペプチド断片をコードする核酸によって置換することができる。しかしながらやはり、好ましくは、欠陥型ウイルスは、その総てではないが、ウイルス粒子の封入に必要なそのゲノムの配列を保存している。遺伝子の標的投与は、例えば、ＷＯ９５／２８４９４出願に記載されている。
別の側面において、本発明は、場合により本発明の方法の１つによって得られる本発明によるポリペプチド断片、または本発明の核酸の、別の薬剤との併用、例えば、癌の治療のための化学療法薬との併用、心血管疾患の血管形成術処置のための人工血管（またはステント）に関連する使用、またはインフルエンザウイルスなどのウイルスに対するワクチンのアジュバントとしての使用に関する。
好ましい態様では、本発明のポリペプチド断片を、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、または有糸分裂紡錘体阻害剤からなる群に含まれる化学療法薬と組み合わせる。「アルキル化剤」とは、とりわけ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、イソスファミド(isosfamide)、メルファラン、メクロレタミン、オキサリプラチン、ウラムスチン(uramustin)、またはさらにはテモゾロミドを意味する。「代謝拮抗物質」とは、とりわけ、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、またはさらにはペメトレキセドを意味する。「植物アルカロイド」は、例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチンである。「トポイソメラーゼ阻害剤」は、例えば、イリノテカン、トポテカン、またはエトポシドである。「抗腫瘍抗生物質」は、例えば、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、マイトマイシンＣ、またはミトキサントロンである。最後に、「有糸分裂紡錘体阻害剤」は、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンである。
別の側面によれば、本発明は、個体において感染または外傷を診断するための、場合により本発明の方法の１つによって得られる本発明による単離されたポリペプチド断片、または本発明の核酸の使用に関する。
診断は、患者の血清または血漿中でＩＬ−３３の新規な断片（ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０、およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０）の特異的検出を可能とするＥＬＩＳＡ技術を使用することにより確立することができる。
実際に、血液または血清中のＩＬ−３３の量の増加は、個体における感染、炎症または外傷を示し得る。従って、内因性プロテアーゼの作用によりin vivoで形成され得る本発明のポリペプチド断片を感染または炎症状態のマーカーとして使用することを企図することができる。
有利には、これらの特定のＩＬ−３３断片は、それらを特異的に認識する抗体によって検出することができる。
従って、最後の側面において、本発明は、本発明のポリペプチド断片の１つを特異的に認識するが、完全型ＩＬ−３３ａａ１−２７０または末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０は認識しないモノクローナル抗体に関する。有利には、前記抗体は、立体構造抗体（conformational antibody）、すなわち、立体構造エピトープを認識する抗体である。
本発明による抗体は、Antibodies: A Laboratory Manual, E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載されているものなど、当業者に公知の従来技術によって作製することができる。
より具体的には、このような抗体は、Kohler and Milstein (Nature, 1975)の技術に従い、本発明のポリペプチド断片の１以上で免疫した動物のＢリンパ球を骨髄腫と融合させることによって得られたハイブリドーマから生産することができ、これらのハイブリドーマをin vitro、特に、ファーメンターで培養するか、またはin vivoにおいて腹水の形態で生産するか、あるいは、前記モノクローナル抗体は米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような遺伝子工学によって生産することもできる。
本発明のポリペプチド断片を高親和性（親和性定数はｎＭ程度）で特異的に認識する本発明による抗体は、潜在感染または外傷を有する患者の好適な生体サンプル（全血、末梢血の単核細胞、腫瘍生検）を用いた場合に、検出のための信頼できる高感度の診断試薬となる。
従って、特定の態様では、本発明はまた、本発明の抗体を用いて感染または外傷を診断するための方法に関する。この診断方法は、これらの抗体を、当業者に公知の非変性条件下で、非固定細胞（冷凍細胞もしくは生細胞）または固定細胞を用いるフローサイトメトリー、免疫細胞化学または免疫組織化学または免疫沈降において使用することができる。
本発明を以下の実施例でより具体的に説明する。
ａ）本発明のＩＬ−３３断片の証明
完全ヒトＩＬ−３３タンパク質（ＩＬ−３３１−２７０、配列番号１）または末端切断型ヒトＩＬ−３３タンパク質（ＩＬ−３３１１２−２７０、配列番号５）は、製造者の推奨(Promega TnT Coupled Reticulocyte Lysate Systems ref L4610)に従う網状赤血球溶解液でのタンパク質生産の従来技術に従って、in vitroで生産した。すなわち、フルサイズまたは末端切断型のＩＬ−３３（ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ３３ １−２７０または９５−２７０または９９−２７０または１０９−２７０）の発現を可能とする１μｇのプラスミドを、最終反応用量５０μｌ中、反応バッファー１０×（２μｌ）、ポリメラーゼＴ７（１μｌ）、アミノ酸混合物１ｍＭ（１μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／μｌ）を含有するウサギ網状赤血球溶解液（２５μｌ）と混合する。対照は、エンプティーベクターｐｃＤＮＡ３を用いて作製する。３０℃で９０分前後、インキュベーションを行う。好中球プロテアーゼによる切断では、５μｌの溶解液（計画的または非計画的）を、３７℃で１時間、１ｍＵのカテプシンＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ｒｅｆ：２１９３７３）とともに、または３０分間０．３Ｕのエラスターゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｒｅｆ：３２４６８１）とともに、または３０分間０．２５μｇのＰＲ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｒｅｆ：５３９４８３）とともにインキュベートする。切断産物を、ＩＬ−３３のＣ末端部分に対するモノクローナル抗体（ＩＬ−３３３０５Ｂ、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｆ：ＡＬＸ−８０４−７２６）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットゲルにより分析する（図２Ａ）。ヒトＩＬ−３３は、組換えプロテアーゼとしてのカテプシンＧ（Ｃａｔ Ｇ）、エラスターゼ２（エラスターゼ）、およびプロテイナーゼ３（ＰＲ３）の標的となり、in vitroにおいて３つの成熟断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０を生成する。しかしながら、これらの３つの好中球プロテアーゼは、図２Ａの下方の２つのブロットに示されるように、ＩＬ−１サイトカイン型のドメイン（Ｃ末端ドメイン）を切断しない。
さらに、ヒト好中球を、ＥＤＴＡ管に採取したヒト新鮮全血から、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ分離媒体（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ；ｒｅｆ１１１４６８３）を用いて単離および精製した。好中球をＲＰＭＩ／Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）に再懸濁させ、９６ウェルプレートに１００，０００好中球／ｍｌおよび１００μｌ／ウェルの量で分注し、ＰＭＡ（ホルボール１２ミリステートアセテート１３、２５ｎＭ）を用い、３７℃で２時間活性化した。完全ＩＬ−３３タンパク質（上記の通りの２５μｌの計画的溶解液）をセリンプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、５ｍＭ）の存在下または不在下でこれらのヒト好中球とともにインキュベートした。生じた断片の分析は、Ｃ末端部分に対する抗ＩＬ−３３抗体（ＩＬ−３３３０５Ｂ；Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ｒｅｆ：ＡＬＸ−８０４−７２６）を用い、ウエスタンブロットにより行った。生じた断片のサイズの比較は、組換えタンパク質ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０を用いて行った。得られた結果を図２Ｂに示す。これらの結果は、ヒトＩＬ−３３が実際に、ex vivoにおいて、ヒト好中球プロテアーゼであるカテプシン（Ｃａｔ Ｇ）、エラスターゼ２（エラスターゼ）、およびプロテイナーゼ３（ＰＲ３）の標的となることを示す。
ｂ）ＩＬ−３３の新規な断片はin vitroにおいて「超活性」である
新規なＩＬ−３３断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０の生物活性をin vitroにおいて２つの機能的試験にて調べた。一方の試験はヒト好塩基球株におけるＳＴ２依存性ＩＬ−５の分泌に基づくものであり、他方はネズミ脂肪細胞株におけるＳＴ２依存性ＩＬ−６の分泌に基づくものである。
簡単に述べると、ＭＣ／９肥満細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０６）を、６ｍＭのグルタミン、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％Ｒａｔ−Ｔ−ＳＴＩＭ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ｒｅｆ：３５４１１５）および１０％ウシ胎仔血清（ＡＴＣＣ、ｒｅｆ：３０−２０２０）を含有するＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、Ｒｅｆ：３０−２００２）で維持した。２００，０００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルの量で分注し、３７℃で２４時間、タンパク質ＩＬ−３３ａａ１−２７０、ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０（１０μｌの計画的網状赤血球溶解液）とともにインキュベートした。培養上清中に分泌されたＩＬ−６の量を、従来法により「マウスＩＬ−６」キット（Ｒ＆Ｄ、ｒｅｆ：４０６）を用いたＥＬＩＳＡ技術によって測定した。これらの結果から、フルサイズＩＬ−３３ ＩＬ−３３ａａ１−２７０に関して得られる値を導いた。
ヒト好塩基球細胞ＫＵ８１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０９９）を、１０％ウシ胎仔血清（ＡＴＣＣ、ｒｅｆ：３０−２０２０）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（ＡＴＣＣ、Ｒｅｆ：３０−２００１）で維持する。１０６細胞／ウェルを９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルの量で分注し、３７℃で２４時間、タンパク質ＩＬ−３３ａａ１−２７０、ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０（８μｌの計画的網状赤血球溶解液）とともにインキュベートする。培養上清中に分泌されたＩＬ−５の量を、従来法により「ヒトＩＬ−５」キット（Ｒ＆Ｄ、ｒｅｆ：ＤＹ２０５）を用いたＥＬＩＳＡ技術に従って測定した。
これらの各試験において、組換えタンパク質ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０が、フルサイズの活性型ＩＬ−３３ａａ１−２７０よりも高い活性を有することが証明された（図３Ｂおよび３Ｃ）。従って、これら新規なＩＬ−３３断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３ａａ１０９−２７０は、in vitroにおいて完全型に比べて「超活性」である。
ｃ）組換え手段により本発明のＩＬ−３３断片を生産／精製するための方法
当業者に用いられている従来技術に従い、細菌において、完全型または末端切断型ヒト組換えＩＬ−３３タンパク質を、タンパク質の精製を可能とするためにＮ末端６ｘヒスチジンタグと融合させた形で生産した。次に、このヒスチジンタグをトロンビンによる切断によって除去し、目的のタンパク質を立体排除クロマトグラフィーにより精製した。
簡単に述べると、１リットルの培養培地に形質転換株（ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ−ｐＥＴ１５ｂ−ＩＬ−３３ａａ１−２７０またはＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ−ｐＥＴ１５ｂ−ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、またはＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ−ｐＥＴ１５ｂ−ＩＬ−３３ａａ９９−２７０またはＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ−ｐＥＴ１５ｂ−ＩＬ−３３ａａ１０９−２７０）を播種する。ＤＯが０．７に達した際に、１ｍＭのＩＰＴＧを３７℃にて４時間添加することにより目的タンパク質の発現を誘導する。これらの細菌を遠心分離し、ペレットを溶解バッファー（Ｎａ２ＨＰ０４ ５０ｍＭ、ＮａＣｌ ３００ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ ０．５％、ＤＮアーゼＩ １ｍＭ、リゾチーム １ｍＭ、プロテアーゼ阻害剤）と接触させる。音波処理および超遠心分離を行った後、この細菌溶解液を回収し、４℃で４時間、ニッケル−ＮＴＡビーズとともにインキュベートする。これらのビーズを洗浄し、アフィニティー精製したタンパク質を５００ｍＭのイミダゾールで溶出させる。その後、溶出液をイミダゾールから分離し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；閾値１０ｋＤａ ２０ｍＬ）を用いた遠心分離／濃縮により、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌバッファー中で透析する。ヒスチジンタグをトロンビン（２５０単位／ｍＬ、４℃、２０時間）により切断し、タンパク質をゲル浸透クロマトグラフィー（「ゲル濾過」−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム）とその後のＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）による濃縮によって精製する。種々の精製工程の分析をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクーマシーブルー染色により行う。精製されたタンパク質をＮａｎｏｄｒｏｐアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量し、内毒素の存在を「Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ」キット（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｒｅｆ：５０−６４７Ｕ）を用いて決定した。
ＩＬ−３３タンパク質（完全型または切断型）の生産／精製の例を図４に示す。１リットルの細菌培養物からＩＬ−３３の断片（ＩＬ−３３９５−２７０、ＩＬ−３３９９−２７０、ＩＬ−３３１０９−２７０）に相当する少なくとも９ｍｇのタンパク質を得ることができ、一方、フルサイズ型で得ることができたのは１μｇ未満であった。よって、ＩＬ−３３断片の生産収量は、フルサイズ型１−２７０で得られたものの少なくとも９０００倍である。
ｄ）新規なＩＬ−３３断片はin vivoにおいて生物学的に「超活性」である
新規なＩＬ−３３断片の生物活性は、マウスにてin vivoで試験し、人工型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０の活性と比較した。この実験において、完全ヒトタンパク質ＩＬ−３３は、注射に必要な量のタンパク質を得ることができない（注射を施すマウスの数と実施する注射数を考慮すると＞３４０μｇ）ので、除外する。大腸菌(Escherichia coli)（ベクターｐＥＴ１５ｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ；ＢＬ２１菌）で生産し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した組換えタンパク質ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０、ＩＬ−３３ａａ９５−２７０、ＩＬ−３３ａａ９９−２７０およびＩＬ−３３１０９−２７０を、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（８〜１０週齢の雌マウス１２個体）に７日間毎日、腹腔内経路で注射した（２００μ１のＰＢＳ中４μｇ）。マウスを分析したところ、明らかな病的変化、特に、７日後の脾臓体積および重量の増加（図４Ａ）、ならびに空腸の杯状細胞の過形成（図４Ｂ）が見られた。興味深いことに、新規ＩＬ−３３断片のうちの２つ（ＩＬ−３３ａａ９５−２７０およびＩＬ−３３ａａ９９−２７０）は、７日後にマウス血中の顆粒球（主として好中球）数に増加を誘導し、この増加は末端切断型ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０（図４Ｃ）により誘導されたものよりも有意に高く、ＩＬ−３３の新規断片ＩＬ−３３ａａ９５−２７０およびＩＬ−３３ａａ９９−２７０がin vivoにおいて「超活性」型であることを示す。ＩＬ−３３ａａ１１２−２７０型よりも活性の高いＩＬ−３３断片の存在はこれまで全く想像されていなかったので、この結果は全く予期されないものである。
参照文献

Claims (14)

  1. 配列として、ヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ−３３）のアミノ酸９５〜２７０（配列番号２）、９９〜２７０（配列番号３）、または１０９〜２７０（配列番号４）、およびそれらと少なくとも９０％相同であってそれらと同一の生物活性を本質的に有する配列を有する断片から選択される、生物学的に活性な、単離されたヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ−３３）ポリペプチド断片であって、ヒト好中球の少なくとも１つのプロテアーゼによるｈＩＬ−３３切断の天然産物である、断片。
  2. 前記ヒト好中球のプロテアーゼが、カテプシンＧ（ＥＣ３．４．２１．２０）、白血球プロテイナーゼ３（ＥＣ３．４．２１．７６）、および好中球エラスターゼ２（ＥＣ３．４．２１．３７）の群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド断片。
  3. ヒトインターロイキン３３（ｈＩＬ−３３）に比べて少なくとも１つの改善された生物活性を有する、請求項１または２に記載の単離されたポリペプチド断片。
  4. 配列としてｈＩＬ−３３のアミノ酸１１２〜２７０（配列番号５）を有する末端切断型に比べて少なくとも１つの改善された生物活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド断片。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド断片をコードする単離された核酸。
  6. 請求項５に記載の核酸を含んでなる、ヌクレオチドベクター。
  7. 請求項５に記載の核酸または請求項６に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
  8. ＳＴ２受容体の作動薬としての使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に定義されるポリペプチド断片。
  9. 薬剤としての使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に定義されるポリペプチド断片。
  10. 敗血症、シュードモナス角膜炎もしくは結核、線虫もしくはインフルエンザウイルスによる感染からなる感染性疾患、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞からなる心血管疾患、癌、または肥満における脂肪組織炎症の治療における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に定義されるポリペプチド断片。
  11. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の単離されたポリペプチド断片、または請求項５に定義される核酸を含んでなる、医薬組成物。
  12. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の単離されたポリペプチド断片、または請求項５に定義される核酸を含んでなる、個体における感染または外傷を診断するための医薬組成物。
  13. 請求項１〜４のいずれか一項に定義される単離された断片を特異的に認識する、モノクローナル抗体。
  14. 請求項１〜４に定義される単離されたポリペプチド断片の生産方法であって、以下の工程：
    ａ）請求項７に定義される組換え細胞を、好適な培養培地中、好適な培養条件下で培養する工程、
    ｂ）工程ａ）で得られたポリペプチド断片を単離する工程
    を含んでなる、方法。
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