KR20180020141A - 암 치료에 사용되는 peg화된 인터류킨-10 - Google Patents

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KR20180020141A
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존 브라이언 멈
이반 호 찬
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아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드
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Abstract

종양- 및 면역-관련된 질환, 장애 및 상태를 갖는 대상의 면역 반응을 페길화된 IL-10이 포함된 IL-10 물질을 투여함으로써, 조절하는 방법.

Description

암 치료에 사용되는 PEG화된 인터류킨-10
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 5월 28일자로 제출된 미국 가출원 번호 62/167,699을 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 종양학- 및 면역-관련된 질환, 장애 및 상태의 치료 또는 예방에 있어서 면역 반응을 조절하기 위하여 IL-10 물질을 이용하는 방법에 관계한다.
개요
사이토킨 인터루킨-10 (IL-10)은 T 세포, B 세포, 대식세포, 및 항원 제시 세포 (APC)에 작용을 통하여 다중 면역 반응을 조절하는 다표현형(pleiotropic) 사이토킨이다. IL-10은 활성화된 단핵구와 활성화된 대식세포에서 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, GM-CSF 및 G-CSF의 발현을 억제함으로써 면역반응을 억제시킬 수 있으며, NK 세포에 의한 IFN-γ 생산을 또한 억제한다. IL-10은 주로 대식세포에서 발현되지만, 활성화된 T 세포, B 세포, 비만 세포, 및 단핵구에서도 또한 발현이 탐지되었다. 면역 반응을 억제하는 것에 추가하여, IL-10은 IL-2-처리된, 그리고 IL-4-처리된 흉선세포의 증식 촉진, B 세포의 생존력 강화, 그리고 MHC 클래스 II의 발현 자극을 포함한, 면역-자극 성질을 나타낸다.
인간 IL-10은 두 단량체 소단위(subunits) 사이의 비-공유 상호 작용이 파괴될 때, 생물학적으로 비활성이 되는 동종이량체다. 공개된 IL-10의 결정 구조로부터 얻은 데이터는 기능적 이량체가 IFN-γ와 특정 유사성을 나타낸다는 것을 나타낸다(Zdanov et al, (1995) Structure (Lond) 3:591-601).
이의 다표현형 활성의 결과로써, IL-10은 염증 상태, 면역-관련된 장애, 섬유성(fibrotic) 장애, 대사 장애 및 암이 포함된 광범위한 장애 및 상태에 연계되어 있다. 다수의 이러한 질병, 장애 및 상태에 대한 IL-10의 임상 및 전-임상 평가는 치료 가능성을 확고히 해왔다. 더욱이, 페길화된(pegylated) IL-10은 특정 치료 설정에서 페길화안된(non-pegylated) IL-10보다 더 효과적이라는 것을 보여주었다.
요약
본 발명은 키메라 항원 수용체-T 세포 요법 (CAR-T 세포 요법)의 구성요소로써 IL-10 물질 (가령, 페길화된 IL-10)의 사용을 고려한다. CARs는 암 (가령, B 및 T 세포 림프종 치료)과 다른 악성종양에 대한 새로 출현된 치료법을 대표한다. CAR-T T 세포는 예를 들어, 관심 종양에 존재하는 공지된 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체를 발현하도록 변형된 환자-유도 메모리 CD8+ T 세포를 일반적으로 포함한다. 본 발명은 일반적으로 암 치료를 위해 CAR-T 세포 요법을 사용하는 환경에서 설명되지만, 이러한 요법에 국한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
CAR-T T 세포 요법은 환자 본인의 배양된 T 세포를 이용하는 공정인, 입양 세포 전달 (ACT)을 이용하는 것을 포함한다. CAR-T 세포 요법에서, T 세포를 환자로부터 제거하고, 유전적으로 변형시켜 공지된 암(가령, 종양)에 특이적인 항원을 지향하는 CAR을 발현시킨다. 생체외(ex vivo)에서 충분한 수로 증폭시킨 후, 자가 세포는 환자에게 다시 주입되고, 항원 특이적으로 암이 파괴된다. 이와 같은 방식에서, CAR-T T 세포 요법은 환자에서 채취한 혈액으로부터 특정 성분을 분리하고 (가령, 백혈구성분채집술(eukocytapheresis)의 과정에서 악성 백혈구 세포의 제거), 그 다음 나머지 성분들은 다시 환자의 순환계로 복귀시키는 방식으로 처리되는 성분채집술과 유사하다.
이후에 논의되는 바와 같이, CAR-T 세포 요법을 이용한 치료는 표적-항원을 발현시키는 정상 조직을 표적으로 하는 항원-특이적 독성의 유도와 생명을 위협하는 사이토킨-방출 증후군을 야기하는 CAR-T 세포 치료의 극단적 가능성에 의해 부분적으로 제한되어 왔다. 특히, 상당한 항원 부하(burden)를 갖는 고친화성 T 세포 수용체 상호 작용은 활성화-유도된 세포 사멸로 이어질 수 있다는 것이 관찰되었다. 역사적으로, 활성화-유도된 세포 사멸의 증진과 관련하여 IL-10에 대해 과학 문헌들에서 논의되어 왔었다(Georgescu et al. (1997) J Clin Invest 100(10):2622-33). 그러나, 본 발명에서 제시되는 데이터에 따르면 CD8+ T 세포 기능 및 생존을 향상시키면서, 활성화 유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하기 위하여 IL-10 물질을 CAR-T T 세포 요법과 함께 사용할 수도 있음을 암시한다.
추후 더 논의되겠지만, 인간 IL-10은 동종이량체이며, 각 단량체는 178개의 아미노산을 포함하고, 이의 처음 18개 아미노산은 신호 펩티드를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예들은 이 신호펩티드가 결여된 성숙한 인간 IL-10 폴리펩티드 (가령, US 특허 번호. 6,217,857 참고), 또는 성숙한 인간 PEG-IL-10를 포함한다. 추가 특정 구체예들에 있어서, 상기 IL-10 물질은 성숙한 인간 IL-10의 변이체다. 상기 변이체는 성숙한 인간 IL-10의 활성보다 적거나, 이에 필적하거나 또는 이보다 큰 활성을 나타낼 수 있고; 특정 구체예들에서 이 활성은 성숙한 인간 IL-10의 활성에 필적하거나, 또는 이보다 크다.
본 발명의 특정 구체예들은 하나 또는 그 이상의 성질(가령, 약동학적 매개변수, 효과, 등)을 강화시키기 위하여 IL-10의 변형을 고려한다. 이러한 IL-10 변형(modifications)에는 페길화(pegylation), 당화(glycosylation), 알부민 (가령, 인간 혈청 알부민 (HSA)) 접합 및 융합, 그리고 헤실화(hesylation)가 포함된다. 특정 구체예들에서, IL-10은 페길화된다. 추가 구체예들에서, IL-10의 변형으로 면역원성에 치료요법적으로 관련된 결정적인 효과를 초래하지 않고, 추가 구체예들에서 변형된 IL-10은 변형안된 IL-10 보다 면역원성이 적다. ＂IL-10＂, ＂IL-10 폴리펩티드(들)＂, ＂물질(들)＂ 및 이와 유사한 용어들은 예를 들면, 동족체, 변이체 (뮤테인 포함), 이의 단편들, 뿐만 아니라, 예를 들면, 리더 서열 (가령, 신호 펩티드)을 갖는 IL-10 폴리펩티드가 포함된 인간 및 비-인간 IL-10-관련된 폴리펩티드, 그리고 전술한 것들의 변형된 형태를 광범위하게 포함하는 것으로 의도된다. 추가 특정 구체예들에 있어서, ＂IL-10＂, ＂IL-10 폴리펩티드(들)＂, ＂물질(들)＂은 항진제(agonists)다. 특정 구체예들은 페길화된 IL-10에 관계하며, 본 명세서에서 ＂PEG-IL-10"으로도 지칭된다. 본 발명은 전술한 것들을 인코드하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자가 포함된 벡터 및 이와 유사한 것들, 그리고 상기 IL-10 물질을 발현시키는 세포(가령, 형질변환된 세포 및 숙주 세포)를 또한 고려한다.
본 발명은 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하기 위하여, CAR-T 세포 요법과 IL-10 물질을 이용하는 방법을 고려한다. 특정 구체예는 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하는 방법을 고려하는데, 이 방법은 a) 상기 대상에게 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 도입시키고, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하고, 이때 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합하여 활성화-유도된 세포 사멸을 유도할 수 있고; 그리고 b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 IL-10 물질의 치료요법적 효과량을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, CAR은 상기 표적 세포 집단을 특이적으로 인지하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 물질은 활성화된 메모리 CD8+ T 세포의 기능을 강화한다. 다른 구체예들에서, 투여되는 IL-10 물질의 양은 세포독성 기능을 강화하는데 충분하다.
상기 IL-10 물질은 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 투여 전, 동시에 또는 투여 후에, 투여되는 구체예들이 고려된다. 본 발명의 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 물질은 피하로 투여된다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 10 내지 100 ng/mL의 혈장 농도를 얻는데 충분한 양의 IL-10 물질의 투여를 고려한다. 일부 구체예들에서, 상기 IL-10 물질은 1 pg/mL 내지 10.0 ng/mL의 IL-10 혈청 평균 최저 농도(trough concentration)를 유지하는데 충분한 양으로 대상에게 투여된다. 일부 구체예들에서, 1.0 pg/mL 내지 10.0 ng/mL의 IL-10 혈청 평균 최저 농도는 명시된 기간의 최소 95% 동안 유지된다. 본 발명의 추가 구체예들에서, IL-10 혈청 평균 최저 농도는 1.0 pg/mL 내지 100 pg/mL; 0.1 ng/mL 내지 1.0 ng/mL; 1.0 ng/mL 내지 10 ng/mL; 0.5 ng/mL 내지 5.0 ng/mL; 0.75 ng/mL 내지 1.25 ng/mL 또는 0.9 ng/mL 내지 1.1 ng/mL의 범위 안에 있다. 본 발명의 특정 구체예들에서, IL-10 혈청 평균 최저 농도는 최소한 1.25 ng/mL, 최소한 1.5 ng/mL, 최소한 1.6 ng/mL, 최소한 1.7 ng/mL, 최소한 1.8 ng/mL, 최소한 1.85 ng/mL, 최소한 1.9 ng/mL, 최소한 1.95 ng/mL, 최소한 1.97 ng/mL, 그리고 최소한 1.98 ng/mL, 최소한 1.99 ng/mL, 최소한 2.0 ng/mL 또는 2 ng/mL 이상이다.
추가 구체예들에서, 전술한 기간은 최소한 12 시간, 최소한 24 시간, 최소한 48 시간, 최소한 72 시간, 최소한 1 주, 최소한 2 주, 최소한 3 주, 최소한 1 개월, 최소한 6 주, 최소한 2 개월, 최소한 3 개월, 최소한 6 개월, 최소한 9 개월, 또는 12 개월 이상이다.
본 발명의 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 혈청 평균 최저 농도는 상기 기간의 최소한 85%, 상기 기간의 최소한 90%, 최소한 96%, 최소한 98%, 최소한 99% 또는 100% 동안 유지된다.
원하는 정상 상태(steady state) 혈청 최저 농도 (가령, 1 ng/mL)를 유지하는데 충분한 투약 요법은 상기 원하는 정상 상태 혈청 최저 농도 보다 높은 초기 혈청 최저 농도를 초래할 수 있다.　 포유동물 대상에서 IL-10의 약력학 및 약동학적 특징으로 인하여, 초기 최저 농도 (예를 들면, 하나 또는 그 이상의 로딩(loading) 분량 이후, 일련의 유지(maintenance) 분량의 투여를 통하여 획득됨)는 투여 매개변수 (가령, 양 및 빈도)가 일정하게 유지되는 경우에도, 시간의 경과에 따라 점진적으로, 그러나 지속적으로 감소된다.　 상기 기간 후, 점진적 그러나 지속적 감소는 종료되고, 정상 상태 혈청 최저 농도가 유지된다. 　
예를 들면, 정상 상태 혈청 최저 농도 2.0 ng/mL를 유지하기 위하여, ~0.1 mg/kg/일(day)의 IL-10 물질 (가령, mIL-10)을 마우스 (가령, C57BL/6 마우스)에게 비경구 투여 (가령, SC 및 IV)해야 한다. 　 그러나, 상기 정상 상태 혈청 최저 농도는 0.1 mg/kg/일에서 초기 투여 후(그리고 또한 그 이후 임의의 로딩 분량(들)) 대략 30일 까지 달성되지 않을 수 있다.　 오히려, 초기 혈청 최저 농도(가령, 2.5 ng/mL)가 달성된 후, 이 농도는 예를 들면, 대략 30-일 기간의 일정에 걸쳐 점진적으로, 그러나 지속적으로 감소되고, 그 이후 원하는 정상 상태 혈청 최저 농도 (2.0 ng/mL)가 유지된다. 　당업자는 예를 들면, ADME 및 환자-특이적 매개변수를 이용하여 원하는 정상 상태 최저 농도를 유지하는데 필요한 투여분량을 결정할 것이다.　
본 발명에서는 변형된 IL-10 물질을 만들기 위하여 상기 IL-10 물질이 최소한 한 가지 변형을 포함하는 방법을 고려하는데, 이때 변형은 상기 IL-10 물질의 아미노산 서열 변경은 아니다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 IL-10 물질은 PEG-IL-10 물질이다. PEG-IL-10 물질은 IL-10의 최소한 하나의 소단위에서 최소한 하나의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된 최소한 하나의 PEG 분자를 포함할 수 있거나, 또는 다른 구체예들에서는 단일-페길화된 그리고 이중-페길화된 IL-10의 혼합물을 포함할 수 있다. PEG-IL-10 물질에서 PEG 성분은 약 5kDa 이상, 약 10kDa 이상, 약 15kDa 이상, 약 20kDa 이상, 약 30kDa 이상, 약 40kDa 이상, 또는 약 50kDa 이상의 분자량을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 분자량은 약 5kDa 내지 약 10kDa, 약 5kDa 내지 약 15kDa, 약 5kDa 내지 약 20kDa, 약 10kDa 내지 약 15kDa, 약 10kDa 내지 약 20kDa, 약 10kDa 내지 약 25kDa, 또는 약 10kDa 내지 약 30kDa이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 IL-10 물질은 최소한 하나의 Fc 융합 분자, 최소한 하나의 혈청 알부민 (가령, HSA 또는 BSA), HSA 융합 분자 또는 알부민 콘쥬게이트(conjugate)를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 변형된 IL-10 물질은 당화되고, 헤실화되고, 또는 최소한 하나의 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 변형된 IL-10 물질들은 한 가지 이상 유형의 변형을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 변형은 부위-특이적이다. 일부 구체예들은 링커를 포함한다. 변형된 IL-10 물질들은 이하에서 상세하게 논의된다.
본 발명은 IL-10 물질을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 대상에게 도입시키는 것과 함께, 대상의 질환, 장애 또는 상태 (가령, 암-관련된 장애)를 치료 또는 예방하기 위하여 CAR-T 세포 요법의 사용을 또한 고려한다. 이의 직접적, 그리고 국소적 효과로 인하여, 표적 항원을 발현하는 정상 조직을 표적으로 하는 항원 특이적 독성 유도를 저해하는데 필요하고, 생명을 위협하는 사이토킨 방출 증후군을 야기하는 CAR-T 세포 치료의 극단적 효능으로 인하여, 이러한 세포로부터 분비되는 IL-10 물질의 양은 통상적인 방법(가령, 피하)에서 대상에게 투여되는 IL-10 물질의 양보다 훨씬 적다. 실제로, 전술한 효과를 달성하는데 필요한 분비된 IL-10 물질의 양은 혈청에서 검출되지 않을 수 있다.
이러한 일부 구체예들에서, 본 발명은 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하는 방법을 고려하는데, 이 방법은 a) 키메라 항원 수용체를 발현시키고, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하고, 이때 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸을 유도할 수 있고; 그리고 b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 양의 IL-10 물질을 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 상기 대상에게 도입시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 키메라 항원 수용체 및 상기 IL-10 물질은 동일한 벡터에 의해 발현되며, 한편 다른 구체예들에서는 상기 키메라 항원 수용체와 상기 IL-10 물질은 상이한 벡터들에 의해 발현된다. 특정 구체예들에서, 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된다. 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터다. 본 발명은 상기 IL-10 물질을 발현시키는 임의의 다른 수단의 이용 또한 고려한다. 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 물질의 발현은 발현 제어 요소에 의해 조절된다.
상기에서 설명된 구체예들에서, 다수의 세포는 상기 대상으로부터 구할 수 있고, 생체외에서 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구체예들에서, 다수의 세포는 혈장교환(aphaeretic) 공정에 의해 대상으로부터 획득된다. 본 발명의 다른 구체예들에서, 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포이며, 여전히 다른 구체예들에서, 다수의 세포는 자가 종양 세포다.
본 발명은 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하는 방법들을 고려하는데, 이 방법은 a) 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 제 1 다수의 세포, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하고, 그리고 상기 세포 집단에 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도될 수 있으며; 그리고 b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현하도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포를 상기 대상에게 도입시키는 것을 포함한다.
특정 구체예들에서, 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포는 상기 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된 CD8+ T 세포를 포함한다.
특정 구체예들에서, 제 1 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형되며, 한편 다른 구체예들에서, 제 2 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형된다. 본 발명에서 제 1 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 혈장교환(aphaeretic) 공정에 의해 상기 대상으로부터 획득되는 구체예들이 고려된다. 일부 구체예들에서, 제 1 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포이며, 제 2 다수의 세포는 순수 CD8+ T 세포이다. 여전히 다른 구체예들에서, 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 자가 종양 세포다.
전술한 각 구체예에서, 상기 표적 세포 집단은 종양 항원을 포함할 수 있다. Vigneron, N. et al. ((15 July 2013) Cancer Immunity 13:15)는 400개 이상의 양 항원 펩티드가 함유된 T 세포-한정된 인간 종양 항원 데이터베이스를 기술한다. 종양 항원의 예로는 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린(mesothelin), CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본 발명은 대상의 질환, 장애 또는 상태 (가령, 암-관련된 장애)를 치료 또는 예방하기 위하여, IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)의 투여, 또는 IL-10 물질을 발현시키는 벡터의 도입과 복합하여, CAR-T 세포 요법의 사용을 또한 고려한다.
특정 구체예는 암-관련된 질환, 장애 또는 상태 (가령, 종양)을 갖는 대상을 치료하는 방법들을 포함하는데, 이 방법은 a) 상기 대상에게 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 도입시키고, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하고, 이때 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸을 유도할 수 있고; 그리고 b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 IL-10 물질의 치료요법적 효과량을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, 치료되는 대상은 면역-관련된 질환, 장애 또는 상태 또는 본 명세서에서 설명된 또다른 질환, 장애 또는 상태를 갖는다.
본 발명의 특정 구체예들에서, 이러한 방법들은 대상의 암-관련된 질환, 장애 또는 상태의 예방을 위한 치료 프로토콜에 이용되며, 한편 다른 구체예들에서, 이러한 방법들은 면역-관련된 장애의 예방을 위한 치료 프로토콜에 이용된다. 상기 IL-10 물질들에 대한 투여 매개 변수 및 요법, 뿐만 아니라 이러한 물질의 예시적인 유형이 포함된 전술한 방법들의 추가 측면들이 본 발명의 도처에서 기술된다.
본 발명의 추가 구체예들은 암-관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상을 치료하는 방법들을 포함하는데, 이 방법은 a) 키메라 항원 수용체, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하고, 이때 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸을 유도할 수 있고; 그리고 b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 양의 IL-10 물질을 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 상기 대상에게 도입시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 키메라 항원 수용체 및 상기 IL-10 물질은 동일한 벡터에 의해 발현되며, 한편 다른 구체예들에서는 상기 키메라 항원 수용체와 상기 IL-10 물질은 상이한 벡터들에 의해 발현된다. 특정 구체예들에서, 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된다. 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터다. 본 발명은 상기 IL-10 물질을 발현시키는 임의의 다른 수단의 이용 또한 고려한다. 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 물질의 발현은 발현 제어 요소에 의해 조절된다.
상기에서 설명된 구체예들에서, 다수의 세포는 상기 대상으로부터 구할 수 있고, 생체외에서 유전적으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따라, 일부 구체예들에서, 다수의 세포는 혈장교환 공정에 의해 대상으로부터 획득된다. 특정 구체예들에서, 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포이며, 다른 구체예들에서, 다수의 세포는 자가 종양 세포다.
본 발명은 상기 대상에게 도입된 후 최소 1주 후, 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 상기 IL-10 물질을 발현시키는 방법들을 고려한다. 다른 특정 구체예들에서, 상기 대상에게 도입된 후, 최소한 2 주, 최소한 3 주, 최소한 1 개월, 최소한 2 개월, 최소한 3 개월, 최소한 4 개월, 최소한 5 개월, 최소한 6 개월, 최소한 7 개월, 최소한 8 개월, 최소한 9 개월, 또는 최소한 1년 또는 그 이상 후, 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 상기 IL-10 물질을 발현시키는 방법들을 고려한다.
본 발명의 추가 구체예들은 암-관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상을 치료하는 방법들을 고려하는데, 이 방법은 a) 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 제 1 다수의 세포, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하고, 그리고 상기 표적 세포 집단에 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도될 수 있으며; 그리고 b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현하도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포를 상기 대상에게 도입시키는 것을 포함한다. 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 상기 IL-10 물질을 발현시키는 시간의 길이 예시는 도처에서 기술된다.
특정 구체예들에서, 전술한 방법들은 대상에서 암- 또는 면역-관련된 질환, 장애 또는 상태가 포함된, 질환, 장애 또는 상태 예방을 위한 치료 프로토콜에 이용된다.
본 발명은 명세서 도처에서 설명된 기간 동안 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 상기 IL-10 물질을 발현시키는 방법들을 고려한다.
특정 구체예들에서, 상기 치료요법적으로 효과적인 제 1 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포는 상기 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된 CD8+ T 세포를 포함한다.
특정 구체예들에서, 제 1 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형되며, 한편 다른 구체예들에서, 제 2 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형된다. 본 발명에서 제 1 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 혈장교환(aphaeretic) 공정에 의해 상기 대상으로부터 획득되는 구체예들이 고려된다. 일부 구체예들에서, 제 1 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포이며, 제 2 다수의 세포는 순수 CD8+ T 세포이다. 여전히 다른 구체예들에서, 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 자가 종양 세포다.
전술한 각 구체예에서, 상기 표적 세포 집단은 종양 항원을 포함할 수 있고, 이들의 예시는 명세서 도처에서 기술된다.
본 발명은 본 명세서에서 기술된 IL-10 물질을 인코드하는 핵산 분자를 고려한다. 특정 구체예들에서, 핵산 분자는 IL-10 물질을 인코드하는 핵산 분자의 발현을 부여하는 발현 제어 요소에 작동가능하도록 연계된다. 일부 구체예들에서, 벡터 (가령, 플라스미드 또는 바이러스 벡터)는 핵산 분자를 포함한다. 상기 IL-10 물질을 발현하는 형질변환된 또는 숙주 세포 또한 본 발명에서 고려된다.
추가 구체예들에서, 본 발명은 CAR-T T 세포 기능을 강화시키는 방법들을 제공하는데, 이 방법은 a) CAR을 발현하도록 T 세포를 유전적으로 조작하고, 이에 따라 CAR-T T 세포가 만들어지며; 그리고 b) CAR-T T 세포에 의해 분비되는 최소한 하나의 사이토킨의 양을 감소시키는 물질 (가령, 작은 간섭 RNA (siRNA))로 CAR-T T 세포를 조정하는 것을 포함한다. 사이토킨의 예로는 종양 괴사 인자 패밀리 또는 형질 전환 성장 인자 베타 수퍼패밀리 (가령, TGF-β)의 구성원을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. TGF-β의 양 감소로 T 조절 세포의 증식이 감소되는 구체예들이 고려된다.
다른 구체예들은 본 개시 내용의 교시에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 PEG-rHuIL-10으로 처리 후, 29일 차에 PD-1 및 LAG3+ 말초 T 세포의 배수-증가를 도시한다.
도 2는 순수 CD8+ T 세포와 비교하였을 때, PEG-IL-10은 메모리 CD8+T 세포 (CD45RO+)에서 IFNγ 생산을 선호적으로 강화시킨다는 점을 나타낸다.
도 3은 PEG-IL-10이 CD8+T 세포 (CD45RO+)에서 활성화-유도된 세포 사멸을 제한시킬 수 있음을 나타낸다.
상세한 설명
본 명세서가 더 설명되기 전에, 본 명세서는 여기에서 설명된 특정 구체예들에 한정되지 않는다는 것이 이해해야 하고, 본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 제한하기 위한 의도는 없는 것으로 또한 이해한다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 상기 범위의 상한선과 하한선 사이에 하한선의 단위의 1/10까지 각 개재성 값, 그리고 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개재성 값은 본 발명의 범위 안에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 더욱 작은 범위의 상하선과 하한선은 더욱 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 그리고 또한, 본 발명의 범위 안에 포괄되고, 언급된 범위 내에 임의의 특정적으로 배제된 한계에 종속된다. 언급된 범위가 한계 중에서 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계의 한쪽 또는 양쪽을 배제하는 범위 역시 본 발명에서 포함된다. 달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 (＂a＂, ＂an＂ 및 ＂the＂)는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 청구항은 임의의 임의선택적 원소를 배제하도록 작성될 수 있는 것으로 더욱 이해된다. 따라서, 이러한 진술은 청구항 원소의 열거와 관련하여 ＂오로지＂, ＂단독으로＂ 등과 같은 배타적 용어의 이용, 또는 ＂부정적인＂ 제한의 이용에 대한 선행 기초로서 역할을 하는 것으로 의도된다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 오로지 그들의 개시 목적으로만 제공된다. 게다가, 제공된 공개의 일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있고, 이것은 독립적으로 확증될 필요가 있을 수 있다.
개요
CAR-T T 세포 요법은 예를 들면, 암-관련된 (가령, B 및 T 세포 림프종) 그리고 면역-관련된 악성종양의 치료를 위한 전망있는 치료 접근법이다. CAR-T T 세포는 예를 들어, 관심 종양에 존재하는 공지된 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체를 발현하도록 변형된 환자-유도 메모리 CD8+ T 세포를 일반적으로 포함한다. 본 발명은 일반적으로 암 치료를 위한 CAR-T 세포 요법의 사용과 관련하여 설명되지만, 이러한 요법은 또한 다른 징후들의 치료에 유용성이 있음이 밝혀졌다.
본 명세서에서 추가로 논의된 바와 같이, CAR-T 세포 요법이 특정 암 (가령, 비-B 세포 악성종양)의 치료에 이용되었을 때, 상당한 항원 부하(burden)를 갖는 고친화성 T 세포 수용체 상호 작용이 관찰되었고, 이는 활성화-유도된 세포 사멸을 초래할 수 있다. 비록 IL-10은 활성화-유도된 세포 사멸의 강화에 이미 연계되어 있지만, 본 발명에서 제시되는 데이터에 따르면 CD8+ T 세포 기능 및 생존을 향상시키면서, 활성화 유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하기 위하여 IL-10 물질을 CAR-T T 세포 요법과 함께 사용할 수도 있음을 암시한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 핵산 분자와 관련하여 ＂인간＂에 대한 임의의 언급은 폴리펩티드 또는 핵산이 수득되는 방식 또는 공급원에 대해 제한하려는 것이 아니며, 오히려 상기 서열은 자연 발생적 인간 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 서열에 상응할 수 있음을 주지해야 한다. 인간 폴리펩티드 및 이를 인코드하는 핵산 분자에 추가하여, 본 발명은 다른 종으로부터 IL-10-관련된 폴리펩티드 및 상응하는 핵산 분자를 고려한다.
정의
달리 명시되지 않는 한, 다음 용어는 아래에 설명된 의미를 갖는다. 다른 용어들은 명세서를 통하여 정의된다.
용어 ＂환자＂ 또는 ＂대상＂은 호환되며, 인간 또는 비-인간 동물 (가령, 포유류)를 지칭한다.
용어 ＂투여＂, ＂투여하다＂ 및 이와 유사한 것들은 예를 들면, 대상, 세포, 조직, 장기, 또는 생물학적 유체에 적용될 경우, 상기 대상, 세포, 장기, 또는 생물학적 유체에게 예를 들면, IL-10 또는 PEG-IL-10), 핵산 (가령, 고유 인간 IL-10를 인코드하는 핵산); 전술한 것들, 또는 진단 물질이 포함된 약학 조성물을 접촉시키는 것을 지칭한다. 세포 맥락에서, 투여는 이 세포에 시약의 접촉 (가령, 시험관내 또는 생체외), 뿐만 아니라 상기 유체가 세포에 접촉되는 경우, 유체에 시약의 접촉을 포함한다.
용어 ＂치료하다＂, ＂치료하는＂, ＂치료＂ 및 이와 유사한 것들은 대상에게 영향을 주는 질환, 장애, 또는 상태의 최소한 하나의 기저 원인, 또는 대상에게 영향을 주는 질환, 장애, 상태와 연관된 최소한 하나의 증후를 일시적으로 또는 영구적으로 제거, 감소, 억제, 완화 또는 개선시키기 위하여, 상기 질환, 장애 또는 상태, 또는 이의 증후군이 진단되고, 관찰되고, 그리고 이와 유사한 결과 이후 개시된 작용 과정(가령, IL-10 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 투여와 같은)을 지칭한다. 따라서, 치료는 활성 질환을 억제 (예를 들어, 질병, 장애 또는 상태의 발달 또는 추가 발달, 또는 이들과 연관된 임상 증상 연관성 억제)하는 것을 포함한다. 이 용어는 IL-10 또는 PEG-IL-10이 예를 들어, 액상 또는 콜로이드상에서 IL-10 수용체와 접촉하는 상황과 같은 다른 상황에서도 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 ＂치료가 필요한＂이란 용어는 당해 대상이 치료를 필요로 하거나, 또는 치료로 인하여 이익을 얻는다고 의사, 또는 다른 간병인이 내리는 판단을 의미한다. 이 판단은 의사 또는 간병인의 전문 지식의 영역에 있는 다양한 요소를 기반으로 한다.
용어 ＂예방하다＂, ＂예방하는＂, ＂예방＂ 및 이와 유사한 용어들은 예를 들어, 환자에게서 질병, 장애, 상태 또는 이와 유사한 것이 발달되 위험을 일시적으로 또는 영구적으로 예방, 억제, 억제 또는 감소시키기 위해(질환, 장애, 상태 또는 이의 증상이 개시되기 전), 또는 특정 질환, 장애 또는 상태를 갖는 것으로 진단된 대상에서 이의 개시를 지연시키기 위하여(예를 들면 임상적 증상의 부재로 결정됨), 작업 과정 (이를 테면, IL-10 또는 IL-10을 포함하는 약학 조성물의 투여)를 일반적으로 지칭한다. 특정 경우에, 상기 용어는 또한 질환, 장애 또는 상태가 유해한 또는 바람직하지 않은 상태로의 진행을 늦추거나 또는 그것의 진행을 억제하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 ＂예방이 필요한＂이란 용어는 당해 대상이 이를 필요로 하거나, 또는 예방적 관리로 인하여 이익을 얻는다고 의사, 또는 다른 간병인이 내리는 판단을 의미한다. 이 판단은 의사 또는 간병인의 전문 지식의 영역에 있는 다양한 요소를 기반으로 한다.
구절 ＂치료요법적 효과량＂이란 환자에게 단독으로 또는 약학 조성물의 일부로서, 그리고 단일 투여분량 또는 일련의 투여분량의 일부로서, 임의의 검출 가능한 질환, 장애 또는 상태의 증상, 양상 또는 특성에 대한 긍정적인 효과를 나타낼 수 있는 것을 지칭한다. 상기 치료요법적으로 효과량은 관련 생리적 효과를 측정함으로써 확인될 수 있고, 투여 요법 및 대상의 상태의 진단 분석 등과 관련하여 조정될 수 있다. 예를 들면, 투여 후에 생성되는 염증성 사이토킨 양의 측정은 치료요법적으로 효과량이 사용되었는지 여부를 나타낼 수 있다.
＂변화에 영향을 미치기에 충분한 양＂이라는 문구는 특정 요법의 투여 전 (예 : 기준 수준) 그리고 투여 후 측정된 지표의 수준간에 검출가능한 차이가 있음을 의미한다. 지표는 임의의 객관적 파라미터 (예를 들어, IL-10의 혈청 농도) 또는 주관적 파라미터 (예를 들어, 환자의 행복감)를 포함한다.
용어 ＂소분자＂는 약 10kDa 미만, 약 2kDa 미만, 또는 약 1kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물을 지칭한다. 소분자는 무기 분자, 유기 분자, 무기 성분을 함유하는 유기 분자, 방사성 원자를 포함하는 분자 및 합성 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료요법적으로, 소분자는 세포에 더 잘 침투할 수 있고, 분해에 덜 민감할 수 있으며, 큰 분자보다 면역 반응을 이끌어 내기가 쉽지 않다.
용어 ＂리간드＂는 예를 들어, 수용체의 항진제 또는 길항제로서 작용할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드, 막-연합된 또는 막-결합된 분자 또는 그의 복합체를 의미한다. ＂리간드＂는 천연 및 합성 리간드, 예컨대 사이토킨, 사이토킨 변이체, 유사체, 뮤테인 및 항체로부터 유도된 결합 조성물을 포함한다. ＂리간드＂는 또한 소분자, 예컨대 사이토킨의 펩티드 모방체 및 항체의 펩티드 모방체를 포함한다. 이 용어는 또한 항진제 또는 길항제가 아니지만, 그의 생물학적 성질, 예를 들어 신호 또는 부착에 크게 영향을 미치지 않으면서 수용체에 결합할 수 있는 물질을 포함한다. 더욱이, 이 용어는 예를 들어, 화학적 또는 재조합 방법에 의해 막 결합된 리간드의 가용성 형태로 변경된 막-결합된 리간드를 포함한다. 리간드 또는 수용체는 전적으로 세포 안에 존재하는데, 즉 세포질, 핵 또는 일부 다른 세포 내 구획에 존재할 수 있다. 리간드와 수용체의 복합체는 ＂리간드-수용체 복합체＂라고 불린다.
용어 ＂억제제＂ 및 ＂길항제＂, 또는 ＂활성화제＂ 및 ＂항진제＂는 예를 들어, 리간드, 수용체, 보조인자, 유전자, 세포, 조직, 또는 장기의 활성화를 차례로 억제, 또는 활성화시키는 분자를 각각 의미한다. 억제제는 예를 들어, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체 또는 세포를 감소, 차단, 방지, 활성화 지연, 비활성화, 감작화 또는 하향 조절하는 분자다. 활성제는 예를 들어, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체 또는 세포를 증가, 활성화, 촉진, 활성화 증진, 민감화 또는 상향 조절하는 분자다. 억제제는 또한 구성적 활성을 감소, 차단 또는 불활성화시키는 분자로서 정의될 수 있다. ＂항진제＂는 표적과 상호 작용하여 표적 활성화 증가를 유발하거나 촉진시키는 분자이다. ＂길항제＂는 항진제의 작용에 반대되는 분자이다. 길항제는 항진제의 활성을 예방, 감소, 억제 또는 중화시키고, 길항제는 또한 확인된 항진제가 없는 경우에도 표적 수용체와 같은 표적의 구성 활성을 예방, 억제 또는 감소시킬 수 있다.
＂조절하다＂, ＂조절＂ 및 이와 유사한 용어들은 IL-10 물질 (또는 이들을 코딩하는 핵산 분자)의 기능 또는 활성을 직접 또는 간접적으로 증가 또는 감소시키는 분자 (예를 들어, 활성화제 또는 억제제)의 능력을 지칭하거나; 또는 IL-10 물질과 동등한 효과를 생성하는 분자의 능력을 향상시키는 것을 지칭한다. ＂조절제(modulator)＂라는 용어는 상기 기술된 활동에 영향을 미칠 수 있는 분자를 광범위하게 의미한다. 예를 들면, 유전자, 수용체, 리간드 또는 세포의 조절제는 유전자, 수용체, 리간드 또는 세포의 활성을 변화시키는 분자이며, 이때 활성은 그의 조절성이 활성화되거나, 억제되거나 또는 변경될 수 있다. 조절제는 단독으로 작용할 수 있거나, 보조 인자, 예를 들어 단백질, 금속 이온 또는 작은 분자를 사용할 수 있다. ＂조절제(modulator)＂라는 용어는 IL-10과 동일한 작용 기전을 통해 작용하고, 그리고 IL-10에 필적하는 또는 이보다 더 크게 생물학적 반응을 유도할 수 있는 물질(즉, IL-10과 유사한 방식으로 IL-10과 동일한 신호 전달 경로를 조절하는 물질)을 포함한다.
조절제의 예로는 소분자 화합물 및 기타 생체 유기 분자가 있다. 소분자 화합물의 수많은 라이브러리 (예를 들어, 조합 라이브러리)는 상업적으로 이용 가능하며, 조절제를 동정하기 위한 출발점으로 작용할 수 있다. 당업자는 원하는 성질을 갖는 하나 또는 그 이상의 화합물을 동정하기 위하여 이러한 화합물 라이브러리를 스크리닝하고; 그 다음 해당 약물 화학자들은 이의 유사체 및 이의 유도체를 합성하고 평가함으로써, 이러한 하나 또는 그 이상의 화합물을 최적화시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 분석 (예를 들어, 생화학 적 또는 세포-기반 분석)을 개발할 수 있다. 합성 및/또는 분자 모델링 연구는 활성화제의 확인에도 활용될 수 있다.
분자의 ＂활성＂은 리간드 또는 수용체에 대한 분자의 결합; 촉매 활성; 유전자 발현 또는 세포 신호 전달, 분화 또는 성숙을 자극하는 능력; 항원 활성; 다른 분자의 활동의 조절; 그리고 기타 등등을 설명 또는 지칭할 수 있다. 이 용어는 또한 세포-세포 상호 작용 (예를 들어, 부착)을 조절하거나 유지하는 활성, 또는 세포의 구조 (예를 들어, 세포막)를 유지시키는 활성을 지칭할 수 있다. ＂활성＂은 또한 [촉매 활성]/[mg 단백질] 또는 [면역 학적 활성]/[mg 단백질], 생물학적 구획의 농도 등과 같은 특정 활성을 의미할 수도 있다. ＂증식 활성＂이란 용어는 정상적인 세포 분열 촉진 뿐만 아니라, 암, 종양, 이형성증, 세포 형질변환, 전이 및 혈관 신생과 특히 연관된 또는 필요적인 활성을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 ＂필적가능한＂, ＂유사한 활동＂, ＂유사한 활동＂, ＂필적하는 효과＂, ＂~와 필적가능한 효과＂등은 정량적 및/또는 정성적으로 볼 수 있는 상대적인 용어이다. 용어의 의미는 대개 사용되는 문맥에 따라 달라진다. 예를 들면, 수용체를 활성화시키는 두 가지 물질은 질적 관점에서 필적가능한 효과를 갖는 것으로 볼 수 있지만, 한 물질이 당분야에서 수용하는 분석(가령, 분량-반응 분석)에서 측정하였을 때, 또는 당분야에서 수용하는 동물 모델에서 다른 물질의 활성의 약 20 %의 활성만 달성할 수만 있다면, 두 약제는 양적인 관점에서 필적할만한 효과가 없다고 볼 수 있다. 한 결과를 다른 결과와 비교할 때 (가령, 참조 표준에 대한 한 결과), ＂필적가능한＂이란 대개 한 결과가 참조 표준으로부터 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만으로 벗어나는 것을 의미한다. 특정 구체예들에서, 하나의 결과가 참조 표준으로부터 15 % 미만, 10 % 미만 또는 5 % 미만으로 벗어나는 경우, 참조 표준과 필적가능하다라고 한다. 예를 들면, 활성 또는 효과는 효능, 안정성, 용해도 또는 면역 원성을 지칭할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
예를 들면, 세포, 조직, 기관, 또는 유기체의 ＂반응＂이란 가령, 농도, 밀도, 부착, 또는 생물학적 구획내에서 이동, 유전자의 발현비율, 또는 분화 상태에서의 생물학적 또는 생리학적 거동의 변화를 포괄하는데, 이때 상기 변화는 활성화, 자극, 또는 처리와 관련되거나, 또는 유전적 프로그래밍과 같은 내부 기전과 관련된다. 특정 내용에서, ＂활성화＂, ＂자극＂등과 같은 용어는 내부 메커니즘 뿐만 아니라 외부 메커니즘 또는 환경적 요인에 의해 조절되는 세포 활성화를 의미하고; 반면에 ＂억제＂, ＂하향 조절＂등과 같은 용어는 반대의 효과를 나타낸다.
본원에서 호환 이용되는 용어 ＂폴리펩티드,＂ ＂펩티드,＂ 그리고 ＂단백질＂은 임의의 길이의 아미노산의 중합성 형태를 지칭하는데, 이것은 유전적으로 코딩된 아미노산과 비유전적으로 코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 그리고 변형된 폴리펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 이종성 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질; 이종성과 상동성 리더 서열을 갖는 융합 단백질; N-말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않는 융합 단백질; 면역학적으로 태그된 단백질을 갖는 융합 단백질; 기타 등등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 융합 단백질을 포함한다.
본 개시 내용 전반에 걸쳐 단일 문자 또는 3 문자 코드에 따른 아미노산이 언급됨을 알 수 있다. 독자의 편의를 위해, 단일 및 3 문자 아미노산 코드가 아래에 제공된다.
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본원에 사용된 바와 같이, 용어 ＂변이체＂는 자연 발생 변이체 및 비-자연 발생 변이체를 포함한다. 자연 발생 변이체는 동족체 (하나의 종에서 다른 종으로 각각 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 상이한 폴리펩티드 및 핵산) 및 대립 유전자 변이체 (한 종 안에서 한 개체와 다른 개체간에 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 각각 상이한 폴리펩티드 및 핵산)를 포함한다. 비-자연 발생 변이체는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화를 각각 포함하는 폴리펩티드 및 핵산을 포함하며, 이때 서열의 변화는 인위적으로 도입되고 (예컨대, 뮤테인); 예를 들어, 상기 변화는 실험실에서 인간의 개입 (＂인간의 손＂)에 의해 만들어진다. 따라서, 본원에서 ＂뮤테인 (mutein)＂은 일반적으로 단일 또는 다중 아미노산 치환을 지니고, 종종 부위-지향된, 또는 무작위 돌연변이 유발을 겪는 클론된 유전자로부터, 또는 완전히 합성된 유전자로부터 대개 유도된 돌연변이된 재조합 단백질을 의미한다.
용어 ＂DNA＂, ＂핵산＂, ＂핵산 분자＂, ＂폴리뉴클레오티드＂ 및 이와 유사한 것들은 호환사용되며, 임의의 길이의, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 뉴클레오티드의 중합성 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예로는 선형 핵산 및 환형 핵산, 메신져 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA), 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 프로브, 프라이머 및 이와 유사한 것들을 포함한다.
폴리펩티드의 구조 관련 내용에서 이용될 경우, ＂N-말단＂(또는 ＂아미노 말단＂) 및 ＂C-말단＂(또는 ＂카르복실 말단＂)은 각각 폴리펩티드의 극단 아미노 및 카르복실 말단을 지칭하고, 한편 용어 ＂N-말단＂및 ＂C-말단＂은 N-말단 및 C-말단을 향하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 상대적인 위치를 각각 의미하며, 그리고 각각 N-말단 및 C-말단에 잔기를 포함할 수 있다. ＂바로 N-말단＂ 또는 ＂바로 C-말단＂은 제 2 아미노산 잔기에 대한 제 1 아미노산 잔기의 위치를 나타내며, 이때 제 1 및 제 2 아미노산 잔기는 공유적으로 결합되어, 연속된 아미노산 서열이 제시된다.
아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, IL-10 폴리펩티드로부터 ＂유도된＂ 아미노산 서열)의 맥락에서 ＂~로부터 유도된＂이란 상기 폴리펩티드 또는 핵산이 참조 폴리펩티드 또는 핵산 (가령, 자연 발생 IL-10 폴리펩티드 또는 IL-10-인코딩 핵산)에 기반을 둔 서열을 보유한다는 것을 나타내며, 단백질 또는 핵산이 만들어지는 원천 또는 방법에 제한을 둔다는 의미는 아니다. 예를 들면, 용어 ＂~로부터 유도된(derived from)＂에는 참조 아미노산 또는 DNA 서열의 동족체 또는 변이체가 포함된다.
폴리펩티드의 문맥에서, ＂단리된 (isolated)＂이라는 용어는 자연 발생적으로 발생하는 경우, 자연 발생적인 환경과 상이한 환경에 있는 관심 폴리펩티드를 의미한다. ＂단리된＂이란 관심 폴리펩티드가 실질적으로 풍부하고 및/또는 관심 폴리펩티드가 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 시료 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 폴리펩티드가 자연 발생적이지 않은 경우, ＂단리된＂이란 폴리펩티드가 합성 또는 재조합 수단에 의해 제조된 환경으로부터 분리되었음을 나타낸다.
＂농축된(enriched)＂이란 시료가 비-자연적으로 조작되어 (가령, 과학자에 의해), 관심 폴리펩티드가 a) 출발 시료, 가령, 생물학적 시료(가령, 이 폴리펩티드가 자연 발생된 시료, 또는 투여 후에 존재하는) 안에 이 폴리펩티드의 농도보다 훨씬 높은 농도 (가령, 최소한 3-배 이상, 최소한 4-배 이상, 최소한 8-배 이상, 최소한 64-배 이상, 또는 그 이상)이거나, 또는 b) 이 폴리펩티드가 만들어진 환경(가령, 세균 세포 안)에서 농도를 의미한다.
＂실질적으로 순수한(substantially pure)＂이란 성분 (가령, 폴리펩티드)이 조성물의 총 함량의 약 50 % 이상, 전형적으로 총 폴리펩티드 함량의 약 60 % 이상으로 구성됨을 나타낸다. 좀더 일반적으로, ＂실질적으로 순수한＂이란 전체 조성물에서 최소한 75%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 그 이상이 관심 성분인, 조성물을 지칭한다. 일부 경우, 이 폴리펩티드는 조성물의 총 함량의 약 90 % 초과, 또는 약 95 % 초과를 구성할 것이다.
리간드/수용체, 항체/항원, 또는 기타 결합 쌍에서 언급될 때, ＂특이적으로 결합하다＂, 또는 ＂선택적으로 결합하다＂라는 의미는 단백질과 다른 생물학적 물질로된 이종 집단에서 이 단백질의 존재를 결정짓는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 특정 조건 하에서, 명시된 리간드는 특정 수용체에 결합하고, 시료 안에 존재하는 다른 단백질에 유의적인 양으로 결합하지 않는다. 고려된 방법에서 항체, 또는 이 항체의 항원-결합 부위로부터 유도된 결합 조성물은 임의의 다른 항체, 또는 이로부터 유도된 결합 조성물의 친화력과 비교하여 최소한 2-배 이상, 최소한 10-배 이상, 최소한 20-배 이상, 또는 최소한 100-배 이상의 친화력으로 이 항원, 또는 이의 변이체 또는 이의 뮤테인에 결합한다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 가령, Scatchard 분석 (Munsen, et al. 1980 Analyt. Biochem. 107:220-239)에 의해 측정하였을 때, 약 109 리터/mol의 친화력을 가질 것이다.
IL-10 및 PEG-IL-10
항-염증 사이토킨 IL-10은 또한 인간 사이토킨 합성 억제 인자 (CSIF)로도 공지되어 있으며, 유형(클래스)-2 사이토킨으로 분류되며, 여기에는 IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 (Mda-7), 및 IL-26, 인터페론 (IFN-α, -β, -γ, -δ, -ε, -κ, -Ω, 및 -τ) 그리고 인터페론-유사 분자 (리미틴, IL-28A, IL-28B, 및 IL-29)가 포함된 사이토킨 세트이다.
IL-10은 면역 조절 및 염증에서 다표현적 효과를 갖는 사이토킨이다. 이것은 비만 세포에 의해 만들어지며, 이들 세포가 알레르기 반응 부위에서 갖는 염증 효과에 대응한다. IFN-γ, IL-2, IL-3, TNFα 및 GM-CSF와 같은 사전-염증 사이토킨의 합성을 억제할 수 있지만, IL-10은 특정 T 세포 및 비만 세포를 지향하여, B 세포 성숙, 증식 및 항체 생산을 촉진한다. IL-10은 NF-κB 활성을 차단시킬 수 있고, JAK-STAT 신호전달 경로의 제어에 관여한다. 이것은 또한 CD8+ T-세포의 세포독성 활성과 B-세포의 항체 생산을 유도하고, 대식세포 활성과 종양-촉진 염증을 억제한다. CD8+ T-세포의 조절은 분량-의존적이며, 이때 투여분량이 높을 수록 더 강한 세포독성 반응을 유도한다.
인간 IL-10은 동종이량체로써, 분자량은 37kDa이며, 이때 18.5kDa의 각 단량체는 178개의 아미노산을 포함하고, 이중 처음 18개는 신호 펩티드를 포함하고, 그리고 2개의 분자내 이황화결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 상기 IL-10 이량체는 두 단량체 소단위 사이의 비-공유 상호 작용이 파괴될 때, 생물학적으로 비활성이 된다.
본 발명은 인간 IL-10 (NP_000563) 및 80% 상동성을 나타내는 뮤린 IL-10 (NP_034678)및 이의 용도를 고려한다. 또한, 본 발명의 범위는 다른 포유류 종의 IL-10 오르소로그(orthologs), 및 이의 변형된 형태를 포함하는데, 렛트 (수탁 NP_036986.2; GI 148747382); 소 (수탁 NP_776513.1; GI 41386772); 양 (수탁 NP_001009327.1; GI 57164347); 개 (수탁 ABY86619.1; GI 166244598); 및 토끼 (수탁 AAC23839.1; GI 3242896)를 포함한다.
상기에서 암시된 바와 같이, 용어 ＂IL-10＂, ＂IL-10 폴리펩티드(들), ＂IL-10 분자(들)＂, ＂IL-10 물질(들)＂ 및 이와 유사한 용어들은 예를 들면, 동족체, 변이체 (뮤테인 포함), 이의 단편들, 뿐만 아니라, 예를 들면, 리더 서열 (가령, 신호 펩티드)을 갖는 IL-10 폴리펩티드가 포함된 인간 및 비-인간 IL-10-관련된 폴리펩티드, 그리고 전술한 것들의 변형된 형태를 광범위하게 포함하는 것으로 의도된다. 추가 특정 구체예들에 있어서, IL-10, IL-10 폴리펩티드(들), 그리고 IL-10 물질(들)은 항진제다.
상기 IL-10 수용체, 유형 II 사이토킨 수용체는 알파 및 베타 소단위(이들은 차례로 각각 R1 및 R2로도 불림)로 구성된다. 수용체 활성화는 알파 및 베타 모두에 결합을 필요로 한다. IL-10 폴리펩티드의 한 개 동종이량체는 알파에 결합하고, 동일한 IL-10 폴리펩티드의 또다른 동종이량체는 베타에 결합한다.
재조합 인간 IL-10의 유용성은 혈류에서의 신장 청소, 단백질 분해 및 단량체화로 인한 비교적 짧은 혈청 반감기에 의해 빈번하게 제한된다. 결과적으로, 이량체 구조를 파괴하지 않고, IL-10의 약동학적 프로파일을 개선하여, 그 활성에 악영향을 미치지 않는 다양한 접근법이 연구되었다. IL-10의 페길화는 특정 약동학적 매개변수 (가령, 혈청 반감기)의 개선 및/또는 활성의 강화를 야기한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂페길화된 IL-10＂ 및 ＂PEG-IL-10＂ 용어는 상기 IL-10 단백질의 최소한 하나의 아미노산 잔기에 일반적으로 링커를 통하여 공유적으로 부착된 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 보유하는 IL-10 분자를 지칭하며, 상기 링커를 통한 부착은 안정적이다. 용어 ＂단일페길화된 IL-10＂ 및 ＂단일-PEG-IL-10＂은 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자가 상기 IL-10 이량체의 하나의 소단위 상에 단일 아미노산 잔기에 일반적으로 링커를 통하여 공유적으로 부착된다는 것을 나타낸다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂이중페길화된 IL-10＂ 및 ＂(di)-PEG-IL-10＂는 최소한 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자가 상기 IL-10 이량체의 각 소단위 상에 단일 아미노산 잔기에 일반적으로 링커를 통하여 공유적으로 부착된다는 것을 나타낸다.
특정 구체예들에서, 본 발명에 이용된 PEG-IL-10은 1 내지 9개 PEG 분자가 상기 IL-10 이량체의 하나의 소단위의 N-말단에 있는 아미노산 잔기의 알파 아미노기에 링커를 통하여 공유적으로 부착된 단일-PEG-IL-10인 것을 나타낸다. IL-10 하나의 소단위에서 단일페길화는 일반적으로 소단위 셔플링(shuffling)으로 인하여, 페길화안된, 단일페길화된 그리고 이중페길화된 IL-10의 비-균질성 혼합물이 일반적으로 초래된다. 더욱이, 페길화 반응이 완료되기 까지 일반적으로 비-특이적 그리고 다수의-페길화된 IL-10이 초래되고, 따라서 이의 생물활성이 감소된다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예들은 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생성된 단일- 및 이중-페길화된 IL-10의 혼합물 투여를 포함한다.
특정 구체예들에서, PEG 모이어티의 평균 분자량은 약 5kDa 내지 약 50kDa이다. IL-10에 PEG 부착 부위 또는 방법은 결정적인 것은 아니지만, 특정 구체예들에서, 페길화에 의해 상기 IL-10 물질의 활성이 변경되지 않거나, 또는 최소한으로 변경된다. 특정 구체예들에서, 반감기에서 증가는 생물학적 활성의 임의 감소다. PEG-IL-10의 생물학적 활성은 U.S. 특허 7,052,686에서 기술된 바와 같이, 박테리아 항원 (리포폴리사카라이드 (LPS))의 공격을 받고, PEG-IL-10으로 치료받은 대상의 혈청내 염증 사이토킨 (가령, TNF-α 또는 IFN-γ)의 수준을 측정함으로써 일반적으로 평가된다.
IL-10 변이체는 혈청 반감기를 증가시키고, IL-10에 대항하는 면역 반응을 감소시키고, 정제 또는 제조를 촉진시키고, IL-10의 단량체 소단위으로의 전환을 감소시키고, 치료요법적 효과를 개선시키고, 그리고 치료목적으로 사용하는 동안 부작용의 심각성 또는 발생을 경감시키는 것을 포함하는 다양한 목적을 염두에 두고 준비할 수 있다. 아미노산 서열 변이체들은 일부는 해독 후 변이체, 예를 들어, 당화된 변이체일 수 있지만, 대개 자연에서 발견되지 않는 미리 결정된 변이체이다. IL-10의 임의의 변이체들은 만일 이들이 적절한 수준의 IL-10 활성을 보유한다면 사용될 수 있다.
＂보존적 아미노산 치환＂이란 구절은 단백질 안에 있는 아미노산을 유사한 산도, 염기도, 전하, 극성 또는 크기의 측쇄를 갖는 아미노산으로 대체함으로써, 단백질의 활성이 보존되는 치환을 말한다. 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 다음의 집단 내에 아미노산 잔기의 치환을 포함한다: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; 및 6) D, E. 치환, 삽입 또는 결실에 대한 지침은 상이한 종의 상이한 단백질 또는 단백질의 아미노산 서열의 정렬에 기초할 수 있다. 따라서, 임의의 자연-발생적 IL-10 폴리펩티드에 추가하여, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개를 갖는, 통상적으로 20개, 10개, 또는 5개를 넘지않는 아미노산 치환을 보유하는 것을 고려하며, 여기에서 상기 치환은 항상 보존적 아미노산 치환이다.
본 발명은 성숙한 IL-10으로 부터 유도된 연속 아미노산 잔기를 함유하는 성숙한 IL-10의 활성 단편(가령, 하위서열)을 고려한다. 펩티드 또는 폴리펩티드 하위서열의 연속 아미노산 잔기의 길이는 이 하위서열이 유도된 특이적 자연-발생적 아미노산 서열에 따라 다양하다. 일반적으로, 펩티드 및 폴리펩티드는 약 20개 아미노산 ~ 약 40개 아미노산, 약 40개 아미노산 ~ 약 60개 아미노산, 약 60개 아미노산 ~ 약 80개 아미노산, 약 80개 아미노산 ~ 약 100개 아미노산, 약 100개 아미노산 ~ 약 120개 아미노산, 약 120개 아미노산 ~ 약 140개 아미노산, 약 140개 아미노산 ~ 약 150개 아미노산, 약 150개 아미노산 ~ 약 155개 아미노산, 약 155개 아미노산에서 최대 전장의 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다.
추가적으로, IL-10 폴리펩티드는 특정된 길이의 인접 아미노산에 대해 기준 서열과 비교하여, 특정된 서열 동일성을 가질 수 있다(가령, ＂비교 창(comparison window)＂). 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 가령, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 로컬 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat＇l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법 조사, 이들 알고리즘의 자동화 시행 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Madison, Wis.), 또는 수작업 정렬 및 시각적 조사(가령, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)참고)에 의해 실행될 수 있다.
예를 들면, 적합한 IL-10 폴리펩티드는 약 20개 아미노산 ~ 약 40개 아미노산, 약 40개 아미노산 ~ 약 60개 아미노산, 약 60개 아미노산 ~ 약 80개 아미노산, 약 80개 아미노산 ~ 약 100개 아미노산, 약 100개 아미노산 ~ 약 120개 아미노산, 약 120개 아미노산 ~ 약 140개 아미노산, 약 140개 아미노산 ~ 약 150개 아미노산, 약 150개 아미노산 ~ 약 155개 아미노산, 약 155개 아미노산에서 최대 전장의 펩티드 또는 폴리펩티드의 연속 띠에 대하여 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하기에서 추가 논의되는 바와 같이, 상기 IL-10 폴리펩티드는 천연 공급원(가령, 이의 자연-발생적 환경이외의 환경)으로부터 단리될 수 있고, 또한 재조합에 의해 만들어질 수 있고 (가령, 유전적으로 변형된 숙주 세포, 이를 테면 박테리아, 효모, 피치아(pichia), 곤충 세포, 및 이와 유사한 것들에서), 이때 상기 유전적으로 변형된 숙주 세포는 이 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 변형된다. 상기 IL-10 폴리펩티드는 또한 합성에 의해 만들어질 수 있다(가령, 무(free)-세포 화학적 합성).
IL-10 물질을 인코드하는 핵산 분자 및 이들의 자연 발생 및 비-자연 발생 아이소폼, 대립형질 변이체 및 스플라이스(splice) 변이체들을 포함하는 것들도 본 발명에서 고려된다. 본 발명은 자연-발생적 DNA 서열과는 하나 또는 그 이상의 염기가 가변적이지만, 유전자 코드의 축중성으로 인하여 IL-10 폴리펩티드에 대응하는 아미노산 서열로 여전히 해독되는 핵산 서열들을 또한 포괄한다.
키메라 항원 수용체 T 세포
키메라 항원 수용체 T 세포 (CARs; 인공적인 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 및 키메라 면역수용체로도 공지됨)는 암 (가령, B 및 T 세포 림프종 치료)과 다른 악성종양에 대한 새로 출현된 치료법을 대표한다. CAR-T T 세포는 예를 들어, 관심 종양에 존재하는 공지된 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체를 발현하도록 변형된 환자-유도 메모리 CD8+ T 세포를 일반적으로 포함한다. 본 발명에서 고려되는 다른 유형의 T 세포는 순수 T 세포, 중추 메모리 T 세포, 작동체(effector) 메모리 T 세포 또는 이의 조합을 포함한다. 본 발명은 일반적으로 암 치료를 위해 CAR-T 세포 요법을 사용하는 환경에서 설명되지만, 이러한 요법에 국한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
CAR-T T 세포 요법은 입양 세포 전달 (ACT)의 사용을 포함한다. 환자 고유의 배양된 T 세포를 이용하는 ACT는 환자-특이적 암 요법으로 전망을 보여주었다 (Snook and Waldman (2013) Discov Med 15(81):120-25). 특정된 특이성의 항원 표적 수용체를 T 세포 안으로 도입하기 위한 유전 공학 접근법의 사용은 ACT의 잠재 능력을 크게 확장시켰다. 대부분의 경우, 이러한 조작된 키메라 항원 수용체는 단일 클론 항체의 특이성을 T 세포로 이식하는데 사용된다.
CAR-T 세포 요법의 시작은 환자로부터 T 세포를 제거하는 것을 포함한다. 그 다음, 이 T 세포는 공지의 암 (가령, 종양)에 특이적인 항원을 지향하는 CARs들을 발현시키도록 유전적으로 조작된다. 생체외(ex vivo)에서 충분한 수로 증폭시킨 후, 자가 세포는 환자에게 다시 주입되고, 항원 특이적으로 암이 파괴된다.
CARs는 세포외 종양-결합 모이어티, 가장 일반적으로 단일 클론 항체의 단일-사슬 가변 단편 (scFv)에 일반적으로 융합된 세포내 T 세포 신호전달 영역으로 구성된 항원 표적 수용체의 일종이다. CARs는 MHC-매개된 현시와 독립적으로, 세포 표면 항원을 직접 인식하고, 이점은 모든 환자에서 임의의 주어진 항원에 특이적인 단일 수용체 구조물의 사용을 허용한다.
키메라 항원 수용체는 일반적으로 몇 가지 주요 성분들을 포함하는데, 이중 일부는 하기에 기재되어 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂항원-특이적 표적화 영역＂ (ASTR)이란 CAR를 특이적 항원으로 지향시키는 영역을 지칭한다. CAR 상의 상기 표적화 영역들은 세포외에 있다. 본 발명의 특정 구체예들에서, CARs는 최소한 2개의 상이한 항원을 표적으로 하는 최소한 2개의 표적화 영역을 포함한다. 추가 특정 구체예들에 있어서, CARs는 최소한 3개 또는 그 이상의 상이한 항원을 표적으로 하는 최소한 3개 또는 그 이상의 표적화 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-특이적 표적화 영역은 항체 또는 이의 기능적 등가물 또는 이의 단편 또는 그 유도체를 포함하고, 표적 부위 각각은 상이한 항원을 표적으로 한다. 상기 표적화 영역은 전장 중쇄, Fab 단편, 단일 쇄 Fv (scFv) 단편, 2가 단일 쇄 항체 또는 디아바디(diabodies)를 포함할 수 있고, 이들 각각은 상기 표적 항원에 특이적이다. 본 발명의 특정 측면들에서, 상기 표적화 영역은 연계된 사이토킨, 자연 발생 수용체의 리간드 결합 도메인, 면역 반응을 신속하게 하기 위한 수용체, 펩티드, 아피바디(affibodies) 및 백신에 대한 가용성 단백질-펩티드 리간드를 포함할 수 있다. 당업자는 항원-특이적 표적화 영역으로 사용될 수 있는 다른 분자를 알고 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂세포외 공간 도메인(ESD)＂은 항원-특이적 표적화 영역과 막 횡단 도메인 사이의 친수성 영역을 지칭한다. 본 발명에서는 CARs는 ESD를 포함하는데, 이의 예로는 Fc Ab 단편들, 또는 이의 단편들 또는 이의 유도체들; 항체들의 힌지 영역들 또는 이의 단편들 또는 이의 유도체들; 항체들의 CH2 또는 CH3 영역; Gly3 또는 IgGs (이를 테면, 인간 IgG4)의 CH1 및 CH3 도메인 포함하는 인공적인 스페이서 서열; 또는 전술한 것들의 조합이 포함되는 구체예들이 고려된다. 당업자는 본 명세서에서 고려되는 다른 ESD를 알고 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂막경유 도메인 (TMD)＂은 혈장 막을 가로 지르는 CAR의 영역을 의미한다. 일부 구체예들에서, 상기 막경유 영역은 막경유 단백질 (가령, 유형 I 막경유 단백질), 인공적인 소수성 서열, 또는 이의 조합이다. 당업자는 본 개시 내용의 교시와 관련하여 사용될 수 있는 다른 막 횡단 도메인을 알고 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂세포내 신호전달 도메인 (ISD)＂ 및 ＂세포질 도메인＂은 작동체 기능 신호를 변환시키고, 이의 특화된 기능을 수행하도록 세포에게 지시하는 CAR의 부분을 지칭한다. ISDs의 예로는 T-세포 수용체 복합체 또는 이의 임의의 동족체의 제타 쇄 (가령, 에타. 쇄, FcεR1γ 쇄 및 β 쇄, MB1 (Igα) 쇄, B29 (Igβ) 쇄, 등등), 인간 CD3 제타 쇄, CD3 폴리펩티드 (δ, Δ 및 ε), syk 패밀리 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70, 등등.), src 패밀리 티로신 키나제 (Lck, Fyn, Lyn, 등등.) 및 T-세포 변환에 관련된 기타 분자들, 이를 테면, CD2, CD5와 CD28이 포함된다. 당업자는 본 개시의 교시와 관련하여 사용될 수 있는 다른 ISD를 알고있다.
＂공동-자극 도메인(CSD)＂은 메모리 세포의 증식, 생존 또는 발달을 향상시키는 CAR 부분을 지칭한다. 본 명세서의 다른 부분에 명시된 바와 같이, 본 발명의 CARs은 하나 또는 그 이상의 공동-자극 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예들에서, CSD는 TNFR 슈퍼패밀리, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이의 조합들의 하나 또는 그 이상의 구성원을 포함한다. 당업자는 본 개시 내용의 교시와 관련하여 사용될 수 있는 다른 공동-자극 도메인을 알고 있다.
본 발명에서 기술된 CAR-T T 세포 기술과 관련하여 사용되는 용어 ＂링커＂, ＂링커 도메인＂ 및 ＂링커 영역＂이란 약 1개 내지 100개의 아미노산으로된 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 말하며, 본 명세서의 임의의 CAR 도메인/영역을 함께 연계시킨다. 링커는 글리신 및 세린과 같은 유연성 잔기로 구성될 수 있어서, 인접 단백질 도메인은 서로 상대적으로 자유롭게 움직인다. 특정 구체예들은 2 개의 인접한 도메인이 입체적으로 서로 간섭하지 않도록 하는 것이 바람직한 경우, 길이가 더 긴 링커의 사용을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 링커는 절단불가능하며, 다른 구체예들에서, 링커는 절단가능하다 (가령, 2A 링커 (예를 들면 T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능적 등가체, 및 전술한 것들의 조합). 상기 링커에 피코르나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스 CHYSEL 서열 (P2A), 토세아 아시나 바이러스(Thosea asigna virus) (T2A), 또는 이의 조합, 변이체 및 기능적 등가체가 포함되는 본 발명의 구체예들이 고려된다. 추가 구체예들에서, 상기 링커 서열은 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-pro(2B) 모티프를 포함하며, 2A 글리신과 2B 프롤린 사이에 절단가능하다. 다른 링커는 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 개시 내용과 함께 사용하도록 고려된다.
CAR-T T 세포 요법의 상대적으로 급속한 발전이 있었다 (일반적으로, US 특허 공개 출원 번호 20150038684 참고). 1 세대 CARs는 T-세포 수용체 (TCR) 복합체의 CD3ξ 활성화 쇄에 항원-인지 도메인의 융합에 관계하였다. 이들 1 세대 CARs는 시험관내에서 T-세포 작동체 기능을 유도하였지만, 이들의 생체내 효과는 항종양 효능이 낮기 때문에 크게 제한되었다. CAR 기술의 진화로 제 2 세대 CARs이 탄생되었고, 여기에는 CD28의 세포외 도메인들 또는 TNF 수용체 패밀리 분자 변이체, 이를 테면, 4-1BB (CD137) 및 OX40 (CD134)의 예들이 포함된, 하나의 CSD와 협력된 CD3ξ 활성화 쇄를 포함한다. 제 3 세대 CARs이 개발되었고, 이때 CD3ξ 활성화 쇄에 추가하여 2개의 공동-자극 신호가 포함되는데, CSDs는 대부분 CD28 및 4-1BB의 것이다. 제 2 세대와 제 3 세대 CARs는 항종양 효과를 극적으로 개선시켰다. 그러나, 공동자극 분자의 특정 조합이 다른 조합들보다 유리한 지 여부는 전적으로 명확하지는 않다. 더욱이, 진정한 종양-특이적 항원-표적이 결여된 것과 함께, 제 2 세대 및 제 3 세대 CARs의 증가된 효능은 또한 심각한 독성 위험 또한 증가시켰다. (가령, Carpenito et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-65; Grupp et al. (2013) N Engl J Med 368(16):1509-18 참고).
활성화-유도된 세포 사멸
특이적 표적 항원을 지향하는 유전적으로-변형된 T 세포의 주입은 몇 가지 잠재적 장점을 갖는데, 장기적 질환 제어, 세포 독성 화학 요법, 또는 표적 치료법이 같은 유사한 신속한 작용 개시, 그리고 T 세포 레퍼토리의 면역 내성 및 MHC 제한의 우회가 포함된다. 그러나, CAR-T 세포 요법을 사용한 특정 암 (가령, 비-B 세포 악성종양)의 치료는 부분적으로 표적-항원을 발현시키는 정상 조직으로 표적으로 하는 항원-특이적 독성의 유도와 때로, 생명을 위협하는 사이토킨-방출 증후군을 야기하는 CAR-T 세포 치료의 극단적 가능에 의해 부분적으로 제한되어 왔었다(Magee (Nov. 2014) Discov Med 18(100):265-71). 특히, 상당한 항원 부하를 갖는 고친화성 T 세포 수용체 상호 작용은 활성화-유도된 세포 사멸로 이어질 수 있다는 것이 관찰되었다(Song et al. (2012) Blood 119(3):696-706; Hombach et al (2013) Mol Ther 21(12):2268-77).
활성화-유도된 세포 사멸 (AICD), Fas 수용체 (가령, Fas, CD95)와 Fas 리간드 (가령, FasL, CD95 리간드)의 상호작용으로 인한 예정된 세포 사멸은 말초 면역 내성 유지를 지원한다. AICD 작동체 세포는 FasL을 발현시키고, 이 Fas 수용체를 발현시키는 세포 안에서 세포자멸(apoptosis)이 유도된다. 활성화-유도된 세포 사멸은 T 세포 수용체의 반복된 자극으로 인해 활성화된 T 림프구의 음성적 조절자다. 이 과정의 변경은 자가 면역 질환을 유발할 수 있다. (Zhang J, et al. (2004) Cell Mol Immunol. 1(3):186-92).
기전적으로, Fas 리간드가 Fas 수용체에 결합하면 Fas 수용체의 삼량체화가 촉발되고, 이의 세포질 도메인은 그 다음 어뎁터 단백질 FADD (사멸 도메인을 갖는 Fas-연합 단백질)의 사멸 도메인에 결합할 수 있다. 프로카스파제 8은 FADD의 사멸 작동체 도메인에 결합하고, 카스파제 8을 단백질분해적으로 자가-활성화시키고; Fas, FADD, 및 프로카스파제 8은 함께 사멸-유도 신호전달 복합체를 만든다. 활성화된 카스파제 8은 시토졸로 방출되고, 여기에서 세포자멸을 시작하는 카스파제 연계 단계를 활성화시킨다 (Nagata S. (1997) Cell. 88(3):355-65s.
활성화에 의해 유발된 증식과 작동체 세포의 사멸 간의 균형은 T 세포의 항상성 확장에서 중요한 포인트이다. 휴지(resting) T 세포는 세포자멸에 민감하지만, 사이토킨 (가령, IL-2, IL-4, IL-7 및 IL-12) 존재하에서 TCR/CD3을 통한 T 세포의 자극으로 클론 확장된다. 흥미로운 것은, T 세포의 항상성에 있어서 이들 분자의 역할은 때때로 역행적이라는 점이다. 예를 들면, IL-2는 CD4+ T 세포의 증식과 생존에 필수적이지만, 활성화-유도된 세포 사멸을 위한 전제 조건이기도 하다. 더욱이, IL-18은 활성화된 CD8+ T 세포의 팽창과 생존을 촉진하는 것으로 나타났다. IL-18은 자극에 노출된 후, 특정 기능을 가진 CD8+ T 세포 집단의 크기를 조절함으로써, 면역/염증 반응에 영향을 줄 수 있다. 활성화된 T 세포의 증식 및 활성화-유도된 세포 사멸의 조절은 면역/염증 반응과 밀접하게 관련되어 있다(Li, W., et al. (July 2007) J Leukocyte Bio 82(1):142-51).
CAR-T T 세포 요법에서 IL-10의 효과
IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)의 특징은 본 명세서 도처에서 기술된다. 항-염증 및 면역억제 분자로써, IL-10은 항원 현시, CD4+ T 세포 기능, CD8+ T 세포 병인균-특이적 기능 (Biswas et al. (2007) J Immunol 179(7):4520-28), 바이러스 에피토프-특이적 CD8+ T 세포 IFNγ 반응 (Liu et al. (2003) J Immunol 171(9):4765-72), 및 항-LCMV (림프구성 맥락수막염바이러스) CD8+ T 세포 반응 (Brooks et al. (2008) PNAS USA 105(51):20428-433)을 억제한다.
IL-10은 활성화-유도된 세포 사멸의 강화 내용에서 논의되며 (Georgescu et al. (1997) J Clin Invest 100(10):2622-33), 본 명세서에서 제시되는 시험관내 그리고 생체내 데이터에서 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)은 CAR-T T 세포 요법과 복합되어, CD8+ T 세포 기능 및 생존을 강화시키는 한편, 활성화-유도된 세포 사멸을 억제 또는 제한시킬 수 있다.
예를 들면, 실험 단락의 실시예 1에서 제시되는 발현에서 PEG-IL-10 투여는 CD8+ T 세포 면역 활성화를 매개하였다는 것이 제시된다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이, PEG-rHuIL-10으로 치료하기 전과 후, 종양 환자에서 PD-1- 및 LAG3- 발현시키는 CD8+ T 세포의 수를 비교하였다(실시예 1 참고). PD-1과 LAG3은 모두 CD8+ T 세포 활성화와 세포독성 기능의 표지다. PD-1을 발현시키는 말초 CD8+ T 세포의 수는 ~2-배 증가되었고, LAG3을 발현시키는 말초 CD8+ T 세포의 수는 ~4-배 증가되었다. 전체적으로, 이들 데이터에서 PEG-IL-10 투여는 CD8+ T 세포 면역 활성화를 중재한다는 것을 나타낸다.
PEG-IL-10를 투여하면 활성화된 메모리 CD8+ T 세포의 기능이 강화된다는 것이 또한 관찰되었다 (실시예 2 참고). 메모리 T 세포 (항원-경험한 T 세포로도 불림)는 기존 감염, 암에 노출 및 백신접종을 이미 경험하고, 기존 감염, 암에 노출 또는 기존 백신접종 동안 이들의 동적 항원에 반응한 T 림프구의 하위집단 (가령, 헬퍼 T 세포 (CD4+) 및 세포독성 T 세포 (CD8+))이다. 대조적으로, 순수 T 세포는 주변 안에서 이들의 동족 항원과 마주치지 않았고, 이들은 활성화 표지 CD25, CD44 또는 CD69 부재, 그리고 메모리 CD45RO 아이소폼(isoform)의 부재를 일반적으로 특징으로 한다. 일반적으로 CD45RO+인 메모리 T 세포는 순수 T 세포보다 더 신속하고, 강력한 면역반응을 재현 및 탑재할 수 있다.
CAR-T T 세포는 메모리 CD8+ T 세포로부터 유도되기 때문에, 메모리 CD8+ T 세포 상에서 PEG-IL-10의 효과는 시험관내에서 평가되었다. 실시예 2에서 제시된 데이터는 활성화된 메모리 CD8+ T 세포의 기능을 강화시키는 PEG-IL-10의 효과와 일관된다.
방법과 모델
본 발명은 CAR-T 세포 치료의 결과로서 본원에 기술된 치료법에 반응할 수 있는 활성화-유도된 세포 사멸을 겪은, 또는 의심받은 후보 대상 집단 (또는 개별 대상)을 동정하기 위한 다양한 방법 및 모델을 고려한다. 이러한 요법은 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)의 단일 요법, 그리고 활성화-유도된 세포 사멸을 예방 또는 제한시키는데 있어서 유익한 활성을 나타내는 것으로 밝혀진 하나 또는 그 이상의 별개 물질과 IL-10 물질을 함께 사용하는 복합 요법을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법 및 모델을 이용하여 IL-10 물질의 투여로 활성화-유도된 세포 사멸이 바람직한 수준으로 감소되는지, 또는 IL-10 물질과 또다른 물질의 조합이 더 유익한 지의 여부를 결정할 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 방법 및 모델을 이용하여 상기 조합의 투여가 바람직하지 않은 효과를 초래하는지 여부를 결정할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예들은 시험관내, 생체외 및 생체내 방법 및/또는 모델의 사용을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예들에서, 상기 대상 집단 (또는 개별 대상)은 비-인간 동물 (가령, 설치류) 또는 인간이다.
예를 들면, 본 발명의 한 측면은 활성화-유도된 세포 사멸을 겪은 또는 가지는 것으로 의심되는 시험 대상이 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)을 이용한 치료의 후보인지를 결정하는 방법을 고려하는데, 상기 방법은 a) 활성화-유도된 세포 사멸의 징후를 가진 시험 대상을 제공하고, b) 참조 집단에서 원하는 반응을 얻는데 충분한 양의 IL-10 물질을 이 시험 대상에게 투여하고, 그리고 c) 이 시험 대상이 원하는 반응을 나타내는 지를 확인하는 것을 포함하고; 이때 상기 원하는 반응이 확인된다는 것은 이 시험 대상이 치료 후보라는 것을 나타낸다. 당업자는 병용 요법과 함께 사용하기 위하여 이러한 방법을 변형시킬 수 있다. 상기 원하는 반응은 상황에 따라 호의적인 결과가 될 수 있다.
상술 한 바와 같이, 본 발명은 또한 다양한 모델을 고려한다. 신뢰할 수 있고, 재현가능한 결과를 제공하는 모든 모델이 사용할 수 있다. 당업자는 본 발명의 요지와 관련하여 사용될 수 있는 모델들을 잘 알고 있으며; 한 구체예에서, 상기 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)은 비-인간 대상 (가령, 마우스)을 포함하는 모델에서 평가된다. 본 발명의 특정 구체예들은 IL-10 물질이 다른 물질과 함께 조합하여, 또는 다른 물질 없이, 활성화-유도된 세포 사멸을 예방 또는 감소시키는 후보인지를 확인하기 위한 모델을 고려한다.
본 발명의 추가 구체예들은 다른 물질과 함께, 또는 다른 물질 없이, IL-10 물질의 최적화된 양을 결정하기 위한 방법 또는 모델을 포함한다. 최적 양은 예를 들어, 대상 또는 개체군에서 최적 효과를 달성하는 양일 수 있다. 상기 물질(들)의 양을 조작함으로써, 임상의는 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 감소시키기 위한 최적의 투여 요법을 결정할 수 있다.
생물표지( Biomarkers )
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법 및 모델과 함께 생물표지의 사용을 고려한다. 용어 ＂생물표지＂란 정상적인 생물학적 과정, 병적 과정 또는 치료요법적 중재에 대한 약리학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는 특성을 의미한다. 지시약은 신체 또는 이의 산물에서 측정할 수 있고, 결과 또는 질병의 발병에 영향을 주거나 또는 예측할 수 있는 모든 물질, 구조 또는 프로세스일 수 있다.
본 발명의 일부 구체예들에서, 생물표지(들)은 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)을 이용한 치료법에 대한 임상적 반응을 예상하는데 이용된다. 경우에 따라, 사전-생물표지는 이 생물 표지가 관리-표준 치료요법을 결정하는 일부분으로써 적용될 수 있는 시점까지 유효성이 입증될 때 치료법에서 사용할 수 있다.
혈청 농도
본 명세서에서 기술된 방법에서 IL-10의 혈액 혈청 수준은 다음을 포함하는 몇 가지 방법으로 특징화된다: (1) 일부 명시된 수준 또는 수준 범위 이상의 IL-10 혈청 평균 최저 농도; (2) 일정 시간 동안 일부 명시된 수준 이상의 IL-10 혈청 평균 최저 농도; (3) 일부 명시된 수준 또는 수준 범위 이상 또는 이하의 정상 상태 IL-10 혈청 농도 수준; 또는 (4) 일부 명시된 수준 또는 수준 범위 이상 또는 이하의 농도 프로파일의 Cmax. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 평균 혈청 최저 IL-10 농도는 특정 징후에서 특히 중요한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 일부 구체예들에서, 생성될 수 있는 혈액 혈장 및/또는 혈청 수준 농도 프로파일은 다음을 포함한다: IL-10 평균 혈장 및/또는 혈청 최저 농도는 약 1.0 pg/mL 이상, 약 10.0 pg/mL 이상, 약 20.0 pg/mL 이상, 약 30 pg/mL 이상, 약 40 pg/mL 이상, 약 50.0 pg/mL 이상, 약 60.0 pg/mL 이상, 약 70.0 pg/mL 이상, 약 80.0 pg/mL 이상, 약 90 pg/mL 이상, 약 0.1 ng/mL 이상, 약 0.2 ng/mL 이상, 약 0.3 ng/mL 이상, 약 0.4 ng/mL 이상, 약 0.5 ng/mL 이상, 약 0.6 ng/mL 이상, 약 0.7 ng/mL 이상, 약 0.8 ng/mL 이상, 약 0.9 ng/mL 이상, 약 1.0 ng/mL 이상, 약 1.5 ng/mL 이상, 약 2.0 ng/mL 이상, 약 2.5 ng/mL 이상, 약 3.0 ng/mL 이상, 약 3.5 ng/mL 이상, 약 4.0 ng/mL 이상, 약 4.5 ng/mL 이상, 약 5.0 ng/mL 이상, 약 5.5 ng/mL 이상, 약 6.0 ng/mL 이상, 약 6.5 ng/mL 이상, 약 7.0 ng/mL 이상, 약 7.5 ng/mL 이상, 약 8.0 ng/mL 이상, 약 8.5 ng/mL 이상, 약 9.0 ng/mL 이상, 약 9.5 ng/mL 이상, 또는 약 10.0 ng/mL 이상이다.
본 발명의 특정 구체예들에서, IL-10 혈청 평균 최저 농도는 1.0 pg/mL 내지 10 ng/mL의 범위 안에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 IL-10 혈청 평균 최저 농도는 1.0 pg/mL 내지 100 pg/mL의 범위 안에 있다. 다른 구체예들에서, 상기 IL-10 혈청 평균 최저 농도는 0.1 ng/mL 내지 1.0 ng/mL의 범위 안에 있다. 다른 구체예들에서, 상기 IL-10 혈청 평균 최저 농도는 1.0 ng/mL 내지 10 ng/mL의 범위 안에 있다. 본 발명은 비록 이러한 범위가 명시적으로 열거되어 있지 않더라도, 본 명세서에 기재된 농도에 포함되는 임의의 농도를 포함하는 범위를 고려하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, 구체예에서 상기 평균 혈청 IL-10 농도는 0.5 ng/mL 내지 5 ng/mL의 범위 안에 있을 수 있다. 추가 실시예에서, 본 발명의 특정 구체예들은 약 0.5 ng/mL 내지 약 10.5 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 9.0 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 8.0 ng/mL, 약 1.0 ng/mL 내지 약 7.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 9.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 8.0 ng/mL, 약 1.5 ng/mL 내지 약 7.0 ng/mL, 약 2.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL, 약 2.0 ng/mL 내지 약 9.0 ng/mL, 약 2.0 ng/mL 내지 약 8.0 ng/mL, 내지 약 2.0 ng/mL 내지 약 7.0 ng/mL의 범위 안에 있는 IL-10 혈청 평균 최저 농도를 포함한다.
특정 구체예들에서, IL-10 혈청 평균 최저 농도, 1 - 2 ng/mL는 치료 과정에 걸쳐 유지된다. 본 발명은 상기 IL-10 평균 혈청 정점 농도가 치료 기간 동안 약 10.0 ng/mL에 대등하거나 또는 이보다 낮은 구체예들을 또한 고려한다. 추가 구체예들은 IL-10 혈청 평균 최저 농도가 약 1.0 pg/mL에 대등하거나 또는 이보다 낮은 것을 고려한다. 최적의 평균 혈청 농도는 일반적으로 바람직하지 않은 부작용을 유발하지 않으면서, 원하는 치료 효과가 달성되는 농도이다.
특정 본 발명의 구체예들은 IL-10 요법을 제공받은 대상에게서 부작용을 예측하고, 따라서 잠재적으로 부작용을 회피하기 위하여 이 대상을 모니터하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (1) 상기 대상에서 IL-10의 정점 농도를 측정하고; (2) 상기 대상에서 IL-10의 최저 농도를 측정하고; (3) 정점-최저 변동을 산출하고; 그리고 (4) 상기 산출된 정점-최저 변형을 이용하여, 상기 대상에서 잠재적 부작용을 예상한다. 특정 대상 집단에서, 정점-최저 변동이 더 작다는 것은 상기 대상이 IL-10-관련된 부작용을 경험할 가능성이 더 낮다는 것을 나타낸다. 또한, 일부 구체예들에서, 특정 투여 매개변수를 이용하여 특정 질환, 장애 및 상태 치료를 위하여 특정 정점-최저 변동이 결정되며, 이들 변동은 참조 표준으로 이용된다.
대다수 약물의 경우, 혈장 약물 농도는 다차원적으로 감소한다. 정맥 내 투여 직후, 이 약물은 초기 공간(혈장 용적으로 최소한으로 한정됨)을 통하여 신속하게 분포되고, 그 다음 혈관외 공간 (예를 들어, 특정 조직)쪽으로 보다 느리고 평형적으로 분포된다. IL-10의 정맥 투여는 2-구획 역학 모델과 연관된다(Rachmawati, H. et al. (2004) Pharm. Res. 21(11):2072-78 참고). 피하 재조합 hIL-10의 약동학이 또한 연구되었다 (Radwanski, E. et al. (1998) Pharm. Res. 15(12):1895-1901). 따라서, IL-10의 적절한 투약 관련 매개 변수를 평가할 때, 분포 용적(volume-of-distribution) 고려 사항이 관련된다. 더욱이, 특이적 세포 유형에 IL-10 물질을 표적화시키려는 노력이 있었고 (가령, Rachmawati, H. (May 2007) Drug Met. Dist. 35(5):814-21), IL-10 약동학 및 투약 원리의 영향력은 이러한 노력의 성공에 매우 중요하다.
본 발명은 상기에서 제시된 임의의 IL-10 혈청 최저 농도를 유지시키는 임의의 투여분량의 투여 및 투약요법을 고려한다. 예를 들면, 상기 대상이 인간일 때, 페길화안된 hIL-10은 0.5 μg/kg/일 이상, 1.0 μg/kg/일 이상, 2.5 μg/kg/일 이상, 5 μg/kg/일 이상, 7.5 μg/kg 이상, 10.0 μg/kg 이상, 12.5 μg/kg 이상, 15 μg/kg/일 이상, 17.5 μg/kg/일 이상, 20 μg/kg/일 이상, 22.5 μg/kg/일 이상, 25 μg/kg/일 이상, 30 μg/kg/일 이상, 또는 35 μg/kg/일 이상의 투여분량으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 예를 들면, 상기 대상이 인간일 경우, 상대적으로 작은 PEG (가령, 5kDa의 단일-2-PEG-hIL-10)를 포함하는 페길화된 hIL-10은 0.5 μg/kg/일 이상, 0.75 μg/kg/일 이상, 1.0 μg/kg/일 이상, 1.25 μg/kg/일 이상, 1.5 μg/kg/일 이상, 1.75 μg/kg/일 이상, 2.0 μg/kg/일 이상, 2.25 μg/kg/일 이상, 2.5 μg/kg/일 이상, 2.75 μg/kg/일 이상, 3.0 μg/kg/일 이상, 3.25 μg/kg/일 이상, 3.5 μg/kg/일 이상, 3.75 μg/kg/일 이상, 4.0 μg/kg/일 이상, 4.25 μg/kg/일 이상, 4.5 μg/kg/일 이상, 4.75 μg/kg/일 이상, 또는 5.0 μg/kg/일 이상의 투여분량으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
IL-10 혈청 농도, 투여분량 그리고 특정 IL-10 혈청 농도, 등등을 얻는데 필수적인 치료 프로토콜과 관련하여 상기 논의는 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)을 이용한 단일 요법에 속하지만, 당업자 (가령, 약리학자)는 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)이 하나 또는 그 이상의 추가 요법과 병행하여 투여될 때, 최적의 투약 요법(들)을 결정할 수 있다.
IL-10 생산 방법
본 발명의 폴리펩티드는 비-재조합 (가령, 화학적 합성) 및 재조합 방법이 포함된 임의의 적합한 방법에 의해 만들어질 수 있다.
A. 화학적 합성
폴리펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 합성은 액상 또는 고형-상을 통해 진행될 수 있다. 고형-상 펩티드 합성 (SPPS)은 비자연적 아미노산 및/또는 펩티드/단백질 골격 변형의 혼입을 허용한다. 본 발명의 폴리펩티드를 합성하기 위해, 다양한 형태의 SPPS, 예컨대, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 및 t-부틸옥시카르보닐 (Boc)이 이용 가능하다. 화학적 합성의 세부 사항은 당업계에 공지되어 있다(가령, Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; and Camarero J.A. et al., (2005) Protein Pept Lett. 12:723-8).
고형-상 펩티드 합성은 하기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 알파 기능 (Nα) 및 임의의 반응성 측쇄는 산-불안정 또는 염기 불안정성 그룹으로 보호된다. 보호기는 아미드 결합 연결 조건 하에서 안정하지만, 형성된 펩티드 사슬을 손상시키지 않고 쉽게 절단될 수 있다. α-아미노 작용기에 적합한 보호기는 다음을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: Boc, 벤질옥시카르보닐 (Z), O-클로로벤질옥시카르보닐, 바이-페닐이소프로필옥시카르보닐, tert-아밀옥시카르보닐 (Amoc), α, α-디메틸-3,5-디메톡시-벤질옥시카르보닐, o-니트로술페닐, 2-시아노-t-부톡시-카르보닐, Fmoc, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥시-1-일리덴)에틸 (Dde) 및 이와 유사한 것들.
적합한 측쇄 보호기는 다음을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다: 아세틸, 알릴 (All), 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 벤질 (Bzl), 벤질옥시카르보닐 (Z), t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시메틸 (Bom), o-브로모벤질옥시카르보닐, t-부틸 (tBu), t-부틸디메틸실일, 2-클로로벤질, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 2,6-디클로로벤질, 시클로헥실, 시클로펜틸, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde), 이소프로필, 4-메톡시-2,3-6-트리메틸벤질술포닐 (Mtr), 2,3,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐 (Pmc), 피발일, 테트라히드로피란-2-일, 토실 (Tos), 2,4,6-트리메톡시벤질, 트리메틸실일 및 트리틸 (Trt).
고형상 합성에서, C-말단 아미노산은 적합한 지지체 물질에 커플링된다. 적합한 지지체 물질은 합성 공정의 단계별 축합 및 절단 반응에 대한 시약 및 반응 조건에 대해 불활성이고, 그리고 사용되는 반응 매질에서 용해되지 않는 물질이다. 상업적으로 이용가능한 지지체 물질의 예로는 반응기 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체; 클로로메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체; 히드록시메틸화된 또는 아미노메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체; 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 펩티드 산의 제조가 필요한 경우, 폴리스티렌 (1%)-디비닐벤젠 또는 4-벤질옥시벤질-알코올 (Wang-엥커(anchor)) 또는 2-클로로트리틸 클로라이드로 유도화된 TentaGel®이 이용될 수 있다. 펩티드 아미드의 경우, 폴리스티렌 (1%) 디비닐벤젠 또는 5-(4＇-아미노메틸)-3＇,5＇-디메톡시펜옥시)발레르산 (PAL-엥커) 또는 p-(2,4-디메톡시페닐-아미노 메틸)-펜옥시 기 (Rink 아미드 엥커)로 유도화된 TentaGel®이 이용될 수 있다.
에탄올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 디클로로메탄, 테트라히드로퓨란, N-메틸피롤리돈 또는 유사 용매 안에 활성화 시약을 추가함으로써, 실온 또는 상승된 온도(가령, 40℃~60℃) 그리고 가령, 2 ~ 72 시간의 반응 시간으로 지지체 물질에 C-말단 Fmoc-보호된 아미노산을 반응시켜 이 중합체 지지체에 연계가 이루어질 수 있다.
Nα-보호된 아미노산 (가령, Fmoc 아미노산)을 PAL, Wang 또는 Rink 엥커에 커플링시키는 것은 예를 들면, 1-히드록시벤조트리아졸 또는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 존재 또는 부재하에서 커플링 시약, 이를 테면, N,N＇-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N,N＇-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 또는 기타 카르보디이미드, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플로오르붕산염 (TBTU) 또는 기타 우로늄 염, O-아실-우레아제, 벤조트리아졸-1-일-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트 (PyBOP) 또는 포스포니움 염, N-히드록시숙시니미드, 기타 N-히드록시이미드 또는 옥심의 도움으로 실행되는데, 가령, 염기, 이를 테면, 예를 들면, 디이소프로필에틸아민 (DIEA), 트리에틸아민 또는 N-메틸몰포린의 추가와 함께 또는 추가없이, HOBt 추가와 TBTU의 도움으로 실행되는데, 가령, 2 ~72 시간의 반응 시간 동안 디이소프로필에틸아민으로 실행된다 (가령, 3 시간 동안 1.5 ~ 3-배 초과량의 아미노산과 커플링 시약에서, 예를 들면, 2-배 초과량으로, 그리고 약 10℃~50℃, 예를 들면, 25℃에서 용매, 이를 테면, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 또는 디클로로메탄, 가령, 디메틸포름아미드에서).
상기 커플링 시약을 대신하여, 상기에서 설명된 조건하에 활성 에스테르 (가령, 펜타플루오르페닐, p-니트로페닐 또는 이와 유사한 것들), Nα-Fmoc-아미노산, 이의 산 클로라이드 또는 산 플로라이드의 대칭 무수물을 이용하는 것 또한 가능하다.
Nα-보호된 아미노산 (가령, Fmoc 아미노산)은 DIEA의 추가와 함께, 그리고 10 ~ 120 분, 가령, 20 분의 반응 시간으로, 디클로로메탄 내에서 2-클로로트리틸 수지에 커플링될 수 있지만, 상기 용매와 염기에 한정되지 않는다.
보호된 아미노산의 연속 커플링은 펩티드 합성에서 통상적인 방법에 따라, 전형적으로 자동화된 펩티드 합성기에서 수행될 수 있다. 5 ~ 20 분 동안 디메틸포름아미드에서 가령, 피페리딘 (10% ~ 50%)으로 처리함으로써, 고형 상에서 커플링된 아미노산의 Nα-Fmoc 보호기를 절단한 후, 가령, DMF 안에서 50% 피페리딘으로 2X2분, 그리고 DMF 안에서 20% 피페리딘으로 1 x 15 분, 그 다음 3 ~ 10-배 과량, 가령, 10-배 과량의 보호된 아미노산은 불활성, 비-수성, 극성 용매 이를 테면, 디클로로메탄, DMF 또는 이 둘의 혼합물에서, 그리고 약 10℃ ~ 50℃, 가령, 25℃에서 기존 아미노산에 커플링된다. PAL, Wang 또는 Rink 엥커에 제 1 Nα-Fmoc 아미노산의 커플링에는 이미 언급된 시약이 커플링 시약들이 적합하다. 보호된 아미노산의 활성 에스테르, 또는 그의 염화물 또는 불화물 또는 대칭 무수물을 대안으로 사용할 수 있다.
고형 상 합성이 끝날 때, 펩티드는 지지체 물질로부터 잘라내고, 동시에 측쇄 보호기를 잘라낸다. 0.5 ~ 3 시간, 가령, 2 시간 안에 5%-20% V/V의 소거제, 이를 테면, 디메틸술피드, 에틸메틸술피드, 티오아니솔, 티오크레솔, m-크레솔, 아니솔 에탄에디티올, 페놀 또는 물, 가령, 15% v/v 디메틸술피드/에탄에디티올/m-크레솔 1:1:1의 추가와 함께, 트리플루오르아세트산 또는 기타 강력한 산성 매질에서 절단이 실행될 수 있다. 완전히 보호된 측쇄를 갖는 펩티드는 2-클로로트리틸 앵커를 빙초산/트리플루오로에탄올/디클로로메탄 (2 : 2 : 6)을 이용하여 절단함으로써 수득된다. 상기 보호된 펩티드는 보호된 펩티드는 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 상기 펩티드가 Wang 앵커를 통해 고형 상에 연결되면, 그리고 C-말단 알킬아미드화된 펩티드를 획득하려는 의도라면, 알킬아민 또는 플루오로알킬아민에 의한 아미노분해를 통하여 절단이 수행될 수 있다. 상기 아미노분해는 약 -10℃~ 50℃ (가령, 약 25℃), 그리고 약 12 시간~24 시간 (가령, 약 18 시간)의 반응 시간으로 시행된다. 또한, 펩티드는 재에스테르 화에 의해, 예를 들어 메탄올로 지지체로부터 절단될 수 있다..
수득되는 산성 용액은 3 ~ 20 배 양의 냉-에테르 또는 n-헥산과 혼합될 수 있는데, 가령, 10-배 과량의 디에틸 에테르와 혼합되어, 소거제와 에테르에 남아있는 절단된 보호기를 분리해낸다. 추가 정제는 빙초산으로부터 펩티드를 수차례 재-침전시킴으로써 수행될 수 있다. 수득된 침전물은 물 또는 tert-부탄올 또는 두 용매의 혼합물, 예컨대 tert-부탄올/물의 1 : 1 혼합물에서 수취하고, 동결-건조시킬 수 있다.
수득된 펩티드는 다음을 포함하는 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있고; 아세트산 염 형태의 약 염기성 수지를 통한 이온 교환; 비-유도화된 폴리스티렌/디비닐벤젠 공중합체 (가령, Amberlite® XAD) 상에서 소수성 흡착 크로마토그래피; 실리카 겔 상에서 흡착 크로마토그래피; 가령, 카르복시메틸 셀룰로오스 상에서 이온 교환 크로마토그래피; 가령, Sephadex® G-25 상에서 분포 크로마토그래피; 역류 분포 크로마토그래피; 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 가령, 옥틸 또는 옥타데실실일실리카 (ODS) 상에서 역-상 HPLC.
B. 재조합 생산
인간 및 마우스 IL-10의 제조 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호. 5,231,012에서 기술되며, 여기에는 재조합 및 기타 합성 기술이 포함된, IL-10 활성을 갖는 단백질을 만드는 방법을 교시한다. IL-10는 바이러스 기원의 것일 수 있고, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스로부터 바이러스 IL-10의 클로닝 및 발현 (BCRF1 단백질)은 Moore et al., (1990) Science 248:1230에서 기술된다. IL-10은 본원에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 여러 가지 방법으로 수득할 수 있다. 재조합 인간 IL-10은 PeproTech, Inc., Rocky Hill, N.J.에서 상업적으로 이용가능하다.
폴리펩티드를 재조합 기술을 이용하여 만드는 경우, 이 폴리펩티드는 임의의 적합한 구조체 및 임의의 적합한 숙주 세포를 사용하여 세포내 단백질 또는 분비된 단백질로서 생성될 수 있으며, 이때 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포, 이를 테면, 차례로 박테리아 (가령, 대장균(E. coli)) 또는 효모 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포로 이용될 수 있는 진핵 세포의 다른 예로는 곤충 세포, 포유류 세포, 및/또는 식물 세포가 포함된다. 포유류 숙주 세포가 이용될 때, 여기에는 인간 세포 (가령, HeLa, 293, H9 및 Jurkat 세포); 마우스 세포 (가령, NIH3T3, L 세포, 및 C127 세포); 영장류 세포 (가령, Cos 1, Cos 7 및 CV1); 그리고 헴스터 세포 (가령, 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포)가 포함된다.
폴리펩티드의 발현에 적합한 다양한 숙주-벡터 시스템이 당업계에 공지된 표준 절차에 따라 사용될 수 있다. 가령, Sambrook et al., 1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press, New York; 그리고 Ausubel et al. 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Wiley and Sons 참고. 숙주 세포 안으로 유전 물질을 도입시키는 방법에는 예를 들면, 형질변환, 전기천공, 접합, 인산칼슘염 방법 및 이와 유사한 것들이 포함된다. 상기 도입된 폴리펩티드-인코딩 핵산의 안정적인 발현을 제공하는 전달 방법이 선택될 수 있다. 상기 폴리펩티드-인코딩 핵산은 유전가능한 에피좀 요소 (가령, 플라스미드)로 제공되거나, 또는 게놈에 통합될 수 있다. 관심 폴리펩티드의 생산에 이용되는 적절한 다양한 벡터들이 상업적으로 이용가능하다.
벡터는 숙주 세포 안에 염색체외 유지용으로 제공되거나, 또는 숙주 세포 게놈 안에 통합용으로 제공될 수 있다. 발현 벡터는 전사 및 해독 조절 서열을 제공하고, 유도성 또는 구조성 발현을 제공할 수 있는데, 이때 상기 코딩 영역은 전사 개시 영역, 그리고 전사 및 해독 종료 영역의 전사 제어 하에 작동가능하도록-연계된다. 일반적으로, 상기 전사 및 해독 조절 서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종료 서열, 해독 개시 및 종료 서열, 그리고 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 프로모터는 구성 또는 유도성일 수 있으며, 강력한 구성 프로모터(가령, T7) 일 수 있다.
발현 구조체는 일반적으로 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열에 근접하게 위치된 편리한 제한 부위를 갖는다. 상기 벡터가 포함된 세포의 선별을 용이하게 하기 위하여 발현 숙주에서 작동하는 선별가능 표지가 존재할 수 있다. 더욱이, 상기 발현 구조체는 추가 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 하나 또는 두 개의 복제 시스템을 가질 수 있으므로, 예를 들어, 발현을 위해 포유류 또는 곤충 세포에서, 그리고 클로닝 및 증폭을 위하여 원핵 숙주에서 유기체가 유지되는 것이 허용된다. 또한, 상기 발현 구조체는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 허용하는 선별가능 표지 유전자를 내포한다. 선별가능 유전자는 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 이용된 숙주 세포에 따라 변할 것이다.
단백질의 단리 및 정제는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 구조적으로 및/또는 유도시 단백질이 발현되도록 유전적으로 변형된 세포의 용해물로부터, 또는 면역친화성 정제에 의하여 합성 반응 혼합물로부터 단백질을 단리할 수 있고, 이것은 일반적으로 시료를 항 단백질 항체와 접촉시키고, 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하기 위해 세척하고, 특이적으로 결합된 단백질을 용리시키는 것을 포함한다. 단리된 단백질은 투석 및 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다. 한 구체예에서, 단백질은 금속 킬레이트 크로마토그래피 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 단백질은 분리가 용이하도록 변형을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 실질적으로 순수한 또는 단리된 형태로 (예를 들어, 다른 폴리펩티드가 없음) 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 존재할 수 있는 다른 성분 (가령, 기타 폴리펩티드 또는 기타 숙주 세포 성분들)에 비하여, 조성물 안에 해당 폴리펩티드가 풍부하게 존재할 수 있다. 예를 들면, 조성물 안에 다른 발현된 단백질이 실질적으로 없도록, 가령, 약 90% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만으로 상기 폴리펩티드가 존재하도록, 정제된 폴리펩티드가 제공될 수 있다.
IL-10 폴리펩티드를 인코딩하는 구조체를 제공하기 위하여 당분야에 공지된 IL-10-관련된 상이한 핵산을 조작하는 재조합 기술을 이용하여, IL-10 폴리펩티드가 만들어질 수 있다. 특정 아미노산 서열이 제공될 때, 당업자는 예를 들어, 분자 생물학에서 그의 배경 및 경험의 견지에서 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 상이한 핵산 분자를 인지할 것이다.
아미드 결합 치환
일부 경우들에서, IL-10은 펩티드 결합이외의 하나 이상의 결합을 포함하며, 예를 들어, 적어도 2 개의 인접한 아미노산은 아미드 결합이외의 결합을 통해 결합된다. 예를 들면, 바람직하지 않은 단백질 분해, 또는 다른 분해 수단을 감소 또는 제거하고 및/또는 혈청 안정성을 증가시키고 및/또는 구조 유연성을 제한하거나 증가시키기 위하여, IL-10 골격 안에 하나 또는 그 이상의 아미드 결합이 치환될 수 있다.
또다른 실시예에서, IL-10에서 하나 또는 그 이상의 아미드 연계 (-CO-NH-)는 아미드 연계의 동배체(isostere)인 연계, 이를 테면, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스(cis) 및 트란스(trans)), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 또는 -CH2SO-으로 대체될 수 있다. IL-10에서 하나 또는 그 이상의 아미드 연계는 예를 들면, 환원된 동배체 슈도펩티드 결합으로 또한 대체될 수 있다. Couder et al. (1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41:181-184 참고. 이러한 대체물 및 이들을 수행하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
아미노산 치환
하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 IL-10 폴리펩티드에서 만들어질 수 있다. 비-제한적인 예들은 다음과 같다:
a) 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 노르류신, (S)-2-아미노부틸산, (S)-시클로헥실알라닌을 포함하는 알킬-치환된 소수성 아미노산의 치환, 또는 분기형, 환형 및 직쇄 알킬, 알케닐 또는 알키닐 치환이 포함된 C1-C10 탄소로부터 지방족 측쇄에 의해 치환된 기타 단순 알파-아미노산;
b) 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 술포티로신, 바이페닐닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 2-벤조티에닐알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 히스티딘을 포함하는 방향족-치환된 수소성 아미노산의 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아자, 할로겐화된 (플루오르, 클로로, 브로모, 또는 요오드) 또는 상기 열거된 방향족 아미노산의 알콕시 (C1-C4)-치환된 형태의 치환, 이들의 예들은 다음과 같다: 2-, 3- 또는 4-아미노페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-클로로페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메틸페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메톡시페닐알라닌, 5-아미노-, 5-클로로-, 5-메틸- 또는 5-메톡시트립토판, 2＇-, 3＇-, 또는 4＇-아미노-, 2＇-, 3＇-, 또는 4＇-클로로-, 2, 3, 또는 4-바이페닐닐알라닌, 2＇-, 3＇-, 또는 4＇-메틸-, 2-, 3- 또는 4-바이페닐닐알라닌, 그리고 2- 또는 3-피리딜알라닌;
c) 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 호모아르기닌이 포함된 염기성 측쇄를 포함하는 아미노산의, 기존 아미노산의 알킬, 알케닐, 또는 아릴-치환된 (C1-C10 분기형, 선형, 또는 환형) 유도체들을 포함하는 치환, 이때 상기 치환체는 이형원자 (이를 테면, 알파 질소, 또는 단부 질소 또는 질소들, 또는 예를 들면, 프로-R 위치에서 알파 탄소 상에 있을 수 있다. 예시적인 예로서 삼을 수 있는 화합물은 다음을 포함한다: N-엡실론-이소프로필-리신, 3-(4-테트라히드로피리딜)-글리신, 3-(4-테트라히드로피리딜)-알라닌, N,N-감마, 감마＇-디에틸-호모아르기닌. 알킬 기가 알파-탄소의 프로-R 위치에 있는 화합물들, 이를 테면, 알파-메틸-아르기닌, 알파-메틸-2,3-디아미노프로피온산, 알파-메틸-히스티딘, 알파-메틸-오르니틴 또한 포함된다. 알킬, 방향족, 헤테로방향족으로부터 형성된 아미드 (여기에서 헤테로방향족 기는 하나 또는 그 이상의 질소, 산소 또는 황 원자들을 단독으로 또는 조합으로 보유함), 카르복실산 또는 임의의 많은 공지된 활성화된 유도체들 이를 테면, 산 클로라이드, 활성 에스테르, 활성 아졸리드 및 관련된 유도체들, 그리고 리신, 오르니틴, 또는 2,3-디아미노프로피온산도 또한 포함된다;
d) 아스파트산, 글루탐산, 호모글루탐산, 티로신을 포함하는 산성 아미노산을 알킬, 아릴, 아릴알킬, 및 2,4-디아미노프로피온산의 헤테로아릴 술폰아미드의 치환, 오르니틴 또는 리신 및 테트라졸-치환된 알킬 아미노산;
e) 아스파라긴, 글루타민이 포함된 측쇄 아미드 잔기의 치환, 그리고 아스파라긴 또 글루타민의 알킬 또 방향족 치환된 유도체들; 그리고
f) 세린, 트레오닌, 호모세린이 포함된 히드록실-함유 아미노산의 2,3-디아미노프로피온산의 치환, 그리고 세린 또는 트레오닌의 알킬 또는 방향족 치환된 유도체들.
일부 경우들에서, IL-10은 하나 또는 그 이상의 자연 발생 비-유전적으로 인코드된 L-아미노산, 합성 L-아미노산, 또는 아미노산의 D-거울상체를 포함한다. 예를 들면, IL-10은 오직 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 예를 들면, IL-10 폴리펩티드는 다음 잔기중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 히드록시프롤린, β-알라닌, o-아미노벤조산, m-아미노벤조산, p-아미노벤조산, m-아미노메틸벤조산, 2,3-디아미노프로피온산, α-아미노이소부틸산, N-메틸글리신 (사르코신), 오르니틴, 시트룰린, t-부틸알라닌, t-부틸글리신, N-메틸이소류신, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 노르류신, 나프틸알라닌, 피리딜알라닌 3-벤조티에닐 알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오르페닐알라닌, 3-플루오르페닐알라닌, 4-플루오르페닐알라닌, 페니실아민, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, β-2-티에닐알라닌, 메티오닌 술폭시드, 호모아르기닌, N-아세틸 리신, 2,4-디아미노 부틸산, rho-아미노페닐알라닌, N-메틸발린, 호모시스테인, 호모세린, ε-아미노 헥사논산, ω-아미노헥사논산, ω-아미노헵타논산, ω-아미노옥타논산, ω-아미노데카논산, ω-아미노테트라데카논산, 시클로헥실알라닌, α,γ-디아미노부틸산, α,β-디아미노프로피온산, δ-아미노 발레르산, 및 2,3-디아미노부틸산.
추가 변형
시스테인 잔기 또는 시스테인 유사체가 IL-10 폴리펩티드에 도입되어, 이황화물 연계를 통하여 다른 펩티드에 연계를 제공하거나, 또는 상기 IL-10 폴리펩티드의 고리화를 제공한다. 시스테인 또는 시스테인 유사체를 도입하는 방법은 당분야에 공지되어 있다; 가령, U.S. 특허 번호. 8,067,532 참고.
IL-10 폴리펩티드는 고리화될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 시스테인 또는 시스테인 유사체는 IL-10 폴리펩티드 안으로 도입될 수 있으며, 이때 도입된 시스테인 또는 시스테인 유사체는 제 2 도입된 시스테인 또는 시스테인 유사체와 함께 이황화물 결합을 만들 수 있다. 고리화의 다른 수단은 옥심 링커 또는 란티오닌 링커의 도입을 포함한다; 가령, U.S. 특허 번호. 8,044,175 참고. 고리화 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산 (또는 비-아미노산 모이어티) 조합이 이용되거나 및/또는 도입될 수 있다. 고리화 결합은 다리 도입을 허용하는 기능기를 갖는 임의의 아미노산 (또는 아미노산 및 -(CH2)n-CO- 또는 -(CH2)n-C6H4-CO-)으로 만들어질 수 있다. 일부 실시예는 디술피드, 디술피드 모방체 이를 테면, -(CH2)N-카르바 다리, 티오아세탈, 티오에테르 다리 (시스타티오닌 또는 란티오닌) 및 에스테르와 에테르를 포함하는 다리다. 이들 실시예에서, n은 임의의 정수일 수 있지만, 대부분 10 미만이다.
기타 변형은 예를 들면, N-알킬 (또는 아릴) 치환 (ψ[CONR]), 또는 구조체 락탐 및 기타 환형 구조에 가교된 골격을 포함한다. 기타 유도체들은 C-말단 히드록시메틸 유도체들, o-변형된 유도체들 (가령, C-말단 히드록시메틸 벤질 에테르), 치환된 아미드, 이를 테면, 알킬아미드 및 하이드라지드가 포함된 N-말단 변형된 유도체들을 포함한다.
일부 경우들에서, IL-10 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 L-아미노산은 하나 또는 그 이상의 D-아미노산으로 대체된다.
일부 경우들에서, IL-10 폴리펩티드은 레트로인버스(retroinverso) 유사체이다 (가령, Sela and Zisman (1997) FASEB J. 11:449 참고). 레트로-인버스 펩티드 유사체는 선형 폴리펩티드의 이성질체로써, 이때 아미노산 서열의 방향이 역전되고(reversed)(역행(retro)), 키랄성, L-아미노산 보다는 D-아미노산을 이용하여, D- 또는 L- 하나 또는 그 이상의 아미노산이 반전된(inverted)(역행(inverso))된다 [가령, Jameson et al. (1994) Nature 368:744; 그리고 Brady et al. (1994) Nature 368:692].
IL-10 폴리펩티드는 ＂단백질 변환 도메인＂ (PTD)을 포함하는데, 이것은 지질 이중층, 미셀, 세포 막, 기관 막, 또는 소포 막을 횡단하는 것이 용이한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 또는 유기 또는 무기 분자를 지칭한다. 또다른 분자에 부착된 PTD는 이 분자가 막을 횡단하는 것을 촉진하는데, 예를 들면, 세포외 공간으로부터 세포내 공간으로 이동하거나, 세포질로부터 기관 내로 이동하는 것을 촉진한다. 일부 구체예들에서, PTD는 IL-10 폴리펩티드의 아미노 말단에 공유적으로 연계되며, 다른 구체예들에서, PTD는 IL-10 폴리펩티드의 카르복시 말단에 공유적으로 연계된다. 예시적인 단백질 변환 도메인은 최소 운데카펩티드 단백질 변환 도메인 (YGRKKRRQRRR을 포함하는 HIV-1 TAT의 잔기 47-57에 상응; 서열 번호:1); 세포 안으로 직접 진입하는데 충분한 수의 아르기닌 잔기 수를 포함하는 폴리아르기닌 서열 (가령, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10-50개의 아르기닌); VP22 도메인 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); 초파리(Drosophila) 안테나페디아(Antennapedia) 단백질 변환 도메인 (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); 절두된 인간 칼시토닌 펩티드 (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); 폴리리신 (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (서열 번호:2); 트란스포르탄 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열 번호:3); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열 번호:4); 및 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호:5)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 PTDs는 YGRKKRRQRRR (서열 번호:1), RKKRRQRRR (서열 번호:6); 3개의 아르기닌 잔기~ 50개의 아르기닌 잔기로된 아르기닌 동종중합체를 포함하나, 이에 국한되지 않으며; 예시적인 PTD 도메인 아미노산 서열은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: YGRKKRRQRRR (서열 번호:1); RKKRRQRR (서열 번호:7); YARAAARQARA (서열 번호:8); THRLPRRRRRR (서열 번호:9); 및 GGRRARRRRRR (서열 번호:10).
IL-10 폴리펩티드의 C-말단의 아미노산의 카르복실기 COR3는 자유형 (R3 = OH), 또는 생리학적으로-용인되는 알칼리 또는 알칼리 토류 염 이를 테면, 가령, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염의 형태로 존재할 수 있다. 카르복실기는 또한 1 차, 2 차 또는 3 차 알코올, 예컨대 메탄올, 분기형 또는 비-분기 C1-C6-알킬 알코올, 예를 들어, 에틸 알코올 또는 tert- 부탄올로 에스테르화될 수 있다. 카르복실기는 암모니아, 분기형 또는 비-분기형 C1-C6-알킬 아민 또는 C1-C6 디알킬 아민, 예컨대, 메틸아민 또는 디메틸아민과 같은 1 차 또는 2 차 아민으로 아미드화될 수 있다.
IL-10 폴리펩티드의 N-말단의 아미노산 NR1R2의 아미노기는 자유형 (R1 = H 및 R2 = H) 또는 생리학적으로-용인되는 염, 이를 테면, 가령, 클로라이드 또는 아세테이트 형태로 존재할 수 있다. 아미노기는 R1 = H 및 R2 = 아세틸, 트리플루오르아세틸, 또는 아다만틸과 같은 산으로 또한 아세틸화될 수 있다. 상기 아미노기는 펩티드 화학에서 통상적으로 사용되는 아미노-보호기, 이를 테면, 상기에서 제시된 바와 같은 (가령, Fmoc, 벤질옥시-카르보닐 (Z), Boc, 및 Alloc) 보호기에 의해 보호된 형태로 존재할 수 있다. 상기 아미노기는 N-알킬화될 수 있는데, 이때 R1 및/또는 R2 = C1-C6 알킬 또는 C2-C8 알케닐 또는 C7-C9 아랄킬임. 알킬 잔기는 직쇄형, 분기형 또는 환형 (가령, 차례로 에틸, 이소프로필 및 시클로헥실)이다.
IL-10 기능을 강화 및/또는 모방하기 위한 특정 변형
본 발명에 개시된 치료 형태 (예를 들어, IL-10)의 하나 이상의 물리적 특성 및/또는 이들이 투여되는 방식을 개선시키는 것이 종종 유익하고, 때로는 필수적이다. 물리적 성질의 개선은 예를 들면, 면역원성을 조절하는 방법; 물 용해도, 생물이용성, 혈청 반감기, 및/또는 치료요법적 반감기를 증가시키는 방법; 및/또는 생물학적 활성을 조절하는 방법을 포함한다. 특정 변형(예를 들어, 에피토프 태그)은 또한, 예를 들어, 검출 검정에 사용되는 항체의 생성 및 단백질 정제의 용이성을 제공하는데 유용할 수 있다. 이러한 개선은 일반적으로 치료 방법의 생체 활성에 악영향을 미치지 않고 및/또는 면역원성을 증가시키지 않도록 부여되어야 한다.
IL-10의 페길화가 본 발명에서 고려하는 하나의 특정 변형이며, 한편 다른 변형으로는 당화 (N-및 O-연계된); 폴리시알릴화; 혈청 알부민 (가령, 인간 혈청 알부민 (HSA), 시아노 혈청 알부민, 또는 소의 혈청 알부민 (BSA))을 포함하는 알부민 융합 분자; 예를 들면, 콘쥬게이트된 지방산 쇄를 통하여 (아실화) 알부민 결합; 그리고 Fc-융합 단백질을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
페길화 ( Pegylation ): 단백질 치료제의 임상 효과는 종종 짧은 혈장 반감기 및 프로테아제 분해에 대한 민감성으로 인해 대개 제한적이다. 다양한 치료요법적 단백질 (가령, 과립구집락자극인자)의 연구에서 이러한 어려움은 임의의 다양한 비단백질성 중합체, 가령, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 상기 폴리펩티드 서열을 접합 또는 연계시키는 것을 포함하는 다양한 변형을 통하여 극복할 수 있다는 것을 보여주었다. 이는 단백질 및 비단백질성 중합체, 가령, PEG 모두에 공유적으로 연계된 연계 모이어티에 의해 종종 영향을 받는다. 이러한 PEG-접합된 생체 분자는 임상적으로 유용한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 가령, 보다 우수한 물리적 및 열적 안정성, 효소 분해에 대한 민감성, 증가된 용해도, 생체내 순환 반감기 및 제거 감소, 면역원성 및 항원성 감소 및 독성 감소가 포함된다.
약동학적 매개변수에 대한 페길화의 유익한 효과 외에도, 페길화 자체는 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, PEG-IL-10은 페길화되지 않은 IL-10보다 특정 암에 대해 효능이 더 있는 것으로 나타났다(가령, EP 206636A2 참고).
폴리펩티드 서열에 대한 접합에 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 물에 가용성이며, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R, 이때 R은 수소 또는 보호기, 이를 테면, 알킬 또는 알카놀기이며, n은 1~1000 사이의 정수다. R이 보호기인 경우, 일반적으로 1~ 8개 탄소를 갖는다. 폴리펩티드 서열에 접합된 PEG는 선형 또는 분기형일 수 있다. 분기형 PEG 유도체들, ＂별모양-PEGs＂ 및 다중-암을 갖는 PEGs 또한 본 발명에서 고려된다. 본 발명에 사용된 PEG의 분자량은 특정 범위로 제한되지 않으며, 예시는 본 명세서 도처에 제시된다; 예를 들면, 특정 구체예들에서 5kDa ~ 20kDa 분자량을 갖고, 다른 기타 구체예들에서는 4kDa~10kDa 분자량을 갖는다.
본 발명은 PEGs가 상이한 n 값을 갖고, 따라서 다양한 상이한 PEGs들이 명세서에서 제시된, 콘쥬게이트 화합물 또한 고려한다. 예를 들면, 일부 조성물은 콘쥬게이트 혼합물을 포함하고, 이때 n=1, 2, 3 및 4이다. 일부 조성물들의 경우, 콘쥬게이트(n=1인 경우)의 백분율은 18-25%이며, 콘쥬게이트(n=2인 경우)의 백분율은 50-66%이며, 콘쥬게이트(n=3인 경우)의 백분율은 12-16%이며, 그리고 콘쥬게이트(n=4인 경우)의 백분율은 최대 5%이다. 이러한 조성물은 당업계에 공지된 반응 조건 및 정제 방법에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 반응 조건은 명세서 전반에 걸쳐 기재되어 있다. 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 콘쥬게이트를 분리할 수 있고, 예를 들어, 원하는 수의 PEGs가 부착된 콘쥬게이트가 포함된 분획이 확인되고, 변형되지 않은 단백질 서열과 다른 수의 PEGs가 부착된 콘쥬게이트가 없도록 정제된다.
페길화는 폴리펩티드의 N-말단의 알파 아미노기, 리신 잔기의 측쇄상의 엡실론 아미노기 그리고 히스티딘 잔기의 측쇄상의 이미다졸 기에서 가장 빈번하게 일어난다. 대부분의 재조합 폴리펩티드는 하나의 알파 및 엡실론 아미노기 그리고 이미다졸 기를 보유하기 때문에, 링커 화학 물질에 따라 많은 위치 이성질체가 생성될 수 있다. 당업계에 공지된 일반적인 페길화 전략이 본 발명에 적용될 수 있다.
두 가지 광범위하게 이용되는 제 1 세대 활성화된 단일메톡시 PEGs (mPEGs)는 숙시니미딜 카르보네이트 PEG (SC-PEG; 가령, Zalipsky, et al. (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114; 및 Miron and Wilcheck (1993) Bio-conjug. Chem. 4:568-569 참고)와 벤조트리아졸 카르보네이트 PEG (BTC-PEG; 가령, Dolence, et al. US 특허 번호. 5,650,234 참고), 이들은 리신 잔기와 선호적으로 반응하여 카르바메이트 결합을 형성하지만, 또한 히스티딘 및 티로신 잔기와 반응하는 것으로도 알려져 있다. 특정 분자 (예를 들어, IFNα) 상의 히스티딘 잔기에 대한 결합은 가수 분해에 불안정한 이미다졸 카르바메이트 연계인 것으로 나타났다 (가령, Lee and McNemar, U.S. 특허 번호. 5,985,263 참고). 제 2 세대 페길화 기술은 이러한 불안정한 결합 뿐만 아니라 잔류 물 반응성의 선택성을 피하기 위해 고안되었다. PEG-알데히드 링커의 사용은 환원적 아민화를 통해 폴리펩티드의 N-말단 상의 단일 부위를 표적으로 한다.
PEG는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 서열의 자유 아미노 또는 카르복실기와 폴리에틸렌 글리콜 사이에 결합을 중개하는 말단 반응기 ( ＂스페이서＂)을 통해 본 발명의 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 자유 아미노기에 결합될 수 있는 스페이스를 갖는 PEG는 N-히드록시숙시닐이미드 폴리에틸렌 글리콜인데, 이것은 폴리에틸렌 글리콜의 숙신산 에스테르를 N-히드록시숙시닐이미드로 활성화시킴으로써 만들어질 수 있다. 자유 아미노기에 결합될 수 있는 또다른 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진으로써, 이는 폴리에틸렌 글리콜 단일메틸 에테르를 시아누르산 클로라이드와 반응시킴으로써 만들어질 수 있다. 자유 카르복실기에 결합되는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 폴리옥시에틸렌디아민을 포함한다.
다양한 통상적인 방법을 통하여 본 발명의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 서열을 PEG에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, pH 5~ 10의 용액, 4℃ ~실온의 온도 범위에서 30 분~20 시간 동안, 시약:단백질의 몰 비 4:1~30:1을 이용하여 접합 반응이 실행될 수 있다. 원하는 치환도를 만들 수 있도록 반응을 지시하는 반응 조건이 선택될 수 있다. 일반적으로, 저온, 낮은 pH (가령, pH=5), 및 짧은 반응 시간은 부착되는 PEGs의 수를 감소시키는 경향이 있으며, 반면 고온, 중성 내지 높은 pH (가령, pH≥7), 그리고 더 긴 반응 시간은 부착되는 PEGs 수를 증가시키는 경향이 있다. 당업계에 공지된 다양한 수단을 사용하여 반응을 종결시킬 수 있다. 일부 구체예들에서 상기 반응 혼합물을 산성화시키고, 가령, -20℃에서 동결시킴으로써 상기 반응은 종료된다. 다양한 페길화 분자는 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,252,714; 5,643,575; 5,919,455; 5,932,462; 및 5,985,263에서 논의된다. PEG-IL-10은 가령, U.S. 특허 번호 7,052,686에서 기술된다. 본 발명에서의 사용을 고려한 특정 반응 조건은 실험 단락에 기재되어 있다.
본 발명은 PEG 모방체의 사용 또한 고려한다. PEG의 속성 (예를 들어, 향상된 혈청 반감기)을 유지하면서, 몇 가지 추가적인 유리한 특성을 부여하는 재조합 PEG 모방체가 개발되었다. 예를 들면, PEG와 유사한 연장된 형태를 만들 수 있는 단순 폴리펩티드 쇄 (예를 들면, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser 및 Thr을 포함)는 관심 단백질 약물에 사전 융합된 재조합적으로 만들어질 수 있다 (가령, Amunix＇s XTEN technology; Mountain View, CA). 이로써 제조 공정 동안 부가적인 접합 단계의 필요성이 없어진다. 더욱이, 확립된 분자 생물학 기술은 면역 원성 및 제조 특성의 최적화를 허용하면서 폴리펩티드 사슬의 측쇄 조성을 제어할 수 있게 한다.
당화: 본 발명의 목적을 위하여, ＂당화(glycosylation)＂는 글리칸을 단백질, 지질 또는 다른 유기 분자에 부착시키는 효소 과정을 광범위하게 의미한다. 본 발명과 연계하여 ＂당화＂ 용어는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티의 추가 또는 제거 (기저 당화 부위의 제거에 의해 또는 당화를 화학적 및/또는 효소적 수단을 통하여 제거), 및/또는 고유 서열에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수도 있는 하나 또는 그 이상의 당화 부위를 추가한다는 것을 의미한다. 또한, 상기 문구는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 성질 및 비율의 변화를 포함하는 천연 단백질의 당화의 질적 변화를 포함한다.
당화는 IL-10과 같은 폴리펩티드의 물리적 성질 (예, 용해도)에 극적으로 영향을 미칠수 있고, 단백질 안정성, 분비 및 준세포(subcellular) 국소화에서도 중요할 수 있다. 당화된 폴리펩티드는 또한 향상된 안정성을 나타낼 수 있거나, 반감기와 같은 하나 이상의 약동학 특성을 개선할 수 있다. 또한, 용해도 개선은 예를 들어, 비당화된 폴리펩티드를 포함하는 제제보다 약학 투여에 보다 적합한 제형의 생성을 가능하게할 수 있다.
당화 부위의 추가는 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 폴리펩티드에 변경은 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기 (O-연계된 당화 부위의 경우) 또는 아스파라긴 잔기 (N-연계된 당화 부위의 경우)의 추가 또는 치환에 의해 만들어질 수 있다. 각 유형에서 볼 수 있는 N-연계된 그리고 O-연계된 올리고사카라이드 및 당 잔기들은 상이할 수 있다. 일반적으로 두 가지 모두에서 발견되는 한 가지 유형의 당은 N-아세틸뉴라민산(이하 시알산으로 지칭됨)이다. 시알산은 일반적으로 N-연계된 올리고사카라이드와 O-연계된 올리고사카라이드 모두의 말단 잔기이며, 이의 음전하 때문에, 당 단백질에 산성을 부여할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예는 N-당화 변이체의 생성 및 이용을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 서열은 핵산 수준에서 변화를 통하여 임의선택적으로 변경될 수 있는데, 사전선택된 염기에서 이 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 돌연변이시켜, 원하는 아미노산으로 해독되는 코돈이 생성된다.
폴리시알릴화: 본 발명은 해당 폴리펩티드의 안정성 및 생체내 약동학을 개선시키기 위하여, 자연 발생적, 생물분해가능한 α-(2→8) 연계된 폴리시알산 (＂PSA＂)에 폴리펩티드를 접합시키는 폴리시알릴화의 사용을 또한 고려한다. PSA는 생물분해가능한, 독성이 없는 천연 고분자로서 친수성이 높아서, 혈청 반감기를 증가시키는 혈액에서의 높은 겉보기 분자량을 제공한다. 또한, 다양한 펩티드 및 단백질 치료제의 폴리시알릴화는 현저하게 감소된 단백질 분해, 생체내 활성의 정체, 면역원성 및 항원성의 감소를 가져왔다 (가령, G. Gregoriadis et al., Int. J. Pharmaceutics 300(1-2):125-30 참고). 부위-특이적 폴리시알릴화를 위한 다양한 기술이 이용가능하다 (가령, T. Lindhout et al., PNAS 108(18)7397-7402 (2011) 참고).
알부민 융합: 접합을 위한 추가 적합한 성분 및 분자에는 알부민, 이를 테면, 인간 혈청 알부민 (HSA), 시아노 혈청 알부민, 및 소의 혈청 알부민 (BSA)이 포함된다.
본 발명에 따라, 알부민은 카르복실 말단, 아미노 말단, 카르복실 말단과 아미노 말단 모두에서, 그리고 내부적으로 약물 분자(가령, 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드)에 콘쥬게이트될 수 있다 (가령, USP 5,876,969 및 USP 7,056,701 참고).
본 발명에서 고려되는 HSA-약물 분자 콘쥬게이트에서, 다양한 형태의 알부민, 이를 테면, 알부민 분비 프레(pre)-서열 및 이의 변이체, 이의 단편들 및 이의 변이체들, 그리고 HSA 변이체들이 이용될 수 있다. 이러한 형태는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 원하는 알부민 활성을 보유한다. 추가 구체예들에서, 본 발명은 알부민, 알부민 단편, 및 알부민 변이체, 등등에 직접 또는 간접적으로 융합된 폴리펩티드 약물 분자가 포함된 융합 단백질에 관계하며, 이때 상기 융합 단백질은 융합안된 약물 분자보다 더 높은 혈장 안정성을 갖거나 및/또는 상기 융합 단백질은 융합안된 약물 분자의 치료요법적 활성을 유지한다. 일부 구체예들에서, 간접 융합은 링커, 이를 테면, 펩티드 링커 또는 이의 변형된 형태에 영향을 받는다.
상기에서 암시된 바와 같이, 알부민을 본 발명의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드에 융합시키는 것은 예를 들면, 유전적 조작에 의해 이루어질 수 있는데, HSA를 코딩하는 핵산, 또는 이의 단편이 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산에 연결된다.
알부민 결합을 위한 대안 전략: 직접 융합에 대한 대안으로 몇 가지 알부민 결합 전략이 개발되었고, 본 명세서에서 기술된 상기 IL-10 물질을 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 콘쥬게이트된 지방산 쇄 (아실화)를 통한 알부민 결합 및 알부민 결합 도메인 (ABD) 폴리펩티드 서열과 본 명세서에서 기술된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질을 고려한다.
기타 분자와의 접합(Conjugation): 접합을 위한 추가 적합한 성분 및 분자에는 예를 들면, 티로글로불린; 파상풍 톡소이드; 디프테리아 톡소이드; 폴리아미노산 이를 테면, 폴리(D-리신:D-글루탐산); 로타바이러스의 VP6 폴리펩티드; 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 핵단백질; 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH); 그리고 B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표현 항원; 또는 전술한 것들의 임의의 조합이 포함된다.
따라서, 본 발명은 폴리펩티드 서열의 N-및/또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 추가 성분 또는 분자의 접합을 고려하는데, 이를 테면, 또다른 폴리펩티드 (가령, 상기 대상 폴리펩티드에 이종성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드), 또는 운반체 분자의 접합을 고려한다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 서열은 또다른 성분 또는 분자를 갖는 콘쥬게이트로 제공될 수 있다.
IL-10 폴리펩티드는 또한 크고, 천천히 대사되는 거대 분자, 이를 테면, 단백질; 폴리사카라이드, 이를 테면, 세파로즈, 아가로즈, 셀룰로오스, 또는 셀룰로오스 비드; 중합체 아미노산, 이를 테면, 폴리글루탐산, 또는 폴리리신; 아미노산 공중합체; 비활성화된 바이러스 입자; 비활성화된 박테리아 톡신, 이를 테면, 디프테리아 톡소이드, 파상풍, 콜레라 또는 류코톡신 분자; 비활성화된 박테리아; 및 수지상 세포에 콘쥬게이트되는 것 또한 고려된다. 이러한 콘쥬게이트된 형태는 원하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드에 대항하는 항체를 만드는데 이용될 수 있다.
접합을 위한 추가 후보 성분 및 분자는 단리 또는 정제에 적합한 것들을 포함한다. 특정 비-제한적 실시예로는 결합 분자, 이를 테면, 바이오틴 (바이오틴-아비딘 특이적 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴, 또는 예를 들면, 플라스틱 또는 폴리스티렌 비드, 플레이트 또는 비드, 자석 비드, 테스트 스트립 및 막이 포함된 고형 지지체를 포함하는 분자가 포함된다.
Fc -융합 분자: 특정 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복실-말단은 면역글로불린 Fc 영역 (가령, 인간 Fc)에 융합되어, 융합 콘쥬게이트 (또는 융합 분자)가 형성된다. Fc 융합 콘쥬게이트는 생물 약제의 전신 반감기를 증가시키므로, 생물 의약품의 투여 빈도를 줄일 수 있다.
Fc는 혈관 안을 둘러싸는 내피 세포에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합하고, 그리고 결합시, Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되고, 혈액 순환에 재사용되어 분자는 순환된다. 이러한 Fc 결합은 내인성 IgG가 긴 혈장 반감기를 유지하는 기전으로 여겨진다. 보다 최근의 Fc 융합 기술은 기존의 Fc 융합 접합체와 비교하여, 생물약제의 약동학 및 약력학 특성을 최적화하기 위하여, 항체의 Fc 영역에 생물 의약품의 단일 사본을 연결한다.
기타 변형: 본 발명은 하나 이상의 특성을 개선하기 위해, 현재 알려진, 또는 미래에 개발될 IL-10의 다른 변형의 사용을 고려한다. 예로는 예를 들면, U.S. 특허 출원 번호 2007/0134197 및 2006/0258607에서 기술된 다양한 양태의 헤실화, 그리고 융합 테그로써 SUMO가 포함된 융합 분자가 포함된다 (LifeSensors, Inc.; Malvern, PA).
링커: 링커 및 그 사용에 대해서는 상기에서 설명했다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 서열을 변형시키는데 사용되는 상기 성분 및 분자 중 임의의 것은 임의로 링커를 통해 콘쥬게이트될 수 있다. 적합한 링커에는 일반적으로 변형된 폴리펩티드 서열과 연결된 성분 및 분자 사이의 일부 운동을 허용하기에 충분한 길이를 갖는 ＂유연성 링커(flexible linkers)＂를 포함한다. 상기 링커 분자의 길이는 일반적으로 약 6-50개 원자다. 상기 링커 분자는 예를 들면, 아릴 아세틸렌, 에틸렌 글리콜 2-10개의 단량체 단위, 디아민, 이산성(diacids), 아미노산, 또는 이의 조합들이 함유된 올리고머일 수도 있다. 적합한 링커는 용이하게 선택될 수 있으며, 임의의 적합한 길이, 이를 테면, 1개 아미노산 (가령, Gly), 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 10-20개, 20-30개, 30-50개 또는 50개 이상의 아미노산이 될 수 있다.
유연성 링커의 예로는 글리신 중합체(G)n, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 글리신-세린 중합체(예를 들면, (GmSo)n, (GSGGS)n (서열 번호:11), (GmSoGm)n, (GmSoGmSoGm)n (서열 번호:12), (GSGGSm)n (서열 번호:11), (GSGSmG)n (서열 번호:12) 및 (GGGSm)n (서열 번호:13), 그리고 이들의 조합을 포함하며, 이때 m, n, 및 o는 각각 독립적으로 최소한 1 내지 20의 정수, 가령, 1-18, 2-16, 3-14, 4-12, 5-10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)에서 선택되며, 그리고 다른 유연성 링커들도 포함된다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조를 갖추지 않고, 따라서, 성분들 간의 중성 테더(tether) 역할을할 수 있다. 유연성 링커의 예로는 GGSG (서열 번호:14), GGSGG (서열 번호:15), GSGSG (서열 번호:12), GSGGG (서열 번호:16), GGGSG (서열 번호:17), 및 GSSSG (서열 번호:18)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
유연성 링커의 추가 예로는 글리신 중합체(G)n 또는 글리신-세린 중합체(가령, (GS)n, (GSGGS)n (서열 번호:11), (GGGS)n (서열 번호:13) 및 (GGGGS)n (서열 번호:19)을 포함하며, 여기에서 n=1 ~ 50, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50)이다. 예시적인 유연성 링커는 GGGS (서열 번호:13), GGGGS (서열 번호:19), GGSG (서열 번호:14), GGSGG (서열 번호:15), GSGSG (서열 번호:12), GSGGG (서열 번호:16), GGGSG (서열 번호:17), 및 GSSSG (서열 번호:18)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 이들 링커 서열의 다량체 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 또는 30-50)는 함께 연계되어, 본 명세서에서 개시하고 있는 IL-10 물질에 이종성 아미노산 서열을 콘쥬게이트시키는데 이용될 수 있는 유연성 링커를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 이종성 아미노산 서열은 신호 서열 및/또는 융합짝, 이를 테면, 알부민, Fc 서열, 및 이와 유사한 것들이 될 수 있다.
치료요법적 및 예방적 용도
본 발명은 CAR-T 세포 요법을 받고 있는 환자들에서 활성화-유도된 세포 사멸의 심각성을 방지 또는 감소시키기 위하여 본 명세서에서 설명된 IL-10 물질(가령, PEG-IL-10)의 사용을 고려한다. 더 구체적으로, IL-10 물질은 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하는 방법에 이용되는데, 이 방법은 상기 대상에게 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 도입시키고, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며, 그리고 이때 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸을 유도할 수 있다.
특정 구체예들에서, 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 치료요법적으로 효과량의 상기 IL-10 물질은 상기 대상에게 비경구(가령, 피하)로 투여된다. 다른 구체예들에서, 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포와 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 IL-10 물질이 상기 대상에게 도입된다. 추가 구체예들에서, 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 치료요법적으로 효과량의 IL-10 물질은 상기 IL-10 물질을 발현시키도록 유전적으로 변형되고, 이로 인하여 상기 발현 구조체는 CAR를 발현시키는 세포들과 다른 세포에 존재하는 세포 수단에 의해 상기 대상으로 도입된다.
IL-10 물질을 인코딩하는 유전 물질은 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통하여 세포 안으로 도입될 것이다. 두 가지 주요의 방법은 재조합 바이러스 (바이러스 벡터라고도 함)를 사용하는 방법과 네이키드(naked) DNA 또는 DNA 복합체를 사용하는 방법 (비-바이러스 방법)이 있다. 사용될 수 있는 바이러스의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 단순 포진 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 비-바이러스 방법의 예로는 네이키드 DNA의 주입, 전달을 향상시키는 물리적 방법 (가령, 전기천공) 및 전달을 향상시키기 위한 화학적 방법 (예, 리포플렉스)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특정 구체예들에서, 벡터 (가령, 바이러스 벡터)는 상기 유전자를 운반하도록 유전적으로 작제된다. 상기 벡터는 정맥 내로 투여되거나, 신체의 특정 조직에 직접 주사되어 개별 세포에 흡수된다. 대안으로, 대상으로부터 세포 일부를 제거하여, 생체외 환경에서 벡터에 노출시킨 다음, 이 벡터를 함유하는 세포를 환자에게 되돌려 보낼 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 물질의 발현은 발현 제어 요소에 의해 조절된다.
본 명세서에서 기술하는 IL-10 물질과 병용하여 사용되는 CAR-T 세포 요법을 이용하여 암, 예를 들면, 자궁암, 경부암, 유방암, 전립선암, 고환암, 위장관 (가령, 식도, 구인두, 위, 소장 또는 대장, 결장 또는 직장)의 암, 신장암, 신 세포암, 방광암, 뼈암, 골수암, 피부암, 두경부암, 간암, 담낭암, 심장암, 폐암, 췌장암, 타액선암, 부신암, 갑상선암, 뇌암 (예, 신경아 교종), 신경절암, 중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS) 암 그리고 조혈 시스템 및 면역 체계 (예 : 비장 또는 흉선)의 암을 포함하는, 증식성 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방할 수 있다. 본 발명은 예를 들면, 면역원성 종양, 비-면역원성 종양, 휴면(dormant) 종양, 바이러스-유도된 암 (가령, 상피 세포 암, 내피 세포 암, 편평 세포 암종 및 유두종 바이러스), 선암종, 림프종, 암종, 흑색종, 백혈병, 골수종, 육종, 기형종, 화학적으로 유도된 암, 전이 및 혈관신생을 포함하는 다른 암-관련된 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 방지하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 조절 T-세포 및/또는 CD8+ T-세포의 활성을 조절함으로써, 종양 세포 또는 암 세포 항원에 대한 내성을 감소시키는 것을 고려한다 (가령, Ramirez-Montagut, et al. (2003) Oncogene 22:3180-87; 및 Sawaya, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:1501-09 참고). 특정 구체예들에서, 종양 또는 암은 결장암, 난소암, 유방암, 흑색종, 폐암, 아교모세포종 또는 백혈병이다. 암 관련 질환, 장애 및 상태의 용어(들)의 사용은 암과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 상태를 광범위하게 의미하며, 예를 들어, 혈관신생 및 형성 장애와 같은 전암 상태를 포함한다.
다른 구체예들에서, 본원에 기재된 IL-10 물질과 함께 사용되는 CAR-T 세포 요법은 면역/염증 관련 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어들, 이를 테면, ＂면역 질환＂, ＂면역 상태＂, ＂면역 장애＂, ＂염증 질환＂, ＂염증 상태＂, ＂염증 장애＂ 및 이와 유사한 것들은 면역 또는 염증 관련 질환 (가령, 병리학적 염증 및 자가면역 질환)을 광범위하게 포괄하는 것을 의미한다. 이러한 상태는 종종 다른 질병, 장애 및 상태와 불가분의 관계로 얽혀 있다. 예를 들면, ＂면역 상태＂는 암, 종양 및 혈관신생과 같은 증식성 상태, 가령, 암, 종양 및 혈관신생; (급성 및 만성) 감염, 종양 및 면역계에 의한 박멸에 저항하는 암을 지칭한다.
면역- 및 염증-관련된 질환, 장애 및 상태의 비-제한적인 목록에는 관절염 (가령, 류마티스 관절염), 신부전, 루푸스, 천식, 건선, 대장염, 췌장염, 알레르기, 섬유증, 외과적 합병증 (예를 들어, 염증성 사이토킨이 치유를 예방하는 경우), 빈혈 및 섬유근육통을 포함한다. 만성 염증과 관련될 수 있는 기타 질환 및 장애는 알츠하이머병, 울혈성 심부전증, 뇌졸중, 대동맥 판막 협착증, 동맥경화증, 골다공증, 파킨슨병, 감염, 염증성 장 질환 (가령, 크론병 및 궤양성 장염), 알레르기 접촉 피부염 및 기타 습진, 전신 경화증, 이식 및 다발성 경화증을 포함한다.
약학 조성물
IL-10 물질을 대상에게 투여할 때, 본 발명은 이 대상에게 투여하기에 적합한 임의의 형태의 조성물의 사용을 고려한다. 일반적으로, 이러한 조성물은 IL-10 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 또는 생리학적으로 허용되는 희석제, 운반체 또는 부형제를 포함하는 ＂약학 조성물＂이다. 상기 약학 조성물은 본 발명의 방법에 이용될 수 있고; 따라서, 예를 들면, 상기 약학 조성물은 본 발명에 기술된 치료 및 예방 방법 및 용도를 실시하기 위하여, 대상에게 생체외 또는 생체내로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 의도된 방법 또는 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화될 수 있고; 예시적인 투여 경로가 본 발명에 기재되어 있다 더욱이, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 질병, 장애 및 상태를 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 기재된 바와 같은 다른 치료 학적 활성제 또는 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 전형적으로 본 발명에 의해 고려되는 치료요법적으로 효과량의 IL-10 물질과 하나 또는 그 이상의 약학적으로 그리고 생리학적으로 허용되는 제형 제제를 포함한다. 적합한 약학적으로 수용가능한 또는 생리학적으로 수용가능한 희석제, 운반체 또는 부형제는 항산화제 (가령, 아스코르브산 및 이황화나트륨), 보존제 (가령, 벤질 알코올, 메틸 파라벤, 에틸 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트), 유화제, 현탁화제, 분산제, 용매, 충진제, 벌크제, 세제, 완충제, 비이클, 희석제 및/또는 어쥬번트를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 적합한 비이클은 생리 식염수 용액 또는 시트르산 완충 식염수일 수 있으며, 비경구 투여를 위한 약학적 조성물에서 통상적인 다른 물질이 보충될 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수는 추가 예시적인 비이클이다 당업자는 본 발명에서 의도된 약학적 조성물 및 투여 형태에서 사용될 수 있는 다양한 완충액을 쉽게 인지할 것이다. 전형적인 완충제는 약학적으로 허용되는 약산, 약염기 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 완충 성분은 인산, 타르타르산, 젖산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 글루탐산 및 이들의 염과 같은 수용성 물질일 수 있다. 수용가능한 완충 물질은 예를 들면, 트리스 완충액, N-(2-히드록시에틸)피페르진-N＇-(2-에탄술폰산) (HEPES), 2-(N-몰포리노)에탄술폰산 (MES), 2-(N-몰포리노)에탄술폰산 나트륨 염 (MES), 3-(N-몰포리노)프로판술폰산 (MOPS), 및 N-트리스[히드록시메틸]메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS)을 포함한다.
약학 조성물을 제형화한 후, 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수 또는 동결 건조된 분말로서 멸균 바이알에 저장할 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용 가능한 형태, 사용 전에 재구성이 필요한 동결 건조된 형태, 사용 전에 희석을 요하는 액체 형태, 또는 다른 허용 가능한 형태로 저장될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제 학적 조성물은 일회용 용기 (가령, 단일 사용 바이알, 앰풀, 주사기 또는 자동주사기(가령, EpiPen®와 유사한 것))로 제공되며, 반면 다른 구체예들에서 다중-사용 용기 (가령, 다중-사용 바이알)로 제공된다. 임의의 약물 전달 장치는 IL-10을 전달하는데 사용될 수 있는데, 예를 들면, 임플란트 (예를 들어, 이식 가능한 펌프) 및 카테테르 시스템, 저속 주입 펌프 및 장치들이 이용되며, 이들 모두는 당업자들에게 잘 알려져 있는 것들이다. 일반적으로 피하 투여 또는 근육내 투여되는 디포(Depot) 주사를 사용하여 본 발명에 개시된 폴리펩티드를 정해진 기간 동안 방출시킬 수 있다. 상기 디포 주사는 일반적으로 고체- 또는 유성-기반이며, 일반적으로 본 명세서에 기재된 제제 성분 중 적어도 하나를 포함한다. 당업자는 디포 주사에 가능한 제제 및 용도에 대해 잘 알고 있다.
약학 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 현탁액 형태일 수 있다. 이 현탁액은 본 발명에 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 상기 멸균 조제물은 비경구적으로 수용가능한 비독성 희석제 또는 용매, 이를 테면 1,3-부탄 디올에서 용액 또는 현탁액, 용액일 수 있다. 사용가능한 희석제, 용매 및 분산 매질은 물, 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액, Cremophor EL ™ (BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충된 식염수 (PBS), 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함한다. 추가적으로, 멸균된 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로 이용될 수 있다. 이 목적으로, 임의의 단순(bland) 고정된 오일이 이용될 수 있는데, 합성 모노- 또는 디글리세리드가 포함된다. 더욱이, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용된다. 흡수를 지연시키는 물질 (가령, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴)을 포함시킴으로써, 특정 주사 가능한 제제의 흡수를 연장시킬 수 있다.
활성 성분이 포함된 약학 조성물은 예를 들면, 테블릿, 캡슐, 트로키제(troches), 당의정(lozenges), 수성 또는 지성 현탁액, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멸젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽, 용액, 마이크로비드 또는 엘륵시르(elixirs)와 같은 경구 사용에 적합한 형태일 수 있다. 특정 구체예들에서, 본발명에 기재된 IL-10 물질과 함께 투여되는 물질의 활성 성분은 경구 사용에 적합한 형태이다. 경구 사용에 의도된 약학 조성물은 약학 조성물 제조를 위하여 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 조제될 수 있으며, 이러한 조성물은 약학적으로 세련되고, 맛있는 조제물을 제공하기 위하여 감미제, 풍미제, 발색제 및 보존제가 포함된 하나 또는 그 이상의 물질을 포함할 수 있다. 테블릿, 캡슐 및 이와 유사한 것들은 활성 성분 그리고, 정제의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 무-독성 부형제와의 혼합물로 함유한다. 이들 부형제는 예를 들면, 희석제 이를 테면, 탄산칼슘, 락토즈, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화(granulating) 및 붕해(disintegrating) 물질, 이를 테면, 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 이를 테면, 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 그리고 윤활제, 이를 테면 스테아레이트 마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다.
경구 투여에 적합한 상기 테블릿, 캡슐 및 이와 유사한 것들은 피복되지 않을 수 있거나, 또는 위장관에서 분해 및 흡수를 지연시키고, 이로 인하여 더 오랜 기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공하도록 하기 위하여 공지의 기술에 의해 피복될 수 있다. 예를 들면, 시간-지연 물질, 이를 테면 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 이용될 수 있다. 이들은 또한 당업계에 공지된 기술로 코팅되어, 제어된 방출을 위한 삼투성 치료용 테블릿이 만들어질 수 있다. 투여된 조성물의 운반을 제어하기 위한 추가 물질은 생물분해가능한 또는 생체적합한 입자 또는 중합체 물질, 이를 테면, 폴리에스테르, 폴리아민산, 히드로겔, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 에틸렌-비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 프로파민 술페이트, 또는 락티드/글리콜리드 공중합체, 폴리락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 에틸렌비닐아세테이트 공중합체를 포함한다. 예를 들면, 경구제는 코아세르베이션 기술, 또는 계면중합에 의해 제조된 마이크로 캡슐 안에, 차례로 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로 캡슐 또는 폴리(메틸메타크롤레이트) 마이크로캡슐 안에, 또는 콜로이드 약물 전달 시스템 안에 포획 될 수 있다. 콜로이드 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노-캡슐, 마이크로스피어, 마이크로비드, 그리고 수중유 유제, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜을 비롯한 지질-기초된 시스템을 포함한다. 상기 언급된 제형의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다.
경구용 제형은 경질 젤라틴 캡슐로 제공될 수 있고, 이때 활성 성분은 불활성 고형 희석제, 예를 들면, 칼슘 카르보네이트, 인산칼슘염, 카올린 또는 미소결정 셀룰로오스이며, 또는 연질 젤라틴 캡슐로 제공될 수 있고, 이때 활성 성분은 물 또는 유질 매질, 예를 들면, 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브오일과 혼합된다.
수성 현탁액은 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들면 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알기네이트 나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트라가탄 검 및 아카시아검; 분산 또는 습윤제, 예를 들면, 자연-발생적 인지질 (가령, 레시틴), 또는 지방산과 알킬렌 산화물의 축합 산물 (가령, 폴리옥시-에틸렌 스테아레이트), 또는 장쇄 지방족 알코올 (가령, 헵타데카에틸렌옥시세탄올의 경우)과 에틸렌 산화물의 축합 산물, 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분적 에스테르 (가령, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트)와 에틸렌 산화물의 축합 산물, 또는 지방산과 헥시톨 안하이드리드 (가령, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트)로부터 유도된 부분적 에스테르와 메틸렌 산화물의 축합 산물일 수 있다. 수성 현탁액은 하나 또는 그 이상의 보존제를 포함할 수도 있다.
유성 현탁액은 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일, 또는 액체 파라핀과 같은 광유에 활성 성분을 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 유성 현탁액은 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 증점제를 함유할 수 있다. 상기 제시된 바와 같이, 감미제 및 풍미제를 첨가하여 맛좋은 구강 제제를 제공할 수 있다.
물을 첨가하여, 수성 현탁액을 제조하는데 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 또는 그 이상의 보존제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제가 본 발명에 예시된다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 수중유(oil-in-water) 에멀젼의 형태일 수 있다. 유성 상은 식물성 오일, 예를 들면, 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 또는 미네랄 오일, 예컨대, 액체 파라핀 또는 이들의 혼합물 일 수 있다. 적합한 유화제는 자연 발생 검(gums), 예를 들면, 아카시아검 또는 트라가탄검; 자연 발생 인지질, 예를 들면, 대두, 레시틴, 및 지방산으로부터 유도된 에스테르 또는 부분적 에스테르; 헥시톨 안하이드리드, 예를 들면, 소르비탄 모노올레이트; 그리고 에틸렌 산화물과 부분적 에스테르의 축합 산물, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다.
제제는 또한 임플란트, 리포좀, 하이드로겔, 전구약물(prodrugs) 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제제와 같이 급속한 분해 또는 신체로부터의 제거로부터 조성물을 보호하는 운반체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트 단독으로, 또는 밀랍과 복합된, 시간 지연 물질이 사용할 수 있다.
본 발명은 직장 투여를 위한 좌약 형태로 상기 IL-10 폴리펩티드의 투여를 고려한다. 좌약은 상온에서 고체이지만, 직장 온도에서 액체가 되고, 따라서 직장에서 용해되어 약물을 방출하는데 적절한 비-자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제조될 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
상기 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10) 및 본 발명에서 고려된 기타 물질들은 현재 공지된 또는 미래 개발될 임의의 다른 적합한 약학 조성물 (가령, 비강 또는 흡입용 스프레이) 형태일 수도 있다.
제제 안에 폴리펩티드 (가령, IL-10) 또는 이의 단편 농도는 상당히 가변적일 수 있으며 (가령, 약 0.1% 미만, 통상적으로 최소한 2%에서 최대 20%~ 50% 또는 그 이상의 중량비), 일반적으로, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 유체 부피, 점도 및 대상-기반의 인자에 기초하여 주로 선택될 것이다.
투여 경로
본 발명은 임의의 적절한 방식으로 상기 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10), 및 이의 조성물의 투여를 고려한다. 적합한 투여 경로는 비경구 (가령, 근육내, 정맥, 피하 (가령, 주사 또는 임플란트), 복강내, 낭내(intracisternal), 관절내, 복강내, 대뇌 (뇌실질(intraparenchymal) 및 뇌실내), 구강, 비강, 질, 설하, 안공내, 직장, 국소 투여 (가령, 경피), 설하 및 흡입을 포함한다. 일반적으로 피하 투여 또는 근육내 투여되는 디포(Depot) 주사를 사용하여 본 발명에 개시된 IL-10 물질을 정해진 기간 동안 방출시킬 수 있다..
본 발명의 일부 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)은 비경구로 투여되며, 추가 특정 구체예들에 있어서 상기 비경구 투여는 피하 투여다.
CAR-T 세포 요법에 있어서, 대상에게 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 도입시키는 대체 수단이 기술되는데, 이때 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며, 그리고 이때 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸을 유도할 수 있다.
복합 요법(COMBINATION THERAPY)
본 발명에서 기술된 CAR-T T 세포 요법에 추가적으로, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 활성 물질 (가령, 화학치료요법 물질) 또는 기타 예방적 또는 치료요법적 비-약학적 형태 (가령, 국소 방사선 요법 또는 전신 방사선 요법)과 복합하여 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)의 사용을 고려한다. 예를 들면, 본 발명은 치료 양생을 고려하는데, 이때 방사선 단계가 선행되거나, 또는 하나 또는 그 이상의 추가 요법 (가령, CAR-T T 세포 요법과 IL-10 물질의 투여) 또는 본 명세서에서 개시된 바와 같은 물질과 함께 치료 한 후 시행된다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 골수 이식, 말초 혈액 줄기 세포 이식 또는 다른 유형의 이식 요법과 조합하여, CAR-T T 세포 요법 및 IL-10 물질(가령, PEG-IL-10)의 사용을 추가로 고려한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ＂복합 요법＂은 별도로 투여되거나, 또는 도입된, 가령, 별도 투여를 위해 별도로 제형화되거나(예를 들어, 키트로 제공될 수 있는 바와 같이), 그리고 함께 투여되거나 도입될 수 있는 치료법을 포함하는 의미다. 특정 구체예들에서, 상기 IL-10 물질과 기타 물질(들)은 연속적으로 투여 또는 적용되는데, 가령, 한 물질이 하나 또는 그 이상의 기타 물질보다 먼저 투여된다. 다른 구체예들에서, 상기 IL-10 물질과 기타 물질(들)은 동시에 투여되는데, 가령, 2가지 또는 그 이상의 물질은 동시 또는 거의 동시에 투여되고; 2가지 또는 그 이상의 물질은 2가지 또는 그 이상의 별도 제형안에 존재하거나, 또는 단일 제형(가령, 공동-제형) 안에 복합될 수 있다. 상기 물질이 순차적으로 또는 동시에 투여되는지 여부에 관계없이, 본 발명의 목적을 위해 복합 투여되는 것으로 간주된다.
본 발명의 IL-10 물질은 상황에 따라 임의의 방식으로 적어도 하나의 다른 활성제와 조합하여 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 IL-10 물질과 기타 물질(들)을 이용한 치료는 기간에 걸쳐 유지된다. 또다른 구체예에서, 최소한 하나의 기타 물질(들)을 이용한 치료는 감소 또는 중단되며 (가령, 해당 대상이 인정적인 경우), 한편 본 발명의 IL-10 물질(가령, PEG-IL-10)은 지속적 투약 요법으로 유지된다. 추가 구체예에서, 최소한 하나의 기타 물질(들)을 이용한 치료는 감소 또는 중단되며 (가령, 해당 대상이 안정적인 경우), 한편 본 발명의 IL-10 물질을 이용한 치료는 감소된다(가령, 더 낮은 투여분량, 더 적은 빈도의 투여, 또는 치료 양생의 단축). 여전히 또다른 구체예에서, 최소한 하나의 기타 물질(들)을 이용한 치료는 감소 또는 중단되며 (가령, 해당 대상이 안정적인 경우), 한편 본 발명의 IL-10 물질을 이용한 치료는 증가된다(가령, 더 높은 투여분량, 더 빈번한 빈도의 투여, 또는 치료 양생의 연장). 추가 구체예에서, 최소한 하나의 기타 물질(들)을 이용한 치료는 유지되며, 한편 본 발명의 IL-10 물질을 이용한 치료는 감소 또는 중단된다(가령, 더 낮은 투여분량, 더 적은 빈도의 투여, 또는 치료 양생의 단축). 추가 구체예에서, 최소한 하나의 기타 물질(들)을 이용한 치료는 감소 또는 중단되며, 한편 본 발명의 IL-10 물질(가령, PEG-IL-10)을 이용한 치료는 감소 또는 중단된다(가령, 더 낮은 투여분량, 더 적은 빈도의 투여, 또는 치료 양생의 단축).
본 발명에서 기술된 CAR-T T 세포 요법과 병용하여, 본 발명은 증식성 상태, 암, 종양, 또는 전암 질환, 장애 또는 상태를 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)과 원하는 활성을 나타내는 최소한 하나의 추가 치료요법적 또는 예방적 물질(들) 또는 진단 물질로 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 본 발명의 구체예들은 전통적인 화학요법 치료제 (가령, 알킬화제, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 항생제, 항-대사산물, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 항호르몬제 및 탁소이드(taxoids))의 사용을 고려한다. 기타 본 발명의 구체예들은 종양 성장의 부가적 또는 공조적 억제를 얻기 위하여 신호 변환 억제제 (가령, GLEEVEC 또는 HERCEPTIN) 또는 면역조절제와 복합하여 본 명세서에서 기술하고 있는 IL-10 물질을 투여하는 것을 포함하는 종양 억제 또는 종양 성장을 위한 방법들을 고려한다.
본 명세서에서 기술하고 있는 CAR-T T 세포 요법과 병용하여, 본 발명은 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10), 그리고 원하는 활성을 나타내는 최소한 하나의 추가 물질(들) 또는 진단 물질들과 함께, 면역- 및/또는 염증-관련된 질환, 장애 및 상태, 뿐만 아니라 이들과 연관된 장애를 치료 및/또는 방지하는 방법을 또한 제공한다. 복합 요법에 유용한 치료요법적 물질의 예로는 비-스테로이드 항-염증 약물 (NSAIDs), 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제, 스테로이드, TNF 길항제 (가령, REMICADE 및 ENBREL), 인터페론-β1a (AVONEX), 인터페론-β1b (BETASERON), 및 면역 점검 억제제 (가령, YERVOY)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
투여
본 발명의 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)은 예를 들면, 투여 목적 (가령, 원하는 해결 정도); 투여될 제형의 대상 연령, 체중, 성별 및 건강 및 신체 상태; 그리고 투여 경로에 의존적인 양으로 해당 대상에게 투여될 수 있다. 효과적인 투여량 및 투여 방법은 예를 들어, 안전 및 용량-증가 시험, 생체내 연구 (가령, 동물 모델) 및 당업자에게 공지된 다른 방법으로부터 용이하게 결정될 수 있다.
다른 곳에서 상세하게 논의된 바와 같이, 본 발명은 IL-10의 투여로 특정 혈청 최저 농도를 달성하고, 투여 및/또는 특정 혈청 평균 최저 농도를 유지하는 구체예를 고려한다.
일반적으로, 투여 매개변수는 환자에게 비가역적으로 독성일 수 있는 양 (즉, 최대 허용 투약량, ＂MTD＂)보다 작은 양, 그리고 상기 대상에서 측정가능한 효과를 발생시키는데 필요한 양보다 적지 않은 양을 나타낸다. 이러한 양은 예를 들어, 투여 경로 및 다른 요인을 고려하여, ADME와 관련된 약동학 및 약력학 파라미터에 의해 결정된다.
효과적인 투여분량 (ED)은 그것을 복용하는 대상의 일부분에서 치료 반응 또는 원하는 효과를 나타내는 약제의 투여분량 또는 양이다. 물질의 ＂정중 효과 분량＂ 또는 ED50은 이것을 투여하는 집단의 50%에서 치료 반응 또는 원하는 효과를 나타내는 약제의 투여분량 또는 양이다. ED50은 해당 물질의 효과에 대한 합리적인 기대치의 척도로 흔히 사용되지만, 임상의가 모든 관련 요인을 고려하여 적절하다고 생각할 수 있는 복용량일 필요는 없다. 따라서, 일부 경우에서 유효량은 산출된 ED50보다 많을 수 있고, 다른 경우에서 유효량은 산출된 ED50보다 적을 수 있고, 여전히 다른 상황에서, 유효량은 산출된 ED50과 동일할 수 있다.
PEG-IL-10의 치료요법적으로 효과량은 약 0.01 ~ 약 100 μg 단백질/체중 kg/일, 약 0.1 ~ 20 μg 단백질/체중 kg/일, 약 0.5 ~ 10 μg 단백질/체중 kg/일, 또는 약 1 ~ 4 μg 단백질/체중 kg/일 범위가 될 수 있다. 일부 구체예들에서, PEG-IL-10은 약 50 ~ 800 μg 단백질/체중 kg/일 (가령, 약 1 ~16 μg 단백질/체중 kg/일의 PEG-IL-10)를 전달하기 위하여 연속 주입에 의해 투여된다. 주입 속도는 예를 들면, 부작용 및 혈액 세포 수의 평가에 따라 달라질 수 있다. IL-10 물질에 대한 다른 특정 투여 매개변수는 본 명세서의 도처에서 설명된다.
특정 구체예들에서, 개시된 IL-10 물질의 투여량은 ＂단위 투여형＂ 안에 포함된다. ＂단위 투여형(unit dosage form)＂이라는 문구는 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각각의 단위는 본 발명의 IL-10 물질 단독, 또는 원하는 효과를 만드는데 충분한 하나 또는 그 이상의 추가 물질과 복합된 미리결정된 양을 함유한다. 단위 투약형의 매개 변수는 특정 물질 및 달성될 효과에 달라짐을 이해할 것이다.
키트
본 발명은 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10), 및 이의 약학 조성물을 포함하는 키트를 또한 고려한다. 키트는 일반적으로 하기 기술된 바와 같이, 다양한 성분을 수용하는 물리적 구조의 형태이고, 예를 들어 상기 기술된 방법의 실시에 이용될 수 있다.
키트는 본 명세서에서 기술하고 있는 IL-10 물질 (가령, PEG-IL-10)를 포함할 수 있고(가령, 멸균 용기에 제공), 이것은 대상에게 투여하는데 적합한 약학 조성물 형태일 수 있다. 상기 IL-10 물질은 바로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들면, 투여 전에 재구성 또는 희석이 필요한 형태로 제공될 수 있다. IL-10 물질이 사용자에 의해 재구성되어야 하는 형태인 경우, 키트는 또한 IL-10 물질와 함께 포장되거나, 또는 별도로 포장된 완충제, 약학적으로 허용되는 부형제 및 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다. 키트는 또한 IL-10 물질 및/또는 사용되는 특정 CAR-T T 세포 요법의 성분들 모두를 함유할 수 있고; 이 키트는 여러 물질을 개별적으로 포함할 수 있거나 또는 이미 키트 안에서 복합될 수 있다. 본 발명의 키트는 그 안에 수용된 구성 요소를 적절하게 유지하는데 필요한 조건 (예를 들어, 냉동 또는 냉동)을 위해 설계될 수 있다.
키트에는 라벨 또는 포장 삽입물이 포함될 수 있는데, 여기에는 해당 구성 요소에 대한 식별 정보 및 사용 지침(가령, 투여 매개변수, 작용 기전(들), 약동학적 내지 약력학, 부작용, 금기사항, 등등이 포함된 활성 성분(들)의 임상 약리학)이 포함된다. 키트의 각 구성 요소는 개별 용기 내에 포함될 수 있으며, 모든 다양한 용기는 단일 포장 내에 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는 로트 번호 및 유통기한과 같은 제조업체 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 예를 들어, 구성 요소를 수용하는 물리적 구조에 통합되거나, 물리적 구조 내에 별도로 포함되거나, 또는 키트의 구성 요소(가령, 앰풀, 주사기 또는 바이알)에 부착될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 디스크 (예를 들어, 하드 디스크, 카드, 메모리 디스크), CD- 또는 DVD-ROM/RAM과 같은 광학 디스크, DVD, MP3 등의 컴퓨터 판독 가능 매체를 추가로 포함할 수 있거나, 또는 자기 테이프, 또는 RAM 및 ROM과 같은 전기적 저장 매체 또는 자기/광 저장 매체, 플래시 매체 또는 메모리-타입 카드와 같은 이들의 하이브리드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 실제 사용설명서가 키트 내에 존재하지 않고, 원격 공급원으로부터, 예를 들면, 인터넷 사이트를 통해 사용설명서를 획득하기 위한 수단이 제공된다.
실험
다음 실시예는 당업자에게 본 발명을 만들고 이용하는 방법에 관한 완전한 개시와 설명을 제공하기 위해 제안되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않고, 또한 이들은 아래 실험이 수행되거나, 그리고 수행될 수 있는 모든 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 현재 시제로 기술된 예시적인 설명은 반드시 수행될 필요는 없으며, 여기에서 설명된 데이터 등을 생성하기 위해 기술내용이 수행될 수 있음을 이해해야 한다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다.
달리 지시되지 않으면, 분율은 중량에 의한 분율이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도 (℃)이고, 그리고 압력은 대기압 또는 이에 가깝다. 다음을 포함하는 표준 약어들이 이용된다: s 또는 sec = 초(들); 분 = 분(들); h 또는 hr = 시간(들); aa = 아미노산(들); bp = 염기쌍(들); kb = 켈로베이스(들); nt = 뉴클레오티드(들); ng = 나노그램; μg = 마이크로그램; mg = 밀리그램; g = 그램; kg = 킬로그램; dl 또는 dL = 데시리터; μl 또는 μL = 마이크로리터; ml 또는 mL = 밀리리터; l 또는 L = 리터; nM = 나노몰; μM = 마이크로몰; mM = 밀리몰; M = 몰; kDa = 킬로달톤; i.m. = 근육내(로); i.p. = 복강내(로); SC 또는 SQ = 피하(로); HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; BW = 체중; U = 단위; ns = 통계학적으로 유의적이지 않음; PMA = 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트; PBS = 인산염-완충된 염수; DMEM = Eagle 배지의 Dulbeco의 변형; PBMCs = 일차 말초 혈액 단핵 세포; FBS = 태아 소 혈청; FCS = 태아 송아지 혈청; HEPES = 4-(2-히드록시에틸)-1-피페르진에탄술폰산; LPS = 리포폴리사카라이드; RPMI = Roswell Park Memorial Institute 배지; APC = 항원 제시 세포; FACS = 형광-활성화된 세포 분류.
재료와 방법
다음의 일반적인 물질 및 방법을 표시된 경우에 사용하였거나, 또는 아래의 실시예에서 사용될 수 있다:
분자 생물학 절차. 분자 생물학의 표준 방법은 과학 문헌에 기술되어 있다(가령, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; and Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y. 참고, 여기에는 박테리아 세포에서 클로닝 및 DNA 돌연변이생성 (Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서 클로닝 (Vol. 2), 글리코콘쥬게이트 및 단백질 발현 (Vol. 3), 그리고 생물정보학 (Vol. 4)이 설명되어 있다).
항체-관련된 프로세스 폴리클론 및 단일클론 항체들을 만들고, 정제하고 단편화하는 것이 설명된다 (가령, Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); 리간드/수용체 상호작용을 특징화하는 표준 기술이 이용가능하고 (가령, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., NY); 형광-활성화된 세포 분류(FACS)가 포함된 유동 세포측정 방법이 이용가능하고 (가령, Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ); 그리고 핵산 프라이머 및 프로브가 포함된 핵산, 폴리펩티드, 그리고 항체들을 가령, 진단 시약으로 이용하기 위하여 변형시키는데 적합한 형광 시약이 이용가능하다 (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO.). 항체에 대한 자세한 논의는 본 명세서의 도처에서도 볼 수 있다.
소프트웨어. 가령, 항원 단편들, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능 도메인, 당화 부위, 및 서열 정렬을 결정하는 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용가능하다 (가령, GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); 및 DeCypher™ (TimeLogic Corp., Crystal Bay, NV) 참고.
페길화 ( Pegylation ). 본 명세서에서 개시된 바와 같이 , 당업자에 공지된 임의의 수단에 의해 페길화된 IL-10이 합성될 수 있다. 단일-PEG-IL-10 및 단일-/2-PEG-IL-10 믹스를 만드는 예시적인 합성 과정이 설명되어 있다 (가령, U.S. 특허 번호. 7,052,686; US 특허 공개 번호 2011/0250163; WO 2010/077853). 본 발명의 특정 구체예들은 선택적으로 페길화된 단일- 및 2-PEG-IL-10의 믹스를 포함한다. 본 발명 실시에서 적합한 PEGs의 생산 및 사용(그리고 기타 약물 운반 기술)에 있어서 자신의 기술을 활용하는 것 이외에도, 당업자는 PEG 관련 기술의 많은 상업적 공급업자(가령, NOF America Corp (Irvine, CA) 및 Parchem (New Rochelle, NY))들을 잘 알고 있다 .
동물. 당업자에게 공지된 다양한 마우스 및 다른 동물 계통이 본 발명의 교시와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역적격성 Balb/C 또는 B-세포 - 결핍 Balb/C 마우스는 The Jackson Lab., Bar Harbor, ME에서 구할 수 있고, 표준 절차에 따라 이용될 수 있다 (가령, Martin et al (2001) Infect. Immun., 69(11):7067-73 및 Compton et al. (2004) Comp. Med. 54(6):681-89 참고).
IL-10 농도. 혈청 IL-10 농도 수준 및 노출 수준은 당분야에 이용되는 표준 방법에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 실험 대상이 마우스인 경우, 꼬리 잘힌 마우스의 전혈(~50 ㎕/마우스)을 모세혈관에 수집하고, 원심분리를 통하여 혈청과 혈액 세포를 분리시키고, ELISA 키트 및 기술을 이용하여 IL-10 노출 수준을 결정함으로써, 혈청 노출 수준 분석이 실행될 수 있다.
FACS 분석. FACS 분석을 위한 수많은 프로토콜, 재료 및 시약은 상업적으로 이용 가능하며, 명세서의 교시와 함께 사용될 수 있다 (가령, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ; Cell Signaling Technologies, Danford, MA; Abcam, Cambridge, MA; Affymetrix, Santa Clara, CA). 직접 유동 세포분석 (가령, 콘쥬게이트된 일차 항체이용)과 간접 유동 세포분석 (가령, 일차 항체와 콘쥬게이트된 제 2 차 항체)이 이용될 수 있다. 예시적인 직접 유동 프로토콜은 다음과 같다: 수거한 세포를 세척하고, 세포 현탁액은 얼음처럼 차가운 PBS, 10% FCS, 1% 아지드 나트륨 안에 1-5 x 106 세포/mL의 농도로 조정한다. 세포는 폴리스티렌 밑둥근 12 x 75 mm2 Falcon 튜브 안에서 착색될 수 있다. 세포가 충분히 원심 분리되어, 상청액은 세포의 손실이 거의 없이 제거될 수 있지만, 이 세포를 재현탁시키기 곤란할 정도는 아니다. 일차 라벨된 항체가 추가될 수 있고 (0.1-10 μg/mL), 필요하다면, 희석액은 3% BSA/PBS에서 만들어질 수 있다. 최소한 30 분 동안 4℃에서 항온처리 후, 400 g에서 5 분 동안 3x 원심분리함으로써 세포가 세척될 수 있고, 그 다음 0.5 - 1 mL의 얼음처럼 차가운 PBS, 10% FCS, 1% 아지드 나트륨에서 재현탁될 수 있다. 분석할 때까지(바람직하게는 같은 날) 세포는 얼음 위에서 암 상태로 유지될 수 있다. 세포는 표준 방법론을 사용하여 며칠 동안 보존할 수 있고; 상이한 항원에 대한 고정은 항원-특이적 최적화를 요구할 수 있다.
이하에 기술된 분석은 대표적인 것이지만, 배타적이지 않다.
PBMC 및 CD8 + T-세포 유전자 발현 분석. 다음 프로토콜은 유전자 발현을 검사하는 예시적인 분석법을 제공한다.
인간 PBMCs는 임의의 표준 프로토콜에 따라 단리될 수 있다 ( 가령, Fuss et al. (2009) Current Protocols in Immunology, Unit 7.1, John Wiley, Inc., NY 참고). RPMI (Life Technologies; Carlsbad, CA), 10 mM HEPES (Life Technologies; Carlsbad, CA), 10% FCS (Hyclone Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA) 및 페니실린/스트렙토마이신 칵테일(Life Technologies; Carlsbad, CA)이 함유된 완전 RPMI로 임의의 표준 조직 배양물 처리된 6-웰 플레이트 (BD; Franklin Lakes, NJ)에서 웰당 2.5 mL의 PBMCs (세포 밀도 8 백만 세포/mL)가 배양될 수 있다. 인간 페길화된-IL-10은 100 ng/mL의 최종 농도로 웰에 추가되고, 7-일 항온처리될 수 있다. CD8+ T-세포는 Miltenyi Biotec＇s MACS 세포 분리 기술을 이용하여, 제작자의 프로토콜 (Miltenyi Biotec; Auburn, CA)에 따라 PBMCs로부터 단리될 수 있다. RNA는 추출될 수 있고, 단리된 CD8+ T-세포와 CD8+ T-세포 고갈된-PBMCs로부터 각각 Qiagen＇s RNeasy Kit 및 RT2 First Strand Kit를 이용하여 제작자(Qiagen N.V.; Netherlands)의 지침에 따라 cDNA가 합성될 수 있다. 정량적인 PCR은 cDNA 주형 상에서 RT² SYBR Green qPCR Mastermix 및 프라이머 (IDO1, GUSB, 및 GAPDH)(Qiagen)를 이용하여, 제작자의 프로토콜에 따라 시행될 수 있다. IDO1 Ct 값은 하우스키핑(housekeeping) 유전자, GUSB 및 GAPDH의 평균 Ct 값으로 표준화될 수 있다.
PBMC 및 CD8 + T-세포 사이토킨 분비 분석 PEG-IL-10으로 처리하고, 그 다음 항-CD3 항체로 처리하였을 때, 활성화된 일차 인간 CD8+ T-세포는 IFN-γ 를 배출한다. 다음 프로토콜은 사이토킨 분비를 검사하는 예시적인 분석법을 제공한다.
인간 PBMCs는 임의의 표준 프로토콜에 따라 단리될 수 있다 (가령, Fuss et al. (2009) Current Protocols in Immunology, Unit 7.1, John Wiley, Inc., NY 참고). RPMI (Life Technologies; Carlsbad, CA), 10 mM HEPES (Life Technologies; Carlsbad, CA), 10% FCS (Hyclone Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA) 및 페니실린/스트렙토마이신 칵테일(Life Technologies; Carlsbad, CA)이 함유된 완전 RPMI로 임의의 표준 조직 배양물 처리된 6-웰 플레이트 (BD; Franklin Lakes, NJ)에서 웰당 2.5 mL의 PBMCs (세포 밀도, 8 백만 세포/mL)가 배양될 수 있다. 인간 페길화된-IL-10은 100 ng/mL의 최종 농도로 웰에 추가되고, 3-일 항온처리될 수 있다. CD8+ T-세포는 Miltenyi Biotec＇s MACS 세포 분리 기술을 이용하여, 제작자의 프로토콜 (Miltenyi Biotec; Auburn, CA)에 따라 PBMCs로부터 단리될 수 있다. 상기 단리된 CD8+ T-세포는 1 μg/mL 항-CD3 항체 (Affymetrix eBioscience)를 함유하는 완전 RPMI로 임의의 표준 조직 배양 플레이트에서 4 시간 동안 배양될 것이다. 4-시간 항온처리 후, 배지를 수거하고, 시판되는 ELISA 키트와 제작자의 프로토콜 (Affymetrix eBioscience)에 따라 IFN-γ에 대하여 분석될 수 있다.
TNFα 억제 분석. U937 세포(Sigma-Aldrich (#85011440)에서 이용가능한 림프모세포 인간 세포 계통; St. Louis, MO)의 PMA-자극으로 이 세포는 TNFα를 방출하게 되고, 이들 TNFα-방출 세포를 인간 IL-10로 후속 처리하면, 약량-의존적인 방식으로 TNFα 분비가 감소된다. 다음의 프로토콜을 이용하여 예시적인 TNFα 억제 분석이 실시될 수 있다.
10% FBS/FCS 및 항생제를 포함하는 RMPI에서 U937 세포를 배양한 후, 1 x 105, 90% 생존가능한 U937 세포를 96-웰 편평한 바닥 플레이트 (임의의 혈장-처리된 조직 배양 플레이트 (가령, Nunc; Thermo Scientific, USA)가 이용될 수 있음)에서 조건당 삼중으로 도말된다. 다음 조건을 제공하기 위하여 세포를 도말한다(모두 최소한 삼중; ＇배지 단독'의 경우 웰의 수를 배로 하는데, 그 이유는 절반은 10 nM PMA로 항온처리 후 생존능에 이용될 것이기 때문이다): 5 ng/mL LPS 단독; 5 ng/mL LPS+ 0.1 ng/mL rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 1 ng/mL rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 10 ng/mL rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 100 ng/mL rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 1000 ng/mL rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 0.1ng/mL PEG-rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 1 ng/mL PEG-rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 10 ng/mL PEG-rhIL-10; 5 ng/mL LPS+ 100 ng/mL PEG-rhIL-10; 및 5 ng/mL LPS+ 1000 ng/mL PEG-rhIL-10. 각 웰은 10 nM PMA/200 μL에 24 시간 동안 노출되며, 37℃에서 5% CO2 배양기에서 배양하고, 그 이후 세포의 ~90%는 흡착되어야 한다. 3개의 별도 웰은 재-현탁될 수 있고, 이 세포를 카운트하여 생존능을 평가한다 (>90%는 생존가능하다). 새로운, 비-PMA-함유 배지로 부드럽게, 그러나 철저하게 세척하여(3X), 세포가 웰 안에 여전히 있도록 한다. 적절한 농도 (2X, 이 용적은 100% 희석될 것이기 때문에)의 100 μL rhIL-10 또는 PEG-rhIL-10을 포함된 배지의 각 웰에 추가하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 30 분 동안 배양한다. 각 웰에서 5 ng/mL LPS의 최종 농도를 얻기 위하여 웰당 10 ng/mL 스톡 LPS를 100 μL 추가하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 18-24 시간 동안 배양한다. 상청액을 제거하고, 제조업체의 지침에 따라 TNFα ELISA를 수행한다. ELISA에서 이중으로 각 조건화된 상청액을 운용한다.
MC/9 세포 증식 분석. IL-10를 MC/9 세포 (Cell Signaling Technology에서 이용가능한 비만 세포 특징을 갖는 뮤린 세포 계통; Danvers, MA)에 투여하면 약량-의존적 방식으로 세포 증식이 증가된다. Thompson-Snipes, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:507-10)는 MC/9 세포에 IL3+ IL-10 및 IL-3+ IL-4+ IL-10이 보충된 표준 분석 프로토콜을 설명한다. 공급업자 (가령, R&D Systems, USA; 및 Cell Signaling Technology, Danvers, MA)는 이 분석을 rhIL-10의 로트 방출 분석으로 이용한다. 당업자는 Thompson-Snipes, L.et al.에 기재된 표준 분석 프로토콜을 변형시킬 수 있고, 이 세포에는 IL-10만 보충된다.
활성화-유도된 세포 사멸 분석. 다음 프로토콜은 예시적인 활성화-유도된 세포 사멸 분석을 제공한다.
인간 PBMCs는 임의의 표준 프로토콜에 따라 단리될 수 있다 (가령, Fuss et al. (2009) Current Protocols in Immunology, Unit 7.1, John Wiley, Inc., NY 참고). CD8+T 세포 (CD45RO+)는 Miltenyi Biotec의 항-CD45RO MACS 비드와 MACS 세포 분리 기술을 이용하여, 제작자의 프로토콜 (Miltenyi Biotec; Auburn, CA)에 따라 단리될 수 있다. 세포를 활성화시키기 위하여, 1 mL의 단리된 세포 (밀도는 3 x 106 세포/mL)는 항-CD3 및 항-CD28 항체들 (Affymetrix eBioscience, San Diego, CA)로 사전-피복된 표준 24-웰 플레이트(BD; Franklin Lakes, NJ)에서 AIM V 배지(Life Technologies; Carlsbad, CA)에 3일동안 배양될 수 있다. 사전-피복 과정은 10 μg/mL 항-CD3 및 2 μg/mL 항-CD28 항체들이 함유된 300 μL의 카르보네이트 완충액 (0.1 M NaHCO3 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 0.5 M NaCl (Sigma-Aldrich), pH 8.3)을 각 웰에 추가하고, 2 시간 동안 37℃에서 항온처리하고, 그리고 각 웰을 AIM V 배지로 세척하여 실시할 수 있다. 3-일 활성화 기간 이후, 세포는 수거되고, 카운트되고, 표준 24-웰 플레이트에서 1 mL 의 AIM V 배지에 재-도말되고 (밀도는 2 x 106 세포/mL), 그리고 100 ng/mL PEG-hIL-10로 3일 동안 처리될 수 있다. 활성화 및 PEG-hIL-10을 이용한 처리 프로세스는 반복될 수 있고, 그 이후 생존가능한 세포는 제작자 (Life Technologies)의 프로토콜에 따라 Trypan Blue 압출에 의해 카운트될 수 있다.
종양 모델 및 종양 분석. 당업계에서 허용되는 임의의 종양 모델, 분석법 및 이와 유사한 것들은 다양한 종양에 대해 본 명세서에 기술된 IL-10 물질의 효과를 평가하는데 사용될 수 있다. 아래에서 설명하는 종양 모델 및 종양 분석은 활용할 수 있는 종양 모델을 대표한다. 신생 마우스 종양 세포는 종양 접종당 104, 105 또는 106 세포로 피하 또는 피내 주사된다. Ep2 유방암, CT26 결장암, PDV6 피부의 편평 상피암 및 4T1 유방암 모델이 사용될 수 있다 (가령, Langowski et al. (2006) Nature 442:461-465 참고). 면역적격성 Balb/C 또는 B-세포 결핍 Balb/C 마우스가 이용될 수 있따. PEG 10-mIL-10은 면역적격성 마우스에 투여될 수 있고, 한편, PEG-hIL-10 처리는 B-세포 결핍 마우스에 실시될 수 있다. 처리 시작되기 전, 종양은 100-250 mm3 크기에 도달하도록 한다. 종양 이식으로부터 떨어진 위치에서 IL-10, PEG-mIL-10, PEG-hIL-10, 또는 완충액 대조가 SC 투여된다. 종양 성장은 일반적으로 전자 캘리퍼스를 사용하여 매주 두 번 모니터링된다. 종양 조직 및 림프관을 다양한 종점에서 수확하여, 다수의 염증 표지에 대한 mRNA 발현을 측정하고, 여러 염증 세포 표지에 대한 면역조직화학을 수행한다. 조직을 액체 질소에서 급속 동결시키고, -80℃에서 보관한다. 일차 종양의 성장은 일반적으로 전자 캘리퍼스를 사용하여 매주 두 번씩 모니터링된다. 종양의 양은 공식을 사용하여 계산될 수 있는데(폭2 x 길이/2), 이때 길이는 더 긴 크기다. 처리 시작되기 전, 종양은 90-250 mm3 크기에 도달하도록 한다.
실시예 1
PEG-IL-10는 CD8 + T 세포 면역 활성화를 중재한다.
PD-1 및 LAG3-발현하는 CD8+ T 세포의 수의 변화는 PEG-rHuIL-10으로 치료하기 전, 그리고 치료 후 29일차에 암 환자에서 측정되었다. 지속적인 부분 반응을 보이는, 치료에 반응한 2 명의 환자의 혈액 내 PD1+ CD8 T 세포는 증가되었다. 첫 번째 환자 (신장 세포 암종)는 매일 20 μg/kg의 PEG-rHuIL-10을 SC로 투여받았고, 22 주 후에 전체 종양 부하가 71 % 감소했다. 두 번째 환자 (흑색종)는 매일 40 μg/kg의 PEG-rHuIL-10을 SC로 투여받았고, 22 주 후에 전체 종양 부하가 57 % 감소했다.
말초 혈액 단구 세포 (PBMC)는 전처리 과정과 치료 기간 동안 말초 혈액으로부터 단리되었으며, FACS 분석하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, PD-1을 발현하는 말초 CD8+ T 세포의 수는 29 일 이내에 ~ 2 배 증가하고, 처리 기간 동안 계속 증가하고, 그리고 LAG3을 발현하는 말초 CD8+ T 세포의 수는 29 일 이내에 ~ 4배 증가하였다. PD-1과 LAG3은 모두 CD8+ T 세포 활성화와 세포독성 기능의 표지다. 이와 같은 발견은 PEG-rHuIL-10 투여는 CD8+ T 세포 면역 활성화를 중재한다는 것을 암시한다.
실시예 2
PEG-IL-10은 활성화된 메모리 CD8 + T 세포의 기능을 강화시킨다.
메모리 T 세포 (항원-경험한 T 세포로도 불림)는 기존 감염, 암에 노출 및 백신접종을 이미 경험하고, 기존 감염, 암에 노출 또는 기존 백신접종 동안 이들의 동적 항원에 반응한 T 림프구의 하위집단 (가령, 헬퍼 T 세포 (CD4+) 및 세포독성 T 세포 (CD8+))이다. 대조적으로, 순수 T 세포는 주변에서 이들의 동족 항원과 마주치지 않았고, 이들은 활성화 표지 CD25, CD44 또는 CD69 부재, 그리고 메모리 CD45RO 아이소폼(isoform)의 부재를 일반적으로 특징으로 한다. 일반적으로 CD45RO+인 메모리 T 세포는 순수 T 세포보다 더 신속하고, 강력한 면역반응을 재현 및 탑재할 수 있다.
CAR-T T 세포는 메모리 CD8+ T 세포로부터 유도되기 때문에, 메모리 CD8+ T 세포 상에서 PEG-IL-10의 효과는 표준 방법을 이용하여 시험관내에서 평가되었고, 이의 예들은 본 명세서에서 기술된다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, PEG-IL-10은 메모리 CD8+T 세포 (CD45RO+)에서 IFNγ 생산을 선호적으로 강화시키지만, 순수 CD8+T 세포에서는 그러지 않는다. 이들 데이터는 활성화된 메모리 CD8+ T 세포의 기능을 강화시키는 PEG-IL-10의 효과와 일관된다.
실시예 3
PEG-IL-10 처리는 활성화된 메모리 CD8 + T 세포 수를 상당히 증가시킨다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이, CAR-T 세포 요법은 메모리 CD8+ T 세포로부터 유도된다. 효과적이기 위하여, 주입된 메모리 CD8+ T 세포는 세포 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 지속적이어야 한다 (Curran KJ, Brentjens RJ. (20 Apr 2015) J Clin Oncol pii: JCO.2014.60.3449; Berger et al., (Jan 2008) J Clin Invest 118(1):294-305). 그러나, T 세포의 반복된 활성화는 활성화 유도된 세포 사멸을 유도하여 세포의 수를 줄이고, 따라서 전반적인 치료 효능을 감소시킨다.
본 발명에 기술된 절차를 사용하여, 두 기증자로부터의 인간 CD45RO+ 메모리 CD8+ T 세포의 활성화-유도된 세포사멸은 PEG-IL-10으로 처리 및 처리하지 않는 경우 확인하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 2회의 TCR 및 공동-자극에 의한 활성화 후, 인간 CD45RO+ 메모리 CD8+ T 세포를 PEG-IL-10으로 처리하면, 생존 가능한 세포 수가 더 많아졌다. 이러한 데이터는 PEG-IL-10이 활성화-유도된 세포 사멸을 제한할 수 있어서, 더 많은 수의 활성화된 메모리 T 세포가 지속됨을 나타낸다. 이와 같은 관찰로부터 CAR-T 세포 요법과 PEG-IL-10을 병용 사용하면 추가적인 임상적 이점이 있음을 시사한다.
본 발명의 특정 구체예들이 본 명세서에서 기술되며, 이는 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 공지된 최적의 방식을 포함한다. 전술한 설명을 읽으면, 개시된 실시예들의 설명, 변형이 당업자에게 명백해질 수 있으며, 당업자는 이러한 변형을 적절하게 사용할 수 있다는 것을 예상한다. 따라서, 본 발명은 여기에 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시되는 것으로 의도될 수 있고, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 본 명세서에 첨부된 청구범위에서 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 이의 가능한 변형 모두에서 상기-기술된 요소의 임의의 조합이 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한 또는 맥락에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 본 발명에 포괄된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 수탁 번호 및 기타 참고 문헌은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조에 포함되도록 지시된 것처럼 본 발명에 참고로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mumm, John B. Chan, Ivan H. <120> METHODS OF USING INTERLEUKIN-10 FOR TREATING DISEASES AND DISORDERS <130> ARMO-016WO <150> US 62/167,699 <151> 2015-05-28 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 2 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 3 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 4 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 5 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 6 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 7 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 8 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 9 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 10 Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> This stretch of residues may be present 1 to 50 times. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> This residue may be present 1 to 20 times. <400> 11 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> This residue may be present 1 to 20 times. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> This stretch of residues may be present 1 to 20 times. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> This residue may be present 1 to 20 times. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> This residue may be present 1 to 20 times. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> This residue may be present 1 to 20 times. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> This residue may be present 1 to 20 times. <400> 12 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> This stretch of residues may be present 1 to 50 times. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> This residue may be present 1 to 20 times. <400> 13 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 14 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 15 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 16 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 17 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 18 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> This stretch of residues may be present 1 to 50 times. <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (95)

  1. 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하는, 다음을 포함하는 방법:
    a) 상기 대상에게 키메라 항원 수용체가 발현되도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 (CAR)를 도입시키고,
    이때, 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며;
    이때, 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도되며; 그리고
    b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 치료요법적으로 효과량의 IL-10 물질을 상기 대상에게 투여하고;
    이로 인하여 T-세포-매개된 면역 반응은 조절된다.
  2. 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은 상기 대상에게 다음의 것을 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 도입시키고:
    a) 키메라 항원 수용체 (CAR),
    이때, 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며;
    이때, 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도되며; 그리고
    b)활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 상기 IL-10 물질;
    이로 인하여 T-세포-매개된 면역 반응은 조절된다.
  3. 대상에서 표적 세포 집단에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 조절하는 방법에 있어서, 이 방법은 상기 대상에게 다음을 도입시키는 것을 포함하는 방법:
    a) 키메라 항원 수용체(CAR)가 발현되도록 유전적으로 변형된, 치료요법적으로 효과적인 제 1 다수의 세포,
    이때, 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며;
    이때, 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도되며; 그리고
    b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 IL-10 물질을 발현하도록 유전적으로 변형된, 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포;
    이로 인하여 T-세포-매개된 면역 반응은 조절된다.
  4. 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 CAR은 상기 표적 세포 집단을 특이적으로 인지하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 CAR은 막경유 도메인과 신호전달 도메인을 더 포함하는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 이때 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 이때 상기 신호전달 도메인은 최소한 하나의 공동-자극 도메인을 포함하는, 방법.
  8. 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 활성화된 메모리 CD8+ T 세포의 기능을 강화시키는, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 투여에 앞서 투여되는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 투여와 동시에 투여되는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 투여 이후 투여되는 방법.
  12. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 키메라 항원 수용체와 IL-10 물질은 동일한 벡터에 의해 발현되는, 방법.
  13. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 키메라 항원 수용체와 IL-10 물질은 상이한 벡터에 의해 발현되는, 방법.
  14. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  15. 청구항 3에 있어서, 이때 상기 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  16. 청구항 3에 있어서, 이때 상기 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포는 상기 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  17. 청구항 12-16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 벡터는 플라스미드를 포함하는, 방법.
  18. 청구항 12-16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 방법.
  19. 청구항 12-16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질의 발현은 발현 제어 요소에 의해 조절되는, 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 이때 투여되는 IL-10 물질의 양은 세포독성 기능을 강화하는데 충분한, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 이때 투여되는 IL-10 물질의 양은 10-100 ng/mL의 혈청 농도를 얻는데 충분한, 방법.
  22. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 PEG-IL-10인, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 이때 PEG-IL-10은 IL-10의 최소한 하나의 단량체의 최소한 하나의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된 최소한 하나의 PEG 분자를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 22에 있어서, 이때 PEG-IL-10은 단일-페길화된 그리고 이중-페길화된 IL-10의 혼합물을 포함하는, 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 이때 PEG-IL-10에서 PEG 성분은 5kDa ~ 20kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  26. 청구항 22에 있어서, 이때 PEG-IL-10에서 PEG 성분은 최소한 20kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  27. 청구항 22에 있어서, 이때 PEG-IL-10에서 PEG 성분은 최소한 30kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  28. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 피하로 투여되는, 방법.
  29. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 상기 대상으로부터 구할 수 있고, 생체외에서 유전적으로 변형되는, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 혈장교환(apheresis)에 의해 대상으로부터 획득되는, 방법.
  31. 청구항 3에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형되는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 제 2 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형되는, 방법.
  33. 청구항 31 및 32에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 혈장교환(apheresis)에 의해 대상으로부터 획득되는, 방법.
  34. 청구항 30에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포인, 방법.
  35. 청구항 33에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포인, 방법.
  36. 청구항 33에 있어서, 이때 상기 제 2 다수의 세포는 순수 CD8+ T 세포인, 방법.
  37. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 자가 종양 세포인, 방법.
  38. 청구항 3에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 자가 종양 세포인, 방법.
  39. 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 세포 집단은 종양 항원을 포함하는, 방법.
  40. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, 또는 이의 임의의 조합으로 구성된 집단에서 선택되는, 방법.
  41. 암-관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상을 치료하는, 다음을 포함하는 방법:
    a) 상기 대상에게 키메라 항원 수용체가 발현되록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 (CAR)를 도입시키고,
    이때, 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며;
    이때, 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도되며; 그리고
    b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한하는데 충분한 치료요법적으로 효과량의 IL-10 물질을 상기 대상에게 투여한다.
  42. 암-관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상을 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 다음의 것들을 발현시키도록 유전적으로 변형된 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포를 상기 대상에게 도입시키는 것을 포함하는, 방법:
    a) 키메라 항원 수용체 (CAR),
    이때, 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며;
    이때, 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도되며; 그리고
    b)활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 상기 IL-10 물질.
  43. 암-관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상을 치료하는, 다음을 포함하는 방법에 있어서, 상기 대상에게 다음을 도입시키는 것을 포함하는 방법:
    a) 키메라 항원 수용체(CAR)가 발현되도록 유전적으로 변형된, 치료요법적으로 효과적인 제 1 다수의 세포,
    이때, 상기 키메라 항원 수용체는 상기 표적 세포 집단에 결합할 수 있는 최소한 하나의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하며;
    이때, 상기 키메라 항원 수용체 표적화 영역이 상기 표적 세포 집단에 결합함으로써 활성화-유도된 세포 사멸이 유도되며; 그리고
    b) 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양의 IL-10 물질을 발현하도록 유전적으로 변형된, 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포.
  44. 청구항 41-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 CAR은 상기 표적 세포 집단을 특이적으로 인지하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 방법.
  45. 청구항 41-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 CAR은 막경유 도메인과 신호전달 도메인을 더 포함하는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 이때 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  47. 청구항 45에 있어서, 이때 상기 신호전달 도메인은 최소한 하나의 공동-자극 도메인을 포함하는, 방법.
  48. 청구항 41-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 IL-10 물질은 활성화된 메모리 CD8+ T 세포의 기능을 강화시키는, 방법.
  49. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 투여에 앞서 투여되는 방법.
  50. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 투여와 동시에 투여되는 방법.
  51. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포 투여 이후 투여되는 방법.
  52. 청구항 42에 있어서, 이때 상기 키메라 항원 수용체와 IL-10 물질은 동일한 벡터에 의해 발현되는, 방법.
  53. 청구항 42에 있어서, 이때 상기 키메라 항원 수용체와 IL-10 물질은 상이한 벡터에 의해 발현되는, 방법.
  54. 청구항 42에 있어서, 이때 상기 치료요법적으로 효과적인 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  55. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포는 세포독성 기능을 강화시키는데 충분한 양으로 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염되는, 방법.
  56. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 치료요법적으로 효과적인 제 2 다수의 세포는 상기 IL-10 물질을 발현시키는 벡터로 형질감염된 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  57. 청구항 52-56중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 벡터는 플라스미드를 포함하는, 방법.
  58. 청구항 52-56중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 방법.
  59. 청구항 52-56중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질의 발현은 발현 제어 요소에 의해 조절되는, 방법.
  60. 청구항 41에 있어서, 이때 투여되는 IL-10 물질의 양은 세포독성 기능을 강화하는데 충분한, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 이때 투여되는 IL-10 물질의 양은 10-100 ng/mL의 혈청 농도를 얻는데 충분한, 방법.
  62. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 PEG-IL-10인, 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 이때 PEG-IL-10은 IL-10의 최소한 하나의 단량체의 최소한 하나의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된 최소한 하나의 PEG 분자를 포함하는, 방법.
  64. 청구항 62에 있어서, 이때 PEG-IL-10은 단일-페길화된 그리고 이중-페길화된 IL-10의 혼합물을 포함하는, 방법.
  65. 청구항 62에 있어서, 이때 PEG-IL-10에서 PEG 성분은 5kDa ~ 20kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  66. 청구항 62에 있어서, 이때 PEG-IL-10에서 PEG 성분은 최소한 20kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  67. 청구항 62에 있어서, 이때 PEG-IL-10에서 PEG 성분은 최소한 30kDa의 분자량을 갖는, 방법.
  68. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 IL-10 물질은 피하로 투여되는, 방법.
  69. 청구항 41 또는 42에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 상기 대상으로부터 구할 수 있고, 생체외에서 유전적으로 변형되는, 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 혈장교환(apheresis)에 의해 대상으로부터 획득되는, 방법.
  71. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형되는, 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 이때 상기 제 2 다수의 세포는 상기 대상으로부터 얻고, 생체외에서 유전적으로 변형되는, 방법.
  73. 청구항 71 및 72에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 혈장교환(apheresis)에 의해 대상으로부터 획득되는, 방법.
  74. 청구항 70에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포인, 방법.
  75. 청구항 73에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포는 메모리 CD8+ T 세포인, 방법.
  76. 청구항 73에 있어서, 이때 상기 제 2 다수의 세포는 순수 CD8+ T 세포인, 방법.
  77. 청구항 41 또는 42에 있어서, 이때 상기 다수의 세포는 자가 종양 세포인, 방법.
  78. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 제 1 다수의 세포와 제 2 다수의 세포는 자가 종양 세포인, 방법.
  79. 청구항 41-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 세포 집단은 종양 항원을 포함하는, 방법.
  80. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, 또는 이의 임의의 조합으로 구성된 집단에서 선택되는, 방법.
  81. 청구항 42 또는 43에 있어서, 이때 IL-10 물질은 상기 대상에게 도입된 후 최소 2주 후, 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양으로 발현되는, 방법.
  82. 청구항 42 또는 43에 있어서, 이때 IL-10 물질은 상기 대상에게 도입된 후 최소 1개월 후, 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양으로 발현되는, 방법.
  83. 청구항 42 또는 43에 있어서, 이때 IL-10 물질은 상기 대상에게 도입된 후 최소 3개월 후, 활성화-유도된 세포 사멸을 방지 또는 제한시키는데 충분한 양으로 발현되는, 방법.
  84. 청구항 42 또는 43에 따른 IL-10 물질을 인코드하는 핵산 분자.
  85. 청구항 84에 있어서, 이때 핵산 분자는 IL-10 물질을 인코드하는 핵산 분자의 발현을 부여하는 발현 제어 요소에 작동가능하도록 연계되는, 방법.
  86. 청구항 84 또는 85의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  87. 청구항 86에 있어서, 이때 상기 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 방법.
  88. 청구항 87에 있어서, 이때 상기 벡터는 플라스미드를 포함하는, 방법.
  89. 청구항 52 또는 43의 IL-10 물질을 발현하는 형질변환된 또는 숙주 세포.
  90. CAR-T T 세포의 기능을 강화시키는, 다음을 포함하는 방법:
    a) CAR기 발현되도록 T 세포를 유전적으로 조작하고, 이로 인하여 CAR-T T 세포가 생성되며; 그리고
    b) CAR-T T 세포에 의해 분비되는 최소한 하나의 사이토킨의 양을 감소시키는 물질로 CAR-T T 세포를 조절하고, 이로 인하여 CAR-T T 세포의 기능이 강화된다.
  91. 청구항 90에 있어서, 이때 상기 물질은 작은 간섭 RNA (siRNA)인, 방법.
  92. 청구항 91에 있어서, 이때 상기 사이토킨은 종양 괴사 인자 패밀리 또는 형질전환 성장 인자 베타 슈퍼패밀리의 구성원인, 방법.
  93. 청구항 92에 있어서, 이때 상기 종양 괴사 인자 패밀리의 구성원은 TNFα인, 방법.
  94. 청구항 92에 있어서, 이때 형질전환 성장 인자 베타 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β인, 방법.
  95. 청구항 94에 있어서, 이때 TGF-β의 양 감소로 T 조절 세포의 증식이 감소되는, 방법.
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